(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする被検体における狼瘡を治療するための組成物であって、
有効な量の式
【化１】
0006033230.tif 000007
を有する化合物、またはその塩と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体または賦形剤とを有する組成物。
【請求項２】
前記被検体はヒトである、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物は経口投与される、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物は一日一回投与される、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物は一日二回投与される、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
前記化合物は約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
前記化合物は約５０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される、請求項１記載の組成物。
【請求項８】
前記化合物は約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
前記化合物は約１ｍｇ〜約１ｇの用量で投与される、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
前記化合物は約５ｍｇ〜約１００ｍｇの用量で投与される、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
前記化合物は約５ｍｇ〜約３０ｍｇの用量で投与される、請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか記載の組成物において、前記被検体は治療の間に、血清ＩＬ−１２、腎臓ｐＳＴＡＴ３、脾臓形質細胞、血清抗核抗体、血清ＩＦＮα、またはタンパク尿の減少を経験する組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
狼瘡治療
【背景技術】
【０００２】
狼瘡（全身性紅斑性狼瘡、ＳＬＥ）は、血管や、心臓組織、ＣＮＳ、腎臓、皮膚、関節を含む身体の様々な部分を攻撃する慢性的な炎症や、抗体、活性Ｔ細胞および活性Ｂ細胞の存在を特徴とする慢性自己免疫疾患である。重篤な場合には、抗体が腎臓の細胞（糸球体）に堆積させられ、炎症をもたらし、腎不全、すなわちループス腎炎として公知の状態をもたらす可能性がある。
【０００３】
狼瘡の原因は分からないが、疾患の兆候は、環境性病原菌や環境性毒素、遺伝子多型に関連付けられている（Ｍｏｒｅｌ；Ｆａｉｒｈｕｒｓｔ、Ｗａｎｄｓｔｒａｔ  ｅｔ  ａｌ．、２００６）。また、性別、ホルモンの影響、およびサイトカイン調節異常が狼瘡の発生と緊密に関連付けられている（ＡｒｉｎｇｅｒおよびＳｍｏｌｅｎ、２００４；Ｓｍｉｔｈ−Ｂｏｕｖｉｅｒ、Ｄｉｖｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００８）。狼瘡は男性よりも９倍も多くの女性を冒す。狼瘡はあらゆる年齢で生じ得るが、１０歳から５０歳の間の人達において最も多く現れる。アフリカ系アメリカ人やアジア人が他の人種の人達よりも頻繁に冒される。
【０００４】
狼瘡の治療法は存在しない。狼瘡の現在の処置は症状を制御することを目的とし、高用量のグルココルチコイドおよび／またはヒドロキシクロロキンなどの、重篤な副作用を伴う毒性薬品や免疫抑制剤に限定される。重篤な疾患（例えば、腎障害の兆候を有する患者）は、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、アザチオプリン（ＡＺＡ）、および／またはシクロホスファミド（ＣＴＸ）を含むより積極的な薬物を必要とする（ＢｅｒｔｓｉａｓおよびＢｏｕｍｐａｓ、２００８）。ＣＴＸ、ＡＺＡ、およびＭＭＦは非常に毒性があり、非常に免疫抑制的であり、処置された患者のうちの５０％だけに完全寛解が見られ、再発率は２年間で最大３０％である。
【０００５】
記憶Ｂ細胞、さらに重要なことに記憶Ｂ細胞から分化する長命形質細胞（ＬＬ−ＰＣ）は狼瘡に関与する重要な細胞の種類である（Ｎｅｕｂｅｒｔ、Ｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００８；ＳａｎｚおよびＬｅｅ、２０１０）。長命形質細胞は大量の高親和性アイソタイプスイッチ型抗体を合成して分泌する（Ｍｅｉｓｔｅｒ、Ｓｃｈｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、２００７；Ｍｕｌｌｅｒ、Ｄｉｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００８）。循環する抗核抗体（ＡＮＡ）は、抗体が自己組織上に堆積し、免疫複合体を形成し、最終的に組織破壊、エピトープ拡大、および他の臓器系の障害をもたらす機会を増やす。ＬＬ−ＰＣは化学耐性があり放射線耐性があると一般的に分かっており、様々な熱ショックタンパク質や薬ポンプを過剰発現させる（Ｏｂｅｎｇ、Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００６；Ｎｅｕｂｅｒｔ、Ｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００８）。また、ＬＬ−ＰＣは主に骨髄に存在し、骨髄において、ＬＬ−ＰＣはシクロホスファミドやグルココルチコイドなどの現在の狼瘡治療から守られる。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（非特許文献）
（非特許文献１）  ＡＬＰＥＲＯＶＩＣＨ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｎｅｗ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｏｒ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｕｐｕｓ  ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ，"Ｌｕｐｕｓ（２００７），Ｖｏｌ．１６，ｐｐ．１８−２４
（非特許文献２）  ＡＲＩＮＧＥＲ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｕｍｏｕｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ：  ａ  ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ，"Ｌｕｐｕｓ（２００４），Ｖｏｌ．１３，ｐｐ．３４４−３４７
（非特許文献３）  ＢＥＲＴＳＩＡＳ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｕｐｕｓ  ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ：  ｌｅｔ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｉｔ  ｔｈｅ  ｐａｔｉｅｎｔ，"Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（２００８），Ｖｏｌ．４，ｐｐ．４６４−４７２
（非特許文献４）  ＢＯＤＹ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ，"Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２００４），Ｖｏｌ．３１，ｐｐ．７３−７８
（非特許文献５）  ＢＯＵＭＰＡＳ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  ＢＧ９５８８（Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ｌｉｇａｎｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ）Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  Ｈｅｍａｔｕｒｉａ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  Ｌｕｐｕｓ  Ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ，"Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  &  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（２００３），Ｖｏｌ．４８，ｐｐ．７１９−７２７
（非特許文献６）  ＢＯＵＺＩＤ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃ−ｔｅｌｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎ  ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｗｏｍｅｎ：  Ａｎ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ｉｎ  ａ  Ｔｕｎｉｓｉａｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，"Ｌａ  Ｔｕｎｉｓｉｅ  Ｍｅｄｉｃａｌｅ（２０１０），Ｖｏｌ．８８，ｐｐ．４６７−４６９
（非特許文献７）  ＣＨＥＶＲＩＥＲ  ｅｔ  ａｌ．，"ＣＤ９３  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｎｉｃｈｅ，"ＰＮＡＳ（２００９），Ｖｏｌ．１０６，ｐｐ．３８９５−３９００
（非特許文献８）  ＣＨＵＮ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＩＬ−６  ａｎｄ  ＩＬ−１０  ａｓ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｌｕｐｕｓ  Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ，"Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００７），Ｖｏｌ．２７，ｐｐ．４６１−４６６
（非特許文献９）  ＣＯＯＭＢＳ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐａｉｎ，ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｅａｌｔｈ  ｓｔａｔｕｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＣＰ−６９０，５５０，ａｎ  ｏｒａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  Ｊａｎｕｓ  ｋｉｎａｓｅ（ＪＡＫ）ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ，"Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．（２０１０），Ｖｏｌ．６９，ｐｐ．４１３−４１６
（非特許文献１０）  ＣＵＮＮＩＮＧＨＡＭ，"Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｌｏｓｓ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｈｏ  Ｈａｖｅ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｒｅｃｅｉｖｅ  Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ  Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ，"Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．（２００７），Ｖｏｌ．１８，ｐｐ．２２３−２３４
（非特許文献１１）  ＥＧＮＥＲ，"Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｅｓｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ＳＬＥ，"Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．（２０００），Ｖｏｌ．５３，ｐｐ．４２４−４３２
（非特許文献１２）  ＥＳＰＥＬＩ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｌｏｃａｌ  Ｒｅｎａｌ  Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｌｕｐｕｓ  Ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ，"Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．（２０１１），Ｖｏｌ．２２，ｐｐ．２９６−３０５
（非特許文献１３）  ＦＡＩＲＨＵＲＳＴ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｌｕｐｕｓ  Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ：  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ａ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ，"Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００６），Ｖｏｌ．９２，ｐｐ．１−６９
（非特許文献１４）  ＦＵ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ，"Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．&  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００８），Ｖｏｌ．１０，Ｒ１１２
（非特許文献１５）  ＨＯＵＳＳＩＡＵ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｕｐｕｓ  ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ，"Ｌｕｐｕｓ（２００８），Ｖｏｌ．１７，ｐｐ．４２６−４３０
（非特許文献１６）  ＫＡＭＥＮ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，"Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｏｂｅｓ．（２０１０），Ｖｏｌ．１７，ｐｐ．５４０−５４５
（非特許文献１７）  ＫＩＳＳ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｎｔｉ−ｎｕｓｃｌｅｏｓｏｍｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，ａ  ｒｅｌｉａｂｌｅ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｆｏｒ  ｌｕｐｕｓ  ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ，"Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００９），Ｖｏｌ．４２，ｐｐ  ３９３−３９８
（非特許文献１８）  ＬＡＣＯＴＴＥ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｄｅｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｙｅｒｓ  ｉｎ  Ｌｕｐｕｓ：  Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  Ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  Ｎｅｐｈｒｉｔｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙｓ  ｏｆ（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ１  Ｍｉｃｅ，"Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１０），Ｖｏｌ．１８４，ｐｐ．３９３７−３９４５
（非特許文献１９）  ＭＥＩＳＴＥＲ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ  Ｍｙｅｌｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，"Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００７），Ｖｏｌ．６７，ｐｐ．１７８３−１７９２
（非特許文献２０）  ＭＯＲＥＬ，"Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ＳＬＥ：  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ，"Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．（２０１０），Ｖｏｌ．６，ｐｐ．３４８−３５７
