(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体支持体上にアレイ状に固定された複数種類のレクチンと、診断対象由来の病理サンプルの表面の糖鎖との結合を測定しＡＴＬ細胞表面の各糖鎖構造の多寡を定量化して糖鎖プロファイリングを得、この糖鎖プロファイリング・パターンをそれらライブラリーと比較して白血病、リンパ腫の細胞表面の糖鎖構造を測定し、この測定した糖鎖構造を白血病とリンパ腫との病型の診断基準とすることを特徴とする、糖質プロファイリングによる血液腫瘍診断のための診断基準を得る方法。
【請求項２】
前記病理サンプルが好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球からなる白血球の中のいずれか一種、又は、複数であることを特徴とする請求項１に記載の糖質プロファイリングによる血液腫瘍診断のための診断基準を得る方法。
【請求項３】
前記白血球の細胞膜画分あるいはオルガネラ画分を用いることを特徴とする請求項 ２ に記載の糖質プロファイリングによる血液腫瘍診断のための診断基準を得る方法。
【請求項４】
前記細胞膜画分あるいはオルガネラ画分の糖鎖の発現状態を用いることを特徴とする請求項３ に記載の糖質プロファイリングによる血液腫蕩診断のための診断基準を得る方法。
【請求項５】
前記レクチンが、 AAL 、MAL-1、PHA(E) 、DSA、ACG、LEL、Jacalin、 ACA 、WGA 、SNA、SSA、TJA-1、NPA、GNA、HHL、Calsepa、RCA120、BPL、PWM、TxLC-1、EELの中の少なくとも２ 種類以上を含むことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の糖質プロファイリングによる血液腫瘍診断のための診断基準を得る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、血液腫瘍診断技術に関し、特に、成人Ｔ細胞白血病（Adult T-cell Leukemia/Lymphopma）（本明細書、図面において「ＡＴＬ」と表すことがある）の早期診断技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＴＬは、乳児期に母乳を介してレトロウイルスであるヒトＴリンパ球指向性ウイルス（本明細書、図面において「ＨＴＬＶ−１」と表すことがある）に感染した約５〜１０％の人が４０〜６０年の歳月を経て発症する難治性の血液腫瘍である。現在有効な早期診断技術が開発されておらず、化学療法・生物製剤による治療の開始時期を見極めることが非常に困難なため、治癒率は他の白血病に比べて極めて低いとされている。
【０００３】
ＡＴＬには四つの病型（くすぶり型、慢性型、白血病型、リンパ腫型）があり、特に白血病型とリンパ腫型は悪性度が高く、予後も極めて悪い。
【０００４】
図１を用いてＡＴＬ発症の分子機序を説明する。
【０００５】
ＨＴＬＶ−１から産生されるガン遺伝子産物Taxは、免疫とストレスへの応答を制御する核内転写因子エヌエフカッパーB（NF-κB）（核内転写因子カッパビー(Nuclear Factor kappaB)）を恒常的に活性化し、ＨＴＬＶ−１感染リンパ球の不死化をもたらす。その後、染色体DNAの変異が蓄積し、宿主細胞自身が持つNF-κB活性化リン酸化酵素NIKがマイクロRNA（miRNA）の作用で高発現となり、Taxに代わりＨＴＬＶ−１由来のガン遺伝子産物ＨＢＺが細胞性免疫の活性を弱め、ＡＴＬ細胞の増殖が容易な体内環境が形成されＡＴＬを発症する。
【０００６】
なお、本明細書、図面において、ＨＴＬＶ−１から産生されるガン遺伝子産物Taxを単に「Tax」と表し、核内転写因子エヌエフカッパーB（NF-κB）（核内転写因子カッパビー(Nuclear Factor kappaB)）を単に「NF-κB」と表すことがある。
【０００７】
これまでの研究から細胞レベルでのＡＴＬ発症機序の解明はかなり進んだが、個体レベル（ＨＴＬＶ−１キャリア）のＡＴＬ発症危険度を早期に診断する技術が現時点で開発されていないことが大きな課題となっている。
【０００８】
特に最近の知見で、悪性度の高いリンパ腫型では国際的な標準治療法として認知されているジドブジン/インターフェロン投与法（AZT/IFN法）はリンパ腫型には全く効果が無いため、mLSG15と呼ばれる化学療法を適応するが、現状では白血病型とリンパ腫型を早期に峻別する技術は無く治療成績改善の大きな障壁となっている。
【０００９】
無症候キャリアーの段階での将来のＡＴＬ発症危険度と病型を予測する診断技術の開発が強く望まれている。
【００１０】
白血病／リンパ腫の病型診断としては、以下の３種類を組み合わせたものが標準的とされている
１）ＨＥ／ＭＰＯ染色等を用いた腫瘍細胞の染色・顕微鏡観察による形態学的診断（例えば、特許文献１、２）、
２）細胞表面蛋白質に対する蛍光抗体を用いたフローサイトメトリー（ＦＣＭ）による免疫表現型病型診断（例えば、特許文献３）、
３）染色体および遺伝子に対する核型/遺伝子診断（例えば、特許文献４）。
【００１１】
