(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞においてヒトＥＶＩ１の発現を低減できる、単離二本鎖オリゴリボヌクレオチドまたはそのｓｈＲＮＡ種もしくはｓｉＲＮＡ種であって、該オリゴリボヌクレオチドが配列番号１３および配列番号１４の組合せを含む、単離二本鎖オリゴリボヌクレオチド、またはそのｓｈＲＮＡ種もしくはｓｉＲＮＡ種。
【請求項２】
前記オリゴリボヌクレオチドが、配列番号５のヌクレオチド配列を標的とする、請求項１に記載の単離二本鎖オリゴリボヌクレオチド、またはそのｓｈＲＮＡ種もしくはｓｉＲＮＡ種。
【請求項３】
請求項１〜２のいずれか１項に記載の単離オリゴリボヌクレオチドと、薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントとを含む医薬組成物。
【請求項４】
有効量の請求項１〜２のいずれか１項に記載の単離オリゴリボヌクレオチドを含む、腫瘍細胞成長を阻害するための組成物。
【請求項５】
化学療法薬または化学療法剤をさらに含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
有効量の請求項３または５に記載の医薬組成物を含む、腫瘍成長を阻害するための組成物。
【請求項７】
前記腫瘍が、肺、乳房、前立腺もしくは卵巣の組織または器官の腫瘍、あるいは黒色腫もしくは急性骨髄性白血病である、請求項４または６に記載の組成物。
【請求項８】
リポソーム中に被包された、請求項３または５に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記リポソームが、ＰＥＧ化されている、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記リポソームが、細胞ターゲッティング部分を含む、請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記細胞ターゲッティング部分が、タンパク質、ペプチドまたはアプタマーである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ナノ粒子中に被包された、請求項３または５に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記ナノ粒子が、脂質、シクロデキストリン、キトサン、炭水化物ポリマー、エラスチン様ポリマーまたはリン酸カルシウムポリマーまたはその組合せを含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記ナノ粒子が、ＰＥＧ化されている、請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ナノ粒子が、細胞ターゲッティング部分を含む、請求項１２、１３または１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記細胞ターゲッティング部分が、タンパク質、ペプチドまたはアプタマーである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
腫瘍細胞においてヒトＥＶＩ１遺伝子の発現を特異的に低減するための医薬組成物であって、該医薬組成物は、腫瘍細胞においてヒトＥＶＩ１の発現を低減できる、単離二本鎖オリゴリボヌクレオチドまたはそのｓｈＲＮＡ種もしくはｓｉＲＮＡ種を含み、ここで、該オリゴリボヌクレオチドが配列番号１３および配列番号１４の組合せを含み、該医薬組成物が、化学療法薬または化学療法剤と、薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントとをさらに含む、医薬組成物。
【請求項１８】
腫瘍成長を阻害するための、請求項３、５または８〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
有効量の請求項１〜２のいずれか１項に記載の単離オリゴリボヌクレオチドを含む、腫瘍細胞の死滅を誘発するための組成物。
【請求項２０】
有効量の請求項３または５に記載の医薬組成物を含む、腫瘍細胞の死滅を誘発するための組成物。
【請求項２１】
腫瘍細胞の死滅を誘発するための、請求項３、５および８〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記腫瘍が、肺、乳房、前立腺もしくは卵巣の組織または器官の腫瘍、あるいは黒色腫もしくは急性骨髄性白血病である、請求項１９または２０に記載の組成物あるいは請求項１７、１８または２１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２０１０年５月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／３４７，１０４号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、がんならびにがんを治療するための試薬および方法に関する。本発明は、概して、腫瘍細胞成長を阻害する試薬および方法に関し、前記試薬および方法を、それ自体で、ならびに従来の抗がん薬治療を補助する、または補完する実施形態において提供する。本発明は、具体的には、特に、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の実施形態で腫瘍細胞成長を阻害する、一本鎖および二本鎖形式の単離リボ核酸オリゴヌクレオチドならびにその医薬組成物を提供する。細胞成長を阻害するために前記試薬を使用するための方法もまた提供される。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の背景
腫瘍細胞成長には、多数の遺伝子の発現、特に、その発現の調節不全が関与していることが公知である。調節不全を有するいくつかの遺伝子とは、発生の際には正常に発現されるが、腫瘍細胞では不適切に発現され、制御されない成長、侵襲性およびがんのその他の表現型的特徴の一因となる遺伝子である。
【０００４】
１種のこのような遺伝子は、ＥＶＩ１と呼ばれる。ＥＶＩ１（エコトロピックウイルス組込み部位１）遺伝子は、ジンクフィンガータンパク質をコードし、正常な発生および発がんにおいての両方で重要な役割を果たす。ＥＶＩ１の過剰発現は、雌の生殖器のものなど特定の固形腫瘍において見られ、ＥＶＩ１は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を始めとする骨髄悪性腫瘍の出現および臨床特徴の重要な寄与因子であるとわかっている。
【０００５】
ヒトＥＶＩ１は、３番染色体のバンドｑ２６に位置している（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、１９９０年、Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＥＶＩ１  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｌｏｃａｔｅｄ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ３ｑ２４−ｑ２８  ｂｕｔ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｉｎ  ｔｈｒｅｅ  ｃａｓｅｓ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｎｏｎｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔ（３；５）（ｑ２５；ｑ３４）  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓ  ５巻：２２１〜３１頁）、６０ｋｂに及び、１６のエキソンを含有し、複数の代替５’ｍＲＮＡ変異体およびいくつかの代替スプライシングされた転写物を有する（Ｗｉｅｓｅｒ、２００７年、Ｔｈｅ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ＥＶＩ１：  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ、Ｇｅｎｅ  ３９６巻：３４６〜５７頁）。主要なＥＶＩ１型は、１４５ｋＤａの見かけの分子量を有する１０５１個のアミノ酸のタンパク質である（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、１９９０年、Ｕｎｉｑｕｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＥＶＩ１  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ａｎ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ：  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃＤＮＡｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５巻：９６３〜７１頁；Ｍａｔｓｕｇｉら、１９９０年、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＥＶＩ１  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｅｎｅ、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０巻：１２５９〜６４頁）。ＥＶＩ１は、各々、７つおよび３つのジンクフィンガードメインからなる２セットに組織化される複数のジンクフィンガードメインを有する。２セットのジンクフィンガードメインならびにＣ末端の酸性領域の間に抑制ドメインが同定されている（図１参照）。「Δ３２４転写物」と呼ばれる、ＥＶＩ１遺伝子からの１種の特定の転写物は、ジンクフィンガー６および７を欠く８８−ｋＤａのタンパク質をコードするＥＶＩ１の代替スプライシング変異体であり、ヒトおよびマウス細胞において低レベルで見られる（Ｂｏｒｄｅｒｅａｕｘら、１９９０年、Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＶＩ１  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｇｅｎｅ  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ｍＲＮＡｓ  ｗｈｉｃｈ  ｄｉｆｆｅｒ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｍｏｔｉｆｓ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５巻：９２５〜７頁）。「−Ｒｐ９変異体」と呼ばれる別の変異体は、抑制ドメイン中の９個のアミノ酸を欠き、ヒトおよびマウス細胞では非常によく見られる。
