(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シート状構造物を安定に搬送する方法であって、下部に位置する第一の液体部と上部に位置する第二の液体部とで形成される液液界面を含む液中において、シート状構造物を前記液液界面かまたは前記第一の液体部に位置させ、前記液液界面を含む液が、シート状構造物が保持された第一の液体部に第二の液体部を加えたものである、前記方法。
【請求項２】
シート状構造物の比重が、第二の液体部の比重よりも大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
シート状構造物が、シート状骨格筋芽細胞培養物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
シート状構造物が保持された第一の液体部が、シート状構造物を保持した第三の液体部から該第三の液体部を除去した後、第一の液体部を、該シート状構造物に加えたものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
シート状構造物を搬送するためのデバイスであって、下部に位置する第一の液体部と液液界面を介して上部に位置する第二の液体部とを含む液および該液を保持する容器からなり、前記第一の液体部を構成する成分は生体適合性であり、前記第一の液体部の比重は前記シート状構造物の比重より低く、シート状構造物が前記第一の液体部中に位置される、前記デバイス。
【請求項６】
シート状構造物が、シート状骨格筋芽細胞培養物である、請求項５に記載のデバイス。
【請求項７】
シート状骨格筋芽細胞培養物を搬送するためのキットであって、シート状骨格筋芽細胞培養物を保持しているか、または保持させるための第一の液体部を収容している第一の部材と、該第一の液体部に加えるとその上部に液液界面を形成する第二の液体部を収容している第二の部材とを含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シート状構造物の搬送方法ならびに搬送用デバイスおよびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の心臓病に対する治療の革新的進歩にかかわらず、重症心不全に対する治療体系は未だ確立されていない。心不全の治療法としては、βブロッカーやＡＣＥ阻害剤による内科治療が行われるが、これらの治療が奏功しないほど重症化した心不全には、補助人工心臓や心臓移植などの置換型治療、つまり外科治療が行われる。
このような外科治療の対象となる重症心不全には、進行した弁膜症や高度の心筋虚血に起因するもの、急性心筋梗塞やその合併症、急性心筋炎、虚血性心筋症（ＩＣＭ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）などによる慢性心不全やその急性憎悪など、多種多様の原因がある。
【０００３】
これらの原因と重症度に応じて弁形成術や置換術、冠動脈バイパス術、左室形成術、機械的補助循環などが適用されるが、この中で、ＩＣＭやＤＣＭによる高度の左室機能低下から心不全を来たしたものについては、心臓移植や人工心臓による置換型治療のみが有効な治療法とされてきた。しかしながら、これら重症心不全患者に対する置換型治療は、慢性的なドナー不足、継続的な免疫抑制の必要性、合併症の発症など解決すべき問題が多く、すべての重症心不全に対する普遍的な治療法とは言い難い。
【０００４】
このような状況から、重症心不全治療の解決策として新しい再生医療の開発が進められている。重症心筋梗塞等においては、心筋細胞が機能不全に陥り、さらに線維芽細胞の増殖、間質の線維化が進行し心不全を呈するようになる。心不全の進行に伴い、心筋細胞は傷害されて細胞死に至るが、心筋細胞は殆ど細胞分裂をおこさないため、心筋細胞数は減少し心機能の低下もさらに進む。このような重症心不全患者に対する心機能回復には細胞移植法が有用とされ、既に自己骨格筋芽細胞による臨床応用が開始されている。
【０００５】
細胞の移植方法としては、細胞の懸濁液を注射器などで直接心筋組織内に注入する手法や、組織工学を応用した温度応答性培養皿を用いて作製したシート状細胞培養物を心臓表面に貼付する手法などが試みられている。シート状細胞培養物を用いる手法は、大量の細胞を広範囲に安全に移植することが可能であり、例えば拡張型心筋症のように心臓全体に病変がある場合の治療にとくに有用である。シート状細胞培養物の製造方法も、種々のものが開発されている（特許文献１）。
【０００６】
