(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号７３−７５および１１８−１２０、配列番号７６−７８および１２１−１２３、または配列番号７０−７２および１１５−１１７の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１−３アミノ酸配列をそれぞれ含む、抗ＥＧＦＲ抗体分子；
ｂ）配列番号８２−８４および１２７−１２９、配列番号８５−８７および１３０−１３２、配列番号８８−９０および１３３−１３５または配列番号９１−９３および１３６−１３８の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１−３アミノ酸配列をそれぞれ含む、抗ＨＥＲ２抗体分子；および
ｃ）配列番号９７−９９および１４２−１４４、または配列番号１００−１０２および１４５−１４７の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１−３アミノ酸配列をそれぞれ含む、抗ＨＥＲ３抗体分子
を含む、医薬組成物。
【請求項２】
ａ）それぞれ、配列番号７３−７５および１１８−１２０、および配列番号７６−７８および１２１−１２３の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１−３アミノ酸配列を含む２つの別個の抗ＥＧＦＲ抗体分子；
ｂ）それぞれ、配列番号８２−８４および１２７−１２９、および配列番号８８−９０および１３３−１３５の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１−３アミノ酸配列を含む２つの別個の抗ＨＥＲ２抗体分子；および
ｃ）それぞれ、配列番号９７−９９および１４２−１４４、および配列番号１００−１０２および１４５−１４７の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１−３アミノ酸配列を含む２つの別個の抗ＨＥＲ３抗体分子
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ａ）それぞれ、配列番号７３−７５および１１８−１２０、および配列番号７６−７８および１２１−１２３の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１−３アミノ酸配列を含む２つの別個の抗ＥＧＦＲ抗体分子；
ｂ）それぞれ、配列番号８５−８７および１３０−１３２、および配列番号９１−９３および１３６−１３８の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１−３アミノ酸配列を含む２つの別個の抗ＨＥＲ２抗体分子；および
ｃ）それぞれ、配列番号９７−９９および１４２−１４４、および配列番号１００−１０２および１４５−１４７の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１−３アミノ酸配列を含む２つの別個の抗ＨＥＲ３抗体分子
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ａ）抗ＥＧＦＲ抗体分子が、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号２０の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む軽鎖、または配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号２４の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む軽鎖を含む；
ｂ）抗ＨＥＲ２抗体分子が、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３２の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む軽鎖、または配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号４０の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む軽鎖を含む；および
ｃ）抗ＨＥＲ３抗体分子が、配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号５２の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む軽鎖、または配列番号５４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号５６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む軽鎖を含む
請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
ａ）それぞれ、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号２０の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号２４の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む軽鎖を含む２つの別個の抗ＥＧＦＲ抗体分子；
ｂ）それぞれ、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３２の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号４０の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む軽鎖を含む２つの別個の抗ＨＥＲ２抗体分子；および
ｃ）それぞれ、配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号５２の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号５４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号５６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む軽鎖を含む２つの別個の抗ＨＥＲ３抗体分子
を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
ヒト化されている請求項１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体分子、抗ＨＥＲ２抗体分子および抗ＨＥＲ３抗体分子を含み、抗体分子の少なくとも１つがヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常ドメインを含む、医薬組成物
【請求項７】
抗体分子の少なくとも１つが、抗癌剤と結合した抗体を含む免疫複合体である、請求項１−６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
請求項１−６のいずれかに記載の組成物を生産するための方法であって、該組成物の抗体分子を発現することができるそれぞれの宿主細胞を提供すること、抗体分子の発現のために適した条件下で該宿主細胞を培養すること、および生じた抗体分子を単離することを含む、方法。
【請求項９】
ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体；
ｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体；
ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体；
ｉｖ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体；
ｖ）配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体；および
ｖｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体
を含む医薬組成物。
【請求項１０】
ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体；
ｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体；
ｉｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体；
ｉｖ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体；
ｖ）配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体；および
ｖｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体
を含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の組成物を生産するための方法であって、該組成物の抗体を発現することができるそれぞれの宿主細胞を提供すること、抗体の発現のために適した条件下で該宿主細胞を培養すること、および生じた抗体を単離することを含む、方法。
【請求項１２】
宿主細胞を単一のバイオリアクターにおいて培養する、請求項８または１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１−７、９および１０のいずれかに記載の組成物であって、それを必要とする患者を処置することにおける使用のための、組成物。
【請求項１４】
請求項１−７、９および１０のいずれかに記載の組成物であって、患者における癌の処置における使用のための、組成物。
【請求項１５】
癌が抗ＨＥＲ抗体またはチロシンキナーゼインヒビターでの処置に対して耐性の獲得を有する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１−７、９および１０のいずれかに記載の組成物であって、患者におけるＥＧＦＲ、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３依存により特徴付けられる障害の処置における使用のための、組成物。
【請求項１７】
患者がヒトである、請求項１３−１６のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーを標的とする新規組換え抗体およびヒト癌治療における使用のためのこれらの抗体の２またはそれ以上を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮増殖因子受容体ファミリー（ＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ／ＨＥＲファミリー）は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のサブグループであり、４つの成員：ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３およびＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４から成る。ＥＧＦＲファミリーの成員は、細胞外リガンド結合領域、単一の膜貫通ドメインおよび細胞内チロシンキナーゼを有する密接に関連した一本鎖モジュラー糖タンパク質である。通常の生理的状況では、ＥｒｂＢファミリーは細胞の増殖、分化および移動の調整において鍵となる事象を調節する。ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３は、正常細胞の悪性形質転換および癌細胞の持続的な増殖（プロ生存経路）において極めて重要な役割を果たすと考えられる。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２は多くの上皮癌によって過剰発現されることが認められている。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の過剰発現はさらに、いくつかのヒト上皮癌における疾患の進行、生存率の低下、応答不良および化学療法抵抗性に結びついてきた。悪性転換および癌進行におけるＨＥＲ４の役割は、議論されているが、ここでさらに議論しない。
【０００３】
ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２は、検証された癌標的であり、これらのチロシンキナーゼのモノクローナル抗体および小分子インヒビターの両方は、種々の癌の処置のために承認されている。ＨＥＲ３は、現在、可能性のある治療標的として探求されている。しかしながら、これらの治療に最初に応答する患者は、しばしば耐性の獲得の進展により再発する。前臨床試験は、耐性発現における非標的化受容体の１つまたは両方の関与を指摘する。したがって、ＥｒｂＢ受容体が、成長刺激性シグナル伝達および悪性表現型を維持するために、お互いに置き換わる能力を有するようである。したがって、２つまたは全３つの受容体の同時標的化が、ＥｒｂＢファミリー依存を有する癌細胞を阻害するさらに効率的な方法であり得る。
【０００４】
ＥＧＦＲは、ヒト外陰癌腫細胞系に由来するヒトｃＤＮＡのクローニングおよびシーケンシングにより最初に決定および記載された１１８６アミノ酸残基の単一のポリペプチド鎖からなる１７０ｋＤａ細胞表面糖タンパク質である。ＥＧＦＲは、３つの主なドメイン：細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよびチロシンキナーゼを含む細胞内ドメインを含む。ＥＧＦＲの触媒活性は、チロシンキナーゼドメイン（残基６８５−９５３）に帰属し、リガンド結合されると活性化される。
【０００５】
ＥＧＦＲは、２つの異なるコンフォメーション、すなわち束縛型(tethered)コンフォメーション（閉型）および拡張型(extended)コンフォメーション（開型）にて存在する。受容体は、２つのコンフォメーション間で移動する。束縛型コンフォメーションにおいて、ＥＧＦＲの細胞外領域のドメインＩＩおよびＩＶは相互作用し、自己阻害状態における受容体のままである。さらに、ドメインＩＩＩは、ドメインＩから有意な距離で維持されており、それによって、両方のドメインに対するＥＧＦの結合は同時に不可能である。ＥＧＦＲの拡張型コンフォメーションにおいて、ドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩは、Ｃ型に立体的に配置され、ＥＧＦ結合のための空間を与える。さらに、該構造変化は、「二量化アーム」としても知られているドメインＩＩにおける２０残基領域からなるβ−ヘアピンの暴露を誘導する。ＥＧＦＲのドメインＩＩから伸びる二量化アームは、別のＥＧＦＲのドメインＩＩと広大な接触を作り、それによりＥＧＦＲホモ二量体を形成する。
【０００６】
二量化は、受容体の調節領域におけるチロシン残基のリン酸化のために十分近い受容体の活性な細胞質チロシンキナーゼドメインをもたらす。さらに、２つの受容体の膜近傍領域は、チロシンキナーゼ二量体の安定化において重要であることが見出されている逆平行二量体を形成する。「リガンド媒介」二量化がさらに共通するテーマである他のチロシンキナーゼ受容体と比較して、「受容体媒介」二量化メカニズムは、ＥｒｂＢファミリーに関してユニークである。
【０００７】
ＥＧＦＲの細胞内チロシンキナーゼドメインの活性化の多くの様式が示唆されている。他の受容体チロシンキナーゼとは異なって、デフォルトによるＥＧＦＲチロシンキナーゼドメインは、リン酸化および活性化キナーゼにおいてのみ通常観察されるコンフォメーションをとる。これは、ＥＧＦＲのキナーゼドメインが構成的に活性であることを示す。したがって、構成的チロシンキナーゼの制御は、トランス−リン酸化に対する二量化パートナーのＣ−末端レギュレーター領域の送達を介して起こる。チロシンキナーゼドメインの活性化が結晶学的試験において視覚化されていない阻害相互作用の変位を含むという別の可能性がある。しかしながら、２つのＥＧＦＲの二量化時に形成されるチロシンキナーゼの非対称二量体がチロシンキナーゼ活性の制御のために重要であることということを、ＥＧＦＲの膜近傍およびチロシンキナーゼの結晶構造分析が示した。該非対称ホモ二量体において、チロシンキナーゼの１つはレシーバーを果たすが、他のチロシンキナーゼドナーを果たす。レシーバーキナーゼドメインのみが、触媒活性を有し、受容体のＣ−末端におけるチロシン残基をリン酸化する（シスまたはトランスまたは両方のいずれかが未知である）。
【０００８】
クラスリン−介在エンドサイトーシスは、ＥＧＦＲの下方制御の最も重要なメカニズムである。ＥＧＦＲの運命は、リガンド−受容体複合体の安定性に依存する。ＥＧＦがＥＧＦＲへ結合すると、ＥＧＦＲホモ二量体は、迅速にクラスリン−被覆ピットに標的化され、リガンド誘導エンドサイトーシスを介してインターナリゼーションされる(internalized)。同時に、ＥＧＦＲは、モノユビキチンおよびポリユビキチンの両方の結合により大きくユビキチン化される。ユビキチンリガーゼＣｂｌは、ＥＧＦＲのユビキチン化に関与する。Ｃｂｌは、直接的に、またはアダプタータンパク質、例えば、Ｇｒｂ２を介して間接的のいずれかで、ＥＧＦＲの調節領域におけるリン酸化チロシン残基へ結合する。Ｇｒｂ２を介するＥＧＦＲへのＣｂｌの結合は、受容体インターナリゼーションのために必要である。Ｅｓｐ１５はまた、ＥＧＦＲインターナリゼーションにおいて役割を果たす。しかしながら、Ｅｓｐ１５の正確な役割は、未だ議論されている。ユビキチン化は、ＥＧＦＲのエンドサイトーシス下方調節およびリソソームへのＥＧＦＲのエンドソーム選別に関与する。ユビキチン鎖は、輸送のために必要なエンドソーム選別複合体（ＥＳＣＲＴ）および初期エンドソームの膜にユビキチン化タンパク質を保持するＨｒｓ／ＳＴＡＭにより認識され、それによりＥＧＦＲの再循環を妨げる。次に、ＥＧＦＲは、管腔内粒子（ＩＬＶ）に分類され、後期エンドソームへのＥＧＦＲの送達および最後にリソソームにおける分解を引き起こす。
【０００９】
ＥＧＦＲの分解と対照的に、ＥＧＦに結合されるとき、ＴＧＦ−α結合は受容体再循環が可能である。ＴＧＦ−αリガンドは、酸性環境によって初期エンドソームにおいてＥＧＦＲから迅速に解離し、受容体脱リン酸化、脱ユビキチン化、およびそれによる細胞表面への受容体の再循環を引き起こす。ＥＧＦＲへのＥＰＲ結合は、ＥＧＦＲのエンドサイトーシス選別に対してＴＧＦ−αと同じ効果を有する。ＨＢ−ＥＧＦおよびＢＴＣの両方は、リソソーム分解のための全てのＥＧＦＲを標的とするが、ＡＲは、速いならびに遅いＥＧＦＲ再循環を引き起こす。
【００１０】
ヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ２またはＮｅｕ）は、最初に、１９８４年にＳｃｈｅｃｈｔｅｒらにより記載された。ＨＥＲ２は、１２３４個のアミノ酸からなり、４つのサブドメインＩ−ＩＶ、膜貫通ドメイン、膜近傍ドメイン、細胞内細胞質チロシンキナーゼおよび制御Ｃ−末端ドメインからなる細胞外ドメインを有するＥＧＦＲと構造的に類似している。
【００１１】
束縛型ＥＧＦＲにおけるドメイン配置を制限するドメインＩＩ−ＩＶ接触は、ＨＥＲ２に存在しない。不活性化ＥＧＦＲにおける束縛型を安定化させるために重要な７つの保存された残基のうちの３つは、ＨＥＲ２と異なっている。したがって、ＨＥＲ２は、暴露され、一見保たれている二量化アームを有する拡張型（開型）におけるＥＧＦＲに似ており、受容体−受容体相互作用を駆動する。束縛型ＨＥＲ２コンフォメーションの非存在は、受容体がＥｒｂＢファミリーの他のメンバーに対して見られるとおり自己阻害を欠いていることを示す。サブドメインＩ−ＩＩＩの安定な接合面は、ＥＧＦＲ−ＥＧＦ複合体の拡張型立体配置と同様の拡張型立体配置におけるＨＥＲ２を維持しているようである。ドメインＩおよびＩＩＩ間の相互作用は、ＥＧＦＲのドメインＩおよびＩＩＩにおけるリガンド−結合部位に対応する領域に関与し、リガンドに対する立体的空間をなくし、ＨＥＲ２をリガンドへ結合することを不可能にする。ドメインＩＩおよびＩＶは、ＥｒｂＢファミリーのＨＥＲ２および別のメンバーのヘテロダイマー形成を安定化させる２つの別個の接合面を形成する。
【００１２】
生物物理学試験は、溶液または結晶において重要なＨＥＲ２ホモ二量化を検出しなかった。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のドメインＩＩの残基は類似である。しかしながら、二量体接合面でのＡｒｇ２８５は、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２間で保存されていなかった。ＨＥＲ２において、残基２８５はＬｅｕである。変異試験は、該位置のＬｅｕが溶液においてＨＥＲ２ホモ二量体の非存在と部分的に関与することを示す。インビボでの無傷なＨＥＲ２の二量化は、ＨＥＲ２の膜貫通ドメインにおける部位のさらなる相互作用を必要とし得る。
【００１３】
ＨＥＲ２は、既知のリガンドに結合しないＥｒｂＢファミリーの唯一のメンバーである。ＨＥＲ２は代わりに、他のＥｒｂＢファミリーメンバーを有する異種複合体の形成によって活性化され、それによりＥＦＧＲおよびＨＥＲ３リガンドにより間接的に調節される。ＨＥＲ２は、３つの他のＥｒｂＢ受容体の好ましいヘテロ二量化パートナーである。ＨＥＲ２は、リガンド受容体複合体解離速度を遅くすることによりそれらのリガンドの他のＥｒｂＢ受容体の親和性を増強させ、それによってＨＥＲ２はシグナル伝達を増強および延長させる。他のＥｒｂＢ受容体のリガンド親和性を増強させるＨＥＲ２の能力は、ヘテロ二量化パートナーとして、ＨＥＲ２の雑多な性質を反映し得る。ＨＥＲ２およびＥｒｂＢファミリーの別のリガンド結合受容体のヘテロ二量化は、クロスリン酸化を引き起こし、Ｃ−末端チロシン残基のリン酸化をもたらす。最も活動的なＨＥＲ２ヘテロダイマーは、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３複合体である。ＨＥＲ２は、活性キナーゼを提供することによりキナーゼ欠失ＨＥＲ３を補足する。
【００１４】
