(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１（寄託番号：ＫＣＣＭ１１１７９Ｐ）菌株であって、
前記菌株は、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）の葉から分離されたものであり、
前記菌株は、乳酸（ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）生成能を有し、生成された乳酸のうちＤ型が７０％以下である、菌株。
【請求項２】
ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３（寄託番号：ＫＣＣＭ１１１８０Ｐ）菌株であって、
前記菌株は、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）の葉から分離されたものであり、
前記菌株は、乳酸（ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）生成能を有し、生成された乳酸のうちＤ型が７０％以下である、菌株。
【請求項３】
ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６（寄託番号：ＫＣＣＭ１１１８１Ｐ）菌株であって、
前記菌株は、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）の葉から分離されたものであり、
前記菌株は、乳酸（ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）生成能を有し、生成された乳酸のうちＤ型が７０％以下である、菌株。
【請求項４】
ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９（寄託番号：ＫＣＣＭ１１１８２Ｐ）菌株であって、
前記菌株は、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）の葉から分離されたものであり、
前記菌株は、乳酸（ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）生成能を有し、生成された乳酸のうちＤ型が７０％以下である、菌株。
【請求項５】
前記菌株は、耐酸性能を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載
の菌株。
【請求項６】
前記菌株は、ｐＨ２〜ｐＨ４において０．５時間〜５時間の耐酸性能を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項７】
前記菌株は、耐胆汁酸能を有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項による菌株またはその培養液を含む組成物。
【請求項９】
組成物は、発酵食品組成物であることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チャノキ葉から分離した新規なラクトバチルス・プランタラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
飲む用途の茶は、ツバキ科のカメリアシネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）の芽や葉の中に存在する酸化酵素を不活性化し、水分を除去したものである。このような茶は、ビタミンをはじめ、カフェイン、タンニン、フラボノイドおよび精油等を配合し、食品分野を例として、多くの分野で広く活用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】韓国特許第１０−９０９４５２号公報
【特許文献２】韓国特許第１０−９１１１１５号公報
【特許文献３】韓国特許第１０−９７３９７７号公報
【特許文献４】韓国特許第１０−２００８−１０２７７３号公報
【特許文献５】韓国特許第１０−２０１０−９９５３６号公報
【特許文献６】韓国特許第１０−２００６−５３５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、新規ラクトバチルス・プランタラム菌株を提供しようとするものである。また、前記新規ラクトバチルス・プランタラム菌株またはその培養液を含む組成物を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一側面は、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１菌株を提供する。
【０００６】
本発明の一側面は、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３菌株を提供する。
【０００７】
本発明の一側面は、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６菌株を提供する。
【０００８】
本発明の一側面は、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９菌株を提供する。
【０００９】
本発明の他の一側面は、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１菌株、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３菌株、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６菌株およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９菌株のうち一つ以上またはその培養液を含む組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る新規ラクトバチルス・プランタラム菌株は、耐酸性に優れるので、これを食品として摂取した場合、胃においても生存可能であり、ひいては腸内到達率が高まり得る。本発明に係るラクトバチルス・プランタラム菌株は、耐胆汁酸能に優れるので、腸内定着力に優れる。また、本発明に係るラクトバチルス・プランタラム菌株は、抗菌力に優れるので、有害細菌抑制効果に優れる。本発明に係るラクトバチルス・プランタラム菌株は、生成した乳酸中におけるＤ‐乳酸の比率が従来のラクトバチルス・プランタラムに比べて低いので、乳酸に脆弱な成人または乳幼児も自由に摂取可能である。そして、本発明に係るラクトバチルス・プランタラム菌株は、既存のラクトバチルス・プランタラムに比べて少ない量の乳酸を生成するので、これを利用して食品を発酵させる場合、食品は、まろやかな味を有するようになる。したがって、本発明に係る新規ラクトバチルス・プランタラム菌株は、食品分野を例として、多様な分野において広く活用され得る。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
