(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理的条件下でｃ−ｍｙｃ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズする第一のオリゴヌクレオチドを含む組成物であって、該第一のオリゴヌクレオチドが、配列番号１１５である、組成物。
【請求項２】
追加のオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の組成物であって、該追加のオリゴヌクレオチドが、配列番号１１０、１１１、１１２、１１３、および１１４からなる群から選択される、組成物。
【請求項３】
ｃ−ｋｉ−Ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−Ｒａｓ、ｂｃｌ−２、Ｈｅｒ−２およびＴＧＦ−αからなる群から選択される遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズする追加のオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
細胞に導入するための、ｃ−ｍｙｃ遺伝子のプロモーター領域とハイブリダイズする配列番号１１５であるオリゴヌクレオチドであって、ここに、該細胞がｃ−ｍｙｃ遺伝子を発現でき、かつ、増殖可能である、オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
導入により、細胞の増殖低下がもたらされる、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
細胞が、膵臓癌、大腸癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、白血病、前立腺癌、リンパ腫、卵巣癌および黒色腫からなる群から選択される癌細胞である、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
細胞が動物に存在する、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
動物がヒトである、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
請求項４に記載のオリゴヌクレオチドおよび化学療法剤を含む試験化合物を含有する組成物。
【請求項１０】
請求項４に記載のオリゴヌクレオチドおよび細胞にオリゴヌクレオチドを導入するための薬物送達系を含む組成物。
【請求項１１】
配列番号１１５の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドおよびリポソームを含む医薬組成物。
【請求項１２】
リポソームがカルジオリピンを基にしたカチオン性リポソームである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
膵臓癌、大腸癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、白血病、前立腺癌、リンパ腫、卵巣癌および黒色腫からなる群から選択される癌の治療のための医薬の製造における、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、同時係属特許出願である２００４年６月１日出願の米国特許出願第一０／８５８，１６４号明細書、２００４年６月１日出願の米国特許出願第一０／８５８，３４１号明細書、２００４年６月１日出願の米国特許出願第一０／８５８，１４５号明細書、２００４年６月１日出願の米国特許出願第一０／８５８，０９４号明細書、２００４年６月１日出願の米国特許出願第一０／８５８，０１３号明細書、２００４年６月１日出願の米国特許出願第一０／８５８，１４６号明細書、２００４年９月２２日出願の米国特許出願第６０／６１１，９７４号明細書、および２００４年１２月１７日出願の米国特許出願第６０／６３７，２１２号明細書に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、遺伝子発現の阻害に関する方法および組成物に関する。特に、本発明は、癌に関与する発癌遺伝子を阻害するためのオリゴヌクレオチドを基にした療法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
発癌遺伝子は、癌生物学の理解における中心的コンセプトとなっており、治療薬に関する価値ある標的を提供できる。発癌遺伝子およびそれらの産物は全て細胞内で作用する。このことが、タンパク質ベースの薬物を無効にさせる。というのも、タンパク質ベースの薬物の特異性は、リガンド−受容体認識に関係しているからである。
【０００４】
アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、発癌遺伝子を特異的に標的化する治療用化合物の研究中のものである（非特許文献１、非特許文献２）。アンチセンス薬は、標的ｍＲＮＡのリボソーム翻訳を妨害することによって作用する修飾合成オリゴヌクレオチドである。これまでに開発されたアンチセンス薬は、標的ｍＲＮＡに結合し、ｍＲＮＡのリボヌクレアーゼＨ（ＲＮアーゼＨ）分解を引き起こすことによって、標的ｍＲＮＡを破壊する。オリゴヌクレオチドは、約２０分の半減期を有し、したがって、多くの細胞内で急速に分解される（非特許文献３）。オリゴヌクレオチドの安定性を増大させるために、それらは、しばしば化学的に修飾され、例えば、それらは、主鎖におけるホスフェート酸素の１つを硫黄置換することによって保護される（ホスホロチオエート）。（非特許文献４、非特許文献５）。しかし、この修飾は、アンチセンスの分解を遅くすることができるだけであり、したがって、有効となるためには大用量のアンチセンス薬が必要である。
【０００５】
アンチセンス療法の使用をめぐる楽観主義にも関わらず、十分な量のアンチセンスを細胞内に入れることの困難性、非配列特異的作用、大量の硫黄含有ホスホチオエートオリゴヌクレオチドによる毒性とそれらが標的細胞内に入る能力がないこと、および大用量の連続的送達によるコスト高など、アンチセンス薬の使用には、多くの重大な問題がある。アンチセンス薬によるさらなる問題は、それらの非特異的活性である。
必要なものは、発癌遺伝子を標的にするさらなる非タンパク質ベースの癌療法である。低用量において有効であり、かつ、対象にとって非毒性の療法が特に必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ウィックストロム  Ｅ．（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ，Ｅ．）（編）、「Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ａｉｄｓ」、ニューヨーク：ウィリー−リス（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．）１９９１年
【非特許文献２】ムレー  Ｊ．Ａ．Ｈ．（Ｍｕｒｒａｙ  Ｊ．Ａ．Ｈ．）（編）、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ」、ニューヨーク：ウィリー−リス（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．）１９９２年
【非特許文献３】フィッシャー  Ｔ．Ｌ．（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｔ．Ｌ．）ら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ」、Ｒｅｓ．２１：３８５７−３８６５頁（１９９３）
【非特許文献４】ミリガン  Ｊ．Ｆ．（Ｍｉｌｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｆ．）ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１９２３−１９３７頁（１９９３）
【非特許文献５】ワグナー  Ｒ．Ｗ．（Ｗａｇｎｅｒ  Ｒ．Ｈ．）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：１５１０−１５１３頁（１９９３）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、遺伝子発現の阻害に関する方法および組成物に関する。特に、本発明は、癌に関与する発癌遺伝子を阻害するためのオリゴヌクレオチドを基にした療法を提供する。
【０００８】
いくつかの実施態様において、本発明は、生理的条件下で、ｂｃｌ−３遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズする第一のオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１４３８、３、７、８または９）を含む組成物を提供する。いくつかの実施態様において、第一のオリゴヌクレオチドにおけるシトシン塩基の少なくとも１つが、５−メチルシトシンである。いくつかの実施態様において、第一のオリゴヌクレオチドにおけるシトシン塩基の全てが、５−メチルシトシンである。いくつかの好ましい実施態様において、ｂｃｌ−２遺伝子のプロモーター領域への第一のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより、ｂｃｌ−２遺伝子の発現が阻害される。いくつかの実施態様において、ｂｃｌ−２遺伝子は細胞の染色体上に存在し、ｂｃｌ−２遺伝子のプロモーター領域と第一のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションは、該細胞の増殖を低下させる。いくつかの実施態様において、該組成物は、第二のオリゴヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドにおけるシトシン塩基の少なくとも１つ（例えば全て）が、５−メチルシトシンである。いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドは、配列番号３、７、８または９を含み、第一のオリゴヌクレオチドとは異なる（例えば、第二のオリゴヌクレオチドが、配列番号３を有していれば、第一のオリゴヌクレオチドは、配列番号３以外の配列を有するなど）。いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドは、第二の遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズし、該第二の遺伝子はｂｃｌ−２ではない。いくつかの実施態様において、第二の遺伝子は、発癌遺伝子（例えば、ｃ−ｋｉ−Ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−Ｒａｓ、ｃ−ｍｙｃ、Ｈｅｒ−２、またはＴＧＦ−α）である。
【０００９】
別の実施態様において、本発明は、配列番号１のヌクレオチド１から４０の間、配列番号１のヌクレオチド１６１から３５０の間、配列番号１のヌクレオチド４０１から５９０の間、配列番号１のヌクレオチド１００２から１２６０の間を含む位置で、ｂｃｌ−２遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【００１０】
さらに他の実施態様において、本発明は、オリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１４３８、３、７、８または９）；および、増殖可能で発現可能なｂｃｌ−２遺伝子を含む細胞を提供すること；および該細胞にオリゴヌクレオチドを導入することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様において、該導入により細胞の増殖低下がもたらされる。特定の実施態様において、該導入により、ｂｃｌ−２遺伝子発現の阻害がもたらされる。いくつかの実施態様において、該細胞は癌細胞である。いくつかの実施態様において、該細胞は、宿主動物（例えば、非ヒト哺乳動物またはヒト）中に存在する。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、体重１ｋｇ当たり、０．０１μｇから１００ｇの間、好ましくは、１ｍｇから１００ｍｇの間の投与量で、宿主動物に導入される。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、１日１回以上、宿主動物に導入される。他の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、連続的に宿主動物に導入される。さらなる実施態様において、該細胞は、細胞培養物中に存在する。いくつかの実施態様において、該方法は、該細胞に試験化合物を導入するステップをさらに含む。いくつかの実施態様において、該試験化合物は、公知の化学療法剤である。いくつかの実施態様において、前記癌は、膵癌、大腸癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、白血病、前立腺、リンパ腫、卵巣または黒色腫である。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドにおけるシトシン塩基の少なくとも１つ（例えば、全て）が、５−メチルシトシンである。
【００１１】
いくつかの実施態様において、本方法は、薬物送達系をさらに提供する。いくつかの実施態様において、該薬物送達系は、リポソーム（例えば、中性脂肪または脂質様化合物を含むリポソーム）を含む。いくつかの実施態様において、該薬物送達系は、細胞標的成分（例えば、細胞表面受容体または核受容体に対するリガンドまたはリガンド様分子）を含む。特定の実施態様において、該薬物送達系は、インビボで使用するためのものであり、オリゴヌクレオチドおよびリポソームは、体重１ｋｇ当たり、２：１から１：３／１μｇから１００ｍｇの比率で存在する。
【００１２】
本発明は、ｂｃｌ−２遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド；およびｂｃｌ−２遺伝子を含む細胞を提供すること；そして該オリゴヌクレオチドを該細胞に導入することを含む方法を、さらに提供する。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含み、ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つは、５−メチルシトシンである。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ｂｃｌ−２遺伝子のプロモーター領域に、完全に相補的である。他の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ｂｃｌ−２遺伝子のプロモーター領域に、部分的に相補的である。例えば、特定の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ｂｃｌ−２遺伝子のプロモーター領域に対して、１つの誤対合を含有する。いくつかの好ましい実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ｂｃｌ−２遺伝子のプロモーター領域に対してのみ相補的であり、ヒトゲノムの他の領域に対しては、完全に相補的であることはない。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、１０ヌクレオチド長から６０ヌクレオチド長の間であり、好ましくは、１５ヌクレオチド長から３５ヌクレオチド長の間である。
【００１３】
いくつかの実施態様において、該方法は、薬物送達系をさらに提供する。いくつかの実施態様において、該薬物送達系は、リポソーム（例えば、中性脂肪または脂質様化合物を含むリポソーム）を含む。いくつかの実施態様において、該薬物送達系は、細胞標的成分（例えば、細胞表面受容体または核受容体に対するリガンドまたはリガンド様分子）を含む。特定の実施態様において、該薬物送達系は、インビボで使用するためのものであり、該オリゴヌクレオチドおよび該リポソームは、体重１ｋｇ当たり、２：１から１：３／１μｇから１００ｍｇの比率で存在する。
【００１４】
さらなる実施態様において、本発明は、生理的条件下で、ｂｃｌ−２遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含み、ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つは、５−メチルシトシンである。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ｂｃｌ−２遺伝子のプロモーター領域に、完全に相補的である。他の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ｂｃｌ−２遺伝子のプロモーター領域に、部分的に相補的である。例えば、特定の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ｂｃｌ−２遺伝子のプロモーター領域に対して、１つの誤対合を含有する。いくつかの好ましい実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ｂｃｌ−２遺伝子のプロモーター領域に対してのみ相補的であり、ヒトゲノムの他の領域に対しては、完全に相補的であることはない。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、１０ヌクレオチド長から６０ヌクレオチド長の間であり、好ましくは、１５ヌクレオチド長から３５ヌクレオチド長の間である。
【００１５】
本発明は、生理的条件下、ｂｃｌ−２遺伝子の発現が阻害されるような条件下で、ｂｃｌ−２遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物を、さらに提供する。
【００１６】
本発明は、生理的条件下、細胞の増殖が低下するような条件下で、該細胞の染色体上にあるｂｃｌ−２遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物を、さらに提供する。
【００１７】
また、本発明は、生理的条件下で、ｂｃｌ−２遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズし、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含んでおり、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンである第一オリゴヌクレオチド；および、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含み、ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンである第二オリゴヌクレオチド、を含む組成物を提供する。
【００１８】
特定の実施態様において、本発明は、生理的条件下に、ｂｃｌ−２遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズし、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含んでおり、該ＣＧジヌクレオチド対中のシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンであるオリゴヌクレオチドを含むキット；ならびに、細胞の染色体上にｂｃｌ−２遺伝子を含む該細胞の増殖を低下させるか、または遺伝子発現を阻害するためのキットの使用説明書を提供する。いくつかの実施態様において、該キット内の組成物は、対象における癌を治療するために使用され、該説明書は、対象における癌を治療するためにキットを使用するための説明書を含む。いくつかの実施態様において、該説明書は、医薬品の表示に関する米国食品医薬品局により要求された説明書である。
【００１９】
また、本発明は、癌と診断された対象からの生物学的サンプルおよびサンプル中の発癌遺伝子の発現の有無を検出する試薬を提供すること；サンプル中の発癌遺伝子の発現の有無を検出すること；生理的条件下、生物学的サンプル中に発現した発癌遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズし、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含んでおり、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンであるオリゴヌクレオチドを対象に導入すること、を含む方法を提供する。
【００２０】
本発明は、生理的条件下、生物学的サンプル中に発現した癌または過剰増殖疾患に関与する遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズし、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含んでおり、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンであるオリゴヌクレオチドを提供すること；および該遺伝子の発現が阻害されるような条件下で、該オリゴヌクレオチドを対象に投与すること、を含む、対象における遺伝子の発現を阻害する（例えば、癌または他の過剰増殖疾患を治療するための）方法をさらに提供する。いくつかの実施態様において、該対象はヒトである。
【００２１】
さらなる実施態様において、本発明は、疑わしい発癌遺伝子を含む細胞および該遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供すること；該オリゴヌクレオチドを該細胞に導入すること；そして該オリゴヌクレオチドの不在の場合と比較して、該オリゴヌクレオチドが存在した場合に該細胞の増殖が阻害されるかどうかを判定すること、を含む化合物のスクリーニング法を提供する。いくつかの実施態様において、該細胞は、細胞培養物（例えば、癌細胞系）中に存在する。他の実施態様において、該細胞は、宿主動物（例えば、非ヒト哺乳動物）中に存在する。いくつかの実施態様において、該方法は、ハイスループットスクリーニング法である。
【００２２】
したがって、いくつかの実施態様において、本発明は、生理的条件下に、ｃ−ｋｉ−Ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズする第一のオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号４７、４８、５０または５３）を含む組成物を提供する。特定の実施態様において、第一のオリゴヌクレオチドのシトシン塩基の少なくとも１つ（例えば全て）は、５−メチルシトシンである。いくつかの実施態様において、ｃ−ｋｉ−Ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域に対する第一のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより、ｃ−ｋｉ−Ｒａｓ遺伝子の発現が阻害される。特定の実施態様において、ｃ−ｋｉ−Ｒａｓ遺伝子は、細胞の染色体上にあり、ｃ−ｋｉ−Ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域に対する第一のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより、該細胞の増殖が低下する。いくつかの実施態様において、該組成物は、第二のオリゴヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドにおけるシトシン塩基の少なくとも１つは５−メチルシトシンである。他の実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドにおけるシトシン塩基の全てが５−メチルシトシンである。いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドは、配列番号４７、４８、５０または５３を含み、第二のオリゴヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドとは異なる（例えば、第二のオリゴヌクレオチドが、配列番号４７の配列を有していれば、第一のオリゴヌクレオチドは、配列番号４７以外の配列を有するなど）。特定の実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドは、第二の遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズし、該第二の遺伝子は、ｃ−ｋｉ−Ｒａｓではない。いくつかの実施態様において、第二の遺伝子は、発癌遺伝子（例えば、これらに限定はしないが、ｃ−Ｈａ−Ｒａｓ、ｃ−ｍｙｃ、Ｈｅｒ−２、またはＴＧＦ−α、およびｂｃｌ−２など）である。
【００２３】
さらに他の実施態様において、本発明は、配列番号４６のヌクレオチド１から２８９の間、または配列番号４６のヌクレオチド４３２から６５８の間を含む位置で、ｃ−ｋｉ−Ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【００２４】
他の実施態様において、本発明は、ｃ−ｋｉ−Ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号４７、４８、５０または５３を含むオリゴヌクレオチド）；および発現可能なｃ−ｋｉ−Ｒａｓ遺伝子を含み、増殖できる細胞を提供すること；そして該オリゴヌクレオチドを該細胞に導入すること、を含む方法を提供する。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含み、ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つは、５−メチルシトシンである。他の実施態様において、該オリゴヌクレオチドのＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の全てが、５−メチルシトシンである。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、配列番号４６のヌクレオチド１から２８９の間、または配列番号４６のヌクレオチド４３２から６５８の間を含む位置で、ｃ−ｋｉ−Ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズする。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、１５塩基長から３０塩基長の間である。
【００２５】
いくつかの好ましい実施態様において、導入により細胞の増殖低下がもたらされる。いくつかの実施態様において、該導入により、ｃ−ｋｉ−Ｒａｓ遺伝子の発現阻害がもたらされる。いくつかの実施態様において、該細胞は癌細胞（例えば、これらに限定はしないが、膵癌、大腸癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、白血病、前立腺、リンパ腫、卵巣、または黒色腫など）である。いくつかの実施態様において、該細胞は、宿主動物中に存在する。いくつかの実施態様において、該宿主動物は、非ヒト哺乳動物である。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、体重１ｋｇ当たり、０．０１μｇから１００ｇの間、好ましくは、１ｍｇから１００ｍｇの間の投与量で、宿主動物に導入される。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、１日１回以上、宿主動物に導入される。他の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、連続的に（例えば、２時間から２週間の間の期間）宿主動物に導入される。他の実施態様において、該細胞は、細胞培養物中に存在する。いくつかの実施態様において、該方法は、該細胞に試験化合物を導入するステップをさらに含む。いくつかの実施態様において、該試験化合物は公知の化学療法剤である。
【００２６】
いくつかの実施態様において、該方法は薬物送達系をさらに提供する。いくつかの実施態様において、該薬物送達系は、リポソーム（例えば、中性脂肪または脂質様化合物を含むリポソーム）を含む。いくつかの実施態様において、該薬物送達系は、細胞標的成分（例えば、細胞表面受容体または核受容体に対するリガンドまたはリガンド様分子）を含む。特定の実施態様において、該薬物送達系は、インビボで使用するためのものであり、該オリゴヌクレオチドおよび該リポソームは、体重１ｋｇ当たり、２：１から１：３／１μｇから１００ｍｇの比率で存在する。
【００２７】
さらなる実施態様において、本発明は、生理的条件下で、ｃ−ｋｉ−Ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供し、該オリゴヌクレオチドにおけるシトシン塩基の少なくとも１つ（例えば、全て）は、５−メチルシトシンである。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ｃ−ｋｉ−Ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域に、完全に相補的である。他の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ｃ−ｋｉ−Ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域に、部分的に相補的である。例えば、特定の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ｃ−ｋｉ−Ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域に対して、１つの誤対合を含有する。いくつかの好ましい実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ｃ−ｋｉ−Ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域に対してのみ相補的であり、ヒトゲノムの他の領域に対しては、完全に相補的であることはない。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、１０ヌクレオチド長から６０ヌクレオチド長の間であり、好ましくは、１５ヌクレオチド長から３５ヌクレオチド長の間である。
【００２８】
本発明は、生理的条件下にｃ−ｋｉ−Ｒａｓ遺伝子の発現が阻害されるような条件下で、ｃ−ｋｉ−Ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物を、さらに提供する。
【００２９】
本発明は、生理的条件下、細胞の増殖が低下するような条件下で、該細胞の染色体にあるｃ−ｋｉ−Ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物を、さらに提供する。
【００３０】
また、本発明は、生理的条件下で、ｃ−ｋｉ−Ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズし、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含んでおり、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンである第一のオリゴヌクレオチド；少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含み、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンである第二のオリゴヌクレオチド、を含む組成物を提供する。
【００３１】
特定の実施態様において、本発明は、生理的条件下に、ｃ−ｋｉ−Ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズし、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含み、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンであるオリゴヌクレオチドを含むキット；ならびに、細胞の染色体上にｃ−ｋｉ−Ｒａｓ遺伝子を含む、該細胞の増殖を低下させるかまたは遺伝子発現を阻害するためのキットの使用説明書を提供する。いくつかの実施態様において、該キット内の組成物は、対象における癌を治療するために使用され、該説明書は、対象における癌を処置するためのキットの説明書を含む。いくつかの実施態様において、該説明書は、医薬品表示に関する米国食品医薬品局により要求された説明書である。
【００３２】
また、本発明は、次の工程を含む方法を提供する：癌と診断された対象からの生物学的サンプル、およびサンプル中の発癌遺伝子の発現の有無を検出する試薬を提供すること；サンプル中の発癌遺伝子の発現の有無を検出すること；生理的条件下で、生物学的サンプル中で発現した発癌遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズし、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含んでおり、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンを含むオリゴヌクレオチドを対象に投与すること。
