(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号９のアミノ酸配列を含む、合成ペプチド。
【請求項２】
Ｎ末端残基のアセチル化により修飾されている、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号９に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、補体活性化を調節する、合成ペプチド。
【請求項４】
一つまたは複数のアミノ酸置換、修飾、挿入、または欠失を有する配列番号９のアミノ酸配列を含み、補体活性化を調節する、合成ペプチド。
【請求項５】
一つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有する配列番号９のアミノ酸配列を含み、補体活性化を調節する、合成ペプチド。
【請求項６】
アミノ酸残基が３０以下である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチドの治療有効量および少なくとも１つの薬剤的に許容できる担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、炎症性疾患および自己免疫疾患における治療介入分野に関する。より具体的には、本発明は、補体の活性化を調節し、炎症性疾患、自己免疫性疾患および病原性疾患等の補体介在性疾患の予防および治療において治療薬として用いることができる、ペプチド化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然免疫系に必要不可欠な成分である補体系は、侵入病原体に対する生体防御機構として重要な役割を担っており、適応免疫応答を刺激し、免疫複合体およびアポトーシス細胞の除去を促進する。３つの異なる経路：古典経路、レクチン経路および副経路（alternative pathway）で、補体系は構成される。Ｃ１ｑおよびマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）は、それぞれ古典経路およびレクチン経路の、構造的に関連がある認識分子である。ＩｇＭまたはクラスター化ＩｇＧがＣ１ｑの主要なリガンドとして機能するが、一方ＭＢＬはマンナン等の多糖類を認識する。Ｃ１ｑおよびＭＢＬによるリガンド結合は、Ｃ４およびＣ２の逐次活性化をもたらし、古典経路およびレクチン経路でのＣ３転換酵素を形成する。対照的に、副経路の活性化は認識分子を必要としないが、古典経路またはレクチン経路により惹起されるＣ３活性化を増幅することができる。これら３つの経路のうちのいずれかの活性化によって、炎症性メディエーター（Ｃ３およびＣ５ａ）および膜侵襲複合体（ＭＡＣ）が形成され、細胞溶解が引き起こされる。
【０００３】
補体系は多くの防御免疫機能において重要な役割を担っているが、補体活性化は、広範な自己免疫性疾患および炎症性疾患の進行において、組織の損傷の重要なメディエーターである（非特許文献１）。
【０００４】
補体を調節する物質が必要とされている。補体系は病原性微生物に対する極めて重要な宿主防御であるが、それが抑制なく活性化すると、宿主細胞の壊滅的な損傷を引き起こす場合がある。現在、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、および多発性硬化症等の自己免疫疾患を含む、多くの疾患経過における補体の調節不全に付随する既知の罹患率および死亡率にもかかわらず、ヒト用に現在承認されている抗補体治療は、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）罹患患者用に認可された精製ヒトＣ１阻害剤、および発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）の治療に用いられる、抗Ｃ５長時間作用性ヒト化モノクローナル抗体であるエクリズマブ／ソリリス（Solaris）の２つのみである。ＰＮＨおよびＨＡＥは共に罹患する人がほとんどいない希少疾患であり、現在、調節不全の補体活性化が中心的な役割を果たす、広く見られる疾患経過に対し承認されている補体調節物質は存在しない。
【０００５】
アストロウイルス科（Astroviridae）は、一本鎖の、メッセンジャー−センスＲＮＡゲノムを有する、非エンベロープの、２０面体ウイルスのファミリーを構成している。これらのウイルスは、ヒトにおける胃腸炎、および他の動物種における他の疾患の大きな原因である。それらが世界における小児下痢性疾患の推定２〜１７％を引き起こしていると推定されている。
【０００６】
アストロウイルスのコートタンパク質（「ＣＰ」）は補体系に対し強力な作用を有しており、このことは、該タンパク質の「活性」部分が、補体介在性疾患による組織損傷を低減することにおいて臨床的な有用性を持ち得ることを示唆している。ヒトアストロウイルス１型（ＨＡｓｔＶ−１）から精製した野生型コートタンパク質（「ＷＰ  ＣＰ」）は、Ｃ１ｑおよびＭＢＬと結合することができ、古典経路およびレクチン経路両方の活性化を調節することができる（非特許文献２）。この特性は、ヒト好中球ペプチド−１（ＨＮＰ−１）について記載される特性と類似している（非特許文献３及び４）。ＨＡｓｔＶ−１のコート（coat）タンパク質は、組換えバキュロウイルスコンストラクトから発現された後に精製された、７８７個のアミノ酸からなる分子である（非特許文献５）
【０００７】
補体系の古典経路、レクチン経路および副経路を阻害するためのペプチド化合物を開発することは、これら３つの経路それぞれが多数の自己免疫性疾患および炎症性疾患の経過の一因となることが示されているため、重要である。古典経路およびレクチン経路の特異的な遮断が特に興味の対象となっているが、それは、これら両方の経路が多くの動物モデルにおける虚血再灌流により誘導される障害と関係付けられているためである（非特許文献６〜９）。副経路不全を有するヒトは深刻な細菌感染症に罹患する。そのため、機能的な副経路は侵入病原体に対する免疫監視機構に必要不可欠である。
【０００８】
補体活性化を調節することができ、炎症性疾患、自己免疫性疾患および病原性疾患等の補体介在性疾患を予防および治療するための治療薬として用いることができるペプチド化合物を開発することが望ましいであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ricklin, D., Lambris, J.D. 2007. Nat. Biotech. 25, 1265-1275.
【非特許文献２】Hair et al., 2010. Molec. Immunol. 47, 792-798
【非特許文献３】van den Berg et al., 1998. Blood. 92, 3898-3903
【非特許文献４】Groeneveld et al., 2007. Molec. Immunol. 44, 3608-3614
【非特許文献５】Bonaparte et al., 2008, J. Virol. 82, 817-827
【非特許文献６】Castellano et al., 2010, Amer. J. Pathol. 176, 1-12.
【非特許文献７】Lee et al., 2010, Mol. Immunol. 47, 972-981.
【非特許文献８】Tjernberg, et al., 2008, Transplantation. 85, 1193-1199.
【非特許文献９】Zhang et al. 2006, J. Immunol. 177, 4727-4734.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、補体系の古典経路およびレクチン経路を調節するペプチド化合物、およびこれらの化合物を使用する方法を提供する。具体的には、本発明のペプチド化合物はＣ１およびＭＢＬと結合し、それらを調節および不活性化することができるため、副経路はそのままに、古典経路およびレクチン経路の活性化をその最も早いポイントで効果的に阻害することができる。これらのペプチド化合物は、副経路（alterative pathway）に影響を与えずにＣ１およびＭＢＬの活性化を選択的に調節および阻害するための治療薬として価値があり、古典経路およびレクチン経路の活性化調節不全を介した疾患を治療するために用いることができる。他の実施形態では、本ペプチド化合物は、古典経路の活性化を調節するが、レクチン経路の活性化は調節しない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ＣＰ１と称される、ヒトアストロウイルスコートタンパク質由来の３０個のアミノ酸からなり、Ｃ１ｑおよびＭＢＬに結合することにより古典経路およびレクチン経路の活性化を調節することができる配列番号１を有する、単離・精製されたペプチドの同定に基づいている。
【００１２】
他の実施形態では、本発明は、ＣＰ１のペプチド模倣薬、ペプチド類似体および／または合成誘導体であり、例えば、内部ペプチドの欠失および置換、Ｎ末端およびＣ末端での欠失および置換を有しており、Ｃ１ｑおよびＭＢＬに結合することにより古典経路およびレクチン経路の活性化を調節することができるペプチド化合物を対象としている。
【００１３】
本発明のさらなる実施形態は、ペプチド化合物がＮ末端残基のアセチル化によって修飾されている、本発明のペプチド化合物のうちのいずれか１つである。
【００１４】
一部の実施形態では、ペプチド配列は、配列番号１に対し、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。
【００１５】
本発明の別の実施形態はさらに、医薬組成物を提供する。例えば、本発明は、治療有効量の、上記化合物のいずれか１つのペプチドおよび少なくとも１つの薬剤的に許容できる担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００１６】
本発明の別の実施形態はさらに、対象に上記組成物を投与することを含む、対象における補体系を調節する方法を提供する。
【００１７】
