(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の１３１２から６０６９位の核酸配列を含む核酸分子を含む大豆植物を有する耕作地に、ＡＨＡＳ阻害性イミダゾリノン系除草剤を含む有効量の除草剤組成物を適用するステップを含み、有効量は耕作地の雑草の成長及び野生型大豆植物の成長を阻害する、耕作地において雑草を防除する方法。
【請求項２】
前記核酸分子が配列番号１の１３０２〜６０７９位の核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸分子が配列番号１の核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
除草剤組成物がさらに１又は２以上の他のイミダゾリノン系除草剤、他のＡＨＡＳ阻害性除草剤、ＥＰＳＰＳ阻害性除草剤、ＧＳ阻害性除草剤、ＰＰＯ阻害性除草剤、オーキシン系除草剤及びそれらの組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＡＨＡＳ阻害性イミダゾリノン系除草剤が、イマザピル、イマザピック又はそれらの組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
さらに耕作地に、有効量の１又は２以上の他のイミダゾリノン系除草剤、他のＡＨＡＳ阻害性除草剤、ＥＰＳＰＳ阻害性除草剤、ＧＳ阻害性除草剤、ＰＰＯ阻害性除草剤、オーキシン系除草剤及びそれらの組合せを適用するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＥＰＳＰＳ阻害性除草剤がグリホセートを含み、ＰＰＯ阻害性除草剤がサフルフェナシルを含む請求項４又は６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
雑草がグリホセートに抵抗性である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
さらにストロビルリンを耕作地に適用するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ストロビルリンがピラクロストロビンを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
除草剤組成物がさらにイマザピル若しくはイマザピック、又は以下に記載のいずれかを含む、請求項１に記載の方法：
イマザピル及びイマザピックの組み合わせ；
イマザピル、イマザピック、及びベンタゾンの組み合わせ；
イマザピル、イマザピック、及びピラクロストロビンの組み合わせ；
イマザピル、イマザピック、及びサフルフェナシルの組み合わせ；
イマザピル、イマザピック、サフルフェナシル及びグリホセートの組み合わせ；
イマザピル及びベンタゾンの組み合わせ；
イマザピル及びピラクロストロビンの組み合わせ；
イマザピル及びサフルフェナシルの組み合わせ；
イマザピル、サフルフェナシル及びグリホセートの組み合わせ；
イマザピル及びグリホセートの組み合わせ；
イマザピック及びグリホセートの組み合わせ；
イマザピック、サフルフェナシル、及びグリホセートの組み合わせ。
【請求項１２】
配列番号１の１３１２から６０６９位の核酸配列を含む核酸分子を含む大豆植物を有する作物畑に、ＡＨＡＳ阻害性イミダゾリノン系除草剤を含む有効量の除草剤組成物を適用するステップを含む、作物畑においてグリホセート耐性雑草を防除する方法。
【請求項１３】
大豆植物が配列番号１の核酸配列を有する核酸分子を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸分子が配列番号１の１３０２から６０７９位の核酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ＡＨＡＳ阻害性イミダゾリノン系除草剤が、イマザピル、イマザピック又はそれらの組み合わせから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
さらにストロビルリンを耕作地に適用するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
ＡＨＡＳＬタンパク質の修飾型をエンコードし、６５３位（Ｓ６５３Ｎ）でセリン−アスパラギンの置換を含み、かつ配列番号１の１３１２から６０６９位の核酸配列を含む単離又は組み換え核酸分子。
【請求項１８】
核酸分子が組み換え核酸構築体である、請求項１７に記載の単離又は組み換え型核酸分子。
【請求項１９】
請求項１７に記載の単離又は組み換え型核酸分子を含むトランスジェニック大豆植物。
【請求項２０】
配列番号１のヌクレオチド１３０２から６０７９位の核酸配列を含む異種核酸分子を含む、トランスジェニック大豆植物。
【請求項２１】
大豆植物がＡＨＡＳ阻害性除草剤に抵抗性である、請求項２０に記載のトランスジェニック大豆植物。
【請求項２２】
配列番号１の１３１２から６０６９位の核酸配列を含む核酸分子を増幅できる第１及び第２の単離核酸分子を含む、標的核酸分子の増幅で使用するための核酸プライマーの単離対。
【請求項２３】
第１の単離核酸分子が配列番号３７、３９、４１、４３及び６７から選択される核酸配列を含む、請求項２２に記載の核酸プライマーの単離対。
【請求項２４】
第２の単離核酸分子が配列番号３８、４０、４２、４４及び６８から選択される核酸配列を含む、請求項２２に記載の核酸プライマーの単離対。
【請求項２５】
第１の単離核酸分子が配列番号４１の配列を含み、第２の単離核酸分子が配列番号４２の配列を含む、請求項２２に記載の核酸プライマーの単離対。
【請求項２６】
前記対が、配列番号１の核酸配列を有する核酸分子を増幅できる、請求項２２に記載の核酸プライマーの単離対。
【請求項２７】
第１及び第２の核酸プライマーを含み、第１及び第２の核酸プライマーが配列番号１の１３１２から６０６９位の核酸配列を含む核酸分子を増幅できる、生物学的試料中の前記核酸分子を特定するキット。
【請求項２８】
第１及び第２の核酸プライマーが、配列番号１の核酸配列を有する核酸分子を増幅できる、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
生物学的試料において配列番号１の１３１２から６０６９位の核酸配列を含む大豆核酸分子の存在を検出する方法であって、
（ａ）大豆ＤＮＡを含有する生物学的試料と、第１及び第２の核酸プライマーと、を含む混合物を形成し、第１の核酸プライマーが配列番号３７、３９、４１、４３及び６７から選択される核酸配列を含み、かつ第２の核酸プライマーが配列番号３８、４０、４２、４４及び６８から選択される核酸配列を含むステップ、
（ｂ）第１及び第２の核酸プライマーが、配列番号１の１３１２から６０６９位のヌクレオチドの核酸配列の存在の診断のための又はこの存在を示すアンプリコンを増幅できる条件下で混合物を反応させるステップであって、当該アンプリコンは（i）配列番号１のヌクレオチド１から１３１１位を含む５’大豆隣接配列部位および（iii）配列番号１の１３１２から６０６９位の核酸配列部位を含み、前記ヌクレオチド１３１１位と前記ヌクレオチド１３１２位の間はジャンクションである核酸分子からなり、並びに
（ｃ）増幅されたアンプリコンの存在又は欠如を検出し、増幅されたアンプリコンの存在が、生物学的試料は当該大豆核酸分子を含むものであることを示すステップ
を含む、方法。
【請求項３０】
生物学的試料において配列番号１の１３１２から６０６９位の核酸配列を含む大豆核酸分子の存在を検出する方法であって、
（ａ）大豆ＤＮＡを含有する生物学的試料と、前記核酸分子の部位及び（i）５’隣接領域部位又は（ii）３’隣接領域部位のいずれかにハイブリダイズできる核酸分子プローブと、を含む混合物を形成するステップであって、前記５’隣接領域は配列番号１の１から１３１１位からなり、及び前記３’隣接領域は配列番号１の６０７０から１０６５６位からなり、
（ｂ）核酸分子プローブと、前記核酸分子部位及び（i）５’隣接領域部位又は（ii）３’隣接領域部位のいずれかにハイブリダイズできる条件下で混合物を反応させるステップ、並びに
（ｃ）プローブと大豆ＤＮＡのハイブリダイゼーションを検出し、核酸分子プローブと大豆ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの存在が、前記核酸分子の生物学的試料中における存在を示すステップ
を含む、方法。
【請求項３１】
生物学的試料が大豆の種子を含む、請求項２９又は３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
生物学的試料が大豆植物の一部を含む、請求項２９又は３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
配列番号１の１３１２から６０６９位の核酸配列を含む核酸分子を含む大豆植物において栽培地で収率を増加させる方法であって、
ＡＨＡＳ阻害性イミダゾリノン系除草剤を含む有効量の除草剤組成物を、前記大豆植物及び栽培地に適用し、ＡＨＡＳ阻害性除草剤が、栽培地における雑草の成長を減少させるステップ、並びに
前記大豆植物から種子を収穫するステップを含む方法。
【請求項３４】
（ａ）配列番号１の１３１２から６０６９位の核酸配列を含む核酸分子を含む大豆植物と第２の大豆植物とを交雑するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）の交雑種から種子を得るステップ、
（ｃ）種子からＤＮＡ試料を得るステップ、並びに
（ｄ）試料中の前記核酸分子の存在を検出し、前記核酸分子の存在が、この種子がＡＨＡＳ阻害性除草剤抵抗性大豆植物を生み出すことができることを示すステップを含む、ＡＨＡＳ阻害性除草剤抵抗性大豆植物を育種する方法。
【請求項３５】
ＡＨＡＳＬタンパク質の修飾型をエンコードし、６５３位（Ｓ６５３Ｎ）でセリン−アスパラギンの置換を含み、かつ配列番号１の１３１２から６０６９位の核酸配列を含む核酸分子をさらに含むトランスジェニック大豆植物の種子。
【請求項３６】
前記核酸分子が配列番号１の核酸配列を含む、請求項３５に記載の種子。
【請求項３７】
種子が系ＢＰＳ−ＣＶ１２７−９の植物又は系ＢＰＳ−ＣＶ１２７−９の子孫の植物であって、前記系の種子の代表的試料がＮＣＩＭＢ受託番号４１６０３で寄託された、請求項３５に記載の種子。
【請求項３８】
種子が１又は２以上のＡＨＡＳ阻害性除草剤又はＡＨＡＳ阻害性除草剤の組み合わせを含む除草剤組成物で処理された、請求項３５に記載の種子。
【請求項３９】
栽培地で請求項３８に記載の種子を播くステップを含む、栽培地で雑草をコントロールする方法。
【請求項４０】
請求項３５に記載の種子を成長させることによって生産される、トランスジェニック大豆植物。
【請求項４１】
（Ａ）配列番号１の１３１２から６０６９位の核酸配列を含む核酸分子を含む大豆種子を提供するステップ、
（Ｂ）種子が発芽し、前記核酸分子を含む成長大豆植物を生ずることができる条件下で、大豆種子を成長培地に播くステップ、並びに
（Ｃ）成長培地、種子又は植物を、イミダゾリノン系除草剤、スルホニル尿素系除草剤、それらの相互の組合せ及びそれらと少なくとも１種の他の有効成分との組合せからなる群から選択される少なくとも１種の成分を含む除草剤組成物と接触させるステップ
を含む、トランスジェニック大豆植物を成長させる方法。
【請求項４２】
ステップ（Ｃ）をステップ（Ｂ）の前に実施し、成長培地と除草剤組成物を接触させるステップを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ステップ（Ｃ）をステップ（Ｂ）の後に実施し、植物又は成長培地を、植物が成長培地から発芽した後で接触させるステップを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
除草剤組成物が、（１）イミダゾリノン系除草剤、スルファミド系除草剤及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１種の組成物と、（２）防かび剤、抗菌剤、有機リン酸エステル系除草剤、スルファミド系除草剤、ベンゾチアジアジノン系除草剤及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１種の他の有効成分との組合せを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
除草剤組成物が、イマザピル若しくはイマザピック、又は以下の組み合わせのいずれか１つを含む、請求項４１に記載の方法：
（Ａ）イマザピル及びイマザピック；
（Ｂ）イマザピル、イマザピック、及びベンタゾン；
（Ｃ）イマザピル、イマザピック、及びピラクロストロビン；
（Ｄ）イマザピル、イマザピック、及びサフルフェナシル；
（Ｅ）イマザピル、イマザピック、サフルフェナシル、及びグリホセート；
（Ｆ）イマザピル及びベンタゾン；
（Ｇ）イマザピル及びピラクロストロビン；
（Ｈ）イマザピル及びサフルフェナシル；
（Ｉ）イマザピル、サフルフェナシル、及びグリホセート；
（Ｊ）イマザピル及びグリホセート；
（Ｋ）イマザピック及びグリホセート；又は
（Ｌ）イマザピック、サフルフェナシル、及びグリホセート。
【請求項４６】
前記核酸分子が、配列番号１のヌクレオチド１３０２から６０７９位の核酸配列を有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
大豆植物から生物学的試料を得るステップ、並びに
試料について、少なくとも１種の免疫学的アッセイを実施し、このアッセイがポリペプチドを検出できるステップ
を含む、生物学的試料中の配列番号１の１３１２から６０６９位の核酸配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドを検出する方法。
【請求項４８】
免疫学的アッセイが、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、免疫染色、免疫組織化学法、タンパク質チップアッセイ、放射性免疫沈降法、イムノクロマト膜による迅速アッセイ、イムノクロマトスティックによる迅速アッセイ及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
（a）配列番号１の１３１２から６０６９位の核酸配列を含む核酸分子、又は（ｂ）前記核酸分子によってコードされたポリペプチド、のいずれかの検出に使用する装置であって、
表面を有する固体支持体と、
固体支持体の表面に結合した少なくとも１種の診断分子とを含み、
前記診断分子は：
前記核酸分子によってコードされたポリペプチドの少なくとも１つの部位と結合できる結合部位；又は
前記核酸分子部位及び（i）５’隣接領域部位若しくは（ii）３’隣接領域部位のいずれかとハイブリダイズできる核酸分子プローブから選択され；
前記５’隣接領域は配列番号１の１から１３１１位からなり、及び前記３’隣接領域は配列番号１の６０７０から１０６５６位からなる、
装置。
【請求項５０】
固体支持体が、（Ａ）ガラス、ゲル、ポリマー、プラスチック、弾性素材、セラミック、金属及びそれらの組合せからなる群から選択される、若しくは（Ｂ）プレート、チップ、膜、棒、スティック、ビーズ、ファイバー、マット、格子、布、血管壁及びそれらの組合せからなる群から選択される、又は（Ｃ）（Ａ）及び（Ｂ）の両方から選択される、請求項４９に記載の装置。
【請求項５１】
少なくとも１種の診断分子が、核酸塩基のオリゴマープローブ、アプタマー、抗体及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４９に記載の装置。
【請求項５２】
核酸塩基のオリゴマープローブが核酸類似体を含む、請求項５１に記載の装置。
【請求項５３】
抗体が、モノクローナル抗体、一本鎖抗体及び前記核酸分子によってコードされる前記ポリペプチドに対する結合特異性を保有する免疫反応性の抗体断片からなる群から選択される、請求項５１に記載の装置。
【請求項５４】
診断分子（単数又は複数）が、共有結合、配位結合及び非共有結合から選択される方法によって表面に固定されている、請求項４９に記載の装置。
【請求項５５】
基質が、免疫クロマトグラフ用ストリップを含む、請求項４９に記載の装置。
【請求項５６】
装置が複数の画定されたゾーンのアレイを含み、個々のゾーンが（ａ）固体支持体の表面の一部及びそれに結合する（ｂ）前記少なくとも１種の診断分子を含む、請求項４９に記載の装置。
【請求項５７】
前記診断分子が、核酸分子、ポリペプチド、それらに特異的な抗体、これらの任意の誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４９に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年１月７日提出の米国仮出願第６１／１４３，０４９号の利益を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＥＦＳ−ＷＥＢを介して提出した配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出され、テキストフォーマットで電子的に提出された配列表を含む。テキストファイルは、２０１０年１月５日に作成された「１３７８３５８．ｔｘｔ」と題された配列表を含み、サイズは４７，０５２バイトである。このテキストファイルに含まれる配列表は本明細書の一部であり、参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、全般に分子生物学に関し、アセトヒドロキシ酸シンターゼを阻害する植物の除草剤に対する耐性を増加する組成物及び方法並びに雑草防除のための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）は、世界の多くの地域において重要な作物である。バイオテクノロジー的方法が、生産物の農業形質及び質の改善のために大豆にて供されてきている。大豆生産において重要なこのような農業形質の１つは、除草剤耐性、特にグリホセート除草剤に対する耐性である。グリホセート耐性大豆の使用が増えたためグリホセートに耐性である雑草が出現した。したがって、雑草を管理するためにグリホセート以外の除草剤に対する耐性を有する大豆植物の必要性がある。
【０００５】
大豆などの植物におけるトランス遺伝子の表現型発現（除草剤耐性をもたらす遺伝子など）は、遺伝子それ自体の構造及び植物ゲノムにおけるその統合の位置によって影響を受ける。同時に、ゲノムに中の異なる位置における（外来ＤＮＡにおける）トランス遺伝子の存在は、さまざまな様式で植物の全表現型に影響を与えると思われる。植物における商業的に興味深い形質の遺伝子操作による導入の農業的及び工業的な成功は、さまざまな因子に依存する長期的手順であり得る。遺伝的形質転換植物の実際の形質転換及び再生は、一連の選択ステップの第１ステップに過ぎず、これらのステップは、広範囲の遺伝的特性化、最終的に優良なイベント（ｅｖｅｎｔ）の選択をもたらす、野外実験における育種及び評価を含む。
【０００６】
作物の改良における遺伝的修飾の使用の増加、商業品種へのトランス遺伝子の遺伝子移入の改善、ＧＭＯ及び非ＧＭＯ生産物の分離並びに独占所有権のある材料の特定のため、特定のトランスジェニックイベントを明確に検出及び／又は特定する能力は、次第に重要になってきている。特定のトランスジェニックイベントの検出のための、迅速且つ簡便の両方であり、広範囲の実験室設定の必要がない方法の開発の必要性が依然としてある。さらに、特定のイベントの検出方法は、組み換え作物由来の食品の市場導入前の承認及び表示を要求する規制の順守、又は環境モニタリング、野外における作物の形質のモニタリング若しくは作物収穫に由来する生産品のモニタリングにおける使用、及び規制条項又は契約条項の支配を受ける当事者の順守の確保における使用に役立つであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一実施形態において、本発明は、イベント１２７核酸分子を含む大豆植物を有する耕作地に、有効量の非選択性除草剤を適用するステップを含む、耕作地において雑草を防除する方法を提供する。
【０００８】
別の実施形態において、本発明は、イベント１２７核酸分子を含む大豆植物を有する作物畑に、有効量のＡＨＡＳ阻害除草剤を適用するステップを含む、作物畑においてグリホセート耐性の雑草を防除する方法を提供する。
【０００９】
さらに別の実施形態において、本発明は、配列番号１の１３１２から６０６９位の核酸配列を有する単離核酸分子を提供する。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、配列番号１の１３０２から６０７９位の核酸配列を有する異種核酸分子を有するトランスジェニック大豆植物をさらに提供する。
【００１１】
本発明は、イベント１２７核酸分子を増幅できる第１及び第２の単離核酸分子を含む、核酸プライマーの単離対をさらに提供する。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、第１及び第２の核酸プライマーを含み、第１及び第２の核酸プライマーがイベント１２７核酸分子を増幅できる、生物学的試料中のイベント１２７核酸分子を特定するキットを提供する。
【００１３】
本発明は、（ａ）大豆ＤＮＡ並びにイベント１２７特異的核酸分子を増幅できる第１及び第２の核酸プライマーを含有する生物学的試料を含む混合物を形成するステップ、（ｂ）第１及び第２の核酸プライマーが、イベント１２７特異的核酸分子を増幅できる条件下で混合物を反応させるステップ、並びに（ｃ）増幅された核酸分子断片の存在を検出し、大豆イベント１２７特異的核酸分子の存在が、大豆植物がイベント１２７大豆植物であることを示すステップを含む、イベント１２７大豆植物を特定する方法をさらに提供する。
【００１４】
その上さらなる実施形態において、本発明は、（ａ）大豆ＤＮＡ及びイベント１２７特異的核酸分子とハイブリダイズできる核酸分子プローブを含有する生物学的試料を含む混合物を形成するステップ、（ｂ）核酸分子プローブと、イベント１２７特異的核酸分子とがハイブリダイズできる条件下で混合物を反応させるステップ、並びに（ｃ）プローブとＤＮＡのハイブリダイゼーションを検出し、核酸分子プローブと大豆ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの存在が、イベント１２７核酸分子の存在を示すステップを含む、イベント１２７核酸分子を有する大豆植物を特定する方法をさらに提供する。
【００１５】
本発明は、イベント１２７核酸分子を含む大豆植物において収率を増加させる方法をさらに提供し、この方法は、有効量のＡＨＡＳ阻害性除草剤を、イベント１２７核酸分子を含む１種又は複数種の大豆植物及び周辺地域に適用し、ＡＨＡＳ阻害性除草剤が、周辺地域における雑草の成長を減少させるステップ、並びに１種又は複数種の大豆植物から種子を収穫するステップを含む。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、（ａ）イベント１２７核酸分子を含む大豆植物と第２の大豆植物とを交雑するステップ、（ｂ）ステップ（ａ）の交雑種から種を得るステップ、（ｃ）種子からＤＮＡ試料を得るステップ、並びに（ｄ）試料中のイベント１２７核酸分子の存在を検出し、イベント１２７核酸分子の存在が、この種子がＡＨＡＳ阻害性除草剤抵抗性大豆植物を生み出すことができることを示すステップを含む、ＡＨＡＳ阻害性除草剤抵抗性大豆植物を育種する方法を提供する。
【００１７】
本発明は、イベント１２７核酸分子を含む大豆植物の種子をさらに提供する。
【００１８】
さらに別の実施形態において、本発明は、（ａ）ＤＮＡ並びにイベント１２７特異的核酸分子を増幅できる第１及び第２の核酸プライマーを含有する生物学的試料を含む混合物を形成するステップ、（ｂ）第１及び第２の核酸プライマーがイベント１２７特異的核酸分子を含む核酸分子を増幅できる条件下で混合物を反応させるステップ、並びに（ｃ）増幅された核酸分子の存在を検出し、イベント１２７特異的核酸分子の存在が、この試料がイベント１２７核酸分子を含有することを示すステップを含む、生物学的試料中のイベント１２７核酸分子の存在を検出する方法を提供する。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、（ａ）ＤＮＡ及びイベント１２７特異的核酸分子とハイブリダイズできる核酸プローブを含有する生物学的試料を含む混合物を形成するステップ、（ｂ）プローブと、イベント１２７特異的核酸分子とがハイブリダイズできる条件下で混合物を反応させるステップ、並びに（ｃ）ハイブリダイズされた核酸分子の存在を検出し、イベント１２７特異的核酸分子の存在が、この試料がイベント１２７核酸分子を含有することを示すステップを含む、生物学的試料中のイベント１２７核酸分子を検出する方法を提供する。
【００２０】
本発明は、（ａ）ＤＮＡ及びイベント１２７インサート核酸分子を増幅できる第１及び第２のプライマーを含有する生物学的試料を含む混合物を形成するステップ、（ｂ）第１及び第２の核酸プライマーがイベント１２７インサート核酸分子を含む核酸分子を増幅できる条件下で混合物を反応させるステップ、並びに（ｃ）増幅された核酸分子の存在を検出し、イベント１２７インサート核酸分子の存在が、この試料がイベント１２７インサートＤＮＡを含有することを示すステップを含む、生物学的試料中のイベント１２７インサート核酸分子の存在を検出する方法を提供する。
【００２１】
さらに別の実施形態において、本発明は、（ａ）ＤＮＡ及び１２７インサート核酸分子の領域とアニーリングできる第１のプライマーと、宿主ゲノム中の隣接する核酸分子とアニーリングできる第２のプライマーとを含有する生物学的試料を含む混合物を形成するステップ、（ｂ）第１及び第２の核酸プライマーが、イベント１２７インサート核酸分子の断片を含む、増幅された核酸分子を作り出すことができる条件下で混合物を反応させるステップ、並びに（ｃ）増幅された核酸分子の存在を検出し、イベント１２７インサート核酸分子の断片の存在が、この試料がイベント１２７インサートＤＮＡを含有することを示すステップを含む、生物学的試料中のイベント１２７インサート核酸分子の存在を検出する方法を提供する。
【００２２】
別の実施形態において、本発明は、（ａ）イベント１２７核酸分子を含む大豆種子を提供するステップ、（ｂ）種子が発芽し、イベント１２７核酸分子を含む成長大豆植物を生ずることができる条件下で、大豆種子を成長培地に播くステップ、並びに（ｃ）成長培地、種子又は植物を、イミダゾリノン系除草剤、スルホニル尿素系除草剤、それらの相互の組合せ及びそれらと少なくとも１種の他の有効成分との組合せからなる群から選択される少なくとも１種の成分を含む除草剤組成物と接触させるステップを含む、大豆植物を成長させる方法を提供する。
【００２３】
さらに別の実施形態において、本発明は、大豆植物から生物学的試料を得るステップ、並びに試料について、少なくとも１種の免疫学的アッセイを実施し、このアッセイがイベント１２７ポリペプチドを検出できるステップを含む、試料中のイベント１２７ポリペプチドを検出する方法を提供する。
【００２４】
本発明は、表面を有する固体支持体、及び固体支持体の表面に結合した少なくとも１種のイベント１２７診断分子を含む、生体分子の検出に使用する装置をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】プラスミドｐＡＣ３２１の略図である。
【図１Ｂ】ＡＨＡＳＬ  ５’ＵＴＲ、ｃｓｒ１−２コーディング配列及び形質転換に使用されたＡＨＡＳＬ  ３’ＵＴＲを含有する、ｐＡＣ３２１のＰｖｕＩＩ断片の略図である。コピー数のサザンブロット分析に使用された酵素の制限部位（ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ、ＳｐｅＩ）、骨格の不在、世代間の安定性を示す。
【図２】大豆イベント１２７植物の一例の育種歴の略図である。
【図３】大豆イベント１２７インサートを含むｐＡＣ３２１  ＰｖｕＩＩ形質転換断片のアライメントの略図である。
【図４Ａ】（例３）に記載のように、大豆イベント１２７植物の一例におけるインサートのコピー数のサザンブロットハイブリダイゼーションの結果である。
【図４Ｂ】（例３）に記載のように、大豆イベント１２７植物の一例におけるインサートのコピー数のサザンブロットハイブリダイゼーションの結果である。
【図４Ｃ】（例３）に記載のように、大豆イベント１２７植物の一例におけるインサートのコピー数のサザンブロットハイブリダイゼーションの結果である。
【図４Ｄ】ハイブリダイゼーション実験に使用したプローブの相対的位置の略図である。
【図５Ａ】（例３）に記載のように、大豆イベント１２７植物の一例において、ベクター骨格配列の不在を示すサザンブロットハイブリダイゼーションの結果である。プローブＶＰ１を使用した結果である。
【図５Ｂ】（例３）に記載のように、大豆イベント１２７植物の一例において、ベクター骨格配列の不在を示すサザンブロットハイブリダイゼーションの結果である。プローブＶＰ２を使用した結果である。
【図５Ｃ】（例３）に記載のように、大豆イベント１２７植物の一例において、ベクター骨格配列の不在を示すサザンブロットハイブリダイゼーションの結果である。１２７イベント配列におけるハイブリダイゼーションの領域の相対的位置の略図である。
【図６Ａ】イベント１２７配列の世代間安定性のサザンブロットハイブリダイゼーション分析の結果である。５’ＵＴＲプローブを使用した結果である。
【図６Ｂ】イベント１２７配列の世代間安定性のサザンブロットハイブリダイゼーション分析の結果である。ＡＨＡＳプローブを使用した結果である。
【図６Ｃ】イベント１２７配列の世代間安定性のサザンブロットハイブリダイゼーション分析の結果である。３’ＵＴＲプローブを使用した結果である。
【図６Ｄ】イベント１２７配列の世代間安定性のサザンブロットハイブリダイゼーション分析の結果である。それぞれのプローブのイベント１２７配列に関するハイブリダイゼーション領域の略図である。
【図７】大豆イベント１２７植物の一例におけるインサート及び隣接配列の図である。（例３）に記載の配列決定に使用した６つのアンプリコンをさらに示す。
【図８】大豆イベント１２７のインサート及び隣接領域に（配列番号１）関する完全長核酸配列である。１〜１３１１位は５’隣接ＤＮＡを表し、１３１２〜６０６９位は修飾ＡＨＡＳＬタンパク質をコードするインサートＤＮＡを表し、６０７０〜１０，６５６位は３’隣接ＤＮＡを表す。
【図９】（例３）に記載のように、大豆イベント１２７植物の一例におけるＡｔＳｅｃ  ６１γサブユニットの転写のＲＴ−ＰＣＲ分析のゲル電気泳動結果である。
【図１０】（例３）に記載のように、大豆イベント１２７植物の一例において、３’隣接ジャンクションにｃｓｒ１−２コーディング配列の３７６ｂｐの重複が挿入されることによって作り出された５０１ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の転写のＲＴ−ＰＣＲ分析のゲル電気泳動結果である。
【図１１】（例３）に記載のように、イベント１２７−特異的ＰＣＲ検出方法の例のゲル電気泳動の結果である。
【図１２】イベント１２７、すなわち、ｐＡＣ３２１構築体（配列番号：４）由来の６１５６ｂｐのＰｖｕＩＩ断片を作り出すために使用されたＤＮＡである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、ＡＨＡＳ阻害性除草剤、例えばイミダゾリノン系除草剤、スルホニル尿素系除草剤、トリアゾロピリミジンスルホアニリド系除草剤及び／又はピリミジルオキシベンソエート系除草剤に対する耐性を示す大豆植物を提供する。本発明の大豆植物は、大豆ゲノム中の特徴付けられた位置に配置された挿入された核酸分子を含有する。さらに、開示された大豆植物を使用するための方法及び組成物を提供する。
【００２７】
さらに詳細に本発明を記載する前に、まず下記の用語を定義する。
【００２８】
Ｉ．定義
本明細書において使用する場合、「大豆」及び「大豆植物」はＧｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ植物を意味し、大豆を育種できるすべての植物種を含む。「大豆植物」という用語は、植物部位を含む。本明細書において使用する場合、「植物部位」という用語は、植物細胞、植物器官、植物プロトプラスト、植物が再生され得る植物細胞組織培養、植物のカルス、植物塊及び植物又は植物の一部中の無傷な植物細胞、例えば、胚、花粉、胚珠、種子、種子の鞘、葉、花、枝、果実、茎、根、根端、葯、子葉、胚軸などを含む。穀物は、種の成長又は再生以外の目的のための、商業的栽培者により生産される成熟種子を意味することを意図する。再生植物の子孫、誘導体、変異体及び突然変異体もまた本発明の範囲内に含まれ、イベント１２７核酸分子を含むこれらの部位も提供される。
【００２９】
「イベント１２７核酸分子」は、配列番号１の１３１２〜６０６９位の核酸配列を含む核酸分子、天然のセリン（Ｓ６５３Ｎ）ではなく、６５３位に対応するアスパラギンを含有するＡＨＡＳＬタンパク質を有するＡＨＡＳ酵素の修飾型の発現を提供し、ＡＨＡＳ酵素の修飾型が野生型ＡＨＡＳ酵素の酵素活性を正常に阻害するＡＨＡＳ阻害剤に対する耐性を示す伝統的植物育種により得られるそれらの変異体或いはこれらの任意の相補体を指す。イベント１２７核酸分子は、配列番号１の１３１２〜６０６９位に隣接するさらなる配列（又は、変異体に関しては、５’及び３’位に隣接するさらなる配列）を含有していてもよい。
【００３０】
「イベント１２７領域」は、イベント１２７核酸分子の少なくとも断片を含み、イベント１２７植物を表示している核酸分子を指す。イベント１２７領域は、５’及び／又は３’ジャンクション領域、インサートＤＮＡ又はインサートＤＮＡのｃｓｒ１−２重複ジャンクション領域及びインサートＤＮＡの残りの１つ又は複数を含むことができ、さらに５’及び／又は３’隣接配列ＤＮＡもさらにイベント１２７領域に含まれ得る。
【００３１】
本明細書において使用する場合、「イベント１２７特異的核酸分子」という用語は、試料中のイベント１２７核酸分子を識別的に特定する、又は識別的に特定できる核酸分子配列を指す。イベント１２７特異的核酸分子は、形質転換イベントにより得られたインサートＤＮＡ中のジャンクション領域及び固有の突然変異又は重複を含むことができる。例えば、ＰＣＲ反応における配列番号３７及び３８の核酸配列を有するＰＣＲプライマーの使用は、イベント１２７核酸分子を表示しているアンプリコンの増幅をもたらす。
【００３２】
「イベント１２７分子」は、イベント１２７核酸分子に由来する、イベント１２７核酸分子から得られる又はイベント１２７核酸分子によりコードされる核酸分子、ポリペプチド分子及び他の生体分子を指す。
【００３３】
「イベント１２７診断分子」は、イベント１２７核酸分子を直接又は間接的のどちらかで検出するために使用できる分子を指す。イベント１２７診断分子は、イベント１２７核酸分子又はこのような核酸分子から発現したポリペプチドを検出する方法に使用できる核酸分子、例えばプライマー及びプローブ、抗体及びそれらの結合部位保有断片（例えば、ｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）及びＨドメイン欠失抗体）、ポリペプチド及びそれらの誘導体、核酸類似体、アプタマーなどを含む。
【００３４】
本明細書において使用する場合、「インサートＤＮＡ」は形質転換処理を介して植物材料に導入された異種ＤＮＡを指し、本明細書に説明したような形質転換に使用されたもともとのＤＮＡとは異なるＤＮＡを含む。「イベント１２７インサート核酸」及び「イベント１２７インサートＤＮＡ」は、（イベント１２７を生み出すために使用したＤＮＡすなわち図１２に提供されるｐＡＣ３２１構築体に由来する６１５６ｂｐのＰｖｕＩＩ断片（配列番号４）とは異なる）配列番号：１の１３１２〜６０６９位の核酸配列を有する核酸分子を指す。
【００３５】
「イベント１２７」植物、細胞、種子、植物部位又は植物組織は、イベント１２７核酸分子を含有する、好ましくは少なくとも１つのイベント１２７固有の核酸を含有する任意の植物、細胞、種子、植物部位又は植物組織を指す。イベント１２７植物は、配列番号１の配列を有する核酸分子を含有するイベント１２７〜９大豆植物、例えばＢＰＳ−ＣＶ１２７−９と称される大豆植物を含む。
【００３６】
「隣接ＤＮＡ」という用語は、生物、例えば、植物中に、挿入された核酸分子のすぐ上流又はすぐ下流且つ近接して天然に存在するゲノムＤＮＡを指す。本明細書において使用する場合、「隣接領域」又は「隣接配列」は、もともとの外来の挿入されたＤＮＡ分子のすぐ上流（５’）且つ近接する、又はもともとの外来インサートＤＮＡ分子のすぐ下流（３’）且つ近接した、どちらかに位置する、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、１０００、１５００、２０００、２５００若しくは５０００塩基対又はそれ以上の配列を指す。イベント１２７の隣接領域の限定されない例は、配列番号２及び３並びにそれらの変異体及び断片で示され、配列番号２は配列番号１の１〜１３１１位を表し、配列番号３は配列番号１の６０７０〜１０，６５６位を表す。
【００３７】
