(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で表されるジアシルグリセロールと結合した分岐型ポリエチレングリコール。
【化１５】
0006051758.tif 000017
（式（１）中、Ｒ１は炭素数１〜７の炭化水素基である。
Ｒ２は炭素数９〜２１のアルキル基またはアルケニル基である。
nはポリエチレングリコール鎖の平均付加モル数であり、10≦n≦100である。
Ｘは分岐型ポリエチレングリコールとジアシルグリセロールのリンカー部位であり、式（２）で表される。
【化１６】
0006051758.tif 000018
（式（２）中、Ｙはエーテル結合を表す。ｌ＝０、ｍ＝０である。）
【請求項２】
請求項１記載の分岐型ポリエチレングリコールを含む、ポリエチレングリコール修飾リポソーム。
【請求項３】
下記の工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）を含むことを特徴とする、式（３）で表されるジアシルグリセロールと結合した分岐型ポリエチレングリコールの製造方法。
【化１７】
0006051758.tif 000019
（式（３）中、Ｒ１は炭素数１〜７の炭化水素基である。
Ｒ２は炭素数９〜２１のアルキル基またはアルケニル基である。
nはポリエチレングリコール鎖の平均付加モル数であり、10≦n≦100である。）
工程（Ａ）:  下記式（４）で表される化合物にエチレンオキサイドを付加し、下記式（５）のポリエチレングリコール誘導体を得る工程；
【化１８】
0006051758.tif 000020
【化１９】
0006051758.tif 000021
（式（５）において、nはポリエチレングリコール鎖の平均付加モル数であり、10≦n≦100である。）
工程（Ｂ）：  式（５）のポリエチレングリコール誘導体中のエチレンオキサイド基末端水酸基の水素原子を炭化水素基に置換することによって、下記式（６）のポリエチレングリコール誘導体を得る工程；
【化２０】
0006051758.tif 000022
（式（６）中、Ｒ１は炭素数１〜７の炭化水素基である。
nはポリエチレングリコール鎖の平均付加モル数であり、10≦n≦100である。）
工程（Ｃ）：  式（６）のポリエチレングリコール誘導体をｐＨ1.0-3.0で酸加水分解し、式（７）のポリエチレングリコール誘導体を得る工程；
【化２１】
0006051758.tif 000023
（式（７）中、Ｒ１は炭素数１〜７の炭化水素基である。
nはポリエチレングリコール鎖の平均付加モル数であり、10≦n≦100である。）
工程（Ｄ）：  式（７）のポリエチレングリコール誘導体中の末端水酸基と脂肪酸とを脱水縮合させ、前記式（３）の分岐型ポリエチレングリコールを得る工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジアシルグリセロールと結合した分岐型ポリエチレングリコール、その製造方法およびポリエチレングリコール修飾リポソームに関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームはリン脂質から構成される脂質二重膜によって形成される、数10nm-数100nmのカプセルであり、その中に薬剤を安定に内包することができる。このようなリポソームの一つにその表面をポリエチレングリコール(PEG)で修飾させたPEGリポソームがある。PEGリポソームは、表面のPEG鎖が形成する水和層とPEG鎖自体の立体障害により、オプソニンのような血清たんぱくや、単核細胞系に属する細胞との相互作用が抑制され、高い血中滞留性を実現することができる。特に高い血中滞留性が要求される抗がん剤のデリバリーにおいては、PEGリポソームであるDOXIL（登録商標）が上市されており、その有用性が実証されている。
【０００３】
