(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）サンドイッチ免疫アッセイであって、
少なくとも１つの捕捉抗体及び少なくとも１つのシグナル抗体を含む少なくとも２つのエピトープ適合性抗体を含み、
両方の抗体の、ＴＳＨに対する解離定数（Ｋｄ）が約１ｎＭ以下であり、
捕捉抗体のＫｄが卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）及び絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）に対して、それぞれ、１０００ｎＭ超、１０００ｎＭ超、及び５００ｎＭ超であり、
前記免疫アッセイが、単一洗浄ステップを用いるものであり、かつ
前記捕捉抗体及び前記シグナル抗体が、以下の捕捉／シグナル抗体対（Ｂｉｏｓｐａｃｉｆｉｃ、カタログ番号５４０９  クローン：Ｎ／Ａ）／（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、カタログ番号１０−Ｔ２５Ｃ、クローン：Ｍ９４２０６）及び（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、カタログ番号１０−Ｔ２５Ｃ、クローン：Ｍ９４２０６）／（Ｂｉｏｓｐａｃｉｆｉｃ、カタログ番号５４０９、クローン：Ｎ／Ａ）から選択される、
上記免疫アッセイ。
【請求項２】
捕捉抗体及びシグナル抗体がそれぞれＴＳＨに対して０．５ｎＭ以下のＫｄを有する、請求項１に記載の免疫アッセイ。
【請求項３】
捕捉抗体及びシグナル抗体がそれぞれＴＳＨに対して０．１５ｎＭ以下のＫｄを有する、請求項１に記載の免疫アッセイ。
【請求項４】
ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに対するシグナル抗体のＫｄが、それぞれ、２５０ｎＭ超、３５ｎＭ以上及び３５ｎＭ超である、請求項１に記載の免疫アッセイ。
【請求項５】
捕捉抗体及びシグナル抗体が、それぞれ、ＴＳＨのＴＳＨ−βサブユニット上の少なくとも２つの異なるエピトープに結合することができる、請求項１に記載の免疫アッセイ。
【請求項６】
捕捉抗体及びシグナル抗体がエピトープ適合性抗体である、請求項１に記載の免疫アッセイ。
【請求項７】
甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）サンドイッチ免疫アッセイであって、
少なくとも１つの捕捉抗体及び少なくとも１つのシグナル抗体を含む少なくとも２つのエピトープ適合性抗体を含み、
両方の抗体の、ＴＳＨに対する解離定数（Ｋｄ）が約１ｎＭ以下であり、
捕捉抗体のＫｄが卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）及び絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）に対して、それぞれ、１０００ｎＭ超、１０００ｎＭ超、及び５００ｎＭ超であり、
前記免疫アッセイが、単一洗浄ステップを用いるものであり、かつ
前記捕捉抗体及びシグナル抗体が、以下の捕捉／シグナル抗体対（Ｂｉｏｓｐａｃｉｆｉｃ、カタログ番号５４０９、クローン：Ｎ／Ａ）／（Ａｂｂｏｔｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、クローン：１０−１１７９−４５６）及び（Ａｂｂｏｔｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、クローン：１０−１１７９−４５６）／（Ｂｉｏｓｐａｃｉｆｉｃ、カタログ番号５４０９、クローン：Ｎ／Ａ）から選択される、
上記免疫アッセイ。
【請求項８】
ＴＳＨ免疫アッセイを実施するための方法であって、
（ａ）液体試料を、ＴＳＨに対する捕捉抗体を有する免疫センサーを導管中に備えた装置に挿入するステップ、
（ｂ）シグナル抗体を前記液体試料に溶解させるステップ、
（ｃ）前記捕捉抗体、ＴＳＨ及び前記シグナル抗体を含むサンドイッチ複合体を前記免疫センサー上で形成するステップ、
（ｄ）非複合体化シグナル抗体を洗浄液でセンサーから１回以下の洗浄ステップで洗浄するステップ、並びに
（ｅ）前記複合体化シグナル抗体に伴うシグナルを検出するステップ
を含み、
捕捉抗体及びシグナル抗体それぞれがＴＳＨに対して１ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有し、
捕捉抗体のＫｄが卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）及び絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）に対して、それぞれ、７０〜１０００ｎＭ、３５〜１０００ｎＭ、及び４０〜５００ｎＭの範囲であり、かつ
前記捕捉抗体及び前記シグナル抗体が、以下の捕捉／シグナル抗体対（Ｂｉｏｓｐａｃｉｆｉｃ、カタログ番号５４０９  クローン：Ｎ／Ａ）／（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、カタログ番号１０−Ｔ２５Ｃ、クローン：Ｍ９４２０６）及び（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、カタログ番号１０−Ｔ２５Ｃ、クローン：Ｍ９４２０６）／（Ｂｉｏｓｐａｃｉｆｉｃ、カタログ番号５４０９、クローン：Ｎ／Ａ）から選択される、
上記方法。
【請求項９】
捕捉抗体及びシグナル抗体それぞれがＴＳＨに対して０．５ｎＭ以下のＫｄを有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
捕捉抗体及びシグナル抗体それぞれがＴＳＨに対して０．１５ｎＭ以下のＫｄを有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
捕捉抗体及びシグナル抗体それぞれがＴＳＨに対して０．０４〜０．１ｎＭのＫｄを有し、
ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに対するシグナル抗体Ｋｄが、それぞれ、７０〜３００ｎＭ、３５〜５４ｎＭ及び４０〜４５ｎＭであり、かつ
ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに対する捕捉抗体Ｋｄが、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに対するシグナル抗体Ｋｄより大きい、
請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
サンドイッチ複合体が、前記捕捉抗体及び前記シグナル抗体と液体試料との実質的に非連続的な接触により形成される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
サンドイッチ複合体が、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧのうちの１つ又は複数との交差反応を軽減するための１つ又は複数の介在する洗浄ステップなしで形成される、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
液体試料が、希釈された血液試料、非希釈血液試料、希釈された血漿試料又は非希釈血漿試料である、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
捕捉抗体がビーズに共有結合している、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
シグナル抗体が、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ及び蛍光部分からなる群から選択されるレポーター分子にコンジュゲートしている、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
検出ステップが電気化学的である、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
検出ステップが光学的である、請求項８に記載の方法。
【請求項１９】
試料及び非結合シグナル抗体を捕捉抗体から取り除くための単一洗浄ステップを含み、洗浄液が、レポーター分子の基質も含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
計量チャンバーで液体試料を計量して１〜５００μＬの容積を有する計量された試料を作るステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２１】
免疫センサーと流体連通している洗浄液ポーチを破裂させて、前記導管に５〜５００μＬの洗浄液を放出するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２２】
前記洗浄液中に複数の空気セグメントを作るステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２３】
捕捉抗体及びシグナル抗体が、それぞれ、ＴＳＨのＴＳＨ−βサブユニット上の少なくとも２つの異なるエピトープに結合することができる、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
捕捉抗体及びシグナル抗体がエピトープ適合性抗体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＴＳＨ免疫アッセイを実施するための方法であって、
（ａ）液体試料を、ＴＳＨに対する捕捉抗体を有する免疫センサーを導管中に備えた装置に挿入するステップ、
（ｂ）シグナル抗体を前記液体試料に溶解させるステップ、
（ｃ）前記捕捉抗体、ＴＳＨ及び前記シグナル抗体を含むサンドイッチ複合体を前記免疫センサー上で形成するステップ、
（ｄ）非複合体化シグナル抗体を洗浄液でセンサーから１回以下の洗浄ステップで洗浄するステップ、並びに
（ｅ）前記複合体化シグナル抗体に伴うシグナルを検出するステップ
を含み、
捕捉抗体及びシグナル抗体それぞれがＴＳＨに対して１ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有し、
捕捉抗体のＫｄが卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）及び絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）に対して、それぞれ、７０〜１０００ｎＭ、３５〜１０００ｎＭ、及び４０〜５００ｎＭの範囲であり、かつ
前記捕捉抗体及びシグナル抗体が、以下の捕捉／シグナル抗体対（Ｂｉｏｓｐａｃｉｆｉｃ、カタログ番号５４０９  クローン：Ｎ／Ａ）／（Ａｂｂｏｔｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、クローン：１０−１１７９−４５６）及び（Ａｂｂｏｔｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、クローン：１０−１１７９−４５６）／（Ｂｉｏｓｐａｃｉｆｉｃ、カタログ番号５４０９  クローン：Ｎ／Ａ）から選択される、
上記方法。
【請求項２６】
非連続アッセイ及び低洗浄液サイクルのアッセイのための甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）サンドイッチ免疫アッセイ抗体選択方法であって、少なくとも１つの捕捉抗体及び少なくとも１つのシグナル抗体を含む少なくとも２つのエピトープ適合性抗体を選択するステップを含み、捕捉抗体の、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）及び絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）に対するＫｄが、それぞれ、１０００ｎＭ以上、１０００ｎＭ以上及び５００ｎＭ以上であり、シグナル抗体の、ＴＳＨに対するＫｄが約１ｎＭ未満であり、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに対するＫｄが、それぞれ、２５０ｎＭ超、３５ｎＭ以上及び３５ｎＭ超であり、
前記捕捉抗体及び前記シグナル抗体が、以下の捕捉／シグナル抗体対（Ｂｉｏｓｐａｃｉｆｉｃ、カタログ番号５４０９  クローン：Ｎ／Ａ）／（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、カタログ番号１０−Ｔ２５Ｃ、クローン：Ｍ９４２０６）及び（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、カタログ番号１０−Ｔ２５Ｃ、クローン：Ｍ９４２０６）／（Ｂｉｏｓｐａｃｉｆｉｃ、カタログ番号５４０９、クローン：Ｎ／Ａ）から選択される、
上記方法。
【請求項２７】
捕捉抗体及びシグナル抗体それぞれがＴＳＨに対して０．５ｎＭ以下のＫｄを有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
捕捉抗体及びシグナル抗体それぞれがＴＳＨに対して０．１５ｎＭ以下のＫｄを有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
非連続アッセイ及び低洗浄液サイクルのアッセイのための甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）サンドイッチ免疫アッセイ抗体選択方法であって、少なくとも１つの捕捉抗体及び少なくとも１つのシグナル抗体を含む少なくとも２つのエピトープ適合性抗体を選択するステップを含み、捕捉抗体の、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）及び絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）に対するＫｄが、それぞれ、１０００ｎＭ以上、１０００ｎＭ以上及び５００ｎＭ以上であり、シグナル抗体の、ＴＳＨに対するＫｄが約１ｎＭ未満であり、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに対するＫｄが、それぞれ、２５０ｎＭ超、３５ｎＭ以上及び３５ｎＭ超であり、
前記捕捉抗体及び前記シグナル抗体が、以下の捕捉／シグナル抗体対（Ｂｉｏｓｐａｃｉｆｉｃ、カタログ番号５４０９  クローン：Ｎ／Ａ）／（Ａｂｂｏｔｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、クローン：１０−１１７９−４５６）及び（Ａｂｂｏｔｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、クローン：１０−１１７９−４５６）／（Ｂｉｏｓｐａｃｉｆｉｃ、カタログ番号５４０９  クローン：Ｎ／Ａ）から選択される、