このような細胞培養物を臨床応用する場合には、移植用または試験用としての使用が予定されている施設内または外で作製されるかに拘らず、かかる培養物を移植または使用が行われる場所へ安定的に搬送する必要がある。シート状の培養角膜上皮シートや細胞培養物を含む膜組織を安定的に搬送すべく、種々の方法や器具が開発されている（特許文献２および３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００７−５２８７５５号公報
【特許文献２】特開２００３−７０４６０号公報
【特許文献３】特許第４７４９１５５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このような中、本発明者は、シート状の構造物を、液中で安定的に搬送する手段を開発するにあたり、シート状構造物が液中で保持された状態にあっては、搬送時の振動により液面が揺れる結果、シート状構造物が揺動し、その一部や全部が折り畳まれたり破損したりすること、とくに、脆弱なシートの場合、重なってしまった部分を伸展して元の形状に戻すことが極めて困難であるなどの問題に直面した。したがって、本発明の目的は、そのような問題を解決し、シート状構造物を安定して搬送するための方法、デバイス、およびキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を進める中、シート状構造物を液中または液面に保持する液体に、これと液液界面を形成する別の液体を加えることにより、かかるシート状構造物の振動による動作を抑制し、そのシート形状を維持しつつ、安定に搬送することができることを見出し、さらに研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、以下の［１］〜［８］に関する。
［１］シート状構造物を安定に搬送する方法であって、下部に位置する第一の液体部と上部に位置する第二の液体部とで形成される液液界面を含む液中において、シート状構造物を前記液液界面かまたは前記第一の液体部に位置させる、前記方法。
［２］シート状構造物の比重が、第二の液体部の比重よりも大きい、［１］に記載の方法。
［３］シート状構造物が、シート状骨格筋芽細胞培養物である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］液液界面を含む液が、シート状構造物が保持された第一の液体部に第二の液体部を加えたものである、［１］〜［３]のいずれかに記載の方法。
［５］シート状構造物が保持された第一の液体部が、シート状構造物を保持した第三の液体部から該第三の液体部を除去した後、第一の液体部を、該シート状構造物に加えたものである、［４］に記載の方法。
［６］シート状構造物を搬送するためのデバイスであって、下部に位置する第一の液体部と液液界面を介して上部に位置する第二の液体部とを含む液および該液を保持する容器からなり、シート状構造物が前記液液界面かまたは前記第一の液体部に位置される、前記デバイス。
［７］シート状構造物が、シート状骨格筋芽細胞培養物である、［６］に記載のデバイス。
［８］シート状骨格筋芽細胞培養物を搬送するためのキットであって、シート状骨格筋芽細胞培養物を保持しているか、または保持させるための第一の液体部を収容している第一の部材と、該第一の液体部に加えるとその上部に液液界面を形成する第二の液体部を収容している第二の部材とを含む、前記キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、液液界面を介して接触するような少なくとも２種類の液体を用いることにより、脆弱なシート状骨格筋芽細胞培養物などのシート状構造物を液中で安定させることができる。さらに、第二の液体部で第一の液体部に蓋をすることにより、第一の液体部の蒸発を防ぐことができる。
とくに、本発明により、液中に存在するシート状構造物を搬送する際の振動によるシート形状のよれ、しわ、折り畳みなどを防止することができ、物理的に安定させることができる。
さらに、本発明によると、シート状構造物を液中で安定させることができる安価で簡便な方法、デバイス、およびキットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、シート状構造物が第一の液体部および第二の液体部が形成する液液界面に位置する態様を示した図である。
【図２】図２は、シート状構造物が第一の液体部および第二の液体部が形成する液液界面に位置する態様を示した図である。（１）は断面図であり、（２）は上面図である。
【図３】図３は、シート状構造物が第一の液体部および第二の液体部が形成する液液界面に位置する態様を示した図である。（１）は断面図であり、（２）は上面図である。
【図４】図４は、シート状構造物が第一の液体部に位置する態様を示した図である。（１）は断面図であり、（２）は上面図である。
