(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚の老化の予防および／もしくは低減ならびに／または皮膚を水和するための候補化合物をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
ａ．少なくとも１種の試験化合物を、ケラチノサイトサンプルと接触させる工程、
ｂ．前記ケラチノサイトにおける、ＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を測定する工程、
ｃ．非処理ケラチノサイトと比較して、ａ．で処理されたケラチノサイトにおいて前記遺伝子の少なくとも１種の発現の少なくとも１．４倍の活性化が測定された化合物を選択する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記遺伝子の少なくとも１種の発現の前記活性化が少なくとも１．６倍であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ｂ．が、工程ａ．の前および後に行われることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ａ’．少なくとも２つのケラチノサイトサンプルを調製する工程、
ａ．サンプルの一方を少なくとも１種の試験化合物と接触させる工程、続いて、
ｂ．前記サンプルにおける、ＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を測定する工程、および
ｃ．非処理ケラチノサイトと比較して、ａ．で処理されたケラチノサイトにおいて前記遺伝子の少なくとも１種の発現の少なくとも１．４倍の活性化が測定された化合物を選択する工程
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子の少なくとも１種の発現の前記活性化が、少なくとも１．６倍であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が、対応する遺伝子のｍＲＮＡを定量することによって測定されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が、対応する遺伝子によってコードされたタンパク質を定量することによって測定されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＬＡＲＧＥ遺伝子の発現が、工程ｂ．で測定されることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
試験化合物が、植物抽出物から選択されることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｃ．で測定された前記遺伝子の少なくとも１種の発現の活性化が、非処理ケラチノサイトと比較して少なくとも２倍であることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
光老化を予防および／または低減させる候補化合物をスクリーニングするための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、老化、特に光老化の予防および／もしくは低減ならびに／または皮膚を水和するためのＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を活性化する化合物の同定および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
翻訳後修飾、特にグリカン合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子は、グリコシルトランスフェラーゼおよびスルホトランスフェラーゼを含み、細胞の情報伝達および活性を調節するのに必須である。ＬＡＲＧＥ、ＳＴ８ＳＩＡ１およびＨＳ６ＳＴ２遺伝子によってコードされたグリカン合成および修飾酵素は、ゴルジ体に存在する。
【０００３】
正確には、ＬＡＲＧＥ遺伝子は、α−ジストログリカン（α−ＤＧ）のグリコシル化に関与するＮ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼをコードする（Hewitt J E. Investigating the functions of LARGE: lessons from mutant mice. Methods Enzymol 2010: 479: 367-386, Hewitt J E. Abnormal glycosylation of dystroglycan in human genetic disease. Biochim Biophys Acta 2009: 1792: 853-861）。
【０００４】
α−ＤＧは、基底膜と細胞膜との境界面で発現される主要な非インテグリン接着分子であり、細胞骨格アクチンを細胞外マトリックスに連結させ、接着とシグナル伝達経路の調節とに関与する可能性がある（Ibraghimov-Beskrovnaya O, Ervasti J M, Leveille C J, Slaughter C A, Sernett S W, Campbell K P. Primary structure of dystrophin-associated glycoproteins linking dystrophin to the extracellular matrix. Nature 1992: 355: 696-702, Barresi R, Campbell K P. Dystroglycan: from biosynthesis to pathogenesis of human disease. J Cell Sci 2006: 119: 199-207）。α−ＤＧは、細胞外マトリックス受容体として機能するために大規模な翻訳後プロセシングを必要とする（Yoshida-Moriguchi T, Yu L, Stalnaker S H, et al. O-mannosyl phosphorylation of alpha-dystroglycan is required for laminin binding. Science 2010: 327: 88-92）。α−ＤＧは、増殖の制御、細胞内部および外部の張力をもたらす可能性がある細胞骨格の組織化、細胞の極性化、分化、および運動などの種々の細胞の機能に関与している（Sgambato A, Caredda E, Leocata P, et al. Expression of alpha-dystroglycan correlates with tumour grade and predicts survival in oral squamous cell carcinoma. Pathology 2010: 42: 248-254）。
【０００５】
α−ＤＧは、上皮細胞で発現され、上皮の成長に必須である。α−ＤＧの主要なリガンドであるパールカン（perlecan）が欠乏すると、α−ＤＧの脱落が強化され、上皮のＤＧ複合体が不安定になり、タンパク質分解処理を受けやすくなる（Herzog C, Has C, Franzke C W, et al. Dystroglycan in skin and cutaneous cells: beta-subunit is shed from the cell surface. J Invest Dermatol 2004: 122: 1372-1380）。
【０００６】
ヒトＬＡＲＧＥ遺伝子は、機能的なα−ＤＧの生成およびα−ＤＧのリガンドの結合活性に必要である（Yoshida-Moriguchi T, Yu L, Stalnaker S H, et al. O-mannosyl phosphorylation of alpha-dystroglycan is required for laminin binding. Science 2010: 327: 88-92）。
【０００７】
α−ＤＧの異常なグリコシル化は、ラミニンおよびその他の細胞外マトリックスタンパク質への結合を壊し、その結果、ジストログリカノパチーと称される病気を引き起こす（Moore C J, Goh H T, Hewitt J E. Genes required for functional glycosylation of dystroglycan are conserved in zebrafish. Genomics 2008: 92: 159-167; Martin P T. Congenital muscular dystrophies involving the O-mannose pathway. Curr Mol Med 2007: 7: 417-425; Moore C J, Hewitt J E. Dystroglycan glycosylation and muscular dystrophy. Glycoconj J 2009: 26: 349-357）。ジストログリカノパチーは、主としてこのようなα−ＤＧグリコシル化の欠乏に起因すると推測される臨床表現型（特に、筋ジストロフィー、ＣＮＳ異常、および目の欠陥）を示す。さらにＬＡＲＧＥの不活性化突然変異もα−ＤＧの機能的なグリコシル化を低減させ、その結果、マウスおよびヒトにおいてジストログリカノパチーを引き起こす。ヒトＬＡＲＧＥ遺伝子における突然変異が、ＭＤＣ１Ｄと称されるジストログリカノパチーの根源である（Longman C, Brockington M, Torelli S, et al. Mutations in the human LARGE gene cause MDC1D, a novel form of congenital muscular dystrophy with severe mental retardation and abnormal glycosylation of alpha-dystroglycan. Hum Mol Genet 2003: 12: 2853-2861）。マウスＬＡＲＧＥオーソログは、ヒトＬＡＲＧＥと９７．８％同一であり、マウスＬＡＲＧＥの欠失は、ＭＤＣ１Ｄに類似した筋ジストロフィーを発症するｍｙｄマウスの原因である。