上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は２０１１年５月２７日提出の米国特許仮出願第６１／４９１，０８８号明細書の優先権を主張し、この特許文献の全内容及び開示を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
本発明は、概して、最小限の洗浄能力を有するシステムにおいて免疫アッセイを実施する方法に関する。特に、本発明は、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）アッセイを、それに関連する夾雑（交差反応）内分泌糖タンパク質ホルモン類似物の存在下で実施する方法に関する。本発明は、ＴＳＨアッセイを実施するのに最良の性能特性を有する抗体を選択するための方法にも関する。これらのアッセイは、内分泌糖タンパク質ホルモン類似物などの干渉物質の影響をさらに軽減するスカベンジング試薬（ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）の包含からも利益を得る。
【背景技術】
【０００３】
免疫アッセイは、１９５９年に初めて開発されたが、ヒト及び動物健康並びに環境試験に有用な感度の高い診断ツールとなっている（Ｗｕ、２００６、Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、３６９：１１９）。その適用は当技術分野では一般的かつ周知となっている。
【０００４】
免疫アッセイを実施するアプローチはいくつか存在し、本発明は非競合的又はサンドイッチ免疫アッセイに焦点を合わせている。免疫アッセイは、不均一又は均一のものに分類することも可能である。均一アッセイのほうが単純なアッセイ特性を有するが高濃度薬物に限られてきた（Ｅｎｇｅｌ  ＆  Ｋｈａｎｎａ、１９９２、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１５０：９９）。不均一アッセイでは、結合物質を非結合物質から分離する必要があり、本発明の焦点である。
【０００５】
サンドイッチ免疫アッセイは典型的には、第１に捕捉抗体又は固体支持体に共有結合している抗体への抗原含有試料の導入を伴う２ステップアッセイとして実施される。これに続いて、非特異的試料成分は洗い流し、対象の抗原は固体支持体抗体に結合したままにしておく。第２のステップでは、検出又はシグナル抗体がアッセイに導入され、続いてさらに別の洗浄ステップがある。最後に、検出基質がアッセイに添加されて、抗原濃度を定量する。洗浄ステップを伴う２ステップ免疫アッセイは、バックグラウンド信号を抑えて高感度検出を可能にするので、一般的に好まれる。
【０００６】
捕捉抗体又は固体支持体に共有結合している抗体へ検出抗体と抗原含有試料を一緒に導入することにより「１ステップ」サンドイッチ免疫アッセイを実施することもある。得られるアッセイは洗浄されて非結合試薬を取り除く。最後に、検出基質がアッセイに添加されて、抗原濃度を定量する。
【０００７】
１ステップアッセイのほうが簡単であり、特にポイントオブケア適用における、操作に必要になるステップ数も少なく、関連ハードウェアの複雑性も少ないので、限定的な洗浄液容積を用いた１ステップアッセイの必要性が存在する。ポイントオブケア装置では、洗浄ステップの必要性を減らすか取り除けば、装置コストとアッセイ時間、ハードウェアコストと複雑性及び使い捨て装置サイズが減少し、これにより今度は環境への廃棄物並びにそのコストを減らすのに有益になる。
【０００８】
現在まで、洗浄ステップが限られている又はない１ステップ免疫アッセイは、内在性関連抗原の存在が検出結果を混乱させる高バックグラウンドを生じる場合には、抗原には使用されてこなかった。一部の疾患状態ではよくある内在性抗原が対象の抗原よりも多く高モル濃度で見出される場合には、このことは特に当てはまる。
【０００９】
問題のある抗原の例は甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）であり、チロトロピンとしても知られ、典型的には関連内分泌糖タンパク質ホルモンである絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）及び卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）と結合して存在している。これらの４種の関連ホルモンは、同一のアルファサブユニット及び高度に類似するベータサブユニットを有する（Ｖａｓｓａｒｔ、２００４、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２９（３）：１１９）。その結果、アルファサブユニットに対する抗体はこれら４種のホルモンを識別しない（Ｗａｄａ、１９８２、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８（９）：１８６２）。特に非常に高濃度の夾雑ホルモンの存在下で、これらの４種の関連ホルモンを識別することができるベータ特異的抗体を同定するのも、これらのホルモンが非常に類似する一次配列を有するために、困難である（Ｃｏｒｎｅｌｌ、１９７３、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４８（１２）：４３２７）。さらに、ＴＳＨ上の独自の（抗原）エピトープを同定し、これら独自のエピトープを認識する抗体を得るのは困難である。サンドイッチアッセイでは、適切な特異性特徴を有して重複していない捕捉及びシグナル抗体を用いて、抗体の選択をさらに限定するのも重要である。
【００１０】
サンドイッチ免疫アッセイにおける洗浄ステップは、反応において夾雑ホルモンの濃度を減少させて、夾雑種に伴うシグナルを抑えるのに役立つ。したがって、洗浄ステップのない又は洗浄能力が限られている１ステップサンドイッチ免疫アッセイは、特に夾雑物が非常に高濃度で存在する場合には、関連する夾雑ホルモン分子の存在下でＴＳＨを特異的に検出することはできなかった。たとえば、免疫アッセイにおいて洗浄ステップを使用して交差反応種の濃度を減少させる重要性を記載するＵＳ２００８０３１１６７６を参照されたい。これらの問題に取り組む試みは、Ｈａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．１９８６、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９、１１２１〜３６；Ｓｏｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９８４、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、７３、２３７；及びＬｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００３、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６、１２１に見出せる。
【００１１】
ＥＰ１７３９７３には、特定の会合定数値を有する抗βサブユニットＴＳＨモノクローナル抗体が使用されるＴＳＨの決定のための方法が記載されている。関連するＥＰ２１２５２２には、ＴＳＨ−βサブユニット特異的モノクローナル抗体が異なるエピトープを認識することを特徴とするアッセイが記載されている。この方法は、ＬＨ、ＣＧ及びＦＳＨなどの他の糖タンパク質ホルモンの存在による阻害を抑えようとするものである。
【００１２】
１ステップサンドイッチ免疫アッセイ、特に洗浄能力が抑えられている又は取り除かれているポイントオブケアアッセイに使用される１ステップサンドイッチ免疫アッセイ及び特にＴＳＨを検出するための１ステップサンドイッチ免疫アッセイの必要性が存在する。さらに、そのような免疫アッセイを実施することができる抗体試薬を同定する必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、高度に関連する内在性内分泌糖タンパク質ホルモンである、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）及び絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）により引き起こされる干渉を最小限に抑えつつ、液体試料において甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を検出するための装置、免疫アッセイ及び方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１つの捕捉抗体及び少なくとも１つのシグナル抗体を含む少なくとも２つのエピトープ適合性抗体を含み、ＴＳＨに対する両方の抗体の解離定数（Ｋｄ）が１ｎＭ未満又は約１ｎＭ、たとえば、０．５ｎＭ以下又は０．１５ｎＭ以下であり、捕捉抗体のＫｄが卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）に対しては１０００ｎＭ超、２５００ｎＭ超又は３０００ｎＭ超であり、黄体形成ホルモン（ＬＨ）に対しては５００ｎＭ超、１０００ｎＭ超又は３０００ｎＭ超であり、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）に対しては２００ｎＭ超、５００ｎＭ超又は２５００ｎＭ超であり、単一洗浄ステップを用いる甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）サンドイッチ免疫アッセイに関する。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、ＴＳＨ免疫アッセイを実施するための方法であって、（ａ）液体試料を、ＴＳＨに対する捕捉抗体を有する免疫センサーを導管中に備えた装置に挿入するステップ、（ｂ）シグナル抗体を前記液体試料に溶解させるステップ、（ｃ）前記捕捉抗体、ＴＳＨ及び前記シグナル抗体を含むサンドイッチ複合体を前記免疫センサー上で形成するステップ、（ｄ）非複合体化シグナル抗体を洗浄液でセンサーから１回以下の洗浄ステップで洗浄するステップ、並びに（ｅ）前記複合体化シグナル抗体に伴うシグナルを検出するステップを含む上記方法に関する。好ましくは、捕捉抗体とシグナル抗体はそれぞれ、ＴＳＨに対して１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下又は０．１５ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。サンドイッチ複合体は好ましくは、前記捕捉抗体及び前記シグナル抗体と液体試料との実質的に非連続的な接触により形成される。サンドイッチ複合体は好ましくは、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧのうちの１つ又は複数との交差反応を軽減するための１つ又は複数の介在する洗浄ステップなしで形成される。この方法は好ましくは、捕捉抗体から試料及び非結合シグナル抗体を取り除く単一洗浄ステップを含み、洗浄液はレポーター分子に対する基質も含む。この方法は計量チャンバーで液体試料を計量して、１〜５００μＬの容積を有する計量された試料を作るステップをさらに含んでいてもよい。場合により、この方法は、免疫センサーと流体連通している洗浄液ポーチを破裂させて、前記導管に５〜５００μＬの洗浄液を放出するステップを含む。場合により、洗浄液中に複数の空気セグメントを作って免疫アッセイの洗浄を促進させてもよい。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、非連続アッセイ及び低洗浄液サイクルのアッセイのためのＴＳＨサンドイッチ免疫アッセイ抗体選択方法であって、少なくとも１つの捕捉抗体と少なくとも１つのシグナル抗体を含む少なくとも２つのエピトープ適合性抗体を選択するステップを含み、捕捉抗体の、ＴＳＨに対する解離定数（Ｋｄ）が約１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満又は０．１５ｎＭ未満であり、捕捉抗体のＫｄ値がＦＳＨに対しては１０００ｎＭ超、２５００ｎＭ超又は３０００ｎＭ超であり、ＬＨに対しては５００ｎＭ超、１０００ｎＭ超又は３０００ｎＭ超であり、ＣＧに対しては２００ｎＭ超、５００ｎＭ超又は２５００ｎＭ超であり、シグナル抗体の、ＴＳＨに対するＫｄが約１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満又は０．１５ｎＭ未満であり、シグナル抗体のＫｄがＦＳＨに対しては２５０ｎＭ超又は１０００ｎＭ超であり、ＬＨに対しては３５ｎＭ超、２００ｎＭ超又は２５０ｎＭ超であり、ＣＧに対しては３５ｎＭ超又は２５０ｎＭ超である、上記方法に関する。
【００１７】
好ましい態様では、シグナル抗体のＫｄはＦＳＨに対して好ましくは、２５０ｎＭ超又は１０００ｎＭ超であり、ＬＨに対しては好ましくは、３５ｎＭ超、２００ｎＭ超又は２５０ｎＭ超又は１０００ｎＭ超であり、ＣＧに対しては好ましくは、３５ｎＭ超又は２５０ｎＭ超である。場合により、捕捉抗体のＫｄ値はＦＳＨに対しては好ましくは、１０００ｎＭ超、好ましくは２５００ｎＭ超又は３０００ｎＭ超であり、ＬＨに対しては５００ｎＭ超、１０００ｎＭ超又は３０００ｎＭ超であり、ＣＧに対しては好ましくは、２００ｎＭ超、５００ｎＭ超又は２５００ｎＭ超である。範囲に関しては、捕捉抗体は場合により１０００〜５０００ｎＭのＫｄ（ＦＳＨ）、５００〜５０００ｎＭのＫｄ（ＬＨ）及び２００〜５０００ｎＭのＫｄ（ＣＧ）を有しており、シグナル抗体は好ましくは、２５０〜５０００ｎＭのＫｄ（ＦＳＨ）、２００〜５０００ｎＭのＫｄ（ＬＨ）及び３５〜５０００ｎＭのＫｄ（ＣＧ）を有している。さらに好ましくは、捕捉抗体は１０００〜５０００ｎＭのＫｄ（ＬＨ）及び５００〜５０００ｎＭのＫｄ（ＣＧ）を有し、さらに好ましくは、シグナル抗体は３５〜５０００ｎＭのＫｄ（ＬＨ）を有している。用いられる液体試料は好ましくは、希釈された血液試料、非希釈血液試料、希釈された血漿試料又は非希釈血漿試料を含む。
【００１８】
捕捉抗体及びシグナル抗体はそれぞれが好ましくは、ＴＳＨのＴＳＨ−βサブユニット上の少なくとも２つの異なるエピトープに結合することができる。したがって、捕捉抗体及びシグナル抗体は好ましくは、エピトープ適合性抗体である。特に好ましい実施形態では、捕捉抗体及びシグナル抗体は次の捕捉／シグナル抗体対、５４０９／Ｔ２５Ｃ及びＴ２５Ｃ／５４０９から選択される。たとえば、捕捉抗体はマウスモノクローナル抗体（Ｂｉｏｓｐａｃｉｆｉｃ  カタログ番号５４０９ＳＰＴＮＥ−５）を含んでいてもよく、シグナル抗体はマウスモノクローナル抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  カタログ番号１０−Ｔ２５Ｃ）を含んでいてもよい。
【００１９】
一態様では、捕捉抗体は２５００超、たとえば、３０００超の第１のＫｄ比、Ｋｄ（ＦＳＨ）対Ｋｄ（ＴＳＨ）を有し、シグナル抗体は１５００超、たとえば、１８００超の第２のＫｄ比、Ｋｄ（ＦＳＨ）対Ｋｄ（ＴＳＨ）を有する。場合により、第１のＫｄ比は１５００〜５００００に及び、第２のＫｄ比は１５００〜５００００に及ぶ。さらに好ましくは、捕捉抗体は６０００超の第１のＫｄ比、Ｋｄ（ＦＳＨ）対Ｋｄ（ＴＳＨ）を有する。
