(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流体カートリッジにサンプルを導入する工程を有するサンプルの分析を行う方法であって、
前記マイクロ流体カートリッジは、カートリッジに前記流体サンプルを導入するサンプルポートと、
１以上のマイクロ流体チャネルが配置され、かつ前記チャネル内には前記サンプル中に存在する分析対象物（検体）に結合して結合剤／検体／標識複合体を形成することができる結合剤と標識とが置かれた基材と、
前記１以上のマイクロ流体チャネル内に、検体と標識の結合が発生する領域であり、結合剤／検体／標識複合体及び結合剤／検体／標識複合体を形成していない標識を検出する領域（検出領域）であって、前記検出領域から結合した検体が除去され、結合していない残留標識の測定により間接的に前記検体の濃度を測定して、サンプル中に存在する検体がカートリッジ内の検体結合剤と標識とに結合することができる検出領域とを含み；
検出領域に存在する標識（結合剤／検体／標識複合体中の標識及び検体と複合体化していない標識の双方）に存在する標識の第一濃度を検出し、第一の参照または対照値を得る工程；
検出領域から結合剤／検体／標識複合体を除去する工程；及び
前記検出領域内で前記結合剤／検体／標識複合体を除去した後に残留する複合体化していない標識の第二濃度を検出する工程を有する方法。
【請求項２】
前記サンプルがカートリッジに導入される前に、前記結合剤と標識が検出領域内に置かれている請求項１に記載の方法。
【請求項３】
使用の前に、１以上の他の試薬が、検出領域内の上流、検出領域内、または検出領域の上流及び検出領域内に置かれる請求項２に記載の方法。
【請求項４】
１以上の分析を行う請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
１つのサンプルについて同一の分析測定を複数回行い、及び／または１つのサンプルについて異なる分析を行う請求項４に記載の方法。
【請求項６】
結合剤が検体に付着しているか、または常磁性粒子などの粒子に結合して結合体／常磁性粒子／検体／標識複合体を形成している請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
標識がグルコースオキシダーゼである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
さらに、作業電極とカウンターまたは参照電極、またはカウンター及び参照電極を含み、作業電極がカートリッジの検出領域に存在する、電気化学的方法を含む請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
別個のカウンターまたは参照電極、またはカウンター及び参照電極が、各々対応する作業電極用として設けられているか、または単一のカウンターまたは参照電極、または単一のカウンター及び参照電極が設けられて作業電極と共に働く請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記１以上の他の試薬がグルコース、フェロシアナイド及びパーオキシダーゼである請求項３〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
サンプルのカートリッジへの導入により、結合剤及び標識の少なくとも一部が検出領域内で溶解し、または懸濁する請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
検出が電気化学的に行われる請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
酸化または還元電位が標識濃度の測定に用いられる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
電位が、バックグラウンド効果を減少させるために、または結合インキュベーション段階で酵素により発生する電流を最小化するために適用される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
電位が、サンプルに存在するバックグラウンド・シグナルを発生する電気化学的な妨害効果を除去するか、または最小化するために適用される請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
さらに、酸化型と還元型との間に変換でき、かつ電気化学的に検出できるパーオキシダーゼを使用する請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
サンプルが全血サンプルである請求項１０〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
検出がサンプルの分離、洗浄及び／またはサンプルの希釈なしに直接行われる請求項１０〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
下記（ａ）及び（ｂ）を含む流体サンプルの分析を行う分析システム：
（ａ）前記流体サンプルをカートリッジに導くサンプルポートを有する流体カートリッジと、
１以上のマイクロ流体チャネルが配置され、かつ前記チャネル内には前記サンプル中に存在する分析対象物（検体）に結合して結合剤／検体／標識複合体を形成することができる結合剤と標識とが置かれた基材と、
結合剤／検体／標識複合体及び結合剤／検体／標識複合体を形成していない標識を検出する前記１以上のマイクロ流体チャネル内の領域、または全体が検体と標識の結合が生じる領域であって、前記検出領域から結合した検体が除去され、結合していない残留標識の測定により間接的に前記検体の濃度を測定し、前記結合剤が常磁性粒子を含む領域とを含む；
（ｂ）下記(i)、(ii)及び(iii)を有する読み取りデバイス： 
(i)カートリッジを読み取りデバイスに導くレシービングポート；
(ii)カートリッジに磁力を適用して、カートリッジ内の検出領域から常磁性粒子を除去することができる磁石または磁力発生手段；及び
(iii)カートリッジの検出領域から検体／結合剤複合体を除去する前及び後の双方において、検出領域内に存在する標識を検出する検知手段。
【請求項２０】
検出領域内で検出される標識の第一濃度から、検出領域内から検体／結合剤／標識複合体を除去した後に検出される標識の第二濃度迄の減少が、読み取りデバイスにより検出され、サンプル中に存在する検体の濃度が読み取りデバイスによって計算される請求項１９に記載の分析システム。
【請求項２１】
前記標識が電気化学的に検出される請求項２０に記載の分析システム。
【請求項２２】
読み取りデバイスが、さらにユーザーがサンプル中に存在する検体濃度を確認するためのディスプレイまたは印刷デバイス手段、及び／または検体濃度を離隔した位置または関係者に伝える送信手段を有する請求項１９〜２１のいずれかに記載の分析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、使い捨てのアッセイ(分析)（assay）用カートリッジとそれに関連するリーダー（reader）（読み取り装置）、またそれらの個々の構成部品を含む、マイクロ流体に基づくアッセイ装置に関する。本発明はまた、本発明のカートリッジやデバイス、さらにはアッセイを行うためのキットを使用するアッセイ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インビトロ診断（ＩＶＤ）産業では、絶えず性能を向上させようとするニーズがある。性能の向上には、正確さ（accuracy）、精度（precision）、コスト、多重化、総テスト時間等の改善が挙げられる。本明細書で説明する新規で、減算法を用いて補正する（subtractive corrective）アッセイ装置及び方法は、このような改善を提供するように設計されている。この新規な減算法を用いて補正するアッセイ装置及び方法は、使い捨てストリップ（strip）及び再利用可能なリーダーで構成されている。他の検出方法も適用できるが、好ましい実施形態として電気化学的検出法が注目されている。
【０００３】
従来技術では、検出可能な変化を生み出す磁性粒子と関連する結合物質が、磁場により検出領域へ運搬されるという多くの実施例がある。一般的に、未結合の標識（ラベル）が検出領域から取り除かれ、結合した標識が検出領域内に蓄積され検出可能な変化が引き起こされる。
【０００４】
全体的に参照することにより援用される米国特許出願公開第２００９／０１３０７７１号明細書には、分析対象物（検体）を捕捉する磁性粒子の使用について記載されているが、検出領域内にそれらを蓄積し、その領域内で増加した分析対象物の濃度を測定することが記載されている。また、米国特許出願公開第２００９／０１３０７７１号明細書では、任意のバックグラウンド補正用に分離した参照領域を使用する。これは、試料自体のバックグラウンド補正のみに機能し、上記２つの領域は異なるので、標識または他の試薬の濃度のばらつきに作用せず、それ故、再懸濁した試薬濃度についての差、また参照領域と検出領域の大きさや不透明度（opacity）のような２つの異なる領域内での測定の再現性についての差が存在することになる。また米国特許出願公開第２００９／０１３０７７１号明細書はバックグラウンド測定用の検出領域を用いる可能性に言及しているが、それは“ＧＯＤ［標識］粒子が実質的に検出領域に存在していない”場合のみであるので、標識濃度のばらつきの補正はしない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０１３０７７１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、インビトロ診断（ＩＶＤ）テストを実施するための安価で信頼性の高いアッセイシステムを提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、簡単かつ安価に組み立てられると同時に、特定のアッセイ（単数または複数）を実施するよう構成できる、アッセイ用カートリッジ設計のプラットフォーム（platform；基板ということがある。）とリーダー（読み取りデバイス）を提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、種々の異なる特定のアッセイを実施するよう簡単に適合させることができるアッセイ用カートリッジを提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、種々の異なるアッセイを行うために好ましく使用されるか、または容易に適合できるリーダーを含むアッセイシステムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、すべての試薬を最初に検出領域内に配置することによる、新規な減算法アッセイ装置及び方法の開発に基づいている。このアッセイのアーキテクチャでは、非結合標識の濃度を検体濃度の測定に使用することにより、非常に正確で感度の高い測定を可能にする。
【００１１】
本発明は、第１の態様において、流体試料（サンプル）中の分析対象物（検体）（analyte）検出用の減算法アッセイにて使用されるマイクロ流体アッセイ用カートリッジを提供する。カートリッジは以下のものを含む：
カートリッジ内に前記流体試料を導入するためのサンプルポート、
内部に配置された１以上の微小流体流路（チャネル）（channel）を含み、及び試料内の任意の検体を結合させるチャネル内に配置された結合剤を含む基板、及び試料中に存在する検体量の検出用の標識、及び
検体と標識の結合が発生する領域であり、その領域から結合した検体が取り除かれ、任意の残存する未結合標識の測定により間接的に前記検体の濃度を決定することができる領域を、その範囲内または全体的に含む検出領域。
【００１２】
検出領域は、試料の添加による試薬の再水和にて同時に発生する結合反応及び酵素反応に必要な試薬を含む。具体的な実施態様では、特に、抗−検体磁性粒子、抗−検体グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）標識及びメディエーター（媒体；mediator）系が検出領域内に配置される。グルコースは検出領域の上流に堆積され、カートリッジが試料により充填される際、グルコースは再水和され試料とともに検出領域へと運ばれる。試料（グルコースを含む）は結合試薬及び酵素試薬を再水和する。すぐに両方の反応が開始する（結合複合体と基質の酵素の代謝回転（ターンオーバー）の形成）。次いで、アッセイの変数の数（抗−検体−ＧＯＤ標識の濃度、メディエーターの濃度、作用電極の大きさ等）を考慮して、酵素代謝回転のリファレンス測定が行われる。このリファレンス測定は抗−検体−ＧＯＤ標識の濃度に影響される。以下、この測定を磁気分離前測定と称する。
【００１３】
規定の時間（例えば４分）後に、磁場をストリップに適用する。その結果、常磁性粒子−検体及び常磁性粒子−検体−標識複合体が選択的に検出領域から磁場の発生源へと除去され、未結合のＧＯＤ標識が検出領域に残される。規定の期間（例えば２分）後に、検出領域内に残留する未結合ＧＯＤ標識の濃度を測定する。磁気分離工程前後での標識濃度の関係性は、試料内の検体濃度を決定するために使用される。
【００１４】
磁気分離の前後の標識濃度を測定する減算補正アッセイを実施することには多くの利点がある。使い捨てＩＶＤ（インビトロ診断）ストリップ内のばらつきと不正確さの大きな要因は、カートリッジ内に堆積された試薬の量／濃度である。各試薬は、標識濃度を決定しさらには標識濃度の違いを補正することを可能にするよう検出領域内に堆積されているので、補正減算アッセイ法ではこれを補正する。これは、作用電極での事象のみにより情報を得られるので、減算方式に非常に適している（すなわち、作用電極での標識濃度を測定し、結合した標識の磁性を除去した後、作用電極での標識濃度を再測定する）。検出可能な物質がその電極に運ばれる蓄積アッセイにおいては、試薬のそれぞれが検出領域に位置していた場合でも、結合物質は依然として作用電極に運ばれ（従ってストリップの他の場所でも標識濃度のばらつきを補正することができないので）、補正の機会はない。これは本発明の補正減算アッセイでは発生しないので、本発明は非常に正確な標識濃度（及び前記したその他のばらつきの発生源）のばらつき補正を可能にし、その結果、精度、感度、正確さ、また全体的なアッセイ性能の向上につながる（補正の可能性は、さらに詳細な説明に記載するように、アッセイ性能に重大な影響をもたらすものである。）。
【００１５】
減算補正法のさらなる主な利点は、ストリップの体積の独立性である。ラベルが磁性粒子により検出領域に運ばれるアッセイ方法では、測定はチャネルのストリップの体積変化（幅、高さ等）の影響を受けやすい（すなわち、結合可能な検体の量はストリップの寸法のばらつきにより変化する。）。減算補正法の場合、ストリップの体積は正規化される。作用電極表面で単一の物質のみが測定されるので、これは磁気分離前の測定により行われる。従ってこの測定では、作用電極におけるサンプル量のみが測定されるので、ストリップの体積の補正が可能となり、ストリップチャネルの高さ、ストリップ幅、ストリップ体積、電極サイズ、及び試薬濃度のばらつきを、精度の高い結果を得るために補正することができる。
【００１６】
また、結合した標識を検出領域に運び常磁性粒子を蓄積させるアッセイでは、高精度な結果を確保するために、常磁性粒子のすべて（または再現可能な数）を収集し、再現可能な方法（例えば常磁性粒子ビーズ帯の寸法）で検出器にそれらを提供することは困難である。減算法では、常磁性粒子及び結合された物質は検出領域から取り除かれるので、このような問題は生じない。
