(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボツリヌス毒素、
非還元性二糖又は非還元性三糖、
非イオン性界面活性剤、及び
生理適合性緩衝剤；
を含み、
前記非還元性二糖又は非還元性三糖の濃度が１０％〜４０％（ｗ／ｖ）の範囲であり、前記非イオン性界面活性剤の濃度が０．００５％〜０．５％（ｗ／ｖ）の範囲であり、且つｐＨが４．５〜６．５の範囲である
液体組成物。
【請求項２】
非還元性二糖が、トレハロース二水和物、スクロース、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の液体組成物。
【請求項３】
非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート、ソルビタンエステル、Triton（登録商標）X-100、ＮＰ−４０、ポロキサマー及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の液体組成物。
【請求項４】
緩衝剤が、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、酒石酸緩衝剤、マレイン酸緩衝剤、及びヒスチジン緩衝剤からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の液体組成物。
【請求項５】
１又は２以上の正の電荷を帯びた効率基が結合された正の電荷を帯びた骨格をさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の液体組成物。
【請求項６】
正の電荷を帯びた効率基を有する正の電荷を帯びた骨格が、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）１５−Ｇ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）１５−Ｇ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ、及びＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）１５−Ｇ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項５に記載の液体組成物。
【請求項７】
１又は２以上の正の電荷を帯びた効率基が、（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、及び（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（式中、下付き文字ｐ及びｑは、それぞれ独立に０〜２０の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列である、請求項５に記載の液体組成物。
【請求項８】
ボツリヌス毒素が治療量で存在する、請求項１〜７のいずれかに記載の液体組成物。
【請求項９】
ボツリヌス毒素が、ボツリヌス毒素血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ型から選択される、請求項１〜８のいずれかに記載の液体組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の液体組成物の凍結乾燥物。
【請求項１１】
ボツリヌス毒素が、ボツリヌス毒素血清型Ａ型である、請求項９に記載の液体組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の液体組成物の凍結乾燥物。
【請求項１３】
請求項１０又は１２に記載の凍結乾燥物、及び
注射器
を含むキット。
【請求項１４】
ボツリヌス毒素、非還元性二糖又は非還元性三糖、非イオン性界面活性剤、及び生理的適合性緩衝剤を組み合わせて液体組成物を形成すること
を含み、
前記非還元性二糖又は非還元性三糖の濃度が１０％〜４０％（ｗ／ｖ）の範囲であり、
前記非イオン性界面活性剤の濃度が０．００５％〜０．５％（ｗ／ｖ）の範囲であり、且つ
前記液体組成物のｐＨが４．５〜６．５の範囲である
ボツリヌス毒素製剤の安定化方法。
【請求項１５】
液体組成物を、凍結乾燥によって乾燥させるステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、Span（登録商標）20、Span（登録商標）60、Span（登録商標）65、及びSpan（登録商標）80からなる群から選択される、請求項３又は１１に記載の液体組成物。
【請求項１７】
生理適合性緩衝剤が、クエン酸、酢酸、コハク酸、酒石酸、マレイン酸、ヒスチジン、シトレート／アセテート、シトレート／ヒスチジン、シトレート／タルトレート、マレエート／ヒスチジン、スクシネート／ヒスチジン及びリン酸緩衝剤からなる群から選択される、請求項１６に記載の液体組成物。
【請求項１８】
ゲル化剤、粘性調整剤又はその組合せをさらに含む、請求項１〜９、１１、１６又は１７に記載の液体組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の液体組成物の凍結乾燥物。
【請求項２０】
ゲル化剤が、セルロースベースゲル化剤であり、及び／又は粘性調整剤が、ポリエチレングリコール、ポロキサマー、ポリアクリル酸、ポリアミド、及び植物ガムの１又は２以上から選択される、請求項１８又は１９に記載の液体組成物又は凍結乾燥物。
【請求項２１】
動物由来タンパク質性賦形剤を含まない、請求項１〜９、１１、１８又は２０に記載の液体組成物。
【請求項２２】
アルブミンを含まない、請求項２１に記載の液体組成物。
【請求項２３】
動物由来タンパク質性賦形剤を含まない、請求項１０、１２、１９又は２０に記載の凍結乾燥物。
【請求項２４】
アルブミンを含まない、請求項２３に記載の凍結乾燥物。
【請求項２５】
組み合せるステップが、動物由来タンパク質性賦形剤を添加せずに行われる、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項２６】
組み合わせるステップが、アルブミンを含む動物由来タンパク質性賦形剤を添加せずに行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
乾燥組成物が、固形ケークを含む、請求項１４、１５、２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
凍結乾燥物が、動物由来タンパク質性賦形剤を含まない、請求項１３に記載のキット。
【請求項２９】
凍結乾燥物が、アルブミンを含まない、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
ボツリヌス毒素が、血清型Ａ型であり、１０Ｕ〜１５０Ｕの範囲、４００Ｕ〜８００Ｕの範囲、及び１０００Ｕ〜２５００Ｕの範囲から選択される量で存在する、請求項８に記載の液体組成物。
【請求項３１】
ボツリヌス毒素が、血清型Ａ型であり、２０００Ｕ〜３５０００Ｕの範囲で存在する、請求項１〜７のいずれかに記載の液体組成物。
【請求項３２】
ボツリヌス毒素が、血清型Ａ型であり、１０００Ｕ〜５００００Ｕの範囲で存在する、請求項１０、１２、１９、２０、２３又は２４に記載の凍結乾燥物。
【請求項３３】
製剤バルク薬剤産物を含む、請求項１〜９又は１１に記載の液体組成物。
【請求項３４】
製剤バルク薬剤産物を含む、請求項１０、１２、１９、２０、２３、２４又は３２に記載の凍結乾燥物。
【請求項３５】
粉末である、請求項１０、１２、１９、２０、２３、２４、３２又は３４に記載の凍結乾燥物。
【請求項３６】
凍結乾燥したケークである、請求項１０、１２、１９、２０、２３、２４、３２又は３４に記載の凍結乾燥物。
【請求項３７】
凍結乾燥物が粉末である、請求項１３、２８又は２９に記載のキット。
【請求項３８】
凍結乾燥物が凍結乾燥したケークである、請求項１３、２８又は２９に記載のキット。
【請求項３９】
非晶質固形組成物である、請求項１０に記載の凍結乾燥物。
【請求項４０】
固体組成物が、少なくとも１つの正の電荷を帯びた効率基が結合されたポリペプチド又は非ペプチジルポリマーから選択される正の電荷を帯びた骨格を含み、前記正の電荷を帯びた効率基が、アミノ酸配列（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、アミノ酸配列（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、及びアミノ酸配列（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（式中、下付き文字ｐ及びｑは、それぞれ独立に０〜２０の範囲若しくは２〜５の範囲から選択される整数である）から選択される、請求項３９に記載の凍結乾燥物。
【請求項４１】
正の電荷を帯びた骨格が、ポリリジンを含むポリペプチドである、請求項４０に記載の凍結乾燥物。
【請求項４２】
正の電荷を帯びた骨格が、非ペプチジルポリマーである、請求項４０に記載の凍結乾燥物。
【請求項４３】
正の電荷を帯びた骨格が、ポリエチレンイミン及びポリプロピレンイミンから選択されるポリアルキレンイミンである、請求項４２に記載の凍結乾燥物。
【請求項４４】
固体組成物が、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）１５−Ｇ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）１５−Ｇ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ、及びＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）１５−Ｇ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである正の電荷を帯びた骨格を含む、請求項３９〜４１のいずれかに記載の凍結乾燥物。
【請求項４５】
ボツリヌス毒素が治療量で存在する、請求項３９〜４４のいずれかに記載の凍結乾燥物。
【請求項４６】
ボツリヌス毒素が、ボツリヌス毒素血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ型から選択される、請求項３９〜４５のいずれかに記載の凍結乾燥物。
【請求項４７】
ボツリヌス毒素が、血清型Ａ型のボツリヌス毒素であり、１５０ｋＤの分子量を有する、請求項４６に記載の凍結乾燥物。
【請求項４８】
