(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
好中球細胞上のＭＵＣ１レセプターを活性化させることにより細胞数の増殖を刺激するまたは増大させる方法であって、
（ｉ）ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７またはＭＴ１−ＭＭＰとしても知られるＭＭＰ１４、または
（ｉｉ）ＭＵＣ１レセプターのＭＧＦＲ部分を活性化させる抗体もしくはＮＭ２３リガンド、
と好中球細胞をインビトロもしくはエクスビボで接触させることによって活性化させることを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＵＣ１発現細胞の数を増やす方法に関する。
【０００２】
(関連特許)
本願は、２００５年３月３０日出願の米国仮出願第６０／６６７２１６号の優先権の利益を主張する。また本願は、２００５年９月１４日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ／第２００５／０３２８２１号の優先権の利益を主張する。該出願のすべての内容は参照により本願に援用される。
【背景技術】
【０００３】
本願においては、腫瘍形成におけるＭＵＣ１レセプターの役割を記述している２００４年８月２６日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ／第２００４／０２７９５４号（国際公開第２００５／０１９２６９号）、２００２年７月１８日公開のＰＣＴ国際公開第０２／０５６０２２号パンフレット、および２００１年１１月２７日出願の米国特許出願第０９／９９６０６９号で２００３年２月２０日公開の第２００３／００３６１９９号の記載内容は参照により援用される。
【０００４】
近年の研究においては、癌幹細胞（ＣＳＣ）の存在が立証されている（「腫瘍形成幹細胞の予測的識別」（Prospective identification of tumorigenic stem cells） Al-Hajj M, Wicha MS, Benito-Hernandez A, Morrison SJ, および Clarke MF. 非特許文献１; 「クローン化可能多発性骨髄腫細胞の特徴付け」（Characterization of clonogenic multiple myeloma cells） Matsui W, Huff CA, Wang Q, Malehorn MT, Barber J, Tanhehco Y, Smith BD, Civin CI, および Jones RJ.非特許文献２; 「ヒト脳腫瘍における癌幹細胞の識別」（Identification of a cancer stem cell in human brain tumor） Singh SK, Clarke ID, Terasaki M, Bonn VE, Hawkins C, Squire J, およびDirks PB. 非特許文献３。正常幹細胞は、恒久的に自己再生が可能であり、かつ区別可能な組織タイプの成人細胞に分化することが可能であるという特徴を有する。前駆細胞は、区別可能な組織タイプに更に分化可能であるが、「あらゆる」タイプの細胞に分化することは不可能である。すべての癌細胞が自己再生して新しい宿主において疾病を誘発したり新しい腫瘍を形成することできるわけではないことが分かっている（「重症複合型免疫不全マウスへの移植後におけるヒト急性骨髄性白血病を引き起こす細胞」（A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice） Lapidot T, Srirad C, Vormoor J, Murdoch B, Hoang T, Caceres-Cortes J, Minden M, Paterson B, Caligiuri M, およびDick J.非特許文献４; 「ヒト脳腫瘍における癌幹細胞の識別」（Identification of a cancer stem cell in human brain tumor） Singh SK, Clarke ID, Terasaki M, Bonn VE, Hawkins C, Squire J,および Dirks PB. 非特許文献５; 「ヒト急性骨髄性白血病は原始造血細胞を起源とする階層として組織される」（Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell） Bonnet D.および Dick JE. 非特許文献６。より正確に言えば、ごく一部の癌細胞のみが自己再生して新しい腫瘍を形成する（すなわち転移する）ことが可能である。癌は「行き過ぎを抑えて均衡をとる（checks and balances）」という自らの厳重規制システムが故障した正常幹細胞によって引き起こされるという理論が先導理論として存在する（「自己再生と充実性腫瘍幹細胞」（Self-renewal and solid tumor stem cells） Al-Hajj MおよびClarke MF. 非特許文献７。充実性腫瘍は、幹細胞群を有する臓器に発生する。乳癌、前立腺癌、結腸癌、および肺癌を含む上皮癌は、成人に最も多く見られる癌である。これらの癌の７５％以上は、ＭＵＣ１レセプターの異常発現という特徴を有する（「人乳ムチン（mucin）のコア蛋白質に対する乳癌反応性モノクローナル抗体の開発と特徴付け」（Development and characterization of breast cancer reactive monoclonal antibodies directed to the core protein of the human milk mucin） Burchell J, Gendler S, Taylor-Papadimitriou J, Girling A, Lewis A, Millis R, およびLamport D. 非特許文献８; 「上皮サイアロムチン（sialomucins）に対するモノクローナル抗体は、耳下腺の腺リンパ腫における様々な細胞部位におけるエピトープを認識する」（Monoclonal antibodies to epithelial sialomucins recognize epitopes at different cellular sites in adenolymphomas of the parotid gland） Zotter S, Hageman P C, Lossnitzer A, Mooi W, Hilgers J. 非特許文献９; 「結腸直腸癌におけるムチンおよびムチン結合蛋白質」（Mucins and mucin binding proteins in colorectal cancer） Byrd JCおよびBresalier RS. 非特許文献１０）。ここで、異常発現とは、レセプターが内腔細胞のアピカルボーダーにもはや局在せず��細胞表面全体に渡って均一に分布していることを意味する（「ヒト悪性胸部腫瘍とヒト良性胸部腫瘍とに対する新しいモノクローナル抗体（ＤＦ３）の特異反応性」（Differential reactivity of a novel monoclonal antibody (DF3) with human malignant versus benign breast tumors） 非特許文献１１。ＭＵＣ１陽性癌の割合が最も多い癌は乳癌で、乳癌の９６％には異常ＭＵＣ１発現が見られる。興味深いことに、成人女性において、胸部組織は、各月経期間と妊娠期間に伴って成長とアポトーシスという周期性バーストを経なければならない。したがって、胸部組織は、機能幹細胞群または少なくとも前駆細胞群を、成人女性の生涯に渡って維持しなければならない。
【０００５】
癌幹細胞の成長を促進する成長因子およびそのレセプターを識別することによって、研究、治療、およびその他の用途のために、幹細胞と前駆細胞をどのように成長させ操作するかについて理解する鍵を得ることができる。
【０００６】
ＭＵＣ１（ムチン１）は、多くの上皮細胞タイプに発現する膜貫通ムチン糖蛋白質である（「ヒト腫瘍に伴う多形性上皮ムチンの分子クローニングと発現」（Molecular cloning and expression of the human tumor associated polymorphic epithelial mucin）, PEM. Gendler Sj, Lancaster CA, Taylor-Papadimitriou J, Dhuig, T, Peat, N, Burchell, J, Pemberton, L, Lalani, E-NおよびWilson D. 非特許文献１２; 「癌腫に伴うムチンであるエピシアリン（Episialin）は、代替アミノ末端を有するスプライス変異形をコード化する多形性遺伝子によって生成される」（Episialin, a carcinoma associated mucin, is generated by a polymorphic gene encoding splice variants with alternative amino termini） Ligtenberg MJL, Vos HL, Genissen, AMCおよびHilkens J. 非特許文献１３, 「上記エピシアリンは造血細胞上に形成される」（on haematopoietic cells）（「潜在的な乳癌のマーカーとしての骨髄と末梢血におけるＭＵＣ１とＥＧＰ４０の評価」（Evaluation of MUC1 and EGP40 in Bone marrow and Peripheral Blood as a Marker for Occult breast cancer）） 非特許文献１４, 「上記エピシアリンは前駆細胞上にも形成される」（on progenitor cells as well）（「正常ヒト乳腺における上皮前駆体」（Epithelial Progenitors in the Normal Human mammary Gland） Stingl J, Raouf A, Emerman J, and Eaves C. 非特許文献１５。細胞表面レセプターＭＵＣ１は、健康な上皮組織のアピカルボーダーに存在するが、ヒト充実性腫瘍の広範囲に渡って異常発現する（細胞表面全体に渡って蔓延する）。ＭＵＣ１レセプターは細胞表面から開裂、すなわち「分離する」こともあることが知られている。ＭＵＣ１の外領域は実際的に以下の３つの識別可能領域、すなわち１）縦列反復、２）自己集合する鎖間結合領域、および３）ここではＰＳＭＧＦＲと呼ばれる、蛋白質分解後に細胞表面に付着したままのレセプターの部分から構成される。主としてＰＳＭＧＦＲからなる、開裂後に細胞表面に付着したままのＭＵＣ１レセプターの部分は、主要な成長因子レセプターであって、インビトロにおいてＭＵＣ１陽性癌細胞の成長を媒介する。原型膜貫通・細胞質領域からなる一方で、癌細胞上で発生する天然開裂部位として見られるＰＳＭＧＦＲ配列の末端で終結する外領域を有する変異ＭＵＣ１レセプターのトランスフェクションは、これらの細胞が非固定的に成長することが可能であることを十分立証するものである（悪性形質転換の検証）。このＭＵＣ１の開裂形態は、ヒト癌性組織試料におけるＭＵＣ１レセプターの優勢な形態である。
【０００７】
さらに詳細には、ＭＵＣ１は、以下に記載する名称の複数の領域を備える。該記載に列挙する順序は、細胞表面に最も近い領域から、細胞から遠くなる方へという順序である。ＭＵＣ１レセプターの基本構造は、図１に示した。図示したとおり、レセプターは、１）細胞質尾部、２）膜貫通セクション、３）ＭＧＦＲ、４）ＩＢＲ、５）固有領域、６）繰返し、および信号ペプチドを備えたＮ−末端領域を備えている。ＭＵＣ１および正常／腫瘍細胞におけるその機能の詳細は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／第０３２８２１号を参照のこと。該出願における、細胞表面上の開裂ＭＵＣ１の機能と活動に関するすべての記載内容は参照により本願に援用される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】(2003). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 3983-3988
【非特許文献２】(2004) Blood, 103, 2332-2336
【非特許文献３】(2003) Cancer Res., 63, 5281-5828)
【非特許文献４】(1994). Nature, 17, 645-648
【非特許文献５】(2003) Cancer Res., 63, 5281-5828
【非特許文献６】(1997) Nat. Med. 3, 730-737)
【非特許文献７】(2004) Oncogene, 23, 7274-7282）
【非特許文献８】(1987) Cancer Res., 47, 5476-5482
【非特許文献９】(1988) Cancer Rev. 11-12, 55-101
【非特許文献１０】(2004) Cancer Metastasis Review Jan-Jun;23(1-2):77-99.
【非特許文献１１】(1984) Kufe D, Inghirami G, Abe, M, Hayes D, Justi-wheeler H, Schlom J. Hybridoma, 3, 223-232）
【非特許文献１２】(1990) J. Biol. Chem. 265, 15286-15293
【非特許文献１３】(1990) J. Biol. Chem. 265, 15573-15578)
【非特許文献１４】(2001). Zhong XY, Kaul S, Bastert G, Arch Gynecol Obstet 264:177-181)
【非特許文献１５】(2005). Journal of Mamary Gland Biology and Neoplasia, Vol. 10, No. 1, 49-59
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様では、本発明は、細胞上のＭＵＣ１レセプターを活性化させることにより細胞数の増殖を刺激するまたは増大する方法を目的とする。活性化は、（ｉ）ＭＵＣ１のＭＧＦＲ部分を多重結合化させる作用物質、（ｉｉ）ＭＵＣ１の開裂を増大させて成長因子レセプター形態にする作用物質、または（ｉｉｉ）ＭＵＣ１レセプターのＭＧＦＲ部分を活性化させるリガンドに細胞を接触させることによって行われ得る。細胞は、非腫瘍細胞であってもよいが、幹細胞、前駆細胞、子宮内膜細胞、好中球前駆体、および好中球等の未熟細胞であることが好ましい。更に、本方法では、ＭＵＣ１レセプターは、細胞表面に付着した開裂生成物であり得る。ＭＵＣ１開裂生成物は、ＭＧＦＲであり得る。更に、ＭＧＦＲはＰＳＭＧＦＲを含み得る。本方法において、ＭＵＣ１レセプターはＭＵＣ１レセプターの多重結合化作用物質によって活性化され得る。更に、多重結合化作用物質は二価であり得る。二価の作用物質は、ＭＧＦＲの部分を認識し得る。更に、二価の作用物質は合成化合物であり得る。二価の作用物質は、ＭＵＣ１の二量体リガンドであり得る。更に、二価の作用物質は、抗体であり得る。本方法では、開裂を増大させる作用物質は酵素であり得る。酵素は、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７またはＭＴ１−ＭＭＰとしても知られるＭＭＰ１４であり得る。
【００１０】
他の態様では、本発明は、白血球数低下の症状を表す患者を治療する方法であって、細胞内のＭＵＣ１レセプターを活性化させる作用物質を患者に投与することを備えた方法を目的とする。本方法は、治療が必要であると示された被験体に投与することを含みうる。これにおいて、活性化は、（ｉ）ＭＵＣ１のＭＧＦＲ部分を多重結合化させる作用物質、（ｉｉ）ＭＵＣ１の開裂を増大させて成長因子レセプター形態にする作用物質、または（ｉｉｉ）ＭＵＣ１レセプターのＭＧＦＲ部分を活性化させるリガンドに細胞を接触させることによって行われる。
【００１１】
更に他の態様では、本発明は、未熟細胞を増殖させることによって医療効果が達成されることを示す症状を表す患者を、細胞内のＭＵＣ１レセプターを活性化させる作用物質によって治療する方法を目的とする。本方法では、ＭＵＣ１は、ＭＵＣ１レセプターのＭＧＦＲ部分を二量化することによって活性化され得る。ＭＵＣ１がＭＵＣ１の開裂を刺激することによって活性化させられ、細胞表面に付着したままの部分が本質的にＰＳＭＧＦＲから、好ましくはｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲからなるようにすることも可能である。本方法では、ＭＵＣ１又は翻訳後修飾ＭＵＣ１の生成を刺激することによって、ＭＵＣ１を活性化できる。更に本方法では、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を添加して、ＭＵＣ１又は翻訳後修飾ＭＵＣ１の生成を刺激することによって、ＭＵＣ１を活性化できる。
【００１２】
更に他の態様では、本発明は（ｉ）ＭＵＣ１、（ｉｉ）細胞表面にみられるＭＵＣ１のフラグメント、または（ｉｉｉ）ＭＵＣ１のＭＧＦＲ部分をコード化するＤＮＡを患者の増殖を所望する細胞の部位に投与して未熟細胞を増殖させることによって軽減され得る症状を表す患者を治療する方法に関する。
【００１３】
他の態様では、ＭＵＣ１、細胞表面にみられるＭＵＣ１のフラグメント、またはＭＵＣ１のＭＧＦＲ部分をインビトロにおいて導入することによって未熟細胞の増殖を刺激する方法を目的とする。本方法において、患者をＭＵＣ１陰性癌の治療用の化学療法作用物質で治療できる。
【００１４】
本発明は更に、（ｉ）ＭＵＣ１のＭＧＦＲ部分を多重結合化させる作用物質、（ｉｉ）ＭＵＣ１の開裂を増大させて成長因子レセプター形態にする作用物質、または（ｉｉｉ）ＭＵＣ１レセプターのＭＧＦＲ部分を活性化させるリガンドと、医薬的に許容可能なキャリヤとを備えた合成物に関する。
【００１５】
本発明の上記目的およびその他の目的は、以下の本発明の説明、添付の参照図面、および添付の特許請求の範囲からより十分に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明は、以下に記載の詳細な説明と添付の図面からより十分に明らかになるであろう。ただしこれらは実例として記載されているにすぎない。したがってこれらは本発明を限定するものではない。
【００１７】
【図１】全長ＭＵＣ１レセプターと、成長因子レセプター開裂生成物ＭＧＦＲとを表す概略図である。
【図２】細胞増殖評価分析のグラフである。３つの異なる細胞株、すなわち（Ａ）乳癌細胞株１５０４、（Ｂ）ごく若干ＭＵＣ１陽性であってＭＵＣ１二量化への成長に若干反応を示すＨｅＬａ細胞、および（Ｃ）ＭＵＣ１陰性であるＨＥＫ２９３細胞を、ａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲで処理した。正規化された細胞成長は、抗体濃度の関数としてグラフに表されている。ＭＵＣ１陽性乳癌細胞株１５０４の成長曲線は、典型的な二相反応を示している。これは、クラスＩの成長因子レセプターの特性である。各抗体が各２つのレセプターを二量化するときに抗体濃度が増大するにつれて、細胞成長は増大する。抗体濃度が過剰に高くなって、各単一抗体が２つのレセプターを二量化するのではなく、単一レセプターに結合するようになると、細胞成長は低下し始める。二量化がなくなると、成長信号は消失する。ＨＥＫ２９３細胞は、ＭＵＣ１レセプターを欠損しているので、ａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲによるＭＵＣ１刺激に対して無反応である。これらの結果は、ＰＳＭＧＦＲ配列を含むＭＵＣ１レセプターの部分が成長因子レセプターとして機能し、二量化時に細胞を刺激し分裂させることを示している。ａｎｔｉ−Ｍｕｃ１とは、ａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲ抗体を意味する。
【図３】細胞増殖評価分析のグラフである。ＰＳＭＧＦＲ配列の末端で終結する切断外領域を有するＭＵＣ１レセプターで安定的にトランスフェクションされたヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞（ＭＵＣ１−陰性）を、ａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲで処理した。正規化細胞成長は、抗体濃度の関数としてグラフに表されており、ＭＵＣ１レセプターのＰＳＭＧＦＲ部分がレセプターのこの部分の二量化を介して細胞成長を媒介することを示している。
【図４】細胞増殖評価分析のグラフである。３つの細胞株は、レセプターを二量化することが不可能な一価ａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲで処理した。グラフから、対照である細胞株（Ａ）ＨｅＬａと（Ｂ）ＨＥＫ２９３とは、抗体添加による影響を受けないことが分かり、一方、ＭＵＣ１陽性細胞株である乳癌細胞株１５０４（Ｃ）、（Ｄ）においては、細胞成長が抑制されていることが分かる。
【図５】ＭＡＰキナーゼ増殖経路のＥＲＫ２分岐が、ＭＵＣ１レセプターのＰＳＭＧＦＲ領域の二量化時に活性化される（ＥＲＫ２がリン酸化する）ことを示すウエスタンブロットである。