【００１７】
この測定方法は非常に簡単なので、多重測定を可能にするカートリッジフォーマットを形成することが容易である。この測定では、多くの異なる分析や、同じ検体の多重測定が可能となる。さらに、アッセイの簡便さにより、非常に少量のサンプル量を使用する製造性が高く安価なカートリッジの設計が可能なので、多くの製品に応用できる。
【００１８】
本発明のカートリッジの設計は、容易に適合され、複数の異なるアッセイを行うことも可能なので、種々のアッセイのためのアッセイプラットフォームとみなすこともできる。配置されるカートリッジ及びチャネルは、当業者に公知の方法、フォトリソグラフィ、湿式化学エッチング、レーザーアブレーション法、射出成形、エンボス加工と印刷技術などの任意の方法で形成することができる。しかしながら、好ましい実施態様では、それらに配置されるカートリッジ、チャネル、及びその他の機能（feature）は、上板、中板、下板の３つの別々の基板のサンドイッチ構造に形成される。
【００１９】
カートリッジは、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリスチレン、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）等任意の適当な材料から形成することができ、その／各基板は単数のまたは複数の材料から形成することができる。３つの基板を含む実施態様では、中層の基板は、チャネル、試料導入ポートなどのカートリッジの特定の機能に対応して基板を切り抜いたパターンを含む。適当にカットした上層及び下層の基板を、それらの間に中層の基板を挟むようにサンドイッチ状にし適合することにより（例えば、熱シール、接着、ステープル留め等により）、チャネルや他の機能が配置されている位置へカートリッジを設置することができる。上部及び／または下部基板の開口部または機能は、試料を充填できるようにカートリッジから空気を排出するように設計したり、カートリッジを正しい位置に配置しやすくするようリーダー装置の機能と同じ位置に配置するように（以下に説明するように）設計することができる。
【００２０】
上記するように、使用にあたって、試料は、毛細管現象などにより、サンプル注入ポート（導入口）を介してカートリッジに導入される。好ましい実施態様では、試料注入ポートは、カートリッジの側面または表面の開口部である。カートリッジは、一般的に上面と底面と４つの端面を含む薄い平面状のデバイスであることが望ましい。この構成では、サンプル注入ポートをカートリッジエッジのいずれか１つの端面に形成し、ユーザーが端面に形成された開口部に試料を接触させるだけでカートリッジ内へ試料を取り込むことができるようにする。ある実施態様において、使用時にユーザーが流体サンプルをポート／開口部に接触させると、カートリッジ内の前記チャネルの寸法により、流体が毛細管現象によりカートリッジ内に引き込まれる。サンプルポート／開口部の寸法は、チャネルの寸法よりも小さくまたは大きくする。
【００２１】
前記カートリッジ内のチャネルには、１以上の流体ストップ（停止）機能を備えることができる。流体ストップ機能は、毛細管現象のみで試料及び／またはその他の流体がストップ機能を通過するのを防止するよう設計されている。ストップ機能は、疎水性材料（例えば、印刷可能な導電性または非導電性インク）、またはチャネル表面の表面特性を変化させ親水性／疎水性の違いを生み出す（例えば、レーザアブレーション、表面刻み加工（surface scoring）、表面材料除去、金属材料の蒸着などの方法により）プロセスまたは材料が好ましく、障壁となるように／障壁に接するように設計されているか、またはチャネルの壁面またはチャネル内の空隙（例えば、チャネルにまたがる蓋体（lid）及び/または基板材料の孔）にコーティングされている。チャネルが３つの基板を積層したサンドイッチ構造で形成されている実施態様では、疎水性材料を、上板及び／または下板に適用することができる。例えば、３つの基板が共にサンドイッチされた場合、疎水停止材料は前記チャネルの上面及び／または底面上で役立つ機能となる。
【００２２】
本発明のカートリッジは、マイクロ（微小）流体チャネルだけでなく、チャネルと接続されその後サンプルが一旦カートリッジに導入される１以上の電極の機能を備えることができる。電極は、必要に応じて様々な測定値が取得できるよう、リーダー内の電気接点に接続するように設計されている。例えば、カートリッジ内の１つまたは複数の電極は、カートリッジの正しい装填を検出するように設計されており、リーダーはユーザーに、カートリッジがリーダーに正しく挿入されたか、及び／またはサンプルがカートリッジに正しく導入されたかどうかについて信号を送る。電極はまた、サンプル自体の１つまたは複数の電気的測定を行うこともできる。例えば、試料が全血液試料である場合には、電極は、検出される検体の正確な濃度を決定することが重要である試料のヘマトクリット測定を行うことができる。導電性及び／またはインピーダンス（電気抵抗）測定は、検査される試料に応じて決定することができる。検体検出に用いられる標識は、電気化学的（または電気化学反応に関与する）であってもよく、それによりこれらの電極は、標識濃度及びそれによる検体濃度の測定に用いることができる。このように、本発明のカートリッジは、充填検出、ヘマトクリット測定及び検体測定等のために試料の電気的測定を使用することができる。
【００２３】
電極を形成するために、任意の導電性材料を使用することができる。例えば、スクリーン印刷可能なカーボンインク、銀／塩化銀インク、金、白金、銅などを用いて、スクリーン印刷、スパッタ法、インクジェット印刷、または化学エッチング、レーザアブレーションなどを含む様々な手段による基板からの電極材料の部分的除去など様々な手段によって、基板に適用することができる。
【００２４】
カートリッジに導入される試料は、任意の適当な流体試料でよい。例えば、全血液、血漿、唾液、精液、汗、血清、月経、羊水粘膜液、涙、組織スワブ、尿、脳脊髄液、粘液などのように、被験体から採取された流体試料が挙げられる。本発明のアッセイシステムは大規模な成長中のＩＶＤ市場（例えば、癌、心臓病、感染症）を含むヒトの健康の分野に応用できることが理解されるであろう。このアッセイはまた、薬物や薬物作用を検査するために使用することもできる。しかしこのシステムはまた、有毒物質、細菌やウイルスなどの感染性病原体を検出することが望ましい環境にて応用することもできる。従って、河川や湖沼または固体表面からのスワブ（細菌検査用標本）からの試料が、カートリッジに供給する流体試料を得るために取得されることもある。このアッセイシステムはまた、実験室用、治療の現場及び検査の現場の獣医学用途に利用することもできる。基本的に、試料が流体の態様で提供される任意のアッセイは、本発明で利用することができる。
【００２５】
試料には、例えば、供給源から直接得られる全血液などの物質、並びにろ過、沈殿、希釈、蒸留、混合、濃縮、阻害剤の不活化などの技術を用いて前処理された物質が含まれる。これらの工程は、試料がカートリッジに導入される前に行ってもよいし、カートリッジ自体により行うこともできる。
【００２６】
試料は、カートリッジがリーダーに装着される前またはリーダーに装着された後に、導入することができる。カートリッジは、試料が毛細管現象により導入されるように設計することができる。
【００２７】
検出される検体は、任意の所望の検体であり、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、微生物（細菌やウィルスなど）、化学薬品、毒物、医薬品、代謝物、細胞部位などが挙げられる。例えば、本システムは、適当な結合剤と結合できる任意の種類の検体を検出するように構成される。結合剤は、検出すべき検体に特異的に結合することができる適当な任意の薬剤でよい。例えば、検体がタンパク質またはペプチドである場合、結合剤は、タンパク質／ペプチドに特異的に結合することができる受容体または抗体である。一方、抗体は、抗体が特異的に結合するように設計されているタンパク質／ペプチドと結合する。核酸は、特に検体核酸とハイブリダイズすることが可能な他の核酸と結合する。微生物は、その微生物の表面上のタンパク質に特異的に結合する抗体と結合する。化学薬品、毒物、医薬品、代謝物は、適当な結合反応または親和性を介して、前記化学的検体と反応可能であるか、結合可能である化学部位と結合する。多くの種類の結合技術が、当業者によく知られている。
【００２８】
さらに、結合剤として酵素または酵素基質が挙げられる。例えば、酵素方法論でよく説明されるグルコースなどの検体が検出される、例えばグルコースとの酵素反応に引き続いて形成される反応生成物が当業者に公知の電気化学的または光学的検知法を用いて検出される。このような測定は、独立した（スタンドアロン）測定として、または試料中の検出すべき他の検体の測定と組み合わせて行うことができる。
【００２９】
結合剤は、例えば物理的吸着、共有化学結合、非共有結合性の化学結合（例えば、ビオチン−アビジン）、または上記の任意の組み合わせの方法で、常磁性粒子のような磁気剤に付着させる。好ましい実施態様では結合剤は非共有結合性の化学結合（例えば、ビオチ
ン−アビジン結合）を介して常磁性体に結合される。磁気剤／粒子に結合する結合剤を含むよう機能化した磁気剤／粒子をカートリッジのチャネル内に単に堆積させ、試料をカートリッジに適用し、チャネル内に引き込まれる際に機能化した磁気剤／粒子を流体試料によって再懸濁して試料内の検体（分析対象物）と接触するようにしてもよい。
【００３０】
前述したように、カートリッジには結合剤だけでなく、さらに前記マイクロ流体チャネルに堆積させる１または複数の試薬（reagents）を含んでもよい。この試薬は捕捉検体の検出を容易にすることができる。前記の１または複数の試薬としては、例えば、捕捉検体に特異的に結合するように調整された標識（label）が挙げられる。これによりその検出が容易になる。これらの試薬は、機能化された常磁性粒子のような他の試薬と別々にまたは組み合わせて堆積させることができる。
【００３１】
さらに、前記微小流体チャネル（単数または複数）内に堆積された試薬は、他の試薬の安定性を向上させる、試薬の再懸濁を改善／制御する、血液試料の凝固を防止する、酵素的または化学的反応に必要な基質または補因子を提供する、カートリッジに適用された後の試料のｐＨまたはイオン条件を制御する、標識により発生する信号、及び標識−誘発反応の生成物をリーダーで検出される物質へ変換する酵素により発生する信号を強めるなどの機能を有するが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
結合した検体（結合分析対象物）は、その検体が検出可能な信号を発生することができる場合は間接的に検出することができ、それにより検出領域から結合検体が除去されると信号が減少することになるし、または検体の結合において反応生成物を発生させるために反応を行い、検出領域から結合検体を取り除いた後、未反応の検体の減少量を検出することができる。しかし好ましい実施態様では、結合した検体を、その検体と結合できる標識と接触させ、続いて標識／結合剤／検体の複合体を検出領域から取り除き、残存する遊離した非結合標識を検出する。通常、標識は最初に結合剤が結合した部位とは異なる、検体の別の部位に結合することができ、またそのような複合体の生成においてのみ形成される結合剤／検体の複合体の部位に結合することができる。
【００３３】
結合剤及び任意の検出剤／標識は、カートリッジのチャンネルで堆積されるとき、乾燥状態であることが望ましい。
【００３４】
捕捉剤及び標識（検体の捕捉及び検出を容易にするように設計されている）が必要とされる場合、それらは共にまたは別々に堆積され、試料を供給して再水和する際にともに合わせることができる。アッセイで要求されるその他の試薬は、捕捉及び／または標識と共に堆積することもできるし、それらのいずれかまたは両方を別々に堆積することもできる。このようにして試薬の再水和を行うことができる。
【００３５】
各カートリッジは単数または複数の検体の検出を行うよう設計することができる。また、各カートリッジは、単一のカートリッジの使用で１以上のアッセイを行うことができるように、１以上のマイクロ流体チャネルシステムを含むことができる。
【００３６】
カートリッジは容易に大量生産できることが望ましい。
【００３７】
カートリッジが試料とともに搭載されると、任意の捕捉検体は、適当なリーダーによって間接的に検出される。本発明はこのようなリーダーを提供し、本発明の重要な態様は、試料をカートリッジに供給する以外、緩衝液または追加の流体は必要としないことである。この利点の１つとしては、カートリッジ自体は初めに乾燥していること、すなわち試料の投入前にはカートリッジ内に流体がほとんどまたは全く含まれていないことである。これは、カートリッジ自体の製造を簡素化するだけでなく、貯蔵寿命を向上させ、本発明のほとんどのカートリッジを室温で保存することができるので、カートリッジ内の化学的または生物学的成分が使用前に劣化することはほとんどない。
【００３８】
さらなる態様において、サンプルの分析を行う方法が提供される。この方法は、
サンプル中に存在する任意の分析対象物が結合剤によって結合されることが可能となるように本発明のマイクロ流体カートリッジに試料を導入すること；及び
初期の参照／対照（reference/control）値を得るために、標識（検体への結合及び未結合の両方）の量（レベル）を検出すること；
結合検体を検出領域から取り除くこと；及び
カートリッジに存在する検体の結合後に残存する任意の未結合または未反応の検体を検出すること、または未結合または未反応の検体を結合できる標識を検出することを含む。
【００３９】
通常、検体／結合剤複合体及び検体／結合剤／標識複合体は、非結合及び／または未反応の検体または非結合標識が検出できるように取り除くことができるか、またはカートリッジ内の別の場所へ移動することができる。
【００４０】
さらなる態様では、流体試料の分析を行うアッセイシステムが提供される。そのアッセイシステムは、
ａ）第一の態様による、常磁性粒子（またはそれらの好ましい具体例）を含むマイクロ流体カートリッジ；及び
ｂ）リーダー装置
を含む。
リーダーのデバイスは、
ｉ）リーダー内にカートリッジを導入するためのレシービングポート；
ii）カートリッジに磁力を適用し、カートリッジ内の検出領域から常磁性粒子を除去することが可能な磁石または磁力を発生する手段；
iii）カートリッジの検出領域から検体／結合剤複合体を除去する前と後の両方にて、カートリッジの検出領域内に存在する任意の標識を検出する検出手段
を含む。
【００４１】
他のシステムとは異なり、本発明は、検出領域から特異的に結合した複合体の除去に基づいている。初期の信号は標識及び／または結合剤の再構築後に検出することができる。標識は過剰に存在する可能性があり、その初期信号は最大または最大に近いレベルである。しかし、複合体形成や検出領域からの標識／検体／結合剤複合体の除去において、磁力の適用などにより（例えば、機能化された常磁性粒子を捕捉相として使用する場合）、標識及び結合剤に結合可能であった試料中に存在する検体の量に反比例するような信号の減少が検出できる。
【００４２】
