(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列ＥＱＬＫＫＳＫＴＬを有し、かつアミノ酸数が１５個以下であるポリペプ
チドを含む、炎症性疾患の治療用医薬組成物。
【請求項２】
前記ポリペプチドのアミノ酸数が１２個以下であることを特徴とする請求項１に記載の
医薬組成物。
【請求項３】
前記ポリペプチドが環状構造を有することを特徴とする請求項１〜２のいずれか１項に
記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ポリペプチドがアミノ酸配列ＣＥＱＬＫＫＳＫＴＬＣを有することを特徴とする請
求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ポリペプチドが環状構造を有することを特徴とする請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記炎症性疾患がアテローム性動脈硬化性疾患である、請求項１〜５のいずれかに記載
の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症およびアテローム形成を伴う疾患に関与するＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）に関する。ヒトＣＤ１５４としても知られているＣＤ４０リガンドは３３ｋＤａのII型膜貫通型タンパク質であり、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）遺伝子スーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ４０Ｌは活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞および活性化血小板に選択的に発現されるが、他の造血・非造血細胞（たとえば上皮細胞や内皮細胞など）でも見られる。
【背景技術】
【０００２】
膜結合型ＣＤ４０Ｌは、ＴＮＦファミリーの他のすべてのメンバーと同様にトリマーとして存在し、この形態においてのみ十分な生物学的活性を発揮する。可溶性ＣＤ４０Ｌは、血液中では大部分がモノマーとして存在するが、高濃度になるとトリマーを形成する。ＣＤ４０Ｌは当初ＣＤ４０のリガンドとして同定されたが、近年ＣＤ４０レセプターとしてインテグリンαIIｂβ３、α５β１およびＭａｃ−１がさらに同定されている。
【０００３】
マクロファージ１抗原（Ｍａｃ−１）は、ヘテロダイマーのインテグリン分子αＭβ−２（αＭβ２）を構成するサブユニットタンパク質の１つであるインテグリンαＭ（ＩＴＧＡＭ）としても知られている。αＭβ２は、単球、顆粒球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞などの自然免疫系に関与する様々な白血球の表面に発現されている。αＭβ２は白血球の接着および遊走を制御することにより炎症を媒介し、食作用、細胞媒介性細胞傷害、走化性、細胞の活性化などの免疫反応のいくつかにも関与している。
【０００４】
ＣＤ４０Ｌはアテローム性動脈硬化症などの慢性炎症性疾患に関与する。ＣＤ４０Ｌはその古典的レセプターであるＣＤ４０と相互作用することによってＢ細胞およびＴ細胞の機能を制御する。さらに、ＣＤ４０Ｌは血小板インテグリンαIIｂβ３と相互作用することによって血栓を安定化する。抗ＣＤ４０Ｌ抗体療法は臨床試験の初期段階において有望な結果が得られたものの、血栓塞栓性合併症が頻発したため研究が中止された。また、ＣＤ４０Ｌの長期阻害は慢性炎症性疾患の治療に最も必要とされるものであるが、宿主の免疫防御を著しく損なってしまう。したがって、ＣＤ４０Ｌ全体の阻害は魅力的な治療方法とは言えない。Zirlikら, Circulation, 2007, 1571-1580には、マウスにおいてＣＤ４０ＬがＣＤ４０を介さずにアテローム形成を媒介したことが既に報告されており、ＣＤ４０Ｌと白血球インテグリンＭａｃ−１とが相互作用することが新たに示された。しかしながら、この文献では、インビトロにおいてＭａｃ−１タンパク質全体のどの部位がＣＤ４０Ｌと相互作用するのかについては開示されていない。また、ペプチドや特異抗体によるターゲティングは試みられていない。
【０００５】
ＷＯ２００４／０４５５４２には、細胞表面上に発現されたリガンドに特異的に結合可能なペプチドと親水性ポリマーとを含む治療用バイオコンジュゲートが開示されている。このポリペプチドはＣＤ１１ｂＩドメインなどの様々な配列から得ることができる。
【０００６】
ＷＯ９１／１９５１１には、β２インテグリンサブユニットＣＤ１１ｂの一部を含む治療用ペプチド組成物を投与することを含む、ヒト患者における食細胞媒介性組織傷害（たとえば炎症など）の抑制方法が開示されている。しかしながら、開示されているペプチドは本発明のペプチドとは異なるものである。さらに、この文献においてアテローム性動脈硬化症は主要な標的ではない。
【０００７】
Wolfら, “Interaction of CD40L with the Leukocyte Integrin Mac-1: A New Pathway for CD40L-Mediated Inflammation in Atherogenesis”, Heart, Lung and Circulation, vol. 17, January 1, 2008, p. S 240には、ＣＤ４０Ｌ媒介性炎症の第２経路としてＣＤ４０ＬとＭａｃ−１との相互作用が記載されている。記載されているメカニズムによって、アテローム形成における炎症性シグナル伝達をより深く理解することができる。しかしながら、この文献の要約には結合部位や特異的ペプチド・抗体についての記載はない。
【０００８】
Liら, The American Journal of Pathology, vol. 172 (2008), pp 1141-1151には、アテローム性動脈硬化症ではなく再狭窄を有する動物モデルが記載されている。ＣＤ４０ＬによるＭａｃ−１の発現誘導が開示されているが、ＣＤ４０ＬとＭａｃ−１との結合やこれを治療目的で使用することについては開示されていない。
【０００９】
Zhangら, J.Biol.Chemistry (1996), pp 29953-29957では、インテグリンαＭβ２のＩドメイン内に存在する不連続部位が同定されており、この不連続部位はインテグリンαＭβ２の接着活性を調節する。この領域は空間的に近接した２つの短いループで構成されていることが記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明において、上記の相互作用および治療のためのその使用は分子レベルで特徴付けられており、特徴的なＣＤ４０Ｌ結合部位として、Ｍａｃ−１ Ｉドメイン内のα１ヘリックスとβシートＢとの間の表面露出ループに存在するアミノ酸配列Ｅ１６２〜Ｌ１７０が同定されている。好適かつ安定な阻害性ペプチド（以下、ｃＭ７と称する）を用いたＣＤ４０Ｌ／Ｍａｃ−１結合のターゲティングによって、マウスにおける炎症およびアテローム性動脈硬化病変形成を特異的かつ最も効果的に抑制できることが立証された。したがって、ＣＤ４０Ｌ／Ｍａｃ−１相互作用を特異的に抑制することは、ＣＤ４０リガンドの機能全体を阻害するという望ましくない作用を引き起こすことなくアテローム性動脈硬化症および他の慢性炎症性疾患を治療できる新規かつ魅力的な抗炎症療法であると考えられる。
【００１１】
慢性炎症はアテローム性動脈硬化症を引き起こす。当初Ｔ細胞に関連して報告された腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーであるＣＤ４０Ｌは、アテローム形成の主要調節因子として関与している。ＣＤ４０Ｌの機能をブロックすると、アテローム性動脈硬化プラークの形成およびその進行が低減されるだけでなく、病変における単球数および脂質量が抑制され、かつ（ヒトにおける安定なプラークに一般的に見られる）膠原線維および平滑筋細胞が増加する。さらにＣＤ４０Ｌは、プラークの破壊に関与するコラゲナーゼの発現と、プラーク崩壊後の血栓形成のトリガーとなる組織因子の発現とを単球／マクロファージにおいて増大させる。驚くべきことにＣＤ４０Ｌは、骨髄由来細胞のＣＤ４０Ｌの関与やＣＤ４０Ｌの古典的レセプターであるＣＤ４０とは無関係に、アテロームの形成を促進させることが以前に報告されている。これらの知見は、ＣＤ４０ＬがＣＤ４０以外のレセプターと相互作用することにより、内皮細胞や平滑筋細胞などの血管細胞において一定の役割を果たしていることを示唆している。
【００１２】
本発明は、白血球インテグリンＭａｃ−１（免疫性、炎症および止血に関与する様々な公知のリガンドと相互作用する接着レセプター）とＣＤ４０Ｌとの相互作用に関する。中和抗体によりＭａｃ−１を阻害すると、単球の動員が阻害され、アテローム性動脈硬化病変の形成が顕著に抑制された。本発明においては、Ｍａｃ−１とＣＤ４０Ｌとの相互作用を期待される治療用途に用いることとする。
【００１３】