【図６】ＭＵＣ１のＰＳＭＧＦＲ領域に結合する小分子が、該部位に結合するａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲと競争する競争実験のウエスタンブロットである。競争相手である小分子が存在する場合、抗体は結合せずＥＲＫ２リン酸化は抑制される。これらの結果は、ＭＵＣ１レセプターのＰＳＭＧＦＲ部分が細胞成長を媒介し、レセプターの二量化がこの成長信号を引き起こすことを示している。本図に示した競争相手である化合物ＭＮ９の化学式は以下のとおりである。
【化１】
0005938365.tif 000002
化合物ＭＮ２１の化学式は以下のとおりである。
【化２】
0005938365.tif 000003
【００１８】
化合物ＭＮ１３の化学式は以下のとおりである。
【化３】
0005938365.tif 000004
【図７】４枚のヒト乳癌試料の拡大写真である。図７Ａと図７Ｃは、ＭＵＣ１陽性癌の同じセクションから得た隣接片である。図７Ｂと図７Ｄは、ＭＵＣ１陰性癌の同じセクションから得た隣接片である。図７Ａと図７Ｂのセクション（図上段）は、レセプター開裂後に細胞表面に付着したままのＭＵＣ１レセプターの部分に結合するａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲで処理した。図７Ｃと図７Ｄのセクション（図下段）は、癌細胞表面からしばしば分離するＭＵＣ１レセプターの縦列反復部分に結合するＶＵ４Ｈ５抗体で処理した。ＶＵ４Ｈ５での染色の度合いに比較してａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲでの染色の度合いが非常に大きいことに注目されたい。この結果は、癌細胞表面上のＭＵＣ１レセプターの優勢形態が縦列反復部分を欠損しており本質的にＰＳＭＧＦＲ配列から構成されることを示している。
【図８】３枚の乳癌生検試料の隣接片の写真である。これらの試料は、図８Ａ：Ｈ＆Ｅ、図８Ｂ：ａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲ、図８Ｃ：ＶＵ４Ｈ５のいずれかで染色した。図８Ｂ）と図８Ｃ）とを比較すると、ＶＵ４Ｈ５は細胞質を広く染色しているのに対して、ａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲは細胞表面膜を明らかに染色している。これは、癌細胞において、ＭＵＣ１レセプターが開裂して縦列反復部分を放出するものの、細胞表面に付着したままのＰＳＭＧＦＲ配列を含む部分を残すことを示している。
【図９】４枚のヒト肺癌組織試料の拡大写真である。図９Ａと図９Ｃは、ＭＵＣ１陽性肺癌の第１のセクションから得た隣接片である。図９Ｂと図９Ｄは、ＭＵＣ１陰性癌から得た隣接片である。図９Ａと図９Ｂのセクション（図上段）は、レセプター開裂後に細胞表面に付着したままのＭＵＣ１レセプターの部分に結合するａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲで処理した。図９Ｃと図９Ｄのセクション（図下段）は、癌細胞表面からしばしば分離するＭＵＣ１レセプターの縦列反復部分に結合するＶＵ４Ｈ５抗体で処理した。ＶＵ４Ｈ５での染色の度合いに比較してａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲでの染色の度合いが非常に大きいこと、ならびにａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲでの染色は細胞表面に限定されていることに注目されたい。これらの結果もまた、ＭＵＣ１陽性肺癌細胞表面上のＭＵＣ１レセプターの優勢形態が縦列反復部分をほぼ欠損しており本質的にＰＳＭＧＦＲ配列から構成されることを示している。
【図１０】図９Ａ〜図９Ｄ同様のＭＵＣ１陽性肺癌組織試料の同じ一式のより大きく拡大した写真である。拡大してみると、ａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲの染色は細胞表面に限定されている一方、ＶＵ４Ｈ５は広く細胞質を染色していることが明らかに観察される。これは、ＭＵＣ１陽性肺癌細胞表面上のＭＵＣ１レセプターが開裂して縦列反復部分を放出し、細胞表面に付着したままのＭＧＦＲ部分を残すことを示している。
【図１１】２枚の結腸癌組織試料の写真である。これらの試料は、図１１Ａはａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲ、図１１ＢはＶＵ４Ｈ５で染色した。矢印は、すべての細胞構造を欠損している事実から示されるように非常に癌性が高いセクションの部分を示す。図１１Ａのセクションは、ａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲにより染色された暗色領域を示しているが、ＭＵＣ１レセプターの縦列反復部分を認識するＶＵ４Ｈ５で染色された隣接する図１１Ｂのセクションの同一領域は、まったく染色されていない。これらの結果は、ＭＵＣ１陽性結腸癌において、ＭＵＣ１レセプターが開裂して縦列反復部分を放出するものの、細胞表面にそのまま付着したままのＰＳＭＧＦＲ配列を含む部分を残すことを示している。
【図１２】２枚のＭＵＣ１陰性組織試料の写真である。これらの試料は、図１２Ａはａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲ、図１２ＢはＶＵ４Ｈ５で染色した。図１２Ａにおいて矢印は複数の肥満細胞を示しており、その表面はａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲで全体的に染色されたがＶＵ４Ｈ５では染色されていないことに注目されたい。これらの結果は、ＰＳＭＧＦＲ配列を含むが縦列反復領域を含まないＭＵＣ１レセプターの開裂形態が肥満細胞の表面上に存在することを示している。
【図１３】図１２Ａの拡大写真であって、ａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲで被覆された肥満細胞を示している。矢印は、ＭＵＣ１開裂生成物であるＰＳＭＧＦＲで被覆された肥満細胞を示す。
【図１４】健康な卵管組織試料の隣接片の写真である。図１４Ａはａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲ、図１４ＢはＶＵ４Ｈ５抗体で染色した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本願では、「a」と「an」は単数と複数との両方を示すものとして用いられている。
【００２０】
用語「ＭＵＣ１成長因子レセプター」（ＭＧＦＲ）の機能的定義は以下のとおりである。すなわち、ＭＵＣ１レセプターの部分は、成長因子等の活性化リガンドまたは開裂酵素等の修飾酵素と相互作用して細胞増殖を促進する。ＭＵＣ１のＭＧＦＲ領域は、細胞表面に最も近い細胞外部分であって、後に定義するＰＳＭＧＦＲの大部分またはすべてによって画定される。ＭＧＦＲは、非修飾ペプチドと、例えばリン酸化反応、グリコシル化等の酵素修飾を経たペプチドとの両方を含む。本発明の結果は、以下のメカニズムと一致している。該メカニズムにおいて、この部分は、細胞からＩＢＲの一部またはすべてが放出される原因となる腫瘍形成を伴う部位におけるＭＵＣ１開裂時にリガンドにアクセス可能である。
【００２１】
本明細書では、「ａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲ」とは、ＭＧＦＲの領域と場合によってＰＳＭＧＦＲの任意部分を認識する任意の抗体を意味する。ｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲに対する抗体は、本願における好ましい例であるが、必ずしもこの特定の配列に対する抗体に限定されるものではなく、ＭＧＦＲやＰＳＭＧＦＲの他のフラグメントも同様に考慮される。
【００２２】
用語「鎖間結合領域（ＩＢＲ）」の機能的定義は以下のとおりである。すなわち、ＭＵＣ１レセプターの部分は、他のＭＵＣ１分子の同一領域に強く結合している部分である。各レセプターのＩＢＲを介して、ＭＵＣ１は他のＭＵＣ１レセプターと集合（すなわち、自己集合）することが可能になる。この自己集合は、健康な細胞で観察されるＭＵＣ１レセプターのクラスタリングに寄与し得る。一実施形態において、ＩＢＲは、ＭＵＣ１レセプターの細胞外配列（SEQ ID NO: 1）の５０７〜５４９のアミノ酸を備えると定義される全長ヒトＭＵＣ１レセプターの領域内における少なくとも１２〜１８のアミノ酸配列のストレッチとして概して定義され得る。５２５〜５４０および５２５〜５４９のアミノ酸を備えることが特に好ましい（数については、Andrew Spicerら., J. Biol. Chem Vol 266 No. 23, 1991 pgs. 15099-15109を参照のこと。これらのアミノ酸の数は、Genbank受入れ番号Ｐ１５９４１の１０６７、１１０９、１０８５、１１００、１０８５、１１０９に対応する（PID G547937, SEQ ID NO: 1））。或いは後ほど詳述する上記のフラグメント、機能変異形、または同類置換形である。
【００２３】
用語「開裂ＩＢＲ」とは、細胞表面に付着したままのレセプター分子セグメントから放出されたＩＢＲ（またはその一部分）を意味する。この放出は、酵素によるものでも、ＩＢＲの他の開裂によるものでもよい。本明細書においては、ＩＢＲが「細胞の表面に存在する」とき、ＩＢＲは、分離や開裂がなされていない細胞表面レセプターの部分に付着していることを意味する。対象とする開裂ＩＢＲは、「疾病に関わる開裂」であって、すなわち癌に至り得るタイプの開裂である。
【００２４】
用語「定常領域（ＣＲ）」とは、ＭＵＣ１の任意の非反復配列である。これは、ＩＢＲとの比率１：１で存在し、健康な細胞および腫瘍形成細胞において開裂時に分離するＭＵＣ１の一部を形成する。
【００２５】
用語「反復」とは、本技術分野における通常の意味を有する。
【００２６】
用語「ＭＵＣ１成長因子レセプターの一次配列」（ＰＳＭＧＦＲ）」とは、一部の場合にはＭＧＦＲの大部分またはすべてを画定するペプチド配列であって、以下に定義するように、ペプチド配列の機能変異形およびフラグメントである。ＰＳＭＧＦＲは、以下の表１に挙げたSEQ ID NO: 10、ならびに２０まで（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）のアミノ酸置換のうち任意の整数値、および／またはＮ−末端および／またはＣ−末端における２０までのアミノ酸追加またはアミノ酸削除のうち任意の整数値を有するそのすべての機能変異形とフラグメントとして定義される。上記の「機能変異形またはフラグメント」とは、SEQ ID NO: 10のペプチドに特定に結合するまたは特定に相互作用するリガンドに特定に結合するまたは特定に相互作用することが可能な変異形またはフラグメントを意味する。SEQ ID NO: 10のＰＳＭＧＦＲペプチドの機能変異形であるＰＳＭＧＦＲの一例としては（「天然」についてはｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲを参照）、SEQ NO:12が挙げられる（ｖａｒ−ＰＳＭＧＦＲを参照）。これはｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲとは違って、天然−ＳＲＹ−の代わりに−ＳＰＹ−配列を含む（配列リスト内の太字を参照のこと）。天然形態と比較すると、ｖａｒ−ＰＳＭＧＦＲは構造安定性が高い。このことは、抗体生成等の特定の用途において重要となり得る。ＰＳＭＧＦＲは、非修飾ペプチドと、例えばリン酸化反応、グリコシル化等の酵素修飾を経たペプチドとの両方を含む。
【００２７】
用語「ＭＵＣ１成長因子レセプターの拡張配列」（ESMGFR）とは、以下に定義したペプチド配列であって（表１のSEQ ID NO: 15を参照）、Ｈｉｓ−ｖａｒ−ＰＳＭＧＦＲのすべてとＰＳＩＢＲの近接端部の９つのアミノ酸を定義する。
【００２８】
用語「ＭＵＣ１成長因子レセプターの腫瘍特定の拡張配列」（ＴＳＥＳＭＧＦＲ）とは、ペプチド配列である（一例として表１のSEQ ID NO: 16を参照）。このペプチド配列は、細胞表面に付着し続けかつＰＳＭＧＦＲと同様に活性化リガンドと相互作用可能な腫瘍細胞に見られるＭＵＣ１開裂生成物を定義する。
【００２９】
ＰＳＩＢＲとは、以下に定義したペプチド配列であって（表１のSEQ ID NO: 17を参照）、ＩＢＲの大部分またはすべてを画定する。
【００３０】
「切断鎖間結合領域」（ＴＰＳＩＢＲ）とは、以下に定義したペプチド配列である（表１のSEQ ID NO: 18を参照）このペプチド配列は、一部の腫瘍細胞におけるレセプター開裂後に細胞表面から放出されたＩＢＲの小部分を画定する。
【００３１】
ＰＳＭＧＦＲＴＣは、切断ＭＵＣ１レセプターのイソフォームであって、ＰＳＭＧＦＲを備える。またＰＳＭＧＦＲＴＣは、Ｎ−末端の最高約３０まで（すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）のアミノ酸において切断される。またＰＳＭＧＦＲＴＣは、全長ＭＵＣ１レセプターの細胞膜貫通細胞質配列を備える。本明細書では、ポリペプチドやレセプター等のような大きな分子内において特定される配列の位置を示す「Ｎ−末端において」という文言は、分子のＮ−末端アミノ酸を源とするアミノ酸３０未満の配列を意味する。場合によって、後述するこの他の切断ＭＵＣ１レセプターのイソフォーム同様に、ＰＳＭＧＦＲＴＣはＭＵＣ１−Ｎ−末端信号配列（表１のSEQ ID NO: 2、3、または4）を含み得る。これは通常、長さが２０〜３０のアミノ酸であるか、或いはその機能フラグメントまたは変異形である。該配列は通常、切断ＭＵＣ１レセプターのイソフォームをコード化する核酸構造によってコード化され翻訳されるが、通常細胞膜にレセプターが挿入される前または挿入時に開裂する。該ＰＳＭＧＦＲＴＣ、すなわち場合によって信号配列を含むＰＳＭＧＦＲＴＣは、上記の定義による「Ｎ−末端において」「ＰＳＭＧＦＲ配列を有する」ペプチドまたは蛋白質であり得る。一例として、Ｎ−末端において（すなわち極Ｎ−末端においてまたはそのアミノ酸が３０以下において）ｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲ（SEQ NO:10）を有するｎａｔ− ＰＳＭＧＦＲＴＣ（SEQ ID NO: 5、極(extreme)Ｎ−末端におけるSEQ ID NO: 2、3、または4の信号ペプチドの有無は問わない）が挙げられる。
【００３２】
本明細書では、レセプターの「多重結合」は、レセプターの二量化を無制限に含む。多重結合は更に、1つのコレセプター又は複数のコレセプターとＭＵＣ１との結合、或いは複数のＭＵＣ１レセプターの相互結合を含む。これは複数原子価を有する１または複数のリガンドとともに集合することもある。
【００３３】
細胞表面レセプターに対する「リガンド」とは、レセプターと相互作用して、一時的または恒久的にその構造および／または機能を変更することができる任意の物質を意味する。リガンドの例としては、レセプターの結合相手（例えば抗体またはその抗原結合フラグメント）、レセプターの化学構造を変更できる作用物質（例えば修飾酵素）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
「活性化リガンド」とは、レセプターと相互作用して信号を細胞に形質導入することが可能なリガンドを意味する。活性化リガンドの例としては、レセプターに結合可能な１つを上回る活性部位を有する単一分子種等の細胞表面レセプターの誘導多重結合に影響を及ぼす種、二量体、四量体、高多重結合体、二価抗体、またはその二価抗原結合フラグメント、または複数の分子種を備えた複合体等が挙げられるが、これらに限定されない。活性化リガンドは更に、レセプターが信号を送るようにレセプターを修飾する種を含み得る。酵素は、レセプターを修飾して他の活性化リガンドの新しい認識部位にする場合には活性化リガンドとなり得る。例えば、炭水化物を添加することによってレセプターに対するリガンドの親和性が増大する場合に、グリコシラーゼ（glycosylase）は活性化リガンドである。開裂酵素は、開裂生成物がレセプターのもっと高い活性型である場合には活性化リガンドである。これは例えば、リガンドの認識部位をよりアクセスし易いものにすることによって可能である。ＭＵＣ１管細胞または前駆細胞においては、活性化リガンドはＭＵＣ１を開裂させてレセプターを化学的に修飾する種となったり、或いはＭＵＣ１細胞の表面上でＭＧＦＲと相互作用して増殖を刺激する細胞への信号を形質導入するように働く種になったりし得る。例えば、誘導多重結合体に影響を及ぼす種となり得る。
【００３５】
「成長因子」とは、上記に識別した成長因子の種類に入る場合も入らない場合も含めた種を意味する。これは、活性化リガンドとして作用するという点で成長因子として作用するものである。
【００３６】
「ＭＵＣ１が存在する細胞」とは、その表面にＭＵＣ１および／またはＭＧＦＲが発現している細胞を意味する。
【００３７】
本明細書において「未熟細胞」とは、未分化幹細胞から、前駆細胞や、様々な前駆細胞、好中球等といったその他の細胞までを含めた、様々な分化段階にある細胞を意味する。これらは部分的な分化細胞を含むが、完全な分化細胞は含まれない。
【００３８】
用語「幹細胞」とは、複数系統分化と自己再生とが可能であるとともに、組織再生が可能である細胞を意味する。幹細胞は、臍帯血、肝幹細胞、膵幹細胞、神経幹細胞、骨髄幹細胞、末梢血幹細胞、またはこれを混合したものを起源とするが、これらに限定されない。更に、本発明は、特定の源から得た特定の幹細胞の移植に限定されず、相互混合された「複数の幹細胞源」から得た幹細胞を含み得る。したがって、移植量を増大させるために、単一または複数の幹細胞源から得た幹細胞の共移植において、膨張間葉間質細胞を使用してもよい。
【００３９】
本明細書において用語「癌」としては、以下を含むが、これらに限定されない。すなわち、胆道癌、膀胱癌、グリア芽腫と髄芽細胞腫とを含む脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、じゅう毛癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、急性白血病や骨髄性白血病を含む血液癌、多発性骨髄腫、ＡＩＤＳ関連白血病と成人Ｔ細胞リンパ腫、ボーウェン病やパジェット病を含む上皮内癌、肝臓癌、肺癌、ホジキン病やリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫、神経芽細胞腫、扁平上皮癌を含む口腔癌、上皮細胞、間質細胞、胚細胞、間葉細胞から発生する癌を含む卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、繊維肉腫、骨肉腫を含む肉腫、黒色腫、カポジ肉腫、好塩基性細胞癌、扁平上皮癌を含む皮膚癌、セミノーマ、非セミノーマ（奇形腫、じゅう毛癌）、間質腫瘍、胚細胞腫瘍等の胚腫瘍を含む睾丸癌、甲状腺異常、髄質腫瘍を含む甲状腺癌、腺癌、ウィルムス腫瘍を含む腎臓癌が含まれる。特に、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、脳腫瘍に好適である。
【００４０】
本明細書において、用語「癌の治療」としては、以下を含むが、これらに限定されない。すなわち、化学療法、放射線治療、アジュバント療法、または上記方法の組合せである。バリエーションが可能な治療の態様としては以下が挙げられるが、これらに限定されない。すなわち、投与量、投与のタイミング、投与期間、または治療法である。これらは他の治療と組み合わせても組み合わせなくてもよく、その場合にも投与量、投与のタイミング、または投与期間は多様であり得る。癌の他の治療法は外科的治療がある。これは単独で、或いは上記の治療方法のいずれかと組み合わせて使用できる。医療における一般的技術者によって適切な治療を決定することができる。
【００４１】
「癌または腫瘍形成を予防する作用物質」とは、本明細書記載の癌または腫瘍形成に関わるプロセスを妨げる任意の作用物質を意味する。
【００４２】
本明細書において「細胞表面レセプター鎖間結合領域の開裂を増大させる作用物質」とは、特定の位置において開裂の認識モチーフを生成する糖類やリン酸塩でＭＵＣ１を修飾することによって、該特定の位置において開裂を促進する合成物を意味する。他の酵素は、他の開裂酵素を活性化させることによってレセプターの開裂を増大し得る。細胞表面レセプターＩＢＲの開裂を増大させる作用物質の選択方法の一つは、上記のように開裂に影響を及ぼす酵素をまず特定し、これらの酵素の活動を変更する能力があるかどうかについて作用物質とその類似体をスクリーニングする方法である。別の方法としては、ＭＵＣ１の開裂の部位を変更する能力があるかについて、同様の酵素（例えば同じファミリー由来）の活動に影響を及ぼすと知られている作用物質を試験し、これら作用物質の類似体を同様に試験する方法がある。この他、作用物質を、酵素とＭＵＣ１レセプターとを含む無細胞評価分析においてスクリーニングし、開裂率または開裂位置を、抗体検査であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等によって測定してもよい。この他、最初にＭＵＣ１に影響を及ぼす酵素を識別せずに、作用物質がＭＵＣ１の開裂部位または開裂率を変更する能力があるかについて、ＭＵＣ１が存在する細胞に対して作用物質をスクリーニングしてもよい。例えば、作用物質を、ＭＵＣ１が存在する細胞全体を含む評価分析においてスクリーニングし、上澄細胞の集合潜在能力を測定することができる。これは、ＭＵＣ１の開裂部分に付着したままのＩＢＲの量、すなわちＭＧＦＲとＩＢＲとの間の開裂程度の指標とすることができる。この他の技法においては、ＭＵＣ１が存在する細胞全体を含む評価分析において作用物質をスクリーニングして上澄細胞を除去し、例えばＭＧＦＲの標識抗体を使用して、ＭＧＦＲ部分のアクセス性について残余細胞を試験する。作用物質は分子ライブラリ等の市販源から識別できるし、同じ機能能力を有する既知の作用物質に基づき合理的に設計し、スクリーニング評価分析を用いてその活性について試験できる。
