(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養面を有する２以上の担体および該担体と液体を収納する容器を含む接着細胞用デバイスであって、培養の過程で担体間の間隔を変化させることができる可動手段をさらに有し、該容器は、上面に開口部を有し、前記担体は、その細胞培養面の少なくとも一部が前記容器の底面に対して略垂直となる形状を有する、前記デバイス。
【請求項２】
担体が、略平面状であり、容器の底面に対して略垂直である形状を有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
２以上の担体が、１つの連結手段に着脱可能に固定され、該連結手段は容器に着脱可能に固定される、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項４】
さらに、容器内の液体を循環させる循環手段を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５】
可動手段が、担体を円状に配置するものであり、該可動手段を構成する円周が広がることにより、担体間の距離が広がる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６】
可動手段が、直線上に等間隔に担体を配置するものであり、該可動手段が伸長することにより、担体間の間隔が広がる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項７】
２つの可動手段に連結された担体がそれぞれ入れ子状に配置されており、２つの可動手段が離れるように移動することにより、隣接していた担体と隣接しなくなり、担体間の距離が変化する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のデバイスを用いたシート状細胞培養物を製造する方法であって、
シートを形成する細胞を、担体と液体を収納した容器中の前記担体の細胞培養面上に培養すること、および
細胞培養面にシートを接着した状態で担体を容器から取り出すこと、
を含む、前記方法。
【請求項９】
細胞の培養が、細胞培養面を水平面と平行にした状態でプレ培養を行い、その後細胞培養面を垂直にして本培養することにより行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞が、骨格筋芽細胞である、請求項８または９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、接着細胞を培養し、洗浄、剥離などその後の処理も行えるデバイス、該デバイスを用いたシート状細胞培養物の製造方法、および該製造方法によって製造されたシート状細胞培養物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の心臓病に対する治療の革新的進歩にかかわらず、重症心不全に対する治療体系は未だ確立されていない。心不全の治療法としては、βブロッカーやＡＣＥ阻害剤による内科治療が行われるが、これらの治療が奏功しないほど重症化した心不全には、補助人工心臓や心臓移植などの置換型治療、つまり外科治療が行われる。
【０００３】
このような外科治療の対象となる重症心不全には、進行した弁膜症や高度の心筋虚血に起因するもの、急性心筋梗塞やその合併症、急性心筋炎、虚血性心筋症（ＩＣＭ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）などによる慢性心不全やその急性憎悪など、多種多様の原因がある。
これらの原因と重症度に応じて弁形成術や置換術、冠動脈バイパス術、左室形成術、機械的補助循環などが適用される。
【０００４】
この中で、ＩＣＭやＤＣＭによる高度の左室機能低下から心不全を来たしたものについては、心臓移植や人工心臓による置換型治療のみが有効な治療法とされてきた。しかしながら、これら重症心不全患者に対する置換型治療は、慢性的なドナー不足、継続的な免疫抑制の必要性、合併症の発症など解決すべき問題が多く、すべての重症心不全に対する普遍的な治療法とは言い難い。
【０００５】
その一方、最近、重症心不全治療の解決策として新しい再生医療の展開が不可欠と考えられている。
