(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離され、かつ組換え型のＢドメイン完全欠失ブタ第ＶＩＩＩ因子またはＢドメイン部分欠失ブタ第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）変異体であって、配列番号７のアミノ酸７１４〜７４０に対応するアミノ酸配列を欠き、ここで、ＯＢＩ−１と比較して、総第ＶＩＩＩ因子変異体１ミリグラムあたりの凝固活性の単位の増加を示す、ＦＶＩＩＩ変異体。
【請求項２】
配列番号１と少なくとも９０％同一である配列を含み、配列番号７のアミノ酸７１４〜７４０に対応するアミノ酸配列を欠く、請求項１に記載のＦＶＩＩＩ変異体。
【請求項３】
前記変異体が、配列番号１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８または９９．９％の同一性を共有する、請求項２に記載のＦＶＩＩＩ変異体。
【請求項４】
前記変異体が、配列番号１と９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８または９９．９％の同一性を共有する、請求項３に記載のＦＶＩＩＩ変異体。
【請求項５】
前記変異体が配列番号１である、請求項４に記載のＦＶＩＩＩ変異体。
【請求項６】
前記ＦＶＩＩＩ変異体が部分的にＢドメインを欠失し、前記Ｂドメインの残りの部分が、配列番号４からなる配列から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＦＶＩＩＩ変異体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＦＶＩＩＩ変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターを含む、単離された哺乳類細胞。
【請求項１０】
以下のステップを含む、ＦＶＩＩＩ変異体を産生する方法：
ａ．請求項９に記載の哺乳類細胞を培養するステップ；および
ｂ．前記哺乳類細胞から前記ＦＶＩＩＩ変異体を単離するステップ。
【請求項１１】
以下のステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法：
ｃ．適切な賦形剤と共に前記第ＶＩＩＩ因子変異体を医薬組成物に製剤化するステップ。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の第ＶＩＩＩ因子変異体を含む医薬組成物。
【請求項１３】
血友病の治療を必要とする患者において血友病を治療するための医薬の調製における、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＦＶＩＩＩ変異体の使用。
【請求項１４】
前記血友病が血友病Ａである、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記血友病が後天性血友病である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
前記患者が、ヒトＦＶＩＩＩ抗体を発生させた、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記第ＶＩＩＩ因子が、２００μｇ／用量、１５０μｇ／用量または１４０μｇ／用量以下の量で投与される、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
血友病を治療するのに使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＦＶＩＩＩ変異体を含む組成物。
【請求項１９】
前記血友病が血友病Ａである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記血友病が後天性血友病である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記第ＶＩＩＩ因子変異体が、２００μｇ／用量、１５０μｇ／用量または１４０μｇ／用量以下の量で投与されることを特徴とする、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液凝固因子および血友病の分野に属する。本発明は、本明細書においてｒＦＶＩＩＩｖ３と命名され、既知の第ＶＩＩＩ因子製品と比較して増加した比活性を有する抗血友病第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の新規変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固は、血小板が損傷部位において損傷した血管の切断壁に接着する時に始まる。その後、酵素によって制御された反応のカスケードにおいて、可溶性フィブリノーゲン分子は、酵素トロンビンにより、血栓内で血小板を共に保持するフィブリンの不溶性の鎖に変換される。このカスケードの各ステップにおいて、変異体前駆体は、一連の次の変異体前駆体を切断するプロテアーゼに変換される。これらのステップのほとんどにおいて、補因子が必要とされる。
【０００３】
（抗血友病第ＶＩＩＩ因子またはＦＶＩＩＩとも呼ばれる）第ＶＩＩＩ因子は、フォン・ヴィルブラント因子に堅固に非共有結合した血液中の不活性前駆体として循環している。第ＶＩＩＩ因子は、このカスケードにおいて、フォン・ヴィルブラント因子から第ＶＩＩＩ因子を解離し、その凝血促進機能を活性化するトロンビンまたは第Ｘａ因子によって、タンパク質分解により活性化される。その活性形態において、変異体第ＶＩＩＩａ因子は、第Ｘ因子活性化に対する第ＩＸａ因子の触媒効率を数桁分増加させる補因子である。
【０００４】
ヒトＦＶＩＩＩのクローニングにより、この変異体は、Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２という順番のいくつかのドメイン内に編成された２３３２個のアミノ酸を含むことが明らかになっている（非特許文献１；非特許文献２および非特許文献３）。ＦＶＩＩＩのほとんどは、血漿中でヘテロ二量体であり、軽鎖および様々な重鎖の誘導体を含む。このヘテロ二量体構造は、この前駆体のアルギニン１６４８におけるタンパク質切断によるものであり、その結果、重鎖および軽鎖は、それぞれＡ１−Ａ２−ＢおよびＡ３−Ｃ１−Ｃ２を含む。重鎖内の不均一性は、そのカルボキシ末端Ｂドメイン内の限定分解により説明される。
【０００５】
第Ｘ因子活性化のための補因子として機能するためには、第ＦＶＩＩＩ因子は、第Ｘａ因子またはトロンビンによる限定分解を必要とする。この活性化には、重鎖上の３７２位および７４０位および軽鎖上の１６８９位のアルギニンでの切断が伴う。不活性前駆体と比較して、活性ＦＶＩＩＩ補因子は、軽鎖フラグメント１６４９−１６８９およびＢドメイン全体を欠いていることが証明されている（非特許文献４）。
【０００６】
第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子に対する抗体に欠陥を有し、第ＶＩＩＩ因子で治療されていない人々は、関節の炎症反応から早期死亡までの様々な範囲の重篤な症状を引き起こす可能性のある制御されていない内出血に苦しんでいる。米国で約１０，０００人に達する重症血友病患者は、ヒト第ＶＩＩＩ因子の注射により治療することができ、十分な頻度および濃度で投与される場合に、血液の正常な凝固能力を回復する。実際、第ＶＩＩＩ因子は、伝統的に、正常な血漿中に存在し、血友病Ａを患う個人由来の血漿中の凝固欠陥を補正する物質として定義される。
【０００７】
様々な純度のヒト血漿由来第ＶＩＩＩ因子のいくつかの調製物が、血友病Ａの治療のために市販されている。これらには、ウイルスのために熱処理および界面活性剤処理されるが、顕著なレベルの抗原変異体を含む多くのドナーのプールされた血液由来の部分精製第ＶＩＩＩ因子、より低レベルの抗原性不純物およびウイルス汚染物を有するモノクローナル抗体精製第ＶＩＩＩ因子、ならびに組換えヒト第ＶＩＩＩ因子が含まれる。
【０００８】
第ＶＩＩＩ因子の活性を阻害する抗体（「阻害物質」または「阻害抗体」）の発生が、血友病患者の管理における深刻な問題である。
【０００９】
同種抗体は、第ＶＩＩＩ因子の治療点滴に反応して、血友病Ａ患者の約２０％において発生する。阻害物質を発生し、以前に治療されていない血友病Ａ患者において、この阻害物質は、通常、治療の１年以内に発生する。さらに、第ＶＩＩＩ因子を不活性化する抗体（自己抗体）は、時折、第ＶＩＩＩ因子が以前は正常なレベルであった個人において発生する。阻害物質の力価が十分に低い場合、患者は、第ＶＩＩＩ因子の用量を増加させることによって管理することができる。しかし、この阻害物質の力価は、第ＶＩＩＩ因子が圧倒することができないほど高い場合が多い。代替戦略は、活性プロトロンビン複合体濃縮製剤（例えば、ＫＯＮＹＮＥ（Ｃｕｔｔｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＦＥＩＢＡ（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、ＰＲＯＰＬＥＸ（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社））または組換えヒト第ＶＩＩａ因子を用いる通常の止血中に、第ＶＩＩＩ因子の必要性を回避することである。さらに、ブタ第ＶＩＩＩ因子は、通常、ヒト第ＶＩＩＩ因子よりも実質的に低い阻害物質との反応性を有するので、部分精製されたブタ第ＶＩＩＩ因子製剤（ＨＹＡＴＥ：Ｃ（ＩＰＳＥＮ  Ｐｈａｒｍａ社））が用いられている。ヒト第ＶＩＩＩ因子に対する阻害抗体を発生している多くの患者は、ブタ第ＶＩＩＩ因子を用いた治療に成功しており、長期間、かかる治療に耐容性を示している。
【００１０】
