(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレルゲンエキスを製造する方法であって、
ａ）アレルゲンを含む供給源材料を液体抽出剤と接触させて、液相に溶解した脂質を含む混合物ならびにアレルゲンおよびタンパク質を含む供給源材料残渣からなる固相を生成するステップと、
ｂ）前記混合物を第１の分離ステップに供して、前記供給源材料残渣を単離するステップと、
ｃ）前記供給源材料残渣をアレルゲン抽出剤と接触させて、液相に溶解したアレルゲンの混合物および非アレルギー性残渣からなる固相を生成するステップと、
ｄ）前記混合物を第２の分離ステップに供して、液層に溶解した前記アレルゲンを単離し、粗アレルゲンエキスを生成するステップと、
ｅ）前記粗アレルゲンエキスを低分子画分除去ステップに供して、３．５ｋＤａ未満の分子サイズを有する分子を除去するステップと、
ｆ）前記アレルゲンエキスが３〜５℃にて１０００μＳ／ｃｍ未満の伝導率になるまで、ステップｅ）を実行して、精製された天然アレルゲンエキスを得るステップと、
ｇ）前記天然アレルゲンエキスをｐＨ２〜４．０に酸性化して、前記酸性化したエキスを５〜３０分間維持した後、前記エキスを低分子画分除去ステップに供して、３．５ｋＤａ未満の分子サイズを有する分子を除去し、ｐＨを７．０〜８．０に調節して脱色アレルゲンエキスを生成するステップと、
ｈ）前記脱色アレルゲンエキスをグルタルアルデヒドまたはホルムアルデヒドと接触させるステップと、
ｉ）前記脱色アレルゲンエキスを分子画分除去ステップに供して、１００ｋＤａ未満の分子サイズを有する分子を除去するステップと、
ｊ）前記アレルゲンエキスが３〜５℃にて２１０μＳ／ｃｍ未満の伝導率になるまで、かつ／またはＵＶまたは可視走査により測定した場合にグルタルアルデヒドがなくなるまでステップｉ）を実行して、脱色重合アレルゲンエキスを得るステップと
を含み、
前記供給源材料が、ピーナッツ（アラキス・ヒポゲア（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇｅａ））、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）の花粉、ヒカゲミズ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ）の花粉、アシ（Ｐｈｒａｇｍｉｔｅｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）の花粉およびオオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）の花粉、アシブトコナダニ（Ａｃａｒｕｓ  ｓｉｒｏ）、ネッタイタマニクダニ（Ｂｌｏｍｉａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、コナヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ）、デルマトファゴイデス・ミクロセラス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｍｉｃｒｏｃｅｒａｓ）、ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）、ユーログリファス・マイネイ（Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ  ｍａｙｎｅｉ）、レピドグリファス・デストラクター（ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｕｓ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）、ケナガコナダニ（Ｔｙｒｏｐｈａｇｕｓ  ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｔｉａｅ）、ネコの上皮、イヌの上皮、ウマの上皮、ヒトの上皮、ウサギの上皮、ならびに羽毛から選択されることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記伝導率が３〜５℃にて５００μＳ／ｃｍ未満になるまで、前記低分子画分除去ステップ（ｆ）が継続されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記天然アレルゲンエキスが、ｐＨ２〜２．１に酸性化されることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、前記天然アレルゲンエキスが、ｐＨ２．０〜３．０に酸性化されることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法において、前記アルデヒドが、毎分０．００１〜０．５ｍｌの添加速度で前記エキスに加えられることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法において、前記伝導率が３〜５℃にて５０〜２００μＳ／ｃｍになるまで、前記分子画分除去ステップ（ｊ）が継続されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法において、前記低分子画分除去ステップｅ）またはｇ）が、限外濾過ステップ、ダイアフィルトレーションステップ、透析ステップまたは濾過を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法において、前記供給源材料が、ピーナッツ（アラキス・ヒポゲア（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇｅａ））であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法において、当該方法がアレルギー処置のための医薬品の製造において使用されることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法において、当該方法がピーナッツアレルギーの処置のための医薬品の製造において使用されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精製アレルゲンエキスを製造するための方法、ならびにアレルギーの診断および処置に使用するための医薬組成物およびワクチン剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギーは免疫系の後天性過敏症であり、アレルゲンとして知られている無害な環境物質への曝露によって誘発される。Ｉ型過敏反応はアレルギー反応に特徴的であり、過剰量のＩｇＥ抗体が産生され、それによって、炎症反応を誘発する好塩基球および肥満細胞が次に活性化される。その影響は、アナフィラキシー反応を誘発する血管拡張、粘液分泌、神経刺激および平滑筋収縮など全身に及び場合も、または体内の特定の領域、例えば呼吸器に限局される場合もある。
【０００３】
食物アレルギーは、学童の約６％および成人の約４％が冒され、致死的なアナフィラキシー反応を含む重大の結果をもたらし得る、新たに現れた主要な公衆衛生問題である（１）。したがって、アレルギーは、患者のアレルギー症状の当面の臨床的影響および家族の日常活動を越えて広がり、生活の質の精神社会面に顕著な影響を及ぼし得る（２）。現在、この型のアレルギーに対する標準的ケアとしては、問題となるアレルゲンの厳格な回避およびエピネフリンによる処置が挙げられる。
【０００４】
ピーナッツアレルギーは、免疫系の過剰反応を誘発する、ピーナッツ由来の食材に対するＩ型過敏（ＩｇＥ媒介）免疫応答である。米国喘息アレルギー財団（Ａｓｔｈｍａ  ａｎｄ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）は、ピーナッツアレルギーが米国おける食品関連の死亡原因として最も多いと推測し、人口の０．４〜０．６％が冒されていると評価している。ピーカン、ピスタチオ、松果およびクルミなどの木の実もまた、一般的なナッツアレルゲンである。
【０００５】
これまでに、１１種のアレルゲン（Ａｒａ  ｈ  １からＡｒａ  ｈ  １１まで）がピーナッツ（アラキス・ヒポゲア（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇｅａ））から同定されており、それらの多くが配列決定され、クローニングされている。国際免疫学会連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ）（ＩＵＩＳ）の名称に基づけば、これらのアレルゲンには以下のものが含まれる。Ａｒａ  ｈ  １、６４ｋＤａのクピン（Ｃｕｐｉｎ）（ビシリン（Ｖｉｃｉｌｌｉｎ）型、７Ｓグロブリン）；Ａｒａ  ｈ  ２、１７ｋＤａのコングルチン（２Ｓアルブミン）；Ａｒａ  ｈ  ３、６０ｋＤａのクピン（レグミン型、１１Ｓグロブリン、グリシニン）；Ａｒａ  ｈ  ４、３７ｋＤａのクピン（レグミン型、１１Ｓ、グリシニン）；Ａｒａ  ｈ  ５、１５ｋＤａのプロフィリン；Ａｒａ  ｈ  ６、１５ｋＤａのコングルチン（２Ｓアルブミン）；Ａｒａ  ｈ  ７、１５ｋＤａのコングルチン（２Ｓアルブミン）；Ａｒａ  ｈ  ８、１７ｋＤａの感染特異的タンパク質、ＰＲ−１０；Ａｒａ  ｈ  ９、９．８ｋＤａの非特異的脂質輸送タンパク質１；Ａｒａ  ｈ  １０、１６ｋＤａのオレオシン、およびＡｒａ  ｈ  １１、１４ｋＤａのオレオシン。
【０００６】
ネコに対するアレルギーは極めて一般的であり、アレルギー罹患者の最大２５％に起こる。ネコアレルギーは、イヌの鱗屑に対するアレルギーよりも一般的であり、このことは、アレルゲンとしてのネコの毛および鱗屑の能力ならびに一般にはネコを入浴させないという事実と関係している可能性がある。ネコアレルゲンは、一部ホルモン制御下にあるので、特に非去勢雄ネコが大量に産生する。鱗屑は、常に空気で運ばれ、粘着性があり、公共の場所、ネコがいない場所でも見出される。これは、ネコの飼い主の衣類に載って運ばれ、その後公共の場所に落とされた鱗屑によるものである。したがって、ネコアレルゲンは、ネコが住んだことがない家の中でも、ハウスダストの一成分になっている。ネコの鱗屑粒子のサイズは極めて小さく、肺の中深くに吸入される。したがって、ネコの鱗屑はアレルギー喘息の一般的な原因となり、ネコに対してアレルギーのあるネコの飼い主は、喘息症状が一層悪化する傾向がある（８、９）。
ネコおよびイヌの主要なアレルゲンは、毛／鱗屑エキスおよび唾液の中に見出すことができ、それ故、上皮アレルゲンと考えられる。相異なる８種のアレルゲンがネコにおいて同定され、それらの多くが配列決定され、クローニングされている。ＩＵＩＳウェブサイトｉによれば、これらのアレルゲンには、以下のものが含まれる。Ｆｅｌ  ｄ  １、１４および４ｋＤａのウテログロビン；Ｆｅｌ  ｄ  ２、６９ｋＤａのアルブミン；Ｆｅｌ  ｄ  ３、１１ｋＤａのシスタチン；Ｆｅｌ  ｄ  ４、２２ｋＤａのリポカリン；Ｆｅｌ  ｄ  ５、４００ｋＤａの免疫グロブリンＡ；Ｆｅｌ  ｄ  ６、８００〜１０００ｋＤａの免疫グロブリンＭ；Ｆｅｌ  ｄ  ７、１７．５ｋＤａのフォンエブネル腺タンパク質；Ｆｅｌ  ｄ  ８、２４ｋＤａのラセリン（Ｌａｔｈｅｒｉｎ）様タンパク質。主要なネコアレルゲンであるＦｅｌ  ｄ  １は、タンパク質および免疫化学の手法により広範に特徴づけられており、最近、組換えアレルゲンとして発現された。Ｆｅｌ  ｄ  １は、１７ｋｄの２つのサブユニットからなる約３６ｋＤａの二量体である（１０）。
【０００７】
草アレルギーは、特定の季節にその病歴のある人々が冒される、最も一般的で流行しているアレルギー形態の１つである。このアレルゲンは、晩春および初夏の数か月の間、空気中に存在し、そのためアレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎および喘息を誘発し得る。草に座るかまたは芝生を刈ることにより皮膚が草と直接接触すると、皮膚のそう痒、蕁麻疹およびアトピー性皮膚炎が誘発されることがある。最も代表的な種の１つは、草群の筆頭として選択されるオオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）である。相異なる９つのアレルゲンがオオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）種から同定された。アレルゲンウェブサイトｉによれば、これらのアレルゲンには以下のものが含まれる。Ｐｈｌ  ｐ  １、２７ｋＤａのベータ−エクスパンシン）；Ｐｈｌ  ｐ  ２、１０〜１２ｋＤａの草群ＩＩ／ＩＩＩ）；Ｐｈｌ  ｐ４、５５ｋＤａのタンパク質、Ｐｈｌ  ｐ  ５、３２ｋＤ、Ｐｈｌ  ｐ  ６、１１ｋＤａ、Ｐｈｌ  ｐ  ７、６ｋＤａのカルシウム結合タンパク質、Ｐｈｌ  ｐ  １１、２０ｋＤａのＯｌｅ  ｅ  １関連タンパク質、Ｐｈｌ  ｐ  １２、１４ｋＤａのプロフィリン、およびＰｈｌ  ｐ  １３、５５ｋＤａのポリガラクツロナーゼ。
【０００８】
アシ属（Ｐｈｒａｇｍｉｔｅｓ）は、草群に属する属である。Ｐ．オーストラリス（Ｐ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ）またはアシ（Ｐ．ｃｏｍｍｕｎｉｓ）を含むいくつかの種が記載されている。アシ（Ｐｈｒａｇｍｉｔｅｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）の花粉は、様々な地域でアレルゲン性があると報告されている。受粉は、緯度と高度に応じて夏から秋の間に起こる。