本発明のさらなる実施形態は、上記医薬組成物を投与することによって補体により媒介される組織損傷が関連する疾患を治療する方法であり、該補体により媒介される組織損傷が関連する疾患は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、膜性増殖性糸球体腎炎、血清病、成人呼吸窮迫症候群（ＡＳＤＳ）、虚血再灌流障害、脳卒中、心筋梗塞、同種または異種移植障害、超急性拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、アルツハイマー病、熱傷、血液透析による損傷、心肺バイパスによる損傷、発作性夜間（pocturnal）血色素尿症（ＰＮＨ）、および遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）からなる群から選択される。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、補体により媒介される組織損傷が関連する疾患を治療するのに有効な少なくとも１つの他の活性成分を対象に投与することをさらに含む、該疾患を治療する方法であり、該少なくとも１つの他の活性成分は、非ステロイド系抗炎症剤、副腎皮質ステロイド、疾患修飾性抗リウマチ薬、Ｃ１−阻害剤、およびエクリズマブからなる群から選択される。
【００１９】
別段の定めがない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照によって組み込まれるものとする。さらに、材料、方法、および例は、例示のためだけのものであって、制限することを意図してはいない。
【００２０】
本発明の他の特徴および利点は、発明を実施するための方法、図、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＣＰが、Ｃ１ｑへの結合において、ヒト好中球デフェンシン１（ＨＮＰ−１）と用量依存的に競合することを示しているグラフである。Ｃ１ｑを、増量させていく（increasing amounts of）ＷＴ  ＣＰ（丸）またはＢＳＡ（三角）と混合し、ＨＮＰ−１を被膜したＥＬＩＳＡプレートに添加した。洗浄後、Ｃ１ｑに対するポリクローナル抗体を用いて結合したＣ１ｑを測定した。データは独立した３つの実験の平均値である。エラーバーはＳＥＭを表わす。
【図２】図２Ａは、ＣｌｕｓｔａｌＷ解析で決定した、ＷＴ  ＣＰ（配列番号３６）と３０アミノ酸ＨＮＰ−１分子（配列番号３７）の配列比較を示している。ＣＰおよびＨＮＰ−１の配列間で、シンボル「＊」は同一の残基を示しており、「：」は保存残基を示しており、「．」は半保存残基を示している。図２Ａはまた、この配列比較に基づいて合成された、２つの３０アミノ酸ペプチド（ＣＰ１（配列番号１）およびＣＰ２（配列番号２））を示している。図２Ｂは、Ｃ１ｑとの結合能において、ＷＴ  ＣＰと濃度依存的に競合するペプチド化合物を示すグラフである。一定量のＣ１ｑを、増量させていくＷＴ  ＣＰと混合し、ＣＰ１（シンボルなし）またはＣＰ２（四角）で被膜したＥＬＩＳＡプレートに添加した。ＢＳＡをＷＴ  ＣＰ（三角）と置き換えた場合、競合は起こらなかった。データは独立した３つの実験の平均値である。エラーバーはＳＥＭを表わす。
【図３】ＣＰペプチドのＣ１ｑへの結合能を示している。ペプチドＣＰ１、ＣＰ２、ＨＮＰ−１（図３Ａ）、Ｃ０４Ａ、Ｃ２７Ａ（図３Ｂ）、Ｅ２３Ａ、Ｅ２５Ａ（図３Ｃ）およびΔ８−２２（図３Ｄ）をＥＬＩＳＡプレート上に被膜し、増量させていく精製Ｃ１ｑと共にインキュベートした。Ｃ１ｑをＣ１ｑに対するポリクローナル抗血清で検出した。データは、各ペプチド誘導体に対する３連の測定値を表わしている。エラーバーはＳＥＭを表わす。
【図４】Ｃ１活性化を、ＣＰ１は調節するが、ＣＰ２は調節しないことを示している。部分的に精製したヒトＣ１を、単独で、凝集型ＩｇＧと共に、または凝集型ＩｇＧおよび増量させていくＣＰ１（図４Ａ）もしくはＣＰ２（図４Ｂ）ペプチド（２５０ｍＭストックの１〜４μｌ）と共に、３７℃で９０分間インキュベートした。その後、反応混合物を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに充填し、Ｃ１ｓに対するポリクローナル抗血清で免疫ブロットした。図４Ａおよび４Ｂにおいて、Ｃ１ｓの活性化を表わすＣ１ｓの重鎖および軽鎖、並びに酵素前駆体Ｃ１ｓは、ゲルイメージの右に表示され、一方、分子量マーカー（ｋＤ）はゲルイメージの左に表示される。図４Ｃおよび４Ｄは、Ｏｄｙｓｓｅｙ  ｉｍａｇｉｎｇで決定した、Ｃ１活性化の程度を定量化しているグラフであり、それぞれ、ＣＰ１（図４Ｃ）およびＣＰ２（図４Ｄ）に対応している。データは独立した２つの実験の平均値である。エラーバーはＳＥＭを表わす。
【図５】Ｃ４活性化試験における、ペプチド化合物の補体活性調節を示すグラフである。ＥＬＩＳＡプレートを、抗オボアルブミン抗体を飾ったオボアルブミンで予め被膜した。ＮＨＳを、単独で、またはＢＳＡ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）対照、ＷＴ  ＣＰ（１．８μｇ）、もしくはペプチド化合物（０．５ｍＭ）と共に、１５分間インキュベートし、続けてオボアルブミン−抗体標的に添加した。ポリクローナルＣ４抗体を用いてＣ４沈着を検出した。Ｃ４沈着はＮＨＳ単独を１００％に標準化し、全ての値を、熱失活したＮＨＳ対照のバックグラウンド値を引いて調節した。データは独立した３つの実験の平均値である。エラーバーはＳＥＭを表わす。 
【図６】溶血試験における、ペプチド化合物の補体活性調節を示すグラフである。図６Ａでは、抗体感作したヒツジ赤血球を、ＮＨＳ単独と共に、またはペプチド化合物（１．４ｍＭ）もしくはＤＭＳＯ対照と共に、インキュベートした。図６Ｂでは、抗体感作したヒツジ赤血球を、ＮＨＳ（白棒）もしくはＢ因子枯渇血清（黒棒）単独と共に、またはペプチド化合物（０．７７ｍＭ）もしくはＤＭＳＯ対照と共に、インキュベートした。溶血は血清単独を１００％に標準化した。図６Ａは独立した３つの実験から得た平均データを示しており、図６Ｂは１つの実験から得たデータを示している。エラーバーはＳＥＭを表わす。
【図７】Ｂ因子枯渇血清における極性取り合わせペプチド（Polar Assortant peptide）の溶血試験滴定（hemolytic assay titration）を示すグラフである。極性取り合わせペプチドが用量依存的に古典経路の活性化を調節することをデータは示している。
【図８】オリゴマー状態のＥ２３ＡのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析を示すグラフである。図８ＡはＥ２３Ａの線形モード解析を示しており、図８ＢはＥ２３Ａの反射モード解析を示している。Ｅ２３Ａは２９３４．３７の理論的質量を有する。図８Ａでは、より低い分解度およびより低い質量精度の線形モードが、ペプチドピークの拡大表示において、モノアイソトピックなペプチドピークを欠いて示されている。図８Ｂでは、高い分解度および質量精度の反射モードが、ペプチドピークの拡大表示に示されている。図８Ａおよび８Ｂの両方で、前記ペプチドの理論的質量を超える質量電荷比（ｍ／ｚ）を有する主なピークは存在しない。
【図９】図９Ａは、リョクトウ植物デフェンシン１（ＶｒＤ１）（配列番号３８）の残基と比較した、Ｅ２３Ａのアミノ酸残基（配列番号５の残基２〜２９）を示している。Ｅ２３ＡをＣＰＨＭｏｄｅｌｓ−３．０サーバーにアップロードし、Ｅ２３Ａの２〜２９番目の残基と植物デフェンシンＶｒＤ１の１７〜４４番目の残基を配列比較した。配列比較はＣｌｕｓｔａｌＷ解析で確認した。シンボル「＊」は同一の残基を示しており、「：」は保存残基を示しており、「．」は半保存残基を示している。図９ＢはＥ２３Ａの構造モデルを示しているイメージである。ＣＰＨＭｏｄｅｌｓ−３．０によって作製されたＰＤＢ座標をＪｍｏｌのＦｉｒｓｔＧｌａｎｃｅにアップロードし、構造モデルを可視化した。Ｎ末端のαヘリックスおよびβストランドをリボンとして示し、矢印はカルボキシ末端を向いている。ランダムコイルを平滑化した骨格の痕跡（smoothed backbone trace）として示す。推定ジスルフィド結合を細い円柱として示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、具体的にはＣ１およびＭＢＬに結合および／または不活性化し、したがって副経路に影響を及ぼすことなくその最も早い時点で古典経路およびレクチン経路活性化を調節することにより、補体系の古典経路およびレクチン経路を調節するペプチド化合物を提供する。これらのペプチド化合物は、古典経路およびレクチン経路の無調節な活性化により媒介される病気および状態の治療に治療薬としての価値をもつ。
【００２３】
本発明は、ヒトアストロウイルス外被タンパク質（ＣＰ１とよばれる）由来の３０のアミノ酸の単離精製されたペプチド、すなわちＣ１ｑおよびＭＢＬに結合することにより古典経路およびレクチン経路活性化を調節することができる配列（配列番号１）をもつペプチドの同定に基づく。他の実施形態では、ペプチド化合物は古典経路の活性化を調節するが、レクチン経路の活性化を調節しない。
【００２４】
ＣＰ１のアミノ酸構造の修飾が、Ｃ１ｑ活性を調節することができるさらなるペプチド化合物の発見を導いてきた。
【００２５】
本明細書で使用される「ペプチド化合物」という用語は、天然由来であってよいアミノ酸配列、またはペプチド模倣薬、ペプチド類似体および／または配列番号１に基づく約３０のアミノ酸の合成誘導体であってもよいアミノ酸配列を表す。さらに、ペプチド化合物は約３０未満のアミノ酸残基、例えば約２０から約３０のアミノ酸残基であってよく、また例えば約１０から約２０のアミノ酸残基のペプチド化合物であってよい。例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０のアミノ酸のペプチド残基は、本発明の文脈内でペプチド化合物になる可能性が高い。
【００２６】
本開示のペプチド化合物は一般に、約３０のアミノ酸残基または約３０未満のアミノ酸残基の、束縛された（constrained）（すなわち例えばβターンまたはβプリーツシートを開始するアミノ酸が存在するような構造の要素をいくつか有する、または例えばジスルフィド結合したＣｙｓ残基の存在により環化された）、または束縛されていない（unconstrained）(即ち直鎖)アミノ酸配列である。
【００２７】
ペプチド配列内のアミノ酸の置換基（substitute）は、そのアミノ酸が属する分類の他の要員から選択してもよい。例えば非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。芳香環構造を含むアミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが挙げられる。極性的に中性（polar neutral）であるアミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニンおよびリジンが挙げられる。負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。例えば、配列内の１つまたは複数のアミノ酸残基は、機能的に同等に作用し静かな変換（silent alteration）をもたらす同様な極性の別のアミノ酸により置換し得る。
