(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
【化１】
0006051167.tif 000016
（式中、Ｒは下記式（Ｉ）である）
【化２】
0006051167.tif 000017
で表されるヒドロキシメチルフルフラール誘導体。
【請求項２】
請求項１に記載のヒドロキシメチルフルフラール誘導体を有効成分とする医薬品。
【請求項３】
一般式
【化３】
0006051167.tif 000018
（式中、Ｒは下記式（Ｉ）、
【化４】
0006051167.tif 000019
又は（ＩＶ）水素原子である）で表されるヒドロキシメチルフルフラール誘導体を有効成分とする熱ショックタンパク質誘導剤。
【請求項４】
一般式
【化５】
0006051167.tif 000020
（式中、Ｒは下記式（Ｉ）、
【化６】
0006051167.tif 000021
又は（ＩＶ）水素原子である）で表されるヒドロキシメチルフルフラール誘導体を有効成分とする抗ストレス剤。
【請求項５】
一般式
【化７】
0006051167.tif 000022
（式中、Ｒは下記式（Ｉ）、
【化８】
0006051167.tif 000023
又は（ＩＶ）水素原子である）で表されるヒドロキシメチルフルフラール誘導体を有効成分とする自律神経調節剤。
【請求項６】
アスパラガス茎を熱水加熱処理する工程を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載のヒドロキシメチルフルフラール誘導体の製造方法。
【請求項７】
アスパラガス茎に水を１〜５０倍量加え、５０〜３００℃で、大気圧下又は加圧下で、２０〜１８０分間熱水加熱処理することでアスパラガス茎を熱水加熱処理する工程を含む、
ことを特徴とする一般式
【化９】
0006051167.tif 000024
（式中、Ｒは（ＩＶ）水素原子である）で表されるヒドロキシメチルフルフラール誘導体の製造方法。
【請求項８】
酵素処理する工程をさらに含む、請求項６又は７に記載のヒドロキシメチルフルフラール誘導体の製造方法。  
【請求項９】
３０〜６０℃の温度で、１〜７２時間、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ及びプルラナーゼからなる群より選択される少なくとも１つの酵素を用いて酵素処理する、
ことを特徴とする請求項８に記載のヒドロキシメチルフルフラール誘導体の製造方法。
【請求項１０】
アスパラガス茎に水を１〜５０倍量加え、５０〜３００℃で、大気圧下又は加圧下で、２０〜１８０分間熱水加熱処理することで得られたアスパラガス茎熱水加熱処理物を有効成分とする熱ショックタンパク質誘導剤。
【請求項１１】
アスパラガス茎に水を１〜５０倍量加え、５０〜３００℃で、大気圧下又は加圧下で、２０〜１８０分間熱水加熱処理することで得られたアスパラガス茎熱水加熱処理物を有効成分とする抗ストレス剤。
【請求項１２】
アスパラガス茎に水を１〜５０倍量加え、５０〜３００℃で、大気圧下又は加圧下で、２０〜１８０分間熱水加熱処理することで得られたアスパラガス茎熱水加熱処理物を有効成分とする自律神経調節剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒドロキシメチルフルフラール誘導体、医薬品、熱ショックタンパク質誘導剤、抗ストレス剤、自律神経調節剤、飲食品、及びヒドロキシメチルフルフラール誘導体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
長時間の労働、様々な肉体的及び精神的ストレス環境等に曝される現代人において、多くの人が、健康診断等の検査を行っても異常が認められないにもかかわらず、食欲不振、不眠、めまい、冷や汗等の身体的症状、又は人間不信、情緒不安定、イライラ、抑うつ気分等の精神的症状を訴えている。このような不定愁訴を伴う症状は、自律神経失調症と診断されることが多い。このような自律神経失調症に対しては通常、抗不安薬、ホルモン剤等の薬物療法、食事療法、運動等による生活習慣の改善等により対処しているのが現状である。【０００３】
過度のストレス負荷により、上述のような自律神経失調症をはじめとした自律神経障害が誘発されることが知られている。自律神経障害においては、交感神経と副交感神経との均衡（自律神経のバランス）の乱れ、自律神経の活動度の低下等がみられる。自律神経のバランスの乱れとは、交感神経が優位である状態、又は副交感神経が優位である状態を意味する。また、自律神経の活動度の低下により、ストレス対処能力が低下することが知られている。例えば、消化管の働きは主に副交感神経に支配されているため、ストレス負荷により交感神経の緊張が持続すると、消化管の働きが抑制され、食欲不振、便秘等の胃腸障害が引き起こされる。また、ストレス負荷により副交感神経がうまく機能せずに交感神経の活動が亢進され続けると、不眠が引き起こされると考えられている。【０００４】
上述のように、ストレスと自律神経障害との間には密接な関連性が存在する一方で、ストレス負荷によらない自律神経障害もまた存在する。また、ストレス負荷は必ずしも自律神経障害を引き起こすわけではなく、他の身体的症状を誘発する場合もある。【０００５】
ストレスタンパク質と呼ばれるタンパク質のひとつに、熱ショックタンパク質（以下、ＨＳＰ）がある。ＨＳＰは、分子量が数万〜１５万程度のタンパク質であり、分子量によりいくつかのファミリーに分類されている（ＨＳＰ１０、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ４０、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ１１０等）。ＨＳＰは、生体が物理的、化学的、生理的又は精神的ストレスを受けた場合に、細胞内に誘導されるタンパク質の一群である。ＨＳＰは具体的には、生体が、熱、細菌感染、炎症、活性酸素、紫外線、飢餓、低酸素状態等の様々なストレス条件に曝された際に発現が亢進されて、細胞を保護する役割を有する。また、タンパク質の折りたたみ（フォールディング）の制御、異常タンパク質の凝集抑制といった分子シャペロンとしての機能をも有する。【０００６】
ＨＳＰの中でも特にＨＳＰ７０については、盛んに研究がなされており、消化管や皮膚等の多くの臓器に恒常的に発現していること等が報告されている。近年、ＨＳＰ７０の抗細胞死作用及び抗炎症作用が認められ、多様なストレスに対する細胞保護効果が報告されている（非特許文献１〜４）。このため、ＨＳＰ７０誘導活性物質を医薬品、化粧品等に応用しようとする研究が行われるようになった。天然物由来のＨＳＰ７０誘導活性物質に関しては、芍薬の主成分であるペオニフロリンが報告されている（非特許文献５）。【０００７】
アスパラガスは、日本においては北海道をはじめ各地で栽培及び収穫される野菜である。アスパラガスは、種々の生理活性を有することが見出されている。特許文献１には、アスパラガス茎抽出物が、各種の疲労（肉体的疲労、精神的ストレスによる疲労等）に対する予防及び回復効果を有することが記載されている。また、特許文献２には、アスパラガス茎抽出物が脳機能改善効果を有することが記載されている。さらに、特許文献３には、アスパラガス擬葉抽出物が自律神経調整効果を有することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−４５７５０号公報
【特許文献２】特開２００７−２３０８７０号公報
【特許文献３】特開２０１１−１５３１２５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｘｉａｏ−Ｒｏｎｇ  Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ；１３（３２）：４３５５−４３５９（２００７）
【非特許文献２】Ｓａｒａｈ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２２，３８３６−３８４５（２００８）
【非特許文献３】Ｈｉｒａｔａ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ；７９（４）：２４３−５０（２００９）
【非特許文献４】Ｔａｄａｓｈｉ  Ｎｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ；４６（１）：４３−５１（２０１０）
【非特許文献５】Ｄａｉ  Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｅｓｓ＆Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ；９（４），３７８−３８９（２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、抗ストレス効果、及び自律神経調節効果に関与するアスパラガス抽出物又はアスパラガス処理物中の成分については、今まで報告がなされていなかった。【００１１】
本発明者らは、アスパラガス熱水加熱処理物由来の新規のヒドロキシメチルフルフラール誘導体を見出し、並びに該ヒドロキシメチルフルフラール誘導体が優れたＨＳＰ誘導活性、抗ストレス効果及び自律神経調節効果を有することを見出し、本発明を完成した。本発明は、新規のヒドロキシメチルフルフラール誘導体、優れた効果を有する医薬品、ＨＳＰ誘導剤、抗ストレス剤、及び自律神経調節剤を提供することを目的とする。また、優れたＨＳＰ誘導活性、抗ストレス効果及び自律神経調節効果を有する飲食品を提供することを目的とする。さらに、低コスト化が可能でありかつ簡便なヒドロキシメチルフルフラール誘導体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係るヒドロキシメチルフルフラール誘導体は、
一般式
【化１】
0006051167.tif 000002
（式中、Ｒは下記式（Ｉ）、
【化２】
0006051167.tif 000003
（ＩＩ）ＨＯＯＣＣＨ２ＣＯＣＯ−、（ＩＩＩ）ＨＯＯＣＣＨ２ＣＨ２ＣＯＣＯ−、及び（ＩＶ）水素原子からなる群より選択される）で表される。【００１３】
前記ヒドロキシメチルフルフラール誘導体は、アスパラガス茎を熱水加熱処理することにより得られてもよい。【００１４】
本発明の第２の観点に係る医薬品は、前記ヒドロキシメチルフルフラール誘導体を有効成分とする。【００１５】
