(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）レッドクローバーの花部若しく葉花、及びそのイソフラボン抽出物から選ばれる少なくとも１種と（ｂ）亜麻種子および亜麻種子由来のリグナン抽出物から選ばれる少なくとも１種との混合物からの、ムコール属に属するカビによる発酵産物である、エストロゲン類似活性を有する発酵産物。
【請求項２】
請求項１記載の発酵産物からの抽出物。
【請求項３】
上記ムコール属に属するカビが、ムコール シルシネロイデス（M. circineloides）、ムコール  ヒエマリス（M.hiemalis）及びムコール プシラス（M. pusillus）から選ばれる少なくとも１種である、請求項１記載の発酵産物又は請求項２記載の抽出物。
【請求項４】
請求項２又は３記載の抽出物で、DNAチップとMCF-7細胞を用いて解析算出した、該抽出物投与の有無による発現変動遺伝子とエストロゲン(E2)応答遺伝子の各発現の相関係数（R）が、少なくとも0.7以上であることを特徴とする請求項２又は３記載の抽出物。
【請求項５】
上記抽出物が、エタノール抽出物である、請求項２〜４のいずれか１項記載の抽出物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エストロゲン（17βエストラジオール、E2）応答遺伝子148種類を搭載したオリゴDNAマイクロアレイによるエストロゲン応答遺伝子発現プロファイルにおけるE2との相関解析により見出され、大豆イソフラボンアグリコンであるダイゼインの微生物代謝産物であり高エストロゲン類似活性を有するエコール（Equol）とほぼ同等のエストロゲン類似活性を発現する、ケカビ目に属する各種カビによるレッドクローバーと亜麻種子由来の発酵産物と該発酵産物からの抽出物に関する。
【背景技術】
【０００２】
閉経期（40歳）前後の女性はエストロゲン分泌低下により、イライラ、ほてりや不眠などの更年期障害症に悩まされるのみならず、骨量や骨密度の減少により骨粗鬆症になりやすい。我が国の骨粗鬆症患者は、潜在患者を含めると1,200万人に達しており、高齢化社会の進展に伴い更に増加する傾向にあると言われている。骨粗鬆症における骨折は、寝たきり老人発生の大きな原因の一つであり、高齢化社会における大きな社会問題になっている。
【０００３】
多くの軽度の潜在患者は実際に治療を受けているわけではなく、そのような多くの人たちにはエストロゲンを補充するための大豆イソフラボンのような植物性エストロゲンサプリメント、大豆イソフラボンを含む豆腐や豆乳などの大豆食品、さらにイソフラボンアグリコンを豊富に含むテンペ、納豆や味噌などの発酵食品、等多くの製品が提供されている。
【０００４】
大豆イソフラボンは天然には配糖体として存在し、ゲニスチン、ダイジン、グリシチンの３種類の存在が知られている。その中で、ゲニスチンとダイジンが比較的高いエストロゲン類似活性を有し、その活性の強さはE2の1/1,000 ~1/10,000以下である。第一世代の大豆イソフラボンサプリメントは吸収性の悪い天然のままの配糖体型を主成分としたものである。第二世代の大豆イソフラボンサプリメントは、より吸収性の高い糖鎖を切断したイソフラボンアグリコンを主成分とするものであるが、骨粗鬆症の予防や更年期障害症状軽減に充分なものとは言えない。
【０００５】
大豆中に含まれるイソフラボンはE2と構造が類似しているが、そのエストロゲン類似活性はE2の1/1,000 ~1/10,000以下であるため、エストロゲンレセプター(ER)への結合によりE2に対して抗エストロゲン作用を発揮し、またE2の分泌が低下したような（E2濃度が低い）場合には、エストロゲン類似作用を発現することが知られている。最近の疫学調査において、日本などのアジア諸国で心血管系疾患や乳がん発症率が欧米諸国に比べて低いことが明らかにされているが、これは日常生活における大豆イソフラボンの摂取によるものであると考えられている。さらに、日本人では前立腺癌発症率が低いのは大豆イソフラボンの摂取によるものであることが示されている（非特許文献１および非特許文献２参照）。
【０００６】
しかしながら、これらの効果には個人差があることが報告されている。イソフラボンは腸内フローラにより代謝され、その代謝産物の中でもエコール（Equol）という物質は、ダイゼインから生成され、ダイゼインよりもはるかに高いエストロゲン受容体β (ERβ) 結合能（約100倍）およびエストロゲン類似活性を有することが知られている（非特許文献３および非特許第4832412号参照）。大豆イソフラボンよりは、その活性代謝産物のエコールが臨床応用（乳癌、前立腺癌予防効果、更年期障害軽減、骨粗鬆症の予防効果など）に有用性が高いこと（非特許文献５、非特許文献６および非特許文献７参照）、さらにエコールが大豆イソフラボンの有効性本体であることが学術的に支持されている（非特許文献８参照）。
