(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、癌の治療および予防のいずれかもしくは両方または癌細胞成長の阻害のための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）ＳＭＹＤ２ポリペプチドを、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドまたはＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドの断片であって配列番号６５のリジン５３１および／もしくはリジン５７４を含む断片と、前記ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドまたは断片のメチル化が可能な条件下において試験物質の存在下で接触させる段階；
（ｂ）前記ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドまたは断片における配列番号６５のリジン５３１および／もしくはリジン５７４のメチル化レベルを検出する段階；ならびに
（ｃ）前記ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドまたは断片における配列番号６５のリジン５３１および／もしくはリジン５７４のメチル化レベルを前記試験物質の非存在下で検出されたメチル化レベルと比較して低下させる試験物質を選択する段階。
【請求項２】
前記ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドの断片が、配列番号６５の５００番目から７２４番目のアミノ酸からなる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドの断片が、配列番号６５のリジン５３１を含む２０アミノ酸からなる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドの断片が、配列番号６５のリジン５７４を含む２０アミノ酸からなる、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物科学の分野、より具体的には癌研究、癌診断および癌治療の分野に関する。特に、本発明は、癌、特に膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌の存在および／またはこれらを発症する素因を検出および診断するための方法に関する。本発明はまた、癌、特に膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌を治療および予防するための方法に関する。本発明はさらに、癌、特に膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌の治療および／または予防に有効な候補物質をスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
優先権
本出願は、２０１１年１２月２日に出願された米国仮出願第６１／５６６，１９３号の恩典を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
熱ショックタンパク質（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）９０（ＨＳＰ９０）は、進化的に保存されている分子シャペロンであり、ＨＳＰ９０「クライアント」と呼ばれる２００種超のタンパク質の安定化および活性化に関与する；これらの多くは、構成的な細胞内シグナル伝達およびストレス適応反応に必須である［非特許文献１、２］。この任務を達成するために、ＨＳＰ９０、および「コシャペロン」と呼ばれるさらなるタンパク質は、ＨＳＰ９０シャペロンマシンとして公知の動的複合体を形成する［非特許文献３］。癌細胞は、多くの変異したおよび過剰発現している癌タンパク質をミスフォールディングおよび分解から保護するために、ＨＳＰ９０シャペロン機構を使用する。したがって、ＨＳＰ９０は、癌遺伝子依存および癌生存の重要な促進因子として認識されている［非特許文献４］。
【０００４】
ＨＳＰ９０の機能は、アセチル化、リン酸化およびニトロシル化などの様々な翻訳後修飾によって調節されている。ＨＳＰ９０β上の荷電リンカーのリン酸化は、アリル炭化水素受容体（ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＡＨＲ）クライアントとの相互作用を調節する。ＨＳＰ９０中央ドメインにおけるリン酸化セリン２２５およびセリン２５４がアラニンに変異すると、ＨＳＰ９０のＡＨＲへの結合が増加するが、これは、リン酸化が複合体を負に調節することを示唆している［非特許文献５］。他の事例では、ＨＳＰ９０のリン酸化は、クライアントの成熟を促進する。例えば、（チロシン３００における）ＳＲＣ依存性のＨＳＰ９０ＡＢ１のリン酸化は、血管内皮成長シグナル伝達の活性化で、クライアントの内皮一酸化窒素合成酵素（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）（ｅＮＯＳ）とのシャペロン結合を増加させる［非特許文献６］。一方、未知のアセチラーゼによって中央ドメインにおけるリジン２９４がアセチル化されると、クライアントのタンパク質の成熟およびコシャペロン結合の両方が阻害され［非特許文献７、８］、ヒストン脱アセチル化酵素６は、この残基をインビボで脱アセチル化する。さらに、ＨＳＰ９０ＡＢ１  ＣＴＤにおけるシステイン５９７がニトロシル化されると、ｅＮＯＳの活性化がインビボで阻害され［非特許文献９、１０］、インビトロにおけるＳ−ニトロシル化はＨＳＰ９０のＡＴＰａｓｅ活性を阻害し、シャペロンサイクルの立体配座平衡を変化させる。ＨＳＰ９０について、他の翻訳後修飾が報告されている。しかしながら、メチル化の生理学的意義は、いまだに解明されていない。
【０００５】
網膜芽細胞腫抑制タンパク質（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＲＢ）は、細胞周期調節において中心的な役割を有し、数種類の癌で変異している［非特許文献２３〜２５］。ＲＢはＥ２Ｆ転写因子と相互作用し、Ｓ期の開始に関連する遺伝子を調節することができる。ＲＢは、その低リン酸化状態ではＥ２Ｆに結合し、Ｅ２Ｆ標的遺伝子の発現を抑制する。ＲＢがサイクリン／ＣＤＫ複合体によって過リン酸化されると、Ｅ２ＦはＲＢから離れ、細胞周期進行を促すその標的遺伝子を転写活性化する［非特許文献２３、２４、２６、２７］。ＲＢは、ヒト小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）の９０％超では不活性化されていると報告されているが［非特許文献２３］、ヒト癌の大部分は、ＣＤＫの調節解除により主としてリン酸化状態にある野生型ＲＢを発現する。それにより、ほとんどのヒト癌は、ＲＢ機能の調節解除によりＧ１チェックポイント制御を喪失していると思われるので、ＲＢのリン酸化は、癌細胞増殖を制御する経路における重要な調節工程である［非特許文献２４］。リン酸化に加えて、ＲＢタンパク質は、アセチル化されることが公知である［非特許文献２８、２９］。ケラチノサイトの分化において、ＲＢはアセチルトランスフェラーゼＰ−ＣＡＦによってアセチル化され、核局在化シグナル内に位置する２個の主要なリジン残基（リジン８７３および８７４）のアセチル化が、ＲＢタンパク質の核内保持を介して、分化において重要な役割を果たしている可能性がある［非特許文献３０］。しかしながら、ＲＢ機能の調節に関するリジンのメチル化を含めて、他の翻訳後修飾（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＰＴＭ）の意義は、依然として不明である。
本発明者らは、特定のヒストンメチルトランスフェラーゼ（ｈｉｓｔｏｎｅ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＨＭＴ）が、正常な細胞バイオロジーに加えて、ヒト癌の病因において重要な役割を果たすことを実証した［特許文献１〜２、非特許文献１１〜１３］。ＨＭＴはまた、ヒト細胞の悪性化に関与すると示唆されている［非特許文献１４〜１６］。
【０００６】
ＳＭＹＤ２は、ＳＥＴドメインおよびＭＹＮＤドメインを含有するＳＭＹＤファミリーメンバーの１つとして最初に同定された［非特許文献１７］。ＳＭＹＤ２は、Ｈ３Ｋ３６をメチル化し、Ｓｉｎ３ＡおよびＨＤＡＣ１ヒストン脱アセチル化酵素複合体と共同して、転写抑制因子として機能することが示されている［非特許文献１７］。ヒストンのメチル化プロセスに加えて、ＳＭＹＤ２はまた、ｐ５３および網膜芽細胞腫（ＲＢ）タンパク質をメチル化し、それによりそれらの機能を変化させる［非特許文献１８、１９］。アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｒｓ  ｌａｅｖｉｓ）では、ｓｍｙｄ２は筋組織で発現しているので、筋細胞の分化に関連する可能性がある［非特許文献２０］。ｓｍｙｄ２はまた、様々な種類の新生仔マウス組織、特に新生仔の心臓で発現していることが示されているが［非特許文献２１］、心筋細胞の分化および心臓の形態形成に不可欠なＳＭＹＤ１とは異なり、ＳＭＹＤ２は、マウス心臓の発達に重要ではない［非特許文献２２］。
【０００７】
したがって、一定の特性は明らかになっているが、正常な細胞バイオロジー、および癌のような疾患におけるＳＭＹＤ２の意義は、依然として大部分が不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００５／０７１１０２
【特許文献２】ＷＯ２００３／０２７１４３
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Trepel, J., Mollapour, M., Giaccone, G. & Neckers, L. Nat Rev Cancer 10, 537-549 (2010).
【非特許文献２】Wandinger, S.K., Richter, K. & Buchner, J. J Biol Chem 283, 18473-18477 (2008).
【非特許文献３】Pratt, W.B. & Toft, D.O. Exp Biol Med (Maywood) 228, 111-133 (2003).
【非特許文献４】Whitesell, L. & Lindquist, S.L. Nat Rev Cancer 5, 761-772 (2005).
【非特許文献５】Ogiso, H. et al. Biochemistry 43, 15510-15519 (2004).
【非特許文献６】Duval, M., Le Boeuf, F., Huot, J. & Gratton, J.P. Mol Biol Cell 18, 4659-4668 (2007).
【非特許文献７】Scroggins, B.T. et al. Mol Cell 25, 151-159 (2007).
【非特許文献８】Kovacs, J.J. et al. Mol Cell 18, 601-607 (2005).
【非特許文献９】Retzlaff, M. et al. EMBO Rep 10, 1147-1153 (2009).
【非特許文献１０】Martinez-Ruiz, A. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 8525-8530 (2005).
【非特許文献１１】Hamamoto R et al. Nat Cell Biol 6,731-40 (2004)
【非特許文献１２】Takawa, M. et al. Cancer Sci (2011).
【非特許文献１３】Yoshimatsu, M. et al. Int J Cancer 128, 562-573 (2011).
【非特許文献１４】Portela, A. & Esteller, M. l 28, 1057-1068 (2010).
【非特許文献１５】Schneider, R., Bannister, A.J. & Kouzarides, T. Trends Biochem Sci 27, 396-402 (2002).
【非特許文献１６】Sparmann, A. & van Lohuizen, M. Nat Rev Cancer 6, 846-856 (2006).
【非特許文献１７】Brown, M.A., Sims, R.J., 3rd, Gottlieb, P.D. & Tucker, P.W. Mol Cancer 5, 26 (2006).
【非特許文献１８】Huang, J. et al. Nature 444, 629-632 (2006).
【非特許文献１９】Saddic, L.A. et al. J Biol Chem 285, 37733-37740 (2010).
【非特許文献２０】Kawamura, S., Yoshigai, E., Kuhara, S. & Tashiro, K. Cytotechnology 57, 161-168 (2008).
【非特許文献２１】Diehl, F. et al. PLoS One 5, e9748 (2010).
【非特許文献２２】Gottlieb, P.D. et al. Nat Genet 31, 25-32 (2002).
【非特許文献２３】Burkhart, DL. et al. Nat Rev Cancer 8, 671-682 (2008).
【非特許文献２４】Knudsen, ES. et al. Nat Rev Cancer 8, 714-724 (2008).
【非特許文献２５】Weinberg, RA. et al. Cell 81, 323-330 (1995).
【非特許文献２６】Sherr CJ. Science 274, 1672-1677 (1996).
【非特許文献２７】Sherr, CJ. et al. Cancer Cell 2, 103-112 (2002).
【非特許文献２８】Chan, HM. et al. Nat Cell Biol 3, 667-674 (2001).
【非特許文献２９】Nguyen, DX. et al. EMBO J 23, 1609-1618 (2004).
【非特許文献３０】Pickard, A. et al. J Cell Sci 123, 3718-3726 (2010).
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、ＳＭＹＤ２（ＳＥＴ  ａｎｄ  ＭＹＮＤ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ２）遺伝子、およびそれが癌細胞成長において果たす重要な役割に関する。このようなものとして、本発明は、癌を検出、診断、治療および／または予防するための新規な組成物および方法、ならびに癌の予防および治療のいずれかまたは両方に有用な候補物質をスクリーニングする過剰発現方法に関する。
【００１１】
本発明の間に、本発明者らは、ＳＭＹＤ２遺伝子が、例えば、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌を含む様々な癌で過剰発現していることを確認した。本発明者らはまた、ＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質およびＲＢ１タンパク質に対するＳＭＹＤ２タンパク質のメチルトランスフェラーゼ活性を確認した。
【００１２】
これらの知見を考慮して、ＳＭＹＤ２タンパク質の発癌活性は、癌細胞で重要な役割を果たすために、ヒストンタンパク質、ＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質またはＲＢ１タンパク質との相互作用によってもたらされると仮定した。本発明の間に、ＳＭＹＤ２タンパク質は、ヒストンタンパク質、ＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質および／またはＲＢ１タンパク質のメチル化によって癌細胞増殖を促進することを発見した。
【００１３】
従来のインビトロのメチルトランスフェラーゼアッセイを使用して、本発明者らは、ＳＭＹＤ２タンパク質が、ＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質を用量依存的にメチル化することを実証した。質量分光分析により、本発明者らは、ＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質のリジン５３１および／またはリジン５７４を、ＳＭＹＤ２依存性のメチル化の主要標的として同定した。本発明者らは、ＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質のリジン５７４におけるモノメチル化が、二量体化およびシャペロニン複合体形成を促進したことをさらに確認した。加えて、メチル化ＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質は、癌細胞増殖を加速させた。
【００１４】
本発明者らはまた、ＳＭＹＤ２タンパク質が、ＲＢ１タンパク質をメチル化することを実証した。質量分光分析により、ＲＢ１のリジン８１０が、ＳＭＹＤ２タンパク質によってメチル化されたことが明らかになった。このメチル化は、インビトロおよびインビボの両方において、ＲＢ１タンパク質のセリン８０７および／またはセリン８１１のリン酸化を促進した。さらに、本発明者らは、メチル化ＲＢ１タンパク質がＥ２Ｆ転写活性を加速させ、細胞周期進行を促進することを実証した。これらの結果は、ＳＭＹＤ２タンパク質が様々な種類の癌において重要な癌タンパク質であり、リジン８１０におけるＳＭＹＤ２依存性のＲＢ１メチル化が、癌細胞の細胞周期進行を促進することを示している。
総合すると、このデータは、ＳＭＹＤ２分子を標的とすることが、癌の臨床管理における新たな診断治療戦略の開発に有望であり得ることを示唆している。
【００１５】
したがって、本発明の目的は、対象由来の生体試料におけるＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルを疾患指標として使用して、対象における癌、特に膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌の存在またはこれらを発症する素因を診断または決定する方法を提供することである。ＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルが該遺伝子の正常対照レベルと比較して上昇していることは、対象が癌、特に膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌および／または膵臓癌に罹患しているかまたはこれらを発症するリスクを有することを示す。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、癌、特に膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌の治療および／または予防に有効な候補物質をスクリーニングする方法を提供することである。このような物質はＳＭＹＤ２ポリペプチドに結合するか、またはＳＭＹＤ２ポリペプチドの生物学的活性またはＳＭＹＤ２遺伝子もしくはＳＭＹＤ２遺伝子に代わるレポーター遺伝子の発現を低下させるであろう。あるいは、このような物質は、ＳＭＹＤ２ポリペプチドとＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドまたはＲＢ１ポリペプチドとの間の結合を阻害するか、またはＳＭＹＤ２ポリペプチドのメチルトランスフェラーゼ活性を阻害するであろう。
【００１７】
より具体的には、本発明は、以下の［１］〜［３３］を提供する：
［１］対象由来の生体試料におけるＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルを決定する段階を含む、対象における癌を検出もしくは診断するかまたは癌を発症する素因を検出するための方法であって、前記遺伝子の正常対照レベルと比較した前記発現レベルの上昇が、前記対象が癌に罹患しているかまたは癌を発症するリスクを有することを示し、前記発現レベルが、以下からなる群より選択される任意の方法によって決定される、方法：
（ａ）ＳＭＹＤ２遺伝子のｍＲＮＡを検出すること；
（ｂ）ＳＭＹＤ２遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること；および
（ｃ） ＳＭＹＤ２遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出すること、
［２］前記上昇が、前記正常対照レベルよりも少なくとも１０％大きい、［１］に記載の方法、
［３］前記対象由来の生体試料が、生検標本、唾液、痰、血液、血清、血漿、胸水または尿試料を含む、［１］に記載の方法、
［４］以下からなる群より選択される試薬を含む、対象における癌の存在または癌を発症する素因を検出または診断するためのキット：
（ａ）ＳＭＹＤ２遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＳＭＹＤ２遺伝子によってコードされるタンパク質を検出するための試薬、および
（ｃ）ＳＭＹＤ２遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出するための試薬、
［５］前記試薬が、ＳＭＹＤ２遺伝子のｍＲＮＡに結合するプローブまたはプライマーセットである、［４］に記載のキット、
［６］前記試薬が、ＳＭＹＤ２遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体または該タンパク質の断片に対する抗体である、［４］に記載のキット、
［７］前記生物学的活性が、細胞増殖促進活性またはメチルトランスフェラーゼ活性である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法、または［４］〜［６］のいずれかに記載のキット、
［８］以下の段階を含む、癌の治療および予防または癌細胞成長の阻害のいずれかまたは両方のための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）試験物質を、ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはＳＭＹＤ２ポリペプチドの機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）前記ポリペプチドまたは前記ポリペプチドの機能的等価物と前記試験物質との間の結合活性を検出する段階；および
（ｃ）前記ポリペプチドまたは前記ポリペプチドの機能的等価物に結合する試験物質を選択する段階、
［９］以下の段階を含む、癌の治療および予防または癌細胞成長の阻害のいずれかまたは両方のための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）試験物質を、ＳＭＹＤ２遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；および
（ｂ）ＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルを前記試験物質の非存在下の発現レベルと比較して低下させる試験物質を選択する段階、
［１０］以下の段階を含む、癌の治療および予防または癌細胞成長の阻害のいずれかまたは両方のための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）試験物質を、ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはＳＭＹＤ２ポリペプチドの機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドまたは該ポリペプチドの機能的等価物の生物学的活性を検出する段階；および
（ｃ）前記ポリペプチドまたは前記ポリペプチドの機能的等価物の生物学的活性を前記試験物質の非存在下で検出された生物学的活性と比較して抑制する試験物質を選択する段階、
［１１］前記生物学的活性が、細胞増殖促進活性またはメチルトランスフェラーゼ活性である、［１０］に記載の方法、
［１２］以下の段階を含む、癌の治療および予防または癌細胞成長の阻害のいずれかまたは両方のための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）試験物質を、ＳＭＹＤ２遺伝子の転写調節領域と前記転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入された細胞と、接触させる段階、
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現または活性レベルを測定する段階；および
（ｃ）前記レポーター遺伝子の発現または活性レベルを前記試験物質の非存在下のレベルと比較して低下させる試験物質を選択する段階、
［１３］以下の段階を含む、癌の治療および予防または癌細胞成長の阻害のいずれかまたは両方のための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはＳＭＹＤ２ポリペプチドの機能的等価物を、メチル化されるべき基質と、前記基質のメチル化が可能な条件下において試験物質の存在下で接触させる段階；
（ｂ）前記基質のメチル化レベルを検出する段階；および
（ｃ）前記基質のメチル化レベルを前記試験物質の非存在下で検出されたメチル化レベルと比較して低下させる試験物質を選択する段階、
［１４］前記基質が、ヒストンタンパク質、または少なくとも１つのメチル化部位を含むヒストンタンパク質の断片である、［１３］に記載の方法、
［１５］前記ヒストンが、ヒストンＨ４またはヒストンＨ３である、［１４］に記載の方法、
［１６］前記基質が、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチド、または少なくとも１つのメチル化部位を含むＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドの断片である、［１３］に記載の方法、
［１７］前記メチル化部位が、配列番号６５のリジン５３１および／またはリジン５７４である、［１６］に記載の方法、
［１８］前記基質が、ＲＢ１ポリペプチド、または少なくとも１つのメチル化部位を含むＲＢ１ポリペプチドの断片である、［１３］に記載の方法、
［１９］前記メチル化部位が、配列番号６８のリジン８１０である、［１８］に記載の方法、
［２０］以下の段階を含む、癌を治療もしくは予防するかまたは癌細胞成長を阻害するための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）ＳＭＹＤ２ポリペプチドのＨＳＰ９０ＡＢ１結合ドメインを含むポリペプチドを、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドのＳＭＹＤ２結合ドメインを含むポリペプチドと、試験物質の存在下で接触させる段階；
（ｂ）前記ポリペプチド間の結合を検出する段階；
（ｃ）段階（ｂ）で検出された結合レベルを、前記試験物質の非存在下で検出されたものと比較する段階；および
（ｄ）前記ポリペプチド間の結合を阻害する試験物質を、癌の治療および予防または癌細胞成長の阻害のいずれかまたは両方のための候補物質として選択する段階、
［２１］前記ＨＳＰ９０ＡＢ１結合ドメインを含むポリペプチドが、配列番号６３の１００位〜２４７位のアミノ酸残基を含む、［２０］に記載の方法、
［２２］前記ＳＭＹＤ２結合ドメインを含むポリペプチドが、配列番号６５の５００位〜７２４位のアミノ酸残基を含む、［２０］に記載の方法、
［２３］以下の段階を含む、癌の治療および予防または癌細胞成長の阻害のいずれかまたは両方のための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）ＳＭＹＤ２ポリペプチドのＲＢ１結合ドメインを含むポリペプチドを、ＲＢ１ポリペプチドのＳＭＹＤ２結合ドメインを含むポリペプチドと、試験物質の存在下で接触させる段階；
（ｂ）前記ポリペプチド間の結合を検出する段階；および
（ｃ）段階（ｂ）で検出された結合レベルを、前記試験物質の非存在下で検出されたものと比較する段階；および
（ｄ）前記ポリペプチド間の結合を阻害する試験物質を、癌の治療および予防または癌細胞成長の阻害のいずれかまたは両方のための候補物質として選択する段階、
［２４］前記ＲＢ１結合ドメインを含むポリペプチドが、配列番号６３の３３０位〜４３３位のアミノ酸残基を含む、［２３］に記載の方法、
［２５］前記ＳＭＹＤ２結合ドメインを含むポリペプチドが、配列番号６８の７７３位〜８１３位のアミノ酸残基を含む、［２３］に記載の方法、
［２６］以下の段階を含む、癌を治療もしくは予防するかまたは癌細胞成長を阻害するための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）試験物質を、ＳＭＹＤ２遺伝子およびＲＢ１遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のＲＢ１ポリペプチドまたは該ＲＢ１ポリペプチドの機能的等価物のリン酸化レベルを検出する段階；および
（ｃ）前記ポリペプチドまたは前記ポリペプチドの機能的等価物のリン酸化レベルを前記試験物質の非存在下で検出されたリン酸化レベルと比較して低下させる試験物質を選択する段階、
［２７］ＲＢ１ポリペプチドのリン酸化レベルが、配列番号６８のセリン８０７および／またはセリン８１１でリン酸化されたＲＢ１に対する抗体によって検出される、［２６］に記載の方法、
［２８］以下の構成要素を含む、癌の治療および予防または癌細胞成長の阻害のいずれかまたは両方のための候補物質をスクリーニングするためのキット：
（ａ）ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはＳＭＹＤ２ポリペプチドの機能的等価物；
（ｂ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群より選択される構成要素
（ｉ）ヒストンタンパク質、または少なくとも１つのメチル化部位を含むヒストンタンパク質の断片、
（ｉｉ）ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドまたはＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドの機能的等価物；
（ｉｉｉ）ＲＢ１ポリペプチドまたはＲＢ１ポリペプチドの機能的等価物；
（ｃ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群より選択される試薬；
（ｉ）ヒストンタンパク質またはヒストンタンパク質の機能的等価物のメチル化レベルを検出するための試薬；
（ｉｉ）ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドまたはＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドの機能的等価物のメチル化レベルを検出するための試薬；
（ｉｉｉ）ＲＢ１ポリペプチドまたはＲＢ１ポリペプチドの機能的等価物のメチル化レベルを検出するための試薬；および
（ｄ）メチル供与体、
［２９］ヒストンタンパク質が、ヒストンＨ４またはヒストンＨ３である、［２８］に記載のキット、
［３０］段階（ｃ）（ｉ）の試薬が、メチル化ヒストンＨ４タンパク質またはメチル化ヒストンＨ３タンパク質に対する抗体である、［２８］に記載のキット、
［３１］段階（ｃ）（ｉｉ）の試薬が、配列番号６５のリジン５３１および／またはリジン５７４でメチル化されたＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドに対する抗体である、［２８］に記載のキット、
［３２］段階（ｃ）（ｉｉｉ）の試薬が、配列番号６８のリジン８１０でメチル化されたＲＢ１ポリペプチドに対する抗体である、［２８］に記載のキット、ならびに
［３３］前記メチル供与体が、Ｓ−アデノシルメチオニンである、［２８］〜［３２］のいずれかに記載のキット。
【００１８】
当業者であれば、本発明の１つまたは複数の局面が特定の目的を満たすことができる一方、１つまたは複数の他の局面が他の特定の目的を満たすことができることを理解するであろう。各目的は、すべての点が、等しく本発明のすべての局面に当てはまらない場合がある。したがって、前述の目的は、本発明の任意の一態様に関して択一的に考慮することができる。
【００１９】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、添付の図面および実施例と併せて以下の詳細な説明を読めば、さらに十分に明らかになるであろう。しかしながら、上述の本発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも例示的な態様のものであり、本発明または本発明の他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。本発明の他の目的および特徴は、添付の図面および実施例と併せて以下の詳細な説明を読めば、さらに十分に明らかになるであろう。
【００２０】
特に、本発明を多数の特定の態様を参照して本明細書において説明するが、その説明は本発明を例証するものであり、本発明を限定するものとして構成されていないことが認識されよう。当業者であれば、添付の特許請求の範囲によって記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更および適用に想到することができる。同様に、本発明の他の目的、特徴、利益、および利点は、本概要および以下に記載される特定の態様から明らかになり、当業者には容易に明白になるであろう。このような目的、特徴、利益、および利点は、添付の実施例、データ、図面、およびそれらから引き出されるあらゆる妥当な推論と併せて上記から、単独で、または本明細書に組み入れられる参考文献を考慮して、明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
本発明の様々な局面および適用は、以下の図面の簡単な説明ならびに本発明の詳細な説明およびその好ましい実施形態を考慮することで、当業者に明白になるであろう。
【図１Ａ−Ｃ】図１は、ＳＭＹＤ２が癌組織および癌細胞で過剰発現していることを実証する。パートＡは、膀胱癌症例１２５例および正常膀胱症例２８例におけるｍＲＮＡレベルでのＳＭＹＤ２についてのｑＲＴ−ＰＣＲによる発現分析を示す。結果は、箱髭図によって示す。ハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨおよびＳＤＨを使用した。マンホイットニーＵ検定を統計分析に使用した（Ｐ＜０．０００１）。パートＢは、膀胱癌試料と正常器官組織との間のＳＭＹＤ２のｍＲＮＡレベルの比較を示す。正常器官組織には、脳、乳房、大腸、食道、眼、心臓、肝臓、肺、膵臓、胎盤、腎臓、直腸、脾臓、胃および精巣が含まれる。パートＣは、膀胱癌組織および正常膀胱組織の免疫組織化学分析を示す。すべての組織試料は、ＢｉｏＣｈａｉｎから購入した。元の倍率：ｘ２００。
【００２２】
【図１Ｄ−Ｅ】パートＤは、１種の非癌性細胞株（ＷＩ−３８）、１２種の膀胱癌細胞株（ＳＷ７８０、Ｊ８２、ＲＴ４、ＵＭＵＣ３、ＨＴ１１９７、ＨＴ１３７６、５６３７、ＥＪ２８、Ｔ２４、２５３Ｊ、２５３ＪＢＶおよびＳＣａＢＥＲ）、５種の肺癌細胞株（ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＬＣ３１９、Ｈ２１７０、Ａ５４９およびＳＢＣ５）、２種の大腸癌細胞株（ＬｏＶｏおよびＨＣＴ１１６）および１種の肝臓癌細胞株（ＳＮＵ４７５）におけるｍＲＮＡレベルでのＳＭＹＤ２発現レベルを調べるためのｑＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。パートＥは、様々な種類の細胞株におけるタンパク質レベルでのＳＭＹＤ２発現レベルを示す。抗ＳＭＴＤ２および抗ＡＣＴＢ（内部標準）抗体を用いて、大腸線維芽細胞株ＣＣＤ−１８Ｃｏ、２種の膀胱癌細胞株（ＲＴ４およびＳＷ７８０）、２種の肺癌細胞株（Ａ５４９およびＳＢＣ５）、１種の大腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６）および１種の子宮頸癌細胞株（ＨｅＬａ）のライセートをイムノブロットした。
【００２３】
【図１Ｆ−１】パートＦは、Ｏｎｃｏｍｉｎｅにおける遺伝子発現データの分析を示す。枠内の太いバーは平均発現レベルであり、枠は試料の９５％を表す。エラーバーは枠の上下にあり、発現レベルの範囲は２個の点によって囲まれる。
【００２４】
【図１Ｆ−２】図１Ｆ−２は、図１Ｆ−１の続きである。
【００２５】
【図１Ｆ−３】図１Ｆ−３は、図１Ｆ−２の続きである。
【００２６】
【図１Ｆ−４】図１Ｆ−４は、図１Ｆ−３の続きである。
【００２７】
【図２Ａ−Ｃ】図２は、ＳＭＹＤ２が癌細胞成長に関与することを実証する。パートＡは、ＳＭＹＤ２ノックダウンのタンパク質レベルでの検証を示す。抗ＳＭＹＤ２および抗ＡＣＴＢ（内部標準）抗体を用いて、ｓｉＲＮＡ処理７２時間後のＳＷ７８０およびＲＴ４細胞のライセートをイムノブロットした。パートＢは、膀胱癌細胞株（ＳＷ７８０およびＲＴ４）の増殖に対するＳＭＹＤ２ノックダウンの効果を、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８によって測定したもの示す。相対細胞数は、ｓｉＮＣ処理細胞数に対して標準化する（ｓｉＮＣ＝１）：結果は、３回の独立した実験の平均＋／−ＳＤ（エラーバー）である。Ｐ値は、スチューデントｔ−検定を使用して計算した（＊、Ｐ＜０．０５）。パートＣは、ＳＭＹＤ２のメチル化活性が、その成長促進効果に重要であることを示す。ＦＬＡＧ−Ｍｏｃｋ、−ＳＭＹＤ２（ＷＴまたはΔＮＨＳＣ／ΔＧＥＥＶ）をＣＯＳ７細胞にトランスフェクトし、トランスフェクション１０日後にギムザ染色を実施した。抗ＦＬＡＧ抗体を使用してウエスタンブロットによって、ＳＭＹＤ２（ＷＴまたはΔＮＨＳＣ／ΔＧＥＥＶ）の発現を確認した。ＡＣＴＢの発現は、対照として役立った。
【００２８】
【図２Ｄ−Ｅ】パートＤは、ＳＭＹＤ２が細胞周期のＧ１／Ｓ移行を促進することを示す。細胞周期状態によって細胞を分類する、ＦＡＣＳ結果の数値解析。Ｓ期のＴ−ＲＥｘ−ＳＭＹＤ２細胞の割合は、対照細胞（Ｔ−ＲＥｘ−ＭｏｃｋおよびＴ−ＲＥｘ−ＣＡＴ）よりもわずかに多い。３回の独立した実験の平均＋／−ＳＤ（エラーバー）。フィッシャーＰＬＳＤ事後検定を使用して、Ｐ値を計算した（＊＊、Ｐ＜０．０１；＊、Ｐ＜０．０５）。パートＥは、材料および方法に記載されているように、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合抗ＢｒｄＵおよび７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）で複合染色した後にフローサイトメトリーによって分析した細胞周期分布を示す。
【００２９】
【図２Ｆ−Ｇ】パートＦは、肺癌細胞株の増殖に対するＳＭＹＤ２ノックダウンの効果を示す。相対細胞数は、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ８によって測定し、ｓｉＮＣ処理細胞数に対して標準化する（ｓｉＮＣ＝１）：結果は、３回の独立した実験の平均＋／−ＳＤである。Ｐ値は、スチューデントｔ−検定を使用して計算した（＊、Ｐ＜０．０５）。パートＧは、ＨｅＬａ細胞における細胞周期動態に対するｓｉＳＭＹＤ２の効果を示す。細胞周期分布は、材料および方法に記載されているように、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合抗ＢｒｄＵおよび７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）で複合染色した後にフローサイトメトリーによって分析した。
【００３０】
【図３Ａ−Ｄ】図３は、ＳＭＹＤ２が、細胞質においてＨＳＰ９０ＡＢ１と複合体を形成することを実証する。パートＡは、ＦＬＡＧ−ｍｏｃｋまたはＦＬＡＧ−ＳＭＹＤ２を発現する細胞の免疫沈降物の銀染色を示す。ＦＬＡＧ−ＭｏｃｋまたはＦＬＡＧ−ＳＭＹＤ２を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースを使用して免疫沈降した。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色、続いて質量分析に供した。パートＢは、ＨＡ−ＨＳＰ９０ＡＢ１またはＨＡ−ＭｏｃｋおよびＦＬＡＧ−ＳＭＹＤ２発現ベクターを２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトし、抗ＦＬＡＧおよび抗ＨＡ抗体でＨＡ−免疫沈降物をイムノブロットしたことを示す。パートＣは、ＦＬＡＧ−ＳＭＹＤ２と内因性ＨＳＰ９０との相互作用を示す。相互作用は、抗ＨＳＰ９０および抗ＦＬＡＧ抗体を使用して、ＦＬＡＧ−免疫沈降物のウエスタンブロットによって確認した。パートＤは、ＳＭＹＤ２のＳＥＴドメインを含んでいた領域が、ＨＳＰ９０ＡＢ１との相互作用に必要であることを示す。ＨＡ−ＨＳＰ９０ＡＢ１発現ベクターおよび６種の異なる長さのＦＬＡＧ−ＳＭＹＤ２発現ベクター（［１〜４３３］、［１〜１００］、［１〜２５０］、［１００〜４３３］、［２５０〜４３３］および［３３０〜４３３］）を２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。抗ＨＡアガロースビーズを使用して免疫沈降を実施し、抗ＦＬＡＧおよび抗ＨＡ抗体で試料をイムノブロットした。