（非特許文献２１）  ＭＯＲＩＭＯＴＯ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｈｅ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１３  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｌｕｐｕｓ  Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ：  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｏｔｈｅｒ  Ｔｈ１−，Ｔｈ２−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ，"Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００１），Ｖｏｌ．３４，ｐｐ．１９−２５
（非特許文献２２）  ＭＵＬＬＥＲ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ａｎｔｉ−ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，"Ｌｕｐｕｓ（２００８），Ｖｏｌ．１７，ｐｐ．４３１−４３６
（非特許文献２３）  ＮＥＵＢＥＲＴ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ  ｄｅｐｌｅｔｅｓ  ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｌｕｐｕｓ−ｌｉｋｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ，"Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００８），Ｖｏｌ．１４，ｐｐ．７４８−７５５
（非特許文献２４）  ＮＩＥＷＯＬＤ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｈｉｇｈ  ｓｅｒｕｍ  ＩＦＮ−α  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｓ  ａ  ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ，"Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００７），Ｖｏｌ．８，ｐｐ．４９２−５０２
（非特許文献２５）  ＯＢＥＮＧ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ａ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌｓ，"Ｂｌｏｏｄ（２００８），Ｖｏｌ．１０７，ｐｐ．４９０７−４９１６
（非特許文献２６）  ＳＡＮＺ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｉｎ  ＳＬＥ，"Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．（２０１０），Ｖｏｌ．６，ｐｐ．３２６−３３７
（非特許文献２７）  ＳＭＩＴＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｆｅｍａｌｅ  ｐｒｅｐｏｎｄｅｒａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｕｐｕｓ  ｉｎ  ＳＪＬ／Ｊ  ｍｉｃｅ，"Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．（２００７），Ｖｏｌ．１２２，ｐｐ．１０１−１０７
（非特許文献２８）  ＳＭＩＴＨ−ＢＯＵＶＩＥＲ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｓｅｘ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｅｍａｌｅ  ｂｉａｓ  ｉｎ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ，"Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（２００８），Ｖｏｌ．２０５，ｐｐ．１０９９−１１０８
（非特許文献２９）  ＳＯＺＺＡＮＩ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ  ｉｎ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，"Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０１０），Ｖｏｌ．４３，ｐｐ．１９６−２０３
（非特許文献３０）  ＴＵＣＣＩ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２  ａｎｄ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  １  ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｃｅ  ｉｎ  ｌｕｐｕｓ  ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ，"Ｃｌｉｎ．&  Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００８），Ｖｏｌ．１５４，ｐｐ．２４７−２５４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ループス腎炎を含む狼瘡の新たな処置の必要性が存在する。ＬＬ−ＰＣを標的として減少させることができる狼瘡処置の必要性が特に存在する。  
【課題を解決するための手段】
【０００７】
化合物Ａで被検体の狼瘡を処置するための方法が提供される。一実施形態において、被検体はヒトである。一実施形態において、化合物Ａは経口投与される。一実施形態において、化合物Ａは一日一回投与される。一実施形態において、化合物Ａは一日二回投与される。一実施形態において、化合物Ａはプロドラッグとして投与される。
【０００８】
一実施形態において、化合物Ａは約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。一実施形態において、化合物Ａは約５０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一実施形態において、化合物Ａは約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一実施形態において、化合物Ａは約１ｍｇ〜約１ｇの用量で投与される。一実施形態において、化合物Ａは約５ｍｇ〜約１００ｍｇの用量で投与される。一実施形態において、化合物Ａは約５ｍｇ〜約２０ｍｇの用量で投与される。
【０００９】
一実施形態において、被検体は処置の間に血清ＩＬ−１２の減少を経験する。一実施形態において、被検体は処置の間に腎臓ｐＳＴＡＴ３の減少を経験する。一実施形態において、被検体は処置の間に脾臓形質細胞の減少を経験する。一実施形態において、被検体は処置の間に血清抗核抗体の減少を経験する。一実施形態において、被検体は処置の間に血清ＩＦＮαの減少を経験する。一実施形態において、被検体は処置の間にタンパク尿の減少を経験する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、化合物Ａがどのように急性狼瘡ＭＲＬ／ｌｐｒマウスモデルにおいてテストされたかに関する概略を示す。
【図２】図２は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける様々な用量での経口投与後４時間の様々な組織における化合物Ａのレベルを示す。
【図３】図３は、化合物Ａで処置されたＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおけるリンパ腺肥大の出現率の減少を示す。
【図４】図４は、様々な用量の化合物Ａで処置されたＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける脾臓のサイズと脾臓白血球細胞の総数との減少を示す。
【図５】図５は、化合物Ａで処置されたＭＲＬ／ｌｐｒマウスの体重の変化を示す。
【図６】図６は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける様々な用量の化合物Ａでの処置を伴って循環するＩＬ−１２サイトカインのレベルと、そうした処置を伴うことなく循環するＩＬ−１２サイトカインのレベルとを示す。
【図７】図７は、化合物Ａで処置されたＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける相補体Ｃ３のレベルを示す。
【図８】図８は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける糸球体への白血球浸潤のために染色された腎臓の切片を示す。研究終了時に、化合物Ａで処置された３種類全ての動物に対してビヒクルで処置された動物においてより多くの糸球体腎炎が観察される。黒色の矢印は、ｄｅｘで処置された動物とビヒクルで処置された動物との両方における糸球体浸潤と白血球浸潤とを拡大したものを示すが、化合物Ａで処置された動物には存在しない。
【図９】図９は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの疾患した腎臓におけるＪＡＫ２の標的、すなわちｐＳＴＡＴ３のレベルの低下を示す。
【図１０】図１０は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける１００ｍｇ／ｋｇの化合物Ａでの処置後の形質細胞の割合の低下を示す。
【図１１】図１１は、化合物Ａで処置されたＭＲＬ／ｌｐｒマウスの脾臓におけるＡＳＣのレベルの低下を示す。１００ｍｇ／ｋｇの用量に対する、抗クロマチン抗体を分泌するＡＳＣの減少は、同じ用量（図１０）でフローサイトメトリによって測定される通り、脾臓におけるＰＣの比率の低下と非常に相関する。
【図１２】図１２は、化合物Ａがどのように人の狼瘡に関してゆっくりと自然発症するＮＺＭマウスモデルでテストされたかに関する概略を示す。
【図１３】図１３は、ビヒクルまたはＤｅｘで処置されたＮＺＭマウスを超える、化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスの生存率の増加を示す。
【図１４】図１４は、ＮＺＭマウスにおける化合物Ａでの処置に関して時間の経過に伴う血清抗ｄｓＤＮＡ  ＡＮＡのレベルを示す。
【図１５】図１５は、ＮＺＭマウスにおける化合物Ａでの処置に関して時間の経過に伴う抗ＳｍｉｔｈＡＮＡのレベルを示す。
【図１６】図１６は、化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスに関して研究終了時の血清におけるＩＮＦαサイトカインのレベルを示す。
【図１７】図１７は、ＮＺＭマウスにおける化合物Ａでの処置に関して時間の経過と共に測定されたタンパク尿の総計を示す。
【図１８Ａ】図１８Ａは、化合物Ａでの処置に関して時間の経過と共に個々のＮＺＭマウスに対して測定されたタンパク尿の総計のレベルを示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、化合物Ａでの処置に関して時間の経過と共に個々のＮＺＭマウスに対して測定されたタンパク尿の総計のレベルを示す。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、化合物Ａでの処置に関して時間の経過と共に個々のＮＺＭマウスに対して測定されたタンパク尿の総計のレベルを示す。
【図１８Ｄ】図１８Ｄは、化合物Ａでの処置に関して時間の経過と共に個々のＮＺＭマウスに対して測定されたタンパク尿の総計のレベルを示す。
【図１８Ｅ】図１８Ｅは、化合物Ａでの処置に関して時間の経過と共に個々のＮＺＭマウスに対して測定されたタンパク尿の総計のレベルを示す。
【図１９】図１９は、様々な対照と化合物Ａとで処置されたＮＺＭマウスからの染色切片の腎臓組織病理を示す。黒色の矢印は糸球体浸潤と白血球浸潤とを拡大したものを指し、それらは化合物Ａで処置されたマウスには存在しない。
【図２０】図２０は、化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスからの染色された切片の肺組織病理を示す。黒色の矢印は、狼瘡と関連付けられる、腺腫、血管炎、および重篤な肺の炎症を指す。これらの病気の兆候のうちの３つ全てがＣＴＸや化合物Ａで処置された動物においてはなくなっている。
【図２１】図２１は、ＮＺＭマウスにおける化合物Ａの経口投薬後の狼瘡疾患組織、すなわち腎臓におけるＪＡＫ２標的であるｐＳＴＡＴ３のレベルの低下を示す。
【図２２】図２２は、ＮＺＭマウスにおける化合物Ａの処置に関して時間の経過と共に測定されたＩＬ−１２サイトカインのレベルを示す。
【図２３】図２３は、ＮＺＭマウスにおける化合物Ａの処置に関して時間の経過と共に測定されたＩＬ−１７Ａサイトカインのレベルを示す。
【図２４】図２４は、ＮＺＭマウスにおける化合物Ａの処置に関して時間の経過と共に測定されたＩＬ−６サイトカインのレベルを示す。
【図２５】図２５は、ＮＺＭマウスにおける化合物Ａの処置に関して時間の経過と共に測定されたＭＩＰ−１αケモカインのレベルを示す。
【図２６】図２６は、ＮＺＭマウスにおける化合物Ａの処置に関して時間の経過と共に血清内で測定されたケモカインＣＸＣＬＩＯ／ＩＰ−１０のレベルを示す。
【図２７】図２７は、ＮＺＭマウスにおける化合物Ａの処置に関して時間の経過と共に血清内で測定されたケモカインＣＸＣＬ９／ＭＩＧのレベルを示す。
【図２８】図２８は、ＮＺＭマウスにおける化合物Ａの処置に関して時間の経過と共に血清内で測定されたサイトカインＩＬ−４のレベルを示す。
【図２９】図２９は、ＮＺＭマウスにおける化合物Ａの処置に関して時間の経過と共に血清内で測定されたサイトカインＩＬ−１３のレベルを示す。
【図３０】図３０は、ＮＺＭマウスにおける化合物Ａの処置に関して時間の経過と共に血清内で測定されたＴＮＦαのレベルを示す。
【図３１】図３１は、ＮＺＭマウスにおける化合物Ａの処置に関して時間の経過と共に血清内で測定されたＫＣ／ＩＬ−８のレベルを示す。
【図３２】図３２は、研究終了時における化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスの脾臓質量を示す。
【図３３】図３３は、化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスにおいて時間の経過と共に測定された平均身体質量を示す。
【図３４】図３４は、化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスの血清中で時間の経過と共に測定された骨吸収バイオマーカＣＴｘの平均レベルを示す。
【図３５】図３５は、化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスにおけるＣＤ１９／Ｂ２２０−ＣＤ３８＋ＣＤ１３８＋脾臓形質細胞の割合を示す。上部分はグラフ化された割合データを示し、下部分はフローサイトメトリからの代表的な未加工ドットプロットを提供する。
【図３６】図３６は、化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスの脾臓から抗クロマチンＡＮＡ抗体を分泌させるＡＳＣ細胞の出現率を示す。
【図３７】図３７は、化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスにおけるマーカＣＤ３８の平均的な発現を示す。
【図３８】図３８は、化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスにおける生きた脾臓短命形質細胞の割合を示す。
【図３９】図３９は、化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスにおける生きた骨髄短命形質細胞の割合を示す。
【図４０】図４０は、化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスにおける生きた脾臓長命形質細胞の割合を示す。
【図４１】図４１は、化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスにおける生きた骨髄長命形質細胞の割合を示す。
【図４２】図４２は、化合物Ａで処置されると共にＸ軸とＹ軸とにおけるマーカに従ってゲーティングされたＮＺＭマウスからの、生きたゲートＣＤ１９陰性ＣＤ１９陽性の脾臓形質細胞と骨髄形質細胞との代表的なフロー・サイトメトリ・ドット・プロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
量、持続時間などのような測定可能な値に関して言及する時に本明細書において使用される場合、「約」という用語は、その値の合理的な変動、例えば、特定された値から±１０％などを含むように意図される。例えば、「約５０％」という語句は５０の±１０％、すなわち４５％〜５５％を含み得る。
【００１２】
本明細書において使用される場合、「被検体」という用語は、ヒトを含む温血動物、好適には哺乳類を含む。好適な実施形態において、被検体は霊長類である。またさらに好適な実施形態において、被検体はヒトである。
【００１３】
化合物Ａを使用して被検体の狼瘡を処置するための方法が提供される。化合物Ａは［８−（４−メタンスルホニル−フェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−２−イル］−［３−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−フェニル］−アミンという化学名を有するＪＡＫ２インヒビタである。化合物Ａは下記の構造を有する。
