(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原性ポリペプチドをコードする導入遺伝子配列を含むレンチウイルスベクターであって、導入遺伝子配列がＭＨＣクラスＩプロモーターの転写制御下にある、レンチウイルスベクター。
【請求項２】
コードされた免疫原性ポリペプチドに対し、導入遺伝子配列がＣＭＶプロモーターの転写制御下にあるベクターより大きなＣＴＬ応答をインビボで誘導する、請求項１のレンチウイルスベクター。
【請求項３】
ＭＨＣクラスＩプロモーターが、ＨＬＡ−Ａ２プロモーター、ＨＬＡ−Ｂ７プロモーター、ＨＬＡ−Ｃｗ５プロモーター、ＨＬＡ−Ｆ、またはＨＬＡ−Ｅプロモーターである、請求項１または２に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項４】
前記ＭＨＣクラスＩプロモーターの配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の配列と９５％を超える同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項１または２に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項５】
Ｕ３のプロモーターおよびエンハンサーが欠失しているＬＴＲ、レンチウイルス由来のｃＰＰＴ／ＣＴＳ配列、Ψ（プサイ）配列、または２つのレンチウイルスＬＴＲを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項６】
レンチウイルスベクターがエンハンサーを含有しない、請求項１〜５のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項７】
前記免疫原性ポリペプチドが、ＨＩＶウイルス由来のＧａｇ、Ｐｏｌおよび／またはＮｅｆタンパク質由来の抗原、または少なくとも１つの腫瘍抗原を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項９】
レンチウイルスベクター粒子の作製方法であって、
ａ）適切な宿主細胞に請求項１〜７のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクターをトランスフェクトするステップと、
ｂ）前記宿主細胞に、レトロウイルスの少なくとも構造タンパク質およびポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするウイルスＤＮＡ配列を含有するパッケージングプラスミドベクターをトランスフェクトするステップと、
ｃ）前記レンチウイルスベクターの発現およびレンチウイルスベクター粒子へのパッケージングを得るために、ステップｂ）でトランスフェクトした宿主細胞を培養するステップと、
ｄ）ステップｃ）で培養した宿主細胞によるレンチウイルスベクターの発現およびパッケージングの結果生じるレンチウイルスベクター粒子を回収するステップと
を含む、方法。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスベクター粒子。
【請求項１１】
少なくとも以下の配列エレメント：
ａ）ｃＰＰＴ／ＣＴＳポリヌクレオチド配列と、
ｂ）Ｕ３のプロモーターおよびエンハンサーが欠失しているＬＴＲと、
ｃ）ＭＨＣクラスＩプロモーターの制御下の導入遺伝子配列と
を含むレンチウイルスベクター粒子。
【請求項１２】
前記プロモーター配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５のプロモーター配列と９５％を超える同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項１１に記載のレンチウイルスベクター粒子。
【請求項１３】
医薬品またはワクチンとして使用するための、請求項１〜７および１１〜１２のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えワクチン技術の分野の発明であり、治療および予防ワクチンとして使用することができるレンチウイルスベクターの改良に関する。ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣＩ）プロモーターを含有する該ベクターは、他のベクターに比べて改良された特徴を提供する。
【背景技術】
【０００２】
組換えワクチンは、改変ウイルスを作製するためのウイルスゲノムの改変を可能にする組換えＤＮＡ技術の進歩に伴い開発されてきた。このようにして、宿主で特異的免疫応答を発生させるために、感染すると標的細胞で発現される免疫原性タンパク質をコードするように遺伝子配列を非病原性ウイルスに導入することは可能であった。
【０００３】
このようなワクチンは、ワクチン技術における大きな進歩となっている（Ｋｕｔｚｌｅｒら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ、９（１０）：７７６〜７８８頁、２００８）。特に、これらは伝統的なワクチンに比べて、生（弱毒化）ウイルスを回避し、不活化ワクチンの製造に伴うリスクを排除する利点を有する。
【０００４】
改変レトロウイルス（レトロウイルスベクター）を用いる遺伝子送達は、１９８０年代前半にＭａｎｎら（Ｃｅｌｌ、３３（１）：１５３〜９頁、１９８３）により紹介された。最も一般的に使用されるオンコレトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）に基づく。該ウイルスは、ポリタンパク質Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖが作製される単純なゲノムを有し、ウイルスの複製にトランスで必要とされる（Ｂｒｅｃｋｐｏｔら、２００７、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、１４（１１）：８４７〜６２頁；Ｈｅら  ２００７、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、６（６）：９１３〜２４頁）。シスで通常必要とされる配列は、長末端反復配列（ＬＴＲ）ならびにこの近接：組み込みに必要とされる逆方向反復（ＩＲまたはａｔｔ部位）、パッケージング配列Ψ、トランスポートＲＮＡ結合部位（プライマー結合部位、ＰＢＳ）、および逆転写に関与する幾つかの付加配列（ＬＴＲ内の反復Ｒ、およびプラス鎖開始に必要なポリプリントラクト、ＰＰＴ）である。複製欠損レトロウイルスベクターを生成するには、一般に、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を完全に欠失させ、発現カセットと置き換える。
【０００５】
レンチウイルスゲノムに由来するレトロウイルスベクター（すなわちレンチウイルスベクター）は、他のウイルス系に比べて幾つかの利点を示すため、遺伝子治療および免疫療法目的の両方に対する有望なツールとして現れた。特に、レンチウイルスベクター自体毒性でなく、他のレトロウイルスと異なりレンチウイルスは、非分裂細胞、特に樹状細胞を形質導入することができ（Ｈｅら  ２００７、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、６（６）：９１３〜２４頁）、内因性経路を通じた抗原提示を可能にする。
【０００６】
レンチウイルスは、遺伝子組成の類似性、複製の分子機構、および該ウイルスの宿主との生物学的相互作用により連結される。レンチウイルスは、長期の不顕性感染後に知らぬ間に始まりゆっくりと進行するスロー病（ｓｌｏｗ  ｄｉｓｅａｓｅ）症候群の病原体として最もよく知られ、故に、レンチウイルスは「スロー」ウイルスと呼ばれている（Ｎａｒａｙａｎら、１９８９、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ、７０（７）：１６１７〜３９頁）。レンチウイルスは、全てのレトロウイルスと同じ基本構成を有するが、インビボでのレンチウイルス複製において重要な役割を果たすアクセサリー遺伝子（例えば、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆ、ｔａｔ、およびｒｅｖ）の存在のためより複雑である。
【０００７】
レンチウイルスはレトロウイルス科のスローウイルス属に相当し、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ感染性脳炎ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）を含む。レンチウイルスは宿主中でいつまでも持続し得、生涯にわたる感染の過程において可変的な速度で継続的に複製し得る。宿主における該ウイルスの持続複製は、宿主防御を回避する該ウイルスの能力に依存する。
【０００８】
組換え組み込みレンチウイルスベクターの設計は、レンチウイルスのシス作用性配列とトランス作用性配列の分離に基づく。非分裂細胞への効率的な形質導入は、レンチウイルスゲノム中の２つのシス作用性配列、セントラルポリプリントラクト（ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）（ｃＰＰＴ）およびセントラルターミネーション配列（ｃｅｎｔｒａｌ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＣＴＳ）の存在を必要とする。これらは、樹状細胞（ＤＣ）を含む非分裂細胞の核への遺伝子移入の効率を最大化する、セントラルＤＮＡ「フラップ」と呼ばれる３本鎖ＤＮＡ構造の形成をもたらす（Ｚｅｎｎｏｕら、２０００、Ｃｅｌｌ、１０１（２）１７３〜８５頁；Ａｒｈｅｌら、２００７、ＥＭＢＯ  Ｊ、２６（１２）：３０２５〜３７頁）。