【００３３】
本発明は、対象における遺伝子の発現を阻害する（例えば、癌または他の過剰増殖疾患を治療するために）方法をさらに提供するものであって、生理的条件下、生物学的サンプル中で発現した癌または過剰増殖疾患に関与する遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズし、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含んでおり、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンを含むオリゴヌクレオチドを提供すること；そして、該遺伝子の発現が阻害されるような条件下で、該オリゴヌクレオチドを対象に投与すること、を含む方法を提供する。いくつかの実施態様において、該対象はヒトである。
【００３４】
さらなる実施態様において、本発明は、次の工程を含む化合物のスクリーニング法を提供するものである；疑わしい発癌遺伝子を含む細胞、および該遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供すること；および該オリゴヌクレオチドを該細胞に投与すること；および該オリゴヌクレオチドの不在の場合と比較して、該オリゴヌクレオチドが存在した場合に該細胞の増殖が阻害されるかどうかを判定すること。いくつかの実施態様において、該細胞は、細胞培養物（例えば、癌細胞系）中に存在する。他の実施態様において、該細胞は、宿主動物（例えば、非ヒト哺乳動物）中に存在する。いくつかの実施態様において、該方法はハイスループットスクリーニング法である。
【００３５】
いくつかの実施態様において、本発明は、生理的条件下、ｃ−ｍｙｃ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズする第一のオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１１０、１１１、１１２、１１３、１１４または１１５）を含む組成物を提供する。いくつかの実施態様において、第一のオリゴヌクレオチドのシトシン塩基の少なくとも１つ（例えば全て）は５−メチルシトシンである。いくつかの好ましい実施態様において、ｃ−ｍｙｃ遺伝子のプロモーター領域に対する第一のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより、ｃ−ｍｙｃ遺伝子の発現が阻害される。いくつかの実施態様において、ｃ−ｍｙｃ遺伝子は、細胞の染色体上にあり、ｃ−ｍｙｃ遺伝子のプロモーター領域に対する第一のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより、該細胞の増殖が低下する。いくつかの実施態様において、該組成物は、第二のオリゴヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドにおけるシトシン塩基の少なくとも１つ（例えば全て）は、５−メチルシトシンである。いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドは、配列番号１１０、１１１、１１２、１１３、１１４または１１５を含み、第二のオリゴヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドとは異なる（例えば、第二のオリゴヌクレオチドが、配列番号１１０の配列を有していれば、第一のオリゴヌクレオチドは、配列番号１１０以外の配列を有するなど）。いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドは第二の遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズし、該第二の遺伝子はｃ−ｍｙｃではない。いくつかの実施態様において、第二の遺伝子は発癌遺伝子（例えば、ｃ−ｋｉ−Ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−Ｒａｓ、ｂｃｌ−２、Ｈｅｒ−２、またはＴＧＦ−α）である。
【００３６】
本発明は、配列番号１０８のヌクレオチド３から１２４の間、または配列番号１０８のヌクレオチド１６５から６２９の間を含む位置で、ｃ−ｍｙｃ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物を、さらに提供する。
【００３７】
本発明は、生理的条件下、ｃ−ｍｙｃ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１１０、１１１、１１２、１１３、１１４または１１５）およびｃ−ｍｙｃ遺伝子を発現できるｃ−ｍｙｃ遺伝子を含んでおり、増殖できる細胞、を提供すること；そして、該オリゴヌクレオチドを該細胞に導入すること、を含む方法をさらに提供する。いくつかの実施態様において、該導入により、該細胞の増殖低下がもたらされる。特定の実施態様において、該導入により、ｃ−ｍｙｃ遺伝子発現の阻害がもたらされる。いくつかの実施態様において、該細胞は癌細胞である。他の実施態様において、該細胞は、宿主動物（例えば、非ヒト哺乳動物またはヒト）中に存在する。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、体重１ｋｇ当たり、０．０１μｇから１００ｇの間、好ましくは、１ｍｇから１００ｍｇの間の投与量で、宿主動物に導入される。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、１日１回以上、宿主動物に導入される。他の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、連続的に宿主動物に導入される。さらなる実施態様において、該細胞は、細胞培養物中に存在する。いくつかの実施態様において、該方法は、該細胞に試験化合物を導入するステップをさらに含む。いくつかの実施態様において、該試験化合物は、公知の化学療法剤である。いくつかの実施態様において、前記癌は、膵癌、大腸癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、白血病、前立腺、リンパ腫、卵巣、または黒色腫である。
【００３８】
いくつかの実施態様において、該方法は、薬物送達系をさらに提供する。いくつかの実施態様において、該薬物送達系は、リポソーム（例えば、中性脂肪または脂質様化合物を含むリポソーム）を含む。いくつかの実施態様において、該薬物送達系は、細胞標的成分（例えば、細胞表面受容体または核受容体に対するリガンドまたはリガンド様分子）を含む。特定の実施態様において、該薬物送達系は、インビボで使用するためのものであり、該オリゴヌクレオチドおよび該リポソームは、体重１ｋｇ当たり、２：１から１：３／１μｇから１００ｍｇの比率で存在する。
【００３９】
いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドにおけるシトシン塩基の少なくとも１つ、好ましくは全てが５−メチルシトシンである。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、１０ヌクレオチド長から６０ヌクレオチド長の間であり、好ましくは、１５ヌクレオチド長から３５ヌクレオチド長の間である。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、配列番号１０８のヌクレオチド３から１２４の間、または配列番号１０８のヌクレオチド１６５から６２９の間を含む位置で、ｃ−ｍｙｃ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズする。
【００４０】
さらなる実施態様において、本発明は、生理的条件下で、ｃ−ｍｙｃ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供し、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含み、該ＣＧジヌクレオチド対中のシトシン塩基の少なくとも１つは５−メチルシトシンを含む組成物を提供する。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ｃ−ｍｙｃ遺伝子のプロモーター領域に、完全に相補的である。他の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ｃ−ｍｙｃ遺伝子のプロモーター領域に、部分的に相補的である。例えば、特定の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ｃ−ｍｙｃ遺伝子のプロモーター領域に対して、１つの誤対合を含有する。いくつかの好ましい実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ｃ−ｍｙｃ遺伝子のプロモーター領域に対してのみ相補的であり、ヒトゲノムの他の領域に対しては、完全に相補的であることはない。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、１０ヌクレオチド長から６０ヌクレオチド長の間であり、好ましくは、１５ヌクレオチド長から３５ヌクレオチド長の間である。
【００４１】
本発明は、生理的条件下、ｃ−ｍｙｃ遺伝子の発現が阻害されるような条件下で、ｃ−ｍｙｃ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物を、さらに提供する。
【００４２】
本発明は、生理的条件下、細胞の増殖が低下するような条件下で、該細胞の染色体にあるｃ−ｍｙｃ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物を、さらに提供する。
【００４３】
また、本発明は、生理的条件下で、ｃ−ｍｙｃ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズし、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含み、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンである第一のオリゴヌクレオチド；少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含み、ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つは、５−メチルシトシンを含む第二のオリゴヌクレオチド、を含む組成物を提供する。
【００４４】
特定の実施態様において、本発明は、生理的条件下に、ｃ−ｍｙｃ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含み、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンを含むオリゴヌクレオチドを含むキット；ならびに、細胞の染色体上にｃ−ｍｙｃ遺伝子を含む該細胞の増殖を低下させるか、または遺伝子発現を阻害するためのキットの使用説明書を提供する。いくつかの実施態様において、該キット内の組成物は、対象における癌を治療するために使用され、該説明書は、対象における癌を処置するためのキットの説明書を含む。いくつかの実施態様において、該説明書は、医薬品表示に関する米国食品医薬品局により要求された説明書である。
【００４５】
また、本発明は、癌と診断された対象からの生物学的サンプル、およびサンプル中の発癌遺伝子の発現の有無を検出する試薬を提供すること；サンプル中の発癌遺伝子の発現の有無を検出すること；そして、生理的条件下に、生物学的サンプル中に発現した発癌遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズし、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含んでおり、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンを含むオリゴヌクレオチドを対象に投与すること、を含む方法を提供する。
【００４６】
本発明は、生理的条件下に、生物学的サンプル中に発現した癌または過剰増殖疾患に関与する遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含み、ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンを含むオリゴヌクレオチドを提供すること；および該遺伝子の発現が阻害されるような条件下で、該オリゴヌクレオチドを対象に投与することを含む、対象における遺伝子の発現を阻害する（例えば、癌または他の過剰増殖疾患を治療するために）方法をさらに提供する。いくつかの実施態様において、該対象はヒトである。
【００４７】
さらなる実施態様において、本発明は、疑わしい発癌遺伝子を含む細胞および該遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供すること；および該オリゴヌクレオチドを該細胞に投与すること；および該オリゴヌクレオチドの不在の場合と比較して、該オリゴヌクレオチドが存在した場合に該細胞の増殖が阻害されるかどうかを判定することを含む、化合物のスクリーニング法を提供する。いくつかの実施態様において、該細胞は、細胞培養物（例えば、癌細胞系）中に存在する。他の実施態様において、該細胞は、宿主動物（例えば、非ヒト哺乳動物）中に存在する。いくつかの実施態様において、該方法は、ハイスループットスクリーニング法である。
【００４８】
いくつかの実施態様において、本発明は、生理的条件下に、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズする第一のオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号６７、６８、６９、７１、７３、７４、７６、７８、８４、１６０、１６１、または１６２）を含む組成物を提供する。いくつかの実施態様において、第一のオリゴヌクレオチドのシトシン塩基の少なくとも１つは、５−メチルシトシンである。いくつかの実施態様において、第一のオリゴヌクレオチドのシトシン塩基の全てが、５−メチルシトシンである。特定の実施態様において、第一のオリゴヌクレオチドは、生理的条件下で、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズする。いくつかの好ましい実施態様において、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域と第一のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の発現が阻害される。いくつかの実施態様において、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子は、細胞の染色体上にあり、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域への第一のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより、該細胞の増殖が低下する。いくつかの実施態様において、該組成物は、第二のオリゴヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドにおけるシトシン塩基の少なくとも１つ（例えば、全て）は、５−メチルシトシンである。いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドは、配列番号６７、６８、６９、７１、７３、７４、７６、７８、８４、１６０、１６１または１６２を含み、第一のオリゴヌクレオチドは、第二のオリゴヌクレオチドとは異なる（例えば、第二のオリゴヌクレオチドが、配列番号６７の配列を有していれば、第一のオリゴヌクレオチドは、配列番号６７とは異なる配列を有するなど）。いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドは、第二の遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズし、第二の遺伝子は、ｃ−Ｈａ−ｒａｓではない。いくつかの実施態様において、第二の遺伝子は、発癌遺伝子（例えば、ｃ−ｋｉ−Ｒａｓ、ｃ−ｍｙｃ、ｂｃｌ−２、Ｈｅｒ−２、またはＴＧＦ−α）である。
【００４９】
本発明は、配列番号６６のヌクレオチド２１から２２０の間、配列番号６６のヌクレオチド２３３から８６０の間、配列番号６６のヌクレオチド１４１１から１５３０の間、または配列番号６６のヌクレオチド１６３１から１７２２の間を含む位置で、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物を、さらに提供する。
【００５０】
さらに他の実施態様において、本発明は、生理的条件下、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号６７、６８、６９、７１、７３、７４、７６、７８、８４、１６０、１６１、または１６２）；および発現可能な、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子を含む細胞であって、増殖できる細胞、を提供すること；および該オリゴヌクレオチドを、該細胞に導入すること、を含む方法を提供する。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、１５塩基長から３０塩基長の間である。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、配列番号６６のヌクレオチド２１から２２０の間、配列番号６６のヌクレオチド２３３から８６０の間、配列番号６６のヌクレオチド１４１１から１５３０の間、または配列番号６６のヌクレオチド１６３１から１７２２の間を含む位置で、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズする。
【００５１】
いくつかの実施態様において、該導入により、該細胞の増殖低下がもたらされる。特定の実施態様において、該導入により、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子発現の阻害がもたらされる。いくつかの実施態様において、該細胞は癌細胞である。いくつかの実施態様において、前記癌は、膵癌、大腸癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、白血病、前立腺、リンパ腫、卵巣、または黒色腫である。他の実施態様において、該細胞は、宿主動物（例えば、非ヒト哺乳動物またはヒト）中に存在する。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、体重１ｋｇ当たり、０．０１μｇから１００ｇの間、好ましくは、１ｍｇから１００ｍｇの間の投与量で、宿主動物に導入される。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、１日１回以上、宿主動物に導入される。他の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、連続的に（例えば、２時間から２週間の間の期間）宿主動物に導入される。他の実施態様において、該細胞は、細胞培養物中に存在する。特定の実施態様において、該方法は、該細胞に試験化合物を導入するステップをさらに含む。いくつかの実施態様において、該試験化合物は、公知の化学療法剤である。
【００５２】
いくつかの実施態様において、該方法は、薬物送達系をさらに提供する。いくつかの実施態様において、該薬物送達系は、リポソーム（例えば、中性脂肪または脂質様化合物を含むリポソーム）を含む。いくつかの実施態様において、該薬物送達系は、細胞標的成分（例えば、細胞表面受容体または核受容体に対するリガンドまたはリガンド様分子）を含む。特定の実施態様において、該薬物送達系は、インビボで使用するためのものであり、該オリゴヌクレオチドおよび該リポソームは、体重１ｋｇ当たり、２：１から１：３／１μｇから１００ｍｇの比率で存在する。
【００５３】
さらなる実施態様において、本発明は、生理的条件下で、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドにおけるシトシン塩基の少なくとも１つ（例えば全て）は、５−メチルシトシンである。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域に、完全に相補的である。他の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域に、部分的に相補的である。例えば、特定の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域に対して、１つの誤対合を含有する。いくつかの好ましい実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域に対してのみ相補的であり、ヒトゲノムの他の領域に対しては、完全に相補的であることはない。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、１０ヌクレオチド長から６０ヌクレオチド長の間であり、好ましくは、１５ヌクレオチド長から３５ヌクレオチド長の間である。
【００５４】
本発明は、生理的条件下、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の発現が阻害されるような条件下で、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物を、さらに提供する。
【００５５】
本発明は、生理的条件下、細胞の増殖が低下するような条件下で、該細胞の染色体にあるｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物を、さらに提供する。
【００５６】
また、本発明は、生理的条件下で、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズする第一のオリゴヌクレオチド、即ち少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含んでおり、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンを含むオリゴヌクレオチド；および第二のオリゴヌクレオチド、即ち少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含み、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンを含むオリゴヌクレオチド、を含む組成物を提供する。
【００５７】
特定の実施態様において、本発明は、生理的条件下で、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズし、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含んでおり、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンを含むオリゴヌクレオチドを含むキット；ならびに、細胞の染色体上にｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子を含む該細胞の増殖を低下させるか、または遺伝子発現を阻害するためのキットの使用説明書を提供する。いくつかの実施態様において、該キット内の組成物は、対象における癌を治療するために使用され、該説明書は、対象における癌を処置するためのキットの使用説明書を含む。いくつかの実施態様において、該説明書は、医薬品表示に関する米国食品医薬品局により要求された説明書である。
【００５８】
また、本発明は、癌と診断された対象からの生物学的サンプル、およびサンプル中の発癌遺伝子の発現の有無を検出する試薬を提供すること；生物学的サンプル中の発癌遺伝子の発現の有無を検出すること；生理的条件下に、生物学的サンプル中に発現した発癌遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズし、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含んでおり、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンを含むオリゴヌクレオチドを対象に投与すること、を含む方法を提供する。
【００５９】
本発明は、生理的条件下、生物学的サンプル中に発現した癌または過剰増殖疾患に関与する遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含んでおり、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンを含むオリゴヌクレオチドを提供すること；そして該遺伝子の発現が阻害されるような条件下で、該オリゴヌクレオチドを対象に投与すること、を含む、対象における遺伝子の発現を阻害する（例えば、癌または他の過剰増殖疾患を治療するために）方法をさらに提供する。いくつかの実施態様において、該対象はヒトである。
【００６０】
さらなる実施態様において、本発明は、疑わしい発癌遺伝子を含む細胞、および該遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供すること；および該オリゴヌクレオチドを該細胞に投与すること；および該オリゴヌクレオチドの不在の場合と比較して、該オリゴヌクレオチドが存在した場合に該細胞の増殖が阻害されるかどうかを判定すること、を含む、化合物のスクリーニング法を提供する。いくつかの実施態様において、該細胞は、細胞培養物（例えば、癌細胞系）中に存在する。他の実施態様において、該細胞は、宿主動物（例えば、非ヒト哺乳動物）中に存在する。いくつかの実施態様において、該方法は、ハイスループットスクリーニング法である。
【００６１】
いくつかの実施態様において、本発明は、配列番号３１、３２、３５、３６、３７または３８を含むオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣＧヌクレオチド対を含み、ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンを含む。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドの全てのＣＧヌクレオチド対のシトシン塩基の全てが、５−メチルシトシンである。特定の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、生理的条件下で、Ｈｅｒ−２遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズする。いくつかの好ましい実施態様において、Ｈｅｒ−２遺伝子のプロモーター領域に対する該オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより、Ｈｅｒ−２遺伝子の発現が阻害される。いくつかの実施態様において、Ｈｅｒ−２遺伝子は、細胞の染色体上にあり、Ｈｅｒ−２遺伝子のプロモーター領域に対する該オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより、該細胞の増殖が低下する。いくつかの実施態様において、該組成物は、第二のオリゴヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含んでおり、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つは５−メチルシトシンである。いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドは、配列番号３１、３２、３５、３６、３７または３８を含む。いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドは、第二の遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズし、第二の遺伝子はＨｅｒ−２ではない。いくつかの実施態様において、第二の遺伝子は、発癌遺伝子（例えば、ｃ−ｋｉ−Ｒａｓ、ｃ−ｍｙｃ、ｂｃｌ−２、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、またはＴＧＦ−α）である。
【００６２】
他の実施態様において、本発明は、配列番号２９のヌクレオチド２０５から３４４の間、または配列番号２９のヌクレオチド３８２から４３５の間を含む位置で、ｃ−ｍｙｃ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【００６３】
さらなる実施態様において、本発明は、生理的条件下で、Ｈｅｒ−２遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【００６４】
さらに他の実施態様において、本発明は、オリゴヌクレオチド（例えば、配列番号３１、３２、３５、３６、３７、または３８）；およびＨｅｒ−２遺伝子を含む細胞を提供すること；および該オリゴヌクレオチドを該細胞に投与すること、を含む方法を提供する。いくつかの実施態様において、該投与により、該細胞の増殖低下がもたらされる。特定の実施態様において、該投与により、Ｈｅｒ−２遺伝子発現の阻害がもたらされる。いくつかの実施態様において、該細胞は癌細胞である。他の実施態様において、該細胞は、宿主動物（例えば、非ヒト哺乳動物またはヒト）中に存在する。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、体重１ｋｇ当たり、０．０１μｇから１００ｇの間、好ましくは、１ｍｇから１００ｍｇの間の投与量で、宿主動物に投与される。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、１日１回以上、宿主動物に投与される。他の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、連続的に宿主動物に投与される。さらなる実施態様において、該細胞は、細胞培養物中に存在する。いくつかの実施態様において、該方法は、該細胞に試験化合物を投与するステップをさらに含む。いくつかの実施態様において、該試験化合物は、公知の化学療法剤である。いくつかの実施態様において、前記癌は、膵癌、大腸癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、白血病、前立腺、リンパ腫、卵巣、または黒色腫である。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含み、ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つ、好ましくは全てが、５−メチルシトシンを含む。
【００６５】
本発明は、Ｈｅｒ−２遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド；およびＨｅｒ−２遺伝子を含む細胞を提供すること；そして該オリゴヌクレオチドを該細胞に投与すること、を含む方法をさらに提供する。
【００６６】
さらなる実施態様において、本発明は、生理的条件下で、Ｈｅｒ−２遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供するものであり、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含んでおり、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つは５−メチルシトシンを含む。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、Ｈｅｒ−２遺伝子のプロモーター領域に、完全に相補的である。他の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、Ｈｅｒ−２遺伝子のプロモーター領域に、部分的に相補的である。例えば、特定の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、Ｈｅｒ−２遺伝子のプロモーター領域に対して、１つの誤対合を含有する。いくつかの好ましい実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、Ｈｅｒ−２遺伝子のプロモーター領域に対してのみ相補的であり、ヒトゲノムの他の領域に対しては、完全に相補的であることはない。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、１０ヌクレオチド長から６０ヌクレオチド長の間であり、好ましくは、１５ヌクレオチド長から３５ヌクレオチド長の間である。
【００６７】
本発明は、生理的条件下、Ｈｅｒ−２遺伝子の発現が阻害されるような条件下で、Ｈｅｒ−２遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物を、さらに提供する。
【００６８】
本発明は、生理的条件下、細胞の増殖が低下するような条件下で、該細胞の染色体上にあるＨｅｒ−２遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物を、さらに提供する。
