(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドを含む単離されたタンパク質を含む二量体であって、
前記ポリペプチドは、
（ａ）配列番号４、６、１２及び１４からなる群において示された配列からなるポリペプチド；
（ｂ）（ａ）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドであって、
配列番号２の２８番目の位置にＷ又はＹ、かつ、配列番号２の４４番目の位置にＴを有し、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能なポリペプチド；及び
（ｃ）（ａ）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドであって、
配列番号２の２８番目の位置にＷ又はＹ、かつ、配列番号２の４４番目の位置にＴを有し、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能なポリペプチド；
からなる群より選択され、かつ、
前記ポリペプチドが、少なくとも１つの異種タンパク質に結合している、前記二量体。
【請求項２】
異種タンパク質が、ＩｇＧＦｃドメインである、請求項１に記載の二量体。
【請求項３】
異種タンパク質が、リンカーによってポリペプチドに結合している、請求項１に記載の二量体。
【請求項４】
リンカーの配列が、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０からなる群より選択される、請求項３に記載の二量体。
【請求項５】
タンパク質が、
（ａ）配列番号８、１０、１６及び１８からなる群において示された配列からなるポリペプチド；
（ｂ）（ａ）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドであって、
配列番号２の２８番目の位置にＷ又はＹ、かつ、配列番号２の４４番目の位置にＴを有し、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能な前記ポリペプチド；及び
（ｃ）（ａ）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドであって、
配列番号２の２８番目の位置にＷ又はＹ、かつ、配列番号２の４４番目の位置にＴを有し、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能な前記ポリペプチド；
からなる群より選択されるポリペプチドを含む、請求項２に記載の二量体。
【請求項６】
ポリペプチドの配列が配列番号６である、請求項１に記載の二量体。
【請求項７】
単離されたタンパク質が、リンカーによって異種タンパク質に結合しているポリペプチドを含む、請求項６に記載の二量体。
【請求項８】
リンカーがペプチドリンカーを含み、異種タンパク質がヒト抗体Ｆｃドメインを含む、請求項７に記載の二量体。
【請求項９】
リンカーが配列番号２７のアミノ酸配列を含み、異種タンパク質が配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の二量体。
【請求項１０】
単離されたタンパク質が、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の二量体。
【請求項１１】
単離されたタンパク質が、配列番号１０のアミノ酸配列からなる、請求項７に記載の二量体。
【請求項１２】
有効量の請求項１に記載の二量体を、薬学的に許容可能な担体と混合して含む、医薬組成物。
【請求項１３】
対象においてミオスタチン活性又はアクチビン活性を阻害するための、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
対象においてアクチビンが過剰発現している疾患を治療するための、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
疾患が癌である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
疾患が卵巣癌である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への参照）
本出願は、２００８年１１月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／２００，２５０号及び２００９年１１月６日に出願された米国仮特許出願第６１／２５９，０６０号の優先権を主張し、その全開示は確認され、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の技術分野は、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ  β）ファミリーメンバー、及び改善された性質を有する可溶性ＴＧＦ−β受容体、並びに様々の疾患を治療するためにＴＧＦ−βファミリーメンバーの活性を調節する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）ファミリータンパク質には、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、アクチビン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、及び増殖分化因子（ＧＤＦ）が含まれる。これらファミリーのメンバーは、細胞増殖、分化、及びその他の機能などの幅広い範囲の生物学的過程の制御に関与する。
【０００４】
ミオスタチンとも言われる増殖分化因子８（ＧＤＦ−８）は、その大部分が、発生過程にある細胞及び成人の骨格筋組織で発現するＴＧＦ−βファミリーメンバーである。ミオスタチンは、骨格筋成長の負の制御において必須の役割を果たしていると考えられている（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３８７，８３−９０（１９９７），Ｚｉｍｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：１４８６−１４８８（２００２））。動物において、ミオスタチンを拮抗することが除脂肪体重を増加させることが示されている。
【０００５】
その他のＴＧＦ−βファミリータンパク質のメンバーには、関連した増殖分化因子である、増殖分化因子１１（ＧＤＦ−１１）がある。ＧＤＦ−１１はミオスタチンのアミノ酸配列と約９０％の配列同一性を有する。ＧＤＦ−１１は発育中の動物における軸パターン形成において機能し（Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １１：１８１２−２６（１９９７））、かつ、骨格筋の分化及び成長においても役割を果たすと考えられている。
【０００６】
アクチビンＡ、Ｂ及びＡＢはそれぞれ、２つのポリペプチド鎖であるβＡ及びβＢのホモ二量体及びヘテロ二量体である（Ｖａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１，７７６−７７９（１９８６），Ｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１，７７９−７８２（１９８６））。アクチビンは卵胞刺激ホルモン合成の制御に関わる性腺ペプチドとして最初発見され、現在では数多くの生物活性の制御に関わると考えられている。アクチビンＡは、アクチビンの主な形態である。
【０００７】
アクチビン、ミオスタチン、ＧＤＦ−１１及びその他のＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーは、その両方が膜貫通セリン／トレオニンキナーゼであるアクチビンＩＩ型及びアクチビンＩＩＢ型受容体と結合し、それらとの組み合わせを介して刺激を伝達する（Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，２８０３６−２８０４４（２００４））。架橋研究によって、ミオスタチンがアクチビンＩＩ型受容体であるＡｃｔＲＩＩＡ及びＡｃｔＲＩＩＢとインビトロで結合可能であることが確認された（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９８：９３０６−１１（２００１））。また、ＧＤＦ−１１がＡｃｔＲＩＩＡ及びＡｃｔＲＩＩＢの両方と結合するという証拠もある（Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １６：２７４９−５４（２００２））。
【０００８】
ＴＧＦ−βタンパク質の発現が、様々な疾患及び障害と関連することが知られている。さらに、複数のＴＧＦ−βタンパク質を同時に拮抗することができる治療用分子がこれら疾患及び障害に特に効果的な可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３８７，８３−９０（１９９７）
【非特許文献２】Ｚｉｍｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：１４８６−１４８８（２００２）
【非特許文献３】Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １１：１８１２−２６（１９９７）
【非特許文献４】Ｖａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１，７７６−７７９（１９８６）
【非特許文献５】Ｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１，７７９−７８２（１９８６）
【非特許文献６】Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，２８０３６−２８０４４（２００４）
【非特許文献７】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９８：９３０６−１１（２００１
【非特許文献８】Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １６：２７４９−５４（２００２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
商業規模での治療用タンパク質の生産には、十分に発現させることが可能で、かつ、タンパク質の完全性を破壊することなく精製することができるタンパク質が必要である。製造性は、費用効率の良いタンパク質の生産を可能にするために十分効果的な方法においてタンパク質を発現させ、精製する能力として記載することができる。商業的環境においての製造性は、可能な治療用タンパク質それぞれについて決定されるべきである。タンパク質の発現及び精製過程はそれぞれのタンパク質に対して最適化され得るが、製造性はタンパク質の固有の特性の関数でもあり得る。本発明は、ＴＧＦ−βタンパク質を効果的に拮抗する、改善された製造性特性を有する生物学的に活性な治療用タンパクを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、アクチビン、ＧＤＦ−１１及びミオスタチンと結合してその活性を阻害することができ、かつ、改善された製造性特性によって特徴付けられる安定化ヒトアクチビン受容体ＩＩＢ（ｓｖＡｃｔＲＩＩＢと表される）を含む、単離されたタンパク質を提供する。安定化ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２の２８番目及び４４番目の両方の位置にアミノ酸置換を有することによって特徴付けられる。
【００１２】
１つの実施形態においては、単離されたタンパク質は、２８番目の位置にＷ又はＹから選択される１アミノ酸置換があり、かつ、４４番目の位置がＴになる１アミノ酸置換がある、配列番号２に示された配列を有するポリペプチドを含む。別の実施形態においては、ポリペプチドは、２８番目の位置にＷ又はＹから選択される１アミノ酸置換があり、かつ、４４番目の位置がＴになる１アミノ酸置換がある、配列番号２のアミノ酸１９から１３４に示される配列を有する。別の実施形態においては、ポリペプチドは、２８番目の位置にＷ又はＹから選択される１アミノ酸置換があり、かつ、４４番目の位置がＴになる１アミノ酸置換がある、配列番号２のアミノ酸２３から１３４に示される配列を有する。別の実施形態においては、ポリペプチドは、２８番目の位置にＷ又はＹから選択される１アミノ酸置換があり、かつ、４４番目の位置がＴになる１アミノ酸置換がある、配列番号２のアミノ酸２５から１３４に示される配列を有する。別の実施形態においては、ポリペプチドは、上述のポリペプチドのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性をもつアミノ酸配列を有し、このポリペプチドは、２８番目の位置にＷ又はＹから選択される１アミノ酸置換を、かつ、４４番目の位置がＴになる１アミノ酸置換を有し、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能である。１つの実施形態においては、上述のポリペプチドの２８番目の置換はＷであり、かつ、４４番目の置換はＴであり、並びにこのポリペプチドはミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能である。
【００１３】
別の実施形態においては、単離されたタンパク質は配列番号４、６、１２及び１４からなる群において示された配列を有する、安定化アクチビンＩＩＢ受容体ポリペプチドを含む。別の実施形態においては、タンパク質は配列番号４、６、１２又は１４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、このポリペプチドは２８番目の位置にＷ又はＹを、かつ、４４番目の位置にＴを有し、並びにミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能である。別の実施形態においては、タンパク質は配列番号４、６、１２又は１４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、このポリペプチドは２８番目の位置にＷ又はＹを、かつ、４４番目の位置にＴを有し、並びにミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能である。別の実施形態においてタンパク質は、配列番号４、６、１２又は１４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、このポリペプチドは２８番目の位置にＷ又はＹを、かつ、４４番目の位置にＴを有し、並びにミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能である。１つの実施形態においては、２８番目の置換はＷであり、かつ、４４番目の置換はＴであり、このポリペプチドはミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能である。
【００１４】
さらなる実施形態においては、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は異種タンパク質をさらに含む。１つの実施形態においては、異種タンパク質はＦｃドメインである。さらなる実施形態においては、ＦｃドメインはヒトＩｇＧＦｃドメインである。さらなる実施形態においては、異種タンパク質はリンカー又はヒンジリンカーペプチドによって連結されている。１つの実施形態においては、リンカー又はヒンジリンカーは、配列番号２５、２７、３８、４０、４２、４４、４５、４６、４８、４９及び５０からなる群に示されるアミノ酸配列からなる群より選択される。さらなる実施形態においては、配列番号２７、３８、４０、４２、４４、４５、又は４６に示されるヒンジリンカーは、ヒトＩｇＧ２Ｆｃ（配列番号２２）をｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに連結する。別の実施形態においては、配列番号４８、４９、又は５０に示されるヒンジリンカーはヒトＩｇＧ１Ｆｃ（配列番号２３）又は改変されたＩｇＧ１Ｆｃ（配列番号４７）をｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに連結する。
【００１５】
さらなる実施形態においては、タンパク質は配列番号８、１０、１６及び１８からなる群に示される配列を有するポリペプチドを含む。別の実施形態においては、タンパク質は配列番号８、１０、１６又は１８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、このポリペプチドは２８番目の位置にＷ又はＹを、かつ、４４番目の位置にＴを有し、並びにミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能である。別の実施形態においては、タンパク質はタンパク質は配列番号８、１０、１６又は１８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、このポリペプチドは２８番目の位置にＷ又はＹを、かつ、４４番目の位置にＴを有し、並びにミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能である。別の実施形態においては、タンパク質はタンパク質は配列番号８、１０、１６又は１８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、このポリペプチドは２８番目の位置にＷ又はＹを、かつ、４４番目の位置にＴを有し、並びにミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能である。さらなる実施形態においては、上述のポリペプチドの２８番目の置換はＷであり、４４番目の置換はＴであり、このポリペプチドはミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能である。
【００１６】
さらなる実施形態においては、タンパク質は、６４番目の位置のアミノ酸残基がアラニンである、上記で引用されたポリペプチドを含む。
【００１７】
別の態様においては、本発明は、安定化ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する。１つの実施形態においては、ポリヌクレオチドは、配列番号２で示されたポリペプチド配列において２８番目の位置にＷ又はＹから選択される１アミノ酸置換があり、かつ、４４番目の位置がＴになる１アミノ酸置換があるポリペプチド配列をコードする。別の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸１９から１３４に示される配列において２８番目の位置にＷ又はＹから選択される１アミノ酸置換と、４４番目の位置がＴである１アミノ酸置換とを有するポリペプチドをコードする。別の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸２３から１３４に示される配列において２８番目の位置にＷ又はＹから選択される１アミノ酸置換と、４４番目の位置がＴである１アミノ酸置換とを有するポリペプチドをコードする。別の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸２５から１３４に示される配列において２８番目の位置にＷ又はＹから選択される１アミノ酸置換と、４４番目の位置がＴである１アミノ酸置換とを有するポリペプチドをコードする。別の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、２８番目の位置にＷ又はＹから選択される１アミノ酸置換と４４番目の位置がＴになる１アミノ酸置換とを有し、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１と結合することが可能であり、上記ポリペプチドのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。１つの実施形態においては、上記ポリヌクレオチドは、２８番目の位置がＷである置換と４４番目の位置がＴである置換とを有し、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１と結合することが可能であるポリペプチドをコードする。
【００１８】
１つの実施形態においては、核酸分子は、配列番号４、６、１２及び１４からなる群に示される配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、核酸分子は、２８番目の位置にＷ又はＹを、かつ、４４番目の位置にＴを有し、並びにミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能であり、配列番号４、６、１２又は１４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、核酸分子は、２８番目の位置がＷ又はＹであり、かつ、４４番目の位置がＴであり、並びにミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能であり、配列番号４、６、１２又は１４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、核酸分子は、２８番目の位置がＷ又はＹであり、かつ、４４番目の位置がＴであり、並びにミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能であり、配列番号４、６、１２又は１４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態においては、上記ポリヌクレオチドは、２８番目の位置がＷである置換と４４番目の位置がＴである置換とを有し、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１と結合することが可能であるポリペプチドをコードする。