【０００９】
樹状細胞は、主な機能が抗原を提示し免疫応答を開始することである抗原提示細胞（ＡＰＣ）の主要なクラスを構成するため、抗原提示に最も重要である。
【００１０】
免疫応答を生じるには、抗原タンパク質が細胞によりペプチドに処理され、該ペプチドが主要組織適合遺伝子複合体タンパク質（ＭＨＣ）により細胞表面に示されなければならない。循環ＡＰＣは、ペプチド−ＭＨＣ複合体を流入領域リンパ節でＴ細胞に提示し、該リンパ節で該複合体はＴ細胞受容体と相互作用し、共刺激シグナルと共にＴ細胞を活性化する。
【００１１】
様々な研究が、レンチウイルスベクターの接種はＤＣによる抗原提示、および抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ；ＣＤ８＋  Ｔ細胞）の強い活性化をもたらすことを示している。したがって、レンチウイルスベクターは、遺伝子導入および免疫療法適用のためにこの１０年間操作されてきた。
【００１２】
レンチウイルスベクターは、ＬＴＲ  Ｕ３配列の除去により安全性が改善され、ＬＴＲ内にもともと存在するウイルスプロモーターおよびエンハンサー配列を完全に欠く「自己不活性化」ベクターをもたらした。
【００１３】
レンチウイルスベクターを含有するレンチウイルス粒子は、種々のＤＮＡプラスミド、すなわち
（ｉ）パッケージングプラスミド（少なくともＧａｇ、Ｐｏｌ  Ｒｅｖ、Ｔａｔおよび、幾つかの場合ではトランスファー構築物のパッケージングに必要な構造タンパク質および酵素タンパク質を発現する）；
（ｉｉ）トランスファープラスミド（発現カセットならびにパッケージング、逆転写、および組み込みに必要なＨＩＶシス作用性因子を含有する）；ならびに
（ｉｉｉ）エンベロープコードプラスミド（ほとんどの場合、幅広い種類の細胞、特には、ＤＣを含む主要組織適合（ＭＨＣ）抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的にすることができる混合粒子（偽型）の形成を可能にするタンパク質、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質（ＶＳＶ．Ｇ））
によりＨＥＫ  ２９３Ｔヒト培養細胞を一過性トランスフェクションしたときに組換え技術により作製することができる。
【００１４】
この手順は、トランスフェクト細胞によるレンチウイルス粒子ベクターの一過性産生を得られるようにする。しかし、レンチウイルス粒子ベクターは、パッケージング遺伝子、プロウイルスコードＤＮＡ、およびエンベロープ遺伝子を細胞ゲノムに安定に挿入して、細胞により継続的に産生することもできる。これは、一過性トランスフェクションを必要とせずに細胞によるレンチウイルス粒子ベクターの継続的産生を可能にする。当然のことながら、これらの手順の組み合わせが使用されてもよく、ＤＮＡ／プラスミドの幾つかは細胞ゲノムに組み込まれ、他は一過性トランスフェクションにより提供される。
【００１５】
非組み込みレンチウイルスベクターは、特にワクチン接種目的での挿入変異事象に関連した潜在的発癌のリスクを軽減するように設計されている：
【００１６】
抗原コード組み込みレンチウイルスベクターの直接注射に基づくワクチン接種において、関連する抗原を発現する形質導入細胞は、誘発された免疫応答の標的になり、数日または数週間以内にワクチン接種された生物から排除される。
【００１７】
さらに、自己不活性化レンチウイルスベクターにおけるウイルスプロモーターおよびエンハンサー配列の３’ＬＴＲのＵ３領域における欠失は、内因性プロモーター活性化の可能性を制限する。この欠失は、Ｘ連鎖（ＳＣＩＤ−Ｘ１遺伝子）重症免疫不全症の稀な形態に罹患している子どもにモロニーウイルスベースのレトロウイルスベクターを用いて行われた、１９９８〜１９９９年に実施されたＳＣＩＤ−Ｘ１遺伝子治療試験から得られた経験に直接対処する（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏら、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ．、２８８（５４６６）：６６９〜７２頁）。この試験中、ヒトＬＭ０２癌原遺伝子のすぐ近くでのモロニー由来レトロウイルスベクターの組み込みの結果、子ども９名中４名が白血病を発症した（Ｈａｃｅｉｎ−Ｂｅｙ−Ａｂｉｎａら、２００８、Ｊ．Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、１１８（９）：３１３２〜３１４２頁）。悪性腫瘍は、ＬＭ０２癌原遺伝子へのウイルスＵ３プロモーター／エンハンサーの近接の結果であることが示された。
【００１８】
エンハンサーは、転写活性化因子として離れて作用することができるシス作用性配列である。エンハンサーは、様々な細胞タイプ、特にＤＣにおいて導入遺伝子強発現を得るのに最も効率的であると思われるため、ウイルス由来ベクターで幅広く使用されている（Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ、Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙら、２０００、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １１（１３）：１９０１〜９頁；Ｒｏｕａｓら、２００８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９（９）：７１５〜２４頁；Ｋｉｍｕｒａら、２００７、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １５（７）：１３９０〜９頁；Ｇｒｕｈら、２００８、Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  １０（１）２１〜３２頁）。しかし、挿入変異の安全性問題を考えると、このような転写エンハンサー配列は、エンハンサー近接効果による挿入変異のリスクをなくすためにレンチウイルスベクター構築物から欠失させるべきである。このエンハンサー近接効果は、挿入変異の圧倒的に最も多い機構であり、遺伝子導入後の腫瘍形成事象のヒトまたは動物症例において記載された唯一の効果である。
【００１９】
故に、ウイルスエンハンサーを含まず、および免疫原性ペプチドをコードする導入遺伝子の十分な発現、できればＣＭＶプロモーターを用いる場合に観察されるのと同じ程度の発現を可能にするレトロウイルス、特にレンチウイルスベクターを開発する必要がある。
【００２０】
最近の研究は、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ遺伝子（ＭＨＣクラスＩＩ）（Ｋｉｍｕｒａら、２００７、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １５（７）：１３９０〜９頁）およびデクチン−２遺伝子（Ｌｏｐｅｓら、２００８、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８２（１）：８６〜９５頁）に由来するＤＣ特異的プロモーターによるウイルスプロモーターの置換について報告している。Ｌｏｐｅｓらにおいて使用されたデクチン−２遺伝子プロモーターは、推定エンハンサーおよびアデノウイルス保存配列（アデノウイルスプロモーター中の逆方向末端反復）を含有する（Ｂｏｎｋａｂａｒａら、２００１、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６７：６８９３〜６９００頁）。Ｋｉｍｕｒａらにより使用されたＭＨＣクラスＩＩ遺伝子プロモーターは、いずれの既知のエンハンサーも含有しない。
【００２１】
けれども、エンハンサーがなければ、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターは、ＤＣにおける十分な導入遺伝子発現をもたらさないことが見出された。特に、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターを含むレンチウイルスベクターは、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーで観察された免疫応答と対照的に、免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスで免疫反応を引き起こさなかった。マウスに注射後、組み込みおよび持続的導入遺伝子発現は観察されたが、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターを通じて転写されたレンチウイルスベクターは、ワクチン接種ブースト後でさえ抗原特異的ＣＤ８＋  細胞傷害性Ｔリンパ球応答を刺激しなかった。したがって、これらの研究の著者らは、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターの使用は、免疫療法との関連ではなく遺伝子置換療法のように発現の持続性が求められる適用にのみ対象となると結論付けた。
【００２２】
故に、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターは、抗原に対する免疫応答の誘導に関してレンチウイルスベクターの適切なプロモーターではない。さらに、デクチン−２プロモーターは樹状細胞特異的であり、他の非発現細胞タイプに組み込まれるベクターを排除できない。さらに、デクチン−２プロモーターは、エンハンサーを含有するようだ。故に、デクチン−２プロモーターは、安全性の理由のため、レンチウイルスベクターの良好なプロモーターではない。
【００２３】