炎症はアテローム性動脈硬化症などの多くの慢性疾患を引き起こすが、炎症を選択的に抑制する治療法は現在ほとんど存在しない。アテローム性動脈硬化症に関して、スタチン類（様々な抗炎症作用を発揮する脂質低下剤）は上記のような選択的抑制を治療に応用できる可能性を垣間見させるものである。別種の薬剤であるＣｏｘ−２阻害剤は極めて広範な治療効果を示す良い例であるが、副作用のない抗炎症薬を開発することの難しさを示す例でもある。また、ＣＤ４０Ｌなどのサイトカインの全体的な阻害をターゲットとした従来のコンセプトは、急性または長期的な副作用が見られたことにより概して失敗に終わっている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、アミノ酸配列が明確に定義されたエピトープと特異的に結合する低分子ペプチド阻害剤および／または抗体を使用したＣＤ４０Ｌ／Ｍａｃ−１相互作用の特異的阻害、ならびに医薬組成物におけるこれらの使用に関する。配列ＥＱＬＫＫＳＫＴＬを含む上記ペプチドはＭａｃ−１ Ｉドメインの一部分を模倣しているため、ＣＤ４０Ｌ上の対応領域に結合する。上記抗体は（修飾後の）該ペプチド配列を認識するため、Ｍａｃ−１上のＥＱＬＫＫＳＫＴＬに結合する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｍａｃ−１ Ｉドメイン内の特徴的部位へのＣＤ４０Ｌの結合を示す。
【図２】インビトロおよびインビボにおいてペプチド拮抗剤の特性を評価した結果を示す。
【図３】インビトロおよびインビボにおけるＣＤ４０Ｌ／Ｍａｃ−１相互作用の炎症性細胞動員への寄与を示す
【図４】マウスにおけるＣＤ４０Ｌ／Ｍａｃ−１相互作用の特異的ブロッキングによるアテローム性動脈硬化症の抑制を示す。
【図５】Ｍａｃ−１ Ｉドメイン組換え変異体およびＣＤ４０Ｌ組換え変異体の細菌発現を示す。
【図６】インビトロおよびインビボにおけるｃＭ７を用いたペプチド処置が、細胞のアポトーシスおよび細胞毒性を引き起こさなかったことを示す。
【図７】インビトロにおける、Ｍａｃ−１ ＩドメインのＣＤ４０Ｌ結合部位に対する特異的モノクローナル抗体による白血球動員の調節を示す。
【図８】インビボにおけるｃＭ７処置が炎症の代表的特性に及ぼす影響を示す。
【図９】インビボにおける長期的ペプチド処置が免疫学的特性に及ぼす影響を示す。
【図１０】マウスにおいてＣＤ４０／Ｍａｃ−１相互作用が血栓形成および血栓の安定化を媒介しないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明に関連するアミノ酸配列は本発明を完成する過程において同定された。本発明のポリペプチドはアミノ酸配列ＥＱＬＫＫＳＫＴＬ（配列番号１）を含む。本発明において、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチドを使用することが必須である。しかしながら、たとえば上記アミノ酸配列に含まれる１つのアミノ酸を置換して、上記アミノ酸配列をわずかに修飾することも可能である。アミノ酸を置換しても、アミノ酸の極性は維持される。これは、疎水特性または親水特性を有するアミノ酸を、同じ特性を有する別のアミノ酸で置換することを意味する。たとえば、ロイシン残基をイソロイシン残基で置換したり、ロイシン残基をアルギニンで置換することが可能である。配列番号１のアミノ酸配列のうち１つアミノ酸のみを置換することが好ましい。
【００１７】
別の修飾方法として、欠失させてもペプチドの生物学的活性が維持されるようなアミノ酸を１つまたは場合によって２つ欠失させることができる。しかしながら、欠失させることが可能なアミノ酸がどれであるのかを注意深く見極めなければならず、ペプチド活性を注意深くモニターする必要がある。
【００１８】
上記ポリペプチドが有するアミノ酸は１５個以下であり、１２個以下であることがより好ましい。本発明のポリペプチドは、その生物学的活性に悪影響を及ぼさないアミノ酸をＮ末端および／またはＣ末端にさらに含んでいてもよい。
【００１９】
実験により、上記ペプチド配列のうち最も重要な部分はおそらくアミノ酸モチーフＱＬＫであろうことが示されている。したがって、医療目的に使用され得る抗体は上記モチーフＱＬＫを認識するものであることが好ましい。別の好ましい実施形態では、抗体が認識するモチーフはＥＱＬＫＫである。また、このモチーフは環状構造（すなわちＣＥＱＬＫＫＣ）で使用することもできる。
【００２０】
医薬組成物に使用するポリペプチドは、患者体内における分解に対して安定化されていなければならない。通常のペプチド分解が阻害または少なくとも遅延されるようにペプチド構造を化学的に修飾して安定化させる。別の好ましい方法では、所望の生物学的作用を保持させたままペプチドを環状化して安定化させる。環状ペプチド構造の利点は、分解が遅延することによりバイオアベイラビリティが増強されることである。好ましい実施形態では、上記ペプチドはアミノ酸配列ＣＥＱＬＫＫＳＫＴＬＣ（配列番号２）を有する。
【００２１】
さらに別の手法では、Ｎ末端またはＣ末端を修飾する。興味深い方法の１つでは、上記ペプチド分子にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）単位を直接結合させるか、好ましくはリンカーを介してＰＥＧ単位を結合させる。この方法により、ペプチド分子の安定性が向上するという利点が得られる。さらに、修飾されたペプチド分子は、患者の体内にとどまる時間が長くなるためバイオアベイラビリティが改善される。しかしながら、ペプチドの標的部位への結合を阻害するような立体配座の変化を伴う修飾を行ってはならない。
【００２２】
さらに別の実施形態では、上記ペプチド配列はペプチド類似体によって少なくとも部分的に置換されている。
【００２３】
本発明の医薬組成物は当業者によく知られている適切な形態で投与することができる。本発明の組成物は、経口剤または適切な注射剤の形態で投与することができる。さらに、クリームまたは軟膏剤の形態で局所投与することも可能である。本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチドに加えて、安定化剤、ｐＨ調整剤、保存剤などの、医薬組成物に一般に用いられる添加剤を含む。
【００２４】
本発明の医薬組成物は、炎症性疾患および／またはアテローム性動脈硬化性疾患の治療に使用することが好ましい。具体的には、本発明の組成物は、冠動脈疾患、関節リウマチ、ループス、喘息などの慢性炎症性疾患の治療に好適に使用することができ、これらの他にも、ＣＤ４０Ｌが関与するとされるあらゆる病態の治療に好適に使用できる可能性がある。
【００２５】
別の実施形態では、本発明は、アミノ酸配列ＶＭＥＱＬＫＫＳＫＴＬＦＳ（配列番号３）の少なくとも一部を含むエピトープに特異的に結合する抗体に関する。この抗体はヒト化抗体であることが好ましい。このような抗体は、マウス抗体のヒト化によって調製することができる。あるいは、いわゆるファージディスプレー法によって得ることもできる。抗体が認識するエピトープは判明しているため、このような抗体は容易に得ることができる。このような抗体は、上記の配列に含まれているエピトープに特異的に結合し、Ｍａｃ−１のＣＤ４０Ｌへの接着を阻害する。この抗体はＩｇＧ抗体であることが好ましい。別の実施形態では、結合フラグメント（Ｆａｂ）を使用することもできる。このような機能的に活性な抗体部位も「抗体」に包含されると理解される。
【００２６】
本発明の開示によるペプチドベースの治療法によって、上記の問題点のいくつかが克服されうる。ＣＤ４０Ｌは、ＣＤ４０、ならびにインテグリンであるαIIｂβ３、Ｍａｃ−１（αＭβ２）およびαＶβ１を含む少なくとも４つの異なるレセプターを有する。本発明では、ＣＤ４０Ｌのレセプター依存性特性に対して特異的な新規の選択的阻害剤を使用する。同様の方法を用いて、他の相互作用パートナーならびにこれらの相互作用パートナーに割り当てられた、炎症、免疫性、および止血における機能を選択的にブロックすることによって、種々のＣＤ４０Ｌ依存性病態のテーラーメイド薬の開発が可能となりうる。配列番号２で示される好ましい環状ポリペプチド（ｃＭ７）は、ＣＤ４０Ｌ／Ｍａｃ−１結合の阻害およびこの結合の下流効果（炎症性遺伝子の発現、炎症性細胞の動員、アテロームの形成など）に対して効果的かつ特異的であった。したがって、ｃＭ７はアテローム性動脈硬化症などの慢性炎症性疾患に対抗するための有益な新規の治療法であると考えられる。
【００２７】
本発明のポリペプチドが、望ましくない他の非特異的副作用を引き起こすことなく、ＣＤ４０Ｌ／Ｍａｃ−１相互作用を特異的に阻害できたことは驚くべき結果の１つであった。具体的には、インビボにおいて本発明のポリペプチドはＣＤ４０Ｌ／ＧＰIIｂ／IIIａを介した血栓形成を阻害しなかった。本願において開示されるこのような結果は、ＣＤ４０Ｌのブロッキングにより治療を行うというコンセプトを支持するものである。ＣＤ４０Ｌ全体の阻害をターゲットとした従来公知のコンセプトは、急性または長期的な副作用により失敗に終わっている。具体的には、臨床データより、血栓を不安定な状態にする可能性が最も高い血栓塞栓性合併症を引き起こすことが明らかとなっている［Andreら (2002), Nat.Med. 8, pp 247-252］。これに対し、本発明のポリペプチドおよび抗体によって達成されるＣＤ４０Ｌ／Ｍａｃ−１相互作用の特異的阻害は、血栓の安定性にほとんど影響を与えなかった。具体的には、ｃＭ７はインビトロにおいてＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ結合を阻害せず、Ｔｈ１／Ｔｈ２表現型などの基本的な免疫学的特性の変化を誘導しなかった。
【００２８】
実験の結果を図にまとめ、図の説明においてより詳細に記載した。
【実施例】
【００２９】
図１に、Ｍａｃ−１ Ｉドメイン内の特徴的部位へのＣＤ４０Ｌの結合を示す。
【００３０】
（ａ）Ｉドメインをその結晶構造（ＩＮＡ５）に基づき、リボン図（左）およびＭ１〜Ｍ８に対応する直鎖状ペプチドを備えた水和表面モデル（右）で示す。
【００３１】
（ｂ）固相結合アッセイにおいて組換えＣＤ４０Ｌは固相化Ｉドメインに特異的に結合した。
【００３２】