【０００７】
イソフラボンの効果に個人差があるのは、腸内にエコール生産菌を保持するか否かに依存しており、疫学調査により西洋人ではエコール非生産者（equol-nonproducers）が多く、前立腺癌などのハイリスク因子とされている。一方、大豆加工食品を日常的に食している日本人では約50%がエコール生産者（equol-producers）であるとされている（非特許文献９参照）。
【０００８】
ヒト腸内フローラからダイゼインを資化し、エコールを生産する微生物としてバクテロイデス（Bacteroides）E-23-15 （FERM BP-6435号） やストレプトコッカス（Streptococcus）E-23-17（FERM BP-6436号）（特許文献１参照）、ラクトコッカス  ガルビエ（Lactococcus garviae）やラクトコッカス（Lactococcus）20-92（FERM BP-10036号）（特許文献2参照）、さらにビフィドバクテリウム  アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）やビフィドバクテリウム  ブレーベ（Bifidobacterium breve）（特許文献３参照）などが分離・同定されている。これらの微生物をダイゼイン含有物に作用させることによるエコール製造方法や該微生物を作用させた飲食物や栄養補助食品等のエコール産生組成物などが知られている（特許文献１、特許文献２および特許文献３参照）。
【０００９】
しかしながら、これらの微生物によるダイゼインからのエコール変換効率が充分とは言えず、またそのエコール変換効率は精製ダイゼインを添加した微生物培養培地中で微生物を培養した場合のものであり、ダイゼインを含む大豆、あるいは大豆胚芽のような材料を使用した時のものではない。また、エコール生産菌は嫌気および偏性嫌気性菌が多く、さらにビフィドバテリウムのように栄養要求性の高い菌もあり、これら微生物の大量培養による効率的、かつ安価なエコール生産を実施するのは困難であり、エコールとほぼ同等のエストロゲン類似活性を有し、かつ安価な作用物の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】WO09/07392
【特許文献２】特許第3864317号
【特許文献３】特開2006-204296
【特許文献４】特許第4832412号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Nagata Y., et al.: J. Nutr. 137: 1974-1979, 2007.
【非特許文献２】直江道夫他：大豆と日本人と前立腺癌、泌尿器科  20: 1531-1536, 2007.
【非特許文献３】Sathymoothy N. and Wang TT.:  Eur. J. Cancer 33: 2384-2389, 1997.
【非特許文献４】臼井健：大豆タンパク質研究 Vol. 9: 153-157, 2006.
【非特許文献５】Ingraham D., et al.: Lancet 350: 990-994, 1997.
【非特許文献６】Duncan AM., et al.: Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention 9: 581-586, 2002.
【非特許文献７】Akaza H., et al.: Jpn. J. Clin. Oncol. 32: 296-300, 2002.
【非特許文献８】Settchell KDR., et al.: J. Nutr. 132: 3577-3584, 2002.
【非特許文献９】Uchiyama S., et al.: Ann. Nutr. Metab. 45: 113 (abs), 2001.
【非特許文献１０】Zhu Y., et al.:Evaluation of Estrogenic Activity of Flavonoids by an Oligo-DNA Microarray Assay. JST資料番号G0184A
【非特許文献１１】Ise,R., et al.: 2005, FEBS Letters, March 14; 579(7),1732-1740
【非特許文献１２】小川和宏：科研費補助金データベース登録番号16500503
【非特許文献１３】Schena, Mark : Microarray Analysis, John Wiley & Sons, pp 312-323 2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