【００２８】
保存的変化は一般に、得られるタンパク質の構造および機能に変化をあまりもたらさない。非保存的変化は、得られるタンパク質の構造、活性、または機能に変換をもたらす可能性が高い。例えば本開示のペプチドは、１つまたは複数の次の保存的なアミノ酸置換：脂肪族アミノ酸例えばアラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンなどの別の脂肪族アミノ酸による置き換え；セリンのトレオニンによる置き換え；トレオニンのセリンによる置き換え；酸性残基例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸などの別の酸性残基による置き換え；アミド基を有する残基例えばアスパラギンおよびグルタミンなどの、アミド基を有する別の残基による置き換え；塩基性残基例えばリジンおよびアルギニンなどの、別の塩基性残基による交換；ならびに芳香族残基例えばフェニルアラニンおよびチロシンなどの、別の芳香族残基による置き換え、を含む。
【００２９】
特に好ましいアミノ酸置換としては次のものが挙げられる：
ａ）負電荷を低減し得るようにＧｌｕに対するＡｌａの置換またはその逆；
ｂ）正電荷を維持し得るようにＡｒｇに対するＬｙｓの置換またはその逆；
ｃ）正電荷を低減し得るようにＡｒｇに対するＡｌａの置換またはその逆；
ｄ）負電荷を維持し得るようにＡｓｐに対するＧｌｕの置換またはその逆；
ｅ）遊離−ＯＨを維持することができるようにＴｈｒに対するＳｅｒの置換またはその逆；
ｆ）遊離ＮＨ２を維持することができるようにＡｓｎに対するＧｌｎの置換またはその逆；
ｇ）ほぼ疎水性アミノ酸に相当するようなＬｅｕもしくはＶａｌに対するＩｌｅの置換またはその逆；
ｈ）ほぼ芳香族アミノ酸に相当するようなＴｙｒに対するＰｈｅの置換またはその逆；および
ｉ）ジスルフィド結合が影響を受けるようにＣｙｓに対するＡｌａの置換またはその逆。
【００３０】
一実施形態では、本発明はヒトアストロウイルス外被タンパク質由来の単離精製されたペプチドを開示し、前記ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【００３１】
別の実施形態では、本発明は１つまたは複数のアミノ酸の置換、修飾、挿入、または欠失をもつ配列番号１のアミノ酸配列を含む、単離精製された合成ペプチドを開示し、前記ペプチドは補体活性化を調節する。
【００３２】
別の実施形態では、本発明は１つまたは複数のアミノ酸の置換をもつ配列番号１のアミノ酸配列を含む、単離精製された合成ペプチドを開示し、前記ペプチドは補体活性化を調節する。
【００３３】
ペプチド化合物は、内部ペプチド欠失および置換、ならびに配列番号１に基づくＮ末端およびＣ末端での欠失および置換を有してもよい。いくつかの実施形態では、ペプチドは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０またはそれ以上のアミノ酸置換、修飾、挿入，または欠失を有する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ペプチド配列は配列番号１と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。
【００３５】
アストロウイルス外被タンパク質ペプチドおよび誘導体
ＨＮＰ−１とＷＴ  ＣＰとの間の相同性領域を包含した２種の３０残基ペプチド、ＣＰ１およびＣＰ２を合成した（図２Ａ）。ＣＰ１が古典経路活性化の一貫した調節を示した一方で、ＣＰ２は古典経路活性化の調節を示さなかった。ＣＰ１は、図２Ａに示すように、そのＮ末端およびＣ末端にてＨＮＰ−１との限定された相同性を保持する（各４残基）が；しかし、これらの側面の残基に対してその内部に相同性は存在しない。いかなる理論にも縛られるものではないが、ＷＴ  ＣＰは、Ｃ１およびＭＢＬの両分子のコラーゲン様領域に結合することにより、ならびにＣ１ｑおよびＭＢＬからそれらとそれぞれ関連するセリンプロテアーゼ、すなわちＣ１ｓ−Ｃ１ｒ−Ｃ１ｒ−Ｃ１ｓおよびＭＡＳＰ２をそれぞれ分離することにより、Ｃ１およびＭＢＬ活性を調節し得る(Hair et al., 2010. Molec. Immunol. 47, 792-798)。
【００３６】
本開示でのペプチド化合物は、ＣＰ１、すなわち上述のＨＡｓｔＶ  ＣＰの３０アミノ酸ペプチドのペプチド欠失および置換により合成される。さらなるペプチド化合物は、以下の表１に示すように、ＣＰ１の修飾に基づき合成されている。
【００３７】
【表１】
0006033774.tif 000002
【００３８】
ＣＰ１はヒトアストロウイルス外被タンパク質由来の単離精製されたペプチドであり、前記ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【００３９】
ＣＰ２はヒトアストロウイルス外被タンパク質由来の単離精製されたペプチドであり、前記ペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【００４０】
親ペプチドとしてＣＰ１を使用して、４種類のアラニン置換（Ｃ０４Ａ、Ｃ２７Ａ、Ｅ２３Ａ、Ｅ２５Ａ）を作製した（アラニン置換残基は表１において太字かつ下線で示す）。残基８から残基２２までの内部欠失をΔ８−２２ペプチドのために作製した（内部欠失は表１においてダッシュで示す）。ＣＰ２、ＣＰ１、およびＣＰ１誘導体をプレート上に被覆した。ブロッキング後、Ｃ１ｑを増量させつつ（increasing amount of）室温で１時間添加し、その後Ｃ１ｑに対する抗血清を用いてＣ１ｑを検出した。Ｃ１ｑの各種ペプチド誘導体との結合性を図３に示す。データは各ペプチド化合物に関する３連での読み取りを表す。ＣＰ１はＣ１ｑに用量依存的に結合した（図３Ａ）。ＣＰ２はＣ１ｑにＣＰ１ほど結合しなかったが、ＨＮＰ−１のその結合性と同様のレベルでＣ１ｑに結合した（図３Ａ）。
【００４１】
表１に示すように、ＣＰ１は２つのシステイン残基を第４位および第２７位に含有し、これらのシステイン残基は、個々にＣ０４ＡおよびＣ２７Ａではアラニンに置換される。ＣＰ１のシステイン残基を標的化して、ＣＰ１でのジスルフィド結合が古典経路活性化のために必要であるどうかを判定した。当技術分野に公知であるように、Ｃ３のペプチドレギュレータ（コンプスタチン）およびＣ１ｑ（ペプチド２Ｊ）（共にアミノ酸配列に２つのシステイン残基を含有する）は活性のためにジスルフィド結合による環化（cyclicalization）を必要とする(Sahu et al.,1996.J. Immunol. 157,884-891; Roos et al.,2001. J. Immunol. 167,7052-7059)。システイン置換はＣ１ｑ結合（図３Ｂ）またはＣ４活性化（図５）に有意な効果を示さない。しかし、両方のシステイン置換は、溶血アッセイでの補体調節活性を減少させることを示した（図６Ｂ）。このことは、システイン残基のジスルフィド結合を介した環化はＣ１ｑの結合に重要ではないが、環化が補体系の活性を阻害する能力に対する様々な効果を有すると思われることを示唆する。したがって、いかなる理論にも縛られるものではないが、システイン残基のジスルフィド結合は、Ｅ２３Ａの構造モデルが示唆しているように、適したペプチドの立体配座および安定性に重要であり得る（図９Ｂ）。
【００４２】
表１に示すように、第２３位および第２５位のグルタミン酸残基はまた、アラニンにより置換されていた。これらの負電荷をもつアミノ酸がＣ１ｑ分子上の非水酸化リジン残基とのＣＰ相互作用に関与し得るため、グルタミン酸残基の置換がなされた。Ｅ２３ＡおよびＥ２５Ａペプチドは、Ｃ１ｑへの効率的な結合（図３Ｃ）を示し、また全ての機能分析でＣＰ１と同様のまたはＣＰ１を超える調節活性を示した（図５および６）。具体的には、Ｅ２３Ａは、試験を行った他の全てのペプチド誘導体と比較して、古典経路活性化に優れた調節を示した。中性のアラニン残基による負電荷をもつグルタミン酸の１つの置換がペプチドの調節活性を増強するようである。
【００４３】
表１に示すように、Δ８−２２ペプチドはＥ２３Ａからの残基８〜２２の欠失であった。このペプチドは試験を行った全ての機能分析で活性であり、Ｃ１ｑに結合した（図３Ｄ）。このΔ８−２２ペプチドは２つのシステインおよび２つのグルタミン酸残基を保持し、またＣＰ１の大きさの半分である（１５残基対３０残基）。
【００４４】
Δ８−２２ペプチド（配列番号７）は合成中に酸化されて、２つのシステイン残基間にジスルフィド結合を形成した（Δ８−２２酸化）。このペプチドは試験を行った全ての機能分析で活性であった。２つのシステイン残基をΔ８−２２ペプチドにてジスルフィド結合を形成していないシステイン誘導体と置き換えると、ペプチドの残留が減少した。（Δ８−２２ペプチドＡｂｕ；配列番号８）。このペプチドは、試験を行った全ての機能分析で活性であった。ペプチドの極性取り合わせ（Polar Assortant）（配列番号９）に関しては、Δ８−２２ペプチドからの１５アミノ酸残基がスクランブル（scramble）されていた。このペプチドもまた、試験を行った全ての機能分析で活性であった。
【００４５】
ペプチドの合理的欠失、置換、および修飾
以下の表２に示すように、ＣＰ１の一連のペプチド欠失、置換、および修飾を開示する。表１および表２に示すように、対象物(subject matter)は、配列番号１〜３５のアミノ酸配列のいずれか１つを含む単離精製した合成ペプチドを開示する。
【００４６】
【表２】
0006033774.tif 000003
0006033774.tif 000004
【００４７】
内部欠失
上述のように、ＣＰ１は図２Ａに示すようにＨＮＰ−１の最初の１０残基の長さと配列をもつ３０アミノ酸残基である。これらの２種類の分子の配列は、ＣＰ１の環化のために必要とされるＮ末端およびＣ末端でのシステイン残基に基づく。これはＨＮＰ−１と相同性である配列を有さないＣＰ１の１８残基内部領域をもたらす。ＣＰ１の内部欠失が徐々に増加して合成され、Ｃ１ｑおよびＭＢＬの結合性に対して判断される（表２、内部欠失）。
【００４８】
Ｎ末端およびＣ末端欠失
表２に示すように（Ｎ末端およびＣ末端欠失）、Ｎ末端およびＣ末端アミノ酸は、次第に、ＣＰ１の各システイン残基まで個々に欠失される。さらには、ＣＰ１およびＣＰ２からのＮ末端およびＣ末端の両方の欠失がなされ、１５のアミノ酸ペプチドが形成される。これらの修飾ペプチド化合物が合成されて、これらの側面の残基をＣ１ｑおよびＭＢＬ結合活性に必要とするかを判定するために、Ｃ１ｑおよびＭＢＬ結合性について修飾ペプチド化合物を判断する。これらの欠失は、補体活性化を調節するために必要とされるペプチド化合物の最小サイズを決定するのに役立つ。
