(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラビンアデニンジヌクレオチドまたはその塩を有効成分として含有する角膜上皮細胞死の抑制剤（亜鉛類を含有する場合を除く）であって、投与形態が点眼投与であり、剤形が点眼剤である、該角膜上皮細胞死が紫外線照射によって誘発される、抑制剤。
【請求項２】
紫外線が紫外線Ｂ波である、請求項１に記載の抑制剤。
【請求項３】
フラビンアデニンジヌクレオチドまたはその塩の濃度が０．０１〜１％（ｗ／ｖ）である、請求項１または２に記載の抑制剤。
【請求項４】
フラビンアデニンジヌクレオチドまたはその塩の濃度が０．０５％（ｗ／ｖ）である、請求項１または２に記載の抑制剤。
【請求項５】
角膜上皮細胞死の抑制剤（亜鉛類を含有する場合を除く）を製造するためのフラビンアデニンジヌクレオチドまたはその塩の使用であって、該角膜上皮細胞死が紫外線照射によって誘発され、投与形態が点眼投与であり、剤形が点眼剤である、使用。
【請求項６】
紫外線が紫外線Ｂ波である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
フラビンアデニンジヌクレオチドまたはその塩の濃度が０．０１〜１％（ｗ／ｖ）である、請求項５または６に記載の使用。
【請求項８】
フラビンアデニンジヌクレオチドまたはその塩の濃度が０．０５％（ｗ／ｖ）である、請求項５または６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ：Ｆｌａｖｉｎ  Ａｄｅｎｉｎｅ  Ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）またはその塩（以下、これらを総称して「ＦＡＤ等」ともいう）を有効成分として含有する角膜上皮細胞死の抑制剤であって、該角膜上皮細胞死が紫外線照射によって誘発される、抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
角膜は外界と直接接している組織であり、常時、種々のストレスに曝露されている。外的ストレスの一種である紫外線には、紫外線Ａ波（波長：３２０ｎｍ以上４００ｎｍ未満）、紫外線Ｂ波（波長：２９０ｎｍ以上３２０ｎｍ未満）および紫外線Ｃ波（波長：２００ｎｍ以上２９０ｎｍ未満）の３種が知られている。日本眼科紀要，  ５７，  ７３４−７３８（２００６）（非特許文献１）には、紫外線Ｂ波（以下、「ＵＶ−Ｂ」ともいう）および紫外線Ｃ波（以下、「ＵＶ−Ｃ」ともいう）は角膜上皮で吸収されること、および、ＵＶ−Ｃはオゾン層において吸収されるので問題とはならない一方、臨床的に問題になるのはＵＶ−Ｂであることが記載されている。
【０００３】
また、Ｅｘｐ．  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．，  ９０（２），  ２１６−２２（２０１０）（非特許文献２）には、ＵＶ−Ｂによって角膜上皮細胞のアポトーシス（細胞死）が誘発されることが開示されており、実際、前記非特許文献１には、ＵＶ−Ｂが角膜上皮損傷、角膜浮腫・混濁などを導くことが開示されている。
【０００４】
一方、ＦＡＤは細胞の酸化還元に直接関与する補酵素型ビタミンＢ２であり、角膜の酵素呼吸代謝を促進することが知られている。さらに、フラビタン（登録商標）点眼液０．０５％  添付文書（非特許文献３）には、ＦＡＤの二ナトリウム塩はビタミンＢ２欠乏または代謝障害が関与すると推定される角膜炎に対して有用であることが記載されている。
【０００５】
しかしながら、ＦＡＤが紫外線によって誘発される角膜上皮細胞死に及ぼす影響については全く明らかとなっておらず、むしろ、国際公開第９９／４３３４７号（特許文献１）には、ＦＡＤの二ナトリウム塩を含有するフラビタン（登録商標）点眼液が角膜上皮障害を誘発する眼科用剤として例示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第９９／４３３４７号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】日本眼科紀要，  ５７，  ７３４−７３８（２００６）
【非特許文献２】Ｅｘｐ．  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．，  ９０（２），  ２１６−２２（２０１０）
【非特許文献３】フラビタン（登録商標）点眼液０．０５％  添付文書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以上のように、紫外線照射によって誘発される角膜上皮細胞死を抑制する薬剤を探索することは興味深い課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、紫外線照射によって誘発される角膜上皮細胞死を抑制する薬物を探索するため鋭意研究を行ったところ、フラビンアデニンジヌクレオチド二ナトリウム塩（以下、「本化合物」ともいう）が顕著な細胞死抑制効果を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチドまたはその塩（ＦＡＤ等）を有効成分として含有する角膜上皮細胞死の抑制剤であって、該角膜上皮細胞死が紫外線照射によって誘発される、抑制剤（以下、「本剤」ともいう）である。