乳酸菌は、グルコース等の糖類を分解して乳酸（ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）を生成する細菌を指す。乳酸菌の乳酸発酵によって生成された乳酸は、病原菌や有害細菌の生育を阻止することができ、このような性質は、乳製品、キムチ類、醸造食品等の食品の製造に利用されている。また、乳酸菌は、哺乳類の腸内に生息して雑菌による異常発酵を防止するので、整腸剤としても利用される重要な細菌である。
【００１２】
ラクトバチルス・プランタラムは、乳酸菌に属する菌株で、主にキムチの発酵が多く進んで酸味が出る際に生長するものと知られている。生成する乳酸の光学異性体はＤ型とＬ型である。ラクトバチルス・プランタラムは、発酵が必要な各種食品に広く利用され得るので、耐酸性能、耐胆汁酸能および抗菌力に優れるラクトバチルス・プランタラムが開発されれば、有用に使用され得る。
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明の一側面は、ラクトバチルス・プランタラムＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１（寄託番号：ＫＣＣＭ１１１７９Ｐ）菌株を提供する。本発明の一側面は、ラクトバチルス・プランタラムＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３（寄託番号：ＫＣＣＭ１１１８０Ｐ）菌株を提供する。本発明の一側面は、ラクトバチルス・プランタラムＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６（寄託番号：ＫＣＣＭ１１１８１Ｐ）菌株を提供する。本発明の一側面は、ラクトバチルス・プランタラムＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９（寄託番号：ＫＣＣＭ１１１８２Ｐ）菌株を提供する。
【００１５】
本発明に係るラクトバチルス・プランタラムＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９のうち一つ以上は、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）の葉から分離した菌株でラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に属する。具体的に、本発明に係るラクトバチルス・プランタラム菌株は、チャノキ葉を、チャノキ葉の重量に対し５〜１５重量％の食塩で漬け込むステップ；漬け込んだチャノキ葉を、０．１％〜３％のフラクトオリゴ糖を例とする糖溶液と混合して、２５〜３５℃で１〜５日間培養するステップ；および、ｐＨ５未満からなる培養液を採って、２５〜３５℃の嫌気条件下で１〜５日間培養するステップを含む方法により分離してよい。
【００１６】
本発明の一側面によるラクトバチルス・プランタラムＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９のうち一つ以上は、優れた耐酸性能を有する。ラクトバチルス・プランタラムを例とする乳酸菌を生菌剤として摂取する場合、乳酸菌特有の効果を発揮するためには、腸内到達率が高いことが好ましい。腸内到達率を高くするためには、まず、胃酸の分泌によってｐＨの低い胃における生存率が高くなければならない。胃の空腹時、ｐＨは１．２〜２程度であるが、飲食物を摂取した場合、ｐＨは約２〜３程度であるものと知られている。本発明に係るラクトバチルス・プランタラム菌株は、ｐＨ２超過〜４、具体的にｐＨ２超過〜３．５またはｐＨ２．５〜４、より具体的にｐＨ２．５〜３．５、さらに具体的にｐＨ２．５〜３において優れた耐酸性能を有する。一方、飲食物を摂取する場合、飲食物の胃での平均滞留時間は、１〜３時間程度と知られている。本発明に係るラクトバチルス・プランタラム菌株は、０．５時間〜５時間、具体的には１時間〜４時間の間、ｐＨ２超過〜４、具体的にｐＨ２超過〜３．５またはｐＨ２．５〜４、より具体的にｐＨ２．５〜３．５、さらに具体的にｐＨ２．５〜３において優れた耐酸性能を有する。したがって、本発明に係るラクトバチルス・プランタラム菌株は、胃での滞留期間中、胃の低いｐＨにおいても生存可能であるので、食品として摂取した場合、腸内到達率が高い。
【００１７】
本発明の一側面によるラクトバチルス・プランタラム菌株は、優れた耐胆汁酸能を有する。胃を通過した食物は、小腸へ伝達され、このとき、胆汁酸が分泌されて食物の消化を助ける。胆汁酸に対する耐性が高い菌株は、腸内定着力も良いものと知られている。本発明の一側面によるラクトバチルス・プランタラム菌株は、耐胆汁酸能に優れるので、腸内定着力が優れている。
【００１８】
本発明の一側面によるラクトバチルス・プランタラム菌株は、乳酸生成能を有する。一般的に、乳酸菌が生成する乳酸には、Ｌ型とＤ型がある。このうち、Ｄ‐乳酸は、体内の代謝速度がＬ‐乳酸に比べて遅いので、血中Ｄ‐乳酸の濃度が高くなると乳酸中毒症を誘発し得る。したがって、乳酸に脆弱な成人や、乳幼児は、Ｄ‐乳酸を多量生成する乳酸菌をできるだけ摂取しないことが好ましい。
【００１９】
本発明の他の一側面によるラクトバチルス・プランタラム菌株は、生成した乳酸中に、Ｄ型が７５％以下、具体的に７０％以下、より具体的に６５％以下である乳酸を生成してよい。
【００２０】
本発明の他の一側面によるラクトバチルス・プランタラム菌株は、１７．５ｇ／Ｌ以下、具体的に１７ｇ／Ｌ以下、より具体的に１６．５ｇ／Ｌ以下、さらに具体的に１５ｇ／Ｌ以下、さらに具体的に１４．５ｇ／Ｌ以下、さらに具体的に１４ｇ／Ｌ以下、さらに具体的に１３．５ｇ／Ｌ以下の乳酸を生成してよい。
【００２１】
このように、本発明に係るラクトバチルス・プランタラム菌株は、既存のラクトバチルス・プランタラムよりもＤ型の比率が低い乳酸を生成するので、乳酸に脆弱な成人や乳幼児も自由に摂取可能である。また、乳酸生成量も、既存のラクトバチルス・プランタラムよりも低いため、これを利用して食品を発酵させる場合、食品がよりまろやかな味を有し得る。
【００２２】
本発明の一側面は、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１菌株、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３菌株、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６菌株およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９菌株のうち一つ以上の抽出物または培養液を提供する。本発明の他の一側面は、ラクトバチルス・プランタラムＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１菌株、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３菌株、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６菌株およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９菌株のうち一つ以上における、その抽出物またはその培養液を含む組成物を提供する。