好ましくは、免疫療法においてレンチウイルスベクターは、所望の特異的免疫応答を誘発する導入遺伝子の有効な発現を提供する。これは、樹状細胞などのＡＰＣにおいて発現が高レベルであることを必要とする。
【００２４】
レンチウイルスベクターにより形質導入された細胞は、より高度の安全性を提供するために免疫応答により排除されることも好ましい。すなわち、導入遺伝子に対して生じた免疫応答は、レンチウイルスベクターにより形質導入される細胞を排除するのに十分な宿主における免疫応答を誘発することができる。形質導入細胞の排除は、宿主におけるレンチウイルスベクターの持続性、および該ベクターの起こり得る副次的影響を排除する。形質導入細胞が排除されるためには、発現は、非樹状細胞において免疫応答による排除を可能にするレベルで求められる。
【００２５】
同時に、プロモーターは、ナイーブおよび記憶Ｔ細胞の活性化に関与する重要な細胞（すなわち、樹状細胞）による免疫刺激を最大化すべきであり、悪性腫瘍をもたらす幹細胞における挿入変異および遺伝毒性のリスクを最小化すべきである。故に、プロモーターは、樹状および他の細胞において十分に高い活性を有するべきであるが、エンハンサーを含有すべきでない。これらの基準に基づき、ＣＭＶプロモーターなどのウイルスプロモーターは、強力なエンハンサーが存在するため理想ではない。これらの基準は、次のように要約される：
１．最大の免疫応答を誘導するための、樹状細胞を含む抗原提示細胞における高発現；
２．誘導された免疫応答による排除に十分な他の形質導入細胞タイプにおける発現；および
３．挿入による影響を回避するためのエンハンサーエレメントの欠如
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
故に、改良されたベクターに対する必要性が当技術分野に存在する。本発明は、当技術分野におけるこれらの必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明は、レンチウイルスベクターを含む組成物および該ベクターの使用方法を包含する。１つの実施形態において、本発明は、免疫原性ポリペプチドをコードする導入遺伝子配列を含むレンチウイルスベクターを包含し、導入遺伝子配列はＭＨＣクラスＩプロモーターの転写制御下にあり、ベクターは、コードされた免疫原性ポリペプチドに対し、導入遺伝子配列がＣＭＶプロモーターの転写制御下にあるベクターより大きなＣＴＬ応答をインビボで誘導する。
【００２８】
好ましくは、ＭＨＣクラスＩプロモーターは、ＨＬＡ−Ａ２プロモーター、ＨＬＡ−Ｂ７プロモーター、ＨＬＡ−Ｃｗ５プロモーター、ＨＬＡ−Ｅプロモーター、またはＨＬＡ−Ｆプロモーターである。
【００２９】
様々な実施形態において、プロモーター配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５のプロモーター配列と９０％を超える、好ましくは９５％を超える、より好ましくは９９％を超える同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含む。
【００３０】
様々な実施形態において、ベクターは、Ｕ３のプロモーターおよびエンハンサーが欠失しているＬＴＲ、レンチウイルス由来のｃＰＰＴ／ＣＴＳ配列、Ψ（プサイ）配列、ならびに／または２つのレンチウイルスＬＴＲを含む。
【００３１】
好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターはエンハンサーを含有しない。
【００３２】
導入遺伝子によりコードされる免疫原性ポリペプチドは、ＨＩＶウイルス由来のＧａｇ、Ｐｏｌおよび／またはＮｅｆタンパク質由来の抗原を含む。抗原は、少なくとも１つの腫瘍抗原であってもよい。
【００３３】
本発明はさらに、本発明のレンチウイルスベクターを含む単離された宿主細胞を包含する。
【００３４】
本発明はさらに、レンチウイルスベクター粒子の作製方法を包含する。このような方法は、適切な宿主細胞にレンチウイルスベクターをトランスフェクトするステップと；該宿主細胞に、レトロウイルスの少なくとも構造タンパク質およびインテグラーゼタンパク質をコードするウイルスＤＮＡ配列を含有するパッケージングプラスミドベクターをトランスフェクトするステップと；前記レンチウイルスベクターの発現およびレンチウイルスベクター粒子へのパッケージングを得るために、前記トランスフェクト宿主細胞を培養するステップと；前記培養宿主細胞における発現およびパッケージングの結果生じるレンチウイルスベクター粒子を回収するステップとを含み得る。
【００３５】
本発明はさらに、本発明のレンチウイルスベクターを含むレンチウイルスベクター粒子を包含する。レンチウイルスベクター粒子は、ｃＰＰＴ／ＣＴＳポリヌクレオチド配列；Ｕ３のプロモーターおよびエンハンサーが欠失しているＬＴＲ；ならびに／またはＭＨＣクラスＩプロモーターの制御下の導入遺伝子配列を含み得る。好ましくは、プロモーター配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５のプロモーター配列と９０％を超える、好ましくは９５％を超える、より好ましくは９９％を超える同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含む。
【００３６】
本発明はさらに、医薬品またはワクチンとして使用するための、本発明によるレンチウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター粒子を含む組成物を包含する。
【００３７】
本発明はさらに、ｃＰＰＴ／ＣＴＳポリヌクレオチド配列；Ｕ３のプロモーターおよびエンハンサーが欠失しているＬＴＲ；ならびに／またはＭＨＣクラスＩプロモーターの制御下の導入遺伝子配列を含むレンチウイルスベクター粒子を患者に投与するステップを含む、Ｔ細胞応答の誘導方法を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩプロモーターの略図である。ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣＩ）プロモーターは、保存された調節エレメント、すなわち、κＢ（ＮＦ−κＢ結合部位）、ＩＳＲＥ（インターフェロン刺激応答エレメント）、ＳＸＹ（ＳＸＹ調節エレメント）、ＴＡＴＡ（転写シグナル）およびＡＴＧ（導入遺伝子形質導入（ｔｒａｄｕｃｔｉｏｎ）のためのスタートコドン）を示す。ＭＨＣＩＩプロモーターファミリーは、ＳＸＹ、ＴＡＴＡおよびＡＴＧ調節エレメントのみを示す。
【図２】２つの異なる細胞タイプにおける様々なプロモーターに駆動されたＧＦＰ発現を示す図グラフである。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子に連結された様々なプロモーターを有するレンチベクター構築物が、ＨＥＫ２９３ＴおよびＢＤＣＭ細胞を形質導入するのに使用され、ＧＦＰ発現を駆動するプロモーターの能力が測定された。
【図３】様々なインターフェロンによるＧＦＰ発現の誘導を示すグラフである。様々なプロモーターを有するレンチベクターが、様々なインターフェロン分子の存在下でＨＥＫ２９３ＴおよびＢＤＣＭ細胞を形質導入するために使用された。ＧＦＰ発現を駆動するプロモーターの能力が次いで評価された。２９３Ｔ（Ａ）およびｉＢＤＣＭ細胞（Ｂ）におけるＭＦＩが示されている。κＢおよびＩＳＲＥ調節配列が除去され、ＭＨＣＩＩ様プロモーターに形質転換したＭＨＣＩおよびβ２ｍプロモーターの縮小バージョンもテストされた。
【図４】Ｃ５７ＢＩ／６ｊマウスにおけるＴ特異的応答（中央値）を示すグラフである。Ｃ５７ＢＩ／６ｊマウスが、ＨＩＶ抗原発現が示されたプロモーターにより駆動される１．１０６ＴＵのレンチベクターで免疫された。免疫１２日後、ＨＩＶ抗原に対する特異的Ｔ細胞応答は、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴによりマウス脾臓細胞でモニターされた。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
最大の免疫応答を誘導するための樹状細胞における高発現；誘導された免疫応答により排除するのに十分な他の形質導入細胞タイプにおける発現；および挿入による影響を回避するためのエンハンサーエレメントの欠如の基準を満たし得るプロモーターが存在するかどうかを判定するために、ヒト遺伝子プロモーターがレンチウイルスベクターでの有用性について調べられた。ヒトプロモーターは、樹状細胞および他の組織における発現レベルについて分析された。期待される高レベルの樹状細胞発現および全組織での比較的高い平均発現を有するプロモーターが、定量分析を用いて選択された。プロモーターはさらに、エンハンサー配列の欠如に対して選択された。
【００４０】
これらの基準を満たすプロモーターの１つのグループは、ＭＨＣクラスＩプロモーターである。ＭＨＣクラスＩプロモーターは、ＮＦ−Ｋｂ結合部位、インターフェロン刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）、およびＳＸＹ調節モジュール（ＳＸＹ）の保存を示す。ＭＨＣクラスＩプロモーターにおけるこれらのエレメントの配置は、図１に図示されている。
【００４１】
ＭＨＣクラスＩＩプロモーターは、抗原提示細胞（樹状細胞を含む）特異的プロモーターであると見なされている。図１にも見られるように、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターはＳＸＹモジュールを含有するが、該プロモーターはＮＦ−Ｋｂ結合部位またはＩＳＲＥを含有しない（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｅｌｓｅｎら、１９９８、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、４８：２０８〜２２１頁）。故に、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターはＭＨＣクラスＩプロモーターとは極めて異なる。