しかし、ウイルスまたは他の血液由来の汚染物質のリスクに関する公衆衛生上の懸念により、ブタ血液から精製されたブタ第ＶＩＩＩ因子の有用性が制限されている。したがって、「ＯＢＩ−１」と命名された組換えブタ第ＶＩＩＩ因子変異体が開発され、これは、例えば、特許文献１に記載されている。ＯＢＩ−１は、Ｂドメイン部分欠失ブタ第ＦＶＩＩＩ因子である。この分子は、現在、臨床開発中である。
【００１１】
Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子変異体は、第ＶＩＩＩ因子の凝血促進および補因子活性を保持することが知られている。これに加えて、Ｍｅｒｔｅｎｓら（非特許文献４）は、このＢドメインおよびリジン７１３からアルギニン７４０に及ぶ重鎖配列を欠く組換えヒト第ＶＩＩＩ因子変異体について記載している。
【００１２】
多くの血友病患者は、出血およびその結果生じる変形性血友病性関節症（ｄｅｆｏｒｍｉｎｇ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ  ａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ）を防ぐために、毎日、第ＶＩＩＩ因子の交換を必要としている。この点からみて、より強力な第ＶＩＩＩ因子分子に対する必要性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第０１／６８１０９号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｖｅｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１２，３３７〜３４２
【非特許文献２】Ｔｏｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１２，３４２〜３４７
【非特許文献３】Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１２，３３０〜３３７
【非特許文献４】Ｍｅｒｔｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ（１９９３）８５，１３３〜１４２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
第一の態様において、本発明は、単離された組換え型のＢドメイン完全欠失第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）変異体もしくは単離された組換え型のＢドメイン部分欠失第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）変異体であって、図２に示すブタ第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸７１６〜７４２または配列番号７のアミノ酸７１４〜７４０に対応する最高で２７個のアミノ酸配列を欠くＦＶＩＩＩ変異体に関する。この２７個のアミノ酸配列ＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲ（配列番号１０）は、部分的に、または完全に欠失させることができる。
【００１６】
一実施形態において、本発明は、単離された組換え型のＢドメイン完全欠失ＦＶＩＩＩ変異体もしくは単離された組換え型のＢドメイン部分欠失ＦＶＩＩＩ変異体であって、図２に示すブタ第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸７１６〜７４２または配列番号７のアミノ酸７１４〜７４０に対応する最高で２７個のアミノ酸配列を欠き、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸が欠失してもよいＦＶＩＩＩ変異体に関する。別の実施形態において、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個または２０個のアミノ酸が欠失する。別の実施形態において、２７個、２６個または２５個のアミノ酸が欠失する。別の実施形態において、ＤＩＧＤＹＹＤＮＴＹＥＤＩＰＧＦＬＬＳＧＫＮＶＩＥＰＲ（配列番号１０）に対応する２７個のアミノ酸が欠失する。
【００１７】
一実施形態において、本発明は、単離された組換え型のＢドメイン完全欠失ＦＶＩＩＩ変異体もしくは単離された組換え型のＢドメイン部分欠失ＦＶＩＩＩ変異体であって、図２に示すヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸７１６〜７４２または配列番号８のアミノ酸７１４〜７４０に対応する最高で２７個のアミノ酸配列を欠き、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸が欠失してもよいＦＶＩＩＩ変異体に関する。別の実施形態において、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個または２０個のアミノ酸が欠失する。別の実施形態において、２７個、２６個または２５個のアミノ酸が欠失する。別の実施形態において、ＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲ（配列番号１１）に対応する２７個のアミノ酸が欠失する。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、ＤＩＧＤＹＹＤＮＴＹＥＤＩＰＧＦＬＬＳＧＫＮＶＩＥＰＲ（配列番号１０）に対応する２７個のアミノ酸を完全に欠く、単離された組換え型のＢドメイン完全欠失ブタＦＶＩＩＩ変異体もしくは単離された組換え型のＢドメイン部分欠失ブタＦＶＩＩＩ変異体に関する。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、ＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲ（配列番号１１）に対応する２７個のアミノ酸を完全に欠く、単離された組換え型のＢドメイン完全欠失ヒトＦＶＩＩＩ変異体もしくは単離された組換え型のＢドメイン部分欠失ヒトＦＶＩＩＩ変異体に関する。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は、ＮＩＤＤＹＹＥＤＴＹＥＤＩＰＴＰＬＬＮＥＮＮＶＩＫＰＲ（配列番号１２）に対応する２７個のアミノ酸を完全に欠く、単離された組換え型のＢドメイン完全欠失イヌＦＶＩＩＩ変異体もしくは単離された組換え型のＢドメイン部分欠失イヌＦＶＩＩＩ変異体に関する。
【００２１】
本発明の第二の態様は、記載した第一の態様および実施形態で定義したとおりのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００２２】
第三の態様において、本発明は、第二の態様で定義したとおりのポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。
【００２３】
本発明の第四の態様は、第三の態様で定義したとおりの発現ベクターを含む哺乳類細胞に関する。
【００２４】
第五の態様において、本発明は、以下のステップを含む、第一の態様で定義したとおりのＦＶＩＩＩを産生する方法に関する：
ａ．第四の態様に係る哺乳類細胞を培養するステップ；および
ｂ．この哺乳類細胞からこのＦＶＩＩＩ変異体を単離するステップ。
【００２５】
本発明の第六の態様は、第一の態様で定義したとおりのＦＶＩＩＩ変異体を含む医薬組成物に関する。
【００２６】
第七の態様において、本発明は、血友病を患う患者を治療する方法であって、本発明の第一の態様に係る治療有効量のＦＶＩＩＩ変異体を、それを必要としている患者に投与することによって、前記患者の血友病を治療することを含む方法に関する。
【００２７】
第八の態様において、本発明は、血友病の治療に使用するための、第一の態様に係るＦＶＩＩＩ変異体に関する。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
単離した、組換え型のＢドメイン完全欠失第ＶＩＩＩ因子またはＢドメイン部分欠失第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）変異体であって、図２に示すブタ第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸７１６〜７４２または配列番号７のアミノ酸７１４〜７４０に対応するアミノ酸配列を欠くＦＶＩＩＩ変異体。
（項目２）
配列番号１と少なくとも９０％同一である配列を含み、図２に示すブタ第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸７１６〜７４２または配列番号７のアミノ酸７１４〜７４０に対応するアミノ酸配列を欠く、項目１に記載のＦＶＩＩＩ変異体。
（項目３）
上記変異体が、配列番号１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８または９９．９％の同一性を共有する、項目２に記載のＦＶＩＩＩ変異体。
（項目４）
上記変異体が、配列番号１と９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８または９９．９％の同一性を共有する、項目３に記載のＦＶＩＩＩ変異体。
（項目５）
上記変異体が配列番号１である、項目４に記載のＦＶＩＩＩ変異体。
（項目６）
単離した、組換え型のＢドメイン完全欠失第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）変異体またはＢドメイン部分欠失第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）変異体であって、図２に示すヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸７１６〜７４２または配列番号８のアミノ酸７１４〜７４０に対応するアミノ酸配列を欠くＦＶＩＩＩ変異体。