【００１１】
また、本発明の他の態様は、ＦＡＤ等を有効成分として含有する角膜上皮細胞死の抑制剤であって、該角膜上皮細胞死が紫外線Ｂ波照射によって誘発される、抑制剤である。
【００１２】
また、本発明の他の態様は、ＦＡＤ等の濃度が０．０１〜１％（ｗ／ｖ）である、本剤である。
【００１３】
また、本発明の他の態様は、ＦＡＤ等の濃度が０．０５％（ｗ／ｖ）である、本剤である。
【００１４】
また、本発明の他の態様は、投与形態が点眼投与である、本剤である。
また、本発明の他の態様は、剤形が点眼剤である、本剤である。
【発明の効果】
【００１５】
後述するように、本化合物を含むＦＡＤ等は、紫外線照射によって誘発される角膜上皮細胞の生細胞数の低下を顕著に抑制することから、紫外線照射によって誘発される角膜上皮細胞死の抑制剤となりうる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＵＶ−Ｂ照射前に角膜上皮細胞を本化合物で処置した場合の生存率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
フラビンアデニンジヌクレオチドは、下記式（１）で示される化合物である。
【００１８】
【化１】
0005969872.tif 000002
【００１９】
フラビンアデニンジヌクレオチドの塩としては、医薬として許容される塩であれば特に制限はなく、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などの無機酸との塩、酢酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸、アジピン酸、グルコン酸、グルコヘプト酸、グルクロン酸、テレフタル酸、メタンスルホン酸、乳酸、馬尿酸、１，２−エタンジスルホン酸、イセチオン酸、ラクトビオン酸、オレイン酸、パモ酸、ポリガラクツロン酸、ステアリン酸、タンニン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、硫酸ラウリルエステル、硫酸メチル、ナフタレンスルホン酸、スルホサリチル酸などの有機酸との塩；臭化メチル、ヨウ化メチルなどとの四級アンモニウム塩；臭素イオン、塩素イオン、ヨウ素イオンなどのハロゲンイオンとの塩；リチウム、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩；鉄、亜鉛などとの金属塩；アンモニアとの塩；トリエチレンジアミン、２−アミノエタノール、２，２−イミノビス（エタノール）、１−デオキシ−１−（メチルアミノ）−２−Ｄ−ソルビトール、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール、プロカイン、Ｎ，Ｎ−ビス（フェニルメチル）−１，２−エタンジアミンなどの有機アミンとの塩などが挙げられる。
【００２０】
フラビンアデニンジヌクレオチドの塩としてはナトリウム塩が好ましく、特に、下記式（２）で示されるフラビンアデニンジヌクレオチド二ナトリウム塩が好ましい。
【００２１】
【化２】
0005969872.tif 000003
【００２２】
また、フラビンアデニンジヌクレオチドまたはその塩（ＦＡＤ等）は、水和物または溶媒和物の形態をとっていてもよい。
【００２３】
フラビンアデニンジヌクレオチドに幾何異性体または光学異性体が存在する場合は、当該異性体またはその塩も本発明の範囲に含まれる。また、フラビンアデニンジヌクレオチドにプロトン互変異性体が存在する場合には、当該互変異性体またはその塩も本発明の範囲に含まれる。
【００２４】
フラビンアデニンジヌクレオチドまたはその塩（水和物または溶媒和物の形態をとる場合を含む）に、結晶多形および結晶多形群（結晶多形システム）が存在する場合には、それらの結晶多形体および結晶多形群（結晶多形システム）も本発明の範囲に含まれる。ここで、結晶多形群（結晶多形システム）とは、それら結晶の製造、晶出、保存などの条件および状態（なお、本状態には製剤化した状態も含む）により、結晶形が変化する場合の各段階における個々の結晶形およびその過程全体を意味する。
【００２５】
フラビンアデニンジヌクレオチドまたはその塩は有機合成化学の分野における通常の方法に従って製造できる。また、Ｓｉｇｍａ社などにより市販されているものを用いることもできる。
【００２６】
本発明おいて、「紫外線照射によって誘発される角膜上皮細胞死の抑制」とは、紫外線照射によって誘発される角膜上皮細胞の生細胞数の低下を抑制することを意味するのみならず、該生細胞数の低下（すなわち、角膜上皮細胞死）を伴う角膜上皮損傷、角膜浮腫・混濁などを予防または治療することをも意味する。
