(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する単離されたポリペプチドであって：
（ａ）配列番号２、４、若しくは６、又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも９０％、の配列同一性を有するポリペプチドであって、配列番号２の成熟ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸６２〜３９７であり、配列番号４の成熟ポリペプチド配列は、配列番号４のアミノ酸の１８〜４１８であり、そして配列番号６の成熟ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸６９〜３９７であり；
（ｂ）高ストリンジェンシー条件下で、又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号１、３、若しくは５、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１、３、若しくは５、又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、配列番号２の成熟ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸６２〜３９７であり、配列番号４の成熟ポリペプチド配列は、配列番号４のアミノ酸の１８〜４１８であり、そして配列番号６の成熟ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸６９〜３９７であり；
（ｄ）配列番号２、４、若しくは６、又はその成熟ポリペプチド配列の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体であって、配列番号２の成熟ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸６２〜３９７であり、配列番号４の成熟ポリペプチド配列は、配列番号４のアミノ酸の１８〜４１８であり、そして配列番号６の成熟ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸６９〜３９７であり；並びに
（ｅ）Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリペプチドの断片であって、配列番号２に対応する配列の場合、少なくとも３３７個のアミノ酸残基を含み、配列番号４に対応する配列の場合、少なくとも３５５個のアミノ酸残基を含み、配列番号６に対応する配列の場合、少なくとも３３７個のアミノ酸残基を含む、断片
から選択されるペプチド。
【請求項２】
配列番号２、４、若しくは６、又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号２の成熟ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸６２〜３９７であり、配列番号４の成熟ポリペプチド配列は、配列番号４のアミノ酸の１８〜４１８であり、そして配列番号６の成熟ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸６９〜３９７であする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
高ストリンジェンシー条件下で、又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号１、３、若しくは５又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１、３、若しくは５と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号２、４か、又は６からなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号２、４、若しくは６の成熟ポリペプチドをからなり、配列番号２の成熟ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸６２〜３９７であり、配列番号４の成熟ポリペプチド配列は、配列番号４のアミノ酸の１８〜４１８であり、そして配列番号６の成熟ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸６９〜３９７である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
Ｅ．コリＮＲＲＬ Ｂ‐５０４００に含まれるプラスミドｐＡａＣ４Ｔ７３７に含まれるポリヌクレオチドによってコードされるか；Ｅ．コリＮＲＲＬ Ｂ‐５０３８８に含まれるプラスミドｐＡａＣ４ｔ５２１に含まれるポリヌクレオチドによってコードされるか、又はＥ．コリＮＲＲＬ Ｂ５０４０１に含まれるプラスミドｐＡａＭＡＴ７３７に含まれるポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドを含んで成る組成物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
発現宿主内でそのポリペプチドの産生を指示する１若しくは複数の制御配列に作用可能に連結された請求項９に記載のポリヌクレオチドを含んで成る核酸構築物又は発現ベクター。
【請求項１１】
そのポリペプチドの産生を指示する１若しくは複数の制御配列に作用可能に連結された請求項９のポリヌクレオチドを含んで成る組換え宿主細胞。
【請求項１２】
Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体をコードする異種ポリヌクレオチドを含んで成る宿主細胞であって、前記異種ポリヌクレオチドが：
（ａ）配列番号２、４、若しくは６、又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号２の成熟ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸６２〜３９７であり、配列番号４の成熟ポリペプチド配列は、配列番号４のアミノ酸の１８〜４１８であり、そして配列番号６の成熟ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸６９〜３９７である、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体をコードするか；
（ｂ）高ストリンジェンシー条件下で、又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号１、３、若しくは５、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするか；あるいは
（ｃ）配列番号１、３、若しくは５、又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、
当該宿主細胞が、異種ポリヌクレオチドを含まない宿主細胞と比較して、同じ条件下で培養された場合により大量のＣ４‐ジカルボン酸を産生することができる宿主細胞。
【請求項１３】
異種ポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドにとって外来性のプロモーターに作用可能に連結されている、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする第２の異種ポリヌクレオチドをさらに含んで成る、請求項１２又は１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする第３の異種ポリヌクレオチドをさらに含んで成る、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
宿主細胞が、糸状菌宿主細胞である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
宿主細胞が、アスペルギルス宿主細胞である、請求項１６に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項１８】
宿主細胞が、アスペルギルス・オリゼ宿主細胞である、請求項１６に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項１９】
Ｃ４‐ジカルボン酸が、リンゴ酸である、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
Ｃ４‐ジカルボン酸の製造方法であって：
（ａ）Ｃ４‐ジカルボン酸を産生するのに好適な条件下、培地中で請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養し；そして
（ｂ）Ｃ４‐ジカルボン酸を回収すること、
を含んで成る方法。
【請求項２１】
Ｃ４‐ジカルボン酸の産生を増大する方法であって：
（ａ）請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを宿主細胞内に形質転換し；
（ｂ）Ｃ４‐ジカルボン酸を産生するのに好適な条件下、培地中で形質転換宿主細胞を培養し；そして
（ｃ）Ｃ４‐ジカルボン酸を回収すること、
を含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本出願は、コンピューター可読形式の配列表を含んでおり、これを本明細書中で援用する。
【０００２】
生物学的材料の寄託の参照
本出願は、生物学的材料の寄託への参照を含んでおり、これを本明細書中で援用する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有するポリペプチドと、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、このポリヌクレオチドを含む核酸構築物、ベクター、及び宿主細胞、並びにこのポリペプチドの製造方法と使用方法、及びリンゴ酸などのＣ４‐ジカルボン酸の製造方法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
関連技術の説明
有機酸は、さまざまな産業での商業的利用の長い歴史がある。例えば、有機酸は、食物及び飼料業界で（クエン酸、アスコルビン酸、乳酸、酢酸、及びグルコン酸）、様々な重合体の製造のためのモノマーとして（アジピン酸、乳酸、アクリル酸、及びイタコン酸）、金属キレート剤として（グルコン酸）、そして「グリーン」溶媒として（酢酸）使用される（Sauer et al., 2008, Trends in Biotechnology 26: 100-108）。有機酸は、それら自体が市販製品になり得、それらは他の化学物質の製造に使用される化学的構成要素にもなり得る。特殊用途に加えて、Ｃ４‐ジカルボン酸はまた、大量の工業薬品、例えば１，４‐ブタンジオール、テトラヒドロフラン、及びγ‐ブチロラクトンなどの製造のための構成要素化合物としての役目も果たし得ることが長い間、認識されてきた。従来の石油化学経路によってこれらの大量の工業薬品を製造するためのコストは、石油由来の構成要素の高いコストのため増加する。
【０００５】
有機酸は、石油由来の原料からの化学合成によって（例えば、フマル酸、リンゴ酸、アクリル酸、及びアジピン酸）又は微生物発酵（例えば、クエン酸、乳酸、グルコン酸、及びイタコン酸）によって商業的に製造される。いくつかの有機酸、例えばフマル酸やリンゴ酸などはまた、微生物発酵でも製造できるが、現在では、低い製造コストのため石油化学原料からの化学合成によって商業的に製造されている。しかしながら、石油由来の構成要素化学物質のコスト上昇、原油価格に影響する地政学的な不安定性、及び再生可能資源から得られた原料を利用する製造工程が実施する願望は、微生物発酵による有機酸及び他の化学物質の製造への新たな興味を刺激した。
【０００６】
今日、リンゴ酸は石油化学原料からの化学合成によって商業的に製造されているもの、それは微生物発酵によっても製造できる。リンゴ酸は、遺伝子操作された酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））（Zelle et al., 2008, Appl. Environ. Microbiol. 74: 2766-2777）及び天然に存在する糸状菌、例えばアスペルギルス亜種など（米国特許第３，０６３，９１０号；Bercovitz et al., 1990, Appl. Environ. Microbiol. 56: 1594-1597）において高いレベルで製造されてきた。Ａｂｅら（米国特許第３，０６３，９１０号）及びＢｅｒｃｏｖｉｔｚら（1990, Appl. Environ. Microbiol. 56: 1594-1597）は、アスペルギルスのいくつかの種で高レベルのリンゴ酸産生を報告した。そのうえ、Ｂａｔｔａｔら（1991 , Biotechnol. Bioengineering, 37: 1108-1116）は、最適化条件下で、撹拌型発酵槽中でアスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）によって１１３ｇ／Ｌもの高いリンゴ酸産生を報告した。酵母における微生物発酵によるジカルボキシル酸産生がＷＯ２０１０／００３７２８に記載されている。微生物発酵によるリンゴ酸産生はまた、ＷＯ２００９／０１１９７４とＷＯ２００９／１５５３８２にも記載されている。アスペルギルスの遺伝子工学によるリンゴ酸産生の改善が、発酵による経済的な商業的リンゴ酸産生を可能にする。
【０００７】
特定の培養条件下（好気性条件及び高Ｃ：Ｎ比；中和剤として及びリンゴ酸生合成のためのＣＯ2源として炭酸カルシウムが加えられる）、アスペルギルス亜種においてリンゴ酸過剰産生が起こる。これらの条件下で、サイトゾルを介する過剰な代謝、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルの低下が、増強されたリンゴ酸生合成と培地中への分泌をもたらす。増強されたリンゴ酸産生は、遺伝子工学を使用することでピルビン酸カルボキシラーゼ（Bauer et al., 1999, FEMS Microbiol Lett. 179: 107-113）又はリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Pines et al., 1997, Appl. Microbiol. Biotechnol. 48: 248-255）のレベルの上昇、及びリンゴ酸輸送体（Zelle et al., 2008、前掲）の発現の増加によってサッカロミセス・セレビシエで報告された。生化学的証明に基づいて、アスペルギルス・フラバス株ＡＴＣＣ１３６９７においてリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性がリンゴ酸産生を制限していることが示唆された（Peleg et al., 1988, Appl. Microbiol. Biotechnol. 28: 69-75）。２０１０年８月２７日出願された「Methods for Improving Malic Acid Production in Filamentous Fungi」と題されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／４７００２号（上記文献の内容全体を本明細書中に援用する）には、糸状菌におけるリンゴ酸産生が記載されている。
【０００８】
組み換えＤＮＡ技術を使用した遺伝子工学の結果としてアスペルギルス属におけるＣ４‐ジカルボン酸産生、例えばリンゴ酸産生などを改善することは、当該技術分野では有利なはずである。とりわけ、本発明は、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有するポリペプチド、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びＣ４‐ジカルボン酸産生（例えば、リンゴ酸産生）の改善方法を提供する。
【発明の概要】
【０００９】
発明の概要
本発明は、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する単離されたポリペプチドに関する。一態様において、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する単離されたポリペプチドは、以下の：（ａ）配列番号２、４、若しくは６又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）低ストリンジェンシー条件下で、配列番号１、３、若しくは５、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；（ｃ）配列番号１、３、若しくは５、又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；（ｄ）配列番号２、４、若しくは６、又はその成熟ポリペプチド配列の１若しくは複数（例えば２個、数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体；並びに（ｅ）Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリペプチドの断片、から選択される。本発明はまた、Ｃ４‐ジカルボン酸（例えば、リンゴ酸）の製造方法に関する。一態様において、その方法は、（ａ）本明細書中に記載したＣ４‐ジカルボン酸輸送体をコードする異種ポリヌクレオチドを含んで成る宿主細胞（例えば、糸状菌宿主細胞）を培養し；そして（ｂ）Ｃ４‐ジカルボン酸（例えば、リンゴ酸）を回収すること、を含んで成る。別の態様において、前記方法は、（ａ）宿主細胞（例えば、糸状菌宿主細胞）の中に本明細書中に記載したＣ４‐ジカルボン酸輸送体をコードする異種ポリヌクレオチドを形質転換し；（ｂ）培地中で形質転換生物体を培養し；そして（ｃ）Ｃ４‐ジカルボン酸（例えば、リンゴ酸）を回収すること、を含んで成る。前記方法の態様によって、宿主細胞はさらに、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及び／又はピルビン酸カルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含んで成る。
【００１０】
本発明はまた、本明細書中に記載したＣ４‐ジカルボン酸輸送体をコードする異種ポリヌクレオチドを含んで成る宿主細胞（例えば、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）などの糸状菌宿主細胞）にも関連しており、ここで、前記宿主細胞は、高レベルのＣ４‐ジカルボン酸（例えば、リンゴ酸）を分泌しているか、そして／あるいは分泌することができる。態様によって、前記宿主細胞はさらに、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及び／又はピルビン酸カルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含んで成る。
【００１１】
本発明はまた、シグナルペプチドとそれをコードするポリヌクレオチドにも関する。一態様において、本発明は、タンパク質をコードする遺伝子に作用可能に連結された配列番号２の第１〜６１又は第１〜６８アミノ酸から成る又はそれを含んで成るシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。別の態様において、本発明は、タンパク質をコードする遺伝子に作用可能に連結された配列番号４の第１〜１７アミノ酸から成る又はそれを含んで成るシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。別の態様において、本発明は、タンパク質をコードする遺伝子に作用可能に連結された配列番号６の第１〜６８アミノ酸から成る又はそれを含んで成るシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００１２】
本発明はまた、本明細書中に記載したポリペプチドを含んで成る組成物、そのポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含んで成る核酸構築物、発現ベクター、組換え宿主細胞、及びそのポリペプチドの製造方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ｐＳｈＴｈ６０の制限地図を示す。
【図２】ｐＳａＭＦ３５の制限地図を示す。
【図３】アスペルギルス・アクレアツスＣ４‐ジカルボン酸輸送体遺伝子（ｃ４ｔ７３７）のゲノムＤＮＡ配列と推定アミノ酸配列（それぞれ配列番号１と２）を示す。
【図４】ｐＳａＭＦ３６の制限地図を示す。
【図５】アスペルギルス・アクレアツスＣ４‐ジカルボン酸輸送体遺伝子（ｃ４ｔ５２１）のゲノムＤＮＡ配列と推定アミノ酸配列（それぞれ配列番号３と４）を示す。
【図６】アスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｍｄｈ３）のゲノムＤＮＡ配列と推定アミノ酸配列（それぞれ配列番号１１と１２）を示す。
【図７】ｐＳａＭＦ２１の制限地図を示す。
【図８Ａ】８Ｂと一緒に、アスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｃ）のゲノムＤＮＡ配列と推定アミノ酸配列（それぞれ配列番号１５と１６）を示す。
【図８Ｂ】８Ａと一緒に、アスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｃ）のゲノムＤＮＡ配列と推定アミノ酸配列（それぞれ配列番号１５と１６）を示す。
【図９】ｐＲＹＡＮ１の制限地図に示す。
【図１０】ｐＡａＭＡＴ７３７の制限地図を示す。
【図１１】ｐＳａＭＦ３８の制限地図を示す。
【図１２】アスペルギルス・アクレアツスＣ４‐ジカルボン酸輸送体遺伝子（ｍａｔ７３７）のゲノムＤＮＡ配列と推定アミノ酸配列（それぞれ配列番号５と６）を示す。
【００１４】
定義
Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体：「Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体」という用語は、本明細書中では、リンゴ酸、コハク酸、オキサロ酢酸、マロン酸、及び／又はフマル酸を細胞外に輸送できるジカルボン酸透過酵素と規定される（Grobler et al., 1995, Yeast 11 : 1485-1491；Camarasa et al., 2001 , Applied and Environmental Microbiology 67: 4144- 4151）。トコンドリアにより持ち込まれたタンパク質及びそれらの標的配列を予測するコンピュータによる方法は、Claros and Vincens, 1996, Eur. J. Biochem. 241 : 779- 786によって記載されている。
【００１５】
態様によって、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体には、成熟ポリペプチド配列番号２、配列番号４、及び／又は配列番号６のＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性（例えば、リンゴ酸輸送体活性）の少なくとも２０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％がある。
【００１６】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼ：「リンゴ酸デヒドロゲナーゼ」という用語は、本明細書中では、ＮＡＤＨ＋Ｈ+の存在下でオキサロ酢酸のリンゴ酸とＮＡＤ+への還元を触媒するリンゴ酸：ＮＡＤ+酸化還元酵素（ＥＣ１．１．１．３７）と規定される。本発明の目的において、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性は、以下の手順により測定される。アッセイ溶液は、１ｍＭのオキサロ酢酸、１００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭのＮａＨＣＯ3、５ｍＭのＭｇＣｌ2、及び０．１ｍＭのＮＡＤＨから成る（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA）。基質としてオキサロ酢酸を含まないアッセイ溶液は、バックグラウンドＮＡＤＨ分解速度を計測するための対照として実施される。それぞれの上清の１／１００、１／５００、１／２５００、及び１／１２５００の希釈液を再蒸留水によって準備する。アッセイ溶液の２７０μｌのアリコートを、９６ウェルポリスチレン平底プレートに分配する。３０μｌのそれぞれの希釈上清サンプルを加えて、アッセイを開始する。以下の設定：３４０ｎｍ、速度表示、によりSPECTRAMAX（登録商標）340PCプレートリーダー（Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA）を使用して反応を観察する。ＮＡＤＨの濃度系列を検量線の構築に使用し、そして精製リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA）の希釈系列を正の対照として使用する。リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性の一単位は、ｐＨ８．０、２５℃にて１分あたり１μモルのオキサロ酢酸とＮＡＤＨ＋Ｈ+をリンゴ酸とＮＡＤ+に変換できる酵素の量に相当する。
【００１７】
態様によって、リンゴ酸デヒドロゲナーゼには、成熟ポリペプチド配列番号１２のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性の少なくとも２０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％がある。
【００１８】
ピルビン酸カルボキシラーゼ：「ピルビン酸カルボキシラーゼ」という用語は、本明細書中では、ＡＴＰとＨＣＯ3-の存在下でピルビン酸のオキサロ酢酸、ＡＤＰ、及びホスファートへのカルボキシ化を触媒するピルビン酸：二酸化炭素リガーゼ（ＡＤＰ生成）（ＥＣ６．４．１．１）と規定される。本発明の目的において、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を、アッセイにＴｒｉｓバッファーｐＨ８．０を使用することを除いて、ピルビン酸カルボキシラーゼのためのSigma（登録商標）Quality Control Test手順の手順に従って測定する（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA）。ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の一単位は、ｐＨ７．８、３０℃にて１μモルのピルビン酸とＣＯ2をオキサロ酢酸に変換できる酵素の量に相当する。
【００１９】
態様によって、ピルビン酸カルボキシラーゼには、成熟ポリペプチド配列番号１６のピルビン酸カルボキシラーゼ活性の少なくとも２０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％がある。
【００２０】
異種ポリヌクレオチド：「異種ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中では、宿主細胞にとって固有ではないポリヌクレオチド；構造変更がコード領域になされた天然ポリヌクレオチド；組み換えＤＮＡ技術によるＤＮＡ操作、例えば、異なる（非自己）プロモーターの結果として発現が量的に変更された天然ポリヌクレオチド；又は宿主細胞内への１若しくは複数（例えば、２個、数個）のポリヌクレオチドのコピーの導入により発現が量的に変更された天然ポリヌクレオチド、と規定される。
【００２１】
単離された／精製された：「単離された」及び「精製された」という用語は、それが天然に関連する少なくとも一つの成分から取り出されたポリペプチド又はポリヌクレオチドを意味する。例えば、ポリペプチドは、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって決定した場合、少なくとも１％の純度、例えば、少なくとも５％の純度、少なくとも１０％の純度、少なくとも２０％の純度、少なくとも４０％の純度、少なくとも６０％の純度、少なくとも８０％の純度、少なくとも９０％の純度、少なくとも９３％の純度、少なくとも９５％の純度、少なくとも９７％の純度、少なくとも９８％の純度か、又は少なくとも９９％の純度であり、そして、ポリヌクレオチドは、アガロース電気泳動で決定された場合、少なくとも１％の純度、例えば、少なくとも５％の純度、少なくとも１０％の純度、少なくとも２０％の純度、少なくとも４０％の純度、少なくとも６０％の純度、少なくとも８０％の純度、少なくとも９０％の純度、少なくとも９３％の純度、少なくとも９５％の純度、少なくとも９７％の純度、少なくとも９８％の純度、又は少なくとも９９％はの純度である。
【００２２】
コード配列：「コード配列」という用語は、そのポリペプチドのアミノ酸配列を特定するポリヌクレオチド配列を意味する。コード配列の境界は、一般に、オープンリーディングフレームによって決定され、オープンリーディングフレームは、通常、ＡＴＧの開始コドンで始まるか、又はＧＴＧやＴＴＧなどの代替開始コドンで始まり、そして終止コドン、例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡなどで終わる配列である。コード配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ポリヌクレオチド、及び／又は遺伝子組み換えポリヌクレオチド配列であってもよい。
【００２３】
ｃＤＮＡ配列：用語「ｃＤＮＡ配列」は、真核細胞から得た成熟し、スプラインシングされたｍＲＮＡ分子から逆転写によって生成され得るＤＮＡ配列を意味する。ゲノムＤＮＡから転写された初期の、一次ＲＮＡ転写物は、成熟し、スプライシングされたｍＲＮＡとして出現する前に、スプラインシングを含めた一連のステップを介して処理されたｍＲＮＡの前駆体である。ｃＤＮＡ配列は、対応するゲノムＤＮＡ配列では存在し得る、介在イントロン配列を欠いている。従って、「配列番号ＸのｃＤＮＡ配列」という語句は、存在しているならは、配列番号Ｘの介在するイントロン配列が取り除かれた後に得られた配列を意図する。場合によっては、−参照ゲノムＤＮＡ配列が介在イントロン配列を欠いているとき−ｃＤＮＡ配列は対応するゲノムＤＮＡ配列と同一であることがある。
【００２４】
ゲノムＤＮＡ配列：用語「ゲノムＤＮＡ配列」は、起源生物体のゲノム（例えば、真核生物又は原核生物ゲノム）に見られるＤＮＡ配列を意味する。場合によっては、真核生物ゲノムからのゲノムＤＮＡ配列は、ＲＮＡスプライシングの結果として一次ＲＮＡ転写物から取り除かれる１若しくは複数の介在イントロン配列を含んでいる。従って、「配列番号ＹのゲノムＤＮＡ配列」という語句は、もしあれば、ＲＮＡスプライシング前に存在している介在イントロン配列を含んでいる起源生物体からの対応ＤＮＡ配列を意図する。
【００２５】
成熟ポリペプチド配列：「成熟ポリペプチド配列」という用語は、いずれかの翻訳後配列修飾（例えば、Ｎ末端プロセシング及び／又はＣ末端切断など）の後の参照ポリペプチド配列の部分を意味する。場合によっては、成熟ポリペプチド配列は、参照ポリペプチド配列全体と同一であってもよい。一態様において、成熟ポリペプチド配列は、配列番号２の第１〜６８アミノ酸がシグナルペプチドであると予測したＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎプログラム（European Bioinformatics Institute）によると、配列番号２の第６９〜３９７アミノ酸である。別の態様において、成熟ポリペプチド配列は、配列番号２の第１〜６１アミノ酸がシグナルペプチドであると予測したＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1 -6）によると、配列番号２の第６２〜３９７アミノ酸である。別の態様において、成熟ポリペプチド配列は、配列番号４の第１〜１７アミノ酸がシグナルペプチドであると予測したＳｉｇｎａｌＰプログラムによると配列番号の第４１８〜４１８アミノ酸である。別の態様において、成熟ポリペプチド配列は、シグナルペプチドがないと予測したＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎプログラムによると、配列番号４の第１〜４１８アミノ酸である。別の態様において、成熟ポリペプチド配列は、配列番号６の第１〜６８アミノ酸がシグナルペプチドであると予測したＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎプログラムによると、配列番号の第６６９〜３９７アミノ酸である。
【００２６】
成熟ポリペプチドコード配列：「成熟ポリペプチドコード配列」という用語は、成熟ポリペプチド配列をコードする参照ポリヌクレオチド配列（例えば、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列）の部分を意味する。場合によっては、成熟ポリペプチドコード配列は、参照ポリヌクレオチド配列全体と同一であることもある。一態様において、成熟ポリペプチドコード配列は、配列番号１の第１〜２０４ヌクレオチドがシグナルペプチドをコードすると予測したＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎプログラム（European Bioinformatics Institute）によると、配列番号１の第２０５〜１１９４ヌクレオチドである。別の態様において、成熟ポリペプチドコード配列は、配列番号１の第１〜１８３ヌクレオチドがシグナルペプチドをコードすると予測したＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1 -6）によると、配列番号１の第１８４〜１１９４ヌクレオチドである。別の態様において、成熟ポリペプチドコード配列は、配列番号３の第１〜５１ヌクレオチドがシグナルペプチドをコードすると予測したＳｉｇｎａｌＰプログラムによると、配列番号３の第５２〜１２５７ヌクレオチドである。別の態様において、成熟ポリペプチドコード配列は、シグナルペプチドがないと予測したＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎプログラムによると、配列番号３の１〜１２５７ヌクレオチドである。別の態様において、成熟ポリペプチドコード配列は、配列番号５の第１〜２０４ヌクレオチドがシグナルペプチドをコードすると予測したＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎプログラムによると、配列番号５の第２０５〜１１９４ヌクレオチドである。
【００２７】
断片：「断片」という用語は、参照ポリペプチド配列のアミノ及び／又はカルボキシル末端から１若しくは複数（例えば、２個、数個）のアミノ酸が欠失されたポリペプチドを意味する。一態様において、断片は、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する。別の態様において、断片は、配列番号２の少なくとも３３７個のアミノ酸残基、例えば、少なくとも３５７個のアミノ酸残基、又は少なくとも３７７個のアミノ酸残基を含んでいる。別の態様において、断片は、配列番号４の少なくとも３５５個のアミノ酸残基、例えば、少なくとも３７５個のアミノ酸残基又は少なくとも３９５個のアミノ酸残基を含んでいる。別の態様において、断片は、配列番号６の少なくとも３３７個のアミノ酸残基、例えば、少なくとも３５７個のアミノ酸残基又は少なくとも３７７個のアミノ酸残基を含んでいる。
【００２８】
部分配列：「部分配列」という用語は、参照ヌクレオチド配列の５’及び／又は３’末端から１若しくは複数（例えば、２個、数個）のヌクレオチドが欠失されたポリヌクレオチドを意味する。一態様において、部分配列は、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する断片をコードする。別の態様において、部分配列は、配列番号１の少なくとも１０１１個のヌクレオチド、例えば、少なくとも１１７１個のヌクレオチド又は少なくとも１１３１個のヌクレオチドを含んでいる。別の態様において、部分配列は、配列番号３の少なくとも１０６５個のヌクレオチド、例えば、少なくとも１１２５個のヌクレオチド又は少なくとも１１８５個のヌクレオチドを含んでいる。別の態様において、部分配列は、配列番号５の少なくとも１０１１個のヌクレオチド、例えば、少なくとも１１７１個のヌクレオチド又は少なくとも１１３１個のヌクレオチドを含んでいる。
【００２９】
対立遺伝子変異体：「対立遺伝子変異体」という用語は、同じ染色体座を占める遺伝子の二個以上の代替形態のいずれか意味する。対立遺伝子変異は、天然においても突然変異を通して発生し、そして集団内の多型性をもたらすことができる。遺伝子突然変異は、サイレントであり得るか（コードしているポリペプチドの変化がない）、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされるポリペプチドである。
配列同一性：２つのアミノ酸配列又は２つのヌクレオチド配列の間の関連性は、「配列同一性」というパラメーターによって説明される。
【００３０】
本発明の目的において、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277）のＮｅｅｄｌｅプログラムに実装されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）を使用して決定される。使用される任意パラメーターは、１０のギャップ開始ペナルティー、０．５のギャップ伸長ペナルティー、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。（‐ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長同一性」の出力は、パーセント同一性として使用され、そして以下のとおり計算される：
（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップ総数）
【００３１】
本発明の目的において、２つのデオキシリボヌクレオチド酸配列間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al,2000、前掲）のＮｅｅｄｌｅプログラムに備わった、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Needleman and Wunsch,1970、前掲）を用いて決定される。使用される任意のパラメータは、１０のギャップ開始ペナルティー、０．５のギャップ伸長ペナルティー、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長同一性」の出力は、パーセント同一性として使用され、そして以下のように計算される：
（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップ総数）
【００３２】
発現：「発現」という用語は、これだけに限定されるものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含めた、ポリペプチドの産生にかかわるあらゆるステップを含む。
【００３３】
核酸構築物：用語「核酸構築物」は、天然に存在するの遺伝子から単離され、そうでなければ天然に存在しない様式で核酸のセグメントを含むように修飾されている、あるいは合成の−一本鎖又は二本鎖−核酸性分子を意味し、ここで、前記核酸分子は、１若しくは複数（例えば、２個、数個）の制御配列を含んで成る。
【００３４】
制御配列：「制御配列」という用語は、ポリペプチド発現に必要な核酸配列を意味する。制御配列は、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに固有であっても、又は外来性であってもよく、そして互いに固有であっても、又は外来性であってもよい。こうした制御配列には、これだけに限定されるものではないが、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーター配列が含まれる。制御配列は、ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドのコード領域と制御配列との連結を容易にする特定の制限部位を導入する目的でリンカーを提供し得る。
【００３５】
作用可能に連結された：「作用可能に連結された」という用語は、制御配列が、制御配列はコード配列の発現を指示するようポリヌクレオチドのコード配列に対する位置で適切に配置されている配置を意味する。
【００３６】
