(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つで表されるタンパク質を用いてＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸中のＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を加水分解する工程、及びＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸をラセミ化してＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を生成させる工程を含むことを特徴とするＤ−アミノ酸の製造方法：
（ａ）配列番号８に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｂ）配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｃ）配列番号８に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子によってコードされ、かつ、Ｄ−サクシニラーゼ活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、Ｄ−サクシニラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つで表されるタンパク質を用いてＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸中のＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を加水分解する工程、およびＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸をラセミ化してＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を生成させる工程が同時に行なわれることを特徴とする請求項１に記載の方法：
（ａ）配列番号８に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｂ）配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｃ）配列番号８に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子によってコードされ、かつ、Ｄ−サクシニラーゼ活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、Ｄ−サクシニラーゼ活性を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品等の中間体の原料となるＤ−アミノ酸の製造に利用できる、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を脱アシル化してＤ−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質（以下、Ｄ−サクシニラーゼと呼ぶ）に関する。また、本発明は、かかるＤ−サクシニラーゼと、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを組み合わせて使用することにより、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を効率的に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性アミノ酸は、医薬品、農薬及び食品などの分野で多くの需要があるが、Ｄ−アミノ酸は、光学的に純粋なアミノ酸、特に発酵法などの産物（天然のアミノ酸）として得ることが難しい。従って、Ｄ−アミノ酸を、いかにして効率的に製造するかは、産業上重要な課題となっている。
【０００３】
この課題に対して、Ｎ−アセチルアミノ酸のラセミ体を合成し、酵素法によりラセミ体中のＤ体を選択的に加水分解する方法が開発された。この方法は、Ｄ−アミノアシラーゼなどの酵素の特異性を利用してＮ−アセチル−ＤＬ−アミノ酸を加水分解し、必要なＤ−アミノ酸のみを特異的に生成させる方法であり、光学純度に優れた生成物を容易に得ることができる（特許文献１、２、３）。
【０００４】
しかし、この方法でＤ−アミノ酸の収率を向上させるには、ラセミ体の半分、すなわちＤ−アミノアシラーゼに対して反応せず系中に残存したＮ−アセチル−Ｌ−アミノ酸を化学的にラセミ化してＮ−アセチル−ＤＬ−アミノ酸に戻し、再度原料として用いるという工程が必要となる。そこで、Ｎ−アセチル−Ｌ−アミノ酸のラセミ化を触媒するラセマーゼ作用を有する酵素が有用となる。たとえば、医薬品原料などとして重要であるＤ−トリプトファンは、Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファンをＤ−アミノアシラーゼにより加水分解することにより得ることができる。そして、Ｄ−アミノアシラーゼに対して反応せず系中に残存したＮ−アセチル−Ｌ−トリプトファンをラセマーゼにより再度ラセミ化し、生成したラセミ体中のＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンをＤ−アミノアシラーゼにより加水分解する。この二つの工程を一連の酵素反応として連続的に行うことにより、Ｄ−トリプトファンを高収率で得ることができる（特許文献４）。
【０００５】
このような用途に有効なラセマーゼとして、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼが知られている。この酵素は、Ｎ−アシル修飾されていないアミノ酸には作用せず、Ｎ−アシルアミノ酸を特異的にラセミ化する酵素である。化学合成されたＮ−アセチルアミノ酸のラセミ体を原料とし、Ｄ−アミノアシラーゼとＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼを反応させることにより、Ｄ−アミノ酸を高収率で得ることができると考えられる。
【０００６】
しかし、この方法は実用化に大きな障害があった。それは、報告されているＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼのＮ−アセチルアミノ酸への反応性が極めて低いため、工業的な規模、時間において、高収率でＤ−アミノ酸が得られないことである。
【０００７】
これに対して、Ｎ−サクシニルアミノ酸を基質とするＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ、即ちサクシニルアミノ酸ラセマーゼが同定され、当該酵素を用いることにより、工業的な規模、時間での効率的なＮ−サクシニルアミノ酸のラセミ化が可能になったことが報告されている（特許文献５、６、非特許文献１）。
【０００８】
一方、Ｎ−サクシニルアミノ酸を基質とするアシラーゼ反応については、従来公知のＤ−アミノアシラーゼが、ごくわずかにＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を加水分解できることは分かっていたものの（特許文献５）、Ｎ−アセチル−Ｄ−アミノ酸を基質とした時と比較すると、その加水分解活性は格段に低かった。そのため、従来公知のＤ−アミノアシラーゼをサクシニルアミノ酸ラセマーゼと組み合わせても、工業的な規模、時間において、高収率でＤ−アミノ酸を得ることはできなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００２−３２０４９１号公報
【特許文献２】特開２００６−２５４７８９号公報
【特許文献３】ＷＯ２００４／０５５１７９
【特許文献４】特開２００１−４６０８８号公報
【特許文献５】特開２００８−０６１６４２号公報
【特許文献６】特開２００８−３０７００６号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓａｋａｉ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，４５（１４），４４５５−６２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸の加水分解活性が高く、サクシニルアミノ酸ラセマーゼと組み合わせることにより、工業的な規模、時間においてＤ−アミノ酸を高収率で製造することができる新規なＤ−サクシニラーゼを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記目的を達成するために、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸加水分解能力を指標として様々な土壌微生物をスクリーニングした結果、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を加水分解する能力に優れる新規な微生物（クプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）・エスピー．Ｐ４−１０−Ｃ）を見出し、該新規な微生物が新規なＤ−サクシニラーゼを産生していることを見出した。さらに、該新規なＤ−サクシニラーゼ遺伝子のクローニングに成功し、ＤＮＡ組換え法によりＤ−サクシニラーゼの遺伝子工学的生産にも成功した。
また、本発明者らは、前記知見を基に、公的機関に寄託されているこの微生物の近縁種についても鋭意探索を行い、それらの中からもＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を加水分解する能力に優れるものを見出し、該寄託微生物が新規なＤ−サクシニラーゼを産生していることを見出した。さらに、これらの新規なＤ−サクシニラーゼ遺伝子のクローニングに成功し、ＤＮＡ組換え法によりＤ−サクシニラーゼの生産にも成功した。そして、これらの知見に基づき、本発明者らは、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、本発明によれば、（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つで表されることを特徴とするタンパク質が提供される：
（ａ）配列番号２，４，６または８に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｂ）配列番号１，３，５または７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｃ）配列番号２，４，６または８に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、Ｄ−サクシニラーゼ活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号１，３，５または７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、Ｄ−サクシニラーゼ活性を有するタンパク質。
【００１４】
また、本発明によれば、（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つで表されることを特徴とする遺伝子が提供される：
（ａ）配列番号２，４，６または８に記載の塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号１，３，５または７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号２，４，６または８に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｄ−サクシニラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号１，３，５または７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、Ｄ−サクシニラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【００１５】