一方、近年、研究が盛んに行われているsiRNA等の核酸デリバリー分野でもPEG化リポソームは有力なキャリアの一つとして考えられている。siRNAは病原タンパク質の産生を抑制する核酸医薬品であり、副作用が少なく、大量合成が容易であるという利点があり、次世代の高機能医薬品として期待が高まっている。しかし、siRNAは体内の酵素によって、血中で容易に分解されるため、siRNA単独の使用は困難であり、siRNAをデリバリーするDDS技術が不可欠である。siRNAのリポソームによるデリバリーにおいては、一般に核酸を安定化させるために、リポソームにカチオン性脂質等を過剰量添加し核酸と静電的なコンプレックスを形成させ、更に細胞への取り込みを増大させるために、コンプレックス全体での電荷をカチオン性としている。
【０００４】
PEGリポソームの構成材料の1つとしては、リン脂質PEGが使われるが、これはアニオン性を示すリン酸基を有しており、薬物の種類によっては内包に悪影響を与えることがある(特許文献1、非特許文献1)。特に上記のsiRNAを含む、全体としてカチオン性を示すコンプレックスの内包には望ましくない場合があり、そのため電荷を持たない脂質PEGが注目され、この脂質PEGをリポソームの構成材料に用いたときにリポソームが優れた安定性、体内動態を示すという報告がなされている(非特許文献2)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第6586001号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】THE JOURNAL OF PHARMACOLOGY ANDEXPERIMENTAL THERAPEUTICS Vol.328 No.1 321-330
【非特許文献２】Molecular Therapy Vol.17 No.5 872-879
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
PEG鎖1本の非電荷脂質PEGはsiRNAのキャリアとして実績を残しているが、リポソームの安定性を含め、未だ幾つかの課題が残っている。特にリポソームの安定性を更に向上させることは、医療業での利用上、特に重要である。
【０００８】
本発明の課題は、２本のPEG鎖を有する、ジアシルグリセロールと結合した、高純度で、かつリポソームの安定性を向上させる、ポリエチレングリコール誘導体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
開発者らは、分岐型ポリエチレングリコールを用いることにより、直鎖型より高いリポソームの安定性を有する、ジアシルグリセロールと結合したポリエチレングリコールを開発した。
【００１０】
更には分岐型ポリエチレングリコールの導入に、特徴的な構造を有する、ジオール化合物からエチレンオキサイド付加させることを主な特徴とする製法を用いることにより、安定なエーテルリンカーを有しかつ非常に高純度な、ジアシルグリセロールと結合した分岐型ポリエチレングリコール誘導体を開発した。
【００１１】
すなわち、本発明は、式（１）で表されるジアシルグリセロールと結合した分岐型ポリエチレングリコールに係るものである。
【化１】
0006051758.tif 000002
（式（１）中、Ｒ１は炭素数１〜７の炭化水素基である。
Ｒ２は炭素数９〜２１のアルキル基またはアルケニル基である。
nはポリエチレングリコール鎖の平均付加モル数であり、10≦n≦100である。
Ｘは分岐型ポリエチレングリコールとジアシルグリセロールのリンカー部位であり、式（２）で表される。
【化２】
0006051758.tif 000003
（式（２）中、Ｙはエーテル結合を表す。ｌ＝０、ｍ＝０である。）
【００１２】
また、本発明は、後述の工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）を含むことを特徴とする、式（３）で表されるジアシルグリセロールと結合した分岐型ポリエチレングリコールの製造方法に係るものである。
【化３】
0006051758.tif 000004
（式（３）中、Ｒ１は炭素数１〜７の炭化水素基である。
Ｒ２は炭素数９〜２１のアルキル基またはアルケニル基である。