【００４２】
別の抗原提示細胞特異的プロモーター、デクチン−２は、インターフェロン刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）を含有するが、ＳＸＹモジュールを含有しない（Ｂｏｎｋａｂａｒａら、２００１、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６７：６８９３〜６９００頁）。
【００４３】
ヒトβ２ミクログロブリン（β２ｍ）プロモーターは、単一のＮＦ−Ｋｂ結合部位の上流ではあるがＩＳＲＥを含有することから、ＭＨＣクラスＩプロモーターと若干の類似性を示す。
【００４４】
様々な哺乳動物（ヒト）ＭＨＣクラスＩプロモーターの配列は以下に示される：
【００４５】
ＨＬＡ−Ａ２（ＭＨＣ  Ｉ）：
ａｔｔｇｇｇｇａｇｔｃｃｃａｇｃｃｔｔｇｇｇｇａｔｔｃｃｃｃａａｃｔｃｃｇｃａｇｔｔｔｃｔｔｔｔｃｔｃｃｃｔｃｔｃｃｃａａｃｃｔａｔｇｔａｇｇｇｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｇａｔａｃｔｃａｃｇａｃｇｃｇｇａｃｃｃａｇｔｔｃｔｃａｃｔｃｃｃａｔｔｇｇｇｔｇｔｃｇｇｇｔｔｔｃｃａｇａｇａａｇｃｃａａｔｃａｇｔｇｔｃｇｔｃｇｃｇｇｔｃｇｃｇｇｔｔｃｔａａａｇｔｃｃｇｃａｃｇｃａｃｃｃａｃｃｇｇｇａｃｔｃａｇａｔｔｃｔｃｃｃｃａｇａｃｇｃｃｇａｇｇ
（配列番号１）
【００４６】
ＨＬＡ−Ｂ７（ＭＨＣ  Ｉ）：
ｇｇｇｇａｇｇｃｇｃａｇｃｇｔｔｇｇｇｇａｔｔｃｃｃｃａｃｔｃｃｃｃｔｇａｇｔｔｔｃａｃｔｔｃｔｔｃｔｃｃｃａａｃｔｔｇｔｇｔｃｇｇｇｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃａｇｇａｔａｃｔｃｇｔｇａｃｇｃｇｔｃｃｃｃａｃｔｔｃｃｃａｃｔｃｃｃａｔｔｇｇｇｔａｔｔｇｇａｔａｔｃｔａｇａｇａａｇｃｃａａｔｃａｇｃｇｔｃｇｃｃｇｃｇｇｔｃｃｃａｇｔｔｃｔａａａｇｔｃｃｃｃａｃｇｃａｃｃｃａｃｃｃｇｇａｃｔｃａｇａｇ
（配列番号２）
【００４７】
ＨＬＡ−Ｃｗ５（ＭＨＣ  Ｉ）：
ｃａｃｔｇｇｇｇａｇｇｃｇｃｃｇｃｇｔｔｇａｇｇａｔｔｃｔｃｃａｃｔｃｃｃｃｔｃａｇｔｔｔｃａｃｔｔｃｔｔｃｔｃｃｃａａｃｃｔｇｃｇｔｃｇｇｇｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇａａｔａｃｔｃａｔｇａｃｇｃｇｔｃｃｃｃａａｔｔｃｃｃａｃｔｃｃｃａｔｔｇｇｇｔｇｔｃｇｇｇｔｔｃｔａｇａｇａａｇｃｃａａｔｃａｇｃｇｔｃｔｃｃｇｃａｇｔｃｃｃｇｇｔｃｔａａａｇｔｃｃｃｃａｇｔｃａｃｃｃａｃｃｃｇｇａｃｔｃａｇａｔｔｃｔｃｃｃｃａｇａｃｇｃｃｇａｇ
（配列番号３）
【００４８】
ＨＬＡ−Ｅ（ＭＨＣ  Ｉ）：
ｔａａｇａａｃｔｇｃｔｇａｔｔｇｃｔｇｇｇａａａｃｔｃｔｇｃａｇｔｔｔｃｃｃｇｔｔｃｃｔｃｔｃｇｔａａｃｃｔｇｇｔｃａｔｇｔｇｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｇａｔａｃｔｃａｔｇａｃｇｃａｇａｃｔｃａｇｔｔｃｔｃａｔｔｃｃｃａａｔｇｇｇｔｇｔｃｇｇｇｔｔｔｃｔａｇａｇａａｇｃｃａａｔｃａｇｃｇｔｃｇｃｃａｃｇａｃｔｃｃｃｇａｃｔａｔａａａｇｔｃｃｃｃａｔｃｃｇｇａｃｔｃａａｇａａｇｔｔｃｔｃａｇｇａｃｔｃａｇａｇｇ
（配列番号４）
【００４９】
ＨＬＡ−Ｆ（ＭＨＣ  Ｉ）：
ａｇｇｃｃｃｃｇａｇｇｃｇｇｔｇｔｃｔｇｇｇｇｔｔｇｇａａｇｇｃｔｃａｇｔａｔｔｇａｇａａｔｔｃｃｃｃａｔｃｔｃｃｃｃａｇａｇｔｔｔｃｔｃｔｔｔｃｔｃｔｃｃｃａａｃｃｃｇｔｇｔｃａｇｇｔｃｃｔｔｃａｔｃｃｔｇｇａｔａｃｔｃａｔａａｃｇｃｇｇｃｃｃｃａｔｔｔｃｔｃａｃｔｃｃｃａｔｔｇｇｇｃｇｔｃｇｃｇｔｔｔｃｔａｇａｇａａｇｃｃａａｔｃａｇｔｇｔｃｇｃｃｇｃａｇｔｔｃｃｃａｇｇｔｔｃｔａａａｇｔｃｃｃａｃｇｃａｃｃｃｃｇｃｇｇｇａｃｔｃａｔａｔｔｔｔｔｃｃｃａｇａｃｇｃｇｇａｇｇｔｔｇｇｇｇｔｃａｔｇ
（配列番号５）
【００５０】
ＭＨＣＩプロモーター（ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７またはＨＬＡ−Ｅ）がレンチウイルスベクターに挿入された。比較のため、普遍的に発現されるＥＦ１αおよびユビキチン（ＵＢＣ）遺伝子のプロモーターもレンチウイルスベクターに挿入された。ＥＦ１αおよびユビキチンプロモーターは、いずれの同定されたエンハンサーも含有せず、ＳＸＹモジュール、ＮＦ−Ｋｂ結合部位またはＩＳＲＥを含有しない。それどころか、ＥＦ１αおよびユビキチン（ＵＢＣ）プロモーターは代わりにＳｐ１およびＡｐ１結合部位を含有する。ＣＭＶプロモーターを含有するベクターも生成された。ＭＨＣＩＩプロモーター（ＨＬＡ−ＤＲα）またはβ２ｍプロモーターを含有するベクターも生成された。これらのベクターにおいて、プロモーターは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を駆動する。
【００５１】
樹状細胞特異的発現を探すために、ベクターは、キャプシド形成プラスミドおよび本質的にＮａｌｄｉｎｉら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：２６３〜７頁に記載されているようなＶＳＶ．Ｇエンベロープを提供するプラスミドとのＨＥＫ２９３  Ｔ細胞での同時トランスフェクションによりパッケージングされた。ＨＥＫ２９３  Ｔ細胞およびＢＤＣＭ細胞（樹状様細胞系）は両方とも、次いで種々のベクターの粒子で形質導入された。発現は、全てのベクターを有するＨＥＫ２９３  Ｔ細胞において検出された。
【００５２】
ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター、またはＥＦ１αプロモーターを有するベクターは、ＨＥＫ２９３  Ｔ細胞においてＢＤＣＭ細胞より高い発現を示した（図２）。しかし、ＭＨＣＩＩプロモーター（ＨＬＡ−ＤＲα）、ＭＨＣＩプロモーター（ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７またはＨＬＡ−Ｅ）、またはβ２ミクログロブリンプロモーター（β２ｍ）を有するベクターは、ＢＤＣＭ細胞においてＨＥＫ２９３  Ｔ細胞より高い発現を示した。故に、これらのプロモーターは全て、樹状細胞特異的過剰発現を示した。
【００５３】
様々なインターフェロンの存在下での発現の誘導も評価された。結果は図３ＡおよびＢに示されている。ＭＨＣＩＩプロモーターはインターフェロンにより誘導できなかった。しかし、ＭＨＣＩプロモーターは、両方の細胞タイプにおいてインターフェロンγにより誘導でき、ＨＥＫ２９３  Ｔ細胞においてインターフェロンαにより誘導できた。ＭＨＣＩプロモーターに類似して、β２ｍプロモーターもインターフェロンにより誘導できた。ＩＳＲＥおよびＮＦ−Ｋｂ結合部位を除去するためのＭＨＣＩまたはβ２ｍプロモーターの切断（プロモーター−ＳＸＹ−ＧＦＰ）は、誘導性を減少させた。故に、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｅ、およびβ２ｍプロモーターの切断バージョンは、誘導性に関してＭＨＣＩＩプロモーターのようにふるまう。
【００５４】
次に、マウスは、ＨＩＶ抗原発現が様々なプロモーター（ウイルス、ユビキタス、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、およびβ２ｍ）により駆動されるレンチベクターで免疫された。免疫１２日後、特異的Ｔ細胞応答がＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴによりマウス脾臓細胞でモニターされた。図４に示されているように、ＭＨＣＩプロモーターを有するレンチベクターによる免疫化は、最も高い特異的Ｔ細胞応答を示した。
【００５５】
図４に見られるように、ＭＨＣＩプロモーターによるＴ特異的応答は、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ユビキチン、またはＭＨＣＩＩプロモーターより高く、ＥＦ１αまたはＣＭＶプロモーターによるＴ特異的応答より３倍超高かった。β２ｍプロモーターによるＴ特異的応答は、ＭＨＣＩプロモーターに類似していた。これらの結果は、ＭＨＣＩプロモーターが、インビボでのＴ特異的応答を最大化するためにレンチベクターで使用するのにＥＦ１ａ、ユビキチン、ＣＭＶ、またはＭＨＣＩＩプロモーターより予想外に優れたプロモーターであることを示すものである。
【００５６】
本発明は、ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣＩ）含有プロモーターを含むレンチウイルスベクター、および宿主における免疫応答を誘導するためのこれらの使用を包含する。
【００５７】
本発明は故に、宿主の細胞、好ましくは樹状細胞（ＤＣ）において、好ましくは免疫原性ポリペプチドをコードする導入遺伝子の転写を指示する、クラスＩ  ＭＨＣ遺伝子プロモーター由来のプロモーター配列を含むレンチウイルスベクターを主目的として有する。
【００５８】
レンチウイルスベクター
本発明の文脈内では「レンチウイルスベクター」は、シス作用性レンチウイルスＲＮＡまたはＤＮＡ配列を含み、トランスで提供されるレンチウイルスタンパク質（例えば、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、および／またはＥｎｖ）を必要とする導入遺伝子による宿主細胞の形質導入のための非複製ベクターを意味する。レンチウイルスベクターは、機能性Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖタンパク質の発現を欠く。レンチウイルスベクターは、前記レトロウイルスベクターの作製または開発の段階に応じてＲＮＡまたはＤＮＡ分子の形態で存在してもよい。