【００４３】
「ＭＵＣ１レセプターの開裂を増大させる作用物質」とは、任意の位置においてＭＵＣ１レセプターの開裂を促進するまたは増大させる任意の合成物を意味する。該作用物質は、幹細胞または前駆細胞の数を増大させるために使用することができる。その理由は、開裂が達成されれば、細胞増殖に関係する機能レセプターであるＭＧＦＲのアクセス性を増大させるまたは促進することができるからである。該作用物質は、細胞を候補作用物質にさらし、上澄細胞において対照に対する開裂ＭＵＣ１レセプターの量を測定することによって選択することができる。
【００４４】
本明細書において「被験体」とは、哺乳類（好ましくはヒト）を意味し、好ましくは、幹細胞または前駆細胞を被験体内の部位に投与することによって治療され得る疾病を有する哺乳類を意味する。例としては、ヒト、ヒト以外の霊長類、雌牛、馬、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコが含まれる。一般に本発明はヒトでの使用を目的とする。
【００４５】
本明細書において「サンプル」とは、被験体から得た任意の身体組織または体液のサンプルを意味する。好ましくは、例えばリンパ、唾液、血液、尿、乳、胸部分泌物等の体液等である。血液が最も好ましい。本明細書記載の様々な方法において使用される組織および／または細胞のサンプルは、以下を含めた標準的方法によって得ることができるが、これらの方法に限定されない。すなわち、パンチ生検や細胞スクレーピングを含めた組織生検、針生検、吸引やその他の方法による血液やその他の体液の採取が含まれる。
【００４６】
ＭＵＣ１レセプターの操作による細胞の増大
【００４７】
本願は、レセプター開裂後に細胞表面に付着したままのＭＵＣ１レセプターの部分、すなわち主にＮａｔ−ＰＳＭＧＦＲからなるＭＧＦＲ（表１のSEQ ID NO: 10）（図１）が、幹細胞および／または、前駆細胞、またはより広義には更に他の分化段階を経る可能性がある細胞の成長を推進する主要な成長因子レセプターであることを開示する。該レセプターは、治療、研究およびその他の目的のために、インビトロ、エクスビボ、および／またはインビボにてこれらの幹細胞または前駆細胞の成長を促進すべく意図的に活性化することが可能である。
【００４８】
ＭＵＣ１レセプターは、１）レセプター開裂を誘導すること、２）レセプターを二量化する作用物質となり得る活性化リガンド（アクセス可能なレセプターの部分に結合する抗体を含む）を用いて、レセプターを有する細胞を処理すること、３）ＭＵＣ１レセプターまたはそのＭＧＦＲ部分で細胞をトランスフェクションすること、および／または細胞がＭＵＣ１レセプターおよび／またはその活性化リガンドを発現可能にする遺伝子または他のメカニズムを送達すること、によって意図的に活性化させることが可能である。
【００４９】
ＭＵＣ１レセプターは正常上皮上に発現し、そこにおいてレセプターは成人内腔細胞のアピカルボーダーで通常クラスター状になっている。ＭＵＣ１は更に、腸粘膜、多能性脊髄幹細胞、好中球前駆体、および好中球に発現する。出願人は、肥満細胞が本質的にＰＳＭＧＦＲ配列からなる切断ＭＵＣ１レセプターで被覆されていることを発見した（図１２、１３）。近年、乳癌患者がＧ−ＣＳＦ（粒状球コロニー刺激因子）治療を受けると、患者の分離ＭＵＣ１の血清レベルが大きく増大すると報告されている（「アジュバント療法における乳癌患者において、Ｇ−ＣＳＦは循環CA 15-3レベルの増大を誘導する」（G-CSF induces elevation of circulating CA 15-3 in breast carcinoma patients treated in an adjuvant setting） Briasoulis E, Andreopolou E, Tolis CF, Bairaktari E, Katsaraki A, Dimopoulos MA, Fountzilas G, Seferiadis C ans Pavlidis N. (2001) Cancer, 91, 909-917）。該研究結果から、分離ＭＵＣ１のレベルの増大は、好中球の数の増大に関係することがわかる。これらの研究者は、これらの好中球が有するＭＵＣ１レセプターは細胞質において増大したが、好中球表面上ではＭＵＣ１レセプターは増大しなかったと報告している。出願人は、本明細書において結論を打ち立てている。すなわち、好中球表面上にＭＵＣ１が発現しないという上記結論は誤った結論であるという結論を打ち立てた。理由は、ここに引用された研究は、ＭＵＣ１レセプターの縦列反復部分を認識する抗体（ＣＡ １５．３）を使用していることである（図８、１０、１４を参照）。図８、１０は、レセプターの縦列反復部分に結合する抗体であるＶＵ４Ｈ５で検査した場合、ＭＵＣ１レセプターに対して細胞質では染色陽性であるものの細胞表面では染色陽性でない乳癌細胞と肺癌細胞とを示している。ただし、隣接セクションをレセプターのＰＳＭＧＦＲ部分に結合するａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲで検査すると、レセプターの開裂生成物が細胞表面を完全に被覆していることがわかる。出願人は、先に、本質的にＰＳＭＧＦＲ配列からなるＭＵＣ１レセプターの開裂生成物が成長因子レセプターとして機能することを示した。図１４は、健康な卵管の組織試料を示している。図から、ａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲ（図１４Ａ）で検査した場合には卵管内を満たす内腔細胞は細胞表面上で染色陽性となるが、一方ＶＵ４Ｈ５（図１４Ｂ）で検査した場合には細胞質においてのみ染色陽性となることがわかる。卵管およびその他の管を満たす細胞は、ＰＳＭＧＦＲ領域を含むが縦列反復を含まないＭＵＣ１開裂生成物を示している。これらの内腔細胞は癌性ではなく、しばしば活性化させられるにちがいない。これらの組織は幹細胞と前駆細胞とを含むので、速い細胞代謝回転が可能である。
【００５０】
これらのデータは、Ｇ−ＣＳＦが好中球の増殖を刺激したという考え、増殖の増大が縦列反復セクションから切り離された開裂形態において好中球表面上に存在するＭＵＣ１レセプター数の増大によるものであるという考え、およびＭＵＣ１のこの蛋白質分解形態が増殖を推進する成長因子レセプターであるという考えと一致する。レセプターの縦列反復部分に結合する抗体を使用した場合も、ヒト癌性組織試料における細胞は、ＭＵＣ１について細胞質は大いに染色が見られたが、細胞表面には染色が見られなかった（図７Ｃ、８Ｃ、１０Ｃ）。一方、ＭＵＣ１のＰＳＭＧＦＲ領域に対する抗体を使用して隣接組織片を検査したところ、細胞表面全体が縦列反復セクションを含まずＰＳＭＧＦＲ配列を含む開裂ＭＵＣ１によって均一に被覆されていた（図７Ａ、８Ｂ、１０Ｂ）。これらの結果から、好中球、その前駆体、および多能性幹細胞を含めた幹細胞におけるＭＵＣ１レセプターの優勢形態は、本質的にＰＳＭＧＦＲを備えたまたはＰＳＭＧＦＲからなる開裂形態である。この開裂ＭＵＣ１は、幹細胞、前駆細胞、好中球、および前駆体の全部ではないが一部の増殖・増大を媒介する。更に、ＭＵＣ１のＭＧＦＲ部分の二量化は、この細胞増殖を引起すことになる。このとき、場合によって任意の作用物質を用いてもよい。したがって、ＭＵＣ１を二量化する作用物質は、インビトロ、エクスビボ、インビボまたはインシツ（in situ)等において、特定の細胞タイプの成長を刺激するために使用することができる。特に、幹細胞、前駆体、前駆細胞、好中球等は、ＭＵＣ１のＭＧＦＲ部分を二量化または多量化する作用物質を添加することによって増殖するよう刺激され得る。
【００５１】
ＭＵＣ１レセプターのＰＳＭＧＦＲまたはｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲ配列に対する二価抗体は、腫瘍細胞に存在するＭＵＣ１の成長を刺激することがわかった（図２〜６）。ＭＵＣ１レセプターを活性化させ、未熟細胞または幹細胞を含む多様な非癌性細胞の増殖を促進させるために、同様の抗体を使用することができる。ａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲやａｎｔｉ−ｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲは、該抗体の例である。ただし、ＭＧＦＲの領域に対する任意の抗体を使用して、レセプターのｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲ部分にアクセス可能であるＭＵＣ１陽性細胞の成長を刺激してもよい。ＭＵＣ１レセプターの天然リガンドまたはその機能模造体も、ＭＵＣ１が媒介する細胞成長を促進するために使用可能である。ＭＵＣ１レセプターのリガンドの例としては、ＮＭ２３、１４−３−３、および／またはカテプシンＤ（cathepsin D）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
この他、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７またはＭＴ１−ＭＭＰ／ＭＭＰ１４等の酵素を全長レセプターが存在する細胞に投与して、成長因子レセプター形態への開裂を増大させることにより細胞成長を促進することもできる。レセプターのＰＳＭＧＦＲ部分が露出するようなＭＵＣ１レセプターを開裂させることが可能な酵素は、ＭＵＣ１提示細胞の増殖を促進する許容可能な方法となる。
【００５３】
上記文献に記載のとおり、Ｇ−ＣＳＦはＭＵＣ１の生成、具体的には成長因子レセプターとして作用するＭＵＣ１の開裂形態の生成を増大させる。したがって、ＭＵＣ１レセプターおよび／またはＧ−ＣＳＦレセプターが存在する幹細胞、好中球、および他の細胞タイプの成長を刺激する方法には、Ｇ−ＣＳＦレセプターとＭＵＣ１レセプターとの両方、具体的には、レセプターの開裂後に細胞表面に付着したままの部分に作用する作用物質が含まれ得る。すなわち、幹細胞の増殖と好中球数の増大は、同時にあるいは、時差をつけて、両レセプターを刺激することによって達成可能である。
【００５４】
幹細胞、前駆細胞、好中球、肥満細胞、およびこれらの前駆体の成長を刺激する技法の用途は多くある。単一幹細胞は増殖、分化して臓器全体になり得る。幹細胞および前駆体の成長および／または分化の操作方法は、組織再生、臓器再生、減少した細胞数を増大させて脊柱損傷やアルツハイマー病等の症状を治療する等、多くの用途があるであろう。これらの細胞の成長は、インビトロ またはエクスビボにおいて行うことができる。例えば、患者自身の細胞を増大させてから、患者にその細胞を再導入することができる。この他、刺激性作用物質を、単独の幹細胞／幹細胞状の細胞またはそれらの組み合わせに対して、例えば組織や神経の損傷部位にインビボにおいて導入してもよい。他の実施形態では、幹細胞の場合には同種細胞を使用してもよい。
【００５５】
一実施形態では、二量化抗体等のＭＵＣ１レセプターのＭＧＦＲ部分に対する作用物質を用いて、好中球減少を誘導する治療を受けている患者において白血球数を増大させることができる。これらの作用物質は、非癌性状態またはＭＵＣ１陰性癌の治療を受けている患者や他の免疫不全患者に対して直接投与してもよい。この他、本発明の方法を用いて患者自身の好中球またはその前駆体を患者から除去して増大してから、患者に再導入してもよい。例えば、この方法によって、多くの放射線治療や脊髄を破壊する他の治療を受けている患者が脊髄移植を受ける必要がなくなることもあり得る。白血病などの状態についても、この方法で治療することにより患者の免疫システムと血液状態を回復させることが可能である。ＭＵＣ１レセプターのＭＧＦＲ部分を二量化する抗体を含む本発明の方法は、インビトロ またはエクスビボにおいて好中球またはその前駆体に適用してから抗体を欠損させて患者に再び導入する。同様に、ＭＵＣ１の開裂を増大させて成長因子レセプター形態にする作用物質を使用して、幹細胞、前駆体、前駆細胞、好中球、および好中球前駆体（適用される細胞はこれらに限定されない）等の未熟細胞の成長を刺激することができる。ＭＵＣ１レセプターのＭＧＦＲ部分を活性化させる成長因子等のリガンドを用いてこれらの細胞タイプの成長を刺激することもできる。これらの方法を用いて、細胞増殖を所望する幹細胞、好中球、または細胞表面レセプターＭＵＣ１が存在するその他の細胞を刺激することができる。
【００５６】
幹細胞、前駆細胞、好中球、好中球前駆体等の未熟細胞の成長を刺激するよう設計された遺伝子治療の一形態は、以下のとおりである。すなわち、ＭＵＣ１、好ましくは本質的にＰＳＭＧＦＲからなる切断ＭＵＣ１の遺伝暗号を指定するＤＮＡを、細胞増殖が望ましい幹細胞、前駆細胞、好中球、または類似細胞等の未熟細胞に導入するものである。開裂後に細胞表面に付着したままのレセプターの部分に結合するＭＵＣ１のリガンドまたは抗体をコード化するＤＮＡは、新しい細胞の成長を刺激するために導入することができる。Ｇ−ＣＳＦは、ＭＵＣ１レセプターの発現又は開裂を刺激するので、Ｇ−ＣＳＦレセプターをコード化するＤＮＡを同時に導入することができる。
【００５７】
他の実施形態では、本発明はＭＵＣ１を活性化させる作用物質、および／またはＭＵＣ１レセプターを二量化しおよび／またはＭＵＣ１の開裂を助け、ＭＵＣ１レセプターおよび／またはＧ−ＣＳＦレセプターとの両方が存在する幹細胞、好中球、およびその他の細胞タイプの増殖を引き起こす作用物質と組み合わせてＧ−ＣＳＦを投与または添加することに関する。
【００５８】
当業者は、必要以上の実験を行わずに本明細書の開示内容に基づき上記の機能を果たす作用物質の識別、合成、および／または選択を行うことができる。
【００５９】
腫瘍細胞におけるＭＵＣ１の発現
【００６０】
ＭＵＣ１陽性癌における細胞成長の主要なメカニズムは、発現するＭＵＣ１レセプターの全体量よりもむしろ、ＭＵＣ１開裂発生量にもっと依存し得る。見掛け分子量約２０〜３０kDを有するアクリルアミド（acrylamide）ゲルに拡散する低分子量種（一部グリコシル化されている）はＭＵＣ１陽性腫瘍細胞に存在するが、非腫瘍ＭＵＣ１細胞には検出可能なほど十分な数だけ存在しない。腫瘍細胞におけるＭＵＣ１レセプターの２つの開裂部位はすでに識別されている。第１の開裂部位はＩＢＲの中央であり、第２の開裂部位（我々の得た証拠によればより腫瘍形成形態である）はＩＢＲのＣ−末端である。第１の開裂部位はＴＰＳＩＢＲ（SEQ ID NO: 17）のＮ−末端に位置し、第２の開裂部位はSEQ ID NO:13を有するｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲのＮ−末端に位置する。開裂が第１の部位で発生する場合、細胞表面に付着したままのレセプターの部分はＴＳＥＳＭＧＦＲに類似している（表１のSEQ ID NO: 16を参照のこと。ただし天然ＳＲＹ配列を有する）。開裂が第２の部位で発生した場合、細胞表面に付着したままのレセプターの部分は表１のSEQ ID NO: 11に示したＰＳＭＧＦＲである。腫瘍に特異的なこの低分子量種は、天然ＰＳＭＧＦＲ配列、場合によってはＴＳＥＳＭＧＦＲ配列で本質的に構成されており、細胞で発現するＭＵＣ１レセプターの全体量よりも、類似のリガンドを利用でき、つまりそれ自身が凝集することはない。この結論は以下により支持される。すなわち、本発明においては、増殖する腫瘍細胞の感受性は、ＭＵＣ１レセプターの短形態の量の関数であるということがわかっている。図７は、ヒト乳癌試料の４枚の拡大写真を示している。図７Ａと図７Ｃは、ＭＵＣ１陽性癌の同じセクションから得た隣接辺である。図７Ｂと図７Ｄは、ＭＵＣ１陰性癌の同じセクションから得た隣接辺である。図７Ａと図７Ｂのセクション（図上段）は、レセプター開裂後に細胞表面に付着したままのＭＵＣ１レセプターの部分に結合するａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲで処理した。図７Ｃと図７Ｄのセクション（図下段）は、癌細胞表面からしばしば分離するＭＵＣ１レセプターの縦列反復部分に結合するＶＵ４Ｈ５抗体で処理した。ＶＵ４Ｈ５での染色の度合いに比較してａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲでの染色の度合いが非常に大きいことに注目されたい。この結果は、癌細胞表面上のＭＵＣ１レセプターの優勢形態が縦列反復部分を欠損しており本質的にＰＳＭＧＦＲ配列から構成されることを示している。図９は、ヒト肺癌試料の４枚の拡大写真を示している。図９Ａと図９Ｃは、ＭＵＣ１陽性肺癌の第１のセクションから得た隣接辺である。図９Ｂと図９Ｄは、ＭＵＣ１陰性癌から得た隣接辺である。図９Ａと図９Ｂのセクション（図上段）は、レセプター開裂後に細胞表面に付着したままのＭＵＣ１レセプターの部分に結合するａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲで処理した。図９Ｃと図９Ｄのセクション（図下段）は、癌細胞表面からしばしば分離するＭＵＣ１レセプターの縦列反復部分に結合するＶＵ４Ｈ５で処理した。ＶＵ４Ｈ５での染色の度合いに比較してａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲでの染色の度合いが非常に大きいこと、ならびにａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲでの染色は細胞表面に限定されていることに注目されたい。これらの結果も、ＭＵＣ１陽性肺癌細胞表面上のＭＵＣ１レセプターの優勢形態が縦列反復部分を欠損しており本質的にＰＳＭＧＦＲ配列から構成されることを示している。図１１は、結腸癌組織試料の２枚の写真を示している。図１１Ａは、ａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲで染色し、図１１ＢはＶＵ４Ｈ５で染色した。矢印は、非常に癌性が高いセクションの部分を示している。これは、その部分がすべての細胞構造を失っていることからわかる。図１１Ａのセクションには、ａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲで染色された暗領域が見られるが、ＭＵＣ１レセプターの縦列反復部分を認識するＶＵ４Ｈ５で染色処理した図１１Ｂの隣接セクションの同じ領域はまったく染色されていない。これらの結果も、腫瘍が最速に成長する部分は、縦列反復部分が欠損しかつ細胞表面に付着した原型ｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲ配列を含むレセプターの部分が残っているＭＵＣ１形態が存在していることを示している。
【００６１】
ＭＵＣ１レセプターの開裂生成物が腫瘍細胞において成長因子レセプターとして機能するという結論を更に支持するために、ＨＥＫ細胞にＭＵＣ１変異形をトランスフェクションした。このＭＵＣ１変異形は、ＰＳＭＧＦＲの後で終結しているか（表１を参照のこと。SEQ ID NO: 5）、あるいは鎖間結合領域（ＰＳＩＢＲ）全体の後で終結しているか（SEQ ID NO: 6）のいずれかであった。ＰＳＩＢＲを含むレセプターでトランスフェクションされた細胞は、ＰＳＭＧＦＲの後で終結する（例えばSEQ ID NO: 5）ＭＵＣ１変異形でトランスフェクションされた細胞よりも成長が４〜６倍遅かった。出願人は、ＭＵＣ１の蛋白質分解形態が、広範囲な癌細胞の増殖を推進する成長因子レセプターであることをすでに示している。図２は、３つの異なる細胞株、すなわち（Ａ）乳癌細胞株１５０４、（Ｂ）ごくわずかにＭＵＣ１陽性であってＭＵＣ１二量化への成長においてわずかに反応を示すＨｅＬａ細胞、（Ｃ）ＭＵＣ１陰性であるＨＥＫ２９３が、ａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲで処理された細胞増殖評価分析のグラフである。正規化細胞成長を、抗体濃度の関数としてグラフに表している。ＭＵＣ１陽性乳癌細胞株１５０４の成長曲線は、クラスI成長因子レセプターの特性である典型的な二相反応を示しており、各抗体がそれぞれ２つのレセプターを二量化するとき、抗体濃度が増大するにつれて細胞の成長は増大する。
【００６２】