（項目７）
配列番号１と少なくとも９０％同一である配列を含み、図２に示すブタ第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸７１６〜７４２または配列番号８のアミノ酸７１４〜７４０に対応するアミノ酸配列を欠く、項目６に記載のＦＶＩＩＩ変異体。
（項目８）
上記変異体が、配列番号２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８または９９．９％の同一性を共有する、項目７に記載のＦＶＩＩＩ変異体。
（項目９）
上記変異体が、配列番号２と９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８または９９．９％の同一性を共有する、項目８に記載のＦＶＩＩＩ変異体。
（項目１０）
上記変異体が配列番号２である、項目９に記載のＦＶＩＩＩ変異体。
（項目１１）
上記ＦＶＩＩＩ変異体が部分的にＢドメインを欠失し、上記Ｂドメインの残りの部分が、配列番号４または配列番号５からなる配列から選択される、項目１〜１０のいずれか一項に記載のＦＶＩＩＩ変異体。
（項目１２）
項目１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（項目１３）
項目１２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（項目１４）
項目１３に記載の発現ベクターを含む哺乳類細胞。
（項目１５）
以下のステップを含む、項目１〜１０のいずれか一項に記載のＦＶＩＩＩ変異体を産生する方法：
ａ．項目１４に記載の哺乳類細胞を培養するステップ；および
ｂ．上記哺乳類細胞から上記ＦＶＩＩＩ変異体を単離するステップ。
（項目１６）
以下のステップをさらに含む、項目１５に記載の方法：
ｃ．適切な賦形剤と共に上記第ＶＩＩＩ因子変異体を医薬組成物に製剤化するステップ。
（項目１７）
項目１〜１０のいずれか一項に記載の第ＶＩＩＩ因子変異体を含む医薬組成物。
（項目１８）
血友病を患う患者を治療する方法であって、項目１〜１０のいずれか一項に記載の治療有効量のＦＶＩＩＩ変異体を、それを必要としている患者に投与することによって、上記患者の血友病を治療することを含む方法。
（項目１９）
血友病を治療するのに使用する、項目１〜１０のいずれか一項に記載のＦＶＩＩＩ変異体。
（項目２０）
上記血友病が血友病Ａである、項目１８または項目１９に記載の方法または使用。
（項目２１）
上記血友病が後天性血友病である、項目１８または項目１９に記載の方法または使用。
（項目２２）
上記血友病が、ヒトＦＶＩＩＩ抗体を発生している患者において治療される、項目１８〜２１のいずれか一項に記載の方法または使用。
（項目２３）
上記第ＶＩＩＩ因子が、２００μｇ／用量、１５０μｇ／用量または１４０μｇ／用量以下の量で投与される、項目１８〜２２のいずれか一項に記載の方法または使用。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】５つの既知のＦＶＩＩＩ製品（白のカラム）および新規ｒｐＦＶＩＩＩｖ３（斜線のカラム）に必要な一用量あたりのタンパク質量（μｇ）を示すグラフである。ＢＤＤ＝Ｂドメイン欠失；ＦＬ＝全長；ｕ＝μ。
【図２ａ】同じ配列の連続である。図２ａ〜図２ｅは、ヒト（ｈｕｍａｎ）（ヒト（ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））、ブタ（イノシシ）、マウス（ｍｏｕｓｅ）（マウス（ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ））およびイヌ（ｄｏｇ）（イヌ（ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ））の第ＶＩＩＩ因子配列間の配列アラインメントを示す。この配列アラインメントは、第ＶＩＩＩ因子の研究のための血友病Ａ変異データベースおよびリソースサイト（ｈａｄｂ．ｏｒｇ．ｕｋ）のホームページであるＨＡＤＢ（ａｋａ  ＨＡＭＳＴｅＲＳ）２０１０から取得される。番号付けは、ヒト配列に従い、配列表中の配列のアミノ酸番号と同一ではない。太字で二重下線の配列は、本発明の組換えＦＶＩＩＩｖ３変異体で欠損している配列を示す。下線の配列は、Ｂドメインの配列である。灰色で強調される配列は、本発明のＢドメイン部分欠失ＦＩＩＩｖ３配列に保持され得るＢドメインの部分である。
【図２ｂ】同じ配列の連続である。図２ａ〜図２ｅは、ヒト（ｈｕｍａｎ）（ヒト（ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））、ブタ（イノシシ）、マウス（ｍｏｕｓｅ）（マウス（ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ））およびイヌ（ｄｏｇ）（イヌ（ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ））の第ＶＩＩＩ因子配列間の配列アラインメントを示す。この配列アラインメントは、第ＶＩＩＩ因子の研究のための血友病Ａ変異データベースおよびリソースサイト（ｈａｄｂ．ｏｒｇ．ｕｋ）のホームページであるＨＡＤＢ（ａｋａ  ＨＡＭＳＴｅＲＳ）２０１０から取得される。番号付けは、ヒト配列に従い、配列表中の配列のアミノ酸番号と同一ではない。太字で二重下線の配列は、本発明の組換えＦＶＩＩＩｖ３変異体で欠損している配列を示す。下線の配列は、Ｂドメインの配列である。灰色で強調される配列は、本発明のＢドメイン部分欠失ＦＩＩＩｖ３配列に保持され得るＢドメインの部分である。
【図２ｃ】同じ配列の連続である。図２ａ〜図２ｅは、ヒト（ｈｕｍａｎ）（ヒト（ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））、ブタ（イノシシ）、マウス（ｍｏｕｓｅ）（マウス（ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ））およびイヌ（ｄｏｇ）（イヌ（ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ））の第ＶＩＩＩ因子配列間の配列アラインメントを示す。この配列アラインメントは、第ＶＩＩＩ因子の研究のための血友病Ａ変異データベースおよびリソースサイト（ｈａｄｂ．ｏｒｇ．ｕｋ）のホームページであるＨＡＤＢ（ａｋａ  ＨＡＭＳＴｅＲＳ）２０１０から取得される。番号付けは、ヒト配列に従い、配列表中の配列のアミノ酸番号と同一ではない。太字で二重下線の配列は、本発明の組換えＦＶＩＩＩｖ３変異体で欠損している配列を示す。下線の配列は、Ｂドメインの配列である。灰色で強調される配列は、本発明のＢドメイン部分欠失ＦＩＩＩｖ３配列に保持され得るＢドメインの部分である。
【図２ｄ】同じ配列の連続である。図２ａ〜図２ｅは、ヒト（ｈｕｍａｎ）（ヒト（ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））、ブタ（イノシシ）、マウス（ｍｏｕｓｅ）（マウス（ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ））およびイヌ（ｄｏｇ）（イヌ（ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ））の第ＶＩＩＩ因子配列間の配列アラインメントを示す。この配列アラインメントは、第ＶＩＩＩ因子の研究のための血友病Ａ変異データベースおよびリソースサイト（ｈａｄｂ．ｏｒｇ．ｕｋ）のホームページであるＨＡＤＢ（ａｋａ  ＨＡＭＳＴｅＲＳ）２０１０から取得される。番号付けは、ヒト配列に従い、配列表中の配列のアミノ酸番号と同一ではない。太字で二重下線の配列は、本発明の組換えＦＶＩＩＩｖ３変異体で欠損している配列を示す。下線の配列は、Ｂドメインの配列である。灰色で強調される配列は、本発明のＢドメイン部分欠失ＦＩＩＩｖ３配列に保持され得るＢドメインの部分である。
【図２ｅ】同じ配列の連続である。図２ａ〜図２ｅは、ヒト（ｈｕｍａｎ）（ヒト（ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））、ブタ（イノシシ）、マウス（ｍｏｕｓｅ）（マウス（ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ））およびイヌ（ｄｏｇ）（イヌ（ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ））の第ＶＩＩＩ因子配列間の配列アラインメントを示す。この配列アラインメントは、第ＶＩＩＩ因子の研究のための血友病Ａ変異データベースおよびリソースサイト（ｈａｄｂ．ｏｒｇ．ｕｋ）のホームページであるＨＡＤＢ（ａｋａ  ＨＡＭＳＴｅＲＳ）２０１０から取得される。番号付けは、ヒト配列に従い、配列表中の配列のアミノ酸番号と同一ではない。太字で二重下線の配列は、本発明の組換えＦＶＩＩＩｖ３変異体で欠損している配列を示す。下線の配列は、Ｂドメインの配列である。灰色で強調される配列は、本発明のＢドメイン部分欠失ＦＩＩＩｖ３配列に保持され得るＢドメインの部分である。
【図３】実施例５に記載の校正標準のＳＥＣプロファイルおよび検量線の線形回帰の典型例を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ブタＢドメイン部分欠失ＦＶＩＩＩｖ３の配列を示し、
配列番号２は、ヒトＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩｖ３の配列を示し、
配列番号３は、イヌＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩｖ３の配列を示し、
配列番号４は、本発明のＢドメイン部分欠失ＦＶＩＩＩ分子内に存在し得るブタＦＶＩＩＩＢドメイン由来の配列（いわゆる「Ｂドメインリンカー」）を示し、
