(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むヤエヤマヒメボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ  ｙａｙｅｙａｍａｎａ）に由来する変異型ルシフェラーゼ。
【請求項２】
請求項１に記載のルシフェラーゼをコードする塩基配列を含むことを特徴とする核酸。
【請求項３】
配列番号１１に示される塩基配列を含むことを特徴とする請求項２に記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はホタル由来ルシフェラーゼの変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内のシグナル伝達および遺伝子発現といった細胞の機能を調べるためには、蛍光色素および蛍光タンパク質といった蛍光プローブ並びにルシフェリン・ルシフェラーゼ反応を利用する化学発光プローブが用いられている。特に遺伝子の発現調節の解析には、励起光による細胞のダメージが生じず且つ自家発光の問題が生じない、定量性に優れた発光計測が用いられる。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子が導入された細胞を観察する場合、ルシフェラーゼ活性に因る細胞からの発光強度を測定することで、ルシフェラーゼ遺伝子の発現の強さ（具体的には発現量）を調べることができる。具体的には、最初に細胞を溶解して細胞溶解液を作製し、その後この細胞溶解液にルシフェリンおよびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）等を添加し、光電子増倍管を用いたルミノメーターで発光強度を定量し、その結果に基づいて発現量を特定する。この方法では、発光強度の測定は細胞を溶解した後に行われる。このため、ある時点でのルシフェラーゼ遺伝子の発現量は、測定に使用した全細胞の平均値として得られる。ルシフェラーゼ遺伝子等の発光遺伝子をレポーター遺伝子として導入する方法として、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクチン法またはエレクトロポレーション法等を使用でき、各方法は目的および細胞の種類の違いに応じて使い分けられている。細胞に導入するルシフェラーゼ遺伝子の上流または下流に目的のＤＮＡ断片を繋ぎ、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を測定することで、当該ＤＮＡ断片がルシフェラーゼ遺伝子の転写に及ぼす影響を調べることが可能となる。また、細胞に導入するルシフェラーゼ遺伝子と目的の遺伝子とを共発現させることで、当該遺伝子産物がルシフェラーゼ遺伝子の発現に及ぼす影響を調べることが可能となる。
【０００３】
時間経過に沿って発光遺伝子の発現量を分析するには、生きた細胞からの発光強度を経時的に測定する必要がある。このような測定は、ルミノメーターを備えたインキュベーターにて細胞を培養し、細胞集団全体からの発光強度を一定時間ごとに測定することで行われる。細胞集団全体における発光遺伝子の発現量の経時的な変化を捉えることにより、一定の周期性をもった発現リズム等を分析することができる。
【０００４】
近年、生物学および医学の研究において、生命現象を分子レベルで動的に捉える必要性が高まってきている。蛍光観察を利用する研究分野では、試料内のタンパク質分子機能を動的に捉えるために、タイムラプスまたは動画撮像が行われている。従来技術では、蛍光試料を用いた経時的観察（例えば、蛍光分子を付したタンパク質１分子の動画観察）が行われている。
【０００５】
一方、経時的観察のために化学発光試料を用いる場合、化学発光試料の発光強度は極めて小さいため、イメージ・インテンシファイアを装着したＣＣＤカメラを用いて観察する必要がある。また最近では、化学発光試料を観察するための光学系を有した顕微鏡も開発されている（特許文献１および２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−３０１５９９号公報
【特許文献２】国際公開第０６／０８８１０９号
【特許文献３】特開２００９−５４５４３６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ルシフェリンを発光させる新規ルシフェラーゼを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様に係るルシフェラーゼは、ヤエヤマヒメボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ  ｙａｙｅｙａｍａｎａ）に由来する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ヤエヤマヒメボタル由来の変異型ルシフェラーゼが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ｄ−ルシフェリンを基質として用いた場合に野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼにより誘起された発光の各ｐＨにおける発光スペクトルを示す図である。
【図２】Ｄ−ルシフェリンを基質として用いた場合に各種ルシフェラーゼにより誘起された発光の発光強度を比較した図である。
【図３】Ｄ−ルシフェリンを基質として用いた場合に各種ルシフェラーゼにより誘起された発光の発光スペクトルを示した図である。
【図４】近赤外発光ルシフェリンアナログを基質として用いた場合に各種ルシフェラーゼにより誘起された発光の発光強度を比較した図である。
【図５】近赤外発光ルシフェリンアナログを基質として用いた場合に各種ルシフェラーゼにより誘起された発光の発光スペクトルを示した図である。
【図６】近赤外発光ルシフェリンアナログを基質として用いた場合にＣＢＲルシフェラーゼ（Ｃｌｉｃｋ Ｂｅｅｔｌｅ Ｒｅｄ（ＣＢＲ） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）により誘起された発光の発光スペクトルを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の実施形態は、ヤエヤマヒメボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ  ｙａｙｅｙａｍａｎａ）に由来する変異型ルシフェラーゼに関する。
【００１２】
「ルシフェラーゼ」とは、一般に、発光が生じる化学反応を触媒する酵素を指す。当該酵素の基質となる物質はルシフェリンと呼ばれる。ＡＴＰの存在下、ルシフェラーゼの触媒作用により、ルシフェリンが化学変化を起こす際に発光する。現在、ルシフェラーゼは、ホタルに由来するものおよびバクテリアに由来するものが取得されている。実施形態に係るルシフェラーゼも、上述の通り定義されるルシフェラーゼと同義であるが、後述するホタルから初めて取得された新規のルシフェラーゼである。実施形態に関してルシフェリンとは、ホタルルシフェラーゼの基質となるルシフェリンおよびそのアナログを意味する。ルシフェリンアナログは、例えば、ＷＯ２００９／０９６１９７及びＷＯ２０１０／１０６８９６に基質として記載された物質である。具体的には、例えば、ジメチルアニリン−モノエン型ルシフェリン、ジメチルアニリン−ジエン型ルシフェリン、ジメチルアニリン型ルシフェリン、これらの誘導体及びＤ−ルシフェリンの誘導体である。
【００１３】
実施形態に係るルシフェラーゼは、ヤエヤマヒメボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ  ｙａｙｅｙａｍａｎａ）に由来する変異型ルシフェラーゼである。ヤエヤマヒメボタルとは節足動物門昆虫綱コウチュウ目ホタル科ホタル属に属すホタルである。この明細書および特許請求の範囲では、ヤエヤマヒメボタルから得られた変異型ルシフェラーゼを、変異型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ、変異型ヤエヤマヒメボタル由来ルシフェラーゼ、変異型ルシフェラーゼ、変異型等と称する。
【００１４】
また、ここにおいて、ヤエヤマヒメボタルから得られたルシフェラーゼであって何ら変異処理を受けていないものを、野性型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ、野性型ヤエヤマヒメボタル由来ルシフェラーゼ、野性型ルシフェラーゼ、野性型等と称する。図１は、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼを用いた場合に得られたルシフェリンの発光スペクトルを示している。この図に示されるとおり、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼにより誘起された発光の最大発光波長は、ｐＨ８．０、ｐＨ７．５、ｐＨ７．０、ｐＨ６．５、ｐＨ６．０およびｐＨ５．５において、それぞれ、約５７４ｎｍ、約５７４ｎｍ、約５８２ｎｍ、約６０５ｎｍ、約６１４ｎｍおよび約６１６nmであり、ｐＨが下がるほど最大発光波長が長くなる傾向がみられる。ここで、「最大発光波長」とは、ルシフェラーゼが誘起するルシフェリンの発光を測定することによって得られるスペクトルにおいて、発光強度が最大となる波長を意味する。
【００１５】