【００１９】
別の実施形態においては、核酸分子は、配列番号３、５、１１及び１３、又はその相補鎖からなる群より選択される配列を有するポリヌクレオチドを含む。
【００２０】
別の実施形態においては、単離された核酸分子は上記で示されたポリヌクレオチドを含み、さらに少なくとも１つの異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態においては、核酸分子は配列番号８、１０、１６及び１８からなる群に示される配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、核酸分子は、２８番目の位置にＷ又はＹ、４４番目の位置にＴを有し、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能であり、配列番号８、１０、１６又は１８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、核酸分子は、２８番目の位置にＷ又はＹ、４４番目の位置にＴを有し、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能であり、配列番号８、１０、１６又は１８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、核酸分子は、２８番目の位置にＷ又はＹ、４４番目の位置にＴを有し、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能であり、配列番号８、１０、１６又は１８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態においては、上記ポリヌクレオチドは２８番目がＷである置換とＳ４４がＴになる置換とを有し、ミオスタチン、アクチビンＡ又はＧＤＦ−１１と結合することが可能であるポリペプチドをコードする。さらなる実施形態において核酸分子は、配列番号７、９、１５及び１７、又はその相補鎖からなる群から選択される配列を有するポリヌクレオチドを含む。
【００２１】
別の実施形態においては、核酸分子は配列番号２５、２７、３８、４０、４２、４４、４５、４６、４８、４９及び５０からなる群に示されるリンカー及びヒンジリンカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
【００２２】
さらなる実施形態において核酸分子は、転写又は翻訳調節配列をさらに含む。別の態様においては、安定化ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、組み換えベクター又はポリペプチドが提供される。別の態様においては、組み換えベクターを含む宿主細胞が提供され、及び、タンパク質又はポリペプチドの発現を促進する条件下で宿主細胞を培養することによる、安定化ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質及びポリペプチの生産方法も提供される。
【００２３】
本発明は、少なくとも１つの本発明の安定化ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド又はタンパク質を含む組成物をさらに提供する。１つの実施形態においてその組成物は、安定化ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド又はタンパク質と、薬学的に許容可能な担体との混合物を含有する医薬組成物である。
【００２４】
別の態様においては、本発明は、治療を必要とする対象に、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢタンパク質及びポリペプチド、並びにこれらを含有する医薬組成物を投与することによって、ミオスタチン、アクチビンＡ又はＧＤＦ−１１活性を低減する、又は阻害する方法を提供する。
【００２５】
別の態様においては、本発明は、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢタンパク質又はポリペプチドを含有する効果量の組成物又は医薬組成物を対象に投与することにより、かかる治療を必要とする対象において除脂肪体重を増加させる、又は除脂肪体重の脂肪量に対する率を増加させる方法を提供する。
【００２６】
別の態様においては、本発明は、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド又はタンパク質を含有する医薬組成物を対象に投与することにより、筋消耗などの障害にかかった対象において筋消耗を治療する、又は予防する方法を提供する。筋消耗は、癌性悪液質、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、鬱血性閉塞肺疾患、慢性心不全、化学性悪液質、ＨＩＶ／ＡＩＤＳによる悪液質、腎不全、尿毒素、関節リウマチ、加齢によるサルコペニア、加齢に伴う衰弱、器官萎縮、手根管症候群、アンドロゲン欠亡、及び長期臥床、脊髄損傷、発作、骨折、火傷、加齢による筋消耗、インスリン抵抗性、並びにその他の障害を含むが、これらには限定されない。筋消耗は宇宙飛行による無重力から生じる場合もある。
【００２７】
別の態様においては、本発明は、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢタンパク質又はポリペプチドを含有する効果量の医薬組成物を対象に投与することにより、治療を必要とする対象において、アクチビンが過剰発現した状態を治療する方法を提供する。１つの実施形態においては、その疾患は癌である。別の態様においては、本発明は、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢタンパク質又はポリペプチドを含有する医薬組成物をそれらの治療が必要な対象に投与する工程を含む、代謝性障害を治療する方法を提供し、ここで代謝性障害は、骨量減少、糖尿病、肥満、グルコース不耐性、高血糖、及びメタボリック症候群から選択される。別の態様においては、本発明は、対象においてｓｖＡｃｔＲＩＩＢタンパク質又はポリペプチドを発現することができる、本発明のｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド又はタンパク質をコードするベクターをそれらを必要とする対象に投与する工程を含む、筋消耗若しくは代謝性又はアクチビンに関係した疾患の遺伝子治療の方法を提供する。
【００２８】
別の態様において本発明は、任意の数のアッセイにおいてｓｖＡｃｔＲＩＩＢタンパク質又はポリペプチドのいずれかを補足剤又は結合剤として使用することにより、ミオスタチン、アクチビン、又はＧＤＦ−１１を検出する、及び定量する方法を提供する。
[本発明1001]
安定化アクチビンＩＩＢ受容体ポリペプチドを含む、単離されたタンパク質であって、前記ポリペプチドは
（ａ）配列番号4、6、12及び14からなる群において示された配列からなるポリペプチド；
（ｂ）（ａ）に対して少なくとも90％の配列同一性を有するポリペプチドであって、28番目の位置にＷ又はＹ、かつ、44番目の位置にＴを有し、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−11に結合することが可能なポリペプチド；及び
（ｃ）（ａ）に対して少なくとも95％の配列同一性を有するポリペプチドであって、28番目の位置にＷ又はＹ、かつ、44番目の位置にＴを有し、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−11に結合することが可能なポリペプチド；
からなる群より選択される、単離されたタンパク質。
[本発明1002]
ポリペプチドが少なくとも1つの異種タンパク質に結合している、本発明1001のタンパク質。
[本発明1003]
異種ポリペプチドがＩｇＧＦｃドメインである、本発明1002のタンパク質。
[本発明1004]
異種ポリペプチドがリンカー配列によってポリペプチドに結合している、本発明1002のタンパク質。
[本発明1005]
リンカーが、配列番号25、配列番号27、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号48、配列番号49及び配列番号50からなる群より選択される、本発明1004のタンパク質。
[本発明1006]
（ａ）配列番号8、10、16及び18からなる群において示された配列からなるポリペプチド；
（ｂ）（ａ）に対して少なくとも90％の配列同一性を有するポリペプチドであって、28番目の位置にＷ又はＹ、かつ、44番目の位置にＴを有し、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−11に結合することが可能な前記ポリペプチド；及び
（ｃ）（ａ）に対して少なくとも95％の配列同一性を有するポリペプチドであって、28番目の位置にＷ又はＹ、かつ、44番目の位置にＴを有し、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−11に結合することが可能な前記ポリペプチド；
からなる群より選択されるポリペプチドを含む、本発明1003のタンパク質。
[本発明1007]
64番目の位置のアミノ酸残基がアラニンである、本発明1001のタンパク質。
[本発明1008]
安定化アクチビンＩＩＢ受容体ポリペプチド（ｓｖＡｃｔＲＩＩＢ）を含む、単離されたタンパク質であって、前記ポリペプチドは
（ａ）28番目の位置にＷ及びＹからなる群から選択される1アミノ酸置換があり、かつ、44番目の位置がＴになる1アミノ酸置換がある、配列番号2で示された配列からなるポリペプチド；
（ｂ）28番目の位置にＷ及びＹからなる群から選択される1アミノ酸置換があり、かつ、44番目の位置がＴになる1アミノ酸置換がある、配列番号2のアミノ酸19から134に示される配列からなるポリペプチド；
（ｃ）28番目の位置にＷ及びＹからなる群から選択される1アミノ酸置換があり、かつ、44番目の位置がＴになる1アミノ酸置換がある、配列番号2のアミノ酸23から134に示される配列からなるポリペプチド；
（ｄ）28番目の位置にＷ及びＹからなる群から選択される1アミノ酸置換があり、かつ、44番目の位置がＴになる1アミノ酸置換がある、配列番号2のアミノ酸25から134に示される配列からなるポリペプチド；及び
（ｅ）（ａ）から（ｄ）のいずれか1つと少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドであって、28番目の位置にＷ及びＹからなる群から選択される1アミノ酸置換、及び、44番目の位置がＴになる1アミノ酸置換があり、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−11と結合することが可能な前記ポリペプチド；
からなる群より選択される、単離されたタンパク質。
[本発明1009]
本発明1008のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
[本発明1010]
（ａ）配列番号4、6、12及び14からなる群において示された配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）28番目の位置にＷ又はＹ、かつ、44番目の位置にＴを有し、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−11に結合することが可能であり、（ａ）に対して少なくとも90％の配列同一性を有する前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）28番目の位置にＷ又はＹ、かつ、44番目の位置にＴを有し、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−11に結合することが可能であり、（ａ）に対して少なくとも95％の配列同一性を有する前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
[本発明1011]
ポリヌクレオチドが配列番号3、5、11及び13又はその相補鎖からなる群より選択された配列を有する、本発明1010の核酸分子。
[本発明1012]
ポリヌクレオチドが少なくとも1つの異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、本発明1010の核酸分子。
[本発明1013]
（ａ）配列番号8、10、16及び18からなる群において示された配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）28番目の位置にＷ又はＹ、かつ、44番目の位置にＴを有し、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−11に結合することが可能であり、（ａ）に対して少なくとも90％の配列同一性を有する前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び
（ｃ）28番目の位置にＷ又はＹ、かつ、44番目の位置にＴを有し、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−11に結合することが可能であり、（ａ）に対して少なくとも95％の配列同一性を有する前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む、本発明1012の核酸分子。
[本発明1014]
ポリヌクレオチドが配列番号7、9、15及び17又はその相補鎖からなる群より選択された配列を有する、本発明1013の核酸分子。
[本発明1015]
ポリヌクレオチドが転写又は翻訳調節配列に機能的に連結された、本発明1010の核酸分子。
[本発明1016]
本発明1010の核酸分子を含む組み換えベクター。
[本発明1017]
本発明1016の組み換えベクターを含む宿主細胞。
[本発明1018]
宿主細胞が哺乳動物の細胞である、本発明1017の宿主細胞。
[本発明1019]
ｓｖＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の発現を促進する条件下で本発明1017の宿主細胞を培養する工程、及びタンパク質を回収する工程を含む、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の生産方法。
[本発明1020]
効果量の本発明1001のタンパク質と薬学的に許容可能な担体との混合物を含む医薬組成物。
[本発明1021]
治療上効果量の本発明1020の組成物を対象に投与する工程を含む、治療を必要とする対象においてミオスタチン活性又はアクチビン活性を阻害する方法。
[本発明1022]
治療上効果量の本発明1020の組成物を対象に投与する工程を含む、治療を必要とする対象において除脂肪体重を増加させる、又は除脂肪体重の脂肪量に対する率を増加させる方法。
[本発明1023]
治療上効果量の本発明1020の組成物を対象に投与する工程を含む、治療を必要とする対象において筋消耗疾患又は代謝性障害を治療する方法。
[本発明1024]
筋消耗疾患が、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、鬱血性閉塞肺疾患、慢性心不全、癌性悪液質、エイズ、腎不全、尿毒症、関節リウマチ、加齢によるサルコペニア、器官萎縮、手根管症候群、アンドロゲン欠亡、火傷、糖尿病、長期臥床、脊髄損傷、発作、骨折、加齢、又は微少重力への暴露による筋消耗から選択される、本発明1023の方法。
[本発明1025]
代謝性障害が糖尿病、肥満、高血糖及び骨量の減少から選択される、本発明1023の方法。
[本発明1026]
治療上効果量の本発明1020の組成物を対象に投与する工程を含む、治療を必要とする対象において、アクチビンが過剰発現している疾患を治療する方法。
[本発明1027]
疾患が癌である、本発明1026の方法。
[本発明1028]
本発明1016のベクターを投与する工程を含み、前記ベクターが対象においてｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現を誘導させることが可能である、治療を必要とする対象において、筋消耗若しくは代謝性又はアクチビンに関係した障害を治療する方法。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ＳＥＣカラムでのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ）とｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）との間の比較を示す。ｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）は単一のピークを示すのに対して、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ）は３つのピークを示す。
【図２】１４日間の期間にわたって１０ｍｇ／ｋｇのｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）の単回投与を受けた１０のＣ５７Ｂｌ／６マウスにおける体重の増加を１０ｍｇ／ｋｇのＰＢＳの投与を受けた１０のマウスと比較した。
【図３】０．３ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、及び３０ｍｇ／ｋｇのｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）の単回投与を受けたＣ５７Ｂｌ／６における、時間経過に伴う除脂肪体重の用量関連変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
（詳細な記述）
本発明は、安定化ヒトアクチビンＩＩＢ受容体（ｓｖＡｃｔＲＩＩＢ）ポリペプチドを含む、単離されたタンパク質を提供する。本発明のタンパク質及びポリペプチドは、３つのＴＧＦ−βタンパク質、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１の少なくとも１つと結合し、これらタンパク質の少なくとも１つの活性を阻害する能力、及びその他のＡｃｔＲＩＩＢ可溶性受容体と比較して、改善された製造性特性を有することによって特徴づけられる。安定化ヒトアクチビンＩＩＢ受容体ポリペプチドは、配列番号２において示されるＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインに対する、Ｅ２８及びＳ４４の両方の位置のアミノ酸置換によって特徴づけられる。１つの実施形態においては、安定化ヒトアクチビンＩＩＢ受容体ポリペプチドは、配列番号２の６４番目の位置にアラニンの置換をさらに有していてもよい。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、「ＴＧＦ−βファミリーメンバー」又は「ＴＧＦ−βタンパク質」という用語は、アクチビンを含む、トランスフォーミング成長因子ファミリーに構造的に関係した成長因子、及び増殖分化因子（ＧＤＦ）タンパク質を意味する（Ｋｉｎｇｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．８：１３３−１４６（１９９４），ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌ．１Ｂ，Ｄ．ＬｅＲｏｉｔｈ  ａｎｄ  Ｃ．Ｂｏｎｄｙ．ｅｄ．，ＪＡＩ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，Ｃｏｎｎ，ＵＳＡ：ｐｐ  ３５７−３９３）。
【００３２】
ミオスタチンとも言われるＧＤＦ−８は、骨格筋組織の負の制御因子である（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９４：１２４５７−１２４６１  （１９９７））。ミオスタチンは、約３７５アミノ酸の長さで、ヒトのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＢ８６６９４（配列番号３５）を有する不活性タンパク質として合成される。Ｎ−末端不活性型プロドメイン及び約１０９アミノ酸のＣ−末端タンパク質を生産する四塩基性のプロセシング部位でのタンパク分解によって、前駆体タンパク質は切断されて活性化され、このＣ−末端タンパク質は約２５ｋＤａのホモ二量体を形成するように二量体化する。このホモ二量体は成熟しており、生物学的に活性なタンパク質である（Ｚｉｍｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６，１４８６（２００２））。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、「プロドメイン」又は「プロペプチド」という用語は、活性型Ｃ−末端タンパク質を分離するために切断された、不活性Ｎ−末端タンパク質を意味する。本明細書で使用されるとき、「ミオスタチン」又は「成熟ミオスタチン」という用語は、単量体、二量体又はその他の形態の、成熟した、生物学的に活性なＣ−末端ポリペプチド、並びに対立変異体、スプライシングによる変異体、及び融合ペプチド及びポリペプチドを含む、生物学的に活性な断片又は関係したポリペプチドを意味する。成熟ミオスタチンは、ヒト、マウス、ニワトリ、ブタ、シチメンチョウ、及びラットを含む多くの種間で１００％の配列相同性を有することが報告されている（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９８，９３０６（２００１））。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、ＧＤＦ−１１は、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔアクセッション番号Ｏ９５３９０（配列番号３６）を有するＢＭＰ（骨形態形成タンパク質）、及びそのタンパク質の変異体、並びに種のホモログを意味する。ＧＤＦ−１１は軸骨格の前／後パターニングの制御に関係するが（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２２（９３）：２６０−２６４（１９９９）；Ｇａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０８（１），２２２−２３２（１９９９））、出生後の機能については分かっていない。
