(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘導心筋細胞をインビトロで発生させる方法であって、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃおよびＴｂｘ５であるリプログラミング因子ポリペプチドを生後線維芽細胞内に導入することを含み、ここで該導入により心筋細胞への生後線維芽細胞の直接リプログラミングが起こり、これにより誘導心筋細胞を発生させる、方法。
【請求項２】
生後線維芽細胞にＢａｆ６０ｃポリペプチドを導入することを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生後線維芽細胞がヒト細胞、げっ歯類細胞、又は非ヒト霊長類細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該導入がリプログラミング因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で生後線維芽細胞を遺伝子的に修飾することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
該核酸が組み換えベクターである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ヌクレオチド配列が転写調節エレメントに作動可能に連結している、請求項４記載の方法。
【請求項７】
転写調節エレメントが生後線維芽細胞中で機能する構成的プロモーターである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
該導入が生後線維芽細胞へ外因性のリプログラミング因子ポリペプチドを導入することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
該外因性リプログラミング因子ポリペプチドが非相同蛋白質形質導入ドメインを含む、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
誘導心筋細胞を単離することを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞であって、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃおよびＴｂｘ５であるリプログラミング因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の外因性核酸で遺伝子的に修飾されている、生後線維芽細胞。
【請求項１２】
遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞がヒト細胞、げっ歯類細胞、又は非ヒト霊長類細胞である、請求項１１記載の遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞。
【請求項１３】
１つ以上の外因性核酸が線維芽細胞のゲノム内に組み込まれる、請求項１１記載の遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞。
【請求項１４】
請求項１１記載の遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞を含む組成物。
【請求項１５】
組成物が液体培地、凍結保存剤、又はマトリックス成分を含む、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
マトリックスがコラーゲン、ゼラチン、フィブリン、フィブリノーゲン、ラミニン、グリコサミノグリカン、エラスチン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、グリカン、ポリ（乳酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレンオキシド）、セルロース；セルロース誘導体、澱粉、澱粉誘導体、ポリ（カプロラクトン）、及びポリ（ヒドロキシ酪酸）の１つ以上を含む、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１１記載の遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞から派生させた誘導心筋細胞。
【請求項１８】
請求項１７の誘導心筋細胞を含む組成物。
【請求項１９】
組成物が液体培地、凍結保存剤、又はマトリックス成分を含む、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
マトリックスがコラーゲン、ゼラチン、フィブリン、フィブリノーゲン、ラミニン、グリコサミノグリカン、エラスチン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、グリカン、ポリ（乳酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレンオキシド）、セルロース；セルロース誘導体、澱粉、澱粉誘導体、ポリ（カプロラクトン）、及びポリ（ヒドロキシ酪酸）の１つ以上を含む、請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
ａ）
ｉ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃおよびＴｂｘ５であるリプログラミング因子ポリペプチド；又は、
ｉｉ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃおよびＴｂｘ５であるリプログラミング因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸；と
ｂ）緩衝剤；
を含むリプログラミング組成物。
【請求項２２】
製薬上許容しうる賦形剤を更に含む、請求項２１記載のリプログラミング組成物。
【請求項２３】
治療剤を更に含む、請求項２１記載のリプログラミング組成物。
【請求項２４】
請求項２１記載のリプログラミング組成物を含む移植可能な装置。
【請求項２５】
装置がステントである請求項２４記載の移植可能な装置。
【請求項２６】
リプログラミング組成物が放出が制御された組成物である、請求項２４記載の移植可能な装置。
【請求項２７】
必要とするレシピエント個体に移植するための細胞の製造方法であって、ドナー個体の生後線維芽細胞から誘導心筋細胞をインビトロで発生させることを含み、ここで該発生は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃおよびＴｂｘ５であるリプログラミング因子ポリペプチドを生後線維芽細胞へ導入することを含み、この導入により心筋細胞への生後線維芽細胞の直接リプログラミングが起こり、これにより誘導心筋細胞が発生するものであり、該ドナー個体はレシピエント個体と免疫適合性である、方法。
【請求項２８】
レシピエントとドナーが同じ個体である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
レシピエントとドナーが異なる個体である、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
誘導心筋細胞が請求項１記載の方法を用いて発生される、請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
生後線維芽細胞がげっ歯類細胞である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は参照により全体が本明細書に組み込まれる２０１０年４月２８日出願
の米国特許仮出願６１／３２８，９８８号及び２０１０年7月１４日出願の米国特許仮出願６１／３６４，２９５号の利益を請求する。
【背景技術】
【０００２】
心臓疾患は、西洋諸国における成人及び小児の第１の死亡原因である。伏在病理は典型的には心不全をもたらす心筋細胞の消失、又は、先天的な心臓奇形をもたらす胚発生中の心筋細胞の不適切な発生である。心筋細胞は殆ど、又は全く再生能力を有さないため、現在の治療手順は限定されている。胚性肝細胞は明確な心臓発生能力を有しているが、心臓の分化の効率、腫瘍発生の危険性、及び細胞拒絶の問題を克服しなければならない。
【０００３】
当該技術分野においては心筋細胞を発生させる方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許公開第２００９／０２０８４６５号
【特許文献２】米国特許第７，６８２，８２８号
【特許文献３】米国特許公開第２０１０／００７５４２１号
【特許文献４】国際特許出願公開第２００９／１５２４８４号
【特許文献５】国際特許出願公開２００９／１５２４８５号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Takahashi and Yamanaka (2006)Cell 126:663.
【発明の概要】
【０００６】
本開示は生後線維芽細胞から心筋細胞を発生させる方法を提供する。本開示は更に心筋細胞を発生させる場合の使用のための細胞及び組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１Ａ〜Ｉは心筋細胞誘導因子を求めるスクリーニングの結果を示す。
【図２】図２Ａ〜Ｆは線維芽細胞における心臓遺伝子発現に対する種々の因子の作用を示す。
【図３】図３Ａ〜Ｊは心筋細胞内への直接の心線維芽細胞のリプログラミングを示す。
【図４】図４Ａ〜Ｄは誘導心筋細胞（ｉＣＭ）における遺伝子発現のリプログラミングを示す。
【図５】図５Ａ〜ＤはｉＣＭにおける自発的Ｃａ２＋流入、電気活動性、及び拍動を示す。
【図６】図６Ａ〜Ｃは心筋細胞内への心線維芽細胞のインビボリプログラミングを示す。
【図７】図７Ａ〜Ｇは心筋細胞様細胞への心線維芽細胞のインビボリプログラミングを示す。
【図８】図８Ａ〜Ｎはインビボの心リプログラミングの単細胞分析を示す。
【図９】図９は追加的インビボリプログラミングされたｉＣＭの活動電位を示す細胞内記録を示す。
【図１０】図１０Ａ〜Ｄは冠動脈結紮後のｄｓＲｅｄ又はＧＭＴ（３つの因子:Gata4-Ｍｅｆ２ｃ-Tbx-5をコードする発現ベクター）注射心臓に関する危険面積（ＡＡＲ）及び梗塞サイズの測定及び心エコー検査データを示す。
【図１１】図１１Ａ〜Ｄは心筋細胞梗塞後の心臓機能に対する心リプログラミング因子のインビボ送達の作用を示す。
【図１２】図１２Ａ〜Ｆ及び図１３Ａ〜Ｅは傷害時の心線維芽細胞に対する、そしてインビボリプログラミングに対するチモシンβ４の作用を示す。
【図１３】同上。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
定義
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「蛋白」という用語は、本明細書においては互換的に使用し、いずれかの長さのアミノ酸の重合体の形態を指し、これは遺伝子敵にコードされた、及び非遺伝子的にコードされたアミノ酸、化学的又は生化学的に修飾又は誘導体化されたアミノ酸、及び修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを包含することができる。用語は融合蛋白、例えば非相同アミノ酸配列を有する融合蛋白、非相同及び相同のリーダー配列を有する融合物であってＮ末端メチオニン残基を有するか有さないもの；免疫学的にタグ付けされた蛋白等を包含するがこれらに限定されない。
【０００９】
「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は本明細書においては互換的に使用し、そして、いずれかの長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのいずれか、又はそれらの類縁体の重合体形態を指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例は線状及び環状の核酸、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブ、及びプライマーを包含する。
【００１０】
「作動可能に連結」という用語は所望の昨日を与える分子間の機能的連結を指す。例えば、核酸の文脈における「作動可能に連結」とは、転写、翻訳等のような所望の機能を与える核酸間の機能的連結、例えば核酸発現制御配列（例えばプロモーター、シグナル配列、又は転写因子結合部位のアレイ）と第２のポリヌクレオチドとの間の機能的連結を指し、この場合、発現制御配列は第２のポリヌクレオチドの転写および／または翻訳に影響する。
【００１１】
本明細書において使用する場合、細胞に言及する場合の「単離された」という用語は、細胞が天然に存在する環境とは異なる環境にある細胞を指し、例えば、細胞が天然には多細胞生物中に存在し、そして細胞がその多細胞生物から取り出されている場合に、細胞は「単離された」ものとなる。単離され、遺伝子的に修飾されている宿主細胞は、遺伝子的に修飾された宿主細胞の混合集団中、又は、遺伝子的に修飾された宿主細胞及び遺伝子的に修飾されていない宿主細胞を含む混合集団中に存在することができる。例えば、単離された遺伝子的に修飾された宿主細胞は、インビトロの遺伝子的に修飾された宿主細胞の混合集団中に、又は、遺伝子的に修飾された宿主細胞及び遺伝子的に修飾されていない宿主細胞を含む混合インビトロ集団中に存在できる。
【００１２】
「宿主細胞」とは、本明細書において使用する場合、インビボ又はインビトロの細胞（例えば単細胞実体として培養されている真核生物細胞）を意味し、その真核生物細胞は、核酸（例えば外因性核酸）又は外因性ポリペプチドに対するレシピエントとして使用できるか、又は使用されており、そして外因性ポリペプチドの導入により修飾されているか、核酸により遺伝子的に修飾されている元の細胞の子孫を包含する。単細胞の子孫は天然、偶然、又は故意の突然変異により、形態において、又はゲノム又は全ＤＮＡ相補物において、元親と完全に同一である必要はないと理解される。
【００１３】
「遺伝子的修飾」という用語は、新しい核酸（即ち細胞にとって外因性の核酸）の導入の後に細胞において誘導される恒久的又は一過性の遺伝子の変化を指す。遺伝子的変化（「修飾」）は宿主細胞のゲノム内への新しい核酸の取り込みにより、又は、染色体外エレメントとしての新しい核酸の一過性又は安定な維持により、達成することができる。細胞が真核生物細胞の場合、恒久的な遺伝子的変化は細胞のゲノム内への核酸の導入により達成できる。遺伝子的修飾の適当な方法は、ウィルス感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈降、直接マイクロインジェクション等を包含する。
【００１４】
本明細書において使用する場合、「外因性核酸」という用語は、自然界の細胞の中に通常又は天然に存在および／またはそれにより生産されることのない、および／またはその細胞に導入される（例えばエレクトロポレーション、トランスフェクション、感染、リポフェクション、又は細胞内に核酸を導入するいずれかの他の手段による）核酸を指す。
【００１５】
「個体」、「対象」、「宿主」及び「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、そして、ネズミ（ラット、マウス）、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄類（例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）等を包含するがこれらに限定されない哺乳類を指す。一部の実施形態においては、個体はヒトである。一部の実施形態においては、個体はネズミである。
【００１６】
「治療有効量」又は「効果のある量」とは、疾患を治療するために哺乳類又は他の対象に投与した場合に、疾患に対するそのような治療を起こすために十分な化合物の量又は細胞の数を意味する。「治療有効量」は化合物又は細胞、疾患及びその重症度、及び治療すべき対象の年齢、体重等により変動することになる。
【００１７】
本発明を更に説明する前に、記載した特定の実施形態はそれ自体が当然ながら変動してよいため、本発明はそれに限定されないと理解しなければならない。更に又、本明細書において使用している用語は特定の実施形態を説明することを目的としており、そして、本発明の範囲は添付請求項によってのみ制限されることになるため、限定的であることを意図していない。
【００１８】
数値のある範囲が示された場合、その範囲の上限と下限の間の別途明示しない限り下限の単位の１０分の一までの各介在値、及びその記載された範囲における何れかの他の記載された又は介在する値は、本発明の範囲に包含されると理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は独立してより小さい範囲に包含されて良く、そして記載された範囲における何れかの特に除外される限度の対象となる本発明の範囲にやはり包含される。記載された範囲が限度の一方又は両方を包含する場合、それらの包含された限度の何れか又は両方を除外した範囲もまた本発明に包含される。
【００１９】
特段の記載が無い限り、本明細書において使用する全ての専門技術用語は本発明が属する技術の通常の当業者により共通して理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載したものと同様又は等価な何れかの方法及び物質は本発明の実施又は試験においてやはり使用できるが、好ましい方法及び物質は以下に記載するとおりである。本明細書において言及する全ての公開文書はその公開文書が引用されている関連である方法及び／又は物質を開示及び説明するために参照により本明細書に組み込まれる。
【００２０】
本明細書及び添付請求項で使用される場合、特段に明示されない限り、単数標記は複数標記も包含するものとする。即ち、「誘導心筋細胞」と言及する場合、そのような心筋細胞の複数が包含され、そして「生後線維芽細胞」と言及する場合は、１つ以上の生後線維芽細胞及び当業者の知るその等価物等の言及をも包含する。更に請求項は何れかの任意の要素を除外するように作成されている場合がある。その場合、その叙述は、請求項要素の列挙との関連において「単独の」、「唯一の」等の排他的な用語の使用、又は「負の」限定の使用の先行基礎となることを意図している。
【００２１】
本明細書において考察する公開文書は本出願の出願日よりも前のそれらの開示に関してのみ提示している。ここに示すものの何れも、本発明が前の発明によるそのような公開に先行する資格を有さないことを受け入れたと捕らえてはならない。更に又、提示した公開文書の日付は個々に確認すべき必要があるかもしれない実際の公開の日付とは異なる場合がある。
【００２２】
本開示は生後線維芽細胞から心筋細胞を発生させる方法を提供する。本開示は更に、心筋細胞を発生させる場合に使用するための細胞及び組成物を提供する。
【００２３】
心筋細胞を発生させる方法
本開示は生後線維芽細胞から心筋細胞を発生させる方法を提供する。方法は一般的に、リプログラミング因子１つ以上を生後線維芽細胞内に導入することを包含する。一部の場合において、ポリペプチド自体を生後線維芽細胞内に導入する。別の場合においては、生後線維芽細胞はリプログラミング因子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上で遺伝子的に修飾される。
【００２４】
一部の実施形態においては、方法はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドから選択されるリプログラミング因子１つ以上を生後線維芽細胞内に導入することを包含する。一部の場合において、ポリペプチド自体を生後線維芽細胞内に導入する。別の場合においては、生後線維芽細胞はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上により遺伝子的に修飾される。
【００２５】
一部の実施形態においては、方法は３種（そして３種のみ）のリプログラミング因子： Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを線維芽細胞内に導入することを包含する。一部の場合において、ポリペプチド自体を生後線維芽細胞内に導入する。別の場合においては、生後線維芽細胞はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上により遺伝子的に修飾される。
【００２６】
本発明方法を用いて生後線維芽細胞から直接発生させた心筋細胞を、本明細書においては「誘導心筋細胞」と称する。Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆのようなポリペプチドもまた、本明細書においては集合的に「リプログラミング因子」又は「リプログラミング転写因子」と称する。リプログラミング因子１つ以上を導入する生後線維芽細胞は、先ず幹細胞又は先祖細胞となることなく、分化した心筋細胞に直接リプログラミングされる。
【００２７】
上記した通り、一部の例においては、心筋細胞を発生させる本発明方法はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上で生後線維芽細胞を遺伝子的に修飾することを包含する。ヌクレオチド配列によりコードされるリプログラミング因子は生後線維芽細胞中で生産され、そして、リプログラミング因子１つ以上の生産の結果として、遺伝子的に修飾された線維芽細胞は分化した心筋細胞に直接リプログラミングされる。遺伝子的に修飾された線維芽細胞は先ず幹細胞又は先祖細胞になることなく、分化した心筋細胞に直接リプログラミングされる。
【００２８】
上記した通り、一部の場合においては、心筋細胞を発生させる本発明方法はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上で生後線維芽細胞を遺伝子的に修飾することを包含する。Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドは生後線維芽細胞中で生産され、そして、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドの生産の結果として、遺伝子的に修飾された線維芽細胞は分化した心筋細胞に直接リプログラミングされる。遺伝子的に修飾された線維芽細胞は先ず幹細胞又は先祖細胞になることなく、分化した心筋細胞に直接リプログラミングされる。
【００２９】
一部の場合において、生後線維芽細胞は生後線維芽細胞内にＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドの１つ以上のそれ自体を導入することにより修飾される。Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドの１つ以上が導入されている（ポリペプチド自体を導入することによるか、又は、ポリペプチド１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上を導入することによる）生後線維芽細胞は「修飾された線維芽細胞」又は「修飾された生後線維芽細胞」と称する。Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上が導入されている生後線維芽細胞は「遺伝子的に修飾された線維芽細胞」又は「遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞」と称する。
【００３０】
一部の場合において、生後線維芽細胞Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチド自体を宿主生後線維芽細胞内に導入することにより修飾される。Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドが導入されている（ポリペプチド自体を導入することによるか、又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上を導入することによる)生後線維芽細胞は「修飾された線維芽細胞」又は「修飾された生後線維芽細胞」と称する。Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上が導入されている生後線維芽細胞は「遺伝子的に修飾された線維芽細胞」又は「遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞」と称する。
【００３１】
上記した通り、本発明方法を用いながら、リプログラミング因子１つ以上（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つ以上; 又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）を生後線維芽細胞内に導入（例えばリプログラミング因子ポリペプチド事態を生後線維芽細胞内に導入するか；又は生後線維芽細胞をリプログラミング因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上で遺伝子的に修飾する）し、そしてその結果、修飾された線維芽細胞は先ず幹細胞又は先祖細胞になることなく、分化した心筋細胞に直接リプログラミングされる。即ち、例えば、修飾された、又は遺伝子的に修飾された線維芽細胞は早期の心臓先祖マーカーの検出可能なレベルを生成しない。例えば、修飾された、又は遺伝子的に修飾された線維芽細胞は、検出可能なレベルのＩｓｌ１、即ち心臓分化前に一過性に発現される早期心臓先祖マーカーを生産しない。
【００３２】
一部の実施形態においては、生後線維芽細胞はリプログラミング因子１つ以上（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つ以上；又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上でインビトロで遺伝子的に修飾されるか；又はリプログラミング因子ポリペプチド自体の１つ以上（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つ以上；又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）は生後線維芽細胞内にインビトロで導入され；ここで、修飾された、又は遺伝子的に修飾された線維芽細胞はインビトロで心筋細胞になる。線維芽細胞がインビトロで心筋細胞に直接リプログラミングされ、誘導心筋細胞が発生した後、誘導心筋細胞は個体内に導入できる。
【００３３】
例えば、一部の実施形態においては、本発明方法はａ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上でインビトロで生後線維芽細胞を遺伝子的に修飾すること、ここで遺伝子的に修飾された線維芽細胞中のコードされたポリペプチドの生産はインビトロで心筋細胞内への直接の遺伝子的に修飾された線維芽細胞のリプログラミングをもたらすものであること；及びｂ）誘導心筋細胞を個体に導入することを包含する。他の実施形態において、本発明方法はａ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドの１つ以上をインビトロで生後線維芽細胞内に導入し、修飾された線維芽細胞を発生させること、ここで修飾された線維芽細胞はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドの１つ以上の導入の結果として、インビトロで心筋細胞に直接リプログラミングされ、これにより、誘導心筋細胞を発生させること；及びｂ）誘導心筋細胞を個体に導入することを包含する。
【００３４】
別の例として、一部の実施形態においては、本発明方法はａ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上でインビトロで生後線維芽細胞を遺伝子的に修飾すること、ここで遺伝子的に修飾された線維芽細胞中のＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドの生産はインビトロで心筋細胞内への直接の遺伝子的に修飾された線維芽細胞のリプログラミングをもたらし、これにより、誘導心筋細胞を発生させること；及びｂ）誘導心筋細胞を個体に導入することを包含する。他の実施形態において、本発明方法はａ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドをインビトロ生後線維芽細胞に導入し、修飾された線維芽細胞を生成すること、ここで修飾された線維芽細胞はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドの導入の結果として、インビトロで心筋細胞に直接リプログラミングされ、これにより誘導心筋細胞を発生させること；及びｂ）誘導心筋細胞を個体に導入することを包含する。
【００３５】
他の実施形態において、生後線維芽細胞はリプログラミング因子１つ以上（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つ以上；又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上でインビトロで遺伝子的に修飾されるか; 又はリプログラミング因子ポリペプチド自体の１つ以上（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つ以上；又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）は生後腺維芽細胞内にインビトロで導入され；そして修飾された、又は遺伝子的に修飾された腺維芽細胞は個体に導入され、そこで修飾された、又は遺伝子的に修飾された腺維芽細胞はインビボで心筋細胞に直接リプログラミングされる。
【００３６】
即ち、例えば、一部の実施形態においては、本発明方法はａ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上でインビトロで生後線維芽細胞を遺伝子的に修飾すること；及びb)遺伝子的に修飾された線維芽細胞を個体内に導入すること、ここで遺伝子的に修飾された線維芽細胞中のＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドの１つ以上の生産は、インビボの心筋細胞への直接の遺伝子的に修飾された線維芽細胞のリプログラミングをもたらし、これにより個体において誘導心筋細胞を発生させることを包含する。他の実施形態において、本発明方法はａ）インビトロで生後線維芽細胞中にＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチド１つ以上を導入し、修飾された線維芽細胞を発生させること；及びｂ）個体内に修飾された線維芽細胞を導入すること、ここで修飾された線維芽細胞は Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドの１つ以上の導入の結果としてインビボで心筋細胞に直接リプログラミングされ、これにより個体において誘導心筋細胞を発生させることを包含する。
【００３７】
別の例として、一部の実施形態においては、本発明方法はａ） Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上でインビトロで生後線維芽細胞を遺伝子的に修飾すること、; and b)個体内に遺伝子的に修飾された線維芽細胞を導入すること、ここで遺伝子的に修飾された線維芽細胞中のＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドの生産は インビボの心筋細胞への直接の遺伝子的に修飾された線維芽細胞のリプログラミングをもたらし、これにより個体において誘導心筋細胞を発生させることを包含する。他の実施形態において、本発明方法はａ）インビトロで生後線維芽細胞内にＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを導入し、修飾された線維芽細胞を発生させること；及びｂ）個体内に修飾された線維芽細胞を導入すること、ここで修飾された線維芽細胞は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドの導入の結果として、インビボで心筋細胞に直接リプログラミングされ、これにより個体において誘導心筋細胞を発生させることを包含する。
【００３８】
他の実施形態において、生後線維芽細胞はリプログラミング因子１つ以上（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆ；又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）の１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上でインビボで遺伝子的に修飾されるか、又はリプログラミング因子ポリペプチド自体の１つ以上（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つ以上；又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）は生後線維芽細胞にインビボで導入され；そして修飾された、又は遺伝子的に修飾された腺維芽細胞はインビボで心筋細胞に直接リプログラミングされる。
【００３９】
リプログラミング因子１つ以上（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つ以上；又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上で遺伝子的に修飾された、又はリプログラミング因子ポリペプチド自体の１つ以上（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つ以上；又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）で修飾された生後線維芽細胞は、約５日〜約７日、又は約７日〜約１４日の期間のうちに分化した心筋細胞にリプログラミングされる。例えば、生後線維芽細胞の集団が上記した通りリプログラミング因子ポリペプチドを導入することにより遺伝子的に修飾されるか、又は修飾される場合、集団の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、又は７５％超（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は９８％超）が約５日〜約７日、約７日〜約１４日、又は約２週間〜約４週間の期間のうちに分化した心筋細胞（誘導心筋細胞）にリプログラミングされる。
【００４０】
一部の実施形態においては、生後線維芽細胞の集団がリプログラミング因子１つ以上（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つ以上；又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上で遺伝子的に修飾される場合、又は生後線維芽細胞の集団が線維芽細胞内にリプログラミング因子事態の１つ以上（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つ以上；又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）を導入することにより修飾される場合、集団の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、又は７５％超（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は９８％超）が約５日〜約７日、約７日〜約１４日、又は約２週〜約４週の期間のうちにｃＴｎＴ＋となる（即ち心トロポニンＴを発現する）。
