(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはその抗原結合性フラグメントであって、配列番号５９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号６８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２領域および配列番号７９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３領域と；配列番号８７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号９７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２領域および配列番号１０４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３領域と、を含む、ｍＡｂまたはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
ヒトＣＤ２０に特異的に結合する、請求項１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
ヒト化されたｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントである、請求項１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
【請求項４】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５９４５で寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体と同じアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
【請求項５】
前記抗原結合性フラグメントが、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ＦａｂまたはＦｖフラグメントである、請求項１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
【請求項６】
前記ｍＡｂが、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｂアイソタイプ分子である、請求項１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
【請求項７】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５９４５で寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体と同じ重鎖および軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
【請求項８】
薬学的に受容可能なキャリア中に、請求項１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントを含む、薬学的組成物。
【請求項９】
薬学的に受容可能なキャリア中に、請求項１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントを含む、Ｂ細胞悪性腫瘍または自己免疫疾患を処置するための薬学的組成物。
【請求項１０】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５９４５で寄託されたハイブリドーマによって産生されるｍＡｂを産生することができる細胞株。
【請求項１１】
請求項１、４または７に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントをコードする核酸を発現させることを含む、ＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを生成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府の補助の記載）
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ／Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｕｔｉｔｕｔｅによって与えられた助成金番号ＣＡ８１７７６、ＣＡ９６５４７、ＡＩ５６３６３およびＣＡ５４４６４の連邦政府の補助によりなされた。アメリカ合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
（関連出願の情報）
本出願は、Ｕ．Ｓ．Ｃ．３５条の１１９（ｅ）のもとに、本明細書中に参照としてその全体が援用される、米国仮特許出願番号６０／４６９，４５１（２００３年５月９日出願）の優先権の利益を主張する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、ＣＤ２０に対して指向されるモノクローナル抗体ならびにこれらを生成および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
Ｂリンパ球は、体液性免疫の起源であり、造血性悪性腫瘍の相当な部分に相当し、かつ、自己免疫に寄与する。従って、Ｂ細胞およびそれらの悪性対応物によって発現される細胞表面分子は、免疫療法のための重要な標的である。ＭＳ４Ａ遺伝子ファミリーのＢ細胞特異的メンバーであるＣＤ２０は、未成熟および成熟Ｂ細胞ならびにそれらの悪性対応物の表面上に発現される（ＴｅｄｄｅｒおよびＥｎｇｅｌ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １５：４５０〜４５４）。
【０００５】
マウス細胞株および組織におけるＣＤ２０転写物の限定的解析によって、マウスＣＤ２０もまたＢ細胞特異的であることが示唆される（Ｔｅｄｄｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４３８８）。ヒトＣＤ２０およびマウスＣＤ２０の両方のｃＤＮＡは、膜を４回貫通するのに十分な長さの疎水性領域を有する膜埋込みタンパク質をコードする（Ｔｅｄｄｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４３８８；Ｔｅｄｄｅｒら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：２０８；Ｅｉｎｆｅｌｄら（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ．７：７１１；ＳｔａｍｅｎｋｏｖｉｃおよびＳｅｅｄ（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：１９７５）。マウスおよびヒトＣＤ２０は、アミノ酸配列において、特に膜貫通型の長いアミノ−およびカルボキシル−末端細胞質ドメインにおいて、よく保存されている（７３％）（Ｔｅｄｄｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４３８８）。これらの細胞質ドメインは、セリン−およびトレオニン−リッチであり、リン酸化のための複数のコンセンサス配列を有する。ヒトＣＤ２０はグリコシル化されないが、異なるセリンおよびトレオニン残基での単一タンパク質の差次的リン酸化の結果として、３つのアイソフォーム（３３−、３５−および３７，０００Ｍｒ）が生じる（Ｔｅｄｄｅｒら（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：１３２１；ＴｅｄｄｅｒおよびＳｃｈｌｏｓｓｍａｎ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１０００９；Ｖａｌｅｎｔｉｎｅら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：８０８５）。
【０００６】
ＣＤ２０は、ヒトＢ細胞の活性化、増殖およびＣａ２＋輸送の調節に関与する（Ｔｅｄｄｅｒら（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：９７３；Ｂｕｂｉｅｎら（１９９３）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２１：１１２１）。ＣＤ２０の抗体連結によって膜貫通シグナルを生成し得、その結果、ＣＤ２０のリン酸化増強（ＴｅｄｄｅｒおよびＳｃｈｌｏｓｓｍａｎ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１０００９）、ｃ−ｍｙｃおよびＢ−ｍｙｂ癌遺伝子発現の誘導（Ｓｍｅｌａｎｄら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：６２５５；Ｇｏｌａｙら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３００）、細胞タンパク質のセリン／トレオニンおよびチロシンリン酸化の誘導（Ｄｅａｎｓら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：４４９４）、ＣＤ１８、ＣＤ５８およびＭＨＣクラスＩＩ分子発現の増大（Ｗｈｉｔｅら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：８４６；ＣｌａｒｋおよびＳｈｕ（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：７２０）、ならびにＢ細胞接着を誘導するタンパク質チロシンキナーゼ活性化（ＫａｎｓａｓおよびＴｅｄｄｅｒ（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：４０９４）をもたらす。ＣＤ２０連結は、膜貫通Ｃａ２＋輸送を促進するが（Ｂｕｂｉｅｎら（１９９３）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２１：１１２１）、通常、大規模な架橋後を除いて（Ｄｅａｎｓら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：４４９４）、細胞内カルシウム（［Ｃａ２＋］ｉ）３レベルを増加させない（Ｂｕｂｉｅｎら（１９９３）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２１：１１２１；Ｔｅｄｄｅｒら（１９８６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：８８１；Ｇｏｌａｙら（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：３７９５）。ＣＤ２０に結合している抗体は、マイトジェン刺激によって細胞周期のＧ１期からＳ／Ｇ２＋Ｍ期へのＢ細胞進行を阻害し、かつ、マイトジェン誘導性のＢ細胞分化および抗体分泌を阻害する（Ｔｅｄｄｅｒら（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：９７３；Ｔｅｄｄｅｒら（１９８６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６；Ｇｏｌａｙら（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：３７９５；ＧｏｌａｙおよびＣｒａｗｆｏｒｄ（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６２：２７９）。大規模なＣＤ２０架橋はまた、アポトーシスにも影響を及ぼし得る（Ｈｏｌｄｅｒら（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：３１６０；Ｓｈａｎら（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９１：１６４４）。これらの相違する観察は、ＣＤ２０が、細胞周期進行の間に活性化される膜輸送体またはＣａ２＋イオンチャネルを形成するオリゴマー複合体の構成要素であるという知見（Ｂｕｂｉｅｎら（１９９３）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２１：１１２１；Ｋａｎｚａｋｉら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３０９９；Ｋａｎｚａｋｉら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４７３３；Ｋａｎｚａｋｉら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：４９６４）によって、部分的に説明され得る。これにもかかわらず、ＣＤ２０欠損（ＣＤ２０−／−）マウスの系統におけるＢ細胞発達および機能は、正常であると報告されている（Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４８：１２５）。
【０００７】
ヒトＢ細胞系統悪性腫瘍の大部分は、ＣＤ２０を発現する（Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９８４）Ｂｌｏｏｄ  ６３：１４２４）。ＣＤ２０に対して指向される、キメラのまたは放射標識したモノクローナル抗体に基づく治療は、非ホジキンリンパ腫に対して用いられてきた（Ｐｒｅｓｓら（２００１）Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ：２２１〜２４０；Ｋａｍｉｎｓｋｉら（１９９３）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２９：４５９〜４６５；Ｗｅｉｎｅｒ（１９９９）Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：４３〜５１；Ｏｎｒｕｓｔら（１９９９）Ｄｒｕｇｓ  ５８：７９〜８８；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９９８）Ｏｎｃｏｌｏｇｙ
１２：１７６３〜１７６９）。臨床研究により抗ＣＤ２０モノクローナル抗体治療はまた、関節リウマチ、特発性血小板減少性紫斑病および溶血性貧血ならびに他の免疫媒介疾患の発現も寛解させることが示される（ＳｉｌｖｅｒｍａｎおよびＷｅｉｓｍａｎ（２００２）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４８：１４８４〜１４９２；ＥｄｗａｒｄｓおよびＣａｍｂｒｉｄｇｅ（２００１）Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ４０：１〜７）。
【０００８】
競合する仮説が、インビボにおける抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の治療効力を説明するのに用いられる。１つのモデルにおいて、ＣＤ２０は、生来の免疫系の活性化またはエフェクター機構の活性化を介して、モノクローナル抗体媒介性のＢ細胞枯渇の膜埋込み標的として働く（Ｒｅｆｆら（１９９４）Ｂｌｏｏｄ  ８３：４３５〜４４５；Ｍａｌｏｎｅｙら（１９９７）Ｂｌｏｏｄ  ９０：２１８８〜２１９５；Ｍａｌｏｎｅｙら（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１５：３２６６〜３２７４）。
【０００９】
キメラヒトＩｇＧ１抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体であるリツキシマブは、古典経路補体（Ｃ）活性化ならびに新しく単離したリンパ腫細胞およびＢ細胞株のＣ依存性細胞傷害性の誘導に、極めて有効である（Ｒｅｆｆら（１９９４）Ｂｌｏｏｄ  ８３：４３５〜４４５；Ｇｏｌａｙら（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９８：３３８３〜３３８９；Ｃｒａｇｇら（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５〜１０５２；Ｄｉ  Ｇａｅｔａｎｏら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：１５８１〜１５８７；Ｂｅｌｌｏｓｉｌｌｏら（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９８：２７７１〜２７７７）。リツキシマブはまた、患者（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｏｌｋら（２００１）Ｂｒ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１１５：８０７〜８１１）および霊長類（Ｋｅｎｎｅｄｙら（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０７１〜１０７９）の両方において、インビボでＣを活性化する。さらに、ＣＤ５９を含むＣ調節タンパク質の腫瘍細胞発現は、抗ＣＤ２０治療への耐性と関連する（Ｇｏｌａｙら（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９８：３３８３〜３３８９；Ｔｒｅｏｎら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２４：２６３〜２７１）。大多数は、Ｃ依存性細胞傷害性を、リツキシマブ抗体によってインビトロおよびインビボにおいてヒトリンパ腫細胞を枯渇させるのに用いられる主要経路とみなすが（Ｇｏｌａｙら（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９８：３３８３〜３３８９；Ｃｒａｇｇら（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５〜１０５２；Ｄｉ  Ｇａｅｔａｎｏら（２００３）Ｊ．ＩｍｍｕｎｏＬ  １７１：１５８１〜１５８７；Ｇｏｌａｙら（２０００）Ｂｌｏｏｄ  ９５：３９００〜３９０８；Ｄｉ  Ｇａｅｔａｎｏら（２００１）Ｂｒ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１１４：８００〜８０９；Ｗｅｉｎｅｒ（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０１：７８８）、その他は、Ｃ媒介性溶解ならびに腫瘍細胞上でのＣインヒビターＣＤ４６、ＣＤ５５、およびＣＤ５９の発現に対する腫瘍細胞の感受性によって、リツキシマブ治療の成果は予測されないことを見出している（ＷｅｎｇおよびＬｅｖｙ（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９８：１３５２〜１３５７）。臨床的に用いられるアイソタイプと異なるアイソタイプのキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体が、非ヒト霊長類において正常Ｂ細胞を枯渇させないことから、他の抗体依存性作用もまた重要なようであり（Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃ．２５：７０５〜７０８）、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の抗腫瘍作用は、ＩｇＧに対するＦｃレセプター（ＦｃγＲ）を介する免疫活性化に一部依存する（Ｃｌｙｎｅｓら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．６：４４３〜４４６）。あるいは、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体処置によって膜貫通Ｃａ２＋輸送およびＢ細胞機能が変化し、それにより細胞周期を通じて進行を妨害し（ＴｅｄｄｅｒおよびＥｎｇｅｌ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １５：４５０〜４５４）、Ｂ細胞アポトーシスを誘導し得る（Ｓｈａｎら（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９１：１６４４〜１６５２；Ｄｅｍｉｄｅｍら（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１２：１７７〜１８６）。
【００１０】
免疫療法を受けているヒトにおいて機構研究を実施することの複雑性のため、インビボにおいてこれらの仮説を区別するのは困難である（ＥｄｗａｒｄｓおよびＣａｍｂｒｉｄｇｅ（２００１）Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ４０：１〜７）。さらに、人体研究は、骨髄の他に、Ｂ細胞の２％未満を含む、血液中の変化に主に集中している。従って、末梢リンパ系組織中に見出される大多数のＢ細胞に対する抗ＣＤ２０治療の効果を正確に確認することは困難である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
特に、Ｂ細胞悪性腫瘍および自己免疫疾患のようなＢ細胞疾患において、Ｂ細胞機能を変化させるための改良された試薬および方法が、当該分野で必要とされている。また、ＣＤ２０に対して指向される従来のモノクローナル抗体と異なる免疫反応性特性を有する、新しい抗ＣＤ２０モノクローナル抗体も必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、所望の特性を有するＣＤ２０と反応する新規のモノクローナル抗体の生成および同定に一部基づく。
【００１３】
従って、１つの実施形態において、本発明はＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、このＢ細胞へのｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントの結合密度は、Ｂ細胞および／またはそれらの悪性対応物への１以上の従来のｍＡｂ（例えば、ｍＡｂ  １Ｆ５）の結合密度よりも、少なくとも２倍高い。
【００１４】
別の局面として、本発明はＣＤ２０に特異的に結合するｍＡｂまたはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、Ｂ細胞（および／またはそれらの悪性対応物）上のこのＣＤ２０へのｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントの結合により、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントのためのＢ細胞上の結合部位のアップレギュレーションがもたらされる。
【００１５】
さらなる局面として、本発明はＣＤ２０に特異的に結合するｍＡｂまたはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、このｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントは、ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４、ＨＢ２０−２５およびＭＢ２０−１１からなる群より選択されるｍＡｂと同じ抗原決定基に結合する。特定の実施形態において、このｍＡｂは、ＨＢ２０−２５およびＭＢ２０−１１からなる群より選択される。他の実施形態において、この抗原結合性フラグメントは、ＨＢ２０−２５およびＭＢ２０−１１の抗原結合性フラグメントからなる群より選択される。
【００１６】
別の局面において、本発明はＣＤ２０に特異的に結合するｍＡｂまたはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、このｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントは、ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４、ＨＢ２０−２５およびＭＢ２０−１１からなる群より選択されるｍＡｂに由来する重鎖ＣＤＲ３領域、あるいは、このＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４、ＨＢ２０−２５またはＭＢ２０−１１の重鎖ＣＤＲ３領域に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する重鎖ＣＤＲ３領域を含む。
【００１７】
さらに他の実施形態において、本発明はＣＤ２０に特異的に結合するｍＡｂまたはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、このｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントは、ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４およびＨＢ２０−２５からなる群より選択されるｍＡｂに由来する軽鎖ＣＤＲ３領域、あるいは、このＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４またはＨＢ２０−２５の軽鎖ＣＤＲ３領域に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖ＣＤＲ３領域を含む。
【００１８】
さらなる実施形態において、本発明はＣＤ２０に特異的に結合するｍＡｂまたはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、このｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントは、ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４およびＨＢ２０−２５からなる群より選択されるｍＡｂに由来するＣＤＲ３領域、あるいは、このＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４またはＨＢ２０−２５のＣＤＲ３領域に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有するＣＤＲ３領域を含む。
【００１９】
なおさらなる実施形態において、本発明はＣＤ２０に特異的に結合するｍＡｂまたはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、このｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントは、ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４およびＨＢ２０−２５からなる群より選択されるｍＡｂに由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域、あるいは、このＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４またはＨＢ２０−２５の、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む。
【００２０】
さらに別の局面として、本発明はＣＤ２０に特異的に結合するｍＡｂまたはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、このｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントは、以下からなる群より選択される：
（ａ）配列番号３（ＨＢ２０−３）、配列番号５（ＨＢ２０−４）、配列番号９（ＨＢ２０−２５）または配列番号２１（ＭＢ２０−１１）の重鎖可変領域、あるいはこの配列番号３、配列番号５、配列番号９または配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む、重鎖を含む、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント；
（ｂ）配列番号３１（ＨＢ２０−３）、配列番号３３（ＨＢ２０−４）、または配列番号３７（ＨＢ２０−２５）の軽鎖可変領域、あるいはこの配列番号３１、配列番号３３、または配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む、軽鎖を含む、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント；ならびに
（ｃ）（ａ）および（ｂ）に記載の重鎖および軽鎖を含む、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
【００２１】
さらに別の局面として、本発明はＣＤ２０に特異的に結合するｍＡｂまたはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、このｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントは、以下からなる群より選択される：
（ａ）配列番号３（ＨＢ２０−３）の重鎖可変領域またはこの配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号３１（ＨＢ２０−３）の軽鎖可変領域またはこの配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント；
（ｂ）配列番号５（ＨＢ２０−４）の重鎖可変領域またはこの配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号３３（ＨＢ２０−４）の軽鎖可変領域またはこの配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント；ならびに
（ｃ）配列番号９（ＨＢ２０−２５）の重鎖可変領域またはこの配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号３７（ＨＢ２０−２５）の軽鎖可変領域またはこの配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
【００２２】
他の特定の実施形態において、本発明はＣＤ２０に特異的に結合するｍＡｂまたはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、このｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントは、ＨＢ２０−３（配列番号３）、ＨＢ２０−４（配列番号５）、ＨＢ２０−２５（配列番号９）およびＭＢ２０−１１（配列番号２１）からなる群より選択されるｍＡｂに由来する重鎖可変領域を含む。
【００２３】
なお、さらなる実施形態において、本発明はＣＤ２０に特異的に結合するｍＡｂまたはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、このｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントは、ＨＢ２０−３（配列番号３１）、ＨＢ２０−４（配列番号３３）およびＨＢ２０−２５（配列番号３７）からなる群より選択されるｍＡｂに由来する軽鎖可変領域を含む。
【００２４】
さらなる局面として、本発明はマウスＣＤ２０に特異的に結合するｍＡｂまたはその抗原結合性フラグメントを提供する。
【００２５】
本発明のｍＡｂおよび抗原結合性フラグメントを含む薬学的組成物もまた提供される。
【００２６】
１つの実施形態として、本発明は、ＨＢ２０−１、ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４およびＨＢ２０−２５からなる群より選択されるｍＡｂと同じ抗原決定基に特異的に結合する、ｍＡｂまたはその抗原結合性フラグメントを含む薬学的組成物を提供する。
【００２７】
本発明はまた、本発明のｍＡｂおよび抗原結合性フラグメントを生成するための細胞株も提供する。
【００２８】
さらなる局面として、本発明は、Ｂ細胞および／またはそれらの悪性対応物を枯渇させるのに有効な量で、本発明のｍＡｂもしくは抗原結合性フラグメントまたは薬学的組成物を哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、哺乳動物被験体においてＢ細胞を枯渇させる方法を提供する。
【００２９】
なおさらなる局面として、本発明は、ＣＤ２０に特異的に結合する処置有効量のｍＡｂまたはその抗原結合性フラグメントを、Ｂ細胞疾患を有する哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、Ｂ細胞疾患を処置する方法を提供し、ここで、このｍＡｂまたはその抗原結合性フラグメントは、循環Ｂ細胞および／またはそれらの悪性対応物に少なくとも７５％の枯渇をもたらす、１２５ｍｇ／ｍ２以下の処置有効投薬量範囲を有する。
【００３０】
なおさらなる局面として、本発明は、処置有効量の本発明のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントあるいは薬学的組成物を、Ｂ細胞疾患を有する哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、Ｂ細胞疾患を処置する方法を提供する。
【００３１】
前記方法の特定の実施形態において、このＢ細胞疾患は、Ｂ細胞悪性腫瘍または自己免疫疾患である。
【００３２】
さらなる局面として、本発明は、処置有効量の以下：（ｉ）本発明のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントあるいは薬学的組成物、および（ｉｉ）単球またはマクロファージ機能を増強する化合物を、Ｂ細胞疾患を有する哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、Ｂ細胞疾患を処置する方法を提供する。
【００３３】
別の局面として、本発明はＣＤ２０に特異的に結合するｍＡｂを生成する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：（ａ）抗体応答を誘発するのに十分な条件下で、ＣＤ２０またはその抗原的に有効なフラグメントでＣＤ２０−／−哺乳動物を免疫する工程；（ｂ）この哺乳動物から抗体産生細胞を収集する工程；（ｃ）この抗体産生細胞を、培養不死化細胞と融合させて、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を生成する工程；（ｄ）このハイブリドーマ細胞を、モノクローナル抗体の産生に十分な条件下で培養する工程；ならびに（ｅ）この培養物から、ＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体を回収する工程。
【００３４】
さらに別の局面として、本発明はＣＤ２０に特異的に結合するｍＡｂを生成する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：（ａ）抗体応答を誘発するのに十分な条件下で、ＣＤ２０またはその抗原的に有効なフラグメントでＣＤ２０−／−哺乳動物を免疫する工程；（ｂ）この哺乳動物から、ＣＤ２０に特異的に結合する抗体を産生する細胞を収集する工程；（ｃ）この抗体産生細胞から、免疫グロブリンコード遺伝子を単離する工程；（ｄ）この免疫グロブリンコード遺伝子を細胞に導入して、形質転換細胞を生成する工程；（ｅ）この形質転換細胞を、この免疫グロブリン遺伝子の転写および翻訳ならびにモノクローナル抗体の産生に十分な条件下で培養する工程；ならびに（ｅ）この培養物から、ＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体を回収する工程。
【００３５】
本発明は、Ｂ細胞（および／またはそれらの悪性対応物）を枯渇させるのに用いるための、および／またはＢ細胞疾患の処置のための、本発明の核酸、ベクター、ｍＡｂもしくは抗原結合性フラグメントまたは薬学的組成物の使用をさらに提供する。
【００３６】
他の局面として、本発明は、本発明のｍＡｂおよび抗原結合性フラグメントの重鎖および軽鎖をコードする単離核酸をさらに提供する。さらに、これらの単離核酸を含むベクターおよび細胞も提供する。
【００３７】
本発明は、例えば以下を提供する。
（項目１）
ＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはその抗原結合性フラグメントであって、該ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントのＢ細胞への結合密度が、ｍＡｂ  １Ｆ５のＢ細胞への結合密度よりも少なくとも２倍高い、ｍＡｂまたはその抗原結合性フラグメント。
（項目２）
前記ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントがヒトＣＤ２０に特異的に結合する、項目１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目３）
項目２に記載のｍＡｂであって、該ｍＡｂは、以下の工程：
（ａ）抗体応答を誘発するのに十分な条件下で、ＣＤ２０またはその抗原的に有効なフラグメントでＣＤ２０−／−哺乳動物を免疫する工程；
（ｂ）該哺乳動物から、ＣＤ２０に特異的に結合する抗体を産生する細胞を収集する工程；
（ｃ）該抗体産生細胞から、免疫グロブリンコード遺伝子を単離する工程；
（ｄ）該免疫グロブリンコード遺伝子を細胞に導入して、形質転換細胞を生成する工程；（ｅ）該形質転換細胞を、該免疫グロブリン遺伝子の転写および翻訳ならびにモノクローナル抗体の産生に十分な条件下で培養する工程；ならびに
（ｅ）該培養物から、ＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体を回収する工程
を包含する方法によって生成される、ｍＡｂ。
（項目４）
前記抗原結合性フラグメントが、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ＦａｂまたはＦｖフラグメントである、項目１に記載の抗原結合性フラグメント。
（項目５）
検出可能に標識される、項目１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目６）
治療化合物と結合体化される、項目１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目７）
細胞傷害性薬剤と結合体化される、項目６に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目８）
裸の抗体である、項目１に記載のｍＡｂ。
（項目９）
二重特異性抗体である、項目１に記載のｍＡｂ。
（項目１０）
ＣＤ２０の細胞外ドメインに結合する、項目１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目１１）
キメラｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントである、項目１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目１２）
ヒト化ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントである、項目１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目１３）
Ｂ細胞上のＣＤ２０への前記ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントの結合により、該Ｂ細胞上のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントに対する結合部位のアップレギュレーションがもたらされる、項目１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目１４）
ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４、ＨＢ２０−２５およびＭＢ２０−１１からなる群より選択されるｍＡｂと同じ抗原決定基に結合する、項目１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目１５）
前記ｍＡｂがＨＢ２０−２５およびＭＢ２０−１１からなる群より選択される、項目１４に記載のｍＡｂ。
（項目１６）
ＨＢ２０−３およびＨＢ２０−４の抗原結合性フラグメントからなる群より選択される、項目１４に記載の抗原結合性フラグメント。
（項目１７）
ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４、ＨＢ２０−２５およびＭＢ２０−１１からなる群より選択されるｍＡｂに由来する重鎖ＣＤＲ３領域、あるいは、該ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４、ＨＢ２０−２５またはＭＢ２０−１１の重鎖ＣＤＲ３領域に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する重鎖ＣＤＲ３領域を含む、項目１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目１８）
前記ＨＢ２０−２５ｍＡｂに由来する重鎖ＣＤＲ３領域、または、該ＨＢ２０−２５の重鎖ＣＤＲ３領域に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する重鎖ＣＤＲ３領域を含む、項目１７に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目１９）
ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４およびＨＢ２０−２５からなる群より選択されるｍＡｂに由来する軽鎖ＣＤＲ３領域、あるいは、該ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４またはＨＢ２０−２５の軽鎖ＣＤＲ３領域に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、項目１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目２０）
前記ＨＢ２０−２５ｍＡｂに由来する軽鎖ＣＤＲ３領域、または、前記ＨＢ２０−２５の重鎖ＣＤＲ３領域に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、項目１９に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目２１）
ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４およびＨＢ２０−２５からなる群より選択されるｍＡｂに由来するＣＤＲ３領域、あるいは、該ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４またはＨＢ２０−２５のＣＤＲ３領域に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有するＣＤＲ３領域を含む、項目１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目２２）
ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４およびＨＢ２０−２５からなる群より選択されるｍＡｂに由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域、あるいは、該ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４またはＨＢ２０−２５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域のそれぞれに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む、項目１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目２３）
前記ＨＢ２０−２５ｍＡｂに由来するＣＤＲ３領域を含むか、または該ＣＤＲ３領域に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する、項目２２に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目２４）
項目１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントであって、以下：
（ａ）配列番号３（ＨＢ２０−３）、配列番号５（ＨＢ２０−４）、配列番号９（ＨＢ２０−２５）または配列番号２１（ＭＢ２０−１１）の重鎖可変領域、あるいは、該配列番号３、配列番号５、配列番号９または配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む、重鎖を含む、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント；
（ｂ）配列番号３１（ＨＢ２０−３）、配列番号３３（ＨＢ２０−４）、または配列番号３７（ＨＢ２０−２５）の軽鎖可変領域、あるいは、該配列番号３１、配列番号３３、または配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む、軽鎖を含む、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント；ならびに
（ｃ）（ａ）および（ｂ）に記載の重鎖および軽鎖を含む、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント
からなる群より選択される、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目２５）
項目１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントであって、以下：
（ａ）配列番号３（ＨＢ２０−３）の重鎖可変領域または該配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号３１（ＨＢ２０−３）の軽鎖可変領域または該配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント；
（ｂ）配列番号５（ＨＢ２０−４）の重鎖可変領域または該配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号３３（ＨＢ２０−４）の軽鎖可変領域または該配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント；ならびに
（ｃ）配列番号９（ＨＢ２０−２５）の重鎖可変領域または該配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号３７（ＨＢ２０−２５）の軽鎖可変領域または該配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント
からなる群より選択される、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目２６）
項目２５に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントであって、以下：
配列番号９（ＨＢ２０−２５）の重鎖可変領域または該配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号３７（ＨＢ２０−２５）の軽鎖可変領域または該配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント
を含む、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目２７）
ＨＢ２０−３（配列番号３）、ＨＢ２０−４（配列番号５）、ＨＢ２０−２５（配列番号９）およびＭＢ２０−１１（配列番号２１）からなる群より選択されるｍＡｂに由来する重鎖可変領域を含む、項目１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目２８）
ＨＢ２０−３（配列番号３１）、ＨＢ２０−４（配列番号３３）およびＨＢ２０−２５（配列番号３７）からなる群より選択されるｍＡｂに由来する軽鎖可変領域を含む、項目１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目２９）
薬学的に受容可能なキャリア中に、項目１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントを含む、薬学的組成物。
（項目３０）
前記組成物が、単球またはマクロファージ機能を増強する化合物をさらに含む、項目２９に記載の薬学的組成物。
（項目３１）
薬学的に受容可能なキャリア中に、ＨＢ２０−１、ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４およびＨＢ２０−２５からなる群より選択されるモノクローナル抗体と同じ抗原決定基に特異的に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはその抗原結合性フラグメントを含む、薬学的組成物。
（項目３２）
モノクローナル抗体ＨＢ２０−２５と同じ抗原決定基に特異的に結合するｍＡｂまたはその抗原結合性フラグメントを含む、項目３１に記載の薬学的組成物。
（項目３３）
前記抗原結合性フラグメントが、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ＦａｂまたはＦｖフラグメントである、項目３１に記載の薬学的組成物。
（項目３４）
前記ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントが検出可能に標識される、項目３１に記載の薬学的組成物。
（項目３５）
前記ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントが治療化合物と結合体化される、項目３１に記載の薬学的組成物。
（項目３６）
前記ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントが細胞傷害性薬剤と結合体化される、項目３５に記載の薬学的組成物。
（項目３７）
前記ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントが裸の抗体である、項目３１に記載の薬学的組成物。
（項目３８）
前記ｍＡｂが二重特異性抗体である、項目３１に記載の薬学的組成物。
（項目３９）
前記ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントが、キメラｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントである、項目３１に記載の薬学的組成物。
（項目４０）
前記ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントが、ヒト化ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントである、項目３１に記載の薬学的組成物。
（項目４１）
前記ｍＡｂが、ＨＢ２０−１、ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４およびＨＢ２０−２５からなる群より選択される、項目３１に記載の薬学的組成物。
（項目４２）
前記ｍＡｂがＨＢ２０−２５である、項目３１に記載の薬学的組成物。
（項目４３）
前記抗原結合性フラグメントが、ＨＢ２０−１、ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４およびＨＢ２０−２５の抗原結合性フラグメントからなる群より選択される、項目３１に記載の薬学的組成物。
（項目４４）
マウスＣＤ２０に特異的に結合する、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはその抗原結合性フラグメント。
（項目４５）
前記抗原結合性フラグメントが、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ＦａｂまたはＦｖフラグメントである、項目４４に記載の抗原結合性フラグメント。
（項目４６）
検出可能に標識される、項目４４に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目４７）
治療化合物と結合体化される、項目４４に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。（項目４８）
細胞傷害性薬剤と結合体化される、項目４７に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目４９）
裸の抗体である、項目４４に記載のｍＡｂ。
（項目５０）
二重特異性抗体である、項目４４に記載のｍＡｂ。
（項目５１）
ＣＤ２０の細胞外ドメインに結合する、項目４４に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目５２）
Ｂ細胞上のＣＤ２０へのｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントの結合により、該Ｂ細胞上のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントのための結合部位のアップレギュレーションがもたらされる、項目４４に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目５３）
前記ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントが、ＭＢ２０−１、ＭＢ２０−２、ＭＢ２０−３、ＭＢ２０−６、ＭＢ２０−７、ＭＢ２０−８、ＭＢ２０−１０、ＭＢ２０−１１、ＭＢ２０−１３、ＭＢ２０−１４、ＭＢ２０−１６およびＭＢ２０−１８からなる群より選択されるｍＡｂと同じ抗原決定基に特異的に結合する、項目４４に記載のｍＡｂまたは
抗原結合性フラグメント。
（項目５４）
前記ｍＡｂが、ＭＢ２０−１、ＭＢ２０−２、ＭＢ２０−３、ＭＢ２０−６、ＭＢ２０−７、ＭＢ２０−８、ＭＢ２０−１０、ＭＢ２０−１１、ＭＢ２０−１３、ＭＢ２０−１４、ＭＢ２０−１６およびＭＢ２０−１８からなる群より選択される、項目５３に記載のｍＡｂ。
（項目５５）
ＭＢ２０−１、ＭＢ２０−２、ＭＢ２０−３、ＭＢ２０−６、ＭＢ２０−７、ＭＢ２０−８、ＭＢ２０−１０、ＭＢ２０−１１、ＭＢ２０−１３、ＭＢ２０−１４、ＭＢ２０−１６およびＭＢ２０−１８の抗原結合性フラグメントからなる群より選択される、項目５３に記載の抗原結合性フラグメント。
（項目５６）
ＭＢ２０−１、ＭＢ２０−２、ＭＢ２０−７、ＭＢ２０−８、ＭＢ２０−１１、ＭＢ２０−１４、ＭＢ２０−１６およびＭＢ２０−１８からなる群より選択されるｍＡｂに由来する重鎖ＣＤＲ３領域、あるいは、該ＭＢ２０−１、ＭＢ２０−２、ＭＢ２０−７、ＭＢ２０−８、ＭＢ２０−１１、ＭＢ２０−１４、ＭＢ２０−１６またはＭＢ２０−１８の重鎖ＣＤＲ３領域に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する重鎖ＣＤＲ３領域を含む、項目５３に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目５７）
ＭＢ２０−１、ＭＢ２０−２、ＭＢ２０−３、ＭＢ２０−７、ＭＢ２０−８、ＭＢ２０−１３、ＭＢ２０−１４およびＭＢ２０−１８からなる群より選択されるｍＡｂに由来する軽鎖ＣＤＲ３領域、あるいは、該ＭＢ２０−１、ＭＢ２０−２、ＭＢ２０−３、ＭＢ２０−７、ＭＢ２０−８、ＭＢ２０−１３、ＭＢ２０−１４またはＭＢ２０−１８の軽鎖ＣＤＲ３領域に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、項目５３に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目５８）
ＭＢ２０−１、ＭＢ２０−２、ＭＢ２０−７、ＭＢ２０−８、ＭＢ２０−１３、ＭＢ２０−１４およびＭＢ２０−１８からなる群より選択されるｍＡｂに由来するＣＤＲ３領域、あるいは、該ＭＢ２０−１、ＭＢ２０−２、ＭＢ２０−７、ＭＢ２０−８、ＭＢ２０−１３、ＭＢ２０−１４またはＭＢ２０−１８のＣＤＲ３領域に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有するＣＤＲ３領域を含む、項目５３に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目５９）
ＭＢ２０−１、ＭＢ２０−２、ＭＢ２０−７、ＭＢ２０−８、ＭＢ２０−１３、ＭＢ２０−１４およびＭＢ２０−１８からなる群より選択されるｍＡｂに由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域、あるいは、該ＭＢ２０−１、ＭＢ２０−２、ＭＢ２０−７、ＭＢ２０−８、ＭＢ２０−１３、ＭＢ２０−１４およびＭＢ２０−１８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域のそれぞれに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む、項目５３に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目６０）
項目５３に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントであって、以下：
（ａ）配列番号１１（ＭＢ２０−１）、配列番号１３（ＭＢ２０−２）、配列番号１５（ＭＢ２０−７）、配列番号１７（ＭＢ２０−８）、配列番号２１（ＭＢ２０−１１）、配列番号２３（ＭＢ２０−１４）、配列番号２５（ＭＢ２０−１６）または配列番号２７（ＭＢ２０−１８）の重鎖可変領域、あるいは、該配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５または配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む、重鎖を含む、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント；
（ｂ）配列番号３９（ＭＢ２０−１）、配列番号４１（ＭＢ２０−２）、配列番号４３（ＭＢ２０−３）、配列番号４５（ＭＢ２０−７）、配列番号４７（ＭＢ２０−８）、配列番号５１（ＭＢ２０−１３）、配列番号５３（ＭＢ２０−１４）または配列番号５５（ＭＢ２０−１８）の軽鎖可変領域、あるいは、該配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号５１；配列番号５３および配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む、軽鎖を含む、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント；ならびに
（ｃ）（ａ）および（ｂ）に記載の重鎖および軽鎖を含む、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント
からなる群より選択される、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目６１）
項目５３に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントであって、以下：
（ａ）配列番号１１（ＭＢ２０−１）の重鎖可変領域または該配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号３９（ＭＢ２０−１）の軽鎖可変領域または該配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント；
（ｂ）配列番号１３（ＭＢ２０−２）の重鎖可変領域または該配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号４１（ＭＢ２０−２）の軽鎖可変領域または該配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント；
（ｃ）配列番号１５（ＭＢ２０−７）の重鎖可変領域または該配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号４５（ＭＢ２０−７）の軽鎖可変領域または該配列番号４５のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント；
（ｄ）配列番号１７（ＭＢ２０−８）の重鎖可変領域または該配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号４７（ＭＢ２０−８）の軽鎖可変領域または該配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント；
（ｅ）配列番号１１（ＭＢ２０−１３）の重鎖可変領域または該配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号５１（ＭＢ２０−１３）の軽鎖可変領域または該配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント；
（ｆ）配列番号２３（ＭＢ２０−１４）の重鎖可変領域または該配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号５３（ＭＢ２０−１４）の軽鎖可変領域または該配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント；ならびに
（ｇ）配列番号２７（ＭＢ２０−１８）の重鎖可変領域または該配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号５５（ＭＢ２０−１８）の軽鎖可変領域または該配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント
からなる群より選択される、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目６２）
ＭＢ２０−１（配列番号１１）、ＭＢ２０−２（配列番号１３）、ＭＢ２０−７（配列番号１５）、ＭＢ２０−８（配列番号１７）、ＭＢ２０−１１（配列番号２１）、ＭＢ２０−１４（配列番号２３）、ＭＢ２０−１６（配列番号２５）およびＭＢ２０−１８（配列番号２７）からなる群より選択されるｍＡｂに由来する重鎖可変領域を含む、項目５３に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目６３）
ＭＢ２０−１（配列番号３９）、ＭＢ２０−２（配列番号４１）、ＭＢ２０−３（配列番号４３）、ＭＢ２０−７（配列番号４５）、ＭＢ２０−８（配列番号４７）、ＭＢ２０−１３（配列番号５１）、ＭＢ２０−１４（配列番号５３）およびＭＢ２０−１８（配列番号５５）からなる群より選択されるｍＡｂに由来する軽鎖可変領域を含む、項目５３に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメント。
（項目６４）
薬学的に受容可能なキャリア中に、項目５３に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントを含む、薬学的組成物。
（項目６５）
前記組成物が、単球またはマクロファージ機能を増強する化合物をさらに含む、項目６４に記載の薬学的組成物。
（項目６６）
項目１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントを産生する、細胞株。
（項目６７）
前記細胞株がハイブリドーマ細胞株である、項目６６に記載の細胞株。
（項目６８）
ハイブリドーマ細胞株ＨＢ２０−２５およびＭＢ２０−１１からなる群より選択される、項目６７に記載の細胞株。
（項目６９）
項目４４に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントを産生する、細胞株。
（項目７０）
前記細胞株がハイブリドーマ細胞株である、項目６９に記載の細胞株。
（項目７１）
ハイブリドーマ細胞株ＭＢ２０−１、ＭＢ２０−２、ＭＢ２０−３、ＭＢ２０−６、ＭＢ２０−７、ＭＢ２０−８、ＭＢ２０−１０、ＭＢ２０−１１、ＭＢ２０−１３、ＭＢ２０−１４、ＭＢ２０−１６およびＭＢ２０−１８からなる群より選択される、項目７０に記載の細胞株。
（項目７２）
項目１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントあるいは項目３１に記載の薬学的組成物を、Ｂ細胞を枯渇させるのに有効な量で哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、哺乳動物被験体においてＢ細胞を枯渇させる方法。
（項目７３）
項目３に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントあるいは項目３２に記載の薬学的組成物を、Ｂ細胞を枯渇させるのに有効な量で哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、哺乳動物被験体においてＢ細胞を枯渇させる方法。
（項目７４）
前記哺乳動物被験体がヒトであり、かつ、前記薬学的組成物が皮下投与される、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記組成物が１回の投与当たり３７５ｍｇ／ｍ２よりも低い用量で投与される、項目７３に記載の方法。
（項目７６）
前記組成物が１回の投与当たり３７．５ｍｇ／ｍ２よりも低い用量で投与される、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記組成物が１回の投与当たり０．３７５ｍｇ／ｍ２よりも低い用量で投与される、請求項７６に記載の方法。
（項目７８）
前記組成物が０．０７５ｍｇ／ｍ２と１２５ｍｇ／ｍ２との間の用量で投与される、請求項７４に記載の方法。
（項目７９）
前記哺乳動物被験体がヒトである、項目７２に記載の方法。
（項目８０）
前記薬学的組成物が非経口経路によって投与される、項目７２に記載の方法。
（項目８１）
前記薬学的組成物が、髄腔内、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与からなる群より選択される経路によって投与される、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
０．０７５ｍｇ／ｍ２と１２５ｍｇ／ｍ２との間の用量の前記ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントが、１回の投与につき前記哺乳動物被験体に投与される、項目７２に記載の方法。
（項目８３）
１０ｍｇ／ｍ２と７５ｍｇ／ｍ２との間の前記ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントを含む用量が、１回の投与につき前記哺乳動物被験体に投与される、項目８２に記載の方法。（項目８４）
循環Ｂ細胞において少なくとも７５％の枯渇が達成される、項目８２に記載の方法。
（項目８５）
組織Ｂ細胞において少なくとも６０％の枯渇が達成される、項目８２に記載の方法。
（項目８６）
循環Ｂ細胞における前記枯渇が、少なくとも７日間観察される、項目８２に記載の方法。（項目８７）
循環Ｂ細胞における前記枯渇が、少なくとも３０日間観察される、項目８２に記載の方法。
（項目８８）
前記方法が、長期間にわたる哺乳動物被験体へのｍＡｂ、抗原結合性フラグメントまたは薬学的組成物の２回以上の投与を含む、項目８２に記載の方法。
（項目８９）
Ｂ細胞疾患を処置する方法であって、ＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはその抗原結合性フラグメントの処置有効量を、Ｂ細胞疾患を有する哺乳動物被験体に投与する工程を包含し、ここで、該ｍＡｂまたはその抗原結合性フラグメントは１２５ｍｇ／ｍ２以下の処置有効投薬量範囲を有し、循環Ｂ細胞に少なくとも７５％の枯渇をもたらす、方法。
（項目９０）
前記ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントが、３７．５ｍｇ／ｍ２以下の処置有効投薬量範囲を有する、項目８９に記載の方法。
（項目９１）
前記ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントが、１０ｍｇ／ｍ２以下の処置有効投薬量範囲を有する、項目８９に記載の方法。
（項目９２）
前記ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントが、０．３７５ｍｇ／ｍ２以下の有効投薬量範囲を有する、項目８９に記載の方法。
（項目９３）
前記ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントが、０．０７５ｍｇ／ｍ２以下の有効投薬量範囲を有する、項目８９に記載の方法。
（項目９４）
循環Ｂ細胞における前記枯渇が、少なくとも７日間観察される、項目８９に記載の方法。（項目９５）
循環Ｂ細胞における前記枯渇が、少なくとも３０日間観察される、項目８９に記載の方法。
（項目９６）
前記Ｂ細胞疾患がＢ細胞悪性腫瘍である、項目８９に記載の方法。
（項目９７）
前記Ｂ細胞疾患が自己免疫疾患である、項目８９に記載の方法。
（項目９８）
前記哺乳動物被験体がヒトである、項目８９に記載の方法。
（項目９９）
前記薬学的組成物が非経口経路によって投与される、項目８９に記載の方法。
（項目１００）
前記薬学的組成物が、髄腔内、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与からなる群より選択される経路によって投与される、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
前記方法が、長期間にわたる哺乳動物被験体への薬学的組成物の２回以上の投与を含む、項目８９に記載の方法。
（項目１０２）
Ｂ細胞疾患を処置する方法であって、処置有効量の項目１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントあるいは項目３１に記載の薬学的組成物を、Ｂ細胞疾患を有する哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目１０３）
前記Ｂ細胞疾患がＢ細胞悪性腫瘍である、項目１０２に記載の方法。
（項目１０４）
前記Ｂ細胞疾患が自己免疫疾患である、項目１０２に記載の方法。
（項目１０５）
前記哺乳動物被験体がヒトである、項目１０２に記載の方法。
（項目１０６）
前記薬学的組成物が非経口経路によって投与される、項目１０２に記載の方法。
（項目１０７）
前記薬学的組成物が、髄腔内、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与からなる群より選択される経路によって投与される、項目１０６に記載の方法。
（項目１０８）
前記方法が、長期間にわたる哺乳動物被験体への薬学的組成物の２回以上の投与を含む、項目１０２に記載の方法。
（項目１０９）
Ｂ細胞疾患を処置する方法であって、処置有効量の以下：
（ｉ）項目１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントあるいは項目３１に記載の薬学的組成物、および
（ｉｉ）単球またはマクロファージ機能を増強する化合物を、Ｂ細胞疾患を有する哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目１１０）
前記哺乳動物被験体が、抗ＣＤ２０ｍＡｂ治療に対して耐性である、項目１０９に記載の方法。
（項目１１１）
前記哺乳動物被験体が、ｍＡｂ  Ｃ２Ｂ８を用いた治療に対して耐性である、項目１１０に記載の方法。
（項目１１２）
前記哺乳動物被験体が、化学療法により処置されていたかまたは現在処置中である、請求項１０９に記載の方法。
（項目１１３）
前記哺乳動物被験体が、Ｂ細胞疾患を再発している、項目１０９に記載の方法。
（項目１１４）
前記哺乳動物被験体が、免疫無防備状態である、項目１０９に記載の方法。
（項目１１５）
ＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する方法であって、以下の工程：（ａ）抗体応答を誘発するのに十分な条件下で、ＣＤ２０またはその抗原的に有効なフラグメントでＣＤ２０−／−哺乳動物を免疫する工程；
（ｂ）該哺乳動物から抗体産生細胞を収集する工程；
（ｃ）該抗体産生細胞を、培養不死化細胞と融合させて、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を生成する工程；
（ｄ）該ハイブリドーマ細胞を、モノクローナル抗体の産生に十分な条件下で培養する工程；ならびに
（ｅ）該培養物から、ＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体を回収する工程を包含する、方法。
（項目１１６）
前記哺乳動物がマウスである、項目１１５に記載の方法。
（項目１１７）
前記抗体産生細胞がＢ細胞である、項目１１５に記載の方法。
（項目１１８）
前記不死化細胞が骨髄腫細胞である、項目１１５に記載の方法。
（項目１１９）
抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を単離する工程をさらに包含する、項目１１５に記載の方法。
（項目１２０）
項目１１５に記載の方法によって生成される、モノクローナル抗体。
（項目１２１）
項目１２０に記載のモノクローナル抗体の抗原結合性フラグメント。
（項目１２２）
ＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する方法であって、以下の工程：（ａ）抗体応答を誘発するのに十分な条件下で、ＣＤ２０またはその抗原的に有効なフラグメントでＣＤ２０−／−哺乳動物を免疫する工程；
（ｂ）該哺乳動物から、ＣＤ２０に特異的に結合する抗体を産生する細胞を収集する工程；
（ｃ）該抗体産生細胞から、免疫グロブリンコード遺伝子を単離する工程；
（ｄ）該免疫グロブリンコード遺伝子を細胞に導入して、形質転換細胞を生成する工程；（ｅ）該形質転換細胞を、該免疫グロブリン遺伝子の転写および翻訳ならびにモノクローナル抗体の産生に十分な条件下で培養する工程；ならびに
（ｅ）該培養物から、ＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体を回収する工程
を包含する、方法。
（項目１２３）
ＨＢ２０−１、ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４、ＨＢ２０−５、ＨＢ２０−２５およびＭＢ２０−１１からなる群より選択されるｍＡｂに由来するＣＤＲ３領域、あるいは、該ＨＢ２０−１、ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４、ＨＢ２０−５、ＨＢ２０−２５またはＭＢ２０−１１のＣＤＲ３領域に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有するＣＤＲ３領域を含む、可変領域を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
（項目１２４）
ＨＢ２０−１、ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４、ＨＢ２０−５、ＨＢ２０−２５およびＭＢ２０−１１からなる群より選択されるｍＡｂに由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域、あるいは、該ＨＢ２０−１、ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４、ＨＢ２０−５、ＨＢ２０−２５またはＭＢ２０−１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域のそれぞれに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む、可変領域を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
（項目１２５）
配列番号２（ＨＢ２０−１）、配列番号４（ＨＢ２０−３）、配列番号６（ＨＢ２０−４）、配列番号８（ＨＢ２０−５）、配列番号１０（ＨＢ２０−２５）および配列番号２２（ＭＢ２０−１１）の重鎖可変領域、あるいは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０または配列番号２２と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域からなる群より選択される可変領域を有する重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
（項目１２６）
ＨＢ２０−１、ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４、ＨＢ２０−５およびＨＢ２０−２５からなる群より選択されるｍＡｂに由来するＣＤＲ３領域、あるいは、該ＨＢ２０−１、ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４、ＨＢ２０−５またはＨＢ２０−２５のＣＤＲ３領域に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有するＣＤＲ３領域を含む、可変領域を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
（項目１２７）
ＨＢ２０−１、ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４、ＨＢ２０−５およびＨＢ２０−２５からなる群より選択されるｍＡｂに由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域、あるいは、該ＨＢ２０−１、ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４、ＨＢ２０−５またはＨＢ２０−２５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域のそれぞれに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む、可変領域を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
（項目１２８）
配列番号３０（ＨＢ２０−１）、配列番号３２（ＨＢ２０−３）、配列番号３４（ＨＢ２０−４）、配列番号３６（ＨＢ２０−５）および配列番号３８（ＨＢ２０−２５）の軽鎖可変領域、あるいは、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域からなる群より選択される可変領域を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
（項目１２９）
項目１２３に記載の単離核酸を含む、ベクター。
（項目１３０）
項目１２４に記載の単離核酸を含む、ベクター。
（項目１３１）
項目１２５に記載の単離核酸を含む、ベクター。
（項目１３２）
項目１２６に記載の単離核酸を含む、ベクター。
（項目１３３）
項目１２７に記載の単離核酸を含む、ベクター。
（項目１３４）
項目１２８に記載の単離核酸を含む、ベクター。
（項目１３５）
項目１２３に記載の単離核酸を含む、細胞。
（項目１３６）
項目１２４に記載の単離核酸を含む、細胞。
（項目１３７）
項目１２５に記載の単離核酸を含む、細胞。
（項目１３８）
項目１２６に記載の単離核酸を含む、細胞。
（項目１３９）
項目１２７に記載の単離核酸を含む、細胞。
（項目１４０）
項目１２８に記載の単離核酸を含む、細胞。
（項目１４１）
ＭＢ２０−１、ＭＢ２０−２、ＭＢ２０−７、ＭＢ２０−８、ＭＢ２０−１０、ＭＢ２０−１１、ＭＢ２０−１４、ＭＢ２０−１６およびＭＢ２０−１８からなる群より選択されるｍＡｂに由来するＣＤＲ３領域、あるいは、該ＭＢ２０−１、ＭＢ２０−２、ＭＢ２０−７、ＭＢ２０−８、ＭＢ２０−１０、ＭＢ２０−１１、ＭＢ２０−１４、ＭＢ２０−１６またはＭＢ２０−１８のＣＤＲ３領域に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有するＣＤＲ３領域を含む、可変領域を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
（項目１４２）
ＭＢ２０−１、ＭＢ２０−２、ＭＢ２０−７、ＭＢ２０−８、ＭＢ２０−１０、ＭＢ２０−１１、ＭＢ２０−１４、ＭＢ２０−１６およびＭＢ２０−１８からなる群より選択されるｍＡｂに由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域、あるいは、該ＭＢ２０−１、ＭＢ２０−２、ＭＢ２０−７、ＭＢ２０−８、ＭＢ２０−１０、ＭＢ２０−１１、ＭＢ２０−１４、ＭＢ２０−１６またはＭＢ２０−１８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域のそれぞれに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む、可変領域を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
（項目１４３）
配列番号１２（ＭＢ２０−１）、配列番号１４（ＭＢ２０−２）、配列番号１６（ＭＢ２０−７）、配列番号１８（ＭＢ２０−８）、配列番号２０（ＭＢ２０−１０）、配列番号２２（ＭＢ２０−１１）、配列番号２４（ＭＢ２０−１４）、配列番号２６（ＭＢ２０−１６）および配列番号２８（ＨＢ２０−１８）の重鎖可変領域、あるいは、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６または配列番号２８と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域からなる群より選択される可変領域を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
（項目１４４）
ＭＢ２０−１、ＭＢ２０−２、ＭＢ２０−３、ＭＢ２０−７、ＭＢ２０−８、ＭＢ２０−１０、ＭＢ２０−１３、ＭＢ２０−１４およびＭＢ２０−１８からなる群より選択されるｍＡｂに由来するＣＤＲ３領域、あるいは、該ＭＢ２０−１、ＭＢ２０−２、ＭＢ２０−３、ＭＢ２０−７、ＭＢ２０−８、ＭＢ２０−１０、ＭＢ２０−１３、ＭＢ２０−１４またはＭＢ２０−１８のＣＤＲ３領域に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有するＣＤＲ３領域を含む、可変領域を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
（項目１４５）
ＭＢ２０−１、ＭＢ２０−２、ＭＢ２０−３、ＭＢ２０−７、ＭＢ２０−８、ＭＢ２０−１０、ＭＢ２０−１３、ＭＢ２０−１４およびＭＢ２０−１８からなる群より選択されるｍＡｂに由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域、あるいは、該ＭＢ２０−１、ＭＢ２０−２、ＭＢ２０−３、ＭＢ２０−７、ＭＢ２０−８、ＭＢ２０−１０、ＭＢ２０−１３、ＭＢ２０−１４またはＭＢ２０−１８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域のそれぞれに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む、可変領域を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
（項目１４６）
配列番号４０（ＭＢ２０−１）、配列番号４２（ＭＢ２０−２）、配列番号４４（ＭＢ２０−３）、配列番号４６（ＭＢ２０−７）、配列番号４８（ＭＢ２０−８）、配列番号５０（ＭＢ２０−１０）、配列番号５２（ＭＢ２０−１３）、配列番号５４（ＭＢ２０−１４）および配列番号５６（ＭＢ２０−１８）の軽鎖可変領域、あるいは、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４または配列番号５６と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域からなる群より選択される可変領域を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
（項目１４７）
項目１４１に記載の単離核酸を含む、ベクター。
（項目１４８）
項目１４２に記載の単離核酸を含む、ベクター。
（項目１４９）
項目１４３に記載の単離核酸を含む、ベクター。
（項目１５０）
項目１４４に記載の単離核酸を含む、ベクター。
（項目１５１）
項目１４５に記載の単離核酸を含む、ベクター。
（項目１５２）
項目１４６に記載の単離核酸を含む、ベクター。
（項目１５３）
項目１４１に記載の単離核酸を含む、細胞。
（項目１５４）
項目１４５に記載の単離核酸を含む、細胞。
（項目１５５）
項目１４３に記載の単離核酸を含む、細胞。
（項目１５６）
項目１４４に記載の単離核酸を含む、細胞。
（項目１５７）
項目１４５に記載の単離核酸を含む、細胞。
（項目１５８）
項目１４６に記載の単離核酸を含む、細胞。
（項目１５９）
哺乳動物被験体においてＢ細胞を枯渇させる方法であって、項目３に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントを投与する工程を包含し、抗ＣＤ２２または抗ＣＤ１９抗体を投与する工程をさらに包含する、方法。
（項目１６０）
ＣＤ２０に特異的に結合する抗ヒトＣＤ２０ｍＡｂまたはその抗原結合性フラグメントであって、該ｍＡｂまたはその抗原結合性フラグメントの重鎖ＣＤＲ３領域がアミノ酸配列ＦＹＸＹＸＸＸ１ＹＧＡＸ２ＸＸＹを含む、抗ヒトＣＤ２０ｍＡｂまたはその抗原結合性フラグメント。
（項目１６１）
アミノ酸配列ＮＸＸＸＸを含む重鎖ＣＤＲ１領域をさらに含む、項目１６０に記載のそのｍＡｂ抗原結合性フラグメント。
（項目１６２）
アミノ配列ＸＨＦＷＸＸ３ＸＷＸを含む軽鎖ＣＤＲ３領域をさらに含む、項目１６１に記載のそのｍＡｂ抗原結合性フラグメント。
（項目１６３）
薬学的に受容可能なキャリア中に、項目１６０に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントを含む、薬学的組成物。
（項目１６４）
薬学的に受容可能なキャリア中に、項目１６１に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントを含む、薬学的組成物。
（項目１６５）
薬学的に受容可能なキャリア中に、項目１６２に記載のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントを含む、薬学的組成物。
（項目１６６）
単球またはマクロファージ機能を増強する化合物をさらに含む、項目１６３に記載の薬学的組成物。
（項目１６７）
単球またはマクロファージ機能を増強する化合物をさらに含む、項目１６４に記載の薬学的組成物。
（項目１６８）
単球またはマクロファージ機能を増強する化合物をさらに含む、項目１６５に記載の薬学的組成物。
（項目１６９）
項目１６３に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、哺乳動物被験体においてＢ細胞を枯渇させる方法。
（項目１７０）
項目１６４に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、哺乳動物被験体においてＢ細胞を枯渇させる方法。
（項目１７１）
請求項１６５に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、哺乳動物被験体においてＢ細胞を枯渇させる方法。
【００３８】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の本発明の説明においてより詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｍは、Ｃｄ２０遺伝子の標的破壊を図解する。図１Ａは、Ｃｄ２０遺伝子の３’末端をコードするゲノムクローンを示す。図１Ｂは、エクソン５〜８（黒四角）を含む野生型Ｃｄ２０のイントロン−エクソン構成を示す。エクソン番号は、ヒトＣＤ２０構造に基づく（Ｔｅｄｄｅｒら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：２５６０〜２５６８）。図１Ｃは、標的ベクター構造を示す。図１Ｄは、エクソン６中のＥｃｏＲＶ制限酵素認識部位が欠失した、相同組換え後のＣｄ２０対立遺伝子の構造を示す。図１Ｅは、ＥｃｏＲＶで消化し、ニトロセルロースに転写し、そして図１Ｄに示した５’ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた、２匹の野生型および４匹のＣＤ２０−／−同腹仔に由来するゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を示す。図１Ｆは、エクソン６（ＥｃｏＲＶ部位の５’）およびエクソン７に結合するプライマーを用いた、野生型およびＣＤ２０−／−同腹仔に由来するゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅を示す。Ｇ３ＰＤＨ増幅を、ポジティブコントロールとして示す。図１Ｇは、野生型およびＣＤ２０−／−同腹仔の脾臓ＲＮＡから生成されたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を示す。各反応混合物は、エクソン３によってコードされる配列とハイブリダイズする１つのセンスプライマー、およびエクソン６またはＮｅｏｒ遺伝子プロモーター配列とハイブリダイズする２つのアンチセンスプライマーを含んだ。エクソン３およびエクソン６のプライマーを用いて増幅させたＤＮＡは４４５ｂｐの長さであり、一方、エクソン３およびＮｅｏプライマーは７４９ｂｐフラグメントを増幅した。
【図１−２】図１Ａ〜１Ｍは、Ｃｄ２０遺伝子の標的破壊を図解する。図１Ｈは、ＭＢ２０−１３モノクローナル抗体と、ＣＤ２０  ｃＤＮＡをトランスフェクトされた（太線）またはトランスフェクトされていない（破線）３００．１９細胞またはＣＨＯ細胞との反応性を示す。細線は、二次抗体単独またはアイソタイプコントロールモノクローナル抗体で染色した、ＣＤ２０  ｃＤＮＡ−トランスフェクト細胞を示す。免疫蛍光染色は、フローサイトメトリー分析によって可視化した。図１Ｉは、フローサイトメトリー分析により、ＭＢ２０−７（フィコエリトリン結合体化、抗マウスＩｇＧ２ｂ抗体を用いて可視化）および抗ＣＤ１９（ＦＩＴＣ結合体化）モノクローナル抗体を用いた、ＣＤ２０−／−または野生型同腹仔に由来する脾細胞の免疫蛍光染色を示す。四角で線引きした四分区間は、非反応性のモノクローナル抗体コントロールを用いて決定した、細胞の陰性および陽性集団を示す。図１Ｈおよび図１Ｉの結果は、１２種類の抗マウスＣＤ２０モノクローナル抗体を用いて得た結果の代表である。図１Ｊは、ＣＤ２０−／−および野生型同腹仔におけるＢリンパ球分布を示す。ゲートをかけた細胞集団は、表４に記載されている細胞に相当し、１０匹の同腹仔の群を用いて得た結果を示す。