【００２０】
本発明は、以下の非限定的図に照らしてみればさらによく理解されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】免疫センサーカートリッジカバーの等尺上面図である。
【００２２】
【図２】免疫センサーカートリッジカバーの等尺下面図である。
【００２３】
【図３】免疫センサーカートリッジのためのテープガスケットのレイアウトの上面図である。
【００２４】
【図４】免疫センサーカートリッジ底の等尺上面図である。
【００２５】
【図５】免疫センサーカートリッジのレイアウトの略図である。
【００２６】
【図６】乾燥試薬を用いて液体を修正するための部位を含む、免疫センサーカートリッジ内の流体及び空気経路の略図である。
【００２７】
【図７】ＣＧ及びそのＫｄ値の決定のためのＦＲＥＴベースの結合データを示す図である。
【００２８】
【図８】ＦＳＨ及びＬＨの磁気ビーズ捕捉を示す図である。
【００２９】
【図９】ポリスチレンビーズを使用するＦＳＨの減少した交差反応性を示す図である。
【００３０】
【図１０】ポリスチレンビーズを使用するＬＨの減少した交差反応性を示す図である。
【００３１】
【図１１】磁気ビーズを使用するＦＳＨの減少した交差反応性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
序論
様々な実施形態で、本発明は、好ましくは洗浄ステップが限られている又は洗浄ステップがない、干渉物質の存在下でサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施するための免疫アッセイ、装置及び方法に関する。本発明は、これらの夾雑干渉物質の存在下で正確なアッセイ結果を可能にして有益である。第１の実施形態では、本発明は甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）サンドイッチ免疫アッセイを行うための装置及び方法並びにそのような免疫アッセイ用の抗体を選択するための方法に関する。第２の実施形態では、本発明は、免疫アッセイに、特にＴＳＨ免疫アッセイに、並びに単一洗浄ステップを用いる又は洗浄ステップなしの関連する装置及び方法に関する。第３の実施形態では、本発明は、免疫アッセイに、特にＴＳＨ免疫アッセイに、並びにそのような夾雑物に伴う干渉を抑える又は取り除く内在性夾雑物に対する抗体で被覆されたスカベンジャービーズ（ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｂｅａｄ）を用いる関連する装置及び方法に関する。代わりに、そのような抗体はカートリッジ表面に共有結合していてもよいし、反応媒体中の遊離の抗体を含んでいてもよい。場合により、これらの実施形態のうちの１つ又は複数を互いに組み合わせてもよい。
【００３３】
ＴＳＨ免疫アッセイ及びＴＳＨ免疫アッセイ用の抗体を選択するための方法
第１の実施形態では、本発明は、ＴＳＨについての免疫アッセイに並びにそのような免疫アッセイを行うための関連する装置及び方法に関する。本発明の免疫アッセイは、高度に関連する内在性内分泌糖タンパク質ホルモンである、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）及び絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）が存在するにも関わらずＴＳＨの正確な検出を提供して有益である。ある種の疾患状態では、これらの関連ホルモンは著しく高濃度で存在することがある。低洗浄容積プラットフォームである、ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）免疫アッセイプラットフォーム（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）に関するアッセイが本明細書に例示されている。共同所有されている米国特許第７，４１９，８２１号を参照されたい。この特許の全体は参照により本明細書に組み込まれる。本特許明細書では、用語「低洗浄」は、典型的には数十マイクロリットルから約５ミリリットルの桁で比較的少量の洗浄液を含むポーチを組み込んでいる有効な使い捨て検査装置又は類似する量の洗浄液が、装置が結合している機器から供給される類似の装置を含むと解釈される。いくつかの例となる実施形態では、装置と方法は５〜５００μＬ、たとえば、２５〜２５０μＬ又は５０〜１５０μＬ、好ましくは約１００μＬの洗浄量を用いる。本発明は、捕捉抗体、分析物及びシグナル抗体が混合されてサンドイッチ免疫アッセイを形成し、次に洗浄液を使用して、非結合分析物及び非結合シグナル抗体を含む試料を、たとえば磁性があってもよいビーズ上又はセンサー上などの、好ましくはある方法で固定化されている捕捉抗体上に形成されているサンドイッチから取り除くアッセイという構想も含む。これらの種類の装置及びシステムは一般には患者ケアの時点で検査することと関連している。
【００３４】
別の態様では、本発明は、洗浄能力が限られているシステムにおいてサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを実施するための抗体を選択する方法に関する。具体的には、交差反応性が減少した抗体が選択され、このことが今度はサンドイッチＥＬＩＳＡにおける分析特異性を増加させる。これらの特徴は、低洗浄サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにおいては特に有用である。特定の例として、内在性内分泌糖タンパク質ホルモンであるＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧの存在下でｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）カートリッジを使用するＴＳＨアッセイの性能は本明細書において実証されている。これとは対照的に、ＴＳＨをアッセイする典型的先行市販システムは複数の洗浄ステップを利用して、ある種の疾患状態下では高モル濃度で存在することができる内在性内分泌糖タンパク質ホルモンの存在を減少させる。しかし、これらの複数の洗浄システムは本明細書において開示されるこれらの特異性特徴を有する抗体の使用からも利益を得ること、また、本発明は限られた洗浄能力を用いる免疫アッセイシステム又は装置に限定されると考えるべきではないことは明らかである。
【００３５】
好ましい実施形態では、２種類のサンドイッチ抗体は、主にＴＳＨ分子のベータサブユニット又は所望の程度の特異性を示しているこの領域と重複しているエピトープに対して選択される。これら２種類のサンドイッチ抗体の理想的特徴は、ＴＳＨのベータサブユニットのエピトープ（好ましくは異なるエピトープ）を認識し、ＴＳＨのアルファサブユニットだけには限られないことである。この認識は、アルファサブユニットとベータサブユニットの両方にまたがるエピトープであって、ＴＳＨに対し高親和性を、その他の交差反応性種に対しては低親和性を示す上記エピトープを含むことができることが企図されている。さらに、これらの抗体は好ましくは、ＴＳＨ分子には低Ｋｄを示し、その他の内在性糖タンパク質ホルモンであるＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧには高Ｋｄ値を有する。
【００３６】
本明細書で使用されるように、用語「解離定数」又は「Ｋｄ」とは、一般的反応の平衡定数のことであり、
【数１】
0005938471.tif 000002
Ａは抗体、Ｂは分析物、すなわち抗原である。この反応では、解離定数又はＫｄ値は、
【数２】
0005938471.tif 000003
として表される。一般的には、解離定数が低いほど、抗体Ａが分析物Ｂに対して持つ親和性又は結合の程度はそれだけ大きくなる。これらの動力学値を決定する方法は当技術分野では周知である。たとえば、Ｇｏｏｄｒｉｃｈ  ＆  Ｋｕｇｅｌ、２００７、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００３７】
特に好ましい実施形態では、捕捉抗体及びシグナル抗体はＴＳＨに対して高親和性（低Ｋｄ）を示す。低濃度では弱いシグナルを出す抗体は高可変性（ノイズ）を有し、さらに高い測定される交差反応性と識別するのが困難になる。これらの抗体は候補抗体として選択すべきではない。特に好ましい実施形態では、ＴＳＨ抗原に対して１ｎＭ以下、たとえば、０．５ｎＭ以下、０．１５ｎＭ以下又は０．１ｎＭ以下のＫｄを有する抗体が選択されて、本発明の免疫アッセイのための捕捉抗体及び／又はシグナル抗体として機能する。
【００３８】
サンドイッチハイブリダイゼーションのために選択される２つ以上の抗体についての別の好ましい実施形態では、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに対する最大のＫｄ値を有する抗体は捕捉抗体として使用されることになる。別の態様では、２つの抗体が捕捉抗体及びシグナル抗体の候補として同定される場合、大きいほうのＫｄ値（たとえば、５〜１０００％、２０〜１００％又は２０〜５０％大きい）を有する抗体は捕捉抗体として好まれる場合がある。どちらの場合にも、ＴＳＨに対して低Ｋｄ値、たとえば１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．１５ｎＭ以下又は０．１ｎＭ以下を有することに加えて、抗体（捕捉抗体及びシグナル抗体）は、干渉する内在性糖タンパク質ホルモンであるＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧのそれぞれに対しては比較的高Ｋｄ値を有することが望ましい。
【００３９】
特に好ましい実施形態では、捕捉抗体は、１０００ｎＭ超、２５００ｎＭ超、３０００ｎＭ超又は４０００ｎＭ超のＫｄ（ＦＳＨ）、５００ｎＭ超、８００ｎＭ超、１０００ｎＭ超、２５００ｎＭ超又は４０００ｎＭ超のＫｄ（ＬＨ）、及び２００ｎＭ超、５００ｎＭ超、２５００ｎＭ超又は４０００ｎＭ超のＫｄ（ＣＧ）を有する。範囲に関しては、捕捉抗体は、場合により１０００〜５０００ｎＭ、１５００〜４０００ｎＭ又は２５００〜３０００ｎＭに及ぶＫｄ（ＦＳＨ）、５００〜５０００ｎＭ、７５０〜１２００ｎＭ又は８００〜１０００ｎＭ、１０００〜５０００ｎＭ又は１５００〜４０００ｎＭに及ぶＫｄ（ＬＨ）及び３５〜５０００ｎＭ、２００〜５０００ｎＭ、２１０〜２５００ｎＭ又は２２０〜５００ｎＭに及ぶＫｄ（ＣＧ）を有する。
【００４０】
同様に、シグナル抗体は好ましくは、２５０ｎＭ超、１０００ｎＭ超又は４０００ｎＭ超のＫｄ（ＦＳＨ）、３５ｎＭ超、２００ｎＭ超、２５０ｎＭ超、１０００ｎＭ超、２５００ｎＭ超又は４０００ｎＭ超のＫｄ（ＬＨ）、及び３５ｎＭ超、２５０ｎＭ超又は２５００ｎＭ超のＫｄ（ＣＧ）を有する。範囲に関しては、シグナル抗体は、場合により２５０〜５０００ｎＭ、２５０〜２５００ｎＭ又は２５０〜５００ｎＭに及ぶＫｄ（ＦＳＨ）、３５〜５０００ｎＭ、２００〜５０００ｎＭ、３５〜２５００ｎＭ、２００〜２５００ｎＭ、３５〜１０００ｎＭ又は２００〜１０００ｎＭに及ぶＫｄ（ＬＨ）及び３５〜５０００ｎＭ、３５〜２５００ｎＭ又は３５〜１０００ｎＭに及ぶＫｄ（ＣＧ）を有する。この方法の特定の実施形態では、ＴＳＨ結合種は好ましくは、抗体、抗体の断片（たとえば、Ｆａｂ断片）、一本鎖抗体、アプタマー、受容体及び他の特異的結合種から選択される。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態は、少なくとも１つの捕捉抗体及び少なくとも１つのシグナル抗体を含む少なくとも２つのエピトープ適合性抗体を含み、ＴＳＨに対する両方の抗体のＫｄが約１ｎＭ未満（又は以下）、たとえば、０．５ｎＭ以下、０．１５以下又は０．１ｎＭ以下であり、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに対する捕捉抗体のＫｄがそれぞれ約２５００超、約５００超及び約２００ｎＭ超であり、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに対するシグナル抗体のＫｄがそれぞれ約２５０超、約２００超及び約３５ｎＭ超である、ＴＳＨサンドイッチ免疫アッセイに取り組む。さらに好ましくは、ＣＧに対する捕捉抗体のＫｄは約３５ｎＭ超であり、ＬＨに対するシグナル抗体のＫｄは約３５ｎＭ超である。これに関連して、「エピトープ適合性」は、上記のように、対象の分析物上の異なるエピトープに選択的に結合することができることを意味する。ＴＳＨ免疫アッセイでは、抗体は好ましくは、少なくとも一部がＴＳＨのベータサブユニット上にある異なるエピトープに選択的に結合することができる。
【００４２】
ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧと比べたＴＳＨに対する捕捉抗体及びシグナル抗体の相対的選択性は、Ｋｄ比、すなわちＫｄ（内分泌糖タンパク質ホルモン類似体、たとえばＦＳＨ、ＬＨ、ＣＧ又はその平均）対Ｋｄ（ＴＳＨ）の比の点からも特徴付けることができる。この態様では、Ｋｄ比値が大きいほど、分母の内分泌糖タンパク質ホルモン類似体と比べたＴＳＨに選択的に結合する抗体の能力はそれだけ大きくなる。一態様では、たとえば、固定化された抗体は、２５００超、たとえば、３０００超又は５０００超の第１のＫｄ比、ＫｄＦＳＨ対ＫｄＴＳＨを有する。さらに又は代わりに、シグナル抗体は、１５００超、たとえば、１８００超又は２０００超の第２の解離定数比、ＫｄＦＳＨ対ＫｄＴＳＨを有する場合がある。範囲に関しては、固定化された抗体は好ましくは、１５００〜５００００、たとえば、１８００〜３００００又は２０００〜２８０００の第１のＫｄ比、ＫｄＦＳＨ対ＫｄＴＳＨを有し、シグナル抗体は、１５００〜５００００、たとえば、１８００〜３００００又は１９００〜２００００の第２のＫｄ比、ＫｄＦＳＨ対ＫｄＴＳＨを有する場合がある。
【００４３】
上記のように、免疫アッセイは好ましくは、２つの非重複エピトープでＴＳＨに結合する一対の異なる抗体を用いる。特に好ましい実施形態では、捕捉抗体はＴＳＨ捕捉マウスモノクローナル抗体（たとえば、Ｂｉｏｓｐａｃｉｆｉｃカタログ番号５４０９ＳＰＴＮＥ−５）を含み、シグナル抗体はシグナル伝達マウスモノクローナル抗体（たとえば、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄカタログ番号１０−Ｔ２５Ｃ）を含む。この態様では、捕捉抗体は好ましくはビーズ、たとえばラテックス及び／又はポリスチレンビーズに共有結合しており、シグナル抗体は、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ及び蛍光又は光学的吸収部からなる群から選択されるレポーター分子にコンジュゲートしている。検出ステップは好ましくは、電気化学的、たとえば、電流測定であるが、光学的、たとえば、蛍光及び吸光であることも可能である。