nはポリエチレングリコール鎖の平均付加モル数であり、10≦n≦100である。）
【発明の効果】
【００１３】
本発明の技術によって得られた、ジアシルグリセロールと結合した分岐型ポリエチレングリコール誘導体は、ジアシルグリセロールと結合した直鎖型ポリエチレングリコールと比較して、有意に高い、リポソームの安定性を実現した。
【００１４】
また、本分岐型ポリエチレングリコール誘導体は、DDS素材として望ましい極めて高い純度で製造することが可能となった。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明におけるジアシルグリセロールと結合した分岐型ポリエチレングリコールとは、2本のポリエチレングリコール鎖を有する構造とジアシルグリセロールを有する構造がリンカーを介して結合した化合物であり、直鎖型のポリエチレングリコールと比較して、安定性に優れたリポソームを作製することができる。
【００１６】
上記のジアシルグリセロールと結合した分岐型ポリエチレングリコールは前記式（１）で表される。
【００１７】
Ｘは、分岐型ポリエチレングリコールとジアシルグリセロールのリンカー部位であり、前記式（２）で表される。
【００１８】
Ｙは、エーテル結合である。ｌ、mはリンカー部位のアルキル基の炭素数を表し、l=0、m=0である。
【００１９】
式（１）中のＲ１は、炭素数１〜７の炭化水素基を表す。Ｒ１の炭素数は、４以下が更に好ましく、１以下が一層好ましい。炭化水素基は、好ましくはアルキル基、芳香族基であり、特に好ましくはアルキル基である。具体的な炭化水素基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第三ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、ベンジル基が挙げられる。最も好ましくはメチル基である。
【００２０】
式（１）中のＲ２は、炭素数９〜２１のアルキル基またはアルケニル基である。Ｒ２の炭素数は、１３〜１７が好ましく、１７が更に好ましい。Ｒ２は、飽和及び不飽和炭化水素であってよく、また直鎖又は分岐鎖であってよい。また、Ｒ２は脂肪酸Ｒ２ＣＯＯＨ由来のものであるが、Ｒ２ＣＯとしては、飽和及び不飽和の直鎖又は分岐鎖の脂肪酸由来のアシル基が挙げられる。具体的には、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトイレイン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、リノール酸が好ましい。
【００２１】
(中間体の合成)
本発明の中間体は次のように製造できる。まず、ジグリセリンとアセトンを反応させ、有機溶剤と水を用いた抽出精製により、式（４）で表される１,2-イソプロピリデンジグリセリンを得ることができる。この化合物は公知である。
【化４】
0006051758.tif 000005
【００２２】
次いで、工程（Ａ）〜（Ｃ）によって中間体を得る。
工程（Ａ）:  ソジウムメチラート、金属ナトリウム、金属カリウムまたはt-ブトキシカリウムを触媒とし、式（４）で表される化合物にエチレンオキサイドを付加し、下記式（５）のポリエチレングリコール誘導体を得る。
【化５】
0006051758.tif 000006
（式（５）において、nはポリエチレングリコール鎖の平均付加モル数であり、10≦n≦100である。）
【００２３】
このようにエチレンオキシド付加重合反応を用いることで、高収率で、かつカラム精製することなく、工業的に適した方法で、高純度の分岐型ポリアルキレングリコール誘導体を製造することができる。
このエチレンオキサイド付加重合体は次のような方法で製造することができる。トルエン、もしくは無溶媒中、金属ナトリウムや金属カリウム、水素化ナトリウム、水素化カリウム、ナトリウムメトキシド、カリウム-t-ブトキシドのアルカリ条件下、オキシエチレンを重合させて得ることができる。
【００２４】