【図１−３】図１Ａ〜１Ｍは、Ｃｄ２０遺伝子の標的破壊を図解する。図１Ｋは、ＣＤ２０−／−Ｂ細胞のマイトジェン応答を示す。ＣＤ２０−／−および野生型同腹仔に由来する精製脾臓Ｂ細胞（２×１０５／ウェル）を、抗ＩｇＭ  Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメント、抗ＩｇＭ抗体＋ＩＬ−４、またはＬＰＳと共に培養した。値は、３連の培養物からの平均値（±ＳＥＭ）であり、４回の独立した実験で得られた結果を示す。図１Ｌは、アイソタイプ特異的ＥＬＩＳＡで測定した、６匹のＣＤ２０−／−（黒ぬり棒グラフ）および野生型（白抜き棒グラフ）同腹仔についての平均（±ＳＥＭ）血清Ｉｇレベルを示す。図１Ｍは、Ｔ細胞依存性の体液性免疫応答を示す。２匹のＣＤ２０−／−（黒丸、実線）マウスおよび野生型（白四角、破線）マウスを０日目と２１日目にＤＮＰ−ＫＬＨで免疫し、表示時点に血清を採取した。血清抗ＤＮＰ抗体を、アイソタイプ特異的ＥＬＩＳＡによって決定した。平均ＣＤ２０−／−（実線）抗体レベルおよび平均野生型（破線）抗体レベルを示す。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｉは、Ｂ細胞成長中のＣＤ２０発現を示す。図２Ａは、ＭＢ２０−７（太線）またはアイソタイプコントロール（破線）モノクローナル抗体を用いた、マウスリンパ芽球様細胞株の免疫蛍光染色を示す。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの骨髄（図２Ｂ）、血液（図２Ｃ）、末梢リンパ節（ＰＬＮ；図２Ｄ）、脾臓（図２Ｅ）および腹腔（図２Ｆ）から単離されたリンパ球の単一細胞懸濁液を、フローサイトメトリー分析を用いて２色免疫蛍光染色法によって試験した。図２Ｇは、４色フローサイトメトリー分析で評価した、骨髄Ｂ細胞亜集団によるＣＤ２０発現を示す。プロＢ細胞を、リンパ球の前方散乱および側方散乱特性を有するＣＤ４３＋Ｂ２２０ｌｏ細胞として同定した。プレＢ細胞は、ＩｇＭ−ＣＤ４３−Ｂ２２０ｌｏ細胞であった。未成熟および成熟ＣＤ４３−Ｂ細胞を、ＩｇＭおよびＢ２２０の相対密度に基づき３つの集団（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ）に分類した。バックグラウンド蛍光染色を、ネガティブコントロールとしてアイソタイプが適合したコントロールモノクローナル抗体を用いて評価した（点線）。図２Ｈは、ＨＳＡおよびＣＤ２１発現の相対密度によって規定される、Ｔ１、Ｔ２または成熟（Ｍ）脾臓Ｂ細胞によるＣＤ２０発現を示す。図２Ｉは、ＣＤ２３発現、ならびにＩｇＭおよびＣＤ２１の相対密度によって規定される、Ｔ１、Ｔ２、辺縁帯（ＭＺ）および成熟（Ｍ）脾臓Ｂ細胞によるＣＤ２０発現を示す。全ての結果は、３匹以上の２ヶ月齢野生型マウスを用いて得られた結果の代表である。
【図２−２】図２Ａ〜２Ｉは、Ｂ細胞成長中のＣＤ２０発現を示す。図２Ａは、ＭＢ２０−７（太線）またはアイソタイプコントロール（破線）モノクローナル抗体を用いた、マウスリンパ芽球様細胞株の免疫蛍光染色を示す。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの骨髄（図２Ｂ）、血液（図２Ｃ）、末梢リンパ節（ＰＬＮ；図２Ｄ）、脾臓（図２Ｅ）および腹腔（図２Ｆ）から単離されたリンパ球の単一細胞懸濁液を、フローサイトメトリー分析を用いて２色免疫蛍光染色法によって試験した。図２Ｇは、４色フローサイトメトリー分析で評価した、骨髄Ｂ細胞亜集団によるＣＤ２０発現を示す。プロＢ細胞を、リンパ球の前方散乱および側方散乱特性を有するＣＤ４３＋Ｂ２２０ｌｏ細胞として同定した。プレＢ細胞は、ＩｇＭ−ＣＤ４３−Ｂ２２０ｌｏ細胞であった。未成熟および成熟ＣＤ４３−Ｂ細胞を、ＩｇＭおよびＢ２２０の相対密度に基づき３つの集団（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ）に分類した。バックグラウンド蛍光染色を、ネガティブコントロールとしてアイソタイプが適合したコントロールモノクローナル抗体を用いて評価した（点線）。図２Ｈは、ＨＳＡおよびＣＤ２１発現の相対密度によって規定される、Ｔ１、Ｔ２または成熟（Ｍ）脾臓Ｂ細胞によるＣＤ２０発現を示す。図２Ｉは、ＣＤ２３発現、ならびにＩｇＭおよびＣＤ２１の相対密度によって規定される、Ｔ１、Ｔ２、辺縁帯（ＭＺ）および成熟（Ｍ）脾臓Ｂ細胞によるＣＤ２０発現を示す。全ての結果は、３匹以上の２ヶ月齢野生型マウスを用いて得られた結果の代表である。
【図２−３】図２Ａ〜２Ｉは、Ｂ細胞成長中のＣＤ２０発現を示す。図２Ａは、ＭＢ２０−７（太線）またはアイソタイプコントロール（破線）モノクローナル抗体を用いた、マウスリンパ芽球様細胞株の免疫蛍光染色を示す。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの骨髄（図２Ｂ）、血液（図２Ｃ）、末梢リンパ節（ＰＬＮ；図２Ｄ）、脾臓（図２Ｅ）および腹腔（図２Ｆ）から単離されたリンパ球の単一細胞懸濁液を、フローサイトメトリー分析を用いて２色免疫蛍光染色法によって試験した。図２Ｇは、４色フローサイトメトリー分析で評価した、骨髄Ｂ細胞亜集団によるＣＤ２０発現を示す。プロＢ細胞を、リンパ球の前方散乱および側方散乱特性を有するＣＤ４３＋Ｂ２２０ｌｏ細胞として同定した。プレＢ細胞は、ＩｇＭ−ＣＤ４３−Ｂ２２０ｌｏ細胞であった。未成熟および成熟ＣＤ４３−Ｂ細胞を、ＩｇＭおよびＢ２２０の相対密度に基づき３つの集団（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ）に分類した。バックグラウンド蛍光染色を、ネガティブコントロールとしてアイソタイプが適合したコントロールモノクローナル抗体を用いて評価した（点線）。図２Ｈは、ＨＳＡおよびＣＤ２１発現の相対密度によって規定される、Ｔ１、Ｔ２または成熟（Ｍ）脾臓Ｂ細胞によるＣＤ２０発現を示す。図２Ｉは、ＣＤ２３発現、ならびにＩｇＭおよびＣＤ２１の相対密度によって規定される、Ｔ１、Ｔ２、辺縁帯（ＭＺ）および成熟（Ｍ）脾臓Ｂ細胞によるＣＤ２０発現を示す。全ての結果は、３匹以上の２ヶ月齢野生型マウスを用いて得られた結果の代表である。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｃは、マウスＣＤ２０およびＣＤ２０−／−Ｂ細胞の生化学的特性決定を示す。図３Ａは、ＨＢ２０−８（ＰＢ４；ヒトＣＤ２０）およびＭＢ２０−１（マウスＣＤ２０）モノクローナル抗体をそれぞれ用いて、表面ビオチン化Ｒａｊｉ（ヒト）およびＡ２０（マウス）Ｂ細胞株から免疫沈降したＣＤ２０（矢印）を示す。アイソタイプが適合したコントロールモノクローナル抗体（Ｃ抗体）を用いた免疫沈降を示す。還元ゲルパネル中の縦の破線は、これらの結果が平行に泳動した別個のゲルに由来するものであることを示している。図３Ｂは、ＣＤ２０発現のウエスタンブロット分析を示す。Ｒａｊｉ（１×１０６細胞／レーン）、Ａ２０および３００．１９Ｂ細胞株または精製マウス脾臓Ｂ細胞（５×１０６細胞／レーン）の溶解物を、還元条件下で煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてニトロセルロースに移した後に、ＭＢ２０−１モノクローナル抗体でプローブした。
【図３−２】図３Ａ〜３Ｃは、マウスＣＤ２０およびＣＤ２０−／−Ｂ細胞の生化学的特性決定を示す。図３Ｃは、ＰＭＡを含んでまたは含まずにインキュベートした初代Ｂ細胞およびＢ細胞株における、ＣＤ２０リン酸化を示す。リン酸塩を含まない培地中で培養したＡ２０細胞（２×１０７）、ＬＰＳ活性化マウス脾臓Ｂ細胞（２×１０７）およびＲａｊｉ細胞（１×１０７）を、３２ＰＯ４を含む培地中で９０分間インキュベートした。各々の培養物の半分をＰＭＡ（２００ｎｇ／ｍＬ）と共に３０分間インキュベートした後に、これらの細胞を界面活性剤で溶解させた。
【図４−１】図４Ａ〜４Ｄは、ＣＤ２０−／−Ｂ細胞における変化したＣａ２＋応答を示す。Ｃａ２＋応答は、ＣＤ２０−／−および野生型同腹仔に由来するｉｎｄｏ−１負荷Ｂ細胞において、ＩｇＭ（図４Ａ）、ＣＤ１９連結（図４Ｂ）、またはタプシガルジン（図４Ｃ）によって誘導される。１分（矢印）で、最適濃度のヤギ抗ＩｇＭ  Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメント、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体またはタプシガルジンを、ＥＧＴＡの存在下または非存在下で添加した。ｉｎｄｏ−１蛍光比率の増大は、［Ｃａ２＋］ｉの増大を示す。結果は、少なくとも６回の実験からの結果の代表である。図４Ｄでは、ＣＤ２０−／−（細線）および野生型（太線）同腹仔に由来する脾細胞によるＣＤ１９発現を、フローサイトメトリー分析で、フィコエリトリン結合体化抗ＣＤ１９モノクローナル抗体を用いた免疫蛍光染色によって評価した。破線は、コントロールモノクローナル抗体を用いた野生型脾細胞の染色を示す。
【図４−２】図４Ａ〜４Ｄは、ＣＤ２０−／−Ｂ細胞における変化したＣａ２＋応答を示す。Ｃａ２＋応答は、ＣＤ２０−／−および野生型同腹仔に由来するｉｎｄｏ−１負荷Ｂ細胞において、ＩｇＭ（図４Ａ）、ＣＤ１９連結（図４Ｂ）、またはタプシガルジン（図４Ｃ）によって誘導される。１分（矢印）で、最適濃度のヤギ抗ＩｇＭ  Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメント、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体またはタプシガルジンを、ＥＧＴＡの存在下または非存在下で添加した。ｉｎｄｏ−１蛍光比率の増大は、［Ｃａ２＋］ｉの増大を示す。結果は、少なくとも６回の実験からの結果の代表である。図４Ｄでは、ＣＤ２０−／−（細線）および野生型（太線）同腹仔に由来する脾細胞によるＣＤ１９発現を、フローサイトメトリー分析で、フィコエリトリン結合体化抗ＣＤ１９モノクローナル抗体を用いた免疫蛍光染色によって評価した。破線は、コントロールモノクローナル抗体を用いた野生型脾細胞の染色を示す。
【図５−１】図５Ａ〜５Ｂは、ＣＤ２０−／−および野生型同腹仔の精製脾臓Ｂ細胞におけるタンパク質チロシンリン酸化を示す。図５Ａでは、Ｂ細胞（２×１０７／試料）を、Ｆ（ａｂ’）２抗ＩｇＭ抗体フラグメントと共に、示した時間インキュベートし、そして界面活性剤で溶解させた。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースに移し、そして抗ホスホチロシン（抗ｐＴｙｒ）抗体で免疫ブロットした。このブロットを溶出し、等価タンパク質負荷のためのコントロールとして抗ＳＨＰ−１抗体でリプローブした。
【図５−２】図５Ａ〜５Ｂは、ＣＤ２０−／−および野生型同腹仔の精製脾臓Ｂ細胞におけるタンパク質チロシンリン酸化を示す。図５Ｂは、ＣＤ２０−／−Ｂ細胞によるシグナル伝達分子のチロシンリン酸化を示す。野生型およびＣＤ２０−／−同腹仔に由来する精製脾臓Ｂ細胞を、Ｆ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＭ抗体（４０μｇ／ｍＬ）で、示した時間刺激した。細胞の界面活性剤溶解物を、抗ホスホチロシン抗体を用いたウエスタンブロット分析に利用して、タンパク質リン酸化を評価した。続いて、これらのブロットを溶出し、抗ＥＲＫ２抗体でリプローブして、試料間の等価タンパク質負荷を確認した。分子量マーカー（ｋＤａ）の移動を各パネルに示す。全ての結果は、少なくとも３回の別個の実験で得られた結果を代表する。
【図６−１】図６Ａ〜６Ｃは、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体と、マウス脾臓Ｂ細胞との反応性を示す。図６Ａは、代表的な抗ＣＤ２０（実線）またはアイソタイプが適合したコントロール（破線）モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍＬ）で染色した、ＣＤ１９＋細胞の蛍光強度を示す。図６Ｂは、モノクローナル抗体濃度の範囲にわたる抗ＣＤ２０モノクローナル抗体染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。矢印は、０．５μｇ／ｍＬで用いた場合のモノクローナル抗体染色の平均強度を示す。
【図６−２】図６Ａ〜６Ｃは、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体と、マウス脾臓Ｂ細胞との反応性を示す。図６Ｃは、抗ＣＤ２０（実線）またはアイソタイプが適合したコントロール（破線）モノクローナル抗体（０．５μｇ／ｍＬ）で染色した、ＣＤ１９＋細胞の蛍光強度を示す。全ての場合において、モノクローナル抗体染色は、フローサイトメトリー分析で、ＰＥ結合体化アイソタイプ特異的二次抗体を用いて可視化した。結果は、３回以上の実験で得られた結果を代表する。
【図７−１】図７Ａ〜７Ｄは、インビボでのＢ細胞枯渇を示す。図７Ａは、フローサイトメトリー分析で免疫蛍光染色によって決定した、野生型またはＣＤ２０−／−マウスをＭＢ２０−１１またはアイソタイプが適合したコントロールモノクローナル抗体で処置した後の、血液（２日目）および脾臓（７日目）からの代表的なＢ細胞枯渇を示す。数は、ゲートをかけたＢ２２０＋Ｂ細胞の百分率を示す。
【図７−２】図７Ａ〜７Ｄは、インビボでのＢ細胞枯渇を示す。図７Ｂは、ＭＢ２０またはアイソタイプコントロールモノクローナル抗体で２匹以上の野生型同腹仔を処置した後の、血液（２または７日目、１ｍＬ当たり）および脾臓（７日目）のＢ細胞の総数（±ＳＥＭ）を示す。ＭＢ２０またはアイソタイプコントロールモノクローナル抗体処置マウスについての平均値結果間の有意差を、以下のように示す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図７−３】図７Ａ〜７Ｄは、インビボでのＢ細胞枯渇を示す。図７Ｃは、ＭＢ２０−１１モノクローナル抗体を異なる用量で用いた処置の７日後の、野生型同腹仔における血液および脾臓Ｂ細胞数（±ＳＥＭ）を示す（１データポイント当たり２匹以上のマウス）。未処置（０）とモノクローナル抗体処置マウスの間の有意差を、以下のように示す；＊＊ｐ＜０．０１。図７Ｄは、０日目でのＭＢ２０−１１（黒丸）またはアイソタイプコントロール（白丸）モノクローナル抗体処置後の、野生型マウスにおける血液および脾臓のＢ細胞数（±ＳＥＭ）を示す（１群当たり５匹以上のマウス）。時間０の後に示した値は、１時間で得られたデータを示す。
【図８−１】図８Ａ〜８Ｅは、Ｂ細胞枯渇がＦｃγＲ依存性であることを示す。図８Ａは、０日目にＦｃＲγ−／−、ＦｃγＲＩ−／−、ＦｃγＲＩＩ−／−およびＦｃγＲＩＩＩ−／−マウスをＭＢ２０−１１（黒丸）またはアイソタイプコントロール（白丸）モノクローナル抗体で処置した後の血液Ｂ細胞枯渇を示す。値は、モノクローナル抗体処置の前（時間０）および１時間または２日、４日もしくは７日後の平均循環Ｂ細胞数（±ＳＥＭ、１ｍＬ当たり）を示す（１時点当たり５匹以上のマウス）。図８Ｂは、モノクローナル抗体処置の７日後の代表的な脾臓Ｂ細胞枯渇を示す。数は、表示ゲート内のＢ２２０＋リンパ球の百分率を示す。図８Ｃは、ＭＢ２０−１１（黒棒）またはアイソタイプコントロール（白棒）モノクローナル抗体処置の７日後の平均脾臓Ｂ細胞数（±ＳＥＭ）を示す（１群当たり５匹以上のマウス）。数は、コントロールモノクローナル抗体処置同腹仔と比較して、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体処置マウスにおけるＢ２２０＋リンパ球の平均相対百分率を示す。図８Ｄは、０日目でのＦｃＲγ−／−同腹仔のＭＢ２０−１（黒丸）またはアイソタイプコントロール（白丸）モノクローナル抗体処置後のＢ細胞枯渇を、０日目での野生型同腹仔のＭＢ２０−１（黒四角）またはアイソタイプコントロール（白四角）モノクローナル抗体処置と比較して示す。ＦｃＲγ−／−同腹仔をＭＢ２０−１またはコントロールモノクローナル抗体で処置した７日後の代表的な脾臓Ｂ細胞枯渇。数は、Ｂ２２０＋リンパ球の百分率を示す。棒グラフは、ＦｃＲγ−／−（黒棒）または野生型（白棒）マウスをＭＢ２０−１またはアイソタイプコントロールモノクローナル抗体で処置した７日後の平均脾臓Ｂ細胞数（±ＳＥＭ）を示す（１群当たり５匹以上のマウス）。図８Ｅは、０日目でのＦｃＲγ−／−同腹仔のＭＢ２０−１８（黒丸）またはアイソタイプコントロール（白丸）モノクローナル抗体処置後の血液および脾臓（７日目）Ｂ細胞枯渇を、０日目での野生型同腹仔のＭＢ２０−１８（黒四角）またはアイソタイプコントロール（白四角）モノクローナル抗体処置と比較して示す。棒グラフ（ヒストグラム）は、ＦｃＲγ−／−（黒棒）または野生型（白棒）マウスをＭＢ２０−１８またはアイソタイプコントロールモノクローナル抗体で処置した７日後の平均脾臓Ｂ細胞数（±ＳＥＭ）を示す（１群当たり５匹以上のマウス）。図８Ａ〜Ｅでは、ＭＢ２０またはアイソタイプコントロールモノクローナル抗体処置マウスについての平均値の結果間の有意差を、以下のように示す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図８−２】図８Ａ〜８Ｅは、Ｂ細胞枯渇がＦｃγＲ依存性であることを示す。図８Ａは、０日目にＦｃＲγ−／−、ＦｃγＲＩ−／−、ＦｃγＲＩＩ−／−およびＦｃγＲＩＩＩ−／−マウスをＭＢ２０−１１（黒丸）またはアイソタイプコントロール（白丸）モノクローナル抗体で処置した後の血液Ｂ細胞枯渇を示す。値は、モノクローナル抗体処置の前（時間０）および１時間または２日、４日もしくは７日後の平均循環Ｂ細胞数（±ＳＥＭ、１ｍＬ当たり）を示す（１時点当たり５匹以上のマウス）。図８Ｂは、モノクローナル抗体処置の７日後の代表的な脾臓Ｂ細胞枯渇を示す。数は、表示ゲート内のＢ２２０＋リンパ球の百分率を示す。図８Ｃは、ＭＢ２０−１１（黒棒）またはアイソタイプコントロール（白棒）モノクローナル抗体処置の７日後の平均脾臓Ｂ細胞数（±ＳＥＭ）を示す（１群当たり５匹以上のマウス）。数は、コントロールモノクローナル抗体処置同腹仔と比較して、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体処置マウスにおけるＢ２２０＋リンパ球の平均相対百分率を示す。図８Ｄは、０日目でのＦｃＲγ−／−同腹仔のＭＢ２０−１（黒丸）またはアイソタイプコントロール（白丸）モノクローナル抗体処置後のＢ細胞枯渇を、０日目での野生型同腹仔のＭＢ２０−１（黒四角）またはアイソタイプコントロール（白四角）モノクローナル抗体処置と比較して示す。ＦｃＲγ−／−同腹仔をＭＢ２０−１またはコントロールモノクローナル抗体で処置した７日後の代表的な脾臓Ｂ細胞枯渇。数は、Ｂ２２０＋リンパ球の百分率を示す。棒グラフは、ＦｃＲγ−／−（黒棒）または野生型（白棒）マウスをＭＢ２０−１またはアイソタイプコントロールモノクローナル抗体で処置した７日後の平均脾臓Ｂ細胞数（±ＳＥＭ）を示す（１群当たり５匹以上のマウス）。図８Ｅは、０日目でのＦｃＲγ−／−同腹仔のＭＢ２０−１８（黒丸）またはアイソタイプコントロール（白丸）モノクローナル抗体処置後の血液および脾臓（７日目）Ｂ細胞枯渇を、０日目での野生型同腹仔のＭＢ２０−１８（黒四角）またはアイソタイプコントロール（白四角）モノクローナル抗体処置と比較して示す。棒グラフは、ＦｃＲγ−／−（黒棒）または野生型（白棒）マウスをＭＢ２０−１８またはアイソタイプコントロールモノクローナル抗体で処置した７日後の平均脾臓Ｂ細胞数（±ＳＥＭ）を示す（１群当たり５匹以上のマウス）。図８Ａ〜Ｅでは、ＭＢ２０またはアイソタイプコントロールモノクローナル抗体処置マウスについての平均値の結果間の有意差を、以下のように示す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図８−３】図８Ａ〜８Ｅは、Ｂ細胞枯渇がＦｃγＲ依存性であることを示す。図８Ａは、０日目にＦｃＲγ−／−、ＦｃγＲＩ−／−、ＦｃγＲＩＩ−／−およびＦｃγＲＩＩＩ−／−マウスをＭＢ２０−１１（黒丸）またはアイソタイプコントロール（白丸）モノクローナル抗体で処置した後の血液Ｂ細胞枯渇を示す。値は、モノクローナル抗体処置の前（時間０）および１時間または２日、４日もしくは７日後の平均循環Ｂ細胞数（±ＳＥＭ、１ｍＬ当たり）を示す（１時点当たり５匹以上のマウス）。図８Ｂは、モノクローナル抗体処置の７日後の代表的な脾臓Ｂ細胞枯渇を示す。数は、表示ゲート内のＢ２２０＋リンパ球の百分率を示す。図８Ｃは、ＭＢ２０−１１（黒棒）またはアイソタイプコントロール（白棒）モノクローナル抗体処置の７日後の平均脾臓Ｂ細胞数（±ＳＥＭ）を示す（１群当たり５匹以上のマウス）。数は、コントロールモノクローナル抗体処置同腹仔と比較して、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体処置マウスにおけるＢ２２０＋リンパ球の平均相対百分率を示す。図８Ｄは、０日目でのＦｃＲγ−／−同腹仔のＭＢ２０−１（黒丸）またはアイソタイプコントロール（白丸）モノクローナル抗体処置後のＢ細胞枯渇を、０日目での野生型同腹仔のＭＢ２０−１（黒四角）またはアイソタイプコントロール（白四角）モノクローナル抗体処置と比較して示す。ＦｃＲγ−／−同腹仔をＭＢ２０−１またはコントロールモノクローナル抗体で処置した７日後の代表的な脾臓Ｂ細胞枯渇。数は、Ｂ２２０＋リンパ球の百分率を示す。棒グラフは、ＦｃＲγ−／−（黒棒）または野生型（白棒）マウスをＭＢ２０−１またはアイソタイプコントロールモノクローナル抗体で処置した７日後の平均脾臓Ｂ細胞数（±ＳＥＭ）を示す（１群当たり５匹以上のマウス）。図８Ｅは、０日目でのＦｃＲγ−／−同腹仔のＭＢ２０−１８（黒丸）またはアイソタイプコントロール（白丸）モノクローナル抗体処置後の血液および脾臓（７日目）Ｂ細胞枯渇を、０日目での野生型同腹仔のＭＢ２０−１８（黒四角）またはアイソタイプコントロール（白四角）モノクローナル抗体処置と比較して示す。棒グラフは、ＦｃＲγ−／−（黒棒）または野生型（白棒）マウスをＭＢ２０−１８またはアイソタイプコントロールモノクローナル抗体で処置した７日後の平均脾臓Ｂ細胞数（±ＳＥＭ）を示す（１群当たり５匹以上のマウス）。図８Ａ〜Ｅでは、ＭＢ２０またはアイソタイプコントロールモノクローナル抗体処置マウスについての平均値の結果間の有意差を、以下のように示す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図８−４】図８Ａ〜８Ｅは、Ｂ細胞枯渇がＦｃγＲ依存性であることを示す。図８Ａは、０日目にＦｃＲγ−／−、ＦｃγＲＩ−／−、ＦｃγＲＩＩ−／−およびＦｃγＲＩＩＩ−／−マウスをＭＢ２０−１１（黒丸）またはアイソタイプコントロール（白丸）モノクローナル抗体で処置した後の血液Ｂ細胞枯渇を示す。値は、モノクローナル抗体処置の前（時間０）および１時間または２日、４日もしくは７日後の平均循環Ｂ細胞数（±ＳＥＭ、１ｍＬ当たり）を示す（１時点当たり５匹以上のマウス）。図８Ｂは、モノクローナル抗体処置の７日後の代表的な脾臓Ｂ細胞枯渇を示す。数は、表示ゲート内のＢ２２０＋リンパ球の百分率を示す。図８Ｃは、ＭＢ２０−１１（黒棒）またはアイソタイプコントロール（白棒）モノクローナル抗体処置の７日後の平均脾臓Ｂ細胞数（±ＳＥＭ）を示す（１群当たり５匹以上のマウス）。数は、コントロールモノクローナル抗体処置同腹仔と比較して、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体処置マウスにおけるＢ２２０＋リンパ球の平均相対百分率を示す。図８Ｄは、０日目でのＦｃＲγ−／−同腹仔のＭＢ２０−１（黒丸）またはアイソタイプコントロール（白丸）モノクローナル抗体処置後のＢ細胞枯渇を、０日目での野生型同腹仔のＭＢ２０−１（黒四角）またはアイソタイプコントロール（白四角）モノクローナル抗体処置と比較して示す。ＦｃＲγ−／−同腹仔をＭＢ２０−１またはコントロールモノクローナル抗体で処置した７日後の代表的な脾臓Ｂ細胞枯渇。数は、Ｂ２２０＋リンパ球の百分率を示す。棒グラフは、ＦｃＲγ−／−（黒棒）または野生型（白棒）マウスをＭＢ２０−１またはアイソタイプコントロールモノクローナル抗体で処置した７日後の平均脾臓Ｂ細胞数（±ＳＥＭ）を示す（１群当たり５匹以上のマウス）。図８Ｅは、０日目でのＦｃＲγ−／−同腹仔のＭＢ２０−１８（黒丸）またはアイソタイプコントロール（白丸）モノクローナル抗体処置後の血液および脾臓（７日目）Ｂ細胞枯渇を、０日目での野生型同腹仔のＭＢ２０−１８（黒四角）またはアイソタイプコントロール（白四角）モノクローナル抗体処置と比較して示す。棒グラフは、ＦｃＲγ−／−（黒棒）または野生型（白棒）マウスをＭＢ２０−１８またはアイソタイプコントロールモノクローナル抗体で処置した７日後の平均脾臓Ｂ細胞数（±ＳＥＭ）を示す（１群当たり５匹以上のマウス）。図８Ａ〜Ｅでは、ＭＢ２０またはアイソタイプコントロールモノクローナル抗体処置マウスについての平均値の結果間の有意差を、以下のように示す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図９−１】図９Ａ〜９Ｄは、インビボでのＢ細胞枯渇がＣ-非依存性であることを示す。図９Ａは、脾臓Ｂ細胞に対するＭＢ２０モノクローナル抗体のインビトロでのＣ依存性細胞傷害性を示す。値は、３回以上の実験において、ヨウ化プロピジウム陽性（Ｐｌ＋）であったＢ２２０＋細胞の平均（±ＳＥＭ）百分率を示す。図９Ｂは、０日目にＣ３−／−、Ｃ４−／−またはＣ１ｑ−／−マウスをＭＢ２０−１１（黒丸）またはアイソタイプコントロール（白丸）モノクローナル抗体で処置した後のＢ細胞枯渇を示す。血液の値は、モノクローナル抗体処置の前（時間０）および１時間または２日、４日もしくは７日後の平均循環Ｂ細胞数（±ＳＥＭ、１ｍＬ当たり）を示す（１時点当たり５匹以上のマウス）。ＭＢ２０−１１（黒棒）およびアイソタイプコントロール（白棒）モノクローナル抗体処置７日後の代表的な脾臓Ｂ細胞頻度および平均Ｂ細胞数（±ＳＥＭ）（１群当たり５匹以上のマウス）。図９Ｃ〜Ｄは、０日目でのＣ３−／−マウスのＭＢ２０−１またはＭＢ２０−１８（黒丸）あるいはアイソタイプコントロール（白丸）モノクローナル抗体処置後の血液および脾臓Ｂ細胞枯渇を、０日目での野生型マウスのＭＢ２０−１またはＭＢ２０−１８（黒四角）あるいはアイソタイプコントロール（白四角）モノクローナル抗体処置と比較して示す。Ｃ３−／−同腹仔をＭＢ２０−１またはコントロールモノクローナル抗体で処置した７日後の代表的な脾臓Ｂ細胞枯渇。数は、表示ゲート内のＢ２２０＋リンパ球の百分率を示す。棒グラフは、Ｃ３−／−（黒棒）または野生型（白棒）マウスをＭＢ２０−１またはアイソタイプコントロールモノクローナル抗体で処置した７日後の平均脾臓Ｂ細胞数（±ＳＥＭ）を示す（１群当たり５匹以上のマウス）。図９Ａ〜Ｄでは、ＭＢ２０またはアイソタイプコントロールモノクローナル抗体処置マウスについての平均値の結果間の有意差を、以下のように示す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図９−２】図９Ａ〜９Ｄは、インビボでのＢ細胞枯渇がＣ-非依存性であることを示す。図９Ａは、脾臓Ｂ細胞に対するＭＢ２０モノクローナル抗体のインビトロでのＣ依存性細胞傷害性を示す。値は、３回以上の実験において、ヨウ化プロピジウム陽性（Ｐｌ＋）であったＢ２２０＋細胞の平均（±ＳＥＭ）百分率を示す。図９Ｂは、０日目にＣ３−／−、Ｃ４−／−またはＣ１ｑ−／−マウスをＭＢ２０−１１（黒丸）またはアイソタイプコントロール（白丸）モノクローナル抗体で処置した後のＢ細胞枯渇を示す。血液の値は、モノクローナル抗体処置の前（時間０）および１時間または２日、４日もしくは７日後の平均循環Ｂ細胞数（±ＳＥＭ、１ｍＬ当たり）を示す（１時点当たり５匹以上のマウス）。ＭＢ２０−１１（黒棒）およびアイソタイプコントロール（白棒）モノクローナル抗体処置７日後の代表的な脾臓Ｂ細胞頻度および平均Ｂ細胞数（±ＳＥＭ）（１群当たり５匹以上のマウス）。図９Ｃ〜Ｄは、０日目でのＣ３−／−マウスのＭＢ２０−１またはＭＢ２０−１８（黒丸）あるいはアイソタイプコントロール（白丸）モノクローナル抗体処置後の血液および脾臓Ｂ細胞枯渇を、０日目での野生型マウスのＭＢ２０−１またはＭＢ２０−１８（黒四角）あるいはアイソタイプコントロール（白四角）モノクローナル抗体処置と比較して示す。Ｃ３−／−同腹仔をＭＢ２０−１またはコントロールモノクローナル抗体で処置した７日後の代表的な脾臓Ｂ細胞枯渇。数は、表示ゲート内のＢ２２０＋リンパ球の百分率を示す。棒グラフは、Ｃ３−／−（黒棒）または野生型（白棒）マウスをＭＢ２０−１またはアイソタイプコントロールモノクローナル抗体で処置した７日後の平均脾臓Ｂ細胞数（±ＳＥＭ）を示す（１群当たり５匹以上のマウス）。図９Ａ〜Ｄでは、ＭＢ２０またはアイソタイプコントロールモノクローナル抗体処置マウスについての平均値の結果間の有意差を、以下のように示す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図９−３】図９Ａ〜９Ｄは、インビボでのＢ細胞枯渇がＣ-非依存性であることを示す。図９Ａは、脾臓Ｂ細胞に対するＭＢ２０モノクローナル抗体のインビトロでのＣ依存性細胞傷害性を示す。値は、３回以上の実験において、ヨウ化プロピジウム陽性（Ｐｌ＋）であったＢ２２０＋細胞の平均（±ＳＥＭ）百分率を示す。図９Ｂは、０日目にＣ３−／−、Ｃ４−／−またはＣ１ｑ−／−マウスをＭＢ２０−１１（黒丸）またはアイソタイプコントロール（白丸）モノクローナル抗体で処置した後のＢ細胞枯渇を示す。血液の値は、モノクローナル抗体処置の前（時間０）および１時間または２日、４日もしくは７日後の平均循環Ｂ細胞数（±ＳＥＭ、１ｍＬ当たり）を示す（１時点当たり５匹以上のマウス）。ＭＢ２０−１１（黒棒）およびアイソタイプコントロール（白棒）モノクローナル抗体処置７日後の代表的な脾臓Ｂ細胞頻度および平均Ｂ細胞数（±ＳＥＭ）（１群当たり５匹以上のマウス）。図９Ｃ〜Ｄは、０日目でのＣ３−／−マウスのＭＢ２０−１またはＭＢ２０−１８（黒丸）あるいはアイソタイプコントロール（白丸）モノクローナル抗体処置後の血液および脾臓Ｂ細胞枯渇を、０日目での野生型マウスのＭＢ２０−１またはＭＢ２０−１８（黒四角）あるいはアイソタイプコントロール（白四角）モノクローナル抗体処置と比較して示す。Ｃ３−／−同腹仔をＭＢ２０−１またはコントロールモノクローナル抗体で処置した７日後の代表的な脾臓Ｂ細胞枯渇。数は、表示ゲート内のＢ２２０＋リンパ球の百分率を示す。棒グラフは、Ｃ３−／−（黒棒）または野生型（白棒）マウスをＭＢ２０−１またはアイソタイプコントロールモノクローナル抗体で処置した７日後の平均脾臓Ｂ細胞数（±ＳＥＭ）を示す（１群当たり５匹以上のマウス）。図９Ａ〜Ｄでは、ＭＢ２０またはアイソタイプコントロールモノクローナル抗体処置マウスについての平均結値の果間の有意差を、以下のように示す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図１０−１】図１０Ａ〜１０Ｂは、単球がＢ細胞枯渇を媒介することを示す。野生型マウスを、図示したように（矢印）、クロドロネート（ＣＬＯＤ）で処置してマクロファージを枯渇させ、一方、他のマウスは白血球亜集団に遺伝的欠損を有した。図１０Ａは、０日目でのＭＢ２０−１１（黒丸）またはアイソタイプコントロール（白丸）モノクローナル抗体処置後の血液Ｂ細胞枯渇を示す。クロドロネート処置マウスについて、縦の破線は時間０のモノクローナル抗体処置を示し、モノクローナル抗体処置１時間および２日、４日および７日後の血液Ｂ細胞数を決定した。ＣＳＦ１ｏｐマウスについて、モノクローナル抗体処置の１時間後に循環Ｂ細胞数を数量化しなかった。なぜなら、これらのマウスのサイズが小さく、死亡率に関する危険性のためである。１時間の時点でのＢ細胞数を、他方のマウス遺伝子型について示す。図１０Ｂは、ＭＢ２０−１１（黒棒）またはアイソタイプコントロール（白棒）モノクローナル抗体処置７日後の代表的なフローサイトメトリー分析および平均脾臓Ｂ細胞数（±ＳＥＭ）を示す（１群当たり５匹以上のマウス）。アイソタイプコントロールまたはＭＢ２０モノクローナル抗体処置細胞からの平均値の結果間の有意差を、以下のように示す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図１０−２】図１０Ａ〜１０Ｂは、単球がＢ細胞枯渇を媒介することを示す。野生型マウスを、図示したように（矢印）、クロドロネート（ＣＬＯＤ）で処置してマクロファージを枯渇させ、一方、他のマウスは白血球亜集団に遺伝的欠損を有した。図１０Ａは、０日目でのＭＢ２０−１１（黒丸）またはアイソタイプコントロール（白丸）モノクローナル抗体処置後の血液Ｂ細胞枯渇を示す。クロドロネート処置マウスについて、縦の破線は時間０のモノクローナル抗体処置を示し、モノクローナル抗体処置１時間および２日、４日および７日後の血液Ｂ細胞数を決定した。ＣＳＦ１ｏｐマウスについて、モノクローナル抗体処置の１時間後に循環Ｂ細胞数を数量化しなかった。なぜなら、これらのマウスのサイズが小さく、死亡率に関する危険性のためである。１時間の時点でのＢ細胞数を、他方のマウス遺伝子型について示す。図１０Ｂは、ＭＢ２０−１１（黒棒）またはアイソタイプコントロール（白棒）モノクローナル抗体処置７日後の代表的なフローサイトメトリー分析および平均脾臓Ｂ細胞数（±ＳＥＭ）を示す（１群当たり５匹以上のマウス）。アイソタイプコントロールまたはＭＢ２０モノクローナル抗体処置細胞からの平均値の結果間の有意差を、以下のように示す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、既知のマウス抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体のアミノ酸配列アラインメントを示す（表１）。図１１Ａでは、各々のモノクローナル抗体Ｖ、ＤおよびＪ領域についてのコード配列の起点の重鎖アミノ酸番号付けおよび命名は、従来の方法（Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）に従い、この方法では、アミノ酸位置１〜９４ならびに相補性決定領域ＣＤＲ１および２はＶＨ遺伝子によってコードされる。ダッシュは、類似のアミノ酸配列のアラインメントを最大にするためにこの配列中に挿入されたギャップを示す。これらの配列中のギャップを、明確にするためにＶＨ、ＤおよびＪセグメントの間に導入した。図１１Ｂは、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の軽鎖ＶＫアミノ酸配列分析を示す。各々のモノクローナル抗体についてのコード配列の起点のアミノ酸番号付けおよび命名は、従来の方法（Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）に従う。予測したシグナル配列切断部位に続くアミノ酸を、１と番号付けする。ダッシュは、類似のアミノ酸配列のアラインメントを最大にするためにこの配列中に挿入されたギャップを示す。これらの配列中のギャップを、明確にするためにＶＫおよびＪ断片配列の間に導入した。
【図１２】図１２は、図１１に示した既知のマウス抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体についての推定モノクローナル抗体重鎖および軽鎖配列のＵＰＧＭＡ（算術平均を用いた非加重対グループ法）系統樹を示す。比較目的のために、３種のマウス抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体である、ＨＢ２０−０３、−０４および−２５モノクローナル抗体を示す。相対的な水平の系統樹枝長は、配列関連性の尺度である。例えば、既知のマウス抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖は、互いに最も類似しているＨＢ２０−０３、−０４および−２５モノクローナル抗体の配列に対してよりも、さらに互いに類似している。３番目のパネルにおいて、配列決定分析の前に、これらの重鎖と軽鎖の配列を連結して隣接Ｈ＋Ｌ鎖配列を形成する。この分析により、この重鎖および軽鎖の組み合わせが、既知の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体とＨＢ２０−３、−４および−２５モノクローナル抗体の間で関連していないことを示す。このＵＰＧＭＡ系統樹は、Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓバージョン２．０（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて作製した。
【図１３】図１３は、図１１に示す既知のマウス抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体についての推定モノクローナル抗体重鎖Ｖ（Ｄ）Ｊ配列と、ヒトおよびマウスＣＤ２０と反応性のＨＢ２０系およびＭＢ２０系のモノクローナル抗体（表１）の、アミノ酸配列比較を示す。データを、推定モノクローナル抗体重鎖配列のＵＰＧＭＡ系統樹として示す。相対的な水平の系統樹分岐長さは、配列関連性の尺度である。重鎖を、右側に示すように、配列類似性に基づいて群化（Ａ〜Ｇ）した。
【図１４−１】図１４Ａ〜１４Ｎは、ヒトおよびマウスＣＤ２０と反応性のＨＢ２０系およびＭＢ２０系のモノクローナル抗体（表１）の重鎖ＶＨ−Ｄ−ＪＨ結合部配列についてのヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を示す。図１４Ａは、ＨＢ２０−０１、ＨＢ２０−０２およびＨＢ２０−０６についてのアミノ酸配列（配列番号１）およびヌクレオチド配列（配列番号２）を示す；図１４Ｂは、ＨＢ２０−０３についてのアミノ酸配列（配列番号３）およびヌクレオチド配列（配列番号４）を示す；図１４Ｃは、ＨＢ２０−０４についてのアミノ酸配列（配列番号５）およびヌクレオチド配列（配列番号６）を示す；図１４Ｄは、ＨＢ２０−０５についてのアミノ酸配列（配列番号７）およびヌクレオチド配列（配列番号８）を示す；図１４Ｅは、ＨＢ２０−２５についてのアミノ酸配列（配列番号９）およびヌクレオチド配列（配列番号１０）を示す；図１４Ｆは、ＭＢ２０−０１およびＭＢ２０−１３についてのアミノ酸配列（配列番号１１）およびヌクレオチド配列（配列番号１２）を示す；図１４Ｇは、ＭＢ２０−０２についてのアミノ酸配列（配列番号１３）およびヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す；図１４Ｈは、ＭＢ２０−０７についてのアミノ酸配列（配列番号１５）およびヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す；図１４Ｉは、ＭＢ２０−０８についてのアミノ酸配列（配列番号１７）およびヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す；図１４Ｊは、ＭＢ２０−１０についてのアミノ酸配列（配列番号１９）およびヌクレオチド配列（配列番号２０）を示す；図１４Ｋは、ＭＢ２０−１１についてのアミノ酸配列（配列番号２１）およびヌクレオチド配列（配列番号２２）を示す；図１４Ｌは、ＭＢ２０−１４についてのアミノ酸配列（配列番号２３）およびヌクレオチド配列（配列番号２４）を示す；図１４Ｍは、ＭＢ２０−１６についてのアミノ酸配列（配列番号２５）およびヌクレオチド配列（配列番号２６）；ならびに図１４Ｎは、ＭＢ２０−１８についてのアミノ酸配列（配列番号２７）およびヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す。これらの５’ＰＣＲプライマーと重複する配列は２重下線で示し、重複プライマーが各配列の増幅に用いられたので、実際のＤＮＡ配列と異なり得る（表１）。Ｖ、ＤおよびＪ配列間のおおよその結合部境界は、縦棒（｜）でこれらの配列中に指定する。既知のＤ領域ＤＮＡ配列に相同な推定配列には１重下線を引いている。小文字のヌクレオチドは、結合部境界でのヌクレオチド付加または体細胞超変異に関する潜在的部位のいずれかを示す。
【図１４−２】図１４Ａ〜１４Ｎは、ヒトおよびマウスＣＤ２０と反応性のＨＢ２０系およびＭＢ２０系のモノクローナル抗体（表１）の重鎖ＶＨ−Ｄ−ＪＨ結合部配列についてのヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を示す。図１４Ａは、ＨＢ２０−０１、ＨＢ２０−０２およびＨＢ２０−０６についてのアミノ酸配列（配列番号１）およびヌクレオチド配列（配列番号２）を示す；図１４Ｂは、ＨＢ２０−０３についてのアミノ酸配列（配列番号３）およびヌクレオチド配列（配列番号４）を示す；図１４Ｃは、ＨＢ２０−０４についてのアミノ酸配列（配列番号５）およびヌクレオチド配列（配列番号６）を示す；図１４Ｄは、ＨＢ２０−０５についてのアミノ酸配列（配列番号７）およびヌクレオチド配列（配列番号８）を示す；図１４Ｅは、ＨＢ２０−２５についてのアミノ酸配列（配列番号９）およびヌクレオチド配列（配列番号１０）を示す；図１４Ｆは、ＭＢ２０−０１およびＭＢ２０−１３についてのアミノ酸配列（配列番号１１）およびヌクレオチド配列（配列番号１２）を示す；図１４Ｇは、ＭＢ２０−０２についてのアミノ酸配列（配列番号１３）およびヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す；図１４Ｈは、ＭＢ２０−０７についてのアミノ酸配列（配列番号１５）およびヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す；図１４Ｉは、ＭＢ２０−０８についてのアミノ酸配列（配列番号１７）およびヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す；図１４Ｊは、ＭＢ２０−１０についてのアミノ酸配列（配列番号１９）およびヌクレオチド配列（配列番号２０）を示す；図１４Ｋは、ＭＢ２０−１１についてのアミノ酸配列（配列番号２１）およびヌクレオチド配列（配列番号２２）を示す；図１４Ｌは、ＭＢ２０−１４についてのアミノ酸配列（配列番号２３）およびヌクレオチド配列（配列番号２４）を示す；図１４Ｍは、ＭＢ２０−１６についてのアミノ酸配列（配列番号２５）およびヌクレオチド配列（配列番号２６）；ならびに図１４Ｎは、ＭＢ２０−１８についてのアミノ酸配列（配列番号２７）およびヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す。これらの５’ＰＣＲプライマーと重複する配列は２重下線で示し、重複プライマーが各配列の増幅に用いられたので、実際のＤＮＡ配列と異なり得る（表１）。Ｖ、ＤおよびＪ配列間のおおよその結合部境界は、縦棒（｜）でこれらの配列中に指定する。既知のＤ領域ＤＮＡ配列に相同な推定配列には１重下線を引いている。小文字のヌクレオチドは、結合部境界でのヌクレオチド付加または体細胞超変異に関する潜在的部位のいずれかを示す。
【図１４−３】図１４Ａ〜１４Ｎは、ヒトおよびマウスＣＤ２０と反応性のＨＢ２０系およびＭＢ２０系のモノクローナル抗体（表１）の重鎖ＶＨ−Ｄ−ＪＨ結合部配列についてのヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を示す。図１４Ａは、ＨＢ２０−０１、ＨＢ２０−０２およびＨＢ２０−０６についてのアミノ酸配列（配列番号１）およびヌクレオチド配列（配列番号２）を示す；図１４Ｂは、ＨＢ２０−０３についてのアミノ酸配列（配列番号３）およびヌクレオチド配列（配列番号４）を示す；図１４Ｃは、ＨＢ２０−０４についてのアミノ酸配列（配列番号５）およびヌクレオチド配列（配列番号６）を示す；図１４Ｄは、ＨＢ２０−０５についてのアミノ酸配列（配列番号７）およびヌクレオチド配列（配列番号８）を示す；図１４Ｅは、ＨＢ２０−２５についてのアミノ酸配列（配列番号９）およびヌクレオチド配列（配列番号１０）を示す；図１４Ｆは、ＭＢ２０−０１およびＭＢ２０−１３についてのアミノ酸配列（配列番号１１）およびヌクレオチド配列（配列番号１２）を示す；図１４Ｇは、ＭＢ２０−０２についてのアミノ酸配列（配列番号１３）およびヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す；図１４Ｈは、ＭＢ２０−０７についてのアミノ酸配列（配列番号１５）およびヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す；図１４Ｉは、ＭＢ２０−０８についてのアミノ酸配列（配列番号１７）およびヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す；図１４Ｊは、ＭＢ２０−１０についてのアミノ酸配列（配列番号１９）およびヌクレオチド配列（配列番号２０）を示す；図１４Ｋは、ＭＢ２０−１１についてのアミノ酸配列（配列番号２１）およびヌクレオチド配列（配列番号２２）を示す；図１４Ｌは、ＭＢ２０−１４についてのアミノ酸配列（配列番号２３）およびヌクレオチド配列（配列番号２４）を示す；図１４Ｍは、ＭＢ２０−１６についてのアミノ酸配列（配列番号２５）およびヌクレオチド配列（配列番号２６）；ならびに図１４Ｎは、ＭＢ２０−１８についてのアミノ酸配列（配列番号２７）およびヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す。これらの５’ＰＣＲプライマーと重複する配列は２重下線で示し、重複プライマーが各配列の増幅に用いられたので、実際のＤＮＡ配列と異なり得る（表１）。Ｖ、ＤおよびＪ配列間のおおよその結合部境界は、縦棒（｜）でこれらの配列中に指定する。既知のＤ領域ＤＮＡ配列に相同な推定配列には１重下線を引いている。小文字のヌクレオチドは、結合部境界でのヌクレオチド付加または体細胞超変異に関する潜在的部位のいずれかを示す。