さらに、本発明によれば、上記遺伝子をベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする上記タンパク質の製造方法が提供される。
【００１６】
さらに、本発明によれば、上記タンパク質を用いてＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸中のＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を加水分解する工程、及びＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸をラセミ化してＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を生成させる工程を含むことを特徴とするＤ−アミノ酸の製造方法が提供される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のＤ−サクシニラーゼは、従来の酵素に比べてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸の加水分解活性が格段に高いため、公知のサクシニルアミノ酸ラセマーゼと組み合わせて使用することにより、Ｎ−アシルアミノ酸の効率的なラセミ化と加水分解が可能となる。従って、本発明によれば、医薬品原料などとして有用なＤ−アミノ酸を、工業的な規模、時間において高収率で得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、クプリアビダス・エスピー．Ｐ４−１０−Ｃ株の生産するＤ−サクシニラーゼの電気泳動法による電気泳動像を示す図である。
【図２】図２は、クプリアビダス・エスピー．Ｐ４−１０−Ｃ株の生産するＤ−サクシニラーゼの温度安定性測定時の残存相対活性を示す図である。
【図３】図３は、クプリアビダス・エスピー．Ｐ４−１０−Ｃ株の生産するＤ−サクシニラーゼの至適温度測定時の相対活性を示す図である。
【図４】図４は、クプリアビダス・エスピー．Ｐ４−１０−Ｃ株の生産するＤ−サクシニラーゼの至適ｐＨ測定時の相対活性を示す図である。
【図５】図５は、各種Ｄ−サクシニラーゼのＤ−サクシニラーゼ活性を示す図である。
【図６】図６は、形質転換体の生産するＤ−サクシニラーゼの温度安定性測定時の残存相対活性を示す図である。
【図７】図７は、形質転換体の生産するＤ−サクシニラーゼの至適温度測定時の相対活性を示す図である。
【図８】図８は、形質転換体の生産するＤ−サクシニラーゼのｐＨ安定性測定時の残存相対活性を示す図である。
【図９】図９は、形質転換体の生産するＤ−サクシニラーゼの至適ｐＨ測定時の相対活性を示す図である。
【図１０】図１０は、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニンに対するＤ−サクシニラーゼ反応時の加水分解率を示す図である。
【図１１】図１１は、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニンに対するＤ−サクシニラーゼとサクシニルアミノ酸ラセマーゼ反応時の加水分解率を示す図である。
【図１２】図１２は、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−トリプトファンに対するＤ−サクシニラーゼとサクシニルアミノ酸ラセマーゼ反応時の加水分解率を示す図である。
【図１３】図１３は、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニンに対するＤ−サクシニラーゼとサクシニルアミノ酸ラセマーゼ反応時の加水分解率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明のＤ−サクシニラーゼは、（ａ）配列番号２，４，６または８に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質、または（ｂ）配列番号１，３，５または７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である。配列番号２は、新規な土壌微生物クプリアビダス・エスピー．Ｐ４−１０−Ｃ株のＤ−サクシニラーゼの塩基配列であり、配列番号１は、そのアミノ酸配列である。配列番号４，６，８は、クプリアビダス・エスピー．Ｐ４−１０−Ｃ株の近縁種のＤ−サクシニラーゼの塩基配列である。具体的には、配列番号４は、クプリアビダス・メタリデュランス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ）の、配列番号６は、クプリアビダス・ネケター（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）の、配列番号８は、ラルストニア・ピケッティ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ）のＤ−サクシニラーゼの塩基配列である。配列番号３，５，７はそれぞれ、配列番号４，６，８の塩基配列に対応するアミノ酸配列である。なお、上述のクプリアビダス属の細菌の中には、ラルストニア属の細菌として文献に表記されているものもあるが、クプリアビダス属が正式な属名として一般的に使用され始めている。これらの細菌の学術名は、将来の再分類により、統一又は変更される可能性がある。
【００２０】
上記（ａ）および（ｂ）のタンパク質は、Ｎ−サクシニルアミノ酸のＤ体とＬ体のうちＤ体であるＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸に対する加水分解活性が高く、Ｄ−アミノ酸を効率的に生成させることができるという特徴を有する。上記（ａ）および（ｂ）のタンパク質は、Ｎ−アセチルアミノ酸よりもＮ−サクシニルアミノ酸に対して顕著に高い活性を有する。これらのことから、上記（ａ）および（ｂ）のタンパク質は、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を効率的に加水分解してＤ−アミノ酸とコハク酸を生成する反応を触媒する酵素、つまりＤ−サクシニラーゼであると言える。
【００２１】
本発明のＤ−サクシニラーゼの理化学的性質は、以下の（ｉ）〜（ｖｉ）に示す通りである。
【００２２】
（ｉ）作用：Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を加水分解して、Ｄ−アミノ酸を生じる。
（ｉｉ）サブユニット構造：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が５０〜７０ｋダルトンと２０〜３０ｋダルトンを示すサブユニットを含有するヘテロダイマーである。
（ｉｉｉ）基質特異性：下記一般式（Ｉ）に示す任意のＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸に対して作用する。
0006048851.tif 000002
（一般式（Ｉ）中、Ｒは、置換基を有してもよい炭素数４〜２０のアリール基、または置換基を有してもよい炭素数５〜２０のアラルキル基を示す。）
上記Ｒにおける置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリール基としては、フェニル基、４−ヒドロキシフェニル基などが挙げられる。置換基としては、アミノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、アルキル基、アラルキル基、アリール基、アルカノイル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、又はハロゲン原子等が挙げられる。また、置換基を有していてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基としては、特に限定されず、例えば、ベンジル基、インドリルメチル基、４−フェニルベンジル基、４−ヒドロキシベンジル基等が挙げられる。
（ｉｖ）温度安定性：酵素濃度（０．２ｍｇ／ｍＬ）、リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）で６０分間熱処理した場合、５０℃で残存活性が９０％以上である。
（ｖ）至適温度：酵素濃度（０．０１ｍｇ／ｍＬ）、リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）で反応させる場合、温度４５〜５０℃が至適である。なお、至適とは、酵素濃度（０．０１ｍｇ／ｍＬ）、リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）において、３０℃、４０℃、４５℃、５０℃、６０℃でそれぞれ５分間反応させた場合の活性が最も高かった温度で測定された活性値を１００％としたときの相対値が８０％以上である温度範囲を示す。
（ｖｉ）至適ｐＨ：酵素濃度（０．０１ｍｇ／ｍＬ）、３７℃で６０分間反応させる場合、ｐＨ７〜８が至適である。なお、至適とは、酵素濃度（０．０１ｍｇ／ｍＬ）、緩衝溶液にはリン酸緩衝溶液（ｐＨ５．５−ｐＨ７．５）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５−ｐＨ８．５）、ホウ酸緩衝溶液（ｐＨ８．５−ｐＨ１０．０）を用い、３７℃で６０分間反応させた場合の活性が最も高かったｐＨで測定された活性値を１００％としたときの相対値が８０％以上である温度範囲を示す。
【００２３】
本発明は、（ａ）配列番号２，４，６または８に記載の塩基配列からなる遺伝子、および（ｂ）配列番号１，３，５または７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子も包含する。これらは、上記（ａ）および（ｂ）のタンパク質に対応する遺伝子である。
【００２４】
本発明のＤ−サクシニラーゼは、上記（ａ）および（ｂ）のものに限定されず、（ｃ）配列番号２，４，６または８に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、Ｄ−サクシニラーゼ活性を有するタンパク質、または（ｄ）配列番号１，３，５または７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、Ｄ−サクシニラーゼ活性を有するタンパク質も含む。また、本発明の遺伝子は、（ｃ）配列番号２，４，６または８に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｄ−サクシニラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、または（ｄ）配列番号１，３，５または７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、Ｄ−サクシニラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含む。これは、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列の一部に変異が生じたり、またその結果としてタンパク質のアミノ酸配列の一部に変異が生じても、機能的には同等のタンパク質であることが多いからである。また、本発明のＤ−サクシニラーゼの遺伝子を、由来生物以外の宿主生物（大腸菌など）に組込んで本発明のＤ−サクシニラーゼを発現させる場合、発現効率向上のため、宿主生物のコドンユーセージに合わせて塩基配列を変更することもあるからである。
【００２５】
ここで、「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造やＤ−サクシニラーゼ活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、１〜５０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個である。ただし、配列表の配列番号１，３，５または７に記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位を含むアミノ酸配列の場合には、３０℃、ｐＨ７〜８の条件下で配列表の配列番号１，３，５または７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の５０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上のＤ−サクシニラーゼ活性を保持していることが望ましい。
