(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＢＭＰ−６（配列番号：１）に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲは相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ならびに前記ＨＣＶＲはＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１はＲＳＳＥＮＩＹＲＮＬＡ（配列番号：２）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ２はＡＡＴＮＬＡＤ（配列番号：３）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ３はＱＧＩＷＧＴＰＬＴ（配列番号：４）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ１はＧＹＴＦＴＳＹＡＭＨ（配列番号：５）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ２はＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＮＦＫＧ（配列番号：６）またはＹＩＮＰＹＮＲＧＴＫＹＮＥＮＦＫＧ（配列番号：７）のポリペプチドであり、および前記ＨＣＤＲ３はＲＰＦＧＮＡＭＤＩ（配列番号：８）のポリペプチドである、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記ＬＣＤＲ１がＲＳＳＥＮＩＹＲＮＬＡ（配列番号：２）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ２がＡＡＴＮＬＡＤ（配列番号：３）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ３がＱＧＩＷＧＴＰＬＴ（配列番号：４）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ１がＧＹＴＦＴＳＹＡＭＨ（配列番号：５）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ２がＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＮＦＫＧ（配列番号：６）のポリペプチドであり、および前記ＨＣＤＲ３がＲＰＦＧＮＡＭＤＩ（配列番号：８）のポリペプチドである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記ＬＣＤＲ１がＲＳＳＥＮＩＹＲＮＬＡ（配列番号：２）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ２がＡＡＴＮＬＡＤ（配列番号：３）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ３がＱＧＩＷＧＴＰＬＴ（配列番号：４）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ１がＧＹＴＦＴＳＹＡＭＨ（配列番号：５）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ２がＹＩＮＰＹＮＲＧＴＫＹＮＥＮＦＫＧ（配列番号：７）のポリペプチドであり、および前記ＨＣＤＲ３がＲＰＦＧＮＡＭＤＩ（配列番号：８）のポリペプチドである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含み、前記ＬＣＶＲは配列番号：９のポリペプチドであり、および前記ＨＣＶＲは配列番号：１０または配列番号：１１のポリペプチドである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
前記ＬＣＶＲが配列番号：９のポリペプチドであり、および前記ＨＣＶＲが配列番号：１０のポリペプチドである、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記ＬＣＶＲが配列番号：９のポリペプチドであり、および前記ＨＣＶＲが配列番号：１１のポリペプチドである、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣは配列番号：１２のポリペプチドであり、および前記ＨＣは配列番号：１３または配列番号：１４のポリペプチドである、請求項１または４に記載の抗体。
【請求項８】
前記ＬＣが配列番号：１２のポリペプチドであり、および前記ＨＣが配列番号：１３のポリペプチドである、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
前記ＬＣが配列番号：１２のポリペプチドであり、および前記ＨＣが配列番号：１４のポリペプチドである、請求項７に記載の抗体。
【請求項１０】
２個の軽鎖および２個の重鎖を含み、各軽鎖は配列番号：１２のポリペプチドであり、および各重鎖は配列番号：１３のポリペプチドである、請求項１、４、および７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
２個の軽鎖および２個の重鎖を含み、各軽鎖は配列番号：１２のポリペプチドであり、および各重鎖は配列番号：１４のポリペプチドである、請求項１、４、および７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片および許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
治療に使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
貧血の治療に使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
前記貧血が慢性疾患の貧血である、請求項１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１６】
前記慢性疾患の貧血が癌性貧血および慢性腎疾患の貧血からなる群より選択される、請求項１５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医学分野に関する。より特には、本発明はヒトＢＭＰ−６に結合する抗体またはその抗原結合断片に関し、慢性疾患の貧血（ＡＣＤ）（例、癌性貧血）または慢性腎疾患（ＣＫＤ）の貧血を治療するために有用である場合がある。
【背景技術】
【０００２】
ＢＭＰ−６は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ファミリーのメンバーであり、ＢＭＰファミリーには２０より多くのメンバーがある。ＢＭＰファミリーメンバーは、細胞の転写調節へとつながるＳＭＡＤ経路で情報伝達を開始するリガンドである。ＢＭＰ−６ノックアウトマウスは生存可能且つ生殖能力があり、正常な骨及び軟骨発生を示すことが報告されている。一方で、近縁種であるＢＭＰ−７のノックアウトマウスは、腎臓、眼、および骨の欠損があり出生後に死亡する。ＢＭＰ−６またはＢＭＰ−７のいずれかの個々のノックアウトは心臓発生に変化を生じないことが示されているが、ＢＭＰ−６とＢＭＰ−７のダブルノックアウトは心臓にいくつかの欠損と遅延を示し、胎仔は心不全のため死亡した。ＢＭＰ−７の存在は、マウスモデルにおいて、線維症と関連する慢性心疾患の進行を阻害するのに重要であることも示されている。従って、ＢＭＰ−６抗体を用いてヒトＢＭＰ−６を阻害する場合、ＢＭＰ−７に対する交差反応性はおそらく望ましくない。
【０００３】
過剰な炎症性サイトカインが鉄恒常性の制御不全、赤血球形成の減少、および赤血球寿命の低下を引き起こす場合、ある種の慢性疾患（例、がん、腎臓病、および自己免疫疾患）はＡＣＤを導き得る。ヘプシジンは鉄恒常性に関与する重要なホルモンとして同定された。高濃度のヘプシジンはＡＣＤ中で見られる鉄制限赤血球形成と関連している。ＢＭＰ−６はヘプシジン発現を上昇させることが示されている。
【０００４】
特許文献１はヒトＢＭＰ−６に対して作製されたマウス抗体のマウスへの投与を開示した。Ｒ＆Ｄシステムズから市販されたマウス抗体ＭＡＢ５０７を用いた３日間の治療法後のある時点で、ヘプシジンの減少と鉄の増加が報告された。複数のＢＭＰに対する選択性もまた開示され、ＢＭＰ−６抗体ＭＡＢ５０７の投与がＢＭＰ−７をある投薬量で阻害することが示された。しかしながら、現状では、ＢＭＰ−６をターゲットとする抗体が治療用途に承認されたものはない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０５６９８１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