【０００８】
異なるジストログリカノパチーを有する患者由来の培養線維芽細胞においてＬＡＲＧＥが過剰発現されると、機能的なα−ＤＧが生成される。ガラクトース、フコースまたはシアリン酸の複合糖質への転移が弱められた突然変異ＣＨＯ細胞では、ＬＡＲＧＥは、α−ＤＧグリコシル化を誘導することが可能であった。ＰＯＭＴ１またはＰＯＭＧｎＴ１などの、この経路の他の遺伝子で機能喪失型突然変異を有する細胞では、ＬＡＲＧＥの過剰発現は、α−ＤＧにおけるグリコシル化を誘導することができる。ＬＡＲＧＥのアップレギュレーションは、α−ＤＧのグリコシル化および機能を回復させることができるジストログリカノパチーの治療戦略とみなされている。
【０００９】
ＬＡＲＧＥ遺伝子のように、ＳＴ８ＳＩＡ１遺伝子は、ガングリオシド合成に関与するＩＩ型膜貫通タンパク質をコードする。ＨＳ６ＳＴ２遺伝子は、硫酸塩のヘパラン硫酸への転移を触媒する酵素をコードする。
【００１０】
したがって、細胞の老化、特にケラチノサイトの老化、より詳細にはＵＶによって誘発される細胞の老化を予防する、減少させる、またはさらに阻害する生成物または活性薬剤を提供することが望ましくかつ重要である。
【発明の概要】
【００１１】
したがって、本発明は、このような有用な薬剤を同定する方法を提供する。
【００１２】
したがって、本発明は、皮膚の老化の予防および／もしくは低減ならびに／または皮膚を水和するための候補化合物をスクリーニングするためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
ａ．少なくとも１種の試験化合物を、ケラチノサイトサンプルと接触させる工程、
ｂ．前記ケラチノサイトにおける、ＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を測定する工程、
ｃ．非処理ケラチノサイトと比較して、ａ．で処理されたケラチノサイトにおいて前記遺伝子の少なくとも１種の発現の少なくとも１．４倍の活性化が測定された化合物を選択する工程を含む方法に関する。
【００１３】
好ましい一つの実施形態において、本発明は、皮膚の老化の予防および／もしくは低減ならびに／または皮膚を水和するための候補化合物をスクリーニングするためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
ａ．少なくとも１種の試験化合物を、ケラチノサイトサンプルと接触させる工程、
ｂ．前記ケラチノサイトにおける、ＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を測定する工程、
ｃ．非処理ケラチノサイトと比較して、ａ．で処理されたケラチノサイトにおいて前記遺伝子の少なくとも１種の発現の少なくとも１．６倍の活性化が測定された化合物を選択する工程を含む方法に関する。
【００１４】
第一の実施形態によれば、工程ｂ．は、工程ａ．の前および後に行われる。このケースにおいて、工程ａ．の前にケラチノサイトで測定されたＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現は、対照値（すなわち非処理ケラチノサイト）に相当する。
【００１５】
したがって、工程ｃ．は、ａ．で処理されたケラチノサイトにおいて、ＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現の、工程ａ．の前の同じケラチノサイトと比較して少なくとも１．４倍の活性化が測定された化合物を選択することを含む。
【００１６】
好ましい一つの実施形態において、工程ｃ．は、ａ．で処理されたケラチノサイトにおいて、ＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現の、工程ａ．の前の同じケラチノサイトと比較して少なくとも１．６倍の活性化が測定された化合物を選択することを含む。
【００１７】
その他の実施形態によれば、本方法は、ケラチノサイトサンプルを調製する第一の工程ａ’．を含む。したがって、好ましくは、本発明は、皮膚の老化の予防および／もしくは低減ならびに／または皮膚を水和するための候補化合物をスクリーニングするためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、以下の
ａ’．少なくとも２つのケラチノサイトサンプルを調製する工程、
ａ．サンプルの一方を少なくとも１種の試験化合物と接触させる工程、続いて、
ｂ．前記サンプルにおける、ＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を測定する工程、および
ｃ．非処理ケラチノサイトと比較して、ａ．で処理されたケラチノサイトにおいて前記遺伝子の少なくとも１種の発現の少なくとも１．４倍の活性化が測定された化合物を選択する工程を含む方法に関する。
【００１８】
この第二の実施形態において、工程ａ．を受けていないケラチノサイトサンプルで測定されたＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現は、対照値（すなわち非処理ケラチノサイト）に相当する。
【００１９】
好ましい一実施形態によれば、本方法は、ケラチノサイトサンプルを調製する第一の工程ａ’．を含む。したがって、好ましくは、本発明は、皮膚の老化の予防および／もしくは低減ならびに／または皮膚を水和するための候補化合物をスクリーニングするためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
ａ’．少なくとも２つのケラチノサイトサンプルを調製する工程、
ａ．サンプルの一方を少なくとも１種の試験化合物と接触させる工程、続いて、
ｂ．前記サンプルにおける、ＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を測定する工程、および
ｃ．非処理ケラチノサイトと比較して、ａ．で処理されたケラチノサイトにおいて前記遺伝子の少なくとも１種の発現の少なくとも１．６倍の活性化が測定された化合物を選択する工程を含む方法に関する。
【００２０】
この第二の実施形態において、工程ａ．を受けていないケラチノサイトサンプルで測定されたＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現は、対照値（すなわち非処理ケラチノサイト）に相当する。
また、本出願が提供する発明として、以下に例示するものが挙げられる。
[１]  皮膚の老化の予防および／もしくは低減ならびに／または皮膚を水和するための候補化合物をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
ａ．少なくとも１種の試験化合物を、ケラチノサイトサンプルと接触させる工程、
ｂ．前記ケラチノサイトにおける、ＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を測定する工程、
ｃ．非処理ケラチノサイトと比較して、ａ．で処理されたケラチノサイトにおいて前記遺伝子の少なくとも１種の発現の少なくとも１．４倍の活性化が測定された化合物を選択する工程
を含む、方法。
[２]  前記遺伝子の少なくとも１種の発現の前記活性化が少なくとも１．６倍であることを特徴とする、[１]に記載の方法。
[３]  工程ｂ．が、工程ａ．の前および後に行われることを特徴とする、[１]または[２]に記載の方法。
[４]  ａ’．少なくとも２つのケラチノサイトサンプルを調製する工程、
ａ．サンプルの一方を少なくとも１種の試験化合物と接触させる工程、続いて、
ｂ．前記サンプルにおける、ＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を測定する工程、および
ｃ．非処理ケラチノサイトと比較して、ａ．で処理されたケラチノサイトにおいて前記遺伝子の少なくとも１種の発現の少なくとも１．４倍の活性化が測定された化合物を選択する工程
を含むことを特徴とする、[１]に記載の方法。
[５]  前記遺伝子の少なくとも１種の発現の前記活性化が、少なくとも１．６倍であることを特徴とする、[４]に記載の方法。
[６]  ＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が、対応する遺伝子のｍＲＮＡを定量することによって測定されることを特徴とする、[１]から[５]のいずれか一項に記載の方法。
[７]  ＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が、対応する遺伝子によってコードされたタンパク質を定量することによって測定されることを特徴とする、[１]から[５]のいずれか一項に記載の方法。
[８]  ＬＡＲＧＥ遺伝子の発現が、工程ｂ．で測定されることを特徴とする、[１]から[７]のいずれか一項に記載の方法。
[９]  試験化合物が、植物抽出物から選択されることを特徴とする、[１]から[８]のいずれか一項に記載の方法。
[１０]  工程ｃ．で測定された前記遺伝子の少なくとも１種の発現の活性化が、非処理ケラチノサイトと比較して少なくとも２倍であることを特徴とする、[１]から[９]のいずれか一項に記載の方法。
