(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＰＶに対する免疫反応を個体において誘導するための、配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項２】
前記分子がＤＮＡプラスミドである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸分子を含む医薬組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸分子を含む注射可能な医薬組成物。
【請求項５】
ＨＰＶに対する免疫反応を個体において誘導するための組成物であって、請求項１に記載の核酸分子を含む、組成物。
【請求項６】
前記核酸分子がＤＮＡ分子である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記核酸分子がプラスミドである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が電気穿孔法により前記個体に導入されるものであることを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の核酸分子を含む組み換えワクチン。
【請求項１０】
前記組み換えワクチンが組み換えワクシニアワクチンである、請求項９に記載の組み換えワクチン。
【請求項１１】
請求項１に記載の核酸分子を含む弱毒化生ワクチン。
【請求項１２】
ＨＰＶに対する免疫反応を個体において誘導するための、請求項９に記載の組み換えワクチン。
【請求項１３】
ＨＰＶに対する免疫反応を個体において誘導するための、請求項１１に記載の弱毒化生ワクチン。
【請求項１４】
前記個体がＨＰＶ感染を有すると診断された、請求項５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の改良型ワクチン、ＨＰＶに対する免疫反応を誘導するための改良法、ならびにＨＰＶに対して予防的および／または治療的に個体を免疫化するための改良法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、２００９年１月２３日に出願された米国特許仮出願第６１／１４６，９４２号および２０１０年１月２１日に出願された米国特許出願第１２／６９１，５８８号に対する優先権を主張し、これらの開示は参照により各々が本明細書に組込まれる。
【０００３】
パピローマウイルスは、最高で７つの初期遺伝子および２つの後期遺伝子を含む小さいＤＮＡウイルスである。一般に、パピローマウイルスの初期遺伝子はＥ１〜Ｅ７と命名され、パピローマウイルスの後期遺伝子はＬ１およびＬ２と命名される。いくつかの動物の種類に、パピローマウイルスファミリーの一員は感染することができる。
【０００４】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染は日常的であり、性的接触によって伝染され得る。ＨＰＶは、ＤＮＡ配列相同性に基づいて５６種類以上に分類された。上皮異形成および他の損傷を引き起こすＨＰＶの１６型および１８型は、多くの場合、癌、特に、子宮頸部、膣、外陰部および肛門管の上皮内癌および湿潤性癌のリスクの増加と関連する。
【０００５】
ＤＮＡワクチンは、弱毒化生ウイルスワクチンおよび組み換えタンパク質に基づくワクチンなどの、より伝統的なワクチン接種法を上回る多くの概念的な利点を有する。ＤＮＡワクチンは、安全であり、安定であり、容易に産生され、かつヒトにおいて十分に耐容性を示し、前臨床試験はプラスミド組み込みの証拠を示さない（非特許文献１：非特許文献２）。さらに、ＤＮＡワクチンの有効性が、ベクターに対する、以前から存在する抗体力価によって影響されないという事実により、ＤＮＡワクチンは反復投与に十分に適する（非特許文献３）。しかし、大型動物に移行した時、ＤＮＡワクチンの臨床導入に対する１つの重大な障害は、プラットフォームとなる免疫原性の減少であった（非特許文献４）。コドン最適化、ＲＮＡ最適化および免疫グロブリンリーダー配列の付加などの、ＤＮＡワクチン免疫原の遺伝子工学処理における最近の技術的進歩により、ＤＮＡワクチンの発現および免疫原性が改良され（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）、かつ、近年、電気穿孔法などのプラスミド送達システムの技術が開発された（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。さらに、コンセンサス免疫原を使用することで、天然の抗原のみと比較して、細胞性免疫反応の幅を拡大させることができる可能性があることを複数の研究が示唆した（非特許文献１２；非特許文献１３）。
【０００６】
ＨＰＶ感染を予防および治療するための改良型ワクチンならびに方法に対するニーズが依然としてある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍａｒｔｉｎ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ：ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１９９９．１０（５）：ｐ．７５９−６８
【非特許文献２】Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｗ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｏｍｅ．Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１９９５．７７２：ｐ．３０−９
【非特許文献３】Ｃｈａｔｔｅｒｇｏｏｎ，Ｍ．，Ｊ．Ｂｏｙｅｒ，ａｎｄ  Ｄ．Ｂ．Ｗｅｉｎｅｒ，Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ：ａ  ｎｅｗ  ｅｒａ  ｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ，１９９７．１１（１０）：ｐ．７５３−６３
【非特許文献４】Ｌｉｕ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｊ．Ｂ．Ｕｌｍｅｒ，Ｈｕｍａｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ａｄｖ  Ｇｅｎｅｔ，２００５．５５：ｐ．２５−４０
【非特許文献５】Ａｎｄｒｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｐ１２０  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，１９９８．７２（２）：ｐ．１４９７−５０３
【非特許文献６】Ｄｅｍｌ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  Ｇａｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２００１．７５（２２）：ｐ．１０９９１−１００１
【非特許文献７】Ｌａｄｄｙ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｂａｓｅｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００７．２５（１６）：ｐ．２９８４−９
【非特許文献８】Ｆｒｅｌｉｎ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍＲＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ３／４Ａ  ｇｅｎｅ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，２００４．１１（６）：ｐ．５２２−３３
【非特許文献９】Ｈｉｒａｏ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ／ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｉｎ  ｐｉｇｓ  ａｎｄ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００８．２６（３）：ｐ．４４０−８
【非特許文献１０】Ｌｕｃｋａｙ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２００７．８１（１０）：ｐ．５２５７−６９
【非特許文献１１】Ａｈｌｅｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ３／４Ａ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｌｏｃａｌ  ＤＮＡ  ｕｐｔａｋｅ，ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ３＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７．１７９（７）：ｐ．４７４１−５３
