(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵過程により生産される１，４−ジアミノブタン発酵液から菌体を除去するステップ（ステップ１）と、
前記ステップ１で菌体を分離した発酵液に塩基性物質を添加して生成された塩を除去するステップ（ステップ２）と、
前記ステップ２で塩を除去した発酵液を濃縮するステップ（ステップ３）と、
前記ステップ３で濃縮された発酵液を結晶化するステップ（ステップ４）と、
前記ステップ４で発酵液から結晶化した不純物を除去するステップ（ステップ５）と、
前記ステップ５で不純物を除去した発酵液から１，４−ジアミノブタンを回収するステップ（ステップ６）とを含む、１，４−ジアミノブタン発酵液から１，４−ジアミノブタンを分離及び精製する方法。
【請求項２】
前記ステップ２の塩基性物質が、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム又は水酸化アンモニウムである、請求項１に記載の分離及び精製する方法。
【請求項３】
前記ステップ３の発酵液の濃縮が低温濃縮法である、請求項１に記載の分離及び精製する方法。
【請求項４】
前記低温濃縮法が、真空条件１０ｍｍＨｇ〜７６０ｍｍＨｇ及び蒸気温度１０℃〜１００℃の範囲内で、生成される凝縮水を除去することにより行われる、請求項３に記載の分離及び精製する方法。
【請求項５】
前記ステップ３の発酵液の濃縮が、水分が全量の５ｗｔ％〜３０ｗｔ％になるように行う、請求項１に記載の分離及び精製する方法。
【請求項６】
前記ステップ４の結晶化ステップが、０．０５℃／分〜１．０℃／分の冷却速度で発酵液を冷却する、請求項１に記載の分離及び精製する方法。
【請求項７】
前記ステップ６の回収が、高温濃縮法と分別蒸留法が連続して行われる、請求項１に記載の分離及び精製する方法。
【請求項８】
前記高温濃縮法が、真空条件１０ｍｍＨｇ〜７６０ｍｍＨｇ及び蒸気温度３０℃〜１５８℃の範囲で、不純物を除去した発酵液から生成される凝縮水が蒸留塔に投入されて行われる、請求項７に記載の分離及び精製する方法。
【請求項９】
前記蒸留塔において、水とアンモニウムは蒸留塔の上部で回収され、１，４−ジアミノブタンは蒸留塔の下部で回収される、請求項８に記載の分離及び精製する方法。
【請求項１０】
前記ステップ６の回収が、高温濃縮法で残った発酵液をステップ３の濃縮ステップに循環させる、請求項１に記載の分離及び精製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵液から高純度及び高収率の１，４−ジアミノブタンを分離及び精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，４−ジアミノブタン（1,4-diaminobutane）（別名、プトレシン）は、動物の死体やオスの精液に多量に存在する物質であり、化学産業においてポリアミド−４，６の単量体として用いられている。現在商用化されている工程は化学工程を用いており、化学工程においては、毒性の強いシアン化水素（別名、青酸カリ）とアクリロニトリルを用いてスクシノニトリルを製造し、脱水素化工程を経て合成された１，４−ジアミノブタンを精製過程で純粋な１，４−ジアミノブタンにして生産する。前記化学工程は、原料物質自体の毒性が強く、脱水素化工程のために高温、高圧の工程を必要とし、高価な触媒を用いなければならないという問題がある。
【０００３】
よって、前記化学工程の代案として、再生可能なバイオマス由来の炭素源から１，４−ジアミノブタンを生産する方法が求められている現状である。
【０００４】
近年、変異微生物を用いた発酵による１，４−ジアミノブタンの生産方法が開発されているが（特許文献１）、発酵液から１，４−ジアミノブタンを高純度、高収率で分離及び精製する方法に関する研究は不足している現状である。
【０００５】
よって、本発明者は、１，４−ジアミノブタンを高純度、高収率で分離及び精製する方法に関する研究を重ね、菌体を分離した発酵液に塩基性物質を添加して生成された塩を除去するステップと、濃縮した発酵液の結晶化により不純物を除去するステップとを経て、１，４−ジアミノブタンを回収及び濃縮するステップを繰り返すことにより高純度、高収率で１，４−ジアミノブタンが得られることを確認し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国公開特許第１０−２００９−０１０７９２０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、発酵過程により生産される１，４−ジアミノブタン発酵液から