しかし、この方法を用いても鑑別が困難な病型も少なくない。
【００１２】
また、ＦＣＭや遺伝子診断設備のコスト、技術習得の難度、診断確定まで要する時間など改善が強く望まれている。
【００１３】
近年、レクチンのような糖類結合因子を使用することに基づく分析方法が提案されており（例えば、特許文献５、６）、固体支持体（スライドガラス基盤）上に複数のレクチンを搭載したレクチンマイクロアレイを用いて細胞の状態を判別する方法も提案されている（特許文献７）。しかし、レクチンマイクロアレイを用いた診断方法を、無症候キャリアーの段階での将来のＡＴＬ発症危険度、病型予測に適用する提案はされていなかった。
【００１４】
非特許文献１は、本邦のＨＴＬＶ−１キャリアー１２１８名を対象とした、２００１〜２００８年の７年間の追跡調査で、ＡＴＬ発症の危険因子を調査したものである。全抹消リンパ球に対するＨＴＬＶ−１感染細胞の比率が４％を超えるとＡＴＬ発症のリスクが増すことが報告されている。しかし、この報告でもどのような細胞が白血病型もしくはリンパ腫型になるかについての明確な記述は無く、他のバイオマーカー（血中可溶性ＩＬ−２受容体、リンパ球形態、乳酸脱水素酵素）の値も病型との相関性は見いだせない。
【００１５】
このように、従来の方法では、ＡＴＬ発症リスクを定量的に示すものが抗原蛋白質、もしくはプロウイルスＤＮＡに限定され、病型の判別も不可能であった。すなわち、従来、早期診断によるＡＴＬの病型予測は不可能であり、非特許文献１にあるように、各種治療法の成績と病型との関連性をレトロスペクティブに検討できるだけであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特許第２６５０２１７号公報
【特許文献２】特許第３２７１６６６号公報
【特許文献３】特許第３７６１８６１号公報
【特許文献４】特許第４０８８６９４号公報
【特許文献５】特開２００８−２９３４７号公報
【特許文献６】ＷＯ２００４／５３３５９９Ａ１公報
【特許文献６】ＷＯ２０１０／１３１６４１Ａ１公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Human T-cell leukemia virus type I (HTLV-1) proviral load and disease progression in asymptomatic HTLV-1 carriers: a nationwide prospective study in Japan. Blood vol 116:1211-1219, 2010. Iwanaga M, Watanabe T, Utsunomiya A, Okayama A, Uchimaru K, Koh KR, Ogata M, Kikuchi H, Sagara Y, Uozumi K, Mochizuki M, Tsukasaki K, Saburi Y, Yamamura M, Tanaka J, Moriuchi Y, Hino S, Kamihira S, Yamaguchi K; Joint Study on Predisposing Factors of ATL Development investigators.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
ＡＴＬは、急性期の病型（白血病型・リンパ腫型）によって治療法の治癒成績が異なるが、従来法であるフローサイトメトリー（ＦＣＭ）による病型鑑別は不能で、患者の予後を考えた場合大きな問題となっている。
【００１９】
また、細胞染色顕微鏡観察、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）、遺伝子診断を組み合わせた他の血液腫瘍と同様の診断方法によっても病型鑑別は不能であった。
【００２０】
更に、上述の通り、既存の血液診断で白血病とリンパ腫との病型を正確に判定するには、コスト・技術・解析時間など、医療従事者に大きな負担が発生していた。
【００２１】
そこで、この発明は、従来の診断法に替わる簡便かつ低コストで、自己免疫診断にも応用可能な血液腫瘍診断技術を提案することを目的にしている。
【００２２】
特に、無症候キャリアーの段階で、将来のＡＴＬ発症危険度と病型を予測する診断技術を提案すること、白血病とリンパ腫との病型診断をはじめとする血液検査分野における診断精度の飛躍的な向上を図ることを目的にしている。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
請求項１記載の発明は、
固体支持体上にアレイ状に固定された複数種類のレクチンと、診断対象由来の病理サンプルの表面の糖鎖との結合を測定しＡＴＬ細胞表面の各糖鎖構造の多寡を定量化して糖鎖プロファイリングを得、この糖鎖プロファイリング・パターンをそれらライブラリーと比較して白血病、リンパ腫の細胞表面の糖鎖構造を測定し、この測定した糖鎖構造を白血病とリンパ腫との病型の診断基準とすることを特徴とする、糖質プロファイリングによる血液腫瘍診断のための診断基準を得る方法
である。
【００２４】
請求項２記載の発明は、
