(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
Ｒ１−（ＡＡ）ｎ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−（ＡＡ）ｐ−Ｒ２
式中、
Ｘ１は、グリシン、スレオニンまたはヒスチジンであり、
Ｘ２は、アラニン、グルタミンまたはグリシンであり、
Ｘ３は、グリシン、アスパラギンまたはセリンであり、
Ｘ４は、バリン、イソロイシンまたはロイシンであり、
Ｘ５は、セリン、アスパラギン酸またはフェニルアラニンであり、
Ｘ６は、アラニン、グルタミン酸またはリジンであり、
Ｘ１がグリシンの場合、Ｘ２はアラニンで、Ｘ３はグリシンであり、
Ｘ１がスレオニンの場合、Ｘ３はアスパラギンであり、
Ｘ１がヒスチジンの場合、Ｘ２はグリシンであり、
ＡＡは、アミノ酸またはその誘導体の１つを表し、ｎ及びｐは０〜２の整数を表し、
Ｒ１は、Ｎ末端アミノ酸の一級アミノ官能基を表し、遊離、またはアセチル基またはベンジル、トシル及びベンジルオキシカルボニル基から選択される芳香族基であってよい、飽和または不飽和の炭素数１〜３０のアルキル鎖を有するアシル基で置換され、
Ｒ２は、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル官能基の水酸基を表し、遊離、または炭素数１〜３０のアルキル鎖から選択される基、ＮＨ２、ＮＨＹまたはＮＹＹ基、ここで、Ｙは炭素数１〜４のアルキル鎖を表す、により置換される、
で表される、ヒトＳＩＲＴタンパク質の高度保存領域のペプチド配列由来のペプチドであって、
前記ペプチドが以下の配列の１つに対応することを特徴とするペプチド。
（配列番号４）Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ
（配列番号５）Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＮＨ２
（配列番号６）Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ
（配列番号７）Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−ＮＨ２
【請求項２】
前記ペプチドが、１種または複数の生理的に好適な溶媒である、水、グリセロール、エタノール、プロパンジオール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシル化ジエチレングリコールまたはプロポキシル化ジエチレングリコール、環状ポリオール、白色ワセリン、植物油、これら溶媒の混合物から選ばれる溶媒に可溶化されることを特徴とする、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが医薬品として利用されることを特徴とする、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
生理的に好適な媒体中に、少なくとも請求項１または２に記載のペプチドをＳＩＲＴ６活性化剤として有することを特徴とする組成物であって、単独でまたは少なくとも１つの他の活性剤と組み合わせて使用する、化粧料組成物。
【請求項５】
前記ペプチドを、最終組成物の全重量に対して、１×１０−９Ｍ〜１×１０−３Ｍの濃度で有する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ペプチドを、最終組成物の全重量に対して、２×１０−８Ｍ〜１×１０−５Ｍの濃度で有する、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が局所投与される、請求項４〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、前記ペプチドの作用を促進する少なくとも１つの他の活性剤をさらに含有することを特徴とする、請求項４〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１または２に記載の前記ペプチド、及びＤＮＡ分解の予防及び／または修復に生理的に好適な媒体を有する組成物の、化粧料としての利用。
【請求項１０】
請求項１または２に記載の前記ペプチド、及びテロメア維持の改善に生理的に好適な媒体を有する組成物の、化粧料としての利用。
【請求項１１】
請求項１または２に記載の前記ペプチド、及びケラチノサイト分化マーカーの発現の増進、皮膚の線維芽細胞による細胞外マトリックスタンパク質の発現の促進に生理的に好適な媒体を有する組成物の、化粧料としての利用。
【請求項１２】
請求項１または２に記載の前記ペプチド、及び任意の外部ストレスに対する皮膚の保護に生理的に好適な媒体を有する組成物の、化粧料としての利用。
【請求項１３】
前記外部ストレスがＵＶ照射である、請求項１２に記載の利用。
【請求項１４】
前記外部ストレスが酸化ストレスである、請求項１２に記載の利用。
【請求項１５】
老化及び光老化の皮膚の兆候の予防及び/又は治療用であることを特徴とする請求項４記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧料及び医薬分野、特に皮膚科学分野に位置する。本発明は、ヒトサーチュイン（ｓｉｒｔｕｉｎ：ＳＩＲＴ）タンパク質の高度保存領域に由来するサーチュイン６（ＳＩＲＴ６）活性化ペプチドに関する。
【０００２】