菌体分離、塩除去、濃縮、不純物除去及び回収ステップを経て高純度、高収率の１，４−ジアミノブタンを分離及び精製する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明の一実施態様は、発酵過程により生産される１，４−ジアミノブタン発酵液から菌体を除去するステップ（ステップ１）と、前記ステップ１で菌体を分離した発酵液に塩基性物質を添加して生成された塩を除去するステップ（ステップ２）と、前記ステップ２で塩を除去した発酵液を濃縮するステップ（ステップ３）と、前記ステップ３で濃縮した発酵液から不純物を除去するステップ（ステップ４）と、前記ステップ４で不純物を除去した発酵液から１，４−ジアミノブタンを回収するステップ（ステップ５）とを含む、１，４−ジアミノブタン発酵液から１，４−ジアミノブタンを分離及び精製する方法を提供する。
【０００９】
前記ステップ１は、発酵過程により生産される１，４−ジアミノブタン発酵液から菌体を除去するステップであり、本発明においては１，４−ジアミノブタンを生産できるように変形された微生物を用いて培養した発酵液であれば微生物の種類に関係なく全て用いることができる。用いることができる微生物としては、エシェリキア属、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、パントエア属、セラチア属、コリネバクテリウム属などに属する微生物が挙げられる。
【００１０】
本発明において使用される発酵液としては、例えば変異型コリネバクテリウム、変異型大腸菌などを用いて１，４−ジアミノブタンを生産することができる。
【００１１】
前記発酵液から菌体を分離するために用いられる方法としては、遠心分離機、フィルタープレス、圧搾濾過器、珪藻土濾過器、回転式真空濾過器、膜分離器、凝集及び浮遊方法などを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１２】
分離した菌体は、乾燥させて動物用飼料や肥料などとして用いることができる。菌体を分離した液は、ｐＨ調整貯蔵タンクに送られる。
【００１３】
前記ステップ２は、前記ステップ１で菌体を分離した発酵液に塩基性物質を添加して生成された塩を除去するステップであり、塩の除去により１，４−ジアミノブタンの精製を容易にするステップである。
【００１４】
１，４−ジアミノブタンが培地中にフリー状態で存在する場合、発酵液のｐＨは１１．２以上となる。ｐＨが高い場合、菌株が１，４−ジアミノブタンを生成できず、細胞膜が破壊される溶解現象が発生する。それを防止するために培養中の発酵液に中和剤が投入されるが、それはほとんど硫酸である。塩酸を用いない理由は、腐食性の問題があるからである。
【００１５】
また、１，４−ジアミノブタンのＮ供給源として培地内に硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）が含まれるが、前記硫酸アンモニウムの２ＮＨ４＋がＮ供給源として用いられ、残りのＳＯ４２−は培地中にフリー状態で存在するか、一部は中性条件で１，４−ジアミノブタンと反応して１，４−ジアミノブタン塩（（ＣＨ２）４（ＮＨ３＋）２−ＳＯ４２−）を形成する。ここで、用いられるＮ供給源の種類によっては、１，４−ジアミノブタンにＳＯ４２−以外にＣｌ−などの陰イオンが結合した状態で存在する。
【００１６】
前述したように、培養中の発酵液に中和剤を投入することにより、菌体を分離した発酵液のｐＨも中性となり、１，４−ジアミノブタンが中性条件でＳＯ４２−などの陰イオンに結合して塩の状態で存在するので、容易に精製できない。
【００１７】
よって、本発明においては、前記ステップ２を設け、１，４−ジアミノブタンを容易に精製するために、塩基性物質を添加して１，４−ジアミノブタンに結合された塩を除去する。
【００１８】
これを反応式で表すと次の通りである。
【００１９】
【化１】
0005996650.tif 000002
【００２０】
１，４−ジアミノブタンに結合された塩を除去するために、アルカリ成分（塩基性物質）を投入してｐＨ値を１１．２〜１４．０に調整しなければならない。前記反応式におけるアルカリ成分（塩基性物質）はＣａ（ＯＨ）２である。
【００２１】
１，４−ジアミノブタンの特性上、ｐＨ値が１１．２以下では１，４−ジアミノブタンの電子が＋１価となり、９．７以下では＋２価となる。よって、ｐＨが低いと１，４−ジアミノブタンの電子が＋２価となり、他の陰イオン（又は塩）に結合して１，４−ジアミノブタンを精製することが困難になる。よって、ｐＨ値が１１．２以上となるように維持することが好ましく、１１．２〜１４．０に調整することがより好ましい。