[１１]  光老化を予防および／または低減させる候補化合物をスクリーニングするための、[１]から[１０]のいずれか一項に記載の方法。
[１２]  ＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現の活性化剤であって、[１]から[１１]のいずれか一項に記載の方法に従って得ることができ、皮膚の老化の予防および／もしくは低減ならびに／または皮膚を水和するための活性化剤の化粧用の使用。
[１３]  ＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現の活性化剤であって、[１]から[１１]のいずれか一項に記載の方法に従って得ることができ、皮膚の老化の予防および／もしくは低減ならびに／または皮膚を水和するための活性化剤。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
「皮膚の老化」という表現は、老化による、好ましくは光誘起性の老化または光老化による皮膚の外観のあらゆる変化、例えば、皺および小皺、しなびた皮膚、たるんだ皮膚、薄くなった皮膚、ならびに弾力および／または張りがなくなった皮膚など、加えて、外観の変化によって組織的に反映されない皮膚のあらゆる内部の変化、例えば、紫外線放射に晒された後のあらゆる皮膚の内部の劣化、特にコラーゲンの劣化などを意味する。
【００２２】
「皮膚を水和すること」は、特に、皮膚細胞の情報伝達および機能の改善、例えば皮膚細胞のバリア機能の改善等により、皮膚の自然な湿度を維持し、皮膚の乾燥を防ぐことを意味する。
【００２３】
試験化合物は、どのようなタイプのものであってもよい。試験化合物は、天然由来のものでもよいし、または、化学合成によって生成されたものでもよい。試験化合物としては、構造的に定義された化学物質、特性が決定されていない化合物もしくは物質、または化合物の混合物のライブラリーも含み得る。
【００２４】
天然化合物としては、動物由来、または草木などの植物由来の化合物が挙げられる。好ましくは、試験化合物は、植物性であり、好ましくは植物抽出物から選択される。
【００２５】
工程ａ．に従って、試験化合物をケラチノサイトサンプルと接触させる。
【００２６】
工程ｂ．に従って、前記ケラチノサイトにおいて、ＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が測定される。工程ｂ．において、好ましくはＬＡＲＧＥ遺伝子の発現が測定される。
【００２７】
実際には、驚くべきことに、ＬＡＲＧＥ遺伝子発現は、ＵＶＢ照射で減少することが出願人により示される。ＵＶＢ照射は、老化および脱水を悪化させることがよく知られている要因である。それゆえに、理論にとらわれずにいえば、皮膚が老化する間にＬＡＲＧＥ遺伝子発現の減少による異常なグリコシル化がいっそう進む可能性がある。これは、本発明に従って同定された化合物（複数可）の投与により直される可能性がある。
【００２８】
用語「ＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現」は、対応する遺伝子のｍＲＮＡ、または対応する遺伝子によってコードされたタンパク質を意味するものとする。したがって、前記遺伝子発現は、ｍＲＮＡまたはタンパク質を定量することにより測定が可能である。これは、実施例４、５および１２で特に示されている。
【００２９】
当業者は、対象の遺伝子のｍＲＮＡを定量的または半定量的に検出することにより前記遺伝子発現を決定する技術を熟知している。特異的なヌクレオチドプローブを用いたｍＲＮＡのハイブリダイゼーションに基づく技術が最も一般的であり、例えばノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）、定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）がある。
【００３０】
続いて、試験化合物で処理した後のＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現は、対照値、すなわち処理前に同じケラチノサイトで得られた値、または非処理の別のケラチノサイトサンプルで得られた値と比較される。
【００３１】
工程ｃ．に従って、有用な化合物は、非処理ケラチノサイトと比較して、ａ．で処理されたケラチノサイトにおいて前記遺伝子の少なくとも１種の発現の少なくとも１．４倍の活性化が測定された化合物である。好ましくは、前記遺伝子の少なくとも１種の発現の活性化は、少なくとも２倍の活性化である。
【００３２】
好ましい一つの実施形態において、工程ｃ．に従って、有用な化合物は、非処理ケラチノサイトと比較して、ａ．で処理されたケラチノサイトにおいて前記遺伝子の少なくとも１種の発現の少なくとも１．６倍の活性化が測定された化合物である。好ましくは、前記遺伝子の少なくとも１種の発現の活性化は、少なくとも２倍の活性化である。
【００３３】
本明細書において定義されたスクリーニング法によって選択された化合物は、その後、皮膚の老化および／または皮膚の水和に対するそれらの作用について、他のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルおよび／または（動物またはヒトにおける）ｉｎ  ｖｉｖｏモデルで試験することもできる。本発明に係る有用な化合物は、標的のＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２、および／またはＳＴ８ＳＩＡ１遺伝子の活性化剤である。
【００３４】
また本発明の主題は、皮膚の老化の予防および／もしくは低減ならびに／または皮膚を水和するための、上述した方法に従って得ることができるＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現の活性化剤の化粧用の使用でもある。
【００３５】
その他の態様によれば、本発明の目的は、皮膚の老化の予防および／もしくは低減ならびに／または皮膚を水和するための治療用組成物を作製するための、上述した方法に従って得ることができるＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現の少なくとも１種の活性化剤の使用である。したがって、本発明はまた、皮膚の老化の予防および／もしくは低減ならびに／または皮膚を水和するための、上述した方法に従って得ることができるＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２、およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現の少なくとも１種の活性化剤の使用にも関する。
【００３６】
活性化剤は、ＬＡＲＧＥ、ＨＳ６ＳＴ２およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現、すなわち対応する遺伝子の少なくとも１種によってコードされたｍＲＮＡまたはタンパク質の少なくとも１種の量を実質的に増加させる化合物を指す。用語「実質的に」は、少なくとも１．４倍、好ましくは少なくとも１．６倍、より好ましくは少なくとも２倍の増加を意味する。
【００３７】
活性化剤は、組成物の０．００１〜１０重量％の比率で、好ましくは組成物の０．０１〜５重量％の比率で用いることができる。
【００３８】
活性化剤は、有機分子から選択してもよいが、植物抽出物であってもよい。
【００３９】
上述のスクリーニング法によって同定された活性化剤は、生理学的に許容できるキャリアー、好ましくは美容用に許容される媒体、すなわち、毒性、不相容性、不安定またはアレルギー性応答の危険がない、ヒト皮膚と接触して使用するのに適した媒体、特に、使用者が受け入れ難いあらゆる不快感（発赤、突っ張り感、ひりひり感など）を引き起こさない媒体と組み合わせて組成物中に配合することができる。これらの組成物は、例えば経口的または局所的に投与してもよい。好ましくは、本組成物は、局所的に適用される。経口投与による場合、本組成物は、錠剤、ジェルカプセル、糖コーティング錠剤、シロップ、懸濁液、溶液、粉末、顆粒、エマルジョン、遅延放出のためのマイクロスフェアもしくはナノスフェアまたは脂質もしくは高分子小胞の懸濁液の形態であってもよい。局所投与による場合、本組成物は、より詳細には皮膚を治療するのに使用するためであり、軟膏、クリーム、ミルク、軟膏、粉末、含浸パッド、溶液、ゲル、スプレー、ローション、または懸濁液の形態であってもよい。本組成物はまた、遅延放出のための、マイクロスフェアもしくはナノスフェア、または脂質もしくは高分子小胞、または高分子パッチもしくはヒドロゲルの懸濁液の形態であってもよい。この局所適用のための組成物は、無水の形態、水を含む形態、またはエマルジョンの形態であってもよい。局所適用のための組成物は、水中油型、油中水型、もしくは複合エマルジョン（Ｗ／Ｏ／ＷまたはＯ／Ｗ／Ｏ）（これらは任意選択でマイクロエマルジョンもしくはナノエマルジョンであってもよい）の形態、または水性分散液、溶液、水性ゲル、または粉末の形態であってもよい。好ましい変形物において、本組成物は、ゲル、クリーム、またはローションの形態である。
【００４０】
本組成物の生理学的に許容できるキャリアーは、一般的には水を含み、任意選択でその他の溶媒、例えばエタノールを含む。
【００４１】
この組成物は、好ましくは顔および／または体の皮膚のためのケアおよび／またはクレンジング製品として用いられ、特に、例えばポンプディスペンサーボトル、エアロゾルまたはチューブ中に調整された流体、ゲルもしくはムースの形態であってもよいし、あるいは例えば広口瓶中に調整されたクリームの形態であってもよい。変形体として、本組成物は、メイクアップ製品、特にファンデーション、またはルースパウダーもしくはコンパクトパウダーの形態であってもよい。