重症心筋梗塞等においては、心筋細胞が機能不全に陥り、さらに線維芽細胞の増殖、間質の線維化が進行し心不全を呈するようになる。心不全の進行に伴い、心筋細胞は傷害されてアポトーシスに陥るが、心筋細胞は殆ど細胞分裂をおこさないため、心筋細胞数は減少し心機能の低下もさらに進む。
このような重症心不全患者に対する心機能回復には細胞移植法が有用とされ、既に自己骨格筋芽細胞による臨床応用が開始されている。
【０００６】
近年、その一例として、組織工学を応用した温度応答性培養皿を用いることによって、成体の心筋以外の部分に由来する細胞を含む心臓に適用可能な三次元に構成された細胞培養物と、その製造方法が提供された（特許文献１）。
【０００７】
このように移植に用いるための細胞培養物を製造するために、様々な培養容器が提供されている。例えば特許文献２には、多孔構造部を有する細胞培養担体基板が開示され、該多孔構造部の孔内で細胞を培養することで高密度の三次元構造体を製造することが開示されている。また特許文献３には、培養面を有する底板の一部または全部とその他の部分とが分離可能である培養容器が開示され、かかる構成により、シート状の培養物を容易に支持体へと載置できることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００７−５２８７５５号公報
【特許文献２】特開２０１１−１７２５３３号公報
【特許文献３】特開２００９−２２２４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、接着細胞の培養において、省スペースで簡便に大量の細胞を培養およびその後の処理を行うためのデバイス、該デバイスを用いたシート状細胞培養物の製造方法および該方法を用いて製造されたシート状細胞培養物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
シート状細胞培養物の製造においては、拒否反応の少なさ等の観点から自家細胞を用いることが好ましいが、自家細胞を用いてシート状細胞培養物を製造する場合、細胞の増殖や分化に時間を要するため、製造工程を律速してしまう上に、従来のシート状細胞培養物の製造方法では、通常培養容器の底面に接着させてシートを形成させるため、スペースの都合からも同時に多くのシート状細胞培養物を製造できないという新たな課題に直面した。かかる課題を解決するため、本発明者は鋭意研究を続ける中で、通常の培養条件の下で細胞培養面を水平面に対して垂直に形成しても、接着細胞が培養可能であるという新たな知見を獲得し、さらに研究を続けた結果、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、以下に関する。
［１］細胞培養面を有する１または２以上の担体および該担体と液体を収納する容器を含む接着細胞用デバイスであって、該容器は、上面に開口部を有し、前記担体は、その細胞培養面の少なくとも一部が前記容器の底面に対して略垂直となる形状を有する、前記デバイス。
［２］担体が、略平面状であり、容器の底面に対して略垂直である形状を有する、［１］のデバイス。
［３］１または２以上の担体が、１つの連結手段に着脱可能に固定され、該連結手段は容器に着脱可能に固定される、［１］または［２］のデバイス。
【００１２】
［４］さらに、容器内の液体を循環させる循環手段を含む、［１］〜［３］のデバイス。
［５］２以上の担体間の間隔を変化させることができる可動手段をさらに有する、［１］〜［４］のデバイス。
［６］［１］〜［５］のデバイスを用いたシート状細胞培養物を製造する方法であって、
シートを形成する細胞を、担体と液体を収納した容器中の前記担体の細胞培養面上に培養すること、および
細胞培養面にシートを接着した状態で担体を容器から取り出すこと、
を含む、前記方法。
［７］細胞が、骨格筋芽細胞である、［６］の方法。
［８］［６］または［７］の方法を用いて製造された、シート状細胞培養物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、省スペースで大量の細胞を培養することができる。また、培地などの液体を容器ごと交換できるため、培地の廃棄および再充填などの手順も従来に比べて圧倒的に簡便に行うことができ、培養の手間が大幅に削減できる。さらに、培養面を培養装置外からであっても容易に観察できるため、経過観察におけるコンタミネーションのリスクも低減できる。また、あらゆる接着細胞に応用できることから、製造に時間がかかるシート状細胞培養物も、同時に大量培養可能である。さらに、培地に代えて緩衝液や剥離用の液体組成物を入れた容器に換装することにより、洗浄や剥離などの作業も簡便に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、例１において観察された、培養１日目および培養４日目のスライドグラスに接着した接着細胞の様子を表した写真である。１日目には少ししか見られなかった接着細胞が、４日目には増えているのが確認できる。