変異型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼを得るための変異とは、発光反応に関する性質を向上させる変異であってよい。例えば、発光強度を高める変異であってよい。
【００１６】
発光強度が低い化学発光試料を顕微鏡により撮像する場合、鮮明な画像を撮影するために必要な露出時間は長くなる。このような化学発光試料は、使用できる研究用途が制限される。例えば、発光強度の低さのために３０分間の露出時間が必要となる場合、３０分間の経時的撮影は可能であっても、より短い時間での撮影、さらにはリアルタイムでの撮影は不可能である。また、画像の取得に当って、発光する細胞に焦点を合わせるために複数枚の画像を取得し比較する必要があるが、発光強度の低さのために長い露出時間を必要とする場合、１枚の画像を取得するだけでも手間と時間を要することになる。
【００１７】
実施形態に係る変異型ルシフェラーゼは、既知のルシフェラーゼと比較して高い発光強度を有する発光を誘起し得る。従って、実施形態に係るルシフェラーゼは、タンパク質のイメージングのためのレポーターとして利用する場合に特に有利な効果を奏する。すなわち、かかる好ましい実施形態に係るルシフェラーゼは、少量でも高い発光強度を提供できるため、発現量が低いタンパク質の良好な検出を可能とする。また、かかる好ましい実施形態に係るルシフェラーゼは、得られる発光強度が高いことにより検出に必要な露出時間を短縮できる。このため、かかる好ましい実施形態に係るルシフェラーゼを経時的観察のためのレポーターとして利用すれば、撮影に必要な露出時間を短くすることが可能となり、よりリアルタイムに近い観察が可能となる。すなわち、時間分解能が高い経時的観察が可能となる。
【００１８】
実施形態に係る変異型ルシフェラーゼは、例えば、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓに由来するルシフェラーゼによる発光強度の１．２倍以上、１．５倍以上、２．０倍以上、２．５倍以上、３．０倍以上、３．５倍以上または４．０倍以上の発光強度を示し得る。また、実施形態に係るルシフェラーゼは、例えば、コメツキムシ由来の赤色ルシフェラーゼ（ＣＢＲルシフェラーゼ）による発光強度の２．０倍以上、３．０倍以上、４．０倍以上、５．０倍以上、６．０倍以上、７．０倍以上、８．０倍以上、９．０倍以上または１０倍以上の発光強度を示し得る。
【００１９】
さらに、実施形態に係るルシフェラーゼは、例えば、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼによる発光強度の１．２倍以上、１．５倍以上、２．０倍以上、２．５倍以上、３．０倍以上、３．５倍以上または４．０倍以上の発光強度を示し得る。
【００２０】
発光反応に関する性質を向上させる変異とは、さらに、例えば、最適ｐＨを変更する変異、最適温度を変更する変異、分解安定性を向上させる変異等であってよい。
【００２１】
変異の別の例は、発光スペクトルの最大発光波長がシフトする変異である。このような変異型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼを発光反応の酵素として用いた場合、野生型を用いた場合と比較して、最大発光波長がシフトした発光スペクトルが得られる。図１に示されるとおり、ｐＨ７．０の環境下において野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼを用いた場合、最大発光波長が５７４ｎｍ付近となる発光が生じるが、このような変異によって、最大発光波長が長波長側または短波長側にシフトする。このような変異を有する変異型ルシフェラーゼにおいて、最大発光波長のシフトは、発光反応におけるｐＨ条件を特定のｐＨにした場合にのみ生じてもよい。例えば、ｐＨ６．５未満の範囲およびｐＨ７．０を超える範囲ではシフトが生じないものの、ｐＨ６．５からｐＨ７．０の範囲においてシフトが生じてよい。この変異型ルシフェラーゼを野生型ルシフェラーゼまたはその他の変異型ルシフェラーゼとともに細胞内に発現させた場合、これらのルシフェラーゼを、最大発光波長の差異に基づいて区別することができる。したがって、マーカーとしてこれらのルシフェラーゼを利用する研究において、最大発光波長がシフトした変異型ルシフェラーゼを使用することで、マーカーの選択肢を増やすことができる。
【００２２】
先述の変異は、最大発光波長のシフトにより発光色の変化を生じさせるものであってもよい。例えば、変異により、発光反応の発光色は緑色から赤色へと変化する。
このような変異型ルシフェラーゼを使用した発光反応の観察により、細胞内の機能をより詳細に調べることが可能になる。例えば、野生型ルシフェラーゼと変異型ルシフェラーゼとを、それぞれ、異なる２つのタンパク質に融合させて同一細胞内で発現させ、発光色の差に基づき、その細胞内のそれぞれのタンパク質の挙動を識別することができる。この場合、発光色の異なる発光反応は、１種類の基質のみを使用することによって達成することができ、実験上の簡便さの点で有利である。また、異なる細胞内で目的のタンパク質を発現させ、それぞれの細胞において異なる発光色を示す発光を誘起する場合においても、使用する基質は１種類のみでよいことから、さらに、コストの観点からも有利である。
【００２３】
実施形態に係るルシフェラーゼによれば、発光観察に使用される基質と酵素とを様々に組み合わせることにより発光観察の適用範囲が拡大されることが期待される。具体的には、ルシフェリンとルシフェラーゼとの組合せを選択することにより、異なる発光波長及び／又は発光色を有する複数の発光を得て、発光波長及び／又は発光色の相違を利用して、細胞内の現象を観察することができる。このような新規のルシフェラーゼが提供されることにより、細胞の機能解析に利用される発光反応の酵素の選択肢を増やし、これにより酵素と基質との組合せのバリエーションを増やすことができる。
【００２４】
また、変異型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼを得るための変異とは、ルシフェラーゼの性質に変化を与えない変異であってよい。例えば、発光反応に対する寄与率の高い配列またはドメインにおいては変化がなく、発光反応に対する寄与率の低い配列またはドメインについて変化が生じる変異であってよい。具体的には、例えば、発光反応にあまり関与しない部位を削る変異、そのような部位に特定の配列を挿入する変異、末端に特定の配列を付加する変異等であってよい。
【００２５】
さらに、変異型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼを得るための変異とは、ルシフェラーゼとしての発光活性以外の性質を変化させる変異であってよい。例えば、実験的な操作性を向上させる変異であってよい。具体的には、例えば、野生型ルシフェラーゼが哺乳細胞内において低い可溶性を示す場合にその可溶性を高める変異であってよい。
【００２６】
上記のような発光強度を高める変異、最大発光波長がシフトする変異および発光強度の温度依存性が変化する変異は、任意の組み合わせで同時に導入することができ、または互いに独立して導入することができる。
【００２７】
実施形態に係るルシフェラーゼの一例は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むルシフェラーゼである。当該ルシフェラーゼは、ヤエヤマヒメボタルから得られた野生型のルシフェラーゼの変異体である。この変異体は、配列番号１に記載される野性型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列上の２８３番目のセリンに対応するアミノ酸残基が、アラニンによって置換されている。この変異型ルシフェラーゼをコードする核酸は、例えば、配列番号１１に示される塩基配列を有する核酸である。配列番号１１に示される塩基配列は、野生型ルシフェラーゼをコードする配列番号２の塩基配列に対して、後述のような哺乳細胞における発現に対するコドン最適化を施し、更に、対応するアミノ酸配列上で上述の置換が生じるような変異を入れたものである。
【００２８】
配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する変異型ルシフェラーゼは、野生型ルシフェラーゼと比較して、特定のｐＨにおいて最大発光波長のシフトが生じている。このように発光スペクトルに最大発光波長のシフトを生ずる変異型ルシフェラーゼは、当該ルシフェラーゼが触媒する発光反応において、例えば、赤色の発光を生ずる。発光反応において赤色の発光を生ずる変異型ルシフェラーゼを以降、「赤色変異型ルシフェラーゼ」、「赤色ルシフェラーゼ」、「赤色変異型」または「赤色変異体」という。
【００２９】