【００２６】
また、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件（ここでいう相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）は、比較する配列間において一致する塩基の数が最大となるような並べ方にして演算された値であることが望ましい）、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、好ましくは６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳに相当するに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。ただし、配列表の配列番号２，４，６または８に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合には、３０℃、ｐＨ７〜８の条件下で配列表の配列番号１，３，５または７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の５０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上のＤ−サクシニラーゼ活性を保持していることが望ましい。
【００２７】
上記（ｃ）及び（ｄ）のＤ−サクシニラーゼ活性を有するタンパク質及びその遺伝子は、例えばＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製、ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；東洋紡製などの市販のキットやＰＣＲ法を利用して配列番号２，４，６または８に記載の塩基配列を改変することによって得ることができる。得られた遺伝子によってコードされるタンパク質の活性は、例えば、得られた遺伝子を大腸菌に導入して形質転換体を作成し、この形質転換体を培養して酵素タンパク質を生成させ、この形質転換体、この形質転換体の菌体破砕液もしくは精製した酵素タンパク質をＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に添加してＤ−アミノ酸の生成を実施例に記載の方法で測定することによって確認することができる。
【００２８】
次に、本発明のＤ−サクシニラーゼの製造方法について説明する。本発明のＤ−サクシニラーゼの製造は、その遺伝子を適当なベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで適当な宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養することによって容易に行うことができる。
【００２９】
ベクターとしては、原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターおよびファージベクター、ウィルスベクター等が包含される。組換えベクターの調製は、常法に従って行えばよく、例えば、これらのベクターに、本発明のＤ−サクシニラーゼの遺伝子を適当な制限酵素およびリガーゼ、あるいは必要に応じてさらにリンカーもしくはアダプターＤＮＡを用いて連結することにより容易に行うことができる。また、Ｔａｑポリメラーゼのように増幅末端に一塩基を付加するようなＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅作製した遺伝子断片であれば、ＴＡクローニングによるベクターへの接続も可能である。
【００３０】
また、宿主細胞としては、従来公知のものが使用可能であり、組換え発現系が確立しているものであれば特に制限されないが、好ましくは大腸菌、枯草菌、放線菌、麹菌、酵母といった微生物ならびに昆虫細胞、動物細胞、高等植物などが挙げられ、より好ましくは微生物が挙げられ、特に好ましくは大腸菌（例えば、Ｋ１２株、Ｂ株など）が挙げられる。形質転換体の調製は、常法に従って行えばよい。
【００３１】
得られた形質転換体を、その宿主細胞に応じた適当な培養条件で一定期間培養すれば、組込まれた遺伝子から本発明のＤ−サクシニラーゼが発現されて、形質転換体中に蓄積する。
【００３２】
形質転換体中に蓄積した本発明のＤ−サクシニラーゼは、未精製のまま用いることができるが、精製したものを使用しても良い。この精製方法としては、従来公知のものが使用可能であり、例えば、培養後の形質転換体あるいはその培養物を適当な緩衝液中でホモジナイズし、超音波処理や界面活性剤処理等により細胞抽出液を得、そこからタンパク質の分離精製に常套的に利用される分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。このような分離技術としては、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
次に、本発明のＤ−サクシニラーゼをサクシニルアミノ酸ラセマーゼと組み合わせて用いてＤ−アミノ酸を製造する方法について説明する。本発明によれば、Ｄ−アミノ酸は、本発明のＤ−サクシニラーゼを用いてＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸（ラセミ体）中のＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸（Ｄ体）を効率的に加水分解する工程によって製造される。
【００３４】
この工程は、具体的には、適当な溶液中に、本発明のＤ−サクシニラーゼと原料のＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸を溶解させて反応液を調製し、この反応液を適当な条件に設定することによって行うことができる。
【００３５】
使用する溶液は、蒸留水でもよいが、必要により、リン酸塩やトリスなどの緩衝剤を使用してもよい。緩衝剤を使用する場合、その濃度は２０〜２００ｍＭであることが好ましく、ｐＨは６〜８であることが好ましい。
【００３６】
本発明のＤ−サクシニラーゼは、反応液中１〜１００００ｍｇ／Ｌ（１０〜１０００００Ｕ／Ｌ）の濃度で使用されることが好ましい。
【００３７】
本発明のＤ−サクシニラーゼと反応させるＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸は、種々の公知の方法によって合成することができ、例えばＳａｋａｉ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，４５（１４），４４５５−６２に記載の方法によって合成することができる。原料のＤＬ−アミノ酸の種類は、製造したいＤ−アミノ酸の種類に応じて適宜選択すればよく、天然に存在する２０種のアミノ酸および非天然アミノ酸およびその誘導体であることができる。反応液中のＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸の濃度は、特に限定されないが、一般的に１重量％〜３０重量％である。
【００３８】
本発明のＤ−アミノ酸の製造方法では、反応を進行させる温度は、本発明のＤ−サクシニラーゼが十分作用する温度であれば特に限定されないが、一般的には５〜６０℃が好ましく、１０〜５５℃がより好ましく、３０〜５０℃がさらに好ましい。また、反応時のｐＨは、本発明のＤ−サクシニラーゼが十分作用するｐＨであれば特に限定されないが、一般的にはｐＨ５〜１０が好ましく、ｐＨ６〜９がより好ましい。反応時間は、特に限定されないが、一般的に１〜１２０時間程度、好ましくは１〜７２時間程度、さらに好ましくは１〜２４時間程度である。反応時間は、製造したいＤ−アミノ酸の種類と所望の収量、収率、使用する酵素や基質の量、量比、反応温度や反応ｐＨなどを考慮し、実験的に適宜選択することができる。
【００３９】
なお、本発明のＤ−アミノ酸の製造方法で使用するＤ−サクシニラーゼは、精製されたものや未精製のもの（粗酵素液など）に限定されず、形質転換体中に含まれた状態のものであってもよい。この場合は、形質転換体を反応系に添加して、形質転換体を培養させながら同時に反応を進行させるか、又は予め培養された形質転換体を反応系に添加すればよい。
【００４０】
本発明のＤ−アミノ酸の製造方法は、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸をラセミ化してＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を生成させる工程をさらに含む。本発明のＤ−サクシニラーゼは、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸（ラセミ体）中のＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を主に加水分解するため、このままではラセミ体のうち、Ｎ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸の多くが無駄になってしまう。そこで、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸をラセミ化してＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を生成させてやれば、残ったＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸もＤ−アミノ酸に変換することができる。
【００４１】
Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼは、Ｎ−サクシニルアミノ酸のＬ体をＤ体に変換する反応とＤ体をＬ体に変換する反応の両方を触媒してその比率をほぼ等しく（ラセミ化）する酵素である。本発明の製造方法で使用するＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼは、Ｎ−サクシニルアミノ酸をラセミ化することができれば特に限定されず、特開２００７−８２５３４号公報に記載されたＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼや特開２００８−６１６４２号公報に記載されたＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼなどの従来公知のものを使用することができる。
【００４２】
Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸をラセミ化する反応は、例えば以下の条件でＮ−サクシニルアミノ酸、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼおよび緩衝剤を含む反応溶液中で混合することにより行なう。反応温度は、使用するＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼが十分作用する温度であれば特に限定されないが、一般的には２５〜７０℃が好ましく、３７〜６０℃がより好ましい。反応時のｐＨは、使用するＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼが十分作用するｐＨであれば特に限定されないが、一般的にはｐＨ５〜９が好ましく、ｐＨ６〜８がより好ましい。Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼは、反応液中５０〜１５０００ｍｇ／Ｌ（５０００〜１５０００００Ｕ／Ｌ）の濃度で使用されることが好ましい。Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼは、２価の金属イオンを０．１ｍＭ〜１Ｍ（好ましくは０．１〜１ｍＭ）の終濃度で添加することにより、活性が著しく向上する。添加する２価の金属イオンとしては、Ｍｎ２＋，Ｃｏ２＋，Ｍｇ２＋，Ｆｅ２＋およびＮｉ２＋が挙げられる。Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼの反応に用いる緩衝剤は、Ｄ−サクシニラーゼの反応に用いる緩衝剤と同様のものが使用できる。なお、特開２００７−８２５３４号に記載のＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼは、その後の研究により、Ｎ−サクシニルアミノ酸をより好適な基質とするＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼであることが判明している。従って、特開２００７−８２５３４号に記載のＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼは、本発明のＤ−サクシニラーゼと組合せて使用することができる。