【００４４】
本発明は、リガンド結合アッセイとしても特徴付けることができる。たとえば、一実施形態では、本発明は、少なくとも１つの捕捉リガンド及び少なくとも１つのシグナルリガンドを含み、ＴＳＨに対する両方のリガンドの解離定数が約１ｎＭ未満（又は以下）、たとえば、０．５ｎＭ以下、０．１５ｎＭ以下又は０．１ｎＭ以下であり、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに対する捕捉リガンドのＫｄがそれぞれ約２５００超、約５００超及び約２００ｎＭ超であり、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに対するシグナルリガンドのＫｄがそれぞれ約２５０超、約２００超及び約３５ｎＭ超である、ＴＳＨサンドイッチアッセイに関する。さらに好ましくは、捕捉リガンドのＫｄは、ＬＨに対しては約１０００ｎＭ超であり、ＣＧに対しては約５００ｎＭ超であり、ＬＨに対するシグナルリガンドのＫｄは約３５ｎＭ超である。ここでは、リガンドは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体の断片、アプタマー及び一本鎖抗体からなる群から選択してもよい。
【００４５】
本発明は、ＴＳＨに対して高度に選択的でありＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧなどの競合する内分泌糖タンパク質ホルモン類似体に対して非選択的である免疫アッセイを用いて、分析物、たとえばＴＳＨを検出するための方法も目的とする。たとえば、一実施形態では、本発明は、少なくとも１つの捕捉抗体及び少なくとも１つのシグナル抗体を含む少なくとも２つのエピトープ適合性抗体を使用して全血ＴＳＨサンドイッチアッセイを実施する方法に関する。ＴＳＨに対する両方の抗体のＫｄは１ｎＭ未満又は約１ｎＭ、たとえば、０．５ｎＭ以下、０．１５ｎＭ以下又は０．１ｎＭ以下である。ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに対する捕捉抗体のＫｄ値は、それぞれ約２５００超、約５００超及び２００ｎＭ超であり、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに対するシグナル抗体のＫｄ値は、それぞれ約２５０超、約２００超及び約３５ｎＭ超である。さらに好ましくは、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに対する捕捉抗体のＫｄ値は、それぞれ約１０００超、約１０００超及び１０００ｎＭ超であり、ＬＨに対するシグナル抗体のＫｄ値は約３５ｎＭ超である。この方法は、（ａ）ＴＳＨシグナル抗体及び電気化学的センサー上に固定化されたＴＳＨ捕捉抗体に全血試料を接触させてサンドイッチ複合体を形成するステップ、並びに（ｂ）前記複合体化シグナル抗体に伴うシグナルを検出するステップを含む。
【００４６】
本発明は、ＴＳＨの検出以外の有用性を有する。たとえば、一態様では、本発明は、少なくとも１つの捕捉抗体又はリガンド及び少なくとも１つのシグナル抗体又はリガンドを含む少なくとも２つの抗体又は他のリガンドを含む全血試料で実施される分析物サンドイッチ免疫アッセイであって、分析物の、前記少なくとも２つの抗体又はリガンドに対するＫｄが、少なくとも２つの選択された既知の交差反応物（タンパク質配列夾雑抗原と密接な関係がある）に対するＫｄより、少なくとも前選択したレベルで低い、たとえば、５００分の１、１０００分の１又は１００００分の１である、上記分析物サンドイッチ免疫アッセイに関する。この態様では、サンドイッチは好ましくは、試料への実質的に非連続的抗体又はリガンド添加により形成される。アッセイは検出に先立つ単一洗浄ステップを用いて実施してもよい。ここで、たとえば、標的分析物は、ＴＳＨ、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧのうちの１つであることが可能であり、交差反応物はＴＳＨ、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧからなる群から選択してもよいが、標的分析物ではない。したがって、本発明の他の実施形態では、標的分析物はＴＳＨではなく、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧのうちの１つから選択してもよい。
【００４７】
低洗浄サンドイッチ免疫アッセイ
ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧなどの競合する内分泌糖タンパク質ホルモン類似体と比べたＴＳＨに対する上記の抗体又はリガンドの選択性は、限定的な洗浄ステップを用いる免疫アッセイに特に適している本発明の免疫アッセイ、装置及び方法に役立つ。したがって、本発明は、相当量の洗浄液のためのスペースが十分にない分析検査カートリッジ又は装置を用いることがある、ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）免疫アッセイフォーマットなどのポイントオブケア検査装置の実行に特によく適している。
【００４８】
従来のＴＳＨアッセイでは、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧのうちの１つ又は複数を伴う交差反応を軽減するためには、複数の繰り返される洗浄ステップを用いることが正確な結果に決定的に重要である。本発明のいくつかの実施形態によれば、サンドイッチが試料への非連続的抗体添加により形成される、すなわち捕捉抗体及びシグナル抗体がこの試料にほぼ同時に、介在する洗浄ステップなしで接触する場合にアッセイは機能する。アッセイは、場合により、検出に先立つ単一洗浄ステップ、たとえば血液及び非結合シグナル抗体を捕捉抗体から取り除く１回に限定的な洗浄ステップを含む。したがって、第２の実施形態では、本発明は洗浄ステップが減らされた免疫アッセイに関する。この実施形態の一態様では、単一洗浄ステップを使用して非結合分析物及びシグナル抗体をサンドイッチアッセイから取り除く。
【００４９】
この実施形態の一態様では、本発明は、少なくとも１つの捕捉抗体及び少なくとも１つのシグナル抗体を含む少なくとも２つのエピトープ適合性抗体を含み、ＴＳＨに対する両方の抗体のＫｄが１ｎＭ未満又は約１ｎＭ、たとえば０．５ｎＭ以下、０．１５ｎＭ以下又は０．１ｎＭ以下であり、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに対する捕捉抗体のＫｄが、それぞれ約２５００ｎＭ超、約５００ｎＭ超及び約２００ｎＭ超であり、単一洗浄ステップを用いるＴＳＨサンドイッチ免疫アッセイに関する。さらに好ましくは、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに対する捕捉抗体のＫｄが、それぞれ、約１０００ｎＭ超、約１０００ｎＭ超及び約１０００ｎＭ超である。これとの関連で、「単一洗浄ステップ」とは、洗浄液（好ましくは分析物及びシグナル抗体が実質的にない）が免疫センサーに向けられて非結合分析物及び非結合シグナル抗体を免疫センサーの領域から取り除く洗浄ステップのことである。単一洗浄ステップにおいて用いられる洗浄液の量は大きく異なっていてもよいが、好ましくは１０００μＬ未満、７５０μＬ未満、５００μＬ未満又は２５０μＬ未満である。本発明において用いられる免疫センサーの種類は大きく異なっていてもよく、たとえば、電気化学センサー、弾力表面波センサー、表面プラズモン共鳴センサー、温度センサー、電界効果トランジスタセンサー、光学センサー、エバネッセント波センサー、導波管センサー、等から選択してもよい。
【００５０】
本発明は、分析物、たとえば、ＴＳＨを１回以下の洗浄ステップを用いる免疫アッセイで検出するための方法も目的とする。たとえば、一実施形態では、本発明は、少なくとも１つの捕捉抗体及び少なくとも１つのシグナル抗体を含む少なくとも２つのエピトープ適合性抗体を使用して全血ＴＳＨサンドイッチアッセイを実施する方法に関する。ＴＳＨに対する両方の抗体のＫｄは、１ｎＭ未満又は約１ｎＭ、たとえば、０．５ｎＭ以下、０．１５ｎＭ以下又は０．１ｎＭ以下である。ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに対する捕捉抗体のＫｄ値は、それぞれ約２５００ｎＭ超、約５００ｎＭ超及び約２００ｎＭ超であり、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに対するシグナル抗体のＫｄ値は、それぞれ約２５０ｎＭ超、約２００ｎＭ超及び約３５ｎＭ超である。さらに好ましくは、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに対する捕捉抗体のＫｄ値は、それぞれ約１０００ｎＭ超、約１０００ｎＭ超及び約１０００ｎＭ超であり、ＬＨに対するシグナル抗体のＫｄ値は約３５ｎＭ超である。この方法は、（ａ）全血試料をＴＳＨシグナル抗体及び電気化学的センサー上に固定化されたＴＳＨ捕捉抗体に接触させてサンドイッチ複合体を形成するステップ、（ｂ）試料及び非複合体化シグナル抗体を前記センサーから洗浄するステップ、並びに（ｃ）前記複合体化したシグナル抗体に伴うシグナルを検出するステップを含む。
【００５１】
この実施形態では、洗浄液は好ましくは、水及び１つ又は複数の添加物を含む液体を含み、望ましい程度にセンサーを洗浄することができなければならない。一態様では、洗浄液は酵素基質ＡＮＰＰ（リン酸アミノニトロフェニル）を含む。洗浄液ｐＨは好ましくは、レポーター酵素に最適であるように維持され、これはアルカリホスファターゼでは、約９〜１０の最適アルカリ性ｐＨである。洗浄液は好ましくは、電気化学アッセイにおける電気伝導度に影響を与える塩も含み、これは塩化ナトリウム及びマグネシウムにより供給される。マグネシウムはアルカリホスファターゼの補因子でもあり、低濃度で存在して酵素活性を増強することがある。他の酵素ベースのアッセイのための洗浄液は、溶液中での酵素安定性のために、電気化学であれば電気伝導度のために必要な適切な酵素基質、塩及び緩衝剤も、任意の適切な酵素補因子と共に含有すると考えられる。
【００５２】
既知の干渉物質に対するスカベンジャービーズの包含
第３の実施形態では、本発明は、１つ又は複数のスカベンジャービーズを用いるＴＳＨサンドイッチ免疫アッセイに、並びにそのような免疫アッセイを行うための関連する装置及び方法に関する。分析物、たとえば、ＴＳＨに対するアッセイの選択性を増強するために、たとえば、交差反応物、たとえば、ＦＳＨ、ＬＨ、ＣＧに対する抗体で標識されたラテックス又はポリスチレンビーズを含むスカベンジャービーズが試料中に溶解する混合物に添加される実施形態が考案された。このようにして、交差反応物には、ＴＳＨ捕捉抗体上の比較的好ましくない結合部位と試料中に溶解させたビーズ上の比較的好ましい結合部位とが与えられる。
【００５３】
この実施形態の一態様では、たとえば、本発明は、少なくとも１つの捕捉抗体及び少なくとも１つのシグナル抗体を含む少なくとも２つのエピトープ適合性抗体を含む免疫アッセイに関する。このアッセイは、ＦＳＨ、ＬＨ、ＣＧに対する抗体（ビーズ抗体）で被覆されたスカベンジャービーズをさらに含み、前記抗体のそれぞれのＫｄが、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧのそれぞれに対して、１ｎＭ未満又は約１ｎＭ、たとえば、０．５ｎＭ以下、０．１５ｎＭ以下又は０．１ｎＭ以下であり、ＴＳＨに対する前記ビーズ抗体のそれぞれのＫｄが約２５０ｎＭ超である。免疫アッセイにおいて用いられる捕捉抗体及びシグナル抗体のＴＳＨに対するＫｄは、好ましくは、上記の通り、約１ｎＭ未満（又は以下）、たとえば、０．５ｎＭ以下、０．１５ｎＭ以下又は０．１ｎＭ以下である。
【００５４】
したがって、一実施形態では、本発明は、少なくとも１つの捕捉抗体及び少なくとも１つのシグナル抗体を含む少なくとも２つのエピトープ適合性抗体を用い、１つ又は複数のスカベンジャービーズを使用して、そうでなければ競合する内分泌糖タンパク質ホルモン類似体であるＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧにより引き起こされることがある干渉を抑えるＴＳＨサンドイッチ免疫アッセイに関する。ここでは、ＴＳＨに対する捕捉抗体及びシグナル抗体のＫｄは好ましくは、１ｎＭ未満又は約１ｎＭ、たとえば、０．５ｎＭ以下、０．１５ｎＭ以下又は０．１ｎＭ以下である。添加されたスカベンジャービーズはＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに対するビーズ抗体で被覆されており、これらの抗体ごとに対するＫｄは好ましくは、それぞれＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧごとに対して、１ｎＭ未満又は約１ｎＭ、たとえば、０．５ｎＭ以下、０．１５ｎＭ以下又は０．１ｎＭ以下である。
【００５５】
一態様では、ビーズは、競合する内分泌糖タンパク質ホルモン類似体ごとに選択的である単一種類の抗体で被覆されている。別の態様では、ビーズは複数種類の抗体で被覆されており、第１のビーズ抗体はＦＳＨに対して選択的であり、第２のビーズ抗体はＬＨに対して選択的であり、第３のビーズ抗体はＣＧに対して選択的である。たとえば、第１のビーズ抗体はＦＳＨ及びＬＨに対して選択的であり、第２のビーズ抗体はＣＧに対して選択的であるビーズ抗体の他の組合せも可能である。
【００５６】
別の態様では、複数の異なるビーズを用いてもよい。たとえば、競合する内分泌糖タンパク質ホルモン類似体に選択的に結合する、それぞれが異なる抗体を有する３種類の異なるビーズを用いてもよい。たとえば、免疫アッセイ、装置及び方法は、それぞれＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに選択的に結合する第１のビーズ、第２のビーズ及び第３のビーズを用いてもよい。さらに具体的には、第１のビーズはＦＳＨに対して選択的な第１のビーズ抗体を含み、第２のビーズはＬＨに対して選択的な第２のビーズ抗体を含み、第３のビーズはＣＧに対して選択的な第３のビーズ抗体を含んでいてもよい。
【００５７】
ＴＳＨがこれらのビーズに優先的に結合するのを回避するために、ＴＳＨに対するビーズ抗体（１種類のビーズ上であれ複数種類のビーズ上であれ）のそれぞれのＫｄは約２５０ｎＭ超であることが望ましい。抗体標識化に関してのスカベンジャービーズの調製は、ＴＳＨに対する捕捉抗体について本明細書に記載されている方法に従う。上記の実施形態の場合と同じように、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに対するＴＳＨ捕捉抗体のＫｄは、それぞれ約２５００ｎＭ超、約５００ｎＭ超及び約２００ｎＭ超であることが好ましい。同様に、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに対するＴＳＨシグナル抗体のＫｄは、それぞれ約２５０ｎＭ超、約２００ｎＭ超及び約３５ｎＭ超であることが望ましい。
