(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
回転に適合されたバイオリアクターであって、
壁部分と、第１及び第２端部とを有するインキュベーションキャビティーであって、前記インキュベーションキャビティーが、前記インキュベーションキャビティーの前記第１の端部を構成する半透膜（１１）と、前記インキュベーションキャビティーの前記第２の端部を構成する密閉可能な蓋（１３）とを備えることにより実質的に密閉制限を提供し、前記半透膜（１１）が、所定の分子量又はサイズまでの分子に対して透過性であり、インキュベーションチャンバに出入りするガス交換並びに前記インキュベーションキャビティー内の水性培地、細胞及び細胞集合体の保持を可能にする、インキュベーションキャビティーと、
平衡チャンバ（１６）であって、前記平衡チャンバが、前記インキュベーションキャビティー内の１つ以上の細胞培養、組織バイオプシー、又は細胞クラスタ残留物のために酸素及び二酸化炭素などのガスの交換のための容積を提供する、平衡チャンバと
を含むバイオリアクターであり、
前記蓋（１３）が、前記壁部分に取り外し可能に装着されることにより、前記インキュベーションキャビティー全体へのアクセスを提供し、さらに、蓋（１３）は透明部分（１４）を有するバイオリアクター。
【請求項２】
前記蓋（１３）が、ロック可能に前記壁部分に装着される請求項１に記載のバイオリアクター。
【請求項３】
前記インキュベーションキャビティー及び前記壁部分が、実質的に円筒形状を有する請求項１に記載のバイオリアクター。
【請求項４】
前記バイオリアクターが、関連する回転手段によって、水平な回転軸の周りの回転に適合され、前記回転軸が、前記インキュベーションキャビティーを通る中心軸と実質的に一致する請求項３に記載のバイオリアクター。
【請求項５】
前記蓋（１３）が、生物学的材料を前記インキュベーションキャビティーに導入するか、又は前記インキュベーションキャビティーから取り出すためのチューブとアクセス可能である密閉ポートを有する請求項１〜４のいずれか一項に記載のバイオリアクター。
【請求項６】
前記半透膜は、小分子に対して透過性であるが、細菌、マイコプラズマ又は他の生存生物が通過することを防止することの可能な請求項１に記載のバイオリアクター。
【請求項７】
回転に適合されたバイオリアクターであって、
インキュベーションキャビティーであって、前記インキュベーションキャビティーが、実質的に円筒状の壁と、前記壁の第１の端部における半透膜（１１）と、前記壁の第２の端部における密閉可能な蓋（１３）と共に、実質的に密閉制限を提供し、前記蓋（１３）が前記壁の前記第２の端部に取り外し可能に装着されることにより、前記インキュベーションキャビティー全体へのアクセスを提供するインキュベーションキャビティーと、
水性液体を含むリザーバチャンバであって、前記リザーバチャンバが前記リザーバチャンバから平衡チャンバまでの蒸発を促進させるための装置を含むリザーバチャンバと、
前記半透膜（１１）から蒸発促進装置までの実質的に閉じられた導管と、水性液体のリザーバチャンバの壁とをもたらす平衡チャンバと
を含むバイオリアクターであり、
前記半透膜（１１）が水に対して実質的に不透過性であり、且つ酸素及び二酸化炭素に対して実質的に透過性であることにより、
ａ）前記半透膜（１１）及び前記平衡チャンバを通しての前記インキュベーションキャビティーのガス抜きと、
ｂ）インキュベーションチャンバ内の水の実質的な保持と
を容易にするバイオリアクター。
【請求項８】
前記リザーバチャンバ及び前記インキュベーションチャンバの少なくとも一方から蒸発した水が、前記平衡チャンバにおいて、少なくとも５０％、少なくとも７０％、及び少なくとも９０％からなる群から選択される相対的湿度をもたらす請求項７に記載のバイオリアクター。
【請求項９】
前記バイオリアクターが、前記インキュベーションキャビティー内及び前記リザーバチャンバ内の水溶液又は懸濁液で３７℃にて操作される場合、３日後に、前記インキュベーションキャビティー内の、少なくとも８０％、少なくとも９０％、及び少なくとも９５％からなる群から選択される水の相対的保持を有する請求項７に記載のバイオリアクター。
【請求項１０】
前記インキュベーションキャビティー及び前記壁が実質的に円筒形状を有する請求項７に記載のバイオリアクター。
【請求項１１】
前記バイオリアクターが関連する回転手段によって水平の回転軸の周りの回転に適合され、前記回転軸が前記インキュベーションキャビティーを通る中心軸と実質的に一致する請求項１０に記載のバイオリアクター。
【請求項１２】
前記インキュベーションキャビティーが、２５μｌ〜１０００ｍｌ、５０μｌ〜５００ｍｌ、及び１００μｌ〜２００ｍｌからなる群から選択される内部流体容積を有する請求項７に記載のバイオリアクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インキュベーションキャビティーへの簡単かつ迅速なアクセスを容易にする蓋を備えるバイオリアクターに関する。具体的には、インキュベーションキャビティーの端部壁が蓋によって構成されることにより、この蓋の取り外しによってインキュベーションキャビティーを完全にアクセス可能な状態にするものである。
【背景技術】
【０００２】
本質的に平らな培養容器における「従来的」細胞培養の過程中に、一般には一次細胞、特にバイオプシーは脱分化する傾向がある。視覚的に、バイオプシーは、細胞が組織のブロックから出て培養容器の平らな支持面上に移動するような「溶融アイスクリーム効果」を呈する。遺伝子発現は、これら「移動する」細胞中では変更され、これが、分化した組織の細胞成分としてよりはむしろ単離された細胞として生化学的に行動し始める。脱分化した細胞は、無傷の生物体における対応する細胞によって正常に発現されたものとは異なる生化学的経路を発現する。これに加えて、不死化細胞は、無傷の生物体における対応する致死細胞と比較して、その特定の機能の一部又は多くを通常は喪失している。
【０００３】