【００３５】
アクチビンＡはポリペプチド鎖βＡのホモ二量体である。本明細書で使用されるとき、「アクチビンＡ」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００２１９２（配列番号３４）を有するアクチビンタンパク質を意味する。アクチビンＡ、Ｂ、及びＡＢはそれぞれ、２つのポリペプチド鎖βＡとβＢのホモ二量体又はヘテロ二量体である。本明細書で使用されるとき、「アクチビン」は、アクチビンＡ、Ｂ、及びＡＢ並びにそのタンパク質の変異体及び種のホモログを意味する。
【００３６】
受容体ポリペプチド
本明細書で使用されるとき、アクチビンＩＩ型Ｂ受容体（ＡｃｔＲＩＩＢ）という用語は、アクセッション番号ＮＰ＿００１０９７を有するヒトアクチビン受容体又はその変異体を意味し、それらは例えば６４番目の位置のアルギニンがアラニンに置換されている。可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ（野生型）という用語は、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン、配列番号２の１から１３４のアミノ酸（シグナル配列を含む）、又は１９から１３４のアミノ酸（シグナル配列を含まない）を意味する。
【００３７】
安定化受容体ポリペプチド
本発明は、安定化ＡｃｔＩＩＢ受容体ポリペプチド（本明細書では「ｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド」と示される）を含む、単離されたタンパク質を提供する。本明細書で使用されるとき、「ｓｖＡｃｔＲＩＩＢタンパク質」という用語は、安定化ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むタンパク質を意味する。本明細書で使用されるとき、「単離された」という用語は、内因性材料からある程度精製されたタンパク質又はポリペプチド分子を意味する。これらのポリペプチド及びタンパク質は、アクチビンＡ、ミオスタチン、又はＧＤＦ−１１のいずれか１つに結合し、かつ、活性を阻害する能力によって、加えて改善された製造性製造性特性によって特徴づけられる。
【００３８】
安定化ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２の２８番目と４４番目の位置の両方にアミノ酸置換を有することによって特徴づけられる。一貫性を保つために、安定化ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド及びタンパク質のアミノ酸の位置は常に、ポリペプチドが成熟したり又は切断型であっても、配列番号２における位置として示される。本明細書で使用されるとき、「成熟」という用語は、そのシグナル配列を含まないポリペプチド又はペプチドを意味する。本明細書で使用されるとき、「切断型」という用語は、Ｎ末端アミノ酸又はＣ末端アミノ酸が除去されたポリペプチドを意味する。
【００３９】
１つの実施形態においては、単離された安定化アクチビンＩＩＢ受容体ポリペプチド（ｓｖＡｃｔＲＩＩＢ）は、２８番目の位置にＷ又はＹから選択される１アミノ酸置換があり、かつ、４４番目の位置がＴになる１アミノ酸置換がある、配列番号２で示された配列からなるポリペプチドを有する。別の実施形態においては、ポリペプチドは、２８番目の位置にＷ又はＹから選択される１アミノ酸置換があり、かつ、４４番目の位置がＴになる１アミノ酸置換がある配列番号２のアミノ酸１９から１３４に示される配列を有する。別の実施形態においては、ポリペプチドは、２８番目の位置にＷ又はＹから選択される１アミノ酸置換があり、かつ、４４番目の位置がＴになる１アミノ酸置換がある、配列番号２のアミノ酸２３から１３４に示される配列を有する。別の実施形態においては、ポリペプチドは、２８番目の位置にＷ又はＹから選択される１アミノ酸置換があり、かつ、４４番目の位置がＴになる１アミノ酸置換がある、配列番号２のアミノ酸２５から１３４に示される配列を有する。別の実施形態においては、ポリペプチドは、上記ポリペプチドのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一性を有し、２８番目の位置にＷ又はＹから選択される１アミノ酸置換を、かつ、４４番目の位置がＴになる１アミノ酸置換を有し、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１と結合することが可能である。１つの実施形態においては、上記ポリペプチドの２８番目の置換はＷであり、４４番目の置換がＴであり、このポリペプチドはミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能である。
【００４０】
１つの実施形態においては、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは例えば配列番号４、８、１２、及び１６のシグナル配列を含む。しかしながら、本出願のポリペプチドの調製には様々はシグナルペプチドが使用できる。シグナルペプチドは、例えば配列番号４の１から１９のアミノ酸に示される配列、又は配列番号３１及び３２に示されるシグナル配列を有する場合がある。ｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現のために有効なその他の任意のシグナルペプチドを使用してもよい。他の実施形態においては、成熟ペプチドを残してシグナル配列は除去される。シグナル配列を欠いたｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの例としては、例えば、配列番号６、１０、１４及び１８が挙げられる。
【００４１】
１つの実施形態においては、タンパク質は配列番号４、６、１２及び１４からなる群において示された配列を有するポリペプチドからなる群より選択されたポリペプチドである、安定化アクチビンＩＩＢ受容体ポリペプチドを含む。これらポリペプチドは配列番号２の２５から１３４のアミノ酸を表し、このポリペプチドは２８番目の位置にＷ又はＹから選択される１アミノ酸置換を、かつ、４４番目の位置がＴになる１アミノ酸置換を有し、並びに配列番号２に示される配列とは異なるシグナル配列を含み、及び含まずに、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１と結合することが可能である。別の実施形態においては、タンパク質は配列番号４、６、１２又は１４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、このポリペプチドは２８番目の位置にＷ又はＹを、かつ、４４番目の位置にＴを有し、並びにミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能である。１つの実施形態においては、２８番目の位置の置換はＷ、かつ、４４番目の置換はＴであり、このポリペプチドはミオスタチン、アクチビンＡ又はＧＤＦ−１１に結合することが可能である。
【００４２】
さらなる実施形態においては、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は異種タンパク質をさらに含む。１つの実施形態においては、異種タンパク質はＦｃドメインである。さらなる実施形態においては、ＦｃドメインはヒトＩｇＧＦｃドメインである。１つの実施形態においては、タンパク質は配列番号８、１０、１６及び１８からなる群において示された配列を有するポリペプチドを含む。別の実施形態においては、タンパク質は配列番号８、１０、１６又は１８、に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、このポリペプチドは２８番目の位置にＷ又はＹを、かつ、４４番目の位置にＴを有し、並びにミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能である。１つの実施形態においては、２８番目の位置の置換はＷ、かつ、４４番目の置換はＴであり、このポリペプチドはミオスタチン、アクチビンＡ又はＧＤＦ−１１に結合することが可能である。
【００４３】
さらなる実施形態においては、タンパク質は６４番目のアミノ酸残基がアラニンである、上述されたポリペプチドのいずれか１つを含む。
【００４４】
別の実施形態においては、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド及びタンパク質という用語は、Ｎ及びＣ末端切断型を含めた、配列番号２、４、６、１２及び１４の断片を含むタンパク質を包含し、ここでこのポリペプチドは２８番目の位置にＷ又はＹ、かつ、４４番目の位置にＴを有し、並びにミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能である。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの「誘導体」という用語は、少なくとも１つの付加的な化学部分又は、グリコシル基、脂質、アセチル基、又はＣ−末端若しくはＮ−末端融合ポリペプチド、ＰＥＧ分子への結合、及び下記により完全に記載されるその他の改変などの、共有又は凝集結合を形成する少なくとも１つの付加的なポリペプチドを意味する。安定化ＡｃｔＲＩＩＢ受容体ポリペプチドはまた、哺乳類細胞、大腸菌、酵母及びその他の組み換え宿主細胞などの様々な細胞型における発現による、プロセシングによって生じるＣ及びＮ末端への修飾を含む、付加的な改変及び誘導体をも含む。
【００４６】
本発明のｓｖＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、融合タンパク質を形成するために、直接あるいはリンカー配列を介してｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに連結した異種ポリペプチドをさらに含む。本明細書で使用されるとき、「融合タンパク質」という用語は、組み換えＤＮＡ技術を介して連結した異種ポリペプチドを有するタンパク質を意味する。異種ポリペプチドは、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ００／２９５８１において記載されたような、安定化ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのオリゴマー形成とさらなる安定化を促進するＦｃポリペプチド、ｈｉｓタグ、及びロイシンジッパードメインなどを含むが、これらには限定されない。１つの実施形態においては、異種ポリペプチドはＦｃポリペプチド又はドメインである。１つの実施形態においては、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１Ｆｃ（配列番号２３）、改変されたＩｇＧ１Ｆｃ（配列番号４７）、ＩｇＧ２Ｆｃ（配列番号２２）、及びＩｇＧ４Ｆｃ（配列番号２４）ドメインから選択される。ｓｖＡｃｔＲＩＩＢタンパク質はＩｇＧ１（配列番号２９）、ＩｇＧ２（配列番号２８）、又はＩｇＧ４（配列番号３０）のヒンジ配列の全体又は部分をさらに含んでいてもよい。ｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの例は、配列番号８、１０、１６及び１８に示される配列からなるポリペプチド、並びに２８番目と４４番目の置換が保持されている、これらの配列と実質的な相同性を有するポリペプチドから選択される。本明細書で使用されるとき、「実質的な相同性」は、２８番目のＷ又はＹ及び４４番目のＴが保持されており、配列番号８、１０、１６、及び１８、のいずれかに対して少なくとも８０％同一、８５％同一、９０％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、９９％同一なポリペプチドであって、ミオスタチン、アクチビンＡ又はＧＤＦ−１１に結合することが可能なポリペプチドを意味する。１つの実施形態においては、２８番目の置換がＷ、及び４４番目の置換がＴであり、このポリペプチドはミオスタチン、アクチビンＡ又はＧＤＦ−１１に結合することが可能である。
【００４７】
ｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは任意に、「リンカー」配列をさらに含んでいてもよい。リンカーは主に、ポリペプチドと２番目の異種ポリペプチド若しくはその他の型の融合との間の、又は２つ以上の安定化ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド間のスペーサーとして機能する。１つの実施形態においては、リンカーはペプチド結合によって結合しているアミノ酸、好ましくはペプチド結合によって結合している、天然に生じる２０のアミノ酸から選択される１から２０のアミノ酸から作られる。１以上のこれらアミノ酸は、当業者によって理解されるようにグリコシル化されていてもよい。１つの実施形態においては、１から２０のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及びリジンから選択され得る。１つの実施形態においては、リンカーはグリシンやアラニンなどの立体障害のないアミノ酸から主に作られる。リンカーの例としては、ポリグリシン（特に（Ｇｌｙ）５、（Ｇｌｙ）８）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、及びポリアラニンが挙げられる。下記の実施例において示される１つの好適なリンカーの例は、（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ（配列番号２５）である。さらなる実施形態においてｓｖＡｃｔＲＩＩＢは、配列番号２７に例示されたような、ヒンジ領域に隣接して提供されるリンカー配列、又はＩｇＧの部分的なヒンジ領域である、「ヒンジリンカー」を含んでいてもよい。ヒンジ配列は、ＩｇＧ２Ｆｃ（配列番号２８）、ＩｇＧ１Ｆｃ（配列番号２９）、及びＩｇＧ４Ｆｃ（配列番号３０）を含む。
【００４８】
ヒンジリンカー配列はまた、製造性及びｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質の安定性を改善するために設計される場合がある。１つの実施形態においては、配列番号２７、３８、４０、４２、４４、４５、及び４６のヒンジリンカーは、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに結合した場合に製造性を改善するように、ＩｇＧ２Ｆｃ（配列番号２２）を用いて設計された。１つの実施形態において、例えば配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０を有するヒンジリンカー配列は、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドがヒトＩｇＧ１Ｆｃ（配列番号２３）又は改変されたヒトＩｇＧ１Ｆｃ（配列番号４７）に結合する場合に製造性を改善するように設計された。これらポリペプチドの改善された製造性は下記実施例４において記載される。
【００４９】
リンカーはまた、非ペプチドリンカーであってもよい。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−、式中ｓ＝２−２０、などのアルキルリンカーも用いられ得る。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル（例えばＣ１−Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えばＣｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなどの非−立体障害のない基によってさらに置換され得る。
【００５０】
本明細書で開示されるｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、分解を減少させる、及び／又は半減期を上昇させる、毒性を低減させる、免疫原性を低下させる、及び／又はｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの生物学的活性を上昇させる、などの所望の特性を付与する目的で、非ポリペプチド分子に結合される場合もある。分子の例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリリジン、デキストランなどの線状ポリマー；脂質；コレステロール基（ステロイドなど）；炭水化物、又はオリゴ糖分子などが挙げられるが、これらには限定されない。
【００５１】
ｓｖＡｃｔＲＩＩＢタンパク質及びポリペプチドは、その他のＡｃｔＲＩＩＢ可溶性ポリペプチドと比較して、改善された製造性特性を有する。本明細書で使用されるとき、「製造性」という用語は、特定のタンパク質の、そのタンパク質の組み換え発現及び精製過程における安定性を意味する。製造性は、発現及び精製の条件下における分子固有の特性に起因すると考えられている。改善された製造性の特徴の例は下記実施例において示され、タンパク質の均一なグリコシル化（実施例２）、細胞力価の上昇、タンパク質の組み換え生産過程における成長及びタンパク質発現（実施例１）、改善された精製特性（実施例２）、及び低いｐＨでの改善された安定性（実施例２）が含まれる。本発明のｓｖＡｃｔＲＩＩＢタンパク質及びポリペプチドは、その他の可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと比較して、インビトロ及びインビボでの活性の保持を伴った、改善された製造性を示す（実施例２及び３）。さらに下記実施例４に示したように、付加的なヒンジリンカー配列はさらなる製造性の有効性を付与する。
【００５２】
本明細書で使用されるとき、「ｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド活性」又は「可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの生物学的活性」という用語は、インビトロ又はインビボにおけるｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの１以上の活性を意味し、この活性には下記実施例において示した活性が含まれるが、これらには限定されない。ｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの活性には、ミオスタチン又はアクチビンＡ又はＧＤＦ−１１に結合する能力、及びミオスタチン又はアクチビンＡ又はＧＤＦ−１１の活性を阻害又は中和する能力が含まれるが、これらには限定されない。本明細書で使用されるとき、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に「結合することが可能である」という用語は、下記実施例において示される、Ｋｉｎ  ＥｘＡ（商標）法などの当該技術分野において周知の方法によって測定される結合を意味する。ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１のインビトロでの阻害は、例えば、下記実施例で記載された細胞を用いたｐＭＡＲＥ  Ｃ２Ｃ１２アッセイによって測定することができる。下記実施例３において示されたインビボ活性は、マウスモデルにおける除脂肪体重の増加によって示された。ｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド及びタンパク質のインビボ活性は、体重の増加、除脂肪体重の増加、及び除脂肪体重の脂肪量に対する率の増加を含むが、これらには限定されない。治療上の活性はさらに、特定の型の腫瘍によって起こる悪液質の低減又は予防、特定の型の腫瘍の成長の予防、及び特定の動物モデルの生存率の上昇を含む。ｓｖＡｃｔＲＩＩＢタンパク質及びポリペプチド活性についてのさらなる議論は下記に提供される。
【００５３】
別の態様においては、本発明は、本発明のｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する。本明細書で使用されるとき、「単離された」という用語は、内因性の材料からある程度精製された核酸分子を意味する。
【００５４】
１つの実施形態においては、ポリヌクレオチドは配列番号２で示される配列において、２８番目の位置にＷ又はＹから選択される１アミノ酸置換があり、かつ、４４番目の位置がＴになる１アミノ酸置換がある配列を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態においては、ポリヌクレオチドは配列番号２の１９から１３４に示されるアミノ酸において、２８番目の位置にＷ又はＹから選択される１アミノ酸置換があり、かつ、４４番目の位置がＴになる１アミノ酸置換がある配列を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態においては、ポリヌクレオチドは配列番号２の２３から１３４に示されるアミノ酸において、２８番目の位置にＷ又はＹから選択される１アミノ酸置換があり、かつ、４４番目の位置がＴになる１アミノ酸置換がある配列を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態においては、ポリヌクレオチドは配列番号２の２５から１３４に示されるアミノ酸において、２８番目の位置にＷ又はＹから選択される１アミノ酸置換があり、かつ、４４番目の位置がＴになる１アミノ酸置換がある配列を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、２８番目の位置にＷ又はＹから選択される１アミノ酸置換を、かつ、４４番目の位置がＴになる１アミノ酸置換を有し、並びにミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能なポリペプチドであって、上記ポリペプチドのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。１つの実施形態においては、上記実施形態のポリヌクレオチドは２８番目の置換がＷであり、かつ、４４番目の置換がＴであるポリペプチドをコードする。
