(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
テモゾロミド治療を伴う放射線治療を受けることにより増加した生存率を有する膠芽細胞腫の患者を決定するためのインビトロ方法であって、以下のステップ：
前記膠芽細胞腫の患者由来の脳腫瘍組織細胞の試験サンプル中のＴＯＰ２Ａ遺伝子の発現レベルを決定し、
公知の正常な脳組織細胞中の対照サンプル中のＴＯＰ２Ａ遺伝子の発現レベルを決定し、
前記試験サンプル及び対照サンプル中の前記ＴＯＰ２Ａのレベルを比較し、そして
前記試験サンプル中の前記ＴＯＰ２Ａの発現レベルが、対照サンプル中の前記ＴＯＰ２Ａのレベルよりも高い場合、前記膠芽細胞腫の患者が、前記テモゾロミド治療を伴う放射線治療を受けることにより増加した生存率を有すると決定する
ことを含む、方法。
【請求項２】
前記膠芽細胞腫の患者が、さらに手術を受けている、請求項１に記載のインビトロ方法。
【請求項３】
前記遺伝子の発現レベルの決定が、インサイチュハイブリダイゼーション若しくはＲＴ‐ＰＣＲ分析などの核酸ベースの検出方法においてオリゴヌクレオチドを使用することにより前記遺伝子のｍＲＮＡ転写産物のレベルを決定すること、又は任意により、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ若しくはウェスタンブロット分析などのタンパク質ベースの検出方法において抗体を使用することにより前記遺伝子のそれぞれのタンパク質のレベルを決定することを含む、請求項１に記載のインビトロ方法。
【請求項４】
膠芽細胞腫の患者におけるテモゾロミドの細胞毒性を検出するためのインビトロ方法であって、ここで、低濃度のＴＯＰ２Ａタンパク質を有する細胞が、高濃度のＴＯＰ２Ａを含む細胞よりもテモゾロミドに対してより低い感受性である、方法。
【請求項５】
テモゾロミド治療を受けるヒト対象における膠芽細胞腫の前記予後を決定するためのキットであって、前記キットが、以下：
ａ）付随及び循環アジュバントテモゾロミド治療を伴う放射線治療を受ける際に、ＴＯＰ２Ａ遺伝子の発現のレベルを特異的に検出することができる試薬；及び
ｂ）付随及び循環アジュバントテモゾロミド治療を伴う放射線治療を受ける前記ヒト対象における膠芽細胞腫の予後を決定するための前記キットを使用するための説明書
を含む、キット。
【請求項６】
前記試薬が、前記遺伝子のｍＲＮＡと相補的な核酸プローブを含む、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記試薬が、前記遺伝子によってコードされるタンパク質と特異的に結合する抗体を含む、請求項５に記載のキット。
【請求項８】
テモゾロミド治療を伴う放射線治療を受けることにより増加した生存率を有する請求項１で決定した膠芽細胞腫の患者を治療するためのテモゾロミドを含む、ＴＯＰ２Ａ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膠芽細胞腫の患者の生存を予測するために有用な、テモゾロミドによるトポイソメラーゼＩＩアルファ（ＴＯＰ２Ａ）阻害に関する。
【０００２】
より特に、本発明は、ＴＯＰ２Ａ転写産物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）レベルがテモゾロミド治療に対する膠芽細胞腫の化学療法感受性を決定することを示し、従って、非常に高いレベルのＴＯＰ２Ａ転写産物が、テモゾロミド化学療法を受けるＧＢＭ患者において、良好な予後指標となることを説明する。
【背景技術】
【０００３】
膠芽細胞腫（グレード４の星状細胞腫）は、最も悪性の及び最も一般的な原発性成人脳がんである（Furnariら、2007）。これらの腫瘍の極めて異種性の及び浸潤性の性質が完全切除を事実上不可能にし、従って術後の処置様式にかかわらず、生存期間の中央値は非常に悪い。術後の放射線治療単独では、非常にわずかな延命効果のみを与える一方で、放射線治療にニトロソウレアベースの化学療法の追加では、４０％〜４６％などの６％の１年生存率の増加、及び生存期間の中央値の２月増加の軽度の利益を与えた（Stewart, 2002）。ＥＯＲＴＣ‐ＮＣＩＣ試験の５年間の解析は、標準術後放射線治療に付随及び循環（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ ａｎｄ ｃｙｃｌｉｃａｌ）アジュバントテモゾロミド（ＤＮＡアルキル化剤）の追加が、術後の放射線治療のみと比較して、生存期間の中央値及び２年生存率を有意に改善したことを示した（Stuppら、2009）。全体の生存率は、テモゾロミドありで、２年で２７．２％、３年で１６．０％、４年で１２．１％、及び５年で９．８％であるのに対して、放射線治療のみでは、それぞれ１０．９％、４．４％、３．０％、及び１．９％であった（Stuppら、2009）。さらに、生存期間の中央値は、１２．１月〜１４．６月に増加した（Stuppら、２００９）。より重要なのは、ＭＧＭＴプロモーターのメチル化が、テモゾロミド化学療法からの成果及び利益のための最も強い予測因子となることを見出したことである（Stuppら、2009）。無進行生存率の解析は、テモゾロミド及び放射線治療で処置された、メチル化されたＭＧＭＴプロモーターを有する腫瘍の患者についてのみ利益を示した。