発現ベクター：「発現ベクター」という用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んで成り、且つ制御配列が作用可能に連結されている直鎖又は環状ＤＮＡ分子を意味するが、ここで、前記制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現をもたらす。最小の場合でも、発現ベクターは、プロモーター配列、並びに転写及び翻訳停止シグナル配列を含んで成る。
【００３７】
宿主細胞：「宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体をコードするポリヌクレオチド）を含んで成る核酸構築物又は発現ベクターを用いて、形質転換、トランスフェクション、形質導入などを受けるあらゆるタイプの細胞を意味する。「宿主細胞」という用語は、複製中に起こる突然変異のため親細胞と同一ではない、親細胞のあらゆる子孫を包含する。
【００３８】
変異体：「変異体」という用語は、１若しくは複数の位置にて１若しくは複数（例えば、２個、数個）のアミノ酸残基の変更、すなわち、置換、挿入、及び／又は欠失を含んでなる、活性、例えばＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有するポリペプチドを意味する。置換は、異なるアミノ酸によるある位置を占めていアミノ酸の置き換えを意味し；欠失は、ある位置を占めているアミノ酸の除去を意味し；挿入は、ある位置を占めているアミノ酸に隣接した１若しくは複数の、例えば１〜３個のアミノ酸の追加を意味する。
【００３９】
容積生産性：「容積生産性」という用語は、単位時間あたりの、使用した系の容積（例えば、培地とその内容物の全容積）あたりの産生された参照産物の量（例えば、産生されたＣ４‐ジカルボン酸の量）を指す。
【００４０】
発酵培地：「発酵培地」という用語は、１若しくは複数（例えば、２個、数個）の糖、例えば、グルコース、フルクトース、ショ糖、セロビオース、キシロース、キシルロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、及び／又は可溶性オリゴ糖など含んで成る培地を指し、ここで、前記培地は、一部が、宿主細胞によってＣ４‐ジカルボン酸などの所望の産物に変換（発酵）され得る。場合によっては、発酵培地は、例えば、サトウキビ、デンプン、又はセルロースなどの天然源から得られ、そして、酵素的分解（糖化）による供給源の前処理の結果であってもよい。
【００４１】
本明細書中の値又はパラメーターの「about」への言及には、その値又はパラメーター自体に向けられた態様が含まれる。例えば、「約×」に関する説明には、態様「×」が含まれる。
【００４２】
本明細書中及び添付の請求項で使用されるとき、単数形の「a」、「or」、及び「the」は、別段の明確な指示がない限り、複数の指示物を含んでいる。本明細書中に記載した発明の態様には、態様「から成る」及び／又は「から本質的に成る」が含まれることは理解される。
【００４３】
別段の規定されない限り、又は文脈による明確な指示のない限り、本明細書中に使用されるすべての技術的及び学術用語は、本願発明が属する技術分野の当業者に理解されているのと同じ意味を有する。
【００４４】
発明の詳細な説明
Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有するポリペプチド
本発明は、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する単離されたポリペプチドに関する。一態様において、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する単離されたポリペプチドは、以下の：
（ａ）配列番号２、４、若しくは６、又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）低ストリンジェンシー条件下で、配列番号１、３、若しくは５、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
【００４５】
（ｃ）配列番号１、３、若しくは５、又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号２、４、若しくは６、又はその成熟ポリペプチド配列の１若しくは複数（例えば、２個、数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体；並びに
（ｅ）Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリペプチドの断片、から選択される。
【００４６】
別の態様において、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する単離されたポリペプチドは、以下の：
（ａ）配列番号２又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）低ストリンジェンシー条件下で、配列番号１、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
【００４７】
（ｃ）配列番号１又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号２又はその成熟ポリペプチド配列の１若しくは複数（例えば、２個、数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体、並びに
（ｅ）Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリペプチドの断片、から選択される。
【００４８】
別の態様において、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する単離されたポリペプチドは、以下の：
（ａ）配列番号４又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）低ストリンジェンシー条件下で、配列番号３、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
【００４９】
（ｃ）配列番号３又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｄ）、配列番号４又はその成熟ポリペプチド配列の１若しくは複数（例えば、２個、数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体；並びに
（ｅ）Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリペプチドの断片、から選択される。
【００５０】
別の態様において、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する単離されたポリペプチドは、以下の：
（ａ）配列番号６又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）低ストリンジェンシー条件下で、配列番号５、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
【００５１】
（ｃ）配列番号５又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号６又はその成熟ポリペプチド配列の１若しくは複数（例えば、２個、数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体、並びに
（ｅ）Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリペプチドの断片、から選択される。
【００５２】
これらの態様のいくつかにおいて、単離されたポリペプチドには、配列番号２又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性のアミノ酸配列があり、そしてそれは、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する。一態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２又はその成熟ポリペプチド配列と１０個未満のアミノ酸、例えば、５つのアミノ酸、４つのアミノ酸、３つのアミノ酸、２つのアミノ酸、又は１つのアミノ酸しか異ならないアミノ酸配列を含んで成る。
【００５３】
一態様において、前記ポリペプチドは、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する配列番号２、配列番号２の成熟ポリペプチド配列、その対立遺伝子変異体、又は前記配列の断片のアミノ酸配列を含んで成るか又はそれから成る。別の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含んで成るか又はそれから成る。別の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の成熟ポリペプチド配列を含んで成るか又はそれから成る。別の好ましい態様では、前記ポリペプチドは、配列番号２の第６２〜３９７又は第６９〜３９７アミノ酸を含んで成るか又はそれから成る。
【００５４】
これらの態様のいくつかにおいて、単離されたポリペプチドには、配列番号４又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性のアミノ酸配列があり、そしてそれは、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する。一態様において、前記ポリペプチドは、配列番号４又はその成熟ポリペプチド配列と１０個未満のアミノ酸、例えば、５つのアミノ酸、４つのアミノ酸、３つのアミノ酸、２つのアミノ酸、又は１つのアミノ酸しか異ならないアミノ酸配列を含んで成る。
【００５５】
一態様において、前記ポリペプチドは、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する配列番号４、配列番号４の成熟ポリペプチド配列、その対立遺伝子変異体、又は前記配列の断片のアミノ酸配列を含んで成るか又はそれから成る。別の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含んで成るか又はそれから成る。別の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号４の成熟ポリペプチド配列を含んで成るか又はそれから成る。別の好ましい態様では、前記ポリペプチドは、配列番号４の第５２〜４１８アミノ酸を含んで成るか又はそれから成る。
【００５６】
これらの態様のいくつかにおいて、単離されたポリペプチドには、配列番号６又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性のアミノ酸配列があり、そしてそれは、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する。一態様において、前記ポリペプチドは、配列番号６又はその成熟ポリペプチド配列と１０個未満のアミノ酸、例えば、５つのアミノ酸、４つのアミノ酸、３つのアミノ酸、２つのアミノ酸、又は１つのアミノ酸しか異ならないアミノ酸配列を含んで成る。
【００５７】
一態様において、前記ポリペプチドは、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する配列番号６、配列番号６の成熟ポリペプチド配列、その対立遺伝子変異体、又は前記配列の断片のアミノ酸配列を含んで成るか又はそれから成る。別の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含んで成るか又はそれから成る。別の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号６の成熟ポリペプチド配列を含んで成るか又はそれから成る。別の好ましい態様では、前記ポリペプチドは、配列番号６の第６９〜３９７アミノ酸を含んで成るか又はそれから成る。
【００５８】
一態様において、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する単離されたポリペプチドは、非常に低ストリンジェンシー条件下で、低ストリンジェンシー条件下で、中ストリンジェンシー条件下で、中〜高ストリンジェンシー条件下で、高ストリンジェンシー条件下で、又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号１、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York）。
【００５９】
一態様において、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する単離されたポリペプチドは、非常に低ストリンジェンシー条件下で、低ストリンジェンシー条件下で、中ストリンジェンシー条件下で、中〜高ストリンジェンシー条件下で、高ストリンジェンシー条件下で、又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号３、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる。
【００６０】
一態様において、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する単離されたポリペプチドは、非常に低ストリンジェンシー条件下で、低ストリンジェンシー条件下で、中ストリンジェンシー条件下で、中〜高ストリンジェンシー条件下で、高ストリンジェンシー条件下で、又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号５、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる。
【００６１】
別の態様において、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する単離されたポリペプチドは、配列番号１、３、若しくは５、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖と少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
【００６２】
一態様において、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する単離されたポリペプチドは、配列番号１、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖と少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
【００６３】
一態様において、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する単離されたポリペプチドは、配列番号３、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖と少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
【００６４】
一態様において、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する単離されたポリペプチドは、配列番号５、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖と少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
【００６５】
一態様において、前記ポリペプチドは、配列番号１、３、若しくは５、又はその成熟ポリペプチドコード配列によってコードされる。一態様において、前記ポリペプチドは、配列番号１又はその成熟ポリペプチドコード配列によってコードされる。一態様において、前記ポリペプチドは、配列番号１によってコードされる。一態様において、ポリペプチドは、配列番号３又はその成熟ポリペプチドコード配列によってコードされる。一態様において、前記ポリペプチドは、配列番号３によってコードされる。一態様において、前記ポリペプチドは、配列番号５又はその成熟ポリペプチドコード配列によってコードされる。一態様において、前記ポリペプチドは、配列番号５によってコードされる。一態様において、前記ポリペプチドは、配列番号１、３又は５の部分配列によってコードされ、ここで、前記部分配列はＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有するポリペプチドをコードする。一態様において、前記ポリペプチドは、配列番号１の部分配列によってコードされ、ここで、前記部分配列はＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有するポリペプチドをコードする。一態様において、前記ポリペプチドは、配列番号３の部分配列によってコードされ、ここで、前記部分配列はＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有するポリペプチドをコードする。一態様において、前記ポリペプチドは、配列番号５の部分配列によってコードされ、ここで、部分配列はＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有するポリペプチドをコードする。
一態様において、単離されたポリペプチドは、配列番号２、４、若しくは６、又はその成熟ポリペプチド配列の１若しくは複数（例えば、２個、数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体である。一態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体である。一態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の成熟ポリペプチド配列の１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体である。一態様において、前記ポリペプチドは、配列番号４の１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体である。一態様において、前記ポリペプチドは、配列番号４の成熟ポリペプチド配列の１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体である。一態様において、前記ポリペプチドは、配列番号６の１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体である。一態様において、前記ポリペプチドは、配列番号６の成熟ポリペプチド配列の１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体である。
【００６６】
好ましくは、アミノ酸の変化は、小さいものであり、すなわちタンパク質の折り畳み及び／又は活性に大きな影響を与えない保存的アミノ酸置換；典型的には１〜約３０アミノ酸の小さい欠失；小さなアミノ末端又はカルボキシル末端伸長、例えばアミノ末端メチオニン残基など；最長約２０〜２５残基の小さいリンカーペプチド；又は正味荷電もしくは他の機能（例えばポリヒスチジン区域、抗原性エピトープもしくは結合ドメインなど）を変化させることにより精製を促進する小さい伸長である。
【００６７】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸、アスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、及び小アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン）の群内である。一般に比活性を変化させないアミノ酸置換は当該分野で公知であり、例えばH. Neurath and R.L. Hill, 1979, The Proteins, Academic Press, New Yorkに記載されている。最も一般的に存在する交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【００６８】
あるいはアミノ酸の変化は、ポリペプチドの物理化学的性質が改変されるようなものである。例えばアミノ酸変化は、ポリペプチドの熱安定性を改良し、基質特異性を改変し、最適ｐＨを変化させることなどがある。
【００６９】
親ポリペプチド中の必須アミノ酸は、当該分野で公知の方法、例えば部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発（Cunningham and Wells, 1989, Science 244:1081-1085）により同定することができる。後者の方法において、分子のすべての残基で単一のアラニン変異が導入され、そして分子の活性に決定的に重要なアミノ酸残基を同定するために、得られる変異分子がＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性について試験される。また、Hilton et al.、1996, J. Biol. Chem. 271:4699-4708を参照。酵素の活性部位又は他の生物学的相互作用はまた、核磁気共鳴、結晶解析、電子回折、又は光親和性標識のような方法に推定接触部位アミノ酸の変異を組合せるような、物理的構造分析により測定される。例えば、de Vos et al., 1992, Science 255:306-312；Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224:899-904；Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309:59-64を参照。必須アミノ酸の本体はまた、本発明のポリペプチドと関連するポリペプチドとの同一性の解析から推定できる。
【００７０】
単一の又は複数のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を行い、公知の突然変異誘発法、組換え、及び／又はシャフリングを行い、次に関連するスクリーニング法（例えば、Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241:53-57；Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156；ＷＯ９５／１７４１３；又はＷＯ９５／２２６２５に開示された方法）を使用して試験することができる。使用できる他の方法には、変異性ＰＣＲ、ファージ表示（例えば、Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837；米国特許第５，２２３，４０９号；ＷＯ９２／０６２０４）、及び領域特異的突然変異誘発（Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145；Ner et al., 1988, DNA 7:127）がある。
【００７１】
突然変異誘発／シャフリング法は、宿主細胞に発現されるクローン化され突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するために、高処理能力自動スクリーニング法と組合せることができる（Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17:893-896）。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発ＤＮＡ分子は宿主細胞から回収し、当該分野で公知の標準的方法を使用して迅速に配列決定することができる。これらの方法は、ポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性の迅速な測定を可能にする。
【００７２】
態様によって、配列番号２、４、若しくは６の、又はその成熟ポリペプチド配列のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入の総数は、１０個以下、例えば１、２、３、４、５、６、７、８又は９個以下である。
【００７３】
別の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２、４、若しくは６、又はその成熟ポリペプチド配列の断片であって、ここで、前記断片には、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性がある。一態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２又はその成熟ポリペプチド配列の断片であって、ここで、断片には、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性がある。一態様において、前記断片は、配列番号２の少なくとも３３７個のアミノ酸残基、例えば、少なくとも３５７個のアミノ酸残基又は少なくとも３７７個のアミノ酸残基を含んでいる。別の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号４又はその成熟ポリペプチド配列の断片であって、ここで、前記断片には、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性がある。一態様において、前記断片は、配列番号４の少なくとも３５５個のアミノ酸残基、例えば、少なくとも３７５個のアミノ酸残基又は少なくとも３９５個のアミノ酸残基を含んでいる。別の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号６又はその成熟ポリペプチド配列の断片であって、ここで、断片には、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性がある。一態様において、前記断片は、配列番号６の少なくとも３３７個のアミノ酸残基、例えば、少なくとも３５７個のアミノ酸残基又は少なくとも３７７個のアミノ酸残基を含んでいる。
【００７４】
前記ポリペプチドは、一方のポリペプチドの一部がもう一方のポリペプチドの一部のＮ末端又はＣ末端で融合されているハイブリッドポリペプチドであってもよい。
【００７５】
前記ポリペプチドは、別のポリペプチドが本発明のポリペプチドのＮ末端又はＣ末端で融合されている、融合ポリペプチド又は切断可能な融合ポリペプチドであってもよい。融合ポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチドに別のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを融合することによって製造される。融合ポリペプチドを製造する技術は、当該技術分野で公知であり、そしてそれらがフレーム内に存在し、且つ融合ポリペプチドの発現が同じ（単数若しくは複数の）プロモーター及びターミネーターで制御されるようにポリペプチドをコードするコード配列を連結することを含む。融合タンパク質はまた、融合が翻訳後に作製されるインテイン技術を使用して構築されてもよい（Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583；Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779）。
【００７６】
融合ポリペプチドはさらに、２つのポリペプチドの間の開裂部位を含んで成る。融合タンパク質の分泌時に、前記部位は、２つのポリペプチドを放出しながら開裂される。開裂部位の例には、これだけに限定されるものではないが、以下の文献に開示されている部位が含まれる：Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576；Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251；Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488- 3493；Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503；及びContreras et al., 1991 , Biotechnology 9: 378-381；Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512；Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987；Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248；及びStevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48。
【００７７】
Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有するポリペプチドの供給源
本発明のＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有するポリペプチド（例えば、配列番号２、４、若しくは６のポリペプチド、又はその成熟ポリペプチド配列）は、任意の属の微生物から得てもよい。本発明の目的において、ある供給源に関連して本明細書中で使用される用語「から得られる」は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、その供給源により、又はその供給源からのポリヌクレオチドが挿入された菌株により産生されることを意味するものとする。一態様において、ある供給源から得られるポリペプチドは、細胞外に分泌される。
【００７８】
前記ポリペプチドは細菌のポリペプチドであってもよい。例えば、前記ポリペプチドは、グラムの陰性の細菌のポリペプチド、例えば、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する、グラム陽性細菌のポリペプチド、例えば、バチルス（Bacillus）、クロストリジウム（Clostridium）、エンテロコッカス（Enterococcus）、ゲオバチルス（Geobacillus）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、又はオセアノバチルス（Oceanobacillus）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、若しくはストレプトミセス（Streptomyces）のポリペプチドなど、又はグラム陰性細菌のポリペプチド、例えば、カンピロバクター（Campylobacter）、Ｅ．コリ（E. coli）、フソバクテリウム（Fusobacterium）、ヘリコバクター（Helicobacter）、イリオバクター（llyobacter）、ナイセリア（Neisseria）、シュードモナス（Pseudomonas）、サルモネラ（Salmonella）、若しくはウレアプラズマ（Ureaplasma）のポリペプチドでもよい。
【００７９】
一態様において、前記ポリペプチドは、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・クラウシイ（Bacillus clausii）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・フィルムス（Bacillus firmus）、バチルス・ラウタス（Bacillus lautus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）のポリペプチドである。
【００８０】
別の態様において、前記ポリペプチドは、ストレプトコッカス・エキシミリス（Streptococcus equisimilis）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、又はストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）亜種ズーエピデミクス（Zooepidemicus）のポリペプチドである。
【００８１】
別の態様において、前記ポリペプチドは、ストレプトミセス・アクロモゲネス（Streptomyces achromogenes）、ストレプトミセス・アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトミセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトミセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、又はストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）のポリペプチドである。
【００８２】
前記ポリペプチドはまた、真菌ポリペプチドであってもよい。例えば、前記ポリペプチドは、酵母ポリペプチド、例えば、カンジダ（Candida）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ピキア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、又はヤロウィア（Yarrowia）のポリペプチドなど、あるいは、糸状菌ポリペプチド、例えば、アクレモニウム（Acremonium）、アガリクス（Agaricus）、アルテルナリア（Alternarta）、アスペルギルス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、ボトリオスペリア（Botryospaeria）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、ケトミジウム（Chaetomidium）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、クラビセプス（Claviceps）、コクリオボルス（Cochliobolus）、コプリノプシス（Coprinopsis）、コプトテルメス（Coptotermes）、コリナスカス（Corynascus）、クリホネクトリア（Cryphonectria）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、ディプロジア（Diplodia）、エキシジア（Exidia）、フィリバシジウム（Filibasidium）、フザリウム（Fusarium）、ジベレラ（Gibberella）、ホロマスチゴトイデス（Holomastigotoides）、フミコーラ（Humicola）、イルペックス（Irpex）、レンチヌラ（Lentinula）、レプトスペリア（Leptospaeria）、マグナポルテ（Magnaporthe）、メラノカルプス（Melanocarpus）、メリピルス（Meripilus）、ムコール（Mucor）、ミセリフトラ（Myceliophthora）、ネオカリマスティクス（Neocallimastix）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、フェネロケテ（Phanerochaete）、ピロミセス（Piromyces）、ポイトラシア（Poitrasia）、シュードプレクタニア（Pseudoplectania）、シュードトリコニムファ（Pseudotrichonympha）、リゾムコール（Rhizomucor）、シゾフィルム（Schizophyllum）、シタリジウム（Scytalidium）、タラロミセス（Talaromyces）、サーモアスクス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トリコデルマ（Trichoderma）、トリコフェア（Trichophaea）、ベルチシリウム（Verticillium）、ボルバリエラ（Volvariella）、又はキシラリア（Xylaria）のポリペプチドなどでもよい。
【００８３】
別の態様において、前記ポリペプチドは、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ジアスタチクス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロミセス・ダグラシイ（Saccharomyces douglasii）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）、又はサッカロミセス・オビホルミス（Saccharomyces oviformis）のポリペプチドである。
【００８４】
別の態様において、前記ポリペプチドは、アクレモニウム・セルロリチクス（Acremonium cellulolyticus）、アスペルギルス・アクレアタス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フェチヅス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニーヅランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、クリソスポリウム・イノプス（Chrysosporium inops）、クリソスポリウム・ケラチノフィルム（Chrysosporium keratinophilum）、クリソスポリウム・ルクノウェンセ（Chrysosporium lucknowense）、クリソスポリウム・メルダリウム（Chrysosporium merdarium）、クリソスポリウム・パニコラ（Chrysosporium pannicola）、クリソスポリウム・クイーンスランヂクム（Chrysosporium queenslandicum）、クリソスポリウム・トロピクム（Chrysosporium tropicum）、クリソスポリウム・ゾナツム（Chrysosporium zonatum）、フザリウム・バクトリジオイデス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フザリウム・クルークウェレンセ（Fusartum crookwellense）、フザリウム・クルモルム（Fusartum culmorum）、フザリウム・グラミネアルム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミヌム（Fusarium graminum）、フザリウム・ヘテロスポルム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネグンジ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・レチクラツム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロセウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サンブシヌム（Fusartum sambucinum）、フザリウム・サルコクロウム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・スルフレウム（Fusartum sulphureum）、フザリウム・トルロスム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トリコテシオイデス（Fusarium trichothecioides）、フザリウム・ベエナツム（Fusarium venenatum）、フミコーラ・グリセア（Humicola grisea）、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコーラ・ランギノーサ（Humicola lanuginosa）、イルペックス・ラクテウス（Irpex lacteus）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、ミセリフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ペニシリウム・フニクロスム（Penicillium funiculosum）、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Penicillium purpurogenum）、ファネロケテ・クリソスポルツム（Phanerochaete chrysosportum）、チエラビア・アクロマチカ（Thielavia achromatica）、チエラビア・アルボミセス（Thielavia albomyces）、チエラビア・アルボピロサ（Thielavia albopilosa）、チエラビア・アウストラレインシス（Thielavia australeinsis）、チエラビア・フィメティ（Thielavia fimeti）、チエラビア・ミクロスポラ（Thielavia microspora）、チエラビア・オビスポラ（Thielavia ovispora）、チエラビア・ペルビアナ（Thielavia peruviana）、チエラビア・セトーサ（Thielavia setosa）、チエラビア・スペデドニウム（Thielavia spededonium）、チエラビア・スブテルモフィラ（Thielavia subthermophila）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギイ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）のポリペプチドである。
