(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヨブスマソウ及び／又はイヌドウナをアルコール抽出して、前記ヨブスマソウ及び／又はイヌドウナ由来の小眼球症関連転写因子抑制成分を得る工程を備える、小眼球症関連転写因子抑制剤の製造方法。
【請求項２】
ヨブスマソウ及び／又はイヌドウナをアルコール抽出して、前記ヨブスマソウ及び／又はイヌドウナ由来の小眼球症関連転写因子抑制成分を得る工程を備える、メラニン生成抑制剤の製造方法。
【請求項３】
ヨブスマソウ及び／又はイヌドウナをアルコール抽出して、前記ヨブスマソウ及び／又はイヌドウナ由来の小眼球症関連転写因子抑制成分を得る工程を備える、美白用化粧品組成物の製造方法。
【請求項４】
前記アルコール抽出におけるアルコール濃度が２５％以上８０％以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヨブスマソウ及び／又はイヌドウナのアルコール抽出成分を含み、生体において効果的にメラニン色素の生成を抑制可能な生理活性組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、健康・美容への関心が高まっており、例えば、肌の美白に関する研究が数多くなされている。肌の黒ずみの原因はメラニンの生成によるものであるが、通常、皮膚におけるメラニンの生成メカニズムは下記の通り説明される。すなわち、図１に示されるように、紫外線や体内のメラニン産生刺激ホルモンによって刺激を受けると、メラニン産生酵素であるチロシナーゼが活性化され、皮膚のメラノサイトの中にあるチロシンを基質として酵素反応によってドーパクロムやインドール−５，６−キノンに変換し、酸化重合反応で次第に黒くなり、メラニン色素が作り出される。
【０００３】
メラニン生成抑制剤として、上記のうちチロシナーゼの活性を阻害するものがある。例えば、ハイドロキノンにグルコースがひとつ結合した配糖体である「アルブチン」は、メラニン色素を生成するメラノサイト（色素生成細胞）の中にあるチロシナーゼの活性を阻害する作用を持っており、これによりメラニンの生成を抑制する。また、ヒト皮膚に紫外線を照射して誘導される色素沈着に対する抑制効果が二重盲検法により調べられ、アルブチン配合乳液の塗布が有効であることが示されている。このように、チロシナーゼの活性を阻害する成分は数多く見つかっているが、いくら阻害作用を有していようとも、ヒトに有害となる物質である場合は適用することができない。このような観点から、ヒトへの安全性の高い食用植物等にメラニン生成抑制成分を見出し、これを抽出して化粧品に用いる技術が数多くなされている（例えば、特許文献１〜５や非特許文献１等）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−８８８５６号公報
【特許文献２】特開２０１１−３７８５１号公報
【特許文献３】特開２０１０−１７３９６４号公報
【特許文献４】特開２０１０−１１１６４５号公報
【特許文献５】特開２０１０−４３０４１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Miyazawa et al. “Character Impact Odorants of Wild Edible Plant-Cacalia hastate L. var. orientalis-Used in Japanese Traditional Food”, Journal of Oleo Science 59, (10) 527-533 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、メラニン生成抑制剤としては、チロシナーゼ等のメラニン色素産生酵素そのものに対する阻害作用を有するものが数多く知られている。或いは、抗酸化成分によって、メラニン生成時の酸化重合を抑えることもなされている。しかしながら、メラニン生成抑制はチロシナーゼの酵素反応を抑制することや、酸化重合を抑えることのみでは十分でない場合がある。
【０００７】
例えば、小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）は、メラニン色素産生酵素の遺伝子発現を促進することが知られており、ＭＩＴＦを抑制することができれば、メラニン生成を根元から抑えることができるものと考えられる。
【０００８】