【００５５】
１つの実施形態においては、本発明の単離された核酸分子は、配列番号４、６、１２及び１４からなる群において示された配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、核酸は、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能であり、２８番目の位置にＷ又はＹ、かつ、４４番目の位置にＴを有し、配列番号４、６、１２又は１４に対して少なくとも、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態においては、上記実施形態のポリヌクレオチドは、２８番目の置換がＷ、かつ、４４番目の置換がＴであり、並びにミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能なポリペプチドをコードする。
【００５６】
別の実施形態においては、単離された核酸分子は少なくとも１つの異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。１つの実施形態においては、異種タンパク質はＦｃドメインであり、さらなる実施形態においては、ＦｃドメインはヒトＩｇＧＦｃドメインである。別の実施形態においては、核酸分子は、配列番号２５、２７、３８、４０、４２、４４、４５、４６、４８、４９又は５０に示されるリンカー及びヒンジリンカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。さらなる実施形態においては、それらポリヌクレオチドは配列番号２６、３７、３９、４１、及び４３からなる群から選択される配列を有する。
【００５７】
１つの実施形態においては、核酸分子は、配列番号８、１０、１６及び１８からなる群において示された配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、核酸はミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能であり、２８番目の位置にＷ又はＹ、かつ、４４番目の位置にＴを有し、配列番号８、１０、１６及び１８からなる群に対して少なくとも、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態においては、上記実施形態のポリヌクレオチドは、２８番目の置換がＷ、かつ、４４番目の置換がＴであり、並びにミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能なポリペプチドをコードする。
【００５８】
１つの実施形態においては、単離された核酸分子は配列番号３、５、１１及び１３又はその相補鎖からなる群より選択された配列を有するポリヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、単離された核酸分子は配列番号７、９、１５及び１７又はその相補鎖からなる群より選択された配列を有するポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態においては、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合することが可能であり、２８番目の位置にＷ又はＹ、かつ、４４番目の位置にＴを有し、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、又は１８と実質的に相同なポリペプチドをコードする、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７と単離された核酸分子とは、ストリンジェント又はモデレートな条件でハイブリダイズする。
【００５９】
本発明の核酸分子は一本鎖及び二本鎖両方のＤＮＡ、並びにそのＲＮＡ相補鎖を含む。ＤＮＡは、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、およびその組み合わせなどを含む。ゲノムＤＮＡは、配列番号３、５、１１若しくは１３のＤＮＡ、又は好適なその断片をプローブとして使用することにより、標準的な技術で単離され得る。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡは、数多くの種に使用可能なゲノムライブラリーから得られる。合成ＤＮＡは、重複したオリゴヌクレオチド断片を化学的に合成し、次いでコード領域及びフランキング配列の部分又は全てを再構築するために、断片を並べることによって入手可能である。ＲＮＡは、Ｔ７プロモーター及びＲＮＡポリメラーゼを用いたベクターなどの高レベルのｍＲＮＡ合成を誘導する原核生物発現ベクターから得ることができる。ｃＤＮＡは、ＡｃｔＲＩＩＢを発現する様々は組織から単離されたｍＲＮＡを用いて調製されたライブラリーから得られる。本発明のＤＮＡ分子は、完全長遺伝子、並びにポリヌクレオチド及びその断片を含む。完全長遺伝子はまた、Ｎ−末端シグナル配列をコードする配列を含んでいてもよい。
【００６０】
本発明はさらに、ポリヌクレオチドが転写又は翻訳調節配列に機能的に連結された、上述の核酸分子を提供する。
【００６１】
ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列の例。
シグナル配列を含むｓｖＡｃｔＲＩＩＢ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）
ａｔｇｇａｇｔｔｔｇｇｇｃｔｇａｇｃｔｇｇｇｔｔｔｔｃｃｔｃｇｔｔｇｃｔｃｔｔｔｔａａｇａｇｇｔｇｔｃｃａｇｔｇｔｇａｇａｃａｃｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｃｔａｃｔａｃａａｃｇｃｃａａｃｔｇｇｇａｇｃｔｇｇａｇｃｇｃａｃｃａａｃｃａｇａｃｃｇｇｃｃｔｇｇａｇｃｇｃｔｇｃｇａａｇｇｃｇａｇｃａｇｇａｃａａｇｃｇｇｃｔｇｃａｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃｃｔｇｇｃｇｃａａｃａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｃａｔｃｇａｇｃｔｃｇｔｇａａｇａａｇｇｇｃｔｇｃｔｇｇｃｔａｇａｔｇａｃｔｔｃａａｃｔｇｃｔａｃｇａｔａｇｇｃａｇｇａｇｔｇｔｇｔｇｇｃｃａｃｔｇａｇｇａｇａａｃｃｃｃｃａｇｇｔｇｔａｃｔｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇｔｇａｇｇｇｃａａｃｔｔｃｔｇｃａａｃｇａｇｃｇｃｔｔｃａｃｔｃａｔｔｔｇｃｃａｇａｇｇｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃｇｇａａｇｔｃａｃｇｔａｃｇａｇｃｃａｃｃｃｃｃｇａｃａｇｃｃｃｃｃａｃｃ（配列番号３）
【００６２】
シグナル配列を含むｓｖＡｃｔＲＩＩＢ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）
ｍｅｆｇｌｓｗｖｆｌｖａｌｌｒｇｖｑｃｅｔｒｗｃｉｙｙｎａｎｗｅｌｅｒｔｎｑｔｇｌｅｒｃｅｇｅｑｄｋｒｌｈｃｙａｓｗｒｎｓｓｇｔｉｅｌｖｋｋｇｃｗｌｄｄｆｎｃｙｄｒｑｅｃｖａｔｅｅｎｐｑｖｙｆｃｃｃｅｇｎｆｃｎｅｒｆｔｈｌｐｅａｇｇｐｅｖｔｙｅｐｐｐｔａｐｔ（配列番号４）
【００６３】
シグナル配列を含まないｓｖＡｃｔＲＩＩＢ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）
ｇａｇａｃａｃｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｃｔａｃｔａｃａａｃｇｃｃａａｃｔｇｇｇａｇｃｔｇｇａｇｃｇｃａｃｃａａｃｃａｇａｃｃｇｇｃｃｔｇｇａｇｃｇｃｔｇｃｇａａｇｇｃｇａｇｃａｇｇａｃａａｇｃｇｇｃｔｇｃａｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃｃｔｇｇｃｇｃａａｃａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｃａｔｃｇａｇｃｔｃｇｔｇａａｇａａｇｇｇｃｔｇｃｔｇｇｃｔａｇａｔｇａｃｔｔｃａａｃｔｇｃｔａｃｇａｔａｇｇｃａｇｇａｇｔｇｔｇｔｇｇｃｃａｃｔｇａｇｇａｇａａｃｃｃｃｃａｇｇｔｇｔａｃｔｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇｔｇａｇｇｇｃａａｃｔｔｃｔｇｃａａｃｇａｇｃｇｃｔｔｃａｃｔｃａｔｔｔｇｃｃａｇａｇｇｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃｇｇａａｇｔｃａｃｇｔａｃｇａｇｃｃａｃｃｃｃｃｇａｃａｇｃｃｃｃｃａｃｃ（配列番号５）
【００６４】
シグナル配列を含まないｓｖＡｃｔＲＩＩＢ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）
ｅｔｒｗｃｉｙｙｎａｎｗｅｌｅｒｔｎｑｔｇｌｅｒｃｅｇｅｑｄｋｒｌｈｃｙａｓｗｒｎｓｓｇｔｉｅｌｖｋｋｇｃｗｌｄｄｆｎｃｙｄｒｑｅｃｖａｔｅｅｎｐｑｖｙｆｃｃｃｅｇｎｆｃｎｅｒｆｔｈｌｐｅａｇｇｐｅｖｔｙｅｐｐｐｔａｐｔ（配列番号６）
【００６５】
シグナル配列を含むｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）ポリヌクレオチド配列
ａｔｇｇａｇｔｔｔｇｇｇｃｔｇａｇｃｔｇｇｇｔｔｔｔｃｃｔｃｇｔｔｇｃｔｃｔｔｔｔａａｇａｇｇｔｇｔｃｃａｇｔｇｔｇａｇａｃａｃｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｃｔａｃｔａｃａａｃｇｃｃａａｃｔｇｇｇａｇｃｔｇｇａｇｃｇｃａｃｃａａｃｃａｇａｃｃｇｇｃｃｔｇｇａｇｃｇｃｔｇｃｇａａｇｇｃｇａｇｃａｇｇａｃａａｇｃｇｇｃｔｇｃａｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃｃｔｇｇｃｇｃａａｃａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｃａｔｃｇａｇｃｔｃｇｔｇａａｇａａｇｇｇｃｔｇｃｔｇｇｃｔａｇａｔｇａｃｔｔｃａａｃｔｇｃｔａｃｇａｔａｇｇｃａｇｇａｇｔｇｔｇｔｇｇｃｃａｃｔｇａｇｇａｇａａｃｃｃｃｃａｇｇｔｇｔａｃｔｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇｔｇａｇｇｇｃａａｃｔｔｃｔｇｃａａｃｇａｇｃｇｃｔｔｃａｃｔｃａｔｔｔｇｃｃａｇａｇｇｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃｇｇａａｇｔｃａｃｇｔａｃｇａｇｃｃａｃｃｃｃｃｇａｃａｇｃｃｃｃｃａｃｃｇｇａｇｇｇｇｇａｇｇａｔｃｔｇｔｃｇａｇｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃａｃｃｔｇｔｇｇｃａｇｇａｃｃｇｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃｇｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｃｃａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃａｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｇｔｔｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｔｇｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｇｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａａｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｇｇｇａｇｇａｇａｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃａｃｃｔｃｃｃａｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｇｇｔａａａ（配列番号７）
【００６６】
シグナル配列を含むｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）ポリペプチド配列
ｍｅｆｇｌｓｗｖｆｌｖａｌｌｒｇｖｑｃｅｔｒｗｃｉｙｙｎａｎｗｅｌｅｒｔｎｑｔｇｌｅｒｃｅｇｅｑｄｋｒｌｈｃｙａｓｗｒｎｓｓｇｔｉｅｌｖｋｋｇｃｗｌｄｄｆｎｃｙｄｒｑｅｃｖａｔｅｅｎｐｑｖｙｆｃｃｃｅｇｎｆｃｎｅｒｆｔｈｌｐｅａｇｇｐｅｖｔｙｅｐｐｐｔａｐｔｇｇｇｇｓｖｅｃｐｐｃｐａｐｐｖａｇｐｓｖｆｌｆｐｐｋｐｋｄｔｌｍｉｓｒｔｐｅｖｔｃｖｖｖｄｖｓｈｅｄｐｅｖｑｆｎｗｙｖｄｇｖｅｖｈｎａｋｔｋｐｒｅｅｑｆｎｓｔｆｒｖｖｓｖｌｔｖｖｈｑｄｗｌｎｇｋｅｙｋｃｋｖｓｎｋｇｌｐａｐｉｅｋｔｉｓｋｔｋｇｑｐｒｅｐｑｖｙｔｌｐｐｓｒｅｅｍｔｋｎｑｖｓｌｔｃｌｖｋｇｆｙｐｓｄｉａｖｅｗｅｓｎｇｑｐｅｎｎｙｋｔｔｐｐｍｌｄｓｄｇｓｆｆｌｙｓｋｌｔｖｄｋｓｒｗｑｑｇｎｖｆｓｃｓｖｍｈｅａｌｈｎｈｙｔｑｋｓｌｓｌｓｐｇｋ（配列番号８）
【００６７】
シグナル配列を含まないｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）ポリヌクレオチド配列
ｇａｇａｃａｃｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｃｔａｃｔａｃａａｃｇｃｃａａｃｔｇｇｇａｇｃｔｇｇａｇｃｇｃａｃｃａａｃｃａｇａｃｃｇｇｃｃｔｇｇａｇｃｇｃｔｇｃｇａａｇｇｃｇａｇｃａｇｇａｃａａｇｃｇｇｃｔｇｃａｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃｃｔｇｇｃｇｃａａｃａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｃａｔｃｇａｇｃｔｃｇｔｇａａｇａａｇｇｇｃｔｇｃｔｇｇｃｔａｇａｔｇａｃｔｔｃａａｃｔｇｃｔａｃｇａｔａｇｇｃａｇｇａｇｔｇｔｇｔｇｇｃｃａｃｔｇａｇｇａｇａａｃｃｃｃｃａｇｇｔｇｔａｃｔｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇｔｇａｇｇｇｃａａｃｔｔｃｔｇｃａａｃｇａｇｃｇｃｔｔｃａｃｔｃａｔｔｔｇｃｃａｇａｇｇｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃｇｇａａｇｔｃａｃｇｔａｃｇａｇｃｃａｃｃｃｃｃｇａｃａｇｃｃｃｃｃａｃｃｇｇａｇｇｇｇｇａｇｇａｔｃｔｇｔｃｇａｇｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃａｃｃｔｇｔｇｇｃａｇｇａｃｃｇｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃｇｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｃｃａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃａｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｇｔｔｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｔｇｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｇｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａａｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｇｇｇａｇｇａｇａｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃａｃｃｔｃｃｃａｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｇｇｔａａａ（配列番号９）
【００６８】
シグナル配列を含まないｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）ポリペプチド配列
ｅｔｒｗｃｉｙｙｎａｎｗｅｌｅｒｔｎｑｔｇｌｅｒｃｅｇｅｑｄｋｒｌｈｃｙａｓｗｒｎｓｓｇｔｉｅｌｖｋｋｇｃｗｌｄｄｆｎｃｙｄｒｑｅｃｖａｔｅｅｎｐｑｖｙｆｃｃｃｅｇｎｆｃｎｅｒｆｔｈｌｐｅａｇｇｐｅｖｔｙｅｐｐｐｔａｐｔｇｇｇｇｓｖｅｃｐｐｃｐａｐｐｖａｇｐｓｖｆｌｆｐｐｋｐｋｄｔｌｍｉｓｒｔｐｅｖｔｃｖｖｖｄｖｓｈｅｄｐｅｖｑｆｎｗｙｖｄｇｖｅｖｈｎａｋｔｋｐｒｅｅｑｆｎｓｔｆｒｖｖｓｖｌｔｖｖｈｑｄｗｌｎｇｋｅｙｋｃｋｖｓｎｋｇｌｐａｐｉｅｋｔｉｓｋｔｋｇｑｐｒｅｐｑｖｙｔｌｐｐｓｒｅｅｍｔｋｎｑｖｓｌｔｃｌｖｋｇｆｙｐｓｄｉａｖｅｗｅｓｎｇｑｐｅｎｎｙｋｔｔｐｐｍｌｄｓｄｇｓｆｆｌｙｓｋｌｔｖｄｋｓｒｗｑｑｇｎｖｆｓｃｓｖｍｈｅａｌｈｎｈｙｔｑｋｓｌｓｌｓｐｇｋ（配列番号１０）
【００６９】
シグナル配列を含むｓｖＡｃｔＲＩＩＢ（Ｅ２８Ｙ、Ｓ４４Ｔ）
ａｔｇｇａｇｔｔｔｇｇｇｃｔｇａｇｃｔｇｇｇｔｔｔｔｃｃｔｃｇｔｔｇｃｔｃｔｔｔｔａａｇａｇｇｔｇｔｃｃａｇｔｇｔｇａｇａｃａｃｇｇｔａｃｔｇｃａｔｃｔａｃｔａｃａａｃｇｃｃａａｃｔｇｇｇａｇｃｔｇｇａｇｃｇｃａｃｃａａｃｃａｇａｃｃｇｇｃｃｔｇｇａｇｃｇｃｔｇｃｇａａｇｇｃｇａｇｃａｇｇａｃａａｇｃｇｇｃｔｇｃａｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃｃｔｇｇｃｇｃａａｃａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｃａｔｃｇａｇｃｔｃｇｔｇａａｇａａｇｇｇｃｔｇｃｔｇｇｃｔａｇａｔｇａｃｔｔｃａａｃｔｇｃｔａｃｇａｔａｇｇｃａｇｇａｇｔｇｔｇｔｇｇｃｃａｃｔｇａｇｇａｇａａｃｃｃｃｃａｇｇｔｇｔａｃｔｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇｔｇａｇｇｇｃａａｃｔｔｃｔｇｃａａｃｇａｇｃｇｃｔｔｃａｃｔｃａｔｔｔｇｃｃａｇａｇｇｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃｇｇａａｇｔｃａｃｇｔａｃｇａｇｃｃａｃｃｃｃｃｇａｃａｇｃｃｃｃｃａｃｃ（配列番号１１）
【００７０】
シグナル配列を含むｓｖＡｃｔＲＩＩＢ（Ｅ２８Ｙ、Ｓ４４Ｔ）
ｍｅｆｇｌｓｗｖｆｌｖａｌｌｒｇｖｑｃｅｔｒｙｃｉｙｙｎａｎｗｅｌｅｒｔｎｑｔｇｌｅｒｃｅｇｅｑｄｋｒｌｈｃｙａｓｗｒｎｓｓｇｔｉｅｌｖｋｋｇｃｗｌｄｄｆｎｃｙｄｒｑｅｃｖａｔｅｅｎｐｑｖｙｆｃｃｃｅｇｎｆｃｎｅｒｆｔｈｌｐｅａｇｇｐｅｖｔｙｅｐｐｐｔａｐｔ（配列番号１２）
【００７１】
シグナル配列を含まないｓｖＡｃｔＲＩＩＢ（Ｅ２８Ｙ、Ｓ４４Ｔ）
ｇａｇａｃａｃｇｇｔａｃｔｇｃａｔｃｔａｃｔａｃａａｃｇｃｃａａｃｔｇｇｇａｇｃｔｇｇａｇｃｇｃａｃｃａａｃｃａｇａｃｃｇｇｃｃｔｇｇａｇｃｇｃｔｇｃｇａａｇｇｃｇａｇｃａｇｇａｃａａｇｃｇｇｃｔｇｃａｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃｃｔｇｇｃｇｃａａｃａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｃａｔｃｇａｇｃｔｃｇｔｇａａｇａａｇｇｇｃｔｇｃｔｇｇｃｔａｇａｔｇａｃｔｔｃａａｃｔｇｃｔａｃｇａｔａｇｇｃａｇｇａｇｔｇｔｇｔｇｇｃｃａｃｔｇａｇｇａｇａａｃｃｃｃｃａｇｇｔｇｔａｃｔｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇｔｇａｇｇｇｃａａｃｔｔｃｔｇｃａａｃｇａｇｃｇｃｔｔｃａｃｔｃａｔｔｔｇｃｃａｇａｇｇｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃｇｇａａｇｔｃａｃｇｔａｃｇａｇｃｃａｃｃｃｃｃｇａｃａｇｃｃｃｃｃａｃｃ（配列番号１３）
【００７２】
シグナル配列を含まないｓｖＡｃｔＲＩＩＢ（Ｅ２８Ｙ、Ｓ４４Ｔ）
ｅｔｒｙｃｉｙｙｎａｎｗｅｌｅｒｔｎｑｔｇｌｅｒｃｅｇｅｑｄｋｒｌｈｃｙａｓｗｒｎｓｓｇｔｉｅｌｖｋｋｇｃｗｌｄｄｆｎｃｙｄｒｑｅｃｖａｔｅｅｎｐｑｖｙｆｃｃｃｅｇｎｆｃｎｅｒｆｔｈｌｐｅａｇｇｐｅｖｔｙｅｐｐｐｔａｐｔ（配列番号１４）
【００７３】
シグナル配列を含むｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｙ、Ｓ４４Ｔ）ポリヌクレオチド配列