「従来的」細胞培養条件とは対照的に、「微小重力」条件は、培養内の多くのタイプの細胞の分化状態を保存する。微小重力バイオリアクターは、典型的には円筒状又は管状のインキュベーションキャビティー又はコンパートメントの連続的回転によって微小重力条件を維持する。この回転が、インキュベーションキャビティーの壁に細胞が付着することを防止するよう絶えず補助し、最小の剪断力を用いて流体環境内に細胞を懸濁させる。これが、細胞が相互作用しかつコロニーに集合することを誘導する。これらコロニーは、スフェロイド、細胞集塊、細胞集合体及びＰｒｏｔｏＴｉｓｓｕｅ（商標）（これら全ては、本明細書では等価物と考えられる）が挙げられる様々な名前を与えられてきた。微小重力培養については、細胞は、最初は小さい（直径が約１００μｍ）ビーズ上に頻繁に播種される（これが、微小組織構造の形成を加速する）が、これは必ずしも必須ではなく、例えば骨格を使用するもの（非特許文献１）、又は、架橋ヒドロゲルを使用するもの（非特許文献２）など文献において公開されたいくつかの他の選択肢がある。スフェロイドが、これらビーズの周囲の細胞成長によって形成されるので、ビーズは通常、細胞で完全に覆われるようになる。この方法で形成されるスフェロイドは、成体組織に類似するように高度に分化されるようになる（非特許文献３）、（非特許文献４）、（非特許文献５）。
【０００４】
微小重力バイオレアクターは、様々な状況で使用されてきた。初期研究は、微小重力バイオリアクターシステムが、細胞への剪断応力を低減させることによって、細胞が三次元構造を形成することを補助することを示した（非特許文献６）。
【０００５】
現在、非常に多くの文献が、微小重力バイオリアクターシステムにおいて成長された細胞の増大した分化を立証している。確認のために参照されたい（非特許文献３）、及び、（非特許文献７）。
【０００６】
例えば、微小重力培養は、神経前駆体細胞が、細胞クラスタ又は「神経球」を形成することを誘導する。これら神経球は、より分化した細胞（β−チューブリン  ＩＩＩ−及びグリア筋原線維酸性タンパク質−ポジティブ）の層を包囲する未成熟の分化する細胞（ネスチン−及び分化する細胞核抗原−ポジティブ）の表面層を有する、粗ではあるが組織化された構造物によって特徴付けられる。これら「神経球」は、神経移植可能な組織の開発に関する有望性を示している。例えば、（非特許文献８）を参照されたく、並びに、（非特許文献９）を参照されたい。
【０００７】
あるいは、別の例については、多分化能ヒト網膜細胞株の微小重力培養が、ほぼインビボの表現型に近い発現を誘導し、これは細胞が他の条件下で成長される場合には達成できなかったものである（非特許文献１０）。（非特許文献１１）。改善された分化は、他の組織においても立証されている（非特許文献１２）（非特許文献１３）。微小重力バイオオリアクターに関するいくつかの技術的問題が報告されている。例えば、側頭下顎関節（ＴＭＪ）円板が平板培養又は微小動力バイオリアクターのいずれかを使用して操作された場合、視覚的外観、組織学的構造、及びコラーゲンＩ型及びＩＩ型の分布（より多くのコラーゲンＩＩ型を有するバイオリアクター円板で）で著しい差異がありながら、総マトリックス含量及び圧縮硬直において顕著な差異がなかったことである。著者らは、微小重力バイオリアクター培養システムの改善が必要であることを結論付けた（非特許文献１４）。ＤＮＡ修復系もまた、悪影響を受けるように思われる（非特許文献１５）。周知でありかつ広範に使用されているが、現在使用可能な微小重力バイオリアクターは、重大な限界を有する。
【０００８】
先行技術の微小重力バイオリアクターの別の重大な限界は、水分の損失であり、これが細胞成長に影響を及ぼす。インキュベーション中の脱水（５〜１０％までにすぎなくても）は、ｐＨ並びに塩、栄養物質等の濃度などの濃度依存性パラメータにおいて変化をもたらす。多くの細胞型は、それらの環境に非常に感受性が高い。このような細胞にとっては、このような環境条件における小さな変化であっても、細胞成長及び遺伝子発現に影響を及ぼす可能性がある。この問題は、小容量のバイオリアクターにおいて特に顕著であり、ここでは容量の小さな変化が、濃度依存パラメータにおいて比較的大きな変化を引き起こす可能性がある。この脱水問題に対するいくらかの解決なくしては、小容量のバイオリアクターは、バイオリアクターが使用されるインキュベータ内で加湿された条件（１００％相対湿度）を維持したとしても、急激な水分の損失を経験するであろう。小容量のバイオリアクターにおけるこの急激な脱水に関する傾向性、すなわち、相対容積におけるこの急激な変化に関する傾向性は、例えば、培地を補充又は交換するなどの時間を浪費する手動での監視及び操作の必要性を大幅に増大させる。この傾向性は、実際上、小容量バイオリアクター内の培地の長時間にわたる維持管理を実行不可能または不可能なものにする。結果的に、細胞インキュベーションコンパートメント内に非常に高い水分保持力を備える微小重力バイオリアクターを提供することは有利なことであろう。
【０００９】
先行技術の微小重力バイオリアクターの更に別の限界は、細胞及び成長培地を添加し又は取り出すために使用されるアクセスポートが、典型的に、従来の「ルアーロック」クロージャに依存していることである。これら及び同様なクロージャは、有限のデッド容積を有し、これがバイオリアクターの容積が減少されるに伴って、比例的に増加するようになる。この不利点は、本質的にデッド容積がないポートを使用することで解決される。
【００１０】
ルアーロッククロージャはまた、インキュベーションコンパートメントにおける気泡の存在に導く。バイオリアクターは、インキュベーションコンパートメント内に気泡を含まない状態で維持されることが好ましく、この気泡は、スフェロイドを分解するなどの悪影響を別途有する。この気泡の問題は、小容量バイオリアクターで特に顕著であり、ここでは、比較的有意な体積に相当し得る。この気泡問題に対するいくつかの解決策が、先行技術において既知である。例えば、特許文献１は、インキュベーションコンパートメントから気泡を捕捉するためのリザーバチャンバを提供する。しかしながら、これら解決策は、関係する体積のために、小容量のバイオリアクターには全く不適切である。したがって、より良い解決策とは、インキュベーションコンパートメントへの気泡の導入のいかなる可能性も排除する、アクセスポートのためのクロージャ機構を提供することである。
【００１１】
従来の「ルアーロック」及び類似するクロージャはまた、これらが滑らかな内表面を有さないために流体乱流を増加させ、このことがスフェロイドに悪影響を及ぼす増大した剪断力に導く可能性がある。微小重力バイオリアクターは、分化した又は分化する細胞及び他の組織のために微小重力条件を維持するために、インキュベーションコンパートメントの連続的回転を必要とする。インキュベーションコンパートメント内表面が好適に適合されていなければ、乱流を生じる場合がある。このような乱流は、スフェロイドの引き裂き又は「剪断」へと進む場合がある。結果的に、乱流を回避するアクセスポート機構を備える微小重力バイオリアクターを提供することが有利である。
【００１２】