大豆イソフラボンアグリコンであるダイゼインの微生物代謝産物であるエコールとほぼ同等の高エストロゲン類似活性を有する植物性作用物の提供。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、エストロゲン活性評価用スポット型DNAマイクロアレイ（特許文献４）、すなわちエストロゲン（E2）応答遺伝子148種類を搭載したオリゴDNAマイクロアレイ（以下、DNAチップと称する）を用いて、ケカビ目に属する各種カビによる各種基質発酵産物からの抽出物のMCF-7細胞への投与の有無により得られた遺伝子発現プロファイルとE2で同様に処理して得られた遺伝子発現プロファイルとの間で相関解析を実施することにより（非特許文献10及び11）、レッドクローバーと亜麻種子の混合物由来のカビ発酵産物からの抽出物が、エコールとほぼ同等のエストロゲン類似活性を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
3日間枯渇処理して培養し、次いで充分な増殖促進活性化濃度の各種抽出物を添加・培養したMCF-7細胞からmRNAを抽出した。これをテンプレートにして合成した蛍光標識cDNAをDNAチップにハイブリダイズさせて、エストロゲン応答遺伝子（148種類）を用いて発現プロファイルを得て、これをMCF-7細胞にE2を作用させて得られるプロファイルとの間で相関解析を実施し相関係数を求めたところ、エストロゲン類似活性の高い植物性作用物ほどE2との相関係数が高いことが明らかになった（非特許文献11）。
なお、該文献では、ゲニスティンのE2との相関係数が0.93であり、ダイゼインのそれは0.74であることが注目される。しかしながら、ゲニスティンはヘム鉄による生体防御因子ヘムオキシダーゼ(HO-1)の発現誘導を抑制する一方、ダイゼインは抑制しない。ヘム鉄とイソフラボンは食品として併用される可能性も高いことから、食品成分としてはHO-1誘導を抑制しにくいダイゼインが好ましいと考えられる。またエストラジオールはHO-1誘導を抑制しなかったことなどから、イソフラボンによるHO-1誘導抑制は、エストロゲン受容体を介する既知の機序とは異なるものによる可能性が示唆されている。（非特許文献12）。
【００１５】
本発明におけるMCF-7細胞とDNAチップを用いた植物性抽出物のエストロゲン類似活性の測定は、該抽出物に含まれるエストロゲン類似作用物のエストロゲン受容体（ER）への結合を介したエストロゲンシグナルだけでなく、核内移行性や細胞膜透過性を含めた総合的なエストロゲン類似活性、すなわち健康食品、医薬部外品又は医薬品としての有用性を評価できるところに特徴がある。
【００１６】
本発明では、古くから植物性エストロゲン源として食用、ハーブティーや漢方薬などに使用されてきた植物、およびそれらの種々の組み合わせの混合物をケカビ目に属する各種カビで発酵し、それら発酵産物からの抽出物について、MCF-7細胞およびDNAチップを用いたアッセイにより、エストロゲン応答遺伝子発現におけるE2との相関係数を求めた。その結果、レッドクローバーと亜麻種子の混合物のカビ発酵産物からの抽出物は、それぞれ単独のカビ発酵産物からの同抽出物に比べて極めて高い相関係数を有することが判明した。このように、レッドクローバーと亜麻種子の組み合わせ混合物のカビ発酵産物からの抽出物は、それぞれの単独に比べて相乗的なエストロゲン類似活性を発揮するという格別な効果により、上記課題を解決し本発明を完成するに至った。
【００１７】
レッドクローバーと亜麻種子の混合物のカビ発酵産物からの抽出物はそれぞれの単独に比べて相乗的なエストロゲン類似活性を発揮し、大豆イソフラボンアグリコンであるダイゼインの高活性微生物代謝産物として知られているエコールと同等、およびそれ以上のエストロゲン類似活性を有することは、これまでに知られておらず、従来技術から推測されない。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（５）を提供するものである。
（１）  ダイゼインの微生物代謝産物であるエコールとほぼ同等のエストゲン類似活性を有する作用物を含有するレッドクローバーと亜麻種子、およびレッドクローバー由来のイソフラボン抽出物と亜麻種子由来のリグナン抽出物のそれぞれの混合物のケカビ目に属するカビ発酵産物。
（２）  （１）記載の発酵産物からの抽出物。
（３）  （１）記載のカビは、リゾプス（Rhizopus）属では、リゾプスニベウス（R. niveus）、リゾプス オリザ（R. oryzae）、リゾプス  オリゴスポラス（R.oligosporus）、 リゾプス ストロニファー（R.stolonifer）、及びムコール（Mucor）属としてはムコール シルシネロイデス（M. circineloides）、ムコール ヒエマリス（M.hiemalis）、ムコール プシラス（M. pusillus)などの内から選ばれる少なくとも１種である。