本発明は、食用植物由来の成分を含むとともに、ＭＩＴＦ抑制作用を示し、従来よりもメラニン生成抑制作用に優れた生理活性組成物及びその製造方法、ＭＩＴＦ抑制剤、並びにメラニン生成抑制剤、化粧品組成物、抗ガン剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、各種天然資源を収集し、各種溶媒を用いて極性の違いにより種々の抽出物を作製し、その生理活性を調べて系統的ライブラリーを構築している。このうち、天然資源抽出物のメラニン生成抑制作用について鋭意研究を進めたところ、天然に自生する山菜の一種であるヨブスマソウやイヌドウナのアルコール抽出物に、チロシナーゼ阻害成分、及び抗酸化成分とともに、ＭＩＴＦ抑制成分が含まれていることを知見した。ヨブスマソウやイヌドウナは、冷涼な地域に広く自生する山菜であり、食経験もありヒトへの安全性が高い。そして、上記各成分を含むことにより、ＭＩＴＦによるチロシナーゼ遺伝子発現を抑制し、チロシナーゼによる酵素反応を阻害し、且つ、酵素反応後の酸化重合反応を抑制することも可能であるため、メラニン生成に関して、根元から最終生成に至るまでの各段階において効果的に作用させることができることを知見した。
【００１０】
本発明は上記知見に基づいてなされたものである。すなわち、
第１の本発明は、ヨブスマソウ及び／又はイヌドウナをアルコール抽出して得られる、生理活性組成物である。
【００１１】
本発明において、「ヨブスマソウ」、「イヌドウナ」とは、キク科コウモリソウ属（Ｐａｒａｓｅｎｅｃｉｏ）のヨブスマソウ、イヌドウナを意味する。「アルコール抽出」とは、極性の違いによって、ヨブスマソウ及び／又はイヌドウナに含まれる成分の一部を、アルコールを含む溶媒中に抽出すること意味する。
【００１２】
第１の本発明は、ヨブスマソウ及び／又はイヌドウナ由来の小眼球症関連転写因子抑制成分を含んでおり、ＭＩＴＦによるチロシナーゼ遺伝子発現を抑制し、メラニン生成を根元から抑制することができる。
【００１３】
第１の本発明において、小眼球症関連転写因子抑制成分の分子量は３０００以下である。
【００１４】
第２の本発明は、ヨブスマソウ及び／又はイヌドウナをアルコール抽出する工程を備える、生理活性組成物の製造方法である。
【００１５】
第２の本発明において、アルコール抽出におけるアルコール濃度は２５％以上８０％以下とすることが好ましい。尚、「アルコール濃度」とは、抽出溶媒全体の体積を１００％とした場合に占めるアルコール体積の占める割合を意味する。当該範囲内において、上記のＭＩＴＦ抑制成分を含む生理活性組成物を効率的に得ることができる。仮に水（熱水）や純粋なアルコールを溶媒として用いた場合、生理活性組成物のメラニン生成抑制作用が劣ってしまう。
【００１６】
第３の本発明は、第１の本発明に係る生理活性組成物を含む、小眼球症関連転写因子抑制剤である。
【００１７】
第４の本発明は、第１の本発明に係る生理活性組成物を含む、メラニン生成抑制剤である。
【００１８】
第５の本発明は、第１の本発明に係る生理活性組成物を含む、化粧品組成物である。
【００１９】
第６の本発明は、第１の本発明に係る生理活性組成物を含む、抗ガン剤である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係る生理活性組成物は、ヒトへの安全性が高い食用山菜の抽出成分を含んでなるもので、ＭＩＴＦによるチロシナーゼ遺伝子発現を抑制し、チロシナーゼの酵素反応を阻害し、且つ、酵素反応後の酸化重合反応を抑制することも可能である。すなわち、本発明によれば、食用植物由来の成分を含むとともに、ＭＩＴＦに対する抑制作用を示し、従来よりもメラニン生成抑制作用に優れた生理活性組成物及びその製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】皮膚のメラニン生成メカニズムを説明するための図である。
【図２】本発明に係る生理活性組成物の効果を説明するための図である。
【図３】ヨブスマソウ抽出物のマッシュルームチロシナーゼ活性に及ぼす影響を示すデータである。
【図４】ヨブスマソウ抽出物のメラニン産生に及ぼす影響を示すデータである。
【図５】ヨブスマソウ精製物のマッシュルームチロシナーゼ活性に及ぼす影響を示すデータである。
【図６】ヨブスマソウ精製物のメラニン産生に及ぼす影響を示すデータである。
【図７】ヨブスマソウ精製物の抗酸化能を示すデータである。
【図８】ヨブスマソウ精製物（分画３）による細胞のｍＲＮＡ発現の定量に係るデータである。
【図９】ヨブスマソウ精製物（分画３）のメラニン産生抑制作用に係るデータである。
【図１０】ヨブスマソウ精製物（分画３、４）と既存のメラニン抑制剤とについて、遺伝子発現に及ぼす影響を比較したデータである。
【図１１】ヨブスマソウ精製物（分画３、４）と既存のメラニン抑制剤とについて、メラニン産生に及ぼす影響を比較したデータである。
【図１２】各種刺激剤の違いによる、ヨブスマソウ精製物の遺伝子発現に及ぼす影響を比較したデータである。