【００４１】
一部の実施形態においては、誘導心筋細胞を発生させる本発明方法はリプログラミング因子１つ以上（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つ以上；又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上で宿主生後線維芽細胞（又は宿主生後線維芽細胞の集団）を遺伝子的に修飾すること；遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞の集団を発生させること、及び一定時間（例えば、５日〜７日、１週〜２週、又は２週〜４週）の後、遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞の集団をソーティングすることにより心筋細胞をリッチ化することを包含する。遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞の集団は線維芽細胞特異的マーカーの発現に関してソーティングすることにより残存線維芽細胞がある場合はそれを除去することができる。遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞の集団は心筋細胞特異的マーカーの発現に関してソーティングすることができる。
【００４２】
一部の実施形態においては、誘導心筋細胞を発生させる本発明方法は、宿主生後線維芽細胞内にリプログラミング因子ポリペプチド１つ以上（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つ以上；又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）を導入することにより宿主生後線維芽細胞（又は宿主生後線維芽細胞の集団）を修飾すること；修飾された生後線維芽細胞の集団を発生させること、及び一定時間（例えば、５日〜７日、１週〜２週、又は２週〜４週）の後、修飾された生後線維芽細胞の集団をソーティングすることにより心筋細胞をリッチ化することを包含する。修飾された生後線維芽細胞の集団は線維芽細胞特異的マーカーの発現に関してソーティングすることにより残存線維芽細胞がある場合はそれを除去することができる。修飾された生後線維芽細胞の集団は心筋細胞特異的マーカーの発現に関してソーティングすることができる。
【００４３】
一部の実施形態においては、宿主生後線維芽細胞はリプログラミング因子１つ以上（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つ以上；又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上で遺伝子的に修飾されるか、又はリプログラミング因子ポリペプチド１つ以上（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つ以上；又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）を宿主生後線維芽細胞に導入することにより修飾され; そしてまた、検出可能なマーカー（例えば、検出可能なシグナルを直接発生するポリペプチド; 基質に対して作用する際に検出可能なシグナルを発生する酵素）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子的に修飾され、その場合、検出可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列は心筋細胞特異的プロモーターに作動可能に連結している。直接検出可能なシグナルを与える適当なポリペプチドは蛍光蛋白、例えば緑色蛍光蛋白、黄色蛍光蛋白、青色蛍光蛋白等を包含する。基質に対して作用する際に検出可能なシグナルを発生する適当な酵素は例えばルシフェラーゼ（基質ルシフェリンに対して作用）、アルカリホスファターゼ等を包含する。心筋細胞特異的プロモーターは、例えばα−ミオシン重鎖プロモーター；ｃＴｎＴプロモーター等を包含する。検出可能なマーカーの発現は誘導心筋細胞の検出を可能にすることができ；そして誘導心筋細胞のソーティングの手段を与えることができる。
【００４４】
上記した様な修飾又は遺伝子的修飾のための宿主細胞として機能する生後線維芽細胞は種々の入手元の何れかに由来することができる。哺乳類の線維芽細胞、例えばヒト線維芽細胞、ネズミ（例えばマウス）線維芽細胞、ラット線維芽細胞、ブタ線維芽細胞等を使用できる。一部の実施形態においては、線維芽細胞はヒト線維芽細胞である。他の実施形態において、線維芽細胞はマウス線維芽細胞である。他の実施形態において、線維芽細胞はラット線維芽細胞である。即ち、「生後線維芽細胞」は生後哺乳類から得られた線維芽細胞、又は生後哺乳類から得られた線維芽細胞の子孫を指す。
【００４５】
生後線維芽細胞は種々の組織入手元の何れかより得ることができる。例えば、心臓線維芽細胞、包皮線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、肺線維芽細胞が挙げられる。
【００４６】
線維芽細胞は生存個体から得ることができる。線維芽細胞は生存個体から採取した組織から得ることができる。線維芽細胞は適当な臓器ドナーと見なされる最近死亡した個体から得ることができる。一部の実施形態においては、個体は、例えば個体が適当な線維芽細胞源であるかどうかを調べるために。種々の遺伝子障害、ウィルス感染に関してスクリーニングされ、その場合、個体は１つ以上の遺伝子障害、ウィルス感染等に基づいて除外される場合がある。
【００４７】
適当な線維芽細胞は線維芽細胞に特徴的なマーカーを発現し、その場合、そのようなマーカーは、例えばビメンチン、ポリ１−４−ヒドロキシラーゼ（コラーゲン合成に関与する細胞内酵素）、線維芽細胞特異的蛋白−１（例えばStrutz等、(1995)J.Cell Biol.130:393）参照、線維芽細胞表面抗原、及び１型コラーゲンを包含する。一部の実施形態においては、宿主細胞として使用される線維芽細胞は心線維芽細胞であり、その場合、心線維芽細胞はＴｈｙ１＋、ビメンチン＋として特徴付けることができ、そして又、ｃ−ｋｉｔ及びｃ−ｋｉｔの等価物に関して陰性である。
【００４８】
一般的に、本発明方法による修飾又は遺伝子的修飾のための宿主細胞として使用するのに適する線維芽細胞は非形質転換の（例えば正常な細胞増殖を示す）ものであり、そして別様には正常である。
【００４９】
修飾又は遺伝子的修飾のための宿主細胞が線維芽細胞の集団である場合、線維芽細胞の集団は単離され、例えば、線維芽細胞の集団は少なくとも約７５％の線維芽細胞、少なくとも約８０％の線維芽細胞、少なくとも約８５％の線維芽細胞、少なくとも約９０％の線維芽細胞、少なくとも約９５％の線維芽細胞、少なくとも約９８％の線維芽細胞、少なくとも約９９％の線維芽細胞、又は９９％超線維芽細胞よりなる。
【００５０】
生後線維芽細胞は非胚性の対象、新生乳児、小児、又は成人の組織から派生させることができる。生後線維芽細胞は帝王切開を含む出生時から死亡までの期間内に対象から採集した新生仔又は生後の組織から派生させることができる。例えば、誘導心筋細胞を発生させるために使用する生後線維芽細胞は、約１０分齢超、約１時間齢超、約１日齢超、約１月齢超、約２月齢超、約６月齢超、約１年齢超、約２年齢超、約５年齢超、約１０年齢超、約１５年齢超、約１８年齢超、約２５年齢超、約３５年齢超、＞４５年齢、＞５５年齢、＞６５年齢、＞８０年齢、＜８０年齢、＜７０年齢、＜６０年齢、＜５０年齢、＜４０年齢、＜３０年齢、＜２０年齢又は＜１０年齢
である対象に由来するものであることができる。
【００５１】
組織から線維芽細胞を単離する方法は当該分野で知られており、そして何れかの知られた方法を使用できる。非限定的な例として、心線維芽細胞はIeda等、(2009)Dev.Cell,16:233の方法を用いて、又は実施例１に記載する通り、得ることができる。包皮線維芽細胞は男性個体、例えば８〜１４日齢の男性個体の包皮組織（即ち陰茎亀頭を被覆している皮膚組織；陰茎包皮）から得ることができる。線維芽細胞は包皮組織を粉砕し、次に組織を単細胞にまで解離させることにより得ることができる。包皮細胞クランプは物理的な脱クランプ処理又は例えばトリプシンを用いた酵素消化を包含する当該分野で知られている何れかの手段により解離させることができる。
【００５２】
上記した通り、生後線維芽細胞はリプログラミング因子１つ以上（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つ以上；又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上で遺伝子的に修飾されるか、又は、リプログラミング因子ポリペプチド自体の１つ以上（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つ以上；又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）を生後線維芽細胞内に導入することにより修飾される。そのようなリプログラミング因子のアミノ酸配列は当該分野で知られている。リプログラミング因子をコードするヌクレオチド配列は当該分野で知られている。
【００５３】
リプログラミング因子 
上記考察した通り、生後線維芽細胞はリプログラミング因子１つ以上（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つ以上；又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上で遺伝子的に修飾されるか、又は、生後線維芽細胞はリプログラミング因子ポリペプチド自体の１つ以上（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つ以上；又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）を生後線維芽細胞内に導入することにより修飾される。
【００５４】
一部の実施形態においては、リプログラミング因子１つ以上はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆを１、２、３、４、５、６、７、８、又は９個包含する。一部の実施形態においては、リプログラミング因子１つ以上はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの全てを包含する。一部の実施形態においては、リプログラミング因子１つ以上はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆのサブセットを包含する。例示されるサブセットは下記を包含する。
【００５５】
１）Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆ；
【００５６】
２）Ｇａｔａ４、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆ；
【００５７】
３）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆ；
【００５８】
４）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆ；
【００５９】
５）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆ；
【００６０】
６）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆ；
【００６１】
７）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆ；
【００６２】
８）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、及びＳｒｆ；
【００６３】
９）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、及びＳｍｙｄ１；
【００６４】
１０）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｅｓｐ１、Ｍｙｏｃｄ、Ｎｋｘ２−５、及びＴｂｘ５；
【００６５】
１１）Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｅｓｐ１、Ｍｙｏｃｄ、Ｎｋｘ２−５、及びＴｂｘ５；
【００６６】
１２）Ｇａｔａ４、Ｍｅｓｐ１、Ｍｙｏｃｄ、Ｎｋｘ２−５、及びＴｂｘ５；
【００６７】
１３）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｙｏｃｄ、Ｎｋｘ２−５、及びＴｂｘ５；
【００６８】
１４）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、及びＴｂｘ５；
【００６９】
１５）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｅｓｐ１、Ｍｙｏｃｄ、及びＴｂｘ５；
【００７０】
１６）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｅｓｐ１、Ｍｙｏｃｄ、及びＮｋｘ２−５；
【００７１】
１７）Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｅｓｐ１、Ｍｙｏｃｄ、及びＴｂｘ５；
【００７２】
１８）Ｇａｔａ４、Ｍｅｓｐ１、Ｍｙｏｃｄ、及びＴｂｘ５；
【００７３】
１９）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｙｏｃｄ、及びＴｂｘ５；
【００７４】
２０）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｅｓｐ１、及びＴｂｘ５；
【００７５】
２１）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｅｓｐ１、及びＭｙｏｃｄ；
【００７６】
２２）Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｅｓｐ１、及びＴｂｘ５；
【００７７】
２３）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５．
【００７８】
上記した通り、一部の実施形態においては  リプログラミング因子のサブセットはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５である。
【００７９】
Ｇａｔａ４
Ｇａｔａ４ポリペプチドは多くの遺伝子のプロモーター領域に存在するＧＡＴＡモチーフを認識して結合する）例えばコンセンサス配列５’−ＡＧＡＴＡＧ−３’を認識して結合する）ＧＡＴＡファミリー亜鉛フィンガー転写因子のメンバーである。例えばHuang等、(1995)Gene155:219を参照できる。種々の種に由来するＧａｔａ４ポリペプチドに関するアミノ酸配列及びＧａｔａ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が当該分野で知られている。例えば１）ゲンバンクアクセッション番号ＮＰ＿００２０４３．２（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  Ｇａｔａ４アミノ酸配列；及びゲンバンクアクセッション番号ＮＭ＿００２０５２（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  Ｇａｔａ４コードヌクレオチド配列；２）ゲンバンクアクセッション番号ＮＰ＿００３２１１８（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  Ｇａｔａ４アミノ酸配列）；及びゲンバンクアクセッション番号ＮＭ＿００８０９２（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  Ｇａｔａ４コードヌクレオチド配列）；３）ゲンバンクアクセッション番号ＮＰ＿６５３３３１（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  Ｇａｔａ４アミノ酸配列）；及びゲンバンクアクセッション番号ＮＭ＿１４４７３０（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  Ｇａｔａ４コードヌクレオチド配列）；４）ゲンバンクアクセッション番号ＡＢＩ６３５７５（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ  Ｇａｔａ４アミノ酸配列；及びゲンバンクアクセッション番号ＤＱ８８６６６４（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ  Ｇａｔａ４コードヌクレオチド配列；及び５）ゲンバンクアクセッション番号ＡＡＨ７１１０１．１（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ  Ｇａｔａ４アミノ酸配列）；及びゲンバンクアクセッション番号ＢＣ０７１１０７（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ  Ｇａｔａ４コードヌクレオチド配列）を参照できる。
【００８０】
一部の実施形態においては、適当なＧａｔａ４核酸は配列番号１４に示すヌクレオチド配列の約９００ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、約１０００ｎｔ〜約１１００ｎｔ、約１１００ｎｔ〜約１２００ｎｔ、又は約１２００ｎｔ〜１３２９ｎｔの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態においては、適当なＧａｔａ４核酸は配列番号２８に示すヌクレオチド配列の約９００ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、約１０００ｎｔ〜約１１００ｎｔ、約１１００ｎｔ〜約１２００ｎｔ、又は約１２００ｎｔ〜１３２３ｎｔの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００８１】
適当なＧａｔａ４核酸はＧａｔａ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、その場合、一部の実施形態においては、適当なＧａｔａ４ポリペプチドは配列番号１３に示すアミノ酸の約３５０アミノ酸（ａａ）〜約４００ａａ、又は約４００ａａ〜４４２ａａの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態においては、適当なＧａｔａ４ポリペプチドは配列番号２７に示すアミノ酸配列の約３５０アミノ酸（ａａ）〜約４００ａａ、又は約４００ａａ〜４４2ａａの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。コードされるＧａｔａ４ポリペプチドは生物学的に活性であり、例えばプロモーター中に存在するＧＡＴＡモチーフを認識して結合（例えばコンセンサス配列５’−ＡＧＡＴＡＧ−３’を認識して結合）し；そしてＧＡＴＡモチーフを含むプロモーターに作動可能に連結している遺伝子の転写を活性化させる。
【００８２】
一部の実施形態においては、Ｇａｔａ４ポリペプチドに機能的に等価なポリペプチド（又はそのような機能的等価物をコードするヌクレオチド配列）を使用する。例えば、一部の実施形態においては、Ｇａｔａ５ポリペプチド（又はＧａｔａ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）を使用する。他の実施形態において、Ｇａｔａ６ポリペプチド（又はＧａｔａ６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）を使用する。
【００８３】
Ｇａｔａ５ポリペプチドのアミノ酸配列、及びＧａｔａ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は当該分野で知られている。例えばゲンバンクアクセッション番号：１）ＮＰ＿５３６７２１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＧａｔａ５アミノ酸配列）、及びＮＭ＿０８０４７３（ＮＰ＿５３６７２１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；２）ＮＰ＿０３２１１９（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓＧａｔａ５アミノ酸配列）、及びＮＭ＿００８０９３（ＮＰ＿０３２１１９アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；及び３）ＮＰ＿００１０１９４８７（ＲａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓＧａｔａ５アミノ酸配列）、及びＮＭ＿００１０２４３１６（ＮＰ＿００１０１９４８７アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）を参照できる。
【００８４】
Ｇａｔａ６ポリペプチドのアミノ酸配列、及びＧａｔａ６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は当該分野で知られている。例えばゲンバンクアクセッション番号：１）ＮＰ＿００５２４８（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＧａｔａ６アミノ酸配列）、及びＮＭ＿００５２５７（ＮＰ＿００５２４８アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；２）ＮＰ＿０６２０５８（ＲａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓＧａｔａ６アミノ酸配列）及びＮＭ＿０１９１８５（ＮＰ＿０６２０５８アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；３）ＮＰ＿０３４３８８（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓＧａｔａ６アミノ酸配列）、及びＮＭ＿０１０２５８（ＮＰ＿０３４３８８アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）を参照できる。
【００８５】
一部の実施形態においては、Ｇａｔａ４ポリペプチドの適当な機能的等価物はＧａｔａ５ポリペプチド又はＧａｔａ６ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドである。
【００８６】
一部の実施形態においては、Ｇａｔａ４ポリペプチドの機能的等価物をコードする適当なヌクレオチド配列はＧａｔａ５ポリペプチド又はＧａｔａ６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００８７】
Ｍｅｆ２ｃ
Ｍｅｆ２ｃ（筋細胞特異的エンハンサー因子２ｃ）は多くの筋特異的遺伝子の調節領域に存在するＭＥＦ２エレメント（例えばコンセンサス配列：５′−ＣＴ（Ａ／ｔ）（ａ／ｔ）ＡＡＡＴＡＧ−３′）に特異的に結合する転写活性化物質である。例えばＡｎｄｒｓ等、（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２３２４６を参照できる。Ｍｅｆ２ｃは１つ以上の翻訳後修飾、例えばＳｅｒ−５９及びＳｅｒ−３９６上のホスホリル化；ｙｓ−３９１上のスモイル化；及びＬｙｓ−４上のアセチル化を包含できる。
【００８８】
種々の種に由来するＭｅｆ２ｃポリペプチドのアミノ酸配列及びＭｅｆ２ｃポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は当該分野で知られている。例えば１）ゲンバンクアクセッション番号ＸＰ＿００１０５６６９２（ＲａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓＭｅｆ２ｃアミノ酸配列）；及びゲンバンクアクセッション番号ＸＭ＿００１０５６６９２（ＲａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓＭｅｆ２ｃコードヌクレオチド配列）；２）ゲンバンクアクセッション番号ＮＰ＿０７９５５８．１（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓＭｅｆ２ｃアイソフォーム２アミノ酸配列）；及びゲンバンクアクセッション番号ＮＭ＿０２５２８２（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓＭｅｆ２ｃアイソフォーム２コードヌクレオチド配列）；３）ゲンバンクアクセッション番号ＮＰ＿００１１６４００８（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓＭｅｆ２ｃアイソフォーム１アミノ酸配列）；及びゲンバンクアクセッション番号ＮＭ＿００１１７０５３７（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓＭｅｆ２ｃアイソフォーム１コードヌクレオチド配列）；４）ゲンバンクアクセッション番号ＮＰ＿００１１２４４７７（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＭｅｆ２ｃアイソフォーム２アミノ酸配列）；及びゲンバンクアクセッション番号ＮＭ＿００１１３１００５（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＭｅｆ２ｃアイソフォーム２コードヌクレオチド配列）；５）ゲンバンクアクセッション番号ＮＰ＿００２３８８（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＭｅｆ２ｃアイソフォーム１アミノ酸配列）；及びゲンバンクアクセッション番号ＮＭ＿００２３９７（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＭｅｆ２ｃアイソフォーム１コードヌクレオチド配列）を参照できる。
【００８９】
一部の実施形態においては、適当なＭｅｆ２ｃ核酸は配列番号１６に示すヌクレオチド配列の約９００ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、約１０００ｎｔ〜約１１００ｎｔ、約１１００ｎｔ〜約１２００ｎｔ、約１２００ｎｔ〜１３００ｎｔ、又は約１３００ｎｔ〜１３９２ｎｔの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００９０】
一部の実施形態においては、適当なＭｅｆ２ｃ核酸は配列番号１８に示すヌクレオチド配列の約９００ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、約１０００ｎｔ〜約１１００ｎｔ、約１１００ｎｔ〜約１２００ｎｔ、約１２００ｎｔ〜１３００ｎｔ、又は約１３００ｎｔ〜１４２２ｎｔの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態においては、適当なＭｅｆ２ｃ核酸は配列番号２３に示すヌクレオチド配列の約９００ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、約１０００ｎｔ〜約１１００ｎｔ、約１１００ｎｔ〜約１２００ｎｔ、又は約１２００ｎｔ〜１２９６ｎｔの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００９１】
適当なＭｅｆ２ｃ核酸は配列番号１５に示すアミノ酸配列の約３５０アミノ酸（ａａ）〜約４００ａａ、又は約４００ａａ〜４６３ａａの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。コードされるＭｅｆ２ｃポリペプチドは生物学的に活性であり、例えば、プロモーター中のＭＥＦ２Ｃエレメントを認識して結合し；そしてプロモーターに作動可能に連結している遺伝子の転写を活性化させる。
【００９２】
一部の実施形態においては、適当なＭｅｆ２ｃポリペプチドは配列番号２４に示すアミノ酸配列の約３５０アミノ酸（ａａ）〜約４００ａａ、又は約４００ａａ〜４３２ａａの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。コードされるＭｅｆ２ｃポリペプチドは生物学的に活性であり、例えば、プロモーター中のＭＥＦ２Ｃエレメントを認識して結合し；そしてプロモーターに作動可能に連結した遺伝子の転写を活性化させる。
【００９３】
適当なＭｅｆ２ｃ核酸はＭｅｆ２ｃポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、適当なＭｅｆ２ｃポリペプチドは配列番号１７に示すアミノ酸配列の約３５０アミノ酸（ａａ）〜約４００ａａ、又は約４００ａａ〜４７３ａａの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。コードされるＭｅｆ２ｃポリペプチドは生物学的に活性であり、例えば、プロモーター中のＭＥＦ２Ｃエレメントを認識して結合し；そしてプロモーターに作動可能に連結した遺伝子の転写を活性化させる。
【００９４】
一部の実施形態においては、Ｍｅｆ２ｃポリペプチドに機能的に等価なポリペプチド（又はそのような機能的等価物をコードするヌクレオチド配列）を使用する。例えば、一部の実施形態においては、Ｍｅｆ２ａポリペプチド（又はＭｅｆ２ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）を使用する。他の実施形態において、Ｍｅｆ２ｂポリペプチド（又はＭｅｆ２ｂポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）を使用する。他の実施形態において、Ｍｅｆ２ｄポリペプチド（又はＭｅｆ２ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）を使用する。
【００９５】
Ｍｅｆ２ａ、Ｍｅ２ｂ、及びＭｅｆ２ｄポリペプチドのアミノ酸配列はＭｅｆ２ａ、Ｍｅ２ｂ、及びＭｅｆ２ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と同様に知られている。例えば、ゲンバンクアクセッション番号：１）ＮＰ＿００５５７８．２（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＭｅｆ２ａアイソフォーム１アミノ酸配列）、及びＮＭ＿００５５８７（ＮＰ＿００５５７８．２アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；２）ＮＰ＿００１１２４３９８．１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＭｅｆ２ａアイソフォーム２アミノ酸配列）、及びＮＭ＿００１１３０９２６（ＮＰ＿００１１２４３９８．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；３）ＮＰ＿００１１２４３９９．１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＭｅｆ２ａアイソフォーム３アミノ酸配列）、及びＮＭ＿００１１３０９２７（ＮＰ＿００１１２４３９９．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；４）ＮＰ＿００１１２４４００．１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＭｅｆ２ａアイソフォーム４アミノ酸配列）、及びＮＭ＿００１１３０９２８（ＮＰ＿００１１２４４００．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；５）ＮＰ＿００１１３９２５７．１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＭｅｆ２ｂアイソフォームａアミノ酸配列）、及びＮＭ＿００１１４５７８５（ＮＰ＿００１１３９２５７．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；６）ＮＰ＿００５９１０．１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＭｅｆ２ｂアイソフォームｂアミノ酸配列）、及びＮＭ＿００５９１９（ＮＰ＿００５９１０．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；７）ＮＰ＿０３２６０４．２（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓＭｅｆ２ｂアイソフォーム１アミノ酸配列）、及びＮＭ＿００８５７８（ＮＰ＿０３２６０４．２アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；８）ＮＰ＿００１０３８９４９．１（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓＭｅｆ２ｂアイソフォーム２アミノ酸配列）、及びＮＭ＿００１０４５４８４（ＮＰ＿００１０３８９４９．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；９）ＮＰ＿００５９１１．１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＭｅｆ２ｄアミノ酸配列）、及びＮＭ＿００５９２０（ＮＰ＿００５９１１．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；及び１０）ＮＰ＿５９８４２６．１（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓＭｅｆ２ｄアミノ酸配列）、及びＮＭ＿１３３６６５（ＮＰ＿５９８４２６．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）を参照できる。
【００９６】
一部の実施形態においては、Ｍｅｆ２ｃポリペプチドの適当な機能的等価物はＭｅｆ２ａポリペプチド、Ｍｅｆ２ｂポリペプチド、又はＭｅｆ２ｄポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドである。
【００９７】
一部の実施形態においては、Ｍｅｆ２ｃポリペプチドの機能的等価物をコードする適当なヌクレオチド配列はＭｅｆ２ａポリペプチド、ａＭｅｆ２ｂポリペプチド、又はａＭｅｆ２ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００９８】