ＩｇＥ結合能を有する相異なる５つのタンパク質がアシ属（Ｐｈｒａｇｍｉｔｅｓ）で同定された。Ａｌｌｅｒｇｏｍｅウェブサイトｉによれば、これらのアレルゲンには以下のものが含まれる。３０ｋＤａのエクスパンシン；草群４に属する６０ｋＤａのタンパク質；３５ｋＤａのリボヌクレアーゼ、１４ｋＤａのプロフィラン（ｐｒｏｆｉｌｕｎ）、および最後にポリガラクツロナーゼ。
【０００９】
ブタクサ（Ｒａｇｗｅｅｄ）（ブタクサ属（Ａｍｂｒｏｓｉａ））は、中央ヨーロッパで主として生育する雑草である。植物はある季節のみ生きるが、この植物は最大数千の花粉粒を生成する。日の出後の暖気、湿度および微風が、花粉粒の放出を促す。これまでに、相異なる３つの種がアレルギー症状と関連づけられている（アンブロシア・アルテミシイフォリア（Ａｍｂｏｒｓｉａ  ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａ（ショートブタクサ）、Ａ．プシロスタキア（Ａ．ｐｓｉｌｏｓｔａｃｈｙａ）（西洋ブタクサ）およびＡ．トリフィダ（Ａ．ｔｒｉｆｉｄａ）（ジャイアントブタクサ））。相異なる１０種のアレルゲンがショートブタクサにおいて同定されており、それらの多くは配列決定され、クローニングされている。アンブロシア・アルテミシイフォリア（Ａｍｂｏｒｓｉａ  ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａ）の場合には、アレルゲンの国際命名法に従って、これらのアレルゲンはＡｍｂ  ａ  １からＡｍｂ  ａ  １０と名付けられている。ＩＵＩＳウェブサイトｉによれば、これらのアレルゲンには以下のものが含まれる。Ａｍｂ  ａ  １、３８ｋＤａのペクチン酸リアーゼ；Ａｍｂ  ａ  ２、３８ｋＤａのペクチン酸リアーゼ；Ａｍｂ  ａ  ３、１１ｋＤａのプラストシアニン；Ａｍｂ  ａ  ４、３０ｋＤａのデフェンシン様タンパク質；Ａｍｂ  ａ  ５、５ｋＤａ；Ａｍｂ  ａ  ６、１０ｋＤａの脂質輸送タンパク質；Ａｍｂ  ａ  ７、１２ｋＤａのプラストシアニン；Ａｍｂ  ａ  ８、１４ｋＤａのプロフィリン；Ａｍｂ  ａ  ９、１０ｋＤａのポルカンシン（Ｐｏｌｃａｎｃｉｎ）、およびＡｍｂ  ａ  １０、１８ｋＤａのポルカンシン様タンパク質。Ａ．プシロスタキア（Ａ．ｐｓｉｌｏｓｔａｃｈｙａ）の場合、アレルゲンＡｍｂ  ｐ  ５のみが生物学的機能が未知であると記載されている。５ｋＤａの１つのアレルゲンのみがＡ．トリフィダ（Ａ．ｔｒｉｆｉｄａ）においても記載されている。
【００１０】
雑草は、それらのアレルゲンエキスの分類に従って、相同群に分類することができる。アンブロシア（Ａｍｂｒｏｓｉａ）をこの群の植物の筆頭の１つとして選択した。このため、この花粉エキスで得られた結果は他の雑草に外挿することができるｉ。
【００１１】
アレルギーは、アレルゲン免疫療法、特異的免疫療法（ＳＩＴ）または特異的アレルギーワクチン接種（ＳＡＶ）を含むいくつかの公知の方法により処置することができ、ＳＡＶはアレルギー性疾患のための免疫療法の一形態であり、免疫寛容を誘導する目的でアレルゲンエキスを漸進的に増量して患者にワクチン接種するものである。アレルゲン免疫療法は、アレルギー反応により誘導された症状を改善するものというよりアレルゲンへの免疫応答を調節するものであり、薬物治療の必要性の低減、症状の重症度の軽減、または過敏状態すべての除去のいずれかを行うことができる。
【００１２】
アレルゲン免疫療法が、アレルゲン回避は別として、アレルゲン吸入により、また膜翅目群の昆虫に刺されることにより誘発されるＩｇＥ媒介アレルギー性疾患を原因処置するための唯一の手段であるという多くの証拠があるが、アレルゲンエキスによる免疫療法は、食物アレルギーの処置には通常用いられない。最近の２つの研究によってのみ、ヘーゼルナッツおよび桃でそれぞれ感作された個体に舌下免疫療法を用いて、中程度の臨床効果が得られることが実証されている（３、４）。
【００１３】
これまでの研究では、免疫系を確立するために徐々に大きくする極小ピーナッツ片を小児に与えて小量免疫寛容を誘導する試みがなされてきた（４、６）。初期の臨床試験データは、免疫療法を用いてピーナッツアレルギーを改善できることを示すが（７）、ピーナッツに対するアレルギー反応を予防または治療するための確立された処置は現在なく、アトピー個体の唯一の有効な選択肢は、全ピーナッツ、ピーナッツ小片およびピーナッツ油を含有するかまたは混入する食物を回避すること、およびエピネフリンの自己注射を容易にできるようにすることである。
【００１４】
免疫療法のリスクの１つは、感作された患者へのアレルゲンの注入が重篤なアレルギー反応またはアナフィラキシーを誘発する可能性があることである。２０世紀の初頭におけるその最初の使用以来、アレルゲン免疫療法の安全性および効果をさらに改善するために多くの努力がなされてきた。アプローチの１つは、アレルゲン性は低減されているが免疫原性は維持されているアレルゲンワクチン剤を使用することである。
【００１５】
米国特許第５，７７０，６９８号明細書および欧州特許第０６６２０８０号明細書は、アレルゲンエキスを精製するために、かつアレルゲン／タンパク質の最終含量を高めるために、物質類および他の低分子量物質を除去する方法について開示している。この方法は、アレルギー活性のあるタンパク質から非アレルギー性化合物を解離させるような条件下で静電力、疎水力またはその他の物理力を破壊することからなる。この方法は、それぞれのアレルゲンタンパク質のｐＩより下にｐＨを低下させることによって、温和に酸処理することから構成することができる。
【００１６】
アレルゲン性を低減する種々の方法の１つは、アルデヒド、主としてホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドを用いて天然アレルゲンエキスを化学的に修飾してアレルゴイドを生成することからなる。このアルデヒド処理により、それらのアレルゲン性の一部が失われ（すなわち、ＩｇＥ反応性Ｂ細胞エピトープの低減を示す）、アレルギー性副作用が軽減した反応生成物（主としてポリマー）が得られる。同時に、アレルゲンの天然免疫原性はＴ細胞エピトープが不変であるために保持される。アレルゲン修飾のこのルートは、アレルゲンワクチン剤の製造業者の一部に採用されて、この原理に基づいた市販品が開発されている。一般には、アレルゲンエキスをさらに精製して、最も重要でかつ臨床に関連するアレルゲンを慎重に選別する傾向がある。
【００１７】
欧州特許第１８３４６４９号明細書および欧州特許第１８３４６４８号明細書は、アレルゲンエキスを製造する方法について開示している。しかしながら、そのような方法では、混入する低分子量タンパク質は十分に除去されない。
【００１８】
混入する低分子量タンパク質、刺激物および有毒成分の除去を保証するようにアレルゲン精製工程を最適化することにより、アレルギー性疾患の免疫療法で使用する医薬品の安全性および効果をさらに改善する必要がある。
【発明の概要】
【００１９】
本発明者らは、重合工程をさらに改善し、ダニ、花粉（草、雑草および樹木を含む）、上皮アレルゲンおよび食物アレルゲンなどの特定のエキスのアレルゲン性を低減するために、重合前、グルタルアルデヒドによる処理の前の中間ステップを開発してきた。
【００２０】
本発明の目的は、アレルゲンを含むエキスの調製方法、ならびにアレルギー処置のための医薬組成物およびワクチン剤を提供することである。さらなる目的は、ＩｇＥ結合能は低減しているがその免疫原性は保持している、最適な効果を有するアレルゲンエキスを提供することである。
【００２１】
本発明の第１の態様により、アレルゲンエキスを製造する方法であって、
ａ）アレルゲンを含む供給源材料を液体抽出剤と接触させて、液相に溶解した脂質を含む混合物ならびにアレルゲンおよびタンパク質を含む供給源材料残渣からなる固相を生成するステップと、
ｂ）混合物を第１の分離ステップに供して、供給源材料残渣を単離するステップと、
ｃ）供給源材料残渣をアレルゲン抽出剤と接触させて、液相に溶解したアレルゲンの混合物および非アレルギー性残渣からなる固相を生成するステップと、
ｄ）混合物を第２の分離ステップに供して、液層に溶解したアレルゲンを単離し、粗アレルゲンエキスを生成するステップと、
ｅ）粗アレルゲンエキスを低分子画分除去ステップに供して、３．５ｋＤａ未満の分子サイズを有する分子を除去するステップと、
ｆ）アレルゲンエキスが３〜５℃にて１０００μＳ／ｃｍ未満の伝導率になるまで、ステップｅ）を実行して、精製された天然アレルゲンエキスを得るステップと
を含む方法を提供する。
【００２２】
さらなる処置ステップとして、
ｇ）天然アレルゲンエキスを酸性にして、３．５ｋＤａ未満の分子サイズを有する分子を除去し、そのｐＨを中和して、脱色アレルゲンエキスを生成するステップを含むことができる。
【００２３】
この方法は、
ｈ）天然アレルゲンエキスまたは脱色アレルゲンエキスをアルデヒドと接触させるステップと、
ｉ）１００ｋＤａ未満の分子サイズを有する分子を除去するステップと
を含む重合ステップをさらに含むことができる。
【００２４】
本発明の第２の態様により、本発明の第１の態様の方法により得られるアレルゲンエキスを提供する。
【００２５】
本発明の第３の態様により、アレルギー処置において有効な治療物質として使用するための精製アレルゲンエキスを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
定義
「アレルゲン」は、ＩｇＥ応答および／またはＩ型アレルギー反応を誘導することができる分子と定義することができる。
本明細書において言及する用語「脱色（アレルゲンエキス）」は、含有され得る吸着色素を含む無関係の物質を除去することにより、天然エキスから得られる半精製アレルゲンエキスと定義することができる。
【００２７】
本発明のアレルゲンエキスは、ＩｇＥ媒介免疫反応を個体に惹起することが知られている天然アレルゲンを含むいかなる供給源材料に由来してもよい。そのようなアレルゲンとしては、食物アレルゲン（例えば、ピーナッツ）、空気媒介アレルゲン（例えば、草、樹木、薬草および雑草からの花粉、チリダニ、菌類およびカビ）、昆虫アレルゲン（例えば、ゴキブリ、ノミ、ミツバチおよびスズメバチの毒）、ならびに上皮アレルゲン（動物の毛、動物の鱗屑（例えば、ネコおよびイヌの鱗屑））を挙げることができる。
【００２８】
樹木、草および雑草からの花粉アレルゲンは、ブナ目（Ｆａｇａｌｅｓ）（例えば、ハンノキ属（Ａｌｎｕｓ）およびカバノキ属（Ｂｅｔｕｌａ））、シソ目（Ｌａｍｉａｌｅｓ）（例えば、オリーブ属（Ｏｌｅａ）およびオオバコ属（Ｐｌａｎｔａｇｏ））、イネ目（Ｐｏａｌｅｓ）（例えば、オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ））、キク目（Ａｓｔｅｒａｌｅｓ）（例えば、ブタクサ属（Ａｍｂｒｏｓｉａ）およびヨモギ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ））、ナデシコ目（Ｃａｙｏｐｈｙｌｌａｌｅｓ）（例えば、アカザ属（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ）およびオカヒジキ属（Ｓａｌｓｏｌａ））、バラ目（Ｒｏｓａｌｅｓ）（例えば、ヒカゲミズ属（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ））、ヤマモガシ目（Ｐｒｏｔｅａｌｅｓ）（例えば、プラタナス属（Ｐｌａｔａｎｕｓ））の分類目群に由来する。チリダニは、コナダニ（Ａｓｔｉｇｍａｔａ）（例えば、ヒョウヒダニ属（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）およびユーログリファス属（Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ））の目群に属する。カビおよび菌類に由来する空気媒介アレルゲンは、プレオスポラ（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａｌｅｓ）目（例えば、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ））、カプノディウム（Ｃａｐｎｏｄｉａｌｅｓ）目（例えば、クラドスポリウム属（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ））などに属する。
【００２９】
本発明による供給源材料は、食物アレルゲン、ピーナッツ、全ピーナッツ、空気媒介アレルゲン（例えば、花粉（樹木の花粉、雑草の花粉、草の花粉、穀草の花粉）、チリダニ、菌類、カビ）、ダニ、草、樹木および雑草のアレルゲン、上皮アレルゲン（動物の毛、動物の鱗屑、例えば、ネコの毛および鱗屑、イヌの毛および鱗屑）、ならびに昆虫アレルゲン（例えば、ゴキブリ、ノミ、ミツバチおよびスズメバチの毒）を含む任意のアレルゲンであってよい。
【００３０】
好ましい食物アレルゲンはピーナッツである。ピーナッツアレルゲンはアラキス・ヒポゲア（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇｅａｌ）がより好ましい。
【００３１】