リーダーは、カートリッジが装着されるレシービングポート（receiving port）を含む。リーダーはカートリッジが正しく装着されるように調節することができ、種々の態様を取ることができる。例えば、カートリッジは、ＣＤなどを載せるコンピュータのように、リーダーに入る搬送機構上に最初に配置することができる。または、レシービングポートはカートリッジを受入れられる大きさにし、カートリッジが正しく装着されたとき、リーダー内にある内部ストッパー部材と接した状態となる。さらに、またはあるいは、カートリッジの表面上、またはカートリッジの表面のカット部に見られる機能が、リーダー内にある機能と同じ場所に配置するように設計され、カートリッジがリーダー内に正しく配置されたときのみ、カートリッジの読み取りが可能となる。
【００４３】
さらなる態様では、カートリッジをリーダーに予め搭載（preload）し、使い捨てカートリッジとリーダーを組み合わせ、所定の位置に固定することができる。この態様において、計測器とカートリッジは分離できないため、計測器とカートリッジは、一体化された単独の使い捨て装置として１回限り使用することができる。
【００４４】
結合剤が磁気ビーズなどの磁気剤の表面に結合されている実施態様では、リーダーには、磁場を印加するようまたは近接近にして付与するよう設計されているか、または永久磁石や磁場を印加した電磁石が含まれ、それにより、前記カートリッジの微小流体チャネルの特定の領域で、磁性粒子が保持されることが理解される。この領域は、特に検出領域から離れて配置されている。検出領域外の特定の領域に磁性粒子を収集することにより、未結合標識または未結合検体の測定による任意の分析対象物の検出を容易にしたり及び／または検出感度を向上させたりすることができる。永久磁場または電磁場は、カートリッジから永久磁石を近くにまたは遠くに移動することにより、または印加磁場の強度を強めたり弱めたりすることにより、軽減または増加させることができる。
【００４５】
使用の際、磁石及び磁場は検出領域から磁性粒子を取り出すために使用される。
【００４６】
ある実施態様では、常磁性粒子は検出用の検体及び標識を捕捉するために使用される。
常磁性粒子−検体−標識複合体が形成可能な一定時間後、磁石または磁場を利用して常時性粒子（検体と標識の複合常磁性粒子を含む）を検出領域から遠ざけ、検体濃度が増加するにつれて標識濃度が減少することによる検体濃度の測定を可能にする。この実施態様では、検出領域で検出される残存する標識は完全に形成された反応複合体の一部ではない（すなわち、常磁性粒子に結合されていない）任意の標識である。これは、検体に結合していない遊離した標識である場合もあり、または検体に結合した標識の場合もある。
【００４７】
検体を検出するために使用される標識は、試料の供給によりカートリッジが充填されて再水和する際、標識（及びその他の反応成分）が検出領域全体に分散されるような方法で堆積される。標識から発生する初期信号は、検体濃度とは無関係であり、特定の検体結合を介して捕捉相の試薬（例えば、機能化された磁性粒子など）に結合された標識を除去した後に行われる特定の測定のために重要なベースラインを形成することができる。
【００４８】
本発明のリーダーはさらに、試料カートリッジ内の任意の捕捉検体を検出する検出手段を備えている。検出手段は、特定の分析に応じて任意の適当な手段とすることができる。例えば、検出手段として、標識化されたまたは非標識の結合検体または反応生成物から発生した電気化学信号を検出するポテンシオスタット（定電位電解装置）を使用することができる。結合した検体／反応生成物は固有の電気化学的特性を有しており、例えば適当な電位が印加された後に発生する電流を測定することができ、または結合した検体と電気化学的手段により検出された標識を別々に結合するために、さらなる標識を使用することができる。その他の標識として、蛍光標識、放射性標識、リン光標識、金属コロイド粒子、生物発光標識、比色標識などが採用され、それに従い検出手段が調節される。さらに、上記したように、結合した検体や放射生成物自体は、ラマン分光法などを用いて直接検出することができる。また、自然に発生する試料の成分、または化学的もしくは酵素反応により生成する物質または標識の吸光度測定を使用することができる。
【００４９】
リーダーが電気化学的検出を使用する場合、信号の測定方法としては、クロノアンペロメトリー（chronoamperometric）、ポテンシオメトリー（potentiometric）、インピーダンス（impedance）、リニアスイープ（linear sweep）、電荷移動（charge transfer）、電位差ストリッピング（potentiometric stripping）、ガルバノメトリー（galvanometric）、ボルタンメトリー分析（voltametric analysis）（微分パルス（differential pulse）、方形波（square wave）、サンプルＤＣ（sample DC）、ノーマルパルス（normal pulse）、ＡＣボルタンメトリー、ＡＣ第二高調波（AC second harmonic）、微分ノーマルパルス（differential normal pulse））などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
検出可能な標識は、単独でまたは金属酸化物、多糖類またはラテックス粒子などの微小粒子やビーズと組み合わせて使用することができる。多くの種類のラテックス及び他の粒子が、当該技術分野で知られている。
【００５１】
リーダーは、特定の温度で分析ができるような加熱装置だけでなく、１以上の異なる分析を実施するようにリーダーをプログラムすることができる適当な電気回路及びソフトウェアなどの他の機能を設けることもできる。
【００５２】
カートリッジとリーダーを含む本発明の基板（プラットフォーム）システムには、以下のような多くの特徴的な利点がある：
１．サンプル量の減少：指先穿刺血液サンプルのような流体の毛管導入により、使用時の複雑さを軽減し、どのような環境でも検査を行うことができ（例えば、救急車、ケア（介護）の現場、医師の手術、戦場、家庭等）、またグルコース検査のように製品をどこにでも置くことができる。
２．室温安定性：既存のＩＶＤテストの多くは、冷蔵貯蔵して移送することを要するが、この要件は、製品にかなりのコストがかかり、製品の使用と配布を制限することになる。試料カートリッジは初期状態で“乾燥している”ので、その安定性と貯蔵寿命の向上につながる。また、本特許に記載された特定のアッセイ法は、検出領域から特異的に結合した複合体の除去前の初期バックグラウンド測定を可能にする。この初期バックグラウンド測定は、補正のために使用することができる。
３．材料の低コストと簡便な製造工程により、売上原価（ＣＯＧＳ）が低くなり、インビトロ診断（ＩＶＤ）ストリップの販売により、実質的に利益が増加するようになる。従来の検査では、ストリップ材料費や全体的なアッセイ費用が高く複雑になる傾向にあったので、これは特に、免疫測定及び分子ＩＶＤの市場で望まれている。
４．リーダーの低コスト化。洗浄緩衝液は必要がないのでリーダー装置が簡素化される。電気化学的または単純な光学的測定などの簡単な検出方法を使用することにより、リーダー計測がシンプルになり、コストが低くなる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
以下、図面を参照しながら、実施例として本発明をさらに説明する。
【００５４】
【図１】本発明による試料カートリッジの概略図である。
【図２】本発明のカートリッジの形成方法についての概略図である。
【図３】種々の機能を示す本発明によるカートリッジを表す。
【図４】種々の機能を示す本発明によるカートリッジ表す。
【図５】本発明によるリーダー装置の概略図である。
【図６】リーダー装置の内部機構を示す。
【図７】本発明による検査カートリッジ内の湿式試薬を用いて行った総ＰＳＡ減算アッセイの応答の実験結果を示すグラフである。
【図８】本発明による検査カートリッジ内の乾式試薬及び蛍光検出を用いて行った遊離型ＰＳＡのアッセイの応答の実験結果を示すグラフである。
【図９】本発明による装置機能のブロック図である。
【図１０】本発明による均一なイムノアッセイ（免疫的測定）例の構成を示す。
【図１１】本発明の好ましい実施態様の反応機構を示す。
【図１２】本発明による２０個の測定チャネルを含む使い捨てカートリッジの概略図を示す。
【図１３】本発明による２０個の測定チャネルを含む使い捨てカートリッジの実施形態を表す。
【図１４】本発明による単一の共通の対電極を含む使い捨てカートリッジを示す。
【図１５】本発明による４個の測定チャネルを含む使い捨てカートリッジの実施形態を表す。
【図１６】ＧＯＤを２分間基質系で反応させた後、３秒クロノアンペロメトリー・トランジェント（過渡電流）（chronoamperometric transient）の３秒測定点から抽出した電流値をプロットしたＧＯＤ滴定曲線を示すグラフである。
【図１７】２４０秒トランジェント（過渡電流）（transient）の３秒測定点から抽出された電流値をプロットしたＧＯＤ滴定のグラフである。
【図１８】印加電圧−３５０ｍＶ、４分間のインキュベーションに続く２分間の反応後に−３５０Ｖで測定したＧＯＤ滴定のグラフである。
【図１９】通常の２分間のＧＯＤ滴定と、−３５０ｍＶの電圧を４分間印加した後の２分間滴定のＧＯＤ滴定曲線を比較するグラフである。
【図２０】本発明によるＰＳＡ濃度の未補正の磁気分離後の測定のグラフを示す；
【図２１】本発明によるＰＳＡの全濃度に対する磁気分離前の電流及び磁気分離後の電流の差を示す表である。
【図２２】本発明によるＰＳＡの全濃度に対する磁気分離前の電流及び磁気分離後の電流の差を示すグラフである。
【図２３】本発明による磁気分離前の電流に対する磁気分離後の電流の比を示す表である。
【図２４】本発明による磁気分離前の電流に対する磁気分離後の電流の比を示すグラフである。
【図２５】本発明による磁気分離前の電流の平均値と磁気分離後の電流の平均値との差を示すグラフである。
【図２６】本発明による、測定したＰＳＡ濃度（ｘ）と磁気分離前測定の傾きを磁気分離後測定の傾きで除した値（ｙ）の関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明の１実施態様による試料カートリッジ（１４）は図１に示される。血液などの流体は試料導入口（１３）へ導入される（例えば、指や静脈血から）。この特定の実施態様では、１つの試料導入口（１３）から４つのチャネル（４，５，６，７）へ広がっている。以下の説明は全血試料であるサンプルに関するが、これに限定するものとして解釈されるべきではない。
【００５６】
血液が試料導入口（１３）に供給されると、最初の単一チャネルは４つの別々のチャネルに分離する。各チャネルで測定を行うことは可能であり、同一検体の４つの測定で単一検体の反復結果を得ることもできるし、各チャネルで異なる検体を測定することもできる。４チャネル型のストリップを図１に示す。２０チャネル型のストリップ（１０５）は図１２に示され、１５チャネル型のストリップの物理的な実施形態（１０６）は図１３に示されている。図１２の電極構成の拡大図には、対電極（１０７）、作用電極（１０８）及び均一に堆積された関連試薬（１０９）が示され、検出領域（１０８）は、特定の試薬によって検体の結合が生じるチャネルの領域内に配置される。その他の実施態様では図１４に示すように、各作用電極に対して個別の対電極を有するのではなく、共通の対電極（１１１）が利用されるストリップ設計である。この共通の対電極は、リーダーの電子機器を簡略化することができ、また、使い捨てカートリッジ幅は電極の数に影響されるので使い捨てのカートリッジサイズを減少することができる。各作用電極に対して個別の対電極を有する場合は、２０の作用電極測定が可能なカートリッジで電極は計４０個であり、共通の対電極を有する場合は、電極数は２１個に減少される。
【００５７】
全試料の投入量は、充満させるチャネル数に応じて１μｌより少ない量とする。それはユーザーが１滴の血液などのサンプルを注入すると、すべてのチャネル（４，５，６，７）が毛管力により満たされる程度の量である。この作業は非常に速く、いくつかのイムノアッセイプラットフォームを充填する非常に長い血液分離とは対照的に、血糖ストリップの充填により適合するものである。４つのチャネル（４，５，６，７）に堆積させるものは、抗体で機能化された常磁性粒子、抗体で機能化された標識、標識酵素であり、また抗−異好性試薬（anti-heterophile reagents）、安定剤、電気化学メディエーターと抗凝固剤（８，９，１０，１１）である。試料導入口（１２）には標識酵素（１３）により電気化学的に測定可能な物質に変換される酵素基質を堆積させ、リーダーによる検出のための測定可能な信号を発生させる。
【００５８】
各チャネルに配置される電極（１，２，３）は、電気化学的測定を行うために使用されるが、他の例では、光学的またはその他の検出測定を行うことができる。また、電極は血液が十分にカートリッジに供給されたことをユーザーに伝えるためにも使用される。
【００５９】
図２に示すように、カートリッジ（１４）が３枚の基板（２０，２１及び２２）から形成される場合、チャンネルは、スクリーン印刷された電極（２３）を有する基材層（２０）と蓋層（２２）との間に挟まれた接着剤層（２４）から材料を除去することにより形成される。図２では、蓋層（２２）は接着剤（２４）に形成されるチャネル（２４）よりも短く、チャネルはカートリッジが組み立てられる際に蓋の縁部（２５）に接触し通気孔を形成する。これによりカートリッジは毛細管力により満たされ、また流体ストップ機能も形成する。図１５は、このストリップ設計（１１２）の物理的な実施態様を示す。この特定の実施態様では、上蓋を切り出した円形状の開口部（１１３）があり、この円形領域へ十分な量の試料を滴下することによって、デバイスへの充填が可能となる。
【００６０】
カートリッジ（１４）をリーダーに挿入する際、カートリッジの加熱機構を始動させ、予め規定した一定温度で検査中にカートリッジを加熱することができる。
【００６１】
カートリッジの４つの各サンプルチャネル（４，５，６，７）において、電極（図１の１，２，３）を設けてもよい。リーダーを通じて電極間の電気的導通をチェックすることにより、リーダーはチャンネル（４，５，６，７）が正常にサンプルで満たされていることを確認することができる。これは、単純なコンダクタンス測定により行うことができる。特定のチャネルにおいて、電極（１，２）が正常に血液で湿潤されると（チャネル（４）が完全に試料で満たされていることを意味する。）、電流が血液サンプルを介して一方の電極からもう一方の電極へ流れる。血液試料が存在しないか、またはチャネルが部分的にのみ湿潤している場合は、少なくとも一方の電極が湿潤せず、一方の電極からもう一方の電極へ電流が流れないことを意味する。デバイスの充填をより正確に判定するため（試料が検体検出に用いる電極を完全にカバーしていることを確認するため）、各チャンネルに追加の電極を備えることもできる。追加の電極は、各チャネルのもう一方の電極の下流側に（カートリッジへの供給時における試料の流れとの関係で）配置するとよい。別のチャネルでの追加の電極間の電流の伝導により、これらのチャネルが充填されていることが示唆され、電流の不足により一方のまたは両方のチャネルがサンプル充填されていないことが示唆されるだろう。
【００６２】
本発明のカートリッジ／アッセイシステムでは、血液サンプルのヘマトクリット値の測定が可能である。
【００６３】
図３は、端部まで流体（３３）が充填されたチャネルを有する単一チャネル型のカートリッジを示し、チャネルは、毛細管力により装置を充填し流体ストップ機能を形成する通気孔（３２）を形成する蓋（３７）の縁部によって定められる。
【００６４】