本発明はまた、生理的に許容可能な媒体中に、ＳＩＲＴ６活性化ペプチドを有し、単独または少なくとも１種の他の活性剤と組み合わせて使用される、化粧料または医薬組成物に関する。本発明はまた、化粧料組成物中の活性剤としてこの新規ペプチドを利用することに関する。本発明はさらに、ＤＮＡ分解の予防及び／または修復、テロメア維持の改善及び細胞老化の低減に化粧料組成物を利用することに関する。さらに、本発明は、活性剤または活性剤を含有する組成物の有効量を治療箇所に塗布することにより、老化及び光老化の皮膚兆候を防止及び／または治療を目的とする化粧処理方法に適用される。
【背景技術】
【０００３】
老化は、時間とともに生物の構造と機能が変化する生理的過程と経験したストレスとの組み合わせに対応する。遺伝因子による内因性老化並びに疲労やストレス状態及び妊娠などのホルモンの変化による生化学的な変化は、汚染物質、太陽光、疾病、生活様式などの生活を通して生物が晒される環境因子による外因性の老化と区別されることがある。老化は、全ての細胞と臓器に影響を与える、緩徐な進行性の過程である。したがって、これは、外部環境と内部媒体との間にバリアを構築し、生物を外部ストレスから保護する皮膚に当てはまる。老化の過程では、皮膚に変化が表れ、しわ、小じわ、過色素沈着または低色素沈着、乾燥、さらに皮膚の脱水、表皮の薄化、弾性線維症などが表れる。
【０００４】
内因性老化は、繰り返される細胞分裂と深く関わっている。したがって、ヒト体細胞では、細胞型によっては、機能を失ったテロメアが現れ、老衰またはアポトーシスを誘導するまで、テロメアは細胞分裂の周期を短縮する。この現象が、ヒト体細胞は制限された分裂回数がプログラムされているという事実を説明する生体時計を構築する。
【０００５】
細胞老化現象は、特に皮膚が太陽光に晒される身体部分の酸化的損傷により促進され、その後、光老化が内因性老化に重なる。酸化的損傷は、種々の因子、内因性（代謝、炎症、酸化還元サイクル）及びＵＶ照射や電離放射線などの外因性因子、たばこ乱用、食事により供給される種々の分子（毒性金属、アルコール）により促進される。酸化ストレスによる損傷はまた、ＤＮＡ、脂質及びタンパク質に達する。ＤＮＡレベルでは、酸化ストレスが多くの構造的変化（突然変異、開裂、共有結合タンパク質架橋）を引き起こす。８−オキソグアニンなどの酸化された塩基は、加齢とともに増加し、１日当たり及び細胞当たり１００００塩基に達することがある。
【０００６】
老化を治療するために、酸化ストレスによりＤＮＡに生じた局部的損傷を治療でき、かつテロメア安定性を促進することにより細胞老化を遅らせることができる新規化合物を同定することは興味深い。
【０００７】
そのような状況において、最近、本発明者らはこれらの種々の機能を満たすことができる興味深い分子標的を同定した。
【０００８】
ＳＩＲＴタンパク質は、細胞核またはミトコンドリアのタンパク質であり、ＮＡＤ＋依存性デアセチラーゼ機能を有し、サーチュインファミリーに属する。サーチュインのデアセチラーゼまたはモノ−ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性は、一部のヒストンのアセチル化量を変化させる。これは、サーチュイン、特にサーチュイン１、２及び３がエピジェネティック現象の制御に関与していることを示唆する。
【０００９】
ヒトサーチュインファミリーは、進化を通して非常に保存的な、ＳＩＲＴ１からＳＩＲＴ７と名付けられた、７つのタンパク質を有する。
【００１０】
ＳＩＲＴ６は、細胞核サーチュインで特異的にテロメアクロマチンと関連し、テロメア構造の維持と安定化の役割を果たしている（非特許文献１）。したがって、ＳＩＲＴ６遺伝子を無効化したマウスでは、角化細胞の複製老化に加えて、早期老化及び短寿命が見られる（非特許文献２）。
【００１１】
テロメアは、染色体の端部を覆う構造を有し、酵素的分解、再結合及び染色体間融合から染色体を保護している。ヒトでは、これらの構造は、数千回のＤＮＡ配列の繰り返しにより構築され、ＴＲＦ１やＴＲＦ２などの特異的なタンパク質と関係がある。最近の研究により、細胞老化においてＴＲＦ２の発現が減少することが示されている（非特許文献３）。
【００１２】
一方、ＳＩＲＴ６は、ＤＮＡがオキシダントにより損傷された場合に細胞が利用するＤＮＡ修復機構である、塩基除去によるＤＮＡ修復において重要な役割を果たす。これらの発見は、ＳＩＲＴ６がゲノムの完全性及び老化現象の制御に必要であり、細胞寿命の増加に直接関わっている可能性を示唆している（非特許文献４）。
【００１３】
ＳＩＲＴ１タンパク質活性化ペプチドを利用して、皮膚の防御及び老化対策に有効な化粧料または医薬組成物を調製することができ（特許文献１〜４）、またある種のＳＩＲＴ７誘導性医薬化合物が、加齢性疾患の治療に有用であることが知られている（特許文献５）。ところが、皮膚細胞中のＳＩＲＴ６タンパク質を活性化できるペプチド化合物がスキンケアに必要であるにもかかわらず、そのようなペプチド化合物は現在まで報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】フランス特許２８８３７５１号
【特許文献２】フランス特許２８８３７５２号
【特許文献３】フランス特許２８８３７５３号
【特許文献４】フランス特許２８８３７５４号
【特許文献５】欧州特許１９５５７１５号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｍｉｃｈｉｓｈｉｔａら，Ｎａｔｕｒｅ，２００８，Ｍａｒ．２７；４５２（７１８６）：４９２−６
【非特許文献２】Ｋａｗａｈａｒａ，ＴＬら、Ｃｅｌｌ，２００９，Ｊａｎ．９；１３６（１）：６２−７４
【非特許文献３】Ａｍｏｙｅｌら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ａｐｒ．２００９；１２９（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １ｓ），ｓ７０