【図１３】各種刺激剤の違いによる、ヨブスマソウ精製物のメラニン産生に及ぼす影響を比較したデータである。
【図１４】ヨブスマソウ精製物の抗ガン作用を示すデータである。
【図１５】本発明に係る生理活性組成物の抗ガン作用について説明するための図である。
【図１６】分画３について、細胞密度による抗ガン活性の相違を比較したデータである。
【図１７】ヨブスマソウ抽出物及びモミジガサ抽出物のマッシュルームチロシナーゼ活性に及ぼす影響を示すデータである。
【図１８】ヨブスマソウ抽出物及びモミジガサ抽出物の抗酸化能を示すデータである。
【図１９】ヨブスマソウ抽出物及びモミジガサ抽出物のメラニン産生に及ぼす影響を示すデータである。
【図２０】ヨブスマソウ抽出物及びモミジガサ抽出物のＭＩＴＦ  ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を示すデータである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
＜生理活性組成物＞
本発明に係る生理活性組成物は、ヨブスマソウ及び／又はイヌドウナをアルコール抽出して得られるものである。
【００２３】
ヨブスマソウ、イヌドウナとしては、天然に存在するキク科コウモリソウ属のヨブスマソウ、イヌドウナを用いることができる。或いは、促進栽培等によって人工的に栽培、収穫されたものでもよい。
【００２４】
本発明に係る生理活性組成物には、ヨブスマソウ及び／又はイヌドウナ由来のＭＩＴＦ抑制成分が含まれている。当該ＭＩＴＦ抑制成分は、分子量３０００以下の脂溶性の高い物質である。
【００２５】
また、本発明に係る生理活性組成物には、上記のＭＩＴＦ抑制成分の他、ヨブスマソウ及び／又はイヌドウナ由来のチロシナーゼ阻害成分、及び、抗酸化成分も含まれているとよい。生理活性組成物に含まれるチロシナーゼ阻害成分は、上記ＭＩＴＦ抑制成分よりも水溶性が高い成分であり、抗酸化成分は、チロシナーゼ阻害成分と同等又はチロシナーゼ阻害成分よりも水溶性が高い成分である。尚、生理活性組成物に含まれる上記の各種成分の割合は特に限定されるものではなく、抽出操作によって変化し得る。このような生理活性組成物は、具体的には例えば下記のような製造方法により製造することができる。
【００２６】
＜生理活性組成物の製造方法＞
本発明に係る生理活性組成物の製造方法は、ヨブスマソウ及び／又はイヌドウナをアルコール抽出する工程を備えている。当該工程は、極性の違いによって、ヨブスマソウ及び／又はイヌドウナに含まれる成分の一部をアルコール溶媒中に抽出可能な工程であればよく、抽出操作は公知の方法により実施可能である。尚、抽出の際は、刃物等を用いてヨブスマソウ及び／又はイヌドウナを細かく切断しておくと良い。これにより、含有成分を効率的に抽出することができる。
【００２７】
本発明に係る生理活性組成物の製造方法においては、抽出溶媒におけるアルコール濃度を２５％以上８０％以下とすることが好ましい。より好ましくは、５０％以上８０％以下、特に好ましくは６０％以上８０％以下である。本発明では、抽出溶媒として、水（熱水）や純粋なアルコールを用いるよりも、２５％以上８０％以下の濃度のアルコールを用いるほうが、上記の各種有効成分を効率的に抽出することができる。アルコールの温度は特に限定されるものではなく、例えば常温にて抽出可能である。アルコールの種類としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等、特に限定されるものではないが、特にエタノールが好ましい。
【００２８】
本発明に係る生理活性組成物の製造方法においては、アルコール抽出により得られた生理活性組成物を減圧乾固、或いは、凍結乾燥する工程を備えていてもよい。これにより、生理活性組成物の保存性や取り扱い性を向上させることができる。
【００２９】
このようにして得られる本発明に係る生理活性組成物は、食用植物由来のＭＩＴＦ抑制成分を含み、さらに、チロシナーゼ阻害成分及び抗酸化成分を含んでいる。すなわち、図２に示すように、ＭＩＴＦ抑制成分によって、チロシナーゼの遺伝子発現を抑制してメラニン生成を根元から抑え（第１の効果）、発現を抑制しきれなかったチロシナーゼについては、チロシナーゼ阻害成分によって酵素反応を阻害してドーパクロムやインドール−５，６−キノンの生成を抑え（第２の効果）、さらに、これらが生成したとしても抗酸化成分によって酸化重合を抑えることができる（第３の効果）。すなわち、本発明に係る生理活性組成物は、３段階でメラニン生成を抑制することができ、従来よりもメラニン生成抑制作用に優れたものといえる。
【００３０】
＜小眼球症関連転写因子抑制剤、メラニン生成抑制剤＞