【非特許文献１２】Ｙａｎ．，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＨＩＶ−１  ｓｕｂｔｙｐｅ  Ｂ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，２００７．１５（２）：ｐ．４１１−２１
【非特許文献１３】Ｒｏｌｌａｎｄ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｃｅｓｔｒａｌ  ｃｅｎｔｅｒ−ｏｆ−ｔｒｅｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２００７．８１（１６）：ｐ．８５０７−１４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
コンセンサスＨＰＶ１８型（ＨＰＶ  １８）のＥ６およびＥ７のアミノ酸配列を含むタンパク質、ならびにかかるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。これらの核酸構築物およびこれらの核酸構築物がコードするタンパク質は、抗ＨＰＶ免疫反応を起こすことができる改良型免疫原性標的物をもたらす。
【０００９】
かかるタンパク質をコードする構築物、かかるタンパク質を含むワクチン、かかるタンパク質をコードする核酸分子を含むワクチン、ならびに抗ＨＰＶ免疫反応を誘導する方法も提供する。
【００１０】
本発明の態様には、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子が含まれる：配列番号１；配列番号１の断片；配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する配列；配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する配列の断片；配列番号５；ＨＰＶコード配列を含む配列番号５の断片；配列番号５と少なくとも９０％の相同性を有する配列；およびＨＰＶコード配列を含む配列番号５と少なくとも９０％の相同性を有する配列の断片；配列番号７；ＨＰＶコード配列を含む配列番号７の断片；配列番号７と少なくとも９０％の相同性を有する配列；およびＨＰＶコード配列を含む配列番号７と少なくとも９０％の相同性を有する配列の断片。
【００１１】
本発明は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する：配列番号２をコードするヌクレオチド配列；配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号２の断片をコードするヌクレオチド配列；配列番号２の断片と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号６をコードするヌクレオチド配列；ＨＰＶ配列を含む配列番号６の断片をコードするヌクレオチド配列；ＨＰＶ配列を含む配列番号６と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；ＨＰＶ配列を含む配列番号６の断片と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
【００１２】
本発明は、かかる核酸分子を含む医薬組成物、およびＨＰＶに対する免疫反応を個体において誘導する方法におけるそれらの医薬組成物の使用をさらに提供し、これらの方法はかかる核酸分子を含む組成物を個体に投与するステップを含む。
【００１３】
本発明は、かかる核酸分子を含む組み換えワクチン、およびＨＰＶに対する免疫反応を個体において誘導する方法におけるそれらの組み換えワクチンの使用をさらに提供し、これらの方法はかかる組み換えワクチンを個体に投与するステップを含む。
【００１４】
本発明は、かかる核酸分子を含む弱毒化生病原体、およびＨＰＶに対する免疫反応を個体において誘導する方法におけるそれらの病原体の使用をさらに提供し、これらの方法はかかる弱毒化生病原体を個体に投与するステップを含む。
【００１５】
本発明は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をさらに提供する：配列番号２；配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有する配列；配列番号２の断片；配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有する配列の断片；配列番号６；配列番号６と少なくとも９０％の相同性を有する配列；配列番号６の断片；配列番号６と少なくとも９０％の相同性を有する配列の断片。
【００１６】
本発明は、かかるタンパク質を含む医薬組成物、およびＨＰＶに対する免疫反応を個体において誘導する方法におけるそれらの医薬組成物の使用をさらに提供し、これらの方法はかかるタンパク質を含む組成物を個体に投与するステップを含む。
【００１７】
本発明は、かかるタンパク質を含む組み換えワクチン、およびＨＰＶに対する免疫反応を個体において誘導する方法におけるそれらの組み換えワクチンの使用をさらに提供し、これらの方法はかかる組み換えワクチンを個体に投与するステップを含む。
【００１８】
本発明は、かかるタンパク質を含む弱毒化生病原体、およびＨＰＶに対する免疫反応を個体において誘導する方法におけるそれらの病原体の使用をさらに提供し、これらの方法はかかる弱毒化生病原体を個体に投与するステップを含む。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子：
配列番号１；
配列番号１の断片；
配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する配列；
配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する配列の断片；
配列番号５；
ＨＰＶコード配列を含む配列番号５の断片；
配列番号５と少なくとも９０％の相同性を有する配列；および
ＨＰＶコード配列を含む配列番号５と少なくとも９０％の相同性を有する配列の断片。
（項目２）
配列番号１を含む、項目１に記載の核酸分子。
（項目３）
配列番号１と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む、項目１に記載の核酸分子。
（項目４）
配列番号１と少なくとも９８％の相同性を有する配列を含む、項目１に記載の核酸分子。
（項目５）
配列番号１からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９９％の相同性を有する配列を含む、項目１に記載の核酸分子。
（項目６）
配列番号５を含む、項目１に記載の核酸分子。
（項目７）
配列番号５と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む、項目１に記載の核酸分子。
（項目８）
配列番号５と少なくとも９８％の相同性を有する配列を含む、項目１に記載の核酸分子。
（項目９）
配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９９％の相同性を有する配列を含む、項目１に記載の核酸分子。
（項目１０）
以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子：
配列番号２をコードするヌクレオチド配列；
配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
配列番号２をコードするヌクレオチド配列の断片；
配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；
配列番号６をコードするヌクレオチド配列；
配列番号６と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
ＨＰＶ配列を含む配列番号６をコードするヌクレオチド配列の断片；および
ＨＰＶ配列を含む配列番号６と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片。
（項目１１）
配列番号２をコードするヌクレオチド配列を含む、項目１０に記載の核酸分子。
（項目１２）
配列番号６をコードするヌクレオチド配列を含む、項目１０に記載の核酸分子。
（項目１３）
前記分子がプラスミドである、項目１に記載の核酸分子。
（項目１４）
項目１に記載の核酸分子を含む医薬組成物。
（項目１５）
項目１に記載の核酸分子を含む注射可能な医薬組成物。
（項目１６）
ＨＰＶに対する免疫反応を個体において誘導する方法であって、項目１に記載の核酸分子を含む組成物を、前記個体に投与するステップを含む方法。
（項目１７）
前記核酸分子がＤＮＡ分子である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記核酸分子がプラスミドである、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記核酸分子が電気穿孔法により前記個体に導入される、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