（４）  （２）記載の抽出物で、DNAチップとMCF-7細胞を用いて解析算出した、該抽出物投与の有無による発現変動遺伝子とエストロゲン応答遺伝子の発現型の相関係数（R）が、少なくとも0.7以上であることを特徴とする抽出物及びその基質発酵産物。
（５）  （１）及び（２）記載の発酵産物あるいは抽出物を含有する食品、飲料、化粧品、香水、医薬部外品及び医薬品。
【発明の効果】
【００１８】
ダイゼインの微生物代謝産物である高エストロゲン類似活性を有するエコールとほぼ同等のエストロゲン類似活性を示す、レッドクローバーと亜麻種子、およびレッドクローバー由来のイソフラボン抽出物と亜麻種子由来のリグナン抽出物のそれぞれの混合物のケカビ目に属するカビ発酵産物、および該発酵産物からの抽出物を提供することができる。
さらに、該発酵産物および該抽出物を含有する食品、飲料、化粧品、育毛剤、香水、医薬部外品及び医薬品等を提供することができる。
ケカビ目に属するカビの発酵物からの抽出物のエストロゲン類似活性は、エストロゲン応答細胞であるMCF-7細胞およびエストロゲン応答遺伝子を搭載したDNAチップを用いて、それぞれ該抽出物およびE2のMCF-7細胞における遺伝子発現プロファイルの示す相関を解析し、相関係数を求めることにより測定することができる。
ケカビ目に属するカビとしてはリゾプス（Rhizopus）属およびムコール（Mucor）属のカビを使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】亜麻種子単独、レッドクローバー単独および亜麻種子とレッドクローバーの混合物（50 : 50, w/w）のそれぞれのムコール  プシラス（M. pusillus）による発酵産物由来の抽出物（70%水性アルコール抽出物）、エストロゲン（E2: 17β-estradiol）およびエコール（Equol）によるMCF-7細胞の増殖促進活性を示す。図は３回測定した結果の平均と標準偏差を示す。危険率はp<0.01である。但し、＊印はcontrolに対して、危険率p<0.05であることを示す。
【図２】エストロゲン（E2）応答遺伝子148種を搭載したオリゴDNAマイクロアレイ（DNAチップ）を用いた植物抽出物に含まれる作用物のエストロゲン類似活性の測定法を示す。
【図３】エストロゲン応答遺伝子(148種)の発現における、（１）レッドクローバー、（２）亜麻種子および（３）レッドクローバーと亜麻種子の混合物 （50 : 50, w/w）のそれぞれのムコール プシラス（M.pusillus）発酵産物由来の抽出物および（４）エコールのそれぞれとE2との相関解析図および相関係数（R）を示す。相関係数（R）は回帰直線（グラフに示した近似線）をもとに算出した。また、それぞれ比較する試料の間で危険率を算出し、相関解析の信頼性を評価した。
【図４】機能グループ別エストロゲン応答遺伝子(148種)と、（１）レッドクローバー、（２）亜麻種子および（３）レッドクローバーと亜麻種子の混合物 (50 : 50, w/w)のそれぞれのムコール プシラス（M. pusillus）発酵産物からの抽出物および（４）エコールの夫々の発現変動遺伝子との相関解析結果を示す。（危険率 p<0.01）
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明で使用するレッドクローバー（学名：Trifolium pretense）は、マメ科の多年草で赤紫色の花をつけるため、和名ではアカツメクサ、ムラサキツメクサとも呼ばれている。欧米ではレッドクローバーは古くからハーブとして多用されており、米国食品医薬品局（FDA）では、レッドクローバーを一般に安全と認知されている物質（GRAS : generally recognized as safe）として認定している。レッドクローバーはイソフラボンの含有量が他の植物と比較して多く、同じイソフラボンで有名な大豆と比較しても含まれる量は10倍以上であることが知られている。
【００２１】
レッドクローバーに含まれるイソフラボンの中には、大豆と同様に配糖体のダイジンやゲニスチンが含まれ、その他にアグリコン型のフォルモノネチン（Formononetin）やバイオカイニンA （Biochainin A）、グルコシド型のオノニン（Ononin）およびシスソトリン（Sissotrin）などが含まれている。その中でも、フォルモノネチン、バイオカイニンAは、アグリコン型であるため腸内変換の必要もなく、ダイゼインやゲニステインのようなイソフラボンよりも吸収率が高く、肝臓で脱メチル化されダイゼインとゲニステインに変換されて効率よく効果を発揮すると言われている。
【００２２】