外来インサートＤＮＡのランダムな統合をもたらす形質転換手順は、各形質転換体に特徴的及び固有のさまざまな隣接領域を含有する、個別の形質転換体をもたらす。組み換えＤＮＡが、伝統的な交雑を介して植物に導入された場合、その隣接領域は、一般的にもともとの形質転換体の隣接領域から変化しないと思われる。個別の形質転換イベントは、一片の異種インサートＤＮＡとゲノムＤＮＡとの間、又は二片のゲノムＤＮＡの間又は二片の異種ＤＮＡの間に固有のジャンクションを含有すると思われる。
【００３８】
「ジャンクションポイント」は２つの特異的ＤＮＡ断片が連結するポイント、例えばインサートＤＮＡが隣接ＤＮＡと連結するポイントである。ジャンクションポイントは、天然生物に見出される様式から改変された様式で２つのＤＮＡ断片が１つに連結した形質転換生物にも存在する。本明細書において使用する場合、「ジャンクションＤＮＡ」又は「ジャンクション領域」は、ジャンクションポイントを含むＤＮＡを指す。大豆イベント１２７由来のＤＮＡ中のジャンクションポイントの限定されない例は、例えば配列番号５及び６に示される配列を含み、配列番号５は配列番号１の１３１１〜１３１２位を表し、配列番号６は配列番号１の６０６９〜６０７０位を表す。
【００３９】
本明細書において使用する場合、「トランスジェニック」という用語は、任意の細胞、細胞系、カルス、組織、植物部位若しくは植物、初期にそのように改変されたトランスジェニックな遺伝子型及び初期再生イベントにより有性交雑又は無性繁殖により生み出された遺伝子型を含む、異種核酸の存在によって改変されている遺伝子型を含むと理解するべきである。本明細書において使用する場合、「トランスジェニック」という用語は、従来の植物育種方法による、又は天然発生イベント、例えばランダムな他家受精、非組み換えウィルス感染、非組み換え細菌性形質転換、非組み換え転位又は自然突然変異によるゲノムの改変（染色体又は染色対外）は包含しない。
【００４０】
「形質転換」は、遺伝的に安定な遺伝的形質をもたらす核酸断片の宿主生物のゲノムへの転移を指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」生物と称される。植物の形質転換法の例は、当分野において公知の方法及び下記の方法を含む。
【００４１】
「トランスジェニックイベント」は、対象のトランス遺伝子を含む核酸発現カセット、植物ゲノムへのトランス遺伝子のインサートによってもたらされる植物集団の再生、及び特定のゲノム位置へのインサートを特徴とする特定の再生植物の選択を含む、異種ＤＮＡ構築体（単数又は複数）を有する植物細胞の形質転換により生み出される。イベントは、トランス遺伝子（単数又は複数）の発現によって、表現型の上で特徴付けられる。遺伝子レベルにおいて、イベントは、植物の遺伝子構造の一部である。
【００４２】
本明細書において使用する場合、「試料」は、核酸分子又はポリペプチドを含有する任意の試料を含み、植物、植物材料に由来する、又は製品中、例えば、限定するものではないが、植物材料を含む、又は植物材料に由来する食品又は試料（生鮮品又は加工品）中に存在する。
【００４３】
形質転換に関連した「導入（ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ）」又は「導入された（ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ）」は、異種ＤＮＡ構築体の、構築体が植物細胞内部への接近を獲得するような様式における植物への提示を意図する。本発明の植物及び方法は、核酸構築体が植物の少なくとも一細胞の内部への接近を獲得するだけの、核酸構築体を植物に導入する特定の方法に依存しない。限定するものではないが、安定な形質転換方法、一時的形質転換方法及びウィルス媒介方法を含む核酸構築体を植物に導入する方法は、当分野において公知である。
【００４４】
「子孫」という用語は、イベント１２７植物と別の種との間の有性交雑（例えば、異系交雑、自己交雑又は戻し交雑）により生み出された植物を指す。反復親への戻し交雑を繰り返した後でさえ、イベント１２７親に由来する挿入されたＤＮＡ及び／又は隣接ＤＮＡは、同じ染色体位置における交雑の子孫中に存在し、例えば、イベント１２７特異的領域に関するスクリーニングによって特定できる。
【００４５】
本明細書において使用する場合、核酸分子に関連した「異種」は、外来種を起源とする核酸分子、又は同じ種に由来する場合、意図的なヒトの介入によって構成及び／又はゲノム遺伝子座において、その天然型から改変された核酸分子である。
【００４６】
「単離された」若しくは「精製された」核酸分子又はそれらの生物学的に活性な部分は、その天然発生の環境において見出だされる核酸分子に通常伴う又は相互作用する成分を実質的に又は基本的に含まない。したがって、単離された、又は精製された核酸分子は、他の細胞材料、若しくは組み換え技術により作製された場合、培養培地を実質的に含まない、又は化学的に合成された場合、化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。
【００４７】
「プローブ」は、検出可能の標識又はレポーター分子例えば、放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、酵素などと結合した核酸分子を指す。このようなプローブは、標的核酸分子鎖と相補的であり、この場合、大豆植物由来又は本イベント由来のＤＮＡを含む試料由来であっても、大豆イベント１２７植物の生体材料由来の単離ＤＮＡ鎖と相補的である。プローブは、デオキシリボ核酸又はリボ核酸を含むだけではなく、標的ＤＮＡ配列の存在を特異的に検出できるポリアミド及び他のプローブも含む。
【００４８】
本明細書において使用する場合、「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的標的ＤＮＡ鎖とアニーリングでき、プライマーと標的ＤＮＡ鎖の間にハイブリッドを形成でき、その後ポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼによって、標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長され得る単離核酸分子である。「プライマー対」は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は他の既存の核酸増幅方法による、標的核酸分子の増幅に使用するための一対のプライマーを指す。「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」は、特定のＤＮＡセグメントの増幅に使用する技術である。
【００４９】
「系」又は「株」は、一般的にある程度同系交配であり、一般的に同質遺伝子又は準同質遺伝子である、同一の家系の個別の群である。
【００５０】
本発明に関連する「交雑された」又は「交雑する」という用語は、例えば植物の場合、例えば子孫（例えば、細胞、種子又は植物）を生み出すための受粉を介した配偶子の融合を意味する。この用語は、有性交雑（１種の植物と別の植物による受粉）及び植物の場合、自殖（自家受粉、すなわち花粉及び胚株が同じ植物由来である場合）の両方を包含する。
【００５１】
「遺伝子移入」という用語は、１つの遺伝的背景から別の遺伝的背景への遺伝子座の所望の対立遺伝子の伝達を指す。一方法において、所望の対立遺伝子は、２つの親の間の有性交雑を介して遺伝子移入でき、親の一方の少なくとも１つはそのゲノム中に所望の対立遺伝子を有する。
【００５２】
ＩＩ．大豆イベント１２７植物
トランスジェニックＡＨＡＳ阻害剤耐性大豆植物に関する組成物及び方法を提供する。このような組成物は、イベント１２７大豆植物を含む。イベント１２７大豆植物は、イミダゾリノン耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼの大型サブユニット遺伝子のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（ｃｓｒ１−２）から本明細書に定義の大豆ゲノムへの挿入又は遺伝子移入によって、野生型又は非形質転換大豆植物から改変されている。いくつかの実施形態において、ｃｓｒ１−２遺伝子の大豆ゲノムへのインサートは、天然のセリン（Ｓ６５３Ｎ）ではなく６５３位に対応するアスパラギンを含有するＡＨＡＳＬタンパク質を有する、改変型のアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）酵素の発現をもたらす。ＡＨＡＳ酵素は、分枝型アミノ酸の生合成にとって重要であり、特定の除草剤（ＡＨＡＳ阻害性除草剤）により阻害される。ＡＨＡＳ遺伝子の改変はこの阻害を克服し、したがって、広範囲のＡＨＡＳ阻害性除草剤に対する耐性をもたらす。したがって、大豆イベント１２７植物は少なくとも１種のＡＨＡＳ阻害性除草剤に対して耐性であり、又はイベント１２７核酸分子を欠いた大豆植物と比較して、少なくとも１種のＡＨＡＳ阻害性除草剤に対して耐える量が増加する。
【００５３】
ＡＨＡＳ阻害剤耐性をもたらす核酸分子は、大豆ゲノムの特徴的な位置におけるインサートが見出され、その結果１２７イベントを生じる。一実施形態において、列挙した染色体位置にイベント１２７核酸分子を担持するイベント１２７大豆植物は、少なくとも配列番号５及び／又は６の核酸分子配列を有する、１つ又は複数のゲノム／トランス遺伝子のジャンクションを含む。イベント１２７のゲノムインサート部位の特徴付けは、育種効率の強化をもたらし、育種集団及びそれらの子孫中のトランス遺伝子インサートを追跡するための分子マーカーの使用を可能にする。イベント１２７大豆植物の特定、検出及び使用に関するさまざまな方法及び組成物を、本明細書において提供する。
【００５４】
ｃｓｒ１−２発現カセット、プラスミドｐＡＣ３２１由来のＰｖｕＩＩ断片を、大豆ゲノム中の単一の特徴付けられた遺伝子座において統合し、イベント１２７をもたらした。一実施形態において、イベント１２７において挿入されたｃｓｒ１−２カセットは、プラスミドｐＡＣ３２１由来のもともとの形質転換断片と比較して、３か所に突然変異を含有し、１つの突然変異はＡＨＡＳコーディング配列の中であり、他の２つはＡＨＡＳＬ  ３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の下流である。このような突然変異は、コーディング配列におけるＧからＡへの突然変異を含み、これによりＲ２７２からＫ２７２へのアミノ酸置換を有するＡＨＡＳポリペプチドの発現がもたらされる。点突然変異のサザンブロット分析及び配列検証により、このインサートが少なくも８世代にわたって安定であることが示される。イベント１２７中に挿入されたＤＮＡは、３’統合ポイント（重複は、配列番号１の５６９４〜６０６９位により表される）の直前に、ｃｓｒ１−２コーディング配列の一部の３７６の塩基対（ｂｐ）の重複もさらに含有する。この重複した３７６ｂｐのセグメントは、３’隣接配列に及ぶ５０１ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をもたらす。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の結果は、この５０１ｂｐのＯＲＦが転写されないことを示唆している。いくつかの実施形態において、イベント１２７核酸分子は、シロイヌナズナＳＥＣ６１γサブユニットの遺伝子座（Ａｔ３ｇ４８５７０）の大部分をさらに含有し、これは、形質転換に使用したＤＮＡ断片の構成要素である。他の実施形態において、ＳＥＣ６１γサブユニット遺伝子は大豆イベント１２７植物において発現され得る。例えば、以下の実施例においてより詳細に開示されるように、ＲＴ−ＰＣＲ実験は、シロイヌナズナＳＥＣ６１γサブユニット遺伝子が、イベント１２７の葉の組織においてわずかに転写されることを示す。合計約１．３キロベース（ｋｂ）の５隣接大豆ＤＮＡは、約４．６ｋｂの３’隣接大豆ＤＮＡと一緒に配列決定されている。本発明に従って、隣接配列の情報を、イベント１２７特異的定性ＰＣＲ検出方法の開発に使用できる。特定された点突然変異及び重複などのイベント１２７核酸分子の他の特徴もまた、子孫及びそれらの誘導体を含むイベント１２７植物の検出のために本明細書に提供される方法に使用できる。
【００５５】
本発明のイベント１２７植物は、ＡＨＡＳ阻害性除草剤の適用に対して耐性である。イベント１２７植物は、５０ｇ  ａｉ／ｈａと約５００ｇ  ａｉ／ｈａとの間、７０ｇ  ａｉ／ｈａと約４００ｇ  ａｉ／ｈａとの間、及び７０ｇ  ａｉ／ｈａと約３００ｇ  ａｉ／ｈａとの間の除草剤適用量と同等の量を含む適用レベルにおいて、ＡＨＡＳ阻害性除草剤のレベルに対して耐性又は耐性の強化を示す。このような耐性は、除草剤の市販の適用レベルの１×、２×、３×、４×、５×又はそれを超える量のＡＨＡＳ阻害性除草剤のレベルに対する耐性もまた含み得る。
【００５６】
ＡＨＡＳ阻害性除草剤に対する耐性は、除草剤耐性を決定する任意の方法によって決定できる。例えば、大豆イベント１２７植物が、適切な対照植物と比較して、対照植物により示される損傷より少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％若しくは１０００％又はそれ以上少ない損傷を示す場合、大豆イベント１２７植物はＡＨＡＳ阻害性除草剤又は他の化学物質に対する耐性を実証することができる。この様式においてＡＨＡＳ阻害性除草剤又は他の化学物質に対して耐性である植物は、適切な対照植物と比較して「耐性の改善」を示す。除草剤又は他の化学物質による処理からもたらされる損傷は、当業者によって適切と見なされる植物の成長又は健全性の任意のパラメーターを評価することによって査定される。損傷は、外観検査及び／又は個別の植物若しくは植物群の適切なパラメーターの統計学的分析によって査定され得る。したがって、損傷は、例えば草高、植物の重量、葉の色、開花、繁殖力、産出高、種子生産などのパラメーターを評価することによって査定され得る。損傷は、発生の特定の段階（例えば、成熟又は開花）までの経過時間又は植物が特定の化学物質及び／又は除草剤による処理から回復するまでの経過時間を評価することによって査定され得る。
【００５７】
ＡＨＡＳ阻害性除草剤又は他の化学物質により引き起こされる損傷は、イベント１２７植物が除草剤によって処理された後、又は除草剤と接触させられた後のさまざまな時点において査定され得る。対照植物が最大の損傷を示す時間について査定され得る、又は除草剤若しくは他の化学物質により処理されなかった対照植物が、処理を受けた時点のサイズ若しくは段階と比較して測定可能に成長した、及び／又は発達した期間後に査定され得る。さらに、損傷は、試験植物が除草剤により処理された後さまざまな時間、例えば１２時間若しくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日若しくは３週間、４週間又はそれより長い時間において査定され得る。試験植物及び対照植物の処理に応じた差が検出可能である限り、いずれの査定時間も適切である。
【００５８】
本発明は、イベント１２７核酸分子を含有する大豆系ＣＶ６０３（「ＢＰＳ−ＣＶ１２７−９」としても公知である）の種子をさらに含み、ＮＣＩＭＢ特許受託番号４１６０３及びそれに由来する植物、植物細胞及び種子として寄託されている。出願（単数又は複数）は、イベント１２７核酸分子を含有する大豆植物の少なくとも２５００種の種子を、国立産業食品及び海洋菌収集所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，Ｆｏｏｄ，ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＮＣＩＭＢ））、２３  Ｓｔ．Ｍａｃｈａｒ  Ｄｒｉｖｅ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ  ＡＢ２  １ＲＹ、スコットランド、英国に２００８年１２月２２日に寄託し、ＮＣＩＭＢ受託番号４１６０３に指定された。これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約ブダペスト条約の条件下で維持される。この寄託は、単に当業者の便宜のために実施されたものであり、寄託が３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２のもとに要求されたことを承認するものではない。２００８年１２月２２日にＮＣＩＭＢに寄託された種子は、Ｅｍｂｒａｐａ  （Ｅｍｐｒｅｓａ  Ｂｒａｓｉｌｅｉｒａ  ｄｅ  Ｐｅｓｑｕｉｓａ  Ａｇｒｏｐｅｃｕａｒｉａ）により維持された寄託から採取した。この寄託物の利用は、本出願の係属期間中、特許商標庁長官及び要請に応じて長官により権利があると決定された者に利用可能にされるものである。出願における任意の特許請求の許可において、出願人（単数又は複数）は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８０８に準じて、国立産業食品及び海洋菌収集所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，Ｆｏｏｄ，ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  （ＮＣＩＭＢ））、２３  Ｓｔ．Ｍａｃｈａｒ  Ｄｒｉｖｅ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ  ＡＢ２  １ＲＹ、スコットランド、英国に寄託されたイベント１２７核酸分子を含有する大豆植物の少なくとも２５００種の種子の試料（単数又は複数）を公衆に利用可能にするものである。大豆系ＣＶ６０３の種子のこの寄託は、公共の寄託機関であるＮＣＩＭＢ  寄託機関において、３０年間若しくは最新の請求後５年間又は特許の権利行使可能期間のどちらかより長い期間維持され、その期間中に生き残れない場合再寄託される。さらに、出願人（単数又は複数）は、寄託における試料の生存の表示を含む３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８０１〜１．８０９の要件をすべて満たしている。出願人（単数又は複数）は、生物学的材料の運搬又はその商業的輸送に関して、法律により課せられている任意の制限を放棄する権限は有さない。出願人（単数又は複数）は、この特許のもとに認められたそれらの権利又は植物防疫法（Ｐｌａｎｔ  Ｖａｒｉｅｔｙ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｃｔ）（７  ＵＳＣ  ２３２１  ｅｔ  ｓｅｑ．）のもとに大豆系ＣＶ６０３に適用可能な権利の任意の侵害を放棄しない。無認可の種子増殖は禁止されている。種子は規制され得る。
【００５９】
本発明のイベント１２７大豆植物は、イベント１２７大豆植物を生じる初期形質転換イベントの子孫、誘導体、変異体及び突然変異体をさらに含む。このような植物は、限定するものではないが、育種記録、除草耐性法、分子検出法、本明細書に開示の方法及びそれらの組合せを含む、このような植物の任意の特定方法を使用して特定され得る。
【００６０】
本発明のイベント１２７大豆植物は、少なくとも１種のＳ６５３Ｎ突然変異を欠いた内因性ＡＨＡＳ酵素の活性に干渉する除草剤（ＡＨＡＳ阻害性除草剤）に対して耐性である。ＡＨＡＳ酵素の活性に干渉する除草剤は、イミダゾリノン系除草剤、スルホニル尿素系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤、ピリミジニルオキシベンゾエート系除草剤、スルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン系除草剤又はそれらの混合物若しくは組合せを含む。一実施形態において、このような除草剤は、イミダゾリノン系除草剤、スルホニル尿素系除草剤又はそれらの混合物である。イミダゾリノン系除草は、限定するものではないが、ＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）（イマゼタピル）、ＣＡＤＲＥ（登録商標）（イマザピック）、ＲＡＰＴＯＲ（登録商標）（イマザモックス）、ＳＣＥＰＴＥＲ（登録商標）（イマザキン）、ＡＳＳＥＲＴ（登録商標）（イマザメタベンズ）、ＡＲＳＥＮＡＬ（登録商標）（イマザピル）、前述の除草剤の任意の誘導体及び前述の除草剤の２種以上の混合物又は組合せ、例えばイマザピル／イマザモックス（ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標））を含む。イミダゾリノン系除草剤は、限定するものではないが、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミジアゾリン−２−イル）−ニコチン酸、［２−（４−イソプロピル）−４−］［メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−３−キノリンカルボン］酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−）４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル］−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、［２−（４−イソプロピル−４−メチル５−オキソ−２−）イミダゾリン−２−イル］−５−メチルニコチン酸及びメチル［６−（４−イソプロピル−４−）メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル］−ｍ−トルエート及びメチル［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−）オキソ−２−イミダゾリン−２−イル］−ｐ−トルエートの混合物からも選択できる。一実施形態において５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸及び［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−）イル］−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸が使用される。別の実施形態において、［２−（４−イソプロピル−４−］メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸が使用される。
【００６１】
本発明に使用できるスルホニル尿素系除草剤は、限定するものではないが、クロロスルフロン、メトスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、チフェンスルフロンメチル、トリベヌロンメチル、ベンスルフロンメチル、ニコスルフロン、エタメトスルフロンメチル、リムスルフロン、トリフルスルフロンメチル、トリアスルフロン、ピリミスルフロンメチル、シノスルフロン、アミドスルフロン、フルザスルフロン、イマゾスルフロン、ピラゾスルフロンエチル、ハロスルフロン、アジムスルフロン、シクロスルフロン、エトキシスルフロン、フラザスルフロン、フルピルスルフロンメチル、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン、オキサスルフロン、メソスルフロン、プロスルフロン、スルホスルフロン、トリフルオキシスルフロン、トリトスルフロン、前述の除草剤の任意の誘導体及び前述の除草剤の２種以上の混合物を含む。本発明のトリアゾロピリミジン系除草は、限定するものではないが、クロランスラム、ジクロスラム、フロラスラム、フルメツラム、メトスラム及びペノキススラムを含む。本発明のピリミジニルオキシベンゾエート（又はピリミジニルカルボキシ）系除草剤は、限定するものではないが、ビスピリバック、ピリチオバック、ピリミノバック、ピリベンゾキシム及びピリフタリドを含む。スルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン系除草剤は、限定するものではないが、フルカルバゾン及びプロポキシカルバゾンを含む。
【００６２】
ピリミジニルオキシベンゾエート系除草剤は、ピリミジニルチオベンゾエート系除草剤と関係があり、米国雑草学会（Ｗｅｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）によりピリミジニルチオベンゾエート系除草剤の表題で一般化され得るものと認識される。したがって、本発明の除草剤は、限定するものではないが、上記のピリミジニルオキシベンゾエート系除草剤を含むピリミジニルチオベンゾエート系除草剤をさらに含む。
【００６３】
ＩＩＩ．核酸分子
本発明は、単離されたイベント１２７核酸分子をさらに提供する。本明細書において使用する場合、「核酸分子」という用語の使用は、ＤＮＡを含む核酸分子に限定する意図のものではなく、任意のヌクレオチド、例えば、リボヌクレオチド及びリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの組合せを含むことができる。このようなデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドは、天然発生分子及び合成類似体の両方を含む。核酸分子は、限定するものではないが、一本鎖型、二本鎖型、ヘアピン、ステム−アンド−ループ構造などを含むすべての配列型をさらに包含する。一実施形態において、イベント１２７核酸分子は、配列番号１の１３１２から６０６９位の核酸配列を有する核酸分子を含む。別の実施形態において、イベント１２７核酸分子は、配列番号１の１３０２から６０７９位のヌクレオチド配列を有する核酸分子を含む。
【００６４】
イベント１２７核酸分子は、配列番号１の断片をさらに含む。ヌクレオチド配列の「断片」は、任意の長さ、例えば、少なくとも７、１５、２０、２５、３０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５５０、６５０、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３５００、４０００、４５００又はそれ以上のヌクレオチド（ｎｔ）長の断片であり得る。これらの断片は、限定するものではないが、診断プローブ及びプライマーを含む多くの用途を有する。当然のこととして、大型の断片、例えば、６０１〜８０００ｎｔ長の断片は、すべてではない場合、配列番号１のヌクレオチド配列の大部分に対応する断片であるので、本発明に従って有用である。例えば、少なくとも２０長の断片は、配列番号１のヌクレオチド配列由来の２０又はそれ以上の連続した塩基を含む断片が意図される。
【００６５】
イベント１２７植物は、イミダゾリノン阻害性除草剤に対する抵抗性又は耐性をもたらし得る、Ｓ６５３Ｎ突然変異を有するＡＨＡＳＬコーディング配列を有するトランスジェニック発現カセットを含む。このカセットは、ＡＨＡＳＬコーディング配列に動作可能に連結された５’調節配列及び３’調節配列をさらに含む。「動作可能に連結された」は、２つ以上の構成要素の間の機能性連結を意味することが意図される。例えば、対象の核酸分子と調節配列（例えばプロモーター）と間の動作可能な連結は、対象の核酸分子の発現を可能にする機能性連結である。動作可能に連結された構成要素は、連続であっても、又は非連続であってもよい。動作可能な連結を、２つのタンパク質のコーディング領域の連結を指すために使用する場合、コーディング領域は同一のリーディングフレーム内に存在することが意図される。
【００６６】
したがって、大豆イベント１２７植物中の発現カセットは、５’〜３’の転写方向に、植物において機能性の、転写及び翻訳の開始領域（例えばプロモーター）、ＡＨＡＳＬ  Ｓ６５３Ｎコーディング領域及び転写及び翻訳の終止領域を含有する。「プロモーター」は、コーディング配列又は機能性ＲＮＡの発現を調節できるヌクレオチド配列を指す。一般に、コーディング配列は、プロモーター配列の３’に位置する。プロモーター配列は、近接及びより遠位の上流構成要素を含むことができ、後者の構成要素は多くの場合エンハンサーと呼ばれる。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができるヌクレオチド配列であり、プロモーターの固有の構成要素であっても、又はプロモーターのレベル又は組織特異性を強化するために挿入された異種構成要素であってもよい。プロモーターは、それら全体が天然遺伝子に由来してもよく、又は天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なる構成要素から構成されていてもよく、さらに合成ヌクレオチドセグメントを含んでいてもよい。異なるプロモーターは、異なる組織型若しくは細胞型において、又は発達の異なる段階において、又は異なる環境条件に応じて遺伝子の発現を対象とできることは、当業者には理解される。常時、大部分の細胞型において発現される核酸断片を生じるプロモーターは、「構成的プロモーター」と称される。
【００６７】
一実施形態において、大豆イベント１２７植物中の発現カセットは、動作可能に連結した構成要素として、シロイヌナズナｃｓｒ１−２プロモーターの調節下において配列をコードするＡＨＡＳＬ  Ｓ６５３Ｎ及びｃｓｒ１−２転写終止領域を含有する。発現カセットは、ＰｖｕＩＩ断片として核酸構築体ｐＡＣ３２１に由来する。一実施形態において、発現カセットは配列番号４の配列を有する。
【００６８】
イベント１２７核酸分子の検出及び／又は特定のためのさまざまな方法に使用できる単離核酸分子を提供する。一実施形態において、「単離」核酸分子は、核酸分子が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて核酸分子に天然に隣接する配列（例えば、配列をコードするタンパク質）（すなわち、核酸の５’末端及び３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、さまざまな実施形態において、単離核酸分子は核酸分子が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいて核酸分子に天然に隣接する、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ又は０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有できる。
【００６９】
いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号５及び／又は６で示されるジャンクションＤＮＡ配列を含む。他の実施形態において、核酸分子は、配列番号５及び／又は６で示されるジャンクションＤＮＡ配列或いはそれらの変異体及び断片を含む。ジャンクションＤＮＡ配列の変異体及び断片は、イベント１２７ＤＮＡを識別的に特定するために適している。本明細書の別の箇所において述べたように、このような配列は、試料中のイベント１２７インサートＤＮＡの検出に使用するためのプライマー及び／又はプローブとしての使用が見出される。
【００７０】
他の実施形態において、イベント１２７植物、イベント１２７インサートＤＮＡ又はイベント１２７特異的核酸分子を検出できる核酸分子を提供する。このような配列は、配列番号５及び／又は６で示される核酸分子、又はそれらの変異体又はそれらの相補体を含む、任意の核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、イベント１２７核酸分子を検出するために使用される核酸分子は、配列番号５及び／又は６で示される配列又はそれらの相補体を含む。イベント１２７核酸分子、イベント１２７インサートＤＮＡ又はイベント１２７特異的領域を検出する核酸分子の断片及び変異体は、イベント１２７植物を識別的に特定するために適している。本明細書の別の箇所において述べたように、このような配列は、プライマー及び／又はプローブとしての使用が見出される。さらに、配列番号：３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、６７、６８、６９、７０に出示される配列若しくはそれらの相補体又は配列番号：３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、６７、６８、６９、７０の変異体及び断片若しくはそれらの相補体を含む、又はそれらからなる単離ＤＮＡヌクレオチドプライマー配列を提供する。
【００７１】
一実施形態において、本明細書において使用するための特異的プライマー対は、（特定された配列番号１に対する相対的位置とともに）以下に示すフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む。プライマーは３２７塩基対のバンドサイズを作り出すことが予測される。
【表１】
0005988585.tif 000002
【００７２】
本明細書において使用する場合、核酸配列に関する「変異体」は、実質的に類似の配列を指す。核酸分子に関しては、変異体は、５’末端及び／又は３’末端における欠失（例えば切断）；天然の核酸分子中の１つ又は複数の内部部位における、１つ又は複数のヌクレオチドの欠失及び／又は付加；並びに／或いは天然の核酸分子中の１つ又は複数の部位における、１つ又は複数のヌクレオチドの置換を有する核酸分子を含む。
【００７３】
本発明において、イベント１２７特異的領域（例えば、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、６７、６８、６９，及び７０）の検出のために、本明細書において開示したようなプライマーの任意の組合せが使用できる。プライマー対の限定されない例は、配列番号３５及び３６；配列番号３７及び３８；配列番号３９及び４０；配列番号４１及び４２；配列番号４３及び４４、配列番号６７及び６８、配列番号６９及び７０を含む。さらなるプライマー及びプライマー対は、開示された方法における使用のために、本発明に従ってさらに設計され得る。
【００７４】
提供された方法における使用のためのプローブ及びプライマーは、標的ＤＮＡ配列と結合し、生物学的試料、例えば試験される植物から得られた試料中の核酸分子を特異的に検出及び／又は特定するために十分なヌクレオチド長のプローブ及びプライマーである。ハイブリダイゼーション条件又は反応条件が、この結果を得るために操作者によって決定され得ることが認識される。この長さは、選択した検出方法において有用である任意の長さ、例えば８、１０、１１、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００ヌクレオチド若しくはそれ以上、又は約１１〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００又はそれ以上のヌクレオチド長であってよい。このようなプローブ及びプライマーは、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で標的配列と特異的にハイブリダイズできる。標的ＤＮＡ配列と異なり、標的ＤＮＡ配列を特異的に検出及び／又は特定する能力を保有するプローブは既存の方法で設計され得るが、実施形態に従ったプローブ及びプライマーは、標的配列を含む連続ヌクレオチドの完全なＤＮＡ配列の同一性を有することができる。したがって、プローブ及びプライマーは、標的核酸分子（例えば、配列番号：３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４）に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列の同一性又は相補性を共有でき、或いは、標的配列（例えば、配列番号：３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４）と１、２、３、４、５、６又はそれ以上のヌクレオチドが異なってもよい。プローブは、プライマーとしても使用できるが、一般的に標的ＤＮＡ又はＲＮＡと結合するように設計され、増幅過程には使用されない。
【００７５】
いくつかの実施形態において、イベントＤＮＡの断片を増幅するために特異的プライマーを使用して、「特異的プローブ」として使用できるアンプリコンを作製でき、又はアンプリコンそれ自体が、生物学的試料中のイベント１２７核酸分子の特定のために検出され得る。又は、ＰＣＲ反応の際にプローブを使用して、増幅イベントの検出を可能にできる（例えば、Ｔａｑｍａｎプローブ又はＭＧＢプローブ）（いわゆるリアルタイムＰＣＲ）。プローブと試料との結合が可能な条件下で、プローブが生物学的試料中の核酸分子とハイブリダイズする場合、この結合は検出でき、したがって、生物学的試料中のイベント１２７の存在が表示できる。結合されたプローブのこのような特定は、当分野において記載されている。一実施形態において、最適条件下でプローブは、イベントの５’隣接領域又は３’隣接領域を含む領域と特異的にハイブリダイズする配列であり、それらと連続するインサートＤＮＡの一部をさらに含み、したがってジャンクション領域にまたがる。特異的プローブは、イベント１２７核酸分子の特異的領域に対して少なくとも８０％、８０及び８５％の間、８５及び９０％の間、９０及び９５％の間並びに９５及び１００％同一（又は相補的）の配列を含むことができる。
【００７６】