【非特許文献４】Ｍｏｓｔｏｓｌａｖｓｋｙら，Ｃｅｌｌ，２００６，Ｊａｎ．２７；１２４（２）：３１５−２９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、下記一般式（Ｉ）：
Ｒ１−（ＡＡ）ｎ−Ｘ１−Ｘ２−−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−（ＡＡ）ｐ−Ｒ２
のヒトＳＩＲＴタンパク質の高度保存領域に由来するペプチドが、非常に良好なＳＩＲＴ６活性化剤であり、外部ストレス、特にＵＶ照射によるＤＮＡ分解を予防し、及び／または効果的に修復し、テロメア維持を改善し、細胞老化を低下させることを示した。したがって、これらのペプチドは、皮膚の老化及び光老化の治療に好適である。
【００１７】
本発明に関するペプチドは、以下の事実により特徴付けされる。すなわち、本ペプチドは、
・皮膚細胞内のＳＩＲＴ６の発現を活性化し、
・ＵＶＢ照射による皮膚細胞のＤＮＡ分解を低減し、
・酸化ストレスに対する皮膚細胞の保護を促進し、
・特異的にテロメアに関連するＴＲＦ２タンパク質の発現を刺激し、
・線維芽細胞による細胞外マトリックスタンパク質の発現を上昇させ、
・表皮のバリア機能を最適化する。
【００１８】
「ペプチドまたはＳＩＲＴ６を活性化する活性剤またはヒトＳＩＲＴ６を活性化できる活性剤」は、細胞内に存在するＳＩＲＴ６量を、遺伝子発現を直接的または間接的に変化させてタンパク質合成を増加させることにより、またはタンパク質の安定化やメッセンジャーＲＮＡ転写の安定化などの他の生物学的過程により、増加させることが可能な、一般式（Ｉ）に示すペプチドを指すものと解する。
【００１９】
皮膚は、皮膚、粘膜及び上皮付属器を構築する組織を覆う全てを指すものと解する。
【００２０】
ＳＩＲＴファミリーの７つのタンパク質のペプチド配列のアラインメントは、欧州バイオインフォマティクス研究所から利用可能な、複数ペプチド配列アラインメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ２を利用して行い、図１に示した。最適アラインメントは、３つの高度保存領域を示す。
【００２１】
「ヒトＳＩＲＴタンパク質の高度保存領域」は、配列を最高のホモロジーに基づいて配置した時に、ファミリーの７つのサーチュインの少なくとも２つの実質的に同一の連続するアミノ酸を有するペプチド配列を指すものと解する。
第１の高度保存領域はＧｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙペプチド配列を有し、
第２の高度保存領域はＧｌｎ−Ａｓｎペプチド配列を有し、
第３の高度保存領域はＨｉｓ−Ｇｌｙペプチド配列を有する。
【００２２】
したがって、本発明の第１の対象は、一般式（Ｉ）：
Ｒ１−（ＡＡ）ｎ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−（ＡＡ）ｐ−Ｒ２
式中、
Ｘ１は、グリシン、スレオニンまたはヒスチジンであり、
Ｘ２は、アラニン、グルタミンまたはグリシンであり、
Ｘ３は、グリシン、アスパラギンまたはセリンであり、
Ｘ４は、バリン、イソロイシンまたはロイシンであり、
Ｘ５は、セリン、アスパラギン酸またはフェニルアラニンであり、
Ｘ６は、アラニン、グルタミン酸またはリジンであり、
Ｘ１がグリシンの場合、Ｘ２はアラニンで、Ｘ３はグリシンであり、
Ｘ１がスレオニンの場合、Ｘ３はアスパラギンであり、
Ｘ１がヒスチジンの場合、Ｘ２はグリシンであり、
ＡＡは、アミノ酸またはその誘導体の１つを表し、ｎ及びｐは０〜２の整数を表し、
Ｒ１は、Ｎ末端アミノ酸の一級アミノ官能基を表し、遊離、またはアセチル基またはベンジル、トシル及びベンジルオキシカルボニル基から選択される芳香族基であってよい、飽和または不飽和の炭素数１〜３０のアルキル鎖を有するアシル基で置換され、
Ｒ２は、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル官能基の水酸基を表し、遊離、または炭素数１〜３０のアルキル鎖から選択される基、ＮＨ２、ＮＨＹまたはＮＹＹ基、ここで、Ｙは炭素数１〜４のアルキル鎖を表す、により置換される、
に対応する、ヒトＳＩＲＴタンパク質の高度保存領域のペプチド配列由来の６〜１０アミノ酸からなるペプチドである。
一般式（Ｉ）の上記配列は、６〜１０のアミノ酸残基からなる。
【００２３】
本発明の特に好ましい実施態様によれば、上記ペプチドは以下の配列を有する。
（配列番号１）Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２
（配列番号２）Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２
（配列番号３）Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−ＮＨ２
（配列番号４）Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ
（配列番号５）Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＮＨ２
（配列番号６）Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ
（配列番号７）Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−ＮＨ２
（配列番号８）Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−ＮＨ２
【００２４】