別のＢＭＰ−６抗体を提供する必要性がまだ残っている。特に、ＢＭＰ−７を含む他のＢＭＰファミリーメンバーに対してＢＭＰ−６に選択的な、効き目のあるＢＭＰ−６抗体を提供する必要性がまだ残っている。ＢＭＰ−７を含む他のＢＭＰファミリーメンバーに対してＢＭＰ−６に選択的で、長期薬動力学的応答を生み出す効き目のあるＢＭＰ−６抗体を提供する必要性もまだ残っている。ＡＣＤの治療のために、ＢＭＰ−７を含む他のＢＭＰファミリーメンバーに対してＢＭＰ−６に選択的な、効き目のあるＢＭＰ−６抗体を提供する必要性もまだ残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って、本発明が提供するのは、ヒトＢＭＰ−６（配列番号：１）に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲは相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲはＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１はＲＳＳＥＮＩＹＲＮＬＡ（配列番号：２）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ２はＡＡＴＮＬＡＤ（配列番号：３）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ３はＱＧＩＷＧＴＰＬＴ（配列番号：４）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ１はＧＹＴＦＴＳＹＡＭＨ（配列番号：５）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ２はＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＮＦＫＧ（配列番号：６）またはＹＩＮＰＹＮＲＧＴＫＹＮＥＮＦＫＧ（配列番号：７）のポリペプチドであり、および前記ＨＣＤＲ３はＲＰＦＧＮＡＭＤＩ（配列番号：８）のポリペプチドである。
【０００８】
ある実施形態で、本発明が提供するのは、ヒトＢＭＰ−６（配列番号：１）に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲは相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲはＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１はＲＳＳＥＮＩＹＲＮＬＡ（配列番号：２）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ２はＡＡＴＮＬＡＤ（配列番号：３）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ３はＱＧＩＷＧＴＰＬＴ（配列番号：４）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ１はＧＹＴＦＴＳＹＡＭＨ（配列番号：５）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ２はＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＮＦＫＧ（配列番号：６）のポリペプチドであり、および前記ＨＣＤＲ３はＲＰＦＧＮＡＭＤＩ（配列番号：８）のポリペプチドである。
【０００９】
ある実施形態で、本発明が提供するのは、ヒトＢＭＰ−６（配列番号：１）に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲは相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲはＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１はＲＳＳＥＮＩＹＲＮＬＡ（配列番号：２）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ２はＡＡＴＮＬＡＤ（配列番号：３）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ３はＱＧＩＷＧＴＰＬＴ（配列番号：４）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ１はＧＹＴＦＴＳＹＡＭＨ（配列番号：５）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ２はＹＩＮＰＹＮＲＧＴＫＹＮＥＮＦＫＧ（配列番号：７）のポリペプチドであり、および前記ＨＣＤＲ３はＲＰＦＧＮＡＭＤＩ（配列番号：８）のポリペプチドである。
【００１０】
ある実施形態で、本発明が提供するのは、ヒトＢＭＰ−６（配列番号：１）に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含み、前記ＬＣＶＲは配列番号：９のポリペプチドであり、および前記ＨＣＶＲは配列番号：１０または配列番号：１１のポリペプチドである。さらなる実施形態で、本発明が提供するのは、ヒトＢＭＰ−６（配列番号：１）に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含み、前記ＬＣＶＲは配列番号：９のポリペプチドであり、および前記ＨＣＶＲは配列番号：１０のポリペプチドである。別の実施形態で、本発明が提供するのは、ヒトＢＭＰ−６（配列番号：１）に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含み、前記ＬＣＶＲは配列番号：９のポリペプチドであり、および前記ＨＣＶＲは配列番号：１１のポリペプチドである。
【００１１】
ある実施形態で、本発明が提供するのは、ヒトＢＭＰ−６（配列番号：１）に結合する抗体であって、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含み、前記ＬＣＶＲは配列番号：９のポリペプチドであり、および前記ＨＣＶＲは配列番号：１０または配列番号：１１のポリペプチドである。さらなる施形態で、本発明が提供するのは、ヒトＢＭＰ−６（配列番号：１）に結合する抗体であって、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含み、前記ＬＣＶＲは配列番号：９のポリペプチドであり、および前記ＨＣＶＲは配列番号：１０のポリペプチドである。別の実施形態で、本発明が提供するのは、ヒトＢＭＰ−６（配列番号：１）に結合する抗体であって、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含み、前記ＬＣＶＲは配列番号：９のポリペプチドであり、および前記ＨＣＶＲは配列番号：１１のポリペプチドである。
【００１２】
ある実施形態で、本発明が提供するのは、ヒトＢＭＰ−６（配列番号：１）に結合する抗体であって、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣは配列番号：１２のポリペプチドであり、および前記ＨＣは配列番号：１３または配列番号：１４のポリペプチドである。さらなる実施形態で、本発明が提供するのは、ヒトＢＭＰ−６（配列番号：１）に結合する抗体であって、ＬＣおよびＨＣを含み、前記ＬＣは配列番号：１２のポリペプチドであり、および前記ＨＣは配列番号：１３のポリペプチドである。別の実施形態で、本発明が提供するのは、ヒトＢＭＰ−６（配列番号：１）に結合する抗体であって、ＬＣおよびＨＣを含み、前記ＬＣは配列番号：１２のポリペプチドであり、および前記ＨＣは配列番号：１４のポリペプチドである。
【００１３】
ある実施形態で、本発明が提供するのは、ヒトＢＭＰ−６（配列番号：１）に結合する抗体であって、２個の軽鎖および２個の重鎖を含み、各軽鎖は配列番号：１２のポリペプチドであり、および各重鎖は配列番号：１３のポリペプチドである。ある実施形態で、本発明が提供するのは、ヒトＢＭＰ−６（配列番号：１）に結合する抗体であって、２個の軽鎖および２個の重鎖を含み、各軽鎖は配列番号：１２のポリペプチドであり、および各重鎖は配列番号：１４のポリペプチドである。
【００１４】
本発明はまた、ＲＮＡの形態または（ｃＤＮＡを含むＤＮＡである）ＤＮＡおよび合成ＤＮＡの形態であってもよい、本発明の上記抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドに関する。前記ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であってもよい。本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードするコーディング配列は、遺伝コードの重複または縮重の結果、異なる場合がある。