本明細書において使用する場合、「増幅されたＤＮＡ」又は「アンプリコン」は、核酸の鋳型の一部である標的核酸分子の核酸分子増幅の産物を指す。例えば、有性交雑から得られた大豆植物がイベント１２７核酸分子を含有するかどうかを決定するために、大豆植物組織試料から抽出されたＤＮＡを、挿入された異種ＤＮＡの挿入部位に近接する隣接配列に由来する第１のプライマー及びイベント１２７核酸分子の存在の診断である、又はその表示であるアンプリコンを産生する挿入された異種ＤＮＡに由来する第２のプライマーを含むＤＮＡプライマー対を使用する、核酸分子増幅法に供することができる。イベント１２７領域に関する「診断」によって、生物学的試料中のイベント１２７領域の存在又は不在を識別する任意の方法又はアッセイの使用が意図される。又は、第２のプライマーは、隣接配列に由来し得る。さらに他の実施形態において、プライマー対は、発現構築体の挿入された核酸分子全体及びトランスジェニックインサートに隣接する配列、例えば配列番号１を含むアンプリコンを作製するように挿入されたＤＮＡの両側の隣接配列に由来し得る。アンプリコンは、イベントを診断する長さであり、イベントを診断する配列を有する（例えば、イベント１２７領域由来のジャンクションＤＮＡを含有する）。アンプリコンは、プライマー対＋１ヌクレオチド塩基対の組み合わされた長さから、ＤＮＡ増幅プロトコルによって作製可能な任意の長さのアンプリコンまでの長さに及ぶことができる。隣接配列に由来するプライマー対のメンバーは、挿入されたＤＮＡ配列から遠位に位置することができ、この距離は、１ヌクレオチド塩基対から増幅反応の限界まで、又は約２万ヌクレオチド塩基対まで及ぶことができる。別の実施形態において、プライマー対は、インサートＤＮＡ又はインサートＤＮＡの断片を増幅するために設計できる。このようなプライマー対は、生物学的試料中のイベント１２７インサートＤＮＡの存在を検出するために有用である。「アンプリコン」という用語の使用は、ＤＮＡ熱増幅反応において形成され得るプライマー二量体を明確に排除する。
【００７７】
特定の実施形態において、有用なプライマー対は、インサートＤＮＡと隣接５’又は３’ゲノムＤＮＡとのジャンクションポイントと重複する１つのプライマーを含むであろう。このようなプライマーは、５’隣接ＤＮＡとインサートＤＮＡとの間のジャンクションポイント（すなわち、配列番号１の１３１１と１３１２位との間のジャンクション）周辺並びにインサートＤＮＡと３’隣接ＤＮＡとの間のジャンクションポイント（すなわち、配列番号１の６０６９と６０７０位との間のジャンクション）周辺に設計できる。このようなプライマーは、隣接領域又はインサートＤＮＡのどちらかに由来する約１０ヌクレオチドと、インサートＤＮＡ又は隣接領域中のジャンクションポイントを横切る少なくとも１ヌクレオチドとがハイブリダイズするように設計できる。したがって、例えば、プライマーは、少なくとも配列番号１の以下の位置：１３１１〜１３２１、１３０２〜１３１２、６０６０〜６０７０及び／又は６０６９〜６０７９によって表されるヌクレオチドとハイブリダイズするように設計されたヌクレオチド配列を含むことができる。
【００７８】
他の実施形態において、有用なプライマー対は、インサートＤＮＡのｃｓｒ１−２コーディング配列の重複された部分の５’末端（配列番号１の５６９４位）と近接インサートＤＮＡ（すなわち、配列番号１の５６９３位）との間のジャンクションポイントと重複する１つのプライマーを含むであろう。このようなプライマーは、重複領域又は近接インサートＤＮＡのどちらかに由来する約１０ヌクレオチドと、ジャンクションポイント（例えば、配列番号１の少なくとも５６９３〜５７０３又は少なくとも５６８４〜５６９４）を横切る少なくとも１ヌクレオチドとがハイブリダイズするように設計できる。
【００７９】
本発明における使用のためのプローブ及びプライマーを調製及び使用する方法は、当分野において公知である。ＰＣＲプライマー対は、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩバージョン６（Ｉｎｆｏｒｍａｘ  Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．）；ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）；及びＰｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ０．５（著作権）、１９９１年、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）におけるＰＣＲプライマー分析ツールを目的として意図されたコンピュータプログラムを使用することによって、公知の配列に由来してもよい。さらに、この配列は視覚的にスキャンでき、プライマーは、当業者に公知の指針を使用して、手作業で特定され得る。
【００８０】
ＩＶ．育種方法
開示されたイベント１２７大豆植物は、さらなるイベント１２７大豆植物、例えば子孫植物を生み出す育種方法を使用する育種プログラムに使用できる。このような育種方法は、例えばさまざまな地理的領域における商業生産における使用又はさらなる大豆育種集団の生産のために、大豆植物の生産に使用できる。
【００８１】
さらに、イベント１２７大豆植物は、ＡＨＡＳ阻害剤耐性を組み合わせたさらなる対象の形質、例えば、グリホセート、グルホシネート及び／又はジカンバなどのさらなる除草剤に対する抵抗性の組合せを有する（「スタック形質」又は「形質のスタッキング」とも称される）大豆植物を生産するための育種方法を使用する育種プログラムに使用できる。さらに、イベント１２７大豆植物は、多数のＡＨＡＳ阻害性除草剤抵抗性コーディング配列を有する大豆植物を生産するための育種方法を使用する育種プログラムに使用できる。さらに、開示された植物は、入力形質（例えば疾患及び病原体抵抗性、例えばＢｔ遺伝子によってもたらされる抵抗性）及び出力形質、例えば油及びタンパク質の質及び量を含む、他の農学的に重要な形質と組み合わせたＡＨＡＳ阻害性除草剤耐性形質を有する植物を生産するための育種方法を使用する育種プログラムに使用できる。
【００８２】
ＡＨＡＳ阻害性除草剤抵抗性大豆植物を育種する開示された方法は、（ａ）イベント１２７大豆植物と第２の大豆植物を交雑するステップ、及び（ｂ）交雑種から種子を得るステップを含む。得られた種子は、さらにスクリーニングされ、イベント１２７核酸分子を有するＤＮＡを含有する種子を特定できる。このような方法は、交雑種からＤＮＡ試料を得るステップ及び試料を、イベント１２７核酸分子の存在又は不在に関してアッセイするステップを含み得る。又は、種子は、ＡＨＡＳ阻害性除草剤耐性に関してスクリーニングされ、イベント１２７ＤＮＡを含有する種子及び子孫を特定できる。
【００８３】
イベント１２７大豆植物は、大豆に関して利用可能な任意の育種方法を使用して育種できる。例えば、イベント１２７大豆植物は、トランスジェニックイベント１２７大豆植物から成長した、第１の親大豆植物（又は、除草剤耐性をもたらす、実施形態の発現カセットによる形質転換に由来するそれらの子孫）と、除草剤耐性表現型を欠いた第２の親大豆植物とをまず有性交雑し、その結果、複数の第１子孫植物を生産し、次いで所望の除草剤耐性を示す第１子孫植物を選択し、第１子孫植物を自殖させ、その結果複数の第２子孫植物を生産し、次いで所望の除草剤耐性を示す第２子孫植物から選択することによって育種できる。これらのステップは、第１除草剤耐性子孫植物又は第２除草剤耐性子孫植物と、第２の親大豆植物又は第３の親大豆植物とを戻し交雑し、その結果所望の除草剤耐性を示す大豆植物を生産するステップをさらに含むことができる。表現型に関する子孫のアッセイが必要ないことがさらに認識される。本明細書の別の箇所において開示したように、さまざまな方法及び組成物が、イベント１２７インサートを検出及び／又は特定するために使用できる。
【００８４】
２種の異なるトランスジェニック植物を有性交雑し、２種の独立に分離して加えられた外来遺伝子を含有する子を生産できることもまた理解されるべきである。適切な子孫の自殖は、加えられた外来遺伝子の両方がホモ接合である植物を生産できる。親植物への戻し交雑及び非トランスジェニック植物との異系交雑も企図され、栄養繁殖も企図される。しかし、任意の方法を用いてこのような植物を生じることも可能である。
【００８５】
イベント１２７核酸分子を含有する同系交配させた大豆系は、大豆種の生産における使用及び新しい且つ異なる同系交配大豆系を作出するための育種プログラムにおける親植物としての使用のために開発できる。同系交配させた大豆系は、多くの場合、伝統的な育種及び／又は分子遺伝子移入の技術を介した新規な形質遺伝子移入のための標的として使用される。同系交配させた系のホモ接合性及び表現型安定性を決定するために、多くの分析方法が利用可能である。
【００８６】
いくつかの実施形態において、本発明のイベント１２７大豆植物の生産をもたらす核酸分子は、第２の除草剤、例えばグリホセートに対する抵抗性をもたらす核酸分子とともに、分子スタックに操作できる。他の実施形態において、分子スタックは、第３の除草剤に対する耐性をもたらす少なくとも１種のさらなる核酸分子をさらに含む。一実施形態において、この配列はグルホシネートに対する耐性をもたらし、特定の実施形態において、この配列は、ｐａｔを含む。
【００８７】
他の実施形態において、本発明のイベント１２７大豆植物は、１つ又は複数の対象の形質を含み、いくつかの実施形態において、形質の所望の組合せを有する植物を作出するために、イベント１２７ＤＮＡは核酸分子配列及び／又は対象の形質の任意の組合せをスタックされる。本明細書において使用する場合、形質は、特定の配列又は配列群に由来する表現型を指す。例えば、除草剤耐性核酸分子は、殺虫性及び／又は殺虫活性を有するポリペプチド、例えばバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）毒性タンパク質（Ｂｔタンパク質）、レクチンなどをコードする、任意の他の核酸分子をスタックされ得る。作製された組合せは、対象の核酸分子の任意の１つの多数のコピーをさらに含むことができる。
【００８８】
いくつかの実施形態において、大豆イベント１２７ＤＮＡは、さらに改善された特性を有する本発明のトランスジェニック植物を作出するために、他の除草剤耐性形質をスタックされ得る。このような実施形態に使用できる他の除草剤耐性核酸分子は、例えば、グリホセート酸化還元酵素をコードする遺伝子などの他の作用様式によって、グリホセート又はＡＨＡＳ素媒材に対する耐性をもたらす核酸分子を含む。大豆イベント１２７ＤＮＡと組み合わせることができる他の形質は、植物により高レベルの５−エノールピルビニルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）を産生する能力をもたらす核酸分子に由来する形質を含む。大豆１２７イベントと組み合わせることができる他の形質は、スルホニル尿素及び／又はイミダゾリノンに対する耐性をもたらす形質を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態において、大豆イベント１２７ＤＮＡは、例えば、パラ−ヒドロキシフェニルピルベート（ＨＰＰ）がホモジゲンチジン酸に変換される反応を触媒する酵素であるヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼをスタックされ得る。この酵素を阻害し、ＨＰＰのホモジゲンチジン酸への変換を阻害するためにこの酵素と結合する分子は、除草剤として有用である。このような除草剤に対する耐性をもたらす植物中の形質は、当分野において公知である。大豆イベント１２７ＤＮＡにスタックされ得る適切な除草剤耐性形質の他の例は、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ核酸分子（２，４−Ｄ及び他のフェノキシオーキシン系除草剤に対する耐性並びにアリールオキシフェノキシプロピオネート系除草剤に対する耐性をもたらすことが報告されている）及びジカンバ耐性核酸分子を含む。
【００９０】
大豆イベント１２７ＤＮＡと組み合わせることができる形質の他の例は、外来ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする核酸分子によりもたらされる形質を含む。外来ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼを含有する植物は、酵素のグルタミン合成酵素を阻害する、グルホシネート系除草剤に対する耐性の改善を示すことができる。大豆イベント１２７ＤＮＡと組み合わせることができる除草剤耐性形質の他の例は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）活性の改変をもたらす核酸分子によってもたらされる形質を含む。このような核酸分子を含有する植物は、ｐｒｏｔｏｘ酵素を標的とする任意のさまざまな除草剤（「ｐｒｏｔｏｘ阻害剤」とも称される）に対する耐性の改善を示すことができる。
【００９１】
ＡＨＡＳ阻害剤耐性形質と組み合わせることができる除草剤耐性形質の他の例は、少なくとも１種の除草剤に対する耐性を植物、例えば大豆植物中にもたらす形質を含む。特定の除草剤に対するそれらの耐性が変動する植物として、除草剤耐性大豆は当分野において公知である。これらの耐性に関与する形質（単数又は複数）を、イベント１２７大豆植物を育種することによって、又はイベント１２７大豆植物を用いた他の方法を介して組み合わせ、本発明の植物及びそれらの使用方法を提供できる。
【００９２】
大豆イベント１２７ＤＮＡを、さまざまな所望の形質組合せをさらに含む本発明の植物を生産するために、限定するものではないが、高油含有量、アミノ酸組成物、タンパク質含有量、消化率改善又は改変脂肪酸組成物などの動物試料として望ましい形質を含む、少なくとも１種の他の形質と組み合わせることができる。
【００９３】
大豆イベント１２７ＤＮＡは、他の所望の形質、例えば、大豆シスト線虫抵抗性形質などの非病原性且つ疾患抵抗性の遺伝子、例えばＳＣＮ及び油含有量の増加又は改変脂肪酸組成物などの加工又は加工製品に望ましい形質（例えば、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子及びポリマー又はバイオプラスチック（例えば、β−ケトチオラーゼ、ポリヒドロキシ酪酸シンターゼ及びアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素）はポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の発現を容易にする）と組み合わせることができる。除草剤耐性核酸分子と任意の農業形質を提供する核酸分子とを組み合わせることもできる。
【００９４】
これらのスタックされた組合せは、限定するものではないが、任意の公知の方法論又は遺伝的形質転換による植物育種を含む、任意の方法によって作出され得る。配列が、植物を遺伝的に形質転換することによってスタックされる場合、対象の核酸分子配列は、任意の時に任意の順番で組み合わせることができる。形質は、任意の形質転換カセットの組合せにより提供された対象の核酸分子を用いて、同時形質転換プロトコルにおいて同時に導入できる。例えば、２つの配列を導入する場合、２つの配列は個別の形質転換カセットに含有され得る（トランス）か、又は同じ形質転換カセットに含有され得る（シス）。配列の発現は、同じプロモーターによって、又は異なるプロモーターによって駆動され得る。ある場合において、対象の核酸分子の発現を抑制すると思われる形質転換カセットを導入することが望ましいことがある。これを、他の抑制カセット又は過剰発現カセットの任意の組合せと組み合わせ、植物中に形質の所望の組合せを作り出すことができる。核酸分子は、部位特異的組み換え系を使用して所望のゲノム位置にスタックされ得ることがさらに認識される。
【００９５】
イベント１２７ＤＮＡを有する大豆植物の育種方法をさらに提供し、この方法は、（ａ）イベント１２７大豆植物又はそれらの誘導体と、第２の大豆親植物とを交雑させるステップ、（ｂ）交雑種から種子を得るステップ、（ｃ）１つ又は複数の種子からＤＮＡ試料を得るステップ、及び（ｄ）イベント１２７核酸分子の存在を検出するステップを含む。
【００９６】
Ｖ．形質転換植物
イベント１２７形質と組み合わせた形質を有する大豆植物は、イベント１２７大豆植物から得られた植物材料又は部分の形質転換によって生産できる。さらなる形質を、技術者に利用可能な任意の形質転換方法を使用してイベント１２７大豆植物内に組み合わせることができる。したがって、イベント１２７大豆植物は、イベント１２７大豆植物内にさらなる異種核酸分子を導入する形質転換方法における使用のための植物材料の供給源として使用できる。例えば、形質質転換ベクターを調製し、対象遺伝子をイベント１２７大豆植物内に導入し、多数の導入形質を有する大豆植物を生産できる。
【００９７】
このような方法に使用する形質転換ベクターを使用して、本明細書に記載の遺伝子を含む任意の対象遺伝子を用いて形質転換された植物を生産できる。形質転換ベクターは、選択可能なマーカー及び導入される対象の遺伝子を含むことができ、通常、形質転換されたイベント１２７大豆植物において発現される。このような選択可能なマーカーは、当分野において公知である。本発明の対象の遺伝子は、導入される所望の形質に依存して変化する。例えば、表現型におけるさまざまな変化は、植物中の脂肪酸組成物の改変、植物のアミノ酸含有率の改変、植物の昆虫及び／又は病原体の防御の機序の改変などを含む対象の変化であってよい。これらの結果は、植物中の異種産物の発現の提供又は内因性産物の発現の増加によって達成することができる。又は、この結果は、植物中の１種又は複数種の内因性産物、特に酵素又は補因子の発現の減少を提供することによって達成することができる。これらの変化は、形質転換植物の表現型における変化をもたらす。
【００９８】
任意の形質転換ベクターは、本発明の方法において使用できる。多くの植物形質転換ベクター及び植物を形質転換させる方法が利用可能である。形質転換方法を使用して、本明細書に記載の形質を含む、イベント１２７インサートによって提供されるＡＨＡＳ阻害性除草剤耐性形質を有する任意の形質がスタックできる。
【００９９】
ＶＩ．検出方法
例えば、子孫及び誘導体を含む大豆植物から得られた試料由来の、生物学的試料中のイベント１２７核酸分子を特定及び／又は検出するための方法及び組成物を提供する。このような方法は、任意の生物学的材料においてイベント１２７領域又は核酸分子の特定及び／又は検出における使用を見出す。このような方法は、例えば、種子の純度を確認する方法及びイベント１２７核酸分子のための種地において種子をスクリーニングする方法を含む。一実施形態において、生物学的試料中の１２７インサート核酸分子を特定する方法を提供し、この方法は生物学的試料と、イベント１２７核酸分子を増幅できる第１及び第２の核酸プライマーとの混合物を形成するステップ、第１及び第２の核酸プライマーが大豆イベント１２７核酸分子を増幅可能な条件下で混合物を反応させるステップ、及び増幅されたイベント１２７核酸分子の存在又は不在を検出するステップを含む。いくつかの実施形態において、イベント１２７核酸分子はイベント１２７特異的核酸分子である。
【０１００】
大豆ＤＮＡを有する生物学的試料と、大豆イベント１２７核酸分子とハイブリダイズできる核酸分子プローブとを含有する混合物を形成するステップ、核酸分子プローブとイベント１２７核酸分子とがハイブリダイズ可能な条件下で混合物を反応させるステップ、及び試料中で核酸分子プローブとイベント１２７核酸分子とがハイブリダイズしたかどうかを検出し、ハイブリダイゼーションの存在がイベント１２７核酸分子の存在を示すステップを含む、生物学的試料中のイベント１２７核酸分子を特定する方法をさらに提供する。
【０１０１】
本発明の方法は、生物学的試料中のイベント１２７インサート核酸分子を特定及び／又は検出するためにも使用できる。一実施形態において、生物学的試料中のイベント１２７核酸分子を特定する方法を提供し、この方法は、生物学的試料と、イベント１２７インサート核酸分子を増幅できる第１及び第２の核酸プライマーとの混合物を形成するステップ、第１及び第２の核酸プライマーがイベント１２７インサート核酸分子を増幅可能な条件下で混合物を反応させるステップ、及び増幅されたイベント１２７インサート核酸分子の存在又は不在を検出するステップを含む。
【０１０２】
ＤＮＡを有する生物学的試料と、イベント１２７核酸分子とハイブリダイズできる核酸分子プローブとを含有する混合物を形成するステップ、核酸分子プローブとイベント１２７核酸分子とがハイブリダイズ可能な条件下で混合物を反応させるステップ、及び試料中で核酸分子プローブとイベント１２７核酸分子とがハイブリダイズしたかどうかを検出し、ハイブリダイゼーションの存在がイベント１２７核酸分子の存在を示すステップを含む、生物学的試料中のイベント１２７核酸分子を特定する方法をさらに提供する。
【０１０３】
生物学的試料中のイベント１２７領域の検出方法をさらに提供する。本発明の方法を使用して検出され得るイベント１２７領域は、イベント１２７インサートＤＮＡ、５’ジャンクション領域、３’ジャンクション領域、５’隣接領域、３’隣接領域、形質転換イベントからもたらされたインサートＤＮＡ中の固有の突然変異若しくは重複又は任意のそれらの組合せ及び断片を含む。
【０１０４】
生物学的試料は、イベント１２７核酸分子を有するＤＮＡが存在するかどうかの決定が所望される任意の試料を含むことができる。例えば、生物学的試料は、任意の植物材料又は植物材料を含む若しくは植物材料に由来する材料、例えば、限定するものではないが、食品又は試料を含むことができる。本明細書において使用する場合、「植物材料」は、植物又は植物部位から得られる、又は植物又は植物部位に由来する材料を指す。特定の実施形態において、生物学的試料は大豆組織を含む。他の実施形態において、生物学的試料は大豆の葉の組織から得られる。さらに他の実施形態において、生物学的試料は大豆の種子組織から得られる。
【０１０５】
任意のイベント１２７関連核酸分子は、本発明の方法を使用して検出及び／又は特定され得る。例えば、検出され得る核酸分子は、限定するものではないが、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなどを含む。他の実施形態において、イベント１２７核酸分子によりコードされるポリペプチドは、本発明の方法を使用して検出及び／又は特定され得る。検出及び／又は特定される核酸分子は、インサートＤＮＡ中の特定された突然変異、例えば、Ｓ６５３Ｎ又はＲ２７２Ｋなどを有するＡＨＡＳポリペプチドをコードする核酸分子、プロモーター配列、終始配列、このような配列の断片及びそれらの組合せを含むイベント１２７インサートＤＮＡの任意の断片を包含できる。
【０１０６】
本明細書に開示の方法に使用するプライマー及びプローブは、既存の方法によって、例えば、このような配列の再クローニング及び配列決定によって、開示された配列を確認（及び必要に応じて修正）するために使用できる。核酸分子のプローブ及びプライマーは、標的ＤＮＡ配列を特異的に検出する。任意の既存の核酸ハイブリダイゼーション法又は増幅法は、試料中のトランスジェニックイベント由来の核酸分子の存在を検出又は特定するために使用できる。「特異的に検出する」は、核酸分子が、１２７特異的領域を増幅するためのプライマーとして使用できるか、又は核酸分子が、イベント１２７特異的領域を有する核酸分子と、ストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするプローブとして使用できるかのどちらかであることを意図する。１２７イベント又は１２７イベントの特異的領域の特異的検出を可能にするハイブリダイゼーションのレベル又は程度は、１２７特異的領域を含む核酸分子と、この領域を欠いた核酸分子との識別のために十分であり、その結果、イベント１２７分子の識別的特定を可能にする。「イベント１２７核酸分子の増幅を可能にするために十分な配列の同一性又は相補性を共有する」は、配列が、イベント１２７核酸分子を有する核酸分子の断片に対して、又は完全長に及んで、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性又は相補性を共有することを意図する。
【０１０７】
特定の増幅プライマー対を使用する（例えばＰＣＲによる）標的核酸分子の増幅に関して、「ストリンジェントな条件」は、プライマー対が、対応する野生型配列（又はその相補体）を有するプライマーが結合するであろう標的核酸分子とハイブリダイズし、好ましくはＤＮＡの熱増幅反応において、イベント１２７核酸分子を有する特定可能な増幅産物（アンプリコン）を作製可能な条件である。ＰＣＲの取組みにおいて、オリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ反応に使用するために設計し、イベント１２７核酸分子を増幅できる。ＰＣＲプライマーの設計及びＰＣＲクローニングの方法は、当分野において一般に公知である。特定のＰＣＲプロトコルにおける多くのパラメーターは、特定の実験室条件に応じて調整する必要があると思われ、わずかに改変され得、さらに同様の結果の収集を可能にすることが理解されている。これらの調整は当業者には明らかであろう。
【０１０８】
開示された方法に使用するプライマーを使用して、任意の１２７核酸分子を増幅できる。例えば、プライマー対は、イベント１２７核酸分子断片を含有する植物の表示である領域を増幅できるように設計され得る。一実施形態において、このようなプライマー対は、単一のジャンクション、例えば５’ジャンクション領域又は３’ジャンクション領域を含む領域を増幅できる。このようなプライマー対は、隣接染色体領域（例えば、５’隣接領域又は３’隣接領域）からインサートＤＮＡの方向に伸長をプライミングできる１つのプライマーを含み、一方、第２のプライマーは、隣接染色体領域中の第１のプライマーの方向にインサートＤＮＡからプライミングできる。このようなプライマー対は、ジャンクション領域を包含する核酸分子を増幅する。いくつかの実施形態において、増幅対に使用されるプライマーの１つは、ジャンクション領域（例えば、５’ジャンクション領域又は３’ジャンクション領域）の１つをまたがる領域とアニーリングでき、染色体領域方向又はインサートの方向に増幅できる。このような方法に使用する隣接染色体領域のプライマーは、５’隣接染色体領域又は３’隣接染色体領域のどちらともアニーリングでき、インサートの方向に増幅をプライミングする。他の実施形態において、プライマー対は、２つのジャンクションを増幅できるように設計され得る。
【０１０９】
５’隣接領域又は３’隣接領域とアニーリングできる適切なプライマーの他の例は、このような方法に使用するために設計でき、配列番号１の１〜１３１１位の間又は配列番号１の６０７０から１０，６５６位までの核酸分子とアニーリングできる、約１０又は１２から約４０ヌクレオチドのプライマー配列を含むことができる。
【０１１０】
又は、植物ゲノム全体を通してアニーリングでき、インサート特異的プライマーと連結して使用し、インサートＤＮＡ及び隣接配列の断片を包含する核酸分子を増幅できる、ランダムなプライマーを開発できる。いくつかの実施形態において、インサート特異的プライマーは、インサート特異的プライマーを使用して増幅された断片の検出が可能なように標識され得る。他の実施形態において、得られた増幅された核酸分子を標識プローブとハイブリダイズさせ、イベント１２７核酸分子を特定又は検出できる。
【０１１１】
別の実施形態において、全インサートＤＮＡ又はイベント１２７ＤＮＡの表示であるインサートの一部を増幅するプライマー対を開発できる。例えば、いくつかの実施形態において、インサートの５’隣接領域及び３’隣接領域からプライミングするプライマーを使用して全ＤＮＡを増幅するプライマー対を設計できる。又は、イベント１２７インサート単独の領域を増幅でき、インサートの存在を特定するプライマー対を設計できる。例えば、生物学的試料中のインサートの存在を検出するために使用する、プラスミドｐＡＣ３２１のＰｖｕＩＩ断片内の任意の領域を増幅するプライマーを設計できる。このようなプライマーは、配列番号１の１３１２及び６０６９位の間の領域を含むインサートＤＮＡの任意の領域を増幅できるプライマーを含む。いくつかの実施形態において、インサートＤＮＡのシロイヌナズナ突然変異ＡＨＡＳコーディング配列（例えば、２７６２から４７７４又はそれらの断片）又はインサートのコーディング配列及び調節配列の任意の組合せを増幅できるプライマー対を開発できる。
【０１１２】
増幅核酸分子（アンプリコン）は、イベント１２７核酸分子を検出できる任意の長さの核酸分子であり得る。例えば、アンプリコンは、約１０、５０、１００、２００、３００、５００、７００、１００、２０００、３０００、４０００、５０００ヌクレオチド長又はそれ以上である。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、１つ又は複数のイベント１２７核酸分子の特異的領域が検出され得る。
【０１１４】
イベント１２７核酸分子を増幅及び／又は検出できる任意のプライマーを、本発明の方法に用いることができる。一実施形態において、プライマーは、イベント１２７核酸分子、例えば、配列番号１の配列を有する核酸分子に対応する、又は配列番号１の配列を有する核酸分子と相補的な８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又はそれ以上の連続するヌクレオチドを含むか、又はそれらに相補的である。例えば、いくつかの実施形態において、第１又は第２のプライマーが、イベント１２７核酸分子を増幅する核酸分子との十分な配列同一性又は配列相補性を共有する場合、第１及び第２のプライマーは、配列番号：３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、６７、６８、６９及び７０の核酸分子を含む。その上さらなる実施形態において、第１及び第２のプライマーは、配列番号：３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、６７、６８、６９及び７０で示される配列の任意の１つ又は任意の組合せを含むことができる。プライマーは、少なくとも６、７、８、９、１０、１５、２０、１５若しくは３０又は約７〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５若しくはそれより長いヌクレオチドを含む大豆イベント１２７領域を増幅するために十分な任意の長さのプライマーであり得る。
【０１１５】
上記のように、ある実施形態において、有用なプライマー対は、インサートＤＮＡ及び隣接５’ゲノムＤＮＡ又は隣接３’ゲノムＤＮＡの間のジャンクションポイントと重複する１つのプライマーを含むであろう。このようなプライマーは、５’隣接ＤＮＡとインサートＤＮＡとの間のジャンクションポイント（すなわち、配列番号１の１３１１と１３１２位との間のジャンクション）周辺並びにインサートＤＮＡと３’隣接ＤＮＡとの間のジャンクションポイント（すなわち、配列番号１の６０６９と６０７０位との間のジャンクション）周辺に設計できる。このようなプライマーは、隣接領域又はインサートＤＮＡのどちらかに由来する約１０ヌクレオチドと、インサートＤＮＡ又は隣接領域中のジャンクションポイントを横切る少なくとも１ヌクレオチドとがハイブリダイズするように設計できる。したがって、例えば、プライマーは、少なくとも配列番号１の以下の位置：１３１１〜１３２１、１３０２〜１３１２、６０６０〜６０７０及び／又は６０６９〜６０７９によって表されるヌクレオチドとハイブリダイズするように設計されたヌクレオチド配列を含むことができる。
【０１１６】
他の実施形態において、有用なプライマー対は、インサートＤＮＡのｃｓｒ１−２コーディング配列の重複された部分の５’末端（配列番号１の５６９４位）と近接インサートＤＮＡ部分（すなわち、配列番号１の５６９３位）の３’末端との間のジャンクションポイントと重複する１つのプライマーを含むであろう。このようなプライマーは、重複領域又は近接インサートＤＮＡのどちらかに由来する約１０ヌクレオチドと、ジャンクションポイント（例えば、配列番号１の少なくとも５６９３〜５７０３又は少なくとも５６８４〜５６９４）を横切る少なくとも１ヌクレオチドとがハイブリダイズするように設計できる。
【０１１７】
本明細書の他の箇所で述べたように、例えばリアルタイムＰＣＲを含む、イベント１２７核酸分子をＰＣＲ増幅する任意の方法を用いることができる。
【０１１８】
したがって、いくつかの実施形態において、生物学的試料中のイベント１２７核酸分子の存在を検出する方法を提供する。この方法は、（ａ）生物学的試料からＤＮＡ飼料を抽出するステップ、（ｂ）限定するものではないが、ｉ）配列番号：３５及び配列番号：３６の配列、ｉｉ）配列番号：３７及び配列番号：３８、ｉｉｉ）配列番号：３９及び配列番号：４０、ｉｖ）配列番号：４１及び配列番号：４２、ｖ）配列番号：４３及び配列番号：４４、ｖｉ）配列番号：６７及び配列番号：６８、並びにｖｉｉ）配列番号：６９及び配列番号：７０を含む、ＤＮＡプライマー分子対（例えば、組合せにより大豆イベント１２７領域が増幅される、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、６７、６８、６９、及び７０の任意の組合せ）を提供するステップ、（ｃ）ＤＮＡ増幅反応条件を提供するステップ、（ｄ）ＤＮＡ増幅反応を実施し、その結果ＤＮＡアンプリコン分子を作製するステップ、並びに（ｅ）ＤＮＡアンプリコン分子を検出し、ＤＮＡ増幅反応におけるＤＮＡアンプリコンの検出が、試料中のイベント１２７核酸分子の存在を示すステップを含む。核酸分子がプライマー又はプローブとして機能するためには、特定の溶媒及び塩濃度を用いた下で安定な二本鎖構造を形成できるように、配列が十分に相補的であることだけが必要である。
【０１１９】
ハイブリダイゼーション技術において、標的イベント１２７核酸分子と選択的にハイブリダイズする核酸分子の全部又は一部を用いることができる。核酸分子プローブを指す場合、「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブがその標的配列と、他の配列とハイブリダイズするよりも検出可能に大きい程度（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍を超える）にハイブリダイズする条件を意図する。特定の増幅プライマー対を使用する標的核酸分子の増幅（例えばＰＣＲによる）に関して、「ストリンジェントな条件」は、プライマー対が、対応する野生型を有するプライマーが結合するであろう標的核酸分子とハイブリダイズ可能な条件である。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、さまざまな環境において異なる。ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄の条件のストリンジェンシーを調節することによって、プローブに対して１００％相補的である標的配列を特定できる（相同プロービング（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｂｉｎｇ））。或いは、配列にいくつかの不一致を可能にするようにストリンジェンシー条件を調整することにより、より程度の低い同一性を検出することができる（非相同的プロービング（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｂｉｎｇ））。一般に、プローブは約１０００ヌクレオチド長未満又は５００ヌクレオチド長未満である。
【０１２０】
本明細書において使用する場合、実質的に同一又は相補的な配列は、高度にストリンジェントな条件下で比較される、核酸分子の相補体と特異的にハイブリダイズする核酸分子である。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェント条件は、例えば、約４５℃において６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、その後、５０℃において２×ＳＳＣの洗浄は、当業者にとって公知である。通常、ハイブリダイゼーション及び検出のためのストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．５Ｍ  Ｎａイオン未満、通常ｐＨ７．０から８．３において約０．０１から１．０ＭのＮａイオン濃度（又は他の塩）であり、温度は、短いプローブ（例えば１０から５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃及び長いプローブ（例えば５０ヌクレオチドを超える）に関しては少なくとも６０℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定な薬剤を加えることによっても達成できる。低ストリンジェンシーの条件の例は、３７℃における３０から３５％のホルムアミドの緩衝液、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を用いたハイブリダイゼーション及び５０から５５℃における１×から２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０ＭのＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸３ナトリウム）中の洗浄を含む。中程度のストリンジェンシーの条件の例は、３７℃における４０から４５％のホルムアミド、１．０ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳを用いたハイブリダイゼーション及び５０から６０℃における０．５×から１×ＳＳＣ中の洗浄を含む。高度なストリンジェンシー条件の例は、３７℃における５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳを用いたハイブリダイゼーション及び６０から６５℃における０．１×ＳＳＣ中の洗浄を含む。場合により、洗浄緩衝液は、約０．１％から約１％のＳＤＳを含み得る。ハイブリダイゼーション期間は約２４時間以内、ふつうは訳４時間から訳１２時間である。洗浄時間は少なくとも平衡に達するために十分な時間の長さであろう。