抗体濃度が過剰に高くなり、各単一抗体が２つのレセプターを二量化しないで単一レセプターに結合するようになると、細胞の成長は減少し始める。二量化が行われなければ、成長信号はない。ＨＥＫ２９３細胞は、ＭＵＣ１レセプターを欠損しているので、ａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲによるＭＵＣ１刺激に反応しない。これらの結果は、ＰＳＭＧＦＲ配列を含むＭＵＣ１レセプターの部分が成長因子レセプターとして機能し、二量化時に細胞を刺激して分裂させることを示している。図３は、切断外領域を有するともにＰＳＭＧＦＲ配列の端で終結するＭＵＣ１レセプターで安定的にトランスフェクションされたヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞（ＭＵＣ１陰性）が、ａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲ抗体で処理された細胞増殖評価分析のグラフである。正規化細胞成長は、抗体濃度の関数としてグラフに表されており、ＭＵＣ１レセプターのＰＳＭＧＦＲ部分がレセプターのその部分の二量化を介して細胞成長を媒介することを示している。図４は、３つの細胞株がレセプターを二量化することができない一価ａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲで処理された細胞増殖評価分析のグラフである。グラフから、対照細胞株である（Ａ）ＨｅＬａと（Ｂ）ＨＥＫ２９３とは抗体の添加によって影響を受けないが、ＭＵＣ１陽性乳癌細胞株１５０４である（Ｃ）と（Ｄ）とにおいては、細胞成長が抑制されていることが分かる。図５は、ＭＡＰキナーゼ（kinase）増殖経路のＥＲＫ２分岐が、ＭＵＣ１レセプターのＰＳＭＧＦＲ領域の二量化時に活性化される（ＥＲＫ２がリン酸化される）ことを示すウエスタンブロット法である。図６は、ＭＵＣ１のＰＳＭＧＦＲ領域に結合する小分子がその部位に結合するａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲと競争する競争実験のウエスタンブロット法である。競争相手である小分子が存在すると、抗体は結合せずＥＲＫ２のリン酸化が抑制される。これらの結果は、ＭＵＣ１レセプターのＰＳＭＧＦＲ部分が細胞成長を媒介すること、ならびにレセプターの二量化がこの成長信号をトリが可能であることを示している。これらの結果は、成長因子レセプターとして作用するＭＵＣ１レセプターの部分が開裂生成物（そこにおいてＩＢＲの大部分またはすべてが細胞表面から放出されている）であるという結論を支持している。更に、これらの結果は、ＭＵＣ１レセプターの多くの部分が開裂してＴＰＳＩＢＲ（SEQ ID NO: 18）を放出している場合の腫瘍が特に攻撃性の癌であって、開裂してＩＢＲ全体を放出しておりかつ細胞表面に付着するＰＳＭＧＦＲ（SEQ ID NO: 11）が残っている場合の腫瘍が更に攻撃性であることを支持している。したがって、ＭＵＣ１レセプターのＴＰＳＩＢＲ（SEQ ID NO: 18）部分に対する抗体を使用して、ＭＵＣ１陽性癌の攻撃性を評価することができる。
【００６３】
これらの研究結果に矛盾することなく、細胞（組織）上のアクセス可能なＭＧＦＲの量は、腫瘍の攻撃性と細胞成長の進行性に関係し得る。したがって、レセプターのＭＧＦＲ部分を認識するとともにＭＵＣ１媒介細胞成長を引き起こすとみられる抗体は、レセプターのＰＳＭＧＦＲ部分にアクセス可能なＭＵＣ１を発現する非癌性細胞における細胞成長を促進するために使用することができる。該細胞の例としては、幹細胞、好中球、肥満細胞、およびその他の未熟細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
非腫瘍細胞の増殖
【００６５】
他の実施形態では、本発明は、幹細胞または任意の前駆細胞が治療価値を有する被験体を治療する方法、または本発明の１つ以上の抗体またはその抗原結合フラグメントによる治療を必要とする他の状態を治療する方法を提供する。本方法は、被験体に対して、抗体またはその抗原結合フラグメントを、被験体の幹細胞または前駆細胞を増大させるために有効な量だけ投与することを含む。特定の実施形態において、上記抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれか、特にＭＧＦＲ、ＰＳＭＧＦＲ、ｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲ等と特定的に結合するものを使用することができる。特定の実施形態では、上記抗体またはその抗原結合フラグメントを、例えばＭＵＣ１レセプターの鎖間結合領域から分離した後に細胞に付着したままのＭＧＦＲ等のＭＵＣ１レセプターの相互作用を増大させるために有効な量だけ投与する。本方法の一実施形態において、特に抗体またはその抗原結合フラグメントがＭＧＦＲに特定的に結合する場合において、該治療方法は開裂ＭＵＣ１等の成長因子レセプターの誘導二量化に有効な量だけ抗体またはその抗原結合フラグメントを被験体に投与することを含み得る。
【００６６】
未熟細胞の増大
【００６７】
未熟細胞は、体幹細胞、胚幹細胞、臍帯血幹細胞、およびその他の十分には分化していない細胞が含まれる。成人幹細胞は体幹細胞として知られ、特定の組織の分化細胞中に見られる未分化細胞であって、最も多能な細胞である。該成人幹細胞は１００を上回る疾病と状態とを治療するためにすでに使用されている。「胞子状細胞」と呼ばれる特定の成人幹細胞は、すべての組織に存在する（Vacanti, M. P., A. Roy, J. Cortiella, L. Bonassarおよび C. A. Vacanti. 2001, J Cell Biochem 80:455-60.）。胚幹細胞は、ヒトの胚が全能である初期段階の未分化内肥満細胞から得られる培養細胞である。臍帯血幹細胞は、誕生後の胎盤や臍帯の血液を由来とする。臍帯血幹細胞を使用して、グンター病、ハンター症候群、ハーリー症候群、急性白血病を制限なく治療することがきる。
【００６８】
本発明においては同種の治療も考えられる。
【００６９】
更に、特に、脊髄は２種類の幹細胞を有する。すなわち、造血細胞（血液細胞を生成し得る）と間質細胞（脂肪、軟骨、および骨を生成し得る）とを有する。間質細胞は、神経組織等、多くの種類の組織に分化していくことができる。造血細胞は、白血球、赤血球、血小板（栓球）といった、血液循環においてみられる３種の血液細胞を生成する。多能性造血細胞または多能性造血幹細胞（ＰＨＳＣ）は、脊髄に見られる幹細胞である。ＰＨＳＣは、骨髄系統とリンパ性系統との両方のすべての血液細胞タイプを生成する前駆細胞である。この細胞の例としては、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、小膠細胞、赤血球（赤血球細胞）、巨核球（例えば血小板）、および樹状細胞が挙げられる。
【００７０】
上記のとおり、ＭＵＣ１レセプターの蛋白質分解形態は、幹細胞や前駆細胞等の未熟細胞タイプを含めた（これらに限定されない）多くの細胞タイプの増殖を推進する主要な成長因子レセプターとして機能する。表３に、ＭＵＣ１を発現するとして知られている細胞タイプと、本発明の方法が適している治療とを挙げた。また、ＭＵＣ１またはＭＵＣ１切断変異体を発現する細胞に遺伝的操作を行ってから本発明の方法を適用してＭＵＣ１レセプターを刺激し細胞増殖を誘導または増大させることによって、ＭＵＣ１を発現しない細胞タイプを刺激して増殖させることも可能であろう。
【００７１】
抗体
【００７２】
抗体の生成に使用されるペプチド（peptide）は、動物に免疫性を与える前にグリコシル化されていてもいなくてもよい。これらのペプチドの配列は、通常の数で存在している場合にはＭＵＣ１レセプターの配列を必ずしも厳密に反映する必要はない。例えば、本発明者は、「−ＳＰＹ−」モチーフを有するＰＳＭＧＦＲペプチド変異形ｖａｒ−ＰＳＭＧＦＲ（SEQ ID NO: 12）に対する抗体が、「−ＳＲＹ−」モチーフを有する実際の天然配列（すなわちｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲ 、SEQ ID NO: 10）に対する抗体よりも、ＭＵＣ１蛋白質に対してより親和性が大きくかつ特定性が大きいことを観察した。特定の実施形態において、変異体をＰＳＭＧＦＲペプチド配列に導入して、抗体生成を増大させ得る更に強固なペプチドを生成することも可能であろう。例えば、SEQ ID NO: 12のｖａｒ−ＰＳＭＧＦＲ配列におけるＲ〜Ｐ変異によって、実際により強固なペプチドが得られ、これはより免疫原性であった。ＩＢＲやＴＰＳＩＢＲ等、特に免疫原性でないペプチドの領域に対する抗体を生成する別の方法は、特定のペプチド配列に対して、無関係な配列でタグ付けすることである。該無関係な配列においては、アミノ酸がＤ形態をとるので宿主動物の免疫反応を刺激するように作用する。抗体生成のために動物に免疫性を与えるために使用されるペプチド配列は、グリコシル化してもよい。薬品スクリーニングを行うために、また同族抗体を発生するために本明細書で使用したＭＵＣ１ペプチド配列は、ＭＵＣ１のヒト種を由来とする。ＰＳＭＧＦＲ、ＩＢＲ、およびＵＲの一部分については種全体にかなり保持されていることから、自己の配列が他の種由来であるＭＵＣ１ペプチドも、同じ目的で薬剤スクリーニングを行う場合に、また抗体を生成するために使用することが可能である。
【００７３】
特定の態様では、本発明は抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。一実施形態において、本発明はＭＧＦＲに特定に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。特定の実施形態では、上記の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＰＳＭＧＦＲに特定に結合する。該特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO: 10に記載のアミノ酸配列、またはＮ−末端における最大１５のアミノ酸の追加または削除を備えたまたは最大２０のアミノ酸置換を備えた機能変異形またはそのフラグメントに特定に結合可能である。他の実施形態では、これはSEQ ID NO: 10に記載のアミノ酸配列、または最大１０のアミノ酸置換を備えた機能変異形またはそのフラグメントに特定に結合する。他の実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO: 10に記載のアミノ酸配列、または最大５のアミノ酸置換を備えた機能変異形またはそのフラグメントに特定に結合する。更に他の実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO: 10に記載のアミノ酸配列に特定に結合する。特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ヒト、ヒト化された、異種の、またはキメラヒューマン−ノン−ヒューマン（chimeric human-non-human）の抗体またはその抗原結合性フラグメントである。特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、原型抗体または原型単一鎖抗体を備える。特定の実施形態では、一価の抗体またはその抗原結合性フラグメントは単一鎖Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ'フラグメント、Ｆａｂフラグメント、またはＦｄフラグメントを備えてもよい。本発明の二価の抗体またはその抗原結合性フラグメントについては、特定の実施形態ではＦ(ａｂ')２である抗原結合性フラグメントを備える。特定の該組成において抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ポリクローナルであり、一方他の実施形態ではそれはモノクローナルである。
【００７４】
抗体の抗原結合性部分内には、公知のとおり、抗原のエピトープに直接相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、パラトープの三次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）とが存在する（概略は、Clark, 1986; Roitt, 1991を参照）。ＩｇＥ免疫グロブリンの重鎖Ｆｄフラグメントと軽鎖の両方において、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４まで）があり、これら４つの領域はそれぞれ、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ３まで）で分かれている。これらＣＤＲ領域、具体的にはＣＲＤ３領域、更に具体的には重鎖ＣＤＲ３は、抗体特定性を大きく左右する。
【００７５】
公知のとおり、哺乳類抗体の非ＣＤＲ領域は、原抗体のエピトピック特定性を保持しながら、同種または異種特異性の抗体の同様の領域で置換され得る。このことは、「ヒト化された」抗体の開発と使用において明白である。この、「ヒト化された」抗体において、非ヒトＣＤＲはヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ'領域に共有結合して機能抗体を生成する。例えば、そのすべての内容が参照により本願に援用される米国特許第４８１６５６７号、第５２２５５３９号、５５８５０８９号、５６９３７６２号、５８５９２０５号を参照のこと。該抗体またはそのフラグメントは、本発明の範囲内に含まれる。
【００７６】
特定の実施形態において、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖部位の大部分について形質転換されたマウスに免疫性を与えることによって完全なヒトモノクローナル抗体を調製することができる。これらのマウス（例えばゼノマウス（アブジェニックス）、ＨｕＭＡｂマウス（メダレックス／ゲンファーム））の免疫処置後、標準的なハイブリドーマ技術に従ってモノクローナル抗体を調製することができる。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有するので、ヒトへの投与時にヒトアンチマウス抗体（ＨＡＭＡ）反応を引き起こさない。
【００７７】
特定の実施形態において、本発明は、新規性のある抗体またはその抗原結合性フラグメントの生成方法を備える。これは、キメラ抗体、ヒト化された抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ(ａｂ')２フラグメント、二重特異性抗体、融合抗体、標識抗体、またはこれらの抗体の類似抗体を生成する工程のいずれかを含む。対応する方法は、当業者には既知であり、また例えばHarlowおよびLaneによる「抗体の実験室マニュアル」（"Antibodies, A Laboratory Manual"）, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988に記載されている。キメラ抗体の生成については、例えば国際公開第８９／０９６２２号に記載されている。ヒト化された抗体の生成方法については、例えば欧州特許出願公開（Ａ１）０ ２３９ ４００号および国際公開第９０／０７８６１号に記載されている。更に本発明に従って使用される抗体源は、いわゆる異種抗体である。マウスにおけるヒト抗体等の異種抗体の生成の基本手順は、例えば国際公開第９１／１０７４１号、国際公開第９４／０２６０２号、国際公開第９６／３４０９６号、国際公開第９６／３３７３５号に記載されている。下記のとおり、本発明の抗体は、多様な形態で存在可能である（原型抗体の他、例えばＦｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント等といったその抗原結合性フラグメント、ならびに単鎖の形態（すなわち単鎖抗体として）。例えば、国際公開第８８／０９３４４号を参照のこと。
【００７８】
したがって、当業者には明らかなとおり、本発明は特定の実施形態において、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆｄフラグメントや、Ｆｃおよび／またはＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域がホモローグヒト／非ヒト配列で置換されたキメラ抗体や、ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域がホモローグヒト／非ヒト配列で置換されたキメラＦ(ａｂ')２フラグメント抗体や、ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域がホモローグヒト／非ヒト配列で置換されたキメラＦａｂフラグメント抗体や、ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域がホモローグヒト／非ヒト配列で置換されたキメラＦｄフラグメント抗体を更に提供する。本発明は、いわゆる単鎖抗体も含む。
【００７９】
抗体の化学的誘導体と調剤
【００８０】
特定の実施形態では、本発明は、上記の本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントまたはその化学的誘導体を備えた合成物に関する。本発明の合成物は更に、医薬的に許容可能なキャリヤを備えてもよい。用語「化学的誘導体」とは通常基本分子の一部ではない追加の化学的部分を含む分子である。該部分は、基本分子の溶解性、半減期、吸収性等を向上させ得る。この他、その部分は、基本分子の所望しない副作用を弱めて基本分子の毒性を減少させることができる。該部分の例は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences等様々な文献に記載されている。
【００８１】
当業者には既知のとおり、適切な医薬的キャリヤの例としては、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水乳濁液等の乳濁液、様々なタイプの湿潤剤、無菌溶液等が挙げられる。該キャリヤを備えた合成物は、既知の従来方法で調剤することができる。これらの医薬的合成物は、適切な投与量で被験体に投与することができる。適切な合成物の投与は、様々な方法によって実施可能である。例えば、静脈投与、腹膜内投与、皮下投与、筋内投与、局所投与、皮内投与等が挙げられる。鼻噴霧調剤等のエアゾール調剤の例としては、精製水溶液、または保存剤や等張剤が添加されたその他の活性剤溶液等が挙げられる。該調剤は、例えば鼻腔内投与の場合には鼻粘膜に適合するｐＨと等張状態に調整することが好ましい。直腸投与または膣投与の場合の調剤は、適切なキャリヤを有する座薬として提供され得る。
【００８２】
治療有効投与量は、本発明の抗体および／またはその抗原結合性フラグメントの量が、治療される疾病の症状または状態を改善する量を意味する。該合成物の治療有効性および治療毒性は、細胞培養または実験動物における標準的調剤手順によって定めることができる。例えば、ＥＤ５０（母数の５０％において治療的に有効な投与量）およびＬＤ５０（母数の５０％において致命的な投与量）である。治療有効性と治療毒性との間の投与比率は、治療の指標であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として示すことができる。
【００８３】
本発明の抗体および／またはその抗原結合性フラグメントの生物活性は、例えばＭＧＦＲ等を適切な表面構造に発現する細胞に薬剤を局在化させるための候補となるような十分な親和性を有することが可能であることを示す。したがって、本発明の抗体および／またはその抗原結合性フラグメントを細胞に対して結合させることは、治療的にまたは診断的に活性のある作用物質を送達するために有用となり得る（薬剤、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、脂質、蛋白質、遺伝子治療／遺伝子送達を含む）。したがって、本発明の抗体および／またはその抗原結合性フラグメントは（例えば蛍光性、放射性、酵素、核磁気、コロイド、他の信号体等に）分類付けされて、インビトロにおける「免疫化学」的評価分析を含めたインビボ、またはインビトロにおける特定の標的を検出するために使用され得る。これらは、インビボにおいて、組織、細胞、またはＭＧＦＲを発現する他の物質を検出するための核技術イメージング技法と同様の方法で使用可能である。本発明の他の方法としては、増大させる必要がある細胞を分類するおよび／または単離する方法としてＭＵＣ１レセプターのＭＧＦＲ部分に結合する抗体を使用することが挙げられる。いったん分類されると、これらの細胞はインビトロにおいて増大する。例えばコレセプターおよび／または活性リガンドの遺伝暗号を指定する新しい遺伝物質を、細胞の増大前または増大後にこれら選択細胞に加えてもよい。活性抗体は、被験体への導入前に細胞母集団から分離可能である。更に他の方法としては、治療上活性のある作用物質を患者に送達することが挙げられる。この方法には、少なくとも１つの抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび治療上活性のある作用物質を患者に投与することが含まれる。治療上活性のある作用物質は、薬剤、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、蛋白質、脂質、およびそれらの組合せから選択することが好ましい。
【００８４】
蛋白質
【００８５】
本発明の他の態様によれば、一連の単離された蛋白質またはペプチドが提供される。新規性のあるペプチドとしては、ＰＳＭＧＦＲとＰＳＭＧＦＲＴＣとして上記に定義されたもの、ならびにSEQ ID NOS: 2-19が挙げられる。更に、本発明は、上記の本発明の単離核酸分子のいずれかによってコード化される、上記に特に明記されていない任意の蛋白質またはペプチドも網羅する。更に本発明は、上記の蛋白質またはペプチドの固有のフラグメント、ならびにモノクローナルまたはポリクローナルの抗体を含む上記の蛋白質またはペプチドの固有のフラグメントに対する抗体も網羅する。