（ｃ）Ｉドメインは固相化ＣＤ４０Ｌに濃度依存的に結合した。グラフに挿入した図は、クマシーブルー染色アクリルアミドゲル上の精製組換えＣＤ４０ＬおよびＩドメインを示す。Ｍａｃ−１（２ＬＰＭ１９ｃ、ＩＣＲＦ４４）、ＣＤ４０Ｌ（４０８０４、２４−３１）またはＬＦＡ−１（ＨＩ１１１）を特異的にブロックする種々のクローンついて、固相化フィブリノゲン（ｄ）またはＣＤ４０Ｌ（ｅ）へのＭａｃ−１発現ＣＨＯ細胞の接着をブロックする能力を試験した。
【００３３】
低分子ペプチド阻害剤Ｍ１〜Ｍ８（５０μＭ）を使用してＣＤ４０Ｌの結合をブロックした。
（ｆ）固相結合アッセイにおいて、ＣＤ４０Ｌの固相化Ｉドメインへの結合をブロックした（Ｍ１〜Ｍ８の配列は表１に示す）。
（ｇ）接着アッセイにおいて、活性化ＴＨＰ−１細胞の固相化ＣＤ４０Ｌへの接着をブロックした。
（ｈ）フローサイトメトリーにおいて、新たに単離したヒト顆粒球および単球への蛍光標識ＣＤ４０Ｌの結合をブロックした。
（ｉ）高吸収性プラスチックプレートにペプチドＭ１〜Ｍ８を固相化し、ビオチン化ＣＤ４０Ｌを直接結合させ、その結合を定量した。
【００３４】
（ｊ）Ｍａｃ−１発現ＣＨＯ細胞へのＣＤ４０Ｌの結合をブロックする能力について、Ｉドメインペプチド（５０μＭ）に対してもフローサイトメトリーによる試験を行い、その結果を代表的なドットプロットで示した。
データは少なくとも３回の独立した実験から得られた平均値±ＳＥＭで示した（ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ，ｉ）。（ｈ）には健康な男性ドナー３名が含まれていた。ｎ．ｂ．は結合しなかったことを示す。
【００３５】
図２に、インビトロおよびインビボにおいてペプチド拮抗剤の特性を評価した結果を示す。
（ａ）ＣＤ４０Ｌ／Ｍａｃ−１結合部位を模倣するペプチドＭ７を固相結合アッセイにおいて評価したところ、ペプチドＭ７はＣＤ４０Ｌの固相化Ｉドメインへの結合を濃度依存的に阻害していた。
【００３６】
（ｂ）インビボでの使用に最適化されたｃＭ７（特異的ペプチド阻害剤Ｍ７の環状変異体）は、動的フローチャンバーアッセイにおいてＭａｃ−１発現ＣＨＯ細胞株の固相化ＣＤ４０Ｌへの接着を阻害した。ｃＭ７の特異性は、ｃＭ７が別のＭａｃ−１リガンドであるＩＣＡＭ−１（ｃ）およびＧＰＩｂα（ｄ）へのＭａｃ−１発現細胞の接着をブロックしなかったのに対し、ＧＰＩｂαに特異的なコントロールペプチドＭ２がＧＰＩｂαへの接着を効果的にブロックしたことにより実証された。
【００３７】
（ｅ）ｃＭ７およびｓｃＭ７は、固相化ＣＤ４０−ＦｃフラグメントへのＣＤ４０Ｌの結合に影響を及ぼさなかった。これに対し、抗ＣＤ４０ブロッキング抗体は濃度依存的に分子間相互作用をブロックした。
【００３８】
（ｆ）ＦＩＴＣ標識ｃＭ７はＣＤ４０Ｌ導入マウス線維芽細胞と特異的に結合したが、ｍｏｃｋ導入線維芽細胞とは結合しなかったことがフローサイトメトリーにより示された。
【００３９】
（ｇ）腹腔内注射したｃＭ７の薬物動態を示す。
【００４０】
（ｈ）腹腔内注射したｃＭ７は、ｓｃＭ７と比較して、化学誘引物質ＭＣＰ−１の血漿中濃度を低下させかつ（ｉ）防御性ＩＬ−１０の血漿中濃度を増加させることによって、ＴＮＦ−α誘導性炎症反応を抑制した（１群あたりｎ＝８）。
（ｊ）ｃＭ７で処置した動物の顆粒球において酸化ストレスが低減された。
【００４１】
（ｋ，ｌ）ｃＭ７注射後に血小板Ｐ−セレクチンの発現が低下したこと、血小板−白血球凝集塊が減少したことから、血小板の活性化が抑えられたことが分かる。
データは少なくとも３回の独立した実験から得られた平均値±ＳＥＭで示した。
【００４２】
図３に、インビトロおよびインビボにおけるＣＤ４０Ｌ／Ｍａｃ−１相互作用の炎症性細胞動員への寄与を示す。
【００４３】
（ａ）ＷＴ（野性型）マウス（１群あたりｎ＝６）を特異的ペプチド阻害剤ｃＭ７で処置すると、非特異的ペプチドコントロールｓｃＭ７または生理食塩水の注射により処置した場合と比較して、チオグリコール酸塩により惹起される腹膜腔への白血球の動員が阻害された。ＣＤ４０Ｌ−／−マウス（１群あたりｎ＝６）においては、ペプチドによる処置の効果は見られなかった。
【００４４】
（ｂ）ＴＮＦ−αでプライミングしたヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）にＭａｃ−１発現ＣＨＯ細胞を接着させた。これらの細胞はいずれも、抗Ｍａｃ−１抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体または抗ＬＦＡ−１抗体で選択的にブロッキングした。
【００４５】
（ｃ）抗ＣＤ４０Ｌ抗体は、抗ＩＣＡＭ−１抗体または抗Ｍａｃ−１抗体とほぼ同程度にヒト単球のＨＵＶＥＣへの動的接着をブロッキングした（ｎ≧４）。
【００４６】
（ｄ）フロー条件下においては、フィブリノゲンと比較してより多くのＭａｃ−１−ＣＨＯ細胞が固相化ＣＤ４０Ｌと接着した。
【００４７】
（ｅ〜ｇ）ＣＤ４０Ｌ欠損内皮細胞（ＥＣ）と相互作用させた場合、野生型内皮細胞と相互作用させた場合と比較して、接着マウス白血球数およびローリングマウス白血球数は減少した（１群あたりｎ＝５）。平均白血球ローリング速度はＣＤ４０Ｌ欠損内皮細胞において増加した。
【００４８】
（ｈ）ＣＤ４０Ｌの欠損は、接着分子ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＶＣＡＭ−１およびＰ−セレクチンの表面発現を抑制しなかった。
（ｉ）生物顕微鏡検査において、ＴＮＦ−αを攻撃感染させたマウスの白血球の接着（ｊ）およびローリング（ｋ）は、ｃＭ７（ｎ＝１０）の腹腔内注射によって阻害されたが、ｓｃＭ７（ｎ＝９）または生理食塩水（ｎ＝１２）の腹腔内注射では阻害されなかった。
（ｌ）生物顕微鏡検査において、ｃＭ７の静脈注射は白血球ローリングを直接的に阻害した。
データは平均値±ＳＥＭで示した。スケールバーは２０μｍを示す（ｉ）。
【００４９】
図４に、マウスにおけるＣＤ４０Ｌ／Ｍａｃ−１相互作用の特異的ブロッキングによりアテローム性動脈硬化症が抑制されることを示す。２０週間にわたりＬＤＬｒ−／−マウスに高コレステロール食餌を与えた。ＣＤ４０Ｌ／Ｍａｃ−１相互作用に対する特異的阻害剤ｃＭ７（ｎ＝１３）、非特異的ペプチドコントロールｓｃＭ７（ｎ＝１２）、または生理食塩水（ｎ＝１２）を１週あたり３回マウスに注射した。
【００５０】
（ａ）ｃＭ７は、ｓｃＭ７またはペプチドコントロールと比較して、大動脈基部における血管内膜病変の面積を顕著に縮小させた。
【００５１】
（ｂ）ｃＭ７による処置によって腹大動脈における脂質沈着が減少した。
【００５２】
（ｃ）オイルレッドＯ陽性面積の定量により評価したところ、コントロールによる処置と比較して、ｃＭ７で処置した動物の大動脈基部における脂質含量が減少していた。
【００５３】
アテローム性動脈硬化プラーク内のマクロファージ数（ｄ）および平滑筋細胞数（ｅ）、ならびにコラーゲン含有量（ｆ）を免疫組織化学的方法によって定量した。
【００５４】
（ｇ）安定なコラーゲン線維と不安定なコラーゲン線維との相対分布を、ピクロシリウスレッド染色を使用した偏光顕微鏡法によって測定した。ｃＭ７で処置したマウスは、ｓｃＭ７または生理食塩水で処置したマウスと比較して、赤色に染色された安定なコラーゲン線維のパーセンテージが顕著に高かった（生理食塩水に対してはｐ＝０．００８１、ｓｃＭ７に対してはｐ＝０．０１４０；１群あたりｎ≧９）。
【００５５】
アテローム性動脈硬化病変の切片中のＴ細胞含有量（ｈ）および増殖マーカーＫｉ−６７（ｉ）を定量した。データは平均値±ＳＥＭで示し、オイルレッドＯ特異的染色（ｂ）、Ｍａｃ−３特異的染色（ｃ）、α−アクチン特異的染色（ｅ）、ピクロシリウスレッド特異的染色（ｆ）の代表的な画像、ならびにオイルレッドＯ染色した代表的な大動脈ｅｎ ｆａｃｅ（正面）標本を右側に示した。スケールバーは１０００μｍ（ａ，ｂ）、および２００μｍ（ｃ，ｅ，ｆ）を示す。
【００５６】
図５
Ｍａｃ−１ Ｉドメイン組換え変異体およびＣＤ４０Ｌ組換え変異体の細菌発現
（ａ）αＭ ＩドメインをコードするヒトＭａｃ−１アミノ残基Ｒ１１５〜Ｓ３４０を、細菌発現システムを用いて可溶性Ｈｉｓタグ融合タンパク質（〜２８ｋＤａ）として生成させ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）で精製した。
（ｂ）さらに、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび塩化ナトリウム濃度を上昇させることにより夾雑した細菌性タンパク質を除去した。クマシー染色によってＩドメインの単離を確認し、Ｉドメインを含む溶出画分をプールし、ＰＢＳに対して透析した。
（ｃ）ヒトＣＤ４０Ｌ（Ｅ１０８〜Ｌ２６１）のＴＮＦ相同領域を、ｃ−ｍｙｃタグおよびＨｉｓタグを融合させたタンパク質として生成させた。このタンパク質（〜１９ｋＤａ）を不溶性封入体から抽出し、ＩＭＡＣで精製し、次いでＰＢＳに対して透析することによってリフォールディングした。
ＳＤＳポリアクリルアミドゲルによって評価したところ、上記いずれのタンパク質調製物の純度も＞９５％であった。それぞれの記号は、（Ｗ）洗浄画分、（ＦＴ）カラムフロースルー、（Ｅ）溶出画分、（Ｍ）タンパク質サイズマーカーを示す。
【００５７】
図６
インビトロおよびインビボにおけるｃＭ７を用いたペプチド処置は、細胞のアポトーシスおよび細胞毒性を引き起こさなかった。