項目１に記載の核酸分子を含む組み換えワクチン。
（項目２１）
前記組み換えワクチンが組み換えワクシニアワクチンである、項目２０に記載の組み換えワクチン。
（項目２２）
項目１に記載の核酸分子を含む弱毒化生ワクチン。
（項目２３）
以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質：
配列番号２；
配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有する配列；
配列番号２の断片；
配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有する配列の断片；
配列番号６；
配列番号６と少なくとも９０％の相同性を有する配列；
ＨＰＶ配列を含む配列番号６の断片；および
ＨＰＶ配列を含む配列番号６と少なくとも９０％の相同性を有する配列の断片。
（項目２４）
配列番号２を含む、項目２３に記載のタンパク質。
（項目２５）
配列番号２と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む、項目２３に記載のタンパク質。
（項目２６）
配列番号２と少なくとも９８％の相同性を有する配列を含む、項目２３に記載のタンパク質。
（項目２７）
配列番号２と少なくとも９９％の相同性を有する配列を含む、項目２３に記載のタンパク質。
（項目２８）
配列番号６を含む、項目２３に記載のタンパク質。
（項目２９）
配列番号６と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む、項目２３に記載のタンパク質。
（項目３０）
配列番号６と少なくとも９８％の相同性を有する配列を含む、項目２３に記載のタンパク質。
（項目３１）
配列番号６と少なくとも９９％の相同性を有する配列を含む、項目２３に記載のタンパク質。
（項目３２）
項目２３に記載のタンパク質を含む医薬組成物。
（項目３３）
項目２３に記載のタンパク質を含む注射可能な医薬組成物。
（項目３４）
項目２３に記載のタンパク質を含む組み換えワクチン。
（項目３５）
前記組み換えワクチンが組み換えワクシニアワクチンである、項目３４に記載の組み換えワクチン。
（項目３６）
項目２３に記載のタンパク質を含む弱毒化生ワクチン。
（項目３７）
ＨＰＶに対する免疫反応を個体において誘導する方法であって、項目２３に記載のタンパク質を含む組成物を前記個体に投与するステップを含む方法。
（項目３８）
ＨＰＶに対する免疫反応を個体において誘導する方法であって、項目２０に記載の組み換えワクチンを前記個体に投与するステップを含む方法。
（項目３９）
ＨＰＶに対する免疫反応を個体において誘導する方法であって、項目２２に記載の弱毒化生ワクチンを前記個体に投与するステップを含む方法。
（項目４０）
前記個体がＨＰＶ感染を有すると診断された、項目１６に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】プラスミド構築物を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書で使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」という語句は、１つの核酸分子が別の核酸分子とハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を表す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる環境において様々である。より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特異的配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、標的配列と相補的なプローブの５０％が、平衡状態でこの標的配列とハイブリダイズする（規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度の下での）温度である。一般に、これらの標的配列はＴｍにおいて過剰に存在するので、これらのプローブの５０％が平衡状態で占有する。典型的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３において、塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的に約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に対して少なくとも約３０℃であり、長いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドに対して少なくとも約６０℃である条件であろう。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定剤の付加によっても達成され得る。
【００２１】
ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列相同性を、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５，３３８９、これは、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）ならびにＰＡＵＰ＊４．０ｂ１０ソフトウェア（Ｄ．Ｌ．Ｓｗｏｆｆｏｒｄ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて測定してもよい。「類似度のパーセンテージ」を、ＰＡＵＰ＊４．０ｂ１０ソフトウェア（Ｄ．Ｌ．Ｓｗｏｆｆｏｒｄ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて計算する。コンセンサス配列の平均類似度を、系統樹の全配列と比較して計算する。
【００２２】
簡潔に述べると、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌを表すＢＬＡＳＴアルゴリズムは、配列類似度の決定に適している（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０，これは、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）。ＢＬＡＳＴ解析を行うソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公表されている。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一の長さのワードと整列させた時に、ある正の値の域値スコア（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｖａｌｕｅｄ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｓｃｏｒｅ）Ｔと一致するかまたはそれを満足させる問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、ハイスコアな配列の対（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア域値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｓｃｏｒｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，前出）。これらの最初の近隣ワードヒットは、それらを含むＨＳＰを見出す検索を開始するための種として機能する。このワードヒットは、累積のアラインメントスコアが増加することができる限り、各配列に沿って両方向に拡大される。各方向のワードヒットの拡大は、以下の場合に停止される：１）累積のアラインメントスコアが、その最大達成値からＸ量低下する場合；２）１つ以上の負のスコア残基アラインメント（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｃｏｒｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）の蓄積により、累積スコアが０以下になる場合；または３）いずれかの配列の末端に到達する場合。ＢｌａｓｔアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。このＢｌａｓｔプログラムでは、初期設定として、ワード長（Ｗ）が１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９，１０９１５−１０９１９参照、これは、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）アラインメント（Ｂ）が５０、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較が使用される。このＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０，５８７３−５７８７、これは、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）およびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴは、２つの配列間の類似度の統計解析を行う。このＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似度の１つの測定は、２つのヌクレオチド配列間の一致が偶然に生じる確立の指標を与える最小合計確立（ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｓｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸と他の核酸の比較における最小合計確立が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は別の核酸と類似するとみなされる。