前記病理サンプルが好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球からなる白血球の中のいずれか一種、又は、複数であることを特徴とする請求項１に記載の糖質プロファイリングによる血液腫瘍診断のための診断基準を得る方法
である。
【００２５】
請求項３記載の発明は、
前記白血球の細胞膜画分あるいはオルガネラ画分を用いることを特徴とする請求項 ２ に記載の糖質プロファイリングによる血液腫瘍診断のための診断基準を得る方法
である。
【００２６】
請求項４記載の発明は、
前記細胞膜画分あるいはオルガネラ画分の糖鎖の発現状態を用いることを特徴とする請求項３ に記載の糖質プロファイリングによる血液腫蕩診断のための診断基準を得る方法
である。
【００２７】
請求項５記載の発明は、
前記レクチンが、 AAL 、MAL-1、PHA(E) 、DSA、ACG、LEL、Jacalin、 ACA 、WGA 、SNA、SSA、TJA-1、NPA、GNA、HHL、Calsepa、RCA120、BPL、PWM、TxLC-1、EELの中の少なくとも２ 種類以上を含むことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の糖質プロファイリングによる血液腫瘍診断のための診断基準を得る方法
である。
【発明の効果】
【００２８】
この発明によれば、ＡＴＬ細胞をバイオマーカーでリンパ腫型と白血病型に分けることができ、ＡＴＬ発症前ＨＴＶＬ−１キャリアーの将来の発症危険度・病態の予測を非常に簡便に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ＡＴＬ発症の分子機序を説明する概略図。
【図２】実施例１で用いた６種類の試験サンプルの光学顕微鏡観察写真。
【図３】実施例１で用いた６種類の試験サンプルの細胞のNF-κB活性化の程度を免疫ブロット法（WB）で検討した結果を表す図。
【図４】実施例１で用いた６種類の試験サンプルの細胞のＦＡＣＳ解析によるＣＤ４／ＣＤ２５発現状態を表す図。
【図５】実施例１で用いた６種類の試験サンプルの細胞についての細胞形態とTax発現／NF-κB活性相関性、ＦＡＣＳ非相関性との関係を表す図。
【図６】実施例１に使用したレクチンマイクロアレイに使用されている４５種類のレクチンを表す図。
【図７】実施例１のレクチンマイクロアレイの測定結果の数値を規格化した結果を表す図。
【図８】実施例１のレクチンマイクロアレイとレクチンとの結合性の一覧。
【図９】実施例１のレクチンマイクロアレイの測定結果（数値）を元に多変量解析（主成分分析）した結果を表す図。
【図１０】実施例１のレクチンマイクロアレイの測定結果（数値）を元に多変量解析（階層クラスター分析）した結果を表す図。
【図１１】実施例１のレクチンマイクロアレイの測定結果（数値）を元に抽出されたレクチンを表す図。
【図１２】実施例２で用いたＡＴＬ臨床検体の光学顕微鏡観察写真。
【図１３】実施例２で用いたＡＴＬ臨床検体の細胞のNF-κB活性化の程度を免疫ブロット法（WB）で検討した結果を表す図。
【図１４】実施例２のレクチンマイクロアレイの測定結果を数値化して表した図。
【図１５】実施例２のレクチンマイクロアレイの測定結果（数値）を元に多変量解析（階層クラスター分析）した結果を表す図。
【図１６】ＡＴＬ患者リンパ球凍結検体についてのレクチンマイクロアレイの測定結果（数値）を元に多変量解析（階層クラスター分析）した結果を表す図。
【図１７】ＡＴＬ細胞及び非ＡＴＬ細胞についてのレクチンマイクロアレイの測定結果（数値）を元に多変量解析（階層クラスター分析）した結果を表す図。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
この発明が提案する糖質プロファイリングによる血液腫瘍診断方法は、固体支持体上に固定された複数の糖鎖結合性分子（レクチン）と、診断対象由来の病理サンプルの表面の糖鎖との結合測定に基づいて前記診断対象の将来の発症危険度・病態の予測を行うものである。
【００３１】
すなわち、スライドガラスのような固体支持体上に２種類以上の糖鎖結合性分子（レクチン）を固定化したアレイを用い、診断対象由来の病理サンプル、例えば、ヒトの白血球が持つ糖鎖発現状態（糖鎖プロファイリング）の違いを計測することにより、前記診断対象の将来の発症危険度・病態の予測を行い、最適な治療法を選択することを可能にするものである。
【００３２】
前記において、血液腫瘍診断は、成人Ｔ細胞白血病における、白血病とリンパ腫との病型診断を行うものである。
【００３３】
固体支持体上に固定された複数の糖鎖結合性分子（レクチン）と、診断対象由来の病理サンプルの表面の糖鎖との結合測定を行い、ＡＴＬ細胞表面の各糖鎖構造の多寡を定量化し、糖鎖プロファイルに基づき白血病、リンパ腫の細胞表面の糖鎖構造を把握し、白血病とリンパ腫との病型診断を行うものである。
【００３４】
すなわち、本発明は、複数腫、例えば、４５種類のレクチンが固体支持体上にアレイ状に搭載されているレクチンアレイを用い、診断対象由来の病理サンプルの表面の糖鎖との前記レクチン結合測定に基づいて前記診断対象の将来の発症危険度・病態の予測を行うものである。