【００１５】
ある実施形態で、本発明が提供するのは、配列番号：１３のアミノ酸配列または配列番号：１４のアミノ酸配列を有する重鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子である。ある実施形態で、本発明が提供するのは、配列番号：１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子である。
【００１６】
ある実施形態で、本発明が提供するのは、配列番号：１３のアミノ酸配列を有する重鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、および配列番号：１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子である。ある実施形態で、本発明が提供するのは、配列番号：１４のアミノ酸配列を有する重鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、および配列番号：１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子である。
【００１７】
本発明のポリヌクレオチドは、前記配列が発現制御配列に機能的に連結された後に宿主細胞中で発現される。発現ベクターは、典型的には、エピソームまたは宿主染色体ＤＮＡに組み込まれた一部としてのいずれかで宿主生物中で複製可能である。一般的には、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするために、発現ベクターは選択マーカー（例、テトラサイクリン、ネオマイシン、およびジヒドロ葉酸還元酵素）を含む。
【００１８】
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、哺乳類細胞（例、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＨＥＫ２９３若しくはＣＯＳ細胞）、大腸菌細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、若しくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、または真菌もしくは酵母細胞中で容易に生産可能である。宿主細胞を、当該技術分野で周知の技術を使って培養する。
【００１９】
目的のポリヌクレオチド配列（例、抗体またはその抗原結合断片のポリペプチドおよび発現コントロール配列）を含むベクターは、細胞宿主の種類に依存して異なる周知の方法により宿主細胞に移行可能である。例えば、塩化カルシウム形質転換が原核細胞に一般的に利用されるが、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが他の細胞宿主に対して使用可能である。
【００２０】
ある実施形態で、本発明が提供するのは、本発明の一又は複数のＤＮＡ分子を含む哺乳類細胞であって、前記細胞は配列番号：１３のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号：１２のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体を発現することができる。ある実施形態で、本発明が提供するのは、本発明の複数のＤＮＡ分子を含む哺乳類細胞であって、前記細胞は配列番号：１４のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号：１２のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体を発現することができる。
【００２１】
ある実施形態で、本発明が提供するのは、アミノ酸配列が配列番号：１３である重鎖およびアミノ酸配列が配列番号：１２である軽鎖を含む本発明の抗体を生産する方法であって、本発明の哺乳類細胞を前記抗体が発現されるような条件下で培養する工程、および前記発現抗体を回収する工程を含む、方法である。ある実施形態で、本発明が提供するのは、アミノ酸配列が配列番号：１４である重鎖およびアミノ酸配列が配列番号：１２である軽鎖を含む本発明の抗体を生産する方法であって、本発明の哺乳類細胞を前記抗体が発現されるような条件下で培養する工程、および前記発現抗体を回収する工程を含む、方法である。さらなる実施形態では、本発明は、本発明の方法により生産される抗体を提供する。
【００２２】
ある実施形態では、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合断片および許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。より特には、本発明の前記組成物は、一又は複数の追加的治療剤をさらに含む。
【００２３】
ある実施形態では、本発明は、貧血を治療する方法であって、治療の必要がある患者に有効量の本発明の抗体またはその抗原結合断片を投与する工程を含む、方法を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、貧血を治療する方法であって、有効量の本発明の抗体またはその抗原結合断片を投与する工程を含み、前記貧血が慢性疾患の貧血である、方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、貧血を治療する方法であって、有効量の本発明の抗体またはその抗原結合断片を投与する工程を含み、前記慢性疾患の貧血が癌性貧血および慢性腎疾患の貧血からなる群より選択される、方法を提供する。
【００２４】
ある実施形態では、本発明は、ヘプシジン関連鉄制限貧血を治療する方法であって、治療の必要がある患者に有効量の本発明の抗体またはその抗原結合断片を投与する工程を含む、方法を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、ヘプシジン関連鉄制限貧血を治療する方法であって、有効量の本発明の抗体またはその抗原結合断片を投与する工程を含み、前記ヘプシジン関連鉄制限貧血が癌性貧血および慢性腎疾患の貧血からなる群より選択される、方法を提供する。
【００２５】
ある実施形態では、本発明は、鉄剤不応性鉄欠乏性貧血（ＩＲＩＤＡ）を治療する方法であって、治療の必要がある患者に有効量の本発明の抗体またはその抗原結合断片を投与する工程を含む、方法を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、ＩＲＩＤＡを治療する方法であって、治療の必要がある患者に有効量の本発明の抗体またはその抗原結合断片を投与する工程を含み、ＩＲＩＤＡがＴＭＰＲＳＳ６遺伝子中の欠損により引き起こされる、方法を提供する。
【００２６】
ある実施形態では、本発明は、シェーグレン症候群を治療する方法であって、治療の必要がある患者に有効量の本発明の抗体またはその抗原結合断片を投与する工程を含む、方法を提供する。
【００２７】
ある実施形態では、本発明は、血清鉄レベル、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させる方法であって、その増加の必要がある患者に有効量の本発明の抗体またはその抗原結合断片を投与する工程を含む、方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、血清鉄レベルを増加させる方法であって、その増加の必要がある患者に有効量の本発明の抗体またはその抗原結合断片を投与する工程を含む、方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、網状赤血球数を増加させる方法であって、その増加の必要がある患者に有効量の本発明の抗体またはその抗原結合断片を投与する工程を含む、方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、赤血球数を増加させる方法であって、その増加の必要がある患者に有効量の本発明の抗体またはその抗原結合断片を投与する工程を含む、方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、ヘモグロビンを増加させる方法であって、その増加の必要がある患者に有効量の本発明の抗体またはその抗原結合断片を投与する工程を含む、方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、ヘマトクリットを増加させる方法であって、その増加の必要がある患者に有効量の本発明の抗体またはその抗原結合断片を投与する工程を含む、方法を提供する。