【図２】図２は、培養開始時と培養６日目それぞれにおける細胞数を表したグラフである。グラフから分かるように、６日目には細胞数が倍増しており、本発明のデバイスにより接着細胞が十分に培養可能であることが示されている。
【００１５】
【図３】図３は、本発明の可動部の一態様を表す模式図である。本態様において可動部は、担体を円状に配置するものであり、可動部を構成する円周が広がることにより、担体間の距離が広がることとなる。
【図４】図４は、本発明の可動部の一態様を表す模式図である。本態様において可動部は直線上に等間隔に担体を配置するものであり、可動部が伸長することにより、担体間の間隔が広がることとなる。
【図５】図５は、本発明の可動部の一態様を表す模式図である。本態様においては、２つの可動部に連結された担体がそれぞれ入れ子状に配置されており、２つの可動部が離れるように移動することにより、隣接していた担体と隣接しなくなり、その結果担体間の距離が変化するものである。
【００１６】
【図６】図６は、本発明のデバイスの一態様を表す模式図である。本態様においては、複数の担体が着脱可能に連結手段に固定されており、該連結手段は容器に着脱可能に固定されている（Ａ）。そして該連結手段を容器から取り外すことにより、担体全てを一度に容器から取り外すことが可能である（Ｂ）。取り外した連結手段は、別に容器に換装することも可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の１つの側面において、本発明は、細胞培養面を有する１または２以上の担体および該担体と液体を収納する容器を含む接着細胞用デバイスであって、該容器は、上面に開口部を有し、前記担体は、その細胞培養面の少なくとも一部が前記容器の底面に対して略垂直となる形状を有する、前記デバイスに関する。
【００１８】
本発明において、「接着細胞用デバイス」とは培養を含む接着細胞を取り扱う複数の作業において有用なデバイスを意味する。かかる作業としては、これに限定するものではないが、例えば培養、洗浄、剥離、染色などが挙げられる。
本発明において、「担体」とは、接着細胞を接着させる足場構造を意味する。接着細胞は担体の表面である「細胞培養面」に接着することができる。
【００１９】
本発明において、「細胞培養面」とは、担体の構造のうち、細胞が接着し、培養される面を意味し、典型的には液体中に浸漬された担体の表面である。しかしながら浸漬された担体の表面全てが細胞培養面である必要はなく、例えば浸漬された表面のうち、細胞を接着させるのに好適に形成された面のみを指してもよい。
【００２０】
本発明のデバイスは、上面に開口部を有する、液体を入れるための容器、および細胞培養面を有する１または２以上の担体を有している。したがって液体および担体の出し入れは基本的に上面開口部からされ、好ましくは蓋をすることができる。液体および担体の出し入れは容器の上面開口部から行うが、容器の中の液体中に一部浸漬された状態の担体を水平方向に移動してもよい。容器の材質は液体を入れておけるものであれば何でもよく、当業者であれば適宜選択することができる。内部の観察が容易であるという観点からは、好ましくは透明な材質であり、単回使用可能であり、丈夫で細胞毒性がなく、滅菌可能という観点からは、プラスチック材質、容器底面に細胞を接着させにくくするという観点からは、好ましくは細胞接着性の低い材質である。これらの材質としては、これに限定するものではないが、例えばガラス、ポリカーボネイト、ポリスチレン、ポリプロピレンなどが挙げられる。
【００２１】