図２には、基質としてＤ−ルシフェリンを用いた場合におけるHeLa細胞中での野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼとその変異型ルシフェラーゼ、Ｐ．ピラリスルシフェラーゼ（プロメガ社、Ｌｕｃ２ルシフェラーゼ）およびコメツキ由来の赤色発光ルシフェラーゼ（プロメガ社、ＣＢＲルシフェラーゼ）によるルシフェリンの発光強度を比較したグラフが示されている。ここでは、Ｐ．ピラリスルシフェラーゼ（プロメガ社、Ｌｕｃ２ルシフェラーゼ）による発光強度を１としたときの相対的な値が示されている。この図から、特定の哺乳細胞内での測定条件下において、赤色変異型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼは、Ｐ．ピラリスルシフェラーゼにより達成される発光強度の３．２０倍、ＣＢＲルシフェラーゼにより達成される発光強度の９．７０倍の発光強度を達成していることがわかる。また、野生型ルシフェラーゼにより達成される発光強度の２．０６倍の発光強度を達成していることがわかる。なお、図２においては、基質として、D−ルシフェリンを使用した場合の発光強度について示したが、実施形態に係るルシフェラーゼを用いた発光反応においては、これ以外の他の基質を使用することもできる。例えば、ＷＯ２００９／０９６１９７及びＷＯ２０１０／１０６８９６に記載されている基質を使用することができる。当該基質は、例えば、ジメチルアニリン−モノエン型ルシフェリン、ジメチルアニリン型ルシフェリン、これらの誘導体、ジメチルアニリン−ジエン型ルシフェリンの誘導体及びＤ−ルシフェリンの誘導体である。
【００３０】
また、図３には、Ｄ−ルシフェリンを基質として使用した場合にこれら３種のルシフェラーゼの各々により誘起された発光の発光スペクトルが示されている。ヤエヤマヒメボタル赤色変異型ルシフェラーゼは、HeLa細胞内において、最大発光波長を野生型の６０７ｎｍから６１３ｎｍにシフトさせることができる。長い波長を有する光は、生体内での透過性がより優れている。そのため、この変異型ルシフェラーゼを用いることにより、組織、胚および個体を測定の対象とする場合のように、ルシフェリンから光の検出手段までの間に遮蔽物が多く介在する場合であっても、発光強度の低下を抑えて発光を検出することができる。なお、ＣＢＲルシフェラーゼの最大発光波長は６２０nmである。
【００３１】
図４は、近赤外ルシフェリンアナログであるジメチルアニリン−ジエン型ルシフェリン（具体的には、アカルミネ（登録商標）、和光純薬社製）を基質として使用した場合においてこれら３種のルシフェラーゼおよびＰ．ピラリスルシフェラーゼの各々が誘起する発光の発光強度を示す。この図において、ヤエヤマヒメボタルの赤色変異体による発光の発光強度は、Ｐ．ピラリスルシフェラーゼの約３．８倍、ＣＢＲルシフェラーゼの約９．７倍である。このように、特定の実施形態に係るルシフェラーゼを用いた場合、従来の赤色ルシフェラーゼであるＣＢＲルシフェラーゼを用いた場合と比較して、より高い発光強度を達成できる。なお、図４において、基質として、ジメチルアニリン−ジエン型ルシフェリンを使用した場合の発光強度について示したが、実施形態に係るルシフェラーゼを用いた発光反応においては、これ以外の他の基質を使用することもできる。例えば、ＷＯ２００９／０９６１９７及びＷＯ２０１０／１０６８９６に記載されている基質を使用することができる。当該基質は、例えば、ジメチルアニリン−モノエン型ルシフェリン、ジメチルアニリン型ルシフェリン、これらの誘導体、ジメチルアニリン−ジエン型ルシフェリンの誘導体及びＤ−ルシフェリンの誘導体である。
【００３２】
上記の変異は、配列番号１とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質に対しても導入することができる。例えば、そのようなタンパク質のアミノ酸配列と配列番号１との対応関係を考慮して変異を導入することができる。たとえば、そのようなタンパク質にＳ２８６Ａ変異を導入したい場合、配列番号１と導入の対象とするタンパク質の配列とを比較して、配列番号１に示されるアミノ酸配列の２８６番目のＳに対応するアミノ酸残基を決定し、当該アミノ酸をＡに置換することでＳ２８６Ａ変異を導入することができる。ここにおいて「対応するアミノ酸残基」は、例えば相同性検索といった公知の技術を利用して決定することができる。
【００３３】
また、実施形態は、赤色変異体に対して更なる変異を導入した変異型ルシフェラーゼも含む。例えば、赤色変異体に対して、さらなる発光強度の向上を目的として、さらなる変異を導入した変異型ルシフェラーゼを含む。あるいは、赤色変異体に対して、発光強度の向上とは別の目的、例えば、可溶性の向上、分解に対する耐性の向上等を目的として、さらなる変異を導入した変異型ルシフェラーゼを含む。具体的には、実施形態は、赤色変異体のアミノ酸配列（配列番号１０）との間で一定の相同性を示すアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼと比較して、より高い強度でルシフェリンを発光させる変異型ルシフェラーゼを含む。
【００３４】
実施形態に係る変異型ルシフェラーゼのその他の例は、実験的な操作性を向上させる変異が導入された変異型ルシフェラーゼである。たとえば、野生型ルシフェラーゼが哺乳細胞内において低い可溶性を示す場合、実施形態に係る変異型ルシフェラーゼは、その可溶性を高める変異が導入されたルシフェラーゼである。
【００３５】
変異型ルシフェラーゼとは、野性型ルシフェラーゼの特徴、すなわちルシフェラーゼ活性が得られる限りにおいて（好ましくは従来のルシフェラーゼと比較して高い発光強度が得られる限りにおいて）、ルシフェラーゼのアミノ酸配列に任意の変異、例えば、アミノ酸の置換、欠失および／または付加等が生じたルシフェラーゼであってよい。この変異とは、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列の１以上のアミノ酸の変異または１から数個のアミノ酸の変異であり、好ましくは、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列の１から２０のアミノ酸の変異、より好ましくは１から１５のアミノ酸の変異、より好ましくは１から１０のアミノ酸の変異、より好ましくは１から５のアミノ酸の変異、より好ましくは１から４のアミノ酸の変異、より好ましくは１から３のアミノ酸の変異、より好ましくは１または２のアミノ酸の変異である。好ましくは、当該変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列は、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列との間で７５％以上、８０％以上、８５%以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相同性を有する。
【００３６】
本発明の他の実施形態は、上記実施形態に係るルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸に関する。すなわち、当該核酸は、ヤエヤマヒメボタルに由来するルシフェラーゼ遺伝子を含む核酸である。実施形態において、核酸とは、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを指す。また、実施形態において、ルシフェラーゼの「遺伝子」とは、主として、ｍＲＮＡに転写される領域、すなわち構造遺伝子を意味する。
【００３７】
実施形態に係るルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸の例は、配列番号１１に示される塩基配列を含む核酸である。配列番号１１の配列を有する遺伝子は赤色変異体をコードする。配列番号１１は、配列番号２に記載するヤエヤマヒメボタルからクローニングされた野生型の塩基配列に対して変異を導入することで得られる配列である。この配列を有する遺伝子は、ヤエヤマヒメボタルからクローニングされた塩基配列に変異を加えたものであり、変異型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ（配列番号１０）をコードする。
【００３８】
実施形態に係る核酸は、野生型ルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列において変異が生じた変異型ルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を含む核酸である。ここにおいて、変異型ルシフェラーゼ遺伝子とは、コードされたルシフェラーゼが、野性型ルシフェラーゼの特徴、すなわちルシフェラーゼ活性が得られる限りにおいて（好ましくは従来のルシフェラーゼと比較して高い発光強度が得られる限りにおいて）、塩基配列中の特定の塩基、たとえば数個の塩基の置換、欠失および／または付加等を受けた遺伝子であってよい。また、塩基配列の変異には、コードされるアミノ酸配列に変化が生じない変異が含まれる。
【００３９】
そのようなコードされるアミノ酸配列に変化が生じない変異の一例は、遺伝子中に存在する特定の制限酵素の認識配列を無効にする変異である。この変異によって、遺伝子を含む核酸は当該制限酵素によって切断されなくなるものの、当該遺伝子は変異前と同じアミノ酸をコードできる。このような変異は、制限酵素の認識配列を構成するコドンを、異なる塩基配列の同義コドンに変換することで達成できる。このような変異は、遺伝子組み換えに使用する制限酵素の認識配列が当該遺伝子中に存在する場合に有用である。この場合、予め遺伝子中の認識配列を無効にしておくことで、制限酵素で処理した場合に遺伝子を含む核酸が断片化することを防ぐことができ、結果として組み換えが容易になる。特定の制限酵素の認識配列を無効にした例は、配列番号１２に示される塩基配列である。当該塩基配列は、ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号１１）からＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの認識配列を無効にしたものである。
【００４０】