【００４９】
アラニンスキャン（Ｓｃａｎ)
アラニンスキャンニングを行い、ペプチドの活性に関与する特定のアミノ酸残基を同定する。アラニンスキャンニングでは、アラニンを用いて各残基を連続的に置換する。必須アミノ酸の置換はペプチド活性に変化をもたらし、その活性度が置換されたアミノ酸の重要性の相対的測定値とみなされる。
【００５０】
対象物は、ある位置でアラニンにより置換されたペプチド化合物を開示する。対象物は、配列番号１の配列を含む単離精製された合成ペプチドを開示し、前記合成ペプチドでは１つまたは複数のアミノ酸がアラニンで置換され、本ペプチドは補体活性化を調節する。１つまたは複数の実施形態では、アラニンで置換されたアミノ酸は第４、２３、２５、または２７位に存在する。
【００５１】
２つのグルタミン酸残基位置は両方とも個々におよび同時にアラニンで置換される（表２、太字および下線）。いかなる理論にも縛られるものではないが、野生型ＣＰ分子は、セリンプロテアーゼＣ１ｓ−Ｃ１ｒ−Ｃ１ｒ−Ｃ１ｓおよびＭＡＳＰ２とそれぞれ結合するために必要とされるＣ１ｑおよびＭＢＬ上の反応性リジン残基と相互に作用し得る。グルタミン酸に関連する負電荷を仮定すると、これらの残基は直接的にＣＰ結合を促進するＣ１ｑおよびＭＢＬ上の正電荷をもつリジン残基と相互に作用する。２つのシステイン残基位置は、両方とも個々におよび同時にアラニンで置換される（表２、太字および下線部）。
【００５２】
N末端アセチル化
対象物は、Ｎ末端がアセチル化されたペプチド化合物を開示する。ＣＰ１のアセチル化は、ペプチドのＮ末端での電荷を減少させることにより、効果を高める（すなわち静電効果）（RicklinおよびLambris、2008. Nat. Biotech. 25、1265-1275)。この修飾は、Ｃｏｍｐｓｔａｔｉｏｎにより示されているように、エクソペプチダーゼに関わるペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性の改良に役立ち得る（RicklinおよびLambris、2008. Nat. Biotech. 25、1265-1275)。Ｎ末端アセチル化から合成されたペプチド化合物としては、上述のあらゆるペプチドが含まれるが、前記ペプチドはＮ末端残基のアセチル化により修飾されている。
【００５３】
補体系およびその調節異常に関連する病気
補体は細菌やエンベロープをもついくつかのウイルスなどの病原体に対する重要な宿主防御である一方で、その無制限な活性化が破壊的な宿主細胞損傷を引き起こす。補体により媒介される宿主組織の損傷は、自己免疫の病変、例えば：関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、膜性増殖性糸球体腎炎、および血清病などの様々な病気に関与している。前記損傷はまた、以下の病気：成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血再灌流障害（脳卒中および心筋梗塞を含む）、同種および異種移植術合併症（超急性拒絶および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含む）、アルツハイマー病、熱傷、血液透析による損傷、心肺バイパスによる損傷、および発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）の原因の一因をもたらすと確認されている。
【００５４】
遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）は、非機能性Ｃ１阻害因子レベルの減少により引き起こされる非常に稀な遺伝性疾患であり、ＨＡＥの症状には急性の浮腫が挙げられる。Ｃ１阻害剤はＣ１活性化を天然に調節し、また急性浮腫の治療は、Ｃ１阻害剤の実質的な注入または血漿輸血を必要とする。アストロウイルスＣＰはＣ１活性化を機能的に遮断するので、ＨＡＥを治療するための本開示のペプチド化合物を使用することは治療必要性を満たす。その理由はＣ１阻害剤は、複数の対象からのヒト血清から精製しなければならないので、ヒト血液由来病原体により汚染され得る。本開示のペプチド化合物の治療的投与は、Ｃ１阻害剤を用いた補助療法においてまたは独立した治療法としてのいずれかにてＣ１を調節する。
【００５５】
本開示のペプチド化合物は、副経路活性に影響を与えることなくＣ１ｑおよびＭＢＬ活性化を選択的に調節し、したがって古典経路およびレクチン経路の無調節な活性化よって媒介される病気を予防および治療するのに最適である。副経路は侵入病原体に対する免疫学的監視に不可欠であり、副経路の欠陥をもつヒトは深刻な細菌感染症を患う。Ｃ１ｑおよびＭＢＬの結合および不活性化により、ペプチド化合物は、古典経路およびレクチン経路の活性化を効率よく調節する一方で、副経路を正常に保ち得る。
【００５６】
本明細書に使用される「調節する」という用語は、ｉ）酵素、タンパク質、ペプチド、因子、副生成物、またはその誘導体の生物学的機能を、個々にまたは複合体の状態で、制御、減少、阻害、調節すること；ｉｉ）生体タンパク質、ペプチド、またはその誘導体の量を、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで減少させること；またはｉｉｉ）関連する一連の生物学的反応または化学的反応を含むことが知られている事象、カスケード、または経路の生物学的連鎖（biological chain）を遮断すること、をさす。「調節する」という用語は、したがって例えば対照試料と比較した補体カスケードの単一成分量を減少させること、成分もしくは成分複合体の形成率またはその総量を減少させること、または細胞融解、転換酵素の形成、補体由来の細胞膜傷害複合体、炎症、もしくは炎症性疾患の形成のような結果をもたらす複合プロセスまたは一連の生物学的反応の全活性を減少させることを説明するために使用してもよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイで、「調節する」という用語は、いくつかの生物学的事象または化学的事象の測定可能な変化または減少を意味し得るが、当業者が、測定可能な変化または減少が「調節」の全てである必要がないことは理解されるであろう。
【００５７】
製剤処方および投与
本開示は補体系の調節が可能な医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、少なくとも１つの上述のペプチド化合物と少なくとも１つの薬剤的に許容できる担体、希釈剤、または賦形剤とを含む。薬剤的に許容できる担体、賦形剤、または安定剤は、使用される用量および濃度において受容者に無毒である。これらは固形、半固形または液体であり得る。本発明の医薬組成物は錠剤、丸薬、粉末、トローチ剤、小袋、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、溶液、またはシロップの形状であり得る。
【００５８】
薬剤的に許容できる担体、希釈剤、または賦形剤のいくつかの例としては：ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、スターチ、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップ、およびメチルセルロースが挙げられる。本発明の医薬組成物は、当技術分野で公知の手順を用いて処方され、活性成分の迅速な、一般的もしくは持続的なまたは遅延性の放出をもたらす。
【００５９】
本開示は、対象に上述の組成物を投与することを含む、対象での補体系を調節する方法に関する。本発明の医薬組成物は、適切な純度のペプチド化合物を薬剤的に許容できる担体、希釈剤、または賦形剤と混合することにより調製される。処方およびそのような処方の調製方法の例は、当技術分野で周知である。本発明の医薬組成物は、上記に記載した様々な疾患および病気の予防薬および治療薬として有用である。一実施形態では、組成物は、治療有効量のペプチド化合物を含む。別の実施形態では、組成物は補体媒介性組織損傷に関連する少なくとも１つの病気の治療に有効な少なくとも１つの他の活性成分を含む。本明細書に使用される「治療有効量」という用語は、対象の有意な利点を示すのに十分な活性成分の各々の総量をさす。
【００６０】
本明細書に使用される「対象」という用語は、診断、予後、または治療が望まれるあらゆる対象を意味する。例えば、対象は哺乳類、例えばヒトまたは非ヒト霊長類(例えばサル（ape）、サル（monkey）、オランウータンまたはチンパンジーなど)、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ（cattle）、またはウシ（cow）であり得る。
【００６１】
本明細書に使用される「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、疾患（例えば本明細書に記載の疾患）もしくはその症状を改善する、または疾患（例えば本明細書に記載の疾患）もしくはその症状の進行を予防または遅延させるのに効果的な量、様式（例えば投与スケジュール）、および／またはモード（例えば投与ルート）で治療薬を投与することをさす。これは、例えば疾患またはその症状に関連するパラメータの、例えば、統計的に有意な程度までまたは当業者に検出可能な程度までの改善により明らかであり得る。有効量、様式、またはモードは、対象により変更可能であり、また対象に合わせてもよい。疾患またはその症状を予防または遅延させることにより、治療は罹患したまたは診断された対象において疾患またはその症状を予防またはその結果による悪化を遅延させ得る。
【００６２】
ペプチド化合物の治療有効量は、いくつかの因子、例えば治療中の状態、状態の重篤度、投与時間、投与ルート、使用する化合物の排泄速度、治療継続期間、関与する共同療法、ならびに対象の年齢、性別、体重、および状態、等により変化する。当業者は、治療有効量を決定し得る。したがって、当業者は投与量のタイター量（titer）を必要とし投与経路を変更して、最大の治療効果を得てもよい。
【００６３】
効果的な１日投与量は、一般に体重１キログラムあたり約０．００１から約１００ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）の範囲であり、好ましくは約０．０１から約５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．１から約２０ｍｇ／ｋｇの範囲である。この投与量は、１日１〜６回の投与方法により実現される。あるいは、最適な治療は、頻度のより低い投与方法の徐放性製剤により実現され得る。
【００６４】