【００６９】
また、本発明は、生理的条件下で、Ｈｅｒ−２遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズする第一のオリゴヌクレオチド、即ち少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含み、ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つは、５−メチルシトシンを含むオリゴヌクレオチド；および第二のオリゴヌクレオチド、即ち少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含んでおり、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンを含むオリゴヌクレオチド、を含む組成物を提供する。
【００７０】
特定の実施態様において、本発明は、生理的条件下で、Ｈｅｒ−２遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズし、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含み、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンを含むオリゴヌクレオチドを含むキット；ならびに、細胞の染色体上にＨｅｒ−２遺伝子を含む該細胞の増殖を低下させるか、または遺伝子発現を阻害するためのキットの使用説明書を提供する。いくつかの実施態様において、該キット内の組成物は、対象における癌を処置するために使用され、該説明書は、対象における癌を処置するためのキットの説明書を含む。いくつかの実施態様において、該説明書は、医薬品表示に関する米国食品医薬品局により要求された説明書である。
【００７１】
また、本発明は、癌と診断された対象からの生物学的サンプルおよびサンプル中の発癌遺伝子の発現の有無を検出する試薬を提供すること；サンプル中の発癌遺伝子の発現の有無を検出すること；生理的条件下で、生物学的サンプル中に発現した発癌遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズし、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含んでおり、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンを含むオリゴヌクレオチドを対象に投与すること、を含む方法を提供する。
【００７２】
本発明は、生理的条件下で、生物学的サンプル中に発現した癌または過剰増殖疾患に関与する遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含んでおり、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンを含むオリゴヌクレオチドを提供すること；および該遺伝子の発現が阻害されるような条件下で、該オリゴヌクレオチドを対象に投与することを含む、対象における遺伝子の発現を阻害する（例えば、癌または他の過剰増殖疾患を治療するために）方法をさらに提供する。いくつかの実施態様において、該対象はヒトである。
【００７３】
さらなる実施態様において、本発明は、疑わしい発癌遺伝子を含む細胞および該遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供すること；および該オリゴヌクレオチドを該細胞に投与すること；そして該オリゴヌクレオチドの不在の場合と比較して、該オリゴヌクレオチドが存在した場合に該細胞の増殖が阻害されるかどうかを判定することを含む、化合物のスクリーニング法を提供する。いくつかの実施態様において、該細胞は、細胞培養物（例えば、癌細胞系）中に存在する。他の実施態様において、該細胞は、宿主動物（例えば、非ヒト哺乳動物）中に存在する。いくつかの実施態様において、該方法は、ハイスループットスクリーニング法である。
【００７４】
いくつかの実施態様において、本発明は、配列番号１３４、１３６、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、または１４４を含むオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含んでおり、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンを含む。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドの全てのＣＧヌクレオチド対におけるシトシン塩基の全てが５−メチルシトシンである。特定の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、生理的条件下で、ＴＧＦ−α遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズする。いくつかの実施態様において、ＴＧＦ−α遺伝子のプロモーター領域への該オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより、ＴＧＦ−α遺伝子の発現が阻害される。いくつかの実施態様において、ＴＧＦ−α遺伝子は、細胞の染色体上にあり、ＴＧＦ−α遺伝子のプロモーター領域に対する該オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより、該細胞の増殖が低下する。いくつかの実施態様において、該組成物は、第二のオリゴヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含んでおり、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つは、５−メチルシトシンを含む。いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドは、配列番号１３４、１３６、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３または１４４からなる群から選択される。他の実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドは、第二の遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズし、第二の遺伝子は、ＴＧＦ−αではない。さらなる実施態様において、第二の遺伝子は、発癌遺伝子（例えば、ｃ−ｋｉ−Ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、ｂｃｌ−２、Ｈｅｒ−２、またはｃ−ｍｙｃ）である。
【００７５】
他の実施態様において、本発明は、配列番号１３１のヌクレオチド１から９０の間、配列番号１３１のヌクレオチド１７５から２１９の間、配列番号１３１のヌクレオチド２６１から３６７の間、配列番号１３１のヌクレオチド４３１から９３０の間、または配列番号１３１のヌクレオチド９６４から１２３７の間を含む位置で、ｃ−ｍｙｃ遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【００７６】
さらに他の実施態様において、本発明は、生理的条件下、ＴＧＦ−α遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【００７７】
さらなる実施態様において、本発明は、オリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１３４、１３６、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、または１４４）；およびＴＧＦ−α遺伝子を含む細胞を提供すること；および該オリゴヌクレオチドを、該細胞に投与すること、を含む方法を提供する。いくつかの実施態様において、該投与により、該細胞の増殖低下がもたらされる。特定の実施態様において、該投与により、ＴＧＦ−α遺伝子発現の阻害がもたらされる。いくつかの実施態様において、該細胞は癌細胞である。他の実施態様において、該細胞は、宿主動物（例えば、非ヒト哺乳動物またはヒト）中に存在する。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、体重１ｋｇ当たり、０．０１μｇから１００ｇの間、好ましくは、１ｍｇから１００ｍｇの間の投与量で、宿主動物に投与される。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、１日１回以上、宿主動物に投与される。他の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、連続的に宿主動物に投与される。さらなる実施態様において、該細胞は、細胞培養物中に存在する。いくつかの実施態様において、該方法は、該細胞に試験化合物を投与するステップをさらに含む。いくつかの実施態様において、該試験化合物は、公知の化学療法剤である。いくつかの実施態様において、前記癌は、膵癌、大腸癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、白血病、前立腺、リンパ腫、卵巣、または黒色腫である。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含み、ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つ、好ましくは全てが、５−メチルシトシンを含む。
【００７８】
本発明は、ＴＧＦ−α遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドおよびＴＧＦ−α遺伝子を含む細胞を提供すること；そして該オリゴヌクレオチドを、該細胞に投与すること、を含む方法をさらに提供する。
【００７９】
さらなる実施態様において、本発明は、生理的条件下で、ＴＧＦ−α遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供し、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド地を含んでおり、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つは５−メチルシトシンを含む。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−α遺伝子のプロモーター領域に、完全に相補的である。他の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−α遺伝子のプロモーター領域に、部分的に相補的である。例えば、特定の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−α遺伝子のプロモーター領域に対して、１つの誤対合を含有する。いくつかの好ましい実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−α遺伝子のプロモーター領域に対してのみ相補的であり、ヒトゲノムの他の領域に対しては、完全に相補的であることはない。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、１０ヌクレオチド長から６０ヌクレオチド長の間であり、好ましくは、１５ヌクレオチド長から３５ヌクレオチド長の間である。
【００８０】
本発明は、生理的条件下に、ＴＧＦ−α遺伝子の発現が阻害されるような条件下で、ＴＧＦ−α遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物をさらに提供する。
【００８１】
本発明は、生理的条件下に、細胞の増殖が低下するような条件下で、該細胞の染色体上にあるＴＧＦ−α遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物を、さらに提供する。
【００８２】
また、本発明は、生理的条件下で、ＴＧＦ−α遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズする第一のオリゴヌクレオチド、即ち少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含んでおり、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンを含むオリゴヌクレオチド；および第二のオリゴヌクレオチド、即ち少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含んでおり、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンを含むオリゴヌクレオチド、を含む組成物を提供する。
【００８３】
特定の実施態様において、本発明は、生理的条件下で、ＴＧＦ−α遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含んでおり、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンを含むオリゴヌクレオチドを含むキット；ならびに、細胞の染色体上にＴＧＦ−α遺伝子を含む該細胞の増殖を低下させるか、または遺伝子発現を阻害するためのキットの使用説明書を提供する。いくつかの実施態様において、該キット内の組成物は、対象における癌を処置するために使用され、該説明書は、対象における癌を処置するためのキットの説明書を含む。いくつかの実施態様において、該説明書は、医薬品表示に関する米国食品医薬品局により要求された説明書である。
【００８４】
また、本発明は、癌と診断された対象からの生物学的サンプルおよびサンプル中の発癌遺伝子の発現の有無を検出する試薬を提供すること；サンプル中の発癌遺伝子の発現の有無を検出すること；生理的条件下、生物学的サンプル中に発現した発癌遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズし、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含んでおり、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンを含むオリゴヌクレオチドを対象に投与すること、を含む方法を提供する。
【００８５】
本発明は、生理的条件下、生物学的サンプル中に発現した癌または過剰増殖疾患に関与する遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド対を含んでおり、該ＣＧジヌクレオチド対におけるシトシン塩基の少なくとも１つが５−メチルシトシンを含むオリゴヌクレオチドを提供すること；および該遺伝子の発現が阻害されるような条件下で、該オリゴヌクレオチドを対象に投与することを含む、対象における遺伝子の発現を阻害する（例えば、癌または他の過剰増殖疾患を治療するために）方法をさらに提供する。いくつかの実施態様において、該対象はヒトである。
【００８６】
さらなる実施態様において、本発明は、疑わしい発癌遺伝子を含む細胞および該遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供すること；および該オリゴヌクレオチドを該細胞に投与すること；および該オリゴヌクレオチドの不在の場合と比較して、該オリゴヌクレオチドが存在した場合に該細胞の増殖が阻害されるかどうかを判定することを含む、化合物のスクリーニング法を提供する。いくつかの実施態様において、該細胞は、細胞培養物（例えば、癌細胞系）中に存在する。他の実施態様において、該細胞は、宿主動物（例えば、非ヒト哺乳動物）中に存在する。いくつかの実施態様において、該方法は、ハイスループットスクリーニング法である。
【００８７】
他の実施態様において、本発明は、癌療法のための方法および組成物に関する。特に、本発明は、リポソームベースの癌療法を提供する。
【００８８】
したがって、いくつかの実施態様において、本発明は、カチオン性、中性、またはアニオン性リポソームおよびオリゴヌクレオチドを含む（例えば、それらから構成される）医薬組成物を提供する。いくつかの好ましい実施態様において、該リポソームは、カルジオリピンを基にしたカチオン性リポソーム（例えば、ＮＥＯＰＨＥＣＴＩＮ）である。いくつかの好ましい実施態様において、ＮＥＯＰＨＥＣＴＩＮ対オリゴヌクレオチドの電荷比は、６：１である。他の実施態様において、該リポソームは、Ｎ−〔１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル〕−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート（ＤＯＴＡＰ）を含む。
【００８９】
いくつかの実施態様において、本発明は、オリゴヌクレオチド（例えば、発癌遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド）およびカチオン性、中性、またはアニオン性リポソームを含む（例えば、それらから構成される）第一の医薬組成物を含み、所望により第２の医薬組成物を含むキットを提供するものであって、ここで該第２の医薬組成物は公知の化学療法剤（例えば、ＴＡＸＯＴＥＲＥ、ＴＡＸＯＬ、またはＶＩＮＣＲＩＳＴＩＮＥ）を含んでおり、該公知の化学療法剤は第一の医薬組成物とは別に製剤化される、キットを提供する。いくつかの実施態様において、該化学療法剤は、標準投与量の半分未満、より好ましくは１／３未満、さらに好ましくは１／４未満、さらに好ましくは１／１０未満、さらに好ましくは１／１００未満で存在する。
【００９０】
さらに他の実施態様において、本発明は、カチオン性、中性、またはアニオン性リポソームおよびオリゴヌクレオチド（例えば、発癌遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド）から構成される医薬組成物を提供すること；そして該医薬組成物を癌細胞に曝露することを含む方法を提供する。いくつかの好ましい実施態様において、該リポソームは、カルジオリピンを基にしたカチオン性リポソーム（例えば、ＮＥＯＰＨＥＣＴＩＮ）である。いくつかの好ましい実施態様において、ＮＥＯＰＨＥＣＴＩＮ対オリゴヌクレオチドの電荷比は、６：１である。他の実施態様において、該リポソームは、Ｎ−〔１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル〕−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート（ＤＯＴＡＰ）を含む。いくつかの実施態様において、該癌細胞は、前立腺癌細胞、卵巣癌細胞、乳癌細胞、白血病細胞、またはリンパ腫細胞である。いくつかの実施態様において、該細胞は、宿主動物（例えばヒト）中にある。いくつかの実施態様において、該医薬組成物は、宿主動物に、１日１回または複数回（例えば連続的に）導入される。いくつかの実施態様において、該方法は、対象に公知の化学療法剤（ＴＡＸＯＴＥＲＥ、ＴＡＸＯＬ、またはＶＩＮＣＲＩＳＴＩＮＥ）を投与するステップをさらに含んでなり、公知の化学療法剤は、カチオン性、中性、またはアニオン性リポソームとは別個に製剤化される。好ましい実施態様において、公知の化学療法剤は、該医薬組成物とは別個に製剤化される。いくつかの実施態様において、該化学療法剤は、標準投与量の半分未満、より好ましくは１／３未満、さらに好ましくは１／４未満、さらに好ましくは１／１０未満、さらに好ましくは１／１００未満で存在する。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ｂｃｌ−２遺伝子の核酸配列（配列番号１）を示している。
【図２】本発明のいくつかの実施態様に用いられたｂｃｌ−２に対するアンチジーンの配列を示している。Ｘは、メチル化Ｃヌクレオチドを表す。
【図３】ｃ−ｅｒＢ−２（Ｈｅｒ−２）遺伝子の核酸配列（配列番号２９）を示している。
【図４】本発明のいくつかの実施態様に用いられたｃ−ｅｒＢ−２に対するアンチジーンの配列を示している。Ｘは、メチル化Ｃヌクレオチドを表す。
【図５】ｃ−ｋｉ−Ｒａｓ遺伝子の核酸配列（配列番号４６）を示している。
【図６】本発明のいくつかの実施態様に用いられたｃ−ｋｉ−Ｒａｓに対するアンチジーンの配列を示している。Ｘは、メチル化Ｃヌクレオチドを表す。
【図７】ｃ−Ｈａ−Ｒａｓ遺伝子の核酸配列（配列番号６６）を示している。
【図８】本発明のいくつかの実施態様に用いられたｃ−Ｈａ−Ｒａｓに対するアンチジーンの配列を示している。Ｘは、メチル化Ｃヌクレオチドを表す。
【図９】ｃ−ｍｙｃ遺伝子の核酸配列（配列番号１０８）を示している。
【図１０】本発明のいくつかの実施態様に用いられたｃ−ｍｙｃに対するアンチジーンの配列を示している。Ｘは、メチル化Ｃヌクレオチドを表す。
【図１１】ＴＧＦ−α遺伝子の核酸配列（配列番号１３１）を示している。
【図１２】本発明のいくつかの実施態様に用いられたＴＧＦ−αに対するアンチジーンの配列を示している。Ｘは、メチル化Ｃヌクレオチドを表す。
【図１３】本発明のいくつかの実施態様に用いられたｃ−ｋｉ−Ｒａｓに対するアンチジーンによる細胞増殖の発現阻害を示している。
【図１４】本発明のいくつかの実施態様に用いられたｂｃｌ−２に対するアンチジーンによる細胞増殖の発現阻害を示している。
【図１５】本発明のいくつかの実施態様に用いられたｃ−ｅｒｂ−２に対するアンチジーンによる細胞増殖の発現阻害を示している。
【図１６】本発明のいくつかの実施態様に用いられたｃ−Ｈａ−Ｒａｓに対するアンチジーンによる細胞増殖の発現阻害を示している。
【図１７】本発明のいくつかの実施態様に用いられたｃ−ｍｙｃに対する抗原による細胞増殖の発現阻害を示している。
【図１８】本発明のいくつかの実施態様に用いられたＴＧＦ−αに対するアンチジーンによる細胞増殖の発現阻害を示している。
【図１９】ｃ−ｋｉ−Ｒａｓに対するアンチジーンによる細胞増殖の発現阻害の用量応答曲線を示している。
【図２０】ｂｃｌ−２に対する抗原によるＦＳＣＣＬ細胞（Ａ）およびＭＣＦ−７細胞（Ｂ）の細胞増殖の発現阻害の用量応答曲線を示している。
【図２１】ｃ−ｅｒｂ−２に対する抗原による細胞増殖の発現阻害の用量応答曲線を示している。
【図２２】ｃ−Ｈａ−Ｒａｓに対するアンチジーンによる細胞増殖の発現阻害の用量応答曲線を示している。
【図２３】ｃ−ｍｙｃに対する抗原による細胞増殖の発現阻害の用量応答曲線を示している。
【図２４】ＴＧＦ−αに対するアンチジーンによるＴ４７Ｄ細胞（Ａ）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（Ｂ）の細胞増殖の発現阻害の用量応答曲線を示している。
【図２５】ｃ−ｋｉ−Ｒａｓに対するアンチジーンの代表的変異体を示している。
【図２６】ｂｃｌ−２に対する抗原の代表的変異体を示している。
【図２７】ｃ−ｅｒｂ−２に対するアンチジーンの代表的変異体を示している。
【図２８】ｃ−ｈａ−ｒａｓに対するアンチジーンの代表的変異体を示している。
【図２９】ｃ−ｍｙｃに対するアンチジーンの代表的変異体を示している。
【図３０】ＴＧＦ−αに対するアンチジーンの代表的変異体を示している。
【図３１】Ｂｃｌ−２を標的化した非メチル化オリゴヌクレオチドによるリンパ腫細胞の阻害を示している。
【図３２】本発明の組成物による治療後、ＰＣ−３  ＧＦＰ前立腺癌皮下モデルにおける腫瘍の平均腫瘍体積を示している。
【図３３】本発明の組成物による治療後、ＰＣ−３  ＧＦＰ前立腺癌皮下モデルにおける腫瘍の平均体重を示している。
【図３４】本発明の組成物による治療後、ＰＣ−３  ＧＦＰ前立腺癌皮下モデルにおける腫瘍の平均腫瘍体積を示している。
【図３５】本発明の組成物による治療後、ＰＣ−３  ＧＦＰ前立腺癌皮下モデルにおける腫瘍の平均最終腫瘍体積を示している。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
定義
本発明の理解を助けるために、多数の用語および語句を以下に定義する：
【００９３】
本明細書に用いられるとおり、用語「前記化学療法剤は、標準投与量の半分未満で存在する」とは、ヒトへの投与に使用される標準的投与量範囲の最少値の半分未満（例えば、５０％未満、好ましくは４０％未満、さらに好ましくは１０％未満、さらに好ましくは１％未満）の投与量を言う。いくつかの実施態様において、標準的投与量範囲は、製造元によって推奨される投与量範囲である。他の実施態様において、標準的投与量範囲は、当該分野における医師によって使用される範囲である。さらに他の実施態様において、標準的投与量範囲は、当該分野における医療の通常の標準と考えられる範囲である。該投与量範囲内における具体的な投与量は、例えば、対象の年齢、体重、および健康状態、ならびに治療されている癌のタイプによって決定される。
【００９４】
本明細書に用いられるとおり、用語「前記遺伝子の発現が阻害されるような条件下」とは、本発明のオリゴヌクレオチドが遺伝子（例えば、該遺伝子のプロモーター領域）にハイブリダイズし、該オリゴヌクレオチドが不在の場合の転写レベルに比較して、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも２５％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、該遺伝子の転写を阻害する条件を言う。本発明は、ある特定の遺伝子の発現阻害に限定されない。代表的遺伝子としては、これらに限定はしないが、ｃ−ｋｉ−Ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、ｃ−ｍｙｃ、ｈｅｒ−２、ＴＧＦ−α、およびｂｃｌ−２が挙げられる。
【００９５】
本明細書に用いられるとおり、用語「細胞の増殖が低下するような条件下」とは、本発明のオリゴヌクレオチドが細胞（例えば癌）に投与された場合、該オリゴヌクレオチドが不在の場合の該細胞の増殖率に比較して、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも２５％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、該細胞の増殖率を低下させる条件を言う。
【００９６】
本明細書に用いられるとおり、用語「エピトープ」とは、特定の抗体に接触させる抗原の部分を言う。
【００９７】
タンパク質またはタンパク質の断片が、宿主動物を免疫化するために用いられる場合、該タンパク質の多くの領域が該タンパク質の特定の領域または三次元構造に特異的に結合する抗体の産生を誘導でき；これらの領域または構造は、「抗原決定基」と称される。抗原決定基は、抗体への結合に関して、完全な抗原（すなわち、免疫応答を誘発するために用いられる「免疫原」）と競合できる。
【００９８】
本明細書に用いられるとおり、用語「対象」は、これらに限定はしないが、具体的な治療のレシピエントとなる、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類などの任意の動物（例えば哺乳動物）を言う。通常、用語の「対象」および「患者」は、本明細書において、ヒト対象に関して互換的に用いられる。
【００９９】
本明細書に用いられるとおり、用語「コンピューターメモリ」および「コンピューターメモリ装置」とは、コンピュータプロセッサによって読み取り可能な保存媒体を言う。コンピューターメモリの例としては、これらに限定はしないが、ＲＡＭ、ＲＯＭ、コンピュータチップ、デジタルビデオディスク（ＤＶＤ）、コンパクトディスク（ＣＤ）、ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）および磁気テープが挙げられる。
【０１００】
本明細書に用いられるとおり、用語「コンピュータ読み取り可能媒体」とは、コンピュータプロセッサに情報（例えばデータおよび命令）を保存および提供するための任意の装置またはシステムを言う。コンピュータ読み取り可能媒体の例としては、これらに限定はしないが、ＤＶＤ、ＣＤ、ハードディスクドライブ、磁気テープおよびネットワーク上に媒体を流すためのサーバーが挙げられる。
【０１０１】
本明細書に用いられるとおり、用語「プロセッサ」および「中央処理装置」あるいは「ＣＰＵ」とは、互換的に用いられ、コンピューターメモリ（例えば、ＲＯＭまたは他のコンピューターメモリ）からプログラムを読み取ることができ、そのプログラムにしたがって１組のステップを実施できる装置を言う。
【０１０２】
本明細書に用いられるとおり、用語「非ヒト動物」とは、これらに限定はしないが、齧歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ、反芻類、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥類などの脊椎動物、ならびにショウジョウバエおよび線虫などの非脊椎動物などの全ての非ヒト動物を言う。いくつかの実施態様において、「非ヒト動物」とはさらに、細菌病原体、ウィルス病原体などの原核生物およびウィルス類を言う。
【０１０３】
本明細書に用いられるとおり、用語「核酸分子」とは、これらに限定はしないが、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの分子を含有する任意の核酸を言う。該用語は、これらに限定はしないが、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン（pseudo isocytosine）、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリンなどのＤＮＡおよびＲＮＡの公知のあらゆる塩基アナログを含む配列を包含する。
【０１０４】
用語の「遺伝子」とは、ポリペプチド、前駆体、またはＲＮＡ（例えばｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えばＤＮＡ）配列を言う。該ポリペプチドは、完全長コード配列によって、または、完全長または断片の所望の活性または機能的性質（例えば、酵素活性、リガンド結合性、シグナル伝達性、免疫原性など）が保持される限り、該コード配列のいずれかの部分によってコードされ得る。また、該用語は、該遺伝子が完全長ｍＲＮＡの長さに対応するように、５’末端または３’末端のいずれかの末端において、約１ｋｂ以上離れた双方の末端のコード領域に隣接して位置する構造遺伝子のコード領域および該配列を包含する。コード領域の５’に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と称される。コード領域の３’または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と称される。用語の「遺伝子」は、ｃＤＮＡおよび遺伝子のゲノム体の双方を包含する。遺伝子のゲノム体またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と称される非コード配列によって割り込まれたコード部分を含有する。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に翻訳される遺伝子の区域であり；イントロンは、エンハンサーなどの調節要素を含有できる。イントロンは、核または第一次転写体から除去または「スプライスアウト」され；したがって、イントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写体には不在である。ｍＲＮＡは翻訳時、新生ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列または順序を規定する働きをする。
【０１０５】
本明細書に用いられるとおり、用語「異種遺伝子」とは、その自然の環境にはない遺伝子を言う。例えば、他の種に導入された１つの種由来の遺伝子が含まれる。また、異種遺伝子としては、何らかの方法で変化した（例えば、変異した、複数コピーで加えられた、非天然調節配列に結合した、など）ある生物に固有の遺伝子が挙げられる。異種遺伝子は内因性遺伝子とは区別される、即ち異種遺伝子配列は染色体中の遺伝子配列に結合した天然に見られないＤＮＡ配列に典型的に結合しているか、または天然に見られない染色体の部分（例えば、通常は発現しない座に発現した遺伝子）と結合している。
【０１０６】
本明細書に用いられるとおり、用語「遺伝子発現」とは、遺伝子の「転写」を介して（すなわち、ＲＮＡポリメラーゼの酵素作用を介して）、遺伝子にコードされた遺伝情報を、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはｓｎＲＮＡ）に、また、タンパク質では、ｍＲＮＡの「翻訳」を介して、タンパク質のコード遺伝子をタンパク質に変換する過程を言う。遺伝子発現は、該過程における多くの段階で調節できる。「本明細書に用いられるとおり、用語「アップレギュレーション」または「活性化」とは、遺伝子発現産物（すなわち、ＲＮＡまたはタンパク質）の産生を増加させる調節を言い、一方、「ダウンレギュレーション」または「抑制」とは、産生を低下させる調節を言う。アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションに関与している分子（例えば、転写因子）は、しばしば、それぞれ、「活性化因子」および「抑制因子」と呼ばれる。
【０１０７】
遺伝子のゲノム体は、イントロンを含有する他に、ＲＮＡ転写体に存在する配列の５’末端および３’末端双方に位置する配列も含み得る。これらの配列は、「フランキング」配列または「フランキング」領域と称される（これらのフランキング配列は、ｍＲＮＡ転写体に存在する非翻訳配列に対して５’または３’に位置している）。５’フランキング領域は、遺伝子の転写を制御する、または影響を与えるプロモーターまたはエンハンサーなどの調節配列を含有し得る。３’フランキング領域は、転写の終結、翻訳後開裂およびポリアデニル化を指令する配列を含有し得る。