【図５】図５は、１種類（左）または２種類（右）の液体とシート状細胞培養物とを収容するシャーレに振動を与えた後の状態を示した写真図である。
【図６】図６は、１種類（左）または２種類（右）の液体とシート状細胞培養物とを収容するシャーレに振動を与えた後の状態を示した写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の一側面は、シート状構造物を安定に搬送する方法であって、下部に位置する第一の液体部と上部に位置する第二の液体部とで形成される液液界面を含む液中において、シート状構造物を前記液液界面かまたは前記第一の液体部に位置させる、前記方法に関する。
【００１４】
本明細書におけるシート状構造物には、シート形状を有する物体であればとくに限定されないが、例えば、シート状細胞培養物などの、生体由来材料からなる平膜上の膜組織や、プラスチック、紙、織布、不織布、金属、高分子、脂質といった種々の材質のフィルム等が含まれる。これらのうち、液中で難分解性のもの、液中で難崩壊性のものなどが好ましい。シート状構造物は、多角形や円形などであってもよく、幅、厚み、直径などは一様であってもなくてもよい。本発明におけるシート状構造物は、１枚のみを単層の状態で搬送の用に供してもよいし、２枚以上を重ねた積層の状態で搬送の用に供してもよい。後者の場合、積層の各層は互いに連結していても、連結していなくてもよく、連結している場合は、重なり合っている部分が全て連結していても、部分的に連結していてもよい。
【００１５】
本明細書において、シート状細胞培養物とは、細胞が互いに連結してシート状になったものをいい、典型的には１の細胞層からなるものであるが、２以上の細胞層から構成されるものも含む。細胞同士は、直接および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であればとくに限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、とくに、細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。
【００１６】
本明細書におけるシート状細胞培養物は、上記の構造を形成し得る任意の細胞から構成される。かかる細胞の例としては、限定されずに、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞）、心筋細胞、線維芽細胞、滑膜細胞、上皮細胞（例えば、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞）、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、歯根膜細胞、皮膚細胞などが挙げられる。本明細書においては、単層の細胞培養物を形成するもの、例えば、筋芽細胞などが好ましく、とくに好ましくは骨格筋芽細胞である。
【００１７】
細胞は、細胞培養物による治療が可能な任意の生物に由来し得る。かかる生物には、とくに限定されないが、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジなどが含まれる。また、シート状細胞培養物の形成に用いる細胞は１種類のみであってもよいが、２種類以上の細胞を用いることもできる。本発明の好ましい態様において、細胞培養物を形成する細胞が２種類以上ある場合、最も多い細胞の比率（純度）は、細胞培養物製造終了時において、例えば骨格筋芽細胞の場合、６５％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上である。
【００１８】
本発明におけるシート状細胞培養物は、スキャフォールド（細胞培養時の足場）に細胞を播種し、培養することによって得られるシート形状の培養組織などでもよいが、好ましくは、細胞培養物を構成する細胞由来の物質のみからなり、それら以外の物質を含まない。
シート状細胞培養物は、任意の既知の手法によって製造されたものであってよい。
【００１９】
本明細書において、第一の液体部は、少なくとも１種の成分から構成され、その成分としてはとくに限定されないが、例えば、水、水溶液、非水溶液、懸濁液、乳液などの液体から構成される。
本明細書における液または液体とは、全体として流動性を有する流体であればよく、細胞足場などの固形物質や気泡などその他非液体成分を含んでもよい。
【００２０】