【００４３】
前述のＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼによるラセミ化反応とＤ−サクシニラーゼによる加水分解反応は、別々に行なうことも可能であるが、同時に行なわれることが好ましい。同時に行われる場合、微視的に見ると、まずＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸のうちＤ体が本発明のＤ−サクシニラーゼにより加水分解（脱サクシニル化）され、目的のＤ−アミノ酸が生成する。基質のＤ体が消費されるとラセミ状態が解消されるため、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼはＬ体をＤ体に変換する反応をより促進する。Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼにより生成したＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸は、本発明のＤ−サクシニラーゼにより順次Ｄ−アミノ酸へと分解される。この繰返しにより、理論的にはほぼすべてのＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に変換することができる。ラセミ化反応および加水分解反応を同時に行う場合の反応条件は、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼおよび本発明のＤ−サクシニラーゼが活性を発揮する条件の範囲内であれば特に限定しないが、基質濃度０．０１重量％〜３０重量％、ｐＨ５〜９、温度４０〜５０℃で行うことが好ましい。ラセミ化反応および加水分解反応に要する時間は、原料として用いるＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸が、所望する量のＤ−アミノ酸へと変換し得るまでの時間であれば特に制限されず、仕込み量によっても異なるが、一般的に１日〜７日程度である。
【００４４】
本発明において使用するＤ−サクシニラーゼのアシラーゼ活性は、例えば以下のＤ−アミノ酸オキシダーゼ法により測定することができる。
＜試薬＞
１０  ｍＭ  Ｎ−サクシニル−Ｄ−バリン
１．０（Ｕ／ｍＬ）  ペルオキシダーゼ（東洋紡製ＰＥＯ−３０１）
１．０  ｍＭ  ４−アミノアンチピリン（第一化学薬品製）
１．０  ｍＭ  ＴＯＯＳ（同人化学研究所製）
６．０（Ｕ／ｍＬ）  Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（バイオザイム製ＤＯＸ２）
を含む２５ｍＭリン酸緩衝溶液を反応試薬とする。
なお、Ｎ−サクシニル−Ｄ−バリンの合成は、例えば以下のようにして行うことができる。Ｄ−バリン（ナカライテスク製、４．７ｇ）と無水コハク酸（ナカライテスク製、４．０ｇ）を４０ｍＬの酢酸（ナカライテスク製）に溶解させる。次に、溶液を５０〜６０℃に加熱し、溶媒を揮発させて結晶化させる。次に、結晶化した白い沈殿を集めて、酢酸エチル２０ｍＬとメタノール２０ｍＬの混合液中で再結晶化させる。そして、沈殿を乳鉢で破砕し、乾燥させ、Ｎ−サクシニル−Ｄ−バリンを得る。詳細は非特許文献１に記載されている。
＜測定条件＞
反応試薬２．７ｍＬを３７℃で５分間予備加温する。酵素溶液０．３ｍＬを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、５５５ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検は酵素溶液の代わりに酵素を溶解する溶液を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＤ−サクシニラーゼ活性を求める。ここでＤ−サクシニラーゼ活性における１単位（Ｕ）とは、上記条件下で１分間に１マイクロモルのＤ−アミノ酸を生成する酵素量として定義する。
【００４５】
（数１）
活性（Ｕ／ｍＬ）＝
｛（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率｝／
｛３１．０×０．３×１／２×１．０｝
【００４６】
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、３１．０は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、１／２は酵素反応で生成したＨ２Ｏ２の１分子から形成するＱｕｉｎｏｎｅｉｍｉｎｅ色素が１／２分子であることによる係数、０．３は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
【００４８】
［実施例１］Ｄ−サクシニラーゼのスクリーニング
本発明菌株は、以下の方法により土壌中よりスクリーニングを行い単離した。培地として、硝酸アンモニウム０．２％、リン酸二水素カリウム０．２％、リン酸水素二ナトリウム０．３％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％、酵母エキス０．０１％、ポリペプトン０．０１％、誘導物質Ｎ−サクシニル−Ｄ−フェニルアラニン０．２％を含むｐＨ７．５の培地に少量の土壌を加え、３５℃で試験管振盪培養することで、土壌より集積培養を数回実施した。同様の培地で寒天２％を含むシャーレ培地を作成し、集積培養を行った培養液をプレートアウトし、単離コロニーとした。単離されたコロニーを、再度上記培地で試験管振盪培養し、以下の方法でＤ−サクシニラーゼ活性を持った菌株をセレクトした。
【００４９】
ＨＰＬＣ分析による産生菌の選抜：コロニー単離された菌株培養液中の、Ｎ−サクシニル−Ｄ−フェニルアラニンに対して強い活性を示す菌株をセレクトするため、下記のＨＰＬＣによる分析を行った。
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２（５μｍ、４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ）（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）、移動相：ｐＨ２．３リン酸水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、温度：４０℃、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍの条件で、培養後遠心分離した培養上清液中のＮ−サクシニル−Ｄ−フェニルアラニンの分解とＤ−フェニルアラニンの生成を、Ｎ−サクシニル−Ｄ−フェニルアラニン、及びＤ−フェニルアラニンが溶出される時間のピーク面積より分析した。
このような方法を経て得られた菌株は、下記の菌学的性質を有するものであった。この菌株をクプリアビダス・エスピー．Ｐ４−１０−Ｃ（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ）と命名した。
【００５０】
（細菌学試験Ｉ）
１．細胞形態：桿菌（０．７−０．８×１．２−２．０μｍ）
２．グラム染色性：陰性
３．胞子の有無：陰性
４．運動性：あり
５．コロニー状態  培地：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ａｇａｒ
培養時間：２４Ｈｒ
直径：２．０−３．０ｍｍ
色調：淡黄色
形：円形
隆起状態：レンズ状
周縁：全縁
表面の形状：スムーズ
透明度：不透明
粘調度：バター状
６．生育温度試験：３７℃    生育
４５℃    生育
７．カタラーゼ反応：陽性
８．オキシダーゼ反応：陽性
９．グルコースからの酸／ガス生産（酸生産／ガス生産）：陰性／陰性
１０．Ｏ／Ｆテスト（酸化／発酵）：陰性／陰性
【００５１】
【表１】
0006048851.tif 000003
【００５２】
（細菌学試験ＩＩＩ）
１．クエン酸の利用（Ｓｉｍｍｏｎｓ法）：陽性
２．でんぷんの加水分解：陰性
３．リパーゼ活性（Ｔｗｅｅｎ２０）：陰性  ４．Ｄ−リボースからの酸産生：陰性
５．イノシトールからの酸産生：陰性
６．マンニトールからの酸産生：陰性
７．Ｌ−アラビノースからの酸産生：陰性
【００５３】
以上の生化学的、菌学的諸性質の結果、運動性を有するグラム陰性桿菌で、グルコースを酸化せずカタラーゼ及びオキシダーゼが陽性を示し、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓの一般性状と一致する。
ＡＰＩ試験の結果、Ｃ．ｇｉｌａｒｄｉｉの性状と類似する点も多いが、クエン酸の利用、イノシトールを酸化しない点は異なる。
【００５４】
【表２】
0006048851.tif 000004
【００５５】
さらに、ＢＬＡＳＴをもちいたアポロンＤＢ−ＢＡ  ４．０に対する相同性検索上位株の１６ＳｒＤＮＡによる簡易分子系統の結果、Ｃ．ｇｉｌａｒｄｉｉの１６ＳｒＤＮＡとクラスターを形成し近縁である事を示した。
しかし、配列間に２１塩基の相違点があり、Ｃ．ｇｉｌａｒｄｉｉに近縁なＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｓｐ．とする事が妥当であった。
【００５６】
【表３】
0006048851.tif 000005
【００５７】
この事から、自然界より新たに発見した微生物はクプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属に属する細菌に分類された。なお、本発明で発見した菌株は、クプリアビダス・エスピー．Ｐ４−１０−Ｃ（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ）として、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３８７として国際寄託されている（国際寄託日：２０１１年６月２８日）。
【００５８】
［実施例２］  クプリアビダス・エスピー．Ｐ４−１０−Ｃ株の生産するＤ−サクシニラーゼの精製
クプリアビダス・エスピー．  Ｐ４−１０−Ｃ株を、普通ブイヨン“栄研”１．８％、粉末酵母エキスＤ−３  ０．２％（和光純薬工業（株）製、Ｃｏｄｅ：３９０−００５３１）、カザミノ酸「ダイゴ」０．１％（和光純薬工業（株）製、Ｃｏｄｅ：３９２−００６５５）、リン酸水素二カリウム０．３％、グルコース０．２％を添加したｐＨ７．５の培地で、５００ｍＬフラスコに２００ｍＬ培地を加えオートクレーブ滅菌した培地２７本を用い３５℃、１５０ｒ／ｍｉｎ、回転攪拌で２日間培養した。培養終了時の濁度（ＡＢＳ６６０ｎｍ）は２．７で、ｐＨ８．６であった。
培養後、冷却遠心分離機（日立工機（株）製）を用い、８０００ｒ／ｍｉｎで３０分間遠心分離を行い集菌した。集菌した菌体を、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）緩衝液で洗浄した後、再度遠心分離し、菌体３６ｇを得た。
取得菌体量の約３倍の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）緩衝液１００ｍＬで懸濁後、氷冷下の超音波細胞破砕装置  ＢＤ−１（東湘電気（株）製）を用い、５分サイクルで１０回超音波破砕を行った。破砕後、高速冷却遠心機（日立工機（株）製）で８０００ｒ／ｍｉｎ、４℃、６０分間遠心分離し、上清液１７８ｍＬを得た。これを粗酵素液とした。
なお、本菌株は培養時にＮ−サクシニル−Ｄ−フェニルアラニンを添加しなくともＤ−サクシニラーゼを産生した。