【０００６】
ＥＶＩ１タンパク質は、核に位置し、そのジンクフィンガードメインの両方によって独立に特異的ＤＮＡ配列と結合できる（Ｐｅｒｋｉｎｓら、１９９１年、ＥＶＩ１，  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１巻：２６６５〜７４頁；Ｄｅｌｗｅｌら、１９９３年、Ｆｏｕｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｖｅｎ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＶＩ１  ｍｙｅｌｏｉｄ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ＧＡ（Ｃ／Ｔ）ＡＡＧＡ（Ｔ／Ｃ）ＡＡＧＡＴＡＡ、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３巻：４２９１〜３００頁；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、１９９５年、ＥＶＩ１  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｏｒｋｓ  ａｓ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｖｉａ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ａ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ＧＡＣＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＡＡ（Ｎ１−２８）ＣＴＣＡＴＣＴＴＣ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １０巻：１９６１〜７頁）。近位ジンクフィンガードメインは、ＧＡ（Ｃ／Ｔ）ＡＡＧＡ（Ｔ／Ｃ）ＡＡＧＡＴＡＡ（配列番号２０１）からなる１５ヌクレオチドのコンセンサス配列を認識し、ＥＶＩ１は、このドメインによってＧａｔａ２プロモーターと直接的に結合することがわかっている（Ｙｕａｓａら、２００５年、Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＥＶＩ１  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＧＡＴＡ−２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＥＭＢＯ  Ｊ  ２４巻：１９７６〜８７頁；Ｙａｔｓｕｌａら、２００５年、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ＥＶＩ１  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０巻：３０７１２〜２２頁）。さらに、このドメインの結合部位は、Ｇａｔａ１と、ＤＮＡ結合について競合するＧａｔａ１コンセンサスモチーフを有する（Ｋｒｅｉｄｅｒら、１９９３年、Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｉｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＶＩ１  ｍｙｅｌｏｉｄ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｅｎｅ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０巻：６４５４〜８頁）。今日までに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究によって、遠位ジンクフィンガードメインは、コンセンサスＧＡＡＧＡＴＧＡＧ（配列番号２０２）を認識することが示されたが、遠位ジンクフィンガードメインを介してＥＶＩ１によって直接調節される遺伝子は報告されていない。
【０００７】
図２に示されるように、ＥＶＩ１はまた、いくつかの転写調節因子と相互作用する。特に、コレプレッサーＣｔＢＰとの相互作用は、ＥＶＩ１機能にとって重要である（Ｉｚｕｔｓｕら、２００１年、Ｔｈｅ  ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ＣｔＢＰ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ＥＶＩ１  ｔｏ  ｒｅｐｒｅｓｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｂｌｏｏｄ  ９７巻：２８１５〜２２頁；Ｐａｌｍｅｒら、２００１年、ＥＶＩ１  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｒｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＣｔＢＰ  ｃｏ−ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６巻：２５８３４〜４０頁）。ＣｔＢＰは、ＥＶＩ１によるリポーター遺伝子の転写抑制を増大させ、相互作用を消滅させるＥＶＩ１における点突然変異は、ＥＶＩ１媒介性転写抑制、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βに応じたＭｖ１Ｌｕ細胞の成長阻害およびＲａｔ−１線維芽細胞の形質転換を大幅に低減する。
【０００８】
ＥＶＩ１はまた、ヒストン脱アセチル化酵素と直接的に、またはＣｔＢＰを介して相互作用し、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、ＥＶＩ１による転写抑制を部分的に軽減する（Ｖｉｎａｔｚｅｒら、２００１年、Ｔｈｅ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ＥＶＩ１  ａｎｄ  ＭＤＳ１／ＥＶＩ１  ｒｅｐｒｅｓｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ、Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  １１４巻：５６６〜７３頁；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙら、２００１年、Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＶＩ１  ｗｉｔｈ  ｃＡＭＰ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＣＢＰ）  ａｎｄ  ｐ３００／ＣＢＰ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  （Ｐ／ＣＡＦ）  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＶＩ１  ａｎｄ  ｉｎ  ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｓｐｅｃｋｌｅｓ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６巻：４４９３６〜４３頁；Ｓｐｅｎｓｂｅｒｇｅｒ  ＆  Ｄｅｌｗｅｌ、２００８年、Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ＥＶＩ１  ａｎｄ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ，  ＳＵＶ３９Ｈ１  ａｎｄ  Ｇ９ａ、ＦＥＢ  Ｓ  Ｌｅｔｔ  ５８２巻：２７６１〜７頁）。ＥＶＩ１は、コアクチベーターＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）およびＰ３００／ＣＢＰ関連因子（Ｐ／ＣＡＦ）と結合し、ＣＢＰの同時発現は、リポーター遺伝子に対するＥＶＩ１の抑制効果を中程度に活性化する効果に変換することができることもわかっている（Ｃａｔｔａｎｅｏ  ＆  Ｎｕｃｉｆｏｒａ、２００８年、ＥＶＩ１  ｒｅｃｒｕｉｔｓ  ｔｈｅ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ＳＵＶ３９Ｈ１  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １０５巻：３４４〜５２頁）。