第一の液体部を構成する成分は、シート状構造物に与える影響が少ないものであればとくに限定されない。シート状構造物が生体由来材料からなる膜である場合、第一の液体部を構成する成分は、生物学的安定性や長期保存可能性の観点から、生体適合性のもの、すなわち、生体組織や細胞に対して炎症反応、免疫反応、中毒反応などの望まない作用を起こさないか、少なくともかかる作用が小さいものが好ましく、例えば、水、生理食塩水、生理緩衝液（例えば、ＨＢＳＳ、ＰＢＳ、ＥＢＳＳ、Ｈｅｐｅｓ、重炭酸ナトリウム等）、培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７、ＩＭＤＭ等）、糖液（スクロース溶液、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（Ｒ）ＰＬＵＳ等）、海水、血清含有溶液、レノグラフィン（Ｒ）溶液、メトリザミド溶液、メグルミン溶液、グリセリン、エチレングリコール、アンモニア、ベンゼン、トルエン、アセトン、エチルアルコール、ベンゾール、オイル、ミネラルオイル、動物脂、植物油、オリーブ油、コロイド溶液、流動パラフィン、テレピン油、アマニ油、ヒマシ油などが挙げられる。
【００２１】
シート状構造物がシート状細胞培養物である場合、第一の液体部を構成する成分のうちの少なくとも１種は、細胞を安定して保存することができ、細胞生存に必要な最低限の酸素や栄養等を含み、細胞を浸透圧等により破壊しないものが好ましく、例えば、生理食塩水、生理緩衝液（例えば、ＨＢＳＳ、ＰＢＳ、ＥＢＳＳ、Ｈｅｐｅｓ、重炭酸ナトリウム等）、培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７、ＩＭＤＭ等）、糖液（スクロース溶液、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（Ｒ）ＰＬＵＳ等）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
第一の液体部を構成する成分の量は、シート状構造物を液中または液面に保持できる程度であって、形成される液嵩が、シート状構造物が上下方向に過度に稼動しない程度の高さであればとくに限定されない。例えば、シャーレを用いる場合、直径約１０ｍｍのシート状骨格筋芽細胞培養物に対しては、液嵩が０．１ｍｍ〜１１ｍｍであり、直径約２０ｍｍのシート状骨格筋芽細胞培養物に対しては、液嵩が０．１ｍｍ〜１６ｍｍであるのが好ましい。
第一の液体部の液嵩が低いと、シート状構造物の、第一の液体部と第二の液体部とが形成する液液界面との物理的距離が短いため、シート状構造物が該液液界面の影響（例えば、圧力等）を受けやすく、揺動が効果的に抑制される。
ただし、第一の液体部を構成する成分が２種以上の液体である場合であって、第一の液体部の中で１つ以上の液液界面を形成し、これにより隔てられた液層を形成する場合には、前述の嵩は、シート状構造物が位置する液層の嵩であってもよい。
【００２３】
本明細書において、第二の液体部は、１種の成分から構成され、第一の液体部と液液界面を形成する。
また、本明細書において、液液界面とは、混ざり合わない２つの液体の境界面をいう。
【００２４】
液液界面を形成する第二の液体部と第一の液体部との組み合わせは、液液界面を形成できるものであればとくに限定されないが、例えば、水相と有機相や、水性と油性などのような相溶性の低いもの、粘度が異なるもの、比重が異なるもの、および／または表面張力が異なるもののうちの１または２以上の組み合わせが挙げられる。
【００２５】
本発明において、液液界面を有する液中でのシート状構造物の安定化についてのメカニズムは必ずしも明らかではないが、液体の有する表面張力の差により、液液界面は気液界面に比べてより安定し、もって、液液界面にシート状構造物に触れた場合には、かかる表面張力によりシート状構造物を液液界面に位置させ続ける力が働き、その自由稼動領域を奪い、一方、シート状構造物が液液界面に触れずに、その下部に位置する第一の液体部に位置する場合には、該液液界面が、シート状構造物に対して抑える力が働き、いずれの場合も結果としてシート状構造物の揺動が顕著に低減されるものと考えられる。
【００２６】
第二の液体部を構成する成分は、第一の液体部と液液界面を形成する液状のものであればとくに限定されないが、シート状構造物に与える影響が少ないものが好ましく、例えば、水、生理食塩水、生理緩衝液（例えば、ＨＢＳＳ、ＰＢＳ、ＥＢＳＳ、Ｈｅｐｅｓ、重炭酸ナトリウム等）、培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７、ＩＭＤＭ等）、糖液（スクロース溶液、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（Ｒ）ＰＬＵＳ等）、海水、血清含有溶液、レノグラフィン（Ｒ）溶液、メトリザミド溶液、メグルミン溶液、グリセリン、エチレングリコール、アンモニア、ベンゼン、トルエン、アセトン、エチルアルコール、ベンゾール、オイル、ミネラルオイル、動物脂、植物油、オリーブ油、コロイド溶液、流動パラフィン、テレピン油、アマニ油、ヒマシ油などが挙げられる。