本発明に用いられる担体は、容器に出し入れ可能であるように収納されている。本発明のデバイスは１または２以上の担体を有していてよく、これらの担体は各々独立してデバイスから分離して出し入れすることが可能である。本発明の担体の形状は、該担体の有する細胞培養面の少なくとも一部が容器の底面に対して略垂直となる形状である。一般的にある面１に対して別の面２が垂直であるとは、面１の任意の法線ベクトルに対して、面２の任意の法線ベクトルが直交することを意味する。本発明において「略垂直」とは、基本的に垂直であることを意味するが、垂直とみなされる程度に傾斜しているか、または垂直と近似し得る程度に傾斜していることを許容するものであることを意図している。典型的には、液体中を容器開口部方向または開口部と逆方向への移動する際に流体力学的に抵抗が小さくなるような形状を含み、これに限定するものではないが、例えば、水平方向の表面積が垂直方向の表面積と比較して小さい、面状、錘状または柱状の形状などが挙げられる。
【００２２】
本発明の担体の材質は、細胞毒性を有しない限り特に限定されない。細胞の接着性を向上させるという観点から、好ましくは疎水性ポリマー、ポリカーボネイト、ポリスチレン、ポリプロピレンなどが挙げられる。
上述の通り、本発明の担体は、取り扱う細胞およびそのデバイスの使用目的に応じて、様々な表面処理を施されていてもよい。これに限定するものではないが例えば、通常の接着細胞の場合、接着性向上の観点から、疎水性ポリマー、フィブリン、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンなどの接着性タンパク質などでコーティングしてもよいし、シート状細胞培養物を製造する場合には、シート形状を保ったまま培養物を剥離しやすくするために、温度応答性ポリマーなどでコーティングされていてもよいし、細胞の接着性をコントロールする場合には、ナノピラーのような表面処理をされていてもよい。
【００２３】
本発明のデバイスは、担体を容易に出し入れすることができるため、容器内の液体を交換するのが非常に簡便である。さらに言えば、１または２以上の担体が容器のアタッチメントとして機能することができるため、新鮮な培地や、洗浄液、剥離液などの別の液体が入った容器にアタッチメントを換装する感覚で使用することが可能である。したがって培地の排出や注入に複雑な手順を必要としない。また、本発明のデバイスを用いることができる細胞は、接着細胞である限り特に限定されない。したがって広範な細胞に、広範な用途で用いることが可能である。そして、例えばシート状骨格筋芽細胞培養物の製造において使用する場合には、温度応答性ポリマーを細胞培養面にコートした平面形状の担体を用いるなど、使用する細胞および用途に応じて最適な担体をアタッチメントとして適宜選択することも可能である。
【００２４】
本発明の好ましい一態様において、担体が略平面状であり、容器の底面に対して略垂直となるように容器に収納されている。本発明において「略平面状」とは、基本的には平面であることを意味するが、平面とみなされるか、または平面と近似し得る程度に平面状である曲面を含むことを意図している。上述の通り本発明において担体とは、接着細胞が接着する足場構造を意味しているため、担体が略平面状である場合、広い面部分を細胞培養面とするのが通常である。したがって担体の広い面部分の任意の法線ベクトルが、容器底面の任意の法線ベクトルと略直交することを意味している。
【００２５】
かかる態様において、担体の取扱の簡便さ、培地の還流のしやすさなどの点から、好ましくは担体が平面状である。特にシート状細胞培養物の形成などにおいては、形成されるシートの厚みに偏りが少なくなるなどの利点を有する。
また、別の一態様において、１または２以上の担体が、１つの連結手段に着脱可能に固定されている。したがって、担体が連結手段に対してアタッチメントとして機能し、該連結手段を操作することにより、複数の担体をまとめて操作することも可能である。
【００２６】
また、この連結手段は容器に分離可能に固定される。したがって連絡手段が容器に対してアタッチメントとして機能し得る。連結手段は上記の構成を満たす限りにおいて、いかなる形状を有していてもよい。これに限定するものではないが、例えば容器の蓋状の形状に、複数の担体を差し込めるような形状であってもよいし、容器の内部に収まるかご状の形状で、その中に担体を差し込めるような形状であってもよい。したがって、かかる態様においては、連結手段を容器から脱離させることにより、複数の担体を有している場合であっても、それらを一度に容器内から取り出すことが可能となる。
【００２７】