【００２３】
本明細書で使用される「遺伝子構築物」という用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を表す。コード配列は、核酸分子が投与される個体の細胞において発現を指示することができる、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節要素と作動可能に連結される開始シグナルおよび終止シグナルを含む。
【００２４】
本明細書で使用される「発現できる形態」という用語は、個体の細胞に存在する時に、コード配列が発現するように、タンパク質をコードするコード配列と作動可能に連結される必須の調節配列を含む遺伝子構築物を表す。
【００２５】
免疫原によって誘導される細胞性免疫反応を高めるための多面的戦略から生じる改良型ワクチンを開示する。改変したコンセンサス配列を作製した。コドン最適化、ＲＮＡ最適化、および高効率な免疫グロブリンリーダー配列の付加を含む遺伝子改変も開示する。この新規の構築物を、対応するコドン最適化免疫原よりも強力で、広範な細胞性免疫反応を引き起こすように設計した。
【００２６】
改良型ＨＰＶワクチンは、抗ＨＰＶを誘導することができる免疫原として改良型ワクチンを特に効果的にさせるエピトープを有するタンパク質、およびそのようなエピトープを有するタンパク質をコードする遺伝子構築物に基づく。したがって、ワクチンは治療的または予防的に免疫反応を誘導し得る。いくつかの実施形態において、この免疫原を送達する手段には、ＤＮＡワクチン、組み換えワクチン、タンパク質サブユニットワクチン、この免疫原を含む組成物、弱毒化ワクチンまたは不活化ワクチンがある。いくつかの実施形態において、このワクチンは、以下からなる群から選択される組み合わせを含む：１つ以上のＤＮＡワクチン、１つ以上の組み換えワクチン、１つ以上のタンパク質サブユニットワクチン、この免疫原を含む１つ以上の組成物、１つ以上の弱毒化ワクチンおよび１つ以上の不活化ワクチン。
【００２７】
いくつかの実施形態によると、ワクチンが個体に送達され、この個体の免疫システムの活性を調節し、それによって、ＨＰＶに対する免疫反応が高まる。このタンパク質をコードする核酸分子がこの個体の細胞に取り込まれると、このヌクレオチド配列がこれらの細胞において発現し、それによって、このタンパク質がこの個体に送達される。プラスミドなどの核酸分子上のこのタンパク質のコード配列を、組み換えワクチンの一部としておよび弱毒化ワクチンの一部として、単離したタンパク質またはベクターのタンパク質部分として送達する方法を提供する。
【００２８】
ＨＰＶに対して予防的および／または治療的に個体を免疫化する組成物ならびに方法を提供する。
【００２９】
この免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を送達するための組成物を、調節要素と作動可能に連結する。組成物には、この免疫原をコードするプラスミド、この免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えワクチン、本発明のタンパク質をコードするおよび／もしくは本発明のタンパク質を含む弱毒化生病原体；本発明のタンパク質を含む不活化病原体；または本発明のタンパク質を含むリポソームもしくはサブユニットワクチンなどの組成物が含まれてもよい。本発明は、さらに、組成物を含む注射可能な医薬組成物に関する。
【００３０】
配列番号１は、ＨＰＶ１８のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む。配列番号５は配列番号１を含み、ＨＰＶ１８のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原をコードするヌクレオチド配列と連結されるＩｇＥリーダー配列をさらに含む。配列番号２は、ＨＰＶ１８のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原のアミノ酸配列を含む。配列番号６は配列番号２を含み、コンセンサス免疫原配列と連結されるＩｇＥリーダー配列をさらに含む。このＩｇＥリーダー配列は配列番号４であり、配列番号３によってコードされ得る。配列番号７はプラスミドｐＧＸ３０２の核酸配列であり、配列番号５が発現するようにその中に取り込まれている。
【００３１】
いくつかの実施形態において、ワクチンは、配列番号２または配列番号２をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、配列番号２をコードする核酸分子として配列番号１を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、好ましくは、配列番号６または配列番号６をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、好ましくは、配列番号６をコードする核酸分子として配列番号５を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、好ましくは、配列番号７を含む。
【００３２】
配列番号１の断片は、９０以上のヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態において、配列番号１の断片は、１８０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、２７０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、３６０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、４５０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、５４０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、６３０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、７２０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、７７０以上のヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態において、本明細書で説明される断片などの配列番号１の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、配列番号１の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列を含まない。配列番号１の断片は、１８０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、２７０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、３６０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、４５０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、５４０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、６３０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、６９０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、７６０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、７８０未満のヌクレオチドを含んでもよい。
【００３３】