【００３１】
【図３Ｅ−Ｈ】パートＥは、ＨＳＰ９０ＡＢ１に対するＳＭＹＤ２の結合領域の概略図を示す。パートＦは、ＨＳＰ９０ＡＢ１のＣ末端領域がＳＭＹＤ２への結合に必要であることを示す。ＦＬＡＧ−ＳＭＹＤ２発現ベクターおよび４種の異なる長さのＨＡ−ＨＳＰ９０ＡＢ１ベクター（［１〜７２４］、［１〜５００］、［２５０〜７２４］および［５００〜７２４］）を２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。抗ＦＬＡＧおよび抗ＨＡ抗体でＨＡ−免疫沈降物をイムノブロットした。パートＧは、ＳＭＹＤ２に対するＨＳＰ９０ＡＢ１の結合領域の概略図を示す。パートＨは、ＳＭＹＤ２およびＨＳＰ９０ＡＢ１がＨｅＬａ細胞で共局在していることを示す。抗ＳＭＹＤ２（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８）および抗ＨＳＰ９０（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４）抗体、ならびにＤＡＰＩでＨｅＬａ細胞を染色した。スケールバーは、１０マイクロメートルを表す。
【００３２】
【図４Ａ−Ｃ】図４は、ＳＭＹＤ２が、Ｋ５３１およびＫ５７４でＨＳＰ９０ＡＢ１をメチル化することを実証する。パートＡは、ＳＭＹＤ２による用量依存的なＨＳＰ９０ＡＢ１のメチル化を示す。精製Ｈｉｓ−ＨＳＰ９０ＡＢ１およびＨｉｓ−ＳＭＹＤ２組換えタンパク質を使用してインビトロのメチルトランスフェラーゼ反応を実施し、フルオログラフィーでメチル化ＨＳＰ９０ＡＢ１を可視化した。ロードするタンパク質量は、ポンソーＳで膜を染色することによって確認した。パートＢは、インビボの標識実験による、ヒト細胞におけるＨＳＰ９０のメチル化を示す。ＦＬＡＧ−Ｍｏｃｋ、ＦＬＡＧ−ＳＭＹＤ２（ＷＴ）またはＦＬＡＧ−ＳＭＹＤ２（ΔＮＨＳＣ／ΔＧＥＥＶ）発現ベクターを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、シクロヘキシミドおよびクロラムフェニコールを含む無メチオニン培地で処理した。次いで、それらをＬ−［メチル−３Ｈ］メチオニンで５時間標識した抗ＨＳＰ９０抗体で細胞ライセートを免疫沈降し、フルオログラフィーによってメチル化ＨＳＰ９０を可視化した。ポンソーＳで膜を染色し、抗ＨＳＰ９０、抗ＦＬＡＧおよび抗ＡＣＴＢ（内部標準）抗体で全細胞ライセートをイムノブロットした。パートＣは、ＨＳＰ９０ＡＢ１のＣ末端領域（５００〜７２４）がＳＭＹＤ２によってメチル化されたことを示す。５種の異なる長さのＧＳＴ−ＨＳＰ９０ＡＢ１およびＨｉｓ−ＳＭＹＤ２を使用して、インビトロのメチルトランスフェラーゼアッセイを実施した。フルオログラフィーによってメチル化活性を可視化し、ＣＢＢ染色を行ってタンパク質量を確認した。
【００３３】
【図４Ｄ】パートＤは、モノメチル化ＨＳＰ９０ＡＢ１ペプチドに対応するＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。リジン５９４残基の１４Ｄａの増加が観察されたが、これは、リジン５９４がモノメチル化されたことを実証している。スコアおよび予想は、それぞれマスコットイオンスコアおよびマスコットデータベース検索結果の予想値を示す。
【００３４】
【図４Ｅ−Ｇ】パートＥは、ＨＳＰ９０ＡＢ１のメチル化部位の概略図を示す。パートＦは、Ｈｉｓ−ＳＭＹＤ２および完全長Ｈｉｓ−ＨＳＰ９０ＡＢ１（ＷＴ、Ｋ５３１Ａ／Ｋ５７４ＡおよびＫ５７４Ａ）を使用するインビトロのメチルトランスフェラーゼアッセイの結果を示す。Ｓ−アデノシル−Ｌ−［メチル−３Ｈ］メチオニンの存在下でＨｉｓ−ＳＭＹＤ２および完全長Ｈｉｓ−ＨＳＰ９０ＡＢ１（ＷＴ、Ｋ５３１Ａ／Ｋ５７４ＡおよびＫ５７４Ａ）を反応させ、混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、フルオログラムによって可視化した。ポンソーＳで膜を染色した。パートＧは、Ｈｉｓ−ＳＭＹＤ２および部分的なＨｉｓ−ＨＳＰ９０ＡＢ１［５００〜７２４］（ＷＴ、Ｋ５３１ＡおよびＫ５７４Ａ）を使用するインビトロのメチルトランスフェラーゼアッセイの結果を示す。Ｓ−アデノシル−Ｌ−［メチル−３Ｈ］メチオニンの存在下でＨｉｓ−ＳＭＹＤ２および部分的なＨｉｓ−ＨＳＰ９０ＡＢ１［５００〜７２４］（ＷＴ、Ｋ５３１ＡおよびＫ５７４Ａ）を反応させ、混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、フルオログラムによって可視化した。ポンソーＳで膜を染色した。
【００３５】
【図４Ｈ−Ｉ】パートＨは、ＳＭＹＤ２によってメチル化されたＨＳＰ９０ＡＢ１の概略図を示す。ＨＳＰ９０ＡＢ１の５００位〜７２４位の部分が、ＳＭＹＤ２による推定メチル化領域である。パートＩは、ＨＳＰ９０ＡＢ１のアミノ酸配列を示す。リジン５３１および５７４は、ヒト（ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））、ウサギ（カイウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ））、ラット（ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））、マウス（ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ））、ツメガエル（アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ））およびゼブラフィッシュ（ダニオ・レリオ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｔｉｏ））を含む様々な種にわたって保存されている。
【００３６】
【図５Ａ−Ｅ】図５は、Ｋ５７４のメチル化が、ＨＳＰ９０ＡＢ１シャペロニン複合体の形成に重要であることを実証する。パートＡはインビボの架橋アッセイを示し、ＨＳＰ９０ＡＢ１のメチル化依存的な架橋を示している。ｓｉＳＭＹＤ２＃２でＨｅＬａ細胞を処理し、ｓｉＲＮＡ処理２４時間後に、ＦＬＡＧ−ＨＳＰ９０ＡＢ１（ＷＴ）およびＨＡ−ＭｏｃｋまたはＨＡ−ＳＭＹＤ２発現ベクターを細胞にトランスフェクトし、続いて、Ｌ−フォト−ロイシンおよびＬ−フォト−メチオニンを含有するＤＭＥＭ−ＬＭの存在下でＵＶ照射した。次いで、抗ＦＬＡＧ、抗ＳＭＹＤ２および抗ＡＣＴＢ（内部標準）抗体で細胞ライセートをイムノブロットした。パートＢは、ＨＡ−ＳＭＹＤ２発現ベクターの存在下において、ＦＬＡＧ−ＭｏｃｋまたはＦＬＡＧ−ＨＳＰ９０ＡＢ１（ＷＴ）およびＨＡ−ＨＳＰ９０ＡＢ１（ＷＴまたはＫ５３１Ａ／Ｋ５７４Ａ）発現ベクターをコトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を使用する免疫沈降分析の結果を示す。抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２アガロースビーズを使用して免疫沈降を実施し、抗ＦＬＡＧおよび抗ＨＡ抗体で試料をイムノブロットした。パートＣは、ＨＡ−ＳＭＹＤ２発現ベクターの存在下において、ＦＬＡＧ−ＭｏｃｋまたはＦＬＡＧ−ＨＳＰ９０ＡＢ１（ＷＴ）およびＨＡ−ＨＳＰ９０ＡＢ１（ＷＴ、Ｋ５３１ＡまたはＫ５７４Ａ）発現ベクターをコトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を使用する免疫沈降分析の結果を示す。抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２アガロースビーズを使用して免疫沈降を実施し、抗ＦＬＡＧおよび抗ＨＡ抗体で試料をイムノブロットした。パートＤおよびＥは、ＨＳＰ９０ＡＢ１のＫ５７４のメチル化が、いくつかのコシャペロンへの結合に重要であることを示す。ＨＡ−ＳＭＹＤ２発現ベクターの存在下において、ＦＬＡＧ−ＨＳＰ９０ＡＢ１（ＷＴ）またはＦＬＡＧ−ＨＳＰ９０ＡＢ１（Ｋ５３１Ａ／Ｋ５７４Ａ）（Ｄ）、ＦＬＡＧ−Ｍｏｃｋ、ＦＬＡＧ−ＨＳＰ９０ＡＢ１（ＷＴ）、ＦＬＡＧ−ＨＳＰ９０ＡＢ１（Ｋ５３１Ａ）またはＦＬＡＧ−ＨＳＰ９０ＡＢ１（Ｋ５７４Ａ）（Ｅ）発現ベクターを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２アガロースビーズで免疫沈降を実施し、抗ＨＯＰ、抗Ｃｄｃ３７、抗ｐ２３、抗ＨＳＰ９０ｍｅＫ５７４ｍｅ１および抗ＦＬＡＧ抗体で試料をイムノブロットした。
【００３７】
【図５Ｆ−Ｇ】パートＦは、ＳＭＹＤ２依存性のメチル化によるＨＳＰ９０ＡＢ１二量体化の促進を示す。ＳＭＹＤ２の存在下または非存在下におけるＨＳＰ９０ＡＢ１のインビトロのメチルトランスフェラーゼ反応の後、ＢＳによってＨＳＰ９０ＡＢ１を架橋し、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および抗ＨＳＰ９０抗体を使用するウエスタンブロッティングを行った。フルオログラムによってメチル化活性を検証し、ポンソーＳで膜を染色して、ロードするタンパク質量を可視化した。パートＧは、抗モノメチル化ＨＳＰ９０ＡＢ１Ｋ５７４ｍｅ抗体の力価および特異性の、ＥＬＩＳＡによる分析を示す。
【００３８】
【図５Ｈａ−ｂ】パートＨは、ＨＳＰ９０ＡＢ１のメチル化が癌細胞成長を促進することを示す。パートＨａは、ＦＬＡＧ−ＨＳＰ９０ＡＢ１（ＷＴまたはＫ５３１Ａ／Ｋ５７４Ａ）を安定発現するＨｅＬａ細胞におけるＨＳＰ９０ＡＢ１（ＷＴまたはＫ５３１Ａ／Ｋ５７４Ａ）発現の検証を示す。ＦＬＡＧ−ＨＳＰ９０（ＷＴまたはＫ５３１Ａ／Ｋ５７４Ａ）を安定発現するＨｅＬａ細胞を構築し、抗ＦＬＡＧおよび抗ＡＣＴＢ（内部標準）抗体でライセートをイムノブロットした。パートＨｂは、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ８を使用して２４時間ごとに実施した細胞成長アッセイの結果を示す。相対細胞数は、ＨＳＰ９０ＡＢ１（ＷＴ）を発現する細胞の数に対して標準化する：結果は、３回の独立した実験の平均＋／−ＳＤである。Ｐ値は、スチューデントｔ−検定を使用して計算した（＊、Ｐ＜０．０５）。
【００３９】
【図６Ａ−Ｃ】図６は、ＳＭＹＤ２がＲＢ１をメチル化し、そのＣ末端ドメインを介して複合体を作ることを実証する。パートＡは、ＲＢ１がＳＭＹＤ２によってメチル化されることを実証する。精製Ｎ−ＲＡＳ、Ｈ−ＲＡＳ、Ｋ−ＲＡＳ、ＲＢ１、ｐ５３、Ａｕｒｏｒａ  ＢおよびＡＫＴ１組換えタンパク質を使用して、インビトロのメチルトランスフェラーゼ反応を実施した。フルオログラフィーでメチル化タンパク質を可視化した。パートＢおよびＣは、ＳＭＹＤ２およびＲＢ１タンパク質の免疫共沈降アッセイの結果を示す。ＳＭＹＤ２発現ベクターおよびＲＢ１発現ベクターまたはｍｏｃｋ対照ベクターを２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースを使用して免疫沈降によって、ＦＬＡＧ−ＳＭＹＤ２とＨＡ−ＲＢ１（Ｂ）との、またはＦＬＡＧ−ＲＢ１とＨＡ−ＳＭＹＤ２（Ｃ）との相互作用を調べ、抗ＦＬＡＧおよび抗ＨＡ抗体でイムノブロットした。
【００４０】
【図６Ｄ−Ｅ】パートＤは、ＳＭＹＤ２のＣ末端領域がＲＢ１との相互作用に必須であることを実証する。ＦＬＡＧ−ＲＢ１発現ベクターおよび３種の異なる領域のＨＡ−ＳＭＹＤ２ベクター（ＳＭＹＤ２タンパク質の１位〜２５０位、２５０位〜３３０位および３２０位〜４３３位のアミノ酸）を２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースを使用して免疫沈降を実施し、抗ＦＬＡＧおよび抗ＨＡ抗体で試料をイムノブロットした。パートＥは、ＳＭＹＤ２およびＲＢ１タンパク質がＳＢＣ５細胞で共局在していることを実証する。抗ＲＢ１（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８）および抗ＳＭＹＤ２（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４）抗体、ならびにＤＡＰＩでＳＢＣ５細胞を染色した。スケールバーは、３０マイクロメートルを表す。
【００４１】
【図７Ａ】図７は、ＳＭＹＤ２がＲＢ１をＫ８１０でメチル化することを実証する。パートＡは、ＲＢ１のＣ末端領域がＳＭＹＤ２によってメチル化されることを実証する。精製ＲＢ１組換えタンパク質［ＲＢ１（完全）、ＲＢ１（１〜３７８）、ＲＢ１（３７９〜９２８）およびＲＢ１（７７３〜９２８）］を使用して、インビトロのメチルトランスフェラーゼアッセイを実施し、フルオログラフィーでメチル化タンパク質を可視化した。
【００４２】
【図７Ｂ】パートＢは、モノメチルＲＢ１ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。ＲＢ１タンパク質（７７３〜９２８）をＳＭＹＤ２で処理し、次いで混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＣＢＢ染色の後、−２５ｋＤａのタンパク質バンドをＡＰＩで消化し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供した。モノメチル化ＲＢ１のスペクトルを示す。＊Ｋは、モノメチルリジンを示す。
【００４３】
【図７Ｃ−Ｄ】パートＣは、Ｋ８１０Ａ−ＲＢ１がＳＭＹＤ２によってメチル化されないことを実証する。ＲＢ１（７７３〜９２８、７７３〜８１３）、Ｋ８１０Ａ−ＲＢ１（７７３〜８１３）を使用して、インビトロのメチルトランスフェラーゼアッセイを実施した。パートＤおよびＥは、抗Ｋ８１０ｍｅ  ＲＢ１抗体の検証を示す。ＲＢ１（全長）およびＲＢ１（７７３〜９２８）（Ｄ）またはＲＢ１（７７３〜８１３）およびＫ８１０Ａ−ＲＢ１（７７３〜８１３）（Ｅ）を用いて、インビトロのメチルトランスフェラーゼアッセイを行った。抗ＲＢ１Ｋ８１０ｍｅおよび抗Ｈｉｓ（内部標準）抗体で試料をイムノブロットした。
【００４４】
【図７Ｅ−Ｆ】パートＥは、抗Ｋ８１０ｍｅ  ＲＢ１抗体の検証を示す。ＲＢ１（７７３〜８１３）およびＫ８１０Ａ−ＲＢ１（７７３〜８１３）を用いて、インビトロのメチルトランスフェラーゼアッセイを行った。パートＦは、ＦＬＡＧ−ＷＴ−ＲＢ１ベクターまたはＦＬＡＧ−Ｋ８１０Ａ−ＲＢ１ベクターおよびＨＡ−ＷＴ−ＳＭＹＤ２ベクターまたはＨＡ−ＳＭＹＤ２（ΔＮＨＳＣ／ＧＥＥＶ）ベクターを２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトしたことを示す。抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースを使用して免疫沈降を実施し、抗ＲＢ１Ｋ８１０ｍｅ、抗ＦＬＡＧおよび抗ＨＡ抗体で試料をイムノブロットした。
【００４５】
【図８Ａ−Ｃ】図８は、ＳＭＹＤ２によるＲＢ１のリン酸化の促進を実証する。パートＡは、ＳＭＹＤ２の発現レベルがＲＢ１のリン酸化レベル（セリン８０７／８１１）と相関することを示す。正常細胞株（ＣＣＤ１８ＣｏおよびＨＦＬ１）および癌細胞株（ＨｅＬａ、ＡＣＣ−ＬＣ−３１９、Ａ５４９、ＳＷ４８０、ＳＷ７８０、ＨＣＴ１１６およびＳＢＣ５）のライセートを、抗ｐ−ＲＢ１（セリン８０７／８１１）、抗ＳＭＹＤ２および抗ＡＣＴＢ（内部標準）抗体でイムノブロットした。パートＢは、ＦＬＡＧ−ＳＭＹＤ２ベクターおよびｍｏｃｋベクター（陰性対照）を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトしたことを示す。コンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するＲＩＰＡ様緩衝液で細胞を溶解させ、抗ＦＬＡＧ、抗ホスホ（ｐｈｏｓｐｈｏ）−ＲＢ１（セリン８０７／８１１）および抗ＲＢ１（内部標準）抗体で試料をイムノブロットした。パートＣは、ＨＡ−ＳＭＹＤ２ベクターをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞における免疫細胞化学的分析の結果を示す。ＨＡ−ＳＭＹＤ２ベクターをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした後、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で細胞を固定し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理した。固定した細胞を、抗ホスホ−ＲＢ１（セリン８０７／８１１）（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８）および抗ＨＡ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４）抗体、ならびにＤＡＰＩで染色した。
【００４６】
【図８Ｄ−Ｅ】パートＤは、ＳＭＹＤ２のノックダウンがＲＢ１（セリン８０７／８１１）のリン酸化レベルを低下させることを示す。ＳＭＹＤ２特異的ｓｉＲＮＡを使用してＳＭＹＤ２をノックダウンした後、コンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するＲＩＰＡ様緩衝液で細胞を溶解させた。抗ＳＭＹＤ２、抗ホスホ−ＲＢ１（セリン８０７／８１１）および抗ＲＢ１（内部標準）抗体を用いて、イムノブロットを実施した。パートＥは、ＦＬＡＧ−ＲＢ１（７７３〜８１３）ベクターおよびＨＡ−ＷＴ−ＳＭＹＤ２ベクターおよびＨＡ−ＳＭＹＤ２（ΔＮＨＳＣ／ＧＥＥＶ）ベクターをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を使用する免疫沈降分析の結果を示す。抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースを用いて免疫沈降を行った。抗ＦＬＡＧ、抗ホスホ−ＲＢ１（セリン８０７／８１１）および抗ホスホ−ＲＢ１（セリン７８０）抗体をイムノブロット分析に使用した。
【００４７】
【図９Ａ−Ｃ】図９は、リジン８１０におけるＳＭＹＤ２依存性のＲＢ１のモノメチル化が、セリン８０７／８１１におけるＲＢ１のリン酸化をインビトロで増加させることを実証する。パートＡは、連続的なインビトロのメチル化およびキナーゼアッセイの研究戦略を示す。パートＢは、ＢＳＡ（陰性対照）と反応させる基質として組換えＲＢ１（７７３〜８１３）タンパク質を使用するか、または酵素としてＳＭＹＤ２を使用して実施したインビトロのメチルトランスフェラーゼアッセイの結果を示す。抗ＲＢ１Ｋ８１０ｍｅ抗体を用いてウエスタンブロットによってＲＢ１のメチル化を確認した後、ＣＤＫ４／サイクリンＤ１複合体を酵素として使用してインビトロのキナーゼアッセイを行った。抗ホスホ−ＲＢ１（セリン８０７／８１１）抗体で試料をイムノブロットした。ロードするタンパク質およびペプチドの量は、ＭｅｍＣｏｄｅ（商標）Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって可視化した。パートＣは、リジン８１０におけるＲＢ１のメチル化が、ＲＢ１（セリン８０７／８１１）のリン酸化レベルを促進することを示す。いくつかの異なる用量のＳＭＹＤ２で処理したＲＢ１のインビトロのメチルトランスフェラーゼアッセイの後、ＣＤＫ４／サイクリンＤ１複合体を酵素として用いてインビトロのキナーゼアッセイを実施した。抗ホスホ−ＲＢ１（セリン８０７／８１１）および抗ＲＢ１  Ｋ８１０ｍｅ抗体で試料をイムノブロットした。ロードするタンパク質およびペプチドの量は、ＭｅｍＣｏｄｅ（商標）Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって可視化した。
【００４８】
【図９Ｄ−Ｆ】パートＤは、ＷＴ−ＲＢ１（７７３〜８１３）およびＫ８１０Ａ−ＲＢ１（７７３〜８１３）を用いるインビトロのメチルトランスフェラーゼおよびキナーゼアッセイの結果を示す。抗ＲＢ１  Ｋ８１０ｍｅ、抗ホスホ−ＲＢ１（セリン８０７／８１１）および抗Ｈｉｓ（内部標準）抗体をイムノブロット分析に使用した。パートＥは、ＲＢ１のメチル化および非メチル化ペプチドの配列を示す。パートＦは、ＣＤＫ４／サイクリンＤ１を酵素源として用いて実施した、Ｋ８１０メチル化または非メチル化ＲＢ１ペプチドのインビトロのキナーゼアッセイの結果を示す。抗ＲＢ１  Ｋ８１０ｍｅおよび抗ホスホ−ＲＢ１（セリン８０７／８１１）抗体をイムノブロット分析に使用した。ロードするペプチド量は、ＭｅｍＣｏｄｅ（商標）Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって可視化した。２回の独立した実験の平均＋／−ＳＤ（エラーバー）である。Ｐ値は、スチューデントｔ−検定を使用して計算した（＊＊、Ｐ＜０．０１）。
【００４９】
【図９Ｇ】パートＧは、２種の異なる用量のＣＤＫ４／サイクリンＤ１で処理したＲＢ１ペプチドのインビトロのキナーゼアッセイの結果を示す。ロードするペプチド量は、ＭｅｍＣｏｄｅ（商標）Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって可視化した。
【００５０】
【図１０Ａ−Ｂ】図１０は、ＲＢ１のリジン８１０のメチル化が、ＲＢ１のリン酸化およびＥ２Ｆルシフェラーゼ活性をインビボで促進することを実証する。パートＡは、ＨＡ−ＷＴ−ＳＭＹＤ２ベクターおよびＦＬＡＧ−ＷＴ−ＲＢ１ベクターまたはＦＬＡＧ−Ｋ８１０Ａ−ＲＢ１ベクターをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を使用する免疫沈降分析の結果を示す。抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースを用いて、免疫沈降を行った。抗ＦＬＡＧ、抗ＲＢ１  Ｋ８１０ｍｅおよび抗ホスホ−ＲＢ１（セリン８０７／８１１）抗体をイムノブロット分析に使用した。パートＢは、ＦＬＡＧ−ＷＴ−ＲＢ１（７７３〜８１３）ベクターまたはＦＬＡＧ−Ｋ８１０Ａ−ＲＢ１（７７３〜８１３）ベクターおよびＨＡ−ＷＴ−ＳＭＹＤ２ベクターをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を使用する免疫沈降分析の結果を示す。抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースを用いて、免疫沈降を行った。抗ＦＬＡＧ、抗ＲＢ１  Ｋ８１０ｍｅおよび抗ホスホ−ＲＢ１（セリン８０７／８１１）抗体をイムノブロット分析に使用した。
【００５１】
【図１０Ｃ−Ｄ】パートＣは、ＷＴ−ＲＢ１およびＫ８１０Ａ−ＲＢ１を２９３Ｔ細胞で過剰発現させた後のＥ２Ｆ受容体アッセイの結果を示す。３回の独立した実験の平均＋／−ＳＤ（エラーバー）。Ｐ値は、スチューデントｔ−検定を使用して計算した（＊＊＊、Ｐ＜０．００１）。パートＤは、ＳＭＹＤ２によるＲＢ１のメチル化を介したＲＢ１のリン酸化の動的調節の概略モデルを示す。
【００５２】
【図１１】図１１は、ＳＭＹＤ２処理後またはＳＭＹＤ２非処理後にＲＢ１の酸加水分解によって得られたアミノ酸のクロマトグラムを示す。挿入図は、アルギニンの周辺領域の拡大図を示す。モノメチル化リジン（ＭＫ）およびノルバリン（ｎ−Ｖ）を除いて、アミノ酸残基は、それらの１文字略語を使用して注釈を付ける。ＮＨ３：アンモニア、ＡＭＱ：アミノ酸誘導体化試薬による加水分解から生じた６−アミノキノリン。
【００５３】
【図１２】図１２は、Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ  ２９３細胞株の細胞成長分析の結果を示す。本発明者らは、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−ＲＥｘ（商標）ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、野生型ＲＢ１（ＲＢ１−ＷＴ）およびＫ８１０置換ＲＢ１（ＲＢ１−Ｋ８１０Ａ）を過剰発現することができる安定細胞株を樹立した。野生型およびＫ８１０置換ＲＢ１タンパク質の両方を、１マイクログラム／ｍｌのドキシサイクリンによって誘導した。細胞数はＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ）によって計算し、ｙ値は１日目に対する相対細胞数を示す（ｄ１＝１）。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
態様の説明
本明細書に記載されるものと類似または等価な任意の方法および材料を、本発明の態様の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法、装置および材料をこれから説明する。しかしながら、本材料および本方法を説明する前に、本発明が、本明細書に記載される特定のサイズ、形、寸法、材料、方法論、プロトコルなどに限定されず、これらがルーチンな実験法および最適化にしたがって変動し得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の形式または態様を記載するためのものに過ぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図していないことも理解されるべきである。
【００５５】
本明細書で言及される各刊行物、特許、または特許出願の開示は、参照によりその全体が具体的に本明細書に組み入れられる。しかしながら、本明細書のいかなる記載も、本発明が、先行発明によるこのような開示に先行している資格を有しないことの承認として解釈されるべきではない。
特に定義がない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合には、定義を含む本明細書が優先される。加えて、材料、方法、および実施例は例証に過ぎず、限定を意図するものではない。
【００５６】
定義
「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単語は、本明細書で使用される場合、特に指定のない限り、「少なくとも１つの」を意味する。
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、核酸残基のポリマーを指すのに本明細書において互換的に使用され、かつ特記しない限り、その一般に認められている１文字コードで呼ばれる。これらの用語は、１つまたは複数の核酸がエステル結合によって結合している核酸（ヌクレオチド）ポリマーに適用される。核酸ポリマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせから構成されてもよく、天然に存在する核酸ポリマーおよび天然に存在しない核酸ポリマーの両方を包含する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、または核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせから構成され得る。
【００５７】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すのに本明細書において互換的に使用される。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸のみならず、アミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体のアミノ酸ポリマーであって、１つまたは複数のアミノ酸残基が修飾された残基であるか、または対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的模倣体などの天然に存在しない残基である、アミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体のアミノ酸ポリマーを指す。
【００５８】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸のみならず、天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされたもの、ならびに細胞内で翻訳後に修飾されたもの（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然に存在するアミノ酸と同一の基本化学構造（水素に結合したα炭素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基）を有するが、修飾されたＲ基または修飾された骨格を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸と異なる構造を有するが、類似した機能を有する化合物を指す。
アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  生化学命名委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨された、それらの一般的に公知の３文字記号または１文字記号により言及される場合もある。
【００５９】
本発明との関連において、「ＳＭＹＤ２遺伝子」、「ＨＳＰ９０ＡＢ１遺伝子」、または「ＲＢ１遺伝子」という語句は、ヒトのＳＭＹＤ２遺伝子、ＨＳＰ９０ＡＢ１遺伝子もしくはＲＢ１遺伝子、またはヒトのＳＭＹＤ２遺伝子、ＨＳＰ９０ＡＢ１遺伝子もしくはＲＢ１遺伝子の機能的等価物のいずれかをコードするポリヌクレオチドを包含する。ＳＭＹＤ２遺伝子、ＨＳＰ９０ＡＢ１遺伝子、またはＲＢ１遺伝子は、従来のクローニング方法によって、または選択されたヌクレオチド配列に基づく化学合成によって、天然に存在するポリヌクレオチドとして天然から得ることができる。ｃＤＮＡライブラリなどを使用して遺伝子をクローニングするための方法は、当技術分野において周知である。
【００６０】
特に定義がない限り、「癌（ｃａｎｃｅｒ）」という用語は、ＳＭＹＤ２遺伝子を過剰発現する癌を指す。ＳＭＹＤ２遺伝子を過剰発現する癌の例には、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌が含まれるが、これらに限定されない。
【００６１】
物質（例えば、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチドなど）に関連して使用される「単離された」および「精製された」という用語は、物質が、その元の環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）から取り出され、それのようにしてその天然の状態と入れ替わることを示す。単離された核酸の例には、組換え技術によって作製された場合には、他の細胞物質もしくは培養培地を実質的に含まないか、または化学合成された場合には、前駆化学物質もしくは他の化学物質を実質的に含まないＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、およびそれらの誘導体が含まれる。好ましい実施形態において、本発明のペプチドをコードする核酸分子は、単離または精製されている。
【００６２】
本発明との関連において、「単離された」または「精製された」ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体は、天然起源に別に含まれ得る１つまたは複数の混入物質を実質的に含まない。したがって、単離されたまたは精製された抗体は、タンパク質（抗体）が由来する細胞もしくは組織起源に由来する、炭水化物、脂質、もしくは他の混入タンパク質などの細胞物質を実質的に含まないか、または化学合成された場合には、前駆化学物質もしくは他の化学物質を実質的に含まない抗体を指す。「細胞物質を実質的に含まない」という用語には、ポリペプチドの単離元であるか、または組換えにより作製されたポリペプチドの元となる細胞の細胞成分からポリペプチドが分離されている、ポリペプチドの調製物が含まれる。
【００６３】
したがって、細胞物質を実質的に含まないポリペプチドには、（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、または５％未満の異種タンパク質（本明細書において、「混入タンパク質」とも呼ばれる）を有するポリペプチドの調製物が含まれる。ポリペプチドが組換えにより作製される場合には、それは、好ましくは、培養培地も実質的に含まず、このようなポリペプチドには、タンパク質調製物の容積の約２０％、１０％、または５％未満の培養培地を含むポリペプチド調製物が含まれる。ポリペプチドが化学合成によって作製される場合には、それは、好ましくは、前駆化学物質または他の化学物質を実質的に含まず、このようなポリペプチドには、タンパク質調製物の容積の（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、５％未満の、タンパク質の合成に関与する前駆化学物質または他の化学物質を含むポリペプチド調製物が含まれる。特定のタンパク質調製物が、単離または精製されたポリペプチドを含有することは、例えば、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクーマシー・ブリリアント・ブルー染色などの後の単一バンドの出現によって示され得る。好ましい実施形態において、本発明の抗体およびポリペプチドは、単離または精製されている。ｃＤＮＡ分子などの「単離された」または「精製された」核酸分子は、組換え技術によって作製された場合には、他の細胞物質もしくは培養培地を実質的に含まない可能性があり、または、化学合成された場合には、前駆化学物質もしくは他の化学物質を実質的に含まない可能性がある。好ましい実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸分子は、単離または精製されている。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「生体試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅ）」という用語は、生物全体、またはその組織、細胞、もしくは構成部分（例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜臍帯血、尿、膣液、および精液を含むがこれらに限定されない体液）のサブセットを指す。「生体試料」はさらに、生物全体またはその細胞、組織、もしくは構成部分のサブセットから調製されたホモジネート、ライセート、抽出物、細胞培養物、もしくは組織培養物、またはその画分もしくは一部を指す。最後に、「生体試料」は、タンパク質またはポリヌクレオチドなどの細胞成分を含有する、その中で生物が増殖した栄養ブロスまたはゲルなどの培地を指す。
【００６５】
本発明の方法および組成物に「予防」および「予防法」との関連において有用性が見出される限り、このような用語は、疾患による死亡率および罹患率の負荷を軽減する任意の働きを意味するために本明細書において互換的に使用される。予防および予防法は「一次、二次、および三次の予防レベルで」行うことができる。一次予防および予防法は疾患の発症を回避するのに対し、二次および三次レベルの予防および予防法は、疾患の進行および症候の出現の予防および予防法、ならびに機能の回復および疾患に関連する合併症の軽減による既存の疾患の悪影響の軽減を目的とした働きを包含する。あるいは、予防および予防法は、特定の障害の重症度の緩和、例えば、腫瘍の増殖および転移の低減を目的とした広範囲の予防的治療を含むことができる。
【００６６】
本発明のある態様が、癌の治療および／もしくは予防法、ならびに／または術後再発の予防を包含する程度において、このような方法は、以下の段階のいずれかを含み得る：癌細胞の外科的切除、癌腫細胞成長の阻害、腫瘍の退行または退縮、寛解の誘導および癌発症の抑制、腫瘍の退縮、ならびに転移の軽減または阻害。癌の有効な治療および／または予防法は死亡率を減少させ、癌を有する個体の予後を改善し、血液中の腫瘍マーカーのレベルを低下させ、癌に伴う検出可能な症候を緩和する。治療は、対象において、ＳＭＹＤ２遺伝子の発現低下、または癌のサイズ、有病率もしくは転移能の減少などの臨床的利益につながる場合にも「有効」であると考えられ得る。治療が予防的に適用される場合、「有効」は、それが、癌の形成を遅延もしくは予防するか、または癌の臨床症状を予防もしくは緩和することを意味する。有効性は、特定の腫瘍型を診断または治療するための任意の公知の方法に関連して決定される。
【００６７】
遺伝子またはタンパク質：
本発明は、ＳＭＹＤ２（ＳＥＴ  ａｎｄ  ＭＹＮＤ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ２）、ＨＳＰ９０ＡＢ１（熱ショックタンパク質９０ｋＤａ  α（細胞質性）、クラスＢメンバー１）、およびＲＢ１（網膜芽細胞腫１）の遺伝子、ならびにこれらの遺伝子によってコードされるタンパク質に関する。
本発明の関心対象である遺伝子の典型的な核酸およびアミノ酸配列を以下の番号で示す。しかしながら、本発明は、これらの特定の配列に限定されない：
ＳＭＹＤ２：配列番号６２および６３；
ＨＳＰ９０ＡＢ１：配列番号６４および６５；
ＲＢ１：配列番号６７および６８。
上記配列データは、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号でも利用可能である：
ＳＭＹＤ２：ＮＭ＿０２０１９７およびＮＰ＿０６４５８２；
ＨＳＰ９０ＡＢ１：ＮＭ＿００７３５５およびＮＰ＿０３１３８１；
ＲＢ１：ＮＭ＿０００３２１およびＮＰ＿０００３１２。
【００６８】
本明細書において、関心対象である遺伝子、例えばＳＭＹＤ２、ＨＳＰ９０ＡＢ１、またはＲＢ１遺伝子によってコードされるポリペプチドは、「ＳＭＹＤ２（またはＨＳＰ９０ＡＢ１もしくはＲＢ１）ポリペプチド」、または「ＳＭＹＤ２（またはＨＳＰ９０ＡＢ１もしくはＲＢ１）タンパク質」、または単に「ＳＭＹＤ２」（または「ＨＳＰ９０ＡＢ１」もしくは「ＲＢ１」）」と呼ばれる。本発明との関連において、「ＳＭＹＤ２（またはＨＳＰ９０ＡＢ１もしくはＲＢ１）遺伝子」という語句は、特定のヒトポリペプチドをコードするポリヌクレオチドだけではなく、ヒト遺伝子の機能的等価物をコードするポリヌクレオチドも包含する。関心対象である特定の遺伝子は、従来のクローニング方法によって、または選択されたヌクレオチド配列に基づく化学合成によって、天然に存在するポリヌクレオチドとして天然から得ることができる。上記のように、および以下により詳細に議論するように、ｃＤＮＡライブラリなどを使用して遺伝子をクローニングするための方法は、当技術分野において周知である。
【００６９】
本発明の一態様によれば、機能的等価物も上記「ポリペプチド」であると考えられる。本明細書において、ポリペプチドの「機能的等価物」は、そのポリペプチドと等価な生物学的活性を有するポリペプチドである。すなわち、元の参照ポリペプチドの生物学的能力を保持する任意のポリペプチドを、本発明におけるこのような機能的等価物として使用することができる。
【００７０】
機能的等価物の例には、ＳＭＹＤ２（またはＨＳＰ９０ＡＢもしくはＲＢ１）タンパク質の天然に存在するアミノ酸配列と比べて、１つまたは複数、例えば１〜５個のアミノ酸または元のアミノ酸の最大５％が置換、欠失、付加、および／または挿入されているものが含まれる。あるいは、このポリペプチドは、それぞれのタンパク質の配列に対して少なくとも約８０％の相同性（配列同一性とも呼ばれる）、より好ましくは少なくとも約９０％〜９５％の相同性、多くの場合には約９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有するアミノ酸配列から構成されてもよい。特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性は、「Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)」のアルゴリズムにしたがって決定することができる。他の実施形態において、機能的等価物は、ストリンジェントな条件下で該遺伝子の天然に存在するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドでもよい。
本発明との関連において、ポリペプチドは、それを作製するために使用される細胞もしくは宿主、または利用される精製法に応じて、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、または形態における変動を有することができる。それでもなお、それが、関心対象であるヒトタンパク質のものと等価な機能を有する限り、それは、ＳＭＹＤ２（またはＨＳＰ９０ＡＢもしくはＲＢ１）ポリペプチドの機能的等価物の範囲内である。