ＥＧＦＲと対照的に、ＨＥＲ２は、過剰発現されるとき、インターナリゼーション耐性である。ＨＥＲ２の過剰発現は、さらに、他のＥｒｂＢファミリーメンバーのエンドサイトーシスを阻害することが報告されている。ＨＥＲ２がリソソーム分解を免れ、それにより細胞膜に残存する２つもメカニズムが示唆されている。ＨＥＲ２がインターナリゼーションを回避するか、またはそれが効率的にエンドソームから再循環され、細胞膜に戻る。標識された抗体を使用する試験は、ＨＥＲ２が常にインターナリゼーションされ、再循環されることを示した。対照的に、他の試験は、再循環を阻害することが知られている化合物で処理された細胞において細胞内ＨＥＲ２を同定しなかった。
【００１５】
ＨＥＲ２のカルボキシル末端が、インターナリゼーションのために必要な全てのシグナルを有さないこと、またはそれが、クラスリン−介在エンドサイトーシスのために必須の阻害シグナルを含むことを提案している。さらに、試験は、ＨＥＲ２ヘテロダイマーが、エンドソームに送達されないことを示した。ＥＧＦＲ上に見られる１つのようなＣｂｌドッキング部位はまた、ＨＥＲ２（Ｙ１１１２）に同定されている。それにより、Ｃｂｌは、ＨＥＲ２に補充され、ＨＥＲ２のユビキチン化を引き起こし得るが、Ｃｂｌの実際結合効率は不明である。ＨＥＲ２が膜突出との結合によってインターナリゼーション耐性であることが提案されている。最後に、他の試験は、ＨＥＲ２−ＥＧＦＲヘテロダイマーのエンドサイトーシス耐性が、クラスリン−被覆ピットの非効率的なＥＧＦ−誘導形成と関連することを示した。
【００１６】
ヒト上皮増殖因子受容体３としても知られるＥｒｂＢファミリーの３番目の成員（ＨＥＲ３、ＥｒｂＢ３）は、１９８９年にＫｒａｕｓ  Ｍ．  Ｈらによって同定された。ＨＥＲ３遺伝子は１３４２アミノ酸のタンパク質をコードし、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２と顕著な構造類似性を有する。全体的な大きさ、２つのシステインクラスター（ドメインＩＩおよびＩＶ）を伴う４つの細胞外サブドメイン（Ｉ〜ＩＶ）、ならびにチロシンキナーゼドメインなどの特徴は、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２と構造類似性を示す。ＨＥＲ３のチロシンキナーゼドメインは、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメインと５９％の配列相同性を示す。
【００１７】
ＥＧＦＲと同様に、ＨＥＲ３は繋留立体配座と伸長立体配座で存在する。繋留立体配座では、二量体化アームがドメインＩＶとの相互作用によって埋没し、ドメインＩとＩＩＩは効率的なリガンド結合のためには離れすぎている。細胞外ドメインＩおよびＩＩＩへのリガンド結合はＨＥＲ３の伸長立体配座で起こり、ＥｒｂＢファミリーの他の成員とのヘテロ二量体化をもたらし、伸長したリガンド結合ＨＥＲ３分子はＨＥＲ２と優先的にヘテロ二量体化する。リガンド結合時にＨＥＲ３ホモ二量体は形成されない。伸長およびリガンド結合ＨＥＲ３分子は、優先的にＨＥＲ２とヘテロ二量体化する。
【００１８】
ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２と異なり、ＨＥＲ３のチロシンキナーゼは触媒活性が損なわれており、検出可能な生物学的応答のためには不十分である。プロテインキナーゼの触媒ドメインにおいて高度に保存された２つのアミノ酸残基は、ＨＥＲ３の触媒ドメインでは変化している。これらは、残基８１５のアスパラギン酸のアスパラギンによる置換および残基７４０のグルタミン酸のヒスタミンによる置換である。これら２つのアミノ酸置換が、ＨＥＲ３がそのチロシンキナーゼドメインの触媒活性を欠く理由であると考えられる。ＨＥＲ３の内因性キナーゼ活性の低下のせいで、受容体は、それ自体のリガンド結合に応答するために別のＥｒｂＢファミリー成員とヘテロ二量体化する必要がある。
【００１９】
ＨＥＲ３のエンドサイトーシスについてはほとんど知られていない。その上、種々の試験が、ＨＥＲ３はＨＥＲ２と同程度にエンドサイトーシスが低下していることを示唆している。これと一致して、ＨＥＲ３−ＮＲＧ１複合体はＥＧＦＲ−ＥＧＦ複合体よりもインターナリゼーションが非効率的で、より緩慢であることが認められており、ＨＥＲ３がＥＧＦＲほど効率よくエンドサイトーシスされないという考え方を裏づける。しかし、ＥＧＦＲのＣ末端尾部がＨＥＲ３のＣ末端尾部で置換された場合、ＥＧＦＲはエンドサイトーシス障害となり、ＨＥＲ３のＣ末端の領域が受容体をインターナリゼーションから保護することを示唆した。また、ＮＲＧ１は、ＥＧＦがＴＧＦαによって活性化される場合に認められるように、エンドソームにおけるリガンド−受容体複合体の解離のためにＨＥＲ３を効率的に標的として分解に至らしめることもないと示唆されている。
【００２０】
ＥｒｂＢファミリーの標的化は、癌処置戦略として最近１０年間で非常に実行されている。異なる処置様式例えば、チロシンキナーゼインヒビター（ＴＫＩ）、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびリガンドトラップが、探索されている。癌の処置のためのモノクローナル抗体の利点は、標的特異性であり、慣用の細胞毒性癌化学療法と比較して低い毒性を保証する。モノクローナル抗体は、異常に高レベルのＥＧＦＲまたはＨＥＲ２を有する固形腫瘍の処置に対して承認されており、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２を標的とする多数のｍＡｂが臨床試験を行われている。ＴＫＩは、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のチロシンキナーゼドメインにおけるＡＴＰ−結合部位に結合することにより受容体シグナル伝達を阻害する。エルロチニブ／タルセバ（登録商標）は、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼを阻害し、ラパチニブ／タイケルブ（登録商標）は、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の両方のチロシンキナーゼを阻害する。エルロチニブおよびラパチニブ(laptinib)は、両方、非小肺癌（ＮＳＣＬＣ）およびＨＥＲ２を過剰発現する転移乳癌のそれぞれの処置における使用のためのＦＤＡ承認ＴＫＩである。
【００２１】
しかしながら、モノクローナル抗体治療およびＴＫＩ臨床的有用性にもかかわらず、処置に対して耐性の獲得の発達は増加している問題である。ｍＡｂおよび慣用の細胞毒性化学療法の組合せ治療は、処置有効性を増加させるために行われているアプローチの１つである。さらに、いくつかの戦略は、モノクローナル抗体の有効性を増加させるため、エフェクター機能の増強を含むため、および直接的または間接的な放射性核種または毒素で抗体を武装するために試験されている。別の戦略は、異なる標的に対するｍＡｂの組合せである。
【００２２】
ＥｒｂＢ受容体のデュアル阻害に対する科学的論理的根拠は、単一の受容体標的化よりもデュアルＥｒｂＢアプローチを利用する優れた抗腫瘍活性をもたらした多くのインビトロおよびインビボ前臨床試験において築かれた。モノクローナル抗体混合物によるＥＧＦＲおよびＨＥＲ２における多数のエピトープの同時標的化は、インビトロおよびインビボにてｍＡｂよりも優れていることが証明され（Friedman et al., PNAS 2005, 102:1915-20）、ＴＫＩゲフィチニブ、および２つのｍＡｂトラスツマブおよびペルツズマブ間の組合せは、ＨＥＲ２を過剰発現する乳癌細胞の異種移植片腫瘍を有するマウスにおいて、任意の単剤と比較して有意に改善された抗腫瘍有効性を提供している（Arpino et al., J Natl Cancer Inst 2007, 99:694-705）。
【００２３】
ＥｒｂＢ受容体ファミリーにおける受容体チロシンキナーゼの共活性化の能力は、インビトロにて発がん性形質転換中に起こることが観察され、ヒト原発性腫瘍の発生および進行において重要な役割を果たすようである。さらに、ＥｒｂＢファミリーメンバーの共同役割は、ＥｒｂＢを過剰発現する癌細胞におけるｍＡｂおよびＴＫＩに対する耐性が他のＥｒｂＢファミリーメンバーの活性の増加と関連することを証明するインビトロおよびインビボ試験により支持されている。ＲＴＫ共活性化は、ネットワークロバスト性を獲得し、シグナル伝達結果の多様性を増加させるために、癌細胞が２またはそれ以上のＲＴＫを同時に活性化することができる。ＲＴＫ共活性化は、多数の癌型において、特にＴＫＩに対して耐性の獲得において反復され、ＲＴＫ共活性化の結果として切り替わる癌遺伝子は、癌細胞が下流シグナル伝達分子の継続活性を介する化学耐性をなし遂げる一般的なメカニズムであり得ることを示唆する。ＲＴＫ共活性化は、活性化受容体チロシンキナーゼの階層を証明し、したがって、ドミナントＲＴＫの不活性化後、二次的(secondary)ＲＴＫの迅速な補償を可能にするPillay et al, Neplasia 2009; 11: 448-58, 2による試験においてさらに記載されている。二次的ＲＴＫの共活性化は、自己分泌−パラクリン成長因子分泌、ドミナントＲＴＫによる直接的リン酸転移、シグナル伝達中間体、例えばＳｒｃを介する間接的リン酸化、または転写制御を介して起こり得る。ドミナントＲＴＫの例はＥＧＦＲおよびＨＥＲ２を含み、二次的ＲＴＫはＨＥＲ３を含み得る。
【００２４】
高レベルのＥｒｂＢファミリー受容体を有する癌の処置のために使用されるｍＡｂおよびＴＫＩに対する耐性を克服するための可能な戦略は、発がん性ＲＴＫシグナル伝達を中断し、代償メカニズムを克服するために、多数のＥｒｂＢ受容体の同時標的化を含む。このような戦略は、強力なＥｒｂＢシグナル伝達ネットワークへの非一般的な摂動を誘導し、それにより、うまくいけば耐性の発達を克服する。
【発明の概要】
【００２５】
本発明は、ＨＥＲファミリーの多数のメンバーを非常に広範に妨げる（ｐａｎ−ＨＥＲ阻害）ＨＥＲファミリー内の受容体に対する改善された治療である。さらに特に、本発明は、受容体ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３の１つ以上に依存して、ヒト癌治療、例えば乳癌、卵巣癌、胃癌、肺癌および他の癌の処置のための抗体組成物の使用である。このような癌に対する現在利用できる処置、例えばＨＥＲファミリーの受容体に対する利用できるモノクローナル抗体、抗体の組合せならびに小分子と比較して、本発明の抗体組成物は、単独、または所望により他の処置、例えば化学療法と組み合わせてのいずれかで優れた臨床応答を提供し得ると考えられる。
【００２６】
１つの局面において、本発明は、少なくとも１つの別個の抗ＨＥＲ抗体分子が第１のＨＥＲファミリー受容体の抗原に結合し、少なくとも１つの別個の抗ＨＥＲ抗体分子が第２のＨＥＲファミリー受容体の抗原に結合する組換え抗体組成物に関する。
【００２７】
さらなる局面において、本発明は、少なくとも１つの別個の抗ＨＥＲ抗体分子が第１のＨＥＲファミリー受容体の抗原に結合し、少なくとも１つの別個の抗ＨＥＲ抗体分子が第２のＨＥＲファミリー受容体の抗原に結合し、少なくとも１つの別個の抗ＨＥＲ抗体分子が第３のＨＥＲファミリー受容体の抗原に結合する組換え抗体組成物に関する。
【００２８】
好ましくは、本発明は組換え抗体組成物に関し、該組成物は、１２５４、１２７７または１５６５に由来するＣＤＲを有するか、または１２５４、１２７７または１５６５の結合を阻害することができる、および／または１２５４、１２７７または１５６５と同じエピトープに結合する少なくとも１つの抗ＥＧＦＲ抗体；４３８４、４３８５、４５１７または４５１８に由来するＣＤＲを有するか、または４３８４、４３８５、４５１７または４５１８の結合を阻害することができる、および／または４３８４、４３８５、４５１７または４５１８と同じエピトープに結合する少なくとも１つの抗ＨＥＲ２抗体；ならびに、５０３８または５０８２に由来するＣＤＲを有するか、または５０３８または５０８２の結合を阻害することができる、および／または５０３８または５０８２と同じエピトープに結合する少なくとも１つの抗ＨＥＲ３抗体を含む。本発明の特定の好ましい態様において、抗体組成物は、抗体１２７７＋１５６５＋４３８４＋４５１７＋５０３８＋５０８２のＣＤＲを有する抗体、または、該抗体の結合を阻害することができる、および／または該抗体と同じエピトープに結合する抗体を含む。
【００２９】
本発明の典型的な抗体組成物は、癌の処置におけるインビボ使用につながる、典型的な癌細胞系の増殖の阻害において有効であることが証明された。これらの指示的結果(indicative result)は、マウスにおけるヒト癌の異種移植片モデルにおいて確認された。
【００３０】
さらなる局面において、本発明は、抗癌剤と結合した本発明の組換え抗体組成物を含む免疫複合体に関する。
【００３１】
さらなる局面において、本発明は、本発明の抗体をコードする核酸分子、該核酸を含む発現ベクターおよび該核酸または発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
【００３２】
さらなる局面において、本発明は、本発明の抗体組成物を生産するための方法に関する。
【００３３】
なおさらなる局面において、本発明は、本発明の抗体組成物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【００３４】
さらに、本発明は、ヒトまたは他の哺乳動物における癌を処置するための方法であって、治療有効量の本発明の抗体組成物のそれを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。
【００３５】
なおさらなる局面において、本発明は、抗体および／またはＴＫＩでの処置に対して耐性の獲得を有するヒトまたは他の哺乳動物における、医薬として使用のための、癌の処置における使用のための、および／または癌の処置における使用のための、本発明の抗体組成物に関する。
【００３６】
さらなる局面において、本発明は、癌治療における同時、別々または連続投与のための組み合わせとして、本発明の抗体組成物および少なくとも１つの化学療法または抗新生物化合物を含む医薬品に関する。本発明の抗体組成物が、第２選択処置、すなわち慣用の化学療法または抗新生物剤を使用する処置の後または同時に、あるいは、放射線療法および／または外科手術の後または同時に使用することができる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】Ａ）９６時間異なる濃度の示された抗体および抗体混合物で処置されたＡ４３１ＮＳ細胞の代謝活性。Ｂ）９６時間異なる濃度の示された抗体および抗体混合物で処置されたＮＣＩ−Ｎ８７細胞の代謝活性。Ｃ）９６時間１０ｎＭのヘレグリンベータの存在下で異なる濃度の示された抗体および抗体混合物で処置されたＭＣＦ７細胞の代謝活性。
【図２】９６時間異なる濃度の示された混合物で処置されたＡ４３１ＮＳ細胞の代謝活性。
【図３】９６時間異なる濃度の示された抗体混合物で処置されたＭＣＦ７細胞の代謝活性。
【図４】９６時間１０ｎＭのヘレグリンベータの存在下で異なる濃度の示された抗体混合物で処置されたＮＣＩ−Ｎ８７細胞の代謝活性。
【図５】９６時間異なる濃度の示された抗体混合物および参照モノクローナル抗体セツキシマブおよびトラスツマブで処置されたＡ４３１ＮＳ細胞、９６時間異なる濃度の示された抗体混合物および参照モノクローナル抗体セツキシマブおよびトラスツマブで処置されたＮＣＩ−Ｎ８７細胞、ならびに９６時間１０ｎＭのヘレグリンベータの存在下で異なる濃度の示された抗体混合物および参照モノクローナル抗体セツキシマブおよびトラスツマブで処置されたＭＣＦ７細胞の代謝活性。
【図６】９６時間２μｇ／ｍｌの示された抗体および抗体混合物で処置された示された細胞系の成長阻害の最大レベル。
【図７】示された抗体および抗体混合物で一晩処置後の細胞系ＨＮ５、ＮＣＩ−Ｎ８７およびＭＣＦ７におけるＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３レベルのウェスタンブロット分析。
【図８】癌細胞系Ａ４３１ＮＳ（ＥＧＦＲ−依存）、Ｈ３５８（ＥＧＦＲ−依存）、ＨＣＣ２０２（ＨＥＲ２−依存）、ＯＥ１９（ＨＥＲ２−依存）およびＨ８２０（ＥＧＦＲ−依存）の成長および増殖における異なる抗体混合物および抗体の効果を示す滴定。
【図９】癌細胞系Ａ４３１ＮＳ（ＥＧＦＲ−依存）、Ｈ３５８（ＥＧＦＲ−依存）、ＨＣＣ２０２（ＨＥＲ２−依存）、ＯＥ１９（ＨＥＲ２−依存）およびＨ８２０（ＥＧＦＲ−依存）の成長および増殖における異なる抗体混合物および抗体の効果を示す滴定。
【図１０】癌細胞系Ａ４３１ＮＳ（ＥＧＦＲ−依存）、Ｈ３５８（ＥＧＦＲ−依存）、ＨＣＣ２０２（ＨＥＲ２−依存）、ＯＥ１９（ＨＥＲ２−依存）およびＨ８２０（ＥＧＦＲ−依存）の成長および増殖における異なる抗体混合物および抗体の効果を示す滴定。
【図１１】癌細胞系Ａ４３１ＮＳ（ＥＧＦＲ−依存）、Ｈ３５８（ＥＧＦＲ−依存）、ＨＣＣ２０２（ＨＥＲ２−依存）、ＯＥ１９（ＨＥＲ２−依存）およびＨ８２０（ＥＧＦＲ−依存）の成長および増殖における異なる抗体混合物および抗体の効果を示す滴定。
【図１２】癌細胞系Ａ４３１ＮＳ（ＥＧＦＲ−依存）、Ｈ３５８（ＥＧＦＲ−依存）、ＨＣＣ２０２（ＨＥＲ２−依存）、ＯＥ１９（ＨＥＲ２−依存）およびＨ８２０（ＥＧＦＲ−依存）の成長および増殖における異なる抗体混合物および抗体の効果を示す滴定。
【図１３】一晩示された抗体および抗体混合物で処置後の細胞系Ｈ２９２およびＯＶＣＡＲ−８におけるＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３レベルのウェスタンブロット分析。
【図１４】癌細胞系ＯＥ１９、ＢＴ４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ、ＨＣＣ２０２、Ｎ８７、Ａ４３１ＮＳおよびＡ５４９の成長および増殖における異なる抗体混合物および抗体の効果を示す滴定。
【図１５】癌細胞系ＯＥ１９、ＢＴ４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ、ＨＣＣ２０２、Ｎ８７、Ａ４３１ＮＳおよびＡ５４９の成長および増殖における異なる抗体混合物および抗体の効果を示す滴定。
【図１６】癌細胞系ＯＥ１９、ＢＴ４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ、ＨＣＣ２０２、Ｎ８７、Ａ４３１ＮＳおよびＡ５４９の成長および増殖における異なる抗体混合物および抗体の効果を示す滴定。
【図１７】癌細胞系ＯＥ１９、ＢＴ４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ、ＨＣＣ２０２、Ｎ８７、Ａ４３１ＮＳおよびＡ５４９の成長および増殖における異なる抗体混合物および抗体の効果を示す滴定。
【図１８】癌細胞系ＯＥ１９、ＢＴ４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ、ＨＣＣ２０２、Ｎ８７、Ａ４３１ＮＳおよびＡ５４９の成長および増殖における異なる抗体混合物および抗体の効果を示す滴定。
【図１９】癌細胞系ＯＥ１９、ＢＴ４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ、ＨＣＣ２０２、Ｎ８７、Ａ４３１ＮＳおよびＡ５４９の成長および増殖における異なる抗体混合物および抗体の効果を示す滴定。
【図２０】癌細胞系ＯＥ１９、ＢＴ４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ、ＨＣＣ２０２、Ｎ８７、Ａ４３１ＮＳおよびＡ５４９の成長および増殖における異なる抗体混合物および抗体の効果を示す滴定。
【図２１】癌細胞系Ａ４３１ＮＳ、Ｈ１９７５、ＨＣＣ２０２、ＡＵ５６５およびＨ３５８の成長および増殖における異なる抗体混合物および抗体の効果を示す滴定。
【図２２】癌細胞系Ａ４３１ＮＳ、Ｈ１９７５、ＨＣＣ２０２、ＡＵ５６５およびＨ３５８の成長および増殖における異なる抗体混合物および抗体の効果を示す滴定。
【図２３】癌細胞系Ａ４３１ＮＳ、Ｈ１９７５、ＨＣＣ２０２、ＡＵ５６５およびＨ３５８の成長および増殖における異なる抗体混合物および抗体の効果を示す滴定。
【図２４】癌細胞系Ａ４３１ＮＳ、Ｈ１９７５、ＨＣＣ２０２、ＡＵ５６５およびＨ３５８の成長および増殖における異なる抗体混合物および抗体の効果を示す滴定。
【図２５】癌細胞系Ａ４３１ＮＳ、Ｈ１９７５、ＨＣＣ２０２、ＡＵ５６５およびＨ３５８の成長および増殖における異なる抗体混合物および抗体の効果を示す滴定。
【図２６】Ａ４３１ＮＳヒト腫瘍異種移植片モデルにおける異なる抗体混合物および抗体の成長阻害効果。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
定義
「抗体」または「抗体分子」という用語は血清の機能性成分を表し、しばしば分子（抗体もしくは免疫グロブリン）の集合体または１つの分子（抗体分子もしくは免疫グロブリン分子）と称される。抗体は、特異的抗原決定基（抗原または抗原性エピトープ）と結合または反応することができ、続いて免疫学的エフェクター機構の誘導を導き得る。個々の抗体は通常単一特異性とみなされ、抗体の組成物はモノクローナル（すなわち同一の抗体分子から成る）またはポリクローナル（すなわち同じ抗原またはさらには別個の異なる抗原上の同一または異なるエピトープと反応する２またはそれ以上の異なる抗体から成る）であり得る。それぞれの抗体は、その対応する抗原に特異的に結合することを可能にする独特の構造を有し、すべての天然抗体は、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖の同じ全体的基本構造を有する。抗体はまた、集合的に免疫グロブリンとしても知られる。
【００３９】