【００４２】
本組成物は、様々な補助剤、例えば以下から選択される少なくとも１種の化合物等：
−  油、特に、以下から選択することができる油：直鎖または環状の、揮発性または不揮発性のシリコーンオイル、例えばポリジメチルシロキサン（ジメチコン）、ポリアルキルシクロシロキサン（シクロメチコン）、およびポリアルキルフェニルシロキサン（フェニルジメチコン）；合成油、例えばフルオロ油、アルキルベンゾエート、および分岐炭化水素、例えばポリイソブチレン；植物油、特にダイズ油、またはホホバ油；ならびにミネラルオイル、例えば液状のワセリン；
−  ワックス、例えばオゾケライト、ポリエチレンワックス、蜜蝋、またはカルナウバ蝋；
−  シリコーンエラストマー、特に、触媒の存在下で、少なくとも１つの反応性基（特に水素またはビニル）を含み、端部および／または側位に少なくとも１つのアルキル基（特にメチル）またはフェニルが結合しているポリシロキサンと、オルガノヒドロゲノポリシロキサンなどのオルガノシリコーンとを反応させることにより得られたシリコーンエラストマー；
−  界面活性剤、好ましくは乳化界面活性剤（これらは非イオン性、アニオン性、カチオン性または両性のいずれでもよい）、特に、ポリオールの脂肪酸エステル、例えばグリセロールの脂肪酸エステル、ソルビタンの脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールの脂肪酸エステル、およびスクロースの脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールの脂肪アルキルエーテル；アルキルポリグルコシド；ポリシロキサン変性ポリエーテル；ベタイン、およびそれらの誘導体；ポリクォータニウム（polyquaternium）；エトキシ化脂肪アルキル硫酸塩；スルホコハク酸塩；サルコシン酸塩；リン酸アルキルおよびジアルキル、ならびにそれらの塩；ならびに、脂肪酸石鹸；
−  補助界面活性剤、例えば直鎖脂肪族アルコール、特にセチルアルコール、およびステアリルアルコール；
−  増粘剤および／またはゲル化剤、特に、アクリロイルメチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）の、ならびに／またはアクリルアミドおよび／もしくはアクリル酸の、ならびに／またはアクリル酸塩もしくはエステルの、架橋または非架橋の、親水性または両親媒性ホモポリマーおよびコポリマー；キサンタンガムまたはグアールガム；セルロース誘導体；ならびにシリコーンゴム（ジメチコノール）；
−  有機遮断剤、例えばジベンゾイルメタン誘導体（例えば、ブチル−メトキシジベンゾイルメタンなど）、ケイ皮酸誘導体（例えば、エチルヘキシルメトキシシンナメートなど）、サリチル酸塩、パラ−アミノ安息香酸、β，β’−ジフェニルアクリレート、ベンゾフェノン、ベンジリデンカンファー誘導体、フェニルベンズイミダゾール、トリアジン、フェニルベンゾトリアゾール、およびアントラニル酸誘導体；
−  無機遮断剤、コーティングされたまたはコーティングされていない顔料またはナノ顔料の形態の鉱物酸化物をベースとするもの、特に二酸化チタンまたは酸化亜鉛をベースとするもの；
−  染料；
−  保存剤；
−  金属イオン封鎖剤、例えばＥＤＴＡ塩；
−  芳香剤；
−  およびそれらの混合物を含んでもよいが、ここで列挙されたものに限定されない。
【００４３】
このような補助剤の例としては、特に、本発明に係る組成物において追加成分として使用するのに適したスキンケア産業で一般的に用いられる化粧品および薬剤成分の制限のない様々な種類を記載しているＣＴＦＡディクショナリー（The Cosmetic, Toiletry and Fragrance Associationによって出版されたInternational Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, 11th edition, 2006）で述べられているものが挙げられる。
【００４４】
本組成物はまた、光学効果を有する少なくとも１種の化合物、例えばフィラー、顔料、真珠層、張り剤（tensioning agent）、およびマット化ポリマー（matting polymer）、ならびにそれらの混合物を含んでいてもよい。
【００４５】
用語「フィラー」は、適用直後に、組成物に量感または堅さおよび／もしくは柔らかさ、マット作用、ならびに均一性を付与するのに適した、無色または白色の、鉱物性または合成の、層状または非層状の粒子を意味するものと理解されたい。フィラーとしては、特に、タルク、雲母、シリカ、カオリン、Ｎｙｌｏｎ（登録商標）粉末、例えばナイロン−１２（Ａｔｏｃｈｅｍ社により販売されているＯｒｇａｓｏｌ（登録商標））、ポリエチレン粉末、ポリウレタン粉末、ポリスチレン粉末、ポリエステル粉末、任意選択で加工デンプン、シリコーン樹脂マイクロビーズ、例えば東芝（Ｔｏｓｈｉｂａ）社によりＴｏｓｐｅａｒｌ（登録商標）という名称で販売されているもの、ヒドロキシアパタイト、および中空シリカマイクロスフェア（Ｍａｐｒｅｃｏｓ社のＳｉｌｉｃａ  Ｂｅａｄｓ（登録商標））が挙げられる。
【００４６】
用語「顔料」は、組成物を着色し、かつ／または不透明化することを目的とした、媒体に溶解しない白色または有色の鉱物性または有機性粒子を意味するものと理解されたい。顔料は、標準的なサイズのものであってもよし、またはナノメートルサイズのものであってもよい。鉱物質顔料のなかでも特に、二酸化チタン、二酸化ジルコニウム、および二酸化セリウムが挙げられ、さらに酸化亜鉛、酸化鉄、および酸化クロムも挙げられ得る。
【００４７】
用語「真珠層」は、光を反射する、真珠光沢を有する粒子を意味するものと理解されたい。想定され得る真珠層のなかでも特に、天然の真珠母、酸化チタン、酸化鉄、天然顔料またはオキシ塩化ビスマスでコーティングされた雲母が挙げられ、さらに有色のチタンマイカも挙げ得る。
【００４８】
これらのフィラーおよび／または顔料および／または真珠層の水相中の質量濃度は、組成物の総重量に対して一般的には０．１％〜２０％、好ましくは０．２％〜７重量％である。
【００４９】
用語「張り剤」は、皮膚を緊張した状態にして、この張り作用を用いて皮膚を滑らかにすることに適した化合物、および皺および小皺を少なくすること、またはさらに皮膚から皺および小皺を即座に除去することにも適した化合物を意味するものと理解されたい。張り剤としては、天然由来のポリマーを挙げ得る。用語「天然由来のポリマー」は、植物由来ポリマー、外皮に由来するポリマー、卵タンパク質、および天然由来のラテックスを意味する。これらのポリマーは、好ましくは親水性である。植物由来ポリマーとしては、タンパク質、およびタンパク質加水分解物が挙げられ、より詳細には穀草、豆類および油産出植物の抽出物、例えばトウモロコシ、ライ、コムギ、ソバ、ゴマ、スペルトコムギ、エンドウマメ、インゲンマメ、レンズマメ、ダイズおよびルピナスの抽出物を挙げ得る。合成ポリマーは、一般的にはラテックスまたは擬似ラテックスの形態であり、重縮合型であってもよいし、またはフリーラジカルの重合により得てもよい。特に、ポリエステル／ポリウレタン、およびポリエーテル／ポリウレタンの分散系を挙げ得る。好ましくは、緊張剤は、ＰＶＰ／ジメチコニルアクリレートおよび親水性ポリウレタンのコポリマー（Ｈｙｄｒｏｍｅｒ社のＡｑｕａｍｅｒｅ  Ｓ−２００１（登録商標））である。
【００５０】
用語「マット化ポリマー」は、本明細書において、皮膚の光沢を減らして顔色を一様にする、溶液中、分散系中の、または粒子の形態のあらゆるポリマーを意味する。例としては、シリコーンエラストマー；樹脂粒子；およびそれらの混合物を挙げ得る。シリコーンエラストマーの例としては、信越化学工業株式会社（Ｓｈｉｎ−Ｅｔｓｕ）によってＫＳＧ（登録商標）という名称で販売されている製品、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ社によりＴｒｅｆｉｌ（登録商標）、ＢＹ２９（登録商標）もしくはＥＰＳＸ（登録商標）という名称で販売されている製品、またはＧｒａｎｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社によりＧｒａｎｓｉｌ（登録商標）という名称で販売されている製品を挙げ得る。
【００５１】
また本発明に従って用いられる組成物は、活性化剤以外の作用薬剤、特に以下から選択される少なくとも１種の作用薬剤：増殖因子の産生を刺激する薬剤；抗糖化または脱糖化剤；コラーゲン合成を増加させる、またはその分解を予防する薬剤（抗コラゲナーゼ剤、特にマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤）；エラスチン合成を増加させる、またはその分解を予防する薬剤（抗エラスターゼ剤）；インテグリンまたはテンシンなどの接着斑成分の合成を刺激する薬剤；グリコサミノグリカンまたはプロテオグリカン合成を増加させる、またはそれらの分解を予防する薬剤（抗プロテオグリカナーゼ剤）；線維芽細胞増殖を増加させる薬剤；色素脱失剤または色素沈着抑制剤；抗酸化剤もしくはフリーラジカル捕捉剤、または防汚剤；およびそれらの混合物を含んでいてもよいが、ここで列挙されたものに限定されない。
【００５２】