空気媒介アレルゲンは、樹木花粉（セイヨウヤマハンノキ（Ａｌｎｕｓ  ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）、シラカバ（Ｂｅｔｕｌａ  ａｌｂａ）、セイヨウハシバミ（Ｃｏｒｙｌｕｓ  ａｖｅｌｌａｎａ）、アリゾナイトスギ（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ａｒｉｚｏｎｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐｅａ）、プラタナス（Ｐｌａｔａｎｕｓ）種）、草花粉（ギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｄａｃｔｙｌｏｎ）、カモガヤ（Ｄａｃｔｙｌｉｓ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ）、ヒロハノウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｅｌａｔｉｏｒ）、シラゲガヤ（Ｈｏｌｃｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ）、ホソムギ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ）、オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）、アシ（Ｐｈｒａｇｍｉｔｅｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ナガハグサ（Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ））、雑草花粉（ブタクサ（Ａｍｂｒｏｓｉａ  ｅｌａｔｉｏｒ）、オウシュウヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、アカザ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ａｌｂｕｍ）、ヒカゲミズ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ）、ヘラオオバコ（Ｐｌａｎｔａｇｏ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）、オカヒジキ（Ｓａｌｓｏｌａ  ｋａｌｉ））および穀草花粉（マカラスムギ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ））、チリダニ（アシブトコナダニ（Ａｃａｒｕｓ  ｓｉｒｏ）、ネッタイタマニクダニ（Ｂｌｏｍｉａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、コナヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ）、デルマトファゴイデス・ミクロセラス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｍｉｃｒｏｃｅｒａｓ）、ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）、ユーログリファス・マイネイ（Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ  ｍａｙｎｅｉ）、レピドグリファス・デストラクター（ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｕｓ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）、ケナガコナダニ（Ｔｙｒｏｐｈａｇｕｓ  ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｔｉａｅ））、菌類およびカビ（アルテルナリア・アルテルナート（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔｅ）、クラドスポリウム・ヘルバラム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｈｅｒｂａｒｕｍ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ））の群から選択することができる／または群から選択することができる。
【００３２】
上皮アレルゲンは、ネコの毛および鱗屑、イヌの毛および鱗屑、ウマの毛および鱗屑、ヒトの毛および鱗屑、ウサギの毛および鱗屑、ならびに羽毛を含む、任意の動物から選択することができる。
【００３３】
昆虫アレルゲンは、アリ、ノミ、ダニ（アシブトコナダニ（Ａｃａｒｕｓ  ｓｉｒｏ）、ネッタイタマニクダニ（Ｂｌｏｍｉａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、コナヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ）、デルマトファゴイデス・ミクロセラス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｍｉｃｒｏｃｅｒａｓ）、ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）、ユーログリファス・マイネイ（Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ  ｍａｙｎｅｉ）、レピドグリファス・デストラクター（ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｕｓ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）、ケナガコナダニ（Ｔｙｒｏｐｈａｇｕｓ  ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｔｉａｅ））、ゴキブリ、スズメバチ毒およびミツバチ毒から選択することができる。
【００３４】
好ましくは、供給源材料は、食物アレルゲン（アラキス・ヒポゲア（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇｅａｌ））、花粉（セイヨウヤマハンノキ（Ａｌｎｕｓ  ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）、シラカバ（Ｂｅｔｕｌａ  ａｌｂａ）、セイヨウハシバミ（Ｃｏｒｙｌｕｓ  ａｖｅｌｌａｎａ）、アリゾナイトスギ（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ａｒｉｚｏｎｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐｅａ）、プラタナス（Ｐｌａｔａｎｕｓ）種、ギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｄａｃｔｙｌｏｎ）、カモガヤ（Ｄａｃｔｙｌｉｓ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ）、ヒロハノウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｅｌａｔｉｏｒ）、シラゲガヤ（Ｈｏｌｃｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ）、ホソムギ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ）、オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）、アシ（Ｐｈｒａｇｍｉｔｅｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ナガハグサ（Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）、ブタクサ（Ａｍｂｒｏｓｉａ  ｅｌａｔｉｏｒ）、オウシュウヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、アカザ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ａｌｂｕｍ）、ヒカゲミズ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ）、ヘラオオバコ（Ｐｌａｎｔａｇｏ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）、オカヒジキ（Ｓａｌｓｏｌａ  ｋａｌｉ）、マカラスムギ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ））、チリダニ（アシブトコナダニ（Ａｃａｒｕｓ  ｓｉｒｏ）、ネッタイタマニクダニ（Ｂｌｏｍｉａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、コナヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ）、デルマトファゴイデス・ミクロセラス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｍｉｃｒｏｃｅｒａｓ）、ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）、ユーログリファス・マイネイ（Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ  ｍａｙｎｅｉ）、レピドグリファス・デストラクター（ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｕｓ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）、ケナガコナダニ（Ｔｙｒｏｐｈａｇｕｓ  ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｔｉａｅ））、菌類およびカビ（アルテルナリア・アルテルナート（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔｅ）、クラドスポリウム・ヘルバラム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｈｅｒｂａｒｕｍ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ））、上皮アレルゲン（ネコの毛および鱗屑、イヌの毛および鱗屑、ウマの毛および鱗屑、ヒトの毛および鱗屑、ウサギの毛および鱗屑、ならびに羽毛）、昆虫アレルゲン（アリ、ノミ、ダニ、ゴキブリ、スズメバチ毒およびミツバチ毒）から選択される。
【００３５】
より好ましくは、供給源材料は、ピーナッツ（アラキス・ヒポゲア（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇｅａ））、花粉（オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、ヒカゲミズ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ）、アシ（Ｐｈｒａｇｍｉｔｅｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）およびオオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ））、ダニ（ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ））、ならびに上皮（ネコの鱗屑）から選択される。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態では、供給源材料は、アラキス・ヒポゲア（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇｅａｌ）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、ヒカゲミズ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ）、オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）、ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）、アシ（Ｐｈｒａｇｍｉｔｅｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ヒカゲミズ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ）およびネコの鱗屑から選択される。
【００３７】
本発明のより一層好ましい実施形態では、供給源材料は、アラキス・ヒポゲア（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇｅａ）、オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）、アシ（Ｐｈｒａｇｍｉｔｅｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ヒカゲミズ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ）およびネコの鱗屑から選択される。