本発明の第３の観点に係る熱ショックタンパク質誘導剤は、前記ヒドロキシメチルフルフラール誘導体を有効成分とする。【００１６】
本発明の第４の観点に係る抗ストレス剤は、前記ヒドロキシメチルフルフラール誘導体を有効成分とする。【００１７】
本発明の第５の観点に係る自律神経調節剤は、前記ヒドロキシメチルフルフラール誘導体を有効成分とする。【００１８】
本発明の第６の観点に係る飲食品は、前記熱ショックタンパク質誘導剤、前記抗ストレス剤、又は前記自律神経調節剤を含有する、ことを特徴とする。【００１９】
本発明の第７の観点に係るヒドロキシメチルフルフラール誘導体の製造方法は、アスパラガス茎を熱水加熱処理する工程を含む、ことを特徴とする。【００２０】
前記製造方法は、酵素処理する工程をさらに含んでいてもよい。【００２１】
本発明の第８の観点に係る熱ショックタンパク質誘導剤は、アスパラガス茎熱水加熱処理物を有効成分とする。【００２２】
本発明の第９の観点に係る抗ストレス剤は、アスパラガス茎熱水加熱処理物を有効成分とする。【００２３】
本発明の第１０の観点に係る自律神経調節剤は、アスパラガス茎熱水加熱処理物を有効成分とする。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、新規のヒドロキシメチルフルフラール誘導体、優れた効果を有する医薬品、ＨＳＰ誘導剤、抗ストレス剤、及び自律神経調節剤を提供することができる。また、優れたＨＳＰ誘導活性、抗ストレス効果及び自律神経調節効果を有する飲食品を提供することができる。さらに、低コスト化が可能でありかつ簡便なヒドロキシメチルフルフラール誘導体の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ヒドロキシメチルフルフラール誘導体によるＨＳＰ７０  ｍＲＮＡ発現誘導活性を示す図である。
【図２】ヒドロキシメチルフルフラール、アスパラガス茎熱水加熱処理物、及び酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物によるＨＳＰ７０  ｍＲＮＡ発現誘導活性を示す図である。
【図３】ヒドロキシメチルフルフラール、アスパラガス茎熱水加熱処理物、及び酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物によるＨＳＰ７０タンパク質発現誘導活性を示す図である。
【図４】マウス断眠モデルにおける、アスパラガス茎熱水加熱処理物投与による血清中過酸化脂質量の変化を示す図である。
【図５】マウス断眠モデルにおける、アスパラガス茎熱水加熱処理物投与による血中コルチコステロン濃度の変化を示す図である。
【図６】マウス断眠モデルにおける、アスパラガス茎熱水加熱処理物投与による脱毛発現率の変化を示す図である。
【図７】マウス断眠モデルの胃における、アスパラガス茎熱水加熱処理物投与によるＨＳＰ７０タンパク質発現量の変化を示す図である。
【図８】マウス断眠モデルの肝臓における、アスパラガス茎熱水加熱処理物投与によるＨＳＰ７０タンパク質発現量の変化を示す図である。
【図９】マウス断眠モデルの腎臓における、アスパラガス茎熱水加熱処理物投与によるＨＳＰ７０タンパク質発現量の変化を示す図である。
【図１０】ヒトにおける、アスパラガス茎熱水加熱処理物投与によるＨＳＰ７０  ｍＲＮＡ発現量の変化を示す図である。
【図１１】ヒトにおける、アスパラガス茎熱水加熱処理物投与による自律神経バランスの変化を示す図である。
【図１２】ヒトにおける、アスパラガス茎熱水加熱処理物投与による自律神経活動度の変化を示す図である。
【図１３】ヒトにおける、酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物投与によるＨＳＰ７０  ｍＲＮＡ発現量の変化を示す図である。
【図１４】ヒトにおける、酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物投与による自律神経バランスの変化を示す図である。
【図１５】ヒトにおける、酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物投与による自律神経活動度の変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００２７】
（１．ヒドロキシメチルフルフラール誘導体）
本発明によるヒドロキシメチルフルフラール誘導体は、下記一般式で表される。
【化３】
0006051167.tif 000004
【００２８】
上記一般式中、Ｒは、下記式（Ｉ）
【化４】
0006051167.tif 000005
、（ＩＩ）ＨＯＯＣＣＨ２ＣＯＣＯ−、及び（ＩＩＩ）ＨＯＯＣＣＨ２ＣＨ２ＣＯＣＯ−、及び（ＩＶ）水素原子からなる群より選択される。
【００２９】
Ｒが上記式（Ｉ）である場合、ヒドロキシメチルフルフラール誘導体は下記構造式で表される。
【００３０】
【化５】
0006051167.tif 000006
【００３１】
Ｒが上記式（Ｉ）である場合、ヒドロキシメチルフルフラール誘導体は下記の２つの立体異性体を含む（Ｒ体及びＳ体）。
【化６】
0006051167.tif 000007
【００３２】
Ｒが上記（ＩＶ）水素原子である場合、ヒドロキシメチルフルフラール誘導体は下記構造式で表される（化合物名：ヒドロキシメチルフルフラール）。
【００３３】
【化７】
0006051167.tif 000008
【００３４】
本発明によるヒドロキシメチルフルフラール誘導体は、以下に示すように、アスパラガス茎を熱水加熱処理することにより得られてもよい。
【００３５】
本発明によるヒドロキシメチルフルフラール誘導体は、以下に示すように、優れた熱ショックタンパク質誘導活性、抗ストレス効果及び自律神経調節効果を有する。
【００３６】
（２．ヒドロキシメチルフルフラール誘導体の製造方法）
本発明によるヒドロキシメチルフルフラール誘導体の製造方法は、アスパラガス茎を熱水加熱処理する工程を含む。
【００３７】
本明細書において、「熱水加熱処理する」とは、熱水中で加熱処理することを意味する。本発明で用いられるアスパラガス茎としては、例えば、グリーンアスパラガス、ホワイトアスパラガス、ムラサキアスパラガス等の茎部を用いることができる。また、アスパラガスの産地は特に限定されず、国産品のアスパラガスを用いてもよく、又は輸入品のアスパラガスを用いてもよい。本発明の効果を奏するアスパラガスであれば、適宜選択され得る。
【００３８】
アスパラガス茎を熱水加熱処理する工程は、例えば、アスパラガス茎に１〜５０倍量の水を加え、２０〜１８０分間、熱水中で加熱することにより行われる。この際の温度は、例えば、５０〜３００℃が好ましい。大気圧下で熱水加熱処理を行う場合には、例えば、１００℃以上の温度が好ましい。なお、加圧下で熱水加熱処理を行ってもよく、例えば、０．１〜０．２ＭＰａの圧力（オートクレーブを用いる場合には、例えば、０．１２ＭＰａ）が好ましい。
【００３９】
上述のようにアスパラガス茎を熱水加熱処理することにより、本発明によるヒドロキシメチルフルフラール誘導体が得られる。このように、本発明によるヒドロキシメチルフルフラール誘導体の製造方法は、アスパラガス茎を熱水加熱処理する工程を含む。該製造方法においては、野菜として広く流通しているアスパラガスの茎部を用いるため、安価にヒドロキシメチルフルフラール誘導体を製造することができる。また、高度な技術、特別な装置等を用いることなく、アスパラガスを熱水加熱処理することで、簡便にヒドロキシメチルフルフラール誘導体を製造することができる。さらに、食材であるアスパラガスを熱水加熱処理するため、該製造方法により得られたヒドロキシメチルフルフラール誘導体は安全性が高いといえ、熱水加熱によりアスパラガス茎を滅菌することもできる。なお、本発明の効果を奏する熱水加熱処理方法であれば、適宜選択され得る。
【００４０】
本発明によるヒドロキシメチルフルフラール誘導体の製造方法は、熱水加熱処理する工程の効率を高め、ヒドロキシメチルフルフラール誘導体を効率的に製造する目的で、下記に例示される付加的な工程をさらに含んでいてもよい。
【００４１】
上記付加的な工程として、例えば、熱水加熱処理前における、アスパラガス茎を細断する工程が挙げられ得る。アスパラガス茎を、例えば、０．５〜１０ｃｍ程度の大きさに細断することができる。細断においては、例えば、ナイフ、カッター等を用いて手作業で行ってもよいし、細断機、ミル等の機械を用いてもよい。本発明の効果を奏する細断方法であれば、適宜選択され得る。
【００４２】
上記付加的な工程として、例えば、熱水加熱処理前における、アスパラガス茎を圧搾する工程が挙げられ得る。アスパラガス茎を、例えば、圧搾機を用いて圧搾することができる。本発明の効果を奏する圧搾方法であれば、適宜選択され得る。
【００４３】
上記付加的な工程として、例えば、植物組織を崩壊させる等の目的のために、熱水加熱処理する工程の前又は後に、酵素処理する工程が挙げられる。酵素処理することで、熱水加熱処理する工程の効率をより高め、ヒドロキシメチルフルフラール誘導体をより効率的に製造することができる。例えば、アスパラガス茎中の繊維質、ペクチン等を効率的に分解させる目的で、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プルラナーゼ等の酵素、又はこれらの酵素の２若しくは３以上の組み合わせが好適に用いられる。本発明の効果を奏する酵素であれば、適宜選択され得る。酵素処理する工程においては、用いる酵素に対して最も適する添加量、温度及び反応時間が選択され得る。セルラーゼを用いる場合、例えば、０．１〜５％（ｗ／ｗ）のセルラーゼ添加量にて、３０〜６０℃の温度で、１〜７２時間、酵素処理を行うことができる。酵素処理する工程は、熱水加熱処理する工程の前に行ってもよいし、熱水加熱処理する工程の後に行ってもよい。なお、アスパラガス茎中のセルロースをより効率的に分解させて、ヒドロキシメチルフルフラール誘導体をより効率的に製造する観点から、熱水加熱処理する工程の後にセルラーゼにより酵素処理することが好ましい。本発明の効果を奏する酵素処理方法であれば、適宜選択され得る。
【００４４】
上記付加的な工程として、例えば、熱水加熱処理後における、残渣を機械的に粉砕する工程が挙げられる。粉砕においては、例えば、ミル、ミキサー等の機械を用いてもよい。本発明の効果を奏する粉砕方法であれば、適宜選択され得る。