製剤処方は、あらゆる適切な経路、例えば経口の、経鼻の、局所の(口腔、舌下腺、または経皮を含む)、または非経口の(皮下、皮内（intracutaneous）、筋肉内、腹腔内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内、静脈内、もしくは皮内（intradermal）注射または注入を含む)経路による投与に適応してもよい。ヒトへの投与には、製剤は好ましくは、アメリカ食品医薬品局（Food and Administration）（ＦＤＡ）で定められた無菌性、発熱性、一般的安全性、および純度標準（purity standard）を満たす。
【００６５】
併用療法
本発明のさらなる実施形態は、補体媒介性組織損傷に関連する病気を予防または治療する方法を提供し、前記方法は対象に本発明の医薬組成物を投与することを含む。本発明の医薬組成物を単独で活性な医薬品として投与し得るが、前記医薬組成物はまた病気の予防または治療に効果的な１つまたは複数の治療薬または予防薬と併用して使用し得る。この態様では、本発明の方法は、補体媒介性組織損傷に関連する少なくとも１つの病気を治療するのに効果的な１つまたは複数のさらなる治療薬または予防薬の前に、同時に、及び／又は後に本発明の医薬組成物を投与することを含む。
【００６６】
例えば本発明の医薬組成物は、いずれか単独でまたは非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、コルチコステロイド、もしくは疾患修飾性抗リウマチ剤（ＤＭＡＲＤ）を組み合わせて、関節リウマチを治療するために使用し得る。
【００６７】
ＮＳＡＩＤの例としては、次の：サリチル酸塩（例えばアスピリン、アモキシプリン（amoxiprin）、ベノリラート、トリサルチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、ファイスラミン（faislamine）、メチルサリチル酸、サリチル酸マグネシウム、およびサリチルサリチラート(サルサラート)など)、アリールアルカン酸(例えばジクロフェナク、アセクロフェナク、アセメタシン、ブロムフェナク、エトドラク、インドメタシン、ケトロラク、ナブメトン、スリンダク、およびトルメチ（tolmeti）など)、２−アリールプロピオン酸（例えばイブプロフェン、カルプロフェン、フェンブフェン、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン、ナプロキセン、チアプロフェン酸、およびスプロフェンなど）、Ｎ‐アリールアントラニル酸（例えばメフェナム酸およびメクロフェナム酸など）、ピラゾリジン誘導体（例えばフェニルブタゾン、アザプロパゾン、メタミゾール、オキシフェンブタゾン、およびスルフィンピラゾンなど）、オキシカム（例えばピロキシカム、ロルノキシカム、メロキシカム、およびテノキシカムなど）、ＣＯＸ−２阻害剤（例えばエトリコキシブ、ルミラコキシブ、およびパレコキシブなど）、スルホンアニリド例えばニメスリドなど、ならびにその他例えばリコフェロンおよびオメガ３脂肪酸など、が挙げられる。
【００６８】
コルチコステロイドの例としては、次の:トリアムシノロン(アリストコート（登録商標）)、コルチゾン(コートン（登録商標）酢酸塩錠)、デキサメタゾン(デカドロン（登録商標）エリキシル剤)、プレドニゾン(デルタゾン（登録商標）)、およびメチルプレドニゾロン(メドロール（登録商標）)が挙げられる。
【００６９】
ＤＭＡＲＤの例としては、次の：メトトレキサート（リウマトレックス（登録商標））、レフルノミド（アラバ（登録商標））、エタネルセプト（エンブレル（登録商標））、インフリキシマブ（レミケード（登録商標））、アダリムマブ（ヒュミラ（登録商標））、アナキンラ（キネレット（登録商標））、スルファサラジン（アザルフィジンＥＮ錠（登録商標））、抗マラリア剤、金塩、ｄ−ペニシラミン、シクロスポリンＡ、シクロホスファミドおよびアザチオプリンが挙げられる。
【００７０】
Ｓｏｌｉｒｉｓ（商標）（エクリズマブ）は、ヒト化抗Ｃ５モノクローナル抗体である。Ｓｏｌｉｒｉｓ（商標）は溶血性貧血のまれな症状、発作性夜間血色素尿症の治療に対し、ＦＤＡにより認可を受けている。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、発作性夜間血色素尿症、心臓疾患、肺疾患、自己免疫疾患、喘息の治療、ならびに移植物の補助的ケアの際にＳｏｌｉｒｉｓ（商標）と併用し得る。
【００７１】
本発明の医薬組成物は、追加の薬剤（additional agent）と一緒に併用療法にて共同でまたは単独で投与し得、または１つの組成物中に医薬組成物および追加の薬剤を組み合わせて投与し得る。用量は、状態の最大限の管理が実現できるように投与および調整される。例えば医薬組成物および追加の薬剤の両方が、通常、単一治療（mono-therapy）投与方法において通常投与される用量の約１０％から約１５０％、より好ましくは約１０％から約８０％の用量レベルで存在する。
【実施例】
【００７２】
本発明は以下の実施例によってさらに説明されるが、実施例は説明のみを目的として提供される。それらがいずれの点においても本発明の範囲および内容を限定していると解釈されるべきではない。
【００７３】
材料および方法
実施例１：ＨＡｓｔＶ−１  ＣＰ、ペプチド、熱凝集ＩｇＧ、血清、赤血球、および補体緩衝液の調製
野生型ＨＡｓｔＶ−１  ＣＰをヨトウガ（Spodoptera frugiperda）細胞（ＩＰＬＢ−Ｓｆ２１株）中で組換えバキュロウイルスから発現させ、前述のように精製した（Bonaparte et al., 2008. J. Virol. 82, 817-827）。ＨＮＰ−１、ＣＰ１、およびＣＰ２ペプチドをバイオマティック社（Biomatik）から入手し、一方、Ｃ０４Ａ、Ｃ２７Ａ、Ｅ２３Ａ、Ｅ２５Ａおよびｄ８−２２はジェンスクリプト社（GenScript）から購入した。出荷前に、前記ペプチド化合物はＨＰＬＣおよびＥＳＩ−質量分析で分析された。受領後直ちに、ペプチドを１０ｍＭの濃度でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、−８０℃で貯蔵した。熱凝集ヒトＩｇＧは、当該技術分野において周知の方法（Bonaparte et al., 2008. J. Virol. 82, 817-827）を用いて調製した。プールされた正常ヒト血清（ＮＨＳ）は、治験審査委員会により承認されたプロトコール（IRB 02-06-EX-0216, Eastern Virginia Medical School）に従って健康なヒトの志願者の血液に由来し、当該技術分野において周知の方法（Cunnion et al., 2001. Infect. Immun. 69, 6796-6803）を用いてプールし、分注し、−８０℃で凍結したものである。抗体感作したヒツジ赤血球を、当該技術分野において周知の方法（Bonaparte et al., 2008. J. Virol. 82, 817-827）を用いて作製した。標準補体緩衝液：ＧＶＢＳ＋＋（ベロナール緩衝食塩水、０．１％ゼラチン、０．１５ｍＭ  ＣａＣｌ２、および１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）およびＧＶＢＳ―ー（ベロナール緩衝食塩水、０．１％ゼラチン、０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ）を使用した。
【００７４】
実施例２：ＷＴ  ＣＰおよびペプチド化合物用Ｃ１ｑ  ＥＬＩＳＡのプロトコール
Ｃ１ｑ結合においてＣＰがＨＮＰ−１と競合するかどうかを解析するために、被膜緩衝液（１００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、［ｐＨ９．６］）中のＨＮＰ−１ペプチド（２．５μＭ）を９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（ヌンク社）上に被膜し、プレートを室温で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔで洗浄し、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ、０．０５％トウィーン−２０（ＰＢＳ／Ｔ）で室温で２時間ブロッキングした。次に、一定量の精製Ｃ１ｑ（１０μｇ／ｍｌ；コンプリメント・テクノロジー社（Complement Technologies, Inc.））を各ウェルに添加し、その一方で、１００μｇ／ｍＬから開始して減量させていく（decreasing amounts of）ＣＰを同時に添加し、室温で１時間インキュベートした。競合の負の対照として、ＢＳＡをＣＰと置き換えた。洗浄後、一次抗体であるヤギ抗Ｃ１ｑポリクローナル抗体（コンプリメント・テクノロジー社）を、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ／Ｔで１：２，０００に希釈し、室温で１時間プレートに加えた。プレートを洗浄し、二次抗体であるロバ抗ヤギＨＲＰ（サンタクルーズバイオテクノロジー社）を３％ＢＳＡ／ＰＢＳ／Ｔで１：２，５００に希釈し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔで洗浄し、テトラメチルベンジジン（tetramethyl benzindine）（シグマ社）で１分間発色させた。その後、０．１ｍｌの１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍの波長でＳｙｎｅｒｇｙ  ＨＴプレートリーダー（バイオテック社（Bio-Tek Instruments））で測定した。ＣＰペプチドであるＣＰ１およびＣＰ２のＣ１ｑ結合における競合的結合を評価するために、ＣＰ１およびＣＰ２をプレート（２．５μＭ）上に被膜し、競合における負の対照としてＣＰと並行してＢＳＡを用いたことを除いて前述と同一の方法で試験を実行した。
【００７５】
ＣＰペプチド誘導体のＣ１ｑへの結合を測定するため、２．５μＭのペプチドをプレート上に被膜し、室温で一晩インキュベートした。洗浄およびブロッキング後、１００μｇ／ｍＬから開始して減量させていくＣ１ｑをウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。Ｃ１ｑを検出し、プレートを前述のように発色させた。
【００７６】
実施例３：Ｃ１ｓの免疫ブロット