【００３８】
本発明のより好ましい実施形態では、アレルゲンはアラキス・ヒポゲア（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇｅａｌ）である。
【００３９】
供給源材料がピーナッツである場合、好ましくは、皮を取り除くか、またはこの材料を粉砕するか、もしくは粉末化することができる。ピーナッツは、トーストするか、ローストするか、フライにするか、または生のままとすることができる。
【００４０】
供給源材料は、液体抽出剤との接触のために表面積を最大にするように処理することができる。供給源材料をホモジナイズ、ブレンド、粉砕または粉末化して、液体抽出のための均質のスラリーにすることができる。液体抽出ステップは、供給源材料から脂質および脂肪酸などの親油性化合物を除去する「脱脂」ステップである。
【００４１】
液体抽出剤はアセトンとすることができ、アセトンは冷たくてもよい。液体抽出ステップは、１：１の比（供給源材料の重量／液体抽出剤の重量）、または液体抽出剤の重量が供給源材料の重量を超える任意の比、例えば１：２、１：３、１：５、１：１０で実施することができる。液体抽出ステップは、供給源材料１ｋｇと液体抽出剤２Ｌの比で実施することが好ましい。液体抽出ステップは、供給源材料中の脂質が液体抽出剤に溶解するのに十分な時間実施することが好ましく、この時間は、１分超、好ましくは５分超、より好ましくは３０分超、最も好ましくは１時間以上とすることができる。液体抽出ステップは、２０〜２５℃の間で実施することができるが、好ましくは２〜６℃、最も好ましくは３〜５℃の間で冷却して実施する。液体抽出ステップの間、供給源材料を液体抽出剤と共に撹拌または揺動することが好ましい。
【００４２】
第１の分離ステップは濾過とすることができる。
【００４３】
第１の分離ステップの後、供給源材料残渣を液体抽出剤で洗浄することができる。場合によっては、供給源材料残渣を、液体抽出剤でさらに抽出し、次いで分離することができる。１回、２回またはそれ以上のさらなる液体抽出ステップを実施することが好ましい。供給源材料残渣と接触させた後、液体抽出剤が透明なままになるまで、供給源材料残渣の液体抽出を継続することが好ましい。
【００４４】
液体抽出の後、供給源材料残渣は乾燥させることができる。供給源材料残渣は２〜２５℃の間で乾燥させることができ、室温で乾燥させることが好ましい。乾燥ステップは、供給源材料残渣から液体抽出剤を除去することを可能にするのに十分な時間継続することが好ましく、この時間は、１〜２４時間、６〜１８時間、１０〜１４時間、好ましくは約１２時間とすることができる。
【００４５】
アレルゲンは、液層に溶解したアレルゲン含む粗アレルゲンエキスおよび「不要な」非アレルギー性残渣からなる固相を生成するためのアレルゲン抽出剤による抽出により、「脱脂」供給源材料残渣から得ることができる。アレルゲン抽出剤は水溶液とすることができ、緩衝剤を含むことが好ましい。アレルゲン抽出剤には、ＰＢＳおよび／またはＮａＣｌ、例えば０．０１Ｍ  ＰＢＳ／０．１５Ｍ  ＮａＣｌの溶液を含むことができる。供給源材料残渣は、アレルゲン抽出剤の重量が供給源材料残渣の重量を超える任意の比、例えば１：２、１：３、１：５、１：１０、１：２０、１：５０で、アレルゲン抽出剤に抽出することができる。供給源材料残渣：アレルゲン抽出剤（重量／重量）を１：１０の比にして、供給源材料残渣をアレルゲン抽出剤に抽出することが好ましい。抽出ステップにおけるアレルゲン抽出剤に対する供給源材料残渣の比は変動させることができるが、供給源材料残渣中のアレルゲンがアレルゲン抽出剤に溶解することができるような比にすべきである。アレルゲン抽出剤による供給源材料残渣の抽出は、供給源材料残渣中のアレルゲンがアレルゲン抽出剤に溶解するのに十分な時間実施することが好ましく、この時間は、３０分〜１２時間、好ましくは１〜６時間、より好ましくは２〜５時間、最も好ましくは約４時間とすることができる。アレルゲン抽出ステップは、２０〜２５℃の間で実施することができるが、好ましくは２〜６℃、最も好ましくは３〜５℃の間で冷却して実施する。アレルゲン抽出ステップの間、供給源材料残渣をアレルゲン抽出剤と共に撹拌または揺動することが好ましい。
【００４６】
アレルゲン抽出ステップの後、液相に溶解したアレルゲンを非アレルギー性残渣から分離して、粗アレルゲンエキスを生成することができる。当業者には周知である、液体から固体を分離する多くの手法が適用できるが、この分離ステップには遠心分離が好ましい。液相に溶解したアレルゲンは、２〜６℃の間、好ましくは３〜５℃の間で、非アレルギー性残渣をペレットとして沈殿させるのに十分な時間、例えば１分〜１時間または１時間超の間、遠心分離することが好ましい。粗アレルゲンエキス（すなわち溶解したアレルゲンを含有する上清）は、２〜６℃の間で保存することができる。非アレルギー性残渣ペレットは、第１のアレルゲン抽出ステップと同じ条件を用い、好ましくは４〜８時間、８〜１２時間または１２時間超など、より長い抽出時間で、アレルゲン抽出剤によりさらに抽出することができる。第２のアレルゲン抽出ステップの後、液相に溶解したアレルゲンを非アレルギー性残渣から分離して、粗アレルゲンエキスを生成することができる。第１および第２のアレルゲン抽出ステップから得られた粗アレルゲンエキスは、次の処理のためにプールすることが好ましい。
【００４７】
粗アレルゲンエキスは、例えば孔径０．４５μｍのフィルターを用いて濾過することができる。粗アレルゲンエキスは、低分子画分除去ステップに供して、塩および他の非アレルギー性化合物など低分子サイズの分子を除去することができる。本出願人は、ピーナッツエキスのタンパク質およびアレルゲン組成物が８〜１５０ｋＤａの間であることを実験的に明らかにした。これらのアレルゲンは、分子画分除去ステップの間、保持する必要がある。例えば、ピーナッツの脂質輸送タンパク質（ＬＴＰ）−重要なアレルゲン−は８ｋＤａであり、これは、低分子画分除去ステップの間、保持する必要がある。ステップｅ）では、８ｋＤａ未満、または７ｋＤａ未満、または６ｋＤａ未満、または５ｋＤａ未満、または４ｋＤａ未満、または３．５ｋＤａ未満の分子サイズを有する分子を除去することができる。アレルゲンエキスの伝導率が、３〜５℃にて、９００μＳ／ｃｍ未満、または８００μＳ／ｃｍ未満、または７００μＳ／ｃｍ未満、または６００μＳ／ｃｍ未満、またはより好ましくは５００μＳ／ｃｍ未満になるまで、低分子画分除去ステップを継続することが好ましい。アレルゲンエキスの伝導率が、３〜５℃にて、２００から１０００μＳ／ｃｍの間、または３００から９００μＳ／ｃｍの間、または最も好ましくは４００から８００μＳ／ｃｍの間になるまで、低分子画分除去ステップを継続することが好ましい。
【００４８】
得られた精製天然アレルゲンエキスは、例えば、孔径０．４５および／または０．２２μｍのフィルターを用いて濾過することができる。
【００４９】
この天然アレルゲンエキスは、規格化、診断、合成およびワクチン接種のための医薬組成物またはワクチン剤の調製に使用することができる。
【００５０】
この方法は、アレルゲンタンパク質に付着する非アレルギー性化合物を、非アレルギー性化合物のタンパク質への付着の原因である静電力、疎水力またはその他の物理力を破壊する手段を用いて除去する、さらなる処理ステップを含むことができる。静電力、疎水力またはその他の物理力を破壊する手段は、陰イオンおよび陽イオン交換物質を含む酸性およびアルカリ性物質、塩ならびに電流からなる化学的手段の群から選択することができる。酸性およびアルカリ性の化学的手段は、タンパク質の等電点を超過させる量で使用することができる。さらなる処理ステップから得られたアレルゲンエキスは、以下の本明細書において、脱色アレルゲンエキスと呼ばれる。
【００５１】
さらなる処置ステップは、
ｇ）天然アレルゲンエキスを酸性にして、３．５ｋＤａ未満の分子サイズを有する分子を除去し、そのｐＨを中和して、脱色アレルゲンエキスを生成するステップを含むことができる。
【００５２】
さらなる処理ステップは温和な酸処理を含むことが好ましい。温和な酸処理では、アレルゲンタンパク質のｐＨは、ｐＨ３未満、例えば２．０から２．５の間のｐＨ値に低下させることができる。アレルゲンタンパク質のｐＨは、２．０から６．０の間にあってもよい。本出願人は、アレルゲンタンパク質に付着する非アレルギー性化合物を解離させるための至適ｐＨは、ｐＨ２．０から２．１の間であることを実験的に同定した。２．０未満のｐＨ値では、脱色アレルゲンエキスのタンパク質プロフィールが不完全になり、ｐＨの低下が不十分、例えば３．０超であると、得られる脱色アレルゲンエキス中の非アレルギー性化合物の除去が不完全になる。
【００５３】
天然アレルゲンエキスのｐＨは、適切な酸、例えばＨＣｌを用いて低下させることができる。酸性化されたエキスは、１〜６０分、好ましくは５〜３０分、より好ましくは１０〜２０分、最も好ましくは約１５分の間、低ｐＨに維持することができる。３．５ｋＤａ未満の分子サイズを有する分子は、低分子画分除去ステップで除去することができる。
【００５４】
さらなる処理ステップの後、得られた脱色エキスを集めることができ、アレルゲンエキスのｐＨを適切なアルカリ、例えばＮａＯＨを用いて中和することができる。タンパク質の沈殿を回避する値、たとえば、ｐＨ７．０超、好ましくはｐＨ７．０から８．０の間、より好ましくはｐＨ７．０から７．５の間、最も好ましくはｐＨ７．３から７．４の間に、ｐＨ値を調整することができる。
【００５５】
さらなる処置ステップは、
ｇ）天然アレルゲンエキスをｐＨ２〜２．１に酸性化して、酸性化したエキスを５〜３０分間維持した後、このエキスを低分子画分除去ステップに供して、３．５ｋＤａ未満の分子サイズを有する分子を除去し、ｐＨを７．３〜７．４に調節して脱色アレルゲンエキスを生成するステップ
を含むことができる。
【００５６】
さらなる処理ステップは、天然アレルゲンエキスをｐＨ２．０〜４．０に酸性化することを含むことができる。
【００５７】
静電力を破壊するための手段は、電気泳動の形態の電流を含むことができる。非アレルギー性化合物の分子量は、８，０００Ｄａ未満、５，０００Ｄａ、好ましくは３，５００未満の分子量とすることができ、フラボノイドおよび／またはそれらの配糖体を含むことがある。
【００５８】
低分子画分除去ステップは、エキスを精製水または緩衝液などの透析液に対して透析する透析ステップとすることができる。低分子画分除去ステップは、２０〜２５℃の間で実施することができるが、好ましくは２〜６℃、最も好ましくは３〜５℃の間で冷却して実施する。低分子画分除去ステップは、１２〜２４時間実施することができ、溶媒、または透析の場合には透析液を定期的に交換して反応を持続する。
【００５９】
得られた脱色アレルゲンエキスは、例えば、孔径０．４５μｍおよび／または０．２２μｍのフィルターを用いて濾過することができ、保存用に凍結または凍結乾燥することができる。
【００６０】
本発明の方法を用いて生成したエキスのいずれもさらに処理することができる。この方法は、
ｈ）天然アレルゲンエキスまたは脱色アレルゲンエキスをアルデヒドと接触させるステップと、
ｉ）１００ｋＤａ未満の分子サイズを有する分子を除去するステップと
を含む重合ステップをさらに含むことができる。
【００６１】
アルデヒドは任意の適切なアルデヒド、例えばグルタルアルデヒドまたはホルムアルデヒドとすることができる。
【００６２】
重合ステップは、
ｈ）天然アレルゲンエキスまたは脱色アレルゲンエキスをグルタルアルデヒドまたはホルムアルデヒドと接触させるステップと、
ｉ）前記エキスを分子画分除去ステップに供して、１００ｋＤａ未満の分子サイズを有する分子を除去するステップと、
ｊ）前記アレルゲンエキスの伝導率が３〜５℃にて２１０μＳ／ｃｍ未満になるまで、かつ／またはグルタルアルデヒドがなくなるまでステップｉ）を実行して、重合アレルゲンエキスまたは脱色重合アレルゲンエキスを得るステップと
を含むことができる。
【００６３】
重合のためのエキスを凍結乾燥している場合、そのエキスを、緩衝液、例えば０．０１Ｍ  ＰＢＳ／０．１５Ｍ  ＮａＣｌの中で、最終濃度０．１〜５００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１００ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは１０〜５０ｍｇ／ｍｌに再構成することができる。
【００６４】
重合反応は、１００ｋＤａ未満（例えば１４〜２５ｋＤａ）のタンパク質バンドが非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで重合エキス中に検出できなくなるまで実施することが好ましい。本出願人は、２つのパラメーターが重合の最適条件に影響を及ぼすことを実験的に明らかにした（表２を参照のこと）。
【００６５】