【００２３】
本発明の一側面は、ラクトバチルス・プランタラムＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１菌株、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３菌株、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６菌株およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９菌株のうち一つ以上における、その抽出物またはその培養液を含む食品組成物を提供する。
【００２４】
前記食品組成物は、健康食品組成物であってよく、茶類、乳製品類、キムチ類、醸造食品を例とする、発酵が必要な発酵食品組成物であってよい。
【００２５】
前記食品組成物の剤形は、特に限定されないが、例えば、錠剤、丸剤、軟質および硬質カプセル剤、顆粒剤、ドリンク剤、カラメル、ダイエットバー、ティーバッグ等に剤形化されてよい。各剤形の食品組成物は、有効成分以外に、当該分野において通常的に使用される成分を、剤形または使用目的に応じて当業者が困難なく適宜選定して配合してよく、他の原料と同時に適用する場合、相乗効果が起こってよい。
【００２６】
前記有効成分の投与量の決定は当業者の水準内にあり、その１日投与量は、例えば、ラクトバチルス・プランタラム１０５〜１０１３ＣＦＵ／日、より具体的には１０６〜１０１０ＣＦＵ／日とされてよいが、これらに制限されず、投与しようとする対象の年齢、健康状態、合併症等の多様な要因に応じて変わってよい。
【００２７】
本発明の一側面は、ラクトバチルス・プランタラムＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１菌株、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３菌株、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６菌株およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９菌株のうち一つ以上における、その抽出物またはその培養液を含む化粧品組成物を提供する。前記化粧品組成物は、局所適用に適したあらゆる剤形として提供されてよい。例えば、溶液、水相に油相を分散させて得たエマルジョン、油相に水相を分散させて得たエマルジョン、懸濁液、固体、ゲル、粉末、ペースト、泡沫（ｆｏａｍ）またはエアロゾル組成物の剤形として提供されてよい。このような剤形の組成物は、当該分野の通常的な方法に従って製造されてよい。
【００２８】
前記の化粧品組成物は、前記した物質以外に主効果を損なわない範囲内で、好ましくは、主効果に相乗効果を与え得る他の成分を含有してよい。本発明に係る化粧品組成物は、ビタミン、高分子ペプチド、高分子多糖およびスフィンゴ脂質からなる群より選択された物質を含んでよい。また、本発明に係る化粧品組成物は、保湿剤、エモリエント剤、界面活性剤、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、有機および無機顔料、香料、冷感剤または制汗剤を含んでよい。前記成分の配合量は、本発明の目的および効果を損なわない範囲内において当業者が容易に選択可能であり、その配合量は、組成物全体の重量を基準に０．０１〜５重量％、具体的には０．０１〜３重量％であってよい。
【００２９】
本発明の一側面は、ラクトバチルス・プランタラムＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１菌株、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３菌株、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６菌株およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９菌株のうち一つ以上における、その抽出物またはその培養液を含む薬学組成物を提供する。前記薬学組成物は、過敏性腸症候群、便秘、下痢等を例とする腸疾患の予防または治療に使用されてよい。
【００３０】
本発明の一側面による薬学組成物は、経口、非経口、直腸、局所、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下等に投与されてよい。経口投与のための剤形は、錠剤、丸剤、軟質および硬質カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、液剤、乳濁剤またはペレット剤であってよいが、これらに限定されるものではない。非経口投与のための剤形は、溶液剤、懸濁剤、乳液剤、ゲル、注射剤、点滴剤、坐剤、パッチまたは噴霧剤であってよいが、これらに限定されるものではない。前記剤形は、当該分野における通常的な方法により容易に製造されてよく、界面活性剤、賦形剤、水和剤、乳化促進剤、懸濁剤、浸透圧調整のための塩または緩衝剤、着色剤、香辛料、安定化剤、防腐剤、保存剤またはその他常用する補助剤を適当に使用してよい。
【００３１】
本発明の一側面による薬学組成物の有効成分は、投与を受けるターゲットの年齢、性別、体重、病理状態およびその深刻度、投与経路または処方者の判断に応じて変わってよい。このような因子に基づいた適用量の決定は、当業者の水準内にあり、その１日投与量は、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜５０００ｍｇ／ｋｇ／日、より具体的には５０ｍｇ／ｋｇ／日〜５００ｍｇ／ｋｇ／日とされてよいが、これらに制限されるものではない。
【００３２】
前記ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９は、２０１１年３月２８日付で大韓民国ソウル市西大門区弘済１洞３６１−２２１楡林ビルにある韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に、それぞれ微生物寄託番号ＫＣＣＭ１１１７９Ｐ，ＫＣＣＭ１１１８０Ｐ，ＫＣＣＭ１１１８１ＰおよびＫＣＣＭ１１１８２Ｐとして寄託された。
【００３３】
（１）ラクトバチルス・プランタラムＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１
寄託機関名：韓国微生物保存センター（韓国国内）
受託番号：ＫＣＣＭ１１１７９Ｐ
受託日：２０１１年０３月２８日
（２）ラクトバチルス・プランタラムＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３
寄託機関名：韓国微生物保存センター（韓国国内）
受託番号：ＫＣＣＭ１１１８０Ｐ
受託日：２０１１年０３月２８日
（３）ラクトバチルス・プランタラムＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６
寄託機関名：韓国微生物保存センター（韓国国内）
受託番号：ＫＣＣＭ１１１８１Ｐ
受託日：２０１１年０３月２８日