本明細書中で使用される「抗体（単数または複数）」という用語はまた、キメラおよび一本鎖抗体、ならびにＦａｂ、Ｆｖフラグメントまたは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントなどの抗体の結合フラグメント、ならびに二量体ＩｇＡ分子または五価ＩｇＭなどの多量体形態を包含するものとする。抗体模擬物も包含される。抗体は、ヒトもしくは非ヒト起源、例えばマウスもしくは他のげっ歯動物由来の抗体、または、例えばマウス抗体に基づく、キメラ、ヒト化もしくは再構成抗体であり得る。抗体の各重鎖は、典型的には重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、典型的にはＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３と称される３つのドメインを含む。各抗体軽鎖は、典型的には軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、典型的にはＣＬと称される単一ドメインを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、超可変性の領域（配列および／または構造的に規定されるループにおいて超可変的であり得る、「超可変領域」）にさらに細分され得る。これらはまた、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が間に介在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される。各ＶＨおよびＶＬは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端の方向にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置された、３つのＣＤＲと４つのＦＲを含む。可変領域内のアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔの番号付け方式として知られる標準化された番号付け方法を用いて番号付けされることが多い（Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、米国メリーランド、ベセスダ）。
【００４０】
抗体が本明細書で述べる特定の抗体に「由来する」または「基づく」と記載されているとき、これは、「由来される」抗体は、特定の状況によって、以下の１つを含むことを意味する：前記特定抗体の重鎖ＣＤＲ３配列；前記特定抗体の重鎖ＣＤＲ３配列と軽鎖ＣＤＲ３配列；前記特定抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列と軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；または前記特定抗体の重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列、または前記重鎖可変領域配列および／もしくは軽鎖可変領域配列のヒト化および／もしくは親和性成熟変異体、またはそれぞれの重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％配列同一性、例えば少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％配列同一性を有する重鎖および／もしくは軽鎖可変領域配列。本明細書で述べる特定の抗体に由来するまたは基づく抗体は、一般に前記特定抗体と同じエピトープに結合し、好ましくは前記特定抗体と実質的に同じ活性を示す。抗体は、前記特定抗体と結合に関して競合する場合、前記特定抗体と同じＨＥＲエピトープに結合するとみなされる。
【００４１】
抗体の標的抗原との相互作用の特異性は、主として重鎖および軽鎖の６つのＣＤＲ内に位置するアミノ酸残基に存する。ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、それゆえ、ＣＤＲの外側の配列よりも個々の抗体間ではるかに可変的である。ＣＤＲ配列は大部分の抗体−抗原相互作用に関与するので、異なる抗体からのフレームワーク配列に移植された特異的抗体からのＣＤＲ配列を発現する発現ベクターを構築することにより、特異的な天然の抗体またはより一般的に所与のアミノ酸配列を有する任意の特異的抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現することが可能である。結果として、非ヒト抗体を「ヒト化」し、なおも元の抗体の結合特異性および親和性を実質的に維持することが可能である。ヒト化についてのより詳細な考察を以下で述べる。
【００４２】
「キメラ抗体」は、その最も広い意味で、１つの抗体からの１またはそれ以上の領域と１またはそれ以上の他の抗体からの１またはそれ以上の領域を含む抗体を指す。本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」は、一般に、部分的にヒト起源であり、かつ部分的に非ヒト起源である、すなわち一部が非ヒト動物、例えばマウスもしくは他のげっ歯動物またはニワトリなどの鳥類に由来する抗体である。キメラ抗体は、ヒトの抗抗体応答、例えばネズミ抗体の場合にはヒトの抗マウス抗体応答の危険性を低減するために、非ヒト抗体よりも好ましい。典型的なキメラ抗体の一例は、可変領域配列がマウスの免疫化に由来するネズミ配列であり、一方定常領域配列はヒトである抗体である。キメラ抗体の場合、非ヒト部分、すなわち典型的には可変領域配列のフレームワーク領域は、抗体をヒト化するためにさらなる変化に供され得る。
【００４３】
「ヒト化する」という用語は、抗体が完全にまたは部分的に非ヒト起源であるという事実、例えば対象とする抗原でのマウスの免疫化から得られたネズミ抗体またはそのようなネズミ抗体に基づくキメラ抗体を指し、ヒトにおける免疫応答を回避するまたは最小限に抑えるために特定のアミノ酸、特にフレームワーク領域ならびに重鎖および軽鎖の定常ドメインのアミノ酸を置換することが可能である。すべての抗体はヒトの抗抗体応答を惹起する潜在能を有し、ヒトの抗抗体応答は、問題の抗体の「ヒトらしさ(humanness)」の度合いとある程度相関することが知られている。免疫原性を正確に予測し、それによって特定の抗体のヒト抗抗体応答を予測することは不可能であるが、非ヒト抗体はヒト抗体よりも免疫原性が高い傾向がある。異種（通常はげっ歯動物）定常領域がヒト起源の配列で置換されたキメラ抗体は、一般に完全な異種起源の抗体よりも免疫原性が低く、治療用抗体はヒト化または完全ヒト抗体を目指す傾向にある。
【００４４】
キメラ抗体または他の非ヒト起源の抗体に関しては、それゆえ、ヒトの抗抗体応答の危険性を低減するためにヒト化されることが好ましい。キメラ抗体に関して、ヒト化は、典型的には可変領域配列のフレームワーク領域の修飾を含む。相補性決定領域（ＣＤＲ）の一部であるアミノ酸残基は、典型的にはヒト化に関連して変化させないが、一部の場合には、例えばグリコシル化部位、脱アミド化部位または望ましくないシステイン残基を除去するために、個々のＣＤＲアミノ酸残基を変化させることが望ましいと考えられる。Ｎ結合グリコシル化は、トリペプチド配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ［式中、ＸはＰｒｏを除く任意のアミノ酸であり得る］中のアスパラギン残基へのオリゴ糖鎖の連結によって起こる。Ｎグリコシル化部位の除去は、好ましくは保存的置換によって、ＡｓｎまたはＳｅｒ／Ｔｈｒ残基のいずれかを異なる残基に突然変異させることによって達成され得る。アスパラギンおよびグルタミン残基の脱アミド化は、ｐＨおよび表面露出などの因子に依存して起こり得る。アスパラギン残基は、主として配列Ａｓｎ−Ｇｌｙ中に存在する場合、およびより低い度合いでＡｓｎ−Ａｌａなどの他のジペプチド配列中に存在する場合、特に脱アミド化を受けやすい。そのような脱アミド化部位、特にＡｓｎ−ＧｌｙがＣＤＲ配列中に存在する場合は、それゆえ、典型的には関与する残基の１つを除去する保存的置換によって、その部位を除去することが望ましいと考えられる。１つの関連する残基を除去するＣＤＲ配列における置換もまた、本発明により包含されることを意図する。
【００４５】
抗体配列のヒト化の数多くの方法が当分野において公知である；例えばＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ（２００８）Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３による総説参照。１つの一般的に使用される方法はＣＤＲ移植であり、この方法は、例えばネズミ由来のキメラ抗体に関しては、ネズミ可変領域遺伝子に対するヒト生殖細胞遺伝子対応物の同定およびこのフレームワークへのネズミＣＤＲ配列の移植を含む。ＣＤＲ移植はＫａｂａｔのＣＤＲ定義に基づき得るが、最近の公表文献（Ｍａｇｄｅｌａｉｎｅ−Ｂｅｕｚｅｌｉｎら（２００７）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ．６４：２１０−２２５）は、ＩＭＧＴの定義（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）がヒト化の結果を改善し得ることを示唆した。ＣＤＲ移植は、ＣＤＲ移植した非ヒト抗体の結合特異性および親和性、したがって生物活性を低下させ得るので、親抗体の結合特異性および親和性を保持するためにＣＤＲ移植した抗体の選択位置に復帰突然変異を導入し得る。可能な復帰突然変異のための位置の同定は、文献および抗体データベースにおいて入手可能な情報を用いて実施することができる。復帰突然変異の候補であるアミノ酸残基は、典型的には抗体分子の表面に位置するものであるが、埋もれた残基または表面露出の度合いが低い残基は通常変化させない。ＣＤＲ移植と復帰突然変異に代わる選択的ヒト化技術は、非ヒト起源の非表面露出残基を保持し、表面残基をヒト残基に変化させる、表面再構成である。
【００４６】
特定の場合には、標的エピトープに対する結合親和性を改善するために１またはそれ以上のＣＤＲアミノ酸残基を変化させることも望ましいと考えられる。これは「親和性成熟」として知られ、例えば抗体のヒト化が結合特異性または親和性の低下をもたらし、復帰突然変異だけでは結合特異性または親和性を十分に改善することができない状況では、場合によりヒト化と併せて実施され得る。様々な親和性成熟方法が当分野において公知であり、例えばＢｕｒｋｓら（１９９７）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９４巻、４１２−４１７頁によって記述されたインビトロスキャニング飽和突然変異誘発およびＷｕら（１９９８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９５巻、６０３７−６０４２頁の段階的インビトロ親和性成熟法が挙げられる。
【００４７】
上述したように、本発明は、ヒト化抗体、すなわちヒト化に供されたと表される抗体を包含する。これらは、本発明の抗体の「ヒト化変異体」とも称され得る。特に、任意の特異的アミノ酸配列に関して本明細書で使用される「重鎖可変領域配列」および「軽鎖可変領域配列」という用語は、その特異的配列だけでなくその任意のヒト化変異体も包含するものとする。本明細書で述べる抗ＨＥＲ抗体の親和性成熟変異体も本発明に包含されるものとする。
【００４８】
本明細書で使用される場合、例えば参照配列と少なくとも９０％または９５％配列同一性、例えば少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有する、特定の重鎖可変領域または軽鎖可変領域配列と比較して、特定の最小レベルの配列同一性を有する重鎖可変領域配列または軽鎖可変領域配列と言えば、そのような参照配列のヒト化および／または親和性成熟変異体を包含するが、これらに限定はされないものとする。
【００４９】
「組換え抗体」という用語は、抗体のコード配列を含む１つの発現ベクター（またはおそらく２以上の発現ベクター、典型的には２つの発現ベクター）でトランスフェクトされた細胞または細胞株から発現される抗体であって、前記コード配列が天然では該細胞に結合していない、抗体を指す。
【００５０】
「ベクター」という用語は、核酸配列が、異なる遺伝的環境の間での輸送のためおよび／または宿主細胞における発現のために挿入され得る核酸分子を指す。核酸配列の転写のための調節エレメント（少なくとも適切なプロモーター）を担持するベクターは、「発現ベクター」と称される。「プラスミド」と「ベクター」という用語は互換的に使用され得る。本発明に関連して使用される発現ベクターは、当分野で公知の任意の適切な種類、例えばプラスミドまたはウイルスベクターであり得る。
【００５１】
「ポリクローナル抗体」または「（モノクローナル）抗体の混合物」という用語は、同じまたは異なる抗原上の異なる特異的抗原決定基と結合するまたは反応することができる２またはそれ以上の異なる抗体分子の組成物を指す。本発明に関連して、ポリクローナル抗体の個々の抗体は、ＨＥＲファミリーの異なる抗原決定基に結合する。好ましくは、本発明のポリクローナル抗体の個々の抗体は、ＨＥＲファミリーの異なるエピトープ、より好ましくは別個の実質的にオーバーラップしないエピトープに結合する。ポリクローナル抗体の可変性は、一般に抗体分子の可変領域に位置すると考えられる。
【００５２】
抗体が種々のアイソタイプとして、例えばヒトアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２、またはネズミアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＡとして存在することは当分野において周知である。本発明の抗体は任意のアイソタイプであり得る。本発明のポリクローナル抗体組成物の個々の抗体が２以上のアイソタイプの抗体を含むことは可能であるが、それらは、好ましくはすべて同じアイソタイプである。
【００５３】
「ＨＥＲ依存」という用語は、悪性特性、例えば増殖、成長、運動性、浸潤、生存および／または化学耐性を維持するための１つ以上のＨＥＲファミリー受容体に依存を有する癌細胞を示す。依存は、受容体過剰発現、受容体変異、自己分泌成長因子生産および／または他の受容体系とのクロストーク(cross-talk)により引き起こされ得る。
【００５４】
「ｐａｎ−ＨＥＲ」または「ｐａｎ−ＨＥＲ抗体組成物」という用語は、少なくとも２つのＨＥＲファミリー受容体上の少なくとも２つの異なる抗原に結合することができる抗体分子の組成物を示す。本発明の文脈において、抗体組成物の個々の抗体は、ＨＥＲファミリーの異なる抗原決定因子に結合する。好ましくは、抗体組成物の個々の抗体は、それぞれ、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３またはＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３に結合する。
【００５５】
「ＨＥＲ」という用語は、「背景技術」の章で上述した「ヒト上皮増殖因子受容体」を表し、「ＥｒｂＢ」という用語と互換的に使用され、４つのメンバーＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３およびＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４からなる受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のサブグループを特徴付ける。同時に、これらの４つの受容体は、「ＨＥＲファミリー」受容体を構成する。本明細書において使用されるとき、ＨＥＲの変異体、アイソフォームおよび種ホモログを含むことを意図している。
【００５６】
「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」という用語は、主として抗体の結合特異性を決定することに関与する抗体の可変ドメインに認められる「超可変」領域を指す。Ｌｅｆｒａｎｃら（２００３），ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７，５５−７７における定義参照。抗体の重鎖および軽鎖はそれぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される３つのＣＤＲ領域を含み、そのうちＣＤＲ３が最も大きな可変性を示す。
【００５７】
「エピトープ」という用語は、動物において抗原性または免疫原性活性を有する、より大きな分子（例えば抗原または抗原性部位）の一部分を表すために使用される。免疫原性活性を有するエピトープは、動物において抗体応答を惹起するより大きな分子の一部分である。抗原性活性を有するエピトープは、当分野で公知の任意の方法によって測定した場合抗体が免疫特異的に結合するより大きな分子の一部分である。抗原性エピトープは必ずしも免疫原性であるとは限らない。抗原は、抗体または抗体フラグメントが免疫特異的に結合する物質、例えば毒素、ウイルス、細菌、タンパク質またはＤＮＡである。抗原または抗原性部位は、非常に小さなものでない限り、多くの場合２以上のエピトープを有し、多くの場合免疫応答を刺激することができる。エピトープは直鎖状または立体配座であり得る。直鎖状エピトープは、一般に、抗体によって認識されるタンパク質分子上の約６〜１０の隣接アミノ酸から成る。これに対し、立体配座エピトープは、連続的に配置されていないが、抗体が特定の三次元構造を認識するアミノ酸から成る。タンパク質分子が三次元構造に折りたたまれた場合、エピトープを形成するアミノ酸が並置されて、抗体が立体配座エピトープを認識することが可能になる。変性タンパク質では直鎖状エピトープだけが認識される。立体配座エピトープは、当然、折りたたまれたタンパク質の外側になければならない。
【００５８】
「別個のエピトープ」という用語は、本発明の２つの異なる抗体が別個のエピトープに結合する場合、抗原結合に関して１００％未満の競合、好ましくは抗原結合に関して８０％未満の競合、より好ましくは抗原結合に関して５０％未満の競合、および最も好ましくはできる限り少ない競合、例えば抗原結合に関して約２５％未満の競合が存在するという事実を指す。同じ抗原への結合に関して互いに競合することができる抗体は、同じエピトープもしくはオーバーラップするエピトープに結合し得るかまたは互いのすぐ近傍に結合部位を有し得るので、競合は主として立体障害によって引き起こされる。抗体対の「別個のエピトープ」についての分析は、当分野で公知の方法によって、例えばＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）もしくはＨＥＲファミリーおよび個々の蛍光標識抗体を発現する細胞に関する他のフローサイトメトリー分析を用いた飽和抗体条件下での結合実験によって、またはフローセル表面に捕捉されたまたは結合したＨＥＲファミリー抗原を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって実施され得る。ＳＰＲを用いて抗体間の競合を測定するための方法は以下の実施例で述べる。
【００５９】
別個のエピトープは、好ましくは、本発明の組成物中の２つの異なる抗ＨＥＲ抗体が、それらのそれぞれのエピトープに同時に結合することができるのに十分なほど抗原結合に関して低い競合を有するという意味で「オーバーラップしてない」。種々の度合いのオーバーラップが存在し得ること、および別個のエピトープは、それぞれの抗体がそれらのエピトープに実質的に結合することができる限り、ある程度のオーバーラップの存在にもかかわらず「オーバーラップしていない」とみなされ得ることは当業者に理解される。これは一般に、２つの抗体間の抗原結合に関する競合が約５０％未満である場合に当てはまるとみなされる。
【００６０】
同様に、本発明の抗体と「結合に関して競合する」抗体は、抗原結合に関して約５０％またはそれ以上の競合を示すものと定義され得る。
【００６１】
同じ抗原上の異なるエピトープに結合する抗体は、エピトープの位置によって、それらが結合する抗原の活性に対し様々な作用を有し得る。抗原の活性部位にあるエピトープに結合する抗体は抗原の機能を完全にブロックし得るが、異なるエピトープに結合する別の抗体は、単独では抗原の活性にほとんどまたはまったく作用を及ぼさないこともあり得る。そのような抗体は、しかしながら、なおも補体を活性化し、それによって抗原の排除をもたらすことがあり、同じ抗原上の異なるエピトープに結合する１またはそれ以上の抗体と組み合わせた場合相乗効果をもたらし得る。本発明に関連して、エピトープは、好ましくはＨＥＲファミリーの細胞外ドメインの一部分である。本発明の抗原は、好ましくは、抗体または抗体フラグメントが免疫特異的に結合する細胞外ドメインＨＥＲファミリータンパク質、ポリペプチドまたはそのフラグメントである。ＨＥＲファミリー関連抗原はまた、抗体または抗体フラグメントが免疫特異的に結合するＨＥＲポリペプチドの細胞外ドメインまたはそのフラグメントの類似体または誘導体であり得る。
【００６２】
「免疫グロブリン」という用語は、一般に血液または血清中で認められる抗体の混合物の集合的名称として使用されるが、他の供給源に由来する抗体の混合物を表すためにも使用され得る。
【００６３】
「コグネイトＶＨおよびＶＬコード対」という用語は、同じ抗体産生細胞内に含まれるまたは同じ抗体産生細胞に由来するＶＨおよびＶＬコード配列の元の対を表す。したがって、コグネイトＶＨおよびＶＬ対は、そのような細胞が由来するドナー中に元々存在するＶＨおよびＶＬ対合を示す。「ＶＨおよびＶＬコード対から発現される抗体」という用語は、抗体または抗体フラグメントが、ＶＨおよびＶＬＬコード配列を含むベクター、プラスミドまたは他のポリヌクレオチドから産生されることを示す。コグネイトＶＨおよびＶＬコード対が完全な抗体としてまたはその安定したフラグメントとして発現される場合、それらは、それらが由来する細胞から元々発現される抗体の結合親和性および結合特異性を保持する。コグネイト対のライブラリは、コグネイト対のレパートリーまたはコレクションとも呼ばれ、個別に保持され得るかまたはプールされ得る。
【００６４】
「タンパク質」または「ポリペプチド」とは、長さまたは翻訳後修飾にかかわりなく、あらゆるアミノ酸の鎖を意味する。タンパク質は、単量体として、または２もしくはそれ以上の集合したポリペプチド鎖、タンパク質のフラグメント、ポリペプチド、オリゴペプチドもしくはペプチドを含む多量体として存在し得る。
【００６５】
「ヘッドトゥーヘッドプロモーター」という用語は、プロモーターによって駆動される２つの遺伝子フラグメントの転写が反対の方向で起こるようにごく近接して位置するプロモーター対を指す。ヘッドトゥーヘッドプロモーターは、二方向プロモーターとしても知られている。
【００６６】