上述の通り、本発明に係る生理活性組成物には、ＭＩＴＦ抑制成分、チロシナーゼ阻害成分及び抗酸化成分が含まれていることから、小眼球症関連転写因子抑制剤やメラニン生成抑制剤として好適に利用可能である。尚、小眼球症関連転写因子抑制剤とする場合は、上記の生理活性組成物を得た後、さらに酢酸エチル等の脂溶性の高い溶媒を用いてＭＩＴＦ抑制成分が濃縮された抽出物を得るとよい。
【００３１】
本発明に係る生理活性組成物を含むメラニン生成抑制剤を製造する場合、メラニン生成抑制剤には、上記の抽出物の他、公知のゲル化剤や防腐剤等を含ませることができ、化粧液や化粧用クリームとすることができる。このような場合において、化粧液や化粧用クリームに含まれる、ヨブスマソウ及び／又はイヌドウナをアルコール抽出して得られた抽出物濃度については特に限定されるものではない。抽出物を凍結乾燥等して乾燥する場合は、化粧液や化粧用クリーム１ｍｌに対し、乾燥後の抽出物が０．１〜５ｍｇ、好ましくは１〜５ｍｇ含まれるようにすると、充分なメラニン生成抑制効果を得ることができる。本発明に係る生理活性組成物は、上述の通り、ＭＩＴＦ抑制成分によって、チロシナーゼの遺伝子発現を抑制してメラニン生成を根元から抑え（第１の効果）、発現を抑制しきれなかったチロシナーゼについては、チロシナーゼ阻害成分によって酵素反応を阻害してドーパクロムやインドール−５，６−キノンの生成を抑え（第２の効果）、さらに、これらが生成したとしても抗酸化成分によって酸化重合を抑えることができる（第３の効果）ので、薄い濃度であっても充分なメラニン生成抑制効果を得ることができる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により、本発明に係る生理活性組成物のメラニン生成抑制作用についてさらに詳述するが、本発明は以下の実施例に記載された具体的な形態に限定されるものではない。
【００３３】
１．ヨブスマソウ抽出物のマッシュルームチロシナーゼ阻害作用
抽出物として、ヨブスマソウ８８ｇに溶媒（（１）熱水、（２）７０％  エタノール、（３）１００％メタノール）を加え、ミキサーで細かく粉砕した。（１）の場合はその後１００℃、１０分加熱した。３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上層を濾紙で濾過し回収した。その後、（１）は凍結乾燥機、（２）と（３）はロータリーエバポレータによる減圧乾固を行って溶媒を除去した。固形抽出物の重量を測定後、それぞれ０．１ｇ／ｍｌに調製した。
【００３４】
９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにＬ−チロシン含有溶液（２ｍＭ  Ｌ−チロシン、溶媒：５０ｍＭ燐酸緩衝液ｐＨ６．８）を１００μｌ採り、５０ｍＭ燐酸緩衝液ｐＨ６．８を６０μｌ入れ、１ｍｇ／ｍｌに調製した抽出物を２０μｌ入れた。そして、マッシュルームチロシナーゼ（３００Ｕ）を２０μｌ加え攪拌し、２５℃に設定したハイブリオーブンに入れて、６０分インキュベート後、４９０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図３に示す。
【００３５】
図３から、ヨブスマソウにはチロシナーゼ阻害作用が存在し、７０％エタノールで最も良く抽出されることがわかった。ヨブスマソウの７０％エタノール抽出物がチロシナーゼを５０％阻害する濃度は、ＩＣ５０＝１００μｇ／ｍｌであった。
【００３６】
２．ヨブスマソウ抽出物のメラニン産生抑制作用
マウス由来細胞株（Ｂ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ  ４Ａ５）を用いて、ＤＭＥＭを基礎培地として、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌペニシリンを添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で３〜４日間培養した。メラニン産生を測定するにあたって、細胞を２４時間培養し、培地交換をして１００μＭ  ＩＢＭＸと抽出物及び精製物を添加した後、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で３〜４日間培養した後、メラニン産生量を測定した。
【００３７】
メラニン測定では、細胞を培養した後、ＰＢＳを加え、細胞を２回かきとり、３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清をとり、１Ｎ  ＮａＯＨを加えて６０℃で６０分間処理した。処理した後、合成メラミンを標準物質として、マイクロプレートリーダーで細胞は４５０／６５５ｎｍ、培地は４５０ｎｍで測定した。結果を図４（Ａ）、（Ｂ）に示す。