チャネルの内面は、毛細管力による充填が可能となるよういくらかの親水性を有することが要求される。ある実施態様では２つの親水性表面が使用され、また毛細管現象によりストリップを満たすために疎水性／親水性表面を組合せて使用することもできる。
【００６５】
図３では、試料は試料導入口（３３）に導入され、印刷された電極を有する基材層（３０）と蓋層（３４）との間の、チャネル端部（３６）を有する接着剤層（３１）により形成されたチャネルを満たす。電極は、蓋体層（３７）のように接着剤層が装置端部（３８）の手前で終端するので露出し（３９，４０）、これにより電極がリーダーに接続される。これは、図３に示す単一チャネル装置と同じ装置の斜視断面図である図４において、より明確に示されている。図４では、印刷された電極（５６）を有する基板層（５２）が端部（５４）が明確に分かる接着剤層（５１）に部分的に覆われている。
【００６６】
血液がサンプルチャネル（３３）（図３を参照）を満たすと、予め堆積された乾燥試薬が血液により再懸濁し、それによって存在する任意の検体（複数可）の結合が可能となる。乾燥試薬の可能な堆積位置は、図１（８，９，１０，１１，１２）に示される。血液はチャネル（３３）のストップ機能（３７）まで充填される（図３参照）。機能化された捕捉及び検出試薬が再懸濁すると、血液サンプルとのインキュベーションを所定時間（インキュベーション時間）発生させ、リーダーの適当なソフトウェア及びプログラミングによって制御することができる。常磁性粒子は、捕捉相として、また標識として選択される粒子（例えば、ラテックス）及び複合体（conjugate）として、その高い移動度及び機能性（サイズ依存性、すなわち拡散係数等）により拡散距離、最終的にはインキュベーション時間が短縮される検出相として選択することができる。このタイプの反応は、血液サンプルからの検体の結合において非常に効率的でかつ再現性がある。検体を結合する捕捉相及び検出相において、ヘマトクリット測定は電極（３９，４０）により行ってもよい。ヘマトクリット値は、臨床分析機器によるプラズマ（血漿）の測定を参照値とすることできるので、検体の最終濃度を計算するためにリーダーにより使用することができる。ヘマトクリットの測定は、血漿に対する赤血球の比率が異なることによる所定量の試料中に存在する検体に付随する濃度差を補正するために必要とされる。したがって、全血測定ではヘマトクリットの測定によってこの差を補正することができ、その結果は血漿サンプルに関する結果と一致する。
【００６７】
捕捉相及び検出相試薬が、血液中の任意の検体と結合した後、永久磁石または電磁場を作用電極近傍から常磁性粒子（常磁性粒子−検体−標識複合体を含む）を除去するために使用することができる（図３では、３９及び４０はカウンター／参照電極及び作用電極を表し、いずれか一方の電極をいずれか一方の機能としてリーダーに構成することができる）。この場合、残存する標識の検出は（直接的に、または標識−触媒反応または標識−媒介反応を介して）、電気化学的手段により作用電極で検出することができる。
【００６８】
当然のことながら、前述の説明は、図１を参照して４個のチャネル型のカートリッジに関して、また図３，４では単一のチャネルに関してなされたものであるが、本発明はまた、複数のチャネル、例えば６個、７個、８個のチャネルを有するカートリッジや、図１２，１３，１４に示す例のような２０個のチャネル型カートリッジにも関する。各チャネルでは、再現性／精度向上のために、同じ反応を行ってもよいし、異なるアッセイを実施するように設計することができる−この場合、各カートリッジは、“マルチプレックス（multiplex）（複数の）”反応が行えるようにしてもよい。
【００６９】
最終的に、検出する標識に適した電気的、光学的または他の検出手段を用いて、リーダーにより測定（例えば、電気化学的）が行われる。例えば、標識が電気化学的に活性である生成物を生成する反応を触媒する酵素である場合、検出手段は、図３（３９，４０）に示すカートリッジ内の電極による電気的なものである。図５及び図６に、本発明に係る携帯型リーダーの概略図を示す。リーダー（７０）は、本発明のカートリッジ（６１）を受け入れ保持するためのプラットフォーム（７２）を含む。また、適当な検出手段；カートリッジ（１０４）と接合するコネクタ、電気回路及び関連するコンピュータチップ（複数可）、及びリーダーを制御し、アッセイを行うためのソフトウェアを含むＰＣＢ（ポリ塩化ビフェニル）（１０３）が設けられている。さらに、上述のシステムは常磁性粒子を用いたアッセイを実行するための適応性があるので、この装置には、カートリッジに近接するモータ（１０２）により永久磁石（１０１）を移動する機能が備えられる。例えば、必要に応じて常磁性粒子を操作するために、カートリッジに向かう方向や離れる方向、またはその他の任意の方向へ移動することができる。
【００７０】
リーダーは、またカートリッジプラットフォーム（７２）が熱伝導性を有する材料からなる場合には、積極的に加熱することによりカートリッジに供給された試料の温度を制御することができる。
【００７１】
図５は、結果をリーダー画面（６２）に表示することができる計測器の物理的実施形態を想定した図である。
【００７２】
リーダーの主な機能は、図９のリーダー機能のブロック図に示されており、以下の通りである。
１．カートリッジの信号測定
２．カートリッジの温度制御
３．常磁性粒子の操作
４．較正機構
【００７３】
リーダーは、別々の各テストチャンネルに別々の正確な電気信号を印加して、テストカートリッジの特定のテストチャネル内で行われる所望の電気化学反応を開始、保持、制御することができる。このような電気信号の例としては、ある電圧電位からまたは開回路状態から別の電圧電位状態へのステップ状の信号、ある電位から別の電位への規定時間内でのリニア・スイープ（linear sweep）、または非線形波形の生成、例えば特定の周波数の正弦波及び電圧振幅などがある。リーダーは、異なる測定チャネル間で切り替えるために、アナログスイッチングマルチプレクサー（多重化装置）を使用することができる。
【００７４】
装置は、各テストチャネルからの電気／電気化学的応答を別々に測定することができる。テストカートリッジから測定される信号としては、例えば、直流電流または交流電流、または電圧電位である。リーダーは、異なる測定チャネル間で切り替えるために、アナログスイッチングマルチプレクサー（多重化装置）を使用することができる。
【００７５】
リーダーは、カートリッジとの電気信号のやりとりを確実に行うために、印刷されたテストカートリッジ上の電極と物理的に接触するコネクタを有する。このコネクタは、リーダーのＰＣＢ上に直接取り付けることができる。
【００７６】
提案されるシステムでは、複数の測定、例えば使用される単一のテストサンプルで２０の別々の測定が実行可能であるカートリッジとリーダーで構成され、本システムは、精度と信頼性の結果を改善するために、これらの複数の測定値を使用することができる。テストシステムが同じ検体の複数の別々の測定値を測定するために使用する場合は、このシステムは、得られた２０の結果の平均または両端切取り平均（truncated mean）分析を行うことができる。両端切取り平均分析の場合、２０の結果を大きさの順に仕分けする装置のソフトウェアを用い、最高側と最低側の結果（例えば各々５）を除去し、残りの結果（例えば１０）の平均を求める。標準的な平均値に対する両端切取り平均値の利点は、統計的（または実用的）に外れ値を、平均値を求める前にデータ群から除去することができることである。これにより、期待される結果よりも実質的に高いあるいは低い値へ平均値がシフトする異常な結果が得られることがなくなる。
【００７７】
低コストのアッセイシステムの場合、この方法に関する特定の改善として、不正確なテストサンプル量、不正確な試薬の供給量、不正確な試薬の配合、及びテストサンプルチャネルまたは関連試薬の物理的または環境的な損傷のような原因による異常に高いまたは低い結果を除くことが可能であることが挙げられる。本特許で説明するシステムは、テストカートリッジ内の各サンプルチャネルが、別々の試薬堆積、別々の検出手段（例えば、作用電極と対電極）及び別々のサンプルチャネルなど、事実通り分離されているので、特にこの両端切取り平均分析に適している。
【００７８】
このシステムでは、複数検体の複数の測定値を測定し、単一の検査で複数の分析結果の精度を向上させるように構成することができる。
【００７９】
カートリッジ温度制御：リーダーは検査カートリッジの温度制御が可能である。リーダーの機械的設計では、装置ＰＣＢとテストカートリッジが接続される。したがって、装置ＰＣＢを介してカートリッジと連結されたソース（例えば高電力低抵抗の抵抗器、ＭＯＳＦＥＴトランジスタまたは薄膜フレキシブルプリント回路基板の発熱素子）から発生した熱により加熱することが可能である。これは、検査カートリッジの一点と熱源の一点の両方に接触しているＰＣＢの露出した銅領域によって達成することができる。
【００８０】
その他のリーダー設計では、例えばアルミニウムなどのテストカートリッジへの熱伝達に適した材料で作成された分離された加熱ブロックを含むことができる。この独立した加熱ブロックは、テストカートリッジと直接接触するようにリーダー内に設置してもよい。
【００８１】
試験カートリッジの温度制御は、テストカートリッジと直接接触している表面に接触して１以上の温度センサを配置することによって効果が生じる。リーダーでは、熱に晒される試験カートリッジの温度を監視し、熱源を制御することによりカートリッジに伝達される熱エネルギーの量を調節することができる（例えば、ＭＯＳＦＥＴを介して流れる電流の量を増減させることができる）。
【００８２】
常磁性粒子の操作：リーダーは、テストカートリッジのテストチャンネル内に含まれる常磁性粒子を所定の位置へ収集することが可能である。例えば、リーダーは常磁性粒子を、テストチャネルの作用電極と向かい合ったカートリッジ表面に収集することができるし、検出領域から特別に分離されたテストチャネル上の別の場所に収集することもできる。これを達成する１つの方法は、常磁性粒子を収集するために永久ネオジム磁石を使用することである。磁石を物理的に単一の平面内で移動できるような機構を設け、磁石はある位置でカートリッジと物理的に接触し、常磁性粒子が磁石によって収集され、また他の位置では磁石とテストカートリッジとの間には物理的距離があって、磁石による磁場の影響下にない。
【００８３】
一平面内での磁石の物理的な動きは、例えば、リニアアクチュエータ、ギア機構を用いた回転モーター、または時計仕掛け機構、機械的ばね機構などの使用により電動で、またユーザーにより磁石の移動が開始され制御される手動機構などを介して駆動される。
【００８４】
別の実施態様では、常磁性粒子の制御が通電または非通電によって実行される場合には、永久磁石は電磁石に置き換えることができる。またはリーダーは、常磁性ビーズが集められる所定の位置に固定された永久磁石を実装することができる。
【００８５】
これらの異なる方法を使用して、リーダーは常磁性ビーズに、散在している状態からカートリッジの特定の場所（location）に収集するように作用する。この場所は、常磁性ビーズを、カートリッジの１表面から別の表面へまたはカートリッジの１表面に沿って移動させ、またはカートリッジの表面間を移動させ、またはそれらの組合せにより移動させる。
【００８６】
較正機構（Calibration Mechanism）：使い捨て分析テストカートリッジの製造に関連した工程のばらつきのために、通常、カートリッジの各バッチごとの特徴を把握しておく必要があり、また特定の較正値をリーダーに入力する必要がある。これによってテストカートリッジから発するアッセイ応答が、最終的な分析結果が報告される前に、リーダーにより内部で正規化（normalised）される。この問題を解決するために、リーダーのメモリには異なる較正パラメーターのセットを予めロードしておくことができる。リーダーは、テストストリップ自体の上に、またはテストストリップの装置に独立して挿入される別々の基板上の異なる場所に実装される表面実装抵抗の値により、ある特定のテストカートリッジに使用する較正パラメータのセットを判断することができる。その後、この装置は、予めロードされた特定の較正パラメータセットに関連付けられる表面実装抵抗の値を測定することができる。抵抗バンドのセット（set band of resistances）は、較正コードのセットと関連付けることができる。あるいはレジスタをキャパシタに置き換えることができ、リーダーは、較正コードを有する異なるレベルのキャパシタンスを判断する。あるいは、レジスタをインダクタに置き換えることもでき、リーダーは、較正コードを有する異なるレベルのキャパシタンスを判断することになる。さらに、任意のレジスタ、キャパシタ及びインダクタとの組み合わせを使用することができる。
【００８７】
周囲温度が応答の大きさに影響を与えることは、アッセイ開発の物理的な特徴である。本発明では、この温度効果は、拡散に対する温度の影響により引き起こされる。それにより温度の上昇が常磁性ビーズと標的分析物、及び標識と標的分析物との間の結合効率の増加につながる。酵素活性に及ぼす温度の影響は、また酵素が使用されるアッセイ応答に大きく貢献するだろう。本システムは、例えば医師のオフィスや家庭において使用することができ、このシステムがさらされる温度範囲は摂氏１０℃から４０℃程度までと広い。この温度の影響を取り除く１つの方法は、所定の温度、例えば摂氏４０℃でテストストリップを加熱することである。これにより温度の影響に起因するこのアッセイに係るすべてのばらつきが削除される。またカートリッジを加熱すると、粘度の違いによる血液から血液への影響を最小限に抑えるのに役立つ。このように、リーダーは、前述のようなヒーターとして温度制御手段を備えることができる。
【００８８】
ある特定の態様においては、サンプルカートリッジとそれに関連付けられるリーダーは、検出すべき検体が抗原であり結合剤が抗体であるイムノアッセイ（免疫学的測定法）を行うように設計される。常磁性粒子は、遊離型抗原か、遊離型及び複合型抗原のどちらかに対する抗体の結合によって機能化される。
【００８９】
以下の説明は全血試料であるサンプル、電気化学的検出を引き起こす酵素である標識検出、及び常磁性粒子捕捉相に関するが、これに限定して解釈されるべきではない。
【００９０】
血液がカートリッジのサンプルチャネルに満たされると、図１に示す最初のチャネル（１２）、及び各チャネル（８，９，１０，１１）内に乾燥試薬として予め堆積された試薬は血液により再懸濁し、検体（複数可）の結合が開始される。各チャネル（８，９，１０，１１）内の堆積試薬は、抗−検体抗体で機能化された常磁性体粒子、標識（例えば、抗−検体抗体−酵素複合体）、電気化学的伝達物質（メディエーター；mediator）、抗凝固剤、抗ヘテロフィル試薬（anti-heterophile reagents）及び安定化試薬を含有する。一方、最初の供給チャネル（１２）に堆積される試薬は、酵素基質を含有する。
【００９１】
血液がストリップを満たす際、乾燥酵素基質は再懸濁され、血液によって４つの測定チャネル（酵素基質が過剰になっている箇所）へ輸送される。各チャンネル内の他の試薬は、血液が各チャネルを満たす際に再懸濁される。抗−検体抗体−酵素複合体は、直ちに基質を変換して電気化学的メディエーターとの反応を開始する。電気化学的メディエーターは還元型から酸化型へ変換される。同時に、分析物はイムノアッセイ結合試薬（抗−検体抗体で機能化された常磁性粒子及び抗−検体抗体酵素複合体（標識））により結合される。チャネルを通じて生じているこれらの均一の事象は、所定期間（２〜４分の結合時間）発生させることができる。これらの工程及びこれに続く工程は、４つの全チャネルにおいて、各チャンネルで同じ検体に対してまたは異なる検体に対して生じており、各チャネルでは抗体の組合せを変更することができる。