１μｌの部分精製されたヒトＣ１（０．２ｍｇ／ｍｌ、コンプリメント・テクノロジー社）を、単独で、または熱凝集ヒト免疫グロブリンＧ（５０μｇ／ｍｌの出発溶液を１：２５０に希釈した５μｌ）と共に、または増量させていく指示（indicated）ペプチド（２５０μＭストック）と共に、３７℃で９０分間インキュベートし、ＰＢＳで１１μｌの総体積まで体積を増やした。インキュベーション後、等量のローディングバッファーを全ての試料に添加し、その後煮沸し、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて１４０ボルトで６０分間、電気泳動した。その後、ゲルをニトロセルロースに転写し、ＰＢＳ中の脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）でブロッキングした。ブロットを１：２，０００に希釈したＣ１sに対するヤギポリクローナル抗体（クイデル社（Quidel））でプローブし、ＰＢＳ／０．１％トウィーン−２０で洗浄し、その後に１：１０，０００に希釈したＨＲＰ共役ロバ抗ヤギＩＲＤｙｅ６８０抗体（Ｌｉ−ｃｏｒバイオサイエンス社（Li-cor Biosciences））が続いて、ＰＢＳ／０．１％トウィーンで洗浄した。その後、ブロットをバージョン３．０ソフトウェア（Ｌｉ−ｃｏｒバイオサイエンス社）を用いるＯｄｙｓｓｅｙ  ｉｍａｇｅｒでイメージングし、酵素前駆体種に対して活性化Ｃ１sの特徴であるＣ１sの重鎖および軽鎖の量から、Ｃ１ｓの活性化を測定した。
【００７７】
実施例４：Ｃ４活性化試験
Ｃ４活性化試験はMallik et al., 2005. J. Med. Chem. 48, 274-286から適応した。Ｉｍｍｕｌｏｎ−２、９６ウェルプレートのウェルを被膜緩衝液中の５０μｌの１．０ｍｇ／ｍｌオボアルブミン（フィッシャー社（Fisher））で被膜し、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔで洗浄し、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで室温で２時間ブロッキングした。プレートを再度洗浄した後、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで１：２，０００に希釈したウサギ抗オボアルブミン抗体（ミリポア社）と共に室温で１時間インキュベートした。このインキュベーションの間、ペプチドを１０％ＮＨＳ／ＧＶＢＳ＋＋で０．５ｍＭに希釈し、３７℃で１５分間インキュベートした。その後プレートを洗浄し、ＧＶＢＳ＋＋で１：４に希釈し予めインキュベートした試料をプレートに添加し、室温で３０分間インキュベートした。その後、プレートを洗浄し、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで１：２，０００に希釈したヤギ抗Ｃ４抗体（コンプリメント・テクノロジー社）を１時間加え、その後再度洗浄し、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで１：２，０００に希釈したロバ抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（サンタクルーズバイオテクノロジー社）を１時間加えた。その後、プレートを発色させ、吸光度値を前述のように測定した。
【００７８】
実施例５：溶血試験
ペプチドを無希釈のＮＨＳまたはＢ因子枯渇ヒト血清（コンプリメント・テクノロジー社）で１．４ｍＭまたは０．７７ｍＭに希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、これらのペプチドをＧＶＢＳ＋＋で希釈して２．５％ＮＨＳに等しくし、そのうちの０．２５ｍｌを０．４ｍｌのＧＶＢＳ＋＋および０．１ｍｌの感作ヒツジ赤血球（ＲＢＣ）と混合し、再び３７℃で１時間インキュベートした。手順（procedure）を４．０ｍｌのＧＶＢＳ−−を添加することにより止めて、１，６２０×ｇで５分間遠心し、その上清の吸光度を分光光度計において４１２ｎｍで測定した。各試料の溶解率をＮＨＳのみの対照の溶解率に対し標準化した。
【００７９】
実施例６：Ｂ因子枯渇血清中の極性取り合わせペプチドの溶血試験滴定
極性取り合わせペプチドを図７に示されるように無希釈のＢ因子枯渇ヒト血清（コンプリメント・テクノロジー社）で段階希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。Ｂ因子枯渇血清単独、０．７７ｍＭのΔ８−２２およびＤＭＳＯを対照として含む。その後、これらのペプチドをＧＶＢＳ＋＋で希釈して２．５％ＮＨＳに等しくし、そのうちの０．２５ｍｌを０．４ｍｌのＧＶＢＳ＋＋および０．１ｍｌの感作ヒツジ赤血球（ＲＢＣ）と混合し、再び３７℃で１時間インキュベートした。手順を４．０ｍｌのＧＶＢＳ−−を添加することにより止めて、１，６２０×ｇで５分間遠心し、その上清の吸光度を分光光度計において４１２ｎｍで測定した。各試料の溶解率をＮＨＳのみの対照の溶解率に対し標準化した。
【００８０】
実施例７：統計解析
実験を再現するため、平均値および平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を、当該技術分野において周知の技術（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ＸＰ）を用いて計算した。
【００８１】
実施例８：ペプチドオリゴマー形成の質量分析
質量分析前に合成ペプチドを以下の通りにＣ１８  ＺｉｐＴｉｐｓ（商標）（ミリポア社）で精製した：１０μｌの７０％アセトニトリル（ＡＣＮ）／０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）をＺｉｐＴｉｐを通して２回ピペッティングし樹脂を濡らし、その後１０μｌの０．１％ＴＦＡで２回洗浄して樹脂を平衡化した。酸性化したペプチド試料をＺｉｐＴｉｐを通し吸引して５回上げ下げし、ペプチドを樹脂に結合させた。混入物を、ＺｉｐＴｉｐを通して０．１％ＴＦＡを３回ピペッティングすることにより洗浄し、その後、７０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡを用いて結合したペプチドを新しいチューブに溶出させた。ペプチドをスピードバックで乾燥させ、１０μｌの０．１％ＴＦＡに再懸濁させ、その後、分析前に１：４の比で基質（α−シアノ−４ヒドロキシ桂皮酸またはシナピン酸）と混合した。Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ  ＩＩ（商標）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦを用いて質量分析を行い、データを陽反射モードおよび陽線形モードの両方で得た。
【００８２】
実施例９：Ｅ２３Ａペプチドの相同性モデリング
Ｅ２３Ａのアミノ酸配列をＣＰＨｍｏｄｅｌｓ３．０サーバー（http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/; Lund et al., 2002. Abstract at the CASP5 conference A102）にアップロードした。プログラムによりＥ２３Ａはリョクトウ植物デフェンシン１（ＶｒＤ１）と配列比較され、それにより、構造モデルを作成するための鋳型およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）座標が得られた。その後、Ｅ２３ＡのＰＤＢ座標をＪＭｏｌのＦｉｒｓｔＧｌａｎｃｅ、バージョン１．４５（http://firstglance.jmol.org）にアップロードして、構造を可視化した。
【００８３】
結果
実施例１０：ＣＰはＣ１ｑ結合においてＨＮＰ−１ペプチドと競合する
初期の研究によって、組換えバキュロウイルスにより発現されるタンパク質として発現され、昆虫細胞溶解産物から精製されたＣＰは、効率的にＣ１ｑおよびＭＢＬと結合することができ、その結果、古典補体経路およびレクチン補体経路を阻害できることが明らかにされた（Bonaparte et al., 2008, Hair et al., 2010）。それ以前に、ヒト好中球デフェンシン−１（ＨＮＰ−１）ペプチドは、Ｃ１ｑおよびＭＢＬと結合可能であり、補体の古典経路およびレクチン経路の活性化をそれぞれ調節することが示された（van den Berg et al., 1998. Blood. 92, 3898-3903; Groeneveld et al., 2007. Molec. Immunol. 44, 3608-3614）。ＣＰもこれらの特性を有することを前提として、両タンパク質のアミノ酸配列を分析し、限定的な相同性領域がＨＮＰ−１およびＷＴ  ＣＰの７９〜１３９番目の残基間に発見した。その後、ＣＰがＣ１ｑへの結合においてＨＮＰ−１と直接競合することができるかどうかを、ＨＮＰ−１ペプチドをＥＬＩＳＡプレート上に被膜する競合ＥＬＩＳＡ法を用いて分析した。図１は、ＣＰがＣ１ｑへの結合において、ヒト好中球デフェンシン１（ＨＮＰ−１）と用量依存的に競合することを示すグラフである。一定量の精製Ｃ１ｑおよび増量させていくＣＰを、同時に加えた。ＨＮＰ−１に結合した付着Ｃ１ｑを、Ｃ１ｑに対するポリクローナル抗体で検出した。結合Ｃ１ｑのシグナルはＣＰ量が増加するにつれ減少したが、このことは、ＣＰがＣ１ｑ結合においてＨＮＰ−１と用量依存的に競合することを示している（図１、丸として表示）。対照的に、ＢＳＡをＣＰと置き換えた場合、Ｃ１ｑの結合における競合は検出さず（図１、三角として表示）、同様の競合の欠如がアルドラーゼおよび卵アルブミンに見られた（データ未記載）。さらに、ＨＮＰ−１の代わりにＢＳＡをプレート上に被膜した場合、結合は見られなかった。いかなる理論にも束縛されるものではないが、このデータは、ＨＮＰ−１およびＣＰが同等にＣ１ｑと結合し、古典経路の活性化を調節すること矛盾しない（Hair et al., 2010. J. Virol. 82, 817-827）。
【００８４】
実施例１１：Ｃ１ｑへの結合においてＷＴ  ＣＰと競合する、ＨＮＰ−１に対し相同性を有するＣＰペプチドの同定