ａｔｇｇａｇｔｔｔｇｇｇｃｔｇａｇｃｔｇｇｇｔｔｔｔｃｃｔｃｇｔｔｇｃｔｃｔｔｔｔａａｇａｇｇｔｇｔｃｃａｇｔｇｔｇａｇａｃａｃｇｇｔａｃｔｇｃａｔｃｔａｃｔａｃａａｃｇｃｃａａｃｔｇｇｇａｇｃｔｇｇａｇｃｇｃａｃｃａａｃｃａｇａｃｃｇｇｃｃｔｇｇａｇｃｇｃｔｇｃｇａａｇｇｃｇａｇｃａｇｇａｃａａｇｃｇｇｃｔｇｃａｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃｃｔｇｇｃｇｃａａｃａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｃａｔｃｇａｇｃｔｃｇｔｇａａｇａａｇｇｇｃｔｇｃｔｇｇｃｔａｇａｔｇａｃｔｔｃａａｃｔｇｃｔａｃｇａｔａｇｇｃａｇｇａｇｔｇｔｇｔｇｇｃｃａｃｔｇａｇｇａｇａａｃｃｃｃｃａｇｇｔｇｔａｃｔｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇｔｇａｇｇｇｃａａｃｔｔｃｔｇｃａａｃｇａｇｃｇｃｔｔｃａｃｔｃａｔｔｔｇｃｃａｇａｇｇｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃｇｇａａｇｔｃａｃｇｔａｃｇａｇｃｃａｃｃｃｃｃｇａｃａｇｃｃｃｃｃａｃｃｇｇａｇｇｇｇｇａｇｇａｔｃｔｇｔｃｇａｇｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃａｃｃｔｇｔｇｇｃａｇｇａｃｃｇｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃｇｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｃｃａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃａｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｇｔｔｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｔｇｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｇｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａａｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｇｇｇａｇｇａｇａｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃａｃｃｔｃｃｃａｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｇｇｔａａａ（配列番号１５）
【００７４】
シグナル配列を含むｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｙ、Ｓ４４Ｔ）ポリペプチド配列
ｍｅｆｇｌｓｗｖｆｌｖａｌｌｒｇｖｑｃｅｔｒｙｃｉｙｙｎａｎｗｅｌｅｒｔｎｑｔｇｌｅｒｃｅｇｅｑｄｋｒｌｈｃｙａｓｗｒｎｓｓｇｔｉｅｌｖｋｋｇｃｗｌｄｄｆｎｃｙｄｒｑｅｃｖａｔｅｅｎｐｑｖｙｆｃｃｃｅｇｎｆｃｎｅｒｆｔｈｌｐｅａｇｇｐｅｖｔｙｅｐｐｐｔａｐｔｇｇｇｇｓｖｅｃｐｐｃｐａｐｐｖａｇｐｓｖｆｌｆｐｐｋｐｋｄｔｌｍｉｓｒｔｐｅｖｔｃｖｖｖｄｖｓｈｅｄｐｅｖｑｆｎｗｙｖｄｇｖｅｖｈｎａｋｔｋｐｒｅｅｑｆｎｓｔｆｒｖｖｓｖｌｔｖｖｈｑｄｗｌｎｇｋｅｙｋｃｋｖｓｎｋｇｌｐａｐｉｅｋｔｉｓｋｔｋｇｑｐｒｅｐｑｖｙｔｌｐｐｓｒｅｅｍｔｋｎｑｖｓｌｔｃｌｖｋｇｆｙｐｓｄｉａｖｅｗｅｓｎｇｑｐｅｎｎｙｋｔｔｐｐｍｌｄｓｄｇｓｆｆｌｙｓｋｌｔｖｄｋｓｒｗｑｑｇｎｖｆｓｃｓｖｍｈｅａｌｈｎｈｙｔｑｋｓｌｓｌｓｐｇｋ（配列番号１６）
【００７５】
シグナル配列を含まないｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｙ、Ｓ４４Ｔ）ポリヌクレオチド配列
ｇａｇａｃａｃｇｇｔａｃｔｇｃａｔｃｔａｃｔａｃａａｃｇｃｃａａｃｔｇｇｇａｇｃｔｇｇａｇｃｇｃａｃｃａａｃｃａｇａｃｃｇｇｃｃｔｇｇａｇｃｇｃｔｇｃｇａａｇｇｃｇａｇｃａｇｇａｃａａｇｃｇｇｃｔｇｃａｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃｃｔｇｇｃｇｃａａｃａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｃａｔｃｇａｇｃｔｃｇｔｇａａｇａａｇｇｇｃｔｇｃｔｇｇｃｔａｇａｔｇａｃｔｔｃａａｃｔｇｃｔａｃｇａｔａｇｇｃａｇｇａｇｔｇｔｇｔｇｇｃｃａｃｔｇａｇｇａｇａａｃｃｃｃｃａｇｇｔｇｔａｃｔｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇｔｇａｇｇｇｃａａｃｔｔｃｔｇｃａａｃｇａｇｃｇｃｔｔｃａｃｔｃａｔｔｔｇｃｃａｇａｇｇｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃｇｇａａｇｔｃａｃｇｔａｃｇａｇｃｃａｃｃｃｃｃｇａｃａｇｃｃｃｃｃａｃｃｇｇａｇｇｇｇｇａｇｇａｔｃｔｇｔｃｇａｇｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃａｃｃｔｇｔｇｇｃａｇｇａｃｃｇｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃｇｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｃｃａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃａｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｇｔｔｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｔｇｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｇｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａａｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｇｇｇａｇｇａｇａｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃａｃｃｔｃｃｃａｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｇｇｔａａａ（配列番号１７）
【００７６】
シグナル配列を含まないｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｙ、Ｓ４４Ｔ）ポリペプチド配列
ｅｔｒｙｃｉｙｙｎａｎｗｅｌｅｒｔｎｑｔｇｌｅｒｃｅｇｅｑｄｋｒｌｈｃｙａｓｗｒｎｓｓｇｔｉｅｌｖｋｋｇｃｗｌｄｄｆｎｃｙｄｒｑｅｃｖａｔｅｅｎｐｑｖｙｆｃｃｃｅｇｎｆｃｎｅｒｆｔｈｌｐｅａｇｇｐｅｖｔｙｅｐｐｐｔａｐｔｇｇｇｇｓｖｅｃｐｐｃｐａｐｐｖａｇｐｓｖｆｌｆｐｐｋｐｋｄｔｌｍｉｓｒｔｐｅｖｔｃｖｖｖｄｖｓｈｅｄｐｅｖｑｆｎｗｙｖｄｇｖｅｖｈｎａｋｔｋｐｒｅｅｑｆｎｓｔｆｒｖｖｓｖｌｔｖｖｈｑｄｗｌｎｇｋｅｙｋｃｋｖｓｎｋｇｌｐａｐｉｅｋｔｉｓｋｔｋｇｑｐｒｅｐｑｖｙｔｌｐｐｓｒｅｅｍｔｋｎｑｖｓｌｔｃｌｖｋｇｆｙｐｓｄｉａｖｅｗｅｓｎｇｑｐｅｎｎｙｋｔｔｐｐｍｌｄｓｄｇｓｆｆｌｙｓｋｌｔｖｄｋｓｒｗｑｑｇｎｖｆｓｃｓｖｍｈｅａｌｈｎｈｙｔｑｋｓｌｓｌｓｐｇｋ（配列番号１８）
【００７７】
本発明の別の態様においては、本発明の核酸分子及びポリヌクレオチドを含有する発現ベクターもまた提供され、それらのベクターを用いて形質転換された宿主細胞及びｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを生産する方法もまた提供される。「発現ベクター」という用語は、ポリヌクレオチド配列由来のポリペプチドを発現されるための、プラスミド、ファージ、ウイルス又はベクターを意味する。ｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを発現させるためのベクターは、ベクターの増殖及びクローニングした挿入物を発現させるために必要な最低限の配列を含有する。発現ベクターは、（１）例えばプロモーターやエンハンサーなどの、遺伝子発現の制御において機能する遺伝的エレメント、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質へと翻訳されるｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド及びタンパク質をコードする配列、並びに（３）適した転写開始及び終止配列、の集合を含む転写単位を構成する。これらの配列はさらに選択マーカーを含んでいてもよい。宿主細胞での発現に好適なベクターは容易に入手でき、標準的な組み換えＤＮＡ技術を用いて核酸分子はベクターに挿入される。これらベクターは、特定の組織において昨日するプロモーター及び標的ヒト又は動物細胞においてｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを発現させるためのウイルスベクターを含む場合もある。ｓｖＡｃｔＲＩＩＢを発現させるための好適な発現ベクターはｐＤＳＲａ（国際公開第９０／１４３６３号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）及びｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドを含有するその誘導体であり、並びにいずれのさらなる好適なベクターは当該技術分野において周知であり、下記に記載される。
【００７８】
本発明はさらに、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの作成方法を提供する。その他の様々な発現／宿主系を用いてもよい。これらの系は、組み換えバクテリオファージ、プラスミド又はコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターを用いて形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を用いて感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を用いて感染した、又は細菌性発現ベクター（例えば、Ｔｉ又はｐＢＲ３２２プラスミド）を用いて形質転換した植物細胞系；又は動物細胞系を含むが、これらには限定されない。組み換えタンパク質生産において有用な哺乳類細胞には、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、若しくはＶｅｇｇｉｅＣＨＯ及び血清を含まない培地で成長する関連した細胞株（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８：３１を参照）又はＤＨＦＲが欠損したＣＨＯのＤＸ−Ｂ１１株（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７７：４２１６−２０を参照）などのそれら誘導体、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ  ２３：１７５参照）などのＣＯＳ細胞、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＣＬ１６３）、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣＣＲＬ１０）細胞株、アフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）（ＭｃＭａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２８２１参照）由来のＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株、２９３、２９３ＥＢＮＡ又はＭＳＲ２９３などのヒト胚性腎臓細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、その他の形質転換された霊長類細胞株、正常二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養由来の細胞株、初代外片、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫ又はジャーカット細胞が含まれるが、これらには限定されない。哺乳類での発現は、培地から回収することができる分泌性又は可溶性ポリペプチドの生産を可能にする。
【００７９】
適した宿主‐ベクター系を用いて、本発明の核酸分子を含有する発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、ポリペプチドの生産を可能にする条件下で培養することによりｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは組み換え的に生産される。形質転換細胞は長期間の高収率なポリペプチド生産に用いることができる。選択マーカー及び所望の発現カセットを含有するベクターを用いて一度形質転換された細胞は、例えば、それらの細胞を選択培地に移す前に富栄養培地で生育させることができる。選択マーカーは、挿入された配列をうまく発現させる細胞の成長及び回収を可能にするために設計される。抵抗性を有する安定的に形質転換された細胞の集団を、使用された細胞株に適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。組み換えタンパク質発現の概観は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖ．１８５，Ｇｏｅｄｄｅｌｌ，Ｄ．Ｖ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）に見られる。
【００８０】
原核生物の系を用いて発現させたいくつかの例においては、本発明の発現したポリペプチドには、生物学的に活性になるために生成される正確な３次元構造及びジスルフィド結合を形成する、「リフォールディング」及び酸化が必要とされる可能性がある。リフォールディングは当該技術分野において周知の数多くの工程を用いて達成することができる。それらの方法は、例えば、可溶化したポリペプチドをカオトロピック剤の存在下で、一般的には７より高いｐＨに曝すことを含む。カオトロープの選択は、封入体の可溶化に用いられた選択と同様であるが、カオトロープは典型的にはより低い濃度で用いられる。カオトロピック剤の例には、グアニジン及び尿素が挙げられる。多くの場合、リフォールディング／酸化溶液は、システインの架橋形成を生じるジスルフィドシャッフリングを可能にする、典型的な酸化還元電位を生成する特定の率において、還元剤とその酸化型をも含んでいてもよい。いくつかの一般的に用いられるレドックス対には、システイン／シスタミン、グルタチオン／ジチオビスＧＳＨ、塩化銅、ジチオトレイトールＤＴＴ／ジチアンＤＴＴ、及び２−メルカプロエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂＭＥが含まれる。多くの場合、リフォールディング効率を高めるために、共溶媒が用いられ得る。一般的に用いられる共溶媒はグリセロール、様々な分子量のポリエチレングリコール、及びアルギニンを含む。
【００８１】
加えて、ポリペプチドは標準的な技術に従って、溶液中又は固形担体中で合成することができる。様々な自動合成器が市販され、それらを既知の方法に従って使用することができる。例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（１９８４）；Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，１０５：６４４２，（１９８３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３４１−３４７（１９８６）；Ｂａｒａｎｙ  ａｎｄ  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１−２８４；Ｂａｒａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ，３０：７０５−７３９（１９８７）を参照。
【００８２】
本発明のポリペプチド及びタンパク質は、当業者に周知のタンパク質精製技術に従って精製することができる。１つのレベルにおいては、これらの技術はタンパク質及び非タンパク質画分の粗分画を含む。ペプチド又はポリペプチドは他のタンパク質から分離され、目的のペプチド又はポリペプチドを部分的又は完全に精製する（又は均一になるまで精製する）ためにクロマトグラフィー及び電気泳動技術を用いてさらに精製することができる。本明細書で使用されるとき、「単離されたポリペプチド」又は「精製されたポリペプチド」という用語は、ポリペプチドが天然に得られる状態と比較してある程度精製されている、他の構成成分から単離できる組成物を意味する。精製されたポリペプチドはまたそのため、天然に生じる環境に含まれないポリペプチドを意味する。通常「精製された」という用語は、様々な他の構成要素除去するために分画されたポリペプチド組成物を意味し、かつ、その組成物は実質的にその発現される生物学的活性を保持する。「実質的に精製された」という用語が用いられている場合には、この語は、ペプチド又はポリペプチドがその組成物中の主要な構成要素を形成する、例えば約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、又は約９０％以上のタンパク質を構成する、ペプチド又はポリペプチド組成物を意味する。
【００８３】
精製に使用できる様々な好適な技術は当業者に周知である。これらは例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体（免疫沈降）、などとの沈殿、又は熱変性とその後の遠心；アフィニティクロマトグラフィー（タンパク質−Ａカラム）などのクロマトグラフィー、イオン交換、ゲルろ過、逆相、ヒドロキシアパタイト、疎水性相互作用クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ゲル電気泳動、及びこれら技術の組み合わせを含む。当該技術分野において一般に知られるように、様々な精製過程を実施する順序は変更でき、又は特定の過程を省略することができるが、それでもなおそれらの方法は、実質的に精製されたポリペプチドを調製するための好適な方法である。精製過程の例は下記実施例において提供される。
【００８４】
ポリペプチドの精製度合いを本開示の態様において定量する様々な方法は当業者に周知である。これらは例えば、活性画分の特異的な結合活性を決定すること、又はＳＤＳ／ＰＡＧＥ解析によって画分中のペプチド又はポリペプチドの量を評価することを含む。ポリペプチド画分の純度を評価する好ましい方法は、画分の結合活性を最初の抽出物の結合活性と比較して算出することであり、このように算出する精製度合いを本明細書では「−倍精製番号」と評価する。結合活性の量を示す実際の単位は、当然のことながら、精製を行うために選択された特定のアッセイ技術、及びポリペプチド又はペプチドが検出可能な結合活性を示すか否かに依存する。
【００８５】
安定化アクチビンＩＩＢ型ポリペプチドは、筋肉分解カスケードを活性化するリガンドに結合する。ｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、リガンドであるアクチビンＡ、ミオスタチン、及び／又はＧＤＦ−１１に結合してその活性を阻害することができ、筋萎縮、特定の癌及びその他の疾患を治療する能力を有する。
【００８６】
下記の実施例は、インビトロアッセイにおいてミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合して中和する能力、並びにインビボ活性を保持しながら、本明細書に記載したアミノ酸置換を有するｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド及びタンパク質での改善された特性を示す。これらの特性は、その他の可溶性受容体と比較して改善された製造性を有するタンパク質及びポリペプチドを生じる。
【００８７】
抗体
本発明は、本発明のｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、安定化ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに結合する抗体をさらに含む。本明細書で使用されるとき、「特異的に結合する」という用語は、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに対する結合親和性（Ｋａ）が１０６Ｍ−１以上の抗体を意味する。本明細書で使用されるとき、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体（例えば、抗体：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｓ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８８）を参照）、及びモノクローナル抗体（例えば、米国特許ＲＥ３２，０１１、４、９０２，６１４、４，５４３，４３９、及び４，４１１，９９３、並びにＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅａｒｎ  ａｎｄ  Ｂｅｃｈｔｏｌ（ｅｄｓ．）（１９８０）を参照）を含む、完全な抗体を意味する。本明細書で使用されるとき、「抗体」という用語は、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃ、並びに、組み換えＤＮＡ技術又は完全な抗体の酵素的若しくは化学的開裂によって生産される一本鎖抗体などの抗体断片もまた意味する。「抗体」という用語は、２つの異なる重／軽鎖対及び２つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である、二重特異性又は二価抗体もまた意味する。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合、又はＦａｂ’断片の結合を含む様々な方法によって生産することができる（Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０），Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照）。