【００８６】
蛋白質は、組織または細胞のホモジェネートを含めた生体サンプルから単離することができ、多様な原核・真核発現システムにおいて組換え発現が可能である。これは、発現システムに適切な発現ベクターを構築し、発現ベクターを発現システムに導入し、組換え発現蛋白質を単離することによって実現する。抗原性ペプチドを含めた短ポリペプチド（例えば免疫認識用の細胞表面上のＭＨＣ分子にみられる短ポリペプチド）も、ペプチド合成の十分確立された方法を使用して化学的に使用可能である。
【００８７】
本発明は、新規性のある蛋白質またはペプチドの固有フラグメントも網羅する。これは一態様においては抗体を生成するために使用される。新規性のある蛋白質またはペプチドのうちのいずれかのフラグメントは通常、例えば、核酸分子に関連して記載した固有のフラグメントを含むフラグメントの特色・特性を有する。当業者には理解されるとおり、固有のフラグメントのサイズはフラグメントが保持蛋白質領域の部分を構成するかどうか等の要因に依存する。したがって、新規性のある蛋白質またはペプチドの一部の領域は、固有になるために更に長いセグメントを必要とし、その他の領域はほんの短いセグメントを必要とする。典型的なアミノ酸の数は５〜１２である（例えば、アミノ酸の長さは、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２）。
【００８８】
蛋白質の固有のフラグメントは、蛋白質の区別可能な機能能力を保持しているフラグメントであることが好ましい。蛋白質のフラグメントにおいて保持可能な機能能力には、抗体との相互作用、他の蛋白質またはそのフラグメントとの相互作用、核酸分子の選択結合、および酵素活性が挙げられる。重要な活性の１つは、ポリペプチドを識別するサインとして働く能力である。
【００８９】
当業者は、非ファミリーメンバーから所定の配列を選択的に区別するフラグメントの能力に通常基づいて固有のアミノ酸配列を選択する方法に精通していると思われる。フラグメントの配列を既知のデータベース上の配列と比較するだけで通常十分である。
【００９０】
本発明は、本明細書に記載の新規性のある蛋白質またはペプチドの変異形を網羅する。本明細書において、蛋白質の「変異形」は、該蛋白質の一次アミノ酸配列に対する１つ以上の修飾を含む蛋白質である。蛋白質の変異形を創生する修飾が該蛋白質に施されると、１）蛋白質の活性を産生する、増大させる、減少させる、または消失させる、２）蛋白質の特性を拡大する、例えば発現システムにおける蛋白質安定性や蛋白質間の結合の安定性を向上させる、３）抗原性エピトープの追加または検出可能な部分の追加等、蛋白質の新しい活性または特性を提供する、および／または４）同等のまたはより強い結合をリガンド分子に提供することが可能である。蛋白質の修飾は、修飾を介して、蛋白質をコード化する核酸分子に対して行われ得る。この蛋白質の修飾には、削除、点変異、切断、アミノ酸置換、アミノ酸または非アミノ酸部分の追加が含まれる。この他、修飾は蛋白質に対して直接行うこともできる。これは例えば開裂、化学合成中における１つ以上のアミノ酸の置換、リンカー分子の追加、ビオチン（biotin）等の検出可能な部分の追加、脂肪酸の追加等によって行われる。修飾は更に、本発明のアミノ酸配列のすべてまたは一部を備えた融合蛋白質も網羅する。当業者は、アミノ酸配列における変化の蛋白質構造に及ぼす影響を予測する方法について既知であろう。したがって当業者は、既知の方法に従って、変異形ポリペプチドを「設計」することができる。該方法の一例として、Dahiyat and Mayo in Science 278:82-87, 1997に記載の方法がある。該方法によって、蛋白質はデノボにて設計され得る。該方法は、既知の蛋白質に適用して蛋白質配列を部分的にのみ変化させることができる。Dahiyat and Mayoの計算方法を適用することによって、ＤＯＳ蛋白質の特定の変異形を試験して、その変異形が所望の構造を保持するかどうか決定することができる。
【００９１】
当業者は、例えば保存的アミノ酸置換等、特定のアミノ酸置換が新規性のある蛋白質またはペプチドに対して行われると、上記の蛋白質またはペプチドの「機能変異形」が生成されることも認識するであろう。すなわちこの「機能変異形」は、対応する新規性のある蛋白質またはペプチドの機能能力を有する変異形である。本明細書において、「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸置換が行われる蛋白質の相対電荷またはサイズの特性が変更されないアミノ酸置換を意味する。アミノ酸の保存的置換は、（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖのグループ、（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗのグループ、（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈのグループ、（ｄ）Ａ、Ｇのグループ、（ｅ）Ｓ、Ｔのグループ、（ｆ）Ｑ、Ｎのグループ、および（ｇ）Ｅ、Ｄのグループ内のアミノ酸においてなされる置換を含む。
【００９２】
１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０まで、またはそれ以上の数のアミノ酸置換を有する機能変異形を生成することができる。同様に、上記またはその他の機能変異形を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０まで、またはそれ以上の数のＣ末端および／またはＮ末端における追加または削除を有するようにも調製することができる。所望の場合、上記方法によって調製された蛋白質またはペプチドの変異形を配列して、アミノ酸配列を決定し、該変異形をコード化するヌクレオチド配列を推論することができる。
【００９３】
核酸
【００９４】
本発明は他の態様において、様々な切断ＭＵＣ１レセプター蛋白質、またはその機能変異形、またはそのフラグメントをコード化する核酸配列、および非常に厳密な条件下において上記核酸配列を交雑するその他の核酸配列を提供する。本発明の特定の核酸分子の配列は、SEQ ID NOS 21-25として下記の表２に示した。また、これらの遺伝子の蛋白質生成物の予測アミノ酸配列（それぞれ切断ＭＵＣ１レセプター蛋白質のイソフォームを備える）は、表１に示した。したがって本発明は、一態様において、ＭＵＣ１レセプターの切断イソフォームを示すペプチド配列、これらのペプチド配列、上記の機能修飾形、および上記の変異形をコード化する遺伝子、上記の有用なフラグメント、それらに関する治療生成物と治療方法を含む。本明細書における切断ＭＵＣ１レセプター蛋白質と称されるペプチドは、全長ＭＵＣ１レセプターのフラグメントを含むが、全長ＭＵＣ１レセプター蛋白質（すなわちSEQ ID NO: 1）を含まない。同様に、本明細書に記載のＭＵＣ１レセプターの様々な切断イソフォームをコード化する核酸分子はＭＵＣ１遺伝子コード化領域のフラグメントを含み得るが、全長ＭＵＣ１コード領域を含まない。
【００９５】
本発明の一実施形態によれば、単離核酸分子が提供される。単離拡散分子は、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択される。
【００９６】
（ａ）表１のSEQ ID NO: 5、6、7、8、9に挙げたＭＵＣ１切断レセプターイソフォームペプチドをコード化する核酸分子、または例えばSEQ ID NO: 21、22、23、24、25等のヌクレオチド配列を含む上記の変異形またはフラグメント。
【００９７】
（ｂ）非常に厳密な条件の下で上記（ａ）に挙げた核酸分子と交雑する核酸分子。
【００９８】
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）の核酸分子に削除、追加、および置換を行ったもの。
【００９９】
（ｄ）遺伝コードの縮退によりコドン配列において上記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の核酸分子とは異なる核酸分子。
【０１００】
（ｅ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）の補体。
【０１０１】
本発明の特定の単離核酸は、ＭＵＣ１レセプターの切断イソフォームをコード化する核酸分子、またはその機能フラグメントまたは変異形、またはその機能等価形である（例えば表２に挙げたSEQ ID NO: 21等、核酸配列のうちの１つによってエンコードされた同じ蛋白質をコード化する核酸配列。ただし、機能フラグメントまたは等価形は、該記載の配列によってエンコードされたＭＵＣ１レセプターの切断イソフォームの機能活性を示す蛋白質をコード化するものとする）。本明細書において、ＭＵＣ１レセプターの切断イソフォームの機能活性とは、ＭＵＣ１レセプターペプチド配列の切断イソフォームが、ＭＧＦＲのリガンドに対して特定に相互作用し、該相互作用に反応して細胞成長または細胞増殖を調節することができる能力を意味する。特定の実施形態において、単離核酸分子はSEQ ID NO: 21である。
【０１０２】
本発明は、非常に厳密な条件の下でSEQ ID NOS: 21-25に挙げたヌクレオチド配列からなる核酸分子と交雑する核酸分子を提供する。該核酸は、混合デオキシリボヌクレオチド・リボヌクレオチドから構成されるＤＮＡ、ＲＮＡであってもよいし、合成非天然ヌクレオチドが組み込まれていてもよい。当業者は、正常細胞および腫瘍細胞における核酸および／またはポリペプチドの発現を決定する様々な方法を周知であろう。
【０１０３】
本明細書において、用語「非常に厳密な条件」とは、当業者が周知のパラメータを意味する。核酸交雑パラメータは、例えば「分子クローニング」（Molecular Cloning）: A Laboratory Manual, J. Sambrookら., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, または「分子生物学における現行プロトコル」（Current Protocols in Molecular Biology）, F.M. Ausubelら., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York等、該方法をまとめた文献で参照可能である。より具体的には、本明細書において「厳密な条件」とは、例えば、交雑用緩衝液（３．５×ＳＳＣ、０．０２％ Ficoll、０．０２％ポリビニルピロリドン（polyvinyl pyrrolidone）、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５mM NaH2PO4 （ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２mM ＥＤＴＡ）において６５℃にて交雑することを意味する。ＳＳＣは０．１５M塩化ナトリウム（sodium chloride）／０．１５M クエン酸ナトリウム（sodium citrate）（ｐＨ７）である。ＳＤＳは、ドデシル硫酸ナトリウム（sodium dodecyl sulphate）である。ＥＤＴＡは、エチレンジアミン四酢酸（ethylenediaminetetracetic acid）である。交雑後、ＤＮＡが転移された膜を室温で２×ＳＳＣで洗浄してから、６８℃まで昇温して０．１×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳで洗浄する。
【０１０４】
一般に、本明細書に挙げた特定のSEQ ID NO（表２を参照のこと）の同族体と対立遺伝子は、該ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対してそれぞれ、通常少なくとも４０％のヌクレオチド成分および／または少なくとも５０％のアミノ酸成分を共有する。また、少なくとも５０％のヌクレオチド成分および／または少なくとも６５％のアミノ酸成分を共有する場合もあり、また少なくとも６０％のヌクレオチド成分および／または少なくとも７５％のアミノ酸成分を共有する場合もある。同族体と対立遺伝子は、それぞれSEQ ID NO 21とSEQ ID NO 5、またはSEQ ID NO 22とSEQ ID NO 6、またはSEQ ID NO 23とSEQ ID NO 7、またはSEQ ID NO 24とSEQ ID NO 8、またはSEQ ID NO 25とSEQ ID NO 9のヌクレオチド成分とアミノ酸成分とを共有することが好ましい。また、８０％を上回るポリペプチドをコード化することが好ましく、９０％を上回るポリペプチドをコード化することがより好ましく、９５％を上回るポリペプチドをコード化することが更により好ましく、９９％を上回るポリペプチドをコード化することが最も好ましい。百分率成分は、インターネット（ftp:/ncbi.nlm.nih.gov/pub/）により得られるＮＣＢＩ（Bethesda, Maryland）によって開発された様々な公式利用可能なソフトウェアツールを使用して計算することができる。ツールの例としてはhttp://www.ncbi.nlm.nih.govにて入手可能なＢＬＡＳＴシステムが挙げられる。これはAltschulらが開発したアルゴリズムを使用している（Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997）。Pairwise and ClustalW配置（BLOSUM30マトリックスセッティング）ならびにKyte-Doolittle水治分析も、MacVector配列分析ソフトウェア（Oxford Molecular Group）を使用して入手可能である。上記核酸分子のWatson-Crick補体も、本発明によって網羅される。
【０１０５】
本発明は、SEQ ID NOS 21-25の単離固有フラグメントおよび／またはSEQ ID NOS 21-25の補体も提供する。固有フラグメントは、より大きな核酸の「サイン」である。例えばこれは十分な長さを有するので、その正確な配列が上記新規性のある核酸分子の外側の分子においてみられないことが確認される。当業者は、フラグメントがヒトまたはマウスのゲノムにおいて固有かどうか決定する所定手順を適用するだけで十分である。
【０１０６】
当業者には周知のとおり、上記固有フラグメントのサイズは、遺伝コードにおけるその保存状態に依存する。したがって、SEQ ID NOS 21-25およびその補体の一部領域は、固有であるためにはより長いセグメントを要し、一方その他の領域は短いセグメントのみを要する。通常、その長さはヌクレオチドが１２〜３２の間かまたはそれ以上で（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５またはそれ以上）、最大長さは開示配列の全長である。長さが１８以上のヌクレオチドであるポリヌクレオチドのコード領域またはその補体の多くのセグメントは固有である。当業者は、他の無関係な核酸分子から当該配列を選択的に区別する固有フラグメントの能力に通常基づいて該配列を選択する方法に精通しているであろう。既知のデータベース上のリストと照らしてフラグメントの配列を比較すれば十分であるが、インビトロにおける確証的な交雑と配列分析を実施してもよい。
【０１０７】
本明細書において、「ベクター」とは、所望の配列を異なる遺伝環境間でトランスポートさせるためにまたは宿主細胞において発現させるために制限および連結反応によって挿入することができる相手先である複数の核酸分子の任意の１つである。ベクターは通常、ＤＮＡから構成されるが、ＲＮＡベクターも有用である。ベクターの例としては、プラスミド、ファジェミド、およびウイルスゲノムが挙げられるが、これらに限定されない。クローニングベクターは、宿主細胞において複製可能なベクターであり、かつ１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位によって更に特徴付けられる。この部位においてベクターは確定できる方法で切断可能であり、またこの部位に対して所望のＤＮＡ配列が連結されるので新しい組換えベクターが宿主細胞において複製可能な能力を保持できる。プラスミドの場合、プラスミドが、宿主バクテリアにおいて複製数だけ、または有系分裂により宿主が複製する前に宿主当り１回だけ増大するとき、所望の配列の複製は多数回発生する。ファージの場合、複製は溶菌段階には活発に発生し、溶原段階には控えめに発生する。
【０１０８】
「発現ベクター」とは、調節塩基配列に操作可能に結合されＲＮＡ転写として表すことができるように、所望のＤＮＡ配列を制限・連結反応によって挿入させることができる挿入先である。更にベクターは１つ以上のマーカー配列を有する。このマーカー配列は、ベクターにより形質転換やトランスフェクションがなされたまたはなされていない細胞を識別するために適している。マーカーとしては、例えば、抗生物質やその他の化合物に対する耐性または感受性を増大または減少させる蛋白質をコード化する遺伝子、従来の標準的評価分析によって検出可能な活性を有する酵素をコード化する遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ（β-galactosidase）またはアルカリホスファターゼ（alkaline phosphatase））、形質転換またはトランスフェクションがなされた細胞、宿主、コロニー、またはプラークの表現型に可視的に影響を及ぼす遺伝子（例えば緑蛍光蛋白質）が挙げられる。ベクターは、ベクターが操作可能に結合される相手先であるＤＮＡセグメントにおいて構造遺伝子生成物を自動的に複製・発現可能であることが好ましい。
【０１０９】
本明細書において、コード配列と調節塩基配列は、「操作可能に」結合するとされる。このとき、コード配列と調節塩基配列は、調節塩基配列の影響または制御の下でコード配列の発現または転写が行われるように、共有結合している。コード配列を機能蛋白質に翻訳したい場合、２つのＤＮＡ配列が、操作可能に結合するとされる。ただしこのとき、５つの調節塩基配列内のプロモーターを誘導することによって、コード配列の転写が行われるものとする。またこのとき、２つのＤＮＡ配列間の連鎖の特徴が（１）フレームシフト変異の導入につながらない、（２）コード配列の転写を案内するプロモーター領域の能力に干渉しない、または（３）対応するＲＮＡ転写が蛋白質に翻訳される能力に干渉しないものとする。したがって、プロモーター領域は、以下の場合にコード配列と操作可能に結合する。すなわち、結果として生成される転写が所望の蛋白質またはポリペプチドに翻訳可能なようにプロモーター領域がＤＮＡ配列の転写を達成可能である場合に、プロモーター領域はコード配列と操作可能に結合する。遺伝子発現に必要な調節塩基配列の正確な特徴は、種や細胞のタイプによって様々であり得るが、当業者は周知であろう。
【０１１０】
遺伝子治療
【０１１１】
具体的な実施形態では、ＭＵＣ１、細胞表面にみられるＭＵＣ１のフラグメント、またはＭＵＣ１ポリペプチドのＭＧＦＲ部分をコード化する配列を備えた核酸は、遺伝子治療によって未熟細胞治療が患者に有益である疾病または異常の治療、抑制、または予防を行うために投与される。遺伝子治療とは、発現核酸または発現可能な核酸を被験体に投与することによって実施される治療を意味する。本発明の本実施形態では、核酸は、ＭＵＣ１を発現する未熟細胞の増殖を刺激することによって、治療効果を媒介するエンコードされた蛋白質を生成する。
【０１１２】
更に、他の実施形態では、未熟細胞の増殖を刺激する治療目的で遺伝子Ｇ−ＣＳＦレセプターをともに発現させることもできる。
【０１１３】
本発明に従って、技術的に可能な遺伝子治療方法のいずれかを用いることができる。以下はその例である。
【０１１４】
遺伝子治療の方法に関する概要としては、Goldspielら Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); WuおよびWu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. 「薬理学・毒物学概論」（Rev. Pharmacol. Toxicol）. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993)ならびにMorganおよびAnderson, Ann. 「生化学概論」（Rev. Biochem）. 62:191-217 (1993); May, TIBTECH 11(5):155-215 (1993)を参照のこと。使用可能な組換えＤＮＡ技術について一般に技術的に知られる方法については、Ausubelら (eds.), 「分子生物学における現行プロトコル」（Current Protocols in Molecular Biology）, John Wiley & Sons, NY (1993)、ならびに Kriegler, 「遺伝子の転移および発現」（Gene Transfer and Expression）, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)に記載されている。
【０１１５】