【００２７】
また、第二の液体部を構成する成分は、好ましくは、高い粘度、とくに好ましくは、水以上の粘度を有し、これにより、第一の液体部と第二の液体部とが形成する液液界面が顕著に安定し、シート状構造物の揺動がより効果的に抑制される。シート状構造物が細胞である場合には、粘性の高い成分として、例えば、高タンパク質、増粘多糖類やゲル化剤などを含む溶液を用いるのが好ましい。
【００２８】
第二の液体部を構成する成分の量および嵩はとくに限定されないが、第一の液体部の液面全面を被覆できる程度の量が好ましい。
【００２９】
本発明において、シート状構造物を保持する液は、下部に位置する第一の液体部とこれと液液界面を介して上部に位置する第二の液体部とで形成され、シート状構造物は液液界面かまたは第一の液体部に位置されるものであるところ、かかる位置関係が保持できるものであれば、液の比重はとくに限定されない。好ましくは、第二の液体部の比重は第一の液体部の比重よりも小さく、また第二の液体部の比重は、シート状構造物の比重より小さい。一方、第一の液体部としては、シート状構造物を前記液液界面かまたは前記第一の液体部に所定時間保持できるものであれば、その比重はシート状構造物の比重よりも大きくても小さくてもまた同等であってもよい。
以上の通り、第二の液体部の比重は、とくに限定されないが、シート状細胞培養物を用いる場合は、好ましくは約０．６５〜１．００、とくに好ましくは約０．８７〜０．９６８である。また、第一の液体部の比重は、とくに限定されないが、シート状細胞培養物を用いる場合は、好ましくは約１．００〜１．４６、とくに好ましくは約１．００４〜１．３である。さらにまた、シート状構造物の比重もとくに限定されないが、シート状細胞培養物である場合、血小板、赤血球、白血球の一般的な比重がそれぞれ約１．０３２、約１．０６３〜約１．０８５、約１．０９５であることから、通常はこれらの数値の前後である。
【００３０】
本明細書において、第一の液体部または第二の液体部の比重とは、各液体部を構成する成分の比重をいうが、第一の液体部の成分が２種以上である場合には、典型的には、その総合的な比重をいう。
【００３１】
液液界面を形成するためには、第二の液体部を構成する成分が有する表面張力と第一の液体部を構成する成分が有する表面張力との差が存在することが好ましいが、とくに好ましくは、その差が約30 dyne/cm以上である。例えば、水（72.75 dyne/cm）とパラフィン油（26.4 dyne/cm）とは液液界面を形成するが、水とグリセリン（63.4 dyne/cm）とでは液液界面の形成に最適とはいえない。
【００３２】
本発明の一態様において、シート状細胞培養物は、シート状骨格筋芽細胞培養物である。これは、シート状骨格筋芽細胞培養物は、その一部を液外でつかむと自重で破断するほど脆弱であるがゆえに、従来単体で搬送することができないばかりか、一度折り重なると元の形状に戻すことが極めて困難なため、液中でシート形状を維持しつつ搬送することに大きな意義があるからである。
【００３３】
本明細書において、シート状構造物が液液界面に位置するとは、シート状構造物の全部または一部が液液界面に接触している状態（例えば、図１〜３）などをいう。また、シート状構造物が第一の液体部に位置するとは、シート状構造物の全部が第一の液体部を構成する成分に含まれている状態（例えば、図４）などをいう。
第一の液体部を構成する成分が２種以上である場合、第二の液体部と形成する液液界面とは別の液液界面が、第一の液体部の中に１つ以上形成されていてもよい。
【００３４】
本発明の一態様において、液液界面を含む液は、シート状構造物が保持された第一の液体部に第二の液体部を加えたものである。ここで、第一の液体部にシート状構造物が保持されている状態とは、シート状構造物が第一の液体部を構成する成分の中または液面に保持された状態などをさす。
【００３５】
本明細書において、一の液体部をシート状構造物が保持された別の液体部に加える工程はとくに限定されないが、シート状骨格筋芽細胞培養物のような脆弱なシートを用いる場合には、前記一の液体部をピペットなどにより穏やかに添加することが好ましく、これにより脆弱な構造に損傷を与えるリスクを回避できる。前記一の液体部は、前記別の液体部の気液界面上、前記別の液体部を構成する成分中、および／またはシート状構造物の固液界面上などに加えることができる。