【００９２】
電気化学的測定は、所定の時間に行われる。この時間は、結合時間の終了時、結合中またはストリップが充填された直後とすることができる。クロノアンペロメトリー測定が行われ、電流はメディエーターの電気化学的還元電位で測定される（電気化学的メディエーターは（遊離及び結合）標識によって酸化型に変換される）。この時点で、検体の全ての濃度は、クロノアンペロメトリック・過渡電流（chronoamperometric transient）から計算される同じ値のレート（秒当たりの電流）を有する。
【００９３】
所定の結合時間後、磁石（永久磁石または電磁石）が電極面に対向する蓋面に適用される。常磁性粒子は、蓋の内面に磁力により引きつけられる。作用電極はそのすぐ上の試料のみを測定するので、常磁性粒子が電極に対向する蓋内面に磁力により引きつけられるとき、常磁性粒子には混合した常磁性粒子群が含まれる。常磁性粒子群は、検体に結合しない常磁性粒子、検体に結合した常磁性粒子、及び検体と標識に結合した常磁性粒子（完全なサンドイッチ型の免疫複合体）に分離される。
【００９４】
形成されたサンドイッチ免疫複合体の数は、血液試料中の検体の濃度に比例する。血液中の検体濃度が高いほどサンドイッチ免疫複合体が多く形成され、磁気蓄積時に作用電極の近傍から除去される。従って、この工程は、作用電極での酵素標識濃度を変化させ、検体濃度依存性で生じている。この工程はリアルタイムで測定されるため、クロノアンペロメトリック・過渡電流から計算されるレートは、酵素濃度（検体濃度に比例する）に比例する。従って、レートは検体濃度が増加するにつれて減少する（結合した酵素が多くなるとより多くのイムノアッセイ複合体が形成される）。従って、このアッセイ・フォーマット（assay format）は、従来の不均一なアッセイ・フォーマットではなく、均一なアッセイ・フォーマットにより適合（in tune with）している。このアッセイ・フォーマットを、具体的に電気化学的検出法を用いる酵素標識について図１０に示す。
【００９５】
図１０Ａ及びＢは、均質なイムノアッセイ・フォーマットの概略図であり、チャネル上部（８４）と底部（８５）を有するカートリッジ内のチャネル断面を示し、磁場を付与する前（図１０Ａ）及び後（図１０Ｂ）の作用電極（８１）を示す。Ａでは、標識粒子（８２）と常磁性粒子（８３）は、試料（８７）により再水和される。試料はまた酵素基質及び電気化学的メディエーターを再水和し、酵素標識は再水和の開始から、この基質及びメディエーターと反応する。Ａでは、また結合反応が磁性粒子、検体及び標識の間で生じ、完全な免疫複合体（８６）が形成される。上記領域及び作用電極の周辺領域のみが示されているが、この工程はチャネル全体で行われている。電気化学的測定は、所定の結合時間経過後Ａの状態で開始され、磁石（８０）が、Ｂに示すように、電極面（８４）と反対側の上面（８４）に適用される。すべての常磁性粒子が免疫複合体が形成されるか否かにかかわらず、蓄積される。常磁性粒子とともに蓄積された酵素標識の量は、検体濃度に比例する免疫複合体の形成数に依存する。常磁性粒子及び完全に形成された免疫複合体が磁石の適用により作用電極の近傍から除去されるので、検体濃度が増加すると、電気化学的に測定されるレート／応答が減少する。この例では磁力が作用電極と対向する表面に適用されているが、磁力は常磁性粒子が検出領域から除去されるサンプルチャネルの任意の場所に適用することができる。
【００９６】
本発明の好ましい実施態様では、常磁性粒子と標識が、異なる抗原エピトープを認識する捕捉物及び標識抗体を用いて検体を捕捉することにより、イムノアッセイ積層構造（サンドイッチ構造）を形成するために使用される。本発明のアッセイ・フォーマットの望ましい実施態様では、標識酵素としてグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）を使用する。ＧＯＤは広く血糖測定に使用されてきた。特に、ＧＯＤが過剰で電気化学的メディエーターがストリップで乾燥している場合、ＧＯＤは血液中に含まれるグルコースと反応し、電気化学的メディエーターが酸化型から還元型へ変換され、その後電気化学的に電極で測定される。このシステムはすべての反応成分が過剰である場合に良好に機能し、グルコース濃度がレートを決定するファクター（因子）になる。ＧＯＤは、酵素免疫測定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA）用の酵素標識として使用されているが、電気化学イムノアッセイでは、ＧＯＤは酵素標識としてかなり感度が低いことが分かっている。この問題は、直接結合する電気化学的メディエーターを採用することにより解決される。酸素はＧＯＤ反応での真の受容体であるが、フェリシアニドは、電気化学的測定を行うことができるように、反応物を電気化学的に結合する人工受容体として使用される。
【００９７】
このフェリシアニドとＧＯＤとの反応は、酸素に比べて非常に不利であるが、フェリシアニドを非常に高い濃度にすることにより克服される。この問題は、また、ＧＯＤ自体を過剰にすることにより非効率性がわずかなものとなるので、グルコースセンサーでも克服される。酵素系の免疫測定法では、酵素濃度が測定され、ＧＯＤとフェリシアニドの好ましくない相互作用により感度の問題が生じる。本発明の好ましい実施態様では、この問題を図１１にまとめた結合反応を用いることにより解決する：ＧＯＤはグルコース及び酸素をそれぞれグルコノラクトン及び過酸化水素へ変換する（ＧＯＤ補因子としてＦＡＤ（flavin adenine dinucleotide）を使用）。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及びフェロシアニドが（グルコースと同様に）過剰に存在するので、生成された過酸化水素が、直ちに電気化学的還元反応でフェロシアニドをフェリシアニドへ変換するためＨＲＰにより使用され、その後フェリシアニドは電極で測定される（その後、電極からの電子の損失でフェリシアニドは電気化学的に還元されフェロシアニドに戻される。）。ＧＯＤは、人為的にフェリシアニドと反応せざるを得ないので、酵素標識としてはるかに敏感になり、グルコースの代謝回転は妨げられ、より低いＧＯＤ濃度が測定できる。これは、すべての酵素標識についても同様である；自然界の反応の酵素レートは、測定される事象が酵素反応であるので考えられるいかなる結合系よりも大きい。酵素カスケードを使用すると、二次反応では酵素とメディエータの両方とも過剰で、律速ではないので、この問題を避けることができる。
【００９８】
上記のスキームを使用することには多くの利点がある：
１．ＧＯＤ反応が妨害されず、ＧＯＤ濃度が高感度に測定可能である。
２．ＧＯＤは強固な安定性のある酵素であるので、血中グルコースをモニターする物質として使用される。例えば、ＨＲＰなどの他のラベルは安定性がないことが知られているが、本発明の実施態様では、ＨＲＰの不安定性は、酵素の過剰（大過剰）によって克服することができる。
３．ＧＯＤ／ＨＲＰ反応によって生成したフェリシアニドの濃度を測定するために電気化学的還元を行う。還元反応は血液中の電気化学的干渉の影響を著しく低減する。大多数の物質は酸化反応を妨げる。
４．過剰にできないＨＲＰ及びその他の酵素基質（アルカリホスファターゼなど）とは異なり、すべての成分が過剰（高溶解性で）なので、電気化学的測定に関する直線性（linearity）の問題は存在しない。
５．ほとんどのアッセイにおいてバックグラウンド測定は、較正時の信号振幅の測定によって決定される。このバックグラウンド測定は平均値であり、通常関連する大きな誤差を伴う。バックグラウンドは、堆積試薬濃度のばらつき、検出領域のばらつき、血液間の違いなどの要因によりかなり変動する。これによりほとんどのアッセイの感度が低下する。このシステムでは、バックグラウンドは各チャネルで磁石が適用され特定の信号測定が行われる前に測定される。このように各測定値は、個別にバックグラウンドの補正がされ、非常に感度の高い正確なアッセイ結果を得ることができる。
【００９９】
カートリッジ内に複数のチャネルが存在することにより、検体の測定範囲を拡張できることになる。例えば、典型的な免疫アッセイの用量反応曲線はシグモイド型曲線となる。これは、試薬飽和（試薬が不足して線形結合を維持できない）か、標識／検出法の飽和（すなわち、検出法が飽和して直線的に標識を測定できない）のいずれかによって引き起こされる。しかし、本発明のプラットフォームでは、必要であれば、測定範囲のすべてに渡り線形応答が可能であり、これは異なるチャネルで、異なる試薬を用いるか、または試薬濃度を変えることによって達成される。例えば、リーダーは、限られた濃度範囲ではあるが、非常に高感度となように設計し製造した試薬を備えた１つのチャネルを用いて標識濃度を測定することができる。第二のチャネルでは、試薬を感度はより低いが、同じ分析物に対してより広い濃度範囲を測定できるように設計し製造することができる。したがって、第一のチャネルで達成された信号が、閾値を越えている場合（すなわち、キャリブレーション時にそのアッセイ群の測定可能範囲を超えて高い分析物濃度を表す場合）、他のチャネルからの信号が使用され、反対に、第二のチャネルからの信号が、閾値を下回る場合（すなわち、キャリブレーション時にそのアッセイ群の測定可能範囲より下の低い分析物濃度を表す場合）、第一のチャネルからの信号が分析物の濃度を決定するために使用される。本発明のプラットフォームは、測定可能範囲に渡り線形応答を達成する様々な方法を可能にする。これにより、より正確なキャリブレーションにより試料内及び試料間の精度向上につながり、ひいては合計許容誤差（Allowable Total Error）（ＡＴＥ）の向上につながる。常磁性粒子複合体が検出領域から除去される前に測定が行われた場合には、結果を正規化し、標識濃度または露出した検出領域など発生する可能性のある任意のばらつきの補正に使用できるバックグラウンドの測定ができることになる。
【０１００】
また、複数のチャネルにより、同じカートリッジにおいて異なる試験を組み合わせて行うことができ、例えば、１つのチャネルではクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の測定のために設計された試薬を用い、別のチャネルではアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の測定のために設計された試薬、また別のチャネルではヘマトクリット（Ｈｃｔ）の測定のために設計された試薬を用いることができる。このような組み合わせは、例えば馬などの血液サンプルを使用する獣医学の分野での用途で極めて有用である。これらの検体の場合には、ＣＫ及びＡＳＴは、図１０に示すような方式を用いたサンドイッチ免疫測定法により測定することができる。また、ＣＫ及びＡＳＴのいずれかまたは両方で、酵素結合反応により検出可能な反応物を産生する酵素活性を用いて検出することができる。これらのテストは、カートリッジで、２つの電極間の血液試料のコンダクタンスを用いるヘマトクリット測定と組み合わせることができる。また、異なる検体を、１つのチャネル内で検出することもできる。例えば、別々に発光する蛍光標識を、異なる分析物に対して用いることができ、すべての異なる標識発光からの信号を読み取る能力を有するリーダーで検出できるすべての検体に対して反応する磁性粒子とともに用いられる。
【実施例】
【０１０１】
以下、本発明の具体的な実施例によって得られた実験データを示す。電気化学的な信号は、リーダーの代わりに市販のポテンショスタットを用いて検出している。
【０１０２】
総ＰＳＡ（Ｉ）の電気化学的アッセイ
試薬類：
ニュートラアビジン：サーモサイエンティフィック（Thermo Scientific）社、カタログ番号 31000（ニュートラアビジン  ビオチン結合タンパク質）
マレイミド−ＰＥＧ２−ビオチン：サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 21901（ＥＺ-リンクマレイミド−ＰＥＧ２−ビオチン）
ラテックス粒子：インビトロジェン（Invitrogen）社、カタログ番号 C37259（CML  ラテックス  ４％  W/V、10μm）
常磁性粒子：アデムテック（Ademtech）社、カタログ番号 03223（200nm Strep+ 常磁性粒子）
抗体１Ｈ１２：ハイテスト（Hytest）社、カタログ番号 4P33 MAb 1H12（抗ＰＳＡ、ヒト）
抗体５Ａ６：ハイテスト社、カタログ番号 4P33 MAb 5A6（抗ＰＳＡ、ヒト）
ｂＧＯＤ：ロックランド（Rockland）社、カタログ番号 B000-07（ビオチン化グルコースオキシターゼ）
ＰＢＳ：サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 28372（BupH リン酸緩衝生理食塩水パック）
ＢＳＡ：シグマ（Sigma）社、カタログ番号 A4503-50G（ウシ血清由来アルブミン）
水：シグマ社、カタログ番号 W4502（分子生物学用の水）
酢酸アンモニウム：シグマ社、カタログ番号 1542-250G（酢酸アンモニウム）
ＭＥＳ：シグマ社、カタログ番号 M8250-25G（2-モルホリノエタンスルホン酸（MES hydrate））
フェロシアン化物（Ferrocyanide）：シグマ社、カタログ番号 P3289-100G（フェロシアン化カリウム（potassium ferrocyanide））
グルコース：シグマ社、カタログ番号 G8270-1 KG（グルコース（D-(+)-Glucose））
塩酸（ＨＣｌ）：シグマ社、カタログ番号 H1758-100ML（塩酸（hydrochloric acid）、36.5-38％）
水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）：シグマ社、カタログ番号 72068（水酸化ナトリウム溶液（sodium hydroxide solution））
ＨＲＰ（ペルオキシダーゼ）：BBI Enzymes社、カタログ番号 HRP4C（西洋ワサビペルオキシダーゼ（Horseradish Peroxidase））
２ＭＥＡ：サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 20408（２−メルカプトエタノールアミン塩酸塩）
ＰＳＡ標準品（WHO 1st IRP（96/670）に従って較正済み）：パーキンエルマー（Perkin Elmer）社、カタログ番号 A073-301（前立腺特異抗原測定キット（ProStatus PSA free/total kit）、Delfia（登録商標））
ビオチン定量化測定キット（Biotin quantification kit）：サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 28005（ピアース  ビオチン標識効率測定キット（Pierce biotin quantification kit））
サイズ排除カラム：ＧＥヘルスケア社、カタログ番号 17-0851-01（PD10カラム）
ＥＤＴＡ：シグマ社、カタログ番号 EDS-100G（エチレンジアミン四酢酸、無水）
トゥイーン（Tween）：シグマ社、P7949-100ML（Tween-20）