【００３８】
図４から、ヨブスマソウ抽出物の中で、７０％エタノール抽出物がＩＢＭＸで誘導されるメラニン産生を最も強く抑制した。細胞のメラニン含量と培地に放出されたメラニン量を総合すると、メラニン色素産生を５０％阻害する濃度は、ＩＣ５０＝８〜１０μｇ／ｍｌであった。これはチロシナーゼ阻害濃度と比較して、低濃度であった。
【００３９】
３．ヨブスマソウ７０％エタノール抽出物からの有効成分の精製
ヨブスマソウ１３６２ｇを細断し、７０％エタノールを５．５Ｌ加えてワーリングブレンダーで粉砕した。これを２０００ｒｍｐで５分間遠心分離し、上層を濾紙で濾過して回収した。残渣を回収し、７０％エタノールを２．２Ｌ加え、同様に遠心分離し、上層を濾紙で濾過して回収したあと、最初に回収したものに加えた。その後、ロータリーエバポレータによる減圧乾固を行い、エタノールを留去した後、凍結乾燥を行って溶媒を完全に除去した。固形抽出物の重量は４４．５ｇであった。
【００４０】
逆相樹脂のＤｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０（三菱化学社製）を用いて、極性の違いによってヨブスマソウ７０％エタノール抽出物を精製した。４５ｇのＨＰ−２０をメタノールに溶解してカラムに詰めた。これを３０％メタノールで平衡化後、２１ｇのヨブスマソウ７０％エタノール抽出物を２４５ｍｌの３０％エタノールに溶解したものをカラムに注入した。ここで溶出したものを「分画１」（３０％メタノール溶出物）とした。次に７５％メタノール３００ｍｌを注入して溶出したものを「分画２」とした。さらに１００％メタノール３００ｍｌを注入して溶出したものを「分画３」とした。最後に、酢酸エチル３００ｍｌを注入して溶出したものを「分画４」とした。同様の操作を２回行い、合計４２ｇのヨブスマソウ７０％エタノール抽出物を分画した。それぞれの分画はロータリーエバポレータによる減圧乾固と凍結乾燥で溶媒を除去した。収率は下記表１に記載の通りである。
【００４１】
【表１】
0005942185.tif 000002
【００４２】
４．ヨブスマソウ分画の性状解析
各分画について、マッシュルームチロシナーゼ阻害作用及びメラニン色素抑制作用を評価した。
【００４３】
図５に、ヨブスマソウ７０％エタノール抽出物からのＨＰ−２０で精製した各分画のチロシナーゼ阻害作用を示す。分画２がチロシナーゼを５０％阻害する濃度は、ＩＣ５０＝５０μｇ／ｍｌであった。一方で、分画３、４は測定した濃度ではほとんどチロシナーゼ阻害作用を示さなかった。
【００４４】
図６（Ａ）、（Ｂ）に、各分画がＢ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ  ４Ａ５によるメラニン色素産生に及ぼす影響を示す。チロシナーゼ阻害作用の高い分画２のメラニン色素抑制効果は弱いものであった。一方で、ほとんどチロシナーゼ阻害作用を示さなかった分画３と４に強いメラニン色素抑制効果が観察された。
【００４５】
５．抗酸化能の測定
メラニン色素産生を抑制するには、図２に示したようにチロシナーゼを抑制する作用以外に、酸化重合反応を阻害する場合が考えられるため、各分画の抗酸化能を測定した。抗酸化能は、１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）を用いてラジカル捕捉活性を測定することで評価した。１００μＭ  ＤＰＰＨ（エタノール溶液）を１ｍｌ試験管にとり、分画を各濃度に調整したものを２０μｌ加え、３０秒撹拌して室温、暗所で３０分間おいた。その後、分光光度計で５１７ｎｍの吸光度を測定することで、ラジカルの消失を測定した。結果を図７に示す。
【００４６】
図７のように、チロシナーゼ阻害作用の強かった分画２が最も抗酸化能が強く、次いで分画１が強い活性を示した。一方で、細胞のメラニン産生を抑制する効果の最も強かった分画３と４の抗酸化能は弱いものであった。以上より、分画３と４がメラニン産生を抑制するメカニズムは、チロシナーゼの抑制及び酸化重合反応の阻害とは別にあると考えられる。
【００４７】
６．ヨブスマソウ精製物（分画３）によるＭＩＴＦ及びチロシナーゼ遺伝子発現の抑制