さらに、最近、ＥＶＩ１は、ヒストンＨ３リシン９特異的ヒストンメチルトランスフェラーゼＳＵＶ３９Ｈ１およびＧ９ａと会合することがわかった（Ｋｕｒｏｋａｗａら、１９９８年、Ｔｈｅ  ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＥＶＩ１  ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ  ＴＧＦ−β  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  Ｓｍａｄ３、Ｎａｔｕｒｅ  ３９４巻：９２〜６頁；Ｓｏｏｄら、１９９９年、ＭＤＳ１／ＥＶＩ１  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ＴＧＦ−β１  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｓ  ｉｔｓ  ｇｒｏｗｔｈ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ｂｕｔ  ｔｈｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＭＬ１／ＭＤＳ１／ＥＶＩ１，  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔ（３；２１），  ａｂｒｏｇａｔｅｓ  ｇｒｏｗｔｈ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＴＧＦ−β１、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １３巻：３４８〜５７１８、１９頁）。したがって、ＥＶＩ１は、種々の転写調節因子と高次複合体を形成し、これらの会合は、ＥＶＩ１による転写調節にとって重要である（図２��照のこと）。
【０００９】
さらに、ＥＶＩ１は、ＴＧＦ−β経路（最良と特性決定されている）を始めとする種々のシグナル伝達経路に影響を及ぼすことがわかっている。ＴＧＦ−βは、ほとんどの細胞種の増殖および細胞分化を制御し、腫瘍発生の阻害において重要な役割を果たす。ＥＶＩ１は、ＨｅｐＧ２細胞におけるｐ３ＴＰ−ＬｕｘリポータープラスミドのＴＧＦ−β媒介性活性化を大幅に抑制し、ＥＶＩ１は、Ｍｖ１Ｌｕおよび３２Ｄ細胞におけるＴＧＦ−β媒介性成長阻害を抑制する（Ａｌｌｉｓｔｏｎら、２００５年、Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＢＭＰ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂｙ  ＥＶＩ１、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０巻：２４２２７〜３７頁；Ｎｉｔｔａら、２００５年、Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＶＩ１  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＰＲ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ＣｔＢＰ  ２００５年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４巻：６１６５〜７３頁）。さらに、ＥＶＩ１は、Ｘｅｎｏｐｕｓアニマルキャップ外殖片において、およびＣ２Ｃ１２細胞において、ＴＧＦ−βおよびその他のＴＧＦ−βファミリーメンバーによる内因性遺伝子の誘導を干渉する（Ａｌｌｉｓｔｏｎら、２００５年、同著）。ＥＶＩ１は、少なくとも２つの可能性ある機序によってＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する：物理的相互作用によるＳｍａｄ３活性の低減およびコレプレッサーＣｔＢＰの動員（Ｉｚｕｔｓｕら、２００１年、同著；Ｋｕｒｏｋａｗａら、１９９８年、同書）。
【００１０】
ＭＤＳ１／ＥＶＩ１と呼ばれる１種のＥＶＩ１転写物変異体は、ＭＤＳ１遺伝子（ＥＶＩ１の上流に位置し、それ自体でも発現される）に由来する配列と、ＥＶＩ１とからなる（Ｗｉｅｓｅｒ、２００７年、同書）。ＭＤＳ１−ＥＶＩ１は、ＥＶＩ１とは対照的に、３２Ｄ細胞においてＴＧＦ−β誘発性成長阻害を増強し（Ｓｏｏｄら、１９９９年、同書）、ＨｅｐＧ２細胞においてｐ３ＴＰ−ＬｕｘのＴＧＦ−β媒介性活性化を効率的には抑制できない（Ｎｉｔｔａら、２００５年、同書）。低い抑制活性は、ＥＶＩ１と比較して、ＭＤＳ１／ＥＶＩ１のコレプレッサーＣｔＢＰと結合する低い能力と相関する（同著）（図２参照のこと）。
【００１１】
対照的に、特定の細胞タンパク質は、アポトーシスを誘導し、腫瘍細胞成長の別の方法であるその破壊が促進される。このような細胞タンパク質の例として、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）が挙げられ、これらは種々のストレス刺激に応答し、アポトーシスの誘発において重要な役割を果たすマイトジェン活性化タンパク質キナーゼである。ＥＶＩ１は、ｃ−ＪｕｎのＪＮＫ１媒介性リン酸化を大幅に抑制する。反対に、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用するＥＶＩ１発現の低減は、ＭＯＬＭ−１およびＨＥＣ１Ｂ細胞において、内因性ＪＮＫ１活性を実験的に回復させる（Ｋｕｒｏｋａｗａら、２０００年、Ｔｈｅ  ＥＶＩ１  ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｃ−  Ｊｕｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ、ＥＭＢＯ  Ｊ  １９巻：２９５８〜６８頁）。ＥＶＩ１は、近位ジンクフィンガードメインを介してＪＮＫと物理的に相互作用し、このドメインを欠くＥＶＩ１突然変異体は、ＪＮＫ１活性を抑制できない。ＥＶＩ１はまた、ＪＮＫを阻害する能力に依存して細胞をストレス誘導性細胞死から保護する（同著）（図２参照のこと）。
【００１２】
ＪＮＫに加えて、いくつかの機序が、ＥＶＩ１の生存機能において役割を果たすと提案されている。ＥＶＩ１は、前骨髄球性白血病（Ｐｍｌ）遺伝子を活性化することによってマウス骨髄前駆細胞をアポトーシスから保護する（Ｂｕｏｎａｍｉｃｉら、２００５年、ＥＶＩ１  ａｂｒｏｇａｔｅｓ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ＰＭＬ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０巻：４２８〜３６頁）。ＥＶＩ１が、ＲＩＥ細胞において、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）−Ａｋｔ依存性機序を介してＴＧＦ−βまたはタキソール媒介性アポトーシスを抑制することも報告された（Ｌｉｕら、Ｅｖｉ１  ｉｓ  ａ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｆａｃｔｏｒ  ｗｈｉｃｈ  ｃｏｎｖｅｙｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｂｏｔｈ  ＴＧＦ−β  ａｎｄ  ｔａｘｏｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｖｉａ  ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５巻：３５６５〜７５頁）。アクチベータータンパク質（ＡＰ）−１は、Ｆｏｓ−Ｊｕｎヘテロ二量体またはＪｕｎ−Ｊｕｎホモ二量体からなる転写因子複合体である。種々の刺激に応じて遺伝子発現を調節し、分化、増殖およびアポトーシスを始めとするいくつかの細胞プロセスを制御する。ＥＶＩ１は、ＮＩＨ３Ｔ３およびＰ１９細胞において、その遠位ジンクフィンガードメインに依存して、ＡＰ−１活性を上げ、ｃ−ｆｏｓプロモーター活性化を刺激する（Ｔａｎａｋａら、１９９４年、ＥＶＩ１  ｒａｉｓｅｓ  ＡＰ−１  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｃ−ｆｏｓ  ｐｒｏｍｏｔｏｒ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｄｏｍａｉｎ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９巻：２４０２０〜６頁）。遠位ジンクフィンガードメインは、Ｒａｔ−１細胞におけるＥＶＩ１媒介性形質転換には必要であるので、ＡＰ−１活性の増強は、おそらく、ＥＶＩ１による細胞形質転換に寄与する。
【００１３】