【０１０８】
用語の「野生型」とは、天然源から単離した遺伝子または遺伝子産物を言う。野生型遺伝子は、集団内に最も多く見られるものであり、したがって、該遺伝子の「正常」形態または「野生型」形態を任意に表している。対照的に、用語の「改変」または「変異」は、野生型遺伝子または野生型遺伝子産物と比較して、配列および／または機能的性質における改変（すなわち、特性の変更）を示す遺伝子または遺伝子産物を言う。天然の変異体は単離できる；これらは、野生型遺伝子または野生型遺伝子産物に比較した場合、特性が変化している（核酸配列の変化を含み）という事実によって同定されることが認められる。
【０１０９】
本明細書に用いられるとおり、用語「核酸分子コード」、「ＤＮＡ配列コード」、および「ＤＮＡコード」とは、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を言う。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序によって、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序が決定される。このように、ＤＮＡ配列は、アミノ酸配列をコードしている。
【０１１０】
本明細書に用いられるとおり、用語「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド」および「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」とは、遺伝子のコード領域を含む核酸配列、言い換えると、遺伝子産物をコードする核酸配列を意味する。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ形態に存在し得る。ＤＮＡ形態に存在する場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一本鎖（すなわち、センス鎖）でも、二本鎖でもあり得る。転写の適切な開始および／または一次ＲＮＡ転写体の正しいプロセシングをさせるために必要ならば、エンハンサー／プロモーター、スプライス接合体、ポリアデニル化シグナルなどの好適な制御要素は、該遺伝子のコード領域に近接して配置できる。あるいは、本発明の発現ベクターに利用されるコード領域は、内因性エンハンサー／プロモーター、スプライス接合体、介在配列、ポリアデニル化シグナルなど、または内因性制御要素と外来性制御要素の組合せの両方を含有し得る。
【０１１１】
本明細書に用いられるとおり、用語「オリゴヌクレオチド」とは、短い一本鎖ポリヌクレオチド鎖を言う。オリゴヌクレオチドは、典型的には、２００残基長未満（例えば、８から１００の間）であるが、本明細書に用いられる用語は、より長いポリヌクレオチド鎖（例えば、５０００残基のような大きさ）を包含することも意図されている。オリゴヌクレオチドは、しばしば、それらの長さによって称される。例えば、２４残基のオリゴヌクレオチドは、「２４量体」と称される。オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリダイズすることによって、または他のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることによって、二次および三次構造を形成できる。このような構造としては、これらに限定はしないが、二重、ヘアピン、十字、湾曲、および三重構造が挙げられる。
【０１１２】
いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは「アンチジーン」である。本明細書に用いられるとおり、用語「アンチジーン」とは、遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを言う。いくつかの実施態様において、プロモーターに対するアンチジーンのハイブリダイゼーションによって、遺伝子の発現が阻害される。
【０１１３】
本明細書に用いられるとおり、用語「相補的な」または「相補性」は、塩基対合則に関連したポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）に関して用いられる。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に相補的である。相補性は、「部分的」であり得、そこでは、核酸塩基のいくつかのみが塩基対合則に対合している。あるいは、核酸間に、「完全な」または「全体的」相補性があり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に重要な影響を及ぼす。これは、増幅反応ならびに核酸間の結合に依存する検出法において、特に重要である。
【０１１４】
本明細書に用いられるとおり、用語「完全に相補的」とは、例えば、本発明のオリゴヌクレオチドに関して用いられる場合、全てのヌクレオチドが標的配列（例えば遺伝子）に相補的であるオリゴヌクレオチドを言う。
【０１１５】
本明細書に用いられるとおり、用語「部分的に相補的」とは、例えば、本発明のオリゴヌクレオチドに関して用いられる場合、少なくとも１つのヌクレオチドが標的配列に相補的でないオリゴヌクレオチドを言う。好ましい部分的に相補的なオリゴヌクレオチドは、生理的条件下で、標的配列に依然としてハイブリダイズできるものである。用語の「部分的に相補的」とは、該オリゴヌクレオチドの内部またはいずれかの末端に、１つまたは複数の非相補的ヌクレオチドの領域を有するオリゴヌクレオチドを言う。末端に誤対合を有するオリゴヌクレオチドでも依然として標的配列にハイブリダイズできる。
【０１１６】
用語の「相同性」とは、相補性の程度を言う。部分的相同性または完全相同性（すなわち、同一性）があり得る。部分的に相補的な配列とは、完全に相補的な核酸分子が、「実質的に相同性」である標的核酸にハイブリダイズすることを、少なくとも部分的に阻害する核酸分子である。標的配列に対する完全に相補的な配列のハイブリダイゼーション阻害は、低ストリンジェンシー条件下、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロットまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を用いて調べることができる。実質的に相同性の配列またはプローブは、低ストリンジェンシー条件下、標的に対して完全に相同性の核酸分子の結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）に競合または阻害する。とはいっても、非特異的結合が可能であるような低ストリンジェンシー条件ということではない；低ストリンジェンシー条件は、２つの配列相互の結合が特異的（選択的）相互作用であることを必要とする。非特異的結合の不在は、実質的に非相補的な（例えば、同一性が約３０％未満）第２の標的の使用によって試験でき；非特異的結合の不在下では、プローブは、第２の非相補的標的にハイブリダイズしない。
【０１１７】
ｃＤＮＡまたはゲノムクローンなどの二本鎖核酸配列に関して用いられる場合、用語の「実質的に相同性」とは、上記の低ストリンジェンシー条件下、二本鎖核酸配列のいずれかの鎖または双方の鎖にハイブリダイズできる任意のプローブを言う。
【０１１８】
遺伝子は、一次ＲＮＡ転写体の差異的スプライシングによって生成する複数のＲＮＡ種を産生し得る。同じ遺伝子のスプライス変種であるｃＤＮＡは、配列同一性または完全相同性の領域（双方のｃＤＮＡ上に、同じエキソンまたは同じエキソンの部分の存在を示す）および完全非同一性の領域（例えば、ｃＤＮＡ１上には、エキソン「Ａ」の存在を示し、ｃＤＮＡ２は、代わりに、エキソン「Ｂ」を含有する）を含む。２つのｃＤＮＡは、配列同一性の領域を含有するため、それらは双方とも、双方のｃＤＮＡ上に見られる配列を含有する遺伝子全体または該遺伝子の部分から誘導されたプローブにハイブリダイズし；したがって、２つのスプライス変種は、このようなプローブに、および互いに、実質的に相同性である。
【０１１９】
一本鎖核酸配列に関して用いられる場合、用語の「実質的に相同性」とは、上記の低ストリンジェンシー条件下、一本鎖核酸配列にハイブリダイズできる（すなわち、相補的な）任意のプローブを言う。
【０１２０】
本明細書に用いられるとおり、用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸の対合に関して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の結合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドのＴｍ、および核酸内のＧ：Ｃ比などの因子によって影響される。その構造内に、相補的核酸の対合を含有する単一分子は、「自己ハイブリダイズされている」と言われる。
【０１２１】
本明細書に用いられるとおり、用語「Ｔｍ」は、「融解温度」に関して用いられる。融解温度は、二本鎖核酸分子の集団が、一本鎖へと半分に解離する温度である。核酸のＴｍを算出する等式は、当技術分野でよく知られている。標準的文献に示されるとおり、Ｔｍ値の単純な推定値は、核酸が１ＭのＮａＣｌにおける水溶液中にある場合、等式：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）によって算出できる（例えば、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）およびヤング（Ｙｏｕｎｇ）、Ｑｕａｎｔａｔｉｖｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｉｚａｔｉｏｎ（１９８５）を参照）。他の文献は、Ｔｍの算出に、構造特性ならびに配列特性を考慮に入れるより複雑な演算を含む。
【０１２２】
本明細書に用いられるとおり、用語「ストリンジェンシー」は、核酸ハイブリダイゼーションが行われる温度、イオン強度、および有機溶媒などの他の化合物の存在という条件に関して用いられる。「低ストリンジェンシー条件」下では、目的とする核酸配列は、正確な相補体、１つの塩基誤対合を有する配列、密接に関連した配列（例えば、９０％以上の相同性を有する配列）、および部分的相同性のみを有する配列（例えば、５０〜９０％の相同性を有する配列）にハイブリダイズする。「中ストリンジェンシー条件」下では、目的とする核酸配列は、正確な相補体、１つの塩基誤対合を有する配列、および密接に関連した配列（例えば、９０％以上の相同性を有する配列）とのみハイブリダイズする。「高ストリンジェンシー条件」下では、目的とする核酸配列は、正確な相補体、および（温度などの条件に依るが）１つの塩基誤対合を有する配列とのみハイブリダイズする。言い換えると、高ストリンジェンシー条件下では、１つの塩基誤対合を有する配列に対するハイブリダイゼーションを除外するために、温度を上げることができる。
【０１２３】
核酸ハイブリダイゼーションに関して用いられる場合、「高ストリンジェンシー条件」は、約５００ヌクレオチド長のプローブを用いる場合、５Ｘ  ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４  Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨによりｐＨを７．４に調整）、０．５％のＳＤＳ、５Ｘデンハート試薬および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、４２℃での結合またはハイブリダイゼーションに引き続き、４２℃で、０．１Ｘ  ＳＳＰＥ、１．０％のＳＤＳを含む溶液中での洗浄に相当する条件を含む。
【０１２４】
核酸ハイブリダイゼーションに関して用いられる場合、「中ストリンジェンシー条件」は、約５００ヌクレオチド長のプローブを用いる場合、５Ｘ  ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４  Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨによりｐＨを７．４に調整）、０．５％のＳＤＳ、５Ｘデンハート試薬および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、４２℃での結合またはハイブリダイゼーションに引き続き、４２℃で、１．０Ｘ  ＳＳＰＥ、１．０％のＳＤＳを含む溶液中での洗浄に相当する条件を含む。
【０１２５】
「低ストリンジェンシー条件」は、約５００ヌクレオチド長のプローブを用いる場合、５Ｘ  ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４  Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨによりｐＨを７．４に調整）、０．１％のＳＤＳ、５Ｘデンハート試薬〔５００ｍｌ当たり、５０Ｘデンハートは：５ｇのフィコール（タイプ４００、Ｐｈａｒｍｃｉａ）、５ｇのＢＳＡ（フラクションＶ；シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含有〕および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、４２℃での結合またはハイブリダイゼーションに引き続き、４２℃で、５Ｘ  ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳを含む溶液中での洗浄に相当する条件を含む。
【０１２６】
本発明は、約５００ヌクレオチド長のプローブのハイブリダイゼーションに限定されない。本発明は、およそ８ヌクレオチド長から数千（例えば少なくとも５０００）ヌクレオチド長までの間のプローブの使用を考慮している。当業者は、他のサイズのプローブでは、ストリンジェンシー条件を変更し得ることを認識している（例えば、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）およびヤング（Ｙｏｕｎｇ）、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（１９８５）およびサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールドスプリング・ハーバープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９８９）を参照）。
【０１２７】
低ストリンジェンシー条件を含む多数の等価条件を使用できることが、当業界ではよく知られており；プローブの長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）および標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成、溶液中の存在、または固定化など）ならびに塩および他の成分の濃度（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールの存在または不在）が考慮され、また、ハイブリダイゼーション溶液は、上記に挙げた条件とは異なるが、等価である低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションの条件を生み出すために、ハイブリダイゼーション溶液を変化させることができる。さらに、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイゼーションを促進させる条件（例えば、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄ステップの温度増加、ハイブリダイゼーション溶液におけるホルムアミドの使用など）は当技術分野で知られている（「ストリンジェンシー」に関する上記の定義を参照）。
【０１２８】
本明細書に用いられるとおり、用語「生理的条件」とは、動物（例えばヒト）内部の、またはそれに近似した特定のストリンジェンシー条件を言う。インビトロで使用される代表的な生理的条件としては、これらに限定はしないが、３７℃、９５％の空気、５％のＣＯ２、哺乳動物細胞を培養するための市販の培地（例えば、ジブコ（Ｇｉｂｃｏ）、メリーランド州から入手できるＤＭＥＭ培地）、５〜１０％の血清（例えば、ウシ血清またはウマ血清）、追加緩衝液、および任意にホルモン（例えば、インスリンおよび上皮成長因子）が挙げられる。
【０１２９】
用語の「単離」とは、「単離オリゴヌクレオチド」または「単離ポリヌクレオチド」におけるように、核酸に関して用いられる場合、同定され、核酸配列の天然源において、通常、核酸配列に結合している少なくとも１つの成分または混入物から分離された核酸配列を言う。単離核酸は、天然状態で見られるのとは異なる形態または設定において存在する。対照的に、非単離核酸は、天然に存在する状態で見られるＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸である。例えば、特定のＤＮＡ配列（例えば遺伝子）は、宿主細胞の染色体上に、隣接遺伝子の近くに見られ；特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列などのＲＮＡ配列は、多数のタンパク質をコードする他の多数のｍＲＮＡとの混合物として細胞中に見られる。しかし、特定のタンパク質をコードする単離核酸としては、例えば、通常、特定のタンパク質を発現する細胞中核酸であって、天然の細胞の染色体位置とは異なる染色体位置にあるか、または、天然に見られる核酸配列とは異なる核酸配列によってはさまれている核酸などが挙げられる。単離核酸、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドは、一本鎖形態においても二本鎖形態においても存在し得る。単離核酸、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを、タンパク質を発現させるために利用する場合、該オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、最小限、センス鎖またはコード鎖を含有することになる（すなわち、該オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドは、一本鎖であり得る）が、センス鎖およびアンチセンス鎖の双方を含有し得る（すなわち、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドは、二本鎖であり得る）。
【０１３０】
本明細書に用いられるとおり、用語「精製された」または「精製する」とは、サンプルからの成分（例えば、混入物）の除去を言う。例えば、抗体は、混入している非免疫グロブリンタンパク質の除去によって精製され；また、標的分子に結合しない免疫グロブリンの除去によっても精製される。非免疫グロブリンタンパク質の除去および／または標的分子に結合しない免疫グロブリンの除去により、サンプル中の標的反応性免疫グロブリンのパーセント増加がもたらされる。他の例では、組換えポリペプチドを細菌宿主細胞中に発現させ、該ポリペプチドを、宿主細胞タンパク質の除去によって精製し；それによって、サンプル中の組換えポリペプチドのパーセントを増加させる。
【０１３１】
「アミノ酸配列」および「ポリペプチド」または「タンパク質」などの用語は、該アミノ酸配列を、挙げられたタンパク質分子に関連した完全な天然アミノ酸配列に限定することを意味しない。
【０１３２】
本明細書に用いられるとおり、用語「天然タンパク質」は、タンパク質がベクター配列によってコードされたアミノ酸残基を含有しないことを示しており；すなわち、天然タンパク質は、天然タンパク質に見られるアミノ酸のみを含有している。天然タンパク質は、組換え法によって作製できるか、または天然源から単離できる。
【０１３３】
本明細書に用いられるとおり、用語「部分」とは、タンパク質に関する場合（「特定のタンパク質の部分」などの場合）、そのタンパク質の断片を言う。該断片は、４つのアミノ酸残基からアミノ酸配列全体マイナス１アミノ酸までのサイズの範囲であり得る。
【０１３４】
用語の「サザンブロット」とは、サイズによってＤＮＡを分画するために、寒天ゲルまたはアクリルアミドゲル上でＤＮＡを分析し、引き続き、該ＤＮＡを、該ゲルから、ニトロセルロースまたはナイロン膜などの固体支持体へ移すことを言う。次いで、固定化ＤＮＡを、標識化したプローブによって探索して、使用したプローブに相補的なＤＮＡ種を検出する。該ＤＮＡは、電気泳動の前に、制限酵素によって開裂できる。電気泳動後、該ＤＮＡは、固体支持体に移す前に、または移す時に、部分的に脱プリン化し、変性させることができる。サザンブロットは、分子生物学者の標準的な手段である（Ｊ．サンブルック（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州、９．３１−９．５８頁（１９８９））。
【０１３５】
用語の「ノーザンブロット」とは、サイズによってＲＮＡを分画するために、寒天ゲル上でのＲＮＡの電気泳動によってＲＮＡを分析し、続いて該ＲＮＡを該ゲルから、ニトロセルロースまたはナイロン膜などの固体支持体へ移すことを言う。次いで、固定化ＲＮＡを、標識化したプローブによって探索して、使用したプローブに相補的なＲＮＡ種を検出する。ノーザンブロットは、分子生物学者の標準的な手段である（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、７．３９−７．５２頁（１９８９））。
【０１３６】
用語の「ウェスタンブロット」とは、ニトロセルロースまたは膜などの支持体上に固定化したタンパク質（またはポリペプチド）の分析を言う。タンパク質をアクリルアミドゲル上で操作して、タンパク質を分離し、続いて該タンパク質を該ゲルからニトロセルロースまたはナイロン膜などの固体支持体へ移す。次いで、固定化タンパク質を、対象となる抗原に対して反応性を有する抗体に曝露する。抗体の結合は、放射標識抗体の使用など、種々の方法によって検出できる。
【０１３７】
本明細書に用いられるとおり、用語「細胞培養物」とは、任意のインビトロ細胞培養物を言う。この用語には、連続細胞系（例えば、不死表現型により）、一次細胞培養物、形質転換細胞系、有限細胞系（例えば、非形質転換細胞）、およびインビトロで維持された任意の他の細胞集団が含まれる。
【０１３８】
使用される用語の「真核生物」とは、「原核生物」と区別可能な生物を言う。この用語は、核膜によって境界づけられた真核の存在、核膜内に、染色体があること、膜で境界づけられた細胞小器官の存在など、真核生物の通常の特徴、および真核生物に一般的に見られる他の特徴を示す細胞を有する全ての生物を包含することが意図されている。したがって、この用語には、これらに限定はしないが、真菌、原生動物、および動物（例えばヒト）が含まれる。
【０１３９】
本明細書に用いられるとおり、用語「インビトロ」とは、人工的環境および人工的環境内で生じる過程または反応を言う。インビトロ環境は、これらに限定はしないが、試験管および細胞培養物から構成できる。用語の「インビボ」とは、自然環境（例えば、動物または細胞）および自然環境内で生じる過程または反応を言う。
【０１４０】
用語の「試験化合物」および「候補化合物」とは、疾患、疾病、病気、または身体機能の障害（例えば癌）を、治療または予防するために使用する候補である任意の化学物質、医薬品、薬物などを言う。試験化合物は、公知の、および可能性を有する治療用化合物の双方を含む。試験化合物は、本発明の方法を用い、スクリーニングによって、治療用であることを決定できる。本発明のいくつかの実施態様において、試験化合物には、アンチセンス化合物が含まれる。
【０１４１】
本明細書に用いられるとおり、用語「公知の化学療法剤」とは、疾患（例えば癌）の治療に有用であることが知られている化合物を言う。癌に対して有効である代表的な化学療法剤としては、これらに限定はしないが、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン（ＣＡ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキセート（ＭＴＸ）、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）が挙げられる。
【０１４２】
本明細書に用いられるとおり、用語「サンプル」は、その最も広い意味において用いられる。ある意味では、それは、生物学的サンプルならびに環境サンプルの任意の出所から得られた検体または培養物を意味する。生物学的サンプルは、動物（ヒトを含めて）から得ることができ、液体、固体、組織、および気体を包含する。生物学的サンプルとしては、血漿、血清などの血液産物が挙げられる。環境サンプルとしては、表面物質、土壌、水、結晶および工業サンプルが挙げられる。しかし、このような例は、本発明に適用できるサンプルタイプを限定するものとして考えるべきではない。
【０１４３】
本発明は、癌治療のための方法および組成物に関する。特に本発明は、種々の癌に関与する発癌遺伝子の阻害のためのオリゴヌクレオチドを基にした療法を提供する。本発明は、特定の癌の治療に限定されない。限定はしないが、乳癌などの任意の癌を標的化できる。本発明はまた、癌または発癌遺伝子を標的化することに限定されない。本発明の方法および組成物は、発現を阻害することが望ましい任意の遺伝子との使用（例えば、治療使用または研究使用）に好適である。
【０１４４】
Ｉ．発癌遺伝子の標的
幾つかの実施態様において、本発明は、発癌遺伝子の抗遺伝子阻害剤を提供する。本発明は、特定の発癌遺伝子の阻害に限定されない。実際、本発明は、これに限定はしないが、本明細書に開示されたものなど、任意の数の発癌遺伝子に対する抗遺伝子阻害剤を包含する。
【０１４５】
Ａ．Ｒａｓ
多くの科学者に注目されている１つの遺伝子は、ヒト癌原遺伝子、ｃ−Ｈａ−ｒａｓである。ｃ−Ｈａ−ｒａｓのプロモーター領域の核酸配列は、図７に示している。この遺伝子は、化学シグナルを細胞に中継し、細胞分化を制御する中枢ディスパッチャーとして作用する。ｒａｓ遺伝子を変化させることにより、該遺伝子を「オン」位置に留まらせることができる。ｒａｓ発癌遺伝子は、大腸癌、肺癌、膀胱癌および哺乳動物の癌など、癌の３０％までの基礎をなすと考えられている[ボス（Ｂｏｓ), Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９：４６８２−４６８９頁(１９８９)]。したがってｒａｓ発癌遺伝子は、治療薬の標的となった。
【０１４６】
ｒａｓ  ｍＲＮＡの種々の部位に相補的なオリゴヌクレオチド類は、細胞培養物中の細胞増殖速度を減少させるｒａｓタンパク質（ｐ２１）の合成を阻害できることを示す幾つかの報告がある（米国特許第５，５７６，２０８号明細書；米国特許第５，５８２，９８６号明細書；ダスカ（Ｄａｓｋａ）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓ．５：２６７−２７５頁［１９９０］；ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓ．４：２４３−２５２頁［１９８９］；セゾン−ベーモアラス（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：１１１１−１１１６頁［１９９３］）。ｃ−Ｈａ−ｒａｓ  ｍＲＮＡ転写物の５’フランキング領域に相補的なオリゴヌクレオチド類は、ヌードマウスにおける腫瘍増殖を１４日間まで阻害することが示されている（グレイ（Ｇｒａｙ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：５７７−５８０頁［１９９３］）。ｃ−Ｈａ−ｒａｓ  ｍＲＮＡのコドン１２における点変異（Ｇ＞Ｃ）に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞増殖ならびに皮下注入された場合のヌードマウスにおける腫瘍増殖を阻害したことが、最近報告されており（米国特許第５，５７６，２０８号明細書；米国特許第５，５８２，９８６号明細書；シュワブ（Ｓｃｈｗａｂ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０４６０−１０４６４［１９９４］）；これらの各々は、参考文献として本明細書に組み込まれる。アンチセンス薬物が、小規模臨床試験において卵巣腫瘍を縮小したことも複数の研究者により報告されている（ラウシュ（Ｒｏｕｓｈ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１１９２−１１９４頁［１９９７］）。
【０１４７】
Ｂ．Ｈｅｒ−２
ＨＥＲ−２（ｎｅｕ発癌遺伝子またはｅｒｂＢ−２としても知られている）発癌遺伝子は、幾つかのヒト癌（ハインズ（Ｈｙｎｅｓ）およびスターン（Ｓｔｅｒｎ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙ．Ａｃｔａ  １１９８：１６５−１８４頁［１９９４］；ダウガル（Ｄｏｕｇａｌｌ）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ９：２１０９−２１２３頁［１９９４］）において、また哺乳動物の発生（リー（Ｌｅｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７８：３９４−３９８頁［１９９５］）におけるその役割のため、広範に調査されている受容体様チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）をコードする。Ｈｅｒ−２のプロモーター領域の核酸配列を図３に示している。ＨＥＲ−２タンパク質の配列は、胎盤（カウッセンス（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１１３２−１１３９頁［１９８５］）から、また胃癌細胞系（ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：２３０−２３４頁［１９８６］）から上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ｍＲＮＡに対する相同性によりクローン化されたｃＤＮＡから決定された。ＨＥＲ−２  ｍＲＮＡは、約４．５ｋｂ（カウッセンス（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１１３２−１１３９頁［１９８５］；ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：２３０−２３４頁［１９８６］）であることが示されており、正常ヒト組織および悪性ヒト組織（ｐ１８５ＨＥＲ−２）において１８５ｋＤａの膜内外糖タンパク質をコードする（ハインズ（Ｈｙｎｅｓ）およびスティーン（Ｓｔｅｅｎ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１９８：１６５−１８４頁［１９９４］；ダウガル（Ｄｏｕｇａｌｌ）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９：２１０９−２１２３頁［１９９４］）。ＨＥＲ−２の過剰発現は、培養細胞の形質転換を引き起こし（ディフィオレ（ＤｉＦｉｏｒｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３７：１７８−１８２頁［１９８７］；ハジアク（Ｈｕｄｚｉａｋ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７１５９−７１６３［１９８７］）、乳癌および卵巣癌の積極的臨床進行に関連している（スラモン（Ｓｌａｍｏｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：１７７−１８２［１９８７］；スラモン（Ｓｌａｍｏｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７０７−７１２［１９８９］）。
【０１４８】
ＨＥＲ−２は、癌において最も頻繁に変化する遺伝子の１つである。それは、チロシンキナーゼ活性により膜内外受容体（ｐ１８５としても知られている）をコードし、上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーのメンバーであり、したがって、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲまたはＨＥＲ−１）に関連する。ＨＥＲ−２遺伝子発現の異常は、多種多様の癌に存在し、乳癌、卵巣癌および胃癌に最もよく見られる。ＨＥＲ−２は、ヒト乳癌および卵巣癌全体の２５〜３０％に過剰発現する。ＨＥＲ−２過剰発現のレベルは、乳癌の臨床段階、予後および転移の可能性とよく相関する。ＨＥＲ−２の過剰発現は、低生存率、再発率の増加および転移可能性の増加に関連する。タン（Ｔａｎ）ら、（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５７：１１９９頁［１９９７］）は、ＨＥＲ−２遺伝子の過剰発現が、乳癌細胞の形質転換能力を増加させることなくそれらの転移可能性を増加させることを示している。
【０１４９】