【００１４】
【化１】
0006033230.tif 000002
【００１５】
本発明において使用される化合物Ａはプロドラッグを含む任意の適切な化学的形態で投与されてもよい。適切なプロドラッグは親化合物の薬学的に許容可能な塩の形態を含む。好適には、プロドラッグは投与後に親化合物（すなわち、化合物Ａ）に転換する。本明細書において使用される通り、「薬学的に許容可能な塩」は親化合物の誘導体を指し、親化合物の誘導体においては、化合物の酸性塩または塩基塩を作ることによって化合物が変性させられる。薬学的に許容可能な塩の例は、塩基性アミン残基の鉱酸塩または有機酸塩を含むが、それらには限定されない。
【００１６】
したがって、一実施形態において、化合物Ａは親化合物の塩誘導体として投与される。一実施形態において、化合物Ａは化合物Ａの酸性塩として投与される。
【００１７】
任意の適切な投与方法が使用されてもよい。例として、注入（皮下、静脈、非経口、腹腔内、髄腔内など）、経口、直腸、経粘膜、吸入、および経皮を含む。注入によって投与される時には、注入はボーラス投与または持続注入であり得る。
【００１８】
化合物Ａは、ＩＶ注入、または錠剤もしくはカプセルなどの経口投薬形態によって投与されるのが好ましい。例えば、化合物Ａは無菌凍結乾燥粉末として提供されてもよく、無菌凍結乾燥粉末は、注入前に、例えば、注入のための無菌水、塩水溶液（ＮａＣｌ）、またはマンニトール溶液で再構成されてもよい。したがって、一実施形態において、化合物Ａは静脈（ＩＶ）注入によって投与される。別の実施形態において、化合物Ａは経口投与される。一実施形態において、化合物Ａは錠剤で経口投与される。別の実施形態において、化合物Ａはカプセルで経口投与される。
【００１９】
経口投与に関しては、化合物Ａは当業者に周知の薬学的に許容可能な担体と化合物Ａを組み合わせることによって容易に製剤化され得る。こうした担体は、化合物Ａが、処置される被検体による経口摂取のために、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリ、懸濁液、乳剤などとして製剤化されることを可能にする。経口使用のための薬学的製剤は、固体賦形剤と化合物Ａを組み合わせ、選択的に、結果として生じる混合物を粉砕し、所望される場合には、錠剤または糖衣錠のコアを取得するために適切な補助剤を添加した後で顆粒の混合物を加工することによって取得されることができる。適切な賦形剤は、増量剤もしくは希釈剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、抗接着剤、流動促進剤、湿潤剤および界面活性剤、冷却剤および顔料、香味剤、甘味料、吸収剤、ならびに風味遮断剤を含む。
【００２０】
希釈剤は典型的には、錠剤のサイズを増加させるために、わずかな量の活性薬物に添加される。最も一般的な希釈剤はラクトースであり、ラクトースはαラクトースまたはβラクトースという２つの異性体型で存在し、結晶質または非晶質のいずれかであり得る。様々な種類のラクトースは噴霧乾燥ラクトースモノハイドレート（例えば、Ｓｕｐｅｒ−Ｔａｂ（商標））、α−ラクトースモノハイドレート（例えば、Ｆａｓｔ  Ｆｌｏ（登録商標））、無水α−ラクトース、無水β−ラクトース、および凝集ラクトースを含む。他の希釈剤は、圧縮糖ＮＦ、デキストロース賦形剤ＮＦ、およびデキストレートＮＦなどの糖を含む。好適な希釈剤はラクトースモノアンヒドリド（例えば、ＦａｓｔＦｌｏ（登録商標））である。他の好適な希釈剤は微晶質セルロース（例えば、Ａｖｉｃｃｌ（登録商標）ＰＨおよびＣｏｏｌｕｓ（商標））、および超微小セルロース（例えば、Ｅｌｃｅｍａ（登録商標））を含む。
【００２１】
希釈剤はデンプンやデンプン誘導体を含んでもよい。デンプンは、小麦、とうもろこし、米、およびじゃがいもから取得された天然のデンプンを含む。他のデンプンは、事前にゼラチン化されたデンプンＮＦ、およびデンプングリコール酸ナトリウムＮＦを含む。デンプンおよびデンプン誘導体は崩壊剤としても機能する。他の希釈剤は、２塩基性リン酸カルシウムＵＳＰ（例えば、Ｄｉ−Ｔａｂ（登録商標）およびＥｍｃｏｍｐｒｅｓｓ（登録商標））、３塩基性リン酸カルシウムＮＦ（例えば、Ｔｒｉ−Ｔａｂ（登録商標）およびＴｒｉ−Ｃａｆｏｓ（登録商標））、および硫酸カリシウムＮＦ（例えば、Ｃｏｍｐａｃｔｒｏｌ（登録商標））などの無機塩を含む。マンニトールＵＳＰ、ソルビトールＮＦ、およびキシリトールＮＦのようなポリオールもまた希釈剤として働いてもよい。多くの希釈剤が崩壊剤や結合剤としても機能し、これらの追加の特性は処方物を開発する時に考慮に入れられなければならない。
【００２２】
崩壊剤は、錠剤を破壊して、薬学的な活性成分の粒子と賦形剤とにするために錠剤処方物に含まれ、賦形剤は活性成分の溶解を容易にすると共に活性成分のバイオアベイラビリティを高める。デンプンのカルボキシメチルエーテルの架橋ナトリウム塩（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムＮＦ、Ｅｘｐｌｏｔａｂ（登録商標）、およびＰｒｉｍｏｇｅｌ（登録商標））を含むデンプンおよびデンプン誘導体が有用な崩壊剤である。好適な崩壊剤はＳｔａｒｃｈ１５００（登録商標）などの事前にゼラチン化されたデンプンである。別の好適な崩壊剤は架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（例えば、クロスカルメロースナトリウムＮＦ、Ａｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌ（登録商標））である。他の崩壊剤は、架橋ポリビニルピロリドン（例えば、クロスポビドンＮＦ）、微晶質セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ）を含む。
【００２３】
結合剤は薬学的活性成分や他の賦形剤を凝集するための湿式造粒賦形剤として使用される。結合剤は粉末の流れを改善し成形性を改善するように選択される。結合剤は、微晶質セルロースＮＦ、メチルセルロースＵＳＰ、カルボキシメチルセルロースナトリウムＵＳＰ、ヒドロキシプロピルメチルセルロースＵＳＰ、ヒドロキシエチルセルロースＮＦ、およびヒドロキシプロピルセルロースＮＦなどのセルロース誘導体を含む。他の結合剤は、ポリビドン、ポリビニルピロリドン、ゼラチンＮＦ、天然ガム（例えば、アカシア、トラガカント、グアー、およびペクチン）、デンプンペースト、事前にゼラチン化されたデンプンＮＦ、スクロースＮＦ、とうもろこしシロップ、ポリエチレングリコール、およびアルギン酸ナトリウム、アンモニウムカルシウムアルギネート、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、ポリエチレングリコールを含む。好適な結合剤は、ポリビニルピロリドンであり、特にポリビドンＵＳＰであり、好適にはポリビドンＫ−２９／３２である。
【００２４】
潤滑剤は、パンチ面への錠剤の粘着を防ぐと共に圧縮段階の間に摩擦を減少させるために錠剤処方物において使用される。潤滑剤は典型的には、野菜油（例えば、コーン油）、鉱物油、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ−４０００およびＰＥＧ−６０００）、ステアリン酸の塩（例えば、ステアリン酸カルシウムおよびフマル酸ステアリルナトリウム）、鉱物塩（例えば、タルク）、無機塩（例えば、塩化ナトリウム）、有機塩（例えば、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、およびオレイン酸ナトリウム）、およびポリビニルアルコールを含む。好適な潤滑剤はステアリン酸マグネシウムである。
【００２５】
糖衣錠のコアは適切なコーティングを提供されてもよい。この目的のために、濃縮糖溶液が使用されてもよく、濃縮糖溶液は必要に応じて、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物を含んでもよい。染料または顔料は活性化合物の用量の異なる組み合わせを識別または特徴付けるために錠剤または糖衣錠のコーティングに添加されてもよい。
【００２６】
経口的に使用されることができる薬学的製剤は、ゼラチンで作られた押込み式カプセルを含むだけでなく、ゼラチンと、グリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤とで作られたシールされた柔らかいカプセルを含む。押込み式カプセルは、ラクトースなどの増量剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、選択的に安定剤を有する混合物中に化合物Ａを含むことができる。柔らかいカプセルにおいて、化合物Ａは、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体中で溶解または懸濁させられてもよい。また、安定剤が添加されてもよい。経口投与のための処方物全てがこうした投与に適した用量のものであるべきである。
【００２７】
口腔内投与に関して、組成物は従来の方法で処方された錠剤またはトローチ剤の形態をとってもよい。
【００２８】
吸入による投与に関して、化合物Ａは、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオルエタン、二酸化炭素、または他の適切な気体などの適切な高圧ガスを用いて、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾル噴霧提示の形態で送達されるのが便利である。加圧エアロゾルの場合、用量単位は測定した量を送達するための弁を提供することによって決定されてもよい。例えば、吸入具または吸入器における使用のためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、その化合物と、ラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末ベースとの粉末混合物を含んで処方されてもよい。
【００２９】
化合物Ａは、注入、例えば、ボーラス注入または持続注入による非経口投与のために処方されてもよい。注入のための処方物は、保存剤を添加された単位用量の形態、例えば、アンプルまたは多回投与容器で提示されてもよい。組成物は、油性または水性のビヒクル中の、懸濁液、溶液、または乳剤のような形態をとってもよく、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの処方剤を含んでもよい。
【００３０】
非経口投与のための薬学的処方物は水溶性形態の化合物Ａの水溶液を含む。さらに、化合物Ａの懸濁液は適切な油性注入懸濁液として調製されてもよい。適切な親油性溶媒またはビヒクルは、ごま油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。水性注入懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含んでもよい。選択的に、懸濁液は、高濃度溶液の調製を可能にするように化合物Ａの可溶性を増加させる適切な安定剤または薬剤を含んでもよい。
【００３１】
化合物Ａは、使用前には、例えばピロゲンを含まない無菌水などの適切なビヒクルを用いた構成のために粉末の形態のものであってもよい。
【００３２】
化合物Ａはまた、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の座薬の基剤を含有する、座薬または停留浣腸などの直腸組成物に製剤化されてもよい。
【００３３】
先に記載された製剤に加えて、化合物Ａはまたデポ製剤として製剤化されてもよい。こうした長時間作用型製剤は、（例えば、皮下または筋肉内）植込みによって、または筋肉注射によって投与されてもよい。このように、例えば、化合物Ａは、（例えば、許容可能な油中の乳剤としての）適切なポリマー材料または適切な疎水性材料、またはイオン交換樹脂と共に製剤化されたり、難溶性の誘導体、例えば、難溶性の塩として製剤化されたりしてもよい。
【００３４】
リポソームと乳剤とは疎水性薬物に対する送達ビヒクルまたは担体の周知例である。ジメチルスルホイシドなどの特定の有機溶媒もまた利用されてもよいが、それらは通常非常に毒性があるという代償を伴う。さらに、化合物Ａは治療剤を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスなどの徐放システムを使用して送達されてもよい。様々な形態の徐放性材料が確立されており、それらは当業者には周知である。徐放性カプセルは、それらの化学的性質に応じて、数時間から１００日を超える期間の間、化合物Ａを放出してもよい。
【００３５】
薬学的組成物はまた適切な固相またはゲル相の担体または賦形剤を備えてもよい。こうした担体または賦形剤の例は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどのポリマーを含むが、それらには限定されない。
【００３６】
化合物Ａは、狼瘡を処置するために有効な量、すなわち、疾患の症状を妨げ、緩和し、または改善するために有効な量、処置される被検体の生存を延ばすために有効な量、および／または被検体における狼瘡関連バイオマーカに好ましい影響を与えるために有効な量で投与される。化合物Ａの有効量の決定は本明細書において提供される詳細な開示や実施例を鑑みた当業者の能力の充分な範囲内である。有効量は、被検体の大きさ、狼瘡疾患の重篤度、投与の頻度（例えば、一日に複数回に対して一日一回）、化合物の投与の方法、被検体の健康状態や共存症の状態、（例えば、同じ薬物または同様な薬物を用いる）処方する医師の判断や経験、投与の方式、投与される剤形のバイオアベイラビリティ特性、選択された用法、および併用療法の種類（例えば、グルココルチコイド）などの要因に従って変化し得る。例えば、単独療法のための化合物Ａの有効量は、化合物Ａが他の狼瘡治療と組み合わせて共に使用される時に有効である化合物Ａの量よりも多い用量であり得る。有効な用量はインビトロまたは動物モデルの試験系から導き出される用量反応曲線から推定されることができ、有効な用量は被検体の表面積または体重に基づいてもよい。
【００３７】
化合物の最適な用量未満である少ない用量で処置を始めることができる。その後、現状で最適な効果に到達するまで、わずかな増分で用量を増加させることができる。一日分の総用量は、所望される場合には、その日の間に、ポーションに分割されて投与されてもよい。用法を最適化するために、化合物Ａの有効性が処置を受けている被検体内の様々なバイオマーカに対する処置の効果をモニタリングすることによってモニタリングされることができる。有用なバイオマーカは本明細書の実施例に列挙されるものを含む（例えば、抗核抗体、ＩＦＮαおよびＩＬ−１２などのサイトカイン、タンパク尿、ＪＡＫ２インヒビタなど）。狼瘡処置の有効性をモニタリングするために特に便利な２つのバイオマーカはタンパク尿および抗核抗体である。有効な用量の化合物Ａは処置前のバイオマーカのレベルと比較して所望の方法でバイオマーカを変化させる（例えば、タンパク尿を減少させ、抗核抗体を減少させ、ｐＳＴＡＴ３を減少させるなどである）。こうして、化合物Ａの有効な用量は、少ない用量で開始して、これらのバイオマーカのうちの１つ以上をモニタリングしながら徐々に増やすことによって最適化されることができる。概して、治療を開始する前に患者からのバイオマーカ（例えば、タンパク尿または抗核抗体）の最初の評価と、処置の間の異なる時点における１つ以上の追加の評価とを取得することが好ましい。こうした用途において、治療前のベースライン決定が決定され、それからバイオマーカ（例えば、タンパク尿または抗核抗体）の変化が治療の流れの間に決定される。あるいは、２つ以上の連続した決定が処置前ベースライン測定を必要とすることなく処置の間に行われることができる。こうした用途においては、バイオマーカ（例えば、タンパク尿または抗核抗体）の最初の評価が、レベルが増加しているか、または減少しているかを決定するためのベースラインレベルとして被検体から行われるべきである。
【００３８】
好適な実施形態において、化合物Ａを用いた処置を受けている被検体は狼瘡疾患と関連付けられる１つ以上のバイオマーカの望ましい変化を経験する。狼瘡と関連付けられる適切なバイオマーカは、リンパ腺腫、脾腫、脾臓の白血球数、血清ＩＬ−１２、血清Ｃ３、腎臓糸球体細胞充実度、腎臓間質浸潤、腎臓ｐＳＴＡＴ３、脾臓形質細胞、血清抗核抗体、血清抗ｄｓＤＮＡ抗核抗体、血清ＩＦＮα、タンパク尿、肺浸潤物、血清ＩＬ−１７Ａ、血清ＩＬ−６、血清ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、血清ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０、血清ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、血清ＩＬ−４、血清ＩＬ−１３、血清ＴＮＦα、血清ＫＣ／ＩＬ−８、および血清ＣＴｘを含む。したがって、一実施形態において、被検体は化合物Ａを用いた処置の間にリンパ腺腫の減少を経験する。別の実施形態において、被検体は化合物Ａを用いた処置の間に脾腫の減少を経験する。別の実施形態において、被検体は化合物Ａを用いた処置の間に脾臓の白血球数の減少を経験する。別の実施形態において、被検体は化合物Ａを用いた処置の間に血清ＩＬ−１２の減少を経験する。別の実施形態において、被検体は化合物Ａを用いた処置の間に血清Ｃ３の増加を経験する。別の実施形態において、被検体は化合物Ａを用いた処置の間に腎臓糸球体細胞充実度の減少を経験する。別の実施形態において、被検体は化合物Ａを用いた処置の間に腎臓間質浸潤の減少を経験する。別の実施形態において、被検体は化合物Ａを用いた処置の間に腎臓ｐＳＴＡＴ３の減少を経験する。別の実施形態において、被検体は化合物Ａを用いた処置の間に脾臓間質細胞の減少を経験する。別の実施形態において、被検体は化合物Ａを用いた処置の間に血清抗核抗体の減少を経験する。別の実施形態において、被検体は化合物Ａを用いた処置の間に血清抗ｄｓ−ＤＮＡ抗核抗体の減少を経験する。別の実施形態において、被検体は化合物Ａを用いた処置の間に血清ＩＮＦαの減少を経験する。別の実施形態において、被検体は化合物Ａを用いた処置の間にタンパク尿の減少を経験する。別の実施形態において、被検体は化合物Ａを用いた処置の間に肺浸潤物の減少を経験する。別の実施形態において、被検体は化合物Ａを用いた処置の間に血清ＩＬ−１７Ａの減少を経験する。別の実施形態において、被検体は化合物Ａを用いた処置の間に血清ＩＬ−６の減少を経験する。別の実施形態において、被検体は化合物Ａを用いた処置の間に血清ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αの減少を経験する。別の実施形態において、被検体は化合物Ａを用いた処置の間に血清ＣＸＣ１０／ＩＰ−１０の減少を経験する。別の実施形態において、被検体は化合物Ａを用いた処置の間に血清ＣＸＣ９／ＭＩＧの減少を経験する。別の実施形態において、被検体は化合物Ａを用いた処置の間に血清ＩＬ−４の減少を経験する。別の実施形態において、被検体は化合物Ａを用いた処置の間に血清ＩＬ−１３の減少を経験する。別の実施形態において、被検体は化合物Ａを用いた処置の間に血清ＴＮＦαの減少を経験する。別の実施形態において、被検体は化合物Ａを用いた処置の間に血清ＫＣ／ＩＬ−８の減少を経験する。別の実施形態において、被検体は化合物Ａを用いた処置の間に血清ＣＴｘの減少を経験する。