【００３５】
このように、本発明は、ＡＴＬ細胞表面の各糖鎖構造の多寡を定量化し、糖鎖プロファイルに基づき白血病とリンパ腫との病型を瞬時に峻別する早期診断技術を提案するものである。
【００３６】
レクチンアレイとは、固体支持体上に複数のレクチンを固定化し、反応させる糖鎖との結合測定を行うものである。固体支持体はガラス、プラスチック、金属等が用いられる。例えば、診断対象になっている細胞の持つ糖鎖を蛍光標識し、固体支持体に固定されたレクチンと反応させる。このときレクチンに結合した蛍光標識された細胞の蛍光強度が測定でき、その蛍光強度は蛍光標識された細胞の量に対応して増減する。測定された蛍光強度は数値化して扱うことができる。
【００３７】
レクチンマイクロアレイは、糖鎖の構造をディジタルに完全決定するものではなく、レクチンのアフィニティー情報を介して糖鎖のバイオロジカルなエピトープ像を与えるものである。このことを指して、糖鎖のプロファイリングパターンを与えるということが多く、糖鎖のプロファイリングと呼ばれる。
【００３８】
レクチンアレイを用いる本発明によれば、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）では殆ど差が見出せないＡＴＬ細胞表面の糖鎖構造の差異を定量化し、ＡＴＬ細胞個々の性格付けを明瞭に行うことができる。そこで、ＨＴＬＶ−１キャリアー末梢血中に存在するごく一部のＨＴＬＶ−１感染細胞の糖鎖解析により、従来は不可能であったＡＴＬ発症前キャリアーの予測的病型診断に適用するものである。
【００３９】
ＡＴＬキャリアーおよび患者から採取した病理サンプル（例えば、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球からなる白血球の中のいずれか一種、又は、複数）の糖鎖プロファイリングをレクチンマイクロアレイで行い、病型毎の特徴化を行ったライブラリーを構築する。
【００４０】
診断対象者（患者）から採取した病理サンプルの糖鎖プロファイリング・パターンをそれらライブラリーと比較することで、ＡＴＬの病型が容易に判別でき、最適な治療法の選択や予後の予測がより正確に行えることとなった。
【００４１】
本発明の方法によれば、レクチンマイクロアレイは、ＦＣＭでは殆ど差が見出せないＡＴＬ細胞表面の糖鎖構造の差異を定量化し、ＡＴＬ細胞個々の性格付けを明瞭に行えるので、従来不可能であったＡＴＬ発症前キャリアーの予測的病型診断をＨＴＬＶ−１キャリアー末梢血中に存在するごく一部のＨＴＬＶ−１感染細胞の糖鎖解析で行うことが出きる。
【００４２】
本発明によれば、ＡＴＬ細胞の糖鎖について複数のレクチン（例えば、４５種のレクチン）でプロファイリングすることにより、病型を瞬時に診断することができる。
【００４３】
本発明によれば、ＡＴＬ発症リスクと病型予測を数値で表すことが可能になった。
【００４４】
ＡＴＬの特に悪性度の高い二つの病型である、白血病型とリンパ腫型を早期に峻別する診断技術は従来存在しなかった。本願の発明者等が行った試験によれば、ＡＴＬ細胞４例とも健常人Ｔリンパ球２例とは全く異なる糖鎖プロファイルを示し、さらにリンパ腫形成に関与すると予想される細胞凝集性に対応して系統クラスターを形成することが示された。この結果から、糖鎖プロファイルにより病型分類を行う本願発明を完成させたものである。
【００４５】
以下、本発明の好ましい実施例について説明するが、本発明はかかる実施例及び上述した実施形態に限られることなく、特許請求の範囲の記載から把握される技術的範囲において種々の形態に変更可能である。
【実施例１】
【００４６】
糖質プロファイリングをＡＴＬ病型診断へ応用できることを試験によって確認した。
【００４７】
試験サンプルとして健常人由来CD3+、CD4+ヘルパーT細胞（PBL-M、PBL-I）２例、ATL細胞株（C8166、ED）２例、CD25+ATL患者末梢血（ATL4、ATL9）２例を用いた。
【００４８】
光学顕微鏡観察では、PBLは細胞が均一で小さく、ATL細胞は株・患者由来細胞共に大型で、C8166、ATL4、ATL9の順で凝集の度合いが高く、EDは全く凝集を形成しない（図２）。ATL細胞は形態的に３グループ（高凝集型、微凝集型、分離型）に分類できることがわかった。
【００４９】
次に、これら6例の細胞のNF-κB活性化の程度を免疫ブロット法（WB）で検討した（図３）。
【００５０】
HTLV-1から産生されるガン遺伝子産物Taxの発現はC8166、ATL4、ATL9の順に発現量が多く、HTLV-1に感染していない健常人サンプルとEDでは発現が認められなかった。奇数レーンは細胞質分画（Cyt）、偶数レーンは核分画（Nuc）。
【００５１】
Ｉ−κBは、NF-κB活性化の負の制御因子でNF-κB（p65）を細胞質に留める働きがある。NF-κB活性化のシグナルが強いとプロテオソームによる分解を受け、p65は核に移行して様々な遺伝子の転写を誘導する。
【００５２】
PBLでは、Ｉ−κB が細胞質に明瞭な集積を見せ、1/10程度が核に移行している（レーン１〜４）。
【００５３】