【００２２】
投入される塩基性物質としては、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化アンモニウムなどが用いられる。
【００２３】
生成された塩（前記反応式においては、生成された塩は硫酸カルシウムである）を除去する方法としては、遠心分離機、フィルタープレス、圧搾濾過器、珪藻土濾過器、回転式真空濾過器、膜分離器、凝集及び浮遊方法などを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
回収された塩（硫酸カルシウム）は、さらに精製過程を経て食品添加剤、セメントの混合材、肥料、鋳物の模型、医療用ギプスなどに用いられる。前記反応式による塩除去工程においては、概ね硫酸カルシウムのみ除去される。硫酸カルシウムを除く他の物質は、水に対する溶解度が高いため、結晶として析出しないからである。
【００２５】
前記ステップ３は、前記ステップ２で塩を除去した発酵液を濃縮するステップであり、これにより１，４−ジアミノブタンの精製収率を向上させることができる。
【００２６】
塩除去ステップ後に得た母液はほとんどが水分であるため、優先的に水分を除去する工程を伴うことになる。前記濃縮機は、遠心濃縮機、蒸発濃縮機、対流循環式濃縮機、低温減圧濃縮機、回転式減圧濃縮機、減圧蒸発濃縮機、薄膜濃縮機及び板型濃縮機からなる群から選択されて用いられるが、これらに限定されるものではない。低温減圧濃縮機を用いた低温濃縮法で発酵液を濃縮することが好ましい。前記低温減圧濃縮機の使用条件は次の通りである。
【００２７】
圧力条件は１０〜７６０ｍｍＨｇの真空状態、好ましくは７０〜２００ｍｍＨｇである。温度条件は１０〜１００℃、好ましくは４５〜６７℃を維持することが好ましい。ここで、水分は全量の５〜３０ｗｔ％、好ましくは１０〜２５ｗｔ％を残して除去する。
【００２８】
濃縮度が高いと粘度が増加するので濾過の問題があり、濃縮度が低いと不純物が結晶として形成されないので精製の意味がなくなる。また、前記濃縮された水分％によって１，４−ジアミノブタンの精製収率が変化し、水分を全て除去すると、不純物の溶解度が低くなり、微細な結晶が析出するので、濾過時間が長くなるという問題が生じる。除去された凝縮水には発酵後に残ったアンモニアが共に回収されるが、硫酸を用いて硫酸アンモニウムを生成して副産物として活用することができる。
【００２９】
前記ステップ４は、前記ステップ３で濃縮した発酵液から不純物を除去するステップであり、これにより１，４−ジアミノブタンの精製収率を向上させることができる。
【００３０】
前記濃縮した発酵液に存在する不純物は、遠心分離機、フィルタープレス、圧搾濾過器、珪藻土濾過器、回転式真空濾過器、膜分離器、凝集及び浮遊方法、フィルターペーパーを用いた濾過などによって除去することができるが、これらに限定されるものではない。濾過後の母液は１，４−ジアミノブタン回収ステップで用いられ、固体成分は廃棄される。
【００３１】
前記ステップ３と前記ステップ４の間に結晶化ステップをさらに含んでもよい。塩を除去した発酵液を濃縮するステップ後に、濃縮した発酵液を結晶化するステップをさらに含むことで、発酵液が結晶化し、結晶成長することにより不純物を除去することができる。また、発酵液が結晶化し、結晶成長することにより精製収率を向上させることができる。
【００３２】
前記結晶化の方法には、冷却結晶化、 Ｓａｌｔｉｎｇ−ｏｕｔ結晶化、Ｄｒｏｗｎｉｎｇ−ｏｕｔ結晶化、溶液結晶化、溶融結晶化、ｓｅｅｄ結晶化などが用いられるが、これらに限定されるものではない。さらなる精製ステップを経ることなく効率を向上させるために、追加の物質が投入されない方法を用いることが好ましいが、具体的には、冷却結晶化方法を用いることが好ましい。前記冷却結晶化は、０．０１℃／分〜１０℃／分の冷却速度で、好ましくは０．０５℃／分〜１．０℃／分の冷却速度で２０℃まで冷却することにより行うことができる。
【００３３】
前記ステップ５は、前記ステップ４で不純物を除去した発酵液から１，４−ジアミノブタンを回収するステップであり、前記不純物を除去した発酵液から１，４−ジアミノブタンを分離することができる。
【００３４】
分離過程は、高温濃縮法と分別蒸留法が連続して行われる。具体的には、高温濃縮段階で濃縮された蒸気が分別蒸留段階のために蒸留塔の中間の高さの位置に投入される。
【００３５】
前記高温濃縮法と分別蒸留法の圧力条件は１０〜７６０ｍｍＨｇの真空状態、好ましくは７０〜２００ｍｍＨｇである。温度条件は３０〜１５８℃、好ましくは８０〜１２０℃を維持することが好ましい。本発明の具体的な実施例において、上記圧力条件及び温度条件下で蒸留することにより、蒸留塔の上部には水とアンモニウムが分離し、蒸留塔の下部には１，４−ジアミノブタンが分離精製された。