【００５９】
レンチウイルスベクターは、プラスミドなどの組換えＤＮＡ分子の形態にあってもよい。レンチウイルスベクターは、レンチウイルスおよび他のタンパク質の複合体内のＲＮＡ分子などのレンチウイルス粒子ベクターの形態であってもよい。典型的には、改変または組換えレンチウイルス粒子に相当するレンチウイルス粒子ベクターは、一本鎖ＲＮＡの２つのコピーからなるゲノムを含む。これらのＲＮＡ配列は、宿主細胞ゲノムに挿入された二本鎖ＤＮＡ配列（プロウイルスベクターＤＮＡ）からの転写により得ることができ、または形質転換された宿主細胞でのプラスミドＤＮＡ（プラスミドベクターＤＮＡ）の一過性発現から得ることができる。
【００６０】
レンチウイルスベクターは、レンチウイルス、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ感染性脳炎ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）に由来し、病原性に関与する遺伝的決定基を除去し、治療効果を得るのに有用な新たな決定基を導入するために改変される。
【００６１】
このようなベクターは、シスおよびトランス作用性配列の分離に基づく。複製欠損ベクターを生成するために、トランス作用性配列（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、ｒｅｖ、およびｅｎｖ遺伝子）を欠失させ、導入遺伝子をコードする発現カセットに置き換えることができる。
【００６２】
非分裂細胞への効率的な組み込みおよび複製は、通常、レンチウイルスゲノムの中心に２つのシス作用性配列、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）およびセントラルターミネーション配列（ＣＴＳ）の存在を必要とする。これらは、セントラルＤＮＡ「フラップ」と呼ばれる３本鎖ＤＮＡ構造の形成をもたらし、該フラップは、樹状細胞などの非分裂細胞の核孔での組み込み前複合体の脱コート、および核への発現カセットの効率的な移入のためのシグナルとして作用する。
【００６３】
１つの実施形態において、本発明は、特に、欧州特許出願ＥＰ  ２  １６９  ０７３号に記載されているようなｃＰＰＴ／ＣＴＳ配列と呼ばれるセントラルポリプリントラクトおよびセントラルターミネーション配列を含むレンチウイルスベクターを包含する。
【００６４】
宿主細胞ゲノムへのベクタープロウイルスＤＮＡ配列の組み込みに関与する長末端反復配列（ＬＴＲ）などのさらなる配列は、通常はシスで存在する。ベクターは、図１に示されているように、例えば前記ＬＴＲのドメインＵ３（ΔＵ３）中のＬＴＲ配列を変異させて得ることができる（Ｍｉｙｏｓｈｉ  Ｈら、１９９８、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ７２（１０）：８１５０〜７頁；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９８、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２（１２）：９８７３〜８０頁）。
【００６５】
好ましくは、ベクターはエンハンサーを含有しない。１つの実施形態において、本発明は、３’ＬＴＲ中のプロモーターおよびエンハンサー配列を除去している変異Ｕ３領域（ΔＵ３）を好ましくは有するＬＴＲ配列を含むレンチウイルスベクターを包含する。
【００６６】
パッケージング配列Ψ（プサイ）も、ポリヌクレオチド配列のキャプシド形成を助けるためにベクター粒子に取り込むことができる（Ｋｅｓｓｌｅｒら、２００７、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２１（９）：１８５９〜７４頁；Ｐａｓｃｈｅｎら、２００４、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  １２（６）：１９６〜２０３頁）。
【００６７】
１つの実施形態において、本発明は、レンチウイルスパッケージング配列Ψ（プサイ）を含むレンチウイルスベクターを包含する。
【００６８】
トランスポートＲＮＡ結合部位もしくはプライマー結合部位（ＰＢＳ）またはウッドチャック転写後調節エレメント（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ  ＰｏｓｔＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＷＰＲＥ）などのさらなる追加の機能性配列も、インビボで導入遺伝子のより安定な発現を得るために、有利には本発明のレンチウイルスベクターポリヌクレオチド配列に含まれてもよい。
【００６９】
１つの実施形態において、本発明は、ＰＢＳを含むレンチウイルスベクターを包含する。１つの実施形態において、本発明は、ＷＰＲＥおよび／またはＩＲＥＳを含むレンチウイルスベクターを包含する。
【００７０】
故に、好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターは、少なくとも１つのｃＰＰＴ／ＣＴＳ配列、１つのΨ配列、１つの（好ましくは２つの）ＬＴＲ配列、およびクラスＩ  ＭＨＣプロモーターの転写制御下で導入遺伝子を含む発現カセットを含む。
【００７１】
様々な実施形態において、レンチウイルスベクターは、ＭＨＣクラスＩプロモーターを含む。好ましくは、ＭＨＣクラスＩプロモーターは、ＨＬＡ−Ａ２プロモーター、ＨＬＡ−Ｂ７プロモーター、ＨＬＡ−Ｃｗ５プロモーター、ＨＬＡ−ＦまたはＨＬＡ−Ｅプロモーターである。様々な実施形態において、ＭＨＣクラスＩプロモーター配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５のプロモーター配列と９０％を超える、好ましくは９５％を超える、より好ましくは９９％を超える同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含む。
【００７２】
様々な実施形態において、ＭＨＣクラスＩプロモーターを含むレンチウイルスベクターは、コードされた免疫原性ポリペプチドに対し、導入遺伝子配列がＣＭＶプロモーターの転写制御下にあるベクターより大きなＣＴＬ応答をインビボで誘導する。
【００７３】
様々な実施形態において、ＭＨＣクラスＩプロモーターを含むレンチウイルスベクターは、コードされた免疫原性ポリペプチドに対し、導入遺伝子配列がＥＦ１αプロモーターの転写制御下にあるベクターより大きなＣＴＬ応答をインビボで誘導する。好ましくは、ＭＨＣＩプロモーターを用いるＣＴＬ応答は、ＥＦ１αプロモーターを用いるより少なくとも２倍または３倍高い。本発明の文脈内で、ベクターが「コードされた免疫原性ポリペプチドに対し、導入遺伝子配列がＥＦ１αプロモーターの転写制御下にあるベクターより大きなＣＴＬ応答をインビボで誘導する」かどうかは、実施例３に記載されたアッセイを用いて判定することができる。類似の結果をもたらす他のアッセイも使用することができる。
【００７４】
様々な実施形態において、ＭＨＣクラスＩプロモーターを含むレンチウイルスベクターは、コードされた免疫原性ポリペプチドに対し、導入遺伝子配列がユビキチンプロモーターの転写制御下にあるベクターより大きなＣＴＬ応答をインビボで誘導する。本発明の文脈内で、ベクターが「コードされた免疫原性ポリペプチドに対し、導入遺伝子配列がユビキチンプロモーターの転写制御下にあるベクターより大きなＣＴＬ応答をインビボで誘導する」かどうかは、実施例３に記載されたアッセイを用いて判定することができる。類似の結果をもたらす他のアッセイも使用することができる。
【００７５】
導入遺伝子
本発明の文脈内で「導入遺伝子」は、レンチウイルスベクターで形質導入される細胞に普通は存在しない、レンチウイルスベクター内の核酸配列である。レンチウイルスベクターは、形質導入細胞にこの配列を導入するのに役立つ。用語「導入遺伝子」は、導入遺伝子の形質導入を促進するようなベクターの配列を含まない。導入遺伝子は、別の生物由来の核酸配列であってもよい。あるいは、導入遺伝子は、同じ生物由来であるが、発現を制御する異なる調節配列を有する核酸配列であってもよい。導入遺伝子は、センスまたはアンチセンス核酸分子であってもよい。本発明の好ましい実施形態によれば、導入遺伝子配列は免疫原性ポリペプチドをコードする。
【００７６】
好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、ウイルス、細菌、または真菌性である。１つの実施形態において、免疫原性ポリペプチドは腫瘍抗原である。１つの実施形態において、免疫原性ポリペプチドはアレルゲンである。
【００７７】
この免疫原性ポリペプチドは好ましくは、感染症の病原体由来の１つまたは幾つかのエピトープ、例えばＨＩＶのＧａｇ、Ｐｏｌ、および／またはＮｅｆタンパク質由来の抗原を含む。
【００７８】
ポリエピトープを形成する幾つかのエピトープも、本発明の導入遺伝子によりコードされてもよい。
【００７９】
特定の実施形態において、このようなエピトープは、腫瘍において同定された標的抗原に由来し、細胞媒介免疫応答がエピトープに対して得られるように選択することができる。腫瘍の幾つかのタイプに関して、および腎臓癌、膀胱癌、結腸癌、肺癌、乳癌、白血病、骨髄腫およびリンパ腫を含む、特にメラノーマまたは癌腫において選択され得る標的抗原は、当技術分野において十分に記述されている。
【００８０】
ＭＨＣＩプロモーター
本発明は、レンチウイルスベクターへのＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣＩ）プロモーターの挿入を包含する。本明細書で使用されるとき、「ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣＩ）プロモーター」は、自然発生または合成ＭＨＣクラスＩプロモーターを含む。用語「ＭＨＣクラスＩプロモーター」は、β２ｍプロモーターを含まない。
【００８１】
自然発生ＭＨＣＩプロモーター
自然発生ＭＨＣＩプロモーターの例は、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｃｗ５、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ遺伝子プロモーターである。これらの自然発生ＭＨＣＩプロモーターは通常、ＭＨＣクラスＩタンパク質をコードする遺伝子、またはゲノムデータベース（例えば：ＮＣＢＩポリヌクレオチドデータベースｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｕｉｄｅ／ｄｎａ−ｒｎａ）中のこのようなタンパク質を推定的にコードすると見なされる遺伝子のプロモーター領域からクローン化または複製される。β２ｍおよびクラスＩ  ＭＨＣタンパク質は両方とも、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に進入する。
【００８２】
これらの遺伝子によりコードされるタンパク質は、ほぼ全ての細胞タイプにおいて見出される。ＭＨＣＩタンパク質は通常、白血球の膜の表面に存在し、ここでβ２ミクログロブリン（β２ｍ）と結合する。これらの結合タンパク質の役割は、内因性供給源由来のペプチドをＣＤ８＋  Ｔ細胞に提示することである。これらは故に、抗原特異的免疫応答の生成に中心的な役割を果たす。ＭＨＣクラスＩタンパク質は、多年の間広く研究および記載されてきたため、この遺伝子は十分に特徴付けされ、およびＢＬＡＳＴ方法（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９０）．  Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５（３）：４０３〜４１０頁）などの配列比較ツールを用いて検出可能である。
【００８３】
ＭＨＣクラスＩプロモーターは、樹状細胞を含む抗原提示細胞中で強力に活性化される能力のほか、他のヒト体組織の大部分において強度を低下させる能力を共有する。
【００８４】
本発明のＭＨＣクラスＩプロモーターは、１つまたは複数のＳｐ１およびＥＴｓ結合部位などのさらなる調節エレメントを含有することができる。好ましい実施形態において、ＭＨＣクラスＩプロモーターは、２つのＳｐ１結合部位および１つのＥｔｓ結合部位を含有する。他の実施形態において、Ａｐ１および／またはＡｐ２部位がＭＨＣクラスＩプロモーターにさらに含有される。
【００８５】
好ましいプロモーターは、ヒトＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｃｗ５、ＨＬＡ−ＥおよびＨＬＡ−Ｆプロモーターである。
【００８６】
合成ＭＨＣクラスＩプロモーター
ＭＨＣクラスＩプロモーターはまた、合成であってもよい。合成ＭＨＣクラスＩプロモーターには、ＭＨＣクラスＩプロモーターの個々の成分を会合するために分子生物学的手法を用いて合成されるプロモーター、または分子生物学的手法を用いる自然発生ＭＨＣクラスＩプロモーターに由来するプロモーターが含まれる。
【００８７】
様々な実施形態において、合成ＭＨＣクラスＩプロモーターは、ＭＨＣクラスＩ遺伝子プロモーターのプロモーター配列（配列番号：１〜５）と９０％を超える、好ましくは９５％を超える、より好ましくは９９％を超える同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含む。
【００８８】
ＩＳＲＥ
ＭＨＣクラス遺伝子の転写は、通常は２つの主要な調節エレメント：インターフェロン刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）およびＳＸＹモジュール（Ｗ／Ｓ、Ｘ１Ｘ２／部位αおよびＹ／エンハンサーＢ調節エレメントを包含する）（図１参照）により媒介される。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｌｓｅｎ、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９８）  ４８：２０８〜２１１頁も参照のこと。
【００８９】
これらの調節プロモーターエレメントは、転写開始部位の約２２０から約９５ヌクレオチド上流に広がる領域に局在化される。これらは、ＭＨＣクラスＩ遺伝子の組織特異的転写およびサイトカイン誘導転写を媒介する。
【００９０】
ＭＨＣクラスＩ遺伝子プロモーターのＩＳＲＥは通常、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）ファミリーメンバーに対する結合部位を含有している。故に、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）ファミリーメンバーに結合することはＭＨＣクラスＩプロモーターの特性である。これは、例えば、ゲルシフトアッセイにより検証することができる。
【００９１】
ＮＦ−κＢ結合部位
別の調節エレメント、エンハンサーＡ（核内転写因子κＢ（ＮＦ−κＢ）に対する結合部位を含有する）は、ほとんどの場合で存在する。故に、核内転写因子κＢ（ＮＦ−κＢ）に結合することはＭＨＣクラスＩプロモーターの特性である。これは、例えば、ゲルシフトアッセイにより検証することができる。
【００９２】
ＳＸＹモジュール
ＩＳＲＥに加えて、ＭＨＣクラスＩプロモーターは通常、合わせてＳＸＹモジュールと呼ばれる３つの調節エレメント：ＳまたはＷボックス、Ｘ１／ＣＲＥＸ２ボックスまたは部位α、およびＹボックスまたはエンハンサーＢからなる保存された上流配列モチーフの別のセットを共有する。このＳＸＹモジュールは通常、調節因子Ｘ（ＲＦＸ；ＲＦＸ５、ＲＦＸＢ／ＡＮＫおよびＲＦＸＡＰからなる）、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）／活性化転写因子（ＡＴＦ）、および核内因子Ｙ（ＮＦＹ）を含有する多タンパク質複合体により協同的に結合され、これらの遺伝子のトランス活性化を駆動するエンハンセオソームとして作用する。故に、これらの因子に結合することはＭＨＣクラスＩプロモーターの特性である。これは、例えば、ゲルシフトアッセイにより検証することができる。
【００９３】
対照的に、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターはエンハンサーＡまたはＩＳＲＥエレメントを示さない（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｊ．ら、１９９８、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．  ４８：２０８〜２２１頁）。さらに、ＲＦＸサブユニットの１つまたはＣＩＩＴＡにおける変異による重症複合免疫不全、裸リンパ球症候群（ＢＬＳ）を有する患者から確立された細胞系を用いた研究により例証されているように、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子調節においてＲＦＸおよびＣＩＩＴＡは極めて重要であることが見出されている（ＤｅＳａｎｄｒｏ，Ａ．ら、１９９９、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ、６５：２７９〜２８６頁）。また、ＣＩＩＴＡまたはＲＦＸサブユニットの１つのどちらかの欠如は、それぞれＭＨＣエンハンセオソームの機能および会合に影響を及ぼし、ＭＨＣクラスＩＩの欠如およびＭＨＣクラスＩ転写レベルの低下をもたらす（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｊ．ら  ２００４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６：６７〜７５頁）。
【００９４】
１つの実施形態において、本発明は、好ましくは免疫原性ポリペプチドをコードする、最も好ましくは微生物抗原または治療タンパク質をコードする導入遺伝子の発現を指示するように、ＭＨＣクラスＩプロモーターをレンチウイルスベクターに挿入するステップを含む方法を包含する。方法はさらに、ＤＮＡフラップ配列などの本明細書に言及された他の核酸エレメントのいずれかを挿入するステップを含んでもよい。
【００９５】
レンチウイルス粒子ベクターの作製
本発明は、好ましくはエンハンサー配列を含まないが、代わりにクラスＩ  ＭＨＣプロモーターを含有するレンチウイルス粒子ベクターの作製方法を提供する。レンチウイルス粒子ベクター（またはレンチウイルスベクター粒子）は、ウイルスタンパク質に関連してレンチウイルスベクターを含む。該ベクターは、組み込みまたは非組み込みベクターであってもよい。
【００９６】
遺伝子発現を駆動するための従来技術ベクターにおいて使用されるウイルスエンハンサー配列を、ＭＨＣクラスＩプロモーターと置換することは、レトロウイルスベクターの安全性を向上させ得、すなわち、
１）エンハンサー配列に関連した挿入変異のリスクを減少させる；および
２）ＭＨＣクラスＩプロモーターは、全てでないとしてもほとんどのヒト細胞タイプで活性化されるため、ひとたび免疫応答が導入遺伝子の産物に対して誘発されれば、ベクターが組み込まれた細胞は全て、どんな細胞タイプであれ免疫系により排除される。故に、一定の期間後、人体はこのようなベクターのいかなる複製物も含有し得ない。