【０００４】
これらの知見は、より良好なテモゾロミド化学療法反応を有する患者のサブクラスを識別する特定の遺伝子特徴の存在を示唆する。
【０００５】
本発明において、前向き研究は、患者を標準選択／除外基準で選択し、そして一定の治療プロトコールに供して実施され、そしてそれは、腫瘍の最大限安全な切除に続いて付随及び循環アジュバントテモゾロミド治療を伴う放射線治療を含む。患者の生存データは、発現特徴が生存を予測できる遺伝子を同定するための腫瘍の遺伝子発現プロファイルと相関する。本発明者等は、本明細書で、患者の生存に関してＧＢＭにおける高いトポイソメラーゼＩＩアルファ（ＴＯＰ２Ａ）転写産物の影響に関する本発明者等の結果を報告する。本発明者等はさらに、テモゾロミドがインビトロでＴＯＰ２Ａ活性を阻害し、そしてグリオーマ細胞におけるＴＯＰ２Ａのサイレンシングがテモゾロミド耐性をそれらに与えることを機能性試験により示す。星状細胞腫のグレードにわたってＴＯＰ２Ａ及びトポイソメラーゼの他のアイソフォームの評価をまた、グリオーマにおけるそれらの役割を明らかにするために行った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の主な目的は、予後マーカー、ＴＯＰ２Ａを提供することであり、そしてそれは、膠芽細胞腫の患者に与えられる化学療法処置の種類を予測するために有用である。
【０００７】
本発明の他の目的は、ヒト対象における膠芽細胞腫の予後決定方法を提供し、ここで前記方法は、手術を受けそしていつでも付随及び循環アジュバントテモゾロミド治療を伴う放射線治療を受けることができるヒト対象から得た脳腫瘍組織細胞の試験サンプルにおけるＴＯＰ２Ａ遺伝子の発現レベルと、公知の正常な脳組織細胞の対照サンプルにおけるＴＯＰ２Ａ遺伝子の発現レベルとを決定することを含み、ここで、対照サンプルと比べて試験サンプルにおけるＴＯＰ２Ａのより高い発現レベルが、試験サンプルを得たヒト対象における膠芽細胞腫の良好な予後及びより良好な生存を示す。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、予後マーカー及びヒト対象における膠芽細胞腫の予後決定方法を提供し、ここで前記方法は、手術を受けそしていつでも付随及び循環アジュバントテモゾロミド治療を伴う放射線治療を受けることができるヒト対象から得た脳腫瘍組織細胞の試験サンプルにおけるＴＯＰ２Ａ遺伝子の発現レベルと、公知の正常な脳組織細胞の対照サンプルにおけるＴＯＰ２Ａ遺伝子の発現レベルとを決定することを含み、ここで、対照サンプルと比べて試験サンプルにおけるＴＯＰ２Ａのより高い発現レベルが、試験サンプルを得たヒト対象における膠芽細胞腫の良好な予後及びより良好な生存を示す。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１Ａは、ＴＯＰ２Ａの発現とＧＢＭの患者の生存である。１０２人のＧＢＭ患者に関するカプラン‐マイヤー生存推定値（Ｋａｐｌａｎ‐Ｍｅｉｅｒ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｅｓｔｉｍａｔｅ）を、ＴＯＰ２Ａ転写産物レベルについて計算する。単変量解析におけるＴＯＰ２Ａについての陽性群（ｌｏｇ２比（ｒａｔｉｏ）≧９．２５；ｎ＝３４）及び陰性群（ｌｏｇ２比（ｒａｔｉｏ）＜９．２５；ｎ＝６８）に関する生存曲線。ＴＯＰ２Ａについて陽性である場合（緑線）は、陰性である場合（青線）よりもより良い生存を有する。図１Ｂは、異なるグレードの星状細胞腫におけるＴＯＰ２Ａの転写産物レベルの散布図である。表示されたサンプルのＲＴ‐ｑＰＣＲ分析から得られた対数変換された遺伝子発現比を、ＴＯＰ２Ａについて示す。それぞれの群における水平線は、中央値を示す。
【図２】図２は、異なるグレードの星状細胞腫におけるトポイソメラーゼファミリーメンバーの転写産物レベルの散布図である。表示されたサンプルのＲＴ‐ｑＰＣＲ分析から得られた対数変換された遺伝子発現比を、ＴＯＰ１（Ａ）、ＴＯＰ２Ｂ（Ｂ）、ＴＯＰ３Ａ（Ｃ）、ＴＯＰ３Ｂ（Ｄ）及びＴＯＰＯＲＳ（Ｅ）について示す。それぞれの群における水平線は、中央値を示す。
【図３】図３Ａは、エトポシドがＴＯＰ２Ａによるプラスミド緩和活性を阻害することを示す。ＴＯＰ２Ａ酵素によるプラスミド緩和アッセイを、エトポシドの非存在下（レーン２）、又は高濃度のエトポシド（レーン３〜５）、又はエタノール（溶媒対象）（レーン６）で実施した。図３Ｂは、テモゾロミドがＴＯＰ２Ａによるプラスミド緩和活性を阻害することを示す。ＴＯＰ２Ａ酵素によるプラスミド緩和アッセイを、テモゾロミドの非存在下（レーン２）、又は高濃度のテモゾロミド（レーン３〜４）、又はＤＭＳＯ（溶媒対象）（レーン５）で実施した。図３Ｃは、ＴＯＰ２ＡのｓｉＲＮＡノックダウンを示す。細胞溶解物を、対照（シクロフィリン）及びＴＯＰ２ＡのｓｉＲＮＡ処理４８時間後から調製し、そして等量のタンパク質を、表示された抗体で免疫ブロットに供した。図３Ｄは、ＴＯＰ２Ａの下方制御がエトポシド化学療法に対するグリオーマ細胞耐性を与えることを示す。