【００２８】
ある実施形態では、本発明は、治療に使用するための、本発明の抗体またはその抗原結合断片を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、貧血の治療に使用するための、本発明の抗体またはその抗原結合断片を提供する。別の実施形態では、本発明は、慢性疾患の貧血の治療に使用するための、本発明の抗体またはその抗原結合断片を提供する。別の実施形態では、本発明は、慢性腎疾患の貧血または癌性貧血の治療に使用するための、本発明の抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００２９】
ある実施形態では、本発明は、ヘプシジン関連鉄制限貧血の治療に使用するための、本発明の抗体またはその抗原結合断片を提供する。別の実施形態では、本発明は、癌のヘプシジン関連鉄制限貧血の治療に使用するための、本発明の抗体またはその抗原結合断片を提供する。別の実施形態では、本発明は、慢性腎疾患のヘプシジン関連鉄制限貧血の治療に使用するための、本発明の抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００３０】
ある実施形態では、本発明は、ＩＲＩＤＡの治療に使用するための、本発明の抗体またはその抗原結合断片を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、ＩＲＩＤＡがＴＭＰＲＳＳ６遺伝子中の欠損により引き起こされる、ＩＲＩＤＡの治療に使用するための、本発明の抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００３１】
ある実施形態では、本発明は、シェーグレン症候群の治療に使用するための、本発明の抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００３２】
ある実施形態では、本発明は、医薬品の製造のための、本発明の抗体またはその抗原結合断片の使用を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、貧血治療用の医薬品の製造のための、本発明の抗体またはその抗原結合断片の使用を提供する。別の実施形態では、本発明は、慢性疾患の貧血治療用の医薬品の製造のための、本発明の抗体またはその抗原結合断片の使用を提供する。別の実施形態では、本発明は、慢性腎疾患の貧血治療用の医薬品の製造のための、本発明の抗体またはその抗原結合断片の使用を提供する。別の実施形態では、本発明は、癌性貧血治療用の医薬品の製造のための、本発明の抗体またはその抗原結合断片の使用を提供する。
【００３３】
ある実施形態では、本発明は、ＩＲＩＤＡ治療用の医薬品の製造のための、本発明の抗体またはその抗原結合断片の使用を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、ＩＲＩＤＡがＴＭＰＲＳＳ６遺伝子中の欠損により引き起こされる、ＩＲＩＤＡ治療用の医薬品の製造のための、本発明の抗体またはその抗原結合断片の使用を提供する。
【００３４】
ある実施形態では、本発明は、シェーグレン症候群治療用の医薬品の製造のための、本発明の抗体またはその抗原結合断片の使用を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
「抗体」の一般的構造は当該技術分野でとりわけ周知である。ＩｇＧ型の抗体については、鎖内および鎖間ジスルフィド結合を介して架橋される４本のアミノ酸鎖（２本の「重」鎖および２本の「軽」鎖）がある。抗体については、重鎖の一つが軽鎖の一つと鎖間ジスルフィド結合を形成し、他の重鎖は他の軽鎖と鎖間ジスルフィド結合を形成し、そして、重鎖の一つが他の重鎖と２個の鎖間ジスルフィド結合を形成する。抗原結合断片は、抗体の断片（例、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、またはｄｉ−ｓｃＦｖ）である。
【００３６】
ある種の生物系で発現されると、Ｆｃ領域に糖鎖付加されるヒトＦｃ配列を有する抗体がある。抗体は他の位置でも糖鎖付加される場合がある。当業者は、本発明の抗体がそのような糖鎖付加を含む可能性があることを理解する。典型的には、糖鎖付加は抗体のＦｃ領域のよく保存されたＮ−グリコシル化部位で起こる。Ｎ−グリカンは一般的にはアスパラギンに結合する。配列番号決定法によるアスパラギン２９５が、本発明の抗体のグリコシル化部位であると予想される。
【００３７】
本発明の抗体は、ヒトゲノム配列由来のフレームワークと定常領域と同一または実質的に同一な、ヒトを起源とするフレームワーク、ヒンジ領域、および定常領域を有するように設計された人工抗体である。完全ヒトフレームワーク、ヒンジ領域、および定常領域は、ヒト生殖系列配列ならびに自然発生する体細胞突然変異を有する配列および／または人工的な変異を有する配列である。本発明の抗体は、一若しくは複数のアミノ酸置換、欠失、または付加をその中に含む完全ヒトフレームワーク、ヒンジ領域、または定常領域由来のフレームワーク、ヒンジ領域、または定常領域を含んでもよい。さらに、本発明の抗体は、ヒトにおいて実質的に非免疫原性である。
【００３８】
抗体Ｉは二本の軽鎖と二本の重鎖を含み、各軽鎖は配列番号：１２のポリペプチドからなり、そして、各重鎖は配列番号：１３のポリペプチドからなる。抗体ＩＩは二本の軽鎖と二本の重鎖を含み、各軽鎖は配列番号：１２のポリペプチドからなり、そして、各重鎖は配列番号：１４のポリペプチドからなる。抗体Ｉの各重鎖をコードする特定のＤＮＡ分子は配列番号：１６であり、そして、抗体Ｉの各軽鎖をコードする特定のＤＮＡ分子は配列番号：１５である。抗体ＩＩの各重鎖をコードする特定のＤＮＡ分子は配列番号：１７であり、そして、抗体ＩＩの各軽鎖をコードする特定のＤＮＡ分子は配列番号：１５である。
【００３９】
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、当該技術分野で周知の技術（例、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、そのような技術の組み合わせ、または当該技術分野でよく知られた他の技術）を使用して生産することができる。抗体の生産および精製方法は当該技術分野で周知であり、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（抗体）、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ラボマニュアル）、Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第５〜８および１５章、ＩＳＢＮ０−８７９６９−３１４−２に見出すことができる。
【００４０】
ＣＫＤの貧血は、ＣＫＤに罹患する患者の初期および共通の合併症である貧血である。癌性貧血は血液悪性腫瘍およびいくつかの固形腫瘍が原因の貧血である。一方、化学療法誘導性貧血は、化学療法剤でがん患者を治療することが原因の貧血である。ＣＫＤ貧血は、他の症状の中で、糖尿病性神経障害、心血管疾患、および網膜症を悪化させる。がん関連貧血は、相対的死亡リスクが増加することと相関する。がん関連貧血に対する現状の治療選択肢が輸血に限定されているのは、赤血球産生促進剤が化学療法誘導性貧血にのみ適用があるからである。
【００４１】
本明細書中でヒトＢＭＰ−６に対するＢＭＰ−６抗体またはその抗原結合断片の親和力に言及するのに用いられる「結合」は、特に他に指摘がない場合、約１×１０−８Ｍ未満、好ましくは約１×１０−９Ｍ未満の（本明細書中に基本的に記載される表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサを３７℃で使用することを含む、当該技術分野で既知の一般的方法により決定される）ＫＤを意味することを意図している。
【００４２】
本発明の抗体に言及して本明細書中で使用される用語「選択的」は、（限定はされないが、ヒトＢＭＰ−５若しくはヒトＢＭＰ−７を含む）ＢＭＰファミリーの少なくとも一つのメンバーに結合する抗体よりも、ヒトＢＭＰ−６に約１０００、５００、２００、１００、５０、１０、または約５倍低いＫＤ（３７℃での表面プラズモン共鳴により測定されるもの）で結合する抗体を指す。追加的にまたは代替的に、本明細書中の以下の実施例２〜３に記載される方法で測定する場合、本発明のＢＭＰ−６選択的抗体またはその抗原結合断片はヒトＢＭＰ−６に結合するが、（限定はされないが、ヒトＢＭＰ−５若しくはヒトＢＭＰ−７を含む）ヒトＢＭＰファミリーの少なくとも一つのメンバーに結合しないか又は最小限だけ結合する。