本発明で使用する亜麻 （学名：Linum usitatissimum）はアマ科の一年草で、ヌメゴマ（滑胡麻）、一年亜麻、アカゴマなどとも呼ばれている。亜麻リグナンは亜麻種子に豊富に含まれる成分で、セコイソラリシレシノールジグルコシド（Secoisolariciresinol diglucosides, SDG）が多く、大豆イソフラボンと同様に弱いエストロゲン類似活性を示すことが知られている。
【００２３】
一般に、世界の中でも日本と北欧の女性では、女性ホルモン分泌の低下に伴う更年期障害症を発症する患者数が少ないと言われている。日本では大豆を食べていることがその一因であり、現在その有効成分としては植物性エストロゲンの大豆イソフラボンであるとされている。一方、北欧では、日本で大豆が食されているのと同様に、亜麻種子がパンの材料やデザートのトッピングなどとして日常的に食されている。亜麻種子には、上記のようにSDGと呼ばれるリグナンが含まれており、この亜麻リグナンは閉経期に低下する女性ホルモンの働きを補い、更年期障害の諸症状を緩和する、新しいタイプの植物性エストロゲンとして期待されている。
【００２４】
レッドクローバーは花部だけなく、葉花を用いることができる。ハーブティーなどに利用されているレッドクローバーの葉花破砕乾燥物と亜麻種子の種々の割合からなる混合物のそれぞれを加圧滅菌し、放冷後、カビ胞子を接種して、固体培養により発酵させることができる。また、原料が粉末の場合には、液体培養により発酵させることができる。
【００２５】
ケカビ目に属するカビとして、リゾプス（Rhizopus） 属およびムコール（Mucor）属のカビを用いることができる。たとえば、リゾプス（Rhizopus）属では、リゾプス ニヴェウス（R. niveus）、リゾプス オリザ（R. oryzae）、リゾプス  オリゴポラス（ R.oligosporus）、リゾプス  ストロニファー（R.stolonifer）等、またムコール（Mucor）属では、ムコール シルシネロイデス（M. circineloides）、ムコール  ヒエマリス（M.hiemalis）、ムコール プシラス（M. pusillus）などの内から選ばれる少なくとも1種である。
本発明に係る微生物については、独立行政法人製品評価技術基盤機構等から入手することができる。
【００２６】
カビ発酵産物からの抽出物は、(1)発酵産物に99%エタノールを加えて最終濃度が70%となるように調製、(2)発酵産物のホモジナイズ、(3)数時間抽出（室温~30℃）、(4)遠心分離、あるいは加圧バッグフィルターろ過、(5)遠心分離上清、あるいはフィルター濾液を減圧濃縮・乾固して、(6)抽出物を調製する。また、同抽出物から脂質を除去したい場合には、非極性溶媒（n-ヘキサンやジエチルエーテル）で抽出除去することができる。
【００２７】
かくして調製した、レッドクローバー、亜麻種子および両者の混合物(50 : 50,w/w) のそれぞれのムコール プシラス（M. pusillus）発酵産物からの抽出物の少量を70%エタノールに溶解し、フィルター濾過（0.22μ）滅菌後、減圧下で濃縮・乾固して各種抽出物サンプルを調製した。各サンプルを少量のジメチルスルフォキサイド（DMSO）で溶解し、エストロゲン応答細胞であるMCF-7細胞に添加・培養したところ、これらの抽出物はE2と同様に用量依存的にMCF-7細胞の増殖を促進し、エストロゲン類似活性を有することが判明した（実施例２）。
【００２８】
さらに、DNAチップを用いエストロゲン応答遺伝子発現におけるレッドクローバーおよび亜麻種子のそれぞれのムコール プシラス（M. pusillus）発酵産物由来の抽出物とE2との間で遺伝子発現プロファイルの相関関係を解析したところ、それぞれの相関係数（R）は0.57および0.42であり、エコールに比べてかなり低いエストロゲン類似活性を示した。しかしながら、レッドクローバーと亜麻種子の混合物（50 : 50, w/w）のムコール プシラス（M. pusillus）発酵産物からの抽出物の相関係数（R）は0.82で、エコールの0.82と同等で、高いエストロゲン類似活性を有することを認めた（実施例３）。
【００２９】
このことから、レッドクローバーと亜麻種子の組み合わせ混合物のカビ発酵産物からの抽出物はそれぞれの単独に比べて相乗的なエストロゲン類似活性を発揮するという格別な効果があることが判明した（実施例３）。ちなみに、レッドクローバーの代わりに大豆を用いた場合、大豆と亜麻種子の混合物のムコール プシラス（M. pusillus）発酵産物からの抽出物の相関係数（R）は0.77でエコールの0.82よりも低値であった。
【００３０】