非還元性二糖又は非還元性三糖が、無水型トレハロース、トレハロース二水和物、スクロース、ラフィノース、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３９〜４７のいずれかに記載の凍結乾燥物。
【請求項４９】
非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート、ソルビタンエステル、Triton（登録商標）X-100、ＮＰ−４０、ポロキサマー及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３９〜４８のいずれかに記載の凍結乾燥物。
【請求項５０】
非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、Span（登録商標）20、Span（登録商標）60、Span（登録商標）65、及びSpan（登録商標）80からなる群から選択される、請求項４９に記載の凍結乾燥物。
【請求項５１】
生理適合性緩衝剤が、クエン酸、酢酸、コハク酸、酒石酸、マレイン酸、ヒスチジン、シトレート／アセテート、シトレート／ヒスチジン、シトレート／タルトレート、マレエート／ヒスチジン、スクシネート／ヒスチジン及びリン酸緩衝剤からなる群から選択される、請求項３９〜５０のいずれかに記載の凍結乾燥物。
【請求項５２】
ゲル化剤、粘性調整剤又はその組合せをさらに含む、請求項５１に記載の凍結乾燥物。
【請求項５３】
ゲル化剤が、セルロースベースゲル化剤であり、及び／又は粘性調整剤が、ポリエチレングリコール、ポロキサマー、ポリアクリル酸、ポリアミド、及び植物ガムの１又は２以上から選択される、請求項５２に記載の凍結乾燥物。
【請求項５４】
ポロキサマーが、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８８、及びポロキサマー４０７から選択される、請求項５３に記載の凍結乾燥物。
【請求項５５】
非還元性二糖又は非還元性三糖が、１０〜２５重量％の濃度範囲にある、請求項５１又は５２に記載の凍結乾燥物。
【請求項５６】
非イオン性界面活性剤が、０．０１〜０．２重量％の濃度範囲にある、請求項５５に記載の凍結乾燥物。
【請求項５７】
動物由来タンパク質性賦形剤を含まない、請求項３９〜５６のいずれかに記載の凍結乾燥物。
【請求項５８】
アルブミンを含まない、請求項５７に記載の凍結乾燥物。
【請求項５９】
ボツリヌス毒素が、血清型Ａ型であり、１０Ｕ〜１５０Ｕの範囲、４００Ｕ〜８００Ｕの範囲、及び１０００Ｕ〜２５００Ｕの範囲から選択される量で存在する、請求項３９、５７又は５８に記載の凍結乾燥物。
【請求項６０】
粉末又は非晶質のケークである、請求項３９に記載の凍結乾燥物。
【請求項６１】
１又は２以上の正の電荷を帯びた効率基が結合された正の電荷を帯びたポリリジン骨格をさらに含み、前記１又は２以上の正の電荷を帯びた効率基が、（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、及び（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（式中、下付き文字ｐ及びｑは、それぞれ独立に０〜２０の範囲若しくは２〜５の範囲から選択される整数である）から選択されるアミノ酸配列であり、ボツリヌス毒素が血清型Ａ型である、請求項１に記載の液体組成物。
【請求項６２】
１又は２以上の正の電荷を帯びた効率基が結合された正の電荷を帯びた骨格をさらに有し、正の電荷を帯びた効率基を有する前記正の電荷を帯びた骨格が、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）１５−Ｇ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）１５−Ｇ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ、及びＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）１５−Ｇ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲから選択されるアミノ酸配列を有し、ボツリヌス毒素が血清型Ａ型である、請求項１に記載の液体組成物。
【請求項６３】
血清型Ａ型のボツリヌス毒素が１５０ｋＤの分子量を有する、請求項６１又は６２に記載の液体組成物。
【請求項６４】
非還元性二糖又は非還元性三糖の濃度が１０％〜２５％（ｗ／ｖ）の範囲である、請求項１に記載の液体組成物。
【請求項６５】
非還元性二糖又は非還元性三糖の濃度が１０％〜２５％（ｗ／ｖ）の範囲である、請求項１４に記載の方法。
【請求項６６】
非還元性二糖又は非還元性三糖の濃度が１５％〜２０（ｗ／ｖ）％の範囲である、請求項１に記載の液体組成物。
【請求項６７】
非還元性二糖又は非還元性三糖の濃度が１５％〜２０（ｗ／ｖ）％の範囲である、請求項１４に記載の方法。
【請求項６８】
非還元性二糖又は非還元性三糖の濃度が１５％〜２０重量％の範囲である、請求項３９又は４８に記載の凍結乾燥物。
【請求項６９】
ボツリヌス毒素；
１０％〜４０％（ｗ／ｖ）の量で存在する非還元性二糖又は非還元性三糖；
０．００５％〜０．５％（ｗ／ｖ）の量で存在する非イオン性界面活性剤；及び生理適合性緩衝剤を含み、
前記非還元性二糖又は非還元性三糖の量と前記非イオン性界面活性剤の量が、結晶形成を防ぐ方法で液体組成物を乾燥した時に、非晶質な非結晶固体を提供する、液体組成物。
【請求項７０】
非還元性二糖が、トレハロース二水和物、スクロース、及びその組合せからなる群から選択される、請求項６９に記載の液体組成物。
【請求項７１】
非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート、ソルビタンエステル、Triton（登録商標） X-100、NP-40、ポロキサマー、及びその組合せからなる群から選択される、請求項６９又は７０に記載の液体組成物。
【請求項７２】
緩衝剤が、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、酒石酸緩衝剤、マレイン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤及びヒスチジン緩衝剤からなる群から選択される、請求項６９〜７１のいずれかに記載の液体組成物。
【請求項７３】
ｐＨが、ｐＨ４．５〜ｐＨ６．５の範囲内である、請求項７２に記載の液体組成物。
【請求項７４】
１又は２以上の正の電荷を帯びた効率基が結合された正の電荷を帯びた骨格をさらに含む、請求項６９〜７３のいずれかに記載の液体組成物。
【請求項７５】
正の電荷を帯びた効率基が結合した正の電荷を帯びた骨格が、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）１５−Ｇ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）１５−Ｇ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ、及びＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）１５−Ｇ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項７４に記載の液体組成物。
【請求項７６】
１又は２以上の正の電荷を帯びた効率基が、（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、及び（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（式中、下付き文字ｐ及びｑは、それぞれ独立に０〜２０の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列である、請求項７４に記載の液体組成物。
【請求項７７】
正の電荷を帯びた骨格が、ポリリジンである、請求項７４〜７６のいずれかに記載の液体組成物。
【請求項７８】
ボツリヌス毒素が、ボツリヌス毒素血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ型から選択される、請求項６９〜７７のいずれかに記載の液体組成物。
【請求項７９】
ボツリヌス毒素が、血清型Ａである、請求項７８に記載の液体組成物。
【請求項８０】
ボツリヌス毒素が、血清型Ａ型のボツリヌス毒素であり、１５０ｋＤの分子量を有する、請求項７９に記載の液体組成物。
【請求項８１】
ボツリヌス毒素が治療量で存在する、請求項７８〜８０のいずれかに記載の液体組成物。
【請求項８２】
動物由来タンパク質性賦形剤及び／又はアルブミンを含まない、請求項８１に記載の液体組成物。
【請求項８３】
請求項６９〜８２のいずれかに記載の液体組成物の凍結乾燥物。
【請求項８４】
非晶質な非結晶固体である、請求項８３に記載の凍結乾燥物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００９年６月２５日出願の米国仮特許出願番号第６１／２２０，４３３号に対する優先権を主張し、その内容がその全体にわたり参照により組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ボツリヌス毒素を含む医薬製剤に関する。特に本発明は、非タンパク質性賦形剤により安定化されたボツリヌス毒素製剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
ボツリヌス毒素（Botulinum toxins）(ボツリン毒素（botulin toxins）又はボツリヌス神経毒素（botulinum neurotoxins）としても知られる）は、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum bacteria）により生み出される神経毒素である。ボツリヌス毒素は、神経筋接合部全体にわたりアセチルコリンのシナプス伝達又は放出を阻害することにより筋肉麻痺をもたらす。ボツリヌス毒素の作用は基本的に、通常は筋痙攣又は筋収縮を引き起こすシグナルを遮断し、結果として麻痺をもたらす。
【０００４】