シクロフィリン（赤）又はＴＯＰ２Ａ（青）いずれかのｓｉＲＮＡで形質移入したＵ２５１細胞を、表示された濃度のエトポシドで処理し、そして生細胞の比率を４８時間後にＭＴＴアッセイにより定量した。対照及びＴＯＰ２ＡのｓｉＲＮＡ処理細胞の生存率（％）における差に関するｔ検定を評価し、そしてＰ値は、それぞれ２、４、８及び１６μｇ／ｍＬ；ｐ＝０．０２９７、０．０３３６、＜０．０００１、及び０．０４２である。図３Ｅは、ＴＯＰ２Ａの下方制御がテモゾロミド化学療法に対するグリオーマ細胞耐性を与えることを示す。本実験を「Ｄ」と同じように実施したが、細胞はテモゾロミドで処理した。対照及びＴＯＰ２ＡのｓｉＲＮＡ処理細胞の生存率（％）における差に関するｔ検定を評価し、そしてＰ値は、それぞれ２５０、５００、１０００及び２０００μＭ；ｐ＝０．０６６８、０．００９７、０．０６８７、及び０．０１３４である。
【図４】図４は、グリオーマ細胞株におけるトポイソメラーゼファミリーメンバーの転写産物レベルを示す。グリオーマ細胞株由来のＲＮＡのリアルタイム逆転写定量ＰＣＲ分析から得られた対数変換された遺伝子発現比（淡いピンクバー、細胞株の左から右の順：ＬＮ１８、ＬＮ２２９、Ｕ１３８、Ｕ２５１、Ｕ３４３、Ｕ３７３、Ｕ８７）を、ＴＯＰ１、ＴＯＰ２Ａ，ＴＯＰ２Ｂ、ＴＯＰ３Ａ、ＴＯＰ３Ｂ、及びＴＯＰＯＲＳについて示す。それぞれのバーは、１つのサンプル由来のデータを示す。それぞれのサンプルにおいて、遺伝子発現における倍率変化を、正常な脳サンプル（濃ピンクバー）におけるその平均発現と比較して計算する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、膠芽細胞腫の患者の生存を予測するために有用な、テモゾロミドによるＴＯＰ２Ａ阻害を提供する。本発明は、テモゾロミド化学療法を受ける患者においてＧＢＭに関する予後マーカーを識別するための方法に関する。
【００１１】
従って、本発明は、膠芽細胞腫のインビトロにおける予後決定方法を提供し、ここで、前記方法は、試験サンプル及び対照サンプルにおけるＴＯＰ２Ａ遺伝子の発現のレベルを決定することを含み、ここで、対照サンプルに比べて試験サンプルにおけるＴＯＰ２Ａの発現のより高いレベルが、膠芽細胞腫の良好な予後を示す。
【００１２】
本発明の一つの実施態様において、試験サンプルは、手術を受け、そしていつでも付随及び循環アジュバントテモゾロミド治療を伴う放射線治療を受けることができるヒト対象から得た脳腫瘍組織細胞である。
【００１３】
本発明の他の実施態様において、前記遺伝子の発現レベルの決定は、インサイチュハイブリダイゼーション若しくはＲＴ‐ＰＣＲ分析などの核酸ベースの検出方法においてオリゴヌクレオチドを使用することにより前記遺伝子のｍＲＮＡ転写産物のレベルを決定すること、又は任意により、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ若しくはウェスタンブロット分析などのタンパク質ベースの検出方法において抗体を使用することにより前記遺伝子の個別のタンパク質のレベルを決定することを含む。
【００１４】
本発明のさらに他の実施態様において、膠芽細胞腫患者におけるテモゾロミドの細胞毒性の決定方法であり、ここで低濃度のＴＯＰ２Ａタンパク質を有する細胞は、高濃度のＴＯＰ２Ａを含む細胞よりもテモゾロミドに対してより少ない感受性である。
【００１５】
本発明のさらに他の実施態様において、テモゾロミド治療を受けるヒト対象における膠芽細胞腫の予後を決定するためのキットであり、ここで前記キットは以下：
ａ）付随及び循環アジュバントテモゾロミド治療を伴う放射線治療を受ける際に、ＴＯＰ２Ａ遺伝子の発現のレベルを特異的に検出することができる試薬；及び
ｂ）付随及び循環アジュバントテモゾロミド治療を伴う放射線治療を受ける前記ヒト対象における膠芽細胞腫の予後を決定するための前記キットを使用するための説明書
を含む。
【００１６】
本発明のさらに他の実施態様において、キット中の試薬は、前記遺伝子のｍＲＮＡに相補的な核酸プローブを含む。
【００１７】
本発明のさらに他の実施態様において、キット中の試薬は、前記遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体を含む。
【００１８】
前向き研究は、患者を標準選択／除外基準で選択し、そして一定の治療プロトコールに供して実施され、そしてそれは、腫瘍の最大限安全な切除に続いて付随及び循環アジュバントテモゾロミド治療を伴う放射線治療を含む。患者の生存データは、発現特徴が生存を予測できる遺伝子を同定するための腫瘍の遺伝子発現プロファイルと相関する。患者の生存に関してＧＢＭにおける高いトポイソメラーゼＩＩアルファ（ＴＯＰ２Ａ）転写産物の影響に関する結果を、本明細書で報告する。テモゾロミドがインビトロでＴＯＰ２Ａ活性を阻害し、そしてグリオーマ細胞におけるＴＯＰ２Ａのサイレンシングがテモゾロミド耐性をそれらに与えることを機能性試験によりさらに示す。星状細胞腫のグレードにわたるＴＯＰ２Ａ及びトポイソメラーゼの他のアイソフォームの評価をまた、グリオーマにおけるそれらの役割を明らかにするために行った。
【実施例】
【００１９】