このような薬剤の例は、特に：植物抽出物、特にコンドラス・クリスパス（Chondrus crispus）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）、エンドウ（Pisum sativum）（Ｐｒｏｔｅａｓｙｌ（登録商標）ＴＰ  ＬＳ）、センテラ・アジアティカ（Centella asiatica）、セネデスムス（Scenedesmus）、モリンガ・プテリゴスペルマ（Moringa pterygosperma）、ウィッチヘーゼル、クリ（Castanea sativa）、ハイビスカス・サブダリファ（Hibiscus sabdriffa）、ポリアンテス・ツベロサ（Polianthes tuberosa）、アルガニア・スピノサ（Argania spinosa）、アロエベラ、ナルキッソス・タルゼッタ（Narcissus tarzetta）、またはカンゾウの抽出物；ダイダイ（Citrus aurantium）（ネロリ）のエッセンシャルオイル；α−ヒドロキシ酸、例えばグリコール酸、乳酸、およびクエン酸、ならびにそれらのエステル；β−ヒドロキシ酸、例えばサリチル酸、およびそれらの誘導体；植物タンパク質（特にダイズまたはヘーゼルナッツ）の加水分解物；アシル化オリゴペプチド（特にＳｅｄｅｒｍａ社によりＭａｘｉｌｉｐ（登録商標）、Ｍａｔｒｉｘｙｌ（登録商標）３０００、Ｂｉｏｐｅｐｔｉｄｅ（登録商標）ＣＬまたはＢｉｏｐｅｐｔｉｄｅ（登録商標）ＥＬという商標名で販売されているもの）；酵母抽出物、特にサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の酵母抽出物；藻類抽出物、特にコンブ抽出物；ビタミン、およびそれらの誘導体、例えばパルミチン酸レチニル、アスコルビン酸、アスコルビルグルコシド、アスコルビルリン酸マグネシウムまたはナトリウム、アスコルビルパルミテート、アスコルビルテトライソパルミテート、アスコルビルソルベート、トコフェロール、酢酸トコフェロール、およびトコフェリルソルベート；アルブチン；コウジ酸；エラグ酸；およびそれらの混合物である。
【００５３】
変形物として、またはそれに加えて、本発明に従って用いられる組成物は、少なくとも１種のエラスターゼ阻害剤（抗エラスターゼ剤）、例えば特にＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ  Ｓｅｒｏｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅｓ／Ｃｏｇｎｉｓ  Ｆｒａｎｃｅ社によりＰｒｏｔｅａｓｙｌ  ＴＰ  ＬＳ（登録商標）という商標名で販売されているエンドウ（Pisum sativum）種子の抽出物を含んでもよい。
【００５４】
本組成物はまた、不活性添加剤もしくはこれらの添加剤の組み合わせ、例えば湿潤剤、安定剤、水分調節剤、ｐＨ調節剤、浸透圧調節剤、またはＵＶ−ＡおよびＵＶ−Ｂ遮断剤などを含んでいてもよい。
【００５５】
以下の実施例は、本発明の範囲を制限することなく本発明を説明する。
【実施例１】
【００５６】
ヒトケラチノサイトにおけるＬＡＲＧＥ発現の試験
プロトコール：
ＰＣＲによって、ＬＡＲＧＥのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現を培養ヒトケラチノサイトで評価し、免疫組織化学的染色によって、ＬＡＲＧＥタンパク質の発現をヒト皮膚サンプルで評価した。
【００５７】
新生児包皮に由来するケラチノサイト（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）を６ウェルプレート中に置き、成分補充したケラチノサイト増殖培地（ＥｐｉＬｉｆｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。インキュベーターで３７℃で２４時間培養した後、培地を基礎培地で交換し、さらに２４時間培養し、７０％密集度の細胞をＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄し、ｍＲＮＡ抽出に使用した。
【００５８】
ｍＲＮＡをＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）を用いて単離し、ＱｕａｎｔＩｔキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を用いて定量した。
【００５９】
逆転写を、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造元の推奨に従って用いて行った。
【００６０】
培養ケラチノサイトにおけるＬＡＲＧＥのｍＲＮＡ発現レベルを定量するために、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ−ＰＣＲ）を使用した。結果を、これらのサンプルのハウスキーピング遺伝子の発現に対して正規化した。結果を、標的遺伝子であるＬＡＲＧＥの発現レベルの倍率変化に関して示した。
【００６１】
ＬＡＲＧＥのＰＣＲプライマー（Fujimura et al, 2005）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）から入手した。
【００６２】
ハウスキーピング遺伝子は、ＰＢＧＤであった。ＰＢＧＤのＰＣＲプライマーを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）から入手した。
【００６３】
ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉによる検出を用いてリアルタイムＰＣＲ（Ｂｉｏｒａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒＩＱ）を行った。全ての試験で、標準化プログラムを用いてｃＤＮＡを増幅した。各サンプルに、ＩＱ  ＳＹＢＲグリーンスーパーミックス、Ｈ２Ｏ、および各プライマーを入れた。反応あたりのｃＤＮＡの最終量は、逆転写に用いられる全ＲＮＡの７５ｎｇに相当した。
【００６４】
標的遺伝子の発現の相対的な定量化を、Ｐｆａｆｆｌの数学モデル（Pfaffl, MW, Nucleic Acids Res. 29(9), p. E45, 2001）を用いて行った。結果を、２人の異なるドナーからの細胞を用いて確認した。
【００６５】
ＬＡＲＧＥタンパク質の発現を、免疫組織化学法（ＩＨＣ）によって異なるドナー（ＺｅｎＢｉｏ  ｉｎｃ．ＮＣ、ＵＳＡ、およびＣｙｂｒｄｉ、ＭＤ、ＵＳＡ）からの凍結皮膚サンプルで評価した。６μｍの切片に、一次抗ヒトＬＡＲＧＥヤギ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）および二次ロバ抗ヤギ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＰＡ、ＵＳＡ）を用いて染色を行った。ＡＥＣシステム（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ）を用いて染色を可視化した。３〜５人のドナーそれぞれからの２〜６個の切片で染色を評価した。
【００６６】
結果：
１人のドナーからのケラチノサイトにおけるＬＡＲＧＥのｍＲＮＡ発現の評価から、ＬＡＲＧＥは、正常なヒト培養ケラチノサイトにおいて発現されることが示される。データを２人のドナーのケラチノサイトで確認した。
【００６７】
ヒト皮膚におけるＬＡＲＧＥ染色の評価から、表皮の基底層、基底上層、および顆粒層のケラチノサイトにおいて、細胞核近傍に極度に局在した染色が示された。表皮の外層では、可視的な染色強度は減少した。
【００６８】
この試験から、ＬＡＲＧＥ遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで正常なヒトケラチノサイトで発現されることは明らかである。
【実施例２】
【００６９】
マイクロアレイ解析による正常ヒトケラチノサイトにおけるＬＡＲＧＥのｍＲＮＡ発現のＵＶＢ照射での阻害試験
プロトコール：
ＬＡＲＧＥのｍＲＮＡ発現に対するＵＶＢ照射の作用を培養ヒトケラチノサイトで評価した。
【００７０】
活性を試験する前に、ヒト培養ケラチノサイトでＵＶＢの細胞毒性を評価した。この実験では細胞毒性を起こさない線量のＵＶＢ照射を用いた。
【００７１】
新生児包皮に由来するケラチノサイト（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）を６ウェルプレートで平板培養し、成分補充したケラチノサイト増殖培地（ＥｐｉＬｉｆｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。インキュベーターで３７℃で２４時間培養した後、４０〜５０％密集度の細胞をＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄し、ＢｉｏＳｕｎ装置（Ｖｉｌｂｅｒ  Ｌｏｕｒｍａｔ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて様々なＵＶＢ線量でＵＶＢを照射し、最後にケラチノサイト用基礎培地（ＥｐｉＬｉｆｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で２４時間インキュベートした。７０〜８０％密集度の細胞をＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄し、ｍＲＮＡ抽出およびマイクロアレイ解析のために急速冷凍した細胞ペレットを調製した。
【００７２】
ケラチノサイトサンプルにおけるＬＡＲＧＥのｍＲＮＡ発現レベルを定量するために、Ａｇｉｌｅｎｔの全ヒトゲノムオリゴマイクロアレイ解析を使用した。ＵＶＢ照射したサンプルにおけるＬＡＲＧＥ発現の結果を、対照の非照射サンプルにおけるＬＡＲＧＥ発現に対して正規化した。結果を、標的遺伝子であるＬＡＲＧＥの発現レベルの倍率変化に関して示した。結果を、２人の異なるドナーからの細胞を用いて確認した。