【００８５】
別の態様において、前記ポリペプチドは、アスペルギルス属のポリペプチド、例えば、アスペルギルス・アクレアツスのポリペプチド、例えば、Ｅ．コリＮＲＲＬ Ｂ‐５０４００、Ｅ．コリＮＲＲＬ Ｂ‐５０３８８、又はＥ．コリＮＲＲＬ Ｂ‐５０４０１からのアスペルギルス・アクレアツスのポリペプチドなどである。
【００８６】
別の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２又は配列番号４のアスペルギルス・アクレアツスのポリペプチドである。別の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２のアスペルギルス・アクレアツスのポリペプチドである。別の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号４のアスペルギルス・アクレアツスのポリペプチドである。
【００８７】
当然のことながら、前述の種について、本発明は、これらが知られている種名にかかわらず、完全又は不完全状態、及び他の分類学上の同等物、例えば、アナモルフを包含する。当業者は、適当な同等物の同一性を容易に認識する。
【００８８】
これらの種の株は、多くの菌株保存機関、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）（ＤＳＭ）、オランダ微生物株保存センター（Centraalbureau voor Schimmelcultures）（ＣＢＳ）、アグリカルチュラル・リサーチ・サービス・パテント・カルチャー・コレクション（Agricultural Research Service Patent Culture Collection）、ノーザン・リジョナル・リサーチ・センター（Northern Regional Research Center）（ＮＲＲＬ）で公に容易に入手できる。
【００８９】
前記ポリペプチドは、同定され、そして前記プローブを使用して自然から単離された微生物を含む他の供給源（例えば、土壌、コンポスト、水など）から得られる。自然の環境から微生物を単離する技術は、当該分野で周知である。次に、そのような微生物のゲノムもしくはｃＤＮＡライブラリーを同様にスクリーニングすることにより、ポリヌクレオチドが得られる。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、（単数若しくは複数の）プローブを用いていったん検出されると、当業者に公知の方法を使用してポリヌクレオチドが単離又はクローン化される（例えば、Sambrook et al., 1989、前掲参照）。
【００９０】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド（例えば、配列番号２、４又は６に関連する任意の態様のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド）にも関する。
【００９１】
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離又はクローン化するのに使用される方法は当該分野で公知であり、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、又はこれらの組合せを含む。そのようなゲノムＤＮＡからのポリヌクレオチドのクローニングは、例えば公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は発現ライブラリーの抗体スクリーニングを使用して、共通の構造的特徴を有するクローン化されたＤＮＡフラグメントを検出することにより行われる。例えば、Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New Yorkを参照。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、連結活性化転写（ＬＡＴ）、及びポリヌクレオチドベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）のような他の核酸増幅法も使用される。ポリヌクレオチドは、アスペルギルス属（例えば、アスペルギルス・アクレアツス）の株又は他のもしくは関連する微生物からクローン化され、従って例えば、ヌクレオチド配列のポリペプチドをコードする領域の対立遺伝子変異体もしくは種間変異体でもよい。
【００９２】
本発明はまた、配列番号１、３、若しくは５、又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含んで成るか又はそれから成る単離されたポリヌクレオチドに関連しており、そしてそれは、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有するポリペプチドをコードする。
【００９３】
一態様において、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含んで成るか又はそれから成り、そしてそれは、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有するポリペプチドをコードする。
【００９４】
一態様において、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号３又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含んで成るか又はそれから成り、そしてそれは、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有するポリペプチドをコードする。
【００９５】
一態様において、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号５又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含んで成るか又はそれから成り、そしてそれは、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有するポリペプチドをコードする。
【００９６】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾は、このポリペプチドと実質的に類似のポリペプチドの合成に必要なことがある。ポリペプチドと「実質的に類似」という用語は、ポリペプチドの非天然型を意味する。これらのポリペプチドは、ある工学作成的意味で、天然供給源から単離されるポリペプチドとは異なり、例えば比活性、熱安定性、最適ｐＨなどが異なる変異体である。変異体は、配列番号１、３、又は５の成熟ポリペプチドコード配列として提示されるポリヌクレオチド、例えばその部分配列に基づいて、及び／又はポリペプチドのアミノ酸配列に変化を与えないが、酵素の産生を目的とした宿主生物のコドン使用に対応するヌクレオチド置換の導入により、又は異なるアミノ酸配列を与えるヌクレオチド置換の導入により、構築される。ヌクレオチド置換の一般的説明については、例えばFord et al., 1991, Protein Expression and Purification 2:95-107を参照。
【００９７】
本発明はまた、本明細書中に規定のように、非常に低ストリンジェンシー条件下で、低ストリンジェンシー条件下で、中ストリンジェンシー条件下で、中〜高ストリンジェンシー条件下で、高ストリンジェンシー条件下で、又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号１、３、若しくは５；配列番号１、３、若しくは５の成熟ポリペプチドコード配列；その完全長相補鎖；又は前記配列の対立遺伝子変異体若しくは部分配列にハイブリダイズする本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドにも関する（Sambrook et al., 1989、前掲）。
【００９８】
一態様において、前記単離されたポリヌクレオチドは、本明細書中に規定のように、非常に低ストリンジェンシー条件下で、低ストリンジェンシー条件下で、中ストリンジェンシー条件下で、中〜高ストリンジェンシー条件下で、高ストリンジェンシー条件下で、又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号１；配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列；その完全長相補鎖；又は前記配列の対立遺伝子変異体若しくは部分配列にハイブリダイズする（Sambrook et al., 1989、前掲）。
【００９９】
一態様において、前記単離されたポリヌクレオチドは、本明細書中に規定のように、非常に低ストリンジェンシー条件下で、低ストリンジェンシー条件下で、中ストリンジェンシー条件下で、中〜高ストリンジェンシー条件下で、高ストリンジェンシー条件下で、又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号１；配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列；その完全長相補鎖；又は前記配列の対立遺伝子変異体若しくは部分配列にハイブリダイズする（Sambrook et al., 1989、前掲）。
【０１００】
一態様において、前記単離されたポリヌクレオチドは、本明細書中に規定のように、非常に低ストリンジェンシー条件下で、低ストリンジェンシー条件下で、中ストリンジェンシー条件下で、中〜高ストリンジェンシー条件下で、高ストリンジェンシー条件下で、又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号１；配列番号５の成熟ポリペプチドコード配列；その完全長相補鎖；又は前記配列の対立遺伝子変異体若しくは部分配列にハイブリダイズする（Sambrook et al., 1989、前掲）。
【０１０１】
一態様において、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列、又はＥ．コリＮＲＲＬ Ｂ‐５０４００内に含まれるプラスミドｐＡａＣ４Ｔ７３７内に含まれる配列、あるいは、例えば、配列番号１の第２０５〜１１９４若しくは第１８４〜１１９４ヌクレオチドから成るポリヌクレオチドなどのＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する配列番号２の断片（例えば、配列番号２の第６９〜３９７若しくは第６２〜３９７アミノ酸）をコードする配列番号１の部分配列を含んで成るか又はそれから成る。
【０１０２】
別の態様において、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３、配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列、又はＥ．コリＮＲＲＬ Ｂ‐５０３８８内に含まれるプラスミドｐＡａＣ４Ｔ５２１内に含まれる配列、あるいは、例えば、配列番号３の第５２〜１２５７ヌクレオチドから成るポリヌクレオチドなどのＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する配列番号４の断片（例えば、配列番号４の第１８〜４１８アミノ酸）をコードする配列番号３の部分配列を含んで成るか又はそれから成る。
【０１０３】
別の態様において、前記ポリヌクレオチドは、配列番号５、配列番号５の成熟ポリペプチドコード配列、又はＥ．コリＮＲＲＬ Ｂ‐５０４０１内に含まれるプラスミドｐＡａＭＡＴ７３７内に含まれる配列、あるいは、例えば、配列番号５の第２０５〜１１９４ヌクレオチドから成るポリヌクレオチドなどのＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する配列番号６の断片（例えば、配列番号６の第６９〜３９７アミノ酸）をコードする配列番号５の部分配列を含んで成るか又はそれから成る。
【０１０４】
配列番号１、３、若しくは５のポリヌクレオチド、又はその部分配列；並びに配列番号２、４、若しくは６のアミノ酸配列、又はその断片は；当該技術分野で周知の方法に従って異なる属又は種の株からＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを同定し、そしてクローニングするための核酸プローブを設計するのに使用できる。特に、かかるプローブは、その中の対応遺伝子を同定し、そして単離するために、注目の属又は種のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションと、それに続く標準的なサザンブロッティング手順に使用できる。かかるプローブは、全配列に比べて長さがかなり短いが、少なくとも１４ヌクレオチド、例えば、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３５ヌクレオチド、又は少なくとも７０ヌクレオチドでなければならない。好ましくは、核酸プローブは、長さが少なくとも１００ヌクレオチド、例えば、長さが少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、又は少なくとも９００ヌクレオチドである。ＤＮＡプローブとＲＮＡプローブの両方が使用できる。前記プローブは、対応遺伝子を検出するために通常（例えば、32Ｐ、3Ｈ、35Ｓ、ビオチン、又はアビジンなどにより）標識される。かかるプローブは本発明に包含される。
【０１０５】
そういった他の菌株から調製されたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーは、先に記載したプローブがハイブリダイズし、且つＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡについてスクリーニングされ得る。こうした他の菌株からのゲノムＤＮＡ又は他のＤＮＡは、アガロース若しくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、又は他の分離技法によって分離され得る。ライブラリからのＤＮＡ又は分離されたＤＮＡは、ニトロセルロース又は他の好適な担体材料に移され、そしてその上に固定され得る。配列番号１、３、若しくは５、又はその部分配列と相同であるクローン又はＤＮＡを同定するために、好ましくは、前記担体材料はサザンブロットで使用される。
【０１０６】
本発明の目的において、ハイブリダイゼーションとは、非常に低い〜非常に高いストリンジェンシー条件下で、ポリヌクレオチドが配列番号１、３、若しくは５；配列番号１、３、若しくは５の成熟ポリペプチドコード配列；その完全長相補鎖；又は前記配列の部分配列に相当する標識核酸プローブとハイブリダイズすることを意味する。これらの条件下で、核酸プローブがハイブリッドする分子は、例えば、エックス線フィルムを使用することで検出できる。
【０１０７】
一態様において、前記核酸プローブは、配列番号１、３又は５である。一態様において、前記核酸プローブは、配列番号１、３又は５の成熟ポリペプチドコード配列である。別の態様において、前記核酸プローブは、配列番号２、４、若しくは６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はその断片である。別の態様において、前記核酸プローブは配列番号１である。別の態様において、前記核酸プローブは配列番号３である。別の態様において、前記核酸プローブは配列番号５である。別の態様において、前記核酸プローブは、Ｅ．コリＮＲＲＬ Ｂ‐５０４００内に含まれるプラスミドｐＡａＣ４Ｔ７３７に含まれるポリヌクレオチドであって、ここで、前記ポリヌクレオチドはＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有するポリペプチドをコードする。別の態様において、前記核酸プローブは、Ｅ．コリＮＲＲＬ Ｂ‐５０４００内に含まれるプラスミドｐＡａＣ４Ｔ７３７内に含まれる成熟ポリペプチドコード配列であって、ここで、前記ポリペプチドにはＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性がある。別の態様において、前記核酸プローブは、Ｅ．コリＮＲＲＬ Ｂ‐５０３８８内に含まれるプラスミドｐＡａＣ４Ｔ５２１内に含まれるポリヌクレオチドであって、ここで、前記ポリヌクレオチドはＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有するポリペプチドをコードする。別の態様において、前記核酸プローブは、Ｅ．コリＮＲＲＬ Ｂ‐５０３８８内に含まれるプラスミドｐＡａＣ４Ｔ５２１内に含まれる成熟ポリペプチドコード配列であって、ここで、前記ポリペプチドにはＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性がある。別の態様において、前記核酸プローブは、Ｅ．コリＮＲＲＬ Ｂ‐５０４０１内に含まれるプラスミドｐＡａＭＡＴ７３７内に含まれるポリヌクレオチドであって、ここで、前記ポリヌクレオチドはＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有するポリペプチドをコードする。別の態様において、前記核酸プローブは、Ｅ．コリＮＲＲＬ Ｂ‐５０４０１内に含まれるプラスミドｐＡａＭＡＴ７３７内に含まれる成熟ポリペプチドコード配列であって、ここで、前記ポリペプチドにはＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性がある。
【０１０８】
長さが少なくとも１００ヌクレオチドの長いプローブに関して、最適には、非常に低い〜非常に高いストリンジェンシーは、５×ＳＳＰＥ、０．３％のＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌの剪断、変性サケ精子ＤＮＡ、並びに非常に低い及び低ストリンジェンシーでは２５％のホルムアミド、中程度及び中〜高ストリンジェンシーでは３５％のホルムアミド、又は高い及び非常に高いストリンジェンシーでは５０％のホルムアミドのいずれかの中、４２℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションと、それに続く１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング手順と規定される。担体材料は、最後に、４５℃（非常に低ストリンジェンシー）にて、５０℃（低ストリンジェンシー）にて、５５℃（中ストリンジェンシー）にて、６０℃（中〜高ストリンジェンシー）にて、６５℃（高ストリンジェンシー）にて、及び７０℃（非常に高いストリンジェンシー）にて、１５分間、２×ＳＳＣ、０．２％のＳＤＳを使用してそれぞれ３回洗浄される。
【０１０９】
長さが約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの短いプローブに関しては、ストリンジェンシー条件は、最適には、１ｍｌあたり０．９ＭのＮａＣｌ、０．０９ＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．６、６ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＮＰ‐４０、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１ｍＭのリン酸一ナトリウム、０．１ｍＭのＡＴＰ、及び０．２ｍｇの酵母ＲＮＡ中、Bolton and McCarthy（1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:1390）による計算を使用した算出Ｔmを下回る約５℃〜約１０℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションと、それに続く１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング手順と規定される。担体材料は、最後に、算出Ｔmを下回る５℃〜１０℃にて、６×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳ中、１５分間で１回、そしてそれぞれ６×ＳＣＣを使用して１５分間で２回洗浄される。
【０１１０】
核酸構築物
本発明はまた、制御配列に適合する条件下で適切な宿主細胞中で、コード配列の発現を指示する１つ又は複数（例えば、２個、数個）の制御配列に機能できる形で結合した、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。本発明はまた、組換え宿主細胞、並びに（単数若しくは複数の）制御配列に適合する条件下で好適な宿主細胞内で発現を指示する１若しくは複数の制御配列に作用可能に連結された、本明細書中に記載のＣ４‐ジカルボン酸輸送体（及び／又はリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、又は本明細書中に記載のピルビン酸カルボキシラーゼ）をコードする異種ポリヌクレオチドを含んで成る核酸の利用方法も包含する。かかる核酸構築物は、本明細書中に記載の任意の宿主細胞及び方法で使用できる。
【０１１１】
本明細書中に記載のポリヌクレオチドは、種々の方法で操作されてポリペプチドを発現させる。発現ベクターによっては、ベクターへの挿入の前にポリヌクレオチドの操作が好ましいか又は必要なことがある。組換えＤＮＡ法を使用してポリヌクレオチドを修飾する方法は、当該分野で周知である。
【０１１２】
制御配列は、プロモーター配列、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞により認識されるポリヌクレオチドでもよい。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を仲介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、選択された宿主細胞（変異プロモーター、末端切断型プロモーター、及びハイブリッドプロモーターを含む）中で転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであり、宿主細胞に対して同種又は異種の細胞外もしくは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。
【０１１３】
本明細書中に記載のそれぞれのポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドにとって外来性であるプロモーターを作用可能に連結されていてもよい。例えば、一態様において、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体をコードする異種ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドにとって外来性であるプロモーターに作用可能に連結されている。別の態様において、リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする異種ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドにとって外来性であるプロモーターに作用可能に連結されている。別の態様において、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドにとって外来性であるプロモーターに作用可能に連結されている。
【０１１４】
細菌宿主細胞中で本発明の核酸構築物の転写を指示するための適切なプロモーターの例は、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）αアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）マルトース生成性アミラーゼ（ａｍｙＭ）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子、Ｅ．コリ（E. coli）ｌａｃオペロン、ストレプトミセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、及び原核生物ベータ−ラクタマーゼ遺伝子（Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731）、並びにｔａｃプロモーター（DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25）から得られるプロモーターである。さらなるプロモーターは、「組換え細菌からの有用なタンパク質」、Gilbert et al., 1980, Scientific American, 242: 74-94；及びSambrook et al., 1989、前掲に記載されている。
【０１１５】
糸状菌宿主細胞中で本発明の核酸構築物の転写を指示するための適切なプロモーターの例は、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）アセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）もしくはアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）アルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）トリオースリン酸イソメラーゼ、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ（ＷＯ９６／００７８７）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）アミログルコシダーゼ（ＷＯ００／５６９００）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）Ｄａｒｉａ（ＷＯ００／５６９００）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）Ｑｕｉｎｎ（ＷＯ００／５６９００）、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）ベータグルコシダーゼ、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）セロビオヒドロラーゼII、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼＩ、トリトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼII、トリトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼIII、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼIV、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼＶ，トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）キシラナーゼII、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）ベータ−キシロシダーゼの遺伝子から得られるプロモーター、並びにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（非翻訳リーダーがアスペルギルス属のトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子からの非翻訳リーダーによって置き換えられたアスペルギルス属の中性α‐アミラーゼをコードする遺伝子からの改変プロモーター；制限されることのない例には、非翻訳リーダーがアスペルギルス・ニデュランス又はアスペルギルス・オリゼのトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子からの非翻訳リーダーによって置き換えられたアスペルギルス・ニガーの中性α‐アミラーゼをコードする遺伝子からの改変プロモーターが含まれる）；及びその変異体、末端切断型、及びハイブリッドプロモーターである。
【０１１６】
酵母宿主において有用なプロモーターは、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メタロチオネイン（ＣＵＰ１）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）３−ホスホグリセレートキナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞の他の有用なプロモーターは、Romanos et al., 1992, Yeast 8:423-488に記載されている。
【０１１７】
制御配列はまた、宿主細胞により認識されて転写を停止させる適切な転写停止配列でもよい。停止配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’末端に機能できる形で結合している。選択された宿主細胞中で機能する任意のターミネーターが本発明で使用される。
【０１１８】
糸状菌宿主細胞の好適なターミネーターは、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）アントラニレートシンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）α−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）ＴＡＫＡアミラーゼ、及びフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
【０１１９】
酵母宿主細胞の好適なターミネーターは、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）チトクロムＣ（ＣＹＣ１）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）グリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞の他の有用なターミネーターは、Romanos et al., 1992, 前述、に記載されている。
【０１２０】
制御配列はまた、転写物が宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域であるとき、適切なリーダー配列でもよい。リーダー配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’末端に機能できる形で結合している。選択された宿主細胞中で機能する任意のリーダー配列が使用され得る。
【０１２１】
糸状菌宿主細胞の好適なリーダーは、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）ＴＡＫＡアミラーゼ、及びアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。
【０１２２】
酵母宿主細胞の適切なリーダーは、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）３−ホスホグリセレートキナーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）α因子、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【０１２３】
制御配列はまた、ポリヌクレオチドの３’末端に機能できる形で結合した配列であり、転写されると、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして、宿主細胞により認識されるポリアデニル化配列でもよい。最適な宿主細胞内で機能する任意のポリアデニル化配列が使用されてもよい。
【０１２４】
糸状菌宿主細胞の好適なポリアデニル化配列は、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）アントラニレートシンターゼ、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ、及びアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）α−グルコシダーゼの遺伝子から得られる。
【０１２５】
酵母宿主細胞の適切なポリアデニル化配列は、Guo and Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15:5983-5990に記載されている。
【０１２６】
制御配列はまた、ポリペプチドのＮ末端に結合したシグナルペプチドをコードし、ポリペプチドを細胞の分泌経路に向けるシグナルペプチドコード領域でもよい。ポリヌクレオチドのコード配列の５’末端は、翻訳読みとり枠中で、ポリペプチドをコードするコード配列のセグメントに天然で結合しているシグナルペプチドコード配列を本来含有する。あるいはコード配列の５’末端は、コード配列に対して異種であるシグナルペプチドコード配列を含有してもよい。この異種シグナルペプチドコード配列は、コード配列がシグナルペプチドコード配列を天然に含有しない場合、必要となることがある。あるいは異種シグナルペプチドコード配列は、ポリペプチドの分泌を増強するために、天然のシグナルペプチドコード配列を単に置換してもよい。しかし選択された宿主細胞の分泌経路へ発現されたポリペプチドを指示する任意のシグナルペプチドコード配列が、使用され得る。
【０１２７】
細菌宿主細胞の有効なシグナルペプチドコード配列は、バチルス（Bacillus）ＮＣＩＢ １１８３７マルトース生成性アミラーゼ、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）ズブチリシン（subtilisin）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）ベータ−ラクタマーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）α−アミラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｆＳ、ｎｐｒＭ）、及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。さらなるシグナルペプチドは、Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57:109-137に記載されている。
【０１２８】
糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード配列は、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）ＴＡＫＡアミラーゼ、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）セルラーゼ、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）エンドグルカナーゼＶ、フミコーラ・ラヌギノーサ（Humicola lanuginosa）リパーゼ、及びリゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。
【０１２９】
酵母宿主細胞の有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）α因子及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）インベルターゼの遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード配列は、Romanos et al., 1992、前掲、に記載されている。
【０１３０】
制御配列はまた、ポリペプチドのＮ末端に位置するプロペプチドをコードするプロペプチドコード配列でもよい。生じるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又はある場合にはチモーゲン）として知られている。プロポリペプチドは一般に不活性であり、プロポリペプチドから、プロペプチドの触媒性もしくは自己触媒性切断により活性ポリペプチドに変換することができる。プロペプチドコード配列は、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）アルカリ性ホスファターゼ（ａｐｒＥ）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophilia）ラッカーゼ（ＷＯ９５／３３８３６）、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）α因子の遺伝子から得られる。
【０１３１】
シグナルペプチドとプロペプチド配列との両方がポリペプチドのＮ末端に存在する場合、プロペプチド配列はポリペプチドのＮ末端の隣に位置し、シグナルペプチド配列はプロペプチド配列のＮ末端の隣に位置する。
【０１３２】
宿主細胞の増殖に対して、ポリペプチドの発現を制御を可能にする制御配列を付加することが好ましいことがある。制御系の例は、化学的又は物理的刺激（制御化合物の存在を含む）に応答して遺伝子発現をオン又はオフさせるものである。原核細胞系の制御系には、ｌａｃ、ｔａｃ、及びｔｒｐオペレーター系がある。酵母ではＡＤＨ２系又はＧＡＬ１系が使用される。
【０１３３】
糸状菌では、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼプロモーター、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）ＴＡＫＡ α−アミラーゼプロモーター、及びアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）グルコアミラーゼプロモーターが、使用され得る。制御配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核生物系では制御配列には、メソトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、及び重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子がある。これらの場合に、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは制御配列に機能できる形で結合しているであろう。
【０１３４】
発現ベクター
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、プロモーター、及び転写と翻訳停止シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。本発明はまた、組換え宿主細胞、そしてＣ４‐ジカルボン酸輸送体（及び／又はリンゴ酸デヒドロゲナーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼ）をコードする異種ポリヌクレオチド；並びにプロモーター；及び転写と翻訳停止シグナルを含んで成る遺伝子組み換え発現ベクターの利用方法を包含する。かかる遺伝子組み換え発現ベクターは、本明細書中に記載の任意の宿主細胞及び方法に使用され得る。
【０１３５】
本明細書に記載の種々のヌクレオチドと制御配列は連結されて組換え発現ベクターが作成され、これは、１つ又は複数（例えば、２個、数個）の便利な認識部位を含有して、そのような部位で、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入又は置換を可能にする。あるいは、前記ポリヌクレオチドは、この配列を含むポリヌクレオチド又は核酸構築物を、発現用の適切なベクターに挿入することにより発現される。発現ベクターの作成においてコード配列は、発現用の適切な制御配列と機能できる形で結合するように、ベクター中に位置する。
【０１３６】