以下の実施例は、本発明の例示のために与えられ、従って本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００２０】
実施例１
腫瘍サンプルの採取
腫瘍サンプルを、インド バンガロールのＳｒｉ Ｓａｔｈｙａ Ｓａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｉｇｈｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅs（ＳＳＳＩＨＭＳ）とＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＮＩＭＨＡＮＳ）で手術した患者から採取した。難治性てんかんのための手術中に得られた正常な脳組織（前側頭葉）を、対照サンプルとして使用した。試験は、２つの臨床センターの倫理委員会により精査され及び承認され、そして患者の同意は、ＩＥＣガイドライン及び承認の通りに試験の開始前に取得した。
【００２１】
実施例２
細胞株、ｓｉＲＮＡ及び形質移入
Ｕ３７３、Ｕ１３８、ＬＮ１８、ＬＮ２２９、Ｕ３４３、Ｕ８７、Ｋ５６２、Ｕ２５１及びＳＶＧ細胞を、３７℃、５％ＣＯ2を有する加湿雰囲気で、それぞれ１０％ウシ胎児血清、ペニシリン及びストレプトマイシンを有するＤＭＥＭ中で培養した。ヒトＴＯＰ２Ａ及びシクロフィリンの二本鎖ｓｉＲＮＡを設計し、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）により化学的に合成した。ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ ｓｉＲＮＡは、ＴＯＰ２Ａの違ったコード領域配列（Ｇｅｎｂａｎｋ（商標）アクセッション番号ＮＭ＿００１０６７）を標的とする４つの異なる二本鎖ｓｉＲＮＡの混合物である。二本鎖ｓｉＲＮＡを、１×ユニバーサルＲＮＡオリゴ緩衝液（２０ｍＭのＫＣｌ、６ｍＭのＨＥＰＥＳ‐ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、０．２ｍＭのＭｇＣｌ2）中に溶解した。ｓｉＲＮＡ形質移入（２００ｎＭ）を、Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してメーカーの説明通りに行った。
【００２２】
実施例３
細胞生存能力アッセイ
化学療法感受性アッセイのために、細胞をプレートに蒔いた２４時間後に、細胞を細胞毒性薬剤で処理し、そして３７℃、５％ＣＯ2で４５時間インキュベートした。この時点で、ＭＴＴ（２０μＬ（５ｍｇ／ｍＬ））を細胞に添加した。ＭＴＴ添加３時間後、ホルマザン結晶をＤＭＳＯ（２００μＬ）に溶解し、そして５５０ｎｍでの吸光度として測定した。対照細胞による吸光度を、１００％であると考え、そしてすべてのサンプルを対照細胞に対して規格化した。すべてのアッセイを３連で行った。
【００２３】
実施例４
ＲＮＡの単離及びＲＴ‐ｑＰＣＲ
全ＲＮＡをＴＲI Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を使用して凍結組織から抽出した。ＲＮＡサンプルを、分光光度計を使用して吸光度を測定することにより定量し、そして品質保証のために、ＭＯＰＳホルムアルデヒドゲル上で可視化した。選択した遺伝子の発現レベルの相対定量を、以下の２ステップ方法を使用して行った。第一ステップにおいて、ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ ｋｉｔ（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ）を使用して、異なる組織サンプル由来のＲＮＡから生成し；続いて、リアルタイム定量ＰＣＲを、ｃＤＮＡをテンプレートとして、遺伝子特異的プライマーセット及びＳＹＢＲグリーン色素を含むＤｙｎａｍｏ ｋｉｔ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７９００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）配列決定システムで行った。すべての測定を、３連で行った。ＧＡＲＳ（グリシル‐ｔＲＮＡ合成酵素）、ＡＧＰＡＴ１（１‐アシルグリセロール‐３‐リン酸 Ｏ‐アシルトランスフェラーゼ１）、ＡＴＰ５Ｇ１（ＡＴＰ合成酵素、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ０複合体、サブユニットＣ１（サブユニット９））及びＲＰＬ３５Ａ（リボソームタンパク質Ｌ３５ａ）遺伝子を、それらの発現レベルがアレイ試験において不変であることを見出したので内部対照として使用した。てんかん患者からの正常な脳組織サンプルを、参照として使用した。デルタデルタＣＴ法を、比率の計算のために使用した。使用するＲＴ‐ＰＣＲプライマーの配列及び条件を、要求に応じて提供する。図１Ｂ、並びに２Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥにおけるそれぞれのドットは、内部参照遺伝子で規格化後、１つのサンプル由来の転写産物レベルの中央値を示す。すべての群（正常、ＤＡ、ＡＡ及びＧＢＭ）のＲＮＡ発現レベル（ｌｏｇ２比）を、正規分布について試験し、そしてそれらが、正常に分布していないことを見出した。結果を、平均ｌｏｇ２比±ＳＤの形式で表した。群間の比較を、クラスカル‐ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ‐Ｗａｌｌｉｓ）の一元配置分散分析を使用して実施し、そしてさらにサブグループ内の比較を、ＳＰＳＳバージョン１６．０ソフトウェアを使用して、ボンフェローニ補正事後（ａｄｊｕｓｔｅｄ ｐｏｓｔ‐ｈｏｃ）検定で実施した。