ＣＰはＣ１ｑへの結合においてＨＮＰ−１と効率的に競合するため、ＣＰおよびＨＮＰ−１がアミノ酸配列レベルで相同性を共有しているかどうかを分析した。７８７個のアミノ酸からなるＣＰ分子と３０個のアミノ酸からなるＨＮＰ−１ペプチドの配列比較をＣｌｕｓｔａｌ  Ｗを用いて行った（Larkin et al., 2007. Bioinformatics. 23, 2947-2948）。相同性領域をＨＮＰ−１およびＣＰ分子の７９〜１３９番目の残基の間に確認した（図２Ａ）。このＣＰ配列がＷＴ  ＣＰの補体調節機能を保持しているかどうかを確認するために、ＣＰ分子の７９〜１０８番目（ＣＰ１）および１０９〜１３８番目（ＣＰ２）の残基をコードする、３０個の残基からなるペプチドを２つ合成した（図２Ａ）。ＣＰ１はＨＮＰ−１の最初の１０残基と並べ、一方、ＣＰ２は最後の２０残基と並べた。ＣＰ１およびＣＰ２のペプチドが、Ｃ１ｑと直接結合し、Ｃ１ｑへの結合においてＷＴ  ＣＰと競合可能であるかどうかを確認するために、ＣＰ１およびＣＰ２がＥＬＩＳＡプレート上に被膜される競合ＥＬＩＳＡ法を行った。一定量の精製Ｃ１ｑおよび増量させていくＷＴ  ＣＰを同時に添加し、その後結合したＣ１ｑをＣ１ｑに対するポリクローナル抗体で検出した。ＣＰが存在しない場合、Ｃ１ｑはＣＰ１ペプチドにより効率的に結合されるが；ＣＰを増量するにつれてＣ１ｑのシグナルは減少し、このことは、Ｃ１ｑ結合においてＣＰがＣＰ１と用量依存的に競合することを示している（図２Ｂ、点線で表示）。同じ条件下でＢＳＡをＣＰと置き換えた場合、ＣＰ１はＣ１ｑに効率的に結合し、競合は確認されなかった（図２Ｂ、三角で表示）。ＣＰ１と対照的に、ＣＰ２はＣ１ｑ結合において競合しなかった（図２Ｂ、四角で表示）。従って、ＣＰの７９〜１０８番目までの残基で、ＷＴ  ＣＰと同程度にＣ１ｑと結合するのには十分である。
【００８５】
実施例１２：ＣＰのペプチド誘導体のＣ１ｑへの結合
ＣＰ１ペプチドのＷＴ  ＣＰと同程度にＣ１ｑと競合的に結合する能力から、これらの活性に重大な意味を持つペプチド残基が最初に解析されることとなった。上記表１に示すように、親ＣＰ１ペプチドを標的アミノ酸置換および大部分欠失させたものを合成した。Ｃ０４ＡおよびＣ２７Ａを設計し、ＣＰ１内の２つのシステイン残基間の推定ジスルフィド結合がＣ１ｑ結合および補体活性化調節に必要であるかどうかを評価した。Ｅ２３ＡおよびＥ２５Ａを合成し、これらの負に帯電しているグルタミン酸残基がＣ１ｑ結合および補体調節に必要であるかどうかを評価した。最後に、８〜２２番目の内部残基を除去しているペプチド（Δ８−２２）を設計し、ＨＮＰ−１と相同性を持たないこの領域がＣ１ｑ結合および補体活性化調節に必要であるかどうかを決定した。このΔ８−２２ペプチドは、前記２つのシステインおよび２つのグルタミン酸残基を保持している。
【００８６】
これらのペプチドがＣ１ｑと結合することができるかどうかを確認するために、種々のペプチド誘導体をＥＬＩＳＡプレート上に被膜する結合実験を行った。増量させつつ精製Ｃ１ｑを加え、その後結合したＣ１ｑをＣ１ｑに対するポリクローナル抗体で検出した。ＣＰ１は用量依存的にＣ１ｑと結合し（図３Ａ）、Ｃ１ｑ結合においてＷＴ  ＣＰと競合するその能力と一貫していた（図２Ｂ）。ＣＰ２はＨＮＰ−１と同じレベルでＣ１ｑと結合し（図３Ａ）、このことは、このペプチドが、Ｃ１ｑ結合においてＣＰと競合しないが、恐らくＨＮＰ−１のＣ末端の２０アミノ酸に対するその相同性の結果として、Ｃ１ｑと結合する能力は保持していることを示している。次に、Ｃ０４ＡおよびＣ２７ＡのＣ１ｑへの結合能を分析したところ、両方のペプチドがＣＰ１と同様にＣ１ｑと結合した（図３Ｂ）。Ｅ２３ＡおよびＥ２５ＡがＣＰ１およびＣＰ２の間のレベルでＣ１ｑと結合することが分かり（図３Ｃ）、この傾向はΔ８−２２ペプチドにも観察された（図３Ｄ）。
【００８７】
要約すると、全てのＣＰ１誘導体ペプチドはＣ１ｑと結合するが、その結合の程度はアミノ酸置換に依存して変化する。いかなる理論にも束縛されるものではないが、システイン（Ｃ０４およびＣ２７）残基もグルタミン酸（Ｅ２３およびＥ２５）残基も、どちらもＣ１ｑ結合においては決定的な役割を担っているようには思われない。さらに、Δ８−２２ペプチドは、ＣＰ１の１５個の内部アミノ酸残基の欠失を有しているが、Ｃ１ｑ結合活性をなお保持している。従って、ＣＰ１誘導体によって、Ｃ１ｑへの結合がグルタミン酸残基にもシステイン残基にも依存していないことが個々に明らかされ、このことは、ジスルフィド結合による環化（cyclicalization）は必要ないことを示している。
【００８８】
実施例１３：ＣＰ１ペプチドはＣ１ｓの活性化を調節する。
精製ＣＰは、Ｃ１ｑと結合し酵素前駆体Ｃ１ｓの切断を阻止することによって、Ｃ１の位置（level）で古典経路の活性化を調節することができる（Hair et al., 2010. J. Virol. 82, 817-827）。ＣＰ１ペプチドおよびＣＰ２ペプチドがＣ１活性化も調節可能であるかどうかを評価するために、部分精製されたＣ１複合体を、ＣＰ１およびＣＰ２の量を増加させつつ熱凝集型ＩｇＧ（古典経路の活性化の強力な刺激物質）と共に３７℃で９０分間インキュベートした。Ｃ１ｓ活性化を評価するために、酵素前駆体Ｃ１ｓの重鎖および軽鎖への切断を検出した。Ｃ１単独のインキュベーションはＣ１ｓの最小限の自発的活性化を示しただけだが、熱凝集型ＩｇＧ存在下でのＣ１は強力なＣ１ｓの切断を示した（図４Ａ、レーン１および２）。Ｃ１および熱凝集型ＩｇＧを、ＣＰ１を増量させつつインキュベーションしたところ、自発的なＣ１活性化で観察されたレベル（図４Ａ、レーン１）まで、Ｃ１ｓ切断を用量依存的に抑制した（図４Ａ、レーン３〜６）。ＣＰ１とは対照的に、ＣＰ２は、試験されたどの濃度においても、Ｃ１ｓ切断の有意な調節を示さなかった（図４Ｂ、レーン３〜６）。ＣＰ１およびＣＰ２対して、それぞれのペプチドに対する２つの独立した実験におけるＣ１ｓ切断調節のＯｄｙｓｓｅｙ  ｉｍａｇｉｎｇによる定量化によって、これらの結果は確認された（図４Ｃ〜４Ｄ）。ＣＰ２はＣ１ｑに対し僅かな結合しか示さず（図３Ａ）、Ｃ１ｓ切断を調節する能力を示さなかったが（図４Ｂおよび４Ｄ）、ＣＰ１とＣＰ２を組み合わせることによって、ＣＰ１単独よりもより大きなＣ１ｓ切断調節がもたらされるかどうかを試験した。一緒のＣＰ１およびＣＰ２は、ＣＰ１単独で観察されたもの以上のＣ１ｓ切断調節をもたらさなかった。ペプチド誘導体のＣ１ｑと結合する能力に一貫して、全てのＣＰ１ペプチド誘導体は、ＣＰ１で示されたようにＣ１ｓ活性化を阻害することも分かった（データ未記載）。いかなる理論にも束縛されるものではないが、古典経路の第一成分であるＣ１で活性化を調節するＣＰ１の能力は、このペプチドが、ＷＴ  ＣＰと同様に古典経路の活性化を調節することを示している。
【００８９】
実施例１４：機能分析におけるＣＰペプチドによる補体活性の調節
機能分析においてペプチド化合物の補体活性化調節能を測定するために、Ｃ４活性化試験および溶血試験を用いた。Ｃ４活性化試験として、当該技術分野において周知の方法（Mallik et al., 2005. J. Med. Chem. 48, 274-286）を改変して、ＥＬＩＳＡプレートをオボアルブミンで被膜し、それに抗オボアルブミン抗体を結合させ、免疫複合体標的を模倣した。その後、種々のペプチド化合物を１０％ＮＨＳ／ＧＶＢＳ＋＋で０．５ｍＭに希釈し、１５分間インキュベートした後、各ウェルに添加した。古典経路の活性化（Ｃ４）を、抗Ｃ４ポリクローナル抗体を用いてＣ４断片の沈着を検出することによって解析した。図５に示すように、ＮＨＳ単独、ＮＨＳ＋ＢＳＡ、およびＮＨＳ＋ＤＭＳＯは全て、同様のＣ４断片の沈着を示したが、一方、ＷＴ  ＣＰで処理されたＮＨＳはＣ４活性化を調節した。ＣＰ１は３５％の阻害効果を示したが、一方ＣＰ２はＣ４活性化に対し効果を与えず、このことはＣ１ｓ活性化で観察された結果と一貫している（図４）。Ｃ０４Ａ、Ｃ２７Ａ、Ｅ２５Ａ、およびΔ８−２２のペプチド化合物は全て、Ｃ４の補体活性化を２０〜４５％阻害した。Ｅ２３ＡはＣ４活性化を強力に９０％抑制した。
【００９０】
ペプチド化合物による血清中補体活性の調節を、標準的な溶血性補体分析で評価した。ヒツジ赤血球を抗体で感作し、ＮＨＳと共にインキュベートし、その際ペプチドのプレインキュベーションはあってもなくてもよく、そして溶血性補体活性を測定した。Ｃ４活性化試験とは対照的に、３つの補体経路（典型、レクチンおよび副）全てが存在し、観察された調節活性に寄与した可能性がある。しかし、初期の補体活性化は、赤血球に対する抗体、従って古典経路によって、最初に惹起される。図６Ａに示されるように、ＮＨＳは、単独またはＤＭＳＯ存在下で、予想通りに赤血球を溶解させた。ＣＰ２は、ＣＰ２ペプチドが調節効果を持たなかったＣ４活性化試験とは対照的に、ＣＰ１（６６％阻害）と同じようなレベルに溶解を調節した。Ｃ０４Ａは赤血球溶解に対し最小の効果しか持たなかったが、一方Ｃ２７Ａはより阻害的であった（８５％阻害）。Ｃ４活性化試験で見られた効果と同様に、Ｅ２３Ａは、６０％の阻害を有したＥ２５Ａと比較して赤血球溶解を効率的に阻害（８５％阻害）した。Δ８−２２ペプチド化合物は赤血球溶解を７５％阻害した。
【００９１】
本ペプチドが副経路の活性化を調節するかどうかを試験するために、最小限の阻害しかＮＨＳで生じないように、プレインキュベーション中に用いる血清の量を増加させて、効率的に試験ペプチドの濃度を０．７７ｍＭまで低下させた（図６Ｂ）。次に、古典経路単独に対する本ペプチドの調節活性を、溶血試験においてＢ因子枯渇血清を用い、同量のペプチドおよび血清を使用することで、評価した（図６Ｂ）。ＮＨＳで見られた調節欠如とは対照的に、親ペプチドＣＰ１は、Ｂ因子枯渇血清中で補体古典経路の活性化を調節した。さらに、ペプチド化合物Ｅ２３Ａ、Ｅ２５Ａ、およびΔ８−２２は、補体古典経路の活性化を有意に調節した。いかなる理論にも束縛されるものではないが、より大量の血清においては、副経路がより効率的に活性化され始め、いくつかのペプチドが、補体活性化全体ではないが古典経路の活性化を効率的に調節し続け、このことは、副経路が溶血を媒介していることを示している。図５および６の調節活性の比較は、Ｅ２３Ａが優良な補体調節を及ぼすことを示している。
【００９２】
極性取り合わせペプチドは、ＮＨＳおよびＢ因子枯渇血清での溶血試験において古典経路活性の有意な調節を最初に示した（データ未記載）。このペプチドの古典経路に対する調節活性をさらに調査するために、極性取り合わせペプチドの希釈をＢ因子枯渇血清で行った。ＮＨＳ単独およびＤＭＳＯビヒクルで見られた調節欠如とは対照的に、極性取り合わせペプチドは、Δ８−２２よりも有意に優って古典経路の活性化を用量依存的に調節した（図７、０．７７ｍＭのΔ８−２２と０．７７ｍＭの極性取り合わせを比較せよ）。
【００９３】
実施例１５：ＣＰペプチドは高次構造にオリゴマー形成しない
ＣＰペプチドの特性をさらに明らかにするために、これらの化合物が二量体、三量体等の高次構造にオリゴマー形成できるかどうかを評価した。ＣＰペプチドのオリゴマー化を評価するために、線形および反射モードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析で、表１の７種類のＣＰペプチド全てを分析した。両方のモードにおいて、全てのペプチドが、主要なピークを持たず、試験ペプチドの理論的質量よりも大きな質量電荷比（ｍ／ｚ）を保有する単量体であることが分かった。図８Ａ〜８Ｂは、線形モードおよび反射モードの両方をそれぞれ示している。線形モードは反射モードよりもより低い分解能であったが、両方のモードによって、Ｅ２３Ａが明らかな高次ピークを他に持たない単量体であることが示された。