Ｔｂｘ５
Ｔｂｘ５（Ｔ−ボックス転写因子５）は一部の遺伝子のプロモーター領域におけるＴ−ボックス（例えばコンセンサス配列５’−（Ａ／Ｇ）ＧＧＴＧＴ−３’を有するエレメント）と結合してこれを認識する転写因子であり；そしてそのようなプロモーターに作動可能に連結した遺伝子の転写を活性化する。
【００９９】
種々の種に由来するＴｂｘ５ポリペプチドに関するアミノ酸配列、及びＴｂｘ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は当該分野で知られている。例えば：１）ゲンバンクアクセッション番号ＣＡＡ７０５９２．１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＴｂｘ５アミノ酸配列）；及びゲンバンクアクセッション番号Ｙ０９４４５（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＴｂｘ５コードヌクレオチド配列）；２）ゲンバンクアクセッション番号ＮＰ＿０００１８３（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＴｂｘ５アミノ酸配列）；及びゲンバンクアクセッション番号ＮＭ＿０００１９２（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＴｂｘ５コードヌクレオチド配列）；３）ゲンバンクアクセッション番号ＮＰ＿００１００９９６４．１（ＲａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓＴｂｘ５アミノ酸配列）；及びゲンバンクアクセッション番号ＮＭ＿００１００９９６４（ＲａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓＴｂｘ５コードヌクレオチド配列；４）ゲンバンクアクセッション番号ＮＰ＿０３５６６７（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓＴｂｘ５アミノ酸配列）；及びＮＭ＿０１１５３７（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓＴｂｘ５コードヌクレオチド配列）；５）ゲンバンクアクセッション番号ＮＰ＿００１０７９１７０（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓＴｂｘ５アミノ酸配列）；及びゲンバンクアクセッション番号ＮＭ＿００１０８５７０１（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓＴｂｘ５コードヌクレオチド配列）を参照できる。
【０１００】
一部の実施形態においては、適当なＴｂｘ５核酸は配列番号２０に示すヌクレオチド配列の約９００ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、約１２００ｎｔ〜１３００ｎｔ、約１３００ｎｔ〜約１４００ｎｔ、又は約１４００ｎｔ〜約１５００ｎｔ、又は約１５００ｎｔ〜１５４２ｎｔの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態においては、適当なＴｂｘ５核酸は配列番号２５に示すヌクレオチド配列の約９００ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、約１２００ｎｔ〜１３００ｎｔ、約１３００ｎｔ〜約１４００ｎｔ、又は約１４００ｎｔ〜約１５００ｎｔ、又は約１５００ｎｔ〜１５６０ｎｔの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１０１】
一部の実施形態においては、適当なＴｂｘ５核酸は配列番号２２に示すヌクレオチド配列の約９００ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、約１２００ｎｔ〜１３００ｎｔ、約１３００ｎｔ〜約１４００ｎｔ、又は約１４００ｎｔ〜約１５００ｎｔ、又は約１５００ｎｔ〜１５５７の連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１０２】
適当なＴｂｘ５核酸はＴｂｘ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態においては、適当なＴｂｘ５ポリペプチドは配列番号１９に示すアミノ酸配列の約３５０アミノ酸（ａａ）〜約４００ａａ、約４００ａａ〜約５００ａａ、又は約５００ａａ〜５１３ａａの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態においては、適当なＴｂｘ５ポリペプチドは配列番号２６に示すアミノ酸配列の約３５０アミノ酸（ａａ）〜約４００ａａ、約４００ａａ〜約５００ａａ、又は約５００ａａ〜５１８ａａの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。コードされる。 Ｔｂｘ５ポリペプチドは生物学的に活性であり、例えば、プロモーター中のＴｂｘ５結合部位（例えば、コンセンサス配列５’−（Ａ／Ｇ）ＧＧＴＧＴ−３’を有するエレメント）を認識して結合し；そしてプロモーターに作動可能に連結した遺伝子の転写を活性化させる。
【０１０３】
適当なＴｂｘ５核酸はＴｂｘ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、一部の実施形態においては、適当なＴｂｘ５ポリペプチドは配列番号２１に示すアミノ酸配列の約３５０アミノ酸（ａａ）〜約４００ａａ、約４００ａａ〜約５００ａａ、又は約５００ａａ〜５１８ａａの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。コードされるＴｂｘ５ポリペプチドは生物学的に活性であり、例えば、プロモーター中のＴｂｘ５結合部位（例えばコンセンサス配列５’−（Ａ／Ｇ）ＧＧＴＧＴ−３’を有するエレメント）を認識して結合し；そしてプロモーターに作動可能に連結した遺伝子の転写を活性化させる。
【０１０４】
Ｍｅｓｐ１
一部の実施形態においては、適当な中胚葉後蛋白（Ｍｅｓｐ１）核酸は配列番号３０に示すヌクレオチド配列の約６００ヌクレオチド〜約８００ヌクレオチド（ｎｔ）、又は８０４ｎｔの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１０５】
適当なＭｅｓｐ１核酸はＭｅｓｐ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、一部の実施形態においては、適当なＭｅｓｐ１ポリペプチドは配列番号２９に示すアミノ酸配列の約２００アミノ酸（ａａ）〜約２５０ａａ、又は約２５０ａａ〜２６８ａａの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。コードされるＭｅｓｐ１ポリペプチドは生物学的に活性である。
【０１０６】
Ｎｋｘ２−５
一部の実施形態においては、適当なＮｋｘ２−５核酸は配列番号３２に示すヌクレオチド配列の約３５０ヌクレオチド〜約４５０ヌクレオチド（ｎｔ）、又は４５６ｎｔの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態においては、適当なＮｋｘ２−５核酸は配列番号３４に示すヌクレオチド配列の約８５０ヌクレオチド〜約９５０ヌクレオチド（ｎｔ）、又は９７５ｎｔの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態においては、適当なＮｋｘ２−５核酸は配列番号３６に示すヌクレオチド配列の約２３０ヌクレオチド〜約３３０ヌクレオチド（ｎｔ）、又は３３９ｎｔの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１０７】
適当なＮｋｘ２−５核酸はＮｋｘ２−５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、一部の実施形態においては、適当なＮｋｘ２−５ポリペプチドは配列番号３１に示すアミノ酸配列の約１２５アミノ酸（ａａ）〜約１５０ａａの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態においては、適当なＮｋｘ２−５ポリペプチドは配列番号３３に示すアミノ酸配列の約２７５アミノ酸（ａａ）〜約３００ａａ、又は約３００ａａ〜約３２４ａａの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態においては、適当なＮｋｘ２−５ポリペプチドは配列番号３５に示すアミノ酸配列の約７５アミノ酸（ａａ）〜約１００ａａ、又は約１００ａａ〜約１１２ａａの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。コードされるＮｋｘ２−５ポリペプチドは生物学的に活性である。
【０１０８】
Ｉｓｌ−１
一部の実施形態においては、適当なｉｓｌｅｔ−１（Ｉｓｌ−１）核酸は配列番号３８に示すヌクレオチド配列の約９００ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、又は１０５０ｎｔの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１０９】
適当なＩｓｌ−１核酸はＩｓｌ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、一部の実施形態においては、適当なＩｓｌ−１ポリペプチドは配列番号３７に示すアミノ酸配列の約３００アミノ酸（ａａ）〜約３２５ａａ、又は約３２５ａａ〜３４６ａａの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。コードされるＩｓｌ−１ポリペプチドは生物学的に活性である。
【０１１０】
Ｍｙｏｃｄ
一部の実施形態においては、適当なミオカルジン（Ｍｙｏｃｄ）核酸は配列番号４０に示すヌクレオチド配列の約１５００ヌクレオチド〜約２０００ヌクレオチド（ｎｔ）、又は２０５５ｎｔの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態においては、適当なＭｙｏｃｄ核酸は配列番号４２に示すヌクレオチド配列の約２５００ヌクレオチド〜約２９００ヌクレオチド（ｎｔ）、又は２９６１ｎｔの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態においては、適当なＭｙｏｃｄ核酸は配列番号４４に示すヌクレオチド配列の約２５００ヌクレオチド〜約２８００ヌクレオチド（ｎｔ）、又は２８７１ｎｔの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１１１】
適当なＭｙｏｃｄ核酸はＭｙｏｃｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで一部の実施形態においては、適当なＭｙｏｃｄポリペプチドは配列番号３９に示すアミノ酸配列の約６００アミノ酸（ａａ）〜約６５０ａａ、又は約６５０ａａ〜６８４ａａの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態においては、適当なＭｙｏｃｄポリペプチドは配列番号４１に示すアミノ酸配列の約９００アミノ酸（ａａ）〜約９５０ａａ、又は約９５０ａａ〜９８６ａａの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態においては、適当なＭｙｏｃｄポリペプチドは配列番号４３に示すアミノ酸配列の約９００アミノ酸（ａａ）〜約９２５ａａ、又は約９２５ａａ〜９３８ａａの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。コードされるＭｙｏｃｄポリペプチドは生物学的に活性である。
【０１１２】
Ｓｍｙｄ１
一部の実施形態においては、適当なＳｍｙｄ１核酸は配列番号４６に示すヌクレオチド配列の約１４００ヌクレオチド〜約１４５０ヌクレオチド（ｎｔ）、又は約１４５０ｎｔ〜１４７３ｎｔの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１１３】
適当なＳｍｙｄ１核酸はＳｍｙｄ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで一部の実施形態においては、適当なＳｍｙｄ１ポリペプチドは配列番号４５に示すアミノ酸配列の約４００アミノ酸（ａａ）〜約４５０ａａ、又は約４５０ａａ〜４９０ａａの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。コードされるＳｍｙｄ１ポリペプチドは生物学的に活性である。
【０１１４】
Ｓｒｆ
一部の実施形態においては、適当なＳｒｆ核酸は配列番号４８に示すヌクレオチド配列の約１４５０ヌクレオチド〜約１５００ヌクレオチド（ｎｔ）、又は約１５００ｎｔ〜１５２７ｎｔの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１１５】
適当なＳｒｆ核酸はＳｒｆポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで一部の実施形態においては、適当なＳｒｆポリペプチドは配列番号４７に示すアミノ酸配列の約４５０アミノ酸（ａａ）〜約５００ａａ、又は約５００ａａ〜５０８ａａの連続ストレッチと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。コードされるＳｒｆポリペプチドは生物学的に活性である。
【０１１６】
リプログラミング因子１つ以上（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つ以上；又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット） をコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上の導入は、生後腺維芽細胞を心筋細胞にリプログラミングするために十分であることが解っている。即ち、生後線維芽細胞は線維芽細胞を幹細胞に、又は先祖細胞を生後線維芽細胞にリプログラミングする誘導因子（例えば何れかの他の外因性ポリペプチド；いずれかの他の外因性ポリペプチドをコードする何れかの他の核酸）を導入する必要なく、リプログラミングされて心筋細胞となることができる。例えば本発明方法は外因性Ｓｏｘ２ポリペプチド、外因性Ｏｃｔ−３／４ポリペプチド、外因性ｃ−Ｍｙｃポリペプチド、外因性Ｋｌｆ４ポリペプチド、外因性Ｎａｎｏｇポリペプチド、又は外因性Ｌｉｎ２８ポリペプチドの何れかを生後線維芽細胞内に導入することを必要とせず、そしてそれを包含しない。本発明方法は線維芽細胞を幹細胞又は先祖細胞にリプログラミングするＳｏｘ２、Ｏｃｔ−３／４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、又は何れかの他のポリペプチドの何れかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を生後線維芽細胞に導入することを必要とせず、そしてそれを包含しない。
【０１１７】
上記した通り、誘導心筋を発生させるためには、生後線維芽細胞をプログラミング因子１つ以上（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つ以上；又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上で遺伝子的に修飾する。誘導心筋は心筋細胞特異的マーカー１つ以上を発現し、ここで心筋細胞特異的マーカーは、心トロポニンＩ、心トロポニン−Ｃ、トロポミオシン、カベオリン−３、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖−２ａ、ミオシン軽鎖−２ｖ、リアノジン受容体、筋節α−アクチニン、Ｎｋｘ２．５、コネキシン４３、及び心房ナトリウム排泄増加性因子を包含するがこれらに限定されない。誘導心筋細胞は又、筋節構造を呈することができる。誘導心筋細胞は心筋細胞特異的遺伝子Ａｃｔｃ１（心α−アクチン）、Ｍｙｈ６（α−ミオシン重鎖）、Ｒｙｒ２（リアノジン受容体２）、及びＧｊａ１（コネキシン４３）の増大した発現を呈する。Ｃｏｌ１ａ２（コラーゲン１ａ２）のような線維芽細胞マーカーの発現はｉＣＭの誘導元である線維芽細胞と比較して誘導心筋細胞においてダウンレギュレートされる。
【０１１８】
心筋細胞に特異的な種々のマーカーの発現は従来の生化学的又は免疫化学的な方法（例えば酵素結合免疫吸着試験；免疫組織化学試験等）により検出される。或いは、心筋細胞特異的マーカーをコードする核酸の発現を検査できる。細胞中の心筋細胞特異的マーカーコード核酸の発現は逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）又はハイブリダイゼーション分析、分子生物学的方法により確認することができ、これらは何れかのマーカー蛋白に関してコーディングしているｍＲＮＡを増幅、検出及び分析するために過去より一般的に使用されている。心筋細胞に特異的なマーカーに関してコーディングしている核酸配列は知られており、そして、ゲンバンクのような公的データベースを通じて入手可能であり；即ち、プライマー又はプローブとして使用するために必要なマーカー特異的配列は容易に調べられる。
【０１１９】
誘導心筋細胞はまた自発的収縮を呈することができる。誘導心筋細胞が自発的収縮を呈するかどうかは、標準的な電気生理学的方法（例えばパッチクランプ）を用いて調べることができ；適当な方法は実施例に記載するとおりである。
【０１２０】
誘導心筋細胞は又、自発的Ｃａ２＋振動を呈することができる。Ｃａ２＋振動は標準的な方法を用いて、例えば種々のカルシウム感受性染料の何れかを用いて検出できる。細胞内Ｃａ２＋イオン検出染料はフラ−２、ビス−フラ２、インド−１、キン−２、キン−２ＡＭ、ベンゾチアザ−１、ベンゾチアザ−２、インド−５Ｆ、フラ−ＦＦ、ＢＴＣ、マグ−フラ−２、マグ−フラ−５、マグ−インド−１、フルオ−３、ロド−２、ロド−３、フラ−４Ｆ、フラ−５Ｆ、フラ−６Ｆ、フルオ−４、フルオ−５Ｆ、フルオ−５Ｎ、オレゴングリーン４８８ＢＡＰＴＡ、カルシウムグリーン、カルセイン、フラ−Ｃ１８、カルシウムグリーン−Ｃ１８、カルシウムオレンジ、カルシウムクリムゾン、カルシウムグリーン−５Ｎ、マグネシウムグリーン、オレゴングリーン４８８ＢＡＰＴＡ−１、オレゴングリーン４８８ＢＡＰＴＡ−２、Ｘ−ロド−１、フラＲｅｄ、ロード−５Ｆ、ロード−５Ｎ、Ｘ−ロード−５Ｎ、マグ−ロード−２、マグ−Ｘ−ロード−１、フルオ−５Ｎ、フルオ−５Ｆ、フルオ−４ＦＦ、マグ−フルオ−４、エクオリン、デキストランコンジュゲート又はこれらの染料の何れかの何れか他の誘導体、及びその他のものを包含するがこれらに限定されない（例えばMolecular Probes、Eugeneのカタログ又はインターネットサイトを参照でき、又、Nuccitelli編、Methods in Cell Biology,Volume 40:A Practical Guide to the Study of Calcium in Living Cells,Academic Press(1994);Lambert編、Calcium Signaling Protocols(Methods in Molecular Biology Volume 114),Humana Press(1999);W.T.Mason編、Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity.A Practical Guide to Technology for Quantitative Real-Time Analysis,Second Ed,Academic Press(1999);Calcium Signaling Protocols(Methods in Molecular Biology),2005,D.G.Lamber編、Humana Pressも参照できる）。
【０１２１】
後線維芽細胞への外因性リプログラミング因子ポリペプチドの導入
一部の実施形態においては、外因性リプログラミング因子ポリペプチド（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つ以上；又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）の生後線維芽細胞への導入は外因性リプログラミング因子ポリペプチドに生後線維芽細胞を接触させることにより達成され、その場合、外因性リプログラミング因子ポリペプチドは細胞内に取り込まれる。
【０１２２】
一部の実施形態においては、各々の外因性リプログラミング因子ポリペプチドは蛋白形質導入ドメインを含む。非限定的な例として、外因性Ｇａｔａ４ポリペプチド、外因性Ｍｅｆ２Ｃポリペプチド及びＴｂｘ４ポリペプチドは蛋白形質導入ドメインに共有結合的に、又は非共有結合的に連結される。
【０１２３】
「蛋白形質導入ドメイン」又はＰＴＤとは、脂質２層、ミセル、細胞膜、小器官膜、又は小胞膜の通過を促進するポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、又は有機又は無機の化合物を指す。別の分子に結合したＰＴＤは分子が膜を通過すること、例えば細胞外空間から細胞内空間に、又はシトゾルから小器官内に進むことを促進する。一部の実施形態においては、ＰＴＤはリプログラミング因子ポリペプチド（例えば、Ｇａｔａ４ポリペプチド、Ｍｅｆ２ｃポリペプチド、又はＴｂｘ５ポリペプチド）のアミノ末端に共有結合する。一部の実施形態においては、ＰＴＤはリプログラミング因子ポリペプチド（例えば、Ｇａｔａ４ポリペプチド、Ｍｅｆ２ｃポリペプチド、又はＴｂｘ５ポリペプチド）のカルボキシル末端に共有結合する。
【０１２４】
例示される蛋白形質導入ドメインは最小ウンデカペプチド蛋白形質導入ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを含むＨＩＶ−１ＴＡＴの残基４７〜５７に相当；配列番号１）；細胞内への直接進入のために十分なアルギニンの数を含むポリアルギニン配列（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０〜５０アルギニン）；ＶＰ２２ドメイン（Zender等、Cancer Gene Ther.2002 June;9(6):489-96);Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ蛋白形質導入ドメイン（Noguchi等、Diabetes 2003; 52(7):1732-1737);トランケーションされたヒトカルシトニンペプチド(Trehin等、Pharm.Research,21:1248-1256、2004); ポリリジン (Wender等、PNAS,Vol.97:13003-13008);ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号２）；ＴｒａｎｓｐｏｒｔａｎＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号３）；ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号４）；及びＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５）を包含するがこれらに限定されない。例示されるＰＴＤはＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号６）；３アルギニン残基〜５０アルギニン残基のアルギニンホモポリマーを包含するがこれらに限定されず；例示されるＰＴＤドメインアミノ酸配列は以下の何れか：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）；ＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号６）；ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号７）；ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号８）；及びＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号９）を包含するがこれらに限定されない。
【０１２５】
一部の実施形態においては、外因性リプログラミング因子ポリペプチド（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つ以上；又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）は３アルギニン残基〜５０アルギニン残基、例えば３〜６アルギニン残基、６〜１０アルギニン残基、１０〜２０アルギニン残基、２０〜３０アルギニン残基、３０〜４０アルギニン残基、又は４０〜５０アルギニン残基のアルギニンホモポリマーを含む。一部の実施形態においては、外因性リプログラミング因子ポリペプチド（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つ以上；又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）はリプログラミング因子ポリペプチドのアミノ末端に共有結合した（例えばペプチド結合による）６つのＡｒｇ残基を含む。一部の実施形態においては、外因性リプログラミング因子ポリペプチドはリプログラミング因子ポリペプチドのカルボキシ末端に共有結合した（例えばペプチド結合による）６つのＡｒｇ残基を含む。
【０１２６】
宿主生後線維芽細胞内に導入された外因性リプログラミング因子ポリペプチドs（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つ以上；又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）  は例えば少なくとも約７５％純粋、少なくとも約８０％純粋、少なくとも約８５％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９８％純粋、少なくとも約９９％純粋、又は９９％超純粋まで精製でき、例えば、細胞内に導入されるリプログラミング因子以外の蛋白が非含有となり、そして、細胞内に導入されるリプログラミング因子以外の巨大分子が非含有となるまで精製できる。
【０１２７】
生後線維芽細胞の遺伝子的修飾
一部の実施形態においては、生後線維芽細胞内への外因性リプログラミング因子ポリペプチド（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つ以上；又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）の導入はリプログラミング因子ポリペプチドs（例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つ以上；又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸１つ以上による生後線維芽細胞の遺伝子的修飾により達成される。以下の考察においては、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆ (又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）の１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸１つ以上は「外因性核酸１つ以上」と包括的に称する。
【０１２８】
上記した外因性リプログラミング因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸１つ以上は組み換え発現ベクターであることができ、その場合、適当なベクターは例えば組み換えレトロウィルス、レンチウィルス、及びアデノウィルス；レトロウィルス発現ベクター、レンチウィルス発現ベクター、核酸発現ベクター、及びプラスミド発現ベクターを包含する。一部の場合において、外因性核酸１つ以上は宿主生後線維芽細胞及びその子孫のゲノム内に組み込まれる。別の場合においては、外因性核酸１つ以上は宿主生後線維芽細胞およびその子孫中エピソーム状態で存続する。一部の場合において、リプログラミング因子コード核酸の内因性の天然のバージョンは細胞内に既に存在してよいが、追加的な「外因性遺伝子」を宿主生後線維芽細胞に与えることによりリプログラミング因子の発現を増大させる。別の場合においては、外因性リプログラミング因子コード核酸は、宿主生後線維芽細胞内の内因性リプログラミング因子コード核酸二位よりコードされるポリペプチドとはアミノ酸１つ以上が異なるアミノ酸配列を有するリプログラミング因子ポリペプチドをコードする。
【０１２９】
一部の実施形態においては、生後線維芽細胞はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの１つをコードするヌクレオチド配列を各々が含む、別個の発現コンストラクト（発現ベクター）３つにより遺伝子的に修飾される。一部の実施形態においては、発現コンストラクトはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆの２つ以上をコードするヌクレオチド配列を含むことになる。
【０１３０】
一部の実施形態においては、生後線維芽細胞はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５の１つをコードするヌクレオチド配列を各々が含む、別個の発現コンストラクト（発現ベクター）３つにより遺伝子的に修飾される。一部の実施形態においては、発現コンストラクトはＧａｔａ４及びＭｅｆ２ｃの両方、Ｇａｔａ４及びＴｂｘ５の両方、又はＭｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５の両方をコードするヌクレオチド配列を含むことになる。一部の実施形態においては、発現コンストラクトはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５をコードするヌクレオチド配列を含むことになる。
【０１３１】
一部の実施形態においては、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆ（又はサブセット、例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５)ポリペプチドの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸１つ以上はインビトロで単一の生後線維芽細胞（例えば、単一の生後線維芽細胞宿主細胞）内に導入される。他の実施形態において、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆ（又はサブセット、例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５)ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸１つ以上はインビトロで生後線維芽細胞の集団（例えば、宿主生後線維芽細胞の集団)内に導入される。一部の実施形態においては、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆ（又はサブセット、例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５)ポリペプチド１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸１つ以上はインビボで生後線維芽細胞（例えば、単一の生後線維芽細胞又は生後線維芽細胞の集団)内に導入される。
【０１３２】
生後線維芽細胞の集団がＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆ（又はサブセット、例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５)ポリペプチドの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸１つ以上で遺伝子的に修飾される（インビトロ又はインビボ）場合、外因性核酸１つ以上は生後線維芽細胞の総集団の２０％超、例えば２５％、３０％、３５％、４０％、４４％、５０％、５７％、６２％、７０％、７４％、７５％、８０％、９０％、又は２０％超の他パーセントの細胞内に導入できる。
【０１３３】
一部の実施形態においては、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆ（又はサブセット、例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５)ポリペプチドの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上は、遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞中のリプログラミング因子ポリペプチド１つ以上の生産を可能にする発現コンストラクトである。一部の実施形態においては、発現コンストラクトはウィルスコンストラクト、例えば組み換えアデノ関連ウィルスコンストラクト（例えば米国特許第７，０７８，３８７参照）、組み換えアデノウィルスコンストラクト、組み換えレンチウィルスコンストラクト等である。
【０１３４】
適当な発現ベクターは、ウィルスベクター（例えば、ワクシニアウィルス系ウィルスベクター;ポリオウィルス;アデノウィルス(例えばLi等、Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549,1994;Borras等、Gene Ther 6:515 524,1999;Li and Davidson,PNAS 92:7700 7704,1995;Sakamoto等、H Gene Ther 5:1088 1097,1999;国際特許出願公開９４／１２６４９，国際特許出願公開９３／０３７６９；国際特許出願公開９３／１９１９１；国際特許出願公開９４／２８９３８；国際特許出願公開９５／１１９８４及び国際特許出願公開９５／００６５５参照）；アデノ関連ウィルス（例えばAli等、Hum Gene Ther 9:81 86,1998,Flannery等、PNAS 94:6916 6921,1997;Bennett等、Invest Opthalmol Vis Sci38:2857-2863,1997;Jomary等、Gene Ther4:683-690,1997,Rolling等、Hum Gene Ther 10:641 648,1999;Ali等、Hum Mol Genet 5:591-594,1996;Srivastava、国際特許出願公開９３／０９２３９、Samulski等、J. Vir.(1989)63:3822 3828;Mendelson等、Virol. (1988)166:154 165；及びFlotte等、PNAS(1993)90:10613-10617参照);ＳＶ４０；単純疱疹ウィルス；ヒト免疫不全ウィルス（例えばMiyoshi等、PNAS94:10319-23,1997;Takahashi等、J Virol73:7812 7816,1999参照);レトロウィルスベクター（例えば、ネズミ白血病ウィルス、脾臓壊死ウィルス、及びレトロウィルスから派生させたベクター、例えばラウス筋節ウィルス、ハーベイ筋節ウィルス、トリ白血病ウィルス、レンチウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、骨髄増殖性筋節ウィルス、乳癌ウィルス）等を包含するがこれらに限定されない。