ＥＶＩ１は、特定のがん細胞種において高度に発現される。ＥＶＩ１遺伝子は、扁平上皮癌、非小細胞癌の最も豊富な種類の７６％において増幅される（Ｋａｎｇら、２００９年、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅｓ，  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ＥＰＨＢ３，  ＭＡＳＰ１  ａｎｄ  ＳＳＴ  ａｔ  ３ｑ２６．２−ｑ２９  ｉｎ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇ、ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ９巻：２３７〜５２頁）。ＥＶＩ１遺伝子はまた、肺腺癌においても増幅される（同著）。ＥＶＩ１の発現は、非腫瘍組織と比較して、２５種のヒト非小細胞肺がんサンプルのうち１９種において大幅に高いことが、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定された（Ｙｏｋｏｉら、２００３年、ＴＥＲＣ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｂａｂｌｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ３ｑ２６  ａｍｐｌｉｃｏｎ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒｓ、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ９巻：４７０５〜１３頁）。Ｂｒｏｏｋｓらによる研究は、ＥＶＩ１は、２５種のヒト卵巣腫瘍サンプルのうち２２種および７種の黒色腫サンプルのうち６種において高度に発現されたことをＲＴ−ＰＣＲによって実証した（Ｂｒｏｏｋｓら、１９９６年、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｇｅｎｅ  ＥＶＩ１  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｃａｎｃｅｒｓ、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ７４巻：１５１８〜２５頁）。
【００１４】
したがって、ＥＶＩ１は、とりわけ、発がんにおけるその役割のために、特定のがんの治療のための望ましい治療標的であり、腫瘍細胞成長を阻害するために、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導するために、そうでなければ、単独または従来の抗がん剤とともに使用される改善されたがん治療のための方法を提供するために、ＥＶＩ１発現または活性または両方を阻害するための試薬および方法に対する必要性が当技術分野に存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の要旨
本発明は、腫瘍細胞成長を阻害するために、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導するために、そうでなければ、単独または従来の抗がん剤とともに使用される改善されたがん治療のための方法を提供するために、ＥＶＩ１発現または活性または両方を阻害するための試薬および方法を提供する。
【００１６】
第１の態様では、本発明は、腫瘍細胞においてヒトＥＶＩ１の発現を低減できる、ヒトＥＶＩ１遺伝子配列（本明細書において、配列番号１として、またＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＶＩ１  ｖ３  ＮＭ＿００１１０５０７８．３およびＮＰ＿００１０９８５４８として同定されている）のヌクレオチド配列の連続部分である配列を有し、配列番号１のヌクレオチド配列の前記連続部分が、ヌクレオチド２４６から２６６、ヌクレオチド９６９から１００２、ヌクレオチド２９００から２９２０またはヌクレオチド２９８４から３００４である単離オリゴリボヌクレオチドおよびその薬学的に許容される塩を提供する。特定の実施形態では、本発明は、一本鎖であり、１９〜２１個のリボヌクレオチド残基を含む単離オリゴリボヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、本発明は、二本鎖であり、１９〜２１のリボヌクレオチド残基を含む単離オリゴリボヌクレオチドを提供する。
【００１７】
特定の実施形態では、本発明は、配列番号１のヌクレオチド２４６から２６６によって同定されるオリゴリボヌクレオチドである試薬を提供する。このようなオリゴヌクレオチドの特定ではあるが、限定されない例は、配列番号１７から５６によって同定される。本発明は、配列番号１７および１８、配列番号１９および２０、配列番号２１および２２、配列番号２３および２４、配列番号２５および２６、配列番号２７および２８、配列番号２９および３０、配列番号３１および３２、配列番号３３および３４、配列番号３５および３６、配列番号３７および３８、配列番号３９および４０、配列番号４１および４２、配列番号４３および４４、配列番号４５および４６、配列番号４７および４８、配列番号４９および５０、配列番号５１および５２、配列番号５３および５４、または配列番号５５および５６の組合せを含む、二本鎖の低分子干渉ＲＮＡまたは低分子（短鎖）ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）である試薬を提供する。
【００１８】
追加の特定の実施形態では、本発明は、配列番号１のヌクレオチド９６９から９８９またはヌクレオチド８９２から１００２によって同定されるオリゴリボヌクレオチドである試薬を提供する。このようなオリゴヌクレオチドの特定ではあるが、限定されない例は、配列番号５７から１２０によって同定される。本発明は、配列番号５７および５８、配列番号５９および６０、配列番号６１および６２、配列番号６３および６４、配列番号６５および６６、配列番号６７および６８、配列番号６９および７０、配列番号７１および７２、配列番号７３および７４、配列番号７５および７６、配列番号７７および７８、配列番号７９および８０、配列番号８１および８２、配列番号８３および８４、配列番号８５および８６、配列番号８７および８８、配列番号８９および９０、配列番号９１および９２、配列番号９３および９４、配列番号９５および９６、配列番号９７および９８、配列番号９９および１００、配列番号１０１および１０２、配列番号１０３および１０４、配列番号１０５および１０６、配列番号１０７および１０８、配列番号１０９および１１０、配列番号１１１および１１２、配列番号１１３および１１４、配列番号１１５および１１６、配列番号１１７および１１８、または配列番号１１９および１２０の組合せを含む、二本鎖の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または低分子（短鎖）ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）である試薬を提供する。
【００１９】
さらなる追加の特定の実施形態では、本発明は、配列番号１のヌクレオチド２９００から２９２０によって同定されるオリゴリボヌクレオチドである試薬を提供する。このようなオリゴヌクレオチドの特定ではあるが、限定されない例は、配列番号１２１から１６０によって同定される。本発明は、配列番号１２１および１２２、配列番号１２３および１２４、配列番号１２５および１２６、配列番号１２７および１２８、配列番号１２９および１３０、配列番号１３１および１３２、配列番号１３３および１３４、配列番号１３５および１３６、配列番号１３７および１３８、配列番号１３９および１４０、配列番号１４１および１４２、配列番号１４３および１４４、配列番号１４５および１４６、配列番号１４７および１４８、配列番号１４９および１５０、配列番号１５１および１５２、配列番号１５３および１５４、配列番号１５５および１５６、配列番号１５７および１５８、または配列番号１５９および１６０の組合せを含む、二本鎖の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または低分子（短鎖）ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）である試薬を提供する。
【００２０】
なおさらなる追加の特定の実施形態では、本発明は、配列番号１のヌクレオチド２９８４から３００４によって同定されるオリゴリボヌクレオチドである試薬を提供する。このようなオリゴヌクレオチドの特定ではあるが、限定されない例は、配列番号１６１から２００によって同定される。本発明は、配列番号１６１および１６２、配列番号１６３および１６４、配列番号１６５および１６６、配列番号１６７および１６８、配列番号１６９および１７０、配列番号１７１および１７２、配列番号１７３および１７４、配列番号１７５および１７６、配列番号１７７および１７８、配列番号１７９および１８０、配列番号１８１および１８２、配列番号１８３および１８４、配列番号１８５および１８６、配列番号１８７および１８８、配列番号１８９および１９０、配列番号１９１および１９２、配列番号１９３および１９４、配列番号１９５および１９６、配列番号１９７および１９８、または配列番号１９９および２００の組合せを含む、二本鎖の、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または低分子（短鎖）ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）である試薬を提供する。
【００２１】
本発明は、具体的には、配列番号２、３、４、５または６によって同定される単離オリゴリボヌクレオチドである試薬を提供する。これらの実施形態は、配列番号７および８、配列番号９および１０、配列番号１１および１２、配列番号１３および１４または配列番号１５および１６の組合せを含む、二本鎖の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または低分子（短鎖）ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）として特に提供される。
【００２２】
本発明はさらに、任意の前記の本発明の単離オリゴリボヌクレオチドおよび薬学的に許容される塩、担体、賦形剤またはアジュバントを含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、リポソーム中に被包され、ある追加の特定の実施形態では、前記リポソームは、ＰＥＧ化され、および／または、細胞ターゲッティング部分を含み、前記細胞ターゲッティング部分は、それだけには限らないが、タンパク質、ペプチドまたはアプタマーである。特定の追加の実施形態では、前記医薬組成物は、ナノ粒子をさらに含み、これでは、前記ナノ粒子は、とりわけ、脂質、シクロデキストリン、キトサン、炭水化物ポリマー、エラスチン様ポリマーまたはリン酸カルシウムポリマーまたはその組合せを含有し得る。これらの実施形態では、前記ナノ粒子は、ＰＥＧ化されていてもよく、および／または細胞ターゲッティング部分を含んでもよく、前記細胞ターゲッティング部分は、それだけには限らないが、タンパク質、ペプチドまたはアプタマーであってもよい。