組換え発現ベクターは、便利に組換えＤＮＡ法を受けることができ、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことができる任意のベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）でもよい。ベクターの選択は典型的には、ベクターが導入される宿主細胞とベクターとの適合性に依存する。ベクターは線状プラスミドでも閉じた環状プラスミドでもよい。
【０１３７】
一態様において、本明細書中に記載したＣ４‐ジカルボン酸輸送体、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、及び／又はピルビン酸カルボキシラーゼをコードする各ポリヌクレオチドは、独立したベクトル上に含まれる。一態様において、前記ポリヌクレオチドのうちの少なくとも２が、一つのベクター上に含まれる。一態様において、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、及びピルビン酸カルボキシラーゼをコードするすべてのポリヌクレオチドが、一つベクター上に含まれる。
【０１３８】
ベクターは、自律的複製性ベクター（すなわち、染色体外物質として存在し、その複製が染色体複製に依存しない）、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、又は人工染色体でもよい。ベクターは自己複製を確実にする手段を含む。あるいはベクターは、宿主細胞中に導入された時に、ゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれている染色体とともに複製されるものでもよい。さらに宿主細胞のゲノムに総ＤＮＡを一緒に含有する、単一のベクターもしくはプラスミド又は２つもしくはそれ以上のベクターもしくはプラスミドもしくはトランスポゾンが使用される。
【０１３９】
前記ベクターは、好ましくは、形質転換、トランスフェクション、形質導入などを受けた細胞の容易な選択を可能にする１つ又は複数（例えば、２個、数個）の選択マーカーを含有する。選択マーカーは、その生成物が、殺生物剤耐性もしくはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体への原栄養性を与える遺伝子である。
【０１４０】
細菌性選択マーカーの例は、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）もしくはバチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）のｄａｌ遺伝子、又は抗生物質耐性（例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、又はテトラサイクリン耐性）を付与するマーカーである。酵母宿主細胞の適切なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、及びＵＲＡ３である。糸状菌宿主細胞で使用される選択マーカーには、特に限定されないが、ａｍｄＳ（アセトアミドダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイル転移酵素）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニル転移酵素）、及びｔｒｐＣ（アントラニレートシンターゼ）、並びにこれらの同等物がある。アスペルギルス（Aspergillus）細胞での使用に好適なものは、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）又はアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）のａｍｄＳ及びｐｙｒＧ遺伝子、及びストレプトミセス・ヒグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）のｂａｒ遺伝子である。
【０１４１】
前記ベクターは、好ましくは、宿主細胞ゲノムへのベクターの組み込み、又は遺伝子に依存しない細胞中のベクターの自律複製を可能にする要素を含有する。
【０１４２】
宿主細胞ゲノムへの組み込みのために、ベクターは、相同的もしくは非相同的組換えによるゲノムへの組み込みのために、ポリペプチド又はベクターの他の要素をコードするポリヌクレオチドの配列に依存する。あるいは、ベクターは、（単数若しくは複数の）染色体中の（単数若しくは複数の）正確な位置で宿主細胞のゲノムへの相同的組換えによる組み込みを指示する追加のポリヌクレオチドを含んでよい。正確な位置での組み込み確率を上げるために、組み込み要素は十分な数の核酸、例えば１００〜１０，０００塩基対、４００〜１０，０００塩基対、そして８００〜１０，０００塩基対を有し、これは、相同的組換えの確率を上昇させるために、対応する標的配列と高度の配列同一性を有する。組み込み要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同的である任意の配列である。さらに組み込み要素は、非コード又はコードポリヌクレオチドである。一方ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノム中に組み込まれてもよい。
【０１４３】
自律複製のためにベクターは、ベクターが問題の宿主細胞中に自律的に複製することを可能にする複製開始点をさらに含んでよい。複製開始点は、細胞中で機能する自律的複製を仲介する任意のプラスミドレプリケータでもよい。本明細書において用語「複製開始点」又は「プラスミドレプリケータ」は、プラスミド又はベクターがインビボで複製することを可能にするポリヌクレオチドを意味する。
【０１４４】
細菌性複製開始点の例は、Ｅ．コリ（E. coli）中での複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、及びｐＡＣＹＣ１８４と、バチルス（Bacillus）中での複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０、及びｐＡＭβ１の複製開始点である。
【０１４５】
酵母宿主細胞で使用される複製開始点の例は、２ミクロン複製開始点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３との組合せ、及びＡＲＳ４とＣＥＮ６との組合せである。
【０１４６】
糸状菌細胞で有用な複製開始点の例は、ＡＭＡ１及びＡＮＳ１である（Gems et al., 1991, Gene 98:61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15:9163-9175; ＷＯ００／２４８８３）。ＡＭＡ１遺伝子の単離とこの遺伝子を含むプラスミド又はベクターの構築は、ＷＯ００／２４８８３に記載された方法に従って行われる。
【０１４７】
ポリペプチドの産生を上昇させるために、本発明のポリヌクレオチドの２つ以上のコピーを宿主細胞に挿入してもよい。ポリヌクレオチドのコピー数の上昇は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノムに組み込むか、又はポリヌクレオチドを有する増幅可能な選択マーカー遺伝子を含めることにより得ることができる（ここで、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、従ってポリヌクレオチドの追加のコピーを含む細胞は、適切な選択剤の存在下で細胞を培養することにより選択することができる）。
【０１４８】
前記の要素を連結して本発明の組換え発現ベクターを構築するのに使用される方法は、当業者に周知である（例えば、Sambrook et al., 1989、前掲を参照）。
【０１４９】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼとリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド
組換え宿主細胞とその使用方法の態様によって、宿主細胞はリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する。態様によって、宿主細胞はリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含んで成る。前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、本発明を実施するのに好適な任意のリンゴ酸デヒドロゲナーゼであってよい。一態様において、前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、宿主細胞のサイトゾル内に存在している酵素である。
【０１５０】
本明細書中に記載の組換え宿主細胞と方法の一態様において、前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、次の（ａ）配列番号１２又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するリンゴ酸デヒドロゲナーゼ；（ｂ）低ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１１又はその成熟ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号１１又はその成熟ポリペプチドコード配列のｃＤＮＡ配列、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の完全長相補鎖、にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ；（ｃ）（ｉｖ）配列番号１１又はその成熟ポリペプチドコード配列、（ｖ）配列番号１１又はその成熟ポリペプチドコード配列のｃＤＮＡ配列、あるいは（ｖｉ）（ｉｖ）又は（ｖ）の完全長相補鎖、と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ；（ｄ）配列番号１２又はその成熟ポリペプチド配列の１若しくは複数（例えば、２個、数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成るリンゴ酸デヒドロゲナーゼ変異体；並びに（ｅ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリペプチドの断片である。
【０１５１】
一態様において、前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、配列番号１２又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るか又はそれから成る。一態様において、前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、配列番号１２又はその成熟ポリペプチド配列と１０個未満のアミノ酸、例えば、５つ未満のアミノ酸、４つ未満のアミノ酸、３つ未満のアミノ酸、２つ未満のアミノ酸、又は１つのアミノ酸しか異ならないアミノ酸配列を含んで成る。
【０１５２】
一態様において、リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、配列番号１２のアミノ酸配列、配列番号１２の成熟ポリペプチド配列、その対立遺伝子変異体、又はリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する、前記配列の断片を含んで成るか又はそれから成る。別の態様において、前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、配列番号１２のアミノ酸配列を含んで成るか又はそれから成る。別の態様において、前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、配列番号１２の成熟ポリペプチド配列を含んで成るか又はそれから成る。別の態様において、前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、配列番号１２の第１〜３３０アミノ酸を含んで成るか又はそれから成る。
【０１５３】
一態様において、前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば、中ストリンジェンシー条件下で、中〜高ストリンジェンシー条件下で、高ストリンジェンシー条件下で、又は非常に高いストリンジェンシー条件の下で（ｉ）配列番号１１又はその成熟ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号１１又はその成熟ポリペプチドコード配列のｃＤＮＡ配列、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989、前掲）。
【０１５４】
一態様において、前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、（ｉｖ）配列番号１１又はその成熟ポリペプチドコード配列のｃＤＮＡ配列、（ｖ）配列番号１１又はその成熟ポリペプチドコード配列、あるいは（ｖｉ）（ｉｖ）又は（ｖ）の完全長相補鎖と少なくとも６５％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１５５】
一態様において、前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、配列番号１１又はその成熟ポリペプチドコード配列によってコードされる。一態様において、前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、配列番号１１によってコードされる。一態様において、前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、配列番号１１の成熟ポリペプチドコード配列によってコードされる。一態様において、前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、配列番号１１の部分配列によってコードされ、ここで、前記部分配列はリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。一態様において、前記部分配列は、配列番号１１の少なくとも８８５個のヌクレオチド、例えば、少なくとも９３０個のヌクレオチド又は少なくとも９７５個のヌクレオチドを含んでいる。
【０１５６】
一態様において、前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、先に記載したとおり、配列番号１２又はその成熟ポリペプチド配列の１若しくは複数（例えば２、数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体である。一態様において、前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、配列番号１２の１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体である。一態様において、前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、配列番号１２の成熟ポリペプチド配列の１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体である。態様によって、配列番号１２又はその成熟ポリペプチド配列のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入の総数が、１０個を超えない、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９個以下である。
【０１５７】
別の態様において、前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、配列番号１２又はその成熟ポリペプチド配列の断片であって、ここで、前記断片にはリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性がある。一態様において、前記断片は、配列番号１２の少なくとも２９５個のアミノ酸残基、例えば、少なくとも３１０個のアミノ酸残基又は少なくとも３２５個のアミノ酸残基を含んでいる。
【０１５８】
前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼはまた、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの対立遺伝子変異体又は人工変異体であってもよい。
【０１５９】
先に記載したように、前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼはまた、融合ポリペプチド又は切断可能な融合ポリペプチドを含んでいる。
【０１６０】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドの単離又はクローン化に使用される技術は、先に記載されている。
【０１６１】
配列番号１１のポリヌクレオチド；又はその部分配列；並びに配列番号１２のアミノ酸配列；又はその断片が、先に記載したように、異なる属又は種の株からリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡの同定、そしてクローン化のための核酸プローブを設計するのに使用されてもよい。そのようなプローブが本発明に包含される。その他の生物体から調製されたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーは、先に記載したように、先に記載したプローブにハイブリダイズし、且つリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡについてスクリーニングされてもよい。
【０１６２】
一態様において、前記核酸プローブは配列番号１１である。別の態様において、前記核酸プローブは、配列番号１１の成熟ポリペプチドコード配列である。別の態様において、前記核酸プローブは、配列番号１２をコードするポリヌクレオチド配列、その成熟ポリペプチド配列、又は前記配列の断片である。
【０１６３】
長さが少なくとも１００ヌクレオチドの長いプローブに関して、非常に低い〜非常に高いストリンジェンシー及び洗浄条件は、先に記載したとおり規定される。長さが約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの短いプローブに関しては、ストリンジェンシー及び洗浄条件は、先に記載したとおり規定される。
【０１６４】
前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、任意の属の微生物から得ることもできる。一態様において、前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、本明細書中に記載した微生物由来の細菌、酵母、又は糸状菌リンゴ酸デヒドロゲナーゼであってもよい。別の態様において、前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、アスペルギルス・オリゼのリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、例えば、配列番号１２のアスペルギルス・オリゼ・リンゴ酸デヒドロゲナーゼである。
【０１６５】
本発明を実施するのに使用できる他のリンゴ酸デヒドロゲナーゼには、これだけに限定されるものではないが、アスペルギルス・ニデュランス・リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＡＮ６７１７．１；SI MS et al., 2004, Mycol. Res. 108 : 853-857）；アスペルギルス・ニガー・リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ａｎ１６ｇ００１２０；Pel et al., 2007, Nature Biotechnology 25: 221 -231）；フィトホトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＰＩＴＧ１３６１４．１；Calcagno et al., 2009, Mycological Research 113: 771-781）；サッカロミセス・セレビシエ・リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＹＫＬ０８５Ｗ；McAlister-Henn and Thompson, 1987, J Bacteriol. 169: 5157-5166）；タラロマイセス・エメルソニー（Talaromyces emersonii）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＡＦ４３９９９６、ＡＦ４８７６８２；Maloney et al., 2004, Eur. J. Biochem. 271 : 3115- 3126）；及びウスチラゴ・マイデス（Ustilago maydis）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｕｍ００４０３、ｕｍ１１１６１；McCann and Snetselaar, 2008, Fungal Genetics and Biology 45: S77-S87）、配列番号２０のアスペルギルス・オリゼ・リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、（配列番号１９のポリヌクレオチド配列でコードされている；２０１０年８月２７日付で出願された「Methods for Improving Malic Acid Production in Filamentous Fungi」と題された米国特許出願第１２／８７０，５２３号を参照）、あるいは、その中のそれぞれの参考文献に記載のリンゴ酸デヒドロゲナーゼの任意の態様が含まれる。
【０１６６】
本発明は、先に記載したリンゴ酸デヒドロゲナーゼ・ポリペプチド配列及びポリヌクレオチド配列に適用される本明細書中に記載の配列同一性、ハイブリダイゼーション、変異体、及び断片の任意の態様も包含する。例えば、一態様において、リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、（ａ）配列番号２０又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するリンゴ酸デヒドロゲナーゼ；（ｂ）低ストリンジェンシー条件下で、例えば、中ストリンジェンシー条件下で、中〜高ストリンジェンシー条件下で、高ストリンジェンシー条件下で、又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１９又はその成熟ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号１９又はその成熟ポリペプチドコード配列のｃＤＮＡ配列、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の完全長相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ；（ｃ）（ｉｖ）配列番号１９又はその成熟ポリペプチドコード配列、（ｖ）配列番号１９又はその成熟ポリペプチドコード配列のｃＤＮＡ配列、あるいは（ｖｉ）（ｉｖ）又は（ｖ）の完全長相補鎖と少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％への配列同一性を有するポリヌクレオチドをコードされるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ；（ｄ）配列番号２０又はその成熟ポリペプチド配列の１若しくは複数（例えば、２個、数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成るリンゴ酸デヒドロゲナーゼ変異体；あるいは、（ｅ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリペプチドの断片、である。
【０１６７】
先に記載したように、リンゴ酸デヒドロゲナーゼはまた、自然（例えば、土、コンポスト、水など）から単離された微生物又は天然材料（例えば、土、コンポスト、水など）から直接得られたＤＮＡ試料を含めた他の供給源から同定され、そして得られてもよい。
【０１６８】
ピルビン酸カルボキシラーゼとピルビン酸カルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド
組換え宿主細胞とその使用方法の態様によって、宿主細胞はピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有する。態様によって、宿主細胞はピルビン酸カルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含んで成る。前記ピルビン酸カルボキシラーゼは、本発明を実施するのに好適な任意のピルビン酸カルボキシラーゼであってよい。一態様において、前記ピルビン酸カルボキシラーゼは、宿主細胞のサイトゾル内に存在している酵素である。
【０１６９】
本明細書中に記載の組換え宿主細胞と方法の一態様において、前記ピルビン酸カルボキシラーゼは、次の（ａ）配列番号１６又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するピルビン酸カルボキシラーゼ；（ｂ）低ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１５又はその成熟ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号１５又はその成熟ポリペプチドコード配列のｃＤＮＡ配列、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の完全長相補鎖、にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるピルビン酸カルボキシラーゼ；（ｃ）（ｉｖ）配列番号１５又はその成熟ポリペプチドコード配列、（ｖ）配列番号１５又はその成熟ポリペプチドコード配列のｃＤＮＡ配列、あるいは（ｖｉ）（ｉｖ）又は（ｖ）の完全長相補鎖、と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるピルビン酸カルボキシラーゼ；（ｄ）配列番号１６又はその成熟ポリペプチド配列の１若しくは複数（例えば、２個、数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成るピルビン酸カルボキシラーゼ変異体；並びに（ｅ）ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリペプチドの断片である。
【０１７０】
一態様において、前記ピルビン酸カルボキシラーゼは、配列番号１６又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るか又はそれから成る。一態様において、前記ピルビン酸カルボキシラーゼは、配列番号１６又はその成熟ポリペプチド配列と１０個未満のアミノ酸、例えば、５つ未満のアミノ酸、４つ未満のアミノ酸、３つ未満のアミノ酸、２つ未満のアミノ酸、又は１つのアミノ酸しか異ならないアミノ酸配列を含んで成る。
【０１７１】
一態様において、ピルビン酸カルボキシラーゼは、配列番号１６のアミノ酸配列、配列番号１６の成熟ポリペプチド配列、その対立遺伝子変異体、又はピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有する、前記配列の断片を含んで成るか又はそれから成る。別の態様において、前記ピルビン酸カルボキシラーゼは、配列番号１６のアミノ酸配列を含んで成るか又はそれから成る。別の態様において、前記ピルビン酸カルボキシラーゼは、配列番号１６の成熟ポリペプチド配列を含んで成るか又はそれから成る。別の態様において、前記ピルビン酸カルボキシラーゼは、配列番号１６の第１〜１１９３アミノ酸を含んで成るか又はそれから成る。
【０１７２】
一態様において、前記ピルビン酸カルボキシラーゼは、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば、中ストリンジェンシー条件下で、中〜高ストリンジェンシー条件下で、高ストリンジェンシー条件下で、又は非常に高いストリンジェンシー条件の下で（ｉ）配列番号１５又はその成熟ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号１５又はその成熟ポリペプチドコード配列のｃＤＮＡ配列、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989、前掲）。
【０１７３】
一態様において、前記ピルビン酸カルボキシラーゼは、（ｉｖ）配列番号１５又はその成熟ポリペプチドコード配列のｃＤＮＡ配列、（ｖ）配列番号１５又はその成熟ポリペプチドコード配列、あるいは（ｖｉ）（ｉｖ）又は（ｖ）の完全長相補鎖と少なくとも６５％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１７４】
一態様において、前記ピルビン酸カルボキシラーゼは、配列番号１５又はその成熟ポリペプチドコード配列によってコードされる。一態様において、前記ピルビン酸カルボキシラーゼは、配列番号１５によってコードされる。一態様において、前記ピルビン酸カルボキシラーゼは、配列番号１５の成熟ポリペプチドコード配列によってコードされる。一態様において、前記ピルビン酸カルボキシラーゼは、配列番号１５の部分配列によってコードされ、ここで、前記部分配列はピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。一態様において、前記部分配列は、配列番号１５の少なくとも３０６０個のヌクレオチド、例えば、少なくとも３２４０個のヌクレオチド又は少なくとも３４２０個のヌクレオチドを含んでいる。
【０１７５】
一態様において、前記ピルビン酸カルボキシラーゼは、先に記載したとおり、配列番号１６又はその成熟ポリペプチド配列の１若しくは複数（例えば２、数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体である。一態様において、前記ピルビン酸カルボキシラーゼは、配列番号１６の１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体である。一態様において、前記ピルビン酸カルボキシラーゼは、配列番号１６の成熟ポリペプチド配列の１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体である。態様によって、配列番号１６又はその成熟ポリペプチド配列のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入の総数が、１６個を超えない、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９個以下である。
【０１７６】
別の態様において、前記ピルビン酸カルボキシラーゼは、配列番号１６又はその成熟ポリペプチド配列の断片であって、ここで、前記断片にはピルビン酸カルボキシラーゼ活性がある。一態様において、前記断片は、配列番号１６の少なくとも１０２０個のアミノ酸残基、例えば、少なくとも１０８０個のアミノ酸残基又は少なくとも１１４０個のアミノ酸残基を含んでいる。
【０１７７】
前記ピルビン酸カルボキシラーゼはまた、ピルビン酸カルボキシラーゼの対立遺伝子変異体又は人工変異体であってもよい。
【０１７８】
先に記載したように、前記ピルビン酸カルボキシラーゼはまた、融合ポリペプチド又は切断可能な融合ポリペプチドを含んでいる。
【０１７９】
ピルビン酸カルボキシラーゼはまた、ミトコンドリア性ピルビン酸カルボキシラーゼの変異体であってもよいので、それにより、ミトコンドリア内へのインビボ移入がサイトゾル内のピルビン酸カルボキシラーゼ変異体のレベル増加を抑える。
【０１８０】
ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドの単離又はクローン化に使用される技術は、先に記載されている。
【０１８１】
配列番号１５のポリヌクレオチド；又はその部分配列；並びに配列番号１６のアミノ酸配列；又はその断片が、先に記載したように、異なる属又は種の株からピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡの同定、そしてクローン化のための核酸プローブを設計するのに使用されてもよい。そのようなプローブが本発明に包含される。その他の生物体から調製されたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーは、先に記載したように、先に記載したプローブにハイブリダイズし、且つピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡについてスクリーニングされてもよい。
【０１８２】
一態様において、前記核酸プローブは配列番号１５である。別の態様において、前記核酸プローブは、配列番号１５の成熟ポリペプチドコード配列である。別の態様において、前記核酸プローブは、配列番号１６をコードするポリヌクレオチド配列、その成熟ポリペプチド配列、又は前記配列の断片である。
【０１８３】
長さが少なくとも１００ヌクレオチドの長いプローブに関して、非常に低い〜非常に高いストリンジェンシー及び洗浄条件は、先に記載したとおり規定される。長さが約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの短いプローブに関しては、ストリンジェンシー及び洗浄条件は、先に記載したとおり規定される。
【０１８４】
前記ピルビン酸カルボキシラーゼは、任意の属の微生物から得ることもできる。一態様において、前記ピルビン酸カルボキシラーゼは、本明細書中に記載した微生物由来の細菌、酵母、又は糸状菌ピルビン酸カルボキシラーゼであってもよい。別の態様において、前記ピルビン酸カルボキシラーゼは、アスペルギルス・オリゼのピルビン酸カルボキシラーゼ、例えば、配列番号１６のアスペルギルス・オリゼ・ピルビン酸カルボキシラーゼである。
【０１８５】
本発明の実施に使用できる他のピルビン酸カルボキシラーゼには、これだけに限定されるものではないが、アスペルギルス・クラバツス（Aspergillus clavatus）ＮＲＲＬ１ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＸＰ＿００１２７１６６４；直接寄託、（２００６年１０月２６日）寄託、The Institute for Genomic Research, 9712 Medical Center Drive, Rockville, MD 20850, USA）；アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）Ａｆ２９３ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＸＰ＿７５２０５４；Nierman et al., 2005, Nature 438: 1151-1156）；アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）ＦＧＳＣ Ａ４ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＸＰ＿６６２０６６；Galagan et al., 2005, Nature 438: 1105-1115）；アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）ピルビン酸カルボキシラーゼ（Ａｎ１５ｇ０２８２０；Pel et al., 2007, Nature Biotechnology 25: 221 - 231；ＡＳＰＮＧ ５０６１；Panneman et al.（１９９８年７月）ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪに受入）；アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）ピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｏ９３９１８；直接寄託、（１９９８年１０月）寄託、The Institute for Genomic Research, 9712 Medical Center Drive, Rockville, MD 20850, USA）；マグナポルテ・グリセア（Magnaporthe grisea）７０‐１５ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＸＰ＿３６７８５２；直接寄託、（２００５年９月２６日）寄託、Broad Institute of MIT and Harvard, 320 Charles Street, Cambridge, MA 02142, USA）；ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）ＯＲ７４Ａピルビン酸カルボキシラーゼ（ＸＰ＿９６５６３６；Galagan et al., 2003, Nature 422: 859- 868）；リゾープス・オリゼピルベート（Rhizopus oryzaepyruvate）カルボキシラーゼ（ＲＯ３Ｇ＿０６９３１．１）；サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＮＰ＿００９７７７；Gaffeau et al., 1996, Science 274: 546-547）；シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＮＰ＿５９５９００；直接寄託、（２００７年６月２９日）寄託、European Schizosaccharomyces genome sequencing project, Sanger Institute, The Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1 SA）；ウスチラゴ・マイデス（Ustilago maydis）ピルビン酸カルボキシラーゼ（ｕｍ０１０５４；McCann and Snetselaar, 2008, Fungal Genetics and Biology 45: S77-S87）が含まれる。本発明は、先に記載したピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチド配列及びポリヌクレオチド配列に適用される本明細書中に記載の配列同一性、ハイブリダイゼーション、変異体、及び断片の任意の態様も包含する。
【０１８６】
先に記載したように、リンゴ酸デヒドロゲナーゼはまた、自然（例えば、土、コンポスト、水など）から単離された微生物又は天然材料（例えば、土、コンポスト、水など）から直接得られたＤＮＡ試料を含めた他の供給源から同定され、そして得られてもよい。
【０１８７】
宿主細胞
本発明はまた、本明細書中に記載したポリペプチドの産生を指示する１若しくは複数（例えば、２個、数個）の制御配列に作用可能に連結された、本明細書中に記載したポリヌクレオチドを含んで成る組換え宿主細胞にも関する。本発明はまた、Ｃ４‐ジカルボン酸の遺伝子組み換え産生のための１若しくは複数の記載のポリペプチドの発現を指示する、１若しくは複数の制御配列に作用可能に連結され得る本明細書中に記載した１若しくは複数のポリヌクレオチドに含んで成る組換え宿主細胞、並びにＣ４‐ジカルボン酸の産生のためのかかる宿主細胞の使用方法も包含する。前記宿主細胞は、記載のポリヌクレオチドのうちの任意の１つ又はその複数の組合せを含み得る。例えば、一態様において、前記組換え宿主細胞は、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体をコードする異種ポリヌクレオチドを含んで成り、且つ任意に、リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする異種ポリヌクレオチド、及び／又はピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含んで成るが、ここで、前記宿主細胞は、同じ条件下で培養された場合に、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体をコードする異種ポリヌクレオチドを含まない宿主細胞と比較して、より大量のＣ４‐ジカルボン酸を産生する（又は産生できる）。一態様において、前記組換え宿主細胞は、以下の：
【０１８８】