配列番号５は、本発明のＢドメイン部分欠失ＦＶＩＩＩ分子内に存在し得るヒトＦＶＩＩＩＢドメイン由来のＢドメインリンカー配列を示し、
配列番号６は、本発明のＢドメイン部分欠失ＦＶＩＩＩ分子内に存在し得るイヌＦＶＩＩＩＢドメイン由来のＢドメインリンカー配列を示し、
配列番号７は、全長のブタＦＶＩＩＩのアミノ酸配列を示し、
配列番号８は、全長のヒトＦＶＩＩＩのアミノ酸配列を示し、
配列番号９は、全長のイヌＦＶＩＩＩのアミノ酸配列を示し、
配列番号１０は、図２に示すブタ第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸７１６〜７４２または配列番号７のアミノ酸７１４〜７４０に対応する２７個のペプチド配列を示し、
配列番号１１は、図２に示すヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸７１４〜７４０または配列番号８のアミノ酸７１４〜７４０に対応する２７個のペプチド配列を示し、
配列番号１２は、図２に示すイヌ第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸７１４〜７４０または配列番号９のアミノ酸７０８〜７３４に対応する２７個のペプチド配列を示す。
【００３０】
本発明は、特定の２７個のアミノ酸欠失を含む組換え型のＢドメイン部分欠失ブタ第ＶＩＩＩ因子タンパク質の変異体の発見に基づいている。本明細書でｒｐＦＶＩＩＩｖ３と命名されるこの変異体は、この２７個のアミノ酸ストレッチを含む類似タンパク質、すなわち、「ＯＢＩ−１」と呼ばれる組換え型のＢドメイン部分欠失ブタＦＶＩＩＩと比較した時に、増加した比活性を有することが示されている。ＯＢＩ−１、そのアミノ酸配列およびＯＢＩ−１をコードするポリヌクレオチドは、例えば、米国特許第６，４５８，５６３号から知られている。
【００３１】
本発明は、単離された組換え型のＢドメイン完全欠失第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）変異体もしくは単離された組換え型のＢドメイン部分欠失第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）変異体であって、図２に示すブタ第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸７１６〜７４２または配列番号７のアミノ酸７１４〜７４０に対応するアミノ酸配列を欠くＦＶＩＩＩ変異体に関する。
【００３２】
さらに、本発明は、単離された組換え型のＢドメイン完全欠失ＦＶＩＩＩ変異体もしくは単離された組換え型のＢドメイン部分欠失ＦＶＩＩＩ変異体であって、図２に示すブタ第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸７１６〜７４２または配列番号７のアミノ酸７１４〜７４０に対応する２７個のアミノ酸配列を欠き、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸が欠失してもよいＦＶＩＩＩ変異体に関する。一方の変異体においては、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個または２０個のアミノ酸が欠失する。もう一方の変異体においては、２７個、２６個または２５個のアミノ酸が欠失する。ｒｐＦＶＩＩＩｖ３変異体において、ＤＩＧＤＹＹＤＮＴＹＥＤＩＰＧＦＬＬＳＧＫＮＶＩＥＰＲ（配列番号１０）に対応する２７個のアミノ酸が欠失する。
【００３３】
さらに、本発明は、単離された組換え型のＢドメイン完全欠失ＦＶＩＩＩ変異体もしくは単離された組換え型のＢドメイン部分欠失ＦＶＩＩＩ変異体であって、図２に示すヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸７１４〜７４０または配列番号８のアミノ酸７１４〜７４０に対応する２７個のアミノ酸配列を欠き、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸が欠失してもよいＦＶＩＩＩ変異体に関する。一方の変異体においては、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個または２０個のアミノ酸が欠失する。もう一方の変異体においては、２７個、２６個または２５個のアミノ酸が欠失する。ヒトＦＶＩＩＩｖ３変異体（ｒｈＦＶＩＩＩｖ３）において、ＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲ（配列番号１１）に対応する２７個のアミノ酸が欠失する。
【００３４】
さらに、本発明は、単離された組換え型のＢドメイン完全欠失ＦＶＩＩＩ変異体もしくは単離された組換え型のＢドメイン部分欠失ＦＶＩＩＩ変異体であって、図２に示すイヌ第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸７１４〜７４０または配列番号９のアミノ酸７０８〜７３４に対応する２７個のアミノ酸配列を欠き、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸が欠失してもよいＦＶＩＩＩ変異体に関する。一方の変異体においては、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個または２０個のアミノ酸が欠失する。もう一方の変異体においては、２７個、２６個または２５個のアミノ酸が欠失する。イヌＦＶＩＩＩｖ３変異体（ｒｃＦＶＩＩＩｖ３）において、ＮＩＤＤＹＹＥＤＴＹＥＤＩＰＴＰＬＬＮＥＮＮＶＩＫＰＲ（配列番号１２）に対応する２７個のアミノ酸が欠失する。
【００３５】
かかる変異体は、インタクトな２７個のアミノ酸配列を含む類似の変異体と比較した時に、上昇した比活性を有する。好ましくは、この比活性は、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％または６０％超増加する。
【００３６】
本明細書で使用される「比活性」という用語は、ヒト第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿の凝固欠陥を補正する活性を表す。比活性は、ヒト第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿の凝固時間を正常ヒト血漿の凝固時間と比較する標準アッセイにおいて、総第ＶＩＩＩ因子変異体１ミリグラムあたりの凝固活性の単位で測定される。高純度のＦＶＩＩＩ濃縮物についてＦＤＡが承認するＦＶＩＩＩ製品の力価を測定するのに適切な標準アッセイは、一段階凝固アッセイ（ｏｎｅ−ｓｔａｇｅ  ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ａｓｓａｙ）と呼ばれる（ＯＳＣＡ；実施例５；Ｌａｎｇｄｅｌｌ  ＲＤ，Ｗａｇｎｅｒ  ＲＨ，Ｂｒｉｎｋｈｏｕｓ  ＫＭ．，Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｎ  ｏｎｅ−ｓｔａｇｅ  ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ｔｅｓｔｓ：ａ  ｐｒｅｓｕｍｐｔｉｖｅ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  ａｎｄ  ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｏｎｅ−ｓｔａｇｅ  ａｎｔｉｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ  ａｓｓａｙ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ，１９５３；４１：６３７−４７；Ｂｒａｎｄ  ＪＴ，Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ：ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ，Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ，１９９３；１１７：４８−５１；Ｐｒｅｓｔｏｎ  ＦＥ，Ｋｉｔｃｈｅｎ  Ｓ，Ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ａｓｓａｙｓ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，１９９８；４：６５１−３；米国臨床研究所規格委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＮＣＣＬＳ  ＵＳＡ）），Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｏａｇｕｌａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ；認可されたガイドライン，ＮＣＣＬＳ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ  Ｈ−４８−Ａ  １９９７；１７：１−３６を参照されたい）。試料中に存在するＦＶＩＩＩタンパク質の量は、例えば、ＳＥＣ  ＨＰＬＣ（サイズ排除高速液体クロマトグラフィー）により測定することができる。
【００３７】
第ＶＩＩＩ因子活性の１ユニットは、正常ヒト血漿１ミリリットル中に存在する活性である。このアッセイにおいて、血餅形成時間が短いほど、アッセイされる第ＶＩＩＩ因子の活性は高い。ブタ第ＶＩＩＩ因子は、ヒト第ＶＩＩＩ因子アッセイにおいて凝固活性を有する。
【００３８】
本発明に沿って、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、互換的に使用されている。