【００５９】
粗酵素液を透析チューブに詰め、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）１．２Ｍ硫酸アンモニウム含有緩衝液中に投入し、低温室内（４℃）で攪拌を行いながら、数回緩衝液を交換し一昼夜透析を行った。透析終了後、高速冷却遠心機（日立工機（株）製）で４０００ｒ／ｍｉｎ、４℃、３０分間遠心分離し、上清液１００ｍＬを得た。この上清液を、予め２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）１．２Ｍ硫酸アンモニウム含有緩衝液で平衡化したＢｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍカラム（東ソー（株）製）（３．２ｃｍφ×２０ｃｍ）に供して目的酵素を吸着させ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）１．２Ｍ硫酸アンモニウム含有緩衝液と２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）緩衝液を総量２０００ｍＬ用い、直線濃度勾配法で酵素を溶出し、Ｄ−サクシニラーゼ活性のある画分を回収した。Ｂｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬで得られた活性画分を７０％硫酸アンモニウム飽和にて濃縮し、遠心分離１０，０００ｒ／ｍｉｎ、４℃、６０分間にて沈殿を回収した。回収した沈殿を、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で透析した。この透析した酵素液３３ｍＬを、予め５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化したＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ＣＨＴ  ＴｙｐｅＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）ハイドロキシアパタイトカラム（１．６ｃｍφ×２０ｃｍ）に吸着させた。次に、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）と３００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を総量１５０ｍＬ用いて直線濃度勾配法で酵素を溶出し、Ｄ−サクシニラーゼ活性のある画分を回収した。Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ＣＨＴ  ＴｙｐｅＩにより得られた活性画分１３０ｍＬを、ビバスピン  ２０（ザルトリウス（株）製）分画分子量１００００の限外ろ過膜を用いて、２０ｍＬに濃縮した。回収した濃縮液を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）酸緩衝液で透析した。この透析液を、予め２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）緩衝液で平衡化したＨｉ  Ｔｒａｐ  Ｑ  Ｆ．Ｆ．カラム５ｍＬ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）に供し、続いて２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）と２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）０．３Ｍ塩化ナトリウム酸緩衝液を総量２００ｍＬ用いて直線濃度勾配法で酵素を溶出し、Ｄ−アミノアシラーゼ活性のある画分を回収した。
【００６０】
Ｄ−サクシニラーゼ活性が確認された画分の少量を定法のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析に供し、不純蛋白質が混在しない画分を回収し、新規Ｄ−サクシニラーゼを得た。精製後の電気泳動結果を図１に示す。
【００６１】
［実施例３］クプリアビダス・エスピー．Ｐ４−１０−Ｃ株の生産するＤ−サクシニラーゼの酵素学的性質
実施例２で得られたＤ−サクシニラーゼの酵素学的性質を、以下の方法で測定した。
【００６２】
１．分子量
定法のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳｕｐｅｒＳｅｐ  Ａｃｅ  １０−２０％  和光純薬社製）で測定を行った。タンパク質分子量マーカー（積水メディカル（株）製、タンパク質分子量マーカー「第一」・ＩＩＩ）（このマーカーは、フォスフォリラーゼｂ（９７，４００ダルトン）、ウシ血清アルブミン（６６，２６７ダルトン）、アルドラーゼ（４２，４００ダルトン）、カルボニックアンヒドラーゼ（３０，０００ダルトン）、トリプシンインヒビター（２０，１００ダルトン）、及びリゾチーム（１４，４００ダルトン）を含む）の移動度より分子量を求めた。分子量は５０〜７０ｋダルトンと２０〜３０ｋダルトンのサブユニットを含有するヘテロダイマーであった（図１）。
【００６３】
２．基質特異性
前記したＤ−アミノ酸オキシダーゼ法（ただし、Ｎ−サクシニル−Ｄ−トリプトファン、Ｎ−サクシニル−Ｄ−フェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−Ｄ−セリンに対する活性値を測定する場合は、反応基質として１０ｍＭ  Ｎ−サクシニル−Ｄ−バリンではなく、１０ｍＭ  Ｎ−サクシニル−Ｄ−トリプトファン、１０ｍＭ  Ｎ−サクシニル−Ｄ−フェニルアラニン、１０ｍＭ  Ｎ−サクシニル−Ｄ−セリンを使用し、それぞれ測定する。）並びに以下に記載のＨＰＬＣ分析法に則り、以下のＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を反応させて確認を行った。
アミノ酸オキシダーゼが作用しにくいＮ−サクシニル−Ｄ−アスパラギン酸、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アスパラギン、Ｎ−サクシニル−Ｄ−グルタミン酸に対しては、ＨＰＬＣ測定によりカラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２（５μｍ、４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ）（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）、移動相：ｐＨ２．３リン酸水溶液：アセトニトリル＝９０：１０、温度：４０℃、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍの条件で、Ｄ−アミノ酸の検量線を作成し、反応液を分析し、Ｄ−アミノ酸濃度を測定した。
基質側鎖のタイプによる活性の差異を検討するため、カルボキシ基を持ったＮ−サクシニル−Ｄ−グルタミン酸、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アスパラギン酸、カルボキシ基がアミド化されているＮ−サクシニル−Ｄ−アスパラギン、疎水性の芳香環を有するＮ−サクシニル−Ｄ−フェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−Ｄ−トリプトファン、疎水性の脂肪族炭化水素基を有するＮ−サクシニル−Ｄ−バリン、親水性のヒドロキシ基を有するＮ−サクシニル−Ｄ−セリンについて実験を行なった。
その結果を表４に示す。表４から明らかなように、側鎖による差異はあるものの、実施例２で得られたＤ−サクシニラーゼは、様々なタイプのアミノ酸に対し酵素活性を示すことが確認された。
【００６４】
【表４】
0006048851.tif 000006
【００６５】
さらに、１０ｍＭの各種Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸をＤ−アミノ酸へ加水分解する能力について、実施例２で得られたＤ−サクシニラーゼと公知Ｄ−アミノアシラーゼアマノ（和光純薬工業株式会社  コード：３２９−６１０６３、特開２００１−０００１８５、アルカリゲネス・キシロースオキシダンス・サブスピーシーズ・キシロースオキシダンス  Ａ−６株由来）を比較した。
その結果を表５に示す。表５から明らかなように、実施例２で得られたＤ−サクシニラーゼは、基質により異なるが、公知のＤ−アミノアシラーゼアマノより約１０００倍以上優れていた。
測定方法は、実施例２で得られたＤ−サクシニラーゼについては、上述のＤ−アミノ酸オキシダーゼ並びにＨＰＬＣ分析法に則って行った。また、公知Ｄ−アミノアシラーゼアマノについては、０．１ｍＭの塩化コバルトを含む溶液中で反応させ、すべてＨＰＬＣ分析法に則って行った。
実施例２で得られたＤ−サクシニラーゼのＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸からＤ−アミノ酸への加水分解活性は１２Ｕ／ｍｇ以上である。
【００６６】
【表５】
0006048851.tif 000007
【００６７】
３．温度安定性及び至適温度
実施例２で得られたＤ−サクシニラーゼ酵素液を用いて、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ法で温度安定性と至適温度を調べた。温度安定性は酵素液（０．２ｍｇ／ｍＬ）をｐＨ７．５のリン酸緩衝溶液中で４℃、４０℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、又は７０℃で６０分間処理し、その酵素活性を求めた。至適温度は、酵素液（０．０１ｍｇ／ｍＬ）をｐＨ７．５のリン酸緩衝溶液中で反応温度を３０℃から６０℃まで変化させ、その酵素活性を求めた。温度安定性の評価は４℃で処理した場合を１００％とした残存相対活性で示した。また、至適温度の評価は５０℃における酵素活性を１００％とした相対活性で示した。結果を図２（温度安定性）及び図３（至適温度）に示す。図２から明らかなように、本酵素は、５０℃の熱処理によってもその酵素活性は、４℃で処理したときの９０％以上の活性を維持することが分かった。また、図３から明らかなように、本酵素の至適温度は４５℃から５０℃付近である。なお、至適温度とは、酵素濃度（０．０１ｍｇ／ｍＬ）、リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）において、３０℃、４０℃、４５℃、５０℃、６０℃でそれぞれ５分間反応させた場合の活性が、最も高かった温度を１００％としたときの相対値で８０％以上である温度範囲を示す。
【００６８】
４．至適ｐＨ
実施例２で得られたＤ−サクシニラーゼ酵素液（０．０１ｍｇ／ｍＬ）を用いて、上記記載のＨＰＬＣ分析法で至適ｐＨを調べた。緩衝溶液にはリン酸緩衝溶液（ｐＨ５．５−ｐＨ７．５）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５−ｐＨ８．５）、ホウ酸緩衝溶液（ｐＨ８．５−ｐＨ１０．０）を用い、それぞれのｐＨで３７℃、６０分間反応させた後、その酵素活性を求めた。ｐＨ安定性の評価は、ｐＨ＝７．４５の場合を１００とした相対活性で示した。結果は図４に示す。図４から明らかなように、本酵素は、ｐＨ＝６．９９〜８．４０で、ｐＨ＝７．４５で処理したときの８０％以上の活性を示した。
【００６９】
５．金属イオンの影響
実施例２で得られたＤ−サクシニラーゼ酵素液（０．０１ｍｇ／ｍＬ）を用いて、以下の表６に示す様々な２価の金属イオンをそれぞれ終濃度１ｍＭ存在下で３７℃、６０分間反応させ、Ｄ−サクシニラーゼ活性を上記記載のＨＰＬＣ分析法で測定し、無添加の酵素活性を１００とした相対活性で示した。結果を表６に示す。表６から明らかなように、本酵素活性は、金属イオンによる顕著な影響を受けなかった。
【００７０】
【表６】
0006048851.tif 000008
【００７１】
［実施例４］クプリアビダス・エスピー．Ｐ４−１０−Ｃ株由来のＤ−サクシニラーゼ遺伝子の単離
１．部分配列の取得