【００２４】
実施例５
ウェスタンブロッティング
細胞株由来のタンパク質溶解物を、ＲＩＰＡ緩衝液中で調製し、そして総タンパク質の等量を、ブラッドフォード試薬により定量後、イムノブロッティングのために使用した。次の抗体（ＴＯＰ２Ａ（Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ；Ｃａｔ＃Ｍ７１８６；１：２５０）及びアクチン（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ＃Ａ３８５４；１：２５０００））を、本試験について使用した。
【００２５】
実施例６
ＴＯＰ２Ａ酵素アッセイ
ＴＯＰ２Ａ活性を、プラスミド緩和アッセイを使用してインビトロで測定した。簡単に言えば、緩和アッセイは、トポイソメラーゼＩＩ反応緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＡＴＰ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、３０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）の最終容量３０μｌ中に、プラスミドＤＮＡ（ｐＢＲ３２２；２００ｎｇ／反応物）及び２ユニットのＴＯＰ２Ａ（Ｔｏｐｇｅｎ Ｃａｔ＃２００Ｈ‐２）を含む。反応物を３７℃で３０分間、インキュベートし、そして２．５μｌのローディング色素（３０％グリセロール及び０．２５％ブロモフェノールブルー）の添加により反応を停止した。サンプルを１％ネイティブアガロースゲル（インターカレーターなし）上で分析した。ゲルを、エチジウムブロマイドで１０〜１５分間染色した。エトポシド又はテモゾロミドの効果を決定するために、反応混合物中に特定量を添加した。
【００２６】
実施例７
免疫組織化学（ＩＨＣ）
腫瘍組織及び対照サンプルからパラフィン切片（４μｍ）を、シランコートスライド上に採取し、そしてＴＯＰ２Ａのタンパク質発現を、１２７サンプル（１６ＤＡ、２１ＡＡ、７７ＧＢＭ、及び１３対照サンプル）に関して、免疫組織化学（ＩＨＣ）により評価した。脱パラフィン切片の熱誘導抗原回復（ｈｅａｔ‐ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）を、クエン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ６．０）中で、６００Ｗで３０〜３５分間、マイクロ波オーブンで行った。最初のプロセシングステップ後、切片を、ＴＯＰ２Ａ（Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ；Ｃａｔ＃Ｍ７１８６、１：６０希釈）一次抗体で、室温で一晩、インキュベートした。これは、次に超高感度非ビオチンＨＲＰ検出システム（ＱＤ４４０‐ＸＡＫ、Ｂｉｏｇｅｎｅｘ、ＵＳＡ）でのインキュベーションを行う。３，３’‐ジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ）を、発色物質として使用した。顕著に増加したＴＯＰ２ＡのｍＲＮＡレベルを示した腫瘍を、陽性対照として供給した。一次抗体を除いた陰性対照スライドを、染色のそれぞれのバッチと組み合わせた。核及び細胞質染色の両方を認めた。核及び細胞質の免疫組織化学染色を、０〜２の３ポイントスケールに関して、半定量的にスコア化し、ここで腫瘍の中心部内で、０＝非染色、１＋＝弱染色、及び２＋＝強染色である。２＋の核及び細胞質陽性のみ、分析のために考慮した。免疫陽性を、それぞれの腫瘍標本由来の１０００超の細胞で評価した。標識指数（ｌａｂｅｌｉｎｇ ｉｎｄｅｘ）（ＬＩ）を、カウントした全細胞のうち、２＋染色を示した細胞のパーセンテージとして表す。
【００２７】
実施例８
ＩＨＣデータに関する統計分析
すべての連続変数を、正規分布について試験し、そしてそれらは、非正規であることを見出した。グレード特異的発現パターンを決定するために、非パラメトリック検定、クラスカル‐ウォリスの順位の一元配置分散分析を、ＩＨＣによって評価したデータで実施した。４つの群すべての平均間の有意差を、一元配置分散分析の後に多重比較のためのボンフェローニ補正事後検定により決定した。結果を、平均ＬＩ±ＳＤの形式で表す。すべての分析を、ＳＰＳＳバージョン１５．０を使用して実施した。
【００２８】
実施例９
腫瘍サンプル