「トランスフェクション」という用語は、本明細書では外来ＤＮＡを細胞に導入することについての広義語として使用される。この用語はまた、外来ＤＮＡを細胞に導入するための他の機能的に均等内容の方法、例えば形質転換、感染、形質導入またはドナー細胞とアクセプター細胞の融合を包含するものとする。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「増殖を阻害する」（例えば細胞に関して）という用語は、本発明の抗体組成物と接触した場合、該抗体組成物の非存在下で同じ細胞の増殖と比較して細胞の増殖（細胞数の増大）または代謝の測定可能な低下、例えば少なくとも約１０％、より好ましくは、例えば少なくとも約２０％または３０％、さらに好ましくは少なくとも約４０％または５０％、例えば少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９９％またはさらには１００％の細胞培養物の増殖の阻害を包含するものとする。
【００６８】
本明細書で使用される「処置」という用語は、症状または疾患状態を緩和する、軽減する、改善するまたは根絶する（治癒する）のに十分な量での本発明の抗体組成物の投与を指す。本発明の２またはそれ以上の抗体の投与は、一般に抗体の同時投与として、好ましくは処置に使用されるすべての抗体を含む組成物の形態で行われる。しかし、本発明の２またはそれ以上の抗体を別々に投与することも可能である。したがって、本明細書における、例えば少なくとも２つの抗体を含む組換え抗体組成物の投与と言えば、少なくとも２つの抗体をそのまま含む組成物の投与のみならず、抗体の別々の投与も包含することは言うまでもない。すなわち、本発明の２またはそれ以上の抗体の組合せは、同時に、連続的にまたは別々に投与され得る。
【００６９】
２つの配列、例えば可変領域配列の間の同一性パーセントは、２つの配列の最適アラインメントのために導入されねばならないギャップを考慮に入れて、それらの配列によって共有される同一位置の数（同一位置の数／総位置数×１００として計算される）を指す。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、容易に入手可能なソフトウェアを用いて達成され得る。適切なソフトウェアプログラムは、オンラインでの使用とダウンロードの両方に関して、ならびにタンパク質配列とヌクレオチド配列の両方のアラインメントに関して、様々なソースから入手可能である。１つの適切なプログラムは、ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇから入手可能な、あるいは、例えば、同じく様々な他のタンパク質およびヌクレオチドインフォマティクスツールを提供する、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ）から入手可能な、ＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ１１；２２（２２）：４６７３−８０）である。
【００７０】
特定の抗ＥＧＦＲ抗体、例えば９９２、１０２４、１０３０、１２５４および１２７７として称される抗体が本明細書で述べるとき、これらの抗体番号は、一般的に、ＷＯ２００８／１０４１８３に記載されている抗ＥＧＦＲ抗体を示す。
【００７１】
特定の抗ＨＥＲ２抗体、例えば４３８２、４３８４、４３８５および４５１８として称される抗体が本明細書で述べるとき、これらの抗体番号は、一般的に、ＷＯ２０１１／１０７９５７Ａ１に記載されている抗ＨＥＲ２抗体を示す。
【００７２】
特定の抗ＨＥＲ３抗体、例えば４７８５、５０３８、５０８２および５０９６として称される抗体が本明細書で述べるとき、これらの抗体番号は、配列表において提供されるＤＮＡおよびアミノ酸配列を有する抗ＨＥＲ３抗体を示す。
【００７３】
抗体混合物
１つの態様において、本発明は、組換え抗体組成物、すなわち、少なくとも１つの別個の抗ＨＥＲ抗体分子が第１のＨＥＲファミリー受容体の抗原に結合し、少なくとも１つの別個の抗ＨＥＲ抗体分子が第２のＨＥＲファミリー受容体の抗原に結合する組成物に関する。好ましい態様において、本発明は、組換え抗体組成物、すなわち、少なくとも１つの別個の抗ＨＥＲ抗体分子が第１のＨＥＲファミリー受容体の抗原に結合し、少なくとも１つの別個の抗ＨＥＲ抗体分子が第２のＨＥＲファミリー受容体の抗原に結合し、少なくとも１つの別個の抗ＨＥＲ抗体分子が第３のＨＥＲファミリー受容体の抗原に結合する組成物に関する。さらなる好ましい態様において、抗体組成物は、第１のＨＥＲファミリー受容体の抗原に結合することができる少なくとも１つの別個の抗ＨＥＲ抗体分子、および第２のＨＥＲファミリー受容体の抗原に結合することができる少なくとも２つの別個の抗ＨＥＲ抗体分子を含む。さらなる好ましい態様において、抗体組成物は、第１のＨＥＲファミリー受容体の抗原に結合することができる少なくとも２つの別個の抗ＨＥＲ抗体分子、および第２のＨＥＲファミリー受容体の抗原に結合することができる少なくとも２つの別個の抗ＨＥＲ抗体分子を含む。さらなる好ましい態様において、抗体組成物は、第１のＨＥＲファミリー受容体の抗原に結合することができる少なくとも１つの別個の抗ＨＥＲ抗体分子、第２のＨＥＲファミリー受容体の抗原に結合することができる少なくとも１つの別個の抗ＨＥＲ抗体分子、および第３のＨＥＲファミリー受容体の抗原に結合する少なくとも２つの別個の抗ＨＥＲ抗体分子を含む。さらなる好ましい態様において、抗体組成物は、第１のＨＥＲファミリー受容体の抗原に結合することができる少なくとも１つの別個の抗ＨＥＲ抗体分子、第２のＨＥＲファミリー受容体の抗原に結合することができる少なくとも２つの別個の抗ＨＥＲ抗体分子、および第３のＨＥＲファミリー受容体の抗原に結合する少なくとも２つの別個の抗ＨＥＲ抗体分子を含む。なおさらなる好ましい態様において、抗体組成物は、第１のＨＥＲファミリー受容体の抗原に結合することができる少なくとも２つの別個の抗ＨＥＲ抗体分子、第２のＨＥＲファミリー受容体の抗原に結合することができる少なくとも２つの別個の抗ＨＥＲ抗体分子、および第３のＨＥＲファミリー受容体の抗原に結合することができる少なくとも２つの別個の抗ＨＥＲ抗体分子を含む。
【００７４】
第１および第２のＨＥＲファミリー受容体は、それぞれ、好ましくはＥＧＦＲおよびＨＥＲ２、ＨＥＲ２およびＥＧＦＲ、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３、ＨＥＲ３およびＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３、ＨＥＲ３およびＨＥＲ２である。抗体分子がＨＥＲファミリーの３つの異なる受容体に結合する態様において、第１、第２および第３のＨＥＲファミリー受容体は、それぞれ、好ましくはＥＧＦＲおよびＨＥＲ２およびＨＥＲ３、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３およびＨＥＲ２、ＨＥＲ２およびＥＧＦＲおよびＨＥＲ３、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３およびＥＧＦＲ、ＨＥＲ３およびＥＧＦＲおよびＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ２およびＥＧＦＲである。
【００７５】
別個の抗ＨＥＲ抗体は、受容体上の非重複エピトープに結合する。
【００７６】
抗体の非重複性は、好ましくは、ＨＥＲ発現細胞を使用するＦＡＣＳ分析において異なって標識された抗体を使用して、またはフローセル表面に捕捉または結合されたＨＥＲ抗原を使用する表面プラズモン共鳴を使用することにより決定される。非重複エピトープに結合する組成物は、１つまたは２つのエピトープを標的とするモノクローナル抗体の組成物と比較して、ＨＥＲコンフォメーションにおける差異に対してそれほど過敏ではあり得ず、そして変異に対してそれほど過敏ではあり得ないため、より広範囲にわたるＨＥＲ依存性癌型に対して使用することができる。さらに、非重複エピトープに結合する抗体組成物は、より少ないエピトープを標的とする組成物と比較してより優れた有効性を提供し得る。特に、抗体組成物は、癌細胞の最終分化に対して、インビボでより優れた有効性を提供し得る。
【００７７】
本発明の抗体組成物において、第１のＨＥＲファミリー受容体の抗原に結合する少なくとも２つの別個の抗ＨＥＲ抗体分子、および第２のＨＥＲファミリー受容体の抗原に結合する少なくとも２つの別個の抗ＨＥＲ抗体分子を含むことが好ましく、ＨＥＲファミリーの少なくとも３つの異なる受容体に結合することができる抗体組成物がより好ましい。これらの好ましい組成物は、本発明の抗体組成物を設計する方法に関連する案内と共に以下により詳細に記載されている。
【００７８】
組成物の抗体は、非ヒト可変鎖およびヒト定常鎖を有するキメラ抗体であり得る。非ヒト可変鎖は、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、非ヒト霊長類または他の適当な動物に由来し得る。完全ヒト抗体を得るために、ヒト抗体遺伝子を有するトランスジェニック動物で、抗体を産生させることができる。抗体はまた、非ヒトＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列中に移植されている、上記ヒト化抗体であり得る。
【００７９】
好ましくは、ヒト定常鎖はＩｇＧ１またはＩｇＧ２アイソタイプである。さらに好ましくは、組成物中の全ての抗体は、製造が容易であるため同じアイソタイプである。しかしながら、いくつかの場合において、アイソタイプが異なる抗体を組成物に含めることは、有益であり得る。
【００８０】
好ましくは、本発明の抗体組成物は、ヒトＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３、変異ヒトＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３、ならびにヒトＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３の欠失変異体から成る群より選択されるＨＥＲファミリー受容体に結合することができる抗体を含む。好ましくは、抗体は、臨床実験の前に、適当な毒性試験で調べることができるように、ヒトおよび非ヒト霊長類の両方のＥＧＦＲ、ＨＥＲ２および／またはＨＥＲ３に結合することができる。好ましくは、非ヒト霊長類はカニクイザルである。
【００８１】
癌細胞系Ａ４３１ＮＳおよびＭＣＦ７で得られた結果（実施例３）は、抗ＥＧＦＲ混合物および抗ＨＥＲ３または抗ＨＥＲ２混合物の組合せが、癌細胞成長の阻害における相乗的増加を引き起こすこと、および全３つの受容体に対する混合物の組合せが、２つの受容体に対する個々の混合物および混合物の組合せよりも優れていることを示した。
【００８２】
全３つの受容体に対する混合物の組合せを、市販のモノクローナル抗体セツキシマブ（抗−ＥＧＦＲ）およびトラスツマブ（抗−ＨＥＲ２）およびこれらの２つの抗体の混合物と比較した。結果は、３つの受容体ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３に対する抗体混合物の組合せが、異なる細胞系において、セツキシマブおよびトラスツマブの両方、ならびに、これらの２つの抗体の混合物よりも優れていることを示す。
【００８３】
全般的に、結果は、ＨＥＲファミリー受容体の２つ以上の最適な標的化が、それぞれの受容体に対する抗体の混合物を混合することにより得られること、および３つの受容体の標的化が、２つの受容体の標的化よりも優れていることを示した。
【００８４】
細胞系ＭＣＦ７、ＨＣＣ２０２、ＢＴ４７４、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５、Ａ４３１ＮＳ、ＨＮ５、Ｈ２９２、ＤＵ１４５およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８（実施例４）で得られる結果はまた、抗ＥＧＦＲ混合物および抗ＨＥＲ２混合物の組合せが、全ての試験される細胞系を阻害することを示した。これらの受容体の１つのみの標的化は、特定の受容体に依存する細胞系の阻害をもたらす。全般的に、これらの結果は、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２に対する抗体の混合物の組合せが、非常に広範な阻害プロフィールを与え、したがって、最後に、受容体のいずれかに依存する腫瘍を有する患者を処置するために使用され得ることを示す。
【００８５】
ウェスタンブロット研究の結果（実施例５および７）は、単一の受容体（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３）に対する抗体の混合物が、それらのそれぞれの標的の分解を誘導すること、およびそれぞれの標的に対する抗体混合物の組合せが、全３つの受容体の効率的な分解を同時に誘導することができることを示す。
【００８６】
癌細胞系Ａ４３１ＮＳ、Ｈ３５８、ＨＣ２０２、ＯＥ１９およびＨ８２０で得られる結果（実施例６）は、抗体混合物および個々の抗体の効果が、異なる細胞系間で変化するが、３つの受容体ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３のそれぞれに対する抗体を含む抗体混合物は、一般的に、細胞成長および増殖の阻害に非常に有効であることを示す。６つの抗体、すなわち３つの受容体のそれぞれに対する２つの抗体を含む混合物は、一般的に、異なる細胞系にわたって最も有効である。
【００８７】
実施例８の結果は、抗体混合物および個々の抗体の効果が、異なる細胞系間で変化するが、３つの受容体ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３に対する３つ、４つまたは６つの抗体からなる抗体混合物は、一般的に、癌細胞成長および増殖の阻害に非常に有効であることを示す。
【００８８】
実施例９の結果は、ＨＥＲファミリーにおける２つ以上の受容体の最適な標的化が、それぞれの受容体に対する抗体の混合物を混合することにより得られること、３つの受容体の標的化が、２つの受容体の標的化よりも優れていること、および、抗体の混合物でのそれぞれの受容体の標的化が、単一の抗体でのそれぞれの受容体の標的化よりも優れていることを証明する。
【００８９】
最後に、インビボ有効性実験の結果（実施例１０）は、ＥＧＦＲ＋ＨＥＲ３またはＥＧＦＲ＋ＨＥＲ２＋ＨＥＲ３に対する抗体の組合せまたは抗体混合物でＡ４３１ＮＳ腫瘍異種移植片を処置することが、個々の標的ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３に対するモノクローナル抗体および抗体混合物、またはＥＧＦＲ＋ＨＥＲ２またはＨＥＲ２＋ＨＥＲ３に対するモノクローナル抗体の組合せおよび抗体混合物で腫瘍を処置することと比較して、より有効でアルコとを示す。
【００９０】
これらの実験から明らかなことは、本発明者らにより提供される抗体の組合せが、癌細胞系の非常に広範な範囲に対して有効性を示すことである。
【００９１】
好ましい態様において、本発明の抗体組成物は、抗体：９９２、１０２４、１０３０、１２５４、１２７７および１５６５のＣＤＲを有する抗体の結合を阻害することができる、および／または抗体：９９２、１０２４、１０３０、１２５４、１２７７および１５６５のＣＤＲを有する抗体と同じエピトープに結合する抗体から成る群より選択される少なくとも２つの別個の抗ＥＧＦＲ抗体分子を含む。
【００９２】
別の好ましい態様において、抗体組成物は、抗体：９９２＋１０３０、９９２＋１０２４、１０２４＋１０３０、１０３０＋１２５４、１０３０＋１２７７、１０３０＋１５６５、１２５４＋１２７７、１２５４＋１５６５および１２７７＋１５６５のＣＤＲを有する抗体からなる組合せの群から選択される少なくとも２つの別個の抗ＥＧＦＲ抗体分子を含む。特定の態様において、抗ＥＧＦＲ抗体は、抗体１２７７＋１５６５または１２５４＋１５６５のＣＤＲを有する。
【００９３】
別の好ましい態様において、抗体組成物は、抗体：４３８２、４３８４、４３８５、４５１７および４５１８のＣＤＲを有する抗体の結合を阻害することができる、および／または抗体：４３８２、４３８４、４３８５、４５１７のＣＤＲを有する抗体と同じエピトープに結合する抗体から成る群より選択される少なくとも２つの別個の抗ＨＥＲ２抗体分子を含む。
【００９４】
別の好ましい態様において、抗体組成物は、抗体：４３８２＋４３８４、４３８２＋４３８５、４３８２＋４５１７、４３８２＋４５１８、４３８４＋４３８５、４３８４＋４５１７、４３８４＋４５１８、４５１７＋４５１８および４３８５＋４５１８のＣＤＲを有する抗体からなる組合せの群から選択される少なくとも２つの別個の抗ＨＥＲ２抗体分子を含む。特定の態様において、抗ＨＥＲ２抗体は、抗体４３８４＋４５１７または４３８５＋４５１８のＣＤＲを有する。
【００９５】
別の好ましい態様において、抗体組成物は、抗体：４７８５、５０３８、５０８２および５０９６のＣＤＲを有する抗体の結合を阻害することができる、および／または抗体：４７８５、５０３８、５０８２および５０９６のＣＤＲを有する抗体と同じエピトープに結合する抗体から成る群より選択される少なくとも２つの別個の抗ＨＥＲ３抗体分子を含む。
【００９６】
別の好ましい態様において、抗体組成物は、抗体：４７８５＋５０３８、４７８５＋５０８２、４７８５＋５０９６、５０３８＋５０８２、５０３８＋５０９６および５０８２＋５０９６のＣＤＲを有する抗体からなる組合せの群から選択される少なくとも２つの別個の抗ＨＥＲ３抗体分子を含む。特定の態様において、抗ＨＥＲ３抗体は、抗体５０３８＋５０８２のＣＤＲを有する。
【００９７】
別の好ましい態様において、抗体組成物は、抗体：９９２＋１０２４＋４７８５＋５０８２、９９２＋１０２４＋４３８２＋４３８５＋４５１８、９９２＋１０２４＋４３８２＋４３８５＋４５１８＋４７８５＋５０８２、４３８２＋４３８５＋４５１８＋４７８５＋５０８２、１５６５＋４５１７＋５０８２、１２７７＋４５１７＋５０８２、１２７７＋４３８４＋５０３８、１２７７＋４３８４＋５０８２、１２７７＋１５６５＋５０３８＋５０８２、１２７７＋１５６５＋４３８４＋４５１７、４３８４＋４５１７＋５０３８＋５０８２、１２７７＋４３８４＋４５１７＋５０８２、１２７７＋４３８４＋４５１７＋５０３８、１２７７＋１５６５＋４３８４＋４５１７＋５０３８＋５０８２および１２７７＋１５６５＋４３８５＋４５１８＋５０３８＋５０８２のＣＤＲを有する抗体からなる組合せの群から選択される。
【００９８】
本発明の好ましい態様は、重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列のそれぞれが、これらの抗体の任意の１つの重鎖可変領域および軽鎖可変領域配列のそれぞれと少なくとも９０％配列同一性、好ましくは少なくとも９５％配列同一性、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有し、前記抗体と結合に関して競合すると定義される抗体分子を含む組換え抗体組成物を含む。
【００９９】
特定の態様において、本発明の抗体組成物は、１２５４、１２７７または１５６５に由来するＣＤＲを有するか、１２５４、１２７７または１５６５の結合を阻害することができる、および／または１２５４、１２７７または１５６５と同じエピトープに結合する少なくとも１つの抗ＥＧＦＲ抗体；４３８４、４３８５、４５１７または４５１８に由来するＣＤＲを有するか、４３８４、４３８５、４５１７または４５１８の結合を阻害することができる、および／または４３８４、４３８５、４５１７または４５１８と同じエピトープに結合する少なくとも１つの抗ＨＥＲ２抗体；ならびに、５０３８または５０８２に由来するＣＤＲを有するか、５０３８または５０８２の結合を阻害することができる、および／または５０３８または５０８２と同じエピトープに結合する少なくとも１つの抗ＨＥＲ３抗体を含む。
【０１００】
好ましい態様において、抗体組成物は、抗ＥＧＦＲ抗体が、１２７７＋１５６５または１２５４＋１５６５に由来するＣＤＲを有するか、または１２７７＋１５６５または１２５４＋１５６５の結合を阻害することができる、および／または１２７７＋１５６５または１２５４＋１５６５と同じエピトープに結合する；抗ＨＥＲ２抗体が、４３８４＋４５１７または４３８５＋４５１８に由来するＣＤＲを有するか、または４３８４＋４５１７または４３８５＋４５１８の結合を阻害することができる、および／または４３８４＋４５１７または４３８５＋４５１８と同じエピトープに結合する、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３のそれぞれに対する２つの抗体を含む
【０１０１】
さらなる好ましい態様において、抗体組成物は、抗体１２７７＋１５６５＋４３８４＋４５１７＋５０３８＋５０８２のＣＤＲを有する抗体、または該抗体の結合を阻害することができる、および／または該抗体と同じエピトープに結合する抗体を含む。
【０１０２】
さらなる好ましい態様において、抗体組成物は、抗体１２７７＋１５６５＋４３８５＋４５１８＋５０３８＋５０８２のＣＤＲを有する抗体、または該抗体の結合を阻害することができる、および／または該抗体と同じエピトープに結合する抗体を含む。
【０１０３】
以下の表１は、付属の配列表に示すように、抗体９９２、１０２４、１０３０、１２５４、１２７７、１５６５、４３８２、４３８４、４３８５、４５１７、４５１８、４７８５、５０３８、５０８２および５０９６の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖（ＬＣ）（上記で説明したように、軽鎖配列は軽鎖可変領域（ＶＬ）配列とヒトカッパ定常領域配列の両方を含む）のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列についての配列ＩＤ番号を示す。
表１：選択した抗ＨＥＲ抗体の重鎖可変領域および軽鎖のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列についての配列ＩＤ番号
【表１】
0006033783.tif 000002
【０１０４】
下表２および３は、本発明による様々な抗ＨＥＲ抗体の重鎖（表２）および軽鎖（表３）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列を示す。これらの抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む軽鎖のアミノ酸配列、ならびにエンコードＤＮＡ配列（ＣＨＯ細胞における発現のために最適化した）を付属の配列表に示す。これらの配列の配列ＩＤ番号の概要については上記の表１参照。