工程（Ｂ）：  式（５）のポリエチレングリコール誘導体中のエチレンオキサイド基末端水酸基の水素原子を炭化水素基に置換することによって、下記式（６）のポリエチレングリコール誘導体を得る。
【化６】
0006051758.tif 000007
（式（６）中、Ｒ１は炭素数１〜７の炭化水素基である。
nはポリエチレングリコール鎖の平均付加モル数であり、10≦n≦100である。）
【００２５】
ここで、例えば、Ｒ１がメチル基である化合物は、式（８）の構造式を有する。
【化７】
0006051758.tif 000008
【００２６】
工程（Ｃ）：  式（６）のポリエチレングリコール誘導体をｐＨ1.0-3.0で酸加水分解し、式（７）のポリエチレングリコール誘導体を中間体として得る。
【化８】
0006051758.tif 000009
（式（７）中、Ｒ１は炭素数１〜７の炭化水素基である。
nはポリエチレングリコール鎖の平均付加モル数であり、10≦n≦100である。）
【００２７】
すなわち、環状アセタール基の脱保護は、酢酸、リン酸、塩酸、硫酸等の酸にてpH1.0-3.0に調整して水溶液中で反応させ、式（７）で表される化合物を得る。脱保護時のpHが低すぎるとポリアルキレングリコール鎖の分解、グリセロールの2,3位のエーテル結合の切断によるポリアルキレングリコール鎖の遊離が起きる。
【００２８】
ここで、例えば、Ｒ１がメチル基である中間体は、式（９）の構造式を有する。
【化９】
0006051758.tif 000010
【００２９】
（中間体から式（３）の化合物の合成）
次の工程（Ｄ）によって、式（７）のポリエチレングリコール誘導体中の末端水酸基と脂肪酸とを脱水縮合させ、式（３）の分岐型ポリエチレングリコールを得る。
すなわち、２個の水酸基を有する式（７）で表される化合物と脂肪酸を、触媒を用いて縮合させて、式（３）で表されるジアシルグリセロールがエーテルを介して結合した分岐型ポリエチレングリコール誘導体が得られる。
【００３０】
用いる脂肪酸Ｒ２ＣＯＯＨとしてはカプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトイレイン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、リノール酸等の飽和及び不飽和の直鎖又は分岐鎖の脂肪酸が挙げられる。
【００３１】
（リポソーム）
本発明の脂質PEG誘導体を含むリポソームは、核酸、医薬、生理活性物質を内包させることができる。これらの核酸、医薬の種類は特に限定されていない。本発明の脂質PEGのリポソームへの配合量は遺伝子の発現や医薬を発効させるのに十分な量であればよい。
【００３２】
核酸としては、RNA、DNA、オリゴヌクレオチド等が挙げられる。例えば、siRNA、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、酵素、サイトカイン等がある。
【００３３】
核酸を内包する場合の1つの例示的な実施形態において、リポソームは、本発明の脂質PEG誘導体と、中性脂質(例えば、ジアシルフォスファチジルコリン)と、ステロール(例えば、コレステロール)と、カチオン性脂質(例えば、アミン性脂質)との混合物を含む。
【００３４】
本発明の脂質PEG誘導体を含むリポソームの形態は特に限定されないが、例えば、脂質混合物をクロロホルム等の有機溶剤に溶解し、エバポレーターによって脱溶剤し乾固させた形態や、脂質混合物を水系溶剤に分散した形態、水系溶剤に分散したリポソームを凍結乾燥させた形態が挙げられる。
【００３５】
水系溶剤を使用するときは、単なる水を用いてもよいし、少量のアルコール等を含む混合溶剤であってもよい。好ましくは、局方注射用水、蒸留水等が用いられる。この時、水系溶剤に生理活性物質や、タンパク質、緩衝物質や各種の塩、血漿等を溶解させ、溶液状としたものであってもよい。
【００３６】
脂質混合物を水系溶剤に分散した形態としては、特に限定されないが、分散液をホモジナイザーや高圧噴射乳化機等を使用して乳化させたり、エクストラルーダーやリポナイザー等により粒径の揃ったリポソームとして得ることが出来る。