強いメラニン産生抑制効果を示したヨブスマソウ精製物の分画３は、チロシナーゼ阻害作用や抗酸化能以外の作用を持つと考えられたため、色素細胞特異的転写因子であるＭＩＴＦ遺伝子のｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を検討した。ＭＩＴＦ（小眼球症関連転写因子）とは、色素細胞（メラニン産生細胞）の分化・増殖を制御するマスター転写因子であり、標的遺伝子はメラニン合成酵素のチロシナーゼと、チロシナーゼのアミノ酸配列と４０％の類似性を持つチロシナーゼ関連タンパク−１（ＴＲＰ−１）やチロシナーゼ関連タンパク−２（ＴＲＰ−２）／ドーパクロムトートメラーゼ（ＤＣＴ）であり、これらに対して特異的に発現を促進する。近年では、ＭＩＴＦをコードする遺伝子が黒色腫細胞で大きく増幅されていることが発見され、黒色腫癌遺伝子として機能している可能性も示唆されるなど、癌治療の新たな戦略として注目されている。
【００４８】
φ６０ｍｍのディッシュで１２時間〜３日間培養した細胞を、５ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、１ｍｌのＴＲＩｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ）を加えて常法にしたがってＲＮＡを抽出した。これよりＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（タカラバイオ社製）を用いて、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法によりｍＲＮＡを定量した。実験に用いたＰｒｉｍｅｒの塩基配列は下記表２の通りである。
【００４９】
【表２】
0005942185.tif 000003
【００５０】
図８（Ａ）〜（Ｄ）に、細胞をＩＢＭＸで１２時間処理したときのＭＩＴＦ及びその下流のｍＲＮＡ発現に及ぼすヨブスマソウ精製物（分画３）の影響を示す。図８（Ａ）のように、ヨブスマソウ分画３は１．５μｇ／ｍｌの濃度で、ＩＢＭＸによるＭＩＴＦ  ｍＲＮＡ発現の誘導を強く阻害した。また、図８（Ｂ）〜（Ｄ）に示すように、その下流のチロシナーゼ、ＴＲＰ−１及びＤＣＴの発現も阻害した。
【００５１】
図９に、分画３による細胞のメラニン産生抑制効果の検証結果を示す。図９に示すように、分画３は、１．５μｇ／ｍｌより低濃度の０．７５μｇ／ｍｌの濃度にて、十分なメラニン抑制効果が観察された。
【００５２】
７．ヨブスマソウ精製物と既存のメラニン抑制剤との比較
２４時間培養して培地交換をして、ＩＢＭＸで処理した細胞に、分画３、４（Ｆｒ．３、４）を１．５μｇ／ｍｌ、アルブチン、コウジ酸を１５、３０μｇ／ｍｌの濃度で添加した後、１２時間培養して、ＲＮＡを抽出した。そして、リアルタイムＰＣＲ法を用いてＭＩＴＦ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＤＣＴ遺伝子の発現を抑えるか調べた。結果を図１０（Ａ）〜（Ｄ）に示す。
【００５３】
図１０に示すように、分画３、４で全ての遺伝子の発現が抑えられていた。アルブチンは、３０μｇ／ｍｌでは１５μｇ／ｍｌの場合よりも発現が抑えられていたが、コウジ酸では発現が活性化されていた。このように分画３、４は既存のメラニン抑制剤にはないＭＩＴＦ抑制効果があり、同時にその下流の遺伝子発現も抑制していることが示された。
【００５４】
Ｂ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ細胞のＩＢＭＸ刺激によるメラニン産生に及ぼす影響を比較した。結果を図１１（Ａ）、（Ｂ）に示す。図１１に示すように、分画３、４は、既存のメラニン抑制剤であるアルブチンやコウジ酸と比較して、１０分の１以下の濃度でメラニン産生を抑制した。
【００５５】
８．各種刺激剤の違いによるヨブスマソウ精製物の効果の比較
２４時間培養して培地交換をして、ＩＢＭＸ、α−ＭＳＨ、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎで処理した細胞に、分画３を１．５μｇ／ｍｌの濃度で添加した後、１２時間培養して、ＲＮＡを抽出した。そして、リアルタイムＰＣＲ法を用いてＭＩＴＦ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＤＣＴ遺伝子の発現を抑えるか否かを調べた。結果を図１２（Ａ）〜（Ｄ）に示す。
【００５６】
図１２に示すように、いずれの刺激剤においても、分画３はＭＩＴＦの発現を最も強く抑制した。これらの結果より、分画３には強いＭＩＴＦ抑制効果があり、それに引き続いて、その下流の遺伝子であるチロシナーゼやＴＲＰ−１、ＤＣＴの発現を抑制していると考えられる。
【００５７】
さらに、Ｂ１６−ｍｅｌａｎｏｍａ細胞の各種刺激剤によるメラニン産生に及ぼす影響を比較した。結果を図１３（Ａ）、（Ｂ）に示す。図１３に示すように、ＩＢＭＸ、α−ＭＳＨ、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎのいずれの刺激で産生されるメラニンであっても、分画３は強く抑制した。