【００９７】
この方法の１つの実施形態によれば、粒子ベクターは、ＤＮＡプラスミドで形質転換された宿主細胞において得られる。
【００９８】
このようなＤＮＡプラスミドは、
−細菌複製起源（例えば：ｐＵＣ  ｏｒｉ）、
−選択のための抗生物質耐性遺伝子（例えば：ＫａｎＲ）、およびより特定すると
−ＭＨＣクラスＩプロモーターに転写的に連結された少なくとも１つの導入遺伝子を含むレンチウイルスベクター
を含み得る。
【００９９】
このような方法は、以下のステップ：
ｉ）適切な宿主細胞にレンチウイルスベクターをトランスフェクトするステップと、
ｉｉ）前記宿主細胞に、レトロウイルス（好ましくはレンチウイルス）の少なくとも構造活性およびポリメラーゼ（＋／−インテグラーゼ）活性をコードするウイルスＤＮＡ配列を含有するパッケージングプラスミドベクターをトランスフェクトするステップと（このようなパッケージングプラスミドは当技術分野で記載されている（Ｄｕｌｌら、１９９８、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７２（１１）：８４６３〜７１頁；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９８、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２（１２）：９８７３〜８０頁））、
ｉｉｉ）前記レンチウイルスベクターの発現およびレンチウイルスベクター粒子へのパッケージングを得るために、前記トランスフェクト宿主細胞を培養するステップと、
ｉｖ）前記培養宿主細胞におけるステップｉｉｉ）の発現およびパッケージングの結果生じるレンチウイルスベクター粒子を回収するステップと
を含む、本発明による組換えベクター粒子の作製を可能にする。
【０１００】
種々の理由のため、得られたレトロウイルス粒子をシュードタイピングする、すなわち特異的粒子エンベロープタンパク質を付加または置換することが有用であり得る。例えば、これは、組換え粒子を天然粒子または他の組換え粒子と区別するために、異なるエンベロープタンパク質を有するのに有利であり得る。ワクチン接種戦略の問題において、この後者がレンチウイルスに対して既に免疫を生じた場合、シュードタイピングされた粒子ベクターは免疫系を免れる可能性が高い。疾患に対して患者を免疫するのに類似の粒子ベクターの連続注射が必要とされる場合、これは特に有用である。
【０１０１】
本発明のレトロウイルス粒子をシュードタイピングするために、宿主細胞は、ウイルスエンベロープタンパク質、好ましくはＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質をコードする１つまたは幾つかのエンベロープＤＮＡプラスミドでさらにトランスフェクトされ得る。
【０１０２】
適切な宿主細胞は、好ましくは、例えばＨＥＫ細胞系のようなヒト培養細胞系である。
【０１０３】
あるいは、ベクター粒子の作製方法は、ゲノムが１つまたは複数の以下の成分、すなわち、レンチウイルスベクターＤＮＡ配列、パッケージング遺伝子、およびエンベロープ遺伝子で安定に形質転換されている宿主細胞において実施される。このようなＤＮＡ配列は、ベクター配列の転写を可能にし、および粒子産生速度を向上させる追加のプロモーターを含む本発明によるプロウイルスベクターに類似していると見なすことができる。
【０１０４】
好ましい実施形態において、宿主細胞は、全細胞を膨潤または死滅させることなしにウイルス粒子を培地中で連続的に産生することができるようにさらに改変される。ウイルス粒子を作製するためのこのような手法に関しては、Ｓｔｒａｎｇら、２００５、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９（３）：１１６５〜７１頁；Ｒｅｌａｎｄｅｒら、２００５、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １１（３）：４５２〜９頁；Ｓｔｅｗａｒｔら、２００９、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、１６（６）：８０５〜１４頁；およびＳｔｕａｒｔら、２０１１、Ｈｕｍ  ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ（印刷中）を参照することができる。
【０１０５】
本発明のある目的物は、レンチウイルス粒子ベクターで形質転換された宿主細胞からなる。
【０１０６】
レンチウイルス粒子ベクターは、以前に定義されているように、以下のエレメント：
−ｃＰＰＴ／ＣＴＳポリヌクレオチド配列と、
−ＭＨＣクラスＩプロモーターの制御下の導入遺伝子配列、および場合により、上に記載された追加のエレメントの１つと
を含むことができる。
【０１０７】
導入遺伝子を細胞で発現させる方法
本発明は、導入遺伝子を細胞、好ましくは非分裂細胞で発現させる方法を包含する。方法は、導入遺伝子の発現を可能にする条件下で、細胞を本発明のレンチウイルスベクターまたはレンチウイルス粒子ベクターで形質導入するステップを含む。
【０１０８】
細胞は、好ましくは哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。特に好ましいのはヒト非分裂細胞である。
【０１０９】
導入遺伝子は、好ましくは免疫原性ポリペプチドをコードする。方法はさらに、ポリペプチドを回収または単離するステップを含んでもよい。
【０１１０】
レンチウイルスベクターまたはレンチウイルス粒子ベクターは、好ましくはクラスＩ  ＭＨＣプロモーターを含む。
【０１１１】
１つの実施形態において、本発明は、ＭＨＣクラスＩプロモーターが導入遺伝子の発現を指示するようにＭＨＣクラスＩプロモーターをレンチウイルスベクターに挿入するステップと、ＭＨＣクラスＩプロモーターを含有するベクターで細胞を形質導入するステップとを含む、導入遺伝子の発現方法を包含する。
【０１１２】
レンチウイルスベクターの治療的使用
本発明はさらに、エピトープ、より特にＭＨＣクラスＩプロモーターの転写制御下でベクター中に存在する導入遺伝子によりコードされたエピトープに対する免疫学的反応の発生または改善を誘発するまたはこれに寄与することができる治療組成物またはワクチンを調製するための、本発明によるレンチウイルスベクター（特にはレンチウイルス粒子ベクターの形態で）の使用に関する。
【０１１３】
本発明は故に、医薬品またはワクチンとして有用であるベクターを提供する。
【０１１４】
これらのベクターは、感染症、特にはウイルス感染、より具体的には、ＡＩＤＳおよび他の免疫不全などのレトロウイルス感染に伴う疾患の治療または予防に優先的に使用される。
【０１１５】
本発明はまた、腫瘍および癌に対する治療プロトコルにおいて使用することもでき、特には腫瘍に対する免疫療法またはワクチン接種療法のプロトコルにおいて使用され得る。
【０１１６】
本発明のベクターは、樹状細胞をより特異的に標的にして、これらの細胞における導入遺伝子により発現された抗原に関連する細胞媒介免疫応答および特にはＣＴＬ応答を得ることから、本発明のベクターは、マイコバクテリウムまたはＨＩＶウイルスなどのスローまたは内因性病原微生物を標的にするワクチンとして特に有用である。
【０１１７】
したがって、本発明は、以前に定義されているようなレンチウイルスベクターを含む免疫原性組成物に関する。
【０１１８】
本発明の免疫原性組成物は、好ましくは、標的細胞へのベクターゲノムの核移入を誘発または刺激するように、ベクターおよびベクター粒子中にｃＰＰＴおよびＣＴＳ配列を含有する。
【０１１９】
逆転写中に、ｃＰＰＴおよびＣＴＳ配列は、ＤＮＡ三重螺旋と呼ばれるＤＮＡベクター配列の核移入を刺激する３本鎖ＤＮＡ構造の形成を誘導する。好ましくは、ベクターは、導入遺伝子、ならびにレトロウイルスまたはレトロウイルス様起源の逆転写、発現およびキャプシド形成の調節シグナルを含み、組成物は、ベクター中に存在する導入遺伝子配列によりコードされた１つまたは幾つかのエピトープに対するＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）および／またはＣＤ４応答を誘導または刺激することができる。
【０１２０】
導入遺伝子の発現は、ベクターへのＭＨＣクラスＩプロモーターの包含により大幅に向上される。
【０１２１】
故に、本発明によるレンチウイルスベクターは、記憶ＣＴＬ応答の発生を誘導し、改善する能力、または一般に記憶ＣＴＬ応答の発生に関連する能力を有する。換言すると、該ベクターは、細胞媒介免疫応答、特にはＣＴＬ応答または記憶応答の誘導、刺激、または該応答の発生への関与により、アレルギー、自己免疫疾患、腫瘍疾患、または感染症を治療するための治療組成物の調製に使用することができる。
【０１２２】
本発明のレンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターを宿主に投与するステップと、宿主において導入遺伝子に対する特異的免疫応答を発生させるステップとを含む治療方法、および免疫応答の誘導方法において使用することができる。これらの宿主で発生した細胞および抗体は、診断試薬として使用することができる。
【０１２３】
本発明によるレンチウイルスベクターは、全身、局所、または皮膚、皮内（例えば腫瘍内）投与経路を含む、既知の投与経路を通じて患者に直接投与することができる。エクスビボ投与、例えば標的細胞のエクスビボ形質導入とこれに続く治療される患者への処理細胞の投与も、本発明により包含される。
【０１２４】
特定の実施形態において、本発明による免疫原性組成物は、細胞媒介免疫応答、特にはＣＴＬ媒介免疫応答を誘導し、改善し、または該応答の発生にインビボで関与するように、患者に直接投与することができる。