【図１４−４】図１４Ａ〜１４Ｎは、ヒトおよびマウスＣＤ２０と反応性のＨＢ２０系およびＭＢ２０系のモノクローナル抗体（表１）の重鎖ＶＨ−Ｄ−ＪＨ結合部配列についてのヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を示す。図１４Ａは、ＨＢ２０−０１、ＨＢ２０−０２およびＨＢ２０−０６についてのアミノ酸配列（配列番号１）およびヌクレオチド配列（配列番号２）を示す；図１４Ｂは、ＨＢ２０−０３についてのアミノ酸配列（配列番号３）およびヌクレオチド配列（配列番号４）を示す；図１４Ｃは、ＨＢ２０−０４についてのアミノ酸配列（配列番号５）およびヌクレオチド配列（配列番号６）を示す；図１４Ｄは、ＨＢ２０−０５についてのアミノ酸配列（配列番号７）およびヌクレオチド配列（配列番号８）を示す；図１４Ｅは、ＨＢ２０−２５についてのアミノ酸配列（配列番号９）およびヌクレオチド配列（配列番号１０）を示す；図１４Ｆは、ＭＢ２０−０１およびＭＢ２０−１３についてのアミノ酸配列（配列番号１１）およびヌクレオチド配列（配列番号１２）を示す；図１４Ｇは、ＭＢ２０−０２についてのアミノ酸配列（配列番号１３）およびヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す；図１４Ｈは、ＭＢ２０−０７についてのアミノ酸配列（配列番号１５）およびヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す；図１４Ｉは、ＭＢ２０−０８についてのアミノ酸配列（配列番号１７）およびヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す；図１４Ｊは、ＭＢ２０−１０についてのアミノ酸配列（配列番号１９）およびヌクレオチド配列（配列番号２０）を示す；図１４Ｋは、ＭＢ２０−１１についてのアミノ酸配列（配列番号２１）およびヌクレオチド配列（配列番号２２）を示す；図１４Ｌは、ＭＢ２０−１４についてのアミノ酸配列（配列番号２３）およびヌクレオチド配列（配列番号２４）を示す；図１４Ｍは、ＭＢ２０−１６についてのアミノ酸配列（配列番号２５）およびヌクレオチド配列（配列番号２６）；ならびに図１４Ｎは、ＭＢ２０−１８についてのアミノ酸配列（配列番号２７）およびヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す。これらの５’ＰＣＲプライマーと重複する配列は２重下線で示し、重複プライマーが各配列の増幅に用いられたので、実際のＤＮＡ配列と異なり得る（表１）。Ｖ、ＤおよびＪ配列間のおおよその結合部境界は、縦棒（｜）でこれらの配列中に指定する。既知のＤ領域ＤＮＡ配列に相同な推定配列には１重下線を引いている。小文字のヌクレオチドは、結合部境界でのヌクレオチド付加または体細胞超変異に関する潜在的部位のいずれかを示す。
【図１４−５】図１４Ａ〜１４Ｎは、ヒトおよびマウスＣＤ２０と反応性のＨＢ２０系およびＭＢ２０系のモノクローナル抗体（表１）の重鎖ＶＨ−Ｄ−ＪＨ結合部配列についてのヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を示す。図１４Ａは、ＨＢ２０−０１、ＨＢ２０−０２およびＨＢ２０−０６についてのアミノ酸配列（配列番号１）およびヌクレオチド配列（配列番号２）を示す；図１４Ｂは、ＨＢ２０−０３についてのアミノ酸配列（配列番号３）およびヌクレオチド配列（配列番号４）を示す；図１４Ｃは、ＨＢ２０−０４についてのアミノ酸配列（配列番号５）およびヌクレオチド配列（配列番号６）を示す；図１４Ｄは、ＨＢ２０−０５についてのアミノ酸配列（配列番号７）およびヌクレオチド配列（配列番号８）を示す；図１４Ｅは、ＨＢ２０−２５についてのアミノ酸配列（配列番号９）およびヌクレオチド配列（配列番号１０）を示す；図１４Ｆは、ＭＢ２０−０１およびＭＢ２０−１３についてのアミノ酸配列（配列番号１１）およびヌクレオチド配列（配列番号１２）を示す；図１４Ｇは、ＭＢ２０−０２についてのアミノ酸配列（配列番号１３）およびヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す；図１４Ｈは、ＭＢ２０−０７についてのアミノ酸配列（配列番号１５）およびヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す；図１４Ｉは、ＭＢ２０−０８についてのアミノ酸配列（配列番号１７）およびヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す；図１４Ｊは、ＭＢ２０−１０についてのアミノ酸配列（配列番号１９）およびヌクレオチド配列（配列番号２０）を示す；図１４Ｋは、ＭＢ２０−１１についてのアミノ酸配列（配列番号２１）およびヌクレオチド配列（配列番号２２）を示す；図１４Ｌは、ＭＢ２０−１４についてのアミノ酸配列（配列番号２３）およびヌクレオチド配列（配列番号２４）を示す；図１４Ｍは、ＭＢ２０−１６についてのアミノ酸配列（配列番号２５）およびヌクレオチド配列（配列番号２６）；ならびに図１４Ｎは、ＭＢ２０−１８についてのアミノ酸配列（配列番号２７）およびヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す。これらの５’ＰＣＲプライマーと重複する配列は２重下線で示し、重複プライマーが各配列の増幅に用いられたので、実際のＤＮＡ配列と異なり得る（表１）。Ｖ、ＤおよびＪ配列間のおおよその結合部境界は、縦棒（｜）でこれらの配列中に指定する。既知のＤ領域ＤＮＡ配列に相同な推定配列には１重下線を引いている。小文字のヌクレオチドは、結合部境界でのヌクレオチド付加または体細胞超変異に関する潜在的部位のいずれかを示す。
【図１４−６】図１４Ａ〜１４Ｎは、ヒトおよびマウスＣＤ２０と反応性のＨＢ２０系およびＭＢ２０系のモノクローナル抗体（表１）の重鎖ＶＨ−Ｄ−ＪＨ結合部配列についてのヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を示す。図１４Ａは、ＨＢ２０−０１、ＨＢ２０−０２およびＨＢ２０−０６についてのアミノ酸配列（配列番号１）およびヌクレオチド配列（配列番号２）を示す；図１４Ｂは、ＨＢ２０−０３についてのアミノ酸配列（配列番号３）およびヌクレオチド配列（配列番号４）を示す；図１４Ｃは、ＨＢ２０−０４についてのアミノ酸配列（配列番号５）およびヌクレオチド配列（配列番号６）を示す；図１４Ｄは、ＨＢ２０−０５についてのアミノ酸配列（配列番号７）およびヌクレオチド配列（配列番号８）を示す；図１４Ｅは、ＨＢ２０−２５についてのアミノ酸配列（配列番号９）およびヌクレオチド配列（配列番号１０）を示す；図１４Ｆは、ＭＢ２０−０１およびＭＢ２０−１３についてのアミノ酸配列（配列番号１１）およびヌクレオチド配列（配列番号１２）を示す；図１４Ｇは、ＭＢ２０−０２についてのアミノ酸配列（配列番号１３）およびヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す；図１４Ｈは、ＭＢ２０−０７についてのアミノ酸配列（配列番号１５）およびヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す；図１４Ｉは、ＭＢ２０−０８についてのアミノ酸配列（配列番号１７）およびヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す；図１４Ｊは、ＭＢ２０−１０についてのアミノ酸配列（配列番号１９）およびヌクレオチド配列（配列番号２０）を示す；図１４Ｋは、ＭＢ２０−１１についてのアミノ酸配列（配列番号２１）およびヌクレオチド配列（配列番号２２）を示す；図１４Ｌは、ＭＢ２０−１４についてのアミノ酸配列（配列番号２３）およびヌクレオチド配列（配列番号２４）を示す；図１４Ｍは、ＭＢ２０−１６についてのアミノ酸配列（配列番号２５）およびヌクレオチド配列（配列番号２６）；ならびに図１４Ｎは、ＭＢ２０−１８についてのアミノ酸配列（配列番号２７）およびヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す。これらの５’ＰＣＲプライマーと重複する配列は２重下線で示し、重複プライマーが各配列の増幅に用いられたので、実際のＤＮＡ配列と異なり得る（表１）。Ｖ、ＤおよびＪ配列間のおおよその結合部境界は、縦棒（｜）でこれらの配列中に指定する。既知のＤ領域ＤＮＡ配列に相同な推定配列には１重下線を引いている。小文字のヌクレオチドは、結合部境界でのヌクレオチド付加または体細胞超変異に関する潜在的部位のいずれかを示す。
【図１４−７】図１４Ａ〜１４Ｎは、ヒトおよびマウスＣＤ２０と反応性のＨＢ２０系およびＭＢ２０系のモノクローナル抗体（表１）の重鎖ＶＨ−Ｄ−ＪＨ結合部配列についてのヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を示す。図１４Ａは、ＨＢ２０−０１、ＨＢ２０−０２およびＨＢ２０−０６についてのアミノ酸配列（配列番号１）およびヌクレオチド配列（配列番号２）を示す；図１４Ｂは、ＨＢ２０−０３についてのアミノ酸配列（配列番号３）およびヌクレオチド配列（配列番号４）を示す；図１４Ｃは、ＨＢ２０−０４についてのアミノ酸配列（配列番号５）およびヌクレオチド配列（配列番号６）を示す；図１４Ｄは、ＨＢ２０−０５についてのアミノ酸配列（配列番号７）およびヌクレオチド配列（配列番号８）を示す；図１４Ｅは、ＨＢ２０−２５についてのアミノ酸配列（配列番号９）およびヌクレオチド配列（配列番号１０）を示す；図１４Ｆは、ＭＢ２０−０１およびＭＢ２０−１３についてのアミノ酸配列（配列番号１１）およびヌクレオチド配列（配列番号１２）を示す；図１４Ｇは、ＭＢ２０−０２についてのアミノ酸配列（配列番号１３）およびヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す；図１４Ｈは、ＭＢ２０−０７についてのアミノ酸配列（配列番号１５）およびヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す；図１４Ｉは、ＭＢ２０−０８についてのアミノ酸配列（配列番号１７）およびヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す；図１４Ｊは、ＭＢ２０−１０についてのアミノ酸配列（配列番号１９）およびヌクレオチド配列（配列番号２０）を示す；図１４Ｋは、ＭＢ２０−１１についてのアミノ酸配列（配列番号２１）およびヌクレオチド配列（配列番号２２）を示す；図１４Ｌは、ＭＢ２０−１４についてのアミノ酸配列（配列番号２３）およびヌクレオチド配列（配列番号２４）を示す；図１４Ｍは、ＭＢ２０−１６についてのアミノ酸配列（配列番号２５）およびヌクレオチド配列（配列番号２６）；ならびに図１４Ｎは、ＭＢ２０−１８についてのアミノ酸配列（配列番号２７）およびヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す。これらの５’ＰＣＲプライマーと重複する配列は２重下線で示し、重複プライマーが各配列の増幅に用いられたので、実際のＤＮＡ配列と異なり得る（表１）。Ｖ、ＤおよびＪ配列間のおおよその結合部境界は、縦棒（｜）でこれらの配列中に指定する。既知のＤ領域ＤＮＡ配列に相同な推定配列には１重下線を引いている。小文字のヌクレオチドは、結合部境界でのヌクレオチド付加または体細胞超変異に関する潜在的部位のいずれかを示す。
【図１５】図１５は、既知のマウス抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体ならびにヒトおよびマウスＣＤ２０と反応性のＨＢ２０系およびＭＢ２０系のモノクローナル抗体の、重鎖ＶＨ−Ｄ−ＪＨ結合部配列についてのアミノ酸配列アラインメントを示す。各々のモノクローナル抗体を、他のモノクローナル抗体配列との相同性との比較で群化する。示した配列の相対順位は、２Ｂ８（リツキシマブ）モノクローナル抗体配列との関連性に基づいた。各々のモノクローナル抗体Ｖ、ＤおよびＪ領域についてのコード配列の起点の重鎖アミノ酸番号付けおよび命名は、従来の方法（Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）に従い、この方法では、アミノ酸位置１〜９４ならびにＣＤＲ１および２はＶＨ遺伝子によってコードされる。ドットは、各々のモノクローナル抗体と、全てのモノクローナル抗体についてのコンセンサスアミノ酸配列との間の同一性を示す。ダッシュは、類似のアミノ酸配列のアラインメントを最大にするためにこの配列中に挿入されたギャップを示す。これらの配列中のギャップを、明確にするためにＶＨおよびＤ断片の間に導入した。ＣＤＲ領域を、明確にするために囲む。
【図１６】図１６は、図１１に示す既知のマウス抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体についての推定モノクローナル抗体軽鎖ＶＪ配列と、ヒトおよびマウスＣＤ２０と反応性のＨＢ２０系およびＭＢ２０系のモノクローナル抗体の、アミノ酸配列比較を示す。データを、推定モノクローナル抗体軽鎖Ｖ配列およびＪ配列のＵＰＧＭＡ系統樹として示す。相対的な水平の系統樹分岐長さは、配列関連性の尺度である。軽鎖を、右側に示すように、配列類似性に基づいて群化（Ａ〜Ｇ）した。
【図１７−１】図１７Ａ〜１７Ｎは、ヒトおよびマウスＣＤ２０と反応性のＨＢ２０系およびＭＢ２０系のモノクローナル抗体（表１）の軽鎖Ｖ〜Ｊ配列についてのヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を示す。これらの５’ＰＣＲプライマーと重複する配列は２重下線で示し、重複プライマーが各々の配列の増幅に用いられたので、実際のＤＮＡ配列と異なり得る（表１）。図１７Ａは、ＨＢ２０−０１、ＨＢ２０−０２およびＨＢ２０−０６についてのアミノ酸配列（配列番号２９）およびヌクレオチド配列（配列番号３０）を示す；図１７Ｂは、ＨＢ２０−０３についてのアミノ酸配列（配列番号３１）およびヌクレオチド配列（配列番号３２）を示す；図１７Ｃは、ＨＢ２０−０４についてのアミノ酸配列（配列番号３３）およびヌクレオチド配列（配列番号３４）を示す；図１７Ｄは、ＨＢ２０−０５についてのアミノ酸配列（配列番号３５）およびヌクレオチド配列（配列番号３６）を示す；ならびに図１７Ｅは、ＨＢ２０−２５についてのアミノ酸配列（配列番号３７）およびヌクレオチド配列（配列番号３８）を示す；図１７Ｆは、ＭＢ２０−０１についてのアミノ酸配列（配列番号３９）およびヌクレオチド配列（配列番号４０）を示す；図１７Ｇは、ＭＢ２０−０２についてのアミノ酸配列（配列番号４１）およびヌクレオチド配列（配列番号４２）を示す；図１７Ｈは、ＭＢ２０−０３についてのアミノ酸配列（配列番号４３）およびヌクレオチド配列（配列番号４４）を示す；図１７１は、ＭＢ２０−０７についてのアミノ酸配列（配列番号４５）およびヌクレオチド配列（配列番号４６）を示す；図１７Ｊは、ＭＢ２０−０８についてのアミノ酸配列（配列番号４７）およびヌクレオチド配列（配列番号４８）を示す；図１７Ｋは、ＭＢ２０−１０についてのアミノ酸配列（配列番号４９）およびヌクレオチド配列（配列番号５０）を示す；図１７Ｌは、ＭＢ２０−１３についてのアミノ酸配列（配列番号５１）およびヌクレオチド配列（配列番号５２）を示す；図１７Ｍは、ＭＢ２０−１４についてのアミノ酸配列（配列番号５３）およびヌクレオチド配列（配列番号５４）を示す；ならびに図１７Ｎは、ＭＢ２０−１８についてのアミノ酸配列（配列番号５５）およびヌクレオチド配列（配列番号５６）を示す。小文字のヌクレオチドは、結合部境界でのヌクレオチド付加または体細胞超変異のための潜在的部位のいずれかを示す。「Ｎ」は、配列中のヌクレオチドが不明瞭であり、従って対応するアミノ酸が不明であることを示す。
【図１７−２】図１７Ａ〜１７Ｎは、ヒトおよびマウスＣＤ２０と反応性のＨＢ２０系およびＭＢ２０系のモノクローナル抗体（表１）の軽鎖Ｖ〜Ｊ配列についてのヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を示す。これらの５’ＰＣＲプライマーと重複する配列は２重下線で示し、重複プライマーが各々の配列の増幅に用いられたので、実際のＤＮＡ配列と異なり得る（表１）。図１７Ａは、ＨＢ２０−０１、ＨＢ２０−０２およびＨＢ２０−０６についてのアミノ酸配列（配列番号２９）およびヌクレオチド配列（配列番号３０）を示す；図１７Ｂは、ＨＢ２０−０３についてのアミノ酸配列（配列番号３１）およびヌクレオチド配列（配列番号３２）を示す；図１７Ｃは、ＨＢ２０−０４についてのアミノ酸配列（配列番号３３）およびヌクレオチド配列（配列番号３４）を示す；図１７Ｄは、ＨＢ２０−０５についてのアミノ酸配列（配列番号３５）およびヌクレオチド配列（配列番号３６）を示す；ならびに図１７Ｅは、ＨＢ２０−２５についてのアミノ酸配列（配列番号３７）およびヌクレオチド配列（配列番号３８）を示す；図１７Ｆは、ＭＢ２０−０１についてのアミノ酸配列（配列番号３９）およびヌクレオチド配列（配列番号４０）を示す；図１７Ｇは、ＭＢ２０−０２についてのアミノ酸配列（配列番号４１）およびヌクレオチド配列（配列番号４２）を示す；図１７Ｈは、ＭＢ２０−０３についてのアミノ酸配列（配列番号４３）およびヌクレオチド配列（配列番号４４）を示す；図１７１は、ＭＢ２０−０７についてのアミノ酸配列（配列番号４５）およびヌクレオチド配列（配列番号４６）を示す；図１７Ｊは、ＭＢ２０−０８についてのアミノ酸配列（配列番号４７）およびヌクレオチド配列（配列番号４８）を示す；図１７Ｋは、ＭＢ２０−１０についてのアミノ酸配列（配列番号４９）およびヌクレオチド配列（配列番号５０）を示す；図１７Ｌは、ＭＢ２０−１３についてのアミノ酸配列（配列番号５１）およびヌクレオチド配列（配列番号５２）を示す；図１７Ｍは、ＭＢ２０−１４についてのアミノ酸配列（配列番号５３）およびヌクレオチド配列（配列番号５４）を示す；ならびに図１７Ｎは、ＭＢ２０−１８についてのアミノ酸配列（配列番号５５）およびヌクレオチド配列（配列番号５６）を示す。小文字のヌクレオチドは、結合部境界でのヌクレオチド付加または体細胞超変異に関する潜在的部位のいずれかを示す。「Ｎ」は、配列中のヌクレオチドが不明瞭であり、従って対応するアミノ酸が不明であることを示す。
【図１７−３】図１７Ａ〜１７Ｎは、ヒトおよびマウスＣＤ２０と反応性のＨＢ２０系およびＭＢ２０系のモノクローナル抗体（表１）の軽鎖Ｖ〜Ｊ配列についてのヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を示す。これらの５’ＰＣＲプライマーと重複する配列は２重下線で示し、重複プライマーが各々の配列の増幅に用いられたので、実際のＤＮＡ配列と異なり得る（表１）。図１７Ａは、ＨＢ２０−０１、ＨＢ２０−０２およびＨＢ２０−０６についてのアミノ酸配列（配列番号２９）およびヌクレオチド配列（配列番号３０）を示す；図１７Ｂは、ＨＢ２０−０３についてのアミノ酸配列（配列番号３１）およびヌクレオチド配列（配列番号３２）を示す；図１７Ｃは、ＨＢ２０−０４についてのアミノ酸配列（配列番号３３）およびヌクレオチド配列（配列番号３４）を示す；図１７Ｄは、ＨＢ２０−０５についてのアミノ酸配列（配列番号３５）およびヌクレオチド配列（配列番号３６）を示す；ならびに図１７Ｅは、ＨＢ２０−２５についてのアミノ酸配列（配列番号３７）およびヌクレオチド配列（配列番号３８）を示す；図１７Ｆは、ＭＢ２０−０１についてのアミノ酸配列（配列番号３９）およびヌクレオチド配列（配列番号４０）を示す；図１７Ｇは、ＭＢ２０−０２についてのアミノ酸配列（配列番号４１）およびヌクレオチド配列（配列番号４２）を示す；図１７Ｈは、ＭＢ２０−０３についてのアミノ酸配列（配列番号４３）およびヌクレオチド配列（配列番号４４）を示す；図１７１は、ＭＢ２０−０７についてのアミノ酸配列（配列番号４５）およびヌクレオチド配列（配列番号４６）を示す；図１７Ｊは、ＭＢ２０−０８についてのアミノ酸配列（配列番号４７）およびヌクレオチド配列（配列番号４８）を示す；図１７Ｋは、ＭＢ２０−１０についてのアミノ酸配列（配列番号４９）およびヌクレオチド配列（配列番号５０）を示す；図１７Ｌは、ＭＢ２０−１３についてのアミノ酸配列（配列番号５１）およびヌクレオチド配列（配列番号５２）を示す；図１７Ｍは、ＭＢ２０−１４についてのアミノ酸配列（配列番号５３）およびヌクレオチド配列（配列番号５４）を示す；ならびに図１７Ｎは、ＭＢ２０−１８についてのアミノ酸配列（配列番号５５）およびヌクレオチド配列（配列番号５６）を示す。小文字のヌクレオチドは、結合部境界でのヌクレオチド付加または体細胞超変異に関する潜在的部位のいずれかを示す。「Ｎ」は、配列中のヌクレオチドが不明瞭であり、従って対応するアミノ酸が不明であることを示す。
【図１７−４】図１７Ａ〜１７Ｎは、ヒトおよびマウスＣＤ２０と反応性のＨＢ２０系およびＭＢ２０系のモノクローナル抗体（表１）の軽鎖Ｖ〜Ｊ配列についてのヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を示す。これらの５’ＰＣＲプライマーと重複する配列は２重下線で示し、重複プライマーが各々の配列の増幅に用いられたので、実際のＤＮＡ配列と異なり得る（表１）。図１７Ａは、ＨＢ２０−０１、ＨＢ２０−０２およびＨＢ２０−０６についてのアミノ酸配列（配列番号２９）およびヌクレオチド配列（配列番号３０）を示す；図１７Ｂは、ＨＢ２０−０３についてのアミノ酸配列（配列番号３１）およびヌクレオチド配列（配列番号３２）を示す；図１７Ｃは、ＨＢ２０−０４についてのアミノ酸配列（配列番号３３）およびヌクレオチド配列（配列番号３４）を示す；図１７Ｄは、ＨＢ２０−０５についてのアミノ酸配列（配列番号３５）およびヌクレオチド配列（配列番号３６）を示す；ならびに図１７Ｅは、ＨＢ２０−２５についてのアミノ酸配列（配列番号３７）およびヌクレオチド配列（配列番号３８）を示す；図１７Ｆは、ＭＢ２０−０１についてのアミノ酸配列（配列番号３９）およびヌクレオチド配列（配列番号４０）を示す；図１７Ｇは、ＭＢ２０−０２についてのアミノ酸配列（配列番号４１）およびヌクレオチド配列（配列番号４２）を示す；図１７Ｈは、ＭＢ２０−０３についてのアミノ酸配列（配列番号４３）およびヌクレオチド配列（配列番号４４）を示す；図１７１は、ＭＢ２０−０７についてのアミノ酸配列（配列番号４５）およびヌクレオチド配列（配列番号４６）を示す；図１７Ｊは、ＭＢ２０−０８についてのアミノ酸配列（配列番号４７）およびヌクレオチド配列（配列番号４８）を示す；図１７Ｋは、ＭＢ２０−１０についてのアミノ酸配列（配列番号４９）およびヌクレオチド配列（配列番号５０）を示す；図１７Ｌは、ＭＢ２０−１３についてのアミノ酸配列（配列番号５１）およびヌクレオチド配列（配列番号５２）を示す；図１７Ｍは、ＭＢ２０−１４についてのアミノ酸配列（配列番号５３）およびヌクレオチド配列（配列番号５４）を示す；ならびに図１７Ｎは、ＭＢ２０−１８についてのアミノ酸配列（配列番号５５）およびヌクレオチド配列（配列番号５６）を示す。小文字のヌクレオチドは、結合部境界でのヌクレオチド付加または体細胞超変異に関する潜在的部位のいずれかを示す。「Ｎ」は、配列中のヌクレオチドが不明瞭であり、従って対応するアミノ酸が不明であることを示す。
【図１７−５】図１７Ａ〜１７Ｎは、ヒトおよびマウスＣＤ２０と反応性のＨＢ２０系およびＭＢ２０系のモノクローナル抗体（表１）の軽鎖Ｖ〜Ｊ配列についてのヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を示す。これらの５’ＰＣＲプライマーと重複する配列は２重下線で示し、重複プライマーが各々の配列の増幅に用いられたので、実際のＤＮＡ配列と異なり得る（表１）。図１７Ａは、ＨＢ２０−０１、ＨＢ２０−０２およびＨＢ２０−０６についてのアミノ酸配列（配列番号２９）およびヌクレオチド配列（配列番号３０）を示す；図１７Ｂは、ＨＢ２０−０３についてのアミノ酸配列（配列番号３１）およびヌクレオチド配列（配列番号３２）を示す；図１７Ｃは、ＨＢ２０−０４についてのアミノ酸配列（配列番号３３）およびヌクレオチド配列（配列番号３４）を示す；図１７Ｄは、ＨＢ２０−０５についてのアミノ酸配列（配列番号３５）およびヌクレオチド配列（配列番号３６）を示す；ならびに図１７Ｅは、ＨＢ２０−２５についてのアミノ酸配列（配列番号３７）およびヌクレオチド配列（配列番号３８）を示す；図１７Ｆは、ＭＢ２０−０１についてのアミノ酸配列（配列番号３９）およびヌクレオチド配列（配列番号４０）を示す；図１７Ｇは、ＭＢ２０−０２についてのアミノ酸配列（配列番号４１）およびヌクレオチド配列（配列番号４２）を示す；図１７Ｈは、ＭＢ２０−０３についてのアミノ酸配列（配列番号４３）およびヌクレオチド配列（配列番号４４）を示す；図１７１は、ＭＢ２０−０７についてのアミノ酸配列（配列番号４５）およびヌクレオチド配列（配列番号４６）を示す；図１７Ｊは、ＭＢ２０−０８についてのアミノ酸配列（配列番号４７）およびヌクレオチド配列（配列番号４８）を示す；図１７Ｋは、ＭＢ２０−１０についてのアミノ酸配列（配列番号４９）およびヌクレオチド配列（配列番号５０）を示す；図１７Ｌは、ＭＢ２０−１３についてのアミノ酸配列（配列番号５１）およびヌクレオチド配列（配列番号５２）を示す；図１７Ｍは、ＭＢ２０−１４についてのアミノ酸配列（配列番号５３）およびヌクレオチド配列（配列番号５４）を示す；ならびに図１７Ｎは、ＭＢ２０−１８についてのアミノ酸配列（配列番号５５）およびヌクレオチド配列（配列番号５６）を示す。小文字のヌクレオチドは、結合部境界でのヌクレオチド付加または体細胞超変異に関する潜在的部位のいずれかを示す。「Ｎ」は、配列中のヌクレオチドが不明瞭であり、従って対応するアミノ酸が不明であることを示す。
【図１７−６】図１７Ａ〜１７Ｎは、ヒトおよびマウスＣＤ２０と反応性のＨＢ２０系およびＭＢ２０系のモノクローナル抗体（表１）の軽鎖Ｖ〜Ｊ配列についてのヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を示す。これらの５’ＰＣＲプライマーと重複する配列は２重下線で示し、重複プライマーが各々の配列の増幅に用いられたので、実際のＤＮＡ配列と異なり得る（表１）。図１７Ａは、ＨＢ２０−０１、ＨＢ２０−０２およびＨＢ２０−０６についてのアミノ酸配列（配列番号２９）およびヌクレオチド配列（配列番号３０）を示す；図１７Ｂは、ＨＢ２０−０３についてのアミノ酸配列（配列番号３１）およびヌクレオチド配列（配列番号３２）を示す；図１７Ｃは、ＨＢ２０−０４についてのアミノ酸配列（配列番号３３）およびヌクレオチド配列（配列番号３４）を示す；図１７Ｄは、ＨＢ２０−０５についてのアミノ酸配列（配列番号３５）およびヌクレオチド配列（配列番号３６）を示す；ならびに図１７Ｅは、ＨＢ２０−２５についてのアミノ酸配列（配列番号３７）およびヌクレオチド配列（配列番号３８）を示す；図１７Ｆは、ＭＢ２０−０１についてのアミノ酸配列（配列番号３９）およびヌクレオチド配列（配列番号４０）を示す；図１７Ｇは、ＭＢ２０−０２についてのアミノ酸配列（配列番号４１）およびヌクレオチド配列（配列番号４２）を示す；図１７Ｈは、ＭＢ２０−０３についてのアミノ酸配列（配列番号４３）およびヌクレオチド配列（配列番号４４）を示す；図１７１は、ＭＢ２０−０７についてのアミノ酸配列（配列番号４５）およびヌクレオチド配列（配列番号４６）を示す；図１７Ｊは、ＭＢ２０−０８についてのアミノ酸配列（配列番号４７）およびヌクレオチド配列（配列番号４８）を示す；図１７Ｋは、ＭＢ２０−１０についてのアミノ酸配列（配列番号４９）およびヌクレオチド配列（配列番号５０）を示す；図１７Ｌは、ＭＢ２０−１３についてのアミノ酸配列（配列番号５１）およびヌクレオチド配列（配列番号５２）を示す；図１７Ｍは、ＭＢ２０−１４についてのアミノ酸配列（配列番号５３）およびヌクレオチド配列（配列番号５４）を示す；ならびに図１７Ｎは、ＭＢ２０−１８についてのアミノ酸配列（配列番号５５）およびヌクレオチド配列（配列番号５６）を示す。小文字のヌクレオチドは、結合部境界でのヌクレオチド付加または体細胞超変異に関する潜在的部位のいずれかを示す。「Ｎ」は、配列中のヌクレオチドが不明瞭であり、従って対応するアミノ酸が不明であることを示す。
【図１７−７】図１７Ａ〜１７Ｎは、ヒトおよびマウスＣＤ２０と反応性のＨＢ２０系およびＭＢ２０系のモノクローナル抗体（表１）の軽鎖Ｖ〜Ｊ配列についてのヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を示す。これらの５’ＰＣＲプライマーと重複する配列は２重下線で示し、重複プライマーが各々の配列の増幅に用いられたので、実際のＤＮＡ配列と異なり得る（表１）。図１７Ａは、ＨＢ２０−０１、ＨＢ２０−０２およびＨＢ２０−０６についてのアミノ酸配列（配列番号２９）およびヌクレオチド配列（配列番号３０）を示す；図１７Ｂは、ＨＢ２０−０３についてのアミノ酸配列（配列番号３１）およびヌクレオチド配列（配列番号３２）を示す；図１７Ｃは、ＨＢ２０−０４についてのアミノ酸配列（配列番号３３）およびヌクレオチド配列（配列番号３４）を示す；図１７Ｄは、ＨＢ２０−０５についてのアミノ酸配列（配列番号３５）およびヌクレオチド配列（配列番号３６）を示す；ならびに図１７Ｅは、ＨＢ２０−２５についてのアミノ酸配列（配列番号３７）およびヌクレオチド配列（配列番号３８）を示す；図１７Ｆは、ＭＢ２０−０１についてのアミノ酸配列（配列番号３９）およびヌクレオチド配列（配列番号４０）を示す；図１７Ｇは、ＭＢ２０−０２についてのアミノ酸配列（配列番号４１）およびヌクレオチド配列（配列番号４２）を示す；図１７Ｈは、ＭＢ２０−０３についてのアミノ酸配列（配列番号４３）およびヌクレオチド配列（配列番号４４）を示す；図１７１は、ＭＢ２０−０７についてのアミノ酸配列（配列番号４５）およびヌクレオチド配列（配列番号４６）を示す；図１７Ｊは、ＭＢ２０−０８についてのアミノ酸配列（配列番号４７）およびヌクレオチド配列（配列番号４８）を示す；図１７Ｋは、ＭＢ２０−１０についてのアミノ酸配列（配列番号４９）およびヌクレオチド配列（配列番号５０）を示す；図１７Ｌは、ＭＢ２０−１３についてのアミノ酸配列（配列番号５１）およびヌクレオチド配列（配列番号５２）を示す；図１７Ｍは、ＭＢ２０−１４についてのアミノ酸配列（配列番号５３）およびヌクレオチド配列（配列番号５４）を示す；ならびに図１７Ｎは、ＭＢ２０−１８についてのアミノ酸配列（配列番号５５）およびヌクレオチド配列（配列番号５６）を示す。小文字のヌクレオチドは、結合部境界でのヌクレオチド付加または体細胞超変異に関する潜在的部位のいずれかを示す。「Ｎ」は、配列中のヌクレオチドが不明瞭であり、従って対応するアミノ酸が不明であることを示す。
【図１８】図１８は、既知のマウス抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体、ならびにヒトおよびマウスＣＤ２０と反応性のＨＢ２０系およびＭＢ２０系（表１）のモノクローナル抗体の、軽鎖ＶＪ配列についてのアミノ酸配列アラインメントを示す。各々のモノクローナル抗体を、他のモノクローナル抗体配列との相同性と比較して群化する。示した配列の相対順位は、全ての抗ＣＤ２０モノクローナル抗体についてのコンセンサス軽鎖配列に対する関連性に基づいた。各々のモノクローナル抗体ＶおよびＪ領域についてのコード配列の起点の軽鎖アミノ酸番号付けおよび命名は、従来の方法（Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）に従う。ドットは、各々のモノクローナル抗体と、全てのモノクローナル抗体についてのコンセンサスアミノ酸配列との間の同一性を示す。ダッシュは、類似のアミノ酸配列のアラインメントを最大にするためにこの配列中に挿入されたギャップを示す。これらの配列中のギャップを、明確にするためにＶフラグメントおよびＪフラグメントの間に導入した。ＣＤＲ領域を、明確にするために囲む。
【図１９】図１９は、既知のマウス抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体ならびにヒトおよびマウスＣＤ２０と反応性のＨＢ２０系およびＭＢ２０系のモノクローナル抗体についての、推定モノクローナル抗体重鎖および軽鎖配列のＵＰＧＭＡ分析を示す。配列決定分析の前に、重鎖Ｖ（Ｄ）Ｊおよび軽鎖（ＶＪ）配列を連結して隣接Ｈ＋Ｌ鎖配列を形成した。重鎖と軽鎖のペアを、右側に示すように、重鎖と軽鎖の間の配列類似性（図１３および図１６）に基づいて群化した。
【図２０】図２０Ａ〜Ｂは、Ｂ細胞の細胞表面に結合する抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の密度が、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体誘導性のＢ細胞枯渇の有効性を調節することを示す。正常密度の５０％の細胞表面ＣＤ２０を発現するヘテロ接合のＣＤ２０＋／−マウスにおけるＢ細胞枯渇を、野生型同腹仔と比較して調べた。両方の同腹仔の組を、１０または２５０μｇのいずれかのＭＢ２０−１１モノクローナル抗体（黒棒）あるいはアイソタイプが適合したコントロール（白棒）モノクローナル抗体を用いて静脈内に処置し（ｎ≧３マウス／群）、血液（１ｍＬ当たり）（図２０Ａ）および脾臓（合計）（図２０Ｂ）のＢ２２０＋Ｂ細胞数を７日目にフローサイトメトリーによって数量化した。値は、平均（±ＳＥＭ）Ｂ細胞数を示すと共に、コントロールモノクローナル抗体処置同腹仔と比較してＭＢ２０−１１モノクローナル抗体処置マウスに残存しているＢ細胞の百分率を示す。各群のマウスについての平均値の結果間の有意差を、以下のように示す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。ＭＢ２０−１１モノクローナル抗体は、２５０μｇで用いた場合、ＣＤ２０＋／−および野生型同腹仔の循環Ｂ細胞および脾臓Ｂ細胞を効率的に取り除いた。しかしながら、ＭＢ２０−１１モノクローナル抗体を１０μｇで用いた場合、ＣＤ２０＋／−マウスではＢ細胞のある画分に限り枯渇し、一方、野生型同腹仔ではＢ細胞の大部分が枯渇した。
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｂは、ＣＤ２０へのＭＢ２０−１１モノクローナル抗体の結合により、細胞表面のＣＤ２０密度が増大することを示す、図２１Ａ）。ＭＢ２０−１１モノクローナル抗体結合の増大は、精製マウス脾臓Ｂ細胞の間接的免疫蛍光染色法によって示し、この精製マウス脾臓Ｂ細胞は、アイソタイプコントロール（Ｃ）またはＭＢ２０−１１モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍＬ）のいずれかと共に表示した時間インキュベートした後に、蛍光色素結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ二次抗体で染色し、続いてフローサイトメトリー分析を行った。０時点について、これらの細胞を、モノクローナル抗体と共に氷上で３０分間インキュベートした後に洗浄し、二次抗体で染色した。図２１Ｂは、細胞表面ＣＤ２０へのＭＢ２０−１１モノクローナル抗体結合の代表的な時間経過を、ＭＢ２０−１８モノクローナル抗体と比較して示す。各々の値は、図２１Ａに記載のとおり、精製脾臓Ｂ細胞の蛍光染色についての平均蛍光チャネル数を表す。これらの結果は、３回以上の独立した実験で得られた結果を代表する。
【図２２】図２２Ａ〜Ｂは、ＨＢ２０−３、−４、および−２５モノクローナル抗体が、既知の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体よりも高い密度で細胞表面ＣＤ２０に結合することを示す。ヒト血液リンパ球（図２２Ａ）およびＲａｊｉ  Ｂリンパ芽球様細胞株（図２２Ｂ）と、１Ｆ５、ＨＢ２０−３およびＢ１抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（実線）または二次抗体単独（破線）との反応性を示す。これらの抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を、あらかじめ決定した濃度で（１Ｆ５を、１：２００希釈した腹水として；ＨＢ２０−３を、ＨＢ２０−３ハイブリドーマからの組織培養上清液として；またはＢ１モノクローナル抗体を、１０μｇ／ｍＬの精製モノクローナル抗体もしくは組織培養上清液としてのいずれかで）用いて飽和させ、最適な染色を得た。全ての場合において、モノクローナル抗体染色は、フローサイトメトリー分析で、ＰＥ結合体化アイソタイプ特異的二次抗体を用いて視覚化した。結果は、３回以上の実験で得られた結果を代表する。
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｂは、ＭＢ２０−１１モノクローナル抗体の静脈内（図２３Ａ）または皮下（ｓ．ｃ．；図２３Ｂ）投与が、インビボで循環Ｂ細胞および組織Ｂ細胞を効率的に枯渇させることを示す。ＭＢ２０−１１モノクローナル抗体を表示した用量で用いて、野生型マウスを皮下または静脈内のいずれかで処置した。値は、フローサイトメトリーで評価した、７日目の平均（±ＳＥＭ）の血液（１ｍＬ当たり）または脾臓（合計）Ｂ２２０＋Ｂ細胞数（ｎ≧２）を表す。各群のマウスについての平均値の結果間の有意差を、以下のように示す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、従来の抗ＣＤ２０ｍＡｂ（例えば、１Ｆ５または２Ｂ８）と比較して異なる結合特性および他の特徴を有する、ヒトＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のパネルの生成に一部基づく。特に、本発明のｍＡｂおよび抗原結合性フラグメントは、従来の抗ＣＤ２０抗体とは分子レベルで（例えば、軽鎖および／または重鎖可変領域あるいは相補性決定領域（「ＣＤＲ」）のような可変領域の特定の断片のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列によって）区別され得る。
【００４１】
特定の実施形態において、本発明のｍＡｂおよび抗原結合性フラグメントは、従来のｍＡｂよりも高密度でＢ細胞に結合し得、この性質が、Ｂ細胞を枯渇させる方法にとって、治療法または診断法にとって、あるいは実験用試薬としての使用（例えば、Ｂ細胞の同定またはＢ細胞の精製のため）にとって有利である。
【００４２】
本発明はまた、マウスＣＤ２０に特異的に結合するｍＡｂおよびその抗原結合性フラグメントも提供する。
【００４３】
さらに、ＣＤ２０−／−哺乳動物（例えば、マウス）から単離された抗体産生細胞（例えば、Ｂ細胞）から産生される抗ＣＤ２０ｍＡｂを提供する。
【００４４】
次に、本発明を、添付図面を参照して説明し、その中で本発明の好ましい実施形態を示す。本発明は、種々の形態で具体化され得、本明細書中で示した実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、この開示が詳細かつ完全であるように、かつ当業者に本発明の範囲を十分に伝達するように、これらの実施形態を提供する。例えば、１つの実施形態に関して例証した特徴は他の実施形態に組み込まれ得、そして特定の実施形態に関して例証した特徴はその実施形態から削除され得る。さらに、本明細書中で示した実施形態に対する多数の変形および追加は、本開示に照らして当業者にも明らかであり、本発明から逸脱しない。
【００４５】
他に規定しない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通して理解されているのと同じ意味を有する。本明細書中で本発明の記述に用いられる用語は、単に特定の実施形態を記述する目的のためであって、本発明を限定することを意図しない。
【００４６】
本発明の記載および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別のものを示さない限り、複数形も同様に包含することを意図する。
【００４７】
本明細書中に記載される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。
【００４８】
特に指示のない限り、標準方法が、本発明による抗体またはそれらの抗原結合性フラグメントの生成、核酸配列の操作、形質転換細胞の作製などに用いられ得る。このような技術は当業者に公知である。例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）；Ｆ．Ｍ，ＡＵＳＵＢＥＬら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。
【００４９】
（抗ＣＤ２０ｍＡｂ、抗原結合フラグメントおよび細胞株）
１つの局面として、本発明は、ＣＤ２０に特異的に結合するｍＡｂおよびそれらの抗原結合性フラグメントを提供する。本明細書中で使用される場合、「ＣＤ２０に特異的に結合するｍＡｂ」および「抗ＣＤ２０ｍＡｂ」ならびに類似語は、置き替え可能である。特定の実施形態において、このｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントは、ヒトＣＤ２０および／またはマウスＣＤ２０に特異的に結合する。このｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントは、ＣＤ２０タンパク質の任意の領域に結合可能であるが、代表的な実施形態においては、ＣＤ２０の細胞外領域に結合する。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、多様な文法形態での用語「抗体」または「抗体分子」とは、免疫グロブリン分子（ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤを含む）および／または免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗体結合部位またはパラトープを含み、かつ抗原に結合可能な分子）をいう。「抗体結合部位」または「抗原結合部位」は、抗原に特異的に結合する重鎖および軽鎖の可変および超可変（ＣＤＲ）領域からなる、抗体分子の構造部分である。当該分野で公知のように、抗体の特有の性質は、免疫グロブリンアイソタイプに関連している。代表的な実施形態において、抗体または抗原結合性フラグメントは、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｂアイソタイプ分子である。この抗体またはフラグメントはさらに、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラなど）および哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコなど）の種を含む、任意の種の起源由来であってもよい。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」とは、実質的に同種の抗体の集団（すなわち、この集団を構成する個々の抗体が、少量存在し得る天然に生じる突然変異の可能性を除いて、同一である）から得られる抗体をいう。ｍＡｂは非常に特異的であり、抗原上の単一の抗原決定基（すなわち、エピトープ）に対して指向される。この特性は、代表的には異なる抗原決定基に対して指向される抗体を含む、ポリクローナル抗体調製物と対照的である。
【００５２】
用語「抗体」および「ｍＡｂ」は、本明細書において最も広い意味で使用され、具体的には、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、裸の抗体、抗体結合体、および抗体フラグメントを、これらが所望の生物活性を示す限りは包含する。さらに、用語「抗体」および「ｍＡｂ」は、インタクトな（すなわち、完全な）免疫グロブリン分子、または、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメントを含めた、パラトープを含む抗体の抗原結合性フラグメント、ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体を包含する。
【００５３】
単鎖Ｆｖまたは「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体重鎖および軽鎖可変ドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することが可能になる。ｓＦｖの総説について、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１３３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．２６９〜３１５（１９９４）を参照のこと。単鎖抗体の生成は当該分野で記載されており（例えば、米国特許第第５，２６０，２０３号を参照のこと）、その開示内容は、参考として本明細書中に援用される。単鎖抗体を生成する１つの例示的な方法において、コンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリーを、免疫動物の脾臓から単離したＲＮＡから調製し、適切な抗体を発現しているファージミドを内皮組織上でパニングによって選択する。従来のハイブリドーマ技術を超える本アプローチの利点は、単回に約１０４倍もの数の抗体が生成され、かつスクリーニングされ得ること、ならびに単鎖中のＨおよびＬ鎖の組合せによって新しい特異性が生じ、適切な抗体を見出す機会がさらに増大することである。
【００５４】
用語「ダイアボディー」とは、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントをいい、これらのフラグメントは、同じポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメインと連結した重鎖可変ドメインを含む。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを用いることによって、これらのドメインを別の鎖の相補ドメインと強制的に対合させ、２つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディーは当該分野において公知であり、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ９０：６４４４〜６４４８（１９９３）を参照のこと。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、「直鎖状抗体」との表現は、一対の抗原結合部位を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む抗体をいう。直鎖状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得、Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：１０５７〜１０６２（１９９５）に、より詳細に記載される。