【００７３】
標準的なＲＮＡ抽出プロトコール（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ  ＩＩ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いてｍＲＮＡを単離した。ＲＮＡサンプルの品質を、Ａｇｉｌｅｎｔの２１００バイオアナライザープラットフォーム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＵＳＡ）によって確認した。ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒを評価して、全ＲＮＡサンプルの完全性および全体の品質を確認した。
【００７４】
Ｃｙ３およびＣｙ５で標識されたｃＲＮＡを生成するために、ＲＮＡサンプルを増幅し、ＡｇｉｌｅｎｔのＬｏｗ  ＲＮＡ  Ｉｎｐｕｔ  Ｌｉｎｅａｒ  Ａｍｐキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＵＳＡ）を用いて製造元のプロトコールに従って標識した。
【００７５】
ハイブリダイゼーションの手順を、Ａｇｉｌｅｎｔの遺伝子発現ハイブリダイゼーションキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＵＳＡ）を用いてＡｇｉｌｅｎｔの６０−ｍｅｒオリゴマイクロアレイプロセシングプロトコールに従って行った。
【００７６】
ハイブリダイズしたＡｇｉｌｅｎｔのオリゴマイクロアレイの蛍光シグナルを、ＡｇｉｌｅｎｔのＤＮＡマイクロアレイスキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＵＳＡ）を用いて検出した。ＡｇｉｌｅｎｔのＦｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアを使用して、マイクロアレイの画像ファイルを読み出して処理した。
【００７７】
示差的な遺伝子発現を決定するために、Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｒｅｓｏｌｖｅｒａ遺伝子発現データ解析システム（Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｂｉｏｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてデータファイルをさらに解析した。倍率変化が２より大きくｐ値が０．０１未満の遺伝子を、示差的に発現されたとみなした。
【００７８】
結果：
非照射の対照と比較した、２０ｍＪ／ｃｍ２の線量でＵＶＢ照射した１人のドナーからのケラチノサイトにおけるＬＡＲＧＥのｍＲＮＡ発現における倍率変化の評価は、−４．０（±０．００）、および−４．５（±０．００）であった。
【００７９】
非照射の対照と比較した、３０ｍＪ／ｃｍ２の線量でＵＶＢ照射した１人のドナーからのケラチノサイトにおけるＬＡＲＧＥのｍＲＮＡ発現における倍率変化の評価は、−６．６（±０．００）、および−７．９（±０．００）であった。
【００８０】
データを２人のドナーのケラチノサイトで確認した。
【００８１】
この試験から、ＵＶＢ照射は、正常なヒトケラチノサイトにおけるＬＡＲＧＥ遺伝子発現を有意に減少させることは明らかである。
【実施例３】
【００８２】
ＰＣＲによる正常なヒトケラチノサイトにおけるＬＡＲＧＥのｍＲＮＡ発現のＵＶＢ照射での阻害試験
プロトコール：
ＰＣＲによって、ＬＡＲＧＥのｍＲＮＡ発現に対するＵＶＢ照射の作用を培養ケラチノサイトで評価した。
【００８３】
新生児包皮に由来するケラチノサイト（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）を６ウェルプレートで平板培養し、成分補充したケラチノサイト増殖培地（ＥｐｉＬｉｆｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。インキュベーターで３７℃で２４時間培養した後、４０〜５０％密集度の細胞をＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄し、ＢｉｏＳｕｎ装置（Ｖｉｌｂｅｒ  Ｌｏｕｒｍａｔ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて様々なＵＶＢ線量でＵＶＢを照射し、最後にケラチノサイト用基礎培地（ＥｐｉＬｉｆｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で２４時間インキュベートした。７０〜８０％密集度の細胞をＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄し、ｍＲＮＡ抽出に使用した。
【００８４】
実施例１の試験と同様の試験を行った。
【００８５】
結果を、２人の異なるドナーからの細胞を用いて確認した。活性を試験する前に、ヒト培養ケラチノサイトでＵＶＢの細胞毒性を評価した。
【００８６】
結果：
１０ｍＪ／ｃｍ２、２０ｍＪ／ｃｍ２、および３０ｍＪ／ｃｍ２の線量でＵＶＢ照射した１人のドナーからのケラチノサイトにおけるＬＡＲＧＥのｍＲＮＡ発現の評価は、それぞれ０．２８（±０．０３）、０．１３（±０．０４）、および０．０６（±０．０１）であった。非処理の対照において、ケラチノサイトの発現レベルは、１．０（±０．２０）であった。データを２人のドナーのケラチノサイトで確認した。
【００８７】
この試験から、ＵＶＢ照射は、正常なヒトケラチノサイトにおけるＬＡＲＧＥ遺伝子発現を有意に減少させることは明らかである。
【実施例４】
【００８８】
作用薬剤を用いた正常なヒトケラチノサイトにおけるＬＡＲＧＥのｍＲＮＡ発現の刺激試験
プロトコール：
ＰＣＲによって、ＬＡＲＧＥのｍＲＮＡ発現に対するレスベラトロールの作用を培養ケラチノサイトで評価した。
【００８９】
新生児包皮に由来するケラチノサイト（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、６ウェルプレートで成分補充したケラチノサイト培地（ＥｐｉＬｉｆｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。３７℃で２４時間培養した後、７０％密集度の細胞をＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）で洗浄し、試験しようとする作用薬剤を含む基礎ケラチノサイト培地（ＥｐｉＬｉｆｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に濃度を増加させながら２４時間インキュベートした。活性を試験する前に、作用薬剤の細胞毒性を、ヒト培養ケラチノサイトで評価した。
【００９０】
実施例１の試験と同様の試験を行った。
【００９１】
結果：
０．００２％、０．００１％、および０．０００５％のレスベラトロールで処理したケラチノサイトにおけるＬＡＲＧＥのｍＲＮＡ発現の評価は、それぞれ４．８４（±０．９４）、３．６３（±０．４１）、および２．７（±０．１３）であった。対照の非処理ケラチノサイトにおいて、ＬＡＲＧＥのｍＲＮＡ発現の評価は、０．９９（±０．０１）であった。これから、ＬＡＲＧＥのｍＲＮＡ発現は、レスベラトロール処理によって有意に増加することが実証される。データを２人のドナーのケラチノサイトで確認した。
【００９２】
以下の表１に結果を示す：
【表１】
0006043343.tif 000002
(1)作用薬剤の濃度は、調製物の重量に対する作用薬剤の重量として示される。
(2)刺激の程度は、ハウスキーピング遺伝子の発現に対する作用のため多少大きく見積もられている。
【００９３】
この試験から、試験された作用薬剤は、正常なヒトケラチノサイトにおけるＬＡＲＧＥのｍＲＮＡ発現を有意に刺激できることは明らかである。
【実施例５】
【００９４】
レスベラトロールを用いた正常なヒトケラチノサイトにおけるＬＡＲＧＥタンパク質の発現の刺激試験
プロトコール：
実施例４で用いられたレスベラトロールのＬＡＲＧＥタンパク質発現に対する作用を培養ケラチノサイトで評価した。
【００９５】
新生児包皮に由来するケラチノサイト（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、ポリ−Ｌ−オルニチン（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）でコーティングされたカバーガラスを含む６ウェルプレートで、成分補充したケラチノサイト培地（ＥｐｉＬｉｆｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。３７℃で２４時間培養した後、４０〜５０％密集度の細胞をＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）で洗浄し、試験しようとする抽出物を含む基礎ケラチノサイト培地（ＥｐｉＬｉｆｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で４８時間インキュベートした。活性を試験する前に、抽出物の細胞毒性をヒト培養ケラチノサイトで評価した。
【００９６】