【０１２１】
ハイブリダイゼーション反応において、特異性は典型的にはハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、重大な因子は最終洗浄溶液のイオン強度及び温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて、Ｔｍは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ及びＷａｈｌ（１９８４年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８巻：２６７〜２８４頁の式、すなわちＴｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌから近似することができ、式中、Ｍは一価陽イオンのモル濃度、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドの百分率であり、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセントであり、Ｌは塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔｍは、（所定のイオン強度及びｐＨ下の）相補的標的配列の５０％が完全一致のプローブとハイブリダイズする温度である。Ｔｍはそれぞれ１％の不一致ごとに約１℃減少し、したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、及び／又は洗浄条件を調整して、所望の同一性の配列とハイブリダイズさせることができる。例えば、≧９０％の同一性を有する配列が求められる場合、Ｔｍは１０℃減少し得る。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度及びｐＨにおいて、特異的配列及びその相補体についての熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。しかし、重度にストリンジェントな条件は、熱融解温度（Ｔｍ）よりも１、２、３、又は４℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができ、中程度にストリンジェントな条件は、熱融解温度（Ｔｍ）よりも６、７、８、９、又は１０℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができ、低ストリンジェンシー条件は、熱融解温度（Ｔｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５、又は２０℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができる。当業者は、この式、ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件、並びに所望のＴｍを使用して、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄溶液のストリンジェンシーにおける変動が本質的に説明されることを理解しているであろう。所望の程度の不一致が４５℃（水溶液）又は３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴｍをもたらす場合、ＳＳＣ濃度を増加させることにより、高温を使用できるようにすることが最適である。プローブと標的ＤＮＡ分子とのハイブリダイゼーションは、当業者に高知の任意の数の方法によって検出でき、これらは、限定するものではないが、蛍光タグ、放射活性タグ、抗体に基づくタグ及び化学発光タグを含むことができる。
【０１２２】
核酸分子は、それらが相補性を示す場合、別の核酸分子の「相補体」であると言われる。本明細書において使用する場合、核酸分子の１つの個々のヌクレオチドが他のヌクレオチドと相補的である場合、分子は「完全な相補性」を示すと言われる。少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」な条件下で、十分な安定性で相互にハイブリダイズし、相互にアニーリングしたままでいることができる場合、２つの分子は「最小限に相補的」であると言われる。同様に、従来の「高度にストリンジェンシー」な条件下で、十分な安定性で相互にハイブリダイズし、相互にアニーリングしたままでいることができる場合、分子は「相補的」であると言われる。
【０１２３】
他の実施形態において、イベント１２７植物は、シロイヌナズナＡＨＡＳポリペプチドの発現の検出によって検出又は特定され得る。ＡＨＡＳポリペプチドの検出には任意の方法が使用できる。例えば、導入されたＡＨＡＳタンパク質に対して惹起された抗体を使用して、ＡＨＡＳポリペプチドの発現の存在を検出できる。
【０１２４】
限定するものではないが、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂｉｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓを含む任意の方法を使用して、イベント１２７核酸分子又はそれらのアンプリコンを検出できる。一方法において、近接する隣接ＤＮＡ配列及び挿入されたＤＮＡ配列の両方と重複するＤＮＡオリゴヌクレオチドが設計される。他の実施形態において、イベント１２７特異的アンプリコンを可能にするＤＮＡプライマーオリゴが設計される。オリゴヌクレオチドをマイクロウェルプレートのウェルに固定する。対象領域のＰＣＲ後に、一本鎖ＰＣＲ産物を固定されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼ及び予想される次の塩基に特異的な標識ｄｄＮＴＰを使用する一塩基伸長反応の鋳型として機能させることができる。読出しは、蛍光又はＥＬＩＳＡに基づいて実施できる。シグナルは、増幅、ハイブリダイゼーション及び一塩基伸長法が成功することにより、インサート／隣接配列の存在を示す。
【０１２５】
本発明の方法に使用する別の検出方法は、パイロシーケンシング技術である。この方法において、近接ＤＮＡとインサートＤＮＡとのジャンクションと重複するオリゴヌクレオチドが設計されるか、又はイベント１２７特異的領域を増幅できるオリゴ対が用いられる。オリゴヌクレオチドを、対象領域（挿入された配列中の一プライマー及び隣接配列中の一プライマー）由来の一本鎖ＰＣＲ産物とハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホ硫酸及びルシフェリンの存在下でインキュベートする。ｄＮＴＰを個別に加え、取込みにより測定される光シグナルがもたらされる。光シグナルは、増幅、ハイブリダイゼーション及び一塩基伸長法又は多塩基伸長法の成功によるトランス遺伝子インサート／隣接配列の存在を示す。
【０１２６】
蛍光偏光法を使用して、本発明のアンプリコンを検出することもまた可能である。この方法を使用して、近接ＤＮＡとインサートＤＮＡとのジャンクションと重複するオリゴヌクレオチドが設計されるか、又はイベント１２７特異的領域を増幅できるオリゴ対が用いられる。オリゴヌクレオチドを、対象領域（挿入されたＤＮＡ列中の一プライマー及び隣接ＤＮＡ中の一プライマー）由来の一本鎖ＰＣＲ産物とハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼ及び傾向標識ｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートする。一塩基伸長法はｄｄＮＴＰの取込みをもたらす。取込みは、蛍光光度計を使用して、偏光の変化として測定できる。蛍光の変化は、増幅、ハイブリダイゼーション及び一塩基伸長法の成功によるトランス遺伝子インサート／隣接配列の存在を示す。
【０１２７】
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）は、イベント１２７核酸分子の存在の検出及び定量にもさらに使用できる。簡潔に言うと、近接ＤＮＡとインサートＤＮＡとのジャンクションと重複するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計されるか、又はイベント１２７核酸分子を増幅できるオリゴ対が用いられる。ＦＲＥＴプローブ及びＰＣＲプライマー（インサートＤＮＡ配列中の一プライマー及び隣接ゲノム配列中の一プライマー）を、熱安定性ポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下で循環させる。ＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションにより、ＦＲＥＴプローブのクエンチ部分から離れた蛍光部分の切断及び放出がもたらされる。蛍光シグナルは、増幅及びハイブリダイゼーションの成功による隣接配列／トランス遺伝子インサート配列の存在を示す。
【０１２８】
分子指標もまた、開示の方法に使用できる。簡潔に言うと、隣接ＤＮＡとインサートＤＮＡとのジャンクションと重複するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計されるか、又は１２７特異的領域を増幅できるオリゴ対が用いられる。ＦＲＥＴプローブの固有の構造は、ごく近接した蛍光部分及びクエンチ部分を維持する二次構造の包含をもたらす。ＦＲＥＴプローブ及びＰＣＲプライマー（インサートＤＮＡ列中の一プライマー及び隣接配列中の一プライマー）を、熱安定性ポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下で循環させる。ＰＣＲ増幅の成功後、ＦＲＥＴプローブと標的配列とのハイブリダイゼーションにより、プローブ二次構造の除去及び蛍光部分及びクエンチ部分の空間的隔離がもたらされる。蛍光シグナルが生じる。蛍光シグナルは、増幅及びハイブリダイゼーションの成功による隣接配列／トランス遺伝子インサート配列の存在を示す。
【０１２９】
アンプリコン内に見出される配列に特異的なプローブを使用するハイブリダイゼーション反応は、本発明のＰＣＲ反応によって作製されるアンプリコンを検出するためのさらに別の方法である。
【０１３０】
別の実施形態において、イベント１２７核酸分子は、イベント１２７核酸分子により作製されるポリペプチドを検出するための方法により検出又は特定され得る。例えば、ｃｓｒ−１ＡＨＡＳ遺伝子の発現産物は、本明細書に開示の方法を使用して検出され得る。このような方法は、挿入されたイベント１２７核酸分子により作製されたポリペプチドと結合できる結合タンパク質の使用を含む。このような方法は、限定するものではないが、免疫学的アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、抗原アッセイ、免疫染色、免疫組織化学法、タンパク質チップアッセイ、放射性免疫沈降法、イムノクロマト膜による迅速アッセイ及びイムノクロマトスティックによる迅速アッセイ（側方フロー試験）を含む。
【０１３１】
本明細書に開示の方法は、例えば、診断分子（プライマー及び／又はプローブなど）を基質に結合し、装置、例えばアレイ又はマイクロアレイ又はマルチウェルプレートを形成することによって、ハイスループット技術における使用に適号させることができる。この装置は、チップ、スライド、プレート、膜、ファイバー、ビーズ、ストリップ、スティック、マット、格子、棒、布、血管壁などの任意の有用なフォーマットで提供できる。さらに、基質は、ガラス、セラミック、ゲル（例えば、ヒドロゲル、ミクロゲル、擬似ゲル）及びポリマー材料（例えば、プラスチック、シリコン、フッ素ポリマー）などの利用可能な任意の材料で作製できる。したがって、本発明の装置及び方法に使用する基質は、限定するものではないが、シリカチップ、ナイロン膜、光ファイバー、マルチウェルプレートなどを含む。プローブ又は他のイベント１２７診断分子を、共有結合、配位結合及び非共有結合（例えば、イオン結合、水素結合、親油性引力）などの、利用可能な任意の結合方法を使用して基質に結合できる。
【０１３２】
ハイスループットな検出、特定又は発現のモニタリングのためのアレイに基づく方法を利用して、イベント１２７核酸分子ハイブリダイゼーションの標的を測定できる。この「チップ」に基づく取組みは、遺伝子特異的ハイブリダイゼーションの標的として核酸分子のマイクロアレイを使用して、対応する遺伝子の発現を定量的に測定するステップを含む。大きな配列の個々のヌクレオチドを、同時にクエリできる。ハイブリダイゼーションを使用して、ヌクレオチド配列を効率的に分析できる。
【０１３３】
利用可能な任意のマイクロアレイ法を、本発明の方法に使用できる。例えば、マイクロアレイ法により、すべての可能なサブ配列候補を表す一連のオリゴヌクレオチド又はｃＤＮＡ分子とのハイブリダイゼーションによって、分析する配列を比較できる。第２の方法は、試料と、オリゴヌクレオチド又はｃＤＮＡプローブのアレイとをハイブリダイズする。イベント１２７標的配列のサブ配列と相補的なオリゴヌクレオチド又はｃＤＮＡ分子からなるアレイを使用して、標的配列の同一性を決定し、その量を測定し、標的配列と参照配列との差を検出することができる。核酸分子のマイクロアレイを、タンパク質分子又はそれらの断片を用いてスクリーニングし、タンパク質分子又はそれらの断片と特異的に結合する核酸分子を決定することもできる。本発明の方法に使用する他のマイクロアレイ診断方法は、例えば、米国特許公開第２００７／０２９８４２３号に開示の方法を含む。
【０１３４】
したがって、イベント１２７核酸分子は、試料中で利用可能な任意の方法を使用して特定又は検出できる。このような方法は、限定するものではないが、ゲル分離技術、核酸ブロット検出（例えば、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション）、定性的、半定量的又は定量的ＰＣＲ、改変ＡＨＡＳＬの発現の検出のための免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、任意の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、一本鎖後退又は結合領域保有抗体断片を使用するストリップアッセイ（例えば、側方フローストリップ））及びマイクロアレイ又は「マイクロチップ」に基づく検出アッセイを含む。他の実施形態において、この方法は、質量分析法又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）技術を使用して、生物学的試料中のイベント１２７核酸分子の存在を検出又は特定できる。
【０１３５】
このような検出方法において有用な装置を、本明細書のさまざまな実施形態においてさらに提供し、この装置は表面を有する個体支持体を含み、少なくとも１つのイベント１２７診断分子と結合する。これらは、ハイブリダイゼーションアッセイ装置、免疫アッセイ装置、レポーター−リガンド結合アッセイ装置又は当分野において公知の任意の他の装置であり得る。
【０１３６】
ＶＩＩ．キット
本発明は、イベント１２７植物又はイベント１２７核酸分子を検出するキットをさらに提供し、このキットは、イベント１２７核酸分子を増幅できる第１及び第２の核酸プライマーを含む。得られた増幅されたイベント１２７核酸分子は、直接検出され得る、又はＤＮＡを含有する生物学的試料との反応においてハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。
【０１３７】
本明細書において使用する場合、「キット」は、方法実施形態、より具体的には、生物学的試料中の１２７イベントの特定及び／又は検出を実施する目的のための、一連の試薬を指す。品質管理（例えば種地の純度）、植物材料又は植物材料を含む若しくは植物材料に由来する材料、例えば、限定するものではないが食品又は飼料中のイベント１２７核酸分子の検出の目的のために、このキットを使用でき、その成分を具体的に調節できる。
【０１３８】
特定の実施形態において、生物学的試料中のイベント１２７核酸分子を特定するキットを提供する。このキットは第１及び第２のプライマーを含み、第１及び第２のプライマーはイベント１２７核酸分子を増幅できる。さらなる実施形態において、このキットはイベント１２７核酸分子の検出のための核酸分子をさらに含む。このキットは、例えば、第１のプライマー及び第２のプライマー配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、及び４４の配列を有する核酸分子を含み、第１又は第２のプライマーは、イベント１２７核酸分子を増幅する核酸分子との、十分な配列相同性又は配列相補性を共有する。例えば、特定の実施形態において、第１のプライマー又は第２のプライマーは配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、６７、６８、６９及び７０の配列を有する核酸分子の断片を含み、第１又は第２のプライマーは、イベント１２７分子を増幅する核酸分子との、十分な配列相同性又は配列相補性を共有する。プライマー対は、列番号５の配列を有する核酸分子の断片及び配列番号６の配列を有する核酸分子の断片を含むことができ、又はプライマー対は、ｉ）配列番号：３５及び配列番号：３６、ｉｉ）配列番号：３７及び配列番号：３８、ｉｉｉ）配列番号：３９及び配列番号：４０、ｉｖ）配列番号：４１及び配列番号：４２、ｖ）配列番号：４３及び配列番号：４４、ｖｉ）配列番号：６７及び配列番号：６８、及びｖｉｉ）配列番号：６９及び配列番号：７０の配列から選択され得る。その上さらなる実施形態において、第１及び第２のプライマーは配列番号：３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、６７、６８、６９、及び７０で示される配列の１つ又は任意の組合せを含むことができる。プライマーは、少なくとも６、７、８、９、１０、１５、２０、１５若しくは３０又は約７〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５若しくはそれより長いヌクレオチドを含むイベント１２７領域を増幅するために十分な任意の長さであり得る。
【０１３９】
イベント１２７領域を特異的に検出できる少なくとも１つの核酸分子を含むＤＮＡ検出キットをさらに提供し、この核酸分子は配列番号：５及び／又は６と相同又は相補的な、十分な長さの連続するヌクレオチドの少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、このＤＮＡ検出キットは、配列番号：５及び／又は６を有する核酸分子を含む、又はイベント１２７領域を特異的に検出する配列とハイブリダイズする配列、例えば、配列番号５及び／又は６からなる群から選択される配列を含む。
【０１４０】
ＶＩＩＩ．雑草を防除する方法
本発明は、雑草又は望ましくない植物を防除するための方法及び組成物をさらに提供する。この方法は、一般的に有効量の１種又は複数種の非選択性除草剤を、１種又は複数種のイベント１２７大豆植物を含有する耕作地又は作物畑に適用するステップを含む。任意の雑草は開示の方法で防除できるが、いくつかの実施形態において、この方法は、ＡＨＡＳ阻害性除草剤に対して感受性の、地域又は田畑中の雑草又は望ましくない植物を、まず特定するステップを含むことができる。
【０１４１】
作地域において雑草を防除し、耕作地において雑草又は望ましくない植物の発達又は出現を防止し、作物を生産し、作物の安全を増加する方法を提供する。「防除」及びそれらの派生語、例えば「雑草を防除する」は、雑草及び／又は望ましくない植物の成長、発芽、生殖及び／又は増殖の１種又は複数種の阻害、並びに／或いは雑草及び／又は望ましくない植物の出現及び／又は活性の殺害、除去、破壊又は他の低下を指す。
【０１４２】
本発明の方法は、同じ量及び同じ型の除草剤を用いて処理されていない地域と比較して、地域において雑草又は望ましくない植物の量を少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％減少させるなど、地域において任意の測定可能な量によって雑草又は望ましくない植物を防除できる。雑草又は望ましくない植物の防除は、任意の再現可能な測定方法によって測定できる。一実施形態において、雑草又は望ましくない植物の防除は、除草剤を用いて処理した地域において成長した雑草又は望ましくない植物の数を計測し、同じ大きさの未処理地域において成長した雑草又は望ましくない植物の数と比較することによって測定される。
【０１４３】
本発明は、イベント１２７大豆植物の種子を、播種前及び／又は予備発芽後にＡＨＡＳ阻害性除草剤に接触させることにより、雑草又は望ましくない植物を防除する方法をさらに提供する。この方法は、種子を、例えば適切な成長培地、例えば畑土壌又は温室の鉢植え用培地に播種するステップをさらに含むことができる。本方法は、種子のすぐ近隣における雑草及び／又は望ましくない植物の防除において特に用途が見出される。
【０１４４】
広い意味において、雑草は、望まれない場所に成長するすべての植物を意味すると理解される。
【０１４５】
本発明によって防除され得る雑草は、例えば、双子葉植物及び単子葉植物の雑草を含む。開示の方法を使用して防除できる双子葉植物の雑草は、限定するものではないが、シロガラシ属（Ｓｉｎａｐｉｓ）、マメグンバイナズナ属（Ｌｅｐｉｄｉｕｍ）、ヤエムグラ属（Ｇａｌｉｕｍ）、ハコベ属（Ｓｔｅｌｌａｒｉａ）、シカギク属（Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ）、ローマカミツレ属（Ａｎｔｈｅｍｉｓ）、ハキダメギクゴメギク属（Ｇａｌｉｎｓｏｇａ）、アカザ属（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ）、イラクサ属（Ｕｒｔｉｃａ）、キオン属（Ｓｅｎｅｃｉｏ）、ヒユ属（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ）、スベリヒユ属（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ）、オナモミ属（Ｘａｎｔｈｉｕｍ）、ヒルガオ属（Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｕｓ）、サツマイモ属（Ｉｐｏｍｏｅａ）、タデ属（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ）、ツノクサネム属（Ｓｅｓｂａｎｉａ）、ブタクサ属（Ａｍｂｒｏｓｉａ）、アザミ属（Ｃｉｒｓｉｕｍ）、ヒレアザミ属（Ｃａｒｄｕｕｓ）、ノゲシ属（Ｓｏｎｃｈｕｓ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、イヌガラシ属（Ｒｏｒｉｐｐａ）、キカシグサ属（Ｒｏｔａｌａ）、アゼナ属（Ｌｉｎｄｅｒｎｉａ）、オドリコソウ属（Ｌａｍｉｕｍ）、クワガタソウ属（Ｖｅｒｏｎｉｃａ）、イチビ属（Ａｂｕｔｉｌｏｎ）、イヌスイバ属（Ｅｍｅｘ）、チョウセンアサガオ属（Ｄａｔｕｒａ）、スミレ属（Ｖｉｏｌａ）、チシマオドリコソウ属（Ｇａｌｅｏｐｓｉｓ）、ケシ属（Ｐａｐａｖｅｒ）、ヤグルマギク属（Ｃｅｎｔａｕｒｅａ）、シャジクソウ属（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ）、キンポウゲ属（Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ）及びタンポポ属（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）の各属の雑草を含む。開示の方法を使用して防除できる単子葉植物の雑草は、限定するものではないが、ヒエ属（Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ）、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、メヒシバ属（Ｄｉｇｉｔａｒｉａ）、アワガエリ属（Ｐｈｌｅｕｍ）、イチゴツナギ属（Ｐｏａ）、ウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）、オヒシバ属（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ）、ビロードキビ属（Ｂｒａｃｈｉａｒｉａ）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、スズメノチャヒキ属（Ｂｒｏｍｕｓ）、カラスムギ属（Ａｖｅｎａ）、カヤツリグサ属（Ｃｙｐｅｒｕｓ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、カモジグサ属（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ）、ギョウギシバ属（Ｃｙｎｏｄｏｎ）、ミズアオイ属（Ｍｏｎｏｃｈｏｒｉａ）、フィムブリスチリス属（Ｆｉｍｂｒｉｓｔｙｓｌｉｓ）、オカダモ属（Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ）、ハリイ属（Ｅｌｅｏｃｈａｒｉｓ）、ホタルイ属（Ｓｃｉｒｐｕｓ）、スズメノヒエ属（Ｐａｓｐａｌｕｍ）、カモノハシ属（Ｉｓｃｈａｅｍｕｍ）、ナガボノウルシ属（Ｓｐｈｅｎｏｃｌｅａ）、ツノツメガヤ属（Ｄａｃｔｙｌｏｃｔｅｎｉｕｍ）、コヌカグサ属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）、スズメノテッポウ属（Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓ）及びセイヨウヌカボ属（Ａｐｅｒａ）の各属の雑草を含む。本発明の方法によって防除できる特定の雑草は、限定するものではないが、農業的に重要な雑草、例えば、サツマイモ属（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｓｐｐ．）、ツユクサ属（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａ  ｓｐｐ．）、コトブキギク（Ｔｒｉｄａｘ  ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ）、トウダイグサ属（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｓｐｐ．）、シダ属（Ｓｉｄａ  ｓｐｐ）、センダイグサ属（Ｂｉｄｅｎｓ  ｓｐｐ．）、ハキダメギク属（Ｇａｌｉｎｓｏｇａ  ｓｐｐ．）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｓｐｐ．）、オナモミ属（Ｘａｎｔｈｉｕｍ  ｓｐｐ．）、カザ属（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ヒロハフタバムグラ（Ｓｐｅｒｍａｃｏｃｅ  ｌａｔｉｆｏｌｉａ）、ブラジルハシカグサモドキ（Ｒｉｃｈａｒｄｉａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｏｌｅｒａｃｅｏｕｓ）、イズハハコ属（Ｃｏｎｙｚａ  ｓｐｐ）、アマランサス属（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ  ｓｐｐ．）、アカントスペルマム属（Ａｃａｎｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｓｐｐ．）、イガニガクサ属（Ｈｙｐｔｉｓ  ｓｐｐ．）、スベリヒユ（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、エビスグサ（Ｃａｓｉａ  ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ）を含み、カヤツリグサ属（Ｃｙｐｅｒｕｓ  ｓｐｐ．）のカヤツリグサ科（ｃｙｐｅｒａｃｅａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）並びにビードロキビ属（Ｂｒａｃｈｉａｒｉａ  ｓｐｐ．）、メシヒバ属（Ｄｉｇｉｔａｒｉａ  ｓｐｐ．）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｓｐｐ．）、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ  ｓｐｐ．）、セイバンモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｈａｌｅｐｅｎｓｅ）、ヒエ属（Ｅｃｈｎｏｃｈｌｏａ  ｓｐｐ．）、ヒシバ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｉｎｄｉｃａ）、及びチカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｓｐｐ．）を含む草種の防除をさらに含む。非選択性イミダゾリノン系除草剤の使用で、開示された方法が防除雑草、例えば、ツユクサ属、イズハハコ属、カマエシス・ヒルタ（Ｃｈａｍａｅｓｉｓｅ  ｈｉｒｔａ）、ヒロハフタバムグラ、ブラジルハシカグサモドキ、サツマイモ属、ショウジョウソウ（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）、ヒエ属及びエビスグサを防除する困難の制御にとって有利である。
【０１４６】
さらに、本発明の方法によって防除できる雑草は、例えば、特定の場所に成長している望ましくない作物植物を含む。例えば、大豆植物の田畑においてトウモロコシ植物が望ましくない場合、イベント１２７大豆植物を優勢に含む田畑中に存在する自生のトウモロコシ植物は、雑草と見なすことができる。
【０１４７】
本発明の方法によって防除できる望ましくない植物は、昨シーズンに特定の田畑に以前植えられた望ましくない植物、又は近接地域に植えられた望ましくない植物を含み、大豆、トウモロコシ、キャノーラ、綿、ヒマワリなどを含む作物植物を含む。いくつかの態様において、作物植物は、除草剤、例えば、グリホセート系除草剤又はグルホシネート系除草剤に対して耐性であり得、又はＡＨＡＳ阻害性除草剤に対して耐性であり得る。
【０１４８】
本明細書において使用する場合、「耕作地域」又は「耕作地」は、１種又は複数種の植物、例えば、イベント１２７大豆植物の成長が望まれる任意の領域を含む。このような耕作地域は、限定するものではないが、イベント１２７大豆植物が栽培される田畑（作物畑、野外試験など）、温室、成長チャンバーなどを含む。
【０１４９】
本方法は、耕作地域にイベント１２７大豆種子又は大豆植物を植え付けるステップを含み、いくつかの実施形態において、作物、種子、雑草、望ましくない植物、土壌又はそれらの耕作地域に、有効量の対象の除草剤を適用するステップを含む。除草剤は、イベント１２７大豆植物の栽培期間中任意の時間に適用できる。除草剤は、作物を耕作地域に植え付ける前又は後に適用できる。このような除草剤の適用は、ＡＨＡＳ阻害性除草剤又はそれらの組合せを含み得る。
【０１５０】
「有効量」という用語は、耕作地において雑草又は望ましくない植物防除の任意の観察可能な測定がもたらされるために十分な除草剤の量を意味する。有効量のＡＨＡＳ阻害性除草剤は、約５０ｇ  ａｉ／ｈａから約５００ｇ  ａｉ／ｈａまでの間、約５０ｇ  ａｉ／ｈａ及び約４００ｇ  ａｉ／ｈａの間又は約５０ｇ  ａｉ／ｈａから約３００ｇ  ａｉ／ｈａまでの間の範囲であり得る。有効量の  ＡＨＡＳ阻害性除草剤は、さらに約  ７０ｇ  ａｉ／ｈａ、１４０ｇ  ａｉ／ｈａ又は２８０ｇ  ａｉ／ｈａであり得る。ＡＨＡＳ阻害性除草剤に関する本発明の方法における適用の有効率は、環境を含む多くの因子により影響を受けることがあり、実際の使用条件下で決定されるべきである。雑草又は望ましくない植物の防除は、１種又は複数種のＡＨＡＳ阻害性除草剤を、イベント１２７大豆を有さない地域におけるこのような防除に使用する量と同様又はそれを超える率で適用することにより得ることができる。このような適用率は、７０ｇ  ａｉ／ｈａ、１４０又は２８０ｇ  ａｉ／ｈａの率又はこれらと同等を含む。通常の市販の適用率は、約７０ｇ  ａｉ／ｈａ  のＡＨＡＳ阻害性除草剤であり、さらに１×率の適用と称される。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、有効量は、防除される雑草又は望ましくない植物が耐性である量を超えるＡＨＡＳ阻害性除草剤の量であり得る。例えば、雑草又は望ましくない植物が７０ｇ  ａｉ／ｈａの適用に対して耐性であるが、１４０ｇ  ａｉ／ｈａの適用に対しては感受性である実施形態において、その場合、有効量は１４０ｇ  ａｉ／ｈａである。
【０１５２】
したがって、本発明は、有効量の非選択性除草剤を、１種又は複数種のイベント１２７大豆植物を有する耕作地に適用するステップを含む、耕作地において雑草又は望ましくない植物の成長を防除する方法を提供する。
【０１５３】
有効量のＡＨＡＳ阻害性除草剤を、１種又は複数種のイベント１２７大豆植物を有する耕作地に適用するステップを含む、耕作地においてＡＨＡＳ阻害性除草剤の雑草又は植物を防除する方法をさらに提供する。
【０１５４】
有効量のＡＨＡＳ阻害性除草剤を、１種又は複数種のイベント１２７大豆植物を有する耕作地に適用するステップを含む、耕作地においてＡＨＡＳ阻害性除草剤耐性の雑草又は植物を防除する方法をさらに提供する。このような実施形態において、有効量のＡＨＡＳ阻害性除草剤は、雑草を防除するために十分な量で適用され、一方、イベント１２７大豆植物には実質的に全く影響を与えない。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、雑草は、イベント１２７大豆の種子の地域への植え付け前に防除され得る。例えば、ＡＨＡＳ阻害性除草剤などの非選択性除草剤は、種子の植え付け前に地域において雑草を減少又は除去するための有効量で、種子の植え付け前に適用できる。このような適用は、雑草を防除するために有効な、植え付け前の任意の時間、例えば、植え付け前１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又はそれを超える日数実施できる。さらに、農業用組成物の任意の組合せが、このような方法に適用できる。
【０１５６】
他の実施形態において、雑草は、イベント１２７大豆種子の植え付け後に防除できる。例えば、ＡＨＡＳ阻害性除草剤は、成長大豆植物、植物部位、成長植物の周辺及びその近隣の（土壌などの）成長培地又は地域、すなわち、大豆イベント１２７植物（単数又は複数）が成長する局所環境に、地域において雑草を防除するために有効な量で、適用できる。成長大豆イベント１２７植物は、任意の発達段階にあってよい。いくつかのこのような実施形態において、除草剤を適用する時に、成長大豆は少なくとも第１本葉期にある。さらに、農業用組成物の任意の組合せが、このような方法に適用できる。
【０１５７】
農業用組成物の組合せを本方法に使用する場合、このような組合せは、除草剤、防かび剤、殺菌剤、殺虫剤などの組合せを含むことができる。例えば、ＡＨＡＳ阻害性除草剤は、他の除草剤、例えば、５−エノールピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）−阻害性除草剤、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）阻害性除草剤、プロトポルフィノーゲン［ＩＸ］オキシダーゼ（ＰＰＯ）阻害性除草剤、オーキシン系除草剤又はそれらの組合せと組み合わせることができる。
【０１５８】
ＩＸ．収率を上げる方法
１種又は複数種のイベント１２７大豆植物を有する耕作地に有効量のＡＨＡＳ阻害性除草剤を適用するステップ、及び大豆植物に由来する種子の収穫ステップを含む、大豆植物（単数又は複数）の収率を上げる方法をさらに提供する。いくつかの実施形態において、大豆植物（単数又は複数）の収率の増加は、大豆植物（単数又は複数）の局所地域において成長する、通常は大豆植物（単数又は複数）と競合するであろう雑草の減少の結果である。
【０１５９】
このような方法を使用することによって、地域における大豆の収率は、大豆イベント１２７植物を有さない、比較可能な地域と比較して上げることができる。大豆の収率は、限定するものではないが、有効量のＡＨＡＳ阻害性除草剤がイベント１２７大豆植物を有さない地域に適用される、比較可能な地域から得られた収率と比較して５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％又はそれ以上を含む、任意の量上げることができる。