本発明の特に興味深い実施態様によれば、上記ペプチドは、配列番号４の配列または配列番号５の配列に対応する。
【００２５】
本発明の他の特に好ましい実施態様によれば、上記ペプチドは、配列番号６の配列または配列番号７の配列に対応する。
【００２６】
本発明のペプチドを構築し、ＡＡまたはＸで表されるアミノ酸は、Ｌ−体及びＤ−体の異性体構造を取ることができる。好ましくは、アミノ酸はＬ−体である。
【００２７】
用語「ペプチド」は、ペプチド結合または変性ペプチド結合により連結した２個以上のアミノ酸のつながりを意味する。
【００２８】
「ペプチド」は、上述のような本発明の天然または合成ペプチド、またはタンパク質分解もしくは合成的に得られたその断片の少なくとも１つ、または前述のペプチドの配列により部分的もしくは完全に構築される配列を有する天然または合成ペプチドを指すものと解する。
【００２９】
ペプチド誘導体は、特に擬似ペプチド結合により相互接続したアミノ酸に関する。「擬似ペプチド結合」は、「通常の」ペプチド結合に置き換わることができる結合の全てを指すと解する。
【００３０】
分解に対する耐性を改善するために、本発明のペプチドの保護型が必要となる場合がある。好ましくは、Ｎ末端アミノ酸の一級アミノ官能基を保護するために、アセチル基または芳香族基から選択されてよい、飽和または不飽和の炭素数１〜３０のアルキル鎖を有するアシルであるＲ１基による置換を利用してもよい。好ましくは、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル官能基を保護するために、炭素数１〜３０のアルキル鎖、またはＮＨ２、ＮＨＹまたはＮＹＹ基、ここで、Ｙは炭素数１〜４のアルキル鎖を表す、であるＲ２基による置換を利用する。
【００３１】
本発明のペプチドでは、Ｎ末端、Ｃ末端または両末端領域を保護してもよい。
【００３２】
したがって、本発明は、配列番号１から配列番号８のペプチドが保護または非保護型であることによってあらかじめ定義、特徴付けされる組成物に関する。
【００３３】
本発明の一般式（Ｉ）のペプチドは、構成アミノ酸から、従来の化学合成（固相または均質液相）、または酵素的合成（Ｋｕｌｌｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８０，２２５，８２３４）により得てもよい。
【００３４】
本発明のペプチドは、天然のものでも合成のものでもよい。本発明では、ペプチドは化学合成された合成ペプチドが好ましい。
【００３５】
本発明では、活性剤は、単一のペプチドであっても、ペプチドまたはペプチド誘導体の混合物であってもよい。
【００３６】
本発明のペプチドは、１種または複数の生理的に好適な溶媒、例えば水、グリセロール、エタノール、プロパンジオール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシル化ジエチレングリコールまたはプロポキシル化ジエチレングリコール、環状ポリオール、これら溶媒の混合物、に有利に可溶化される。希釈されたペプチドは、ろ過滅菌法により滅菌する。
【００３７】
この希釈ステップ後、ペプチドを化粧料の分野で利用されているリポソームやマイクロカプセルなどの化粧料または医薬担体にカプセル化または包み込んでもよく、または粉状有機ポリマーやタルクやベントナイトなどの鉱物支持体に吸着させてもよい。
【００３８】
「生理的に好適」とは、選択した溶媒が、毒性または不耐性反応を起こすことなく、皮膚に好適に接触させることが可能であることを意味すると解する。
【００３９】
本発明のペプチドは、医薬品として利用してもよい。
【００４０】
本発明の第２の対象は、生理的に好適な媒体中に、一般式（Ｉ）のペプチドを、ヒトＳＩＲＴ６を活性化する活性剤として有する化粧料または医薬、特に皮膚用組成物である。
【００４１】
本発明の有利な実施態様によれば、本発明の活性剤は、本発明の組成物中に、最終組成物の全重量に対して、約１×１０−９Ｍ〜１×１０−３Ｍ、好ましくは２×１０−８Ｍ〜１×１０−５Ｍの濃度で含まれる。
【００４２】
この濃度範囲は、目的の結果を得るために必要な量、すなわちＳＩＲＴ６を活性化し、ＤＮＡ分解を抑制し、テロメア維持を改善するために必要な量に対応する活性剤の有効量である。
【００４３】
好ましい態様では、本発明の組成物は、皮膚に対して生理的に好適な媒体を有する、局所投与に好適な形態で存在する。「生理的に好適」とは、媒体が、毒性、不適合性、不安定性、アレルギー反応、その他の二次的影響のリスクなしに、皮膚またはヒト上皮付属器に接触させて使用するのに適していることを指すと解する。
【００４４】
「局所投与」とは、本発明の活性剤またはその活性剤を含有する組成物を、皮膚表面に適用または塗ることを指すと解する。
【００４５】
皮膚上に適用される組成物は、水溶液もしくは含水アルコール溶液、油中水型もしくは水中油型エマルション、マイクロエマルション、水性もしくは無水ゲル、セラム、他の小胞分散体、パッチ、クリーム、スプレー、軟膏、ポマード、ローション、コロイド、溶液、懸濁液、その他の形態であってよい。
【００４６】
これらの組成物は、特に水溶液、含水アルコール、油性溶液、水中油型エマルション、油中水型エマルションまたは多層エマルションの形態であってよい。さらに、皮膚、粘膜、唇及び／または上皮付属器に好適に適用できる、クリーム、懸濁液または粉体の形態であってもよい。これらの組成物は、多少流動性を有することがあり、クリーム、ローション、乳液、セラム、ポマード、ゲル、ペーストまたはフォームの外観を有する。また、棒状などの固体で存在することもあり、また、エアロゾル状で皮膚に適用してもよい。さらに、ケア製品として及び／または皮膚化粧品として利用してもよい。
【００４７】