（１）Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体、例えば、以下の：（ａ）配列番号２、４、若しくは６、又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するＣ４‐ジカルボン酸輸送体；（ｂ）低ストリンジェンシー条件下で、配列番号１、３、若しくは５、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＣ４‐ジカルボン酸輸送体；（ｃ）配列番号１、３、若しくは５、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるＣ４‐ジカルボン酸輸送体；（ｄ）配列番号２、４、若しくは６、又はその成熟ポリペプチド配列の１若しくは複数（例えば、２個、数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成るＣ４‐ジカルボン酸輸送体変異体；並びに（ｅ）Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリペプチドの断片、から選択されるＣ４‐ジカルボン酸輸送体などをコードする異種ポリヌクレオチド；
【０１８９】
（２）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、例えば、以下の：（ａ）配列番号１２又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するリンゴ酸デヒドロゲナーゼ；（ｂ）低ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１１又はその成熟ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号１１又は成熟ポリペプチドコード配列のｃＤＮＡ配列、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ；（ｃ）（ｉｖ）配列番号１１又はその成熟ポリペプチドコード配列、（ｖ）配列番号１１又はその成熟ポリペプチドコード配列のｃＤＮＡ配列、あるいは（ｖｉ）（ｉｖ）又は（ｖ）の完全長相補鎖と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ；（ｄ）配列番号１２又はその成熟ポリペプチド配列の１若しくは複数（例えば、２個、数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成るリンゴ酸デヒドロゲナーゼ変異体；並びに（ｅ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリペプチドの断片、から選択されるリンゴ酸デヒドロゲナーゼなどをコードする第２の任意の異種ポリヌクレオチド；そして
【０１９０】
（３）ピルビン酸カルボキシラーゼ、例えば、以下の：（ａ）配列番号１６又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するピルビン酸カルボキシラーゼ；（ｂ）低ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１５又はその成熟ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号１５又は成熟ポリペプチドコード配列のｃＤＮＡ配列、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるピルビン酸カルボキシラーゼ；（ｃ）（ｉｖ）配列番号１５又はその成熟ポリペプチドコード配列、（ｖ）配列番号１５又はその成熟ポリペプチドコード配列、あるいは（ｖｉ）（ｉｖ）又は（ｖ）の完全長相補鎖のｃＤＮＡ配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるピルビン酸カルボキシラーゼ；そして（ｄ）配列番号１６又はその成熟ポリペプチド配列のアミノ酸の１若しくは複数（例えば、２個、数個）の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成るピルビン酸カルボキシラーゼ変異体；並びに（ｅ）ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリペプチドの断片、から選択されるピルビン酸カルボキシラーゼなどをコードする第３の任意の異種ポリヌクレオチドを含んで成り、
【０１９１】
ここで、前記宿主細胞が、同じ条件下で培養した場合に、１若しくは複数のポリヌクレオチドを含まない（例えば、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体をコードする異種ポリヌクレオチドを含まない）宿主細胞と比較して、より大量のＣ４‐ジカルボン酸（例えば、リンゴ酸）を産生する（又は産生できる）。
【０１９２】
一態様において、前記宿主細胞は、本明細書中に記載したＣ４‐ジカルボン酸輸送体をコードする異種ポリヌクレオチド（例えば、配列番号１、３、５、又は記載されたその態様のいずれか）及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含んで成る。本発明において、リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、先に記載したように、本発明を実施するのに好適な任意のリンゴ酸デヒドロゲナーゼであってよい。別の態様において、前記宿主細胞は、本明細書中に記載したＣ４‐ジカルボン酸輸送体をコードする異種ポリヌクレオチド（例えば、配列番号１、３、５、又は記載されたその態様のいずれか）及びピルビン酸カルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含んで成る。本発明において、ピルビン酸カルボキシラーゼは、先に記載したように、本発明を実施するのに好適な任意のピルビン酸カルボキシラーゼであってよい。特に、ピルビン酸カルボキシラーゼは、好ましくは、宿主細胞のサイトゾル内に存在している酵素である。一態様において、前記宿主細胞は、本明細書中に記載したＣ４‐ジカルボン酸輸送体をコードする異種ポリヌクレオチド（例えば、配列番号１、３、５、又は記載されたその態様のいずれか）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする第２の異種ポリヌクレオチド、及びピルビン酸カルボキシラーゼをコードする第３の異種ポリヌクレオチドを含んで成る。
【０１９３】
１若しくは複数（例えば、２個、数個）のポリヌクレオチドを含む構築物又はベクターは、その構築物又はベクターが染色体組み込み体又は前記の自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞に導入される。用語「宿主細胞」は、複製中に起きる変異のために、親細胞と同一ではない親細胞の任意の子孫を包含する。宿主細胞の選択は大体、ポリペプチドをコードする遺伝子とその供給源に依存する。以下に記載した態様は、宿主細胞自体、並びにその宿主細胞の使用方法に適用される。
【０１９４】
宿主細胞は、本発明のポリペプチドの組換え産生が可能な任意の細胞、例えば、原核生物又は真核生物、及び／又はＣ４‐ジカルボン酸（例えば、リンゴ酸）の遺伝子組み換え産生ができる任意の細胞（例えば、任意の糸状菌細胞）である。
【０１９５】
原核生物宿主細胞は、任意のグラム陽性細菌又はグラム陰性細菌である。グラム陽性細菌には、特に限定されないが、バチルス（Bacillus）、クロストリジウム（Clostridium）、エンテロコッカス（Enterococcus）、ゲオバチルス（Geobacillus）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、オセアノバチルス（Oceanobacillus）スタフィロコッカス（Staphylococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、及びストレプトミセス（Streptomyces）がある。グラム陰性細菌には、特に限定されないが、カンピロバクター（Campylobacter）、Ｅ．コリ（E. coli）、フラボバクテリウム（Flavobacterium）、フソバクテリウム（Fusobacterium）、ヘリコバクター（Helicobacter）、イリオバクター（llyobacter）、ナイセリア（Neisseria）、シュードモナス（Pseudomonas）、サルモネラ（Salmonella）、及びウレアプラズマ（Ureaplasma）がある。
【０１９６】
細菌宿主細胞は、任意のバチルス（Bacillus）細胞でもよく、そのバチルス（Bacillus）細胞には、特に限定されないが、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkaophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・クラウジイ（Bacillus calusii）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・フィルムス（Bacillus firmus）、バチルス・ラウタス（Bacillus lautus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、及びバチルス・ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）細胞が含まれる。
【０１９７】
細菌宿主細胞はまた、任意のストレプトコッカス（Streptococcus）細胞でもよく、そのストレプトコッカス（Streptococcus）細胞には、特に限定されないが、ストレプトコッカス・エキシミリス（Streptococcus equisimilis）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、及びストレプトコッカス・エキ（Streptococcus equi）亜種ズーエピデミクス（Zooepidemicus）細胞が含まれる。
【０１９８】
細菌宿主細胞はまた、任意のストレプトミセス（Streptomyces）細胞でもよく、そのストレプトミセス（Streptomyces）細胞には、特に限定されないが、ストレプトミセス・アクロモゲネス（Streptomyces achromogenes）、ストレプトミセス・アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトミセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトミセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及びストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）細胞が含まれる。
【０１９９】
バチルス（Bacillus）細胞へのＤＮＡの導入は、例えばプロトプラスト形質転換（例えば、Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168:111-115参照）により、コンピタントな細胞（例えば、Young and Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81:823-829、又はDubnau and Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56:209-221参照）を使用して、電気穿孔法（例えば、Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6:742-751参照）により、又は接合（例えば、Koehler and Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169:5271-5278参照）により、行われる。Ｅ．コリ（E. coli）細胞へのＤＮＡの導入は、例えばプロトプラスト形質転換（例えば、Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166:557-580）、又は電気穿孔法（例えば、Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16:6127-6145）により、行われる。ストレプトミセス（Streptomyces）細胞へのＤＮＡの導入は、例えばプロトプラスト形質転換と電気穿孔法（例えば、Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49:399-405参照）、接合（例えば、Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171:3583-3585参照）、又は形質導入（例えば、Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:6289-6294参照）により行われる。シュードモナス（Pseudomonas）細胞へのＤＮＡの導入は、例えば電気穿孔法（例えば、Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64:391-397参照）、又は接合（例えば、Pinedo and Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71:51-57参照）により行われる。ストレプトコッカス（Streptococcus）細胞へのＤＮＡの導入は、例えば自然のコンピタンス（例えば、Perry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32:1295-1297参照）、プロトプラスト形質転換（例えば、Catt and Jollick, 1991, Microbios. 68:189-207参照）、電気穿孔法（例えば、Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65:3800-3804参照）、又は接合（例えば、Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45:409-436参照）により行われる。しかしＤＮＡを宿主細胞に導入するための当該分野で周知の任意の方法が使用できる。
【０２００】
宿主細胞はまた、真核生物、例えば哺乳動物、昆虫、植物、又は真菌細胞でもよい。
宿主細胞は、真菌細胞であってもよい。本明細書において「真菌」は、子嚢菌門（Ascomycota）、担子菌門（Basidiomycota）、ツボカビ門（Chytridiomycota）、及び接合菌門（Zygomycota）（Hawksworth et al., Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, CAB International, Univercity Press, Cambridge, UK、で規定されている）、並びに卵菌門（Oomycota）（Hawksworth et al., 1995、前述、171頁に引用）、及び不完全菌類（Hawksworth et al., 1995、前述）を含む。
【０２０１】
真菌宿主細胞は酵母細胞であってもよい。本明細書において「酵母」は、有子嚢胞子酵母（ascosporogenous）酵母（エンドミセタレス目（Endomycetales））、担子胞子形成（basidiosporogenous）酵母、および不完全菌類（Fungi lmperfecti）（不完全酵母菌綱（Blastomycetes））に属する酵母を含む。酵母の分類は将来変わる可能性があるため、本発明の目的において、酵母は Biology and Activities of Yeast（Skinner,F.A., Passmore, S. M、およびDavenport, R. R. 編、Soc. App. Bacteriol. 第9回シンポジウム、1980年）に記載のように規定される。
【０２０２】
酵母宿主細胞は、カンジダ（Candida）、ハンセヌラ（Hansenula）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ピキア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）、又はヤロウイア（Yarrowia）細胞、例えば、クリュイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ディアスタティカス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロミセス・ダグラシー（Saccharomyces douglasii）、サッカロミセス・クリヴェリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）、サッカロミセス・オヴィフォルミス（Saccharomyces oviformis）、又はヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）細胞などであってもよい。
【０２０３】
真菌宿主細胞は糸状菌細胞であってもよい。「糸状菌」は、亜門の真菌門（Eumycota）および卵菌門（Oomycota）のすべての糸状形態を含む（Hawksworth et al., 1995、前述、により規定される）。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複合多糖からなる菌糸体壁によって特徴付けられる。栄養生長は菌糸体伸長により、炭素の異化は偏性好気性である。対照的に、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などの酵母による栄養生長は単細胞葉状体の出芽により、炭素の異化は発酵性であり得る。
【０２０４】
糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、ビヤーカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、コプリヌス（Coprinus）、コリオルス（Coriolus）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、フィリバシジウム（Filibasidium）、フザリウム（Fusarium）、フミコーラ（Humicola）、マグナポルテ（Magnaporthe）、ムコール（Mucor）、ミセリオフトラ（Myceliophthora）、ネオカリマスティクス（Neocallimastix）、ノイロスポラ（Neurospora）、ペシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、フェネロケテ（Phanerochaete）、フレビア（Phlebia）、ピロミセス（Piromyces）、プレロータス（Pleurotus）、シゾフィルム（Schizophyllum）、タラロミセス（Talaromyces）、サーモアスクス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トラメテス（Trametes）、又はトリコデルマ（Trichoderma）細胞であってもよい。
【０２０５】
例えば、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アクレアツス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フォエティダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、ビヤーカンデラ・アヅスタ（Bjerkandera adusta）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・カレギエア（Ceriporiopsis caregiea）、セリポリオプシス・ギルベセンス（Ceriporiopsis gilvescens）、セリポリオプシス・パノシンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、セリポリオプシス・リブロサ（Ceriporiopsis rivulosa）、セリポリオプシス・スブルファ（Ceriporiopsis subrufa）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora）、クリソスポリウム・イオプス（Chrysosporium iops）、クリソスポリウム・ケラチノフィルム（Chrysosporium keratinophilum）、クリソスポリウム・ルクノウェンセ（Chrysosporium lucknowense）、クリソスポリウム・メルダリウム（Chrysosporium merdarium）、クリソスポリウム・パニコラ（Chrysosporium pannicola）、クリソスポリウム・クイーンスランジカム（Chrysosporium queenslandicum）、クリソスポリウム・トロピカム（Chrysosporium tropicum）、クリソスポリウム・ゾナツム（Chrysosporium zonatum）、コプリヌス・シネレウス（Coprinus cinereus）、コリオルス・ヒルスタス（Coriolus hirsutus）、フザリウム・バクトリディオデス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フザリウム・クルックウェルエンス（Fusarium crookwellense）、フザリウム・クルモラム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミヌム（Fusarium graminum）、フザリウム・ヘテロスポルム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネグンディ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・レティクラツム（Fusarium reticulatun）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サンブシヌム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコチロウム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・スルプレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルローサム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トリコテシオイデス（Fusarium trichothecioides）、又はフザリウム・ヴェネナツム（Fusarium venenatum）、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコーラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ペニシリウム・プルプルゲヌム（Penicillium purpurogenum）、ファネロケテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、フレビア・ラジアータ（Phlebia radiata）、プレロータス・エリンギイ（Pleurotus eryngii）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トラメテス・ビロサ（Trametes villosa）、トラメテス・ベルシカラー（Trametes versicolor）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギプラチアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリ���デルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）細胞であってもよい。
【０２０６】
一態様において、宿主細胞は、アスペルギルス宿主細胞である。別の態様において、宿主細胞は、アスペルギルス・オリゼである。
【０２０７】
真菌細胞は、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、およびそれ自体周知の方法で細胞壁の再生を包含するプロセスによって形質転換することができる。アスペルギルス（Aspergillus）とトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞の形質転換に適切な方法は、ＥＰ２３８０２３およびYeltonら、1984年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1474に記載されている。フザリウム（Fusarium）種を形質転換するための適切な方法は、Malardierら、1989年、Gene 78:147-156およびＷＯ９６／００７８７に記載されている。酵母は、Becker and Guarente、編者: Abelson, J. N. and Simon, M.I., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology、第194巻、182-187頁、Academic Press, Inc., New York；Ito et al., 1983年、J. Bacteriol. 153:163;並びにHinnen et al., 1978年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1920に記載の方法を使用して、形質転換してもよい。
【０２０８】
態様によって、宿主細胞は、本明細書中に記載のポリヌクレオチドを１若しくは複数（例えば、２個、数個）含んで成り、ここで、前記宿主細胞は、同じ条件下で培養された場合に、１若しくは複数のポリヌクレオチドを含まない宿主細胞と比較して、高いレベルのＣ４‐ジカルボン酸を分泌している（そして／あるいは分泌できる）。態様によって、宿主細胞は、同じ条件下で培養された場合に、１若しくは複数のポリヌクレオチドを含まない（例えば、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体をコードする異種ポリヌクレオチドを含まない）宿主細胞と比較して少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、又は５００％高いレベルのＣ４‐ジカルボン酸（例えば、リンゴ酸）を分泌しているか、そして／あるいは分泌できる。
【０２０９】
本明細書中に記載の組換え宿主細胞及び方法の態様のいずれかにおいて、Ｃ４‐ジカルボン酸は、リンゴ酸、コハク酸、オキサロ酢酸、マロン酸、若しくはフマル酸、又はそれらの組合せであってもよい。態様によって、Ｃ４‐ジカルボン酸は、リンゴ酸、コハク酸、若しくはフマル酸、又はそれらの組合せである。態様によって、Ｃ４‐ジカルボン酸は、リンゴ酸若しくはフマル酸、又はリンゴ酸とフマル酸の組合せである。態様によって、Ｃ４‐ジカルボン酸はリンゴ酸である。
【０２１０】
これらの態様のどれかにおいて、宿主細胞は、理論値の少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％のＣ４‐ジカルボン酸を産生している（そして／あるいは産生できる）。
【０２１１】
これらの態様のいずれかにおいて、組換え宿主は、１時間あたり約０．１ｇ／Ｌ超、例えば、１時間あたり約０．２ｇ／Ｌ超、１時間あたり０．５ｇ／Ｌ超、１時間あたり０．６ｇ／Ｌ超、１時間あたり０．７ｇ／Ｌ超、１時間あたり０．８ｇ／Ｌ超、１時間あたり０．９ｇ／Ｌ超、１時間あたり１．０ｇ／Ｌ超、１時間あたり１．１ｇ／Ｌ超、１時間あたり１．２ｇ／Ｌ超、１時間あたり１．３ｇ／Ｌ超、１時間あたり１．５ｇ／Ｌ超、１時間あたり１．７５ｇ／Ｌ超、１時間あたり２．０ｇ／Ｌ超、１時間あたり２．２５ｇ／Ｌ超、１時間あたり２．５ｇ／Ｌ超、１時間あたり３．０ｇ／Ｌ超；例えば、１時間あたり約０．１ｇ／Ｌ超〜１時間あたり約２．０ｇ／Ｌ超、例えば、１時間あたり約０．３ｇ／Ｌ超〜１時間あたり約１．７ｇ／Ｌ超、１時間あたり約０．５ｇ／Ｌ超〜１時間あたり約１．５ｇ／Ｌ超、１時間あたり約０．７ｇ／Ｌ超〜１時間あたり約１．３ｇ／Ｌ超、１時間あたり約０．８ｇ／Ｌ超〜１時間あたり約１．２ｇ／Ｌ超、又は１時間あたり約０．９ｇ／Ｌ超〜１時間あたり約１．１ｇ／Ｌ超のＣ４‐ジカルボン酸の容積生産性（例えば、リンゴ酸の容積生産性）を有する。
【０２１２】
組換え宿主細胞は、以下で記載するように、当該技術分野で周知の方法を使用して、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、又はピルビン酸カルボキシラーゼの産生に好適な栄養培地中で培養され得る。
【０２１３】
Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、及びその活性は、当該技術分野で知られている方法を使用することで検出できる。これらの検出法には、特異的抗体、酵素産物の形成、又は酵素基質の消耗の使用が含まれ得る。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001 )；Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)；及びHanai et al., Appl. Environ. Microbiol. 73:7814-7818 (2007)参照。
【０２１４】
産生方法
本発明はまた、本明細書中に記載したポリペプチド（例えば、配列番号２、４、６、又は記載したその態様のいずれかを含んで成るか又はそれから成るポリペプチド）の産生方法であって：（ａ）前記ポリペプチドの産生を促進する条件下で、その野生型では前記ポリペプチドを産生する細胞を培養し、そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収する、ことを含んでなる方法に関する。一態様において、前記細胞は、アスペルギルス（Aspergillus）属である。別の態様において、前記細胞は、アスペルギルス・アクレアツス（Aspergillus aculeatus）である。別の態様において、前記細胞は、Ｅ．コリ（E. coli）NRRL B-50400、Ｅ．コリ（E. coli）NRRL B-50388、又はＥ．コリ（E. coli）NRRL B-50401である。
【０２１５】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを産生する方法であって、（ａ）前記ポリペプチドの産生を促進する条件下で、本発明の組換え宿主細胞を培養し、そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収する、ことを含んでなる方法に関する。
【０２１６】
当該分野で周知の方法を使用して、宿主細胞はＣ４‐ジカルボン酸輸送体の産生に適切な栄養培地中で培養される。例えば細胞は、適切な培地中で、並びにコード配列を発現させるおよび／またはポリペプチドを単離することが可能な条件下で、実験室あるいは工業的発酵槽において振盪フラスコ培養、小規模または大規模発酵（連続、バッチ、供給バッチ、もしくは固相発酵を含む）によって培養することができる。培養は、当該分野において周知の方法を使用して、炭素および窒素源並びに無機塩を含む適切な栄養培地において行われる。適切な培地は販売者から入手可能であり、または（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）のカタログに）公開された組成に従って、調製してもよい。ポリペプチドが栄養培地に分泌される場合、ポリペプチドは培地から直接回収することができる。ポリペプチドが分泌されない場合、細胞溶解物から回収することができる。
【０２１７】
Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体は、先に記載したように、そのポリペプチドに特異的である当該分野において既知の方法を使用して、検出することができる。これらの検出方法は、特異的抗体の使用、酵素生成物の生成、または酵素基質の消失を含んでよい。例えば、本明細書に記載のポリペプチドの活性を測定するために、酵素アッセイが使用される。
【０２１８】
前記ポリペプチドは、当該分野において既知の方法によって回収することができる。例えば、前記ポリペプチドは、特に限定されないが、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、エバポレーション、または沈殿を含む従来の方法によって、栄養培地から回収することができる。
【０２１９】
ポリペプチドは、特に限定されないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、電気泳動法（例えば、分取等電点電気泳動）、差分溶解性（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または抽出（例えば、Protein Purification、編者:J.-C. Janson and Lars Ryden, VCH Publishers, New York, 1989を参照）を含む当該技術分野で周知の様々な方法によって、精製することができる。
【０２２０】
別の態様において、前記ポリペプチドは回収されないが、むしろそのポリペプチドを発現する本発明の宿主細胞を前記ポリペプチドの供給源として使用する。
【０２２１】
植物
本発明はまた、ポリペプチドを回収可能な量で発現し産生するように、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む植物、例えばトランスジェニック植物、植物の部分、又は植物細胞に関する。ポリペプチドは、植物又は植物の部分から回収される。あるいは、ポリペプチドを含有する植物又は植物の部分は、食物や飼料の品質を改良するために、例えば栄養価、嗜好性、流動性を改良するために、又は栄養分吸収阻害因子を破壊するために使用される。
【０２２２】
トランスジェニック植物は、双子葉植物（dicot）でも単子葉植物（monocot）でもよい。単子葉植物の例は、草、例えば牧草（イチゴツナギ（blue grass）、Poa）、飼料草、例えばウシノケグサ（Festuca）、ライグラス（Lolium）、温帯の草（例えばヌカボ（Agrostis））、及び穀類、例えば小麦、オート麦、ライ麦、大麦、イネ、モロコシ、及びトウモロコシ（corn）である。
【０２２３】
双子葉植物の例は、タバコ、マメ科植物（例えばルピナス、ジャガイモ、テンサイ、エンドウ、インゲン、及び大豆）、及びアブラナ科植物（Brassicaceae科）（例えばカリフラワー、菜種、及び密接に関連するモデル生物シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））である。
【０２２４】
植物の部分の例は、茎、カルス、葉、根、果実、種子、及び塊茎、及びこれらの部分を含む個々の組織（例えば、表皮、葉肉、柔組織、維管束組織、分裂組織）である。特定の植物細胞コンパートメント（例えば、葉緑体、アポプラスト、ミトコンドリア、液胞、ペルオキシソーム、及び細胞質）もまた、植物の部分と見なされる。さらに組織の起源に拘わらずすべての植物細胞は、植物の部分と見なされる。同様に本発明の利用を促進するように単離された特定の組織や細胞のような植物の部分（例えば、胚、内胚乳、アリューロン、及び種皮）もまた、植物の部分と見なされる。
【０２２５】
また本発明の範囲には、かかる植物、植物の部分、及び植物細胞の子孫も含まれる。
【０２２６】
ポリペプチドを発現するトランスジェニック植物又は植物細胞はまた、当該分野で周知の方法に従って構築される。簡単に説明すると植物又は植物細胞は、ポリペプチドをコードする１つ又は複数（例えば、２個、数個）の発現構築物を、植物の宿主ゲノム又は葉緑体ゲノムに取り込み、生じる改変植物又は植物細胞を増殖させて、トランスジェニック植物又は植物細胞にすることにより、構築される。
【０２２７】
発現構築物は、植物又は好適な植物の部分中のポリヌクレオチドの発現に必要な適切な制御配列に機能できる形で結合した、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物であることが便利である。さらに発現構築物は、発現構築物が組み込まれる宿主細胞を、及び問題の植物中に構築物を導入するのに必要なＤＮＡ配列（後者は、使用されるＤＮＡ導入法に依存する）を同定するのに有用な選択マーカーを含んでよい。
【０２２８】
制御配列（例えば、プロモーター及びターミネーター配列、及び場合によりシグナル配列又は輸送配列）の選択は、例えばポリペプチドがいつ、どこで、どのように発現されるかにより決定される。例えば、ポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、構成性でも誘導性でもよく、又は成長特異的、ステージ特異的、又は組織特異的でもよく、遺伝子産物は、特定の組織又は植物の部分（例えば種子又は葉）にターゲティングされてもよい。制御配列は、例えばTague et al., 1988, Plant Physiology 86:506に記載されている。
【０２２９】
構成的発現のために、トウモロコシユビキチン１である３５Ｓ−ＣａＭＶ及びイネのアクチン１プロモーターが使用される（Franck et al., 1980, Cell 21:285-294, Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18:675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3:1155-1165）。器官特異的プロモーターは、例えば保存系組織、例えば種子、ジャガイモ塊茎、及び果実からのプロモーター（Edwards and Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24:275-303）、又は分裂組織のような代謝系組織からのプロモーター（Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24:863-878）、種子特異的プロモーター、例えばイネのグルテリン、プロラミン、グロブリン、又はアルブミンプロモーター（Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39:885-889）、レグミンＢ４からのソラマメ（Vicia faba）プロモーターとソラマメ（Vicia faba）からの未知の種子タンパク質遺伝子（Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiol. 152:708-711）、種油体タンパク質からのプロモーター（Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39:935-941）、セイヨウアブラナ（Brassica napus）からの貯蔵タンパク質ｎａｐＡ、又は当該分野で周知の他の種子特異的プロモーター、例えばＷＯ９１／１４７７２に記載されたようなものでもよい。さらにプロモーターは、葉特異的プロモーター、例えばイネ又はトマトからのｒｂｃｓプロモーター（Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102:991-1000）、クロレラウイルス（Chlorella Virus）アデニンメチルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター（Mitra and Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26:85-93）、又はイネからのａｌｄＰ遺伝子プロモーター（Kagaya et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 248:668-674）、又は創傷誘導性プロモーター、例えばジャガイモｐｉｎ２プロモーター（Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22:573-588）でもよい。同様にプロモーターは、温度、渇水、又は塩分の変化のような非生物的処理により誘導されるか、又はプロモーターを活性化する外から加えられる物質［例えば、エタノール、エストロゲン、植物ホルモン（例えば、エチレン、アブシジン酸、及びジベレリン酸）、及び重金属］により誘導されてもよい。
【０２３０】
プロモーターエンハンサー要素はまた、植物中のポリペプチドの高発現を達成するのに使用される。例えばプロモーターエンハンサー要素は、プロモーターと、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとの間に置かれるイントロンでもよい。例えばXu et al., 1993、前述、は、発現を増強するためのイネアクチン１遺伝子の第１イントロンの使用を開示する。