８つの血清学的に関連する天然ボツリヌス毒素が存在し、うち７つは麻痺を引き起こすと知られている（すなわち、ボツリヌス神経毒素血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ型）。これら血清型のそれぞれは、型特異的抗体を用いた中和により識別される。しかしながら、ボツリヌス毒素タンパク質分子の分子量は、これら活性を有するボツリヌス毒素の７つすべてについて、約１５０ｋＤである。ボツリヌス菌により放出される際、ボツリヌス毒素は、関連非毒素タンパク質と共に１５０ｋＤボツリヌス毒素タンパク質分子を含む複合体の形で存在する。複合体の総サイズは変動し得る。例えば、ボツリヌス毒素Ａ型複合体は、ボツリヌス菌により９００ｋＤ、５００ｋＤ及び３００ｋＤの複合体として生み出され得る。ボツリヌス毒素Ｂ型及びＣ型複合体は、７００ｋＤ又は５００ｋＤの複合体としてのみ生み出される。ボツリヌス毒素Ｄ型複合体は、３００ｋＤ及び５００ｋＤの複合体の両方として生み出される。ボツリヌス毒素Ｅ型及びＦ型複合体は３００ｋＤの複合体としてのみ生み出される。複合体は、非毒素赤血球凝集素タンパク質並びに非毒素及び非毒性非赤血球凝集素タンパク質を含むと考えられている。これら２つの非毒素タンパク質（関連神経毒素複合体を含むボツリヌス毒素分子と共にある）は、ボツリヌス毒素分子の変性に対する安定性及び毒素が摂取された際の消化酸に対する保護を提供すると考えられている。
【０００５】
ボツリヌス毒素は公知の天然毒素の中で最も致死性の高いものである一方で、治療剤及び美容剤の両方としての広範にわたる使用が見出されている。例えば、１９８６年に、眉間領域の運動関連皺の治療のためのＡ型ボツリヌス毒素の使用の実施可能性がSchantz and Scottにより、Lewis G E (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, N.Y.: Academic Press, 143-150 (1981)において初めて示された。皺の治療のためのボツリヌスＡ型の使用は１９９２年に発表され（Schantz and Scott, in Lewis G. E. (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, N.Y.: Academic Press, 143-150 (1981)）、１９９４年までには、顔面の他の運動関連皺がＡ型ボツリヌス毒素で治療されていた（Scott, Ophthalmol, 87:1044-1049 (1980)）。美容ボツリヌス毒素治療の需要は年を追って着実に高まり、米国での現在のボツリヌス毒素の年間売上は、１０億ドルを超える。
【０００６】
市販のボツリヌス毒素製剤を製造することの難点の１つは、ボツリヌス毒素の安定化にある。多くのタンパク質と同様、ボツリヌス毒素は、熱、アルカリ性条件、機械的剪断力、又は、反応表面若しくは物質との接触等、環境因子により分解又は変性され得る。さらに、毒素が極度の毒性を有し、治療目的で微少量の毒素しか使用できないことにより、市販製剤においてボツリヌス毒素を安定化することは一層困難となる。もしボツリヌス毒素製剤が適切に安定化されないなら、微少量のボツリヌス毒素が望ましくない反応を起こし、且つ／或いは、その貯蔵容器の内表面に固着し、ボツリヌス毒素又は活性の許容できない減少をもたらし得る。
【０００７】
劣化を防ぎ、ボツリヌス毒素製剤を取り扱いやすくし、輸送費を安くするため、市販のボツリヌス毒素製剤は多くの場合、凍結乾燥（lyophilized）（すなわち凍結乾燥（freeze dried））又は真空乾燥粉末として販売される。ボツリヌス毒素粉末製剤は、使用前に水又は食塩水等の液体担体で再構成される。例えば、市販のボツリヌス毒素製剤の１つは、BOTOX（登録商標）という商標の下で販売されている（Allergan, Inc.社製、カリフォルニア州アーヴァイン）。BOTOX（登録商標）製剤は、個別のバイアルに貯蔵された真空乾燥粉末として配布されており、そのそれぞれが、約１００単位（units、Ｕ）のボツリヌス菌毒素Ａ型複合体、０．５ミリグラムのヒト血清アルブミン及び０．９ミリグラムの塩化ナトリウムを含む。１年の貯蔵寿命の間に表示された効力を維持するため、市販のボツリヌス毒素製剤は−１０℃以下の温度で貯蔵されなければならないことが報告されている。
【０００８】
市販のボツリヌス毒素製剤において、ヒト血清アルブミンは多くの場合バルク担体及び安定剤として添加される。一般に、アルブミンは治療タンパク質（例えばボツリヌス毒素）を１又は２以上の以下の機序により安定化させ得る：（１）ガラス器具類、貯蔵バイアル、及び医薬組成物を注射するために用いられる注射器を含む貯蔵又は調剤容器の内表面への治療タンパク質の固着を減少させること；及び（２）特に治療タンパク質溶液を調製するための再構成後に、治療タンパク質の変性を減少させること。ヒト血清アルブミンは免疫原性が最小限であり、ヒト患者にボツリヌス毒素製剤に対する抗体が生じる可能性を低めるというさらなる利点を有する。
【０００９】
ヒト血清アルブミンは市販のボツリヌス毒素製剤において安定剤として採用されてきたとはいえ、このアプローチと関連する顕著な問題が依然として存在する。深刻な問題の１つは、アルブミンが血液に由来し、したがって血液由来の病原体又は感染因子を保持しがちであるということである。例えば、ヒト血清アルブミンはヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus、ＨＩＶ）を保持し得る。アルブミンはまた、クロイツフエルト・ヤコブ病として知られる神経変性障害を引き起こすことに関与するタンパク質性感染因子であるプリオンを保持し得る。プリオンは、脳においてタンパク質のミスフォールディングを引き起こし、結果として認知症、記憶喪失、発語障害、運動協調性の喪失、及び死亡（多くの場合症状の最初の発症後数ヶ月の期間内）をもたらす。
【００１０】
ヒト血清アルブミンを非タンパク質性安定剤に置き換える試みには、一般に困難があった。非タンパク質性ポリマーは、ボツリヌス毒素に対して反応性であり得るのであり、或いは、ボツリヌス毒素を変性させる及び／又は分解する反応性不純物を含み得る。例えば、いくつかの研究では、ボツリヌス毒素の非タンパク質性安定化化合物としてポロキサマーが使用されてきた。しかしながら、これら研究は、再構成されたポロキサマー安定化ボツリヌス毒素製剤が低いボツリヌス毒素活性を示すことを報告しており、ポロキサマー賦形剤がボツリヌス毒素を適切に安定化させることができず、且つ／或いは、望ましくない分解反応の発生を誘導したことを示唆している。
【００１１】
したがって、安定化されてはいるが、それがタンパク質性賦形剤なしに、特にいかなる動物タンパク質に基づく賦形剤もなしに達成されているボツリヌス毒素製剤が強く望まれるだろう。さらに、それ自体はボツリヌス毒素と反応しない非タンパク質性安定化賦形剤が強く望まれるだろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Schantz and Scott, in Lewis G. E. (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, N.Y.: Academic Press, 143-150 (1981)
【非特許文献２】Scott, Ophthalmol, 87:1044-1049 (1980)
【発明の概要】
【００１３】
態様の１つにおいて、本発明は、非タンパク質性賦形剤により安定化されたボツリヌス製剤に関する。特に、好ましい実施形態において本発明は、アルブミン又は他の動物タンパク質由来賦形剤なしに安定化されたボツリヌス毒素製剤に関する。
【００１４】
本発明の態様の１つは、ボツリヌス毒素、非還元性二糖又は非還元性三糖、非イオン性界面活性剤、及びｐＨ４．５〜６．５を維持できる生理的適合性緩衝剤を含む液体組成物を提供することである。液体組成物中の非還元糖の濃度は、１０％〜４０％（ｗ／ｖ）の範囲であり、非イオン性界面活性剤の濃度は０．００５％〜０．５％（ｗ／ｖ）の範囲である。
【００１５】
本発明のまた別の態様は、上述の液体組成物を乾燥させることにより粉末組成物を提供することである。
【００１６】
本発明はまた、ボツリヌス毒素製剤の安定化方法を提供する。本方法は、ボツリヌス毒素、非還元性二糖又は非還元性三糖、非イオン性界面活性剤、及びｐＨ４．５〜６．５を維持できる生理的適合性緩衝剤成分を、液体組成物を形成するために組み合わせることを含む。液体組成物中の非還元糖の濃度は１０％〜４０％（ｗ／ｖ）の範囲であり、非イオン性界面活性剤の濃度は０．００５％〜０．５％（ｗ／ｖ）の範囲である。任意でこの方法は、安定化粉末組成物を作製するために液体組成物を乾燥させることをさらに含む。
【００１７】
本発明のまた別の態様は、ボツリヌス毒素、非還元性二糖又は非還元性三糖、非イオン性界面活性剤、充填剤及び生理的適合性緩衝剤を含む液体組成物を提供することである。これら実施形態において、非還元性二糖組成物の濃度は、０．５０〜３．０％（ｗ／ｖ）の範囲であり、充填剤の濃度は１．５％〜７．５％の範囲であり、非イオン性界面活性剤の濃度は０．００５％〜０．５％（ｗ／ｖ）の範囲であり；且つ、組成物のｐＨは４．５〜６．５の範囲である。また、充填剤の量に対する非還元性二糖又は非還元性三糖の量は、液体組成物を乾燥させる際に充填剤が結晶化しないように選択される。本発明はまた、かかる液体組成物を乾燥させることにより調製される粉末製剤を明確に考慮している。
【００１８】
本発明はまた、ボツリヌス毒素、非還元性二糖又は非還元性三糖、非イオン性界面活性剤、充填剤及び生理的適合性緩衝剤を、液体組成物を形成するために組み合わせることを含む、ボツリヌス毒素製剤の安定化方法を提供する。非還元性二糖組成物の濃度は、０．５０〜３．０％（ｗ／ｖ）の範囲であり、充填剤の濃度は１．５％〜７．５％の範囲であり、非イオン性界面活性剤の濃度は０．００５％〜０．５％（ｗ／ｖ）の範囲であり；且つ、組成物のｐＨは４．５〜６．５の範囲である。任意でこの方法は、安定化粉末組成物を作製するために液体組成物を乾燥させることをさらに含む。また、充填剤の量に対する非還元性二糖又は非還元性三糖の量は、液体組成物を乾燥させる際に充填剤が結晶化しないように選択される。
【００１９】
本発明はまた、ボツリヌス毒素、非還元糖、非イオン性界面活性剤、生理的適合性緩衝剤、正の電荷を帯びたペプチド及び任意の充填剤を含む液体組成物を提供する。正の電荷を帯びたペプチドは、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）１５−Ｇ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）１５−Ｇ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ、及びＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）１５−Ｇ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。液体組成物のｐＨは、４．５〜６．５の範囲である。本発明はまた、かかる液体組成物を乾燥させることにより調製される粉末製剤を明確に考慮している。