【００３７】
脂質混合物と核酸、医薬との混合物が水系溶媒に分散した形態の製造方法としては公知の方法で行うことができ、適宜選択することができる。製造方法としてはこれらに限定されないが、例えば、脂質混合物と核酸、医薬の混合物を水系溶剤に添加し、ホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等により乳化させる方法、脂質乾燥物に核酸、医薬を含む水系溶剤を添加して乳化する方法、水系溶媒に分散したリポソームに核酸、医薬を含む水系溶媒を添加する方法、水系溶剤に分散させたリポソームに核酸、医薬を含む水系溶媒を添加する方法が挙げられる。
【００３８】
リポソームの大きさ(粒子径)を制御したい場合には、さらに孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でエクストルーダー等を使用して押し出し濾過等を行ってもよい。また、リポソームの粒子径は、５０〜５００ｎｍが好ましく、５０〜３００ｎｍが更に好ましい。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明する。なお、例中の化合物の分析、同定には1H NMR、GPC及びTOF-MSを用いた。
【００４０】
＜1H-NMRの分析方法＞
1H-NMR分析では、日本電子データム(株)製JNM-ECP400、JNM-ECP600を用いた。NMR測定値における積分値は理論値である。
【００４１】
＜GPCの分析方法＞
GPC分析では、GPCシステムとしてSHODEX GPC STSTEM-11を用い、下記条件にて測定を行った。
展開溶媒：テトラヒドロフラン
流速：１ｍＬ/min
カラム：SHODEX KF-801, KF-803, KF-804(I.D. 8mm×30cm)
カラム温度：40℃
検出器:RI ×8
サンプル量：1mg/g, 
100μL  リファレンスにはトリエチレングリコール、PEG4000、PEG20000を用いた。
GPC測定値には、高分子量不純物と低分子不純物を、溶出曲線の変曲点からベースラインを垂直に切って除いたメーンピークの解析値、及び溶出開始点から溶出終了点までのピーク全体での解析値を併記した。
Mnは数平均分子量、Mwは重量平均分子量、Mpはピークトップ分子量を表す。
【００４２】
＜TOF-MSの分析方法＞
TOF-MS分析では、Bruker製  autoflexIII)を用いた。サンプルのマトリックスに1,8,9-Anthracenetriol、リファレンスにAngiotensin II[M+H]1+
Mono 分子量1046.5418、Somatostain
28[M+H]1+Mono 分子量3147.4710を用いた。
【００４３】
(実施例1)
式（１）の化合物の合成(Ｒ１＝メチル基、Ｒ２＝炭素数17の炭化水素、1本当たりのポリエチレングリコール鎖の分子量約1000の場合)
【００４４】
(式（４）の化合物の合成)
温度計、窒素吹き込み管、撹拌機を付した3000mL丸底フラスコへジグリセリン807g、アセトン1614g(5.7mol eq.)、トリフルオロ酢酸(1mol%)を加え、25℃で3時間反応させた。反応後、トリエチルアミン(5mol%)で中和を行い、アセトンを濃縮した。その後、ヘキサン(1600g)水(1600g)を添加し、ヘキサン/水抽出をした。ヘキサン層を除去し、新たなヘキサン(1600g)を加え、ヘキサン/水抽出をした。この抽出を合計5回行った。ヘキサン層を除去した後、水層に食塩533gを溶解させ、クロロホルム(1600g)を加え、25%食塩水/クロロホルム抽出をした。水層を除去し、新たな25%食塩水を加え、25%食塩水/クロロホルム(1600g)抽出をした。この抽出を合計5回行った。クロロホルム層を濃縮した。濃縮液に窒素を吹き込みながら40℃にて減圧乾燥をし、式（４）で表される1,2-イソプロピリデンジグリセリン147g(モル収率 27%)を得た。
1H-NMR(DMSO, 内部標準TMS)  δ(ppm):
1.26, 1.31(3H, 3H, s C(CH3)2)