さらに、これら全ての組成物は、製剤に必要な補助剤に加え、適用が考えられる分野で通常利用されている添加剤を有する。例えば、共溶媒（エタノール、グリセロール、ベンジルアルコール、湿潤剤など）、増粘剤、希釈剤、乳化剤、抗酸化剤、着色剤、遮光剤、顔料、フィラー、保存剤、香料、防臭剤、精油、微量元素、必須脂肪酸、表面活性剤、成膜ポリマー、薬液用または鉱物用フィルター、保湿剤または温泉水などを有する。例えば、多糖類やポリペプチドなどの天然の水溶性ポリマー、メチルセルロース型やヒドロキシプロピルセルロース型のセルロース系誘導体、他の合成ポリマー、ポロキサマー、カルボマー、シロキサン、ＰＶＡまたはＰＶＰ、特にＩＳＰ社製のポリマーが挙げられる。
【００４８】
全ての場合において、当業者であれば、これらの補助剤及びその割合が、本発明の組成物の目的とする有利な性質を害しないように選択されていることを確認する。これらの補助剤は、例えば、組成物の全重量に対して０．０１〜２０％の濃度範囲で存在してよい。本発明の組成物がエマルションである場合、油層は、組成物の全重量に対して５〜８０重量％、好ましくは５〜５０重量％である。組成物に使用される乳化剤と共乳化剤は、対象とする分野で従来から利用されているものであってよい。例えば、組成物に使用される乳化剤と共乳化剤は、組成物の全重量に対して０．３〜３０重量％の割合で利用してよい。
【００４９】
本発明の活性剤は単独で利用してもよく、他の活性剤と組み合わせて利用してもよいと解する。
【００５０】
有効な手段として、本発明の利用可能な組成物は、本発明の活性剤の活性を促進することを目的とし、かつ特に加齢性障害の予防及び／または治療を目的とする、少なくとも１つの他の活性剤をさらに含有する。
【００５１】
限定されるわけではないが、成分の種類として下記が挙げられる。すなわち、他のペプチド活性剤、植物抽出物、瘢痕形成薬、老化防止、しわ防止、スムージング、抗ラジカル、抗ＵＶ剤、真皮高分子の合成またはエネルギー代謝を刺激する薬剤、保湿剤、抗菌材、抗真菌剤、抗炎症剤、麻酔薬、皮膚分化調節剤、染色または脱色剤、爪または毛髪の成長を刺激する薬剤。
【００５２】
優先的には、抗ラジカルまたは抗酸化剤、真皮高分子の合成を刺激する薬剤、他のエネルギー代謝を刺激する薬剤が利用される。特に好ましい実施態様では、本発明の組成物は、本発明のペプチドに加え、
・少なくとも１つのチトクロームｃ活性化化合物、及び／または、
・少なくとも１つのアクアポリン活性化化合物などの保湿化合物、及び／または、
・少なくとも１つのサーチュイン活性化化合物及び特にフランス特許ＦＲ２８８３７５４、米国特許ＵＳ１１／９１０，０９８または欧州特許ＥＰ１８６８６３１に記載のペプチド、及び／または、
・少なくとも１つの細胞接着を増進する化合物、及び／または、
・少なくとも１つのコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ムコ多糖体などのマトリックスタンパク質の産生を促進する化合物、及び／または、
・少なくとも１つのプロテアソーム活性を調整する化合物、及び／または、
・少なくとも１つの日周リズムを調整する化合物、及び／または、
・少なくとも１つのＨＳＰタンパク質を調整する化合物、及び／または、
・少なくとも１つの細胞エネルギーを増進する化合物、及び／または、
・少なくとも１つの皮膚色素沈着を調整する化合物、及び／または、
・少なくとも１つの補酵素Ｑ１０活性化化合物、及び／または、
・少なくとも１つのトランスグルタミナーゼ活性化化合物、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性化化合物などのバリア機能を改善する化合物、及び／または、
・少なくとも１つのミトコンドリア保護化合物、及び／または、
・少なくとも１つの表皮または真皮の成体の体細胞を保護または調整する化合物、及び／または、
・少なくとも１つのＤＮＡ分解を保護または修復する化合物
を有する。
【００５３】
上記化合物は植物、動物または微生物のペプチド加水分解物などの天然由来のものでも、ペプチドなどのように合成物でもよい。
【００５４】
その機能とは無関係に、組成物中の本発明の活性剤に関連する他の活性剤は、多種多様の化学構造を有していてよい。その非制限的な例として、ペプチド、ビタミンＣ及びその誘導体、ビタミンＢ群、ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン）、フィトステロール、サリチル酸及びその誘導体、レチノイド、フラボノイド、糖化アミン、アゾール化合物、金属塩、天然由来ペプチド抽出物、その他天然または合成ポリマーが挙げられる。
【００５５】
本発明の他の対象は、本発明のペプチドを医薬品として生理的に許容可能な媒体中に有する医薬組成物である。本発明の医薬組成物は、乾燥症、脱色または褐色斑、角化症などが挙げられる、早期老化または光老化と関連する皮膚症状を改善する。
【００５６】
有利なことに、本発明のこの形態における組成物は、医薬使用の経口投与に適している。したがって、組成物は、特に錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、チュアブルペースト、そのまま使用するかまたは使用直前に液体と混合して使用する粉剤、シロップ剤、ゲルまたは当業者に周知の他の剤型にしてよい。これらの剤型は、着色剤、甘味料、香料、増量剤、結合剤、保存剤などの好適な製剤添加物を含有する。
【００５７】
本発明の第３の対象は、一般式（Ｉ）のペプチドを、ＤＮＡ分解を予防及び／または修復する活性剤として有する化粧料組成物である。
【００５８】
「ＤＮＡ分解を予防及び／または修復する活性剤」とは、ＤＮＡ分解を抑制、またはＤＮＡ塩基間の光化学反応による損傷の修復を促進するペプチドを指すと解する。