【００２０】
本発明のさらにまた別の態様は、ボツリヌス毒素、非還元糖、非イオン性界面活性剤、生理的適合性緩衝剤、正の電荷を帯びたペプチド及び任意の充填剤を組み合わせることを含む、ボツリヌス毒素製剤の安定化方法を提供することである。正の電荷を帯びたペプチドは、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）１５−Ｇ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）１５−Ｇ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ、及びＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）１５−Ｇ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。液体組成物のｐＨは、４．５〜６．５の範囲である。任意でこの方法は、安定化粉末組成物を作製するために液体組成物を乾燥させることをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】凍結乾燥ボツリヌス毒素の４０℃での貯蔵後の時間の関数としての回復ボツリヌス毒素活性。
【図２】凍結乾燥ボツリヌス毒素の様々な温度での貯蔵後の時間の関数としての回復ボツリヌス毒素活性。
【図３】凍結乾燥ボツリヌス毒素の様々な温度での貯蔵後の時間の関数としての回復ボツリヌス毒素活性。
【００２２】
［本発明の詳細な説明］
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、アルブミン等、動物原料に由来する（すなわち、かかる原料から精製された）タンパク質性賦形剤の添加なしに安定化されるボツリヌス毒素製剤に関する。かかるものとして、本発明のボツリヌス製剤は、血液由来の病原体又は他のタイプの感染因子に伴う潜在的問題に悩まされることがない。本発明はまた、動物由来タンパク質性賦形剤の添加なしにボツリヌス毒素製剤を調製する方法を提供する。好ましい実施形態において、製剤はタンパク質性賦形剤を一切含まない。しかしながら、ある実施形態において、動物原料に由来しないタンパク質性賦形剤（例えば、組換えアルブミン又は組換えゼラチン）が本発明の製剤中に存在してもよい。
【００２４】
本発明のボツリヌス毒素製剤に関して本明細書において使用される、「安定化する（stabilize）」なる用語及びそのバリエーション（例えば、「安定化（stabilization）」、「安定化すること（stabilizing）」、「安定化される（stabilized）」等）は、２０マウスＬＤ５０アッセイにより測定された特定の期間にわたる製剤中のボツリヌス毒素の生物学的活性の維持を指す（LB Pearce, RE Borodic, Tox. Appl. Pharmacol, v128, p69, 1994 and ICCVAM/NICEATM/ECVAM, Scientific Workshop on Alternate Methods to Refine, Reduce and Replace the Mouse LD50 Assay for Botulinum Toxin Testing, 14 November 2006参照）。好ましい実施形態において、特定の期間にわたりボツリヌス毒素の生物学的活性は１００％維持される。しかしながら、他の実施形態において、特定の期間にわたりボツリヌス毒素の生物学的活性は少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％維持される。ある実施形態において、特定の期間の長さは、ボツリヌス毒素製品製造プロセスの長さと一致するよう選択されてもよい。例えば、特定の期間の長さは、１又は２以上の工程下にある際に、ボツリヌス毒素を安定化するのに十分であるよう選択されてもよい。他の実施形態において、貯蔵のためにボツリヌス毒素製剤の長期的安定化を可能にするよう、非毒素製剤成分が選択される等の場合に、特定の期間は週、月又は年単位でさえあるだろう。ある実施形態において、特定の期間は少なくとも２週、少なくとも１ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１年、少なくとも１８ヶ月又は少なくとも２年である。他の実施形態において、特定の期間は、本発明の製剤を用いてボツリヌス毒素が所望の量の生物活性を維持する期間と一致し、この期間は例えば、上述の活性の持続期間を含む。製剤を安定化するために用いられる成分は、低温（例えば、−５℃〜−１０℃）又は、本明細書に記載の通り、周囲温度での安定化を可能にするよう選択されてもよい。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本発明のボツリヌス毒素製剤は固形で提供される。例に過ぎないが、固形製剤を作製するため、製剤は凍結乾燥又は真空乾燥されてもよい。本発明のボツリヌス毒素製剤が固形で提供され、且つ、ボツリヌス製剤の安定性が測定される特定の期間が１週以内である場合、再構成の際に観察される活性は、初期回復の際の活性として言及される。本発明のある好ましい実施形態において、初期回復の際の活性は少なくとも７０％、８０％、又は９０％維持される。他の実施形態において、初期回復の際の活性は少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％維持される。特に好ましい実施形態において、初期回復の際の活性は９９％超であり、１００％でさえあり得る。
【００２６】
他の実施形態において、安定性が測定される特定の期間は、所定の貯蔵温度で１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４ヶ月を超える。本発明のボツリヌス毒素製剤が固形で提供され、且つ、ボツリヌス製剤の安定性が測定される特定の期間が１２ヶ月以上である際、再構成の際に観察される活性は、長期貯蔵の際の活性として言及される。ある好ましい実施形態において、長期貯蔵の際のボツリヌス毒素活性は少なくとも７０％、８０％、又は９０％維持される。ある実施形態において、長期貯蔵の際のボツリヌス毒素活性は９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％維持される。ある実施形態において、２５℃で１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４ヶ月貯蔵後のボツリヌス毒素活性は少なくとも９０％維持される；２５℃で１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４ヶ月貯蔵後のボツリヌス毒素活性は少なくとも９１％維持される；２５℃で１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４ヶ月貯蔵後のボツリヌス毒素活性は少なくとも９２％維持される；２５℃で１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４ヶ月貯蔵後のボツリヌス毒素活性は少なくとも９３％維持される；２５℃で１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４ヶ月貯蔵後のボツリヌス毒素活性は少なくとも９４％維持される；２５℃で１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４ヶ月貯蔵後のボツリヌス毒素活性は少なくとも９５％維持される；２５℃で１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４ヶ月貯蔵後のボツリヌス毒素活性は少なくとも９６％維持される；２５℃で１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４ヶ月貯蔵後のボツリヌス毒素活性は少なくとも９７％維持される；２５℃で１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４ヶ月貯蔵後のボツリヌス毒素活性は少なくとも９８％維持される；或いは、２５℃で１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４ヶ月貯蔵後のボツリヌス毒素活性は少なくとも９９％維持される。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態において、ボツリヌス毒素製剤は固形ではなく液状で貯蔵される。ある好ましい実施形態において、本発明の液体ボツリヌス毒素製剤は、室温で８時間までは少なくとも６０％、７０％、８０％、又は９０％のボツリヌス毒素活性を維持する。特に好ましい実施形態において、本発明の液体ボツリヌス毒素製剤は、室温で８時間までは１００％のボツリヌス毒素活性を保持する。
【００２８】
本発明のボツリヌス製剤の賦形剤は有益なことに、製造及び貯蔵中にボツリヌス毒素が減少する機序を減退させるか、或いは除去する。理論により限定されることを望まないが、本発明の非タンパク質性賦形剤は、製剤の製造、貯蔵、又は運搬のために用いられる容器に対するボツリヌス毒素の望ましくない固着を減少させる又は除去すると考えられる。限定を意図しないかかる容器の例には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、及び他のポリマーで作製されたものが含まれる。さらに、やはり理論により限定されることを望まないが、本発明の非タンパク質性賦形剤は、ボツリヌス毒素と、製造、貯蔵、又は運搬中にボツリヌス毒素が遭遇する対象又は物質との間の望ましくない反応を減少させる又は防ぐと考えられる。好ましい実施形態において、非タンパク質性賦形剤は製剤の他の成分に対して不活性である。
【００２９】
いくつかの実施形態において、ボツリヌス毒素製剤は、取扱い、輸送、又は貯蔵を容易にするため、粉末として調製される。粉末は当技術分野において公知のいかなる方法により調製されてもよい。限定を意図しないかかる方法の例には、凍結乾燥、真空乾燥、ドラム乾燥及び噴霧乾燥が含まれ、凍結乾燥及び真空乾燥が特に好ましい。
【００３０】