【００４５】
上記付加的な工程として、例えば、熱水加熱処理後における、遠心分離又は濾過する工程が挙げられる。これらの工程をさらに含むことで、効率的に残渣を除去して加熱処理液を得ることができる。遠心分離は、例えば、回転数３，０００〜７，０００ｒｐｍ、４〜５０℃で行われ得る。濾過においては、例えば、市販の濾紙、濾布等が用いられ得る。本発明の効果を奏する遠心分離方法又は濾過方法であれば、適宜選択され得る。
【００４６】
上記付加的な工程として、例えば、熱水加熱処理後における、得られた加熱処理液を減圧下で濃縮する工程が挙げられる。濃縮は、例えば、エバポレーター等を用いて行うことができる。本発明の効果を奏する濃縮方法であれば、適宜選択され得る。
【００４７】
上記付加的な工程として、例えば、熱水加熱処理後における、加熱処理液を噴霧乾燥又は凍結乾燥させる工程が挙げられる。噴霧乾燥は、例えば、排風温度７０〜９０℃、チャンバー温度８０〜１００℃で行われ得る。本発明の効果を奏する噴霧乾燥方法又は凍結乾燥方法であれば、適宜選択され得る。
【００４８】
アスパラガス茎を熱水加熱処理する工程に、上記に例示された付加的な工程をさらに含むことで、より効率的にヒドロキシメチルフルフラール誘導体を製造することができる。本発明の効果を奏する付加的な工程であれば、適宜選択され得る。
【００４９】
アスパラガス茎を熱水加熱処理する工程について、以下に例示する。アスパラガス茎を０．５〜１０ｃｍ程度に細断し、水を１〜５０倍量加える。５０〜１００℃で、又は１２１℃の加圧下で、２０〜１８０分間熱水加熱処理を行う。放冷後、０．１〜５％（ｗ／ｗ）のセルラーゼを添加し、３０〜６０℃で、１〜７２時間、酵素処理を行う。その後、残渣を機械的に粉砕し、回転数３，０００〜７，０００ｒｐｍ、４〜５０℃で遠心分離を行うことで上清を得る。その後、該上清を排風温度７０〜９０℃、チャンバー温度８０〜１００℃で噴霧乾燥する。
【００５０】
本明細書において「アスパラガス茎熱水加熱処理物」とは、アスパラガス茎を熱水中で加熱処理し、その後、遠心分離、濾過等により残渣を除去し、濃縮したものをいう。また、本明細書において「酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物」とは、熱水加熱処理する工程の前又は後に、前述の通り酵素処理する工程を経て得られたアスパラガス茎熱水加熱処理物を意味する。アスパラガス茎熱水加熱処理物及び酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物には、有効成分として、前述のヒドロキシメチルフルフラール誘導体が、例えば、少なくとも０．０５％以上含有される。
【００５１】
本発明による製造方法により得られたヒドロキシメチルフルフラール誘導体については、例えば、アスパラガス茎熱水加熱処理物を水又は有機溶媒（メタノール等）に溶解させ、逆相用担体（例えば、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ−２０（製品名）（三菱化学社製）等）のオープンカラムクロマトグラフィーに付することができる。また、例えば、ゲル濾過用担体（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（製品名）（ファルマシアファインケミカル社製）等）によって分画することもできる。さらに、上述の方法で溶出された所定の画分を、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって単離することにより、精製することができる。
【００５２】
特定の理論に縛られることを望むものではないが、上述のようにアスパラガス茎を熱水加熱処理することにより、アスパラガス茎由来の有機酸と糖類とが高温下で反応し、本発明によるヒドロキシメチルフルフラール誘導体が得られると考えられる。有機酸としては、例えば、ピログルタミン酸、α−ケトグルタル酸、オキザロ酢酸等が例示される。一方、糖類としては、例えば、フルクトース、グルコース、スクロース、マンノース等が例示される。
【００５３】
例えば、アスパラガス茎を熱水加熱処理する工程において、アスパラガス茎由来のピログルタミン酸とフルクトースとが、高温下で反応し、以下の化合物が得られると考えられる。
【化８】
0006051167.tif 000009
【００５４】
本発明によるヒドロキシメチルフルフラール誘導体の製造方法においては、上述に例示されるような有機酸と糖類とを含有するアスパラガス以外の植物を適宜用いることができる。例えば、ピログルタミン酸とフルクトースとを含有する野菜を好適に用いることができる。例えば、キャベツ、ブロッコリー、カボチャ、タマネギ、ニンニク、ニンジン等の野菜が好適に用いられ得る。本発明の効果を奏する植物であれば、適宜選択され得る。
【００５５】
（３．ＨＳＰ誘導剤、抗ストレス剤、及び自律神経調節剤）
本発明により、有効成分として本発明によるヒドロキシメチルフルフラール誘導体を含有するＨＳＰ誘導剤、抗ストレス剤、及び自律神経調節剤が提供される。
【００５６】
本発明によるＨＳＰ誘導剤は、生体内又は生体外に存在するＨＳＰを誘導するために用いられ得る。ここでいうＨＳＰとは、例えば、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ４０、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ１１０等であり、好ましくはＨＳＰ７０である。ＨＳＰ誘導活性については、例えば、細胞に該ＨＳＰ誘導剤を添加して培養し、既知の方法により、ＨＳＰ  ｍＲＮＡの発現誘導活性、ＨＳＰタンパク質の発現誘導活性等を測定することにより評価することができる。本発明の効果を奏する評価方法であれば、適宜選択され得る。
【００５７】
本発明による抗ストレス剤は、生体に投与することにより、抗ストレス効果を得ることができる。抗ストレス効果は、例えば、哺乳動物に該抗ストレス剤を投与し、投与前後の酸化ストレス指標、血中ストレスホルモン濃度等を測定することにより評価することができる。本発明の効果を奏する評価方法であれば、適宜選択され得る。
【００５８】
本発明による自律神経調節剤は、生体に投与することにより、自律神経調節効果を得ることができる。自律神経調節効果は、例えば、哺乳動物に該自律神経調節剤を投与し、投与前後の自律神経バランス、自律神経活動度等を測定することにより評価することができる。本発明の効果を奏する評価方法であれば、適宜選択され得る。
【００５９】
また本発明により、アスパラガス茎熱水加熱処理物を有効成分として含有するＨＳＰ誘導剤、抗ストレス剤、及び自律神経調節剤もまた提供される。該アスパラガス茎熱水加熱処理物は、前述の通り、アスパラガス茎を熱水加熱処理することにより得られる。したがって、該アスパラガス茎熱水加熱処理物中には、本発明によるヒドロキシメチルフルフラール誘導体が含有される。
【００６０】
（４．飲食品及び医薬品）
本発明により、本発明によるＨＳＰ誘導剤、抗ストレス剤、及び自律神経調節剤を含有する飲食品が提供される。該飲食品は、常法により、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ゲル状、クリーム状、ペースト状、懸濁液状、水溶液状、乳液状、粉末状等の飲食用に適した形態に加工することができる。また、飲食品中に通常用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、増粘剤、保存剤、安定化剤、ｐＨ調整剤等を添加することができる。さらに、味質の改善のために、本発明の効果を損なわない範囲で、糖類、糖アルコール類、塩類、油脂類、アミノ酸類、有機酸類、グリセリン等を添加することができる。なお、既存の飲食品に、本発明によるＨＳＰ誘導剤、抗ストレス剤、及び自律神経調節剤を含有させて用いる場合、ベースとなる飲食品としては、本発明の効果を奏することのできる飲食品であれば、適宜選択され得る。
【００６１】
本発明によるＨＳＰ誘導剤、抗ストレス剤、及び自律神経調節剤を飲食品として用いる場合、例えば、アスパラガス茎熱水加熱処理物（又は酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物）換算で５０ｍｇ〜２０００ｍｇ／日、好ましくは１００ｍｇ〜１０００ｍｇ／日摂取することにより、所望のＨＳＰ誘導活性、抗ストレス効果、及び自律神経調節効果を得ることができる。摂取量については、摂取の目的、飲食品の形態等に基づき適宜選択され得る。
【００６２】
本発明による飲食品は、抗ストレス効果、及び自律神経調節効果の両方を有する。したがって、ストレス負荷による自律神経障害に対して、抗ストレス効果及び自律神経調節効果の相乗作用により、より高い効果を奏することが期待される。また、ストレス負荷によらない自律神経障害に対しても、自律神経調節効果を奏することが期待される。
【００６３】
本発明によるＨＳＰ誘導剤、抗ストレス剤、及び自律神経調節剤は、医薬品として用いることができる。本発明による医薬品は、有効成分として前述のヒドロキシメチルフルフラール誘導体を含有する。この場合、常法により、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤等の剤型に調製することができる。また、医薬品中に通常用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、増粘剤、保存剤、安定化剤、ｐＨ調整剤等を添加することができる。投与方法については、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、舌下投与等、本発明の効果を奏する範囲で適宜選択され得る。
【００６４】
本発明によるＨＳＰ誘導剤、抗ストレス剤、及び自律神経調節剤を医薬品として用いる場合、例えば、アスパラガス茎熱水加熱処理物（又は酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物）換算で５０ｍｇ〜２０００ｍｇ／日、好ましくは１００ｍｇ〜１０００ｍｇ／日で投与することにより、所望のＨＳＰ誘導活性、抗ストレス効果、及び自律神経調節効果を得ることができる。投与量については、投与の目的、剤型、患者の年齢、体重等に基づき適宜選択され得る。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００６６】