【００２３】
第２の態様において、本発明は、腫瘍細胞を、有効量の任意の前記の本発明の単離オリゴリボヌクレオチドと接触させるステップを含む、腫瘍細胞成長を阻害する方法を提供する。本発明はまた、それを必要とするヒト患者に、任意の前記の本発明の単離オリゴリボヌクレオチドおよび薬学的に許容される塩、担体、賦形剤またはアジュバントを含む本発明の医薬組成物の治療上有効な量を投与するステップを含む、腫瘍成長を阻害する方法を提供する。特定の実施形態では、前記医薬組成物は、単独もしくは複数の従来の抗がん薬もしくは抗がん剤と組み合わせて、またはそれとともに投与される。特定の実施形態では、前記腫瘍は、肺、乳房、前立腺もしくは卵巣組織もしくは器官由来の悪性腫瘍または黒色腫もしくは急性骨髄性白血病である。
【００２４】
本発明によって提供される試薬および方法は、先行技術を上回る特定の利点を有する。これらとして、それだけには限らないが、がん治療の副作用が、オリゴリボヌクレオチドのＥＶＩ１  ＲＮＡへの特異的ターゲッティングによって最小化され、その結果、腫瘍細胞が死滅し、正常組織を残すこと；ＥＶＩ１を阻害するオリゴリボヌクレオチドが、腫瘍親和性リポソーム中に送達され得、それによって治療の効力および有効性が増大すること；ＥＶＩ１を阻害する効果が、従来の化学療法薬治療と、増殖する腫瘍を相乗的に除去するために両因子を腫瘍親和性リポソーム中に加えることによって組み合わされ得ること；およびＥＶＩ１阻害剤が、薬物保持を増強し、腫瘍における薬物濃度を高めるために任意の有利な治療経路によって投与され得ることが挙げられる。
本発明の好ましい実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
腫瘍細胞においてヒトＥＶＩＩの発現を低減できる、単離オリゴリボヌクレオチドおよびその薬学的に許容される塩であって、該単離オリゴリボヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列の連続部分である配列を有し、ここで、配列番号１の該ヌクレオチド配列の該連続部分が、ヌクレオチド２４６から２６６、ヌクレオチド９６９から１００２、ヌクレオチド２９００から２９２０またはヌクレオチド２９８４から３００４である、単離オリゴリボヌクレオチドおよびその薬学的に許容される塩。
（項目２）
１９〜２１個のリボヌクレオチド残基を含む、一本鎖である項目１に記載の単離オリゴリボヌクレオチド。
（項目３）
１９〜２１個のリボヌクレオチド残基を含む、二本鎖である単離オリゴリボヌクレオチド。
（項目４）
配列番号１のヌクレオチド２４６から２６６によって同定される、項目１に記載の単離オリゴリボヌクレオチド。
（項目５）
配列番号１７から５６によって同定されるオリゴリボヌクレオチドを含む、項目４に記載の単離オリゴリボヌクレオチド。
（項目６）
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１７および１８、配列番号１９および２０、配列番号２１および２２、配列番号２３および２４、配列番号２５および２６、配列番号２７および２８、配列番号２９および３０、配列番号３１および３２、配列番号３３および３４、配列番号３５および３６、配列番号３７および３８、配列番号３９および４０、配列番号４１および４２、配列番号４３および４４、配列番号４５および４６、配列番号４７および４８、配列番号４９および５０、配列番号５１および５２、配列番号５３および５４、または配列番号５５および５６の組合せを含む、項目４に記載の二本鎖オリゴリボヌクレオチドまたはそのｓｈＲＮＡ種もしくはｓｉＲＮＡ種。
（項目７）
配列番号１のヌクレオチド９６９から９８９またはヌクレオチド８９２から１００２によって同定される、項目１に記載の単離オリゴリボヌクレオチド。
（項目８）
配列番号５７から１２０によって同定されるオリゴリボヌクレオチドを含む、項目７に記載の単離オリゴリボヌクレオチド。
（項目９）
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号５７および５８、配列番号５９および６０、配列番号６１および６２、配列番号６３および６４、配列番号６５および６６、配列番号６７および６８、配列番号６９および７０、配列番号７１および７２、配列番号７３および７４、配列番号７５および７６、配列番号７７および７８、配列番号７９および８０、配列番号８１および８２、配列番号８３および８４、配列番号８５および８６、配列番号８７および８８、配列番号８９および９０、配列番号９１および９２、配列番号９３および９４、配列番号９５および９６、配列番号９７および９８、配列番号９９および１００、配列番号１０１および１０２、配列番号１０３および１０４、配列番号１０５および１０６、配列番号１０７および１０８、配列番号１０９および１１０、配列番号１１１および１１２、配列番号１１３および１１４、配列番号１１５および１１６、配列番号１１７および１１８、または配列番号１１９および１２０の組合せを含む、項目８に記載の二本鎖オリゴリボヌクレオチドまたはそのｓｈＲＮＡ種もしくはｓｉＲＮＡ種。
（項目１０）
配列番号１のヌクレオチド２９００から２９２０によって同定される、項目１に記載の単離オリゴリボヌクレオチド。
（項目１１）
配列番号１２１から１６０によって同定されるオリゴリボヌクレオチドを含む、項目１０に記載の単離オリゴリボヌクレオチド。
（項目１２）
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１２１および１２２、配列番号１２３および１２４、配列番号１２５および１２６、配列番号１２７および１２８、配列番号１２９および１３０、配列番号１３１および１３２、配列番号１３３および１３４、配列番号１３５および１３６、配列番号１３７および１３８、配列番号１３９および１４０、配列番号１４１および１４２、配列番号１４３および１４４、配列番号１４５および１４６、配列番号１４７および１４８、配列番号１４９および１５０、配列番号１５１および１５２、配列番号１５３および１５４、配列番号１５５および１５６、配列番号１５７および１５８、または配列番号１５９および１６０の組合せを含む、項目１１に記載の二本鎖オリゴリボヌクレオチドまたはそのｓｈＲＮＡ種もしくはｓｉＲＮＡ種。
（項目１３）
配列番号１のヌクレオチド２９８４から３００４によって同定される、項目１に記載の単離オリゴリボヌクレオチド。
（項目１４）
配列番号１６１から２００によって同定されるオリゴリボヌクレオチドを含む、項目１３に記載の単離オリゴリボヌクレオチド。
（項目１５）
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１６１および１６２、配列番号１６３および１６４、配列番号１６５および１６６、配列番号１６７および１６８、配列番号１６９および１７０、配列番号１７１および１７２、配列番号１７３および１７４、配列番号１７５および１７６、配列番号１７７および１７８、配列番号１７９および１８０、配列番号１８１および１８２、配列番号１８３および１８４、配列番号１８５および１８６、配列番号１８７および１８８、配列番号１８９および１９０、配列番号１９１および１９２、配列番号１９３および１９４、配列番号１９５および１９６、配列番号１９７および１９８、または配列番号１９９および２００の組合せを含む、項目１４に記載の二本鎖オリゴリボヌクレオチドまたはそのｓｈＲＮＡ種もしくはｓｉＲＮＡ種。
（項目１６）
配列番号２、３、４、５または６によって同定されるヌクレオチド配列を含む単離オリゴリボヌクレオチド。
（項目１７）
前記オリゴリボヌクレオチドが、配列番号７および８、配列番号９および１０、配列番号１１および１２、配列番号１３および１４または配列番号１５および１６の組合せを含む、項目１６に記載の二本鎖オリゴリボヌクレオチド、またはそのｓｈＲＮＡ種もしくはｓｉＲＮＡ種。
（項目１８）
項目１に記載の単離オリゴリボヌクレオチドと、薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントとを含む医薬組成物。
（項目１９）
項目１６に記載の単離オリゴリボヌクレオチドと、薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントとを含む医薬組成物。
（項目２０）
腫瘍細胞を、有効量の項目１に記載の単離オリゴリボヌクレオチドと接触させるステップを含む、腫瘍細胞成長を阻害する方法。
（項目２１）
腫瘍細胞を、有効量の項目１６に記載の単離オリゴリボヌクレオチドと接触させるステップを含む、腫瘍細胞成長を阻害する方法。
（項目２２）
腫瘍細胞を、有効量の項目１８に記載の医薬組成物と接触させるステップを含む、腫瘍成長を阻害する方法。
（項目２３）
腫瘍細胞を、有効量の項目１９に記載の医薬組成物と接触させるステップを含む、腫瘍成長を阻害する方法。
（項目２４）
前記腫瘍が、肺、乳房、前立腺もしくは卵巣の組織または器官の悪性腫瘍、あるいは黒色腫または急性骨髄性白血病である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
化学療法薬または化学療法剤をさらに含む、項目１８に記載の医薬組成物。
（項目２６）
化学療法薬または化学療法剤をさらに含む、項目１９に記載の医薬組成物。
（項目２７）
腫瘍細胞を、有効量の項目２５に記載の医薬組成物と接触させるステップを含む、腫瘍成長を阻害する方法。
（項目２８）