本明細書において用いられる「ボツリヌス毒素」なる用語は、細菌により生み出されたものであるか、組換え技術により生み出されたものであるかにかかわらず、公知のボツリヌス毒素型のいずれか、及び、人工変異体又は融合タンパク質を含む、引き続いて発見され得るあらゆるかかる型を指すことが意図されている。上述の通り、現在のところ７つの免疫学的に別個のボツリヌス神経毒素、すなわち、ボツリヌス神経毒素血清Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ型が特徴付けられており、そのそれぞれが、型特異的抗体を用いた中和により識別される。これらボツリヌス毒素血清型は、Sigma-Aldrich社及びMetabiologics, Inc.社（ウィスコンシン州マディソン）その他の供給元より入手可能である。これら異なるボツリヌス毒素血清型は、影響を及ぼす動物種並びに誘起する麻痺の重症度及び持続期間において異なる。
【００３１】
本発明の組成物に用いられるボツリヌス毒素は、或いはボツリヌス毒素誘導体、すなわち、ボツリヌス毒素活性を有するが、天然又は組換えの未変性ボツリヌス毒素に対して任意の部分又は任意の鎖に１又は２以上の化学的又は機能的改変を含む化合物でもあり得る。例えば、ボツリヌス毒素は修飾神経毒素（例えば、天然神経毒素又は組換えにより作製された神経毒素又はそれらの誘導体若しくは断片と比較して、そのアミノ酸のうちの少なくとも１つに欠失、修飾又は置換を有する神経毒素）であってもよい。例えば、ボツリヌス毒素は、その特性を高める方法又は望ましくない副作用を減少させる方法で修飾されたが、所望のボツリヌス毒素活性を依然として保持するものであってもよい。ボツリヌス毒素は、細菌により生み出される上述のボツリヌス毒素複合体のいずれかであってもよい。或いは、ボツリヌス毒素は、組換え技術又は合成化学技術を用いて調製された毒素（例えば、異なるボツリヌス毒素血清型のサブユニット又はドメインから調製された組換えペプチド、融合タンパク質、又はハイブリッド神経毒素（例えば米国特許公報第６，４４４，２０９号参照））であってもよい。ボツリヌス毒素はまた、分子全体のうちの必要なボツリヌス毒素活性を有することが示された一部であってもよく、かかる場合にはそのままで、又は、結合分子若しくは共役分子の一部として、例えば融合タンパク質の一部として用いられてもよい。加えて、ボツリヌス毒素はボツリヌス毒素前駆体の形であってもよく、かかる前駆体はそれ自体非毒性であって、例えばタンパク質分解的切断時に毒性になる非毒性亜鉛プロテアーゼであってもよい。
【００３２】
本明細書において用いられる「ボツリヌス毒素複合体」又は「毒素複合体」なる用語は、関連内因性非毒素タンパク質（すなわち、ボツリヌス菌により生み出される赤血球凝集素タンパク質及び非毒素非赤血球凝集素タンパク質）と共にある、およそ１５０ｋＤのボツリヌス毒素タンパク質分子（ボツリヌス毒素血清型Ａ〜Ｇ型のいずれかに属する）を指す。しかしながら、ボツリヌス毒素複合体は、単一の毒素複合体としてボツリヌス菌に由来する必要はないことに注意すべきである。例えば、まず最初にボツリヌス毒素又は修飾ボツリヌス毒素が組換えにより調製され、その後続いて非毒素タンパク質と組み合わされてもよい。組換えボツリヌス毒素はまた、（例えば、List Biological Laboratories社、カリフォルニア州キャンペルから）購入して、その後非毒素タンパク質と組み合わせることもできる。
【００３３】
本発明はまた、「低減ボツリヌス毒素複合体（reduced botulinum toxin complexes）」を考慮している。このボツリヌス毒素複合体は、ボツリヌス菌により生み出されたボツリヌス毒素複合体において天然状態で見出される量と比較して、低減された量の非毒素タンパク質を有する。実施形態の１つにおいて、低減ボツリヌス毒素複合体は、ボツリヌス菌に由来するボツリヌス毒素複合体から赤血球凝集素タンパク質又は非毒素非赤血球凝集素タンパク質の画分を抽出するための、どの従来のタンパク質分離方法を用いても調製される。例えば、低減ボツリヌス毒素複合体は、ｐＨ７．３での赤血球への曝露を介してボツリヌス毒素複合体を解離させることにより作製されてもよい（例えば、欧州公開特許公報第１５１４５５６  Ａ１号参照、本文献は参照により本明細書に組み込まれる）。ＨＰＬＣ、透析法、カラム法、遠心分離法、及びタンパク質からタンパク質を抽出するための他の方法が用いられ得る。或いは、低減ボツリヌス毒素複合体が、合成により作製されるボツリヌス毒素を非毒素タンパク質と組み合わせることにより作製される際には、単に天然ボツリヌス毒素複合体に存在すると考えられるよりも少ない赤血球凝集素又は非毒素非赤血球凝集素タンパク質を混合物に添加するのでもよい。本発明の低減ボツリヌス毒素複合体中の非毒素タンパク質（例えば、赤血球凝集素タンパク質又は非毒素非赤血球凝集素タンパク質又はその両方）のどれも独立に、いかなる量で減少させてもよい。ある典型的な実施例においては、１又は２以上の非毒素タンパク質を、通常ボツリヌス毒素複合体に見出される量と比較して、少なくとも約０．５％、１％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％減少させる。実施形態の１つにおいて、実質的に、ボツリヌス菌に由来するボツリヌス毒素複合体に通常見出されると考えられる非毒素タンパク質のすべて（例えば、＞９５％の赤血球凝集素タンパク質及び非毒素非赤血球凝集素タンパク質）が、ボツリヌス毒素複合体から除去される。また別の実施形態においては、赤血球凝集素タンパク質及び非毒素非赤血球凝集素タンパク質を一切用いず、純粋にボツリヌス毒素分子のみが用いられる。さらに、いくつかの場合では複数の内因性非毒素タンパク質の量を同じ量で減少させてもよいとはいえ、本発明はまた、内因性非毒素タンパク質のそれぞれを異なった量で減少させること、並びに、内因性非毒素タンパク質のうちの少なくとも１つを減少させるが、他のものは減少させないことも考慮している。
【００３４】
複数のボツリヌス毒素の異なった性質及び特性ゆえに、ボツリヌス毒素血清型の混合物は、現時点では一般にヘルスケア産業又は美容産業においては投与されないとはいえ、本発明はまた、複数のボツリヌス毒素の組合せ及び混合物の一般的使用も考慮している。
【００３５】
本発明のボツリヌス毒素製剤は、非イオン性界面活性剤を含む。一般に、ボツリヌス毒素を安定化する能力を有し、製薬学的用途に適したあらゆる非イオン性界面活性剤の使用を、本発明は考慮している。ある実施形態において、非イオン性界面活性剤はポリソルベートであり、限定を意図しないその例には、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、及びポリソルベート８０が含まれる。他の実施形態において、非イオン性界面活性剤はソルビタンエステルであり、限定を意図しないその例には、Span 20、Span 60、Span 65、及び Span 80が含まれる。本発明はまた、ポロキサマーの使用を考慮しており、限定を意図しないその例には、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８８、及びポロキサマー４０７が含まれる。本発明はまた、Triton X-100又はNP-40を非イオン性界面活性剤として用いることを考慮している。加えて本発明は、異なった非イオン性界面活性剤の組合せが同時に用いられる実施形態を考慮している。ある好ましい実施形態において、非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート、ポロキサマー、及びソルビタンからなる群から選択され、ポリソルベート及びソルビタンが特に好ましい。好ましい実施形態において、非イオン性界面活性剤の濃度は、０．００５％〜０．５％の範囲、又は０．０１％〜０．２％の範囲、又は０．０２％〜０．１％の範囲、又は０．０５〜０．０８％の範囲である。本発明はまた、非イオン性界面活性剤の濃度が０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１０％、０．１１％、０．１２％、０．１３％、０．１４％、又は０．１５％である製剤を考慮している。
【００３６】
本発明のボツリヌス毒素製剤は、非還元糖を含む。好ましい実施形態において、非還元糖は、５５℃、５７℃又は６０℃を超えるガラス転移温度を有する。理論に縛られることは望まないが、かかるガラス転移温度は、ボツリヌス毒素の変性を引き起こす望ましくない分子運動を抑制するのに十分な高さであると考えられる。ある特に好ましい実施形態において、非還元糖は二糖であり、限定を意図しないその例には、トレハロース及びスクロースが含まれる。他の実施形態において、非還元糖は三糖であり、その限定を意図しない一例は、ラフィノースである。一般に、本発明のボツリヌス毒素製剤における非還元糖の濃度は、１０％〜４０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１０％〜２５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１５％〜２０％（ｗ／ｖ）の範囲である。いくつかの好ましい実施形態において、非還元糖の濃度は、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％（ｗ／ｖ）である。非還元糖がトレハロースである際には、好ましくは水和型のトレハロース（すなわち、トレハロース二水和物）が製剤を調製するのに用いられるが、無水型のトレハロースの使用も考慮されている。
【００３７】
さらに、本発明の態様の１つは、ボツリヌス毒素製剤の安定性を調整するために、使用する非還元糖を温度の関数として選択してもよいという認識である。例えば、ボツリヌス毒素製剤が冷蔵なしの条件下にある際には、トレハロースを非還元糖として用いることが有益である。なぜなら、トレハロースは周囲温度でボツリヌス毒素に安定性を付与するからである。したがって、本発明のトレハロース含有製剤は有益なことに、周囲温度で様々な製造プロセス中にボツリヌス毒素活性の大した減少もなしに処理され得る。ボツリヌス毒素製剤が冷蔵される状況（例えば、数ヶ月又は数年までの長期貯蔵中）においては、スクロースを非還元糖として選択してもよい。糖の混合物もまた本発明により考慮されている。例えば、ある実施形態において、スクロース及びトレハロースの両方がボツリヌス毒素製剤に添加される。糖混合物の具体的成分比は達成されるべき効果に依存し、常法の実験により決定され得る。やはり本発明の範囲内であるのは、精製、製造、又は貯蔵の異なる段階における、複数の二糖等の異なる非還元糖の単体での又は組み合わせての使用である。したがって、例えば、トレハロースが比較的高温（例えば、周囲温度）での初期処理及び／又は精製中に用いられ、続いてトレハロースの除去及びスクロースとの置換がなされてもよい。二糖等のある非還元糖の除去及びまた別の非還元糖への置換は、例えば、透析法、クロマトグラフィー、又は他の当技術分野において公知の方法により達成されてもよい。