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に該酵素に相当するバンドをアクリルアミドゲル上からＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ：シーケーブロットＰＶＤＦメンブレン）に転写し、Ｎ末端アミノ酸配列分析、内部アミノ酸配列分析を行い、約６０ｋＤａのバンドから内部アミノ酸配列；ＳＮＮＷＶＩＡＧＳＲＴＳＴＧＲ、約２３ｋＤａのバンドからＮ末端アミノ酸配列；ＡＰＰＴＤＲＹＡＡＰＧＬＥＫＰと内部アミノ酸配列；ＭＡＲＤＦＧＰＡＹＶＤＧＤＲＲを得た。これらの同定したアミノ酸配列をもとに縮重プライマーを合成し（表８の配列番号９、１０）、クプリアビダス・エスピーＰ４−１０−Ｃより公知の方法で抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて推奨する条件のもとでＰＣＲを行った。該ＰＣＲで増幅されたＰＣＲ産物をクローニングキットＴａｒｇｅｔ  Ｃｌｏｎｅ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングし、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡製）に形質転換し、形質転換体を取得した。該形質転換体をＬＢ培地で培養し、プラスミドを抽出し、ＢｉｇＤｙｅ（商標登録）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により遺伝子配列を確認し、部分配列５７５ｂｐを取得した。
【００７２】
２．クプリアビダス・エスピー．Ｐ４−１０−Ｃ株からのゲノムＤＮＡの取得
培養液５０ｍＬの菌体を遠心分離操作に供し、菌体をゲノム抽出キット（東洋紡：Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）にて、そのプロトコールに従ってゲノム精製を行った。しかし、本キットで精製したゲノムＤＮＡでは全長配列のクローニングのためのＰＣＲ反応において、長鎖のＤＮＡ断片を増幅させることが出来なかった。ＰＣＲ条件を検討しても改善は見られなかったため、これはゲノムＤＮＡの純度に問題があると考え、「ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｕｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ」に記載されている公知の方法に基づいて、再びゲノムＤＮＡの抽出を行った。まず、５０ｍＬの培地で培養し、集菌した菌体をＴＥ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁して洗浄し、遠心分離操作により、菌体を回収した後、再びこの菌体を１１．３ｍＬのＴＥに懸濁した。さらに、この懸濁液に０．０６ｍＬの２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ（ナカライテスク製）、及び０．６ｍＬの１０％ＳＤＳ溶液を加えた後、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、２ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ溶液を加え十分に攪拌した。その後、１．６ｍＬのＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液（１０％  ＣＴＡＢ／０．７Ｍ  ＮａＣｌ）を混合し、６５℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、等量の２５：２４：１  フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液で除タンパクを行った。通常の細菌であれば、この工程で水層に濁りは見られないが、本菌の場合、濁りが残っていた。そこで、もう一度、等量の２５：２４：１  フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液で除タンパクを行った。これにより、濁りが完全に除去されたので、続いて、分離した水層に対して等量の２４：１  クロロホルム／イソアミルアルコールを加えて混合し、水層を回収した。これと等量のイソプロパノールを水層に加えてＤＮＡを沈殿させ、回収した。沈殿したＤＮＡを０．５ｍＬのＴＥに溶解した後、５μｌの１０ｍｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅを加えて、３７℃で一晩反応させた。反応後、等量の２５：２４：１フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液で除タンパクを行い、２４：１  クロロホルム／イソアミルアルコールを加えて攪拌し、水層を回収した。この操作をさらに２回行った後に得られた水層に終濃度０．４Ｍとなるように３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）を加え、さらに２倍容のエタノールを加えた。沈殿となって生じたＤＮＡを回収し、７０％エタノールで洗浄、乾燥させ、１ｍＬのＴＥに溶解させた。
【００７３】
３．全長配列の取得
次に上記のようにして得られたゲノムＤＮＡを用いて全長配列を取得するために以下の操作を行った。ＴＡＫＡＲＡ  ＬＡ  ＰＣＲ Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、既知配列からＣ末端方向へのＤＮＡ断片を増幅させることに成功し、開始コドンを含むＮ末端から既知の部分遺伝子配列までの塩基配列を決定した。しかしながら、上記キットではＣ末端側の塩基配列を決定することができなかったため、既知の塩基配列に基づき、遺伝子の外側方向に向けた２種類のプライマー（表８の配列番号１１、１２）を新たに設計した。このプライマーを用い、先に得たＤＮＡを鋳型にＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法を行った。これにより、既に取得した部分遺伝子より外側の遺伝子部分を含むＤＮＡ断片を取得し、Ｃ末端配列を決定した。続いて、酵素のＮ末端より上流と推定される部分にＮｄｅＩの切断部位を結合させた配列を有するＤＮＡプライマー（表８の配列番号３４）とＣ末端より下流と推定される部分にＥｃｏＲＩの切断部位を結合させた配列を有するＤＮＡプライマー（表８の配列番号３５）を用いて、この配列の間のＤＮＡを、先に得たＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲにより増幅することで、Ｄ−サクシニラーゼ遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片を取得した。得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、Ｄ−サクシニラーゼ遺伝子の全長が含まれていることを確認し、そのアミノ酸配列を推定した。
【００７４】
本発明で得られたクプリアビダス・エスピー．Ｐ４−１０−Ｃ株由来Ｄ−サクシニラーゼ遺伝子をＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）により検索すると、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｌａｌｌｉｄｕｒａｎｓ  ＣＨ３４のｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｓ４５，  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｍｉｄａｓｅ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＹＰ＿５８７７６３）として登録されている遺伝子と７６％の相同性を示した。このｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｍｉｄａｓｅが属しているｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｃｙｌａｓｅファミリーは、ペニシリンＧやセファロスポリンＣ等を加水分解する酵素であり、このような酵素がＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を加水分解することを推定することは困難であり、機能から予測してホモロジー検索により本遺伝子を取得することは不可能に近い。また、これまでＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を加水分解する酵素は知られておらず、本発明におけるＤ−サクシニラーゼは、新規な酵素であるといえる。また、本発明においてクローニング及びＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸の加水分解能の確認を行った同属のクプリアビダス・メタリデュランス、クプリアビダス・ネケタ−及び、近縁属のラルストニア・ピケッティにおけるアミノ酸相同性比較においても約５０％から約８０％と、近縁属種においてもアミノ酸配列が大きく異なることが分かった（表７）。
【００７５】
【表７】
0006048851.tif 000009
【００７６】
［実施例５］クプリアビダス・メタリデュランス由来のＤ−サクシニラーゼの遺伝子の単離
独立行政法人製品評価技術基盤機構よりクプリアビダス・メタリデュランス（ＮＢＲＣ番号１０１２７２）の菌株を取得し、液体培地で培養した。培養して得た菌体から、ゲノム抽出キット（東洋紡：Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）によりゲノムを抽出した。遺伝子特異的プライマーを合成し（表８の配列番号１３、１４）、得られたゲノムを鋳型にＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いたＰＣＲによって遺伝子を取得した。クローニングキットＴａｒｇｅｔ  Ｃｌｏｎｅ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングし、組換え発現プラスミドｐＤＳＡＣｍを取得した。ｐＤＳＡＣｍをエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡製）に形質転換し、形質転換体を取得した。該形質転換体をＬＢ培地で培養し、プラスミドを抽出し、ＢｉｇＤｙｅ（商標登録）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により遺伝子配列を確認し、アミノ酸配列を推定した。シークエンスに用いたプライマーを表８に示す（表８の配列番号１９，２０，２１，２２，２３，２４）。
【００７７】
［実施例６］クプリアビダス・ネケタ−由来のＤ−サクシニラーゼ遺伝子の単離
独立行政法人製品評価技術基盤機構よりクプリアビダス・ネケター（ＮＢＲＣ番号１０２５０４）の菌株を取得し、液体培地で培養した。培養して得た菌体から、ゲノム抽出キット（東洋紡：Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）によりゲノムを抽出し、遺伝子特異的プライマーを合成し（表８の配列番号１５、１６）、以下、実施例５に記載の方法と同様にして、遺伝子配列全長を取得し、アミノ酸配列を推定した。シークエンスに用いたプライマーを表８に示す（表８の配列番号２５，２６，２７，２８，２９）。
【００７８】
［実施例７］ラルストニア・ピケッティ由来のＤ−サクシニラーゼ遺伝子の単離
独立行政法人製品評価技術基盤機構よりラルストニア・ピケッティ（ＮＢＲＣ番号１０２５０３）の菌株を取得し、液体培地で培養した。培養して得た菌体から、ゲノム抽出キット（東洋紡：Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）によりゲノムを抽出し、遺伝子特異的プライマーを合成し（表８の配列番号１７、１８）、以下、実施例５に記載の方法と同様にして、遺伝子配列全長を取得し、アミノ酸配列を推定した。シークエンスに用いたプライマーを表８に示す（表８の配列番号３０，３１，３２，３３）。
【００７９】
【表８】
0006048851.tif 000010
【００８０】
［実施例８］各種Ｄ−サクシニラーゼ遺伝子を発現する組換えプラスミドの作成