そのようなコードされるアミノ酸配列に変化が生じない変異の別の例は、遺伝子のコドンを特定の生物種における発現に最適化させる変異である。ここにいう「最適化」とは、核酸に含まれる遺伝子のコドンを、特定の生物種においてコドン出現頻度が高いコドンに代えることを意味する。最適化を行った場合、特定の生物種における遺伝子の発現は、最適化をしない場合に比べて高まる。実施形態に係るルシフェラーゼ遺伝子はホタルから取得されたものであるため、当該遺伝子を導入しようとする生物種が分類学的にホタルから遠い程、最適化の効果はより高いと考えられる。実施形態において特定の生物種とは、例えば細菌細胞、酵母細胞および哺乳細胞である。更に哺乳細胞は、例えばマウスの細胞、サルの細胞およびヒトの細胞である。
【００４１】
実施形態に係るコドンが最適化されたルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸の一例は、配列番号１４に示される塩基配列を含む核酸である。当該核酸は、ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号１１）のＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの認識配列を無効にし、且つ哺乳細胞における発現にコドンを最適化することにより得られた核酸である。なお、コドンが最適化されたルシフェラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１３に示される。
【００４２】
実施形態に係る核酸は、Ｋｏｚａｋ配列が付与されたルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を含む核酸を含む。Ｋｏｚａｋ配列とは、開始コドンとその前後の複数の塩基配列から成る配列であり、Ｋｏｚａｋ配列が存在することで、その遺伝子の発現量が増大することがわかっている。Ｋｏｚａｋ配列は、生物種または生物群ごとに共通配列が見出されている。実施形態に係るＫｏｚａｋ配列を含む核酸は、それを導入する生物種に対応したＫｏｚａｋ配列を有する。例えば哺乳細胞に導入される場合、核酸は、Ｋｏｚａｋ配列としてｇｃｃｒｃｃａｔｇｇ（配列番号６）（ｒはグアニンまたはアデニンを意味する）の配列を含む。Ｋｏｚａｋ配列を付与するルシフェラーゼ遺伝子は、野生型遺伝子であってもよいが、上述のようなコドンの最適化を行った変異型遺伝子であってもよい。
【００４３】
本発明のさらに他の実施形態はこれらの核酸を含むベクターに関する。当該ベクターには、ルシフェラーゼをコードする核酸以外に、プロモーター配列や発現を調節するための配列およびマーカー遺伝子の配列を含む核酸等を含んでよい。
【００４４】
本発明のさらに他の実施形態は、先述のベクターを含んだキットに関する。このキットは、２種類以上のベクターを含んでいてもよく、そのうちの少なくとも１つは、実施形態に係るベクターである。好ましくは、２種類以上のベクターは、それぞれ、ルシフェラーゼをコードする塩基配列を含んでおり、これらのルシフェラーゼは、各々、異なる発光色及び／又は発光波長を示す発光反応を触媒する。このようなキットを使用することによって、例えば、発光色及び／又は発光波長の相違に基づき、複数のタンパク質の挙動を同時に観察することができる。
【００４５】
また、本発明のさらに他の実施形態は発光プローブに関する。当該発光プローブは、野生型のルシフェラーゼを含むものでもよいが、変異型ルシフェラーゼを含むものでもよい。特に、公知の技術によって、発光プローブとしての利用に適した改変を加えたものが好ましい。さらに実施形態は、上記発光プローブを用いた種々の試料（インビボ、インビトロ）に関する種々の使用（イメージング、測光等）に有効に適用できる。
【００４６】
本発明のさらに他の実施形態は、実施形態に係るルシフェラーゼを利用して細胞内の機能を解析する方法に関する。当該方法は、実施形態に係るルシフェラーゼを細胞内に導入する工程、および前記ルシフェラーゼが誘起するルシフェリンの発光をイメージング装置により検出する工程を含む。例えば、ＤＮＡ中の特定の発現調節領域の下流に実施形態に係るルシフェラーゼ遺伝子を導入し、ルシフェラーゼの発現を、それが誘起するルシフェリンの発光の有無によって検出することで、発現調節領域の機能を調べることが可能である。
【００４７】
本発明のさらに他の実施形態は、上記実施形態に係るルシフェラーゼを利用して細胞内タンパク質を解析する方法に関する。当該方法は、実施形態に係るルシフェラーゼと解析の対象とするタンパク質とから成る融合タンパク質を細胞内に導入する工程；および、前記ルシフェラーゼが誘起するルシフェリンの発光をイメージング装置により検出する工程を含む。
【００４８】
当該方法は、解析の対象とするタンパク質の細胞内の局在の観察、および、その局在の時間変化の観察（タイムラプス）を含む。また、当該方法は、タンパク質の局在だけでなく、そのタンパク質が単に発現したか否かの確認をも含む。使用される細胞に特別な限定はなく、細胞のイメージングの分野において通常使用できる細胞であってよい。また、解析の対象とするタンパク質も特別に限定はなく、研究の目的に応じたタンパク質を選択することができる。当該タンパク質は、使用する細胞内に本来存在するタンパクであってよく、または細胞内に本来存在しない異種性のまたは改変したタンパク質であってよい。
【００４９】
融合タンパク質を細胞内に導入する場合、既知の導入方法を使用することができる。１つの方法は、細胞外で精製した融合タンパク質を細胞内に直接導入する方法である。例えば、マイクロインジェクション法によって融合タンパク質を細胞内に直接注入することができる。または、融合タンパク質を含む培養液にて細胞をインキュベートさせて、エンドサイトーシスによって融合タンパク質を細胞に取り込ませることができる。また別の方法は、まず融合タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を導入し、その後細胞内で融合タンパク質を発現させる方法である。例えば、当該核酸を含む発現ベクターを、リン酸カルシウム法、リポフェクション法またはエレクトロポレーション法等によって細胞内に導入し、発現ベクターから融合タンパク質を発現させることができる。ここにおいて、融合タンパク質の遺伝子は、実施形態に係るルシフェラーゼ遺伝子と解析の対象とするタンパク質の遺伝子とを含む遺伝子であり、ここにおいて、ルシフェラーゼ遺伝子とタンパク質遺伝子とは、それぞれ正常に翻訳されるよう連結されている。
【００５０】
ルシフェリンの発光をイメージング装置により検出する工程は、既知の検出方法を使用することができる。例えば、ルシフェラーゼを含む融合タンパク質を発現する細胞に、ルシフェリン、ＡＴＰおよびＭｇ２＋イオン等を適宜与えてルシフェラーゼにルシフェリンの発光反応を誘起させ、発生した発光をイメージング装置により検出することができる。イメージング装置とは、例えば発光を捉えるためのフィルターを備えた顕微鏡である。顕微鏡を使用することで、細胞内における発光の位置を特定して、この情報をもとにタンパク質の局在を特定することが可能となる。また、イメージング装置として、経時的に撮像できる機能を備えた顕微鏡を使用することができ、この顕微鏡によって経時的観察も可能となる。
【実施例】
【００５１】
上記特開２００９−５４５４３６号公報に開示された野性型ヤエヤマボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号２）は、以下の通りである。
ATGGAAATGGAAAAGGAAGAGAATGTTGTGTATGGCCCTCAGCCATTCTACCCCATTGAAGCAGGATCCGCAGGAATACAGTTACATAAGTACATGCATCAATATGCACAACTTGGAGCAATCGCTTTTAGTAATGCTCTTACCGGAGTTGATATTTCTTACCAAGAATACTTTGATATAACGTGCCGTCTAGCTGAGGCCATGAAAAATTATGGTATGACGCAGGAAGGACGTATTGCTTTGTGCAGTGAAAATTGTGAAGAATTCTTTATTCCTGTGGTTGCTGGTCTTTACATCGGGGTAGGTGTTGCACCTACTAATGAAATCTACACTCTCCGTGAATTAAATCACAGTTTGGGTATCGCAGAACCGACTATTGTATTCAGCTCCAGAAAAGGCTTACCGAAAGTTCTGGAAGTACAAAAAAATGTTACATGTATCAAAACAATTGTCATATTAGATAGTAAAGTAAACTTTGGAGGTTACGATTGTGTAGAAACTTTCATTAAGAAAAATGTACCGTCAGGTTTTCAACCAAGTAGCTTTAAACCGATGGATGTTAAGAATCGTAAAGAACACCTTGCTCTACTTATGAATTCCTCTGGCTCTACTGGTCTACCTAAAGGTGTACAAATTACACACGAAGGCACTGTTACCAGATTCTCACATGCCAAGGATCCCATTTACGGAAATCAAGTTTCGCCTGGCACTGCTATTTTAACCGTCGTTCCATTCCACCATGGATTCGGTATGTTTACCACTTTAGGATACTTTGCTTGTGGATACCGTGTTGTCATGTTAACAAAATTCGATGAAGAACTATTCTTGAAAACGCTGCAAGACTATAAATGTACCAGTGTGATTCTTGTGCCAACATTATTCGGCATCCTTAACAAAAGTGAATTGATCGATAAATTTGATTTATCTAATCTAACTGAAATTGCTTCTGGTGGAGCTCCTTTGGCAAAGGAAGTTGGTGAAGCTGTTGCCAGACGATTTAATCTACCCGGCATCCGCCAGGGATACGGTTTAACAGAAACGACATCGGCTTTCATTATTACTCCAGAAGGTGACGATAAACCTGGAGCATCTGGGAAAGTAGTACCCTTGTTCAAAGTAAAAGTTATTGATCTTGACACTAAAAAAACATTGGGTGTCAATCGACGAGGAGAGATCTGTGTAAAAGGACCTAGTCTTATGAAAGGCTATGTTCGTAATCCAGAAGCAACAAAAGAAATTATTGATGATGAAGGCTGGATGCACACTGGCGATATTGGATATTACGATGAGGACGAACATTTCTTCATTGTAGATCGTTTGAAATCATTAATCAAATACAAAGGGTACCAGGTACCGCCTGCTGAATTAGAATCCGTTCTTTTGCAACATCCAAATATATTTGACGCTGGTGTAGCTGGTGTCCCCGATCCTGAAGCTGGTGAACTTCCAGGGGCTGTAGTTGTATTGGAAAAAGGAAAGACTATGACCGAGAAGCAAATTGTGGAATACGTTAATAGTCAAGTAGTAAACCACAAACGTTTACGTGGTGGCGTTCGATTTGTGGATGAAGTACCAAAAGGCCTTACTGGAAAAATTGATGCTAAAGTAATTAGAGAAATCCTTAAGAAACCACAATCCAAGATGTAA
【００５２】
また、配列番号２に示される塩基配列をアミノ酸へ翻訳した配列（配列番号１）は、以下の通りである。
MEMEKEENVVYGPQPFYPIEAGSAGIQLHKYMHQYAQLGAIAFSNALTGVDISYQEYFDITCRLAEAMKNYGMTQEGRIALCSENCEEFFIPVVAGLYIGVGVAPTNEIYTLRELNHSLGIAEPTIVFSSRKGLPKVLEVQKNVTCIKTIVILDSKVNFGGYDCVETFIKKNVPSGFQPSSFKPMDVKNRKEHLALLMNSSGSTGLPKGVQITHEGTVTRFSHAKDPIYGNQVSPGTAILTVVPFHHGFGMFTTLGYFACGYRVVMLTKFDEELFLKTLQDYKCTSVILVPTLFGILNKSELIDKFDLSNLTEIASGGAPLAKEVGEAVARRFNLPGIRQGYGLTETTSAFIITPEGDDKPGASGKVVPLFKVKVIDLDTKKTLGVNRRGEICVKGPSLMKGYVRNPEATKEIIDDEGWMHTGDIGYYDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESVLLQHPNIFDAGVAGVPDPEAGELPGAVVVLEKGKTMTEKQIVEYVNSQVVNHKRLRGGVRFVDEVPKGLTGKIDAKVIREILKKPQSKM*
【００５３】
［実施例１：野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの発光スペクトル測定］
１．野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ遺伝子のタンパク質発現
野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ遺伝子を大腸菌でタンパク質発現させるため、ｐＲＳＥＴ−Ｂベクター（インビトロジェン）に導入した。遺伝子発現ベクターの構築は標準的な方法に従い以下のように実験を実施した。
【００５４】
１−１．野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ遺伝子の制限酵素認識部位の改変
特開２００９−５４５４３６号公報に開示された塩基配列（配列番号２）によれば、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ遺伝子はＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの制限酵素認識配列を含む。ルシフェラーゼのアミノ酸配列を維持しつつ、これらの塩基配列におけるこれらの認識配列を除去する遺伝子改変を実施した。この処理は、後述するルシフェラーゼ遺伝子の発現ベクターへの導入を容易にするために行った。遺伝子変異の導入は、多比良和誠編「遺伝子の機能阻害実験法―簡単で確実な遺伝子機能解析から遺伝子治療への応用まで」（羊土社、２００１年発行、ｐ．１７−２５）に示される方法に従った。変異導入後の配列は、配列番号３に示される塩基配列である。配列番号３は、以下の通りである。
ATGGAAATGGAAAAGGAAGAGAATGTTGTGTATGGCCCTCAGCCATTCTACCCCATTGAAGCAGGTTCCGCAGGAATACAGTTACATAAGTACATGCATCAATATGCACAACTTGGAGCAATCGCTTTTAGTAATGCTCTTACCGGAGTTGATATTTCTTACCAAGAATACTTTGATATAACGTGCCGTCTAGCTGAGGCCATGAAAAATTATGGTATGACGCAGGAAGGACGTATTGCTTTGTGCAGTGAAAATTGTGAAGAGTTCTTTATTCCTGTGGTTGCTGGTCTTTACATCGGGGTAGGTGTTGCACCTACTAATGAAATCTACACTCTCCGTGAATTAAATCACAGTTTGGGTATCGCAGAACCGACTATTGTATTCAGCTCCAGAAAAGGCTTACCGAAAGTTCTGGAAGTACAAAAAAATGTTACATGTATCAAAACAATTGTCATATTAGATAGTAAAGTAAACTTTGGAGGTTACGATTGTGTAGAAACTTTCATTAAGAAAAATGTACCGTCAGGTTTTCAACCAAGTAGCTTTAAACCGATGGATGTTAAGAATCGTAAAGAACACCTTGCTCTACTTATGAACTCCTCTGGCTCTACTGGTCTACCTAAAGGTGTACAAATTACACACGAAGGCACTGTTACCAGATTCTCACATGCCAAGGACCCCATTTACGGAAATCAAGTTTCGCCTGGCACTGCTATTTTAACCGTCGTTCCATTCCACCATGGATTCGGTATGTTTACCACTTTAGGATACTTTGCTTGTGGATACCGTGTTGTCATGTTAACAAAATTCGATGAAGAACTATTCTTGAAAACGCTGCAAGACTATAAATGTACCAGTGTGATTCTTGTGCCAACATTATTCGGCATCCTTAACAAAAGTGAATTGATCGATAAATTTGATTTATCTAATCTAACTGAAATTGCTTCTGGTGGAGCTCCTTTGGCAAAGGAAGTTGGTGAAGCTGTTGCCAGACGATTTAATCTACCCGGCATCCGCCAGGGATACGGTTTAACAGAAACGACATCGGCTTTCATTATTACTCCAGAAGGTGACGATAAACCTGGAGCATCTGGGAAAGTAGTACCCTTGTTCAAAGTAAAAGTTATTGATCTTGACACTAAAAAAACATTGGGTGTCAATCGACGAGGAGAGATCTGTGTAAAAGGACCTAGTCTTATGAAAGGCTATGTTCGTAATCCAGAAGCAACAAAAGAAATTATTGATGATGAAGGCTGGATGCACACTGGCGATATTGGATATTACGATGAGGACGAACATTTCTTCATTGTAGATCGTTTGAAATCATTAATCAAATACAAAGGGTACCAGGTACCGCCTGCTGAATTAGAATCCGTTCTTTTGCAACATCCAAATATATTTGACGCTGGTGTAGCTGGTGTCCCCGATCCTGAAGCTGGTGAACTTCCAGGGGCTGTAGTTGTATTGGAAAAAGGAAAGACTATGACCGAGAAGCAAATTGTGGAATACGTTAATAGTCAAGTAGTAAACCACAAACGTTTACGTGGTGGCGTTCGATTTGTGGATGAAGTACCAAAAGGCCTTACTGGAAAAATTGATGCTAAAGTAATTAGAGAAATCCTTAAGAAACCACAATCCAAGATGTAA
【００５５】
１−２．野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ遺伝子の遺伝子発現ベクターへの導入
ルシフェラーゼ遺伝子を、ｐＲＳＥＴ−Ｂベクターの制限酵素サイトＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ間に導入するため、開始コドンおよびその前に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列ＧＧＡＴＣＣを含むプライマー、並びに終止コドンおよびその後ろに制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列ＧＡＡＴＴＣを含むプライマーを作成した。このプライマー対を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子の両端に上述の制限酵素認識部位を含んだ断片の増幅を行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。