（４）ラクトバチルス・プランタラムＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９
寄託機関名：韓国微生物保存センター（韓国国内）
受託番号：ＫＣＣＭ１１１８２Ｐ
受託日：２０１１年０３月２８日
【００３４】
以下、実施例および実験例を挙げつつ、本発明に係る新規なラクトバチルス・プランタラム菌株の分離方法、同定方法および特性について詳細に説明する。しかし、以下の実施例および実験例は、本発明に対する理解を助けるための例示の目的としてのみ提供されたものであるにすぎず、本発明の範疇および範囲がそれらによって制限されるものではない。
【００３５】
［実施例１］ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）菌株の分離
チャノキ葉２００ｇを、１次蒸留水に２回洗浄して異物を除去する。洗浄したチャノキ葉の水気を払い落とし、チャノキ葉重量の８％に該当する食塩と混合した後、３時間室温に放置する。食塩に漬け込まれたチャノキ葉を、１％フラクトオリゴ糖溶液１０００ｍＬに混合した後、３日間、３２℃インキュベーターにおいて培養する。３日後、培養液のｐＨが５未満に下がったかを確認し、ｐＨ５未満である場合、これを採ってディフコラクトバシリＭＲＳアガー（登録商標）（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ＭＲＳ  Ａｇａｒ（登録商標））培地に培養する。このとき、培養は３２℃、嫌気条件のチャンバーで２日間培養した後、白色集落を示すコロニーを採る。
【００３６】
前記のような方法により、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９それぞれを、チャノキ葉から分離した。
【００３７】
［実施例２］ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）菌株の同定
（１）菌株の培養
実施例１において分離したＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６1を、ＭＲＳアガープレートに塗抹（ｓｔｒｅａｋｉｎｇ）し、３７℃で、２日間培養する。得られた単一コロニー（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｌｏｎｙ）を、ＭＲＳブロス（ｂｒｏｔｈ）１０ｍＬに接種し、さらに３７℃で一晩培養してラクトバチルス・プランタラム菌株培養液を製造する。ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９についても、それぞれ実質的に同一の方法によりラクトバチルス・プランタラム菌株培養液を製造する。
【００３８】
（２）ラクトバチルス・プランタラム菌株の糖発酵パターン分析
前記（１）のように製造したＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１菌株の培養液を、ＭＲＳブロス１０ｍＬに０．５％接種して、３７℃で一晩培養した。培養液を８，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を取り除いて菌体のみを集めた後、０．８５％緩衝生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ）を２ｍＬ添加して懸濁した。その後、ＡＰＩ  ５０ＣＨＬキット（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）を使用して、製造社のプロトコルに従って進行した。その具体的な内容は、以下のとおりである。
【００３９】
まず、ＡＰＩ懸濁ミディアム（ｍｅｄｉｕｍ）５ｍＬに菌株の懸濁液を少しずつ入れながら、マクファーランドスタンダード２（ＭｃＦａｒｌａｎｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ２）（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）程度の濁度となるのに必要な懸濁液量を測定した。測定された懸濁液量の２倍をＡＰＩ  ５０ＣＨＬミディアム１０ｍＬに入れた後、振り混ぜた。それぞれ基質が入っているキューピュール（ｃｕｐｕｌｅ）に前記混合物を入れた後、ミネラルオイルを一滴ずつ落とし、３７℃で２日間培養した後、糖発酵パターンを分析した。ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９の菌株培養液についても、それぞれ実質的に同一の方法により糖発酵パターンを分析した。
【００４０】
ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）菌株（ＫＣＴＣ３１０８）を標準菌株として比較した、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９の糖発酵パターン結果、およびその結果を利用したＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９の同定結果は、下表（表１：ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１表２：ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３、表３：ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６および表４：ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９）のとおりである。
【００４１】
【表１】
0006033290.tif 000002
【００４２】
【表２】
0006033290.tif 000003
【００４３】
【表３】
0006033290.tif 000004
【００４４】
【表４】
0006033290.tif 000005
【００４５】
【表５】
0006033290.tif 000006
【００４６】
上記から見られるように、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９は、いずれもラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に対する一致度（％ｉｎｄｅｘ）が９９％以上と示され、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に属することが分かる。
【００４７】