【００４３】
「有効量」は、研究者、医者、若しくは医療従事者が対象としてる組織、システム、動物、哺乳類若しくはヒトへの所望の治療効果または生物学的若しくは医学的応答を示す本発明の抗体あるいは本発明の抗体を含む医薬組成物の量を意味する。抗体の有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する抗体の能力のような因子に従って変わりうる。有効量はまた、治療的有益な効果が、抗体の任意の毒性または有害作用をも上回るものである。
【００４４】
用語「治療」、「治療する」および「治療すること」等は、疾患の進行を減速または逆転させることを含むような意味である。これらの用語はまた、疾患若しくは状態が実際には除去されなくても及び疾患若しくは状態の進行がそれ自体減速若しくは逆転されないとしても、前記疾患若しくは状態の一又は複数の症状を緩和し、改善し、減弱し、除去し、あるいは軽減することを含む。患者は、ＢＭＰ−６活性の阻害により利益を得るであろう病気、疾患、または状態を有する哺乳類、好ましくはヒトのことを指す。
【００４５】
本発明の抗体若しくはその抗原結合断片またはそれを含む医薬組成物は、非経口経路（例、皮下、静脈内、腹腔内、筋中、または経皮）で投与してもよい。本発明の抗体またはその抗原結合断片は、単回若しくは複数回投薬で、単独または医薬的に許容可能な担体及び／若しくは希釈剤と組み合わせて投与してもよい。本発明の医薬組成物は、当該技術分野で周知の方法（例、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（調剤の科学と実務）、第１９版（１９９５）、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）により調製可能であり、そして、本明細書中に開示される抗体および一若しくは複数の医薬的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む。
【実施例】
【００４６】
実施例１：抗体発現と精製
抗体ＩおよびＩＩの重鎖と軽鎖の可変領域のポリペプチド、完全長重鎖アミノ酸配列と軽鎖アミノ酸配列、並びにそれらをコードするヌクレオチド配列を、「アミノ酸およびヌクレオチド配列」と題する章に以下列挙する。また、軽鎖および重鎖ＣＤＲポリペプチドを表１に示す。
【００４７】
限定はされないが抗体ＩおよびＩＩを含む本発明の抗体またはその抗原結合断片を、基本的には以下のようにして作製および精製することができる。適切な宿主細胞（例、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ若しくはＣＨＯ）は、最適な所定のＨＣ：ＬＣベクター比を使用する抗体分泌のための発現系もしくはＨＣとＬＣの両者をコードする単一ベクター系を用いて一過的または安定的のいずれかでトランスフェクト可能である。抗体が分泌された浄化培地を、多数の一般的に使用される技術のいずれかを使用して精製してもよい。例えば、適合する緩衝液（例、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４））で平衡化した、Ｆａｂ断片用ＭａｂＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥヘルスケア）またはＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥヘルスケア）に、培地を簡便に添加してもよい。カラムを洗浄して、非特異的結合成分を除去することができる。結合した抗体は、例えば、ｐＨ勾配（例、２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７〜１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．０またはリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４〜１００ｍＭのグリシン緩衝液ｐＨ３．０）によって溶出可能である。抗体画分を、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出してもよく、その後、プールしてもよい。さらなる精製は、使用目的に依存して、オプションとなる。抗体を、一般的技術を使用して濃縮および／または滅菌濾過してもよい。可溶性凝縮物および多量体は、一般的技術（サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、多様式クロマトグラフィー、またはハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー）により効果的に除去可能である。これらのクロマトグラフィー工程後の抗体純度は、９５％よりも大きい。精製物は、−７０℃で即座に凍結してもよいし、凍結乾燥してもよい。
【００４８】
【表１】
0006033459.tif 000002
【００４９】
実施例２：抗ＢＭＰ６抗体の結合動力学、親和力、および特異性
本発明の抗体またはその抗原結合断片の結合動力学、親和力、ならびにヒトＢＭＰ−６とともにヒトＢＭＰ−５およびヒトＢＭＰ−７に対する選択性は、当該技術分野で既知の方法に従って、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサ（例、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００、またはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００（ＧＥヘルスケア））を使用して決定可能である。
【００５０】
ヒトＢＭＰ−５、ヒトＢＭＰ−６、ヒトＢＭＰ−７およびＭＡＢ５０７を、Ｒ＆Ｄシステムズ（ミネアポリス、ＭＮ）から購入することができる。ＭＡＢ５０７は、ＢＭＰ−６に特異的であると称する商業的な抗体である。カニクイザルＢＭＰ−６およびラットＢＭＰ−６は、標準的方法を使用して作製可能である。ＣＭ４チップ（ＢＩＡｃｏｒｅ＃ＢＲ−１００５−３４）上へのリガンドの固定は、ＥＤＣ／ＮＨＳアミンカップリング法（ＢＩＡｃｏｒｅ＃ＢＲ−１０００−５０）を使用して準備可能である。手短にいうと、４つのフローセルの全ての表面を、ＥＤＣ／ＮＨＳの１：１混合物を１０μＬ／分で７分間注入することで活性化することができる。ヒトＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、およびＢＭＰ−７を、１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）中で１〜２μｇ／ｍＬに希釈し、そして、流速１０μＬ／分でフローセル（Ｆｃ）２、３、または４上に約２００共鳴単位（ＲＵ）で固定する。Ｆｃ１はブランクのままでよい。未反応部位は、１０μＬ／分でエタノールアミンを７分間注入してブロック可能である。３０μＬ／分でグリシン（ｐＨ１．５）を３×３０秒注入して、任意の非共有結合タンパク質を除去することができる。全ての測定を２５および３７℃で実施してもよい。ランニングバッファーを、ＨＢＳ−ＥＰ＋（ＢＩＡｃｏｒｅ＃ＢＲ−１００６−６９）としてもよい。ＢＩＡｃｏｒｅＴ１００評価ソフトウェアバージョン２．０．３を、解析に使用することができる。
【００５１】
抗体ＩとＭＡＢ５０７の様々なＢＭＰファミリーメンバー間の特異性を決定するために、それら抗体を終濃度１０００、１００、１０、１、０．１、０．０１、０．００１、および０（ブランク）ｎＭでランニングバッファーＨＢＳ−ＥＰ＋中に調製してもよい。各サイクルは、全てのフローセル上に５０μＬ／分で３００秒間希釈抗体を注入し、その後、５０μＬ／分で１２００秒間解離させることからなる場合がある。チップ表面を、５０μＬ／分で１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．５）を６０秒間および３０μＬ／分でＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を３０秒間注入することで再生することができる。参照値を差し引いたデータを回収してもよい。そして、各リガンドに対するオンレート（ｋｏｎ）およびオフレート（ｋｏｆｆ）を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ解析ソフトウェアの１：１結合モデルを使用して評価する場合がある。親和力（ＫＤ）は、関係式ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎに従う結合動力学から計算可能である。
【００５２】