3.30−3.66(8H, m C(CH3)2OCHH, 
-CH2-O-CH2-,  CH2OH,
CH(OH))
3.96-3.98(1H, t, C(CH3)2OCHH)
4.14-4.17(1H, m, C(CH3)2OCH)
4,46-4.48(1H, t, CH2OH)
4.62-4.63(1H, m, CH(OH))
【００４５】
(工程（Ａ）)
1,2-イソプロピリデンジグリセリン 50g(0.24mol)、脱水トルエン202g、ナトリウムメトキシド28%メタノール溶液3.56g(0.018mol, 7.5mol%)を5Lオートクレーブに仕込み、60℃に昇温した後、窒素を吹き込みながら、真空度を100mHgにし、脱メタノールを30分間行った。系内を窒素置換後、100℃に昇温し、 0.5MPa以下の圧力でエチレンオキサイド499g(11.3mol)を加えた後、2時間30分間反応を続けた。減圧にて未反応のエチレンオキサイドガスを除去後、70℃に冷却して、下記式（１０）の化合物を得た。
【００４６】
【化１０】
0006051758.tif 000011
1H-NMR(CDCl3, 内部標準TMS) δ(ppm):
1.36, 1.41(3H, 3H, s C(CH3)2)
3.44-3.75(200H, m,  -CH2O（CH2CH2O）nH, CHO(CH2CH2O)nH,
C(CH3)2OCHH
-CH2OCH2-),
4.03-4.06(1H, t, C(CH3)2OCHH),
4.25(1H, m, C(CH3)2OCH)
GPC分析；
＜メインピーク＞
数平均分子量(Mn):1996
重量平均分子量(Mw):2058
多分散度:1.031
ピークトップ分子量(Mp):2067
＜ピーク全体＞
数平均分子量(Mn):1922  重量平均分子量(Mw):2019
多分散度:1.051
TOF-MS  2312.9
【００４７】
(工程（Ｂ）)
温度計、窒素吹き込み管、撹拌機、Dean-stark管、及び冷却管を付した500mL丸底フラスコへ上記式（１０）の化合物を100g(43mmol)、2,6-ジtert-ブチル-p-クレゾール0,10g(0.45mmol)、トルエン300gを仕込み、加熱還流させ、水分を共沸除去した。40℃に冷却後、トリエチルアミン15.1g(149mmol)、メタンスルホン酸クロリド14.0g(122mmol)を加え、40℃にて3時間反応させた。その後、ナトリウムメトキシド28%メタノール溶液50.4g(260mmol)加え、13時間反応させた。続いて、窒素を吹き込みながら減圧にして脱メタノールを40℃にて行った。トルエン100g、2,6-ジtert-ブチル-p-クレゾール0,1g(0.45mmol)を加えた後、ろ過を行った。トルエンを濃縮後、500mL丸底フラスコに移送し、フラスコ内のトルエン量が約300gになるまで、加熱還流させ、水分を除去した。40℃に冷却後、トリエチルアミン15.1g(149mmol)、メタンスルホン酸クロリド14.0g(122mmol)を加え、40℃にて3時間反応させた。その後、ナトリウムメトキシド28%メタノール溶液50.4g(260mmol)加え、4時間反応させた。続いて、窒素を吹き込みながら減圧にして脱メタノールを40℃にて行った。トルエン100g、2,6-ジtert-ブチル-p-クレゾール0,10g(0.45mmol)を加えた。25%食塩水500gを用いて、50℃にてトルエン/水抽出をした。この水洗を合計2回行った。トルエン層をろ過後、濃縮をした。内容量が600ｇになるようにトルエンを添加し、10℃以下に冷却をした後にヘキサン600gを添加し、10℃以下にて晶析をした。結晶をろ別後、ヘキサン800g、,2,6-ジtert-ブチル-p-クレゾール0.16g(0.73mmol)を加え、結晶を洗浄し、下記式（１１）の化合物84g (収率84%)を得た。
【００４８】
【化１１】
0006051758.tif 000012
1H-NMR(CDCl3, 内部標準TMS) δ(ppm):
1.36, 1.41(3H, 3H, s C(CH3)2)