【００８８】
本明細書で使用されるとき、「抗体」という用語はまた、ヒト定常抗体免疫グロブリンドメインが１以上の非ヒト可変抗体免疫グロブリンドメインと結合した抗体、又はその断片である、キメラ抗体をも意味する（例えば、米国特許第５，５９５，８９８号及び米国特許第５，６９３，４９３号を参照）。抗体はまた、「ヒト化」抗体（例えば米国特許第４，８１６，５６７号及びＷＯ９４／１０３３２）、ミニボディ（ＷＯ９４／０９８１７）、マキシボディ、及びヒト抗体を生産する遺伝子をある割合で含有するが、ヒト抗体を生産することができる内因性の抗体の生産が欠損している形質転換動物によって生産された抗体も意味する（例えば、Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）、及び．米国特許第６，３００，１２９号を参照）。「抗体」という用語はまた、多量体抗体、又はヘテロ二量体抗体などの高次元のタンパク質複合体、及び抗イディオタイプ抗体も含む。「抗体」はまた、抗イディオタイプ抗体も含む。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに対する抗体を、例えばインビトロ及びインビボでｓｖＡｃｔＲＩＩＢの同定及び定量に用いることができる。
【００８９】
また、本明細書で開示したｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに特異的に結合する、任意の哺乳類、例えばマウス、及びラット抗体、並びにウサギ抗体からのポリクローナル抗体を含む。
【００９０】
それらの抗体は、本明細書で開示したポリペプチドの検出及びアッセイのために定量的アッセイにおける研究ツールとして使用できる。それらの抗体は上述の方法及び当該技術分野において知られている方法を用いて作成される。
【００９１】
医薬組成物
本発明のタンパク質及びポリペプチドを含有する医薬組成物もまた提供される。それらの組成物は、治療上又は予防上効果量のポリペプチド又はタンパク質を薬学的に許容可能な材料及び生理的に許容できる処方材料との混合物として含む。医薬組成物は、例えば、ｐＨ、容量オスモル濃度、粘性、透明度、色、等張性、臭気、不妊性、安定性、溶解又は放出速度、組成物の吸収又は透過性を改変、維持、又は保存するための処方材料を含有してもよい。好適な処方材料は、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリジンなど）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝液（ホウ酸、重炭酸、トリス−ＨＣｌ、クエン酸、リン酸、その他の有機酸など）；増量剤（マンニトール又はグリシンなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖；二糖及びその他の炭水化物（グルコース、マンノース、又はデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなど）；着色剤；香料及び賦形剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩を形成する対イオン（ナトリウムなど）；防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、又はポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトール又はソルビトールなど）；懸濁化剤；界面活性剤又は湿潤剤（プルロニック類、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などのポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）など）；安定性増進剤（ショ糖又はソルビトール）；等張性増進剤（ハロゲン化アルカリ金属など（好ましくは塩化ナトリウム又は塩化カリウム、マンニトール・ソルビトール）；送達媒体；希釈剤；賦形剤及び／又は医療用佐剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）を含むが、これらには限定されない。
【００９２】
最適な医薬組成物は、例えば意図される投与経路、送達形態、及び所望の容量により、当業者によって決定されるだろう。例えば、上記Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照。それらの組成物は、ポリペプチドの物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、インビボでのクリアランス速度に影響を及ぼす可能性がある。例えば、好適な組成物は注射用水や非経口投与用の生理食塩水であってもよい。
【００９３】
医薬組成物中の主な媒体又は担体は、水性又は非水性いずれの性質であってもよい。例えば、好適な媒体又は担体は、注射用水、生理的食塩水、又は、人工的な脳脊髄液であってもよく、非経口投与用の組成物において一般的なその他の材料が添加されていてもよい。さらなる媒体の例としては、中性の緩衝食塩水又は血清アルブミンを含む食塩水がある。医薬組成物のその他の例としてはトリス緩衝液、又は酢酸緩衝液があり、これらはさらにソルビトール又はその好適な代用品を含む。本発明の１つの実施形態においては、保存用の組成物は、所望される度合いの純度を有する選択された組成物と、最適な処方剤を混合することによって（上記Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照）、凍結乾燥ケーキ又は水溶液の形態で調製できる。さらに治療用組成物を、適した賦形剤、例えばショ糖などを用いて凍結乾燥物として処方してもよい。
【００９４】
製剤は例えば吸入治療、経口、又は注射などの様々な方法によって送達することができる。非経口投与が予定される場合には、本発明の使用における治療用組成物はピロゲンを含まない、薬学的に許容可能な媒体中に所望のポリペプチドを含んだ非経口用に許容できる水溶液の場合がある。非経口注射において、特に好適な媒体は滅菌蒸留水であり、ポリペプチドは滅菌蒸留水中に無菌的に、等張液として、適切に保存されて処方される。さらに別の調製は、その後、蓄積注射を介して送達される可能性がある制御された又は徐放性の産物を提供する、注射可能なミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー性化合物（ポリ酢酸、ポリグリコール酸）、ビーズ、又はリポソームなどの薬剤を含む所望の分子の製剤を含む場合がある。循環血液中での持続期間を促進する効果を有する可能性があるヒアルロン酸もまた使用してもよい。所望の分子を導入するためのその他の好適な手段は移植可能な薬剤送達装置を含む。
【００９５】
別の態様においては、注射投与のために好適な医薬製剤は、水溶液中に、好ましくはハンクス液、リンガー液又は生理緩衝食塩水などの生理的に適合できる緩衝液中に処方される可能性がある。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチル・セルロース・ナトリウム、ソルビトール、又はデキストランなどの懸濁液の粘性を高める基質を含有してもよい。加えて活性化合物の懸濁液は、適した油性の注射懸濁液として調製してもよい。好適な脂溶性溶媒又は媒体には、ごま油などの脂肪油、又はオレイン酸エチルなどの合成脂肪酸エステル、トリグリセリド、又はリポソームが含まれる。非脂質ポリカチオン性アミノポリマーもまた送達に使用してもよい。懸濁液は任意に、高度に濃縮した溶液を調製することを可能にする安定化剤、又は化合物の溶解度を上昇させる薬剤もまた含有してもよい。別の実施形態においては、医薬組成物は吸入用に処方され得る。吸入用溶液は、エアロゾル送達用の噴射剤とともに処方されてもよい。さらに別の実施形態においては、溶液はネブライザー用であってもよい。経肺投与については、化学的に修飾されたタンパク質の経肺送達について記載した、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５にさらに記載される。
【００９６】
特定の製剤が経口で投与されることもまた予定される。本発明の１つの実施形態においては、錠剤及びカプセルなどの固形容量形態の配合において習慣的に使用される担体を含んで、又は含まずに、この方法で投与される分子を処方することができる。例えばカプセルは、バイオアベイラビリティが最大で、かつ、プレシステミックな分解が最少の場合に胃腸管に入った時点で製剤の活性部分が放出されるように設計され得る。治療用分子の吸収を促進するために、さらなる薬剤が含まれる場合もある。希釈剤、香料、低融点のワックス、植物油、滑沢剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、及び結合剤をもまた使用してもよい。経口投与のための医薬組成物はまた、経口投与に好適な容量の当該技術分野において周知の薬学的に許容可能な担体と共に処方することができる。それらの担体は、患者による経口摂取用の錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、溶液、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして医薬組成物を処方することを可能にする。
【００９７】
経口用の医薬調製物は、活性化合物と固形の賦形剤とを組み合わること、及び生じた顆粒混合物を（任意に粉砕した後に）錠剤又は糖衣錠の核を得るために加工することによって得ることができる。望まれる場合には、好適な助剤を加えることもできる。好適な賦形剤には、ラクトース、ショ糖、マンニトール、及びソルビトールを含む糖などの炭水化物又はタンパク質充填剤；トウモロコシ、ムギ、コメ、ジャガイモ又はその他の植物由来の澱粉；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、又はカルボキシメチル・セルロース・ナトリウムなどのセルロース；アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム；並びにゼラチン及びコラーゲンなどのタンパク質が含まれる。望まれる場合には、架橋ポリビニルピロリドン、寒天及びアルギン酸又はその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤又は安定化剤を加えてもよい。
【００９８】
糖衣錠の核は、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、並びに好適な有機溶媒又は溶媒混合物をもまた含有してもよい、濃縮糖溶液などの好適なコーティングと併せて使用され得る。染料又は色素を、産物の識別又は活性化合物の量、すなわち容量を特徴付けるために錠剤や糖衣錠コーティングに加えてもよい。
【００９９】
経口で用いられ得る医薬調製物は、ゼラチンから作られる押し込み型カプセル、並びにゼラチン及びグリセロール又はソルビトールなどのコーティングから作られた、軟らかい、密閉されたカプセルをもまた含む。押し込み型カプセルは、充填剤、又は、ラクトース若しくは澱粉などの結合剤、タルク若しくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、及び任意に安定化剤と混合した、活性成分を含有してもよい。軟カプセル中では、安定化剤を含む、若しくは含まない脂肪油、液体、又は液状ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に活性化合物を溶解又は懸濁し得る。
【０１００】
徐放性又は制御された送達用の製剤中にポリペプチドを含有した製剤を含む、さらなる医薬組成物が当業者にとって明らかだろう。リポソーム担体、生体内分解性の微小粒子又は多孔性ビーズ及び蓄積注射などの様々なその他の徐放性又は制御された送達手段を処方する技術もまた、当業者に知られている。例えば、医薬組成物の送達のための多孔性ポリマー微小粒子の制御放出について記載したＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９を参照。徐放性調製物のさらなる例としては、例えば、フィルム又はマイクロカプセルなどの形態に造形された半透過性ポリマーマトリックスを含む。徐放性マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（ＵＳ３，７７３，９１９、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸塩との共重合体（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６（１９８３）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７，（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，上記）又はポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）を含んでいてもよい。徐放性組成物は、当該技術分野において知られる複数の方法のいずれかによって調製することができるリポソームをもまた含む。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  （ＵＳＡ），８２：３６８８（１９８５）；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９を参照。
【０１０１】
インビボ投与に用いられる医薬組成物は、典型的には無菌的でなくてはならない。これは無菌的なろ過膜を通すことによって達成され得る。組成物が凍結乾燥されている場合には、この方法は凍結乾燥及び再構成の前又はその後のいずれに行われてもよい。非経口投与用の組成物を、凍結乾燥の形態又は溶液中で保存してもよい。加えて、非経口組成物は通常無菌的なアクセスポートを有する容器、例えば点滴用輸液バッグ又は皮下注射針によって貫通させることのできる栓を有するバイアル中に入れられる。
【０１０２】
一度処方された医薬組成物は、溶液、懸濁液、ゲル、乳化剤、固体又は脱水された又は凍結乾燥された粉末として、無菌的なバイアル中に保存され得る。これらの製剤は、すぐに使用できる形態又は投与の前に再構成を必要とする形態（例えば凍結乾燥された形態）のいずれにおいて保存してもよい。
【０１０３】
特定の実施形態においては、本発明は、単回投与単位を生産するためのキットに向けられている。それぞれのキットは、乾燥したタンパク質を有する第一の容器と水性製剤を有する第二の容器の両方を含む可能性がある。本発明の範囲には、単一のチャンバー及び複数のチャンバーがある予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジ及びリオシリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットもまた含まれる。
【０１０４】
治療上用いられる医薬組成物の効果量は、例えば、治療の状況及び目的に依存するだろう。治療のための適した用量レベルはこのため、部分的には、送達される分子、どのポリペプチドを使用するかについての指示、投与経路、並びに患者のサイズ（体重、体表面又は器官サイズ）及び状態（年齢及び全体的な健康）によって多様になるだろうことを当業者は理解するだろう。従って、最適な治療効果を得るために臨床医は用量を滴定してもよく、及び投与経路を変更してもよい。典型的な用量の範囲は、上述の要因に依存して約０．１ｍｇ／ｋｇから最高約１００ｍｇ／ｋｇ以上になる可能性がある。ポリペプチド組成物は好ましくは静脈的に注射又は投与されてもよい。持続性の医薬組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって、３日から４日毎、毎週、又は隔週で投与される可能性がある。投与頻度は使用される製剤中のポリペプチドの薬剤動態パラメーターに依存するだろう。典型的には、所望される効果を達成する用量に達するまで、組成物は投与される。組成物はそのため、経時的に単回投与、若しくは（同じ又は異なる濃度／用量で）複数回投与として、又は持続注射として投与されてもよい。慣習的に適した用量のさらなる改良がなされる。適した用量は適した用量反応データの使用を介して確認されてもよい。
【０１０５】
医薬組成物の投与経路は、例えば、経口的、静脈からの注射を介した、腹膜内、大脳内（実質組織内）、脳室内、筋肉内、眼球内、動脈内、門脈内、病巣内経路、髄内、鞘内、心室内、経皮的、皮下的、若しくは腹腔内；又は経鼻的、腸内、局所的、舌下、尿道的、経膣、又は直腸的手段、徐放性システム又は植え込みデバイスによる、既知の方法に従う。所望される場合には、組成物はボーラス注射若しくは継続的な点滴、又は植え込みデバイスによって投与されてもよい。別に又は加えて、所望される分子が吸収された又は封入された膜、スポンジ、又は別の適した材料の植え込みを介して局所的に組成物を投与してもよい。植え込みデバイスが使用される場合には、デバイスは好適な組織又は器官に植え込んでよく、所望の分子の送達は、拡散、持続放出型ボーラス、又は連続的な投与を介し得る。
【０１０６】
いくつかの例においては、ポリペプチドを発現して分泌するために本明細書に記載されたような方法を用いて遺伝子組み換えされた特定の細胞を移植することによって、本発明のｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを送達することができる。それらの細胞は、動物又はヒト細胞であってもよく、及び自己、異種、又は非相同であってもよい。細胞は任意に不死化されてもよい。免疫反応の機会を減少させるため、細胞は周辺組織の浸潤を避けるように封入されてもよい。封入材料は、典型的には生体適合性の、半透性ポリマー封入剤又は、ポリペプチド産物を放出することができるが患者の免疫系又はその他の周辺組織由来の有害因子による細胞の破壊を防ぐことができる膜である。
【０１０７】
ｓｖＡｃｔＲＩＩＢをコードする核酸分子、又はｓｖＡｃｔＲＩＩＢの誘導体を対象に直接導入する、インビボでのｓｖＡｃｔＲＩＩＢ遺伝子治療もまた想定される。例えば、アデノ関連ウイルスベクターなどの適した送達ベクターを含む又は含まない核酸コンストラクトの局所的な注射を介して、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢをコードする核酸配列は標的細胞に導入される。別のウイルス性ベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペス、ウイルス、及びパピローマウイルスベクターが挙げられるが、これらには限定されない。ウイルスベクターの物理的な転移は、所望の核酸コンストラクト又は所望の核酸配列を含有するその他の適した送達ベクターの局所的な注射、リポソームを介した転移、直接的な注射（ネイキッドＤＮＡ）、又は微小粒子のボンバードメント（遺伝子銃）によってインビボにおいて達成される可能性がある。
【０１０８】
本開示の組成物は、単独で又は、それらの治療効果を高めるための若しくは可能性のある副作用を減少させるための、その他の治療用薬剤との併用において使用してもよい。
【０１０９】
ｓｖＡｃｔＲＩＩＢ組成物の使用
本発明は、インビボ及びインビトロにおいて、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１の量又は活性を、減少させる又は中和するための方法及び医薬組成物を提供する。ｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドはミオスタチン、アクチビンＡ及びＧＤＦ−１１に対する高い結合親和性を有し、かつ、ミオスタチン、アクチビンＡ及びＧＤＦ−１１の少なくとも１つの生物学的活性を低下させ、かつ、阻害することができる。
【０１１０】
１つの態様においては、本発明は、治療を必要とする対象において、対象に効果量のｓｖＡｃｔＲＩＩＢ組成物を投与することによる、ミオスタチンに関係した及び／又はアクチビンＡに関係した障害を治療するための方法及び試薬を提供する。本明細書で使用されるとき、「対象」という用語は、ヒトを含む哺乳類など、いずれの動物をも意味する。
【０１１１】
本発明の組成物は、対象において除脂肪体重を増加させるために有用である。組成物はまた、除脂肪体重の脂肪量に対する割合を増加させ、このため、対象の体重におけるパーセンテージとしての脂肪量を減少させるために有用である可能性もある。実施例３は、本発明のｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド及びタンパク質が総物において除脂肪体重を増加させることができることを示す。
【０１１２】
ｓｖＡｃｔＲＩＩＢ組成物によって治療できる疾患には、様々な形態の筋肉の消耗、並びに糖尿病などの代謝性障害と関係した疾患、及び骨粗鬆症などの骨変性障害などが挙げられるが、これらには限定されない。
【０１１３】
筋肉の消耗疾患は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、進行性筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、ランドゥジー・デジュリン筋ジストロフィー、エルブ筋ジストロフィー、及び乳児神経軸索性筋ジストロフィーなどのジストロフィーもまた含む。さらなる筋肉の消耗疾患は、筋萎縮性側索硬化症、鬱血性閉塞性肺障害、癌、エイズ、腎不全、器官萎縮、アンドロゲン欠亡、及び関節リウマチなどの慢性障害又は疾患から生じる。
【０１１４】