また、標準菌株（ＫＣＴＣ３１０８）と対比して、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１は、α‐メチル‐マンノシド（ｍａｎｎｏｓｉｄｅ）およびラフィノース（ｒａｆｆｉｎｏｓｅ）の利用性質が異なり、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３は、α‐メチル‐マンノシド（ｍａｎｎｏｓｉｄｅ）、ラフィノース（ｒａｆｆｉｎｏｓｅ）およびＤ‐ツラノース（Ｄ‐ｔｕｒａｎｏｓｅ）の利用性質が異なり、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６は、α‐メチル‐マンノシド（ｍａｎｎｏｓｉｄｅ）およびラフィノース（ｒａｆｆｉｎｏｓｅ）の利用性質が異なり、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９は、Ｌ‐アラビノース（Ｌ‐ａｒａｂｉｎｏｓｅ）およびラフィノース（ｒａｆｆｉｎｏｓｅ）の利用性質が異なり、これらはいずれも標準菌株と異なる菌株であることを確認することができる。
【００４８】
（３）ラクトバチルス・プランタラム菌株の酵素活性パターンの分析
前記（１）のように製造したＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１菌株培養液をＭＲＳブロス１０ｍＬに０．５％接種し、３７℃で一晩培養した。培養液を８，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を取り除いて菌体のみを集めた後、０．８５％緩衝生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ）を２ｍＬ添加して懸濁した。その後、ＡＰＩ  ＺＹＭキット（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）を使用して、製造社のプロトコルに従って進行した。その具体的な内容は、以下のとおりである。
【００４９】
まず、ＡＰＩ懸濁ミディアム（ｍｅｄｉｕｍ）５ｍＬに菌株の懸濁液を少しずつ入れながら、マクファーランドスタンダード２（ＭｃＦａｒｌａｎｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ２）（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）程度の濁度となるのに必要な懸濁液量を測定した。測定された懸濁液の量の２倍をＡＰＩ  ５０ＣＨＬミディアム１０ｍＬに入れた後、振り混ぜた。各キューピュール（ｃｕｐｕｌｅ）に前記混合物６５μｌずつを入れて、３７℃で４時間培養した。ＺＹＭ  Ａ試薬とＺＹＭ  Ｂ試薬をそれぞれのキューピュールに１滴ずつ落とし、５分後、色の強さに応じて０〜５まで点数を付け、３以上であれば陽性と判定した。
【００５０】
ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９菌株の培養液についても、それぞれ実質的に同一の方法により酵素活性パターンを分析した。
【００５１】
ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）菌株（ＫＣＴＣ３１０８）を標準菌株として比較した、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９の酵素活性パターン結果は、下表のとおりである。（表６：ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１、表７：ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３、表８：ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６、および表９：ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９）
【００５２】
【表６】
0006033290.tif 000007
【００５３】
【表７】
0006033290.tif 000008
【００５４】
【表８】
0006033290.tif 000009
【００５５】
【表９】
0006033290.tif 000010
【００５６】
上記から見られるように、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９は、いずれも標準菌株（ＫＣＴＣ３１０８）と対比して、酸ホスファターゼ（Ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅａｓｅ）、ナフトール‐ＡＳ‐ＢＩ‐ホスホヒドラーゼ（Ｎａｐｈｔｈｏｌ‐ＡＳ‐ＢＩ‐ｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、α‐ガラクトシダーゼ（α‐ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）およびＮ‐アセチル‐β‐グルコサミニダーゼ（Ｎ‐ａｃｅｔｙｌ‐β‐ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）の酵素活性強度において差があった。したがって、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９は、いずれも標準菌株と異なる菌株であることが分かる。
【００５７】
また、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９は、腸内において発癌性前駆物質に作用して発癌性物質に変化させることで癌を誘発し得る代表的な発癌酵素中の一つとして知られているβ‐グルクロニナーゼ（β‐ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）活性に対して陰性と判定された。なお、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３は、α‐グルコシダーゼ（α‐ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）の活性を抑制する。したがって、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９は、いずれも食品組成物に活用しても差し支えないことが分かる。
【００５８】
（４）ラクトバチルス・プランタラム菌株の抗生物質耐性評価
ペトリ皿（直径１００ｍｍ）に、滅菌したＭＲＳアガーを２０ｍＬずつ入れ、クリーンベンチで冷まして培地を製造した。ＭＲＳブロス１０ｍＬに、（１）で製造したＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１菌株培養液を０．５％接種し、３７℃で６時間培養した。６２５ｎｍにおける吸光度が０．０８〜０．１３程度となるように希釈した。希釈液を滅菌した綿棒に十分に浸した後、あらかじめ作られたＭＲＳアガープレートに全体的に均等に塗抹した。抗生物質感受性評価ディスクをプレート上に適当な間隔を開けて落とした。３７℃で２４時間培養した後、クリーンゾーン（ｃｌｅａｒ  ｚｏｎｅ）の直径を測定した。
【００５９】
ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９菌株培養液についても、それぞれ実質的に同一の方法により抗生物質耐性を評価した。
【００６０】
抗生物質感受性評価ディスク濃度および評価基準は、下表のとおりである。
【００６１】
【表１０】
0006033290.tif 000011
【００６２】
ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）菌株（ＫＣＴＣ３１０８）を標準菌株として比較した、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９の抗生物質耐性評価結果は、下表のとおりである。（表１１：ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１とＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３、表１２：ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６とＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９）
【００６３】
【表１１】
0006033290.tif 000012
【００６４】
【表１２】
0006033290.tif 000013
【００６５】
上記から見られるように、標準菌株（ＫＣＴＣ３１０８）と対比して、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１は、セフタジジム（ｃｅｆｔａｚｉｄｉｍｅ）、クリンダマイシン（ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ）、ニトロフラントイン（ｎｉｔｒｏｆｕｒａｎｔｏｉｎ）の抗生物質耐性パターンにおいて差を示し、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３は、セフタジジム（ｃｅｆｔａｚｉｄｉｍｅ）、ニトロフラントイン（ｎｉｔｒｏｆｕｒａｎｔｏｉｎ）の抗生物質耐性パターンにおいて差を示した。また、標準菌株（ＫＣＴＣ３１０８）と比較して、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６は、セフタジジム（ｃｅｆｔａｚｉｄｉｍｅ）、ニトロフラントイン（ｎｉｔｒｏｆｕｒａｎｔｏｉｎ）およびペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｉｌｉｎ）の抗生物質耐性パターンにおいて差を示し、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９は、セフタジジム（ｃｅｆｔａｚｉｄｉｍｅ）、クリンダマイシン（ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ）、ニトロフラントイン（ｎｉｔｒｏｆｕｒａｎｔｏｉｎ）およびペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｉｌｉｎ）の抗生物質耐性パターンにおいて差を示した。したがって、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９は、いずれも標準菌株と異なる菌株であることがわかる。
【００６６】
糖発酵パターン、酵素活性パターン、抗生物質耐性パターンを総合的に分析すると、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９は、いずれもラクトバチルス・プランタラムに属し、ラクトバチルス・プランタラム標準菌株（ＫＣＴＣ３１０８）と異なる新規な菌株であることが分かる。
【００６７】
［実験例１］耐酸性能評価
（１）ｐＨ別耐酸性能評価
ＭＲＳブロス１０ｍＬに、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１の菌株培養液を０．５％接種し、３７℃で一晩培養した。ＨＣｌでｐＨをそれぞれ２．０、２．５、３．０、３．５に調整して、滅菌したＭＲＳブロス５ｍＬに前記培養液５０μｌを接種した後、３７℃で１時間培養した。１時間後、ペプトン食塩緩衝液で希釈して、１ｍＬあたりの菌数を測定した。前記培養液の菌数を測定した後、０．０１を乗じたものを対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）とし、対照群の菌数を１００％として生存率を計算した。
【００６８】
ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９の菌株培養液についても、それぞれ実質的に同一の方法によりｐＨ別耐酸性能を評価した。
【００６９】
ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）菌株（ＫＣＴＣ３１０８）を標準菌株として、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９の耐酸性能を比較した結果を、下表に示した。（表１３：ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１とＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３、表１４：ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６とＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９）
【００７０】
【表１３】
0006033290.tif 000014
【００７１】
【表１４】
0006033290.tif 000015
【００７２】
上記から見られるように、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９は、いずれもｐＨ２．５〜３．５において標準菌株よりも高い生存率を示した。すなわち、前記ラクトバチルス・プランタラムは、優れた耐酸性能を有することを確認することができる。飲食物摂取時における胃のｐＨが２〜３であることを考慮すると、前記ラクトバチルス・プランタラムが食品組成物に含まれると、胃における生存率が高いことが分かる。
【００７３】
（２）時間別耐酸性能評価
ＭＲＳブロス１０ｍＬに、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１培養液を０．５％接種し、３７℃で一晩培養した。滅菌したＭＲＳブロス５ｍＬに、ＨＣｌでｐＨを２．５に調整した培養液５０μｌを接種した後、３７℃で３時間培養した。１時間および３時間後、ペプトン食塩緩衝液で希釈してから、１ｍＬあたりの菌数を測定した。前記培養液の菌数を測定した後、０．０１を乗じたものを対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）とし、対照群の菌数を１００％として生存率を計算した。
【００７４】
ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９の菌株培養液についても、それぞれ実質的に同一の方法により時間別耐酸性能を評価した。
【００７５】
ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）菌株（ＫＣＴＣ３１０８）を標準菌株として、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９の耐酸性能を比較した結果を、下表に示した。（表１５：ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１とＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３、表１６：ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６とＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９）
【００７６】
【表１５】
0006033290.tif 000016
【００７７】
【表１６】
0006033290.tif 000017
【００７８】
上記から見られるように、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９は、いずれもｐＨ２．５において１時間および３時間後に標準菌株よりも高い生存率を有することを確認することができる。すなわち、前記ラクトバチルス・プランタラム菌株は、いずれも長時間優れた耐酸性能を有することを確認することができる。飲食物摂取時における胃での平均滞留時間が１〜３時間であることを考慮すると、前記ラクトバチルス・プランタラム菌株が食品組成物に含まれると、胃における滞留中にも生存率が高いことが分かる。
【００７９】
したがって、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９は、いずれも胃における滞留期間中に胃の低いｐＨにおいても生存可能であるので、食品として摂取した際に胃において生存可能であり、ひいては腸内到達率が高い。
【００８０】
［実験例２］耐胆汁酸能評価
ＭＲＳブロス１０ｍＬに、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１培養液を０．５％接種し、３７℃で一晩培養した。ウシ胆汁（ｏｘ  ｇａｌｌ）をそれぞれ０．３％、０．５％ずつ添加して、ＭＲＳアガープレートを製造した。対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）としては、ウシ胆汁を添加しなかったＭＲＳアガーを使用した。前記菌株の培養液を希釈してＭＲＳアガー培地に塗抹後、３７℃で２日間培養した。各コロニーを計数した後、対照群の菌数を１００％としてＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１の生存率（％）を計算した結果を、下表に示した。ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９の菌株培養液についても、それぞれ実質的に同一の方法により耐胆汁酸能を評価し、その結果を下表に示した。（表１７：ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１とＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６、表１８：ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３とＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９）
【００８１】
【表１７】
0006033290.tif 000018
【００８２】
【表１８】
0006033290.tif 000019
【００８３】
上記から見られるように、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９は、いずれも優れた耐胆汁酸能を示した。耐胆汁酸能に優れた菌株は、腸内定着力も優れるものと知られているので、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９は、いずれも優れた腸内定着力および腸内到達率を有することが分かる。
【００８４】
［実験例３］乳酸生成能評価
ＭＲＳブロス１０ｍＬに、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１培養液を０．５％接種し、３７℃で一晩培養した。培養液を８，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、上澄み液のみを回収した。回収した上澄み液を８０℃で１５分間処理して、酵素反応を停止させた。蒸留水で熱処理した上澄み液を、１００倍希釈した。Ｄ‐乳酸／Ｌ‐乳酸ＵＶ法キット（ＵＶ  ｍｅｔｈｏｄ  ｋｉｔ）（Ｒ‐ｂｉｏｐｈａｒｍ）を使用して、製造社のプロトコルに従って進行した。その具体的な内容は、以下のとおりである。
【００８５】
キュベット（ｃｕｖｅｔｔｅ）に、キット溶液１（ｋｉｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １）（グリシルグリシンバッファー／Ｌ‐グルタミン酸塩）を１ｍＬ、溶液２（ＮＡＤ溶液）を０．２ｍＬ、ＧＰＴ懸濁液３を０．０２ｍＬずつ、順に添加した。前記において準備した上澄み液０．１ｍＬずつを、キュベットに添加した。対照群には３次蒸留水１ｍＬを、試料には３次蒸留水０．９ｍＬを添加した。よく混ぜてから５分後に、３４０ｎｍにおける吸光度（Ａ１）を測定した。Ｄ‐ＬＤＨ溶液４を０．０２ｍＬずつ添加した後によく混ぜ、３０分間反応させた後、３４０ｎｍにおける吸光度（Ａ２）を測定した。Ｌ‐ＬＤＨ溶液５を０．０２ｍＬずつ添加した後によく混ぜ、３０分間反応させた後、３４０ｎｍにおける吸光度（Ａ３）を測定した。計算法に従って、試料内のＤ‐乳酸濃度とＬ‐乳酸濃度を計算した。ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）菌株（ＫＣＴＣ３１０８）を標準菌株として比較した結果を、下表に示した。
【００８６】
ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９の菌株培養液についても、それぞれ実質的に同一の方法により乳酸生成能を評価し、その結果を下表に示した。（表１９：ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１とＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３、表２０：ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６とＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９）
【００８７】
【表１９】
0006033290.tif 000020
【００８８】
【表２０】
0006033290.tif 000021
【００８９】