【０２３１】
選択マーカー遺伝子と発現構築物の他の部分は、当該分野で入手できるものから選択される。
【０２３２】
核酸構築物は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）介在形質転換、ウイルス介在形質転換、微量注入法、粒子衝撃法、バイオリスティック形質転換、及び電気穿孔法を含む当該分野で周知の通常法に従って、植物ゲノム中に取り込まれる（Gasser et al., 1990, Science 244:1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8:535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338:274）。
【０２３３】
現在、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）介在遺伝子輸送が、トランスジェニック双子葉植物を作成するために選択される方法（総説については、Hooykas and Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19:15-38を参照）であり、単子葉植物を形質転換するのにも使用できるが、これらの植物については他の形質転換法もしばしば使用される。現在トランスジェニック単子葉植物を作成するために選択される方法は、胚カルス又は発生胚（Christou, 1992, Plant J. 2:275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5:158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10:667-674）の粒子衝撃法（形質転換性ＤＮＡで被覆された微細金又はタングステン粒子）である。単子葉植物の形質転換のための別の方法は、Omirulleh et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21:415-428に記載されたようなプロトプラスト形質転換に基づく。本開示に従った使用のための更なる形質転換法には、米国特許第６，３９５，９６６号及び同第７，１５１、２０４号（その両方の全体を本明細書中に援用する）に記載の方法が含まれる。
【０２３４】
形質転換後、発現構築物を取り込んだ形質転換体が選択され、当該分野で周知の方法に従って再生されて植物体になる。形質転換法はしばしば、例えば２つの異なるＴ−ＤＮＡ構築物を用いる同時形質転換、又は特異的リコンビナーゼによる選択遺伝子の部位特異的切断を使用して、再生中又は以後の世代の選択遺伝子の選択的排除のために計画される。
【０２３５】
本発明に従って調製した構築物による特定の植物遺伝子型の直接的な形質転換に加えて、トランスジェニック植物は、構築物を欠いている第２の植物に構築物を有する植物を交配することによって作製されてもよい。例えば、ポリペプチドをコードする構築物は、変異体をもたらす植物をずっと直接形質転換する必要なく、交配することによって特定の植物品種に導入できる。そのため、本発明は、本発明に従って形質転換された細胞から直接再生した植物だけではなく、そのような植物の子孫も包含する。本明細書中に使用される場合、子孫とは、本発明に従って調製された親株のあらゆる世代の子孫を指すことができる。そのような子孫は、本発明に従って調製されたＤＮＡ構築物、又は本発明に従って調製されたＤＮＡ構築物の一部を含み得る。交配は、開始植物系統のドナー植物系統との異花受粉による植物系統への導入遺伝子の導入をもたらす。こうしたステップに関する制限されることのない例は、米国特許第７，１５１、２０４号にさらに明確に述べられている。
【０２３６】
植物は、戻し交配変換の過程により作出されてもよい。例えば、植物には、戻し交配で変換された遺伝子型、系統、純系、又は雑種と呼ばれる植物が含まれる。
【０２３７】
遺伝子マーカーは、ある遺伝的背景から別のものへの、本発明の１若しくは複数の導入遺伝子の遺伝子移入を助けるのに使用され得る。マーカーを介在した選択は、表現型変異によって引き起こされた誤差を避けるために使用できるので、従来の繁殖に対して利点を示す。さらに、遺伝子マーカーは、特定の交配に関して個々の子孫の優良遺伝資源の相対次数のデータを提供し得る。例えば、そうでなければ非農学的に望ましい遺伝的背景を有する所望の形質を有する植物が優良な親と交配されるとき、遺伝子マーカーは、着目の形質を有するだけではなく、所望の遺伝資源の比較的大部分を有してもいる子孫を選択するのに使用できる。このように、特定の遺伝的背景への１若しくは複数の形質を遺伝子移入するのに必要とされる世代数を最小限にする。
【０２３８】
本発明はまた、（ａ）ポリペプチドの産生を促進する条件下で、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物又は植物細胞を培養し、そして（ｂ）ポリペプチドを回収することを含んでなる、本発明のポリペプチドを産生する方法に関する。
【０２３９】
Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性の除去又は低減
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその一部を破壊又は欠失させることを含んでなり、これが、同じ条件下で培養すると親細胞より少ないポリペプチドを産生する変異細胞を与えることを特徴とする、親細胞の変異体を産生する方法に関する。
【０２４０】
変異細胞は、当該分野で周知の方法（例えば、挿入、破壊、置換、又は欠失）を使用して、ポリヌクレオチドの発現を低減させるか又は排除することにより構築される。好適な態様においてポリヌクレオチドは、不活性化される。修飾又は不活性化されるポリヌクレオチドは、例えば活性に必須のコード領域又はその一部、又はコード領域の発現に必要な制御要素でもよい。かかる制御配列又は調節配列の例は、プロモーター配列又はその機能的部分（すなわち、ポリヌクレオチドの発現に影響を与えるのに十分な部分）でもよい。修飾の可能な他の制御配列には、特に限定されないが、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、転写ターミネーター、及び転写アクチベーターがある。
【０２４１】
ポリヌクレオチドの修飾又は不活性化は、親細胞を突然変異誘発に付し、ポリヌクレオチドの発現が低減しているか又は排除されている変異細胞を選択することにより行われる。突然変異誘発（これは特異的でもランダムでもよい）は、例えば、適切な物理的もしくは化学的突然変異誘発剤を使用して、適切なオリゴヌクレオチドを使用して、又はＤＮＡ配列をＰＣＲによる突然変異誘発に付すことにより行われる。さらに突然変異誘発は、これらの突然変異誘発剤の任意の組合せの使用により行われる。
【０２４２】
本発明の目的に適した物理的又は化学的突然変異誘発剤の例には、紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホニル（ＥＭＳ）、重亜硫酸ナトリウム、蟻酸、及びヌクレオチド類似体がある。
【０２４３】
かかる物質が使用される場合、突然変異誘発は典型的には、突然変異誘発すべき親細胞を、好適な突然変異誘発剤の存在下で適切な条件下でインキュベートし、スクリーニングし、及び／又は遺伝子の発現が低減しているか又は発現が無い変異細胞を選択することにより行われる。
【０２４４】
ポリヌクレオチドの修飾又は不活性化は、その転写又は翻訳に必要な遺伝子又は制御要素中の１つ又は複数（例えば、２個、数個）のヌクレオチドの導入、置換、又は除去により行われる。例えば、停止コドンの導入、開始コドンの除去、又は読みとり枠の変化を引き起こすように、ヌクレオチドが挿入されるか又は除去される。かかる修飾又は不活性化は、部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ性突然変異誘発により、当該分野で周知の方法に従って行われる。原則的には修飾はインビボで、すなわち修飾すべきポリヌクレオチドを発現する細胞に直接行われるが、後述するように修飾はインビトロで行うことが好ましい。
【０２４５】
ポリヌクレオチドの発現を排除するか又は低減させるための便利な方法の例は、遺伝子置換、遺伝子欠失、又は遺伝子破壊法に基づく。例えば、遺伝子破壊法では、内因性ポリヌクレオチドに対応する核酸配列は、インビトロで突然変異誘発されて欠陥性の核酸配列を産生し、これは次に親細胞に形質転換されて欠陥遺伝子を産生する。相同的組換えにより、欠陥核酸配列は内因性ポリヌクレオチドに取って代わる。欠陥ポリヌクレオチドはまた、ポリヌクレオチドが修飾又は破壊されている形質転換体の選択に使用されるマーカーをコードすることが好ましい。特に好適な態様においてポリヌクレオチドは、本明細書に記載のような選択マーカーを用いて破壊される。
【０２４６】
本発明はまた、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を細胞に投与するか、又はこれを細胞中で発現することを含んでなる、細胞中のＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有するポリペプチドの発現を阻害する方法であって、ｄｓＲＮＡは本発明のポリペプチドの部分配列を含むことを特徴とする方法に関する。好適な態様においてｄｓＲＮＡは、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又はそれ以上の２本鎖ヌクレオチドの長さである。
【０２４７】
ｄｓＲＮＡは好ましくは、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。好適な態様においてｄｓＲＮＡは、転写を阻害するための小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。別の好適な態様においてｄｓＲＮＡは、翻訳を阻害するためのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。
【０２４８】
本発明はまた、細胞中の前記ポリペプチドの発現を阻害するための、配列番号１、３、若しくは５又はその成熟ポリペプチドコード配列の一部を含んでなる、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子に関する。本発明は特定の作用機構に限定されるものではないが、ｄｓＲＮＡは細胞に入り、類似の又は同一の配列の１本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）（ｍＲＮＡを含む）の分解を引き起こすことができる。細胞がｄｓＲＮＡに曝露されると、相同性遺伝子からのｍＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれるプロセスにより選択的に分解される。
【０２４９】
本発明のｄｓＲＮＡは、遺伝子サイレンシングで使用することができる。ある態様において本発明は、本発明のｄｓＲＮＡｉを使用してＲＮＡを選択的に分解する方法を提供する。この方法は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで行われる。ある態様においてｄｓＲＮＡ分子は、細胞、臓器、又は動物中で機能喪失変異を作成するために使用することができる。ＲＮＡを選択的に分解するためにｄｓＲＮＡ分子を作成し使用する方法は当該分野で周知であり、例えば、米国特許第６，４８９，１２７号；米国特許第６，５０６，５５９号；米国特許第６，５１１，８２４号；及び米国特許第６，５１５，１０９号を参照のこと。
【０２５０】
本発明はさらに、ポリペプチド又はその制御配列をコードするポリヌクレオチドの破壊又は欠失、あるいは、そのポリペプチドをコードするサイレント化遺伝子を含む親細胞の変異細胞に関連しており、これは、親細胞と比較してより少ないかポリペプチドを産生するか又は全く産生しない変異細胞を与える。
【０２５１】
ポリペプチド欠損変異細胞は、固有の及び／又は異種ポリペプチドの発現のための宿主細胞として特に有用である。すなわち本発明はさらに、（ａ）ポリペプチドの産生を促進する条件下で変異細胞を培養し、そして（ｂ）ポリペプチドを回収することを含んでなる、固有の又は異種ポリペプチドを産生する方法に関する。用語「異種ポリペプチド」は、宿主細胞に固有ではないポリペプチド、例えば、天然のタンパク質の変異体、を意味する。宿主細胞は、天然又は異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピーを２つ以上含んでいてもよい。
【０２５２】
注目の産物の培養及び精製に使用される方法は、当該技術分野で知られている方法によって実施され得る。
【０２５３】
Ｃ４‐ジカルボン酸の産生方法
本発明はまた、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有するポリペプチド又はＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用方法にも向けられる。本明細書中に記載したＣ４‐ジカルボン酸輸送体又はそれをコードするポリヌクレオチドが、Ｃ４‐ジカルボン酸（例えば、リンゴ酸）の産生、例えば、産生の増大などの助けとなるように宿主細胞（例えば、糸状菌宿主細胞）に使用されてもよい。これらの方法において、本明細書中に記載した本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドのいずれか（例えば、配列番号１、２、３、４、５、及び／又は６、あるいは記載されたその態様のいずれか）が、以下に記載する態様に例示されるように使用されてもよい。
【０２５４】
一態様において、本発明は、以下の：（１）本明細書中に記載したＣ４‐ジカルボン酸輸送体をコードする異種ポリヌクレオチド（例えば、配列番号１、３、５、又は記載されたその態様のいずれか）を含んで成る宿主細胞（例えば、糸状菌宿主細胞）を培養し、ここで、前記宿主細胞は、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体をコードする異種ポリヌクレオチドを含まない宿主細胞と比較して、高いレベルのＣ４‐ジカルボン酸を分泌し；そして（２）リンゴ酸を回収すること、を含んで成るＣ４‐ジカルボン酸（例えば、リンゴ酸）の産生方法に関する。
【０２５５】
別の態様において、本発明は、以下の：（１）本明細書中に記載したＣ４‐ジカルボン酸輸送体をコードする異種ポリヌクレオチド（例えば、配列番号１、３、５、又は記載されたその態様のいずれか）を宿主細胞（例えば、糸状菌宿主細胞）内に形質転換し、ここで、前記宿主細胞は、異種ポリヌクレオチドを含まない糸状菌宿主細胞と比較して、高いレベルのＣ４‐ジカルボン酸を分泌し；（２）培地中で形質転換生物体を培養し；そして（３）Ｃ４‐ジカルボン酸を回収すること、を含んで成る親宿主細胞に対してＣ４‐ジカルボン酸産生（例えば、リンゴ酸産生）を増加させる方法に関する。前記方法のこれらの態様のいくつかにおいて、Ｃ４‐ジカルボン酸は、リンゴ酸、コハク酸、オキサロ酢酸、マロン酸、若しくはフマル酸、又はその組合せである。態様によって、Ｃ４‐ジカルボン酸は、リンゴ酸、コハク酸、若しくはフマル酸、又はその組合せである。態様によって、Ｃ４‐ジカルボン酸は、リンゴ酸若しくはフマル酸であるか又はリンゴ酸とフマル酸の組合せである。態様によって、Ｃ４‐ジカルボン酸はリンゴ酸である。
【０２５６】
前掲に記載のとおり、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体は、本明細書中に記載した任意のＣ４‐ジカルボン酸輸送体、例えば、以下の：（ａ）配列番号２、４、若しくは６、又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）低ストリンジェンシー条件下で、配列番号１、３、若しくは５、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；（ｃ）配列番号１、３、若しくは５、又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；（ｄ）配列番号２、４、若しくは６、又はその成熟ポリペプチドの１若しくは複数（例えば、２個、数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体；並びに（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリペプチドの断片、から選択されるＣ４‐ジカルボン酸輸送体であり得る。
【０２５７】
例えば、一態様において、本発明は、以下の：
（１）Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体をコードする異種ポリヌクレオチドを含んで成る宿主細胞（例えば、糸状菌宿主細胞）を培養し、ここで、前記Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体は、以下の：（ａ）配列番号２、又はその成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）低ストリンジェンシー条件下で、配列番号１、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；（ｃ）配列番号１又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；（ｄ）配列番号２又はその成熟ポリペプチド配列の１若しくは複数（例えば、２個、数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体；並びに（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリペプチドの断片、から選択され；
【０２５８】
ここで、前記宿主細胞は、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体をコードする異種ポリヌクレオチドを含まない宿主細胞と比較して、高レベルのＣ４‐ジカルボン酸を分泌し；そして
（２）リンゴ酸を回収すること、を含んで成るＣ４‐ジカルボン酸（例えば、リンゴ酸）の産生方法に関する。
【０２５９】
別の代表的な態様において、本発明は、以下の：
（１）Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体をコードする異種ポリヌクレオチドを含んで成る宿主細胞（例えば、糸状菌宿主細胞）を培養し、ここで、前記Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体が、以下の：（ａ）配列番号４又はその成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）低ストリンジェンシー条件下で、配列番号３、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；（ｃ）配列番号３又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；（ｄ）配列番号４又はその成熟ポリペプチド配列の１若しくは複数（例えば、２個、数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体；並びに（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリペプチドの断片、から選択され；
【０２６０】
ここで、前記宿主細胞は、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体をコードする異種ポリヌクレオチドを含まない宿主細胞と比較して、高レベルのＣ４‐ジカルボン酸を分泌し；そして
（２）リンゴ酸を回収すること、を含んで成るＣ４‐ジカルボン酸（例えば、リンゴ酸）の産生方法に関する。
【０２６１】
別の代表的な態様において、本発明は、以下の：
（１）Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体をコードする異種ポリヌクレオチドを含んで成る宿主細胞（例えば、糸状菌宿主細胞）を培養し、ここで、前記Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体が以下の：（ａ）配列番号６又はその成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）低ストリンジェンシー条件下で、配列番号５、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；（ｃ）配列番号５又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；（ｄ）配列番号６又はその成熟ポリペプチドの１若しくは複数（例えば、２個、数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体；並びに（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリペプチドの断片、から選択され；
【０２６２】
ここで、前記宿主細胞は、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体をコードする異種ポリヌクレオチドを含まない宿主細胞と比較して、高レベルのＣ４‐ジカルボン酸を分泌し；そして
（２）リンゴ酸を回収すること、を含んで成るＣ４‐ジカルボン酸（例えば、リンゴ酸）の産生方法に関する。
【０２６３】
Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有するポリペプチドの更なる変形形態及び実施形態が、先の方法において企図され、そして本願を通じて説明される。
【０２６４】
前記方法の一態様において、Ｃ４‐ジカルボン酸（例えば、リンゴ酸）は、約１０ｇ／Ｌ超、例えば、約２５ｇ／Ｌ超、５０ｇ／Ｌ超、７５ｇ／Ｌ超、１００ｇ／Ｌ超、１２５ｇ／Ｌ超、１５０ｇ／Ｌ超、１６０ｇ／Ｌ超、１７０ｇ／Ｌ超、１８０ｇ／Ｌ超、１９０ｇ／Ｌ超、２００ｇ／Ｌ超、２１０ｇ／Ｌ超、２２５ｇ／Ｌ超、２５０ｇ／Ｌ超、２７５ｇ／Ｌ超、３００ｇ／Ｌ超、３２５ｇ／Ｌ超、３５０ｇ／Ｌ超、４００ｇ／Ｌ超、又は５００ｇ／Ｌ超；あるいは、例えば、約１０ｇ／Ｌ超〜約５００ｇ／Ｌ超、約５０ｇ／Ｌ超〜約３５０ｇ／Ｌ超、約１００ｇ／Ｌ超〜約３００ｇ／Ｌ超、約１５０ｇ／Ｌ超〜約２５０ｇ／Ｌ超、約１７５ｇ／Ｌ超〜約２２５ｇ／Ｌ超、又は約１９０ｇ／Ｌ超〜約２１０ｇ／Ｌ超の力価で産生されるか又は分泌される。
【０２６５】
前記方法の態様のいずれかにおいて、宿主細胞において産生された又は分泌されたＣ４‐ジカルボン酸（例えば、リンゴ酸）のレベルは、同じ条件下で培養される場合、異種ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含まない宿主細胞と比較して、少なくとも２５％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、又は少なくとも５００％高められる。
【０２６６】
前記方法のこれらの態様のいずれかにおいて、異種ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドにとって外来性のプロモーターに作用可能に連結されていてもよい。
【０２６７】
前記方法のこれらの態様のいずれかにおいて、宿主細胞は、先に記載したように、リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする第２の異種ポリヌクレオチド（例えば、配列番号１１の成熟ポリペプチドコード配列又は記載されたその態様のいずれか）、及び／又はピルビン酸カルボキシラーゼをコードする第３の異種ポリヌクレオチド（例えば、配列番号１５の成熟ポリペプチドコード配列又は記載されたその態様のいずれか）をさらに含んで成ってもよい。態様によって、前記第２及び／又は第３の異種ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドにとって外来性のプロモーターに作用可能に連結されている。これらの方法で使用できるリンゴ酸デヒドロゲナーゼとピルビン酸カルボキシラーゼの例は、例えば、２０１０年８月２７日に出願された「糸状菌における改善リンゴ酸産生のための方法」と題するＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／４７００２号の中に見られるが、その内容の全体、特にそこに記載されたリンゴ酸デヒドロゲナーゼとピルビン酸カルボキシラーゼのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関して本明細書中に援用する。
【０２６８】
前記方法のこれらの態様のいずれかにおいて、宿主細胞は、先に記載した宿主細胞、例えば、糸状菌宿主細胞、例えば、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、ビヤーカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、コプリヌス（Coprinus）、コリオルス（Coriolus）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、フィリバシジウム（Filibasidium）、フザリウム（Fusarium）、フミコーラ（Humicola）、マグナポルテ（Magnaporthe）、ムコール（Mucor）、ミセリオフトラ（Myceliophthora）、ネオカリマスティクス（Neocallimastix）、ノイロスポラ（Neurospora）、ペシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、フェネロケテ（Phanerochaete）、フレビア（Phlebia）、ピロミセス（Piromyces）、プレロータス（Pleurotus）、リゾープス（Rhizopus）、シゾフィルム（Schizophyllum）、タラロミセス（Talaromyces）、サーモアスクス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トラメテス（Trametes）、又はトリコデルマ（Trichoderma）から成る群から選択される宿主細胞など、のいずれであってもよい。例えば、前記宿主細胞は、アスペルギルス・オリゼ宿主細胞などのアスペルギルス宿主細胞であってもよい。
【０２６９】
本発明の方法において、先に記載したように、組換え宿主細胞は、当該技術分野で周知の方法を使用してＣ４‐ジカルボン酸輸送体の産生に好適な栄養培地中で培養される。
【０２７０】
遺伝子組み換えＣ４‐ジカルボン酸は、これだけに限定されるものではないが、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー）、電気泳動手法、示差溶解度、浸透性、蒸留、抽出（例えば、液間抽出）、パーベーパレーション、抽出濾過、膜濾過、膜分離、逆濾過、又は限外濾過を含めた当該技術分野で知られている手順（例えば、ＷＯ１９９８／０２２６１１及びＵ．Ｓ．７，６０１、８６５を参照）のいずれかを用いて、発酵培地から任意に回収できる。一例において、Ｃ４‐ジカルボン酸は、濾過によって発酵培地中の他の材料から回収される。
【０２７１】
前記方法の態様によって、任意に精製される前及び／又は精製された後の遺伝子組み換えＣ４‐ジカルボン酸は実質的に純粋である。Ｃ４‐ジカルボン酸（又はその具体的なＣ４‐ジカルボン酸、例えばリンゴ酸など）の産生方法に関して、「実質的に純粋」は、１５％以下の不純物質しか含んでいないＣ４‐ジカルボン酸の回収調製物を意図し、ここで、前記不純物質はＣ４‐ジカルボン酸以外の化合物を意図している。一変形形態において、実質的に純粋なＣ４‐ジカルボン酸調製物が提供され、ここで、前記調製物は、２５％以下の不純物質、２０％以下の不純物質、１０％以下の不純物質、５％以下の不純物質、３％以下の不純物質、１％以下の不純物質、又は０．５％以下の不純物質しか含んでいない。
【０２７２】
前記産生方法と本明細書中に記載した宿主細胞に関してＣ４‐ジカルボン酸の産生を試験するのに好適なアッセイは、当該技術分野で知られている方法を使用することで実施できる。例えば、最終的なＣ４‐ジカルボン酸産物（例えば、リンゴ酸）及び他の有機化合物は、例えば、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、ＧＣ‐ＭＳ（ガスクロマトグラフィー質量分析計）、ＬＣ‐ＭＳ（液体クロマトグラフィー質量分析計）などの方法又は当該技術分野で周知の日常的な手順を用いる他の好適な解析法によって分析できる。発酵ブロス中のＣ４‐ジカルボン酸の放出はまた、培養上清によっても試験できる。発酵培地中の副産物及び残存糖（例えば、グルコース）は、例えば、グルコースとアルコールに関する屈折率検出器、及び有機酸に関するＵＶ検出器を使用した、又は他の好適なアッセイ及び検出法を使用した、ＨＰＬＣによって定量化できる（Lin et al., Biotechnol. Bioeng. 90:775 -779 (2005)）。
【０２７３】
シグナルペプチド
本発明はまた、シグナルペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドにも関する。一態様において、シグナルペプチドは、配列番号２の第１〜６１又は１〜６８アミノ酸を含んで成るか又はそれから成る。態様によって、シグナルペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１の第１〜１８３又は１〜２０４ヌクレオチドである。別の態様において、シグナルペプチドは、配列番号４の第１〜１７アミノ酸を含んで成るか又はそれから成る。態様によって、シグナルペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、配列番号３の第１〜５１ヌクレオチドである。別の態様において、シグナルペプチドは、配列番号６の第１〜６８アミノ酸を含んで成るか又はそれから成る。態様によって、シグナルペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、配列番号５の第１〜２０４ヌクレオチドである。
【０２７４】
シグナルペプチド及び／又はプロペプチドに作用可能に連結されたポリヌクレオチドは、タンパク質をコードする遺伝子をさらに含んでいてもよい。前記タンパク質は、好ましくは、シグナルペプチド及び／又はプロペプチドにとって外来性である。
【０２７５】
本発明はまた、核酸構築物、発現ベクター、及びそういったポリヌクレオチドを含んで成る組換え宿主細胞にも関する。
本発明はまた、以下の：（ａ）そういったポリヌクレオチドを含んで成る組換え宿主細胞を培養し；そして（ｂ）タンパク質を回収すること、を含んで成るタンパク質の産生方法にも関する。
【０２７６】
タンパク質は、宿主細胞に対して固有でも異種でもよい。本明細書において用語「タンパク質」は、コードされる生成物の特定の長さを意味し、従って、ペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質を包含する。用語「タンパク質」にはまた、コードされる生成物を形成するように結合した２つまたはそれ以上のポリペプチドも包含される。タンパク質にはまた、ハイブリッドポリペプチド及び融合ポリペプチドも含まれる。
【０２７７】
好ましくはタンパク質は、ホルモンもしくはその変異体、酵素、受容体もしくはその一部、抗体もしくはその一部、又はレポーターである。例えば、タンパク質は、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、又はリガーゼ、例えば、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α‐ガラクトシダーゼ、β‐ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α‐グルコシダーゼ、β‐グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、別のリパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼなどである。
【０２７８】
遺伝子は、任意の原核生物、真核生物、又は他の供給源から得られる。
本発明を以下の例でさらに説明するが、これらは決して本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０２７９】
緩衝液及び基質として使用した化学物質は、少なくとも試薬等級の市販品であった。
真菌株
アスペルギルス・アクレアツスをＣ４‐ジカルボン酸輸送体タンパク質遺伝子ｃ４ｔ７３７、ｃ４ｔ５２１、及びｍａｔ７３７の供給源として使用した。アスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８（又はＡＴＣＣ５６７４７）を、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の供給源として、並びにＣ４‐ジカルボン酸の産生のために使用した。
【０２８０】
培地
ＹＥＧ培地は、１リットルあたり、２０ｇのグルコース、５ｇの酵母抽出物、及び脱イオン水から構成された。
【０２８１】
ＣＯＶＥプレートは、１Ｍのショ糖、２％のＣＯＶＥ塩類溶液、１０ｍＭのアセトアミド、１５ｍＭのＣｓＣｌ、及び２５ｇ／ｌのノーブル寒天から構成された。
【０２８２】
ＣＯＶＥ塩類溶液は、１リットルあたり、２６ｇのＫＣｌ、２６ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、７６ｇのＫＨ2ＰＯ4、５０ｍｌのＣＯＶＥ微量元素溶液、及び脱イオン水から構成された。
【０２８３】
ＣＯＶＥ微量元素溶液は、１リットルあたり、０．０４ｇのＮａ2Ｂ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ、０．０４ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、１．２ｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．７ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．８ｇのＮａ2ＭｏＯ2・２Ｈ2Ｏ、１０ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、及び脱イオン水から構成された。
【０２８４】
種培地は、１リットルあたり、４０ｇグルコース、６ｇのバクトペプトン、７５０ｍｇのＫＨ2ＰＯ4、７５０ｍｇのＫ2ＨＰＯ4、１００ｍｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１００ｍｇのＣａＣｌ2・Ｈ2Ｏ、５ｍｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、５ｍｇのＮａＣｌ、及び脱イオン水から構成された。
【０２８５】
種培地Ｂは、１リットルあたり、３０ｇのグルコース、３ｇのバクトペプトン、５６０ｍｇのＫＨ2ＰＯ4、５６０ｍｇのＫ2ＨＰＯ4、９２５ｍｇのＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ、８２０ｍｇのＮａ2ＨＰＯ4、７５ｍｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、７５ｍｇのＣａＣｌ2・Ｈ2Ｏ、０．７５ｍｌの１０００×Micronutrient Solution、及び脱イオン水から構成された。
【０２８６】
酸産生培地Ｃは、１リットルあたり、１００ｇのグルコース、８０ｇのＣａＣＯ3、６ｇのバクトペプトン、１５０ｍｇのＫＨ2ＰＯ4、１５０ｍｇのＫ2ＨＰＯ4、１００ｍｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１００ｍｇのＣａＣｌ2・Ｈ2Ｏ、１ｍｌの１０００×Micronutrient Solution、及び脱イオン水から構成された。
【０２８７】
発酵槽バッチ培地は、１リットルあたり、１２０ｇのグルコース、１２０ｇのＣａＣＯ3、９ｇのバクトペプトン、１５０ｍｇのＫＨ2ＰＯ4、１５０ｍｇのＫ2ＨＰＯ4、１００ｍｇのＭｇＳＯ・７Ｈ2Ｏ、１００ｍｇのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、５ｍｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、５ｍｇのＮａＣｌ、５ｍＬのPluronic L61、及び脱イオン水から構成された。
【０２８８】
１０００×Micronutrient Solutionは、１リットルあたり、５ｇのＮａＣｌ、５ｇのＦｅＳＯ4７Ｈ2Ｏ、１ｇのクエン酸、及び脱イオン水から構成された。
【０２８９】
ＰＤＡプレートは、３９ｇ／ｌのポテトデキストロース寒天から構成された。
【０２９０】
２×ＹＴ＋ａｍｐプレートは、１リットルあたり、１６ｇのトリプトン、１０ｇの酵母抽出物、５ｇのＮａＣｌ、１００ｍｇのアンピシリン、１５ｇのバクト寒天、及び脱イオン水から構成された。
【０２９１】
実施例１：アスペルギルス・アクレアツスＣ４‐ジカルボン酸輸送体遺伝子のクローニングと発現ベクターｐＳａＭＦ３５の構築
アスペルギルス・アクレアツスからのゲノムＤＮＡを、次のとおり単離した。２ｘ１０6個の胞子を振盪フラスコ内の１００ｍｌのＹＥＧ培地に植え付け、そしてそのフラスコを１６０ｒｐｍで振盪しながら３４℃にて一晩インキュベートした。菌糸を、ＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（登録商標）（Calbiochem, San Diego, CA, USA）を敷いた漏斗を使用した濾過によって集菌し、およそ２ｇの菌糸を、回収し、そして液体窒素中で冷凍した。冷凍菌糸を、ＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（登録商標）の中に包みながら、ハンマーですばや粉砕することによって破壊した。次に、破壊した菌糸を、１０ｍｌの１×溶解バッファー（１００ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ‐１００、０．５ＭのＧｕａｎｉｄｉｎｅ‐ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ）及び３μｌのＲＮアーゼＡ（QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA、１００ｍｇ／ｍｌ）の入った５０ｍｌ容ポリプロピレン製コニカル遠沈管に移した。その遠沈管をゆるやかにボルテックスすることで混合し、そして室温にて５分間インキュベートし、その後、１５０μｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA；２０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。その遠沈管を、転倒撹拌によって混合し、５０℃にて１時間インキュベートした。次に、その遠沈管を７２４０×ｇにて２０分間遠心分離した。次に、上清を、前平衡化ＱＩＡＧＥＮ‐チップ１００（QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA）に加え、そして残りのＤＮＡ抽出ステップを製造業者の取扱説明書に従って実施した。ＤＮＡを、１００μｌのＴＥバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ塩基、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中に再懸濁した。
【０２９２】
１１９４ｂｐのＣ４‐ジカルボン酸輸送体遺伝子ｃ４ｔ７３７を、次に示したプライマー０６９６９８と０６９６９９を使用することでアスペルギルス・アクレアツスのゲノムＤＮＡから増幅した。
【０２９３】
プライマー０６９６９８：
5’‐GTGATAGAACATCGTCCATAATGCTCGGGCAACACT‐3’（配列番号７）
プライマー０６９６９９：
5’‐GTGTCAGTCACCTCTAGTTATTACTCCGATACATCCTCGT‐3’（配列番号８）
【０２９４】