（実施例１）
（アスパラガス茎熱水加熱処理によるヒドロキシメチルフルフラールの製造）
グリーンアスパラガス茎（新鮮重１．５ｋｇ）に水１．５Ｌを加え、熱水加熱処理する目的で、オートクレーブを用いて加圧滅菌し（１２１℃、２０分間）、その後、濾布で濾過し、得られた液をエバポレーターにて減圧下で濃縮して加熱処理物を得た。得られた加熱処理物をカラムクロマトグラフィー（製品名：ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ−２０、三菱化学社製；５００ｍＬ、溶出；Ｈ２Ｏ、５０％メタノール、１００％メタノール）により分画し１．７ｇを得た。次に、得られた分画物を分取用ＨＰＬＣ（製品名：Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｌ−７１００、日立社製）により精製し、化合物（Ｘ）（５．０ｍｇ）を得た。カラムは製品名：ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ  １２０、２０φ×２５０ｍｍ（資生堂社製）を使用し、移動相は、表１の通りであった（Ａ：Ｈ２Ｏ、Ｂ：メタノール）。分取用ＨＰＬＣの流速は、８ｍＬ／分であり、紫外吸光度検出器により検出波長２８０ｎｍで検出した。【００６７】
【表１】
0006051167.tif 000010
【００６８】
上述により得られた化合物（Ｘ）のＮＭＲデータを以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）
δ  ４．４９  （１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ）
５．５９  （１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ）
６．５５  （１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ）
７．４８  （１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ）
９．５２  （１Ｈ，ｓ）【００６９】
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）
δ  ５５．９
１０９．７
１２４．５
１５１．７
１６２．１
１７８．０【００７０】
上述で得られた化合物（Ｘ）の構造を確定するため、市販品のヒドロキシメチルフルフラール（製品名：５−Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−２−ｆｕｒａｌｄｅｈｙｄｅ、東京化成販売株式会社）のＮＭＲデータと化合物（Ｘ）のそれとを比較した。以下に市販品のヒドロキシメチルフルフラールのＮＭＲデータを示す。【００７１】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）
δ  ４．５１  （１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ）
５．５９  （１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ）
６．６０  （１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ）
７．４９  （１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ）
９．５６  （１Ｈ，ｓ）【００７２】
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）
δ  ５５．９
１０９．７
１２４．４
１５１．７
１６２．１
１７７．９【００７３】
上述で得られた化合物（Ｘ）のＮＭＲデータと市販品のそれが一致したため、化合物（Ｘ）は、ヒドロキシメチルフルフラール（下記構造式）であることがわかった。以上より、アスパラガス茎熱水加熱処理物中に、ヒドロキシメチルフルフラールが含まれることが明らかとなった。
【化９】
0006051167.tif 000011
【００７４】
（実施例２）
（アスパラガス茎熱水加熱処理による新規のヒドロキシメチルフルフラール誘導体の製造）
グリーンアスパラガス茎（新鮮重１．０ｋｇ）に水１Ｌを加え、熱水加熱処理する目的で、オートクレーブを用いて加圧滅菌し（１２１℃、２０分間）、その後、濾布で濾過し、得られた液をエバポレーターにて減圧下で濃縮してアスパラガス茎熱水加熱処理物を得た。得られた加熱処理物をカラムクロマトグラフィー（製品名：ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ−２０、三菱化学社製；５００ｍＬ、溶出；Ｈ２Ｏ、３０％メタノール、１００％メタノール）により分画した。次に、得られた分画物７２３．８ｍｇをカラムクロマトグラフィー（製品名：Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０、ファルマシアファインケミカル社製；２５０ｍＬ、溶出；Ｈ２Ｏ）により精製した。さらに、得られた分画物１２．６ｍｇを分取用ＨＰＬＣ（製品名：Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｌ−７１００、日立社製）により精製し、化合物（Ｙ）（２．０ｍｇ）を得た。分取用ＨＰＬＣの条件は、実施例１と同様であった。【００７５】
上述により得られた化合物（Ｙ）をＨＰＬＣ分析（製品名：Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｌ−７１００、日立社製）した結果、リテンションタイムは２２．９９分であった。この分析用ＨＰＬＣにおいて、カラムは製品名：ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ  １２０、４．６φ×２５０ｍｍ（資生堂社製）を使用し、移動相は、表２の通りであった（Ｃ：２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．３）、Ｄ：アセトニトリル）。分析用ＨＰＬＣの流速は、１ｍＬ／分であり、紫外吸光度検出器により検出波長２８０ｎｍで検出した。【００７６】
【表２】
0006051167.tif 000012
【００７７】
上述により得られた化合物（Ｙ）のＬＣ／Ｔｏｆ  ＭＳ分析データを以下に示す。
実測値  ｍ／ｚ  ２３８．０７１０（［Ｍ＋Ｈ］＋）；Ｃ１１Ｈ１２ＮＯ５
理論値  ｍ／ｚ  ２３８．０７１５（［Ｍ＋Ｈ］＋）；Ｃ１１Ｈ１２ＮＯ５
以上から、上述により得られた化合物（Ｙ）はＣ１１Ｈ１１ＮＯ５の分子式を有することが明らかとなった。【００７８】
上述により得られた化合物（Ｙ）の１Ｈ−ＮＭＲデータを以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）
δ  ２．００  （４Ｈ，ｍ）
４．２０  （１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．９，９．２Ｈｚ）
５．２０  （２Ｈ，ｓ）
６．５５  （１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ）
７．３７  （１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ）
９．４５  （１Ｈ，ｓ）【００７９】
（実施例３）
（新規のヒドロキシメチルフルフラール誘導体の合成）
実施例２において得られた化合物（Ｙ）（Ｃ１１Ｈ１１ＮＯ５）は、アスパラガス茎由来のピログルタミン酸（Ｃ５Ｈ７ＮＯ３）とフルクトース（Ｃ６Ｈ１２Ｏ６）とが加熱下で反応したことにより生成したと予想された。このことを検証するために、ピログルタミン酸及びフルクトースを用いて以下の方法で化合物を合成した。なお、化合物（Ｙ）は下記の通り立体異性体の存在が考えられるため、Ｌ−ピログルタミン酸を出発物質としたＳ（Ｌ）体、及びＤ−ピログルタミン酸を出発物質としたＲ（Ｄ）体をそれぞれ合成した。【００８０】
【化１０】
0006051167.tif 000013
【００８１】
Ｌ−ピログルタミン酸（製品名：Ｌ−ピログルタミン酸、東京化成販売株式会社）３．０ｇとＤ−フルクトース（製品名：Ｄ（−）−フルクトース、純正化学株式会社）１．５ｇとを三角フラスコ内で混合し、オートクレーブを用いて加圧加熱処理（１２１℃、２０分間）した。得られた反応物を、カラムクロマトグラフィー（製品名：ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ−２０、三菱化学社製；１５０ｍＬ、溶出；Ｈ２Ｏ、３０％メタノール、１００％メタノール）により分画した。さらに、１００％メタノール画分をカラム（製品名：ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ  １２０、２０φ×２５０ｍｍ、資生堂社製）を用いた分取用ＨＰＬＣにより精製し、Ｓ体の化合物（Ｚ）（２４．４ｍｇ）を得た。分取用ＨＰＬＣの条件は、実施例１と同様であった。【００８２】
Ｄ−ピログルタミン酸（製品名：Ｄ−ピログルタミン酸、東京化成販売株式会社）２．０ｇとＤ−フルクトース（製品名：Ｄ（−）−フルクトース、純正化学株式会社）１．０ｇとを三角フラスコ内で混合し、オートクレーブを用いて加圧加熱処理（１２１℃、２０分間）した。得られた反応物を、カラムクロマトグラフィー（製品名：ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ−２０、三菱化学社製；１００ｍＬ、溶出；Ｈ２Ｏ、３０％メタノール、６０％メタノール）により分画した。６０％メタノール画分をエバポレーターにて減圧下で約５０ｍＬまで濃縮し、その後、酢酸エチル（５０ｍＬ×５）で分液した。酢酸エチル層をエバポレーターにて減圧下で濃縮し、カラムクロマトグラフィー（製品名：ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ−２０、三菱化学社製；１０ｍＬ、溶出；Ｈ２Ｏ、３０％メタノール、６０％メタノール）により分画した。６０％メタノール画分をエバポレーターにて減圧下で濃縮し、Ｒ体の化合物（Ｚ）（２４．６ｍｇ）を得た。【００８３】