【００５６】
抗体フラグメントの生成のために、種々の技術が開発されている。伝統的には、これらのフラグメントはインタクトな抗体のタンパク分解性消化によって生成された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７〜１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）を参照のこと）。しかしながら、今やこれらのフラグメントは、形質転換宿主細胞中で組換え核酸技術によって直接生成され得る。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され得、化学的に結合してＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成する（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３〜１６７（１９９２））。あるいは、Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆ（ａｂ’）２分子のアセンブリを促進するために、ロイシンジッパーＧＣＮ４を用いて形成される。別のアプローチによれば、Ｆｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。抗体フラグメントの生成のための他の技術は、当業者に明らかである。
【００５７】
本発明の例示的なｍＡｂとしては、本明細書中に開示されるように、ＨＢ２０−１、ＨＢ２０−２、ＨＢ２０−３，ＨＢ２０−４、ＨＢ２０−５、ＨＢ２０−６、ＨＢ２０−２５、ＭＢ２０−１、ＭＢ２０−２、ＭＢ２０−３、ＭＢ２０−６、ＭＢ２０−７、ＭＢ２０−８，ＭＢ２０−１０、ＭＢ２０−１１、ＭＢ２０−１３、ＭＢ２０−１４、ＭＢ２０−１６およびＭＢ２０−１８が挙げられる。ＨＢ２０−１、ＨＢ２０−２、ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４、ＨＢ２０−５およびＨＢ２０−６は、以前に、それぞれＨＢ１３ａ、ＨＢ１３ｂ、ＨＢ１３ｃ、ＨＢ１３ｄ、ＨＢ１３ｅおよびＨＢ１３ｆと指定されている。
【００５８】
本発明はさらに、本明細書中で具体的に記載される抗体の対応する鎖もしくは領域と比較して、実質的に類似の重鎖、軽鎖、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、および／またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域の核酸配列および／またはアミノ酸配列を有し（以下により詳細に記載されるように）、かつＣＤ２０に特異的に結合し、そして必要に応じて本明細書中で具体的に記載される抗体および抗体フラグメントの１以上の他の機能特性（例えば、結合密度、Ｂ細胞枯渇の効力）を示す、本明細書中で具体的に開示されるｍＡｂおよび抗原結合性フラグメントの機能的等価物を包含する。１つの例示的な実施形態において、本発明のｍＡｂおよび抗原結合性フラグメントは、本明細書中で具体的に記載されるｍＡｂおよび抗原結合性フラグメントと同じ抗原決定基（すなわち、エピトープ）に結合する。
【００５９】
当業者は、エピトープマッピングによって、抗体が、本明細書中に開示されるｍＡｂの特異性を有するか否かを、過度の実験を行うことなく日常的に決定する。例えば、問題の抗体の１以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ領域あるいは重鎖および／または軽鎖可変領域の、核酸配列および／またはアミノ酸配列を決定し得る。これらの領域における同一の、または機能的に等価なアミノ酸残基配列を有する抗体分子は、同一のまたは類似の結合特異性を有する。可変領域およびＣＤＲ領域の類似性を評価および比較して機能的等価を決定する方法は、当業者に公知である。
【００６０】
モノクローナル抗体が本明細書中に記載されるような抗体と同じ特異性を有するか否かを決定する別の方法は、アミノ酸配列に基づくコンピュータモデリングによって予測される抗体パラトープの３次元構造の比較によるものである。エピトープ−抗体パラトープ相互作用は、代表的には以下の４つの力を包含する：ファンデルワールス力（双極子間相互作用）、水素結合、疎水的相互作用、およびイオン（クーロン）結合。非共有結合は、抗体−抗原複合体を安定化させ、かつ結合させる。この相互作用は、両方の分子の３Ｄ構造によって決定される。従って、抗体パラトープ、エピトープ、および／またはエピトープ−抗体パラトープ複合体の３Ｄ構造を予測することによって、他の抗体に対する免疫特異性の比較が可能になる。
【００６１】
あるいは、またはさらに、ランダムにもしくは特定の遺伝子構造によってのいずれかで、抗体が結合する抗原の断片化に基づく技術を用い、そしてこの抗体を用いて得たフラグメントの反応性を決定することによって、エピトープマッピングが行われ得る。断片化はまた、例えばＰＣＲ技術によって核酸レベルで行われ、続いて転写、および放射性アミノ酸の存在下でインビトロにおけるタンパク質への翻訳が行われ得る。さらに詳細には、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９、ｐｐ．３９０〜３９２を参照のこと。
【００６２】
エピトープマッピングのさらなる方法によって、各々がタンパク質抗原の小さな直線状セグメントに対応する、一組の重複ペプチドを合成し、固相上に配列する。次いで、このペプチドのパネルを試験抗体でプローブし、結合した抗体を、酵素標識二次抗体を用いて検出する（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出、ｐｐ．３９３〜３９６）。
【００６３】
エピトープマッピングについて当該分野で周知のさらなる方法は、ランダム合成またはファージディスプレイペプチドライブラリーからの抗体選択である。例えば、ファージディスプレイライブラリーは、ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの複合体混合物を、ｆ１型ｓｓＤＮＡファージの微動コートタンパク質遺伝子のアミノ末端にクローニングすることによって、構築され得る。このようなファージディスプレイライブラリーは、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから市販されている。これらのライブラリーをストックとして増幅させ得、次いで、各々独立したクローンの複数のコピーを示すのに十分なアリコートを目的の抗体と混合する。抗体結合ファージを「バイオパニング」と呼ばれる手順で回収し、非結合性のファージを除去する。これらの結合ファージを溶出して細菌に感染させるのに用い、そして選択されたストックを増幅させる。最終的に選択されたストックの個々のプラークを成長させ、特異的抗体反応性を（例えば、ＥＬＩＳＡによって）チェックし、そして挿入部位前後のＤＮＡを配列決定する。抗体が結合するペプチドをコードする配列の分析により、抗体の特異性を定義する。さらに詳細には、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２２８〜２５７（１９９３）、ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出、ｐｐ．３９７〜３９８を参照のこと。
【００６４】
信頼性は低いが、ｍＡｂが、本明細書中に記載されるようなｍＡｂと同じ特異性を有するか否かを決定する別の方法は、前者が、後者が標的分子（例えば、ＣＤ２０）に結合するのを妨げるか否かを確認することによるものである。標的分子への結合に関する標準的な競合アッセイにおいてｍＡｂによる結合性の低下によって示されるように、試験されるｍＡｂが、本明細書中に記載されるようなｍＡｂと競合する場合、これらの２つのｍＡｂは、同一の、または密接に関連したエピトープに結合可能である。しかしながら、これは確定的な試験ではない。試験されたｍＡｂおよび本明細書中に開示されるｍＡｂが結合する実際のエピトープは、たとえ試験された抗体が、本明細書中に開示される抗体によって標的分子への結合性を低下させることが可能であるとしてもなお、異なる場合がある。例えば、試験ｍＡｂによるその抗原決定基への結合によって、本明細書中に記載されるｍＡｂ抗体の抗原決定基がマスクされ、同じエピトープを結合することによってではなくむしろ、単にこの試験ｍＡｂの物理的大きさに起因して結合を妨げ得る。従って、特異性を確認するために、より正確な手順（例えば、可変領域のアミノ酸配列決定および３Ｄモデリング）を、競合方法と組み合わせて用いる場合が多い。
【００６５】
ｍＡｂが、本明細書中に記載されるｍＡｂの特異性を有し得るか否かを決定するためのさらに別の方法は、本明細書中に開示されるｍＡｂを標的分子（例えば、ＣＤ２０）と共にプレインキュベートし、次いで、試験されるｍＡｂを添加して、この試験されるｍＡｂが標的に結合する能力を抑制されるか否かを決定することである。試験されるｍＡｂが抑制される場合、本明細書中に開示されるｍＡｂと同じかまたは機能的に等価な、エピトープ特異性を有する可能性がある。しかしながら、この手順は、上で議論した競合研究と同じ制限を受け、従って、必ずしも同一の特異性の決定因ではない。
【００６６】
本発明の特定の実施形態において、ｍＡｂまたはその抗原結合性フラグメントは、ＣＤ２０に特異的に結合し、ここで、ＣＤ２０および／またはＢ細胞に対するｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントの結合密度は、ＣＤ２０および／またはＢ細胞に対する従来の抗ＣＤ２０ｍＡｂ（例えば、２Ｈ７、Ｂ９Ｅ９、１Ｈ４、２Ｂ８、１Ｆ５および／またはＬｅｕ−１６抗体）の結合性よりも、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８５％、２倍、３倍、４倍または５倍かあるいはそれより大きい。さらに、本発明のｍＡｂは、より低密度でＣＤ２０を発現する悪性Ｂ細胞の枯渇において、治療的により有効であり得る。これらの従来の抗体は、当業者に入手可能である（例えば、Ｓｈａｎら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６５８９〜６５９５；Ｓｃｈｕｌｔｚら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：６６６３〜６６６９；およびＨａｉｓｍａら（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２：１８４〜１９０；Ｓｔａｓｈｅｎｋｏら（１９８０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５：１６７８を参照のこと）。本発明の任意の特定の理論に限定されるつもりはないが、抗体結合の密度は、抗体によって結合されるエピトープの接近可能性または利用可能性に起因し得る。従って、この実施形態によれば、本発明の抗体および抗原結合性フラグメントは、上記の１以上の従来の抗体と比較して、細胞表面上への接近可能性が増大したエピトープに対して指向されるようである。本発明のこの実施形態による抗体および抗原結合性フラグメントは、治療用途に有利である。なぜなら、これらは、従来の抗体よりも低い投薬量でＢ細胞枯渇を誘導し得るためである。従来の抗体と比較した結合密度の増加度が、標的（例えば、用いる細胞株）によって変動し得ることを、当業者は理解する。１つの例示的な実施形態において、ｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントは、Ｂ細胞上の結合部位（すなわち、エピトープの接近可能性）をアップレギュレートし、その結果、Ｂ細胞および／またはそれらの悪性対応物に対するｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントの結合密度がより高くなる。
【００６７】
細胞に結合している抗体の密度を決定する方法は、当業者に公知である（例えば、Ｓａｔｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６５：６６３５〜６６４３（２０００）を参照のこと；これは、ＣＤ１９の細胞表面密度を評価する方法を開示している）。他の標準方法としては、スキャッチャード分析が挙げられる。例えば、抗体またはフラグメントを単離し、放射標識し、そしてこの放射標識した抗体の比活性を決定し得る。次いで、この抗体を、ＣＤ２０を発現している標的細胞と接触させる。細胞に結合する放射能を測定し、この比活性に基づいて、細胞に結合した抗体または抗体フラグメントの量を決定し得る。
【００６８】
あるいは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析を使用し得る。一般に、抗体または抗体フラグメントを、ＣＤ２０を発現している標的細胞に結合する。次いで、この抗体に結合する二次試薬、例えば、蛍光色素標識した抗免疫グロブリン抗体を添加する。次いで、蛍光色素染色を測定し、これを用いて細胞に結合している抗体または抗体フラグメントの密度を決定し得る。
【００６９】
別の適切な方法として、抗体または抗体フラグメントを検出可能な標識（例えば、フルオロフォア）で直接標識し、標的細胞に結合させ得る。タンパク質に対する標識の比を決定し、既知量の標識が結合した標準ビーズと比較する。既知の標準物と、細胞に結合した標識の量の比較を用いて、細胞に結合した抗体の量を算出し得る。
【００７０】
本発明の他の実施形態において、機能的に等価な抗体またはフラグメントは、Ｂ細胞の枯渇および／またはＢ細胞疾患の処置に関して、本明細書中に記載される抗体またはフラグメントと同一のまたは類似の効力を有する。本発明のこの局面は、以下により詳細に記載される。例証のために、代表的な実施形態において、機能的に等価な抗体またはフラグメントは、約１２５ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、３７．５ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２、３．７５ｍｇ／ｍ２、１ｍｇ／ｍ２、０．７５ｍｇ／ｍ２、０．３７５ｍｇ／ｍ２、０．１ｍｇ／ｍ２、０．０５ｍｇ／ｍ２、０．００１ｍｇ／ｍ２、０．０００５ｍｇ／ｍ２またはそれより少ない投薬量で、少なくとも約５日間、７日間、１４日間、２１日間、３０日間、４５日間、６０日間、１２０日間または１８０日間以上、循環Ｂ細胞およびまたは組織Ｂ細胞において、少なくとも約２５％、３５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％または９８％以上の枯渇を達成する。他の特定の投薬量、枯渇の程度、および枯渇時間は、以下により詳細に記載される。
【００７１】
本発明の代表的な実施形態において、本発明のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントは、本明細書中に記載されるようなｍＡｂの重鎖または軽鎖を含む。他の例示的な実施形態において、本発明のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントは、本明細書中に記載されるようなｍＡｂに由来する重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。さらに他の実施形態において、このｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントは、本明細書中に開示されるｍＡｂに由来する重鎖Ｖおよび／またはＤおよび／またはＪ領域ならびに／あるいは軽鎖Ｖおよび／またはＪ領域を含む。さらに他の代表的な実施形態において、このｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントは、本明細書中に記載されるｍＡｂの重鎖ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域ならびに／あるいは軽鎖ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域を含む。この実施形態によれば、このｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントは、本明細書中に記載されるようなｍＡｂに由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域（重鎖および軽鎖）を含み得る。
【００７２】
特定の実施形態において、抗ヒトＣＤ２０抗体またはそれらの抗原結合性フラグメントは、ＣＤ２０に特異的に結合し、かつ、アミノ酸配列ＦＹＸＹＸＸＸ１ＹＧＡＸ２ＸＸＹを含む重鎖ＣＤＲ３領域を有し、ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、そしてここで、Ｘ１は任意のアミノ酸であり得、好ましくはＹまたはＳであり、そしてここで、Ｘ２は任意のアミノ酸であり得、好ましくはＭまたはＬであり、そしてここでＦはフェニルアラニンであり、Ｙはチロシンであり、Ｇはグリシンであり、Ａはアラニンであり、Ｍはメチオニンであり、Ｌはロイシンであり、そしてＳはセリンである。ＣＤＲは、図１５および１８に示すように定義される。
【００７３】
ある実施形態において、抗ヒトＣＤ２０抗体またはそれらの抗原結合性フラグメントは、アミノ酸配列ＮＸＸＸＸを含む重鎖ＣＤＲ１領域をさらに含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、Ｎはアスパラギンである。
【００７４】
別の実施形態において、抗ヒト抗ＣＤ２０抗体またはそれらの抗原結合性フラグメントは、アミノ酸配列ＸＨＦＷＸＸ３ＸＷＸを含む軽鎖ＣＤＲ３領域をさらに含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸配列であり得、Ｈはヒスチジンであり、Ｆはフェニルアラニンであり、Ｗはトリプトファンであり、そしてＸ３は任意のアミノ酸であり得、好ましくはＴまたはＩであり、ここでＴはトレオニンであり、そしてＩはイソロイシンである。
【００７５】
さらに、本発明のｍＡｂおよび抗原結合性フラグメントは、上に特定したアミノ酸配列（例えば、重鎖または軽鎖、重鎖および／または軽鎖可変領域、Ｖ、Ｄ、および／またはＪ領域あるいはＣＤＲ）との実質的な配列類似性、例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％またはそれを超えるアミノ酸配列類似性を有するｍＡｂおよび抗原結合性フラグメントを包含する。あるいは、これらの領域をコードする核酸は、本明細書中に記載される抗体の対応領域のヌクレオチド配列と、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％またはそれを超えるヌクレオチド配列類似性を有する。
【００７６】
当業者は、本明細書中に開示されるアミノ酸配列および核酸配列に、本発明の範囲内でいくらかの変更をなし得ることを理解する。例えば、核酸分子またはタンパク質分子のクローニングまたは増幅手順あるいは他の実験室手技により、これらの配列を変更し、ＣＤ２０および／またはＢ細胞への親和性および／または結合密度の増大を提供し、ならびに／あるいはＦｃレセプターとの相互作用の増大し得る。
【００７７】
特定の実施形態において、このｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントは、（ａ）本明細書中で具体的に開示されるｍＡｂの重鎖可変領域、または本明細書中で具体的に開示されるｍＡｂの重鎖可変領域のアミノ酸配列と実質的なアミノ酸配列類似性（上記のような）を有する重鎖可変領域を含む、重鎖を含み；（ｂ）本明細書中に開示されるｍＡｂの軽鎖可変領域、または本明細書中で具体的に開示されるｍＡｂの軽鎖可変領域のアミノ酸配列と実質的なアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む、軽鎖を含み；あるいは（ｃ）上記（ａ）および（ｂ）による重鎖および軽鎖を含むｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントである。特定の実施形態において、本発明のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントは、本明細書中で具体的に開示されるｍＡｂの重鎖可変領域またはこれと実質的なアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、さらにまた、本明細書中に開示されるｍＡｂと同じｍＡｂに由来する軽鎖可変領域またはこれと実質的なアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖の、両方を含む。
【００７８】
当該分野で公知のように、多数の異なるプログラムを用いて、核酸またはポリペプチドが既知の配列に対して配列同一性または類似性を有するか否かを確認し得る。配列同一性および／または類似性は、以下を含むがこれらに限定されない、当該分野で公知の標準技術を用いて決定され得る：Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２，４８２（１９８１）の部分的配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３（１９７０）の配列同一性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，２４４４（１９８８）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，およびＴＦＡＳＴＡ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２，３８７〜３９５（１９８４）に記載されるＢｅｓｔ  Ｆｉｔ配列プログラム（好ましくは初期設定を用いて）、あるいは検査によって。
【００７９】
有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、連続的な、ペアをなすアラインメントを用いて、関連配列の群から複数の配列アラインメントを作製する。このアラインメントを作製するのに用いられるクラスター化関係を示す系統樹もプロットし得る。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５，３５１〜３６０（１９８７）の連続的アラインメント方法の単純化したものを用いる；この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５，１５１〜１５３（１９８９）に記載の方法に類似している。
【００８０】
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３〜４１０，（１９９０）およびＫａｒｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，５８７３〜５７８７（１９９３）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６，４６０〜４８０（１９９６）から入手した。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２はいくつかの検索パラメータを用い、これらのパラメータは好ましくは初期値に設定される。これらのパラメータは動的値であり、目的の配列が検索される特定配列の構成および特定データベースの構成に依存して、プログラム自体によって設定される；しかしながら、これらの値は感度を上げるために調整され得る。
【００８１】
さらなる有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，３３８９〜３４０２）によって報告されるようなギャップ化ＢＬＡＳＴである。
【００８２】
アミノ酸配列同一性値の百分率は、マッチしている同一残基の数を、整列した領域中の「より長い」配列の残基の総数で割ることによって決定され得る。「より長い」配列は、整列した領域中で最大の実際の残基（アラインメントスコアを最大化するためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２によって導入されたギャップは無視される）を有する配列である。
【００８３】
このアラインメントは、整列される配列中へのギャップの導入を含み得る。さらに、本明細書中で具体的に開示されるポリペプチドよりも多いかまたは少ないアミノ酸を含む配列について、１つの実施形態において、配列同一性の百分率は、アミノ酸の総数に対する同一のアミノ酸の数に基づいて決定されると理解されている。従って、例えば、本明細書中で具体的に開示される配列よりも短い配列の配列同一性は、１つの実施形態において、このより短い配列中のアミノ酸の数を用いて決定される。同一性パーセント計算において、相対的重みは、配列バリエーション（例えば、挿入、欠失、置換など）の種々の発現に割り当てられない。
【００８４】
１つの実施形態において、同一であるもののみがポジティブにスコア付けされ（＋１）、ギャップを含む全ての形態の配列バリエーションは値「０」を割り当てられ、これにより、配列類似性計算のための下記のような重み付けスケールまたはパラメータの必要性が除去される。パーセント配列同一性は、例えば、マッチしている同一残基の数を、整列した領域中の「より短い」配列の残基の総数で割り、１００をかけることによって算出され得る。「より長い」配列は、整列した領域中で最大の実際の残基を有する配列である。
【００８５】
他の実施形態において、本明細書中で具体的に記載されるｍＡｂまたは対応する抗原結合性フラグメントあるいは特定領域に対して、「実質的な配列類似性」を有するｍＡｂ、抗原結合性フラグメント、またはその特定領域は、当業者に公知の標準条件下で、本明細書中に具体的に開示される核酸の対応するセグメントにハイブリダイズし、かつ本明細書中で定義されるような機能的に等価なｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントをコードする核酸によって、コードされる。
【００８６】
例証のために、本明細書中で具体的に開示される配列に対して、このような核酸配列のハイブリダイゼーションを、低いストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシーまたは実にストリンジェントな条件下（例えば、それぞれ、３７℃で５×デンハート溶液、０．５％ＳＤＳおよび１×ＳＳＰＥを含む３５〜４０％ホルムアミドの洗浄ストリンジェンシーで表される条件；４２℃で５×デンハート溶液、０．５％ＳＤＳ、および１×ＳＳＰＥを含む４０〜４５％ホルムアミドの洗浄ストリンジェンシーで表される条件；および／または４２℃で５×デンハート溶液、０．５％ＳＤＳおよび１×ＳＳＰＥを含む５０％ホルムアミドの洗浄ストリンジェンシーで表される条件）で実行し得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版  １９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を参照のこと。
【００８７】
遺伝コードの縮重に起因して、本発明のｍＡｂおよび抗原結合性フラグメントをコードする核酸に可変性が存在し得ることを当業者は理解する。この遺伝コードの縮重（これにより、異なる核酸配列が同じポリペプチドをコードすることが可能になる）は、当該分野で周知である。
【００８８】
この核酸配列中のさらなるバリエーションは、非翻訳配列（例えば、イントロン配列ならびに５’および３’非翻訳配列）の存在（または非存在）によって導入され得る。
【００８９】
ところで、本発明者らは、望ましい特性を有する抗ＣＤ２０ｍＡｂのパネルを生成し、特徴付けしてきたが、類似のまたは改良した抗体およびフラグメントを生成することは、当業者にとって日常的である。例えば、この重鎖および／または軽鎖可変領域（またはそれらの部分、例えば、１以上のＣＤＲ）の配列は、所望の特性を有する他の抗体の同定のための起点として用いられ得る。１つのアプローチとして、本明細書中に開示される配列の変異体を含むファージライブラリーが生成され得る。このファージライブラリーは、任意の望ましい特性、例えば、ＣＤ２０反応性、結合密度、Ｂ細胞枯渇の効力、Ｂ細胞疾患処置の効力などに基づいて、選択され得る。
【００９０】
さらに、本明細書中で具体的に開示されるｍＡｂおよびその抗原結合性フラグメントのアミノ酸配列および核酸配列を変更するために、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性または相違を含む、当該分野で公知の任意の特性（例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズなど）に基づき得る。特定の実施形態において、アミノ酸配列中に保存的置換を行う。本明細書中で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、天然に生じる置換の確率が、偶然に生じる置換の確率よりも約１０倍より大きい置換である（例えば、Ｄａｙｈｏｆｆら，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１９７１，９５〜９６頁および図９〜１０に記載される計算方法によって定義されるような）。
【００９１】
アミノ酸置換を行う際に、アミノ酸の疎水性親水性指標（ヒドロパシーインデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ））が考慮され得る。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際の疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、一般に当該分野において理解されている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５を参照のこと；その全体が本明細書中に参考として援用される）。アミノ酸の相対的な疎水性親水性的性質は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、これが次に、他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）とそのタンパク質の相互作用を規定することが一般に認められている。
【００９２】
各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指標を割り当てられており（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、同上）、これらの値は以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００９３】
このアミノ酸の置換が、親水性に基づいてなされ得ることもまた、当該分野で理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号（その全体が本明細書中に参考として援用される）は、タンパク質の最大局所的平均親水性（ｔｈｅ  ｇｒｅａｔｅｓｔ  ｌｏｃａｌ  ａｖｅｒａｇｅ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）が、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるので、そのタンパク質の生物学的特性と相関することを言及している。
【００９４】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（＋３．０）；リジン（±３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【００９５】
他の実施形態において、機能的に等価な本発明のｍＡｂおよび抗原結合性フラグメントは、１４、１２、１０、８、６、５、４、３、２または１以下のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を有する、本明細書中に開示されるｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントに由来する、上記の１以上の特定領域（例えば、重鎖または軽鎖、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域またはその部分）を含むものを包含する。特定の実施形態において、本発明のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域を含み、ここで、各ＣＤＲ領域は、５、４、３、２または１以下のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含む。例示的な実施形態において、このＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域は各々、５、４、３、２または１以下の保存的アミノ酸置換を含む。
【００９６】
これらの抗体またはフラグメントは、さらに１を超える抗原特異性を有し得、例えば、二重特異性抗体である得る。この二重特異性抗体は、例えば、さらに別のＣＤ２０エピトープに結合し得る。さらに、この二重特異性抗体は、他の抗原、例えばＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ５２、ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＨＬＡ−ＤＲ１０（Ｌｙｍ−１）に対する；あるいはＦｃレセプター、例えば、ＣＤ１６、ＣＤ６４およびＣＤ８９に対する；Ｔ細胞レセプター（例えば、Ｔ細胞レセプター複合体のゼータ鎖）または他の細胞表面分子（例えば、サイトカイン、ホルモンまたは成長因子レセプターのようなレセプター）に対する、結合特異性を有し得る。
【００９７】
これらの抗体およびそのフラグメントは、さらに「キメラ」抗体であり得る。キメラ抗体および抗原結合性フラグメントは、２以上の異なる種（例えば、マウスおよびヒト）に由来する部分を含む。キメラ抗体は、ヒト定常ドメイン遺伝子セグメント中にスプライスされた所望の特異性のマウス可変領域を用いて生成され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。このように、非ヒト（例えば、マウス）抗体を改変して、ヒト臨床用途により適するように生成され得る。
【００９８】
本発明のｍＡｂは、さらに「ヒト化」または「ＣＤＲグラフト化」形態の非ヒト（例えば、マウス）ｍＡｂであり得、これらはマウスｍＡｂよりも、ヒトに対する治療薬として利益をもたらし得る。なぜなら、特に、本発明のｍＡｂはマウス抗体ほど迅速にはヒトの循環から取り除かれず、かつ、ヒト被験体に投与した場合、一般に有害な免疫反応を引き起こさないためである。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源から導入された１以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入（ｉｍｐｏｒｔ）」残基と称される場合が多く、これらは代表的には「移入」可変ドメインから受け取られる。ヒト化抗体を調製する方法は、一般に当該分野で周知であり、本明細書中に開示されるｍＡｂに容易に適用され得る。例えば、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４〜１５３６（１９８８））に従って、げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに置換することによって、ヒト化を本質的に行い得る。特定の実施形態において、非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、レシピエント抗体の超可変（ＣＤＲ）領域残基が、所望の特異性、親和性、および結合能を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）に由来する超可変領域残基によって置換される、ヒト抗体（レシピエント抗体）である。ある場合に、このヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域残基はまた、対応する非ヒト残基によっても置換される（いわゆる「復帰突然変異」）。このような復帰突然変異のための位置は、配列および構造分析によって、またはコンピュータモデルを用いた可変領域の３次元構造の分析によって決定され得る。さらに、ファージディスプレイライブラリーは、抗体配列内の選択された位置でアミノ酸を変化させるのに用いられ得る。ヒト化抗体のこの特性はまた、ヒトフレームワークの選択によっても影響を受ける。さらに、親和性などの抗体特性をさらに改善するために、ヒト化およびキメラ化抗体を改変して、レシピエント抗体中またはドナー抗体中には見出されない残基を含み得る。一般に、このヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲドメインに対応する全てのまたは実質的に全ての少なくとも１つ、２つ、または実に３つ全てのＣＤＲドメインを含み、かつ、全てのまたは実質的に全てのこのフレームワーク領域残基がヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域残基である。このヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、代表的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部も必要に応じて含む。さらに詳細については、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５（１９８６）；およびＲｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２９（１９８８）を参照のこと。従って、本発明の１つの実施形態において、抗原（すなわち、ＣＤ２０）を結合する抗体の能力を実質的に干渉することなく、グラフトすることによってヒト免疫グロブリンの構成要素を導入す��ヒト化されたｍＡｂが提供される。
【００９９】
本発明のｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントは、他の薬剤（例えば、治療薬）と結合体化しない裸の抗体または抗原結合性フラグメントであり得る。あるいは、このｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントは、治療薬（例えば、細胞傷害性薬剤、低分子化合物、ホルモン、成長因子、サイトカイン、酵素、ＲＮａｓｅ、コード配列を含むリボザイムまたは核酸分子、アンチセンスＲＮＡおよびＲＮＡｉ）と結合体化し得る（すなわち、免疫複合体を形成する）。
【０１００】
例示的な細胞傷害性薬剤としては、タンパク質毒素、例えば、リシン、ジフテリア毒素、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシン、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、アブリンまたは他のリボソーム不活化タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。これらのタンパク質は、化学的架橋剤を用いて化学的に、あるいはタンパク質毒素の全てかまたは一部をコードする融合タンパク質を構築することによる組換え核酸技術によって、抗体または抗体フラグメントに連結させ得る。他の例示的な細胞傷害性薬剤としては、９０Ｙ、１３１Ｉまたは１１１Ｉｎのような高エネルギー放射性同位体が挙げられる。さらなる細胞傷害性薬剤としては、細胞傷害性薬および細胞増殖抑止薬、例えば、メトトレキサート、クロラムブシル、アドリアマイシン、ダウノルビシンおよびビンクリスチンが挙げられる。
【０１０１】
あるいは、このｍＡｂまたは抗原結合性フラグメントは、検出可能に標識され得る。例示的な検出可能標識としては、放射標識、重金属、発色団、フルオロフォアおよび酵素反応の最終産物が検出可能な酵素が挙げられる。検出可能に標識された抗体および抗原結合性フラグメントは、例えば、診断法および実験室的方法に用いられ得る。
【０１０２】
これらの抗ＣＤ２０ｍＡｂは、当該分野で公知の任意の標準方法によって、例えば、ハイブリドーマ方法（ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７（１９７５）；ならびにＧｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９〜１０３，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））によって、または組換え技術（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に開示される、およびＷｏｏｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６〜９（１９８５）による）によって、生成され得る。
【０１０３】
モノクローナル抗体は、代表的には、同じ抗体結合部位を有する抗体分子の均質な集団を生成する、ハイブリドーマ細胞のような単一細胞のクローン化によって生成される。このハイブリドーマ細胞は、抗体産生細胞と、骨髄腫または他の自己永続的細胞株を融合させることによって生成される。このような抗体の調製は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７（１９７５））によって初めて記載され、この記載は、その全体が本明細書中に参考として援用される。さらなる方法は、Ｚｏｌａ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７））によって記載される。そのようにして調製したハイブリドーマ上清を、抗体分子（ＣＤ２０に結合し、かつ／または本明細書中に記載されるような他の望ましい特性を有する）の存在についてスクリーニングし得る。
【０１０４】
一般に、抗ＣＤ２０ｍＡｂを産生するハイブリドーマを生成するために、骨髄腫または他の自己永続的細胞株を、ＣＤ２０に対して高免疫化した哺乳動物の脾臓、リンパ節または他の抗体産生細胞から得たリンパ球と融合する（例えば、Ｋｅａｒｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３：１５４８−５０（１９７９）を参照のこと）。
【０１０５】
１つの実施形態において、ハイブリドーマを調製するのに用いられる骨髄腫細胞株は、リンパ球と同じ種に由来する。本発明における使用に適したマウス骨髄腫は、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａから入手可能なＮＳ−１骨髄腫細胞株である。
【０１０６】
脾細胞は、代表的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５００を用いて骨髄腫細胞と融合させる。融合ハイブリッドをＨＡＴに対する感受性によって選択する。開示されたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、本明細書中に記載される酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて同定する。
【０１０７】
これらの抗体産生細胞は、近交系マウス系、例えばＣ５７ＢＬ／６系から採取可能である。他の実施形態において、この抗体産生細胞は、ＣＤ２０−／−哺乳動物、例えばＣＤ２０−／−マウスに由来する。１つの代表的な実施形態において、このＣＤ２０−／−マウスは、初めに１２９系マウスから得られる。このＣＤ２０−／−哺乳動物は、当業者に公知であり、かつ本明細書中に記載されるような技術（例えば、Ｈｏｇａｎら（１９８６）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）を用いて作製され得る。
【０１０８】
本発明の抗ＣＤ２０ｍＡｂは、完全ヒトであり得る。完全ヒト抗体を調製する方法は、当分野で公知であり、トランスジェニック動物およびファージディスプレイ技術の使用を含む。
【０１０９】
次に、内因性免疫グロブリン生成がない場合に、免疫の際にヒト抗体のレパートリーを生成する能力のあるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することも可能である。例えば、キメラマウスおよび生殖細胞系変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失が、内因性抗体生成の完全阻害をもたらすことが記載されてきた。このような生殖細胞系変異体マウスにヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイを移入することによって、抗原負荷の際にヒト抗体の生成がもたらされる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０、２５５１〜２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２，２５５〜２５８（１９９３）を参照のこと。
【０１１０】