本発明の別の一態様において、本発明のデバイスは、容器内の液体を循環させる循環手段を有している。容器内の液体を循環させることにより、培養の際には細胞が容器底面に滞留しないため、細胞を細胞培養面に接着させやすくなり、また、細胞培養面に接着した細胞には鮮度の高い培地を供給しやすくなり、洗浄などにおいても高い効果を期待できる。循環手段は、容器内の液体を循環させることができれば、いかなる機構を有していてもよい。かかる機構としては、例えば容器内の液体を攪拌することで循環させる攪拌手段であってもよいし、液体の流入口および流出口を容器に設け、流入口から液体を流入させ、流出口から液体を流出させることで循環させるような機構であってもよい。例えば、容器の底面に配置された攪拌子により、容器の下方から上方に向けて垂直方向に延びた担体同士の間の液体に流れを生じせしめてもよい。このように発生した流れは容器側面を伝わって容器底面に戻ることができる。
【００２８】
さらに別の一態様において、本発明のデバイスは２以上の担体を有し、これら任意の担体間の間隔を変化させることが可能な可動手段を有している。培養の過程で担体間の間隔を変化させることにより、細胞がよりコンフルエントに近づいた培養面における培地の循環効率を高めることができる。かかる可動手段としては、これに限定するものではないが、例えばレール上で各担体を水平方向および／または垂直方向に移動させ、間隔を調整するような機構の他、図３〜５などに示されるような機構が挙げられる。
【００２９】
本発明のデバイスは任意の接着細胞を用い得るため、本発明のデバイスを用いて、シート状細胞培養物を製造することもできる。したがって本発明の別の側面において、本発明のデバイスを用いたシート状細胞培養物の製造方法が提供される。かかる方法は、シートを形成する細胞を細胞培養面上に培養すること、および細胞培養面にシートを接着した状態で担体を容器から取り外すことを含む。
【００３０】
本発明において、「シート状細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいい、典型的には１の細胞層からなるものであるが、２以上の細胞層から構成されるものも含む。細胞同士は、直接および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。シート状細胞培養物は、好ましくは生体に由来しないスキャフォルドを含まない。
【００３１】
シート状細胞培養物には、シート状細胞培養物を形成し得る任意の細胞が含まれる。かかる細胞の例としては、限定されずに、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞）、心筋細胞、線維芽細胞、間葉系幹細胞、滑膜細胞、胚性幹細胞、上皮細胞、内皮細胞などが含まれる。これらのうち、本発明においては、単層の細胞培養物を形成するもの、例えば、筋芽細胞などが好ましい。
【００３２】
細胞は、細胞培養物による治療が可能な任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジなどが含まれる。また、シート状細胞培養物の形成に用いる細胞は１種類のみであってもよいが、２種類以上の細胞を用いることもできる。本発明の好ましい態様において、細胞培養物を形成する細胞が２種類以上ある場合、最も多い細胞の比率（純度）は、細胞培養物製造終了時において、６５％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上である。
【００３３】
また、上記ステップ以外に、シート状細胞培養物を形成するのに有用な様々なステップをさらに含んでよい。例えば容器から取り外された担体は、例えば洗浄、剥離などの次のステップに供されてよい。これら次のステップにおいては、本発明のデバイスを用いても用いなくてもよい。例えば洗浄のステップは、本発明の容器に、例えばハンクス緩衝液やリン酸緩衝液などのシート状細胞培養物の洗浄に用いられる液を入れ、前記担体を該容器に装着することで洗浄してもよいし、単に前記液を前記担体にかけ流して洗浄してもよい。また剥離のステップもまた、例えばハンクス緩衝液やリン酸緩衝液などのシート状細胞培養物の剥離に用いる液中で、例えば振とうなどをすることにより剥離してもよいし、シート状細胞培養物が付着した担体をそのまま支持体上に載置して、支持体にシート状細胞培養物を移してもよい。
【００３４】