【００３９】
化合物Ａの投与レジメンは、剤形の薬物動態、処置または阻害される狼瘡症状の種類、被検体の大きさ、狼瘡疾患の重篤度、および有効用量などの要因に従って変化し得る。化合物Ａの投与のタイミングは、上記の考慮や本発明の詳細な開示を鑑みて有効性を最適化したり副作用を最小化したりするように、処置する医師によって容易に変更されることができる。
【００４０】
本発明に従った化合物Ａに対する投薬スケジュールには広い柔軟性がある。特定の実施形態において、特定の実施形態において、投薬スケジュールは他のＪＡＫインヒビタに適していることが公知の投薬スケジュールから適合させられることができる。例えば、ＪＡＫインヒビタであるタソシチニブ（ＣＰ−６９０５５０）やＩＮＣＢ０２８０５０がそれぞれ、二日ごとに５ｍｇ〜３０ｍｇの用量、または一日ごとに４ｍｇ〜１０ｍｇの用量で関節リウマチに有効であることが示された（Ｃｏｏｍｂｓ、Ｊ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ、２０１０；ｗｗｗ．ｍｅｄｐａｇｅｔｏｄａｙ．ｃｏｍ／ＭｅｅｔｉｎｇＣｏｖｅｒａｇｅ／ＡＣＲ／２３３０８）。従来技術のＪＡＫインヒビタが関節リウマチを処置するために使用され、狼瘡を処置するために使用されなかったとしても、比較は可能である。なぜならば、有効なＪＡＫインヒビタは両方の疾患を処置する能力があるからである。
【００４１】
化合物Ａは任意の適切な用量で投与されてもよい。一実施形態において、化合物Ａは体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ〜約１ｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約２００ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜約５００ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜約１００ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇ〜約２００ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇ〜約１００ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは体重１ｋｇ当たり約２５ｍｇ〜約１５０ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは体重１ｋｇ当たり約５０ｍｇ〜約１００ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは体重１ｋｇ当たり約５５ｍｇ〜約１００ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは体重１ｋｇ当たり約１ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは体重１ｋｇ当たりの約５ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは体重１ｋｇ当たり約５０ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは体重１ｋｇ当たり約１００ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは約０．１ｍｇ〜約１ｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは約０．５ｍｇ〜約５００ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは約１ｍｇ〜約１００ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは約５ｍｇ〜約５０ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは約５ｍｇ〜約３０ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは約５ｍｇ〜約２０ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは約１ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは約５ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは約１０ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは約２０ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは約３０ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは約４０ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは約５０ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは約１００ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、化合物Ａは約２００ｍｇの用量で投与される。上記の用量は化合物Ａを投与するあらゆる方法に適し、特に経口投薬に適している。
【００４２】
化合物Ａは任意の適切なスケジュールに従って上記の用量で投与されてもよい。化合物Ａの投薬量は一定であるか、または投薬スケジュールの範囲内で変化されるかであり得る。（ａ）所望のバイオマーカの変化が観察されない場合、または（ｂ）顕著な薬物関連毒性が観察される場合でなければ、化合物Ａの用量は、スケジュールの間、一定のレベルで維持されてもよく、（ａ）の場合には、次の用量が例えば約２０％〜３０％だけ増加させられることができ、（ｂ）の場合には、次の用量が例えば約２０％〜３０％だけ減少させられることができる。適切な化合物Ａのスケジュールは典型的には月一回の投薬から一日に複数回の投薬の範囲である。好適な実施形態において、化合物Ａは一日一回投与される。別の実施形態において、化合物Ａは週一回投与される。別の実施形態において、化合物Ａは一日に二回投与される。別の実施形態において、化合物Ａは一日に三回投与される。別の実施形態において、化合物Ａは一日に四回投与される。
【００４３】
１つ以上の追加の狼瘡処置を化合物Ａの投与と組み合わせて使用することができる。こうした処置は狼瘡薬剤を含み、狼瘡薬剤は、グルココルチコイド、ヒドロキシクロロキン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、アザチオプリン（ＡＺＡ）、およびシクロホスファミド（ＣＴＸ）を含むが、それらには限定されない。これらの薬剤の適切な用量は当該分野において周知である。
【００４４】
材料および方法
動物
狼瘡になりやすい６週齢のメスのＭＲＬ／ｌｐｒ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ、第０００４８５号）のマウスと狼瘡になりにくい対照のＭＲＬ／Ｍｐｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ、第０００４８６号）のマウスとを生後６週間でＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（メイン州Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ）から取得した。ＳＬＥになりやすい自然発症ＮＺＢＷＦ１／Ｊ（ＮＺＭ）（カタログ番号第１００００８号）のメスのマウスと（実験の時間からの範囲内で）狼瘡になりにくいＮＺＷ／ＬａｃＪ（カタログ番号第００１０５８号）のメスのマウスとを生後１５週間でＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（メイン州Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ）から取得した。全てのマウスを２４時間の明暗周期で維持し、食料や水を自由裁量で入手可能にした。全ての実験動物の手順は、Ｃｅｐｈａｌｏｎ，ＩｎｃのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）の規制、承認されたＩＡＣＵＣプロトコルの第０３−０４０号および第０３−０３−０４１号によって承認され、そしてそれらに従った。
【００４５】
ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、一次リンパ組織と二次リンパ組織とにおける自己反応性Ｔ細胞および自己反応性Ｂ細胞の適切なアポトーシスを妨げる不活性Ｆａｓ分子（中枢性寛容機構と末梢性寛容機構との両方における欠陥）によって迅速なリンパ増殖性疾患にかかる。この障害のある寛容機構により、末梢に入る全Ｔ細胞および全Ｂ細胞のうちの一定の割合が、自己タンパク質／組織に反応する可能性が高いので、若年期に自己免疫を起こす。ＭＲＬ／ｌｐｒモデルのマウスはいくつかの慢性炎症疾患の様な症状にかかり、それらは、抗核抗体の発生、関節炎、皮膚科的兆候、タンパク尿をもたらし最終的に死をもたらす免疫複合体媒介性糸球体腎炎を含む早期狼瘡および末期狼瘡の特性である。あまり特徴付けられていない現象はＣＮＳおよび心臓の症状であり、それらの両方ともヒトにおいてはより一般的である。これまでの最適化の研究や妥当性の研究が、疾患は罹患したＭＲＬ／ｌｐｒ動物だけに現れ、対照マウスであるＭＲＬ／Ｍｐには現れないことと、抗核抗体（ＡＮＡ）が第４週から第１２週の間に迅速に形成し、第１８週から第２５週程度でループス腎炎の発症をもたらし、タンパク尿が存在することとを明らかに示した。致死率はメスにおいて高く、生後約２５週間で生じ、直腸疾患は、糸球体腎炎、糸球体浸潤物、硬化症、および血管炎を含む。皮膚炎と関連付けられる脾腫とリンパ腺腫との両方もまた観察されることができる。
【００４６】
ＮＺＭ種は遺伝的な進行性全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）のマウスモデルとして働く。ＮＺＭマウスにおける疾患の展開は異常なポリクローナルＢ細胞活性によって特徴付けられ、ＤＮＡや他の核抗原に対する自己抗体、および細胞骨格タンパク質に対する自己抗体を含む様々な自己抗体を多く作り出す。循環する免疫複合体の増加が高齢のマウスにおいて致命的な糸球体腎炎をもたらし得る。
【００４７】
化合物Ａ
化合物Ａを以下で記載される５工程の方法と類似した方法で調製した（国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／３７３６３号の実施例３５を参照されたい）。
【００４８】
工程１：メタノール（約２５ｍＬ）中の１−（３−ブロモ−フェニル）−ピペラジン（約１ｇ）と酢酸（約０．４ｍＬ）との溶液に水／メタノール中で３７％のホルムアルデヒド（約５６．７：３７：６．３、水：ホルムアルデヒド：メタノール、約５ｍＬ）を添加する。混合物を約１８時間室温で攪拌する。懸濁液を氷／水浴中で約５℃に冷却し、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム（約５ｇ）を小分けにして添加する。混合物を攪拌して約１８時間室温まで温める。混合物を飽和含水塩化アンモニウム（約２００ｍＬ）の中にゆっくりと注ぎ、約１時間攪拌する。混合物をジクロロメタンで抽出する（約７５ｍＬで３回）。組み合わされた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過して蒸発させる。１−（３−ブロモ−フェニル）−４−メチル−ピペラジンを淡黄色油（約１ｇ）として生じさせるように、材料を約１８時間高真空下に置く。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ，ｐｍ）：７．１０（ｄｄ，＝８．２，８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．０４（ｄｄ，Ｊ＝２．１，２．１Ｈｚ，１Ｈ），６．９５（ｄｄｄ，Ｊ＝７．８，１．７，０．７Ｈｚ，１Ｈ），６．８３（ｄｄｄ，Ｊ＝８．３，２．４，０．６Ｈｚ，１Ｈ），３．２３−３．１８（ｍ，４Ｈ），２．５８−２．５４（ｍ，４Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ）．ＭＳ＝２５５，２５７（ＭＨ）＋。
【００４９】
工程２：１，４−ジオキサン（約１００ｍＬ）中の３−ブロモ−ピリジン−２−イルアミン（約１０ｇ）の溶液にエトキシカルボニルイソチオシアネート（約７ｍＬ）を滴下添加する。混合物を約１８時間窒素雰囲気の下で攪拌する。揮発性物質を蒸発させて、ろう様固体を生じさせる。回収した材料をヘキサン（約２５０ｍＬ）で圧潰する。Ｎ−（３−ブロモ−２−ピリジニル）−Ｎ’−カルボエトキシ−チオ尿素を単離し、さらに精製することなく使用する。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，（Ｄ３Ｃ）２ＳＯ，δ，ｐｐｍ）：１１．４６（ｓ，１Ｈ），１１．４３（ｓ，１Ｈ），８．４９（ｄｄ，Ｊ＝４．６，１．５Ｈｚ，１Ｈ），８．１８（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．５Ｈｚ，１Ｈ），７．３３（ｄｄ，Ｊ＝８．０，４．７Ｈｚ，１Ｈ），４．２３（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．２７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）．ＭＳ＝２１５（ＭＨ）＋。
【００５０】
工程３：メタノール（約７０ｍＬ）とエタノール（約７０ｍＬ）との混合物中のヒドロキシルアミンヒドロクロリド（約１７ｇ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（約２６ｍＬ）との攪拌した懸濁液にＮ−（３−ブロモ−２−ピリジニル）−Ｎ’−カルボエトキシ−チオ尿素を添加する。混合物を室温で約２時間攪拌して約１８時間約６０℃に加熱する。懸濁液を室温まで冷却し、濾過し、そしてメタノールですすぎ、水ですすぎ、それからメタノールですすぐ。８−ブロモ−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−２−イルアミンをオフホワイト固体（約８ｇ）として単離する。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，（Ｄ３Ｃ）２ＳＯ，δ，ｐｐｍ）：８．５８（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７３（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．８０（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），６．２５（ｓ，２Ｈ）．ＭＳ＝２１３，２１５（ＭＨ）＋。
【００５１】
工程４：オーブン乾燥チューブを酢酸パラジウム（約０．２ｇ）とトリフェニルホスフィン（約０．６ｇ）で満たす。チューブを高真空下から取り除き、約５分間窒素流の下でバックフラッシュする。１，４−ジオキサン（約１０ｍＬ）などの適切な溶媒を添加し、混合物を適切な時間（例えば、約１０分間）窒素の下で攪拌する。８−ブロモ−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−２−イルアミン（約０．７５ｇ）と、（４−メチルスルホニルフェニル）ボロン酸（約１ｇ）と、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（約１０ｍＬ）などの適切な溶媒と、水（約１０ｍＬ）中で約１．５Ｍの炭酸ナトリウムなどの適切な塩基とを添加する。窒素の下で約２分間室温で混合物を攪拌して、チューブをシールし、約１８時間約８０℃で加熱した。混合物を丸底フラスコに移し、揮発性物質を減圧下で蒸発させる。製品を適切な方法で単離する。例えば、水（約１００ｍＬ）を添加して混合物を攪拌してもよい。次に濾過によって固体を収集し、選択的に水ですすぎ、空気乾燥させ、エーテル／ジクロロメタン（約４：１、約１０ｍＬ）で圧潰し、濾過してエーテルですすいでもよい。８−（４−メタンスルホニル−フェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−２−イルアミンを黄褐色固体（約０．６ｇ）として単離する。ＭＰ＝２３６〜２３９℃。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，（Ｄ３Ｃ）２ＳＯ，δ，ｐｐｍ）：８．６３（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），８．３８（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），８．０３（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ）  ７．０３（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），６．２１（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），３．２８（ｓ，３Ｈ）．ＭＳ＝２８９（ＭＨ）＋。