【０１６０】
Ｘ．農業用化学組成物
本発明は、開示された大豆１２７植物に適用するための農業用組成物をさらに提供する。このような組成物は、除草剤、防かび剤、抗菌剤、肥料などを含むことができる。一実施形態において、この農業用組成物は、１種若しくは複数種の除草剤又は１種若しくは複数種の除草剤と別の農業用組成物、例えば防かび剤、抗菌剤、肥料などとの組合せを含む、除草組成物である。
【０１６１】
任意の除草剤は、大豆イベント１２７作物、作物部位、又はイベント１２７大豆植物を含有する耕作地域に適用できる。除草剤の分類（すなわち、除草剤のクラス及びサブクラスへのグループ分け）は当分野において周知であり、ＨＲＡＣ（除草剤抵抗性（対策）委員会（Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ａｃｔｉｏｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ））及びＷＳＳＡ（アメリカ雑草学会（ｔｈｅ  Ｗｅｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ））による分類を含む。ＨＲＡＣ分類は、例えば、ウェブサイトのｈｒａｃｇｌｏｂａｌ．ｃｏｍ／Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ  ＨｅｒｂｉｃｉｄｅＭｏｄｅｏｆＡｃｔｉｏｎ／ｔａｂｉｄ／２２２／Ｄｅｆａｕｌｔ．ａｓｐｘにおいてワールドワイドに利用できる。ＨＲＡＣ分類の簡略版（対応するＷＳＳＡグループに関する覚書も含む）。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、本発明は、イミダゾリノン系除草剤、スルホニル尿素系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤、ピリミジニルオキシベンゾエート系除草剤、スルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン系除草剤及びそれらの混合物からなる群から選択される、少なくとも１種のＡＨＡＳ阻害性除草剤の使用を含む方法を提供する。これらの方法において、ＡＨＡＳ阻害性除草剤は、限定するものではないが、種子処理、土壌処理及び茎葉処理を含む当分野において公知の任意の方法によって適用できる。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、ＡＨＡＳ阻害性除草剤は、１種又は複数種のさらなる農業用組成物、例えば、さらなる除草剤、防かび剤、抗菌剤、抗ウィルス組成物又はそれらの組合せと組み合わせることができる。この組合せに使用するさらなる除草剤は、スルファミド系除草剤、有機リン酸エステル系除草剤及びベンゾチアジアジノン系除草剤を含む、任意の除草剤を含む。スルファミド系除草剤は、限定するものではないが、サフルフェナシルを含む。有機リン酸エステル系除草剤は、限定するものではないが、グリホセート及びグルホシネートを含む。ベンゾチアジアジノン系除草剤は、限定するものではないが、ベンタゾンを含む。このような組合せに使用する防かび剤は、限定するものではないが、ピラクロストロビンを含む。
【０１６４】
ＡＨＡＳ阻害性除草剤組成物の組合せを用いた処理、及び／又は１種又は複数種のＡＨＡＳ阻害性除草剤組成物及び１種又は複数種のさらなる農業用組成物を用いた処理は、このような組成物の混合物、このような組成物の同時適用、このような組成物の連続適用又はそれらの任意の組合せの適用によって発生し得る。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、ＡＨＡＳ阻害性除草剤組成物は、少なくとも１種のＡ）ＡＨＡＳ阻害性除草剤及び少なくとも１種のＢ）クラスｂ１）からｂ１５）までの除草剤：
ｂ１）脂質生合成阻害剤；
ｂ２）アセト乳酸シンターゼ阻害剤（ＡＨＡＳ阻害剤）；
ｂ３）光合成阻害剤；
ｂ４）プロトポルフィリノーゲン−ＩＸオキシダーゼ阻害剤；
ｂ５）白化除草剤；
ｂ６）エノールピルビニルシキミ酸−３−リン酸合成酵素阻害剤（ＥＰＳＰ阻害剤）；
ｂ７）グルタミンシンターゼ阻害剤；
ｂ８）７，８−ジヒドロプロテイン酸シンターゼ阻害剤（ＤＨＰ阻害剤）；
ｂ９）有糸分裂阻害剤；
ｂ１０）長鎖脂肪酸合成の阻害剤（ＶＬＣＦＡ阻害剤）；
ｂ１１）セルロース生合成阻害剤；
ｂ１２）脱共役除草剤；
ｂ１３）オーキシン除草剤；
ｂ１４）オーキシン輸送阻害剤；
ｂ１５）ベンゾイルプロップ、フラムプロップ、フラムプロップ−Ｍ、ブロモブチド、クロルフルレノール、シンメチリン、メチルダイムロン、エトベンザニド、ホサミン、メタム、ピリブチカルブ、オキサジクロメホン、ダゾメット、トリアジフラム及び臭化メチルからなる群から選択される他の除草剤、並びに
それらがカルボキシ基を有するという条件で、活性化合物Ｂの農業的に許容可能な塩及び活性化合物Ｂの農業的に許容可能な誘導体
から選択されるさらなる活性化合物を含む。
【０１６６】
他の場合において、少なくとも１種のＡ）ＡＨＡＳ阻害性除草剤及び少なくとも１種の除草剤Ｂのこのような組合せを、毒性緩和剤Ｃ（このような毒性緩和剤は少なくとも１種のＡＨＡＳ阻害性除草剤と組み合わせてもまた使用できる）と組み合わせて使用できる。毒性緩和剤Ｃは、ベンキサコール、クロキントセット、シオメトリニル、ジクロライド、ジシクロノン、ジエトレート、フェンクロラゾ−ル、フェンクロリム、フルラゾール、フルキソフェニム、フリラゾール、イキサジフェン、メフェンピル、メフェネート、ナフタル酸無水物、２，２，５−トリメチル−１−３−（ジクロロアセチル）−１，３−オキサゾリジン（Ｒ−２９１４８）、４−（ジクロロアセチル）−１−オキサ−４−アザスピロ［４．５］デカン（ＡＤ−６７；ＭＯＮ４６６０）及びオキサベトリニル並びに活性化合物Ｃのそれらの農業的に許容可能な塩及びそれらがカルボキシル基を有するという条件で、活性化合物Ｃの農業的に許容可能な誘導体から選択できる。
【０１６７】
ＡＨＡＳ阻害化合物と組み合わせて使用できる除草剤Ｂの例は、
ｂ１）脂質生合成阻害剤の群から：クロラジホップ、クロジナホップ、クロホップ、シハロホップ、ジクロホップ、フェノキサプロップ、フェノキサプロップ−Ｐ、フェチアプロップ、フルアジホップ、フルアジホップ−Ｐ、ハロキシホップ、ハロキシホップ−Ｐ、イソキサピリホップ、メタミホップ、プロパキザホップ、キザロホップ、キザロホップ−Ｐ、トリホップ、アロキシジム、ブトロキシジム、クレトジム、クロプロキシジム、シクロキシジム、プロホキシジム、セトキシジム、テプラロキシジム、トラルコキシジム、ブチレート、シクロエート、ジアルレート、ジメピペレート、ＥＰＴＣ、エスプロカルブ、エチオレート、イソプロリネート、メチオベンカルブ、モリネート、オルベンカルブ、ペブレート、プロスルホカルブ、スルファルレート、チオベンカルブ、チオカルバジル、トリアルレート、ベルノレート、ベンフレセート、エトフメセート及びベンスリド；
ｂ２）ＡＨＡＳ阻害剤の群から：アミドスルフロン、アジムスルフロン、ベンスルフロン、クロリムロン、クロロスルフロン、シノスルフロン、シクロスルファムロン、エタメトスルフロン、エトキシスルフロン、フラザスルフロン、フルピルスルフロン、ホラムスルフロン、ハロスルフロン、イマゾスルフロン、ヨードスルフロン、メソスルフロン、メトスルフロン、ニコスルフロン、オキサスルフロン、ピリミスルフロン、プロスルフロン、ピラゾスルフロン、リムスルフロン、スルホメツロン、スルホスルフロン、チフェンスルフロン、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリフルオキシスルフロン、トリフルスルフロン、トリトスルフロン、イマザメタベンズ、イマザモックス、イマザピック、イマザピル、イマザキン、イマゼタピル、クロランスラム、ジクロスラム、フロラスラム、フルメツラム、メトスラム、ペノキススラム、ビスピリバック、ピリミノバック、プロポキシカルバゾン、フルカルバゾン、ピリベンゾキシム、ピリフタリド及びピリチオバック；
ｂ３）光合成阻害剤の群から：アトラトン、アトラジン、アメトリン、アジプロトリン、シアナジン、シアナトリン、クロラジン、シプラジン、デスメトリン、ジメタメトリン、ジプロペトリン、エグリナジン、イパジン、メソプラジン、メトメトン、メトプロトリン、プロシアジン、プログリナジン、プロメトン、プロメトリン、プロパジン、セブチラジン、セクブメトン、シマジン、シメトン、シメトリン、テルブメトン、テルブチラジン、テルブチリン、トリエタジン、アメトリジオン、アミブジン、ヘキサジノン、イソメチオジン、メタミトロン、メトリブジン、ブロマシル、イソシル、レナシル、テルバシル、ブロムピラゾン、クロリダゾン、ジミダゾン、デスメジファム、フェニソファム、フェンメジファム、フェンメジファム−エチル、ベンゾチアズロン、ブチウロン、エチジムロン、イソウロン、メタベンズチアズロン、モノイソウロン、テブチウロン、チアザフルロン、アニスロン、ブツロン、クロルブロムロン、クロレツロン、クロロトルロン、クロロクスロン、ジフェノクスロン、ジメフロン、ジウロン、フェヌロン、フルオメツロン、フルオチウロン、イソプロツロン、リヌロン、メチウロン、メトベンズロン、メトブロムロン、メトクスロン、モノリヌロン、モヌロン、ネブロン、パラフルロン、フェノベンズロン、シズロン、テトラフルロン、チジアズロン、シペルクアット、ジエタムクアット、ジフェンゾクアット、ジクアット、モルファムクアット、パラクアット、ブロモボニル、ブロモキシニル、クロロキシニル、ヨードボニル、イオキシニル、アミカルバゾン、ブロモフェノキシム、フルメジン、メタゾール、ベンタゾン、プロパニル、ペンタノクロル、ピリダート及びピリダホル；
ｂ４）プロトポルフィリノーゲン−ＩＸオキシダーゼ阻害剤の群から：アシフルオルフェン、ビフェノックス、クロメトキシフェン、クロルニトロフェン、エトキシフェン、フルオロジフェン、フルオログリコフェン、フルオロニトロフェン、ホメサフェン、フリルオキシフェン、ハロサフェン、ラクトフェン、ニトロフェン、ニトロフルオルフェン、オキシフルオルフェン、フルアゾラート、ピラフルフェン、シニドン−エチル、フルミクロラック、フルミオキサジン、フルミプロピン、フルチアセット、チジアジミン、オキサジアゾン、オキサジアルジル、アザフェニジン、カルフェントラゾン、スルフェントラゾン、ペントキサゾン、ベンズフェンジゾン、ブタフェナシル、ピラクロニル、プロフルアゾル、フルフェンピル、フルプロパシル、ニピラクロフェン及びエトニプロミド；
【０１６８】
ｂ５）白化除草剤の群から：メトフルラゾン、ノルフルラゾン、フルフェニカン、ジフルフェニカン、ピコリナフェン、ベフルブタミド、フルリドン、フルロクロリドン、フルルタモン、メソトリオン、スルコトリオン、イソキサクロルトール、イソキサフルトール、ベンゾフェナップ、ピラゾリナート、ピラゾキシフェン、ベンゾビシクロン、アミトロール、クロマゾン、アクロニフェン、４−（３−トリフルオロメチルフェノキシ）−２−（４−トリフルオロメチルフェニル）ピリミジン及びさらに、式Ｉ：の３−ヘテロシクリル−置換ベンゾイル誘導体
【化１】
0005988585.tif 000003
式中、可変のＲ８からＲ１３を以下のように定義する：Ｒ８、Ｒ１０は水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６−アルキル、Ｃ１〜Ｃ６−ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６−アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６−ハロアルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６−アルキルチオ、Ｃ１〜Ｃ６−アルキルスルフィニル又はＣ１〜Ｃ６−アルキルスルホニルであり、Ｒ９は、チアゾール−２−イル、チアゾール−４−イル、チアゾール−５−イル、イソオキサゾール−３−イル、イソオキサゾール−４−イル、１０イソオキサゾール−５−イル、４，５−ジヒドロイソオキサゾール−３−イル、４，５−ジヒドロイソオキサゾール−４−イル及び４，５−ジヒドロイソオキサゾール−５−イルからなる群から選択される複素環基であり、述べた９個の基は、非置換であっても又はハロゲン、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４−ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ４−ハロアルコキシ又はＣ１〜Ｃ４−アルキルチオによる一置換若しくは多置換、例えば一、二、三、若しくは四置換であってもよく、Ｒ１１は、水素、ハロゲン又はＣ１〜Ｃ６−アルキルであり、Ｒ１２は、Ｃ１〜Ｃ６−アルキルであり、Ｒ１３は水素又はＣ１〜Ｃ６−アルキルである；
ｂ６）ＥＰＳＰシンターゼ阻害剤の群から：グリホセート；
ｂ７）グルタミンシンターゼ阻害剤の群から：グルホシネート及びビラナホス；
ｂ８）ＤＨＰシンターゼ阻害剤の群から：アスラム；
ｂ９）有糸分裂阻害剤の群から：ベンフルラリン、ブトラリン、ジニトラミン、エタルフルラリン、フルクロラリン、イソプロパリン、メタプロパリン、ニトラリン、オリザリン、ペンジメタリン、プロジアミン、プロフルラリン、トリフルラリン、アミプロホス−メチル、ブタミホス、ジチオピル、チアゾピル、プロピザミド、テブタム、クロルタール、カルベタミド、クロルブファム、クロルプロファム及びプロファム；
ｂ１０）ＶＬＣＦＡ阻害剤の群から：アセトクロル、アラクロル、ブタクロル、ブテナクロル、デラクロル、ジエタチル、ジメタクロル、ジメテナミド、ジメテナミド−Ｐ、メタザクロル、メトラクロル、Ｓ−メトラクロル、プレチラクロル、プロパクロル、プロピソクロル、プリナクロル、テルブクロル、テニルクロル、キシラクロル、アリドクロル、ＣＤＥＡ、エプロナズ、ジフェナミド、ナプロパミド、ナプロアニリド、ペトキサミド、フルフェナセット、メフェナセット、フェントラザミド、アニロホス、ピペロホス、カフェンストロール、インダノファン及びトリジファン；
ｂ１１）セルロース生合成阻害剤の群から：ジクロベニル、クロルチアミド、イソオキサベン及びフルポキサム；
ｂ１２）脱共役剤除草剤の群から：ジノフェナート、ジノプロプ、ジノサム、ジノセブ、ジノテルブ、ＤＮＯＣ、エチノフェン及びメジノテルブ；
ｂ１３）オーキシン系除草剤の群から：クロメプロップ、２，４−Ｄ、２，４，５−Ｔ、ＭＣＰＡ、ＭＣＰＡチオエチル、ジクロルプロップ、ジクロルプロップ−Ｐ、メコプロップ、メコプロップ−Ｐ、２，４−ＤＢ、ＭＣＰＢ、クロラムベン、ジカンバ、２，３，６−ＴＢＡ、トリカムバ、キンクロラック、キンメラック、クロピラリド、フルロキシピル、ピクロラム、トリクロピル及びベナゾリン；
ｂ１４）オーキシン輸送阻害剤の群から：ナプタラム、ジフルフェンゾピル；
ｂ１５）ベンゾイルプロップ、フラムプロップ、フラムプロップ−Ｍ、ブロモブチド、クロルフルレノール、シンメチリン、メチルジムロン、エトベンザニド、ホサミン、メタム、ピリブチカルブ、オキサジクロメホン、ダゾメット、トリアジフラム及び臭化メチル
である。
【０１６９】
群ｂ１）からｂ１５）の活性化合物Ｂ及び活性化合物Ｃは公知の除草剤及び毒性緩和剤であり、例えば、Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｎａｍｅｓ（ｈｃｌｒｓｓ．ｄｅｍｏｎ．ｃｏ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌのサイトにおいてワールドワイドに利用可能）；  Ｆａｒｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ２０００  Ｖｏｌ．８６、Ｍｅｉｓｔｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、２０００年；Ｂ．Ｈｏｃｋ、Ｃ．Ｆｅｄｔｋｅ、Ｒ．Ｒ．Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｈｅｒｂｉｚｉｄｅ、Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ  １９９５年；Ｗ．Ｈ．Ａｈｒｅｎｓ、Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第７版、Ｗｅｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、１９９４年；及びＫ．Ｋ．Ｈａｔｚｉｏｓ、Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第７版の付録、Ｗｅｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、１９９８年を参照されたい。２，２，５−トリメチル−３−（ジクロロアセチル）−１，３−オキサゾリジン［ＣＡＳ  Ｎｏ．５２８３６−３１−４］は、Ｒ−２９１４８の名称でも公知である。４−（ジクロロアセチル）−１−オキサ−４−アザスピロ［４．５］デカン［ＣＡＳ  Ｎｏ．７１５２６−０７−０３］は、ＡＤ−６７及びＭＯＮ４６６０の名称でも公知である。式ＩＩの白化除草剤は、ＷＯ９６／２６２０２、ＷＯ９７／４１１１６、ＷＯ９７／４１１１７及びＷＯ９７／４１１１８に開示されている。
【０１７０】
活性化合物Ｃとして、この組成物は、下記の化合物の少なくとも１種を含むことができる：ベノキサコール、クロキントセット、ジクロルミド、フェンクロラゾ−ル、フェンクロリム、フルキソフェニム、フリラゾール、イソキサジフェン、メフェンピル、２，２，５−トリメチル−３−（ジクロロアセチル）−１，３−オキサゾリジン、４−（ジクロロアセチル）−１−オキサ−４−アザスピロ［４．５］デカン及びオキサベトリニル及び／又はそれらの農業的に許容可能な塩及び／又は化合物がＣＯＯＨ基を有する場合には農業的に許容可能な誘導体。
【０１７１】
有効成分の組合せを含有する組成物は、活性化合物Ａとして少なくとも１種のＡＨＡＳ阻害性化合物及びクラスｂ１）からｂ１５）より選択される少なくとも１種の除草剤並びに必要に応じて１種又は複数種の毒性緩和剤Ｃを含む、二元組成物及び三元組成物であってよい。
【０１７２】
成分Ａとして少なくとも１種のＡＨＡＳ阻害性化合物及び少なくとも１種の除草剤Ｂを含む二元組成物において、活性化合物Ａ：Ｂの重量比は、１：５００から１０：１の範囲、１：１００から１０：１の範囲、１：５０から１０：１の範囲、又は１：２５から５：１の範囲であってよい。
【０１７３】
少なくとも１種のＡＨＡＳ阻害性化合物及び少なくとも１種の毒性緩和剤Ｃ，を含む二元組成物において、活性化合物Ａ：Ｃの重量比は、通常１：１００から１０：１の範囲、１：５０から１０：１の範囲、又は１：２５から５：１の範囲である。
【０１７４】
成分ＡとしてＡＨＡＳ阻害性化合物、少なくとも１種の除草剤Ｂ及び少なくとも１種の毒性緩和剤Ｃの両方を含む三元組成物において、成分Ａ：Ｂ：Ｃの相対的重量比は、１０：１：１から１：５００：１０の範囲、１０：１：１から１：１００：１０の範囲、１０：１：１から１：５０：１の範囲、又は５：１：１から１：２５：５の範囲であってよい。一実施形態において、三元組成物において、除草剤Ｂ対毒性緩和剤Ｃの重量比は５０：１から１：１０の範囲である。
【０１７５】
米国特許第７，３７５，０５８号（参照によりその全体は本明細書に組み込まれる）に記載の除草性活性混合物もまた、大豆イベント１２７植物に関する処理に使用できる。
【０１７６】
プロトポルフィリノーゲン［ＩＸ］オキシダーゼ（ＰＰＯ）阻害性除草剤もまた、本発明の組成物における使用を見出される。ＰＰＯ阻害性除草剤は当分野において公知であり、限定するものではないが、ジフェニルエーテル系除草剤（ニトロフェニルエーテル系除草剤を含む）、例えば、アシフルオルフェン（５−［２−クロロ−４−（トリフルオロメチル）フェノキシ］−２−ニトロ安息香酸）、ビフェノキス（メチル５−（２，４−ジクロロフェノキシ）−２−ニトロベンゾエート）、ＤＰＥＩ（５−［２−クロロ−４−（トリフルオロメチル）フェノキシ］−２−ニトロアセトフェノンオキシム−ｏ−（酢酸、メチルエステル））、ＤＰＥＩＩ（５−［２−クロロ−４−（トリフルオロメチル）フェノキシ］−３−メトキシフタリド）、エトキシフェン（（１Ｓ）−１−カルボキシエチル２−クロロ−５−［２−クロロ−４−（トリフルオロメチル）フェノキシ］ベンゾエート）、ホメサフェン（５−［２−クロロ−４−（トリフルオロメチル）フェノキシ］−Ｎ−（メチルスルホニル）−２−ニトロベンズアミド）、ラクトフェン（エチルＯ−［５−（２−クロロ−α，α，α−トリフルオロ−ｐ−トリルオキシ）−２−ニトロベンゾイル］−ＤＬ−ラクテート）及びオキシフルオルフェン（２−クロロ−１−（３−エトキシ−４−ニトロフェノキシ）−４−（トリフルオロメチル）ベンゼン）を含む。ＰＰＯ阻害性除草剤は、ジカルボキシイミド系除草剤、例えば、Ｎ−フェニル−フタルイミデスフルミクロラク（［２−クロロ−５−（シクロヘキサ−１−エン−１，２−ジカルボキシミド）−４−フルオロロフェノキシ］酢酸）、フルミオキサジン（Ｎ−（７−フルオロ−３，４−ジヒドロ−３−オキソ−４−プロプ−２−イニル−２Ｈ−１，４−ベンゾオキサジン−６−イル）シクロヘキサ−１−エン−１，２−ジカルボキサミド）をさらに含む。ＰＰＯ阻害性除草剤はトリアゾリノン系除草剤、例えば、カルフェントラゾン（α，２−ジクロロ−５−［４−（ジフルオロメチル）−４，５−ジヒドロ−３−メチル−５−オキソ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］−４−フルオロベンゼンプロパン酸）及びスルフェントラゾン（Ｎ−［２，４−ジクロロ−５−［４−（ジフルオロメチル）−４，５−ジヒドロ−３−メチル−５−オキソ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］フェニル］メタンスルホンアミド）さらに含む。ＰＰＯ阻害性除草剤は、限定するものではないが、ニピラクロフェン（１−［２，６−ジクロロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール−５−アミン）及びピラフルフェン（２−クロロ−５−（４−クロロ−５−ジフルオロメトキシ−１−メチルピラゾール−３−イル）−４−フルオロフェノキシ酢酸）を含む、フェニルピラゾール系除草剤をさらに含む。ＰＰＯ阻害性除草剤は、オキサジアゾロン系除草剤、例えば、オキサジアゾン（３−［２，４−ジクロロ−５−（１−メチルエトキシ）フェニル］−５−（１，１−ジメチルエチル）−１，３，４−オキサジアゾール−２（３Ｈ）−オン）及びオキサジアルギル（５−ｔｅｒｔ−ブチル−３−［２，４−ジクロロ−５−（プロパ−２−イニルオキシ）フェニル］−１，３，４−オキサ���アゾール−２（３Ｈ）−オン）もまた含む。ＰＰＯ阻害性除草剤チアジアゾロン系除草剤は、例えば、フルチアセト（［［２−クロロ−４−フルオロ−５−［（テトラヒドロ−３−オキソ−１Ｈ，３Ｈ−［１，３，４］チアジアゾロ［３，４−ａ］ピリダジン−１−イリデン）アミノ］フェニル］チオ］酢酸）；Ｚａｇａｒ及びＳｉｅｖｅｒｎｉｃｈの米国特許公開第２００８２５４９８５号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）のＩＩＩ．４）項に記載のチアジアゾロン系除草剤もさらに含む。
【０１７７】
オーキシン系除草剤もまた、本発明の組成物における使用が見出される。オーキシン系除草剤は、有効成分作用様式がオーキシン模倣体又はオーキシン阻害剤（抗オーキシン）としてである除草性有効成分を含むオーキシン系除草剤を含む。オーキシン系除草剤の例は、限定するものではないが、ピクロラム（４−アミノ−３，５，６−トリクロロピコリン酸）；ジカンバ（３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸）；クロフィブル酸（（ｐ−クロロフェノキシ）イソ酪酸）；２−（４−クロロフェノキシ）−２−メチルプロパン酸）；ベナゾリン（４−クロロ−２−オキソ−３−ベンゾチアゾール酢酸；４−クロロ−２−オキソベンゾチアゾリン−３−イル−酢酸）；ＴＩＢＡ（２，３，５−トリヨードベノズ酸）；２，３，６−ＴＢＡ（２，３，６−トリクロロ安息香酸）；トリクロピル（３，５，６−トリクロロ−２−ピリジルオキシ酢酸）；キンクロラック（３，７−ジクロロキノリン−８−カルボン酸）；及びオーキシン模倣性除草剤又はオーキシン遮断フェノキシ系除草剤、例えば、２，４−Ｄ（（２，４−ジクロロフェノキシ）酢酸）、ＭＣＰＡ（（４−クロロ−２−メチルフェノキシ）酢酸）、２，４−ＤＢ（４−（２，４−ジクロロフェノキシ）酪酸）、２，４−ＤＥＰ（トリス［２−（２，４−ジクロロフェノキシ）エチル］ホスフェート）、４−ＣＰＡ（４−クロロフェノキシ酢酸）、２，４，５−Ｔ（（２，４，５−トリクロロフェノキシ）酢酸）、ジクロルプロプ（２−（２，４−ジクロロフェノキシ）プロパン酸）、フェノプロプ（２−（２，４，５−トリクロロフェノキシ）プロパン酸）及びメコプロプ（２−（２−メチル−４−クロロ−フェノキシ）プロピオン酸）を含むフェノキシ酢酸、フェノキシプロピオン酸及びフェノキシ酪酸除草剤を含む。
【０１７８】
本発明の農業用組成物の組合せの例は、イマザピル及びイマザピック；イマザピル及びベンタゾン；イマザピル、イマザピック及びベンタゾン；イマザピル及びピラクロストロビン；イマザピル、イマザピック及びピラクロストロビン；イマザピル及びサフルフェナシル；イマザピル、イマザピック及びサフルフェナシル；イマザピック、サフルフェナシル及びグリホセート；イマザピル、イマザピック、サフルフェナシル及びグリホセート；イマザピック及びグリホセート；イマザピル及びグリホセート；イマザピル、サフルフェナシル及びグリホセート；並びにサフルフェナシル及びグリホセートを含む。
【０１７９】
適用前に、ＡＨＡＳ阻害性除草剤などの除草剤を、日常的な製剤、例えば、溶液、エマルジョン、懸濁液、ダスト、散剤、ペースト及び顆粒に変換され得る。使用形態は、特定の意図する目的に依存し、それぞれの場合、本発明に従った化合物の細かく、且つ均一な分散が確保されるべきである。
【０１８０】
本発明の方法に使用する製剤は、任意の公知の方法、例えば、農薬製剤に適した補助剤、例えば溶媒及び／又は担体、所望であれば乳化剤、界面活性剤及び分散剤、保存剤、消泡剤、凍結防止剤、種子処理用製剤に関しては場合により着色剤及び／又は結合剤及び／又はゲル化剤を用いて活性化合物を拡大することによって調製され得る。
【０１８１】
製剤に使用する適切な溶媒の例は、水、芳香族溶媒（例えば、Ｓｏｌｖｅｓｓｏ製品、キシレン）、パラフィン（例えば、鉱油分画）、アルコール（例えば、メタノール、ブタノール、ペンタノール、ベンジルアルコール）、ケトン（例えば、シクロヘキサノン、ガンマ−ブチロラクトン）、ピロリドン（ＮＭＰ、ＮＯＰ）、酢酸塩（グリコールジアセテート）、グリコール、脂肪酸ジメチルアミド、脂肪酸及び脂肪酸エステルを含む。溶媒混合物もまた使用できる。
【０１８２】
本発明の製剤に使用する適切な担体の例は、粉砕天然鉱物（例えば、カオリン、粘土、タルク、チョーク）及び粉砕合成鉱物（例えば、高度な分散シリカ、ケイ酸塩）を含む。
【０１８３】
本発明の製剤に使用する適切な乳化剤は、非イオン性及びアニオン性乳化剤（例えば、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、アルキルスルホン酸及びアリールスルホン酸）を含む。
【０１８４】
本発明の製剤に使用する適切な分散剤の例は、リグニン−亜硫酸パルプ廃液及びメチルセルロースを含む。
【０１８５】
本発明の製剤に使用する適切な界面活性剤は、リグノスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、フェノールスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸、アルキルアリールスルホン酸塩、アルキル硫酸、アルキルスルホン酸塩、脂肪アルコール硫酸塩、脂肪酸及び硫酸化脂肪アルコールグリコールエーテルのアルカリ金属、アルカリ土類金属及びアンモニウムの塩、さらにスルホン化ナフタレン及びナフタレン誘導体とホルムアルデヒドの縮合物、ナフタレン又はナフタレンスルホン酸とフェノール及びホルムアルデヒドの縮合物、ポリオキシエチレンオクチルフェノールエーテル、エトキシ化イソオクチルフェノール、オクチルフェノール、ノニルフェノール、アルキルフェノールポリグリコールエーテル、トリブチルフェニルポリグリコールエーテル、トリステアリールフェニルポリグリコールエーテル、アルキルアリールポリエーテルアルコール、アルコール及び脂肪アルコールエチレンオキサイド縮合物、エトキシ化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、エトキシ化ポリオキシプロピレン、ラウリルアルコールポリグリコールエーテルアセタール、ソルビトールエステル、リグノ亜硫酸パルプ廃液及びメチルセルロースを含む。
【０１８６】
直接噴霧可能な溶液、エマルジョン、ペースト又は油分散液の調製に適切な物質は、ケロシン又はディーゼル油などの高沸点の媒体の鉱油分画、さらにコールタール油及び植物起源又は動物起源の油、脂肪族、環状及び芳香族の炭水化物、例えば、トルエン、キシレン、パラフィン、テトラヒドロナフタレン、アルキル化ナフタレン又はそれらの誘導体、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、シクロヘキサノール、シクロヘキサノン、イソホロン、極性の高い溶媒、例えば、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン又は水である。
【０１８７】
グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコールなどの凍結防止剤及び殺菌剤なども製剤に加えることができる。
【０１８８】
本発明の製剤に使用する適切な消泡剤は、例えば、シリコン又はステアリン酸マグネシウムに基づく消泡剤を含む。
【０１８９】
本発明の製剤に使用する適切な保存剤は、例えば、ジクロロフェノール及びベンジルアルコールヘミホルムアルデヒドを含む。
【０１９０】
本発明の種子処理製剤は、結合材及び場合により着色剤をさらに含むことができる。
【０１９１】
結合剤を開示の種子製剤に加え、処理後に活性材料の種子への接着を改善できる。適切な結合剤は、ブロックコポリマーＥＯ／ＰＯ界面活性剤であるが、さらに、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリブテン、ポリイソブチレン、ポリスチレン、ポリエチレンアミン、ポリエチレンアミド、ポリエチレンイミン、（Ｌｕｐａｓｏｌ（登録商標）、Ｐｏｌｙｍｉｎ（登録商標））、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリビニルアセテート、チロース及びこれらのポリマーに由来するコポリマーである。
【０１９２】
場合により着色剤もまた本製剤に含まれ得る。種子処理製剤のために適切な着色剤又は染料は、ローダミンＢ（Ｒｈｏｄａｍｉｎ  Ｂ）、Ｃ．Ｉ．ピグメントレッド（Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｒｅｄ）１１２、Ｃ．Ｉ．ソルベントレッド（Ｃ．Ｉ．Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｒｅｄ）１、ピグメントブルー１５：４、ピグメントブルー１５：３、ピグメントブルー１５：２、ピグメントブルー１５：１、ピグメントブルー８０、ピグメントイエロー１、ピグメントイエロー１３、ピグメントレッド１１２、ピグメントレッド４８：２、ピグメントレッド４８：１、ピグメントレッド５７：１、ピグメントレッド５３：１、ピグメントオレンジ４３、ピグメントオレンジ３４、ピグメントオレンジ５、ピグメントグリーン３６、ピグメントグリーン７、ピグメントホワイト６、ピグメントブラウン２５、ベーシックバイオレット１０、ベーシックバイオレット４９、アシッドレッド５１、アシッドレッド５２、アシッドレッド１４、アシッドブルー９、アシッドイエロー２３、ベーシックレッド１０、ベーシックレッド１０８である。
【０１９３】
適切なゲル化剤の例は、カラギーナン（Ｓａｔｉａｇｅｌ（登録商標））である。
【０１９４】
散剤、拡散材料及びダスト散布可能（ｄｕｓｔａｂｌｅ）な製品は、活性物質と固体担体とを混合し、同時に粉砕することによって調製され得る。
【０１９５】
顆粒、例えば、コーティング顆粒、含浸顆粒及び均質顆粒は、活性化合物を固体担体に結合させることによって調製され得る。固体担体の例は、シリカゲル、ケイ酸塩、タルク、カオリン、アタクレイ（ａｔｔａｃｌａｙ）、石灰岩、石灰、チョーク、膠灰粘土、黄土、粘土、ドロマイト、珪藻土、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、酸化マグネシウムなどの鉱物土類、粉砕した合成材料、肥料、例えば、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素など、及び植物起源の製品、例えば穀類粗挽き粉、樹皮粗挽き粉、木材粗挽き粉及び木の実の殻の粗挽き粉、セルロース粉末及び他の個体担体である。
【０１９６】
一般的に、製剤は、除草剤、例えばＡＨＡＳ阻害性除草剤の０．０１から９５重量％、好ましくは０．１から９０重量％を含む。除草剤は、９０重量％から１００重量％、好ましくは９５重量％から１００重量％（ＮＭＲスペクトルによる）の純度で用いられ得る。種子処理の目的に関しては、それぞれの製剤は２〜１０倍に希釈し、０．０１から６０重量％の活性化合物、好ましくは０．１から４０重量％のすぐに使える調整品の濃度をもたらし得る。
【０１９７】
本発明のＡＨＡＳ阻害性除草剤は、それらの製剤自体の形態で、又はそれらから調製された使用形態、例えば、直接噴霧可能な溶液、散剤、懸濁液又は分散液、エマルジョン、油分散液、ペースト、ダスト散布可能な製品、拡散材料又は顆粒の形態で、噴霧、散布、ダスト散布、拡散又は注入によって、使用され得る。使用形態は、意図する目的に完全に依存し、個々の場合において、本発明によるＡＨＡＳ阻害性除草剤の最も細かい分散を可能にすることを確実にすることが意図される。
【０１９８】
水性の使用形態は、水を加えることによって、エマルジョンの濃縮物、ペースト又は可湿性散剤（噴霧可能な粉末、油分散液）から調製され得る。エマルジョン、ペースト又は油分散液を調製するために、そのまま、又は油又は溶媒に溶解した物質は、湿潤剤、粘着付与剤、分散剤又は乳化剤を用いて水中で均質化できる。しかし、さらに、活性物質、湿潤剤、粘着付与剤、分散剤又は乳化剤、必要に応じて溶媒又は油からなる濃縮物を調製でき、このような濃縮物は、水による希釈に適している。
【０１９９】
すぐ使える調製品中の活性化合物の濃縮物は、比較的広範囲に変更できる。一般的に、それらは０．０００１から１０％、好ましくは０．０１から１重量％である。
【０２００】
本発明のＡＨＡＳ阻害性除草剤はまた、超微量法（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ−ｖｏｌｕｍｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ）（ＵＬＶ）においても良好に使用することができ、この場合、９５重量％を超える活性化合物を含有する製剤を適用すること、或いは活性化合物を添加剤なしに適用することも可能である。
【０２０１】
以下は、本発明の方法に使用するためのＡＨＡＳ阻害性除草剤製剤の例である。
【０２０２】
１．葉面適用のために水で希釈する製品。種子処理の目的に関しては、このような製品を希釈して、又は希釈しないで種子に適用できる。
【０２０３】
Ａ）水溶性濃縮物（ＳＬ、ＬＳ）
１０重量部のＡＨＡＳ阻害性除草剤を９０重量部の水又は水溶性溶媒に溶解する。代替として、湿潤剤又は他の補助剤を加える。ＡＨＡＳ阻害性除草剤は水で希釈すると溶解し、それによって１０％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害性除草剤を含む製剤を得る。
【０２０４】
Ｂ）分散性濃縮物（ＤＣ）
２０重量部のＡＨＡＳ阻害性除草剤を７０重量部のシクロヘキサンに溶解し、１０重量部の分散剤、例えばポリビニルピロリドンを加える。水で希釈して分散液を得、それによって、２０％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害性除草剤を含む製剤を得る。
【０２０５】
Ｃ）乳化性濃縮物（ＥＣ）
１５重量部のＡＨＡＳ阻害性除草剤を７重量部のキシレンに溶解し、ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウム及びエトキシル化ヒマシ油（それぞれ５重量部）を加える。水で希釈してエマルジョンを得、それによって１５％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害性除草剤を含む製剤を得る。
【０２０６】
Ｄ）エマルジョン（ＥＷ、ＥＯ、ＥＳ）
２５重量部のＡＨＡＳ阻害性除草剤を３５重量部のキシレンに溶解し、ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウム及びエトキシル化ヒマシ油（それぞれ５重量部）を加える。この混合物に、乳化装置（例えばＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘ）を用いて３０重量部の水を導入し、均質なエマルジョンを得る。水で希釈してエマルジョンを得、それによって２５％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害性除草剤を含む製剤を得る。