（ａ，ｂ）チオグリコール酸塩によって腹膜腔に動員されたマクロファージに、腹腔内注射によりｃＭ７、ｓｃＭ７および抗Ｍａｃ−１ブロッキング抗体Ｍ１／７０のいずれかを攻撃感染させた。４時間後、腹腔浸出液細胞を採取し、アネキシンＶの結合およびヨウ化プロピジウムの取り込みを定量した。インビボにおいてｓｃＭ７と比較したところ、ｃＭ７による処置では細胞のアポトーシスもネクローシスも増加しなかった。これに対して、抗体による処置では、腹腔マクロファージのアポトーシスおよびネクローシスのパーセンテージは顕著に高かった。
（ｃ，ｄ）インビトロにおいて増殖させたヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、ｃＭ７またはｓｃＭ７とともにインキュベートし、これとは別にＣＤ４０Ｌと組み合わせてｃＭ７、ｓｃＭ７、または抗ＣＤ４０ブロッキング抗体とともにインキュベートした。カスパーゼ３／７活性によって評価したところ、２４時間にわたるペプチドでの処置は細胞傷害性を誘導しなかった。内皮細胞のアポトーシスをＬＤＨの放出によって測定したところ、ＣＤ４０ＬでプライミングしたＨＵＶＥＣをｃＭ７とともにインキュベートした場合にアポトーシスがわずかに増加したことが判明した。
データは少なくとも３回の独立した実験から得られた平均値±ＳＥＭで示した。
【００５８】
図７
インビトロにおいて、Ｍａｃ−１ ＩドメインのＣＤ４０Ｌ結合部位を特異的に認識するモノクローナル抗体によって白血球動員が調節される。マウスを直鎖状ペプチドＶ１６０〜Ｓ１７２で免疫化した。
（ａ）クローンＲＣ３は、固相化ペプチドＭ７に特異的に結合したが、スクランブルペプチドｓＭ７およびＭａｃ−１ ＩドメインフラグメントＭ８には結合しなかった。
（ｂ）抗Ｍ７は、Ｉドメイン全体に対するブロッキング抗体クローン２ＬＰＭ１９ｃと同程度にＭａｃ−１発現ＣＨＯ細胞の固相化ＣＤ４０Ｌへの接着を阻害した。Ｉドメイン全体をブロッキングするとＣＨＯ細胞はフィブリノゲンに接着しなかったが、直鎖状ペプチドＶ１６０〜Ｓ１７２をブロッキングした場合にはフィブリノゲンに接着した。
（ｃ）動的フローチャンバーアッセイにおいて対応するＩｇＧコントロールと比較したところ、抗Ｍ７による処置は、単層コンフルエント活性化内皮細胞へのマウスＲＡＷ２４６．７細胞の接着をブロックした。
データは少なくとも３回の独立した実験から得られた平均値±ＳＥＭで示した。
【００５９】
図８に、インビボにおけるｃＭ７処置が炎症の代表的特性に及ぼす影響を示す。ＣＤ４０Ｌ／Ｍａｃ−１相互作用に特異的な阻害剤であるｃＭ７または非特異的ペプチドコントロールｓｃＭ７を腹腔内注射することにより、Ｃ５７／Ｂ６マウスを処置した。炎症状態はＴＮＦ−αを注射することにより誘導した。
【００６０】
（ａ〜ｃ）ＣＸＣＬ−１（＝ＭＣＰ−１）およびＲＡＮＴＥＳは炎症性細胞に関与することによりアテローム性動脈硬化症を含む炎症性疾患を引き起こすケモカインであるが、急性炎症モデル（ＴＮＦ−αの攻撃感染によるサイトカイン産生）に本発明の化合物を投与するとＣＸＣＬ−１（＝ＭＣＰ−１）およびＲＡＮＴＥＳの濃度が低下した。一方、抗炎症性ＴＨ２サイトカインＩＬ−１０は増加傾向が見られた。アテローム性動脈硬化症を発症したマウスにおいてはサイトカイン濃度の全身的な調節はほとんど行われないため、急性期モデルを選択した。ｃＭ７処置マウスにおいて、ケモカインであるＣＸＣＬ−１およびＲＡＮＴＥＳの血漿中濃度は、炎症性状態が緩和される方向にシフトしたが、防御性ＩＬ−１０の血漿中濃度は増加傾向が見られた。
（ｄ〜ｅ）白血球サブセットの活性化は、接着分子であるＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、およびＰ−セレクチンの表面発現をフローサイトメトリーで定量することにより評価した。両群について、ＴＮＦ−αの誘導による単球（ｇ）、好中球（ｈ）およびＧｒ−１陽性炎症性単球（ｉ）の動員を測定した。
データは１群あたり８匹のマウスを用いて得られた平均値±ＳＥＭで示した。
【００６１】
図９
インビボにおける長期的ペプチド処置が免疫学的特性に及ぼす影響を示す。ＬＤＬＲ−／−マウスに高コレステロール食餌を与え、ペプチド阻害剤ｃＭ７、コントロールペプチドｓｃＭ７または生理食塩水を２０週間にわたって１週あたり３回注射した。（ａ〜ｆ）サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの血漿中レベルをｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｂｅａｄ ａｓｓａｙによって定量した。Ｔ細胞亜集団（ｇ〜ｈ）、Ｂ細胞（ｉ）およびＧｒ−１陽性炎症性単球（ｊ）はフローサイトメトリーによって定量した。
【００６２】
実施例１
組換えタンパク質の発現
Ｍａｃ−１のアミノ酸配列Ｒ１１５〜Ｓ３４０をコードするＤＮＡ配列をｐＥＴ２０ｂ（ノバジェン）に挿入し、次いでＮｉ−ＮＴＡ固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（キアゲン）およびＱセファロース（ＧＥヘルスケア）を使用した陰イオン交換クロマトグラフィーで精製することにより、Ｍａｃ−１ ＩドメインをＨｉｓタグ融合タンパク質として得た。また、アミノ酸配列Ｅ１０８〜Ｌ２６１をコードするＤＮＡをｐＨＯＧ−２１３４に挿入することにより、Ｈｉｓタグおよびｃ−ｍｙｃタグを融合させたタンパク質としてＣＤ４０Ｌを得た。得られたＣＤ４０ＬはＮｉ−ＮＴＡ固定化金属アフィニティークロマトグラフィーで精製した。
【００６３】
Ｃ末端にＨｉｓタグを含む融合タンパク質である上記のＭａｃ−１ Ｉドメインは以下のようにして得た。５’−ＡＧＡＡＧＴＴＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＣＴ−３’（配列番号４）および５’−ＧＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＡＧＣＧＣＴＧＡＡＧＣＣＴＴＣＣＴＧ−３’（配列番号５）で示されるプライマーを使用したＰＣＲに基づく方法により、Ｍａｃ−１のアミノ酸配列Ｒ１１５〜Ｓ３４０をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターｐＥＴ２０ｂ（ノバジェン）に挿入した。テンプレートとして、ヒトＭａｃ−１のαチェーン全体を構造的に発現したＣＨＯ細胞株を使用した。得られたＰＣＲフラグメントはｐＧＥＭＴ（プロメガ）にクローニングした後、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ（ニュー・イングランド・バイオラボ）で切断し、ＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ線状化ｐＥＴ２０ｂに挿入した。この発現ベクターをＢＬ−２１ ＤＥ Ｓｔａｒ（インビトロジェン）に導入して形質転換させ、０．５ｍＭ ＩＰＴＧ（シグマ）を添加して発現させた。得られたタンパク質をＢｕｇＢｕｓｔｅｒ溶解試薬（ノバジェン）で抽出し、次いで標準的なＦＰＬＣシステム（ＧＥヘルスケア）においてＮｉ−ＮＴＡ固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（キアゲン）で精製した。２５０ｎＭイミダゾール（シグマ）で標的タンパク質を溶出した後、Ｍａｃ−１ Ｉドメイン（〜２８ｋＤａ）を含む画分を２０ｍＭトリス−Ｃｌおよび２０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）に対して透析し、Ｑ−セファロースカラム（ＧＥヘルスケア）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーでさらに精製した。また、三量体化ドメインならびにＮ末端にＨｉｓタグおよびｃ−ｍｙｃタグを含む融合タンパク質である上記ＣＤ４０Ｌは以下のようにして得た。
【００６４】
アミノ酸配列Ｅ１０８〜Ｌ２６１をコードするＤＮＡ配列は、５’−ＣＣＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＡＣ−３’（配列番号６）および５’−ＣＴＴＣＴＡＧＡＡＡＡＣＡＧＣＴＴＴＧＡＡＡＴＧＣＡＡＡＡＡＧＡ−３’（配列番号７）で示されるプライマーを使用したＰＣＲにより増幅した。テンプレートとして、ヒトＣＤ４０ＬをコードするｃＤＮＡクローン（オリジーン）を使用した。Ｈｉｓタグおよびｃ−ｍｙｃタグは、５’−ＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＡＣＡＡＡＡＧＣＴＧＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＡＧ−３’（配列番号８）および５’−ＴＧＡＧＧＴＡＣＣＴＡＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＧＡＧ−３’（配列番号９）で示されるプライマーを使用して増幅した。三量体化ドメインのテンプレートとしては、５’−ＡＴＧＡＡＡＣＡＧＡＴＴＧＡＡＧＡＴＡＡＡＡＴＴＧＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＧＡＧＣＡＡＡＡＴＴＴＡＴＣＡＴＡＴＴＧＡＡＡＡＣＧＡＡＡＴＴＧＣＧＣＧＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＣＴＧＡＴＴＧＧＡＧＡＡ−３’（配列番号１０）で示されるプライマーを使用した。上記のＰＣＲフラグメントはすべてｐＧＥＭＴにクローニングし、ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩ（Ｈｉｓタグおよびｃ−ｍｙｃタグ）、ＫｐｎＩおよびＸｂａＩ（三量体化モチーフ）、ならびにＸｂａＩおよびＮｏｔＩ（ＣＤ４０Ｌ）でそれぞれ切断した。次いで、これらのフラグメントを、発現ベクターｐＨＯＧ−２１（Schwarzら, Circ.Res., 2006, p. 25-33）にクローニングし、細菌株ＴＧ−１（プロメガ）に導入して形質転換させた。１ｍＭ ＩＰＴＧの誘導によりＣＤ４０Ｌを発現させた。このタンパク質を不溶性封入体として抽出した後、７Ｍ尿素、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０中で溶解し、Ｎｉ−ＮＴＡ固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって変性条件下で精製した。尿素濃度を徐々に低下させて透析することによってＣＤ４０Ｌをリフォールディングした。得られたＭａｃ−１ ＩドメインおよびＣＤ４０Ｌは、最終的にＰＢＳに対して透析し、使用するまで−８０℃で保存した。これらの組換えタンパク質をＳＤＳゲル電気泳動によって評価したところその純度はいずれも＞９０％だった。