ＨＥＲ−２の過剰発現は、正常なＨＥＲ−２の発現および変異ＨＥＲ−２の発現双方の増加を含む。ＨＥＲ−２癌原遺伝子の活性化は、３つのメカニズム−点変異、遺伝子増幅および過剰発現のいずれかによって発生し得る。遺伝子増幅は、最もよく見られるメカニズムである。リガンド活性化が形質転換を促進させるために必要である他のＥＧＦファミリーメンバーと違って、ＨＥＲ−２の過剰発現だけで形質変換にとって十分である（コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１：３０８９７頁［１９９６］）。
【０１５０】
ＨＥＲ−２遺伝子産物のレベルを低下させるために、幾つかの治療的アプローチが使用されている。アデノウィルスタイプ５遺伝子産物Ｅ１Ａは、ヌードマウスにおける乳癌モデルを用いて可能性のある療法として研究されている。この遺伝子産物は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕプロモーター活性を抑制することによりＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現を抑制することができ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現卵巣癌細胞の腫瘍発生の可能性を抑止できる。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現乳癌異種移植片を有するマウスにおいて、アデノウィルスまたはリポソームのいずれかにより送達されたＥ１Ａは、腫瘍増殖を阻害し、対照と比較してマウス生存を延長させた（チャング（Ｃｈａｎｇ）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４：５６１頁［１９９７］）。
【０１５１】
ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質産物およびＦｃガンマＲＩＩＩ（ＣＤ１６）双方の細胞外ドメイン、ヒトナチュラルキラー細胞、好中球、および分化単核食細胞により発現されたＦｃガンマ受容体を標的とする二重特異性抗体を評価するために臨床試験が実施された（ウェイナー（Ｗｅｉｎｅｒ）ら、Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ、４：４７１頁［１９９５］）。
【０１５２】
ＨＥＲ−２の過剰発現はまた、化学療法に対する耐性増加に関連することが見出されている。したがって、ＨＥＲ−２のレベル上昇患者は、多くの薬剤に対して応答不良である。ＨＥＲ−２発現を阻害するために用いられる方法は、通常用いられる化学療法剤と併用されている（ウエノ（Ｕｅｎｏ）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：９５３頁［１９９７］）。アデノウィルスタイプ５遺伝子産物、Ｅ１Ａとタキソールとの併用は、ヒト乳癌細胞において相乗効果を示した。チロシン特異的阻害剤であるエモジンが、シスプラチン、ドキソルビシンおよびエトポシドなど、種々の化学療法薬に対する非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の感度を高めることがツアング（Ｚｈａｎｇ）ら、（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １２：５７１頁［１９９６］）により立証された。ＨＥＲ−２抗体は、ヒト乳癌細胞におけるタモキシフェンの有効性を増加させることを見出した（ウィッタース（Ｗｉｔｔｅｒｓ）ら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、４２：１頁［１９９７］）。
【０１５３】
オリゴヌクレオチド類もまた、ＨＥＲ−２の機能を研究するために用いられている。ｍＲＮＡ転写開始部位の４２から６９ヌクレオチド上流のＨＥＲ−２プロモーターに標的化された三重形成オリゴヌクレオチドが、ＨＥＲ−２のインビトロ発現を阻害することが見出された（エッビングハウス（Ｅｂｂｉｎｇｈａｕｓ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９２：２４３３頁［１９９３］）。ポーラム（Ｐｏｒｕｍｂ）ら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５６：５１５頁［１９９６］）はまた、同じＨＥＲ−２プロモーター領域に標的化された三重形成オリゴヌクレオチドを用いた。ＨＥＲ−２  ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルにおける減少が、培養細胞に見られた。Ｊｕｈｌら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：２９４８２頁［１９９７］）は、タンパク質の膜内外領域のすぐ下流のＨＥＲ−２  ＲＮＡの中央領域に標的化された抗ＨＥＲ−２リボザイムを用いて、ヒト卵巣癌細胞におけるＨＥＲ−２  ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの低下を立証した。ヌードマウスにおける腫瘍成長低下もまた見られた。
【０１５４】
アンチセンスアプローチは、ＨＥＲ−２の過剰発現癌に対する可能性のある療法として用いられている。ペグース（Ｐｅｇｕｅｓ）ら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．、１１７：７３頁［１９９７］）は、アンチセンス方向におけるＨＥＲ−２の１．５ｋｂフラグメントを発現ベクターにクローン化し；この構築体の卵巣癌細胞への形質移入により付着依存性増殖が低下した。カサリニ（Ｃａｓａｌｉｎｉ）ら（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７２：６３１頁［１９９７］）は、１５１ｂｐ長から４１５ｂｐ長のＨＥＲ−２フラグメントを含有する幾つかのヒトＨＥＲ−２アンチセンスベクター構築体を用いて、肺腺癌におけるＨＥＲ−２タンパク質レベルの減少および付着依存性増殖低下を立証した。コロマー（Ｃｏｌｏｍｅｒ）ら（Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、７０：８１９頁［１９９４］）は、翻訳開始コドンに、またはそのすぐ下流に標的化されたホスホジエステルアンチセンスオリゴヌクレオチド類が、ヒト乳癌細胞の増殖を６０％まで阻害したことを示した。ウィーチェン（Ｗｉｅｃｈｅｎ）ら（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６３：６０４頁［１９９５］）は、ＨＥＲ−２の翻訳開始コドンの３３ヌクレオチド下流のコード領域に標的化された１８−ヌクレオチドホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが、卵巣癌細胞の付着依存性増殖を低下させることを示した。バートラム（Ｂｅｒｔｒａｍ）ら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２００：６６１頁［１９９４］）は、翻訳開始領域およびチロシンキナーゼコンセンサス配列に対して高い相同性を有するｍＲＮＡの翻訳領域の３’部における配列に標的化されたアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いて、ヒト乳癌細胞においてＨＥＲ−２タンパク質レベルが７５％の低下したことを立証した。リュウ（Ｌｉｕ）ら（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．、６：９頁［１９９６］）は、５’キャップ部位およびコード領域に標的化されたアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド類を用いた。５’キャップ部位に標的化された最も有効なオリゴヌクレオチドは、ＨＥＲ−２タンパク質発現を９０％減少した。細胞増殖もまた、同等の量で減少した。ボーグン（Ｖａｕｇｈｎ）ら（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、２４：４５５８頁［１９９６］）は、ＨＥＲ−２の翻訳開始領域に、またはその隣接部に（両側）標的化されたホスホロチオエート、ホスホロジチオエートおよびキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド類を用いた。翻訳開始領域に標的化された互換的なジチオエート／ジエステルオリゴヌクレオチドは、全てのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドよりも僅かに良好に作用した。ブリシュ（Ｂｒｙｓｃｈ）ら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１：９９頁［１９９４］）は、ＨＥＲ−２の翻訳開始コドンに標的化された化学的に修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチド類を用い、タンパク質レベルを減少し、ヒト乳癌細胞系の増殖を阻害した。
【０１５５】
Ｃ．Ｃ−Ｍｙｃ
ｃ−ｍｙｃ遺伝子産物は、即時早期応答遺伝子によりコードされ、その発現は、種々のマイトジェンにより誘導され得る。ｃ−ｍｙｃ遺伝子のプロモーター領域の核酸配列は、図９に示される。Ｃ−ｍｙｃ発現は、細胞分裂に導くシグナル伝達経路に関与する。増殖している細胞は、静止状態細胞よりもｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡおよびｃ−ｍｙｃタンパク質の高レベルを有することが研究により立証された。ヒトｃ−ｍｙｃタンパク質に対する抗体は、ヒト細胞から単離された核におけるＤＮＡ合成を阻害することが知られている。逆に、遺伝子導入により生じたｃ−ｍｙｃの構成的発現は、幾つかの細胞系の分化誘導を阻害する。ｃ−ｍｙｃの構成的発現により、遺伝子導入マウスは腫瘍を発現し易くなる。
【０１５６】
幾つかの研究により、ｃ−ｍｙｃ遺伝子産物は、ＳＭＣ類において増殖的な役割を演じ得ることが示唆されている。ラット大動脈のバルーン脱内皮形成化および傷害により、その後の増殖および移動前に血管ＳＭＣのｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡ発現を増加させることが知られている。また、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１などの幾つかのマイトジェンおよび血清に曝された場合、培養物中のＳＭＣ類が増殖する。これらマイトジェンの各々は、ｃ−ｍｙｃタンパク質、ｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡのいずれか、または双方の他の細胞系において発現を増加できることが見出されている。さらに血清は、ＳＭＣ類におけるｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡレベルを増加させることが見出されている。
【０１５７】
ハレル−ベランら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１４０：２４３１−２４３５頁（１９８８））は、ｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド類が、ヒトＴ細胞におけるその翻訳を効果的に阻害することが立証された。これらＴ細胞が、細胞分裂のＳ期に入ることを阻害された。ｃ−ｍｙｃ癌原遺伝子配列は、マルク（Ｍａｒｃｕ）ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６１：８０９−８６０頁［１９９２］；ワット（Ｗａｔｔ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３０３：７２５−７２８頁［１９８３］；バッテイ（Ｂａｔｔｅｙ）ら、Ｃｅｌｌ、３４：７７９−７８７頁（１９８３）；およびエプスタイン（Ｅｐｓｔｅｉｎ）ら、ＮＴＩＳ公表ＰＢ９３−１００５７６頁に記載されている。
【０１５８】
Ｄ．Ｂｃｌ２
リンパ腫および白血病など、多くのタイプのヒト腫瘍において、ヒトｂｃｌ−２が過剰発現されており、腫瘍形成能に関連し得ると考えられる（ツジモト（Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１４４０−１４４３頁［１９８５］）。ｂｃｌ−２のプロモーター領域の核酸配列を、図１に示している。高レベルのヒトｂｃｌ−２遺伝子発現が、たいていの濾胞性Ｂ細胞リンパ腫および多くの大型細胞非ホジキンリンパ腫など、ｔ（１４；１８）染色体転座を有する全てのリンパ腫に見られている。ｂｃｌ−２遺伝子高レベル発現はまた、長期の急性リンパ球性白血病のたいていの症例、プレＢ細胞タイプの多くの急性リンパ白血病、前立腺、乳房、および大腸の多くの腺癌など、ｔ（１４；１８）染色体翻訳を有さないある種の白血病に見出されている。（リード（Ｒｅｅｄ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：６５２９頁［１９９１］；ユニス（Ｙｕｎｉｓ）ら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｄ．３２０：１０４７頁；キャンポス（Ｃａｍｐｏｓ）ら、Ｂｌｏｏｄ  ８１：３０９１−３０９６頁［１９９３］；マクドーネル（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：６９４０−６９４４頁［１９９２］；ルー（Ｌｕ）ら、Ｉｎｔ．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ５３：２９−３５［１９９３］；ボンナー（Ｂｏｎｎｅｒ）ら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．６８：４３Ａ頁［１９９３］）。
【０１５９】
Ｅ．ＴＧＦ−α
形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）は、アミノ酸５０のポリペプチドである。ＴＧＦ−αプロモーターのアミノ酸配列を図１１に示している。それは、レトロウィルス形質転換されたマウス細胞系から最初に単離され、その後ヒト腫瘍細胞、早期ラット胎児細胞およびヒト脳下垂体の細胞培養物中に確認されている。ＴＧＦ−αは、構造的にも機能的にも上皮成長因子（ＥＧＦ）に密接に関連し、双方が同じ受容体、すなわち、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する。
【０１６０】
ＥＧＦおよびＴＧＦ−α双方の配列および三次元構造が決定されている（キャンプベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）ら、Ｐｒｏｇ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｓ．１：１３頁［１９８９］）。ＴＧＦ−αは、ＥＧＦと約４０％相同性の残基を有するアミノ酸５０のポリペプチドである。両ペプチドは、３つの十分に定義されたループ（Ａ、ＢおよびＣと表示される）を特徴とし、３つの分子内ジスルフィド結合を有する。
【０１６１】
ＴＧＦ−αおよびＥＧＦなど幾つかの成長因子は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦ受容体）との相互作用を経て生物学的効果を発揮すると考えられている。ＥＧＦ受容体は、タイプ１受容体チロシンキナーゼである。ＥＧＦ受容体およびそのリガンドは、正常な生理学的過程ならびに過剰増殖疾患および腫瘍性疾患における役割に関して興味深い。
【０１６２】
ＴＧＦ−αのインビボ前駆体は、開裂して溶解性化合物を産生するアミノ酸１６０の残基の膜結合タンパク質（プロＴＧＦ−アルファ）である（マッサーグ（Ｍａｓｓａｇｕｅ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５：２１３９３−２１３９６頁［１９９０］）。この開裂は、６Ｋｄの分子量を有する５０のアミノ酸から構成される細胞外部分を除去し、タンパク質キナーゼＣを経て作用するホルボールエステル類により刺激され得る重要な制御事象（パンディエラ（Ｐａｎｄｉｅｌｌａ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：１７２６−１７３０頁［１９９０］）と考えられている（パンディエラ（Ｐａｎｄｉｅｌｌａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：５７６９−５７７３頁［１９９１］）。
【０１６３】
培養ヒト前立腺腫瘍系は、上昇したＴＧＦ−α  ｍＲＮＡレベルを含有し、ＴＧＦ−αに応答して増殖する（ワイルディング（Ｗｉｌｄｉｎｇ）ら、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ、１５：１−１２頁［１９８９］）。ＴＧＦ−αは、自己分泌機能およびパラ分泌機能の双方を有し、細胞分裂および血管新生などの生理的活性を刺激すると思われる。遺伝子導入マウスに誘導された場合、ＴＧＦ−αは、上皮過形成およびもとの癌に似た病巣の異形成変化を生じさせる（サンドグレン（Ｓａｎｄｇｒｅｎ）ら、Ｃｅｌｌ、６１：１１２１−１１３５頁［１９９０］）。
【０１６４】
Ｆ．ｃ−ｋｉ−ＲＡＳ
ｃ−ｋｉ−ＲＡＳ（ＫＲＡＳ）発癌遺伝子は、遍在的に発現する。３０ｋｂ超の長さを有するＫＲＡＳは、ＨＲＡＳまたはＮＲＡＳよりもはるかに大きい。ｃ−ｋｉ−ｒａｓのプロモーター領域の配列を図５に示している。３つのｒａｓ遺伝子、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、およびＮＲＡＳは、異なる遺伝子構造を有するが、１８９のアミノ酸残基のタンパク質に関する全てのコードを総称して、ｐ２１と呼ばれる。これらの遺伝子は、それぞれのｐ２１の１２番目または６１番目のアミノ酸残基の組込みに影響を及ぼす単一の点変異により悪性を獲得する。ＫＲＡＳは、ＨＲＡＳよりもはるかに多く悪性疾患に関与する。ＮＩＨ  ３Ｔ３形質変換系における９６のヒト腫瘍または腫瘍細胞系の研究において（パルシアニ（Ｐｕｌｃｉａｎｉ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３００：５３９頁（１９８２））、変異ＨＲＡＳ座はＴ２４膀胱癌細胞においてのみに見られるが、一方、形質転換ＫＲＡＳ遺伝子は、８つの異なる癌および肉腫において確認されている。
【０１６５】
卵巣の重篤な嚢胞腺癌において、フェイグ（Ｆｅｉｇ）ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：６９８頁（１９８４））は、活性化ＫＲＡＳ発癌遺伝子の存在を示したが、この遺伝子は、同じ患者の正常細胞で活性化されていない。形質転換遺伝子産物は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにおいて他の腫瘍におけるＫＲＡＳ形質転換タンパク質の移動度とは異なった電気泳動移動度を示した。したがって、先に記載されていない変異が、この卵巣癌におけるＫＲＡＳ活性化の原因であった。肺癌における発癌遺伝子の役割を研究するために、ローデンヒュース（Ｒｏｄｅｎｈｕｉｓ）ら（Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１７：９２９頁（１９８７））は、インビトロ増幅ステップ後のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションに基づくアッセイを用いた。ゲノムＤＮＡは、開胸術で得られた３９の腫瘍標本から調べた。ＫＲＡＳ遺伝子は、１０の腺癌のうちの５つにおいて、コドン１２における点変異によって活性化されることが見出された。これら腫瘍のうちの２つは、サイズが２ｃｍ未満であり、転移はなかった。１５の扁平細胞癌、１０の大型細胞癌、１つの癌様体、肺外側の原発性腫瘍から２つの転移腺癌、および１つの小型細胞癌にＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、またはＮＲＡＳ変異は見られなかった。未変異ＫＲＡＳ遺伝子のおよそ２０倍の増幅が、直腸癌の孤立性肺転移であると証明された腫瘍に見られた。ヤネズ（Ｙａｎｅｚ）ら（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １：３１５頁（１９８７））は、１６の大腸癌のうちの４つ、２７の肺癌のうちの２つ、８つの乳癌のうちの１つにＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２における変異を見出し；変異は、６１位に見られなかった。コドン１２における６つの可能なアミノ酸置換の中で、１つ以外の全ては同定された７つの変異に示されている。
【０１６６】
Ｇ．他の発癌遺伝子の標的
本発明は、上記の発癌遺伝子に限定されない。本発明の方法は、公知のプロモーター領域を有する任意の発癌遺伝子との使用に好適である。代表的な発癌遺伝子としては、これらに限定はしないが、ＢＣＲ／ＡＢＬ、ＡＢＬ１／ＢＣＲ、ＡＢＬ、ＢＣＬ１、ＣＤ２４、ＣＤＫ４、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ−１、ＨＳＴＦ１、ＩＮＴ１／ＷＮＴ１、ＩＮＴ２、ＭＤＭ２、ＭＥＴ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＮ、ＭＹＣＬ１、ＲＡＦ１、ＮＲＡＳ、ＲＥＬ、ＡＫＴ２、ＡＰＣ、ＢＣＬ２−ＡＬＰＨＡ、ＢＣＬ２−ＢＥＴＡ、ＢＣＬ３、ＢＣＲ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＢＬ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＲＫ、ＣＲＫ−ＩＩ、ＣＳＦ１Ｒ／ＦＭＳ、ＤＢＬ、ＤＤＯＳＴ、ＤＣＣ、ＤＰＣ４／ＳＭＡＤ４、Ｅ−ＣＡＤ、Ｅ２Ｆ１／ＲＢＡＰ、ＥＬＫ１、ＥＬＫ３、ＥＰＨ、ＥＰＨＡ１、Ｅ２Ｆ１、ＥＰＨＡ３、ＥＲＧ、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＦＥＲ、ＦＧＲ、ＦＬＩ１／ＥＲＧＢ２、ＦＯＳ、ＦＰＳ／ＦＥＳ、ＦＲＡ１、ＦＲＡ２、ＦＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＫ、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ−２、ＥＲＢＢ−３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ−４、ＨＳＴ２、ＩＮＫ４Ａ、ＩＮＫ４Ｂ、ＪＵＮ、ＪＵＮＢ、ＪＵＮＤ、ＫＩＰ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ２Ａ、ＫＲＡＳ２Ｂ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＡＳ、ＭＡＸ、ＭＣＣ、ＭＬＨ１、ＭＯＳ、ＭＳＨ２、ＭＹＢＡ、ＭＹＢＢ、ＮＦ１、ＮＦ２、Ｐ５３、ＰＤＧＦＢ、ＰＩＭ１、ＰＴＣ、ＲＢＩ、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＳＫＩ、ＳＲＣ１、ＴＡＬ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＲＡ１、ＴＨＲＢ、ＴＩＡＭ１、ＴＲＫ、ＶＡＶ、ＶＨＬ、ＷＡＦ１、ＷＮＴ２、ＷＴ１、ＹＥＳ１、ＡＬＫ／ＮＰＭ１、ＡＭＩ１、ＡＸＬ、ＦＭＳ、ＧＩＰ、ＧＬＩ、ＧＳＰ、ＨＯＸ１１、ＨＳＴ、ＩＬ３、ＩＮＴ２、ＫＳ３、Ｋ−ＳＡＭ、ＬＢＣ、ＬＭＯ−１、ＬＭＯ−２、Ｌ−ＭＹＣ、ＬＹＬ１、ＬＹＴ−１０、ＭＤＭ−２、ＭＬＨ１、ＭＬＬ、ＭＬＭ、Ｎ−ＭＹＣ、ＯＳＴ、ＰＡＸ−５、ＰＭＳ−１、ＰＭＳ−２、ＰＲＡＤ−１、ＲＡＦ、ＲＨＯＭ−１、ＲＵＯＭ−２、ＳＩＳ、ＴＡＬ２、ＴＡＮ１、ＴＩＡＭ１、ＴＳＣ２、ＴＲＫ、ＴＳＣ１、ＳＴＫ１１、ＰＴＣＨ、ＭＥＮ１、ＭＥＮ２、Ｐ５７／ＫＩＰ２、ＰＴＥＮ、ＨＰＣ１、ＡＴＭ、ＸＰＡ／ＸＰＧ、ＢＣＬ６、ＤＥＫ、ＡＫＡＰ１３、ＣＤＨ１、ＢＬＭ、ＥＷＳＲ１／ＦＬＩ１、ＦＥＳ、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ６、ＦＡＮＣＡ、ＦＬＩ１／ＥＲＧＢ２、ＦＯＳＬ１、ＦＯＳＬ２、ＧＬＩ、ＨＲＡＳ１、ＨＲＸ／ＭＬＬＴ１、ＨＲＸ／ＭＬＬＴ２、ＫＲＡＳ２、ＭＡＤＨ４、ＭＡＳ１、ＭＣＦ２、ＭＬＬＴ１／ＭＬＬ、ＭＬＬＴ２／ＨＲＸ、ＭＴＧ８／ＲＵＮＸ１、ＭＹＣＬＫ１、ＭＹＨ１１／ＣＢＦＢ、ＮＦＫＢ２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＰＭ１／ＡＬＫ、ＮＲＧ／ＲＥＬ、ＮＴＲＫ１、ＰＢＸ１／ＴＣＦ３、ＰＭＬ／ＲＡＲＡ、ＰＲＣＡ１、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ１／ＣＢＦＡ２Ｔ１、ＳＥＴ、ＴＣＦ３／ＰＢＸ１、ＴＧＦＢ１、ＴＬＸ１、Ｐ５３、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＴ１、αｖ−β３、ＰＫＣα、ＴＮＦα、クルステリン（Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ）、サーバイビング（Ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ）、ＴＧＦβ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ＳＲＣ、およびＩＮＴ−１が挙げられる。
【０１６７】
ＩＩ．非発癌遺伝子の標的
本発明は、発癌遺伝子の標的に限定されない。本発明の方法と組成物は、発現をダウンレギュレートすることが望ましい任意の遺伝子の標的化に使用される。例えば、幾つかの実施態様において、標的にされる遺伝子としては、これらに限定はしないが、免疫グロブリンまたは抗体遺伝子、凝固因子遺伝子、プロテアーゼ、脳下垂体ホルモン、プロテアーゼ阻害剤、成長因子、ソマトメジアン、ゴナドトロフィン、ケモタクチン、ケモカイン、血漿タンパク質、血漿プロテアーゼ阻害剤、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、転写因子、または病原体標的（例えば、ウィルス遺伝子、細菌遺伝子、微生物遺伝子、真菌遺伝子）が挙げられる。
【０１６８】
特定の遺伝子の例としては、これらに限定はしないが、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＥ、ＡＰＰ、Ｂ２Ｍ、ＣＯＸ２、ＣＲＰ、ＤＤＸ２５、ＤＭＣ１、ＦＫＢＰ８、ＧＨ１、ＧＨＲ、ＩＡＰＰ、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＧ、ＩＬ１、Ｉｌ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＰＷ、ＭＡＰＫ１４、Ｍｅｉ１、ＭＭＰ１３、ＭＹＤ８８、ＮＤＮ、ＰＡＣＥ４、ＰＲＮＰ、ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５１Ｃ、ＳＡＰ、ＳＮＲＰＮ、ＴＬＲ４、ＴＬＲ９、ＴＴＲ、ＵＢＥ３Ａ、ＶＬＡ−４、およびＰＴＰ−１Ｂ、ｃ−ＲＡＦ、ｍ−ＴＯＲ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＡｐｏＢ−１００、ＨＤＬ、ＶＥＧＦ、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ、ＮＡＤｓ、ＩＣＡＭ−１、ＭＵＣ１、２−ｄＧ、ＣＴＬ、ＰＳＧＬ−１、Ｅ２Ｆ、ＮＦ−ｋＢ、ＨＩＦ、およびＧＣＰＲｓが挙げられる。
【０１６９】
他の実施態様において、病原体の遺伝子が標的にされる。代表的な病原体としては、これらに限定はしないが、ヒト免疫不全ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、Ａ型肝炎ウィルス、呼吸器合胞体ウィルス、重篤な急性呼吸器症候群に関与する病原体、西ナイルウィルス、および食品伝染病原体（例えば、大腸菌）が挙げられる。
【０１７０】
ＩＩＩ．ＤＮＡメチル化
幾つかの実施態様において、本発明は、特定の部位においてメチル化されているオリゴヌクレオチド療法を提供する。本発明は、特定のメカニズムに限定されない。実際には、メカニズムの理解は、本発明を実施するために必要ではないが、遺伝子活性の制御のための１つのメカニズムは、ＤＮＡにおけるシトシン残基のメチル化であると考えられている。５−メチルシトシン（５−ＭｅＣ）は、ＤＮＡにおいて検出された唯一の天然修飾塩基である（エーリック（Ｅｈｒｌｉｃｋ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１２：１３５０−１３５７（１９８１））。全ての遺伝子が、メチル化により調節されるとは限らないが、多くの遺伝子における特定の部位または特定の領域における低メチル化は、転写活性と相関する（デールフラー（Ｄｏｅｒｆｌｅｒ）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５２：９３−１２４頁［１９８４］；クリストマン（Ｃｈｒｉｓｔｍａｎ）、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０８：４９−７８頁［１９８８］；Ｃｅｄａｒ、Ｃｅｌｌ  ３４：５５０３−５５１３頁［１９８８］）。インビトロでのＤＮＡメチル化により、無細胞系における遺伝子の効率的な転写または形質移入遺伝子の一過性発現を防ぐことができる。また、幾つかの特定のシス制御領域におけるＣ残基のメチル化により、転写因子または抑制因子の結合をブロックまたは増強できる（デールフラー（Ｄｏｅｒｆｌｅｒ）、上記文献；クリストマン（Ｃｈｒｉｓｔｍａｎ）、上記文献；セダー（Ｃｅｄａｒ）、Ｃｅｌｌ  ３４：５５０３−５５１３頁（１９８８）；テート（Ｔａｔｅ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．３：２２５−２３１頁［１９９３］；クリストマン（Ｃｈｒｉｓｔｍａｎ）ら、Ｖｉｒｕｓ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ編集、デールフラー，Ｗ．（Ｄｏｅｒｆｌｅｒ，Ｗ）＆ボーム，Ｐ．（Ｂｏｈｍ，Ｐ．）（ＶＣＨ、ヴァインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）、ニューヨーク州）３１９−３３３頁）。
【０１７１】
ＤＮＡメチル化の正常パターンの破壊は、癌発生に関連づけられてきた（クリストマン（Ｃｈｒｉｓｔｍａｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：７３４７−７３５１頁［１９９５］）。腫瘍および腫瘍誘導細胞系のＤＮＡの５−ＭｅＣ含量は、一般に正常組織よりも低い（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４０：１−３０頁［１９８３］）。ｃ−ｍｙｃ、ｃ−Ｋｉ−ｒａｓおよびｃ−Ｈａ−ｒａｓなどの特定の発癌遺伝子の低メチル化は、種々のヒト腫瘍および動物腫瘍において検出されている（ナンブ（Ｎａｍｂｕ）ら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（Ｇａｎｎ）７８：６９６−７０４頁［１９８７］；フェインバーグ（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１１：４７−５４頁［１９８３］；チー（Ｃｈｅａｈ）ら、ＪＮＣＩ７３：１０５７−１０６３頁［１９８４］；ベーブ（Ｂｈａｖｅ）ら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ（Ｌｏｎｄ）９：３４３−３４８頁［１９８８］）。ヒト腫瘍進行の最も良く研究された例の１つにおいて、ＤＮＡの低メチル化は、大腸癌発現における初期事象であることが示されている（ゲーツ（Ｇｏｅｔｚ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１８７−２９０頁［１９８５］）。インビボでのメチル化妨害により、腫瘍形成に至り得る。Ｌ−メチオニンまたは５−アザシトジンなどのメチル化阻害剤の給餌またはリポトロープの除去した食餌の給餌を介した５−アデノシンメチオニンの重度の欠乏により、ラットにおいて肝腫瘍形成が誘導されることが報告されている（ウェインファン（Ｗａｉｎｆａｎ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：２０７１ｓ−２０７７ｓ頁［１９９２］）。極度のリポトロープ欠乏食餌は、ｃ−ｍｙｃ、ｒａｓおよびｃ−ｆｏｓなどの遺伝子における特定の部位におけるメチル基の喪失を生じ得ることが研究により示されている（ディジク（Ｄｉｚｉｋ）ら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １２：１３０７−１３１２頁［１９９１］）。ＤＮＡ  ＭＴアーゼ活性のレベル上昇が存在しているにもかかわらず低メチル化が生じる（ウェインファン（Ｗａｉｎｆａｎ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９：４０９４−４０９７頁［１９８９］）。活性な増殖保持にとって必要な遺伝子は、分化時にメチル化されて不活化され、組織特異的遺伝子は低メチル化され、活性となる。したがって、低メチル化により、２つの状態間の平衡が移動し得る。したがって幾つかの実施態様において、本発明は、この自然現象を利用して、特異的遺伝子プロモーターの部位特異的メチル化のための組成物および方法を提供し、それによってある遺伝子の転写および翻訳を防ぐ。他の実施態様において、本発明は、遺伝子のメチル化パターンを変えることによって目的遺伝子（例えば、腫瘍抑制遺伝子）の発現をアップレギュレートする方法および組成物を提供する。