この実施例２中に基本的に記載されるように実施される実験では、抗体ＩはヒトＢＭＰ−６に０．０２０ｎＭの親和力で結合する。３７℃ではヒトＢＭＰ−５とヒトＢＭＰ−７への結合を検出できないので、抗体ＩはＢＭＰ−６に配列が最も近似するＢＭＰファミリーメンバーであるその２つに対して選択性を示す。
【００５３】
Ｒ＆Ｄの抗体ＭＡＢ５０７はヒトＢＭＰ−６に１ｎＭの親和力で結合するが、抗体Ｉと違って、ＭＡＢ５０７はヒトＢＭＰ−７に対して２３ｎＭの親和力を有する（表２）。ＭＡＢ５０７は、３７℃ではヒトＢＭＰ−５への結合が検出できない（表２）。
【００５４】
抗体Ｉおよび抗体ＩＩのＦａｂは、３７℃で０．０８〜０．０９ｎＭの範囲の同様の親和力でヒトＢＭＰ−６に結合する（表３）。ＭＡＢ５０７のＦａｂ、つまりＦａｂ５０７、は、３７℃で１２．２ｎＭの親和力でヒトＢＭＰ−６に結合する（表３）。
【００５５】
抗体ＩおよびＩＩのＦａｂは、ＭＡＢ５０７のＦａｂよりも１３５〜１５０倍高いヒトＢＭＰ−６に対する親和力を示す。抗体Ｉは、ＭＡＢ５０７に比較すると、５０倍高いヒトＢＭＰ−６に対する親和力を示す。
【００５６】
抗体ＩのＦａｂは、３７℃で７９．６〜８８．０ｐＭの範囲の同様の親和力でヒト、カニクイザル、およびラットのＢＭＰ−６に結合する（表４）。抗体ＩはカニクイザルＢＭＰ−６およびラットＢＭＰ−６への親和力が高いので、抗体Ｉを代理の抗体を用いる必要もなくカニクイザルおよびラット動物モデル中で直接使用することができる。
【００５７】
【表２】
0006033459.tif 000003
【００５８】
【表３】
0006033459.tif 000004
【００５９】
【表４】
0006033459.tif 000005
【００６０】
実施例３：ＢＭＰ６抗体はＢＭＰ−６誘導性ヘプシジン発現を阻害する。
本発明の抗体またはその抗原結合断片によるヒトＢＭＰ−６のインビトロ細胞ベースの阻害は、ＢＭＰ−６がヘプシジン発現を誘導する細胞ベースアッセイにて測定可能である。このインビトロ細胞ベースアッセイをまた使用して、他のＢＭＰ（例、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、およびＢＭＰ−１０）によるヘプシジン誘導に対するＢＭＰ−６抗体の選択性を評価することができる。前記インビトロ細胞ベースアッセイにおいて、ヘプシジンプロモーター上のＢＭＰ応答エレメントへのリガンドＢＭＰの結合は、ＨｅｐＰｒｏｍ＿Ｌｕｃ細胞のルシフェラーゼリポーター活性を誘導する。このアッセイは非常に感度が高く、この様なものはＢＭＰファミリーメンバーのどれが鉄恒常性に関与するのかを示すことには不適である。しかしながら、このアッセイは、細胞環境にて様々なＢＭＰファミリーメンバーに対する阻害剤の選択性を示すことには有効である。
【００６１】
前記ＨｅｐＰｒｏｍ＿Ｌｕｃ細胞株は、Ｈｅｐ３Ｂ２．１−７細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、＃ＨＢ−８０６４）にクローン化したヘプシジンプロモーターＤＮＡ配列（ＨｅｐＰｒｏｍ０．３＋１．０ｋｂ）を含むルシフェラーゼリポーターベクターを安定的トランスフェクションすることにより作製することができる。ＨｅｐＰｒｏｍ＿Ｌｕｃ細胞は、ＤＭＥＭ／高グルコース（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、＃ＳＨ３０２４３．０１）プラス５％熱不活化ＦＢＳ（インビトロジェン、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ、＃１００８２−１４７）と１×ＭＥＭ  ＮＥＡＡ（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）および２００μｇ／ｍｌのＧ４１８硫酸塩（インビトロジェン、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ、＃３０−２３４−ＣＩ）からなる完全培地中で維持可能である。
【００６２】
このアッセイのために、ＨｅｐＰｒｏｍ＿Ｌｕｃ細胞を抗生物質不含有完全培地に１５０，０００細胞／ｍＬで再懸濁する場合がある。０．１ｍＬの再懸濁ＨｅｐＰｒｏｍ＿Ｌｕｃ細胞を、１５，０００細胞／ウエルで９６穴マイクロタイタープレート（コーニング、Ｌｏｗｅｌｌ、ＭＡ、＃３９１７）に加え、その細胞をその後、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２にて３７℃で２４時間インキュベートしてもよい。培養培地をその後除去して、細胞を、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（インビトロジェン、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ、＃１５２６０）を有する８０μＬのＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ（インビトロジェン、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ、＃３１９８５）中で５時間３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下で飢餓状態にする場合がある。
【００６３】
０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを有するＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ中の１０μＬの抗ＢＭＰ６抗体（終濃度の１０×）を、ＢＭＰ−６誘導に関しては０．２ｎＭ〜２０ｎＭの最終投与量範囲、ＢＭＰ−５およびＢＭＰ−７誘導に関しては７．８ｎＭ〜１０００ｎＭの最終投与量範囲、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−９、およびＢＭＰ−１０誘導に関しては１０００ｎＭまでの単一点投薬量で細胞に加える場合がある。１０μＬのリガンドＢＭＰ（終濃度の１０×）を、終濃度ＢＭＰ−２（３．８ｎＭ）、ＢＭＰ−４（３．８ｎＭ）、ＢＭＰ−５、（１２．８ｎＭ）、ＢＭＰ−６（３．４ｎＭ）、ＢＭＰ−７（３．２ｎＭ）、ＢＭＰ−９（０．８ｎＭ）、またはＢＭＰ−１０（４．１ｎＭ）で各ウエルに加えて、細胞を２２〜２４時間３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下でインキュベートする場合がある。培養培地をその細胞から除去して、５０μＬのＧｌｏ溶解バッファー（プロメガ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、＃Ｅ２６６１）を細胞に加えて、２分間振とうした後、室温で５分間インキュベートしてもよい。５０μＬのＢｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ試薬（プロメガ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、＃Ｅ２６２０）をその後細胞に加えて、３０秒間振とうした後、室温で５分間インキュベートする場合がある。発光をＷａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ装置上で１秒／ウエルで測定してもよい。
【００６４】
ＢＭＰ−６抗体による阻害率を計算するために、０％阻害をＢＭＰ−６抗体非添加のリガンドＢＭＰ処理の平均発光として設定する場合がある。そして、１００％阻害をＢＭＰ−６抗体非添加のリガンドＢＭＰ非処理の平均発光として設定する場合がある。３または４パラメータ曲線適用解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（サンディエゴ、ＣＡ）を使用して実施してもよい。
【００６５】
この実施例３に基本的に記載されるように実施される実験において、抗体ＩおよびＩＩは、ＨｅｐＰｒｏｍ＿Ｌｕｃ細胞のＢＭＰ−６誘導性ヘプシジンプロモータールシフェラーゼ活性を強く阻害する（表５）。この阻害はＭＡＢ５０７よりも約２２倍以上強い。
【００６６】
表６のデータが示すのは、ヒトＩｇＧＰＡＡ４コントロールと比較して１０００ｎＭの単一点濃度で試験した場合、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、およびＢＭＰ−１０誘導によるヘプシジンプロモータールシフェラーゼ活性を、抗体ＩおよびＩＩが優位に阻害しないことである。このアッセイでの抗体ＩおよびＩＩは、試験した複数のＢＭＰに対して選択性を示す。ＭＡＢ５０７は、しかしながら、ＢＭＰ−６に対する選択性を示さず、１０００ｎＭ（Ｎ＝６）で平均−１．７％阻害を有するヒトＩｇＧＰＡＡ４に比較して、ＢＭＰ−７に対して１０００ｎＭ（Ｎ＝２）で平均５４．２％阻害を示す。