【０２０７】
Ｅ）懸濁液（ＳＣ、ＯＤ、ＦＳ）
振とうさせたボールミルにおいて、２０重量部のＡＨＡＳ阻害性除草剤を粉砕し、１０重量部の分散剤、湿潤剤及び７０重量部の水又は有機溶媒を加えて微細なＡＨＡＳ阻害性除草剤の懸濁液を得る。水で希釈してＡＨＡＳ−阻害性除草剤の安定な懸濁液を得、それによって２０％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害性除草剤を含む製剤を得る。
【０２０８】
Ｆ）水分散性顆粒及び水溶性顆粒（ＷＧ、ＳＧ）
５０重量部のＡＨＡＳ阻害性除草剤を、細かく粉砕し、５０重量部の分散剤及び湿潤剤を加えて、技術装置（例えば、押し出し機、噴霧塔、流動床）を用いて水分散性又は水溶性の顆粒として作製する。水で希釈してＡＨＡＳ−阻害性除草剤の安定な懸濁液又は溶液を得、それによって５０％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害性除草剤を含む製剤を得る。
【０２０９】
Ｇ）水分散性散剤及び水溶性散剤（ＷＰ、ＳＰ、ＳＳ、ＷＳ）
７５重量部のＡＨＡＳ阻害性除草剤をローターステーターミルにおいて粉砕し、２５重量部の分散剤、湿潤剤及びシリカゲルを加える。水で希釈してＡＨＡＳ−阻害性除草剤の安定な懸濁液又は溶液を得、それによって７５％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害性除草剤を含む製剤を得る。
【０２１０】
Ｈ）ゲル製剤（ＧＦ）
振とうさせたボールミルにおいて、２０重量部のＡＨＡＳ阻害性除草剤を粉砕し、１０重量部の分散剤、１重量部のゲル化湿潤剤及び７０重量部の水又は有機溶媒を加えて、微細なＡＨＡＳ阻害性除草剤懸濁液を得る。水で希釈してＡＨＡＳ阻害性除草剤の安定な懸濁液を得、それによって２０％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害性除草剤を含む製剤を得る。このゲル製剤は、種子処理としての使用に適している。
【０２１１】
２．葉面適用に希釈しないで用いる製品。種子処理の目的のためには、このような製品は希釈して種子に適用できる。
【０２１２】
Ａ）ダスト散布可能な散剤（ＤＰ、ＤＳ）
５重量部のＡＨＡＳ阻害性除草剤を微細に粉砕し、９５重量部の微細に分割したカオリンと密に混合する。これにより、５％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害性除草剤を有するダスト散布可能な製品が得られる。
【０２１３】
Ｂ）顆粒（ＧＲ、ＦＧ、ＧＧ、ＭＧ）
０．５重量部のＡＨＡＳ阻害性除草剤を微細に粉砕し、９５．５重量部の担体を合わせ、それによって０．５％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害性除草剤を含む製剤が得られる。通常の方法は、押し出し、噴霧乾燥又は流動床である。これにより顆粒を得、希釈せずに葉面使用に適用される。
【０２１４】
従来の種子処理用製剤は、例えば流動可能な濃縮物ＦＳ、溶液ＬＳ、乾燥処理用散剤のＤＳ、スラリー処理のための水分散可能な散剤ＷＳ、水溶性散剤ＳＳ及びエマルジョンＥＳ及びＥＣ並びにゲル製剤ＧＦを含む。これらの製剤は、希釈して、又は希釈しないで種子に適用できる。種子への適用は、播種前に実施するか、又は種子に直接適用するかのどちらかである。
【０２１５】
一実施形態において、ＦＳ製剤を種子処理に使用する。通常、ＦＳ製剤は、１〜８００ｇ／ｌの有効成分、１〜２００ｇ／ｌの界面活性剤、０から２００ｇ／ｌの凍結防止剤、０から４００ｇ／ｌの結合剤、０から２００ｇ／ｌの顔料及び１リットルまでの溶媒、好ましくは水を含むことができる。
【０２１６】
種子処理に関しては、本発明のイベント１２７大豆植物の種子を除草剤、アミドスルフロン、アジムスルフロン、ベンスルフロン、クロリムロン、クロロスルフロン、シノスルフロン、シクロスルファムロン、エタメツルフロン、エトキシスルフロン、フラザスルフロン、フルピルスルフロン、ホラムスルフロン、ハロスルフロン、イマゾスルフロン、ヨードスルフロン、メソスルフロン、メトスルフロン、ニコスルフロン、オキサスルフロン、ピリミスルフロン、プロスルフロン、ピラゾスルフロン、リムスルフロン、スルホメツロン、スルホスルフロン、チフェンスルフロン、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリフルオキシスルフロン、トリフルスルフロン、トリトスルフロン、イマザメタベンズ、イマザモックス、イマザピック、イマザピル、イマザキン、イマゼタピル、クロランスラム、ジクロスラム、フロラスラム、フルメツラム、メトスラム、ペノキススラム、ビスピリバック、ピリミノバック、プロポキシカルバゾン、フルカルバゾン、ピリベンゾキシム、ピリフタリド、ピリチオバック及びそれらの混合物などのＡＨＡＳ阻害性除草剤からなる群から選択される除草剤、又はＡＨＡＳ阻害性除草剤を含む製剤を用いて処理する。
【０２１７】
種子処理という用語は、当分野において公知の適切な種子処理技術、例えば、種子粉衣、種子のコーティング、種子へのダスト散布、種子の浸漬及び種子のペレット化を含む。
【０２１８】
本発明の一変形に従って、本発明のさらなる主題は、組成物／製剤としてＡＨＡＳ阻害性除草剤を含有するいずれかの顆粒製剤（例えば、場合により１種又は複数種の個体又は液体、農業的に許容可能な担体を含み、及び／又は場合により１種又は複数種の農業的に許容可能な界面活性剤を含む顆粒製剤）の、特に種子を播く畝への適用による土壌の処理方法である。この方法は、例えば穀物、トウモロコシ、綿及びヒマワリの苗床に有利に用いられる。
【０２１９】
本発明は、アミドスルフロン、アジムスルフロン、ベンスルフロン、クロリムロン、クロロスルフロン、シノスルフロン、シクロスルファムロン、エタメツルフロン、エトキシスルフロン、フラザスルフロン、フルピルスルフロン、ホラムスルフロン、ハロスルフロン、イマゾスルフロン、ヨードスルフロン、メソスルフロン、メトスルフロン、ニコスルフロン、オキサスルフロン、ピリミスルフロン、プロスルフロン、ピラゾスルフロン、リムスルフロン、スルホメツロン、スルホスルフロン、チフェンスルフロン、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリフルオキシスルフロン、トリフルスルフロン、トリトスルフロン、イマザメタベンズ、イマザモックス、イマザピック、イマザピル、イマザキン、イマゼタピル、クロランスラム、ジクロスラム、フロラスラム、フルメツラム、メトスラム、ペノキススラム、ビスピリバック、ピリミノバック、プロポキシカルバゾン、フルカルバゾン、ピリベンゾキシム、ピリフタリド及びピリチオバックからなる群から選択される少なくとも１種のＡＨＡＳ阻害性除草剤を含む種子処理用製剤を用いてコーティングされた種子、又はそれらを含有する種子をさらに含む。
【０２２０】
「種子」という用語は、限定するものではないが、真の種子、種子の一部、吸枝、球茎、球根、果実、塊茎、挿し木、摘梢などを含む、すべての種類の種子及び植物のむかごを包含する。好ましい実施形態において、真の種子を用いる。「真の種子」は、種皮又は外種皮内に封入された、胚を含有する熟した植物の胚珠並びに例えば穀果又はそう果として果皮又は殻中に封入されたこれらを含有できる種子様生殖構造を指す。
【０２２１】
「によりコーティングされた及び／又は含有する」という用語は、一般的に、適用方法に依存して原料は多かれ少なかれ増殖産物に浸透するが、有効成分は、適用時に増殖産物の表面の大部分に存在することを意味する。前記増殖産物が（再度）植え付けられた時、前記増殖産物は有効成分を吸収できる。
【０２２２】
ＡＨＡＳ阻害性除草剤又はＡＨＡＳ阻害性除草剤を含む製剤による種子処理適用を、植物の播種前、及び植物の発生前に種子に噴霧又はダスト散布することによって実施する。
【０２２３】
種子の処理において、有効量のＡＨＡＳ阻害性除草剤又はＡＨＡＳ阻害性除草剤を含む製剤を用いて種子を処理することによって、対応する製剤を適用する。本明細書において、適用率は一般的に、０．１ｇから１０ｋｇ／種子１００ｋｇ、好ましくは１ｇから５ｋｇ／種子１００ｋｇ、特に１ｇから２．５ｋｇ／種子１００ｋｇのａ．ｉ．（又はａ．ｉ．の混合物若しくは製剤）である。レタスなどの特定の作物に関しては、この比率はより高くなり得る。
【０２２４】
イベント１２７大豆植物に適用された任意の除草剤製剤は、「タンク混合」組成物として調製できる。このような実施形態において、個々の原料又は原料の組合せは、相互に分離して保存できる。その後原料は、適用前に相互に混合できる。通常、このような混合は適用直前に行われる。タンク混合過程において、混合前、個々の原料は水又は適切な有機溶媒中に存在する。このような製剤の調製方法及びガイダンスは当分野において公知である。
【０２２５】
本方法は、さらにイベント１２７大豆植物に使用する除草剤の組合せの開発を可能にする。このような方法において、耕作地域の環境条件が評価される。評価され得る環境条件は、限定するものではないが、土地及び表面の水質汚染の懸念、作物の使用目的、作物の耐性、残積土、耕作地域に存在する雑草、土質、土壌のｐＨ、土壌中の有機質の量、適用機器、及び耕作の実践を含む。環境条件の評価において、有効量の除草剤の組合せを作物、作物部位、作物の種子又は耕作地域に適用できる。
【０２２６】
いくつかの実施形態において、イベント１２７大豆植物に適用された除草剤は、感受性の雑草若しくは望ましくない植物の成長の開始を防止するために機能し、及び／又は対象地域において成長している雑草若しくは望ましくない植物に損傷を与えるために機能する。いくつかの実施形態において、除草剤又は除草剤混合物は、対象地域（すなわち、田畑又は耕作地域）にその後に植え付けられた作物に影響を与える雑草又は望ましくない植物に、これらの効果を発揮する。この方法において、除草剤の組合せの適用は、必ずしも同時には起こらない。作物を植え付けられた田畑が、検出可能な量の第１の除草剤を含有し、耕作地域に作物が存在する期間のある時点において第２の除草剤を適用するならば、作物は本発明に従った混合物を用いて処理されていると見なされる。したがって、提供する方法は、「発芽前」、「発芽後」、「植え付け前の組み込み」である除草剤の適用、及び／又は植え付け前の種子処理を含む除草剤の適用を包含する。
【０２２７】
さらに、イベント１２７大豆植物の種子のコーティング方法を提供する。本方法は、有効量の除草剤又は（本明細書の別の箇所で開示した）除草剤の組合せを用いて種子をコーティングするステップを含む。その後、種子を耕作地域に植え付けることができる。有効量の除草剤又は（本明細書の別の箇所で開示した）除草剤の組合せを含むコーティングを有するイベント１２７植物の種子をさらに提供する。
【０２２８】
「発芽前」は、植物が目に見えるように土から現れる前、及び／又は種子の発芽前に対象地域（例えば、田畑又は耕作地域）に適用される除草剤を指す。「発芽後」は、植物が土から目に見えるように現れた後に地域に適用される除草剤を指す。いくつかの事例において、「発芽前」及び「発芽後」という用語は、対象地域中の雑草又は望ましくない植物に関して使用され、いくつかの事例において、これらの用語は対象地域中の作物に関して使用される。雑草又は望ましくない植物に関して使用される場合、これらの用語は、特定の型の雑草、対象地域に存在する、又は対象地域に存在すると考えられている雑草又は望ましくない植物の種だけに当てはめることができる。任意の除草剤が、発芽前及び／又は発芽後の処理に使用できるが、いくつかの除草剤は、発芽前、又は発芽後のどちらかに適用した時に、雑草（単数又は複数）又は望ましくない植物の防除においてより有効であることが公知である。例えば、リムスルフロンは、発芽前及び発芽後の両方の活性を有するが、他の除草剤は発芽前（メトラクロル）又は発芽後（グリホセート）の活性が優勢である。特定の除草剤のこれらの特性は当分野において公知であり、当業者によって容易に決定される。さらに、当業者は、適切な除草剤並びに本発明のトランスジェニック植物及び／又は本発明のトランスジェニック植物を植え付ける地域に使用する適用時期を容易に選択できるであろう。「植え付け前の組み込み」は、植え付け前の土壌に化合物を組み込むことを含む。
【０２２９】
したがって、例えば、雑草若しくは望ましくない植物をよりよく防除するために、対象作物の植え付け前に地域を１種又は複数種の除草剤で処理する「植え付け前の焼き払い」などの、作物を成長させる、及び／又は雑草若しくは望ましくない植物を防除するための改善された方法を提供する。さらに、「不耕起」又は「低耕起」（「耕起減少」とも称される）である、作物を成長させる、及び／又は雑草若しくは望ましくない植物を防除する方法を提供する。このような方法において、伝統的な方法と比較して土壌は耕作されない、又は成長周期の間頻繁には耕作されず、これらの方法は、そうしなければ人件費及び燃料費を含むさらなる耕作により被るであろうコストを節減できる。
【０２３０】
本方法は、多数のクラスの除草剤の同時適用及び／又は連続適用の使用を包含する。いくつかの実施形態において、本方法は、本発明の植物及び／又は対象地域（例えば、田畑又は耕作地域）及び／又は雑草及び／又は望ましくない植物を、唯一の除草剤又は他の化学物質、例えばイミダゾリノン系除草剤を用いて処理するステップを含む。
【０２３１】
除草剤を対象地域（及びその中の任意の植物）に適用する時期は、雑草又は望ましくない植物の防除を最適にするために重要であり得る。除草剤の適用時期は、植物のサイズ及び／又は成長段階及び／又は対象地域における植物、例えば、地域において成長する作物植物又は雑草若しくは望ましくない植物の発達を参照して決定できる。成長段階及び／又は植物の発達は当分野において公知である。例えば、大豆植物は、ＶＥ（発芽）、Ｖｃ（単小葉）、Ｖ１（第１の三つ葉）及びＶ２からＶＮとして公知の栄養成長段階を介して通常発達する。その後、大豆は、光周期の指示に反応して生殖成長期に転換し、生殖段階は、Ｒ１（開花開始）、Ｒ２（完全に開花）、Ｒ３（鞘ができ始める）、Ｒ４（完全に鞘ができる）、Ｒ５（結実開始）、Ｒ６（完全に結実）、Ｒ７（成熟開始）及びＲ８（完全に成熟）を含む。したがって、例えば、除草剤又は他の化学物質を、植物が成長している対象地域に適用する時期は、特定の地域における一部の、又はすべての植物が少なくとも特定のサイズ及び／又は成長段階及び／又は発達に達している時期であっても、又は特定の地域における一部の、又はすべての植物が、特定のサイズ及び／又は成長段階及び／又は発達にいまだ達していない時期であってもよい。
【０２３２】
いくつかの実施形態において、イベント１２７大豆植物は、発芽後の除草剤処理に対する耐性の改善を示す。例えば、イベント１２７植物は、高用量の除草剤に対して耐性であり得、広範囲の除草剤に対して耐性であり得（すなわち、複数のＡＨＡＳ阻害剤化学物質に対する耐性）、及び／又は適切な対照植物との比較において、発達の初期又は後期に適用された除草剤の用量に対して耐性であり得る。
【０２３３】
除草剤などの異なる化学物質は、異なる「残存」効果を有する、すなわち、化学物質又は除草剤により処理が、処理された地域において成長する植物に対して効果を有する時間が異なる。このような効果は、処理された地域（例えば、田畑又は耕作地）の所望の将来の目的に依存して、望ましくも、又は望ましくなくもあり得る。したがって、作物のローテーションスキームは、個々の作物に使用されるであろう処理による残存効果及び同じ地域においてその後成長するであろう作物に対するそれらの効果に基づいて選択され得る。当業者は除草剤の残存効果を評価するために使用できる技術をよく知っており、例えば、ＡＨＡＳに作用し阻害する除草剤は、それらの残存活性レベルが変動する。さまざまな除草剤の残存活性は当分野において公知であり、例えば、土壌中の水分レベル、温度、ｐＨ及び土壌の組成（質及び／又は有機物質）などのさまざまな環境因子により変動することもまた公知である。除草剤の残存活性に対する耐性の改善が有益である場合、イベント１２７大豆植物は、作物を成長させる方法における特定の使用が見出される。
【０２３４】
さらに、本発明の大豆イベント１２７植物は、除草剤処理と組み合わせて作物に使用するさらなる化学物質、例えば、毒性緩和剤、スルホン酸アンモニウムなどのアジュバント及び作物油濃縮物などによる処理に対する耐性の改善を提供する。
【０２３５】
さらに、開示された方法は、ＡＨＡＳ阻害性除草剤又は除草剤の混合物並びに１種又は複数種の殺虫剤、防かび剤、殺線虫剤、抗菌剤、殺ダニ剤、成長調節因子、不妊化剤、情報化学物質、忌避剤、誘引剤、フェロモン、摂食刺激物質若しくは他の生物学的活性化合物又は昆虫病原性の細菌、ウィルス又は真菌の使用を含み、さらにより広域性の農業保護をもたらす多成分混合物を形成する。方法に使用できるこのような農業保護剤の例は、：殺虫剤、例えば、アバメクチン、アセフェート、アセタミプリド、アミドフルメト（Ｓ−１９５５）、アベルメクチン、アザジラクチン、アジホス−メチル、ビフェントリン、ビフェナゼート、ブプロフェジン、カルボフラン、カルタップ、クロルフェナピル、クロルフルアズロン、クロルピリホス、クロルピリホス−メチル、クロマフェノジド、クロチアニジン、シフルメトフェン、シフルトリン、ベータ−シフルトリン、シハロトリン、ラムダ−シハロトリン、シペルメトリン、シロマジン、デルタメトリン、ジアフェンチウロン、ダイアジノン、ディルドリン、ジフルベンズロン、ジメフルトリン、ジメトエート、ジノテフラン、ジオフェノラン、エマメクチン、エンドスルファン、エスフェンバレレート、エチプロール、フェノチオカルブ、フェノキシカルブ、フェンプロパトリン、フェンバレレート、フィピロニル、フロニカミド、フルベンジアミド、フルシトリネート、タウ−フルバリネート、フルフェネリム（ＵＲ−５０７０１）、フルフェノクスロン、ホノホス、ハロフェノジド、ヘキサフルムロン、ヒドラメチルノン、イミダクロプリド、インドキサカルブ、イソフェンホス、ルフェヌロン、マラチオン、メタフルミゾン、メタアルデヒド、メタミドホス、メチダチオン、メトミル、メトプレン、メトキシクロール、メトフルトリン、モノクロトホス、メトキシフェノジド、ニテンピラム、ニチアジン、ノバルロン、ノビフルムロン（ＸＤＥ−００７）、オキサミル、パラチオン、パラチオン−メチル、ペルメトリン、ホレート、ホサロン、ホスメト、ホスファミドン、ピリミカーブ、プロフェノホス、プロフルトリン、ピメトロジン、ピラフルプロール、ピレトリン、ピリダリル、ピリプロール、ピリプロキシフェン、ロテノン、リアノジン、スピノサド、スピロジクロフェン、スピロメシフェン（ＢＳＮ２０６０）、スピロテトラマト、スルプロホス、テブフェノジド、テフルベンズロン、テフルトリン、テルブホス、テトラクロルビンホス、チアクロプリド、チアメトキサム、チオジカルブ、チオスルタップ−ナトリウム、トラロメトリン、トリアザメート、トリクロルホン及びトリフルムロン；防かび剤、例えば、アシベンゾラル、アルジモルフ、アミスルブロム、アザコナゾール、アゾキシストロビン、ベナラキシル、ベノミル、ベンチアバリカルブ、ベンチアバリカルブ−イソプロピル、バイノミアル（ｂｉｎｏｍｉａｌ）、ビフェニル、ビテルタノール、ブラストサイジン−Ｓ、ボルドー液（三塩基性硫酸銅）、ボスカリド／ニコビフェン、ブロムコナゾール、ブピリメート、ブチオベート、カルボキシン、カルプロパミド、カプタホール，キャプタン、カルベンダジム、クロロネブ、クロロタロニル、クロゾリネート、クロトリマゾール、オキシ塩化銅、硫酸銅及び水酸化銅などの銅塩、シアゾファミド、シフルナミド、シモキサニル、シプロコナゾール、シプロジニル、ジクロフルアニド、ジクロシメット、ジクロメジン、ジクロラン、ジエトフェンカルブ、ジフェノコナゾール、ジメトモルフ、ジモキシストロビン、ジニコナゾール、ジニコナゾール−Ｍ、ジノカップ、ジスコストロビン、ジチアノン、ドデモルフ、ドジン、エコナゾール、エタコナゾール、エジフェンホス、エポキシコナゾール、エタボキサム、エチリモール、エトリジアゾール、ファモキサドン、フェンアミドン、フェナリモル、フェンブコナゾール、フェンカラミド、フェンフラム、フェンヘキサミド、フェノキサニル、フェンピクロニル、フェンプロピジン、フェンプロピモルフ、酢酸トリフェニルスズ、トリフェニルスズヒドロキシド、フェルバム、フェルフラゾエート、フェリムゾン、フルアジナム、フルジオキソニル、フルメトベル、フルオピコリド、フルオキサストロビン、フルキンコナゾール、フルキンコナゾール、フルシラゾール、フルスルファミド、フルトラニル、フルトリアフォル、フォルペット、ホセチルアルミニウム、フベリダゾール、フララキシル、フラメタピル、ヘキサコナゾール、ヒメキサゾール、グアザチン、イマザリル、イミベンコナゾール、イミノクタジン、イオジカルブ（ｉｏｄｉｃａｒｂ）、イプコナゾール、イプロベンホス、イプロジオン、イプロバリカルブ、イソコナゾール、イソプロチオラン、ガスガマイシン、クレソキシム−メチル、マンコゼブ、マンジプロパミド、マンネブ、マパニピリン（ｍａｐａｎｉｐｙｒｉｎ）、メフェノキサム、メプロニル、メタラキシル、メトコナゾール、メタスルホカルブ、メチラム、メトミノストロビン／フェノミノストロビン、メパニピリム、メトラフェノン、ミコナゾール、ミクロブタニル、ネオ−アソジン（メタンアルソン酸第二鉄）、ヌアリモル、オクチリノン、オフレース、オリサストロビン、オキサジキシル、オキソリン酸、オキスポコナゾール、オキシカルボキシン、パクロブトラゾール、ペンコナゾール、ペンシクロン、ペンチオピラド、ペルフラゾエート、ホスホン酸、フタリド、ピコベンザミド、ピコキシストロビン、ポリオキシン、プロベナゾール、プロクロラズ、プロシミドン、プロパモカルブ、塩酸プロパモカルブ、プロピコナゾール、プロピネブ、プロキナジド、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、ピラゾホス、ピリフェノックス、ピリメタニル、ピリフェノックス、ピロルニトリン、ピロキロン、キンコナゾール、キノキシフェン、キントゼン、シルチオファム、シメコナゾール、スピロキサミン、ストレプトマイシン、硫黄、テブコナゾール、テクラゼン、テクロフタラム、テクナゼン、テトラコナゾール、チアベンダゾール、チフルザミド、チオファナート、チオファナート−メチル、チラム、チアジニル、トルクロホス−メチル、トリフルアニド、トリアジメホン、トリアジメノール、トリアリモール、トリアゾキシド、トリデモルフ、トリモルファミドトリシクラゾール、トリフロキシストロビン、トリホリン、トリチコナゾール、ウニコナゾール、バリダマイシン、ビンクロゾリン、ジネブ、ジラム，及びゾキサミド；殺線虫剤、例えば、アルディカルブ、オキサミル及びフェナミホス；抗菌剤、例えば、ストレプトマイシン；殺ダニ剤、例えば、アミトラズ、キノメチオネート、クロロベンジレート、シヘキサチン、ジコホール、ジエノクロル、エトキサゾール、フェナザキン、酸化フェンブタスズ、フェンプロパトリン、フェンピロキシメート、ヘキシチアゾクス、プロパルギット、ピリダベン及びテブフェンピラド；並びに昆虫病原性の細菌、例えば、バチルス・チューリンゲンシス亜種アイザワイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ａｉｚａｗａｉ）、バチルス・チューリンゲンシス亜種クルスターキ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｋｕｒｓｔａｋｉ）及びバチルス・チューリンゲンシスのカプセル化されたデルタ−エンドトキシン（例えば、Ｃｅｌｌｃａｐ、ＭＰＶ、ＭＰＶＩＩ）；昆虫病原性の真菌、例えば、黒きょう病真菌（ｇｒｅｅｎ  ｍｕｓｃａｒｄｉｎｅ  ｆｕｎｇｕｓ）；及びバキュロウィルス、ＨｚＮＰＶ、ＡｆＮＰＶなどのヌクレオポリヘドロウィルス（ＮＰＶ）を含む昆虫病原性のウィルス及びＣｐＧＶなどの顆粒病ウィルス（ＧＶ）を含む生物学的作用因子を含む。本方法に使用されるこれらのさまざまな混合相手と、他の組成物（例えば、除草剤）との重量比は、通常、１００：１及び１：１００の間、又は３０：１及び１：３０の間、１０：１及び１：１０の間又は４：１及び１：４の間である。
【０２３６】
生物学的有効量の対象のＡＨＡＳ阻害性除草剤又は除草剤の混合物及び有効量の少なくとも１種のさらなる生物学的活性化合物又は薬品を含む組成物をさらに提供し、さらに少なくとも１種の界面活性剤、固体希釈剤又は液体希釈剤をさらに含むことができる。このような生物学的活性化合物又は薬品の例は、：殺虫剤、例えば、アバメクチン、アセフェート、アセタミプリド、アミドフルメト（Ｓ−１９５５）、アベルメクチン、アザジラクチン、アジホス−メチル、ビフェントリン、ビフェナゼート、ブプロフェジン、カルボフラン、クロルフェナピル、クロルフルアズロン、クロルピリホス、クロルピリホス−メチル、クロマフェノジド、クロチアニジン、シフルトリン，ベータ−シフルトリン、シハロトリン、ラムダ−シハロトリン、シペルメトリン、シロマジン、デルタメトリン、ジアフェンチウロン、ダイアジノン、ジフルベンズロン、ジメトエート、ジオフェノラン、エマメクチン、エンドスルファン、エスフェンバレレート、エチプロール、フェノチカルブ、フェノキシカルブ、フェンプロパトリン、フェンバレレート、フィピロニル、フロニカミド、フルシトリネート、タウ−フルバリネート、フルフェネリム（ＵＲ−５０７０１）、フルフェノクスロン、ホノホス、ハロフェノジド、ヘキサフルムロン、イミダクロプリド、インドキサカルブ、イソフェンホス、ルフェヌロン、マラチオン、メタアルデヒド、メタミドホス、メチダチオン、メトミル、メトプレン、メトキシクロール、モノクロトホス、メトキシフェノジド、ニチアジン、ノバルロン、ノビフルムロン（ＸＤＥ−００７）、オキサミル、パラチオン、パラチオン−メチル、ペルメトリン、ホレート、ホサロン、ホスメト、ホスファミドン、ピリミカーブ、プロフェノホス、ピメトロジン、ピリダリル、ピリプロキシフェン、ロテノン、スピノサド、スピロメシフェン（ＢＳＮ２０６０）、スルプロホス、テブフェノジド、テフルベンズロン、テフルトリン、テルブホス、テトラクロルビンホス、チアクロプリド、チアメトキサム、チオジカルブ、チオスルタップ−ナトリウム、トラロメトリン、トリクロルホン及びトリフルムロン；防かび剤、例えば、アシベンゾラル、アゾキシストロビン、ベノミル、ブラストサイジン−Ｓ、ボルドー液（三塩基性硫酸銅）、ブロムコナゾール、カルプロパミド、カプタホール、キャプタン、カルベンダジム、クロロネブ、クロロタロニル、オキシ塩化銅、銅塩、シフルフェナミド、シモキサニル、シプロコナゾール、シプロジニル、（Ｓ）−３，５−ジクロロ−Ｎ−（３−クロロ−１−エチル−１−メチル−２−オキソプロピル）−４−メチルベンザミド（ＲＨ７２８１）、ジクロシメット（Ｓ−２９００）、ジクロメジン、ジクロラン、ジフェノコナゾール、（Ｓ）−３，５−ジヒドロ−５−メチル−２−（メチルチオ）−５−フェニル−３−（フェニル−アミノ）−４Ｈ−イミド−アゾール−４−オン（ＲＰ４０７２１３）、ジメトモルフ、ジモキシストロビン、ジニコナゾール、ジニコナゾール−Ｍ、ドジン、エジフェンホス、エポキシコナゾール、ファモキサドン、フェンアミドン、フェナリモル、フェンブコナゾール、フェンカラミド（ＳＺＸ０７２２）、フェンピクロニル、フェンプロピジン、フェンプロピモルフ、酢酸トリフェニルスズ、トリフェニルスズヒドロキシド、フルアジナム、フルジオキソニル、フルメトベル（ＲＰＡ４０３３９７）、フルモルフ／フルモリン（ｆｌｕｍｏｒｆ／ｆｌｕｍｏｒｌｉｎ）（ＳＹＰ−Ｌ１９０）、フルオキサストロビン（ＨＥＣ５７２５）、フルキンコナゾール、フルシラゾール、フルトラニル、フルトリアフォル、フォルペット、ホセチルアルミニウム、フララキシル、フラメタピル（Ｓ−８２６５８）、ヘキサコナゾール、イプコナゾール、イプロベンホス、イプロジオン、イソプロチオラン、カスガマイシン、クレソキシム−メチル、マンコゼブ、マンネブ、メフェノキサム、メプロニル、メタラキシル、メトコナゾール、メトミノストロビン／フェノミノストロビン（ＳＳＦ−１２６）、メトラフェノン（ＡＣ３７５８３９）、ミクロブタニル、ネオ−アソジン（メタンアルソン酸第二鉄）、ニコビフェン（ＢＡＳ５１０）、オリサストロビン、オキサジキシル、ペンコナゾール、ペンシクロン、プロベナゾール、プロクロラズ、プロパモカルブ、プロピコナゾール、プロキナジド（ＤＰＸ−ＫＱ９２６）、プロチオコナゾール（ＪＡＵ６４７６）、ピリフェノックス、ピラクロストロビン、ピリメタニル、ピロキロン、キノキシフェン、スピロキサミン、硫黄、テブコナゾール、テトラコナゾール、チアベンダゾール、チフルザミド、チオファナート−メチル、チラム、チアジニル、トリアジメホン、トリアジメノール、トリシクラゾール、トリフロキシストロビン、トリチコナゾール、バリダマイシン及びビンクロゾリン；殺線虫剤、例えば、アルディカルブ、オキサミル及びフェナミホス；抗菌剤、例えば、ストレプトマイシン；殺ダニ剤、例えば、アミトラズ、キノメチオネート、クロロベンジレート、シヘキサチン、ジコホール、ジエノクロル、エトキサゾール、フェナザキン、酸化フェンブタスズ、フェンプロパトリン、フェンピロキシメート、ヘキシチアゾクス、プロパルギット、ピリダベン及びテブフェンピラド；  並びに昆虫病原性の細菌、例えば、バチルス・チューリンゲンシス亜種アイザワイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ａｉｚａｗａｉ）、バチルス・チューリンゲンシス亜種クルスターキ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｋｕｒｓｔａｋｉ）及びバチルス・チューリンゲンシスのカプセル化されたデルタ−エンドトキシン（例えば、Ｃｅｌｌｃａｐ、ＭＰＶ、ＭＰＶＩＩ）；昆虫病原性の真菌、例えば、黒きょう病真菌（ｇｒｅｅｎ  ｍｕｓｃａｒｄｉｎｅ  ｆｕｎｇｕｓ）；及びバキュロウィルス、ＨｚＮＰＶ、ＡｆＮＰＶなどのヌクレオポリヘドロウィルス（ＮＰＶ）を含む昆虫病原性のウィルス及びＣｐＧＶなどの顆粒病ウィルス（ＧＶ）を含む生物学的作用因子を含む。本方法は、遺伝的に形質転換され無脊椎動物有害生物に対する毒性タンパクを発現する（バチルス・チューリンゲンシスのデルタエンドトキシンなど）植物の使用をさらに含み得る。このような実施形態において、外来的に適用された無脊椎動物有害生物の防除化合物の効果は、発現された毒性タンパク質との相乗作用であり得る。
【０２３７】
したがって、本方法は、ＡＨＡＳ阻害性除草剤又はＡＨＡＳ阻害性除草剤の組合せを用いることができ、殺虫剤及び／又は防かび剤及び／又は肥料などの他の農業用化学物質の使用をさらに含むことができる。このような併用処理の使用はさらなる雑草種に対する活性範囲を拡大でき、任意の抵抗性生物型の増殖を抑制できる。
【０２３８】
実施形態を以下の実施例においてさらに定義する。これらの実施例は、例示目的のみで示されることを理解すべきである。上記の考察及びこれらの実施例から当業者は本質的な特徴を確認し、それらの精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の実施形態のさまざまな変形及び改良を作製し、それをさまざまな用法及び条件に適合させることができる。したがって、本明細書に示し、記載したものに加えて、前述の記載から本発明の実施形態のさまざまな改良が当業者には明らかであろう。このような改良もまた、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【実施例】
【０２３９】
（例１）：トランスジェニック植物の調製
トランスジェニック大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ  Ｌ．）植物を、イミダゾリノン系除草剤に抵抗性をもたらす突然変異アセトヒドロキシ酸シンターゼ大サブユニット（ＡＨＡＳＬ）コーディング配列を含有する、プラスミドｐＡＣ３２１由来のＤＮＡの線状化断片（ＰｖｕＩＩ）を使用して開発した。ｐＡＣ３２１プラスミドは、６５３位に対応する位置に、天然のセリンではなくアスパラギンを有する、突然変異シロイヌナズナＡＨＡＳＬ遺伝子（ｃｓｒ１−２）（Ｓ６５３Ｎ）コーディング配列を含有する。ＡＨＡＳ（Ｓ６５３Ｎ）コーディング配列は、天然のシロイヌナズナＡＨＡＳプロモーター配列及び転写終止配列の調節下にある。例えば、米国特許公開第２００５／００３４１８７号を参照されたく、この全体は参照により本明細書に組み込まれる。ＰｖｕＩＩ断片は、シロイヌナズナＡＨＡＳＬプロモーター、除草剤耐性シロイヌナズナＡＨＡＳＬｌ（ｃｓｒ１−２）コーディング配列及びシロイヌナズナＡＨＡＳＬターミネーターを含む。このプロモーター、コーディング配列及びターミネーターのカセットは、本明細書においてｃｓｒ１−２カセットと称される。
【０２４０】
市販品種「Ｃｏｎｑｕｉｓｔａ」の単一大豆種子の頂端分裂組織由来の胚発生軸組織を、微粒子銃形質転換のために使用した。微粒子銃形質転換（微粒子銃又は粒子照射）（Ａｒａｇａｏ、Ｆ．Ｊ．Ｌ．ら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９９６年；９３巻：１４２〜１５０頁）を使用して、ｃｓｒ１−２遺伝子を含有する大豆形質転換イベントを作製した。照射の前に、ｃｓｒ１−２電子断片を含有するＤＮＡを顕微鏡レベルの金粒子上に沈殿させた。次いで、沈殿させたＤＮＡ及び粒子をプラスチックマクロキャリア（ｍａｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）に配置し、ストッピングスクリーン（ｓｔｏｐｐｉｎｇ  ｓｃｒｅｅｎ）がマクロキャリアを保持するように高速で加速した。ＤＮＡを有する粒子を、それらのｆｌｉｇｈｔの継続、最終貫通及び大豆植物細胞への組み込みを可能にした。照射された細胞を、５０ｇ  ａｉ／ｈａ相当のイミダゾリノン系除草剤であるイマザピルを含有する選択培地に移し、ｃｓｒ１−２遺伝子を形質転換された照射細胞のみを成長させ続けた。この過程により、耐性Ｔ０植物を特定し、大豆イベント１２７と名付けた（表１）。
【０２４１】
（例２）系統発達
以下の表１に示すように、大豆イベント１２７の初代形質転換体を、によりＴ４世代まで維持した。
【表２】
0005988585.tif 000004
【０２４２】
９種のＴ３植物（Ｅ０１、Ｅ０２、Ｅ０３、Ｅ０４、Ｅ０５、Ｅ０６、Ｅ０７、Ｅ０９及びＥ１０）由来の種子の遺伝子解析により、トランス遺伝子分離は、必ずしも単純なメンデルのパターンに従ってはおらず、複数の活性遺伝子座があることが示唆された。正常な表現型を有する、イマザピルに対する耐性に関してメンデルの分離を示すＴ３植物由来のＴ４子孫（Ｅ０９、Ｅ１０及びＥ０５）を、非トランスジェニック品種（ＢＲＳ１３７、Ｃｏｎｑｕｉｓｔａ及びＢＲ９７−７０６６）と交雑させ、４種の集団を発生させた（表２、図２）。
【表３】
0005988585.tif 000005
【０２４３】
Ｆ２及びＦ３世代において、温室において正常な表現型及びイマザピルに対する耐性を有するファミリー及び個別の植物を選択した。トランスジェニックＣｏｎｑｕｉｓｔａ（Ｔ４−Ｅ１０）×非トランスジェニックＣｏｎｑｕｉｓｔａの間の交雑のＦ２集団において、イマザピル（１００ｇ  ａｉ／ｈａ）に対する耐性についての分離パターン（耐性３８：非耐性１３）は、イベント１２７を含有するトランスジェニック系Ｖ０３−６０３（ＣＶ−６０３）中の単一優勢遺伝子がイマザピルに対する耐性を調節することを示した。
【０２４４】
４種の交雑（表２）それぞれに由来するＦ４及び／又はＦ５系を使用した引き続く野外試験により、その後の分析及び開発のための優良大豆系としてのイベント１２７を含有するＶ０３−６０３系の選択が支持された。野外試験に、３種の複製を用いるランダムな完全ブロック計画及び分割処理実験を使用して、４つの位置に植え付けた。エントリーは全試験区であり、イマザピル適用率（０、７０、２４０又は２８０ｇ  ａｉ／ｈａ）がサブ試験区であった。植物に、植え付け後１８〜２１日に噴霧、適用後１４日に評価した。植物を、損傷パーセントで評価した（０＝試験区において死亡した植物なしから１００＝試験区において全植物が死亡）。収集したさらなるデータは、植物の丈、種子の収率、種子のサイズ、開花までの日数及び成熟までの日数を含んだ。
【表４】
0005988585.tif 000006
【表５】
0005988585.tif 000007
【表６】
0005988585.tif 000008
【０２４５】
（例３）：分子の特徴付け
Ａ：ＤＮＡ及びＲＮＡの単離及び定量の方法