【００５８】
スカベンジャービーズは非磁性であり、試料中に懸濁したままでも可能であり、したがって、洗浄ステップ及び検出ステップに先立って試料と一緒に廃棄物チャンバーに取り除かれることに留意されたい。代わりに、スカベンジャービーズは磁性があってもよく、ＴＳＨ捕捉部位領域、たとえばＴＳＨ免疫センサーから離れている装置の領域に、磁界を適用することにより引き付けられる。代わりに、スカベンジャービーズは磁性があるが、磁界を適用して又は適用せずに廃棄物チャンバーに取り除かれてもよい。磁気ビーズを免疫センサーに磁気的に保持しておくための様々な手段は、Ｍｉｌｌｅｒへの米国特許出願第６１／３７１，０６６号明細書に記載されており、この特許文献の全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【００５９】
交差夾雑物干渉を抑える磁気スカベンジャービーズの使用は図８に図解されている。示されるように、ＬＨに対して選択的なスカベンジャー抗体を有する磁気ビーズが試料に添加され、試料中に含有されるＬＨに選択的に結合する。たとえば、永久磁石から又は電磁石からの磁界は、センサーから離れた好ましくはその上流の領域に磁気ビーズを局在化するように、装置（カートリッジ）において又は装置読取り機においてのいずれかで印加される。これにより、交差反応する又は競合する分析物、ここではＬＨからの干渉が抑えられて有利である。
【００６０】
好ましい実施形態では、犠牲ビーズ（ｓａｃｒｉｆｉｃｉａｌ  ｂｅａｄ）は乾燥試薬被覆に取り込まれ、この被覆はいくつかの実施形態では、シグナル抗体を含有する同じ乾燥試薬被覆であってもよい。したがって、一実施形態では、分析装置には、（ａ）ＦＳＨ、ＬＨ若しくはＣＧのうちの１つ若しくは複数の影響を軽減するのに適している犠牲ビーズ及び／又は（ｂ）シグナル抗体若しくは標識分析物などのシグナル発生試薬のどちらか又は両方を含む乾燥試薬被覆が含まれる。乾燥試薬被覆は、好ましくは（ａ）ＦＳＨ、ＬＨ若しくはＣＧのうちの１つ若しくは複数の影響を軽減するのに適している犠牲ビーズ及び／又は（ｂ）シグナル抗体若しくは標識分析物などのシグナル発生試薬のどちらか又は両方も含む試薬カクテルから形成されてもよい。一態様では、試薬被覆及び／又はカクテルは、米国特許同時係属出願第１２／４１１，３２５号明細書に開示されている、異好抗体により引き起こされる干渉を軽減するためのＩｇＭ又はその断片をさらに含んでおり、この特許文献は参照によりその全体を組み込まれている。試薬カクテルが置かれることになる表面は、好ましくは先ずコロナ処理されて、プリントされたカクテルの広がりを促進することになる荷電表面基を提供する。
【００６１】
一般的には、乾燥試薬被覆を形成するのに使用される試薬カクテルは、水溶性タンパク質、アミノ酸、ポリエーテル、ヒドロキシル基を含有するポリマー、糖又は炭水化物、塩及び場合により色素分子をさらに含んでいてもよい。それぞれの成分の１つ又は複数を使用することができる。一実施形態では、カクテルは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、グリシン、塩、メトキシポリエチレングリコール、ショ糖及び場合により、プリンティング過程を視覚化するのに役立つ色を提供するブロモフェノールブルーを含有する。一実施形態では、１〜２０μＬのカクテルが、分析装置の、たとえば保持チャンバー又は他の導管内の所望の表面にプリントされ、そのカバーと組み立てられる前に風乾させておく（加熱して又は加熱せずに）。好ましい態様では、試薬カクテル及びそこから形成される乾燥試薬被覆は、ラクチトール、ＤＥＡＥ−デキストラン、マグネシウム及び塩化ナトリウムなどの塩、ＩｇＧ／ＩｇＭ、ヘパリン、界面活性剤（単数又は複数）並びにローダミンのうちの１つ又は複数を含む。
【００６２】
試薬カクテルは好ましくは、犠牲ビーズ及び場合により他の干渉低減試薬を含有するプリント可能な水溶液として処方される。生体試料、たとえば血液を導入すると、試料は好ましくは、アッセイの第１ステップで試薬と混合する。試薬はまた、化学的及び流体属性に関してアッセイ性能を最適化する無機塩及び界面活性剤を含んでいてもよい。他の任意の添加剤は、十分な抗凝血を保証するヘパリン及びプリント後の試薬の位置を視覚化するための色素を含んでいてもよい。場合により、微生物増殖を阻害するためのアジ化ナトリウムなどの安定化剤及びタンパク質の安定化のためのラクチトールとジエチルアミノエチル−デキストラン（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．、Ｍｏｎｍｏｕｔｈ  Ｈｏｕｓｅ、Ｍａｍｈｉｌａｄ  Ｐａｒｋ、Ｐｏｎｔｙｐｏｏｌ、ＮＰ４  ０ＨＺ  ＵＫ）の混合物も存在する。いったん装置に置かれると、置かれた試薬は、たとえば、温風流中で３０〜６０分間乾燥させてもよい。一実施形態では、試薬は自動プリント機器を使用して装置の試料注入口にプリントされ、乾燥されて試薬被覆層を含有する犠牲ビーズを形成する。
【００６３】
別の実施形態では、検査カートリッジは、複数の乾燥試薬被覆を含んでいてもよい（その場合、被覆は、それを区別するために、それぞれ第１試薬被覆、第２試薬被覆、等と呼んでもよい）。たとえば、犠牲ビーズは第１試薬被覆に含まれてもよく、第１試薬被覆は、たとえば、シグナル抗体を含有する第２試薬被覆に隣接していてもよい。この態様では、第２試薬被覆は第１試薬被覆の上流に又は下流に位置していてもよいが、シグナル抗体を含有する試薬被覆が犠牲ビーズを含有する試薬被覆の下流に位置しているのが好ましい。好ましい実施形態では、保持チャンバーは、犠牲ビーズ及び場合により様々な形態の干渉を軽減する他の試薬を含む第１試薬被覆で被覆されている。この態様では、シグナル抗体を含む第２試薬被覆は、好ましくは保持チャンバーの下流、すなわち免疫センサーのすぐ上流に位置している。
【００６４】
さらに他の実施形態では、犠牲ビーズは、分析装置、たとえば、カートリッジの一部でなくてもよい。たとえば、犠牲ビーズは試料収集装置、たとえば、キャピラリー、バキュテナー（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）（商標）又は注射器に組み込まれていてもよい。たとえば、犠牲ビーズ被覆は、収集装置の内壁上で形成されてもよい。したがって、一実施形態では、本発明は、第１容器又は位置で血液試料を修正するのに先ず使用される犠牲ビーズを含む免疫アッセイを実施し、次に試料は捕捉抗体及びシグナル抗体を有する第２容器又は位置に通されるためのキットに関する。
【００６５】
本明細書で考察されるビーズに加えて又はビーズの代わりとして、試料は、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．への共同所有されている米国特許出願第１２／６２０，１７９号明細書に記載されている種類の犠牲ビーズ（場合により、白血球にオプソニン化されている）で修正されてもよく、この特許文献の全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
免疫センサー製作
上記のように、本発明は、電気化学免疫センサーを使用するｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）システムを参照することにより最もよく説明される。免疫センサーの好ましい実施形態のウェハレベルの微細加工は以下の通りである。ベース電極は、１５μｍセンター上の正方形アレイの７μｍゴールドディスクからなる。アレイはほぼ６００μｍ径の円形領域をカバーし、Ｓｉ／ＳｉＯ２／ＴｉＷ／Ａｕを含む一連の層から作製される基材上に厚さ０．３５μｍの薄層のポリイミドを光パターン形成することにより達成される。７μｍの微小電極のアレイは、露出金属のキャパシタンスに伴ういかなる電気化学バックグランド電流からの寄与も抑えて、高い収集効率の電気活性種を与える。金属上に、ＰＶＡ層、たとえば、光形成性ポリビニルアルコールが含まれるとバックグランド電流の減少が著しく増強される。
【００６７】
多孔質ＰＶＡ層は好ましくは、ウェハ上の微小電極上にＰＶＡとスチルバゾリウム（ｓｔｉｌｂｉｚｏｎｉｕｍ）光活動性架橋剤の水性混合物をスピンコートすることにより調製される。スピンコート混合物は、場合によりウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。次に、ＰＶＡ層は、アレイ上及びアレイ周囲の領域のみを覆うように光パターン形成されてもよく、好ましくは約０．２〜１．０μｍ、たとえば、０．４〜０．８μｍ又は約０．６μｍの厚みを有する。異なるＴＳＨ抗体に対する免疫センサーは、ビーズ上に抗体を被覆し、ビーズをそれが接着するセンサー表面に塗布することにより作製してもよい。
【００６８】
下記のビーズ調製法を使用して、脱イオン水中、約０．６〜２．０ｗｔ％、たとえば、約０．８〜１．６ｗｔ％又は約１ｗｔ％固体を含む、約３０〜６０ｎＬ、たとえば、３５〜５０ｎＬ、又は約４０ｎＬの液滴を、センサーを覆う光パターン形成された多孔質ポリビニルアルコール選択透過性層上に微粒分散させ（たとえば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５５４，３３９号の方法及び装置を使用して）、乾燥させておいてもよい。乾燥した粒子は、その血液試料又は洗浄液への溶解を実質的に防ぐ多孔質層に接着するべきである。
【００６９】
捕捉ビーズ製作
本発明のために使用される捕捉ビーズは、使用されるのが固定化された捕捉抗体のためでも任意のスカベンジャービーズ抗体のためでも、種々の技法により形成することができる。好ましい実施形態では、抗ＴＳＨ及び抗ＨＳＡで被覆されたカルボン酸修飾ラテックス微粒子（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．及びＳｅｒａｄｙｎ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｉｎｃ．より市販されている）は両方とも同じ方法により調製される。粒子は好ましくは、先ず遠心分離によりバッファー交換され、続いて抗体が添加されて、これを粒子上に受動的に吸着させておく。次に、粒子上のカルボキシル基は好ましくは、たとえば、ＭＥＳバッファー中のＥＤＡＣ、ｐＨ６．２で活性化され、抗体へのアミド結合を形成する。いかなるビーズ凝集体も遠心分離により取り除いてよく、完成ビーズは、たとえば、約−８０℃で凍結保存されてもよい。
【００７０】
カートリッジ設計
図を参照すると、本発明において使用するための任意のカートリッジ設計は、カバー（図１、図２）、基部（図４）及び基部とカバーの間に配置された薄膜接着ガスケット（図３）を備えている。この時点で図１を参照すると、カバー１は、亀裂を生じることなく柔軟な蝶番部５、９、１０で繰り返し変形することが可能な硬質物質、好ましくはプラスチックで作られている。カバーは蓋２を備え、この蓋は柔軟な蝶番９によりカバー本体に取り付けられている。実施中、試料の試料保持チャンバー３４への導入後、蓋は試料入口４への入り口をしっかり閉めて、試料漏出を防ぐことができ、蓋はフック３により固定される。カバーは、カバー本体に対して取り外し可能であり、柔軟な蝶番部５、１０によりカバー本体に取り付けられている２つのヘラ６、７をさらに備えている。実施中、ポンプ手段の作用を受けると、ヘラ６は、薄層ガスケット２１に覆われている空洞４３を備える浮袋に力を加えて液体をカートリッジの導管内に液体を移す。第２のポンプ手段による作用を受けると、ヘラ７はガスケット２１に力を加え、ガスケットはそこに設けられた裂け目２２及び２３のせいで変形することができる。カートリッジは読取り装置への挿入のために改造されており、したがってこの目的のために複数の機械的及び電気的接続を有する。カートリッジの手動操作が可能であることも明白であるべきである。したがって、カートリッジを読取り装置に挿入すると、ガスケットは、空洞４２に位置しているほぼ１３０μＬの分析／洗浄溶液（「液」）で満たされた液体含有ホイルパック上に圧力を送り、スパイク３８上でパッケージを破裂させて、液体を、基部において短い横断導管を介してセンサー導管に接続している導管３９中に排出する。分析液は、毛細管ストップ（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｓｔｏｐ）として機能するテープガスッケトの小開口上に先ず液体を押し付ける分析導管の前を満たしている。カートリッジに適用される分析器機構の他の動きを使用して、分析導管内の制御された位置で分析液中に１つ又は複数の空気部分を注入してもよい。これらの部分を使用して、最小限の液体でセンサー表面と周囲の導管を洗浄するのに役立てる。
【００７１】
カバーは、柔軟な薄層８で覆われている穴部をさらに備えている。実施中、薄層にかけられる圧力は、ガスケットの小さな穴部２８を通って導管２０内に１つ又は複数の空気部分を排出する。
【００７２】
図２を参照すると、基部の下面は、第２の導管１１及び第１の導管１５をさらに備えている。第２の導管１１は狭窄部１２を含み、この狭窄部は液体の流れに抵抗力を与えることにより液体流を制御する。任意の被覆１３、１４は疎水性表面を提供し、これらの被覆はガスケット穴部３１、３２と一緒になって導管１１、１５間の液体流を制御する。基部の陥凹１７は導管３４において空気の経路を与えてガスケットの穴部２７を通って導管３４につながる。
【００７３】
図３を参照すると、薄層ガスケット２１は、基部及びカバー内の導管間の液体の移動を容易にし、必要な場合には圧力下でガスケットを変形させる様々な穴部及び裂け目を備えている。したがって、穴部２４は液体を導管１１から廃棄物チャンバー４４に流してやることができ、穴部２５は導管３４と１１の間に毛細管ストップを備えており、穴部２６は陥凹１８と導管４０間で空気を流してやることができ、穴部２７は陥凹１７と導管３４間に空気流動を与え、穴部２８は、任意の閉じられる弁４１を介して導管１９から廃棄物チャンバー４４に液体を流してやることができる。穴部３０及び３３は、それぞれカッタウェイ３５及び３７内に収納されている免疫センサーチップ（上記）を導管１５内の液体に接触させることができる。特定の実施形態では、カッタウェイ３７は接地電極及び／又は対基準電極を収納し、カッタウェイ３５は少なくとも１つの分析物センサー及び場合により伝導度センサーを収納する。穴部２９は下のフィルターを外部空気供給に接近させ、洗浄液流動中に噴き出される気泡を生成させる。気泡の縁は、センサー上の部分的洗浄を果たす洗浄液にはっきりした変化を生じる。典型的なＥＬＩＳＡアッセイは、捕捉センサーの効果的な洗浄を可能にするはっきりしたバッファー変化（部分的洗浄ではなく）を利用する。
【００７４】