【００５８】
以上のように、ヨブスマソウのアルコール抽出物には、抗酸化成分（分画１〜３）、チロシナーゼ阻害成分（分画１、２）及びＭＩＴＦ抑制成分（分画３、４）が含まれており、従来の美白剤に含まれるコウジ酸やアルブチンよりも、低濃度にてメラニン生成を抑制可能なことが分かった。これら分画１〜４は、極性の違いによって各種溶媒で精製可能であり、例えば、精製して分画３、４を得ることで、ＭＩＴＦ抑制剤としても用いることができる。
【００５９】
９．ヨブスマソウ精製物（分画３）の細胞増殖抑制作用（抗ガン作用）
分画３を添加し培養した細胞を用いて各種癌細胞株の増殖を測定した。結果を図１４に示す。図１４に示すように、分画３は悪性黒色腫であるＢ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ  ４Ａ５及びヒト肺癌細胞株Ａ５４９に対して、強い細胞増殖抑制が確認された。一方で、マウス由来間葉系幹細胞Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２、ヒト肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２、ヒト白血病細胞株Ｕ９３７、マウス由来脂肪前駆細胞３Ｔ３−Ｌ１の細胞増殖には、同じ濃度の範囲ではほとんど影響を及ぼさなかった。以上のように、分画３は悪性黒色腫や肺癌に選択的に抗ガン作用を示すことが分かった。
【００６０】
例えば、Nature. 480(7375), 94-98 (2011)、A SUMOylation-defective MITF germline mutation predisposes to melanoma and renal carcinomaや、Nature. 480(7375), 99-103 (2011)、A novel recurrent mutation in MITF predisposes to familial and sporadic melanomaに開示されている通り、最近になってＭＩＴＦは悪性黒色種の原因遺伝子であることを示す知見が得られており、図１５に概念的に示すように、本発明に係る生理活性組成物（分画３）は、このＭＩＴＦを抑制することによって、抗ガン作用を示したものと考えられる。ＭＩＴＦをターゲットとした抗がん剤は従来において得られておらず、本発明は新規抗がん剤としても極めて有効と考えられる。
【００６１】
細胞密度による抗ガン活性の相違を比較した結果を図１６に示す。図１６から明らかなように、分画３は、高密度で細胞を培養した場合に、より強い抗ガン作用があることが分かった。
【００６２】
１０．補足実験（他のＣａｃａｌｉａ植物との比較）
以下に、本発明に係るヨブスマソウから得られる生理活性組成物が、同じＣａｃａｌｉａ植物の一種であるモミジガサから得られる組成物よりも極めて優れた美白効果を有することについて示す。
【００６３】
１０．１．マッシュルームチロシナーゼ阻害作用
抽出物として、ヨブスマソウ８８ｇに溶媒（（１）熱水、（２）７０％  エタノール、（３）１００％メタノール）を加え、ミキサーで細かく粉砕した。（１）の場合はその後１００℃、１０分加熱した。３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上層を濾紙で濾過し回収した。その後、（１）は凍結乾燥機、（２）と（３）はロータリーエバポレータによる減圧乾固を行って溶媒を除去した。固形抽出物の重量を測定後、それぞれ０．１ｇ／ｍｌに調製した。一方、モミジガサについても同様にして、それぞれ０．１ｇ／ｍｌに調製した。
【００６４】
９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにＬ−チロシン含有溶液（２ｍＭ  Ｌ−チロシン、溶媒：５０ｍＭ燐酸緩衝液ｐＨ６．８）を１００μｌ採り、５０ｍＭ燐酸緩衝液ｐＨ６．８を６０μｌ入れ、１ｍｇ／ｍｌに調製した抽出物を２０μｌ入れた。そして、マッシュルームチロシナーゼ（３００Ｕ）を２０μｌ加え攪拌し、２５℃に設定したハイブリオーブンに入れて、６０分インキュベート後、４９０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図１７に示す。
【００６５】
図１７から、ヨブスマソウ抽出物は、７０％エタノール抽出物で最も強くチロシナーゼを阻害したが、モミジガサ抽出物は、どの溶媒で抽出したとしても、全く阻害作用を示さなかった。
【００６６】
１０．２．抗酸化能の測定