特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、及び特許文献６は、それぞれ微小動力バイオリアクターの改良を開示する。特許文献７は、肝細胞スフェロイドをインキュベートするための従来の市販の微小重力バイオリアクターの使用を開示する。しかしながら、これら特許又は公開された出願のいずれも、脱水の問題を解決せず若しくは小型のインキュベーションコンパートメント容積を有するか、あるいは、ゼロ容積のアクセスポートを有する微小重力バイオリアクターを開示していない。
【００１３】
先行技術のバイオリアクターの全ての容積は、更に別の主要問題、すなわち、例えば皮下注射器又はピンセットを超える直径を有する器具で、インキュベーションチャンバ／キャビティーにアクセスするのが困難であるという問題を抱えている。したがって、個々の又は少量のスフェロイドを損傷のリスク（例えば、注射器の使用における剪断力による）なしに、バイオリアクターから取り出すことが困難である。
【００１４】
特許文献８及び特許文献２は、中心軸の周りを回転可能である円筒状のバイオリアクターを記載していて、このバイオリアクターは、膜によって隔離された細胞培養チャンバと供給用チャンバとを備える。特許文献２は、取り外し可能な蓋は開示していないが、その代わりに、インキュベータの端部を構成するばかりでなく側壁を構成するフランジ２２を開示する。更に、このフランジは、取り外しがはるかに容易であり、取り外しの際には、膜から分けられる。特許文献８は、微小重力バイオリアクターではないが（６０ｍｌのインキュベーション容積）、単にローラ−ボトルシステムであり、したがって、ねじ付リングを取り外す場合、培養チャンバ全体にアクセスすることが困難であるだろう。更に、ねじ付リングが取り外された場合でも、対処するためのシリコーン膜がまだ存在する。したがって、特許文献８のバイオリアクターシステムは、インキュベーションキャビティーへの容易なアクセスをもたらさない。特許文献８の図９において、培地容器５５内の膜支持グリッド８２を保持するための何かがないように見える。同様に、透析膜６４を保持するものは何もない。したがって、使用者が細胞培養チャンバ（透析膜６４と７２内のガス交換膜との間にある）を開ける前に、使用者は、それを空にするか水抜き５５をしなければならないだろう。さもないと、透析膜が落下し、培地がこぼれる可能性がある。
【００１５】
微小重力は、細胞が分化された表現型を呈することを誘導するよう使用されるため、回転の中断により、通常インキュベーションチャンバの底部にスフェロイドが沈殿する。これにより、スフェロイド同士がくっついたり、又はインキュベーションチャンバの壁に接着したりして、所望の表現型が失われ始める。したがって、スフェロイドをインキュベーションチャンバから取り出すことが必要な場合、インキュベーションチャンバを開き、スフェロイドの１つ以上の部分を取り出し、更にインキュベーションチャンバを非常に速く閉める（例えば、数分以内に）ことが可能でなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際公開第９５／０７３４４号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５１５３１３１号明細書
【特許文献３】米国特許第５４３７９９８号明細書
【特許文献４】米国特許第５６６５５９４号明細書
【特許文献５】米国特許第５９８９９１３号明細書
【特許文献６】米国特許第６６４２０１９号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００５／００８４９６５号明細書
【特許文献８】米国特許第５５７６２１１号明細書
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】［リー  ＫＷ（Ｌｅｅ  ＫＷ）、ウォング  Ｓ（Ｗａｎｇ  Ｓ）、ダドデタン  Ｍ（Ｄａｄｓｅｔａｎ  Ｍ）、ヤスゼムスキー  ＭＪ（Ｙａｓｚｅｍｓｋｉ  ＭＪ）、ルー  Ｌ（Ｌｕ  Ｌ）ら著、「制御された孔構造を備える３次元ナノ複合体骨格を介しての増強された細胞内方成長及び増殖」（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｅｌｌ  ｉｎｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｒｅｅ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｎａｎｏ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）、バイオマクロ分子（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）１１：６８２〜６８９頁、２０１０年］
【非特許文献２】［ビラヌエバ  Ｉ（Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ  Ｉ）、クレメント  ＢＪ（Ｋｌｅｍｅｎｔ  ＢＪ）、フォン  ドイッチュ  Ｄ（Ｖｏｎ  Ｄｅｕｔｓｃｈ  Ｄ）、ブライアント  ＳＪ（Ｂｒｙａｎｔ  ＳＪ）著、「ポリ（エチレングリコール）ヒドロゲル内に封入され、かつ回転壁容器内で培養された軟骨細胞における初期代謝活性を変更する架橋密度」（Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｌｔｅｒｓ  ｅａｒｌｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｏｔａｔｉｎｇ  ｗａｌｌ  ｖｅｓｓｅｌ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．１０２：１２４２〜１２５０頁、２００９年］
【非特許文献３】［ナブラン  Ｓ（Ｎａｖｒａｎ  Ｓ）著、「３−Ｄ細胞生物学及び組織工学への低剪断型式微小重力の適用」（Ｔｈｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｗ  ｓｈｅａｒ  ｍｏｄｅｌｌｅｄ  ｍｉｃｒｏｇｒａｖｉｔｙ  ｔｏ  ３−Ｄ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌ  Ａｎｎ  Ｒｅｖ．１４：２７５〜２９６頁、２００８年］