【００３８】
本発明のまた別の態様は、本明細書において特定される非還元糖（又は糖）が、ある実施形態において、固形ボツリヌス毒素製剤の主要な充填剤として作用し得るという認識である。特に、非還元糖が本明細書において特定される量で添加される場合には、ボツリヌス毒素製剤の凍結乾燥又は真空乾燥の際に安定的で力学的に強力なケークを形成し得ることが見出された。理論により限定されることは望まないが、かかる製剤における非還元糖は非晶質固体を形成し、非還元糖上のヒドロキシル基が水素結合を最大化するようランダムに非還元糖を方向付けることで、ボツリヌス毒素を安定化させ、力学的頑強性を固形ケークに付与すると考えられる。いくつかの好ましい実施形態において、本明細書において記述される非還元糖は、ボツリヌス毒素製剤の唯一の充填剤として用いられる。他の好ましい実施形態において、非還元糖は主要な充填剤として作用するが、少量の第２の充填剤がボツリヌス毒素製剤に添加される。第２の充填剤は特に限定されず、ボツリヌス毒素製剤の安定性に対して容認しがたい悪影響を与えないいかなる充填剤であってもよい。結晶化する傾向を有する第２の充填剤を用いる際には、十分に低い濃度でそれを添加し、結果としてそれが結晶化し得ないことが好ましい。理論により限定されることは望まないが、かかる第２の充填剤の結晶化は、凍結乾燥又は真空乾燥後に得られる固形ケークの安定性に悪影響を及ぼすであろうと考えられる。
【００３９】
本発明のさらなる態様の１つは、非還元糖が本明細書において記述される濃度で、凍結乾燥ボツリヌス毒素製剤の安定化のためのみならず、液相中のボツリヌス毒素製剤の安定化のためにも用いられ得るという予想外の結果である。
【００４０】
好ましい実施形態において、ボツリヌス毒素製剤は緩衝剤を含む。一般に、ｐＨを４．５〜６．５の範囲、より好ましくは５〜６の範囲、最も好ましくは約５．５に維持できる生理的適合性緩衝剤はどれも、本発明のボツリヌス毒素製剤に適している。限定を意図しないかかる緩衝剤の例には、クエン酸、酢酸、コハク酸、酒石酸、マレイン酸、及びヒスチジンの塩を含むものが含まれる。限定を意図しない適切な緩衝剤濃度の例には、０．４００％〜０．６００％；０．４５０％〜０．５７５％、又は０．５００％〜０．５６５％の範囲の緩衝剤濃度が含まれる。本発明はまた、緩衝塩の混合物を含むボツリヌス毒素製剤を考慮しており、限定を意図しないかかる混合物の例には、シトレート／アセテート、シトレート／ヒスチジン、シトレート／タルトレート、マレエート／ヒスチジン、又はスクシネート／ヒスチジンが含まれる。ある好ましい実施形態において、緩衝剤はリン酸緩衝剤である。
【００４１】
ある実施形態において、ボツリヌス毒素製剤は（非還元糖に加えて）充填剤を含むのであり、これは凍結乾燥型のボツリヌス毒素製剤の取扱いを容易にする。ある好ましい実施形態において、充填剤は凍結乾燥条件下で結晶化し、固形状態で他の賦形剤とあまり混合しない。しかしながら、他の好ましい実施形態において、充填剤は、凍結中に結晶化する傾向を有すると知られている（例えば、マンニトール又はグリシン）とはいえ、凍結乾燥条件下で非晶質のままである。当業者により理解されるであろうことだが、凍結乾燥中に充填剤が結晶化するか、或いは非晶質のままであるかは、充填剤のタイプ、製剤の他の成分に対する充填剤の量、及び製剤が凍結乾燥される速度を含む、複数の因子により制御されている。ある好ましい実施形態において、充填剤に対する非還元糖の量は、充填剤の結晶化を抑制するよう調節される。この場合、充填剤に対する非還元糖の比は、重量パーセントで、０．３３〜１；０．５〜１、０．７５〜１；１：１；２：１、３：１、又は４：１より大きくてもよい。本発明により考慮される充填剤の限定を意図しない例には、ソルビトール、マンニトール、グリシン、アルギニン、及びヒスチジンが含まれる。いくつかの実施形態において、充填剤の濃度は、１％〜１０％、２％〜６％、３％〜５％又は４％〜４．５％（ｗ／ｖ）の範囲であってもよい。ある好ましい実施形態において、充填剤が用いられる際には、非還元糖の濃度を１０％〜４０％（ｗ／ｖ）の範囲から０．５％〜３．０％（ｗ／ｖ）の範囲に減少させてもよい。さらに、ある好ましい実施形態において、充填剤に対する非還元糖の比は、０．０７〜２．０、好ましくは０．４〜０．６の範囲である。したがって、例に過ぎないが、製剤は、充填剤としてマンニトール及び非還元糖としてトレハロース二水和物を含んでいてもよく、マンニトールは１．５％〜７．５％（ｗ／ｖ）の濃度範囲で存在し、トレハロース二水和物０．５％〜３．０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲で存在する。好ましくは、充填剤は塩化ナトリウムではない。
【００４２】
本発明のボツリヌス毒素製剤は、あらゆる従来の投与経路を介して投与され得る。本発明のいくつかの実施形態において、ボツリヌス毒素製剤は、筋内注射又は皮下注射により対象へと投与される。他の実施形態において、ボツリヌス毒素製剤は局所投与される。ボツリヌス毒素製剤が局所投与されるか、或いは注射により投与されるかにかかわらず、製剤は、ボツリヌス毒素の当該組織への透過を促進するため、本明細書に記載の、正の電荷を帯びた効率基（efficiency groups）を有する正の電荷を帯びた担体を含んでいてもよい。しかしながら、正の電荷を帯びた担体は安定化に不要であり、製剤がかかる正の電荷を帯びた担体を含まない実施形態を本発明は考慮していることに注意すべきである。本発明のボツリヌス毒素製剤はまた、薬剤送達装置を介して投与されてもよく、その限定を意図しない一例は、皮膚パッチである。
【００４３】
ボツリヌス毒素製剤が局所投与される際には、ボツリヌス毒素の経皮透過を促進するために、本明細書に記載の、正の電荷を帯びた分枝基を有する正の電荷を帯びた担体を製剤中に含むことが有益である（米国特許出願第０９／９１０，４３２号；第１１／０７３，３０７号；第１１／０７２，０２６号；及び第１０／７９３,１３８号も参照。これら文献それぞれが、その全体にわたり参照により組み込まれる）。正の電荷を帯びた担体又は何らかの他の経皮輸送亢進手段を使用しないのであれば、局所適用されたボツリヌス毒素の経皮フラックスはかなり低いと予測されるだろう。本発明がまた、本明細書に記載の正の電荷を帯びた担体の使用に加えて、経皮輸送を亢進する他の方法を本発明のボツリヌス毒素製剤と共に使用することも考慮している点に注意すべきである。限定を意図しないかかる方法の例には、リポソーム、イオントフォレーゼ、ミセル等を用いたボツリヌス毒素製剤の経皮送達が含まれる。
【００４４】
さらに、ボツリヌス毒素製剤が局所投与されるのであれば、製剤の粘性を高め、ボツリヌス毒素の適用をより容易且つ正確にするため、それをゲル化剤及び／又は粘性調整剤と混合することが多くの場合有益である。加えて、もし正の電荷を帯びた担体が用いられるのであれば、これら薬剤は、ボツリヌス毒素の活性の減少をもたらす傾向にある水性ボツリヌス毒素／担体製剤の乾燥を防ぐのに役立つ。特に好ましい薬剤は、帯電しておらず、ボツリヌス毒素活性又は毒素担体複合体の皮膚透過効率を妨げないものである。ゲル化剤は、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（hydroxypropylcellulose、ＨＰＣ）等のある種のセルロースベースゲル化剤であってもよい。いくつかの実施形態において、ボツリヌス毒素／担体複合体は、２〜４％ＨＰＣを有する組成物中に処方される。或いは、ボツリヌス毒素／担体複合体を含む溶液の粘性は、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）を添加することにより改変されてもよい。他の実施形態において、ボツリヌス毒素／担体溶液は、Cetaphil（登録商標）保湿剤等の前もって混合された粘性の薬剤と組み合わされる。他の実施形態において、粘性調整剤はポロキサマーであり、限定を意図しないその例には、ポロキサマー１８８及びポロキサマー４０７が含まれる。粘性調整剤はまた、ポリアクリル酸、ポリアミド、又は植物ガム（例えば、グアーガム）であってもよい。さらに、本明細書に記載のボツリヌス毒素製剤は、エマルション（マイクロエマルションを含む）、懸濁液、クリーム、ローション、ゲル、粉末、又は他の典型的な固形又は液体組成物を形成するよう賦形剤と混合されてもよく、これら組成物は、皮膚及びかかる組成物が用いられ得る他の組織に適用するために用いられる。かかる組成物はまた、抗菌剤、保湿剤及び水和剤、透過剤、保存剤、乳化剤、天然油若しくは合成油、溶媒、界面活性剤、洗剤、皮膚軟化剤、抗酸化剤、芳香剤、充填剤、増粘剤、ワックス、除臭剤、染料、着色剤、粉末、及び任意で麻酔剤、かゆみ止め添加剤、植物抽出物、品質改良剤、暗色化剤若しくは明色化剤、光沢剤、湿潤剤、雲母、ミネラル、ポリフェノール、シリコン又はそれらの誘導体、日焼け止め、ビタミン、並びに薬用植物等の、かかる製品中に典型的に用いられる他の成分を含んでいてもよい。
【００４５】
本発明はまた、本発明のボツリヌス毒素製剤を調製及び／又は投与するためのキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、ボツリヌス毒素、及び、本発明の安定化製剤を作製するために必要なさらなる賦形剤を含む。キットはまた、かかる製剤を作製するために用いられ得るプレミックスを含んでいてもよい。他の実施形態において、キットは、凍結乾燥された本発明のボツリヌス毒素製剤及び製剤を送達するための装置を含み、限定を意図しないその例の１つは注射器である。
【００４６】
本発明は、治療中に「治療量」のボツリヌスを対象に送達する製剤を提供する。本明細書において用いられる「治療量」なる用語は、所望の効果（例えば、筋肉の弛緩、皺の治療、痛みの治療、又は汗腺等の過活動腺の活性の減少）を生み出すのに十分なボツリヌス毒素の量を指す。「治療量」のボツリヌス毒素とは、望ましくない麻痺又は他の望ましくない若しくは有害な副作用を引き起こさない安全量であることが、暗に含意されている。投与されるボツリヌス毒素の具体的な量は、投与経路、投与部位、治療されるべき適応症、及び特定の製剤中のボツリヌス毒素の血清型（又は複数の血清型）を含む、複数の因子に依存するだろう。例えば、Ａ型血清型ボツリヌス毒素が選択される際に、治療量は、１０Ｕ〜１５０Ｕ又は１０００Ｕ〜２５００Ｕの範囲であってもよい。他の好ましい実施形態において、治療量は、４００Ｕ〜８００Ｕ及び１０００Ｕ〜５００００Ｕ、好ましくは２０００Ｕ〜３５０００Ｕ、より好ましくは３０００Ｕ〜３００００Ｕ、なお一層好ましくは４０００Ｕ〜２５０００Ｕの範囲である。ある実施形態において、治療量は、４０００Ｕ〜８０００Ｕ、９０００Ｕ〜１９０００Ｕ、又は２００００Ｕ〜４００００Ｕの範囲である。