【００５６】
最終濃度が等倍の１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が１．０ｍＭのＭｇＳＯ４、最終濃度が０．０２Ｕ／μｌのＴＯＹＯＢＯ  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（１Ｕ／μｌ）、最終濃度がそれぞれ０．３μＭのプライマー対を含む２０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型としてＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ認識配列を持たないルシフェラーゼ遺伝子の溶液を０．４μｌ加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５５℃３０秒および６８℃２分を３０サイクル繰り返し、最後に６８℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を通常のエタノール沈殿法により沈殿濃縮し、制限酵素処理用１０×Ｈ  Ｂｕｆｆｅｒを４μｌ、制限酵素ＢａｍＨＩ（東洋紡績株式会社）および制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡績株式会社）を各２μｌならびに滅菌脱イオン水３２μｌを加えて溶解し、３７℃で２時間保温して制限酵素処理した。その後、この反応溶液をエタノール沈殿法により沈殿濃縮した後、滅菌脱イオン水に溶解した。この溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色を行った。紫外線照射下において確認されるＤＮＡバンドを含むゲルを、ナイフを用いて切り出した。この切り出したゲルからＷｉｚａｒｄ（Ｒ）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いてＤＮＡを抽出した。これらの操作はマニュアルに従って実施した。その後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｐａｃｋ（ニッポンジーン）をマニュアルに従って用いて、あらかじめ同様の方法で制限酵素ＢａｍＨＩと制限酵素ＥｃｏＲＩで処理したｐＲＳＥＴ−Ｂベクターに抽出したＤＮＡを導入した。このベクターＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に形質転換し、コロニーを形成させた。
【００５７】
得られたコロニーを鋳型としてダイレクトコロニーＰＣＲを実施し、ｐＲＳＥＴ−Ｂに導入したルシフェラーゼ遺伝子を増幅した。ダイレクトコロニーＰＣＲは、Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧ−３’：配列番号７）およびＴ７  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＴＡ  ＧＴＴ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＣＧＧ  ＴＧＧ−３’：配列番号８）のプライマー対を用いて行った。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）および最終濃度がそれぞれ０．２μＭのプライマーを含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を２５サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。
【００５８】
増幅が確認できたＰＣＲ反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。ＰＣＲ産物精製キットＥｘｏＳＡＰ−ＩＴを用いて、ＰＣＲ反応溶液に含まれる余剰なｄＮＴＰおよびプライマーを除去し、ＰＣＲダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。シークエンスには、ベクタープライマーまたは遺伝子特異的なプライマーを用いた。ＰＣＲ産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に２．５倍量の１００％エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上清を取り除いた後、７０％エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にＨｉ−Ｄｉ  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）を１５μｌ加え、溶解させた。この溶液を９４℃２分間の熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌ  ジェネティックアナライザを用いて塩基配列を読み取り、配列番号３の塩基配列が、正常に遺伝子発現ベクターｐＲＳＥＴ−Ｂに導入されていることを確認した。
【００５９】
２．発光タンパク質の精製
ＪＭ１０９（ＤＥ３）を含む大腸菌溶液５０μｌにルシフェラーゼ発現ベクター０．５μｌを添加し、氷上で１０分、その後４２℃で１分、最後に氷上で２分インキュベートした。その後、大腸菌溶液５０μｌをＳＯＣ培地２００μｌに加えた。その大腸菌／ＳＯＣ培地混合溶液を３７℃で２０分間振とうしながらインキュベートした。インキュベート後のサンプル１００μｌをＬＢ培地プレート（１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）にストリークし、３７℃で一晩インキュベートした。翌日得られたコロニーをピックアップし、５００ｍｌスケールのＬＢ培地で培養した。培養は３７℃で２４時間、１８℃で２４時間行った。合計４８時間の培養の後、遠心分離で菌体を回収し、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）に再度懸濁して超音波破砕した。菌体破砕液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分）し、沈査を除去して上清を回収した。ベッドボリューム２ｍｌのカラムにＮｉ−Ａｇａｒ懸濁液５００μｌと０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２ｍｌを加え、カラムを平衡化した。回収した上清をカラムに添加し、自然落下させた。上清の全量がカラムを通過するまでの間の操作は全て４℃の条件で行った。２５ｍＭイミダゾール／０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液２ｍｌでカラムを洗浄した。洗浄後のカラムに５００ｍＭイミダゾール／０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液を２ｍｌ加え、ルシフェラーゼを溶出した。溶出されたサンプルをゲルろ過カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア）でろ過し、脱塩した。脱塩後のサンプルをＶｉｖａｓｐｉｎ６（ザルトリウス）で限界ろ過し、濃縮されたサンプルにグリセリンを添加して、５０％グリセリン溶液とした。保存は−２０℃で行った。
【００６０】
３．発光スペクトルの測定
測定のための装置としてＬｕｍｉＦｌＳｐｅｃｔｒｏＣａｐｔｕｒｅ（ＡＴＴＯ）を用い、０．１Ｍクエン酸／０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０−８．０）に１ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン、２ｍＭ  ＡＴＰおよび４ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む溶液に、精製酵素を１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの間の最終濃度で添加し、酵素添加後１５秒経過時点で発光スペクトルを測定した。測定結果を図１に示す。
【００６１】
図１より、取得された野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼによる発光スペクトルは、ｐＨ７．５の環境において、５７４ｎｍ付近に最大発光波長を示すことがわかる。また、最大発光波長は、ｐＨ８．０、ｐＨ７．０、ｐＨ６．５、ｐＨ６．０およびｐH５．５のそれぞれにおいて、約５７４ｎｍ、約５８２ｎｍ、約６０５ｎｍ、約６１４ｎｍおよび約６１６nm、であり、ｐＨが下がるほど最大発光波長は長くなる傾向がみられた。
【００６２】
［実施例２：変異型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの作製とHeLa細胞内における発光強度および発光スペクトルの比較］
【００６３】
１．変異型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの作製