Ｍｅｎｄｅｚら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６〜１５６（１９９７））は、この技術をさらに改良し、抗原を負荷されると高親和性完全ヒト抗体を生成する、「Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ  ＩＩ」と称されるトランスジェニックマウスの系統を作製した。これは、上記のように内因性ＪＨセグメントに欠損を有するマウスへの、メガベースヒト重鎖および軽鎖の遺伝子座の生殖細胞系組込みによって達成された。このＸｅｎｏｍｏｕｓｅ  ＩＩは、約６６個のＶＨ遺伝子、完全ＤＨおよびＪＨ領域ならびに３つの異なる定常領域（μ、δおよびχ）を含む１，０２０ｋｂのヒト重鎖遺伝子座を有し、かつ、３２個のＶκ遺伝子、ＪκセグメントおよびＣκ遺伝子を含む８００ｋｂのヒトκ遺伝子座も有する。これらのマウスにおいて生成される抗体は、遺伝子再配列、アセンブリ、およびレパートリーを含むあらゆる点で、ヒトにおいて見られる抗体に酷似している。これらのヒト抗体は、マウス遺伝子座での遺伝子再配列を妨げる内因性ＪＨセグメントにおける欠損に起因して、内因性抗体よりも優先的に発現される。
【０１１１】
ｍＡｂを生成する他の方法もまた、公知である。例えば、Ｓａｓｔｒｙら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：５７２８〜５７３２（１９８９））；およびＨｕｓｅら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５〜１２８１（１９８９））によって記載されるような、免疫学的レパートリーからｍＡｂを単離する方法を参照のこと。
【０１１２】
あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８、５５２〜５５３（１９９０））は、免疫されていないドナーに由来する免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ヒト抗体および抗体フラグメントをインビトロで生成するのに用いられ得る。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、糸状バクテリオファージ（例えば、Ｍ１３またはｆｄ）の主動または微動コートタンパク質遺伝子のいずれかの中にインフレームでクローン化され、そしてファージ粒子の表面上に機能的抗体フラグメントとして提示される。この糸状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、この抗体の機能特性に基づく選択は、結果としてこれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択ももたらす。従って、このファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣する。ファージディスプレイは、種々の形式で行われ得る；例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３、５６４〜５７１（１９９３）を参照のこと。
【０１１３】
Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源が、ファージディスプレイに用いられ得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ  ３５２、６２４〜６２８（１９９１））は、免疫マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。免疫されていないヒトドナーに由来するＶ遺伝子のレパートリーが構築され得、そして抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体が、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２，５８１〜５９７（１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１２，７２５〜７３４（１９９３）に記載の技術に本質的に従って単離され得る。自然免疫応答において、抗体遺伝子は高率で突然変異を蓄積する（体細胞超変異）。導入されたこれらの変更のいくつかによって高い親和性が授与され、高親和性表面免疫グロブリンを提示しているＢ細胞は、その後の抗原負荷の間に優先的に複製され、分化する。この天然プロセスは、「ｃｈａｉｎシャフリング」として公知の技術を用いて模倣され得る（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０、７７９〜７８３）。この方法において、ファージディスプレイによって得られた「一次」ヒト抗体の親和性は、この重鎖および軽鎖Ｖ領域遺伝子を、免疫されていないドナーから得られるＶドメイン遺伝子の天然に存在する改変体（レパートリー）のレパートリーに順次置き換えることによって改善され得る。この技術によって、ｎＭの範囲で親和性を有する抗体および抗体フラグメントの生成が可能になる。極めて大きなファージ抗体レパートリーを作製するためのストラテジーは、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１、２２６５〜２２６６（１９９３））によって記載されている。
【０１１４】
モノクローナル抗体の生成に関するさらなる情報は、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第３版，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９６；ＬｉｄｄｅｌｌおよびＷｅｅｋｓ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ，Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ：Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，１９９５；ＢｒｅｉｔｌｉｎｇおよびＤｕｂｅｌ：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９；ならびにＰｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｂａｒｂａｓら，編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，２００１もまた参照のこと。
【０１１５】
本発明者らは、識別可能な特性（例えば、ＣＤＲ領域、結合密度など）を有する新規の抗体がＣＤ２０−／−哺乳動物から生成され得るという、予期せぬ発見をした。従って、１つの代表的な実施形態において、本発明は、ＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：（ａ）抗体応答を誘発するのに十分な条件下で、ＣＤ２０またはその抗原的に有効なフラグメントでＣＤ２０−／−哺乳動物（例えば、マウス）を免疫する工程；（ｂ）この哺乳動物から抗体産生細胞（例えば、Ｂ細胞）を収集する工程；（ｃ）この抗体産生細胞を、培養不死化細胞（例えば、骨髄腫細胞）と融合させて、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を生成する工程；（ｄ）このハイブリドーマ細胞を、モノクローナル抗体の産生に十分な条件下で培養する工程；ならびに（ｅ）この培養物から、ＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体を回収する工程。この方法は、抗ＣＤ２０ｍＡｂを産生するハイブリドーマ細胞株の単離を必要に応じて包含し得る。
【０１１６】
別の実施形態において、本発明はＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：（ａ）抗体応答を誘発するのに十分な条件下で、ＣＤ２０またはその抗原的に有効なフラグメントでＣＤ２０−／−哺乳動物を免疫する工程；（ｂ）この哺乳動物から、ＣＤ２０に特異的に結合する抗体を産生する細胞を収集する工程；（ｃ）この抗体産生細胞から、免疫グロブリンコード遺伝子を単離する工程；（ｄ）この免疫グロブリンコード遺伝子を異なる細胞に導入して、形質転換細胞を生成する工程；（ｅ）この形質転換細胞を、この免疫グロブリン遺伝子の転写および翻訳ならびにモノクローナル抗体の産生に十分な条件下で培養する工程；ならびに（ｅ）この培養物から、ＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体を回収する工程。特定の実施形態において、重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子は共に、この抗体産生細胞からかまたは異なる抗体産生細胞から単離され、そして形質転換細胞中に導入される。この形質転換細胞は、任意の適切な細胞、例えば、哺乳動物細胞またはＣＨＯもしくはＢＨＫ細胞のような細胞株であってもよい。
【０１１７】
上記のように、本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマ細胞、ハイブリドーマ細胞株、およびハイブリドーマ細胞培養物もまた、本発明によって提供される。本発明の例示的なハイブリドーマ細胞株としては、ハイブリドーマＨＢ２０−１、ＨＢ２０−２、ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４、ＨＢ２０−５、ＨＢ２０−６、ＨＢ２０−２５、ＭＢ２０−１、ＭＢ２０−２、ＭＢ２０−３、ＭＢ２０−６、ＭＢ２０−７、ＭＢ２０−８、ＭＢ２０−１０、ＭＢ２０−１１、ＭＢ２０−１３、ＭＢ２０−１４、ＭＢ２０−１６およびＭＢ２０−１８が挙げられる。
【０１１８】
ハイブリドーマ細胞株ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４、ＨＢ２０−２５、ＭＢ２０−１、ＭＢ２０−１１およびＭＢ２０−１８は、ブダペスト条約に従って、２００４年５月５日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）に寄託され、それぞれ、ＡＴＣＣ受託番号＿（ＨＢ２０−３）、＿（ＨＢ２０−４）、＿（ＨＢ２０−２５）、＿（ＭＢ２０−１）、＿（ＭＢ２０−１１）および＿（ＭＢ２０−１８）を付与された。
【０１１９】
本発明はまた、本発明のｍＡｂ、抗原結合性フラグメント、抗体重鎖および／または抗体軽鎖またはその部分（例えば、可変領域、ＣＤＲ領域）をコードする核酸も提供する。この核酸は、一本鎖または二本鎖の、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらのキメラであり得、そして完全にまたは部分的に合成であるかまたは天然に存在してもよい。これらの核酸は、改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得る。さらに、この核酸は、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコなどの哺乳動物種を含む、任意の起源の種由来であってもよい。
【０１２０】
特定の実施形態において、この核酸は、単離された核酸である。本明細書中で使用される場合、「単離された」核酸とは、天然に存在する生物体の少なくともいくつかの他の成分（例えば、一般にこの核酸に伴って見出される細胞構造成分または他のポリペプチドもしくは核酸）から分離されているかまたはこれらの成分を実質的に含まない核酸を意味する。
【０１２１】
本発明はまた、本発明の核酸を含む、発現ベクターおよび遺伝子送達ベクターを含むベクターも提供する。適切なベクターとしては、細菌発現ベクター、真菌発現ベクター、哺乳動物ベクター、酵母発現ベクターおよび植物発現ベクターが挙げられる。例示的なベクターとしては、細菌人工染色体、コスミド、酵母人工染色体、ファージ、プラスミド、脂質ベクターおよびウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルスなど）が挙げられる。
【０１２２】
発現ベクターは、原核細胞または真核細胞におけるポリペプチドの発現のために設計され得る。例えば、ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系において）または哺乳動物細胞において発現され得る。いくつかの適切な宿主細胞が、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）においてさらに議論される。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためのベクターとしては、例えば、ｐＹｅｐＳｅｃｌ（Ｂａｌｄａｒｉら，（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９〜２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３〜９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら，（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３〜１２３）、ならびにｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）中でタンパク質を生成するための核酸の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃ系（Ｓｍｉｔｈら，（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６〜２１６５）およびｐＶＬ系（Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｖ．Ａ．，およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．ｄ．（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１〜３９）が挙げられる。
【０１２３】
哺乳動物発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７），ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７〜１９５）が挙げられる。
【０１２４】
このベクターは、一般に、本発明の核酸と作動可能に結合する発現制御エレメント（例えば、プロモーター）を含む。所望のレベルおよび所望の組織特異的発現によって、多様な発現制御エレメントを使用し得ることが理解される。さらに、このプロモーターは、構成性であっても誘導性であってもよい（例えば、メタロチオネインプロモーターまたはホルモン誘導性プロモーター）。この発現制御エレメントは、宿主細胞にとってネイティブであっても外来であってもよく、そして天然配列であっても合成配列であってもよい。このプロモーターは、一般に、目的の標的細胞（複数可）において機能するように選択される。これらの核酸は、さらに他の適切な発現制御配列（例えば、転写／翻訳制御シグナルおよびポリアデニル化シグナル）と結合し得る。ウイルス調節エレメントは、しばしば哺乳動物細胞中で使用される。例えば、哺乳動物発現ベクター中で一般に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。
【０１２５】
さらに、挿入したタンパク質コード配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルが一般に必要とされる。これらの翻訳制御配列（ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含み得る）は、天然および合成の両方の、多様な起源の配列であり得る。
【０１２６】
さらに、本発明の単離された核酸およびベクターを含む宿主細胞（例えば、酵母細胞、細菌細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞または真菌細胞）が提供される。この細胞は、本発明の核酸またはベクターを用いて、一過性にまたは安定に形質転換され得る。特定の実施形態において、この核酸は宿主細胞のゲノム中に安定に組み込まれる。さらに、この細胞は培養され得る（すなわち、単離され得る）か、または生きた生物におけるインサイチュの細胞であり得る。
【０１２７】
（使用方法）
本発明の抗体、抗原結合性フラグメント、核酸および薬学的組成物は、いくつかの調査、診断および／または治療用途に用いられ得る。例えば、本発明の抗体および抗原結合性フラグメントは、Ｂ細胞特異的マーカーであるＣＤ２０に特異的に結合する。従って、これらの試薬は、Ｂ細胞を同定する方法、ＣＤ２０機能を研究する方法ならびにＣＤ２０またはＢ細胞の免疫親和性精製の方法における用途が見出されている。Ｂ細胞を単離する方法は、研究室での研究、治療または診断方法に用いられ得る。例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する被験体から組織または細胞を取り出し、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントを用いてこれらのＢ細胞を精製除去し、そしてこのＢ細胞枯渇組織または細胞を被験体に再導入し得る。さらに、本発明の抗体、抗原結合性フラグメントおよび組成物は、診断目的に、例えば、リンパ腫の同定に用いられ得る。本発明の方法はまた、（上記のように）治療薬と結合体化した抗体または抗原結合性フラグメントを用いた、分子のＢ細胞特異的送達にも提供される。さらに、本発明はまた、（例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍および自己免疫疾患のようなＢ細胞疾患の処置のために）Ｂ細胞を枯渇させる治療方法も提供する。
【０１２８】
１つの特定の実施形態において、本発明は、動物被験体（例えば、哺乳動物被験体）においてＢ細胞を枯渇させる方法を提供し、この方法は、本発明のｍＡｂ、抗原結合性フラグメントまたは薬学的組成物を、Ｂ細胞を枯渇させるのに有効な量でこの哺乳動物被験体に投与する工程を包含する。「Ｂ細胞を枯渇させるのに有効な量」とは、Ｂ細胞の少なくとも約２５％、３５％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれを超える削減（すなわち、枯渇）を達成するのに有効な量を意味する。いくつかの実施形態において、検出可能なＢ細胞は存在しないか、または実質的に存在しない。Ｂ細胞を検出する方法およびＢ細胞枯渇を測定する方法は、当該分野で公知である（例えば、実施例９〜１２、１４および１７を参照のこと）。代表的な実施形態において、少なくとも約２５％、３５％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれを超える枯渇は、末梢循環および／または組織（例えば、脾臓、リンパ節）のＢ細胞において達成される。臨床用途のために、末梢循環Ｂ細胞が測定／モニターされ、これは、一般に組織においてＢ細胞枯渇を評価する方法よりも侵襲性が低いことを、当業者は理解する。
【０１２９】
本発明はさらに、Ｂ細胞疾患を有する動物（例えば、哺乳動物）被験体に処置有効量の１以上の本発明のモノクローナル抗体、抗原結合性フラグメントまたは薬学的処方物を投与する工程を包含する、Ｂ細胞疾患を処置する方法を提供する。特定の実施形態において、このＢ細胞疾患は、Ｂ細胞悪性腫瘍または自己免疫疾患である。
【０１３０】
用語「Ｂ細胞悪性腫瘍」およびその文法的変形は、最も広い意味で使用され、代表的にはリンパ系組織（例えば、骨髄またはリンパ節）に生じるが、非リンパ系組織（例えば、甲状腺、胃腸管、唾液腺および結膜）にも生じ得る、Ｂ細胞の悪性腫瘍または新生物をいう。本発明の処置方法は、具体的には、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、ヘアリーセル白血病、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、およびプロリンパ性白血病のＢ細胞サブタイプを非限定的に含む、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞悪性腫瘍に関する。Ｂ細胞サブタイプ非ホジキンリンパ腫は、悪性Ｂ細胞リンパ球によって引き起こされるリンパ腫の（２９タイプを超える）大きな群を包含して用いられる用語であり、低悪性度／濾胞性ＮＨＬ、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非分割細胞ＮＨＬおよび巨大腫瘤病変ＮＨＬを含むがこれらに限定されない公知のタイプのリンパ腫の大きなサブセットを表す。
【０１３１】
自己免疫疾患は、１つには自己寛容の崩壊によって引き起こされ、これは続いて、自己抗体の生成および患部組織における免疫グロブリンの沈積を含む、自己に対する免疫応答を引き起こす。自己抗体は免疫複合体を形成し、補体およびＦｃレセプター媒介性組織炎症および破壊を促進する。大部分の自己免疫疾患は、正常な体組織と反応性の抗体の生成によって生じるか、または正常な体組織と反応性の抗体の産生によって悪化する。Ｂリンパ球は、自己抗体の供給源であるので、これらのタイプの免疫媒介性疾患の処置に合理的な標的を提供する。Ｂリンパ球はまた、抗原を提示し、かつエフェクターＴリンパ球の成長を調節し得る。
【０１３２】
８０種類を超える自己免疫疾患が同定されている。自己免疫疾患、それらの病因論および処置は、国立衛生研究所の自己免疫疾患調整委員会（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって刊行されるＡｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｌａｎにおいて広範に議論される。本発明によって処置可能な代表的な自己免疫疾患としては、免疫複合体性障害（例えば、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、壊死性脈管炎、リンパ節炎、結節性動脈周囲炎および全身性エリテマトーデスにつながるような免疫複合体性障害）が挙げられるが、これらに限定されない。他の例示的な自己免疫疾患としては、関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、乾癬、潰瘍性大腸炎、全身性硬化症、皮膚筋炎／多発性筋炎、抗リン脂質抗体症候群、強皮症、尋常性天疱瘡、ＡＮＣＡ関連血管炎（例えば、ヴェーゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発性血管炎）、ブドウ膜炎、シェーグレン症候群、クローン病、ライター症候群、強直性脊椎炎、ライム関節炎、ギヤン‐バレー症候群、橋本甲状腺炎、および心筋症が挙げられるが、これらに限定されない。本発明によって処置可能な、抗体産生と関連する他の疾患としては、多発性硬化症、アトピー性皮膚炎、血小板減少性紫斑病、顆粒球減少症、自己免疫性溶血性貧血、外来抗原に対する免疫反応、例えば妊娠中の胎児Ａ−Ｂ−Ｏ血液型、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病、グレーヴズ病、およびアレルギー反応が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３３】
本発明の方法は、例えば、移植拒絶を含む、Ｂ細胞または抗体が関与する任意の他の障害または状態の処置に用いられ得る。
【０１３４】
「処置有効」量は、被験体の状態に多少の改善または寛解をもたらすか、あるいはこの状態の再発または回帰を防止するかまたは遅延させるのに十分な、抗ＣＤ２０抗体または抗原結合性フラグメントの量である。
【０１３５】
被験体は、当該分野で公知の標準技術によってモニターされ、Ｂ細胞悪性腫瘍または特定の自己免疫疾患の臨床的徴候を追跡され得る。例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍の場合、腫瘍退縮（例えば、固形腫瘍の場合は腫瘍サイズ）、抗ＣＤ２０抗体を用いた循環Ｂ細胞の表現型または生検組織の表現型がモニターされ得る。
【０１３６】
被験体の年齢、性別、種および状態、所望の枯渇度、処置されるべき疾患および／または用いられる特定の抗体もしくは抗原結合性フラグメントを含むいくつかの要因に基づいて、
投薬量が選択され得、かつ当業者によって決定され得ることを、当業者は理解する。例えば、非ホジキンリンパ腫患者または自己免疫疾患を有する患者は、本明細書中に記載されるように、約０．０００５〜約１５００ｍｇ／ｍ２／週、具体的には約０．００１〜約１５０ｍｇ／ｍ２／週、より具体的には約０．２５〜約７５ｍｇ／ｍ２／週、より具体的には約２．５〜約５０ｍｇ／ｍ２／週の抗ＣＤ２０抗体を受容し得る。
【０１３７】
本発明の実施形態において、これらの抗体および抗原結合性フラグメントは、従来の抗ＣＤ２０抗体よりも高密度でＢ細胞に結合し、従って、より効率的な（すなわち、より低い投薬量で）Ｂ細胞の枯渇をもたらし得る（上で定義したように）。あるいは、またはさらに、この抗体が反応する特定のエピトープに起因して、より効率的な枯渇がもたらされ得る。例示的な実施形態において、この抗体または抗原結合性フラグメントの投薬量（薬学的組成物の一部として、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリア中において）は、少なくとも約０．０００５、０．００１、０．０５、０．０７５、０．１、０．２５、０．３７５、０．５、１、２．５、５、１０、２０、３７．５、５０もしくは１００ｍｇ／ｍ２および／または約２００、１７５、１５０、１２５、１００、７５、６０、５０、３７．５、２０、１５、１０、５、２．５、１、０．５、０．３７５、０．１、０．０７５もしくは０．０１ｍｇ／ｍ２未満である。他の例示的な実施形態において、この投薬量は、約０．０００５ｍｇ／ｍ２と約２００ｍｇ／ｍ２の間、約０．００１ｍｇ／ｍ２と約１５０ｍｇ／ｍ２の間、約０．０７５ｍｇ／ｍ２と約１２５ｍｇ／ｍ２の間、約０．３７５ｍｇ／ｍ２と約１００ｍｇ／ｍ２の間、約２．５ｍｇ／ｍ２と約７５ｍｇ／ｍ２の間、約１０ｍｇ／ｍ２と約７５ｍｇ／ｍ２の間、および約２０ｍｇ／ｍ２と約５０ｍｇ／ｍ２の間である。
【０１３８】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、本発明のｍＡｂ、抗原結合性フラグメントおよび／または組成物は、約３７５ｍｇ／ｍ２未満の用量で；約３７．５ｍｇ／ｍ２未満の用量で；約０．３７５ｍｇ／ｍ２未満の用量で；および／または約０．０７５ｍｇ／ｍ２と約１２５ｍｇ／ｍ２の間の用量で、投与され得る。
【０１３９】
この指定の投薬量により、少なくとも約３、５、７、１０、１４、２０、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１５０もしくは１８０日間またはそれより長い期間、Ｂ細胞枯渇がもたらされ得る（上記のように）。
【０１４０】
本発明の代表的な実施形態において、約１２５ｍｇ／ｍ２以下の投薬量の抗体または抗原結合性フラグメントにより、少なくとも約７、１４、２１、３０、４５、６０日間、９０または１２０日間、Ｂ細胞枯渇がもたらされる（上記のように）。別の代表的な実施形態において、約３７．５ｍｇ／ｍ２以下の投薬量により、少なくとも約７、１４、２１、３０、４５、６０、９０または１２０日間、Ｂ細胞が枯渇する。さらに他の実施形態において、約０．３７５ｍｇ／ｍ２以下の投薬量により、少なくとも約７、１４、２１、３０、４５または６０日間、Ｂ細胞の枯渇がもたらされる。別の実施形態において、約０．０７５ｍｇ／ｍ２以下の投薬量により、少なくとも約７、１４、２１、３０、４５または６０日間、Ｂ細胞の枯渇がもたらされる。さらに他の実施形態において、約０．０１ｍｇ／ｍ２、０．００５ｍｇ／ｍ２または実に０．００１ｍｇ／ｍ２以下の投薬量により、少なくとも約３、５、７、１０、１４、２１または３０日間、Ｂ細胞の枯渇がもたらされる。これらの実施形態によれば、この投薬量は、任意の適切な経路によって投与され得るが（下記のように）、必要に応じて、皮下経路によって投与される。
【０１４１】
別の局面として、本発明は、Ｂ細胞枯渇および／またはＢ細胞疾患の処置が、現在利用可能な方法で使用されている投薬量よりも低い投薬量の抗体または抗体フラグメントで達成され得るという研究結果を提供する。従って、別の実施形態において、本発明は、Ｂ細胞を枯渇させる方法および／またはＢ細胞疾患を処置する方法を提供し、これらの方法は、動物被験体（例えば、哺乳動物被験体）に、ＣＤ２０に特異的に結合する有効量のｍＡｂまたはその抗原結合性フラグメントを投与する工程を包含し、ここで、約２００、１７５、１５０、１２５、１００、７５、６０、５０、３７．５、２０、１０、５、２．５、１、０．５、０．３７５、０．２５、０．１、０．０７５、０．０５、０．００１、０．０００５ｍｇ／ｍ２またはそれより少ない投薬量により、２５％、３５％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれより多いＢ細胞（循環および／または組織のＢ細胞）の枯渇が、少なくとも約３、５、７、１０、１４、２１、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１５０もしくは１８０日間またはそれより長い期間、もたらされる。代表的な実施形態において、約１２５ｍｇ／ｍ２もしくは７５ｍｇ／ｍ２またはそれより少ない投薬量により、少なくとも約７、１４、２１、３０、６０、７５、９０、１２０、１５０または１８０日間、Ｂ細胞の少なくとも約５０％、７５％、８５％または９０％の枯渇がもたらされる。他の実施形態において、約５０、３７．５または１０ｍｇ／ｍ２の投薬量により、少なくとも約７、１４、２１、３０、６０、７５、９０、１２０または１８０日間、Ｂ細胞の少なくとも約５０％、７５％、８５％または９０％の枯渇がもたらされる。さらに他の実施形態において、約０．３７５または０．１ｍｇ／ｍ２の投薬量により、少なくとも約７、１４、２１、３０、６０、７５または９０日間、Ｂ細胞の少なくとも約５０％、７５％、８５％または９０％の枯渇がもたらされる。さらなる実施形態において、約０．０７５、０．０１、０．００１、または０．０００５ｍｇ／ｍ２の投薬量により、少なくとも約７、１４、２１、３０または６０日間、Ｂ細胞の少なくとも約５０％、７５％、８５％または９０％の枯渇がもたらされる。これらの実施形態によれば、この投薬量は、任意の適切な経路によって投与され得るが（下記のように）、必要に応じて、皮下経路によって投与される。
【０１４２】
この実施形態によれば、この抗体または抗原結合性フラグメントは、本明細書中に記載されるような抗体または抗原結合性フラグメント（機能的に等価な抗体および抗原結合性フラグメントを含む）である。他の特定の実施形態において、この抗体または抗原結合性フラグメントは、従来の抗体と比較してより高い密度でＣＤ２０またはＢ細胞に結合する（上記のように）。
【０１４３】
本発明の抗体、抗原結合性フラグメントおよび薬学的組成物は、他の治療薬またはレジメンと組み合わせて用いられ得る。例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍の場合、このようなレジメンまたは治療としては、化学療法、放射免疫治療（ＲＩＴ）、化学療法および外部ビーム放射（併用様式療法、ＣＭＴ）、または併用様式放射免疫治療（ＣＭＲＩＴ）単独または組み合わせなどが挙げられる。従って、本発明の抗ＣＤ２０抗体および抗体フラグメントは、非ホジキンリンパ腫を処置するために最も一般的な化学療法レジメンである、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド−ヒドロキシドキソルビシン−オンコビン（ビンクリスチン）−プレドニゾロン）と組み合わせられ得る。さらに、本明細書中の抗ＣＤ２０抗体は、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２２（例えば、米国特許第５，４８４，８９２号、米国出願番号１０／３７１，７９７号の米国特許公開番号２００４／０００１８２８号、米国出願番号１０／３７２，４８１号の米国特許公開番号２００３／０２０２９７５号および米国仮出願番号６０／４２０，４７２号に記載のように（これらの各々の全内容は、ＣＤ２２抗原および抗ＣＤ２２抗体のこれらの教示に関して、参考として本明細書中に援用される））、ならびに他の抗ＣＤ２０抗体、例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ（商標）（Ｃ２Ｂ８；リツキシマブ；ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含む、他の抗体と組み合わせて投与され得る。
【０１４４】
従って、いくつかの実施形態において、本発明は、哺乳動物被験体においてＢ細胞を枯渇させる方法を提供し、これらの方法は、この被験体に、本発明のｍＡｂおよび／またはその抗原結合性フラグメントを投与する工程を包含し、そしてさらに１以上のさらなる抗体および／またはそれらの抗原結合性フラグメントを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、このさらなる抗体は、抗ＣＤ２２、抗０ＣＤ−１９抗体または両方の抗体であり得る。このさらなる抗体（単数または複数）および／またはその抗原結合性フラグメント（複数可）は、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントの投与に関連して、任意の順序で投与され得る。例えば、このさらなる抗体（単数または複数）および／または抗原結合性フラグメント（複数可）は、本発明の抗体および／または抗原結合性フラグメントを被験体に投与する前に、投与と同時に、および／または投与の後に、投与され得る。このさらなる抗体（単数または複数）および／または抗原フラグメント（複数可）は、本発明の抗体および／または抗原結合性フラグメントと同じ薬学的組成物中に存在し得、ならびに／あるいは異なる薬学的組成物中に存在し得る。本発明の抗体および／または抗原結合性フラグメントの用量および投与の様式、ならびにこのさらなる抗体（単数または複数）および／または抗原結合性フラグメント（複数可）の用量は、本願において提供されるような、かつ当該分野で周知の投薬量および投与の様式の任意の教示に従って、同じであっても異なっていてもよい。
【０１４５】
１つの特定の実施形態において、この被験体は、本発明の抗体に加えて、単球またはマクロファージの機能を（例えば、少なくとも約２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９％またはそれを超えて）増強する化合物を投与される。このような化合物は当該分野において公知であり、非限定的に、サイトカイン、例えばインターロイキン（例えば、ＩＬ−１２）、およびインターフェロン（例えば、αまたはγインターフェロン）が挙げられる。単球またはマクロファージの機能または増大を増強する化合物は、この抗体または抗原結合性フラグメントと同じ薬学的組成物中に処方され得る。この抗体／フラグメントと化合物が別々に投与される場合、これらは同時に（互いに数時間以内に）投与され得るか、治療の同一コースの間に投与され得るか、または順に（すなわち、患者はまず抗体／フラグメント処置のクールを受け、次にマクロファージ／単球機能を増強する化合物のコースを受ける、あるいは逆も同様）投与され得る。
【０１４６】
本発明のこの実施形態は、本発明の抗体および抗体フラグメントを用いて、または当該分野で公知の他の抗体を用いて実施され得、そして抗ＣＤ２０モノクローナル抗体治療（例えば、Ｃ２Ｂ８のような従来の抗体を用いた治療）に対して耐性のある被験体、化学療法で現在処置中であるかまたは以前に処置されていた被験体、Ｂ細胞疾患を再発している被験体、免疫無防備状態の被験体、あるいはさもなければマクロファージまたは単球機能に欠陥を有する被験体に、特に適している。本発明者らは、単球によって主に媒介される抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）が、Ｂ細胞枯渇において、以前に認識されていた役割よりも重要な役割を果たすことを見出した。抗ＣＤ２０治療に対して耐性があるか、またはＢ細胞疾患の再発を有する患者の有病率は、マクロファージまたは単球の機能の欠陥に、少なくとも部分的に起因し得る。従って、本発明は、ＡＤＣＣおよび／またはマクロファージおよび／または単球の機能を増強する方法を提供し、この方法は、抗ＣＤ２０抗体および抗原結合性フラグメントを投与する方法と併せて用いられる。
【０１４７】
本発明はまた、獣医学目的のために非ヒト哺乳動物および鳥類の処置にも実施され得るが、本発明に記載の被験体はヒト被験体であり得る。本発明の診断法および治療法を実施し得る哺乳動物被験体の非限定的な例としては、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ヤギ、ヒツジ、非ヒト霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ウサギおよびヒトが挙げられる。鳥類としては、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、ガチョウおよびアヒルが挙げられる。
【０１４８】
本発明の抗体組成物は、吸入（例えば、エアロゾルによって）、口内（例えば、舌下）、局所（すなわち、気道表面を含む、皮膚表面および粘膜表面の両方）、鞘内、関節内、胸膜内（ｉｎｔｒａｐｌｕｒａｌ）、（大）脳内、静脈内、動脈内、腹腔内、経口、リンパ内、筋肉内、皮内、皮下、経皮、鼻腔内、直腸または腟投与が挙げられるがこれらに限定されない、任意の投与様式を用いて投与され得、そして蠕動手段によるかまたはデポー剤の形態で送達され得るが、ただし最適な経路は、いかなる所定の場合にも、当該分野で周知のように、被験体の種、年齢、性別および総合的状態のような要因、処置されるべき状態の性質および重症度および／または投与される特定の組成物の性質（すなわち、投薬量、剤形）に依存する。特定の実施形態において、投与の経路は、週に１回または２回、ボーラスまたは長期間にわたる連続注入によってである。他の特定の実施形態において、投与の経路は、必要に応じて週に１回または２回、皮下注射によってである。
【０１４９】
投与に適したレジメンは、処置される被験体および状態によって可変であるが、代表的には、初期投与の後に、次の注射または他の投与が、１以上の間隔を置いて反復投与される。この投与の間の間隔は、ほんの数時間程度であってもよく、または１週間以上もの間であってもよい。あるいは、連続静脈内注入を使用して、有効な血中濃度を維持し得る。
【０１５０】
本明細書中に開示される抗体はまた、インビトロでの手順に用いられ得る。これらの抗体は、ＣＤ２０（Ｂリンパ球成長の特定段階の間、Ｂリンパ球上で発現される）を選択的に結合する。従って、本発明の抗体は、細胞の混合試料（例えば、全血）からＢリンパ球を特異的に枯渇させるのに用いられ得る。次いで、富化したかまたは枯渇させたかのいずれかのＢリンパ球画分が、他の細胞型による干渉または相互作用の危険性なしに、必要に応じて実験的に用いられ得る。インビトロで混合細胞集団からＢリンパ球を単離するために、本明細書中に開示される抗体を利用する方法は、当該分野において周知である。非限定的な例として、ＦＡＣＳ、パニングおよび磁気分離技術を本明細書中に開示される抗体と共に用いて、混合細胞集団からＢリンパ球を分離し得る。
【０１５１】
本明細書中に開示される抗体はまた、Ｂリンパ球の成長上の亜集団を相互に区別するためにも用いられ得る。ＣＤ２０はプロＢリンパ球上には発現されない。プレＢリンパ球において、多少の発現が見出され得る。未成熟のＴ１およびＴ２移行Ｂリンパ球は、より高い量のＣＤ２０を発現する。成熟Ｂリンパ球は、より低レベルのＣＤ２０を発現する。この情報は、上で議論した技術と組み合わせるか、または当業者に公知の他の技術と組み合わせて、Ｂリンパ球の研究集団が経験している成長段階を決定するのに有用である。
【０１５２】
（薬学的組成物）
本発明の抗体または抗体フラグメントを含む薬学的組成物もまた提供される。本発明の薬学的組成物は、本明細書中に記載される１以上の抗体または抗体フラグメントを有効成分としてその中に溶解または分散させて薬学的に受容可能なキャリアと共に含む。
【０１５３】
本明細書中で使用される場合、組成物、キャリア、希釈剤および試薬に関して、用語「薬学的に受容可能」とは、これらの物質が望ましくない生理的影響または毒性を生じることなく動物に投与可能であることを示す。
【０１５４】
薬学的組成物の処方物は、製薬化学の技術分野において周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９７５）、特に第８７章、Ｂｌａｕｇ，Ｓｅｙｍｏｕｒによる）を参照のこと。薬学的組成物としては、
非限定的に、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、無水吸着基剤、水中油または油中水エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（多様な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックスを含む半固体混合物が挙げられる。代表的な投薬形態は、非経口（例えば、静脈内または皮下）経路による投与に適した、滅菌した等張性の水性溶液である。この薬学的処方物中における本発明の抗体または抗体フラグメントの濃度は、例えば、約０．０１重量％、０．１重量％、０．５重量％、１重量％または２重量％未満から、５重量％、１０重量％、２０重量％または５０重量％以上ほどまでも、広く変化し得、そして、選択された投与の特定の様式に従って、主に液量、粘性などによって選択される。
【０１５５】
本発明の薬学的組成物はまた、リポソームによって投与され得る。リポソームとしては、エマルジョン、泡沫、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散系、ラメラ層などが挙げられる。これらの調製物中に、送達されるべき本発明の組成物が、単独で、あるいは所望の標的（例えば、抗体）に結合する分子と組み合わせて、または他の治療的もしくは免疫原性の組成物と組み合わせて、リポソームの一部として組み込まれる。本発明で用いるリポソームは、中性および負に帯電したリン脂質およびステロール（例えば、コレステロール）を一般に含む、標準的なベシクル形成脂質から形成される。脂質の選択は、一般に、例えばリポソームサイズ、血流中のリポソームの酸不安定性および安定性などの検討によって導かれる。例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号に記載されるように、種々の方法が、リポソームの調製に利用可能である。
【０１５６】
有効成分としてその中に溶解または分散させて含む薬学的組成物の調製は、当該分野において十分に理解されている。代表的には、このような組成物は溶液または懸濁液として調製される；しかしながら、溶液または懸濁液に適し、使用の前には液体である、固体形態も調製され得る。この調製物はまた、乳化され得る。
【０１５７】
この有効成分は、薬学的に受容可能であり且つこの有効成分と適合性の賦形剤と、本明細書中に記載の方法における使用に適した量で、混合され得る。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、必要に応じて、この組成物は、この有効成分の有効性を高める微量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などを含み得る。
【０１５８】
この薬学的組成物は、これらの成分の薬学的に受容可能な塩を含み得る。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基により生成される）が挙げられ、これらは、例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸、あるいは酢酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸を用いて生成される。遊離カルボキシル基を用いて生成される塩もまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第２鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から誘導され得る。
【０１５９】
例示的な液体キャリアは、有効成分および水以外の物質を含まないか、あるいは生理的ｐＨ値でリン酸ナトリウムのような緩衝液、食塩水、または両方（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水）を含む、滅菌水溶液である。なおさらに、水性キャリアは、塩化ナトリウムおよび塩化カリウム、デキストロース、ポリエチレングリコールならびに他の溶質のような塩に加えて、２種以上の緩衝塩を含み得る。
【０１６０】
液体組成物もまた、水に加えて、および水を排除して、液相を含み得る。このようなさらなる液相としては、例えば、グリセリン、綿実油のような植物油、および水−油エマルジョンが挙げられる。
【０１６１】
本発明を記載したところで、同発明を以下の実施例においてより詳細に説明する。これらの実施例は、単に説明の目的で本明細書中に含まれるものであり、本発明の限定を意図するものではない。
【実施例】
【０１６２】
（実施例１）
（材料および方法）
ＣＤ２０−／−マウスの作製。Ｃｄ２０遺伝子の３’末端をコードするＤＮＡを、１２９／Ｓｖ系マウスＤＮＡファージライブラリーから単離し、マッピングし、そして配列決定して、イントロン−エクソン境界を確認した（図１Ａおよび図１Ｂ）（Ｔｅｄｄｅｒら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：２５６０）。遺伝子ターゲティングは、ｐＭＣ１−ＨＳＶ遺伝子の下流であるＰｓｔＩ（エクソン５）からＥｃｏＲＶ（エクソン６、約１．８ｋｂ）ＤＮＡフラグメントを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベースのベクター（ｐ５９４）を用いた。約１０ｋｂのＫｐｎＩ  ＤＮＡフラグメントを、ネオマイシン耐性（Ｎｅｏｒ）マーカーの下流に挿入した（図１Ｃ）。このプラスミドを、固有のＳａｌＩ制限酵素認識部位を用いて直線化し、標準方法にしたがいＧ４１８を用いて選択した１２９系由来のＥＳ細胞にトランスフェクトした（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８９３２）。１１５個のうち６個のＮｅｏ耐性ＥＳ細胞コロニーが、標的対立遺伝子を保有していた（図１Ｄ）。同一のプローブを用いてＢａｍＨＩ（１２ｋｂよりも大きいフラグメントを６．５ｋｂバンドに縮小した）、ＫｐｎＩ（７．２ｋｂが５．５ｋｂになった）、およびＳｓｐＩ（５．６ｋｂが７．０ｋｂになった）で消化したＤＮＡのサザン分析によって、適切なターゲティングをさらに確認した。１つのＥＳ細胞クローンの細胞が、７世代以上にわたってＣ５７ＢＬ／６マウスと交配させた、８０〜１００％キメラ雄性子孫を生じた。ヘテロ接合性子孫を交配して、ホモ接合性ＣＤ２０−／−および野生型同腹仔を作製した（図１Ｅ）。ほとんどの場合、ＣＤ２０−／−マウスおよび（Ｃ５７ＢＬ／６×１２９）Ｆ１マウスの野生型同腹仔を用いて得た結果は同一であったので、これらの結果をプールした。３〜１０組の同腹仔ペアを種々の年齢で用いて脾臓および腹腔サブセット分析を行ったので、野生型マウスとＣＤ２０−／−マウスの間の比較のみが有効である。マウスを特定の無菌バリア施設中で飼育し、２〜３ヶ月齢で用いた。