【００７１】
天然に存在する配列に対して１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されている変異型または修飾型の関心対象であるポリペプチドから構成される機能的等価物に関して、一般に、タンパク質中の１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸の修飾は、そのタンパク質の機能に重大な影響を与えないか、または重大な影響を及ぼさないことが公知である。一部の場合において、それは、元のタンパク質の所望の機能を促進することさえできる。実際に、変異タンパク質または修飾タンパク質（すなわち、置換、欠失、挿入、および／または付加によって１個、２個、または数個のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配列から構成されるペプチド）は、元の生物学的活性を保持することが公知である（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:5662-6 (1984);Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500 (1982);Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79:6409-13 (1982)）。したがって、当業者であれば、単一のアミノ酸または低比率のアミノ酸（すなわち、５％未満、より好ましくは３％未満、さらにより好ましくは１％未満）を変化させる、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入、もしくは置換が、またはタンパク質の変化によって同様の機能を有するタンパク質が生じる「保存的修飾」とみなされるものが、本発明において許容されることを認識するであろう。したがって、一実施形態において、本発明のペプチドは、最初に開示された参照配列において１個、２個、またはさらにそれ以上のアミノ酸が付加、挿入、欠失、および／または置換されているアミノ酸配列を有してもよい。
【００７２】
生物学的活性が維持されている限り、アミノ酸変異の部位および数は、特に限定されない。しかしながら、一般に、アミノ酸配列の５％以下、より好ましくは３％未満、さらにより好ましくは１％未満を変化させることが好ましい。したがって、好ましい実施形態において、このような変異体において変異させるべきアミノ酸の数は、一般に３０アミノ酸以下、好ましくは２０アミノ酸以下、より好ましくは１０アミノ酸以下、より好ましくは５もしくは６アミノ酸以下、およびさらにより好ましくは３もしくは４アミノ酸以下である。
【００７３】
変異させるべきアミノ酸残基は、好ましくは、アミノ酸側鎖の特性が保存される異なるアミノ酸に変異させられる（保存的アミノ酸置換として公知のプロセス）。アミノ酸側鎖の特性の例は、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、および以下の官能基または特徴を共通に有する側鎖である：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基を含有する側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子を含有する側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミドを含有する側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基を含有する側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族を含有する側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当技術分野において周知である。例えば、以下の８つの群は、各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい）。
【００７４】
このような保存的に修飾されたポリペプチドは、本発明のタンパク質の機能的等価物に含まれる。しかしながら、本発明はこれらに限定されず、得られる修飾ポリペプチドがポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を保持している限り、関心対象であるペプチドの機能的等価物は、非保存的修飾を含むことができる。さらに、修飾タンパク質は、多型バリアント、種間相同体、およびこれらのポリペプチドの対立遺伝子によってコードされるものを排除しない。
【００７５】
１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸残基の付加によって修飾されたポリペプチドの例は、ＳＭＹＤ２ポリペプチド、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチド、またはＲＢ１ポリペプチドの融合タンパク質である。融合タンパク質は、当業者に周知の技術によって、例えば、ＳＭＹＤ２遺伝子、ＨＳＰ９０ＡＢ１遺伝子、またはＲＢ１遺伝子をコードするＤＮＡを、別のペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡとフレームが一致するように連結し、この融合ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、これを宿主内で発現させることによって、作製することができる。融合タンパク質の「他の」成分は、典型的には、数個〜１２個のアミノ酸から構成される小さなエピトープである。得られる融合タンパク質がＳＭＹＤ２ポリペプチド、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチド、またはＲＢ１ポリペプチドの目的の生物学的活性のいずれか１つを保持している限り、ＳＭＹＤ２ポリペプチド、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチド、またはＲＢ１ポリペプチドに融合させるペプチドまたはタンパク質に制限はない。
【００７６】
本発明によって意図される例示的な融合タンパク質には、ＳＭＹＤ２ポリペプチド、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチド、またはＲＢ１ポリペプチドと、他の小さなペプチドまたはタンパク質との、例えばＦＬＡＧ（Hopp TP, et al., Biotechnology 6: 1204-10 (1988)）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基を含有する６×Ｈｉｓまたは１０個のＨｉｓ残基を含有する１０×Ｈｉｓなどのポリヒスチジン（Ｈｉｓタグ）、インフルエンザ凝集体または凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃ断片、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、ｐ１８ＨＩＶ断片、Ｔ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶタグ）、Ｅタグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）、ＳＶ４０Ｔ抗原断片、ｌｃｋタグ、αチューブリン断片、Ｂタグ、プロテインＣ断片などとの融合物が含まれる。本発明のタンパク質に融合させることができるタンパク質の他の例には、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、免疫グロブリン定常領域、βガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）などが含まれる。
【００７７】
本発明によって意図される修飾タンパク質の他の例には、多型バリアント、種間相同体、およびこれらのタンパク質の対立遺伝子によってコードされるものが含まれる。
天然に存在する関心対象である遺伝子またはタンパク質と同一の特定配列から構成される機能的等価物は、当技術分野における従来の技術、例えばハイブリダイゼーション技術（Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001）を使用して、同定および単離することができる。当業者であれば、関心対象である遺伝子の機能的等価物をコードするＤＮＡを単離するために適切なハイブリダイゼーション条件を慣用的な手法で選択することができる。
【００７８】
本明細書において使用される場合、「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、核酸分子が、その標的配列、典型的には複合的な核酸混合物中にある標的配列にハイブリダイズするが、他の配列とは検出可能にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況下で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範囲のガイドは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes,「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)に見られる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低く選択される。Ｔｍは、平衡状態で、標的に相補的なプローブの５０％が、標的配列にハイブリダイズする（規定のイオン強度、ｐＨ、核濃度での）温度である（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍでは、平衡時に、プローブの５０％が占有される）。ホルムアミドなどの脱安定化剤の添加によっても、ストリンジェントな条件を達成することができる。選択的または特異的なハイブリダイゼーションのため、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、以下のものが含まれる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベーションと、５０℃での０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳによる洗浄。
【００７９】
本発明との関連において、当業者であれば、機能的に等価なポリペプチドをコードするＤＮＡを単離するための最適なハイブリダイゼーションの条件をルーチン的に選択することができる。例えば、「Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ  ｂｕｆｆｅｒ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ）を使用して、６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行い、標識されたプローブを添加し、６８℃で１時間以上加熱することにより、ハイブリダイゼーションを実施することができる。例えば、低ストリンジェントな条件においては、以下の洗浄工程を行うことができる。例示的な低ストリンジェントな条件には、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが含まれ得る。多くの場合、高ストリンジェンシー条件が好んで使用される。例示的な高ストリンジェンシー条件には、２×ＳＳＣ、０．０１％ＳＤＳで２０分間、室温での３回の洗浄、次いで１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２０分間、３７℃での３回の洗浄、および１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２０分間、５０℃での２回の洗浄が含まれ得る。しかしながら、温度および塩濃度などのいくつかの因子が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす場合があり、当業者であれば、これらのおよび他の因子をルーチン的に調整して所望のストリンジェンシーに達することができる。
【００８０】
したがって、本発明との関連において、機能的等価物には、関心対象であるヒトポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の全部または一部と、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるポリペプチドが含まれる。これらの機能的等価物には、ヒトタンパク質の哺乳動物相同体、例えば、サル、マウス、ラット、ウサギまたはウシＳＭＹＤ２遺伝子（またはＨＳＰ９０ＡＢ遺伝子もしくはＲＢ１遺伝子）によってコードされるポリペプチドが含まれる。
関連ＤＮＡの配列情報に基づいて合成されたプライマーを使用して、関心対象であるヒトポリペプチドの機能的等価物をコードするＤＮＡを単離するために、ハイブリダイゼーションに代えて、遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用することができる。例示的なプライマー配列の例は、実施例のセクションの半定量的ＲＴ−ＰＣＲにおいて示す。
【００８１】
上記ハイブリダイゼーション技術または遺伝子増幅技術により単離されたＤＮＡによってコードされるポリペプチドの機能的等価物は、通常、元の参照ポリペプチドのアミノ酸配列に対して高い相同性（配列同一性とも呼ばれる）を有するであろう。「高い相同性」（「高い配列同一性」とも呼ばれる）は、典型的には、最適にアライメントされた２つの配列（ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列のいずれか）間の同一性の程度を指す。典型的には、高い相同性または配列同一性は、４０％以上、例えば６０％以上、例えば８０％以上、例えば８５％、９０％、９５％、９８％、９９％以上の相同性を指す。２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の相同性または同一性の程度は、アルゴリズム［Wilbur WJ & Lipman DJ. Proc Natl Acad Sci U S A. 1983 Feb; 80 (3):726-30］にしたがって決定することができる。
【００８２】
配列同一性および配列類似性のパーセントは、従来の技術、例えば、［Altschul SF, et al., J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215 (3):403-10; Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1; 25(17):3389-402］に記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを使用して、容易に決定することができる。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公に入手可能である（ncbi.nlm.nih.gov/のワールドワイドウェブ上）。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列された場合、一致するかまたはいくつかの正の値の閾値スコアＴを満たすかいずれかのクエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高スコアリング配列対（ｈｉｇｈ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐａｉｒ）（ＨＳＰ）を最初に同定することを伴う。Ｔは近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschulら、前記）。これらの最初の近隣ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして働く。
【００８３】
その後、このワードヒットは累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各々の配列に沿って両方向に伸長される。ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（１対の一致残基に対する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（不一致残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を用いて累積スコアを計算する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下した場合；１つもしくは複数の負のスコアリング残基アラインメントの蓄積によって、累積スコアがゼロ未満に進んだ場合、またはいずれかの配列の末端に達した場合、各々の方向におけるワードヒットの伸長は停止する。
【００８４】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。（ヌクレオチド配列についての）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、２８のワードサイズ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝１、Ｎ＝−２、および両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワードサイズ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスをデフォルトとして使用する［Henikoff S & Henikoff JG. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Nov 15; 89(22):10915-9］。
【００８５】
癌を検出または診断する方法：
本発明は、ＳＭＹＤ２が癌の診断マーカーとして役立ち得るという発見に関し、したがって、それに関連する癌の検出において有用性を見出すものである。本明細書において実証されたように、ＳＭＹＤ２遺伝子の発現は、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌で特異的かつ有意に上昇している（図１）。したがって、本明細書において同定された遺伝子、ならびにそれらの転写産物および翻訳産物は、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌のマーカーとしての診断有用性が見出され、細胞試料におけるＳＭＹＤ２遺伝子の発現を測定することによって、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病または前立腺癌を診断することができる。具体的には、本発明は、対象由来の生体試料におけるＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルを決定することによって、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病または前立腺癌の存在またはこれらを発症する素因を検出、診断および／または決定するための方法を提供する。
【００８６】
本発明との関連において、「診断する」という用語は、検出のみならず予測および尤度解析を包含することができる。したがって、本発明は、対象由来の生体試料におけるＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルを決定する段階を含む、対象における癌細胞の存在または癌を発症する素因を検出または同定するための方法であって、該遺伝子の正常対照レベルと比較した該発現レベルの上昇が、該組織における癌細胞の存在または疑いを示す方法を提示する。
【００８７】
本発明によれば、対象の状態を検査するための中間結果が提供され得る。このような中間結果をさらなる情報と組み合わせて、医師、看護師、または他の実務者が、対象が疾患に罹患しているかを決定するのを援助することができる。すなわち、本発明は、癌を検査するための診断マーカーＳＭＹＤ２を提供する。
【００８８】
あるいは、本発明は、対象由来の試料におけるＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルを決定する段階を含む、対象由来の膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病または前立腺癌組織試料における癌細胞を検出または同定するための方法であって、該遺伝子の正常対照レベルと比較した該発現レベルの上昇が、該組織における癌細胞の存在または疑いを示す方法を提供する。
【００８９】
本発明の診断方法は、癌について、治療的介入、病期などの診断基準、ならびに疾患モニタリングおよび監視を含む治療様式に関する決定を行う際に、臨床的に使用してもよい。診断の正確性を改善するために、他の癌関連遺伝子、例えば、癌において差次的に発現されることが公知の遺伝子の発現レベルも決定することができる。さらに、複数の癌関連遺伝子の発現レベルが比較される場合、試料と癌性である参照との間の遺伝子発現パターンの類似性は、対象が、肺癌に罹患しているかまたは肺癌を発症するリスクを有することを示す。
【００９０】
したがって、関心対象である特定遺伝子の発現結果を、組織病変、血液中の公知の腫瘍マーカーのレベル、および対象の臨床経過を含むさらなる情報または別の指標と組み合わせて、医師、看護師、または他の医療実務者が、対象が疾患に罹患していると診断するのを援助することができる。換言すれば、本発明は、対象が疾患に罹患していると診断するために有用な情報を医師に提供し得る。例えば、本発明によれば、対象から得られた組織における癌細胞の存在に関して疑いがある場合、ＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルに加えて、組織病変、血液中の公知の腫瘍マーカーのレベル、および対象の臨床経過などを含む疾患の異なる側面を考察することによって、臨床的判断に至ることができる。例えば、血液中のいくつかの周知の診断用肺癌マーカーには、ＡＣＴ、ＢＦＰ、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、ＣＡ７２−４、ＣＡ１３０、ＣＡ６０２、ＣＥＡ、ＩＡＰ、ＫＭＯ−１、ＳＣＣ、ＳＬＸ、ＳＰ１、Ｓｐａｎ−１、ＳＴＮ、ＴＰＡおよびサイトケラチン−１９断片が含まれる。血液中のいくつかの周知の膀胱癌マーカーには、ＮＭＰ２２、ＢＦＰおよびＴＰＡが含まれる。あるいは、血液中の診断用乳癌マーカー、例えばＣＡ１５−３、ＢＣＡ２２５、ＣＳＬＥＸ、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、ＣＥＡ、ＴＰＡおよびＨＥＲ２も周知である。血液中のいくつかの周知の診断用大腸癌マーカーには、ＣＡ７２−４、ＳＴＮ、ＣＡ１９−９、ＣＥＡおよびＮＣＣ−ＳＴ−４３９が含まれ、血液中の腎臓癌マーカーには、ＢＦＰおよびＩＡＰが含まれ、血液中の肝臓癌マーカーには、ＡＦＰおよびＰＩＶＫＡ−２が含まれ、血液中の頭頸部癌マーカーには、ＳＣＣが含まれ、血液中の精上皮腫マーカーには、ＡＦＰ、β−ｈＣＧ、ＬＤＨが含まれ、血液中の皮膚癌マーカーには、ＳＣＣが含まれ、血液中の膵臓癌マーカーには、ＣＡ１９−９、Ｓｐａｎ−１、ＳＬＸおよびＣＥＡが含まれる。すなわち、本発明のこの特定の態様において、遺伝子発現分析の結果は、対象の疾患病期をさらに診断するための中間結果として役立つ。
【００９１】
本発明の特に好ましい実施形態は、［１］〜［１１］の項目として示される：
［１］以下の段階を含む、対象における癌の存在または癌を発症する素因を検出または診断する方法：
（Ａ）対象由来の生体試料におけるＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルを決定する段階であって、前記遺伝子の正常対照レベルと比較した前記レベルの上昇が、前記対象が癌に罹患しているかまたは癌を発症するリスクを有することを示し、該発現レベルが、以下からなる群より選択される方法のいずれか１つによって決定される、段階：
（ａ）ＳＭＹＤ２遺伝子のｍＲＮＡを検出すること；
（ｂ）ＳＭＹＤ２遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること；および
（ｃ） ＳＭＹＤ２遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出すること、
または
（Ｂ）
（ｉ）対象由来の生体試料を単離または採取する段階、
（ｉｉ）ＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルを測定または決定するために、該対象由来の生体試料を、ＳＭＹＤ２遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと、またはＳＭＹＤ２遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する抗体と接触させる段階、および
（ｉｉｉ）前記接触に基づいてＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルを測定または決定する段階であって、ＳＭＹＤ２遺伝子の正常対照レベルと比較した該レベルの上昇が、該対象が癌に罹患しているかまたは癌を発症するリスクを有することを示す、段階；
［２］測定された試料の発現レベルが、該正常対照レベルよりも少なくとも１０％大きい、［１］に記載の方法；
［３］該生物学的活性が、細胞増殖促進活性またはメチルトランスフェラーゼ活性である、［１］に記載の方法；
［４］該癌が、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌からなる群より選択される、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法；
［５］該発現レベルが、該遺伝子のｍＲＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーションを検出することによって決定される、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法；
［６］該発現レベルが、該遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体の結合を検出することによって決定される、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法；
［７］該対象由来の生体試料が、生検標本、痰、血液、胸水および尿を含む、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法；
［８］該対象由来の生体試料が、上皮細胞を含む、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法；
［９］該対象由来の生体試料が、癌細胞を含む、［８］に記載の方法；および
［１０］該対象由来の生体試料が、癌性上皮細胞を含む、［１］に記載の方法。
［１１］該癌が膀胱癌である場合、該対象由来の生体試料が該対象由来の膀胱組織であり；該癌が肺癌である場合、該対象由来の生体試料が肺組織であり；該癌が乳癌である場合、該対象由来の生体試料が乳房組織であり；該癌が子宮頸癌である場合、該対象由来の生体試料が子宮頸部組織であり；該癌が大腸癌である場合、該対象由来の生体試料が大腸組織であり；該癌が腎臓癌である場合、該対象由来の生体試料が腎臓組織であり；該癌が肝臓癌である場合、該対象由来の生体試料が肝臓組織であり；該癌が頭頸部癌である場合、該対象由来の生体試料が頭頸部組織であり；該癌が精上皮腫である場合、該対象由来の生体試料が精巣組織であり；該癌が皮膚癌である場合、該対象由来の生体試料が皮膚組織であり；該癌が膵臓癌である場合、該対象由来の生体試料が膵臓組織であり；該癌がリンパ腫である場合、該対象由来の生体試料が血液試料またはリンパ節組織であり；該癌が卵巣癌である場合、該対象由来の生体試料が卵巣組織であり；該癌が白血病である場合、該対象由来の生体試料が血液試料または骨髄組織であり；該癌が前立腺癌である場合、該対象由来の生体試料が前立腺組織である、［４］に記載の方法。
【００９２】
膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌を含む癌を診断する方法を以下により詳細に説明する。
本方法によって診断されるべき対象は、好ましくは、哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれるが、これらに限定されない。
【００９３】
本発明の方法は、診断を実施するために、好ましくは、診断されるべき対象から得られたかまたは採取された生体試料を利用する。任意の生物学的材料は、それがＳＭＹＤ２の目的の転写産物または翻訳産物を含み得る限り、決定のための生体試料として使用することができる。対象由来の適切な生体試料の例には、癌を診断することが望まれるかまたは癌に罹患していることが疑われる体組織、ならびに生検標本、血液、痰、胸水および尿などの体液が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、生体試料は、上皮細胞、より好ましくは、癌性上皮細胞、または癌性であることが疑われる組織に由来する上皮細胞を含む細胞集団を含有する。さらに、必要であれば、得られた体組織および体液から細胞を精製し、次いで、それを生体試料として使用してもよい。
【００９４】
例えば、本発明との関連において、診断または検出に適切な癌には、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌が含まれる。これらの癌を診断または検出するために、対象由来の生体試料を以下の器官から採取してもよい：
膀胱：膀胱癌用、
肺：肺癌用、
乳房：乳癌用、
子宮頸部：子宮頸癌用、
大腸：大腸癌用、
腎臓：腎臓癌用、
肝臓：肝臓癌用、
頭頸部：頭頸部癌用、
精巣：精上皮腫用、
皮膚：皮膚癌用、
膵臓：膵臓癌用、
血液またはリンパ節：リンパ腫用、
卵巣：卵巣癌用、
血液または骨髄：白血病用、
前立腺：前立腺癌用。
【００９５】
本発明によれば、対象由来の生体試料におけるＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルを決定し、次いで対照試料と比較することによって、特定の健康または疾患状態と相関させる。当技術分野において公知の方法を使用して、転写（核酸）産物レベルで、発現レベルを決定することができる。例えば、ハイブリダイゼーション法（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション）によってプローブを使用して、ＳＭＹＤ２遺伝子を定量することができる。検出は、チップ上またはアレイ上で行ってもよい。アレイは、ＳＭＹＤ２遺伝子を含む複数の遺伝子（例えば、様々な癌に特異的な遺伝子）の発現レベルを検出するために好ましい。当業者であれば、ＳＭＹＤ２遺伝子の配列情報（配列番号６２）を利用して、このようなプローブを調製することができる。例えば、ＳＭＹＤ２遺伝子のｃＤＮＡをプローブとして使用することができる。必要であれば、色素、蛍光、および同位体などの適切な標識によりプローブを標識し、ハイブリダイズした標識の強度として、遺伝子の発現レベルを検出してもよい。
【００９６】
あるいは、増幅に基づく検出法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）によってプライマーを使用して、ＳＭＹＤ２遺伝子の転写産物を定量することもできる。このようなプライマーは、利用可能な遺伝子の配列情報に基づいて調製することもできる。例えば、実施例で使用したプライマー対（配列番号５および６）を、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロットによる検出に利用してもよいが、本発明はこれらに限定されない。
本方法に関連して使用するために適切なプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件、中程度のストリンジェントな条件、または低ストリンジェントな条件下で、ＳＭＹＤ２遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズするであろう。「ストリンジェントな条件」の詳細は、「遺伝子およびタンパク質」という表題のセクションに記載されている。
【００９７】
あるいは、診断は、当技術分野において公知の方法を使用して、翻訳産物（すなわち、ポリペプチドまたはタンパク質）を定量的に検出することを含んでもよい。例えば、関心対象であるタンパク質に対する抗体を使用してＳＭＹＤ２タンパク質の量を決定し、疾患または正常な状態と相関させてもよい。翻訳産物／タンパク質の量は、例えば、該タンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法を含む任意の従来の技術によって決定してもよい。本発明の方法に関連して使用するために適切な抗体はモノクローナルでもよいしまたはポリクローナルでもよい。さらに、断片がＳＭＹＤ２タンパク質に対する結合能を保持している限り、抗体の任意の免疫原性断片または修飾物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖなど）を、検出に使用することができる。タンパク質の検出のためのこれらの種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明においては、このような抗体およびそれらの等価物を調製するために、任意の方法を利用することができる。
【００９８】
あるいは、ＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて決定してもよく、例えば、染色強度の研究は、ＳＭＹＤ２タンパク質に対する抗体を使用した免疫組織化学分析を介して観察してもよい。より具体的には、強い染色の観察は、タンパク質の存在の増加を示し、同時に、ＳＭＹＤ２遺伝子の高い発現レベルを示す。
【００９９】
さらに、翻訳産物は、その生物学的活性に基づいて検出することもできる。本明細書において発見されたように、ＳＭＹＤ２タンパク質は癌細胞の成長に関与していることが実証された。したがって、ＳＭＹＤ２タンパク質の癌細胞成長促進能力およびメチルトランスフェラーゼ活性は、生体試料中に存在するＳＭＹＤ２タンパク質の指標として使用され得る。本明細書において、細胞成長促進能力は、「細胞増殖活性」、「細胞増殖促進活性」または「細胞増殖促進活性」とも呼ばれる。本明細書において、基質に対するメチルトランスフェラーゼ活性は、ＳＭＹＤ２タンパク質をその生物学的活性に基づいて定量するために有用である。基質（特に、ヒストンＨ４タンパク質またはその断片、ヒストンＨ３タンパク質またはその断片、ＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質またはその断片、ＲＢ１タンパク質またはその断片）のメチル化レベルは、当技術分野において周知の方法によって決定することができる。
【０１００】
さらに、診断の正確性を改善するために、ＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルに加えて、他の癌関連遺伝子、例えば、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌において差次的に発現されることが公知の遺伝子の発現レベルも決定することができる。
【０１０１】
本発明との関連において、対象における癌、または対象由来の試料における癌細胞を検出または同定するための方法は、ＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルの決定から始める。決定したら、前記技術のいずれかを使用して、この値を対照レベルと比較する。本発明との関連において、遺伝子発現が、対照レベルから例えば１０％、２５％、もしくは５０％変化もしくは上昇しているか、または、対照レベルと比較して少なくとも０．１倍、少なくとも０．２倍、少なくとも０．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、もしくは少なくとも１０倍、もしくはそれ以上変化または上昇している場合に、遺伝子発現レベルが「変化した」または「上昇した」と考えられる。したがって、生体試料におけるＳＭＹＤ２遺伝子を含む癌マーカー遺伝子の発現レベルは、対応する癌マーカー遺伝子の対照レベルから、例えば、１０％、２５％、もしくは５０％上昇している場合；または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上上昇している場合、上昇しているとみなされ得る。
【０１０２】
本発明との関連において、「対照レベル」という語句は、対照試料において検出されたＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルを指し、正常対照レベルおよび癌対照レベルの両方を包含する。「正常対照レベル」という語句は、正常な健常個体において、または癌に罹患していないことが判明している個体集団において検出されたＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルを指す。正常な個体は、癌の臨床症状がない個体である。正常対照レベルは、非癌性組織から得られた正常細胞を使用して決定することができる。「正常対照レベル」はまた、癌に罹患していないことが判明している個体または集団の正常な健常組織または細胞において検出されたＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルでもよい。一方、「癌対照レベル」または「癌性対照レベル」という語句は、癌に罹患している個体または集団の癌性組織または細胞において検出されたＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルを指す。
【０１０３】
対象由来の試料において検出されたＳＭＹＤ２の発現レベルの正常対照レベルと比較した上昇は、対象（該試料が得られた）が、癌に罹患しているかまたは癌を発症するリスクを有することを示す。本発明との関連において、対象由来の試料は、試験対象、例えば癌を有すると疑われる患者から得られた任意の組織でもよい。例えば、組織には、上皮細胞が含まれ得る。より具体的には、組織は、癌性であると疑われる上皮細胞でもよい。試料の発現レベルと癌対照レベルとの間の類似性は、該対象（該試料が得られた）が、癌に罹患しているかまたは癌を発症するリスクを有することを示す。他の癌関連遺伝子の発現レベルも測定および比較される場合、試料と癌性である参照との間の遺伝子発現パターンの類似性は、対象が、癌に罹患しているかまたは癌を発症するリスクを有することを示す。
【０１０４】
疾患状態（癌性であるか非癌性であるか）が既知である対象から以前に採取され保管されていた試料を使用することによって、試験生体試料と同時に対照レベルを決定することができる。あるいは、疾患状態が既知である対象由来の試料において、以前に決定されたＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルを分析することによって得られた結果に基づいて、統計的方法によって対照レベルを決定してもよい。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞からの発現パターンのデータベースでもよい。さらに、本発明の一態様によれば、複数の参照試料から決定された複数の対照レベルと、生体試料におけるＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルを比較してもよい。患者由来の生体試料のものと類似した組織型に由来する参照試料から決定された対照レベルを使用することが好ましい。さらに、疾患状態が既知である集団におけるＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルの標準値を使用することが好ましい。標準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得てもよい。例えば、平均値±２Ｓ．Ｄ．または平均値±３Ｓ．Ｄ．の範囲を、標準値として使用してもよい。
【０１０５】
対象由来の生体試料におけるＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇しているか、または癌性対照レベルと類似している場合、対象は、癌に罹患しているかまたは癌を発症するリスクを有すると診断され得る。さらに、複数の癌関連遺伝子の発現レベルが比較される場合、試料と癌性である参照との間の遺伝子発現パターンの類似性は、対象が、癌に罹患しているかまたは癌を発症するリスクを有することを示す。