Taxが高発現しているC8166やATL4では、Ｉ−κB は細胞質・核いずれにも発現が無くNF-κBの強い活性化が示唆されp65は核への集積が見られた（レーン５、６、９、１０）。
【００５４】
一方、Taxの発現が低いもしくは無いATL9やEDではＩ−κB が細胞質に大量に集積し核には殆ど観察されなかったが、p65の核内集積も有意に観察された（レーン７、８、１１、１２）。
【００５５】
次に、上述した６種類の試験サンプルの細胞についてフローサイトメーターを用いたフローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ解析）を行って、ＣＤ４／ＣＤ２５発現状態を把握し（図４）、細胞形態とTax発現／NF-κB活性相関性、ＦＡＣＳ非相関性との関係をまとめた（図６）。
【００５６】
以上の観察結果から、ＦＡＣＳ解析によるＣＤ４／ＣＤ２５プロファイルは必ずしもＡＴＬ細胞表面の状態を反映しないこと、また、傾向として、形態分化とTax発現／NF-κB活性に相関性があり、CD4+ヘルパーT細胞／CD25+ATL患者末梢血とは非相関であること、C8166とATL4はTax強発現で細胞凝集型、EDとATL9はTax微弱発現で細胞分散型と分類が可能で、前者はリンパ腫型、後者は白血病型に近い可能性が示唆された。
【００５７】
実際共同研究者のマウス実験系でもC8166と極めて近いMT4株は腫瘤を形成しやすく、EDでは腫瘤が観察されないとの報告がある。
【００５８】
以上の細胞学的特質を踏まえて前述した６例の細胞より細胞膜／オルガネラ画分を抽出し、レクチンマイクロアレイでレクチン４５種類の量的変動を測定した。
【００５９】
レクチンとは、糖鎖結合性たんぱく質（酵素や抗体を除く）の総称である。レクチンは一般的には、糖鎖の全体構造を認識するのではなく、数残基からなる糖鎖の部分的な構造を認識するものである。
【００６０】
レクチンマイクロアレイは、特異的な糖鎖構造、シアル酸、アシアロフォーム、ガラクトース、アガラクトフォーム、フコース、マンノース、分岐構造、ラクトサミン、O−グリカンなど特異的な糖鎖構造を認識するレクチンをスライドグラス上に固定化したものである。
【００６１】
レクチンの固定化には、エポキシ基などが良く用いられる。今回使用するレクチンアレイに用いられる４５種類については、４２種類が植物由来、２種類がカビ、１種類がカタツムリ由来で、それぞれが特異性の異なる糖鎖結合様式をとる。
【００６２】
この実施例に用いたレクチンマイクロアレイ（LecChip（登録商標） ver.1.0（GPバイオサイエンス社）には４５種類のレクチンがそれぞれ３スポットずつ固定化されている。使用した４５種類のレクチンは図６に示されている。
【００６３】
前述した６例の細胞より細胞膜／オルガネラ画分を抽出し、レクチンマイクロアレイでレクチン４５種類の量的変動の測定は、以下(１)〜(４)の手順で行った。
【００６４】
（１）細胞膜/オルガネラ画分の調製
PBSで洗浄した細胞ペレット106個以上をProteoExtract（登録商標）Subcellular Proteome Extraction Kit（Cat.539790, Merck社）を用いて、分画した。具体的な手順としては、細胞試料に、本キットのExtraction BufferＩ1mLとProtease Inhibitor Cocktail 5μLの混合液を加えて懸濁して、４℃のローテータでゆっくりと10分間反応させた。その後、1,000×gで10分間遠心して、上清を取り除いた沈殿に、本キットのExtraction BufferII1mLとProtease Inhibitor Cocktail 5μL の混合液を加えて懸濁して、４℃のローテータでゆっくりと30分間反応させた。これを、6,000×gで10分間遠心して、その上清（細胞膜/オルガネラ画分）を回収した。
【００６５】
（２）タンパク質定量
Micro-BCA Protein Assay Kit（Cat.23235, Thermo SCIENTIFIC社）を用いてタンパク質を定量した。具体的には、96ウェルプレートに、検量線を作成する80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625μg/mLに調製したBSA、ブランクとするPBS、×1、×1/2、×1/4、×1/8、×1/16、×1/32、×1/64、×1/128に希釈した試料（細胞膜/オルガネラ画分）をそれぞれ100μLずつ調製し、これにMicro BCA Reagent A、Micro BCA Reagent B、Micro BCA Reagent Cを25:24:1の割合で調製した混合液100μLを加えて、2時間37℃で反応させ、562nmの吸光度を測定した。
【００６６】
（３）蛍光(Cy3)標識
測定試料（細胞膜／オルガネラ画分）のタンパク質量1μgに対して、Cy3 Mono Reactive Dye Pack （Cat.PA23001, GE Healthcare社）のタンパク質100μg labeling量を混合し、室温、暗所で１時間反応させて標識し、Zeba（登録商標）Spin Desalting Columns, 7K MWCO（Cat.89882, Thermo SCIENTIFIC社）を用いて、未反応Cy3を除くことを行った。この脱塩カラムは、TBSでの洗浄を行ってから使用した。