ＤＮＡを、改変臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）法（Ｃａｒｌｓｏｎら、１９９１年）を介して大豆の葉組織から単離した。シリカゲル乾燥させた葉の組織を液体窒素で凍結し、Ａｕｔｏｇｒｉｎｄｅｒ（Ａｕｔｏｇｅｎ；Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）により粉砕した。粉砕した組織を予備加熱した、２％（ｗ／ｖ）のＣＴＡＢ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１．４ＭのＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、２０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ９．５（５ｍｌ／６０ｍｇ乾燥葉組織）及びβ−メルカプトエタノール（１０μｌ／ｍｌ緩衝液）からなる抽出緩衝液とともに、７４℃において２０分間インキュベートした。２４４０×ｇにおいて１０分間の遠心分離後、上清を、等量のクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で２回抽出した。ＤＮＡを、０．７容量のイソプロパノールで沈殿させ、０．５ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を、最終濃度約５００ｎｇ／μｌになるように加えたＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解した。単離ＤＮＡを、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、仔ウシ胸腺ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＤＮＡ基準として使用して、Ｐａｃｋａｒｄ  ＦｌｕｏｒｏＣｏｕｎｔ（商標）ＢＦ１００００  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）において蛍光光度計ユーザーマニュアルに従って定量した。
【０２４６】
全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて、イベント１２７のＦ７及びＦ８世代植物に由来するシリカゲル乾燥した若い葉から、及び非トランスジェニック親大豆品種Ｃｏｎｑｕｉｓｔａの葉から抽出した。約２５ｍｇのシリカゲル乾燥した葉の組織を液体窒素で凍結し、Ａｕｔｏｇｒｉｎｄｅｒを用いて粉砕した。全ＲＮＡ単離手順を、製造業者の指示書に従って実施した。カラムにおけるＤＮａｓｅ消化を、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて実施し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔのユーザーマニュアルにおける推奨に従った全ＲＮＡ調製品からの任意の大豆ゲノムＤＮＡを除去した。単離ＲＮＡを、ＢｉｏＭａｔｅ（商標）３分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して２６０ｎｍにおいて吸光度を測定することによって定量した。
【０２４７】
Ｂ：プローブの単離及び標識方法
トランス遺伝子プローブとして使用するＤＮＡ断片の位置を、図１Ｂに示す。ベクター骨格プローブを、図５Ｃ示す。特定されたトランス遺伝子及びベクタープローブの作製に使用するためのＰＣＲプライマーを、以下の表３に提供する。これら５種の重複プローブは全プラスミドに及ぶ。具体的には、プローブ１はＡＨＡＳＬプロモーター領域に及び、プローブ２はｃｓｒ１−２コーディング配列、プローブ３はＡＨＡＳＬ終止領域並びにプローブ４及び５は、一緒に完全ベクター骨格（ＶＢ）を含む。プローブＤＮＡ断片を、プラスミドｐＡＣ３２１を鋳型として使用してＰＣＲ増幅によって作製した。プローブ（それぞれ２５〜５０ｎｇ）を、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ（標識）ＩＩ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して製造業者の指示書に従って、５０μＣｉの（α−３２Ｐ）−ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ；Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）で放射標識した。標識したプローブを、Ｓｐｉｎ−Ｘ（登録商標）Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ｔｕｂｅ  Ｆｉｌｔｅｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ａｃｔｏｎ、ＭＡ）を用いて精製した。
【表７】
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【０２４８】
Ｃ：コピー数、インサートの完全性及び安定性
サザンブロット分析を使用して、ｃｓｒ１−２発現カセットのコピー数及び完全性を決定し、イベント１２７中のプラスミド骨格の不在を確認した。制限酵素ＮｃｏＩ、ＳｐｅＩ及びＸｂａＩを使用して、イベント１２７植物及び非トランスジェニック対照のＣｏｎｑｕｉｓｔａから得たゲノムＤＮＡを消化した。ｐＡＣ３２１  ＰｖｕＩＩ形質転換断片を、図３において大豆イベント１２７を用いてアライメントした。大豆を形質転換させるために使用したプラスミドｐＡＣ３２１由来のＰｖｕＩＩ断片を図３の上部に示す。大豆イベント１２７中のトランス遺伝子インサートに含有されないこの断片の部分を、対角の縞模様で満たされた四角で示す。大豆イベント１２７中のトランス遺伝子インサート及び隣接ゲノム大豆ＤＮＡの特徴を図の下部に示す。ＰｖｕＩＩ形質転換断片のマップ及びトランス遺伝子挿入領域のマップの間に描かれた垂直の破線の間のＤＮＡは両方のＤＮＡ断片に共通である。サザンブロット分析に関する制限部位を示す。ＰｖｕＩＩ形質転換断片のナンバリングシステムは、図１のｐＡＣ３２１プラスミドマップのナンバリングシステムに対応する。大豆イベント１２７インサートに関するナンバリングシステムは、１番が、大豆ゲノム隣接配列（灰色の四角で示された隣接配列）の５’末端の第１ヌクレオチドである図８のナンバリングシステムに対応する。ｃｓｒ１−２カセット中の単一のＮｃｏＩ制限部位は、ｃｓｒ１−２コーディング配列の５’末端に位置し、ＮｃｏＩを有するイベント１２７のゲノムＤＮＡの消化は、ｃｓｒ１−２カセット由来のＤＮＡを含有する２つの断片を作製することが予測された。両方の断片はｃｓｒ１−２カセット中のＮｃｏＩ部位及び隣接大豆ゲノム配列中の最も近いＮｃｏＩ部位により画定される。５’隣接大豆ゲノム配列中に１つのＳｐｅＩ制限部位及びイベント１２７中のＡＨＡＳＬ３’ＵＴＲの下流に２つのＳｐｅＩ制限部位がある。ＸｂａＩ制限部位は、完全ｃｓｒ１−２発現カセットに隣接する。サザンハイブリダイゼーションにより検出されることが期待されるＤＮＡ断片の数及びサイズを、以下の表７に記載する。
【表８】
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【０２４９】
予測される断片サイズは、イベント１２７植物中のクローニングされたインサート及び隣接配列に基づいて見積もられる。５’ＵＴＲプローブ及び３’ＵＴＲプローブはそれぞれＸｂａＩ部位と重複し、したがって、プラスミドｐＡＣ３２１（図４Ａ及び４Ｃのレーン１１において点で記されている）の両方のＸｂａＩ断片とハイブリダイズする。イベント１２７領域の配列分析により、ｃｓｒ１−２コーディング領域の小型部分は、３’トランス遺伝子統合部位のすぐ上流で重複し、これらのサザンブロットの結果において特定される８００ｂｐのバンドの特定を裏付けることが示された。
【０２５０】
イベント１２７のＦ８世代由来のゲノムＤＮＡ（７μｇ）及び非トランスジェニック対照Ｃｏｎｑｕｉｓｔａ由来のゲノムＤＮＡを、容量４０μｌ中で上記の制限酵素（８ユニット／μｇＤＮＡ）を用いて、酵素の製造業者（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ；又はＡｍｅｒｓｈａｍ）により規定された条件下で一晩消化した。制限消化物を、１０ｃｍの長さの０．８％アガロースゲルにおいて電気泳動によって分離した。ＤＮＡを、０．２５ＮのＨＣｌ中に約２０分間ゲルを浸すことによってさらに断片化し、０．４ＮのＮａＯＨを用いて、約３０分間変性させた。このゲルを、２×ＮａＣｌ／クエン酸ナトリウム溶液（ＳＳＣ）を用いてすすぎ、変性ＤＮＡを、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上に、０．４ＮのＮａＯＨを転写緩衝液として使用して転写した。サザンハイブリダイゼーションを、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）に従って実施した。この膜を、６５℃において２〜４時間予備ハイブリダイズし、６５℃において一晩、２０〜３０ｍｌ（約０．２ｍｌ／ｃｍ２）のハイブリダイゼーション緩衝液（２×ＳＳＣ、０．６％のＳＤＳ、５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、５％の硫酸デキストラン、ｐＨ７．２）中で、Ｈｙｂａｉｄ  ＭＡＸＩ  １４ハイブリダイゼーションオーブン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）においてハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、この膜を、２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ（１ｍｌ／ｃｍ２）を用いて室温において１５分間、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ（４ｍｌ／ｃｍ２）を用いて６５℃において３０分間、及び最終的に０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ（４ｍｌ／ｃｍ２）を用いて６５℃において１５分間洗浄した。洗浄後、この膜をプラスチックラップで包み、放射活性シグナル強度次第では、−８０℃において増感スクリーンを有するカセットにおいて、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（商標）ＭＰフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に２〜５日間曝露した。
【０２５１】
さらにサザンブロット分析を上記のように実施し、多世代にわたってインサートの安定性をモニターした。Ｔ４、Ｆ４、Ｆ８及びＦ９世代から植物材料を得た（図２）。これらの試料由来のゲノムＤＮＡを、ＮｃｏＩ及びＳｐｅＩを用いて（上記のように）消化し、サザンブロット分析を上記のように実施した。
【０２５２】
イベント１２７中のインサートのコピー数を、ＮｃｏＩ、ＳｐｅＩ及びＸｂａＩ制限酵素を用い、上記の方法を使用して消化されたイベント１２７のＦ８世代植物由来のゲノムＤＮＡのサザンブロット分析によって評価した。
【０２５３】
サザンブロット分析の結果を図４Ａ、４Ｂ及び４Ｃに提供する。非トランスジェニック大豆品種のＣｏｎｑｕｉｓｔａのゲノムＤＮＡ（レーン１、５及び９）；ｐＡＣ３２１の１−ゲノムコピー同等物をスパイクしたＣｏｎｑｕｉｓｔａ（レーン２、６及び１０）；又はｐＡＣ３２１の２−ゲノムコピー同等物（レーン３、７及び１１）；並びにＦ８世代由来の大豆イベント１２７のゲノムＤＮＡ（レーン４、８及び１２）を、記載のようにＮｃｏＩ（１−４）、ＳｐｅＩ（５−８）及びＸｂａＩ（９−１２）制限酵素を用いて消化した。ブロットを、プローブ５’ＵＴＲ（図４Ａ）、プローブＡＨＡＳ（図４Ｂ）及びプローブ３’ＵＴＲ（図４Ｃ）とハイブリダイズした。第１及び最後のレーン（標識Ｍ）は、λ／ＨｉｎｄＩＩＩラダーを含有し、バンドサイズはキロベースで示される。図４Ｄは、サザンハイブリダイゼーションプローブとイベント１２７インサートの間の相同領域を示す。図４Ｂ中の矢印は、３’隣接配列ジャンクションにおいてイベント１２７中に存在するｃｓｒ１−２のさらなる３７６ｂｐの断片を含有するおよそ８８５ｂｐのＳｐｅＩ断片を示す。
【０２５４】
３種すべての制限酵素を用いて消化し、３種のプローブとハイブリダイズさせた非トランスジェニックＣｏｎｑｕｉｓｔａのＤＮＡは任意のシグナルを示さず、使用したサザンブロットストリンジェンシー条件において、内因性大豆ＡＨＡＳＬ遺伝子も内因性大豆Ｓｅｃ６１γ遺伝子も検出されないことを示している（図４、レーン１、５及び９）。異なる酵素及びプローブの組合せを用いて処理されたイベント１２７のＦ８世代由来のＤＮＡ試料は、ＡＨＡＳＬコーディング配列プローブとハイブリダイズしたＳｐｅＩ消化物を除いて、すべて単一のバンドを示し（図４Ａ、Ｂ及びＣ、レーン４、８及び１２）、ＡＨＡＳＬコーディング配列プローブとハイブリダイズしたＳｐｅＩ消化物は約８００ｂｐのさらなる小さいバンドを有した（図４Ｂ、レーン８、矢印）。このＡＨＡＳＬハイブリダイズ８００ｂｐのＳｐｅＩ断片は、ＡＨＡＳＬコーディング配列の小型断片がイベント１２７中の３’隣接配列ジャンクションにおいて反復されるという観察と一致する（例３Ｅ；完全配列に関する項を参照されたい）。すべての主要なバンドは、ｐＡＣ３２１の１ゲノムコピー同等物と概略で類似のシグナル強度を有した。
【０２５５】
ＮｃｏＩで消化され、Ａｔ  ＡＨＡＳＬ５’ＵＴＲを用いてプロービングされたイベント１２７由来のゲノムＤＮＡは、およそ４．５ｋｂのサイズのハイブリダイジングバンドを作製した。このバンドのサイズは、インサート内のＮｃｏＩ部位及び５’ゲノム大豆隣接配列中のおよそ４．５ｋｂ上流のＮｃｏＩ部位により画定される単一ＤＮＡ断片の（ｎｔ２７６１、図４Ｄ）作製物と一致する。ＡｔＡＨＡＳＬコーディング配列又はＡｔＡＨＡＳＬ３’ＵＴＲのどちらかを用いてプロービングされた同じ消化物は、およそ９．０ｋｂのサイズのハイブリダイジングバンドを作製した。このバンドのサイズは、インサート内のＮｃｏＩ部位（ｎｔ２７６１、図４Ｄ）及び３’大豆ゲノム隣接配列中のおよそ９．０ｋｂ下流のＮｃｏＩ部位により画定される単一ＤＮＡ断片と一致する。
【０２５６】
ＳｐｅＩを用いて消化し、Ａｔ  ＡＨＡＳＬ  ５’ＵＴＲを用いてプロービングしたイベント１２７ゲノムＤＮＡは、およそ４．４ｋｂのサイズのハイブリダイジングバンドを生じた。これは、インサート中のＳｐｅＩ部位（ｎｔ５６２０、図４Ｄ）及び大豆ゲノム中の５’ＤＮＡ隣接配列中の、およそ４．４ｋｂ上流のＳｐｅＩ制限酵素（ｎｔ１２６８、図４Ｄ）による単一ＤＮＡ断片の作製と一致する。上流のＳｐｅＩ部位の存在が、イベント１２７の５’隣接配列の分析において確認された（隣接配列についての項を参照されたい；（例３Ｄ））。Ａｔ  ＡＨＡＳＬコーディング配列又はＡｔ  ＡＨＡＳＬ  ３’ＵＴＲのどちらかを用いてプロービングした同じ消化物もまた、上記の同じ断片に対応する４．４ｋｂのハイブリダイジングバンドを作製した。さらに、ＳｐｅＩ消化物をＡｔ  ＡＨＡＳＬコーディング配列を用いてプロービングした場合およそサイズ０．８ｋｂのハイブリダイジングバンドが検出され、３’隣接ＤＮＡ配列ジャンクションにおいてｃｓｒ１−２遺伝子の３７６ｂｐのセグメントを含有する単一のＳｐｅＩ  ＤＮＡ断片と一致する。このハイブリダイジング断片は、ＤＮＡインサート中のＳｐｅＩ部位及び大豆ゲノム中の０．８ｋｂ下流のＳｐｅＩ部位から作製された（ｎｔ５６２０〜６５０５、図４Ｄ）。０．８ｋｂのハイブリダイジングバンドは、Ａｔ  ＡＨＡＳＬ  ３’ＵＴＲのプローブによっては検出されず、Ａｔ  ＡＨＡＳＬ  ３’ＵＴＲのＤＮＡが０．８ｋｂの断片中に含まれず、インサート中のＳｐｅＩ  ｎｔ５６２０部位がｃｓｒ１−２遺伝子の３７６ｂｐのセグメントに隣接することを示した。したがって、形質転換に使用したプラスミドｐＡＣ３２１の線状ＰｖｕＩＩ断片中のヌクレオチド５６２２及び５７１９にあるＳｐｅＩ制限酵素部位（図１Ｂに示した）は、イベント１２７ゲノム中のＤＮＡインサートには含まれなかった。このことを、ＤＮＡインサートのＤＮＡ配列分析によって確認した（完全配列の項；（例３Ｅ）を参照されたい）。ｐＡＣ３２１をスパイクされた対照中の２８０及び９７ｂｐの、より小型の予測ＳｐｅＩ断片は、この方法を使用する検出レベルより低いシグナルを発生すると思われる。
【０２５７】
ＸｂａＩを用いて消化し、Ａｔ  ＡＨＡＳＬ  ５’ＵＴＲを用いてプロービングした場合、イベント１２７ゲノムＤＮＡはおよそサイズ１０ｋｂの単一のハイブリダイジングバンドを示す。形質転換に使用した線状ＤＮＡ中のＸｂａＩ制限部位の位置に基づいて（図１Ｂ）、イベント１２７ゲノム中のＤＮＡインサート内から作製された、およそ５．７ｋｂのハイブリダイジングバンドが期待された。しかし、イベント１２７中のＤＮＡインサートの配列分析により、線状形質転換ＤＮＡ中のＸｂａＩ制限部位はＤＮＡインサート中にどちらも含まれなかったことが示された（完全配列の項；（例３Ｅ）を参照されたい）。したがって、１０ｋｂのハイブリダイジングバンドを、５’及び３’ＤＮＡ配列の隣接インサート内のＸｂａＩ部位から作製した（ｎｔ４１０及び１０６５２、図４Ｄ）。したがって、同じ消化物を、上記の同じＤＮＡ断片に対応する同じ１０ｋｂハイブリダイジングバンドを発生するＡｔ  ＡＨＡＳＬコーディング配列又はＡｔ  ＡＨＡＳＬ  ３’ＵＴＲのどちらかを用いてプロービングした。
【０２５８】
図４に示すサザンブロットのすべてのハイブリダイジングバンドの数及びサイズの分析は、ｃｓｒ１−２遺伝子の単一の機能性コピーを含有するイベント１２７大豆ゲノム中の単一のＤＮＡインサート並びにｃｓｒ１−２遺伝子の５’末端のタンパク質ＳＥＣ６１γのためのコーディング配列及びインサートの３’末端にｃｓｒ１−２遺伝子の３７６ｂｐのセグメントを含有する単一のＤＮＡ断片の統合と一致する。
【０２５９】
ベクター骨格ＤＮＡを含まなかったｐＡＣ３２１のＰｖｕＩＩ制限断片を用いて形質転換を実施したが、サザンブロット研究を実施して、イベント１２７ゲノム中のプラスミドｐＡＣ３２１ベクターＤＮＡの不在を確認した。イベント１２７に統合された任意のベクター骨格が存在したかどうかを確認するために、上記（図４）のサザンブロット分析に使用した、同じセットのブロットを、２種のベクター骨格特異的プローブとハイブリダイズした（図５）。期待通り、非トランスジェニックＣｏｎｑｕｉｓｔａゲノムＤＮＡを含有するレーンにおいてハイブリダイジングバンドは検出されなかった。形質転換プラスミドｐＡＣ３２１の１つ又は２つのゲノムコピー同等物をスパイクされた非トランスジェニックＣｏｎｑｕｉｓｔａゲノムＤＮＡは、期待したサイズのハイブリダイジングバンドを示した（表７）。このブロットを、プローブＶＰ１（図５Ａ）及びプローブＶＰ２（図５Ｂ）とハイブリダイズした。イベント１２７Ｆ８世代のＤＮＡにおいてハイブリダイジングバンドは検出されず、ベクター骨格ＤＮＡは、このイベント中の大豆ゲノムに統合されたかったことを示唆する。図５Ｃは、ｐＡＣ３２１の構成要素に相当するプローブＶＰ１及びＶＰ２の位置を示す。
【０２６０】
イベント１２７中のインサートの安定性を決定するために、４種の異なる世代、Ｔ４、Ｆ４、Ｆ８及びＦ９（図２）に由来するＤＮＡ試料をサザンブロット分析に供した。ゲノムＤＮＡ試料を、ＮｃｏＩ及びＳｐｅＩを用いて消化し、Ａｔ  ＡＨＡＳＬ  ５’ＵＴＲ、Ａｔ  ＡＨＡＳＬコーディング配列又は形質転換に使用した全ＤＮＡ断片に及ぶＡｔ  ＡＨＡＳＬ  ３’ＵＴＲプローブのいずれかを用いて、プロービングした。これらの制限酵素及びプローブの組合せは、イベント１２７中のＤＮＡインサートに関する固有のフィンガープリントを提供した（図４）。非トランスジェニックＣｏｎｑｕｉｓｔａゲノムＤＮＡを陰性対照として使用して、ｐＡＣ３２１の１つ又は２つのゲノムコピー同等物をスパイクしたＣｏｎｑｕｉｓｔａを陽性対照として使用した（図６）。ＮｃｏＩ又はＳｐｅＩのどちらかを用いて消化した１２７のＴ４世代ＤＮＡに由来する複数のバンドを、３種すべてのプローブを用いて検出し、Ｔ４世代がｃｓｒ１−２カセットの複数のコピーを含有することを示した。しかし、Ｆ４、Ｆ８及びＦ９世代由来のＤＮＡはすべて、インサート及びコピー数の分析においてすでに観察された（図４）同じサザンパターン（図６）を示した。この結果は、Ｔ４世代におけるインサートの複数コピーがＴ４及びＣｏｎｑｕｉｓｔａとの間の交雑の子孫に分離され、単一のコピーだけが選択された分離固体に保有されていることを示す。さらに、この単一コピーは次の世代に安定して受け継がれる。
【０２６１】
Ｄ：インサートＤＮＡの５’及び３’末端に隣接するゲノム配列
インバースＰＣＲを使用して、挿入されたｃｓｒ１−２カセットに隣接する大豆ゲノムＤＮＡの配列を得た（Ｔｒｉｇｌｉａら、１９８８年）。イベント１２７のＦ７世代由来のゲノムＤＮＡ（１μｇ）を、１５ユニットのＸｂａＩ、ＳｐｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ又はＢｇｌＩＩを用いて２０μｌの反応量で３時間消化した。ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩの消化物を、６５℃において、２０分間インキュベートし、酵素を不活性化し、一方ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩ消化物はイソプロパノール沈殿に供した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（８００ユニット、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を、各消化反応液に直接加えた。さらに水を加え、反応量を２００μｌにした。反応液を１６℃において一晩インキュベートし、環状化ＤＮＡをインバースＰＣＲの鋳型として直接使用した。トランス遺伝子隣接配列を、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＸＬ  ＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて増幅した。１００μｌのプライマリーＰＣＲは、１×製造業者に供給されたＰＣＲ緩衝液、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２５ｎｇの環状化ゲノムＤＮＡ断片、１．２ｍＭの酢酸マグネシウム、２ユニットのｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼＸＬ及び０．２μＭの各プライマリーＰＣＲプライマーを含有した。１００μｌネスティッドＰＣＲは、プライマリーＰＣＲの１：５０希釈液の１０μｌを鋳型として使用したことを除き、プライマリーＰＣＲと同じ成分を含有した。プライマリーＰＣＲ及びネスティッドＰＣＲを、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において実施した。プライマー及びネスティッドプライマーの配列を、以下の表４に提供する。初めの９４℃における１分の変性ステップ後、９４℃、９４℃１５秒、６０℃８分及び７２℃２分を３０サイクル実施し、その後、最終の７２℃において、１０分間の伸長ステップを続けた。
【表９】
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【０２６２】
ＰＣＲ反応が完了後、産物を、Ｚｙｍｏ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）−５（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ）を用いて精製した。ＰＣＲ産物を、直接配列決定するか、又はクローニング後に配列決定するかのどちらかを実施した。ＰＣＲ産物又はクローン化した断片が、１ｋｂより長かった場合、プライマーウォーキングを用いて、完全長配列を得た。両方のＤＮＡ鎖を配列決定し、各塩基においてＰｈｒｅｄ４０を超えるクオリティの配列を得た。ＢｉｇＤｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによる  ＡＢＩ  ３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてシーケンシングを実施した。
【０２６３】
ＸｂａＩ消化物から増幅された３’隣接ＰＣＲ産物は約６ｋｂであり、増幅が弱すぎて直接シーケンシングのために十分なＤＮＡは得られなかった。したがって、ＰＣＲ産物をＳｐｅＩを用いて消化し、得られた制限断片、一方は約８００ｂｐ及び他方は約５．２ｋｂをＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ  Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて処理して平滑末端を作製し、ｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ  クローニング  ベクター（Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。個々の断片の１０のクローンを、制限消化により評価し、プライマーウォーキングにより配列決定した。制限断片のジャンクションをＰＣＲ増幅により確認し、ジャンクションにわたってシーケンシングした。
【０２６４】
３ｋｂのＤＮＡ断片を、イベント１２７のＦ７世代のゲノムＤＮＡの分子内環状化ＮｃｏＩ消化物からインバースＰＣＲにより増幅した。断片の両方の末端のシーケンシングは、トランス遺伝子インサートの５’側から特異的に増幅されたことを示した。断片を、さらに配列決定し、１．３ｋｂの５’大豆隣接ゲノム配列を得た。６ｋｂのＤＮＡ断片を、イベント１２７のＦ７世代のゲノムＤＮＡのＸｂａＩ消化物からインバースＰＣＲにより増幅し、サブクローニング後に完全に配列決定した。得られた配列は、それがインサートの３’側に隣接することを示す。５’及び３’隣接領域由来のプライマーを使用して、非トランスジェニック品種ＣｏｎｑｕｉｓｔａのＤＮＡのＰＣＲ分析を実施し、隣接配列が植物ゲノムに生まれつき備わっていたことが確認された（データ非掲載）。
【０２６５】
５’及び３’隣接配列を含む全大豆イベント１２７トランス遺伝子インサート配列を、図８に示す（配列番号：１）。利用可能な公共のＤＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ配列すべて）及びＢＡＳＦ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ所有のＤＮＡデータベースに対して問い合わせた５’隣接配列のＢＬＡＳＴ分析により、専売の大豆の発現配列タグ（ＥＳＴ）と配列同一性の領域が明らかになり、特定された隣接配列の起源が天然の大豆ＤＮＡであることを確認した。配列を、予測オープンリーディングフレームに関してさらに分析した。結果は、隣接配列のヌクレオチド９４１から１２５５であり、挿入の５’末端の上流にある３１５ｂｐのＯＲＦの存在を示した。形質転換配列を含む５’隣接配列のアライメントにより、統合ポイントはヌクレオチド１３１２（図８；配列番号：１）にあり、予測ＯＲＦの終止コドンの下流６０ｂｐであることが明らかになった。
【０２６６】
３’隣接配列の分析により、３’統合ポイントの前に、ｃｓｒ１−２コーディング配列（図８；配列番号：１のヌクレオチド３７６８〜４１４３）の一部と一ヌクレオチドだけ異なる配列の３７６ｂｐのセグメントがあることを示した。３’隣接配列ジャンクションにおけるこの３７６ｂｐ配列の挿入により、トランス遺伝子インサートから３’隣接配列に伸長された５０１ｂｐのＯＲＦが作り出された。このＯＲＦの転写の可能性をＲＴ−ＰＣＲにより調査した。利用可能な公共のＤＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ配列すべて）及びＢＡＳＦ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ所有のＤＮＡデータベースに対して問い合わせた３’隣接配列のＢＬＡＳＴ分析により、大豆カタラーゼ遺伝子に対する近位３’隣接配列中に配列類似性の領域が明らかになった（受託番号Ｚ１２０２１）。しかし、統合ポイントは潜在的遺伝子ホモログの上流約５００ｂｐであり、推定コーディング配列は、統合ポイントの下流約２．４ｋｂである。したがって、可能性のあるカタラーゼホモログが活性遺伝子であったとしても、挿入によって影響を受けるとは思われない。さらに、遠位３’隣接配列の領域は、専売の大豆ＥＳＴと配列同一性を共有していた。
【０２６７】
非トランスジェニックＣｏｎｑｕｉｓｔａのゲノム由来のイベント１２７統合部位のＰＣＲ増幅についての研究を実施した。挿入部位を増幅するために５’隣接領域に一方のプライマー及び３’隣接領域に第２のプライマーを含む、ＰＣＲプライマーセットＡ及びＢは、非トランスジェニック品種Ｃｏｎｑｕｉｓｔａ由来のゲノムＤＮＡを鋳型として使用して、増幅されたＤＮＡ産物を作製しなかった。３’隣接配列に特異的なプライマーを含むＰＣＲプライマーセットＣは、非トランスジェニック品種ＣｏｎｑｕｉｓｔａのＤＮＡ由来の増幅産物を作製しなかったが、イベント１２７由来のゲノムＤＮＡにより期待されたアンプリコンが作製された（データ非記載）。これは、プライマーセットＣにより増幅されたＤＮＡ断片がイベント１２７中には存在しているが、同じ関連のＣｏｎｑｕｉｓｔａのゲノム中には存在していないことを実証しており、挿入部位におけるＤＮＡの再配列が、イベント１２７において発生したことを示唆している。このことは、挿入されたＤＮＡ及びゲノム大豆ＤＮＡのジャンクションに近いｃｓｒ１−２コーディング領域由来の重複配列の３７６ｂｐのセグメントの特定と一致する。
【０２６８】
Ｅ．インサートＤＮＡの完全配列
６種のＰＣＲにより作製されたアンプリコンを、全インサート及び近接大豆ゲノム配列を含むジャンクションに及ぶように設計した（図７）。挿入されたＤＮＡの完全配列を、これらの６種の重複断片をＰＣＲ増幅し、その後ＤＮＡ配列分析することによって得た。配列ＰＣＲ増幅に使用したプライマーの配列を、表５に提供する。形質転換断片の配列に対する配列不一致を含有するＰＣＲアンプリコンを、ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼＸＬを用いて再増幅した。ＰＣＲ産物をＺｙｍｏ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）５を用いて精製し、両方の鎖の配列に関して、直接シーケンシング及びプライマーウォーキンングによってＰｈｒｅｄ  ４０のクオリティレベルまで配列決定した。ＤＮＡシーケンシングを上記のように実施した。
【表１０】
0005988585.tif 000012
【０２６９】
サザンブロット分析は、トランス遺伝子インサートが完全ｃｓｒ１−２発現カセットを含んだことを示唆したが、インサートのクローニング及びシーケンシングを実施し、挿入の完全性を確認した。挿入されたＤＮＡの完全配列を、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、６種の重複するアンプリコンのＰＣＲ増幅によって得た（図７）。完全な大豆イベント１２７インサート配列は４７５８ｂｐ長であり、３’統合ポイントにあるｃｓｒ１−２由来の３７６ｂｐの断片の挿入ではなく、この配列は、３点の突然変異を除いて形質転換断片の配列と同一である（図８；配列番号１）。点突然変異の１つはＡＨＡＳＬコーディング配列におけるＧからＡへの突然変異であり、これによってＲ２７２からＫ２７２へのアミノ酸の変更がもたらされる。これは、保存的アミノ酸置換であり、Ａｔ  ＡＨＡＳタンパク質の除草剤耐性又は酵素特性に影響はない。他の２つの突然変異は、ＧからＡへの突然変異及びＧからＣへの突然変異を含み、これらの両方は、ｃｓｒ１−２遺伝子の３’ＵＴＲの下流に位置し、遺伝的にサイレントである。
【０２７０】
大豆イベント１２７の生産及び育種開発におけるどの時点で、ＡＨＡＳＬコーディング配列においてＧからＡへの突然変異が起こるかを決定するための実験を実施した。初めに、インサートのシーケンシングに使用したＰＣＲ４反応（図７）を、イベント１２７のＴ４及びＦ８世代の両方に由来するゲノムＤＮＡを鋳型として用いて設定し、ＰＣＲ産物を配列決定した。イベント１２７のＴ４世代由来の配列は、期待した（ｐＡＣ３２１）配列と異ならなかった。Ｔ４世代がインサートの多数のコピーを含有することを考慮すると、ＰＣＲ４産物はインサートのさまざまなコピー由来の配列の混合と思われ、２．５ｋｂのイベント１２７遺伝子座特異的ＰＣＲアンプリコンを、フォワード５’隣接  配列中のフォワードプライマー（５’−ＧＣＣＣＴＣＣＴＴＡＴＴＴＡＴＣＣＣＣＴＴＡ−３’；配列番号：３５）及びｃｓｒ１−２コーディング配列中のリバースプライマー（５’−ＡＣＡＡＡＣＣＴＡＣＣＣＡＡＴＴＣＡＴＣＧＣ−３’；配列番号：３６）を用いて設計した。ＰＣＲ産物を直接配列決定した。配列比較により、ＧからＡへの突然変異がイベント１２７のＴ４世代にも存在することが明らかになり、突然変異がＴ４世代の前のいつかに発生し（データ非掲載）、その後の８世代の間維持されていることを示唆した。
【０２７１】
初期形質転換配列は、もともとはＡＨＡＳＬプロモーター及び５’ＵＴＲとしてアノテーションされた２．５ｋｂのセグメントを含有する。近年の配列分析は、この配列セグメントが多量体輸送タンパク質であるＳＥＣ６１のガンマサブユニットをコードする、以前にアノテーションされていないシロイヌナズナ遺伝子をさらに含有することを明らかにしている。イベント１２７位インサート配列は、完全コーディング配列を含むＡｔＳｅｃ６１γサブユニット遺伝子の大部分を含有する。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＲｅｓｏｕｒｃｅによりアノテーションされたＡｔＳｅｃ６１γ５’ＵＴＲは、５’トランス遺伝子統合部位から１８ヌクレオチド下流ではじまる。したがって、インサートがＡｔＳｅｃ６１γ遺伝子のための完全天然プロモーターを含有するとは思えない。
【０２７２】
大豆イベント１２７中のインサートに見出されるシロイヌナズナＡｔＳＥＣ６１γサブユニット遺伝子の転写の可能性を、ＲＴ−ＰＣＲ使用して評価した。ＲＴ−ＰＣＲを、イベント１２７のＦ７世代から抽出された、ＤＮａｓｅ処理全ＲＮＡを鋳型として使用して実施した。２つの内因性大豆遺伝子に特異的なプライマー、Ｉｏｔａ及びＧｍＳｅｃ６１γを陽性対象として使用し、鋳型ＲＮＡのクオリティを確認した。ＤＮａｓｅ処理をしていないシロイヌナズナの葉及び根の組織由来の全ＲＮＡもまた、陽性対照として使用した。結果は、両方の内因性大豆陽性対照であるＩｏｔａ及びＧｍＳｅｃ６１γが、若い大豆の葉の組織に強く転写されており、一方イベント１２７のＦ７世代中のＡｔＳｅｃ６１γサブユニット遺伝子はわずかに弱く転写された。図９中の矢印は、イベント１２７から増幅されたＡｔＳｅｃ６１γのサブユニットに対応する、かすかなＲＴ−ＰＣＲ産物を示す。イベント１２７のＦ７世代由来の増幅された３９３ｂｐＡｔＳｅｃ６１γサブユニットＤＮＡは、シロイヌナズナの葉及び根から増幅されたものと同じサイズである（図９）。プライマーの同じ対もまた、シロイヌナズナの葉及び根の試料中の汚染されたゲノムＤＮＡから期待されたサイズ、９６５ｂｐのバンドを増幅した。イベント１２７ＲＴ−ＰＣＲ産物の同一性を確認するために、それを配列決定し、ＡｔＳｅｃ６１γサブユニットの予測されたｍＲＮＡ配列と比較した（データ非掲載）。両方の配列は一致し、ＡｔＳｅｃ６１γサブユニットがイベント１２７の葉において弱く転写されることを示している。
【０２７３】
３’隣接配列ジャンクションの近くへのｃｓｒ１−２コーディング配列の３７６ｂｐの部分の挿入は（図７）５０１ｂｐのＯＲＦを作り出した。このＯＲＦの転写の可能性を、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって調査した。ＲＴ−ＰＣＲを、２つの異なる量、５００ｎｇ及び１２５ｎｇのＲＮＡの鋳型を用いて実施した。イベント１２７Ｆ８世代ゲノムＤＮＡもまた、ＯＲＦ特異的プライマーを用いた陽性対照反応に使用した。大豆Ｉｏｔａ遺伝子に特異的なプライマーを陽性対照反応に使用して、鋳型ＲＮＡのクオリティを確認した。ＯＲＦ特異的プライマーは、イベント１２７ゲノムＤＮＡ由来の４３５ｂｐの断片を増幅する。しかし、若い葉の組織由来の全ＲＮＡを鋳型として使用して、検出可能なＲＴ−ＰＣＲ産物は観察されず、ＯＲＦがイベント１２７において発現されないことを示唆している（図１０）。
【０２７４】
Ｆ．定量的イベント特異的検出のためのＰＣＲアッセイ
イベント特異的ＰＣＲを、ＤＮＡ隣接配列及びインサート配列の両方から得られた情報を使用して開発した。４対のプライマーを設計し、プライマー中の個々の対の１つのプライマーは５’大豆隣接配列にあり、他方はｃｓｒ１−２カセット中にある。イベント特異的ＰＣＲに使用するプライマーの配列を、以下の表１０に提供する。
【表１１】
0005988585.tif 000013
【０２７５】
プライマーを設計し、約２００から約４００ｂｐ長の間のＰＣＲ産物を増幅した。イベント１２７及び非トランスジェニック品種Ｃｏｎｑｕｉｓｔａの両方に由来するゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。ＰＣＲを、２５ｎｇの鋳型ＤＮＡ、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．４μＭの各プライマー及び１ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／反応液を含む、全容量２５μｌにおいて実施した。９４℃における初めの４分の変性後、９４℃で３０秒、６０℃（イベントＰＣＲ１及び３）又は６６℃（イベントＰＣＲ２及び４）で３０秒及び７２℃で４５秒を３０サイクル実施し、その後、７２℃において最後の１０分間の伸長を続けた。６種の異なる植え付け場所からの大豆イベント１２７及び非トランスジェニック品種Ｃｏｎｑｕｉｓｔａのそれぞれ４種を、「イベントＰＣＲ３」プライマーセットを使用して定量的ＰＣＲによって分析した。