【０１０６】
試験生体試料の発現レベルと対照レベルとの間の差は、細胞の癌性状態または非癌性状態によって発現レベルが相違しないことが公知の対照核酸、例えば、ハウスキーピング遺伝子の発現レベルによって標準化することができる。例示的な対照遺伝子には、β−アクチン、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ、およびリボソームタンパク質Ｐ１が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０７】
癌を診断するため、および／または癌治療の有効性をモニタリングするためのキット：
本発明は、癌を検出もしくは診断するため、および／または癌治療の有効性をモニタリングするためのキットを提供する。好ましくは、癌は、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病または前立腺癌である。具体的には、キットは、対象由来の生体試料におけるＳＭＹＤ２の発現を検出するための少なくとも１つの試薬であって、以下からなる群より選択され得る試薬を含む：
（ａ）ＳＭＹＤ２遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＳＭＹＤ２タンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）ＳＭＹＤ２タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬。
【０１０８】
ＳＭＹＤ２遺伝子のｍＲＮＡを検出するために適切な試薬には、ＳＭＹＤ２  ｍＲＮＡに特異的に結合するか、またはＳＭＹＤ２  ｍＲＮＡを特定する核酸、例えば、ＳＭＹＤ２  ｍＲＮＡの一部分に対する相補的配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。これらの種類のオリゴヌクレオチドの例は、ＳＭＹＤ２  ｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブである。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法に基づいて調製することができる。必要であれば、ＳＭＹＤ２  ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体マトリックス上に固定化することができる。さらに、ＳＭＹＤ２  ｍＲＮＡを検出するための複数の試薬をキットに含めることもできる。
【０１０９】
本発明のプローブまたはプライマーは、典型的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。典型的には、オリゴヌクレオチドは、少なくとも約２０００個、１０００個、５００個、４００個、３５０個、３００個、２５０個、２００個、１５０個、１００個、５０個、または２５個の、ＳＭＹＤ２配列を含む核酸の連続したセンス鎖ヌクレオチド配列、またはＳＭＹＤ２配列を含む核酸のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列、またはこれらの配列の天然に存在する変異体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。特に、例えば、好ましい実施形態において、長さが５〜５０個のオリゴヌクレオチドが、検出されるべき遺伝子を増幅するためのプライマーとして使用することができる。あるいは、ハイブリダイゼーションに基づいた検出手順において、長さが数百個（例えば、約１００〜２００個）の塩基〜数千個（例えば、約１０００〜２０００個）の塩基を有するポリヌクレオチドもまた、プローブに使用することができる（例えば、ノーザンブロットアッセイまたはＤＮＡマイクロアレイ解析）。
【０１１０】
一方、ＳＭＹＤ２タンパク質を検出するために適切な試薬には、ＳＭＹＤ２タンパク質に対する抗体が含まれる。抗体はモノクローナルでもよいしまたはポリクローナルでもよい。さらに、断片がＳＭＹＤ２タンパク質に対する結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または修飾物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖなど）を、試薬として使用することができる。タンパク質の検出のためのこれらの種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明においては、このような抗体およびそれらの等価物を調製するために、任意の方法を利用することができる。さらに、直接結合または間接標識技術を介して、シグナル生成分子によって抗体を標識してもよい。標識、および抗体を標識して抗体とその標的との結合を検出するための方法は、当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明に利用することができる。さらに、ＳＭＹＤ２タンパク質を検出するための複数の試薬が、キットに含まれてもよい。
【０１１１】
直接結合または間接標識技術を介して、シグナル生成分子によって抗体を標識してもよい。標識、および抗体を標識して抗体とその標的との結合を検出するための方法は、当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明に利用することができる。さらに、ＳＭＹＤ２タンパク質を検出するための複数の試薬が、キットに含まれてもよい。
【０１１２】
あるいは、生体試料におけるＳＭＹＤ２タンパク質の発現は、その生物学的活性を指標として使用して検出および測定してもよい。生体試料において、例えば、発現されたＳＭＹＤ２タンパク質による細胞増殖活性またはメチルトランスフェラーゼ活性を測定することによって、生物学的活性を決定することができる。例えば、細胞を、対象由来の生体試料の存在下で培養し、次いで、増殖速度を検出することによって、または細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することによって、生体試料の細胞増殖活性を決定することができる。必要であれば、ＳＭＹＤ２  ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体マトリックス上に固定化することができる。さらに、ＳＭＹＤ２タンパク質の生物学的活性を検出するための複数の試薬が、キットに含まれてもよい。
【０１１３】
一方、生体試料を、ヒストンタンパク質（例えば、ヒストンＨ４タンパク質またはヒストンＨ３タンパク質）もしくはその断片、ＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質もしくはその断片、またはＲＢ１タンパク質もしくはその断片などの基質と共にインキュベートし、メチル化基質に対する抗体を使用して基質のメチル化レベルを検出することによって、生体試料におけるメチルトランスフェラーゼ活性を決定することができる。したがって、本キットは、基質（特に、ヒストンＨ４タンパク質もしくはその断片、ヒストンＨ３タンパク質もしくはその断片、ＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質もしくはその断片、またはＲＢ１タンパク質もしくはその断片）および抗メチル化基質抗体を含んでもよい。このような抗体の例には、ヒストンＨ３タンパク質のメチル化リジン３６、ＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質のメチル化リジン５３１および／もしくはリジン５７４、またはＲＢ１タンパク質のメチル化リジン８１０に結合する抗体が含まれる。そうでなければ、本キットは、ヒストンのメチル化によって放出されるホルムアルデヒドを検出するための適切な標識メチル供与体を含んでもよい。標識メチル供与体は、Ｓ−アデノシル［メチル−３Ｈ］メチオニン（ＳＡＭ）またはＬ−［メチル−３Ｈ］メチオニンであり得る。
【０１１４】
キットは、前記試薬を複数含有してもよい。さらに、キットは、ＳＭＹＤ２遺伝子に対するプローブまたはＳＭＹＤ２タンパク質に対する抗体を結合させるための固体マトリックスおよび試薬、細胞を培養するための培地および容器、陽性および陰性対照試薬、ならびにＳＭＹＤ２タンパク質に対する抗体を検出するための二次抗体を含んでもよい。本発明のキットは、緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、注射器、および使用のための説明を含む添付文書（例えば、文書、テープ、ＣＤ−ＲＯＭなど）を含む、商業的見地および使用者の見地から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。これらの試薬などは、ラベルを有する容器に入っていてもよい。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成されてもよい。
【０１１５】
本発明の一態様によれば、癌を診断するための本発明のキットは、陽性もしくは陰性対照試料のいずれか、またはその両方をさらに含んでもよい。本発明との関連において、陽性対照試料は、樹立された膀胱癌細胞株、肺癌細胞株、乳癌細胞株、子宮頸癌細胞株、大腸癌細胞株、腎臓癌細胞株、肝臓癌細胞株、頭頸部癌細胞株、精上皮腫細胞株、皮膚癌細胞株、膵臓癌細胞株、リンパ腫細胞株、卵巣癌細胞株、白血病細胞株または前立腺癌細胞株、でもよい。あるいは、ＳＭＹＤ２陽性試料はまた、癌患者から得られた膀胱癌組織、肺癌組織、乳癌組織、子宮頸癌組織、大腸癌組織、腎臓癌組織、肝臓癌組織、頭頸部癌組織、精上皮腫組織、皮膚癌組織、膵臓癌組織、リンパ腫細胞、卵巣癌組織、白血病細胞または前立腺癌組織、でもよい。あるいは、陽性対照試料は、カットオフ値を決定し、そのカットオフ値よりも多い量のＳＭＹＤ２  ｍＲＮＡまたはＳＭＹＤ２タンパク質を含有する試料を調製することによって調製してもよい。本明細書において、「カットオフ値」という語句は、正常範囲と癌性範囲を区分する値を指す。例えば、当業者であれば、受信者動作特性（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）（ＲＯＣ）曲線を使用してカットオフ値を決定することができる。本キットは、ＳＭＹＤ２  ｍＲＮＡまたはＳＭＹＤ２ポリペプチドのカットオフ値量を提供する、ＳＭＹＤ２標準試料を含んでもよい。一方、陰性対照試料は、非癌性細胞株または、正常な膀胱組織、肺組織、乳房組織、子宮頸部組織、大腸組織、腎臓組織、肝臓組織、頭頸部組織、精巣組織、皮膚組織、膵臓組織、リンパ節組織、卵巣組織、骨髄組織または前立腺組織などの非癌性組織から調製してもよいし、カットオフ値未満のＳＭＹＤ２  ｍＲＮＡまたはＳＭＹＤ２タンパク質を含有する試料を調製することによって調製してもよい。
【０１１６】
本発明の一実施形態として、試薬がＳＭＹＤ２タンパク質に対するプローブである場合、該試薬を多孔質ストリップなどの固体マトリックス上に固定化して、少なくとも１つの検出部位を形成することができる。多孔質ストリップの測定領域または検出領域は、核酸（プローブ）を各々が含有する複数の部位を含んでもよい。試験片はまた、陰性対照および／または陽性対照のための部位を含有してもよい。あるいは、対照部位は、試験片から分離されたストリップ上に位置してもよい。任意で、異なる検出部位は、異なる量の固定化された核酸を含有してもよい。すなわち、第１の検出部位の量がより多く、その後の部位の量がより少ない。試験試料の添加時、検出可能なシグナルを示す部位の数が、試料中に存在するＳＭＹＤ２  ｍＲＮＡの量の定量的な指標を提供する。検出部位は、任意の適切に検出可能な形で配置してもよく、典型的には、試験片幅にわたるバーまたはドットの形である。
【０１１７】
抗癌物質のスクリーニング：
ＳＭＹＤ２遺伝子、ＳＭＹＤ２ポリペプチドもしくはそれらの機能的等価物、または該遺伝子の転写調節領域を使用して、ＳＭＹＤ２遺伝子の発現またはＳＭＹＤ２ポリペプチドの生物学的活性を変化させる物質をスクリーニングすることが可能である。このような物質は、癌を治療または予防するための薬剤候補として使用してもよい。したがって、本発明は、ＳＭＹＤ２遺伝子、ＳＭＹＤ２ポリペプチドもしくはそれらの機能的等価物、またはＳＭＹＤ２遺伝子の転写調節領域を使用して、癌の治療および予防のいずれかまたは両方のための候補物質をスクリーニングする方法を提供する。
【０１１８】
本発明のスクリーニング方法によって適切な候補として単離および同定される物質は、ＳＭＹＤ２遺伝子の発現またはＳＭＹＤ２遺伝子の翻訳産物の活性を低下させ、抑制し、および／または阻害すると予想され、したがって、癌（特に、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌）の治療および予防のいずれかまたは両方のための候補である。
すなわち、本方法によってスクリーニングされる物質は、臨床的利益を有すると考えられ、動物モデルまたは試験対象において癌細胞成長を制限または予防する能力についてさらに試験することができる。
【０１１９】
本発明との関連において、本スクリーニング方法によって同定されるべき物質には、任意の物質、またはいくつかの物質を含む組成物が含まれる。さらに、本発明のスクリーニング方法によって細胞またはタンパク質に曝露される試験物質は、単一の物質でもよいし、または物質の組み合わせでもよい。物質の組み合わせを前記方法において使用する場合には、物質を逐次的に接触させてもよいし、または同時に接触させてもよい。
あるいは、本発明は、癌の治療もしくは予防または癌細胞成長の阻害に対する試験物質の治療効果を評価する方法を提供する。
【０１２０】
任意の試験物質、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製されたタンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド物質、合成微小分子物質（アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、およびアプタマーなどの核酸コンストラクトを含む）、および天然物質を、本発明のスクリーニング方法において使用することができる。本発明の試験物質はまた、（１）生物学的ライブラリ、（２）空間的にアドレス可能なパラレルな固相または液相のライブラリ、（３）デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法、（４）「一ビーズ一物質」ライブラリ法、および（５）アフィニティクロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリ法を含む、当技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリ法の多数のアプローチのいずれかを使用して得ることができる。アフィニティクロマトグラフィー選択を使用する生物学的ライブラリ法はペプチドライブラリに限定されるが、他の４つのアプローチは物質のペプチドライブラリ、非ペプチドオリゴマーライブラリ、または低分子ライブラリに適用可能である（Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12: 145-67）。分子ライブラリの合成法の例は、当技術分野において見られ得る（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13;Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: 11422-6;Zuckermann et al., J Med Chem 37: 2678-85, 1994;Cho et al., Science 1993, 261: 1303-5;Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2059; Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2061;Gallop et al., J Med Chem 1994, 37: 1233-51）。物質のライブラリは、溶液中（Houghten, Bio/Techniques 1992, 13: 412-21を参照されたい）、またはビーズ上(Lam, Nature 1991, 354: 82-4）、チップ上（Fodor, Nature 1993, 364: 555-6）、細菌上（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上（米国特許第５，５７１，６９８号；第５，４０３，４８４号、および第５，２２３，４０９号）、プラスミド上（Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 1865-9）、もしくはファージ上（Scott and Smith, Science 1990, 249: 386-90;Devlin, Science 1990, 249: 404-6;Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82; Felici, J Mol Biol 1991, 222: 301-10；米国特許出願第２００２１０３３６０号）に提示され得る。
本スクリーニング方法のいずれか１つによってスクリーニングされる物質の構造の一部が、付加、欠失、および／または置換によって変換された化合物は、本発明のスクリーニング方法によって得られる物質に含まれる。
【０１２１】
さらに、スクリーニングされた試験物質がタンパク質である場合、タンパク質をコードするＤＮＡを得るためには、タンパク質の全アミノ酸配列を決定して、タンパク質をコードする核酸配列を推定してもよいし、または得られたタンパク質の部分アミノ酸配列を分析して、その配列に基づいてオリゴＤＮＡをプローブとして調製し、そのプローブを用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、タンパク質をコードするＤＮＡを得てもよい。得られたＤＮＡは、癌を治療または予防するための候補である試験物質の調製における有用性に関して確認される。
【０１２２】
本明細書に記載されるスクリーニングにおいて有用な試験物質には、ＳＭＹＤ２タンパク質、またはインビボで元のタンパク質の生物学的活性を欠くその部分ペプチドに特異的に結合する抗体が含まれ得る。
試験物質ライブラリの構築は当技術分野において周知であるが、試験物質の同定および本スクリーニング方法のためのこのような物質のライブラリ構築についてのさらなる指針を本明細書において以下に提供する。
【０１２３】
本発明の一態様において、ＳＭＹＤ２タンパク質の発現レベルおよび／または生物学的活性の抑制は、癌細胞成長の抑制につながる。したがって、ある物質がＳＭＹＤ２タンパク質の発現および／または活性を抑制する場合、このような抑制は、対象における潜在的な治療効果を示している。本発明との関連において、潜在的な治療効果は、合理的な見込みのある臨床的な利点を指す。このような臨床的な利点の例には、以下のものが含まれるがこれらに限定されない；
（ａ）ＳＭＹＤ２遺伝子の発現低下、
（ｂ）対象における癌のサイズ、有病率、成長もしくは転移能の低減、
（ｃ）癌形成の予防、または
（ｄ）癌の臨床症状の予防もしくは緩和。
【０１２４】
（ｉ）分子モデリング：
試験物質ライブラリの構築は、求められる特性を有することが公知の物質の分子構造、および／またはＳＭＹＤ２タンパク質の分子構造の知識によって容易になる。さらなる評価のために適切な試験物質を予備スクリーニングするための１つのアプローチは、試験物質とＳＭＹＤ２タンパク質との間の相互作用のコンピュータモデリングを利用する。
コンピュータモデリング技術により、選択された分子の三次元原子構造の可視化、およびその分子と相互作用する新たな物質の合理的設計が可能になる。三次元コンストラクトは、典型的には、選択された分子のＸ線結晶学的分析またはＮＭＲイメージングからのデータに依存する。分子動力学は力場データを必要とする。コンピュータグラフィックスシステムは、新たな物質が標的分子にどのように結合するかを予測可能にし、結合特異性を完全にするための物質および標的分子の構造の実験的操作を可能にする。一方または両方に軽微な変化が加えられた場合に、分子−物質相互作用がどのようになるかを予測するには、分子力学ソフトウェアおよび計算集約型コンピュータが必要とされ、それらは、通常、分子設計プログラムと使用者との間のユーザーフレンドリなメニュー方式のインターフェースと連結される。
【０１２５】
上記に概説された分子モデリングシステムの例には、ＣＨＡＲＭＭプログラムおよびＱＵＡＮＴＡプログラム、Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓが含まれる。ＣＨＡＲＭＭは、エネルギー最小化および分子動力学の機能を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィックモデリング、および分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、相互作用的構築、修飾、可視化、および分子の互いの挙動の分析を可能にする。
【０１２６】
特定のタンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングの主題について多数の論文が発表されており、その例には、Rotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97: 159-66;Ripka, New Scientist 1988, 54-8;McKinlay & Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989, 29: 111-22;Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291: 189-93;Lewis & Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236: 125-40, 141-62;および核酸成分のモデル受容体に関するAskew et al., J Am Chem Soc 1989, 111: 1082-90が含まれる。
【０１２７】
化学物質をスクリーニングし図示する他のコンピュータプログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆ．、Ａｌｌｅｌｉｘ，Ｉｎｃ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ、およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｏｎｔａｒｉｏなどの会社から入手可能である。例えば、DesJarlais et al., J Med Chem 1988, 31: 722-9; Meng et al., J Computer Chem 1992, 13: 505-24; Meng et al., Proteins 1993, 17: 266-78; Shoichet et al., Science 1993, 259: 1445-50を参照されたい。
【０１２８】
推定上の阻害剤が同定されたならば、以下に詳述されるように、同定された推定上の阻害剤の化学構造に基づいて、任意の数のバリアントを構築するため、コンビナトリアルケミストリー技術を利用することができる。得られた推定上の阻害剤または「試験物質」のライブラリを、本発明の方法を用いてスクリーニングし、癌の治療および／もしくは予防法ならびに／または癌、特に膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌の術後再発の予防に適した試験物質を同定してもよい。
【０１２９】
（ｉｉ）コンビナトリアル化学合成：
試験物質のコンビナトリアルライブラリは、公知の阻害剤に存在しているコア構造の知識を使用する合理的薬物設計プログラムの一部として作製され得る。このアプローチにより、ハイ・スループット・スクリーニングを容易にする適度のサイズにライブラリを維持することが可能になる。あるいは、ライブラリを構成する分子ファミリーの全順列を簡便に合成することによって、単純な、特に短い、重合体分子ライブラリを構築することもできる。この後者のアプローチの一例は、６アミノ酸長の全ペプチドのライブラリである。このようなペプチドライブラリは、６アミノ酸配列のあらゆる順列を含み得る。この種類のライブラリは、線形コンビナトリアル・ケミカル・ライブラリと呼ばれる。
【０１３０】
コンビナトリアル・ケミカル・ライブラリの調製は、当業者に周知であり、化学合成または生物学的合成のいずれかによって作製され得る。コンビナトリアル・ケミカル・ライブラリには、ペプチドライブラリ（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号；Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37: 487-93;Houghten et al., Nature 1991, 354: 84-6を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。化学的多様性ライブラリを作製するための他の化学を使用することもできる。このような化学には、ペプチド（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９１／１９７３５）、コードされたペプチド（例えば、ＷＯ９３／２０２４２）、ランダムバイオオリゴマー（例えば、ＷＯ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドなどのダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒｓ）（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13）、ビニロガス（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド（Hagihara et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 6568）、グルコース足場を有する非ペプチド性ペプチド模倣体（Hirschmann et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 9217-8）、低分子物質ライブラリの類似有機合成（Chen et al., J. Amer Chem Soc 1994, 116: 2661）、オリゴカルバメート（Cho et al., Science 1993, 261: 1303）、および／またはペプチジルホスホネート（Campbell et al., J Org Chem 1994, 59: 658）、核酸ライブラリ（Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995 supplement;Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USAを参照されたい）、ペプチド核酸ライブラリ（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号を参照されたい）、抗体ライブラリ（例えば、Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14(3): 309-14およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照されたい）、炭水化物ライブラリ（例えば、Liang et al., Science 1996, 274: 1520-22；米国特許第５，５９３，８５３号を参照されたい）、ならびに有機低分子ライブラリ（例えば、ベンゾジアゼピン、Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1; 6(6): 624-31.；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および第５，５１９，１３４号；モルホリノ物質、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン、米国特許第５，２８８，５１４号などを参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３１】
コンビナトリアルライブラリの調製のための材料および方法は市販されている（例えば、３５７  ＭＰＳ，３９０  ＭＰＳ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  ＫＹ，Ｓｙｍｐｈｏｎｙ，Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，４３３Ａ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，９０５０  Ｐｌｕｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡを参照されたい）。加えて、コンビナトリアルライブラリ自体も多数市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．，Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ，Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤなどを参照されたい）。
【０１３２】
（ｉｉｉ）他の候補：
別のアプローチは、ライブラリを作製するために組換えバクテリオファージを使用する。「ファージ法」（Scott & Smith, Science 1990, 249: 386-90;Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82;Devlin et al., Science 1990, 249: 404-6）を使用して、極めて大きいライブラリを構築することができる（例えば、１０６〜１０８個の化学物質）。第２のアプローチは、主として化学的な方法を使用し、Ｇｅｙｓｅｎの方法（Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23: 709-15;Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102: 259-74）；およびＦｏｄｏｒらの方法（Science 1991, 251: 767-73）がその例である。Ｆｕｒｋａら（14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR: 013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93）、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（米国特許第４，６３１，２１１号）、およびＲｕｔｔｅｒら（米国特許第５，０１０，１７５号）は、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験され得るペプチドの混合物を作製する方法を記載している。
【０１３３】
アプタマーは、特定の分子標的に強固に結合する核酸から構成された高分子である。ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（Science. 249:505-510 (1990)）は、アプタマーの選択のためのＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法を開示している。ＳＥＬＥＸ法においては、核酸分子の大きなライブラリ（例えば、１０１５個の異なる分子）をスクリーニングに使用することができる。
【０１３４】
ＳＭＹＤ２ポリペプチドの全長に加えて、利用されるその断片が、天然に存在するＳＭＹＤ２ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を保持している限り、そのポリペプチドの断片を本スクリーニングに使用してもよい。本発明によって意図されるこのような生物学的活性の例には、天然のＳＭＹＤ２ポリペプチドの細胞増殖促進活性および／またはメチルトランスフェラーゼ活性が含まれる。
【０１３５】
ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物は、該ポリペプチドおよび断片がそれらの生物学的活性の少なくとも１つを保持している限り、他の物質にさらに連結させてもよい。有用な物質には、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマーなどが含まれる。これらの種類の修飾を行って、さらなる機能を付与すること、または該ポリペプチドおよび断片を安定化することができる。
【０１３６】
ＳＭＹＤ２ポリペプチド結合物質のスクリーニング：
本発明との関連において、正常な器官では発現されていないにもかかわらず、ＳＭＹＤ２遺伝子の過剰発現が、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌で検出された（図１Ａ〜Ｆ）。さらに、ｓｉＲＮＡによるＳＭＹＤ２のノックダウンおよびＳＭＹＤ２の不活性化は、癌細胞成長の阻害をもたらした（図２）。膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌におけるＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルの上昇、およびｓｉＲＮＡによるＳＭＹＤ２のノックダウン効果により、ＳＭＹＤ２ポリペプチドに結合する物質は、癌細胞増殖を抑制するので、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌を含む癌の治療または予防に有用であると予想される。したがって、本発明はまた、ＳＭＹＤ２ポリペプチドに対する結合活性を指標として使用して、癌細胞増殖を抑制する候補物質をスクリーニングする方法、ならびに癌、特に膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌を治療または予防するための候補物質をスクリーニングする方法を提供する。このスクリーニング方法の特定の一実施形態は、以下の段階を含む：
（ａ）試験物質を、ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物と試験物質との間の結合活性を検出する段階；および
（ｃ）ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物に結合する試験物質を、癌を治療または予防するための候補物質として選択する段階。
【０１３７】
あるいは、本発明によれば、癌の治療または予防に対する試験物質の潜在的な治療効果も評価または推定することができる。いくつかの実施形態において、本発明は、以下の段階を含む、癌の治療もしくは予防、またはＳＭＹＤ２の過剰発現に関連する癌の阻害に対する試験物質の治療効果を評価または推定するための方法を提供する：
（ａ）試験物質を、ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物と該試験物質との間の結合活性を検出する段階；および
（ｃ）該試験物質の潜在的な治療効果を、段階（ｂ）で検出された結合活性と相関させる段階であって、該試験物質が、癌を治療または予防するための候補物質として該ポリペプチドまたはその機能的等価物に結合する場合に、潜在的な治療効果が示される段階。
【０１３８】
本発明との関連において、治療効果は、試験物質およびＳＭＹＤ２ポリペプチドの結合レベルと相関させてもよい。例えば、試験物質がＳＭＹＤ２ポリペプチドに結合する場合、試験物質を、必要な治療効果を有する候補物質として同定または選択してもよい。あるいは、試験物質がＳＭＹＤ２ポリペプチドに結合しない場合、試験物質を、有意な治療効果を有しない物質として同定してもよい。
【０１３９】
本発明のスクリーニング方法を以下により詳細に説明する。
スクリーニングに使用されるべきＳＭＹＤ２ポリペプチドは、組換えポリペプチドもしくは天然由来のタンパク質、またはそれらの部分ペプチドであり得る。試験物質と接触させるべきポリペプチドは、例えば、精製されたポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であり得る。好ましい実施形態において、ポリペプチドを、ＳＭＹＤ２を発現する細胞から単離するか、または化学合成して、試験物質とインビトロで接触させる。
【０１４０】
ＳＭＹＤ２ポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングする方法として、当業者に周知の多くの方法を使用することができる。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法によって、具体的には以下のように行うことができる。ＳＭＹＤ２ポリペプチドをコードする遺伝子を、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳ、およびｐＣＤ８などの外来遺伝子の発現ベクターに挿入することによって、宿主（例えば、動物）細胞などにおいて発現させる。
【０１４１】
発現に使用されるべきプロモーターは、一般に使用され得る任意のプロモーターでもよく、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター（Rigby in Williamson (ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141 (1982)）、ＥＦ−αプロモーター（Kim et al., Gene 91:217-23 (1990)）、ＣＡＧプロモーター（Niwa et al., Gene 108:193 (1991)）、ＲＳＶ  ＬＴＲプロモーター（Cullen, Methods in Enzymology 152:684-704 (1987)）、ＳＲαプロモーター（Takebe et al., Mol Cell Biol 8:466 (1988)）、ＣＭＶ前初期プロモーター（Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84:3365-9 (1987)）、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1:385-94 (1982)）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman et al., Mol Cell Biol 9:946 (1989)）、ＨＳＶ  ＴＫプロモーターなどが含まれ得る。
【０１４２】
外来遺伝子を発現させるための宿主細胞への遺伝子の導入は、任意の方法、例えば、エレクトロポレーション法（Chu et al., Nucleic Acids Res 15:1311-26 (1987)）、リン酸カルシウム法（Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7:2745-52 (1987)）、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata et al., Nucleic Acids Res 12:5707-17 (1984);Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4:1641-3 (1984)）、リポフェクチン法（Derijard B., Cell 76:1025-37 (1994);Lamb et al., Nature Genetics 5:22-30 (1993):Rabindran et al., Science 259:230-4 (1993)）などにしたがって実施することができる。
【０１４３】
ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に、特異性が明らかなモノクローナル抗体のエピトープを導入することによって、モノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を含む融合タンパク質として、ＳＭＹＤ２遺伝子によってコードされるポリペプチドを発現させることができる。任意の市販のエピトープ−抗体システムを使用することができる（Experimental Medicine 13:85-90 (1995)）。マルチクローニング部位の使用によって、例えば、βガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などとの融合タンパク質を発現し得るベクターが、市販されている。また、融合によりＳＭＹＤ２ポリペプチドの特性が変化しないように、数個〜１２個のアミノ酸から構成される小さなエピトープのみを導入することによって調製された融合タンパク質が本明細書において提供される。ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−タグ）、インフルエンザ凝集ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７−タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−タグ）、Ｅ−タグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープと、これらを認識するモノクローナル抗体とを、ＳＭＹＤ２ポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングするためのエピトープ−抗体システムとして使用することができる（Experimental Medicine 13:85-90 (1995)）。
【０１４４】
免疫沈降との関連において、適切な界面活性剤を使用して調製された細胞ライセートに、これらの抗体を添加することによって、免疫複合体が形成される。免疫複合体は、ＳＭＹＤ２ポリペプチド、該ポリペプチドとの結合能を有するポリペプチド、および抗体から構成される。免疫沈降は、上記エピトープに対する抗体を使用する以外に、ＳＭＹＤ２ポリペプチドに対する、上記のように調製され得る抗体を使用して行ってもよい。抗体がマウスＩｇＧ抗体である場合、例えば、プロテインＡセファロースまたはプロテインＧセファロースによって、免疫複合体を沈降させることができる。ＳＭＹＤ２遺伝子によってコードされるポリペプチドが、ＧＳＴなどのエピトープとの融合タンパク質として調製される場合には、グルタチオン−セファロース４Ｂなどのこれらのエピトープと特異的に結合する物質を使用して、ＳＭＹＤ２ポリペプチドに対する抗体を使用する場合と同様に免疫複合体を形成させることができる。
【０１４５】
免疫沈降は、例えば、文献中の方法にしたがってまたは準じて実施することができる（Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988)）。
免疫沈降したタンパク質の分析には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥが一般に使用され、結合したタンパク質は、適切な濃度を有するゲルを使用して、タンパク質の分子量によって分析され得る。ＳＭＹＤ２ポリペプチドに結合したタンパク質は、クーマシー染色または銀染色などの一般の染色法によって検出することが困難であるため、細胞を、放射性同位体３５Ｓ−メチオニンまたは３５Ｓ−システインを含有する培養培地中で培養し、細胞内のタンパク質を標識し、タンパク質を検出することによって、タンパク質の検出感度を改善することができる。タンパク質の分子量が明らかである場合には、標的タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから直接精製し、その配列を決定することができる。
【０１４６】
あるいは、ウエストウエスタンブロッティング分析（Skolnik et al., Cell 65:83-90 (1991)）を使用して、ＳＭＹＤ２ポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングすることができる。特に、ＳＭＹＤ２ポリペプチドに結合するタンパク質を発現すると予想される培養細胞から、ｃＤＮＡライブラリを、ファージベクター（例えば、ＺＡＰ）を使用して調製し、ＬＢ−アガロース上でタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質をフィルタ上に固定し、精製され標識されたＳＭＹＤ２ポリペプチドを上記フィルタと反応させ、ＳＭＹＤ２ポリペプチドに結合したタンパク質を発現しているプラークを標識によって検出することによって、ＳＭＹＤ２ポリペプチドに結合するタンパク質を得ることができる。ビオチンとアビジンとの間の結合を利用することによって、またはＳＭＹＤ２ポリペプチドと特異的に結合する抗体、もしくはＳＭＹＤ２ポリペプチドと融合されるペプチドもしくはポリペプチド（例えば、ＧＳＴ）を利用することによって、ＳＭＹＤ２ポリペプチドを標識してもよい。放射性同位体または蛍光などを使用する方法も、使用してもよい。
【０１４７】
本明細書において使用される場合、「標識」および「検出可能な標識」という用語は、分光的手段、光化学的手段、生物学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段または化学的手段によって検出可能な任意の成分を指すのに使用される。このような標識には、標識されたストレプトアビジン複合体による染色のためのビオチン、磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標））、蛍光染料（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡに一般に使用される他のもの）、および熱量測定標識、例えばコロイド金または着色ガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズが含まれる。このような標識の使用を教示する特許には、米国特許第３，８１７，８３７号、米国特許第３，８５０，７５２号、米国特許第３，９３９，３５０号、米国特許第３，９９６，３４５号、米国特許第４，２７５，１４９号、および米国特許第４，３６６，２４１号が含まれる。このような標識を検出する手段は当業者に周知である。したがって、例えば、放射線標識は写真フィルムまたはシンチレーションカウンタを使用して検出することができ、蛍光マーカーは発光を検出するために光検出器を使用して検出することができる。酵素標識は、典型的には、酵素に基質を与え、基質に対する酵素作用によって生成された反応生成物を検出することによって検出され、熱量測定標識は着色標識を単純に視覚化することによって検出される。
【０１４８】
あるいは、別の実施形態において、本発明のスクリーニング法は、ツーハイブリッド細胞システムを利用してもよい（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；参考文献「Dalton and Treisman, Cell 68:597-612 (1992)」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10:286-92 (1994)」）。
【０１４９】
ツーハイブリッドシステムにおいては、ＳＭＹＤ２ポリペプチドをＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域に融合させ、酵母細胞において発現させる。ＳＭＹＤ２ポリペプチドに結合するタンパク質を発現すると予想される細胞からのｃＤＮＡライブラリを、ライブラリが、発現された場合にＶＰ１６またはＧＡＬ４の転写活性化領域に融合するように、調製する。次いで、ｃＤＮＡライブラリを上記酵母細胞に導入し、ライブラリに由来するｃＤＮＡを、検出された陽性クローンから単離する（ＳＭＹＤ２ポリペプチドに結合するタンパク質が酵母細胞において発現される場合、その２つの結合がレポーター遺伝子を活性化し、陽性クローンを検出可能にする）。上記の単離されたｃＤＮＡを大腸菌に導入し、タンパク質を発現させることによって、ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質を調製することができる。適切なレポーター遺伝子の例には、Ａｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子が含まれるが、これらに限定されず、ＨＩＳ３遺伝子に加えてこのようなものを使用することができる。
【０１５０】
アフィニティクロマトグラフィーを使用して、ＳＭＹＤ２ポリペプチドに結合する物質をスクリーニングすることもできる。例えば、ＳＭＹＤ２ポリペプチドをアフィニティカラムの担体上に固定化し、本発明のポリペプチドに結合可能なタンパク質を含有する試験物質をカラムに適用することができる。本明細書における試験物質は、例えば、細胞抽出物、細胞ライセートなどであり得る。試験物質をロードした後、カラムを洗浄し、ＳＭＹＤ２ポリペプチドに結合した物質を調製することができる。試験物質がタンパク質である場合には、得られたタンパク質のアミノ酸配列を分析し、配列に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、オリゴＤＮＡをプローブとして使用してｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、タンパク質をコードするＤＮＡを得る。
【０１５１】
本発明においては、結合した物質を検出または定量する手段として、表面プラズモン共鳴現象を使用するバイオセンサーを使用してもよい。このようなバイオセンサーを使用した場合、極微量のＳＭＹＤ２ポリペプチドのみを使用して、標識することなく、ＳＭＹＤ２ポリペプチドと試験物質との間の相互作用を、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅなどのバイオセンサーを使用して、ＳＭＹＤ２ポリペプチドと試験物質との間の結合を評価することが可能である。
【０１５２】
タンパク質だけではなくＳＭＹＤ２タンパク質に結合する化学物質（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）を単離するための、固定化されたＳＭＹＤ２ポリペプチドを合成化学物質または天然物質バンクもしくはランダム・ファージ・ペプチド・ディスプレイ・ライブラリに曝露した場合に結合する分子をスクリーニングする方法、およびコンビナトリアルケミストリー技術に基づくハイスループットを使用したスクリーニング法（Wrighton et al., Science 273:458-64 (1996);Verdine, Nature 384:11-13 (1996);Hogan, Nature 384:17-9 (1996)）が当業者に周知である。
【０１５３】
ＳＭＹＤ２ポリペプチドの全長に加えて、ＳＭＹＤ２ポリペプチドの断片は、該断片が、天然に存在するＳＭＹＤ２ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を保持している限り、本スクリーニング方法に使用してもよい。このような生物学的活性には、細胞増殖促進活性およびメチルトランスフェラーゼ活性などが含まれる。
ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその断片は、該ポリペプチドまたは機能的等価物が少なくとも１つの生物学的活性を保持している限り、他の物質にさらに連結させてもよい。使用可能な物質には、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマーなどが含まれる。これらの種類の修飾を行って、さらなる機能を付与すること、または該ポリペプチドまたは機能的等価物を安定化することができる。
【０１５４】
本発明の方法に使用されるＳＭＹＤ２ポリペプチドまたは機能的等価物は、従来の精製方法によって天然に存在するタンパク質として天然から、または選択されたアミノ酸配列に基づく化学合成を通じて、得ることができる。例えば、合成のために採用することができる従来のペプチド合成方法には、以下のものが含まれる：
１）Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；
２）The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976；
３）ペプチド合成（日本語），丸善，１９７５；
４）ペプチド合成の基礎と実験（日本語），丸善，１９８５；
５）医薬品の開発  続第１４巻（ペプチド合成）（日本語），広川書店，１９９１
６）ＷＯ９９／６７２８８；および
７）Barany G.& Merrifield R.B., Peptides Vol. 2,「Solid Phase Peptide Synthesis」，Academic Press, New York, 1980, 100-118。
【０１５５】
あるいは、ＳＭＹＤ２ポリペプチドは、ポリペプチドを作製するための任意の公知の遺伝子工学的方法によって、得ることもできる（例えば、Morrison J., J Bacteriology 1977, 132:349-51;Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology(eds. Wu et al.)1983, 101:347-62）。例えば、最初に、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現可能な形態で（例えば、プロモーターを含む調節配列の下流に）含む適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞中に形質転換し、次いでその宿主細胞を培養して、そのタンパク質を産生させる。より具体的には、ＳＭＹＤ２ポリペプチドをコードする遺伝子を、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳ、またはｐＣＤ８など外来遺伝子を発現させるためのベクター中にその遺伝子を挿入することによって、宿主（例えば、動物）細胞などにおいて発現させる。発現のために、プロモーターを使用することができる。一般に使用される任意のプロモーターを利用することができ、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター（Rigby, Williamson(ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 1982, 83-141）、ＥＦ−αプロモーター（Kim et al., Gene 1990, 91:217-23）、ＣＡＧプロモーター（Niwa et al., Gene 1991, 108:193）、ＲＳＶ  ＬＴＲプロモーター（Cullen, Methods in Enzymology 1987, 152:684-704）、ＳＲαプロモーター（Takebe et al., Mol Cell Biol 1988, 8:466）、ＣＭＶ前初期プロモーター（Seed et al., Proc Natl Acad Sci USA 1987, 84:3365-9）、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen et al., J Mol Appl Genet 1982, 1:385-94）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman et al., Mol Cell Biol 1989, 9:946）、およびＨＳＶ  ＴＫプロモーターなどが含まれる。ＳＭＹＤ２遺伝子を発現させるための、宿主細胞へのベクターの導入は、任意の方法、例えば、エレクトロポレーション法（Chu et al., Nucleic Acids Res 1987, 15:1311-26）、リン酸カルシウム法（Chen et al., Mol Cell Biol 1987, 7:2745-52）、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata et al., Nucleic Acids Res 1984, 12:5707-17; Sussman et al., Mol Cell Biol 1985, 4:1641-3）、およびリポフェクチン法（Derijard B, Cell 1994, 7:1025-37; Lamb et al., Nature Genetics 1993, 5:22-30; Rabindran et al., Science 1993, 259:230-4）などにしたがって実施することができる。
【０１５６】
ＳＭＹＤ２ポリペプチドはまた、インビトロの翻訳系を採用してインビトロで作製してもよい。
試験物質と接触させるべきＳＭＹＤ２ポリペプチドは、例えば、精製されたポリペプチド、可溶性タンパク質、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であり得る。
本方法によって、ＳＭＹＤ２ポリペプチドに結合する物質としてスクリーニングされる試験物質は、癌を治療または予防する潜在能力を有する候補物質であり得る。これらの候補物質が癌を治療または予防する潜在能力を、第２のおよび／またはさらなるスクリーニングによって評価して、癌に対する該物質の治療効果をさらに同定または確認してもよい。例えば、物質を、ＳＭＹＤ２遺伝子を過剰発現する癌細胞と接触させることによって、これらの候補物質を、癌細胞増殖の抑制についてさらに検査してもよい。
【０１５７】
ＳＭＹＤ２の生物学的活性を抑制する物質のスクリーニング：
本発明の間に、ＳＭＹＤ２遺伝子は、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌で特異的かつ有意に過剰発現していることが明らかになった（図１Ｄ、Ｆ）。さらに、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるＳＭＹＤ２遺伝子の抑制は、癌細胞の成長阻害および／または細胞死をもたらした（図２Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）。さらに、ＳＭＹＤ２タンパク質の不活性化は、コロニー形成活性を低下させた（図２Ｃ）。
【０１５８】
さらに、本発明の間に、新規なＳＭＹＤ２基質として同定されたＨＳＰ９０ＡＢ１およびＲＢ１のＳＭＹＤ２メチル化部位をアラニンに置換することにより、ＨＳＰ９０ＡＢ１（図５Ｈ）およびＲＢ１（図１２）の成長促進効果が減少した。
これらの結果は、ＳＭＹＤ２ポリペプチドが癌細胞の生存に関与することを明確に実証しているので、ＳＭＹＤ２ポリペプチドの生物学的活性を阻害する物質は、癌治療に適切な候補物質として役立ち得る。
したがって、本発明はまた、ＳＭＹＤ２ポリペプチドの生物学的活性を指標として使用して、癌の治療および予防のいずれかまたは両方のための候補物質をスクリーニングするための方法を提供する。
例示的な癌には、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌が含まれる。
【０１５９】
具体的には、本発明は、以下の方法を提供する：
以下の段階を含む、癌の治療および予防のいずれかまたは両方のための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）試験物質を、ＳＭＹＤ２ポリヌクレオチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物の生物学的活性を検出する段階；
（ｃ）段階（ｂ）で検出された生物学的活性を、該試験物質の非存在下で検出されたものと比較する段階；
（ｄ）ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物の生物学的活性を低下させるかまたは阻害する試験物質を選択する段階。
【０１６０】
本発明との関連において、ＳＭＹＤ２ポリペプチドの生物学的活性（例えば、細胞増殖促進活性またはメチルトランスフェラーゼ活性）の抑制に対する試験物質の治療効果、または癌の治療および予防のいずれかまたは両方のための候補物質を評価することができる。したがって、本発明はまた、以下の段階を含む、ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物を使用して、ＳＭＹＤ２ポリペプチドの生物学的活性を抑制するための候補物質、または癌の治療および予防のいずれかまたは両方のための候補物質をスクリーニングする方法を提供する：
（ａ）試験物質を、ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；および
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドまたはその機能的等価物の生物学的活性を検出する段階、および
（ｃ）（ｂ）の生物学的活性を試験物質の治療効果と相関させる段階。
【０１６１】
本発明との関連において、治療効果は、ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物の生物学的活性と相関させてもよい。例えば、試験物質が、ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物の生物学的活性を、該試験物質の非存在下で検出されたレベルと比較して抑制または阻害する場合、該試験物質を、治療効果を有する候補物質として同定または選択してもよい。あるいは、試験物質が、ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物の生物学的活性を、該試験物質の非存在下で検出されたレベルと比較して抑制または阻害しない場合、該試験物質を、有意な治療効果を有しない物質として同定してもよい。
【０１６２】
あるいは、いくつかの実施形態において、本発明は、以下の段階を含む、癌の治療および予防のいずれかもしくは両方、またはＳＭＹＤ２遺伝子の過剰発現に関連する癌の阻害に対する試験物質の治療効果を評価または推定するための方法を提供する：
（ａ）試験物質を、ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドまたはその機能的等価物の生物学的活性を検出する段階；および
（ｃ）潜在的な治療効果と該試験物質とを相関させる段階であって、物質が、ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物の生物学的活性を、該試験物質の非存在下で検出された該ポリペプチドの生物学的活性と比較して抑制する場合に、潜在的な治療効果が示される、段階。
【０１６３】
発現、結合および生物学的活性との関連において、「抑制する」という用語は、部分的なものから完全なものにまで及ぶ効果を包含するために、「低下させる」および「阻害する」という用語と互換的に使用される。したがって、本明細書において定義される場合、「生物学的活性を抑制する」という語句は、ＳＭＹＤ２の生物学的活性の、物質の非存在下と比較した少なくとも１０％の抑制、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％の抑制、および最も好ましくは９０％の抑制を指す。
【０１６４】
上記のように、本発明によって意図される癌の例には、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６５】
本発明との関連において、治療効果は、ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物の生物学的活性と相関させてもよい。例えば、試験物質が、ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物の生物学的活性を、該試験物質の非存在下で検出されたレベルと比較して抑制または阻害する場合、該試験物質を、治療効果を有する候補物質として同定または選択してもよい。あるいは、試験物質が、ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物の生物学的活性を、該試験物質の非存在下で検出されたレベルと比較して抑制または阻害しない場合、該試験物質を、有意な治療効果を有しない物質として同定してもよい。
【０１６６】
本発明のスクリーニング方法を以下により詳細に説明する。
任意のポリペプチドは、それらがＳＭＹＤ２ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を保持している限り、本発明のスクリーニング方法に使用することができる。このような生物学的活性の例には、ＳＭＹＤ２ポリペプチドの細胞増殖促進活性およびメチルトランスフェラーゼ活性が含まれる。例えば、ＳＭＹＤ２ポリペプチドを使用することもできるし、ＳＭＹＤ２ポリペプチドと機能的に等価なポリペプチドを使用することもできる。このようなポリペプチドは、細胞によって内因的または外因的に発現されてもよい。ＳＭＹＤ２ポリペプチドの機能的等価物の詳細については、「遺伝子およびタンパク質」の項目を参照されたい。例えば、ＳＥＴドメインを保持するＳＭＹＤ２ポリペプチドの断片、例えば、配列番号６３の１７番目から２４７番目のアミノ酸のアミノ酸配列を含有する断片は、ＳＭＹＤ２ポリペプチドの機能的等価物であり得る。
【０１６７】
本発明のスクリーニング方法によって単離される物質は、ＳＭＹＤ２ポリペプチドのアンタゴニスト（阻害剤）候補であると考えられる。「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することによって、その機能を阻害する分子を指す。この用語は、ＳＭＹＤ２ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を低下させるかまたは阻害する分子も指す。さらに、このスクリーニングによって単離される物質は、ＳＭＹＤ２ポリペプチドと分子（ＤＮＡおよびタンパク質を含む）とのインビボの相互作用を阻害する物質の候補である。
【０１６８】
本方法において検出されるべき生物学的活性が細胞増殖促進活性である場合、例えば、ＳＭＹＤ２ポリペプチドを発現している細胞を調製し、試験物質の存在下で該細胞を培養し、細胞周期などを測定して細胞増殖速度を決定することによって、および例えばＭＴＴアッセイ、コロニー形成アッセイまたはＦＡＣＳによって生存細胞またはコロニー形成活性を測定することによって、細胞増殖促進活性を検出することができる。
【０１６９】
ＳＭＹＤ２を発現する細胞の増殖速度を減少させる物質は、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌などの癌を治療または予防するための候補物質として選択される。いくつかの実施形態において、ＳＭＹＤ２遺伝子を発現する細胞は、ＳＭＹＤ２遺伝子をインビトロで外因的または内因的に発現する単離された培養細胞である。
【０１７０】
より具体的には、方法は、以下の段階を含む：
（ａ）試験物質を、ＳＭＹＤ２遺伝子を過剰発現する細胞と接触させる段階；
（ｂ）細胞増殖促進活性を測定する段階；および
（ｃ）細胞増殖促進活性を該試験物質の非存在下の細胞増殖促進活性と比較して低下させる試験物質を選択する段階。
好ましい実施形態において、本発明の方法は、以下の段階をさらに含んでもよい：
（ｄ）ＳＭＹＤ２遺伝子を全く発現しないかまたはほとんど発現しない細胞に対して効果を有しない試験物質を選択する段階。
【０１７１】
本方法において検出されるべき生物学的活性がメチルトランスフェラーゼ活性である場合、ＳＭＹＤ２ポリペプチドを、基質（例えば、ヒストンＨ４タンパク質またはその断片（例えば、配列番号６６）、ヒストンＨ３タンパク質またはその断片、ＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質、または配列番号６５のリジン５３１および／もしくはリジン５７４を含有するその断片、ＲＢ１タンパク質、または配列番号６８のリジン８１０を含有するその断片（例えば、配列番号６９））および補因子（例えば、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、Ｓ−アデノシル−Ｌ−［メチル−３Ｈ］メチオニン、またはＬ−［メチル−３Ｈ］メチオニン）と、該基質のメチル化に適切な条件下で接触させ、該基質のメチル化レベルを検出することによって、メチルトランスフェラーゼ活性を決定することができる。
【０１７２】
より具体的には、本発明は、以下の［１］〜［１０］の方法を提供する：
［１］以下の段階を含む、癌の治療および予防のいずれかまたは両方のための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）試験物質を、ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物、基質および補因子と、該基質のメチル化に適切な条件下で接触させる段階；
（ｂ）該基質のメチル化レベルを検出する段階；および
（ｃ）該基質のメチル化レベルを該試験物質の非存在下のメチル化レベルと比較して低下させる試験物質を選択する段階；
［２］該基質が、ヒストンタンパク質、または少なくとも１つのメチル化部位を含むその断片である、［１］に記載の方法；
［３］該ヒストンが、ヒストンＨ４またはヒストンＨ３である、［２］に記載の方法；
［４］該基質が、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチド、または少なくとも１つのメチル化部位を含むその断片である、［１］に記載の方法；
［５］該メチル化部位が、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチド（配列番号６５）のリジン５３１および／またはリジン５７４である、［４］に記載の方法；
［６］該基質が、ＲＢ１ポリペプチド、または少なくとも１つのメチル化部位を含むその断片である、［１］に記載の方法；
［７］該メチル化部位が、ＲＢ１ポリペプチド（配列番号６８）のリジン８１０である、［６］に記載の方法、
［８］該補因子が、Ｓ−アデノシルメチオニンである、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法；
［９］該ポリペプチドを該基質および補因子とメチル化促進剤の存在下で接触させる、［１］〜［８］のいずれかに記載の方法；および
［１０］該メチル化促進剤が、Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（ＳＡＨＨ）である、［９］に記載の方法。
【０１７３】
本発明との関連において、ＳＭＹＤ２ポリペプチドのメチルトランスフェラーゼ活性は、当技術分野において公知の方法によって決定することができる（例えば、Brown et al, Mol Cancer 2006;5:26, Huang et al, Nature 2006;444:629-632, Saddic et al, J Biol Chem 2010;285:37733-37740を参照されたい）。
【０１７４】
例えば、ＳＭＹＤ２ポリペプチドおよび基質を、適切なアッセイ条件下で、標識メチル供与体と共にインキュベートすることができる。ヒストンＨ４ペプチド（すなわち、ヒストンＨ４タンパク質またはその断片（例えば、配列番号６６））、ヒストンＨ３ペプチド（すなわち、ヒストンＨ３タンパク質またはその断片）、ＨＳＰ９０ＡＢ１ペプチド（すなわち、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドまたはその断片）、またはＲＢ１ペプチド（すなわち、ＲＢ１ポリペプチドまたはその断片（例えば、配列番号６９））を基質として、および標識Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（例えば、Ｓ−アデノシル−［メチル−１４Ｃ］−Ｌ−メチオニン、Ｓ−アデノシル−［メチル−３Ｈ］−Ｌ−メチオニンおよびＬ−［メチル−３Ｈ］メチオニン）をメチル供与体としてそれぞれ使用することができる。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびフルオログラフィーによって、基質（例えば、ヒストンＨ４ペプチド、ヒストンＨ３ペプチド、ＨＳＰ９０ＡＢ１ペプチド、またはＲＢ１ペプチド）への放射標識の転移を検出することができる。あるいは、反応の後、基質をろ過によってメチル供与体から分離し、フィルタ上に保持された放射標識の量をシンチレーション計数によって定量することができる。発色標識および蛍光標識などの、メチル供与体に付着させることができる他の適切な標識、ならびに基質へのこれらの標識の転移を検出する方法は、当技術分野において公知である。メチルトランスフェラーゼアッセイの例は、「実施例６：ＳＭＹＤ２のメチルトランスフェラーゼ活性の阻害剤のスクリーニング」で説明する。
【０１７５】
あるいは、未標識メチル供与体（例えば、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン）、およびメチル化基質（例えば、ヒストンＨ４ペプチド、ヒストンＨ３ペプチド、ＨＳＰ９０ＡＢ１ペプチド、ＲＢ１ペプチドなど）を選択的に認識する試薬を使用して、ＳＭＹＤ２ポリペプチドのメチルトランスフェラーゼ活性を決定することもできる。例えば、基質のメチル化が可能な条件下で、ＳＭＹＤ２ポリペプチド、メチル化されるべき基質およびメチル供与体をインキュベートした後、メチル化基質を免疫学的な方法によって検出することができる。メチル化基質を認識する抗体を使用した任意の免疫学的技術を、検出に使用することができる。例えば、メチル化ヒストンに対する抗体が市販されている（ａｂｃａｍ  Ｌｔｄ．）。メチル化基質を認識する抗体を用いたＥＬＩＳＡまたはイムノブロッティングを、本発明に使用することができる。
【０１７６】
本発明との関連において、ヒストンＨ４もしくはその断片（例えば、配列番号６６）、ヒストンＨ３タンパク質もしくはその断片、またはＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドもしくはその断片、またはＲＢ１ポリペプチドもしくはその断片（例えば、配列番号６９）は、好ましくは、ＳＭＹＤ２ポリペプチドによってメチル化されるべき基質として使用することができる。基質として使用されるべきヒストンＨ３断片は、好ましくは、リジン３６を保持する。基質として使用されるべきヒストンＨ４断片は、好ましくは、リジン２０を保持する。基質として使用されるべきＨＳＰ９０ＡＢ１断片は、好ましくは、リジン５３１および／またはリジン５７４を保持する。基質として使用されるべきＲＢ１断片は、好ましくは、リジン８１０を保持する。このようなヒストンＨ４断片、ヒストンＨ３断片、ＨＳＰ９０ＡＢ１断片またはＲＢ１断片は、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸残基、およびさらにより好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸残基から構成される。このようなヒストンＨ４断片の例には、配列番号６６のアミノ酸配列を有するペプチドが含まれる。このようなＨＳＰ９０ＡＢ１断片の例には、配列番号６５の５００番目から７２４番目のアミノ酸のアミノ酸配列を含有するペプチドが含まれる。このようなＲＢ１断片の例には、配列番号６９のアミノ酸配列を含有するペプチド、好ましくは配列番号６８の７７３番目から８１３番目のアミノ酸のアミノ酸配列を含有するペプチドが含まれる。あるいは、メチルトランスフェラーゼが増加した親和性／活性を有するヒストンＨ３もしくはその断片の修飾ペプチド、ヒストンＨ４もしくはその断片の修飾ペプチド、ＨＳＰ９０ＡＢ１もしくはその断片の修飾ペプチド、またはＲＢ１もしくはその断片の修飾ペプチドを使用してもよい。このようなペプチドは、アミノ酸を交換および／または付加および／または欠失し、ＳＭＹＤ２ポリペプチドを使用してメチルトランスフェラーゼアッセイの連続実験において該基質を試験することによって設計されることができる。
【０１７７】
本発明において、ＳＭＹＤ２ポリペプチドの任意の機能的等価物は、それが元の（天然、野生型の）ＳＭＹＤ２ポリペプチドのメチルトランスフェラーゼ活性を保持している限り、使用することができる。この目的を達成するために、ＳＭＹＤ２ポリペプチドの機能的等価物は、好ましくは、ＳＭＹＤ２ポリペプチドのＳＥＴドメイン（例えば、配列番号６３の１７位〜２４７位）を保持する。このような機能的等価物の例には、ヒストンＨ３、Ｈ４およびＨＳＰ９０ＡＢ１の場合には配列番号６３の１番目から２５０番目のアミノ酸のアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに配列番号６３の１番目から２５０番目のアミノ酸のアミノ酸配列および配列番号６３の３３０番目から４３３番目のアミノ酸のアミノ酸配列を保持するポリペプチドが含まれる。
【０１７８】
ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に、特異性が明らかなモノクローナル抗体のエピトープを導入することによって、モノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を含む融合タンパク質として、ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物を発現させてもよい。市販のエピトープ−抗体システムを使用することができる（Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)）。マルチクローニング部位の使用によって、例えば、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などとの融合タンパク質を発現し得るベクターが、市販されている。また、融合によりＳＭＹＤ２ポリペプチドの特性が変化しないように、数個〜１２個のアミノ酸からなる小さなエピトープのみを導入することによって調製された融合タンパク質も報告されている。ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−タグ）、インフルエンザ凝集ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７−タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−タグ）、Ｅ−タグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープ。
【０１７９】
本発明は、物質のメチル化を促進する剤の使用を意図する。好ましいメチル化促進剤は、ＳＡＨＨまたはその機能的等価物である。このような剤は物質のメチル化を促進し、それにより、メチルトランスフェラーゼ活性をより高感度で決定することを可能にする。したがって、ＳＭＹＤ２を基質および補因子と該促進剤の存在下で接触させてもよい。一実施形態において、ＳＭＹＤ２ポリペプチドおよび基質を、ＳＭＹＤ２および基質を発現する細胞から単離するか、または化学合成して、試験物質とインビトロで接触させる。
【０１８０】
ＳＭＹＤ２ポリペプチドを発現する細胞を調製し、該細胞を試験物質の存在下で培養し、ヒストン、ＨＳＰ９０ＡＢ１またはＲＢ１のメチル化レベルを、例えば、それらのメチル化部位に特異的に結合する抗体を使用して決定することによって、メチルトランスフェラーゼ活性を検出することもできる。
より具体的には、方法は、以下の段階を含む：
［１］試験物質を、ＳＭＹＤ２遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；
［２］ヒストンＨ４タンパク質のリジン２０、ヒストンＨ３タンパク質のリジン３６（Ｈ３Ｋ９）、ＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質のリジン５３１および／もしくはリジン５７４、またはＲＢ１タンパク質のリジン８１０のメチル化を検出する段階；および
［３］メチル化レベルを該試験物質の非存在下のメチル化レベルと比較して低下させる試験物質を選択する段階。
【０１８１】
上記のように、「生物学的活性を抑制する」という語句は、本明細書において、ＳＭＹＤ２ポリペプチドの生物学的活性の、物質の非存在下と比較した好ましくは少なくとも１０％の抑制、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％の抑制、および最も好ましくは９０％の抑制と定義される。したがって、試験物質は、それが、約１０％の低下、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％の低下、および最も好ましくは９０％の低下を提供する場合、「メチル化レベルを低下させる」と特性決定してもよい。
【０１８２】
好ましい実施形態において、ＳＭＹＤ２遺伝子を発現しない対照細胞が使用される。したがって、本発明はまた、以下の段階を含む、ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物を使用して、細胞成長を阻害するための候補物質、またはＳＭＹＤ２遺伝子関連疾患の治療および予防のいずれかまたは両方のための候補物質をスクリーニングする方法を提供する：
（ａ）試験物質の存在下または非存在下でＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物を発現する細胞、および該試験物質の存在下でＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物を発現しない対照細胞を培養する段階；
（ｂ）ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物を発現する細胞、および対照細胞の生物学的活性（例えば、細胞成長）を検出する段階；および