ＤＭＳＯ：サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 20684（ジメチルスルホキシド）
酢酸：シグマ社、カタログ番号 32,009-9（酢酸）
【０１０３】
試薬の調製：
抗体のビオチン化
抗体のジスルフィド結合の還元；
抗体の１Ｈ１２及び５Ａ６を１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中の２ＭＥＡを用いて、３７℃で９０分で還元する。還元された抗体をＰＤ１０カラムに通し、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中で収集し、タンパク質が含まれると判断される（ＵＶ分光光度計での２８０ｎｍの測定によって）フラクション（画分）を収集する。還元抗体の濃度は、２８０ｎｍで１ｍｇ／ｍｌ＝１．４吸光度単位である抗体の吸光係数を用いて算出される。
【０１０４】
マレイミド−ＰＥＧ２−ビオチンの抗体への結合
マレイミド−ＰＥＧ２−ビオチンを、効率的な結合が起こるようにモル過剰で還元された抗体に添加し、次いで室温で３時間インキュベートする。その後、それを１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２で予め平衡化された別のＰＤ１０カラムに通す。５００μｌのフラクション（画分）を収集し、ＵＶ分光光度計を用いて２８０ｎｍで測定する。相当量レベルのタンパク質を含む画分を選択し、混合する。この溶液の試料を吸光度により２８０ｎｍで再度測定し、抗体の濃度は２８０ｎｍで１ｍｇ／ｍｌ＝１．４吸光度単位である抗体の吸光係数を用いて決定される。その後、抗体あたりの結合ビオチンの数は、製造元の指示に従って、ピアースビオチン定量キットを用いて決定される。
【０１０５】
ラテックス
ニュートラアビジンの吸着
１０μｍのラテックスを、４℃で５分間、16100×ｇでの遠心分離を使用して、ＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．５）で洗浄し、粒子をペレット状にする。そのラテックスを、固形分濃度２％で再懸濁する。ニュートラアビジンは水中で４００μｇ／ｍｌの濃度に調製する。等量の２％のラテックスと４００μｇ／ｍｌのニュートラアビジンを一緒に加え、よく混合する。それらをロータリーミキサー（３０ＲＰＭ）で混合しながら室温で１８時間インキュベートする。その後、その粒子を等量のＰＢＳ（ｐＨ７．２）で３回洗浄し（４℃、16100×ｇで５分間、遠心分離を使用）、固形分濃度２％で同様のＰＢＳ中で再懸濁する。
【０１０６】
ラテックスに結合するビオチン化グルコースオキシターゼ（ＧＯＤ）及びビオチン化抗体５Ａ６
１０μｍのラテックスを、５０ｍＭ、ｐＨ４．２の酢酸アンモニウムで洗浄し（４℃、16100×ｇで５分間、遠心分離を使用)、同様の酢酸アンモニウム中で固形分濃度１％で再懸濁する。ビオチン化されたＧＯＤは、５０ｍＭ、ｐＨ４．２の酢酸アンモニウムで希釈し、濃度１６０μｇ／ｍｌにする。ビオチン化された抗体５Ａ６は、５０ｍＭ、ｐＨ４．２の酢酸アンモニウムで希釈し濃度４０μｇ／ｍｌにする。その後等量の４０μｇ／ｍｌ  ｂ５Ａ６を、１６０μｇ／ｍｌ  ｂＧＯＤに添加する。次いでこの混合物を１％ニュートラアビジンを被覆したラテックスと１：１の割合で混合する。この溶液を十分に混合し、ロータリーミキサー（３０ＲＰＭ）で振盪しながら、室温で３０分間インキュベートする。
【０１０７】
その後、その粒子を等量のｐＨ７．２、ＰＢＳで４回洗浄し（４℃、16100×ｇで５分間、遠心分離を使用）、任意の未結合のビオチン化ＧＯＤ及びビオチン化抗体を除去し、ｐＨ７．２、ＰＢＳ中で再懸濁し、固形分濃度１％のラテックスを得る。
【０１０８】
常磁性粒子
粒子への抗体の結合
２００ｎｍのストレプトアビジンを被覆した常磁性粒子を、０．１％tween、ｐＨ７．２、ＰＢＳ中で洗浄し（磁気分離器を使用）、固形分濃度０．５％になるように同様のＰＢＳ中で再懸濁する。ビオチン化抗体１Ｈ１２を０．１％tween、ｐＨ７．２、ＰＢＳ中で希釈し、５０μｇ／ｍｌとする。等量の０．５％常磁性粒子と５０μｇ／ｍｌビオチン化抗体を合わせて混合し、ロータリーシェーカーを用いて３０ｒｐｍで振盪しながら、室温で３０分間インキュベートする。
【０１０９】
その後、その常磁性粒子を等量の０．１％tween、ｐＨ７．２、ＰＢＳ中で４回洗浄し（磁気分離器を使用）、固形分濃度１％の常磁性粒子になるように同様のＰＢＳ中で再懸濁する。
【０１１０】
アッセイ（分析）手順
アッセイ試薬を、以下に示す量と濃度でエッペンドルフ（登録商標）チューブに入れる：
１％常磁性粒子（ｂ１Ｈ１２を結合した）：２μｌ
１５０ｍｇ/ｍｌ  ＢＳＡ、０．２５％tweenのすべてをｐＨ７．２、ＰＢＳに含む：４μｌ
１％ラテックス（ｂＧＯＤ及びｂ５Ａ６を結合）：２μｌ
ＰＳＡスタンダード：２μｌ
すべての試薬をエッペンドルフに別々に加え、チューブに内に保つ。
最終的にすべての試薬は、
反応緩衝液：１０μｌ
（反応緩衝液は１Ｍ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、２００ｍＭ  グルコース、２００ｍＭ  フェロシアニド、２ｍｇ／ｍｌ  ＨＲＰから成る。）
を添加して混合される。
【０１１１】
これらの試薬を完全に混合した後、０．７μｌをポテンシオスタット（Autolab社製 PGSTAT12）に接続しているカートリッジに加える。カートリッジは、図３及び図４に示すように、スクリーン印刷された２つの炭素電極（一方は作用電極で、他方はカウンター／参照電極）を有する単一のチャネルから構成されている。測定は下記の減算法（subtraction method）によって行われる。
【０１１２】
減算法によるアッセイ（subtraction assay）
４．５分間のインキュベーション後、ポテンシオスタットを開回路から−０．１Ｖへと変化させ、トランジェント（過渡電流；transient）を０．１秒ごとにデータに記録する。５分間のインキュベーション後、作用電極から常磁性粒子複合体を取り除くように磁石をカートリッジ（すなわち、電極の反対面上）に適用させる。結果として得られたトランジェントをさらに５分間記録する。作用電極での反応レート（反応率）は、−０．１Ｖまでの電位ステップの後、約２００秒と３００秒の間で取得されるデータから計算される。
【０１１３】
アッセイ機構の概要
このアッセイの機構では（図１１参照）、試薬が混合されると直ちに、ＧＯＤはグルコースをグルコノラクトンへ変換させ、同時に酸素は過酸化水素へと変換する。次に過酸化水素は、後にフェロシアニドをフェリシアニドに酸化するＨＲＰの基質として作用する。従って生成されるフェリシアニドの濃度は、それ自体がＧＯＤの濃度に依存する生成過酸化水素濃度に依存する。フェリシアニドの濃度は、クロノアンペロメトリーにより測定される。この場合、２電極システムにおける作用電極及びカウンター／参照電極間の−０．１Ｖの電位で発生する電流を測定する。磁石が（作用電極から離れた反対側の面で、作用電極のすぐ上の位置に）適用されると、常磁性粒子は、作用電極近傍から離れ磁石に向かって移動する。ＰＳＡ濃度に応じて、ＧＯＤに被覆された複数の標識粒子は、それ自体がＰＳＡを介して常磁性粒子への付着することによっても除去される。この場合、作用電極表面（測定される箇所）でのＧＯＤ濃度は、除去される標識粒子の数（これは試料中のＰＳＡ濃度に依存する）に応じて減少する。
【０１１４】
結果と考察
図７に検査（テスト）カートリッジにて湿式試薬を用いて行った総ＰＳＡ減算法アッセイ応答の実験結果を示す。検査は緩衝液基質中で０．７μｌの量を使用し、合計１０分間行った。０ｆＭでのＰＳＡの結果は、異なる日に行われた２つの標準偏差誤差のある４つの別々の測定値の平均を示している。他のすべてのデータの測定点は、単一の測定値を表す。ｘ軸は総ＰＳＡ濃度をｆＭ（フェムトモーラー）で表し、ｙ軸は反応レートをＡ／Ｓ（アンペア／秒）で表している。
【０１１５】
図７に示されたデータは、このアッセイ形式がコントロールゼロから１０ｆＭをはるかに下回る総ＰＳＡが容易に検出可能で、非常に高感度であることを示している。このデータは、ほとんどの場合総ＰＳＡレベルが増加するにつれて測定点間の微分係数（defferentiation）が減少する応答となる約２桁範囲（１．５７−１５５ｆＭ）の測定が可能であることを示している。
【０１１６】
減算アッセイでは、磁石が作用電極近傍からＰＳＡを介して電気化学標識と複合化した常磁性粒子を遠ざけるので、総ＰＳＡ濃度の増加によりレート（変化率）が減少する。このレートは電気化学標識の濃度に比例するので、総ＰＳＡ濃度が増加してそれが取り除かれるより多くなるにつれて減少する。なお、このアッセイで使用されるＰＳＡ試料は、世界保健機関（ＷＨＯ）の総ＰＳＡのための１st ＩＲＰ（96/670）に従い較正されていることに留意すべきである。
【０１１７】
このアッセイの感度及び測定可能範囲は、例えば、試薬の組成及び濃度、並びに結合時間、測定時間を最適化することにより調整することができる。
【０１１８】
このアッセイが測定してきた方法では、バックグラウンドのばらつき（試薬量、作用電極の面積等の潜在的な変動に起因する）が補正されていない。しかし、測定のわずかな調整により、各チャンネルにおける各試料の特定の測定の前に正確なバックグラウンド測定が可能になる。例えば、−０．１Ｖの前に（例えば４．５分ではなく２分のインキュベーション後に）電気化学的測定を開始し、ストリップに磁石を適用する前に安定したレートに到達させることにより達成することができる。磁石が適用されると、このレートは変化し、このレート変化は、初期レートがバックグラウンド測定となりＰＳＡ濃度に比例する。
【０１１９】
本発明の具体的態様により得られた実験データは以下の通りである。蛍光信号は、リーダーではなく、市販の蛍光プレートリーダー（パーキンエルマー社製、Victor3 V（登録商標））によって検出される。
【０１２０】
遊離型ＰＳＡ（free PSA）の蛍光乾式アッセイ
試薬類：
マレイミド−ＰＥＧ２−ビオチン：サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 21901（ＥＺ-リンクマレイミド−ＰＥＧ２−ビオチン）
ラテックス粒子：インビトロジェン（Invitrogen）社、カタログ番号 F8827（フルオスフェア（FluoSpheres）、カルボキシレート修飾マイクロスフェア、２μｍ、黄緑色蛍光）
常磁性粒子：アデムテック社、カタログ番号 03223（200nm Strep+ 常磁性粒子）
抗体８Ａ６：ハイテスト社、カタログ番号 4P33 MAb 8A6（抗ＰＳＡ、ヒト）
抗体５Ａ６：ハイテスト社、カタログ番号 4P33のMAb 5A6（抗ＰＳＡ、ヒト）
ＰＢＳ：サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 28372（BupH リン酸緩衝生理食塩水パック）
ＢＳＡ：シグマ社、カタログ番号 A4503-50G（ウシ血清由来アルブミン）
水：シグマ社、カタログ番号 W4502（分子生物学用の水）
トレハロース：シグマ社、カタログ番号 T9531-25G（D-(+)-トレハロース二水和物（trehalose dehydrate））
ＭＥＳ：シグマ社、カタログ番号 M8250-25G (2-モルホリノエタンスルホン酸（MES hydrate）)
塩酸（ＨＣｌ） ：シグマ社、カタログ番号 H1758-100ML （塩酸（hydrochloric acid）、36.5-38％）
水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）：シグマ社、カタログ番号 72068 (水酸化ナトリウム溶液（sodium hydroxide solution）)
２ＭＥＡ：サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 20408（２−メルカプトエタノールアミン塩酸塩）
ＰＳＡ標準品（WHO 1st IRP（96/670）に従い較正済み）：
パーキンエルマー社、カタログ番号 A073-301（前立腺特異抗原測定キット（ProStatus PSA free/total kit）、Delfia（登録商標））
ビオチン定量定キット（Biotin quantification kit）：
サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 28005（ピアース  ビオチン標識効率測定キット（Pierce biotin quantification kit））
サイズ排除カラム：ＧＥヘルスケア社、カタログ番号 17-0851-01（PD10カラム）
ＥＤＴＡ：シグマ社、カタログ番号 EDS-100G（エチレンジアミン四酢酸、無水）
トゥイーン（Tween）：シグマ社、P7949-100ML（Tween-20）
ＤＭＳＯ：サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 20684（ジメチルスルホキシド）
酢酸：シグマ社、カタログ番号 32,009-9（酢酸）
【０１２１】
試薬の調製
抗体のビオチン化
抗体８Ａ６のジスルフィド結合の還元
濃度２ｍｇ／ｍｌから７ｍｇ／ｍｌの希釈していない抗体８Ａ６ストックを使用する。適量の抗体ストックを取り除き、１ｍｇの抗体を得る。１ｍｇの抗体に、適量の１４．２８ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２を添加し、ＥＤＴＡの濃度を１ｍＭにする。
【０１２２】
６ｍｇの２ＭＥＡを、１００μｌの１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２に溶解させる。この２ＭＥＡ溶液１μｌを、抗体溶液１０μｌごとに添加する。この溶液を混合し、３７℃の水浴中で９０分間インキュベートする。
【０１２３】
次いで、この溶液をＰＤ１０カラム（１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２で予め平衡化したもの）に通し、５００μｌのフラクション（画分）を収集する。各画分からのサンプルを取り出し、各画分で検出されるタンパク質を定量に２８０ｎｍの吸光度を用いて、ＵＶ（紫外）分光光度計で測定する。相当量のタンパク質濃度を含む画分を選び、混合してＵＶ分光光度計で再測定する。この測定は、２８０ｎｍで１ｍｇ／ｍｌ＝１．４吸光度単位である抗体の吸光係数を用いて抗体濃度を決定するために使用される。
【０１２４】
マレイミド−ＰＥＧ２−ビオチンの抗体への結合
マレイミド−ＰＥＧ２−ビオチンを１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２に溶解し、２０ｍＭの溶液を得る。この溶液の適量を還元された抗体に添加し、還元抗体の４０倍モル過剰のマレイミド−ＰＥＧ２−ビオチンを得る。次いでこれを混合し、室温で３時間インキュベートする。
【０１２５】
その後、その混合物を、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２で予め平衡化された別のＰＤ１０カラムに通す。５００μｌのフラクション（画分）を収集し、ＵＶ分光光度計を用いて２８０ｎｍで測定する。相当量レベルのタンパク質を含む画分を選択し、混合する。この溶液の試料を吸光度により２８０ｎｍで再度測定し、抗体の濃度は２８０ｎｍで１ｍｇ／ｍｌ＝１．４吸光度単位である抗体の吸光係数を用いて決定される。その後、抗体あたりの結合ビオチンの数は、製造元の指示に従って、ピアースビオチン定量キットを用いて決定される。