表２：選択した抗ＨＥＲ抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列
【表２】
0006033783.tif 000003
表３：選択した抗ＨＥＲ抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列
【表３】
0006033783.tif 000004
【０１０５】
さらに、非ヒト霊長類における毒性試験を行うことができるように、組成物中の全ての抗体が、ヒトならびに少なくとも１つのさらなる霊長類ＥｒｂＢファミリー受容体、例えばチンパンジー、アカゲザル、カニクイザルまたは他のサルに由来するＥｒｂＢに結合することが好ましい。カニクイザルは比較的小さな動物であり、毒性試験によく適している。したがって、さらなる霊長類ＥｒｂＢファミリー受容体は、好ましくはカニクイザルＥｒｂＢである。好ましくは、抗体は、ヒトおよび非ヒト霊長類ＥｒｂＢとほぼ同じ親和性で結合する。
【０１０６】
組成物の抗体のさらなる好ましい特性は、抗体を容易に精製することができるようなタンパク質均質性である。個々の抗体メンバーについて、１つの別個のピークを伴うイオン交換クロマトグラフィープロフィールが、特性化を容易にするために好ましい。明確なイオン交換クロマトグラフィープロフィールもまた、最終抗体組成物の特性化を容易にするために好ましい。イオン交換クロマトグラフィーを使用して区別することができる抗体を組み合わせるときも、１回の実行で全ての抗体を伴う組成物の特性化をできることが好ましい。
【０１０７】
抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ニワトリ、ブタ、ラマ、ヒツジなど、任意の起源であり得る。抗体は実施例に記載されているキメラ抗体であってもよく、または当技術分野で記載されている周知の方法を使ったそのヒト化、超ヒト化（superhumanised）もしくは再構成(reshaped)であってもよい。
【０１０８】
抗体は、投与のために１つの容器において調製され得る。しかしながら、それらは、個々に製造、精製および特徴付けされ得、各容器中の１つの抗体と共に、複数パーツのキットとして別個の容器において提供され得る。このように、それらは、同時に、連続的に、または別々に投与され得る。
【０１０９】
本発明の別の態様は、本発明の抗体、すなわち抗体９９２、１０２４、１０３０、１２５４、１２７７、１５６５、４３８２、４３８４、４３８５、４５１７、４５１８、４７８５、５０３８、５０８２および５０９６から成る群より選択される抗体、またはそのヒト化変異体をコードする、あるいはそのような抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域配列、または参照配列と少なくとも９０％もしくは９５％配列同一性、例えばそのような重鎖および／または軽鎖可変領域配列と少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％配列同一性を少なくとも有する重鎖および／または軽鎖配列をコードする、ヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。
【０１１０】
本発明のさらなる態様は、上記で定義した核酸分子を含む発現ベクターに関する。上述したように、本発明に関する使用のための発現ベクターは、当分野で公知の任意の適切な種類、例えばプラスミドまたはウイルスベクターであり得る。
【０１１１】
本発明のなおさらなる態様は、上記で定義した核酸分子を含む宿主細胞であって、前記核酸分子によってコードされる抗体を発現することができる宿主細胞に関する。
【０１１２】
本発明の抗体および抗体組成物の生産
本発明のさらなる態様は、上皮細胞増殖因子受容体（ＨＥＲ）ファミリーを標的とする組換え抗体および本発明の抗体を含む組成物を生産するための方法に関する。本発明のこの態様の１つの実施形態は、抗体を発現することができる上記で定義した宿主細胞を提供すること、前記宿主細胞を抗体の発現に適した条件下で培養すること、および生じた抗体を単離することを含む、本明細書で定義する抗体を生産するための方法に関する。
【０１１３】
別の実施形態では、本発明は、本明細書で述べる組換え抗ＨＥＲ抗体を含む組換え抗体組成物を生産するための方法であって、それぞれ組換え抗ＨＥＲ抗体を発現することができる多くの細胞を提供すること、細胞を組成物の抗体の発現に適した条件下で培養すること、ならびに生じた抗体を単離することを含む方法に関する。
【０１１４】
本発明の抗体または抗体組成物は、組換えモノクローナルまたはポリクローナル抗体の生産のための当分野で一般に公知の方法によって生産され得る。したがって、本発明の単一抗体の生産の場合、組換えモノクローナル抗体の生産のための当分野で公知の任意の方法を使用し得る。本発明の抗体組成物の生産のためには、個々の抗体を別々に生産し得る、すなわちそれぞれの抗体を別個のバイオリアクターで生産し得るか、または個々の抗体を単一のバイオリアクターで一緒に生産し得る。抗体組成物が２以上のバイオリアクターで生産される場合、各バイオリアクターから個別に精製された上清から得られた抗体をプールすることによって精製抗ＨＥＲ抗体組成物を得ることができる。数のバイオリアクターにおけるポリクローナル抗体組成物の生産のための様々な方法が国際公開第２００９／１２９８１４号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されており、それらのアプローチでは、細胞株または抗体製剤を上流のより後の時点でまたは下流のプロセシングの前またはプロセシングの間に組み合わせる。
【０１１５】
単一バイオリアクターにおける個別抗体の生産の場合、これは、例えば国際公開第２００４／０６１１０４号または同第２００８／１４５１３３号（どちらも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように実施され得る。国際公開第２００４／０６１１０４号に記載されている方法は、ＶＨおよびＶＬタンパク質鎖が生産の間それらの元の対合で維持されることを確実にする、個々の宿主細胞のゲノムへの抗体コード配列の部位特異的組込みに基づく。さらに、部位特異的組込みは位置効果を最小限に抑え、それゆえポリクローナル細胞株における個々の細胞の増殖および発現特性は非常に類似すると予想される。一般に、この方法は以下を含む：ｉ）１またはそれ以上のリコンビナーゼ認識部位を有する宿主細胞；ｉｉ）宿主細胞のものと適合性の少なくとも１つのリコンビナーゼ認識部位を有する発現ベクター；ｉｉｉ）スクリーニングベクターからの選択したＶＨおよびＶＬコード対を、完全長抗体または抗体フラグメントがベクターから発現され得るように発現ベクターに移入することによる発現ベクターのコレクションの作製（スクリーニングベクターが発現ベクターと同一である場合はそのような移入が必要でないとこともある）；ｉｖ）発現ベクターのコレクションおよび宿主細胞のゲノム内のリコンビナーゼ認識部位とベクター内のリコンビナーゼ認識部位を組み合わせることができるリコンビナーゼをコードするベクターでの宿主細胞のトランスフェクション；ｖ）トランスフェクトした宿主細胞からポリクローナル細胞株を得る／作製すること；ならびにｖｉ）ポリクローナル細胞株から抗体組成物を発現させ、収集すること。
【０１１６】
国際公開第２００８／１４５１３３号は、単一バイオリアクターにおける抗体の生産のための別法を述べている。この方法は、ａ）ベクターのそれぞれが、ポリクローナルタンパク質の別個の成員をコードする別個の核酸の少なくとも１コピーを含む、発現ベクターのセットを提供すること、ｂ）細胞のゲノムへの発現ベクターの部位特異的組込みを回避する条件下で宿主細胞を発現ベクターのそれぞれで別々にトランスフェクトし、それにより、それぞれの組成物がポリクローナルタンパク質の１つの別個の成員を発現する、細胞の２またはそれ以上の組成物を得ること；ならびにｃ）細胞の少なくとも２つの組成物を混合してポリクローナル細胞株を得ることによる、２またはそれ以上の別個の成員を含むポリクローナル抗体または他のポリクローナルタンパク質を発現することができるポリクローナル細胞株の作製を含む。国際公開第２００４／０６１１０４号および同第２００８／１４５１３３号の方法はどちらも、組換えポリクローナル抗体を構成するすべての成員を単一バイオリアクターで生産し、単一工程で精製することを可能にし、それにより各抗体のための別々の生産および精製工程の必要性を回避して、同時に異なる抗体の驚くほど均一な生産をもたらすという利点を有する。国際公開第２００８／１４５１３３号の方法は、各生産細胞が特定の抗体をコードするポリヌクレオチドの多数のコピーを担持し得るので、高い収率を提供するというさらなる利点を有する。
【０１１７】
本発明の抗体は、哺乳動物細胞ならびに非哺乳動物真核または原核細胞、例えば植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、真菌、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等を含む、様々な種類の細胞において生産され得る。しかし、抗体は、好ましくは哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、骨髄腫細胞（例えばＳｐ２／０もしくはＮＳ０細胞）、ＮＩＨ ３Ｔ３などの線維芽細胞、またはＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞もしくはＰＥＲ．Ｃ６細胞などの不死化ヒト細胞において生産される。
【０１１８】
核酸配列を宿主細胞にトランスフェクトするための方法は当分野において周知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第３版、２００１参照）。例えば国際公開第２００４／０６１１０４号に記載されている部位特異的組込みに関して、適切な宿主細胞は、そのゲノム内に１またはそれ以上のリコンビナーゼ認識部位を含む。この場合、適切な発現ベクターは、宿主細胞のリコンビナーゼ認識部位（複数可）にマッチする組換え認識部位を含む。例えば部位特異的組込み方法を用いたスクリーニングベクターからの選択ＶＨおよびＶＬコード対の移入に関するさらなる詳細は、国際公開第２００４／０６１１０４号に見出され得る。
【０１１９】
本発明の組換え抗体組成物は、ポリクローナルワーキングセルバンク（ｐＷＣＢ）からの１アンプルを、ポリクローナル細胞株によって発現される個々の抗体の相対的発現レベルの実質的な均一性を維持しながら十分なレベルの抗体発現を可能にする期間、適切な培地で培養することにより、単一バイオリアクターで製造され得る。約１５〜５０日間の生産時間が通常適切である。流加培養または灌流培養などの当分野で公知の培養方法を使用し得る。培地は、好ましくは無血清培地、より好ましくは無血清および無タンパク質培地、例えば化学的組成の明らかな培地である。そのような培地は、典型的には生産のために使用される特定の細胞型の増殖用に設計され、数多くの適切な培地製剤が市販されている。
【０１２０】
組換え抗体組成物は、培地から得られ、慣用的精製技術によって精製される。これらには、例えば、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィおよびゲル濾過などの後続精製段階と組み合わせたアフィニティクロマトグラフィが含まれ得、これらの精製技術は組換え抗体の精製のために頻繁に使用されている。２またはそれ以上の抗体を単一バイオリアクターでポリクローナル細胞株によって生産する場合は、ポリクローナル抗体組成物中の個々の成員すべての存在を、典型的には精製の後で、例えばイオン交換クロマトグラフィによって評価する。ポリクローナル抗体組成物の特性検定は、例えば国際公開第２００６／００７８５３号および同第２００９／０６５４１４号（本明細書中、出典明示により援用）に記載されているように実施し得る。
【０１２１】
治療用組成物
本発明の別の態様は、本発明の抗体組成物、または組換えＦａｂもしくは別の組換え抗体フラグメント組成物を有効成分として含む医薬組成物である。そのような組成物は、癌の改善、予防および／または処置を目的とする。そのような組成物は、癌の改善、予防および／または処置を目的とする。医薬組成物は、ヒトまたは家畜もしくはペットに投与され得るが、典型的にはヒトに投与される。
【０１２２】
本発明の治療用組成物中の個々の抗体間の比率は、または本発明の個々の抗体が同時に、連続的にもしくは別々に投与される場合には、抗体が等量で投与される比率であることが多いが、これは必ずしもそうである必要はない。したがって、２つの抗ＨＥＲ抗体を含む本発明の組成物は、それらを１：１の比率で含むことが多く、３つの抗ＨＥＲ抗体を含む本発明の組成物は、それらを１：１：１の比率で含むことが多い。しかし、個々の抗体の特性によっては、異なる抗体を等しくない量で使用することが望ましい場合があり得る。本発明の組成物中の異なる抗ＨＥＲ抗体についての適切な比率は、国際公開第２０１０／０４０３５６号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように決定され得、そこには、最適の効力および効果を有するコンビナトリアル薬剤を得るために、コンビナトリアル薬剤製品、例えばポリクローナル抗体組成物中の化学的実体間の最適化学量論比を特定し、選択するための方法が記載されている。
【０１２３】
本発明の抗体組成物またはそのフラグメントに加えて、医薬組成物は、少なくとも１つの医薬的に許容され得る希釈剤、担体または賦形剤をさらに含む。これらには、例えば防腐剤、安定剤、界面活性剤／湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節するための塩および／または緩衝剤が含まれ得る。溶液または懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンなどの増粘物質をさらに含み得る。医薬組成物についての適切なｐＨ値は、一般に、必要に応じて緩衝剤を使用して維持され、約５．５〜８．５、例えば約６〜８の範囲内、例えば約７である。
【０１２４】
従来の製薬慣例を用いて、例えば癌患者に投与する適切な製剤または組成物を提供し得る。投与は、典型的には治療的であり、これは、癌状態が診断された後に投与されることを意味する。任意の適切な投与経路、例えば、非経口、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、鼻内、エアロゾル、坐剤または経口投与を使用し得る。本発明の医薬組成物は、典型的には液体溶液または懸濁液、より典型的には水溶液または水性懸濁液、特に等張水溶液または等張水性懸濁液の形態で投与される。
【０１２５】
本発明の医薬組成物は、それ自体公知の方法で、例えば従来の溶解、凍結乾燥、混合、造粒または糖剤化工程によって調製される。医薬組成物は、従来の製薬慣例に従って製剤され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（第２１版）、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、２００５、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、フィラデルフィア、ペンシルベニア、米国；およびＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ編、第３版、２００６，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ニューヨーク、ニューヨーク、米国、参照）。
【０１２６】
液体製剤に代わるものとして、本発明の組成物は、少なくとも１つの抗体を単独でまたは担体、例えばマンニトールと共に含む凍結乾燥形態で調製されてもよく、この場合、組成物は使用前に滅菌水などの液体で再構成される。
【０１２７】
医薬組成物は、約１％〜約９５％、好ましくは約２０％〜約９０％の有効成分を含む。本発明による医薬組成物は、例えばアンプル、バイアル、坐剤、錠剤またはカプセル剤の形態などの単位用量形態で生産され得る。製剤は、癌性疾患または他の状態に対する治療を提供するために治療的または予防的に有効な量（例えば病的状態を予防する、排除するまたは軽減する量）でヒト個体に投与され得る。投与される治療薬の好ましい用量は、癌の重症度、特定の患者の全体的な健康状態、化合物賦形剤の処方、およびその投与経路などの変数に依存する可能性が高い。
【０１２８】
本発明による抗体組成物の治療的使用
本発明による医薬組成物は、哺乳動物における疾患の処置または改善のため、特にヒトにおける癌の処置のために使用され得る。本発明の１つの実施形態は、ヒトまたは他の哺乳動物において癌に伴う１またはそれ以上の症状を予防、処置または改善する方法であって、本発明の医薬抗体組成物の有効量を前記哺乳動物に投与することを含む方法である。
【０１２９】
特定の実施形態は、ＨＥＲファミリーメンバーのいずれかの過剰発現または欠乏を特徴とする障害、特に癌を有するヒト患者を処置するための方法であって、本明細書で定義される組換え抗体組成物を前記患者に投与することを含む方法に関する。
【０１３０】
さらなる態様において、本発明は、抗体および／またはＴＫＩでの処置に対して耐性の獲得を有するヒトまたは他の哺乳動物における癌を処置するための方法であって、本明細書で定義される有効量の抗体組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法に関する。
【０１３１】
多くの因子に基づき、以下の腫瘍型が特に本発明の抗体組成物による治療に適応され得る：乳癌、卵巣癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、膀胱癌、膵癌、黒色腫、頭頸部癌および非小細胞肺癌。本発明の抗体組成物は、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２を過剰発現する癌、例えば多くの乳癌、卵巣癌および胃癌などの特定の上皮癌の処置に特に適用できることが考えられる。
【０１３２】
これらの適応症のそれぞれに関して、２つの主要な臨床経路、すなわち１）少なくとも１つの付加的な治療処置に関連する補助療法または２）単独療法が考えられる。これら２つの選択肢を以下で簡単に論じる。
【０１３３】
１）補助療法：併用療法としても知られる補助療法では、患者は、少なくとも１つの付加的な治療処置、典型的には化学療法剤もしくは抗腫瘍薬および／または放射線療法を併用して本発明の抗体で処置される。あるいはまたは付加的に、本発明の組成物はまた、異なる抗癌抗体、例えばＶＥＧＦを標的とする抗体と組み合わせて使用され得る。したがって、上記で列挙した一次癌標的は、標準的な第一選択療法および第二選択療法に加えて本発明の抗体または組成物の投与によって処置され得る。プロトコールの設計は、例えば腫瘍量の低減ならびに標準的な化学療法の通常用量を低減する能力によって評価される有効性に対応する。そのような用量の低減は、化学療法剤の用量関連毒性を低減することにより付加的なおよび／または長期的な治療を可能にし得る。
【０１３４】
本発明の抗体組成物を、癌細胞の終末分化を誘導することが知られている薬剤と組み合わせることにより、効果をさらに改善し得る。そのような化合物は、例えば、レチノイン酸、トランスレチノイン酸、シスレチノイン酸、フェニルブチレート、神経成長因子、ジメチルスルホキシド、活性型ビタミンＤ３、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール１３−アセテート、ヘキサメチレンビスアセトアミド、トランスフォーミング増殖因子β、酪酸、サイクリックＡＭＰおよびベスナリノンから成る群より選択され得る。好ましくは、化合物は、レチノイン酸、フェニルブチレート、オールトランスレチノイン酸、および活性型ビタミンＤから成る群より選択される。
【０１３５】
本発明の抗体組成物および少なくとも１つの化学療法化合物または抗腫瘍化合物を含む医薬品は、癌療法における同時、個別または連続投与のための併用処置として使用され得る。化学療法化合物は、問題の特定の癌の処置に適する任意の化学療法剤、例えば、アルキル化剤、例えばシスプラチン、カルボプラチンおよび／またはオキサリプラチンなどの白金誘導体；植物アルカロイド(alkoid)、例えばパクリタキセル、ドセタキセルおよび／またはイリノテカン；抗腫瘍抗生物質、例えばドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、アクチノマイシン、ルテオマイシン(luteomycin)および／またはマイトマイシン；トポテカンなどのトポイソメラーゼインヒビター；および／または代謝拮抗剤、例えばフルオロウラシルおよび／または他のフルオロピリミジンから成る群より選択される薬剤であり得る。
【０１３６】
また、本発明の抗体組成物は、チロシンキナーゼインヒビター（ＴＫＩ）に関連する補助療法において使用され得ることも考えられる。これらは、受容体の細胞内チロシンキナーゼドメインと相互作用し、細胞内Ｍｇ−ＡＴＰ部位に関して競合することによりリガンド誘導性受容体リン酸化を阻害する、合成の、主にキナゾリン由来の低分子量分子である。ＨＥＲ２キナーゼをブロックするいくつかのチロシンキナーゼインヒビターが現在臨床開発段階にある。これらのいくつかはまた、ＥＧＦＲまたは他のＥＧＦＲファミリー受容体を標的とする。これらのＴＫＩの総説については、Ｓｐｅｃｔｏｒら（２００７）Ｂｒｅａｓｔ 癌 Ｒｅｓ．９（２）：２０５参照。本発明の抗体組成物およびＨＥＲ２を標的とする少なくとも１つのＴＫＩを含む医薬品は、したがって、癌療法における同時、個別または連続投与のための併用処置としても使用され得る。
【０１３７】
他の実施形態では、本発明の抗体組成物を他の抗体治療薬と組み合わせて使用し得る。これらの例には、例えばＥＧＦＲに対する抗体（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）もしくはＶｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））またはＶＥＧＦに対する抗体（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））が含まれる。さらに他の実施形態では、本発明の抗体組成物は、免疫系の細胞を刺激することが知られている薬剤と組み合わせて使用してもよく、そのような併用処置は本発明の抗体組成物の効果の免疫介在性増強をもたらす。そのような免疫刺激剤の例には、組換えインターロイキン（例えばＩＬ−２１およびＩＬ−２）が含まれる。