図３及び図４を参照すると、導管３４は、ガスケット２１の開口部１２２を介して試料入口４を組み立てられたカートリッジの第１の導管１１に接続する試料保持チャンバーである。カッタウェイ３５は、分析物センサー（単数又は複数）又は分析物応答性表面を、任意の伝導度センサー（単数又は複数）と一緒に収納している。カッタウェイ３７は、必要な場合には電気化学センサーのためのリターン電流経路として接地電極を収納しており、任意の伝導度センサーをも収納していてもよい。カッタウェイ３６は、液体が第１と第２の導管間を通過することができるようにガスケット穴部３１と３２間に流体経路を与える。陥凹４２は、読取り装置内に挿入されるとヘラ７にかかる圧力のせいでスパイク３８により穴をあけられる液体含有パッケージ、たとえば、断裂可能ポーチを組み立てられたカートリッジに収納している。穴をあけられたパッケージから出る液体は３９で第２の導管に流入する。浮袋はその上面をガスケット２１により密封されている陥凹４３を備えている。浮袋はポンプ手段の一実施形態であり、ヘラ６にかかる圧力により発動され、導管４０中の空気を移動させそれによってこの試料を試料チャンバー３４から第１の導管１５に移動させる。
【００７５】
空気が浮袋から試料チャンバーに入る位置（ガスケット穴部２７）及び毛細管ストップ２５を合わせて、試料チャンバーの既定の容積を規定する。いくつかの好ましい実施形態では、試料は１〜５００μＬ、たとえば、５〜２００μＬ又は１０〜５０μＬ、好ましくは約２０μＬの試料容積に計量される。この容積に一致する試料の量は、ヘラ６が押えられているときに第１の導管に移される。したがって、この配置は未計量試料の計量された量をカートリッジの導管内に送達するための計量手段の１つの可能な実施形態である。
【００７６】
本カートリッジでは、試料セグメントを計量するための手段は、基部プラスチック部分において与えられる。セグメントサイズは基部のコンパートメントのサイズ並びにテープガスケットにおける毛細管ストップ及び空気パイプ穴部の位置により制御される。この容積は、１〜５００μＬ、たとえば、１〜２００μＬまで容易に変化させることが可能である。試料サイズのこの範囲の拡大は本発明の文脈内で可能である。
【００７７】
液体は、センサー導管１９でのその提示に先立って試料中への試薬を修正する（たとえば、スカベンジャービーズ、シグナル抗体又は可溶性分子のうちの１つ又は複数を用いて）のに使用することができる分析前導管１１の中を押し通される。代わりに、修正試薬のうちの１つ又は複数は１つ又は複数の導管に位置していてもよい。たとえば、上記１つ又は複数の試薬は、部分１６を超えて導管３４及び／又は導管１５に位置していてもよい。試料を分析前導管の中を押し進めることは、流体移動の発動に対するその応答性を軽減するダイアフラムポンプヘラ７に張力を導入するのにも役立つ。
【００７８】
いくつかのアッセイでは、分析物の定量化が必要な場合は計量は有利である。廃棄物チャンバー４４は、カートリッジの外面の汚染を防ぐために、導管から排出される試料及び／又は液体のために提供される。廃棄物チャンバーを外部の大気に接続する通気孔４５も提供される。カートリッジの特色は、いったん試料が負荷されると、分析を完了することができ、試料に接触する操作員又はその他なしでカートリッジを破棄することができることである。
【００７９】
この時点で図５を参照すると、５１〜５７が、場合により試料又は液体を修正する乾燥試薬で被覆することができる導管及び試料チャンバーの一部である、カートリッジ及びコンポーネントの特色の回路図が提供される。試料又は液体を、それを溶解する乾燥試薬上を少なくとも１回は通過させる。カートリッジ内で試料又は液体を修正するのに使用される試薬は、抗体−酵素コンジュゲート、シグナル抗体、アッセイ化合物間の特異的若しくは非特異的結合反応のいずれかを防ぐブロッキング剤又は犠牲ビーズ（上記）を含んでいてもよい。可溶性ではないがアッセイ成分がカートリッジの内面に非特異的に吸着するのを防ぐのに役立つ表面被覆も提供することができる。
【００８０】
試料又は液体のセグメント内では、修正物質を優先的に溶解させセグメントの既定の領域内に濃縮することができる。これはセグメントの位置と動きを制御することを通じて達成される。したがって、たとえば、先端など、セグメントの一部を修正物質上で交換しさえすれば、この物質の高局所濃度を先端近くで達成することができる。代わりに、物質の均一な分布が望まれる場合、たとえば、修正物質の既知の濃度が定量分析のために必要になる場合、試料又は液体がさらに交換されると、混合され均一に分布することになる。
【００８１】
特定の実施形態では、閉じられる弁５８が第１の導管と廃棄物チャンバーの間に提供される。一実施形態では、弁５８は不透過性物質で被覆されている乾燥スポンジ材を備えている。実施中、スポンジ材を試料又は液体に接触させると、スポンジが膨張して空洞４１を満たし、それによって廃棄物チャンバー４４への液体のそれ以上の流入を実質的に遮断する。さらに、濡れた弁は第１の導管と廃棄物チャンバー間の空気の流れも遮断し、これにより試料チャンバーに接続された第１のポンプ手段は液体を第２の導管に移し、液体を第２の導管から以下のようにして第１の導管内に移すことができる。試料は、制御された時間センサーに曝露された後、分析後導管１９内に移動され、そこで試料を別の試薬により修正することができる。次に、試料をセンサーに戻すことができ、第２の反応期間を開始することができる。代わりに、分析後導管は試料部分をセンサーから分離するためだけに役立つことも可能である。
【００８２】
図６は、３つのポンプ手段６１〜６３を備えている免疫センサーカートリッジのレイアウト図を示す。これらのポンプは特定の実施形態に関して描かれているが、ポンプ手段６１〜６３のそれぞれの機能を果たすことができるいかなるポンプ手段でも本発明内で使用することができることは容易に理解されるであろう。したがって、ポンプ手段１、６１は試料を試料保持チャンバーから第１の導管へ移すことができなければならず、ポンプ手段２、６２は液体を第２の導管内に移すことができなければならず、ポンプ手段３、６３は少なくとも１つのセグメントを第２の導管に挿入することができなければならない。
【００８３】
操作
好ましい実施形態では、第１ステップで、使用者は患者から試料を採血し（又は以下の場合のように、既知ＴＳＨ濃度の対照液体を使用する）、数滴をカートリッジに挿入する。いったんカートリッジが計器に挿入されると、計器は検査サイクルの残りを制御する。シグナル抗体は好ましくは、試料中に溶解されてカートリッジ内の導管（たとえば、保持チャンバー）の壁に被覆されており、試料の一部はポンプにより免疫センサーの位置まで移動される。代わりに、シグナル抗体は免疫センサーの領域又は装置内の他の場所の、しかし理想的には免疫センサーの上流の位置の導管の被覆に配置されていてもよい。ポンプは試料を振動させて、センサー上でのサンドイッチ形成を促進するのにも役立つ。これには約１〜２０分、好ましくは２〜１４分、４〜１２分、又は理想的には約８分かかることがある。次に、ポンプは試料を廃棄物チャンバーに押し込む。別々の洗浄ステップを含む実施形態では、内部液体ポーチから出る洗浄液はポンプにより免疫センサー上に送られて、いかなる残余試料及び非結合シグナル抗体でも洗い流すことができる。液体の一部は、酵素基質も含有するが、センサー領域に残る。次に、免疫センサーで電流の測定が行われる。計器内のソフトウェアはその値、たとえば、実施例のセクションに表に示されている電流及び他のデータを記録する、又は実際の分析物濃度を計算し表示する。
【００８４】
電流測定電気化学システムである、好ましい実施形態の操作中、ＡＬＰの活性から生じる免疫センサーでのｐ−アミノフェノールの酸化に伴う電流は分析器により記録される。様々なリン酸化基質のＡＬＰ脱リン酸化の生化学は周知である。免疫センサーでの電位は、銀−塩化銀基準電極に対して平衡にされる。
【００８５】
多くの種類の免疫アッセイ装置及び方法が記載されており、以下の共同所有の特許及び出願がある。血液試料中の分析物を首尾よく測定するための使い捨て感知装置は、米国特許第５，０９６，６６９号においてＬａｕｋｓにより開示されている。この装置は、血液試料中の分析物濃度を測定する目的で、読取り装置及び読取り装置に収まるカートリッジを用いる。Ｍｉｌｌｅｒらへの米国特許第７，７２３，０９９号は、免疫基準電極を備えた免疫アッセイ装置を記載しており、Ｍｉｌｌｅｒらへの米国特許第７，６８２，８３３号は改良された試料閉鎖装置を備えた免疫アッセイ装置を記載しており、Ｃａｍｐｂｅｌｌらへの米国特許出願公開第２００４／００１８５７７号は多重ハイブリッド免疫アッセイを記載しており、Ｄａｖｉｓらへの米国特許第７，４１９，８２１号は分析物測定及び免疫アッセイのための装置及び方法を記載しており、Ｃｏｌｌｉｅｒらへの米国特許出願公開第２０１０／０１６７３０１号はヌクレオチドコンジュゲートを使用する免疫アッセイ組成物及び方法を記載している。これらの特許及び特許出願はそれぞれが参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【００８６】
免疫アッセイは様々な形態の干渉に感受性であることは当技術分野では周知である。たとえば、共同所有係属米国特許出願第１２／４１１，３２５号（「‘３２５出願」）は、ＩｇＧ試薬カクテルにＩｇＭを含むことにより異好性抗体からの干渉を軽減することに取り組んでいる。「‘３２５出願」は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【００８７】
低洗浄ＴＳＨアッセイのための抗体選択への経験的対理論的アプローチ
ＴＳＨアッセイでは、いくつかの臨床状況において、関連ホルモンはＴＳＨと比べて潜在的に高いモル濃度で見出される。したがって、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧは典型的には、それぞれ５００、５００及び２００，０００ｍＩＵ／ｍＬのレベルでＴＳＨアッセイに添加されて、高濃度の交差反応種の存在下で実試料をシミュレートする（Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄａｔａ  Ｉｎｓｅｒｔ、Ａｂｂｏｔｔ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）。ＴＳＨ、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに対するこれらの濃度は、それぞれおよそ０．９６、３０００、７６０及び４３６，０００ｐＭである。
【００８８】
理論的交差反応性
平衡解離定数は測定されると、得られた解離定数に基づいて予想される交差反応性を比較するために理論的計算を実施することができる。これらの計算は実際のアッセイの結果を正確に予測することはできないが、抗体の親和性がアッセイを実施するのに十分であり、選択された抗体が低洗浄カートリッジ実験において試験された場合に著しくより良い成績を挙げることを保証する指針として使用してもよい。これらの計算は、開発のプロトタイプ段階において思いがけないアッセイ結果を同定することによりアッセイの開発を支援することもできる。たとえば、下の表１を参照されたい。
【００８９】
計算は、２ステップアッセイ並びに洗浄手順に先立って（１）捕捉ステップ及び（２）検出ステップを含む２ステップアッセイを想定することにより実施された。捕捉ステップでは、４種のホルモン全てが捕捉抗体と結合し平衡に達すると想定される。このステップ後捕捉抗体に結合しているそれぞれのホルモンの濃度は捕捉されたホルモンと見なされる。検出ステップでは、捕捉されたホルモンは検出抗体に結合する際に平衡に達すると想定される。この第２ステップ後に検出抗体に結合しているそれぞれのホルモンの濃度は検出された濃度である。次に、交差反応性は干渉ホルモンの検出された濃度をＴＳＨの検出された濃度で割り１００％を掛けることにより計算される。表８に与えられる抗体についての測定された解離定数は計算のために使用された。ＴＳＨ、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに対する濃度はそれぞれほぼ１、３０００、７６０及び４３６，０００ｐＭである。これらの値は、典型的にはＴＳＨアッセイにチャレンジするためにＴＳＨアッセイに添加される値に匹敵する。この計算を使用して、選択された抗体が対照抗体よりも改善されたものであることを確かめる。計算は１００ｐＭ捕捉抗体及び１００ｐＭ検出抗体を想定している。
【００９０】
モデルは、適合性抗体対を決定する又は捕捉抗体についての物質移行の影響などの他の要因として実際のアッセイにおける結果を正確に予測することはできないので、データは、抗体には利点があることを確かめ標的解離定数を見積もる指針として使用されるだけである。したがって、抗体を比較するために、交差反応性計算から決定される値は以下のようにして比較される。対照交差反応性値は、抗体ＴＳＨ  Ａｂ５４４及び４１４Ｂを使用して上の計算を実施することにより定義される。これらの対照抗体について得られる交差反応性の最良値は、改良しなければならない交差反応性であると解釈される。この値は、下の表１においてホルモンごとにアステリスク付きで示されている。いかなる候補抗体対も両方の構成におけるこれらの値よりも低い交差反応性を有するはずである。表のデータから、４１４Ｂと５４０９の組合せは、ＦＳＨとＣＧに対する交差反応性が対照値を上回っている状態を有していることが分かる。この結果により、この組合せがＴＳＨアッセイのための最良の対ではない可能性が示唆される。表は、５４０９、ＭＥ１３０及びＴ２５Ｃの組合せが、全てのホルモンについて、どちらの組合せでも対照値を下回る交差反応性の値を生じることも示している。これは、これらの抗体がアッセイにおいて使用するのに良好な候補である可能性があり、さらに調べられたことを示している。
【表１】
0005938471.tif 000004
【００９１】
本発明は、以下の非限定的実施例に照らしてさらによく理解されることになる。
【実施例】
【００９２】
（例１）：初期抗体スクリーニング
６７の抗体調製物が得られ（表２）、ニトロセルロースドットブロットアッセイを用いて試験された。さらに、ＴＳＨ抗体５４４及びＳｅｒａｄｙｎ抗アルファＬＨモノクローナル抗体（Ｓｅｒａｄｙｎ、カタログ番号ＭＩＴ０４１４Ｂ）は、これらの研究において抗体のベンチマーク交差反応対として使用された。アッセイ標準を与えるため、抗原ＴＳＨ（カタログ番号Ｔ９２６５、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ＦＳＨ（カタログ番号Ｆ４０２１、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ＬＨ（カタログ番号Ｌ５２５９、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、及びＣＧ（カタログ番号Ｃ０４３４、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）は、ＴＳＨ、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧについてそれぞれおよそ３５，０００μＩＵ／ｍＬ、７００，０００ｍＩＵ／ｍＬ、２５０，０００ｍＩＵ／ｍＬ、２×１０７ｍＩＵ／ｍＬの濃度まで１／５ＰＢＳバッファー中に再懸濁された。１μＬのそれぞれの抗原は、ニトロセルロースの小片上にスポットされ乾燥された。ニトロセルロース片は先ずＰＢＳ中１％粉末ミルクで遮断され、次に個々の小片は異なる抗体調製物のそれぞれと一緒にインキュベートされた。次に、小片はＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄され、続いてヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ  ＡＬＰ二次コンジュゲート（カタログ番号４７５１−１８０６、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）が添加され、必要な場合にはある種のポリクローナルには抗ウサギ、ヒツジ及びヤギＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ  ＡＬＰコンジュゲートが使用され、次にＢＣＩＰ／ＮＢＴアルカリホスファターゼ基質（１−成分）（カタログ番号５０−８１−０７、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）が添加された。反応は脱イオン水中ですすぐことにより停止された。