（ｃ）ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物を発現する細胞の生物学的活性を前記試験物質の非存在下で検出された生物学的活性と比較して阻害し、該対照細胞の生物学的活性を阻害しない試験物質を、選択する段階。
【０１８３】
本明細書において明らかになったように、ＳＭＹＤ２ポリペプチドの生物学的活性の抑制は、細胞成長を減少させる。したがって、ＳＭＹＤ２ポリペプチドの生物学的活性を阻害する物質をスクリーニングすることによって、癌を治療または予防する潜在能力を有する候補物質を同定することができる。これらの候補物質が癌を治療または予防する潜在能力を、第２のおよび／またはさらなるスクリーニングによって評価して、癌の治療物質、治療化合物または治療剤を同定してもよい。例えば、ＳＭＹＤ２ポリペプチドの生物学的活性を阻害する物質が、癌の活性も阻害する場合、このような物質は、ＳＭＹＤ２特異的な治療効果を有すると結論付けてもよい。
【０１８４】
ＳＭＹＤ２の発現を変化させる物質のスクリーニング：
本明細書において実証されたように、ｓｉＲＮＡによるＳＭＹＤ２遺伝子発現の低下は、癌細胞増殖の阻害をもたらす（図２）。したがって、ＳＭＹＤ２遺伝子発現の抑制（低下、阻害）は、細胞成長を抑制する（低下させる、阻害する）ことが本明細書において明らかにされている。したがって、レポーター遺伝子の発現または活性を低下させる候補物質をスクリーニングすることによって、癌を治療または予防する潜在能力を有する候補物質を同定することができる。これらの候補物質が癌を治療または予防する潜在能力を、第２のおよび／またはさらなるスクリーニングによって評価して、癌の治療物質を同定してもよい。
【０１８５】
したがって、本発明は、ＳＭＹＤ２遺伝子の発現を阻害する物質をスクリーニングする方法を提供する。ＳＭＹＤ２遺伝子の発現を阻害する物質は、癌細胞増殖を抑制すると予想されるので、ＳＭＹＤ２遺伝子に関連する癌であって、特に膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌である癌の治療または予防に有用である。
【０１８６】
したがって、本発明はまた、癌細胞増殖を抑制する候補物質をスクリーニングするための方法、ならびにＳＭＹＤ２遺伝子に関連する癌であって、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌である癌を治療または予防するための候補物質をスクリーニングするための方法を提供する
【０１８７】
本発明との関連において、このようなスクリーニング方法は、例えば、以下の段階を含んでもよい：
（ａ）試験物質を、ＳＭＹＤ２遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；
（ｂ）該細胞におけるＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
（ｃ）ＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルを該試験物質の非存在下で検出された発現レベルと比較して低下させる試験物質を選択する段階。
【０１８８】
あるいは、いくつかの実施形態において、本発明はまた、以下の段階を含む、癌の治療もしくは予防、またはＳＭＹＤ２遺伝子の過剰発現に関連する癌の阻害に対する試験物質の治療効果を評価または推定するための方法を提供する：
（ａ）試験物質を、ＳＭＹＤ２遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；
（ｂ）該細胞におけるＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
（ｃ）潜在的な治療効果と該試験物質とを相関させる段階であって、試験物質が、ＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルを、該試験物質の非存在下で検出された発現レベルと比較して低下させる場合に、潜在的な治療効果が示される、段階。
【０１８９】
本発明のスクリーニング方法を以下により詳細に説明する。
ＳＭＹＤ２遺伝子を発現する細胞には、例えば、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病もしくは前立腺癌から樹立された細胞株、またはＳＭＹＤ２遺伝子発現ベクターをトランスフェクトされた細胞株が含まれる；このような細胞のいずれかは、本発明の上記スクリーニング方法に使用されることができる。ＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルは、当業者に周知の方法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫染色、およびフローサイトメトリー分析によって推定することができる。本発明との関連において、「発現レベルを低下させる」という語句は、ＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルの、物質の非存在下の発現レベルと比較した好ましくは少なくとも１０％の低下、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％のレベル低下、および最も好ましくは９５％のレベル低下と定義される。本明細書における物質には、化学物質、二本鎖ヌクレオチドなどが含まれる。二本鎖ヌクレオチドの調製は、上記説明の中にある。スクリーニング方法の過程において、ＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルを低下させる物質を、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌などの癌の治療または予防に使用されるべき候補物質として選択することができる。いくつかの実施形態において、ＳＭＹＤ２遺伝子を発現する細胞は、ＳＭＹＤ２遺伝子をインビトロで外因的または内因的に発現する単離された培養細胞である。
【０１９０】
あるいは、本発明のスクリーニング方法は、以下の段階を含んでもよい：
（ａ）試験物質を、ＳＭＹＤ２遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入された細胞と、接触させる段階；
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現または活性レベルを測定する段階；および
（ｃ）該レポーター遺伝子の発現または活性レベルを低下させる候補物質を選択する段階。
【０１９１】
本発明との関連において、細胞成長の阻害に対する試験物質の治療効果、またはＳＭＹＤ２遺伝子関連疾患を治療もしくは予防するための候補物質を評価してもよい。したがって、本発明はまた、癌細胞増殖を抑制する候補物質をスクリーニングする方法、およびＳＭＹＤ２遺伝子関連疾患を治療または予防するための候補物質をスクリーニングする方法を提供する。
【０１９２】
あるいは、いくつかの実施形態において、本発明はまた、以下の段階を含む、癌の治療もしくは予防、またはＳＭＹＤ２の過剰発現に関連する癌の阻害に対する試験物質の治療効果を評価または推定するための方法を提供する：
（ａ）試験物質を、ＳＭＹＤ２遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入された細胞と、接触させる段階；
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現または活性レベルを測定する段階；および
（ｃ）潜在的な治療効果と該試験物質とを相関させる段階であって、試験物質が、該レポーター遺伝子の発現または活性レベルを低下させる場合に、潜在的な治療効果が示される、段階。
【０１９３】
本発明との関連において、このようなスクリーニング方法は、例えば、以下の段階を含んでもよい：
（ａ）試験物質を、ＳＭＹＤ２遺伝子の転写調節領域と、該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とから構成されるベクターが導入された細胞と接触させる段階；
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現または活性レベルを検出する段階；および
（ｃ）（ｂ）の発現または活性レベルを該試験物質の治療効果と相関させる段階。
【０１９４】
本発明との関連において、治療効果は、レポーター遺伝子の発現または活性レベルと相関させてもよい。例えば、試験物質が、レポーター遺伝子の発現または活性レベルを、該試験物質の非存在下で検出されたレベルと比較して低下させる場合、該試験物質を、治療効果を有する候補物質として同定または選択してもよい。あるいは、試験物質が、該レポーター遺伝子の発現または活性レベルを、該試験物質の非存在下で検出されたレベルと比較して低下させない場合、該試験物質を、有意な治療効果を有しない物質として同定してもよい。
【０１９５】
適切なレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野において周知である。例示的なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、イソギンチャクモドキ属の一種（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．）の赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｌａｃＺ、およびβグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）が含まれるが、これらに限定されず、宿主細胞はＣＯＳ７、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａなどである。スクリーニングに必要なレポーターコンストラクトは、レポーター遺伝子配列をＳＭＹＤ２の転写調節領域と接続することによって調製することができる。本明細書におけるＳＭＹＤ２の転写調節領域には、転写開始部位から少なくとも５００ｂｐ上流、好ましくは１０００ｂｐ、より好ましくは５０００ｂｐまたは１００００ｂｐ上流までの領域が含まれる。転写調節領域を含有するヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリから単離することもできるし、またはＰＣＲによって増幅することもできる。スクリーニングに必要なレポーターコンストラクトは、レポーター遺伝子配列をこれらの遺伝子のいずれか１つの転写調節領域と接続することによって調製することができる。転写調節領域を同定するための方法、およびアッセイプロトコルも周知である（Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press）。
【０１９６】
レポーターコンストラクトを含有するベクターを、宿主細胞に感染させ、レポーター遺伝子の発現または活性を、当技術分野において周知の方法によって（例えば、ルミノメーター、吸光度計、フローサイトメーターなどを使用して）検出する。本明細書で定義される場合、「発現または活性を低下させる」は、レポーター遺伝子の発現または活性の、物質の非存在下と比較した好ましくは少なくとも１０％の低下、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％の低下、および最も好ましくは９５％の低下である。いくつかの実施形態において、細胞は、ＳＭＹＤ２遺伝子の転写調節領域と、該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とから構成されるベクターがインビトロで導入された単離された培養細胞である。
【０１９７】
ＳＭＹＤ２と、ＨＳＰ９０ＡＢ１またはＲＢ１のいずれかとの結合を指標として使用するスクリーニング：
本明細書において実証されたように、ＳＭＹＤ２とＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質との直接的な相互作用が、プルダウンアッセイによって示された（図３Ｂ、Ｃ）。抗Ｆｌａｇ抗体を使用してＳＭＹＤ２タンパク質のプルダウンを行い、ＨＡタグ付ＨＳＰ９０ＡＢ１およびＦｌａｇタグ付ＳＭＹＤ２タンパク質の混合物をインキュベートした。続いて、ＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質に対する抗体を使用してウエスタンブロッティングによって、ＳＭＹＤ２結合ＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質を検出した。したがって、本発明は、ＳＭＹＤ２タンパク質とＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質との間の結合を阻害する物質をスクリーニングする方法を提供する。
【０１９８】
さらに、本発明の間に、ＳＭＹＤ２とＲＢ１タンパク質との直接的な相互作用が、プルダウンアッセイによって示された（図６Ｂ、Ｃ）。抗Ｆｌａｇ抗体を使用してＳＭＹＤ２タンパク質のプルダウンを行い、ＨＡタグ付ＲＢ１およびＦｌａｇタグ付ＳＭＹＤ２タンパク質の混合物をインキュベートした。続いて、抗ＨＡ抗体を使用してウエスタンブロッティングによって、ＳＭＹＤ２結合ＲＢ１タンパク質を検出した。したがって、本発明は、ＳＭＹＤ２タンパク質とＲＢ１タンパク質との間の結合を阻害する物質をスクリーニングする方法を提供する。
【０１９９】
ＳＭＹＤ２タンパク質とＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質またはＲＢ１タンパク質との間の結合を阻害する物質は、ＳＭＹＤ２タンパク質とＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質またはＲＢ１タンパク質との間の結合レベルを指標として検出することによってスクリーニングすることができる。したがって、本発明は、ＳＭＹＤ２タンパク質とＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質またはＲＢ１タンパク質との間の結合レベルを指標として使用して、ＳＭＹＤ２タンパク質とＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質またはＲＢ１タンパク質との間の結合を阻害するための物質をスクリーニングする方法を提供する。
【０２００】
さらに、本発明の間に、ＳＭＹＤ２タンパク質によるＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質およびＲＢ１タンパク質のメチル化は、癌細胞成長に関与することが明らかにされている（図５Ｈ、図１２）。したがって、ＳＭＹＤ２タンパク質とＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質またはＲＢ１タンパク質との間の相互作用を阻害する物質は、ＳＭＹＤ２タンパク質によるＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質またはＲＢ１タンパク質のメチル化を抑制することによって、癌細胞増殖を抑制するものであると予想される。したがって、本発明はまた、ＳＭＹＤ２遺伝子を発現する癌細胞、例えば、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病または前立腺癌の成長を阻害するかまたは減少させるための候補物質、したがって、癌、例えば、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病または前立腺癌を治療または予防するための候補物質をスクリーニングする方法を提供する。
【０２０１】
さらに、本スクリーニング方法によって得られる物質はまた、細胞増殖を阻害するために有用であり得る。
本発明にとって特に興味深いのは、以下の［１］〜［７］の方法である：
［１］以下の段階を含む、ＳＭＹＤ２ポリペプチドとＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドまたはＲＢ１ポリペプチドとの間の結合を妨げる物質をスクリーニングする方法：
（ａ）ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物を、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドもしくはその機能的等価物またはＲＢ１ポリペプチドもしくはその機能的等価物と、試験物質の存在下で接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチド間の結合レベルを検出する段階；
（ｃ）段階（ｂ）で検出された結合レベルを、該試験物質の非存在下で検出されたものと比較する段階；および
（ｄ）該結合レベルを低下させる試験物質を選択する段階。
［２］以下の段階を含む、癌の治療および／もしくは予防、または癌細胞成長の阻害に有効な候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物を、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドもしくはその機能的等価物またはＲＢ１ポリペプチドもしくはその機能的等価物と、試験物質の存在下で接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチド間の結合レベルを検出する段階；
（ｃ）段階（ｂ）で検出された結合レベルを、該試験物質の非存在下で検出されたものと比較する段階；および
（ｄ）該結合レベルを低下させる試験物質を選択する段階。
［３］ＳＭＹＤ２ポリペプチドの機能的等価物が、ＳＭＹＤ２ポリペプチドのＨＳＰ９０ＡＢ１結合ドメインを含む、［１］または［２］に記載の方法。
［４］ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドの機能的等価物が、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドのＳＭＹＤ２結合ドメインを含む、［１］または［２］に記載の方法。
［５］ＳＭＹＤ２ポリペプチドの機能的等価物が、ＳＭＹＤ２ポリペプチドのＲＢ１結合ドメインを含む、［１］または［２］に記載の方法。
［６］ＲＢ１ポリペプチドの機能的等価物が、ＲＢ１ポリペプチドのＳＭＹＤ２結合ドメインを含む、［１］または［２］に記載の方法。
［７］該癌が、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌からなる群より選択される、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
【０２０２】
あるいは、いくつかの実施形態において、本発明はまた、以下の段階を含む、癌の治療もしくは予防、または癌の阻害に対する試験物質の治療効果を評価または推定するための方法を提供する：
（ａ）ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物を、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドもしくはその機能的等価物またはＲＢ１ポリペプチドもしくはその機能的等価物と、試験物質の存在下で接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチド間の結合レベルを検出する段階；
（ｃ）段階（ｂ）で検出された結合レベルを、該試験物質の非存在下で検出されたものと比較する段階；および
（ｄ）潜在的な治療効果と該試験物質とを相関させる段階であって、試験物質が該結合レベルを低下させる場合に、潜在的な治療効果が示される、段階。
【０２０３】
さらに、別の実施形態において、本発明はまた、以下の段階を含む、癌の治療もしくは予防、または癌の阻害に対する試験物質の治療効果を評価または推定するための方法を提供する：
（ａ）ＳＭＹＤ２ポリペプチドのＨＳＰ９０ＡＢ１結合ドメインを含むポリペプチドを、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドのＳＭＹＤ２結合ドメインを含むポリペプチドと、試験物質の存在下で接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチド間の結合を検出する段階；および
（ｃ）潜在的な治療効果と該試験物質とを相関させる段階であって、試験物質が該ポリペプチド間の結合を阻害する場合に、潜在的な治療効果が示される、段階。
【０２０４】
本発明との関連において、ＳＭＹＤ２ポリペプチドおよびＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドの機能的等価物は、それぞれＳＭＹＤ２ポリペプチド（配列番号６３）、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチド（配列番号６５）と等価な生物学的活性を有するポリペプチドである。特に、ＳＭＹＤ２ポリペプチドの機能的等価物は、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドに対する結合ドメインを含有するＳＭＹＤ２ポリペプチドの断片である。好ましい実施形態において、ＳＭＹＤ２ポリペプチドの機能的等価物は、配列番号６３のアミノ酸位置１００位〜２４７位のアミノ酸配列を含有するＳＭＹＤ２ポリペプチドの断片である。同様に、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドの機能的等価物は、ＳＭＹＤ２結合ドメインを含有するＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドの断片である。好ましい実施形態において、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドの機能的等価物は、配列番号６５のアミノ酸位置５００位〜７２４位のアミノ酸配列を含有するＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドの断片である。
【０２０５】
さらに、別の実施形態において、本発明はまた、以下の段階を含む、癌の治療もしくは予防、または癌の阻害に対する試験物質の治療効果を評価または推定するための方法を提供する：
（ａ）ＳＭＹＤ２ポリペプチドのＲＢ１結合ドメインを含むポリペプチドを、ＲＢ１ポリペプチドのＳＭＹＤ２結合ドメインを含むポリペプチドと、試験物質の存在下で接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチド間の結合を検出する段階；および
（ｃ）潜在的な治療効果と該試験物質とを相関させる段階であって、試験物質が該ポリペプチド間の結合を阻害する場合に、潜在的な治療効果が示される、段階。
【０２０６】
本発明との関連において、ＳＭＹＤ２ポリペプチドおよびＲＢ１ポリペプチドの機能的等価物は、それぞれＳＭＹＤ２ポリペプチド（配列番号６３）またはＲＢ１ポリペプチド（配列番号６８）と等価な生物学的活性を有するポリペプチドである。特に、ＳＭＹＤ２の機能的等価物は、ＲＢ１ポリペプチドに対する結合ドメインを含有するＳＭＹＤ２ポリペプチドの断片である。好ましい実施形態において、ＳＭＹＤ２ポリペプチドの機能的等価物は、配列番号６３のアミノ酸位置３３０位〜４４３位のアミノ酸配列を含有するＳＭＹＤ２の断片である。同様に、ＲＢ１ポリペプチドの機能的等価物は、ＳＭＹＤ２結合ドメインを含有するＲＢ１ポリペプチドの断片である。好ましい実施形態において、ＲＢ１ポリペプチドの機能的等価物は、配列番号６８のアミノ酸位置７７３位〜８１３位のアミノ酸配列を含有するＲＢ１ポリペプチドの断片である。
【０２０７】
ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドまたはＲＢ１ポリペプチドへのＳＭＹＤ２ポリペプチドの結合を阻害する物質をスクリーニングする方法として、当業者に周知の多くの方法を使用することができる。
スクリーニングに使用されるべきポリペプチドは、組換えポリペプチドもしくは天然起源由来のタンパク質、またはそれらの部分ペプチドであり得る。好ましい実施形態において、ポリペプチドを、ＳＭＹＤ２、ＨＳＰ９０ＡＢ１もしくはＲＢ１を発現する細胞から単離するか、または化学合成して、試験物質とインビトロで接触させる。任意の上記試験物質をスクリーニングに使用することができる。
【０２０８】
ＳＭＹＤ２タンパク質とＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質またはＲＢ１タンパク質との間の結合を検出する方法として、当業者に周知の任意の方法を使用することができる。このような検出は、例えば、免疫沈降、ウエストウエスタンブロッティング分析（Skolnik et al., Cell 65: 83-90 (1991)）、細胞を利用するツーハイブリッドシステム（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；参考文献「Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)」）、アフィニティクロマトグラフィー、および表面プラズモン共鳴現象を使用するバイオセンサーを使用して行うことができる。
【０２０９】
いくつかの実施形態において、本スクリーニング方法は、ＳＭＹＤ２タンパク質およびＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質またはＲＢ１タンパク質の両方を発現する細胞を使用して、細胞ベースのアッセイで行ってもよい。ＳＭＹＤ２タンパク質およびＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質またはＲＢ１タンパク質を発現する細胞には、例えば、癌、例えば、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病または前立腺癌から樹立された細胞株が含まれる。あるいは、該細胞は、ＳＭＹＤ２遺伝子およびＨＳＰ９０ＡＢ１遺伝子またはＲＢ１遺伝子をコードするポリヌクレオチドで細胞を形質転換することによって調製してもよい。このような形質転換は、ＳＭＹＤ２遺伝子およびＨＳＰ９０ＡＢ１遺伝子もしくはＲＢ１遺伝子の両方をコードする発現ベクター、またはＳＭＹＤ２遺伝子もしくはＨＳＰ９０ＡＢ１遺伝子もしくはＲＢ１遺伝子のいずれかをコードする発現ベクターを使用して行ってもよい。本スクリーニング方法は、このような細胞を試験物質の存在下でインキュベートすることによって行うことができる。ＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質またはＲＢ１タンパク質へのＳＭＹＤ２タンパク質の結合は、抗ＳＭＹＤ２抗体、抗ＨＳＰ９０ＡＢ１抗体または抗ＲＢ１抗体を使用して免疫沈降アッセイによって検出することができる。
【０２１０】
本発明との関連において、細胞成長の阻害に対する候補物質の治療効果、またはＳＭＹＤ２遺伝子に関連する癌（例えば、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌）を治療もしくは予防するための候補物質を評価してもよい。したがって、本発明はまた、以下の段階を含む、ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物を使用して、細胞増殖を抑制することができる候補物質、または癌（例えば、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病または前立腺癌）を治療および／予防するための候補物質をスクリーニングする方法を提供する：
（ａ）ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物を、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドもしくはその機能的等価物またはＲＢ１ポリペプチドもしくはその機能的等価物と、試験物質の存在下で接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチド間の結合レベルを検出する段階；
（ｃ）段階（ｂ）で検出された結合レベルを、該試験物質の非存在下で検出されたものと比較する段階；および
（ｄ）（ｃ）の結合レベルを該試験物質の治療効果と相関させる段階。
本発明において、治療効果は、ＳＭＹＤ２ポリペプチドとＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドまたはＲＢ１ポリペプチドとの間の結合レベルと相関させてもよい。例えば、試験物質が、該ポリペプチド間の結合レベルを、該試験物質の非存在下で検出されたレベルと比較して抑制する場合、該試験物質を、治療効果を有する候補物質として同定または選択してもよい。あるいは、試験物質が、該ポリペプチド間の結合レベルを、該試験物質の非存在下で検出されたレベルと比較して抑制または阻害しない場合、該試験物質を、有意な治療効果を有しない物質として同定してもよい。
【０２１１】
ＳＭＹＤ２によるＲＢ１のメチル化を介したＲＢ１のリン酸化を使用するスクリーニング：
本明細書において実証されたように、ＳＭＹＤ２タンパク質はＲＢ１タンパク質をメチル化し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により、ＲＢ１のリジン８１０がＳＭＹＤ２によってメチル化されることが明らかになった（図７Ｂ）。さらに、ＳＭＹＤ２によるＲＢ１のリジン８１０のメチル化は、セリン８０７および／またはセリン８１１におけるＲＢ１のリン酸化を促進した（図９、１０）。さらに、ＳＭＹＤ２によってメチル化されたＲＢ１は、Ｅ２Ｆ転写活性を加速させ、細胞周期進行を促進する（図１０Ｃ、図１２）。
これらの結果は、ＳＭＹＤ２によるＲＢ１のメチル化を介したＲＢ１のリン酸化が癌細胞成長に関与することを実証している。したがって、ＳＭＹＤ２によるＲＢ１のメチル化を介したＲＢ１ポリペプチドのリン酸化レベルを低下させる物質は、癌を治療もしくは予防するか、または癌細胞成長を阻害するための候補物質になり得る。
したがって、本発明はまた、ＳＭＹＤ２によるＲＢ１のメチル化を介したＲＢ１のリン酸化を指標として使用して、癌の治療および予防のいずれかまたは両方のための候補物質をスクリーニングする方法を提供する。
【０２１２】
例示的な癌には、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌が含まれる。
本発明との関連において、このようなスクリーニング方法は、例えば、以下の段階を含んでもよい：
（ａ）試験物質を、ＳＭＹＤ２遺伝子およびＲＢ１遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；
（ｂ）（ａ）の細胞におけるＲＢ１ポリペプチドのリン酸化レベルを検出する段階；および
（ｃ）ＲＢ１ポリペプチドのリン酸化レベルを該試験物質の非存在下で検出されたリン酸化レベルと比較して低下させる試験物質を選択する段階。
【０２１３】
あるいは、いくつかの実施形態において、本発明はまた、以下の段階を含む、癌の治療もしくは予防、またはＳＭＹＤ２遺伝子の過剰発現に関連する癌の阻害に対する試験物質の治療効果を評価または推定するための方法を提供する：
（ａ）試験物質を、ＳＭＹＤ２遺伝子およびＲＢ１遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；
（ｂ）（ａ）の細胞におけるＲＢ１ポリペプチドのリン酸化レベルを検出する段階；および
（ｃ）潜在的な治療効果と該試験物質とを相関させる段階であって、試験物質が、ＲＢ１ポリペプチドのリン酸化レベルを、該試験物質の非存在下で検出されたリン酸化レベルと比較して低下させる場合に、潜在的な治療効果が示される、段階。
【０２１４】
本発明のスクリーニング方法を以下により詳細に説明する。
ＳＭＹＤ２遺伝子およびＲＢ１遺伝子を発現する細胞には、例えば、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病もしくは前立腺癌から樹立された細胞株、またはＳＭＹＤ２遺伝子発現ベクターおよびＲＢ１発現ベクターの両方をトランスフェクトされた細胞株が含まれる；このような細胞のいずれかは、本発明の上記スクリーニング方法に使用されることができる。いくつかの実施形態において、ＳＭＹＤ２遺伝子およびＲＢ１遺伝子を発現する細胞は、ＳＭＹＤ２およびＲＢ１遺伝子をインビトロで外因的または内因的に発現する単離された培養細胞である。
【０２１５】
リン酸化レベルは、当業者に周知の方法、例えば、ウエスタンブロットアッセイおよび免疫染色分析によって推定することができる。
ＲＢ１ポリペプチドのリン酸化は、配列番号６８のセリン８０７および／またはセリン８１１アミノ酸残基でリン酸化されたＲＢ１に対する抗体を使用して、ウエスタンブロッティング分析によって検出することができる。
【０２１６】
上記のように、「リン酸化レベルの低下させる」という語句は、ＲＢ１ポリペプチドのリン酸化レベルの、物質の非存在下のリン酸化レベルと比較した少なくとも１０％の低下、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％のレベル低下、および最も好ましくは９５％のレベル低下を指す。本明細書における物質には、化学物質などが含まれる。スクリーニング方法において、ＲＢ１ポリペプチドのリン酸化レベルを低下させる物質を、膀胱癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、精上皮腫、皮膚癌、膵臓癌、リンパ腫、卵巣癌、白血病および前立腺癌などの癌の治療または予防に使用されるべき候補物質として選択することができる。
【０２１７】
癌を治療もしくは予防するか、または癌細胞成長を阻害するための候補物質をスクリーニングするためのキット：
本発明はさらに、ＳＭＹＤ２ポリペプチドのメチルトランスフェラーゼ活性を測定するためのキットを提供する。キットは、癌を治療もしくは予防するか、または癌細胞成長を阻害するための候補基質をスクリーニングするために使用することができる。本発明の間に、公知の基質であるヒストンタンパク質（好ましくは、Ｈ３またはＨ４）に加えて、ＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質およびＲＢ１タンパク質を、ＳＭＹＤ２ポリペプチドの新規な基質として同定した。したがって、本発明は、ＳＭＹＤ２ポリペプチドのメチルトランスフェラーゼ活性を測定するためのキットであって、ＳＭＹＤ２ポリペプチドの基質としてヒストンポリペプチドもしくはその機能的等価物、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドもしくはその機能的等価物、またはＲＢ１ポリペプチドもしくはその機能的等価物を含有するキットを提供する。このようなキットは、ＳＭＹＤ２ポリペプチド、または試料から精製もしくは単離されたＳＭＹＤ２ポリペプチドを含有する試料におけるＳＭＹＤ２媒介性のメチルトランスフェラーゼ活性を測定するために使用することができる。
【０２１８】
さらに、本発明は、試験物質が、ＳＭＹＤ２ポリペプチドによるヒストン、ＨＳＰ９０ＡＢ１またはＲＢ１ポリペプチドのメチル化を阻害する能力を検出するためのキットであって、ＳＭＹＤ２ポリペプチドと、ＳＭＹＤ２ポリペプチドの基質としてヒストン、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドまたはＲＢ１ポリペプチドとを含有する、キットを提供する。
本発明の上記キットは、ＳＭＹＤ２ポリペプチドによるヒストン、ＨＳＰ９０ＡＢ１またはＲＢ１ポリペプチドのメチル化レベルを調節する物質を同定するための用途を見出すものである。さらに、本発明のキットは、癌を治療もしくは予防するか、または癌細胞成長を阻害するための候補物質をスクリーニングするために有用である。
【０２１９】
具体的には、本発明は、以下の［１］〜［６］のキットを提供する：
［１］以下の構成要素（ａ）〜（ｄ）を含む、癌を治療もしくは予防するか、または癌細胞成長を阻害するための候補物質をスクリーニングするためのキット：
（ａ）ＳＭＹＤ２ポリペプチドまたはその機能的等価物；
（ｂ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群より選択される構成要素
（ｉ）ヒストンタンパク質、または少なくとも１つのメチル化部位を含むその断片、
（ｉｉ）ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチド、または少なくとも１つのメチル化部位を含むその機能的等価物、
（ｉｉｉ）ＲＢ１ポリペプチド、または少なくとも１つのメチル化部位を含むその機能的等価物
（ｃ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群より選択される試薬；
（ｉ）ヒストンタンパク質またはその断片のメチル化レベルを検出するための試薬、
（ｉｉ）ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドまたはその機能的等価物のメチル化レベルを検出するための試薬、
（ｉｉｉ）ＲＢ１ポリペプチドまたはその機能的等価物のメチル化レベルを検出するための試薬；および
（ｄ）メチル供与体。
［２］該ヒストンタンパク質が、ヒストンＨ４またはヒストンＨ３である、［１］に記載のキット。
［３］段階（ｃ）（ｉ）の試薬が、メチル化ヒストンＨ４タンパク質またはメチル化ヒストンＨ３タンパク質に対する抗体である、［１］に記載のキット。
［４］段階（ｃ）（ｉｉ）の試薬が、リジン５３１および／またはリジン５７４でメチル化されたＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドに対する抗体である、［１］に記載のキット。
［５］段階（ｃ）（ｉｉｉ）の試薬が、リジン８１０でメチル化されたＲＢ１ポリペプチドに対する抗体である、［１］に記載のキット。
［６］該メチル供与体が、Ｓ−アデノシルメチオニンである、［１］〜［５］のいずれかに記載のキット。
【０２２０】
本発明のキットの詳細を以下に説明する。
本発明のキットに含まれるヒストンＨ３タンパク質またはＨ４タンパク質は、Ｈ３タンパク質またはＨ４タンパク質の全長でもよいし、またはそれらの機能的等価物、例えば、ヒストンＨ３タンパク質またはＨ４タンパク質の全長の断片でもよい。本明細書において、ヒストンＨ３タンパク質またはＨ４タンパク質の機能的等価物は、ＳＭＹＤ２ポリペプチドによってメチル化され得る、ヒストンＨ３タンパク質またはＨ４タンパク質の全長の修飾ポリペプチド、断片または修飾断片を指す。好ましくは、ヒストンＨ３タンパク質またはＨ４タンパク質の機能的等価物は、ＳＭＹＤ２ポリペプチドによってメチル化され得る少なくとも１つのメチル化部位を保持する。このようなメチル化部位には、ヒストンＨ４タンパク質のリジン２０、およびヒストンＨ３タンパク質のリジン３６が含まれる。
【０２２１】
したがって、ヒストンＨ３タンパク質またはＨ４タンパク質の機能的等価物の好ましい例には、ヒストンＨ３タンパク質またはＨ４タンパク質の断片が含まれ、このような断片は、ヒストンＨ３のリジン３６、またはヒストンＨ４のリジン２０を含有してもよく、１０個よりも多くのアミノ酸残基を有する。より具体的には、このような断片は、配列番号６６のアミノ酸配列からなる断片でもよい。
【０２２２】
本発明のキットに含まれるＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドは、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチド（例えば、配列番号６５）の全長でもよいし、またはその機能的等価物、例えば、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドの全長の断片でもよい。本明細書において、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドの機能的等価物は、ＳＭＹＤ２ポリペプチドによってメチル化され得る、ＨＳＰ９０ＡＢ１の全長の修飾ポリペプチド、断片または修飾断片を指す。好ましくは、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドの機能的等価物は、ＳＭＹＤ２ポリペプチドによってメチル化され得る少なくとも１つのメチル化部位を保持する。このようなメチル化部位には、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチド（配列番号６５）のリジン５３１およびリジン５７４が含まれる。
【０２２３】