【非特許文献４】［フリード  ＬＥ（Ｆｒｅｅｄ  ＬＥ）、バンジャック−ノバコビック  Ｇ（Ｖｕｎｊａｋ−Ｎｏｖａｋｏｖｉｃ  Ｇ）及びランガー  Ｒ（Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ）著、「バイオリアクターにおける細胞−ポリマー軟骨インプラントの培養」（Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ−Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ）、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、５１：２５７〜２６４頁、１９９３年］
【非特許文献５】［ブラウン  ＬＡ（Ｂｒｏｗｎ  ＬＡ）、アルターバーン  ＬＭ（Ａｒｔｅｒｂｕｒｎ  ＬＭ）、ミラー  ＡＰ（Ｍｉｌｌｅｒ  ＡＰ、カウガー  ＮＬ（Ｃｏｗｇｅｒ  ＮＬ）、ハートレイ  ＳＭ（Ｈｅｒｔｌｅｙ  ＳＭ）、アンドリュース  Ａ（Ａｎｄｒｅｗｓ  Ａ）、シルバー  ＰＭ（Ｓｉｌｂｅｒ  ＰＭ）、リー  ＡＰ（Ｌｉ  ＡＰ）著、「回転式壁容器内でスフェロイドとして培養されたラット肝細胞における肝臓機能の維持」（Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  Ｌｉｖｅｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｒａｔ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ａｓ  Ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ  ｉｎ  ａ  Ｒｏｔａｔｉｎｇ  Ｗａｌｌ  Ｖｅｓｓｅｌ）、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ａｎｉｍ．３９：１３〜２０ページ、２００３年］
【非特許文献６】［「低減された剪断応力：シミュレートされた微小重力において三次元組立て品を形成するための哺乳類組織の能力における主要成分」（Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｓｈｅａｒ  ｓｔｒｅｓｓ：  ａ  ｍａｊｏｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｔｏ  ｆｏｒｍ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ｉｎ  ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｇｒａｖｉｔｙ）、グッドウィン  ＴＪ（Ｇｏｏｄｗｉｎ  ＴＪ）、プレウェット  ＴＬ（Ｐｒｅｗｅｔｔ  ＴＬ）、ウォルフ  ＤＡ（Ｗｏｌｆ  ＤＡ）、スパウルディング  ＧＦ（Ｓｐａｕｌｄｉｎｇ  ＧＦ）著、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９３年３月、５１（３）：３０１〜３１１頁］
【非特許文献７】［「微小重力における組織成長（Ｇｒｏｗｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｇｒａｖｉｔｙ）、アンスワース  ＢＲ（Ｕｎｓｗｏｒｔｈ  ＢＲ）、レルケス  ＰＩ（Ｌｅｌｋｅｓ  ＰＩ）著、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９８年８月；４（８）：９０１〜９０７頁］
【非特許文献８】［「回転式壁容器バイオリアクター内で痕跡組織様構造を形成する神経前駆体細胞」（Ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒｍ  ｒｕｄｉｍｅｎｔａｒｙ  ｔｉｓｓｕｅ−ｌｉｋｅ  ｓｔｒｕｃｄｕｒｅｓ  ｉｎ  ａ  ｒｏｔａｔｉｎｇ−ｗａｌｌ  ｖｅｓｓｅｌ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）ロー  ＨＰ（Ｌｏｗ  ＨＰ）、サバリース  ＴＭ（Ｓａｖａｒｅｓｅ  ＴＭ）、シュワルツ  ＷＪ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ＷＪ）著、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ａｎｉｍ．２００１年３月；３７（３）；１４１〜１４７頁］
【非特許文献９】［「回転式壁バイオリアクター内で生育させたＳｅｒｔｏｌｉ−ＮＴ２細胞組織構造中のＮＴ２細胞の急速分化」（Ｒａｐｉｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＴ２  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｓｅｒｔｏｌｉ−ＮＴ２  ｃｅｌｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｇｒｏｗｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｏｔａｔｉｎｇ  ｗａｌｌ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）サポルタ  Ｓ（Ｓａｐｏｒｔａ  Ｓ）、ウィリング  ＡＥ（Ｗｉｌｌｉｎｇ  ＡＥ）、シャメク  Ｒ（Ｓｈａｍｅｋｈ  Ｒ）、ビックフォード  Ｐ（Ｂｉｃｋｆｏｒｄ  Ｐ）、パレデス  Ｄ（Ｐａｒｅｄｅｓ  Ｄ）、キャメロン  ＤＦ（Ｃａｍｅｒｏｎ  ＤＦ）著、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｕｌｌ．２００４年１２月  １５０；６４（４）：３４７〜３５６頁］
【非特許文献１０】［ＮＡＳＡバイオリアクターにおけるヒト網膜細胞株からの３Ｄ網膜様構造の発生］（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ３Ｄ  ｒｅｔｉｎａ−ｌｉｋｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｉｎ  ａ  ＮＡＳＡ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）
【非特許文献１１】［デュット  Ｋ（Ｄｕｔｔ  Ｋ）、ハリス―フッカー  Ｓ（Ｈａｒｒｉｓ−ｈｏｏｋｅｒ  Ｓ）、エラーソン  Ｄ（Ｅｌｌｅｒｓｏｎ  Ｄ）、ライネ  Ｄ（Ｌｙｎｅ  Ｄ）、クマー  Ｒ（Ｋｕｍａｒ  Ｒ）、ハント  Ｒ（Ｈｕｎｔ  Ｒ）、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２００３年；１２（７）：７１７〜７３１頁］