【０１３５】
多くの適当な発現ベクターが当該分野で知られており、そして多くのものが商業的に入手可能である。以下のベクターが例示のため提示され、真核生物宿主細胞に関してはｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられる。しかしながら、何れかの他のベクターも、宿主細胞と適合する限りにおいて使用してよい。
【０１３６】
使用する宿主／ベクター系に応じて、多くの適当な転写及び翻訳の制御エレメントの何れか、例えば、構成及び誘導プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター等を発現ベクター中で使用してよい（例えばBitter等、(1987)Methods in Enzymology,153:516-544参照）。
【０１３７】
一部の実施形態においては、リプログラミング因子コードヌクレオチド配列（例えば、Ｇａｔａ４コードヌクレオチド配列、Ｍｅｆ２ｃコードヌクレオチド配列、Ｔｂｘ５コードヌクレオチド配列）は制御エレメント、例えば転写制御エレメント、例えばプロモーターに作動可能に連結している。転写制御エレメントは真核生物細胞、例えば哺乳類細胞において機能する。適当な転写制御エレメントはプロモーター及びエンハンサーを包含する。一部の実施形態においては、プロモーターは構成的に活性である。他の実施形態において、プロモーターは誘導性である。
【０１３８】
適当な真核生物プロモーター（真核生物細胞中で機能するプロモーター）の非限定的な例はＣＭＶ最初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期及び後期SV40、レトロウィルス由来ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）、及びマウスメタロチオネイン−Ｉを包含する。
【０１３９】
一部の実施形態においては、リプログラミング因子コードヌクレオチド配列は心特異的転写制御エレメント（ＴＲＥ）に作動可能に連結しており、その場合ＴＲＥはプロモーター及びエンハンサーを包含する。適当なＴＲＥは、以下の遺伝子、即ち、ミオシン軽鎖−２、α−ミオシン重鎖、ＡＥ３、心トロポニンＣ、及び心アクチンから派生させたＴＲＥを包含するがこれらに限定されない。Franz等、(1997)Cardiovasc.Res.35:560-566;Robbins等、(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.752:492-505;Linn等、(1995)Circ.Res.76:584-591;Parmacek等、(1994)Mol.Cell.Biol.14:1870-1885;Hunter等、(1993)Hypertension 22:608-617;及びSartorelli等、(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4047-4051.
【０１４０】
適切なベクター及びプロモーターの選択は当該分野で良く知られている。発現ベクターは又、翻訳開始及び転写開始のためのリボソーム結合部位を含有してよい。発現ベクターは又発現を増幅するための適切な配列を包含してよい。
【０１４１】
適当な哺乳類発現ベクター（哺乳類宿主細胞における使用に適する発現ベクター）の例は、組み換えウィルス、核酸ベクター、例えばプラスミド、細菌人工染色体、コウボ人工染色体、ヒト人工染色体、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物発現カセットを包含するがこれらに限定されない。Ｇａｔａ４−、Ｍｅｆ２ｃ−、又はＴｂｘ５コードヌクレオチド配列の発現を駆動するための適当なプロモーターの例はレトロウィルスロングターミナルリピート（ＬＴＲ）エレメント；構成的プロモーター、例えばＣＭＶ、ＨＳＶ１−ＴＫ、ＳＶ４０、ＥＦ−１α、β−アクチン；ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）、及び誘導プロモーター、例えばＴｅｔ−オペレーターエレメントを含有するものを包含するがこれらに限定されない。一部の場合において、哺乳類発現ベクターは外因性Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドのほかに、トランスフェクト又は感染されている細胞の識別又は選択を容易にするマーカー遺伝子をコードする。マーカー遺伝子の例は蛍光蛋白、例えば増強緑色蛍光蛋白、Ｄｓ−Ｒｅｄ（ＤｓＲｅｄ：Ｄｉｓｃｏｓｏｍａｓｐ．赤色蛍光蛋白（ＲＦＰ）；Bevis and Glick(2002)Nat. Biotechnol.20:83)、黄色蛍光蛋白、及びシアノ蛍光蛋白をコードする遺伝子；及び選択剤に対する耐性を付与する蛋白をコードする遺伝子、例えばネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラスチシジン耐性遺伝子等を包含するがこれらに限定されない。
【０１４２】
適当なウィルスベクターの例は、レトロウィルス系のウィルスベクター（レンチウィルスを包含する）；アデノウィルス；及びアデノ関連ウィルスを包含するがこれらに限定されない。適当なレトロウィルス系ベクターの例は、ネズミモロニー白血病ウィルス（ＭＭＬＶ）系のベクターであるが；他の組み換えレトロウィルスも使用してよく、例えばトリ白血症ウィルス、ウシ白血病ウィルス、ネズミ白血病ウィルス（ＭＬＶ）、ミンク細胞フォーカス誘導ウィルス、ネズミ筋節ウィルス、網内皮症ウィルス、テナガザル白血病ウィルス、Ｍａｓｏｎ  Ｐｆｉｚｅｒサルウィルス、又はラウス筋節ウィルスが挙げられ、例えば米国特許６，３３３，１９５を参照できる。
【０１４３】
別の場合においては、レトロウィル系ベクターはレンチウィルス系ベクター（例えば、ヒト免疫不全ウィルス-1 (HIV-1);サル免疫不全ウィルス(SIV);又はネコ免疫不全ウィルス(FIV))であり、例えばJohnston等、(1999),Journal of Virology,73(6):4991-5000 (FIV);Negre D等、(2002),Current Topics in Microbiology and Immunology,261:53-74(SIV); Naldini等、(1996),Science,272:263-267(HIV)を参照できる。
【０１４４】
組み換えレトロウィルスは標的細胞内への進入を支援するためにウィルスポリペプチド（例えばレトロウィルスｅｎｖ）を含んでよい。そのようなウィルスポリペプチドは当該分野で十分樹立されており、例えば米国特許５，４４９，６１４を参照できる。ウィルスポリペプチドは両栄養性ウィルスポリペプチド、例えば両栄養性ｅｎｖであってよく、これは、元の宿主種の外にある細胞を包含する多数の種から派生された細胞内への進入を支援する。ウィルスポリペプチドは元の宿主種の外にある細胞内への進入を支援する異種栄養性ウィルスポリペプチドであってよい。一部の実施形態においては、ウィルスポリペプチドはエコトロピックウィルスポリペプチド、例えばエコトロピックｅｎｖであり、これは元の宿主種の細胞内への進入を支援する。
【０１４５】
細胞内へのレトロウィルスの進入を支援することができるウィルスポリペプチドの例はＭＭＬＶ両栄養性ｅｎｖ、ＭＭＬＶエコトロピックｅｎｖ、ＭＭＬＶ異種栄養性ｅｎｖ、水痘性口内炎ウィルス−ｇ蛋白（ＶＳＶ−ｇ）、ＨＩＶ−１ｅｎｖ、テナガザル白血病ウィルス（ＧＡＬＶ）ｅｎｖ、ＲＤ１１４、ＦｅＬＶ−Ｃ、ＦｅＬＶ−Ｂ、ＭＬＶ１０Ａ１ｅｎｖ遺伝子、及びこれらの変異体、例えばキメラを包含するが、これらに限定されない。例えばYee等、(1994),Methods Cell Biol.,PtA:99-112(VSV-G)；米国特許５，４４９，６１４を参照できる。一部の場合において、ウィルスポリペプチドは発現又は受容体への増強された結合を促進するために遺伝子的に修飾される。
【０１４６】
一般的に、組み換えウィルスはプロデューサー細胞内にウィルスＤＮＡ又はＲＮＡコンストラクトを導入することにより生産される。一部の場合において、プロデューサー細胞は外因性遺伝子を発現しない。別の場合においては、プロデューサー細胞は１つ以上の外因性遺伝子、例えば１つ以上のｇａｇ、ｐｏｌ、又はｅｎｖポリペプチド及び／又は１つ以上のレトロウィルスｇａｇ、ｐｏｌ、又はｅｎｖポリペプチドをコードする遺伝子を含む「パッケージング細胞」である。レトロウィルスパッケージング細胞はウィルスポリペプチドをコードする遺伝子、例えば標的細胞内への進入を支援するＶＳＶ−ｇを含んでよい。一部の場合において、パッケージング細胞は１つ以上のレンチウィルス蛋白、例えばｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、又はｎｅｆをコードする遺伝子を含む。一部の場合において、パッケージング細胞はアデノウィルス蛋白、例えばＥ１Ａ又はＥ１Ｂ又は他のアデノウィルス蛋白をコードする遺伝子を含む。例えば、パッケージング細胞により供給される蛋白は、レトロウィルス派生蛋白、例えばｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ；レンチウィルス派生蛋白、例えばｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、及びｎｅｆ；及びアデノウィルス派生蛋白、例えばＥ１Ａ及びＥ１Ｂであってよい。多くの例において、パッケージング細胞はウィルスベクターの派生元のウィルスとは異なるウィルスから派生させた蛋白を供給する。
【０１４７】
パッケージング細胞系統は何れかの容易にトランスフェクションできる細胞系統を包含するがこれらに限定されない。パッケージング細胞系統は293T細胞、NIH3T3、COS又はHeLa細胞系統に基づくものであることができる。パッケージング細胞は頻繁には、ウィルスパッケージングのために必要な蛋白をコードする遺伝子少なくとも１つにおいて欠失があるウィルスベクタープラスミドをパッケージングするために使用される。そのようなウィルスベクタープラスミドによりコードされる蛋白から欠失している蛋白又はポリペプチドを供給できる何れかの細胞をパッケージング細胞として使用してよい。パッケージング細胞系統の例はＰｌａｔｉｎｕｍ−Ｅ（Ｐｌａｔ−Ｅ）；Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ａ（Ｐｌａｔ−Ａ）；ＢＯＳＣ２３（ＡＴＣＣＣＲＬ１１５５４）；及びＢｉｎｇ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １１２７０）を包含するがこれらに限定されず、例えばMorita等、(2000),Gene Therapy,7:1063-1066; Onishi等、(1996)、Experimental Hematology,24:324-329；米国特許６，９９５，００９を参照できる。市販されているパッケージング系統も有用であり、例えばＡｍｐｈｏ−Ｐａｋ２９３細胞系統、Ｅｃｏ−Ｐａｋ２−２９３細胞系統、ＲｅｔｒｏＰａｃｋＰＴ６７細胞系統、及びＲｅｔｒｏ−ＸＵｎｉｖｅｒｓａｌＰａｃｋａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（全て入手元はＣｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。
【０１４８】
レトロウィルスコンストラクトはある範囲のレトロウィルス、例えばＭＭＬＶ、ＨＩＶ−１、ＳＩＶ、ＦＩＶ、又は本明細書に記載する他のレトロウィルスから派生させて良い。レトロウィルスコンストラクトは特定のウィルスの複製１サイクル超のために必要な全てのウィルスポリペプチドをコードしてよい。一部の場合において、ウィルス進入の効率は他の因子又は他のウィルスポリペプチドの追加により改善する。別の場合においては、レトロウィルスコンストラクトによりコードされるウィルスポリペプチドは米国特許６，８７２，５２８に記載される通り、１サイクルより多い複製を支援しない。そのような状況においては、他の因子又は他のウィルスポリペプチドの追加によりウィルス進入促進を支援できる。例示される実施形態においては、組み換えレトロウィルスはＶＳＶ−ｇポリペプチドを含むがＨＩＶ−１ｅｎｖポリペプチドを含まないＨＩＶ−１ウィルスである。
【０１４９】
レトロウィルスコンストラクトはプロモーター、マルチクローニングサイト、及び／又は耐性遺伝子を含んでよい。プロモーターの例はＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ１α，β−アクチン；レトロウィルスＬＴＲプロモーター及び誘導プロモーターを包含するがこれらに限定されない。レトロウィルスコンストラクトは又パッケージングシグナル（例えばＭＦＧベクターから派生させたパッケージングシグナル；ｐｓｉパッケージングシグシグナル）を含んでよい。当該分野で知られている一部のレトロウィルスコンストラクトの例はｐＭＸ、ｐＢａｂｅＸ又はこれらの派生物を包含するがこれらに限定されない。例えばOnishi等、(1996),Experimental Hematology,24:324-329を参照できる。一部の場合において、レトロウィルスコンストラクトは自己不活性化レンチウィルスベクター（ＳＩＮ）ベクターであり、例えばMiyoshi等、(1998),J.Virol.,72(10):8150-8157を参照できる。一部の場合において、レトロウィルスコンストラクトはＬＬ−ＣＧ、ＬＳ−ＣＧ、ＣＬ−ＣＧ、ＣＳ−ＣＧ、ＣＬＧ又はＭＦＧである。Miyoshi等、(1998),J.Virol.,72(10):8150-8157;Onishi等、(1996),Experimental Hematology,24:324-329;Riviere等、(1995),PNAS,92:6733-6737を参照できる。ウィルスベクタープラスミド（又はコンストラクト）はｐＭＸｓ、ｐＭｘｓ−ＩＢ、ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ、ｐＭＸｓ−ｎｅｏ（ｐＭＸｓ−ＩＢはｐＭＸｓ−ｐｕｒｏのピューロマイシン耐性遺伝子の代わりにブラスチシジン耐性遺伝子を担持しているベクターである）Kimatura等、(2003),Experimental Hematology,31:1007-1014;MFG Riviere等、(1995),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,92:6733-6737;ｐＢａｂｅＰｕｒｏ；Morgenstern等、(1990),Nucleic Acids Research,18:3587-3596;LL-CG,CL-CG,CS-CG,CLG Miyoshi等、(1998),Journal of Virology,72:8150-8157等をレトロウィルス系として、そしてｐＡｄｅｘ１；Kanegae等、(1995),Nucleic Acids Research,23:3816-3821等をアデノウィルス系として包含する。例示される実施形態においては、レトロウィルスコンストラクトはブラスチシジン（例えば、ｐＭＸｓ−ＩＢ）、ピューロマイシン（例えば、ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ、ｐＢａｂｅＰｕｒｏ）；又はネオマイシン（例えば、ｐＭＸｓ−ｎｅｏ）を含む。例えばMorgenstern等、(1990),Nucleic Acids Research、8:3587-3596を参照できる。
【０１５０】
パッケージングシグ細胞から組み換えウィルスを生産する方法及びそれらの使用は十分確立されており；例えば米国特許５，８３４，２５６；６，９１０，４３４；５，５９１，６２４；５，８１７，４９１；７，０７０，９９４；及び６，９９５，００９を参照できる。多くの方法がウィルスコンストラクトをパッケージングシグ細胞系統に導入することから開始する。ウィルスコンストラクトは リン酸カルシウム法、リポフェクション法（Felgner等、(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413-7417)、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、フュージーントランスフェクション等、及び本明細書に記載する何れかの方法を包含するがこれらに限定されない何れかの当該分野で知られている方法により宿主線維芽細胞に導入してよい。
【０１５１】
核酸コンストラクトは細胞の非ウィルス系トランスフェクションのような種々の良く知られた手法を用いて宿主細胞内に導入できる。例示される側面において、コンストラクトはベクター内に取り込まれ、そして宿主細胞内に導入される。細胞への導入はエレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介移行、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソーム媒介移行、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル媒介移行（ナノ粒子）、カチオン重合体媒介移行（ＤＥＡＥデキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等）又は細胞融合を包含するがこれらに限定されない当該分野で知られている何れかの非ウィルス系トランスフェクションにより実施してよい。トランスフェクションの他の方法はトランスフェクション試薬、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ、Ｄｏｊｉｎｄｏ  ＨｉｌｙｍａｘＴＭ、ＦｕｇｅｎｅＴＭ、ｊｅｔＰＥＩＴＭ、ＥｆｆｅｃｔｅｎｅＴＭ、及びＤｒｅａｍＦｅｃｔ?を包含する。
【０１５２】
追加的ポリペプチド
一部の実施形態においては、本発明方法は外因性Ｈｏｐｘポリペプチド、外因性Ｎｋｘ２−５ポリペプチド、外因性Ｈｒｔ２ポリペプチド、外因性Ｐｉｔｘ２ポリペプチド、外因性Ｓｍｙｄ１ポリペプチド、外因性Ｍｙｏｃｄポリペプチド、外因性Ｂａｆ６０ｃポリペプチド、外因性Ｓｒｆポリペプチド、外因性Ｉｓｌ１ポリペプチド、外因性Ｈａｎｄ２ポリペプチド、又は外因性Ｍｅｓｐ１ポリペプチドの何れかを生後線維芽細胞に導入することを必要とせず、そしてそれを包含しない。一部の実施形態においては、本発明方法はＨｏｐｘ、Ｎｋｘ２−５、Ｈｒｔ２、Ｐｉｔｘ２、Ｓｍｙｄ１、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｓｒｆ、Ｉｓｌ１、Ｈａｎｄ２、又はＭｅｓｐ１の何れかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を生後線維芽細胞に導入することを必要とせず、そしてそれを包含しない。しかしながら、他の実施形態において、本発明方法Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５；及び心筋細胞への直接の生後線維芽細胞のリプログラミングに寄与することができる追加的ポリペプチド１つ以上の使用を包含する場合がある。
【０１５３】
生後線維芽細胞は上記した通り修飾（ポリペプチドの生後線維芽細胞への導入による）又は遺伝子的に修飾されることができ、その場合、生後線維芽細胞はＧａｔａ４ポリペプチド、Ｍｅｆ２ポリペプチド、及びＴｂｘ５ポリペプチドで修飾されるか、或いはその場合、生後線維芽細胞はＧａｔａ４ポリペプチド、Ｍｅｆ２ポリペプチド、及びＴｂｘ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上で遺伝子的に修飾される。一部の実施形態においては、１つ以上の追加的ポリペプチド（又はそれをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）が生後線維芽細胞内に導入され、その場合、１つ以上の追加的ポリペプチドはＭｅｓｐ１、Ｉｓｌ１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、Ｓｒｆ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｈｏｐｘ、Ｈｒｔ２、Ｐｉｔｘ２ｃ、及びＮｋｘ２−５から選択される。
【０１５４】
即ち、一部の実施形態においては、生後線維芽細胞はＧａｔａ４ポリペプチド、Ｍｅｆ２ポリペプチド、及びＴｂｘ５ポリペプチド;及び１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のＭｅｓｐ１ポリペプチド、Ｉｓｌ１ポリペプチド、Ｍｙｏｃｄポリペプチド、Ｓｍｙｄ１ポリペプチド、Ｓｒｆポリペプチド、Ｂａｆ６０ｃポリペプチド、Ｈａｎｄ２ポリペプチド、Ｈｏｐｘポリペプチド、Ｈｒｔ２ポリペプチド、Ｐｉｔｘ２ｃポリペプチド、及びＮｋｘ２−５ポリペプチドの生後線維芽細胞内への導入により修飾される。一部の実施形態においては、生後線維芽細胞はＧａｔａ４ポリペプチド、Ｍｅｆ２ポリペプチド、及びＴｂｘ５ポリペプチド；及び１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のＭｅｓｐ１ポリペプチド、Ｉｓｌ１ポリペプチド、Ｍｙｏｃｄポリペプチド、Ｓｍｙｄ１ポリペプチド、Ｓｒｆポリペプチド、Ｂａｆ６０ｃポリペプチド、Ｈａｎｄ２ポリペプチド、Ｈｏｐｘポリペプチド、Ｈｒｔ２ポリペプチド、Ｐｉｔｘ２ｃポリペプチド、及びＮｋｘ２−５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上で遺伝子的に修飾される。以下に例示される非限定的な組み合わせを示す。
【０１５５】
一部の実施形態においては、生後線維芽細胞はＧａｔａ４ポリペプチド、Ｍｅｆ２ポリペプチド、Ｔｂｘ５ポリペプチド、Ｉｓｌ１ポリペプチド、Ｍｅｓｐ１ポリペプチド、Ｍｙｏｃｄポリペプチド、Ｎｋｘ２．５ポリペプチド、Ｓｍｙｄ１ポリペプチド、及びＳｒｆポリペプチドの生後線維芽細胞内への導入により修飾される。一部の実施形態においては、生後線維芽細胞はＧａｔａ４ポリペプチド、Ｍｅｆ２ポリペプチド、Ｔｂｘ５ポリペプチド、Ｉｓｌ１ポリペプチド、Ｍｅｓｐ１ポリペプチド、Ｍｙｏｃｄポリペプチド、Ｎｋｘ２．５ポリペプチド、Ｓｍｙｄ１ポリペプチド、及びＳｒｆポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上により遺伝子的に修飾される。
【０１５６】
一部の実施形態においては、生後線維芽細胞はＧａｔａ４ポリペプチド、Ｍｅｆ２ポリペプチド、Ｔｂｘ５ポリペプチド、Ｍｅｓｐ１ポリペプチド、Ｍｙｏｃｄポリペプチド、及びＮｋｘ２．５ポリペプチドの生後線維芽細胞内への導入により修飾される。一部の実施形態においては、生後線維芽細胞はＧａｔａ４ポリペプチド、Ｍｅｆ２ポリペプチド、Ｔｂｘ５ポリペプチド、Ｍｅｓｐ１ポリペプチド、Ｍｙｏｃｄポリペプチド、及びＮｋｘ２．５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上で遺伝子的に修飾される。
【０１５７】
一部の実施形態においては、生後線維芽細胞はＧａｔａ４ポリペプチド、Ｍｅｆ２ポリペプチド、Ｔｂｘ５ポリペプチド、Ｍｅｓｐ１ポリペプチド、及びＭｙｏｃｄポリペプチドの生後線維芽細胞内への導入により修飾される。一部の実施形態においては、生後線維芽細胞はＧａｔａ４ポリペプチド、Ｍｅｆ２ポリペプチド、Ｔｂｘ５ポリペプチド、Ｍｅｓｐ１ポリペプチド、及びＭｙｏｃｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上により遺伝子的に修飾される。
【０１５８】
一部の実施形態においては、生後線維芽細胞はＧａｔａ４ポリペプチド、Ｍｅｆ２ポリペプチド、Ｔｂｘ５ポリペプチド、及びＭｅｓｐ１ポリペプチドの生後線維芽細胞内への導入により修飾される。一部の実施形態においては、生後線維芽細胞はＧａｔａ４ポリペプチド、Ｍｅｆ２ポリペプチド、Ｔｂｘ５ポリペプチド、及びＭｅｓｐ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上で遺伝子的に修飾される。
【０１５９】
Ｍｅｓｐ１、Ｉｓｌ１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、Ｓｒｆ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｈｏｐｘ、Ｈｒｔ２、Ｐｉｔｘ２ｃ、及びＮｋｘ２−５ポリペプチドのアミノ酸配列はそのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と同様、当該分野で知られている。例えばゲンバンクアクセッション番号：１）ＡＡＲ８８５１１．１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＢＡＦ６０ｃ；アミノ酸配列）、及びＡＹ４５０４３１（ＡＡＲ８８５１１．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；２）ＡＡＲ８８５１０．１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＢＡＦ６０ｃ；アミノ酸配列）、及びＡＹ４５０４３０（ＡＡＲ８８５１０．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；３）ＮＰ＿０６８８０８（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＨａｎｄ２アミノ酸配列）、及びＮＭ＿０２１９７３（ＮＰ＿０６８８０８アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；４）ＮＰ＿１１５８８４．４（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＨｏｐｘアミノ酸配列）、及びＮＭ＿０３２４９５（ＮＰ＿１１５８８４．４アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；５）ＮＰ＿６３１９５８．１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＨｏｐｘアミノ酸配列）、及びＮＭ＿１３９２１２（ＮＰ＿６３１９５８．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；６）ＡＡＧ３１１５７（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＨｒｔ２アミノ酸配列）、及びＡＦ３１１８８４（ＡＡＧ３１１５７アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；７）ＮＰ＿０００３１６（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＰｉｔｘ２ｃアミノ酸配列）、及びＮＭ＿０００３２５（ＮＰ＿０００３１６アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；８）ＮＰ＿０６１１４０．１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＭｅｓｐ１アミノ酸配列）、及びＮＭ＿０１８６７０．３（ＮＰ＿０６１１４０．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；９）ＸＰ＿５２３１５１．２（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓＭｅｓｐ１アミノ酸配列）、及びＸＭ＿５２３１５１（ＸＰ＿５２３１５１．２アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；１０）ＢＡＡ１２０４１．１（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓＭｅｓｐ１アミノ酸配列）、及びＢＡＡ１２０４１（ＢＡＡ１２０４１．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；１１）ＮＰ＿００１１０１００１．１（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓＭｅｓｐ１アミノ酸配列）、及びＮＭ＿００１１０７５３１（ＮＰ＿００１１０１００１．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；１２）ＮＰ＿００４３７８．１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＮＫＸ２−５アミノ酸配列）、及びＮＭ＿００４３８７（ＮＰ＿００４３７８．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；１３）ＮＰ＿００１１５９６４８．１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＮＫＸ２−５アミノ酸配列）、及びＮＭ＿００１１６６１７６（ＮＰ＿００１１５９６４８．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；１４）ＮＰ＿００１１５９６４７．１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＮｋｘ２−５アミノ酸配列）、及びＮＭ＿００１１６６１７５（ＮＰ＿００１１５９６４７．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；１５）ＮＰ＿００２１９３．２（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＩｓｌ１アミノ酸配列）、及びＮＭ＿００２２０２（ＮＰ＿００２１９３．２アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；１６）ＮＰ＿０５９０３５（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓＩｓｌ１アミノａｃｉｄ）、及びＮＭ＿０１７３３９（ＮＰ＿０５９０３５アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；１７）ＢＡＣ４１１５３（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓＩｓｌ１アミノ酸配列）、及びＡＫ０９０２６３（ＢＡＣ４１１５３アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；１８）ＮＰ＿００１１３９７８５．１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＭｙｏｃｄアミノ酸配列）、及びＮＭ＿００１１４６３１３（ＮＰ＿００１１３９７８５．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；１９）ＮＰ＿００１１３９７８４．１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＭｙｏｃｄアミノ酸配列）、及びＮＭ＿００１１４６３１２（ＮＰ＿００１１３９７８４．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；２０）ＮＰ＿７０５８３２．１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＭｙｏｃｄアミノ酸配列）、及びＮＭ＿１５３６０４（ＮＰ＿７０５８３２．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；２１）ＮＰ＿９３８０１５．１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＳｍｙｄ１アミノ酸配列）、及びＮＭ＿１９８２７４（ＮＰ＿９３８０１５．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；２２）ＮＰ＿００１１０００６５．１（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓＳｍｙｄ１アミノ酸配列）、及びＮＭ＿００１１０６５９５（ＮＰ＿００１１０００６５．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；２３）ＮＰ＿００１１５３５９９．１（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓＳｍｙｄ１アミノ酸配列）、及びＮＭ＿００１１６０１２７（ＮＰ＿００１１５３５９９．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）；２４）ＮＰ＿００３１２２．１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓＳｒｆアミノ酸配列）、及びＮＭ＿００３１３１（ＮＰ＿００３１２２．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；２５）ＸＰ＿５１８４８７．２（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓＳｒｆアミノ酸配列）、及びＸＭ＿５１８４８７（ＸＰ＿５１８４８７．２アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；２６）ＮＰ＿００１１０２７７２．１（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓＳｒｆアミノ酸配列）、及びＮＭ＿００１１０９３０２（ＮＰ＿００１１０２７７２．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）を参照できる。
【０１６０】
Ｍｅｓｐ１、Ｉｓｌ１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、Ｓｒｆ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｈｏｐｘ、Ｈｒｔ２、Ｐｉｔｘ２ｃ、及びＮｋｘ２−５ポリペプチドの適当なアミノ酸配列は上記したゲンバンクのエントリーの１つにおいて示されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０１６１】
Ｍｅｓｐ１、Ｉｓｌ１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、Ｓｒｆ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｈｏｐｘ、Ｈｒｔ２、Ｐｉｔｘ２ｃ、及びＮｋｘ２−５ポリペプチドをコードする適当なヌクレオチド配列は上記したゲンバンクのエントリーの１つにおいて示されるヌクレオチド配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を包含する。