したがって、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドの機能的等価物の好ましい例には、配列番号６５のアミノ酸配列のリジン５３１および／またはリジン５７４に対応するリジン残基を保持するＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドの断片が含まれる。好ましくは、このような断片は、配列番号６５のアミノ酸配列の連続する配列であって、リジン５３１および／または５７４を含む配列を含有してもよく、１０個よりも多くのアミノ酸残基を有する。より好ましくは、断片は、１５個、２０個、２５個、３０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個または４００個よりも多くのアミノ酸残基を有してもよい。さらにより好ましくは、断片は、配列番号６５の５００位〜７２４位のアミノ酸残基を含有してもよい。
【０２２４】
本発明のキットに含まれるＲＢ１ポリペプチドは、ＲＢ１ポリペプチド（例えば、配列番号６８）の全長でもよいし、またはその機能的等価物、例えば、ＲＢ１ポリペプチドの全長の断片でもよい。本明細書において、ＲＢ１ポリペプチドの機能的等価物は、ＳＭＹＤ２ポリペプチドによってメチル化され得る、ＲＢ１ポリペプチドの全長の修飾ポリペプチド、断片または修飾断片を指す。好ましくは、ＲＢ１ポリペプチドの機能的等価物は、ＳＭＹＤ２ポリペプチドによってメチル化され得る少なくとも１つのメチル化部位を保持する。このようなメチル化部位には、ＲＢ１ポリペプチド（配列番号６８）のリジン８１０が含まれる。
【０２２５】
したがって、ＲＢ１ポリペプチドの機能的等価物の好ましい例には、配列番号６８のアミノ酸配列のリジン８１０に対応するリジン残基を保持するＲＢ１ポリペプチドの断片が含まれる。好ましくは、このような断片は、配列番号６８のアミノ酸配列の連続する配列であって、リジン８１０を含む配列を含有してもよく、１０個よりも多くのアミノ酸残基を有する。より好ましくは、断片は、１５個、２０個、２５個、３０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個または４００個よりも多くのアミノ酸残基を有してもよい。さらにより好ましくは、断片は、配列番号６８の７７３位〜８１３位のアミノ酸残基を含有してもよい。
【０２２６】
ヒストンタンパク質、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドもしくはＲＢ１ポリペプチド、またはそれらの機能的等価物は、１つまたは複数の標識メチル基、例えば、放射標識メチル基を有してもよい。メチル基に付加することができる他の適切な標識の例には、発色標識、蛍光標識などが含まれる。標識メチル基を有するヒストンタンパク質、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドまたはＲＢ１ポリペプチドは、当技術分野において周知の方法によって調製することができる。
【０２２７】
本発明のキットに含まれるＳＭＹＤ２ポリペプチドは、ＳＭＹＤ２ポリペプチド（例えば、配列番号６３）の全長でもよいし、またはその機能的等価物、例えば、ＳＭＹＤ２ポリペプチドの全長の断片でもよい。本明細書において、ＳＭＹＤ２ポリペプチドの機能的等価物は、ヒストンタンパク質、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドまたはＲＢ１ポリペプチドに対するメチルトランスフェラーゼ活性を有する、ＳＭＹＤ２ポリペプチドの全長の修飾ポリペプチド、断片または修飾断片を指す。
【０２２８】
本明細書において、ＳＭＹＤ２ポリペプチドのＨＳＰ９０ＡＢ１結合領域は、配列番号６３の１００位〜２４７位のアミノ酸残基を有する領域に位置することが発見された。したがって、ＨＳＰＡＢ１ポリペプチドまたはその機能的等価物の組み合わせにおいて、ＳＭＹＤ２ポリペプチドの適切な機能的等価物は、配列番号６３の１００位〜２４７位のアミノ酸残基を含有するポリペプチドでもよい。
【０２２９】
あるいは、本発明の間に、ＳＭＹＤ２ポリペプチドのＲＢ１結合領域は、配列番号６３の３３０位〜４４３位のアミノ酸残基を有する領域に位置することが見出された。したがって、ＲＢ１ポリペプチドまたはその機能的等価物の組み合わせにおいて、ＳＭＹＤ２ポリペプチドの適切な機能的等価物は、配列番号６３の３３０位〜４４３位のアミノ酸残基を含有するポリペプチドでもよい。
【０２３０】
ヒストンタンパク質、ＨＳＰ９０ＡＢ１またはＲＢ１ポリペプチドのメチル化レベルを検出するための試薬は、ヒストンタンパク質、ＨＳＰ９０ＡＢ１またはＲＢ１ポリペプチドのメチル化レベルの検出に使用することができる任意の試薬でもよい。例えば、メチル化ヒストンタンパク質、ＨＳＰ９０ＡＢ１またはＲＢ１ポリペプチドに対する抗体、特に、ヒストンＨ３のメチル化リジン３６、ヒストンＨ４のメチル化リジン２０、配列番号６５のアミノ酸配列のメチル化リジン５３１もしくは５７４、または配列番号６８のアミノ酸配列のメチル化リジン８１０に対する抗体は、好ましくは、このような試薬として使用してもよい。抗メチル化ヒストン、ＨＳＰ９０ＡＢ１またはＲＢ１抗体はモノクローナルでもよいしまたはポリクローナルでもよい。さらに、断片が、メチル化ヒストン、ＨＳＰ９０ＡＢ１またはＲＢ１ポリペプチドに対する結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または修飾物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖなど）を、試薬として使用することができる。これらの種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明においては、このような抗体およびそれらの等価物を調製するために、任意の方法を利用することができる。さらに、直接結合または間接標識技術を介して、シグナル生成分子によって抗体を標識してもよい。標識、および抗体を標識して抗体とその標的との結合を検出するための方法は、当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明に利用することができる。例えば、好ましくは、放射標識、発色標識、蛍光標識などを、抗体を標識するために使用してもよい。キットが、標識を有する抗メチル化ヒストン、ＨＳＰ９０ＡＢ１またはＲＢ１抗体を含有する場合、キットは、該標識によって生成されるシグナルを検出するための試薬をさらに含有してもよい。あるいは、抗体を、発色反応を触媒する酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどと結合してもよい。キットが、酵素と結合された抗メチル化ヒストン、ＨＳＰ９０ＡＢ１またはＲＢ１抗体を含有する場合、キットは、該酵素の発色基質をさらに含有してもよい。あるいは、発色反応を触媒する酵素で標識されたかまたはそれと結合された二次抗体が、本発明のキットに含まれてもよい。
【０２３１】
あるいは、ヒストンタンパク質、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドまたはＲＢ１ポリペプチドのメチル化レベルを検出するための試薬は、ヒストンタンパク質、ＨＳＰ９０ＡＢ１ポリペプチドまたはＲＢ１ポリペプチドのメチル化によって放出される過酸化水素またはホルムアルデヒドを検出するための試薬でもよい。このような試薬は、当技術分野において周知である。
【０２３２】
キットは、前記試薬を複数含有してもよい。さらに、キットは、抗メチル化ヒストンＨ３もしくはＨ４抗体、抗メチル化ＨＳＰ９０ＡＢ１抗体または抗メチル化ＲＢ１抗体を結合させるための固体マトリックス、メチル化に適切な条件下でポリペプチドをインキュベートするための培地または緩衝液および容器、ＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）などのメチル化補因子、陽性および陰性対照試料を含んでもよい。
本発明のキットは、緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、注射器、および使用のための説明を含む添付文書（例えば、文書、テープ、ＣＤ−ＲＯＭなど）を含む、商業的見地および使用者の見地から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。これらの物質などは、ラベルを有する容器に入っていてもよい。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成されてもよい。
【０２３３】
以下、実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。しかしながら、以下の材料、方法、および例は本発明の局面を例証するに過ぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。したがって、本明細書に記載されるものと類似または等価な方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができる。
【実施例】
【０２３４】
実施例１：材料および方法
膀胱組織試料およびＲＮＡ調製。
膀胱組織試料およびＲＮＡ調製は、以前に記載された（Wallard, M.J. et al. Br J Cancer 94, 569-577 (2006)）。簡単に説明すると、膀胱切除術または経尿道的膀胱腫瘍切除術（ＴＵＲＢＴ）のいずれかの際に、原発性尿路上皮癌の外科的標本１２５例を採取し、液体窒素中で急速凍結させた。正常膀胱尿路上皮組織の標本２８例を、悪性病変の証拠がない患者の巨視的に正常な膀胱尿路上皮の区域から採取した。ビメンチンは、間葉系由来細胞で主として発現しており、間質マーカーとして使用した。ウロプラキンは、尿路上皮分化のマーカーであり、最大９０％の上皮由来腫瘍で保存されている（Olsburgh, J. et al. The Journal of pathology 199, 41-49 (2003)）。本研究における組織の使用は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ  Ｌｏｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ｒｅｆ０３／０１８）によって承認された。正常組織（脳、乳房、大腸、食道、眼、心臓、肝臓、肺、膵臓、胎盤、腎臓、直腸、脾臓、胃および精巣）のＲＮＡ試料は、ＢｉｏＣｈａｉｎから購入した。
【０２３５】
細胞培養。
ＣＣＤ−１８Ｃｏ、ＨＦＬ１、５６３７、ＳＷ７８０、ＳＣａＢＥＲ、ＵＭＵＣ３、ＲＴ４、Ｔ２４、ＨＴ−１１９７、ＨＴ−１３７６、Ａ５４９、Ｈ２１７０、ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６、ＬｏＶｏおよび２９３Ｔ細胞は、２００１年および２００３年にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手し、ＳＷ７８０以外は、多型ショート・タンデム・リピート（ＳＴＲ）マーカーのＤＮＡプロファイリングによって試験および確認した。ＳＷ７８０株は、１９７４年に、Ａ．Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚによって悪性度Ｉの移行細胞癌腫から樹立された。ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩおよびＳＢＣ５細胞は、２００１年にＪａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ）から入手し、多型ショート・タンデム・リピート（ＳＴＲ）マーカーのＤＮＡプロファイリングによって試験および確認した。２５３Ｊ、２５３Ｊ−ＢＶおよびＳＮＵ−４７５細胞は、２００１年にＫｏｒｅａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｂａｎｋ（ＫＣＬＢ）から入手し、多型ショート・タンデム・リピート（ＳＴＲ）マーカーのＤＮＡプロファイリングによって試験および確認した。ＥＪ２８細胞は、２００３年にＣｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＣＬＳ）から入手し、多型ショート・タンデム・リピート（ＳＴＲ）マーカーのＤＮＡプロファイリングによって試験および確認した。ＡＣＣ−ＬＣ−３１９細胞は、２００３年に愛知県がんセンターから入手し、ＳＮＰ、変異および欠失分析のＤＮＡプロファイリングによって試験および確認した。すべての細胞株を次の適切な培地において単層で増殖させた：ＥＪ２８、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ−７および２９３Ｔ細胞にはダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）；ＣＣＤ−１８Ｃｏ、ＷＩ−３８、２５３Ｊ、２５３Ｊ−ＢＶ、ＨＴ−１３７６、ＳＣａＢＥＲ、ＵＭＵＣ３およびＳＢＣ５細胞にはイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）；ＳＷ４８０およびＳＷ７８０細胞にはＬｅｉｂｏｖｉｔｚ'ｓ  Ｌ−１５；ＲＴ４、Ｔ２４およびＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋細胞にはＭｃＣｏｙ'ｓ  ５Ａ培地；５６３７、Ａ５４９、Ｈ２１７０、ＡＣＣ−ＬＣ−３１９およびＳＮＵ−４７５細胞にはＲＰＭＩ１６４０培地。ＬｏＶｏ細胞は、１０％ウシ胎仔血清および１％抗生物質／抗真菌溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）が補足された２０％ウシ胎仔Ａ５４９細胞が補足されたＨａｍ'ｓ  Ｆ−１２培地で培養した。すべての細胞を、３７℃で、５％ＣＯ２条件を含むか（ＳＡＥＣ、５６３７、２５３Ｊ、２５３Ｊ−ＢＶ、ＥＪ２８、ＨＴ−１１９７、ＨＴ−１３７６、Ｊ８２、ＲＴ４、ＳＣａＢＥＲ、Ｔ２４、ＵＭＵＣ３、Ａ５４９、Ｈ２１７０、ＡＣＣ−ＬＣ−３１９、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＳＢＣ５および２９３Ｔ  ＲＴ４、Ａ５４９、ＳＢＣ５、２９３Ｔ、ＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋、ＨｅＬａおよびＣＯＳ−７）またはＣＯ２を含まない（ＳＷ４８０およびＳＷ７８０）湿潤空気中で維持した。製造業者のプロトコルにしたがって、ＦｕＧＥＮＥ６（商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、細胞をトランスフェクトした。
【０２３６】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）。
上記のように、膀胱癌組織１２５例および正常膀胱組織２８例をＡｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ'ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅで調製した。定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応のために、ヒトＧＡＰＤＨ（ハウスキーピング遺伝子）、ＳＤＨ（ハウスキーピング遺伝子）、ＳＭＹＤ２のすべてに対する特異的プライマーを設計した（表１のプライマー配列）。製造業者のプロトコルにしたがってＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、ＰＣＲ反応を実施した。
【０２３７】
【表１】
0006051373.tif 000002
【０２３８】
免疫組織化学染色。
パラフィン包埋組織のスライドは、ＢｉｏＣｈａｉｎ（Ｈａｙａｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。免疫組織化学は、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ（登録商標）ＡＢＣ  ＲＥＡＧＥＮＴ（ＰＫ−７１００，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＤＡＢ  ＳＵＢＳＴＲＡＴＥ  ＫＩＴ  ＦＯＲ  ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ（登録商標）（ＳＫ−４１００，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して実施した。パラフィン包埋した膀胱腫瘍標本および正常ヒト組織のスライドをキシレンで脱パラフィン処理し、続いて９９％エタノールで再水和した。１×ＰＢＳ（−）で洗浄した後、スライドを、抗原賦活液、高ｐＨ９（Ｓ２３６７；Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）において高圧下で処理し（１２５℃、３０秒間）、０．３％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）メタノール溶液によって、反応停止を１５分間実施した。３％ＢＳＡによってブロッキングした後、組織切片を希釈比１：２５０のヤギ抗ＳＭＹＤ２ポリクローナル抗体（ｓｃ−７９０８４，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）と共に一晩インキュベートし、続いて、抗ヤギビオチン化ＩｇＧと共に１時間反応させた。ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ（登録商標）ＡＢＣ  ＲＥＡＧＥＮＴと共にインキュベートした後、ＤＡＢ  ＳＵＢＴＲＡＴＥ  ＫＩＴ  ＦＯＲ  ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ（登録商標）を使用して、発色現像を実施した。最後に、マイヤーヘマトキシリン（Ｍｕｔｏ  ｐｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ＱＳ，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって組織標本を２０秒間染色して、細胞質から核を識別した。
【０２３９】
ｓｉＲＮＡトランスフェクション。
ヒトＳＭＹＤ２の転写物を標的とするためのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド二重鎖は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。３種の異なるオリゴヌクレオチド二重鎖の混合物であるｓｉＮｅｇａｔｉｖｅ対照（ｓｉＮＣ）を、対照ｓｉＲＮＡとして使用した。ｓｉＲＮＡ配列を表２に記載する。ｓｉＲＮＡ二重鎖（最終濃度１００ｎＭ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって、膀胱癌細胞株および肺癌細胞株にトランスフェクトした。
【０２４０】
【表２】
0006051373.tif 000003
【０２４１】
コロニー形成能アッセイ。
ＤＭＥＭ  １０％ＦＢＳで培養したＣＯＳ−７細胞に、ｐ３ｘＦＬＡＧ−Ｍｏｃｋ、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＳＭＹＤ２野生型（ＷＴ）またはｐ３ｘＦＬＡＧ−ＳＭＹＤ２酵素失活変異体ベクター（ΔＮＨＳＣ／ΔＧＥＥＶ）をトランスフェクトした。トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を２日間培養し、１０ｃｍディッシュあたり細胞１００００個の密度で１０ｃｍディッシュにトリプリケートで播種した。続いて、０．４（ｍｇ／ｍｌ）ジェネテシン／Ｇ−４１８を含有するＤＭＥＭ  １０％ＦＢＳ中、コロニーが見られるまで、細胞を２週間培養した。Ｇｉｅｍｓａ（ＭＥＲＣＫ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）でコロニーを染色し、コロニー・カウンタ・ソフトウェアによってカウントした。
【０２４２】
質量分析。
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動のタンパク質バンドを切り出し、ジチオスレイトールで還元し、ヨード酢酸によってカルボキシメチル化した。ゲルを洗浄した後、アクロモバクター（Ａｃｈｒｍｏｂａｃｔｅｒ）プロテアーゼＩ（ＡＰＩ、Ｌｙｓ−Ｃ、茨城大学、正木博士より寄贈）を用いて、バンドを３７℃で一晩消化した（Masaki T, et al (1981). Biochim Biophys Acta 660, 44-50.）。ＬＣＱ  Ｄｅｃａ  ＸＰ  ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用するナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって、消化物のアリコートを分析した。逆相材（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３、３マイクロメートル、ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を充填したナノＥＳＩスプレーカラム（１００マイクロメートルｉ．ｄ．ｘ５０ｍｍＬ）を使用して、ペプチドを流量２００ｎｌ／分で分離した。陽イオンモードで質量分析計を作動させ、データ依存ＭＳ／ＭＳモードでスペクトルを得た。ローカルＭＡＳＣＯＴサーバ（バージョン：２．２．１，Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＫ）を使用して、社内データベースに対して、ＭＳ／ＭＳスペクトルを検索した。エンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、還元およびカルボキシメチル化したゲルバンドも３７℃で一晩消化した。消化物のアリコートを脱塩処理し、Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ  ＧｍｂＨ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにアプライした。そして、選択したピークをＬＩＦＴモードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦタンデム質量分析で分析した。
【０２４３】
アミノ酸分析。
内部標準として５０ｐｍｏｌのノルバリンを含有する清潔な６ｍｍＸ３２ｍｍガラス管に、ＰＶＤＦ膜上にブロッティングされ切り出されたタンパク質バンドを個々に挿入し、１１０℃の６Ｎ  ＨＣｌ蒸気で２０時間加水分解した。蛍光体検出のために、６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＱＣ）によって、加水分解した試料をインサイチューで誘導体化した。Ｃ１８逆相カラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３、４．６ｍｍｉ．ｄ．Ｘ１５０ｍｍ、３マイクロメートル、ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）でのイオン対クロマトグラフィーによって、ＡＱＣ−アミノ酸を分離した。モノメチル化リジンの存在を明らかにするために、レーザー誘起蛍光検出器（ＬＩＦ７２６，ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＸｅフラッシュランプを備える蛍光検出器（Ｇ１３１２Ａ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）の両方を使用した（Masuda, A. et al. Anal Chem 82, 8939-8945(2010)）。
【０２４４】
免疫細胞化学。
４％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ（−）で細胞を３０分間固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳ（−）を用いて室温で２分間透過化処理した。続いて、細胞を、室温で１時間、３％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ（−）で覆って、非特異的ハイブリダイゼーションをブロックし、次いで、ウサギ抗Ｒｂ（ｓｃ−１０２，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ｐ−Ｒｂ（セリン８０７／８１１）−Ｒ（ｓｃ−１６６７０−Ｒ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ヤギ抗ＳＭＹＤ２（ｓｃ−７９０８４，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、希釈比１：５００のマウス抗ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、希釈比１：１０００のマウス抗ＨＳＰ９０抗体（ｓｃ−１３１１９，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）および希釈比１：５００のヤギ抗ＳＭＹＤ２（ｓｃ−７９０８４，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）と共にインキュベートした。ＰＢＳ（−）で洗浄した後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８結合抗ウサギ二次抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、または希釈比１：５００のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４結合抗マウス二次抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって、細胞を染色した。４'，６'−ジアミジン−２'−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）で核を対比染色した。ＴＣＳ  ＳＰ２  ＡＯＢＳ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｙｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）下で、蛍光画像を得た。
【０２４５】
免疫沈降。
２９３ＴまたはＣＯＳ−７細胞を、細胞５ｘ１０５個の密度で１００ｍｍディッシュ上に播種した。翌日、製造業者の推奨にしたがってＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、細胞に発現ベクターコンストラクトをトランスフェクトした。４８時間後、トランスフェクトした２９３Ｔ細胞をＰＢＳで洗浄し、コンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を含有するＣｅｌＬｙｔｉｃ（商標）Ｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解した。５００マイクログラムの全細胞抽出物を抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に４℃で１時間インキュベートした。ビーズを１ｍｌのＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．６）で３回洗浄した後、Ｌａｎｅ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＨ）中で煮沸することによって、ビーズに結合したＦＬＡＧタグ付タンパク質を溶出した。次いで、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、銀染色またはウエスタンブロットによって検出した。
【０２４６】
ウエスタンブロット。
コンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を含有するＲＩＰＡ様緩衝液またはＣｅｌＬｙｔｉｃ（商標）Ｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、細胞から全細胞ライセートを調製し、全タンパク質または免疫沈降試料をニトロセルロース膜に転写した。抗ＳＭＹＤ２（ｓｃ−７９０８４，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗Ｒｂ（ｓｃ−１０２，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ホスホ−Ｒｂ（セリン８０７／８１１）−Ｒ（ｓｃ−１６６７０−Ｒ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ホスホ−Ｒｂ（セリン７８０）（Ｃ８４Ｆ６，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄｅｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、抗ＨＳＰ９０（ｓｃ−１３１１９，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＡＣＴＢ（Ｉ−１９，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、抗ＨＡ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗Ｈｉｓ（６３１２１２，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）、抗ＨＯＰ（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ）、抗Ｃｄｃ３７（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および抗ｐ２３（ａｂｃａｍ）抗体で、膜をプローブした。抗モノメチル化ＨＳＰ９０ＡＢ１Ｋ５７４抗体は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製であった。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）と共にインキュベートし強化化学発光（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で可視化することによってタンパク質バンドを検出した。抗モノメチル化ＲＢ１Ｋ８１０抗体は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製であった。ＭｅｍＣｏｄｅ（商標）Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（２４５８０，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって、タンパク質バンドを検出した。
【０２４７】
インビトロのメチルトランスフェラーゼアッセイ。
インビトロのメチル化アッセイでは、Ｈｉｓ−ＷＴ−ＲＢ１、Ｈｉｓ−Ｋ８１０Ａ−ＲＢ１、Ｈｉｓ−ＨＳＰ９０ＡＢ１およびＨｉｓ−ＳＭＹＤ２を上記のように使用した。１．０Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１．０マイクロ−Ｃｉ／ｍｌＬ−［メチル−３Ｈ］メチオニン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）およびＭｉｌｌｉＱ水の中で、１マイクログラムのＨＳＰ９０ＡＢ１  ＲＢ１を１マイクログラムのＳＭＹＤ２と共に１時間インキュベートした。試料緩衝液中で煮沸した後、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、続いてフルオログラフィーによって可視化した。
【０２４８】
インビトロのキナーゼアッセイ
４０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  ＡＴＰを含有する反応緩衝液中、３０℃で１０分間にわたるキナーゼアッセイのために、ＣＤＫ４／サイクリンＤ１（ａｂ５５６９５，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を使用した。試料緩衝液中で煮沸した後、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
【０２４９】
インビボの標識。
以前に記載されているように（Cho, H.S. et al. Cancer Res (2010)）、インビボの標識を実施した。シクロヘキシミド（１００マイクログラム／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（４０マイクログラム／ｍｌ）を含む無メチオニン培地で、細胞を１時間飢餓状態にさせた。次いで、それらをＬ−［メチル−３Ｈ］メチオニン（１０マイクロ−Ｃｉ／ｍｌ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で５時間標識した。抗ＨＳＰ９０抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてＦＬＡＧ−ｍｏｃｋ、ＳＭＹＤ２（ＷＴ）またはＳＭＹＤ２（ΔＮＨＳＣ／ΔＧＥＥＶ）を免疫沈降し、メチル化ＨＳＰ９０をフルオログラフィーによって可視化した。
【０２５０】
インビトロの架橋アッセイ。
以前に記載されているように（Allan, R.K., Mok, D., Ward, B.K. & Ratajczak, T. J Biol Chem 281, 7161-7171 (2006)）、インビトロの架橋アッセイを実施した。ＳＭＹＤ２の存在下または非存在下におけるインビトロのメチルトランスフェラーゼアッセイの後、ＨＳＰ９０ＡＢ１を９４．７ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）および１０ｍＭ  ＢＳ３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に室温で３０分間インキュベートした。１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを添加することによって、架橋反応を停止した。試料緩衝液中で煮沸した後、各反応混合物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および抗ＨＳＰ９０抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用するＷＢに供した。ＷＢの後、ポンソーＳによって膜を染色した。
【０２５１】
インビボの架橋アッセイ。
ＨｅＬａ細胞を、細胞５ｘ１０５個の密度で１００ｍｍディッシュ上に播種した。翌日、細胞をｓｉＳＭＹＤ２＃２で処理した。ｓｉＲＮＡ処理の２４時間後、細胞にｐＣＡＧＧＳ−ｎ３ＦＣ−ＨＳＰ９０ＡＢ１（ＷＴ）またはｐＣＡＧＧＳ−ｎ３ＦＣ−ＨＳＰ９０ＡＢ１（Ｋ５３１Ａ／Ｋ５７４Ａ）をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、ＥＭＥＭを、Ｌ−フォト−ロイシンおよびＬ−フォト−メチオニン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有するダルベッコ変法イーグル制限培地（ＤＭＥＭ−ＬＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と交換し、ＵＶ照射（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（登録商標）ＵＶ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｒａｄｉｎｇ，１０８００  Ｊ）に供した。次いで、細胞を回収し、全タンパク質（５マイクログラム）をニトロセルロース膜に転写し、続いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ならびに、抗ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、抗ＳＭＹＤ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および抗ＡＣＴＢ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）抗体を使用するＷＢを行った。上記のように、タンパク質バンドを検出した。
【０２５２】
プライマー配列。
哺乳動物発現ベクターおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組換えタンパク質用発現ベクターを構築するためのオリゴヌクレオチドをそれぞれ表３−１、表３−２および表４に記載する。
【０２５３】
【表３−１】
0006051373.tif 000004
【０２５４】
【表３−２】
0006051373.tif 000005
【０２５５】
【表４】
0006051373.tif 000006
【０２５６】
実施例２：ＳＭＹＤ２はヒト癌で過剰発現しており、癌細胞成長を調節している。
本発明者らは最初に、臨床膀胱試料の小サブセットにおいて多数のヒストンメチルトランスフェラーゼの発現レベルを調べ、正常細胞と癌細胞との間でＳＭＹＤ２遺伝子の発現レベルに有意差があることを見出した。その結果として、膀胱癌試料１２５例および正常対照試料２８例（イギリス人）を分析し、腫瘍細胞では、ＳＭＹＤ２発現が正常細胞と比較して有意に上昇していることを見出した（Ｐ＜０．０００１、マンホイットニーＵ検定）（図１Ａおよび表５：患者の特徴）。膀胱腫瘍と様々な種類の正常組織との間のＳＭＹＤ２発現レベルも比較し、膀胱腫瘍組織におけるＳＭＹＤ２発現レベルは、心臓、肺、肝臓および腎臓を含む正常な器官組織のものよりも有意に高いことが見出された（図１Ｂ）。加えて、免疫組織化学により、ＳＭＹＤ２は、膀胱癌切片においてタンパク質レベルで過剰発現していることが示された（図１Ｃ）。さらに、Ｏｎｃｏｍｉｎｅデータベースにより、ＳＭＹＤ２は、膀胱癌に加えて、大腸癌および前立腺癌のような様々な種類のヒト癌で過剰発現していることが実証された（図１Ｆ）。
【０２５７】
【表５】
0006051373.tif 000007
【０２５８】
ＳＭＹＤ２が癌細胞の生存に必須であるかを知るために、本発明者らは最初に、様々な細胞株におけるＳＭＹＤ２発現レベルを調べ、膀胱、肺、大腸および肝臓の癌細胞株では、ＳＭＹＤ２が、正常な線維芽細胞由来の正常細胞株ＷＩ−３８と比較して過剰発現していることを見出した（図１Ｄ）。癌細胞におけるＳＭＹＤ２の過剰発現は、タンパク質レベルでも確認された（図１Ｅ）。次いで、２種の独立したｓｉＲＮＡ（表２：ｓｉＲＮＡ配列）によって、膀胱癌細胞（ＳＷ７８０およびＲＴ４）におけるＳＭＹＤ２発現を阻害した。それらのｓｉＲＮＡのノックダウン効果を確認した後に（図２Ａ）、細胞成長アッセイを実施し、ＳＭＹＤ２  ｓｉＲＮＡで処理した細胞では、対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＣ）と比べて有意な成長抑制を見出した（図２Ｂ）。有意な成長抑制は、肺癌細胞株（Ａ５４９、ＬＣ３１９およびＳＢＣ５）でも観察された（図２Ｆ）。ＳＭＹＤ２が発癌活性を有するかを調べるために、本発明者らは、コロニー形成能アッセイを行った。対照のｍｏｃｋベクターと共に、野生型ＳＭＹＤ２（ＳＭＹＤ２  ＷＴ）ベクターおよび酵素失活ＳＭＹＤ２（ＳＭＹＤ２  ΔＮＨＳＣ／ΔＧＥＥＶ）ベクターをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。各培養物において、コロニー形成能アッセイを実施した（図２Ｃ）。野生型ＳＭＹＤ２ベクターをトランスフェクトした細胞は、酵素失活ＳＭＹＤ２ベクターまたはｍｏｃｋ対照ベクターをトランスフェクトしたものよりも多くのコロニーを形成したことから、細胞における発癌を促進するのは、ＳＭＹＤ２のメチル化活性である。ＳＭＹＤ２は癌進行の早期に過剰発現しているので、ＳＭＹＤ２は、ヒトの発癌現象において重要な役割を果たすと思われる。
【０２５９】
癌細胞成長に対するＳＭＹＤ２過剰発現の効果をより詳細に解明するために、Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｔ−ＲＥｘ−２９３，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するヒト胎児腎臓線維芽細胞（ＨＥＫ２９３）細胞を使用して、ＳＭＹＤ２過剰発現の効果を調べた。Ｖ５タグ付ＳＭＹＤ２発現ベクター、空ベクター（ｍｏｃｋ）またはＶ５タグ付ＣＡＴ発現ベクター（対照）をＴ−ＲＥｘ−２９３細胞にトランスフェクトして、ＳＭＹＤ２を発現する安定細胞株を樹立した。本発明者らは、ＦＡＣＳ解析によって細胞周期状態を分析し（図２Ｄ）、Ｔ−ＲＥｘ−ＳＭＹＤ２細胞では、Ｓ期の割合が、対照細胞のものと比較して有意に増加していることを見出した（それぞれＰ＜０．０１［Ｍｏｃｋ、ＳＭＹＤ２］およびＰ＜０．０５［ＣＡＴ、ＳＭＹＤ２］）。反対に、Ｔ−ＲＥｘ−ＳＭＹＤ２細胞におけるＧ０／Ｇ１期の割合は、対照細胞のものよりもわずかに低かった（それぞれＰ＜０．０１［Ｍｏｃｋ、ＳＭＹＤ２］およびＰ＜０．０１［ＣＡＴ、ＳＭＹＤ２］）。ＢｒｄＵおよび７−ＡＡＤ染色も実施して癌細胞の詳細な細胞周期状態を分析し、ＳＭＹＤ２のノックダウン後に、Ｓ期の癌細胞の割合が有意に減少したことを確認した（図２Ｅおよび２Ｇ）。