【０１７２】
本発明は、メチル化オリゴヌクレオチド類の使用に限定されない。実際、遺伝子発現阻害のための非メチル化オリゴヌクレオチド類の使用が、本発明により特に考慮されている。本発明の開発過程時に実施された実験により、Ｂｃｌ−２に対して標的化された非メチル化オリゴヌクレオチドは、メチル化オリゴヌクレオチドのレベルと同等のレベルまでリンパ腫細胞の増殖を阻害することが立証された（例えば、実施例８を参照）。
【０１７３】
ＩＶ．オリゴヌクレオチド類
幾つかの実施態様において、本発明は、発癌遺伝子の発現を阻害するための抗遺伝子オリゴヌクレオチド類を提供する。抗遺伝子のための代表的な設計および産生法が以下に記載されている。以下の記載は、本発明の使用に好適な抗遺伝子化合物の範囲を限定する意図はない。当業者は、さらなる抗遺伝子が、本発明の範囲内にあることを認識している。
【０１７４】
Ａ．オリゴヌクレオチドの設計
幾つかの実施態様において、オリゴヌクレオチド類は、好ましい計画評価基準に基づき設計される。次いでこのようなオリゴヌクレオチド類は、本明細書に開示された方法を用いて有効性に関して試験できる。例えば、幾つかの実施態様において、オリゴヌクレオチド類は、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、さらにより好ましくはＣｐＧアイランドの全てがメチル化される。他の実施態様において、オリゴヌクレオチド類はメチル化を含まない。本発明は、特定のメカニズムに限定されない。実際、メカニズムの理解は、本発明を実施するために必要としないが、好ましいオリゴヌクレオチド類は、少なくとも５０％ＧＣ含量および少なくとも２ＧＣジヌクレオチド類を有するものであることが考慮されている。オリゴヌクレオチド類は、自己ハイブリダイズしないことが好ましい。幾つかの実施態様において、自己ハイブリダイゼーションを最少にするために少なくとも１ＡまたはＴにより設計される。幾つかの実施態様において、自己ハイブリダイズする能力に関してオリゴヌクレオチド類を調査するために市販のコンピュータプログラムが用いられる。好ましいオリゴヌクレオチド類は、少なくとも１０のヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１５のヌクレオチド長であって、１００以下のヌクレオチド長である。特に好ましいオリゴヌクレオチド類は、１８〜２４ヌクレオチド長である。幾つかの実施態様において、オリゴヌクレオチド類は、普遍的タンパク質結合配列ＣＧＣＣＣおよびＣＧＣＧまたはそれらの相補体を含む。
【０１７５】
また、オリゴヌクレオチドは、プロモーターのＴＡＴＡボックスから上流の遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズすることが好ましい。また、オリゴヌクレオチド化合物は、ヒトゲノムの他の領域に完全には相同的でないことが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチド化合物とゲノムの他の領域との相同性は、入手可能な探索手段（例えば、ＮＣＢＩのインターネットサイトで入手できるＢＬＡＳＴ）を用いて決定できる。
【０１７６】
幾つかの実施態様において、オリゴヌクレオチド類は、タンパク質（例えば、転写因子）により結合されることが知られている発癌遺伝子のプロモーター領域の領域とハイブリダイズするように設計される。本発明の代表的なオリゴヌクレオチド化合物は、図２、図４、図６、図８、図１０、および図１２に示される。本発明は、本明細書に記載されたオリゴヌクレオチド類に限定されない。他の好適なオリゴヌクレオチド類を同定できる（例えば、上記の評価基準を用いて）。開示されたオリゴヌクレオチド類の代表的なオリゴヌクレオチド変異体を、図２５〜図３０に示している。候補オリゴヌクレオチド類は、これらに限定はしないが、下記の例示的実施例に記載されたものなど、任意の好適な方法を用いて有効性に関して試験できる。下記の実施例１および２に記載されたインビトロアッセイを用いて、候補オリゴヌクレオチド類は、種々の濃度で細胞増殖を防ぐ能力に関して評価できる。特に好ましいオリゴヌクレオチド類は、低濃度（本明細書に開示されたインビトロアッセイにおいて、例えば、２０μＭ未満、好ましくは１０μＭ未満）で細胞増殖の遺伝子発現を阻害するものである。
【０１７７】
Ｂ．好ましいオリゴヌクレオチドゾーン
幾つかの実施態様において、発癌遺伝子のプロモーター領域内の領域が、オリゴヌクレオチド類のハイブリダイゼーションに関して好ましい領域としてさらに規定される。幾つかの実施態様において、これらの好ましい領域は、「ホットゾーン」と称される。
【０１７８】
幾つかの好ましい実施態様において、ホットゾーンは、有効であると示されているオリゴヌクレオチド化合物（オリゴヌクレオチド類に関して上記節を参照）および上記のオリゴヌクレオチド類に関して好ましい評価基準に基づいて有効であると考えられるものに基づいて規定される。好ましいホットゾーンは、各ホットゾーンに含まれた各化合物の１０ｂｐ上流および下流を包含し、各化合物のさらに４０ｂｐ上流または下流の増分内で少なくとも１以上のＣＧを有する。好ましい実施態様において、ホットゾーンは、ホットゾーンに含まれた各オリゴヌクレオチド化合物の最大１００ｂｐ上流および下流を包含する。さらなる実施態様において、ホットゾーンは、各プロモーターの開始領域に規定される。これらのホットゾーンは、有効な配列または考慮された配列に基づいて規定され、２００ｂｐの好ましい最大長を有する。上記の評価基準に基づいて、代表的なホットゾーンが設計された。これらのホットゾーンを表１に示している。ナンバリングは、本発明の図に記載されている配列に基づいている。
【０１７９】
【表１】
0005922913.tif 000002
【０１８０】
Ｃ．オリゴヌクレオチド類の調製および製剤化
オリゴヌクレオチド合成の公知の任意の方法を使用して、本発明の修飾オリゴヌクレオチド類を調製することができる。メチル化オリゴヌクレオチド類を利用する幾つかの実施態様において、ヌクレオチド、ｄＣは、本発明により教示される適切な場合５−メチル−ｄＣにより置換される。本発明の修飾または非修飾オリゴヌクレオチド類は、任意の市販の自動化核酸合成機を用いることにより最も好適に調製される。それらはまた、顧客仕様書に従って注文オリゴヌクレオチド類を合成する市販の原料から得ることができる。
【０１８１】
オリゴヌクレオチド類が、化合物の好ましい形態であるが、本発明は、これらに限定はしないが、下記のようなオリゴヌクレオチド模倣物など、他のオリゴマーのオリゴヌクレオチド化合物を含む。本発明によるオリゴヌクレオチド化合物は、約１８から約３０の核酸塩基（すなわち、約１８から約３０の結合塩基）を含むことが好ましいが、より長い、またより短い配列を、本発明により使用できる。
【０１８２】
本発明に有用な好ましい化合物の具体的な例としては、修飾された主鎖または非天然のヌクレオシド間の結合を含有するオリゴヌクレオチド類が挙げられる。本明細書に定義されるように、修飾された主鎖を有するオリゴヌクレオチド類としては、主鎖にリン原子を保持するもの、および主鎖にリン原子を有さないものが挙げられる。本明細書の目的のために、ヌクレオシド間主鎖にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチド類はまた、オリゴヌクレオシド類であることが考慮され得る。
【０１８３】
好ましい修飾オリゴヌクレオチド主鎖としては、例えば、ホスホロチオエート類、キラルホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類、ホスホトリエステル類、アミノアルキルホスホトリエステル類、３’−アルキレンホスホネート類ならびにキラルホスホネート類を含むメチルおよび他のアルキルホスホネート類、ホスフィネート類、３’−アミノホスホルアミデートならびにアミノアルキルホスホルアミデート類を含むホスホルアミデート類、チオノホスホルアミデート類、チオノアルキルホスホネート類、チオノアルキルホスホトリエステル類、および直鎖状３’−５’結合を有するボラノホスフェート類、これらの２’−５’結合アナログ、ヌクレオシド単位の隣接対が、３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’に結合している反転極性を有するものが挙げられる。種々の塩類、混合塩類および遊離酸形態もまた含まれる。
【０１８４】
リン原子を含まない好ましい修飾のオリゴヌクレオチド主鎖としては、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合へテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子あるいはヘテロ環式ヌクレオシド間結合により形成される主鎖を有する。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；および混合Ｎ、Ｏ、ＳならびにＣＨ２成分部分を有する他の主鎖を有するものが挙げられる。
【０１８５】
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣物において、ヌクレオシド単位の糖およびヌクレオシド間結合（すなわち、主鎖）は双方とも、新規な基により置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。このようなオリゴマー化合物の１つである、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖主鎖は、アミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖により置換される。核酸塩基は、保持され、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、これらに限定はしないが、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；米国特許第５，７１４，３３１号明細書；および米国特許第５，７１９，２６２号明細書が挙げられ、それらの各々は、参考文献として本明細書に組み込まれる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７頁（１９９１）に見ることができる。
【０１８６】
幾つかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチド類は、ホスホロチオエート主鎖を有するオリゴヌクレオチド類およびヘテロ原子主鎖を有するオリゴヌクレオシド類であり、特に−ＣＨ２、−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られている］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、および米国特許第５，４８９，６７７号明細書に引用される−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［固有のホスホジエステル主鎖は−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表される］、米国特許第５，６０２，２４０号明細書に引用されるアミド主鎖である。また、米国特許第５，０３４，５０６号明細書に引用されるモルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチド類が好ましい。
【０１８７】
修飾オリゴヌクレオチド類はまた、１つ以上の置換糖部分を含有できる。好ましいオリゴヌクレオチド類は、２’位に以下のものの１つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルの１つを含み、ここで該アルキル、該アルケニルおよび該アルキニルは、置換または非置換のＣ１からＣ１０アルキルまたはＣ２からＣ１０のアルケニルおよびアルキニルであり得る。Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２が特に好ましく、式中ｎおよびｍは、１から約１０である。他の好ましいオリゴヌクレオチド類は、２’位に以下のものの１つを含む：Ｃ１からＣ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善するための基、および同様の性質を有する他の置換基。好ましい修飾としては、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、また２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとして知られている）（マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）ら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ７８：４８６頁［１９９５］）すなわち、アルコキシアルコキシ基が挙げられる。さらなる好ましい修飾としては、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ（すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基）、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られており、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（また２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、すなわち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２が挙げられる。
【０１８８】
他の好ましい修飾としては、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）,２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。同様の修飾は、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位または２’−５’結合オリゴヌクレオチドにおいて、および５’末端ヌクレオチドの５’位においても為すことができる。オリゴヌクレオチド類はまた、ペントフラノシル糖の代りにシクロブチル部分などの糖模倣物を有することができる。
【０１８９】
オリゴヌクレオチド類はまた、核酸塩基（当業界ではしばしば単に「塩基」と称される）の修飾または置換を含むことができる。本明細書に用いられる「非修飾」または「天然」の核酸塩基としては、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルならびに他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルならびに他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニン類およびグアニン類、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシル類およびシトシン類、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどの他の合成および天然核酸塩基が挙げられる。さらなる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に記載されているものが挙げられる。これら核酸塩基の中の幾つかは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるために特に有用である。これらには、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンなど、５−置換ピリミジン類、６−アザピリミジン類およびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン類が含まれる。５−メチルシトシンの置換は、０．６〜１．２℃まで核酸二重鎖安定性を増加させることが示されており、現時点で、好ましい塩基置換であり、特に２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組合わせた場合はさらに好ましい。
【０１９０】
本発明のオリゴヌクレオチド類の別の修飾は、オリゴヌクレオチドの１つ以上の部分に対する化学的結合を含むか、またはオリゴヌクレオチドの活性、細胞分散または細胞取込みを増強する共役体を含む。このような部分としては、これらに限定はしないが、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール）、チオコレステロール、脂肪鎖（例えば、ドデカンジオール残基またはウンデシル残基）、リン脂質（例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート）、ポリアミン鎖もしくはポリエチレングリコール鎖またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミン部分あるいはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分などの脂質部分が挙げられる。
【０１９１】
当業者は、上記の修飾を含有するオリゴヌクレオチド類の生成法を熟知している。本発明は、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド類に限定されない。任意の好適な修飾または置換を利用できる。
【０１９２】
特定の化合物における全位置が必ずしも均一に修飾される必要はなく、実際、前述の修飾の１以上を、単一化合物にまたはさらには、オリゴヌクレオチド内の単一ヌクレオシドに取り込むこともできる。本発明は、また下記の通り本発明のアンチセンス化合物を含んでいる医薬組成物および製剤を含む。
【０１９３】
Ｄ．カクテル
幾つかの実施態様において、本発明は、遺伝子（例えば、発癌遺伝子）のプロモーター領域に対して２つ以上のオリゴヌクレオチドを含むカクテルを提供する。幾つかの実施態様において、２つのオリゴヌクレオチドは、同じ遺伝子のプロモーターの異なる領域にハイブリダイズする。他の実施態様において、２つ以上のオリゴヌクレオチドは、２つの異なる遺伝子のプロモーターにハイブリダイズする。本発明は、特定のメカニズムに限定されない。実際、このメカニズムの理解は、本発明を実施するために必要ではないが、本発明の２つ以上の化合物の組合わせが、別々に投与された各々の化合物の付加的阻害よりも大きな癌細胞増殖阻害を提供することが考慮されている。
【０１９４】
Ｖ．研究使用
本発明は、治療適用に限定されない。例えば、幾つかの実施態様において、本発明は、研究用手段としてオリゴヌクレオチド類使用のための組成物および方法を提供する。
【０１９５】
Ａ．キット
例えば、幾つかの実施態様において、本発明は、目的の遺伝子阻害に特異的なオリゴヌクレオチド類、および所望により遺伝子を発現するための公知の細胞系（例えば、癌細胞系）を含むキットを提供する。例えば、このようなキットは、代謝経路の確認または疾患（例えば、癌）における遺伝子の関与、ならびに診断適用に使用される。幾つかの実施態様において、さらにキットは、緩衝剤および他の必要な試薬、ならびにキットを使用するための取扱い説明書を含む。
【０１９６】
Ｂ．標的の検証
幾つかの実施態様において、本発明は、遺伝子標的（例えば、疾患に関与していると疑われる遺伝子）の検証に使用するための方法および組成物を提供する。例えば、幾つかの実施態様において、広範なスクリーニング用途（例えば、遺伝子発現アレイ）において疾患に関与していることが同定されている遺伝子発現は、本発明の方法および組成物を用いてダウンレギュレートされる。本発明の方法および組成物は、標的の検証目的のためのインビトロおよびインビボ使用（例えば、非ヒト動物において）に好適である。他の実施態様において、本発明の化合物は、移植術研究（例えば、ＨＬＡ阻害）に使用される。
【０１９７】
Ｃ．薬物スクリーニング
他の実施態様において、本発明の方法および組成物は、薬物スクリーニング用途に使用される。例えば、幾つかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチド類は、対象の遺伝子発現を阻害するために細胞（例えば、培養物中または非ヒト動物内の）に投与される。幾つかの実施態様において、対象遺伝子の阻害は、生理的または疾患症状を模倣する。他の実施態様において、発癌遺伝子は阻害される。次に試験化合物（例えば、低分子の薬物またはオリゴヌクレオチド模倣物）を、試験細胞に投与し、試験化合物の効果をアッセイする。
【０１９８】
本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリー；ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能性を有するが、新規な非ペプチド主鎖を有し、酵素分解に耐性があるが、生物活性を維持する分子のライブラリー；例えば、ズッケンナン（Ｚｕｃｋｅｎｎａｎｎ）ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８−８５頁［１９９４］を参照）；空間的に操作可能な平行固相または溶液相ライブラリー；分解分離を必要とする合成ライブラリー法；「ワンビズ・ワンコンパウンド」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィ選択を用いる合成ライブラリー法を含む、当技術分野で公知の組合わせライブラリー法における多くの任意のアプローチを用いて得ることができる。生物学的ライブラリーおよびペプトイドライブラリーのアプローチは、ペプチドライブラリーとの使用に好ましいが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５頁）。
【０１９９】
分子ライブラリーの合成法の例は、例えば：デウィット（ＤｅＷｉｔｔ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９頁［１９９３］；エルブ（Ｅｒｂ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２頁［１９９４］；ズッカーマン（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ）ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８頁［１９９４］；チョウ（Ｃｈｏ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１頁：１３０３頁［１９９３］；カレル（Ｃａｒｒｅｌｌ）ら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３．２０５９頁［１９９４］；カレル（Ｃａｒｒｅｌｌ）ら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３．２０６１頁［１９９４］；およびギャロップ（Ｇａｌｌｏｐ）ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３頁［１９９４］の当技術分野で見ることができる。
【０２００】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、ホーテン（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１頁［１９９２］）、またはビーズ上（ラム（Ｌａｍ）、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４頁［１９９１］）、チップ上（フォーダー（Ｆｏｄｏｒ）、Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６［１９９３］）、細菌またはスポア上（参考文献として本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、プラスミド上（カル（Ｃｕｌｌ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５１８６９頁［１９９２］）またはファージ上（スコットおよびスミス（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０頁［１９９０］；デブリン（Ｄｅｖｌｉｎ）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６頁［１９９０］；クワーラ（Ｃｗｉｒｌａ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２頁［１９９０］；フェリシ（Ｆｅｌｉｃｉ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１頁［１９９１］）において提供できる。
【０２０１】
ＶＩ．組成物および送達
幾つかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチド化合物は、医薬品として対象への送達用に医薬組成物として製剤化できる。本発明の新規な抗原化合物は、遺伝子発現または細胞増殖を阻害することが望ましい種々の疾患状態および症状の治療における使用が見出された。幾つかの好ましい実施態様において、該化合物は、例えば、これに限定はしないが、癌など無制御細胞増殖から生じる疾患状態を治療するために用いられる。本発明は、特定の癌の治療に限定されない。本発明のオリゴヌクレオチド化合物は、これらに限定はしないが、乳癌、大腸癌、肺癌、胃癌、膵癌、膀胱癌、白血病、およびリンパ腫などの種々の癌の治療に好適である。下記の考察により、製剤化および投与量の代表的な非限定例が提供される。
【０２０２】
Ａ．医薬組成物
本発明は、医薬組成物（例えば、上記のオリゴヌクレオチド化合物を含む）をさらに提供する。本発明の医薬組成物は、局所治療または全身治療が望ましいかどうかに依って、また治療を受ける部位に依って多くの方法で投与できる。投与は、局所（眼ならびに膣および直腸などの粘膜送達など）、肺（例えば、ネブライザーによるなどの散剤またはエーロゾル剤の吸入またはガス注入；気管内、鼻腔内、表皮および経皮）、経口または非経口であり得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または輸注；または頭蓋内投与、例えば髄腔内投与または心室内投与が挙げられる。
【０２０３】
局所投与用の医薬組成物および製剤としては、経皮用パッチ、軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、点滴剤、座剤、スプレー剤、液剤および散剤を挙げることができる。従来の製薬担体、水性基剤、粉末基剤または油性基剤、増粘剤などが必要で、または望ましいと思われる。
【０２０４】
経口投与用の医薬組成物および製剤としては、散剤または顆粒剤、水媒体または非水媒体中の懸濁剤また液剤、カプセル剤、サッシェまたは錠剤が挙げられる。増粘剤、風味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が望ましいと思われる。
【０２０５】
非経口投与、髄腔内投与または心室内投与用の医薬組成物および製剤としては、緩衝剤、希釈剤、これらに限定はしないが、透過エンハンサー、担体化合物および他の医薬的に許容できる担体または賦形剤などの好適な添加物も含有できる滅菌水溶液を挙げることができる。
【０２０６】
本発明の医薬組成物としては、これらに限定はしないが、液剤、乳濁剤、およびリポソーム含有製剤が挙げられる。これらの組成物は、これらに限定はしないが、予め形成された液体、自己乳化固体および自己乳化半固体を含む種々の成分から生成できる。
【０２０７】
単位剤形において都合よく存在し得る本発明の製薬製剤は、製薬業界に周知の従来からの技法に従って調製できる。このような技法は、有効成分と製薬用担体または賦形剤とを組合わせるステップを含む。一般に製剤は、有効成分と液体担体または微粉固体担体あるいは双方を均一かつ密接に組合わせ、次いで必要ならば製造物を成形することにより調製される。
【０２０８】
本発明の組成物は、これらに限定はしないが、錠剤、カプセル剤、液体シロップ剤、軟質ゲル剤、座剤、および浣腸などの多くの任意の可能な剤形に製剤化できる。本発明の組成物はまた、水性媒体、非水媒体または混合媒体中の懸濁剤として製剤化できる。水性懸濁剤は、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランなど、懸濁剤の粘度を増加させる物質をさらに含有できる。懸濁剤はまた、安定化剤を含有できる。
【０２０９】
本発明の一実施態様において、医薬組成物を製剤化し、発泡剤として使用できる。製薬発泡剤としては、これらに限定はしないが、乳濁剤、ミクロ乳濁剤、ジェリーおよびリポソームなどの製剤が挙げられる。基本的性質は同様であるが、これらの製剤は、最終製造物の成分および粘稠度において変化がある。
【０２１０】
細胞レベルにおいてオリゴヌクレオチド類の取込みを増強させる化合物もまた、本発明の医薬品および他の成分に添加できる。例えば、リポフェクチン（米国特許第５，７０５，１８８号明細書）などのカチオン性脂質、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリジン（国際公開第９７／３０７３１号パンフレット）などのポリカチオン性分子もまた、オリゴヌクレオチド類の細胞取込みを増強させる。
【０２１１】
本発明の組成物は、従来から医薬組成物に見られた他の補助剤成分をさらに含有できる。したがって、例えば、該組成物は、例えば、止痒剤、収斂剤、局所麻酔剤または抗炎症剤など、さらなる適合性の製薬活性物質を含有できるか、または本発明の組成物の種々の剤形を物理的に形成する上で有用なさらなる物質、例えば色素、風味剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定化剤など、を含有できる。しかしながら、このような物質が添加された場合に、本発明の組成物成分の生物活性を過度に妨害してはならない。該製剤は滅菌でき、所望ならば、製剤の核酸と有害な相互作用をしない補助剤、例えば、潤滑剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩類、緩衝剤、着色剤、風味剤および／または芳香物質などと混合できる。
【０２１２】
経口投与用組成物および製剤としては、散剤または顆粒剤、ミクロ粒子剤、ナノ粒子剤、水媒体または非水媒体中の懸濁剤また液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サッシェ、錠剤またはミニ錠剤が挙げられる。増粘剤、風味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が望ましいと思われる。好ましい経口用製剤は、本発明のオリゴヌクレオチド類が、１種以上の透過エンハンサー、界面活性剤およびキレート化剤と組合わせて投与されるものである。好ましい界面活性剤としては、脂肪酸および／またはそのエステル類または塩類、胆汁酸および／またはその塩類が挙げられる。好ましい胆汁酸／塩類としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、ヒドロキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。好ましい脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリドまたは医薬的に許容できるその塩（例えば、ナトリウム）が挙げられる。透過エンハンサーの組合わせ、例えば、胆汁酸／塩類と組合わせた脂肪酸／塩類もまた好ましい。特に好ましい組合わせは、ラウリン酸、カプリン酸およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる透過エンハンサーとしては、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチド類は、スプレー乾燥粒子などの顆粒形態で経口送達でき、あるいはミクロ粒子またはナノ粒子を形成するために複合化できる。オリゴヌクレオチド錯化剤としては、ポリアミノ酸類；ポリイミン類；ポリアクリレート類；ポリアルキルアクリレート類、ポリオキシエタン類、ポリアルキルシアノアクリレート類；カチオン化ゼラチン類、アルブミン類、澱粉類、アクリレート類、ポリエチレングリコール類（ＰＥＧ）および澱粉類；ポリアルキルシアノアクリレート類；ＤＥＡＥ誘導化ポリイミン類、ポルラン類、セルロース類および澱粉類が挙げられる。特に好ましい錯化剤としては、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン類、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノ−メチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギネート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【０２１３】