3.38(6H, s, -CH2O（CH2CH2O）nCH3, -CHO（CH2CH2O）nCH3,)
3.44-3.75(200H,m, -CH2（CH2CH2O）nCH3, CHO(CH2CH2O)nCH3,
C(CH3)2OCHH
-CH2OCH2-),
4.03-4.06(1H, t, C(CH3)2OCHH),
4.23-4.26(1H, m, C(CH3)2OCH)
GPC分析；
＜メインピーク＞
数平均分子量(Mn):2119  重量平均分子量(Mw):2181
多分散度:1.029  ピークトップ分子量（Mp）:2181
＜ピーク全体＞
数平均分子量(Mn):2108  重量平均分子量(Mw):2232
多分散度:1.059
【００４９】
(工程（Ｃ）)
1Lビーカーに上記式（１１）の化合物40g(17mmol)、注射用水500gを入れ、式（１１）の化合物を溶解させた後、85%リン酸水溶液を添加し、溶液のpHを1.8に調整した。続いて、昇温して50℃にて1時間30分間、酸加水分解を行った。加水分解後、400g/L水酸化ナトリウム水溶液を用いて、pH7.0に中和した。クロロホルム200gを添加し、水/クロロホルム抽出をした。この抽出を2回行った。その後、クロロホルム層を濃縮し、トルエン200gに溶解し、硫酸マグネシウム12gを添加し、25℃にて脱水を行った。ろ過後、容器を120gのトルエンで洗浄後、トルエン溶液を10℃以下まで冷却した。続いてヘキサン240gを添加し、10℃以下にて晶析を行った。結晶をろ別後、ヘキサン240gを加え、結晶を洗浄し、下記式（１２）の化合物34g(収率85%)を得た。
【００５０】
【化１２】
0006051758.tif 000013
1H-NMR(CDCl3, 内部標準TMS) δ(ppm):
δ3.38(6H, s, -CH2O（CH2CH2O）nCH3, -CHO（CH2CH2O）nCH3,)
3.49-3.85(202H, m, -CH2O（CH2CH2O）nCH3, CHO(CH2CH2O)nCH3,
-CH2OCH2-, CH2OH-CH(OH
)-),  
GPC分析；
＜メインピーク＞
数平均分子量(Mn):2062  重量平均分子量(Mw):2120
多分散度:1.028  ピークトップ分子量（Mp）:2115
＜ピーク全体＞
数平均分子量(Mn):2070  重量平均分子量(Mw):2178
多分散度:1.052
【００５１】
(工程（Ｄ）)
温度計、窒素吹き込み管、撹拌機、及び冷却管を付した100mL丸底フラスコへステアリン酸4.0g(14mmol)、トルエン32gを仕込み、40℃まで昇温させ、ステアリン酸を溶解させた。続いて、ジシクロへキシルカルボジイミド2.3g(11mmol)、上記式（１２）の化合物8.0g(3.5mmol)、N,N-ジメチル-4-アミノピリジン0.425g(3.5mmol)を添加した後、60℃に昇温した。60℃にて1時間30分間反応させた後、ろ過、濃縮を行った。その後、アセトニトリル40gに溶解し、ヘキサン160gを添加し、ヘキサン/アセトニトリル抽出を行う。ヘキサン層を除去して、新たなヘキサン160gを添加し、再度へキサン/アセトニトリル抽出を行う。この抽出を合計5回行う。アセトニトリル層を濃縮した後、酢酸エチル45gに溶解し、吸着剤「キョワード700」(協和化学工業株式会社製)にてN,N-ジメチル-4-アミノピリジンを吸着処理により除去した。ろ過後、濃縮を行い、下記式（１３）の化合物7.2g(モル収率73%)を得た。
【００５２】
【化１３】
0006051758.tif 000014
1H-NMR(CDCl3, 内部標準TMS) δ(ppm): 
δ0.86-0.90(6H, t, -CHCO2CH2CH2(CH2)14CH3,
-CH2CO2CH2CH2(CH2)14CH3),
1.15-1.35(56H, m, -CHCO2CH2CH2(CH2)14CH3,
-CH2CO2CH2CH2(CH2)14CH3),
1.55-1.65((4H, m -CHCO2CH2CH2(CH2)14CH3,