処理したサンプル中でのＬＡＲＧＥタンパク質発現を非処理サンプルと比較して定量するために、培養ケラチノサイトを有するカバーガラスの免疫細胞化学的染色（ＩＣＣ）を使用した。一次ヤギ抗ヒトＬＡＲＧＥ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）および二次ロバ抗ヤギ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＰＡ）を用いて、染色を３連で行った。染色をＡＥＣシステム（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣＡ）で可視化した。染色の程度を、実験条件ごとに３０のランダムイメージで評価し、染色の視覚的評価を１〜５のスケール（１は最も低い強度であり、５は最も高い強度である）を用いて作製した。平均値間の有意差を対応なしのｔ検定を用いて評価した。
【００９７】
結果：
０．００２％のレスベラトロールで処理したケラチノサイトにおけるＬＡＲＧＥ染色の評価は、３．８（±０．９３）であり、０．００１％のレスベラトロールで処理したケラチノサイトにおける評価は、２．６７（±０．５５）であり、０．０００５％のレスベラトロールで処理したケラチノサイトにおける評価は、２．７（±０．８８）であり、非処理の対照のケラチノサイトにおける評価は、２．０３（±０．７２）であった。非処理ケラチノサイトと処理したケラチノサイトとにおけるＬＡＲＧＥ染色の差は、有意であった（ｐ＜０．００５）。これから、ＬＡＲＧＥタンパク質の量は、レスベラトロール処理によって有意に増加することが実証される。示されたデータは、１人のケラチノサイトのドナーから得たものである。
【００９８】
以下の表２に結果を示す：
【表２】
0006043343.tif 000003
(1)抽出物の濃度は、調製物の重量に対する粗抽出物の重量として示される。
【００９９】
この試験から、レスベラトロールは、正常なヒトケラチノサイトにおけるＬＡＲＧＥタンパク質の発現を刺激できることは明らかである。
【実施例６】
【０１００】
ヒトケラチノサイトにおけるＨＳ６ＳＴ２発現の試験
プロトコール：
ＰＣＲによって、ＨＳ６ＳＴ２のｍＲＮＡ発現を培養ヒトケラチノサイトで評価した。
【０１０１】
新生児包皮に由来するケラチノサイト（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）を６ウェルプレート中に置き、成分補充したケラチノサイト増殖培地（ＥｐｉＬｉｆｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。インキュベーターで３７℃で２４時間培養した後、培地を基礎培地で交換し、さらに２４時間培養し、７０％密集度の細胞をＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄し、ｍＲＮＡ抽出に使用した。
【０１０２】
ｍＲＮＡをＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙキットを用いて単離し、ＱｕａｎｔＩｔキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を用いて定量した。
【０１０３】
細胞サンプルにおけるＨＳ６ＳＴ２のｍＲＮＡ発現レベルを定量するために、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用した。結果を、これらのサンプルのハウスキーピング遺伝子の発現に対して正規化した。結果を、ケラチノサイトにおける標的遺伝子ＨＳ６ＳＴ２の発現レベルの倍率変化に関して示した。
【０１０４】
ＨＳ６ＳＴ２のＰＣＲプライマーを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）から入手した。
【０１０５】
ハウスキーピング遺伝子は、Ｂ２Ｍであった。Ｂ２ＭのＰＣＲプライマーを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）から入手した。
【０１０６】
逆転写を、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて製造元の推奨に従って行った。
【０１０７】
リアルタイムＰＣＲ測定を、ｉＣＹＣＬＥＲ  ＩＱ装置（Ｂｉｏ−ｒａｄ、ＣＡ）をＴａｑｍａｎプローブと共に用いて行った。
【０１０８】
全ての試験で、標準化プログラムを用いてｃＤＮＡを増幅した。各サンプルに、Ｔａｑｍａｎマスターミックス、Ｔａｑｍａｎプローブ、および水を入れた。反応あたりのｃＤＮＡの最終量は、逆転写に用いられる全ＲＮＡの７５ｎｇに相当した。
【０１０９】
標的遺伝子の発現の相対的な定量化を、Ｐｆａｆｆｌの数学モデル（Pfaffl, MW, Nucleic Acids Res. 29(9), p. E45, 2001）を用いて行った。
【０１１０】
結果：
１人のドナーからのケラチノサイトにおけるＨＳ６ＳＴ２のｍＲＮＡ発現の評価から、ＨＳ６ＳＴ２は、正常なヒト培養ケラチノサイトにおいて発現されることが示される。
【実施例７】
【０１１１】
マイクロアレイ解析による正常なヒトケラチノサイトにおけるＨＳ６ＳＴ２のｍＲＮＡ発現のＵＶＢ照射での阻害試験
プロトコール：
ＨＳ６ＳＴ２のｍＲＮＡ発現に対するＵＶＢ照射の作用を培養ヒトケラチノサイトで評価した。
【０１１２】
活性を試験する前に、ヒト培養ケラチノサイトでＵＶＢの細胞毒性を評価した。この実験では細胞毒性を起こさない線量のＵＶＢ照射を用いた。
【０１１３】
実施例２と同様の試験を行った。結果を、２人の異なるドナーからの細胞を用いて確認した。
【０１１４】
結果：
非照射の対照と比較した、２０ｍＪ／ｃｍ２の線量でＵＶＢ照射した１人のドナーからのケラチノサイトにおけるＨＳ６ＳＴ２のｍＲＮＡ発現における倍率変化の評価は、−３．７１（±０．００）、および−３．６７（±０．００）であった。
【０１１５】
非照射の対照と比較した、３０ｍＪ／ｃｍ２の線量でＵＶＢ照射した１人のドナーからのケラチノサイトにおけるＨＳ６ＳＴ２のｍＲＮＡ発現における倍率変化の評価は、−８．８３（±０．００）、および−１１．４７（±０．００）であった。データを２人のドナーのケラチノサイトで確認した。
【０１１６】
この試験から、ＵＶＢ照射は、正常なヒトケラチノサイトにおけるＨＳ６ＳＴ２のｍＲＮＡ発現を有意に減少させることは明らかである。
【実施例８】
【０１１７】
ＰＣＲによる正常なヒトケラチノサイトにおけるＨＳ６ＳＴ２のｍＲＮＡ発現のＵＶＢ照射での阻害試験
プロトコール：
ＰＣＲによって、ＨＳ６ＳＴ２のｍＲＮＡ発現に対するＵＶＢ照射の作用を培養ケラチノサイトで評価した。
【０１１８】
新生児包皮に由来するケラチノサイト（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）を６ウェルプレート中に置き、成分補充したケラチノサイト増殖培地（ＥｐｉＬｉｆｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。インキュベーターで３７℃で２４時間培養した後、４０〜５０％密集度の細胞をＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄し、ＢｉｏＳｕｎ装置（Ｖｉｌｂｅｒ  Ｌｏｕｒｍａｔ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて様々なＵＶＢ線量でＵＶＢを照射し、最後にケラチノサイト用基礎培地（ＥｐｉＬｉｆｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で２４時間インキュベートした。７０〜８０％密集度の細胞をＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄し、ｍＲＮＡ抽出に使用した。
【０１１９】
陽性の結果を、２人の異なるドナーからの細胞を用いて確認した。活性を試験する前に、ヒト培養ケラチノサイトでＵＶＢの細胞毒性を評価した。
【０１２０】
実施例６と同様の試験を行った。結果を、２人の異なるドナーからの細胞を用いて確認した。
【０１２１】
結果：
１０ｍＪ／ｃｍ２、２０ｍＪ／ｃｍ２、および３０ｍＪ／ｃｍ２の線量でＵＶＢ照射した１人のドナーからのケラチノサイトにおけるＨＳ６ＳＴ２のｍＲＮＡ発現評価は、それぞれ０．６２（±０．０８）、０．２２（±０．０６）、および０．１７（±０．０６）であった。非処理の対照において、ケラチノサイトの発現レベルは、１．０（±０．０４）であった。データを２人のドナーのケラチノサイトで確認した。
【０１２２】
この試験から、ＵＶＢ照射は、正常なヒトケラチノサイトにおけるＨＳ６ＳＴ２のｍＲＮＡ発現を有意に減少させることは明らかである。
【実施例９】
【０１２３】
作用薬剤を用いた正常なヒトケラチノサイトにおけるＨＳ６ＳＴ２のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）発現の刺激試験
プロトコール：
ＰＣＲによって、ＨＳ６ＳＴ２のｍＲＮＡ発現に対するレスベラトロールの作用を培養ケラチノサイトで評価した。実施例７と同様の試験を行った。
【０１２４】
新生児包皮に由来するケラチノサイト（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、６ウェルプレートで成分補充したケラチノサイト培地（ＥｐｉＬｉｆｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。３７℃で２４時間培養した後、７０％密集度の細胞をＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）で洗浄し、試験しようとする作用薬剤を含む基礎ケラチノサイト培地（ＥｐｉＬｉｆｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に濃度を増加させながら２４時間インキュベートした。活性を試験する前に、作用薬剤の細胞毒性を、ヒト培養ケラチノサイトで評価した。