例えば、シート状細胞培養物および液体培地を有する培養容器に、第二の液体部を加えるだけで、即時的にシート状細胞培養物を安定して搬送することができる。
【００３６】
本発明の一態様において、シート状構造物が保持された第一の液体部は、シート状構造物を保持した第三の液体部から該第三の液体部を除去した後、第一の液体部を該シート状構造物に加えたものである。こうすることにより、シート状構造物を手や器具により機械的に取出す作業を行う必要がなく、脆弱なシートに対してとくに有利である。例えば、脆弱なシート状細胞培養物を液体培地を含む培養容器で形成した後、培養溶液から液体培地を除去し、第一の液体部、次いで第二の液体部を注ぎ入れることで、シート状細胞培養物はその形成から搬送を経て移植されるまでの間、液体以外のものによる無用の接触を回避することができ、損傷のリスクが極めて低い。
【００３７】
また、本発明の一態様によると、シート状構造物を保持した本来第一の液体部となり得るものを、シート状構造物の性質につき、または、その後の操作性のために、より適したものと簡易に取り替えることが可能となる。例えば、脆弱なシート状細胞培養物が液体培地で形成された場合、かかる液体培地を第一の液体部とし、これに第二の液体部を加えて本発明の方法とすることができることは前述のとおりであるが、かかる液体培地を、本態様により、緩衝液などの任意の他の成分と取り替えることが可能となる。なお、第一の液体部および第三の液体部の組成は同一であってもよい。
【００３８】
また、本発明の別の態様において、第一の液体部を、シート状構造物が第一の液体部の液面に保持されるように加えてもよい。これにより、シート状構造物が底面に張り付くことを効果的に回避し、第一の液体部および第二の液体部を含む液中により効率的に浮遊させることができるので、シート状構造物を液外へ取出す際の操作が容易となるばかりか、シート状構造物が第一の液体部と第二の液体部とで形成される液液界面に、より効率的に位置させ得る。さらに、第三の液体部を除去する前および／または後に、シート状構造物を伸展させる工程を含んでいてもよい。
【００３９】
本明細書において、第三の液体部は、少なくとも１種の成分から構成され、かかる成分は液状であればとくに限定されないが、例えば、水、水溶液、非水溶液、懸濁液、乳液などが挙げられる。シート状構造物が生体由来材料からなる膜である場合、第三の液体部を構成する成分は、生体適合性のものが好ましく、シート状細胞培養物である場合、第三の液体部を構成する成分のうちの少なくとも１種は、細胞を安定して保存することができ、細胞生存に必要な最低限の酸素や栄養等を含み、細胞を浸透圧等により破壊しないものが好ましい。
第三の液体部を構成する成分の量は、シート状構造物を保持できるものであればとくに限定されない。
第三の液体部にシート状構造物が保持されている状態とは、シート状構造物が第三の液体部を構成する成分の中または液面に保持された状態などをさす。
【００４０】
本明細書において、除去とは、典型的には、除去すべき対象を部分的にまたは完全に除去することをいう。第三の液体部を完全に除去しないときは、シート状構造物が長時間または一切、外気に曝されないため、嫌気性やまたは乾燥を嫌うシート状構造物を扱う場合にとくに有利である。また、部分的に除去することで、その後の操作に適する液嵩に調整することができる利点もある。
【００４１】
また、前述のシート状構造物を伸展させる工程の後に、第三の液体部を完全に除去することができる。これにより、シート状構造物の伸展状態を維持したまま、これを収容する容器などの底面に貼り付けて伸展形状を維持できる。このとき、後続の作業効率性の観点より、シート状構造物が容器底面の中央に位置することが望ましい。そして、第一の液体部をかかるシート上構造物の下部に入り込むように添加すると、浮力により伸展したシート状構造物が第一の液体部の表面に保持され、第二の液体部の添加後も、シート状構造物を液液界面に位置させ続けることができる。
液体部の除去は、スポイトによる吸水や、孔による排水などその他当業者に公知の手法を用いることができるが、脆弱なシート状構造物を扱う場合の除去作業はシート状構造物を破損等しないよう、穏やかになされることが好ましい。
【００４２】
本発明の別の側面は、シート状構造物を搬送するためのデバイスであって、下部に位置する第一の液体部と液液界面を介して上部に位置する第二の液体部とを含む液と該液を保持する容器からなり、シート状構造物が前記液液界面かまたは前記第一の液体部に位置される、前記デバイスに関する（例えば、図１〜４）。
【００４３】