エストロゲン応答遺伝子（148種）の機能別グループ（enzymes, signaling, proliferation, transcription, transport, およびothers）ごとの発現におけるE2とレッドクローバー単独のムコールプシラス（M. pusillus）発酵産物由来の抽出物との相関係数は、エコールにくらべて、シグナル（signaling）グループおよび細胞輸送（transport）グループ以外のすべての機能グループで低値であり、また亜麻種子単独の場合は、ほとんどすべての機能グループごとの相関係数はエコールのそれらに比べて低値であった。しかしながら、レッドクローバーと亜麻種子の混合物 （50 : 50, w/w）の同カビ発酵産物からの抽出物はすべての機能別グループでエコールのそれらとほぼ同程度に高い相関係数を示した（実施例３）。
【００３１】
このように、エストロゲン応答遺伝子（148種）の機能別グループごとの発現における相関解析からも、レッドクローバーと亜麻種子の組み合わせ混合物のカビ発酵産物からの抽出物はそれぞれの単独に比べて相乗的なエストロゲン類似活性を発揮するという格別な効果があることが確認された。さらに、シグナル（signaling）グループおよび細胞輸送（transport）グループの遺伝子が特に影響を受けていることから、これらの遺伝子を指標にしてエストロゲン類似活性の具体的な効果に関してモニターすることが可能であると考えられる。
【００３２】
本発明のレッドクローバーと亜麻種子の混合割合は、90 : 10 〜10 : 90 （w/w）の範囲で実施できるが、50 : 50 （w/w）付近の混合割合が望ましい。また、カビ発酵は通常の大豆のテンペ製造に用いられる接種量および培養温度並びに培養時間で同様に実施することができる。
【００３３】
本発明においては、レッドクローバーの代わりにレッドクローバー由来のイソフラボン抽出物、また亜麻種子のかわりに亜麻種子由来のリグナン抽出物を用いることができる。これらの抽出物は市販品から入手することができる。市販されているレッドクローバーのイソフラボン抽出物として、例えば、イソフラボンを2.5%, 8%, 20%および40%含有するレッドクローバー抽出物（中国産、粗粉末、各最小ロット25 kg）やアグリコン型イソフラボンを40%含有する規格化されたレッドクローバー抽出素材（IFL40）（リニア社製、スイス）などが挙げられる。一方、亜麻種子リグナン抽出物としては、カナダの亜麻種子のみを原料とした、リグナン（SDG）を高濃度（40%）に抽出した粉末素材（日本製粉株式会社製、肥満抑制効果素材「ニップンアマニリグナン」）が挙げられる。
【００３４】
レッドクローバーおよび亜麻種子の抽出物はそれぞれイソフラボンおよびリグナン（SDG）を高濃度に含有するので、上記のようにエコールと同等、およびそれ以上のエストロゲン類似活性を有する作用物を含有する発酵産物を得るには、これら両抽出物の混合比を含め、発酵時間の延長などの最適な発酵条件を決定する必要がある。
【００３５】
そのような場合、両抽出物の混合比（イソフラボン：SDG）や培養時間を種々変えた発酵過程で採取したサンプルについて、上述したようにMCF-7細胞およびDNAチップを用いたアッセイによりエストロゲン応答性遺伝子発現におけるE2との相関係数が、エコールの0.82以上を有する作用物を含有する発酵産物とその抽出物を生産できる最適発酵条件を比較的容易に決定することができる。また、発酵に供されるイソフラボンおよびリグナン（SDG）の濃度は、混合物のカビ発酵産物の最終用途目的に応じて適宜決定される。
【００３６】
レッドクローバーのイソフラボン抽出物および亜麻種子のリグナン抽出物は共に粉体であるので、カビによる固体培養では間隙が少なく培養が不均一になるので、加圧滅菌・冷却した粉体混合物（30℃）に蒸米あるいは加圧滅菌亜麻種子を一定量（間隙を形成できる程度の量）添加し、よく混和してカビによる固体培養（仕込み量約50%, w/w）に供することができる
【００３７】
また、固体培養の代わりに、該粉体混合物を滅菌後、ジャーファーメンターを用いて液体培養（仕込み量約10%, w/w）することも可能である。液体培養後、発酵液を遠心分離し、得られた固体を水性エタノール（70%）で抽出することにより、エコール相当の高活性な植物エストロゲン抽出物を調製することができる。
【００３８】
レッドクローバーのイソフラボン抽出物と亜麻種子のリグナン抽出物の混合物のカビ固体培養で得られた発酵産物は相乗的なエストロゲン活性を発揮するカビの代謝産物に加え、イソフラボンアグリコンおよびリグナンをそれぞれ高濃度に含有しており抽出濃縮する必要性がないので、該発酵産物をそのまま製品化することが可能である。
【００３９】
すなわち、該発酵産物を滅菌・乾燥後、コロイドミルなどで微粉体に加工して、この微粉体に必要に応じてビタミン類、さらに賦形剤（乳糖やデンプンなど）、結合剤（デンプン、セルロースなど）や滑沢剤（ステアリン酸マグネシウムなど）などを添加して、一日当たり30 mgのイソフラボンアグリコンが摂取できるように錠剤化してエストロゲンサプリメントとして製品化することが可能である。また、この発酵産物の微粉体は高活性な植物性エストロゲン素材として、健康食品や栄養補助食品など幅広い用途に利用できる。