【０１３８】
２）単独療法：腫瘍の単独療法における本発明に従った抗体組成物の使用に関連して、抗体組成物は、化学療法剤または抗腫瘍薬の同時使用を伴わずに、すなわち単独療法として患者に投与され得る。
【０１３９】
免疫複合体
本発明の組成物の治療的使用についての別の選択肢は、免疫複合体、すなわち１またはそれ以上の抗癌剤と結合した抗体の形態である。特に別個のエピトープに結合する本発明の組成物の場合、これは細胞表面に架橋した抗体−受容体格子を生成し、それにより単一モノクローナル抗体の使用と比較して受容体インターナリゼーションのレベル上昇を潜在的にもたらし得ることが考えられる。そのような組成物の個別抗体の１またはそれ以上の、１またはそれ以上の抗癌剤への結合は、それゆえ、結合した抗癌剤を特異的かつ有効に腫瘍細胞の内部へと送達する可能性を有し、それにより本発明の抗体組成物の作用を増大させ、改善された腫瘍細胞死滅活性を提供する。
【０１４０】
細胞傷害性物質（従来の化学療法剤および他の低分子抗癌薬）、サイトカイン（この場合複合体は「免疫サイトカイン」と称され得る）、毒素（この場合複合体は「免疫毒素」と称され得る）および放射性核種を含む、様々な種類の抗癌剤を本発明の抗体に結合することができ、少数の免疫複合体は既に臨床使用に関して承認されている。これらには、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）（９０Ｙに結合したネズミ抗ＣＤ２０抗体）、Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）（１３１Ｉに結合したネズミ抗ＣＤ２０抗体）およびＭｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）カリケアマイシンに結合したヒト化抗ＣＤ３３抗体）が含まれる。臨床試験で検討されている他の免疫複合体には、例えばドキソルビシンまたはメイタンシノイド化合物に結合した抗体が含まれる。臨床試験で検討されている免疫毒素には、切頭型シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａに結合したいくつかの抗体が含まれる。ＩＬ−２に結合したヒト化ＥｐＣＡＭ抗体を含む免疫サイトカインも試験されている。
【０１４１】
細胞傷害剤に結合させた本発明抗体の場合、これらは、例えば、アルキル化剤（例えばカルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン）、代謝拮抗剤（例えばメトトレキサート、カペシタビン、ゲムシタビン）、アントラサイクリン（例えばブレオマイシン、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ）ならびに植物アルカロイド（例えばドセタキセルおよびパクリタキセルなどのタキサン、ならびにビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビンなどのビンカアルカロイド）を含む、化学療法剤の主要なクラスのいずれかに属し得る。免疫複合体の使用は、抗癌剤を腫瘍に、特にインターナリゼーション後に腫瘍細胞の内部に特異的に向かわせるので、本発明の抗体に基づく免疫複合体は、好都合にはカリケアマイシンもしくはメイタンシン誘導体などの高度細胞傷害性物質、または細菌毒素（例えばシュードモナス外毒素Ａ、ジフテリア毒素）もしくは植物毒素（例えばリシン）などの毒素に基づき得る。
【０１４２】
免疫複合体中の結合した抗癌剤は、一般に、血清中では比較的安定であるが、免疫複合体が標的細胞内にインターナライズされた場合薬剤の放出を可能にする不安定なリンカーによって抗体に連結される。適切なリンカーには、例えば、血清中の中性ｐＨでは安定であるが、インターナリゼーション後にリソソーム内の弱酸性条件下で酸加水分解を受ける化学的リンカー、細胞内チオールによって切断されるジスルフィドリンカー、および血清中で安定であるが、細胞内区画では酵素切断を受けるペプチドリンカーが含まれる。
【０１４３】
様々な結合配置が、本発明の２またはそれ以上の抗体を含む組成物において想定され得る。例えば、２つの抗体に関しては、抗体を２もしくはそれ以上の異なる抗癌薬に結合するか、または一方の抗体を、他方の抗体に結合した酵素などの作用物質によって活性化されるプロドラッグに結合することが可能である。抗体指向性酵素プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）の一般的な概念がモノクローナル抗体に関して記述されており、この場合、ｍＡＢ−酵素複合体により腫瘍に標的化された酵素によってプロドラッグが活性化されるが、本発明は、この方法を特定の条件に適合させる可能性を提供し得る。したがって、正常組織への損傷を回避または低減しつつ、腫瘍細胞の死滅を特異的に増大させることが可能であり得る。
【０１４４】
抗癌性免疫複合体に関するさらなる情報については、Ｗｕら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（９）：１１３７−１１４６；Ｓｃｈｒａｍａら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ５：１４７−１５９；およびＲｏｈｒｅｒ（２００９）ｃｈｉｍｉｃａ ｏｇｇｉ／Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｄａｙ ２７（５）：５６−６０参照。
【０１４５】
用量および投与経路
本発明の抗体組成物は、問題の状態の処置に有効な量で、すなわち所望結果を達成するのに必要な投与量および期間で投与される。治療有効量は、治療されている特定の状態、患者の年齢、性別および体重などの因子、ならびに抗体が単独処置として投与されるかまたは１もしくはそれ以上の付加的な抗癌処置と組み合わせて投与されているかによって異なり得る。
【０１４６】
腫瘍治療のための有効量は、患者において疾患の進行を安定化するおよび／または症状を改善する、好ましくは、例えば腫瘍サイズを低減することによって、疾患の進行を逆転させるその能力によって測定され得る。癌を阻害する本発明の抗体または組成物の能力は、例えば実施例で述べるような、インビトロアッセイによって、ならびにヒト腫瘍における効果を予測する適切な動物モデルにおいて評価され得る。適切な用法は、個々の特定状況において最適の治療応答を提供するために選択され、例えば単回ボーラスとしてまたは持続注入として、および場合によりそれぞれの症例の緊急性によって指示される投与量の調整を伴って投与される。
【０１４７】
本発明による抗体についての明確な投与量はまだ決定されていないが、治療的使用に関して承認されている類似製品（例えばＨＥＲ２またはＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体）との比較を通して一定の投与上の考慮事項を決定することはできる。したがって、本発明の抗体組成物の適切な投与量は、抗ＨＥＲ３モノクローナル抗体トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））または抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））についての推奨投与量と同様であることが考えられる。 個々の状態によって、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は、４ｍｇ／ｋｇの初回用量およびその後週１回の２ｍｇ／ｋｇの用量、または８ｍｇ／ｋｇの初回用量およびその後３週間に１回の６ｍｇ／ｋｇの用量のいずれかで乳癌の処置のために（注入によって）投与され、一方Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）は１４日ごとに６ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０１４８】
本発明の抗体組成物の適切な用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば約１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲内であると考えられる。抗体組成物は、例えば、少なくとも０．２５ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも１ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも１．５ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも２ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも３ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも４ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも５ｍｇ／ｋｇ、および例えば最大５０ｍｇ／ｋｇまで、例えば最大３０ｍｇ／ｋｇまで、例えば最大２０ｍｇ／ｋｇまで、例えば最大１５ｍｇ／ｋｇまでの用量で投与され得る。投与は、通常は適切な間隔で、例えば週に１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回、担当医師が適切と判断する期間にわたって反復され、担当医師は場合により必要に応じて用量を増加または減少させ得る。
【０１４９】
３つの別個の送達方法が本発明の抗体の送達のために企図される。従来の静脈内送達は、おそらく腫瘍の大多数についての標準的な送達技術である。しかし、卵巣、胆管、他の管等の腫瘍のような腹腔における腫瘍に関しては、腹腔内投与が、腫瘍において抗体の高用量を得るためおよび抗体のクリアランスを最小限に抑えるために好ましいことが証明され得る。同様に、一部の固形腫瘍は局所灌流に適した血管系を有する。局所灌流は、腫瘍の部位で抗体の高用量を得ることを可能にし、抗体の短期的なクリアランスを最小限に抑え得る。
【０１５０】
タンパク質または抗体の注入に基づく治療用製品と同様に、安全上の懸案事項は、主として（ｉ）サイトカイン放出症候群、すなわち高血圧、熱、震え、悪寒、（ｉｉ）タンパク質に対する免疫原性応答の発現（すなわち組換え抗体製品に対する患者によるヒト抗体の発現）、および（ｉｉｉ）ＨＥＲファミリー受容体を発現する正常細胞、例えば多くの上皮細胞への毒性に関連する。そのような安全上の懸案事項を監視するために標準的な試験およびフォローアップ手順が用いられる。
【０１５１】
本出願において引用されるすべての特許および非特許参考文献については、それらの全体を出典明示により本明細書に援用する。
【０１５２】
本発明を以下の非限定的実施例においてさらに説明する。
【実施例】
【０１５３】
以下の実施例において使用されるＥＧＦＲおよびＨＥＲ２を標的とする抗体は、ＷＯ２００８／１０４１８３Ａ２およびＷＯ２０１１／１０７９５７Ａ１（これらを出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている方法にしたがって、全て同定されている。実施例においてコントロールｍＡｂとして使用されたモノクローナル抗体は、Ｓｙｎａｇｉｓ（パリビズマブ）である。全実施例において、ｘ軸に対する濃度は、全抗体濃度である、すなわち、２つの抗体の混合物において、それぞれの個々の抗体は、全体の１／２を含む；３つの抗体の混合物において、それぞれの個々の抗体は、全体の１／３を含むなど。
【０１５４】
実施例１：抗ＨＥＲ３抗体のクローニング
免疫化
３匹の雌マウス、すなわち１匹のＢＡＬＢ／ｃＪ、１匹のＣ５７ＢＬ／６マウスおよび１匹のＣ３Ｈ（８〜１０週齢）を免疫化のために使用した。マウスを市販のＨＥＲ３タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３４８−ＲＢ）で免疫化した。最初の４回の免疫化に関しては、ＨＥＲ３タンパク質をＰＢＳに希釈し、フロイントアジュバントと１：１（ｖ／ｖ）で混合した。５回目および最後の免疫化は、アジュバントなしで、ＰＢＳ中のＨＥＲ３タンパク質で行った。
【０１５５】
アジュバントは、免疫応答を増強し、調節するために使用される。１回目の免疫化では完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を使用し、２回目、３回目および４回目の免疫化には不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を使用した。ＩＦＡは鉱油から成る水中油型エマルションであり、ＣＦＡは、加熱殺菌した乾燥ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種を含むＩＦＡである。どちらのアジュバントもデポー作用を有する。ＣＦＡ中のミコバクテリウムは免疫系の強力な活性化を生じさせ、免疫応答の長期的な持続をもたらす。安定なエマルションだけをマウスに投与した。
【０１５６】
組換えＨＥＲ３タンパク質１０μｇをそれぞれの免疫化に使用した。合計で、マウスは５回の注射を受けた。最初の４回の注射についてはすべてのマウスに抗原−アジュバントエマルション２００μｌを皮下（ｓ．ｃ．）注射し、５回目の注射についてはＰＢＳ中の抗原１００μｌを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。免疫化、アジュバント、注射経路等の要約を表４に示す。
【０１５７】
マウスを頚椎脱臼によって犠死させ、脾臓と鼡径リンパ節を採取した。７０μｍセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３５２３５０）に通して解離させることにより、単細胞懸濁液を調製した。３匹のマウスからの細胞をプールし、１０％ＦＢＳを含む冷ＲＰＭＩ−１６４０に再懸濁して、遠沈させた。
表４：免疫化の要約
【表４】
0006033783.tif 000005
【０１５８】
ネズミ形質細胞のＦＡＣＳ選別
赤血球を取り除くため、プールした細胞懸濁液を０．１７Ｍ  ＮＨ４Ｃｌに溶解した。 溶解後、細胞を２％ＦＢＳ／ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を２％ＦＢＳ／ＰＢＳ  １ｍｌに再懸濁し、Ｆｃ−ブロック（抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５３１４１） と共にインキュベートして、１回洗浄した。２％ＦＢＳ／ＰＢＳに再懸濁した後、細胞を抗マウスＣＤ４３−ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５３２７０）、抗マウスＣＤ１３８−ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５３７１４）、抗マウスＩｇＭ−Ｈｏｒｉｚｏｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５６０５７５）、抗マウスＩｇＧ１−ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５０８７４）、抗マウスＭＨＣ ＩＩ（Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅｄ）−ビオチン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５３６２２）および抗マウスＢ２２０／ＣＤ４５Ｒ−ＰｅｒＣＰ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５３０９３）で２０分間、暗所において染色した。 細胞を洗浄し、ストレプトアビジン−ＡＰＣ−Ｃｙ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５４０６３）と共に２０分間インキュベートして、洗浄した。細胞をＦＡＣＳＡｒｉａセルソーターでＦＡＣＳ選別した。Ｂ２２０ｌｏｗＭＨＣＩＩｉｎｔＣＤ４３＋ＣＤ１３８＋ＩｇＭ−である細胞を、ＰＣＲ反応緩衝液を含む３８４ウェルマイクロタイタープレートに単細胞選別した。プレートを遠心分離し、凍結して、−８０℃で保存した。
【０１５９】
コグネイトＶＨおよびＶＬ対の連結
ＶＨおよびＶＬコード−配列の連結を、形質細胞としてゲートした単一細胞に関して実施し、ＶＨおよびＶＬコード配列のコグネイト対合を容易にした。手順は、１段階多重オーバーラップ伸長ＲＴ−ＰＣＲとそれに続くネステッドＰＣＲに基づく２段階ＰＣＲ手法を用いた。本実施例で使用したプライマーミックスはκ軽鎖だけを増幅する。しかし、所望する場合は、λ軽鎖を増幅することができるプライマーを多重プライマーミックスおよびネステッドＰＣＲプライマーミックスに添加することができる。λプライマーを添加する場合は、λ陽性細胞が排除されないように選別手順を適合させるべきである。コグネイトＶＨおよびＶＬ配列の連結についての原理は、国際公開第２００５／０４２７７４号およびＭｅｉｊｅｒら（２００６）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３５８（３）：７６４−７２で詳細に説明されている。
【０１６０】
９６ウェルＰＣＲプレートを解凍し、選別した細胞を多重オーバーラップ伸長ＲＴ−ＰＣＲのための鋳型として使用した。単細胞選別の前に各ウェルに添加した選別緩衝液は、反応緩衝液（ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液；Ｑｉａｇｅｎ）、ＲＴ−ＰＣＲ用プライマーおよびＲＮアーゼインヒビター（ＲＮａｓｉｎ，Ｐｒｏｍｅｇａ）を含んだ。オーバーラップ伸長ＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマーならびにプライマー濃度は、国際公開第２００８／１０４１８３号の表３に列挙されているものと同じであった。これに、ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ５Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（２５倍希釈；Ｑｉａｇｅｎ）およびｄＮＴＰミックス（各２００μＭ）を添加して、反応容量２０μｌ中で所与の最終濃度を得た。プレートを５５℃で３０分間インキュベートし、各細胞からＲＮＡを逆転写（ＲＴ）させた。ＲＴ後、プレートを以下のＰＣＲサイクルに供した：９４℃、１０分、３５×（９４℃、４０秒、６０℃、４０秒、７２℃、５分）、７２℃、１０分。
【０１６１】
ＰＣＲ反応は、ハイスループットを容易にするため２４枚の９６ウェルプレート用のＰｅｅｌ Ｓｅａｌ Ｂａｓｋｅｔ（ＡＢｇｅｎｅ）を用いてＨ２０ＢＩＴ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒで実施した。サイクリング後、ＰＣＲプレートを−２０℃で保存した。
【０１６２】
ネステッドＰＣＲ段階については、所与の最終濃度を得るために各ウェル中に以下の混合物（反応物２０μｌ）を含む９６ウェルＰＣＲプレートを調製した：１× ＦａｓｔＳｔａｒｔ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）、ｄＮＴＰミックス（各２００μＭ）、ネステッドプライマーミックス、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（０．０８Ｕ；Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）およびＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｌｅｎｄ（０．８Ｕ；Ｒｏｃｈｅ）。ネステッドＰＣＲに使用したプライマーならびにプライマー濃度は、国際公開第２００８／１０４１８３号の表４に列挙されているものと同じであった。ネステッドＰＣＲのための鋳型として、多重オーバーラップ伸長ＰＣＲ反応物から１μｌを移した。ネステッドＰＣＲプレートを以下のサーモサイクリングに供した：３５×（９５℃、３０秒、６０℃、３０秒、７２℃、９０秒）、７２℃、１０分。無作為に選択した反応物を１％アガロースゲル上で分析し、約８９０塩基対（ｂｐ）のオーバーラップ伸長フラグメントの存在を確認した。ＰＣＲフラグメントのさらなるプロセッシングまで、プレートを−２０℃で保存した。
【０１６３】
ネステッドＰＣＲからの連結したＶＨおよびＶＬコード対のレパートリーを、異なるドナーからの対を混合せずにプールし、分取用１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。ヒトκ定常軽鎖をコードする配列を、国際公開第２００８／１０４１８３号に記載されているように、オーバーラップ伸長法によって連結したＶＨおよびＶＬコード対のプールしたＰＣＲ産物のＶＬコード領域にスプライスした。ヒトκ定常軽鎖コード配列を、κ軽鎖を有するヒト抗体のコード配列を含むプラスミドから、総容量５０μｌ中、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ（２Ｕ；Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）、１×Ｐｈｕｓｉｏｎ緩衝液、ｄＮＴＰミックス（各２００μＭ）、ｈＫＣｆｏｒｗ−ｖ２プライマーおよびκ３’プライマー（使用したプライマーおよび濃度については国際公開第２００８／１０４１８３号の表５参照）ならびにプラスミド鋳型ｐＬＬ１３８（１０ｎｇ／μｌ）を含む反応物において増幅した。反応物を以下のサーモサイクリングに供した：２５×（９５℃、３０秒、５５℃、３０秒、７２℃、４５秒）、７２℃、１０分。生じたＰＣＲフラグメントを分取用１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。
【０１６４】