【０１６２】
追加的因子
生後線維芽細胞は上記した通り修飾又は遺伝子的に修飾されることができ；そして又、培養系に添加することができる追加的因子１つ以上と接触させることもでき、例えばその追加的因子１つ以上は培養基中の添加剤として包含させることができる。そのような追加的因子の例は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、例えばHuangfu等、(2008)Nature Biotechnol.26:795-797;Huangfu等、(2008)Nature Biotechnol.26:1269-1275参照；ＤＮＡ脱メチル化剤、例えばMikkelson等、(2008)Nature454,49-55参照；ヒストンメチル転移酵素阻害剤、例えばShi等、(2008)Cell Stem Cell2:525-528参照；Ｌ型カルシウムチャンネルアゴニスト、例えばShi等、(2008)3:568-574参照；Wnt3a、例えばMarson等、(2008)Cell134:521-533参照；siRNA、例えばZhao等、(2008)Cell Stem Cell3:475-479参照、を包含するがこれらに限定されない。
【０１６３】
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）はヒストン上の［イプシロン］−Ｎ−アセチルリジンアミノ酸を除去する酵素のクラスである。例示されるＨＤＡＣはこれらのクラスＩのＨＤＡＣ：ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８；及びクラスＩＩのＨＤＡＣ：ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７Ａ、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０を包含する。Ｉ型哺乳類ＨＤＡＣはＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、及びＨＤＡＣＩ１を包含する。ＩＩ型哺乳類ＨＤＡＣはＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、及びＨＤＡＣ１を包含する。一部の実施形態においては、ＨＤＡＣ阻害剤はクラスＩ又はクラスＩＩのＨＤＡＣを選択的に阻害する。
【０１６４】
ＨＤＡＣ阻害剤の適当な濃度は使用する特定のＨＤＡＣ阻害剤に応じて約０．００１ｎＭ〜約１０ｍＭの範囲である。ＨＤＡＣ濃度は０．０１ｎＭ〜１０００ｎＭの範囲であることができる。
【０１６５】
適当なＨＤＡＣ阻害剤はヒストンの脱アセチル化においてＨＤＡＣ酵素活性を阻害する何れかの剤を包含する。適当なＨＤＡＣ阻害剤はカルボキシレートＨＤＡＣ阻害剤；ヒドロキサム酸ＨＤＡＣ阻害剤；ペプチド（例えば、環状テトラペプチド）ＨＤＡＣ阻害剤；ベンズアミドＨＤＡＣ阻害剤；親電子性ケトンＨＤＡＣ阻害剤；ハイブリッド極性ＨＤＡＣ阻害剤；及び短鎖脂肪酸ＨＤＡＣ阻害剤を包含するがこれらに限定されない。
【０１６６】
適当なＨＤＡＣ阻害剤はトリコスタチンＡ及びその類縁体、例えばトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）；及びトリコスタチンＣを包含する（Koghe等、(1998),Biochem.Pharmacol,56:1359-1364）。
【０１６７】
適当なペプチドＨＤＡＣ阻害剤は例えばオキサムフラチン［（２Ｅ）−５−［３−［（フェニルスルホニル）アミノフェニル］−ペンタ−２−エン−４−イノヒドロキサム酸（Kim等、(1999),Oncogene,18:2461-2470）；トラポキシンＡ（シクロ−（Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−ピペコリニル−Ｌ−２−アミノ−８−オキソ−９，１０−エポキシ−デカノイル）（Kijima等、(1993),J.Biol.Chem.268:22429-22435）；ＦＲ９０１２２８、デシペプチド（（１Ｓ，４Ｓ，７Ｚ，１０Ｓ，１６Ｅ，２１Ｒ）−７−エチリデン−４，２１−ジイソプロピル−２−オキサ−１２，１３−ジチア−５，８，２０，２３−テトラビシクロ［８．７．６］トリコス−１６−エン−３，６，９，１９，２２−ペントン）（Nakajima等、(1998).Ex.Cell Res.,241:126-133）；アピシジン、環状テトラペプチド［シクロ−（Ｎ−Ｏ−メチル−Ｌ−トリプトファニル−Ｌ−イソロイシニル−Ｄ−ピペコリニル−Ｌ−２−アミノ−８−オキソデカノイル）］（Darkin-Rattray等、(1996),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,93:13143-13147；アピシジンＩａ、アピジジンＩｂ、アピシジンＩｃ、アピシジンＩＩａ、及びアピシジンＩＩｂ（国際特許出願公開９７／１１３６６）；ＨＣ−トキシン、環状テトラペプチド（Bosch等、(1995),Plant Cell,7:1941-1950）；及びクラミドシン（Bosch等、上出)を包含する。
【０１６８】
適当なＨＤＡＣ阻害剤はヒドロキサム酸系のハイブリッド極性化合物（ＨＰＣ）、例えばサリシルヒドロキサム酸（ＳＢＨＡ）（Andrews等、(2000),International J.Parasitology,30:761-8); スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）（Richon等、(1998),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,95: 3003-7）；アゼライックビスヒドロキサム酸（ＡＢＨＡ）（Ａｎｄｒｅｗｓ等、上出）；アゼライック−１−ヒドロキサメート−９−アニリド（ＡＡＨＡ）（Qiu等、(2000),Mol.Biol.Cell,11:2069-83）；Ｍ−カルボキシケイヒ酸ビスヒドロキサミド（ＣＢＨＡ）（Ｒｉｃｈｏｎ等、上出）；６−（３−クロロフェニルウレイド）カプロイックヒドロキサム酸、３−Ｃｌ−ＵＣＨＡ）（Richon等、上出）; ＭＷ２７９６（Andrews等、上出）; ＭＷ２９９６（Andrews等、上出）；ヒドロキサム酸誘導体NVP-LAQ-824 (Catley等、(2003)Blood 102:2615；及びAtadja等、(2004)Cancer Res.64:689); 及びＣＢＨＡ（ｍ−カルシウムボキシケイヒ酸ビスヒドロキサム酸)を包含する。
【０１６９】
適当なＨＤＡＣ阻害剤は短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）化合物、例えば酪酸ナトリウム（Cousens等、(1979),J.Biol.Chem.,254:1716-23）；イソバレレート（McBain等、(1997),Biochem.Pharm.,53:1357-68）；バルプロ酸；バレレート（McBain等、上出）；４−フェニル酪酸（４−ＰＢＡ）（Lea and Tulsyan,(1995),Anticancer Research,15:879-3）；フェニル酪酸（ＰＢ）（Wang等、(1999),Cancer Research 59: 2766-99）；プロピネート（McBain等、上出）；ブチルアミド（Lea and Tulsyan,上出）；イソブチルアミド（Lea and Tulsyan,上出）；酢酸フェニル（Lea and Tulsyan,上出）；３−ブロモイプロピオネート（Lea and Tulsyan,上出）；トリブチリン（Guan等、(2000),Cancer Research,60:749-55）；酪酸アルギニン；イソブチルアミド;及びバルプロエートを包含する。
【０１７０】
適当なＨＤＡＣ阻害剤はベンズアミド誘導体、例えばＭＳ−２７５［Ｎ−（２−アミノフェニル）−４−［Ｎ−（ピリジン−３−イル−メトキシカルボニル）アミノエチル］ベンズアミド］（Saito等、(1999),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,96:4592-7）；及びＭＳ−２７５の３’−アミノ誘導体（Ｓａｉｔｏ等、上出）；及びＣＩ−９９４を包含する。
【０１７１】
追加的な適当なＨＤＡＣ阻害剤はＢＭＬ−２１０（Ｎ−（２−アミノフェニル）−Ｎ’−フェニル−オクタンジアミド）；デプデシン（例えば、（−）−デプデシン）；ヌルスクリプト（４−（１，３−ジオキソ−１Ｈ，３Ｈ−ベンゾ［デ］イソキノリン−２−イル−Ｎ−ヒドロキシブタンアミド）；スクリプタイド；スラミンナトリウム；酪酸ピバロイルオキシメチル（ピバネックス、ＡＮ−９）、トラポキシン、トラポキシンＢ；ＣＩ−９９４（即ちＮ−アセチルジナリン）；ＭＧＣＤ０１０３（Ｎ−（２−アミノフェニル）−４−［［（４−ピリジン−３−イルピリミジン−２−イル）アミノ］メチル］ベンズアミド）；ＪＮＪ１６２４１１９９（Ｒ−３０６４６５；例えばArts等、(2007)Br.J.Cancer 97:1344参照）；ツバシン；Ａ−１６１９０６；プロキサミド；オキサムフラチン；３−Ｃ１−ＵＣＨＡ（６−（３−クロロフェニルウレイド）カプロイックヒドロキサム酸）；及びＡＯＥ（２−アミノ−８−オキソ−９，１０−エポキシデカン酸）を包含する。
【０１７２】
適当なＤＮＡメチル化阻害剤はＤＮＡメチル転移酵素であり、そして５−デオキシ−アザシチジン（ＤＡＣ）；５−アザシチジン（５−アザ−ＣＲ）（ビダザ）；５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ＣｄＲ；デシタビン）；１−［ｂｅｔａ］−Ｄ−アラビノフラノシル−５−アザシトシン；ジヒドロ−５−アザシチジン；ゼブラリン（（１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−１，２−ジヒドロピリミジン−２−オン）；シネフンジン（例えば、ＩｎＳｏｌｕｔｉｏｎＴＭネフンジン）、及び５−フルオロ−２’−デオキシシジジン（ＦｄＣｙｄ）を包含するがこれらに限定されない。適当な非ヌクレオシドＤＮＡメチル転移酵素阻害剤の例（例えばプロカイン以外）は（−）−エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ）；ヒドララジン；プロカインアミド；サマプリンＡ（Ｎ，Ｎ’−（ジチオジ−２，１−エタンジイル）ビス［３−ブロモ−４−ヒドロキシ−ａ−（ヒドロキシイミノ）−ベンゼンプロパンアミド）；及びＲＧ１０８（２−（１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドル−２−イル）−３−（１Ｈ−インドル−３−イル）プロピオン酸）を包含する。
【０１７３】
適当なヒストンメチル転移酵素（ＨＭＴ）阻害剤はＳＣ−２０２６５１（２−（ヘキサヒドロ−４−メチル−１Ｈ−１，４−ジアゼピン−１−イル）−６，７−ジメトキシ−Ｎ−（１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル）−４−キナゾリンアミン）；カエトシン（Grainer等、(2005)Nature Chem.Biol.1:143）；ＢＩＸ−０１２９４（２−（ヘキサヒドロ−４−メチル−１Ｈ−１，４−ジアゼピン−１−イル）−６，７−ジメトキシ−Ｎ−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−４−キナゾリンアミン３塩酸塩）；３−デアザネプラノシン（Glazer等、(1986)BBRC135:688）等を包含するがこれらに限定されない。
【０１７４】
遺伝子的に修飾された宿主細胞
本開示は単離された遺伝子的に修飾された宿主細胞を包含する遺伝子的に修飾された宿主細胞を提供し、ここで本発明の遺伝子的に修飾された宿主細胞はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸１つ以上を含む（により遺伝子的に修飾されている）。一部の実施形態においては、本発明の遺伝子的に修飾された宿主細胞はインビトロである。一部の実施形態においては、本発明の遺伝子的に修飾された宿主細胞はヒト細胞であるか、又はヒト細胞から派生されている。一部の実施形態においては、本発明の遺伝子的に修飾された宿主細胞はげっ歯類細胞であるか、げっ歯類細胞から派生されている。本開示は更に、本発明の遺伝子的に修飾された宿主細胞の子孫を提供し、この場合、子孫はその派生元である本発明の遺伝子的に修飾された宿主細胞と同じ外因性核酸を含むことができる。本発明は更に本発明の遺伝子的に修飾された宿主細胞を含む組成物を提供する。
【０１７５】
本開示は単離された遺伝子的に修飾された宿主細胞を包含する遺伝子的に修飾された宿主細胞を提供し、ここで本発明の遺伝子的に修飾された宿主細胞はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸１つ以上を含む（により遺伝子的に修飾されている）。一部の実施形態においては、本発明の遺伝子的に修飾された宿主細胞はインビトロである。一部の実施形態においては、本発明の遺伝子的に修飾された宿主細胞はヒト細胞であるか、又はヒト細胞から派生されている。一部の実施形態においては、本発明の遺伝子的に修飾された宿主細胞はげっ歯類細胞であるか、げっ歯類細胞から派生されている。本開示は更に、本発明の遺伝子的に修飾された宿主細胞の子孫を提供し、この場合、子孫はその派生元である本発明の遺伝子的に修飾された宿主細胞と同じ外因性核酸を含むことができる。本発明は更に本発明の遺伝子的に修飾された宿主細胞を含む組成物を提供する。
【０１７６】
遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞
一部の実施形態においては、本発明の遺伝子的に修飾された宿主細胞は遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞である。即ち、本開示はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドの１つ以上、又はサブセット（例えば、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチド) をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸１つ以上を含む（により遺伝子的に修飾されている）遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞を提供する。一部の実施形態においては、本発明の遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞はインビトロである。一部の実施形態においては、本発明の遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞はヒト細胞であるか、又はヒト細胞から派生されている。一部の実施形態においては、本発明の遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞はげっ歯類細胞であるか、げっ歯類細胞から派生されている。本開示は更に本発明の尿遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞の子孫を提供し、ここで子孫は自身の派生元である本発明の遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞と同じ外因性核酸を含むことができる。本開示は更に本発明の遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞を含む組成物を提供する。
【０１７７】
遺伝子的に修飾された誘導心筋細胞
本開示は更に本発明の遺伝子的に修飾された宿主細胞から派生された心筋細胞(“誘導心筋細胞”)を提供する。本発明の誘導心筋細胞は本発明の遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞から派生しているため、本発明の誘導心筋細胞も又遺伝子的に修飾されている。即ち、本開示はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドの１つ以上、又はサブセット（例えば、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチド)をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸１つ以上を含む遺伝子的に修飾された心筋細胞を提供する。一部の実施形態においては、本発明の遺伝子的に修飾された心筋細胞はインビトロである。一部の実施形態においては、本発明の遺伝子的に修飾された心筋細胞はヒト細胞であるか、又はヒト細胞から派生されている。一部の実施形態においては、本発明の遺伝子的に修飾された心筋細胞はげっ歯類細胞であるか、げっ歯類細胞から派生されている。本開示は更に本発明の遺伝子的に修飾された心筋細胞の子孫を提供し、ここで子孫はその派生元である本発明の遺伝子的に修飾された心筋細胞と同じ外因性核酸を含むことができる。本開示は更に本発明の遺伝子的に修飾された心筋細胞を含む組成物を提供する。
【０１７８】
組成物
本開示は本発明の遺伝子的に修飾された宿主細胞（例えば、本発明の遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞;本発明の遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞の子孫; 本発明の誘導心筋細胞;本発明の誘導心筋細胞の子孫)を含む組成物を提供する。本発明の組成物は本発明の遺伝子的に修飾された宿主細胞を含み；そして一部の実施形態においては１つ以上の別の成分を含むことになり、その成分は遺伝子的に修飾された宿主細胞の意図する使用に部分的には基づいて選択されることになる。適当な成分は塩；緩衝剤；安定化剤；プロテアーゼ阻害剤；細胞膜及び／又は細胞壁保存化合物、例えばグリセロール、ジメチルスルホキシド等；細胞に適する栄養培地等を包含するがこれらに限定されない。
【０１７９】
一部の実施形態においては、本発明の組成物は本発明の遺伝子的に修飾された宿主細胞及びマトリックス(「本発明の遺伝子的に修飾された細胞／マトリックス組成物」)を含み、ここで本発明の遺伝子的に修飾された宿主細胞はマトリックスに会合している。「マトリックス」という用語は遺伝子的に修飾された細胞が自身を結合させるか、接着することにより細胞コンポジットを形成できる何れかの適当な担体物質を指す。一部の実施形態においては、マトリックス又は担体物質は後の適用のために望まれる３次元形態において既に存在する。例えば、ウシ心膜組織は、コラーゲンに交差結合され、脱細胞され、そして光固定されるマトリックスとして使用される。
【０１８０】
例えば、マトリックス（「生体適合性基板」とも称する）は対象への移植に適する物質である。生体適合性基板は対象に移植された後には毒性又は傷害性の作用を誘発しない。１つの実施形態において、生体適合性基板は修復又は交換を要する所望の構造に形状化できる表面を有する重合体である。重合体は又、修復又は交換を必要とする構造の一部に形状化できる。生体適合性基板は細胞が自身に結合でき、そしてその上で生育できるようにする支持性の枠組みを与えることができる。
【０１８１】
適当なマトリックス成分は例えばコラーゲン；ゼラチン；フィブリン；フィブリノーゲン；ラミニン；グリコサミノグリカン；エラスチン；ヒアルロン酸；ａプロテオグリカン；グリカン；ポリ（乳酸）；ポリ（ビニルアルコール）；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチレンオキシド）；セルロース；セルロース誘導体；澱粉；澱粉誘導体；ポリ（カプロラクトン）；ポリ（ヒドロキシ酪酸）；ムチン等を包含する。一部の実施形態においては、マトリックスはコラーゲン、ゼラチン、フィブリン、フィブリノーゲン、ラミニン、及びエラスチンの１つ以上を含み；そして更に非蛋白性重合体を含み、例えば更にポリ（乳酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、セルロース、セルロース誘導体、澱粉、及び澱粉誘導体の１つ以上を含むことができる。一部の実施形態においては、マトリックスはコラーゲン、ゼラチン、フィブリン、フィブリノーゲン、ラミニン、及びエラスチンの１つ以上を含み；そして更にヒアルロン酸、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、又はグリカンを含むことができる。マトリックスがコラーゲンを含む場合、コラーゲンはＩ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲン、及びこれらの組み合わせを含むことができる。
【０１８２】
マトリックスはヒドロゲルであることができる。適当なヒドロゲルは２種以上の単量体の重合体、例えば多種の単量体を含むホモポリマー又はへテロポリマーである。適当なヒドロゲル単量体は以下のもの、即ち乳酸、グリコール酸、アクリル酸、１−ヒドロキシメタクリレート（ＨＥＭＡ）、エチルメタクリレート（ＥＭＡ）、プロピレングリコールメタクリレート（ＰＥＭＡ）、アクリルアミド（ＡＡＭ）、Ｎ−ビニルピロリドン、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）、グリシジルメタクリレート（ＧＤＭＡ）、グリコールメタクリレート（ＧＭＡ）、エチレングリコール、フマル酸等を包含する。一般的な交差結合材はテトラエチレングリコールジメタクリレート（ＴＥＧＤＭＡ）及びＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを包含する。ヒドロゲルはホモポリマーであることができ、或いは、上記重合体の２種以上の共重合体を含むことができる。例示されるヒドロゲルはポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）とポリ（ポリプロピレンオキシド）（ＰＰＯ）の共重合体；ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭＦ−１２７（名目式ＥＯ１００−ＰＯ６５−ＥＯ１００のＰＥＯとＰＰＯの２官能性ブロック共重合体、式中、ＥＯはエチレンオキシドであり、そしてＰＯはポリプロピレンオキシド）；ポロキサマー４０７（ポリ（エチレングリコール）の２つの親水性ブロックによりフランキングされたポリ（プロピレングリコール）の中央ブロックよりなるトリブロック共重合体）；名目分子量１２，５００ダルトン及びＰＥＯ：ＰＰＯ比２：１のポリ（エチレンオキシド）−ポリ（ポリプロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）共重合体）；ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）系ヒドロゲル（ＰＮＩＰＡＡｍ系ヒドロゲル）；ＰＮＩＰＡＡｍ−アクリル酸共重合体（ＰＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＡＡｃ）；ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）；ポリ（ビニルピロリドン）等を包含するがこれらに限定されない。
【０１８３】
本発明の遺伝子的に修飾された細胞／マトリックス組成物は更に追加的成分１つ以上を含むことができ、その場合、適当な追加的成分は例えば、成長因子；抗酸化剤；栄養輸送物質（例えばトランスフェリン）；ポリアミン（例えばグルタチオン、スペルミジン等）を包含する。
【０１８４】
本発明の遺伝子的に修飾された細胞／マトリックス組成物中の細胞密度は約１０２個／ｍｍ３〜約１０９個／ｍｍ３、例えば約１０２個／ｍｍ３〜約１０４個／ｍｍ３、約１０４個／ｍｍ３〜約１０６個／ｍｍ３、約１０６個／ｍｍ３〜約１０７個／ｍｍ３、約１０７個／ｍｍ３〜約１０８個／ｍｍ３、又は約１０８個／ｍｍ３〜約１０９個／ｍｍ３の範囲であることができる。
【０１８５】
マトリックスは種々の形態の何れかをとることができ、又は、相対的に不定形であることができる。例えば、マトリックスはシート、円筒、球等の形態であることができる。
【０１８６】
移植可能な装置
本開示はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドの１つ以上を含むリプログラミング組成物を含む移植可能な装置（例えば血管内ステント、スカホールド、移植片（例えば大動脈移植片）、人工心臓弁、冠動脈シャント、ペースメーカー電極、心臓内リード等）を提供する。本開示は更にＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上を含むリプログラミング組成物を含む移植可能な装置を提供する。リプログラミング組成物（Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドの１つ以上を含む、又はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上を含む）は移植可能な装置の表面上にコーティングすることができ、又は、移植可能な装置中のリザーバ内に含有されることができる。リプログラミング組成物が移植可能な装置内のリザーバ内に含有される場合は、リザーバは装置からリプログラミング組成物が溶出できるような構造を有する。
【０１８７】
本開示はＧａｔａ４ポリペプチド、Ｍｅｆ２ｃポリペプチド、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含むリプログラミング組成物を含む移植可能な装置（例えば血管内ステント、スカホールド、移植片（例えば大動脈移植片）、人工心臓弁、冠動脈シャント、ペースメーカー電極、心臓内リード等）を提供する。本開示は更にＧａｔａ４ポリペプチド、Ｍｅｆ２ｃポリペプチド、及びＴｂｘ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上を含むリプログラミング組成物を含む移植可能な装置を提供する。リプログラミング組成物（Ｇａｔａ４ポリペプチド、Ｍｅｆ２ｃポリペプチド、及びＴｂｘ５ポリペプチドを含む、又はＧａｔａ４ポリペプチド、Ｍｅｆ２ｃポリペプチド、及びＴｂｘ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上を含む）は移植可能な装置の表面上にコーティングすることができ、又は、移植可能な装置中のリザーバ内に含有されることができる。リプログラミング組成物が移植可能な装置内のリザーバ内に含有される場合は、リザーバは装置からリプログラミング組成物が溶出できるような構造を有する。
【０１８８】
移植可能な装置が個体中のある部位にある場合、リプログラミング組成物中の核酸又はポリペプチドは移植可能な装置を離れ、そしてポリペプチド又は核酸は移植可能な装置又はその近傍において線維芽細胞内に進入する。即ち、本発明の移植可能な装置は、個体内に移植されれば、移植の部位又はその近傍において線維芽細胞内へのリプログラミング因子又はそれをコードする核酸の導入を可能にし、そして、これにより心筋細胞への線維芽細胞のリプログラミングを可能にする。例えば、本発明の移植可能な装置がステントである場合、そのステントは冠動脈内に移植することができ、そこでリプログラミング因子、又はそれをコードする核酸がステントから溶出し、冠動脈血管床内の線維芽細胞に進入し、そして線維芽細胞を心筋細胞にリプログラミングする。
【０１８９】
本開示はリプログラミング組成物を含むステントを提供する。血管内ステントは例えば、自己膨張可能なステント、バルーン膨張可能なステント、及びステント−グラフトを包含する。
【０１９０】
一部の例において、本発明の移植可能な装置は移植可能な装置（例えば、ステント）の表面に固定された第一の重合体物質（第１の層）の内部に取り込まれたリプログラミング組成物；及び 第一の重合体物質に固定された第二の重合体物質（例えば、バリア層）を含み、ここで第二の重合体物質はリプログラミング組成物中に存在するポリペプチド又は核酸の溶出速度を制御する。一例としては、第一の重合体物質はフルオロ重合体を含むことができ；そして第二の重合体物質はアクリル系を含むことができる。
【０１９１】
一部の例において、本発明の移植可能な装置は、移植可能な装置（例えば、ステント）の表面にコーティングされた重合体層（第１の層）の中に取り込まれたリプログラミング組成物；及び移植可能な装置からのリプログラミング組成物内部に含有されるポリペプチド又は核酸の放出の速度を低減するための重合体層の少なくとも一部分の上のバリア層を含む。重合体層はポリ（メチルメタクリレート）又はポリ（ブチルメタクリレート）を含むことができ、そしてポリ（エチレン−コ−ビニルアセテート）を更に包含できる。バリアは重合体又は無機物質を含有できる。
【０１９２】
第１の層のための適当な重合体物質はポリウレタン、ポリエステルウレタン、シリコーン、フルオロ重合体、エチレン酢酸ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、トリメチレンカーボネート、ポリホスファゼン、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバレレート、ポリジオキサノン、ポリイミノカーボネート、ポリオルトエステル、エチレンビニルアルコール共重合体、L-ポリラクチド、Ｄ，Ｌ−ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、ラクチドとグリコリドの共重合体、ポリメチルメタクリレート、ポリ（ｎ−ブチル）メタクリレート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、エラストマー、及びこれらの混合物を包含するがこれらに限定されない。
【０１９３】
代表的なエラストマーは熱可塑性エラストマー物質、ポリエーテル−アミド熱可塑性エラストマー、フルオロエラストマー、フルオロシリコーンエラストマー、スチレン−ブタジエンゴム、ブタジエン−スチレンゴム、ポリイソプレン、ネオプレン（ポリクロロプレン）、エチレン−プロピレンエラストマー、クロロスルホン化ポリエチレンエラストマー、ブチルゴム、ポリスルフィドエラストマー、ポリアクリレートエラストマー、ニトリル、ゴム、ポリエステル、スチレン、エチレン、プロピレン、ブタジエン及びイソプレン、ポリエステル熱可塑性エラストマー、及びこれらの混合物を包含するがこれらに限定されない。
【０１９４】
バリア層は生体適合性である（即ちその存在が身体からの有害応答を誘発しない）。バリア層は約５０オングストローム〜約２０，０００オングストロームの範囲の厚みを有することができる。バリアは殆どが無機物質であることができる。しかしながら一部の有機化合物（例えば、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニリデン、ナイロン６−６、パーフルオロ重合体、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン２,６−ナフタレンジカルボキシレート、及びポリカーボネート）をバリアに配合してよい。バリア内での使用に適する適当な無機物質は無機元素、例えば純粋な金属、例えばアルミニウム、クロム、金、ハフニウム、イリジウム、ニオブ、パラジウム、白金、タンタル、チタン、タングステン、ジルコニウム、及びこれらの金属の合金、及び無機化合物、例えば無機の珪化物、酸化物、窒化物、及び炭化物を包含するがこれらに限定されない。一般的に、バリアの物質中の薬物の溶解度は重合体担体中の薬剤の溶解度よりも顕著に低い。更に又、一般的に、バリアの物質中の薬物の拡散性も、重合体担体中の薬剤の拡散性よりも顕著に低い。
【０１９５】
バリアは生体分解性（即ち身体の作用により無害化合物にまで分解され得る）であってもなくてもよい。非生体分解性バリア物質を使用してよいが、一部の生体分解性物質をバリアとして使用してよい。例えば、リン酸カルシウム、例えばヒドロキシアパタイト、炭酸ヒドロキシアパタイト、リン酸３カルシウム、ベータリン酸３カルシウム、リン酸８カルシウム、不定形リン酸カルシウム、及びオルトリン酸カルシウムを使用してよい。特定のカルシウム塩、例えばリン酸カルシウム（プラスターオブパリ）もまた使用してよい。バリアの生体分解性は伏在する第１の層からの薬物放出を制御するための追加的機序として機能してよい。
【０１９６】
移植可能な装置の表面に第１の層を固定する方法、及び、第１の層上にバリア層を固定する方法は当該分野で知られている。例えば米国特許７，６９５，７３１及び７，６９１，４０１を参照できる。
【０１９７】
上記した通り、一部の実施形態においては、本発明の移植可能な装置はリプログラミング組成物を含むリザーバを含む。例えば、一部の実施形態においては、本発明の移植可能な装置は身体組織、臓器又は体液を接触させるための少なくとも１つの表面を有し、その場合、移植可能な装置は接触表面；及び接触表面の少なくとも一部分の上の薬物溶出コーティングを含み、ここでコーティングは重合体に渡って分散しているゼオライトを有する重合体を含み、そしてここで、ゼオライトの多孔性の構造は放出剤及びリプログラミング組成物を含有するリザーバを包含する。放出剤はトリガー条件が満たされるまでリザーバから治療物質が退出することを防止する。トリガー条件は体液との放出剤の接触；放出剤近辺のｐＨの変化等であることができる。
【０１９８】
単独又は組み合わせにおける使用に適する生体分解性重合体はポリ（α-ヒドロキシ酸）、例えば、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリラクチド(PLA)、及びポリグリコリド（ＰＧＡ）、及び放出速度を微調整するための種々異なる比における上記の組み合わせ及びブレンド物、ＰＬＧＡ-ＰＥＧ （ポリエチレングリコール）、ＰＬＡ-ＰＥＧ、ＰＬＡ-ＰＥＧ-ＰＬＡ、ポリ無水物、トリメチレンカーボネート、ポリオルトエステル、ポリアスピリン、ポリホスファゲン、及びチロジンポリカーボネート;天然及び合成のヒドロゲル物質、例えばコラーゲン、澱粉、キトサン、ゼラチン、アルギネート、デキストラン、ビニルピロリドン、ポリビニルアルコール （ＰＶＡ）、ＰＶＡ-ｇ-ＰＬＧＡ、ＰＥＧＴ-ＰＢＴ共重合体(ポリアクティブ)、メタクリレート、ポリ（Ｎ-イソプロピルアクリルアミド）、ＰＥＯ-ＰＰＯ-ＰＥＯ （プルロニック）、ＰＥＯ-ＰＰＯ-ＰＡＡ共重合体、及びＰＬＧＡ-ＰＥＯ-ＰＬＧＡを包含するがこれらに限定されない。本発明の実施形態による重合体マトリックスは以下の生体安定性重合体、即ちポリウレタン、ポリメチルメタクリレート共重合体、ポリ酢酸ビニル （ＰＶＡ）、ポリアミド、及びポリウレタンとシリコーンの共重合体のいずれかを単独又は組み合わせにおいて包含してよい。
【０１９９】
リプログラミング組成物
本開示はリプログラミング組成物を提供する。
【０２００】