【００５２】
工程５：オーブン乾燥チューブに酢酸パラジウム（約１０ｍｇ）と、２，２’−ビス−ジシクロヘクシルホスファニル−ビフェニル（約３０ｍｇ）と、８−（４−メタンスルホニル−フェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−２−イルアミン（約７５ｍｇ）、１−（３−ブロモ−フェニル）−４−メチル−ピペラジン（約８０ｍｇ）、炭酸セシウムなどの適切な塩基（約２７０ｍｇ）と、１，４−ジオキサンなどの適切な溶媒（約５ｍＬ）を添加する。チューブを取り外し、窒素で三回バックフラッシュする。チューブをシールし、約７２時間８０℃で加熱する。混合物を室温まで冷却し、製品を適切な方法で単離する。例えば、冷却した混合物をジクロロメタン（約１０ｍＬ）で希釈し、珪藻土のプラグを通して濾過し、ジクロロメタンですすぎ、蒸発させてもよい。次に、例えばＩＳＣＯ自動生成装置（例えば、アミン変性シリカ・ゲル・カラムでは、ヘキサン中で５％から１００％のエチルアセテート）を使用して、例えば、クロマトグラフィを介して材料を精製してもよい。［８−（４−メタンスルホニル−フェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−２−イル］−［３−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−フェニル］−アミン（すなわち、化合物Ａ）を黄色固体（約０．０７ｇ）として単離する。ＭＰ＝２３２〜２３４℃。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ，ｐｐｍ）：８．４９（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．２（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．３８（ｓ，１Ｈ），７．２７−７．２０（ｍ，１Ｈ），７．０４−６．９５（ｍ，２Ｈ），６．８４（ｓ，１Ｈ），６．６０（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３０−３．２５（ｍ，４Ｈ），３．１０（ｓ，３Ｈ），２．６３−２．５８（ｍ，４Ｈ），２．３８（ｓ，３Ｈ）．ＭＳ＝４６３（ＭＨ）＋。
【００５３】
フローサイトメトリ
フローサイトメトリに使用される抗体は、抗マウスＣＤ１３８−ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）と、抗マウスＣＤ１９−ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）と、抗マウスＣＤ３８−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）と、抗マウスＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０−Ｃｙｃ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）と、ラットＩｇＧ１−ＡＰＣアイソタイプ対照（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）と、ラットＩｇＧ２ａ−ＰＥアイソタイプ対照（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）とから成った。ＡｃｃｕｒｉＣ６フローサイトメータを使用して全てのサンプルを分析した。全てのＥｌｉｓｐｏｔ実験に対する脾細胞のエキソビボ培養を含む全ての実験に対して完全培地を使用した。完全培地は、ＲＰＭＩ１６４０（Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）に加えて、１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）、１％のＬ−Ｇｌｎ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）、１％のＮＥＡＡ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）、β−ＭＥ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）に加えて、１０％のＦＢＳ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から成った。
【００５４】
先に公開された報告書（Ｎｅｕｂｅｒｔ、Ｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００８）において使用されたように、洗浄したＲＣＢ溶解脾細胞を形質細胞マーカの目的で染色した。本明細書において使用される場合、「形質細胞」という用語は下記の免疫表現型の定義を指す。ＭＲＬ／ｌｐｒモデルに対する生きたＣＤ１９陰性、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０陰性、ＣＤ１３８陽性、ＣＤ３８陽性の結果として形質細胞を定義した。チューブ／サンプル当たりで合計２００，０００〜５００，０００の結果を収集した。不充分なサンプルは骨髄における形質細胞の決定を限定した。フロー染色プロトコルは以下の通りであった。簡潔に言うと、完全培地（上で定義済み）と、抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣ抗体、抗ＣＤ３８−ＰＥ抗体、抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０−Ｃｙｃ抗体、および抗ＣＤ１３８−ＡＰＣ抗体を有する２．５μｇの抗ＣＤ１６／ＣＤ３２（ＦｃＢｌｏｃｋ）とに細胞を懸濁した。氷の上での染色後２０分で、サンプルを洗浄して固定した。以下で記載される通り、整合した適切なアイソタイプを用いて全てのサンプルを複製した。
【００５５】
血清サイトカインサンプルのＬｕｍｉｎｅｘ分析
サイトカイン分析のための血清サンプルの処理のために、−８０℃の凍結した血漿を氷上で解凍し、ボルテックスし、デブリや凝集物を取り除くために１０分間遠心分離した。製造元の指導に従ってＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイのために合計２５μＬ〜５０μＬの血清を使用した。マウスサイトカイン１０−ｐｌｅｘビーズキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ、第ＬＭＣ０００１号）を使用して１０種類の異なるマウスサイトカインを測定した。簡潔に言うと、２００μＬの洗浄溶液（キットの構成要素）でフィルタプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、メイン州Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、第ＭＡＩＰＳＷＵ１０号）を事前に濡らし、ウェルごとに２５μＬのビーズを添加した。血清サンプルを希釈し、５０μＬの合計量（すなわち、製造元によって提供されるような２５μＬのアッセイ希釈剤に加えた２５μＬのサンプル血清）をウェルごとに添加した。ビーズを有するプレートを暗闇でオービタルシェーカ上で室温（ＲＴ）で２時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、キットのバッファ中でプレートを二回洗浄し、キットと共に提供されたビオチン希釈剤中に１：１０（１００μＬ）の希釈度で二次ビオチン化抗体を添加した。暗闇で室温で一時間プレートをインキュベートして、キットのバッファ中で二回洗浄した。アッセイ希釈剤中のストレパビジンをウェルごとに１００μＬで添加して、暗闇で室温で３０分インキュベートした。プレートを三回洗浄して、１００μＬのキットの洗浄溶液を添加し、暗闇で室温で２分〜３分間かき混ぜた。データ獲得分析ソフトウェアを有するＬｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰ２００装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、第ＭＡＰ０２００号）上で、このインキュベーション期間の直後にプレートを走らせた。真空マニフォルド装置（Ｐａｌｌ、ミシガン州Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、第５０１７号）を使用して全てのビーズ洗浄を行った。全てのサイトカインＬｕｍｉｎｅｘアッセイに関して、基準に沿った最低点または製造元によって設定された検知の限界を下回る値を範囲外と考え、推測しなかったが、特定のアッセイに対する標準曲線に沿って最低点を想定した。
【００５６】
尿分析
全タンパク質の回収と分析とのために尿サンプルを酸沈殿させた。充分な尿が残されたサンプルをＵｒｉｓｔｉｘ（登録商標）白血球尿分析（ＭＲＬ／ｌｐｒ調査のみ）のために使用した。簡潔に言うと、標準的なタンパク質溶液を正常なマウス血清から調製し、混濁度によるマウスタンパク尿アッセイのための基準として使用した。標準的な調製は以下のとおりであった。０μＬ、５μＬ、１０μＬ、１５μＬ、２０μＬ、３０μＬ、４０μＬ、および５０μＬの、キットにおいて提供された場合、４ｍｇ／ｍＬのマウス血清標準タンパク質溶液を全く同様に２つのカラムに添加した。最終的な量を５０μＬに調節するために個々のウェルにＰＢＳを添加した。尿サンプルの調製のために、卓上微小遠心分離器を使用して３分間９８８０×ｇで尿サンプルを遠心分離した。尿の上清（１μＬ〜５０μＬ）を全く同様に添加した。合計５０μＬに量を調節するためにＰＢＳを添加した。懸濁度アッセイのために、空のカラムの中に２５μＬの０．１ＮのＨＣｌを添加し、テストカラムの中に２５０μＬの３％のスルホサリチル酸を添加した。１０分間室温でマイクロプレートをインキュベートし、４５０ｎｍの単一ビームを有するＥＬＩＳＡリーダを使用してプレートを読み取った。Ｕｒｉｓｔｉｘ（登録商標）ストリップアッセイのために、ストリップを並べてラベル付けした。２０マイクロリットルの尿を各テストストリップの正方形上に配置し、結果を記録する前に少なくとも３０秒インキュベートした。全尿分析プレートに基づいた全てのアッセイに関して、基準に沿った最低点または製造元によって設定された検知の限界を下回る値を範囲外と考え、推測しなかったが、その特定のアッセイに対する標準曲線に沿って最低点を想定した。
【００５７】
組織構造
組織構造分析のために、左腎および肺（ＮＺＭモデルのみ）を各動物から取り出し、オービタルロッカ上で４８時間２５℃で１０％緩衝中性１０％ホルマリン（ＥＭＤ）中に固定して、ｄＨ２Ｏを流して一晩洗浄し、処理する準備が整うまで４℃で７０％エタノール中に保存した。組織構造分析に使用される腎臓染料は、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ&Ｅ）と、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）と、トリクロム染色（Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ペンシルバニア州Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）とを含んだ。病理学者が３つ全ての染色切片を採点の目的で使用した。組織構造の採点の全てが独立委員会の認定を受けた獣医学病理学者によって盲検で行われた（Ｊｕｌｉｅ  Ｅｎｇｉｌｅｓ、ＶＭＤ、ＤＡＣＶＰ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）。得点値を決定するために複数の染料を使用した。図８、図１９、および図２０の画像は、病理学者によって盲検で選択された切片の最も悪い影響を受けた範囲を示す。
【００５８】
腎臓ＩＣ−ＧＮ採点方法（Ｓｍｉｔｈ、Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００７）
１．糸球体細胞充実度−得点１−５：ゼロ、低度、中度、高度、重度
２．糸球体壊死−得点１−５：ゼロ、低度、中度、高度、重度
３．糸球体硬化症−得点１−５：ゼロ、低度、中度、高度、重度
４．間質浸潤−得点１−５：ゼロ、低度、中度、高度、重度
５．尿細管萎縮−得点１−５：ゼロ、低度、中度、高度、重度
６．間質線維症−得点１−５：ゼロ、低度、中度、高度、重度
７．血管炎−得点１−５：ゼロ、低度、中度、高度、重度
特定の病理学者の定義
・「壊死」を示す、糸球体係蹄内の核デブリ／核濃縮の存在によって壊死を定義した。多くのサンプルにおいて、これは糸球体係蹄のほんのわずかの部分だけの非常に軽く珍しい発見であった。ＰＡＳ陽性トリクロム陰性材料の壊死によって糸球体係蹄の消失も考えられた。
【００５９】
・糸球体係蹄または糸球体嚢の中の繊維増殖または線維症の増加によって糸球体壊死を定義した。時には糸球体壊死は糸球体変化の「最終段階」と考えられるが、本明細書においては、糸球体壊死は糸球体「壊死」として「活性」な進行性線維症を示す糸球体壊死として分類される。
【００６０】
・腎尿細管上皮の内腔直径および／または平坦化の増加、または細管の脱落によって尿細管萎縮を分類した。
【００６１】
・炎症性浸潤物として間質浸潤を考えた。
【００６２】
・血管炎−非炎症性（変性／増殖性）の脈管の病状を考慮に入れるためのより緩やかな血管炎の定義。脈管変化の大部分は軽く、平滑筋細胞の増殖と細胞外マトリックスのヒアリン化とによって特徴付けられる「動脈硬化」と考えられることができた。この変化は糸球体の病状に付随する高血圧を反映することがあり得る。非常にわずかの動物において、あきらかな血管炎が存在した。大部分の炎症性の変化は血管壁の範囲内であり、上皮には損傷がほとんどないか、または全くなく、明らかな出血／フィブリンの漏れもなかった。多くの炎症性の変化は繊維芽細胞の血管周囲縁も有する。
【００６３】
薬力学（ＰＤ）分析
１１８日目（ＮＺＭモデル）または９８日目（ＭＲＬ／ｌｐｒモデル）に最後の用量の投与後三時間で脾臓と腎臓とを収集し、冷却したイソペンテンを用いてドライアイス上で急速冷凍し、−８０℃で保存した。溶解した脾臓と腎臓とを下記のプロトコルを使用して処理した。組織抽出試薬Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、第ＦＮＮ００７１号）中のプロテアーゼ・インヒビタ・カクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、第５３９１３６号）とＨａｌｔホスファターゼ・インヒビタ・カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、第７８４２０号）またはＲｏｃｈｅホスファターゼ・インヒビタ・カクテル（Ｒｏｃｈｅ、第０４９０６８３７００１号）とを組み合わせることによって調製した、７００マイクロリットルの「組織抽出バッファ」を各サンプルに添加した。ＰＴ  １０−３５  Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザ（ＶＷＲ、第９７０３６−０８２号）を使用してサンプルを均質化して凍結した。均質化の後、１０分間２０００×ｇで４℃にてサンプルを遠心分離し、１５分間１４，０００×ｇの最高速度で４℃にて上清を再遠心分離した。脂質／脂肪のデブリの上部層を取ることを避けるために注意深く上清を取り除いた。ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、第８３２２８号）を使用してタンパク質濃度を３ｍｇ／ｍｌに調節した。Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）３−ｐｌｅｘビーズキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して脾臓ＪＡＫ／ＳＴＡＴ（ｐＳＴＡＴ１／３／５ａ／ｂ）の活動を分析した。製造元の指示に従って両アッセイを行った。
【００６４】
薬物動態（ＰＫ）分析
化合物濃度を決定するための定量分析のために、血漿サンプル、腎臓サンプル、および脾臓サンプルを提出した。ヘパリン化チューブの中に血液サンプルを収集し、血漿を分離するために遠心分離（１６，０００×ｇ、５分間）するまで氷の上に配置した。分析の間、上清を収集し、−２０℃で保存した。分析の時に、内部標準物質（アルプレノロール）を含有する２つの量の冷たいアセトニトリルを各サンプルに添加し、次に、それらのサンプルをボルテックスし、遠心分離した。上清を取り除き、オートサンプラーバイアルの中に配置し、液体クロマトグラフ／質量分光法（ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ）によってサンプル中に存在する化合物の量を分析した。５ｎｇ／ｍＬ〜２００００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲で連続希釈法を介して行われた、ビヒクルだけ（すなわち、そのテストした種のビヒクルグループに由来するビヒクル対照の脾臓または腎臓のいずれか）の標準曲線（組織特異的）に対してサンプル中の化合物濃度を定量化した。標準曲線の最高点よりも１０％を超えて高い濃度を含むサンプルをアセトニトリルで１：１０に希釈した。血漿、腎臓、および脾臓に対する検知の限界は１０ｎｇ／ｍＬ未満であった。
【００６５】
抗核抗体（ＡＮＡ）ＥＬＩＳＡアッセイ