【００５９】
本発明の第４の対象は、一般式（Ｉ）のペプチドを、テロメア維持を改善し、細胞老化を低下させる活性剤として有する化粧料組成物である。
【００６０】
「テロメア維持を改善し、細胞老化を低下させる活性剤」とは、ＴＲＦ２やＳＩＲＴ６などのように、テロメアと特異的に関連して、その安定性に関わるタンパク質の合成を増進するペプチドを指すと解する。
【００６１】
本発明の第５の対象は、一般式（Ｉ）のペプチドを、ケラチノサイト分化マーカーの発現を増進し、皮膚の線維芽細胞による細胞外マトリックスタンパク質の発現を促進する活性剤として有する化粧料組成物である。
【００６２】
本発明の活性剤のこれら特定の性質は、真皮の質を改善し、それにより皮膚の堅さを改善し、表皮のバリア機能を最適化する。
【００６３】
本発明の第６の対象は、あらゆるタイプの外部ストレスから皮膚を保護するために、一般式（Ｉ）のペプチドを活性剤として有する組成物の利用である。
【００６４】
用語「外部ストレス」は、環境が作り出すストレスを指すと解する。例として、汚染、ＵＶ照射、表面活性剤などの刺激製品、保存剤、香料、摩擦、髭剃り、脱毛などの機械的ストレスが挙げられる。汚染は、ディーゼル粒子、オゾン、重金属などによる「外部」汚染と、特に塗料、接着剤、壁紙溶剤（トルエン、スチレン、キシレン、ベンズアルデヒドなど）からの放出や喫煙による「内部」汚染の両者を指すと解する。
【００６５】
特に、本発明の対象は、本発明のペプチドを、ＵＶ照射及び酸化ストレスによる皮膚の損傷を予防または治療するための有効量を有する化粧料組成物の利用である。
【００６６】
本発明の第７の対象は、本発明の活性剤の有効量を有する組成物を、老化や光老化の皮膚兆候を予防及び／または治療するために、皮膚の処置箇所に局所的に適用することを特徴とする、化粧処理法である。
【００６７】
老化の皮膚兆候は、表皮の角質層の表面粗さ、しわ、小じわなどの老化による皮膚及び上皮付属器の外見の変化だけでなく、ＵＶ照射後の真皮の薄化や他の皮膚の内部分解などの、外見の変化としてはその徴候が現れない、皮膚の内部変化を指すと解される。
【００６８】
特に、本発明は、ＵＶ照射によるストレスに対して皮膚を保護することを目的とする化粧処理法に関する。
【００６９】
本発明の他の利点及び特徴は、例示的、非限定的な目的で示す実施例により、より明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ヒトＳＩＲＴタンパク質のペプチド配列のアラインメント（アラインメントは、欧州バイオインフォマティクス研究所から利用可能な、複数ペプチド配列アラインメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ２を使用して行った）である。
【図２】配列番号５のペプチドで２４時間処理した正常ヒト線維芽細胞のサーチュイン６（ＳＩＲＴ６）免疫標識の定量化である。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
実施例１：配列番号５及び配列番号７のペプチドによる、サーチュイン６発現活性化効果の証明
本研究の目的は、配列番号５及び配列番号７のペプチドによる、ヒト皮膚でのサーチュイン６発現への影響を決定することである。そのために、正常ヒト角化細胞（ＮＨＫ）培養物及び正常ヒト線維芽細胞培養物を免疫蛍光により特異的に標識した。
【００７２】
プロトコール：ＮＨＫまたは正常ヒト線維芽細胞を、１日１回、配列番号５または配列番号７のペプチドの１×１０−６Ｍまたは３×１０−６Ｍの溶液で処理する。
【００７３】
２４、４８及び７２時間の短期間処理の研究を行った。
【００７４】
長期間処理の研究も、線維芽細胞については５〜１７継代（または１２継代）、ＮＨＫについては３〜５継代（または２継代培養）により行った。
【００７５】
抗−ＳＩＲＴ６抗体による免疫標識のために、細胞を３．７％で１０分間、パラホルムアルデヒドで洗浄、固定化する。
【００７６】
その後、細胞を抗−ＳＩＲＴ６特異抗体（Ａｂｃａｍ、参照番号：ａｂ６２７３８、ポリクローナル、ウサギ）の存在下に培養した後、蛍光色素を結合した適切な第２抗体を反応させる。特定の媒体に固定し、スライドを落射蛍光顕微鏡（ニコンＥｃｌｉｐｓｅＥ８０ｉ顕微鏡）により観察する。
【００７７】
蛍光強度を、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ分析器バージョン５ソフトウェアを使用してイメージを分析することによって定量する。
【００７８】
結果：試験条件の全てにおいて、コントロール条件下の蛍光よりも強い蛍光が、１×１０−６Ｍまたは３×１０−６Ｍの配列番号５または配列番号７のペプチドで処理した培養物で観察された。
【００７９】
線維芽細胞では、１×１０−６Ｍの配列番号５のペプチドで２４時間処理した細胞において、コントロール細胞よりも最高で蛍光が４７％上昇しているのが観察される（図２）。
【００８０】
ＮＨＫでは、３×１０−６Ｍの配列番号５のペプチドで７２時間処理した細胞において、コントロール細胞よりも最高で蛍光が３５％上昇しているのが観察される。蛍光は、最初の７２時間、用量依存的に上昇する。
【００８１】
一方、試験に用いた両種の細胞において、長期間の処理の間ずっと、ＳＩＲＴ６の発現の上昇が維持されている。
【００８２】
結論：配列番号５及び配列番号７のペプチドは、短期培養の正常ヒト線維芽細胞及びＮＨＫで、サーチュイン６の発現を著しく上昇させる。また、サーチュイン６の発現を刺激する効果は、長期間維持される。
【００８３】
実施例２：配列番号４のペプチドによる、ＴＲＦ２タンパク質発現活性化効果の証明