第１に、グルタルアルデヒドの最終濃度が重要であり、グルタルアルデヒド濃度が増加するとポリマー収率が低下し、透析前の遠心分離によって得られる残渣収率が増加する。約５ｍｇ／ｍｌのグルタルアルデヒド濃度（すなわちアレルゲンエキス１ｍｌ当たりグルタルアルデヒド０．００９ｍｌ）を使用する、従来知られている重合条件とは対照的に、最適なグルタルアルデヒド濃度は、公知量の約２倍、すなわち１０ｍｇ／ｍｌ（アレルゲンエキス１ｍｌ当たりグルタルアルデヒド０．０２ｍｌ）であることが実験的に明らかになった。アルデヒドは１〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲で加えることができる。グルタルアルデヒドの最終濃度に従来の公知量を使用すると、アレルゲンの重合を一部得ることができるが、最適な重合を達成するためには、アルデヒドを最終濃度１０ｍｇ／ｍｌまで加えるか、またはエキス１ｍｌ当たりグルタルアルデヒド０．０２ｍｌの比で加えることが好ましい。
【００６６】
第２に、グルタルアルデヒドの添加速度を低下させると、ポリマー収率が低下し、残渣収率が増加することを本出願人は明らかにした。アルデヒドは、一定の速度、例えば、毎分０．００１〜０．５ｍｌ（１〜５００μｌ／分、６０〜３０００μｌ／時）でエキスに加えることができる。
【００６７】
重合反応は、室温で１〜１２時間、好ましくは７時間の間持続することができる。重合反応は、重合エキス溶液１ｍｌ当たり４０ｍｇの割合でグリシンを用いて停止させることができる。停止反応は、３〜５℃で一晩、好ましくは撹拌しながら、持続することができる。液相中の重合アレルゲンは、不溶残渣から分離して、重合アレルゲンエキスまたは脱色重合アレルゲンエキスを生成することができる。当業者には周知である多くの分離手法が適用できるが、分離ステップには遠心分離が好ましい。エキスは、２〜６℃の間、好ましくは３〜５℃の間で、不溶残渣をペレットとして沈殿させるのに十分な時間、例えば１分〜１時間または１時間超の間、遠心分離することが好ましい。上清（可溶性アレルゲンを含有する）を収集し、分子画分除去ステップ（ｉ）に供することができる。
【００６８】
ステップｉ）では、１５０ｋＤａ未満の分子サイズを有する分子を除去することができる。３ＭＤａ超の分子量を有する分子は、沈殿することが見出されており、重合ステップの間に除去することもできる。
【００６９】
分子画分除去ステップは、エキスを精製水または緩衝液などの透析液に対して３〜５℃で透析する透析ステップとすることが好ましい。３〜５℃で測定した伝導率が、２００μＳ／ｃｍ未満、より好ましくは１７５μＳ／ｃｍ未満、より好ましくは１５０μＳ／ｃｍ未満、より好ましくは１２５μＳ／ｃｍ未満、より好ましくは１００μＳ／ｃｍ未満、より好ましくは５０から２００μＳ／ｃｍの間、最も好ましくは１００から１５０μＳ／ｃｍの間になるまで、分子画分除去ステップを継続することができる。
【００７０】
得られたアレルゲンエキスは、例えば、孔径０．４５μｍおよび／または０．２２μｍのフィルターを用いて濾過することができ、保存用に凍結または凍結乾燥することができる。
【００７１】
低分子画分除去ステップｃ）、ｅ）またはｇ）のいずれも、限外濾過ステップ、ダイアフィルトレーションステップ、透析ステップまたは濾過を含むことができる。
【００７２】
その最も単純な形態では、本発明の方法は、天然可溶性アレルゲンエキスを調製するステップと、場合によっては、例えば温和な酸処理によってエキスをさらに処理して、低分子サイズを有する非アレルギー性化合物を除去するステップと、アルデヒドを用いて、エキスを重合するステップとを含むことができる。天然可溶性アレルゲンエキスは、ピーナッツ、花粉、草、上皮、カビ、菌類、昆虫またはダニのアレルゲンとすることができる。本発明の方法により、ＩｇＥ結合能は低減しているが、その免疫原性は保持しているアレルゲンエキスが得られる。
【００７３】
本発明は、アレルギーのための処置およびアレルギーのための診断薬をさらに含み、両方とも、本発明の方法により生成するアレルゲンエキスを有効成分として含む。本明細書で議論しているように、アレルギーは、ＩｇＥ媒介アレルギー応答を惹起する様々なアレルゲンへの曝露と関連している可能性がある。
【００７４】
本発明の第２の態様により、本発明の第１の態様の方法により得られるアレルゲンエキスを提供する。有効な治療物質として使用するための精製アレルゲンエキスを提供する。本発明の第１の態様の方法により得られる、天然アレルゲンエキス、重合天然アレルゲンエキス、脱色アレルゲンエキス、脱色重合アレルゲンエキスを提供する。エキスは、好ましくは重合天然アレルゲンエキスであり、より好ましくは脱色重合アレルゲンエキスである。
【００７５】
アレルゲンエキスは、ピーナッツ（アラキス・ヒポゲア（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇｅａｌ））、花粉（オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、ヒカゲミズ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ）、アシ（Ｐｈｒａｇｍｉｔｅｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ヒカゲミズ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ）およびオオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ））、ダニ（ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ））、ならびに上皮（ネコの鱗屑）から選択することができる。
【００７６】
アレルゲンエキスはアレルギーの処置に使用することを目的とすることができる。好ましい実施形態では、アレルゲンエキスであるアラキス・ヒポゲア（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇｅａｌ）は、ピーナッツアレルギーの処置に使用することを目的とすることができる。
【００７７】
脱色重合アレルゲンエキスは以下の物理化学的および生物学的特性を特徴とすることができる。
ｉ．水に可溶であること、
ｉｉ．１００ｋＤａ未満の分子量を有する非重合アレルゲン／タンパク質を含まないこと（非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥによるバンドとして同定）、
ｉｉｉ．１００ｋＤａ未満の分子量を有するＩｇＥ認識バンドを含まないこと（非還元条件の免疫ブロット法による同定）、
ｉｖ．１００ｋＤａ未満の分子量を有する重合分子を含まないこと（ＨＰＬＣを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによる測定）、
ｖ．天然エキスに対して、遊離アミノ基が７５％減少していること（フルオレサミン法による測定）、
ｖｉ．天然アレルゲンエキスに対して、生物学的効力が低下（９５％）していること（感作個体に由来する血清の特定プールを用いる、ＩｇＥ  ＥＬＩＳＡ阻害実験による測定）、および
ｖｉｉ．マウスにおいて異常毒性がないこと。
【００７８】
本発明のアレルゲンエキスは、特定のアレルゲンに対する寛容を誘導する目的で、アレルギー個体を処置するための医薬品の有効成分として使用するためのものとすることができる。
【００７９】
免疫疾患の診断における、好ましくはアレルギー性疾患を検出するための、本発明によるアレルゲンエキスの使用を提供する。アレルギー処置のための、またはアレルギー処置のための医薬品の製造における、本発明によるアレルゲンエキスの使用を提供する。この使用は、免疫療法のためであってもよい。この使用は、規格化、診断、合成およびワクチン接種のためであってもよい。この使用は、患者の治療的処置、好ましくは免疫療法におけるものであってもよい。この使用は、免疫療法中に患者をモニターするものであってもよい。
【００８０】
本発明のさらなる態様により、本発明によるアレルゲンエキスを含む医薬組成物を提供する。本発明によるアレルゲンエキスの医薬的有効量を有効成分として含み、かつ少なくとも１つの医薬的に許容される担体または希釈剤を含む、アレルギー処置のための医薬組成物を提供する。本発明によるアレルゲンエキスの診断用有効量を有効成分として含む、アレルギーのための診断用組成物を提供する。
【００８１】
本発明のさらなる態様により、本発明によるアレルゲンエキスを含むワクチン剤を提供する。医薬組成物およびワクチン剤は、１つまたは複数のアジュバント、希釈剤、防腐剤またはそれらの混合物をさらに含むことができる。医薬組成物またはワクチン剤は、生理学的に許容される担体を含むことができる。本明細書で使用する句「医薬的に許容される」は、政府の規制当局により承認されているか、あるいはヒトでの使用に関し、欧州薬局方もしくは米国薬局方または別の一般に認知された薬局方に掲載されていることを意味することが好ましい。
【００８２】
そのような医薬的に許容される担体は、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等、石油、動物、植物または合成起源の油を含む、水および油などの滅菌液体とすることができる。生理食塩水ならびにデキストロースおよびグリセリンの水溶液もまた、特に注射剤のための液体担体として使用することができる。好適な医薬賦形剤としては、マンニトール、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。
【００８３】
本発明のさらなる態様により、本発明によるアレルゲンエキスを、１つまたは複数のアジュバント、希釈剤、防腐剤またはそれらの混合物と共に製剤化することを含む、アレルゲンワクチン剤を製造するための方法を提供する。
【００８４】
本発明のさらなる態様の方法により得られるワクチン剤を提供する。ワクチン剤は皮下使用または舌下使用を目的とすることができる。
【００８５】
アレルギー処置における、またはアレルギー処置のための医薬品の製造における、本発明によるワクチン剤の使用を提供する。
【００８６】
本発明のさらなる態様により、本発明のアレルゲンエキス、医薬組成物またはワクチン剤の有効量に個体を曝露するステップを含むアレルゲン感作を予防する方法を提供する。
【００８７】
本発明のさらなる態様により、本発明のアレルゲンエキス、医薬組成物またはワクチン剤の有効量を個体に投与するステップを含む、感作個体のアレルギーを処置する方法を提供する。アレルゲンエキス、医薬組成物またはワクチン剤は、皮下または舌下に投与することができ、用量を増加させながらまたは一定の用量で投与することができる。
【００８８】
個体はヒトまたは動物、好ましくはヒトとすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、アレルゲンエキスの製造方法の要約を示す図である。
【図２】図２は、天然ピーナッツアレルゲンエキスのＨＰＬＣ分析を示す図である。ＢｉｏＲａｄ低範囲標準（レーン１）、天然エキス（レーン２）、沈殿（レーン３）、分画２０（レーン４）、分画２１（レーン５）、分画４０（レーン６）、分画７８（レーン７）、分画９６（レーン８）、分画１１１（レーン９）。
【図３】図３は、脱色重合ピーナッツアレルゲンエキスのＨＰＬＣ分析を示す図である。
【図４】図４は、脱色重合ピーナッツアレルゲンエキス残渣のＨＰＬＣ分析を示す図である。ＢｉｏＲａｄ低範囲標準（レーン１）、脱色重合エキス残渣（レーン２）、沈殿（３）、分画２１（レーン４）、分画５１（レーン５）、分画７４（レーン６）、分画７５（レーン７）、分画１２０（レーン８）。
【図５】図５は、ピーナッツアレルゲンエキス４０μｇのＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す図である。ＳＴＤ（標準Ｂｉｏ−Ｒａｄ低範囲）、レーン１〜４は還元条件下、レーン５〜８は非還元条件下、ピーナッツ２３０２０９／ＬＮ  天然（レーン１）、ピーナッツ２３０２０９／ＬＤ  脱色（レーン２）、ピーナッツ０３０３０９／ＬＰ  脱色／重合（レーン３）、ピーナッツ０３０３０９／ＬＰ  脱色／重合残渣（レーン４）、ピーナッツ２３０２０９／ＬＮ  天然（レーン５）、ピーナッツ２３０２０９／ＬＤ  脱色（レーン６）、０３０３０９ピーナッツ／ＬＰ  脱色／重合（レーン７）、およびピーナッツ０３０３０９／ＬＰ  脱色／重合残渣（レーン８）。
【図６】図６は、ピーナッツアレルゲンエキス４０μｇのＩＥＦ分析を示す図である。標準Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＩＥＦマーカー、ｐＩ４．４５〜９．６（レーン１および２）、ピーナッツ２３０２０９／ＬＮ  天然（レーン３）、ピーナッツ２３０２０９／ＬＤ  脱色（レーン４）、ピーナッツ０３０３０９／ＬＰ  脱色／重合（レーン５）、ピーナッツ０３０３０９／ＬＰ  脱色／重合残渣（レーン６）。
【図７】図７ａは、ピーナッツアレルギードナーの血清プール（希釈１／２０）およびα−ＩｇＥ−ＰＯ（１２０７０５、希釈１／５００）を用いる、還元条件下におけるピーナッツアレルゲンエキス４０μｇの免疫ブロット分析を示す図である。ピーナッツ２３０２０９／ＬＮ  天然（レーン１）、ピーナッツ２３０２０９／ＬＤ  脱色（レーン２）、ピーナッツ０３０３０９／ＬＰ  脱色／重合（レーン３）、ピーナッツ０３０３０９／ＬＰ  脱色／重合残渣（レーン４）。図７ｂは、ピーナッツアレルギードナーの血清プール（希釈１／２０）およびα−ＩｇＥ−ＰＯ（１２０７０５、希釈１／５００）を用いる、非還元条件下におけるピーナッツアレルゲンエキス４０μｇの免疫ブロット分析を示す図である。ピーナッツ２３０２０９／ＬＮ  天然（レーン１）、ピーナッツ２３０２０９／ＬＤ  脱色（レーン２）、ピーナッツ０３０３０９／ＬＰ  脱色／重合（レーン３）、ピーナッツ０３０３０９／ＬＰ  脱色／重合残渣（レーン４）。