【００４７】
本発明の組成物は、所望の効果を引き起こすように適用され、かかる効果は美容効果又は治療効果であってもよい。所望の効果には、例えば、特に顔面における外見の小皺及び／又は皺の減少、又は、目の拡張、口角の持上げ、若しくは上唇から扇形に広がる皺の平滑化等の他の方法での顔面の外見の調整、又は、筋肉の緊張の全般的な軽減を目的とした、何らかの筋肉の弛緩が含まれる。最後に言及された筋肉の緊張の全般的な軽減という効果は、顔面又は他の部位において達成され得る。本発明の組成物は、単回投与治療としての適用に適した有効量のボツリヌス毒素を含んでいてもよく、或いは、投与現場での希釈又は複数回適用における使用のため、より濃縮されていてもよい。安定化ボツリヌス毒素複合体又は安定化低減ボツリヌス毒素複合体は、顔面の筋肉若しくは他の筋肉の望ましくない痙攣、多汗症、ざ瘡等の症状、又は、筋肉痛若しくは筋痙攣の軽減が望まれる身体の他の部位の症状を治療するため、対象に投与され得る。ボツリヌス毒素は、筋肉又は他の皮膚関連構造に投与される。投与は、例えば、顔面、脚、肩、背中（下背を含む）、腋窩、手掌、足、首、鼠径部、手又は足の背側、肘、上腕、膝、脚上部、殿部、胴体、骨盤、又はボツリヌス毒素の投与が望まれる他の身体のあらゆる部分になされてもよい。
【００４８】
ある好ましい実施形態において、本発明のボツリヌス毒素製剤は、正の電荷を帯びた効率基を有する正の電荷を帯びた担体を含む。この場合、正の電荷を帯びた担体は、ボツリヌス毒素の当該の組織への透過を亢進するのに十分な量で存在する。本明細書において用いられる「正の電荷を帯びた」なる用語は、担体が少なくともいくつかの液相条件下、より好ましくは少なくともいくつかの生理的適合性条件下で正の電荷を有することを意味する。より具体的には、「正の電荷を帯びた」は、例えば第４級アミンのように、問題の基があらゆるｐＨ条件下で帯電した官能性を含むか、或いは、第１級アミンの場合のｐＨ変化等のように、何らかの液相条件下で正の電荷を獲得し得る官能性を含むことを意味する。より好ましくは、本明細書において用いられる「正の電荷を帯びた」なる用語は、生理的適合性条件下で陰イオンと結合する振舞いを有する基を指す。正の電荷を帯びた部分を多数有するポリマーがホモポリマーである必要はなく、このことは当業者にとって明らかであろう。正の電荷を帯びた部分の他の例は先行技術においてよく知られており、容易に利用され得るのであり、このことは当業者にとって明らかであろう。
【００４９】
一般に、正の電荷を帯びた担体は、典型的には原子鎖である正の電荷を帯びた骨格を含み、生理的ｐＨで正の電荷を帯びた鎖中の基、又は、骨格から伸長する側鎖と結合した正の電荷を帯びた基を有する。好ましくは、正の電荷を帯びた骨格それ自体は、明確な生物学的酵素活性又は治療活性を有さない。直鎖骨格は、いくつかの実施形態において、窒素、酸素、硫黄、ケイ素及びリンから選択されるヘテロ原子が割り込む（interrupt）炭化水素骨格である。骨格鎖原子の大部分は、通常は炭素である。加えて、骨格は多くの場合、反復単位のポリマー（例えば、アミノ酸、ポリ（エチレンオキシ）、ポリ（プロピレンアミン）、ポリアルキレンイミン等）だが、ヘテロポリマーでもあり得る。実施形態群の１つにおいて、正の電荷を帯びた骨格はポリプロピレンアミンであり、このとき複数のアミン窒素原子が正の電荷を帯びたアンモニウム基（テトラ置換）として存在する。また別の実施形態において、正の電荷を帯びた骨格は非ペプチジルポリマーであり、それはヘテロポリマー又はホモポリマーであってもよく、例えば、約１００〜約２５０００００Ｄ、好ましくは約２５０〜約１８０００００Ｄ、最も好ましくは約１０００〜約１４０００００Ｄの分子量を有するポリアルキレンイミン、例えばポリエチレンイミン又はポリプロピレンイミン等である。また別の実施形態群において、骨格は、正の電荷を帯びた基（例えば、アンモニウム基、ピリジニウム基、ホスホニウム基、スルホニウム基、グアニジニウム基、又はアミジニウム基）を含む複数の側鎖部分と結合する。この実施形態群における側鎖部分は、骨格に沿って間隔を置いて配置され得るのであり、かかる間隔は一定であるか、或いはばらつきがある。加えて、側鎖の長さは同程度の長さでも異なる長さでもあり得る。例えば、実施形態群の１つにおいて、側鎖は、１〜２０の炭素原子を有し、且つ、上に示した正の電荷を帯びた基のうちの１つが遠位末端（骨格から離れた末端）での終端となる、直鎖又は分枝炭化水素鎖であり得る。本発明のすべての態様において、担体とボツリヌス毒素との間の会合は非共有相互作用によるのであり、限定を意図しないその例には、イオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、又はそれらの組合せが含まれる。
【００５０】
実施形態群の１つにおいて、正の電荷を帯びた骨格は、複数の正の電荷を帯びた側鎖基（例えば、リジン、アルギニン、オルニチン、ホモアルギニン等）を有するポリペプチドである。好ましくは、ポリペプチドは、約１００〜約１５０００００Ｄ、より好ましくは約２５０〜約１２０００００Ｄ、最も好ましくは約１０００〜約１００００００Ｄの分子量を有する。当業者は、アミノ酸が本発明のこの部分に用いられる際には、側鎖が結合の中心でＤ型又はＬ型（Ｒ配置又はＳ配置）を有し得ることを認めるだろう。ある好ましい実施形態において、ポリペプチドは、約５００〜約５０００Ｄ、より好ましくは１０００〜約４０００Ｄ、より好ましくは２０００〜約３０００Ｄの分子量を有する。他の実施形態において、ポリペプチドは少なくとも約１００００の分子量を有する。
【００５１】
また別の実施形態において、骨格部分はポリリジンであり、本明細書において議論される効率基はポリリジンに結合される。ポリリジンは、約１００〜約１５０００００Ｄ、好ましくは約２５０〜約１２０００００Ｄ、最も好ましくは約１０００〜約３０００Ｄの分子量を有していてもよい。典型的な実施形態の１つにおいて、正の電荷を帯びた効率基を有する正の電荷を帯びた担体は、アミノ酸配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）１５−Ｇ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）１５−Ｇ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ、又はＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）１５−Ｇ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有するペプチドである。それはまた、市販のポリリジン（Sigma Chemical Company社製、米国ミズーリ州セントルイス）のいずれかであり得るのであり、それは例えば、ＭＷ＞７００００Ｄを有するポリリジン、７００００〜１５００００ＤのＭＷを有するポリリジン、ＭＷ１５００００〜３０００００Ｄを有するポリリジン及びＭＷ＞３０００００Ｄを有するポリリジン等である。適切なポリリジンの選択は、組成物の他の成分に依存するのであり、組成物に全体として正味の正の電荷を提供し、且つ、好ましくは負の電荷を帯びている成分の総延長の１〜４倍の長さを提供するのに十分であるだろう。
【００５２】
或いは、骨格はペプトイド等のポリペプチドの類似体であり得る。例えば、Kessler, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32:543 (1993)；Zuckermann et al. Chemtracts--Macromol. Chem. 4:80 (1992)；及びSimon et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:9367 (1992)参照。簡潔に述べると、ペプトイドの１つは、側鎖がアルファ炭素原子ではなく骨格窒素原子と結合しているポリグリシンである。上述のように、正の電荷を帯びた骨格成分を提供するため、典型的には側鎖に正の電荷を帯びた基で終端となっている部分がある。ペプトイドの合成は例えば、米国特許公報第５，８７７，２７８号に記述されており、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。本明細書において用いられる用語として、ペプトイド骨格構造を有する正の電荷を帯びた骨格が「非ペプチド」とみなされる。なぜならこれらは、α炭素位置に天然側鎖を有するアミノ酸からなってはいないからである。
【００５３】
例えば、ポリペプチドの立体的又は電子的模倣体（steric or electronic mimics）を利用して、様々な他の骨格が用いられ得るのであり、このときペプチドのアミド結合は、エステル結合、チオアミド（−−ＣＳＮＨ−−）、逆チオアミド（reversed thioamide）（−−ＮＨＣＳ−−）、アミノメチレン（−−ＮＨＣＨ２−−）又は逆メチレンアミノ(reversed methyleneamino)（−−ＣＨ２ＮＨ−−）基、ケトメチレン（−−ＣＯＣＨ２−−）基、ホスフィネート（−−ＰＯ２ＲＣＨ２−−）、ホスホンアミデート及びホスホンアミデートエステル（−−ＰＯ２ＲＮＨ−−）、逆ペプチド（reverse peptide）（−−ＮＨＣＯ−−）、トランスアルケン（−−ＣＲ＝ＣＨ−−）、フルオロアルケン（−−ＣＦ＝ＣＨ−−）、ジメチレン（−−ＣＨ２ＣＨ２−−）、チオエーテル（−−ＣＨ２Ｓ−−）、ヒドロキシエチレン（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）、メチレンオキシ（−−ＣＨ２Ｏ−−）、テトラゾール（ＣＮ４）、スルホンアミド（−−ＳＯ２ＮＨ−−）、メチレンスルホンアミド（−−ＣＨＲＳＯ２ＮＨ−−）、逆スルホンアミド（reversed sulfonamide）（−−ＮＨＳＯ２−−）、並びに、マロナート及び／又はジェム−ジアミノ−アルキルサブユニットを有する骨格、例えば、Fletcher et al.（ (1998) Chem. Rev. 98:763）により概説され、そこに引用されている文献により詳細に説明されているもの等、代用のものに置換される。前述の置換の多くが、α−アミノ酸から形成される骨格と比較してほぼ等配電子のポリマー骨格をもたらす。
【００５４】