上述により得られたＳ体、Ｒ体の化合物（Ｚ）をＨＰＬＣ分析（製品名：Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｌ−７１００、日立社製）した結果、リテンションタイムはそれぞれ２２．８９分であった。分析用ＨＰＬＣの条件は、実施例２と同様であった。【００８４】
上述により得られたＳ体、Ｒ体の化合物（Ｚ）について、ＭＳ、ＮＭＲ分析データを以下に示す。
ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ２３７
ＥＩ−ＨＲ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ２３７．０６１２；Ｃ１１Ｈ１１ＮＯ５【００８５】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）：Ｓ体
δ  ２．３３  （４Ｈ，ｍ）
４．３４  （１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．９，９．０Ｈｚ）
５．５１  （２Ｈ，ｓ）
６．７３  （１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ）
７．３８  （１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ）
９．５７  （１Ｈ，ｓ）【００８６】
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）：Ｓ体
δ  ２５．８
３０．２
５７．０
５９．６
１１４．０
１２４．０
１５４．５
１５６．７
１７３．４
１７９．６
１８１．１【００８７】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）：Ｒ体
δ  ２．３３  （４Ｈ，ｍ）
４．３４  （１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．９，９．０Ｈｚ）
５．２７  （２Ｈ，ｓ）
６．７３  （１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ）
７．３８  （１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ）
９．５７  （１Ｈ，ｓ）【００８８】
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）：Ｒ体
δ  ２５．８
３０．３
５７．０
５９．６
１１３．７
１２４．０
１５４．５
１５６．８
１７３．４
１７９．６
１８１．１【００８９】
実施例２で得られた化合物（Ｙ）の絶対構造を決定するため、実施例２で得られた化合物（Ｙ）と、上述により得られたＳ体の化合物（Ｚ）、Ｒ体の化合物（Ｚ）をキラルカラム（製品名：ＣＨＩＲＡＬ  ＰＡＫ  ＩＡ、４．６φ×１５０ｍｍ、ダイセル社製）を用いてＨＰＬＣ分析（製品名：Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｌ−７１００、日立社製）を行った。カラム以外の分析用ＨＰＬＣ条件は、実施例２と同様であった。その結果、Ｓ体の化合物（Ｚ）のリテンションタイムは１８．９２分、Ｒ体の化合物（Ｚ）のリテンションタイムは２０．５７分であった。実施例２で得られた化合物（Ｙ）のリテンションタイムは１９．０６分であったことから、実施例２で得られた化合物（Ｙ）はＳ体であることが明らかとなった。【００９０】
実施例２におけるＨＰＬＣ分析データ、ＬＣ／Ｔｏｆ  ＭＳ分析データ及び１Ｈ−ＮＭＲデータと、本実施例における上述の分析データと、を比較すると、実施例２により得られた化合物（Ｙ）と本実施例により得られた化合物（Ｚ）とは、同一の化合物であることが示された。したがって、実施例２で得られたアスパラガス茎熱水加熱処理物中に、少なくとも、以下の構造式を有するヒドロキシメチルフルフラール誘導体のＳ体が含まれることが明らかとなった。【００９１】
【化１１】
0006051167.tif 000014
【００９２】
（実施例４）
（ＨＳＰ７０  ｍＲＮＡ発現誘導活性の評価）
市販品のヒドロキシメチルフルフラール（実施例１と同様）（以下、サンプル１という）、実施例３で合成されたヒドロキシメチルフルフラール誘導体のＳ体（以下、サンプル２−Ｓという）及び同ヒドロキシメチルフルフラール誘導体のＲ体（以下、サンプル２−Ｒという）、並びに以下の方法で製造されたアスパラガス茎熱水加熱処理物（以下、サンプル３という）、及び酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物（以下、サンプル４という）のＨＳＰ７０誘導活性を、ＨＳＰ７０のｍＲＮＡ発現レベルを測定することにより評価した。【００９３】
以下に、サンプル３の製造方法を示す。グリーンアスパラガス茎（新鮮重６．６３ｋｇ）に水２８．５Ｌを加え、熱水加熱処理する目的で、加圧滅菌（１２１℃、２０分）を行った。冷却後、濾紙（製品名：東洋濾紙５Ａ、東洋濾紙社製）で濾過し、エバポレーターにて濃縮を行った。濃縮液約１０Ｌに賦形剤（製品名：パインデックス、松谷化学工業社製）２７５．４ｇを添加し、凍結乾燥してアスパラガス茎熱水加熱処理物含有粉末５４２．４ｇ（このうち、アスパラガス茎固形分由来のアスパラガス茎熱水加熱処理物２６７．０ｇ、賦形剤２７５．４ｇ）を得た。【００９４】
以下に、サンプル４の製造方法を示す。グリーンアスパラガス茎（新鮮重１２ｋｇ）に水２４Ｌを加え、熱水加熱処理する目的で、加圧滅菌（１２１℃、２０分）を行った。４５℃まで放冷後、スクラーゼＣ（製品名）（三菱化学フーズ社製）２０ｇ及びマセロチームＡ（製品名）（ヤクルト薬品工業社製）２０ｇを添加し、４５℃で３日間酵素処理を行った。その後、加圧滅菌（１２１℃、２０分）し、濾布で濾過し、濾液３５Ｌを回収した。エバポレーターにより９Ｌの容量となるまで濃縮した。この濃縮液に賦形剤（製品名：パインデックス、松谷化学工業社製）１．２０ｋｇを添加し、再度、加圧滅菌（１２１℃、２０分）した。その後、凍結乾燥して酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物含有粉末２．１２ｋｇ（このうち、アスパラガス茎固形分由来の酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物０．９２ｋｇ、賦形剤１．２０ｋｇ）を得た。【００９５】
まず、サンプル１、サンプル２−Ｓ、及びサンプル２−Ｒについて、ヒト前骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０細胞）を用いてＨＳＰ７０  ｍＲＮＡ発現レベルを評価した。【００９６】
以下に、ヒト前骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０細胞）を用いたＨＳＰ７０  ｍＲＮＡ発現レベルの評価法を示す。ＨＬ−６０（提供元：大日本製薬）を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（製品名：ＭｕｌｔｉＳｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｔｒａｃｅ社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（製品名：ＲＰＭＩ１６４０培地「ニッスイ」（２）粉末、日水製薬株式会社製）に懸濁し、１．５ｍＬサンプリングチューブ内に移した（５０万個／１ｍＬ／チューブ）。同時に終濃度１ｍｇ／ｍＬとなるように、イオン交換水で調製した各サンプル（サンプル１、サンプル２−Ｓ、及びサンプル２−Ｒ）を０．１ｍＬ添加した。コントロールには、イオン交換水０．１ｍＬを添加した。３７℃、５％ＣＯ２存在下で４時間培養後、細胞を３，０００ｒｐｍで回収し、ｍＲＮＡ検出用に供した。これから、ＴＲＩｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（ライフテクノロジーズ社製）を使用してトータルＲＮＡを抽出し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（サーモサイエンティフィック社製）で濃度を測定した。ｃＤＮＡ合成キット（製品名：ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｒｅｍｏｖｅｒ、東洋紡ライフサイエンス社製）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。逆転写後の反応液を３ｎｇ／μＬになるようにＮｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ水で希釈し、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲの鋳型とした。【００９７】
ＰＣＲにおいては、プライマーとして、ＨＳＰ７０  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１）、及びＨＳＰ７０  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号２）を使用した。ＨＳＰ７０遺伝子の発現を補正する内部標準遺伝子としてｂｅｔａ  ２  ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ遺伝子を用い、そのプライマーとして、ｂｅｔａ  ２  ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号３）、及びｂｅｔａ  ２  ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４）を使用した。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲは反応キット（製品名：ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ、バイオラッドラボラトリーズ社製）でリアルタイムＰＣＲ解析システム（製品名：ＣＦＸ  Ｃｏｎｎｅｃｔ、バイオラッドラボラトリーズ社製）により行った。トータル１０μＬのＰＣＲ反応液を９５℃で３分間インキュベート（初期変性）し、その後９５℃で１秒の変性、５９℃で１０秒のアニーリングを４０サイクル繰り返した。【００９８】