本研究の目的は、テロメアと特異的関連性を有し、その維持に関与しているタンパク質である、ＴＲＦ２タンパク質のヒト皮膚での発現に対する、配列番号４のペプチドの影響を決定することである。そのために、正常ヒト角化細胞（ＮＨＫ）培養物及び正常ヒト線維芽細胞培養物に対して免疫蛍光による特異的標識を長期間行った。
【００８４】
プロトコール：線維芽細胞については５〜１７継代（または１２継代）、ＮＨＫについては１〜２継代（または１継代、１０日間の処理）培養中の細胞を、１日１回、配列番号４のペプチドの１×１０−６Ｍまたは３×１０−６Ｍの溶液で処理する。
【００８５】
抗−ＴＲＦ２抗体による免疫標識のために、細胞を３．７％で１０分間、パラホルムアルデヒドで洗浄、固定化する。
【００８６】
その後、細胞を抗−ＴＲＦ２特異抗体（Ａｂｃａｍ、参照番号：ａｂ１３５７９、ポリクローナル、マウス）の存在下に培養した後、蛍光色素を結合した適切な第２抗体を反応させる。特定の媒体に固定し、スライドを落射蛍光顕微鏡（ニコンＥｃｌｉｐｓｅＥ８０ｉ顕微鏡）により観察する。
【００８７】
蛍光強度を、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ分析器バージョン５ソフトウェアを使用してイメージを分析することによって定量する。
【００８８】
結果：試験条件の全てにおいて、コントロール条件下による蛍光よりも強い蛍光が、１×１０−６Ｍまたは３×１０−６Ｍの配列番号４のペプチドで処理した培養物で観察された。
【００８９】
線維芽細胞では、１×１０−６Ｍの配列番号４のペプチドで処理した１２継代培養細胞において、コントロール細胞よりも最高で蛍光が６３％上昇しているのが観察される。蛍光は、用量依存的に上昇する。
【００９０】
ＮＨＫでは、３×１０−６Ｍの配列番号４のペプチドで１０日間処理した細胞において、コントロール細胞よりも最高で蛍光が３９％上昇しているのが観察される。蛍光は、用量依存的に上昇する。
【００９１】
結論：配列番号４のペプチドは、長期培養の正常ヒト線維芽細胞及びＮＨＫで、ＴＲＦ２タンパク質の発現を用量依存的に著しく上昇させる。
【００９２】
実施例３：配列番号５のペプチドによる、表皮分化及び表皮のバリア機能を活性化する効果の証明
本研究の目的は、配列番号５のペプチドによる表皮分化への影響を決定することである。そのために、長期間培養した基底層の角化細胞に特異的に発現される、主たる表皮分化のマーカーの発現を調査した。マーカーは、トランスグルタミナーゼ１及びインボルクリンを試験した。
【００９３】
プロトコール：１〜３継代（または２継代、１１日間の処理）の培養ＮＨＫを、１日１回、配列番号５のペプチドの１×１０−６Ｍまたは３×１０−６Ｍの溶液で処理する。
【００９４】
細胞を洗浄、固定化する。特異部位を暴露した後、ＴＧ１に対する特異抗体（ＴＥＢＵ、参照番号：ｓｃ−２５７８６、ポリクローナル、ウサギ）、インボルクリンに対する特異抗体（ＮｏｖｏｃａｓｔｒａＮＣＬ−ＩＮＶ、マウスモノクローナル、クローンＳＹ５）の存在下、細胞を培養する。次いで、蛍光色素を結合した適切な第２抗体の存在下に培養する。観察を簡単に行うために、細胞核を、ＤＮＡに強固に結合する青色蛍光分子であるＤＡＰＩ（４’，６’−ジアミノ−２−フェニリンドール）で対比染色してもよい。特定の媒体に固定し、スライドを落射蛍光顕微鏡（ニコンＥｃｌｉｐｓｅＥ８０ｉ顕微鏡）により観察する。
【００９５】
結果：コントロール条件下による蛍光よりも強い蛍光が、１×１０−６Ｍまたは３×１０−６Ｍの配列番号５のペプチドで処理した培養物及び皮膚部分で観察される。
【００９６】
結論：１×１０−６Ｍまたは３×１０−６Ｍの配列番号５のペプチドは、ＮＨＫ分化を改善し、表皮のバリア機能を最適化する。
【００９７】
実施例４：配列番号５のペプチドによる、皮膚細胞外マトリックス分子の発現を活性化する効果の証明
本研究の目的は、配列番号５のペプチドによる、皮膚細胞外マトリックス分子の発現に対する影響を決定することである。そのために、長期間培養した正常ヒト線維芽細胞におけるコラーゲンＩ及びＩＩＩの発現を調査した。
【００９８】
プロトコール：５〜１７継代（または１２継代）の培養正常ヒト線維芽細胞を、１日１回、配列番号５のペプチドの１×１０−６Ｍまたは３×１０−６Ｍの溶液で処理する。
【００９９】
細胞を冷メタノールで５分間洗浄、固定化する。特異部位を暴露した後、コラーゲンＩに対する特異抗体（ＴＥＢＵ、参照番号：６００−４０１−１０３、ポリクローナル、ウサギ）、またはコラーゲンＩＩＩに対する特異抗体（ＴＥＢＵ、参照番号：６００−４０１−１０５、ポリクローナル、ウサギ）の存在下、細胞を培養する。次いで、蛍光色素を結合した適切な第２抗体の存在下に培養する。特定の媒体に固定し、スライドを落射蛍光顕微鏡（ニコンＥｃｌｉｐｓｅＥ８０ｉ顕微鏡）により観察する。
【０１００】
結果：コントロール条件下による蛍光よりも強い蛍光が、１×１０−６Ｍまたは３×１０−６Ｍの配列番号５のペプチドで処理した培養物及び皮膚部分で観察される。
【０１０１】
結論：１×１０−６Ｍまたは３×１０−６Ｍの配列番号５のペプチドを長期間適用することによって、皮膚細胞外マトリックスの二つの必須タンパク質である、コラーゲンＩ及びＩＩＩの発現が増加される。
【０１０２】
実施例５：ＵＶ照射によるＤＮＡの損傷に対する、配列番号５のペプチドの効果の証明
本研究の目的は、ＵＶ照射によるＤＮＡの損傷に対する、配列番号５のペプチドの保護効果を決定することである。そのために、ＤＮＡの損傷を細胞レベルで定量化することが可能な、コメットアッセイを行った。
【０１０３】
プロトコール：正常ヒト線維芽細胞を、１×１０−６Ｍまたは３×１０−６Ｍ濃度の配列番号５の配列のペプチドとともに２４時間培養した後、６０ｍＪ／ｃｍ２の照射量のＵＶＢで照射し、１×１０−６Ｍまたは３×１０−６Ｍ濃度の上記ペプチドで再度２４時間処理する。