上記から見られるように、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６３，ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６およびＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９は、いずれもＤ‐乳酸およびＬ‐乳酸ともに生成した。また、標準菌株に比べて総乳酸生成量が少なく、生成された乳酸のうちＤ‐乳酸の割合が少なかった。したがって、前記ラクトバチルス・プランタラム菌株を含む食品は、乳酸に脆弱な成人や乳幼児も自由に摂取することができ、また、ラクトバチルス・プランタラム菌株を利用して食品を発酵させる場合、食品がよりまろやかな味を有し得る。
【００９０】
［実験例４］抗菌力評価
（１）ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１
ＭＲＳブロス１０ｍＬに、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１培養液を０．５％接種し、３７℃で一晩培養した。滅菌したＭＲＳアガーを１５ｍＬずつペトリ皿に分注して培地を製造後、前記ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１培養液を１μｌずつ点滴して、３７℃で２４時間培養した。
【００９１】
一方、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）をトリプチックソイアガー（Ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ａｇａｒ）に塗抹して、３７℃で一晩培養した後、ＢＨＩブロスにコロニーを接種して一晩培養した。ＢＨＩソフトアガー（アガー１％）を滅菌して４５〜５０℃に冷ました後、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）培養液１％を接種した。
【００９２】
フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）培養液を、１０ｍＬずつＡＰｓｕｌｌｏｃ３３１２６１培養液上に重層して固めた。３７℃で２４時間培養した後、クリアゾーン（ｃｌｅａｒ  ｚｏｎｅ）の大きさを測定した。ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）菌株（ＫＣＴＣ３１０８）を標準菌株として比較した結果を、下表に示した。
【００９３】
【表２１】
0006033290.tif 000022
【００９４】
上記から見られるように、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６１は、標準菌株よりもフレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）に対する抗菌効果に優れることを確認することができる。
【００９５】
（２）ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６
ＭＲＳブロス１０ｍＬに、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６培養液を０．５％接種し、３７℃で一晩培養した。
【００９６】
一方、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｓ）およびバシラス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）をそれぞれトリプチックソイアガー（Ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ａｇａｒ）に塗抹して、３７℃で一晩培養した後、ＢＨＩブロスにコロニーを接種して一晩培養した。
【００９７】
ＢＨＩソフトアガー（アガー１％）を滅菌して４５〜５０℃に冷ました後、リステリア・モノサイトゲネスおよびバシラス・セレウス菌培養液１％をそれぞれ接種した。ペトリ皿に１５ｍＬずつ分注し、１時間ほど冷まして培地を製造した。滅菌したＭＲＳソフトアガー（アガー１％）を５ｍＬずつ前記製造した培地上に重層して固めた。重層して固めた培地に、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６培養液を５μｌずつ点滴した後、乾燥させた。３７℃で２４時間培養した後、クリアゾーン（ｃｌｅａｒ  ｚｏｎｅ）の大きさを測定した。ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）菌株（ＫＣＴＣ３１０８）を標準菌株として比較した結果を、下表に示した。
【００９８】
【表２２】
0006033290.tif 000023
【００９９】
上記から見られるように、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６６は、標準菌株よりもリステリア・モノサイトゲネスおよびバシラス・セレウス菌に対する抗菌効果に優れることを確認することができる。
【０１００】
（３）ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９
ＭＲＳブロス１０ｍＬに、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９培養液を０．５％接種し、３７℃で一晩培養した。培養液を８，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄み液のみを回収した。上澄み液１０ｍＬを、０．２２μｌシリンジフィルターで除菌して準備した。
【０１０１】
一方、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）およびスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）をそれぞれトリプチックソイアガー（Ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ａｇａｒ）に塗抹して、３７℃で一晩培養した後、ＢＨＩブロスにコロニーを接種して一晩中培養した。
【０１０２】
ＢＨＩアガーを滅菌してペトリ皿に２０ｍＬずつ入れ、冷まして培地を製造した。サルモネラ・チフィムリウムおよびスタフィロコッカス・アウレウス培養液を、滅菌生理食塩水で５０倍希釈した後、滅菌した綿棒で前記製造した培地上に均等に塗抹した。滅菌したペーパーディスクを上げ、前記準備したＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９培養液の上澄み液１００μｌずつをペーパーディスク上に落とした。室温で約３時間放置して吸収されるようにした後、３７℃で２４時間培養した。クリアゾーン（ｃｌｅａｒ  ｚｏｎｅ）の大きさを測定し、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）菌株（ＫＣＴＣ３１０８）を標準菌株として比較した結果を、下表に示した。
【０１０３】
【表２３】
0006033290.tif 000024
【０１０４】
上記から見られるように、ＡＰｓｕｌｌｏｃ  ３３１２６９は、標準菌株よりもサルモネラ・チフィムリウム、スタフィロコッカス・アウレウスに対する抗菌効果に優れることを確認することができる。