【０１６３】
ノックアウトマウス。ＦｃγＲＩ−／−マウスおよびＦｃγＲＩＩＩ−／−マウスは記載のとおりである（Ｂｒｕｈｎｓら（２００３）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８：５７３〜５８１）。Ｃ５７ＢＬ／６、ＦｃγＲＩＩ−／−（Ｂ６、１２９Ｓ−Ｆｃｇｒ２ｔｍ１Ｒａｖ）、ＦｃγＲＩＩＩ−／−（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｆｃｇｒ３ｔｍ１Ｓｊｖ）、Ｂｅｉｇｅ（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｌｙｓｔｂｇ／ｂｇ）、Ｐｅｒｆｏｒｉｎ−／−  （Ｃ５７ＢＬ／６−Ｐｆｐｔｍ１Ｓｄｚ）、ＣＳＦ１ｏｐ（Ｃｓｆ１ｏｐ）、およびヌード（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｈｆｈ１１ｎｕ）マウスを、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ
Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から入手した。ＦｃＲ共通γ鎖（ＦｃＲγ）欠損マウス（ＦｃＲγ−／−、Ｂ６．１２９Ｐ２−Ｆｃｅｒｇ１ｔｍ１）を、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）から入手した。記載のようなＣ１ｑ−／−マウス（Ｂｏｔｔｏら（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：５６〜５９）は、Ｍａｒｋ  Ｗａｌｐｏｒｔ（Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）の許可で、Ｇａｒｎｅｔｔ  Ｋｅｌｓｏｅ（Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）によって提供され、ＬＡＴ−／−マウスは、Ｗｅｉｇｕｏ  Ｚｈａｎｇ（Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から、記載のように（Ｚｈａｎｇら（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：３２３〜３３２）、そしてＣ３−／−およびＣ４−／−マウスは、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｃａｒｒｏｌｌ（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から、記載のように（Ｗｅｓｓｅｌｓら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１１４９０〜１１４９４）、提供された。マクロファージ欠損マウスを、標準方法（Ｖａｎ  ＲｏｏｉｊｅｎおよびＳａｎｄｅｒｓ（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７４：８３〜９３）を用い、−２日目、１日目および４日目にクロドロネートカプセル化リポソーム（０．１ｍＬ／体重１０グラム；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の尾静脈注射によって作製した。全てのマウスを特定の無菌バリア施設中で飼育し、２〜３ヶ月齢で初めて用いた。
【０１６４】
免疫蛍光分析。単細胞白血球懸濁液を、十分に確立した方法（Ｚｈｏｕら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：３８８４）を用い、各抗体の所定の最適濃度を用いて２０〜６０分間、氷上で染色した。リンパ球の前方および側方光散乱特性を有する細胞を、ＦＡＣＳｃａｎまたはＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析した。９８％以上の細胞を排除するようにゲートを位置決めし、非反応性のコントロールモノクローナル抗体（Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を用いて、バックグラウンド染色を決定した。用いた抗体は以下を含む：ＣＤ１９モノクローナル抗体（ＭＢ１９−１）（Ｔｅｄｄｅｒら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：１３２１；ＴｅｄｄｅｒおよびＳｃｈｌｏｓｓｍａｎ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１０００９；Ｖａｌｅｎｔｉｎｅら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：８０８５）；Ｂ２２０モノクローナル抗体（ＲＡ３−６Ｂ２）（ＤＮＡＸ  Ｃｏｒｐ．、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）；Ｔｈｙ１．２（Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）；ＩｇＭ、Ｉ−Ａ、ＣＤ５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２３およびＣＤ４３と反応性の抗体（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）；ならびに抗マウスＩｇＧ３、ＩｇＭおよびＩｇＤ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）。
【０１６５】
抗体。ＨＢ２０−１〜ＨＢ２０−６モノクローナル抗体を、標準方法（Ｓｔｅｅｂｅｒら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：９５２〜９６３）を用い、ヒトＣＤ２０をコードするｃＤＮＡをトランスフェクトしたマウスプレＢ細胞株で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて生成させた。このＨＢ２０−２５マウス抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体を、先に記載の方法（Ｓｔｅｅｂｅｒら（１９９７）前出）と類似の方法を用い、ヒトＣＤ２０をコードするｃＤＮＡでトランスフェクトしたマウスプレＢ細胞株３００．１９で免疫した、Ｃ５７Ｂｌ／６×１２９遺伝的背景のＣＤ２０−／−マウスにおいて生成させた。全てのＭＢ２０モノクローナル抗体を、上記のように、Ｃ５７Ｂｌ／６×１２９遺伝的背景のＣＤ２０−／−マウスにおいて生成させた。
【０１６６】
ＣＤ２０特異的マウスモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマは、ＮＳ−１骨髄腫細胞を、マウスＣＤ２０−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をトランスフェクトした３００．１９細胞で免疫したＣＤ２０−／−マウス由来の脾臓細胞と融合させることによって生成した（Ｋｅａｒｎｅｙら（１９７９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：１５４８）。これらの抗ＣＤ２０モノクローナル抗体ＭＢ２０−１、−２および−１４は、ＩｇＧ１アイソタイプのものであり；ＭＢ２０−６、−１１、および−１６はＩｇＧ２ａであり；ＭＢ２０−７、−８、−１０および−１８はＩｇＧ２ｂであり；ならびにＭＢ２０−３および−１３はＩｇＧ３モノクローナル抗体であった。ＧＦＰと融合したマウスＣＤ２０を発現している、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞および３００．１９プレＢ細胞株は、これらの融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを用いて各細胞株をトランスフェクトすることによって生成した（Ｔｅｄｄｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４３８８）。トランスフェクト細胞を、ＧＦＰ発現に基づく蛍光ベースの細胞選別によって単離した。
【０１６７】
抗ＣＤ２０モノクローナル抗体１Ｆ５（Ｓｈａｎら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６５８９〜６５９５）、Ｂ９Ｅ９（Ｓｃｈｕｌｔｚら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：６６６３〜６６６９）、および１Ｈ４（Ｈａｉｓｍａら（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２：１８４〜１９０）を、Ｆｉｆｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ａｎｄ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ；１１月３〜７日、１９９３）によって入手した。Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）から入手したＢ１抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（Ｓｔａｓｈｅｎｋｏら（１９８０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５：１６７８）を精製モノクローナル抗体として、または希釈腹水として用いた。
【０１６８】
細胞内Ｃａ２＋測定。ヤギＦ（ａｂ’）２抗ＩｇＭ抗体（５〜４０μｇ／ｍＬ；Ｃａｐｐｅｌ／ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ａｕｒｏｒａ、ＯＨ）、抗マウスＣＤ１９モノクローナル抗体（ＭＢ１９−１；４０μｇ／ｍＬ）、タプシガルジン（１μＭ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、またはイオノマイシン（２．６７μｇ／ｍＬ；ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で細胞を処理した後に、［Ｃａ２＋］ｉレベルの変化を標準方法（Ｓｈａｎら（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９１：１６４４）を用いてフローサイトメトリーによってモニターした。場合によっては、ＥＧＴＡ（最終５ｍＭ）を細胞懸濁液に添加した後に、上記の薬剤を添加した。
【０１６９】
Ｂ細胞活性化アッセイ。脾臓Ｂ細胞を、Ｔｈｙ１．２抗体を被覆した磁気ビーズ（ＤＹＮＡＬ（登録商標）Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ  Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）を用いてＴ細胞を除去することによって精製した（＞９３％Ｂ２２０＋）。シグナル伝達研究のために、Ｂ細胞を、５％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃にて５分間インキュベートした後（２×１０７／ｍＬ）、Ｆ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＭ抗体フラグメントを添加した（４０μｇ／ｍＬ）。４００μＭのＥＤＴＡおよび１００μＭのオルトバナジウム酸Ｎａを含む冷生理食塩水を添加した後、これらの細胞を、十分に確立された方法（Ｂｒａｄｂｕｒｙら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２８４１；Ｆｕｊｉｍｏｔｏら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：７０８８）を用いて界面活性剤で溶解させた。ＣＤ２０構造研究のために、Ｂ細胞をＥＺ−ＬＩＮＫ（商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（０．５ｍｇ／ｍＬ；Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で表面ビオチン化し、次いで、界面活性剤で溶解させた。２μｇのモノクローナル抗体およびＰｒｏｔｅｉｎＧ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）を用いてタンパク質を免疫沈降させるとともに、細胞溶解物を、ＩｇＧ１モノクローナル抗体（１μｇ）およびＰｒｏｔｅｉｎＧ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の５０％懸濁液５０μＬを用いて事前に取り除いた。これらのビーズを高塩濃度および低塩濃度ＲＩＰＡ緩衝液で２回、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、サンプル緩衝液中（１０％の２−メルカプトエタノールを含むかまたは含まない）で煮沸し、電気泳動し、そしてニトロセルロース膜に転写した。全細胞溶解物のブロットを、ＭＢ２０−１モノクローナル抗体、ペルオキシダーゼ結合体化４Ｇ１０抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）を用いて、あるいは抗ホスホ−ＣＤ１９（Ｙ５１３）、−ＰＬＣγ（Ｙ７８３）、−Ｓｙｋ（Ｙ５２５／Ｙ５２６）、−ＢＴＫ（Ｙ２２３）、−Ｓｒｃファミリーキナーゼ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、または抗活性ＭＡＰＫ抗体（ＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いてプローブした。これらの膜を剥ぎ取り、ウサギポリクローナル抗ＳＨＰ−１抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、または抗Ｌｙｎ（ｌｙｎ−４４）、抗Ｆｙｎ（Ｆｙｎ３）および抗ＥＲＫ２（Ｃ−１４）抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）でリプローブした。ビオチン化タンパク質または抗体を、ストレプトアビジン結合体化西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）および化学発光増強キット（ＥＣＬ（商標）；Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＩＬ）を用いて検出した。
【０１７０】
ＣＤ２０リン酸化の研究のために、初代Ｂ細胞（１０７／ｍＬ）をリポ多糖（ＬＰＳ
）（Ｅ．ｃｏｌｉ血清型０１１１：Ｂ４、１０μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とともに４８時間培養した。次いで、初代Ｂ細胞および細胞株を、リン酸塩を含まない培地中で１時間培養し、２００μＣｉ／ｍＬ［３２Ｐ］オルトリン酸塩（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を含む培地中で９０分間培養し、洗浄し、溶解させ、免疫沈降させ、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離すると共に、標準方法（ＫａｎｓａｓおよびＴｅｄｄｅｒ（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：４０９４；Ｌｅｖｅｉｌｌｅら（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：６５）に従ってオートラジオグラフィーを行った。
【０１７１】
機能アッセイ。脾臓Ｂ細胞増殖を、［３Ｈ］チミジン取込み反応の標準方法（Ｅｎｇｅｌら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３：３９）によって測定した。８週齢マウスを、２，４−ジニトロフェノール結合体化キーホールリンペットヘモシニアン（１００μｇ、ＤＮＰ−ＫＬＨ；ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標）−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）で免疫したか、または周知の方法（Ｊａｃｏｂら（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１１６５）に従ってミョウバン中に沈殿させたニワトリγグロブリン（５０μｇ、ＮＰ１８−ＣＧＧ）と結合体化した（４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニルアセチル）で２回免疫した。血清ＤＮＰ−およびＮＰ−特異的抗体レベルを、ＥＬＩＳＡによって測定し（Ｅｎｇｅｌら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３：３９；Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：８８５）、同時に標準方法（Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：８８５）を用いて抗体応答の相対的親和性／結合活性（ａｖｉｄｉｔｙ）を評価した。
【０１７２】
免疫療法。２００μＬのＰＢＳ中の滅菌抗マウスＣＤ２０およびアイソタイプコントロールモノクローナル抗体（０．５〜２５０μｇ）を、側方尾静脈に注射した。別に指示しない限り、全ての実験で２５０μｇのモノクローナル抗体を用いた。処置１時間後および２、４、７、２８、４８、５０、５２、５４、５６または５８日後に、血液および脾臓を回収した。赤血球溶解の後に、白血球数を血球計数器によって定量化し、同時にフローサイトメトリー分析を用いた免疫蛍光染色によってＢ２２０＋Ｂ細胞頻度を決定した。ヒトおよびマウスにおける抗体用量（表７）を、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｔｏｏｌ  Ｄｏｓｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ（ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｄｅｒ／ｃａｎｃｅｒ／ａｎｉｍａｌｆｒａｍｅ．ｈｔｍ）を用いて比較した。
【０１７３】
Ｃアッセイ。ＷＴマウス脾臓Ｂ細胞を、Ｔｈｙ−１．２モノクローナル抗体を被覆した磁気ビーズ（ＤＹＮＡＬ（登録商標）、Ｌａｋｅ  Ｓｕｃｃｅｓｓ、ＮＹ）を用いてＴ細胞を除去することによって精製した（＞９３％  Ｂ２２０＋）。インビトロでのＣ媒介性Ｂ細胞死滅の数量化は、標準方法（Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３〜１７１）に従った。脾臓Ｂ細胞を、各抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（０．５μｇ／ｍＬ）および子ウサギＣ（５０倍希釈；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）と共に３７℃で２時間インキュベートした。３７℃で４時間インキュベーションしながら各チューブにＰＢＳを添加し、その後、これらの細胞を洗浄し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）および抗Ｂ２２０モノクローナル抗体で染色し、同時にヨウ化プロピジウム排除をフローサイトメトリー分析によって決定した。
【０１７４】
重鎖および軽鎖遺伝子利用。細胞質ＲＮＡを、ＲＮＥＡＳＹ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）を用いて、１〜１０×１０５個のハイブリドーマ細胞から抽出した。第一鎖ｃＤＮＡを、オリゴ−ｄＴプライマー（ｄＴ１８）およびＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標）キット（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて、細胞質ＲＮＡから合成した。１μＬのｃＤＮＡ溶液を、ＶＨ遺伝子のＰＣＲ増幅のための鋳型として用いた。１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭのｄＮＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、５０ｐｍｏｌの各プライマー、および５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＩＳＣ  Ｂｉｏｅｘｐｒｅｓｓ、Ｋａｙｓｖｉｌｌｅ、ＵＴ）からなる１００μＬ容量の反応混合物中で、ＰＣＲ反応を行った。増幅を３０サイクル行った（９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で１分間；Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）。ＶＨ遺伝子は、当該分野で周知の乱交雑センス５’ＶＨプライマー（ＭｓＶＨＥ；５’ＧＧＧ  ＡＡＴ  ＴＣＧ  ＡＧＧ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＡＧＧ  ＡＧＴ  ＣＴＧ  Ｇ  ３’；配列番号１１０）（Ｋａｎｔｏｒら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１１７５〜１１８６）、およびＣμコード領域に相補的なアンチセンスプライマー（プライマーＣμ−ｉｎ；５’ＧＡＧ  ＧＧＧ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＡＴＴ  ＴＧＧ  ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ３’；配列番号１１１）、Ｃγ領域に相補的なアンチセンスプライマー（プライマーＣγ１；５’ＧＡＧ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＧＧＣ  ３’；配列番号１１２）またはＣα領域に相補的なアンチセンスプライマー（プライマーＣα；５’ＧＴＧ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＴＡＡ  ３’；配列番号１１３）を用いて増幅した。軽鎖ｃＤＮＡは、センスＶκプライマー（表１）およびＣκアンチセンスプライマー（５’ＡＣＴ  ＧＧＡ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  Ｇ  ３’；配列番号１１４）を用いて増幅した。増幅したＰＣＲ産物を、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ゲル精製キット（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を用いてアガロースゲルから精製し、ＡＭＰＬＩＴＡＱ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼおよび初期ＰＣＲ増幅用と同じプライマーを用いたＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇシステムを用いて増幅した後に、ＡＢＩ  ３７７  ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＤＮＡシーケンサーを用いて、直接的に双方向に配列決定した。全てのＶＨおよび軽鎖領域を、センスおよびアンチセンスＤＮＡ鎖の両方について完全に配列決定した（図１４および図１７）。
【０１７５】
【表１−１】
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【０１７６】
【表１−２】
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抗ヒトおよび抗マウスＣＤ２０モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖領域についてのＣＤＲ配列を、表２および表３にそれぞれ記載する。
【０１７７】
【表２】
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【０１７８】
【表３】
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抗体配列アラインメント。公知のハイブリドーマ生成抗ＣＤ２０モノクローナル抗体に由来する重鎖および軽鎖配列は、以下：１Ｆ５（Ｓｈａｎら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６５８９〜６５９５）、Ｂ９Ｅ９（Ｓｃｈｕｌｔｚら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：６６６３〜６６６９）、２Ｈ７（米国特許第６，１２０，７６７号）、２Ｂ８（米国特許第５，８４３，４３９号）、１Ｈ４（Ｈａｉｓｍａら（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２：１８４〜１９０）、Ｌｅｕ−１６（Ｗｕら（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１４：１０２５〜１０３３）である。
【０１７９】
統計分析。全てのデータを平均値±ＳＥＭとして示す。スチューデントｔ検定を用いて、
母平均値間の有意差を決定した。
【０１８０】
（実施例２）
（ＣＤ２０−／−マウスの作製）
ターゲティングベクターは、ネオマイシン耐性遺伝子を含むＣＤ２０の第２細胞外ループ、第４膜貫通ドメイン、および大きなカルボキシル末端細胞質ドメインの一部をコード化するエクソンを置換した（図１Ａ〜１Ｄ）。Ｃｄ２０遺伝子破壊のためのマウスホモ接合体は、標的ＥＳ細胞を用いて生成した創始マウスのヘテロ接合性子孫の交雑によって、予想されたメンデル頻度で得られた。ホモ接合性子孫に由来するゲノムＤＮＡのサザンブロットおよびＰＣＲ分析により、適切なＣｄ２０遺伝子ターゲティングおよびエクソン６〜８のゲノム欠失をさらに確認した（図１Ｅおよび図ＩＦ）。ＣＤ２０−／−マウスの脾細胞から生成されたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって確認したように、野生型ＣＤ２０ｍＲＮＡは、ＣＤ２０−／−マウスに存在しなかった（図１Ｇ）。融合ＣＤ２０−Ｎｅｏｒ遺伝子転写物は、ＰＣＲによってＣＤ２０−／−マウスにおいて低レベルで検出され、この転写物は、Ｎｅｏｒ遺伝子プロモーター配列によってコードされた８８アミノ酸ペプチドと融合した、１５７番目のアミノ酸で切断された異常なＣＤ２０ペプチドに翻訳された。ＣＤ２０−／−マウスにおける細胞表面ＣＤ２０タンパク質発現の欠如を、ＣＤ２０−ＧＦＰ  ｃＤＮＡを用いてトランスフェクトした３００．１９細胞およびＣＨＯ細胞と反応性であるが、トランスフェクトされなかった細胞とは反応性ではない、１２種類のマウス抗マウスＣＤ２０モノクローナル抗体のパネルを用いて確認した（図１Ｈ）。これらのモノクローナル抗体は、野生型マウス由来のＣＤ１９＋脾細胞によって発現される細胞表面ＣＤ２０エピトープと反応したが、ＣＤ２０−／−マウス由来のものとは反応しなかった（図１Ｉ）。従って、Ｃｄ２０遺伝子を標的とする突然変異により、細胞表面のＣＤ２０発現が排除された。
【０１８１】
（実施例３）
（ＣＤ２０−／−マウスにおけるＢ細胞の成長）
ＣＤ２０−／−マウスは、野生型同腹仔と同様に、９年間の観察の間中よく成長かつ繁殖し、生後１年間明らかな解剖学的または形態学的異常、あるいは感染に対する感受性はいずれも示さなかった。ＣＤ２０−／−マウスは、正常頻度のＩｇＭ−Ｂ２２０ｌｏプロ／プレＢ細胞、ＩｇＭ＋Ｂ２２０ｌｏ未成熟Ｂ細胞およびＩｇＭ＋Ｂ２２０ｈｉ成熟Ｂ細胞（図１Ｊ、表４）、ならびに正常数のＡＡ４．１＋または熱安定抗原（ＨＳＡ）ｈｉＢ２２０ｌｏ未成熟／移行Ｂ細胞を、骨髄に有していた。血液、脾臓およびリンパ節のＩｇＭ＋Ｂ２２０＋Ｂ細胞の数は、ＣＤ２０−／−マウスとそれらの野生型同腹仔との間で有意差はなかった（表４）。
【０１８２】
【表４】
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ａ  値は、３〜１０匹の野生型およびＣＤ２０−／−の２ヶ月齢同腹仔に由来する、示された細胞表面マーカーを発現しているリンパ球の平均（±ＳＥＭ）数または百分率（側方および前方光散乱特性に基づく）を表す。
ｂ  Ｂ細胞数は、各組織から収集した細胞の総数に基づいて算出した。
ｃ  値は、１ｍＬ当たりの細胞数を示す。
ｄ  鼠径部リンパ節の対に相応する値。
＊  試料平均値は野生型同腹仔と有意差があった、ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。
【０１８３】
Ｂ細胞ＩｇＭ発現は、ＣＤ２０−／−マウスにおいて、野生型同腹仔の未成熟および成熟Ｂ細胞と比較して有意に低かった（表４、図１Ｊ）。さらに、ＣＤ２０−／−同腹仔の脾臓におけるＩｇＭｈｉＢ２２０ｌｏＢ細胞の数は、約５０％減少した。ＩｇＭｈｉＢ２２０ｌｏＢ細胞数の減少は、大部分のＢ細胞によるＩｇＭ発現の低下を反映し得るが、脾臓辺縁帯Ｂ細胞における低下には起因しなかった。なぜなら、ＣＤ１ｄｈｉＣＤ２１＋表現型を含む細胞の数は、ＣＤ２０−／−と野生型同腹仔との間で有意差がなかったためである（表４）。同様に、移行Ｔ１（ＣＤ２１ｌｏＨＳＡｈｉ）およびＴ２（ＣＤ２１ｈｉＨＳＡｉｎｔ）Ｂ細胞の数（骨髄からの新規移出を表す）は減少しなかった（表４）。むしろ、Ｔ１細胞の頻度および数は、ＣＤ２０−／−マウスの骨髄で観察される成熟ＩｇＭ＋Ｂ２２０ｈｉＢ細胞の頻度の増大と同様に、通常はＣＤ２０−／−マウスにおいてより高かった。ＩｇＭｈｉＢ２２０ｌｏＢ細胞数の減少は、脾臓Ｂ１細胞の減少に一部起因し得る。なぜなら、ＣＤ２０−／−マウスの腹腔内のＣＤ５＋Ｂ２２０ｌｏＢ１ａ細胞数が６４％減少したためである。ＣＤ２０−／−および野生型同腹仔の腹膜におけるＩｇＭ＋Ｂ２２０＋Ｂ細胞の総数は、ＣＤ５−Ｂ２２０ｈｉＢ細胞数の増加に起因して類似していた（表４、図１Ｊ）。Ｂ１ｂ  Ｂ細胞（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ５−Ｂ２２０ｌｏ）の数は、ＣＤ２０−／−および野生型同腹仔において類似していた（表４）。野生型同腹仔由来のＢ細胞と比較した場合、骨髄、血液、リンパ節または脾臓から単離したＣＤ２０−／−Ｂ細胞のサイズ（光散乱特性）に明らかな差異はなかった。脾臓組織切片の免疫組織化学分析により、Ｂ２２０＋Ｂ細胞の別の正常な構築および組織化が明らかになった。従って、ＩｇＭ発現の低下、脾臓におけるＩｇＭｈｉＢ２２０ｌｏＢ細胞サブセットの減少、および腹腔内のＢ１細胞数の低下は例外として、ＣＤ２０発現は、Ｂ細胞の成長および組織局在化に必須ではなかった。
【０１８４】
（実施例４）
（ＣＤ２０−／−Ｂ細胞機能）
表面ＩｇＭ連結に対する精製ＣＤ２０−／−Ｂ細胞の増殖応答は、抗体濃度の範囲（１〜４０μｇ／ｍＬ）にわたって野生型Ｂ細胞に匹敵した（図１Ｋ）。Ｂ細胞が、濃度範囲（０．１〜１０μｇ／ｍＬ）にわたるＬＰＳ（図１Ｋ）によって、または最適以下（５μｇ／ｍＬ）の濃度で抗ＩｇＭ抗体を加えたＩＬ−４（１０〜１００Ｕ／ｍＬ）を用いて活性化された場合、増殖も正常であった。従って、ＣＤ２０の減少により、マイトジェン誘導性増殖に対する検出可能な影響はなかった。正常レベルの全てのＩｇアイソタイプが、ＣＤ２０−／−マウス由来の血清中に見出された（図１Ｌ）。ＣＤ２０−／−マウスはまた、Ｔ細胞依存性抗原であるＤＮＰ−ＫＬＨで免疫した後に野生型同腹仔において観察されるのと類似した、全てのアイソタイプの一次および二次抗体応答を生じた（図１Ｍ）。さらに、ＣＤ２０−／−マウスおよびその野生型同腹仔は、ＮＰ−ＣＧＧで免疫した後、同等の一次および二次ＩｇＭならびにＩｇＧ１抗ＮＰ抗体応答を生じた（各群当たり５匹のマウス）。さらに、ＣＤ２０−／−マウスにおいて生じた一次および二次ＩｇＧ１抗ＮＰ抗体応答の親和性は、その野生型同腹仔において生じたものと類似していた。従って、ＣＤ２０機能は、体液性免疫応答の生成中のＴ−Ｂ細胞相互作用、アイソタイプスイッチングまたは親和性成熟に必要ではなかった。
【０１８５】
（実施例５）
（Ｂ細胞成長中のＣＤ２０発現）
マウス抗マウスＣＤ２０モノクローナル抗体のパネルを用いたところ、２つのマウスプレＢ細胞株（３００．１９および３８Ｂ９）および２つのＴ細胞株（ＢＷ５１４７およびＢＬ４）はＣＤ２０細胞表面タンパク質を発現できず、一方、７０ＺプレＢ株、Ａ２０およびＡＪ９成熟Ｂ細胞株ならびにＮＳ−１プラズマ細胞腫株はＣＤ２０＋であった（図１Ｈおよび図２Ａ）。同様に、ＣＤ２０は骨髄においてＢ２２０＋細胞のサブセットによってのみ発現され（図２Ｂ）；３０±３％のＢ２２０ｌｏリンパ球はＣＤ２０＋であったが、一方、全てのＢ２２０ｈｉＢ細胞はＣＤ２０＋であった（ｎ＝６匹のマウス）。骨髄におけるＣＤ１９＋Ｂ細胞の類似の画分は、ＣＤ２０＋であった（５１±２％、ｎ＝６）。これと一致して、ＣＤ４３＋Ｂ２２０＋プロＢ細胞はＣＤ２０を発現しなかったが、一方、１０±１％（ｎ＝３）のＣＤ４３−ＩｇＭ−Ｂ２２０ｌｏプレＢ細胞はＣＤ２０を低密度で発現した（図２Ｇ）。全てのＣＤ２０＋プレＢ細胞（ＣＤ４３−ＩｇＭ−Ｂ２２０ｌｏ）は、それらの光散乱特性に基づいて小さかったが、これは、ＣＤ２０発現が主に重鎖発現時または重鎖発現時前後に開始したことを示している。これと一致して、未成熟ＩｇＭ＋Ｂ２２０ｌｏＢ細胞の大多数はＣＤ２０を発現した（７６±９％、ｎ＝３；画分Ｉ、図２Ｇ）。骨髄において、未成熟ＩｇＭｈｉＢ２２０＋の亜集団（画分ＩＩ、図２Ｇ）またはＣＤ１９ｌｏＢ細胞は、成熟Ｂ２２０ｈｉ（画分ＩＩＩ、図２Ｇ）またはＣＤ１９ｈｉＢ細胞（図２Ｂ）よりも２７７±５３％（ｎ＝３）高い密度でＣＤ２０を発現した。従って、ＣＤ２０は、小型プレＢ細胞から未成熟Ｂ細胞への移行中に初めて発現し、成熟とともにＣＤ２０発現が増大し、次いで成熟Ｂ２２０ｈｉプール中への循環Ｂ細胞の流入とともに減少する。
【０１８６】
脾臓、血液、末梢リンパ節および腹腔において、圧倒的多数のＩｇＭ＋またはＢ２２０＋Ｂ細胞がＣＤ２０を発現した（図２Ｃ〜２Ｆ）。ＣＤ２０ｈｉＢ２２０ｌｏ細胞の小亜集団は、血液（９±１％、ｎ＝３）および脾臓（７±２％、ｎ＝３）のＢ細胞の間で観察された（図２Ｃおよび図２Ｅ）。脾臓におけるこれらのＣＤ２０ｈｉＢ２２０ｌｏ細胞は、主に移行Ｔ１およびＴ２のＢ細胞（図２Ｈ）であり、骨髄からの新規移出を示している可能性が高い。Ｔ１細胞（ＣＤ２１ｌｏＨＳＡｈｉ）は、成熟Ｂ細胞よりも１３９±２３％（ｎ＝３）高い密度でＣＤ２０を発現し、一方、Ｔ２細胞（ＣＤ２１ｈｉＨＳＡｈｉ）は、５８±１１％（ｎ＝３）高い密度でＣＤ２０を発現した。Ｔ１細胞（ＣＤ２１−ＣＤ２３−ＩｇＭｈｉ）および辺縁帯Ｂ細胞（ＣＤ２１＋ＣＤ２３−ＩｇＭｈｉ）（Ｌｏｄｅｒら（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：７５）はまた、大多数の脾臓Ｂ細胞よりも高いレベルでＣＤ２０を発現した（図２１）。少数のＣＤ２０−末梢Ｂ細胞が一部のマウスにおいて観察されたが、この数は代表的にはＢ２２０＋細胞の２％未満であった。腹腔において、ＣＤ２０は、ＣＤ５＋およびＣＤ５−Ｂ細胞の両方によって同様に発現された（図２Ｆ）。ＣＤ２０は、試験したいずれの組織においても、白血球の他の亜集団によって検出可能なレベルで発現されなかった。従って、マウスＣＤ２０は、もっぱらＢ細胞によって発現され、発現は小型プレＢ細胞成熟中に遅れて開始した。
【０１８７】
（実施例６）
（ＣＤ２０の構造特性）
マウスおよびヒトのＣＤ２０を、マウスＣＤ２０と反応性のＭＢ２０−１モノクローナル抗体およびヒトＣＤ２０の細胞質エピトープと反応性のＰＢ４モノクローナル抗体を用いて、表面標識したＢ細胞株からこれらの分子を沈殿させることによって比較した。マウスＣＤ２０は、非還元条件下でヒトＣＤ２０よりも速く移動したが、また、３３，０００および３５，０００のＭｒを有する少なくとも２つの異なる分子種としても移動した（図３Ａ）。還元条件下では、マウスＣＤ２０は４０，０００および４２，０００のＭｒを有する少なくとも２つの同等に表示される分子種として移動した（図３Ａ）。複数の細胞表面分子が、ヒトＣＤ２０で起きるように、マウスＣＤ２０と共沈した（Ｔｅｄｄｅｒら（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：１３２１；Ｄｅａｎｓら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：４４９４）。ＰＢ４モノクローナル抗体は、ＣＤ２０細胞外ドメインと反応するモノクローナル抗体よりも良好に、ヒトＣＤ２０と関連する分子を共沈させる。マウスにおけるＣＤ２０関連分子の共沈は、モノクローナル抗体の交差反応性に起因しなかった。なぜなら、ウエスタンブロット分析において、ＭＢ２０−１モノクローナル抗体はマウスＣＤ２０とのみ反応し、ＣＤ２０または他のタンパク質はＣＤ２０−／−Ｂ細胞の溶解物から沈殿しなかったためである（図３Ｂ）。予想外に、マウスＣＤ２０は、ホルボールミリスチルアセテート（ＰＭＡ）処理後であっても、休止初代マウスＢ細胞、抗ＩｇＭ抗体活性化Ｂ細胞もしくはＬＰＳ活性化Ｂ細胞、またはＢ細胞株において、ヒトＢ細胞（ＴｅｄｄｅｒおよびＳｃｈｌｏｓｓｍａｎ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１０００９；Ｇｅｎｏｔら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：７１）とは異なり、主要なリンタンパク質ではなかった（図３Ｃ）。さらに、ＬＰＳ芽細胞またはＢ細胞株におけるＰＭＡ誘導性のＣＤ２０リン酸化によって、ヒトＣＤ２０を特徴づける、ＣＤ２０タンパク質Ｍｒの速い種から遅い種への有意なシフトを生じなかった（ＴｅｄｄｅｒおよびＳｃｈｌｏｓｓｍａｎ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１０００９；Ｖａｌｅｎｔｉｎｅら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：８０８５）。従って、マウスおよびヒトＣＤ２０は、多数の構造特性を共有するとともに、いくつかの異なる特性を有する。
【０１８８】
（実施例７）
（ＣＤ２０−／−Ｂ細胞における還元［Ｃａ２＋］ｉ応答）
ＣＤ２０−／−マウスにおける正常なＢ細胞成長にもかかわらず、ＣＤ２０−／−マウス由来の脾臓Ｂ２２０＋Ｂ細胞は、野生型Ｂ細胞と比較した場合、最適な濃度（４０μｇ／ｍＬ；図４Ａ）および最適以下の濃度（５μｇ／ｍＬ）の抗ＩｇＭ抗体とＩｇＭの連結後に、［Ｃａ２＋］ｉ応答の低下を生じた。この迅速な［Ｃａ２＋］ｉ応答の速度論は、ＣＤ２０−／−Ｂ細胞において変化しなかった。しかしながら、最大［Ｃａ２＋］ｉ増加の大きさは、ＣＤ２０−／−Ｂ細胞において３４±４％低く（ｐ＜０．００１、ｎ＝９）、より遅い時点で観察された持続的増加のレベルも、同様に低下した。ＥＧＴＡを用いた細胞外Ｃａ２＋のキレート化により、ＣＤ２０−／−および野生型Ｂ細胞でのＩｇＭ架橋後に観察された［Ｃａ２＋］ｉ増加の速度論および大きさが低下した。ＥＧＴＡ存在下での最大の［Ｃａ２＋］ｉ応答の大きさは、野生型Ｂ細胞と比較して、ＣＤ２０−／−Ｂ細胞において３８±７％低かった（ｐ＜０．００２、ｎ＝７）。
【０１８９】
ＣＤ１９誘導性の［Ｃａ２＋］ｉ応答は、野生型Ｂ細胞と比較して、ＣＤ２０−／−Ｂ細胞について有意に低かった（７０±４％、ｐ＜０．００１、ｎ＝５）（図４Ｂ）。より低い［Ｃａ２＋］ｉ応答は、ＣＤ２０−／−Ｂ細胞によるＣＤ１９発現の低下に起因しなかった（図４Ｄ）。ＥＧＴＡを用いた細胞外Ｃａ２＋のキレート化により、野生型およびＣＤ２０−／−Ｂ細胞の両方におけるＣＤ１９誘導性の［Ｃａ２＋］ｉ応答が大部分排除された。ＣＤ２０−／−Ｂ細胞によるＩｇＭ連結またはＣＤ１９連結後の［Ｃａ２＋］ｉ応答の低下は、おそらく内部Ｃａ２＋貯蔵または細胞外Ｃａ２＋濃度の相違に起因するものではなかった。なぜなら、タプシガルジン誘導性およびイオノマイシン誘導性の［Ｃａ２＋］ｉ応答は、野生型Ｂ細胞におけるよりもＣＤ２０−／−Ｂ細胞において、平均してわずかに高かったためである（図４Ｃ）。このＣＤ２０−／−Ｂ細胞における［Ｃａ２＋］ｉ応答の低下はまた、遺伝的バックグラウンドの相違に起因する可能性も低かった。ＣＤ２０−／−マウスおよびそれらの野生型同腹仔を１２９系ＥＳ細胞から作製したが、少なくとも７世代の間Ｃ５７ＢＬ／６マウスと戻し交配させた。コントロール実験において、ＩｇＭ誘導性およびＣＤ１９誘導性［Ｃａ２＋］ｉ応答は、もしＣ５７ＢＬ／６、（Ｃ５７ＢＬ／６×１２９）Ｆ１および１２９Ｂ細胞（ｎ＝４）について同一でなければ、類似していた。従って、ＣＤ２０−／−マウスにおける［Ｃａ２＋］ｉ応答の低下は、バックグラウンドの相違よりもむしろ、ＣＤ２０機能の欠如に起因する可能性が高かった。ＣＤ１９架橋後に観察される［Ｃａ２＋］ｉ応答は主に膜貫通Ｃａ２＋フラックスに依存し、かつ、ＣＤ１９誘導性［Ｃａ２＋］ｉ応答はＣＤ２０−／−マウスにおいて有意に撹乱されたので、ＣＤ２０機能は膜貫通Ｃａ２＋輸送にとって特に重要であり得る。
【０１９０】
（実施例８）
（ＣＤ２０−／−Ｂ細胞におけるシグナル伝達）
Ｂ細胞膜貫通シグナル伝達におけるＣＤ２０減少の影響を、ＩｇＭ連結後の精製Ｂ細胞における総細胞タンパク質チロシンリン酸化を評価することによって調べた。チロシンリン酸化の総合レベルは、個々の実験における個々のマウス由来のＢ細胞間でいくつかのバリエーションが観察されたものの、ＣＤ２０−／−および野生型同腹仔由来の休止脾臓Ｂ細胞において類似していた（図５Ａ）。ＩｇＭ連結後のタンパク質チロシンリン酸化もまた、ＣＤ２０−／−および野生型同腹仔由来のＢ細胞において類似していた。Ｌｙｎおよび他のＳｒｃキナーゼ、ＰＬＣγ、ＣＤ１９、ＢＴＫ、およびＭＡＰキナーゼを含む、ＩｇＭの下流の個々のシグナル分子のリン酸化もまた、ＣＤ２０−／−および野生型同腹仔由来のＢ細胞において類似していた（図５Ｂ）。従って、ＣＤ２０欠損により、基底のまたはＩｇＭ誘導性の膜貫通シグナル伝達が有意に変更された可能性は低かった。
【０１９１】
（実施例９）
（インビボにおける抗ＣＤ２０モノクローナル抗体によるＢ細胞の枯渇）
各ＩｇＧアイソタイプを代表する、１２種類のマウス抗マウスＣＤ２０モノクローナル抗体を、インビボでＢ細胞に結合し、そしてこれらを枯渇させる能力について、評価した。各モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体アイソタイプとは無関係な特有の平均蛍光強度で、ＣＤ１９＋初代Ｂ細胞とインビトロで一律に反応した（図６Ａ）。初代Ｂ細胞とのモノクローナル抗体の反応性を、モノクローナル抗体濃度の範囲にわたって評価したところ、ほとんどのモノクローナル抗体が、１〜１０μｇ／ｍＬの濃度で用いた場合に染色の飽和レベルに達した（図６Ｂ）。平均して、約０．５μｇ／ｍＬのモノクローナル抗体濃度で、５０％‐最大対数のモノクローナル抗体染色が達成された（矢印、図６Ｂ）。全てのモノクローナル抗体を０．５μｇ／ｍＬで用いた場合、各モノクローナル抗体は、特有の低い平均蛍光強度から高い平均蛍光強度でＣＤ１９＋初代Ｂ細胞と一律に反応した（図６Ｃ、表５）。同様の結果が、マウスＣＤ２０  ｃＤＮＡをトランスフェクトしたプレＢ細胞株を、抗マウスＩｇ二次抗体と共に用いて得られた。この分析に基づいて、ＭＢ２０−１モノクローナル抗体は、最低の相対的親和性／結合活性（ａｖｉｄｉｔｙ）を有するモノクローナル抗体に相当し、一方、ＭＢ２０−１８モノクローナル抗体は、１２種類全ての抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の最高レベルでＢ細胞および染色Ｂ細胞と強く反応した（表５）。従って、各モノクローナル抗体は、Ｂ細胞と特異的に反応し、そしてフローサイトメトリーで評価されるように妥当な結合特性を示した。
【０１９２】
【表５】
0005969577.tif 000007