一部の実施形態においては、本発明のリプログラミング組成物は１）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドの２つ以上の混合物；又は２）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドの２つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上；のいずれかを含む。リプログラミング組成物はポリペプチド又は核酸に加えて、塩、例えばＮａＣｌ、ＭｇＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４等；緩衝剤、例えばトリス緩衝液、Ｎ-（２-ヒロドキシエチル）ピペラジン-Ｎ'-（２-エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２-（Ｎ-モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２-（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）；等、可溶化剤;洗剤、例えばノニオン系洗剤、例えばＴｗｅｅｎ−２０；等、プロテアーゼ阻害剤；グリセロール；等の１つ以上を含むことができる。
【０２０１】
一部の実施形態においては、本発明のリプログラミング組成物は１）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドの混合物；又は２）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上のいずれかを含む。リプログラミング組成物は、ポリペプチド又は核酸に加えて、塩、例えばＮａＣｌ、ＭｇＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４；等、緩衝剤、例えばトリス緩衝液、Ｎ−（２−ヒロドキシエチル）ピペラジン−Ｎ'−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）；等、可溶化剤;洗剤、例えばノニオン系洗剤、例えばＴｗｅｅｎ−２０；等、プロテアーゼ阻害剤;グリセロール；等の１つ以上を含むことができる。
【０２０２】
本発明のリプログラミング組成物上記した通り本発明の移植可能な装置中に包含させることができる。本発明のリプログラミング組成物は個体に直接投与することができる。本発明のリプログラミング組成物は心筋細胞中に生後線維芽細胞をリプログラミングするために有用であり、このリプログラミングはインビトロ又はインビボにおいて実施できる。心筋細胞に生後線維芽細胞をリプログラミングすることは、後に記載するとおり、種々の心臓障害を治療するために使用できる。
【０２０３】
本発明のリプログラミング組成物は製薬上許容しうる賦形剤を包含できる。適当な賦形剤ベヒクルは例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、及びこれらの組み合わせである。更にまた、所望により、ベヒクルは少量の補助的物質、例えば水和剤、又は乳化剤、又は緩衝剤を含有してよい。そのような剤型を調製する実際の方法は知られているか、又は当業者の知る通りである。例えばRemington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton、Pennsylvania、17th edition、1985を参照できる。投与すべき組成物又は組成物は、何れの場合においても、治療される対象において所望の状態を達成するために十分な本発明の抗体の量を含有することになる。
【０２０４】
製薬上許容しうる賦形剤、例えばベヒクル、アジュバント、担体又は希釈剤は市場において容易に入手できる。更にまた、製薬上許容しうる補助的物質、例えばｐＨ調節剤及び緩衝剤、張力調節剤、安定化剤、水和剤等は市場において容易に入手できる。
【０２０５】
一部の実施形態においては、本発明のリプログラミング組成物は制御放出製剤として製剤される。持続放出調製品は当該分野で良く知られている方法を用いて調製してよい。持続放出調製品の適当な例は抗体を含む固体疎水性重合体の半透過性マトリックスを包含し、その場合、マトリックスは形状化された物品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体、非分解性エチレン酢酸ビニル、ヒドロゲル、ポリラクチド、分解性乳酸-グリコール酸共重合体及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を包含する。持続放出調製品中に含まれるポリペプチド又は核酸の活性における考えられる生物学的活性の損失及び考えられる活性の変化は、適切な添加剤の使用により、水分含量の制御により、そして特定の重合体マトリックス組成を開発することにより、防止してよい。
【０２０６】
本発明のリプログラミング組成物は更に、治療剤１つ以上を含むことができる。本発明のリプログラミング組成物に包含されることができる治療剤は、例えばジギタリス、スタチン、抗血小板剤、抗凝固剤、カルシウムチャンネルブロッカー、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、血管拡張剤、アンジオテンシンＩＩ受容体ブロッカー、ベクターブロッカー等を包含できる。
【０２０７】
用途
生後線維芽細胞をリプログラミングする本発明方法は誘導心筋細胞の集団を発生させるために有用であり、その誘導心筋細胞は分析アッセイにおいて、人工心臓組織を発生させるために、そして治療法において有用であることができる。
【０２０８】
分析アッセイ
本発明方法は分析アッセイのための心筋細胞を発生させるために使用できる。分析アッセイは例えば、疾患（例えば心疾患）の治療における心筋細胞の効果を測定するための疾患の非ヒト動物モデル内への心筋細胞の導入；心臓障害の治療における使用に適する候補剤を識別するためのスクリーニング方法における心筋細胞の使用等を包含する。一部の場合において、本発明方法を用いて発生させた心筋細胞は、試験剤の毒性を検査するため、又は薬物最適化のために使用することができる。
【０２０９】
動物モデル
一部の実施形態においては、本発明方法を使用して発生させた心筋細胞は心臓障害の非ヒト動物モデル中に導入することができ、そして障害を緩解することに対する心筋細胞の作用は非ヒト動物モデル（例えばげっ歯類モデル、例えばラットモデル、モルモットモデル、マウスモデル等、非ヒト霊長類モデル；ウサギモデル等）において試験できる。例えば、障害の非ヒト動物モデルにおける心臓障害に対する本発明方法を使用して発生させた心筋細胞の作用は、非ヒト動物モデルにおける疾患心臓組織の中、近傍、又は周囲への心筋細胞の導入により試験することができ；そして、心機能に対する導入心筋細胞の作用がある場合はそれを検査することができる。心機能を検査する方法は当該分野で良く知られており；そしていずれかのそのような方法を使用することができる。
【０２１０】
薬物／剤のスクリーニング又は識別
本発明方法を使用して発生させた心筋細胞はそのような細胞および／またはそれらの種々の子孫の特性に影響する薬物又は被験剤（例えば溶媒、小分子薬物、ペプチド、オリゴヌクレオチド）又は環境条件（例えば培養条件又は操作）を求めるスクリーニングにおいて使用してよい。例えば米国特許７４２５４４８を参照できる。薬物又は被験剤は選択された個々の小分子（例えば以前の薬物スクリーニングで得られた鉛化合物）であるか、又は一部の場合においては、スクリーニングすべき薬物又は被験剤はコンビナトリアルなライブラリ、例えば多くの化学的「ビルディングブロック」を組み合わせることにより、化学合成又は生合成のいずれかにより発生させた多様な化学物質の収集物に由来するものである。例えば、線状コンビナトリアル化学ライブラリ、例えばポリペプチドライブラリは所定の化合物長（例えばポリペプチド化合物中のアミノ酸数）に関して全ての可能な方法において、一連のアミノ酸を組み合わせることにより形成される。多くの被験剤（例えば化合物）は、化学ビルディングブロックのそのようなコンビナトリアルな混合を介して合成されることができる。実際、理論的には１００の互換的化学ビルディングブロックのコンビナトリアルな混合により、１億の４量体化合物又は１００億の５量体化合物の合成が可能となる。例えばGallop等、(1994)、J. Med. Chem 37(9)、1233を参照できる。コンビナトリアル化学ライブラリの調製及びスクリーニングは当該分野で良く知られている。コンビナトリアルな化学ライブラリは、例えばHobbs等、(1993)、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90、6909に記載のダイバーソマー、例えばヒダントイン、ベンゾジアゼピン、及びジペプチド；Chen等、(1994)、J. Amer. Chem. Soc.116: 2661に記載の小型化合物ライブラリの同様な有機合成；Cho,等、(1993)、Science 261、1303に記載のオリゴカーバメート；Campbell等、(1994)、J. Org. Chem.59: 658に記載のペプチジルホスホネート；及び、例えばチアゾリジノン及びメタチアザノン（米国特許５，５４９，９７４）、ピロリジン（米国特許  ５，５２５，７３５及び５，５１９，１３４）、ベンゾジアゼピン（米国特許５，２８８，５１４）を含有する小型有機分子ライブラリを包含するがこれらに限定されない。
【０２１１】
多くのコンビナトリアルなライブラリが例えばComGenex (Princeton, NJ); Asinex (Moscow, Russia); Tripos, Inc. (St. Louis, MO); ChemStar, Ltd. (Moscow, Russia); 3D Pharmaceuticals (Exton, PA); 及び Martek Biosciences (Columbia, MD)から商業的に入手可能である。
【０２１２】
一部の実施形態においては、本発明方法を使用して発生させた心筋細胞を被験剤と接触させ、そして心筋細胞の生物学的活性に対する被験剤の作用がある場合は、それを検査し、その場合、心筋の生物学的活性に対する作用を有する被験剤は心臓の障害又は状態を治療するための候補剤となる。例えば、目的の被験剤は、被験剤の非存在下の生物学的活性と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、又は１０倍超、心筋細胞の生物学的活性を増大させるものである。目的の被験剤は心臓の障害又は状態を治療するための候補剤となる。一部の実施形態においては、接触はインビトロで実施される。他の実施形態において、接触はインビボ、例えば非ヒト動物において実施される。
【０２１３】
「生物学的活性」とはマーカー発現（例えば心筋細胞特異的マーカー発現）、受容体結合、イオンチャンネル活性、収縮活性、及び電気生理学的活性の１つ以上を包含する。
【０２１４】
例えば、一部の実施形態においては、心筋細胞マーカーの発現に対する被験剤の作用がある場合は、それを検査する。新規細胞マーカーは、例えば心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、筋節性ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、Ｎ−カドヘリン、β−アドレノセプター（β１−ＡＲ）、転写因子のＭＥＦ−２ファミリーのメンバー、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）、ミオグロビン、及び心房ナトリウム排泄因子（ＡＮＦ）を包含する。
【０２１５】
別の例として心筋細胞の電気生理学的特性に対する被験剤の作用がある場合はそれを検査する。電気生理学的特性は心筋細胞様活動電位に関するパッチクランプ分析により検討することができる。例えばIgelmund等、Pflugers Arch. 437:669, 1999; Wobus等、Ann. N.Y. Acad. Sci. 27:752, 1995;及びDoevendans等、J. Mol. Cell Cardiol. 32:839, 2000を参照できる。
【０２１６】
別の例として、一部の実施形態においては、リガンドゲートイオン活性に対する被験剤の作用がある場合はそれを検査する。別の例として、一部の実施形態においては、電圧ゲートイオンチャンネル活性に対する被験剤の作用がある場合はそれを検査する。イオンチャンネル活性に対する被験剤の作用は、標準的なアッセイを使用しながら、例えば細胞内イオン（例えばＮａ＋、Ｃａ２＋、Ｋ＋等）の レベルを計測することにより、容易に検査される。あるイオンの細胞内濃度の変化は、チャンネルにより自身の流入が制御されるイオンに対して適切なインジケーターを用いて検出されえる。例えば、イオンチャンネルがカリウムイオンチャンネルである場合は、カリウム検出染料を使用し；イオンチャンネルがカルシウムイオンであるばあいは、カルシウム検出染料を使用する等してよい。
【０２１７】
適当な細胞内Ｋ＋イオン検出染料はＫ＋結合ベンゾフランイソフタレート等を包含するがこれらに限定されない。適当な細胞内Ｃａ２＋イオン検出染料は上記列挙した通りである。
【０２１８】
本明細書に記載したアッセイにおける被験剤の作用は、インビトロの細胞培養又はインビボの何れかにおけるマーカー発現、受容体結合、収縮活性、又は電気生理学的特性のような本発明方法を用いて発生させた心筋細胞の表現型又は活性を観察するための何れかの標準的なアッセイを用いながら検査できる。例えば米国特許７４２５４４８を参照できる。例えば、医薬品候補は、収縮活性に対するそれらの作用に関して、例えばそれらが収縮の範囲又は頻度を増加又は減少させるかどうかを、当該分野で知られている何れかの方法を用いながら試験される。作用が観察される場合は、化合物の濃度を滴定することにより、メジアンの有効用量（ＥＤ５０）を求める。
【０２１９】
被験剤／薬物の毒性
本発明方法を使用して発生させた心筋細胞は、被験剤、又は薬物、例えば心筋細胞、例えば心筋細胞の対する薬理学的作用を有するように設計された被験剤又は薬物、例えば心筋細胞以外の細胞に対する作用を有するように設計されたが、意図しない結果として心筋細胞に潜在的に影響する被験剤又は薬物の毒性を検査するために使用できる。一部の実施形態においては、本開示は、本発明方法を用いて発生させた心筋細胞１つ以上を薬品、被験剤、又は他の因子のある用量に接触させること、及び、毒性又は心毒性のマーカーに関して接触させた心筋細胞を検査することを含む、ヒト又は非ヒト（例えばネズミ、ウサギ、非ヒト霊長類）対象における薬物、被験剤、又は他の因子の毒性作用を評価するための方法を開示する。
【０２２０】
何れかの当該分野で知られている方法を使用することにより、本発明方法を用いて発生させた心筋細胞に対する被験剤又は薬物の毒性又は有害作用を評価してよい。細胞毒性又は心毒性は例えば細胞の生育性、生存性、形態、及び特定のマーカー及び受容体の発現に対する作用により調べることができる。例えば、心筋細胞壊死の生化学的マーカー（例えば心トロポニンＴ及びＩ（ｃＴｎＴ、ｃＴｎＩ）を用いることにより本発明方法を用いて発生させた心筋細胞に対する薬物誘導の毒性又は有害反応を検査してよく、その場合、細胞外液体（例えば細胞培地）中のそのようなマーカーの存在が壊死を示すことができる。例えばGaze and Collinson (2005)Expert Opin Drug Metab Toxicol 1(4):715-725を参照できる。別の例においては、ラクテートデヒドロゲナーゼを用いることにより、本発明方法を用いて発生させた心筋細胞における薬物誘導の毒性又は有害反応を検査する。例えばInoue等、(2007)AATEX 14, Special Issue: 457-462を参照できる。別の例においては、染色体ＤＮＡに対する薬物の作用をＤＮＡの合成又は修復を計測することにより調べ、そして、本発明方法を用いて発生させた心筋細胞における薬物誘導の毒性又は有害反応を検査するために使用することができる。また別の例においては、［３Ｈ］−チミジン又はＢｒｄＵの取り込みの速度、程度、及び／又はタイミングを評価することにより、本発明方法を用いて発生させた心筋細胞における薬物誘導の毒性又は有害反応を検査してよい。
更に別の例において、分裂中期の拡張により測定される姉染色分体交換の速度又は性質を評価することにより、本発明方法を用いて発生させた心筋細胞における薬物誘導の毒性又は有害反応を検査することができる。例えばA. Vickers (pp 375-410 in In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press, 1997)を参照できる。更に別の例においては、電気生理学的特性又はイオンゲートチャンネル（例えばカルシウムゲートチャンネル）の活動性を計測するためのアッセイを用いることにより本発明方法を用いて発生させた心筋細胞における薬物誘導の毒性又は有害反応を検査することができる。又別の例において、収縮活性（例えば収縮の頻度）を用いることにより本発明方法を用いて発生させた心筋細胞における薬物誘導の毒性又は有害反応を検査することができる。
【０２２１】
一部の実施形態においては、本開示は、薬物、被験剤、又は薬理学的剤のある用量に本発明方法を用いて発生させた心筋細胞１つ以上を接触させること、接触させた１つ以上の分化細胞を毒性に関してアッセイすること、及び、アッセイが接触細胞における毒性に関して陰性であった場合に対象に対して薬理学的剤を処方又は投与すること、を含む、ヒト又はネズミ対象における薬物毒性の危険性を低減させるための方法を提供する。一部の実施形態においては、本開示は薬理学的剤のある用量に本発明方法を用いて発生させた心筋細胞１つ以上を接触させること、接触させた１つ以上の分化細胞を毒性に関してアッセイすること、及び、アッセイが接触細胞における毒性に関して低い危険性又は危険性が無いことを示す場合に、対象に対して薬理学的剤を処方又は投与すること、を含む、ヒト又はネズミ対象における薬物毒性の危険性を低減させるための方法を提供する。
【０２２２】
細胞を用いた治療方法
本発明の修飾又は遺伝子的に修飾された線維芽細胞は治療の必要な個体においてそのような治療のために使用できる。同様に、本発明の誘導心筋細胞は治療の必要な個体においてそのような治療のために使用できる。本発明の修飾又は遺伝子的に修飾された線維芽細胞、又は本発明の誘導心筋細胞はレシピエント個体（治療の必要な個体）中に導入することができ、その場合、本発明の修飾又は遺伝子的に修飾された線維芽細胞、又は本発明の誘導心筋細胞のレシピエント個体への導入は個体における状態又は障害を治療する。即ち, 一部の実施形態においては、本発明の治療方法は、それを要する個体に対し、本発明の修飾又は遺伝子的に修飾された線維芽細胞の集団を投与することを包含する。一部の実施形態においては、本発明の治療方法は、それを要する個体に対し、本発明の誘導心筋細胞の集団を投与することを包含する。
【０２２３】
一部の実施形態においては、本開示は細胞移植を、それを要するレシピエント個体において実施するための方法を提供し、方法は一般的に、（ｉ）ドナー個体から得られた線維芽細胞から誘導心筋細胞を発生させること、ここでドナー個体はレシピエント個体と免疫適合性であること；及び（ｉｉ）誘導心筋細胞１つ以上をレシピエント個体内に移植すること、を含む。一部の実施形態においては、レシピエント及びドナー個体は同じ個体である。一部の実施形態においては、レシピエント及びドナー個体は同じ個体ではない。
【０２２４】
一部の実施形態においては、本開示は細胞移植を、それを要するレシピエント個体において実施するための方法を提供し、方法は一般的に、（ｉ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上で宿主生後線維芽細胞を遺伝子的に修飾すること、ここで宿主生後線維芽細胞はドナー個体から得られ、そしてドナー個体はレシピエント個体と免疫適合性であること；及び（ｉｉ）遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞１つ以上をレシピエント個体内に移植すること、を含む。一部の実施形態においては、レシピエント及びドナー個体は同じ個体である。一部の実施形態においては、レシピエント及びドナー個体は同じ個体ではない。
【０２２５】
一部の実施形態においては、本開示は細胞移植を、それを要するレシピエント個体において実施するための方法を提供し、方法は一般的に、（ｉ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドの１つ以上、又はサブセット（例えば、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチド)を宿主生後線維芽細胞内に導入することにより宿主生後線維芽細胞を修飾すること、ここで宿主生後線維芽細胞はドナー個体から得られ、そしてドナー個体はレシピエント個体と免疫適合性であること；及び（ｉｉ）修飾された生後線維芽細胞１つ以上をレシピエント個体内に移植すること、を含む。一部の実施形態においては、レシピエント及びドナー個体は同じ個体である。一部の実施形態においては、レシピエント及びドナー個体は同じ個体ではない。
【０２２６】
誘導心筋細胞を発生させる本発明方法は、人工心臓組織を、例えばそれを要する哺乳類対象に移植するために発生させるために有用である。一部の実施形態においては、本発明の治療方法は、それを要する個体に、本発明の人工心臓組織を投与することを包含する。
【０２２７】
本発明の治療方法は損傷を受けた心臓組織（例えば虚血心臓組織）を交換するために有用である。本発明方法が個体に誘導心筋細胞を導入（移植）することを包含する場合は、同種異系又は自系の移植を実施することができる。
【０２２８】
本開示は個体における心臓障害を治療するための方法を提供し、方法は一般的に、それを必要とする個体に対し、ａ）本発明方法を用いながら調製された誘導心筋細胞の集団； ｂ）本発明方法を用いながら調製された遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞の集団；ｃ）本発明方法を用いながら調製された修飾生後線維芽細胞の集団；又はｄ）本発明方法を用いながら調製された人工心臓組織；の治療有効量を投与することを包含する。
【０２２９】
例えば、一部の実施形態においては、本発明方法はｉ）上記した通りインビトロで誘導心筋細胞を発生させること；及びｉｉ）誘導心筋細胞をそれを要する個体中に導入すること、を含む。他の実施形態において、本発明方法はｉ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドの１つ以上、又はサブセット（例えば、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチド)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上で宿主生後線維芽細胞を遺伝子的に修飾すること; 及びｉｉ）遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞をそれを要する個体中に導入することを含む。
【０２３０】
他の実施形態において、本発明方法はｉ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドの１つ以上、又はサブセット（例えば、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチド）を宿主生後線維芽細胞中に導入することにより宿主生後線維芽細胞を修飾すること；及びｉｉ）修飾された生後線維芽細胞をそれを要する個体中に導入することを含む。
【０２３１】
他の実施形態において、本発明方法はｉ）以下、即ち：ａ）上記した通り誘導心筋細胞を発生させること；及びｂ）誘導心筋細胞をマトリックスと会合させることにより人工心臓組織を発生させることにより人工心臓組織を形成すること；及びｉｉ）人工心臓組織をそれを要する個体中に導入すること；を包含する。他の実施形態において、要件はｉ）以下、即ち：ａ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドの１つ以上、又はサブセット（例えば、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上で宿主生後線維芽細胞を遺伝子的に修飾すること；及びｂ）遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞をマトリックスと会合させることにより人工心臓組織を発生させることにより人工心臓組織を形成すること；及びｉｉ）人工心臓組織をそれを要する個体中に導入すること；を含む。他の実施形態において、要件はｉ）以下、即ち：ａ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドの１つ以上、又はサブセット（例えば、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチド）を宿主生後線維芽細胞に導入することにより宿主生後線維芽細胞を修飾すること；及びｂ）修飾された生後線維芽細胞をマトリックスと会合させることにより人工心臓組織を発生させることにより人工心臓組織を形成すること；及びｉｉ）人工心臓組織をそれを要する個体中に導入すること；を含む。人工心臓組織は個体中、既存の心臓組織の中、上、又は周囲に導入できる。
【０２３２】
本発明方法を用いた治療を要する個体及び／又はドナー個体は、鬱血性心不全を有する個体；変性筋肉疾患に罹患した個体；虚血性心組織をもたらす状態に罹患している個体、例えば冠動脈疾患を有する個体等を包含するがこれらに限定されない。一部の例においては、本発明方法は変性筋肉の疾患又は状態、例えば家族性心筋症、拡張性心筋症、肥大性心筋症、拘束型心筋症、又は結果として虚血性心筋症をもたらす冠動脈疾患を治療するために有用である。一部の例においては、本発明方法は心臓又は心臓血管の疾患又は障害、例えば心臓血管疾患、動脈瘤、狭心症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管偶発症（卒中）、心臓血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心障害、心筋炎、冠状静脈弁疾患、拡張性動脈疾患、拡張期機能不全、心内膜炎、高い血圧（高血圧）、心筋症、肥大性心筋症、拘束型心筋症、結果として虚血性心筋症をもたらす冠動脈疾患、僧帽弁逸脱症、心筋梗塞（心臓発作）、又は静脈血栓塞栓を有する個体を治療するために有用である。
【０２３３】
本発明方法による治療に適する個体は虚血性心臓組織をもたらす状態を包含するがこれに限定されない心臓の状態を有する個体（例えば哺乳類対象、例えばヒト；非ヒト霊長類；実験非ヒト哺乳類対象、例えばマウス、ラット等）、例えば冠動脈疾患を有する個体等を包含する。一部の例においては、治療に適する個体は心臓又は心臓血管の疾患又は状態、例えば 心臓血管疾患、動脈瘤、狭心症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管偶発症（卒中）、心臓血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心障害、心筋炎、冠状静脈弁疾患、拡張性動脈疾患、拡張期機能不全、心内膜炎、高い血圧（高血圧）、心筋症、肥大性心筋症、拘束型心筋症、結果として虚血性心筋症をもたらす冠動脈疾患、僧帽弁逸脱症、心筋梗塞（心臓発作）、又は静脈血栓塞栓に罹患している。一部の例においては、本発明方法による治療に適する個体は変性筋肉疾患、例えば家族性心筋症、拡張性心筋症、肥大性心筋症、拘束型心筋症、又は結果として虚血性心筋症をもたらす冠動脈疾患を有する個体を包含する。
【０２３４】
哺乳類宿主に投与するために、本発明方法を用いて発生させた誘導心筋細胞の集団、又は遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞の集団を医薬組成物として製剤することができる。医薬組成物は滅菌された水性又は非水性の溶液、懸濁液又は乳液であることができ、これは更に生理学的に許容される担体（即ち心筋細胞の活動性を妨害しない非毒性の物質）を含む。当該分野で知られている何れかの適当な担体を要件医薬組成物中で使用してよい。担体の選択は、部分的には投与される物質（即ち細胞又は化合物）の性質に依存することになる。代表的な担体は生理食塩水、ゼラチン、水、アルコール、天然又は合成の油脂、糖類溶液、グリコール、注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチル又はこれらの物質の組み合わせを包含する。場合により、医薬組成物は更に、保存料及び／又は他の添加剤、例えば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート形成剤及び／又は不活性ガス、及び／又は他の活性成分を含有してよい。
【０２３５】
一部の実施形態においては、誘導心筋細胞集団、修飾された生後線維芽細胞の集団、又は遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞の集団はマイクロカプセル化を包含する知られたカプセル化技術に従ってカプセル化される（例えば米国特許４，３５２，８８３；４，３５３，８８８；及び５，０８４，３５０参照）。心筋細胞、修飾された生後線維芽細胞、又は遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞をカプセル化する場合、一部の実施形態においては、心筋細胞、修飾された生後線維芽細胞、又は遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞は、米国特許５，２８４，７６１；５，１５８，８８１；４，９７６，８５９；４，９６８，７３３；５，８００，８２８及び公開ＰＣＴ特許出願国際特許出願ＷＯ９５／０５４５２に記載される通りカプセル化によりカプセル化される。
【０２３６】
一部の実施形態においては、誘導心筋細胞集団、修飾された生後線維芽細胞の集団、又は遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞の集団は後述するとおりマトリックス中に存在する。
【０２３７】
誘導心筋細胞集団、修飾された生後線維芽細胞の集団、又は遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞の集団の単位剤型は約１０３個〜約１０９個、例えば約１０３個〜約１０４個、約１０４個〜約１０５個、約１０５個〜約１０６個、約１０６個〜約１０７個、約１０７個〜約１０８個、又は約１０８個〜約１０９個の細胞を含有できる。
【０２３８】
誘導心筋細胞集団、修飾された生後線維芽細胞の集団、又は遺伝子的に修飾された生後線維芽細胞の集団は通常の操作法に従って凍結保存することができる。例えば、凍結保存は適当な増殖培地、１０％ＢＳＡ及び７．５％ジメチルスルホキシドを包含できる「凍結」培地中、約１〜１０００万個の細胞に対して実施できる。細胞を遠心分離する。生育培地を吸引し、凍結培地と置き換える。細胞を球状体として再懸濁する。細胞を例えば−８０℃のコンテナ中に置くことにより緩徐に凍結する。３７℃バス中で振り回して解凍し、新鮮増殖培地に再懸濁し、そして上記した通り生育させる。
【０２３９】
人工心臓組織
一部の実施形態においては、本発明方法はａ）生後線維芽細胞の集団をインビトロで心筋細胞にリプログラミングすること、例えば生後線維芽細胞がマトリックス中に存在し、そこで誘導心筋細胞の集団を形成させること；及びｂ）個体の既存の心臓組織の中又は上に誘導心筋細胞の集団を移植すること、含む。即ち、本開示はインビトロで人工心臓組織を発生させ；そしてインビボで人工心臓組織を移植するための方法を提供する。一部の実施形態においては、本発明方法はａ）生後線維芽細胞の集団をインビトロで心筋細胞にリプログラミングし、誘導心筋細胞の集団を発生させること； ｂ）誘導心筋細胞をマトリックスと会合させて、人工心臓組織を形成すること；及びｃ）人工心臓組織を個体の既存の心臓組織の中又は上に移植すること；を含む。
【０２４０】
人工心臓組織はそれを要する個体中への同種異系又は自系の移植のために使用できる。人工心臓組織を製造するためには、生後線維芽細胞と接触させるマトリックスを準備することができ、そこで生後線維芽細胞は上記した通り本発明方法を用いて心筋細胞にリプログラミングされる。このことは、このマトリックスを適当な容器に移し、そして細胞含有培養基の層を上面に置く（生後線維芽細胞のリプログラミングの前、又はその間）ことを意味する。「マトリックス」という用語はこの関連においては細胞が自身を結合させるか接着することにより相当する細胞コンポジット、即ち人工組織を形成することができる何れかの適当な担体物質を意味すると理解すべきである。一部の実施形態においては、マトリックス又は単体の物質は、それぞれ、後の適用のために望ましい三次元の形態で既に存在する。例えばウシ心膜組織は、コラーゲンと交差結合し、脱セルロース化され、そして光固定されるマトリックスとして使用される。
【０２４１】
例えば、マトリックス）（「生体適合性基板」とも称する）は細胞集団を付着させることができる対象への移植に適するマトリックスである。生体適合性基板は対象に移植された後に毒性又は傷害性の作用を誘発しない。１つの実施形態において、生体適合性基板は修復又は交換を要する所望の構造に形状化できる表面を有する重合体である。重合体は又、修復又は交換を要する構造の一部分に形状化できる。生体適合性基板は細胞が自身に結合し、自身の上で成育できるようにする支持的フレームワークを提供する。培養された細胞集団を次に、生体適合性基板上で生育させることができ、これにより細胞−細胞相互作用のために必要な適切な間質の距離が与えられる。
【０２４２】
ポリペプチド又は核酸を用いた治療方法
本開示はインビボで心筋細胞内に線維芽細胞をリプログラミングする方法を提供する。
【０２４３】
一部の実施形態においては、方法は一般的にリプログラミング組成物にインビボで線維芽細胞を接触させることを包含する。上記考察した通り、リプログラミング組成物は１）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドの２つ以上；又は２）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｎｋｘ２−５、Ｉｓｌ−１、Ｍｙｏｃｄ、Ｓｍｙｄ１、及びＳｒｆポリペプチドの２つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上の何れかを含む。上記した通り、本発明のリプログラミング組成物は追加的成分１つ以上を含むことができる。本発明のリプログラミング組成物は治療部位又はその近傍において、例えば心臓の中又は周囲において、個体に投与できる。
【０２４４】
一部の実施形態においては、方法は一般的にリプログラミング組成物にインビボで線維芽細胞を接触させることを包含する。上記考察した通り、リプログラミング組成物は１）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドの混合物：又は２）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸１つ以上の何れかを含む。上記した通り、本発明のリプログラミング組成物は追加的成分１つ以上を含むことができる。本発明のリプログラミング組成物は治療部位又はその近傍において、例えば心臓の中又は周囲において、個体に投与できる。
【０２４５】
一部の実施形態においては、リプログラミング組成物は移植可能な装置と組み合わせてそれを要する個体中に導入される。即ち、一部の実施形態においては、本開示はインビボで心筋細胞に線維芽細胞をリプログラミングする方法を提供し、方法は一般的に、本発明の移植可能な装置（本発明のリプログラミング組成物を含む）をそれを要する個体中に導入することを包含し、ここで移植可能な装置は治療部位又はその近傍において、例えば心臓の中又は周囲に導入される。