本発明の特定の実施態様では、（ａ）１種以上のオリゴヌクレオチド化合物および（ｂ）非オリゴヌクレオチドメカニズムによって機能する１種以上の他の化学療法剤を含有する医薬組成物が提供される。このような化学療法剤の例としては、これらに限定はしないが、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン（ＣＡ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）などの抗癌剤が挙げられる。これらに限定はしないが、非ステロイド系抗炎症薬およびコルチコステロイド類などの抗炎症薬、これらに限定はしないが、リビビリン、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビルなどの抗ウイルス薬もまた、本発明の組成物に組合わせることができる。他の非オリゴヌクレオチド化学療法剤もまた、本発明の範囲内にある。２種以上の組合わせ化合物は、一緒にまたは連続的に使用できる。
【０２１４】
Ｂ．送達
本発明のオリゴヌクレオチド化合物は、任意の好適な方法を用いて送達できる。幾つかの実施態様において、裸のＤＮＡを投与する。他の実施態様において、リポフェクションは、対象への核酸の送達に利用される。別のさらなる実施態様において、オリゴヌクレオチド類を送達のためにホスホチオレート類により修飾される（例えば米国特許第６，１６９，１７７号明細書を参照されたい。出典明示により参考文献として本明細書に組み込まれる）。
【０２１５】
幾つかの実施態様において、送達用の核酸類は、それらの取込みを補助するために圧縮される（例えば、参考文献として本明細書に組み込まれる、米国特許第６，００８，３６６号明細書、米国特許第６，３８３，８１１号明細書を参照されたい）。幾つかの実施態様において、圧縮された核酸類は、標的の細胞結合部分を介して特定の細胞タイプ（例えば、癌細胞）に標的化される（例えば、各々が参考文献として本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８４４，１０７号明細書、米国特許第６，０７７，８３５号明細書を参照されたい）。
【０２１６】
幾つかの実施態様において、オリゴヌクレオチド類は、それらの送達を補助するために他の化合物に結合させる。例えば、幾つかの実施態様において、核酸類は、送達を補助するためにポリエチレングリコールに結合させる（例えば、各々が参考文献として本明細書に組み込まれ、米国特許第６，１７７，２７４号明細書、米国特許第６，２８７，５９１号明細書、米国特許第６，４４７，７５２号明細書、米国特許第６，４４７，７５３号明細書および米国特許第６，４４０，７４３号明細書を参照されたい）。さらに他の実施態様において、オリゴヌクレオチド類は、帯電可能な薬物ナノ担体（ファルマイン（ＰｈａｒｍａＩｎ））である保護されたグラフトコポリマー類に結合させる。なおさらなる実施態様において、オリゴヌクレオチド類の細胞内への輸送は、ビタミン類との結合により促進される（エンドサイト（Ｅｎｄｏｃｙｔｅ）社、Ｗｅｓｔ  Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、インディアナ州；例えば、米国特許第５，１０８，９２１号明細書、米国特許第５，４１６，０１６号明細書、米国特許第５，６３５，３８２号明細書、米国特許第６，２９１，６７３号明細書および国際公開第０２／０８５９０８号パンフレットを参照されたい。各々が参考文献として本明細書に組み込まれる）。他の実施態様において、オリゴヌクレオチド類は、ナノ粒子に結合される（例えば、ナノメッド製薬会社（ＮａｎｏＭｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ミシガン州）。
【０２１７】
好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチド類は、送達を補助するために脂質（例えば、リポソーム類またはミセル類）に封入される（例えば、各々が参考文献として本明細書に組み込まれ、米国特許第６，４５８，３８２号明細書、米国特許第６，４２９，２００号明細書を参照されたい）。好ましいリポソーム類としては、これらに限定はしないが、カルジオリピンを基にしたカチオン性リポソーム類（例えば、ネオファーム（ＮｅｏＰｈａｒｍ）、Ｆｏｒｅｓｔ  Ｌａｋｅ、イリノイ州から入手できるＮＥＯＰＨＥＣＴＩＮ）が挙げられる。幾つかの好ましい実施態様において、ＮＥＯＰＨＥＣＴＩＮ対オリゴヌクレオチドの充填比は６：１である。なおさらなる実施態様において、オリゴヌクレオチド類は、送達を補助するためにさらにポリマー類と錯化される（例えば、米国特許第６，３７９，９６６号明細書、米国特許第６，３３９，０６７号明細書、米国特許第５，７４４，３３５号明細書を参照されたい；それらの各々は参考文献として本明細書に組み込まれる；イントラジグム（Ｉｎｔｒａｄｉｇｍ）社、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、メリーランド州を参照）。
【０２１８】
なおさらなる実施態様において、マイルス（Ｍｉｒｕｓ）（Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）により開発された制御された高圧送達系が、オリゴヌクレオチド類の送達に利用されている。
【０２１９】
Ｃ．投与量
投薬は、治療を受ける疾患状態の重症度および応答性に依り治療の過程は、数日から数ヵ月までか、あるいは治癒が達成されるまでか、または疾患状態の減退が達成されるまで続く。最適な投薬計画は、患者の体内における薬物蓄積の測定から算出できる。投与担当医師は、最適用量、投薬方法論および反復率を容易に判定できる。最適用量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的効力、および送達手段に依って変えることができ、インビトロおよびインビボの動物モデルで有効であると判っているＥＣ５０ｓに基づき、または本明細書に記載された実施例に基づいて一般的に推定できる。一般に、用量は、体重１ｋｇ当り０．０１μｇから１００ｇであり、毎日、毎週、毎月または毎年１回以上投与できる。幾つかの実施態様において、投与は、数時間から数日または数週の期間継続される（例えば、静脈内に）。幾つかの実施態様において、処置は、規定された期間連続して投与された後、処置なしの期間が続く。幾つかの実施態様において、連続投薬に次いで処置なしの期間というパターンが、数回（例えば、疾患状態が減退するまで）反復される。
【０２２０】
担当医師は、体液または組織における測定した薬物の滞留時間および濃度に基づいて投薬に関する反復率を推定できる。治療の成功後、疾患状態の再発を防ぐために、対象に維持療法を受けさせることが望ましいと考えられ、該オリゴヌクレオチドを、体重１ｋｇ当り０．０１μｇから１００ｇ、好ましくは１ｍｇから５０ｍｇ、さらにより好ましくは６ｍｇから３０ｍｇの範囲の維持用量で、１日１回以上から２０年毎に１回投与される。
【０２２１】
ＶＩＩ．併用療法
幾つかの実施態様において、本発明の組成物は、既存の療法と併用して提供される。他の実施態様において、本発明の２つ以上の化合物は、組合わせて提供される。幾つかの実施態様において、本発明の成分は、公知の化学癌療剤と併用して提供される。本発明は、特定の化学療法剤に限定されない。
【０２２２】
種々のクラスの抗悪性腫瘍（例えば、抗癌）剤が、本発明の特定の実施態様における使用のために考慮される。本発明による使用に好適な抗癌剤は、これらに限定はしないが、アポトーシスを誘導する、アデノシンデアミナーゼ機能を阻害する、ピリミジン生合成を阻害する、プリン環生合成を阻害する、ヌクレオチド相互変換を阻害する、リボヌクレオチドレダクターゼを阻害する、チミジンモノホスフェート（ＴＭＰ）合成を阻害する、ジヒドロフォレート還元を阻害する、ＤＮＡ合成を阻害する、ＤＮＡとの付加体を形成する、ＤＮＡを損傷する、ＤＮＡ修復を阻害する物、ＤＮＡとインターカレートする物、アスパラギン類をデアミネートする物、ＲＮＡ合成を阻害する物、タンパク質合成または安定性を阻害する物、微小管合成または機能を阻害する物質などが挙げられる。
【０２２３】
幾つかの実施態様において、本発明の組成物および方法の使用に好適な代表的な抗癌剤としては、これらに限定はしないが：１）微小管阻害剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびビンデシンなど）、微小管安定化剤（例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ）、およびドセタキセルなど）を含むアルカロイド類、エピポドフィロトキシン類（例えば、エトポシド（ＶＰ−１６）、およびテニポシド（ＶＭ−２６）など）などのトポイソメラーゼ阻害剤を含むクロマチン機能阻害剤、トポイソメラーゼＩを標的とする薬剤（例えば、カンプトテシンおよびイシリノテカン（ＣＰＴ−１１）など）；２）ナイトロジェンマスタード類（例えば、メクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イフォスファミド、およびブスルファン（ＭＹＬＥＲＡＮ）など）、ニトロソ尿素類（例えば、カルムスチン、ロムスチン、およびセムスチンなど）、および他のアルキル化剤（例えば、ダカルバジン、ヒドロキシメチルメラミン、チオテパ、およびマイトマイシンなど）などの共有ＤＮＡ結合剤（アルキル化剤）；３）核酸阻害剤（例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）など）、アントラサクリン類（例えば、ダウノルビシン（ダウノマイシンおよびセルビジン）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、およびイダルビシン（イダマイシン）など）、アントラセンジオン類（例えば、ミトキサントロンなどのアントラサクリンアナログ）、ブレオマイシン類（ＢＬＥＮＯＸＡＮＥ）など、およびプリカマイシン（ミトラマイシン）などの非共有ＤＮＡ結合剤（抗腫瘍抗生物質）；４）葉酸代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、ＦＯＬＥＸ、およびＭＥＸＡＴＥなど）、プリン代謝拮抗薬（例えば、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ、ＰＵＲＩＮＥＴＨＯＬ）、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、アザチオプリン、アシクロビル、ガンシクロビル、クロロデオキシアデノシン、２−クロロデオキシアデノシン（ＣｄＡ）、および２’−デオキシコフォルマイシン（ペントスタチン）など）、ピリミジンアンタゴニスト（例えば、フルオロピリミジン類（例えば、５−フルオロウラシル（ＡＤＲＵＣＩＬ）、５−フルオロデオキシウリジン（ＦｄＵｒｄ）（フロクスウリジン））など）、およびシトシンアラビノシド類（例えば、ＣＹＴＯＳＡＲ（ａｒａ−Ｃ）およびフルダラビンなど）などの代謝拮抗薬；５）Ｌ−アスパラギナーゼ、およびヒドロキシ尿素などの酵素；６）グルココルチコイド類、抗エストロゲン類（例えば、タモキシフェンなど）、非ステロイド系抗アンドロゲン類（例えば、フルタミドなど）、およびアロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ）など）などのホルモン類；７）白金化合物（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチンなど）；８）抗癌剤、毒素、および／または放射性核種と結合したモノクローナル抗体など；９）生体応答調整物質（例えば、インターフェロン類（例えば、ＩＦＮ−αなど）およびインターロイキン類（例えば、ＩＬ−２など）など）；１０）養子免疫治療；１１）造血成長因子；１２）腫瘍細胞分化を誘導する薬剤（例えば、オール−トランス−レチノイン酸など）；１３）遺伝子療法技法；１４）アンチセンス療法技���；１５）腫瘍ワクチン；１６）腫瘍転移に対する療法（例えば、バチマスタット（ｂａｔｉｍａｓｔａｔ）など）；１７）血管新生阻害剤；１８）プロテオソーム阻害剤（例えば、ＶＥＬＣＡＤＥ）；１９）アセチル化阻害剤および／またはメチル化阻害剤（例えば、ＨＤＡＣ阻害剤）；２０）ＮＦκＢのモジュレーター；２１）細胞分裂周期調節阻害剤（例えば、ＣＤＫ阻害剤）；２２）ｐ５３タンパク質機能のモジュレーター；および２３）放射線、が挙げられる。
【０２２４】
癌療法作業場所でルーチンに使用される任意の腫瘍融解剤が、本発明の組成物および方法における使用を見出される。例えば、米国食品医薬品局は、米国での使用に承認された腫瘍崩壊性剤の処方を支持している。Ｕ．Ｓ．Ｆ．Ｄ．Ａ．に対応する国際政府機関は、同様の処方を支持している。表３は、米国における使用に関して承認された代表的な抗悪性腫瘍薬のリストを提供している。米国で承認された全ての化学療法薬に対して求められる「製品分類」が、代表的な薬剤に関して承認された効能・効果、投薬情報、毒性データなどが記載されていることを当業者は認識されるであろう。
【０２２５】
表３
【表２−１】
0005922913.tif 000003
【表２−２】
0005922913.tif 000004
【表２−３】
0005922913.tif 000005
【表２−４】
0005922913.tif 000006
【表２−５】
0005922913.tif 000007
0005922913.tif 000008
【表２−６】
0005922913.tif 000009
0005922913.tif 000010
【表２−７】
0005922913.tif 000011
【表２−８】
0005922913.tif 000012
【表２−９】
0005922913.tif 000013
0005922913.tif 000014
【表２−１０】
0005922913.tif 000015
【表２−１１】
0005922913.tif 000016
【表２−１２】
0005922913.tif 000017
【表２−１３】
0005922913.tif 000018
【０２２６】
ＶＩＩＩ．カスタマイズされた患者医療
幾つかの実施態様において、本発明は、カスタマイズされた患者治療を提供する。本発明の組成物は、患者疾患（例えば、癌）に独特な特定の遺伝子を標的にする。例えば、幾つかの実施態様において、患者の癌または他の患部組織（例えば、生検）のサンプルを最初に得る。特定の遺伝子（例えば、発癌遺伝子）の発現の存在について生検を分析する。幾つかの好ましい実施態様において、患者の遺伝子の発現レベルを分析する。発現は、特定の発癌遺伝子に対応するＲＮＡまたはＤＮＡの存在に関してモニタリングすることによって検出できる。これらに限定はしないが、下記に開示されたものなどの任意の好適な検出法を利用できる。
【０２２７】
対象患者遺伝子の遺伝子発現パターンの特徴分析後、カスタマイズ療法を、各患者のために作製する。好ましい実施態様において、患者に異常発現する（例えば、腫瘍において）遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド化合物を、治療カクテル中で混合する。幾つかの実施態様において、治療カクテルは、追加の化学療法剤（例えば、上記のもの）をさらに含む。次に該カクテルを、上記のとおり患者に投与する。
【０２２８】
幾つかの実施態様において、癌サンプルの分析および治療化合物に関するオリゴヌクレオチドの選択は自動化される。例えば、幾つかの実施態様において、オリゴヌクレオチド類の最適な選択および濃度に達するために、一連の発癌遺伝子の発現レベルを解析するソフトウェアプログラムを利用する。幾つかの実施態様において、該解析は、患者サンプルを解析する臨床検査室により実施され、治療カクテルの製剤化に関する第２のプロバイダーに伝達される。幾つかの実施態様において、この情報は、インターネットで伝達され、したがって、診断と治療開始との間での最短時間を可能にする。
【０２２９】
Ａ．ＲＮＡの検出
幾つかの実施態様において、発癌遺伝子の検出（例えば、これらに限定はしないが、本明細書に記載されたものなどを含む）は、組織サンプル（例えば、癌組織）中の対応するｍＲＮＡの発現を測定することによって検出される。他の実施態様において、ｍＲＮＡの発現は、これらに限定はしないが、血液、血清、粘液、尿などの体液中で測定される。幾つかの好ましい実施態様において、ｍＲＮＡの発現レベルは、定量的に測定される。ＲＮＡ発現は、下記に開示したものなど、任意の好適な方法により測定できるが、これに限定するものではない。
【０２３０】
幾つかの実施態様において、ＲＮＡは、ノーザンブロット解析により検出される。ノーザンブロット解析は、ＲＮＡの分離および相補的な標識プローブのハイブリダイゼーションを含む。他の実施態様において、ＲＮＡ発現は、特定の構造の酵素的開裂によって検出される（ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ、Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；例えば、米国特許第５，８４６，７１７号明細書；米国特許第６，０９０，５４３号明細書；米国特許第６，００１，５６７号明細書；米国特許第５，９８５，５５７号明細書；および米国特許第５，９９４，０６９号明細書を参照されたい；それらの各々は、参考文献として本明細書に組み込まれる）。ＩＮＶＡＤＥＲアッセイは、オーバラップするオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションにより形成された複合体を開裂する構造特異的酵素を用いることによって特定の核酸配列（例えば、ＲＮＡ）を検出する。
【０２３１】
さらなる実施態様において、ＲＮＡ（または対応するｃＤＮＡ）は、オリゴヌクレオチドプローブに対するハイブリダイゼーションによって検出される。ハイブリダイゼーションおよび検出のための種々の技法を用いる種々のハイブリダイゼーションアッセイが利用できる。例えば、幾つかの実施態様において、ＴａｑＭａｎアッセイ（ＰＥバイオシステムズ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州；例えば、米国特許第５，９６２，２３３号明細書および米国特許第５，５３８，８４８号明細書を参照されたく；それらの各々は、参考文献として本明細書に組み込まれる）が利用される。該アッセイは、ＰＣＲ反応時に実施される。ＴａｑＭａｎアッセイは、ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤ  ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を活用する。５’−レポーター染色（例えば、蛍光染色）および３’−クエンチャー染色を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブが、ＰＣＲ反応に含まれる。ＰＣＲ中、プローブが標的に結合されている場合、ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤポリメラーゼの５’−３’の核酸開裂活性により、レポーター染色とクエンチャー染色との間でプローブが開裂される。クエンチャー染色からレポーター染色が分離されることにより、蛍光が増加する。このシグナルはＰＣＲの各サイクルにより蓄積され、蛍光光度計によりモニターできる。
【０２３２】
さらに他の実施態様において、ＲＮＡ発現を検出するために逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）が用いられる。ＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＲＮＡは、逆転写酵素を用いて相補的なＤＮＡすなわち「ｃＤＮＡ」に酵素的に変換される。次にｃＤＮＡは、ＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用される。ＰＣＲ産物は、これらに限定はしないが、ゲル電気泳動およびＤＮＡ特異的染色による染色または標識プローブに対するハイブリダイゼーションなど、任意の好適な方法により検出できる。幾つかの実施態様において、米国特許第５，６３９，６０６号明細書、米国特許第５，６４３，７６５号明細書、および米国特許第５，８７６，９７８号明細書（それらの各々は、参考文献として本明細書に組み込まれる）に記載されている競合的テンプレート法の標準的混合物による定量的逆転写酵素ＰＣＲが利用される。
【０２３３】
Ｂ．タンパク質の検出
他の実施態様において、発癌遺伝子の遺伝子発現は、対応するタンパク質またはポリペプチドの発現を測定することにより検出される。幾つかの実施態様において、タンパク質発現は、組織サンプルにおいて検出される。他の実施態様において、タンパク質発現は、体液中に検出される。幾つかの実施態様において、タンパク質発現レベルは定量化される。タンパク質発現は、任意の好適な方法により検出できる。幾つかの実施態様において、タンパク質は、タンパク質に対して生じる抗体との結合によって検出される。抗体の生成は、当業者に周知である。
【０２３４】
抗体結合は、当技術分野で公知の技法（例えば、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射線アッセイ、ゲル内沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ（例えば、金コロイド、酵素または放射性同位元素標識を用いて）、ウェスタンブロット、沈殿反応、凝集反応アッセイ（ゲル凝集アッセイ、赤血球凝集反応アッセイなど）、補体結合反応アッセイ、免疫蛍光アッセイ、タンパク質Ａアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなど）により検出される。
【０２３５】
一実施態様において、抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することにより検出される。別の実施態様において、該一次抗体は、二次抗体または一次抗体への試薬の結合を検出することにより検出される。さらなる実施態様において、該二次抗体が標識される。免疫アッセイにおける結合を検出するための多くの方法が当技術分野で公知であり、本発明の範囲内にある。
【０２３６】
幾つかの実施態様において、自動化検出アッセイが利用される。免疫アッセイの自動化法としては、米国特許第５，８８５，５３０号明細書、米国特許第４，９８１，７８５号明細書、米国特許第６，１５９，７５０号明細書、および米国特許第５，３５８，６９１号明細書に記載されているものが挙げられ、それらの各々は、参考文献として本明細書に組み込まれる。幾つかの実施態様において、結果の解析および提示もまた自動化されている。例えば、幾つかの実施態様において、発癌遺伝子に対応する一連のタンパク質の存在または不在に基づく発現プロフィルを作製するソフトウェアが利用される。
【０２３７】
他の実施態様において、該免疫アッセイは、米国特許第５，５９９，６７７号明細書および米国特許第５，６７２，４８０号明細書に記載されており；それらの各々は、参考文献として本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０２３８】
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施態様および態様を示し、さらに説明するために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈してはならない。
【０２３９】
以下の実施例の開示において、以下の略語が適用される：Ｎ（正常）；Ｍ（モル）；ｍＭ（ミリモル）；μＭ（マイクロモル）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｐｍｏｌ（ピコモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｎｇ（ナノグラム）；ｌまたはＬ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；および℃（摂氏度）。
【０２４０】
実施例１
材料と方法
本実施例では、下記の実施例に利用される実験方法を記載する。
Ａ．細胞系
本発明の実験に使用される細胞系を以下に記載する。
【０２４１】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１
組織：悪性腺腫；乳腺；乳房；胸水
腫瘍化：悪性腺腫グレードＩＩＩを形成
発現受容体：上皮成長因子（ＥＧＦ）および形質転換成長因子（ＴＧＦ−アルファ）
発癌遺伝子：ｗｎｔ３＋およびｗｎｔ７ｈ＋
引用文献：
シシリアノＭＪ（Ｓｉｃｉｌｉａｎｏ  ＭＪ）、バーカーＰＥ（Ｂａｒｋｅｒ  ＰＥ）、ケーローＲ（Ｃａｉｌｌｅａｕ）。共通の染色体マーカーを有するヒト乳房腫瘍細胞系の相互に排他的な遺伝子記号。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９７９年３月；３９（３）：９１９−２２頁
カローＲ（ＣａｌｌｅａｕＲ）、オリーブＭ（Ｏｌｉｖｅ  Ｍ）、クルシガーＱＶ（Ｃｒｕｃｉｇｅｒ  ＱＶ）。転移起源の長期ヒト乳癌細胞系：予備的特性化。インビトロ１９７８年１１月；１４（１１）：９１１−５頁。
クルシガーＱＶ（Ｃｒｕｃｉｇｅｒ  ＱＶ）、パサクＳ（Ｐａｔｈａｋ  Ｓ）、カローＲ（Ｃａｌｌｅａｕ  Ｒ）。ヒト乳癌：７つの症例中１ｑを含む標識染色体。Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．１９７６年；１７（４）：２３１−５頁。
サチヤ・プラカシュＫＬ（Ｓａｔｙａ−Ｐｒａｋａｓｈ  ＫＬ）、パサクＳ（Ｐａｔｈａｋ  Ｓ）、スーＴＣ（Ｈｓｕ  ＴＣ）、オリーブＭ（Ｏｌｉｖｅ  Ｍ）、カローＲ（Ｃａｌｌｅａｕ  Ｒ）。８種のヒト乳癌細胞系に対する細胞遺伝学的分析：高頻度の１ｑ、１１ｑおよびＨｅＬａ様標識染色体。Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  １９８１年１月；３（１）：６１−７３頁。
【０２４２】
ＭＣＦ７
組織：悪性腺癌、乳腺、乳房
転移部位：胸水
受容体：エストロゲン受容体＋
発癌遺伝子：ｗｎｔ７ｈ＋
この細胞系はまた、ｃ−ｅｒｂＢ−２を中程度に発現し、ｃ−ｍｙｃ発癌遺伝子を過剰発現することが知られている。
細胞産物：インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）。
引用文献：
ソールＨＤ（Ｓｏｕｌｅ  ＨＤ）ら、乳癌に由来する胸水からのヒト細胞系。Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．５１：１４０９−１４１６頁、１９７３年。
ランダースＪＥ（Ｌａｎｄｅｒｓ  ＪＥ）ら、安定化された野生型ｐ５３タンパク質を含有するヒト腫瘍細胞におけるｍｄｍ２発癌遺伝子発現の翻訳増強。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：３５６２−３５６８頁、１９９７年。
ベーカスＳＳ（Ｂａｃｕｓ  ＳＳ）ら、細胞表面のＨＥＲ−２／ｎｅｕオリゴヌクレオチドの減少と関連する培養ヒト癌細胞（ＡＵ−５６５およびＭＣＦ７）の分化。Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．３：３５０−３６２頁、１９９０年。
【０２４３】
ＭＣＦ１０ＣＡ１
ＭＣＦ１０細胞は、線維嚢胞疾患の女性からの良性乳房組織に由来する。ＭＣＦ１０系は、７種の系からなり、１つは、不死化正常ヒト乳房細胞系のＭＣＦ１０Ａである。ＭＣＦ１０Ａは、Ｔ２４  Ｈａ−ｒａｓにより形質転換されて、ＭＣＦ１０ＡｎｅｏＴ細胞を作製する。腫瘍性進行可能性を有するＭＣＦ１０ＡＴは、異種移植片継代のＭＣＦ１０−ＡｎｅｏＴ細胞に由来する。ＭＣＦ１０ＡＴは、約２５％の異種移植片に癌を発生する。完全悪性ＭＣＦ１０ＣＡ１細胞系は、数回のＭＣＦ１０ＡＴの異種移植片継代物に由来した。ＭＣＦ１０ＣＡ１ａは、その時点で１００％腫瘍を形成し、それは転移するＭＣＦ１０ＣＡ１ａの核型分析は、染色体１の余分な複製物を示す。それは、細胞のＩＶ注入３６日後に肺に転移する。
引用文献：
サントナーＳＪ（Ｓａｎｔｎｅｒ  ＳＪ）ら、悪性前ヒト乳房上皮ＭＣＦ１０ＡＴ細胞に由来する悪性ＭＣＦ１０ＣＡ１細胞系。Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ６５：１０１−１１０頁、２００１年。
【０２４４】
ＭＹＣ−ＭＴ−１
メスＭＭＴＶ−Ｃ−ＭＹＣ遺伝子導入マウスは、乳癌を発症した。該腫瘍を単離し、小さな新鮮組織を、Ｋａｒｍａｎｏｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのジュウショア・リヤオ（Ｊｕｓｈｏａ  Ｌｉａｏ）博士により馴化された培地と共に培養物中に入れる。この腫瘍細胞系は、１０回の継代後確立された。
【０２４５】
ＮＭｕＭＧ
組織：マウス正常乳腺、上皮。
株：ＮＡＭＲＵ、メス
腫瘍化：マウスにおいて良性腫瘍を産生。
引用文献：
オーエンスＲＢ（Ｏｗｅｎｓ  ＲＢ）。マウス由来の腺上皮細胞：選択的培養法。Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．５２：１３７５−１３７８頁、１９７４年。
オーエンスＲＢ（Ｏｗｅｎｓ  ＲＢ）。マウスの正常腺組織由来の上皮細胞培養物。Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．５３：２６１−２６９頁、１９７４年。
イングリングＪＭ（Ｙｉｎｇｌｉｎｇ  ＪＭ）ら。哺乳動物の矮性体は、ＴＧＦ−βの変換に応答してリン酸化され、細胞増殖の制御に関連される。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：８９４０−８９４４頁、１９９６年。
【０２４６】
ＢｘＰＣ−３
組織：悪性腺腫、膵臓。
細胞産物：ムチン、膵癌特異的抗原；ＣＥＡ、癌胎児性抗原。
出所源：６１歳の女性。
腫瘍化：あり。
発癌遺伝子：ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ。
引用文献：
タンＭＨ（Ｔａｎ  ＭＨ）ら。新規な一次ヒト膵臓腫瘍系の特性化。Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．４：１５−２３頁、１９８６年。
ルーアＲ（Ｌｏｏｒ  Ｒ）ら。膵癌の免疫診断における膵臓特異的抗原の使用。Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．２：５６７−５７８頁、１９８２年。
ランＭＳ（Ｌａｎ  ＭＳ）ら。ヒト腫瘍ムチン抗原のポリペプチドコア。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：２９９７−３００１頁、１９９０年。
チャンバーズＪＡ（Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ＪＡ）およびハリスＡ（Ｈａｒｒｉｓ  Ａ）。ヒト管上皮細胞における嚢胞性線維症遺伝子および主要膵臓ムチン遺伝子ＭＵＣ１の発現。Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１０５：４１７−４２２頁、１９９３年
【０２４７】
Ｔ−４７Ｄ
組織：腺管癌、乳腺、乳房、管
転移部位：胸水
出所源：乳房の管癌浸潤を有する５４歳女性の胸水。
受容体発現：エストロゲン、アンドロゲン、カルシトニン、プロゲステロン、グルココルチコイドおよびプロラクチン陽性。
発癌遺伝子：ｗｎｔ３＋およびｗｎｔ７ｈ＋
この細胞系は、ｃ−ｅｒｂＢ−２を過剰発現することも知られている。
引用文献：
キーダーＩ（Ｋｅｙｄａｒ  Ｉ）ら、ヒト乳癌起源の細胞系の確立および特性化。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １５：６５９−６７０頁、１９７９年。
ジャッジＳＭ（Ｊｕｄｇｅ  ＳＭ）およびチャッタートンＲＴ  Ｊｒ．（Ｃｈａｔｔｅｒｔｏｎ  ＲＴ  Ｊｒ．）。乳癌細胞系（Ｔ−４７Ｄ）におけるトリグリセリド生合成のプロゲステロン特異的刺激。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４３：４４０７−４４１２頁、１９８３年。
ランプＳＪ（Ｌａｍｐ  ＳＪ）ら。ヒト乳癌細胞（Ｔ−４７Ｄ）におけるアデニレートシクラーゼの持続的活性化状態のカルシトニン誘導。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１２２６９−１２２７４頁、１９８１年。
シェールＥ（Ｓｈｅｒ  Ｅ）ら。培養物中の乳癌細胞（Ｔ−４７Ｄ）により１，２５−ジヒドロキシ−コレカルシフェロールの全細胞取込みおよび核局在化。Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２００：３１５−３２０頁、１９８１年。
フリーケＨＣ（Ｆｒｅａｋｅ  ＨＣ）ら。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は、ヒト乳癌細胞系（Ｔ−４７Ｄ）に特異的に結合し、増殖を刺激する。Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０１：１１３１−１１３８頁、１９８１年。
ファウストＪＢ（Ｆａｕｓｔ  ＪＢ）およびミーカーＴＣ（Ｍｅｅｋｅｒ  ＴＣ）。ヒト固形腫瘍細胞系におけるｂｃｌ−１遺伝子の増幅および発現。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：２４６０−２４６３頁、１９９２年ＲＦ３３５１４：
ハグエットＥＬ（Ｈｕｇｕｅｔ  ＥＬ）ら。ヒト乳房細胞系ならびにヒト乳房組織の正常および疾患状態におけるヒトＷｎｔ遺伝子２、３、４、および７Ｂの分化発現。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：２６１５−２６２１頁、１９９４年。