【００３６】
高温濃縮の下部液は、初期投入量の２〜１０ｗｔ％、好ましくは４〜８ｗｔ％まで濃縮する。高温濃縮段階で残った液は、低温濃縮段階に投入して循環させることができる。前記段階に循環させて本発明を繰り返すことにより、精製収率を向上させることができる。よって、本発明は、前記高温濃縮法で残った発酵液をステップ３の濃縮ステップに循環させることができる。
【００３７】
本発明の他の実施態様は、発酵過程により生産される１，４−ジアミノブタン発酵液から菌体を除去するステップ（ステップ１）と、前記ステップ１で菌体を分離した発酵液に塩基性物質を添加して生成された塩を除去するステップ（ステップ２）と、前記ステップ２で塩を除去した発酵液を濃縮するステップ（ステップ３）と、前記ステップ３で濃縮した発酵液を結晶化するステップ（ステップ４）と、前記ステップ４で結晶化した発酵液から不純物を除去するステップ（ステップ５）と、前記ステップ５で不純物を除去した発酵液から１，４−ジアミノブタンを回収するステップ（ステップ６）とを含む、１，４−ジアミノブタン発酵液から１，４−ジアミノブタンを分離及び精製する方法を提供する。
【００３８】
前記ステップ１〜３は、本発明の一態様における前記ステップ１〜３の内容と同一である。また、前記ステップ５は本発明の一態様における前記ステップ４の内容と同一であり、前記ステップ６は本発明の一態様における前記ステップ５の内容と同一である。
【００３９】
前記ステップ４は、濃縮した発酵液を結晶化するステップであり、発酵液が結晶化し、結晶成長することによって不純物を除去することができる。このような結晶化による結晶成長によって精製収率を向上させることができる。
【００４０】
前記結晶化方法には、冷却結晶化、、Ｓａｌｔｉｎｇ−ｏｕｔ結晶化、Ｄｒｏｗｎｉｎｇ−ｏｕｔ結晶化、溶液結晶化、溶融結晶化、ｓｅｅｄ結晶化などが用いられるが、これらに限定されるものではない。さらなる精製ステップを経ることなく効率を向上させるために、追加の物質が投入されない方法を用いることが好ましいが、具体的には、冷却結晶化方法を用いることが好ましい。前記冷却結晶化は、０．０１℃／分〜１０℃／分の冷却速度で、好ましくは０．０５℃／分〜１．０℃／分の冷却速度で２０℃まで冷却することにより行うことができる。
【発明の効果】
【００４１】
本発明の１，４−ジアミノブタン発酵液から１，４−ジアミノブタンを分離及び精製する方法によれば、発酵液から菌体分離により分離した菌体は動物飼料用に用いることができ、塩除去により析出する塩は副産物として活用することができる。また、残った母液を濃縮及び蒸留する過程により高純度、高収率の１，４−ジアミノブタンを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】発酵過程により生産される１，４−ジアミノブタン発酵液から菌体分離、塩除去、濃縮、不純物除去及び回収ステップを経て高純度、高収率の１，４−ジアミノブタンを分離及び精製する方法を示す図である。
【図２】発酵過程により生産される１，４−ジアミノブタン発酵液から菌体分離、塩除去、低温濃縮、結晶化、濾過、高温濃縮及び蒸留ステップを経て高純度、高収率の１，４−ジアミノブタンを分離及び精製する方法を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下、本発明の理解を容易にするために好ましい実施例を示す。しかし、下記実施例は本発明をより容易に理解するために示すものであり、本発明を限定するものではない。
【００４４】
未精製の１，４−ジアミノブタン、アミノ酸、有機酸、イオンは高圧液体クロマトグラフィー（High Pressure Liquid Chromatography：以下、ＨＰＬＣという）で分析し、精製した１，４−ジアミノブタンはガスクロマトグラフィー（Gas Chromatography：以下、ＧＣという）で分析した。水分分析はカールフィッシャー水分測定法で分析した。
【実施例１】
【００４５】
１，４−ジアミノブタン発酵液の準備及び菌体分離ステップ
本発明に用いられる１，４−ジアミノブタンは、韓国出願番号第１０−２０１０−１２４８６７号に基づいて製造された発酵液を用いた。具体的には、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ａｒｇＦ）及びグルタメートエクスポーター（exporter）をコードする遺伝子（Ｎｃｇｌ１２２１）の発現又はその発現から得られる生成物の活性を低減又は不活性化し、オルニチンデカルボキシラーゼ（ｓｐｅＣ）をコードする遺伝子を外部から導入した、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を培養する。