各レパートリーからの精製プールＰＣＲフラグメントを、次のものを含むオーバーラップ伸長ＰＣＲ（総容量５０μｌ）による以下のスプライシングによって、ヒトκ定常コード領域の増幅精製したＰＣＲフラグメント（配列番号４１）にスプライスした：ヒトκ定常コード領域フラグメント（１．４ｎｇ／μｌ）、精製プールＰＣＲフラグメント（１．４ｎｇ／μｌ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（０．５Ｕ；Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）およびＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｌｅｎｄ（０．２Ｕ；Ｒｏｃｈｅ）、１×ＦａｓｔＳｔａｒｔ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）、ｄＮＴＰミックス（各２００μＭ）、ｍｈＫＣｒｅｖプライマーおよびｍＪＨセットプライマー（使用したプライマーおよび濃度については国際公開第２００８／１０４１８３号の表５参照）。反応物を以下のサーモサイクリングに供した：９５℃、２分、２５×（９５℃、３０秒、５５℃、３０秒、７２℃、１分）、７２℃、１０分。生じたＰＣＲフラグメント（約４５１８ｂｐ）を分取用１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。
【０１６５】
コグネイトＶＨおよびＶＬコード対のスクリーニングベクターへの挿入
ＨＥＲ３に対して結合特異性を有する抗体を同定するために、得られたＶＨおよびＶＬコード配列を完全長抗体として発現させた。これには、ＶＨおよびＶＬコード対のレパートリーを発現ベクターに挿入し、宿主細胞にトランスフェクトすることが含まれた。
【０１６６】
連結したＶＨおよびＶＬコード対を含む発現ベクターのレパートリーを作製するため、２段階クローニング手順を用いた。統計的に、発現ベクターのレパートリーが、スクリーニングレパートリーの作製に使用されるコグネイト対のＶＨおよびＶＬ  ＰＣＲ産物の数の１０倍に相当する数の組換えプラスミドを含む場合、すべてのユニークな遺伝子対が示される可能性は９９％ある。したがって、４００個のオーバーラップ伸長Ｖ遺伝子フラグメントが得られた場合、すべてのユニーク遺伝子対の９９％の可能性を有するスクリーニングのために少なくとも４０００クローンのレパートリーを作製する。
【０１６７】
簡単に述べると、ヒトκ定常コード領域にスプライスした、連結ＶＨおよびＶＬコード対のレパートリーの精製ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ産物の末端に導入した認識部位でＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ  ＤＮＡエンドヌクレアーゼにより切断した。切断し、精製したフラグメントを、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ消化哺乳動物ＩｇＧ発現ベクター００−ＶＰ−００２（国際公開第２００８／１０４１８３号に記載されている）に、標準的な連結手順によって連結した。連結混合物を大腸菌に電気穿孔し、適切な抗生物質を含む２×ＹＴプレートに添加して、３７℃で一晩インキュベートした。増幅したベクターのレパートリーを、標準的なＤＮＡ精製方法（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプレートから回収した細胞から精製した。ＡｓｃＩおよびＮｈｅＩエンドヌクレアーゼを使用した切断によるプロモーター−リーダーフラグメントの挿入のためにプラスミドを調製した。これらの酵素の制限部位は、ＶＨおよびＶＬコード遺伝子対の間に位置した。ベクターの精製後、ＡｓｃＩ−ＮｈｅＩ消化二方向性哺乳動物プロモーター−リーダーフラグメントを標準的な連結手順によってＡｓｃＩおよびＮｈｅＩ制限部位に挿入した。連結されたベクターを大腸菌で増幅し、標準的な方法を用いてプラスミドを精製した。作製したスクリーニングベクターのレパートリーを、従来の手順によって大腸菌に形質転換した。得られたコロニーを３８４ウェルマスタープレートに集約し、保存した。
【０１６８】
哺乳動物発現プラスミドの増幅のために２段階手順を使用した。最初に、水酸化ナトリウム中でインキュベートすることによって細菌を溶解し、ＤＮＡを変性させた。その後、ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ増幅を実施した（ＧＥ Ａｍｅｒｓｈａｍ）。この方法は、ローリングサークル増幅法によって二本鎖環状ＤＮＡ鋳型を指数関数的に増幅するためにバクテリオファージΦ２９ＤＮＡポリメラーゼを利用する。哺乳動物細胞における抗体発現のために、２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者によって推奨される標準的なトランスフェクション条件を用いて適用した。トランスフェクションの前に細胞にバルプロエートを添加して５０ｍＭとし、その翌日、Ｔｒｙｐｔｏｎｅ Ｎ１を加えてトランスフェクション容量の１．５％（ｗ／ｖ）の最終濃度にした。トランスフェクションの６日後に抗体を含む上清を採取した。標準的な抗ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡで発現レベルを評価した。
【０１６９】
組換えＨＥＲ３タンパク質への結合に関するスクリーニング（ＥＬＩＳＡ）
組換えＨＥＲ３タンパク質を抗原として使用して、抗体特異性をＥＬＩＳＡによって測定した。
【０１７０】
簡単に述べると、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート（カタログ番号４６４７１８）を、ＰＢＳで希釈した１μｇ／ｍｌ  ＨＥＲ３タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３４８−ＲＢ）により４℃で一晩被覆した。５０μｌの２％乳−ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０中でのブロッキングに先立ち、プレートをＰＢＳ−Ｔで１回洗浄した。プレートをＰＢＳ−Ｔおよび２０μｌの２％乳−ＰＢＳ−Ｔで１回洗浄し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３トランスフェクタントからの上清１０μｌを添加して、室温で１時間インキュベートし、その後プレートを各ウェルにつきＰＢＳ−Ｔ、２０μｌで１回洗浄した。ウェルに結合した抗体を検出するために２％乳−ＰＢＳ−Ｔで１：２５０００希釈した二次抗体（ＨＲＰ−ヤギ抗ヒトκ軽鎖、Ｓｅｒｏｔｅｃ、カタログ番号ＳＴＡＲ １００Ｐ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで１回洗浄した後、基質２５μｌ（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号４５１８）を添加し、５分間インキュベートした。反応を停止させるため、インキュベーション後に１Ｍ硫酸２５μｌを添加した。４５０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーにて特異的シグナルを検出した。ＥＬＩＳＡデータから４８０の陽性抗体クローンを同定し、配列分析およびＨＥＲ３への結合の確認のために選択した。
【０１７１】
配列分析およびクローン選択
ＥＬＩＳＡによりＨＥＲ３に結合すると同定されたクローンを元のマスタープレート（３８４ウェル形式）から回収し、寒天プレートに画線接種して単一コロニーを作製し、コロニーをＬＢ培地培養物に取り、激しく振とうしながら３７℃でＯＮインキュベートした。Ｑｉａｐｒｅｐ ９６ターボミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１９３）を用いてプラスミドＤＮＡをクローンから単離し、Ｖ遺伝子のＤＮＡ塩基配列決定に供した。配列を整列させ、すべてのユニークなクローンを選択した。得られた配列のマルチプルアラインメントは個々のクローンのユニーク性を明らかにし、ユニークな抗体の同定を可能にした。配列決定したクローンの配列分析後、２〜４０を超える成員を有する関連配列の３３のクラスターならびに一度だけ提示された２０のクローン型を同定した。関連配列の各クラスターは、おそらく共通の前駆体クローンの体細胞超突然変異を通して誘導された。全体で、各クラスターから１〜２個のクローンを配列および特異性の検証のために選択した。クラスター分析に基づき、１１９のクローンを小規模発現およびさらなる特性検定のために選択した。選択した抗体可変領域の配列を配列表に示す。配列表に示す軽鎖配列はすべて、アミノ酸−ＴＶＡＡＰ−で始まり、Ｃ末端の−ＮＲＧＥＣで終了する、同じヒトκ定常領域を含む。抗体をコードするクローンを検証するため、ＤＮＡプラスミドを調製し、２ｍｌ規模でＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のトランスフェクションを発現のために実施した。トランスフェクションの６日後に上清を採取した。発現レベルを標準的な抗ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡで評価し、「組換えＨＥＲ３タンパク質への結合に関するスクリーニング」で上述したようにＨＥＲ３特異的ＥＬＩＳＡによって、およびＨＥＲ３過剰発現細胞への抗体結合のハイスループットスクリーニング共焦点顕微鏡検査によって特異性を測定した（下記参照）。
【０１７２】
ＨＥＲ３過剰発現細胞への結合に関するスクリーニング（ＯＰＥＲＡ）
１１９のクローンを、共焦点顕微鏡検査を用いてＨＥＲ３過剰発現性乳癌細胞株（ＭＣＦ−７）への結合に関してスクリーニングした。１００００個のＭＣＦ−７細胞を３８４ウェル細胞担体プレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６００７４３９）の各ウェルに接種し、一晩付着させた。培地を再び廃棄し、細胞を２％ホルムアルデヒド溶液（Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号５３３９９８）で洗浄し、固定した。洗浄後、抗体上清４０μｌを各ウェルに移し、プレートを２時間インキュベートして、その後ウェル中の培地を廃棄し、２μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ−４８８標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ１１０１３）、２μｇ／ｍｌのＣｅｌｌＭａｓｋ Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｈ３４５５８）および１μＭ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｈ３５７０）を含む新しい培地３０μｌを各ウェルに添加して、プレートをさらに３０分間インキュベートした。次にＯＰＥＲＡハイスループット共焦点顕微鏡（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて蛍光のレベルを測定した。
【０１７３】
ＥＬＩＳＡおよびＯＰＥＲＡ検証スクリーニングによって得られた結合データから、６４のクローンを中規模発現のために選択した。
【０１７４】
実施例２：ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３それぞれに対する最適な抗体混合物の選択
本実施例は、それぞれ個々のＨＥＲファミリー受容体（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３）に対する抗体の混合物が、個々の抗体よりも優れていることを証明する。
【０１７５】
方法
それぞれの受容体に対する３つのモノクローナル抗体を、本試験のために選択した（表５）。それぞれの受容体に対する抗体は、表面プラズモン共鳴分析により確認されるとおり、非重複エピトープに結合する。
表５：試験において使用された抗体
【表５】
0006033783.tif 000006
【０１７６】
選択された抗体および抗体混合物を、生存性アッセイを用いて、癌細胞系Ａ４３１ＮＳ（ＥＧＦＲ）、ＮＣＩ−Ｎ８７（ＨＥＲ２）および１０ｎＭのヘレグリンベータで刺激されたＭＣＦ−７細胞（ＨＥＲ３）の成長および増殖を阻害する能力について試験した。細胞損傷は、代謝細胞機能および増殖を維持し、そのためのエネルギーを提供する細胞の能力の喪失を不可避的にもたらす。代謝活性アッセイはこの前提に基づいており、それらは通常、ミトコンドリア活性を測定する。細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１１ ６４４ ８０７ ００１）は、生細胞の代謝活性を測定する、すぐ使用できる基質である。代謝活性が生存可能な細胞の数と相関すると仮定する。この実施例では、ＷＳＴ−１アッセイを使用して、種々の濃度の抗体で癌細胞を９６時間処理した後、代謝活性細胞の数を測定した。
【０１７７】
ＷＳＴ−１アッセイを行う前に、適当な抗体および抗体混合物を、２％のＦＢＳおよび１％のＰ／Ｓを補った適当な培地において１００μｇ／ｍｌの最終全抗体濃度に希釈し、最も高い抗体濃度を含むウェルにおいて５０μｇ／ｍｌの最終全抗体濃度とした。次に、抗体の３倍連続希釈を行った。次に、関連する数の細胞を、３８４−ウェルプレートにおける実験ウェルに加えた。プレートを加湿インキュベータにおいて３７℃で４日間インキュベートした。次にＷＳＴ−１試薬を各プレートに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。プレートを軌道プレートシェーカーに１時間移し、ＥＬＩＳＡリーダーにて４５０と６２０ｎｍ（参照波長）で吸光度を測定した。代謝活性細胞（ＭＡＣ）の量を以下のように非処理対照のパーセントとして計算した：
【数１】
0006033783.tif 000007
【０１７８】
結果
細胞系Ａ４３１ＮＳに対する、３つの抗ＥＧＦＲ抗体およびこれらの全ての可能な混合物の滴定の結果は、図１Ａに示される。抗体の混合物が個々の抗体よりも優れていることは明らかである。９９２および１０２４からなる抗体混合物は、最も高い有効性および効力を有したため、選択された。細胞系ＮＣＩ−Ｎ８７に対する、３つの抗ＨＥＲ２抗体およびこれらの全ての可能な混合物の滴定の結果は、図１Ｂに示される。再び、抗体の混合物が個々の抗体よりも優れていた。４３８２、４３８５および４５１８からなる抗体混合物は、最も高い有効性および効力を有したため、選択された。１０ｎＭのヘレグリンベータで刺激された細胞系ＭＣＦ７に対する、３つの抗ＨＥＲ３抗体およびこれらの全ての可能な混合物の滴定の結果は、図１Ｃに示される。最も良いモノクローナル抗体５０８２と最も良い抗体混合物４７８５＋５０８２間を区別することが難しかった。しかしながら、混合物がより良いわずかな傾向があったため、したがって、それをｐａｎ−ＨＥＲ混合物の試験のために選択した。
【０１７９】
実施例３：ｐａｎ−ＨＥＲ抗体混合物の癌阻害活性
本実施例は、ＨＥＲファミリー受容体の２つ以上の最適な標的化が、それぞれの受容体に対する抗体の混合物を混合することにより得られること、および３つの受容体の標的化が２つの受容体の標的化よりも優れていることを証明する。
【０１８０】
方法
３つの受容体、９９２＋１０２４（ＥＧＦＲ）、４３８２＋４３８５＋４５１８（ＨＥＲ２）および４７８５＋５０８２（ＨＥＲ３）に対する最適化された混合物、ならびにこれらの全ての可能な混合物を、実施例２に記載されているものと同様の生存性アッセイを使用して、癌細胞系Ａ４３１ＮＳ（ＥＧＦＲ）、ＮＣＩ−Ｎ８７（ＨＥＲ２）および１０ｎＭのヘレグリンベータで刺激されたＭＣＦ−７細胞（ＨＥＲ３）の成長および増殖を阻害する能力について試験した。
【０１８１】
結果
細胞系Ａ４３１ＮＳ、ＭＣＦ７およびＮＣＩ−Ｎ８７に対する３つの抗体混合物およびこれらの全ての可能な混合物の滴定の結果は、それぞれ、図２、３および４に示される。Ａ４３１ＮＳ細胞において、ＥＧＦＲ混合物およびＨＥＲ３またはＨＥＲ２混合物の組合せは、癌細胞成長の阻害において相乗的増加を生じた（図２）。ＨＥＲ２およびＨＥＲ３に対する混合物の組合せは、Ａ４３１ＮＳ細胞に対して阻害効果を有さなかった。しかしながら、全３つの受容体に対する混合物の組合せは、個々の混合物および２つの受容体に対する混合物の組合せよりも優れていた。
【０１８２】
同様の結果が、ＭＣＦ７細胞系において見出された（図３）。ＥＧＦＲ混合物およびＨＥＲ３またはＨＥＲ２混合物およびＨＥＲ２およびＨＥＲ３混合物の組合せは、癌細胞成長の阻害において相乗的増加を生じた。全３つの受容体に対する混合物の組合せは、個々の混合物および２つの受容体に対する混合物の組合せよりも優れていた。
【０１８３】
ＮＣＩ−Ｎ８７細胞系において、効率的な抗ＨＥＲ２混合物を抗ＥＧＦＲ混合物または抗ＨＥＲ３混合物のいずれかと混合することにより、効力または有効性のいずれかにおいても増加は得られなかった（図４）。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３に対する混合物の組合せは、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞に対する阻害効果を有さなかった。全３つの受容体に対する混合物の組合せは、抗ＨＥＲ２混合物と同様の効力および有効性を有した。
【０１８４】
全３つの受容体に対する混合物の組合せを、市販のモノクローナル抗体セツキシマブ（ＥＧＦＲ）およびトラスツマブ（ＨＥＲ２）およびこれらの２つの抗体の混合物と比較した（図５）。結果は、ｐａｎ−ＨＥＲ混合物が、全３つの細胞系において、セツキシマブおよびトラスツマブの両方より、およびこれらの２つの抗体の混合物よりも優れていることを証明する。
【０１８５】
全般的に、本実施例の結果は、ＨＥＲファミリー受容体の２つ以上の最適な標的化が、それぞれの受容体に対する抗体の混合物を混合することにより得られること、および３つの受容体の標的化が、２つの受容体の標的化よりも優れていることを証明する。
【０１８６】
実施例４：抗体混合物の組合せで、２つのＨＥＲファミリー受容体ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２を同時に標的化することによる阻害プロフィール
本実施例は、抗ＥＧＦＲ混合物およびＨＥＲ２混合物の組合せが、癌細胞系ＭＣＦ７、ＨＣＣ２０２、ＢＴ４７４、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５、Ａ４３１ＮＳ、ＨＮ５、Ｈ２９２、ＤＵ１４５およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８を阻害することを証明する。
【０１８７】
方法
抗ＥＧＦＲ混合物（９９２＋１０２４）、抗ＨＥＲ２混合物（４３８２＋４３８５＋４５１８）およびこれらの２つの混合物の組合せは、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２依存で１０個のヒト癌細胞系の成長を阻害する能力について試験した。市販のモノクローナル抗体セツキシマブおよびトラスツマブを、コントロールとして含んだ。
【０１８８】
癌細胞系ＭＣＦ７、ＨＣＣ２０２、ＢＴ４７４、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５、Ａ４３１ＮＳ、ＨＮ５、Ｈ２９２、ＤＵ１４５およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８を、２μｇ／ｍｌの抗ＨＥＲ２抗体を含む培地中で１０００細胞／ウェルの濃度で９６−ウェルプレートに播種した。プレートを加湿インキュベータにおいて３７℃で４日間インキュベートした。次に、２０μｌのＷＳＴ−１試薬を各プレートに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。次に、プレートを軌道プレートシェーカーに移し、さらに１時間放置した。ＥＬＩＳＡリーダーにて４５０および６２０ｎｍ（参照波長）で吸光度を測定した。成長阻害のレベルを、非処理対照細胞のパーセントとして計算した。
【０１８９】
結果
細胞成長阻害の研究の結果は、図６において見出すことができ、抗ＥＧＦＲ混合物およびＨＥＲ２混合物の組合せが、全ての試験される細胞系を阻害することを示す。受容体の１つのみの標的化は、該受容体に依存する細胞系の阻害をもたらす。全般的に、これらの結果は、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２に対する抗体の混合物の組合せが、非常に広範な阻害プロフィールを与え、したがって、最後に、受容体のいずれかに依存する腫瘍を有する患者を処置するために使用され得ることを示す。
【０１９０】
実施例５：抗体混合物の組合せでのＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３の分解
本実施例は、抗体の混合物が、それらの標的（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３）の分解を誘導すること、および全３つの標的に対する混合物の組合せが、同時に全受容体の分解を誘導することができることを証明する。
【０１９１】
方法
抗体混合物および混合物の組合せにより誘導されるＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３分解のレベルを試験するために、ウェスタンブロット分析を、４８時間抗体で処置されたＨＮ５、Ｎ８７およびＭＣＦ７細胞の全細胞溶解物にて行った。細胞をＴ−７５培養フラスコで培養し、５０％コンフルエントのとき、培養培地を取り出し、細胞を１ｘＰＢＳで洗浄し、０．５％のＦＢＳを含む５ｍｌの培地で希釈された２０μｇ／ｍｌの抗体で処理した。全細胞溶解物を標準ＲＩＰＡバッファーを使用して調製した４８時間後、細胞を処理した。全タンパク質濃度をそれぞれのサンプルにおいて決定し、１−１０μｇのタンパク質を、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３に対する一次抗体を使用するウェスタンブロッティングにより分析した。β−アクチンに対する抗体を負荷対照として使用した。
【０１９２】
結果
ウェスタンブロット研究の結果（図７）は、単一の受容体（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３）に対する抗体の混合物が、それらのそれぞれの標的の分解を誘導すること、およびそれぞれの標的に対する抗体混合物の組合せからなるｐａｎ−ＨＥＲ混合物が、同時に全３つの受容体の効率的な分解を誘導することができることを示す。
【０１９３】
実施例６：ｐａｎ−ＨＥＲ抗体混合物の癌阻害活性