【図８】図８は、ピーナッツアレルギードナーの血清プール（希釈１／２０）およびα−ＩｇＥ−ＰＯ（１２０７０５、希釈１／５００）を用いる、還元条件下におけるピーナッツアレルゲンエキスの免疫ブロット阻害分析を示す図である。レーン１は対照（血清のみ）であり、レーン２〜４は、血清プールに、脱色／重合ピーナッツアレルゲンエキス８００μｇ、エキス４００μｇ（レーン３）およびエキス２００μｇ（レーン４）を加えたものである。
【図９】図９は、ＥＬＩＳＡに基づいた、ピーナッツアレルゲンエキスのＩｇＥ阻害分析を示す図である。
【００９０】
アレルゲンを含むエキスの調製、精製、さらなる処理および重合の方法を詳述する以下の実施例により本発明を説明する。
【００９１】
方法Ａ〜Ｄでは、アレルゲンエキスを製造する方法を詳述し、実施例１〜８では、脱色重合アレルゲンエキスまたは脱色アレルゲンエキスの実験的特徴づけを記載する。
【００９２】
方法
Ａ．アレルゲン原料の脱脂方法
脱脂エキスは、原料の性質に応じた種々の方法により得た。各アレルゲンについての方法は各実施例の中で説明している。一般には、ホモジナイズされた材料を３〜５℃にてアセトン中で脱脂し、濾過する。アセトンが透明になるまで、このステップを繰り返す。脱脂材料を回収し、アセトンがすべて除去されるまで、室温で乾燥する。
【００９３】
Ｂ．天然アレルゲンエキスの調製。
乾燥脱脂材料を秤量し、０．０１Ｍ  ＰＢＳ／０．１５Ｍ  ＮａＣｌの中に１：１０の比で入れ、３〜５℃にて４時間、マグネチックスターラで撹拌しながら抽出した。その後、この溶液を４℃にて３０分間、１０．０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離した。得られた上清は収集して３〜５℃で保存し、ペレットは０．０１Ｍ／ＮａＣｌ  ０．１５Ｍの中で再構成（１：１０）し、３〜５℃にて一晩、マグネチックスターラで撹拌しながら抽出した。この溶液を３〜５℃にて３０分間、１０．０００ｒ．ｐ．ｍで遠心分離し、その上清を収集し、先に得られた分画と混合した。孔径０．４５μｍのフィルターを用いて、合体したエキスを濾過し、伝導率が１０００μＳ／ｃｍ未満になるまで、３ｋＤａカットオフの透析膜で徹底的に透析した。次いで、孔径０．２２μｍのフィルターを用いてこのエキスを濾過した。
【００９４】
Ｃ．脱色アレルゲンエキスの調製
３〜５℃で保持した天然エキス水溶液を、以下の手順を用いてさらに処理した。マグネチックスターラで撹拌しながら、０．１Ｍ  ＨＣｌを添加して、この溶液のｐＨを２〜２．１に調整し、この条件下で１５分間保持した。その後、精製水を用いて、３．５ｋＤａカットオフの透析膜でこのエキスを透析した。この透析は１０容量の精製水に対して３〜５℃にて１７時間行った。精製水は、この時間に４回交換した。温和な酸処理の後、このエキスを収集し、０．１Ｍ  ＮａＯＨを用いて、ｐＨを７．３〜７．４に調整した。最後に、０．２２μｍのフィルターまでエキスを滅菌濾過して凍結し、凍結乾燥した。
【００９５】
Ｄ．重合脱色アレルゲンエキスの調製
完全に希釈されるまでマグネチックスターラで撹拌しながら、最終濃度１５ｍｇ／ｍｌになるように、０．０１Ｍ  ＰＢＳ／０．１５Ｍ  ＮａＣｌの中で、凍結乾燥した脱色エキスを再構成した。重合工程は、脱色エキス１ｍｌ当たりグルタルアルデヒド０．０２ｍｌを用いて、グルタルアルデヒドを添加することからなる。自動注入器を用いて、一定速度（３６ｍｌ／時間）で脱色エキスにグルタルアルデヒドを添加した。重合反応は室温で７時間持続した。溶液１ｍｌ当たりグリセリン４０ｍｇの割合でグリシンを添加して反応を停止した。マグネチックスターラで継続して撹拌しながら、３〜５℃で一晩、この反応を持続した。その後、３〜５℃にて３０分間、１０．０００ｒ．ｐ．ｍ．で溶液を遠心分離した。ペレットを除去して上清を収集し、冷却条件下で、精製水（エキス１ｍｌ当たり水１６．６７ｍｌ）を用いて１００ｋＤａカットオフの透析膜で徹底的に透析した。この工程は、伝導率が２１０μＳ／ｃｍ未満になった時点で終了と見なし、グルタルアルデヒドがないことをＵＶ／可視走査により確認した。最後に、孔径０．２２μｍのフィルターを用いてエキスを滅菌濾過して凍結し、凍結乾燥した。
【００９６】
最終生成物は、凍結乾燥された脱色重合エキスからなり、凍結乾燥状態で４℃にて保存する。
【００９７】
免疫学的特徴づけ
タンパク質含量
天然エキス、脱色エキス、脱色／重合エキスおよび脱色／重合残渣のタンパク質含量を、製造業者の説明書に従いローリービウレット法により測定した。実施例１の一実験ロットに対する結果を表１に示す。
【００９８】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
エキスの凍結乾燥試料を最終濃度１ｍｇ／ｍｌになるように高精製水に再懸濁し、１０〜１５分間撹拌した。この試料を１３０００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心分離し、その上清を自動注入用のバイアルに移した。ＨＰＬＣ分析には、あらかじめ水で平衡化したＰＬ−アクアゲル−ＯＨ  ６０  ８μｍ（ＰｏｌｙｍｅｒＬａｂｓ）カラムを使用した。このカラムはサイズの相違に基づいて分画する。１ｍｌ／分の流速（製造業者の推奨に従い）で試料を流した。２５４ｎｍおよび２８０ｎｍのＵＶシグナルを検出してクロマトグラムを得た。ＨＰＬＣ分析の結果を図２〜４に示す。
【００９９】
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を用いて、エキスのタンパク質／抗原プロフィールを決定した。天然状態または変性状態（緩衝液はβ−メルカプトエタノールを含有し、９５℃で１０分間加熱した）の試料を、２．６７％Ｃ、１５％Ｔのアクリルアミドを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流した。各エキスの凍結乾燥物４０μｇをゲルにロードした。分子量が既知の参照マーカー（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を同じゲルに流した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でゲルを染色した。抗原プロフィールは、スキャナ（Ｓｈａｒｐ  ＪＸ−３３０；Ｓｈａｒｐ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐ，Ｍａｈｗａｈ，ＮＪ）を用いて測定し、Ｉｍａｇｅ  Ｍａｓｔｅｒ  １−Ｄ  Ｅｌｉｔｅ  ｖ  ４．００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて分析した。図５に、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色ゲルを示すが、この図により、脱色／重合アレルゲンエキスは、非還元条件下（レーン７）で、１００ｋＤａ未満の分子量を有する非重合アレルゲン／タンパク質を含まないことが示される。
【０１００】
等電点電気泳動
等電点電気泳動（ＩＥＦ）分析を用いて、タンパク質の等電点による、エキスのタンパク質／抗原プロフィールを決定した。天然状態の試料をポリアクリルアミド電気泳動ゲルに流した。各エキスの凍結乾燥物４０μｇをゲルにロードした。等電点が既知の参照マーカー（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を同じゲルに流した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でゲルを染色し、抗原プロフィールは、スキャナ（Ｓｈａｒｐ  ＪＸ−３３０；Ｓｈａｒｐ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐ，Ｍａｈｗａｈ，ＮＪ）を用いて測定し、Ｉｍａｇｅ  Ｍａｓｔｅｒ  １−Ｄ  Ｅｌｉｔｅ  ｖ  ４．００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて分析した。図６のレーン３〜６に、天然（レーン３）、脱色（レーン４）、脱色／重合（レーン５）および脱色／重合残渣（レーン６）の結果を示す。
【０１０１】
免疫ブロッティング
電気泳動で分離したタンパク質は、Ｐ−Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に転写した。転写後、室温で４時間、膜を乾燥した。この膜を、０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水−２％Ｔｗｅｅｎの中に希釈した血清プールと共に、一晩インキュベートした。ペルオキシダーゼ結合モノクローナル抗ヒトＩｇＥ（Ｉｎｇｅｎａｓａ，Ｍａｄｒｉｄ）を用いて、２時間かけて、特異的ＩｇＥ結合を検出した。アレルゲンプロフィールは、Ｓｈａｒｐ  ＪＸ−３３０を用いて測定し、Ｉｍａｇｅ  Ｍａｓｔｅｒ  １−Ｄ  Ｅｌｉｔｅ  ｖ４．００を用いて分析した。図７ｂのレーン１〜４に、非還元条件下における、天然（レーン１）、脱色（レーン２）、脱色／重合（レーン３）および脱色／重合残渣（レーン４）の結果を示す。脱色／重合アレルゲンエキスは、１００ｋＤａ未満のＩｇＥ認識バンドを示さない。図８では、ピーナッツアレルギードナーの血清プールと比較すると、重合ピーナッツアレルゲンエキスの希釈溶液を用いてＩｇＥ阻害が観察される。
【０１０２】
ＩｇＥ阻害
エキス（天然、脱色および重合）のｉｎ  ｖｉｔｒｏアレルゲン活性を、ＥＬＩＳＡ阻害によって試験し、参照として天然エキスを用いて、５０％阻害点を判定した。プラスチックマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＶ；Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）を、天然エキス（タンパク質１０μｇ／ｍｌ）で一晩コーティングした。天然エキス、脱色エキスおよび重合エキスから数段階希釈溶液を作製した。各希釈溶液を室温で２時間、血清プールと共にインキュベートした。その後、これらのエキス希釈溶液を、天然エキスでコーティングしたプレートに移し、２時間インキュベートした。洗浄後、抗ヒトＩｇＥペルオキシダーゼ１００μｌを加え、室温で３０分間静置した。洗浄後、プレートを３０分間発色させ、硫酸（１Ｎ）で停止した。脱色／重合アレルゲンエキスを用いた場合に、ＩｇＥ結合の最大阻害が観察される（図９）。
【０１０３】
ＩｇＧ阻害
エキス（天然、脱色および重合）のｉｎ  ｖｉｔｒｏアレルゲン活性を、ＥＬＩＳＡ阻害によって試験し、参照として天然エキスを用いて、５０％阻害点を判定した。プラスチックマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＩ；Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）を、天然エキス（タンパク質１０μｇ／ｍｌ）で一晩コーティングした。天然エキス、脱色エキスおよび重合エキスから数段階希釈溶液を作製した。各希釈溶液を室温で２時間、血清プールと共にインキュベートした。その後、これらのエキス希釈溶液を、天然エキスでコーティングしたプレートに移し、２時間インキュベートした。洗浄後、抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ１００μｌを加え、室温で３０分間静置した。洗浄後、プレートを３０分間発色させ、硫酸（１Ｎ）で停止した。
【０１０４】
フルオレサミン
天然エキス、脱色エキスおよび脱色重合エキス中の遊離アミノ基を測定し検出した。アレルゲン間の架橋が反応性の遊離アミノ基により媒介されるので、重合により遊離アミノ基の数は減少する。天然エキスおよび脱色エキスは２５μｇ／ｍｌ、脱色重合エキスは１０００μｇ／ｍｌに調製する。２〜１０ｍｇ／ｍｌの６−アミノカプロン酸を標準として使用する。Ｅｖａｎｓ溶液をすべての試料に加える。アミノ基をこの緩衝液で希釈する。その後、ホウ酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｍ）をすべての試料に加え、ホモジナイズする。最後に、あらかじめアセトンで希釈したフルオレサミンをこの混合物に加え、励起３９０ｎｍおよび発光４８０ｎｍを用いて蛍光光度計で溶液を測定する。
【０１０５】
ＵＶ／可視の走査分光測光
天然アレルゲンエキス、脱色アレルゲンエキスおよび脱色重合アレルゲンエキスを、０．０１Ｍ  ＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌに希釈する。稀釈後、２００から６００ｎｍの間のλで試料を分析する。
【０１０６】
ＨＥＰによる生物学的効力
エキス（天然および脱色）の生物活性を、ＲＥＩＮＡ拮抗法により測定する。プラスチックマイクロタイタープレートを抗ＩｇＥでコーティングする。アレルギー個体からの血清プールをマイクロプレートに加え、３０分間インキュベートする。試料および内部標準（ＩＨＲ）をあらかじめ希釈し、ペルオキシダーゼ標識ＩＨＲと共にインキュベートする。その後、マイクロプレートを洗浄し、インキュベートした試料をマイクロプレートに加え、３０分間インキュベートする。最後に、マイクロプレートを徹底的に洗浄し、クロモゲン（ｃｒｏｍｏｇｅｎ）と共にインキュベートする。プレートを４５０ｎｍで読み取る。
【０１０７】
マウスにおける異常毒性