【非特許文献１２】［フリード  ＬＥ（Ｆｒｅｅｄ  ＬＥ）、ブンジャック−ノバコビック  Ｇ（Ｖｕｎｊａｋ−Ｎｏｖａｋｏｖｉｃ  Ｇ）及びランガー  Ｒ（Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ）著、「バイオリアクターにおける細胞−ポリマー軟骨インプラントの培養（Ｃａｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ−Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．５１：２５７〜２６４頁、１９９３年］
【非特許文献１３】［ブラウン  ＬＡ（Ｂｒｏｗｎ  ＬＡ）、アルターバーン  ＬＭ（Ａｒｔｅｒｂｕｒｎ  ＬＭ）、ミラー  ＡＰ（Ｍｉｌｌｅｒ  ＡＰ）、カウガー  ＮＬ（Ｃｏｗｇｅｒ  ＮＬ）、ハートレイ  ＳＭ（Ｈａｒｔｌｅｙ  ＳＭ）、アンドリュース  Ａ（Ａｎｄｒｅｗｓ  Ａ）、シルバー  ＰＭ（Ｓｉｌｂｅｒ  ＰＭ）、リー  ＡＰ（Ｌｉ  ＡＰ）、「回転式壁容器内でスフェロイドとして培養されたラット肝細胞における肝臓機能の維持」（Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  Ｌｉｖｅｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｒａｔ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ａｓ  Ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ  ｉｎ  ａ  Ｒｏｔａｔｉｎｇ  Ｗａｌｌ  Ｖｅｓｓｅｌ)Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ  Ａｎｉｍ．；３９；１３〜２０頁、２００３年］
【非特許文献１４】［デタモア  ＭＳ（Ｄｅｔａｍｏｒｅ  ＭＳ）、アタナシォー  ＫＡ（Ａｔｈａｎａｓｉｏｕ  ＫＡ）著、「側頭下顎関節円板を操作する組織に向けての回転式バイオリアクターの使用」（Ｕｓｅ  ｏｆ  ｒｏｔａｔｉｎｇ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ｔｏｗａｒｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｅｎｐｏｒｏｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  ｊｏｉｎｔ  ｄｉｓｋ）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．２００５年７月〜８月；１１（７〜８）：１１８８〜１１９７頁］
【非特許文献１５】［クマリ  Ｒ（Ｋｕｍａｒｉ  Ｒ）、シング  ＫＰ（Ｓｉｎｇｈ  ＫＰ）、デュモンド  ＪＷ  Ｊｒ（Ｄｕｍｏｎｄ  ＪＷ  Ｊｒ）著、（「ヒトリンパ細胞におけるＤＮＡ修復能力を低減しかつＤＮＡ損傷を誘導するシミュレートされた微小重力」（Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｇｒａｖｉｔｙ  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：７２３〜７３１頁、２００９年］
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
結果的に、これらの問題を解決する改善された微小重力バイオリアクターを提供することは有利である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、インキュベーションキャビティーへのアクセスを容易にする蓋（１３）を備えるバイオリアクター（１０）に関する。具体的には、インキュベーションキャビティーの端部壁が、蓋（１３）によって構成されることにより、蓋の取り外しによってインキュベーションキャビティーが完全にアクセス可能となる。
【００２０】
この目的及びいくつかの他の目的は、回転に適合されたバイオリアクターによって、本発明の第１の態様において獲得され、このリアクターは、
インキュベーションキャビティー（１５）であって、このインキュベーションキャビティーは、壁の第１の端部内の半透膜（１１又は１２）と、壁の第２の端部及び本質的に円筒状の壁を形成する密閉可能な蓋（１３）とを共に備え、実質的に密閉制限をもたらし、前記半透膜（１１）は、所定の分子量又はサイズまでの分子に対して透過性であり、インキュベーションチャンバ内のガス交換とインキュベーションキャビティー内の細胞及び細胞集合体の保持を可能にすることと、
リザーバチャンバであって、前記リザーバチャンバは、半透膜１１に接する非常に高い湿度レベルの維持のための水又は他の希釈水溶液の容積を提供することと、
−  平衡チャンバであって、半透膜（１１）からリザーバチャンバまでの導管と、バイオリアクター（１９）包囲する外気への狭い接続をもたらすこととを含み、
前記蓋（１３）は、壁の第２の端部に取り外し可能に装着されることにより、インキュベーションキャビティー全体へのアクセスを提供する。
【００２１】
任意選択的に、蓋（１３）は、異なる場所で１つ以上のポートを有してもよい。
第２の態様では、本発明の実施形態は、回転に適合したバイオリアクターを提供し、このバイオリアクターは、
インキュベーションキャビティーであって、このインキュベーションキャビティーは、本質的に円筒状の壁、壁の第１の端部内の半透膜（１１）、及び壁の第２の端部内の密閉可能な蓋（１３）と共に、実質的に密閉制限をもたらし、前記蓋（１３）は、壁の第２の端部に取り外し可能に装着されることにより、インキュベーションキャビティー全体へのアクセスを提供することと、
水性液体を含むリザーバチャンバ（１８）であって、このチャンバは、高い蒸発を促進するための好適な材料から作製された加湿器（１７）を含むことと、
平衡チャンバ（１６）であって、半透膜（１１）から加湿器（１７）までの導管と、バイオリアクター（１９）を包囲する外気への狭い接続をもたらすこととを含み、
この半透膜（１１）は、水に対して実質的に不透過性であり、酸素及び二酸化炭素に対しては実質的に透過性であることにより、
ａ）半透膜（１２）を通してのインキュベーションキャビティーの空気抜きと、
ｂ）インキュベーションチャンバ内の水の実質的な保持を容易にする。
【００２２】