【００３９】
「図２に示すアミノ酸７１６〜７４２に対応するアミノ酸配列を欠く」とは、本発明のＦＶＩＩＩ変異体中のアミノ酸７１６および７４２、ならびにこれらの位置の間のアミノ酸が欠失している、すなわち、含まれないことを意味する。したがって、このアミノ酸ストレッチは、本発明のＦＶＩＩＩ変異体が欠いている２７個のアミノ酸からなる。
【００４０】
本発明の第ＶＩＩＩ因子変異体は、本明細書全体で「ＦＶＩＩＩ変異体（複数可）」もしくは「ＦＶＩＩＩｖ３」または「ｒＦＶＩＩＩｖ３」と命名される。これらは、ブタ、ヒト、イヌ、マウス、またはヒトもしくは動物の治療に適している任意の他の起源のものであり得る。図２は、ヒト、ブタ、マウスおよびイヌ起源のＦＶＩＩＩ配列の配列アラインメントを示す。
【００４１】
本発明のＦＶＩＩＩ変異体において欠失している配列は、太字かつ二重下線で強調されている。このアミノ酸ストレッチは、例えば、ブタまたはヒトの配列と、さらなる種のＦＶＩＩＩ配列を整列させ、本特許出願の図２のようなアミノ酸７１６〜７４２に対応するアミノ酸を取得することによって、他の種のＦＶＩＩＩ変異体について当業者が同定することができる。
【００４２】
本発明の実施形態は、ブタ、ヒトまたはイヌ起源のＦＶＩＩＩ変異体に関する。
【００４３】
一実施形態において、本発明に係るＦＶＩＩＩ変異体は配列番号１の配列を含むか、またはその変異体は、配列番号１と少なくとも９０％同一である配列を含む。１０％の変異性は、この欠失しているアミノ酸ストレッチの外側の配列に影響する、すなわち、この変異体は、ＤＩＧＤＹＹＤＮＴＹＥＤＩＰＧＦＬＬＳＧＫＮＶＩＥＰＲ（配列番号１０）、図２に示すブタ第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸７１６〜７４２もしくは配列番号７のアミノ酸７１４〜７４０に対応するアミノ酸配列を完全に欠いていると理解される。
【００４４】
さらなる実施形態において、本発明のＦＶＩＩＩ変異体は配列番号２の配列を含むか、またはその変異体は、配列番号２と少なくとも９０％同一である配列を含む。かさねて、この変異体は、図２に示すヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸７１４〜７４０もしくは配列番号８のアミノ酸７１４〜７４０に対応するアミノ酸配列ＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲ（配列番号１１）を完全に欠いていると理解される。
【００４５】
さらなる実施形態において、本発明のＦＶＩＩＩ変異体は配列番号３の配列を含むか、またはその変異体は、配列番号３と少なくとも９０％同一である配列を含む。かさねて、この変異体は、図２に示すイヌ第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸７１４〜７４０もしくは配列番号９のアミノ酸７０８〜７３４に対応するアミノ酸配列ＮＩＤＤＹＹＥＤＴＹＥＤＩＰＴＰＬＬＮＥＮＮＶＩＫＰＲ（配列番号１２）を完全に欠いていると理解される。
【００４６】
本発明のＦＶＩＩＩ変異体は、配列番号７、配列番号８または配列番号９の配列と少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８または９９．９％同一である配列も含み得る。
【００４７】
２つのポリペプチド／タンパク質の同一性パーセントを決定するために、これらのアミノ酸配列を最適な比較目的のために整列させる（例えば、ギャップを、第２のアミノ酸配列との最適なアラインメントのために、第１のアミノ酸配列の配列内に導入することができる）。その後、対応するアミノ酸の位置におけるアミノ酸残基を比較する。第１の配列内の位置を、第２の配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基が占める場合、これらの分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、これらの配列が共有する同一の位置の数の関数（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／位置の総数（例えば、重なる位置）×１００）である。
【００４８】
２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい、非限定的な例として、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムが挙げられ、これは、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７で変更された。かかるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実行し、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を取得することができる。ＢＬＡＳＴ変異体検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実行し、本発明の変異体分子と相同なアミノ酸配列を取得することができる。比較目的のためのギャップアラインメントを取得するために、ギャップＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載のとおりに利用できる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いて、分子間の距離関係を検出する反復検索を実行することができる。ＢＬＡＳＴプログラム、ギャップＢＬＡＳＴプログラム、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。配列比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい、非限定的な例として、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７のアルゴリズムが挙げられる。かかるアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（２．０版）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティー４を用いることができる。局所配列の類似性およびアラインメントの領域を同定するのに有用な、さらなる別のアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８に記載されているＦＡＳＴＡアルゴリズムである。ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を比較するためにＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いる場合、ＰＡＭ１２０重量残基表を、例えば、ｋ−ｔｕｐｌｅ値２と共に用いることができる。
【００４９】
２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップを許容しようとしまいと、上記に記載のものと同様の手法を用いて決定することができる。同一性パーセントを計算する際に、完全一致のみが数えられる。
【００５０】
本発明のＦＶＩＩＩ変異体は、部分的にまたは完全にＢドメインを欠失し得る。これは、Ｂドメイン全体が欠失するか、またはＢドメインの一部がこのＦＶＩＩＩ変異体に保持されるかのいずれかを意味する。Ｂドメインの残りの（保持される）部分は、例えば、Ｂドメインの２０個、１５個、１２個、１０個または５個のＮ末端アミノ酸および２０個、１５個、１２個、１０個または５個のＣ末端アミノ酸から選択され、互いにインフレームで融合される。
【００５１】
したがって、好ましくは、本発明のＢドメイン部分欠失ＦＶＩＩＩ変異体において、約９００個のアミノ酸のＢドメインのかなりの部分が除去される。本発明の実施形態において、これらのＦＶＩＩＩ変異体中に存在するＢドメインの５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満がとどまる。
【００５２】
本発明の実施形態において、このＢドメインの残りの部分は、配列番号４、配列番号５または配列番号６からなる配列から選択される。
【００５３】
さらなる態様において、本発明は、上記に記載のポリペプチド／タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドはＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子であり得、そのヌクレオチド配列が、遺伝暗号の既知の関係に従って、本発明の変異体のアミノ酸配列について宿主細胞に暗号情報を例示する。
【００５４】
さらなる態様において、本発明は、上記に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。
【００５５】
「発現ベクター」は、多くの場合、環状構造であり、所望の宿主細胞において自己複製する能力または宿主細胞ゲノムに組み込まれる能力を有し、適切な部位かつ適切な向きでベクター配列に挿入されるコードＤＮＡの発現を可能にする特定の周知の特徴も有するＤＮＡエレメントである。かかる特徴には、コードＤＮＡの転写開始を指示する１つまたは複数のプロモーター配列、ならびにエンハンサーおよびポリアデニル化部位などの他のＤＮＡエレメント（全て当技術分野で周知である）が含まれ得るが、これらに限定されない。「発現ベクター」という用語は、発現ベクターの配列内に挿入される、発現させられるＤＮＡコード配列を有するベクター、および挿入部位に対して配置されるため、その部位に挿入される任意のコードＤＮＡを発現するように機能することができる必須発現制御エレメントを有するベクター（全て当技術分野で周知である）の両方を示すために用いられる。したがって、例えば、プロモーターを欠くベクターは、コードＤＮＡに結合させたプロモーターの挿入によって発現ベクターになることができる。本明細書で使用される発現ベクターは、ウイルスベクターでもあり得る。