【００４０】
さらに、高度な用途には、該発酵産物を水性エタノール（70%）で抽出し、より純粋で高活性な抽出物を調製することにより、化粧品や育毛剤の素材として利用することができる。すなわち、皮膚にはエストロゲン受容体β（ERβ）が発現しており、閉経後女性ではエストロゲン（E2）分泌低下によりシワやシミなどの皮膚の老化現象が起こりやすい。本発明の抽出物はポリフェノールとしての高い抗酸化活性とともに、エコールと同等、およびそれ以上の高いエストロゲン類似活性を有し、さらに上述したように細胞膜透過性にも優れているので、閉経後女性の皮膚老化予防のための化粧品素材として用いることができる。
【００４１】
最近、閉経後女性の薄毛には女性ホルモン（E2）の分泌低下による、ERβ発現毛乳頭細胞でのBMP-2 （Bone morphogenetic protein-2）発現低下が関与していることが明らかにされていることから（山本裕子他：「毛乳頭細胞におけるエストロゲン受容体βを介したBMP-2の調節」日本基礎老化学会  第28回大会講演要旨集2005年）、高いエストロゲン類似活性を有し、かつ細胞透過性にも優れている本発明の抽出物は育毛剤の素材として用いることもできる
【実施例】
【００４２】
実施例１：[各種植物原料のカビ発酵産物および該発酵生産物からの抽出物の調製]
固体培養法(仕込み量約50%, w/w)によるカビ発酵プロセスを以下に示す。各種原料に水分含量が約50%になるように製造水を混合して、加圧滅菌（121℃,15分間）した後、40℃以下になるまで放冷した。これに初発胞子数としてグラム当たり約104個になるようにカビ胞子を接種し、好気的な条件を維持するために培養層を薄く平らにして30℃で48時間培養することにより発酵産物を得た。また、原料が粉体の場合には、蒸米や加圧滅菌した亜麻種子を一定割合添加して間隙を形成させて同様に固体培養に、あるいはそのまま滅菌してジャーファーメンターによる液体培養（仕込み量約10%, w/w）に供することができる。
【００４３】
かくして得られたカビ発酵産物からの抽出物の調製プロセスを以下に示す。各種発酵産物に最終濃度が70%になるように99%エタノールを加え、ホモジナイズしながら、30℃で2時間抽出した。遠心部分離、あるいは加圧バッグフィルターろ過して得られた抽出液を減圧下で濃縮・乾固して抽出物を調製した。
【００４４】
実施例２：[各種抽出物のエストロゲン応答性細胞MCF-7の増殖促進活性]
供試する各種抽出物サンプルは、カビとしてムコール プシラス（M. pusillus） を用いて実施例１に従い調製したレッドクローバーおよび亜麻種子のそれぞれ単独、およびレッドクローバーと亜麻種子の混合物の発酵産物から調製したそれぞれの抽出物の少量を70%エタノールに溶解し、メンブランフィルター（0.22μ）でろ過滅菌後、遠心濃縮機により濃縮・乾固して調製した。
【００４５】
ヒト乳癌細胞株、MCF-7細胞をホルモンや成長因子不含のCharcoal/Dextran処理した培地で3日間培養して枯渇処理した後、96-ウエルプレートに 5 x 103 cells/wellの細胞密度で播種し、一夜培養してウエル底面に接着させた。培養後、培地を除去し、各ウエルに上記のように調製した各抽出物サンプルおよびエコール(Alexsis社)をDMSOに溶解し、それぞれを種々の濃度になるように添加したCharcoal/Dextran処理した培地で、さらに3日間培養した。培養後、培養液を除去して、各ウエルに細胞増殖測定用試薬（CellTiter 96, Promega社）を添加し、1時間後にプレートリーダーを使って波長490 nmの吸光度を測定した。各種物質による増殖活性は、コントロール（溶媒として使用したDMSO を0.1%添加）を１としコントロールに対する相対増殖促進活性を求めた。また、2.7ｘ10-3μg/ml(10 nM)のE2 (Sigma社)を添加した細胞をポジティブコントロールとして使用した。
【００４６】
レッドクローバーおよび亜麻種子のそれぞれ単独および両者の混合物（50 : 50, w/w）のムコール プシラス（M. pusillus ）発酵産物からのそれぞれの抽出物、エストロゲン（E2）およびエコール（Equol）のMCF-7細胞増殖促進活性を以下に示す。E2の増殖促進効果は極めて強く、2.7ｘ10-3μg/ml (10 nM)で充分な増殖促進効果を示した。また, レッドクローバーと亜麻種子の混合物の発酵産物からの抽出物は25 μg/mlで、またエコールは2.4μg/ml(10μM)で最も強い増殖促進活性を示した。レッドクローバーおよび亜麻種子のそれぞれの増殖促進活性の程度は異なるものの、ともに25μg/mlで有意な増殖促進活性を示した。（図１  p<0.05）