腫瘍サンプルを、インド バンガロールのＳｒｉ Ｓａｔｈｙａ Ｓａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｉｇｈｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅs（ＳＳＳＩＨＭＳ）とＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＮＩＭＨＡＮＳ）で手術した患者から採取した。難治性てんかんのための手術中に得られた正常な脳組織（前側頭葉）を、対照サンプルとして使用した。試験は、２つの臨床センターの倫理委員会により精査され及び承認され、そして患者の同意は、ＩＥＣガイドライン及び承認の通りに試験の開始前に取得した。組織を二等分し、そして半分を液体窒素中で瞬間凍結し、そしてＲＮＡの単離まで−８０℃で保存した。他の半分を、ホルマリンで固定し、そしてパラフィン切片に処理した。これらを、星状細胞腫及び免疫組織化学の病理組織学的グレーディングのために使用した。１７２の膠芽細胞腫（ＧＢＭ）、５４の悪性星状細胞腫（グレードＩＩＩ（ＡＡ））、３０のびまん性星状細胞腫（グレードＩＩ（ＤＡ））、及び２０の正常対照を含む全部で２７６サンプルを、本試験で使用した。１７２のＧＢＭサンプル中１０２が、標準化処置プロトコール（詳細は後述）を受けたＧＢＭ患者の前向き選択コホートに由来する。ＴＯＰ２Ａのタンパク質発現を、１２７サンプルでＩＨＣにより腫瘍組織切片上で分析した。
【００２９】
実施例１０
生存とＴＯＰ２ＡのｍＲＮＡレベルとの相関関係
２つの臨床センター（ＮＩＭＨＡＮＳ／ＳＳＩＨＭＳ）で手術を受けた新たに診断された膠芽細胞腫患者（ｎ＝１０２）を、前向き試験に含んだ。倫理委員会による承認及び患者の同意を、試験を開始する前に取得した。患者を以下の組み入れ基準：１）テント上大葉性腫瘍（ｓｕｐｒａｔｅｎｔｏｒｉａｌ ｌｏｂａｒ ｔｕｍｏｒ）成人患者（年齢１８〜６５歳の間）、２）術後のＭＲＩスキャン上で認めたれた最小限の残留物を有する、腫瘍の最大限安全な切除を受けた患者、３）術後のカルノフスキーのパフォーマンススコア（ＫＰＳ）≧７０を有する患者に基づいて採用した。
【００３０】
すべての患者は、腫瘍の最大限安全な切除を受けた。すべての患者は、４５日間毎日継続して１００ｍｇ／日の用量で投与されるテモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ）での付随する化学療法に加えて、３３分割で総線量５９．４Ｇｙを照射する放射線治療からなる統一されたアジュバント治療を受けた。続いて、２８日毎に５日間、１５０ｍｇ／ｍ2（体表面積）の用量のテモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ）で循環化学療法５サイクルを投与した。患者を臨床的及びＭＲ画像で追跡調査した。最大の追跡調査期間は、３４月であった。
【００３１】
結果と考察
高いＴＯＰ２ＡレベルがＧＢＭ患者において良好な予後指標である
１０２のＧＢＭ患者のコホートを前向き試験に採用し、そして標準処置プロトコール（方法で説明した通り）により管理した。この群に関するすべての生存期間の中央値は、１６月であると分かった（カプランマイヤー分析）。本コホートにおいて、予想通り、年齢は、コックス回帰分析（ｐ＝０．０３７；ＨＲ＝１．０２３；Ｂ＝０．０２２）で認められたように、予後不良の重要な予測因子であった。興味深いことに、ＴＯＰ２ＡのｍＲＮＡの発現が、ＧＢＭ患者における予後と有意に相関したことを認め；より高いＴＯＰ２Ａ転写産物レベルが、より良好な予後を予測した（Ｐ＝０．０４３；ＨＲ＝０．８８９；Ｂ＝−０．１１７；コックス回帰分析）。生存に関するＴＯＰ２Ａ転写産物レベル及び年齢の影響を、コックス比例ハザードモデルによりさらに評価して、生存に関するＴＯＰ２Ａの独立した影響を導き出した。年齢（ｐ＝０．０３３；ＨＲ＝１．０２３；Ｂ＝０．０２３）及びＴＯＰ２Ａ転写産物レベル（Ｐ＝０．０３５；ＨＲ＝０．８８８；Ｂ＝−０．１１９）の両方が、多変量解析による有意な予測因子であることを認めた。さらなる分析に関して、ＴＯＰ２ＡのｍＲＮＡの発現を二分して、予後の予測についてカットオフを明らかにした。ＴＯＰ２ＡのｍＲＮＡレベル＜９．２５ｌｏｇ２比を有する患者は、ｍＲＮＡレベル≧９．２５ｌｏｇ２比を有する患者と比較した場合、有意により不良な予後を有することを報告する（それぞれ１３月対２２月の生存期間の中央値）（図１Ａ）。
【００３２】
星状細胞腫におけるＴＯＰ２Ａ及び他のトポイソメラーゼファミリーメンバーの制御
膠芽細胞腫及び他のより低いグレードの星状細胞腫における、ＴＯＰ２Ａ及びトポイソメラーゼファミリーの他のメンバーの発現の制御に関連するさらなる研究を行った。ＴＯＰ２Ａの転写産物レベルが、ＤＡ、ＡＡ及び正常な脳サンプルと比較して、ＧＢＭにおいて非常に高いレベルに有意に上方制御されることを本明細書で報告する（図１Ｂ；表１Ａ）。星状細胞腫において悪性腫瘍のグレードの昇順とともにＴＯＰ２Ａの細胞質の発現の減少はあったが、ＴＯＰ２Ａタンパク質の有意に増加した発現（核）を、他のグレードと比較して膠芽細胞腫において観察した（表１Ｂ）。同様に、ＴＯＰ２Ｂ転写産物レベルがまた、ＤＡ、ＡＡ及び正常な脳サンプルと比較して、ＧＢＭにおいて上方制御されることを見出した（図２Ｂ、表１Ａ）。さらにＴＯＰ３Ａ転写産物レベルがまた、ＤＡ及びＡＡと比較してＧＢＭにおいて上方制御されることを見出した（図２Ｃ；表１Ａ）。これらの遺伝子とは違って、ＴＯＰＯＲＳの転写産物レベルは、正常な脳サンプルと比較して悪性腫瘍の星状細胞腫（ＡＡ及びＧＢＭ）において有意に下方制御されることを見出した（図２Ｅ；表１Ａ）。他のトポイソメラーゼのメンバー、ＴＯＰ１及びＴＯＰ３Ｂは、グリオーマの異なるグレードにわたって制御差異を示さなかった（図２Ａ及びＤ）。同様に、良好な相関について、グリオーマ由来の確立された細胞におけるトポイソメラーゼファミリー遺伝子の同様の制御を見出した（図４）。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