配列番号２の断片は、３０以上のアミノ酸を含んでもよい。いくつかの実施形態において、配列番号２の断片は、６０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、９０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、１２０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、１５０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、１８０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、２１０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、２４０以上のアミノ酸を含んでもよい。配列番号２の断片は、９０未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、１２０未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、１５０未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、１８０未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、２１０未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、２４０未満のアミノ酸を含んでもよい。
【００３４】
配列番号５の全ての断片は、ＨＰＶ配列をコードするコード配列を含む。すなわち配列番号５の断片は、ＩｇＥリーダーペプチドをコードする配列に加えて、配列を含まねばならない。いくつかの実施形態において、配列番号５の断片は、９０以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、配列番号５の断片は、１８０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、２７０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、３６０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、４５０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、５４０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、６３０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、７２０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、８１０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、８３０以上のヌクレオチドを含んでもよい。配列番号５の断片は、１８０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、２７０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、３６０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、４５０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、５４０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、６３０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、６９０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、７２０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、７８０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、８４０未満のヌクレオチドを含んでもよい。
【００３５】
配列番号６の断片は、ＨＰＶ配列を含む３０以上のアミノ酸を含んでもよい。いくつかの実施形態において、配列番号６の断片は、ＨＰＶ配列を含む６０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、ＨＰＶ配列を含む９０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、ＨＰＶ配列を含む１２０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、ＨＰＶ配列を含む１５０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、ＨＰＶ配列を含む１８０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、ＨＰＶ配列を含む２１０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、ＨＰＶ配列を含む２４０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、ＨＰＶ配列を含む２７０以上のアミノ酸を含んでもよい。配列番号６の断片は、ＨＰＶ配列を含む９０未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、ＨＰＶ配列を含む１２０未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、ＨＰＶ配列を含む１５０未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、ＨＰＶ配列を含む１８０未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、ＨＰＶ配列を含む２１０未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、ＨＰＶ配列を含む２４０未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、ＨＰＶ配列を含む２７０未満のアミノ酸を含んでもよい。
【００３６】
いくつかの実施形態によると、免疫原に対する免疫反応を個体において誘導する方法は、ＨＰＶ１８のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原のアミノ酸配列、またはその機能的断片、またはその発現できるコード配列をこの個体に投与するステップを含む。いくつかの実施形態は、ＨＰＶ１８のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原のアミノ酸配列またはその断片をコードする単離した核酸分子を含む。いくつかの実施形態は、ＨＰＶ１８のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原のアミノ酸配列またはその断片をコードする組み換えワクチンを含む。いくつかの実施形態は、ＨＰＶ１８のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原のアミノ酸配列またはその断片を含むサブユニットワクチンを含む。いくつかの実施形態は、ＨＰＶ１８のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原のアミノ酸配列を含む弱毒化生ワクチンおよび／または不活化ワクチンを含む。
【００３７】
改良型ワクチンは、抗ＨＰＶ免疫反応を誘導することができる免疫原として改良型ワクチンを特に効果的にさせるエピトープを有するタンパク質、およびそのようなエピトープを有するタンパク質をコードする遺伝子構築物を含む。したがって、治療的または予防的に免疫反応を誘導するために、ワクチンを提供することができる。いくつかの実施形態において、この免疫原を送達する手段には、ＤＮＡワクチン、組み換えワクチン、タンパク質サブユニットワクチン、この免疫原を含む組成物、弱毒化ワクチンまたは不活化ワクチンがある。いくつかの実施形態において、このワクチンは、以下からなる群から選択される組み合わせを含む：１つ以上のＤＮＡワクチン、１つ以上の組み換えワクチン、１つ以上のタンパク質サブユニットワクチン、この免疫原を含む１つ以上の組成物、１つ以上の弱毒化ワクチン、１つ以上の不活化ワクチン。
【００３８】
本発明の態様は、プラスミドなどの核酸分子上のタンパク質コード配列を、組み換えワクチンの一部として、弱毒化ワクチンの一部として、単離したタンパク質またはベクターのタンパク質部分として送達する方法を提供する。
【００３９】
本発明のいくつかの態様によると、予防的におよび／または治療的に個体を免疫化する組成物ならびに方法が提供される。
【００４０】