これらの結果から、エストロゲン応答遺伝子148種を搭載したDNAチップによるアッセイには、これら細胞増殖促進活性を示す上記濃度で培養したMCF-7細胞から抽出したmRNAを用いた。 
【００４７】
実施例３：[DNAチップによる抽出物のエストロゲン類似活性の測定と各種抽出物のエストロゲン類似活性]
１．実験方法
【００４８】
エストロゲン（E2）応答性遺伝子148種を搭載したDNAチップによるMCF-7細胞に対する各種抽出物のエストロゲン類似活性の測定方法を図２に示す。  DNAチップに搭載したエストロゲン応答遺伝子148種類（UniGene names）の機能別グループ分けは、非特許文献１０に示された通りである。
【００４９】
実施例２で示したように、サンプルとして(1)E2 2.7ｘ10-3μg/ml (10 nM), (2)エコール2.4μg/ml (10μM), (3)レッドクローバーおよび(4)亜麻種子のそれぞれのムコール プシラス（M. pusillus）発酵産物からの抽出物をそれぞれ25 μg/mlおよび(5)レッドクローバーと亜麻種子の混合物(50:50)の同カビ発酵産物からの抽出物25 μg/mlをMCF-7培養液に添加し3日間培養する。化学物質無添加、あるいは上記物質（(1)〜(5)）のそれぞれを添加したMCF-7細胞からmRNAを抽出し、これをテンプレートとして蛍光標識されたcDNAを合成した。かくして調製した蛍光標識cDNAをDNAチップにハイブリダイズさせた後、アレイをレーザースキャンして得られたマイクロアレイデータを用いて、エストロゲン応答遺伝子（148種）の発現における各種エストロゲン類似活性を有する抽出物サンプルとE2との相関解析を実施し、直線回帰による相関係数（R）を求めた。
【００５０】
【表１】
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２．エストロゲン応答遺伝子（148種）の発現におけるエストロゲン（E2）と各種発酵物由来の抽出物サンプルとの相関解析結果（p＜0.01）を表１及び図３に示す。
【００５１】
表１及び図３に示したように、エストロゲン応答性遺伝子発現におけるレッドクローバーおよび亜麻種子それぞれ単独のムコール プシラス（M. pusillus)発酵産物由来の抽出物による変動発現遺伝子とエストロゲン応答遺伝子との相関係数（R）は、それぞれ0.57および0.42であり、エコール比べてかなりエストロゲン類似活性は低かった。しかしながら、レッドクローバーと亜麻種子の混合物の同カビ発酵産物由来の抽出物による発現変動遺伝子とエストロゲン応答遺伝子の相関係数（R）は0.82で、対照のエコールの0.82と同等であり、高いエストロゲン類似活性を有していた。このことは、レッドクローバーと亜麻種子の混合物のカビ発酵産物由来の抽出物はそれぞれの単独の抽出物に比べて相乗的なエストロゲン類似活性を発揮するということを示している。
【００５２】
【表２】
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３．エストロゲン応答遺伝子（148種）の機能別グループごとの発現におけるE2と各抽出物との相関解析（p＜0.01）
エストロゲン応答遺伝子（148種類）を酵素（enzymes）, シグナル（signaling）, 細胞増殖（proliferation）, 転写（transcription）, 細胞輸送（transport）, およびその他（others）の機能別グループに分けて、機能別グループごとの発現における各抽出物とE2との相関解析を実施した結果を表２及び図４に示す。
【００５３】
表２及び図４に示すように、機能別グループごとのE2によるエストロゲン応答遺伝子と、レッドクローバー単独のムコール プシラス（M. pusillus）発酵産物由来の抽出物による発現変動遺伝子の相関係数（R）は、エコールのそれらに比べて、シグナル伝達（signaling）グループおよび細胞内輸送 （transport）グループ以外のすべての機能グループで低値であり、また亜麻種子単独の場合は、ほとんどすべての機能グループでの相関係数（R）はエコールのそれらに比べて低値であった。しかしながら、レッドクローバーと亜麻種子の混合物（50 : 50 w/w）由来の抽出物はすべての機能別グループごとの相関係数（R）は対照のエコールのそれらとほぼ同程度に高い値を示した。
【００５４】
このようにエストロゲン応答遺伝子（148種）の機能別グループごとの発現におけるE2との相関解析からも、レッドクローバーと亜麻種子の混合物のカビ発酵産物からの抽出物はそれぞれの単独に比べて相乗的なエストロゲン様活性を発揮するということが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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