ミオスタチン及び／又はアクチビンの過剰発現は、重篤な筋消耗症候群である悪液質の一因となる可能性がある。悪液質は癌から生じ、及び関節リウマチ、闘病病性ネフロパシー、腎不全、化学療法、火傷による負傷、並びにその他の原因によってもまた生じる。別の実施例においては、エイズに関係した筋消耗を発現しているヒトにおいては、血清及びミオスタチン−免疫反応性タンパク質の筋肉内濃度が上昇し、これが除脂肪量と反比例していることが見いだされた（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：１４９３８−１４９４３（１９９８））。ミオスタチンレベルもまた火傷に反応して上昇し、異化筋肉効果を生じることが示されている（Ｌａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １５，１８０７−１８０９（２００１））。筋消耗を生じるさらなる状態は、車椅子での制限、発作による長期臥床、病気、脊髄損傷、骨折又はトラウマ、及び微小重力環境（宇宙飛行）での筋消耗など、身体障害による不活性から生じる可能性もある。例えば、血漿ミオスタチン免疫反応性タンパク質が長期臥床の後で上昇することが見いだされた（Ｚａｃｈｗｉｅｊａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｇｒａｖｉｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．６（２）：１１（１９９９）。スペースシャトルでの飛行中に微小重力環境に暴露されたラットの筋肉では、微小重力環境に暴露されていないラットの筋肉と比較して、ミオスタチンの発現量が増加したこともまた見いだされた（Ｌａｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ  １６７（３）：４１７−２８（２０００））。
【０１１５】
加えて、年齢に関係した脂肪の筋肉に対する率の増加、及び年齢に関係した筋消耗がミオスタチンと関係していると考えられる。例えば、血清ミオスタチン免疫反応性タンパク質の平均は、若年（１９〜３５歳）、中高年（３６〜７５歳）、及び老年（７６〜９２歳）の男性及び女性の群で年齢に伴って上昇し、これらの群における筋肉量と除脂肪体重の平均は年齢に伴って減少する（Ｙａｒａｓｈｅｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｎｕｔｒ  Ａｇｉｎｇ  ６（５）：３４３−８（２００２））。加えて現在では、ミオスタチンが心筋において低レベルで発現し、この発現が梗塞後の心筋細胞においてアップレギュレートされることが見いだされている（Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８０（１）：１−９（１９９９））。このため、心筋においてミオスタチンレベルを減少させることが梗塞後の心筋の回復を改善する可能性がある。
【０１１６】
ミオスタチンはまた、２型糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、高血糖、及び肥満を含む代謝性障害にも影響を及ぼすと考えられる。例えば、２匹のマウスモデルにおいて、ミオスタチンの欠損が肥満及び糖尿病の表現型を改善することが示されている（Ｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．８：４７９（１９９４））。本開示のｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、それら代謝性障害の治療に適している。そのため、本発明の組成物を投与することは、好適な対象において糖尿病、肥満、及び高血糖の状態を改善するだろう。加えて、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含有する組成物は、肥満の人における食料摂取を減少させる可能性がある。
【０１１７】
本発明の安定化ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの投与は、骨強度を改善して、骨粗しょう症及びその他の変性骨障害を減少させる可能性がある。例えば、ミオスタチン欠損マウスにおいては、ミネラル含量とマウス上腕骨密度の上昇、及び筋肉が結合している領域での骨小柱と皮質の両方におけるミネラル含量の増加、並びに筋肉量の増加が見られる（Ｈａｍｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ  ７１（１）：６３−８（２００２））。加えて、本発明のｓｖＡｃｔＲＩＩＢ組成物は、例えば前立腺癌の治療のためにアンドロゲン除去治療が用いられたような例において、アンドロゲン除去の効果を治療するために使用することができる。
【０１１８】
本発明はまた、動物に効果量のｓｖＡｃｔＲＩＩＢタンパク質を投与することにより、食用動物において筋肉量を増加させるための方法及び組成物を提供する。成熟Ｃ−末端ミオスタチンポリペプチドが、試験された全ての種において相同又は同一であることから、ウシ、ニワトリ、七面鳥、及びブタを含む、いずれの農業上重要な種においても、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが除脂肪体重の増加及び脂肪の減少に効果的であると予測される。
【０１１９】
本発明のｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド及び組成物はまた、下記のインビトロアッセイにおいて示されるように、アクチビンＡの活性を拮抗する。アクチビンＡは特定の型の癌、典型的には、卵巣癌などの性腺腫瘍において発現し、重篤な悪液質を起こすことが知られている（Ｃｉｐｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １４１（７）：２３１９−２７（２０００），Ｓｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １３８（１１）：５０００−５（１９９７）；Ｃｏｅｒｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １０（５）：５３４−４３（１９９６）；Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８２（８）：１４１５−２０（２０００），Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｍｅｓｓｅｒｌｉａｎ，  ｅｔ  ａｌ，Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ７４：９３−７（１９９９）。このため、本開示の組成物は、特定の癌に由来する悪液質などのアクチビンＡの過剰発現及びミオスタチン発現に関係した状態の治療、並びに特定の性腺型腫瘍の治療に用いられる可能性がある。
【０１２０】
加えて、本発明のｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、いずれの数のアッセイにおいても、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１の検出及び定量に有用である。通常、本発明の安定化ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、例えば、Ａｓａｉ，ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３７，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）に記載されているアッセイと同様の様々なアッセイにおいて、ミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１に結合して固定する、補足剤として有用である。いくつかの方法においてはポリペプチドを標識してもよく、又は、ミオスタチンを検出して定量することを可能にするために標識された抗体などの、第三の分子と反応させてもよい。例えば、ポリペプチド又は第三の分子を、酵素標識されたストレプトアビジンなどの第四の分子とその後結合することができるビオチンなどの、検出可能な部分、又はその他のタンパク質で修飾することもできる（Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３５：２５８９（１９８５）；Ｃｈａｕｂｅｒｔ，Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ  １０：５８５（１９９７））。
【０１２１】
下記の実施例は、記載されてきた本発明を説明する目的で提供され、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１２２】
実施例１
ｓｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現及び精製
安定化ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現及び精製には下記の方法を用いた。
【０１２３】
ヒトアクチビンＩＩＢ型受容体のｃＤＮＡをヒト精巣由来のｃＤＮＡライブラリー（クロンテック）から単離し、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１１／５９０，９６２号及び米国特許出願公開第２００７／０１１７１３０号に記載されているようにクローニングした。
【０１２４】
ｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）ポリペプチド（配列番号１０）、及びＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ）（配列番号２１）を生産するために以下の方法を用いた。ｓｖＡｃｔＲＩＩＢ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）（配列番号５）をコードするポリヌクレオチド又はＡｃｔＲＩＩＢ（Ｅ２８Ｗ）（配列番号１９）をコードするポリヌクレオチドを、２８番目のＥをＷに、かつ、４４番目のＳをＴにするアミノ酸置換を生じる変異を含有するプライマーを用いたＰＣＲオーバーラップ伸長を用い、ヒンジリンカー配列（配列番号２６）をコードするポリヌクレオチドを介してヒトＩｇＧ２Ｆｃ（配列番号２２）をコードするポリヌクレオチドに融合させた。ｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧＦｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）の完全長ポリヌクレオチド配列は配列番号９であり、ＡｃｔＲＩＩＢ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧＦｃ（Ｅ２８Ｗ）の完全長配列は配列番号２０である。二本鎖ＤＮＡ断片をｐＴＴ５ベクター（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｃａｎａｄａ（ＮＲＣＣ），６１００  Ａｖｅｎｕｅ  Ｒｏｙａｌｍｏｕｎｔ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ（Ｑｕｅｂｅｃ）Ｃａｎａｄａ  Ｈ４Ｐ  ２Ｒ２）、国際公開第９０１４３６３号に記載されるｐＤＳＲα）及び／又はｐＤＳＲαの誘導体中にサブクローニングした。
【０１２５】
安定化ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃポリペプチドの一過性発現は以下の通りに行った。
【０１２６】
ｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧＦｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）（配列番号１０）、及びＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧＦｃ（Ｅ２８Ｗ）（配列番号２１）ポリペプチドを、２５０μｇ／ｍＬジェネティシン（インビトロジェン）及び０．１％プルロニックＦ６８（インビトロジェン）を添加したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）培地（インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア）中に維持した２９３−６Ｅ細胞（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ、オタワ、カナダ）に適合した血清を含まない懸濁液中一過的に発現させた。トランスフェクションを１Ｌ培地で行った。簡単には、４Ｌのフェルンバッハ振とうフラスコ中で（コーニング）細胞接種材料を１．１×１０６細胞／ｍＬになるまで成長させた。振とうフラスコ培養は、３７℃及び５％ＣＯ２に維持され、加湿された培養器中に設置した、Ｉｎｎｏｖａ  ２１５０  ｓｈａｋｅｒ  ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｎｅｗｓ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、エディソン、ニュージャージー）上で６５ＲＰＭに維持された。トランスフェクションに際しては、２９３−６Ｅ細胞を１．０×１０６細胞／ｍＬに希釈した。
【０１２７】
トランスフェクション複合体を１００ｍＬのＦｒｅｅＳｔｙｌ（商標）２９３培地（インビトロジェン）中で形成させた。１ｍｇのプラスミドＤＮＡを最初に培地に加え、その後３ｍＬのＦｕＧｅｎｅ  ＨＤ  トランスフェクション試薬（ロシュ・アプライド・サイネンス、インディアナポリス、インディアナ）を加えた。トランスフェクション複合体を室温で約１５分間温置し、その後振とうフラスコ中の細胞に加えた。トランスフェクションの２０時間後、２０％（ｗ／ｖ）のペプトンＴＮ１（Ｏｒｇａｎｏ  Ｔｅｃｈｎｉｅ  Ｓ．Ａ．、ＴｅｋｎｉｅＳｃｉｅｎｃｅ、ＱＣ、カナダ）を最終濃度が０．５％（ｗ／ｖ）に達するように加えた。トランスフェクション／発現を４〜７日間行い、その後、４℃で６０分間、４０００ＲＰＭで遠心分離することによって、馴化培地を回収した。
【０１２８】
安定なトランスフェクション及び発現を以下の通りに行った。標準的なエレクトロポレーション方法を用い、安定なＣＨＯ宿主細胞を、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧＦｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）（配列番号９）又はＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧＦｃ（Ｅ２８Ｗ）（配列番号２０）をコードするポリヌクレオチド含有する発現プラスミドと共にトランスフェクションすることによって、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ−Ｆｃ細胞株を作った。宿主細胞株と発現プラスミドをトランスフェクションした後、プラスミドの選択と細胞の回収ができるように、細胞をＧＨＴを加えない、血清を含まない選択培地中で２〜３週間生育させた。生存率が８５％を超えるまで細胞を選択する。このトランスフェクションした細胞プールをその後、１５０ｎＭのメトトレキサートを含有する培地中で培養した。
【０１２９】
６日間の発現アッセイにおいては、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）を発現している細胞のプールはＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ）を発現している細胞のプールと比較して、より高い細胞力価、生育成績、及び生産されたタンパク質の改善された特異的な生産性（ピコグラム／細胞／日）を示した。選択したプールは、例えば、０．９ｇ／ＬのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ）と比較して、約１．２ｇ／ＬのｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）を生産した。
【０１３０】
ｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８ＷＳ４４Ｔ）及びＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ）をそれぞれ発現している細胞株を、典型的なフェドバッチ法を用いて増やした。細胞をＷａｖｅ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＬＬＣ）中に播種した。ボーラス栄養を用い、培養に３回栄養を加えた。１０日目に１０Ｌを回収し、残りを１１日目に回収した。回収した両方を深層ろ過し、その後滅菌ろ過した。馴化培地を１０インチの０．４５／０．２マイクロメートルプレフィルターを通してろ過し、その後６インチの０．２マイクロメートルフィルターを通してろ過した。
【０１３１】
タンパク質の精製
２２０ｍＬのＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）カラムプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケア）に、約５Ｌの馴化培地を直接ロードした。カラムをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水：２．６７ｍＭ塩化カリウム、１３８ｍＭ塩化ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム、８．１ｍＭリン酸水素二ナトリウム、ｐＨ７．４）中で前平衡化した。カラムをＯＤ２８０での測定値がおよそゼロになるまで平衡化緩衝液で洗い、その後タンパク質を０．１Ｍ酢酸を用いて溶出した。
【０１３２】
Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ（商標）プールを、３００ｍＬＳＰ−ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア）（５ｘ１５ｃｍ）にアプライした。カラムを１０ｍＭのＮａＯＡＣ、ｐＨ５を用いて前平衡化した。カラムをその後、ＯＤ２８０での測定値がおよそ０になるまで平衡化緩衝液で洗った。カラムをカラムの２０倍量の、１０ｍＭ  ＮａＯＡＣ中の０〜１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５の勾配緩衝液で溶出した。ＳＰ−ＨＰプールを濃縮し、０．２μＭの酢酸セルロース（コーニング）フィルターを用いてろ過した。
【０１３３】
使用されたタンパク質の配列を下記の表に示す。
【０１３４】
【表１】
0005969557.tif 000002
【０１３５】
実施例２
ポリペプチドの解析
上述のように、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）工程を通して精製したｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）（配列番号１０）ポリペプチド、及びＳＰ−ＨＰカラム工程を通して精製したＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ）（配列番号２１）ポリペプチドの試料をＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて０．２ｍｇ／ｍＬに希釈した。その後、ポリペプチドのグリコシル化プロファイルをＳＥＣを用いて以下のように決定した。
【０１３６】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。実験は、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣ  システム上で２本のカラム（ＴＯＳＯＨＡＡＳ  Ｇ３０００ｓｗｘｌ、７．８ｘ３００ｍｍ）を縦一列に用いて行った。２ｘＰＢＳを移動相として、０．５ｍＬ／分で用いた。
【０１３７】
図１は、上述のプロトコルを用いたＳＥＣカラムにおけるＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ）とｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）との間の比較を示す。３つのピークを示すＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ）と比較して、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）は単一のピークを示す。これらのことは、両方のタンパク質のＦｃ二量体のＮ４２の位置におけるＮ結合型グリコシル化の度合いと対応する。ｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）ポリペプチドの単一のピークは、二量体のＮ４２の位置における完全にグリコシル化されたＮ結合型アスパラギンに対応する。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ）の３つのピークは、（左から右に）Ｎ４２における完全にグリコシル化されたアスパラギン、Ｎ４２における部分的にグリコシル化されたアスパラギン、及びＮ４２における非グリコシル化アスパラギンに対応する。さらに、このことは、このグリコシル化部位においては異種なＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ）と比較して、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）分子は完全にグリコシル化され、そのため精製することが難しいことを示している。加えて予備的な研究が、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）分子が以下に示すような改善された製造性特性の付加を有することを示している。さらなる研究がまた、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ）の最小のグリコシル化ピークが、部分的及び完全にグリコシル化された分子よりも低い物理的及び熱への安定性を有することを示した。