-CH2CO2CH2CH2(CH2)14CH3),
2.27-2.32（4H, m , -CHCO2CH2CH2(CH2)14CH3,
-CH2CO2CH2CH2(CH2)14CH3）,
3.38(6H, s, -CH2O（CH2CH2O）nCH3, -CHO（CH2CH2O）nCH3 ),
3.49-3.85(199H, m, -CH2O（CH2CH2O）nCH3, CHO(CH2CH2O)nCH3,
-CH2OCH2-,)
4.11-4.16(1H, m, -CHHCO2CH2CH2(CH2)14CH3)
4.31-4.34(1H, d, -CHHCO2CH2CH2(CH2)14CH3)
5.18-5.20(1H, m, -CHCO2CH2CH2(CH2)14CH3)
【００５３】
得られた式（１３）の化合物は、TLC(薄層クロマトグラフィー:クロロホルム/メタノール=85/15、90/10)にて展開後、ヨウ素発色にて確認したところ、純度は98%以上であった(リファレンスとして分子量2,000の末端メトキシのポリエチレングリコールを使用)。
【００５４】
残存脂肪酸の分析は、TLC(薄層クロマトグラフィー:クロロホルム/メタノール=99/5)にて、展開し、リン酸硫酸銅の発色にて分析した。その結果、残存ステアリン酸は0.05%以下であった。  
【００５５】
(リポソームとしの評価)
水添大豆ホスファジルコリン  6.059g(7.7mmol)、コレステロール1.0g(2.6mmol)をクロロホルムに溶解させた後、エバポレーターにより溶剤を留去し、さらに6時間真空乾燥させた。この脂質乾燥物0.07gを秤量し、水20mLを加えて、水和させ、湯浴につけながらボルテックスミキサーにて軽く撹拌した。この脂質分散液を0.2μmの孔径のポリカーボネートメンブレンフィルターを用いて、サイジングを行い、リポソーム液を調製した(0.2μm×2回)。該リポソーム液を5セット調製し、それぞれをリポソーム液(i)、(ii)とした。
【００５６】
（実施例Ａ）
別に工程（Ｄ）で得られた式（１３）で表される、ジステアリルグリセロールと結合した、分岐型メチルポリエチレングリコール0.072g(2.57×10-2mmol)を水5mLに溶解させておき、分散液(5.1mM)を調製した。この分散液をリポソーム（i）に添加し、60℃で1時間撹拌し、分岐型ポリエチレングリコール修飾リポソーム（Ａ）を調整した(脂質濃度 4mM、  PEG濃度  1mM)。
【００５７】
（比較例Ｂ）
下記式（１４）で表される化合物(ポリエチレングリコール分子量2000)を0,068g(2.57×10-2mmol)を水5mLに溶解させておき、分散液(5.1mM)を調製した。この分散液(ii)に添加し、60℃で1時間撹拌し、直鎖型ポリエチレングリコール修飾リポソーム(B)を調整した(脂質濃度 4mM、PEG濃度  1mM)。
【００５８】
【化１４】
0006051758.tif 000015
【００５９】
(ポリエチレングリコール修飾リポソームの安定性の検討)
ポリエチレングリコール修飾リポソームの安定性を評価するため、実施例A、比較例Bで得られた2つのポリエチレングリコール修飾リポソームを、40℃の低温恒温器(LTI-700E: EYELA)に入れ、1、2、3ヶ月での安定性を評価した。結果を表に示す。
【００６０】
【表１】
0006051758.tif 000016
【００６１】
40℃でのポリエチレングリコール修飾リポソームの安定性評価の結果、本願発明のジアシルグリセロールと結合した分岐型ポリエチレングリコールを含む、実施例Aのポリエチレングリコール修飾リポソーム（Ａ）は、3ヶ月経過後も安定であった。
【００６２】
一方、従来の直鎖型ポリエチレングリコールを使用したポリエチレングリコール修飾リポソームは、2ヶ月で凝集していた。
【００６３】
以上より、本願発明のジアシルグリセロールと結合した分岐型ポリエチレングリコールを含むポリエチレングリコール修飾リポソームは、従来の直鎖型ポリエチレングリコールを使用したリポソームよりも安定性の高いことが明らかになった。