さらに、本発明のデバイスにおけるシート状細胞培養物の製造をさらに円滑にするため、シート形成細胞を本発明のデバイスで培養する前に、細胞培養面上でプレ培養するステップを含んでもよい。プレ培養においては、細胞の細胞培養面への接着効率を高めるため、細胞培養面を水平面と平行にした状態で培養してよい。一度細胞培養面に接着した細胞は、その後細胞培養面を垂直にして培養しても、その生育速度は水平に培養した場合と違いが生じないため、細胞培養面を水平にしたプレ培養により培養面への細胞の接着を加速し、ある程度培養面に接着した後培養面を垂直にして本培養することにより、より効率的に細胞培養やシート状細胞培養物の製造を行うことが可能となる。
【００３５】
本発明のデバイスを用いてシート状細胞培養物を製造することにより、製造に時間および手間のかかるシート状細胞培養物を、簡便かつ大量に製造することが可能となる。これは特に移植用のシート状細胞培養物を製造する際、拒絶反応を起こさないようにするために自家細胞を用いて製造するのが好ましいところ、オーダーメイドのシート状細胞培養物を大量に準備できる点で有利である。本発明の細胞培養用デバイスは、近年種々の疾患の再生治療において有用であることが示され、自家細胞を用いることが可能であるが、分化、増殖に時間がかかる骨格筋芽細胞のシート状培養物の製造に特に好ましく用いることができる。
【００３６】
上述の通り、本発明のデバイスを用いて製造されたシート状細胞培養物は、担体または細胞培養面の形状を様々に選択することにより、用途に応じて好適な形状や大きさを選択することができる。したがって、本発明のデバイスを用いて製造されたシート状細胞培養物もまた、本発明に含まれる。
【００３７】
以下に本発明の具体的な態様を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
実施例１：垂直培養実験
容器に２０％ＦＢＳを混合したＭＣＤＢ１３１培地および１×１０５個の骨格筋芽細胞をいれ、スライドグラスを垂直に立てた状態で保持具にいれ、該保持具を容器に固定した。容器をマグネティックスターラーで攪拌しながらインキュベーター中で培養し、培養１日目および４日目にスライドグラスに接着した細胞の様子を位相差顕微鏡下で観察した。
【００３９】
また、培養６日目に、スライドグラスに接着した細胞を、１枚あたり２０ｍＬのトリプシン様タンパク質分解酵素を細胞解離剤として添加し、接着した細胞を解離させた。回収した細胞を含む培養液中の細胞を顕微鏡下で目視でカウントし、全細胞数を算出した。
【００４０】
結果を図１および図２に示す。図１は培養１日目（上）および４日目（下）における、スライドグラスに接着した細胞の様子を観察したものである。１日目では細胞がわずかに接着しているのが確認でき、４日目には接着細胞数の増大が確認できた。したがって、培養面を垂直にした状態でも骨格筋芽細胞が接着培養可能であることが確認できた。
さらにこのことを確認するため、培養６日目の細胞数を培養開始時の細胞数と比較した。結果を図２に示す。培養６日目において、細胞数は倍増していることが確認でき、このことからも、培養面を垂直にした状態での骨格筋芽細胞の接着培養が可能であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明によれば、従来の接着細胞培養デバイスでは手間がかかった培地交換や洗浄、剥離の作業を非常に簡便に行うことができ、また省スペースで培養を行うことができるため、骨格筋芽細胞シート状培養物など、製造に時間がかかる上に大量に必要な細胞培養物を製造するのに非常に有用である。また、培養のみならず、洗浄、剥離といった接着細胞培養に付随する他のプロセスへも用いることができる。さらに、用途や作業目的に合わせて担体の材質や形状を任意に選択できるため、従来容器底面の形状に依存していたシート状細胞培養物の形状も任意に変化させることが可能となり、移植部位に応じた最適な形状を選択することも可能となり、医療の現場などにおいても非常に有用である。
【符号の説明】
【００４２】
１  可動手段
２  担体
３  容器
４  連結手段
【図１】
0005912734.tif 000002
【図２】
0005912734.tif 000003
【図３】
0005912734.tif 000004
【図４】
0005912734.tif 000005
【図５】
0005912734.tif 000006
【図６】
0005912734.tif 000007