１．クプリアビダス・エスピー．Ｐ４−１０−Ｃ株由来のＤ−サクシニラーゼ遺伝子の組換えプラスミド
実施例４で得られたＤ−サクシニラーゼ遺伝子のＮ末端及びＣ末端部分にそれぞれ制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩの切断部位を結合させた配列を有するプライマー（表８の配列番号３４、３５）を用いて、この間のＤＮＡを、実施例４で得たゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲにより増幅することで、オープンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＢＳＫと混合し、混合液と等量のライゲーション試薬（東洋紡製ライゲーションハイ）を加えてインキュベーションすることにより、ライゲーションを実施した。このようにしてＤ−サクシニラーゼ遺伝子を大量に発現できるように設計された組換えプラスミドｐＢＳＫＤＳＡＰ４−１０−Ｃを取得した。
【００８１】
２．クプリアビダス・メタリデュランス由来のＤ−サクシニラーゼ遺伝子の組換えプラスミド
実施例５で得られたｐＤＳＡＣｍを制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで処理し、ＤＳＡ遺伝子を切り出し、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＢＳＫと混合し、混合液と等量のライゲーション試薬（東洋紡製ライゲーションハイ）を加えてインキュベーションすることにより、ライゲーションを実施した。このようにしてＤ−サクシニラーゼ遺伝子を大量に発現できるように設計された組換えプラスミドｐＢＳＫＤＳＡＣｍを取得した。
【００８２】
３．クプリアビダス・ネケター由来のＤ−サクシニラーゼ遺伝子の組換えプラスミド
実施例６で得られたｐＤＳＡＣｎを制限酵素ＮｄｅＩ及びＰｓｔＩで処理し、ＤＳＡ遺伝子を切り出し、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＢＳＫと混合し、混合液と等量のライゲーション試薬（東洋紡製ライゲーションハイ）を加えてインキュベーションすることにより、ライゲーションを実施した。このようにしてＤ−サクシニラーゼ遺伝子を大量に発現できるように設計された組換えプラスミドｐＢＳＫＤＳＡＣｎを取得した。
【００８３】
４．ラルストニア・ピケッティ由来のＤ−サクシニラーゼ遺伝子の組換えプラスミド
実施例７で得られたｐＤＳＡＲｐを制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで処理し、ＤＳＡ遺伝子を切り出し、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＢＳＫと混合し、混合液と等量のライゲーション試薬（東洋紡製ライゲーションハイ）を加えてインキュベーションすることにより、ライゲーションを実施した。このようにしてＤ−サクシニラーゼ遺伝子を大量に発現できるように設計された組換えプラスミドｐＢＳＫＤＳＡＲｐを取得した。
【００８４】
［実施例９］  各種Ｄ−サクシニラーゼ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉにおける発現
実施例８で構築したプラスミド：ｐＢＳＫＤＳＡＰ４−１０−Ｃ、ｐＢＳＫＤＳＡＣｍ  ｐＢＳＫＤＳＡＣｎ、及びｐＢＳＫＤＳＡＲｐをそれぞれ、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績製コンピテントハイＤＨ５α）に当製品に添付のプロトコールに従って形質転換し、形質転換体を取得した。得られた各形質転換体のコロニーを、試験管内にて滅菌した５ｍＬのＬＢ液体培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含む）に植菌後、３７℃で２０時間振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、２５ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離により菌体由来の不溶物を除去して、各種由来の形質転換体におけるＤ−サクシニラーゼ粗酵素液を取得した。これらの粗酵素液１００μｌに１５０ｍＭ  Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸１００μｌと２５ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）８００μｌを加えて、３７℃で１６時間反応させた。その反応液の一部をＴＬＣプレート（メルク社製）に供し、ブタノール：酢酸：水（３：１：１、ｖ／ｖ）からなる展開溶媒で展開し、ニンヒドリンスプレーにより、各種Ｄ−アミノ酸を検出した。結果を図５に示す。図５中のＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕはそれぞれ、トリプトファン、フェニルアラニン、バリン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸を示す。また、色は、ニンヒドリンスプレーで発色した時の色を示す。その結果、クプリアビダス・エスピー  Ｐ４−１０−Ｃ及びクプリアビダス・メタリデュランス由来のＤ−サクシニラーゼについて強いＤ−サクシニラーゼ活性を確認することができ、クプリアビダス・ネケター及びラルストニア・ピケッティ由来のＤ−サクシニラーゼについても一定のＤ−サクシニラーゼ活性を確認することができた。
【００８５】
［実施例１０］形質転換体からのクプリアビダス・エスピー  Ｐ４−１０−Ｃ由来のＤ−サクシニラーゼの調製
実施例９で得られたｐＢＳＫＰ４−１０−Ｃを形質転換した形質転換体のコロニーを、５００ｍＬの坂口フラスコに入った６０ｍＬのＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含む）に植菌し、振とう数１８０ｒｐｍで３０℃、１６時間培養し、種培養液とした。この種培養液を１０Ｌ容ジャーファーメンターに入った６ＬのＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含む）に接種し、振とう数４２０ｒｐｍ、３０℃で２１時間培養した。培養終了時の濁度（Ａｂｓ６６０ｎｍ）は３２．７であった。このようにして得られた菌体を遠心分離で集菌し、２５ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）に懸濁し、フレンチプレス破砕機を用いて破砕した。得られた粗酵素液の硫安分画処理を行った後、ＨｉＴｒａｐ  Ｏｃｔｙｌ  ＦＦカラム５ｍＬ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）、ＨｉＴｒａｐ  ＣＭ  ＦＦカラム５ｍＬ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）により分離精製した。本方法により得られたＤ−サクシニラーゼをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析に供したところ、ほとんど不純蛋白質が存在しないことが確認できたので、これを用いて、以下の実施例における酵素特性の評価及びＤ−アミノ酸製造を行った。
【００８６】
［実施例１１］形質転換体の生産するＤ−サクシニラーゼの酵素学的性質
１．形質転換体の生産するＤ−サクシニラーゼの至適温度及び熱安定性
実施例１０で得られた形質転換体の生産するＤ−サクシニラーゼ酵素液を用いて、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ法で温度安定性と至適温度を調べた。温度安定性は、酵素液を所定の温度で３時間加熱させた後、氷冷し、残存する活性を求めた。至適温度は、反応温度を３０℃か６５℃まで変化させ、その酵素活性を求めた。温度安定性の評価は、４℃で処理した場合を１００％とした残存相対活性で示した。また、至適温度の評価は、５０℃における酵素活性を１００％とした相対活性で評価した。結果は図６（温度安定性）及び図７（至適温度）に示した。図６及び７から明らかなように、本酵素は、５０℃で処理しても４℃で処理したときの１００％の活性を維持し、反応至適温度は４５℃から５０℃を示した。
【００８７】
２．形質転換体の生産するＤ−サクシニラーゼの至適ｐＨ及びｐＨ安定性
実施例１０で得られた形質転換体の生産するＤ−サクシニラーゼ酵素液を用いて、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ法及びＨＰＬＣ分析法でｐＨ安定性と至適ｐＨを調べた。緩衝溶液には酢酸緩衝溶液（ｐＨ４．５〜ｐＨ５．５）、リン酸緩衝溶液（ｐＨ５．５〜ｐＨ７．５）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５〜ｐＨ８．５）、又はホウ酸緩衝溶液（ｐＨ８．５〜ｐＨ１０．０）を用い、ｐＨ安定性は、２５℃で２０時間処理した後の酵素活性を求め、至適ｐＨは、それぞれのｐＨで６０分間反応させた後の酵素活性を求めた。酵素活性は、ｐＨ７．５（ｐＨ安定性）、ｐＨ７．０（至適ｐＨ）の場合をそれぞれ１００とした相対活性で示した。結果は、図８（ｐＨ安定性）及び図９（至適ｐＨ）に示した。図８及び９から明らかなように、本酵素は、ｐＨ６〜８で高い活性を示し、ｐＨ４〜ｐＨ１０の範囲においてリン酸緩衝溶液ｐＨ７．５で処理したときの８０％以上の活性を示し、広い範囲のｐＨで極めて安定であった。
【００８８】
４．形質転換体の生産するＤ−サクシニラーゼの金属イオンの影響
実施例１０で得られた形質転換体の生産するＤ−サクシニラーゼ酵素液を用いて、以下の表９に示す様々な２価の金属イオンをそれぞれ終濃度１ｍＭ存在下で３７℃、６０分間反応させ、Ｄ−サクシニラーゼ活性をＨＰＬＣ分析法で測定し、無添加の酵素活性を１００とした相対活性で示した。結果を表９に示す。表９から明らかなように、本酵素活性は、金属イオンによる顕著な影響を受けなかった。
【００８９】
【表９】
0006048851.tif 000011
【００９０】
５．形質転換体の生産するＤ−サクシニラーゼの阻害剤の影響
実施例１０で得られた形質転換体の生産するＤ−サクシニラーゼ酵素液を用いて、以下の表１０に示す様々な阻害剤をそれぞれ終濃度１ｍＭ存在下で３７℃、６０分間反応させ、Ｄ−サクシニラーゼ活性をＨＰＬＣ分析法で測定し、無添加の酵素活性を１００とした相対活性で示した。結果を表１０に示す。表１０から明らかなように、本酵素はＤＴＴやＥＤＴＡ、Ｎ−エチルマレイミドでは阻害されず、ＰＣＭＢやヨードアセトアミド、ヨード酢酸などのシステイン修飾剤で阻害されることから、システイン残基が酵素活性や酵素の安定性等に関与していることがわかった。
【００９１】
【表１０】
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【００９２】
［実施例１２］Ｎ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−トリプトファン及びＮ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニンの合成
ＤＬ−フェニルアラニン１０ｇ（和光純薬社製、Ｃｏｄｅ：１６８−０１３１２）と水酸化ナトリウム７．３ｇ（和光純薬社製、Ｃｏｄｅ：１９８−１３７６５）を１５０ｍＬの水に溶解させ、これに無水コハク酸１８．７ｇ（和光純薬社製、Ｃｏｄｅ：１９８−０４３５５）と水酸化ナトリウム７．３ｇを添加しながら５０℃以下で反応させた。これを減圧濃縮し塩酸（和光純薬社製、Ｃｏｄｅ：０８７−０１０７６）でｐＨ２以下に中和し、粗結晶を得た。次に、粗結晶をｎ−ヘキサン（和光純薬社製、Ｃｏｄｅ：０８５−００４１６）で再結晶させ、沈殿をろ取し、沈殿を粉砕乾燥させＮ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニン４５ｇを得た。
ＤＬ−フェニルアラニンをＤＬ−トリプトファン又はＤＬ−ビフェニルアラニンに変更した以外は同様の手順で、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−トリプトファン及びＮ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニンを得た。