前記腫瘍が、肺、乳房、前立腺もしくは卵巣の組織または器官の悪性腫瘍、あるいは黒色腫もしくは急性骨髄性白血病である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
腫瘍細胞を、有効量の項目２６に記載の医薬組成物と接触させるステップを含む、腫瘍成長を阻害する方法。
（項目３０）
前記腫瘍が、肺、乳房、前立腺もしくは卵巣の組織または器官の悪性腫瘍、あるいは黒色腫もしくは急性骨髄性白血病である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
リポソーム中に被包された、項目１８、１９、２５または２６に記載の医薬組成物。
（項目３２）
前記リポソームが、ＰＥＧ化されている、項目３１に記載の医薬組成物。
（項目３３）
前記リポソームが、細胞ターゲッティング部分を含む、項目３１に記載の医薬組成物。
（項目３４）
前記細胞ターゲッティング部分が、タンパク質、ペプチドまたはアプタマーである、項目３３に記載の医薬組成物。
（項目３５）
ナノ粒子を含む、項目１８、１９、２５または２６に記載の医薬組成物。
（項目３６）
前記ナノ粒子が、脂質、シクロデキストリン、キトサン、炭水化物ポリマー、エラスチン様ポリマーまたはリン酸カルシウムポリマーまたはその組合せを含む、項目３５に記載の医薬組成物。
（項目３７）
前記ナノ粒子が、ＰＥＧ化されている、項目３５に記載の医薬組成物。
（項目３８）
前記ナノ粒子が、細胞ターゲッティング部分を含む、項目３５に記載の医薬組成物。
（項目３９）
前記細胞ターゲッティング部分が、タンパク質、ペプチドまたはアプタマーである、項目３８に記載の医薬組成物。
（項目４０）
項目１から１７のいずれかに記載の単離オリゴリボヌクレオチドと、薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントとを含む、医薬組成物。
（項目４１）
化学療法薬または化学療法剤をさらに含む、項目４０に記載の医薬組成物。
【００２５】
本発明の特定の好ましい実施形態は、特定の好ましい実施形態の以下のより詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、ヒト３番染色体上のヒトＥＶＩＩ遺伝子のエキソン／イントロン構造の模式図である。
【図２】図２は、ヒトＥＶＩＩタンパク質といくつかのヒトアポトーシス関連タンパク質間の刺激性および阻害性相互作用の模式図である。
【図３】図３は、哺乳動物細胞におけるｓｉＲＮＡサイレンシング機序の活性の経路の模式図である。図に示されるように、１）サイレンシングの標的とされる遺伝子の一部に対して特異的な２１ｂｐの配列の低分子干渉ＲＮＡが、ナノ粒子送達系を使用して細胞に導入され；２）ｓｉＲＮＡが、前記ナノ粒子の特定の実施形態を含むエラスチンペプチドのタンパク質分解性消化のためにナノ粒子から取り出され；３）ｓｉＲＮＡが、ＲＩＳＣタンパク質複合体と結合し；４）センス鎖が、ＲＩＳＣ複合体から取り除かれ；５）ｓｉＲＮＡ  ＲＩＳＣ複合体が、標的ｍＲＮＡと結合し；６）標的ｍＲＮＡが、ヌクレアーゼによって分解され；７）タンパク質発現が抑制される。
【図４】図４は、卵巣扁平上皮癌におけるＥＶＩ１の腫瘍特異的発現の例を示すマイクロアレイの顕微鏡写真である。腫瘍組織（左）および隣接する正常組織（右）のホモジネートが、ＳｏｍａＰｌｅｘ（商標）がん組織溶解物タンパク質マイクロアレイスライド（Ｇｅｎｔｅｌ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）において、３連でポリビニルジフルオリドメンブレン上にスポットされている。
【図５】図５は、同一対象から得た正常組織と比較した、雌の生殖器系の２４種の腫瘍におけるＥＶＩ１の相対発現を示すグラフである。
【図６】図６は、細胞生存に関するＥＶＩ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡの濃度依存性効果を示すグラフである。卵巣腫瘍細胞ＴＯＤ１１２ＤおよびＥＳ−２を１２ウェルプレートの各ウェルに播種した。２ｍｌの培地中、１マイクロリットルのＤｈａｒｍａｆｅｃｔ試薬を使用して、細胞に漸増濃度のｓｉＲＮＡを入れた。トリパンブルー染色および血球計での計数を使用して生存細胞数を決定した。
【図７Ａ】図７Ａおよび７Ｂは、卵巣腫瘍細胞成長を阻害するために、ｓｉＥＶＩ１−２９１０の１０ｂｐ上流および下流のｓｉＲＮＡ配列をタイリングすることによって製造されたｓｉＲＮＡ種（配列番号１２１〜１６０）による腫瘍細胞成長阻害の結果を示すグラフである。ＴＯＶ−１１２Ｄ（図７Ａ）またはＥＳ−２（図７Ｂ）卵巣腫瘍細胞に、２．５ｎＭの濃度の各ｓｉＲＮＡをＤｈａｒｍａＦＥＣＴトランスフェクション試薬を使用して投与した。結果は、トランスフェクション（ｓｉＧｌｏ）対照に対する、ＴＯＶ−１１２ＤまたはＥＳ−２卵巣腫瘍細胞の成長阻害パーセントとして表されている。
【図７Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、卵巣腫瘍細胞成長を阻害するために、ｓｉＥＶＩ１−２９１０の１０ｂｐ上流および下流のｓｉＲＮＡ配列をタイリングすることによって製造されたｓｉＲＮＡ種（配列番号１２１〜１６０）による腫瘍細胞成長阻害の結果を示すグラフである。ＴＯＶ−１１２Ｄ（図７Ａ）またはＥＳ−２（図７Ｂ）卵巣腫瘍細胞に、２．５ｎＭの濃度の各ｓｉＲＮＡをＤｈａｒｍａＦＥＣＴトランスフェクション試薬を使用して投与した。結果は、トランスフェクション（ｓｉＧｌｏ）対照に対する、ＴＯＶ−１１２ＤまたはＥＳ−２卵巣腫瘍細胞の成長阻害パーセントとして表されている。
【図８】図８は、免疫ブロット分析の写真（左パネル）および抗ＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡによる腫瘍細胞成長の阻害を示す。卵巣腫瘍細胞ＳＫＯＶ３を、６ウェルプレートの各ウェルに播種した。４ｍｌの培地中、２マイクロリットルのＤｈａｒｍａｆｅｃｔ試薬を使用して、細胞に漸増濃度のｓｉＲＮＡを入れた。トリパンブルー染色および血球計での計数を使用して生存細胞数を決定した。核タンパク質を、細胞から単離し、存在するＥＶＩ１の量を、抗ＥＶＩ１ポリクローナル抗体を使用して検出し、ヤギ抗ウサギＨＲＰコンジュゲートおよび化学発光ペルオキシダーゼ染色を使用して可視化した。図８の右パネルは、左パネルに示される免疫ブロットに使用された実験において使用されたｓｉＲＮＡによる腫瘍細胞成長阻害を反映する棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
好ましい実施形態の詳細な説明
オリゴヌクレオチド合成および酵素反応には、当業者に周知の従来技術を使用し、精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当技術分野でよく遂行されるように、または本明細書に記載されるように実施した。技術および手順は、概して、当技術分野で周知の従来の方法に従って、また本明細書を通じて列挙され、論じられた種々の一般的な参考文献およびより特定の参考文献に記載されるように実施した。例えば、任意の目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．参照のこと。特別の定義が提供されない限り、本明細書に記載される分子生物学、遺伝子工学、分析化学、合成有機化学ならびに医薬品化学および製薬化学に関連して使用される術後体系ならびにそれらの実験室手順および技術は、当技術分野で周知であり、日常的なものである。化学合成、化学分析および患者の治療には、標準技術が使用され得る。
【００２８】
特に文脈によって必要とされない限り、単数の用語は、複数を含むものとし、複数の用語は、単数を含むものとする。
【００２９】
本開示内容に従って使用されるように、以下の用語は、特に断りのない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする：
本発明は、単離ポリヌクレオチド、特に、ヒトＥＶＩ１の一部をコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書において、用語「単離ポリヌクレオチド」とは、ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成由来のポリヌクレオチドまたはその組合せを意味し、その供給源によって、「単離ポリヌクレオチド」は、（１）「単離ポリヌクレオチド」が天然に見られるポリヌクレオチドのすべてまたは一部と会合されず、（２）天然に連結していないポリヌクレオチドに連結され、または（３）長い配列の一部として天然に生じない。
【００３０】
特に断りのない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側の末端は、５’末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は、５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’への付加の方向は、転写方向と呼ばれ；ＲＮＡと同一配列を有し、ＲＮＡ転写物の５’末端の５’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と呼ばれ；ＲＮＡと同一配列を有し、ＲＮＡ転写物の３’末端の３’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と呼ばれる。
【００３１】
本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」とは、少なくとも１０塩基の長さであるポリマー形態のヌクレオチドを意味する。特定の実施形態では、塩基は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾された形態であり得る。この用語は、一本鎖および二本鎖の形態のＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