【０１２６】
ラテックス
抗体の吸着
２μｍのラテックスを４℃で８分間、16100×ｇでの遠心分離を使用してＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．５）で洗浄し、粒子をペレット状にする。ラテックスを、固形分濃度２％で再懸濁する。抗体５Ａ６はＭＥＳ緩衝液中で２５０μｇ／ｍｌの濃度に調製する。等量の２％ラテックスと２５０μｇ／ｍｌ抗体を加え十分に混合する。それらをロータリーミキサー（３０ｒｐｍ）で混合しながら、室温で１８時間インキュベートする。その後、その粒子を等量のＰＢＳ（ｐＨ７．２）で３回洗浄し（４℃、８分、16100×ｇでの遠心分離を使用）、同じ液中で固形分濃度２％に再懸濁する。
【０１２７】
常磁性粒子
粒子への抗体の結合
２００ｎｍのストレプトアビジンを被覆した常磁性粒子を、０．１％Tween、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２で洗浄し（磁気分離器を使用）、固形分濃度０．５％になるように同じ液中で再懸濁する。ビオチン化抗体８Ａ６を０．１％Tween、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２で希釈し、５０μｇ／ｍｌとする。等量の０．５％常磁性粒子と５０μｇ／ｍｌビオチン化抗体を組み合わせ混合し、ロータリーシェーカーを用いて３０ｒｐｍで振盪しながら、室温で３０分インキュベートする。
【０１２８】
常磁性粒子を等量の０．１％Tween、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２で４回洗浄し（磁気分離器を使用）、同液中で再懸濁させ、常磁性粒子の濃度を固形分１％になるようにした。
【０１２９】
試薬の堆積
試薬類を希釈して混合し、以下のものを含む最終的な堆積溶液を得た。
抗体５Ａ６、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２で機能化した０．０２％ラテックス粒子
抗体８Ａ６、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２で機能化した０．１％常磁性粒子
１８０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２
１ｍｇ／ｍｌトレハロース、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２
【０１３０】
乾式アッセイに使用されるカートリッジは、基板（２３）上に電極がないことを除いて、図２に示すものである。基板層（２０）と接着層（２１）を組合わせ、これらの２層に圧力を加え互いに密封し、半分組み立てたカートリッジを形成した。
【０１３１】
この半分組み立てカートリッジのチャネル（流路）（２４）内に、ピペットにより０．５μｌの堆積溶液を堆積させた。
これを４０℃で３０分間乾燥させる。
【０１３２】
その後、半分組み立てカートリッジに蓋（２２）をし、さらに圧力を加え、チャネルに乾燥試薬を備えた完全に形成されたカートリッジを密封した。
【０１３３】
アッセイ（分析）手順
２．５μｌのＰＳＡ標準品をカートリッジに導入し４つのチャンネルに充満させ、乾燥試薬を再懸濁させた。
カートリッジは、結合反応が生じるように室温で８分間インキュベートした。
カートリッジは、パーキンエルマー社のVictor3  Vによりチャネル内で測定できるように特注のホルダーに設置した。
【０１３４】
チャンネル内の蛍光シグナルを、内蔵プログラム「フルオレセイン（485nm/535nm、0.1秒）」を用いて測定した。このプログラムは、測定時間０．１秒で４８５ｎｍでの励起及び５３５ｎｍでの発光を利用している。このシグナルはフィン１（Fin  1）として記録された。
【０１３５】
その後、チャネルから常磁性粒子（及び常磁性粒子に結合した任意の成分）を除去するためにカートリッジに磁石を適用した。
次にチャンネル内の蛍光シグナルを内蔵プログラム「フルオレセイン（485nm/535nm、0.1秒）」を用いて再測定した。このプログラムは、測定時間０．１秒で４８５ｎｍでの励起及び５３５ｎｍでの発光を利用している。このシグナルはフィン２（Fin  2）として記録される。
２つの信号（Fin１−Fin２）の差を算出し、その結果を、遊離型ＰＳＡ濃度に対するグラフとし図８に示した。
【０１３６】
結果と考察
図８に示すデータは、ゼロコントロールから５８ｆＭの遊離ＰＳＡ濃度が検出可能であり、蛍光アッセイ形式が高感度であること示唆している。このデータは、ほとんどの場合総ＰＳＡレベルが増加するにつれて測定点間の微分係数（defferentiation）が減少する応答となる２桁程度（５８−5000ｆＭ）の測定可能範囲を示している。
【０１３７】
この減算法によるアッセイでは、Fin  １信号はＰＳＡ濃度とは無関係であるのに対し、磁石がＰＳＡを介して蛍光標識に複合化した常磁性粒子をチャネルから遠ざけると、Fin  ２信号は遊離型ＰＳＡ濃度が増加するにつれて減少する。従って、これらの信号の差は、ＰＳＡ濃度が増加するにつれて増加する。
なお、このアッセイで使用されるＰＳＡサンプルは総ＰＳＡの世界保健機関（ＷＨＯ）１ST  IRP（96/670）に従い較正がされていることに留意すべきである。
【０１３８】
このアッセイの感度及び測定可能範囲は、例えば、試薬の組成及び濃度、並びに結合時間、励起波長及び発光波長を最適化することにより調整することができる。
【０１３９】
本明細書に記載するこのアッセイ及び他のアッセイの方法は、バックグラウンドのばらつき（試薬量、作用電極の面積等の潜在的な変動に起因する）の信号を補正する２つの測定間の差を用いて測定した。これにより、より高感度で正確な測定を行うことを可能にしている。
【０１４０】
以下、本発明の具体的態様の利点の裏付けとなる実験データを説明する。
【０１４１】
方法の開発
本明細書に記載の磁性粒子に結合した標識を検出領域から除去する減算アッセイ法において、標識グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）（または他の酵素標識）を測定する方法を開発した。すなわち、分析対象物（検体）の濃度を決定するために未結合のＧＯＤ標識を用い測定した。ＧＯＤ標識の濃度は、検出領域から結合したＧＯＤ標識の磁気的な分離／除去の前に測定され、その後２つの測定が標識濃度の相対的な変化を計算し検体濃度を決定するために使用される。
【０１４２】
アッセイの結合時に、同時に酵素反応が発生している（すべての事象は検出領域で発生している）。ＧＯＤ検出カスケードの一例は図１１に示すように、過酸化水素を用いるペルオキシダーゼによるフェロシアニドのフェリシアニドへの変換を用いている。このことからこのセクションで説明する実施例では、ＧＯＤ検出カスケードにおいてフェロシアニドの代わりにＡＢＴＳが使用され、過酸化水素を用いるペルオキシダーゼにより酸化ＡＢＴＳに変換される。この例では、ＧＯＤ検出カスケードは、アッセイの結合時間（例えば４分）の間に酸化ＡＢＴＳを産生している。従って、検出領域からＧＯＤ標識−磁性粒子検体複合体を磁気的に除去した後のＧＯＤ標識の濃度変化は、より大きなバックグラウンド電流に基づき決定される。前述の具体例では、ＧＯＤ濃度、さらには検体濃度の非常に正確な測定を行うためにレート測定を使用している。本発明者らは非常に正確なＧＯＤ濃度測定値を得る電気化学的方法をも開発した。
【０１４３】
図１６に、３秒過渡電流（transient）の３秒測定点の電流値をプロットした典型的なＧＯＤ滴定曲線を示す。ＧＯＤは、クロノアンペロメトリー測定を行う前に２分間基質系と反応させた。線形応答が観測される。これらの測定には、４チャンネルストリップ（図１５に示す）を使用した。
【０１４４】
その結果２分間の酵素反応後に、規定のＧＯＤ濃度は一定の電流を生み出すことになる。もし、さらに２分間酵素反応を起こすと、規定のＧＯＤ濃度で生み出される電流はさらに大きくなる。それ故、磁気的な分離後、未結合標識の濃度は、大きいバックグラウンド電流（４分間のアッセイ結合の間の４分間の酵素反応）に基づき決定される。その結果、本発明者らは、このシナリオに対して下記の技術を開発した。
【０１４５】
ＧＯＤにより大量の酸化ＡＢＴＳが産生されないように、アッセイ結合（例えば、４分間）の間に、電気化学的な電位を電極に印加する。この例では、−３５０ｍＶの電位が印加されるが、任意の酵素／メディエーター系に適した電位を用いることができる。−３５０ｍＶの電位を４分間ストリップに印加することにより、２つの基本的なプロセスが発生する。第一に、ＧＯＤ標識の濃度測定が実行され、第二に、４分間のアッセイ結合の間に産生される酸化ＡＢＴＳの量を大幅に減少させる（従ってＧＯＤ標識濃度が測定される際の電流の大きさも減少する）。
【０１４６】
図１７に、２４０秒過渡電流の３秒時点での測定電流値をプロットしたＧＯＤ滴定の応答を示す（図１７は、プロットされた電流値が２４０秒過渡電流の３秒測定点から抽出される電流値がプロットされたＧＯＤ滴定応答を示している。）。その結果、この応答はＧＯＤ濃度を決定するため使用することができ、またイムノアッセイ（免疫学的試験）操作において磁気的な分離前（すなわち磁性粒子に結合したＧＯＤを取り除く前）のＧＯＤ標識濃度の測定に使用することができる。したがってこのＧＯＤ濃度は、最終的な非結合ＧＯＤ標識の濃度とともにＧＯＤ標識濃度のばらつきを補正するために使用することができる。
【０１４７】
この３秒測定点の測定では、２４０秒過渡信号で発生したものを使用しているが、ＧＯＤ濃度の決定には、この過渡信号の範囲内の任意の測定点を用いることができる。２４０秒後に−３５０ｍＶの電位スイッチを切り、ストリップを開回路電位（ＯＣＰ）に戻す。本例では、ＧＯＤ反応を２分間行い（ＯＣＰ、電位無印加）、その後３秒間クロノアンペロメトリーを測定した。次に３秒過渡信号の３秒電流値をＧＯＤ濃度に対してプロットした（図１８参照）。非常に正確な線形応答が観察される。この測定は、磁気分離後の未結合ＧＯＤ標識濃度測定を示す。この磁気分離後の未結合ＧＯＤ標識濃度と磁気分離前のＧＯＤ標識濃度は、共に検体濃度の決定に用いることができる。
【０１４８】
通常の２分間のＧＯＤ滴定曲線、及び４分間（２４０秒）−３５０ｍＶ電位印加後の２分間のＧＯＤ滴定曲線を図１９に示す。応答は非常に似ている。応答間の小さな差（offset）は、電気化学的バックグラウンド電流の違い、及び−３５０ｍＶの電位の２４０秒間印加時に蓄積される少量の酸化ＡＢＴＳにより生じている。−３５０ｍＶの電位を２４０秒間印加しない場合には、６分間の総ＧＯＤターンオーバー（転換）と２分間のＧＯＤ反応の比較となる。このアッセイスキームにおいては、アッセイ結合時の磁気分離前の段階で生じた４分間の電流による磁気分離後のＧＯＤ濃度を測定することになる。
【０１４９】
この測定法を次に総ＰＳＡイムノアッセイ測定に応用し、測定の有用性を実証した。本実験では、ＰＳＡアッセイのダイナミックレンジを向上させるために、試薬も変更した。
【０１５０】
以下、本発明の具体的実施態様により得られた実験データを説明する。電気化学的な信号は検出は、リーダーに代えて市販のポテンショスタットによって検出した。
【０１５１】
総ＰＳＡ（ＩＩ）の電気化学的アッセイ
試薬類：
ＰＳＡ：ハイテスト社、カタログ番号 8P78（前立腺特異抗原）
ＡＢＴＳ：フルカ（Fluka）社製、カタログ番号 11557
サイズ排除カラム（Zeba size exclusion Columns）：サーモフィッシャーサイエンティフィック（ThermoFisher Scientific）社、カタログ番号 89882
ＳＰＤＰ：ピアース社、カタログ番号 21857（Ｎ−スクシンイミジル  ３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート）
ＧＯＤ：BBI Enzymes社、Cat GO3B3（グルコースオキシターゼ）
マレイミド−ＰＥＧ２−ビオチン：サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 21901（ＥＺ-リンクマレイミド−ＰＥＧ２−ビオチン）
ラテックス粒子：インビトロジェン（Invitrogen）社、カタログ番号 F8765（１μｍ）
常磁性粒子：アデムテック社、カタログ番号 03223（200nm Strep+ 常磁性粒子）
抗体１Ｈ１２：ハイテスト社、カタログ番号 4P33 MAb 1H12（抗ＰＳＡ、ヒト）
抗体５Ａ６：ハイテスト社、カタログ番号 4P33 MAb 5A6（抗ＰＳＡ、ヒト）
ＰＢＳ：サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 28372（BupH リン酸緩衝生理食塩水パック）
ＢＳＡ：シグマ社、カタログ番号 A4503-50G（ウシ血清由来アルブミン）
水：シグマ社、カタログ番号 W4502（分子生物学用の水）
ＭＥＳ：シグマ社、カタログ番号 M8250-25G (2-モルホリノエタンスルホン酸（MES hydrate）)
グルコース：シグマ社、カタログ番号 G8270-1 KG (グルコース（D-(+)-Glucose)）
ＤＴＴ：ピアース社、カタログ番号 20290（１，４−ジチオスレイトール）
塩酸（ＨＣｌ）：シグマ社、カタログ番号 H1758-100ML （塩酸（hydrochloric acid）、36.5-38％）
水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）：シグマ社、カタログ番号 72068 (水酸化ナトリウム溶液（sodium hydroxide solution）)
ＨＲＰ（ペルオキシダーゼ）：BBI Enzymes社、カタログ番号 HRP4C（西洋ワサビペルオキシダーゼ（Horseradish Peroxidase））
２ＭＥＡ：サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 20408（２−メルカプトエタノールアミン塩酸塩）
ビオチン定量化測定キット（Biotin quantification kit）：サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 28005（ピアースビオチン標識効率測定キット（Pierce biotin quantification kit））
サイズ排除カラム：ＧＥヘルスケア社、カタログ番号 17-0851-01（PD10カラム）
ＥＤＴＡ：シグマ社、カタログ番号 EDS-100G（エチレンジアミン四酢酸、無水）
トゥイーン（Tween）：シグマ社、P7949-100ML（Tween-20）
ＤＭＳＯ：サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 20684（ジメチルスルホキシド）
【０１５２】
試薬の調製：
抗体のビオチン化
抗体のジスルフィド結合の還元；
抗体１Ｈ１２を１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中の５０ｍＭ  ２ＭＥＡを用いて、３７℃で９０分で還元する。還元された抗体をＰＤ１０カラムに通し、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中で収集し、タンパク質が含まれると判断される（ＵＶ分光光度計での２８０ｎｍの測定によって）フラクション（画分）を収集する。還元抗体の濃度は、２８０ｎｍで１ｍｇ／ｍｌ＝１．４吸光度単位である抗体の吸光係数を用いて算出される。