【００５６】
本発明の組換えＦＶＩＩＩ変異体の発現は、好ましくは、哺乳類細胞培養において行われる。
【００５７】
したがって、さらなる態様において、本発明は、上記に記載の発現ベクターを含む哺乳類細胞に関する。例えば、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞およびＢＨＫ細胞（ベビーハムスター腎臓細胞）は、本発明の文脈において、適切な宿主細胞である哺乳類細胞である。
【００５８】
本発明の別の態様にしたがって、本発明のＦＶＩＩＩ変異体を産生する方法は、以下のステップを含む：
ａ．上記に記載の哺乳類細胞を培養するステップ；および
ｂ．この哺乳類細胞からこのＦＶＩＩＩ変異体を単離するステップ。
【００５９】
一実施形態において、この方法は、さらに、以下のステップを含む；
ｃ．適切な賦形剤と共に、第ＶＩＩＩ因子変異体を医薬組成物に製剤化するステップ。
【００６０】
ヒトまたは動物の投与に適する賦形剤は、例えば、医薬的に安定な化合物、防腐剤、送達ビヒクル、および／または担体ビヒクルである。第ＶＩＩＩ因子製品に適切な１つの製剤は、例えば、ＷＯ０３／０８０１０８に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【００６１】
さらなる態様において、本発明は、本発明のＦＶＩＩＩ変異体を含む医薬組成物に関する。
【００６２】
本発明のさらなる態様は、第ＶＩＩＩ因子欠乏症を患う患者を治療する方法であって、治療有効量の本発明のＦＶＩＩＩ変異体を、それを必要としている患者に投与することによって、前記患者の第ＶＩＩＩ因子欠乏症を治療することを含む方法に関する。
【００６３】
本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、ＦＶＩＩＩ欠乏症を有し、ＦＶＩＩＩ変異体の医薬組成物を受け入れている患者の血漿中のＦＶＩＩＩレベルを意味し、これは、この患者において測定可能な改善または保護効果を示す（例えば、出血を止める）のに十分である。ＦＶＩＩＩ欠乏症を有する患者は、一般的に、先天性血友病Ａ患者であるが、「後天性血友病」と診断されるそれらの対象も含み、その症状において、先天性血友病ではない患者は、かれらのＦＶＩＩＩに対する阻害抗体を自発的に発生させ、深刻なＦＶＩＩＩ欠乏症を引き起こす。
【００６４】
本発明は、第ＶＩＩＩ因子欠乏症を治療するのに使用する本発明のＦＶＩＩＩ変異体にも関する。
【００６５】
必要に応じて、治療は、この組成物の単回静脈内投与または長期間にわたる定期的投与もしくは連続投与の形態をとり得る。好ましくは、このＦＶＩＩＩ変異体の投与は、静脈内経路によるものである。
【００６６】
本明細書で使用される「第ＶＩＩＩ因子欠乏症」には、欠陥のある第ＶＩＩＩ因子の産生によるか、第ＶＩＩＩ因子の不十分な産生もしくは全く産生されないことによるか、または阻害物質による第ＶＩＩＩ因子の部分阻害もしくは完全阻害によって引き起こされる凝固活性の欠乏が含まれる。血友病Ａは、Ｘ連鎖遺伝子における欠陥、およびＸ連鎖遺伝子がコードする第ＶＩＩＩ因子変異体の欠如または欠乏に起因する第ＶＩＩＩ因子欠乏症のタイプである。
【００６７】
本発明のＦＶＩＩＩ変異体を用いて、血友病患者の第ＶＩＩＩ因子欠乏症による制御不能の出血（例えば、関節内出血、頭蓋内出血、または消化管出血）を治療する。
【００６８】
本発明の一実施形態において、この第ＶＩＩＩ因子欠乏症は血友病Ａである。
【００６９】
別の実施形態において、この第ＶＩＩＩ因子欠乏症は後天性血友病である。
【００７０】
一実施形態において、この第ＶＩＩＩ因子欠乏症は、ヒトＦＶＩＩＩ抗体を発生している患者において治療される。
【００７１】
上述したとおり、本発明のＦＶＩＩＩ変異体は、増加した比活性を有する。したがって、本発明に従ってＶＩＩＩ欠乏症を治療するために、ＦＶＩＩＩ変異体の量を減少させて投与することができる。ＦＶＩＩＩ変異体の量は、本発明の最高で２７個のアミノ酸欠失を含まないＦＶＩＩＩ製品による治療と比較して、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％減少させることができる。
【００７２】
ＦＶＩＩＩ変異体療法の量を減少させることは、期待される免疫原性の低下という利点を有し、すなわち、患者においてＦＶＩＩＩ補充療法に対する阻害抗体の生成の可能性が著しく低下することが期待される。
【００７３】
一実施形態において、本発明の第ＶＩＩＩ因子変異体は、２００μｇ／用量、１５０μｇ／用量、１４５μｇ／用量、１４０μｇ／用量、１３６μｇ／用量、または１３０μｇ／用量以下の量で投与される。
【００７４】
ここで本発明を十分に記載しているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、かつ過度の実験をせずに、同じことが、同等のパラメーター、濃度および条件の広い範囲内で行われ得ることを当業者は理解するであろう。
【００７５】
本発明は、その特定の実施形態に関して記載されているが、さらなる変更が可能であることが理解されるであろう。本出願は、一般的に、本発明の原則に従い、本発明が属する技術の範囲内の公知のまたは習慣的な実施の範囲内にあり、本明細書中に前述された本質的な特徴に適用され得、添付の特許請求の範囲に従うような本開示からの逸脱を含む本発明の全てのバリエーション、使用または適応を包含することが意図される。
【００７６】
学術論文、抄録、公開もしくは非公開の米国特許出願、公開もしくは非公開の外国特許出願、発行された米国特許もしくは外国特許、または任意の他の参考文献を含む、本明細書に引用される全ての参考文献は、これらの引用される参考文献中に提示される全てのデータ、表、図およびテキストを含めて、参照により本明細書に完全に組み込まれる。さらに、本明細書に引用される参考文献中に引用される参考文献の内容全体も、参照により完全に組み込まれる。
【００７７】
公知の方法のステップ、従来の方法のステップ、公知の方法または従来の方法への言及は、本発明の全ての態様、発明を実施するための形態または実施形態が、従来の技術の中で開示、教示、または示唆されることを認めるものではない。
【００７８】
特定の実施形態の上記の説明は、他の人が、（本明細書に引用される参考文献の内容を含む）当業者の技術内の知識を適用することによって、過度の実験をせず、本発明の一般概念を逸脱することなく容易に変更し、かつ／またはかかる特定の実施形態の様々な適用に適合させることができるほど十分に本発明の一般的な性質を明らかにするであろう。したがって、かかる適合および変更は、本明細書に提示される教示および指針に基づいて、開示される実施形態の同等物の範囲内にあると意図される。本明細書の専門用語または用語は、当業者の知識と組み合わせて、本明細書に提示される教示および指針を考慮して当業者によって解釈されるべきであるように、本明細書の用語または専門用語は、説明のためのものであり、限定するためのものではないことが理解されるべきである。
【００７９】
実施例
実施例１：組換え型のブタＢドメイン部分欠失ＦＶＩＩＩ（ＯＢＩ−１）の発現および３つの変異体タンパク質（ｒｐＶＩＩＩｖ１、ｒｐＶＩＩＩｖ２およびｒｐＶＩＩＩｖ３）の単離
ＢＨＫ細胞内でのＯＢＩ−１の発現を、基本的には、米国特許第６，４５８，５６３号に記載されるとおりに行った。３つの変異体（ｒｐＶＩＩＩｖ１、ｒｐＶＩＩＩｖ２およびｒｐＶＩＩＩｖ３）を、産生された物質内で検出した。これらの変異体を単離し、イオン交換クロマトグラフィーにより９５％を上回る純度まで精製した。精製には、ＭｏｎｏＱ  ＨＲ１０／１０半分取陰イオン交換カラム（現在は、ＭｏｎｏＱ  １０／１００  ＧＬ、ＧＥヘルスケアライフサイエンス社、カタログ番号１７−５１６７−０１）を用いるＡＫＴＡエクスプローラーシステム（ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ）（ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０、ＧＥヘルスケアライフサイエンス社、カタログ番号１７−５１６７−０１）を用いた。溶出を、２つの以下の緩衝液を用いる勾配で行った：
緩衝液Ａ：１０ｍＭトリス、ｐＨ７．０、０．０１％ポリソルベート８０
緩衝液Ｂ：緩衝液Ａおよび１Ｍ塩化ナトリウム
精製法の特徴を表１にまとめる。
【００８０】
【表１】
0005922141.tif 000002
【００８１】
実施例２：変異体３（ｒｐＶＩＩＩｖ３）は、変異体１および変異体２よりも非常に高い比活性を有する
各変異体の比活性を、方法ごとにＳＥＣ  ＨＰＬＣによって測定する場合、一段階凝固アッセイ（ＯＳＣＡ）によって評価した力価をタンパク質濃度で割ることにより評価した。ＯＳＣＡ法およびＳＥＣ  ＨＰＬＣ法を、実施例５の「材料および方法」に記載したとおりに行った。
【００８２】
結果
これらの比活性についての結果を表２に示す。
【００８３】
【表２】
0005922141.tif 000003
【００８４】
ＯＳＣＡアッセイにおける変異体３の、有意により高い比活性の観察結果は、特徴的であり、一慣性がある。ＯＳＣＡ法は、ヒトにおける凝固プロセスに対して予測的であり、かつ代表的であるので、変異体３は有意な値の産物であることが期待される。力価が１．５〜２．０倍増加すると、患者に投与されるＦＶＩＩＩの量が減少するため、免疫学的副作用の発生を間接的に減少させる可能性があることが期待される。
【００８５】
実施例３：ｒｐＦＶＩＩＩｖ３の配列決定