【００３２】
本明細書において、用語「ＰＥＧ化された」とは、１種または複数のポリエチレングリコール分子のタンパク質、脂質またはその他の生体分子との結合（共有結合またはその他の）を意味する。
【００３３】
本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」とは、天然に存在する、および／または天然に存在しないオリゴヌクレオチド結合によって一緒に連結された天然に存在するヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、一般に２００以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドサブセットである。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０から６０のヌクレオチド長である。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または３０から４０個の塩基長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、アンチセンスＲＮＡとして使用するために一本鎖である場合も、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または低分子（または短鎖）ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）として二本鎖である場合もある。オリゴヌクレオチドは、放射標識、蛍光標識、抗原性標識またはハプテンなどの検出可能な標識を含み得る。
【００３４】
用語「天然に存在するヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。用語「修飾されたヌクレオチド」は、修飾または置換された糖基などを有するヌクレオチドを含む。用語「オリゴヌクレオチド結合」は、リン酸、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、ホスホロアミデートなどといったオリゴヌクレオチド結合を含む。例えば、各々の開示内容が、任意の目的のために参照により本明細書に組み込まれる、ＬａＰｌａｎｃｈｅら、１９８６年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４巻：９０８１頁；Ｓｔｅｃら、１９８４年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １０６巻：６０７７頁；Ｓｔｅｉｎら、１９８８年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６巻：３２０９頁；Ｚｏｎら、１９９１年、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ６巻：５３９頁；Ｚｏｎら、１９９１年、ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ、（Ｆ．  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ、８７〜１０８頁；Ｓｔｅｃら、米国特許第５，１５１，５１０号；ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ、１９９０年、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０巻：５４３頁参照のこと。
【００３５】
用語「ベクター」は、コード情報を宿主細胞または標的細胞に伝達するために使用される分子（例えば、核酸、プラスミドまたはウイルス）を指すよう使用される。本発明の方法に適したウイルスベクターとして、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルスに由来するものが挙げられる。
【００３６】
用語「発現ベクター」とは、宿主細胞または標的細胞の形質転換に適しており、挿入された核酸配列の発現を方向付ける、および／または制御する制御配列を含む核酸配列を含有するベクターを指す。用語「発現」は、それだけには限らないが、転写およびイントロンが存在する場合にはＲＮＡスプライシングなどのプロセスを含む。
【００３７】
本発明の発現ベクターは、制御配列と作動可能に連結したコード配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含み得る。本明細書において、用語「制御配列」または「制御エレメント」とは、それらが連結しているコード配列の発現およびプロセシングを達成できるポリヌクレオチド配列を指す。このような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なり得る。特定の実施形態によれば、原核生物の制御配列は、プロモーター、リプレッサー、オペレーター、リボソーム結合部位および転写終結配列およびアンチセンスｍＲＮＡを含み得る。特定の実施形態によれば、真核生物の制御配列は、プロモーター、エンハンサーおよび転写終結配列またはタンパク質分解、ｍＲＮＡ分解、核局在性、核外輸送、細胞質保持、タンパク質リン酸化、タンパク質アセチル化、タンパク質ＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｌａｔｉｏｎ）もしくはＲＮＡ阻害（ＲＮＡｉ）を調節する配列を含み得る。特定の実施形態では、「制御配列」は、リーダー配列および／または融合パートナー配列を含み得る。「制御配列」は、「制御配列」が、それらが連結しているコード配列の発現およびプロセシングを達成する場合にコード配列に「作動可能に連結される」。
【００３８】
本明細書において、語句「組織特異的プロモーター」とは、コード配列の転写を方向付けることができ、特定の細胞種内で特異的に活性化される制御配列を含む核酸配列を指す。例えば、肝臓細胞において遺伝子の発現を駆動する肝臓特異的プロモーターとして、それだけには限らないが、ヒトまたはマウスα１−アンチトリプシン、アルブミンプロモーター、血清アミロイドＡ、トランスサイレチン、肝細胞核因子６および主要尿タンパク質（ＭＵＰ）をコードする遺伝子に由来するプロモーターが挙げられる。
【００３９】
通常、宿主細胞または標的細胞に使用される発現ベクターは、ベクター維持のための、また外因性ヌクレオチド配列の発現のための配列を含有する。特定の実施形態では、「フランキング配列」とまとめて呼ばれるこのような配列は、通常、以下のヌクレオチド配列のうち１種または複数を含む：プロモーター、１種または複数のエンハンサー配列、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライシング部位を含有する完全イントロン配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル配列、発現されるべきｓｉＲＮＡをコードする核酸を挿入するための１種または複数の制限エンドヌクレアーゼ部位を含むポリリンカー領域および選択マーカーエレメント。
【００４０】
フランキング配列は、相同である（すなわち、宿主細胞または標的細胞と同一種および／または株に由来する）場合も、異種である（すなわち、宿主細胞または標的細胞種または株以外の種に由来する）、ハイブリッドである（すなわち、２種以上の供給源に由来するフランキング配列の組合せ）場合も、合成または天然である場合もある。そのようなものとして、フランキング配列の供給源は、フランキング配列が宿主細胞または標的細胞機構において機能的であり、それによって活性化され得る限り、任意の原核生物または真核生物、任意の脊椎動物または無脊椎動物生物、または任意の植物であり得る。
【００４１】
本発明のベクターにおいて有用なフランキング配列は、当技術分野で周知の任意のいくつかの方法によって得ることができる。通常、本明細書において有用なフランキング配列は、マッピングすることによって、および／または制限エンドヌクレアーゼ消化によってこれまでに同定されており、ひいては、適当な制限エンドヌクレアーゼを使用して適切な組織供給源から単離することができる。場合によっては、フランキング配列の完全ヌクレオチド配列が公知であり得る。フランキング配列はまた、核酸合成またはクローニングのための本明細書に記載される方法を使用して合成してもよい。
【００４２】
フランキング配列のすべてまたは一部のみが公知である場合は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅方法を使用して、ならびに／またはゲノムライブラリーを、同一または別の種に由来する適したオリゴヌクレオチドおよび／もしくはフランキング配列断片を用いてスクリーニングすることによって得ることができる。フランキング配列が公知ではない場合には、フランキング配列を含有するＤＮＡの断片を、例えば、コード配列または、さらに別の遺伝子（単数または複数）を含有し得るＤＮＡの大きな部分から単離してもよい。単離は、適切なＤＮＡ断片を製造するための制限エンドヌクレアーゼ消化と、それに続く、アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎカラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃａｌｉｆ）または当業者に公知のその他の方法を使用する単離によって達成され得る。この目的を達成するための適した酵素の選択は、当業者には容易に明らかである。
【００４３】