ＤＮＡワクチンは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，７３９，１１８号、同第５，８１７，６３７号、同第５，８３０，８７６号、同第５，９６２，４２８号、同第５，９８１，５０５号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、同第５，６７６，５９４号、および本明細書で引用する優先出願に記載されており、これらは参照により各々が本明細書に組み込まれる。それらの出願に記載される送達プロトコールに加えて、ＤＮＡを送達する代替方法は、米国特許第４，９４５，０５０号および同第５，０３６，００６号に記載されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
【００４１】
本発明は、改良型弱毒化生ワクチン、改良型不活化ワクチン、および抗原をコードする外来遺伝子を送達するために組み換えベクターを使用する改良型ワクチン、さらにサブユニットワクチンおよび糖タンパク質ワクチンに関する。弱毒化生ワクチン、組み換えベクターを使用して外来抗原を送達するワクチン、サブユニットワクチンおよび糖タンパク質ワクチンの例は、米国特許第４，５１０，２４５号、同第４，７９７，３６８号、同第４，７２２，８４８号、同第４，７９０，９８７号、同第４，９２０，２０９号、同第５，０１７，４８７号、同第５，０７７，０４４号、同第５，１１０，５８７号、同第５，１１２，７４９号、同第５，１７４，９９３号、同第５，２２３，４２４号、同第５，２２５，３３６号、同第５，２４０，７０３号、同第５，２４２，８２９号、同第５，２９４，４４１号、同第５，２９４，５４８号、同第５，３１０，６６８号、同第５，３８７，７４４号、同第５，３８９，３６８号、同第５，４２４，０６５号、同第５，４５１，４９９号、同第５，４５３，３６４号、同第５，４６２，７３４号、同第５，４７０，７３４号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４８２，７１３号、同第５，５９１，４３９号、同第５，６４３，５７９号、同第５，６５０，３０９号、同第５，６９８，２０２号、同第５，９５５，０８８号、同第６，０３４，２９８号、同第６，０４２，８３６号、同第６，１５６，３１９号および同第６，５８９，５２９号に記載されており、これらは参照により各々が本明細書に組み込まれる。
【００４２】
細胞に取り込まれると、この遺伝子構築物（複数可）は、機能している染色体外分子としてこの細胞内に存在したままであってもよく、かつ／またはこの細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれてもよい。ＤＮＡは細胞内に導入されてもよく、そこで、１つまたは複数のプラスミドの形態の別々の遺伝物質として留まる。あるいは、染色体に組み込むことができる直鎖ＤＮＡを、この細胞に導入してもよい。この細胞にＤＮＡを導入する場合、染色体へのＤＮＡ組み込みを促進する薬剤を加えてもよい。組み込みを促進するのに有用なＤＮＡ配列が、このＤＮＡ分子に含まれてもよい。あるいは、ＲＮＡをこの細胞に投与してもよい。セントロメア、テロメアおよび複製開始点を含む直鎖ミニ染色体としてこの遺伝子構築物を提供することも考えられる。遺伝子構築物は、細胞内で生存する弱毒化された生の微生物または組み換え微生物ベクターの遺伝物質の一部のままであってもよい。遺伝子構築物は、組み換えウイルスワクチンのゲノムの一部であってもよく、ここで、この遺伝物質はこの細胞の染色体に組み込まれるかまたは染色体外に留まるかのいずれかである。遺伝子構築物は、核酸分子の遺伝子発現に必要な調節要素を含む。これらの要素には、プロモーター、開始コドン、終止コドン、およびポリアデニル化シグナルが含まれる。さらに、大抵、エンハンサーは、標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードする配列の遺伝子発現に必要とされる。これらの要素は、所望のタンパク質をコードする配列に作動可能に連結されること、およびこれらの調節要素は、これらが投与される個体において作動可能であることが必要である。
【００４３】
開始コドンおよび終止コドンは、一般に、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部であると考えられる。しかし、これらの要素は、この遺伝子構築物が投与される個体において機能的であることが必要である。開始および終止コドンはコード配列と共にフレームの中になければならない。
【００４４】
使用されるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルは、個体の細胞内で機能的でなければならない。
【００４５】
本発明を実行するのに有用な、特にヒトの遺伝子ワクチンの産生において有用なプロモーターの例として、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＢＩＶ末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、ＡＬＶプロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子由来のプロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。
【００４６】
本発明を実行するのに有用な、特にヒトの遺伝子ワクチンの産生において有用なポリアデニル化シグナルの例として、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびＬＴＲポリアデニル化シグナルが挙げられるが、それらに限定されない。特に、プラスミドｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）内に存在し、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと称されるＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを使用する。
【００４７】
ＤＮＡ発現に必要な調節要素に加えて、他の要素もこのＤＮＡ分子の中に含まれてもよい。かかる追加の要素はエンハンサーを含む。このエンハンサーは、以下を含む群から選択されてもよいがそれらに限定されない：ヒトアクチンエンハンサー、ヒトミオシンエンハンサー、ヒトヘモグロビンエンハンサー、ヒト筋肉クレアチンエンハンサーならびにＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶのエンハンサーなどのウイルスエンハンサー。
【００４８】
遺伝子構築物は、染色体外にこの遺伝子構築物を維持し、細胞内でこの構築物の複数のコピーを産生するために、哺乳類複製開始点が供給され得る。インビトロジェン（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のプラスミドｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４およびｐＲＥＰ４は、組み込まれることなく、高コピーのエピソーム複製を行うエプスタイン・バーウイルス複製開始点および核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含む。
【００４９】
免疫化の適用に関連するいくつかの好ましい実施形態において、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および追加として、かかる標的タンパク質に対する免疫反応をさらに高めるタンパク質の遺伝子を含む核酸分子（複数可）を送達する。かかる遺伝子の例として、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびシグナル配列が除去され、任意でＩｇＥのシグナルペプチドを含むＩＬ−１５を含むＩＬ−１５などの他のサイトカインならびにリンホカインをコードする遺伝子が挙げられる。有用であり得る他の遺伝子には、以下をコードする遺伝子が含まれる：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌα、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２およびそれらの機能的断片。
【００５０】
何らかの理由で、この遺伝子構築物を受け取る細胞を除去することが望ましい場合、細胞破壊の標的として機能を果たす追加の要素を加えてもよい。発現できる形態のヘルペスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を、この遺伝子構築物に含めることができる。薬剤ガンシクロビルはこの個体に投与され得、かつこの薬剤はｔｋを産生する全細胞を選択的に死滅させるため、この遺伝子構築物を有する細胞の選択的破壊のための手段をもたらす。
【００５１】
タンパク質産生を最大限するために、この構築物が投与される細胞における遺伝子発現に十分に適した調節配列を選択してもよい。さらに、細胞内で最も効率的に転写されるコドンを選択してもよい。当業者は、細胞内で機能的なＤＮＡ構築物を作製することができる。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本明細書記載のタンパク質のコード配列がＩｇＥシグナルペプチドと連結される遺伝子構築物を提供し得る。いくつかの実施形態において、本明細書記載のタンパク質は、ＩｇＥシグナルペプチドと連結される。