【０１２５】
別の実施形態において、免疫原性組成物は、長期記憶細胞媒介応答の発生を可能にし得るように単回でまたは反復投与時に使用される。
【０１２６】
本発明の免疫原性組成物の特定の利点は、目的とするヌクレオチド配列、またはベクターもしくはベクター粒子中に存在する導入遺伝子によりコードされた多数のエピトープに対する細胞媒介免疫応答を誘発または刺激するのに使用できることであり、本発明の免疫原性組成物はまた、遺伝子、例えば、少なくとも８から１５個のアミノ酸、好ましくは９から１２個のアミノ酸をコードすることができる病原体の遺伝子または前記遺伝子の断片の全配列の産物に対して、細胞媒介免疫応答を誘発または刺激するのに使用することもできる。
【０１２７】
本発明はまた、細胞応答を誘導する前記アミノ酸配列、および／または異なる病原体もしくは腫瘍抗原の２つのエピトープに対応する少なくとも２つの異なる配列を含有するアミノ酸配列の多数の反復（少なくとも２つの同一配列）をコードするヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターも包含する。
【０１２８】
結果として、本発明は、腫瘍の治療のための、ならびに特には抗癌または抗感染症治療としての予防的および／または治療的ワクチン接種プロトコルにおいて使用され得る組成物を包含する。
【０１２９】
特に、該組成物は、アジュバント、他の免疫原性組成物、化学療法、または任意の他の治療的処置と組み合わせて使用することができる。
【０１３０】
故に、本発明の種々の実施形態を記載してきたが、本明細書における開示は例示のみであること、ならびに様々な他の代替、適合、および変更が本発明の範囲内で行われ得ることが当業者により留意されるべきである。したがって、本発明は、本明細書に例証されている特定の実施形態に限定されない。
【実施例】
【０１３１】
（実施例１）２つの異なる細胞タイプにおける様々なプロモーターにより駆動されたＧＦＰ発現
様々なプロモーターを包含するレンチベクター構築物を用いてＨＥＫ２９３Ｔ（線維芽細胞系）およびＢＤＣＭ（樹状様細胞系）細胞を形質導入し、ＧＦＰ発現を駆動するプロモーターの能力をフローサイトメトリーにより評価した。ＢＤＣＭ細胞におけるＭＦＩ（平均蛍光強度）を２９３Ｔ細胞で得られたＭＦＩの％で表す。
【０１３２】
ウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびユビキタス（ＵＢＣおよびＥＦ１α）プロモーターがＢＤＣＭにおいて抑制されるようであるのに対し、ＭＨＣＩ（ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７およびＨＬＡ−Ｅ）およびＭＨＣＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲα）プロモーターはこの細胞タイプにおいて過剰発現される。β２ｍプロモーターもこの細胞タイプにおいて過剰発現された。
【０１３３】
細胞を、１０％ＦＢＳ含有完全培地で２４ウェルプレートに１ウェル当たり１×１０５細胞の密度で播種した。細胞タイプごとに、培地をウイルス試料の希釈物３００μｌと交換して、１×１０５細胞の３ウェルを形質導入し、形質導入細胞のパーセンテージが５から３０％の間に含まれるようにした。細胞を次いで３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートし、完全培地１ｍｌをウェルごとに添加した。形質導入７２時間後、細胞をトリプシン処理し、再懸濁し、ＧＦＰ  ＭＦＩをＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターでＦＬ１チャネルを用いて測定した。
【０１３４】
（実施例２）様々なインターフェロンによるＧＦＰ発現の誘導
様々なプロモーターを包含するレンチベクターを用いて、様々なインターフェロン分子の存在下でＨＥＫ２９３ＴおよびＢＤＣＭ細胞を形質導入した。ＧＦＰ発現を駆動するプロモーターの能力を次いで評価した。ＭＨＣ−Ｉおよびβ２ｍプロモーターの縮小バージョン、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｅおよびβ２ｍ−ＳＸＹプロモーター（κΒおよびＩＳＲＥ調節配列を除去し、ＭＨＣＩＩ様プロモーターに形質転換したプロモーター）もテストした。
【０１３５】
図３に示されているように、ＭＨＣＩＩプロモーターは、２９３  ＴまたはＢＤＣＭ細胞のどちらにおいてもインターフェロンにより誘導できなかった。しかし、ＭＨＣＩプロモーターは、両方の細胞タイプにおいてインターフェロンγにより誘導でき、２９３  Ｔ細胞においてインターフェロンαにより誘導できた。ＭＨＣＩプロモーターに類似して、β２ｍプロモーターもインターフェロンにより誘導できた。ＩＳＲＥおよびＮＦ−Ｋｂ結合部位を除去するためのＭＨＣＩまたはβ２ｍプロモーターの切断（プロモーター−ＳＸＹ−ＧＦＰ）は、誘導性を減少させた。故に、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｅ、およびβ２ｍプロモーターの切断バージョンは、誘導性に関してＭＨＣＩＩプロモーターのようにふるまう。
【０１３６】
細胞を、１０％ＦＢＳ含有完全培地で２４ウェルプレートに１ウェル当たり１×１０５細胞の密度で播種した。細胞タイプごとに、培地をウイルス試料の希釈物３００μｌと交換して、１×１０５細胞の１２ウェルを形質導入し、形質導入細胞のパーセンテージが５から３０％の間に含まれるようにした。細胞を次いで３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートし、ベクター形質導入ごとに、完全培地１ｍｌを３ウェルに添加し、６５０Ｕ／ｍｌ（最終５００Ｕ）のＩＦＮγを含有する完全培地１ｍｌを３つの他のウェルに添加し、６５０Ｕ／ｍＬ（最終５００Ｕ）のＩＦＮαを含有する完全培地１ｍｌを３つの他のウェルに添加し、６５０Ｕ／ｍｌ（最終５００Ｕ）のＩＦＮβを含有する完全培地１ｍｌを３つの最後のウェルに添加した。プレートを次いで３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。形質導入７２時間後、細胞をトリプシン処理し、再懸濁し、ＧＦＰ  ＭＦＩをＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターでＦＬ１チャネルを用いて測定した。
【０１３７】
（実施例３）Ｃ５７ＢＩ／６ｊマウスにおけるＴ特異的応答（中央値）
Ｃ５７ＢＩ／６ｊマウスを、ＨＩＶ抗原発現が様々なプロモーター（ウイルス、ユビキタス、ＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩ）により駆動される１×１０６ＴＵのレンチベクターで免疫した。免疫１２日後、特異的Ｔ細胞応答をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴによりマウス脾臓細胞でモニターした。図４に示されているように、ＭＨＣＩプロモーターを包含するレンチベクターによる免疫化は、ウイルスプロモーターが抗原発現を駆動しているときでさえ、使用された他のレンチベクターより高い特異的Ｔ細胞応答を示した。
【０１３８】
脾臓細胞を、レンチベクターで免疫したマウス脾臓から免疫１２日後に単離し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに使用した。９６ウェル組織培養プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、５０μｌ／ウェルの５μｇ／ｍｌ抗マウスＩＦＮγ  ｍＡｂ（マウスＩＦＮγ  Ｅｌｉｓｐｏｔペア；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて一晩、４℃でコーティングした。プレートを２００μｌ  ＤＰＢＳ／ウェルで３回洗浄し、２００μｌ／ウェルのＤＰＢＳ／１０％ウシ胎仔血清で２時間、３７℃でブロックした。プレートを２００μｌ  ＤＰＢＳ／ウェルで３回洗浄した。脾臓細胞を２．５、４．１、または５．１×１０５細胞／ウェルで３通りにプレートに添加し、２μｇ／ｍｌの刺激性ペプチド（抗原に特異的な）、コンカナバリンＡ（５μｇ／ｍｌ；供給源）、または培地単独で刺激した。プレートを３７℃で１８時間インキュベートし、次いで２００μｌ／ウェルのＤＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で３回、２００μｌ／ウェルのＤＰＢＳで３回すすいだ。検出のため、５０μｌ／ウェルの２μｇ／ｍｌ抗マウスＩＦＮγ−ビオチン化モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を室温で２時間添加した。プレートを洗浄し、１００μｌ／ウェルのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ）を室温で９０分間、ダルベッコＰＢＳに１：２０００希釈した。プレートを洗浄後、スポット（ＩＦＮγ分泌細胞）を６０μｌ／ウェルのＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液（Ｓｉｇｍａ）を添加して可視化した。プレートを青いスポットが生じるまで室温で１５〜３０分間インキュベートし、次いで水道水でよく洗浄し、２４時間風乾した。最後に、スポットをＢｉｏｒｅａｄｅｒ  ２０００（Ｂｉｏｓｙｓ）を用いてカウントした。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【配列表】
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