実施例３に記載されている方法を使用して、抗体混合物Ｓｙｍ００４（ＷＯ２００８／１０４１８３に記載されている２つの抗ＥＧＦＲ抗体９９２＋１０２４を含む）、１２７７＋１５６５（抗−ＥＧＦＲ）、１２５４＋１５６５（抗−ＥＧＦＲ）、４３８５＋４３１８（抗−ＨＥＲ２）、４３８４＋４５１７（抗−ＨＥＲ２）、５０３８＋５０８２（抗−ＨＥＲ３）、ｐａｎ−ＨＥＲ抗体混合物１５６５＋４５１７＋５０８２および１２７７＋４３８４＋５０８２（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３のそれぞれに対する１つの抗体）、および１２７７＋１５６５＋４３８４＋４５１７＋５０３８＋５０８２および１２７７＋１５６５＋４３８５＋４５１８＋５０３８＋５０８２（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３のそれぞれに対する２つの抗体）、参照抗体セツキシマブ（抗−ＥＧＦＲ）、トラスツマブ（抗−ＨＥＲ２）、８７３６（ＭＭ−１２１類似体；抗ＨＥＲ３）、および３つの参照抗体の混合物を、ネガティブコントロール抗体と共に、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３またはＥＧＦＲ／ＨＥＲ２／ＨＥＲ３に依存する２２癌細胞系の成長および増殖を阻害する能力について試験した。５細胞系Ａ４３１ＮＳ（ＥＧＦＲ）、Ｈ３５８（ＥＧＦＲ）、ＨＣＣ２０２（ＨＥＲ２）、ＯＥ１９（ＨＥＲ２）およびＨ８２０（ＥＧＦＲ）に対する上記抗体混合物および抗体の滴定の結果は、図８−１２に示される。
【０１９４】
結果
抗体混合物および個々の抗体の効果が、異なる細胞系間で変化するが、３つの受容体ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３のそれぞれに対する抗体を含むｐａｎ−ＨＥＲ抗体混合物は、一般的に、細胞成長および増殖の阻害に有効であることが、図８−１２における結果から見いだすことができる。６つの抗体、すなわち３つの受容体のそれぞれに対する２つの抗体を含むｐａｎ−ＨＥＲ混合物は、一般的に、異なる細胞系にわたって最も有効である。
【０１９５】
実施例７：抗体混合物の組合せでのＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３の分解
本実施例は、抗体の混合物が、それらの標的（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３）の分解を誘導すること、および全３つの標的に対する混合物の組合せが、同時に全受容体の分解を誘導することができることを証明する。
【０１９６】
方法
抗体混合物および混合物の組合せにより誘導されるＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３分解のレベルを試験するために、ウェスタンブロット分析を、４８時間抗体で処置されたＨ２９２およびＯＶＣＡＲ−８細胞の全細胞溶解物にて行った。細胞をＴ−７５培養フラスコで培養し、５０％コンフルエントのとき、培養培地を取り出し、細胞を１ｘＰＢＳで洗浄し、０．５％のＦＢＳを含む５ｍｌの培地で希釈された２０μｇ／ｍｌの抗体で処理した。全細胞溶解物を標準ＲＩＰＡバッファーを使用して調製した４８時間後、細胞を処理した。全タンパク質濃度をそれぞれのサンプルにおいて決定し、１−１０μｇのタンパク質を、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３に対する一次抗体を使用するウェスタンブロッティングにより分析した。β−アクチンに対する抗体を負荷対照として使用した。
【０１９７】
結果
ウェスタンブロット研究の結果（図１３）は、単一の受容体（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３）に対する抗体の混合物が、それらのそれぞれの標的の分解を誘導すること、およびそれぞれの標的に対する抗体混合物の組合せからなるｐａｎ−ＨＥＲ混合物が、同時に全３つの受容体の効率的な分解を誘導することができることを示す。
【０１９８】
Ｈ２９２細胞系において、全ＥＧＦＲにおける小さな減少は、抗ＥＧＦＲ抗体１２７７、１５６５、および、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３のそれぞれに対する１つの抗体からなるｐａｎ−ＨＥＲ混合物（１２７７＋４３８４＋５０８２）で処理された細胞において観察できるが、抗ＥＧＦＲコンパレーター(comparator)抗体セツキシマブで処理された細胞において観察できない。１２７７＋１５６５の混合物は、ＥＧＦＲの効率的な分解をもたらし、これは、それぞれの標的に対する２つの抗体からなるｐａｎ−ＨＥＲ混合物（１２７７＋１５６５＋４３８４＋４５１７＋５０３８＋５０８２）でも観察される。抗ＨＥＲ２抗体の組合せ（４３８４＋４５１７）は、両方の単独で、およびｐａｎ−ＨＥＲ混合物１２７７＋１５６５＋４３８４＋４５１７＋５０３８＋５０８２の一部として、ＨＥＲ２の分解を誘導した。
【０１９９】
Ｈ２９２と同様に、ＯＶＣＡＲ−８溶解物における全ＥＧＦＲにおける小さな減少は、個々の抗体１２７７および１５６５およびｐａｎ−ＨＥＲ混合物１２７７＋４３８４＋５０８２で処理された細胞において観察される。組合せ１２７７＋１５６５およびｐａｎ−ＨＥＲ混合物１２７７＋１５６５＋４３８４＋４５１７＋５０３８＋５０８２は、ＥＧＦＲの非常に効率的な分解を誘導した。抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体は、全ＨＥＲ２に対する微少効果を有し、ＨＥＲ２に対する抗体の組合せ（４３８４＋４５１７）は、受容体の効率的な分解をもたらした。ＨＥＲ３に対する抗体および抗体混合物は、全て、ＯＶＣＡＲ−８細胞における受容体の分解をもたらした。
【０２００】
Ｈ２９２細胞において、ＨＥＲ２の上方制御は、ＥＧＦＲに対する個々の抗体（セツキシマブ、１２７７および１５６５）または抗体の混合物（１２７７＋１５６５）での細胞の処理に応答して観察することができる。これは、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３が該設定において全て同時に破壊されるため、それぞれの標的に対する２つの抗体からなるｐａｎ−ＨＥＲ抗体混合物（１２７７＋１５６５＋４３８４＋４５１７＋５０３８＋５０８２）で処理された細胞において観察されない。ＯＶＣＡＲ−８細胞において、ＨＥＲ３に対する抗体または抗体の混合物で処理された細胞におけるＨＥＲ２の上方制御が見ることができる。再び、これは、同時受容体分解によって、それぞれの標的に対する２つの抗体からなるｐａｎ−ＨＥＲ抗体混合物で処理された細胞において観察されない（１２７７＋１５６５＋４３８４＋４５１７＋５０３８＋５０８２）。受容体上方制御は、ｐａｎ−ＨＥＲ抗体混合物（１２７７＋４３８４＋５０８２）で処理された細胞のいずれかも観察されなかった。したがって、全３つの受容体（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３）がｐａｎ−ＨＥＲ抗体混合物での処理時に破壊されるため、受容体上方制御の結果として、ｐａｎ−ＨＥＲ混合物での細胞の処理は、潜在的に、耐性の出現を防止する。
【０２０１】
実施例８：ｐａｎ−ＨＥＲ抗体混合物の癌阻害活性
本実施例は、標的ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３のそれぞれに対する１つの抗体からなるｐａｎ−ＨＥＲ抗体混合物、すなわちそれぞれの標的に対する１つの抗体を含むｐａｎ−ＨＥＲ混合物、２つの標的（ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３）に対する１つの抗体および１つの標的（ＨＥＲ２）に対する２つの抗体を含むｐａｎ−ＨＥＲ混合物、およびそれぞれの受容体、すなわちＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３に対する２つの抗体からなるｐａｎ−ＨＥＲ混合物の優れた癌阻害活性を記載する。
【０２０２】
方法
実施例３に記載されている方法を使用して、それぞれの受容体に対する抗体混合物１２７７＋１５６５（抗−ＥＧＦＲ）、４３８４＋４５１７（抗−ＨＥＲ２）および５０３８＋５０８２（抗−ＨＥＲ３）、それぞれの受容体に対する２つの抗体を有するｐａｎ−ＨＥＲ混合物（１２７７＋１５６５＋４３８４＋４５１７＋５０３８＋５０８２）、ＥＧＦＲに対する１つの抗体、ＨＥＲ２に対する２つの抗体およびＨＥＲ３に対する１つの抗体を含むｐａｎ−ＨＥＲ混合物（１２７７＋４３８４＋４５１７＋５０３８または１２７７＋４３８４＋４５１７＋５０８２）、それぞれの受容体に対する１つの抗体からなるｐａｎ−ＨＥＲ混合物（１２７７＋４３８４＋５０３８および１２７７＋４３８４＋５０８２）、参照抗体セツキシマブ（抗−ＥＧＦＲ）、トラスツマブ（抗−ＨＥＲ２）、ＭＭ−１２１類似体（抗−ＨＥＲ３）、３つの参照抗体の混合物およびネガティブコントロール抗体を、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３またはＥＧＦＲ／ＨＥＲ２／ＨＥＲ３に依存する１１癌細胞系の成長および増殖を阻害する能力について試験した。７細胞系Ａ４３１ＮＳ、Ｎ８７、Ａ５４９、ＯＥ１９、ＢＴ４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５  ＶＩＩおよびＨＣＣ２０２に対する上記抗体混合物および抗体の滴定の結果は、図１４−２０に示される。
【０２０３】
結果
図１４−２０において示される結果は、抗体混合物および個々の抗体の効果が、異なる細胞系間で変化するが、３つの受容体ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３に対する３つ、４つまたは６つの抗体からなるｐａｎ−ＨＥＲ抗体混合物は、一般的に、癌細胞成長および増殖の阻害に非常に有効であることを示す。実施例５に記載されているとおり、６つの抗体、すなわち、３つの受容体のそれぞれに対する２つの抗体を含むｐａｎ−ＨＥＲ混合物は、一般的に、試験される細胞系にわたって最も有効である。
【０２０４】
実施例９：ｐａｎ−ＨＥＲ抗体混合物の癌阻害活性
本実施例は、抗体混合物の組合せと同時の３つのＨＥＲファミリー受容体（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２／ＨＥＲ３）の標的化が、同時の２つのＨＥＲファミリー受容体（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３またはＨＥＲ２／ＨＥＲ３）の標的化または３つの受容体のいずれか単独の標的化と比較して、広範な阻害プロフィールをもたらすことを記載する。
【０２０５】
方法
実施例３に記載されている方法を使用して、それぞれの受容体に対する抗体混合物１２７７＋１５６５（抗−ＥＧＦＲ）、４３８４＋４５１７（抗−ＨＥＲ２）および５０３８＋５０８２（抗−ＨＥＲ３）、これらの全ての可能な置換、すなわち１２７７＋１５６５＋４３８４＋４５１７（抗−ＥＧＦＲ＋抗−ＨＥＲ２）、１２７７＋１５６５＋５０３８＋５０８２（抗−ＥＧＦＲ＋抗−ＨＥＲ２）および４３８４＋４５１７＋５０３８＋５０８２（抗−ＨＥＲ２＋抗ＨＥＲ３）、それぞれの受容体に対する２つの抗体を有するｐａｎ−ＨＥＲ混合物（１２７７＋１５６５＋４３８４＋４５１７＋５０３８＋５０８２）、それぞれの受容体に対する１つの抗体からなるｐａｎ−ＨＥＲ混合物（１２７７＋４３８４＋５０３８および１２７７＋４３８４＋５０８２）、参照抗体セツキシマブ（抗−ＥＧＦＲ）、トラスツマブ（抗−ＨＥＲ２）、ＭＭ−１２１類似体（抗−ＨＥＲ３）、３つの参照抗体の混合物およびネガティブコントロール抗体を、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３またはＥＧＦＲ／ＨＥＲ２／ＨＥＲ３に依存する１１癌細胞系の成長および増殖を阻害する能力について試験した。５細胞系Ａ４３１ＮＳ、ＡＵ５６５、Ｈ３５８、Ｈ１９７５およびＨＣＣ２０２に対する上記抗体混合物および抗体の滴定の結果は、図２１−２５に示される。
【０２０６】
結果
Ａ４３１ＮＳにおいて、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２またはＥＧＦＲおよびＨＥＲ３に対する混合物の組合せは、実施例３に記載されている結果と同時に癌細胞成長の阻害において相乗的増加をもたらす。ＨＥＲ２およびＨＥＲ３を標的化する混合物の組合せは、Ａ４３１ＮＳ細胞に対する阻害効果を有さなかった。ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３に対する抗体混合物の組合せは、個々の混合物および３つの受容体のそれぞれに対する１つの抗体のみを有する抗体混合物よりも優れており、２つの受容体に対する混合物の組合せと同じくらい有効であった。
【０２０７】
同様の結果は、Ｈ１９７５細胞系で得られた。再び、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２またはＥＧＦＲおよびＨＥＲ３に対する抗体混合物の組合せは、阻害効果における相乗的増加を示した。ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３に対する抗体混合物の組合せは、個々の混合物および３つの受容体のそれぞれに対する１つの抗体のみを有する抗体混合物よりも優れており、２つの受容体に対する混合物の組合せと同じくらい有効であった。
【０２０８】
ＨＣＣ２０２細胞系において、ＨＥＲ２およびＥＧＦＲまたはＨＥＲ２およびＨＥＲ３に対する混合物の組合せは、癌細胞成長および増殖に対して増加した阻害効果を有した。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３に対する抗体混合物の組合せは、ＨＣＣ２０２細胞に対する阻害効果を有さなかった。ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３に対する抗体混合物の組合せは、個々の混合物、２つの受容体に対する混合物の組合せおよび３つの受容体のそれぞれに対する１つの抗体のみを有する抗体混合物よりも優れていた。
【０２０９】
同様の結果は、ＡＵ５６５細胞系で見出された。ＨＥＲ２およびＥＧＦＲまたはＨＥＲ２およびＨＥＲ３に対する混合物の組合せは、癌細胞成長および増殖に対して増加した阻害効果を有した。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３に対する抗体混合物の組合せは、ＡＵ５６５細胞に対する阻害効果を有さなかった。ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３に対する抗体混合物の組合せは、個々の混合物、２つの受容体に対する混合物の組合せおよび３つの受容体のそれぞれに対する１つの抗体のみを有する抗体混合物よりも優れていた。
【０２１０】
Ｈ３５８細胞系において、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３またはＥＧＦＲおよびＨＥＲ２に対する混合物の組合せは、ＥＧＦＲ単独の標的化と比較して、阻害効果における小さな増加をもたらした。混合物の組合せでのＨＥＲ２およびＨＥＲ３の標的化は、ＨＥＲ３単独の標的化に匹敵する癌細胞成長および増殖に対して穏やかな阻害効果をもたらした。しかしながら、全３つの受容体に対する混合物の組合せは、細胞成長および増殖の増加した阻害をもたらし、これは、個々の混合物、２つの受容体に対する混合物の組合せおよび３つの受容体のそれぞれに対する１つの抗体のみを有する抗体混合物よりも優れていた。
【０２１１】
要約すれば、本実施例において示される結果は、ＨＥＲファミリーにおける２つ以上の受容体の最適な標的化がそれぞれの受容体に対する抗体の混合物を混合することにより得られること、３つの受容体の標的化が２つの受容体の標的化よりも優れていること、および抗体の混合物でのそれぞれの受容体の標的化が単一の抗体でのそれぞれの受容体の標的化よりも優れていることを証明する。
【０２１２】
実施例１０：ヒトＡ４３１ＮＳ腫瘍異種移植片モデルにおけるＰａｎ−ＨＥＲ抗体混合物のインビボ有効性
ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３に対する抗体混合物および３つの受容体の組合せのインビボ有効性を評価するために、本発明者らは、Ａ４３１ＮＳヒト腫瘍異種移植片モデルにおいて抗体および混合物を試験した。ＥＧＦＲを過剰発現するヒト表皮癌腫細胞系Ａ４３１は、インビトロおよびインビボの両方において新規抗ＥＧＦＲ化合物の成長阻害効果を試験するとき、広範囲に使用される。ここに示されているインビボ試験において、本発明者らは、親Ａ４３１細胞系のより侵襲性に増殖する変異体、Ａ４３１ＮＳ（ＡＴＣＣ番号．ＣＲＬ−２５９２）を使用した。結果は図２６に示される。
【０２１３】
方法
２×１０６個のＡ４３１ＮＳ細胞を、８週齢メス無胸腺ヌードマウスの左脇腹に皮下に接種した。腫瘍をキャリパーで週に２回測定し、ｍｍ３において腫瘍容量を式：（幅）２×長さ×０．５にしたがって計算した。１７５ｍｍ３の平均腫瘍サイズで、マウスをランダム化し、処置を開始した。マウスを２．５週間、５０ｍｇ／ｋｇ／標的の週に２回腹腔内注射で処理し（全５回注射）、その後観察した。したがって、１つの受容体の標的化は５０ｍｇ／ｋｇの投与においてもたらされ、２つまたは３つの受容体を標的化する抗体組合せで処理されるマウスは、それぞれ１００または１５０ｍｇ／ｋｇで投与された。次の抗体組合せを実験に含んだ：１２７７＋１５６５（抗−ＥＧＦＲ）、４３８４＋４５１７（抗−ＨＥＲ２）、５０３８＋５０８２（抗−ＨＥＲ３）、１２７７＋１５６５＋４３８４＋４５１７（抗−ＥＧＦＲ＋抗−ＨＥＲ２）、１２７７＋１５６５＋５０３８＋５０８２（抗−ＥＧＦＲ＋抗−ＨＥＲ３）、４３８４＋４５１７＋５０３８＋５０８２（抗−ＨＥＲ２＋抗−ＨＥＲ３）、１２７７＋４３８４＋５０３８（抗−ＥＧＦＲ＋抗−ＨＥＲ２＋抗−ＨＥＲ３）および１２７７＋１５６５＋４３８４＋４５１７＋５０３８＋５０８２（抗−ＥＧＦＲ＋抗−ＨＥＲ２＋抗−ＨＥＲ３）。該実験はまた、上記抗体混合物に対して記載されているとおりの用量で投与される抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体セツキシマブおよび抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体トラスツマブを含んだ。
【０２１４】
結果
１７５ｍｍ３の平均腫瘍サイズでの接種の１２日後、マウスを８匹の動物で１１グループにランダム化し、処置を開始した。ＥＧＦＲ＋ＨＥＲ３（１２７７＋１５６５＋５０３８＋５０８２）およびＥＧＦＲ＋ＨＥＲ２＋ＨＥＲ３（Ｐａｎ−ＨＥＲ混合物：１２７７＋４３８４＋５０３８およびＰａｎ−ＨＥＲ混合物：１２７７＋１５６５＋４３８４＋４５１７＋５０３８＋５０８２）を標的化する抗体で処理された動物は、腫瘍増殖コントロールで非常に効率的であった。腫瘍サイズの増加は、抗ＥＧＦＲ＋抗−ＨＥＲ３（１２７７＋１５６５＋５０３８＋５０８２）および抗ＥＧＦＲ＋抗−ＨＥＲ２＋抗−ＨＥＲ３（Ｐａｎ−ＨＥＲ混合物：１２７７＋４３８４＋５０３８およびＰａｎ−ＨＥＲ混合物：１２７７＋１５６５＋４３８４＋４５１７＋５０３８＋５０８２）で処理されたグループにおいて処置期間中ほとんど観察されなかった。ＥＧＦＲ（１２７７＋１５６５）またはＨＥＲ３（５０３８＋５０８２）に対する抗体またはＥＧＦＲ＋ＨＥＲ２（１２７７＋１５６５＋４３８４＋４５１７）およびＨＥＲ２＋ＨＥＲ３（４３８４＋４５１７＋５０３８＋５０８２）を標的とする組合せで処理された動物は全て、処置期間中、腫瘍増殖を続けたが、腫瘍はビヒクル対照と比較してゆっくりな速度で増加した。抗ＨＥＲ３および抗ＨＥＲ２＋抗−ＨＥＲ３抗体組合せで処理された動物は、ビヒクル対照グループと比較して、ごくわずかに小さい腫瘍を有した。抗ＥＧＦＲ（１２７７＋１５６５）または抗ＥＧＦＲ＋抗−ＨＥＲ２（１２７７＋１５６５＋４３８４＋４５１７）で処理されたグループは、ビヒクル対照と比較して、腫瘍阻害およびゆっくりな成長速度を示した。
【０２１５】
観察期間中、抗ＨＥＲ３、抗ＥＧＦＲ＋抗−ＨＥＲ２、抗ＨＥＲ２＋抗−ＨＥＲ３およびセツキシマブで処理されたグループは全て、ビヒクル対照グループと比較してゆっくりな速度で腫瘍増殖を続けた。一般的に、抗ＥＧＦＲ抗体およびＥＧＦＲに対する抗体組合せを含む混合物で処理されたグループは、ＨＥＲ３に対する抗体混合物またはＨＥＲ２＋ＨＥＲ３に対する混合物の組合せで処理されたグループと比較して、よりゆっくりな腫瘍増殖速度を有した。
【０２１６】
ＥＧＦＲ＋ＨＥＲ３およびＥＧＦＲ＋ＨＥＲ２＋ＨＥＲ３を標的とする抗体混合物の組合せ（Ｐａｎ−ＨＥＲ  ６−混合物）および３つの受容体のそれぞれに対して１つの抗体の組合せ（ＰａｎＨＥＲ  ３−混合物）で処理されたグループは全て、該実験を通して腫瘍増殖のコントロールを維持した。
【０２１７】
Ａ４３１ＮＳ腫瘍異種移植片モデルにおけるＥＧＦＲおよびＨＥＲ３の同時標的化の増強された有効性は、インビトロ実験から該細胞系に対して知られているＥｒｂＢ受容体依存を反映する（実施例２）。主にＥＧＦＲシグナル伝達に依存するが、Ａ４３１ＮＳ細胞系はまた、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３間およびある程度ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２間のクロストークに依存するが、後者は現在のインビボ実験において観察されない。
【０２１８】
要約すれば、本実施例において示される結果は、ＥＧＦＲ＋ＨＥＲ３またはＥＧＦＲ＋ＨＥＲ２＋ＨＥＲ３に対する抗体の組合せまたは抗体混合物でのＡ４３１ＮＳ腫瘍異種移植片の処理が、個々の標的ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３に対するモノクローナル抗体および抗体混合物、またはＥＧＦＲ＋ＨＥＲ２またはＨＥＲ２＋ＨＥＲ３に対するモノクローナル抗体および抗体混合物の組合せでの腫瘍の標的化と比較して、より有効であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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