【００６７】
（４）レクチンマイクロアレイ(LecChip（登録商標） ver.1.0)の反応
（３）の工程で蛍光標識した試料をProbing Solution（GPバイオサイエンス社）で、2000、1000、500、250、125、62.5、31.25ng/mLに調製した。LecChip（登録商標） ver.1.0（GPバイオサイエンス社）の各ウェルをProbing Solutionで洗浄し、調製試料を100μLずつアプライし、２０℃のシェーカー上でゆっくりと撹拌させながら１７時間以上反応させた。
【００６８】
（５）レクチンマイクロアレイの測定及び解析
（４）のレクチンマイクロアレイを洗浄せずにエバネッセンテント場励起型スキャナー（GlycoStation（登録商標） Reader 1200（GPバイオサイエンス社））で、液層にて、レクチンマイクロアレイの蛍光測定を行った。測定時の露光時間を199msecとして、カメラゲインは70, 80, 90 ,100, 110の各段階で測定し、GlycoStation（登録商標） Tools Pro ver.1.5（GPバイオサイエンス社）で数値化した。
【００６９】
すなわち、各レクチンに対する蛍光強度を数値化し、得られた各レクチンの３スポットの数値データを平均したものをレクチンの示した蛍光強度とした。
【００７０】
なお、ここでは、蛍光強度を次の手法で補正し、補正したデータを用いた。すなわち、久野、板倉ら（J. Proteomics Bioinform. Vol.1 68-72 (2008)）の手法に従い、蛍光強度は適切な2つのゲインで測定したデータを統合し、高い方のゲインで測定したときに飽和しているシグナルを補正したデータを用いた。
【００７１】
測定結果の数値について、全種類のスポットのシグナル平均値が基準値１００となるように係数を算出し、他のすべてのシグナルにその係数を掛けることで規格化した結果を図７に表す。
【００７２】
図７に表されているレクチンマイクロアレイとレクチンとの結合性を図８にまとめて表した。
【００７３】
PBLは若干の例外を除いて極めてよく似た糖鎖発現プロファイルを示したが、ATL細胞４例は多様な発現様式を示した。具体的には以下のようであった。
【００７４】
C8166では、PBLに比べ、AAL・MAL-Ｉ・PHA(E)・DSA・ACG・LEL・Jacalin・ACA・WGA９種類の有意な発現上昇が見られ、SNA・SSA・TJA-Ｉ・NPA・GNA・HHL・Calsepa７種類の有意な発現量低下がみられた。
【００７５】
ATL4では、C8166からWGAを除いた８種類の発現上昇がみられ、発現低下はC8166と同じ７種類で観察されたが、（C8166より）α2,3-NeuAcに結合性のあるSNA・SSA・TJA-Ｉの低下が顕著であるという大きな特徴を示した。
【００７６】
ATL9では、RCA120・PHA(E)・DSA・BPL・PWM・Jacalinの6種類が発現上昇し、NPA・GNA・HHL・TxLCＩ・EEL５種類の発現低下があり、EDではAAL・PHA(E)・DSA・ACG・LEL・Jacalin・WGA７種類の発現上昇、SNA・SSA・TJA-Ｉ・NPA・GNA・HHL・EEL７種類の発現低下が見られた。
【００７７】
それぞれの数値を元にNIA Array Analysisにて多変量解析した結果を図９、図１０に示す。図９は全サンプル間の解析を主成分分析（ＰＣＡ）した結果を表す図である。図１０は、全サンプル間の解析を階層クラスター分析（ＨＣＡ）した結果を表す図である。
【００７８】
図９に表されているように、主成分分析（ＰＣＡ）では、ＰＣ１によって、ＰＢＬ−Ｍ、ＰＢＬ−Ｉ／ＡＴＬ４／ＡＴＬ９、Ｃ８１６６／ＥＤに分けられ、ＰＣ２によって、ＰＢＬ−Ｍ、ＰＢＬ−Ｉ、ＡＴＬ４、ＥＤ／ＡＴＬ９／Ｃ８１６６に分けられるという結果になった。
【００７９】
また、図１０に表されているように、階層クラスター分析（ＨＣＡ）では、ＰＢＬ−Ｍ、ＰＢＬ−Ｉ／ＡＴＬ４、ＡＴＬ９、Ｃ８１６６、ＥＤに分けられるという結果になった。
【００８０】
図１０は、レクチンマイクロアレイと各検体の糖質類似性クラスターを表すものになるが、この実施例で説明したレクチンアレイプロファイルはＡＴＬ検体を細胞凝集性とリンクしたものになった。
【００８１】
主成分分析（ＰＣＡ）のＰＣ１とＰＣ２の成分を以下の閾値で抽出し、ＰＣのPositive、Negativeごとに抽出されたレクチンを表したものが図１１である。
【００８２】
閾値
Correlationは０．７以上または０．７以下
Fold-changeが２倍以上
なお、図１１において、Feature IDはレクチン名、Correlationは相関係数、PCnumberはそれぞれのレクチンが属する主成分の番号、Directionはその成分の方向性を示し、各サンプル名の下の値はそれぞれのレクチンのシグナル値（前述した測定書結果の数値を常用対数に変換した数値）を示す。
【００８３】