【０２４６】
本発明方法を用いた治療を要する個体及び／又はドナー個体は、鬱血性心不全を有する個体；変性筋肉疾患に罹患した個体；虚血性心組織をもたらす状態に罹患している個体、例えば冠動脈疾患を有する個体等を包含するがこれらに限定されない。一部の例においては、本発明方法は変性筋肉の疾患又は状態、例えば家族性心筋症、拡張性心筋症、肥大性心筋症、拘束型心筋症、又は結果として虚血性心筋症をもたらす冠動脈疾患を治療するために有用である。一部の例においては、本発明方法は心臓又は心臓血管の疾患又は障害、例えば心臓血管疾患、動脈瘤、狭心症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管偶発症（卒中）、心臓血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心障害、心筋炎、冠状静脈弁疾患、拡張性動脈疾患、拡張期機能不全、心内膜炎、高い血圧（高血圧）、心筋症、肥大性心筋症、拘束型心筋症、結果として虚血性心筋症をもたらす冠動脈疾患、僧帽弁逸脱症、心筋梗塞（心臓発作）、又は静脈血栓塞栓を有する個体を治療するために有用である。
【０２４７】
本発明方法による治療に適する個体は虚血性心臓組織をもたらす状態を包含するがこれに限定されない心臓の状態を有する個体（例えば哺乳類対象、例えばヒト；非ヒト霊長類；実験非ヒト哺乳類対象、例えばマウス、ラット等）、例えば冠動脈疾患を有する個体等を包含する。一部の例においては、治療に適する個体は心臓又は心臓血管の疾患又は状態、例えば 心臓血管疾患、動脈瘤、狭心症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管偶発症（卒中）、心臓血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心障害、心筋炎、冠状静脈弁疾患、拡張性動脈疾患、拡張期機能不全、心内膜炎、高い血圧（高血圧）、心筋症、肥大性心筋症、拘束型心筋症、結果として虚血性心筋症をもたらす冠動脈疾患、僧帽弁逸脱症、心筋梗塞（心臓発作）、又は静脈血栓塞栓に罹患している。一部の例においては、本発明方法による治療に適する個体は変性筋肉疾患、例えば家族性心筋症、拡張性心筋症、肥大性心筋症、拘束型心筋症、又は結果として虚血性心筋症をもたらす冠動脈疾患を有する個体を包含する。
【実施例】
【０２４８】
以下の実施例は本発明をどのように作成し、そして使用するかに関する完全な開示及び説明を当業者に提供するために示しており、本発明者等がその発明と見なすものの範囲を限定する意図は無く、そして以下に記載する実験が実施した実験の全て又はそれのみであることを示す意図も無い。使用した数（例えば量、温度等）に関しては正確を確保する努力を行ったが、一部の実験的誤差及び偏差は考慮しなければならない。特段の記載が無い限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、そして圧力は大気圧又はその近傍である。標準的な略記方法、例えばｂｐ、塩基対；ｋｂ、キロ塩基；ｐｌ、ピコリットル；ｓ又はｓｅｃ、秒；ｍｉｎ、分；ｈ又はｈｒ、時間；ａａ、アミノ酸；ｋｂ、キロ塩基；ｂｐ、塩基対；ｎｔ、ヌクレオチド；ｉ．ｍ．、筋肉内（に）；ｉ．ｐ．、腹腔内（に）；ｓ．ｃ．、皮下（に）等を使用してよい。
【実施例１】
【０２４９】
確定された因子による機能的新規細胞中への心線維芽細胞の直接リプログラミング
材料及び方法
αＭＨＣ−ＧＦＰ及びＩｓｌ１−ＹＦＰマウスの発生  α−ミオシン重鎖−緑色蛍光蛋白（αＭＨＣ−ＧＦＰ）マウスを発生させるために、増強緑色蛍光蛋白−内部リボゾーム結合部位−ピューロマイシンＲ（ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ピューロマイシン）ｃＤＮＡをα−ミオシン重鎖（α−ＭＨＣ）プロモーターを含有する発現ベクター中にサブクローニングした（Gulick等、(1991)J Biol Chem 266、9180-9185）。前核マイクロインジェクション及び他の操作法を標準的プロトコルに従って実施した（Ieda等、(2007)Nat Med 13, 604-612）。トランスジーンはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析により識別した（フォワードプライマー、５’−ＡＴＧＡＣＡＧＡＣＡＧＡＴＣＣＣＴＣＣＴ−３’（配列番号１１）；リバースプライマー、５’−ＡＡＧＴＣＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＴＧ−３’（配列番号１２））。Ｉｓｌ１−黄色蛍光蛋白（Ｉｓｌ１−ＹＦＰ）マウスはＩｓｌ１−ＣｒマウスとＲ２６Ｒ−増強黄色蛍光蛋白（Ｒ２６Ｒ−ＥＹＦＰ）マウスを交配することにより得た（Srinivas等、(2001)BMC Dev Biol 1, 4）。
【０２５０】
細胞培養
体外移植組織培養のために、単離された新生仔又は成熟のマウス心臓を粉砕して大きさが１ｍｍ３未満の小片とした。体外移植組織をゼラチンコーティングディッシュ上にプレーティングし、そして体外移植組織培地（ＩＭＤＭ／２０％ＦＢＳ）中で７日間培養した（Andersen等、(2009)Stem Cells 27, 1571-1581）。遊走した細胞を採取し、そして４０−μｍ細胞ストレーナー（ＢＤ）を用いて濾過することにより心臓組織フラグメントの夾雑を回避した。αＭＨＣ−ＧＦＰ−／Ｔｈｙ１＋、Ｉｓｌ１−ＹＦＰ−／Ｔｈｙ１＋、αＭＨＣ−ＧＦＰ−／Ｔｈｙ１＋／ｃ−ｋｉｔ−又はＭＨＣ−ＧＦＰ−／Ｔｈｙ１＋／ｃ−ｋｉｔ＋の生細胞（ヨウ化プロピジウム染色が無いことにより画定）を蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）Ａｒｉａ２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて単離した。新生仔心線維芽細胞の従来の単離のために、心臓を０．１％トリプシンで消化し、そしてプラスチックディッシュ上にプレーティングした（Ieda等、(2009)Dev Cell 16:233）。結合した線維芽細胞を７日間培養し、そしてαＭＨＣ−ＧＦＰ−／Ｔｈｙ１＋細胞に関してソーティングした。ソーティングされた細胞を１０４／ｃｍ２の細胞密度において１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ／Ｍ１９９培地中で培養した。細胞は２４時間後にレトロウィルスで形質導入された。
【０２５１】
心筋細胞の単離
心筋細胞を単離するために、新生仔αＭＨＣ−ＧＦＰ＋心室を小片に切断し、ＩＩ型コラゲナーゼ溶液で消化した（Ieda等、(2009)上出）。単細胞懸濁液は穏やかに磨砕して４０μｍ細胞ストレーナーを通過させることにより得た。αＭＨＣ−ＧＦＰ＋生細胞はＦＡＣＳＡｒｉａ２により単離した。
【０２５２】
分子クローニング及びレトロウィルス感染
レトロウィルスは文献記載通りに発生させた（Kitamura等、(2003)Exp. Hematol. 31:1007; Takahashi and Yamanaka, (2006)Cell 126:663）。要すれば、ｐＭＸｓレトロウィルスベクターを構築するために、候補遺伝子のコーディング領域をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、そしてｐＭＸｓベクター中にサブクローニングした。Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＰｌａｔ−Ｅ細胞中にｐＭＸｓレトロウィルスベクターをトランスフェクトすることによりウィルスを発生させた。ウィルス含有上澄みのプールを形質導入に使用した。２４時間後、培地をＤＭＥＭ／Ｍ１９９培地と交換し、そして２〜３日毎に交換した。候補心線維芽細胞におけるｐＭＸｓ−ＤｓＲｅｄＥｘｐｒｅｓｓレトロウィルス感染により、＞９５％のトランスフェクション効率がもたらされた（Hong等、(2009)Nature 460:1132）。
【０２５３】
コンストラクト中に使用したＭｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、及びＧａｔａ４のマウスヌクレオチド配列を配列番号２３、２５及び２７にそれぞれ示す。コードされるＭｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、及びＧａｔａ４ポリペプチドのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２４、２６、及び２８に示す。
【０２５４】
ＦＡＣＳ分析及びソーティング
緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）発現分析のために、細胞を培養ディッシュから採取し、そしてＦｌｏｗＪｏソフトウエアを用いながらＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分析した。αＭＨＣ−ＧＦＰ／ｃＴｎＴ発現のためには、細胞を１５分間４％ＰＦＡで固定し、サポニンで透過性化し、そして抗ｃＴｎＴ及び抗ＧＦＰ抗体、その後、Ａｌｅｘａ４８８及び６４７とコンジュゲートした二次抗体で染色した（Kattman等、(2006)Dev. Cell 11:723）。
【０２５５】
αＭＨＣ−ＧＦＰ−／Ｔｈｙ１＋及びＩｓｌ１−ＹＦＰ−／Ｔｈｙ１＋細胞ソーティングのためには、細胞をＰＥＣｙ７コンジュゲート抗Ｔｈｙ１抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共にインキュベートし、そしてＦＡＣＳＡｒｉａ２によりソーティングした（Ieda等、(2009)上出）。αＭＨＣ−ＧＦＰ-／Ｔｈｙ１＋／ｃ−ｋｉｔ−及びαＭＨＣ−ＧＦＰ−／Ｔｈｙ１＋／ｃ−ｋｉｔ＋細胞ソーティングのためには、ＰＥＣｙ７コンジュゲート抗Ｔｈｙ１及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート抗ｃ−ｋｉｔ抗体（ＢＤ）を使用した。骨髄細胞をｃ−ｋｉｔ染色の陽性対照として使用した。ＰＥＣｙ７はフィコエリスリンとＣｙ７蛍光染料のコンジュゲートである。
【０２５６】
細胞移植
腺維芽細胞をレトロウィルス感染後翌日に採取した。非肥満糖尿病重度合併免疫不全（ＮＯＤ−ＳＣＩＤ）マウスにおいて左開胸術を実施し、そして１０６個の培養細胞を左心室に注射した。１〜２週間後、心臓を切除して免疫組織化学検査に付した。
【０２５７】
免疫細胞化学検査
細胞を室温で１５分間４％パラホルムアルデヒドで固定し、ブロックし、そして筋節性α−アクチニン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ビメンチン（Ｐｒｏｇｅｎ）、ＧＦＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｔｈｙ−１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、心トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｎｐｐａ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ＲＦＰ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）、Ｎｋｘ２．５（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）に対する一次抗体と共にインキュベートし、二次抗体は、Ａｌｅｘａ４８８又は５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、及びＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とコンジュゲートさせた。
【０２５８】
組織学的検査
細胞注射心臓における免疫組織化学試験のために、心臓を一夜０．４％パラホルムアルデヒド中に固定し、ＯＴＣコンパウンドに包埋し、そして液体窒素中に凍結した（Ieda等、(2007)supra; Ieda等、(2009)上出）。心臓を７μｍ切片として垂直に切断することにより両方の心室が見えるようにした。切片をアクチニン、赤色蛍光蛋白（ＲＦＰ）、緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）に対する一次抗体で染色し、二次抗体はＡｌｅｘａ４８８又は５９４、及び４’，６’−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）にコンジュゲートした。αＭＨＣ−ＧＦＰ心臓におけるＧＦＰ発現パターンを分析するために、心臓を長手方向に切断し、そしてアクチニン、ＧＦＰ及びビメンチンで染色した。
【０２５９】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを細胞から単離し、そして定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）をＡＢＩ７９００ＨＴ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、ＴａｑＭａｎプローブ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）：Ａｃｔｃ１（Ｍｍ０１３３３８２１＿ｍ１）、Ｃｏｌ１ａ２（Ｍｍ００４８３８８８＿ｍ１）、Ｍｙｈ６（Ｍｍ００４４０３５４＿ｍ１）、Ｒｙｒ２（Ｍｍ００４６５８７７＿ｍ１）、Ｇｊａ１（Ｍｍ００４３９１０５＿ｍ１）、Ｔｂｘ５（Ｍｍ００８０３５２１＿ｍ１）を用いながら実施した。ｍＲＮＡレベルはＧａｐｄｈのｍＲＮＡとの比較により規格化した。
【０２６０】
マイクロアレイ分析
マウスのゲノムワイドの遺伝子発現分析をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＭｏｕｓｅ Ｇｅｎｅ１．０ＳＴＡｒｒａｙを用いながら実施した。αＭＨＣ−ＧＦＰ+心筋細胞はＦＡＣＳにより採集した。３因子形質導入ＧＦＰ＋細胞及びＧＦＰ−細胞を培養４時間の後にＦＡＣＳにより採集した。心線維芽細胞もまた培養４時間の後に採集した。ＲＮＡはＰｉｃｏＰｕｒｅＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎ（Ａｒｃｔｕｒｕｓ）を用いて抽出した。マイクロアレイ分析は標準的なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧｅｎｅｃｈｉｐのプロトコルに従って独立した生物学的試料から三連で実施した。データはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＰｏｗｅｒＴｏｏｌ（ＡＰＴ、バージョン１．８．５）を用いながら分析した。直線モデルを各遺伝子に関して試料群にフィットさせることにより、Ｒ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ中のｌｉｍｍａパッケージ（Ｓｍｙｔｈ，２００４）を用いながら推定される群作用及びそれらの関連する有意性を誘導した。調整ｔ統計量及び関連するｐ値を計算した。ｐ値はＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法により擬似発見率に対してコントロールすることにより多数の試験に対して調節した。遺伝子のアノテーションはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（２００７年１１月１２日バージョン）から取り出した。示差的遺伝子発現は統計量／閾値の組み合わせを用いて画定した。
【０２６１】
Ｃａ２＋画像化
Ｃａ２＋画像化は標準的プロトコルに従って実施した。要すれば、細胞を室温で１時間Ｒｈｏｄ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、洗浄し、更に１時間インキュベートすることにより染料の脱エステル化を行った。Ｒｈｏｄ−３標識細胞をＭｉＣＡＭ０２（ＳｃｉＭｅｄｉａ）を用いながらＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ（Ｚｅｉｓｓ）により分析した。
【０２６２】
電気生理学的検査
３因子で４週間形質導入した後、誘導心筋細胞の電気生理学的活動を細胞外電極を用いて実施し、記録には、Ａｘｏｐａｔｃｈ７００Ｂ増幅器及びｐＣｌａｍｐ９．２ソフトウエア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用した。誘導心筋細胞はＧＦＰ発現及び自発的収縮により目視で識別した。２〜４ＭΩの典型的な抵抗を有するガラスパッチピペットをＧＦＰ＋単細胞に直接結合し、Ｔｙｒｏｄｅバス溶液中で細胞外記録を行った。
【０２６３】
統計学的分析
群間の差はスチューデントのｔ検定又はＡＮＯＶＡを用いて統計学的有意性に関して調べた。＜０．０５のｐ値を有意と見なした。
【０２６４】
結果
心筋細胞誘導因子を得るためのスクリーニング
線維芽細胞からの成熟心筋細胞の誘導をレポーター系蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）により定量的に分析できるアッセイ系を開発した（図１Ａ）。これを達成するために、成熟した心筋細胞のみが緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）を発現できるαＭＨＣプロモーター駆動ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ピューロマイシントランスジェニックマウス(αＭＨＣ−ＧＦＰ)を発生させた(Gulick等、(1991)上出）。心線維芽細胞を包含する他の細胞型ではない心筋細胞のみがトランスジェニックマウス心臓においてＧＦＰを発現したことが確認された。
【０２６５】
ＦＡＣＳスクリーニングのために十分な心線維芽細胞を所有するために、ＧＦＰ−心線維芽細胞を体外移植組織培養により新生仔αＭＨＣ−ＧＦＰ心臓から取得した。線維芽細胞様細胞は２日後に体外移植組織から遊走し、そして１週間後にはコンフルエントとなった。遊走細胞はＧＦＰを発現し無かったが、心線維芽細胞のマーカーであるＴｈｙ１及びビメンチンは発現した（図１Ｂ）（Hudon-David等、(2007)J. Mol. Cell. Cardiol. 42:991; Ieda等、(2009)上出）。心筋細胞の夾雑を回避するために、細胞ストレーナーで細胞を濾過することにより心臓組織断片を除去し、ＦＡＣＳによりＴｈｙ１＋／ＧＦＰ−細胞を単離した（図１Ｃ）。ＦＡＣＳのためのマーカーとしてのＴｈｙ１を有する心線維芽細胞の純度は予めわかっている（Ieda等、(2009)上出）。これらの操作法を使用したところ、線維芽細胞培養物中に心筋細胞夾雑は観察されず、そして従来の線維芽細胞単離手法（Ieda等、(2009)上出）よりも２倍超多い数の心線維芽細胞が発生され得た。
【０２６６】
潜在的心リプログラミング因子を選択するために、マイクロアレイ分析を用いることにより、胚齢で第１２．５日において心線維芽細胞（ＣＦ）よりもマウス心筋細胞（ＣＭ）において高値の発現を呈していた転写因子及び後成的リモデリング因子を識別した（Ieda等、(2009)上出）。それらのうち、突然変異時に重度の発生性心欠陥および胚致死性を呈した１３因子を選択した（表）。
【表１】
0005988961.tif 000002
【０２６７】
表。マイクロアレイにより心線維芽細胞と比較して胚性心筋細胞においてアップレギュレートされた転写因子をそれらの倍数リッチ化と共に示す（ｎ＝３）。Ｍｅｓｐ１発現は何れの細胞型においても検出されなかった。
【０２６８】
心臓血管中胚葉特異的転写因子Ｍｅｓｐ１は、アフリカツメガエルにおけるその心分化転換作用のため、同じく包含させた（David等、(2008)Nat. Cell Biol. 10:338）。心線維芽細胞において各遺伝子を効率的に発現するように個々のレトロウィルスを発生させた。
【０２６９】
Ｔｈｙ１＋／ＧＦＰ−新生仔マウス心線維芽細胞を全１４因子を発現するレトロウィルスの混合物を用いて、又はＤｓＲｅｄレトロウィルス（陰性対照）を用いて形質導入した（Hong等、(2009)上出）。ＤｓＲｅｄレトロウィルス感染後一週間、又は如何なるウィルス感染も行わない培養一週間では心線維芽細胞中にＧＦＰ＋細胞は観察されなかった。これとは対照的に、１４因子全ての線維芽細胞中への形質導入は少数のＧＦＰ＋細胞（１．７％）の発生をもたらし、一部の細胞における心リッチ化αＭＨＣ遺伝子の良好な活性化を示していた（図１Ｄ及びＥ）。
【０２７０】
１４因子のどれが心遺伝子発現のために重要であるかを調べるため、個々の因子を１４のプールから連続して除去した。５因子（Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｈｏｐｘ、Ｈｒｔ２、及びＰｉｔｘ２ｃ）を欠いているプールは増大した量のＧＦＰ＋細胞を生産し、それらが必須ではないことを示唆していた（図１Ｄ及びＥ）。着目すべきは、Ｇａｔａ４の除去によりＧＦＰ＋細胞のパーセンテージが０．５％まで減少したのに対し、Ｐｉｔｘ２ｃの除去は５％まで増大させた。９、６、及び５因子のプールから単一の因子の撤去を更に３ラウンド行ったところ、４因子（Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｅｓｐ１、及びＴｂｘ５）が心線維芽細胞からの効率的なＧＦＰ＋細胞の誘導のために重要であることがわかった（図１Ｆ〜Ｈ）。これらの４因子の組み合わせはαＭＨＣ−ＧＦＰレポーターを２０％超活性化させる線維芽細胞の数を劇的に増大させた（図１Ｉ）。
【０２７１】
図１Ａ〜Ｉ。心筋細胞誘導因子を得るためのスクリーニング（Ａ）候補因子を試験するための方策の模式図。（Ｂ）αＭＨＣ−ＧＦＰ心臓体外移植組織から遊走する線維芽細胞様細胞の形態及び特性化。位相差（左）、ＧＦＰ（中央）、およびＴｈｙ−１免疫染色（右）。差し込み図は高倍率画像。（Ｃ）筋細胞を除去するための細胞ストレーナー濾過の後のリプログラミングに関してＴｈｙ−１＋／ＧＦＰ−細胞を体外移植組織培養からＦＡＣＳソーティングした。（Ｄ）ＧＦＰ＋細胞に関するＦＡＣＳ分析のまとめ。１４因子を用いたＧＦＰ＋細胞誘導に対する作用又は１４因子プールからの個々の因子の除去（ｎ＝３）。（Ｅ）ＧＦＰ＋細胞の分析に関するＦＡＣＳプロット。ＧＦＰ＋細胞は１４因子形質導入後一週間に分析した。１４因子からのＧａｔａ４の除去によりＧＦＰ＋細胞の数は低減したが、Ｐｉｔｘ２ｃの除去により増大した。（Ｆ〜Ｈ）９（Ｆ）、６（Ｇ）、又は５（Ｈ）因子のプールからの個々の因子の除去のＧＦＰ＋細胞誘導に対する作用（各々の場合ｎ＝３）。（Ｉ）ＧＦＰ＋細胞は４因子Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｅｓｐ１、及びＴｂｘ５の組み合わせにより線維芽細胞から誘導された。代表的データを各パネルに示す。全てのデータは平均±ＳＤで示す。ＰＩはプロピジウムヨウ素。相対的対照と比較した場合、＊はＰ＜０．０１、＊＊はＰ＜０．０５。スケールバー、１００μｍ。
Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５は心筋細胞誘導のために必要かつ十分である。
【０２７２】
次に、分化心筋細胞の特異的筋節マーカーである心トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）（Kattman等、(2006)上で）の発現を調べた。２０％のＧＦＰ＋細胞が４因子形質導入の１週間後にｃＴｎＴを発現したことがわかった。再度、形質導入において４因子プールからの個々の因子の除去したところ、ｃＴｎＴ発現にはＭｅｓｐ１は不可欠ではないことが解った（図２Ａ及びＢ）。これとは対照的に、Ｍｅｆ２ｃ又はＴｂｘ５の何れかを除去した場合ｃＴｎＴ＋又はＧＦＰ＋細胞は観察されなかった。Ｇａｔａ４の除去はＧＦＰ＋細胞の数には有意に影響しなかったが、ｃＴｎＴ発現は完全に消失し、Ｇａｔａ４もまた必要であることが示唆された。２因子Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５の組み合わせはＧＦＰ発現は誘導したがｃＴｎＴは誘導しなかった。２因子の何れの他の組み合わせ及び単一の因子も、心線維芽細胞におけるＧＦＰとｃＴｎＴの両方の発現を誘導しなかった（図２Ｃ）。これらのデータは、３因子Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５の組み合わせが心遺伝子発現の誘導のために必要かつ十分であることを示唆している。スクリーニングの結果を確認するために、心線維芽細胞を３因子（Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５）＋心形成のためには必須であるが初回スクリーニングで排除されたＮｋｘ２−５で形質導入した。意外にも、Ｎｋｘ２−５を付加すると心線維芽細胞におけるＧＦＰ及びｃＴｎＴの発現が劇的に阻害され、スクリーニング結果を裏付けていた（図２Ｄ）。
【０２７３】
次に、免疫細胞化学分析を用いることにより他の心マーカーがＧＦＰ＋細胞中で発現されたかどうかを調べた。３因子で形質導入された大部分のＧＦＰ＋細胞は筋節性α−アクチニン（アクチニン）を発現し、そして良好に画定された筋節性構造を有していた（図２Ｅ及びＦ）。ＧＦＰ＋細胞は又、ｃＴｎＴ及びＡＮＦ（心房ナトリウム排泄因子）も発現しており、ＧＦＰ＋細胞が数種の心筋細胞特異的マーカーを発現したことを示していた（図２Ｆ）。
【０２７４】
図２Ａ〜Ｆ。３転写因子の組み合わせが線維芽細胞における心遺伝子発現を誘導する。（Ａ）α−ＭＨＣ−ＧＦＰ及び心トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）の発現に関するＦＡＣＳ分析。ＧＦＰ＋及びｃＴｎＴ＋細胞誘導に対する４因子プールからの個々の因子の除去の作用。Ｇａｔａ４の除去はＧＦＰ＋には影響しなかったが、ｃＴｎＴ発現は強力に阻害された。（Ｂ）（Ａ）におけるＧＦＰ＋細胞及びｃＴｎＴ＋細胞の定量的データ（ｎ＝３）。（Ｃ）ＧＦＰ＋及びｃＴｎＴ＋細胞誘導に対する３、２、及び１因子のプールの形質導入の作用（ｎ＝３）。（Ｄ）Ｎｋｘ２−５は３（ＧＭＴ；Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５）因子で形質導入されたリプログラミングを阻害したことを示すＦＡＣＳプロット。（Ｅ）ＧＦＰ（緑）、アクチニン（赤）及びＤＡＰＩ（青）に関する免疫蛍光染色。３因子Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５の組み合わせは、形質導入後２週間で心線維芽細胞における豊富なＧＦＰ発現を誘導した。着目すべきは、ＧＦＰ＋細胞の大部分がアクチニンに関して陽性であった。（Ｆ）誘導心筋細胞は免疫細胞化学分析により数種の心マーカーを発現しており、明確な筋節組織化を伴っていた（アクチニン及びＮｐｐａは形質導入２週間後；ｃＴｎＴは形質導入４週間後）。差し込み図は高倍率画像である。全てのデータは平均±ＳＤで示す。＊は相対的対照と比較してＰ＜０．０１。スケールバー、１００μｍ。
誘導心筋細胞は心線維芽細胞から直接分化される。
【０２７５】
次に、心臓をトリプシン消化し、プラスチックディッシュ上にプレーティングするという従来の線維芽細胞単離方法により新生仔心線維芽細胞を単離した（Ieda等、(2009)上出）。８０％超の細胞がＴｈｙ１を発現し、そしてＴｈｙ１＋／ＧＦＰ−細胞をＦＡＣＳで単離することにより心筋細胞夾雑を排除した（図３Ａ）。以後ＧＭＴと称するＧａｔａ４／Ｍｅｆ２ｃ／Ｔｂｘ５で形質導入された線維芽細胞は体外移植組織培養物から単離された線維芽細胞と同じレベルで１週間後にＧＦＰ、ｃＴｎＴ及びアクチニンを発現した（図３Ｂ及びＣ）。同様の結果が成熟心線維芽細胞へのＧＭＴの導入時にも得られており、筋節様構造の完全な形成が観察された（図３Ｄ及びＥ）。
【０２７６】
誘導心筋細胞が幹様細胞のサブ集団から生じているかどうかを調べるために、ｃ−ｋｉｔ発現（Beltrami等、(2003)Cell 114:763; Wu等、(2006)Cell 127:1137）をＴｈｙ１＋／ＧＦＰ−細胞において分析した。大部分のｃ−ｋｉｔ＋細胞がＴｈｙ１を同時発現していたが、15%のＴｈｙ１＋細胞がｃ−ｋｉｔを発現した。
ＧＦＰ−／Ｔｈｙ１＋／ｃ−ｋｉｔ＋ 細胞及びＧＦＰ−／Ｔｈｙ１＋／ｃ−ｋｉｔ−細胞をＦＡＣＳにより単離し、そして細胞の核集団を３因子で形質導入した。結果は、ＧＦＰ−／Ｔｈｙ１＋／ｃ−ｋｉｔ−細胞からのほうがＧＦＰ−／Ｔｈｙ１＋／ｃ−ｋｉｔ＋細胞からよりも心筋細胞が２〜３倍であることを示していた（図３Ｆ〜Ｈ）。これらの結果は誘導心筋細胞の大部分がｃ−ｋｉｔ陰性集団を起源とすることを示唆していた。
【０２７７】
次に、分化した心筋細胞への心線維芽細胞のリプログラミングが直接の事象であるか、又は、線維芽細胞が更に分化する前に心先祖細胞の消長を経過するかどうかを検討した。これらの２つの可能性の間を区別するために、Ｉｓｌ１−ＣｒｅマウスとＲ２６Ｒ−ＥＹＦＰマウスを交配する（Srinivas等、(2001)上出）ことにより得られたＩｓｌ１−ＹＦＰを用いた。Ｉｓｌ１は心分化の前に一過性に発現される早期心先祖マーカーである。線維芽細胞から発生した心筋細胞が心先祖状態を経由するとすれば、それら及  びそれらの子孫はＹＦＰを永久的に発現するはずである（Laugwitz等、(2005)Nature 433:647）。Ｉｓｌ１−ＹＦＰ−／Ｔｈｙ１＋細胞をＦＡＣＳによりＩｓｌ１−ＹＦＰ心臓体外移植組織から単離し、そして細胞をＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５で形質導入した。得られたｃＴｎＴ＋細胞はＹＦＰを発現せず、誘導心筋細胞（ｉＣＭ）は心先祖細胞に先ずリプログラミングされるわけではないことが示唆された。更に又、これらの結果は、ｉＣＭは新生仔心臓に存在する可能性がある心先祖細胞の希少な集団を起源としないことを示唆している（図３Ｉ及びＪ）。
【０２７８】
図３Ａ〜Ｊ。誘導心筋細胞は分化心線維芽細胞を起源とし、そして直接リプログラミングされる（Ａ）従来の単離方法により単離された心線維芽細胞。大部分の細胞はＴｈｙ１陽性であり、そしてＴｈｙ−１＋／ＧＦＰ−細胞を形質導入に関してＦＡＣＳによりソーティングした。（Ｂ）３因子（ＧＭＴ）による形質導入後１週間の（Ａ）において単離された心線維芽細胞におけるＧＦＰ及びｃＴｎＴ発現に関するＦＡＣＳ分析。（Ｃ）（Ａ）を起源とする３因子誘導心筋細胞におけるＧＦＰ（緑）、アクチニン（赤）及びＤＡＰＩ（青）に関する免疫蛍光染色。（Ｄ）成熟αＭＨＣ−ＧＦＰ心臓から単離された心線維芽細胞を３因子で形質導入した。（Ｅ）（Ｄ）で示した成熟心線維芽細胞を起源とする誘導心筋細胞におけるＧＦＰ、アクチニン及びＤＡＰＩに関する免疫蛍光染色。（Ｆ）ＧＦＰ−／Ｔｈｙ１＋／ｃ−ｋｉｔ＋細胞及びＧＦＰ−／Ｔｈｙ１＋／ｃ−ｋｉｔ−細胞をＦＡＣＳで単離し、そして３因子で形質導入した。（Ｇ）ＧＦＰ−／Ｔｈｙ１＋／ｃ−ｋｉｔ−細胞は３因子形質導入によりＧＦＰ−／Ｔｈｙ１＋／ｃ−ｋｉｔ＋細胞よりも多くＧＦＰ及びｃＴｎＴを発現した。（Ｈ）（Ｇ）におけるＧＦＰ＋細胞及びｃＴｎＴ＋細胞の定量的データ（ｎ＝３）。（Ｉ）Ｉｓｌ１−ＹＦＰ−／Ｔｈｙ１＋細胞Ｉｓｌ１−ＹＦＰ心体外移植組織からソーティングし、そして３因子で形質導入した。（Ｊ）Ｉｓｌ１−ＹＦＰ−／Ｔｈｙ１＋細胞から誘導したｃＴｎＴ＋細胞の殆どがＥＦＰ陰性であった。全てのデータは平均±ＳＤで示す。＊は相対的対照と比較してＰ＜０．０１。スケールバー、１００μｍ。
誘導心筋細胞はグローバル遺伝子発現において新生仔心筋細胞に類似している。
【０２７９】
心筋細胞誘導の経時的過程を分析した。ＧＦＰ＋細胞は誘導後３日で検出され、そして第１０日の２０％まで徐々に数が増大し、そして４週間後もなお存在していた（図４Ａ）。重要な点は、ＧＦＰ＋細胞におけるｃＴｎＴ＋細胞のパーセンテージ及びｃＴｎＴ発現の強度は経時的に有意に増大した（図４Ｂ及びＣ）。ＧＦＰ＋細胞をＧＭＴ形質導入後７、１４及び２８日目にソーティングし、そして候補遺伝子の発現を心線維芽細胞及び新生仔心筋細胞と比較した。心筋細胞特異的遺伝子Ａｃｔｃ１（心α−アクチン）、Ｍｙｈ６（α−ミオシン重鎖）、Ｒｙｒ２（ライアノジン受容体２）、及びＧｊａ１（コネキシン４３）はＧＦＰ＋細胞においては時間依存的態様において有意にアップレギュレートされたが、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）では心線維芽細胞中に検出されなかった。線維芽細胞のマーカーであるＣｏｌ１ａ２（コラーゲン１ａ２）は心筋細胞と同じレベルにまで第７日培養物に由来するＧＦＰ＋細胞において劇的にダウンレギュレートされた。３種のトランスダクションされた遺伝子の発現は４週間後まで誘導心筋細胞において強力にアップレギュレートされ、それらがサイレント化されていないことを示唆していた（図４Ｄ）。これらのデータは３因子が心線維芽細胞から心筋細胞への直接の変換を急速かつ効率的に誘導したが、完全成熟化は緩徐な過程であったことを示している。
【０２８０】
ｉＣＭ、新生仔心筋細胞及び心線維芽細胞のグローバル遺伝子発現パターンをｍＲＮＡマイクロアレイ分析により比較した。ＧＭＴ形質導入２８日後にＧＦＰ＋細胞及び ＧＦＰ−細胞をソーティングした。グローバル遺伝子発現パターにおいて、誘導ＧＦＰ＋細胞は新生仔心筋細胞と全く同様であったが、ＧＦＰ−細胞及び心線維芽細胞とは異なっていた。これらの結果はｉＣＭが新生仔心筋細胞に高度に近似していることを示しており、リプログラミング事象がグローバル遺伝子発現を概して反映していることを示していた。
【０２８１】
図４Ａ〜Ｄ。誘導心筋細胞の遺伝子発現をグローバルにリプログラミングする（Ａ）プレーティングした細胞の数と比較したＧＦＰ＋細胞のパーセント（ｎ＝３）。ＧＦＰ＋細胞の数は各時点においてＦＡＣＳソーティングにより計数した。（Ｂ）ＧＦＰ＋細胞におけるｃＴｎＴ発現のＦＡＣＳ分析。着目すべき点として、ｃＴｎＴ＋細胞の数及びｃＴｎＴの強度は両方とも経時的に増大した（ｎ＝３）。（Ｃ）（Ｂ）におけるｃＴｎＴ強度の定量的データ（ｎ＝４）。（Ｄ）
ｑＰＣＲで測定した場合の心線維芽細胞（ＣＦ）、誘導心筋細胞 (ＧＦＰ＋、形質導入後７日、１４日、２８日）及び新生仔心筋細胞（ＣＭ）におけるＡｃｔｃ１、Ｍｙｈ６、Ｒｙｒ２、Ｇｊａ１、Ｃｏｌ１ａ２及びＴｂｘ５ｍＲＮＡ発現（ｎ＝３）。
誘導心筋細胞は自発的収縮を呈する。
【０２８２】
ｉＣＭが心筋細胞に特徴的な機能的特性を保有しているかどうかを調べるために、細胞内Ｃａ２＋流入を培養４週間後のｉＣＭにおいて分析した。ｉＣＭの約３０％が、新生仔心筋細胞の場合と同様の自発的Ｃａ２＋振動を示した（図５Ａ）。Ｃａ２＋振動の周波数は細胞間で変動していた（図５Ｂ）。更に又、自発的Ｃａ２＋ 波がｉＣＭにおいても新生仔心筋細胞と同様に観察された（図５Ｃ）。
【０２８３】
特徴的なＣａ２＋流入のほかに、ｉＣＭは培養４〜５週間後に自発的収縮活性を示した。拍動細胞における電気的活性の単細胞細胞外記録によれば、新生仔心筋細胞と同様の軌跡が明らかになった（図５Ｄ）（Yeung等、2001）。即ち、心線維芽細胞からｉＣＭへのリプログラミングは遺伝子発現におけるグローバルな変化及び心筋細胞に特徴的な機能的特性を伴っていた。
【０２８４】