【００２７】
本発明において、「紫外線」とは、紫外線Ａ波（波長：３２０ｎｍ以上４００ｎｍ未満）、紫外線Ｂ波（波長：２９０ｎｍ以上３２０ｎｍ未満）および紫外線Ｃ波（波長：２００ｎｍ以上２９０ｎｍ未満）の３種を意味する。背景技術の項で説明したように、角膜上皮細胞死を誘発するものとして臨床的に問題になるのは「紫外線Ｂ波（ＵＶ−Ｂ）」であることが知られている。
【００２８】
本剤は、ＦＡＤ等に、他の有効成分および医薬として許容される添加剤を混合し、汎用されている技術を用いて配合眼科用剤として製剤化することもできるし、また、ＦＡＤ等に、医薬として許容される添加剤を加え、汎用されている技術を用いて単独眼科用剤として製剤化することもできる。なお、我が国では、０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度の本化合物を有効成分として含有する「フラビタン（登録商標）点眼液０．０５％」などの点眼液が市販されている。
【００２９】
本発明において、本剤は眼局所に投与される。本剤の投与形態としては、例えば、点眼投与（眼軟膏の点入も含むものとする）、結膜下投与、結膜嚢内投与、テノン嚢下投与などが挙げられるが、点眼投与が特に好ましい。
【００３０】
本剤の剤形は、眼局所投与に用いられるものであれば特に限定はされないが、例えば、点眼剤、眼軟膏、注射剤、貼布剤、ゲル、挿入剤などが挙げられ、中でも点眼剤が好ましい。なお、これらは当該分野で汎用されている通常の技術を用いて調製することができる。さらに、本治療剤は、これらの製剤の他に眼内インプラント用製剤やマイクロスフェアーなどのＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）化された製剤にすることもできる。
【００３１】
点眼剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、濃グリセリンなどの等張化剤；リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、イプシロン−アミノカプロン酸などの緩衝化剤；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などの界面活性剤；クエン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウムなどの安定化剤；ベンザルコニウム塩化物、パラベンなどの防腐剤などから必要に応じて選択して用い、調製することができ、ｐＨは眼科製剤に許容される範囲内にあればよいが、通常４〜８の範囲内が好ましい。
【００３２】
眼軟膏は、白色ワセリン、流動パラフィンなどの汎用される基剤を用い、調製することができる。
【００３３】
注射剤は、塩化ナトリウムなどの等張化剤；リン酸ナトリウムなどの緩衝化剤；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレートなどの界面活性剤；メチルセルロースなどの増粘剤などから必要に応じて選択して用い、調製することができる。
【００３４】
挿入剤は、生体分解性ポリマー、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸などの生体分解性ポリマーを本化合物とともに粉砕混合し、この粉末を圧縮成型することにより、調製することができ、必要に応じて、賦形剤、結合剤、安定化剤、ｐＨ調整剤などを用いることができる。
【００３５】
眼内インプラント用製剤は、生体分解性ポリマー、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸共重合体、ヒドロキシプロピルセルロースなどの生体分解性ポリマーを用い、調製することができる。
【００３６】
本剤の用量は、剤型、投与すべき患者の症状の軽重、年齢、体重、医師の判断などに応じて適宜変えることができるが、例えば、点眼剤を選択した場合には、０．００５〜５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１〜１％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０２〜０．５％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度のＦＡＤ等を含有する本剤を１回に１〜２滴点眼する。
【００３７】
なお、上述のＦＡＤ等の濃度は、フラビンアデニンジヌクレオチド（フリー体）の濃度でもありうるし、フラビンアデニンジヌクレオチドの塩の濃度でもありうる。
【００３８】
本剤の用法は、剤型、投与すべき患者の症状の軽重、年齢、体重、医師の判断などに応じて適宜変えることができるが、例えば、剤形として点眼剤を選択した場合には、１日１〜１０回、好ましくは１日２〜８回、より好ましくは１日３〜６回に分けて眼局所に投与することができる。
【００３９】