精製したｖ３の配列を、ＭａｓｓＬｙｎｘ  ４．０（ウォーターズ社（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ミルフォード、マサチューセッツ州）を実行し、Ｑ−ＴＯＦ  Ｕｌｔｉｍａ質量分析計でのＬＣＭＳ（液体クロマトグラフィー質量分析法）およびＬＣＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー質量分析法／質量分析法）が続くペプチドマップにより決定した。
【００８６】
約２５０μｇの変異体３を、アミコン社の、１０，０００  ＭＷＣＯフィルターを備えるセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）ＹＭ−１０濃縮器（ミリポア社、ビレリカ、マサチューセッツ州）を用いて、１００μｌ未満の量まで濃縮した。これらの試料を、６ＭグアニジンＨＣｌ／０．００２Ｍ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）／０．０２Ｍ  トリス緩衝液  ｐＨ８  ４５０μｌと混合し、２．０ｍＬのポリプロピレンチューブに移した。１Ｍ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール）を、１０ｍＭの最終濃度になるまで各試料に加え、３７℃で１時間インキュベートした。還元後、２Ｍのヨードアセトアミドを、２０ｍＭの最終濃度になるまで各チューブに加え、室温でさらに１時間インキュベートした。還元し、アルキル化した試料を透析カセットに移し、１．０Ｍの尿素を含む５０ｍＭの重炭酸アンモニウム透析緩衝液（ｐＨ８）１Ｌに対して１時間透析した。次いで、これらの試料を、一定の攪拌を維持しながら、室温で一晩、透析緩衝液１Ｌに対して透析した。透析後、最終的な体積は、それぞれ約０．５ｍＬであった。試料を、２つのアリコート１２５μｇに分けた。
【００８７】
透析後、このタンパク質試料は、トリプシンによるタンパク質消化に最適なマトリックスに含まれていた。トリプシンを、酵素対基質の比を１：２０（ｗ：ｗ）にして各試料に加え、３７℃で８時間インキュベートした。全ての試料をＨＰＬＣバイアルに移し、ＨＰＬＣ−ＭＳによって分析した。
【００８８】
還元し、アルキル化したタンパク質を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８逆相カラム（グレース社、ディアフィールド、イリノイ州）に注入した。この試料注入の前に、ブランク試料（移動相Ａ；０．２％（ｖ：ｖ）ギ酸を含む脱イオン水）を分析し、カラムを平衡化して、干渉ピークが存在しないことを実証した。
【００８９】
質量分析データを、陽イオンモードでエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を用いてＱ−ＴＯＦ  ＡＰＩ−ＵＳ質量分析計またはＱ−ＴＯＦ  Ｕｌｔｉｍａ質量分析計（ウォーターズ社、ミルフォード、マサチューセッツ州）で収集した。試料分析前に、この質量分析計を、１７５〜１２８５ｍ／Ｚの範囲をカバーするＧｌｕ−フィブリノゲンペプチドのフラグメントイオンに５次フィット（５ｔｈ  ｏｒｄｅｒ  ｆｉｔ）を用いて較正した。仕様にパスするための較正では、５ｐｐｍ未満のこれらのペプチドフラグメントの質量のＲＭＳ（二乗平均平方根）誤差が必要とされた。ソフトウェアパッケージＭａｓｓｌｙｎｘ  ４．０（商標）のＳＰ２およびＳＰ４（ウォーターズ社、ミルフォード、マサチューセッツ州）を、データの取得および解析のために用いた。
【００９０】
ＭＳおよびＭＳ／ＭＳの両方のデータを、単独の液体クロマトグラフィー（ＬＣ）ランを用いて収集した。完全な質量分析計（ＭＳ）サーベイスキャンを２００〜１９５０ｍ／ｚで収集した。
【００９１】
ｒｐＦＶＩＩＩの配列を決定すると、配列番号    １に一致した。この配列は、ＯＢＩ−１配列と比較すると、２７個のアミノ酸欠失を含む。
【００９２】
実施例４：ｒｐＦＶＩＩＩｖ３は、他の既知のＦＶＩＩＩ製品よりも高い比活性を有する。
【００９３】
ｒｐＦＶＩＩＩｖ３の比活性を、３種類の市販のＦＶＩＩＩ製品、すなわち、Ｘｙｎｔｈｉａ（登録商標）（ワイス・ファーマシューティカルズ（Ｗｙｅｔｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）社（フィラデルフィア、ペンシルバニア州）の組換え型のＢドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩ）、Ｋｏｇｅｎａｔｅ  ＦＳ（登録商標）（Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（タリータウン、ニューヨーク州）の全長ヒトＦＶＩＩＩ）およびＡｄｖａｔｅ（登録商標）（バクスター社（ウェストレイク・ビレッジ、カリフォルニア州））の全長ヒトＦＶＩＩＩ、ならびに現在臨床開発中のＯＢＩ−１（組換え型のＢドメイン部分欠失ブタＦＶＩＩＩ）、およびＢドメイン欠失イヌ第ＶＩＩＩ因子（Ｄｅｎｉｓｅ  Ｅ．Ｓａｂａｔｉｎｏ  ｅｔ．ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃａｎｉｎｅ  Ｂ−Ｄｏｍａｉｎ−ｄｅｌｅｔｅｄ  ＦＶＩＩＩ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｈｉｇｈ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｓ  ｓａｆｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃａｎｉｎｅ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ａ  ｍｏｄｅｌ，Ｂｌｏｏｄ，１２  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００９，Ｖｏｌ．１１４，Ｎｏ．２０，ｐｐ．４５６２−４５６５）と比較した。
【００９４】
ＯＢＩ−１およびｒｐＦＶＩＩＩｖ３の比活性を、実施例５に記載の方法により測定した。
【００９５】
これらの結果を表３および図１に示す。その比活性の増大により、１用量あたりより低量のｐｒＶＩＩＩｖ３を、患者に投与することができる。一用量あたりのこの減少は、免疫原性の低下につながること、すなわち、患者が阻害抗体を発生する可能性がより低くなることが期待される。
【００９６】
【表３】
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【００９７】
結論として、これらの結果は、ＦＶＩＩＩ補充療法について、ｒｐＶＩＩＩｖ３が、現在市販されているかまたは臨床開発中の試験製品よりも有意により高い比活性を有することを示す。
【００９８】
特に、ＯＢＩ−１中ではなくｒｐＶＩＩＩｖ３中に存在する２７個のアミノ酸の欠失が、（ＯＳＣＡアッセイにより測定した場合）比活性を５０％増加させることは非常に驚くべきことである。
【００９９】
実施例５：材料および方法
一段階凝固アッセイ−ＯＳＣＡ−方法
１．１．０ユニット／ｍＬの力価を目標とするために、標準品をアッセイ緩衝液（１Ｌあたり１０％の第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿＋Ｏｗｒｅｎ’ｓ  Ｖｅｒｏｎａｌ緩衝液、２８ミリモルのバルビタールナトリウムおよび１２５ミリモルのＮａＣｌ、ｐＨ７．３５）で希釈する。
２．目標となる力価まで試験標準物質、活性対照および試料をアッセイ緩衝液で希釈する。
３．Ｓｙｍｅｘ装置（Ｓｙｓｍｅｘ  ＣＡ−１５００、凝固分析器、デイドベーリング社のカタログ番号Ｂ４２６０−１５００（シーメンス社、ディアフィールド、イリノイ州））内の適切なウェルに校正標準（基準）および試薬を添加する。
４．Ｓｙｓｍｅｘ装置の外側のラックに試験標準物質、対照および試料を添加する。
５．分析の順序は、以下のとおりに、この装置内で自動的に行われる。
【０１００】
ａ．試料５μｌを、反応試験管内でアッセイ緩衝液４５μｌに希釈する。
【０１０１】
ｂ．第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿５０μｌをこの反応試験管に加える。
【０１０２】
ｃ．Ｄａｄｅ  Ａｃｔｉｎ  ＦＳ（１．０×１０−４Ｍのエラグ酸活性化因子中の精製大豆ホスファチド、デイドベーリング社、リーデルバッハ、ドイツ）で活性化した部分的トロンボプラスチン時間試薬５０μｌを、この反応試験管に加え、６０秒間インキュベートした。
【０１０３】
ｄ．塩化カルシウム（０．０２５Ｍ、デイドベーリング社、リーデルバッハ、ドイツ）５０μｌをこの反応試験管に加え、２４０秒間インキュベートした。
【０１０４】
ｅ．凝固時間は、３００秒の最大時間まで測定する。
６．その後、この凝固時間は、標準品の検量線によって生成される力価と相関させる。
【０１０５】
サイズ排除（ＳＥＣ）ＨＰＬＣ法
アジレント１１００（アジレント・テクノロジー社、サンタクララ、カリフォルニア州）またはＷａｔｅｒｓ  Ｂｉｏａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣシステム（ウォーターズ社、ミルフォード、マサチューセッツ州）を、タンパク質濃度を決定するためのサイズ排除法のために使用し、これは一般的に使用されている。用いた代表的なサイズ排除カラムは、ＧＥ社のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０．３００  ＧＬ、１０×３００ｍｍ、カタログ番号１７−５１７５−０１（ＧＥヘルスケアライフサイエンス社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）であった。全体的なアッセイプロトコールは以下のとおりである：
１．２０ｍＭ  トリス、ｐＨ７．４および０．０１％ポリソルベート８０と共に４００ｍＭのＮａＣｌを含む代表的な移動相を調製した。
【０１０６】
２．ベースラインの平衡が観察されるまで、この移動相をＨＰＬＣシステムおよびカラムに通した。
【０１０７】