好ましい態様では、核酸配列はＭＵＣ１、細胞表面に見られるＭＵＣ１のフラグメント、またはＭＵＣ１ポリペプチドのＭＧＦＲ部分をコード化することができる。ここで、核酸配列は、適切な宿主においてポリペプチドを発現する発現ベクターの一部である。特に、該核酸配列は、ポリペプチドコード領域に操作可能に結合するプロモーターを有する。該プロモーターは、誘導可能または構成性であって、場合によって組織特有である。他の特定の実施形態において、核酸分子は、ポリペプチドコード配列と他の所望の配列がゲノム内の所望の部位での相同的組換えを促進する領域に挟まれている場合に使用されるので、核酸をコード化する抗体が染色体内発現される（KollerおよびSmithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstraら, Nature 342:435-438 (1989)）。
【０１１６】
核酸は患者に直接送達してもよい。この場合、患者は核酸または核酸運搬ベクターに直接暴露される。あるいは核酸は患者に間接的に送達してもよい。この場合、細胞はまずインビトロにおいて核酸で形質転換され、次に患者に移植される。これらの２つの方法はそれぞれ、インビボまたはエクスビボにおける遺伝子治療としてよく知られている。
【０１１７】
具体的な実施形態では、核酸配列はインビボにおいて直接投与される。この場合、核酸配列が発現されて、エンコードされた生成物が生成される。これは、技術的に既知の多くの方法のいずれかによって達成可能である。例えば、適切な核酸発現ベクターの一部として構成して細胞内に投与してもよい。例えば、欠損性レトロウイルス、弱毒化レトロウイルス、またはその他のウイルスベクターを用いて感染させてもよい。あるいは、裸ＤＮＡを直接注入してもよいし、脂質や細胞表面レセプターやトランスフェクション作用物質で被覆するか、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセルでカプセル化して投与してもよい。あるいは核に侵入するとされるペプチドへの連鎖に投与してもよい。この場合、レセプター媒介エンドサイトーシスを受けるリガンドの連鎖に投与する（例えばWuおよびWu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)を参照のこと）（これはレセプターを特定に発現する細胞タイプを標的にして使用可能）。他の実施形態において、核酸リガンド複合体を形成することができる。これにおいて、リガンドはエンドソームを分裂させる融合誘導ウイルスペプチドを備えているので、核酸はリゾソーマル分解を回避することができる。更に他の実施形態では、特定のレセプターを標的にすることによって、インビボにおいて核酸を細胞特定の取込みと発現を目的として使用することができる。この他、相同的組換えによって、核酸を宿主の細胞ＤＮＡ内に導入したり組み込んだりして発現させることもできる（KollerおよびSmithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)）。
【０１１８】
具体的な実施形態では、ポリペプチドをコード化する核酸配列を含むウイルスベクターが使用される、遺伝子治療で使用されるポリペプチドをコード化する核酸配列は、１つ以上のベクターにクローニングされる。これによって、患者への遺伝子送達が容易になる。レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスは、使用可能なウイルスベクターの一例である。レトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムを正確にパッケージして宿主の細胞ＤＮＡに統合するために必要な構成要素を含んでいる。
【０１１９】
アデノウイルスは、気道上皮に遺伝子を送達するために特に誘引的な媒体である。アデノウイルスは、軽い疾病が起きる際に気道上皮を必然的に感染させるからである。アデノウイルスに基づく送達システムの他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分割細胞を感染させることができるというメリットがある。また、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）も、遺伝子治療用として提案されている。
【０１２０】
遺伝子治療の他の方法には、電気穿孔法、リポフェクション、リン酸カルシウム（calcium phosphate）媒介トランスフェクション、またはウイルス感染等の方法によって組織培養中の細胞に遺伝子を転移することが挙げられる。通常、この遺伝子転移法には、選択可能なマーカーを細胞に転移することが含まれる。このとき、細胞は選択されて、転移遺伝子を有し発現している細胞が単離される。次にこれらの細胞は患者に送達される。
【０１２１】
本実施形態では、得た組換え細胞をインビボにおいて投与する前に、核酸を細胞に導入する。該導入は、技術的に既知の任意の方法で実施可能である。該方法としては、トランスフェクション、電気穿孔法、微量注入法、ウイルスまたは核酸配列を含むバクテリオファージベクターの感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子転移、マイクロ細胞媒介遺伝子転移、スフェロプラスト融合等が挙げられるが、これらに限定されない。外来遺伝子を細胞内に導入する技術においては多数の技法が知られており、これらの技法は、本発明に従って使用してよい。ただし、受手側の細胞の必要な発達・生理機能を妨げてはならない。該技法によって核酸が細胞に安定的に転移されることにより、核酸が細胞により発現可能となり、好ましくは細胞の子孫により遺伝的に発現可能となるべきである。
【０１２２】
遺伝子治療目的で核酸を導入可能な細胞としては、任意の所望の利用可能な細胞タイプが網羅される。該細胞の例としては、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、繊維芽細胞、筋細胞、幹細胞、血液細胞（例えばＴリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、粒状球）、様々な幹細胞または前駆細胞、特に造血幹細胞または前駆細胞（例えば脊髄から得る）、臍帯血、末梢血、胎児肝臓等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２３】
遺伝子治療に用いられる細胞は、自己細胞でも同種細胞でもよい。一実施形態において、遺伝子治療に用いられる細胞は患者の自己細胞である。
【０１２４】
組換え細胞が遺伝子治療に使用される一実施形態において、ポリペプチドをコード化する核酸配列は、細胞またはその子孫によって発現可能であるように細胞に導入され、組換え細胞はこのとき治療効果を得るためにインビボにおいて投与される。具体的な実施形態では、幹細胞または前駆細胞が使用される。インビトロにおいて単離され維持され得る任意の幹細胞および／または前駆細胞は、本発明の本実施形態に従って使用することができる。
【０１２５】
具体的な実施形態では、遺伝子治療の目的で導入される核酸は、コード領域に操作可能に結合する誘導プロモーターを備える。これにより、核酸の発現は、転写の適切な誘導物質の有無を制御することにより制御可能である。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、本発明のペプチド配列をコード化する核酸分子を送達するウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスと弱毒性ポックスウイルスを含むポックスウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルス、Ｔｙウイルス状粒子からなる群から選択される。外生的核酸の送達に使用されているウイルスおよびウイルス状粒子の例としては、複製欠損アデノウイルス（例えば、Xiangら, Virology 219:220-227, 1996; Eloitら, J. Virol. 7:5375-5381, 1997; Chengalvalaら, Vaccine 15:335-339, 1997）、修飾レトロウイルス（Townsendら, J. Virol. 71:3365-3374, 1997）、非複製レトロウイルス（Irwinら, J. Virol. 68:5036-5044, 1994）、複製欠損セムリキ森林熱ウイルス（Zhaoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3009-3013, 1995）、カナリア痘ウイルスおよび高弱毒化ワクシニアウイルス誘導体（Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11349-11353, 1996）、非複製ワクシニアウイルス（Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11341-11348, 1996）、複製ワクシニアウイルス（Moss, Dev. Biol. Stand. 82:55-63, 1994）、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（Davisら, J. Virol. 70:3781-3787, 1996）、シンドビスウイルス（Pugachevら, Virology 212:587-594, 1995）、およびＴｙウイルス状粒子（Allsoppら, Eur. J. Immunol 26:1951-1959, 1996）が挙げられる。特定の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスである。
【０１２７】
特定の用途に使用する可能性がある他のウイルスは、アデノ随伴ウイルス、二重標準ＤＮＡウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、広範囲の細胞タイプと種を感染させることが可能で、遺伝子工学で複製欠損として作り変え可能である。アデノ随伴ウイルスは更に、熱や脂質溶剤に対して安定しており、造血細胞を含めた多様系統の細胞において形質導入頻度が高く、重感染抑制がないので複数の一連の形質導入が可能であるというメリットを有する。アデノ随伴ウイルスは、部位特異的にヒト細胞ＤＮＡに統合され得るので、これにより挿入突然変異の可能性と挿入遺伝子発現の多様性が最小化される。更に、選択的圧力がない１００を上回る経路の組織培養において、野生型アデノ随伴ウイルス感染が後続した。これは、アデノ随伴ウイルスのゲノム統合が比較的安定していることを示す。アデノ随伴ウイルスは、染色体外においても機能する。
【０１２８】
他のウイルスベクターは、非必須遺伝子が当該遺伝子によって置換されている非細胞変性真核ウイルスに基づく。非細胞変性ウイルスとしてはレトロウイルスが挙げられる。レトロウイルスのライフサイクルにおいては、ゲノムウイルスＲＮＡがＤＮＡに逆転写されてから、宿主細胞ＤＮＡにプロウイルス統合がなされる。アデノウイルスとレトロウイルスは、ヒト遺伝子治療試験が認められている。一般にレトロウイルスは複製欠損性である（すなわち、所望の蛋白質合成を行う能力はあるが、感染粒子の生成能力はない）。該遺伝的に変更されたレトロウイルス発現ベクターは、インビボにおいて遺伝子を高効率に形質導入するために一般的に使用される。複製欠損性レトロウイルスを生成するための標準手順（外生遺伝物質をプラスミドに組み込む工程、プラスミドで満たされたパッケージング細胞のトランスフェクションの工程、パッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの生成の工程、組織培養媒体からのウイルス粒子の回収の工程、および標的細胞をウイルス粒子で感染させる工程を含む）は、Kriegler, M., 「遺伝子の転移と発現」（Gene Transfer and Expression）, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990) およびMurry, E.J. Ed. 「分子生物学における方法」（"Methods in Molecular Biology,"） vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, New Jersey (1991)に記載されている。
【０１２９】
様々な技法を使用して、本発明の核酸分子を細胞に導入することができる。これは、核酸分子が宿主においてインビトロで導入されるかインビボで導入されるかに依存する。該技法としては、核酸分子リン酸カルシウム沈殿物のトランスフェクション、ＤＥＡＥを伴う核酸分子のトランスフェクション、当該核酸分子を含めた上記ウイルスによるトランスフェクションまたは感染、リポソーム媒介トランスフェクション等が挙げられる。
【０１３０】
特定の使用において、核酸分子を特定の細胞を標的として用いることが好ましい。そういった場合には、本発明の核酸分子を細胞に送達するために使用される媒体（例えばレトロウイルスやその他のウイルス、リポソーム）はそこに付着する標的分子を有し得る。例えば、標的細胞上の表面膜蛋白質または標的細胞上のレセプターのリガンドに特有な抗体等の分子を、核酸分子送達媒体内に結合または組み込むことができる。特にモノクローナル抗体が好ましい。リポソームを使用して本発明の核酸分子を送達する場合、エンドサイトーシスを伴う表面膜蛋白質に結合する蛋白質は、取込みを目的としておよび／または取込みを容易にするためにリポソーム形成に組み込まれ得る。該蛋白質としては、特定の細胞タイプに指向性を有するカプシド蛋白質またはそのフラグメント、サイクルにおいて内在化を経る蛋白質、細胞内局在化を目的とし細胞内半減期を拡大する蛋白質等が挙げられる。当業者には周知のとおり、高分子送達システムを使用して核酸分子を細胞内に成功裡に送達することもできる。該システムにおいては、核酸分子を経口送達することもできる。
【０１３１】
ベクターを用いた送達の他に、本発明の核酸は、ベクターなしで細胞に送達することができる。例としては、当業者が既知の方法を用いて「未処理」核酸を送達することが挙げられる。
【０１３２】
形質転換動物
【０１３３】
本発明の他の態様では、本発明の発現ベクターを備えたヒト以外の形質転換動物が提供される。ここでいう「ヒト以外の形質転換動物」とは、生殖系細胞および／または体細胞に組み込まれた１つ以上の外生核酸分子を有するヒト以外の動物が含まれる。したがって、形質転換動物は、エピソーマル／染色体組込み発現ベクター等を有する動物を含む。一般に、該発現ベクターは、所望の遺伝子発現パターン（例えば一時的または空間的）を提供する多様なプロモーターを使用することができる。条件付きプロモーターは、本発明の核酸分子と操作可能に結合して、規定方法または条件付き方法にてエンコードされたポリペプチド分子の発現を増大したり減少させたりすることもできる。ポリペプチドの活性または発現のトランス作用ネガティブ／ポジティブレギュレーターも、上記の条件付きプロモーターに操作可能に結合することができる。
【０１３４】
投与と投与量
【０１３５】
治療上使用する場合、本発明の作用物質は、治療上有効な量で投与される。一般に、治療上有効な量とは、治療される特定の状態の発現を遅延させる、該状態の進行を阻害する、または該状態を完全に停止させるために必要な量を意味する。一般に、治療上有効な量は、被験体の年齢、状態、性別、被験体における疾病の性質と程度（これらはすべて通常の技術を有する者によって決定可能）によって異なる。投与量は、特に何らかの合併症がある場合には、個々の内科医または獣医が、調節することができる。治療上有効な量は通常０．０１mg/kg〜約１０００mg/kgの範囲で幅がある。１〜５００mg/kgの範囲の投与量が期待され、１〜５０mg/kgの範囲の投与量が好ましい。他の実施形態において、作用物質は、１μg/kg/日〜１０mg/kg/日の範囲、更に好ましくは１〜２００μg/kg/日の範囲、１〜１００μg/kg/日の範囲、１〜５０μg/kg/日の範囲、または１〜２５μg/kg/日の範囲で投与される。他の実施形態において、投与量は、約０．１mg/kg〜約２００mg/kgの範囲、最も好ましくは約０．２mg/kg〜約２０mg/kgの範囲で投与される。これらの投与量は、１日以上の期間、毎日１回以上の投与回数にて適用可能である。
【０１３６】
本発明の作用物質は、被験体に対して治療的メリットと予防的メリットとのいずれかまたは両方を提供するのに十分な期間投与すべきである。一般に、作用物質は少なくとも１日投与される。ある症例では、作用物質は、被験体の残りの人生に渡って投与され得る。作用物質の投与量は、被験体のニーズと投与形態によって異なり得る。ある症例では、例えば、腫瘍や癌を伴う事象の間、又は該事象の直後に被験体により多く、またより高頻度に投与する必要があり得る。ただし該投与が医療的に所望の結果を達成する場合に限る。一方、いったん医療的に所望する結果が達成された後にその結果を維持するためには低用量の投与を行うことが望ましい場合がある。更に他の実施形態において、前述のとおり被験体の残りの生涯に渡る治療期間を通して作用物質を同一用量だけ投与することも可能である。投与の頻度は、被験体の特性によって異なり得る。作用物質は、毎日、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、毎週、１０日に１回、２週間に１回、毎月、またはそれ以上の期間につき１回、またはここに明記の期間内の任意時に投与可能である。
【０１３７】
一実施形態では、活性を有する作用物質の１日当りの投与量は、約０．０１ミリグラム／kg〜１０００ミリグラム／kgである。１日に１回または数回の投与回数にて５０〜５００ミリグラム／kgの経口投与によって所望の結果が得られると予想される。投与量は、投与形態に応じて、局所性であろうと、全身性であろうと、所望レベルを達成するように適切に調節可能である。該投与量で被験体における反応が不十分な場合、患者の許容レベルが許す範囲で高用量（または他のより局在化した送達ルートによる有効な高用量）を使用してもよい。作用物質の適切な全身性レベルを達成するためには、１日に複数回投与することが考慮される。
【０１３８】
該作用物質は、作用物質の活性を促進する投与量、調剤、投与スケジュールで使用されるとともに、正常な細胞機能に対して仮に影響を及ぼすとしても有意には影響を及ぼさないように用いることが好ましい。
【０１３９】
一実施形態では、作用物質の活性の程度は少なくとも１０％である。他の実施形態では、薬剤の活性の程度は少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である。
【０１４０】
治療目的で被験体に投与する場合、本発明の調剤を、医薬的に許容可能な量にて、および医薬的に許容可能な合成物にて適用する。該医薬的合成物としては、技術的に既知の標準生理的におよび／または医薬的に許容可能なキャリヤと本発明の作用物質との組合せが挙げられる。該合成物は、滅菌すべきであって、患者への投与に適した重量または容量の単位で治療上有効な量の作用物質を含むべきである。ここで用語「医薬的に許容可能なキャリヤ」とは、ヒトまたはその他の動物への投与に適した１つ以上の相溶性のある固体または液体の溶加剤、希釈剤、カプセル剤を意味する。用語「キャリヤ」とは、有機材料または無機材料（天然または合成）を意味し、これを有活性材料に組み合わせると適用が容易になるものである。医薬的合成物の構成要素は、所望する医薬上の有効性を大いに妨げる相互作用がないように本発明の分子と混合したり、それらの構成要素同士で混合したりしてもよい。「医薬的に許容可能」とは、細胞、細胞培養、組織、または有機体等の生体系と適合する非毒性材料を更に意味する。キャリヤの特性は、投与経路に依存する。生理学的および医薬的に許容可能なキャリヤとしては、希釈剤、溶加剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、および技術的に既知のその他の材料が挙げられる。
【０１４１】
該調製は、塩、緩衝剤、保存剤、相溶キャリヤ、および場合によってその他の治療材料を規定どおり含むことができる。医療上使用する場合、塩は医薬的に許容可能であるべきであるが、医薬的に許容可能でない塩は、医薬的に許容可能な塩を調製するために有用に使用可能なので、本発明の範囲から除外されない。該薬理学的・医薬的に許容可能な塩としては、以下の酸から調製した塩が挙げられるが、これらに限定されない。該酸とは、塩酸（hydrochloric）、臭化水素酸（hydrobromic）、硫酸（sulphuric）、硝酸（nitric）、リン酸（phosphoric）、マレイン酸（maleic）、酢酸（acetic）、サリチル酸（salicylic）、ｐトルエンスルホン酸（p toluene sulfonic）、酒石酸（tartaric）、クエン酸（citric）、メタンスルホン酸（methane sulfonic）、蟻酸（formic）、マロン酸（malonic）、琥珀酸（succinic）、ナフタリン２スルホン酸（naphthalene 2 sulfonic）、およびベンゼンスルホン酸（benzene sulfonic）である。更に、医薬的に許容可能な塩は、カルボン酸基のナトリウム塩（sodium salt）、カリウム塩（potassium salt）、カルシウム塩（calcium salt）等のアルカリ金属またはアルカリ土類金属として調製してもよい。
【０１４２】
適切な緩衝剤としては、酢酸（acetic acid）および塩（１〜２％Ｗ／Ｖ）、クエン酸および塩（１〜３％Ｗ／Ｖ）、ホウ酸（boric acid）および塩（０．５〜２．５％Ｗ／Ｖ）、ならびにリン酸および塩（０．８〜２％Ｗ／Ｖ）が挙げられる。
【０１４３】