好ましい実施形態では、リザーバは、それによってリザーバの内容物が補充されるポート（２１）を有する。通常は、水又は水溶液が使用されるであろうが、この溶液は、特定の目的のための添加剤（例えば、インキュベーションチャンバ及び導管を感染から保護するための抗生剤及び抗真菌剤）を含有する場合がある。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態では、蓋（１３）は、容易に着脱可能な方法で、壁の第２の端部に装着される。この点で、インキュベーションキャビティーは、可逆式スナップロック機構によってロック可能であり得る。このような方法で、スフェロイドの一部が培養されていても、インキュベーションキャビティーを開けることが可能であり、インキュベーションチャンバを１０分未満で閉めることも可能である。
【００２４】
本発明の第１及び第２の態様の実施形態については、以下の特性の１つ以上が満たされる：
・インキュベーションキャビティー及び壁は、実質的に円筒形状を有すること；
・バイオリアクターは、関連する回転手段によって、水平の回転軸の周りの回転に適合されていて、前記回転軸は、インキュベーションキャビティーを通る中心軸と実質的に一致していること；
・蓋（１３）は、生物学的材料をインキュベーションキャビティーに導入し、そこから取り出すためのチューブにアクセス可能な少なくとも１つの密閉ポートを有すること
・スフェロイドの一部のインキュベーションキャビティーからの取り出しは、インキュベーションキャビティー内に残るスフェロイドの成長又は生理学的機能に悪影響を及ぼさないこと；
・インキュベーションキャビティー内で、約１週間にわたって、より好ましくは数週間にわたって、最も好ましくは１ヶ月以上の長い期間にわたって、細胞を培養することが可能であること（ここでは、培地は適宜交換される）；
・半透膜は、小分子に対して透過性であるが、細菌、マイコプラズマ又は他の生物体がそこを通過することを防止することができること；並びに
・インキュベーションキャビティーは、約２５μｌ〜約１０００ｍｌ、約５０μｌ〜約５００ｍｌ、約１００μｌ〜約２００ｍｌ、及び約２００μｌ〜約１００ｍｌからなる群から選択される内部流体容積を有することである。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態は、以下の添付の図面によって図示される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の第１の態様によるバイオリアクターの概略的断面図である。
【図２】３つの主要構成成分が分離されている、図１の分解図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
用語の定義
本明細書で使用するとき、以下の用語は以下の意味を有する。
用語「半透膜」とは、一部の化学的又は生物学的物質を透過させ得るが、全ての化学的又は生物学的物質を透過させることはない膜を指す。
【００２８】
用語「インキュベーションキャビティー」とは、その中で細胞培養、組織バイオプシー、細胞クラスタ、スフェロイド、組織様構造、「スフェロイド」又は同様なサンプルが生育され、分化され、インキュベートされ、又は別の方法で培養されるバイオリアクターの一部であるものを指す。用語「インキュベーションキャビティー」は、「インキュベーションチャンバ」及び「インキュベーションコンパートメント」と互換的に使用される。
【００２９】
用語「水に実質的に不透過性」とは、本発明の膜の特性を説明するために使用され、気相及び／又は液相における水及び水様分子の高度な反発を呈する膜を指す。
用語「水にほぼ完全に不透過性」とは、本発明の膜の特性を説明するために使用され、それを横切る１ｂａｒ(０．１ＭＰａ)での水の流速が、０．１ｍＬ／分／ｃｍ２を超えることがない膜を指す。
【００３０】
用語「酸素及び二酸化炭素に実質的に透過性」とは、本発明の膜の特性を説明するために使用され、それを横切って空気が容易に通過する膜を指す。
用語「相対的保持」とは、インキュベーションキャビティー内に水溶液又は懸濁液を有する本発明のバイオリアクターの操作に起因する条件を説明するために使用され、最初に存在している残留する物質の相対的量を指す。例えば、インキュベーションキャビティー（柔軟な膜を有する）における水の相対的保持は、バイオリアクターの操作開始時のキャビティーの容積で割った、バイオリアクター操作後のキャビティーの容積として計算され得る。
【００３１】
用語「毒性」は、当該技術で既知である通常の意味を有する。「毒性」物質は、上記で定義されたような化学的組成物中に存在する量で、細胞、組織又は生物体の機能を損なう又はこれらに損傷を引き起こす可能性がある物質である。
【００３２】
用語「所定の毒性」とは、毒性及び非毒性物質の双方に関連する。パラケルスス（Ｐａｒａｃｅｌｓｕｓ）は、１６世紀に「あらゆるものは毒であり、毒無きものなど存在しない。あるものを無毒とするのは、その服用量のみによってである。」と述べた。物質の毒性のタイプは、例えば、アメリカ合衆国の食品医薬品局（ＦＤＡ）の毒性タイピングスキームに従い決定され得る。このスキームによると、物質の所定の毒性は、Ａ型、Ｂ型などに属し得るか、又は非毒性であり得る。
【００３３】
用語「細胞クラスタ」とは、任意の種類の細胞、組織バイオプシー、細胞クラスタ、組織様構造、「スフェロイド」若しくは、当該技術分野で既知である任意の方法により得られる又は初期培養された同様なサンプルを指す。
【００３４】
用語「細胞」とは、古細菌、原核生物又は真核生物のいずれであろうと、任意のタイプの生存生物からの一次細胞、不死化細胞又は幹細胞を指し、生存細胞を複製することが必要なウィルス又は他の存在も包含する。
【００３５】
用語「微小重力バイオリアクター」とは、回転に適合されたバイオリアクターを指す。
用語「微小重力条件下でインキュベートする」とは、前記バイオリアクターを、１つ以上の細胞培養を液体培養基内で懸濁させる速度で、実質的に水平な中心軸の周りで回転させつつ、このような回転を、前記１つ以上の細胞培養の成長を可能にする時間期間で継続させる、回転に適合されたバイオレアクター内での細胞培養の成長を指す。
【００３６】
用語「水の相対的保持の手段」は、バイオリアクターの特性を説明するために使用され、インキュベーションチャンバ内の水の相対的保持を達成するようインキュベーションチャンバを実質的に制限する膜との組み合わせで使用される潅流以外の任意の手段を指すか、又は代替的に、１ｂａｒ（０．１ＭＰａ）でこの膜を横切る水の流速が、０．１ｍＬ／分／ｃｍ２を超えないよう実質的にインキュベーションチャンバを制限する任意の単一膜を指す。
好ましい実施形態