【００６５】
Ｍａｃ−１リガンド、たとえば、フィブリノゲン、ＩＣＡＭ−１、ＧＰＩｂα、ＲＡＧＥ、Ｃ３ｂｉ、ヘパリンなどの大部分は、Ｍａｃ−１ Ｉドメイン（Ｍａｃ−１のαＭサブユニット内に含まれる２００個以下のアミノ酸からなる配列）（図１ａ）に結合するため、ＩドメインもＣＤ４０Ｌの結合パートナーとして機能していると仮定した。この仮説を検証するため、図５に示すＩドメインおよびＣＤ４０Ｌの組換え変異体を作成した。
【００６６】
固相結合アッセイでは、可溶性ＣＤ４０Ｌおよび固定化ＣＤ４０Ｌのいずれも、単離したＩドメインに特異的に結合した（図１ｂ，ｃ）。このときのＫｄ値は〜６６ｎＭであったことから、この相互作用の親和性は、ＣＤ４０ＬとαIIｂβ３との結合の親和性（〜３０ｎＭ）に匹敵するほど高いことが示された。ＣＤ４０Ｌの結合部位を同定するために、表１に示したＭａｃ−１ Ｉドメインの水和表面に由来する直鎖状ペプチドＭ１〜Ｍ８を用いてペプチドマッピングを行った。
【００６７】
【表１】
0006033781.tif 000002
【００６８】
単離したＭａｃ−１ Ｉドメインの固相化ＣＤ４０Ｌへの結合を評価した最初の固相結合アッセイでは、Ｍａｃ−１フラグメントＭ３、Ｍ４、Ｍ５およびＭ７が阻害剤候補として見出された（図１ｆ）。細胞膜環境においてＭａｃ−１タンパク質全体を用いたより生理学的な条件においては、Ｍ７がＴＨＰ−１細胞のＣＤ４０Ｌへの接着を最も効果的にブロックした。この阻害の程度は、Ｉドメイン全体に対するブロッキング抗体による阻害と同程度であった（図１ｇ）。また、Ｍ７はフローサイトメトリーにおいてヒト顆粒球および単球へのＣＤ４０Ｌの結合をブロックした唯一のペプチドであった（図１ｈ）。さらに、Ｍ７は固相結合アッセイにおいてＣＤ４０Ｌへの直接結合を媒介し（図１ｉ）、活性化Ｍａｃ−１を構造的に発現したチャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｍａｃ−１−ＣＨＯ）へのＣＤ４０Ｌの結合を中和した（図１ｊ）。Ｍ７は濃度依存的にＣＤ４０ＬのＩドメインへの結合をブロックし、そのＩＣ５０は〜４μＭであった（図２ａ）。
【００６９】
興味深いことに、ペプチドＭ７に対応する、Ｍａｃ−１ Ｉドメイン内のアミノ残基配列Ｅ１６２〜Ｌ１７０は、Ｍａｃ−１の三次構造においてα１ヘリックスとβシートＢとの間の表面露出ループに存在しており、他のＭａｃ−１リガンド（ＧＰＩｂα、ＮＩＦ、Ｃ３ｂｉ、ＩＣＡＭ−１またはフィブリノゲン）の結合には関与していない。このことは、上記のアミノ残基配列が特徴的なＣＤ４０Ｌ結合部位であり、この相互作用を選択的にブロックできる可能性があることを示唆している。２つの隣接したシステイン残基を付加し、次いで環化（ｃＭ７）することによってペプチドＭ７を修飾し、インビボにおける血漿中安定性を高めた。コントロールとしてスクランブルペプチド（ｓｃＭ７）を使用した（表１参照）。上記のペプチド阻害剤（ｃＭ７）の特異性を評価するために、フローチャンバーにおいて、種々のＭａｃ−１リガンドへのＭａｃ−１−ＣＨＯ細胞の接着を試験した。ｃＭ７はＣＤ４０Ｌへの細胞接着を強力にブロックしたが（図２ｂ）、ＩＣＡＭ−１およびＧＰＩｂαへの細胞接着には何ら影響を及ぼさなかった（図２ｃ，ｄ）。これに対し、（Ｍ７ではなく）Ｍ２は以前に報告されているようにＭａｃ−１とＧＰＩｂαとの相互作用をブロックしたが、ＣＤ４０Ｌ／Ｍａｃ−１結合には影響を及ぼさなかった。また、ｃＭ７は、ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌとの結合には影響を及ぼさなかった（図２ｅ）。さらに、図６に示すように、ｃＭ７による処置は、インビトロにおいてもインビボにおいてもアポトーシスや細胞毒性を誘導することはなく、忍容性の高い薬剤であることが示唆される。
【００７０】
ＣＤ４０Ｌ／Ｍａｃ−１結合におけるＥ１６２〜Ｌ１７０領域の重要性をさらに具体的に検証するため、ペプチドＶ１６０〜Ｓ１７２に対するモノクローナル抗体（抗Ｍ７と称す）を作成した。ヒトＭａｃ−１ Ｉドメインの配列Ｖ１６０〜Ｓ１７２に対応するペプチドに特異的な抗体（抗Ｍ７と称す）は、ジフテリアトキソイド（Ｍｏｎａｓｈ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、モナシュ大学、メルボルン、オーストラリア）を結合させたペプチド配列Ｃ−ＶＭＥＱＬＫＫＳＫＴＬＦＳ−ＮＨ２（配列番号３）でマウスを免疫化することによって得られた。固相アッセイを行ったところ、この抗血清と固相化ペプチドＭ７との結合性は高いことが確認された。この抗体は、Ｍ７と特異的に結合したが、スクランブルペプチドｓＭ７とは結合せず、Ｍ７と同等の長さを有する別のＭａｃ−１フラグメントであるＭ８とも結合しなかった。抗Ｍ７は、Ｍａｃ−１−ＣＨＯ細胞の固相化ＣＤ４０Ｌへの接着をブロックしたが、フィブリノゲンへの接着はブロックしなかった（図７）。
【００７１】
さらに、ＦＩＴＣで標識したｃＭ７は、ＣＤ４０Ｌを過剰発現したマウス線維芽細胞に濃度依存的に結合したが、ｍｏｃｋ導入コントロール細胞には結合しなかった（図２ｆ）。
【００７２】
実施例２
固相結合アッセイ
ブロッキングペプチドの存在下または非存在下で、組換えＣＤ４０Ｌを固相化Ｍａｃ−１ Ｉドメインとともにインキュベートした。ｓＣＤ４０Ｌの結合は、抗ｃｍｙｃ−ＨＲＰ（インビトロジェン）およびＴＭＢ基質（ピアス）を添加し、比色反応によって検出した。これとは別に、ＣＤ４０Ｌ（Ｐｒｏｖｉｔｒｏ）を固相化し、次いで組換えＭａｃ−１ Ｉドメインの結合を抗Ｈｉｓ−ビオチン（キアゲン）およびＨＲＰ結合ストレプトアビジン（ピアス）を添加して定量した。固相化ペプチドへの結合においては、ＣＤ４０Ｌをミクロビオチン化キット（シグマ）でビオチン化した。評価したすべてのペプチドの等モル濃度混合物を本アッセイのポジティブコントロールとして使用した。
【００７３】
組換えＭａｃ−１ ＩドメインをＰＢＳ中において９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に４℃で一晩かけて固相化した。２％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした後、ＰＢＳで洗浄し、組換えＣＤ４０Ｌを図に示した濃度でウェルに加え、３７℃で２時間インキュベートした。ペプチドＭ１〜Ｍ８の効果は、これらのペプチド（５０μＭ）の存在下でＣＤ４０Ｌ（１０μｇ／ｍｌ）をインキュベートすることによって評価した。結合しなかったＣＤ４０Ｌを０．１％ツウィーン２０／ＰＢＳで洗浄することにより除去した後、抗ｃ−ｍｙｃ−ＨＲＰ（インビトロジェン）を加え、室温で２時間インキュベートした。ＴＭＢ基質（ピアス）を加えて比色反応を４５０ｎｍで測定することにより結合を定量した。これとは別に、Ｈｉｓタグ（Ｐｒｏｖｉｔｒｏ）を付加していないＣＤ４０Ｌを上記と同様に固相化し、ブロッキングした。抗Ｈｉｓ−ビオチンモノクローナル抗体（キアゲン）およびＨＲＰ結合ストレプトアビジン（ピアス）を添加し、比色反応を４５０ｎｍで測定することにより組換えＭａｃ−１ Ｉドメインの結合を定量した。Ｍａｃ−１ Ｉドメインの特異的結合は、ＣＤ４０Ｌコーティングウェルの測定値からＢＳＡコーティングウェルの測定値を差し引いて求めた。Ｋｄは、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）による非線形回帰モデル（１部位結合双曲線モデル）を使用して評価した。ＣＤ４０Ｌのペプチドへの結合を定量するために、ペプチドを５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ１０．６）中において９６ウェルプレートに４℃で一晩かけて固相化した。メーカーの説明書に従ってＣＤ４０Ｌをミクロビオチン化キット（シグマ）でビオチン化し、ＨＲＰ結合ストレプトアビジン（ピアス）を用いて比色反応により検出した。評価したすべてのペプチドの等モル濃度混合物をポジティブコントロールとして使用した。ＢＳＡコーティングウェルの吸光度をネガティブコントロールとして使用し、これを差し引いた。
【００７４】
実施例３
３．１  動的接着アッセイおよび静的接着アッセイ