適切な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム（benzalkonium chloride）（０．００３〜0.03％Ｗ／Ｖ）、クロロブタノール（chlorobutanol）（０．３〜０．９％Ｗ／Ｖ）、パラベン（parabens）（０．０１〜０．２５％Ｗ／Ｖ）、およびチメロサール（thimerosal）（０．００４〜０．０２％Ｗ／Ｖ）が挙げられる。
【０１４４】
多様な投与経路が利用可能である。選択される特定の投与形態は、言うまでもなく選択される薬剤の特定の組合せ、治療される疾病の状態の重症度、患者の状態、および治療効果に必要な投与量に依存する。一般に、本発明の方法は、医学的に許容可能な投与形態のいずれを用いても実施できる。これはすなわち、臨床的に許容不能な副作用を引き起こさずに活性化合物の有効レベルを達成する形態のいずれを用いても実施できるという意味である。該投与形態としては、経口投与、直腸投与、局所投与、鼻投与、他の粘膜投与、直接注射、経皮的投与、舌下投与、またはその他の経路が挙げられる。「非経口」経路には、皮下投与、静脈内投与、筋内投与、または輸液が挙げられる。直接注射は、癌の部位に局所的に送達する場合に好ましい。経口投与は、例えば、癌の進行リスクを有する被験体に予防治療を行う場合に好ましい。これは患者にとって便利でかつ投与スケジュールを立てやすいためである。
【０１４５】
化学／物理学的ベクターを使用して、本発明の作用物質を標的（例えば細胞）に送達し、それによって取込みを容易にしてもよい。本明細書において、「化学／物理学的ベクター」とは、細菌源またはウイルス源を由来とするもの以外の、本発明の作用物質を標的（例えば細胞）に送達することが可能な天然または合成の分子を意味する。
【０１４６】
本発明の化学／物理学的ベクターは、コロイド分散システムであることが好ましい。コロイド分散システムとしては、水中油型乳濁液、ミセル、混合ミセル、リポソーム等の脂質性システムが挙げられる。本発明のコロイドシステムとしてはリポソームが好ましい。リポソームは、インビボまたはインビトロにおいて送達ベクターとして有用な人工膜ベッセルである。０．２〜４．０μmサイズの大型単層ベッセル（ＬＵＶ）は、巨大高分子をカプセルに包むことができることがわかっている。ＲＮＡ、ＤＮＡ、および原型ビリオンは、水性内部においてカプセル化可能で、生物学的に活性な形態で細胞に送達可能である（Fraleyら, Trends Biochem. Sci., v. 6, p. 77 (1981)）。リポソームが有効な遺伝子転移ベクターになるためには、以下のうち１つ以上の特性がなければならない。すなわち（１）生物学的活性を維持しながら高効率にて当該遺伝子がカプセル化される、（２）非標的細胞と比べて、標的細胞に対して優先的かつ十分に結合する、（３）高効率にて小胞（べシクル）の水性内容物が標的細胞の細胞質に送達される、（４）遺伝子情報が正確かつ有効に発現される、という４つの特性のうち１つ以上の特性がなければならない。
【０１４７】
リポソームは、例えば血管細胞壁等の特定の部位（例えば組織）を標的とすることができる。これはリポソームを、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、蛋白質等の特定のリガンドと共役させることによってなされる。
【０１４８】
リポソームは、例えばLIPOFECTIN(商標)とLIPOFECTACE(商標)、Gibco BRL製造の市販品が有用である。これらの製品は、Ｎ−［１−（２，３ジオレロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（N-[1-(2,3 dioleyloxy)-propyl]-N, N, N-trimethylammonium chloride）（ＤＯＴＭＡ）やジメチルジオクタデシルアンモ二ウムブロマイド（dimethyl dioctadecylammonium bromide（ＤＤＡＢ）等のカチオン脂質から形成される。リポソームの生成方法は技術的に周知されており多くの文献に記載されている。リポソームに関する記載は、Gregoriadis, G. in Trends in Biotechnology, V. 3, p. 235-241 (1985)にも見られる。
【０１４９】
特定の実施形態では、媒体は、哺乳類の受手への移植に適した生体適合性微粒子／移植組織であることが好ましい。本方法に従って有用な生体侵食性移植組織の例は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ／第０３３０７号（公開番号 国際公開第９５／２４９２９号、標題：「高分子遺伝子送達システム」（Polymeric Gene Delivery System））、１９９４年３月１５出願米国特許出願第２１３６６８号に対する優先権を主張）に記載されている。国際出願ＰＣＴ／ＵＳ／第０３０７号では、適切なプロモーターの制御下における外生遺伝子を含む生体適合性、好ましくは生分解性高分子マトリックスについて記載されている。高分子マトリックスは、患者において外生遺伝子の持続放出を達成するために使用される。本発明によれば、本発明の作用物質は国際出願ＰＣＴ／ＵＳ／第０３３０７号に開示された生体適合性のある、好ましくは生体分解性のある高分子マトリックス内にカプセル化または分散される。高分子マトリックスは、ミクロスフェア（この場合、作用物質は固体高分子マトリックス全体に分散している）やミクロカプセル（この場合、作用物質は高分子シェルの核に保存される）等の微粒子形状をとることが好ましい。本発明の作用物質を含む高分子マトリックスのその他の形態としては、フィルム、被覆剤、ゲル、移植組織、ステント等が挙げられる。高分子マトリックスのサイズと組成は、マトリックスデバイスの移植先である組織での放出動力学が良好となるように選択される。高分子マトリックスデバイスのサイズは更に、使用される送達方法に従って選択される。この方法は通常組織への注入、または鼻および／または肺動脈弁区へのエアロゾルによる懸濁液の投与によるものである。高分子マトリックス合成物は、良好な分解速度を得るように選択されるとともに、生体接着性材料から形成されるように選択されることが可能である。これによって、デバイスが血管表面に投与された際に転移有効性が更に増大する。マトリックス合成物は、分解せずに長時間に渡る拡散により放出されるように選択してもよい。
【０１５０】
非生分解性高分子マトリックスと生分解性高分子マトリックスとのいずれも、本発明の作用物質を被験体に送達するために使用することができる。生分解性マトリックスの方が好ましい。該ポリマーは、天然ポリマーでも合成ポリマーでもよい。合成ポリマーの方が好ましい。ポリマーは、所望の放出時間に基づき選択される。通常この時間は２、３時間から１年またはそれ以上である。通常、２、３時間から３〜１２か月の間の時間範囲での放出が最も望ましい。ポリマーは場合によって、水中でその重量の最高約９０％まで吸収可能なヒドロゲルの状態であることが可能で、場合によって多価のイオンまたはその他のポリマーと架橋している。
【０１５１】
一般に、本発明の作用物質は、拡散、またはより好ましくは高分子マトリックスの分解を手段として生体侵食性移植を用いて送達される。生分解性送達システムを形成するために使用可能な合成ポリマーの例としては、ポリアミド（polyamides）、ポリカーボネート（polycarbonates）、ポリアルキレン（polyalkylenes）、ポリアルキレングリコール（polyalkylene glycols）、ポリアルキレン酸化物（polyalkylene oxides）、ポリアルキレンテレフタレート（polyalkylene terepthalates）、ポリビニルアルコール（polyvinyl alcohols）、ポリビニルエーテル（polyvinyl ethers）、ポリビニルエステル（polyvinyl esters）、ポリビニルハロゲン化物（polyvinyl halides）、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyrrolidone）、ポリグリコライド（polyglycolides）、ポリシロキサン（polysiloxanes）、ポリウレタン（polyurethanes）およびそのコポリマー、アルキルセルロース（alkyl cellulose）、ヒドロキシアルキルセルロース（hydroxyalkyl celluloses）、セルロースエーテル（cellulose ethers）、セルロースエステル（cellulose esters）、ニトロセルロース（nitro celluloses）、アクリル酸エステル（acrylic esters）およびメタクリル酸エステル（methacrylic esters）のポリマー、メチルセルロース（methyl cellulose）、エチルセルロース（ethyl cellulose）、ヒドロキシプロピルセルロース（hydroxypropyl cellulose）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（hydroxy-propyl methyl cellulose）、ヒドロキシブチルメチルセルロース（hydroxybutyl methyl cellulose）、セルロースアセテート（cellulose acetate）、セルロースプロピオネート（cellulose propionate）、セルロースアセテートブチレート（cellulose acetate butyrate）、セルロースアセテートフタラート（cellulose acetate phthalate）カルボキシルエチルセルロース（carboxylethyl cellulose）、セルローストリアセテート（cellulose triacetate）、セルロースサルフェートナトリウム塩（cellulose sulphate sodium salt）、ポリ（メチルメタクリレート）（poly(methyl methacrylate)）、ポリ（エチルメタクリレート）（poly(ethyl methacrylate)）、ポリ（ブチルメタクリレート）（poly(butylmethacrylate)）、ポリ（イソブチルメタクリレート）（poly(isobutyl methacrylate)）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）（poly(hexylmethacrylate)）、ポリ（イソデシルメタクリレート）（poly(isodecyl methacrylate)）、ポリ（ラウリルメタクリレート）（poly(lauryl methacrylate)）、ポリ（フェニルメタクリレート）（poly(phenyl methacrylate)）、ポリ（メチルアクリレート）（poly(methyl acrylate)）、ポリ（イソプロピルアクリレート）（poly(isopropyl acrylate)）、ポリ（イソブチルアクリレート）（poly(isobutyl acrylate)）、ポリ（オクタデシルアクリレート）（poly(octadecyl acrylate)）、ポリエチレン（polyethylene）、ポリプロピレン（polypropylene）、ポリ（エチレングリコール）（poly(ethylene glycol)）、ポリ（エチレンオキサイド）（poly(ethylene oxide)）ポリ（エチレンテレフタレート）（poly(ethylene terephthalate)）、ポリ（ビニルアルコール（poly(vinyl alcohols)）、ポリビニルアセテート（polyvinyl acetate）、ポリ塩化ビニル（poly vinyl chloride）、ポリスチレン（polystyrene）、およびポリビニルピロリドン（polyvinylpyrrolidone）が挙げられる。
【０１５２】
非生分解性ポリマーの例としては、エチレンビニルアセテート（ethylene vinyl acetate）、ポリ（メチル）アクリル酸（poly(meth)acrylic acid）、ポリアミド（polyamides）、そのコポリマーと混合物が挙げられる。
【０１５３】
生分解性ポリマーの例としては、乳酸（lactic acid）とグリコール酸（glycolic acid）のポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル（poly(ortho)esters）、ポリウレタン（polyurethanes）、ポリ（ブチック酸）（poly(butic acid)）、ポリ（バレリアン酸）（poly(valeric acid)）、およびポリ（ラクチドコカプロラクトン）（poly(lactide-cocaprolactone)）等の合成ポリマー；あるいはアルギナート（alginate）およびデキストラン（dextran）を含むその他のポリ多糖類、セルロース（cellulose）、コラーゲン（collagen）、それらの化学誘導体（例えば、アルキル（alkyl）、アルキレン（alkylene）、ヒドロキシル化物（hydroxylations）、酸化物、およびその他当業者が規定に従って変更した化合物）、アルブミン（albumin）およびその他の親水蛋白質、ゼイン（zein）およびその他のプロラミン（prolamines）、疎水蛋白質、あるいはコポリマーおよびその混合物が挙げられる。一般にこれらの材料は、酵素加水分解またはインビボにて水への露出を行うことによって、表面または全体的な浸食作用により分解する。
【０１５４】
特に該当する生体粘着性ポリマーとしては、H. S. Sawhney, C. P. PathakおよびJ. A. Hubell in Macromolecules, 1993, 26, 581-587に記載の生体侵食性ヒドロゲルが挙げられる。その記載内容は参照により本明細書に援用される。同書にはポリヒアロルン酸（polyhyaluronic acids）、カゼイン（casein）、ゼラチン（gelatin）、グルチン（glutin）、ポリ無水物、ポリアクリル酸（polyacrylic acid）、アルギナート、キトサン（chitosan）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）が記載されている。したがって、本発明は、薬剤として使用するための上記の作用物質の合成物、薬剤の調製方法、およびインビボでの薬剤の持続放出型方法を提供する。
【０１５５】
該合成物は、単位投与形態で作製し、薬学の技術分野では周知の任意の方法で調製できる。すべての方法は、治療作用物質を、１つ以上の副成分を構成するキャリヤと混合する工程を含む。一般に、該合成物は、治療作用物質を均一かつ十分に、液体キャリヤ、細粒固体キャリヤ、またはそれらの両方に混合してから、必要に応じて成形することによって調製される。
【０１５６】
非経口投与に適した合成物は、好ましくは受手の血液と等張である治療作用物質の滅菌水溶製剤を適切に備える。この水溶製剤は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて既知の方法に従って調剤可能である。滅菌注入用製剤は、滅菌注入用溶液または無毒性非経口可能希釈剤／溶剤中の懸濁液であってよい。例えば、１，３−ブタンジオール（1, 3 butane diol）中の溶液が挙げられる。使用できる許容可能な媒体および溶剤としては、水、リンが溶液、生理食塩液が挙げられる。更に、溶剤または懸濁媒体として滅菌不揮発性油が適切に使用される。この用途には、合成モノグリセリド（synthetic monoglyceride）または合成ジグリセリド（synthetic di-glyceride）を含めた任意の低刺激性混合不揮発性油を使用してもよい。更に、注射用製剤にはオレイン酸（oleic acid）等の脂肪酸を使用してもよい。経口、皮下、静脈内、筋内等に適したキャリヤ調剤については、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PAを参照することができる。
【０１５７】
経口投与に適した合成物は、カプセル、カシェ剤、錠剤、トローチ剤等、不連続単位として提供することができる。各投与単位には、規定の治療作用物質量が含まれる。この他の合成物には、シロップ、エリキシル、乳濁液などの水溶液または非水溶液中の懸濁液が含まれる。
【０１５８】
他の送達システムとしては、除放型、遅延放出型、又は持続放出型の送達システムが含まれ得る。該システムによって、本発明の治療作用物質を繰り返し投与する必要がなくなり、被験体と内科医にとって便利性が向上する。多くの種類の放出送達システムが利用可能であり、これらは当業者には周知であろう。これらには、ポリ乳酸（polylactic acid）ポリグリコール酸（polyglycolic acid）、ポリ（ラクチドグリコライド）（poly(lactide-glycolide)）、コポリシュウ酸塩（copolyoxalates），ポリ無水物（polyanhydrides）、ポリエステルアミド（polyesteramides）、ポリオルトエステル（polyorthoesters）、ポリヒドロキシ酪酸（polyhydroxybutyric acid）、およびポリカプロラクトン（polycaprolactone）等ポリマーベースのシステムが挙げられる。薬剤を含む上記のポリマーのマイクロカプセルについては、例えば米国特許第５０７５１０９号に記載されている。脂質である非ポリマーシステムには、コレステロール（cholesterol）、コレステロールエステル（cholesterol esters）および脂肪酸等のステロール（sterol）、またはモノ／ジ／トリグリセリド（mono , di- and tri-glycerides）、リプソーム、リン脂質（phospholipids）、ヒドロゲル放出システム、シラスチックシステム、ペプチドベースシステム、ワックスコーティング、従来の結合剤と補形剤を使用した圧縮錠剤、部分溶融移植組織等の天然脂肪等がある。具体的な例としては、（ａ）米国特許第４４５２７７５号、第４６７５１８９号、第５７３６１５２号に記載された、ポリサッカライドがマトリクス内の形態に含有された侵食性システム、（ｂ）米国特許第３８５４４８０号、第５１３３９７４号、第５４０７６８６号に記載されたように、活性構成要素がポリマーから制御比率で浸透する拡散システムが挙げられる。この他、ポンプベースの機械装置送達システムを使用することもでき、これらの一部は移植に適用される。
【０１５９】
長期持続放出性移植組織の使用は、疾病が進行するおそれがある被験体だけでなく、確定した疾病状態を治療するためにも特に適している。ここで、「長期」放出とは、少なくとも７日間、好ましくは３０〜６０日間活性成分の治療レベルを送達できるように移植組織を形成し配置することを意味する。移植組織は、損傷部位、または組織や細胞の再生を所望する位置に位置決め可能である。長期持続放出性移植組織は、当業者にとっては周知であり、上記の放出システムの一部が含まれる。
【０１６０】
治療作用物質は、単独で投与してもよいし、蛋白質、レセプター、コレセプター、および／または当該領域又は細胞に遺伝子を導入し、当該領域又は細胞において遺伝子を上方制御あるいは下方制御する目的で設計されている遺伝物質を含むその他の作用物質と組み合わせて投与してもよい。治療作用物質が他の作用物質と組み合わせて投与された場合、他の作用物質は例えば静脈内や経口等同じ方法で投与してもよいし、他の形態で別途投与してもよい。例えば、治療作用物質は経口投与し、他の作用物質は静脈内投与してもよい。本発明の一実施形態では、治療作用物質と他の作用物質は、静脈内投与される。他の実施形態では、治療作用物質と他の作用物質は、別々に投与される。
【０１６１】