【００９３】
［実施例１３］Ｄ−サクシニラーゼを用いた、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニンからのＤ−フェニルアラニンの合成
５重量％Ｎ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニン水溶液（ｐＨ７．５）１０ｍＬを基質として用い、形質転換体のＤ−サクシニラーゼ酵素液０．０５ｍｇを添加し、４５℃で３日間反応させたときのＮ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニンからのフェニルアラニンの加水分解率と光学活性を、以下のＨＰＬＣ測定法により算出した。酵素での加水分解によるフェニルアラニンの生成率は、カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２（５μｍ、４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ）（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）、移動相：ｐＨ２．３リン酸水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、温度：４０℃、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍの条件でフェニルアラニンのピーク面積値で測定した。生成したフェニルアラニンの光学活性体比率は、カラム：ＣＲＯＷＮＰＡＫ  ＣＲ（＋）（５μｍ、４．０ｍｍφ×１５０ｍｍ）（ダイセル化学工業（株））、移動相：過塩素酸水溶液（ｐＨ２．０）、温度：１５℃、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍの条件で測定した。結果を図１０に示す。図１０から明らかなように、形質転換体のＤ−サクシニラーゼをＮ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニン水溶液に添加する反応系で、反応３日目で反応液中のＮ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニンの５０％以上が加水分解され、さらに、Ｄ−フェニルアラニンのうち９０％、Ｌ−フェニルアラニンのうち１０％が加水分解された。このことから、本Ｄ−サクシニラーゼは、Ｌ−フェニルアラニンにも作用するが、Ｄ−フェニルアラニンにより強く作用することが明らかである。
【００９４】
［実施例１４］Ｄ−サクシニラーゼ及びサクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いた、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニンからのＤ−フェニルアラニンの合成
５重量％Ｎ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニン水溶液（ｐＨ７．５）１０ｍＬを基質として用い、形質転換体のＤ−サクシニラーゼ酵素液０．０５ｍｇとクロロフレクサス・オーランティアカス由来のサクシニルアミノ酸ラセマーゼ（配列番号３６）溶液５０ｍｇを添加し、４５℃で４日間反応させたときのＮ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニンからのＤ−フェニルアラニンの加水分解生成率、並びに光学活性体比率を、以下のＨＰＬＣ測定法により算出した。加水分解生成率は、カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２（５μｍ、４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ）（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）、移動相：ｐＨ２．３リン酸水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、温度：４０℃、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍの条件で測定した。光学活性体比率は、カラム：ＣＲＯＷＮＰＡＫ  ＣＲ（＋）（５μｍ、４．０ｍｍφ×１５０ｍｍ）（ダイセル化学工業（株））、移動相：過塩素酸水溶液（ｐＨ２．０）、温度：１５℃、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍの条件で測定した。酵素反応前と反応後の、基質のピーク面積値より加水分解率を算出した。さらに、生成したフェニルアラニンの光学活性体比率を算出した。結果を図１１に示す。図１１から明らかなように、本酵素Ｄ−サクシニラーゼとサクシニルアミノ酸ラセマーゼを、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニン水溶液に添加する反応系で、反応４日目で反応液中のＮ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニンの８０％以上がＤ−フェニルアラニンへ変換された。また、サクシニルアミノ酸ラセマーゼを反応系に共存させたことで、大量に残存するＮ−サクシニル−Ｌ−フェニルアラニンのＮ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニンへの変換、さらにＤ−フェニルアラニンへの加水分解反応が優先的に進み、Ｌ−フェニルアラニンの生成を抑制することに成功した。反応４日目の光学純度は９３．６％ｅｅであった。
【００９５】
［実施例１５］  Ｄ−サクシニラーゼ及びサクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いた、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−トリプトファンからのＤ−トリプトファンの合成
５重量％Ｎ−サクシニル−ＤＬ−トリプトファン水溶液（ｐＨ７．５）１０ｍＬを基質として用い、形質転換体のＤ−サクシニラーゼ酵素液０．０５ｍｇとクロロフレクサス・オーランティアカス由来のサクシニルアミノ酸ラセマーゼ（配列番号３６）溶液５０ｍｇを添加し、４５℃で４日間反応させたとき、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−トリプトファンからＤ−トリプトファンの加水分解生成率、並びに光学活性体比率を、以下のＨＰＬＣ測定法により算出した。加水分解生成率は、カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２（５μｍ、４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ）（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）、移動相：ｐＨ２．３リン酸水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、温度：４０℃、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍの条件で測定した。光学活性体比率は、カラム：ＣＲＯＷＮＰＡＫ  ＣＲ（＋）（５μｍ、４．０ｍｍφ×１５０ｍｍ）（ダイセル化学工業（株））、移動相：過塩素酸水溶液（ｐＨ２．０）／メタノール＝９０／１０、温度：１５℃、流速：０．７ｍＬ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍの条件で測定した。酵素反応前と反応後の、基質のピーク面積値より加水分解率を算出した。さらに、生成したトリプトファンの光学活性体比率を算出した。結果を図１２に示す。図１２から明らかなように、本酵素Ｄ−サクシニラーゼとサクシニルアミノ酸ラセマーゼを、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−トリプトファン水溶液に添加する反応系で、反応４日目で反応液中のＮ−サクシニル−ＤＬ−トリプトファンの８０％以上が加水分解された。反応４日目の光学純度は９６．１％ｅｅであった。
【００９６】
［実施例１６］  Ｄ−サクシニラーゼ及びサクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いた、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニンからのＤ−ビフェニルアラニンの合成
５重量％Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニン水溶液（ｐＨ７．５）１０ｍＬを基質として用い、形質転換体のＤ−サクシニラーゼ酵素液０．０５ｍｇとクロロフレクサス・オーランティアカス由来のサクシニルアミノ酸ラセマーゼ（配列番号３６）溶液５０ｍｇを添加し、４５℃で３日間反応させたとき、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニンからＤ−ビフェニルアラニンの加水分解生成率、並びに光学活性体比率を、以下のＨＰＬＣ測定法により算出した。加水分解生成率は、カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２（５μｍ、４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ）（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）、移動相：ｐＨ２．３リン酸水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、温度：５０℃、流速：１．５ｍＬ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍの条件で測定した。光学活性体比率は、カラム：ＣＲＯＷＮＰＡＫ  ＣＲ（＋）（５μｍ、４．０ｍｍφ×１５０ｍｍ）（ダイセル化学工業（株））、移動相：過塩素酸水溶液（ｐＨ２．０）／メタノール＝８５／１５、温度：５０℃、流速：１．５ｍＬ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍの条件で測定した。酵素反応前と反応後の、基質のピーク面積値より加水分解率を算出した。さらに、生成したビフェニルアラニンの光学活性体比率を算出した。結果を図１３に示す。図１３から明らかなように、本酵素Ｄ−サクシニラーゼとサクシニルアミノ酸ラセマーゼを、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニン水溶液に添加する反応系で、反応３日目で反応液中のＮ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニンの９９％以上が加水分解された。反応４日目の光学純度は８８．３％ｅｅであった。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明のＤ−サクシニラーゼは、従来の酵素に比べてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸の加水分解活性が格段に高いため、公知のサクシニルアミノ酸ラセマーゼと組み合わせて使用することにより、Ｎ−アシルアミノ酸の効率的なラセミ化と加水分解が可能となる。従って、本発明のＤ−サクシニラーゼは、医薬品原料などとして有用なＤ−アミノ酸を、工業的な規模、時間において高収率で得るために有用である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１】
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【図５】
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【配列表】
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