下記のとおり、変異型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼを発現する変異型遺伝子を作製した。
【００６４】
哺乳細胞における発現に最適化した遺伝子（配列番号４）に対し、配列番号５のアミノ酸配列上２８６番目のセリンに対応するアミノ酸残基をアラニンに置換する変異（Ｓ２８６Ａ）を導入した。当該変異は、配列番号９に示すプライマー（ＣＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣｎｎｎＧＴＧＡＴＣＣＴＧＧＴＧＣＣＣ：配列番号９）を用いた。
なお、上記哺乳細胞における発現に最適化した遺伝子（配列番号４）は、以下の通りである。
ATGGAAATGGAAAAAGAGGAAAACGTCGTCTACGGCCCCCAGCCCTTCTACCCTATCGAAGCCGGCTCTGCCGGCATCCAGCTGCACAAGTACATGCACCAGTACGCCCAGCTCGGAGCCATTGCCTTCAGCAATGCCCTGACCGGCGTGGACATCAGCTACCAGGAATACTTCGACATCACCTGTCGGCTGGCCGAGGCCATGAAGAACTACGGCATGACCCAGGAAGGCCGGATCGCCCTCTGCAGCGAGAACTGCGAAGAGTTCTTCATCCCCGTGGTGGCCGGCCTGTATATCGGAGTGGGAGTGGCCCCCACCAACGAGATCTACACCCTGAGAGAGCTGAACCACAGCCTGGGAATCGCCGAGCCCACCATCGTGTTCAGCAGCAGAAAGGGCCTGCCCAAGGTGCTGGAAGTGCAGAAAAACGTGACCTGCATCAAGACCATCGTGATCCTGGACAGCAAAGTGAACTTCGGCGGCTACGACTGCGTGGAAACCTTCATCAAAAAGAACGTGCCCAGCGGCTTCCAGCCCAGCTCCTTCAAGCCCATGGACGTGAAGAACCGGAAAGAGCACCTGGCCCTGCTGATGAACAGCAGCGGCTCTACCGGCCTGCCTAAAGGGGTGCAGATCACACACGAGGGCACCGTGACCAGATTCAGCCACGCCAAGGACCCCATCTACGGCAACCAGGTGTCCCCTGGCACCGCCATTCTGACCGTGGTGCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACTTCGCCTGCGGCTACAGAGTGGTCATGCTGACCAAGTTCGATGAAGAACTGTTCCTGAAAACCCTGCAGGACTACAAGTGCACCTCTGTGATCCTGGTGCCCACCCTGTTCGGCATCCTGAACAAGAGCGAGCTGATCGACAAGTTCGACCTGAGCAACCTGACCGAGATCGCCTCTGGCGGAGCCCCTCTGGCCAAAGAAGTGGGAGAAGCCGTCGCCAGACGGTTCAACCTGCCCGGAATCAGACAGGGCTACGGCCTGACCGAAACCACCAGCGCCTTCATCATCACCCCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCTCTGGAAAGGTGGTGCCCCTGTTCAAAGTGAAAGTGATCGACCTGGACACCAAGAAAACCCTGGGCGTGAACAGACGGGGCGAGATCTGTGTGAAGGGCCCCAGCCTGATGAAGGGCTACGTGCGGAATCCTGAGGCCACCAAAGAGATCATCGACGACGAGGGCTGGATGCACACCGGCGACATCGGCTACTACGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGCCCCCAGCCGAGCTGGAATCTGTGCTGCTGCAGCATCCCAACATCTTCGACGCTGGCGTGGCCGGCGTGCCAGATCCTGAAGCTGGCGAACTGCCTGGCGCTGTGGTGGTGCTGGAAAAGGGCAAGACCATGACCGAGAAGCAGATCGTGGAATACGTGAACAGCCAGGTGGTCAACCACAAGCGGCTGAGAGGCGGCGTGCGCTTTGTGGATGAGGTGCCAAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACGCCAAAGTGATCCGGGAAATCCTGAAGAAACCCCAGAGCAAGATGTGA
【００６５】
変異の導入は文献の記載に基づいて行った（Ａｓａｋｏ  Ｓａｗａｎｏ  ａｎｄ  Ａｔｓｕｓｈｉ  Ｍｉｙａｗａｋｉ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，  Ｖｏｌ．２８，  Ｎｏ．１６）。変異導入後にシーケンサーを用いて配列を読み取り、目的とする変異がヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ遺伝子に導入されていることを確認した。
【００６６】
作製したヤエヤマヒメボタル変異型ルシフェラーゼを赤色変異体と称する。これは、Ｓ２８６Ａ変異を有する。
この赤色変異体（Ｓ２８６Ａ）は、更にＫｏｚａｋ配列の付与による変異を有する。
赤色変異体のアミノ酸配列は配列番号１０に記載され、この赤色変異体をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号１１に記載される。
【００６７】
赤色変異体のアミノ酸配列（配列番号１０）は、以下の通りである。
MEMEKEENVVYGPQPFYPIEAGSAGIQLHKYMHQYAQLGAIAFSNALTGVDISYQEYFDITCRLAEAMKNYGMTQEGRIALCSENCEEFFIPVVAGLYIGVGVAPTNEIYTLRELNHSLGIAEPTIVFSSRKGLPKVLEVQKNVTCIKTIVILDSKVNFGGYDCVETFIKKNVPSGFQPSSFKPMDVKNRKEHLALLMNSSGSTGLPKGVQITHEGTVTRFSHAKDPIYGNQVSPGTAILTVVPFHHGFGMFTTLGYFACGYRVVMLTKFDEELFLKTLQDYKCTAVILVPTLFGILNKSELIDKFDLSNLTEIASGGAPLAKEVGEAVARRFNLPGIRQGYGLTETTSAFIITPEGDDKPGASGKVVPLFKVKVIDLDTKKTLGVNRRGEICVKGPSLMKGYVRNPEATKEIIDDEGWMHTGDIGYYDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESVLLQHPNIFDAGVAGVPDPEAGELPGAVVVLEKGKTMTEKQIVEYVNSQVVNHKRLRGGVRFVDEVPKGLTGKIDAKVIREILKKPQSKM*
【００６８】
赤色変異体をコードする遺伝子の塩基配列（配列番号１１）は、以下の通りである。
ATGGAAATGGAAAAAGAGGAAAACGTCGTCTACGGCCCCCAGCCCTTCTACCCTATCGAAGCCGGCTCTGCCGGCATCCAGCTGCACAAGTACATGCACCAGTACGCCCAGCTCGGAGCCATTGCCTTCAGCAATGCCCTGACCGGCGTGGACATCAGCTACCAGGAATACTTCGACATCACCTGTCGGCTGGCCGAGGCCATGAAGAACTACGGCATGACCCAGGAAGGCCGGATCGCCCTCTGCAGCGAGAACTGCGAAGAGTTCTTCATCCCCGTGGTGGCCGGCCTGTATATCGGAGTGGGAGTGGCCCCCACCAACGAGATCTACACCCTGAGAGAGCTGAACCACAGCCTGGGAATCGCCGAGCCCACCATCGTGTTCAGCAGCAGAAAGGGCCTGCCCAAGGTGCTGGAAGTGCAGAAAAACGTGACCTGCATCAAGACCATCGTGATCCTGGACAGCAAAGTGAACTTCGGCGGCTACGACTGCGTGGAAACCTTCATCAAAAAGAACGTGCCCAGCGGCTTCCAGCCCAGCTCCTTCAAGCCCATGGACGTGAAGAACCGGAAAGAGCACCTGGCCCTGCTGATGAACAGCAGCGGCTCTACCGGCCTGCCTAAAGGGGTGCAGATCACACACGAGGGCACCGTGACCAGATTCAGCCACGCCAAGGACCCCATCTACGGCAACCAGGTGTCCCCTGGCACCGCCATTCTGACCGTGGTGCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACTTCGCCTGCGGCTACAGAGTGGTCATGCTGACCAAGTTCGATGAAGAACTGTTCCTGAAAACCCTGCAGGACTACAAGTGCACCGCGGTGATCCTGGTGCCCACCCTGTTCGGCATCCTGAACAAGAGCGAGCTGATCGACAAGTTCGACCTGAGCAACCTGACCGAGATCGCCTCTGGCGGAGCCCCTCTGGCCAAAGAAGTGGGAGAAGCCGTCGCCAGACGGTTCAACCTGCCCGGAATCAGACAGGGCTACGGCCTGACCGAAACCACCAGCGCCTTCATCATCACCCCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCTCTGGAAAGGTGGTGCCCCTGTTCAAAGTGAAAGTGATCGACCTGGACACCAAGAAAACCCTGGGCGTGAACAGACGGGGCGAGATCTGTGTGAAGGGCCCCAGCCTGATGAAGGGCTACGTGCGGAATCCTGAGGCCACCAAAGAGATCATCGACGACGAGGGCTGGATGCACACCGGCGACATCGGCTACTACGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGCCCCCAGCCGAGCTGGAATCTGTGCTGCTGCAGCATCCCAACATCTTCGACGCTGGCGTGGCCGGCGTGCCAGATCCTGAAGCTGGCGAACTGCCTGGCGCTGTGGTGGTGCTGGAAAAGGGCAAGACCATGACCGAGAAGCAGATCGTGGAATACGTGAACAGCCAGGTGGTCAACCACAAGCGGCTGAGAGGCGGCGTGCGCTTTGTGGATGAGGTGCCAAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACGCCAAAGTGATCCGGGAAATCCTGAAGAAACCCCAGAGCAAGATGTGA