あつらえて自家作成したＥＬＩＳＡアッセイによって抗ｄｓＤＮＡと抗Ｓｍｉｔｈ抗原抗体との測定を行った。Ｉｎｏｖａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．からクロマチン被覆プレートを購入した。抗ｄｓＤＮＡと抗Ｓｍｉｔｈ  Ａｇ抗体とのそれぞれの検知のための被覆抗原として、精製ウシ胸腺ｄｓＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ、ミシガン州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）または精製ウシＳｍｉｔｈ抗原（ＧｅｎＷａｙ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を使用した。被覆したプレートをホウ酸塩硫酸塩食塩水（ＢＳＳ）で洗浄し、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と０．１％のＴｗｅｅｎ−２０界面活性剤とを含有するＢＳＳでブロッキングした。マウス抗クロマチン抗体（Ｓｉｇｍａ、２Ｂ１）または２５週齢のＭＲＬ／ｌｐｒ血清を使用して標準曲線を生成した。マウス抗ｄｓＤＮＡ抗体（Ａｂｃａｍ、マサチューセッツ州Ｃａｍｒｉｄｇｅ）またはマウス抗Ｓｍｉｔｈ抗原抗体（Ａｂｃａｍ）を各アッセイの基準として使用した。二次抗体をＡｂｃａｍから購入し（ヤギ抗マウスｐＡｂ−ＨＲＰ）、基質をＲｏｃｋｌａｎｄ（ペンシルバニア州Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ）から購入し（ＴＭＢ）、２０ｍＬのｄＨ２Ｏに対して１ｍＬの濃縮硫酸を使用して反応停止バッファを生成した。５７０ｎＭの基準波長を用いて４５０ｎＭで読み取るＶｉｃｔｏｒ−Ｘ４分光光度計を使用して、発色させたプレートを読み取った。全てのＡＮＡ  ＥＬＩＳＡアッセイに関して、基準に沿った最低点または製造元によって設定された検知の限界を下回る値を範囲外と考え、推測しなかったが、その特定のアッセイに対する標準曲線に沿って最低点を想定した。
【００６６】
抗体分泌Ｂ細胞Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ
Ｂ細胞ＥｌｉｓｐｏｔコンポーネントをＭａｂＴｅｃｈ（スウェーデン、Ｎａｃｋａ  Ｓｔｒａｎｄ）に注文し、ニトロセルロースＩＰフィルタプレートをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（マサチューセッツ州Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）に注文した。精製ウシ胸腺ｄｓＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）、精製ウシＳｍｉｔｈ抗原（ＧｅｎＷａｙ）、または溶解したニワトリ赤血球細胞（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ペンシルバニア州Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ）に由来する煮沸し濾過した精製ニワトリクロマチンのいずれか１０μｇ／ｍＬでＥｌｉｓｐｏｔウェルを被覆した。ガラス均質化を使用して脾臓を処理し、６０μｍの滅菌細胞ストレーナを通して濾過し、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）溶解バッファを使用して赤血球細胞（ＲＢＣ）を溶解した。処理した脾細胞を培養培地の各ウェルに添加した。抗体を分泌する細胞種（ＡＳＣ）の正確な生体外個体数の非対称性を回避するために、ポリクローナルミトゲン様ＬＰＳで細胞を刺激しなかったが、本物の生体外抗体放出のモニタリングを可能にするように培地のみでインキュベートした。全てのＩｇＧ産出ＡＳＣに対する陽性対照として、抗マウスｐａｎ−ＩｇＧを使用し、結果を正規化するために使用した。各モデルに対する初期テスト段階で各抗原に対する個体数を同定した。クロマチンおよび全ＩｇＧのみに関しては、各ウェルに３０，０００個の脾細胞を添加した。Ｓｍｉｔｈ抗原およびｄｓＤＮＡに関しては、各ウェルに５００，０００個の細胞を添加した。ウェルごとの点出現率の飽和限界により、異なる抗原に対して異なる数の脾細胞を添加した。これらの制約は以前に確立された。Ｂ細胞Ｅｌｉｓｐｏｔを３７℃で一晩インキュベートした。各アッセイを展開するために、各ウェルに二次抗体を添加し、インキュベートし、洗浄し、アルカリ性ホスファターゼストレパビジンを共役体として使用し、使用した基質はＢＣＩＰ−ＮＢＴだった。点が見えるまでプレートを発色させた。Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  Ｃ．Ｔ．Ｌ．スキャナおよびＢｉｏｓｐｏｔソフトウェア（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．、オハイオ州Ｓｈａｋｅｒ  Ｈｅｉｇｈｔｓ）を使用して全てのＥｌｉｓｐｏｔ分析を行った。培地と細胞とだけのウェルを減じた値として結果を示した。
【００６７】
統計分析
Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０ソフトウェアを使用して全ての統計を行った。両側Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙまたはペアスチューデントｔ−検定（生存データ）（図面の説明で述べられている場合）のいずれかを使用して、研究終了時分析を行った。時間の経過に伴う変化を示すグラフに関して、グループ間で比較するために一次元配置分散分析を使用した。比較のためのグループ間の割合変化に関して、研究終了時測定に関して特に断りがない場合には、割合の差に関してビヒクルと比較して各パラメータに対して濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を決定した。
【００６８】
（実施例）
【実施例１】
【００６９】
化合物ＡはＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおいて狼瘡を効果的に処置する
プロトコル
ＭＲＬ／ｌｐｒマウスを最初に無作為化し、初期出血を収集し、ベースライン測定のために体重を記録した（図１）。全ての個々のマウスの耳にタグ付けし、実験全体を通してモニタリングした（例えば、グループ番号−ケージの文字−マウス番号、したがって、「３Ｂ５」＝グループ３（Ｇ３）、ケージＢ、マウス番号５）。マウスは同齢であり、６週齢から８週齢で処置を開始した。ほおの出血および尿の収集を実験全体を通して毎週続けた。サイトカインやＡＮＡのレベル、タンパク尿、体重、リンパ腫、一般的な健康状態、および死亡率を含むいくつかのパラメータに関してマウスを個々に追跡した。死亡率を除いた全てのパラメータを２カ月ごとに評価し、死亡率は毎日モニタリングした。全てのグループはグループごとで少なくとも１０匹から１２匹の最小数から成る。生体外実験は、形質細胞、血清補体Ｃ３、およびＡＮＡのレベルに関するフローサイトメトリ分析と、タンパク尿および白血球と、血清サイトカインのプロファイリングと、腎臓の組織変化と、化合物レベル（脾臓、腎臓、血漿における薬物動態（ＰＫ））の決定とを含んだ。マウスを個々に追跡した。全てのデータに関して、マウスを集団にグループ分けし、平均±標準誤差としてデータをグラフ化した。死亡率を除き、２カ月ごとの観察と収集したデータとを各グループに関して記録した。死亡率は毎日観察した。材料および方法の節（上記）と図１とに記載される通り、最終段階の読み取った情報を分析した。化合物Ａを用いた処置に関して、８週齢から１１週齢まで一日二回（ｂ．ｉ．ｄ．）経口（ｐ．ｏ．）で提供された（すなわち、１００ｍｇ／ｋｇの用量に関して、午前中に１００ｍｇ／ｋｇを動物に投与し、午後に１００ｍｇ／ｋｇを動物に投与した）１％のＤＭＳＯに加えてＰＥＧ４００中に懸濁された化合物Ａでマウスを処置して、１１週齢から１８週齢まで処置することなく休み、２１週齢まで残りの三週間の間用量を一日二回経口で提供される化合物Ａ薬物処置を再び開始した。標準的治療は週三回腹腔内に１．５ｍｇ／ｋｇで提供されるデキサメタゾン（ＤＥＸ）を含んだ。ビヒクルは化合物Ａ薬物処置と同時に一日二回経口で与えられるＰＥＧ４００＋１％のＤＭＳＯであった。このモデルに対する組織保持の薬物動態分析が図２で見ることができる。図２に関して注目すべきことは、腎臓内の化合物Ａのレベルは血漿曝露レベルと同様であったことである。これは腎臓が狼瘡における疾患の病状に関する重要な部位であるので重要である。
【００７０】
リンパ腫、脾腫、および白血球数
化合物Ａで処置されたＭＲＬ／ｌｐｒマウスは５５ｍｇ／ｋｇの用量と１００ｍｇ／ｋｇの用量とに対してリンパ腫の低下を示したが、３０ｍｇ／ｋｇの用量ではリンパ腫の低下を示さなかった（１００ｍｇ／ｋｇと５５ｍｇ／ｋｇとに対して１００％がリンパ腫を伴わず、ビヒクルに対しては０％であった。ｐ<０．０５）（図３）。化合物Ａで処置されたＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、ビヒクルと比較して、１００ｍｇ／ｋｇの用量と５５ｍｇ／ｋｇの用量（それぞれ、ｐ<０．００１およびｐ<０．０５）とにおいて脾腫（すなわち、脾臓質量）を示した（ビヒクルに対して、５５ｍｇ／ｋｇに対して４９．４％の減少および１００ｍｇ／ｋｇに対して７４．１％の減少）（図４、上側のパネル）。１００ｍｇ／ｋｇにおいて、化合物Ａは非狼瘡の対照動物のレベル（ＭＲＬ／Ｍｐ、９８ｍｇ）まで脾臓質量を減少させた（図４、上側のパネル）。化合物Ａで処置されたＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、５５ｍｇ／ｋｇの用量と１００ｍｇ／ｋｇの用量との両方において（ｐ<０．０５）、ビヒクルと比較して総白血球数の減少を示した、非狼瘡ＭＲＬ／Ｍｐ動物ほど少なくはならなかった（図４、下側のパネル）。
【００７１】
これらの結果は、脾腫（脾臓膨脹）と、リンパ腫（リンパ節膨脹）と、Ｔ細胞およびＢ細胞の過剰増殖とが、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける狼瘡疾患を示すので重要である。したがって、全体的なリンパ球の数の減少、したがって、脾臓やリンパ節のサイズの減少は、化合物Ａが処置の間に全身の自己免疫反応を部分的に制御することを示す。さらに、脾臓質量と総細胞数とは非狼瘡の歴史的対照よりも下には落ちなかったという事実は、化合物Ａが完全なＪＡＫキナーゼの遮断から予期され得る明白な免疫抑制を引き起こさなかったことを示唆する。したがって、化合物Ａは好ましくない副作用を伴うことなく所望の治療効果を提供する点で有利である。
【００７２】
忍容性
化合物Ａで処置されたＭＲＬ／ｌｐｒマウスは顕著な体重変化を示さなかった（図５）。テストした各用量に関して、明白な毒性を観察せず、体重は実際に増加し、ビヒクルと比較して、全体的な健康の改善を示唆した。
【００７３】
ＩＬ−１２
化合物Ａで処置されたＭＲＬ／ｌｐｒマウスは８週齢から１１週齢の処置段階の間と１８週齢から２１週齢の処置段階の間とでＩＬ−１２サイトカインのレベルの降下を示したが、処置の休業日の間と１２週齢から２０週齢の間とでＩＬ−１２サイトカインのレベルの上昇を示した（図６、＊ｐ<０．０５、＊＊p<０．０１、ビヒクルと比較して、１００ｍｇ／ｋｇに対して５６．１％の減少および５５ｍｇ／ｋｇに対して５０．７％の減少）。
【００７４】
このデータは、化合物Ａが、狼瘡に関与する炎症性サイトカインカスケード、例えばＩＬ−１２を遮断するという結果をサポートするので重要である。
【００７５】
Ｃ３
化合物Ａで処置されたＭＲＬ／ｌｐｒマウスは５５ｍｇ／ｋｇの用量と１００ｍｇ／ｋｇの用量とにおいてビヒクルと比較して血清Ｃ３濃度の顕著な増加を示した（ビヒクルに対して、１００ｍｇ／ｋｇに対して５２．５％の増加および５５ｍｇ／ｋｇに対して５１．４％の増加、ｐ<０．０５）（図７）。
【００７６】
このデータは、血清中のＣ３のレベルが炎症の大きさや程度と間接的に相関するので重要である。ＳＬＥ患者は時間の経過と共にＣ３のレベルおよびＣ４のレベルの減少を示し、これは全身性の炎症の増加を示し、これが組織臓器の損傷をもたらす。しかし、処置を伴うと、これらの要素は元に戻り、処置が全身性の炎症を減少させるので疾患を効果的に処置することを示す。したがって、血清Ｃ３の増加は狼瘡疾患の消散や処置を示す（Ｂｏｕｍｐａｓ、Ｆｕｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。
【００７７】
ループス腎炎
末期のループス腎炎を組織病理学によって評価し、疾患のある動物における腎臓の全損傷の評価のために委員会が認定した病理学者によって採点した（図８、表１）。化合物Ａで処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、デキサメタゾン処置グループとビヒクル処置グループとの両方と比較して、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ&Ｅ）で染色した腎臓切片における細胞浸潤／糸球体腎炎と糸球体のサイズとの両方の減少を示した（図８）。化合物Ａで処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、デキサメタゾンと同様に、１００ｍｇ／ｋｇの用量において、ビヒクルと比較して、糸球体細胞充実度の顕著な減少（３３．３％の減少、ｐ<０．０１）と、間質浸潤の顕著な減少（４０％の減少、p<０．０１）と、血管炎の顕著な減少（４６．１％の減少、ｐ<０．０１）を示した（表１）。５５ｍｇ／ｋｇの用量において、化合物Ａはビヒクルと比較して間質浸潤を減少（３３．３％の減少、ｐ<０．０５）させた（表１）。
【００７８】
これらの結果は、化合物Ａを用いたＭＲＬ／ｌｐｒマウスの処置が狼瘡に罹りやすいマウスにおけるループス腎炎の発達を遅くすることおよび／または防ぐことができることを示すので重要である。
【００７９】
表１．ＭＲＬ／ｌｐｒの腎臓の得点（得点の等級：０〜５、平均±標準偏差）
【００８０】
【表１】
0006033230.tif 000003
【００８１】
薬力学
リン酸化ＳＴＡＴ−３（ｐＳＴＡＴ３）の阻害をＪＡＫ２インヒビタの下流薬力学（ＰＤ）マーカとして使用した。１４７日齢（研究の９１日目）の研究終了時（ＥＯＳ）における薬物の最終投薬の４時間後に、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおいて、５５ｍｇ／ｋｇの用量の化合物Ａと１００ｍｇ／ｋｇの用量の化合物Ａとの両方に対して腎臓ｐＳＴＡＴ３の顕著な減少を観察した（図９）。
【００８２】
このデータは、化合物Ａが、狼瘡にとって特に重要な場所、すなわち腎臓においてＪＡＫ２を効果的に阻害していたことを示すので重要である。
【００８３】
形質細胞
化合物Ａで処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウスはビヒクルと比較して１００ｍｇ／ｋｇの用量において脾臓形質細胞の減少（６５．５％の減少、ｐ<０．０１）を示した（図１０）。化合物Ａで処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウスはビヒクルと比較して１００ｍｇ／ｋｇの用量において脾臓における抗クロマチン抗体分泌細胞（ＡＳＣ）の出現率の減少（８９．１％の減少、ｐ<０．００１）を示した（図１１）。
【００８４】
このデータは、形質細胞が自己抗体を生成する能力を有し、長命形質細胞がヒトにおける継続的な狼瘡の発症の根本的な原因の１つであると考えられるので重要である（Ｅｓｐｅｌｉ、Ｂｏｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．；Ｎｅｕｂｅｒｔ、Ｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００８）。長命形質細胞（ＬＬ−ＰＣ）は主に骨髄（ＢＭ）に存在するが、炎症の部位において脾臓で見つけることもでき、シクロホスファミドに対して耐性があることで公知であり、ループス腎炎を処置するために認められた一治療法である（Ｃｈｅｖｒｉｅｒ、Ｇｅｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００９）。
【実施例２】
【００８５】
化合物ＡはＮＺＭマウスにおいて狼瘡を効果的に処置する
プロトコル
合計で７カ月または２１０日間、ループス腎炎の研究のために、同齢のメスのＮＺＭマウスまたはＮＺＷ／ＬａｃＪマウスを成熟させた。その期間、タンパク尿の検知のために尿を収集した。光学密度に基づいた総合的タンパク質沈殿アッセイによって決定した場合に０．５ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌのタンパク尿を有し、スティックアッセイによって決定されるような３０ｍｇ／ｄｌ〜３００ｍｇ／ｄｌのタンパク質に関して照合確認したマウスをタンパク尿陽性と考え、研究の開始のために選択した。タンパク尿陽性動物のガウス分布を含むようにグループを正規化して（すなわち、１／３の低度タンパク尿、１／３の中度タンパク尿、１／３の高度タンパク尿）、耳に印を付け、尿や血清の収集を含むベースライン測定を行う前にグループ間で無作為化した。全個体数から合計５匹のマウスをベースライン腎臓組織構造評価のために無作為に選択した。各グループに対する処置やテストは図１２に記載される。簡潔に言うと、グループごとに最小で１０匹のマウスを用いて、化合物Ａを１００ｍｇ／ｋｇまたは５５ｍｇ／ｋｇで一日二回経口で投与した。標準的治療のために、シクロホスファミド（ＣＴＸ）を週一回５０ｍｇ／ｋｇで腹腔内に提供し、デキサメタゾンを週三回１．５ｍｇ／ｋｇで腹腔内に提供した。ビヒクルは３％のＤＭＳＯと１０％のＳｏｌｕｔｏｌと８７％のＰＢＳとを含んだ。２１２日齢に処置を開始し、一部のマウスは処置のすぐ後に死んだが、投薬の時間からのグループ全体のサイズと比較して、健康状態に関わらず全ての動物を数えた。末期のループス腎炎を組織病理学によって評価し、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌによって記載された採点方法（Ｓｍｉｔｈ、Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００７）を使用して、疾患のある動物における腎臓損傷全体の評価のために委員会の認定を受けた病理学者によって採点した。関連する図に示される全てのグラフは、「処置の開始」として０日目を示すので、２１２日齢を表すことに留意することが重要である。９８日目または「処置／研究の終了」はＮＺＭ動物に対する３１０日齢を表す。全てのグラフが「研究の日」として時間を示し、研究の日は２１２日齢に開始し３１０日齢に終了する。