【０２６０】
実施例３：ＳＭＹＤ２は、ＨＳＰ９０ＡＢ１と複合体を形成する。
ＳＭＹＤ２が癌細胞成長をどのように促進するのかを明らかにするために、本発明者らは、ＳＭＹＤ２の相互作用パートナーの同定を試みた。２９３Ｔ細胞にＦＬＡＧ−ｍｏｃｋまたはＦＬＡＧ−ＳＭＹＤ２ベクターをトランスフェクトし、免疫沈降（ＩＰ）および質量分析（ＭＳ）分析を行った。その結果として、ＨＳＰ９０ＡＢ１をＳＭＹＤ２の相互作用パートナーとして同定した（図３Ａ）。ＨＳＰ９０タンパク質は、多くの癌タンパク質をシャペロニングしかつそれらの機能を促進することを介して、ヒト癌における重要な役割を果たすと考えられているので（Trepel, J., Mollapour, M., Giaccone, G. & Neckers, L. Nat Rev Cancer 10, 537-549 (2010)）、ＳＭＹＤ２とＨＳＰ９０ＡＢ１との間の機能的な関係を調べた。免疫共沈降分析によって、ＳＭＹＤ２とＨＳＰ９０ＡＢ１との間の相互作用を確認した（図３Ｂおよび３Ｃ）。ＨＳＰ９０ＡＢ１に対するＳＭＹＤ２の結合領域を決定するために、様々な割合のＳＭＹＤ２を発現するように設計したプラスミドクローンをコトランスフェクトし、免疫共沈降分析を実施した（図３Ｄ）。次いで、ＳＭＹＤ２は、ＳＥＴドメインの一部を含む中央領域を介してＨＳＰ９０ＡＢ１に結合することが見出された（図３Ｅ）。ＳＭＹＤ２に対するＨＳＰ９０ＡＢ１の結合領域に関しては、Ｃ末端領域がＳＭＹＤ２との相互作用に重要であり得ることが見出された（図３Ｆおよび３Ｇ）。加えて、免疫細胞化学的分析により、それらは、細胞質で共局在していることが明らかになった（図３Ｈ）。これらの結果は、ＳＭＹＤ２がＨＳＰ９０ＡＢ１と複合体を形成することを示している。
【０２６１】
実施例４：ＳＭＹＤ２は、ＨＳＰ９０ＡＢ１をメチル化する。
ＨＳＰ９０タンパク質は複数の翻訳後修飾（ＰＴＭ）を受けることが公知であるが、メチル化に関する報告はない（Scroggins, B.T. et al. Mol Cell 25, 151-159 (2007), Martinez-Ruiz, A. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 8525-8530 (2005), Mollapour, M. et al. Mol Cell 37, 333-343 (2010), Mollapour, M. et al. Mol Cell 41, 672-681 (2011)）。したがって、ＳＭＹＤ２がＨＳＰ９０ＡＢ１をメチル化し、その機能に影響を与えることができるかを調べた。最初に、インビトロのメチルトランスフェラーゼアッセイを実施し、ＨＳＰ９０ＡＢ１がＳＭＹＤ２によって用量依存的にメチル化されることを見出した（図４Ａ）。次いで、本発明者らは、ＨＳＰ９０ＡＢ１が、細胞内でもＳＭＹＤ２によってメチル化されるかを検証した。２９３Ｔ細胞にＦＬＡＧ−ｍｏｃｋベクター、ＦＬＡＧ−ＳＭＹＤ２（ＷＴ）ベクターまたはＦＬＡＧ−ＳＭＹＤ２（ΔＮＨＳＣ／ΔＧＥＥＶ）をトランスフェクトし、続いて、実施例１に記載したようにインビボの標識実験を行った。その結果、メチル化ＨＳＰ９０ＡＢ１に対応する特異的シグナルが観察され、メチル化は、ＳＭＹＤ２の酵素活性に依存していた（図４Ｂ）。次に、ＨＳＰ９０ＡＢ１のどの部分がＳＭＹＤ２によってメチル化されるかを決定するために、本発明者らは、組換えＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質の欠失変異体をいくつか調製し、インビトロのメチルトランスフェラーゼアッセイを実施した（図４Ｃおよび図４Ｈ）。このデータにより、ＧＳＴ−ＨＳＰ９０ＡＢ１のＣ末端部分（５００〜７２４ａａ）がＳＭＹＤ２によってメチル化されることが明らかになった。続いて、本発明者らは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によってＨＳＰ９０ＡＢ１のメチル化部位の同定を試み、リジン５３１および５７４がＳＭＹＤ２によってメチル化されることを同定した（図４Ｄおよび４Ｅ）。Ｋ５７４をアラニンに置換することにより、ＳＭＹＤ２依存性のＨＳＰ９０ＡＢ１メチル化のシグナルが減少し、Ｋ５３１およびＫ５７４の両方を置換したＨＳＰ９０ＡＢ１タンパク質を使用すると、メチル化シグナルはより減少した（図４Ｆ）。この結果は、部分的なＨＳＰ９０ＡＢ１（５００〜７２４ａａ）を使用しても確認された（図４Ｇ）。これらのメチル化部位は、ダニオ・レリオからホモ・サピエンスまで高度に保存されているので、これらの部位のメチル化は、ＨＳＰ９０ＡＢ１機能の調節に重要であり得る可能性がある（図４Ｉ）。
【０２６２】
実施例５：ＳＭＹＤ２依存性のメチル化は、ＨＳＰ９０ＡＢ１のシャペロニン複合体形成を変化させる。
本発明者らは次に、ＨＳＰ９０ＡＢ１機能に対するＳＭＹＤ２依存性のメチル化の効果をより詳細に分析する。ＳＭＹＤ２のメチルトランスフェラーゼ反応の後、架橋試薬であるビス［スルホスクシンイミジル］スベレート（ＢＳ３）を使用して、二量体化アッセイを実施し、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを行った。その結果、本発明者らは、ＨＳＰ９０ＡＢ１のメチル化依存性の二量体化を見出したが（図５Ｆ）、これは、ＳＭＹＤ２依存性のＨＳＰ９０ＡＢ１がその二量体化形成を促進し得ることを暗示している。続いて、本発明者らは、ＳＭＹＤ２によるメチル化依存性の二量体化が培養細胞で観察されるかを検証した。内因性ＳＭＹＤ２の効果を排除するためにｓｉＳＭＹＤ２処理した後、ＦＬＡＧ−ＨＳＰ９０ＡＢ１（ＷＴ）ベクターおよびＨＡ−ｍｏｃｋベクターまたはＨＡ−ＳＭＹＤ２ベクターを２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、インビボの架橋アッセイを実施し、ＳＭＹＤ２がＨＳＰ９０ＡＢ１の架橋を促進することを見出した（図５Ａ）。免疫共沈降分析により、二重置換（Ｋ５３１Ａ／Ｋ５７４Ａ）は、ＨＳＰ９０ＡＢ１の二量体化プロセスに負の影響を与えたことが示された（図５Ｂ、レーン５と６との間を比較されたい）。どちらの残基がこのプロセスにより重要であるかを決定するために、単一置換（それぞれＫ５３１Ａ、Ｋ５７４Ａ）を含有する変異体発現ベクターを調製し、ＨＡ−ＨＳＰ９０ＡＢ１のＫ５３１ＡではなくＫ５７４Ａが、ＦＬＡＧ−ＨＳＰ９０ＡＢ１（ＷＴ）に対する親和性の低下をもたらしたことを見出した（図５Ｃ、レーン７と８との間を比較されたい）。この結果は、Ｋ５７４のメチル化がＨＳＰ９０ＡＢ１の二量体化により重要であり得ることを示している。
【０２６３】
ＨＳＰ９０は、コシャペロンと共同してそのシャペロン機能を発揮し（Young, J.C., Agashe, V.R., Siegers, K. & Hartl, F.U. Nat Rev Mol Cell Biol 5, 781-791 (2004)）、いくつかの翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、コシャペロンに対するＨＳＰ９０の親和性を変化させると報告されている（Scroggins, B.T. et al. Mol Cell 25, 151-159 (2007), Mollapour, M. et al. Mol Cell 37, 333-343 (2010), Mayer, M.P. Mol Cell 37, 295-296 (2010)）。したがって、本発明者らは、ＳＭＹＤ２によるＨＳＰ９０ＡＢ１のメチル化が、コシャペロンへのＨＳＰ９０ＡＢ１の結合に影響を与える可能性を調査した。ＦＬＡＧ−ＨＳＰ９０ＡＢ１（ＷＴ）ベクターまたはＦＬＡＧ−ＨＳＰ９０ＡＢ１（Ｋ５３１Ａ／Ｋ５７４Ａ）ベクター２９３Ｔ細胞を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、続いて、免疫沈降およびウエスタンブロット分析を行った。本発明者らは、ＨＳＰ９０ＡＢ１のＫ５３１Ａ／Ｋ５７４Ａ置換が、ｐ２３ではなくＨＯＰおよびＣｄｃ３７とのその相互作用を破壊したことを見出した（図５Ｄ、レーン３と４との間を比較されたい）。この際、モノメチル化ＨＳＰ９０ＡＢ１Ｋ５７４を認識する特異的抗体を使用して、ＨＳＰ９０ＡＢ１のメチル化状態もモニタリングした（図５Ｄおよび５Ｇ）。加えて、ＨＳＰ９０ＡＢ１のＫ５３１ＡおよびＫ５７４Ａでの単一変異コンストラクトを使用する実験にしたがって、本発明者らは、５７４位の残基をリジンからアラニンに置換することにより、ｐ２３ではなくＨＯＰおよびＣｄｃ３７に対する結合親和性の低下がもたらされたことを見出した（図５Ｅ、レーン７と８との間を比較されたい）。最後に、腫瘍成長におけるメチル化ＨＳＰ９０ＡＢ１の意義を解明するために、本発明者らは、ＦＬＡＧ−ＨＳＰ９０ＡＢ１（ＷＴ）およびＦＬＡＧ−ＨＳＰ９０ＡＢ１（Ｋ５３１Ａ／Ｋ５７４Ａ）を過剰発現するＨｅＬａ細胞の安定トランスフェクタントを作製した。野生型および置換ＨＳＰ９０タンパク質の安定発現を確認した後に（図５Ｈａ、レーンａ１およびｂ２）、該安定細胞株を使用して成長アッセイを実施し、ＨＳＰ９０ＡＢ１の成長促進効果が、メチル化部位をアラニンに置換することによって減少したことを見出した（図５Ｈｂ、Ｐ＜０．０５）。総合すると、これらのデータにより、ＳＭＹＤ２依存性のメチル化は、ＨＳＰ９０ＡＢ１の二量体化プロセスおよびコシャペロンとの相互作用を容易にし、ヒトの発癌現象に寄与するようであることが示唆された。
【０２６４】
実施例６：ＳＭＹＤ２のメチルトランスフェラーゼ活性の阻害剤のスクリーニング
Ｈｉｓタグ付ＳＭＹＤ２（配列番号６３のアミノ酸配列からなるＨｉｓタグ付ポリペプチド）を、メチルトランスフェラーゼ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８．８）中で、１．８マイクロＭのビオチン化−ヒストンＨ４ペプチド、０．１８マイクロＭのＳ−アデノシル−Ｌ−［メチル−３Ｈ］メチオニンおよび５０マイクログラムのストレプトアビジンコーティングＰＶＴビーズと共に、総容量１５マイクロリットルでインキュベートした。室温で３０分間インキュベートした後、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を添加することによって反応を停止させ、次いで、シンチレーションカウンタを使用して、ビーズから放出された光を測定する。
多数の化学合成した化合物を上記アッセイによって評価した結果、ＳＭＹＤ２のメチルトランスフェラーゼ活性を阻害するいくつかの化合物を同定した。
【０２６５】
実施例７：ＳＭＹＤ２は、ＲＢ１のリジン８１０をインビトロおよびインビボの両方でメチル化する。
ヒトの発癌現象に関与する重要なＳＭＹＤ２基質を同定するために、本発明者らは、様々な腫瘍関連タンパク質を基質として使用してインビトロのメチルトランスフェラーゼアッセイを実施し、ＲＢ１タンパク質を基質として使用した場合に強いメチル化シグナルを見出した（図６Ａ）。ＲＢ１とＳＭＹＤ２タンパク質との間の相互作用をさらに確認するために、本発明者らは、ＦＬＡＧ−ＳＭＹＤ２およびＨＡ−ＲＢ１またはＦＬＡＧ−ＲＢ１およびＨＡ−ＳＭＹＤ２発現ベクターを２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした後に免疫共沈降アッセイを行い、それらの結合を確認した（図６ＢおよびＣ）。加えて、ＳＭＹＤ２の欠失変異体を使用する免疫沈降アッセイにより、ＳＭＹＤ２のＣ末端部分は、ＲＢ１と相互作用するために必須であることが示された（図６Ｄ）。さらに、本発明者らはまた、免疫細胞化学的分析によって、内因性のＲＢ１およびＳＭＹＤ２タンパク質が小細胞肺癌細胞株ＳＢＣ５で共局在していることを確認した（図６Ｅ）。
【０２６６】
本発明者らは次に、ＳＭＹＤ２によるＲＢ１のメチル化部位を同定するために、ＲＢ１タンパク質の一部を発現するように設計したプラスミドベクターを構築し、大腸菌で発現させた組換えタンパク質を調製した。それらのタンパク質を使用して、本発明者らは、インビトロのメチルトランスフェラーゼアッセイを行い（図７Ａ）、ＲＢ１タンパク質のＣ末端領域（７７３ａａ〜９２８ａａ）がメチル化部位を含むことを見出した。続いて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により、ＲＢ１のリジン８１０が、ＳＭＹＤ２によってモノメチル化されることが示された（図７Ｂ）。リジンのＳＭＹＤ２依存性モノメチル化は、アミノ酸分析によっても確認された（図１１）。同定したＲＢ１のメチル化部位を検証するために、本発明者らは、リジン８１０をアラニンに置換した部分的なＲＢ１タンパク質（Ｋ８１０Ａ−ＲＢ１（７７３〜８１３））を調製し、インビトロのメチルトランスフェラーゼアッセイを実施した（図７Ｃ）。ＳＭＹＤ２による野生型ＲＢ１タンパク質の特異的メチル化シグナルは、Ｋ８１０の置換によるものであった。これらの結果に基づいて、本発明者らは、Ｋ８１０モノメチル化ＲＢ１ペプチドを標的とするポリクローナル抗体を作製した。該抗体の特異性を検証するために、本発明者らは、ＳＭＹＤ２有りまたは無しでインビトロのメチルトランスフェラーゼアッセイを実施し、ＳＭＹＤ２依存性のメチル化シグナルを観察した（図７Ｄ）。本発明者らはまた、この抗体が、インビトロにおいて野生型ＳＭＹＤ２で処理したＫ８１０置換ＲＢ１タンパク質（図７Ｅ）も、インビボにおいて酵素失活ＳＭＹＤ２で処理した野生型ＲＢ１タンパク質（図７Ｆ）も認識できないことを見出した。これらの結果は、ＳＭＹＤ２が、ＲＢ１タンパク質のリジン８１０をインビトロおよびインビボの両方でメチル化し、本発明者らが作製した抗体が、Ｋ８１０メチル化ＲＢ１を特異的に認識できることを暗示している。
【０２６７】
実施例８：ＳＭＹＤ２は、リジン８１０のメチル化を介して、セリン８０７／８１１におけるＲＢ１のリン酸化を促進する。
リン酸化はＲＢ１機能の調節において重要な役割を果たすことが周知であることから（Weinberg RA .Cell 81, 323-330(1995), Sherr CJ, et al.Cancer Cell 2, 103-112.(2002)）、本発明者らは、ＲＢ１のリン酸化状態に対するリジン８１０のメチル化の効果を調べた。本発明者らは最初に、セリン８０７／８１１におけるＲＢ１のリン酸化状態を調べるために、２種の非癌性細胞株および７種の癌細胞株のウエスタンブロット分析を実施し、ＲＢ１のより高いリン酸化状態と高ＳＭＹＤ２発現との間にある程度の相関関係を見出した（図８Ａ）。ＳＭＹＤ２がリジン８１０のメチル化を介してＲＢ１のリン酸化状態に影響を与えるかを明らかにするために、本発明者らは、機能獲得実験および機能喪失実験を行った。ＦＬＡＧ−ＳＭＹＤ２を２９３Ｔ細胞に導入した後、本発明者らは、セリン８０７／８１１におけるＲＢ１のリン酸化状態が、ｍｏｃｋベクターをトランスフェクトした細胞と比較して有意に上昇していることを検出した（図８Ｂ）。続いて、免疫細胞化学的分析により、ＨｅＬａ細胞において、ＷＴ−ＳＭＹＤ２の過剰発現は、セリン８０７／８１１におけるＲＢ１のリン酸化を促進したことが検出された（図８Ｃ）。それと一致して、セリン８０７／８１１におけるＲＢ１のリン酸化は、ＳＭＹＤ２のノックダウン後に有意に減少した（図８Ｄ）。ＲＢ１のリン酸化状態に対するＳＭＹＤ２のメチルトランスフェラーゼ活性の効果を調べるために、本発明者らは、部分的なＲＢ１（ＦＬＡＧ−ＲＢ１（７７３〜８１３））を発現するように設計したベクターを、野生型ＳＭＹＤ２発現ベクター（ＨＡ−ＳＭＹＤ２）または酵素失活ＳＭＹＤ２発現ベクター（ＨＡ−ＳＭＹＤ２（ΔＮＨＳＣ／ＧＥＥＶ））と共に２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースを使用して免疫沈降を行った。図７Ｅに示されているように、ＷＴ−ＳＭＹＤ２をトランスフェクトした細胞では、セリン８０７／８１１におけるＲＢ１のリン酸化レベルは、酵素失活ＳＭＹＤ２を有する細胞のものよりも有意に高かった。したがって、ＳＭＹＤ２依存性のＲＢ１メチル化は、セリン８０７／８１１におけるＲＢ１のリン酸化状態を促進すると思われる。
【０２６８】
ＲＢ１のリン酸化状態に対するＳＭＹＤ２依存性のメチル化の効果を評価するために、本発明者らは、ＳＭＹＤ２有りまたは無しで反応させる基質としてＲＢ１を使用して、インビトロのキナーゼアッセイを実施した（図９Ａ）。ＲＢ１のリジン８１０のメチル化を確認した後（図９Ｂ、上）、本発明者らは、試料をＣＤＫ４／サイクリンＤ１複合体（これは、ＲＢ１リン酸化の重要な調節因子である）と反応させ、セリン８０７／８１１におけるＲＢ１のリン酸化状態をウエスタンブロットによってモニタリングした（図９Ｂ、下）。重要なことに、メチル化ＲＢ１は、非メチル化タンパク質よりも高いリン酸化レベルを示した。加えて、本発明者らが、セリン８０７／８１１におけるＲＢ１のリン酸化に対するＳＭＹＤ２の用量依存的な効果を調べたところ、それは用量依存的に増加し、リジン８１０におけるＲＢ１のメチル化レベルと相関していた（図９Ｃ）。同様に、リジン８１０のアラニンへの置換を含有する変異体ＲＢ１は、野生型ＲＢ１よりもずっと弱いリン酸化レベルを示したが（図９Ｄ）、これは、リジン８１０におけるＲＢ１のメチル化が、ＲＢ１のリン酸化レベルを促進するようであることを暗示している。次いで、本発明者らは、Ｋ８１０モノメチル化ＲＢ１ペプチド（Ｋ８１０ｍｅ−ＲＢ１ペプチド（配列番号７０））およびＫ８１０非メチル化ＲＢ１ペプチド（対照−ＲＢ１ペプチド（配列番号６９））を調製し、ＣＤＫ４／サイクリンＤ１複合体によるセリン８０７／８１１におけるＲＢ１のリン酸化に対するＫ８１０モノメチル化の効果をより詳細に調査した（図９Ｅ）。抗ＲＢ１  Ｋ８１０ｍｅ抗体を使用して、ドットブロット分析によってＫ８１０モノメチル化を確認した後に、本発明者らはキナーゼアッセイを行い、セリン８０７／８１１におけるＲＢ１のリン酸化レベルが、Ｋ８１０ｍｅ−ＲＢ１ペプチドでは非メチル化ペプチドよりも有意に高いことを見出した（図９Ｆ）。Ｋ８１０ｍｅ−ＲＢ１では、セリン８０７／８１１におけるＲＢ１のリン酸化がＣＤＫ４用量依存的に上昇していることも確認された（図９Ｇ）。これらの知見は、ＳＭＹＤ２によるＲＢ１のＫ８１０モノメチル化が、セリン８０７／８１１におけるＲＢ１のリン酸化レベルを促進できることを示している。
【０２６９】
実施例９：ＲＢ１のリジン８１０のメチル化は、細胞周期進行を促進する。
インビボにおけるＲＢ１のリン酸化状態に対するメチル化の効果をさらに評価するために、本発明者らは、ＦＬＡＧ−ＷＴ−ＲＢ１ベクターまたはＦＬＡＧ−Ｋ８１０Ａ−ＲＢ１ベクターを、ＨＡ−ＷＴ−ＳＭＹＤ２ベクターと共に２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースを用いて免疫沈降を行った（図１０Ａ）。先のデータと一致して、ＷＴ−ＲＢ１は、リジン８１０置換ＲＢ１（Ｋ８１０Ａ−ＲＢ１）よりも高い、セリン８０７／８１１におけるＲＢ１のリン酸化レベルを示し、この結果は、部分的なＲＢ１（７７３〜８１３）を使用しても確認された（図１０Ｂ）。総合すると、リジン８１０におけるＲＢ１のメチル化はまた、ＲＢ１のリン酸化状態をインビボで促進するようである。
【０２７０】
ＲＢ１のＣＤＫ介在性リン酸化は、ＲＢ１とＥ２Ｆ１（Ｇ１／Ｓ移行期における細胞周期進行に必要な遺伝子を活性化する多機能転写因子である）との相互作用を妨げ、Ｅ２Ｆ１依存性の遺伝子発現を可能にすることが公知である（Sherr CJ. et al. Cancer Cell 2, 103-112.(2002)）。リジン８１０のメチル化はＲＢ１のリン酸化を促進したことから、本発明者らは、細胞周期に対するＲＢ１メチル化の効果を調べるために、Ｅ２Ｆ受容体アッセイを実施した。リジン８１０置換ＲＢ１を過剰発現する細胞では、Ｅ２Ｆ−ルシフェラーゼ活性は、野生型ＲＢ１を過剰発現する細胞と比較して有意に低かった（図１０Ｃ）。この結果は、ＲＢ１のリジン８１０のメチル化がＥ２Ｆ転写活性をインビボで促進し得ることを示している。さらに、本発明者らは、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−ＲＥｘ（商標）２９３細胞株システムを使用したドキシサイクリンの誘導によって、野生型ＲＢ１（ＷＴ）およびＫ８１０置換ＲＢ１（Ｋ８１０Ａ）を発現することができる安定細胞株を樹立した。上記データと一致して、野生型ＲＢ１を発現する細胞は、ＲＢ１（Ｋ８１０Ａ）を発現する細胞よりも高い細胞成長速度を示した（図１２）。総合すると、ＳＭＹＤ２によるＲＢ１のリジン８１０のメチル化は、ＲＢ１のリン酸化の増加を介して、細胞周期進行を促進すると思われる。
【０２７１】
考察
本発明者らは以前に、特定のヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）が、正常な細胞バイオロジーに加えて、ヒト癌の病因において重要な役割を果たすことを実証した（Hamamoto, R. et al. Nat Cell Biol 6, 731-740 (2004), Takawa, M. et al. Cancer Sci (2011), Yoshimatsu, M. et al. Int J Cancer 128, 562-573 (2011)）。加えて、他のグループは、ＨＭＴがヒト細胞の悪性化に関与すると提唱している（Portela, A. & Esteller, M. Nat Biotechnol 28, 1057-1068 (2010), Schneider, R., Bannister, A.J. & Kouzarides, T. Trends Biochem Sci 27, 396-402 (2002), Sparmann, A. & van Lohuizen, M. Nat Rev Cancer 6, 846-856 (2006)）。総合すると、この証拠は、ＨＭＴの調節解除がヒトの発癌現象に有意に寄与することを明確に示唆しているが、ＨＭＴの異常とヒト癌との間の関係についてのより深い理解は、依然として不明である。
【０２７２】
本発明の間に、ＳＭＹＤ２は膀胱および様々な他の癌組織で過剰発現していること、ならびにＳＭＹＤ２は新規な基質としてＨＳＰ９０ＡＢ１およびＲＢ１をメチル化することが、実証された。最近、特定のＨＭＴは、非ヒストンタンパク質をメチル化し、それにより、それらの機能、例えば転写活性、タンパク質安定性、および相互作用パートナーに対する結合親和性を変化させることが示されている（Esteve, P.O. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 5076-5081 (2009), Guo, Z. et al. Nat Chem Biol 6, 766-773 (2010)）。
【０２７３】
本発明のアッセイにより、ＳＭＹＤ２によるＨＳＰ９０ＡＢ１のメチル化は、二量体化プロセスおよびコシャペロンに対する結合親和性のようなその機能に影響を与えること、ならびにこのメチル化プロセスは、癌細胞増殖を促進することが明らかになった（図５）。ＨＳＰ９０は真核細胞で普遍的に発現しており、全タンパク質の最大１〜２％を含む（Borkovich, K.A., Farrelly, F.W., Finkelstein, D.B., Taulien, J. & Lindquist, S. Mol Cell Biol 9, 3919-3930 (1989)）。構造的には、ＨＳＰ９０は、３つのドメイン：Ｎ−ドメイン（ＡＴＰ結合ポケット）、Ｍ−ドメイン（コシャペロンおよびクライアントタンパク質に対する結合領域）、およびＣ末端二量体化ドメイン（二量体化モチーフ）からなる（Wandinger, S.K., Richter, K. & Buchner, J. J Biol Chem 283, 18473-18477 (2008))）。重要なことに、ＨＳＰ９０は進化的に保存されている分子シャペロンとして働き、これは、多数の新たに合成されたポリペプチドおよび不安定なフォールディングタンパク質が正しくフォールディングするのを助けることで、それらが誤って凝集するのを防ぐ（Wandinger, S.K., Richter, K. & Buchner, J. J Biol Chem 283, 18473-18477 (2008), Young, J.C., Agashe, V.R., Siegers, K. & Hartl, F.U. Nat Rev Mol Cell Biol 5, 781-791 (2004)）。クライアントタンパク質には、シグナル伝達およびストレス適応反応に重要な転写因子およびタンパク質キナーゼが含まれるので、ＨＳＰ９０は、複数の細胞機能の調節において必須の役割を果たすと思われる（Zhao, R. et al. Cell 120, 715-727 (2005), Chiosis, G., Vilenchik, M., Kim, J. & Solit, D. Drug Discov Today 9, 881-888 (2004)）。シャペロン機能を発揮するためには、ホモ二量体化、ならびにｐ２１、ＨＯＰおよびＣｄｃ３７などのコシャペロンタンパク質との協調（Taipale, M., Jarosz, D.F. & Lindquist, S. Nat Rev Mol Cell Biol 11, 515-528 (2010)., Wayne, N. & Bolon, D.N. J Biol Chem 282, 35386-35395 (2007)）が、ＡＴＰａｓｅ活性と同様に必須である。クライアントタンパク質が、ＡＴＰ結合ＨＳＰ９０タンパク質によってクランプされ、ＨＳＰ９０が、他のシャペロンおよびコシャペロンと共同してフォールディングプロセスを行い、続いて、ＡＴＰの加水分解によるＨＳＰ９０の立体構造変化に応じて、成熟したクライアントが放出される（Ali, M.M. et al. Nature 440, 1013-1017 (2006), Vaughan, C.K. et al. Mol Cell 23, 697-707 (2006), Hessling, M., Richter, K. & Buchner, J. Nat Struct Mol Biol 16, 287-293 (2009)）。加えて、ＨＳＰ９０の機能は、リン酸化およびアセチル化などの複数のＰＴＭによって調節されると報告されている（Scroggins, B.T. et al. Mol Cell 25, 151-159 (2007), Martinez-Ruiz, A. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 8525-8530 (2005), Mollapour, M. et al. Mol Cell 37, 333-343 (2010), Mollapour, M. et al. Mol Cell 41, 672-681 (2011)）。
【０２７４】
癌細胞では、正常細胞と比較してより多くのコシャペロンがシャペロン複合体中に存在し（Kamal, A. et al. Nature 425, 407-410 (2003)）、この癌特異的なシャペロン機構により、癌細胞は、癌タンパク質をミスフォールディングおよびプロテアソーム分解から保護することができる（Trepel, J., Mollapour, M., Giaccone, G. & Neckers, L. Nat Rev Cancer 10, 537-549 (2010)）。臨床状況では、シャペロンタンパク質はヒト癌で過剰発現しており（Whitesell, L. & Lindquist, S.L. Nat Rev Cancer 5, 761-772 (2005)）、シャペロンの発現上昇は、予後不良（Jameel, A. et al. Int J Cancer 50, 409-415 (1992), Pick, E. et al. Cancer Res 67, 2932-2937 (2007)）および薬物耐性（Trieb, K. et al. Br J Cancer 82, 85-87 (2000)）に関連している。総合すると、この証拠は、ＨＳＰ９０を含むシャペロン複合体が、ヒトの発癌現象に深く関与することを示唆している。実際、ＨＳＰ９０を標的とする阻害剤であって、ＡＴＰ結合ポケットに結合する阻害剤が開発され、臨床試験において評価中である（Trepel, J., Mollapour, M., Giaccone, G. & Neckers, L. Nat Rev Cancer 10, 537-549 (2010)）。代表的な阻害剤であるゲルダナマイシンの１７−アリルアミノ誘導体（１７−ＡＡＧまたはタネスピマイシン）は、臨床試験で評価中のゲルダナマイシン誘導体の１つである（Solit, D.B. & Chiosis, G. Drug Discov Today 13, 38-43 (2008)）。例えば、トラスツズマブと組み合わせた１７−ＡＡＧの、ＨＥＲ−２陽性転移性乳癌患者に対する副作用および治療有効性を検証するために、第ＩＩ相試験が行われ、この併用療法は患者の予後を改善し、毒性は許容可能であることが証明された。このデータにより、さらなる研究ではその治療関連性が調査される可能性があることが確実になる（Modi, S. et al. Clin Cancer Res (2011)）。
【０２７５】
ｐ１０７およびｐ１３０とのポケットファミリーのメンバーであるＲＢ１遺伝子は、最初に知られた腫瘍抑制因子であった（Friend SH. et al. Nature 323, 643-646(1986), Ianari A. et al. Cancer Cell 15, 184-194(2009)）。ＲＢタンパク質は転写補因子として主に機能し、多数の転写因子を調節できかつ多くの標的遺伝子の発現に影響を与えることができる。加えて、ＲＢ１タンパク質は、アデノウイルスＥ１ＡなどのＤＮＡ腫瘍ウイルスの形質転換タンパク質によって標的とされ、大部分のヒト腫瘍細胞では、ＲＢ１遺伝子それ自体またはその上流の調節因子のいずれかの変異により機能的に不活性化されていることが周知である（Trimarchi JM. et al. Nat Rev Mol Cell Biol 3, 11-20(2002)）。その腫瘍抑制活性は、Ｅ２Ｆ転写ファミリーのメンバーに直接結合し、それらが細胞増殖に必要な遺伝子の転写を促進するのを防ぐ能力に、大きく依存している（Trimarchi JM. et al. Nat Rev Mol Cell Biol 3, 11-20(2002)）。ＲＢ／Ｅ２Ｆ経路は、癌細胞では変化していることが多く、細胞増殖制御系を調節解除するので、研究者によって注目されている（Knudsen ES. et al. Clin Cancer Res 16, 1094-1099(2010)）。細胞増殖の調節に関して、マイトジェンは、ＣＤＫ−サイクリン複合体の連続的な活性化を介してＥ２Ｆ依存性プロモーターの転写阻害を回復させ、次いでこれがＲＢをリン酸化し、その転写コリプレッサー能力を弱める（Knudsen ES .et al. Nat Rev Cancer 8, 714-724(2008), Harbour JW. et al. Cell 98, 859-869(1999), Hinds PW. et al. Cell 70, 993-1006(1992)）。このリン酸化は、Ｅ２Ｆを放出するようＲＢタンパク質を誘導し、かつ続いて後期Ｇ１期にＥ２Ｆ応答遺伝子を誘導するために十分である。重要なことに、大多数のヒト腫瘍は、Ｅ２ＦのＲＢタンパク質媒介性抑制を無効にする変異を有する（Sherr CJ. et al. Cancer Cell 2, 103-112(2002)）。これらの変異は、正常な分裂促進シグナルの非存在下で、サイクリンＤ−ＣＤＫ４／６キナーゼの活性化またはＣＤＫ阻害因子ｐ１６の不活性化を介して、ＲＢ１遺伝子それ自体を不活性化するか、またはＲＢタンパク質のリン酸化を促進する。これらの変化はＥ２Ｆの不適切な放出をもたらし、それによりＥ２Ｆ標的遺伝子の転写活性化を誘導し、その結果として癌細胞の細胞増殖を促進する（Ianari A. et al. Cancer Cell 15, 184-194 (2009)）。
【０２７６】
本発明の間に、ＲＢ１のリジン８１０はＳＭＹＤ２によってモノメチル化され、次いでこれがＲＢ１リン酸化およびＥ２Ｆ１転写活性の上昇を介して、細胞周期進行を促進することが発見された（図１０Ｄ）。この知見は、ヒト癌細胞におけるＲＢ／Ｅ２Ｆ経路の調節解除機構に新たな洞察を加える。興味深いことに、最近、他のグループが、ＲＢタンパク質のリジンのメチル化を同定した（Carr SM. et al. EMBO J 30, 317-327 (2011), Saddic LA. et al. J Biol Chem 285, 37733-37740(2010)）。総合すると、リジンのメチル化は、ＲＢ機能の調節において重要な役割を果たす可能性がある。したがって、さらなる機能分析により、ＲＢ／Ｅ２Ｆ経路におけるリジンのメチル化の重要性が明らかになり得る。
【０２７７】
膀胱癌について、いくつかの新規な標的が同定されており、新たに登場した薬物が臨床試験を受けているが、現在の化学療法では十分な転帰を保証することはできず、有害事象を無視することはできない（Black, P.C., Agarwal, P.K. & Dinney, C.P. Urol Oncol 25, 433-438 (2007), Sonpavde, G. et al. Lancet Oncol 11, 861-870 (2010)）。したがって、膀胱癌に対する癌化学療法の能力を拡張する理想的な治療標的を発見することは、依然として重要な目標である。本発明の間に、膀胱癌組織および他の癌組織におけるＳＭＹＤ２の発現レベルは、対応する非新生物組織のものよりも有意に高いことが発見された。さらに、ＳＭＹＤ２のノックダウンは、癌細胞成長を有意に抑制する。ＨＭＴ阻害剤を作製する研究が最近始まっているという事実（Copeland, R.A., Solomon, M.E. & Richon, V.M. Nat Rev Drug Discov 8, 724-732 (2009) Spannhoff, A. et al. J Med Chem 50, 2319-2325 (2007)）を考慮すると、ＳＭＹＤ２は、有害事象がより少ない理想的な癌治療標的であると思われる。ＳＭＹＤ２のさらなる機能分析は、抗癌治療の新規標的としてのＳＭＹＤ２の有用性を確認するために役立つであろう。加えて、ＨＳＰ９０阻害剤およびＳＭＹＤ２阻害剤の組み合わせは、現在の癌治療戦略を強化するために役立ち得る。ＳＭＹＤ２依存性のＨＳＰ９０メチル化と、１７−ＡＡＧのようなＨＳＰ９０阻害剤の感度との間の関係は、将来解明されるべき重要な課題である。
【産業上の利用可能性】
【０２７８】
本明細書に記載される癌の遺伝子発現分析により、癌の予防および治療の標的として特定の遺伝子（すなわち、ＳＭＹＤ２）が同定された。この差次的に発現している遺伝子の発現に基づいて、本発明は、癌を同定および検出するための新規な分子診断マーカーを提供する。したがって、本発明はまた、ＳＭＹＤ２を使用する新規な診断戦略を提供する。さらに、本明細書に記載されるように、ＳＭＹＤ２は、癌細胞の生存に関与する。したがって、本発明はまた、癌を治療および／または予防し、かつ癌細胞成長を阻害するための新規な分子標的を提供する。さらに、本明細書において実証されたように、ＳＭＹＤ２ポリペプチドによってメチル化される新規な基質を同定した。したがって、本発明はまた、癌の治療および／または予防のための新規なスクリーニング戦略を提供する。
本発明はまた、ＳＭＹＤ２と相互作用する遺伝子としてＨＳＰ９０ＡＢ１およびＲＢ１を同定した。したがって、本発明はまた、ＳＭＹＤ２およびＨＳＰ９０ＡＢ１またはＲＢ１を利用する新規な抗癌剤スクリーニング戦略を提供する。
本明細書において実証されたように、ＳＭＹＤ２によるＲＢ１のメチル化は、ＲＢ１リン酸化の増加を介して細胞周期進行を促進した。したがって、本発明はまた、ＳＭＹＤ２によるＲＢ１メチル化を介したＲＢ１リン酸化を阻害する抗癌剤を同定するための新規なスクリーニング戦略を提供する。
【０２７９】
本明細書に記載される材料および方法はまた、癌の予防、診断、および治療のためのさらなる分子標的を同定するために有用である。本明細書で提供されたデータは、癌の包括的な知識を与え、新規の診断戦略の構築を容易にし、治療薬および予防剤のための分子標的の同定の糸口を提供する。このような情報は、腫瘍化に関する知識をより深めるのに貢献し、癌を診断、治療、および究極的には予防する新規の戦略を構築するための指標を提供する。
本発明を、その特定の態様を参照して詳細に説明したが、上記の詳細は本来的には例示および説明のためのものであり、本発明およびその好ましい実施形態を例証することを意図するものと理解されるべきである。当業者であれば、ルーチンな実験によって、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明において様々な変更および修正を行うことができることを容易に認識するであろう。したがって、本発明は、上記説明ではなく、添付の特許請求の範囲およびその等価物によって規定されることを意図する。
【図１Ａ−Ｃ】
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【図１Ｄ−Ｅ】
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【図１Ｆ−１】
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【図１Ｆ−２】
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【図１Ｆ−３】
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【図１Ｆ−４】
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【図２Ａ−Ｃ】
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【図２Ｄ−Ｅ】
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【図２Ｆ−Ｇ】
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【図３Ａ−Ｄ】
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【図３Ｅ−Ｈ】
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【図４Ａ−Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ−Ｇ】
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【図４Ｈ−Ｉ】
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【図５Ａ−Ｅ】
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【図５Ｆ−Ｇ】
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【図５Ｈａ−ｂ】
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【図６Ａ−Ｃ】
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【図６Ｄ−Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ−Ｄ】
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【図７Ｅ−Ｆ】
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【図８Ａ−Ｃ】
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【図８Ｄ−Ｅ】
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【図９Ａ−Ｃ】
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【図９Ｄ−Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図１０Ａ−Ｂ】
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【図１０Ｃ−Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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