【０２７６】
４種すべてのＰＣＲにより、大豆イベント１２７に特異的な、期待されるサイズの産物が作製され（図１１Ａ）、４種のプライマーセットのいずれもが、試料中のイベント１２７核酸分子の検出に使用できることを示唆している。イベント特異的ＰＣＲ産物３を、６種の異なる植え付け場所から収集したイベント１２７大豆植物及び非トランスジェニック品種Ｃｏｎｑｕｉｓｔａの試料を用いてさらに評価した。結果は、ＰＣＲ産物３は、イベント１２７大豆の２４種すべての試料において特異的に増幅されたが、非トランスジェニック対照品種Ｃｏｎｑｕｉｓｔａにおいては特異的に増幅されなかったことを示した（図１１Ｂ及びＣ）。
【０２７７】
Ｇ．定量的イベント特異的検出のためのＰＣＲアッセイ
イベント特異的定量的ＰＣＲを検出のために設計し、イベント１２７核酸大豆が試料中に存在する核酸の全量の０．０８％及び５％の間で試料中に存在する場合、種子の混合バッチ中のイベント１２７核酸を正確且つ精密に定量する。この方法において、介在するプローブとともに２対のプライマーを使用する。イベント特異的ＰＣＲに使用するプライマーの配列を、以下の表１１に提供する。
【表１２】
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【０２７８】
このＴａｑ−Ｍａｎに基づくアッセイにおいて、イベント特異的産物のレベルを、２種の反応混合物において各サイクルの間に内因性対照のレベルと比較する。
【０２７９】
アッセイのフォーマットは、２種のＰＣＲ系それぞれに関して標準曲線を利用し、個々の標準曲線は、３連の測定値に由来するそれぞれ４つの標準点を含む。標準は、１０％イベント１２７大豆ＤＮＡ（標準１）及びその後の希釈緩衝液による段階１：５希釈液（標準２から４）を含有する、２０ｎｇ／μｌの全ゲノムＤＮＡ溶液を調製することによって作成する。
３つの鋳型のない対照（ＮＴＣ）／系を実施し、試薬の純度を検証する。各試料（未知）を、１００ｎｇゲノムＤＮＡ／反応液で分析する。
【０２８０】
イベント及び内因性ＰＣＲのプローブをＦＡＭ（励起４９５ｎｍ；放射５２０ｎｍ）と接合する。プライマーを、１００ｂｐ長未満の短いアンプリコンを作製するように設計する。イベント１２７大豆（１０％）及びＣｏｎｑｕｉｓｔａ（非−ＧＭ）（９０％）由来のゲノムＤＮＡの混合物を２０ｎｇ／μｌに希釈する。標準曲線のために、次いでこれを、１０ｎｇ／μｌのサケ精子ＤＮＡを用いて２０、４及び０．８ｎｇの大豆ＤＮＡに希釈した（反応の容量は５μｌである）。ＰＣＲ反応を、標準成分（ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲマスターミックス及びＵｒａｃｉｌ−Ｎ−グリコシラーゼ（ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ＵＮＧ、ＡＢＩ））すべてを用いて、９６ウェルプレートにおいて２５μｌ容量において実施した。イベントＰＣＲに関しては、プライマーを、４００ｎＭの濃度で、及びプローブを１００ｎＭの濃度で加える。内因性ＰＣＲに関しては、プライマーを１５０ｎＭの濃度で、及びプローブを５０ｎＭの濃度で加える。アッセイを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍにおいて実施する。最初の５０℃において２分及び９５℃において１０分の１サイクル後、９５℃で１５秒及び６０℃で６０秒を４５サイクル実施する。イベント１２７大豆及び非トランスジェニック品種Ｃｏｎｑｕｉｓｔａ並びに混合物のそれぞれの３種の試料を定量的ＰＣＲにより分析する。
【０２８１】
Ｈ．重複及びＳＥＣ６１γ遺伝子の分析
ＲＴ−ＰＣＲを実施して、ｃｓｒ１−２コーディング配列の一部の３７６ｂｐの重複又は大豆イベント１２７中に存在するＡｔＳｅｃ６１γ遺伝子のどちらが転写されたかを決定した。全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用するＲＴ−ＰＣＲの鋳型として使用した。ＡｔＳｅｃ６１γコーディング配列のＲＴ−ＰＣＲ分析に関して、葉及び根に由来するシロイヌナズナの全ＲＮＡ試料を陽性対照としてさらに使用した。シロイヌナズナの全ＲＮＡ試料は、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＤＮａｓｅ処理を行わずに調製した。ＲＴ−ＰＣＲ反応液は、全容量５０μｌ中に１×Ｑｉａｇｅｎ  ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、４００μＭの各ｄＮＴＰ、０．６μＭの各プライマー、２μｌのＱｉａｇｅｎ  ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｅｎｚｙｍｅミックス、及び５００ｎｇ若しくは１２５ｎｇの全ＲＮＡを含有した。ＲＴ−ＰＣＲを、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００を使用して実施した。５０℃におけるリバース転写ステップの３０分後、ＰＣＲ増幅を、以下の条件下：９５℃における１５分の変性ステップ１サイクル；９４℃で３０秒、６４℃で３０秒及び７２℃で１分を３０サイクル並びに；７２℃における１０分間の伸長を１サイクルで実施した。ＲＴ−ＰＣＲ分析に使用したプライマーの配列を、以下の表１２に提供する。
【０２８２】
内因性大豆Ｓｅｃ６１γサブユニット及びＩｏｔａ遺伝子を、陽性対照として使用した。大豆Ｉｏｔａサブユニット遺伝子は、大豆において構成的且つ普遍的に発現される。（Ｙａｍａｍｏｔｏ及びＫｎａｐ、２００１年）。
【表１３】
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【０２８３】
Ｉ．統合部位のＰＣＲ分析
３種のＰＣＲ反応を実施し、非トランスジェニック大豆品種Ｃｏｎｑｕｉｓｔａ中の挿入部位を特徴付けた。本研究に使用したＰＣＲプライマーは、イベント１２７のゲノム中の新規な発現カセットに隣接する５’及び３’ゲノム領域に関して決定されたＤＮＡ配列に由来した。
【０２８４】
ＰＣＲＡのためのＰＣＲプライマー（以下の表１３を参照されたい）を、フォワードプライマーが５’隣接配列に結合し、リバースプライマーが３’統合ポイントの直後の３’隣接配列に結合するように設計した。ＰＣＲＢのためのプライマーを、フォワードプライマーが５’隣接配列に結合し、一方、リバースプライマーは３’隣接配列の遠位末端に近接して結合するように設計した。ＰＣＲＣのための両方のプライマーは、３’隣接配列内に結合するように設計した。
【表１４】
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【０２８５】
ＰＣＲＡ及びＰＣＲＣを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施し、ＰＣＲ２はＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＸＬＰＣＲキットを用いて実施した。イベント１２７又はＣｏｎｑｕｉｓｔａのＤＮＡどちらかの２５ｎｇを、すべてのＰＣＲ増幅に使用した。Ｑｉａｇｅｎ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲに関して、反応液は、全容量２５μｌ中に１×Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ緩衝液、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．４μＭの各プライマー及び１ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含有した。最初の９４℃において４分の変性ステップ後、９４℃で３０秒、６６℃で４５秒及び７２℃で２分間を３０サイクル実施し、その後、最終の７２℃において１０分間の伸長ステップを実施した。
【０２８６】
ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＸＬ  ＰＣＲキットを用いたＰＣＲに関して、反応液は、鋳型ＤＮＡを除いて、隣接配列のクローニングに使用した同じ成分を含有した。最初の９４℃において１分の変性ステップ後、９４℃で１分及び６６℃で１０分を３０サイクル実施し、その後、最終の７２℃において１０分間の伸長ステップを実施した。
【０２８７】
Ｊ．バイオインフォマティクス分析
ＤＮＡ配列アセンブリを、Ｓｔａｄｅｎ  Ｐｒｅｇａｐ４及びＧａｐ４（Ｓｔａｄｅｎ、１９９６年）を用いて実施した。クローニングし、期待したインサート配列のアライメントを、ＬＩ−ＣＯＲ  ＡｌｉｇｎＩＲソフトウェア（Ｌｉｃｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）を用いて実施した。隣接配列を、利用可能な公共のＤＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ配列すべて）及びＢＬＡＳＴ分析（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７年）を介したＢＡＳＦ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ所有のＤＮＡデータベースに対して問い合わせた。３０コドン又はそれ以上のオープンリーディングフレームを、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ｖ９．０のＯＲＦ分析機能（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて特定した。
【０２８８】
これらの実験結果に基づき、大豆イベント１２７は、ｃｓｒ１−２の完全発現カセット並びにＡｔＳｅｃ６１γサブユニット遺伝子の５’ＵＴＲ、全コーディング配列及び３’ＵＴＲを含む、４７５８ｂｐの単一コピーインサートを含有する。ｃｓｒ１−２遺伝子由来のコーディング配列の３７６ｂｐの反復は、隣接配列と３’ジャンクションにおいてさらに統合される。ベクター骨格配列は、大豆ゲノム中に統合されていることが見出されなかった。インサートは、８育種世代にわたって安定に受け継がれており、このインサートが大豆ゲノム中に安定して統合されていることを実証した。ｃｓｒ１−２発現カセット中には３点の突然変異が存在し、１つは突然変異ＡＨＡＳＬタンパク質の除草剤耐性又は酵素特性に影響を与えないＡＨＡＳＬコーディング配列中の保存的突然変異であり、２つは３’ＵＴＲの下流にある。大豆ゲノムＤＮＡの再配列が、インサートの３’末端に隣接するＤＮＡにおいて起こり、これはＤＡＮ統合過程において起こった可能性が最も高いと思われる。このインサートは、ＡｔＳｅｃ６１γサブユニット遺伝子のコーディング配列を含有し、これは、形質転換に使用したＤＮＡ断片に含まれた。この遺伝子は弱く転写されただけである。ｃｓｒ１−２コーディング配列の３７６ｂｐの断片は、新しい５０１ｂｐのＯＲＦを作り出した。ＲＴ−ＰＣＲ実験は、このＯＲＦの検出可能な転写を示さなかった。
【０２８９】
（例４）：雑草防除
Ａ．（例４Ａ）：発芽後適用
３つの野外実験を、ブラジルの中心地域の３か所の異なる場所：Ｓａｎｔｏ  Ａｎｔｏｎｉｏ  ｄｅ  Ｐｏｓｓｅ、ＳＰ、Ｅｍｂｒａｐａ  ＲｉｃｅのＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｔａｔｉｏｎ（ＡＲＳ）及びＳａｎｔｏ  Ａｎｔｏｎｉｏ  ｄｅ  Ｇｏｉａｓ、ＧＯのＢｅａｎｓ（ＣＮＰＡＦ）及びＵｂｅｒａｂａ、ＭＧのＥｍｂｒａｐａ−Ｅｐａｍｉｇ（ＣＴＴＰ）に設置した。各用地の雑草のまん延を、表１３に提示した。
【表１５】
0005988585.tif 000017
【０２９０】
植え付けから収穫までの全手順は、３か所すべての場所に関して同じであった。除草剤は、発芽後初期、雑草が２から４つの葉を有し、大豆作物は最初の三つ葉が完全に開いた時に適用した。３つの複製を有する、完全にランダム化されたブロック計画を使用した。主な処理を、表１５に提示する。
【表１６】
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【０２９１】
イミダゾリノン系除草剤を、イミダゾリノン耐性大豆（イベント１２７由来）の表面に適用し、グリホセートを、ラウンドアップレディー（Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ）大豆（Ｖａｌｉｏｓａ  ＲＲ）の表面に適用し、各場所に隣合わせに植え付けた。イミダゾリノン系除草剤（イマザピル及びＫｉｆｉｘ）は、非イオン性アジュバントであるダッシュ（Ｄａｓｈ）０．２５％ｖ／ｖとともに適用した。１９０ｋｐａで１７０ｌ／ｈａを散布する８００１５の低圧ノズルを有するＣＯ２バックパック噴霧器を、すべての除草剤の適用に使用した。すべての大豆種子を、５０ｃｍの列間隔で、３８０，０００種子／ｈａの個体数を５ｃｍの深さで植え付けた。
【０２９２】
作物の損傷を、適用後日数（ＤＡＡ）１５及び３０に、０は損傷なしであり、１００は作物の死である０から１００スケールに基づいて査定した。除草剤の有効性を、１５、３０及び６０ＤＡＡにおいて、０は防除なしであり、１００はすべて防除である０から１００のスケールに基づいて査定した。
【０２９３】
以下の表１６は、地域において除草剤適用の時点に存在した雑草にわたった、カギとなるこれらの処置の効率を示す。これらの結果に従って、イマザピル及びイマザピル＋イマザピックの組合せは同様の有効性を有した。３０ＤＡＡにおいて、両方の製品は、これらの７種の重要なブラジルの雑草：ＣＹＰＲＯ（８７％）、ＣＯＭＢＥ（８７〜９０％）、ＥＰＨＨＬ（８５〜８７％）、ＩＰＯＧＲ（９０〜９１％）、ＢＯＩＬＦ（８２〜８３％）、ＳＩＤＲＨ（８６〜８７％）及びＲＣＨＢＲ（８３％）にわたって非常に効率的であった。６０ＤＡＡにおいて、発芽後に適用した場合、ＣＹＰＲＯ、ＣＯＭＢＥ、ＲＣＨＢＲ及びＩＰＯＧＲにわたってイミダゾリノン系除草剤はグリホセートより優れていた。
【表１７】
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【０２９４】
（例４Ｂ）：焼き払い適用
３つの野外実験を、ブラジルの中心地域の３か所の異なる場所：Ｓａｎｔｏ  Ａｎｔｏｎｉｏ  ｄｅ  Ｐｏｓｓｅ、ＳＰ、Ｅｍｂｒａｐａ  ＲｉｃｅのＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｔａｔｉｏｎ（ＡＲＳ）及びＳａｎｔｏ  Ａｎｔｏｎｉｏ  ｄｅ  Ｇｏｉａｓ、ＧＯのＢｅａｎｓ（ＣＮＰＡＦ）及びＵｂｅｒａｂａ、ＭＧのＥｍｂｒａｐａ−Ｅｐａｍｉｇ（ＣＴＴＰ）に設置した。これらの各用地の雑草のまん延を、表１７に提示した。
【表１８】
0005988585.tif 000020
【０２９５】
植え付けから収穫までの全手順は、３か所すべての場所に関して同じであった。除草剤は、大豆植え付け５日前の焼き払い時に適用した。
【０２９６】
３つの複製を有する、完全にランダム化されたブロック計画を使用した。主な処理を、表１８に記載した。
【表１９】
0005988585.tif 000021
【０２９７】
イベント１２７由来のイミダゾリノン耐性大豆を、５０ｃｍの列間隔で、３８０，０００種子／ｈａの個体数を５ｃｍの深さで植え付けた。イミダゾリノン系除草剤は、非イオン性アジュバントであるダッシュ（Ｄａｓｈ）０．２５％ｖ／ｖとともに適用した。１９０ｋｐａで１７０ｌ／ｈａを散布する８００１５の低圧ノズルを有するＣＯ２バックパック噴霧器を、すべての除草剤の適用に使用した。（表１８）。
【０２９８】
作物の損傷を、植え付け後日数（ＤＡＰ）１５及び３０に、０は損傷なしであり、１００は作物の死である０から１００スケールに基づいて査定した。除草剤の有効性を、１５、３０及び６０ＤＡＰにおいて、０は防除なしであり、１００はすべて防除である０から１００のスケールに基づいて査定した。
【０２９９】
表１９は、地域において焼き払い適用の時点に存在した雑草にわたった、カギとなるこれらの処置の効率を示す。３０及び６０ＤＡＡにおける結果は、グリホセートと比較したイミダゾリノン系除草剤の残存効果を示した。３０ＤＡＡにおいて、イマザピル＋イマザピックの組合せはイマザピックよりわずかに優れていたが、両方ともＢＲＡＰＬ（８５％）、ＤＩＧＨＯ（９５％）、ＣＹＰＲＯ（８８％）、ＣＯＭＢＥ（７５〜９４％）、ＥＰＨＨＬ（９５％）、ＩＰＯＧＲ（７５％）、ＧＡＳＰＡ（８４〜９５％）及びＢＩＤＰＩ（７９〜９３％）に関して効率的であった。グリホセートは、残存活性は有さず、グリホセートは３０及び６０ＤＡＡにおいてこれら８種の雑草にわたって効率的ではなかった。
【表２０】
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【０３００】
（例４Ｃ）：グリホセート耐性植物の防除
イミダゾリノン系除草剤が耕作地で成長する望ましくないグリホセート耐性の雑草及び作物の防除に使用できるかどうかを決定するために、温室実験を実施した。グリホセート抵抗性植物の種子を、発芽後適用のためにメトロミックス及び発芽前適用のためにＮｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａの土並びに遅延放出性肥料を土壌表面に使用して、４．５インチのポットに植え付けた。植物を、葉上潅水を用いて温室で維持した。
【０３０１】
グリホセート抵抗性の大豆、トウモロコシ及びヒメムカシヨモギそれぞれの５種の個別の植物を、発芽後又は発芽前のどちらかで適用したグリホセート、イマザピル又はイマザピックの噴霧処理に供した。発芽後噴霧は、トウモロコシ及び大豆に関しては２本葉段階並びにヒメムカシヨモギに関しては９本葉段階において実施した。グリホセートは、７７４ｇ  ａｅ／ｈａの率で適用し、一方、イマザピル及びイマザピック除草剤は、２０ｇ  ａｉ／ｈａ、４０ｇ  ａｉ／ｈａ、８０ｇ  ａｉ／ｈａ、１６０ｇ  ａｉ／ｈａ及び２４０ｇ  ａｉ／ｈａの率で適用した。全体の損傷率パーセントを、処理後日数１４及び処理後日数（ＤＡＴ）２５において視覚的に決定した。未処理対照植物は、いずれの研究においても視覚的損傷は示さなかった。発芽後試験の結果を、表２０に要約し、発芽前研究の結果を表２１に要約する。結果は、５つの個別の植物の平均として提供する。
【表２１】
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【表２２】
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【０３０２】
これらの結果は、イミダゾリノン系除草剤が、グリホセート耐性の雑草及び作物を、発芽の前又は後のどちらでも防除に使用できることを示している。１つ有利なことは、グリホセートがもはや防除に有効でない、耐性の雑草及び望ましくない植物を防除するために、イベント１２７植物にイミダゾリノン系除草剤を使用できることである。
【０３０３】
（例４Ｄ）：大豆イベント１２７を使用する大豆生産の増加
非トランスジェニック同系対照（ヌル）及び他の非トランスジェニック（既存）大豆品種（基準）と比較した、イミダゾリノン系除草剤に対する耐性を有するトランスジェニック大豆系（イベント１２７）の農学的、表現型的及び生物季節学的特徴を評価するために、野外試験を実施した。この目的のために、市販の大豆生産の代表的地域であり、遺伝子型が適応されるブラジルの現場において研究を実施した。
【０３０４】
５種の処理（表２２）を、完全にランダム化されたブロック計画において、すべての現場で４回再現した。個々の区画は、同じ区画内の列の間の間隔が０．５ｍである６つの８ｍの長さの列からなり、隣の区画との間の間隔が１．０ｍであった。表現型及び農学的測定値を、３番目及び４番目の列内の植物から決定した。
【０３０５】
これらの評価に含まれる５種の処理は、これらの研究の目的に合う適切なデータを作り出すために必要な、特異的大豆遺伝型と除草剤製剤（イミダゾリノン及び非イミダゾリノン系除草剤）との組合せを表した。
【０３０６】
２種の除草剤処理を、これらの評価に使用した：１）イマザピル、７０ｇ  ａｉ／ｈａの率で噴霧、及び２）Ｖｏｌｔ、ベンタゾン（４００ｇ  ａｉ／ｈａ）及びアジフルオルフェン（Ａｃｉｆｌｕｏｒｆｅｎ）（１７０ｇ  ａｉ／ｈａ）の組合せ、５７０ｇ  ａｉ／ｈａの率で噴霧。さまざまな大豆の遺伝子型及び除草剤製剤を組み合わせ、５種の処理を作り出した（表２２）。これら５種の処理（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５）は、実験計画において完全な再現を構成した。
【表２３】
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【０３０７】
実験を、ブラジルの７か所の試験場において植え付けた（表２３）。試験場は、大豆生産の代表的地域であり、大豆の遺伝子型が適応する地域である。すべての場所は、バイオセイフティーの品質証明書（ＣＱＢ）を有しており、基盤、実験室施設及び現場機器並びに農学研究の経験者及びバイオセイフティーの訓練を受けた者が設置されていた。
【表２４】
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【０３０８】
イベント１２７、同系対照及び基準品種の表現型的、生物季節学的及び農学的類似性を、大豆遺伝型の表現型及び挙動を記載するために日常に使用されるさまざまな特徴を記録することによって決定した。特性は、（特に注釈がなければ）全場所で全区画に関して記録された。チューキー法を使用して、特定の特性に関する有意な効果を有する、ＡＮＯＶＡにより決定された変動の供給源の手段を比較した。
【０３０９】
場所にわたった平均として、イマザピル（Ｔ１）又はＶｏｌｔ（Ｔ２）を用いたイベント１２７の実績と、イマザピル（Ｔ３）を用いた同系対照の実績とは、発芽、最終的な立木（Ｆｉｎａｌ  Ｓｔａｎｄ）、茎の緑度（Ｇｒｅｅｎ  Ｓｔｅｍ）、倒れ（Ｌｏｄｇｉｎｇ）、開花までの日数、成熟までの日数又は収率に関して有意な差はなかった（表２４）。植物の丈及び種子のサイズだけに関しては、Ｔ１はＴ３と有意に差があり、種子のサイズだけに関しては、Ｔ２はＴ３と有意に差があった。さらに、Ｔ１及びＴ２に関する形質、手段、場所における差はいずれも有意な差はなかった（表２４）。
【表２５】
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【０３１０】
本研究の結果は、イベント１２７を含有する大豆系を使用して、このような除草剤の適用がない他の市販の品種と同等である残存活性を有するイミダゾリノン系除草剤の適用後の収率レベルを維持できることを示している。
【０３１１】
（例５）：定性的イベント特異的検出のための、ゲルに基づくＰＣＲアッセイ
定性的ゲルに基づくＰＣＲアッセイ法を、種子及び穀物試料中のイベント１２７核酸の検出に使用するために開発した。この方法は、非トランスジェニック大豆のＤＮＡの混合物中の０．０５％のイベント１２７大豆のＤＮＡを検出できた。
【０３１２】
穀物及び種子の試料を、ミキサーミルＭＭ４００（Ｒｅｔｓｃｈ；Ｈａａｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して３０Ｈｚにおいて３０秒間、２５ｍｌの粉砕ビーカーにおいて粉砕し、均質な粉末を得た。ゲノムＤＮＡを、０．１〜１ｇの粉砕穀物試料からＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）緩衝液、その後クロロホルム−オクタノール抽出液を使用して抽出し、アルコール沈殿させた。得られた沈殿物を溶解し、残った阻害剤を、Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ２０／Ｇ重力フローカラム（Ｑｉａｇｅｎ；Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して陰イオン交換クロマトグラフィーにより除去した。
【０３１３】
ＤＮＡの濃度及び純度を分光光度計Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００（Ｐｅｑｌａｂ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ；Ｅｒｌａｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて試料の吸光度比を波長２６０及び２８０ｎｍ（Ａ２６０／２８０）において、並びに２６０及び２３０ｎｍ（Ａ２６０／２３０）において決定することによってアッセイした。１．８に近いＡ２６０／２８０比及び１．８より高いＡ２６０／２３０を有するＤＮＡを次のＰＣＲのために選択した。
【０３１４】
別のセットのプライマーを開発してイベント１２７特異的領域を増幅し、大豆特異的遺伝子を内因性対照として使用した。イベント特異的ＰＣＲアッセイは、イベント１２７に固有のトランス遺伝子インサート−天然大豆ゲノムＤＮＡのジャンクションを標的とする。すべてのＰＣＲ増幅を、Ｔ１  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ；Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において実施した。１００ナノグラムのゲノムＤＮＡを、各ＰＣＲ反応において鋳型として使用した。
【０３１５】
Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（大豆）のレクチン遺伝子（Ｌｅ１）、（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｋ００８２１）を検出するための大豆特異的ＰＣＲ系を、参照系として使用した。レクチン遺伝子ＰＣＲのためのプライマー配列及びＰＣＲ周期の条件を、Ｈｉｒｄら（Ｊ．ＡＯＡＣ  Ｉｎｔ．、８６巻：６６〜７１頁（２００３年））から適合させた。プライマー配列は、ＳｏｙＬｅｃ−Ｆ（５’−ＴＧＧＴＣＧＣＧＣＣＣＴＣＴＡＣＴＣ）（配列番号６５）及びＳｏｙＬｅｃ−Ｒ（５’−ＧＧＣＧＡＡＧＣＴＧＧＣＡＡＣＧ）（配列番号６６）であった。プライマーは、７０塩基対（ｂｐ）の大豆に特異的な断片を増幅するように設計した。
【０３１６】
内因性対照のためのＰＣＲを、１００ｎｇのゲノムＤＮＡ、２００μＭのｄＮＴＰ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、５００ｎＭの各プライマー及び１ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ／反応液を含む、全容量２０μｌにおいて実施した。最初の９４℃において２分の変性ステップ後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒及び７２℃で３０秒を３２サイクル実施し、その後、最終の７２℃において１分間の伸長ステップを実施した。
【０３１７】
上記のプライマー及び条件を使用する反応を、コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ、２種の異なる系）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、大豆Ｃｏｎｑｕｉｓｔａ、大豆イベント１２７及びＤＮＡ鋳型なし（対照として）から得た個別のＤＮＡ試料を用いて実施し、アガロースゲル上を走らせた。７０塩基対の産物を、大豆植物（Ｃｏｎｑｕｉｓｔａ及びイベント１２７）由来のＤＮＡ試料において得たが、他の試料において、増幅産物は得られなかった。したがって、内因性対照プライマーは、大豆から特異的にゲノムＤＮＡを検出できる。
【０３１８】
イベント１２７大豆のためのイベント特異的アッセイは、５’インサートとゲノム大豆ＤＮＡとのジャンクションにおいて設置した。フォワードプライマー結合部位は天然ゲノム大豆ＤＮＡ（１２７−６１Ｆ：５’−ＧＧＧＣＡＡＡＣＴＡＧＴＣＴＣＧＴＡＡＴＡＴＡＴ）（配列番号：６７）内に位置し、リバースプライマーの結合部位は１２７インサート（１２７−１７６Ｒ：５’−ＣＧＧＡＡＴＴＧＧＴＡＡＴＣＧＡＡＡＴＴ）（配列番号：６８）中に位置する。この反応は、１１６塩基対（ｂｐ）の断片を増幅する。
【０３１９】
イベント特異的プライマー（１２７−６１Ｆ及び１２７−１７６Ｒ）の特異性を、１００ｎｇのゲノムＤＮＡ（コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、大豆ＧＴＳ４０−３−２、大豆３０５４２３、大豆３５６０４３、大豆Ａ２７０４−１２、大豆Ｃｏｎｑｕｉｓｔａ、大豆イベント１２７及び鋳型なしの対照由来）を使用して決定した。イベント特異的反応のためのＰＣＲを、１００ｎｇの鋳型ＤＮＡ、２００μＭのｄＮＴＰ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、５００ｎＭの各プライマー及び１ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ／反応液を含む、全量２０μｌにおいて実施した。最初の９４℃において２分の変性ステップ後、９４℃で３０秒、５６℃で３０秒及び７２℃で３０秒を３２サイクル実施し、その後、最終の７２℃において１分間の伸長ステップを実施した。
【０３２０】
試料中に大豆イベント１２７が存在するかしないかを、増幅されたイベント１２７に特異的な１１６ｂｐのＰＣＲ断片を、臭化エチジウム染色された４％アガロースゲルにおいて分離することによって決定した。
【０３２１】
イベント１２７に特異的な１１６ｂｐのＰＣＲ断片を、大豆イベント１２７試料に対応するすべての反応液において得たが、任意の他の試料において１２７−特異的ＰＣＲ断片は得られなかった。したがって、イベント特異的プライマー１２７−６１Ｆ及び１２７−１７６Ｒは、イベント１２７大豆植物由来のＤＮＡを特異的に検出できる。増幅されたイベント特異的アンプリコン配列を使用するヌクレオチド配列の調査は、ＤＮＡ−ＤＮＡ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  （ＢＬＡＳＴＮ）分析を使用して、１００％の一致を少しも特定しなかった。
【０３２２】
１２７−６１Ｆ及び１２７−１７６Ｒプライマーを使用する反応の検出限界を決定するために、所定のイベント１２７ＤＮＡの含有量（１００％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％及び０％）を含有する基準を、Ｃｏｎｑｕｉｓｔａ  ＤＮＡによるイベント１２７ＤＮＡの段階希釈液によって作製した。各希釈液において、２２の複製ＰＣＲ増幅を上記の条件を使用して実施した。１つのＤＮＡ鋳型なしの対照（ＮＴＣ）／系を実施し、試薬の純度を検証した。
【０３２３】
イベント１２７特異的ＰＣＲ産物（１１６ｂｐ断片）を、０．０５％から１００％のイベント１２７ＤＮＡの範囲で試験したすべての希釈液中に検出した。期待したように、すべての非トランスジェニック大豆試料が大豆特異的ＰＣＲ増幅において期待されるアンプリコンの存在によって増幅可能なＤＮＡを有することを示したとしても、非トランスジェニック大豆試料又は鋳型なしの対照（ＮＴＣ）においてイベント１２７特異的バンドは検出されなかった。１２７−６１Ｆ及び１２７−１７６Ｒプライマーを使用して確実に検出できる試料中の最も少量のイベント１２７ＤＮＡは０．０５％である。
【０３２４】
１２７−６１Ｆ及び１２７−１７６Ｒプライマーを使用するイベント特異的ＰＣＲにより、９５％の信頼性を有する０．１％未満の相対的ＬＯＤが実証される。さらに、１２７−６１Ｆ及び１２７−１７６Ｒプライマーは、０％のイベント１２７参照（１００％の非トランスジェニック大豆）又は鋳型なしの対照反応液において任意の検出可能なＰＣＲ産物を増幅しない。
【０３２５】
ＰＣＲ反応におけるさまざまなアニーリング温度の影響を査定するために、４種の試料（非トランスジェニックＣｏｎｑｕｉｓｔａ大豆ＤＮＡのバックグラウンドで希釈された０％、０．０５％、１％及び１００％のイベント１２７大豆ＤＮＡ）を、アニーリング温度が５４℃及び５８℃の実験において３連に分析した。結果は、アニーリング温度が、最適なアニーリング温度から±２℃まで外れてもイベント１２７特異的ＤＮＡの１００％正確な検出がもたらされることを実証している。
【０３２６】
さまざまなＰＣＲプラットフォームの影響を査定するために、３種の試料（非トランスジェニックＣｏｎｑｕｉｓｔａ大豆ＤＮＡのバックグラウンドで希釈された０．０５％、１％及び１００％のイベント１２７大豆ＤＮＡ）を、ＡＢＩ  ７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して３連に分析した。０％のイベント１２７試料（１００％  のＣｏｎｑｕｉｓｔａ  ＤＮＡ）及びＤＮＡの鋳型を含まない試料は対照として含まれた。
【０３２７】
結果は、さまざまなＰＣＲ装置において１２７−６１Ｆ及び１２７−１７６Ｒプライマーを使用するイベント１２７特異的ＰＣＲアッセイの優れた性能を実証している。検出の相対的限界は、３種すべての反応液において０．０５％であった。期待したように、非トランスジェニック大豆ＤＮＡバックグラウンド又は鋳型なしの対照中に０％のイベント１２７ＤＮＡを含有する試料においてＰＣＲ産物は検出されなかった。
【０３２８】
研究室の間のアッセイの再現性（研究室間の交換可能性）を査定するために、２つの独立した実験を、別個の研究室において実施した。非トランスジェニック大豆ＤＮＡのバックグラウンド中０．０５％から１００％のイベント１２７ＤＮＡ含有量を含有するさまざまな試料を、１００ｎｇのゲノムＤＮＡ／反応を使用し、ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｄｙａｄ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ；Ｍｕｎｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において、２つの独立した実験において２連に分析した。結果は、研究室の間のアッセイの優れた再現性（研究室間の交換可能性）を示した。結果は、１００％陽性の結果が、１００％、１％及び０．５％のイベント１２７ＤＮＡ試料によりもたらされることを実証した。さらに、少なくとも９５％の陽性結果を、０．１％及び０．０５％のイベント１２７ＤＮＡ試料により得られ（相対的ＬＯＤ≦０．０５％と仮定）、陽性なしの結果が、０％イベント１２７ＤＮＡ試料又は鋳型なしの対照において得られた。
【０３２９】
１２７−６１Ｆ及び１２７−１７６Ｒプライマーを使用する、定性的イベント特異的、ゲルに基づくＰＣＲ検出方法は、トランスジェニック大豆ＤＮＡバックグラウンド中０．０５％のイベント１２７ＤＮＡの混合物中のイベント１２７特異的標的配列を検出できる。非トランスジェニック大豆ＤＮＡだけ、又は他のトランスジェニックイベントを含有する試料はどれも、検出可能なイベント１２７特異的ＰＣＲ産物を作製せず、その結果本方法の特異性を実験的に実証している。
【０３３０】
（例６）：イミダゾリノン及びストロビルリンの組合せと共に大豆イベント１２７を使用する、植物の健康増加
大豆イベント１２７植物を、（１）イミダゾリノン系除草剤（単数又は複数）、（２）ストロビルリン系防かび剤及び（３）イミダゾリノン系除草剤（単数又は複数）とストロビルリン系防かび剤と組合せを用いて処理した。
【０３３１】
大豆イベント１２７植物を、５植物／ポットで直径２５ｃｍのポットにおいて成長させた。除草剤（単数又は複数）及び／又は防かび剤（以下の表Ｘに記載）のさまざまな適用は、処理１〜１６に関しては、播種後２３日に実施し、処理１７〜３２に関しては播種後２４日に実施した。
【表２６−１】
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【表２６−２】
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【０３３２】
適用後日数（ＤＡＡ）１、７及び１４において、植物を、植物毒性、活力、植物の丈、相対的光合成、相対的ＳＰＡＤ（すなわち、葉のクロロフィル／緑の相対的程度）及び気孔コンダクタンスに関して査定した。
【０３３３】
以下の表２６に示すように、イマザピック又はイマザピック＋イマザピルを用いた処理にピラクロストロビンを加えることにより、特定の時点においてピラクロストロビンを含まない特定の処理と比較して光合成の正味量が著しく増加し、植物全体の緑化（相対的ＳＰＡＤ）が増加し、気孔コンダクタンス増加する。
【表２７】
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【０３３４】
このことは、ピラクロストロビンとＡＨＡＳ阻害性除草剤（単数又は複数）との組合せが、イベント１２７大豆植物に驚くべき程度の有利性を提供することを示している。
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ−Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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