【表２】
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【００３５】
テモゾロミドはＴＯＰ２Ａ活性を阻害する
高いＴＯＰ２Ａレベルを有するがん細胞が、細胞増殖へのなんらかの影響なしにエトポシドなどのＴＯＰ２Ａ阻害剤に対してより敏感であることが示されてきた（Haoら、2000; Asanoら、1996; Zhouら、2001）。本発明者等の結果が、高いレベルの腫瘍のＴＯＰ２Ａを有するＧＢＭ患者が、テモゾロミド化学療法に対してより良好な反応を示すので、テモゾロミドがＴＯＰ２Ａ阻害剤かもしれないという仮説を立てた。この可能性を試験するために、本発明者等は、テモゾロミドの存在下でスーパーコイルプラスミドＤＮＡを緩和するＴＯＰ２Ａ酵素（１７０ｋＤａ）の能力を評価するＴＯＰ２Ａ酵素アッセイを実施した。ＴＯＰ２Ａ酵素は、スーパーコイルプラスミドＤＮＡを非常に効率的に緩和した（図３Ａのレーン２と１との比較）。この反応への公知のＴＯＰ２阻害剤であるエトポシドの添加は、濃度依存的態様で非常に効率的にＴＯＰ２Ａ緩和活性を阻害する（図３Ａのレーン５，４及び３と２との比較）。興味深いことに、テモゾロミドの添加はまた、ＴＯＰ２Ａ緩和活性を効率的に阻害する（図３Ｂのレーン３及び４と２との比較）。従って、これらの結果は、テモゾロミドがＴＯＰ２Ａ阻害剤であることを示す。
【００３６】
ＴＯＰ２Ａのノックダウンはグリオーマ細胞における化学療法耐性を与える
本発明者等の結果は、テモゾロミドが、ＴＯＰ２Ａ酵素活性を阻害し、そして高い腫瘍のＴＯＰ２Ａを有するＧＢＭ患者が、テモゾロミド化学療法に対してより良好に反応することを示したので、ＴＯＰ２Ａの下方制御が、テモゾロミドに対する耐性をグリオーマ細胞に与えると仮説を立てた。ＴＯＰ２Ａ特異的ｓｉＲＮＡの形質移入は、Ｕ２５１グリオーマ細胞において、ＴＯＰ２Ａタンパク質レベルを効率的に低減した（６１％）（図３Ｃ）。ＴＯＰ２Ａ特異的ｓｉＲＮＡで形質移入したＵ２５１細胞は、シクロフィリンｓｉＲＮＡの形質移入と比較して、テモゾロミド処置に対して有意に耐性であることを見出した（図３Ｅ）。他で示したように、エトポシドは、シクロフィリンｓｉＲＮＡ形質移入細胞よりもＴＯＰ２ＡのｓｉＲＮＡ形質移入細胞を効率悪く阻害した（図３Ｄ）。従って、これらの結果は、テモゾロミドがＴＯＰ２Ａ経路を通じて、その阻害をおそらく引き起こすことにより働き、そして高いＴＯＰ２Ａレベルがテモゾロミド化学療法に対する感受性を提供することを示唆する。
【００３７】
所定の治療様式についての利益を予測することは、がん生物学において困難な課題のままであり、そして個別化した抗がん治療のために非常に重要である。ＧＢＭ患者の予後を改善するための、放射線治療計画及び線量、並びにニトロソウレアベースの化学療法などのさまざまな試みでは、最小限の成功のみしか得られなかった（Stewart, 2002）。付随及び循環アジュバント治療として放射線治療と組み合わせた場合、テモゾロミドは、ＧＢＭ患者の生存期間を増加することが確立されている（Hartら、2008）。興味深いことに、腫瘍においてメチル化されたＭＧＭＴプロモーター遺伝子を有するＧＢＭ患者は、より良好な生存期間を有する（Stuppら、2009）。テモゾロミドの細胞毒性は、主にグアニンの６位の酸素原子のメチル化を通じて仲介する。このＤＮＡ損傷が、ＭＧＭＴにより素早く修復されるため、ＭＧＭＴの後成的な（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ）サイレンシングは、テモゾロミドなどのアルキル化剤での化学療法からの利益を享受するための予測因子として提案されてきた。従って、ＭＧＭＴプロモーターのメチル化は、テモゾロミド及び放射線治療での処置から最も利益を享受する患者の選択を可能にするＧＢＭ腫瘍における最初の予測バイオマーカーであると思われる（Stuppら、2009）。これらの結果から、化学療法に対する腫瘍の反応を予測するための分子マーカーの使用は、非常に重要であると思われる。
【００３８】