ＰＣＲ反応は、５μｌの１０×反応バッファー（Stratagene, La Jolla, CA, USA）、１μｌのＡ．アクレアツスのゲノムＤＮＡ鋳型（１０５ｎｇ／μｌ）、１μｌのプライマー０６９６９８（１００ｎｇ／μｌ）、１μｌのプライマー０６９６９９（１００ｎｇ／μｌ）、１μｌのｄＮＴＰ混合物（１０ｍＭ）、４０．５μｌの脱イオン水、及び０．５μｌのHerculase（登録商標）HotStart DNA polymerase（Stratagene, La Jolla, CA, USA）から構成された。増幅反応物を、９５℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９５℃にて１０秒間、６０℃にて３０秒間、及び７２℃にて１．５分間を１０サイクル；そしてそれぞれ９５℃にて１０秒間、６０℃にて３０秒間、及び７２℃にて１．５分間（１サイクルごとに１０秒追加）を２０サイクル、をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific Inc. Westbury, New York, USA）によりインキュベートした。次に、ＰＣＲ産物を、MinElute（登録商標）PCR Purification Kit（QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA）を使用して精製した。
【０２９５】
プラスミドｐＳｈＴｈ６０（図１；２０１０年８月２７日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／４７００２号も参照）を、Ｓｅｘ ＡＩとＰａｃ Ｉで消化し、ＴＢＥバッファー（１０．８ｇ／ＬのＴｒｉｓ塩基、５．５ｇ／Ｌのホウ酸、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中の０．８％のアガロースゲル電気泳動法によって分離し、そしてQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA）を使用して精製した。次に、前記精製したＰＣＲ産物を、２μｌの５×バッファー（Clontech、Mountain View CA、USA）、２．４μｌの精製ＰＣＲ産物（３３ｎｇ／μｌ）、１．５μｌの消化及びゲル精製ｐＳｈＴｈ６０（１３２ｎｇ／μｌ）、１μｌのIn‐Fusion（商標）酵素、及び３．１μｌの脱イオン水から構成されたIn‐Fusion（商標）Advantage反応キット（Clontech、Mountain View CA、USA）を使用して消化したｐＳｈＴｈ６０断片内に挿入した。反応物は、３７℃にて１５分間、５０℃にて１５分間インキュベートし、氷上に５分間置き、そして４０μｌのＴＥバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ塩基、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で希釈して、ｐＳａＭＦ３５（図２）を得た。
【０２９６】
ｐＳａＭＦ３５を含む先の連結反応の反応物の２．５μｌのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従ってONE SHOT（登録商標）TOP10化学的コンピテントＥ．コリ細胞（Invitrogen、San Diego CA、USA）内に形質転換した。形質転換体を、２×ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体を釣り出し、そしてＤＮＡ配列決定にかけてｃ４ｔ７３７遺伝子がベクター内に組み込まれたことを確認した。
【０２９７】
アスペルギルス・アクレアツスｃ４ｔ７３７遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）と推定アミノ酸配列（配列番号２）を図３に示す。そのコード配列は、終止コドンを含め１１９４ｂｐである。コードしている予測タンパク質は、４４．３ｋＤａの予測分子量と６．９３の等電点ｐＨを有する３９７個のアミノ酸である。前記その遺伝子はイントロンを全く含んでいない。。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6）を使用して、６１残基のシグナルペプチドは予測した。このプログラムに基づいて、予測成熟タンパク質は、３７．３ｋＤａの予測分子量と６．５２の等電点ｐＨを有する３３６個のアミノ酸を含んでいる。ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎプログラム（European Bioinformatics Institute）を使用して、６８個の残基のシグナルペプチドは予測した。このプログラムに基づいて、予測成熟タンパク質は、３６．５ｋＤａの予測分子量と６．５２の等電点ｐＨを有する３２９個のアミノ酸を含んでいる。
【０２９８】
実施例２：アスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８（ＳａＭＦ３５）内への発現ベクター断片の形質転換
ｐＳａＭＦ３５のとアスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８のプロトプラスト調製と形質転換を、約２ｘ１０7個の胞子を１００ｍｌのＹＥＧ培地中に植え付け、そしてそのフラスコを１４０ｒｐｍ、２７℃にて１６〜１８時間インキュベートすることによって実施した。菌糸を、培養物をＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（登録商標）（Calbiochem, San Diego, CA, USA）を敷いた無菌の漏斗に注ぎ入れ、５０ｍｌの０．７Ｍ ＫＣｌですすぐことで集菌した。洗浄した菌糸を、１ｍｌの（濾過滅菌した）０．７Ｍ ＫＣｌあたり、５ｍｇのGLUCANEX（商標）（Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark）及び０．５ｍｇキチナーゼ（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA）から構成された２０ｍｌのプロトプラスト化溶液の入った１２５ｍｌ容フラスコ中に再懸濁し、そして８０ｒｐｍで混合しながら３４℃にて３０分間インキュベートした。プロトプラスト化溶液を、ＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（登録商標）を敷いた無菌の漏斗に注ぎ入れ、そして５０ｍｌのＳＴＣバッファー（１Ｍのソルビトール‐１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ６．５‐１０ｍＭのＣａＣｌ2）ですすいだ。流れ出たものを２本の５０ｍｌ容ポリプロピレン製チューブ内に回収した。そのチューブを１３００×ｇ、室温にて１０分間遠心分離した。上清を捨て、そしてプロトプラストペレットを２０ｍｌのＳＴＣバッファーで再懸濁した。プロトプラストを、ペレットを室温にて２０ｍｌのＳＴＣバッファーで再懸濁し、そして１３００×ｇにて１０分間遠心分離することを２ラウンド行うことによって洗浄した。最終的なペレットを、２ｍｌのＳＴＣバッファーで再懸濁した。プロトプラストを、１０μｌのサンプルを取り出し、そして血球計（VWR、West Chester, PA、USA）でそれらをカウントすることによってカウントした。体積を、ＳＴＣバッファーで調整し、１ｍｌあたり２×１０7個のプロトプラスト濃度を得た。
【０２９９】
プラスミドｐＳａＭＦ３５を、Ｐｍｅ Ｉでの制限消化によって形質転換のために調製した。４９７７ｂｐの発現カセットを、QIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kitを使用してＴＢＥバッファー中の０．８％アガロースゲル電気泳動法によって消化したベクターから分離し、そして精製した。２つの形質転換反応物を調製した。各反応として、プロトプラスト調製物の１００μｌの溶液を、１２ｍｌ容ポリプロピレン製チューブに移し、そこに５μｇの線状化ｐＳａＭＦ３５、２５０μｌのＰＥＧ溶液（６０％ ｗ／ｖのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、１０ｍＭのＴｒｉｓ６．５、１０ｍＭのＣａＣｌ）を加え、続いて緩やかに混合し、そして３７℃にて３０分間インキュベートした。各形質転換体を９ｍｌのＳＴＣバッファーで希釈し、続いて３ｍｌの別々の３つのアリコートをＣＯＶＥプレート上で平板培養した。次に、各プレートを、３４℃にて７〜１０日間インキュベートした。２０個のＳａＭＦ３５形質転換体を、個々のＣＯＶＥプレートに移し、３４℃にて５日間インキュベートした。胞子ストックを、０．１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０中に胞子を回収することによって調製した。培養物を、それぞれグリセロールストック（８００μｌの胞子ストック、２００μｌの０．１％ ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）を調製することによって保存し、そして８０℃にて冷凍した。
【０３００】
実施例３：ｐＳａＭＦ３５の発現ベクター断片を含むアスペルギルス・オリゼ形質転換体（ＳａＭＦ３５）の振盪フラスコ培養におけるリンゴ酸の産生
実施例２に記載のそれぞれのｐＳａＭＦ３５形質転換体と、対照としてのアスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８からの胞子を、個々のＰＤＡプレート上で平板培養し、そして３４℃にて５〜７日間胞子を形成させた。胞子を０．１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０中に回収し、そして血球計を使用してカウントした。種培養を、１００ｍｌの種培地Ｂを含む２５０ｍｌ容フラスコ内に調製し、３００μｌの胞子懸濁液を接種した。種培養物を、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃にて約１７時間培養した。酸産生培養物を、５０ｍｌの酸産生培地Ｃと３ｍｌの１７時間種培養物を含む２５０ｍｌ容バッフルなしフラスコ内に調製した。培養物を、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃にて２〜１０日間インキュベートした。
【０３０１】
振盪フラスコ培養形質転換体のリンゴ酸の定量化は、1200Series Binary LC Systemと1200Series Diode Array Detector（ＤＡＤ）（Agilent Technologies、Santa Clara, CA USA）を使用したReverse Phase High Pressure Liquid Chromatography（ＲＰ‐ＨＰＬＣ）によって実施した。逆相分離を、Aqua５μ Ｃ１８ １２５Å ２０５×４．６ｍｍのＩＤカラムとＡＱ Ｃ１８ ４ｘ３．０ｍｍのSecurity Guard Cartridge（Phenomenex, Inc., Torrance, CA, USA）を使用して実施した。移動相は、１０％のメタノール（ＨＰＬＣ等級）と９０％の１４５ｍＭ ホスファート ｐＨ１．５バッファーから成っていた。
【０３０２】
全培養物サンプルは取り出し、次に、８５０ｍｌの６４ｍＭ リン酸緩衝液と１５０ｍｌのメタノールｐＨ１．６５から構成されたHPLC Running Bufferで１：１０に希釈した。次に、サンプルを、２５ｍｍの０．４５ミクロン・ポリエーテルスルホン膜（Whatman, Florham Park, NJ, USA）を通して濾過し、そして１．５ｍｌの濾液を酸性分析のためにＨＰＬＣバイアル中に入れた。振盪フラスコ培養物の残量を、３層の寒冷紗を通して濾過し、そして１０倍量の二重蒸留した滅菌水で３回をすすいで、不溶性ＣａＣＯ3を取り除いた。細胞ペレットを、寒冷紗から回収し、１５ｍｌ容培養試験管中に入れ、−２０℃にて保存した。
【０３０３】
ＲＰ‐ＨＰＬＣを、２５℃のカラム温度と１１分のランタイムを用いて０．７ｍｌ／分の流量（等張）にて１０μｌの注入体積を使用して実施した。検出は、３６０ｎｍにて４０ｎｍのバンド幅を基準に用い、２１０ｎｍにて８ｎｍのバンド幅に設定した。ボイド時間を３．８分に決定した。４９．２〜３．９３ｍＭの範囲の濃度を有する連続的に希釈したリンゴ酸標準の複数回の注入を実施することによって、リンゴ酸について逆相法の定量性能を決定した。複数回の注入の相対標準偏差（ＲＳＤ）は≦５％であった。リンゴ酸はＲ2≧０．９９９９を示す。
【０３０４】
ｐＳａＭＦ３５を含むアスペルギルス・オリゼ形質転換体は、３日間の振盪フラスコ培養後にアスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８対照を２倍超上回るリンゴ酸産生の改善を示した。
【０３０５】
実施例３Ｂ：ｐＳａＭＦ３５の発現ベクター断片を含むアスペルギルス・オリゼ形質転換体（ＳａＭＦ３５）の発酵
実施例２に記載のアスペルギルス・オリゼｐＳａＭＦ３５形質転換体と、対照形質転換体であるアスペルギルス・オリゼＳｈＴｈ１０４０（２０１０年８月２７日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／４７００２号を参照）を調製し、そして以下の実施例７に記載のとおり発酵させた。
【０３０６】
発酵中のリンゴ酸の定量化を先に記載したように実施した。アスペルギルス・オリゼｐＳａＭＦ３５形質転換体の相対リンゴ酸力価は、アスペルギルス・オリゼＳｈＴｈ１０４０形質転換体に匹敵しているので、先に記載のＳｈＴｈ１０４０とＮＲＲＬ３４８８の比較を根拠に、アスペルギルス・オリゼｐＳａＭＦ３５形質転換体はアスペルギルスオリゼーＮＲＲＬ３４８８対照（過剰発現Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体遺伝子を欠いている）より優れていることを示唆している。
【０３０７】
実施例４：アスペルギルス・アクレアツスＣ４‐ジカルボン酸輸送体遺伝子のクローニングと発現ベクターｐＳａＭＦ３６の構築
１２５７ｂｐのＣ４‐ジカルボン酸輸送体遺伝子ｃ４ｔ５２１を、以下に示したプライマー０６９７００と０６９７０１を使用して単離されたアスペルギルス・アクレアツスゲノムＤＮＡ（実施例１）から増幅した。
【０３０８】
プライマー０６９７００：
5’‐TGTGATAGAACATCGTCCATAATGCACGACCACAGC‐3’（配列番号９）
プライマー０６９７０１：
5’‐GTGTCAGTCACCTCTAGTTATCATTCGAACAACTCGGACA‐3’（配列番号１０）
【０３０９】
ＰＣＲ反応物は、１０μｌの５×反応バッファー、１μｌのＡ．アクレアツス・ゲノムＤＮＡ鋳型（１０５ｎｇ／μｌ）、１μｌのプライマー０６９７００（１００ｎｇ／μｌ）、１μｌのプライマー０６９７０１（１００ｎｇ／μｌ）、１μｌのｄＮＴＰ混合物（１０ｍＭ）、３５．５μｌの脱イオン水、及び０．５μｌのPhusion（商標）Hot Start High‐Fidelity DNAポリメラーゼ（Finnzymes, Inc, Massachusetts, USA）から構成された。増幅反応物を、９８℃にて３０秒間を１サイクル；それぞれ９８℃にて１０秒間、６０℃にて３０秒間、及び７２℃にて１分間を３０サイクル；そして７２℃にて１０分間を１サイクルとプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）によりインキュベートした。ＰＣＲ産物を、Ｄｐｎ Ｉで１時間消化し、すべてのプラスミドＤＮＡ鋳型を分解した。
【０３１０】
プラスミドｐＳｈＴｈ６０（図１）を、Ｓｅｘ ＡＩとＰａｃ Ｉで消化し、ＴＢＥバッファー中の０．８％のアガロースゲル電気泳動法で分離し、そしてQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kitを使用して精製した。次に、先の精製したＰＣＲ産物を、２μｌの５×バッファー、３μｌの精製したＰＣＲ産物（２６ｎｇ／μｌ）、１．５μｌのゲル精製したＳｅｘ ＡＩ及びＰａｃ Ｉ消化、ゲル精製ｐＳｈＴｈ６０（１３２ｎｇ／μｌ）、１μｌのIn‐Fusion（商標）酵素、及び２．５μｌの脱イオン水から構成されたIn‐Fusion（商標）Advantage反応キットを使用して消化したｐＳｈＴｈ６０断片内に挿入した。反応物を、３７℃にて１５分間、５０℃にて１５分間インキュベートし、５分間氷上に置き、そして４０μｌのＴＥバッファーで希釈して、ｐＳａＭＦ３６（図４）を得た。
【０３１１】
先のの連結反応物の２．５μｌのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従ってONE SHOT（登録商標）TOP10化学的コンピテントＥ．コリ細胞に形質転換した。形質転換体を２×ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体を釣り出し、そしてＤＮＡ配列決定にかけて、ｍａｔ５２１遺伝子が首尾よくベクター内に組み込まれたことを確認した。
【０３１２】
アスペルギルス・アクレアツスｃ４ｔ５２１遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）と推定アミノ酸配列（配列番号４）を図５に示す。コード配列は、終止コドンを含めて１２５７ｂｐである。コードしている予測タンパク質は、４６．８ｋＤａの予測分子量と６．３６の等電点ｐＨを有する４１８個のアミノ酸である。その遺伝子はイントロンを全く含んでいない。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6）を使用して、１７残基のシグナルペプチドを予測した。このプログラムに基づいて、予測成熟タンパク質は、４４．９ｋＤａの予測分子量と６．８９の等電点ｐＨを有する４０１個のアミノ酸を含んでいる。
実施例５：アスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８内へのｐＳａＭＦ３６の発現ベクター断片の形質転換（ＳａＭＦ３６）
プロトプラスト調製とアスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８の形質転換を、実施例２に記載のとおり実施した。
【０３１３】
プラスミドｐＳａＭＦ３６を、Ｐｍｅ Ｉでの制限消化によって形質転換のために調製した。５０４０ｂｐの発現カセットを、ＴＢＥバッファー中の０．８％のアガロースゲル電気泳動法によって消化したベクターから分離し、そしてQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kitを使用して精製した。２つの形質転換反応物を調製した。
【０３１４】
各形質転換反応として、１００μｌのプロトプラスト調製物を１２ｍｌ容ポリプロピレン製チューブに移し、そこに５μｇの線状化ｐＳａＭＦ３６と２５０μｌのＰＥＧ溶液（６０％ ｗ／ｖのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、１０ｍＭのＴｒｉｓ６．５、１０ｍＭのＣａＣｌ）を加え、続いて緩やかに混合し、そして３７℃にて３０分間インキュベートした。各形質転換体を９ｍｌのＳＴＣバッファーで希釈し、続いて３ｍｌの別々の３つのアリコートをＣＯＶＥプレート上で平板培養した。次に、各プレートを３４℃にて７〜１０日間インキュベートした。２０個のＳａＭＦ３６形質転換体を、個々のＣＯＶＥプレートに移し、そして３４℃にて５日間インキュベートした。胞子ストックを、０．１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０中に胞子を回収することによって調製した。培養物を、それぞれのグリセロールストック（８００μｌの胞子ストック、２００μｌの０．１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）を調製することによって保存し、−８０℃にて冷凍した。
【０３１５】
実施例６：ｐＳａＭＦ３６（ＳａＭＦ３６）の発現ベクター断片を含むアスペルギルス・オリゼ形質転換体の振盪フラスコ培養におけるリンゴ酸の産生
実施例５に記載のそれぞれのｐＳａＭＦ３６形質転換体と、対照としてのアスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８からの胞子を、実施例３に記載のとおり調製した。振盪フラスコ培養形質転換体のリンゴ酸の定量化を、実施例３に記載のとおり実施した。
【０３１６】
表１には、３日間の振盪フラスコ培養後の、対照としてのアスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８のリンゴ酸産生と比較した、形質転換体であるアスペルギルス・オリゼＳａＭＦ３６‐３及びアスペルギルス・オリゼＳａＭＦ３６‐４のリンゴ酸力価の相対的増加が示されている。アスペルギルス・オリゼＳａＭＦ３６‐３及びアスペルギルス・オリゼＳａＭＦ３６‐４は、アスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８と比較して、それぞれ２．１倍及び２．３倍のリンゴ酸力価の増大を生じた。
【０３１７】
【表１】
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【０３１８】
実施例７：ｐＳａＭＦ３６の発現ベクター断片を含むアスペルギルス・オリゼ形質転換体（ＳａＭＦ３６）の発酵
実施例５に記載のアスペルギルス・オリゼｐＳａＭＦ３６形質転換体と対照形質転換体であるアスペルギルス・オリゼＳｈＴｈ１０４０（２０１０年８月２７日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／４７００２号を参照）を、３４℃にて約７日間ＰＤＡプレート上で培養した。０．２％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含む５〜６ｍｌの体積の無菌５０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．８）を、それぞれ平板培養に加え、そして胞子を、白金耳で掻き取ることによって懸濁した。各懸濁液をピペットによって５０ｍｌ容コニカルチューブに移した。各チューブに関して、２５ｍｌの無菌リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．８）を、７５ｍｌの種培地の入った５００ｍｌ容バッフルなしフラスコに加え、次にそこに２ｍｌの胞子懸濁液を植え付けた。次に、そのフラスコを１８０ｒｐｍ、３４℃にて約２４時間インキュベートした。１タンクあたりに必要とされる１４４ｍｌの種菌を供給するために、種フラスコを組み合わせた。
【０３１９】
１．８リットルの発酵槽バッチ培地を含む３リットル容発酵槽に、アスペルギルス・オリゼｐＳａＭＦ３６形質転換体又はアスペルギルス・オリゼＳｈＴｈ１０４０形質転換体のいずれかの組み合わせ種フラスコからの種培養ブロス１４４ｍｌ（８％）を導入することによって、個別に植え付けをした。この実施例だけに関しては、発酵槽バッチ培地中のグルコース濃度を、６０ｇ／Ｌまで減らし、そして給餌開始が１日遅れた。発酵槽を、３４℃±０．１℃に平衡化し、５００ｒｐｍで撹拌した。流入気流を１ｖ／ｖ／ｍで維持した。２０％のグルコース流を、発酵約４３時間で開始し、約７．３ｇ／時間の速度で投与した。無菌ＣａＣＯ3（約１００ｇ）を５日又は６日目周りで加えて、６〜７の範囲に発酵ｐＨを保った。サンプルを毎日抜き取り、そして実施例３に記載のリンゴ酸産生について分析した。発酵を７又は８日間で終了した。
【０３２０】
発酵におけるリンゴ酸の定量化を、実施例３に記載のとおり実施した。アスペルギルス・オリゼｐＳａＭＦ３６形質転換体の相対リンゴ酸力価は、アスペルギルス・オリゼＳｈＴｈ１０４０に匹敵しているので、先に記載したＳｈＴｈ１０４０とＮＲＲＬ３４８８の比較を根拠に、アスペルギルス・オリゼｐＳａＭＦ３６形質転換体がアスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８（過剰発現Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体遺伝子を欠いている）よりリンゴ酸産生に優れていることを示唆している。
【０３２１】
実施例８：アスペルギルス・オリゼ・リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニングと発現ベクターｐＳａＭＦ２１の構築
プラスミドｐＳａＭＦ２１を、ＮＡＤ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ３）遺伝子配列（ＤＯＧＡＮ：ＡＯ０９０７０１００００１３）（２０１０年８月２７日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／４７００２号に記載のアスペルギルスオリゼーからの１４３０ｂｐの断片）を含むように構築した。アスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８リンゴ酸デヒドロゲナーゼｍｄｈ３遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１１）と推定アミノ酸配列（配列番号１２）を図６に示す。
【０３２２】
（終止コドンを含めて）１４３０ｂｐのゲノムコード配列は、３５ｋＤａの予測質量を有する３３０個のアミノ酸から成るポリペプチドをコードする。コード配列は、５７ｂｐ（１４〜７０ｂｐ）、７０ｂｐ（１０３〜１７２ｂｐ）、７４ｂｐ（２８４〜３５７ｂｐ）、６８ｂｐ（４４６〜５１３ｂｐ）、５８ｂｐ（８９２〜９４９ｂｐ）、４８ｂｐ（１０３５〜１０８２ｂｐ）、及び６２ｂｐ（１２２８〜１２８９ｂｐ）の７つのイントロンが割り込んでいる。ｍｄｈ３遺伝子のコード領域のＧ＋Ｃ含有量は５０．３％である。
【０３２３】
簡単に言えば、プラスミドを、Ｓｅｘ ＡＩとＰａｃ Ｉでの制限消化によるｐＳｈＴｈ６０（図１）の線形化によって構築した。消化したベクターを、ＴＢＥバッファー中の０．８％のアガロースゲル電気泳動法で分離し、そしてQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kitを使用して精製した。ｍｄｈ３遺伝子を、プライマー０６７５２２と０６７５２５を使用してｐＳｈＴｈ７１（２０１０年８月２７日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／４７００２号）から増幅した。
【０３２４】
プライマー０６７５２２：
5’‐AGAACATCGTCCATAATGGTCAAAGCTGGTGAGTTA‐3’（配列番号１３）
プライマー０６７５２５：
5’‐GTGTCAGTCACCTCTAGTTATTACTTTGGTGGTGGGTTCT‐3’（配列番号１４）
【０３２５】
ＰＣＲ反応物は、５μｌの１０×反応バッファー、１μｌのｐＳｈＴｈ７１鋳型（８７ｎｇ／μｌ）、１μｌのプライマー０６７５２２（１００ｎｇ／μｌ）、１μｌのプライマー０６７５２５（１００ｎｇ／μｌ）、１μｌのｄＮＴＰ混合物（１０ｍＭ）、４５．５μｌの脱イオン水、及び０．５μｌのHerculase（登録商標）Hot Start DNAポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, CA, USA）から構成された。増幅反応物を、９５℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９５℃にて１０秒間、５８℃にて３０秒間、及び７２℃にて１．５分間を１０サイクル；それぞれ９５℃にて１０秒間、５０℃にて３０秒間、及び７２℃にて１．５分間（１サイクルごとに１０秒追加）を２０サイクルとプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）によりインキュベートした。ＰＣＲ反応物を、Ｄｐｎ Ｉでの制限消化に１時間晒して、すべてのプラスミドＤＮＡ鋳型を分解した。次に、ＰＣＲ産物を、MinElute（登録商標）PCR Purification Kit（QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA）を使用して精製した。精製したＰＣＲ産物を、２μｌの５×バッファー、０．５μｌの精製したＰＣＲ産物（１１０ｎｇ／μｌ）、１．７μｌのゲル精製したＳｅｘ ＡＩとＰａｃ Ｉで制限消化したｐＳｈＴｈ６０（図１；７８ｎｇ／μｌ）、１μｌのIn‐Fusion（商標）酵素、及び４．８μｌの脱イオン水から構成されたIn‐Fusion（商標）Advantage反応を使用してベクター内に挿入した。反応物を、３７℃にて１５分間、続いて５０℃にて１５分間インキュベートし、その後それを氷上に５分間置き、そして４０μｌのＴＥバッファーで希釈して、ｐＳａＭＦ２１（図７）を得た。連結反応物の２μｌのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従ってONE SHOT（登録商標）TOP10化学的コンピテントＥ．コリ細胞（Invitrogen、San Diego CA、USA）に形質転換した。形質転換体を、２×ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体を、ＤＮＡ配列決定にかけて、ｍｄｈ３遺伝子が首尾よくベクター内に組み込まれことを確認した。
【０３２６】
実施例９：アスペルギルス・オリゼ・ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子のクローニングと発現ベクターｐＲｙａｎ１の構築
プラスミドｐＲｙａｎ１を、２０１０年８月２７日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／４７００２号に記載のアスペルギルスオリゼーからの（２つの終止コドンを含めて）３６４６ｂｐの断片であるピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）遺伝子配列（ＤＯＧＡＮ：ＡＯ０９００２３０００８０１）を含むように構築した。アスペルギルス・オリゼ・ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１５）と推定アミノ酸配列（配列番号１６）を、図８Ａと８Ｂに示す。アスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８とＡＴＣＣ５６７４７ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子は共に、同じヌクレオチド配列を有する。（１つの終止コドンを含む）３６４３ｂｐのゲノムコード配列は、１３１ｋＤａの予測質量で１１９３個のアミノ酸から成るポリペプチドをコードする。コード配列には、６１ｂｐ（３４７５〜３５３５ｂｐ）の１つのイントロンが割り込んでいる。遺伝子のコード領域のＧ＋Ｃ含有量は５７．１％である。
【０３２７】
簡単に言えば、プラスミドを、Ｓｅｘ ＡＩとＰａｃ Ｉでの制限消化によるｐＳｈＴｈ６０（図１）の線形化によって構築した。消化したベクターを、ＴＢＥバッファー中の０．８％のアガロースゲル電気泳動法で分離し、そしてQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kitを使用して精製した。ｐｙｃ遺伝子を、アスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８ゲノムＤＮＡから以下に示したプライマー０６６５４９と０６７３８８を使用して増幅した。
【０３２８】
プライマー０６６５４９：
5’‐TAGAACATCGTCCATAATGGCGGCTCCGTTTCGTCA‐3’（配列番号１７）
プライマー０６７３８８：
5’‐GTGTCAGTCACCTCTAGTTATTATTACGCTTTGACGATCT‐3’（配列番号１８）
【０３２９】
ＰＣＲ反応物は、５μｌの１０×反応バッファー、１μｌのアスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８ゲノムＤＮＡ（１１０ｎｇ／μｌ）、１μｌのプライマー０６６５４９（１００ｎｇ／μｌ）、１μｌのプライマー０６７３８８（１００ｎｇ／μｌ）、１μｌのｄＮＴＰ混合物（１０ｍＭ）、４５．５μｌの脱イオン水、及び０．５μｌのHerculase（登録商標）HotStart DNAポリメラーゼから構成された。増幅反応を、９５℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９５℃にて１０秒間、５８℃にて３０秒間、及び７２℃にて３．５分間を１０サイクル；それぞれ９５℃にて１０秒間、５８℃にて３０秒間、及び７２℃にて３．５分間（１サイクルごとに１０秒追加）を２０サイクルとプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）によりインキュベートした。次に、ＰＣＲ産物を、MinElute（登録商標）PCR Purification Kitを使用して精製した。
【０３３０】
精製したＰＣＲ産物を、２μｌの５×バッファー、１μｌのＰＣＲ産物（１４４ｎｇ／μｌ）、２μｌのゲル精製したＳｅｘ ＡＩとＰａｃ Ｉで制限消化したｐＳｈＴｈ６０（図１；７８ｎｇ／μｌ）、１μｌのIn‐Fusion（商標）酵素、及び４μｌの脱イオン水から構成されたIn‐Fusion（商標）Advantage反応を使用してベクター内に挿入した。反応物を、３７℃にて１５分間、続いて５０℃にて１５分間インキュベートし、その後それを氷上に５分間置き、４０μｌのＴＥバッファーで希釈して、ｐＲＹＡＮ１（図９）を得た。連結反応物の２μｌのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従ってONE SHOT（登録商標）TOP10化学的コンピテントＥ．コリ細胞に形質転換した。形質転換体を、２×ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体を、ＤＮＡ配列決定にかけて、ｐｙｃの遺伝子が首尾よくベクター内に組み込まれたことを確認した。第１３０８ヌクレオチドを、ＣからＴに変更したが、タンパク質配列に影響しなかった。
【０３３１】
実施例１０：アスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８内へのｐＳａＭＦ３６、ｐＳａＭＦ２１、及びｐＲｙａｎ１の発現ベクター断片の形質転換（ＳａＭＦ３６０３）
ベクターｐＳａＭＦ３６（実施例４）、ｐＳａＭＦ２１（実施例８）、及びｐＲｙａｎ１（実施例９）を、形質転換のためにＰｍｅ Ｉを用いて３７℃にて４時間消化することによって調製した。消化したベクターを、０．８％のアガロースＴＢＥゲルにより分離し、５０４０ｂｐのバンドをｐＳａＭＦ３６のために切り出し、５２１３ｂｐのバンドをｐＳａＭＦ２１のために切り出し、そして７４２９ｂｐのバンドをｐＲｙａｎ１のために切り出した。発現カセットを含むバンドを、製造業者の取扱説明書に従ってMacherey‐Nagel Nucleospin（登録商標）Extract II Kit（Dijren, Germany）を使用してそれぞれ精製した。
【０３３２】
３つの形質転換反応物を調製した。各形質転換反応として、１００μｌのプロトプラスト調製物（実施例２）を１２ｍｌ容ポリプロピレン製チューブに移した。これに、等モル当量且つ２５０μｌのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液（６０％ ｗ／ｖのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、１０ｍＭのＴｒｉｓ６．５、１０ｍＭのＣａＣｌ）中、合計５マイクログラムの、ａｍｐマーカー不含、線状化ｐＳｈＴｈ１０４、ｐＳａＭＦ２１、及びｐＲｙａｎ１を加え、続いて緩やかに混合し、そして、３７℃にて３０分間インキュベートした。各形質転換を、９ｍｌのＳＴＣバッファーで希釈し、続いて３ｍｌの別々の３つのアリコートをＣＯＶＥプレート上で平板培養した。次に、各プレートを３４℃にて７〜１０日間インキュベートした。得られた形質転換体を、個々のＣＯＶＥプレートに移し、３４℃にて５日間インキュベートした。胞子ストックを、０．１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０中に胞子を回収することによって調製した。培養物を、それぞれ（８００μｌの胞子ストック、２００μｌの０．１％ ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）のグリセロールストックを調製することによって保存し、−８０℃にて冷凍した。
【０３３３】
実施例１１：ｐＳａＭＦ３６、ｐＳａＭＦ２１、及びｐＲｙａｎ１の発現ベクター断片を含むアスペルギルス・オリゼ形質転換体（ＳａＭＦ３６０３）の振盪フラスコ培養におけるリンゴ酸の産生
実施例１０に記載のそれぞれのアスペルギルス・オリゼ三重形質転換体ＳａＭＦ３６０３と、対照としてのアスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８からの胞子を、実施例３に記載のとおり調製した。振盪フラスコ培養形質転換体のリンゴ酸の定量化を、実施例３に記載のとおり実施した。
【０３３４】
ｐＳａＭＦ３６、ｐＳａＭＦ２１、及びｐＲｙａｎ１を含有するアスペルギルス  ・オリゼ形質転換体ＳａＭＦ３６０３は、アスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８対照株を２．５５倍超上回るリンゴ酸産生の改善を示した。
【０３３５】
実施例１２：ｐＳａＭＦ３６、ｐＳａＭＦ２１、及びｐＲｙａｎ１の発現ベクター断片を含むアスペルギルス・オリゼ形質転換体（ＳａＭＦ３６０３）の発酵
実施例１０に記載のアスペルギルス・オリゼ三重形質転換体ＳａＭＦ３６０３及び対照形質転換体アスペルギルス・オリゼＳａＭＦ２１０３（２０１０年８月２７日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／４７００２号を参照）を、実施例７に記載のとおり調製し、そして発酵させた。
【０３３６】
発酵におけるリンゴ酸の定量化を、実施例３に記載のとおり実施した。アスペルギルス・オリゼ三重形質転換体ＳａＭＦ３６０３の相対リンゴ酸力価は、アスペルギルス・オリゼ形質転換体ＳａＭＦ２１０３に匹敵しているので、以前に記載した比較を根拠に、アスペルギルス・オリゼ三重形質転換体ＳａＭＦ３６０３は、アスペルギルス・オリゼｐＳａＭＦ３６単独形質転換体及びアスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８対照の両方より優れていることが示唆された。
【０３３７】
実施例１３：アスペルギルス・アクレアツスＣ４‐ジカルボン酸輸送体遺伝子のクローニングと発現ベクターｐＳａＭＦ３８の構築
１１９４ｂｐのＣ４‐ジカルボン酸輸送体遺伝子ｍａｔ７３７を、ｐＡａＭＡＴ７３７（図１０；ＤＮＡ２．０、Menlo Park CA、USA）内に合成によって構築した。ｍａｔ７３７遺伝子を、プライマー０６９６９８と０６９６９９（実施例１）を使用してｐＡａＭＡＴ７３７から増幅した。
【０３３８】
ＰＣＲ反応物は、１０μｌの５×反応バッファー、１μｌのｐＡａＭＡＴ７３７鋳型（２０ｎｇ／μｌ）、１μｌのプライマー０６９６９８（１００ｎｇ／μｌ）、１μｌのプライマー０６９６９９（１００ｎｇ／μｌ）、１μｌのｄＮＴＰ混合物（１０ｍＭ）、３５．５μｌの脱イオン水、及び０．５μｌのPhusion（登録商標）Hot Start High‐Fidelity DNAポリメラーゼから構成された。増幅反応物を、９８℃にて３０秒間を１サイクル；それぞれ９８℃にて１０秒間、６５℃にて３０秒間、及び７２℃にて１分間を３０サイクル；７２℃にて１０分間を１サイクルとプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）によりインキュベートした。ＰＣＲ反応物を、Ｄｐｎ Ｉを用いて１時間消化し、すべてのプラスミドＤＮＡ鋳型を分解した。ＰＣＲ産物を、MinElute（登録商標）PCR Purification Kitを使用して精製した。
【０３３９】
プラスミドｐＳｈＴｈ６０（図１）を、Ｓｅｘ ＡＩとＰａｃ Ｉで消化し、ＴＢＥバッファー（１０．８ｇ／ＬのＴｒｉｓ塩基、５．５ｇ／Ｌのホウ酸、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中の０．８％のアガロースゲル電気泳動法で分離し、そしてQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kitを使用して精製した。先の精製したＰＣＲ産物を、２μｌの５×バッファー、０．５μｌの精製したＰＣＲ産物（１８７ｎｇ／μｌ）、１．５μｌの消化及びゲル精製したｐＳｈＴｈ６０（１３２ｎｇ／μｌ）、１μｌのIn‐Fusion（商標）酵素、及び５μｌの脱イオン水から構成されたIn‐Fusion（商標）Advantage反応キットを使用して消化したｐＳｈＴｈ６０断片内に挿入した。反応物を、３７℃にて１５分間、５０℃にて１５分間インキュベートし、５分間氷上に置き、そして４０μｌのＴＥバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ塩基、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で希釈して、ｐＳａＭＦ３８（図１１）を得た。
【０３４０】