欧州薬局方の規格に従い、雌マウス（ＮＭＲＩ系統）に、０．１ｍｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌ濃度の脱色重合ピーナッツエキス１ｍｌを注射した。投与には腹腔内注射を使用した。観察期間は７日であり、その後、体重および行動における顕著な変化は動物に観察されなかった。
【実施例】
【０１０８】
実施例１−ピーナッツアレルゲンエキス
ステップＡ  ピーナッツ原料の脱脂工程
皮を剥いたピーナッツをブレンダーの中でホモジナイズして、ホモジナイズされたスラリーを得た。スラリー１ｋｇに対しある割合の冷アセトンを用いて、ホモジナイズされた材料を脱脂した、すなわちマグネチックスターラで撹拌しながら３〜５℃で１時間、アセトン２Ｌを用いて、脂質、脂肪酸および遊離フラボノイドを抽出した。得られた溶液を、ブフナー漏斗で濾過した。アセトンを除去し、エキスをフィルターに集め、新しいアセトンで２回洗浄した。集めたアセトンが透明になるまで、全工程をさらに２回繰り返した。この工程を終了した後、脱脂ピーナッツエキスを集め、この材料が完全に乾燥しアセトンがすべて除去されるまで、ラミナーフローフードの下で室温にて乾燥した。
【０１０９】
方法ステップＢ〜Ｄにより、脱色重合ピーナッツアレルゲンエキスを得た。
【０１１０】
ピーナッツアレルゲンエキスの特徴づけ
脱色重合ピーナッツアレルゲンエキス生成物は、以下の規格を満たさなければならない。
ａ．水に可溶な生成物であること、
ｂ．１００ｋＤａ未満の分子量を有する非重合アレルゲン／タンパク質を含まないこと（非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥによるバンドとして同定）、
ｃ．１００ｋＤａ未満の分子量を有するＩｇＥ認識バンドを含まないこと（非還元条件の免疫ブロッティングによる同定）、
ｄ．１００ｋＤａ未満の分子量を有する重合分子を含まないこと（ＨＰＬＣを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによる測定）、
ｅ．天然エキスに対して、遊離アミノ基が減少（７５％）していること（フルオレサミン法による測定）、
ｆ．天然アレルゲンエキスに対して、生物学的効力が低下（９５％）していること（感作個体に由来する血清の特定プールを用いる、ＩｇＥ  ＥＬＩＳＡ阻害実験による測定）、
ｇ．マウスにおいて異常毒性がないこと。
【０１１１】
脱色／重合残渣を含むペレットは、天然エキス、脱色エキスおよび脱色／重合エキスの特徴づけにおける対照として利用した（表１および２を参照のこと）。
0005969922.tif 000002
【０１１２】
実施例２−ブタクサアレルゲンエキス（アンブロシア・アルテミシイフォリア（Ａｍｂｒｏｓｉａ  ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａ））
ステップＡ  アレルゲン原料の脱脂工程
受粉後ブタクサから採取したブタクサ花粉を、３〜５℃にて３時間、撹拌を継続しながら、１：４（ｗ／ｖ）の割合の冷アセトンで脱脂する。得られた溶液をブフナー漏斗で濾過し、新しいアセトンで少なくとも３回洗浄した。この工程を終了した後、脱脂エキスを集め、この材料が完全に乾燥しアセトンがすべて除去されるまで、ラミナーフローフードの下で室温にて１２時間乾燥した。
【０１１３】
方法ステップＢ〜Ｄにより、脱色重合ブタクサ（アンブロシア・アルテミシイフォリア（Ａｍｂｒｏｓｉａ  ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａ））を得た。ステップ３で０．１Ｍ  ＨＣｌを添加することにより、溶液のｐＨを４〜４．１に調整する。
【０１１４】
最終生成物は、凍結乾燥された脱色重合ブタクサエキスからなり、凍結乾燥状態で４℃にて保存する。得られた生成物は、以下の規格を満たさなければならない。
ａ．水に可溶な生成物であること、
ｂ．１００ｋＤａ未満の分子量を有する非重合アレルゲン／タンパク質を含まないこと（非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥによるバンドとして同定）、
ｃ．１００ｋＤａ未満の分子量を有するＩｇＥ認識バンドを含まないこと（非還元条件の免疫ブロットによる同定）、
ｄ．１００ｋＤａ未満の分子量を有する重合分子を含まないこと（ＨＰＬＣを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによる測定）、
ｅ．天然エキスに対して、遊離アミノ基が減少（７５％）していること（フルオレサミン法による測定）、
ｆ．天然エキスに対して、生物学的効力が顕著に低下していること（感作個体に由来する血清の特定プールを用いる、ＩｇＥ  ＥＬＩＳＡ阻害実験による測定）、
ｇ．主要アレルゲンＡｍｂ  ａ  １が検出されること、モノクローナル抗体、
ｈ．マウスにおいて異常毒性がないこと。
【０１１５】
主要アレルゲン含量
主要アレルゲンＡｍｂ  ａ  １含量は、Ｉｎｄｏｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈキット（ＩＮＤＯＯＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて測定する。抗Ａｍｂ  ａ  １ポリクローナルＩｇＧ抗体をコーティングする（１ｍｇ／ｍｌで調製したバイアルから１：１０００）。標準曲線は、Ａｍｂ  ａ  １活性２．５Ｕ／ｍｌを含有する米国ＦＤＡ（Ａｍｂ  ａ  １のための放射免疫拡散リファレンス、３０Ｕ  Ａｍｂ  ａ  １／ｍｌを含有するＣ１４−ＲＡＳ）ブタクサエキスに対して定量化および標準化したものを用いて作成する。二次抗体は、ショートブタクサアレルゲンに対して産生されたウサギポリクローナルＩｇＧビオチン化抗体からなる。天然試料および脱色試料を５００ｎｇ／ｍｌに希釈する。これらの値を用いて、重合エキス中の主要アレルゲン含量を計算する。
【０１１６】
脱色／重合残渣を含むペレットは、天然エキス、脱色エキスおよび脱色／重合エキスの特徴づけにおける対照として利用した（表３ａおよび３ｂを参照のこと）。
0005969922.tif 000003
0005969922.tif 000004
【０１１７】
実施例３−花粉アレルゲンエキス（オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｏｐａｅａ））
受粉後オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）の樹木から採取したオリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）花粉を、３〜５℃にて３時間、撹拌を継続しながら、１：４（ｗ／ｖ）の割合の冷アセトンで脱脂する。得られた溶液をブフナー漏斗で濾過し、新しいアセトンで少なくとも３回洗浄した。この工程を終了した後、脱脂エキスを集め、この材料が完全に乾燥しアセトンがすべて除去されるまで、ラミナーフローフードの下で室温にて１２時間乾燥した。
【０１１８】
方法ステップＢ〜Ｄにより、脱色花粉アレルゲンエキスを得た。
【０１１９】
最終生成物は、凍結乾燥された脱色エキスからなり、凍結乾燥状態で４℃にて保存する。得られた生成物は、以下の規格を満たさなければならない。
ａ．水に可溶な生成物であること、
ｂ．２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、天然エキスと同様のタンパク質プロフィールであること、
ｃ．免疫ブロットで測定した場合、天然エキスと同様のアレルゲンプロフィールであること、
ｄ．天然エキスと同様のタンパク質含量であること、
ｅ．天然エキスと同様の主要アレルゲン含量であること、
ｆ．天然エキスと同様の生物活性であること。
0005969922.tif 000005
【０１２０】
実施例４−花粉アレルゲンエキス（ヒカゲミズ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ））
受粉後ヒカケミズ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ）から採取したヒカゲミズ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ）花粉を、３〜５℃にて３時間、撹拌を継続しながら、１：４（ｗ／ｖ）の割合の冷アセトンで脱脂する。得られた溶液をブフナー漏斗で濾過し、新しいアセトンで少なくとも３回洗浄した。この工程を終了した後、脱脂エキスを集め、この材料が完全に乾燥しアセトンがすべて除去されるまで、ラミナーフローフードの下で室温にて１２時間乾燥した。
【０１２１】
方法ステップＢにより、脱色花粉アレルゲンエキスを得た。
【０１２２】
最終生成物は、凍結乾燥された脱色エキスからなり、凍結乾燥状態で４℃にて保存する。得られた生成物は、以下の規格を満たさなければならない。
ａ．水に可溶な生成物であること、
ｂ．２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、天然エキスと同様のタンパク質プロフィールであること、
ｃ．免疫ブロットで測定した場合、天然エキスと同様のアレルゲンプロフィールであること、
ｄ．天然エキスと同様のタンパク質含量であること、
ｅ．天然エキスと同様の主要アレルゲン含量であること、
ｆ．天然エキスと同様の生物活性であること。
0005969922.tif 000006
【０１２３】
実施例５−ダニアレルゲンエキス（ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ））
ダニアレルゲンエキスは、ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）の成熟培養物から方法ステップＢにより得た。
【０１２４】
最終生成物は、凍結乾燥された脱色エキスからなり、凍結乾燥状態で４℃にて保存する。得られた生成物は、以下の規格を満たさなければならない。
ａ．水に可溶な生成物であること、
ｂ．２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、天然エキスと同様のタンパク質プロフィールであること、
ｃ．免疫ブロットで測定した場合、天然エキスと同様のアレルゲンプロフィールであること、
ｄ．天然エキスと同様のタンパク質含量であること、
ｅ．天然エキスと同様の主要アレルゲン含量であること、
ｆ．天然エキスと同様の生物活性であること。
【０１２５】
主要アレルゲン含量
ヤケヒョウヒダニ（Ｄ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）における主要アレルゲン含量（Ｄｅｒ  ｐ  １およびＤｅｒ  ｐ  ２）をＩｎｄｏｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈキットを用いて測定する。抗Ｄｅｒ  ｐ  １および／または抗Ｄｅｒ  ｐ  ２のモノクローナルＩｇＧ抗体をポリスチレンマイクロタイターウェル（ＮＵＮＣ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ）にコーティングする（Ｄｅｒ  ｐ  １については１ｍｇ／ｍｌ、Ｄｅｒ  ｐ  ２については２ｍｇ／ｍｌで調製したバイアルから１：１０００）。標準曲線は、定量化および標準化されたユニバーサル標準（２５００ｎｇ／ｍｌのＤｅｒ  ｐ  １および１０００ｎｇ／ｍｌのＤｅｒ  ｐ  ２を含有するＷＨＯ／ＩＵＩＳヤケヒョウヒダニ（Ｄ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）リファレンスに対してサブ標準化された）を用いて作成する。対照曲線の希釈溶液は、Ｄｅｒ  ｐ  １については２５０〜０．４９ｎｇ／ｍｌ、Ｄｅｒ  ｐ  ２については１００〜０．２ｎｇ／ｍｌである。ダニ試料は通常２倍希釈である。プレートを洗浄した後、希釈アレルゲン標準および試料を１００μｌ加え、室温で１時間インキュベートする。プレートを洗浄した後、１／１０００希釈の二次抗体（ビオチン化モノクローナルＩｇＧ抗体）を１００μｌ加え、室温で１時間インキュベートする。プレートを洗浄した後、１／１０００希釈のストレプトアビジンペルオキシダーゼを１００μｌ加え、室温で３０分間インキュベートする。最後に、プレートを洗浄し、１／１０００希釈の３０％Ｈ２Ｏ２（すなわち１０μｌ／１０ｍｌ  ＡＢＴＳ）を含有する７０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ４．２中の１ｍＭ  ＡＢＴＳを１００μｌ加えて発色させ、４０５ｎｍの光学密度が２．０〜２．４に到達したとき読み取る。
0005969922.tif 000007
【０１２６】
実施例６−ブタクサアレルゲンエキス（アシ（Ｐｈｒａｇｍｉｔｅｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ））
受粉後アシ（Ｐｈｒａｇｍｉｔｅｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）から採取したアシ（Ｐｈｒａｇｍｉｔｅｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）花粉を、３〜５℃にて３時間、撹拌を継続しながら、１：４（ｗ／ｖ）の割合の冷アセトンで脱脂する。得られた溶液をブフナー漏斗で濾過し、新しいアセトンで少なくとも３回洗浄した。この工程を終了した後、脱脂エキスを集め、この材料が完全に乾燥しアセトンがすべて除去されるまで、ラミナーフローフードの下で室温にて１２時間乾燥した。