本明細書において、容器は、内部にシート状構造物、第一の液体部、第二の液体部などを収容でき、液体を透過させないものであればとくに限定されず、市販の容器、袋などを含む任意のものを用いることができる。容器の材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、金属（例えば、鉄、ステンレス、アルミニウム、銅、真鍮）等が挙げられるがこれらに限定されない。容器の例として、例えば、シャーレ、細胞培養皿、細胞培養ボトル、コニカルチューブなどが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、容器は、上面に蓋などを備えることで、閉じられた空間を有するものでもよい。
【００４４】
本発明のデバイスは、シート状構造物を搬送するためのものであればよく、シート状構造物を含んでいてもいなくてもよい。シート状構造物が含まれない場合には、シート状構造物を、第一の液体部と第二の液体部とを含む液に、同デバイスにおける液液界面かまたは第一の液体部に位置させるように添加する。
【００４５】
本発明のデバイスの一態様において、シート状構造物はシート状骨格筋芽細胞培養物である。
【００４６】
本発明の別の側面は、シート状構造物を保持している別の液体の上部に液液界面を形成する液体（本明細書における第二の液体部）そのものにも関する。
【００４７】
本発明の別の側面は、シート状構造物を搬送するためのキットであって、シート状骨格筋芽細胞培養物を保持しているか、または保持させるための第一の液体部を収容している第一の部材と、該第一の液体部に加えるとその上部に液液界面を形成する第二の液体部を収容している第二の部材とを含む、前記キットに関する。
ここでキットの第一の液体部を収容している第一の部材および第二の液体部を収容している第二の部材は、それぞれ、種々の保存可能な形態、例えば、冷蔵、冷凍された状態で、第一の液体部および第二の液体部を収容する適切な部材であれば特に限定されないが、例えば、種々の材質（ガラス、プラスチックなど）のバイアル、アンプル、ボトル、チューブ、シャーレ等の容器などが挙げられる。但し、第一の液体部が細胞などのシート状構造物を保持している場合には、細胞生存性に配慮して保存方法および部材を選択することが好ましい。
【００４８】
本発明のキットには、前述の材料のほか、シート状構造物を収容して輸送する際に用いるシャーレなどの容器、シート状構造物を作製するのに必要な材料、液体を除去する器具、シート状構造物を伸展させるための器具、シート状構造物を移動させるための器具その他使用に必要な材料、シート状構造物を搬送手法に関する情報を含む説明書や、ＣＤ、ＤＶＤ等の電子記録媒体などを含んでいてもよい。本キットに含まれる液や器具等は、滅菌された状態で提供することができる。
【００４９】
本発明のキットの一態様において、シート状構造物はシート状骨格筋芽細胞である。
【００５０】
また、本発明の方法、デバイス、およびキットは、ヒト及び動物の疾病、傷病の治療に用いる細胞培養物の搬送に限らず、液中に遊離した種々の材料の搬送に用いることができることから、本発明の方法、デバイス、およびキットは、医療用途に限られず、研究用途や工業用途にも用いることができる。
【００５１】
以下に、本発明を図面を参照してより詳細に説明するが、これは本発明の特定の具体例を示すものであり、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５２】
実施例１：シート状細胞培養物の作製
２０％ヒト血清を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Invitrogen製）を、３．５ｃｍ  ＵｐＣｅｌｌ（Ｒ）ｄｉｓｈ温度応答性培養皿（セルシード製）に０．８ｍＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２濃度の条件で培養を行った。７時間後にピペッティングにより除去し、２０％ヒト血清含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地１．６６ｍＬに懸濁した９．３×１０６個のヒト骨格筋芽細胞を播種した。播種後、３７℃、５％ＣＯ２濃度の条件で２４時間の培養を行ってシート状細胞培養物（直径約１０ｍｍ、厚さ４００〜４７０μｍ）を作製した。
【００５３】
実施例２：ミネラルオイルおよびＨＢＳＳ（＋）を用いたシート状細胞培養物の振動耐性実験