【表２−１】
0005938471.tif 000005
【表２−２】
0005938471.tif 000006
【００９３】
追加の評価のために選択された抗体は、ＴＳＨ抗原とは良好なシグナルを、且つＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧとは低シグナルを示す小片を同定することにより決定された。これにより、対照としてＴＳＨ  Ａｂ  ５４４及びＳｅｒａｄｙｎ  ＭＩＴ０４１４Ｂを含む、追加の評価のための２５の候補抗体（表３）が得られた。
【表３】
0005938471.tif 000007
【００９４】
次に２５の候補抗体を使用して、下の例１０、１１に記載されている捕捉ビーズとＡＬＰコンジュゲートとの両方を作製した。これらの試薬はｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）カートリッジに組み込まれ、次に本明細書に記載される検査サイクルを使用して交差反応性についてスクリーニングされた。抗原（対照検査液）の濃度はＴＳＨ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＡＢＴ０３１５）、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧについてそれぞれおよそ０．４ｍＩＵ／Ｌ、５００ｍＩＵ／Ｌ、５００ｍＩＵ／Ｌ及び２００，０００ｍＩＵ／Ｌであった。ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧ試薬は、上記と同じ供給源であった。アッセイは、ＴＳＨ単独を用いて、並びにＴＳＨとそれぞれＣＧ、ＦＳＨ及びＬＨを個々に組み合わせて実施された。パーセント交差反応性は、ＴＳＨ単独により生じるシグナルで割るＴＳＨシグナルそれ自体を差し引いて、交差反応抗原のうちの１つと一緒のＴＳＨから生じる電気化学シグナル間の差により計算された。
【００９５】
このスクリーニングにより追加の評価のための４つの候補抗体が得られた（表４）。ＴＳＨ  Ａｂ  ５４４及びＭＩＴ０４１４Ｂ抗体は、高交差反応対照として比較研究のために使用された。最も低い相対的交差反応性を有する抗体からの供給メーカー提供のデータは表４に収載されている。これらは使用された抗原試料と最も低いレベルの交差反応性を有していたことに注目すべきである。これらの抗原は微量のＴＳＨ抗原を含有しており、さらに純度の高い抗原（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、Ｎｏｒｔｈ  Ａｃｔｏｎ、ＭＡより購入）が使用された後の実験では見られなかったさらに高いレベルの交差反応性が観察されたことは、Ａｂｂｏｔｔ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ  ｉ２０００ＳＲ機器（Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、ＵＳＡ）を使用してこれらの干渉抗原を試験することにより後に同定され確認された。交差反応性レベルは試験されたその他の抗体と比べて低かったので、これらの抗体は最良の交差反応性能を有すると予想され、下に記載される他の技法によりさらに分析された。
【表４】
0005938471.tif 000008
【００９６】
（例２）：ＦＲＥＴエピトープマッピング
抗体対適合性は、フェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）ベースの競合アッセイにより決定された。およそ５００〜１０００μｇのそれぞれの内分泌糖タンパク質ホルモン（ＴＳＨ（カタログ番号Ｔ９２６５、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ＦＳＨ（カタログ番号３０Ｒ−ＡＦ０２０、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、Ｎｏｒｔｈ  Ａｃｔｏｎ、ＭＡ）、ＬＨ（カタログ番号３０−ＡＬ１５、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、Ｎｏｒｔｈ  Ａｃｔｏｎ、ＭＡ）及びＣＧ（カタログ番号３０Ｒ−ＡＣ０４８、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、Ｎｏｒｔｈ  Ａｃｔｏｎ、ＭＡ））は、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８カルボン酸サクシニミジルエステル（カタログ番号Ａ２０１００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で標識された。抗体は、蛍光消光部分としてＢＨＱ−１０カルボン酸サクシニミジルエステル（カタログ番号ＢＨＱ−１０Ｓ、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）で標識された。タンパク質はＲｕａｎら（２００９、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ  ３９３：１９６）に従って標識された。
【００９７】
抗体対は非標識抗体の存在下でのその消光力に基づいて選択された。過剰量の６つの抗体は、先ず蛍光標識された抗原と一緒にインキュベートされ、次にそれぞれの試料は６個の試験管に分割された。６個の試験管では、６つのＢＨＱ標識抗体のうちの１つが添加された。したがって、表５に示されるように６×６の反応マトリックスが作製された。それぞれの試験管からの蛍光強度が、ＢＨＱ標識抗体を添加する前と後で測定された。蛍光強度が著しく変化すれば、陽性サンドイッチ対合であることが示された。蛍光強度が変化しない又はほとんど変化しなければ、同一分析物へのＢＨＱ標識抗体の結合を遮断する非標識抗体が存在することが示された。蛍光は同一対について１．０の値に正規化された。表５は相対的蛍光値を与えている。
【表５】
0005938471.tif 000009
【００９８】
（例３）：ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）カートリッジを用いたエピトープマッピング
６つの抗体ごとにポリスチレンビーズとＡＬＰコンジュゲートの両方が作製された（例２に記載されている）。カートリッジは、電気化学的電流（ｎＡ）を発生する０．４ｍＩＵ／Ｌ  ＴＳＨ（組換えＴＳＨ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＡＢＴ０３１５、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて試験された。表６は適合性抗体対を示すいくつかの抗体対を収載している。同一の抗体対組合せは試験されなかった。たとえば、４１４Ｂは、結合の生物学のせいで高交差反応性を有すると予測されるアルファサブユニットを認識し、カートリッジでは試験されなかった。抗体を蛍光タグ又は蛍光消光部分のどちらかで標識することによりエピトープ遮断の可能性があり、特にＢＨＱ標識５４０９及びＭ４と一緒のＴ２５Ｃについて、ＦＲＥＴとサンドイッチＥＬＩＳＡ法の両方間の差を説明することができることは認識されるべきである。抗体対は、３０ｍＩＵ／Ｌ濃度でのＴＳＨ抗原を使用するｉ−ＳＴＡＴカートリッジの電気化学免疫アッセイシステムにおいて試験された。表６の値は、測定された電流をｎＡで表示している。
【表６】
0005938471.tif 000010
【００９９】
交差反応性評価のための抗体対は、ＦＲＥＴ競合アッセイ及びｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）カートリッジデータに基づいて表７に収載されている。
【表７】
0005938471.tif 000011
【０１００】
（例４）：Ｋｄ計算
およそ５００〜１０００μｇのそれぞれの内分泌糖タンパク質ホルモン（ＴＳＨ（カタログ番号Ｔ９２６５、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ＦＳＨ（カタログ番号３０Ｒ−ＡＦ０２０、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、Ｎｏｒｔｈ  Ａｃｔｏｎ、ＭＡ）、ＬＨ（カタログ番号３０−ＡＬ１５、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、Ｎｏｒｔｈ  Ａｃｔｏｎ、ＭＡ）及びＣＧ（カタログ番号３０Ｒ−ＡＣ０４８、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、Ｎｏｒｔｈ  Ａｃｔｏｎ、ＭＡ））は、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８カルボン酸サクシニミジルエステル（カタログ番号Ａ２０１００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で標識された。抗原は、蛍光消光部分としてＢＨＱ−１０カルボン酸サクシニミジルエステル（カタログ番号ＢＨＱ−１０Ｓ、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）でも標識された。タンパク質はＲｕａｎら（２００９、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ  ３９３：１９６）に従って標識された。
【０１０１】
およそ１００〜２５０ｎＭ濃度のＢＨＱコンジュゲート抗体の、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識抗原のそれぞれのＴＳＨでは１００ｐｍｏｌからＬＨ、ＣＧ及びＦＳＨでの約１０００ｐｍｏｌと一緒の添加は、Ｒｕａｎら（２００９、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ  ３９３：１９６）に従ってＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ  Ｍｏｄｅｌ  ＳＬＭ８１００分光蛍光計を使用して実施された。データはＩＤＬソフトウェア（ＩＴＴ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）を用いて解析され、Ｋｄ値（ｎＭ）を得た。データの例は図７に見られる。Ｋｄデータの要約は表８に見られる。ＭＥ１３０、Ｍ４及び４１４Ｂは表９及び１１の抗体特徴を有しておらず、したがって、低レベルの交差反応性を示していない。表８は、４つの異なる抗原を使用して６つの抗体についてのＫｄ結合データを提供しており、値は全てｎＭである。
【表８】
0005938471.tif 000012
【０１０２】
交差反応性レベルは低シグナルではさらに高いので、抗体が十分なシグナルを発生することが重要である。したがって、表９において十分に低いＫｄ値のない抗体（ＴＳＨに対して高親和性）は交差反応性については検討されなかった。これにより、交差反応性試験について考えられる抗体対の新たな一覧が得られた（表１０）。
【表９】
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【表１０】
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【０１０３】
表１１に見られる抗体Ｋｄ特徴を有する抗体は低交差反応性を有すると予想された。
【表１１】
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【０１０４】
（例５）：ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）交差反応性データ
コンジュゲート抗体ビーズ調製物及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）コンジュゲートの組合せはｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）免疫アッセイカートリッジに組み込まれた。
【０１０５】
適合性抗体対（表７）、ＴＳＨに対する適切なＫｄ値（表９）並びにＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに対する高Ｋｄ値（表１１）に基づいて、表１０の組合せが例１に記載される交差反応性について試験され、表１２にまとめられている。干渉抗原のいずれについても５％を超える交差反応性を示す抗体対はアステリスク（＊）で示された。５４０９（捕捉抗体）及びＴ２５Ｃ（シグナル抗体）のみが、表９及び１１に記載される特徴を有する唯一の抗体なので、５％未満の交差反応性を示した。
【０１０６】
捕捉として使用された５４０９と検出抗体として使用されたＴ２５Ｃの抗体組合せは、適合性エピトープを認識するその能力と共に、その抗原結合特徴のせいで低交差反応性を与えることができる唯一の対であった。ＭＥ１３０はＴＳＨに対してより良好な結合親和性を有し、これはより高い電流測定電流発生で示された。より高い電流測定シグナルを示す抗体は、システムのノイズから区別するのにより多くの問題をはらむより低い電流測定シグナルを発生する抗体対と比べて生じる交差反応性は低かった。表１２は、０．４ｍＩＵ／Ｌ  ＴＳＨを使用し、抗原濃度の全てを添加するｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）カートリッジフォーマットにおいて抗原交差反応性を示している。以前決定された適合性抗体対のみが選択された。Ｍ４は、ＴＳＨに対して親和性が不十分で他の抗体組合せと比べてカートリッジアッセイにおいて低シグナルを発生していたので、選択からは取り除かれた（表６及び表８）。
【表１２】
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【０１０７】
（例６）：抗ＦＳＨ  ９５７８４ビーズ調製