付随及びアジュバントテモゾロミド化学療法で処置したＧＢＭ患者における遺伝子の発現の予後的意義の評価に関して、ＴＯＰ２ＡのｍＲＮＡの発現が、より高いＴＯＰ２Ａ転写産物レベルを有するＧＢＭ患者における予後と相関し、より良好な予後を予測することを見出した。特に、腫瘍のＴＯＰ２Ａ転写産物レベル≧９．２５ｌｏｇ２比を有するＧＢＭ患者は、腫瘍のＴＯＰ２Ａ転写産物レベルが９．２５ｌｏｇ２比未満のＧＢＭ患者よりもより良好な生存を有する。なぜ高いＴＯＰ２Ａレベルを有する腫瘍が、テモゾロミド治療に対してより良好に反応するのかを研究することが、本発明者等の目的であった。ＴＯＰ２Ａは、転写、組み換え、複製及び細胞分裂の間の染色体の分離を含むＤＮＡ代謝のさまざまな重要なプロセスの間の、ＤＮＡのトポロジカルな状態を制御するＤＮＡトポイソメラーゼ酵素をコードする（Jarvinen及びLiu, 2003）。真核性のトポイソメラーゼＩＩ（ｔｏｐｏＩＩ）は、ヒト細胞中に２つのアイソフォーム（主要なものは、１７０ｋｄのトポイソメラーゼＩＩアルファ（ｔｏｐｏＩＩα）及び１８０ｋｄのトポイソメラーゼＩＩベータ（ＩＩβ）である）で存在するホモ二量体酵素である（Wang, 1996）。これらの２つの酵素はかなりの相同性（７２％）を共有する一方で、それらは、染色体１７ｑ２１及び３ｐに位置する異なる遺伝子の産物である（Jarvinen及びLiu, 2003）。ＴＯＰ２Ａが、複製された染色体の分離及び縮合の間に、重要な機能を行う一方で、ＴＯＰ２Ｂの正確な機能は、いまだほとんど不明である（Isaacsら、1998; Yangら、2000）。ＴＯＰ２ＡのｍＲＮＡレベルが、ＡＡ及びＤＡと比較してＧＢＭで有意に高く、そしてそれは、ＩＨＣによって核のタンパク質発現にもまた反映したことに注目する。いままでの研究では、少数の場合についてのみＩＨＣによって同様の変化を示してきた。そのような変化の意義は、さらなる評価が必要である（Holden及びTownsend, 1999; Fariaら、2006）。興味深いことに、グレードＩＩ／ＩＩＩにおいて見られる相対的に高いＴＯＰ２Ａレベルは、そしてそれは、さらなる評価を必要とするが、ＴＯＰ２ＡのｍＲＮＡ及び患者の生存の間の同様の相関関係を示唆するかもしれない。
【００３９】
トポイソメラーゼファミリーのＴＯＰ２Ｂ及びＴＯＰ３Ａの他のいくつかのメンバーが、膠芽細胞腫において上方制御されることが報告されているが、その意義は、現在明らかではない。興味深いことに、本発明者等は、ＴＯＰＯＲＳは、結合タンパク質であり、そしてＤＮＡ損傷により誘導されるｐ５３依存性細胞応答を仲介する際に結果として生じる役割を有するｐ５３の活性化補助因子であるという報告（Linら、2005）により説明され得る悪性グリオーマにおけるＴＯＰＯＲＳの下方制御を見出した。
【００４０】
ＴＯＰ２Ａ転写産物及びタンパク質の上昇レベルが、しばしば増加した細胞増殖と相関することは、乳がん、子宮頸がん、小細胞肺がん、胃がん、胃及び大腸がんを含む多くのがんにおいて示されている（Jarvinen及びLiu, 2003）。グリオーマにおいて、ＴＯＰ２ＡのｍＲＮＡの高いレベルが、星状細胞腫のグレードＩＩ及びＩＩＩと比較して、ＧＢＭにおいて認められ、そしてまた、腫瘍のＴＯＰ２Ａタンパク質レベルと相関関係がある（Odaら、2005）。ＴＯＰ２Ａ遺伝子は、染色体１７ｑ１２‐ｑ２１でＨＥＲ‐２がん遺伝子に非常に接近して位置し、そしてほぼ９０％のＨＥＲ‐２増幅原発性乳がんにおいて増幅又は欠失する。より興味深いことに、ＴＯＰ２Ａの増幅又は欠失は、相対的な化学療法感受性及びアントラサイクリン治療に対する耐性の両方を説明するかもしれない（Jarvinen及びLiuら、2003）。さらに、異なる実験方法を使用するインビトロ試験では、ＴＯＰ２Ａ阻害剤に対する感受性が、がん細胞におけるＴＯＰ２Ａの発現レベルに依拠し、低濃度のＴＯＰ２Ａタンパク質を有する細胞が、高濃度のＴＯＰ２Ａを有する細胞よりもＴＯＰ２Ａ阻害薬に対してより感受性が低いことが以前に提供されている（Asanoら、1996; Jarvinenら、2000; Gudkovら、1993; Asanoら、1996; Vassetzkyら、1996; Withoffら、1996）。
【００４１】
高い腫瘍のＴＯＰ２Ａレベルを有するＧＢＭ患者が、テモゾロミド化学療法に対するより良好な生存を有する最初の知見に基づいて、テモゾロミドがまた、ＴＯＰ２Ａ酵素活性に影響を及ぼすことにより作用するかもしれないと仮説を立てる。実際に、本発明者等は、テモゾロミドがインビトロにおいてＴＯＰ２Ａの阻害剤であることを示すことができた。さらに本発明者等は、テモゾロミド治療に対する高いＴＯＰ２Ａレベルを有するＧＢＭ腫瘍のより良好な反応の理由が、高いＴＯＰ２Ａレベルを有する腫瘍が、それらの生存のためにＴＯＰ２Ａに依拠しており、そしてテモゾロミドによって、そのＴＯＰ２Ａ阻害活性を通じて非常に効率的に阻害されるためである可能性があることを提案する。本発明は、ＴＯＰ２Ａの下方制御によりテモゾロミドに対して耐性になる細胞で、グリオーマ細胞のＴＯＰ２Ａレベルが、テモゾロミドに対するそれらの感受性を決定することを報告する。従って、本試験は、テモゾロミド化学療法に対する反応の予測因子として腫瘍のＴＯＰ２Ａ転写産物レベルを示す。
【００４２】
利点：
本発明の利点は、以下：
１．付随及び循環アジュバントテモゾロミド治療を伴う放射線治療を受けるＧＢＭ患者のための有用な予後指標ＴＯＰ２Ａを提供し、
２．従って、最も適切な治療を決定することが可能である
ことである。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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