【００５３】
タンパク質が用いられるいくつかの実施形態において、例えば、当業者は、周知の技術を用いて、本発明のタンパク質を産生および単離することができる。タンパク質が用いられるいくつかの実施形態において、例えば、当業者は、周知の技術を用いて、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ分子を、周知の発現系で使用するための市販の発現ベクターに挿入することができる。例えば、市販のプラスミドｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質産生のために使用してもよい。例えば、市販のプラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を、酵母のサッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株における（タンパク質）産生のために使用してもよい。例えば、市販のＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を昆虫細胞における（タンパク質）産生のために使用してもよい。例えば、市販のプラスミドｐｃＤＮＡ  ＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ）を、チャイニーズハムスター卵巣細胞などの哺乳類細胞における（タンパク質）産生のために使用してもよい。当業者は、これらの市販の発現ベクターおよび発現系または他のものを使用して、通例の技術およびすぐに入手できる出発物質によりタンパク質を産生することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）参照、これは参照により本明細書に組み込まれる）。従って、所望のタンパク質を原核細胞系および真核細胞系の両方において調製することができ、このタンパク質の一連のプロセシング型をもたらすことができる。
【００５４】
当業者は、他の市販の発現ベクターおよび発現系を使用してもよく、または周知の方法およびすぐに入手できる出発物質を用いてベクターを産生してもよい。プロモーターおよびポリアデニル化シグナル、ならびに好ましくはエンハンサーなどの必須の制御配列を含む、様々な種類の宿主に対する発現系は、すぐに入手でき、当業で知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）参照。遺伝子構築物は、この構築物がトランスフェクトされる細胞株において機能的であるプロモーターと作動可能に連結されるタンパク質コード配列を含む。構成的プロモーターの例として、サイトメガロウイルスまたはＳＶ４０のプロモーターが挙げられる。誘導できるプロモーターの例として、マウス乳腺白血病ウイルスまたはメタロチオネインプロモーターが挙げられる。当業者は、すぐに入手できる出発物質から、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡで細胞をトランスフェクトするのに有用な遺伝子構築物を容易に作製することができる。このタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを用いて、適合性宿主を形質転換し、その後、外来ＤＮＡの発現が起こる条件下で培養し、維持する。
【００５５】
産生させたタンパク質を、必要に応じて、かつ当業者に知られるように、これらの細胞を溶解するまたは培地から回収することによって、培養物から回収した。当業者は、周知の方法を用いて、かかる発現系を用いて産生されるタンパク質を単離することができる。上記の特異的タンパク質と特異的に結合する抗体を用いて天然源からタンパク質を精製する方法を、組み換えＤＮＡ法によって産生されるタンパク質の精製に同様に適用してもよい。
【００５６】
組み換え技術によるタンパク質産生に加えて、自動化ペプチド合成機も使用して、本質的には純粋な単離されるタンパク質を産生してもよい。かかる技術は当業者に周知であり、置換を有する誘導体がＤＮＡにコードされるタンパク質産生において供給されない場合に有用である。
【００５７】
ＤＮＡ注射（ＤＮＡワクチン接種とも称される）、組み換えアデノウイルス、組み換えアデノウイルス関連ウイルスおよび組み換えワクシニアなどの組み換えベクターを含むいくつかの周知の技術のいずれかを用いて、これらの核酸分子を送達してもよい。
【００５８】
投与経路には、筋肉内経路、鼻腔内経路、腹腔内経路、皮内経路、皮下経路、静脈内経路、動脈内経路、眼球内経路、および経口経路、ならびに粘膜組織への吸入剤もしくは坐薬による、例えば、膣、直腸、尿道、頬および舌下の組織への洗浄による局所的経路、経皮的経路が含まれるが、それらに限定されない。好ましい投与経路には、筋肉内注射、腹腔内注射、皮内注射および皮下注射が含まれる。遺伝子構築物は、電気穿孔の方法および装置、従来の注射器、無針注射器具、または「微粒子衝撃遺伝子銃」を含むがそれらに限定されない手段により投与されてもよい。
【００５９】
これらのＤＮＡワクチンの送達を促進するのに好ましい電気穿孔装置および電気穿孔法の例には、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらにより出願された米国特許公開第２００５／００５２６３０号（これらの内容は、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）に記載される例が含まれる。３５ＵＳＣ１１９（ｅ）条の下、２００６年１０月１７日に出願された米国特許仮出願第６０／８５２，１４９号および２００７年１０月１０日に出願された米国特許仮出願第６０／９７８，９８２号の利益を主張する、２００７年１０月１７日に出願された同時係属で共同所有の米国特許出願第１１／８７４０７２号（これらの全ては、この全体が本明細書に組み込まれる）に提供されるＤＮＡワクチンの送達を促進する電気穿孔装置および電気穿孔法も好ましい。
【００６０】
以下は、電気穿孔技術を用いた実施形態の例であり、上記で論じた特許参考文献の中で詳細に論じられる：電気穿孔装置は、使用者により事前に設定された電流入力と同じような定電流を生み出すエネルギーのパルスを、哺乳類の所望の組織へ送達するように配置され得る。この電気穿孔装置は、電気穿孔構成要素および電極集合体またはハンドル集合体を含む。この電気穿孔構成要素は、制御装置、電流波形発生器、インピーダンス試験器、波形自動記録装置、入力要素、状況報告要素、伝達ポート、記録構成要素、電源、および電源スイッチを含む電気穿孔装置の１つ以上の様々な要素を含み、かつ組み込むことができる。この電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の１つの要素として機能することができ、他の要素は、この電気穿孔構成要素と連通する別々の要素（または構成要素）である。いくつかの実施形態において、この電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の２つ以上の要素として機能することができ、それは、この電気穿孔構成要素から分離する電気穿孔装置のさらに他の要素と連通することができる。これらの要素は１つの装置として、または互いに連通する別々の要素として機能することができるので、改良型ＨＰＶワクチンを送達するためにこの電気穿孔技術を用いることは、１つの電気機械装置または機械装置の一部として存在する電気穿孔装置の要素に限定されない。この電気穿孔構成要素は、所望の組織に定電流を生み出すエネルギーパルスを送達することができ、フィードバック機構を含む。電極集合体は、空間的配置に複数の電極を有する電極アレイを含み、ここで、この電極集合体は、この電気穿孔構成要素からエネルギーパルスを受け取り、電極を通して所望の組織にエネルギーパルス送る。複数の電極の少なくとも１つは、エネルギーパルスの送達の間は中性であり、所望の組織のインピーダンスを測定し、この電気穿孔構成要素へインピーダンスを伝える。このフィードバック機構は、測定されるインピーダンスを受け取ることができ、この電気穿孔構成要素によって送達されるエネルギーパルスを調節し、定電流を維持することができる。
【００６１】
いくつかの実施形態において、複数の電極は、分散的パターンでエネルギーパルスを送達することができる。いくつかの実施形態において、複数の電極は、プログラムされた順番の下で、電極制御を介して分散的パターンでエネルギーパルスを送達することができ、使用者が、プログラムされた順番を電気穿孔構成要素に入力する。いくつかの実施形態において、プログラムされた順番は、順に送達される複数のパルスを含み、複数のパルスの各パルスは、インピーダンスを測定する１つの中性極と共に少なくとも２つの活性電極によって送達され、複数のパルスの次のパルスは、インピーダンスを測定する１つの中性極と共に少なくとも２つの活性電極の別の１つによって送達される。
【００６２】