抗ＦＳＨ  ９５７８４ビーズは以下の通りに調製された。１５ｍｇの１．０１μｍカルボキシル化されたポリスチレン微粒子（１０％重量／容積）（パーツ番号ＰＣＯ４Ｎ、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を２５ｍＭの２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳバッファー、ｐＨ６．２）中１．２ｍｇの抗ＦＳＨ  ９５７８４と１５分間反応させ、次に遠心分離して上澄みを取り除いた。２５ｍＭのＭＥＳバッファー中にペレットを再懸濁させた後、１０ｍＭのカルボジイミド（ＥＤＡＣ）を試料に添加し４℃で２時間反応させた。これに続いて、試料を遠心分離し、ペレットを１／５生理リン酸緩衝液で２度洗浄した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液中１０％固体で処方された試料は、さらに使用するために保存された。
【０１０８】
これらのビーズは、ＴＳＨ捕捉抗体がＦＳＨコンジュゲートビーズで置き換えられているＦＳＨ検出カートリッジの組立てに使用された。ビーズは、２５％タンパク質安定化溶液（カタログ番号Ｑ２０３０５２９Ｐ１、Ｇｗｅｎｔ  Ｇｒｏｕｐ、Ｐｏｎｔｙｐｏｏｌ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を含む、１／５生理リン酸緩衝液中３．２％固体に処方された。０．０８％Ｔｗｅｅｎ２０中０．８％固体、０．８％タンパク質安定化溶液の処方はチップ上にプリントされ、ＦＳＨカートリッジに組み込まれた。
【０１０９】
およそ５〜１０ｍｇ／ｍＬ（又は０．５〜１％固体）のＦＳＨビーズは、およそ５００ｍＩＵ／ｍＬ  ＦＳＨを含有する試験試料内にスパイク（ｓｐｉｋｅ）され、ピペットを用いて垂直に混合され、直ちにＦＳＨ検出カートリッジの試料入口に注入された。ビーズはカートリッジの試料入口上にプリントし、後で試料がカートリッジ内に導入される際に試料中に溶解させることもできる。
【０１１０】
（例７）：ＬＨビーズ調製
ＬＨポリスチレンビーズは、抗ＦＳＨ  ９５７８４の代わりにＢｉｏｓｐａｃｉｆｉｃ  ＬＨ５３０４抗体が使用される以外は、上の例６と同様に調製された。さらに、上の例６と同じように、これらのビーズを使用してＬＨ検出カートリッジを作製した。
【０１１１】
（例８）：ＦＳＨ磁気ビーズ調製
ＦＳＨ磁気ビーズは以下の通りに調製された。１５ｍｇの０．７０μｍ超常磁性微粒子（１０％重量／容積）（カタログ番号ＭＣ０４、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ、ＵＳＡ）は、５０ｍＭの２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳバッファー、ｐＨ６．２）中３０ｍＭのカルボジイミド（ＥＤＡＣ）と遠心管において１５分間反応させた。この管は磁石上に置かれて、磁石の側に磁気ビーズを引き付け、上澄みは外に吸引した。５０ｍＭのＭＥＳで２回洗浄後、１．２ｍｇの抗ＦＳＨ  ９５７８４（Ａｂｂｏｔｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）は４℃で９０分間ビーズと反応させた。ビーズは磁石を遠心管の横に置くことにより上澄みと分離され、次に上澄みは取り除いた。これに続いて、ペレットを１／５生理リン酸緩衝液で２回洗浄した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液中５％固体で処方された試料はさらに使用するために保存された。
【０１１２】
およそ５〜１０ｍｇ／ｍＬ（又は０．５〜１％固体）のＦＳＨビーズは、およそ５００ｍＩＵ／ｍＬ  ＦＳＨを含有する試験試料内にスパイクされ、ピペットを用いて垂直に混合され、直ちにカートリッジ試料入口に注入された。ビーズはカートリッジの試料入口上にプリントし、後で試料がカートリッジ内に導入される際に試料中に溶解させることもできる。
【０１１３】
（例９）：ＬＨ磁気ビーズ調製
ＬＨ磁気ビーズは、抗ＦＳＨ  ９５７８４の代わりにＢｉｏｓｐａｃｉｆｉｃ  ＬＨ５３０４モノクローナル抗体が使用される以外は、上の例８と同様に調製された。
【０１１４】
（例１０）：ＴＳＨビーズ調製
ＴＳＨ  ５４０９ＡＮＡビーズは以下の通りに調製された。１５ｍｇの０．２μｍカルボキシル化された微粒子（１０％重量／容積）（パーツ番号１３０００５５０１００３９０、Ｓｅｒａｄｙｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）を２５ｍＭの２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳバッファー、ｐＨ６．２）中１．２ｍｇのＴＳＨ  ５４０９ｍＡｂと１５分間反応させ、次に遠心分離して上澄みを取り除いた。２５ｍＭのＭＥＳバッファー中にペレットを再懸濁させた後、１０ｍＭのカルボジイミド（ＥＤＡＣ）を試料に添加し４℃で２時間反応させた。これに続いて、試料を遠心分離し、ペレットを１／５生理リン酸緩衝液で２回洗浄した。タンパク質安定化溶液（カタログ番号Ｑ２０３０５２９Ｐ１、Ｇｗｅｎｔ  Ｇｒｏｕｐ、Ｐｏｎｔｙｐｏｏｌ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を含む１／５生理リン酸緩衝液中３．２％固体で処方された試料は、さらに使用するために保存された。これらのビーズは、ＴＳＨカートリッジを築くのに使用されるチップ上にプリントされた。
【０１１５】
ＴＳＨ基準ビーズ調製は以下の通りであった。この方法は、反応において５４０９ｍＡｂの代わりに抗ＨＳＡ抗体（ＨｙＴａｓｔ  Ｌｔｄ、カタログ４Ｔ２４  Ｍａｂ  １Ｃ８、Ｊｏｕｋａｈａｉｓｅｎｋａｔｕ、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用する以外は５４０９ＡＮＡビーズ方法と同じであった。免疫センサー製造及び操作における基準ビーズの使用は米国特許第７，７３２，０９９号に記載されており、特許文献の全体は参照により本明細書に組み込まれる。ここでは、免疫基準センサーを使用して、免疫センサーへのシグナル抗体の非特異的結合から生じるシグナルを減算する。
【０１１６】
（例１１Ａ）：ＴＳＨシグナル抗体コンジュゲート合成
シグナル抗体コンジュゲート合成の好ましい実施形態は以下の通りである。ＴＳＨ  Ｔ２５Ｃコンジュゲート調製は、ペプシン消化Ｔ２５Ｃ全抗体を使用して、０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ３．５）中３７℃でＴ２５Ｃ  Ｆ（ａｂ）２’を作製した。Ｔ２５Ｃ  Ｆ（ａｂ）２’画分の精製は、Ｓ−３００サイズ排除カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＳＥ−７５１  ８４  Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用することにより実行された。塩酸モノエタノールアミン（ＭＥＡ）を使用して、Ｔ２５Ｃ  Ｆ（ａｂ）２’をＦａｂ−ＳＨに還元し、次にこれをＬＣ−ＳＭＣＣ（サクシニミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］クロロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロン酸］）及び活性化された単分子ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）と４℃で一晩反応させた。次に、サイズ排除カラムを使用して、コンジュゲート画分を精製し、それを１／５生理リン酸緩衝されたタンパク質安定化溶液中に処方した。次に、これはさらに使用するために−８０℃で凍結保存された。
【０１１７】
（例１１Ｂ）：ＬＨ及びＦＳＨシグナル抗体コンジュゲート合成
ＦＳＨ及びＬＨ実験では、アルファサブユニットを認識する４１４Ｂ抗体は上の例１１Ａに記載されるＴ２５Ｃで置き換えられた。この抗体は検出抗体としてスカベンジャービーズ実験のために使用された。
【０１１８】
（例１２）：スカベンジャー又は犠牲ビーズ
スカベンジャービーズアプローチの有用性は図９〜図１１に示されている。図９に示されるように、ポリスチレンビーズを使用すると、ＦＳＨ干渉は１００％を超える交差反応性から１５％未満に著しく減少した。図９は、ＦＳＨビーズ（例６）がＦＳＨ検出カートリッジに組み込まれている実験である。試料は極度に高濃度（５００ｍＩＵ／ｍＬ）のＦＳＨを含有している。ＦＳＨスカベンジャービーズを添加していないシグナルは１００％の値を割り当てられた。ＦＳＨスカベンジャービーズを添加後、シグナルは１５％まで減少した。
【０１１９】
図１０は、例７からのＬＨスカベンジャービーズの影響に焦点を合わせている。例７及び１１Ｂに記載される抗体組合せＬＨ捕捉と４１４Ｂでは、ＬＨ交差反応性はスカベンジャービーズなしでは１００％であり、アッセイサイクルにスカベンジャービーズを添加すると干渉は４％まで減少する。
【０１２０】
前述の例では、ＬＨ抗体はモノクローナル抗体ムス属ベータＬＨ、カタログ番号５３０４  ＳＰ−５であった。およそ０．５ｍｇ／ｍＬのビーズが使用された。ＦＳＨ  ｍＡｂは抗ＦＳＨ  ９５７８４  ＳＰ−５であった。下の表１３は、本発明のこの実施形態に従ってスカベンジャービーズとして用いてもよい様々な市販の物質に関する追加の情報を提供している。
【表１３】
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【０１２１】
図１１は、磁気ビーズを用いることにより、ＦＳＨ交差反応性が約１００％から１０％未満まで著しく減少することが示されている。この実験では、ＦＳＨポリスチレン捕捉ビーズを含有するＦＳＨ検出カートリッジが構築され（例６）、図８に示されるように、ニッケル被覆（Ｎｄ２Ｆｅ４Ｂ）永久磁石がカートリッジに組み込まれた。その上、超常磁性ＦＳＨスカベンジャービーズ（例８）は試料吸気口上にプリントされた（図５、試料入口）。これらのコンポーネント変更を用いて、カートリッジは、標準手順のように構築された。実験は、５００ｍＩＵ／ｍＬのＦＳＨをスパイクされた、およそ２０μＬのＡｂｂｏｔｔ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ  ０  ＴＳＨカリブレーター（Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）試料を添加することにより実施された。
【０１２２】
分析者は、カートリッジを用いてアッセイにおけるステップを実施し、アッセイにおいて発生し得られた電流は、スカベンジャービーズなしのカートリッジ試験について１００％に変換され、スカベンジャービーズがカートリッジにプリントされている試料はスカベンジャービーズなしの結果に基づいて計算され、シグナルの著しい減少が示され、スカベンジャービーズがアッセイにおいてバックグランドを減少させる能力が確かめられた。
【０１２３】
（例１３）：代替モノクローナル抗体を求めるためのスクリーニング
別の実施形態として、１１の抗体調製物が、Ｔ２５Ｃ及び／又は５４０９抗体の潜在的代替物としてＡｂｂｏｔｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（ＡＤＤ）のＴＳＨ抗体細胞系のストックから得られた。Ｔ２５Ｃ及び／又は５４０９抗体に取って代わる潜在的代替モノクローナル抗体を求めるためのスクリーニングアプローチは、同じエピトープが特徴付けられていない抗体で見つかるのであれば、それらはＴ２５Ｃ及び／又は５４０９抗体に類似する特性を潜在的に有するはずであるという仮説に基づいていた。
【表１４】
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【０１２４】
およそ０．１μｇのＡＤＤ  ＴＳＨ全ｍＡｂ候補は３９ｍＩＵ／Ｌ  ＴＳＨ試料と一緒にスパイクされ、よく混合され、捕捉抗体として５４０９を、且つ標識抗体としてＴ２５Ｃを用いるｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）免疫アッセイカートリッジで試験された。２つの抗体クローン、１０−５１８−３０８及び１０−１１７９−４５（表１４）は検出シグナルの著しい減少を示し、これらのクローンが５４０９又はＴ２５Ｃ抗体のどちらかと競合していることが示された。
【０１２５】
抗体クローン１０−５１８−３０８及び１０−１１７９−４５が５４０９及び／又はＴ２５Ｃの潜在的代替物として同定されると、次の試験ステップはこれらのモノクローナル抗体からビーズとコンジュゲートとを作製し、それらが使用可能なサンドイッチ（適合性抗体エピトープ対）を形成するかどうかを判定し、ＴＳＨについて良好なシグナルを、ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧに対して良好な選択性を示すかどうかを判定することであった。
【０１２６】
ＡＤＤ  ＴＳＨ抗体１０−５１８−３０８はＡＮＡビーズにされ、センサーの上にプリントされ、コンジュゲートなしのカートリッジに組み込まれた。ＡＤＤ  ＴＳＨ  １０−１１７９−４５はＦ（ａｂ）２’に消化され、Ｆａｂ断片にされ、さらにＡＬＰとコンジュゲートされてカートリッジ検査のためのコンジュゲートを形成した。５４０９  ＡＮＡ及びＴ２５Ｃコンジュゲートは性能比較のために対照として使用された。評価における以下のステップのためには４つのカートリッジ組合せが存在する。
【表１５】
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【０１２７】
これら４つのサブロットのカートリッジ（表１５）は、感度及び線形評価のために、０．１、０．４、０．６、１、８、４５、８８ｍＩＵ／Ｌレベルで裸のＴＳＨプラズマを含む一連のＴＳＨ自社製対照に対して試験された。これらのカートリッジは、交差反応性評価のために０．４ｍＩＵ／Ｌ  ＴＳＨ試料中５００ｍＩＵ／ｍｌでスパイクされたＬＨ、ＦＳＨ及び２０００００ｍＩＵ／ｍＬでスパイクされたＣＧに対しても試験された。
【０１２８】
上の試験に基づいて、ＴＳＨ抗体クローン１０−１１７９−４５６は、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｔ２５Ｃ抗体に取って代わって抗体Ｂｉｏｓｐａｃｉｆｉｃ５４０９と対を形成する潜在的候補であることが確かめられた。なぜならば、この組合せはＴＳＨに類似するシグナル応答、並びにＴ２５Ｃ／５４０９組合せと比べてＬＨ、ＦＳＨ及びＣＧ交差反応物と１０％未満の交差反応性を有するからである。
【０１２９】
本発明は様々な好ましい実施形態の点から説明されてきたが、当業者であれば、本発明の精神から逸脱することなく様々な修正、置換、省略及び変更を加えることができることは認識されるであろう。したがって、本発明の範囲は以下の特許請求の範囲のみによって限定されることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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