９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）をｓＣＤ４０Ｌでコーティングし、活性化Ｍａｃ−１を構造的に発現したＣＨＯ細胞（以前に報告されているもの）またはＴＨＰ−１細胞とともにインキュベートした。２０〜５０分間かけて細胞を接着させた。この細胞をブロッキング抗体（１０μｇ／ｍｌ）とともにプレインキュベートした。図に示すように、アッセイはペプチド（５０μＭ）の存在下で行った。透過バッファー（６ｍｇ／ｍｌホスファターゼ基質（シグマ）、１％トリトンＸ−１００、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５））を添加して、接着した細胞を比色反応により定量した。これとは別に、接着細胞数をカウントした。マウス内皮細胞を以前に報告されている方法で単離した。ＣＦＤＡ−ＳＥ（インビトロジェン）を取り込ませたＭａｃ−１発現ＣＨＯを４５分間かけて接着させ、蛍光顕微鏡下で定量した。動的な接着アッセイを行うため、３５ｍｍディッシュを、１％ＢＳＡ、ＣＤ４０Ｌ、ＧＰＩｂα（Ａｂｎｏｖａ）、フィブリノゲン（シグマ）またはＩＣＡＭ−１（Ｒ＆Ｄシステムズ）でコーティングした。上記のペプチド（１μＭ）または抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在下、パラレルフローチャンバーシステム（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ）を用い、図に示したずれ速度において接着細胞数およびローリング細胞数を定量した。これとは別に、単離マウス内皮細胞上における腹腔滲出細胞の接着およびローリングを観察した。
【００７５】
３．２  静的接着アッセイ
ＰＢＳ中ｓＣＤ４０Ｌ（１０μｇ／ｍｌ）で９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を４℃で一晩かけてコーティングした。結合しなかったＣＤ４０ＬをＰＢＳで洗浄することにより除去した後、０．１％アガロースを用いてプレートを室温で１時間ブロッキングし、ＰＢＳで洗浄した。ＣＤ４０Ｌに対するブロッキング抗体（１０μｇ／ｍｌ）を図に示した濃度でウェルに添加し、室温で１５分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄した。活性化Ｍａｃ−１４を構造的に発現したＣＨＯ細胞またはＴＨＰ−１細胞をＣＤ１１ｂまたはＣＤ１１ａに対する機能ブロッキング抗体（１０μｇ／ｍｌ）とともに室温で１５分間プレインキュベートした。上記の細胞（５×１０４個／ウェル）を３７℃で２０〜５０分間かけて接着させた。静的接着アッセイは図に示すように５０μＭのペプチド存在下で行った。結合しなかった細胞をＰＢＳで洗浄することにより除去した後、透過バッファー（６ｍｇ／ｍｌホスファターゼ基質（シグマ）、１％トリトンＸ−１００、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５））を添加して、３７℃で１時間インキュベートし、比色反応を４０５ｎｍで測定することにより接着細胞を定量した。これとは別に、顕微鏡（ツァイス）下で接着細胞数をカウントした。これとは別に、実験前にヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を５０ｎｇ／ｍｌＴＮＦ−αで刺激した。メーカーのプロトコルに従って、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＤＡ）（インビトロジェン）をＭａｃ−１発現ＣＨＯに取り込ませた。ＨＵＶＥＣまたはＣＨＯ細胞を図に示したブロッキング抗体（１０μｇ／ｍｌ）を用いて選択的にインキュベートし、洗浄後、ＣＨＯ細胞をＨＵＶＥＣに３７℃で３５分間かけて接着させた。接着しなかった細胞をＰＢＳで洗浄することにより除去した後、接着細胞数を蛍光顕微鏡下でカウントした。
【００７６】
実施例４
４．１  フローサイトメトリー
以前に報告されている方法（Zirlikら，2007）で、フローサイトメトリー分析、血小板活性化アッセイ、および白血球−血小板凝集塊の定量を行った。ＣＤ４０Ｌ発現マウス線維芽細胞へのｃＭ７の結合は、ＦＩＴＣ結合ｃＭ７を定量することにより測定した。Ｍａｃ−１発現ＣＨＯ細胞またはヒト白血球へのＣＤ４０Ｌの結合は、これらの細胞をＣＤ４０Ｌ（１０μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした後、次いで抗ＰｅｎｔａＨｉｓ抗体（キアゲン）を用いて検出した。
【００７７】
４．２  ラミナーフローチャンバーアッセイ
動的接着アッセイは以下のようにして行った。１％ＢＳＡ、ＣＤ４０Ｌ、ＧＰＩｂα（Ａｂｎｏｖａ）、ＩＣＡＭ−１（Ｒ＆Ｄシステムズ）またはフィブリノゲン（シグマ）をそれぞれ１０μｇ／ｍｌおよび３０μｇ／ｍｌの濃度で使用して、３５ｍｍディッシュを４℃で一晩かけてコーティングした。０．５ｄｙｎ／ｃｍ２（静脈の流速）から１５ｄｙｎ／ｃｍ２（動脈の流速）まで流速を増加させながらパラレルフローチャンバーシステム（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ）でＭａｃ−１発現ＣＨＯ細胞の接着およびローリングについて試験を行った。細胞の定量には、顕微鏡（オリンパス）を用いた。図から分かるように、図示したペプチド（１μＭ）または抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在下、図示したずれ速度において阻害剤の効果を試験した。これとは別に、上記と同様にマウス内皮細胞を単離しＴＮＦ−αで刺激した。単離マウス内皮細胞上における腹腔滲出細胞の接着およびローリングを上記と同様に定量した。ローリング速度はＩｍａｇｅ Ｐｒｏ細胞追跡ツール（メディアサイバネティクス）を使用して算出した。
【００７８】
４．３  フローサイトメトリー
以前に報告されている方法（Quezadaら, Ann.Rev.Immunol. (2004), pp 307-328）で、フローサイトメトリー分析、血小板活性化アッセイ、および白血球−血小板凝集塊の定量を行った。以下に簡潔に記載する。マウスの血液サンプルを心臓穿刺によって得た。赤血球は、１５５ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、５．７ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．３中で溶血させた。白血球は０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に再懸濁し、Ｆｃレセプターは抗ＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でブロッキングした。エピトープ特異的蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ））用抗体としては、抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ１１５、抗Ｇｒ−１、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ４１、抗ＣＤ６２Ｐ、抗ＣＤ５４、抗ＣＤ１０２および抗ＣＤ１０６（すべてＥｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手）を含むものを使用した。ＣＤ４０Ｌ導入マウス線維芽細胞またはｍｏｃｋ導入マウス線維芽細胞へのｃＭ７の結合は、図示した濃度のＦＩＴＣ−ｃＭ７と細胞とを３７℃で３０分間インキュベートし、次いでＦＬ−１チャネルにおいて蛍光を定量することにより測定した。Ｍａｃ−１発現ＣＨＯ細胞またはヒト白血球へのＣＤ４０Ｌの結合は、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋添加ＰＢＳ中でＨｉｓタグＣＤ４０Ｌ融合タンパク質（１０μｇ／ｍｌ）とともに３７℃で３０分間インキュベートすることによって行い、次いでＡｌｅｘａ４８８標識抗ＰｅｎｔａＨｉｓ（キアゲン）で検出した。ヒト単球および顆粒球は前方散乱および側方散乱における特性に基づいてゲーティングした。内皮細胞における接着分子の発現を分析するため、細胞をＴＮＦ−αで２４時間刺激し、アクターゼ（シグマ）を使用して剥離し、蛍光色素結合抗体とともにインキュベートした。
【００７９】
実施例５
攻撃感染によるサイトカイン産生
８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄシステムズ）２００ｎｇと、ペプチドｃＭ７もしくはｓｃＭ７のいずれか１００μｇまたはこれと等容量の滅菌生理食塩水とを腹腔内注射した。５時間後、マウスをＣＯ２で安楽死させた。腹膜腔を２ｍｌのＰＢＳでフラッシングし、上清をスクリーニングしてサイトカインを得た。血液は心臓穿刺によって回収した。メーカーの説明書に従い、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＭＣＰ−１、ＫＣおよびＲＡＮＴＥＳの血漿中濃度をＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）（ＢＤバイオサイエンス）で測定した。末梢血の白血球および血小板の活性化は上記と同様にフローサイトメトリーによって評価した。
【００８０】
実施例６
酸化ストレスアッセイ
メーカーの説明書に従ってマウス白血球をジヒドロローダミン（インビトロジェン）とともにプレインキュベートし、活性酸素ストレスの発生をフローサイトメトリーでモニターした。
【００８１】
実施例８
マウス腹膜炎モデル
ＷＴマウスまたはＣＤ４０Ｌ−／−マウス（ジャクソン研究所）に４％チオグリコール酸塩培養液（シグマ）２ｍｌを注射した。１５時間後、ＰＢＳで腹膜腔をフラッシングすることにより腹腔洗浄を行った。赤血球を溶血させた後、腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）数を定量した。
【００８２】