【００４６】
１０Ｌビーカーに発酵液５，０５０ｇを入れ、膜分離器で菌体を分離した。前記膜分離器は、カートリッジ形態のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ２を用い、その製品規格は細孔径(ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ)が０．１μｍ、面積が０．５ｍ２であった。用いられたメンブレンフィルター本体はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のものであり、菌体投入口、循環口、菌体分離した液の出口に分かれている。菌体分離した液は４７９４．９ｇ、菌体と共に除去された液は２５５．１ｇであった。組成は表１の通りである。
【００４７】
【表１】
0005996650.tif 000003
【実施例２】
【００４８】
塩除去ステップ
実施例１で菌体分離した液４７９４．９ｇを１０Ｌビーカーに入れて常温で攪拌した。これに水酸化カルシウム５２８．９ｇを１７．６ｇ／分で投入を完了し、その後２時間攪拌し、次いで遠心分離器で濾過して塩を除去した。ここで、生成された塩は硫酸カルシウムであり、水分を含む重量１１２３．３ｇを回収した。
【実施例３】
【００４９】
低温減圧濃縮ステップ
実施例２の母液４２００．５ｇをＥｙｅｌａ社製の５Ｌ濃縮機に投入し、真空８０ｍｍＨｇ、蒸気温度４７℃を維持して７０％濃縮、７５％濃縮及び８０％濃縮を行った。７０％濃縮の場合、除去された凝縮水は２８９９．９ｇであり、そのうち１，４−ジアミノブタンは１．０ｇ検出された。
【００５０】
上記各水分％の成分組成を分析した結果、表２及び表３に示すように、７０％濃縮時の収率が３９．２％、７５％濃縮時の収率が４５．８％であった。また、８０％濃縮の場合、７５％、７０％に比べて収率が１１．３％、１７．９％高かった。
【００５１】
【表２】
0005996650.tif 000004
【００５２】
【表３】
0005996650.tif 000005
【実施例４】
【００５３】
不純物除去ステップ
４−１）高温で濾過段階のみ行う場合
実施例３の濃縮ステップで残った発酵液１３００．６ｇを二重ジャケット結晶化機にて高温で濾過して不純物を除去した。
【００５４】
４−２）結晶化段階及び濾過段階を行う場合
実施例３の濃縮ステップで残った発酵液１３００．６ｇを２Ｌの二重ジャケット結晶化機に移送し、その後５０℃から２０℃まで冷却した。ここで、０．０１℃／分の冷却速度で冷却し、２０℃を１時間維持してから濾過した。濾過した結晶は水分を含んでおり、６５．４ｇであった。
【００５５】
４−１）又は４−２）段階を経た発酵液の成分を比較した結果、表４に示すように、４−２）の結晶化＋濾過の方法は４−１）の高温濾過の方法より不純物除去率が高かった。
【００５６】
【表４】
0005996650.tif 000006
【実施例５】
【００５７】
回収ステップ
実施例４の濃縮液から１，４−ジアミノブタンを回収するために、高温濃縮法及び分別蒸留法を行った。
【００５８】
不純物を除去した母液１２３５．２ｇを２Ｌの二重ジャケット反応器に投入した。前記二重ジャケット反応器の上部と蒸留塔の中間が連結されている。蒸留塔は、Ａｃｅｇｌａｓｓ社製のｔｒａｙ形態のものであり、全３０段になっており、下から１０段上の部分で反応器に連結されている。反応器は、真空８０ｍｍＨｇ、蒸気温度５０〜９０℃で実験を行った。初期は水分蒸発により４７℃を維持していたが、１，４−ジアミノブタンが蒸発すると温度が９０℃まで上昇した。蒸発した気体は蒸留塔に投入され、上部では水とアンモニウムが７２８．３ｇ回収され、下部では１，４−ジアミノブタンが２８５．８ｇ（ＧＣ純度９９．９ｗｔ％）回収された。二重ジャケット反応器に残った２２１．１ｇは濃縮機に循環させた。
【００５９】
表５は実施例４の不純物除去方法による回収ステップ後の成分分析表である。結晶化段階を経た発酵液の収率が１８．９％高かった。
【００６０】
【表５】
0005996650.tif 000007
【実施例６】
【００６１】
連続循環工程
実施例５の高温濃縮段階で残った母液は低温濃縮機に循環させた。表６は１０回循環させた最終結果物の成分分析表である。連続循環工程で９４．６％回収した。
【００６２】
【表６】
0005996650.tif 000008
【図１】
0005996650.tif 000009
【図２】
0005996650.tif 000010