３．システム適合性を確立するために標準物質を流し、各試料の一般的な実行時間は３０分であった。
【０１０８】
４．例によって、試料を、制御チャンバー温度が４℃であるオートサンプラーに添加した。
【０１０９】
５．例によって、タンパク質１、３、５、１０および２５μｇの様々な量の標準試料を含む既知濃度の較正標準を、１０μｌと５０μｌとの間の体積のカラムに添加した。
【０１１０】
６．未知濃度の試料も、例によって、３０μｌと５０μｌとの間の体積のカラムに添加した。
【０１１１】
７．ＨＰＬＣシステムを、配列セットアップに従って、自動的に試料を流すようにプログラムした。
【０１１２】
８．較正基準および未知試料のピーク面積を、励起および発光が、それぞれ２８０ｎｍおよび３４０ｎｍである蛍光検出に基づいて測定した。
【０１１３】
９．較正標準の線形回帰を作成し、未知試料の濃度をこの検量線に対して決定した。
【０１１４】
較正標準のＳＥＣプロファイルおよび検量線の線形回帰の代表的な例を図３に示す。
【０１１５】
実施例６：フォン・ヴィルブランド因子への結合
フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）は、第ＶＩＩＩ因子と複合体を形成した多量体形態（ＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体）として血漿中で循環する多機能性糖タンパク質である。このＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体は、この結合したＦＶＩＩＩを生体内の血液循環の初期のタンパク質分解から保護するのに役立つ。
【０１１６】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて、ＦＩＩＩ／ｖＷＦ複合体中のこの結合を特徴づける。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６カラム（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  １０／３００ＧＬ，ＧＥヘルスケア社、カタログ番号１７−５１７２−０１、流速＝０．５ｍＬ／分）を、その既知の生体適合性および４０００万ダルトンの高い排除限界のために選択した（移動相製剤緩衝液：２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭのトリス  ｐＨ  ７．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％ＰＳＢ−８０、１１ｍＭのショ糖、１０ｍＭのクエン酸三ナトリウム）。フォン・ヴィルブランド因子（約５００ｋＤの位置で二量体、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社のカタログ番号３０Ｃ−ＣＰ４００３Ｕ、Ｌｏｔ番号Ａ０９１２１０５０、単量体の分子量＝約２６０ｋＤ、濃度＝７７μｇ／ｍｌ）とｒｐＦＶＩＩＩ（約１６０ｋＤ）との間の分子量の違いは、これらの２種類を分離するのに十分である。
【０１１７】
結合の化学量論を、ｒｐＦＶＩＩＩの量を増加させて、一定量のｖＷＦの滴定により決定した。ｒｐＦＶＩＩＩとｖＷＦとの間の複合体形成のプロファイルを、ＳＥＣクロマトグラムおよび適切なピークの積分から決定した。上清中の得られた混合物の可溶性形態を用いて、ｒｐＦＶＩＩＩの量を増加させて、滴定からこの複合体形成の終点を決定した。ｒｐＦＶＩＩＩとｖＷＦとの間に形成されるより大きい、安定した複合体は、通常の保持時間からカラムの排除限界まで移動する。飽和が発生する場合、非結合のｒｐＦＶＩＩＩ量の増加が、ＳＥＣクロマトグラムにおいて観察される。この方法は、変異体の性質の違いや類似性を区別するために使用される。
【０１１８】
実施例７：トロンビン消化の動態
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
組換え型のブタ第ＶＩＩＩ因子（ｒｐＦＶＩＩＩ）分子は、７８．５ｋＤ分子量の軽鎖（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２、７６５−１４４８）および分子量範囲が８６．７ｋＤ（Ａ１−Ａ２）の重鎖から構成される約１６０ｋＤのヘテロ二量体である。ｒｐＦＶＩＩＩの重鎖は異種性であり、細胞からの分泌の際に形成される３つの主な変異体から構成され、ＰＡＣＥ（対塩基性アミノ酸切断酵素（Ｐａｉｒｅｄ  Ｂａｓｉｃ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｅｎｚｙｍｅ））と命名されたスブチリシンファミリーの膜結合型プロテアーゼによって切断され得る。
【０１１９】
ヒト第ＶＩＩＩ因子と同様に、ｒｐＦＶＩＩＩは、トロンビンの限定分解により活性型に変換される。ｒｐＦＶＩＩＩのトロンビン活性化は、Ａｒｇ（３７２）−Ｓｅｒ（３７３）における重鎖の切断部位に特異的である。Ａｒｇ（８０５）−Ｓｅｒ（８０６）における軽鎖の切断領域は、７６５〜８０４に及ぶ小さな４０個のアミノ酸ペプチド部分（約４．４ｋＤ）を遊離する。トロンビンによるこれらの最初の切断の組み合わせは、Ａ１（約５０ｋＤ）、Ａ２（約４０ｋＤ）、およびＡ３−Ｃ１−Ｃ２（約７０ｋＤ）と命名されるサブユニットのヘテロ三量体として、活性化された組換えブタ第ＶＩＩＩ因子を形成する。切断されたｒｐＦＶＩＩＩのＡ１サブユニットおよびＡ３−Ｃ１−Ｃ２サブユニットは、二価金属イオン依存的な結合を保持するが、Ａ２サブユニットは、主として静電相互作用によりＡ１−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２ダイマーと弱く結合する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、これらのサブユニットは、３つの異なるバンドとして示される。このｒｐＦＶＩＩＩ（２ペプチドユニット）の３ペプチドユニットへの変換効率は、この産物のトロンビン活性化に特有である。この方法は、個々の変異体間の類似点および相違点を区別する。
【０１２０】
２つの他の直交法は、ＦＶＩＩＩのトロンビン消化の動態を明らかにするために用いることができ、それを用いた。変性逆相ＨＰＬＣを用いてもよく、ピークプロファイルはＳＤＳ−ＰＡＧＥのそれと同様であると予想される。ペプチドの天然型を保持する陰イオン交換クロマトグラフィーも用いてもよい。
【０１２１】
逆相ＨＰＬＣ
機器：
１．ＨＰＬＣ  １１００シリーズ：アジレント・テクノロジー社、サンタクララ、カリフォルニア州、米国；モデル番号６１３１２Ａ、シリアル番号ＤＥ１０９０７７５３
２．Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  ５ｕｍ  ２．１×７５ｍｍカラム：アジレント・テクノロジー社、サンタクララ、カリフォルニア州、米国；品番６６０７５０−９０９、シリアル番号ＵＳＶＶ００１９８８
試薬：
１．緩衝液Ａ：水中０．１％ＴＦＡ（ＪＴ  Ｂ  Ｂａｋｅｒ、フィリップスバーグ、ニュージャージー州；カタログ番号９４７００−００、ロット番号Ｊ２３Ｊ００）
２．緩衝液Ｂ：アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ（ＪＴ  Ｂ  Ｂａｋｅｒ、フィリップスバーグ、ニュージャージー州；カタログ番号９０１７−０３、ロット番号Ｊ３８８０７）
手順：
１．１ｍｌ／分で、９９％Ａおよび１％Ｂを用いて６０分間カラムを平衡化する。
２．試料注入体積は５０μｌであり、標準品２５μｌを対照として用いた。
３．これらの試料を流すのに用いた方法の一例を表４に示す。
【０１２２】
【表４】
0005922141.tif 000005
【０１２３】
陰イオン交換クロマトグラフィー
機器：
１．ＡｌｌｉａｎｃｅＢｉｏ  ＨＰＬＣ、ウォーターズ社、ミルフォード、マサチューセッツ州、米国；モデル番号２７９６；シリアル番号Ｍ０８ＢＡ１１９９Ｍ
２．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  Ｑ  ５ｕｍ  ４．６×１００ｍｍカラム：ウォーターズ社、ミルフォード、マサチューセッツ州、米国；品番１８６００４９３１；シリアル番号５０２Ｎ１１２５６１ＶＥ０４
試薬：
緩衝液Ａ
１０ｍＭ  トリス塩基（１．２１１ｇ／Ｌ）
２ｍＭ  塩化カルシウム（０．５８８ｇ／Ｌ）
０．０１％ポリソルベート８０（１ｍｌの１０％ＰＳ−８０／Ｌ）
１Ｌまでろ水（でメスアップ）、ｐＨ７．０
緩衝液Ｂ：
１０ｍＭ  トリス塩基（１．２１１ｇ／Ｌ）
２ｍＭ  塩化カルシウム（０．５８８ｇ／Ｌ）
０．０１％ポリソルベート８０（１ｍｌの１０％ＰＳ−８０／Ｌ）
１Ｍ塩化ナトリウム（５８．４４ｇ／Ｌ）
１Ｌまでろ水（でメスアップ）、ｐＨ７．０
手順：
１．０．５ｍｌ／分で、７０％Ａおよび３０％Ｂを用いて６０分間カラムを平衡化する。
２．試料注入体積は５０μｌであり、標準品１０μｌを対照として用いた。
３．これらの試料を流すのに用いた方法の一例を表５に示す。
【０１２４】
【表５】
0005922141.tif 000006
【０１２５】
当業者は、これらのおよび他の方法を用いて、本明細書に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質の理解に達することができることを知っており、認識するであろう。
【図２ａ】
0005922141.tif 000007
【図２ｂ】
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【図２ｃ】
0005922141.tif 000009
【図２ｄ】
0005922141.tif 000010
【図２ｅ】
0005922141.tif 000011
【図１】
0005922141.tif 000012
【図３】
0005922141.tif 000013
【配列表】
0005922141000001.app