本発明の化合物と一緒に投与可能な他の作用物質としては以下の物質が挙げられるが、これらに限定されない。すなわち、アシビシン（Acivicin）、アクラルビシン（Aclarubicin），塩酸アコダゾール（Acodazole Hydrochloride）、アクロニン（Acronine）、アドリアマイシン（Adriamycin）、アドゼレシン（Adozelesin）、アルデスレウキン（Aldesleukin）、アルトレタミン（Altretamine）、アンボマイシン（Ambomycin）、酢酸アメタントロン（Ametantrone Acetate）、アミノグルテチミド（Aminoglutethimide）、アムサクリン（Amsacrine）、アナストロゾール（Anastrozole）、アントラマイシン（Anthramycin）、アスパラギナーゼ（Asparaginase）、アスパリン（Asperlin）、アザシチジン（Azacitidine）、アゼテパ（Azetepa）、アゾトマイシン（Azotomycin）、バチマスタット（Batimastat）、ベンゾデーパ（Benzodepa）、ビカルタマイド（Bicalutamide）、塩酸ビサントレン（Bisantrene Hydrochloride）、ビスナファイドジメシレート（Bisnafide Dimesylate）、ビゼルシン（Bizelesin）、硫酸ブレオマイシン（Bleomycin Sulfate）、ブレキナーナトリウム（Brequinar Sodium）、ブロピリミン（Bropirimine）、ブスルファン（Busulfan）、カクチノマイシン（Cactinomycin）、カルステロン（Calusterone）、カラセミド（Caracemide）、カルベタイマー（Carbetimer）、カルボプラチン（Carboplatin）、カルムスチン（Carmustine）、塩酸カルビシン（Carubicin Hydrochloride）、カルゼルシン（Carzelesin）、セデフィンゴル（Cedefingol）、クロラムブシル（Chlorambucil）、シロルマイシン（Cirolemycin）、シスプラチン（Cisplatin）、クラドリビン（Cladribine）、クリスナトルメシラート（Crisnatol Mesylate）、シクロホスファミド（Cyclophosphamide）、シタラビン（Cytarabine）、ダカルバジン（Dacarbazine）、ダクチノマイシン（Dactinomycin）、塩酸ダウノルビシン（Daunorubicin Hydrochloride）、デシタビン（Decitabine）、デキソルマプラチン（Dexormaplatin）、デザグアニン（Dezaguanine）、デザグアニンメシラート（Dezaguanine Mesylate）、ジアジクオン（Diaziquone）、ドセタクセル（Docetaxel）、ドクソルビシン（Doxorubicin）、塩酸ドクソルビシン（Doxorubicin Hydrochloride）、ドロロキシフェン（Droloxifene）、クエン酸ドロロキシフェン（Droloxifene Citrate）、ドロモスタノロンプロピオネート（Dromostanolone Propionate）、ダゾマイシン（Duazomycin）、エダトレキセート（Edatrexate）、塩酸エフロルニチン（Eflornithine Hydrochloride）、エルサミトルシン（Elsamitrucin）、エンロプラチン（Enloplatin）、エンプロマート（Enpromate）、エピプロジン（Epipropidine）、塩酸エピルビシン（Epirubicin Hydrochloride）、エルブロゾール（Erbulozole）、塩酸エソルビシン（Esorubicin Hydrochloride）、エストラムスチン（Estramustine）、リン酸エストラムスチン（Estramustine Phosphate Sodium）、エタニダゾール（Etanidazole）、エトポシド（Etoposide）、リン酸エトポシド（Etoposide Phosphate）、エトプリン（Etoprine）、塩酸ファドロゾール（Fadrozole Hydrochloride）、ファザラビン（Fazarabine）、フェンレチナイド（Fenretinide）、フロクスウリジン（Floxuridine）、リン酸フルダラビン（Fludarabine Phosphate）、フルオロウラシル（Fluorouracil）、フルオロシタビン（Flurocitabine）、フォスキドン（Fosquidone）、フォストリエシンナトリウム（Fostriecin Sodium）、ゲムシタビン（Gemcitabine）、塩酸ゲムシタビン（Gemcitabine Hydrochloride）、ヒドロキシウレア（Hydroxyurea）、塩酸イダルビシン（Idarubicin Hydrochloride）、イホスファミド（Ifosfamide）、イルモフォシン（Ilmofosine）、インターフェロンアルファ−２ａ（Interferon Alfa-2a）、インターフェロンアルファ−２ｂ（Interferon Alfa-2b）、インターフェロンアルファ−ｎ１（Interferon Alfa-n1）、インターフェロンアルファｎ３（Interferon Alfa-n3）、インターフェロンベータ−Ｉａ（Interferon Beta- I a）、インターフェロンガンマ−Ｉｂ（Interferon Gamma- I b）、イプロプラチン（Iproplatin）、塩酸イリノテカン（Irinotecan Hydrochloride）、酢酸ランレオチド（Lanreotide Acetate）、レトロゾール（Letrozole）、酢酸ロイプロリド（Leuprolide Acetate）、塩酸リアロゾール（Liarozole Hydrochloride）、ロメトレキソルナトリウム（Lometrexol Sodium）、ロムスチン（Lomustine）、塩酸ロソキサントロン（Losoxantrone Hydrochloride）、マソプロコル（Masoprocol）、マイタンシン（Maytansine）、塩酸メクロレタミン（Mechlorethamine Hydrochloride）、酢酸メゲストロール（Megestrol Acetate）、酢酸メレンゲストロール（Melengestrol Acetate）、メルファラン（Melphalan）、メノガリル（Menogaril）、メルカプトプリン（Mercaptopurine）、メトトレキサート（Methotrexate）、メトトレキサートナトリウム（Methotrexate Sodium）、メトプリン（Metoprine）、メトウレデパ（Meturedepa）、ミチンドマイド（Mitindomide）、マイトカルシン（Mitocarcin）、マイトクロミン（Mitocromin）、マイトジリン（Mitogillin）、マイトマルシン（Mitomalcin）、マイトマイシン（Mitomycin）、マイトスパー（Mitosper）、マイトテイン（Mitotane）、塩酸マイトキサントロン（Mitoxantrone Hydrochloride）、マイコフェノリック酸（Mycophenolic Acid）、ノコダゾール（Nocodazole）、ノガラマイシン（Nogalamycin）、オルマプラチン（Ormaplatin）、オキシスラン（Oxisuran）、パクリタキセル（Paclitaxel）、ペグアスパラガス（Pegaspargase）、ペリオマイシン（Peliomycin）、ペンタムスチン（Pentamustine）、硫酸ペプロマイシン（Peplomycin Sulfate）、ペルフォスファミド（Perfosfamide）、ピポブロマン（Pipobroman）、ピポスルファン（Piposulfan）、塩酸ピロキサントロン（Piroxantrone Hydrochloride）、プリカマイシン（Plicamycin）、プロメスタン（Plomestane）、ポルファイマーナトリウム（Porfimer Sodium）、ポルフィロマイシン（Porfiromycin）、プレドニムスチン（Prednimustine）、塩酸プロカーバジン（Procarbazine Hydrochloride）、プロマイシン（Puromycin）、塩酸プロマイシン（Puromycin Hydrochloride）、ピラゾフリン（Pyrazofurin）、リボプリン（Riboprine）、ログレチミド（Rogletimide）、サフィンゴル（Safingol）、塩酸サフィンゴル（Safingol Hydrochloride）、セムスチン（Semustine）、シムトラジン（Simtrazene）、スパルフォセートナトリウム（Sparfosate Sodium）、スパルソマイシン（Sparsomycin）、塩酸スピロゲルマニウム（Spirogermanium Hydrochloride）、スピロムスチン（Spiromustine）、スピロプラチン（Spiroplatin）、ストレプトニグリン（Streptonigrin）、ストレプトゾシン（Streptozocin）、サロフェナル（Sulofenur）、タリソマイシン（Talisomycin）、タキソール（Taxol）、テコガランナトリウム（Tecogalan Sodium）、テガフル（Tegafur）、塩酸テロキサントロン（Teloxantrone Hydrochloride）、テモポルフィン（Temoporfin）、テニポサイド（Teniposide）、テロキシロン（Teroxirone）、テストラクトン（Testolactone）、チアミプリン（Thiamiprine）、チオグアニン（Thioguanine）、チオテパ（Thiotepa）、チオゾフリン（Tiazofurin）��チラパラミン（Tirapazamine）、トポテカン（Topotecan）、塩酸塩（Hydrochloride）、クエン酸トレミフェン（Toremifene Citrate）、酢酸トレストロン（Trestolone Acetate）、リン酸トリシリビン（Triciribine Phosphate）、トリメトレキサート（Trimetrexate）、グルクロン酸トリメトレキサート（Trimetrexate Glucuronate）、トリプトレリン（Triptorelin）、塩酸ツブロゾール（Tubulozole Hydrochloride）、ウラシルマスタード（Uracil Mustard）、ウレデパ（Uredepa）、バプレオチド（Vapreotide）、ベルテポルフィン（Verteporfin）、硫酸ビンブラスチン（Vinblastine Sulfate）、硫酸ビンクリスチン（Vincristine Sulfate）、ビンデシン（Vindesine）、硫酸ビンデシン（Vindesine Sulfate）、硫酸ビンピジン（Vinepidine Sulfate）、硫酸ビングリシナート（Vinglycinate Sulfate）、硫酸ビンロイロシン（Vinleurosine Sulfate）、酒石酸ビロレルビン（Vinorelbine Tartrate）、硫酸ビンロシジン（Vinrosidine Sulfate）、硫酸ビンゾリジン（Vinzolidine Sulfate）、ボロゾール（Vorozole）、ゼニプラチン（Zeniplatin）、ジノスタチン（Zinostatin）、塩酸ゾルビシン（Zorubicin Hydrochloride）が挙げられる。この他の抗腫瘍薬としては、「抗腫瘍薬」（Antineoplastic Agents）(Paul CalabresiおよびBruce A. Chabner)の第５２章と序章、ならびに1202-1263, of Goodman およびGilman's 「治療学の薬理学的基礎」（"The Pharmacological Basis of Therapeutics"）, Eighth Edition, 1990, McGraw-Hill, Inc. (Health Professions Division)に記載されているものが挙げられる。
【０１６２】
本発明は、上記の特定の実施形態の範囲に限定されない。実際、上記の記載内容と添付の図面から、当業者には、上記の他に本発明の様々な変形が可能であることが明らかであろう。該変形は、添付の特許請求の範囲にあるものとする。以下の実施例は、本発明の実例として記載するが、本発明を限定するためのものではない。
【実施例】
【０１６３】
(実施例１−抗体生成)
【０１６４】
本明細書においてａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲと呼ばれるＭＵＣ１レセプターのＭＧＦＲ部分に結合する抗体については、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ／第２００４／０２７９５４号（国際公開第２００５／０１９２６９号）に詳細が記載されており、特に該ＰＣＴ出願の実施例８に記載されている。また抗体生成は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ／第２００５／０３２８２１号にも記載されており、特に該ＰＣＴ出願の実施例２に記載されている。新規性のある抗体は、抗体生成の標準的方法を使用して、ＭＵＣ１レセプターのＭＧＦＲ部分、特に表１に示したｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲまたはｖａｒ−ＰＳＭＧＦＲに対して作用するものであった。ラビットのポリクローナル抗体を生成しカラムクロマトグラフィで精製した。カラムクロマトグラフィにおいては、免疫ペプチドをクロマトグラフィカラムビーズに付着させた。抗体であるａｎｔｉ−ｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲとａｎｔｉ−ｖａｒ−ＰＳＭＧＦＲがＭＵＣ１レセプターのＭＧＦＲ部分に特定かつ集中的に結合していることが分かった。
(実施例２−組織試料の調製)
【０１６５】
図７〜１４に示した組織試料を、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ／第２００５／０３２８２１号（特に該ＰＣＴ出願の実施例３）における上記記載の方法を使用して調製した。ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料を試験し、ＭＵＣ１レセプター上の異なるエピトープを認識する２つの抗体に対する反応性を調べた。該２つの抗体とは以下のとおり。１）ラビットのポリクローナル抗体、ａｎｔｉ−ＰＳＭＧＦＲ。これはレセプター分離後に細胞表面に付着したままのＭＵＣ１レセプターのＰＳＭＧＦＲ部分に結合する。２）市販のマウスのモノクローナル、ＶＵ４Ｈ５（Santa Cruz, CA）。これは、レセプターの縦列反復セクションにおける配列に結合する。各ブロックから１セクションをヘモトキシンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、腫瘍の程度を評価するために用いた。
(実施例３−ＭＵＣ１が存在する細胞の誘導増殖)
【０１６６】
図２〜４で使用した方法については、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ／第２００４／０２７９５４号（国際公開第２００５／０１９２６９号）に詳細が記載されており、特に該ＰＣＴ出願の実施例１に記載されている。ＭＵＣ１陽性細胞を、ＭＵＣ１レセプターのＭＧＦＲ領域に対する新規性のある二価の抗体に露出した。正規化した細胞成長を、抗体濃度の関数としてグラフに表した。二価の抗体は、表１に示したｖａｒ−ＰＳＭＧＦＲまたはｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲ配列のいずれにも作用した（すなわち、２つのＭＧＦＲに同時に結合する能力を有する単一の抗体を生成した）。ＭＵＣ１陽性乳癌細胞（Ｔ４７Ｄおよび１５０４）とｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲがトランスフェクションされたＭＵＣ１陰性細胞株であるＨＥＫ２９３を抗体に露出し、細胞増殖を抗体濃度の関数として調べた。成長因子／レセプター−抗体反応の典型である成長／反応曲線が観察された。特に、非常な低濃度（細胞の小部分のみが抗体に露出されていた）において、細胞増殖のレベルは低かった。抗体濃度が十分高い場合（１つの抗体が隣接するＭＧＦＲに結合可能であった）、細胞増殖は最大であった。抗体が過剰に多い場合、各抗体は、隣接するＭＧＦＲを二量化するというよりむしろ単一のＭＧＦＲにのみ結合し、増殖レベルは低下した。
【０１６７】
本明細書に引用した引用文献はすべて、参照により本明細書に援用される。
【０１６８】
当業者は、規定の実験を使用するだけで、本明細書で特に説明した本発明の具体的な実施形態と同等の多くの実施形態を認識するであろうし、あるいは確認できるであろう。該同等の実施形態は、特許請求の範囲に網羅されるものとする。
【０１６９】
表１：ペプチド配列（Ｎ−末端からＣ末端までのリスト）
全長ＭＵＣ１レセプター（ムチン１前駆体、Genbank受入れ番号Ｐ１５９４１）
(SEQ ID NO: 1)
ＭＵＣ１レセプターと切断イソフォームを細胞膜表面に案内するためのＮ−末端ＭＵＣ−１信号配列。SEQ ID NOS:2、3、4において変異形で示されるとおり、Ｃ−末端において最高３つのアミノ酸残基が欠損し得る。
(SEQ ID NO: 2).
(SEQ ID NO: 3)
(SEQ ID NO: 4)
Ｎ−末端にｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲを有しかつ全長ＭＵＣ１レセプターの膜貫通・細胞質配列を含む切断ＭＵＣ１レセプターのイソフォーム（「ｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲＴＣイソフォーム」。「ＰＳＭＧＦＲＴＣ」の一例。翻訳後及び細胞表面上のレセプター発現前に開裂した可能性のある任意のＮ−末端信号配列は除外されている。）：
(SEQ ID NO: 5)
Ｎ−末端にｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲとＰＳＩＢＲを有しかつ全長ＭＵＣ１レセプターの膜貫通・細胞質配列を含む切断ＭＵＣ１レセプターのイソフォーム（「ＣＭイソフォーム」。翻訳後及び細胞表面上のレセプター発現前に開裂した可能性のある任意のＮ−末端信号配列は除外されている。）：
(SEQ ID NO: 6)
Ｎ−末端にｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲとＰＳＩＢＲと固有領域とを有し、かつ全長ＭＵＣ１レセプターの膜貫通・細胞質配列を含む切断ＭＵＣ１レセプターのイソフォーム（「ＵＲイソフォーム」。任意のＮ−末端信号配列は除外されている。）：
(SEQ ID NO: 7)
全長ＭＵＣ１レセプターの膜貫通・細胞質配列を含む切断ＭＵＣ１レセプターのイソフォーム（「Ｙイソフォーム」。翻訳後及び細胞表面上のレセプター発現前に開裂した可能性のある任意のＮ−末端信号配列は除外されている。）：
(SEQ ID NO: 8)
Ｎ−末端にｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲとＰＳＩＢＲと固有領域と反復とを有し、かつ全長ＭＵＣ１レセプターの膜貫通・細胞質配列を含む切断ＭＵＣ１レセプターのイソフォーム（「Ｒｅｐイソフォーム」。翻訳後及び細胞表面上のレセプター発現前に開裂した可能性のある任意のＮ−末端信号配列は除外されている。）：
(SEQ ID NO: 9)
ＭＵＣ１成長因子レセプターの天然一次配列（ｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲ。「ＰＳＭＧＦＲ」の一例）：
(SEQ ID NO: 10)
ＭＵＣ１成長因子レセプターの天然一次配列（ｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲ。「ＰＳＭＧＦＲ」の一例）。SEQ ID NO: 10のＮ−末端に１つのアミノ酸削除あり：
(SEQ ID NO: 11)
向上した安定性を有するＭＵＣ１成長因子レセプターの天然一次配列の「ＳＰＹ」機能変異形（ｖａｒ−ＰＳＭＧＦＲ。「ＰＳＭＧＦＲ」の一例）：
(SEQ ID NO: 12)
向上した安定性を有するＭＵＣ１成長因子レセプターの天然一次配列の「ＳＰＹ」機能変異形（ｖａｒ−ＰＳＭＧＦＲ。「ＰＳＭＧＦＲ」の一例）SEQ ID NO: 12のＣ−末端に１つのアミノ酸削除あり）：
(SEQ ID NO: 13)
切断ＰＳＭＧＦＲレセプター（ＴＲ）（ｖａｒ−ＰＳＭＧＦＲの「ＳＰＹ」配列あり）：
(SEQ ID NO: 14)
ＭＵＣ１成長因子レセプターの拡大配列（ＥＳＭＧＦＲ）（ｖａｒ−ＰＳＭＧＦＲの「ＳＰＹ」配列あり）：
(SEQ ID NO: 15)
腫瘍特定のＭＵＣ１成長因子レセプターの拡大配列（ＴＳＥＳＭＧＦＲ）（ｖａｒ−ＰＳＭＧＦＲの「ＳＰＹ」配列あり）：
(SEQ ID NO: 16)
鎖間結合領域の一次配列（ＰＳＩＢＲ）：
(SEQ ID NO: 17)
切断鎖間結合領域（ＴＰＳＩＢＲ）：
(SEQ ID NO: 18)
反復モチーフ２（ＲＭ２）：
(SEQ ID NO: 19)
表２：ＭＵＣ１レセプターの切断イソフォームをコード化する核酸配列（５'末端から３'末端までのリスト）：
SEQ ID NO: 1の全長ＭＵＣ１レセプターをコード化する核酸分子の例：
(SEQ ID NO: 20)
SEQ ID NO: 5のｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲＴＣをコード化する核酸分子の例：
(SEQ ID NO: 21)
SEQ ID NO: 6のＣＭイソフォームをコード化する核酸分子の例：
(SEQ ID NO: 22)
SEQ ID NO: 7のＵＲイソフォームをコード化する核酸分子の例：
(SEQ ID NO: 23)
SEQ ID NO: 8のＹイソフォームをコード化する核酸分子の例：
(SEQ ID NO: 24)
SEQ ID NO: 9のＲｅｐイソフォームをコード化する核酸分子の例：
(SEQ ID NO: 25)
【表Ａ】
0005938365.tif 000005
【表Ｂ】
0005938365.tif 000006
【表Ｃ】
0005938365.tif 000007
【図１】
0005938365.tif 000008
【図２】
0005938365.tif 000009
【図３】
0005938365.tif 000010
【図４】
0005938365.tif 000011
【図５】
0005938365.tif 000012
【図６】
0005938365.tif 000013
【図７】
0005938365.tif 000014
【図８】
0005938365.tif 000015
【図９】
0005938365.tif 000016
【図１０】
0005938365.tif 000017
【図１１】
0005938365.tif 000018
【図１２】
0005938365.tif 000019
【図１３】
0005938365.tif 000020
【図１４】
0005938365.tif 000021
【配列表】
0005938365000001.app