上記のリアルタイムＰＣＲ解析システムにより得られたＣｑ値を用い、以下の計算式に基づいてＨＳＰ７０遺伝子の発現量比を算出した（ΔΔＣｔ法）。なお、Ｃｑ値は、遺伝子の増幅反応において、増幅された遺伝子がある一定量に達した時の反応サイクル数を表す。
コントロールのＨＳＰ７０のＣｑ値：Ａ
コントロールのＢ２ＭのＣｑ値：Ｂ
サンプルのＨＳＰ７０のＣｑ値：Ｃ
サンプルのＢ２ＭのＣｑ値：Ｄ
ΔＣｑ（コントロール）＝Ａ−Ｂ
ΔＣｑ（サンプル）＝Ｃ−Ｄ
Δ（ΔＣｑ）＝ΔＣｑ（サンプル）−ΔＣｑ（コントロール）
発現量比＝２−Δ（ΔＣｑ）【００９９】
結果を図１に示す。図１においては、サンプル１、サンプル２−Ｓ、及びサンプル２−ＲのＨＳＰ７０  ｍＲＮＡ発現誘導活性を、コントロールのそれに対する割合（％）として表す。サンプル１、２−Ｓ及び２−Ｒでは、コントロールに比べ、ＨＳＰ７０  ｍＲＮＡ発現が約３〜９倍増強された（サンプル２−Ｓ，２−Ｒ、＊＊ｐ＜０．０１  ｖｓ  コントロール、サンプル１、＊ｐ＝０．０６９  ｖｓ  コントロール）。このことから、ヒドロキシメチルフルフラール、並びに以下の構造式を有するヒドロキシメチルフルフラール誘導体のＳ体及びＲ体は、ＨＳＰ７０誘導活性を有することがｍＲＮＡ発現レベルで明らかとなった。【０１００】
【化１２】
0006051167.tif 000015
【０１０１】
次に、サンプル１、サンプル３、及びサンプル４について、ヒト子宮頸がん細胞（ＨｅＬａ細胞）を用いてＨＳＰ７０  ｍＲＮＡ発現レベルを評価した。【０１０２】
ヒト子宮頸がん細胞（ＨｅＬａ細胞）（提供元：独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター）を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（製品名：ＭｕｌｔｉＳｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｔｒａｃｅ社製）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（製品名：ダルベッコ変法イーグル培地「ニッスイ」２粉末、日本製薬社製）に懸濁し、６穴プレートに播種した（２０万個／２ｍＬ／ｗｅｌｌ）。翌日、フレッシュなＤＭＥＭ（１．８ｍＬ）に交換し、各々終濃度１ｍｇ／ｍＬ（サンプル３及び４については、アスパラガス茎固形分由来のアスパラガス茎熱水加熱処理物及び酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物の終濃度として１ｍｇ／ｍＬ）となるように、イオン交換水で調製した各サンプルを０．２ｍＬ添加した。コントロールには、イオン交換水０．２ｍＬを添加した。２２時間培養後、細胞をセルスクレーバーで剥がし、ｍＲＮＡ検出用に供した。これから、ＲＮＡ抽出キット（製品名：Ｆａｓｔ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ  ｋｉｔ、タカラバイオ社製）を使用してトータルＲＮＡを抽出し、ＤＥＰＣ処理水で１００倍に希釈後、分光光度計で吸光度（波長２６０ｎｍ）を測定した。ＲＮＡ濃度は、吸光度（波長２６０ｎｍ）×４０×希釈倍率＝ＲＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ）の計算式を用いて算出した。ＲＮＡ溶液をＴＥ緩衝液で任意の濃度に希釈し、ｃＤＮＡ合成キット（製品名：Ｐｒｉｍｅ  Ｓｃｒｉｐｔ  １ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ、タカラバイオ社製）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。プライマーにはＯｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒ（製品名）（タカラバイオ社製）を使用した。逆転写後の反応液を１０ｎｇ／μＬになるようにＴＥ緩衝液で希釈し、ＰＣＲの鋳型とした。【０１０３】
ＰＣＲにおいては、プライマーとして、ＨＳＰ７０  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号５）、及びＨＳＰ７０  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号６）を使用した。ＨＳＰ７０遺伝子の発現を補正する内部標準遺伝子としてｂｅｔａ  ２  ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ遺伝子を用い、そのプライマーとして、ｂｅｔａ  ２  ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号３）、及びｂｅｔａ  ２  ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４）を使用した。ＰＣＲにはＰＣＲ酵素（製品名：ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ、タカラバイオ社製）を使用した。トータル２０μＬのＰＣＲ反応液を９４℃で１分間インキュベート（初期変性）し、その後９４℃で３０秒の変性、５７℃（ＨＳＰ７０）又は５９℃（ｂｅｔａ  ２  ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の伸長を３２サイクル（ＨＳＰ７０）又は２４サイクル（ｂｅｔａ  ２  ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）繰り返した。最後に７２℃で３０秒の伸長反応を行い、すべてのＰＣＲを終了した。ＰＣＲ反応液は常法により電気泳動した後、エチジウムブロマイドにより染色した。【０１０４】
ＡｌｐｈａＶｉｅｗ（製品名）（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ社製）にて紫外線照射下の蛍光強度を測定することで、ＨＳＰ７０遺伝子の発現量を測定した。この際、内部標準遺伝子の発現量により補正した値をＨＳＰ７０遺伝子の発現量とした。【０１０５】
結果を図２に示す。図２においては、サンプル１、３及び４のＨＳＰ７０  ｍＲＮＡ発現誘導活性を、コントロールのそれに対する割合（％）として表す。サンプル１、３及び４では、コントロールに比べ、ＨＳＰ７０  ｍＲＮＡ発現が約１．２〜１．５倍増強された（サンプル１，４、＊＊ｐ＜０．０１  ｖｓ  コントロール、サンプル３、＊ｐ＜０．０５  ｖｓ  コントロール）。このことから、ヒドロキシメチルフルフラール、本実施例によるアスパラガス茎熱水加熱処理物、及び酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物は、ＨＳＰ７０誘導活性を有することがｍＲＮＡ発現レベルで明らかとなった。【０１０６】
（実施例５）
（ＨＳＰ７０タンパク質発現誘導活性の評価）
実施例４と同様のサンプル１、３及び４のＨＳＰ７０誘導活性を、ＨＳＰ７０タンパク質発現レベルを測定することにより評価した。【０１０７】
実施例４と同様にＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ添加）に懸濁させたＨｅＬａ細胞を、１２穴プレートに播種した（１０万個／ｍＬ／ｗｅｌｌ）。翌日、フレッシュなＤＭＥＭ（０．９ｍＬ）に交換し、各々終濃度１ｍｇ／ｍＬ（サンプル３及び４については、アスパラガス茎固形分由来のアスパラガス茎熱水加熱処理物及び酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物の終濃度として１ｍｇ／ｍＬ）となるように、イオン交換水で調製した各サンプルを０．１ｍＬ添加した。コントロールには、イオン交換水０．１ｍＬを添加した。２４時間培養後、培養上清を除去し、ＰＢＳ（−）（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２）で洗浄した。その後、一部の細胞をセルスクレーバーで剥がし、１．５ｍＬサンプルチューブに回収して、ＨＳＰ７０タンパク質定量及びトータルタンパク質定量用に供した。【０１０８】
ＨＳＰ７０タンパク質の定量についてはＨＳＰ７０  ＥＬＩＳＡキット（製品名）（Ｅｎｚｏ社製）、トータルタンパク質の定量についてはＭｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔキット（製品名）（ＰＩＥＲＣＥ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて行った。残りの細胞に関しては、３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｔｈｉａｌ−２−ｙｌ）−２，  ５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚａｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）法により細胞増殖に与える影響を評価した。その後、トータルタンパク質量及び生細胞数で補正した値をＨＳＰ７０タンパク質量とした。【０１０９】
結果を図３に示す。図３においては、サンプル１、３及び４のＨＳＰ７０タンパク質発現誘導活性を、コントロールのそれに対する割合（％）として表す。サンプル１、３及び４では、コントロールに比べ、ＨＳＰ７０タンパク質発現が約１．３倍増強された（＊ｐ＜０．０５  ｖｓ  コントロール）。このことから、ヒドロキシメチルフルフラール、本実施例によるアスパラガス茎熱水加熱処理物、及び酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物は、ＨＳＰ７０誘導活性を有することがタンパク質発現レベルで明らかとなった。【０１１０】
以上より、ヒドロキシメチルフルフラール、本実施例によるアスパラガス茎熱水加熱処理物、及び酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物は、優れたＨＳＰ７０誘導活性を有することが示された。【０１１１】