ｐＳａＭＦ３８を含む先の連結反応物の２．５μｌのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従ってONE SHOT（登録商標）TOP10化学的コンピテントＥ．コリ細胞に形質転換した。形質転換体を、２×ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体を、ＤＮＡ配列決定にかけて、ｍａｔ７３７遺伝子がベクター内に組み込まれたことを確認した。
【０３４１】
ｍａｔ７３７遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）と推定アミノ酸配列（配列番号６）を図１２に示す。コード配列は、終止コドンを含めて１１９４ｂｐである。コードしている予測タンパク質は、４４．３ｋＤａの予測分子量と７．３２の等電点ｐＨを有する３９７個のアミノ酸である。その遺伝子はイントロンを全く含んでいない。ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎプログラム（European Bioinformatics Institute）を使用して、６８残基のシグナルペプチドが予測された。このプログラムに基づいて、予測成熟タンパク質は、３６．６ｋＤａの予測分子量と６．５２の等電点ｐＨを有する３２９個のアミノ酸を含んでいる。
【０３４２】
実施例１４：アスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８内への発現ベクター断片ｐＳａＭＦ３８の形質転換（ＳａＭＦ３８）
アスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８のプロトプラスト調製及び形質転換を、実施例２に記載のとおり実施した。
【０３４３】
プラスミドｐＳａＭＦ３８を、形質転換のためにＰｍｅ Ｉで制限消化することによって調製した。４９７７ｂｐの発現カセットを、ＴＢＥバッファー中の０．８％のアガロースゲル電気泳動法により消化したベクターから分離し、そしてMacherey‐Nagel Nucleospin Extract II Kitを使用して精製した。２つの形質転換反応物を調製した。各形質転換反応として、１００μｌのプロトプラスト調製物を、１２ｍｌ容ポリプロピレン製チューブに移し、それに５μｇの線状化ｐＳａＭＦ３８と２５０μｌのＰＥＧ溶液（６０％ ｗ／ｖのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、１０ｍＭのＴｒｉｓ ６．５、１０ｍＭのＣａＣｌ）を加え、続いて緩やかに混合し、そして３７℃にて３０分間インキュベートした。各形質転換を、９ｍｌのＳＴＣバッファーで希釈し、続いて３ｍｌの別々の３つのアリコートをＣＯＶＥプレート上で平板培養した。次に、各プレートを、３４℃にて７〜１０日間インキュベートした。２０個のＳａＭＦ３８形質転換体を、個々のＣＯＶＥプレートに移し、３４℃にて５日間インキュベートした。胞子ストックを、０．１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０中に胞子を回収することによって調製した。培養物を、それぞれのグリセロールストック（８００μｌの胞子ストック、２００μｌの０．１％ ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）を調製することによって保存し、−８０℃にて冷凍した。
【０３４４】
実施例１５：ｐＳａＭＦ３８の発現ベクター断片を含むアスペルギルス・オリゼ形質転換体（ＳａＭＦ３８）の振盪フラスコ培養におけるリンゴ酸の産生
実施例１４に記載のアスペルギルス・オリゼｐＳａＭＦ３８形質転換体と、対照としてのアスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８からの胞子を、実施例３に記載のとおり調製した。振盪フラスコ培養形質転換体のリンゴ酸の定量化を、実施例３に記載のとおり実施した。
【０３４５】
アスペルギルス・オリゼｐＳａＭＦ３８形質転換体は、アスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８対照株を１．８倍超上回るリンゴ酸産生における改善を示した。
【０３４６】
実施例１６：アスペルギルス・アクレアツスＣ４‐ジカルボン酸輸送体遺伝子のクローニングと選択的プロモーター制御下の発現ベクターｐＳａＭＦ４１の構築
以下の実施例は、アスペルギルス・アクレアツスＣ４‐ジカルボン酸輸送体遺伝子が選択的ｇｐｄプロモーターを使用して駆動できることを実証する。
【０３４７】
１２５７ｂｐのＣ４‐ジカルボン酸輸送体遺伝子ｃ４ｔ５２１を、以下に示したプライマー０６１１３８４と０６９７０１を使用してｐＳａＭＦ３６（前掲）から増幅した。
【０３４８】
プライマー０６１１３８４：
5’‐CCAACAGACACATCTAAACAATGCACGACCACAGCA‐3’（配列番号２１）
プライマー０６９７０１：
5’‐GTGTCAGTCACCTCTAGTTATCATTCGAACAACTCGGACA‐3’（配列番号２２）
【０３４９】
ＰＣＲ反応物は、５μｌの１０×反応バッファー、１μｌのｐＳａＭＦ３６鋳型（５０ｎｇ／μｌ）、１μｌのプライマー０６１１３８４（１００ｎｇ／μｌ）、１μｌのプライマー０６９７０１（１００ｎｇ／μｌ）、１μｌのｄＮＴＰ混合物（１０ｍＭ）、４０．５μｌの脱イオン水、及び０．５μｌのHerculase（登録商標）HotStart DNAポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, CA, USA）から構成された。増幅反応物を、９５℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９５℃にて１０秒間、６０℃にて３０秒間、及び７２℃にて１．５分間を１０サイクル；それぞれ９５℃にて１０秒間、６０℃にて３０秒間、及び７２℃にて１．５分間（１サイクルごとに１０秒追加）を２０サイクルとプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）によりインキュベートした。ＰＣＲ反応物を、Ｄｐｎ Ｉを用いて１時間制限消化にかけて、すべてのプラスミドＤＮＡ鋳型を分解した。次に、ＰＣＲ産物を、MinElute（登録商標）PCR Purification Kit（QIAGEN Inc.）を使用して精製した。
【０３５０】
次に、精製したＰＣＲ産物を、５×がバッファー２μｌ、０．６μｌの精製したＰＣＲ産物（１２７ｎｇ／μｌ）、１．７５μｌのゲル精製しＨｉｎｄ ＩＩＩとＰａｃ Ｉで制限消化しｐＳｈＴｈ１０８（１１４ｎｇ／μｌ）、１μｌのIn‐Fusion（商標）酵素、及び４．６５μｌの脱イオン水から構成されたIn‐Fusion（商標）Advantage反応を使用してｇｐｄプロモーターを含むベクター（ｐＳｈＴｈ１０８）内に挿入した。反応物を、３７℃にて１５分間、次に５０℃にて１５分間インキュベートし、次に氷上に５分間置き、そして４０μｌのＴＥバッファーで希釈して、ｐＳａＭＦ４１を得た。
【０３５１】
連結反応物の２．５μｌのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従ってONE SHOT（登録商標）TOP10化学的コンピテントＥ．コリ細胞（Invitrogen）に形質転換した。形質転換体を、２×ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体を、ＤＮＡ配列決定にかけて、ｃ４ｔ５２１遺伝子が首尾よくベクター内に組み込まれたことを確認した。
【０３５２】
アスペルギルス・アクレアツスｃ４ｔ５２１遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）と推定アミノ酸配列（配列番号４）を図５に示す。そのコード配列は、終止コドンを含めて１２５７ｂｐであり、実施例４のｐｇｋプロモーターと比較してｇｐｄプロモーターによって駆動される。
【０３５３】
実施例１７：アスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８への発現ベクター断片ｐＳａＭＦ４１の形質転換（ＳａＭＦ４１）
アスペルギルス・オリゼ３４８８のプロトプラスト調製と形質転換を、実施例２に記載のとおり実施した。
【０３５４】
プラスミドｐＳａＭＦ４１を、形質転換のためにＰｍｅ Ｉを用いて制限消化することによる線形化によって調製した。５０２５ｂｐの発現カセットを、ＴＢＥバッファー中の０．８％のアガロースゲル電気泳動法によって消化したベクターから分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってゲル分離にMacherey Nagel Nucleospin（登録商標）Extract II Kitを使用して精製した。２つの形質転換反応物を調製した。各形質転換反応として、１００μｌのプロトプラスト調製物を１２ｍｌ容ポリプロピレン製チューブに移した。これに５μｇの線状化ｐＳａＭＦ４１と２５０μｌのＰＥＧ溶液（６０％ ｗ／ｖのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、１０ｍＭのＴｒｉｓ６．５、１０ｍＭのＣａＣｌ）を加え、続いて緩やかに混合し、そして３７℃にて３０分間インキュベートした。各形質転換体を、９ｍｌのＳＴＣバッファーで希釈し、続いて３ｍｌの別々の３つのアリコートをＣＯＶＥプレート上で平板培養した。次に、各プレートを、３４℃にて７〜１０日間インキュベートした。ＳａＭＦ４１形質転換体を、個々のＣＯＶＥプレートに移し、そして３４℃にて５日間インキュベートした。胞子ストックを、０．１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０中に胞子を回収することによって調製した。培養物を、それぞれのグリセロールストック（８００μｌの胞子ストック、２００μｌの０．１％ ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）を調製することによって保存し、−８０℃にて冷凍した。
【０３５５】
実施例１８：ｐＳａＭＦ４１の発現ベクター断片を含むアスペルギルス・オリゼ形質転換体（ＳａＭＦ４１）の振盪フラスコ培養におけるリンゴ酸の産生
実施例１７に記載のそれぞれのｐＳａＭＦ４１形質転換体（ＳａＭＦ４１）、実施例５に記載のｐＳａＭＦ３６形質転換体（ＳａＭＦ３６）、及び対照としてのアスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８からの胞子を、実施例３に記載のとおり調製した。振盪フラスコ培養形質転換体のリンゴ酸の定量化を、実施例３に記載のとおり実施した。
【０３５６】
ｇｐｄプロモーターによって駆動されるアスペルギルス・アクレアツスｃ４ｔ５２１遺伝子（配列番号３）を含むアスペルギルス・オリゼＳａＭＦ４１形質転換体は、ｐｇｋプロモーターによって駆動されるアスペルギルス・アクレアツスｃ４ｔ５２１の遺伝子（配列番号３）を含むアスペルギルス・オリゼＳａＭＦ３６形質転換体に匹敵するリンゴ酸産生を示し、さらに、ｃ４ｔ５２１遺伝子を欠いているアスペルギルス・オリゼＮＲＲＬ３４８８対照と比較して約２倍のリンゴ酸力価の増大を示した。
【０３５７】
実施例１９：ｐＳａＭＦ４１の発現ベクター断片を含むアスペルギルス・オリゼ形質転換体（ＳａＭＦ４１）の発酵
実施例１８に記載のアスペルギルス・オリゼｐＳａＭＦ４１形質転換体と対照形質転換体であるアスペルギルス・オリゼＳｈＴｈ１０４０（２０１０年８月２７日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／４７００２号を参照）を、実施例７に記載のとおり調製し、そして発酵させた。
【０３５８】
発酵におけるリンゴ酸の定量化を、先に記載したように実施した。アスペルギルス・オリゼｐＳａＭＦ４１形質転換体の相対リンゴ酸力価は、アスペルギルス・オリゼＳｈＴｈ１０４０形質転換体に匹敵しているので、先に記載したＳｈＴｈ１０４０とＮＲＲＬ３４８８との比較を根拠に、アスペルギルス・オリゼｐＳａＭＦ４１形質転換体は、（過剰発現Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体遺伝子を欠いている）アスペルギルスオリゼーＮＲＲＬ３４８８対照より優れていることが示唆された。
【０３５９】
生物学的材料の寄託
以下の生物学的材料は、ブダペスト条約の条項に従い、the Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, USAに寄託され、以下の受入番号を付与された：
【表２】
0005912111.tif 000003
【０３６０】
これらの株は、本出願の係属中は、その権利を有すると外国の特許法で認められる人への菌株のアクセスを可能にする条件下で寄託されている。寄託物は、寄託された菌株の実質的に純粋な培養物である。寄託物は、本出願の写し又はその所産物が出願される国における外国特許法の必要性に応じて入手できる。しかし寄託物の入手可能性は、政府により認可される特許権を逸脱して、本発明を実施する権利を与えるものではないことを理解すべきである。
【０３６１】
本発明は、以下の付番された段落によりさらに説明される：
［１］以下のものから選択されるＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する単離されたポリペプチド：
（ａ）配列番号２、４、若しくは６、又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも６５％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）低ストリンジェンシー条件下で、中ストリンジェンシー条件下で、中〜高ストリンジェンシー条件下で、高ストリンジェンシー条件下で、又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号１、３、若しくは５、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１、３、若しくは５、又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６５％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号２、４、若しくは６、又はその成熟ポリペプチド配列の１若しくは複数（例えば、２個、数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体；並びに
（ｅ）Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリペプチドの断片。
【０３６２】
［２］以下のものから選択されるＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する単離されたポリペプチド：
（ａ）配列番号２又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）低ストリンジェンシー条件下で、中ストリンジェンシー条件下で、中〜高ストリンジェンシー条件下で、高ストリンジェンシー条件下で、又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号１、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号２又はその成熟ポリペプチド配列の１若しくは複数（例えば、２個、数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体、並びに
（ｅ）Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリペプチドの断片。
【０３６３】
［３］以下のものから選択されるＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する単離されたポリペプチド：
（ａ）配列番号４又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも６５％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）低ストリンジェンシー条件下で、中ストリンジェンシー条件下で、中〜高ストリンジェンシー条件下で、高ストリンジェンシー条件下で、又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号３、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｃ）配列番号３又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６５％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号４又はその成熟ポリペプチド配列の１若しくは複数（例えば、２個、数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体、並びに
（ｅ）Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリペプチドの断片。
【０３６４】
［４］以下のものから選択されるＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する単離されたポリペプチド：
（ａ）配列番号６又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも６５％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）低ストリンジェンシー条件下で、中ストリンジェンシー条件下で、中〜高ストリンジェンシー条件下で、高ストリンジェンシー条件下で、又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号５、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｃ）配列番号５又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６５％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号６又はその成熟ポリペプチド配列の１若しくは複数（例えば、２個、数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体、並びに
（ｅ）Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリペプチドの断片。
【０３６５】
［５］配列番号２、４、若しくは６、又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも６５％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する、段落［１］〜［４］のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０３６６】
［６］低ストリンジェンシー条件下で、低〜中ストリンジェンシー条件下で、中ストリンジェンシー条件下で、中〜高ストリンジェンシー条件下で、高ストリンジェンシー条件下で、又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号１、３、若しくは５、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、段落［１］〜［５］のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０３６７】
［７］配列番号１、３、若しくは５、又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６５％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる、段落［１］〜［６］のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０３６８】
［８］配列番号２、４か、又は６を含んで成るか又はそれから成る、段落［１］〜［７］のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０３６９】
［９］配列番号２、４、若しくは６の成熟ポリペプチドを含んで成るか又はそれから成る、段落［１］〜［７］のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０３７０】
［１０］配列番号２の成熟ポリペプチドが、配列番号２の第６２〜３９７又は６９〜３９７アミノ酸である、段落［９］に記載のポリペプチド。
【０３７１】
［１１］配列番号４の成熟ポリペプチドが、配列番号４の第１８〜４１８アミノ酸である、段落［９］に記載のポリペプチド。
【０３７２】
［１２］配列番号６の成熟ポリペプチドが、配列番号６の第６９〜３９７アミノ酸である、段落［９］に記載のポリペプチド。
【０３７３】
［１３］配列番号２、４、若しくは６の断片であって、ここで、前記断片がＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有している、段落［１］〜［７］のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０３７４】
［１４］配列番号２、４、若しくは６、又はその成熟ポリペプチド配列の１若しくは複数（例えば、２個、数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含んで成る変異体である、段落［１］〜［７］のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０３７５】
［１５］Ｅ．コリＮＲＲＬ Ｂ‐５０４００に含まれるプラスミドｐＡａＣ４Ｔ７３７に含まれるポリヌクレオチドによってコードされる、段落［１］〜［１３］のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０３７６】
［１６］Ｅ．コリＮＲＲＬ Ｂ‐５０３８８に含まれるプラスミドｐＡａＣ４ｔ５２１に含まれるポリヌクレオチドによってコードされる、段落［１］〜［１３］のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０３７７】
［１７］Ｅ．コリＮＲＲＬ Ｂ５０４０１に含まれるプラスミドｐＡａＭＡＴ７３７に含まれるポリヌクレオチドによってコードされる、段落［１］〜［１３］のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０３７８】
［１８］段落［１］〜［１７］のいずれか１項に記載のポリペプチドを含んで成る組成物。
【０３７９】
［１９］段落［１］〜［１７］のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【０３８０】
［２０］発現宿主内でそのポリペプチドの産生を指示する１若しくは複数（例えば、２個、数個）の制御配列に作用可能に連結された段落［１９］に記載のポリヌクレオチドを含んで成る核酸構築物又は発現ベクター。
【０３８１】
［２１］そのポリペプチドの産生を指示する１若しくは複数の制御配列に作用可能に連結された段落［１９］のポリヌクレオチドを含んで成る組換え宿主細胞。
【０３８２】
［２２］段落［１］〜［１７］のいずれか１項に記載のポリペプチドの製造方法であって：
（ａ）前記ポリペプチドの産生を促進する条件下で、その野生型では前記ポリペプチドを産生する細胞を培養し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収すること、を含んで成る方法。
【０３８３】
［２３］段落［１］〜［１７］のいずれか１項に記載のポリペプチドの製造方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドの産生を促進する条件下で、段落［２１］に記載の組換え宿主細胞を培養し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収すること、を含んで成る方法。
【０３８４】
［２４］段落［１］〜［１７］のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにより形質転換されたトランスジェニック植物、植物の部分又は植物細胞。
【０３８５】
［２５］段落［１］〜［１７］のいずれか１項に記載のポリペプチドの製造方法であって：
（ａ）前記ポリペプチドの産生を促進する条件下で、段落［２４］に記載のトランスジェニック植物又は植物細胞を培養し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収すること、を含んで成る方法。
【０３８６】
［２６］親細胞の突然変異体の製造方法であって：段落［１］〜［１７］のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを不活性化し、そしてそれが、親細胞ほどポリペプチドを産生しない突然変異体をもたらすことを含んで成る方法。
【０３８７】
［２７］段落［２６］に記載の方法によって作出される突然変異細胞。
【０３８８】
［２８］天然又は異種タンパク質をコードする遺伝子をさらに含んで成る、段落［２７］に記載の突然変異細胞。
【０３８９】
［２９］タンパク質の製造方法であって：
（ａ）前記タンパク質の産生を促進する条件下で、段落［２７］又は［２８］に記載の突然変異細胞を培養し；そして
（ｂ）前記タンパク質を回収すること、を含んで成る方法。
【０３９０】
［３０］段落［１９］に記載のポリヌクレオチドの部分配列を含んで成る二本鎖阻害性ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であって、ここで、前記ｄｓＲＮＡが場合によりｓｉＲＮＡ分子又はｍｉＲＮＡ分子である分子。
【０３９１】
［３１］長さが約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又はそれを超える二本鎖ヌクレオチドである、段落［３０］に記載の二本鎖阻害性ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子。
【０３９２】
［３２］細胞におけるＣ４‐ジカルボン酸輸送体活性を有するポリペプチド発現の阻害方法であって、段落［３０］又は［３１］に記載の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を前記細胞に投与するか又は前記細胞で発現させることを含んで成る方法。
【０３９３】
［３３］段落［３１］又は［３２］に記載の方法によって作出される細胞。
【０３９４】
［３４］天然又は異種タンパク質をコードする遺伝子をさらに含んで成る、段落［３３］に記載の細胞。
【０３９５】
［３５］タンパク質の製造方法であって：
（ａ）前記タンパク質の産生を促進する条件下で、段落［３３］又は［３４］に記載の細胞を培養し；そして
（ｂ）前記タンパク質を回収すること、を含んで成る方法。
【０３９６】
［３６］配列番号２の第１〜６１又は１〜６８アミノ酸を含んで成るか又はそれから成るシグナルペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【０３９７】
［３７］配列番号４の第１〜１７アミノ酸を含んで成るか又はそれから成るシグナルペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【０３９８】
［３８］配列番号６の第１〜６８アミノ酸を含んで成るか又はそれから成るシグナルペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【０３９９】
［３９］段落［３６］〜［３８］のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドに作用可能に連結されたタンパク質をコードする遺伝子を含んで成る核酸構築物又は発現ベクターであって、ここで、前記遺伝子がシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドにとって外来性である核酸構築物又は発現ベクター。
【０４００】
［４０］段落［３９］に記載の核酸構築物又は発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞。
【０４０１】
［４１］タンパク質の製造方法であって：
（ａ）前記タンパク質の産生を促進する条件下で、段落［４０］に記載の組換え宿主細胞を培養し；そして
（ｂ）前記タンパク質を回収すること、を含んで成る方法。
【０４０２】
［４２］Ｃ４‐ジカルボン酸の製造方法であって：
（ａ）培地中で、段落［１］〜［１７］のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含んで成る宿主細胞を培養し；そして
（ｂ）Ｃ４‐ジカルボン酸を回収すること、を含んで成る方法。
【０４０３】
［４３］Ｃ４‐ジカルボン酸産生を増やす方法であって：
（ａ）段落［１］〜［１７］のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを宿主細胞内に形質転換し；
（ｂ）培地中で形質転換生物体を培養し；そして
（ｃ）Ｃ４‐ジカルボン酸を回収すること、を含んで成る方法。
【０４０４】
［４４］異種ポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドにとって外来性であるプロモーターに作用可能に連結されている、段落［４２］又は［４３］に記載の方法。
【０４０５】
［４５］宿主細胞が、リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする第２の異種ポリヌクレオチド（例えば、配列番号１１の成熟ポリペプチドコード配列又は記載されたその態様のいずれか）をさらに含んで成る、段落［４２］〜［４４］のいずれか１項に記載の方法。
【０４０６】
［４６］第２の異種ポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドにとって外来性のプロモーターに作用可能に連結されている、段落［４５］に記載の方法。
【０４０７】
［４７］宿主細胞が、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする第３のポリヌクレオチド（例えば、配列番号１５の成熟ポリペプチドコード配列又は記載されたその態様のいずれか）をさらに含んで成る、段落［４２］〜［４６］のいずれか１項に記載の方法。
【０４０８】
［４８］第３の異種ポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドにとって外来性のプロモーターに作用可能に連結されている、段落［４７］に記載の方法。
【０４０９】
［４９］宿主細胞が糸状菌宿主細胞である、段落［４２］〜［４８］のいずれか１項に記載の方法。
【０４１０】
［５０］糸状菌宿主細胞が、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、ビヤーカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、コプリヌス（Coprinus）、コリオルス（Coriolus）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、フィリバシジウム（Filibasidium）、フザリウム（Fusarium）、フミコーラ（Humicola）、マグナポルテ（Magnaporthe）、ムコール（Mucor）、ミセリオフトラ（Myceliophthora）、ネオカリマスティクス（Neocallimastix）、ノイロスポラ（Neurospora）、ペシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、フェネロケテ（Phanerochaete）、フレビア（Phlebia）、ピロミセス（Piromyces）、プレロータス（Pleurotus）、リゾープス（Rhizopus）、シゾフィルム（Schizophyllum）、タラロミセス（Talaromyces）、サーモアスクス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トラメテス（Trametes）、又はトリコデルマ（Trichoderma）から選択される、段落［４９］に記載の方法。
【０４１１】
［５１］宿主細胞が、アスペルギルス宿主細胞である、段落［５０］に記載の方法。
【０４１２】
［５２］宿主細胞が、アスペルギルス・オリゼ宿主細胞である、段落［５０］に記載の方法。
【０４１３】
［５３］培地が発酵培地である、段落［４２］〜［５２］のいずれか１項に記載の方法。
【０４１４】
［５４］Ｃ４‐ジカルボン酸が、約１０ｇ／Ｌ超、例えば、約２５ｇ／Ｌ超、５０ｇ／Ｌ超、７５ｇ／Ｌ超、１００ｇ／Ｌ超、１２５ｇ／Ｌ超、１５０ｇ／Ｌ超、１６０ｇ／Ｌ超、１７０ｇ／Ｌ超、１８０ｇ／Ｌ超、１９０ｇ／Ｌ超、２００ｇ／Ｌ超、２１０ｇ／Ｌ超、２２５ｇ／Ｌ超、２５０ｇ／Ｌ超、２７５ｇ／Ｌ超、３００ｇ／Ｌ超、３２５ｇ／Ｌ超、３５０ｇ／Ｌ超、４００ｇ／Ｌ超、又は５００ｇ／Ｌ超；あるいは、例えば、約１０ｇ／Ｌ超〜約５００ｇ／Ｌ超、約５０ｇ／Ｌ超〜約３５０ｇ／Ｌ超、約１００ｇ／Ｌ超〜約３００ｇ／Ｌ超、約１５０ｇ／Ｌ超〜約２５０ｇ／Ｌ超、約１７５ｇ／Ｌ超〜約２２５ｇ／Ｌ超、又は約１９０ｇ／Ｌ超〜約２１０ｇ／Ｌ超の力価である、段落［４２］〜［５３］のいずれか１項に記載の方法。
【０４１５】
［５５］Ｃ４‐ジカルボン酸のレベルが、同じ条件下で培養された場合に、Ｃ４‐ジカルボン酸輸送体をコードするポリヌクレオチドを含まない宿主細胞と比較して、少なくとも２５％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、又は５００％増強される、段落［４２］〜［５４］のいずれか１項に記載の方法。
【０４１６】
［５６］Ｃ４‐ジカルボン酸が、リンゴ酸、コハク酸、オキサロ酢酸、マロン酸、及びフマル酸から選択される、段落［４２］〜［５５］のいずれか１項に記載の方法。
【０４１７】
［５７］Ｃ４‐ジカルボン酸がリンゴ酸である、段落［５６］に記載の方法。
【０４１８】
［５８］段落［１］〜［１７］のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含んで成る宿主細胞であって、ここで、同じ条件下で培養された場合に、異種ポリヌクレオチドなしの宿主細胞と比較して、高いレベルでＣ４‐ジカルボン酸を分泌できる宿主細胞。
【０４１９】
［５９］異種ポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドにとって外来性のプロモーターに作用可能に連結されている、段落［５８］に記載の宿主細胞。
【０４２０】
［６０］リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする第２の異種ポリヌクレオチド（例えば、配列番号１１の成熟ポリペプチドコード配列又は記載されたその態様のいずれか）をさらに含んで成る、段落［５７］又は［５８］に記載の宿主細胞。
【０４２１】
［６１］第２の異種ポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドにとって外来性のプロモーターに作用可能に連結されている、段落［６０］に記載の宿主細胞。
【０４２２】
［６２］ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする第３の異種ポリヌクレオチド（例えば、配列番号１５の成熟ポリペプチドコード配列又は記載されたその態様のいずれか）をさらに含んで成る、［５８］〜［６１］のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【０４２３】
［６２］第３の異種ポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドにとって外来性のプロモーターに作用可能に連結されている、段落［６２］に記載の宿主細胞。
【０４２４】
［６３］宿主細胞が糸状菌宿主細胞である、段落［５８］〜［６２］のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【０４２５】
［６４］宿主細胞が、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、ビヤーカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、コプリヌス（Coprinus）、コリオルス（Coriolus）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、フィリバシジウム（Filibasidium）、フザリウム（Fusarium）、フミコーラ（Humicola）、マグナポルテ（Magnaporthe）、ムコール（Mucor）、ミセリオフトラ（Myceliophthora）、ネオカリマスティクス（Neocallimastix）、ノイロスポラ（Neurospora）、ペシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、フェネロケテ（Phanerochaete）、フレビア（Phlebia）、ピロミセス（Piromyces）、プレロータス（Pleurotus）、リゾープス（Rhizopus）、シゾフィルム（Schizophyllum）、タラロミセス（Talaromyces）、サーモアスクス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トラメテス（Trametes）、又はトリコデルマ（Trichoderma）から選択される、段落［６３］に記載の糸状菌宿主細胞。
【０４２６】
［６５］宿主細胞が、アスペルギルス宿主細胞である、段落［６４］に記載の糸状菌宿主細胞。
【０４２７】
［６６］宿主細胞が、アスペルギルス・オリゼ宿主細胞である、段落［６４］に記載の糸状菌宿主細胞。
【０４２８】
［６７］細胞が、１時間あたり約０．１ｇ／Ｌ超、例えば、１時間あたり約０．２ｇ／Ｌ超、１時間あたり０．５ｇ／Ｌ超、１時間あたり０．６ｇ／Ｌ超、１時間あたり０．７ｇ／Ｌ超、１時間あたり０．８ｇ／Ｌ超、１時間あたり０．９ｇ／Ｌ超、１時間あたり１．０ｇ／Ｌ超、１時間あたり１．１ｇ／Ｌ超、１時間あたり１．２ｇ／Ｌ超、１時間あたり１．３ｇ／Ｌ超、１時間あたり１．５ｇ／Ｌ超、１時間あたり１．７５ｇ／Ｌ超、１時間あたり２．０ｇ／Ｌ超、１時間あたり２．２５ｇ／Ｌ超、１時間あたり２．５ｇ／Ｌ超、又は１時間あたり３．０ｇ／Ｌ超；あるいは、１時間あたり約０．１ｇ／Ｌ超〜１時間あたり約２．０ｇ／Ｌ超、例えば、１時間あたり約０．３ｇ／Ｌ超〜１時間あたり約１．７ｇ／Ｌ超、１時間あたり約０．５ｇ／Ｌ超〜１時間あたり約１．５ｇ／Ｌ超、１時間あたり約０．７ｇ／Ｌ超〜１時間あたり約１．３ｇ／Ｌ超、１時間あたり約０．８ｇ／Ｌ超〜１時間あたり約１．２ｇ／Ｌ超、又は１時間あたり約０．９ｇ／Ｌ超〜１時間あたり約１．１ｇ／Ｌ超のＣ４‐ジカルボン酸の容積生産性が可能である、段落［５８］〜［６６］のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【０４２９】
［６８］宿主細胞が、同じ条件下で培養された場合に、第１の異種ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含まない宿主細胞と比較して、少なくとも２５％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、又は５００％高いレベルのＣ４‐ジカルボン酸を分泌できる、段落［５８］〜［６７］のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【０４３０】
［６９］Ｃ４‐ジカルボン酸が、リンゴ酸、コハク酸、オキサロ酢酸、マロン酸、及びフマル酸から選択される、段落［５８］〜［６８］のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【０４３１】
［７０］Ｃ４‐ジカルボン酸がリンゴ酸である、段落［６９］に記載の宿主細胞。
【０４３２】
本明細書の具体的な態様は本発明のいくつかの態様の例であることを企図しており、本明細書に記載し特許請求される発明の範囲は、決してこれらの態様に限定されるものではない。すべての同等の態様は、本発明の範囲内にあると考えられる。実際、本明細書に示し説明した本発明の種々の変更態様は、前記説明から当業者には明らかであろう。そのような変更態様は、添付の特許請求の範囲内であると企図される。不一致がある場合は、定義を含む本開示が優先するものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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