(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カキノキ科カキの葉を水／１，３−ブチレングリコール＝１００／０〜５０／５０（質量比）の溶媒で抽出した抽出物からなるプロフィラグリン遺伝子発現促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロフィラグリン遺伝子の発現促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
表皮は、厚さが約０．２ｍｍであり、構成する細胞のほとんどが表皮角化細胞である。この表皮角化細胞は表皮の最下層の基底層で分裂し、成熟するに伴い、有棘層、顆粒層、角層へと上方の層へ移行していく。この過程を角化という。
【０００３】
角層は、生体を被覆し、水分の保持や外界からの進入物に対する防御を行う働きをする。このような角層は、表皮角化細胞が産生するケラチンやフィラグリンや脂質などさまざまな物質から構成されている。ケラチンは、表皮細胞の細胞骨格としてのトノフィラメントを形成し、表皮細胞の形態保持に必要不可欠である。
【０００４】
フィラグリンは、顆粒層内のケラトヒアリン顆粒中にプロフィラグリンという前駆物質の状態で多量に存在し、角化の過程においてプロフィラグリンが脱リン酸化とぺプチジルアルギニンデイミナーゼというプロテアーゼの作用によってフィラグリンに分解される。プロフィラグリンから遊離されたフィラグリンは角質細胞の細胞内でケラチン線維同士をコンパクトに凝集させ、細胞全体を扁平化させると考えられている。さらに、フィラグリンは角層の上層でアミノ酸に分解され、そのアミノ酸とその誘導体が天然保湿因子として角層に水分を与えるため、角層に柔軟性を与え、また、角層の落屑に関与する酵素の活性化にも寄与し、角層の正常なターンオーバーにも影響している。以上のように、フィラグリンは健全な角層を形成する上でたいへん重要な役割を担っている。
【０００５】
一方、フィラグリンは乾燥状態によってその合成力が低下し、角層におけるアミノ酸量が低下すること（非特許文献１参照）、さらに、天然保湿因子（アミノ酸）が低下するとケラチンの分子運動性が低下し、角層の柔軟性が失われることが報告されている（非特許文献２参照）。また、プロフィラグリン遺伝子の異常により尋常性魚鱗癬（皮膚の乾燥・落屑と、体幹・四肢伸側の魚鱗状外観を特徴とする遺伝性疾患）が発症する（非特許文献３参照）が、その異常はアトピー性皮膚炎の発症にも関与していることが報告されている（非特許文献４参照）。さらに、プロフィラグリン遺伝子の異常はアトピー性皮膚炎のみならず、気管支喘息患者にも関連していることが報告されている（非特許文献５参照）。
【０００６】
そこで、このような角層の柔軟性低下や皮膚疾患に対して、外部からアミノ酸などの天然保湿因子、グリセリンなどの多価アルコール、ヒアルロン酸などの水溶性高分子、セラミドなどの脂質等を保湿剤として補給する方法が試みられているが、角層は生きた組織や細胞と異なり、生命体ではない複雑な構築物として作り上げられた組織であるので、上記の保湿剤を直接塗布しただけでは健全な角層へ戻すことは困難であり、持続的な効果は期待できない。また、ステロイド剤の塗布も考えられるが、ステロイド剤では副作用の懸念があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Arch. Dermatol. Res.、288、442-446 、1996年
【非特許文献２】皮膚と美容、36、4 、210-228 、2004年
【非特許文献３】Nature Genetics 、38、337-342 、2006年
【非特許文献４】Nature Genetics 、38、441-446 、2006年
【非特許文献５】J. Allergy Clin. Immunol. 、120 、64-68 、2007年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、このような状況下においてなされたものであり、フィラグリンの産生を促すことにより健全な角層を形成させることができ、安全で効果の高いプロフィラグリン遺伝子発現促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、このような状況を鑑みて、食品として長年利用され安全性が高い各種植物の抽出物についてプロフィラグリン遺伝子発現促進作用を調べた結果、カキノキ科カキの葉の抽出物が低濃度で高いプロフィラグリン遺伝子発現促進作用を有することを見出した。すなわち本発明は、カキノキ科カキの葉を水／１，３−ブチレングリコール＝１００／０〜５０／５０（質量比）の溶媒で抽出した抽出物からなるプロフィラグリン遺伝子発現促進剤である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のプロフィラグリン遺伝子発現促進剤は、食品として長年利用され安全性が高く毒性が低いカキの葉の抽出物からなるので、安全性が高く、またヒトのプロフィラグリン遺伝子発現促進効果に優れている。したがって、本発明のプロフィラグリン遺伝子発現促進剤は、フィラグリンの産生を促すことにより健全な角層を形成させるのに有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施形態について説明する。