実施例１で得られたシート状細胞培養物を収容した３．５ｃｍ  ＵｐＣｅｌｌ（Ｒ）ｄｉｓｈからＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を除去し、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ（＋））（Invitrogen製）１．６ｍＬを添加してシート状細胞培養物を剥離させた。シート状細胞培養物を伸展させてから一旦ＨＢＳＳ（＋）を除去し、再度ＨＢＳＳ（＋）１．６ｍＬを添加して浮力を利用しながらシート状細胞培養物を液面に浮かせた。次に、液面にミネラルオイル（SQUIBB製）３ｍＬを添加した。Ｐ１０００マイクロピペット（ギルソン製）を用いて、ミネラルオイルの下層に位置するＨＢＳＳ（＋）を６００μＬ除去した（ＨＢＳＳ（＋）液嵩約０．５〜３ｍｍ）。回転数９３ｒｐｍで２分間、振とう機（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｓｈａｋｅｒ  ＳＨＫ−ＵＳ（Ｒ）（旭硝子社製））でディッシュを振とうし、直後の状態を観察したところ、シート状細胞培養物の形状に変化はなかった（図５右）。
【００５４】
実施例３：ミネラルオイルおよびＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｒ）ＰＬＵＳを用いたシート状細胞培養物の振動耐性実験
実施例１で得られたシート状細胞培養物を収容した３．５ｃｍ  ＵｐＣｅｌｌ（Ｒ）ｄｉｓｈからＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を除去し、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ（＋））１．６ｍＬを添加してシート状細胞培養物を剥離させた。シート状細胞培養物を伸展させてからＨＢＳＳ（＋）を除去し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｒ）ＰＬＵＳ（ＧＥヘルスケア社製）１．６ｍＬを添加して浮力を利用しながらシート状細胞培養物を液面に浮かせた。次に、液面にミネラルオイル３ｍＬを添加した。Ｐ１０００マイクロピペットを用いて、ミネラルオイルの下層に位置するＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｒ）ＰＬＵＳを６００μＬ除去した（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｒ）ＰＬＵＳ液嵩約０．５〜３ｍｍ）。実施例２と同様にディッシュを振とうし、直後の状態を観察したところ、シート状細胞培養物の形状に変化はなかった（図６右）。
【００５５】
比較例１：ＨＢＳＳ（＋）を用いたシート状骨格筋芽細胞の振動耐性実験
実施例１で得られたシート状細胞培養物を収容した３．５ｃｍ  ＵｐＣｅｌｌ（Ｒ）ｄｉｓｈからＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を除去し、（ＨＢＳＳ（＋））１．６ｍＬを添加してシート状細胞培養物を剥離させた。シート状細胞培養物を伸展させてから一旦ＨＢＳＳ（＋）を除去し、再度ＨＢＳＳ（＋）１．６ｍＬを添加して浮力を利用しながらシート状細胞培養物を液面に浮かせた。最後にＰ１０００マイクロピペットを用いてＨＢＳＳ（＋）を６００μＬ除去した（ＨＢＳＳ（＋）液嵩約１〜３ｍｍ）。実施例２と同様にディッシュを振とうし、直後の状態を観察したところ、シート状細胞培養物は折り畳まれていた（図５左）。
【００５６】
比較例２：Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｒ）ＰＬＵＳを用いたシート状骨格筋芽細胞の振動耐性実験
実施例１で得られたシート状細胞培養物を収容した３．５ｃｍ  ＵｐＣｅｌｌ（Ｒ）ｄｉｓｈからＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を除去し、ＨＢＳＳ（＋）１．６ｍＬを添加してシート状細胞培養物を剥離させた。シート状細胞培養物を伸展させてからＨＢＳＳ（＋）を除去し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｒ）ＰＬＵＳ１．６ｍＬを添加して浮力を利用しながらシート状細胞培養物を液面に浮かせた。最後にマイクロピペットを用いてＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｒ）ＰＬＵＳを６００μＬ除去した（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｒ）ＰＬＵＳ液嵩約１〜３ｍｍ）。実施例２と同様にディッシュを振とうし、直後の状態を観察したところ、シート状細胞培養物は折り畳まれていた（図６左）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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