【００８６】
生存率
化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスは５５ｍｇ／ｋｇの用量と１００ｍｇ／ｋｇの用量とにおいてビヒクルと比較して生存率の顕著な増加を示した（研究終了時において、１００ｍｇ／ｋｇに対して７０％の生存率、５５ｍｇ／ｋｇに対して９０％の生存率、p<０．０１）。生存率は標準的治療薬ＣＴＸ（研究終了時において、７０％の生存率、ｐ<０．００１）に匹敵した（図１３）。ＭＭＦおよびアザチオプリンと共に、シクロホスファミドがループス腎炎に苦しむ患者に対する現在の処置の選択肢である。なぜならば、シクロホスファミドはタンパク質免疫抑制剤として働くからである。しかしながら、シクロホスファミドの深刻な副作用により、シクロホスファミドは最も重篤な症状の場合においてだけ使用される。
【００８７】
抗核抗体（ＡＮＡ）
化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスは疾患の経過全体を通して血清抗ｄｓＤＮＡ  ＡＮＡの全体的なレベルの減少を示した（ビヒクルと比較して、１００ｍｇ／ｋｇに対して７３．９％の減少および５５ｍｇ／ｋｇに対して６７．０％の減少、p<０．０１）。化合物Ａによる抗ｄｓＤＮＡ  ＡＮＡの減少は標準的治療薬ＣＴＸ（ビヒクルと比較して、６５．３％の減少、ｐ<０．００１）と同等であった（図１４）。化合物Ａ（およびＣＴＸ）での処置はまた抗ｓｍｉｔｈ抗原ＡＮＡ（ｐ<０．０５）をも顕著に減少させた（図１５）。
【００８８】
このデータは、抗ｄｓＤＮＡ抗体の存在が狼瘡の好ましくない予後と関連付けられ、進行しているループス腎炎、多くの場合には致命的なループス腎炎と非常に関連付けられるので重要である（Ｅｇｎｅｒ、２０００；Ｋｉｓｓ、Ｌａｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００９）。
【００８９】
ＩＦＮα
化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスは、ビヒクルと比較して、中程度であるが顕著な血清ＩＦＮαの減少を示した（１００ｍｇ／ｋｇに対して７３．２％の減少および５５ｍｇ／ｋｇに対して７０．２％の減少、ｐ<０．０５）（図１６）。どちらの標準的治療薬（すなわち、ＣＴＸまたはＤＥＸ）も顕著な減少を示さなかった。
【００９０】
このデータは、Ｉ型ＩＦＮサイトカイン、すなわちＩＮＦαが狼瘡の発病と非常に関連があり、ヒトにおける狼瘡の発症に導くサイトカインの最も早いバーストのうちの１つである（Ｎｉｅｗｏｌｄ、Ｈｕａ  ｅｔ  ａｌ．、２００７）ので重要である。実際、狼瘡患者において循環するＩＮＦαを中和するためにＩＮＦαを特異的に標的化する狼瘡治療が現在開発されている（例えば、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ、ＭＥＤＩ−５４５）。狼瘡患者におけるこの「ＩＦＮαの痕跡」の減少がテストした実験薬の有効性を決定する際に使用される１つのバイオマーカである（Ｓｏｚｚａｎｉ、Ｂｏｓｉｓｉｏ  ｅｔ  ａｌ．）。
【００９１】
タンパク尿
化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスは、ビヒクルに対して、５５ｍｇ／ｋｇと１００ｍｇ／ｋｇとの両方の処置グループに対して疾患の経過全体にわたって総タンパク尿の顕著な減少を示した（ビヒクルと比較して、それぞれ、７６．２５％の減少および８１．８％の減少、ｐ<０．００１）（図１７）。その減少は標準的治療薬ＣＴＸ（６７．１％の減少、ｐ<０．００１）に匹敵した。各処置グループにおける個々のマウスに対するデータが図１８Ａ〜図１８Ｅに示される。化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスはＤＥＸまたはビヒクルと比較してタンパク尿の減少を示し（例えば、反応の大きさや持続時間があまり変化しない）、ＣＴＸに匹敵した。化合物Ａでの処置は同齢の非狼瘡対照マウスのタンパク質よりも下までタンパク質レベルを下げた（図１７、点線）。
【００９２】
これらの結果は、タンパク尿（尿タンパク質）の増加がループス腎炎と関連付けられる腎臓損傷の直接的な結果であるので重要である。さらに、化合物Ａが歴史的非狼瘡対照動物のレベルよりも下までタンパク尿レベルを減少させるという事実は、化合物Ａが病気の進行から動物を単に守るだけでなく、狼瘡疾患を実際に後退させていることを示す。
【００９３】
糸球体腎炎、肺損傷
化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスはビヒクルと比較して５５ｍｇ／ｋｇの用量と１００ｍｇ／ｋｇの用量とにおいて糸球体細胞充実度の減少を示した（それぞれ５９．３％の減少および５６．２％の減少、ｐ<０．００１）（表２）。５５ｍｇ／ｋｇの用量と１００ｍｇ／ｋｇの用量とにおける化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスはビヒクルと比較して間質性繊維症および血管炎の減少を示した（それぞれ、５８．３％の減少および８．３％の減少、ｐ<０．０５）（表２）。化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスは、疾患に罹っていないＮＺＷ／ＬａｃＪの親の同齢の対照のマウスに匹敵する腎臓の病状の減少を示した（図１９）。５５ｍｇ／ｋｇの用量と１００ｍｇ／ｋｇの用量とにおける化合物Ａ（およびＣＴＸ）で処置されたＮＺＭマウスはデキサメタゾンおよびビヒクルで処置された動物と比較して肺浸潤物を防いだ（図２０）。
【００９４】
表２．ＮＺＭ腎臓の得点（得点の等級：０〜５、平均±標準偏差）
【００９５】
【表２】
0006033230.tif 000004
【００９６】
このデータは、糸球体細胞充実度と間質性線維症と血管炎とが狼瘡と関連付けられる糸球体腎炎の指標であるので重要である。化合物Ａがこれらの要素の増加を防ぐだけでなく、７カ月のベースラインＮＺＭマウスと比較して、それらの要素を減少させることもできたという事実は、化合物Ａが疾患の進行から動物を単に守るだけでなく疾患の経過を実際に後退させていることを示す。さらに、肺水腫または肺血管炎および胸膜浸出は、肺炎などの上気道合併症をもたらし得る。化合物Ａが肺血管炎や肺炎を防ぐ能力は本発明の利点である。なぜならば、肺血管炎や肺炎は狼瘡疾患の合併症として一般的であるからである。
【００９７】
薬物動態
薬物動態マーカである蛍光体ＳＴＡＴ３をＪＡＫ２阻害のために使用すると、処置されたマウスの腎臓におけるｐＳＴＡＴ３のレベルはビヒクルまたはＣＴＸのいずれかにおけるレベルよりも顕著に低かった（％変化、ｐ<０．０１）（図２１）。
【００９８】
このデータは、化合物Ａが、狼瘡にとって特に重要な場所、すなわち腎臓でＪＡＫ２を効果的に阻害することを示すので重要である。
【００９９】
サイトカイン
化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスは、ビヒクルと比較して、狼瘡の進行と関連付けられるいくつかのサイトカインの血清レベルの顕著な減少を示した（図２２〜図３１）。例えば、５５ｍｇ／ｋｇの用量の化合物Ａと１００ｍｇ／ｋｇの用量の化合物Ａとは、ビヒクルと比較して、ＩＬ−１２（９９．４％の減少および９９．９％の減少、ｐ<０．００１）（図２２）と、ＩＬ−１７Ａ（７９．１％の減少および８６．２％の減少、ｐ<０．００１）（図２３）と、ＩＬ−６（９８．２％の減少および９７．０％の減少、ｐ<０．００１）（図２４）と、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α（両方の用量に対して９４．５％の減少、ｐ<０．０１）（図２５）と、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０（４７．３％の減少および８０．０％の減少、ｐ<０．０１）（図２６）と、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ（８３．７％の減少および８５．７％の減少、ｐ<０．００１）（図２７）と、ＩＬ−４（９８．７％の減少および９１．８％の減少、ｐ<０．０１）（図２８）と、ＩＬ−１３（８６．２％の減少および７９．５％の減少、ｐ<０．００１）（図２９）と、ＴＮＦα（９２．３％の減少および８８．３％の減少、ｐ<０．００１）（図３０）と、ＫＣ／ＩＬ−８（７８．０％の減少および７２．９％の減少、ｐ<０．００１）（図３１）とを顕著に減少させた。
【０１００】
これらの結果は、これらのサイトカインが、狼瘡患者において評価され、狼瘡による発赤の増加と、その疾患を永続させる自己抗原に対する進行中の免疫反応とに関与するので重要である（Ｃｈｕｎ、Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００７；Ｔｕｃｃｉ、Ｌｏｍｂａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００８）。これらのサイトカインの性質の減少または変性は好ましい利益を患者に提供することができ、疾患の消散の間接的な指標を提供する（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ、Ｔｏｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．、２００１；ＡｒｉｎｇｅｒおよびＳｍｏｌｅｎ、２００４；Ｃｈｕｎ、Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００７；Ｎｉｅｗｏｌｄ、Ｈｕａ  ｅｔ  ａｌ．、２００７；Ｆｕ、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００８；Ｔｕｃｃｉ、Ｌｏｍｂａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００８）。
【０１０１】
脾腫
化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスは、ビヒクルと比較して、研究終了時（ＥＯＳ）の脾臓の総質量の顕著な減少を示した（１００ｍｇ／ｋｇに対して７３．５％の減少および５５ｍｇ／ｋｇに対して７１．８％の減少、ｐ<０．００１）（図３２）。化合物Ａに関して観察された脾臓質量の減少はＣＴＸに匹敵した。
【０１０２】
このデータは、脾腫（脾臓膨脹）がＮＺＭマウスにおける狼瘡疾患を示すので重要である。
【０１０３】
忍容性
化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスはどちらの用量でも体重の変化を示さなかった（図３３）。
【０１０４】
破骨細胞の活動
化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスは、破骨細胞の活動のバイオマーカ（すなわち、Ｉ型コラゲーン架橋ｃ−トリペプチド、ＣＴｘ）を使用して測定すると、骨吸収の顕著な減少を示した（Ｂｏｕｚｉｄ、Ｂａｈｌｏｕｓ  ｅｔ  ａｌ．）。化合物Ａは処置したＮＺＭマウスにおいて血清ＣＴｘのレベルを減少させた（ビヒクルと比較して、１００ｍｇ／ｋｇに対して４６．７％の減少および５５ｍｇ／ｋｇに対して３７．８％の減少、ｐ<０．０１）（図３４）。
【０１０５】
このデータは、化合物Ａが破骨細胞の活動に影響を与え、および／またはＳＬＥなどの慢性炎症性疾患の間の骨再形成に関与するサイトカインに影響を与え得ることを示唆するので重要である。化合物Ａが破骨細胞の活動を減少させる能力は、破骨細胞の活動が狼瘡の間に高められ、このことが、骨の脱塩や全体的な骨質量の損失を引き起こし、骨折、創傷、および関節置換の必要性の増加をもたらすので重要である（ＫａｍｅｎおよびＡｌｅｌｅ）。狼瘡処置に対する標準的治療であるグルココルチコイド、例えば、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、およびプレドニゾンは、この問題を悪化させ、骨芽細胞の活動による破骨細胞の平衡異常を介して骨の損失をさらにもたらし得る（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、２００７）。結果として、骨の脱塩を有する狼瘡患者は骨の損失を回復させるためにビスホスフォネートで処置される場合が多いが、この処置は腎臓系に対して毒性があるので、ループス腎炎を起こしている狼瘡患者を処置する時には逆効果である（Ｂｏｄｙ、Ｄｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）。したがって、化合物Ａが狼瘡を処置すると共に破骨細胞の活動を減少させる能力は、狼瘡に関連する骨の損失を後退させることができ、疾患によって引き起こされる関節の損傷を治療するのを実際に助け得る。
【０１０６】
形質細胞
化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスは、ビヒクルと比較して、１００ｍｇ／ｋｇの用量と５５ｍｇ／ｋｇの用量との両方において脾臓形質細胞の減少を示し（５２．９％の減少および５７．６％の減少、ｐ<０．０５）、化合物Ａによって提供された減少は非狼瘡対照動物と同様であった（５８．４％の減少、ｐ<０．０５）（図３５）。化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスは、１００ｍｇ／ｋｇの用量と５５ｍｇ／ｋｇの用量との両方において、非狼瘡対照マウスのレベルまで、環式ＡＤＰリボースヒドラーゼ、すなわちＣＤ３８の発現の減少を示した（７４．２％の減少および６６．６％の減少、ｐ<０．０５）（図３７）。デキサメタゾンおよびシクロホスファミドの両方もまた脾臓形質細胞のレベルの減少を示したが、減少は顕著ではなかった（図３５）。化合物Ａで処置されたＮＺＭマウスは、シクロホスファミドと同様に、クロマチンに特異的なＡＳＣのレベルの減少を示した（ＣＴＸに対して１００％の減少に対して、５５ｍｇ／ｋｇに対して９７．４％の減少および１００ｍｇ／ｋｇに対して１００％の減少、ｐ<０．０５）（図３６）。
【０１０７】
このデータは、形質細胞は自己抗体を生成する能力があり、長命形質細胞はヒトにおける継続的な狼瘡の発症の根本的な原因のうちの１つであると考えられるので重要である（Ｎｅｕｂｅｒｔ、Ｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００８）。長命形質細胞（ＬＬ−ＰＣ）は主に骨髄（ＢＭ）に存在するが、炎症の部位において脾臓で見つけることもでき、シクロホスファミドに対して耐性があることで公知であり、ループス腎炎を処置するために認められた一治療法である（Ａｌｐｅｒｏｖｉｃｈ、Ｒａｍａ  ｅｔ  ａｌ．、２００７；ＨｏｕｓｓｉａｕおよびＧｉｎｚｌｅｒ、２００８；Ｌａｃｏｔｔｅ、Ｄｕｍｏｒｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０）。化合物Ａが長命形質細胞のレベルを減少させる能力は、これらの細胞が殺傷するのが困難であり、通常、耐化学性と耐放射線性とを有し、骨髄構造内で何十年も生存することができ、狼瘡の間に自己抗体のうちの大部分を作り出すことができるので重要である。脾臓形質細胞の割合は非狼瘡マウスの脾臓形質細胞の割合よりも下がらなかったが、非狼瘡マウスの脾臓形質細胞の割合と同様のレベルに下がり、化合物Ａを用いたＪＡＫ２の遮断が形質細胞の出現率の正常な割合を正常な同齢の対照マウスの形質細胞の出現率の正常な割合に回復することを留意することも重要である。
【０１０８】
要約
マウス間の個々の変化と組織病理学的結果の要約とが表３に見ることができる。表３に示される通り、生存率は、腎臓の得点と、抗ｄｓＤＮＡ  ＡＮＡレベルと、タンパク尿との著しい変化と充分に相関する。これらの結果は、化合物Ａが、動物を疾患の進行から守り、狼瘡疾患の経過を後退させることさえすることによって狼瘡を処置する能力を明らかに示す。
【０１０９】
表３．ＮＺＭの総合的な結果
Ａ：抗ｄｓＤＮＡ  ＩｇＧ、Ｂ：糸球体細胞充実度、Ｃ：糸球体壊死
Ｄ：糸球体硬化症、Ｅ：間質浸潤、Ｆ：尿細管萎縮
Ｇ：間質線維症、Ｈ：血管炎、Ｉ：タンパク尿
【０１１０】
【表３】
0006033230.tif 000005
0006033230.tif 000006
＊ｐ<０．０５、＊＊ｐ<０．０１、＊＊＊ｐ<０．００１対ビヒクル、両側Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙのｔ−検定
タンパク尿「０．００」＝ＢＱＬ、ｘ>１ｍｇ／ｍＬは太字
得点＝「−」疾患なし（１）、「＋」軽度（２）、「＋＋」中度（３）、「＋＋＋」高度（４）、「＋＋＋＋」重篤な疾患（５）
【実施例３】
【０１１１】
化合物Ａは、狼瘡を促進する耐放射線性／耐化学性で病原性の骨髄長命形質細胞の出現率を減少させる