図１１に示されたレクチンについて、それぞれが認識する主な糖鎖構造は以下の通りである。
【００８４】
PC1 Negative（ＰＢＬ−Ｍ，ＰＢＬ−Ｉにおいて発現が高い）
PTLＩ：  Gal, GalNAc認識レクチン。B抗原（Galα1-3(Fucα1-2)Galβ1-4GlcNAc）、A抗原（GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ1-4GlcNAc）を認識する
GSL-II：  GlcNAc認識レクチン。3,4本鎖に分岐したアガラクト末端をもつN結合型鎖を主に認識する
EEL：  B抗原（Galα1-3(Fucα1-2)Galβ1-4GlcNAc）を主に認識するレクチン
UEAＩ：  Fuc認識レクチン。H抗原typeII（Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc）、Lewis y（Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc）、Lewis a（Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc）等を主に認識する
GNA：  Man認識レクチン。主にManを3〜6個程度持つN結合型糖鎖を認識する
SNA：  NeuAc認識レクチン。NeuAc a2-6Gal構造を認識する
TJA-Ｉ：  NeuAc認識レクチン。NeuAc a2-6Gal構造および硫酸化糖を認識する
GSLＩB4：  αGal認識レクチン。B抗原（Galα1-3(Fucα1-2)Gal）、Galα1-3Gal、Galα1-4Gal構造を認識する
SSA：  NeuAc認識レクチン。NeuAc a2-6Gal構造を認識する
VVA：  GalNAc認識レクチン。Tn抗原（GalNAcα-）等を主に認識する
HHL：  Man認識レクチン。主にManを３個以上持つN結合型糖鎖を認識する
GSLＩA4：  GalNAc認識レクチン。Tn抗原（GalNAc a-）等を認識する。
【００８５】
PC1 Positive（ＥＤにおいて発現が高い）
Jacalin：  Gal, O結合型糖鎖認識レクチン。Core3（GlcNAcβ1-3GalNAcα-）、sialyl-T抗原（NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAcα-）、T抗原（Galβ1-3GalNAcα-）、Tn抗原（GalNAcα-）等を認識する
PHA(E)：  Bisecting GlcNAc（GlcNAcβ1-4Man）を主に認識する
DSA：  3,4本鎖に分岐したガラクト末端をもつN結合型糖鎖、ポリラクトサミン（(Galβ1-4GlcNAc)n, n＞=2 ）を認識する
BPL：  Gal認識レクチン。Gal末端構造（Gal b1-4GlcNAc）を持つN結合型糖鎖、Lewis x（Gal b1-4(Fuc a1-3)GlcNAc）、T抗原（Gal b1-3GalNAc）等を認識する
AAL：  Fuc認識レクチン。sialyl Lewis x（NeuAcα2-3Galβ1-3(Fucα1-3)GlcNAc）、Lewis x（Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc）、Lewis y（Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc）、H抗原typeII（Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc）、Core Fucose（N結合型糖鎖のAsnに結合しているGlcNAc残基にα1-6結合したFuc）等を認識する
ACA：  T抗原（Galβ1-3GalNAcα-）、sialyl-T抗原（NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAcα-）等のO結合型糖鎖を認識するレクチン
MALＩ：  NeuAc認識レクチン。NeuAc a2-3Gal構造を認識する。
【００８６】
PC2 Negative（ＡＴＬ９において発現が高い）
PWM：  GlcNAc、Man認識レクチン。GlcNAc b1-4GlcNAcを主に認識する。
【００８７】
以上の分析から、以下のことが認められた
１）ＰＢＬ２例が非常に似通っている
２）C8166とATL4（上述したように、リンパ腫型に近い可能性が示唆されている）は、同一クラスターを形成する
３）Taxの発現が全くなく、細胞の凝集も起こさないED（上述したように、白血病型に近い可能性が示唆されている）は、他のATL細胞から最も距離があり、
４）微量のTax発現があり細胞凝集能はC8166・ATL4とEDの間に位置するATL9（上述したように、白血病型に近い可能性が示唆されている）は、距離的にもその中間に位置した。
【００８８】
これらの結果から、形態分化とレクチンアレイによる糖質プロファイルは相関・定量性があること、レクチンマイクロアレイによるＡＴＬ細胞の病理学的差異の検出が十分可能であることが確認できた。そして、この技術を用いてＡＴＬの早期病型診断技術を確立することが可能になった。