【０１２５】
ケラチノサイトを、様々な濃度の作用薬剤で２４時間処理した。ｍＲＮＡをＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）を用いて単離し、ＱｕａｎｔＩｔキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を用いて定量した。
【０１２６】
結果：
０．００１２５％、および０．００００６％のレスベラトロールで処理したケラチノサイトにおけるＨＳ６ＳＴ２のｍＲＮＡ発現の評価は、それぞれ１．５（±０．１）、および１．５（±０．１）であった。対照の非処理ケラチノサイトにおいて、ＨＳ６ＳＴ２のｍＲＮＡ発現の評価は、１．０（±０．０）であった。これから、ＨＳ６ＳＴ２のｍＲＮＡ発現は、レスベラトロール処理によって増加することが実証される。データを２人のドナーのケラチノサイトで確認した。
【０１２７】
以下の表３に結果を示す：
【表３】
0006043343.tif 000004
作用薬剤の濃度は、調製物の重量に対する作用薬剤の重量として示される。
【０１２８】
結果は、２つのロットの平均として示される。
【０１２９】
この試験から、試験された作用薬剤は、正常なヒトケラチノサイトにおけるＨＳ６ＳＴ２のｍＲＮＡ発現を有意に刺激できることは明らかである。
【実施例１０】
【０１３０】
ヒトケラチノサイトにおけるＳＴ８ＳＩＡ１発現の試験
プロトコール：
ＰＣＲによって、ＳＴ８ＳＩＡ１のｍＲＮＡ発現を培養ヒトケラチノサイトで評価し、ＳＴ８ＳＩＡ１タンパク質の発現をヒト皮膚サンプルで評価した。
【０１３１】
実施例６と同様の試験を行った。
【０１３２】
ＳＴ８ＳＩＡ１のＰＣＲプライマーを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）から入手した。ハウスキーピング遺伝子は、Ｂ２Ｍであった。Ｂ２ＭのＰＣＲプライマーを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）から入手した。結果を、２人の異なるドナーからの細胞を用いて確認した。
【０１３３】
ＳＴ８ＳＩＡ１タンパク質の発現を、免疫組織化学法（ＩＨＣ）によって異なるドナーからの凍結皮膚サンプル（ＺｅｎＢｉｏ  ｉｎｃ．ＮＣ、ＵＳＡ、およびＣｙｂｒｄｉ、ＭＤ、ＵＳＡ）で評価した。６μｍの切片に、一次抗ヒトＳＴ８ＳＩＡ１抗体（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ、ＵＳＡ）および二次ヤギ抗ウサギ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて染色を行った。ＡＥＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて染色を可視化した。３〜５人のドナーそれぞれからの２〜６個の切片で染色を評価した。
【０１３４】
結果：
１人のドナーからのケラチノサイトにおけるＳＴ８ＳＩＡ１のｍＲＮＡ発現の評価から、ＳＴ８ＳＩＡ１は、正常なヒト培養ケラチノサイトにおいて発現されることが示された。データを２人のドナーのケラチノサイトで確認した。
【０１３５】
ヒト皮膚におけるＳＴ８ＳＩＡ１染色の評価から、顆粒状の細胞質の染色の大部分が皮膚表皮の基底層および基底上層のケラチノサイト中であることが示された。
【実施例１１】
【０１３６】
マイクロアレイ解析による正常なヒトケラチノサイトにおけるＳＴ８ＳＩＡ１のｍＲＮＡ発現のＵＶＢ照射での阻害試験
プロトコール：
マイクロアレイ解析によって、ＳＴ８ＳＩＡ１のｍＲＮＡ発現に対するＵＶＢ照射の作用を培養ヒトケラチノサイトで評価した。
【０１３７】
活性を試験する前に、ヒト培養ケラチノサイトでＵＶＢの細胞毒性を評価した。この実験では細胞毒性を起こさない線量のＵＶＢ照射を用いた。
【０１３８】
実施例２と同様の試験を行った。結果を、２人の異なるドナーからの細胞を用いて確認した。
【０１３９】
結果：
非照射の対照と比較した、２０ｍＪ／ｃｍ２の線量でＵＶＢ照射した１人のドナーからのケラチノサイトにおけるＳＴ８ＳＩＡ１のｍＲＮＡ発現における倍率変化の評価は、−５．３８（±０．００）、および−５．１２（±０．００）であった。
【０１４０】
非照射の対照と比較した、３０ｍＪ／ｃｍ２の線量でＵＶＢ照射した１人のドナーからのケラチノサイトにおけるＳＴ８ＳＩＡ１のｍＲＮＡ発現における倍率変化の評価は、−７．２２（±０．００）、および−１１．３６（±０．００）であった。データを２人のドナーのケラチノサイトで確認した。
【０１４１】
この試験から、ＵＶＢ照射は、正常なヒトケラチノサイトにおけるＳＴ８ＳＩＡ１のｍＲＮＡ発現を有意に減少させることは明らかである。
【実施例１２】
【０１４２】
ＰＣＲによる正常なヒトケラチノサイトにおけるＳＴ８ＳＩＡ１のｍＲＮＡ発現のＵＶＢ照射での阻害試験
プロトコール：
ＰＣＲによって、ＳＴ８ＳＩＡ１のｍＲＮＡ発現に対するＵＶＢ照射の作用を培養ケラチノサイトで評価した。
【０１４３】
新生児包皮に由来するケラチノサイト（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）を６ウェルプレート中に置き、成分補充したケラチノサイト増殖培地（ＥｐｉＬｉｆｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。インキュベーターで３７℃で２４時間培養した後、４０〜５０％密集度の細胞をＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄し、ＢｉｏＳｕｎ装置（Ｖｉｌｂｅｒ  Ｌｏｕｒｍａｔ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて様々なＵＶＢ線量でＵＶＢを照射し、最後にケラチノサイト用基礎培地（ＥｐｉＬｉｆｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で２４時間インキュベートした。７０〜８０％密集度の細胞をＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄し、ｍＲＮＡ抽出に使用した。
【０１４４】
陽性の結果を、２人の異なるドナーからの細胞を用いて確認した。活性を試験する前に、ヒト培養ケラチノサイトでＵＶＢの細胞毒性を評価した。
【０１４５】
実施例１０の試験と同様の試験を行った。結果を、２人の異なるドナーからの細胞を用いて確認した。
【０１４６】
結果：
１０ｍＪ／ｃｍ２、２０ｍＪ／ｃｍ２、および３０ｍＪ／ｃｍ２の線量でＵＶＢ照射した１人のドナーからのケラチノサイトにおけるＳＴ８ＳＩＡ１のｍＲＮＡ発現の評価は、それぞれ０．４８（±０．０９）、０．２１（±０．０２）、および０．１４（±０．０８）であった。非処理の対照において、ケラチノサイトの発現レベルは、１．０１（±０．１７）であった。データを２人のドナーのケラチノサイトで確認した。
【０１４７】
この試験から、ＵＶＢ照射は、正常なヒトケラチノサイトにおけるＳＴ８ＳＩＡ１のｍＲＮＡ発現を有意に減少させることは明らかである。
【実施例１３】
【０１４８】
作用薬剤を用いた正常なヒトケラチノサイトにおけるＳＴ８ＳＩＡ１のｍＲＮＡ発現の刺激試験
プロトコール：
ＰＣＲによって、ＳＴ８ＳＩＡ１のｍＲＮＡ発現に対するレスベラトロールの作用を培養ケラチノサイトで評価した。
【０１４９】
新生児包皮に由来するケラチノサイト（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、６ウェルプレートで成分補充したケラチノサイト培地（ＥｐｉＬｉｆｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。３７℃で２４時間培養した後、７０％密集度の細胞をＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）で洗浄し、試験しようとする作用薬剤を含む基礎ケラチノサイト培地（ＥｐｉＬｉｆｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に濃度を増加させながら２４時間インキュベートした。活性を試験する前に、作用薬剤の細胞毒性を、ヒト培養ケラチノサイトで評価した。
【０１５０】
実施例１０の試験と同様の試験を行った。結果を、２人の異なるドナーからの細胞を用いて確認した。
【０１５１】
結果：
０．０００２５％、０．０００１２５％、および０．００００６％のレスベラトロールで処理したケラチノサイトにおけるＳＴ８ＳＩＡ１のｍＲＮＡ発現の評価は、それぞれ１．３３（±０．１８）、１．６２（±０．０２）、および１．２５（±０．２３）であった。対照の非処理ケラチノサイトにおいて、ＳＴ８ＳＩＡ１のｍＲＮＡ発現の評価は、１．０１（±０．０１）であった。これから、ＳＴ８ＳＩＡ１のｍＲＮＡ発現は、レスベラトロール処理によって増加することが実証される。データを２人のドナーのケラチノサイトで確認した。結果は、２つのロットの平均として示される。
【０１５２】
以下の表４に結果を示す。
【表４】
0006043343.tif 000005
(1)作用薬剤の濃度は、調製物の重量に対する作用薬剤の重量として示される。
【０１５３】
この試験から、試験された作用薬剤は、正常なヒトケラチノサイトにおけるＳＴ８ＳＩＡ１のｍＲＮＡ発現を有意に刺激できることは明らかである。
【実施例１４】
【０１５４】
化粧用組成物（Ｏ／Ｗセラム）
以下の組成物は、当業者にとって典型的な方式で調製することができる。
【表５】
0006043343.tif 000006