【０１５３】
マレイミド−ＰＥＧ２−ビオチンの抗体への結合
マレイミド−ＰＥＧ２−ビオチンを、効率的な結合が起こるようにモル過剰で還元された抗体に添加し、次いで室温で３時間インキュベートする。その後、それを１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２で予め平衡化した別のＰＤ１０カラムに通す。５００μｌのフラクション（画分）を収集し、ＵＶ分光光度計を用いて２８０ｎｍで測定する。相当量レベルのタンパク質を含む画分を選択し、混合する。この溶液の試料を吸光度により２８０ｎｍで再度測定し、抗体の濃度は２８０ｎｍで１ｍｇ／ｍｌ＝１．４吸光度単位である抗体の吸光係数を用いて決定される。その後、抗体あたりの結合ビオチンの数は、製造元の指示に従って、ピアースビオチン定量キットを用いて決定される。
【０１５４】
ラテックス
ＳＰＤＰによるラテックスのＧＯＤ／１Ｈ１２への結合
ラテックス粒子を、固形分１％及び１ｍＭのＳＰＤＰの濃度でＰＢＳ緩衝液中の１ｍＭのＥＤＴＡ中でＳＰＤＰに結合する。これを穏やかに振盪しながら、室温で暗所にて９０分間インキュベートする。ＧＯＤ／５Ａ６複合体を、モル過剰のＳＰＤＰ：ＧＯＤ／１Ｈ１２を用いてＳＰＤＰに結合し、室温で暗所にて９０分間インキュベートする。９０分後にＧＯＤ／５Ａ６−ＳＰＤＰの割合は、ｐＨ４．５でＤＴＴを添加しさらに室温で暗所にて３０分間インキュベートすることにより減少する。
【０１５５】
所定の結合時間後、ラテックス粒子を、固形分濃度１％で１ｍＭのＥＤＴＡ、ＰＢＳ緩衝液中で洗浄する（ペレット化及び再懸濁のためにそれぞれ遠心分離及びソニケーションを使用）。ＧＯＤ／５Ａ６−ＳＰＤＰ反応物をZeba脱塩カラムに通し、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中で収集される。その後ラテックス−ＳＰＤＰとＧＯＤ／５Ａ６−ＳＰＤＰを混合し、ラテックス−ＳＰＤＰ結合部位に過剰のＧＯＤ／５Ａ６−ＳＰＤＰを与えるようにする。この結合反応は、室温で暗所にて１９時間、穏やかに振盪しながらインキュベートして行われる。その後、この結合反応物を０．１％Tween  ＰＢＳ中で洗浄し、固形分１％で再懸濁し、使用するまで４℃で暗所にて保存する。
【０１５６】
常磁性粒子
抗体の粒子への結合
２００ｎｍのストレプトアビジンを被覆した常磁性粒子を、０．１％tween、ｐＨ７．２、ＰＢＳ中で洗浄し（磁気分離器を使用）、ビオチン化抗体１Ｈ１２に加え、室温で１時間１０分穏やかに振盪しながらインキュベートし、ビオチン化抗体のビオチンをストレプトアビジン被覆常磁性粒子に結合させる。その後常磁性粒子を等量のＰＢＳ、ｐＨ７．２で４回洗浄し（磁気分離器を使用）、常磁性粒子濃度が固形分１％になるように同じ液中で再懸濁する。
【０１５７】
アッセイ（分析）手順
アッセイ試薬を以下の量と濃度でエッペンドルフチューブに入れる：
１％常磁性粒子（ｂ１Ｈ１２を結合）：１μｌ
１％ラテックス（ｂＧＯＤ及びｂ５Ａ６を結合）：１μｌ
ＰＳＡ（３００ｍｇ/ｍｌ  ＢＳＡ、ＰＢＳ中、最終濃度１０倍）：１μｌ
【０１５８】
すべての試薬をエッペンドルフに別々に入れ、チューブ内に保った。最終的にすべての試薬を以下の緩衝液を加えて混合した。
反応緩衝液：７μｌ
（５００ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．７、２５０ｍＭ  グルコース、１５ｍＭ  ＡＢＴＳ、４ｍｇ／ｍｌ  ＨＲＰ、０．１４％tweenを含む反応緩衝液）
【０１５９】
これらの試薬を十分に混合し、その４μｌをポテンシオスタット（AUTOLAB社 PGSTAT12）に接続されているカートリッジに加える。そのイムノアッセイ反応には、結合反応のためのすべての試薬（抗ＰＳＡ抗体磁性粒子、ＰＳＡ検体、抗ＰＳＡ抗体−ＧＯＤ標識）、及び酵素反応のためのすべての試薬（グルコース、ＨＲＰ，ＡＢＴＳ）が含まれる。カートリッジは、図１及び１５に示すように４つのチャネルでできており、そのうち３つのチャネルはそれぞれスクリーン印刷された２つの炭素電極に接続し、１つのチャネルはスクリーン印刷された２つの銀／塩化銀電極に接続している。この実験では、以下の通りスクリーン印刷した炭素電極を有する３つのチャネルで測定を行った。
【０１６０】
実験方法
試薬を混合すると直ちに結合と酵素反応が開始する。これはすべて検出領域で起こる。３０秒後、３５０ｍＶの負電位をストリップに２４０秒間印加する（トランジェント（過渡電流）に示すように）。２４０秒の過渡電流（トランジェント）の３秒の電流値が記録される（トランジェントの他の点を測定に使用することができる）。この値は、ストリップの検出領域（作用電極）での抗ＰＳＡ抗体−ＧＯＤ標識濃度の測定値を表す。これを「磁気分離前電流／測定」とする。２１０秒後、磁気をストリップに適用する。抗ＰＳＡ抗体磁性粒子−ＰＳＡ−抗ＰＳＡ抗体−ＧＯＤ標識複合体は、未結合の抗ＰＳＡ抗体−ＧＯＤ標識を残したまま、検出領域から取り除かれる。２４０秒後、−３５０ｍＶの電位のスイッチを切り（磁気分離工程後）、ＯＣＰ（開回路電位）に検出領域／ストリップを戻す。クロノアンペロメトリー測定の実行前に、ストリップをＯＣＰ（開回路電位）の状態に２分間保つ。その後、３秒の過渡電流から３秒の電流値を記録する。これを、「磁気分離後電流／測定」とする。測定したすべてのＰＳＡ濃度についてこの手順を繰り返した。
【０１６１】
結果と考察
図２０に、磁気分離後測定による未補正のＰＳＡ濃度を示す。ＰＳＡ濃度が増加するにつれて電流が減少することが観察される。正確性はかなり良く、低ＰＳＡ濃度ではＰＳＡ濃度の平均値は系統的であるが、誤差は大きい。
【０１６２】
ＰＳＡの分析結果のばらつきは、磁気分離前電流／測定のばらつきによって生じたものである。これについての解析は以下の通りである。図２１に、全ＰＳＡ濃度値、及び反復測定における磁気分離前電流と磁気分離後電流の差を示し、このデータを図２２にグラフとして示す。
【０１６３】
ＰＳＡアッセイの性能は、未補正の磁気分離後電流に比べて改善され、感度と全体的な精度が向上した。ＰＳＡアッセイは、磁気分離前電流と磁気分離後電流の変化率を考慮に入れるとさらに向上する。図２３に磁気分離前電流に対する磁気分離後電流の比を示し、このデータを図２４にグラフとして示す。感度と精度についてＰＳＡ性能はさらに向上する。磁気分離前電流についての検討を主に抗ＰＳＡ抗体−ＧＯＤ標識の影響に基づいて行ったが、正規化に用いる磁気分離前電流は、すべての入力要因（抗ＰＳＡ抗体−ＧＯＤ標識、作用電極サイズ、メディエーター（媒体）の濃度、セルの高さ、ＨＣＴなど）の相互作用の結果であると考えられ、従ってアッセイ変動の多くの原因を補正するために使用される。
【０１６４】
このストリップの形式（４チャンネル、２０チャンネルなど）は、測定する同一検体の多重測定、または測定した同一検体の多重測定を可能にする。磁気分離後の電流の平均値（ストリップ内の３測定値）から磁気分離前の電流の平均値（ストリップ内の３測定値）を減算する大まかな補正でも、アッセイ性能は向上する（図２５参照）。この状況では、アッセイは検体を３回測定（１ストリップ内で）するために使用されるが、検体/試料のＰＳＡ濃度を決定するために平均の応答値が使用されている。その結果、測定範囲内での精度の改善により非常に正確な検体量の測定が観測される（これについては本明細書の他の箇所で議論している）。しかし、平均値の大まかな補正方法も、磁気分離前の電流測定は非常に有益である。
【０１６５】
以下、本発明の具体的実施態様によって得られた実験データについてさらに説明する。電気化学的信号は、リーダーの代え市販のポテンショスタットによって検出する。
【０１６６】
総ＰＳＡ（III）の電気化学的アッセイ
試薬類：
ＥＤＣ（N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride）：シグマ社、カタログ番号 03449
Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（N-hydroxysulfosuccinimide）：サーモサイエンティフィック社, カタログ番号 24510
ラテックス粒子：インビトロジェン社、カタログ番号 F8827 (2μm, COOH表面（surface）)
抗体１Ｈ１２：ハイテスト社、カタログ番号 4P33 MAb 1H12（抗ＰＳＡ、ヒト）
抗体５Ａ６：ハイテスト社、カタログ番号 4P33 MAb 5A6（抗ＰＳＡ、ヒト）
ＧＯＤ：BBI Enzymes社、Cat GO3B3（グルコースオキシターゼ）
常磁性粒子：ケミセル（Chemicell）社、500nm SiMag-Carbonyl
ＰＢＳ：サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 28372（BupH リン酸緩衝生理食塩水パック）
ＢＳＡ：シグマ社、カタログ番号 A4503-50G（ウシ血清由来アルブミン）
水：シグマ社、カタログ番号 W4502（分子生物学用の水）
酢酸ナトリウム：シグマ社、カタログ番号 58750
ＭＥＳ：シグマ社、カタログ番号 M8250-25G (2-モルホリノエタンスルホン酸（MES hydrate）)
トリス（Tris）：シグマ社、カタログ番号 93362（トリス塩基（Trizma base））
フェロシアン化物（Ferrocyanide）：シグマ社、カタログ番号 P3289-100G（フェロシアン化カリウム（potassium ferrocyanide））
グルコース：シグマ社、カタログ番号 G8270-1 KG (グルコース（D-(+)-Glucose)）
塩酸（ＨＣｌ）：シグマ社、カタログ番号 H1758-100ML （塩酸（hydrochloric acid）、36.5-38％）
水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）：シグマ社、カタログ番号 72068 （水酸化ナトリウム溶液（sodium hydroxide solution））
ＨＲＰ（ペルオキシダーゼ）：BBI Enzymes社、カタログ番号 HRP4C（西洋ワサビペルオキシダーゼ（Horseradish Peroxidase））
ＰＳＡ：ハイテスト社、カタログ番号 8P78（前立腺特異抗原）
ＥＤＴＡ：シグマ社、カタログ番号 EDS-100G（エチレンジアミン四酢酸、無水）
トゥイーン（Tween）：シグマ社、P7949-100ML（Tween-20）
ＤＭＳＯ：サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 20684（ジメチルスルホキシド）
酢酸：シグマ社、カタログ番号 32,009-9（酢酸）
トレハロース：シグマ社、カタログ番号 T9531（D-(+)-トレハロース二水和物（trehalose dehydrate））
【０１６７】
試薬の調製：
ＥＤＣを使用したラテックスのＧＯＤ及び５Ａ６への結合
１％ラテックス粒子を２０ｍｇ／ｍｌＥＤＣ及び２０ｍｇ／ｍｌＳｕｌｆｏ−ＮＨＳとともに５０ｍＭ、ｐＨ６．０のＭＥＳ緩衝液に入れ、室温で暗所にて２０分間インキュベートする。５０ｍＭ、ｐＨ４．６の酢酸ナトリウムで洗浄し、同液中にて固形分１％で再懸濁する。
【０１６８】
ラテックス−ＥＤＣをＧＯＤ及び５Ａ６抗体に添加し、すべて５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．６中で、最終濃度を０．５％ラテックス、１．５ｍｇ／ｍｌ  ＧＯＤ及び０．５ｍｇ／ｍｌ  ５Ａ６とする。これを穏やかに振盪しながら、室温で３時間１０分インキュベートする。
【０１６９】
５０ｍＭ、ｐＨ７．１のトリス緩衝液でラテックス粒子を洗浄し、４℃で一晩インキュベートする。ラテックス粒子を０．１％tweenの入ったＰＢＳで洗浄し、同液中にて固形分０．５％で再懸濁し、使用するまで４℃の暗所にて保存する。
【０１７０】
ＥＤＣを使用した常磁性粒子の抗体１Ｈ１２への結合
１％常磁性粒子を２０ｍｇ／ｍｌＥＤＣ及び２０ｍｇ／ｍｌＳｕｌｆｏ−ＮＨＳとともに５０ｍＭ、ｐＨ６．０のＭＥＳ緩衝液に入れ、室温で穏やかに振盪しながら２０分間インキュベートする。ＰＢＳで洗浄し、同液中にて固形分１％で再懸濁する。
【０１７１】
０．５％常磁性粒子−ＥＤＣを０．５ｍｇ／ｍｌの１Ｈ１２とともにｐＨ７．２のＰＢＳに入れ、室温で２時間１５分インキュベートする。
【０１７２】
それを０．１％tweenの入った５０ｍＭ、ｐＨ７．１のトリス緩衝液で洗浄し、４℃で一晩インキュベートする。０．１％tweenの入ったＰＢＳにて洗浄し、同液中で再懸濁し、固形分０．５％とする。使用するまで４℃で保存する。
【０１７３】
アッセイ（分析）手順
アッセイ試薬を以下の量と濃度でエッペンドルフチューブに入れる：
１％常磁性粒子（ｂ１Ｈ１２を結合）：１μｌ
０．５％ラテックス（ＧＯＤ及び５Ａ６を結合）：１μｌ
ＰＳＡ（６０ｍｇ/ｍｌ  ＢＳＡ、ＰＢＳ中、最終濃度５倍）：２μｌ
１Ｍ  グルコース：１μｌ
【０１７４】
すべての試薬をエッペンドルフに別々に入れ、チューブ内に保った。最終的にすべての試薬を以下の緩衝液を加えて混合した。
反応緩衝液：５μｌ
（１Ｍ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０、２ｍｇ／ｍｌ  トレハロース、１２０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、４ｍｇ／ｍｌ  ＨＲＰ、２００ｍＭフェロシアニドを含む反応緩衝液）
【０１７５】
これらの試薬を十分に混合し、その０．８μｌをポテンシオスタット（AUTOLAB社 PGSTAT12）に接続しているカートリッジに加える。図３及び４に示すように、カートリッジは単一のチャネルでできており、スクリーン印刷された２つの炭素電極にまたがっている（一方は作用電極で、もう一方はカウンター／参照電極である）。測定は次に示すように実施された。
【０１７６】
実験方法
磁気分離工程の前後における抗−ＰＳＡ−ＧＯＤ標識の測定に、パルス式電気化学的測定法を用いた。計８分間、１分毎にクロノアンペロメトリー測定を行った。特に−３５０ｍＶで０．１秒クロノアンペロメトリー測定を行った。０．１秒での電流値は０．１秒過渡電流から記録した。ストリップにサンプルを適用した後、結合反応と酵素反応が同時に発生している。その後１分毎にパルス電気化学測定を行いデータを記録する。４分後に磁場をストリップに適用すると、抗−ＰＳＡ磁性粒子が作用電極から除去される。除去された抗−ＰＳＡ磁性粒子は、ＰＳＡを介して抗−ＰＳＡ−ＧＯＤ標識が結合した抗−ＰＳＡ磁性粒子と、抗−ＰＳＡ磁性粒子（標識が結合していない）の混合集団となる。５、６、７、８分のパルス電気化学的測定は、残りの未結合の抗−ＰＳＡ−ＧＯＤ標識の測定値となる。２、３、４分の電流値を、時間（分）に対して電流（アンペア）をプロットし回帰直線にフィットさせることによって傾きを算出するために用いた。この傾きは、磁気分離前の測定を表わす。
【０１７７】
同じ手法を５、６、７、８分のデータに適用した。結果として得られた傾きは、未結合の抗−ＰＳＡ−ＧＯＤ標識の測定である磁気分離後の測定を表わす。
【０１７８】
結果と考察
図２６に示すように、磁気分離前の傾きを磁気分離後の傾きで徐した比を総ＰＳＡ濃度（ｐＭ）に対してプロットした。高感度の系統的な線形応答が観察される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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