上で提供される骨格のそれぞれにおいて、正の電荷を帯びた基を有する側鎖基が付加され得る。例えば、スルホンアミド結合骨格（−−ＳＯ２ＮＨ−−及び−−ＮＨＳＯ２−−）は、窒素原子と結合する側鎖基を有し得る。同様にして、ヒドロキシエチレン（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）結合は、ヒドロキシ置換基と結合する側鎖基を有し得る。当業者は、標準的な合成方法を用いて正の電荷を帯びた側鎖基を提供するための、その他の結合化学を容易に適用することができる。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態において、正の電荷を帯びた担体は、正の電荷を帯びた効率基を含む。限定を意図しない効率基の例には、−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２（式中、下付き文字ｎ１は、０〜２０、より好ましくは０〜８、なお一層好ましくは２〜５の整数であり、且つ、下付き文字ｎ２は独立に、約５〜約２５、より好ましくは約７〜約１７、最も好ましくは、約７〜約１３の奇数である）、ＨＩＶ−ＴＡＴ若しくはその断片、又はアンテナペディアＰＴＤ若しくはその断片が含まれる。好ましくは、側鎖基又は分枝基は、前述の一般式−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２を有する。他の好ましい実施形態は、分枝基又は効率基がＨＩＶ−ＴＡＴ断片であり、かかる断片が式（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、又は（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（式中、下付き文字ｐ及びｑは、それぞれ独立に０〜２０の整数である）を有し、且つ、断片のＣ末端又はＮ末端を介して担体分子と結合しているものである。側枝基は、結合の中心でＤ型又はＬ型（Ｒ配置又はＳ配置）を有し得る。好ましいＨＩＶ−ＴＡＴ断片は、下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立に０〜８、より好ましくは２〜５の整数であるものである。他の好ましい実施形態は、分枝基が、アンテナペディアＰＴＤ基又はかかる基の活性を保持するその断片であるものである。これらは当技術分野において知られており、例えば、Console et al., J. Biol. Chem. 278:35109 (2003) によって知られている。好ましくは、正の電荷を帯びた担体は、正の電荷を帯びた側鎖分枝基を、総担体重量に対するパーセントで少なくとも約０．０５％、好ましくは約０．０５〜約４５重量％、最も好ましくは約０．１〜約３０重量％の量で含む。式−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２を有する正の電荷を帯びた分枝基については、最も好ましい量は約０．１〜約２５％である。
【００５６】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態について、限定を意図しない例証を提供することが意図されている。本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなしに修正がなされ得るのであり、当業者はそのことを認識するであろう。
[実施例]
【実施例１】
【００５７】
ボツリヌス毒素製剤の調製
適切な量のトレハロース二水和物、ポリソルベート２０、ヒスチジン、及びヒスチジンＨＣｌを組み合わせることにより、本発明の典型的なボツリヌス毒素製剤を調製した。３６％トレハロース二水和物、０．０５％ポリソルベート２０、及び１．１２６％ヒスチジンを、ｐＨ５．５で含有する２×製剤原液を作製した。この溶液を４℃まで冷却した。硫酸アンモニウム保存懸濁液から遠心分離することにより、ボツリヌス毒素ＡＰＩをペレット化した。毒素ペレットを、０．０５％ポリソルベート２０を含む０．５６％ヒスチジン緩衝剤ｐＨ５．５中に溶解させた。この溶液をヒスチジン／ポリソルベート２０溶液でさらに希釈し、１．０７４μｇ／ｍｌの毒素原液を作製した。
【００５８】
担体ペプチドＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）１５−Ｇ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲの原液を、水に十分なペプチドを溶解させることにより調製し、６．０ｍｇ／ｍＬのペプチド溶液を作製した。毒素原液、ペプチド原液、０．５６％ヒスチジン緩衝剤、及び２×製剤原液を組み合わせ、１８％トレハロース二水和物、０．０２５％ポリソルベート２０、０．５６％ヒスチジン緩衝剤、５５ｎｇ／ｍＬ毒素及び１５０μｇ／ｍｌ担体ペプチドからなる製剤バルク薬剤産物を作製した。
【実施例２】
【００５９】
ボツリヌス毒素製剤の凍結乾燥
本実施例は、本発明のボツリヌス毒素製剤の凍結乾燥手順を提供する。実施例１で記述された製剤バルク薬剤産物を２００μＬアリコートで、５５個の２ｍＬガラスバイアルのそれぞれに導入した。灰色ブチルゴム凍結乾燥栓を緩くガラスバイアルの上部に配置した。バイアルを凍結乾燥器内に配置し、凍結乾燥を開始した。
【００６０】
凍結乾燥プロセスは、次の３つの主な段階を含んでいた：（１）凍結段階；（２）一次乾燥段階；及び（３）二次乾燥段階。これら３つの主な段階のそれぞれが、１又は２以上の個別の工程を含んでおり、それら工程は下に示される温度及び圧力で実施された。一次乾燥の完了に必要な一次乾燥時間は、バイアルの数及びバイアルの充填量に応じて異なった。
【００６１】
【表１】
0006043627.tif 000002
【００６２】
【表２】
0006043627.tif 000003
【００６３】
【表３】
0006043627.tif 000004
【００６４】
【表４】
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【実施例３】
【００６５】
トレハロース二水和物を用いたボツリヌス毒素製剤の安定性
図１及び図２は安定性研究の結果を示している。これら研究では、トレハロース二水和物（１１ｎｇ／バイアル及び１．１ｎｇ／バイアル）を用いた２つの異なる毒素濃縮物で調製されたボツリヌス毒素製剤のバイアルを前述の通り調製し、４℃、２５℃及び４０℃で貯蔵し、１８ヶ月までの期間のボツリヌス毒素の生物学的活性を決定するため、図に示された時点で試験した。ＬＤ５０マウスアッセイを用いて活性を測定し、バイアル当たりの換算単位のボツリヌス毒素として図１及び図２で報告した。実験の開始時（t＝０）には、観察された活性は、図１の製剤ではバイアル当たり１８０２単位のボツリヌス毒素、図２の製剤ではバイアル当たり１９２単位のボツリヌス毒素であった。図１及び図２のボツリヌス毒素活性に観察された変動性は、ＬＤ５０マウスアッセイ及び少ない試料数（ｎ＝１バイアル／温度−時点）を用いて得られたデータに必然的に付随するノイズの結果であると考えられる。こうした変動性にもかかわらず、データはこの１８ヶ月の研究の間、４０℃の貯蔵温度であっても回復活性の減少傾向が一切ないことを示す。これらデータは、本発明の典型的なボツリヌス毒素製剤の安定化の一例を提供する。
【実施例４】
【００６６】
スクロースを用いたボツリヌス毒素製剤の安定性
図３は安定性研究の結果を示す。これら研究では、スクロースを１１ｎｇ／バイアルで用いたボツリヌス毒素製剤のバイアルを、トレハロース含有製剤のための上述のプロトコルを用いて調製し、４℃及び２５℃で貯蔵し、１８ヶ月までの期間のボツリヌス毒素の生物学的活性を決定するため、図に示された時点で試験した。前述のＬＤ５０マウスアッセイを用いて活性を測定し、バイアル当たりの換算単位のボツリヌス毒素として図３に報告した。実験の開始時（t＝０）には、観察された活性はバイアル当たり２２９９単位のボツリヌス毒素だった。図３のボツリヌス毒素活性に観察された変動性は、ＬＤ５０マウスアッセイ及び少ない試料数（ｎ＝１バイアル／温度−時点）を用いて得られたデータに必然的に付随するノイズの結果であると考えられる。こうした変動性にもかかわらず、データはこの１８ヶ月の研究の間、２５℃の貯蔵温度であっても回復活性の減少傾向が一切ないことを示す。これらデータは、本発明の典型的なボツリヌス毒素製剤の安定化の一例を提供する。
【実施例５】
【００６７】
充填剤を用いたボツリヌス毒素製剤の凍結乾燥
本実施例では、適切な量のトレハロース二水和物、マンニトール、ポリソルベート２０、ヒスチジン、及びヒスチジンＨＣｌを組み合わせることによりボツリヌス毒素製剤を調製した。３％トレハロース二水和物、７．５％マンニトール、０．０５％ポリソルベート２０及び０．５６３％ヒスチジンをｐＨ５．５で含有する製剤原液を作製した。この溶液を４℃まで冷却した。ボツリヌス毒素ＡＰＩを、硫酸アンモニウム保存懸濁液から遠心分離することによりペレット化した。毒素ペレットを製剤原液に溶解させた。この溶液の濃度は１１７μｇ／ｍｌだった。この溶液を同じ溶液でさらに希釈し、最終的な毒素原液濃度を１１．７μｇ／ｍｌとした。アミノ酸配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）１５−Ｇ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有する十分な量の担体ペプチドを水に溶解させ、２０ｍｇ／ｍＬの担体ペプチド原液を調製した。これら溶液を組み合わせ、３％トレハロース二水和物、７．５％マンニトール、０．０５％ポリソルベート２０、及び０．５６３％ヒスチジンｐＨ５．５、７５μｇ／ｍｌの担体ペプチド、並びに５．５ｎｇ／ｍＬの毒素という最終組成を有する製剤バルク薬剤産物を作製した。
【００６８】
２００μＬのアリコートの製剤バルク薬剤産物を、１９２個の２ｍＬガラス凍結乾燥バイアルのそれぞれに添加した。灰色ブチルゴム栓をバイアルの上部に緩く配置した。その後バイアルを凍結乾燥器内に配置し、凍結乾燥を開始した。
【００６９】
前の実施例と同様、凍結乾燥プロセスには次の３つの主な段階が含まれた：（１）凍結段階；（２）一次乾燥段階；及び（３）二次乾燥段階。これら３つの主な段階のそれぞれに、下に示される温度及び圧力で実施された１又は２以上の個別の工程が含まれる：
【００７０】
【表５】
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【００７１】
【表６】
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【００７２】
【表７】
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【００７３】
【表８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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