【００９４】
実施例１６：植物デフェンシンＶｒＤ１との相同性に基づくＥ２３Ａの構造モデル
Ｅ２３Ａを古典経路活性化の非常に強力な調節物質とする同定を前提として、Ｅ２３Ａペプチドの構造モデルを作製した。Ｅ２３Ａのアミノ酸配列をＣＰＨｍｏｄｅｌｓ−３．０サーバーにアップロードした。このプログラムはタンパク質相同性モデリングの情報源（resource）であり、そこで、鋳型認識は二次構造によって導かれるプロファイル‐プロファイル配列比較（profile-profile alignment）および曝露（exposure）予測に基づいている（Lund et al., 2002. Abstract at the CASP5 conference A102）。ＣＰおよびＨＮＰ−１間の上述した相同性と一貫して、ＣＰＨｍｏｄｅｌｓ３．０はＥ２３Ａの２〜２９番目の残基を、植物デフェンシン、リョクトウ植物デフェンシン１（ＶｒＤ１）の４６残基のうち１７〜４４番目の残基に対し配列比較した（図９Ａ）。ＶｒＤ１の核磁気共鳴溶液構造（Liu et al., 2006. Proteins. 63, 777-786）に基づいて、Ｅ２３ＡのモデルをＣＰＨｍｏｄｅｌｓ３．０によって作製し、ＪＭｏｌのＦｉｒｓｔＧｌａｎｃｅに表示した（図９Ｂ）。図９Ａは、１１残基のＮ末端αヘリックスと、それに続く２つの逆平行βストランドを示している。αヘリックスおよびβストランドは、２本の、３〜５残基の不規則なループによって連結されている。２つのシステイン残基は、αヘリックスと２つ目のβストランド間でジスルフィド結合を形成していることが示され（細い円柱として表示）、これは全体構造を安定化させるのに機能し得る。
【００９５】
理論的なペプチド化合物設計
実施例１７：ＣＰ１のペプチド類似体の合成
ＣＰ１のペプチド類似体は商業的に合成されている。その後、これらの改変ペプチドを、当該技術分野において周知の結合実験において、Ｃ１ｑおよびＭＢＬとの相互作用について解析する（Hair et al., 2010. Molec. Immunol. 47, 792-798).）。これらの解析について以下に簡潔に説明する。
【００９６】
実施例１８：Ｃ１ｑ結合
ＣＰペプチド類似体を種々の濃度でマイクロタイタープレート上に被膜し、それらの精製Ｃ１ｑ（コンプテック社（CompTech））との結合能について解析する。Ｃ１ｑ結合を、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体（クイデル社（Quidel））と、続くロバ抗マウスＨＲＰ（サンタクルーズ・バイオテック社（Santa Cruz Biotech））で検出する。次に、プレートをテトラメチルベンジジン（tetramethyl benzindine）で発色させ、反応をＨ２ＳＯ４で終了させ、吸光度を４５０ｎｍで測定する。Ｃ１ｑ結合の正の対照はＣＰ１から成り、一方負の対照はＢＳＡである。各ペプチドの結合の初期条件を決定し、その後ペプチドの連続希釈を３連で行って、以前報告されたように（Hair et al., 2010. Molec. Immunol. 47, 792-798）、統計的有意性を決定し、最大半量結合値（half-maximal binding value）を計算する。最大半量結合値を用いて、各ペプチド類似体の相対結合親和性を評価する。
【００９７】
実施例１９：ＭＢＬ結合
ＭＢＬ結合を上述のＣ１ｑ結合実験と同様に行う。精製ヒトＭＢＬおよびヤギ抗ＭＢＬ血清、続いてロバ抗ヤギＨＲＰを、ＭＢＬの検出のために使用する。再度、最大半量結合値を計算し、ペプチド化合物間で比較する。
【００９８】
機能分析において、ＣＰペプチド誘導体のＣ１およびＭＢＬの活性化を阻害する能力を試験した。機能分析において、Ｃ１ｑおよびＭＢＬに特異的に結合するＣＰペプチド類似体を、それらの古典経路およびレクチン経路の活性化を阻害する能力について評価する。Ｃ１およびＭＢＬの阻害についての特異性試験に加えて、抗体惹起補体活性化試験（antibody-initiated complement activation assay）を使用して、ヒトおよびラット両方の血清中のペプチド類似体のＩＣ５０値を決定する。これにより、ペプチドの相対機能活性の直接的な比較が可能となる。
【００９９】
実施例２０：Ｃ１活性化試験
ペプチド化合物を、Ｃ１ｓ免疫ブロット切断試験において、Ｃ１活性化を阻害するそれらの能力について解析する。Ｃ１（コンプテック社）および熱凝集型ＩｇＧを、増量させていくペプチドと共にインキュベートする。Ｃ１ｓを、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線撮像系（Ｌｉ−Ｃｏｒバイオサイエンス社）での分析のために、Ｃ１ｓに対するヤギポリクローナル抗体（クイデル社）と、続く赤外色素標識ロバ抗ヤギ抗体（Ｌｉ−Ｃｏｒバイオサイエンス社）で検出する。熱凝集型ＩｇＧ非存在下または存在下のＣ１は、それぞれＣ１ｓ切断の負の対照および正の対照として各ブロット上に含まれる。種々のＣＰペプチドによるＣ１ｓ切断の阻害の程度を比較するために、Ｏｄｙｓｓｅｙ３．０ソフトウェアを用いてＣ１ｓの重鎖および軽鎖をＣ１ｓ前駆物質に対して定量化し、Ｃ１活性化の百分率を決定する。ＣＰ１＋熱凝集型ＩｇＧはＣ１ｓ切断阻害の正の対照として機能し、必要ならば、実験間の値を標準化するためにも使用することができる。
【０１００】
実施例２１：ＭＢＬ活性化試験
市販のＭＢＬ活性化試験（ハイカルト社（HyCult））を使用し（Hair et al., 2010. Molec. Immunol. 47, 792-798）、ＣＰペプチド類似体を評価した。正常ヒト血清（ＮＨＳ）を増量させていく前記ペプチドと共にインキュベートし、市販キットを用いてレクチン経路阻害について評価した。ＮＨＳ単独はレクチン活性化の正の対照として機能し、一方、熱不活性化ＮＨＳは活性化の負の対照として機能する。レクチン経路活性化の阻害を明らかにするためにＮＨＳ＋ＣＰを対照として用いる。
【０１０１】
あるいは、当該技術分野において周知のレクチン活性化試験（Groeneveld et al., 2007. Molec. Immunol. 44, 3608-3614）を用いて、ペプチド化合物を評価した。
【０１０２】
実施例２２：抗体惹起血清中補体活性化試験
ＣＰ１の阻害活性とそのペプチド類似体を直接的に比較するために、抗体惹起血清中補体活性化試験を用いた。この試験はＪｏｈｎ  Ｌａｍｂｒｉｓ博士および共同研究者（ペンシルバニア大学）がコンプスタチンおよびその類似体のＩＣ５０値を算出するために使用したプロトコールを改変したものである（Mallik et al., 2005. J. Med. Chem. 48, 274-286）。補体活性化阻害を、ＮＨＳ中のオボアルブミン‐抗オボアルブミン複合体への血清Ｃ４固定の阻害を測定することで評価する。マイクロタイター（microtiter）のウェル（well）をオボアルブミン（１０ｍｇ／ｍｌ）で被膜する。次に、ウェルをＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）で室温で１時間飽和させ、１：２，０００希釈のウサギ抗オボアルブミン抗体を加えて免疫複合体を形成させることで、補体を活性化することができる。次に、種々の濃度のペプチドを各ウェルに直接添加し、続いてＧＶＢ＋＋で１：８０に希釈したＮＨＳを添加する。３０分インキュベートした後、１：２，０００希釈のヤギ抗Ｃ４抗体と、続く１：２，５００希釈のロバ抗ヤギＨＲＰ二次抗体を用いて、結合したＣ４を検出する。次に、プレートをテトラメチルベンジジン（tetramethyl benzindine）で発色させ、反応をＨ２ＳＯ４で終了させ、吸光度を４５０ｎｍで測定する。阻害率を、１００％の活性化がペプチド非存在下で起こる活性化と等しいと見なして標準化する。活性化の負の対照として熱不活性化ＮＨＳを使用する。活性化阻害の対照としてＮＨＳ＋ＣＰ１を用いる。
【０１０３】
ペプチド濃度に対して阻害率をプロットして、選択されたペプチド化合物のＩＣ５０値を決定する。ＣＰは古典経路およびレクチン経路を介してＣ４活性化を阻害し、ＣＰの副経路の活性化に対する効果はごく僅かであった（Bonaparte et al., 2008. J. Virol. 82, 817-827, Hair et al., 2010. Molec. Immunol. 47, 792-798）。基準としてＣＰ１を用いることで、全てのペプチド化合物の相対的な阻害活性はこのように直接的に測定される。
【０１０４】
正常ラット血清（ＮＲＳ）中のＣＰペプチドのＩＣ５０値を測定する。野生型ＣＰおよびＣＰ１は、ＮＲＳ中の抗体惹起補体活性化を抑制することが示されている（Hair et al., 2010. Molec. Immunol. 47, 792-798）。ＮＲＳ中のペプチド化合物のＩＣ５０値の決定は、ラットにおける投与量決定実験に非常に重要である。
【０１０５】
他の態様、変態、および実施形態は、以下の請求項の範囲内である。
【０１０６】
参考文献：
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【図１】
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【図２】
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【図３（Ａ）】
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【図３（Ｂ）】
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【図３（Ｃ）】
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【図３（Ｄ）】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８（Ａ）】
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【図８（Ｂ）】
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【図９（Ａ）】
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【図９（Ｂ）】
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【配列表】
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