本発明のプロフィラグリン遺伝子発現促進剤はカキノキ科カキの葉の抽出物からなる。本発明に使用されるカキは、カキノキ科カキノキ属の植物で学名はDiospyros kaki Thunb. で示され、カキノキ（柿の木）とも呼ばれている。カキ（柿）は通常、果実を食用にするため広く栽培され、東アジアや欧米など幅広い地域で栽培されている。また、日本でも古くから栽培されており、果実の食用はもとより、柿の葉が柿の葉寿司や柿の葉茶などで利用されている。したがって、本発明に使用されるカキの葉は食品として長年利用され安全性が高く毒性が低い材料である。
【００１２】
カキの葉の抽出物は、乾燥したカキの葉を特定の抽出溶媒に浸漬する抽出工程を経て得られる。抽出に用いられる溶媒としては、炭化水素、エステル、ケトン、エーテル、ハロゲン化炭化水素、水溶性のアルコール類及び水などが挙げられる。中でも好ましくは水、低級アルコール、多価アルコールの１種または２種以上であり、更に好ましくは水、エタノール、１，３−ブチレングリコールの１種または２種以上である。抽出方法としては、例えば、カキの葉に抽出溶媒を加えて１時間以上浸漬し、ろ過する方法が挙げられる。抽出時の温度は、使用する抽出溶媒の沸点以下の温度であり、例えば、抽出溶媒が水の場合では、好ましくは４０〜９０℃、より好ましくは５０〜８０℃であり、抽出溶媒が５０質量％の１，３−ブチレングリコール（ＢＧ）水溶液の場合では、好ましくは３０〜９０℃、より好ましくは４０〜８０℃である。抽出に際しては、カキの葉をそのまま、または乾燥させた後に、細断ないし粉砕したものを用いるのが好ましい。得られた抽出液は、そのまま用いてもよく、あるいは溶媒留去により濃縮したり、カラムクロマトグラフィーや溶媒分画等の処理により精製したりしてもよい。また、得られた抽出液を０〜１０℃、好ましくは２〜６℃で、３〜１０日間、好ましくは５〜８日間静置した後、ろ過して得られたろ液を抽出物として用いても良い。
【００１３】
本発明のプロフィラグリン遺伝子発現促進剤は、安全性が高く毒性が低いので、外用投与でも内服投与でもいずれの投与方法でも投与が可能であり、医薬品、医薬部外品、化粧品類（例えば、化粧水、乳液、クリーム、ジェル、美容液、パック、オイル、軟膏、スプレー、貼付剤など）等の製剤に配合して利用することができる。該製剤中に配合する場合のカキ葉抽出物（本発明のプロフィラグリン遺伝子発現促進剤）の含有量は、固形分換算で０．００００５〜５質量％であり、好ましくは０．０００１〜２．５質量％である。含有量が０．００００５質量％未満ではプロフィラグリン遺伝子発現促進効果を発揮するのが困難であり、５％質量を超えると製剤の安定性に問題が生じ易くなる。
【実施例】
【００１４】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。
【００１５】
〔実施例１〕
奈良県内で６月に採取したカキの葉を乾燥、細断したもの５０ｇを抽出溶媒である水１０００ｇに８０℃で５時間浸漬した後、ろ紙（アドバンテック東洋社製、５Ｃ）を用いてろ過し、ろ液を得た。このろ液を５℃にて７日間静置保存した後、さらにろ紙を用いてろ過してカキ葉水抽出物のろ液を得た。このカキ葉水抽出物中の抽出溶媒（水）を除いた固形分の含有量は０．８質量％であった。
【００１６】
〔実施例２〕
奈良県内で６月に採取したカキの葉を乾燥、細断したもの５０ｇを抽出溶媒である５０質量％の１，３−ブチレングリコール（ＢＧ）水溶液１０００ｇに５０℃で５時間浸漬した後、ろ紙（アドバンテック東洋社製、５Ｃ）を用いてろ過し、ろ液を得た。このろ液を５℃にて７日間静置保存した後、さらにろ紙を用いてろ過してカキ葉ＢＧ抽出物のろ液を得た。このカキ葉ＢＧ抽出物中の抽出溶媒（ＢＧ水溶液）を除いた固形分の含有量は１．１質量％であった。
【００１７】
実施例１および２で得られたカキ葉抽出物を用いて、下記に示すプロフィラグリン遺伝子発現量の測定試験を行なった。
【００１８】
〔プロフィラグリン遺伝子発現量の測定試験〕
ヒト包皮由来正常表皮角化細胞を用い、培地は表皮角化細胞増殖培地（クラボウ社製）を用いて培養した。細胞を培養プレートに播種し、サブコンフルエントになるまで培養した後、表１に記載の所定濃度になるように各種試料（抽出物）を添加した。更に6 時間培養した後、細胞からＲＮＡを抽出した。なお、試料無添加の場合をコントロールとした。
【００１９】
抽出したＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを作成し、定量リアルタイムＰＣＲ発現解析によりプロフィラグリンｍＲＮＡを定量した。プロフィラグリンに特異的なプライマーは、Presland R.B. らの報告（J. Biol. Chem.、267 、23772 −23781 、1992年）に基づいて作成した。内部標準としてはＧＡＰＤＨ（Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase）を用いた。プロフィラグリン遺伝子発現率は、ＧＡＰＤＨｍＲＮＡ発現量を補正値として用い、プロフィラグリンｍＲＮＡの発現量をコントロール細胞でのｍＲＮＡ発現量に対する割合（百分率）として求めた。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
表１の結果から明らかなように、カキ葉水抽出物（実施例１）およびカキ葉ＢＧ抽出物（実施例２）が優れたプロフィラグリン遺伝子発現促進作用を有することが確認された。したがって、カキ葉抽出物からなる本発明のプロフィラグリン遺伝子発現促進剤は、ヒトのプロフィラグリン遺伝子が表皮角化細胞内で発現するのを促進し、フィラグリンの産生を促すことにより健全な角層を形成させる作用が期待できる。