好ましい実施形態において、本発明で利用される半透膜は、分子の通路を特定の分子量又はサイズまで許可するものである。明確に決まる孔径を備えた半透膜が、当業者に既知であり、市販されている。本発明の好ましい実施形態では、半透膜は、５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１５０ｋＤａ、２００ｋＤａ又は２５０ｋＤａなどの所定の分子量までの分子に透過性であり得る。あるいは、半透膜の透過性は、その中の孔径によって決定されてもよい。半透膜のこの孔径は、０．５μｍ以下であり、例えば０．３μｍ以下であり、好ましくは０．２μｍ未満、更により好ましくは０．１μｍ、最も好ましくは０．０５μｍであることができる。０．２２μｍの孔径を有する膜は、一般的に、細菌及びマイコプラズマが膜を横断することを抑制するために十分であると考えられる。多種多様な膜が使用され得る。これらは、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）、シリコンゴム、発泡プラスチック、放射線処理プラスチック、及び類似の材料からなる群から選択される材料から作製されるが、これらに限定されない。１つの好ましい実施形態では、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）からのＴＥ  ３５  フィルター又はＺｅｆｌｕｏｒフィルター（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓからのカタログ番号６６１４２）が使用され得る。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態では、「水に実質的に不透過性」であり、かつ「酸素及び二酸化炭素に実質的に透過性」である膜を横切る１ｂａｒ（０．１ＭＰａ）での水の流速は、５０ｍｌ／分／ｃｍ２を超えないことであり、好ましくは４０ｍｌ／分／ｃｍ２を超えないこと、より好ましくは３０ｍｌ／分／ｃｍ２を超えないこと、なお更に好ましくは２０ｍｌ／分／ｃｍ２を超えないこと、最も好ましくは、１０ｍｌ／分／ｃｍ２を超えないことである。当業者であれば、水透過性は、ｍｌ／分／ｃｍ２に変換され得る他の単位で表現されることができることを容易に理解するであろう。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態において、「水に実質的に不透過性」であり、かつ「酸素及び二酸化炭素に実質的に透過性」である膜を横切る３ｍｂａｒ（３００Ｐａ）での空気の流速は、少なくとも５ｍｌ／分／ｃｍ２であり、好ましくは少なくとも１０ｍｌ／分／ｃｍ２であり、より好ましくは少なくとも１５ｍｌ／分／ｃｍ２であり、更により好ましくは少なくとも２０ｍｌ／分／ｃｍ２であり、最も好ましくは少なくとも２５ｍｌ／分／ｃｍ２である。当業者であれば、空気流は、ｍｌ／分／ｃｍ２に変換され得る他の単位で表現されることができることを容易に理解するであろう。
【００３９】
「水に実質的に不透過性」であり、かつ「酸素及び二酸化炭素に実質的に透過性」である、使用され得る多種多様の材料からなる膜としては、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）、シリコンゴム、発泡プラスチック、放射線処理プラスチック又は類似の材料からなる当該技術分野で周知の材料が挙げられるが、これらに限定されない。好適な膜の一例は、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）から商品名「ＴＥ３５（登録商標）」で市販されていて、これは、（製造者によって見積もられた）特性を有するポリエステル支持部を備えるＰＴＦＥ膜であり、この特性は、エタノール、３ｍｂａｒ（３００Ｐａ）での空気流速１５ｍｌ／分／ｃｍ２、及び１．４ｂａｒ（０．１４ＭＰａ）での発泡点で測定される場合、孔径０．２μＭ、厚さ１９０μＭ、２０ｍｌ／分／ｃｍ２の０．９ｂａｒ（０．０９ＭＰａ）での水の流速である。好適な膜の別の実施形態は、商品名「ＳｕｒｅＶｅｎｔ（登録商標）」でミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）から市販されているもので、これは（製造者によって見積もられる）特性を有するＰＶＤＦ膜であり、この特性は、孔径が０．２２μＭ、厚さが１００〜１５０μＭ、水破過点が４５ｍｂａｒ（４５００Ｐａ）、空気流速が１０ｐｓｉで１ｓｌｐｍ／ｃｍ２よりも大きい、である。いくつかの実施形態では、この膜は、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）０．２２μｍの「Ｄｕｒａｐｅｌ」膜であるか、又はワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）のＴＥ  ３５及びＴＥ３６膜であり得る。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態において、「酸素及び二酸化炭素に実質的に透過性」であるが「水にほぼ完全に不透過性」である、膜を横切る１ｂａｒ（０．１ＭＰａ）での水の流速は、０．１ｍｌ／分／ｃｍ２を超えず、更により好ましくは０．０５ｍｌ／分／ｃｍ２を超えず、なおより好ましくは０．０４ｍｌ／分／ｃｍ２を超えず、更により好ましくは０．０３ｍｌ／分／ｃｍ２を超えず、なおより好ましくは０．０２ｍｌ／分／ｃｍ２を超えず、最も好ましくは、０．０１ｍｌ／分／ｃｍ２を超えない。当業者であれば、水透過性は、ｍｌ／分／ｃｍ２に変換され得る他の単位で表現されることができることを容易に理解するであろう。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態において、「酸素及び二酸化炭素に実質的に透過性」であるが「水にほぼ完全に不透過性」である、膜を横切る３ｍｂａｒ（３００Ｐａ）での空気の流速は、少なくとも５ｍｌ／分／ｃｍ２であり、好ましくは少なくとも１０ｍｌ／分／ｃｍ２であり、より好ましくは少なくとも１５ｍｌ／分／ｃｍ２であり、更により好ましくは少なくとも２０ｍｌ／分／ｃｍ２であり、最も好ましくは少なくとも２５ｍｌ／分／ｃｍ２である。
【００４２】