実施例９
生物顕微鏡検査
手術の５時間前にマウスＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄシステムズ）２００ｎｇとペプチド１００μｇとを滅菌生理食塩水に溶解し、手術の５時間前にマウスの腹腔内に注射した。塩酸ケタミン（エセックス）およびキシラジン（バイエル）をそれぞれ１８７．５ｍｇ／ｋｇ体重および６２．５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で腹腔内注射することによりマウスに麻酔をかけた。以前に報告されている方法（Iezziら, PNAS (2009), pp 876-881）で精巣挙筋を露出させた。いくつかの実験のために、カテーテルを頚静脈に留置し、顕微鏡で観察しながらペプチドを投与した。温度調整した（３６℃）生理食塩水で精巣挙筋を表面灌流した。マウスの体温を維持するため、マウスをヒーティングパッド上に乗せた。生理食塩水用液浸対物レンズ（Ｗプラン アポクロマート２０ｘ／１．０ ＤＩＣ ＩＲ、カールツァイス）および高感度カメラシステム（ＡｘｉｏＣａｍ ＭＲｍ、カールツァイス）を取り付けた生物顕微鏡（ＡｘｉｏＳｃｏｐｅ Ｖａｒｉｏ、カールツァイス）で各回３０秒間映像を録画した。ローリング白血球数は、赤血球よりも遅い速度で移動する白血球の数と定義した。白血球のローリング速度は、各時間点において白血球が細静脈の所定の長さをローリングするのに必要な平均時間を測定することによって求めた。また、接着白血球は少なくとも３０秒間静止している細胞と定義した。ローリング白血球数および接着白血球数は評価者盲検により定量した。
【００８３】
実施例１０
アテローム形成試験
高コレステロール食餌（ＨＣＤ）を与えた８週齢の雄性ＬＤＬレセプター欠損（ＬＤＬｒ−／−）マウス（ジャクソン研究所）を、用量１００μｇのペプチドｃＭ７もしくはｓｃＭ７（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）または滅菌生理食塩水を１週間あたり３回腹腔内注射することにより処置した。２０週間後、血液サンプルを採取し、白血球亜集団のフローサイトメトリー分析、コレステロールおよびトリグリセリドの血漿中濃度の測定、血漿中サイトカインおよびケモカインの測定を行った。血圧は非侵襲性血圧測定器（ＮＩＢＰ（ハーバードアパラタス））で測定した。マウスを安楽死させ、大動脈基部および大動脈弓をＯＣＴ（ＯＣＴ化合物（ティシュー・テック））中で凍結した。胸大動脈および腹大動脈は１０％緩衝ホルマリンで固定した。マウス大動脈組織のクリオスタット連続切片（６μｍ）をアセトンで固定し、空気乾燥した。非特異的結合は生物種に適した５％正常血清（ベクターラボラトリーズ）でブロッキングした。次いで、リン酸緩衝生理食塩水で希釈し、かつ生物種に適合する５％正常血清を添加した一次抗体とともに切片をインキュベートした。二次抗体とともにインキュベートし、次いでアビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）（ベクターラボラトリーズ）とともにインキュベートした。抗体の結合は３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）（ダコ）で可視化し、ギルのヘマトキシリン液（シグマアルドリッチ）で対比染色した。コントロール染色として、各ＩｇＧアイソタイプ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（ダコ））による染色を行った。マクロファージ特異的染色にはラット抗マウスＭａｃ−３抗体を使用し、平滑筋細胞特異的染色には抗α−アクチン抗体を使用した（ダコ）。Ｉ型コラーゲンを可視化するために、０．１％ピクロシリウスレッド（ポリサイエンス）の飽和ピクリン酸水溶液を新たに調製し、この溶液中でホルマリン固定凍結切片を４時間インキュベートした。０．０１Ｎ ＨＣｌおよび蒸留水でリンスした後、切片を７０％エタノール中で脱水し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（ベクターラボラトリーズ）で封入した。ピクロシリウスレッド染色は偏光顕微鏡法で分析した。ピクロシリウスレッド染色において評価されるコラーゲン線維の色は、コラーゲン線維の太さによって異なり、緑色（細い線維）から黄色、橙黄色、赤色（太い線維）へと変化するため、染色したコラーゲン切片の色の分布を定量した。脂質の沈着は、大動脈切片または腹大動脈のｅｎ ｆａｃｅ（正面）標本をホルマリンで固定した後、オイルレッドＯで染色することによって測定した。大動脈病変の組成を定量するため、すべてのマウスを対象に、大動脈組織切片の分析を顕微鏡下で実施した。大動脈基部においては、右冠動脈口に隣接した大動脈弁の３つの弁葉すべてについて断面像を得て病変の面積を分析した。大動脈壁全体の面積、大動脈基部の病変の面積、およびマクロファージ、脂質、ＳＭＣまたはコラーゲンが染色された面積のパーセンテージを、コンピューターを使用した画像定量（ＩｍａｇｅＰｒｏ（メディアサイバネティクス））により測定した。
【００８４】
実施例１１
１１．１  ペプチド阻害剤の薬物動態
Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＦＩＴＣ標識ｃＭ７を腹腔内注射した。図に示した時間点において血漿サンプル中の蛍光を蛍光プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ）で測定した。血漿サンプルで希釈したＣＭ７−ＦＩＴＣをスタンダードとして使用した。
【００８５】
１１．２  構造モデリング
Ｍａｃ−１ Ｉドメインの構造を、Ｓｉｒｉｕｓ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ１．２（サンディエゴスーパーコンピューターセンター）およびＭａｃ−１ Ｉドメインの結晶学的データセット（ＰＤＢ ＩＤ：１ＮＡ５）を使用して可視化した。
【００８６】
１１．３  抗体およびペプチド
購入したエピトープ特異抗体は、抗ヒトＣＤ１１ｂ、クローン２ＬＰＭ１９ｃ（サンタクルーズバイオテクノロジー）；抗ヒトＣＤ１１ｂ、クローンＩＣＲＦ４４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）；抗ヒトＣＤ１１ａ、クローンＨＩ１１１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）；抗ヒトＣＤ４０Ｌ、クローン２４−３１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）；抗ヒトＣＤ４０Ｌ、クローン４０８０４（Ｒ＆Ｄシステムズ）；および抗ヒトＩＣＡＭ−１、クローンＢＢＩＧ−Ｉ１（Ｒ＆Ｄシステムズ）であった。ペプチドは、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ハイデルベルク）において合成したペプチドをＨＰＬＣで精製し、可能であれば環化した。分子量は質量分析により測定した。ペプチドの純度は＞９５％であった。
【００８７】
１１．４  細胞培養
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）はロンザ社から購入し、２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、０．１％ファンギゾン、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１％ピルビン酸Ｎａ、１％ヘパリン、および１％ＥＣＧＳを含むＭ１９９において増殖させた。単球性ＴＨＰ−１は、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％ＦＣＳ、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ１６４０において培養した。活性化Ｍａｃ−１を構造的に発現したＣＨＯ細胞は以前に報告されているものであるが、このＣＨＯ細胞を、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％ＦＣＳ、１％ＮＥＡＡ、１％Ｌ−グルタミン、１２５μｇ／ｍｌゼオシン、７０μｇ／ｍｌジェネティシンを含むＤＭＥＭにおいて培養した。ＣＤ４０Ｌ導入マウス線維芽細胞およびｍｏｃｋ導入マウス線維芽細胞はＫ．Ｚｉｒｌｉｋ博士（フライブルク大学血液学部（フライブルク、ドイツ））から提供されたものであり、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％ＦＣＳ、１％ＮＥＡＡ、１％Ｌ−グルタミン、１２５μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭにおいて培養した。
【００８８】
１１．５  マウス内皮細胞の単離