上記と同様に、抗酸化能は、１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）を用いてラジカル捕捉活性を測定することで評価した。１００μＭ  ＤＰＰＨ（エタノール溶液）を１ｍｌ試験管にとり、上記の抽出物を１０ｍｇ／ｍｌ濃度に調整したものを２０μｌ加え、３０秒撹拌して室温、暗所で３０分間おいた。その後、分光光度計で５１７ｎｍの吸光度を測定することで、ラジカルの消失を測定した。結果を図１８に示す。
【００６７】
図１８のように、どの溶媒で作成した抽出物でもヨブスマソウ抽出物はモミジガサ抽出物よりも強い抗酸化能を示した。特に、ヨブスマソウ７０％エタノール抽出物は強い抗酸化能を示した。
【００６８】
１０．３．メラニン産生抑制作用
マウス由来細胞株（Ｂ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ  ４Ａ５）を用いて、ＤＭＥＭを基礎培地として、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌペニシリンを添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で３〜４日間培養した。メラニン産生を測定するにあたって、細胞を２４時間培養し、培地交換をして１００μＭ  ＩＢＭＸと抽出物及び精製物を添加した後、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で３〜４日間培養した後、メラニン産生量を測定した。
【００６９】
メラニン測定では、細胞を培養した後、ＰＢＳを加え、細胞を２回かきとり、３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清をとり、１Ｎ  ＮａＯＨを加えて６０℃で６０分間処理した。処理した後、合成メラミンを標準物質として、マイクロプレートリーダーで細胞は４５０／６５５ｎｍ、培地は４５０ｎｍで測定した。結果を図１９（Ａ）、（Ｂ）に示す。
【００７０】
図１９から、Ｂ１６メラノーマ細胞におけるＩＢＭＸ刺激によるメラニン産生に対して、ヨブスマソウ抽出物はモミジガサ抽出物よりも強い抑制作用を示した。特に、ヨブスマソウ７０％エタノール抽出物は強いメラニン産生抑制作用を示した。
【００７１】
１０．４．ＭＩＴＦ  ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響
φ６０ｍｍのディッシュで１２時間〜３日間培養した細胞を、５ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、１ｍｌのＴＲＩｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ）を加えて常法にしたがってＲＮＡを抽出した。これよりＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（タカラバイオ社製）を用いて、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法によりｍＲＮＡを定量した。
【００７２】
図２０に、細胞をＩＢＭＸで１２時間処理したときのＭＩＴＦ及びその下流のｍＲＮＡ発現に及ぼす抽出物の影響を示す。図２０に示すように、Ｂ１６メラノーマ細胞におけるＩＢＭＸ刺激によるＭＩＴＦ  ｍＲＮＡの発現上昇に対して、ヨブスマソウ７０％エタノール抽出物は強い抑制作用を示したが、モミジガサ７０％エタノール抽出物には抑制作用はなかった。この差が、メラニン産生抑制の差になっていると考えられる。
【００７３】
以上、現時点において、最も実践的であり、且つ、好ましいと思われる実施形態に関連して本発明を説明したが、本発明は、本願明細書中に開示された実施形態に限定されるものではなく、請求の範囲及び明細書全体から読み取れる発明の要旨あるいは思想に反しない範囲で適宜変更可能であり、そのような変更を伴う生理活性組成物、生理活性組成物の製造方法、小眼球症関連転写因子抑制剤、及びメラニン生成抑制剤、化粧品組成物、抗ガン剤もまた本発明の技術範囲に包含されるものとして理解されなければならない。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明に係る生理活性組成物には、抗酸化成分、チロシナーゼ阻害成分及びＭＩＴＦ抑制成分（特にＭＩＴＦ抑制成分）が含まれており、従来の美白剤に含まれるコウジ酸やアルブチンよりも、低濃度にてメラニン生成を抑制可能であり、化粧品や薬剤等に好適に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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