【０１０４】
コントロールとして、処理をしない条件で培養、照射を行う。
【０１０５】
次いで、細胞をトリプシンにより支持体から剥離し、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離して濃縮し、計数する。
【０１０６】
所定の数の細胞（２５０００個）を０．７５％で低融点アガロースゲルに加え、事前に１％アガロースで覆ったガラススライド上に載せる。スライドを溶菌溶液に４℃で１．５時間浸漬し、次いでアルカリ溶液に４℃で２０分間浸漬する。これによって細胞は溶菌し、ＤＮＡの変性を行う。スライドを電気泳動溶液に浸漬した後、電界（２０Ｖ−２５０ｍＡ）をかける。このように変性したＤＮＡを、アガロースゲル内を４℃で３０分間移動させる。ＤＮＡ蛍光染料として２μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムをスライドに２０分間適用し、ＤＮＡが損傷されている場合コメット・テール形状にみえるＤＮＡを顕微鏡で観察する。
【０１０７】
定量ソフトウェアにより、試験各条件での平均「テール・モーメント」（またはコメット・テールの長さ）を決定することができる。このパラメーターにより、ＤＮＡの損傷レベルに関する情報が得られる。このパラメーター値が高いほど、ＤＮＡ分解が激しい。
【０１０８】
結果：３×１０−６Ｍの配列番号５のペプチドで処理した細胞では、テール・モーメントがコントロール条件でのテール・モーメントに比べて、２４．８％低減している結果が見られる。
【０１０９】
結論：処理後にＵＶＢ照射を受けた細胞のＤＮＡは、コントロール細胞のＤＮＡに比べて損傷されにくい。この結果により、配列番号５の配列のペプチドのＵＶＢ照射に対する予防的保護及び治療効果が確認される。
【０１１０】
実施例６：酸化ストレス下の配列番号５の保護効果の証明
本研究の目的は、酸化ストレス下の角化細胞に対する、配列番号５のペプチドの保護効果を決定することである。そのために、Ｈ２Ｏ２による酸化ストレス後に特異的免疫標識を行い、サーチュイン６の発現を定量的かつ定性的に評価した。
【０１１１】
プロトコール：培養中のＮＨＫを、配列番号５のペプチドの１×１０−６Ｍまたは３×１０−６Ｍの溶液で２４時間処理する。その後、細胞を２ｍＭのＨ２Ｏ２の存在下に培養し、洗浄した後、配列番号５のペプチドの１×１０−６Ｍまたは３×１０−６Ｍの溶液で再度２４時間処理する。コントロールとして、処理及びＨ２Ｏ２ストレス負荷を行わないで（コントロール０）細胞培養し、処理を行わず、Ｈ２Ｏ２ストレス負荷だけを行って（コントロール１）、細胞培養した。
【０１１２】
抗−ＳＩＲＴ６抗体による免疫標識のために、細胞を３．７％で１０分間、パラホルムアルデヒドで洗浄、固定化する。
【０１１３】
その後、細胞を抗−ＳＩＲＴ６特異抗体（Ａｂｃａｍ、参照番号：ａｂ６２７３８、ポリクローナル、マウス）の存在下に培養した後、蛍光色素を結合した適切な第２抗体を反応させる。特定の媒体に固定し、スライドを落射蛍光顕微鏡（ニコンＥｃｌｉｐｓｅＥ８０ｉ顕微鏡）により観察する。
【０１１４】
蛍光強度を、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ分析器バージョン５ソフトウェアを使用してイメージを分析することによって定量する。
【０１１５】
結果：定量分析は、ＮＨＫを１×１０−６Ｍまたは３×１０−６Ｍの配列番号５のペプチドで処理し、Ｈ２Ｏ２ストレスを与えた場合、ＳＩＲＴ６の発現が、コントロール１に比べてそれぞれ１６％及び２０％上昇することを示す。
【０１１６】
結論：予防的に配列番号５のペプチドにより処理し、続いて酸化ストレスを与えた細胞は、コントロール細胞に比べて、そのＳＩＲＴ６タンパク質含量が高い。この結果により、配列番号５の配列のペプチドが酸化ストレス下のＮＨＫの保護を促進することが確認される。
【０１１７】
実施例７：組成物の調製
１．日焼け防止クリーム
【０１１８】
【表１】
0005938787.tif 000002
【０１１９】
Ａ相及びＢ相の成分を７０℃〜７５℃で別々に加熱する。Ｂ相を攪拌しながらＡ相に乳化させる。Ｃ相を、攪拌を強めながら４５℃で加える。温度が４０℃未満に下がったら、さらにＤ相を加える。激しく攪拌しながら、２５℃まで温度を下げる。
【０１２０】
２．アンチエージングクリーム
【０１２１】
【表２】
0005938787.tif 000003
【０１２２】
Ａ相を６５〜７０℃で調製、融解する。Ｃ相を６５〜７０℃に加熱する。Ａ相がＢ相に乳化される直前に、Ｂ相をＡ相に添加する。約４５℃で、Ｄ相を添加してカルボマーを中和する。Ｅ相を穏やかに攪拌しながら添加し、２５℃まで温度を下げる。必要に応じてＦ相を添加する。
【０１２３】
３．プロテクティブデイクリーム
【０１２４】
【表３】
0005938787.tif 000004
【０１２５】
Ａ相を調製し、攪拌しながら７５℃に加熱する。攪拌しながらカーボポールを、次いでキサンタンガムを分散させてＢ相を調製する。静置する。７５℃に加熱する。
【０１２６】
その温度で、ローター・ステーターで攪拌しながらＡ相をＢ相に乳化させる。急速攪拌しながら、Ｃ相により中和する。４０℃に冷却後、Ｄ相、次いでＥ相を添加する。穏やかに攪拌しながら冷却を続け、Ｆ相を添加する。
【図１】
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【図２】
0005938787.tif 000006
【配列表】
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