各抗マウスＣＤ２０モノクローナル抗体を、ヒトにおける抗ＣＤ２０治療のために最初に４回投与される３７５ｍｇ／ｍ２用量（Ｐｒｅｓｓら（２００１）Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ：２２１〜２４０；Ｋａｍｉｎｓｋｉら（１９９３）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２９：４５９〜４６５；Ｗｅｉｎｅｒ（１９９９）Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：４３〜５１；Ｏｎｒｕｓｔら（１９９９）Ｄｒｕｇｓ  ５８：７９〜８８；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９９８）Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １２：１７６３〜１７６９）よりも約１０倍低い用量に相当する単回用量である２５０μｇ／マウスで、マウスに投与した（表７）。これらの条件下で、複数のモノクローナル抗体は、末梢Ｂ細胞数に対して強力なかつ持続性の効果を有したが、一方、他のモノクローナル抗体は、異質のインビボ効果を有した（図７）。モノクローナル抗体誘導性のＢ細胞枯渇（２日目までには循環から、そして７日目までには脾臓から）の有効性は、モノクローナル抗体アイソタイプと密接に相関し（表５、図７Ａおよび図７Ｂ）、ＩｇＧ２ａ＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ２ｂ＞ＩｇＧ３であった。ＭＢ２０−１１および他のＩｇＧ２ａモノクローナル抗体（ＭＢ２０−６および−１６）は、９５％を超える血液Ｂ細胞および約９３％の脾臓Ｂ細胞を枯渇させた。わずかな残りの末梢Ｂ細胞は、骨髄から出現する未成熟細胞を主に表現型的に示した。このＭＢ２０−１１モノクローナル抗体は、わずか０．５μｇ／マウスを単回用量として投与した場合、有意な数の循環Ｂ細胞を枯渇させたが、一方、７日目までに脾臓Ｂ細胞を有意に枯渇させるには、５倍高いｍＡｂ用量の２．５μｇ／マウスを必要とした（図７Ｃ）。ＭＢ２０−１１モノクローナル抗体の単回投与により、モノクローナル抗体処置の１時間以内に循環Ｂ細胞が枯渇し、Ｂ細胞が循環および脾臓で再増殖を開始する前の約５７日間、耐久的効果を有したという研究結果も同じく印象的であった（図７Ｄ）。対照的に、いずれのモノクローナル抗体も、ＣＤ２０−／−マウスに投与した場合は有意な効果を有さず、そしてアイソタイプコントロールモノクローナル抗体を同一条件下で投与しても、Ｂ細胞数に影響を及ぼさなかった（図７）。同様に、循環および組織のＴｈｙ１．２＋Ｔ細胞数は、Ｂ細胞に限定的なＣＤ２０発現と一致して、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体処置マウスにおいて不変であった（図７Ａ）。
【０１９３】
（実施例１０）
（Ｂ細胞枯渇におけるＦｃｖＲの役割）
抗ＣＤ２０モノクローナル抗体処置によるＢ細胞枯渇における先天性免疫系の役割を、ＦｃγＲ欠損マウスを用いて評価した（Ｔａｋａｉら（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７６：５１９〜５２９）。マウスエフェクター細胞は、ＩｇＧについて３つの異なるＦｃγＲクラスである、高親和性ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、および低親和性ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）分子を発現する（ＲａｖｅｔｃｈおよびＣｌｙｎｅｓ（１９９８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：４２１〜４３２）。ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩは、それぞれのリガンド結合性γ鎖が共通のγ鎖（ＦｃＲγ）と結合する、ヘテロオリゴマー複合体である。ＦｃＲγ鎖発現は、マクロファージによる食作用およびＮＫ細胞による細胞毒性を含む、エフェクター機能のＦｃγＲアセンブリおよびＦｃγＲトリガに必要である（Ｔａｋａｉら（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７６：５１９〜５２９）。高親和性ＦｃγＲＩは、優先的に単量体ＩｇＧ２ａ＞ＩｇＧ２ｂ＞ＩｇＧ３／ＩｇＧ１に結合し、一方、２つの低親和性レセプターは、重合体ＩｇＧの種々のアイソタイプに結合する（Ｆｏｓｓａｔｉ−Ｊｉｍａｃｋら（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：１２９３〜１３０２）。ＦｃγＲＩＩＩは、ＩｇＧ２ａ＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ２ｂ＞＞ＩｇＧ３に結合する（Ｆｏｓｓａｔｉ−Ｊｉｍａｃｋら（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：１２９３〜１３０２）。
【０１９４】
野生型マウスにおけるほぼ完全なＢ細胞枯渇（図７）とは対照的に、ＭＢ２０−１１モノクローナル抗体処置により、ＦｃＲγ−／−マウスにおいて循環Ｂ細胞数が４日間にわたってわずかに２０〜３５％だけ減少し（図８Ａ）、７〜１８日目は影響がなかった。さらに、ＭＢ２０−１１モノクローナル抗体処置により、ＦｃＲγ−／−マウスにおける脾臓Ｂ細胞数は、未成熟Ｂ細胞数の増加に主に起因して、コントロールモノクローナル抗体処置同腹仔と比較して事実上増加した（図８Ｂおよび図８Ｃ）。アイソタイプが適合したコントロールモノクローナル抗体は、ＦｃＲγ−／−マウスにおいて有意な効果がなかった。ＦｃγＲＩ−／−マウスにおいて、ＭＢ２０−１１モノクローナル抗体は、１時間でＢ細胞数の初期減少を誘導したが、２日目に循環Ｂ細胞の不完全な枯渇を誘導した。ＭＢ２０−１１モノクローナル抗体処置により、コントロールモノクローナル抗体処置同腹仔と比較してＦｃγＲ−／−マウスにおいて、７日目に２１％の脾臓Ｂ細胞を残してＢ細胞を一部分のみ枯渇させた。対照的に、ＭＢ２０−１１モノクローナル抗体は、野生型マウス、ＦｃγＲＩＩ−／−マウスおよびＦｃγＲＩＩＩ−／−マウスにおいて７日目までに、循環および組織Ｂ細胞を９５％以上枯渇させた。本明細書中で観察された結果と同じ結果が、２つの独立したＦｃγＲＩＩＩ−／−マウス系を用いて観察された（Ｂｒｕｈｎｓら（２００３）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８：５７３〜５８１；Ｈａｚｅｎｂｏｓら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５：１８１〜１８８）。ＩｇＧ１  ＭＢ２０−１およびＩｇＧ２ｂ  ＭＢ２０−１８モノクローナル抗体によるＢ細胞枯渇は、ＦｃＲγ鎖の欠損によっても同様に影響を受けた。循環Ｂ細胞はＦｃＲγ−／−マウスのＭＢ２０−１モノクローナル抗体処置によって有意には減少しなかったが、一方、循環Ｂ細胞は野生型マウスにおいて枯渇した（図８Ｄ）。同様に、脾臓Ｂ細胞はＦｃＲγ−／−マウスのＭＢ２０−１モノクローナル抗体処置によって有意には減少しなかったが、一方、脾臓Ｂ細胞数は野生型マウスにおいて９３％減少した。循環Ｂ細胞は、ＦｃＲγ−／−マウスのＭＢ２０−１８モノクローナル抗体処置によって有意に減少したが、野生型マウスで起こったのと同程度には減少しなかった（図８Ｅ）。しかしながら、脾臓Ｂ細胞はＦｃＲγ−／−マウスのＭＢ２０−１８モノクローナル抗体処置によって有意には減少しなかったが、一方、脾臓Ｂ細胞数は野生型マウスにおいて７４％減少した。従って、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体治療は、主としてＦｃＲγ鎖発現を必要とする経路を介してＢ細胞を枯渇させた。
【０１９５】
（実施例１１）
（Ｂ細胞枯渇におけるＣの役割）
Ｃ活性化は、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体治療の間のＢ細胞枯渇の主要なメカニズムであると考えられているので、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体処置によるＢ細胞枯渇におけるＣの役割を、Ｃ欠損マウス（Ｗｅｓｓｅｌｓら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１１４９０〜１１４９４）およびＣ１ｑ欠損マウス（Ｚｈａｎｇら（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：３２３〜３３２）を用いて評価した。各抗ＣＤ２０モノクローナル抗体のＣ活性化能力を、まずインビトロで評価した。細胞傷害性能力は抗体間で異なったにもかかわらず、Ｃの存在下において、ほとんどの抗ＣＤ２０モノクローナル抗体が、ヨウ化プロピジウム取り込みをアイソタイプが適合したコントロールモノクローナル抗体と比較することによって示されるように、有意なＢ細胞溶解を誘導した（図９Ａ）。Ｃがなければ、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体のいずれも、これらのインビトロアッセイの間、Ｂ細胞のＰＩ取り込みまたはアポトーシスを誘導しなかった。ＭＢ２０−１１モノクローナル抗体もまたインビトロにおける有意なＣ媒介性Ｂ細胞溶解の誘導に有効であったが、ＭＢ２０−１８モノクローナル抗体は、最も強力なＣ依存性のＢ細胞溶解を惹起した。しかしながら、インビトロでＣ依存性Ｂ細胞死滅を誘導する各モノクローナル抗体の能力は、インビボでＢ細胞を枯渇させる各モノクローナル抗体の能力と相関していなかった（図７Ｂ）。さらに、ＭＢ２０−１１モノクローナル抗体は、Ｃ３−／−およびＣ４−／−マウスにおいて、全ての血液Ｂ細胞および９０％を超える脾臓Ｂ細胞を効率的に取り除いた（図９Ｂ）。この観察は、モノクローナル抗体アイソタイプ特異的ではなかった。なぜなら、ＭＢ２０−１およびＭＢ２０−１８モノクローナル抗体は、Ｃ３−／−および野生型マウスの両方において同程度に血液および脾臓Ｂ細胞を効率的に枯渇させたためである（図９Ｃおよび図９Ｄ）。従って、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体治療は、主としてＦｃγＲ依存性ならびにＣ３−、Ｃ４−およびＣ１ｑ−非依存性のメカニズムを介して、Ｂ細胞を枯渇させる。
【０１９６】
（実施例１２）
（単球はインビボにおいてＢ細胞枯渇を媒介する）
抗ＣＤ２０モノクローナル抗体処置の枯渇能力は、モノクローナル抗体アイソタイプおよびＦｃγＲ発現と直接相関していたので、ＦｃγＲ媒介性のＢ細胞枯渇に対するＮＫ細胞、Ｔ細胞、およびマクロファージの寄与を決定した。リポソームカプセル化クロドロネートで処置することによってマクロファージを欠乏させたマウスは、ＭＢ２０−１１モノクローナル抗体処置の１時間後までに循環Ｂ細胞を有意には枯渇せず、７日間まで正常数の循環Ｂ細胞を有した（図１０Ａ）。同様に、クロドロネート処置マウスにおける脾臓Ｂ細胞数は、コントロールモノクローナル抗体処置同腹仔と比較して、７日目に３９％だけ減少した（図１０Ｂ）。ＣＳＦ−１欠損（ＣＳＦ−１ｏｐ）に起因してマクロファージ亜集団が組織特異的に減少するマウス（Ｃｅｃｃｈｉｎｉら（１９９４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２０：１３５７〜１３７２）もまた、ＭＢ２０−１１モノクローナル抗体処置後の循環Ｂ細胞の除去が緩徐であり、７日目までに表現型的に成熟した脾臓Ｂ細胞の８４％を枯渇したにすぎなかった（図１０）。対照的に、機能的Ｔ細胞を欠く胸腺欠損ヌードおよびＬＡＴ−／−マウス（Ｚｈａｎｇら（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：３２３〜３３２）は、９６％を超える血液および脾臓Ｂ細胞を枯渇させた。同様に、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体処置により、ＮＫ細胞機能に欠陥のあるベージュマウスおよびパーフォリン−／−マウス（Ｋａｇｉら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：３１〜３７）において、約９５％の循環および脾臓Ｂ細胞が除去された（図１０）。これらの研究結果により、ＣＳＦ−１依存性および非依存性マクロファージサブセットの両方が、インビボにおけるＣＤ２０＋Ｂ細胞の枯渇のための主要なエフェクター細胞であり、Ｔ細胞依存性、ＮＫ細胞依存性、およびパーフォリン依存性メカニズムを本質的に排除することを示す。
【０１９７】
（実施例１３）
（モノクローナル抗体配列決定分析）
ＣＤ２０は、分子の比較的小さな部分のみが細胞表面上に発現するという点で、大多数のＢリンパ球細胞表面分子の中でも固有であり、約４２アミノ酸であると推定される。従って、ほとんどの抗ＣＤ２０モノクローナル抗体は、主に、空間的制約によって他の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の結合をブロックする。ほとんどの抗ＣＤ２０モノクローナル抗体がＣＤ２０タンパク質上の同一ではないにしても類似した領域またはエピトープに結合するという印象を残しているが、それはまだ示されていない。さらに、タンパク質抗原と、これらの抗原上の特定のエピトープに結合するモノクローナル抗体の間の相互作用は複雑であり、かつ、各モノクローナル抗体およびその特定のアミノ酸配列にほぼ固有である。抗原および抗体の相互作用におけるこの複雑性のレベルは、ほとんどの外来抗原に対する多様な抗体レパートリーの生成に寄与する。しかしながら、抗ＣＤ２０抗体多様性の限界は、マウスがＣＤ２０を自己抗原としても発現するという事実によって課される。従って、正常な状況下では、マウスは、ヒトＣＤ２０上に存在しておりマウスＣＤ２０とも共通である抗原決定基と反応性の抗体を生成しない。なぜなら、これらのモノクローナル抗体は自己反応性であるためである。従って、正常なマウスで生成された抗ＣＤ２０モノクローナル抗体は、ヒトＣＤ２０上に存在し、かつヒトＣＤ２０に固有の、限定されたエピトープに結合する可能性がある。
【０１９８】
ほとんどのタンパク質抗原に対して生成され得る抗体の多様なレパートリーとは対照的に、マウスの近交系は、著しく均質な抗体を生成することによって、ハプテンまたは構造的に単純な抗原に反応する場合が多い（ＢｌｉｅｒおよびＢｏｔｈｗｅｌｌ（１９８８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１０５：２７〜４３）。制限された体液性応答の最たる例の１つは、（４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル）アセチル（ＮＰ）ハプテンに対するＣ５７ＢＬ／６（Ｉｇｈｂ）マウスの応答である（ＩｍａｎｉｓｈｉおよびＭａｋｅｌａ（１９７５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４１：８４０〜８５４）。タンパク質キャリアと連結したＮＰで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスは、異常なλ１軽鎖を担持する血清抗体を生成し、一方、キャリアタンパク質単独での免疫は、λ１抗体もλ１＋Ｂ細胞も事実上誘発しない（ＩｍａｎｉｓｈｉおよびＭａｋｅｌａ（１９７５）前出；  ＭａｋｅｌａおよびＫａｒｊａｌａｉｎｅｎ（１９７７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．３４：１１９〜１３８；Ｒｅｔｈら（１９７８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：３９３〜４００；Ｒｅｔｈら（１９７９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１００４〜１０１３；Ｋａｒｊａｌａｉｎｅｎら（１９８０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５：３１３〜３１７；ＷｅｉｓｓおよびＲａｊｅｗｓｋｙ（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１６８１〜１６８９；Ｊａｃｏｂら（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１１６５〜１１７５；ＣｕｍａｎｏおよびＲａｊｅｗｓｋｙ（１９８６）ＥＭＢＯ  Ｊ．５：２４５９〜２４６６）。抗ＮＰ応答の初期（免疫後４〜８日間）に、大部分の抗原活性化λ１＋Ｂ細胞が、Ｖ１８６．２（Ｖ１Ｓ２）、Ｃ１Ｈ４、ＣＨ１０、Ｖ２３（Ｖ１Ｓ４）、２４．８、Ｖ１０２（Ｖ１Ｓ７）、およびＶ５８３．５を含むＶＨ遺伝子の大きなＪ５５８（Ｖ１）ファミリーの選択メンバーと組み合わせて、種々のＤ遺伝子セグメントを発現する（ＪａｃｏｂおよびＫｅｌｓｏｅ（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：６７９〜６８７；Ｂｏｔｈｗｅｌｌら（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２４：６２５〜６３７；Ａｌｌｅｎら（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ．７：１９９５〜２００１；Ｊａｃｏｂら（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１２９３〜１３０７）。免疫１０日後までに、大多数のλ１＋Ｂ細胞が、ＹＹＧＳ（配列番号１１５）コンセンサスアミノ酸モチーフを含むチロシンリッチなＣＤＲ３領域をコードする、Ｖ１Ｓ２〜ＤＦＬ１６．１遺伝子再配列を発現する（ＷｅｉｓｓおよびＲａｊｅｗｓｋｙ（１９９０）前出；Ｂｏｔｈｗｅｌｌら（１９８１）前出；Ｊａｃｏｂら（１９９３）前出；ＣｕｍａｎｏおよびＲａｊｅｗｓｋｙ（１９８５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：５１２〜５２０；ＭｃＨｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２９５〜３０５）。λ１軽鎖と対になったＶ１Ｓ．２〜ＤＦＬ１６．１重鎖再配列は、標準的な抗ＮＰ  Ｂ細胞抗原レセプターと称され（Ｒｅｔｈら（１９７８）前出；Ｒｅｔｈら（１９７９）前出）、ＮＰに対するＣ５７ＢＬ／６マウスの一次および二次体液性免疫応答を左右する。従って、これらの特異的抗体遺伝子セグメントの使用により、このモ��クローナル抗体の抗原特異性が予測されると考えられている。
【０１９９】
Ｉｇｈｂマウスにおける抗ＮＰ抗体応答の同質性（ＩｍａｎｉｓｈｉおよびＭａｋｅｌａ（１９７５）前出）は、ホスホリルコリンに対するＢＡＬＢ／ｃマウスの応答（Ｃｒｅｗｓら（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２５：５９〜６６）；Ａ系マウスにおいてｐ−アゾフェニルアルソン酸塩に対して生成される抗体（Ｐａｗｌａｋら（１９７３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３７：２２〜３１）；ＢＡＬＢ／ｃおよびＤＢＡ／２マウスにおける２−フェニルオキサゾロン応答（Ｍａｋｅｌａら（１９７８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４８：１６４４〜１６５６）；ならびにポリ（Ｇｌｕ６０−Ａｌａ３０−Ｔｙｒ１０）に対するＢＡＬＢ／ｃマウスの応答（ＴｈeｚｅおよびＳｏｍｍe（１９７９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２９４〜３０１）を反映している。これらの抗体応答における低い遺伝分散の原因は、依然として不明のままである。単一Ｖ遺伝子セグメント（Ｓｉｅｋｅｖｉｔｚら（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：１２３〜１３２）またはＩｇｈ対立遺伝子（Ｓｉｅｋｅｖｉｔｚら（１９８２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１０２３〜１０３２）に対する抗体応答制限の関係は、相同なＶ（Ｄ）Ｊ再配列を担持する少数のＢ細胞クローンの増殖をもたらす抗原相補性に対して、補助的な、単純で最良の解答を示す。この場合は、生殖細胞系列ＶＨ遺伝子のレパートリーの系特異的な相違が、構造的に類似の分子に対する抗体応答を調節する。あるいは、抗体応答の制限は、自己寛容によって（Ｍａｎｓｅｒら（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．９６：１４１〜１６２；Ｈａｎｄｅら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：１８９〜１９８）、または突然変異性変化に対して確実に寛容性のＶ（Ｄ）Ｊ再配列を発現するリンパ球クローンに依存して（Ｍａｎｓｅｒら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２６：１２８３〜１２８８）、制限され得る。このメカニズムにかかわらず、規定された構造に対する抗体応答は同質であり、かつ、抗体レパートリー内の限られた応答を反映し得、これはまた、抗体が、抗体の可変領域内で特定の保存アミノ酸によって媒介される分子相互作用が全く同じではないにしても、類似の相互作用を介して同一の標的抗原に結合する、という事実も反映し得る。標的抗原とのモノクローナル抗体の相互作用は、主として抗体分子の相補性決定領域（ＣＤＲ）内のアミノ酸によって媒介されるが、フレームワークアミノ酸もまた、抗原結合性活性にとって重要である。従って、構造的に類似の抗体は、同じ抗原または標的分子の領域に結合する可能性が高く、一方、異なるＶ領域を有する構造的に異なる抗体は、異なる分子相互作用を介して、抗原の異なる領域と相互作用する可能性が高い。
【０２００】
標的抗原の同じ領域に結合する構造的に類似の抗体は、標的抗原上の同じ分子部位に結合する可能性がより高いので、公開された抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体のアミノ酸配列を試験した。１Ｆ５（Ｓｈａｎら（１９９９）前出）、Ｂ９Ｅ９（Ｓｃｈｕｌｔｚら（２０００）前出）、２Ｈ７（米国特許第６，１２０，７６７号）、２Ｂ８（米国特許第５，８４３，４３９号）、１Ｈ４（Ｈａｉｓｍａら（１９９８）前出）、およびＬｅｕ−１６（Ｗｕら（２００１）前出）モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖Ｖ領域は、アミノ酸配列が相同である（図１１）。この保存のレベルは、これらのモノクローナル抗体の各々がヌクレオチドレベルでも類似しているという事実を反映する。これらの抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の重鎖を、Ｖ１Ｓ１２１＊０１遺伝子セグメントに由来するＶ領域、Ｌ１６、Ｑ５２またはＳＰ２遺伝子セグメントに由来するＤ領域、およびＪ１またはＪ２遺伝子セグメントのいずれかに由来するＪ領域と、Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントの類似の組み合わせによって生成させる（表１）。同様に、軽鎖を、Ｊ１＊０２またはＪ５＊０１遺伝子セグメントのいずれかに由来するＪ領域を有する、いずれかのＶ４−７２＊０１遺伝子セグメントから生成させた。既知の抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体間の同質性のレベルにより、これらのモノクローナル抗体の各々が、ヒトＣＤ２０上の類似かまたは同一の部位に結合していることが示唆される。
【０２０１】
既知の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体間のアミノ酸配列の相同性のレベルを、抗ヒトＣＤ２０および抗マウスＣＤ２０モノクローナル抗体のより大きなパネルと比較することによって強調する。比較のために、まずこれらの既知の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を、同種のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を有する第２群の抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体（ＨＢ２０−０３、−０４および−２５）と対比させた。重鎖および軽鎖Ｖ領域間の比較類似性を、図１２に示すようにＵＰＧＭＡ系統樹（算術平均を用いた非加重対グループ法）を用いて視覚化した。これらの図において、系統樹分岐点間の水平距離は、配列関連性の尺度である。例えば、既知のマウス抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖は、互いに最も類似していたＨＢ２０−０３、−０４および−２５モノクローナル抗体の配列に対してよりも、さらに互いに類似していた。軽鎖Ｖ領域配列の中でも、１Ｈ４およびＢ９Ｅ９配列が最も類似していたが、２Ｈ７、１Ｆ５および２Ｂ８モノクローナル抗体配列についての配列にもかなり類似していた。同様に、ＨＢ２０−３およびＨＢ２０−４モノクローナル抗体もかなり類似したアミノ酸配列を有したが、これらの配列は、ＨＢ２０−２５モノクローナル抗体の対応する配列との類似性が相対的に低かった。しかしながら、ＨＢ２０−３、−４および−２５モノクローナル抗体の軽鎖配列は、既知の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の配列とは、より一層異なっていた。各モノクローナル抗体間の対になった重鎖および軽鎖の配列相同性を比較したところ、既知の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体と、ＨＢ２０−３、−４および−２５モノクローナル抗体の間の配列相同性のレベルは全く異なっていた（図１２）。このことから、これらの２つの群のモノクローナル抗体は別個であり、かつ、異なる分子相互作用を介してヒトＣＤ２０に結合するかまたはこのＣＤ２０タンパク質上の別個の部位で結合する可能性が高いことが示される。これらのＨＢ２０−３、−４および−２５モノクローナル抗体は、既知の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の共通の特性とは別個の、共通の生物学的特性を有することもまた企図される。
【０２０２】
既知の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体間のアミノ酸配列相同性のレベルを、抗ヒトＣＤ２０および抗マウスＣＤ２０モノクローナル抗体のより大きなパネルとの比較によってさらに示した。一般に、２Ｂ８、Ｂ９Ｅ９、１Ｆ５、１Ｈ４、およびＬｅｕ−１６重鎖は、ＨＢ２０−０１、−０２および−０６モノクローナル抗体の重鎖と配列が類似していた（図１３および図１５）。配列類似性に基づき、これらの重鎖ＶｏＪセグメントを群Ａ配列と称してきた（図１３）。２Ｈ７モノクローナル抗体のアミノ酸配列は類似していたが、他の群Ａ重鎖と相違していたので、この重鎖を群Ｂ重鎖と称した。ＨＢ２０−０３、−０４および−２５は構造的に類似しており、これらを群Ｃ重鎖と称した。ＨＢ２０−０５モノクローナル抗体重鎖もまた構造的に別個であり、これを群Ｄ重鎖と称した。抗マウスＣＤ２０モノクローナル抗体の多くは、構造的に類似の重鎖（ＭＢ２０−０８、−１０、−１８、−０７、−０２および−１４）を共有しており、これらを群Ｅ重鎖と称した。ＭＢ２０−１１および−１６モノクローナル抗体重鎖は、十分に異なっていたので群Ｆと表した。ＭＢ２０−０１および−１３モノクローナル抗体は、他の全ての抗ＣＤ２０モノクローナル抗体と構造的に異なった非常に多様な重鎖を用い、これらを群Ｇ重鎖と称した。これらの異なる重鎖アミノ酸配列の群は、各々の抗ＣＤ２０重鎖の生成のための異なるＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントの利用と、密接に相関した（表１）。従って、これらの既知の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体重鎖は、本明細書中に開示される大多数の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体重鎖とは構造的に異なっていた。
【０２０３】
既知の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体間のアミノ酸配列相同性の著しい高さを、抗ヒトＣＤ２０および抗マウスＣＤ２０モノクローナル抗体のパネル間の軽鎖利用の比較によって、さらに強調した。２Ｂ８、Ｂ９Ｅ９、１Ｆ５、１Ｈ４、Ｌｅｕ−１６および２Ｈ７軽鎖は、配列がかなり類似していたが、他の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体によって用いられる軽鎖とは異なっていた（図１６および図１８）。配列類似性に基づいて、これらの軽鎖を群Ａ配列と称した（図１６）。複数の抗マウスＣＤ２０モノクローナル抗体軽鎖のアミノ酸配列は最も類似していたが、群Ａ配列と相違していたので、これらの軽鎖を群Ｂと称した。ＨＢ２０−０３、−０４および−２５は構造的に異なっており、これらを群Ｃ軽鎖と称した。ＨＢ２０−０１、−０２および−０６モノクローナル抗体は、群Ｅと称される類似の軽鎖を用いた。ＭＢ２０−１８およびＭＢ２０−０１は構造的に異なった軽鎖を用い、従って、これらをそれぞれ群ＦおよびＧと称した。これらの異なる軽鎖アミノ酸配列の群は、各々の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の生成のための異なるＶＪ遺伝子セグメントの利用と、密接に相関した（表１）。従って、これらの既知の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体軽鎖は、本明細書中に開示される抗ＣＤ２０モノクローナル抗体によって用いられる軽鎖とは構造的に異なっていた。
【０２０４】
対になった重鎖および軽鎖のアミノ酸配列の分析により、異なる抗ＣＤ２０モノクローナル抗体は構造的に異なる群に分類され、従って、異なる分子相互作用を介してヒトまたはマウスＣＤ２０に結合することをさらに確認した。２Ｂ８、Ｂ９Ｅ９、１Ｆ５、１Ｈ４およびＬｅｕ−１６モノクローナル抗体は、それぞれＡＡと称される、構造的に類似の重鎖および軽鎖を用いた（図１９、表１）。２Ｈ７モノクローナル抗体重鎖は、他の既知の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体によって用いられる重鎖とは構造的に異なったが、類似の軽鎖と対を形成したので、このモノクローナル抗体をＢＡモノクローナル抗体として群化した。群ＣＣモノクローナル抗体であるＨＢ２０−０３、−０４および−２５は、構造的に異なる抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の固有のクラスを表す。同様に、固有の重鎖および軽鎖の利用、ならびに重鎖および軽鎖の種々の組み合わせを用いて達成される組み合わせの多様性により、他の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の各々を、既知の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体とは構造的に別個のものとして分類することが可能になった（図１９）。
【０２０５】
（実施例１４）
（抗ＣＤ２０モノクローナル抗体結合密度およびＢ細胞枯渇）
ＣＤ２０発現は、種々のリンパ腫タイプにおいて、ならびに個々の腫瘍試料の細胞間で全く異質であり、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体治療結果に影響を及ぼし得る（Ｓｍｉｔｈ（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：７３５９〜７３６８）。代表的には、慢性リンパ性白血病細胞および小リンパ球性リンパ腫細胞は、より高いレベルでＣＤ２０を発現している濾胞性リンパ腫細胞よりも低いリツキシマブ応答速度に対応して、低レベルでＣＤ２０を発現する（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１６：２８２５〜２８３３）。従って、ＣＤ２０密度は、Ｂ細胞に結合してそれらを枯渇のための標的にすることが可能な抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の数を決定するので、ＣＤ２０発現密度は、抗ＣＤ２０治療効力に影響を及ぼす重要な要因であり得る。ＣＤ２０発現密度が治療効力に影響を及ぼすか否かを評価するために、および、密度変化がＢ細胞枯渇に影響を及ぼす程度を決定するために、ヘテロ接合ＣＤ２０＋／−マウスを高用量（２５０μｇ）および低用量（１０μｇ）のＭＢ２０−１１モノクローナル抗体で処置した。ＣＤ２０＋／−マウス由来のＢ細胞は、野生型同腹仔で検出される半分の密度でＣＤ２０を発現する。高い抗ＣＤ２０モノクローナル抗体用量では、野生型またはハプロ不全のＣＤ２０発現は、７日目までに循環または脾臓Ｂ細胞枯渇に検出可能な影響を及ぼさず、９３〜９７％のＢ細胞が脾臓から取り除かれた（図２０Ａおよび図２０Ｂ）。対照的に、低用量の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体は、７日目までに野生型マウスから９３〜９８％の循環および脾臓Ｂ細胞を効率的に枯渇させたが、ＣＤ２０＋／−マウスからはわずかに３０〜４１％の循環または脾臓Ｂ細胞を除去したにすぎなかった（図２０Ａおよび図２０Ｂ）。従って、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体処置の有効性は、ＣＤ２０のＢ細胞発現をわずかに５０％減少させることによって、有意に変化した。さらに、標的Ｂ細胞の表面に結合する抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の密度は、特により低いモノクローナル抗体濃度であった場合、細胞表面のＣＤ２０密度によって大いに影響を受けた。
【０２０６】
（実施例１５）
（ＭＢ２０−１１モノクローナル抗体結合および細胞表面ＣＤ２０発現）
細胞表面のＣＤ２０発現密度は、抗ＣＤ２０治療効力のための重要な要因である（Ｓｍｉｔｈ（２００３）前出）。従って、患者をＧ−またはＧＭ−ＣＳＦで処置するなど、治療中にＣＤ２０発現をアップレギュレートして、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体効力をインビボで高めようとする試みがなされてきた。しかしながら、ＣＤ２０アップレギュレーション以外のメカニズムが、観察されてきた効果の増強の原因である可能性が高い（ＲａｖｅｔｃｈおよびＬａｎｉｅｒ（２０００）Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １６：６９３〜６９９；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｏｌｋら（２００２）Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １６：６９３〜６９９）。本明細書において、ＭＢ２０−１１モノクローナル抗体が、インビボにおけるマウスＢ細胞の枯渇に非常に有効であることを立証してきた（図７〜１０）。ＭＢ２０−１１モノクローナル抗体のインビボでの有効性は、ＩｇＧ２ａアイソタイプに由来するという事実に一部起因するようであるが、他の要素も治療効力に寄与する可能性が高い。従って、脾臓Ｂ細胞による細胞表面ＣＤ２０発現に対するＭＢ２０−１１モノクローナル抗体結合の影響を、インビトロで評価した。予想外に、３７℃で培養Ｂ細胞にＭＢ２０−１１モノクローナル抗体を結合させることにより、氷上に保持した細胞、または類似のもしくは異なるアイソタイプの他のＭＢ２０モノクローナル抗体と共にインキュベートした細胞と比較して、より多くのＭＢ２０−１１モノクローナル抗体の長期間にわたる結合を誘導した（図２１；データは示さず）。平均して、ＭＢ２０−１１モノクローナル抗体結合は、３０分〜８時間にわたって９７±２９％（ｎ＝４、ｐ＜０．０５）増加した（図２１）。ＭＢ２０−１１モノクローナル抗体結合の経時的な増加は、低いモノクローナル抗体親和性に関連してはいないようであった。なぜなら、ＭＢ２０−１１モノクローナル抗体は、細胞表面上のＣＤ２０発現の増加を誘導しなかった他のＭＢ２０モノクローナル抗体と類似したモノクローナル抗体濃度で、染色の飽和レベルに達したためである（図６）。他の抗マウスＣＤ２０モノクローナル抗体はこの性質を示さなかったので（図２１；データは示さず）、ＭＢ２０−１１モノクローナル抗体は、ＣＤ２０上の固有の領域またはエピトープに結合し得る。ＣＤ２０へのＭＢ２０−１１モノクローナル抗体の結合は、Ｂ細胞上の細胞表面ＣＤ２０発現の増加を誘導し得るか、または新生ＭＢ２０−１１モノクローナル抗体結合部位を露出する細胞表面ＣＤ２０分子における高次構造変化を誘導し得る。
【０２０７】
（実施例１６）
（ＨＢ２０−３、−４および−２５モノクローナル抗体の結合密度）
モノクローナル抗体結合密度は、インビボにおける最適な抗ＣＤ２０モノクローナル抗体媒介性のＢ細胞枯渇にとって重要であり（図２０）、これは、より高い結合密度でＢ細胞に結合するモノクローナル抗体ほど、治療的に有効であり得ることを示す。このＭＢ２０−１８モノクローナル抗体は、特にモノクローナル抗体濃度が限定されていた場合、ＭＢ２０群のモノクローナル抗体の最高密度でＢ細胞の表面に結合した（図６）。これは、インビボにおけるＢ細胞枯渇のための他のＩｇＧ２ｂ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の中でもとりわけＭＢ２０−１８モノクローナル抗体の特有の有効性に寄与している可能性がある（図７Ｂ）。それらのアミノ酸配列における有意差に基づいて、群ＣＣのＨＢ２０−３、−４および−２５モノクローナル抗体（表１）が、既知の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の共通の特性とは別個の生物学的特性を共有していることが企図される（図１２）。これらの差異の中で、ＨＢ２０−３、−４および−２５モノクローナル抗体は、間接的免疫蛍光染色アッセイにおいて既知の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体よりも有意に高いレベルでＣＤ２０を発現している、初代Ｂ細胞およびＢリンパ腫細胞株に結合した（図２２）。平均して、これらのＨＢ２０−３、−４および−２５モノクローナル抗体は、１Ｆ５、Ｂ９Ｅ９および１Ｈ４モノクローナル抗体よりも３．７倍高いレベルで、ヒト血液Ｂ細胞に結合した（表６）。同様に、これらのＨＢ２０−３、−４および−２５群のモノクローナル抗体は、１Ｆ５、Ｂ９Ｅ９および１Ｈ４群のモノクローナル抗体よりも、Ｂ細胞株であるＲａｊｉ、ＢＪＡＢおよびＤＨＬ−４に、それぞれ４．５倍、３．１倍および４．３倍高いレベルで結合した。初めて記載された抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であった、Ｂ１モノクローナル抗体（Ｓｔａｓｈｅｎｋｏら（１９８０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５：１６７８）がＢ細胞を染色すること、および他の公開された抗ＣＤ２０モノクローナル抗体と比較した場合、高密度でＢ細胞に特徴的に結合することが、一貫して観察された（表６）。それでもなお、これらのＨＢ２０−３、−４および−２５群のモノクローナル抗体は、Ｂ１モノクローナル抗体よりも高いレベルで初代Ｂ細胞およびＢ細胞株と反応した（表６）。具体的には、このＨＢ２０−３モノクローナル抗体は、Ｂ１モノクローナル抗体よりも、初代Ｂ細胞、Ｒａｊｉ細胞、ＢＪＡＢ細胞およびＤＨＬ−４細胞に、それぞれ６９％、１３０％、７１％および５７％高いレベルで結合した。従って、群ＣＣモノクローナル抗体の固有の特性は、他の既知の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体と比較して、細胞表面ＣＤ２０に対するその特徴的でない高い結合活性である。
【０２０８】
１Ｆ５モノクローナル抗体よりも初代Ｂ細胞およびＢ細胞株と高い密度で結合すること、ならびに高いレベルで反応することに加えて、ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４およびＨＢ２０−２５は、重鎖ＣＤＲ３およびＣＤＲ１領域中に、ならびに軽鎖ＣＤＲ３領域中に、共通のアミノ酸モチーフを共有する。この共通のモチーフは、重鎖については図１５において、そして軽鎖については図１８において明らかである。例えば、この重鎖ＣＤＲ３領域は、アミノ酸配列モチーフＦＹＸＹＸＸＸ１ＹＧＡＸ２ＸＸＹを含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、そしてここで、Ｘ１は任意のアミノ酸であり得、好ましくはＹまたはＳであり、そしてここで、Ｘ２は任意のアミノ酸であり得、好ましくはＭまたはＬであり、そしてここでＦはフェニルアラニンであり、Ｙはチロシンであり、Ｇはグリシンであり、Ａはアラニンであり、Ｍはメチオニンであり、Ｌはロイシンであり、そしてＳはセリンである。
【０２０９】
この重鎖ＣＤＲ１領域は、アミノ酸配列モチーフＮＸＸＸＸを含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、そしてＮはアスパラギンである。
【０２１０】
さらに、この軽鎖ＣＤＲ３領域は、アミノ酸配列モチーフＸＨＦＷＸＸ３ＸＷＸを含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸配列であり得、Ｈはヒスチジンであり、Ｆはフェニルアラニンであり、Ｗはトリプトファンであり、そしてＸ３は任意のアミノ酸であり得、好ましくはＴまたはＩであり、ここでＴはトレオニンであり、そしてＩはイソロイシンである。
【０２１１】
【表６】
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（実施例１７）
（抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の治療有効性）
２．５μｇ用量で静脈内投与したＭＢ２０−１１モノクローナル抗体は、循環および組織Ｂ細胞を効率的に枯渇させたので（図７Ｃ）、皮下（ｓ．ｃ．）投与した類似の小用量の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体が、Ｂ細胞を同程度に枯渇させたか否かを決定した。圧倒的多数の循環および組織Ｂ細胞が、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を静脈内または皮下のいずれかの５μｇ用量として投与したマウスにおいて枯渇した（図２３Ａおよび図２３Ｂ）。リツキシマブは、通常３７５ｍｇ／ｍ２用量でヒトに静脈内投与され、これは２，５００μｇ／マウスの用量に相当する（表７）。マウスにおける効率的なＢ細胞枯渇は、単回５〜１０μｇ用量のＭＢ２０−１１モノクローナル抗体を皮下投与することによって得られ、この用量は、一般に患者に静脈内投与されるリツキシマブの量よりも２５０〜５００倍低い量の抗体に相当する。最新のマウスにおける知見に基づいて、ＭＢ２０−１１モノクローナル抗体に治療上匹敵した抗ＣＤ２０モノクローナル抗体は、ヒトに１．３〜２．６ｍｇの皮下注射として投与した場合、循環および組織Ｂ細胞の両方を効率的に枯渇させ得た。
【０２１２】
【表７】
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＊  仮体重０．０２ｋｇ。
＃  仮体重６５ｋｇ、体表面積として１．７１ｍ２。
リソース：ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｄｅｒ／ｃａｎｃｅｒ／ａｎｉｍａｌｆｒａｍｅ．ｈｔｍが提供しているＤｏｓｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ
前記のものは本発明の例証であって、本発明の限定と解釈されるべきではない。本発明は以下の特許請求の範囲によって規定され、この特許請求の範囲の中には特許請求の範囲の等価物が含まれる。
【図１−３】
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【図４−１】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図１０−１】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１４−６】
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【図１４−７】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１７−５】
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【図１７−６】
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【図１７−７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
0005969577.tif 000050
【図３−２】
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【図４−２】
0005969577.tif 000052
【図５−１】
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【図５−２】
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【図７−１】
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【図８−２】
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【図８−４】
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【図９−２】
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【図９−３】
0005969577.tif 000059
【図１０−２】
0005969577.tif 000060
【配列表】
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