【実施例２】
【００８９】
凍結保存した患者検体及び、リンパ球健常者リンパ球糖質のプロファイリングを行い、凍結保存されたＡＴＬ臨床検体(ＡＴＬ患者リンパ球凍結検体)をレクチンアレイ解析することによって病型ごとに異なる糖質プロファイルを検出できることを以下の試験によって確認した。
【００９０】
試験サンプルとして実施例１で使用したものと同一の健常人由来CD3+、CD4+ヘルパーT細胞（PBL-M、PBL-I）２例と、凍結保存した患者検体７例（Patient#1(Chronic to Acute)、Patient#2(Acute)、Patient#3(Acute)、Patient#4(Chronic)、Patient#5(Acute)、Patient#8(Chronic)、Patient#11(Lympyhoma)）を用いた。
【００９１】
患者検体７例の中の６例（Patient#1、Patient#2、Patient#3、Patient#4、Patient#5、Patient#8）についての光学顕微鏡観察の結果は図１２図示の通りであった。ＡＴＬ臨床検体も細胞凝集性に明確な差異を確認することができた。
【００９２】
これら６例の細胞のNF-κB活性化の程度を免疫ブロット法（WB）で検討した結果は図１３図示の通りであった。
【００９３】
実施例１で説明した方法と同様の方法にして、前述した９例の細胞より細胞膜／オルガネラ画分を抽出し、レクチンマイクロアレイでレクチン４５種類の量的変動を測定し、実施例１で説明したものと同様の方法によって測定結果を数値化した。
【００９４】
測定結果の数値について、全種類のスポットのシグナル平均値が基準値１００となるように係数を算出し、他のすべてのシグナルにその係数を掛けることで規格化した結果を図１４に表す。
【００９５】
それぞれの数値を元にNIA Array Analysisにて多変量解析した結果を図１５に示す。図１５は、全サンプル間の解析を階層クラスター分析（ＨＣＡ）した結果を表す図である。
【００９６】
次に、上述した７例の患者検体とは異なる１３例（Patient-O#11(Lymph node)、Patient-S#5(Acute)、Patient-O#5(Acute)、Patient-S#4(Acute)、Patient-S#2(Acute)、Patient-S#1(Acute)、Patient-O#12(Acute w Treatment) 、Patient-S#3(Lymph node PBL)、Patient-O#3(Acute)、Patient-O#2(Acute)、Patient-O#1(Chronic to Acute Transition)、Patient-O#8(Chronic)、Patient-O#4(Chronic)）の凍結保存した患者検体と、実施例１で使用したものと同一の健常人由来CD3+、CD4+ヘルパーT細胞（PBL-M、PBL-I）２例とを用い、実施例１で行ったのと同様に、これらの細胞より細胞膜／オルガネラ画分を抽出し、レクチンマイクロアレイでレクチン４５種類の量的変動を測定し、実施例１で説明したものと同様の方法によって測定結果を数値化し、全サンプル間の解析を階層クラスター分析（ＨＣＡ）したところ図１６図示の結果になった。
【００９７】
また、ＡＴＬ細胞及び、非ＡＴＬ細胞について実施例１で行ったのと同様に、これらの細胞より細胞膜／オルガネラ画分を抽出し、レクチンマイクロアレイでレクチン４５種類の量的変動を測定し、実施例１で説明したものと同様の方法によって測定結果を数値化し、全サンプル間の解析を階層クラスター分析（ＨＣＡ）したところ図１７図示の結果になった。
【００９８】
図１７はこの試験の結果を表す系統樹である。ただし、試験サンプルとして使用した健常人由来PBL２例（PBL-M、PBL-I）は、CD4+、CD25+制御性T細胞を用いた。ATL細胞は制御性T細胞と同じCD4+、CD25+マーカー発現細胞とされている。しかしながら糖質プロファイリングでは、ATL細胞と制御性T細胞は明瞭に異なる糖質プロファイルを示した。
【００９９】
これらの結果から、白血病型リンパ球の形態分化とTax発現／NF-κB活性との相関性、糖質プロファイリングと病型分化・進展度との相関性、ＡＴＬ患者リンパ球の糖質プロファイルがＡＴＬ病型と細胞凝集性に相関する可能性があることなどが認められた。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明の糖質プロファイリングによる血液腫瘍診断方法は全ての血液腫瘍診断に適応可能であり、本発明によれば、レクチンアレイにより、ＡＴＬに留まらず、ＡＴＬ以外の血液腫瘍、自己免疫疾患などの診断、発症予測が可能になる。すなわち、健常人リンパ球の細胞種ごとの糖鎖プロファイルライブラリーを構築し、ＦＣＭより簡便・安価な診断システムの確立に道を開くものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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