【０２４８】
ＢＴ−４７４
組織：腺管癌、乳腺、乳房
出所源：６０歳女性
発癌遺伝子：ｃ−ｅｒｂＢ−２
引用文献：
ラスファーグスＥＹ（Ｌａｓｆａｒｇｕｅｓ  ＥＹ）ら。固形乳癌から２種のヒト腫瘍上皮細胞系の単離。Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．６１：９６７−９７８頁、１９７８年。
ラスファーグスＥＹ（Ｌａｓｆａｒｇｕｅｓ  ＥＹ）ら。マウス乳房腫瘍ウィルス複製を支持するヒト乳房腫瘍細胞系（ＢＴ−４７４）。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ１５：７２３−７２９頁、１９７９年。
リトルウッド・エバンスＡＪ（Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄ−Ｅｖａｎｓ  ＡＪ）ら。破骨細胞関連プロテアーゼカテプシンＫは、ヒト乳癌に発現する。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：５３８６−５３９０頁、１９９７年。
【０２４９】
ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ
１９９３年に確立されたヒトＢ細胞系
出所源：白血病相における低度の濾胞性リンパ腫中細胞型の男性患者の末梢血由来。
発癌遺伝子：ｃ−ｍｙｃおよびｂｃｌ−２の双方に関して染色体転座を示す。
引用文献：
マハマドＲＭ（Ｍｏｈａｍｍａｄ  ＲＭ）、マハマドＡＮ（Ｍｏｈａｍｍａｄ  ＡＮ）、スミスＭＲ（Ｓｍｉｔｈ  ＭＲ）、ジャワジＮＳ（Ｊａｗａｄｉ  ＮＳ）、ＡＬ−カチブＡ（ＡＬ−Ｋｈａｔｉｂ  Ａ）。ｔ（１４；１８）およびｔ（８；１１）の双方を示すユニークなＥＢＶ−陰性低グレードリンパ腫系（ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ）。Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  ７０：６２−６７頁、１９９３年。
【０２５０】
Ｂ．細胞培養
ヒト乳癌細胞、ＭＣＦ７、ＭＣＦ１０ＣＡｌａ、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＤＡ−ＭＢ４３５．ｅＢ、およびヒト正常乳房細胞、ＭＣＦ１０Ａは全て、Ｋａｒｍａｎｏｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手した。全ての細胞に、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２９ｍＭ重炭酸ナトリウム、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、メリーランド州）中で培養した。さらに、１０％子ウシ血清、１０μｇ／ｍｌインスリン（シグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、セントルイス、ミズーリ州）、および０．５ｎＭエストラジオールをＭＣＦ７培地に用いた。５％ウマ血清およびインスリン（１０μｇ／ｍｌ）をＭＣＦ１０Ｃａｌａに対し用い、１０％胎仔ウシ血清をＭＤＡ−ＭＢ２３１および４３５系に対して用いた。ＭＣＦ１．０Ａ培養物に、５％ウマ血清、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、１００ｎｇ／ｍｌコレラエンテロトキシン（カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、カリフォルニア州）、０．５μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン（シグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ））および２０ｎｇ／ｍｌ上皮成長因子（シグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ））を添加した。全てのフラスコおよびプレートを、３７℃で９５％空気および５％ＣＯ２の加湿雰囲気下でインキュベートした。
【０２５１】
ＭＹＣ−ＭＴ−１細胞はまた、１０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ（上皮成長因子）、１ｎＭエストラジオール、１０μｇ／ｍｌインスリンおよび１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で培養した。ＢｘＰＣ−３膵癌細胞系およびＢＴ−４７４、乳房腫瘍細胞系を、１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ  １６４０中で培養した。乳房腫瘍細胞系、Ｔ−４７Ｄを、２．５μｇ／ｍｌインスリンの添加によるＢＴ−４７４と同じ培地中で培養した。ＮＭｕＭＧ（正常マウス乳腺細胞）細胞系を、４．５ｇ／ｌグルコース、１０μｇ／ｍｌインスリンおよび１０％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ培地中で増殖させた。
【０２５２】
全ての上記細胞を、２５００個から５，０００個／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。細胞を、播種２４時間後、新鮮培地（全容量１００μｌ）中のオリゴヌクレオチド化合物で処理した。この培地を、処理２４時間後、６日間から７日間４８時間毎に、または対照細胞が８０％から１００％コンフルエントになるまでオリゴヌクレオチド不含新鮮培地に置き換えた。オリゴヌクレオチドの抑制効果を、ＭＴＴ染色法を用いて評価した。
【０２５３】
ヒト濾胞性リンパ腫細胞系、ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬを用いて、抗ｍｙｃオリゴヌクレオチドならびに抗Ｂｃｌ−２オリゴヌクレオチドの効果を評価した。ＦＳＣＣＬ細胞は、組織培養中の単一細胞懸濁液として増殖させる。この培養物を、１０％ウシ胎児血清、１％Ｌ−グルタミン、１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリンおよび１．００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ  １６４０中で保持した。ＦＳＣＣＬ細胞を、オリゴヌクレオチド化合物を有する２４ウェルプレート（２ｘ１０５細胞／ウェル／ｍｌ）中で処理し、３７℃で９５％空気および５％ＣＯ２の加湿雰囲気下でインキュベートした。細胞を血球計測器を用いて２４時間毎に計測した。
【０２５４】
Ｃ．オリゴヌクレオチドの調製
バイオシンセシス（ＢＩＯＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ、テキサス州）またはキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）（Ｖａｌｅｎｃｉａ、カリフォルニア州）により、オリゴヌクレオチドの全てを合成し、ゲル精製し、凍結乾燥した。メチル化オリゴヌクレオチドは、全ＣｐＧ部位でメチル化された。メチル化オリゴヌクレオチドを、滅菌純水（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社）に溶解し、培養物中の細胞を処理するために用いた。
【０２５５】
Ｄ．リポフェクチンのカプセル化
２０μｇリポフェクチン（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））および１６μｇオリゴヌクレオチドをそれぞれ、別個の滅菌チューブ中で２００μｌＯｐｔｉ−ＭＥＭ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））培地と共に室温で４５分間インキュベートした。次にそれらを合わせてさらに１５分間インキュベートした。次いで１．６ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を、最終容量２ｍｌおよび最終濃度１μＭのオリゴヌクレオチドに加えた。リポフェクチンおよびオリゴヌクレオチドの濃度は、それらの分子量および所望の化合物濃度に基づいて調製できる。このレベルで細胞毒性効果は無かった。
【０２５６】
Ｅ．細胞増殖阻害アッセイ
細胞増殖阻害を、シグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）（セントルイス、ミズーリ州）から購入された臭化３−［４，５−ジメチル−チアゾール−２−イル］−２，５ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）を用いて評価した。細胞を、５０，０００個細胞／ｍｌで培養培地に再懸濁し、１００μｌを、９６ウェル平底プレート（コスター・コーニング（Ｃｏｓｔａｒ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ニューヨーク州、米国）の各ウェルに分配し、２４時間インキュベートした。培地を、所望の濃度のオリゴヌクレオチドを含有する１００μｌの新鮮培地に変えて、２４時間インキュベートした。対照は、オリゴヌクレオチド溶液の容量に等しい滅菌純水を有する培地とした。この培地に、対照培養がコンフルエントになるまで（６日から７日）２４時間毎にさらなるオリゴヌクレオチドを添加しないで変えた。その後、培地を除き、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ染料を含有する１００μｌの無血清培地を、各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。染料を有する培地を除き、ＰＢＳで洗浄し、１００μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加えて反応性の染料を溶解した。この吸光度を、自動マルチウェル分光光度計（バイオテク・マイクロプレートオートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ａｕｔｏｒｅａｄｅｒ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、バーモント州、米国））を用いて読み取った。各処理は、各回８つの独立したウェルで少なくとも３回反復した。
【０２５７】
Ｆ．タンパク質抽出およびウェスタンブロット解析
細胞を播種し、２００，０００個の細胞／フラスコでＴ２５組織培養フラスコ（コスター・コーニング（Ｃｏｓｔａｒ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ニューヨーク州、米国）中で培養した。細胞を２４時間付着させた。該培地を、１０μＭから２０μＭのオリゴヌクレオチドを含有する新鮮な培地に置き換えて、２４時間インキュベートした。この培地は、別途阻害剤を添加することなく４８時間毎に変えて、対照フラスコがコンフルエントになるまで（６〜７日）細胞培養を継続した。細胞は、１ｘトリプシン：ＥＤＴＡ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｇｉｂｃｏ、メリーランド州）を用いて回収し、２０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により回収した。細胞を、１２５ｍＭのトリスＨＣＬ緩衝液（ｐＨ６．８）に再懸濁し、１０〜２０％出力で音波処理し、４％ＳＤＳの最終濃度に対して８％ＳＤＳの等しい容量に溶解した。細胞抽出物を１０分間沸騰させ、氷上で冷却し、２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離してから上澄液を採取した。タンパク質をＢＣＡタンパク質アッセイキット（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州）を用いて定量した。５０μｇから１００μｇのタンパク質を、１０％から１５％ゲル（各タンパク質の分子量に依って）電気泳動に供し、ニトロセルロース膜（シュレイシャー・アンド・シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）、Ｋｅｎｃｅ、ニューハンプシャー州）に移した。各膜を、１０％乾燥ミルクのＴＢＳＴｅ（トリス緩衝生理食塩水、ツイーン２０）中で２時間ブロックしてから、ＴＢＳＴ中の一次抗体により一晩インキュベートした。ヒトｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｈａ−ｒａｓおよびｅｒｂＢ−２に対する抗体は、マウスＩｇＧ（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）サンディエゴ、カリフォルニア州）であった。膜を、各ＴＢＳＴ中１５分間で３回洗浄してから、ペルオキシダーゼで１時間結合させた二次抗体と共にインキュベートした。この膜を、各ＴＢＳＴ中１０分間で５回洗浄し、各２ｍｌのＬｕｍｉｏ／エンハンサーおよび安定なペルオキシド溶液（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））と共に１分間インキュベートした。該膜を、Ｘ線フィルムに２分間曝露した（曝露時間は、必要ならば１０秒から２４時間まで調整する）。
【０２５８】
実施例２
ｃ−ｋｉ−ＲＡＳ
本実施例では、癌細胞系の増殖を抑制するためにｃ−ｋｉ−Ｒａｓ遺伝子のプロモーターに対して標的化されたオリゴヌクレオチド化合物の能力を記載する。実験は、実施例１に記載されたとおり実施した。この結果を図１３および図１９に示す。ｃ−ｋｉ−Ｒａｓに対して標的化されたオリゴヌクレオチド配列ならびにｃ−ｋｉ−Ｒａｓ遺伝子配列を図５および図６に示す。
【０２５９】
実施例３
Ｂｃｌ−２
本実施例では、癌細胞系の増殖を抑制するためにｂｃｌ−２遺伝子のプロモーターに対して標的化されたオリゴヌクレオチド化合物の能力を記載する。実験を、実施例１に記載されたとおり実施した。この結果を図１４および図２０に示す。ｂｃｌ−２に対して標的化されたオリゴヌクレオチド配列ならびにｂｃｌ−２遺伝子配列を図１および図２に示した。
【０２６０】
実施例４
ｃ−ｈａ−ＲＡＳ
本実施例では、癌細胞系の増殖を抑制するためにｃ−ｈａ−Ｒａｓ遺伝子のプロモーターに対して標的化されたオリゴヌクレオチド化合物の能力を記載する。実験は、実施例１に記載されたとおり実施した。この結果を図１６および図２２に示した。ｃ−ｈａ−Ｒａｓに対して標的化されたオリゴヌクレオチド配列、ならびにｃ−ｈａ−Ｒａｓ遺伝子配列を図７および図８に示す。
【０２６１】
実施例５
ｃ−ｅｒｂＢ−２
本実施例では、癌細胞系の増殖を抑制するためにｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子のプロモーターに対して標的化されたオリゴヌクレオチド化合物の能力を記載する。実験は、実施例１に記載されたとおり実施した。この結果を図１５および図２１に示す。ｃ−ｅｒｂＢ−２に対して標的化されたオリゴヌクレオチド配列、ならびにｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子配列を図３および図４に示す。
【０２６２】
実施例６
ｃ−ｍｙｃ
本実施例では、癌細胞系の増殖を抑制するためにｃ−ｍｙｃ遺伝子のプロモーターに対して標的化されたオリゴヌクレオチド化合物の能力を記載する。実験は、実施例１に記載されたとおり実施した。この結果を図１７および図２３に示す。ｃ−ｍｙｃに対して標的化されたオリゴヌクレオチド配列ならびにｃ−ｍｙｃ遺伝子配列を図９および図１０に示す。
【０２６３】
実施例７
ＴＧＦ−α
本実施例では、癌細胞系の増殖を阻害するためにＴＧＦ−α遺伝子のプロモーターに対して標的化されたオリゴヌクレオチド化合物の能力を記載する。実験は、実施例１に記載されたとおり実施した。この結果を図１８および図２４に示す。ＴＧＦ−αに対して標的化されたオリゴヌクレオチド配列ならびにＴＧＦ−α遺伝子配列を図１１および図１２に示す。
【０２６４】
実施例８
非メチル化オリゴヌクレオチドによる細胞増殖の抑制
本実施例では、Ｂｃｌ−２に対して標的化された非メチル化オリゴヌクレオチドによるリンパ腫細胞系の増殖阻害を記載する。ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ細胞は、２ｘ１０５細胞／ウェルの２４ウェルプレートでｔ＝２４時間で平板培養した。収集される各時点で、三対のウェルを、指定された濃度でオリゴ（ｏｌｉｇｏｓ）を用いてｔ＝０で処理した。対照は、三対で平板培養した。プレートを３７℃でインキュベートした。全ての培養物を、トリパンブルー染色および血球計数器を用いて４日間２４時間毎に細胞数および生存度による実験を通してモニターした。
【０２６５】
ＭＡＢＬ２オリゴヌクレオチドは、Ｂｃｌ−２［５’−ＣＡＸ  ＧＣＡ  ＸＧＸ  ＧＣＡ  ＴＣＣ  ＣＸＧ  ＣＣＸ  ＧＴＧ−３’］（配列番号：３）のプロモーター領域に標的化する。Ｐｈｏ−Ｍａｂｌ−２は、ＭＡＢＬ−２［５’−ＣＡＣ  ＧＣＡ  ＣＧＣ  ＧＣＡ  ＴＣＣ  ＣＣＧ  ＣＣＣ  ＧＴＧ−３’］（配列番号：１４３８）の非メチル化バージョンである。ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ−ヒトＢ細胞リンパ腫（低度の濾胞性開裂中細胞型リンパ腫）から由来。実験プロトコルを表２に示す。
【０２６６】
【表３】
0005922913.tif 000019
【０２６７】
この結果を図３１に示す。この結果は、Ｂｃｌ−２に対する非メチル化オリゴヌクレオチドは、細胞増殖を阻害する上でメチル化オリゴヌクレオチドと同じ程度有効であることを示している。
【０２６８】
実施例９
腫瘍増殖のインビボ抑制
本実施例では、ヒト前立腺癌モデルにおいて本発明のオリゴヌクレオチド類により腫瘍増殖阻害を記載する。
【０２６９】
動物：ヒトＰＣ−３ＧＦＰ前立腺癌皮下モデルを利用した（例えば、ヤング（Ｙａｎｇ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９、７８１−７８６頁、［１９９９］；グリンスキー（Ｇｌｉｎｓｋｉｉ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３、４２３９−４２４３頁、［２００３］；およびカリキン（Ｋａｌｉｋｉｎ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：６、１７−２１頁［２００３］を参照）。５週齢から６週齢の間のオス胸腺欠損ＭＣｒヌードマウスを用いた。動物を飼育し、オートクレーブにより滅菌されたケージ、食餌および敷わらを有するＨＥＰＡろ過環境中で維持した。飼育ペインルス（ｐａｉｎｒｓ）は、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｑｕａｌｉｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ）から入手した。動物飼料（５０１０オートクレーブ可能なげっ歯類飼料）は、ＰＭＩニュートリションインターナショナル（ＰＭＩ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社（Ｂｒｅｎｔｗｏｏｄ、ミズーリ州）から入手した。全部で６０匹のオス動物を試験用に用いた。
【０２７０】
試験薬物：核酸を基にしたオリゴ化合物ＰＮＴ１００およびカチオン性リポソーム送達（ＬＤＶ）製剤とのスクランブル化オリゴ対照ＰＮＴ−Ｃ。
【０２７１】
ＧＦＰ発現ベクター：ｐＬＥＩＮは、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、カリフォルニア州）から入手した。このベクターは、増強されたＧＦＰおよび内部リボソーム侵入部位を含有する同じバイシストロニックなメッセージでネオマイシン耐性遺伝子を発現する。
【０２７２】
細胞培養、ベクター産物、トランスフェクション、およびサブクローニング：１０ＡＩウィルスエンベロープを発現する、ＮＩＨ３Ｔ３誘導パッケージング細胞系であるＰＴ６７は、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から購入した。ＰＴ６７細胞を、１０％胎仔ウシ血清を添加したＤＭＥＭ中で培養した。ベクター産生に関して、７０％コンフルエンスでのパッケージング細胞（ＰＴ６７）を、硫酸Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシル）プロピル］−Ｎ，Ｎ，トリメチルアンモニウムメチル試薬および飽和量のｐＬＥＩＮプラスミドの沈殿混合物と共に１８時間インキュベーションした。新鮮な培地をこの時点で補充した。細胞は、トランスフェクション４８時間後に蛍光顕微鏡により調べた。選択のため、細胞を２００〜１０００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８の存在下で７日間培養した。
【０２７３】
ＰＣ−３−ＧＦＰ細胞のＧＦＰ遺伝子の形質導入：ＧＦＰ遺伝子の形質導入に関して、２０％コンフルエンスＰＣ−３細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１４３５）を、ＰＴ６７細胞のレトロウィルス上澄液および７％胎仔ウシ血清を含有するハム（Ｈａｍ）のＦ−１２Ｋの１：１の予め沈殿させた混合物と共に７２時間インキュベートした。新鮮な培地をこの時点で補充した。ＰＣ−３細胞を、形質導入７２時間後にトリプシンＥＤＴＡにより収集し、２００μｇ／ｍｌ  ６４１８を含んだ選択培地に１：１５の比率で継代培養した。６４１８のレベルを、ステップ毎に１０００Ｎｇ／ｍｌに増加した。ＧＦＰを発現する最も輝いたＰＣ−３細胞クローンを選択し、合わせてから、増幅させ、従来の培養法に移行させた。
【０２７４】
皮下腫瘍増殖：腫瘍ストックを、５ｘ１０６細胞／２００μｌの濃度でＰＣ−３−ＧＦＰ細胞をヌードマウスの側腹部に皮下注入することにより作製した。マウスの皮下に成長した腫瘍の強いＧＦＰ発現が、収集前に証明された。ヌードマウスの皮下成長から収集された腫瘍組織を検査し、壊死のひどい組織または壊死の疑いのある組織または非ＧＦＰ腫瘍組織を除いた。引き続き腫瘍組織を、凡そ２ｍｍ３の小断片に切断した。
【０２７５】
皮下組織断片の移植：前立腺癌ＰＣ−３ＧＦＰの腫瘍ストックは、ＰＣ−３ＧＦＰ細胞をヌードマウスの側腹部に皮下注入することにより確立した。この腫瘍は、使用前の腫瘍ストックとしてヌードマウスの皮下に維持された。移植前に、ＰＣ−３ＧＦＰ腫瘍組織の強いＧＦＰ発現は、蛍光灯により確認された。移植日に、腫瘍を皮下部位から収集し、ＲＰＭＩ−１６４０培地に入れた。壊死組織を除き、生存組織を２ｍｍ３片に切断した。次に組織断片を、ヌードマウスの右側腹部に皮下移植した。
【０２７６】
腫瘍および転移を発現する緑蛍光タンパク質の全身光学的画像：水銀ランプ電源装置を具備したライカ（Ｌｅｉｃａ）ステレオ蛍光顕微鏡モデルＬＺ１２を用いた。ＧＦＰの選択的励起は、Ｄ４２５／６０バンドパスフィルタおよび４７０  ＤＣＸＲダイクロイックミラーを通して生じた。放射蛍光は、１３１７ｘ１０３５ピクセルチップにより、ＳＴ−１３３Ｍｉｃｒｏｍａｘ  Ｈｉｇｈ  Ｓｐｅｅｄ  ＴＥＡ／ＣＣＤ−１３１７Ｋ１熱電冷却カメラ（プリンストン・インスルメンツ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、Ｔｒｅｎｔｏｎ、ニュージャージー州）上のロングパスフィルタＧＧ４７５（クローマ・テクノロジー（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ、バーモント州）を通して回収した。実験を制御し、画像をコントラストと明るさについて処理し、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ３．１ソフトウェア（メディア・才バーネチクス（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ、メリーランド州）の補助により分析した。高分解能画像を、コンピュータまたは連続的ビデオ出力を通して直接取り込んだ。
【０２７７】
試験動物：試験に用いられた全部で６０匹のマウスは、術後１２日目に６群に分けられた。各コホート条件の各群を無作為に選択した。
【０２７８】
処置開始：一次腫瘍が５０〜１００ｍｍ３の推定堆積に達した場合。
【０２７９】
試験計画を表４に示す。
【０２８０】
【表４】
0005922913.tif 000020
【０２８１】
データ収集：
腫瘍サイズ：各動物を、試験終了までカリパス測定による腫瘍成長に関して週１回チェックした。経時的腫瘍体積応答を算出するために、４０日間に亘る測定を実施した。凡その腫瘍体積は、式１／２（ａｘｂ）[式中ｂは、２つの垂直直径のうちのより小さな和である]を用いて算出した。概算腫瘍体積を、式（ＷｘＬ）ｘ１／２により算出した。
【０２８２】
ＧＦＰ画像：移植１２日後に、ＧＦＰ発現腫瘍の全身光学的画像を週１回撮った。
【０２８３】
体重：全動物に関する体重は、試験期間の間、週１回重量を量った。電子計量器を用いて体重を測定した。
【０２８４】
終了：最終腫瘍重量は、試験の４６日目に動物を屠殺した後に得た。各腫瘍は、電子計量器を用いて重量を量った。
【０２８５】
有効性評価に用いた統計的方法：６群全ての腫瘍体積および最終腫瘍重量を、ａｎ＝０．０５（両側性）によるスチューデントｔ２検定を用いて分析した。
【０２８６】
結果：これらの結果を図３２〜３５に示す。図３２は、ＰＮＴ−１００および／またはＴＡＸＯＴＥＲＥによる処置後のＰＣ−３ＧＦＰ前立腺癌皮下モデルにおける腫瘍の平均体積を示す。図３３は、ＰＮＴ−１００および／またはＴＡＸＯＴＥＲＥによる処置後のＰＣ−３ＧＦＰ前立腺癌皮下モデルにおける腫瘍の平均体重を示す。図３４は、ＰＮＴ−１００および／またはＴＡＸＯＴＥＲＥによる処置後のＰＣ−３ＧＦＰ前立腺癌皮下モデルにおける腫瘍の平均腫瘍体積を示す。図３５は、ＰＮＴ−１００および／またはＴＡＸＯＴＥＲＥによる処置後のＰＣ−３ＧＦＰ前立腺癌皮下モデルにおける腫瘍の最終平均腫瘍体積を示す。これらの結果は、ＰＮＴ−１００が腫瘍サイズを低下したことを示している。この効果は、ＴＡＸＯＴＥＲＥの存在下で増加した。
【０２８７】
実施例１０  腫瘍成長のインビボ抑制
本実施例では、ヒト前立腺癌モデルにおいて本発明のオリゴヌクレオチド類のインビボ送達による腫瘍成長の阻害を説明する。
１）種々の血管新生状態で無作為化された異種移植を用いてｉ．ｖ．投与されたＰＮＴ１００に対するＰＣ−３前立腺異種移植腫瘍応答を調査した。この実験は、５日間の一日用量が１ｍｇ／ｋｇのＰＮＴ１００による２ステップのネオフェクチン製剤により実施された。この投薬措置でマウスの全てが、注目すべき毒性応答なしに生存した。
ＩＩ）ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２異種移植のｉ．ｖ．ＰＮＴ１００試験：非ホジキンリンパ腫モデル（ＮＨＬ）におけるＰＮＴ１００−ネオフェクチンのｉ．ｖ．送達および有効性を確立するために、二次的試験を実施した。該試験は、５日間の一日の用量が５ｍｇ／ｋｇのＰＮＴ１００を投与するために計画し、特定のコホートにおいて、ビンクリスチンとの併用療法を計画した。ＰＮＴの１回の用量後、ＰＮＴ１００およびＰＮＴ−Ｃを注射した動物（スクランブル化対照）において顕著な体重損失が見られた。このデータにより、ＰＮＴ１００とＰＮＴ−Ｃとの併用療法の実質的な効果が示されている。ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２移植２０日後の腫瘍負荷量を示す結果から、ＰＮＴ−１００単独、およびビンクリスチンとの併用により、マウスにおける腫瘍が退縮することが示された。
【０２８８】
上記明細書に記述された全ての刊行物および特許は、参考文献として本明細書に組み込まれる。記載された方法および本発明の系に関する種々の修飾および変型は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者にとって明らかとなろう。本発明は、特定の好ましい実施態様と関連して記載されているが、主張されている本発明は、このような特定の実施態様に対して過度に限定してはならないことを理解されるべきである。実際、関連分野の当業者にとって明白である本発明を実施するために記載された様式の種々の修飾は、添付の特許の請求の範囲内にあると意図されている。
【図１】
0005922913.tif 000021
【図２−１】
0005922913.tif 000022
【図２−２】
0005922913.tif 000023
【図２−３】
0005922913.tif 000024
【図２−４】
0005922913.tif 000025
【図３】
0005922913.tif 000026
【図４−１】
0005922913.tif 000027
【図４−２】
0005922913.tif 000028
【図５】
0005922913.tif 000029
【図６−１】
0005922913.tif 000030
【図６−２】
0005922913.tif 000031
【図６−３】
0005922913.tif 000032
【図７】
0005922913.tif 000033
【図８−１】
0005922913.tif 000034
【図８−２】
0005922913.tif 000035
【図８−３】
0005922913.tif 000036
【図８−４】
0005922913.tif 000037
【図８−５】
0005922913.tif 000038
【図９】
0005922913.tif 000039
【図１０−１】
0005922913.tif 000040
【図１０−２】
0005922913.tif 000041
【図１０−３】
0005922913.tif 000042
【図１１】
0005922913.tif 000043
【図１２−１】
0005922913.tif 000044
【図１２−２】
0005922913.tif 000045
【図１２−３】
0005922913.tif 000046
【図１２−４】
0005922913.tif 000047
【図１３】
0005922913.tif 000048
【図１４−１】
0005922913.tif 000049
【図１４−２】
0005922913.tif 000050
【図１４−３】
0005922913.tif 000051
【図１５−１】
0005922913.tif 000052
【図１５−２】
0005922913.tif 000053
【図１６−１】
0005922913.tif 000054
【図１６−２】
0005922913.tif 000055
【図１６−３】
0005922913.tif 000056
【図１６−４】
0005922913.tif 000057
【図１７−１】
0005922913.tif 000058
【図１７−２】
0005922913.tif 000059
【図１８−１】
0005922913.tif 000060
【図１８−２】
0005922913.tif 000061
【図１９】
0005922913.tif 000062
【図２０】
0005922913.tif 000063
【図２１】
0005922913.tif 000064
【図２２】
0005922913.tif 000065
【図２３】
0005922913.tif 000066
【図２４】
0005922913.tif 000067
【図２５−１】
0005922913.tif 000068
【図２５−２】
0005922913.tif 000069
【図２５−３】
0005922913.tif 000070
【図２６−１】
0005922913.tif 000071
【図２６−２】
0005922913.tif 000072
【図２６−３】
0005922913.tif 000073
【図２７−１】
0005922913.tif 000074
【図２７−２】
0005922913.tif 000075
【図２７−３】
0005922913.tif 000076
【図２７−４】
0005922913.tif 000077
【図２７−５】
0005922913.tif 000078
【図２８−１】
0005922913.tif 000079
【図２８−２】
0005922913.tif 000080
【図２８−３】
0005922913.tif 000081
【図２８−４】
0005922913.tif 000082
【図２８−５】
0005922913.tif 000083
【図２８−６】
0005922913.tif 000084
【図２８−７】
0005922913.tif 000085
【図２８−８】
0005922913.tif 000086
【図２９−１】
0005922913.tif 000087
【図２９−２】
0005922913.tif 000088
【図２９−３】
0005922913.tif 000089
【図３０−１】
0005922913.tif 000090
【図３０−２】
0005922913.tif 000091
【図３０−３】
0005922913.tif 000092
【図３１】
0005922913.tif 000093
【図３２】
0005922913.tif 000094
【図３３】
0005922913.tif 000095
【図３４】
0005922913.tif 000096
【図３５】
0005922913.tif 000097
【配列表】
0005922913000001.app