（実施例６）
（マウス断眠モデルにおける抗ストレス効果の評価）
マウス断眠モデルを使用して、実施例４で得られたアスパラガス茎熱水加熱処理物（実施例４における“サンプル３”）の抗ストレス効果を評価した。【０１１２】
６週齢の雄性Ｓｌｃ：ｄｄＹマウス（日本クレア社製）３２匹を４群に分けた（各群８匹）。各々、ノーマル群、コントロール群、低用量アスパラガス茎熱水加熱処理物群（以下、低用量群という）、及び高用量アスパラガス茎熱水加熱処理物群（以下、高用量群という）とした。断眠ストレスを負荷する７日前から、低用量群のマウスには２００ｍｇ／ｋｇ（アスパラガス茎固形分由来のアスパラガス茎熱水加熱処理物換算）の用量で、高用量群のマウスには１０００ｍｇ／ｋｇ（同換算）の用量で、アスパラガス茎熱水加熱処理物含有粉末を通常粉末餌（製品名：ＣＥ−２、日本クレア社製）に添加して毎日給餌した。ノーマル群、コントロール群には通常粉末餌を与えた。コントロール群、低用量群、及び高用量群には、３日間にわたって、１日１２時間（８：００〜２０：００）マウスを水浸させることにより、断眠ストレスを負荷した。ノーマル群には、断眠ストレスを負荷しなかった。【０１１３】
抗ストレス効果について、最後の断眠ストレス負荷日の翌日のマウスにおいて、（１）酸化ストレス指標としての血清中過酸化脂質量（血清トリグリセライド（ＴＧ）量に対する過酸化脂質（ＬＰＯ）量比（ＬＰＯ／ＴＧ））の測定、（２）ストレスホルモンとして知られている血中コルチコステロン濃度の測定、及び（３）脱毛マウスの発現率の評価を行うことで検討した。【０１１４】
図４に、血清中過酸化脂質量の測定結果を示す。図中、ＬＰＯ／ＴＧの値が高いほど、血中酸化ストレスが高い状態であることを示す。コントロール群ではＬＰＯ／ＴＧの値が高かったが、低用量群及び高用量群ではノーマル群と同程度までＬＰＯ／ＴＧの値が低くなった（＊ｐ＜０．０５  ｖｓ  コントロール）。このことから、断眠ストレス負荷により血中酸化ストレスが高い状態にあるマウスに、本実施例によるアスパラガス茎熱水加熱処理物を摂取させることにより、血中酸化ストレスが、断眠ストレス負荷の無いレベルにまで低減されることが示された。【０１１５】
図５に、血中コルチコステロン濃度の測定結果を示す。図中、コルチコステロン濃度の値が高いほど、高ストレス状態にあることを示す。コントロール群ではコルチコステロン濃度の値が高かったが、低用量群ではノーマル群と同程度までコルチコステロン濃度の値が低くなり、さらに高用量群ではノーマル群よりもコルチコステロン濃度の値が低くなった（＊＊ｐ＜０．０１  ｖｓ  コントロール、＊ｐ＜０．０５  ｖｓ  コントロール）。このことから、断眠ストレス負荷により高ストレス状態にあるマウスに、本実施例によるアスパラガス茎熱水加熱処理物を摂取させることにより、高ストレス状態が、断眠ストレス負荷の無いレベルにまで、さらに高用量群では該レベル以下に低減されることが示された。【０１１６】
図６に、脱毛マウスの発現率を示す。図中、脱毛発現率が高いほど、高ストレス状態にあることを示す。ノーマル群、コントロール群、低用量群、及び高用量群での脱毛発現率は各々、０％、７５．０％、３７．５％、及び１２．５％であり、低用量群及び高用量群ではコントロール群に比して脱毛発現率が低かった。このことから、断眠ストレス負荷により高ストレス状態にあるマウスに、本実施例によるアスパラガス茎熱水加熱処理物を摂取させることにより、高ストレス状態が低減されることが示された。【０１１７】
以上より、本実施例によるヒドロキシメチルフルフラール誘導体を含有するアスパラガス茎熱水加熱処理物は、優れた抗ストレス効果を有することが示された。【０１１８】
（実施例７）
（マウス断眠モデルにおけるＨＳＰ７０タンパク質発現誘導活性の評価）
実施例６で使用したマウスを用いて、実施例４で得られたアスパラガス茎熱水加熱処理物（実施例４における“サンプル３”）のＨＳＰ７０誘導活性を、胃、肝臓、及び腎臓におけるＨＳＰ７０タンパク質発現レベルを測定することにより評価した。【０１１９】
実施例６における試験最終日に、各群のマウスを屠殺し、胃、肝臓、及び腎臓を各々摘出した。各臓器（５０ｍｇ）を１．５ｍＬのサンプルチューブに入れ、プロテアーゼインヒビターカクテル（製品名）（シグマ社製）を０．２％（ｖ／ｖ）添加したＨＳＰ７０  ＥＬＩＳＡキット（製品名）（Ｅｎｚｏ社製）の抽出試薬５００μＬを加えた。その後、氷上ですりこぎ棒を用いて各臓器をすりつぶし、４℃、１，５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、上清を回収した。この上清をＨＳＰ７０タンパク質の定量及びトータルタンパク質の定量に供した。【０１２０】
実施例５と同様に、ＨＳＰ７０タンパク質の定量についてはＨＳＰ７０  ＥＬＩＳＡキット（製品名）（Ｅｎｚｏ社製）、トータルタンパク質の定量についてはＭｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔキット（製品名）（ＰＩＥＲＣＥ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて行った。トータルタンパク質量で補正した値をＨＳＰ７０タンパク質量とした。【０１２１】
図７〜９に胃、肝臓、及び腎臓におけるＨＳＰ７０タンパク質発現量を示す。図７〜９においては、コントロール群、低用量群、及び高用量群のＨＳＰ７０タンパク質発現誘導活性を、ノーマル群のそれに対する割合（％）として表す。胃（図７）及び肝臓（図８）では、コントロール群ではノーマル群に比してＨＳＰ７０タンパク質発現量が低下していたが、低用量群及び高用量群ではノーマル群と同程度又はそれ以上にＨＳＰ７０タンパク質発現が増強された（＊ｐ＜０．０５  ｖｓ  コントロール）。腎臓（図９）においても、低用量群及び高用量群ではコントロール群に比してＨＳＰ７０タンパク質発現が増強された（＊＊ｐ＜０．０１  ｖｓ  コントロール）。【０１２２】
以上より、本実施例によるヒドロキシメチルフルフラール誘導体を含有するアスパラガス茎熱水加熱処理物は、動物に投与された場合においても、優れたＨＳＰ７０誘導活性を有することがタンパク質発現レベルで明らかとなった。また、実施例６において示された抗ストレス効果の作用機序のひとつが、本実施例によるヒドロキシメチルフルフラール誘導体を含有するアスパラガス茎熱水加熱処理物のＨＳＰ７０発現誘導活性であることが示唆された。【０１２３】
（実施例８）
（ヒトにおけるＨＳＰ７０  ｍＲＮＡ発現誘導活性の評価）
実施例４で得られたアスパラガス茎熱水加熱処理物（実施例４における“サンプル３”）を用いて、ヒト白血球中のＨＳＰ７０誘導活性を、ＨＳＰ７０  ｍＲＮＡ発現レベルを測定することにより評価した。【０１２４】
自主的に参加を表明したボランティア３名を被験者とした（以下、被験者１、被験者２、及び被験者３という）。アスパラガス茎熱水加熱処理物含有粉末を、被験者１は２００ｍｇ／日、被験者２は４００ｍｇ／日、及び被験者３は８００ｍｇ／日の用量で、１日２回（朝及び夕）に分けて、３日間摂取した（該アスパラガス茎熱水加熱処理物含有粉末２００ｍｇ（被験者１）、４００ｍｇ（被験者２）、及び８００ｍｇ（被験者３）中に、アスパラガス茎固形分由来のアスパラガス茎熱水加熱処理物を各々９８ｍｇ、１９７ｍｇ、及び３９４ｍｇ含んでいた）。【０１２５】
摂取開始前及び摂取終了日に採血を行い、白血球中のＨＳＰ７０  ｍＲＮＡ発現量を測定した。血液１ｍＬを３７℃のＡＣＫ緩衝溶液（０．１５Ｍ  塩化アンモニウム、１．０ｍＭ  炭酸水素カリウム、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ、ｐＨ７．２）１０ｍＬに混和し、３７℃で１０分間保温した。その後、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した。沈殿した白血球に再度ＡＣＫ緩衝溶液１０ｍＬを加え、懸濁させた。同様の操作を３回繰り返した後、沈降した白血球にＴｒｉｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（製品名）（ライフテクノロジーズ社）１．５ｍＬを加え、トータルＲＮＡを抽出した。ＰＣＲ反応を含む、この後の操作は実施例４（ＨｅＬａ細胞での評価）と同様に行い、ＨＳＰ７０  ｍＲＮＡの発現量を評価した。【０１２６】
結果を図１０に示す。図１０においては、摂取開始前の白血球中のＨＳＰ７０  ｍＲＮＡ発現量に対する、摂取終了後のそれの割合（％）を表す。摂取終了後の白血球中のＨＳＰ７０  ｍＲＮＡ発現は、摂取開始前に比べて、アスパラガス茎熱水加熱処理物の用量依存的に２．５〜３．５倍程度増強された。【０１２７】
以上より、本実施例によるヒドロキシメチルフルフラール誘導体を含有するアスパラガス茎熱水加熱処理物は、ヒトに投与された場合においても、優れたＨＳＰ７０誘導活性を有することがｍＲＮＡ発現レベルで明らかとなった。【０１２８】
（実施例９）
（アスパラガス茎熱水加熱処理物の自律神経調節効果の臨床的評価）
実施例４で得られたアスパラガス茎熱水加熱処理物（実施例４における“サンプル３”）を用いてヒトにおける自律神経調節効果を評価した。【０１２９】
自主的に参加を表明したボランティア３０名を被験者として、無作為化プラセボコントロール・ダブルブラインド試験を行った。被験者はくじ引きにて、プラセボ群（以下、Ｐ群という）１５名、又はアスパラガス茎熱水加熱処理物群（以下、Ａ群という）１５名に割付けられた。試験期間中４週間にわたって毎日、Ｐ群の被験者は賦形剤（製品名：パインデックス、松谷化学工業社製）（４００ｍｇ／日）を、一方、Ａ群の被験者はアスパラガス茎熱水加熱処理物含有粉末（４００ｍｇ／日）を１日２回（朝及び夕）に分けて服用した（該アスパラガス茎熱水加熱処理物含有粉末４００ｍｇ中、１９７ｍｇがアスパラガス茎固形分由来のアスパラガス茎熱水加熱処理物、残り２０３ｍｇが賦形剤（同上）であった）。【０１３０】