「酸素及び二酸化炭素に実質的に透過性」であるが「水にほぼ完全に不透過性」である、使用され得る多種多様の材料からなる膜としては、例えば、低い多孔性及び高い疎水性のために、大気圧で非常に低い水透過性を有する限外濾過の目的に初期調製された膜が挙げられるが、これに限定されない。このような膜としては、「ＹＭ１（登録商標）」の商品名でＡｍｉｃｏｎから市販されるもの、並びに「Ｏｍｅｇａ  １Ｋ（登録商標）」の商品名でＰａｌｌ  Ｃｏｒｐから市販される限外濾過膜が挙げられる。他の好適な膜としては、［ポリ（エーテルエーテルケトン）（ＰＥＥＫ）からのミクロ−及び限界濾過フィルム膜」（ソンネンシェイン  Ｍ（Ｓｏｎｎｅｎｓｃｈｅｉｎ  Ｍ）著、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９年  ７４：１１４６］により記載されるようなポリ（エーテルエーテルケトン）（ＰＥＥＫ）及びポリ（フェニレンスルフィド）（ＰＰＳ）などの半結晶性材料の熱的に誘導された転相工程によって調製された熱可塑性限外濾過が挙げられる。固定化された安定支持液体膜（ＳＬＭ）もまた使用され得、これらは、米国特許第５５０７９４９号明細書に開示されるシステムなどの固体、ミクロ多孔質、疎水性支持体内に固定化された好適なオリゴマー性又はポリマー性液体膜材料を含む。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態では、本発明において適用され得る細胞は、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、筋細胞、又は類似細胞、肝組織、脂肪組織（褐色又は白色）、肝臓バイオプシー、腎臓バイオプシー、筋肉バイオプシー、卵巣卵胞、ランゲルハンス小島、及びこれらに由来する全ての癌細胞から選択される。
【００４４】
本発明の特に好ましい実施形態では、本発明において適用され得る細胞は、肝細胞、特にヒト肝細胞である。
図１は、本発明の第１の態様によるバイオリアクター１０の概略的断面図である。バイオリアクター１０は、図１に表示されるように、水平軸の周りの高度の回転対称を有する。このリアクターは、細胞、組織などのインキュベーション用のインキュベーションキャビティー１５を備える。このインキュベーションキャビティーは、本質的に円筒状の壁、壁の第１の端部における半透膜（１１）、及び壁の第２の端部における密閉可能な蓋（１３）（任意選択的にＯ−リング（２２）を使用する実質的に密閉制限である）を一緒に装備する。インキュベーションキャビティー（１５）は、細胞などのインキュベーションのために実質的に密閉制限である半透膜（１２）（無菌フィルターとしても既知）（１１）を一緒に装備する。
【００４５】
栄養及び／又は新鮮な液体培養基を提供するために、半透膜１１は、５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１５０ｋＤａ、２００ｋＤａ又は２５０ｋＤａなどの所定の分子量までの分子に対して透過性である。標準透析膜は、これらの要求を実現する。あるいは、半透膜１１の透過性は、その中の孔径によって決定される。半透膜１１の孔径は、０．５μｍ以下であり、例えば０．３μｍ以下であり、好ましくは、０．２μｍ以下、更により好ましくは０．１μｍ以下、最も好ましくは０．０５μｍ以下である。汚染（例えば、細菌、マイコプラズマ又は酵母）が膜を通過して侵入することを防止する必要性のために、０．２μｍ以下のサイズが好ましい。この好ましい実施形態において、半透膜の主な目的は、細胞及び細菌がインキュベーションキャビティーに入ること（又は離れること）を排除すると同時に、栄養及び老廃物の交換を可能にすることである。したがって、多種多様な膜が１１に使用され得る。これらは、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）、シリコンゴム、発泡プラスチック、放射線処理プラスチック又は類似の材料から作製され得る。これによって、インキュベーションチャンバにおける細胞及び細胞集合体の保持並びに外部感染からのそれらの保護を同時にもたらしながら、栄養及び液体培養基のインキュベーションチャンバへの流入がもたらされる。インキュベーションキャビティー１５は、約２５μｌ〜約１０００ｍｌの内部流体容量を有する。好ましくは、インキュベーションキャビティー１５の流体容量は、約５０μｌ〜約５００ｍｌであり、より好ましくは約０．１〜約２００ｍｌである。小型サイズは、使用のコスト並びに効果的な操作に必要な材料（有機及び無機の双方で）の量を著しく軽減する。小型サイズは、細胞の至近距離からのモニタリング（例えば、遠隔操作カメラ又は顕微鏡）、及び自動化処理加工を容易にする。
【００４６】
より大型のサイズは、再生医薬品のために、大量の代謝物の調製（例えば、薬剤又は他の成分からの）又は更なる実験用の少量のアリコートへの細分化のために使用され得る均質の特性を有する、より大量のスフェロイドの調製を可能にするだろう。
【００４７】
バイオリアクター１０の前に、透明部分１４が配置されることにより、細胞などの培養が、バイオリアクター１０の外側から、例えばカメラを使用して手動で又は自動的に視覚的に監視かつ評価され得る。透明部分１４は、透明であるのみならず培養プロセスに関して生物学的及び化学的に不活性であるガラス、プラスチック又は任意の他の好適な材料から作製され得る。好ましい材料としては、様々なタイプのガラス、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン及びポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）が挙げられるだろう（これらに限定されない）。登録商標／商品名Ｐｅｒｓｐｅｘ（登録商標）、Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ（登録商標）、Ｌｕｃｉｔｅ（登録商標）、Ａｃｒｙｌｉｔｅ（登録商標）、Ｒｈｏｐｌｅｘ（登録商標）、及びＯｒｏｇｌａｓ（登録商標）の下、販売される製品を含む、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）の好適な変形が購入可能である。バイオリアクターの任意の実施形態は、このような透明材料から全体が又は一部が作製されることができる。
【００４８】
インキュベーションキャビティー１５は、実質的に円筒形状を有するが、他の形状もまた可能であり、例えば楕円形状、球形状などである。好ましくは、バイオリアクター１０は、キャビティー１５内での細胞の成長を促進するための関連する回転手段（図示せず）によって、水平の回転軸の周りの回転に適合されている。回転の速度は、細胞又はスフェロイドを懸濁液中に維持するよう調整され、この速度は、スフェロイドのサイズが増加するにつれて変更されねばならない。当業者であれば、細胞又はスフェロイドを懸濁液中に維持するために回転速度を調整する方法を知っていることだろう。
【００４９】
図２は、３つの主要な構成成分が分離されている図１の分解図である。
【図１】
0005922672.tif 000002
【図２】
0005922672.tif 000003