図５Ａ〜Ｄ。誘導心筋細胞は自発的Ｃａ２＋流入、電気的活性及び拍動を呈する（Ａ）α−ＭＨＣ−ＧＦＰ＋細胞は自発的Ｃａ２＋振動を示した。擬似色画像は細胞におけるＲｈｏｄ−３蛍光強度を示している。小型四角はＣａ２＋計測領域を示しており、差込図は高倍率画像を示す（左パネル）。Ｒｈｏｄ−３強度の軌跡（右パネル）は左パネルに相当する。矢印は左の画像に相当する時点を示す。（Ｂ）高周波Ｃａ２＋振動が誘導心筋細胞において観察された。矢印は左の画像に相当する時点を示す。（Ｃ）誘導心筋細胞において観察された自発的Ｃａ２＋波。Ｃａ２＋ｍａｘ及びｍｉｎにおけるＧＦＰ及びＲｈｏｄ−３を示す。ＧＦＰ＋細胞は白点で示す。（Ｄ）単細胞細胞外電極により計測された電気的活性を自発収縮細胞が有していた。代表的なデータを各パネルに示す（ｎ＝１０）。
心線維芽細胞はインビボの３因子形質導入により心筋細胞に変換する。
【０２８５】
次に、Ｇａｔａ４＋Ｍｅｆ２ｃ＋Ｔｂｘ５（ＧＭＴ)-形質導入心線維芽細胞がインビボで心筋細胞にリプログラミングされ得るかどうかを検討するために、
ＧＦＰ−／Ｔｈｙ１＋心線維芽細胞をウィルス形質導入後第１日に採取し、そしてそれらを非肥満糖尿病重度合併免疫不全（ＮＯＤ−ＳＣＩＤ）マウス心臓中に注射した。ＧＭＴ感染細胞は形質導入後第１日にＧＦＰを発現し無かった（図４Ａ）。心線維芽細胞を３因子とＤｓＲｅｄレトロウィルスの混合物かＤｓＲｅｄレトロウィルス（陰性対象）の何れかに感染させることにより容易に蛍光で識別できるようにした。ＤｓＲｅｄを感染させた心線維芽細胞はアクチニンやＧＦＰを発現せず、心筋細胞変換が陰性対照では起こらなかったことが確認された（図６Ａ及びＢ）。ウィルス感染後僅か１日で心臓に注射したにも関わらず、３因子（ＧＭＴ）及びＤｓＲｅｄで形質導入した心線維芽細胞のサブセットは２週間以内にマウス心臓でＧＦＰを発現した（図６Ｂ）。ＧＦＰ＋細胞はアクチニンを発現し、そして明確な筋節様構造を有していた（図６Ｃ）。これらの結果はＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５がインビボで２週間以内に心線維芽細胞を心筋細胞に変換するために十分であったことを示唆している。
【０２８６】
図６Ａ〜Ｃ。心線維芽細胞はインビボで心筋細胞にリプログラミングされることができる。（Ａ）ＤｓＲｅｄ感染心線維芽細胞（ＤｓＲｅｄ−細胞）を感染１日後にＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス心臓に移植し、そして２週間後に免疫細胞化学分析により心臓切片を分析した。ＤｓＲｅｄとマークされた移植線維芽細胞はアクチニン（緑）を発現しなかった。（Ｂ）ＤｓＲｅｄ又はＧａｔａ４／Ｍｅｆ２ｃ／Ｔｂｘ５＋ＤｓＲｅｄ（３Ｆ／ＤｓＲｅｄ−細胞）を感染させた心線維芽細胞を感染１日後にＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス心臓に移植した。着目すべき点は、３Ｆ／ＤｓＲｅｄ細胞のサブセット（赤）がα−ＭＨＣ−ＧＦＰ（緑）を発現したことであった。データは移植後２週間に分析した。（Ｃ）Ｇａｔａ４／Ｍｅｆ２ｃ／Ｔｂｘ５形質導入心線維芽細胞（３Ｆ−細胞）をマウス心臓に移植した。誘導ＧＦＰ＋細胞のサブセットがアクチニン（赤）を発現し、そして筋節性構造を有していた 。差し込み図は高倍率画像である（矢印）。データは移植２週間後に分析した。代表的データを各パネルに示す（各群ｎ＝４）。スケールバー、１００μｍ。
【実施例２】
【０２８７】
機能的心筋細胞への心線維芽細胞の直接リプログラミング
本質的に実施例１に記載した方法を用いながら、外因性のＧａｔａ４、Ｔｂｘ５、及びＭｅｆ２ｃをマウス生後尾部先端線維芽細胞中に導入した。生後尾部先端線維芽細胞の約２０〜３０％が、Ｇａｔａ４、Ｔｂｘ５、及びＭｅｆ２ｃ（ここでＧａｔａ４、Ｔｂｘ５、及びＭｅｆ２ｃはＧＭＴと総称する）の導入後にミオシン重鎖−ＧＦＰ＋細胞（心筋細胞）にリプログラミングされた。
【実施例３】
【０２８８】
ネズミ心線維芽細胞から心筋細胞へのインビボのリプログラミング
材料及び方法レトロウィルス発生、濃度及び滴定。レトロウィルスは実施例１に記載する通り発生させた。Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、 Ｔｂｘ５、及びｄｓＲｅｄのコーディング領域を含有している＠ＭＸｓレトロウィルスベクターをＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＰｌａｔ−Ｅ細胞中にトランスフェクトすることによりウィルスを発生させた。超高力価ウィルス（ｍｌ当たり＞１ｘ１０１０プラーク形成単位（ｐ.ｆ.ｕ））を標準的超遠心分離により得た。Ｒｅｔｒｏ−Ｘ ｑＲＴ−ＰＣＲ滴定キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてレトロウィルス滴定を実施した。
【０２８９】
動物、外科的処置、心エコー検査及び心電図検査。Ｐｏｓｔｎ−Ｃｒｅ；Ｒ２６Ｒ−ｌａｃＺマウスはペリオスチン−Creマウス（Snider等、(2009)Circulation Res.105:934）とＲｏｓａ２６−ｌａｃＺマウス（Soriano (1999)Nat.Genet.21:70）を交配させることにより得た。Ｐｏｓｔｎ−Ｃｒｅ；Ｒ２６Ｒ−ＥＹＦＰマウスはペリオスチン−CreマウスとＲｏｓａ２６−ＥＹＦＰマウス（Srinivas等、(2001)上出）を交配させることにより得た。全ての外科的処置及びその後の分析は遺伝子型及び介入に関して盲検としながら実施した。心筋梗塞（ＭＩ）を文献記載の通り（Qian等、(2011)J. Exp. Med. 208:549）左前下行動脈（ＬＡＤ）の永久結紮により誘導した。濃縮ウィルス（ＧＭＴ（Ｇａｔａ−４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５）；又はＧＭＴＲ（ＧＭＴ＋ＤｓＲｅｄ））のプールを混合し、そして冠動脈閉鎖の後、１０μｌの混合ウィルス＋１０μｌのＰＢＳ又は４０ｎｇ／μｌのチモシンβ４を梗塞領域と境界領域（蒼白化した梗塞領域に基づく）の間の境界に沿って注射した。マウス心エコー検査及び表面心電図検査を文献記載の通り実施した（Qian等、(2011)上出）。
【０２９０】
免疫組織化学検査及び免疫細胞化学検査。免疫組織化学検査及び免疫細胞化学分析を文献記載の通り実施した（Qian等、(2011)上出）。瘢痕の大きさはＭａｓｓｏｎ−Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色（Bock-Marquette等、(2004)Nature 432:466; and Qian等、(2011)上出）により測定した。危険面積（ＡＡＲ）及び心筋梗塞サイズはエバンスブルー／塩化トリフェニルテトラゾリウム標識法により測定した（Kurrelmeyer等、(2000)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:5456）。
【０２９１】
成熟心筋細胞の単離、単細胞パッチクランプ、及び心線維芽細胞遊走アッセイ。成熟心筋細胞の単離は若干の変更を加えながら文献記載のとおり実施した（Xu等、(1999)J. Gen. Physiol. 113:661）。単細胞パッチクランプ記録は文献記載の通り実施した（Knollmann等、(2003)Circulation Res. 92:428; Le Guennec等、(1994)J. Physiol. 478 Pt 3:493; Spencer等、(2003)Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285:H2552）。遊走試験は公開されている体外移植組織培養プロトコル (実施例１； Bock-Marquette等、(2004)上出；及びAndersen等、(2009)上出）に従って実施した。要すれば、単離された成熟マウス心臓を大きさ１ｍｍ３未満の小片にまで粉砕した。体外移植組織は、ゼラチンコーティングディッシュ上にプレーティングし、そして線維芽細胞が粉砕組織から遊走するまで体外移植組織培地（ＩＭＤＭ／２０％ＦＢＳ）中で培養した。遊走線維芽細胞を伴って１０個の心臓片が観察された日数を記録した。
【０２９２】
ＦＡＣＳ及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ。マウス心臓から解離した心細胞を室温で３０分間ＡＰＣコンジュゲート抗Ｔｈｙ１抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。２回ＰＢＳで洗浄した後、染色された細胞をＦＡＣＳＡｒｉａ２（ＢＤ）でソーティングした。ＲＮＡはＴＲｉｚｏｌ法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により抽出した。ＲＴ−ＰＣＲはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いながら実施した。ｑＰＣＲは製造元のプロトコルに応じて、ＡＢＩ７９００ＨＴ（ＴａｑＭａｎ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いながら実施した。Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｒｒａｙの最適化プライマーを使用した。
【０２９３】
統計処理。群間の差は不対スチューデントｔ検定又はＡＮＯＶＡを用いて統計学的有意性に関して調べた。ｐ＜０．０５を有意と見なした。
【０２９４】
結果
実施例１は３つの転写因子Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５（ＧＭＴ）の発現時のインビトロの心筋細胞様細胞中への線維芽細胞の直接リプログラミングを説明している。ｉＰＳ細胞へのリプログラミングにおいて観察されている通り、インビトロで拍動心筋細胞に完全にリプログラミングされた線維芽細胞のパーセンテージは小さかったが、遥かに多くが部分的にリプログラミングされ、追加的刺激により完全に多能性となる潜在力を有するプレｉＰＳ細胞とかなり類似していた。心線維芽細胞はそのネイティブの環境においてより完全にインビボでリプログラミングされる可能性があり、これが生存、成熟及び近隣細胞とのカップリングを促進すると考えられた。それが正しい場合、心線維芽細胞の膨大な内因性プールは再生治療のための新しい心筋細胞の潜在的発生源として機能すると考えられる。
【０２９５】
インビボで高レベルのＧＭＴを効率的に送達するために、レトロウィルスシステムを用いることにより、２ヶ月齢の雄性マウスの心臓中にマーカーとしてＧＭＴ又はｄｓＲｅｄを発現させた。各転写因子及びｄｓＲｅｄ対照を発現する超高力価レトロウィルス(〜１０１０コピー／ｍｌ）１０μｌを混合物として心筋壁中に注射した。レトロウィルス注射の二日後、注射領域を横断する切片を作成し、ｄｓＲｅｄ、心筋細胞マーカー、α−アクチン、及び線維芽細胞集団においてリッチ化されるビメンチンに関して同時染色した。心線維芽細胞に対して何れのマーカーも完全に特異的ではないが、線維芽細胞はビメンチン及び表面マーカーＴｈｙ１及びＤＤＲ２の発現により特徴付けられている（Ieda等、(2009)上出）。ベースラインにおいて、ｄｓＲｅｄも発現する何れかのα−アクチニン又はビメンチン陽性の細胞を検出することは困難であり、最小限のウィルス取り込みを示唆していた。このことは、レトロウィルスは活動的に分裂している細胞に感染するのみであるという観察結果と合致している（Byun等、(2000)J. Gene Med. 2:2）。
【０２９６】
心筋細胞とは異なり胚性の起源を有する線維芽細胞は心筋梗塞（ＭＩ）のような心傷害の後に活性化し、そして傷害部位に遊走し、そして増殖する。心傷害は冠動脈結紮及び梗塞領域に接する心筋中への注射ｄｓＲｅｄレトロウィルスにより誘導した。ｄｓＲｅｄとα−アクチニンを同時発現している細胞はなお検出不能であったが、同様にｄｓＲｅｄ陽性である多くのビメンチン陽性細胞が観察された（図７Ａ）。ウィルスを取り込んだ心臓細胞のパーセンテージを定量するために、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いながら傷害後２日に注射心臓の梗塞／境界領域から解離した細胞を分析した。線維芽細胞でリッチ化される表面マーカーであるＴｈｙ１で染色された細胞は外科処置により増大し、心線維芽細胞の良好な活性化を示唆していた（図７Ｂ）。希少なｄｓＲｅｄ＋Ｔｈｙ１＋細胞は擬似処置されたマウスからＦＡＣＳにより検出されたが；ＭＩを有するマウスの梗塞／境界領域に由来する細胞の４．２％がｄｓＲｅｄ＋Ｔｈｙ１＋であり、傷害字の心線維芽細胞へのウィルスの良好な送達を示唆していた（図７Ｃ）。これと合致して、ｄｓＲｅｄ＋Ｔｈｙ１＋ソーティング細胞は定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によればｄｓＲｅｄ−Ｔｈｙ１＋細胞よりも６０倍高値のレベルのＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５を発現した（図７Ｄ）。
【０２９７】
非筋細胞プールからの心筋細胞変換がインビボで起こっていたかどうかを調べるために、直系追跡実験を用いることにより推定誘導心筋細胞の起源を追尾した。心線維芽細胞を線維芽細胞リッチ化遺伝子ペリオスチンのプロモーター下にＣｒｅ−リコンビナーゼを発現するマウス系統で遺伝子標識した（Snider等、(2009)supra; and Snider等、(2008)Circulation Res. 102:752）。
ペリオスチン発現細胞及び全てのそれらの子孫においてβ−ガラクトシダーゼの活性化をもたらすＲ２６Ｒ−ｌａｃＺレポーター系等と異種交配（Soriano等、(1999)上出）した場合（図７Ｅ）、報告されている通り心線維芽細胞の大部分及び一部の心膜内及び内皮細胞においてβ−ガラクトシダーゼ活性が観察された（Snider等、(2009)supra; Snider等、(2008)supra; and Takeda等、(2010)J. Clin. Invest. 120:254）。最も重要な点は、β−ガラクトシダーゼ活性は冠動脈結紮による傷害の後であっても如何なる心筋細胞でも検出されず、報告と一致していた（図７Ｆ）（Snider等、(2009)supra; Snider等、(2008)supra; and Takeda等、(2010)上出）。しかしながら、ＭＩ及びＧＭＴのレトロウィルス送達の４週間後には、α−アクチニン＋でもある多くのβ−ガラクトシダーゼ＋細胞が心臓の傷害領域で観察され、それらがかつてペリオスチンを発現した細胞の子孫である場合があることを示唆していた（図７Ｇ）。これらの細胞は十分形成された筋節であり、そしてβ−ガラクトシダーゼ−筋細胞と同様の形状を有していた（図７Ｇ）。
【０２９８】
図７Ａ〜Ｇ。遺伝子直径追跡は、心筋細胞様細胞への心線維芽細胞のインビボのリプログラミングを明らかにする。ａ：ＭＩ２日後、ビメンチン＋細胞（緑）中へのｄｓＲｅｄ対照ウィルス（赤）の組み込みはあるが、αアクチニン＋細胞（青）へは無いことを示す心臓に対する免疫蛍光染色の共焦点顕微鏡画像。矢印はｄｓＲｅｄ＋ビメンチン＋細胞（黄）を指し、そのうち２つは高倍率下にスキャンされ、そして右の３パネルに示されており、下部ではマージした画像となっている。ｂ：擬似処置又は心筋梗塞（ＭＩ）の２日後の心臓から得られたＴｈｙ−１陽性細胞のＦＡＣＳ分析による定量。ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５。ｃ：擬似処置又はＭＩマウスのＴｈｙ−１＋ｄｓＲｅｄ＋細胞のＦＡＣＳ分析、定量（左）及び代表的ＦＡＣＳプロット（右）。ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５。ｄ：
ＧＭＴＲ（Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５及びｄｓＲｅｄ）をＭＩ後心臓に注射した２日後にソーティングしたＴｈｙ−１＋ｄｓＲｅｄ−細胞と比較した場合のＴｈｙ−１＋ｄｓＲｅｄ＋細胞におけるＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５のｑＰＣＴ。技術的４連によるｎ＝３。ｅ： Ｐｏｓｔｎ−Ｃｒｅ；Ｒ２６Ｒ−ｌａｃＺ細胞からリプログラミングされた心筋様細胞を直径追跡するための遺伝子消長マッピング方法を示す模式的ダイアグラム。ｆ：擬似処置又はＭＩの４週間後のＰｏｓｔｎ−Ｃｒｅ；Ｒ２６Ｒ−ｌａｃＺマウス心臓切片に対するαアクチニン（緑）、βＧａｌ（赤）、及びＤＡＰＩ（青）に関する免疫蛍光染色。着目すべきは、ＭＩ後であってもαアクチニン＋βＧａｌ＋の二重陽性細胞が存在しない点である。ｇ： ＭＩの４週間後のマウスの境界領域から得られたｄｓＲｅｄ−又はＧＭＴ注射Ｐｏｓｔｎ−Ｃｒｅ；Ｒ２６Ｒ−ｌａｃＺ心臓切片に対するαアクチニン（緑）、βＧａｌ（赤）、及びＤＡＰＩ（青）に関する免疫蛍光染色。最下部のパネルは中央パネルの囲み領域の拡大図である。
【０２９９】
β−ガラクトシダーゼ＋α−アクチニン＋細胞がリプログラミングされている程度及びスペクトルを求めた。心臓切片の厚みが原因となって重複した細胞から生じる擬陽性シグナルの可能性を回避するために、成熟心筋細胞は、冠動脈結紮及びＧＭＴ又はｄｓＲｅｄ対照注射の４週間後のペリオスチン−Ｃｒｅ；Ｒ２６Ｒ−ｌａｃＺ心臓の梗塞／境界領域から単細胞において単離された。
ｄｓＲｅｄ注射心臓から単離された心筋細胞の何れも、免疫染色によれば、β−ガラクトシダーゼ＋ではなく（図８Ａ、ｎ＝６動物、４〜６スライド／動物）； ペリオスチン−Ｃｒｅ；Ｒ２６Ｒ−ＥＹＦＰマウスから単離された同様の細胞は可視化した数千の細胞のうちＹＦＰ＋心筋細胞を示さなかった。これとは対照的に、境界／梗塞領域から得られた心筋細胞のプレパレーション中で単離された細胞の３５％はＧＭＴ注射後にβ−ガラクトシダーゼ＋であった（図８Ｂ及び８Ｃ）。β−ガラクトシダーゼ＋細胞のうち、９８％がα−アクチニン＋であった。β−ガラクトシダーゼ＋細胞が心筋細胞におおてペリオスチン−Ｃｒｅの漏出性の発現又はＣｒｅの異所性の活性化を呈する可能性を調べるために、ＧＭＴレトロを取り込む非筋細胞に関するマーカーを与えるＧＭＴ及びｄｓＲｅｄ（ＧＭＴＲ）に関するプールされたレトロウィルスを心臓に同時注射した。β−ガラクトシダーゼ＋細胞はｄｓＲｅｄに関しても陽性であることがわかり、それらが非心筋細胞起源であることと合致して、それらがウィルスに感染していることが示された（図８Ｄ〜Ｇ）。
【０３００】
形態学的には、β−ガラクトシダーゼ＋細胞の大部分は棒型形状の外観を伴った大型であり、そして二核化しており、同じ単離から得られたβ−ガラクトシダーゼ陰性である内因性心筋細胞に酷似していた（図８Ｄ〜Ｇ）。その後の分析により、α−アクチニン（図８Ｈ）のほかに、β−ガラクトシダーゼ＋細胞は多数の筋節マーカー、例えばトロポミオシン（図８Ｉ）、心筋重鎖（ＭＨＣ）（図８Ｊ）及び心トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）（図８Ｋ）を発現していたことがわかった。細胞の〜５０％に相当する細胞全体に渡ってほぼ正常な筋節構造を示した細胞の例を示す（図８Ｈ〜Ｋ）。細胞はビメンチン、平滑筋α−アクチン、又はＳＭ２２を発現しておらず、細胞がもはや心線維芽細胞ではなく、又、それらは筋線維芽細胞や血管平滑筋とならなかったことが示唆された。簡便のために、 β−ガラクトシダーゼ＋α−アクチニン＋心筋細胞様細胞は、少なくとも区別可能な形態、遺伝子発現及び筋節構造に基づいて、インビボ誘導心筋細胞（ｉＣＭ）と称する。
【０３０１】
内因性心筋細胞との細胞−細胞連絡に関与する蛋白をｉＣＭが発現したかどうかを調べるために、心筋層中の介在板に位置する細胞表面Ｃａ２＋依存性接着分子であるＮ−カドヘリンの発現のレベル及びパターンを調べた。ｉＣＭの９０％超がＮ−カドヘリンを発現し；６１％が細胞境界において局在したＮ−カドヘリンを有し；そして５％が内因性心筋細胞局在化に完全類似していた（図８Ｌ）。心室全体に渡って細胞の電気的カップリング及び筋細胞の同調収縮を促進する心臓における主要なギャップジャンクション蛋白であるコネキシン４３（Ｃｘ４３）の発現もまた調べた。ｉＣＭの約９０％がＣｘ４３を発現し、これらの半数が内因性心筋細胞と同様の高いレベル及びパターンにおいてＣｘ４３を発現しており、細胞境界局在化を伴っており（図８Ｍ）；４％においては、Ｃｘ４３は内因性心筋細胞のものとはほぼ区別できないパターンにおいて局在していた（図８Ｍ）。
【０３０２】
ｉＣＭが成熟心筋細胞の典型的電気生理学的特性を保有しているかどうかを調べるために、細胞内電気記録を標準的なパッチクランプ手法により実施した。ＧＭＴで形質導入されたペリオスチン−Ｃｒｅ；Ｒ２６Ｒ−ＥＹＦＰマウスの境界／梗塞領域に由来する心筋細胞の単細胞懸濁液からの読み取りにより、ＹＦＰ＋細胞（ｉＣＭ）及びＹＦＰ−である内因性心筋細胞の活動電位を比較した（図８Ｎ；及び図９）。多くのリプログラミングされた細胞が生理学的休止期膜電位（−７０ｍＶ以下）を有しており、そして刺激の非存在下では通常は静止性である成熟心室心筋細胞と同様の、電気刺激応答であるが休止期ではない収縮を呈した。変動する活動電位の形態が識別され（図８Ｎ；及び図９）、そして一部の自発的収縮細胞が観察されたが、これらは約−５０ｍＶの休止期電位を有していた。総括すれば、多くのインビボのリプログラミングされた心筋細胞はＧＭＴ導入４週間後には成熟心室心筋細胞に緊密に類似していたが、他のものは概して同様であり、培養物中の単細胞として評価した場合に分極亢進休止期電位を維持するそれらの能力において主に異なっていた。
【０３０３】
図８Ａ〜Ｎ。インビボの心リプログラミングの単細胞分析。ａ〜ｃ：ｄｓＲｅｄ（ａ）又はＧＭＴ（ｂ）注射後４週間のＰｏｓｔｎ−Ｃｒｅ；Ｒ２６Ｒ−ｌａｃＺ心臓の梗塞／境界領域に由来する単離された心筋細胞に対するβＧａｌ及びＤＡＰＩに関する免疫蛍光染色と（ｃ）における定量。ｄ〜ｇ：ＭＩ（ｄ）後４週間のＧＭＴＲ−注射Ｐｏｓｔｎ−Ｃｒｅ；Ｒ２６Ｒ−ｌａｃＺ心臓から単離したＣＭの明視野像。当然ながら（ｅ）はβＧａｌ陽性であり、そして（ｆ、ｇ）はｄｓＲｅｄで同時染色される。ｈ〜ｋ：ＧＭＴ注射後４週間のＰｏｓｔｎ−Ｃｒｅ；Ｒ２６Ｒ−ｌａｃＺ心臓の梗塞／境界領域に由来する単離された心筋細胞に対するβＧａｌ及びＤＡＰＩにより共標識されたαアクチニン、トロポミオシン、心ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、及び心トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）を包含する心マーカーに関する免疫蛍光染色。図は同じプレパレーションに由来する内因性心筋細部の隣の誘導心筋細胞の代表的例を示し、定量と試料サイズを伴う。箱内領域の高倍率画像は最右端のパネルに示す。ｌ〜ｍ：ＧＭＴ注射後４週間のＰｏｓｔｎ−Ｃｒｅ；Ｒ２６Ｒ−ｌａｃＺ心臓の梗塞／境界領域に由来する単離された心筋細胞に対するβＧａｌ及びＤＡＰＩにより共標識されたＮ−カドヘリン又はコネキシン４３に関する免疫蛍光染色。左側２パネルは定量及び試料サイズを伴った代表的画像であり；右側２パネルは同じプレパレーションに由来する内因性心筋細部の隣の最も良好にリプログラミングされた誘導心筋細胞の代表的例を示し、定量と試料サイズを伴う。箱内領域の高倍率画像はマージ図の隣に示す。ｎ：ＭＩ後４週間のＰｏｓｔｎ−Ｃｒｅ；Ｒ２６Ｒ−ＥＹＦＰ心臓から単離した多数の心筋細胞の細胞内電流クランプ記録。ＹＦＰ＋であったｉＣＭは同じプレパレーションに由来するＹＦＰ−であった内因性心筋細部のものに類似した活動電位を示した。細胞はＭＩ及びウィルス形質導入の８週間後のＰｏｓｔｎ−Ｃｒｅ；Ｒｏｓａ−ＥＹＦＰマウスから単離した。
【０３０４】
図９．追加的なインビボリプログラミングされたｉＣＭに関する活動電位を示す細胞内記録（ＭＩ及びＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５感染の８週間後のＰｏｓｔｎ−Ｃｒｅ；Ｒｏｓａ−ＥＹＦＰ心臓から単離したＹＦＰ＋細胞）。
【０３０５】
インビボリプログラミングされたｉＣＭは収縮能力を有しており、そして生存内因性心筋細胞と電気的にカップリングする可能性があるため、内因性心線維芽細胞を筋細胞に変換することは、ＭＩ後の心機能の部分的回復と見なされるかどうかを調べた。全試験はレトロウィルス注射を含めて盲検状態としながら実施され、そして計測完了後にデコードされた。ＧＭＴ又はｄｓＲｅｄ単独を注射されたマウスにＭＩの１日前、及び３日後、及び１、４、８及び１２週間後に一連の高解像度心エコー検査を実施した。エバンズブルー／ＴＴＣ二重染色を用いながら、冠動脈結紮後４８時間の危険面積（ＡＡＲ）、及び心筋の梗塞サイズを検査した。ＧＭＴ及びｄｓＲｅｄ注射マウスはＡＡＲ及び梗塞サイズにおいて差が無く（図１０Ａ）、ＭＩ後初回心傷害の程度はＧＭＴ誘導により有意に影響されなかったことを示唆している。全マウスが冠動脈結紮後の左心室機能の低減を示していた（図１１；及び図１０Ｂ）。注射後８及び１２週間において、各収縮により左心室から駆出される血液の画分（駆出率）及び左室内径短縮率はｄｓＲｅｄを注射された対照と比較してＧＭＴを注射したマウスにおいて有意に改善していた（図１１Ｂ；及び図１０Ｂ〜Ｄ）。１回拍出量（各心拍により駆出される血液の容量）及び心拍出量は８週間後に改善し（図１０Ｃ）、そして１２週間後には正常に近づいた（図１１Ａ）。
【０３０６】
新機能不全の分子リードアウトとして、ｑＰＣＲを実施することにより、傷害領域におけるＧＭＴ注射及び対照の心臓からの心房ナトリウム排泄因子（ＡＮＦ）、脳ナトリウム排泄ペプチド（ＢＮＰ）及びテナシンＣ（Ｔｎｃ）の発現レベルをモニタリングした。予測された通り、ＭＩ後に全てがアップレギュレートされたが、このアップレギュレーションは梗塞心臓におけるＧＭＴの注射により減衰した（図１１Ｂ）。ＭＩによって増大したコラーゲン遺伝子の発現レベルはＧＭＴ注射により部分的に回復したこともわかった（図１１Ｃ）。心機能の改善と合致して、ＧＭＴ注射はＭＩ後８週間でより小さい瘢痕サイズをもたらした（図１１Ｄ）。ＥＣＧは対照ｄｓＲｅｄ注射と比較した場合にＧＭＴ注射による不整脈の証拠を示しておらず 、そして突然死したマウスは無かった。
【０３０７】
図１０Ａ〜Ｄ。冠動脈結紮後のｄｓＲｅｄ又はＧＭＴ注射心臓に関する危険面積（ＡＡＲ）及び梗塞サイズの測定及び追加的心エコー検査データ。ａ：心筋梗塞（ＭＩ）４８時間後のｄｓＲｅｄ又はＧＭＴ注射心臓の代表的心臓から得た左心室の４点の連続薄片に対するエバンズブルーＴＣＣ染色の代表的な図。スケールバー：５００μｍ。ヒストグラムは方法において記載したとおり、危険面積（ＡＡＲ）及び梗塞サイズの盲検定量である。ｄｓＲｅｄ及びＧＭＴ注射ＭＩ心臓の間に統計学的な差は無かった。ｂ〜ｃ：左心室の左室内径短縮率（ＦＳ）、駆出率（ＥＦ）、１回拍出量（ＳＶ）及び心拍出量（ＣＯ）を、ｄｓＲｅｄ又はＧＭＴを注射した心臓に対する高解像度心エコー検査図を用いて示す。ＭＩ後３日（ｂ）及び８週間（ｃ）のこれらの３パラメーターの変化を示す。ｄ：心エコー検査の間の心拍数を各時点関して示したものであり、ｄｓＲｅｄとＧＭＴコホートの間に差が無いことがわかる。（ｂ、ｃ、ｄ）における全エコーデータは盲検的態様において収集された。ｄｓＲｅｄはｎ＝９；ＧＭＴはｎ＝１０。＊ｐ＜０．０５。
【０３０８】
図１１Ａ〜Ｄ。心リプログラミング因子のインビボ送達は心筋梗塞後の新機能を改善させる。ａ：左心室の左室内径短縮率（ＦＳ）、駆出率（ＥＦ）、１回拍出量（ＳＶ）、及び心拍出量（ＣＯ）を高解像度心エコー検査を用いて計測した。ＭＩの前及び１２週間後のこれらのパラメーターの変化を計算した。データは盲検的態様において収集した。ｄｓＲｅｄはｎ＝９； ＧＭＴ(Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５）はｎ＝１０。＊ｐ＜０．０５。ｂ：ＭＩ及びｄｓＲｅｄ又はＧＭＴの注射の４週間後の境界領域から抽出されたＲＮＡに対するＡＮＦ（心房ナトリウム排泄因子）、ＢＮＰ（脳ナトリウム排泄ペプチド）及びＴｎｃ（テナシンＣ）のｑＰＣＲ。ｃ：ＭＩ及びｄｓＲｅｄ又はＧＭＴの注射の４週間後の境界領域から抽出されたＲＮＡに対するＩ型コラーゲンアルファ１（Ｃｏｌ１ａ１）、Ｉ型コラーゲンアルファ２（Ｃｏｌ１ａ２）、ＩＩＩ型コラーゲンアルファ１（Ｃｏｌ３ａ１）、エラスチン（Ｅｌｎ）のｑＰＣＲ。（ｂ）及び（ｃ）のデータは、破線で示されたｄｓＲｅｄ注射擬似処置マウスとの相対比較において示した。各遺伝子型に対して技術的４連によるｎ＝３。ｄ：
ｄｓＲｅｄ又はＧＭＴを注射されたＭＩ８週間後の心臓切片のＭａｓｓｏｎ−Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色。スケールバー：５００μｍ。瘢痕サイズの定量は盲検的態様において各心臓につき４切片中の瘢痕面積の計測により計算した。ｄｓＲｅｄはｎ＝8; ＧＭＴはｎ＝９。＊ｐ＜０．０５.
【０３０９】
ＧＭＴの送達はＭＩ後の心臓修復に大きく影響したが、レトロウィルスに感染したＴｈｙ１＋細胞の数を増大させると更に大きい機能改善がもたらされると推定した。４３アミノ酸のＧアクチン単量体結合蛋白であるチモシンβ４は細胞遊走、心細胞生存を促進し、そして心外膜細胞を活性化することにより増殖性を高め、そして心線維芽細胞及び内皮細胞をより多く生じさせることができる。以前の報告によれば、チモシンβ４はＭＩ後の新機能を改善し、そして瘢痕サイズを減少させる。心線維芽細胞遊走に対するチモシンβ４の作用を試験するために、心体外移植組織遊走アッセイを用いた。線維芽細胞が成人心体外移植組織から遊走するための平均の時間は約３週間であるが；チモシンβ４を用いれば、僅か２週間後に同等の線維芽細胞遊走が観察され、そしてＭＩ後になおいっそう加速された（図１２Ａ）。同様に、ビメンチン＋細胞の集団はＭＩ後に増大し、そしてホスホヒストンＨ３で示されるとおり、チモシンβ４により更に増大した（図１２Ｂ）。チモシンβ４による線維芽細胞の活性化と合致して、ＭＩの状況下レトロウィルスに感染したＴｈｙ１＋（図１２Ｃ）又はビメンチン＋（図１３Ａ）細胞のパーセントは、チモシンβ４の心筋内注射時に二倍超となった（図１２Ｃ）。チモシンβ４によるＧＭＴ発現レトロウィルスの向上した送達は、ペリオスチン−Ｃｒｅ；Ｒ２６Ｒ−ｌａｃＺ心臓の梗塞／境界領域から得られた単細胞心筋細胞培養物中において、全心筋細胞と比較した場合にβＧａｌ＋ｉＣＭのパーセントの上昇をもたらした（５１％ｖｓ３５％、ｐ＜０．０５）（図１２Ｄ）。しかしながら、〜１２％にとどまったインビボのリプログラミング効率（ｉＣＭ／全ＧＭＴウィルス感染細胞）（図１２Ｄ）やリプログラミングの程度（図１３Ｂ）には変化は観察されなかった。
【０３１０】
冠動脈結紮直後のチモシンβ４の注射は報告の通り新機能の機能的改善をもたらしている。チモシンβ４とＧＭＴの同時注射は梗塞後８週間の駆出率及び心拍出量において更に機能的改善をもたらしている（図１３Ｅ；及び図１２Ｃ及び１２Ｄ）。これと合致して、チモシンβ４とＧＭＴの同時注射は、チモシンβ４又はＧＭＴ注射単独の何れと比較した場合も、両方の群で危険面積及び初期梗塞サイズが同様であった（図１３Ｅ）にも関わらず、瘢痕サイズのより大きな減少をもたらした（図１２Ｆ）。
【０３１１】
図１２Ａ〜Ｆ。チモシンβ４は傷害時の心線維芽細胞を活性化させ、そしてインビボリプログラミングを増強する。ａ：Ｔβ４注射の存在下又は非存在下における擬似処置又はＭＩ後の心臓に対して実施した心線維芽細胞遊走アッセイに関する定量。１０検体の粉砕心臓組織が遊走線維芽細胞（「島」）により包囲される日数を３注射心臓から平均した。ｂ：擬似処置、ＭＩ又はＭＩ＋Ｔβ４注射の４８時間後の心臓切片に対するホスホヒストンＨ３（ｐＨ３、赤）、ビメンチン（緑）及びＤＡＰＩ（青）に関する免疫蛍光染色。右側はｐＨ３＋ビメンチン＋細胞に関する定量。各遺伝子型につきｎ＝３。ｃ：擬似処置、ＭＩ又はＭＩ＋Ｔβ４注射の２日後の心臓から得たＴｈｙ−１＋ｄｓＲｅｄ＋細胞のＦＡＣＳ分析と定量（左）及び代表的ＦＡＣＳプロット（右）。ｎ＝３。ｄ：上パネルはＴβ４の存在下又は非存在下におけるＭＩ及びＧＭＴ注射後４週間のＰｏｓｔｎ−Ｃｒｅ；Ｒ２６Ｒ−ｌａｃＺ心臓の梗塞／境界領域から得られた単離ＣＭに対するβＧａｌ及びＤＡＰＩに関する免疫蛍光染色を示す。下パネルは同じ細胞の明視野図である。Ｔβ４の存在下又は非存在下におけるＭＩ及びＧＭＴ注射後４週間の心臓の境界領域から得られた全ＣＭ又は全ｄｓＲｅｄ＋細胞（ウィルス感染）と比較した場合のβＧａｌ＋心筋（ＣＭ）様細胞の定量。ｎ＝３。ｅ：左心室の駆出率（ＥＦ）及び心拍出量（ＣＯ）の変化を外科処置後８週間に高解像度心エコー検査を用いて測定した。ｄｓＲｅｄはｎ＝９；ＧＭＴはｎ＝１０；ｄｓＲｅｄ＋Ｔβ４はｎ＝１０；ＧＭＴ＋Ｔβ４はｎ＝８。ｆ：ｄｓＲｅｄ（ｎ＝８）、ＧＭＴ（ｎ＝９）、ｄｓＲｅｄ＋Ｔβ４（ｎ＝７）又はＧＭＴ＋Ｔβ４（ｎ＝８）注射の後のＭＩ後８週間の多数の心臓切片から盲検的態様において瘢痕面積を計算した。心臓切片に対する代表的なＭａｓｓｏｎ−Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を示す。スケールバー：５００μｍ。瘢痕サイズの定量は盲検的態様において瘢痕面積の計測により計算した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。
【０３１２】
図１３Ａ〜Ｅ。チモシンβ４は傷害時の心線維芽細胞を活性化し、そしてインビボリプログラミングを増強する。ａ：心筋梗塞（ＭＩ）後のチモシンβ４（Ｔβ４）注射の存在下又は非存在下の心臓におけるビメンチン＋細胞中へのｄｓＲｅｄ対照ウィルスの組み込みを示す共焦点顕微鏡画像。矢印はｄｓＲｅｄ＋ビメンチン＋細胞を指す。ｂ：Ｔβ４及びＧＭＴを注射した心臓からの単細胞単離の後のｉＣＭ表現型の定量。ｃ：ＭＩ後４８時間のチモシンβ４及びｄｓＲｅｄ又はＧＭＴを同時注射した心臓の危険面積（ＡＡＲ）及び梗塞サイズの盲検的定量。ｄ：高解像度心エコー検査を用いた場合のＭＩ後８週間の左心室の左室内径短縮率（ＦＳ）及び１回拍出量（ＳＶ）の変化。ｄｓＲｅｄはｎ＝９；ＧＭＴはｎ＝１０；ｄｓＲｅｄ＋Ｔβ４はｎ＝１０；ＧＭＴ＋Ｔβ４はｎ＝８。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。ｅ：心拍数を心エコー検査中に計測したが、４群で差は無かった。（ｄ、ｅ）におけるエコーデータは盲検的態様において収集した。
【０３１３】
上記した実験は常在の心線維芽細胞が心傷害時に、レトロウィルス媒介遺伝子転移を用いたＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５の局所送達により、インビボで心筋細胞様細胞に変換され得ることを示している。インビトロの変換と比較して、インビボの心リプログラミングは同様の初期効率で起こった。リプログラミングされた細胞はより緊密に内因性心筋細胞と類似しており、そしてより完全にリプログラミングされた。
【０３１４】
本発明はその特定の実施形態を参照しながら説明してきたが、本発明の真の精神及び範囲を逸脱することなく種々の変化を行ってよく等価物を置き換えてよいことは当業者の知る通りである。また、特定の状況、物質、組成物、プロセス、プロセス工程又は工程を本発明の目的、精神及び範囲に適合させるために多くの変更を行ってよい。全てそのような変更は添付請求項の範囲に含まれることを意図する。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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