【００６７】
【表５】
0006033459.tif 000006
【００６８】
【表６】
0006033459.tif 000007
【００６９】
実施例４：雄カニクイザルへの単一静脈内投薬後のＢＭＰ−６抗体の薬物動態／薬動力学試験
本発明の抗体または抗原結合断片の血清薬物動態／薬動力学（ＰＫ／ＰＤ）を、正常雄カニクイザルへの単一静脈内投薬後に試験する場合がある。雄カニクイザルは、抗体の単一静脈内（ＩＶ）ボーラス投薬を投薬量１ｍＬ／ｋｇで注射して行ってもよい。様々な時点で採取する血清サンプルから、血清鉄濃度、ＢＭＰ−６抗体レベル、およびヘプシジンレベルを測定してもよい。
【００７０】
薬物動態、血清ヘプシジン、およびＢＭＰ−６の定量のために、約１．５ｍＬの血液を複数の時点で各動物から抗凝固薬が入っていないチューブに回収する場合がある。サンプルは遠心分離の前に外気条件下で凝固させて、血清を得ることができる。サンプルは、約−７０℃での保存前に、湿った氷上で維持する場合がある。臨床病理解析のために、約０．５ｍＬの血液を複数の時点で各動物から大腿静脈を介して回収し、抗凝固薬が入っていないチューブに入れてもよい。その血液を使用し、標準的方法を用いて、血清鉄測定、不飽和鉄結合能測定、総鉄結合能測定、パーセント鉄飽和測定、標準的血液学測定を実施する場合がある。ヘプシジン濃度を、Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｌｏｏｄ、１１０（３）：１０４８（２００７）に記載されるように測定してもよい。
【００７１】
トータルヒトＩｇＧのＥＬＩＳＡを使用して、血清サンプルをＢＭＰ−６抗体の濃度に関して解析する場合がある。血清中のＢＭＰ−６抗体は、９６穴マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒ  Ａｍｉｎｏカタログ＃４３６００６）の抗ヒトκ軽鎖抗体でコートされたウエルに結合し、そして、抗ヒトＩｇＧ４−ＨＲＰ結合抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、＃９２００−０５）を用いて検出可能である。このアッセイの検出上限と下限は、それぞれ２００と１０ｎｇ／ｍＬである場合がある。免疫反応性ＢＭＰ−６抗体の濃度は、４／５パラメータアルゴリズム（ＳｔａｔＬＩＡ、バージョン３．２）を使用して、ラット血清中の化合物の既知の量から作成される検量線により決定してもよい。薬物動態パラメータを、Ｗａｔｓｏｎ（バージョン７．４、生体解析ＬＩＭＳ）ソフトウェアパッケージ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して計算する場合がある。計算されたパラメータは、曲線下面積（ＡＵＣ０−∞）、見かけクリアランス（Ｃｌ）、および排泄半減期を含む場合がある。
【００７２】
この実施例４中で基本的に記載されるように実施される実験において、試験Ｉでは、単一静脈内ボーラスとして投与される抗体Ｉの投薬量は、０．３、１．０、３．０、および１０ｍｇ／ｋｇである。コントロールのヒトＩｇＧ４は、１０ｍｇ／ｋｇで投薬される。試験Ｉのビヒクルはリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）である。薬物動態、血清ヘプシジン、およびＢＭＰ−６の定量のために、抗体Ｉ投与後の薬物動態、血清鉄、および血清ヘプシジン応答に関するデータを、各動物から投薬前（Ｄａｙ−１）、投薬後１、６、１２、２４、４８、７２、１２０、１６８、２４０、３３６、４３２、５２８、および６７２時間、ならびに試験Ｄａｙ３６、４３、５０、および５７に測定する。
【００７３】
この実施例４中で基本的に記載されるように実施される実験において、試験ＩＩでは、単一静脈内ボーラスとして投与される抗体Ｉの投薬量は、０．０５、０．３、および３．０ｍｇ／ｋｇである。コントロールのヒトＩｇＧ４は、３ｍｇ／ｋｇで投薬された。試験ＩＩのビヒクルはリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）プラス０．０２％のＴｗｅｅｎ８０である。抗体Ｉ投与後の薬物動態、血清鉄、および血清ヘプシジン応答に関するデータを、各動物から投薬前（Ｄａｙ−１）ならびに投薬後１、６、１２、２４、４８、７２、１２０、１６８、２４０、３３６、４３２、５２８、６７２、８４０、１００８、１１７６、１３４４、１５１２、１６８０、および１８４８時間に測定する。
【００７４】
試験Ｉ及びＩＩでは、抗体Ｉの最大血清濃度（Ｃｍａｘ）は、おおよそ投薬量に比例して増加し、０．０５〜１０ｍｇ／ｋｇに渡って検討される。検討される投薬量範囲に渡って、抗体Ｉは、投薬量が増えるとクリアランスが減少しおよび排泄半減期が増加するような非線形薬物動態を示す。検討される投薬量範囲に渡って、クリアランスは〜０．５７から〜０．１７ｍＬ／ｈｒ／ｋｇに減少する。試験されるタイムフレームと投薬量範囲に渡って、半減期は〜５８から〜２９５時間の範囲である。
【００７５】
表８および９の薬動力学データが示すのは、抗体Ｉの投与が、投薬後１２０〜２４０時間にほぼベースライン（投薬前）レベルに戻る前に２４時間でピークがある血清鉄の初期即時増加と関連があることである。３および１０ｍｇ／ｋｇ投薬群では、血清鉄は投薬量により依存して２４０時間後に再び上昇する。そして、この試験の終了時に向けて血清鉄の上昇が延長されるのが観察される。
【００７６】
抗体Ｉの投与はまた、投薬後早くて６〜１２時間で起こるカニクイザル血清ヘプシジンの急性減少とも関連する。試験ＩＩでは、血清ヘプシジンは投薬量に依存してベースラインに戻る。しかし、ベースラインへのヘプシジン回帰のこの投薬量依存性は、試験Ｉほどは明らかでない。試験ＩでのヒトＩｇＧ４コントロール抗体は血清ヘプシジンの減少を示すが、試験ＩＩでは再現されない。両方の試験はまた、観察される低血清ヘプシジンレベルと相関しない抗体Ｉの存在下で血清鉄レベルの有意な変化を示す。
【００７７】
【表７】
0006033459.tif 000008
【００７８】
【表８】
0006033459.tif 000009
【００７９】
雄カニクイザルへの単一静脈内投薬後のＨｕＡ５０７の薬物動態／薬動力学試験
この実施例４中で基本的に記載されるように実施される実験において、正常雄カニクイザルへの単一静脈内投薬後に、ＨｕＡ５０７の血清ＰＫ／ＰＤを試験する。ＨｕＡ５０７は、Ｒ＆ＤシステムズのＭＡＢ５０７抗体のマウス定常領域をヒトＩｇＧ４ＰＡＡ骨格で置換して作製されるキメラ抗体である。ＨｕＡ５０７抗体またはコントロールヒトＩｇＧ４の投薬量１０ｍｇ／ｋｇの単一静脈内ボーラスを、１ｍＬ／ｋｇの容量で投与する。この試験のビヒクルはリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）である。解析のために、血液を各動物から投薬前（Ｄａｙ１）ならびに投薬後１、６、１２、２４、４８、７２、９６、１６８、２６４、３３６、４３２、５２８、および６２４時間で採取する。ＨｕＡ５０７抗体の投薬量が１０ｍｇ／ｋｇの場合、平均血清鉄濃度は、投薬前の約１５０μｇ／ｍｌから投薬後１２時間での約２１０μｇ／ｍｌへと増加するが、その後、４８時間までにはベースラインへと降下回帰する。この実施例４で示される抗体Ｉの長期薬動力学効果とは違って、ＨｕＡ５０７を用いた治療は４８時間までの血清鉄濃度の短い初期増加を示すのみであり、抗体Ｉで見られるような長期応答は示さない。
【００８０】
実施例５：ラットＡＣＤモデルにおける効力
本発明の抗体またはその抗原結合断片の効力をラットＡＣＤモデルにて測定することができる。８〜１０週齢の雌ルイスラットにおいて、Ｄａｙ０でグラム陽性大腸菌細胞壁抽出物（ＬｅｅＬａｂｓ、＃ＰＧ−ＰＳ  １０Ｓ）５ｍｇ／ｋｇの一回の腹腔内投薬により、炎症を誘導してもよい。さらなる治療が全くなかった場合、細胞壁抽出物を用いた１０日間の処置中に、ヘモグロビン濃度の減少がこのモデル中で見られる場合がある。本発明の抗体を１０ｍｇ／ｋｇ用いる治療を、Ｄａｙ８でＩＶ投薬により開始し、この抗体の週単位のＩＶ投薬を継続してもよい。ホモグロビン、血清鉄、およびヘプシジンの濃度を測定し、ＨｕＩｇＧ４コントロールによる治療で見られる数値と比較してもよい。
【００８１】
臨床病理解析のために、約０．２ｍＬの血液を複数の時点で各動物からテールクリップを介して回収し、ＥＤＴＡが入っているチューブに入れてもよい。その血液を使用し、標準的方法を用いて、血清鉄測定、不飽和鉄結合能測定、総鉄結合能測定、パーセント鉄飽和測定、標準的血液学測定を実施する場合がある。全ての他の解析のために、約０．７５ｍＬの血液を複数の時点で各動物からテールクリップを介して回収し、抗凝血薬が入っていないチューブに入れてもよい。
【００８２】