【０１２７】
方法ステップＢ〜Ｄにより、脱色重合アシ（Ｐｈｒａｇｍｉｔｅｓ）アレルゲンエキスを得た。
ステップＤでは、重合工程は、エキス１ｍｌ当たりグルタルアルデヒド０．０１５ｍｌの割合を用いて、グルタルアルデヒドを添加することからなる。
【０１２８】
最終生成物は、凍結乾燥された脱色重合アシエキスからなり、凍結乾燥状態で４℃にて保存する。得られた生成物は、以下の規格を満たさなければならない。
ａ．水に可溶な生成物であること、
ｂ．１００ｋＤａ未満の分子量を有する非重合アレルゲン／タンパク質を含まないこと（非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥによるバンドとして同定）、
ｃ．１００ｋＤａ未満の分子量を有するＩｇＥ認識バンドを含まないこと（非還元条件の免疫ブロットによる同定）、
ｄ．１００ｋＤａ未満の分子量を有する重合分子を含まないこと（ＨＰＬＣを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによる測定）、
ｅ．天然エキスに対して、遊離アミノ基が減少（７５％）していること（フルオレサミン法による測定）、
ｆ．天然エキスに対して、生物学的効力が顕著に低下していること（感作個体に由来する血清の特定プールを用いる、ＩｇＥ  ＥＬＩＳＡ阻害実験による測定）、
ｇ．マウスにおいて異常毒性がないこと。
【０１２９】
脱色／重合残渣を含むペレットは、天然エキス、脱色エキスおよび脱色／重合エキスの特徴づけにおける対照として利用した（表７ａおよび７ｂを参照のこと）。
0005969922.tif 000008
0005969922.tif 000009
【０１３０】
実施例７ネコ上皮アレルゲンエキス
ネコの毛を、３〜５℃にて７時間にわたり毎時５分間撹拌した後、１：４０（ｗ／ｖ）の割合の冷アセトンで脱脂する。脱脂は、撹拌せずに少なくとも１６時間継続した。得られた溶液をブフナー漏斗で濾過し、フレークを保持した。ネコの毛を、室温で１時間、同じアセトンで再度脱脂し、これを２回繰り返した。得られたフレークを集め、この材料が完全に乾燥しアセトンがすべて除去されるまで、ラミナーフローフードの下で室温にて１５時間乾燥した。
【０１３１】
ステップＢでは、ネコの毛から得られた乾燥脱脂皮膚フレーク材料を秤量し、１：４０の割合でＰＢＳ  ０．０１Ｍ／ＮａＣｌ  ０．１５Ｍの中に入れ、３〜５℃で４時間、マグネチックスターラで撹拌しながら抽出する。
方法ステップＢ〜Ｄにより、脱色重合ネコアレルゲンエキスを得た。
【０１３２】
最終生成物は、凍結乾燥された脱色重合ネコ上皮エキスからなり、凍結乾燥状態で４℃にて保存する。得られた生成物は、以下の規格を満たさなければならない。
ａ．水に可溶な生成物であること、
ｂ．天然エキスに対して、遊離アミノ基が減少（７５％）していること（フルオレサミン法による測定）、
ｃ．天然エキスに対して、生物学的効力が顕著に低下していること（感作個体に由来する血清の特定プールを用いる、ＩｇＥ  ＲＥＩＮＡ拮抗実験による測定）、
ｄ．主要アレルゲンＦｅｌ  ｄ  １が検出されること、モノクローナル抗体、
ｅ．マウスにおいて異常毒性がないこと。
【０１３３】
主要アレルゲン含量
主要アレルゲンＦｅｌ  ｄ  １含量はＩｎｄｏｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈキットを用いて測定する。抗Ａｍｂ  ａ  １モノクローナルＩｇＧ１抗体をコーティングする（１ｍｇ／ｍｌで調製したバイアルから１：１０００）。標準曲線は、１０００ｎｇ  Ｆｅｌ  ｄ  １／ｍｌを含有するユニバーサルアレルゲン標準を用いて作成する。二次抗体は、ネコ上皮アレルゲンに対して産生されたモノクローナル抗体ＩｇＧ１ビオチン化抗体からなる。天然試料および脱色試料を２５０ｎｇ／ｍｌに希釈する。これらの値を用いて、重合エキス中の主要アレルゲン含量を計算する。
【０１３４】
脱色／重合残渣を含むペレットは、天然エキス、脱色エキスおよび脱色／重合エキスの特徴づけにおける対照として利用した（表８を参照のこと）。
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【０１３５】
実施例８オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）アレルゲンエキス
受粉後オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）から採取したオオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）花粉を、３〜５℃にて３時間、撹拌を継続しながら、１：４（ｗ／ｖ）の割合の冷アセトンで脱脂する。得られた溶液をブフナー漏斗で濾過し、新しいアセトンで少なくとも３回洗浄した。この工程を終了した後、脱脂ピーナッツエキスを集め、この材料が完全に乾燥しアセトンがすべて除去されるまで、ラミナーフローフードの下で室温にて１２時間乾燥した。
【０１３６】
方法ステップＢ〜Ｄにより、脱色重合オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）アレルゲンエキスを得た。
ステップＤでは、重合工程は、エキス１ｍｌ当たりグルタルアルデヒド０．００９ｍｌの割合を用いて、グルタルアルデヒドを添加することからなる。
【０１３７】
最終生成物は、凍結乾燥された脱色重合オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）エキスからなり、凍結乾燥状態で４℃にて保存する。得られた生成物は、以下の規格を満たさなければならない。
ａ．水に可溶な生成物であること、
ｂ．１００ｋＤａ未満の分子量を有する非重合アレルゲン／タンパク質を含まないこと（非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥによるバンドとして同定）、
ｃ．１００ｋＤａ未満の分子量を有するＩｇＥ認識バンドを含まないこと（非還元条件の免疫ブロットによる同定）、
ｄ．１００ｋＤａ未満の分子量を有する重合分子を含まないこと（ＨＰＬＣを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによる測定）、
ｅ．天然エキスに対して、遊離アミノ基が減少（７５％）していること（フルオレサミン法による測定）、
ｆ．天然エキスに対して、生物学的効力が顕著に低下していること（感作個体に由来する血清の特定プールを用いる、ＩｇＥ  ＥＬＩＳＡ阻害実験による測定）、
ｇ．マウスにおいて異常毒性がないこと。
【０１３８】
主要アレルゲン含量
主要アレルゲンＰｈｌ  ｐ  ５含量は、Ｉｎｄｏｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈキットを用いて測定する。抗Ｐｈｌ  ｐ  ５モノクローナルＩｇＧ１抗体をコーティングする（２ｍｇ／ｍｌで調製したバイアルから１：１０００）。標準曲線は組換えＰｈｌ  ｐ  ５ａを用いて作成する。二次抗体は、オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）アレルゲンに対して産生されたモノクローナル抗体ＩｇＧ１ビオチン化抗体からなる。天然試料および脱色試料を２５０ｎｇ／ｍｌに希釈する。これらの値を用いて、重合エキス中の主要アレルゲン含量を計算する。
【０１３９】
脱色／重合残渣を含むペレットは、天然エキス、脱色エキスおよび脱色／重合エキスの特徴づけにおける対照として利用した（表９を参照のこと）。
0005969922.tif 000011
【０１４０】
参照文献
１．Ｖｉｃｋｅｒｙ，  Ｂ．，  Ｂｕｒｋｓ，  Ｗ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｆｏｏｄ  ａｌｌｅｒｇｙ：  ｆｏｃｕｓ  ｏｒａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００９；  ９：３６４−３７０．
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５．Ｈｏｆｍａｎｎ，  Ａ．Ｍ．，  Ｓｃｕｒｌｏｃｋ，  Ａ．Ｍ．，  Ｊｏｎｅｓ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｐａｌｍｅｒ，  Ｋ．Ｐ．，  Ｌｏｋｈｎｙｇｉｎａ，  Ｙ．，  Ｓｔｅｅｌｅ，  Ｐ．Ｈ．，  Ｋａｍｉｌａｒｉｓ，  Ｊ．，  Ｂｕｒｋｓ，  Ａ．Ｗ．  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ａ  ｐｅａｎｕｔ  ｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ｐｅａｎｕｔ  ａｌｌｅｒｇｙ．  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００９  Ｍａｙ  ２６．
６．Ｊｏｎｅｓ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｐｏｎｓ，  Ｌ．，  Ｒｏｂｅｒｔｓ，  Ｊ．Ｌ．，  Ｓｃｕｒｌｏｃｋ，  Ａ．Ｍ．，  Ｐｅｒｒｙ，  Ｔ．Ｔ．，  Ｋｕｌｉｓ，  Ｍ．，  Ｓｈｒｅｆｆｌｅｒ，  Ｗ．Ｇ．，  Ｓｔｅｅｌｅ，  Ｐ．，  Ｈｅｎｒｙ，  Ｋ．Ａ．，  Ａｄａｉｒ，  Ｍ．，  Ｆｒａｎｃｉｓ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｄｕｒｈａｍ，  Ｓ．，  Ｖｉｃｋｅｒｙ，  Ｂ．Ｐ．，  Ｚｈｏｎｇ，  Ｘ．，  Ｂｕｒｋｓ，  Ａ．Ｗ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｅａｎｕｔ  ｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００９  Ａｕｇ；  １２４（２）：２９２−３００，  ３００．
７．Ｃｌａｒｋ，  Ａ．Ｔ．，  Ｉｓｌａｍ，  Ｓ．，  Ｋｉｎｇ，  Ｙ．  Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｏｒａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒｅ  ｐｅａｎｕｔ  ａｌｌｅｒｇｙ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  ２００９  Ａｕｇ；  ６４（８）：１２１８−２０．
８．Ｗａｌｌａｃｅ  ＤＶ．  Ｐｅｔ  ｄａｎｄｅｒ  ａｎｄ  ｐｅｒｅｎｎｉａｌ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｒｈｉｎｉｔｉｓ：  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｐｔｉｏｎｓ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｐｒｏｃ．  ２００９  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；  ３０（６）：５７３−８３．
９．Ｌｉｎｇ  Ｍ，  Ｌｏｎｇ  ＡＡ  Ｐｅｔ  ｄａｎｄｅｒ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ−ｔｏ−ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｓｔｈｍａ：  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｐｔｉｏｎｓ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｐｒｏｃ．  ２０１０  Ｓｅｐ；  ３１（５）：３８５−９１．
１０．Ｇｒｏｅｎｌｕｎｄ  Ｈ，  Ｓａａｒｎｅ  Ｔ，  Ｇａｆｖｅｌｉｎ  Ｇ，  ｖａｎ  Ｈａｇｅ  Ｍ．  Ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｃａｔ  ａｌｌｅｒｇｅｎ，  Ｆｅｌ  ｄ  １，  ｉｎ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１０；１５１（４）：２６５−７４．  Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｏｃｔ  ２２．  Ｒｅｖｉｅｗ．
【０１４１】
参照ウェブサイト
ｉ．  Ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ  Ａｌｌｅｒｇｅｎ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｓｕｂ−Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ．  Ｌｉｓｔ  ｌａｓｔ  ｕｐｄａｔｅ  ２１  ｏｆ  Ｊｕｌｙ  ２００９．
0005969922.tif 000012