以下に、薬理試験および製剤例の結果を示すが、これらの例は本発明をよりよく理解するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００４０】
［薬理試験］
紫外線（ＵＶ−Ｂ）照射前に角膜上皮細胞をＦＡＤで処置した場合に、紫外線照射による生細胞数の低下が抑制されるか否かを評価した。
【００４１】
（試験方法）
ＳＶ４０不死化ヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥ−Ｔ：理化学研究所、バイオリソースセンター、Ｃｅｌｌ  Ｎｏ．：ＲＣＢ２２８０）を９６ウェルプレートに播種（１×１０４個／ウェル）し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で１日培養した。翌日、前記１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を０．０１２５％（ｗ／ｖ）もしくは０．０５％（ｗ／ｖ）フラビンアデニンジヌクレオチド二ナトリウム塩含有ＰＢＳ、０．５％（ｗ／ｖ）コンドロイチン硫酸エステルナトリウム含有ＰＢＳ、またはＰＢＳに交換した後、３７℃で６０分間培養した（以下、それぞれ、「０．０１２５％  ＦＡＤ群」、「０．０５％  ＦＡＤ群」、「０．５％  ＣＳ群」または「基剤群」ともいう）。その後、角膜上皮細胞にＵＶ−Ｂ照射（８０ｍＪ／ｃｍ２）を約１分間行った。各群の培地を再度１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に交換してから、３７℃で２４時間培養した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、カタログ番号：Ｇ３５８０）を用いて生細胞数を測定し、下記式１に従って、生存率を算出した。なお、本試験で用いたフラビンアデニンジヌクレオチド二ナトリウム塩およびコンドロイチン硫酸エステルナトリウムは、それぞれ協和発酵バイオ株式会社および株式会社マルハニチロ食品から購入した。
【００４２】
［式１］
生存率（％）＝（各群の生細胞数／ＵＶ−Ｂ非照射群の生細胞数）×１００
（結果）
試験結果を図１に示す。なお、図１中、値は平均値±標準誤差を示す（Ｎ＝３）。
【００４３】
（考察）
図１から明らかなように、ＵＶ−Ｂ照射前に角膜上皮細胞を本化合物で前処置しておいた場合、濃度依存的な角膜上皮細胞死の抑制作用が確認された。一方で、紫外線を浴びた角膜表面を保護することが知られているコンドロイチン硫酸エステルナトリウム（バイシン（登録商標）ＵＶ添付文書参照）で処置した群では、同作用は確認されなかった。すなわち、ＦＡＤは紫外線照射によって誘発される角膜上皮細胞死を抑制することが示された。
【００４４】
［製剤例］
製剤例を挙げて本発明の薬剤をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの製剤例にのみ限定されるものではない。
【００４５】
（処方例１）
点眼剤（ＦＡＤ濃度：０．０５％（ｗ／ｖ））    １００ｍｌ中
フラビンアデニンジヌクレオチド二ナトリウム塩      ０．０５ｇ
塩化ナトリウム                                      ０．９ｇ
リン酸水素ナトリウム水和物                              適量
滅菌精製水                                              適量
滅菌精製水にフラビンアデニンジヌクレオチド二ナトリウム塩およびそれ以外の上記成分を加え、これらを十分に混合して点眼剤を調製する。フラビンアデニンジヌクレオチド二ナトリウム塩の添加量を変えることにより、ＦＡＤ濃度が０．００５％（ｗ／ｖ）、０．０１％（ｗ／ｖ）または０．１％（ｗ／ｖ）である点眼剤を調製できる。
【００４６】
（処方例２）
眼軟膏（ＦＡＤ濃度：０．０５％（ｗ／ｗ））    １００ｇ中
フラビンアデニンジヌクレオチド二ナトリウム塩      ０．０５ｇ
流動パラフィン                                      １０ｍｇ
白色ワセリン                                            適量
均一に溶融した白色ワセリンおよび流動パラフィンにフラビンアデニンジヌクレオチド二ナトリウム塩を加え、これらを十分に混合して後に徐々に冷却することで眼軟膏を調製する。フラビンアデニンジヌクレオチド二ナトリウム塩の添加量を変えることにより、ＦＡＤ濃度が０．００５％（ｗ／ｗ）、０．０１％（ｗ／ｗ）または０．１％（ｗ／ｗ）である眼軟膏を調製できる。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
フラビンアデニンジヌクレオチドまたはその塩は、紫外線照射によって誘発される角膜上皮細胞の生細胞数の低下を顕著に抑制することから、紫外線照射によって誘発される角膜上皮細胞死の抑制剤となることが期待される。
【図１】
0005969872.tif 000004