【０１３８】
受容体ポリペプチドのアクチビンＡ、ミオスタチン、及びＧＤＦ−１１に対するＫＤ及びＩＣ５０値の決定は、以下に記載されるように得られた。
【０１３９】
ＫｉｎＥｘＡ（商標）平衡アッセイ
リガンドのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃポリペプチドへの結合解離平衡（ＫＤ）を決定するために、ＫｉｎＥｘＡ（商標）（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）技術を用いた、液体ベースの平衡結合アッセイを使用した。ＵｌｔｒａＬｉｎｋ  Ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔ  ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）を、それぞれ約１００μｇ／ｍＬのミオスタチン、ＧＤＦ−１１、及びアクチビンＡで一晩プレコーティングし、その後ＢＳＡでブロッキングした。リガンドでコーティングしたビーズ中を通す前に、１ｐＭ及び３ｐＭのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ）（配列番号２１）及びｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）（配列番号１０）試料を、様々な濃度（０．７ｆＭから１６０ｐＭ）のミオスタチン、アクチビンＡ及びＧＤＦ−１１それぞれと共に、サンプル緩衝液中、室温で８時間、温置した。ビーズに結合した可溶性受容体の量を、ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ中に１ｍｇ／ｍＬの、蛍光（Ｃｙ５）標識したヤギ抗−ヒト‐Ｆｃ抗体によって定量した。結合シグナルは、示したミオスタチン、アクチビンＡ、又はＧＤＦ−１１濃度での平衡において、遊離した可溶性受容体の濃度に比例した。ＫＤは、ＫｉｎＥｘＡ（商標）ソフトウェア（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）中で提供された、双対曲線一部位異種結合モデルを用いた競合曲線の非線形回帰から得られた。それぞれについて得られたＫＤ値を下記の表に示す。
【０１４０】
【表２】
0005969557.tif 000003
【０１４１】
Ｃ２Ｃ１２細胞を使用した活性アッセイ
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ）（配列番号２１）及びｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）（配列番号１０）の、アクチビンＡ、ＧＤＦ−１１、又はミオスタチンの野生型アクチビンＩＩＢ受容体−Ｆｃへの結合を阻害する能力を、以下に記載したように細胞を使用した活性アッセイを用いて試験した。
【０１４２】
ミオスタチン／アクチビン／ＧＤＦ−１１反応性レポーター細胞株を、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞（ＡＴＣＣＮｏ：ＣＲＬ−１７７２）をｐＭＡＲＥ−ｌｕｃコンストラクトと共にトランスフェクションすることによって生成した。ｐＭＡＲＥ−ｌｕｃコンストラクトは、ミオスタチン／アクチビン応答エレメントであるＣＡＧＡ配列（Ｄｅｎｎｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ＥＭＢＯ１７：３０９１−３１００（１９９８））の１２回の繰り返しを、ｐＬｕｃ−ＭＣＳレポーターベクター（ストラタジーン、カタログ番号２１９０８７）のＴＡＴＡボックスの上流にクローニングすることによって作られる。Ｃ２Ｃ１２細胞は天然に、その細胞表面上にアクチビン受容体ＩＩＢを発現する。ミオスタチン／アクチビンＡ／ＧＤＦ−１１が細胞受容体に結合すると、Ｓｍａｄ経路が活性化され、リン酸化されたＳｍａｄが応答エレメントに結合し（Ｍａｃｉａｓ−Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ
８７：１２１５（１９９６））、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を起こす。ルシフェラーゼ活性をその後、市販されているルシフェラーゼレポーターアッセイキット（カタログ番号Ｅ４５５０、プロメガ、マディソン、ウィスコンシン）を用い、製造業者のプロトコルに従って測定した。下記の方法に従って活性を測定するためには、ｐＭＡＲＥ−ｌｕｃ（Ｃ２Ｃ１２／ｐＭＡＲＥ）を用いてトランスフェクションした安定なＣ２Ｃ１２細胞株を使用した。レポーター細胞を９６穴培養中にプレーティングした。濃度を４ｎＭに固定したアクチビンＡ、ミオスタチン、及びＧＤＦ−１１を用い、上述の通りに作成したＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ２Ｆｃ融合コンストラクトを使用したスクリーニングを行った。これらのリガンドをそれぞれ、いくつかの濃度の受容体とともに前保温した。処理した培養におけるルシフェラーゼ活性を決定することによって活性を測定した。ＩＣ５０値をそれぞれのポリペプチドに対して決定した。これらを以下の表に示す。これらの値を以下の表に示す。
【０１４３】
【表３】
0005969557.tif 000004
【０１４４】
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ）とｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）における細胞を使用した活性は、おおよそ同じであった。
【０１４５】
低いｐＨにおける安定性
商業上の生産過程においてウイルスを不活化させる工程が、典型的には低いｐＨ、例えば、約３．０から４．０の間で行われることから、低いｐＨにおけるタンパク質の安定性は、タンパク質の製造性を考える上で有用な指標である。
【０１４６】
商業上のタンパク質精製におけるウイルス不活化工程中に経験される低いｐＨでの、短時間のタンパク質安定性効果を評価するために、以下の試験を行った。それぞれのタンパク質を１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５で１０ｍｇ／ｍＬに希釈した。これを２５℃に保存し、ＳＥＣ解析を用いて０時間、２時間、２４時間の時点で解析した。ＳＥＣ解析は上述した通りに行い、の凝集のパーセンテージを決定した。
【０１４７】
【表４】
0005969557.tif 000005
【０１４８】
このように、４時間目においてｐＨ３．５で生産される高分子量凝集のパーセンテージは、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ）よりもｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）において実質的に低い。
【０１４９】
さらなる研究において、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）がｐＨ３．０、３．５及び５．０への暴露からのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ）よりも良い可逆性を示すこと、及び全てのｐＨにおいてｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８、Ｓ４４Ｔ）がＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ）よりも均一であることが示された。
【０１５０】
このように、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）ポリペプチドがアクチビンＡ、ミオスタチン、及びＧＤＦ−１１活性を阻害する能力を保持しながらも、改善された製造性製造性特性、特に低いｐＨでの安定性、及びＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ）と比較して全てのｐＨでのより高い安定性を有することが示される。
【０１５１】
実施例３
インビボでの効果の決定
１１週齢のメスのＣ５７Ｂｌ／６マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。マウス（１群につき１０匹）にｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）（配列番号１０）又は媒体（ＰＢＳ）を単回投与（１０ｍｇ／ｋｇ）した。それぞれの群の１０匹の動物において、用量投与後３、４、１０及び１４日の時点での除脂肪体重を、ＮＭＲ（ＰＩＸＩｍｕｓ、ＧＥ  ＬＵＮＡＲ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって決定した。それぞれの群のマウスにおける結果を図２に示した。ｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）の単回投与が、動物において除脂肪体重を有意に増加させることがわかる。（Ｐ＜０．００１、反復測定ＡＮＯＶＡに基づく。ｎ＝１０動物／群）。
【０１５２】
用量反応効果を決定するための研究を以下の通りに行った。漸増単回投与で、ＰＢＳ中に０、０．３、３、１０、及び３０ｍｇ／ｋｇのｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）（配列番号１０）を、１０〜１２週齢のメスのＣ５７Ｂｌ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に皮下的に投与した。試験開始時には、ＰＢＳ対象群を含めて、それぞれの用量群に６匹の動物が割り当てられた。４２日の試験期間中、２日から４日毎に、除脂肪体重をＮＭＲ（ＰＩＸＩｍｕｓ、ＧＥ  ＬＵＮＡＲ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって決定した。それぞれの週の終わりには、さらなるデータを得るために、それぞれの群から１匹の動物を処分し（それぞれの週につき、全６群から合計６匹）、その後の週については、残りの動物における除脂肪体重を決定した。結果を図３に示す。ｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）ポリペプチドが用量依存的に、全ての用量において、動物の筋肉量を有意に増加させたことがわかる。
【０１５３】
さらなる研究においては、対照群（ＰＢＳを投与した）と比較して、１０ｍｇ／ｋｇのそれぞれの可溶性受容体の単回投与後の除脂肪体重の増加及び体重の変化を測定するために、メスのＣ５７Ｂｌ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１群あたり１０匹）においてＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ）（配列番号２１）とｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）（配列番号１０）との間の直接の比較を行った。除脂肪体重はＮＭＲ（ＰＩＸＩｍｕｓ、ＧＥ  ＬＵＮＡＲ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって決定し、体重の変化は３７日間、定期的に動物の体重を測定することによって決定した。この比較研究の終わりにおける結果は、除脂肪体重が５％上昇し、体重が９％増加した対照群と比較して、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ）（配列番号２１）は２４％の除脂肪体重の増加と２５％の体重の増加を、及びｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）（配列番号１０）は２５％の除脂肪体重の増加と２０％の体重の増加を示したというものであった。
【０１５４】
さらに、ｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）は、改善された製造性製造性特性を有しながらも、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ）と比較して、同等のインビボ効果を保持することがわかる。
【０１５５】
実施例４
改変されたヒンジリンカーを含む改善された製造性
安定化ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）ポリペプチドのタンパク質発現及び製造性のさらなる改善を試験するために、さらにリンカー及び改変されたヒンジ領域のコンストラクトを作成した。ヒンジリンカー＃１の変更に基づく改変されたリンカー／ヒンジ配列を、Ｍｉｋａｅｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，５７，１９３−２０２（１９９６）及びよく知られた方法論に従って、オーバーラップ伸長ＰＲＣ突然変異生成法を用いて生成した。
【０１５６】
ＩｇＧ２Ｆｃ融合体と共により良く機能するように設計された、改変されたヒンジリンカーは、以下に示すヒンジリンカー＃２〜７である（ヒンジリンカー＃１配列と比較して）。
【０１５７】
ヒンジリンカー＃１ポリヌクレオチド
ｇｇａｇｇｇｇｇａｇｇａｔｃｔｇｔｃｇａｇｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａ（配列番号２６）
【０１５８】
ヒンジリンカー＃１ポリペプチド
ＧＧＧＧＳＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号２７）
【０１５９】
ヒンジリンカー＃２ポリヌクレオチド
ｇｇａｇｇｇｇｇａｇｇａｔｃｔｇａｇｃｇｃａａａｔｇｔｔｇｔｇｔｃｇａｇｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃ（配列番号３７）
【０１６０】
ヒンジリンカー＃２ペプチド
ＧＧＧＧＳＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣ（配列番号３８）
【０１６１】
ヒンジリンカー＃３ポリヌクレオチド
ｇｇａｇｇｇｇｇａｇｇａｔｃｔｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｔｔｃａｇｇｔｃｃａｃｃｇｔｇｃ（配列番号３９）
【０１６２】
ヒンジリンカー＃３ペプチド
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＰＰＣ（配列番号４０）
【０１６３】
ヒンジリンカー＃４ポリヌクレオチド
ｇｇａｇｇｇｇｇａｇｇａｔｃｔｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｔｔｃａｇｇｔｃｃａｃｃｇｇｇａ（配列番号４１）。
【０１６４】
ヒンジリンカー＃４ペプチド
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＰＰＧ（配列番号４２）
【０１６５】
ヒンジリンカー＃５ポリヌクレオチド
ｇｇａｇｇｇｇｇａｇｇａｔｃｔｇａｇｃｇｃａａａｔｇｔｃｃａｃｃｔｔｇｔｇｔｃｇａｇｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃ（配列番号４３）
【０１６６】
ヒンジリンカー＃５ペプチド
ＧＧＧＧＳＥＲＫＣＰＰＣＶＥＣＰＰＣ（配列番号４４）
【０１６７】
ヒンジリンカー＃６ペプチド
ＧＰＡＳＧＧＰＡＳＧＰＰＣＰ（配列番号４５）
【０１６８】
ヒンジリンカー＃７ペプチド
ＧＰＡＳＧＧＰＡＳＧＣＰＰＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号４６）
【０１６９】
以下のヒンジリンカー＃８から＃１０は、ＩｇＧ１Ｆｃ（配列番号２３）又は下記に示す改変されたＩｇＧ１Ｆｃ（配列番号４７）と共により良く機能するように設計された。
【０１７０】
改変されたＩｇＧ１Ｆｃ
ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４７）
【０１７１】
ヒンジリンカー＃８ペプチド
ＧＧＧＧＳＶＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号４８）
【０１７２】
ヒンジリンカー＃９ペプチド
ＧＧＧＧＳＶＤＫＴＨＴＧＰＰＣＰ（配列番号４９）
【０１７３】
ヒンジリンカー＃１０ペプチド
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＤＫＴＨＴＧＰＰＣＰ（配列番号５０）
【０１７４】
改変されたヒンジリンカー配列とｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）との試験を以下の通りに行った。上記に示したｓｖＡｃｔＲＩＩＢ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）（配列番号５）をコードするポリヌクレオチド、改変されたヒンジリンカーをコードするポリヌクレオチド、及びＩｇＧ２Ｆｃ（配列番号２２）をコードするポリヌクレオチド、又はＩｇＧ１Ｆｃ（配列番号２３）をコードするポリヌクレオチド又は改変されたＩｇＧ１Ｆｃ（配列番号４７）を実施例１に記載したようにベクター中にサブクローニングし、Ｄｕｒｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０，Ｎｏ．３，ｅ９（２００２）に記載されたようなＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３培地の代わりに、１．１ｍｇ／ｍＬプルロニック、６ｍＭＬ−グルタミン及び２５μｇ／ｍＬジェネティシン（インビトロジェン）を添加したＦ１７培地（インビトロジェン）を用いるという変更を加えて、実施例１に記載したように一過性２９３−６Ｅ発現系を用いて発現させた。トランスフェクション後、培養を３７℃で７日間生育させた。細胞を除去するために一部を遠心分離し、上清をローディングバッファーと混合し、その後熱処理し、ウエスタンブロットによる解析用に４〜２０％トリス−グリシンゲルにロードした。ニトロセルロース膜にタンパク質を転写した後、試料を、１：１０００に希釈したペルオキシダーゼ結合抗−ヒトＦｃ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ＃３１４２３）と結合させた。
【０１７５】
タンパク質の精製は以下の方法を用いて行った。ｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ変異体を含有する約０．２５Ｌの馴化培地を、５ｆｔ２  １０Ｋ膜の接線流ろ過フィルターを用いて濃縮した。濃縮した材料を、ＰＢＳ（塩化マグネシウム及び塩化カルシウムを含まないダルベッコ）で平衡化した５ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｃｏｌｕｍｎ（商標）（ＧＥヘルスケア）にアプライした。カラムを平衡化緩衝液で、２８０ｎｍ（ＯＤ２８０）での吸収が０．１未満になるまで洗った後、結合したタンパク質を０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．７で溶出し、直ちに１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５で中和した。
【０１７６】
凝集の割合のパーセンテージ及び半分子の割合のパーセンテージを以下の方法によって決定した。それぞれの試料の５０μｌ部分を２本のサイズ排除カラム（ＴＯＳＯＨＡＡＳ
Ｇ３０００ｓｗｘｌ）を縦一列に有したＨＰＬＣシステムに注入することにより、変性サイズ排除クロマトグラフィーの実験を行った。移動相はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の５Ｍ  ＧｕＨＣｌを含有する。全ての試料を７Ｍ  ＧｕＨＣｌを含むＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍＬに希釈した。凝集の割合のパーセンテージを、主要なピークの前に溶出されたピーク面積の合計から決定し、半分子の割合のパーセンテージを主要なピークの後に溶出されたピーク面積の合計から決定した。半分子は不活性半分子を示すと考えられる。
【０１７７】
様々なヒンジリンカーを含むｓｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）の凝集及び半分子分布を以下の表に示す。
【０１７８】
【表５】
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【０１７９】
不活性半分子生産のパーセンテージを減少させることによる、これらの予備的な試験から、このように特定のリンカーが安定化ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ、Ｓ４４Ｔ）の製造性を改善する可能性がある。
【０１８０】
【表６】
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【０１８１】
本発明は、本発明の個別の態様の１つの説明を意図する、本明細書で記載された特定の実施形態によってその範囲を限定されず、かつ、機能的に同等の方法及び構成要素は本発明の範囲に含まれる。実際、前述の明細書及び添付の図表から、当業者は、本明細書で示され、記載されたものに加えて、本発明の様々な変更を理解するだろう。それらの変更は添付の請求項の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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