マウス内皮細胞を単離するために、野性型またはＣＤ４０Ｌ−／−のマウス（いずれもＣ５７ＢＬ／６Ｊ）をＣＯ２で安楽死させ、肺、心臓、脳および肝臓を無菌操作により採取し、カミソリの刃で細かく刻み、０．２％Ｉ型コラゲナーゼ／１％ＢＳＡ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ（レークウッド、ニュージャージー州）およびシグマ（セントルイス、ミズーリ州））中において３７℃で９０分間消化した。０．１％ＢＳＡで洗浄後、７０μｍのナイロンメッシュで濾過し、０．１％ＢＳＡに細胞を再懸濁し、ヒツジ抗ラットＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ（オスロ、ノルウェー））を結合させた抗マウスＣＤ３１抗体とともに室温で１０分間インキュベートした。次いで、ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して細胞を分離して３回洗浄し、ゼラチンコートプレートに播種した。細胞がコンフルエントに達した後、ラット抗マウスＩＣＡＭ−２抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて２回目の磁気ソーティングを行った。２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ヘパリン、１％ウシ内皮細胞増殖因子、０．６％ＮＥＡＡおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した高グルコースＤＭＥＭにおいて細胞を増殖させ、この細胞を実験の２４時間前まで０．１％ＦＢＳを添加したＭ−１９９中で保存した。
【００８９】
１２．  実施例の結果
上記の実験の結果は図にまとめ、図の説明において詳細に記載した。さらに、以下により詳細に説明する。
【００９０】
インビボにおいてペプチドを治療目的で使用するためには血漿中濃度が適切でなければならない。腹腔内注射後、ｃＭ７の血漿中濃度は３０分間〜４時間維持された（図２ｇ）。インビボにおいてこのペプチド阻害剤が炎症性機能を効果的に調節するかどうかを試験した。ｃＭ７でマウスを処置後ＴＮＦ−αを攻撃感染させると、腹腔内の血漿成分中ＭＣＰ−１の発現レベルが低下し、ＣＸＣＬ−１およびＲＡＮＴＥＳについても同様の傾向が見られたが、血漿中および腹水中ＩＬ−１０レベルは上昇した（図２ｈ，ｉ；図８ａ〜ｃ）。さらに、ｃＭ７による処置によって、ＴＮＦ−αの誘導による顆粒球のオキシダティブバーストが抑制され（図２ｊ）、血小板Ｌ−セレクチンの発現が低減され、顆粒球／単球と血小板との凝集塊が減少した（図２ｋ，ｌ）。このことにより、本発明の薬剤の様々な抗炎症性特性が実証された。
【００９１】
Ｍａｃ−１は炎症性疾患において接着因子として機能することが従来知られているため、ｃＭ７は炎症性細胞動員を制限しうると仮定した。この仮定どおり、チオグリコール酸塩により惹起された腹膜細胞の蓄積がｃＭ７によって強力に低減されたことが野生型マウスにおいて確認されたが、ＣＤ４０Ｌ−／−マウスにおいては低減されなかった（図３ａ）。機械論的に、Ｍａｃ−１−ＣＨＯ細胞およびヒト内皮細胞（ＥＣ）の接着は、それぞれＭａｃ−１のＣＨＯ細胞への接着またはＣＤ４０Ｌの内皮細胞への接着を選択的にブロックすることによって阻害できると考えられるが、この逆は成り立たない。したがって、内皮細胞のＣＤ４０Ｌと白血球のＭａｃ−１との相互作用は本発明のペプチドの標的として最も適切であると言える。
【００９２】
抗ＣＤ４０Ｌによる処置によって、抗ＩＣＡＭ−１または抗Ｍａｃ−１による処置と同程度に接着が阻害された（図３ｃ）。フィブリノゲンとは異なり、ＣＤ４０Ｌは生理学的なフロー条件下においてより多くの細胞と結合した（図３ｄ）。ＣＤ４０Ｌ欠損内皮細胞では、フローチャンバーにおけるマウス白血球の動員が強力に阻害されたが（図３ｅ〜ｇ）、これは接着分子の発現を変化させたことによるものではなかった（図３ｈ）。同様に、抗Ｍ７は白血球の活性化内皮細胞への接着を阻害した（図７）。
さらに、ＴＮＦ−αを攻撃感染させたマウスの精巣挙筋血管におけるローリングおよび強固な接着は、ｃＭ７の腹腔内注射によって強力に抑制されたが（図３ｉ〜ｋ）、血圧、白血球数、および血小板数は変化しなかった（表２参照）。
【００９３】
【表２】
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【００９４】
ｃＭ７を静脈内注射したところ、同様のデータが得られた（図３ｌ）。
【００９５】
上記のデータを総合すると、インビボにおいて白血球動員を強力に調節するＣＤ４０Ｌ／Ｍａｃ−１相互作用は、ｃＭ７によって効果的かつ特異的にターゲティングされると言える。
【００９６】
単球の動員は、多くの慢性炎症性疾患の発症および進行に大変重要な役割を果たしている。したがって、ペプチド阻害剤がインビボにおいてマウスのアテローム性動脈硬化症を緩和できるかを試験した。高コレステロール食餌を２０週間にわたり与えたＬＤＬｒ−／−マウスをｃＭ７で処置したところ、大動脈洞および腹大動脈に形成された病変が顕著に縮小された（図４ａ，４ｂ）。さらに、単に大きさが縮小されただけではなく、ｃＭ７により処置されたマウスのアテローム性動脈硬化プラークに含まれたマクロファージの数および蓄積した脂質は顕著に少なく、平滑筋細胞数は増加していた（図４ｃ〜ｅ）。処置群およびコントロール群のいずれにおいてもプラーク内のコラーゲン含有量は増加していたが（図４ｆ）、ｃＭ７により処置したマウスのプラークには安定な太いコラーゲン線維がより多く含まれていた（図４ｇ）。これらの結果から、ＣＤ４０Ｌの遺伝学的または治療的な阻害によってアテローム性動脈硬化病変の形成が抑制され、プラークがより安定な形態へとリモデリングされることが示された。ｃＭ７よる長期処置後、Ｔ細胞数、Ｂ細胞数、Ｔｈ１／Ｔｈ２表現型を表すサイトカイン（ＩＬ−１０、ＩＬ−１２またはＩＮＦ−γ）濃度などの免疫学的特性においてはいかなる変化も観察されなかった（図９）。
【００９７】
脂質濃度、体重、白血球サブセット、血圧、サイトカイン濃度およびケモカイン濃度に変化は見られなかった（表３参照）。
【００９８】
【表３】
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【００９９】
実施例１２
インビボ血栓モデルにおいて潜在的副作用を調査した。３〜４週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、滅菌生理食塩水（１００μｌ）、ペプチドｃＭ７、ｓｃＭ７および図に示した抗体のいずれかを腹腔内注射した。腸間膜細動脈を調査対象として選択し、塩化鉄で傷害を誘導した。ローダミン３Ｇを眼窩後方に注射することによって血小板を染色し、生物顕微鏡（ＡｘｉｏＳｃｏｐｅ Ｖａｒｉｏ、カールツァイス）で観察した。血管閉塞時間および血栓・塞栓形成率を分析した。以前に報告されている方法（Andreら，Loc.Cit.）で尾部出血時間を測定した。
【０１００】
図１０に、マウスにおいてＣＤ４０／Ｍａｃ−１相互作用は血栓形成および血栓の安定化を媒介しないことを示す。塩化鉄によりＣ５７ＢＩ／６野生型マウスに傷害を誘導し、ペプチドｃＭ７、ｓｃＭ７（１００μｇ）、Ｍａｃ−１、ＣＤ４０Ｌ、またはＣＤ４０に対するブロッキング抗体（１００μｇ）、ＩｇＧアイソタイプコントロール（１００μｇ）、および生理食塩水のいずれかを注射し、尾部出血時間（Ａ）および腸間膜細静脈におけるインビボ血栓形成（Ｂ〜Ｄ）を評価した。血栓・塞栓形成率は１分間あたりの塞栓形成頻度（Ｃ，Ｄ）と定義した。データは１群あたり少なくとも４匹のマウスを用いて得られた平均値±ＳＥＭで示した。スケールバーは２００μｍを示す。
【０１０１】
ＣＤ４０Ｌの止血作用は、ＣＤ４０または血小板インテグリンＧＰIIｂ／IIIａ（αIIｂβ３）との相互作用に依存する（Andreら，loc.cit）。この相互作用を阻害するための従来の治療戦略においては、ＣＤ４０Ｌ全体を中和する抗体が使用されていたため、血栓塞栓性合併症が引き起こされていた。本発明者らの研究においても抗ＣＤ４０Ｌブロッキング抗体による処置により尾静脈出血時間が顕著に延長されて７４±１２％（ｎ≧４、ｐ＝０．０４）増加し、このことによって従来の研究結果が確認された。興味深いことに、ｃＭ７による選択的ブロッキングでは出血時間に変化は見られず（図１０Ａ）、これによってＣＤ４０Ｌ／Ｍａｃ−１相互作用がＣＤ４０Ｌの炎症性経路に特異的であることが示唆された。これに従い、ｃＭ７は動脈血栓症モデルにおける血管閉塞時間を延長させなかったが、抗ＣＤ４０Ｌによる処置および抗ＣＤ４０による処置は、腸間膜細動脈における血栓形成を悪化させ、閉塞時間は抗ＣＤ４０Ｌにより１１３±２２％（ｎ＝５、ｐ＝０．００５）延長し、抗ＣＤ４０により１１６±２２％（ｎ＝４、ｐ＝０．０５）延長した（図１０Ｂ）。さらに、ｃＭ７によるＣＤ４０Ｌ／Ｍａｃ−１相互作用の破壊では、血栓・塞栓形成率（ｎ＝５、ｐ＝０．００５）がわずかに増加したが、このような影響は、塞栓形成率が抗ＣＤ４０Ｌによる処置によって３３９±３８％（ｎ＝６、ｐ＝０．００１）増加し、抗ＣＤ４０による処置によって１７３±４０％（ｎ＝３、ｐ＝０．００８）増加したことと比較すると、無視できるものであった。興味深いことに、抗Ｍａｃ−１中和抗体による処置でも塞栓形成率が１３１±４１％（ｎ＝４、ｐ＝０．０３、図１０Ｃ，Ｄ）増加したが、その程度は小さかった。
【０１０２】
ＣＤ４０ＬはＭａｃ−１ Ｉドメイン内の特徴的な領域に特異的に結合することが上記のデータにより示された。本明細書において開示されたペプチドは、Ｍａｃ−１とＣＤ４０Ｌとの結合をブロックしたが、他のレセプター／リガンド相互作用のいくつかにおいては影響を及ぼさなかった。したがって、本明細書において開示されたペプチドおよび抗体は、望ましくない副作用のない薬剤として使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ−ｄ】
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【図４ｅ−ｉ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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