この実施例５中で基本的に記載されるように実施される実験において、抗体Ｉは、Ｄａｙ６０での試験の終了までのほとんどの日で、ｈＩｇＧ４アイソタイプコントロールよりも統計学的に優位に高いヘモグロビンと鉄の長期薬動力学的応答を示す。コントロールと比較した場合、ヘモグロビン濃度の増加は約０．８２〜１．５ｇ／ｄＬである。一旦抗体Ｉ治療が開始されると、治療群の赤血球は小球性の程度が少なくなり且つ低色素の程度も少なくなる。赤血球の特性の変化に基づいて、この試験で観察されるヘモグロビン増加は、赤血球の生産が増加したというよりはむしろ赤血球のサイズと細胞ヘモグロビンレベルの規格が増加することから生じると結論することができる。
【００８３】
アミノ酸およびヌクレオチド配列
配列番号：１                （ヒトＢＭＰ−６）
ＰＰＰＬＲＰＰＬＰＡＡＡＡＡＡＡＧＧＱＬＬＧＤＧＧＳＰＧＲＴＥＱＰＰＰＳＰＱＳＳＳＧＦＬＹＲＲＬＫＴＱＥＫＲＥＭＱＫＥＩＬＳＶＬＧＬＰＨＲＰＲＰＬＨＧＬＱＱＰＱＰＰＡＬＲＱＱＥＥＱＱＱＱＱＱＬＰＲＧＥＰＰＰＧＲＬＫＳＡＰＬＦＭＬＤＬＹＮＡＬＳＡＤＮＤＥＤＧＡＳＥＧＥＲＱＱＳＷＰＨＥＡＡＳＳＳＱＲＲＱＰＰＰＧＡＡＨＰＬＮＲＫＳＬＬＡＰＧＳＧＳＧＧＡＳＰＬＴＳＡＱＤＳＡＦＬＮＤＡＤＭＶＭＳＦＶＮＬＶＥＹＤＫＥＦＳＰＲＱＲＨＨＫＥＦＫＦＮＬＳＱＩＰＥＧＥＶＶＴＡＡＥＦＲＩＹＫＤＣＶＭＧＳＦＫＮＱＴＦＬＩＳＩＹＱＶＬＱＥＨＱＨＲＤＳＤＬＦＬＬＤＴＲＶＶＷＡＳＥＥＧＷＬＥＦＤＩＴＡＴＳＮＬＷＶＶＴＰＱＨＮＭＧＬＱＬＳＶＶＴＲＤＧＶＨＶＨＰＲＡＡＧＬＶＧＲＤＧＰＹＤＫＱＰＦＭＶＡＦＦＫＶＳＥＶＨＶＲＴＴＲＳＡＳＳＲＲＲＱＱＳＲＮＲＳＴＱＳＱＤＶＡＲＶＳＳＡＳＤＹＮＳＳＥＬＫＴＡＣＲＫＨＥＬＹＶＳＦＱＤＬＧＷＱＤＷＩＩＡＰＫＧＹＡＡＮＹＣＤＧＥＣＳＦＰＬＮＡＨＭＮＡＴＮＨＡＩＶＱＴＬＶＨＬＭＮＰＥＹＶＰＫＰＣＣＡＰＴＫＬＮＡＩＳＶＬＹＦＤＤＮＳＮＶＩＬＫＫＹＲＮＭＶＶＲＡＣＧＣＨ
配列番号：２                （ＬＣＤＲ１−抗体Ｉおよび抗体ＩＩ）
ＲＳＳＥＮＩＹＲＮＬＡ
配列番号：３                （ＬＣＤＲ２−抗体Ｉおよび抗体ＩＩ）
ＡＡＴＮＬＡＤ
配列番号：４                （ＬＣＤＲ３−抗体Ｉおよび抗体ＩＩ）
ＱＧＩＷＧＴＰＬＴ
配列番号：５                （ＨＣＤＲ１−抗体Ｉおよび抗体ＩＩ）
ＧＹＴＦＴＳＹＡＭＨ

配列番号：６                （ＨＣＤＲ２−抗体Ｉ）
ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＮＦＫＧ
配列番号：７                （ＨＣＤＲ２−抗体ＩＩ）
ＹＩＮＰＹＮＲＧＴＫＹＮＥＮＦＫＧ

配列番号：８                （ＨＣＤＲ３−抗体Ｉおよび抗体ＩＩ）
ＲＰＦＧＮＡＭＤＩ

配列番号：９                （ＬＣＶＲ−抗体Ｉおよび抗体ＩＩ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＥＮＩＹＲＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＴＮＬＡＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＧＩＷＧＴＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号：１０              （ＨＣＶＲ−抗体Ｉ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＮＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＰＦＧＮＡＭＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号：１１              （ＨＣＶＲ−抗体ＩＩ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＮＰＹＮＲＧＴＫＹＮＥＮＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＰＦＧＮＡＭＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号：１２              （ＬＣ−抗体Ｉおよび抗体ＩＩ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＥＮＩＹＲＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＴＮＬＡＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＧＩＷＧＴＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号：１３              （ＨＣ−抗体Ｉ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＮＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＰＦＧＮＡＭＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
配列番号：１４              （ＨＣ−抗体ＩＩ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＮＰＹＮＲＧＴＫＹＮＥＮＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＰＦＧＮＡＭＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
配列番号：１５              （ＬＣ  ＤＮＡ−抗体Ｉおよび抗体ＩＩ）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＡＴＣＴＴＣＣＧＡＡＡＡＴＡＴＴＴＡＣＣＧＴＡＡＴＴＴＡＧＣＡＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＡＣＡＡＡＣＴＴＡＧＣＡＧＡＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＡＧＧＣＡＴＴＴＧＧＧＧＴＡＣＴＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ
配列番号：１６              （ＨＣ  ＤＮＡ−抗体Ｉ）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＡＴＡＣＡＴＴＣＡＣＴＡＧＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＡＴＡＴＴＡＡＴＣＣＴＴＡＴＡＡＴＧＡＴＧＧＴＡＣＴＡＡＧＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡＡＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＧＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＡＣＧＡＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＡＧＧＣＣＣＴＴＴＧＧＴＡＡＣＧＣＴＡＴＧＧＡＣＡＴＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴ
配列番号：１７              （ＨＣ  ＤＮＡ−抗体ＩＩ）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＡＴＡＣＡＴＴＣＡＣＴＡＧＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＡＴＡＴＴＡＡＴＣＣＴＴＡＴＡＡＴＣＧＴＧＧＴＡＣＴＡＡＧＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡＡＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＧＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＡＣＧＡＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＡＧＧＣＣＣＴＴＴＧＧＴＡＡＣＧＣＴＡＴＧＧＡＣＡＴＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴ
【配列表】
0006033459000001.app