狼瘡に罹りやすい１５週齢のＮＺＭマウスに、合計で二週間、１００ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、または３０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａを週二回経口で投与するか、標準的治療の基準薬であるシクロホスファミドを生理食塩水中で５０ｍｇ／ｋｇで週一回腹腔内に投与するか、またはビヒクル（ＰＥＧ４００）を一日二回経口で投与した。研究終了前２４時間、各マウスに２ｍｇのチミジン類似体であるブロモデオシリウリジン（ＢｒｄＵ）を腹腔内に注入した。ＢｒｄＵ（カタログ番号第５５０８９１号）と抗ＢｒｄＵ−ＦＩＴＣ染色キット（カタログ番号第５５９６１９号）とをＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  （ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ）から取得した。ＢｒｄＵ注入後２４時間、脾臓と骨髄とをフロー染色のために白血球を単離するように個々に処理した。抗ＢｒｄＵ−ＦＩＴＣ（ＢｒｄＵキットから取得した）だけでなく、抗ＣＤ１９−Ｃｙｃ、抗ＣＤ３８−ＰＥ、および抗ＣＤ１３８−ＡＰＣ（全て、カリフォルニア州Ｓａｎ  ＤｉｅｇｏのｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから取得した）で細胞の表面を染色した。分析は、図４２に示される通り、生きたＳＳＣ／ＦＳＣの集団、ＣＤ１９陰性、ＣＤ３８陽性に関するゲーティングと、ＣＤ１３８陽性ＢｒｄＵ陰性（非環式長命形質細胞、領域Ｒ２）、またはＢｒｄＵ陽性（環式短命形質細胞、領域Ｒ１）に関するゲーティングとを含んだ。Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメータを使用して全てのサンプルを分析した。全てのＥｌｉｓｐｏｔ実験に対する脾細胞の生体外培養を含む全ての実験に対して完全培地（Ｒ１０）を使用した。完全培地は、ＲＰＭＩ１６４０（Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）に加えて、１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）、１％のＬ−Ｇｌｎ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）、１％のＮＥＡＡ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）、β−ＭＥ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）に加えて１０％のＦＢＳ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から成る。
【０１１２】
図は、脾臓短命形質細胞（図３８）と、骨髄から単離した短命形質細胞（図３９）と、脾臓長命形質細胞（図４０）と、骨髄から単離した長命形質細胞（図４１）とを示す。ゲーティングの例と、短命形質細胞Ｒ１および長命形質細胞Ｒ２のゲートとを提供する代表的なドットプロットもまた示される（図４２）。グラフは平均±標準誤差を示し、統計学的テストは両側Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙのｔ検定を含み、＊ｐ<０．０５は有意と考えた。示された全ての結果は生きた細胞において元々サイズをゲーティングされ、グラフはＣＤ１９陰性ＣＤ３８／ＣＤ１３８両陽性の集団を示し、その集団は、ＢｒｄＵを組み込んだ（環式なので短命形質細胞、領域Ｒ１を参照されたい）か、またはＢｒｄＵを組み込んでいない（非環式なので長命形質細胞、領域Ｒ２を参照されたい）のいずれかであった。
【０１１３】
化合物Ａは、狼瘡に罹りやすいＮＺＭマウスから通常耐放射線性で耐化学性の長命形質細胞を減少させた。図３８〜図４２に示す通り、環式（短命、領域Ｒ１）と非環式（長命、領域Ｒ２）との両方のＣＤ１３８＋形質細胞が化合物Ａの処置の際に減少する。１００ｍｇ／ｋｇの用量の化合物Ａは骨髄において短命形質細胞と長命形質細胞との両方に影響を与える（図３９および図４１）。３つ全ての用量が脾臓における長命形質細胞に影響を与えた（図４０）。長命形質細胞を標的化することは、これらの細胞が、殺傷するのが困難であり、通常耐化学性で耐放射線性であり、骨髄構造内で何十年も生存することができ、ＳＬＥの間に抗核抗体のうちの大部分を作り出すことができるので重要である。
【０１１４】
好適な実施形態
本発明の好適な実施形態は下記の実施形態を含む。
【０１１５】
実施形態１：化合物Ａを被検体に投与する工程を含む、被検体における狼瘡を処置するための方法。
【０１１６】
実施形態２：有効量の化合物Ａを被検体に投与する工程を含む、被検体における狼瘡を処置するための方法。
【０１１７】
実施形態３：被検体における狼瘡を処置するための薬剤の製造における化合物Ａの使用。
【０１１８】
実施形態４：被検体における狼瘡を処置する際に使用するための化合物Ａ。
【０１１９】
実施形態５：化合物Ａが経口投与される、実施形態１〜実施形態４のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１２０】
実施形態６：化合物Ａが約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１，０００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１〜実施形態５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１２１】
実施形態７：化合物Ａが約１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１〜実施形態５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１２２】
実施形態８：化合物Ａが約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１〜実施形態５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１２３】
実施形態９：化合物Ａが約２５ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１〜実施形態５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１２４】
実施形態１０：化合物Ａが約５０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１〜実施形態５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１２５】
実施形態１１：化合物Ａが約５５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１〜実施形態５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１２６】
実施形態１２：化合物Ａが約１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１〜実施形態５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１２７】
実施形態１３：化合物Ａが約５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１〜実施形態５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１２８】
実施形態１４：化合物Ａが約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１〜実施形態５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１２９】
実施形態１５：化合物Ａが約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１〜実施形態５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１３０】
実施形態１６：化合物Ａが約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１〜実施形態５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１３１】
実施形態１７：化合物Ａが約０．１ｍｇ〜約１ｍｇの用量で投与される、実施形態１〜実施形態５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１３２】
実施形態１８：化合物Ａが約０．５ｍｇ〜約５００ｍｇの用量で投与される、実施形態１〜実施形態５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１３３】
実施形態１９：化合物Ａが約１ｍｇ〜約１００ｍｇの用量で投与される、実施形態１〜実施形態５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１３４】
実施形態２０：化合物Ａが約５ｍｇ〜約５０ｍｇの用量で投与される、実施形態１〜実施形態５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１３５】
実施形態２１：化合物Ａが約５ｍｇ〜約３０ｍｇの用量で投与される、実施形態１〜実施形態５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１３６】
実施形態２２：化合物Ａが約５ｍｇ〜約２０ｍｇの用量で投与される、実施形態１〜実施形態５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１３７】
実施形態２３：化合物Ａが約１ｍｇの用量で投与される、実施形態１〜実施形態５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１３８】
実施形態２４：化合物Ａが約５ｍｇの用量で投与される、実施形態１〜実施形態５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１３９】
実施形態２５：化合物Ａが約１０ｍｇの用量で投与される、実施形態１〜実施形態５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１４０】
実施形態２６：化合物Ａが約２０ｍｇの用量で投与される、実施形態１〜実施形態５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１４１】
実施形態２７：化合物Ａが約３０ｍｇの用量で投与される、実施形態１〜実施形態５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１４２】
実施形態２８：化合物Ａが約４０ｍｇの用量で投与される、実施形態１〜実施形態５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１４３】
実施形態２９：化合物Ａが約５０ｍｇの用量で投与される、実施形態１〜実施形態５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１４４】
実施形態３０：化合物Ａが約１００ｍｇの用量で投与される、実施形態１〜実施形態５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１４５】
実施形態３１：化合物Ａが約２００ｍｇの用量で投与される、実施形態１〜実施形態５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１４６】
実施形態３２：被検体が処置の間にリンパ腫の減少を経験する、実施形態１〜実施形態３１のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１４７】
実施形態３３：被検体が処置の間に脾腫の減少を経験する、実施形態１〜実施形態３２のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１４８】
実施形態３４：被検体が処置の間に脾臓の白血球数の減少を経験する、実施形態１〜実施形態３３のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１４９】
実施形態３５：被検体が処置の間に血清ＩＬ−１２の減少を経験する、実施形態１〜実施形態３４のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１５０】
実施形態３６：被検体が処置の間に血清Ｃ３の増加を経験する、実施形態１〜実施形態３５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１５１】
実施形態３７：被検体が処置の間に腎臓糸球体細胞充実度の減少を経験する、実施形態１〜実施形態３６のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１５２】
実施形態３８：被検体が処置の間に腎臓間質浸潤の減少を経験する、実施形態１〜実施形態３７のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１５３】
実施形態３９：被検体が処置の間に腎臓ｐＳＴＡＴ３の減少を経験する、実施形態１〜実施形態３８のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１５４】
実施形態４０：被検体が処置の間に脾臓形質細胞の減少を経験する、実施形態１〜実施形態３９のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１５５】
実施形態４１：被検体が処置の間に血清抗核抗体の減少を経験する、実施形態１〜実施形態４０のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１５６】
実施形態４２：被検体が処置の間に血清抗ｄｓＤＮＡ抗核抗体の減少を経験する、実施形態１〜実施形態４１のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１５７】
実施形態４３：被検体が処置の間に血清ＩＮＦαの減少を経験する、実施形態１〜実施形態４２のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１５８】
実施形態４４：被検体が処置の間にタンパク尿の減少を経験する、実施形態１〜実施形態４３のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１５９】
実施形態４５：被検体が処置の間に肺浸潤物の減少を経験する、実施形態１〜実施形態４４のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１６０】
実施形態４６：被検体が処置の間に血清ＩＬ−１７Ａの減少を経験する、実施形態１〜実施形態４５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１６１】
実施形態４７：被検体が処置の間に血清ＩＬ−６の減少を経験する、実施形態１〜実施形態４６のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１６２】
実施形態４８：被検体が処置の間に血清ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αの減少を経験する、実施形態１〜実施形態４７のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１６３】
実施形態４９：被検体が処置の間にＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０の減少を経験する、実施形態１〜実施形態４８のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１６４】
実施形態５０：被検体が処置の間に血清ＣＸＣＬ９／ＭＩＧの減少を経験する、実施形態１〜実施形態４９のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１６５】
実施形態５１：被検体が処置の間に血清ＩＬ−４の減少を経験する、実施形態１〜実施形態５０のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１６６】
実施形態５２：被検体が処置の間に血清ＩＬ−１３の減少を経験する、実施形態１〜実施形態５１のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１６７】
実施形態５３：被検体が処置の間に血清ＴＮＦαの減少を経験する、実施形態１〜実施形態５２のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１６８】
実施形態５４：被検体が処置の間に血清ＫＣ／ＩＬ−８の減少を経験する、実施形態１〜実施形態５３のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１６９】
実施形態５５：被検体が処置の間に血清ＣＴｘの減少を経験する、実施形態１〜実施形態５４のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１７０】
実施形態５６：被検体がヒトである、実施形態１〜実施形態５５のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１７１】
実施形態５７：化合物Ａが一日一回投与される、実施形態１〜実施形態５６のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１７２】
実施形態５８：化合物Ａが一日二回投与される、実施形態１〜実施形態５６のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１７３】
実施形態５９：化合物Ａが一日三回投与される、実施形態１〜実施形態５６のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１７４】
実施形態６０：化合物Ａが一日四回投与される、実施形態１〜実施形態５６のいずれかに記載の方法、使用、または化合物。
【０１７５】
当業者が理解する通り、本発明の多数の改変と多数の変化形とが上記の教示を鑑みて考えられる。したがって、添付の特許請求の範囲内で、本発明は本明細書に具体的に記載されたものとは異なる方法で実施されてもよく、本発明の範囲は全てのこうした変化形を含むことを意図されることが理解される。
【０１７６】
本明細書において言及された全ての刊行物は、あらゆる目的でその全体が参照により組み込まれる。
【０１７７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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