【００６９】
２．HeLa細胞内における発光強度および発光スペクトルの比較
次に、ヤエヤマヒメボタル野生型および赤色変異体ルシフェラーゼによるHeLa細胞内での発光強度を測定し、これらを、フォティヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ（プロメガ社、Ｌｕｃ２ルシフェラーゼ）およびコメツキムシ由来の赤色発光のルシフェラーゼＣＢＲ（プロメガ社、ＣＢＲルシフェラーゼ）と比較した。
【００７０】
ヤエヤマヒメボタル野生型ルシフェラーゼの遺伝子を含む核酸および赤色変異体の遺伝子を含む核酸に対してＫｏｚａｋ配列を付与した。なお、これら２種の配列（配列番号１５および配列番号１６）とも哺乳細胞における発現に対してコドン最適化されている。その後、これら配列を、それぞれ、ｐＦ９Ａ  ＣＭＶ  ｈＲＬｕｃ  ｎｅｏ  Ｆｌｅｘｉ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のマルチクローニングサイトのＳｇｆＩおよびＰｍｅＩのサイト間に挿入した。ｐＦ９Ａベクターは内部コントロールとしてウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（ｈＲＬｕｃ）をベクター配列に含んでおり、マルチクローニングサイトに挿入された発光遺伝子による発光強度をウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度との比として算出することが可能である。
同様の手順に従って、フォティヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼおよびＣＢＲルシフェラーゼの遺伝子を含む核酸をｐＦ９Ａベクターのマルチクローニングサイトに挿入した。
【００７１】
発光強度比較はＤｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（米国プロメガ社製、製品番号Ｅ２９４０）を用いて実施した。得られた４種のプラスミドを、４８穴のプレートに播種したＨｅＬａ細胞にそれぞれリポフェクション法で遺伝子導入し、２４時間後ＰＢＳで細胞を洗浄した。４８穴プレートの各ウェルに２ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン／ＣＯ２  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２００μｌずつ添加し、３７℃、各ウェルあたり１秒間測定の条件でＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒ（ＡＴＴＯ）を用いて９０分間発光強度を測定した。９０分経過時点の発光強度を４種ルシフェラーゼの発光強度とした。その後、マニュアルに従ってセレンテラジンを添加し、内部コントロールであるウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度を３７℃、各ウェルあたり１秒間測定の条件でＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒを用いて１５分間発光強度を測定した。ヤエヤマヒメボタル野生型ルシフェラーゼ、赤色変異体、Ｐ．ピラリスルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２  ルシフェラーゼ、プロメガ社）およびＣＢＲルシフェラーゼ（プロメガ社）による発光強度をウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度でそれぞれ除算した値を算出し、その値を各ルシフェラーゼの発光強度としてグラフ化した。その結果を図２に示す。図２において、発光強度は、Ｐ．ピラリスルシフェラーゼによる発光強度を１としたときの比で表わされている。
【００７２】
図２に示されるように、Ｄ−ルシフェリンを発光基質とした場合、HeLa細胞における野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼよって得られた発光強度は、Ｐ．ピラリスルシフェラーゼによる発光強度の１．５５倍であった。赤色変異体によって得られた発光強度は、Ｐ．ピラリスルシフェラーゼによる発光強度の３．２０倍であった。また、ヤエヤマヒメボタルの赤色変異体ルシフェラーゼの発光強度は、コメツキ由来の赤色ルシフェラーゼＣＢＲの発光強度の約９．７倍であった。
【００７３】
次に、HeLa細胞で発現させた各種ルシフェラーゼ（野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ、ヤエヤマヒメボタル赤色変異体およびコメツキ由来の赤色ルシフェラーゼＣＢＲ）の発光スペクトルを測定した。測定は、上記の方法で遺伝子導入・培養したHeLa細胞をはがし，２ｍMのＤ−ルシフェリンを含むＣＯ２  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５００μｌに件濁して、ＬｕｍｉＦｌＳｐｅｃｔｒｏＣａｐｔｕｒｅ（ＡＴＴＯ）を用で測定した。温度は３７℃である。その結果を図３に示す。ヤエヤマヒメボタル赤色変異型ルシフェラーゼは、HeLa細胞内において、最大発光波長を野生型の６０７ｎｍから６１３ｎｍにシフトさせることができる。このとき、コメツキ由来の赤色ルシフェラーゼの最大発光波長は６２０nmである。しかし、発光強度はヤエヤマヒメボタルの赤色変異体の方が約９．７倍明るいことになる。このように、特定の実施形態に係るルシフェラーゼを用いた場合は、従来の赤色ルシフェラーゼを用いた場合と比較して、より高い発光強度を達成できる。
【００７４】
［実施例３：近赤外発光ルシフェリンアナログを用いた場合のHeLa細胞におけるヤエヤマヒメボタル変異体ルシフェラーゼの発光強度およびスペクトルの比較]
実施例２にて作製したルシフェラーゼ遺伝子を含む４種類（野生型ヤエヤマヒメボタル、ヤエヤマヒメボタル赤色変異体、Ｐ．ピラリス、コメツキ由来ＣＢＲ）のプラスミドを、実施例２と同様にHeLa細胞に導入し，近赤外発光ルシフェリンアナログ（ジメチルアニリン−ジエン型ルシフェリン、アカルミネ（登録商標）、和光純薬社製）を発光基質として使用し、温度３７℃で、各種ルシフェラーゼにより得られる発光強度とスペクトルを測定した。ただし、近赤外発光ルシフェリンアナログの濃度は１ｍMである。
【００７５】
図４に、各種ルシフェラーゼにより得られた発光強度の比較図を示している。発光強度は野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼおよびヤエヤマヒメボタルの赤色変異型により得られた発光強度は、それぞれ、Ｐ．ピラリスによる発光強度の１．０２倍および３．８４倍であった。また、これらにより得られた発光強度は、それぞれ、コメツキ由来の赤色ルシフェラーゼ（ＣＢＲ）による発光強度の３．４倍および１２．８倍であった。
【００７６】
図５は、近赤外発光ルシフェリンアナログを基質として用いた場合の、HeLa細胞（３７℃）における野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼおよびヤエヤマヒメボタル赤色変異型ルシフェラーゼにより誘起された発光の発光スペクトルを示している。図５より、両者ともに６６１nmの発光波長を示し、変異による波長のシフトは生じないことがわかる。
【００７７】
図６は、近赤外発光ルシフェリンを用いた場合の、HeLa細胞（３７℃）におけるコメツキ由来の赤色ルシフェラーゼＣＢＲにより誘起された発光の発光スペクトルを示している。図６より、ＣＢＲによる発光は、ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼと同じ条件では発光スペクトルが測定できないほど発光強度が弱いことが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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