いくつかの実施形態において、このフィードバック機構は、ハードウェアまたはソフトウェアのいずれかによって実行される。好ましくは、このフィードバック機構は、アナログ閉ループ回路によって行われる。好ましくは、このフィードバックは、毎５０μｓ、２０μｓ、１０μｓまたは１μｓで生じるが、好ましくはリアルタイムなフィードバックつまり瞬間的（すなわち、反応時間を決定するために利用できる技術によって決定されるような事実上瞬間的）である。いくつかの実施形態において、中性電極は、所望の組織においてインピーダンスを測定し、インピーダンスをこのフィードバック機構へ伝達し、このフィードバック機構はインピーダンスに応答し、事前設定電流と同じような値で定電流を維持するためにエネルギーパルスを調節する。いくつかの実施形態において、このフィードバック機構は、エネルギーパルス送達の間、連続的にかつ瞬間的に定電流を維持する。
【００６３】
いくつかの実施形態において、この核酸分子を、ポリヌクレオチド機能エンハンサーまたは遺伝子ワクチン促進剤の投与と併用して、これらの細胞に送達する。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号および１９９４年１月２６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９号に記載されており、これらは参照により各々が本明細書に組み込まれる。遺伝子ワクチン促進剤は、１９９４年４月１日に提出された米国特許第０２１，５７９号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。核酸分子と併用して投与する助剤を、核酸分子の投与前後に、この核酸分子との混合物として投与するか、または別々に、同時に投与してもよい。さらに、トランスフェクション剤および／または複製剤および／または炎症性薬剤として機能し得、かつＧＶＦと一緒に投与され得る他の薬剤には、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦ、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５などの増殖因子、サイトカインおよびリンホカイン、ならびに線維芽細胞増殖因子、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの表面活性剤、フロイント不完全アジュバンド、モノホスホリルリピドＡ（ＷＬ）を含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体およびスクアレンスクアレンなどの小胞が含まれ、かつヒアルロン酸も、この遺伝子構築物と併用して投与に使用してもよい。いくつかの実施形態において、免疫調節タンパク質を、ＧＶＦとして使用してもよい。いくつかの実施形態において、この核酸分子はＰＬＧと関連して提供され、送達および取り込みを高める。
【００６４】
本発明による医薬組成物は、約１ｎｇ〜約２０００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、本発明による医薬組成物は、約５ｎｇ〜約１０００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、これらの医薬組成物は、約１０ｎｇ〜約８００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、これらの医薬組成物は、約０．１〜約５００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、これらの医薬組成物は、約１〜約３５０μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、これらの医薬組成物は、約２５〜約２５０μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、これらの医薬組成物は、約１００〜約２００μｇのＤＮＡを含む。
【００６５】
本発明による医薬組成物を、使用する投与方法に従って処方する。医薬組成物が注射可能な医薬組成物である場合において、注射可能な医薬組成物は無菌であり、発熱物質も粒子も含まない。好ましくは、等張製剤を使用する。一般に、等張にするための添加剤には、塩化ナトリウム、Ｄ型グルコース、マンニトール、ソルビトールおよび乳糖が含まれ得る。場合によっては、リン酸緩衝食塩水などの等張液が好ましい。安定剤には、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。いくつかの実施形態において、血管収縮剤をこの製剤に加える。
【００６６】
本発明のいくつかの実施形態によると、免疫反応を誘導する方法が提供される。このワクチンは、タンパク質に基づく、弱毒化生ワクチン、細胞ワクチン、組み換えワクチンまたは核酸もしくはＤＮＡワクチンであってもよい。いくつかの実施形態において、粘膜免疫反応を誘導する方法を含む、免疫原に対する免疫反応を個体において誘導する方法は、ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質およびそれらの機能的断片またはそれらの発現できるコード配列のうちの１つ以上を、本発明のタンパク質をコードする単離した核酸分子および／または本発明のタンパク質をコードする組み換えワクチン、および／または本発明のタンパク質のサブユニットワクチンおよび／または弱毒化生ワクチンおよび／または不活化ワクチンと組み合わせて、この個体に投与するステップを含む。ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質およびそれらの機能的断片のうちの１つ以上を、免疫原をコードする単離した核酸分子；および／もしくは免疫原をコードする組み換えワクチンおよび／もしくは免疫原を含むサブユニットワクチンおよび／もしくは弱毒化生ワクチンおよび／もしくは不活化ワクチンの投与前に、それらの投与と同時に、またはそれらの投与の後に投与してもよい。いくつかの実施形態において、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣおよびそれらの機能的断片からなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードする単離した核酸分子を、この個体に投与する。
【００６７】
本発明を、以下の実施例においてさらに説明する。この実施例は本発明の実施形態を示すが、単なる説明の目的で与えられるということが理解されるべきである。上記の説明およびこの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を突き止めることができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な使用および条件に本発明を適用するために、本発明の様々な変更および改良を行うことができる。したがって、本明細書に示され、記載される改良に加えて、本発明の様々な改良は、先の記載から当業者に明らかになるであろう。かかる改良は、添付の特許請求の範囲に入ることも意図される。
【００６８】
米国特許、米国特許出願、および本開示の全体を通して引用される参考文献の各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００６９】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のウイルスタンパク質１８のＥ６およびＥ７の最適化コンセンサス配列を準備した。この配列を、高レベルの発現用に設計する。この配列は、発明者らの遺伝子による免疫技術に有用である。コンセンサス配列を用いて実施される実験結果は陽性であった。図１は、プラスミドｐＧＸ３００２（配列番号７）の中にコンセンサスＨＰＶ１８−６および１８−７の核酸配列を含むプラスミド構築物を示す図である。プラスミドｐＧＸ３００２の中に組み込まれるコンセンサスＨＰＶ１８−６および１８−７の核酸配列は、コンセンサスＨＰＶ１８−６および１８−７のコード配列と連結されるＩｇＥリーダーペプチドのコード配列を含む。
【００７０】
プラスミドｐＧＸ３００２は、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ）およびプラスミド複製開始点（ｐＵＣｏｒｉ）を含むｐＶＡＸ骨格を用いて、ウシ成長ホルモンの３’末端およびポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）を有し、ＣＭＶプロモーター（ｐＣＭＶ）によって促進される、最適化ヒトパピローマウイルス１８−６および１８−７抗原（ＨＰＶ１８のＥ６およびＥ７）を発現する。
【００７１】
【表１】
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【図１】
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【配列表】
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