試験開始前と試験終了日に、加速度脈波検査システム（製品名；パルスアナライザープラスＴＡＳ−９、ＹＫＣ社製）を用いて、自律神経バランス及び自律神経活動度を評価した。該システムは、指尖部から加速度脈波を測定することで、心拍微細変化（Ｈｅａｒｔ  Ｒａｔｅ  Ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ：ＨＲＶ）を検知し、自律神経機能を評価するシステムである。ＨＲＶは、自律神経が心拍にもたらす様々な影響に対する臨床的帰結として表される。自律神経バランスについては、該システムによって与えられる交感神経活動に対する指標（Ｌｏｗ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ：ＬＦ）をＸ軸に、副交感神経活動に対する指標（Ｈｉｇｈ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ：ＨＦ）をＹ軸にプロットした二次元グラフにおいて、該グラフ上の最も自律神経バランスが良好である点と、実測値における点と、の間の距離を用いて評価した。一方、自律神経活動度については、該システムによって与えられる自律神経の活動度を示す数値（ＬＦ及びＨＦ等を用いて該システムにより算出される）を用いた。【０１３１】
図１１に、自律神経バランスの変化を示す。図中、数値がゼロに近いほど、自律神経のバランスが良好であることを示す。Ｐ群（プラセボ群）においては、試験開始前に比して試験終了日では自律神経のバランスが悪化していた。一方、Ａ群（アスパラガス茎熱水加熱処理物群）においては、試験開始前に比して試験終了日では自律神経のバランスが有意に改善されていた（＊ｐ＜０．０５  ｖｓ  試験開始前、ｐ＜０．０１  ｖｓ  プラセボ群）。このことから、本実施例によるアスパラガス茎熱水加熱処理物を服用することにより、自律神経のバランスが改善されることが示された。【０１３２】
図１２に、自律神経活動度の変化を示す。図中、数値が高いほど、自律神経活動度が高いことを示す。Ｐ群（プラセボ群）においては、試験開始前に比して試験終了日では自律神経活動度の低下がみられた。一方、Ａ群（アスパラガス茎熱水加熱処理物群）においては、試験開始前に比して試験終了日では自律神経活動度の上昇がみられた。このことから、本実施例によるアスパラガス茎熱水加熱処理物を服用することにより、自律神経活動が改善されることが示された。【０１３３】
以上より、本実施例によるヒドロキシメチルフルフラール誘導体を含有するアスパラガス茎熱水加熱処理物は、優れた自律神経調節効果を有することが示された。【０１３４】
（実施例１０）
（酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物のヒトにおけるＨＳＰ７０  ｍＲＮＡ発現誘導活性評価、及び自律神経調節効果の臨床的評価）
以下の通り得られた酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物充填カプセルを用いて、ヒトにおけるＨＳＰ７０  ｍＲＮＡ発現誘導活性評価、及び自律神経調節効果の臨床的評価を行った。【０１３５】
（酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物充填カプセルの製造法）
以下に、ヒト摂取用の酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物充填カプセルの製造法を示す。グリーンアスパラガス茎（新鮮重１３０ｋｇ）に水１７０Ｌを加え、熱水加熱処理する目的で、加熱殺菌（１００℃、４５分）を行った。４５℃まで放冷後、酵素（スミチームＣ、及びスミチームＭＣ；ヤクルト薬品工業社製）３．０ｋｇを添加し、４５℃で２４時間攪拌を行った。その後、酵素を失活（１００℃、２０分）させ、遠心分離を行った。エバポレーターにより濃縮し、賦形剤（製品名：パインデックス、松谷化学工業社製）９．０ｋｇを添加し、加圧滅菌（１２１℃、４５分）した。その後、スプレードライにより酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物含有粉末１６．０ｋｇ（このうち、アスパラガス茎固形分由来の酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物７．０ｋｇ、賦形剤９．０ｋｇ）を得た。この酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物含有粉末８．５０ｋｇと固結防止剤（製品名：ステアリン酸カルシウム、サンエース社製）１．８６ｋｇ、セルロース（製品名：セオラス、旭化成社製）８．２０ｋｇを混合し、アスパラガス茎固形分由来の酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物を２０％含むカプセル用粉末を調製した。このカプセル用粉末を１号カプセルに１カプセルあたり２８０ｍｇ充填したものを酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物充填カプセルとした。【０１３６】
（評価方法）
自主的に参加を表明したボランティア２０名を被験者として、低用量で短期間の無作為化プラセボコントロール・ダブルブラインド試験を行った。被験者は無作為にプラセボ群（以下、Ｐ群という）１０名、又は酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物群（以下、Ｅ群という）１０名に割付けられた。試験期間中１週間にわたって、毎日、Ｐ群の被験者は偽薬カプセル（製品名：パインデックス（松谷化学工業社製）６９９．９ｍｇ、及び製品名：マルツエキス（オリエンタル工業社製）１４０．１ｍｇの混合物、計８４０ｍｇ（３カプセル）／日）を、一方、Ｅ群の被験者は酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物充填カプセル（８４０ｍｇ（３カプセル）／日）を毎日、夕食後に服用した（該酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物充填カプセル８４０ｍｇ中、１６８ｍｇがアスパラガス茎固形分由来の酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物、残り６７２ｍｇがパインデックス、ステアリン酸カルシウム、及びセオラスであった）。評価項目を、白血球中のＨＳＰ７０  ｍＲＮＡの発現量、自律神経バランス、及び自律神経活動度とした。【０１３７】
（ＨＳＰ７０  ｍＲＮＡ発現誘導活性評価）
はじめに、ヒト白血球中のＨＳＰ７０  ｍＲＮＡ発現レベルを測定した。試験開始前、及び試験終了日に採血を行い、血液４００μＬからＲＮＡ抽出キット（製品名：Ｎｕｃｌｅｏ  Ｓｐｉｎ  ＲＮＡ  Ｂｌｏｏｄ、タカラバイオ社製）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡの合成、及びＰＣＲの方法は、実施例８に記載した方法に準じた。【０１３８】
結果を図１３に示す。図１３においては、摂取開始前の白血球中のＨＳＰ７０  ｍＲＮＡ発現量に対する、摂取終了後のそれの割合（％）を表す。Ｐ群（プラセボ群）のＨＳＰ７０  ｍＲＮＡ発現量は摂取開始前に比べ、平均値で１７５％であった。一方、Ｅ群（酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物群）のＨＳＰ７０  ｍＲＮＡ発現量は摂取開始前に比べ、平均値で２７８％であり、発現が増強されていた（＊ｐ＝０．０９８  ｖｓ  Ｐ群）。このことから、本実施例による酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物を服用することにより、ＨＳＰ７０  ｍＲＮＡの発現量が著しく増強されることが示された。【０１３９】
（自律神経調節効果に関する臨床的評価）
次に、試験開始前と試験終了日に、加速度脈波検査システム（製品名；パルスアナライザープラスＴＡＳ−９、ＹＫＣ社製）を用いて、自律神経バランス、及び自律神経活動度を評価した。測定の詳細は、実施例９に記載した通りである。【０１４０】
図１４に自律神経バランスの変化を示す。Ｐ群（プラセボ群）においては、試験開始前に比較して試験終了日では自律神経バランスが有意に悪化していた（＊ｐ＜０．０５  ｖｓ  試験開始前）。一方、Ｅ群（酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物群）においては、試験開始前に比較して試験終了日では自律神経のバランスが改善されていた。このことから、本実施例による酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物を服用することにより、自律神経のバランスを改善することが示された。【０１４１】
図１５に自律神経活動度の変化を示す。Ｐ群（プラセボ群）においては、試験開始前に比較して試験終了日では自律神経活動度が有意に悪化していた（＊＊ｐ＜０．０１  ｖｓ  試験開始前）。一方、Ｅ群（酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物群）においては、試験開始前に比較して試験終了日では自律神経活動度が改善されていた。このことから、本実施例による酵素処理アスパラガス茎熱水加熱処理物を服用することにより、自律神経活動度の悪化を防ぐことが示された。【０１４２】
以上説明したように、本発明によれば、新規のヒドロキシメチルフルフラール誘導体、優れた効果を有する医薬品、ＨＳＰ誘導剤、抗ストレス剤、及び自律神経調節剤を提供することができる。また、優れたＨＳＰ誘導活性、抗ストレス効果及び自律神経調節効果を有する飲食品を提供することができる。さらに、低コスト化が可能であり簡便なヒドロキシメチルフルフラール誘導体の製造方法を提供することができる。【０１４３】
なお、本発明は、本発明の広義の精神及び範囲を逸脱することなく、様々な実施形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。つまり、本発明の範囲は、実施形態ではなく、請求の範囲によって示される。そして、請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。【０１４４】
本発明は、２０１１年１２月２０日に出願された日本国特許出願２０１１−２７７９２６号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０１１−２７７９２６号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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