転写終結配列は、通常、ポリペプチドコード領域の末端の３’に位置し、転写を終結させるよう働く。普通、原核細胞における転写終結配列は、Ｇ−Ｃリッチ断片と、それに続くポリＴ配列である。配列は、ライブラリーから容易にクローニングされる、またはさらにベクターの一部として商業的に購入されるが、本明細書に記載されるものなど核酸合成のための方法を使用して容易に合成され得る。真核生物は、エンドヌクレアーゼ切断と、それに続く、ポリＡ残基の付加に必要な転写終結シグナルおよびポリＡシグナルの両方として機能する配列を有する（普通、約２００個のＡ残基からなる）。
【００４４】
本発明の発現およびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、ヒトＥＶＩ１遺伝子の一部をコードする核酸に作動可能に連結したプロモーターを含有する。プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンの上流（すなわち、５’）（一般に、約１００〜１０００ｂｐ内）に位置し、構造遺伝子の転写を制御する転写されない配列である。プロモーターは、従来、２つのクラス：誘導プロモーターおよび構成的プロモーターの一方にグループ分けされる。誘導プロモーターは、栄養分の有無または温度の変化などの培養条件のいくつかの変化に応じて、その制御下でＤＮＡから増大したレベルの転写を開始する。他方、構成的プロモーターは、連続的な遺伝子産物産生を開始する；すなわち、遺伝子発現に対する実験的制御はほとんどない、または全くない。種々の可能性ある宿主細胞または標的細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。
【００４５】
哺乳動物細胞とともに使用するための適したプロモーターは周知であり、それだけには限らないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２などの）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、最も好ましくは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）などの真核生物ウイルスのゲノムから得られたものが挙げられる。その他の適した哺乳動物プロモーターとして、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターが挙げられる。
【００４６】
本発明の組換え発現ベクターの実施において有用な特定のプロモーターとして、それだけには限らないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、１９８１年、Ｎａｔｕｒｅ  ２９０巻：３０４〜１０頁）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’長い末端反復配列に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０年、Ｃｅｌｌ  ２２巻：７８７〜９７頁）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７８巻：１４４４〜４５頁）；およびメタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２年、Ｎａｔｕｒｅ  ２９６巻：３９〜４２頁）が挙げられる。組織特異性を示し、トランスジェニック動物において利用されてきた以下の動物転写制御領域も対象とされる：脾臓腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら、１９８４年、Ｃｅｌｌ  ３８巻：６３９〜４６頁；Ｏｒｎｉｔｚら、１９８６年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｉｎｔ．  Ｂｉｏｌ．  ５０巻：３９９４０９頁；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８７年、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７巻：４２５〜５１５頁）；脾臓β細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５巻：１１５〜２２頁）；精巣、乳房、リンパ球系および肥満細胞において活性であるマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、１９８６年、Ｃｅｌｌ  ４５巻：４８５〜９５頁）；骨髄系細胞において活性であるβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５巻：３３８〜４０頁；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６年、Ｃｅｌｌ  ４６巻：８９〜９４頁）；脳中の乏突起神経膠細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７年、Ｃｅｌｌ  ４８巻：７０３〜１２頁）；骨格筋において活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４巻：２８３〜８６頁）；視床下部において活性である性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４巻：１３７２〜７８頁）；および最も特には、リンパ球系細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４年、Ｃｅｌｌ  ３８巻：６４７〜５８頁；Ａｄａｍｅｓら、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ  ３１８巻：５３３〜３８頁；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８７年、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ７巻：１４３６〜４４頁）。
【００４７】
好ましくは、本発明の発現ベクターのプロモーターは、標的または宿主細胞が由来する組織において活性である。例えば、細胞が、肝臓細胞である場合は、すべて肝臓において活性である、アルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７年、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．  １巻：２６８〜７６頁）；α−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５年、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ５巻：１６３９〜４８頁；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５巻：５３〜５８頁）；またはα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７年、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．  １巻：１６１〜７１頁）を使用できることが有利である。
【００４８】
本発明のベクターはまた、高等真核細胞において転写を増大させるエンハンサー配列を含有し得る。エンハンサーとは、ＤＮＡのシス作用エレメントであり、普通、約１０〜３００ｂｐ長であり、転写を増大するようプロモーターに作用する。エンハンサーは、比較的配向依存性および位置依存性である。それらは、イントロン内ならびに転写単位の５’および３’両方の数キロベース内に見出されている。哺乳動物遺伝子から入手可能であるいくつかのエンハンサー配列が公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、インスリン、トランスサイレチンおよびＨＮＦ−６遺伝子に由来するエンハンサー）。ウイルス由来するエンハンサーもまた、遺伝子の発現を増大するために使用され得る。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーは、真核細胞プロモーターの活性化のための例示的増強エレメントである。エンハンサーは、核酸分子の５’または３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、通常は、プロモーターから５’の部位に位置する。
【００４９】
本発明の発現ベクターは、市販のベクターなどの好都合な出発ベクターから構築され得る。このようなベクターは、所望のフランキング配列のすべてを含有する場合も、含有しない場合もある。本明細書に記載されるフランキング配列のうち１種または複数が、ベクター中にすでに存在しない場合は、個別に得て、ベクター中に連結してもよい。フランキング配列の各々を得るために使用される方法は、当業者に周知である。
【００５０】
ベクターが構築された後、例えば、ＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡをコードする核酸分子が、ベクターの適切な部位に挿入され、完成したベクターが適した宿主細胞または標的細胞中に挿入され得る。選択された宿主細胞または標的細胞への、ＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡをコードするすべての発現ベクターの導入は、トランスフェクション、感染、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン法または上記のその他の公知の技術などの方法を始めとする周知の方法によって達成され得る。選択される方法は、幾分かは、使用される予定の宿主細胞または標的細胞の種類の関数となる。これらの方法およびその他の適した方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．に示されている。
【００５１】
用語「宿主細胞」は、核酸配列を導入されている、または核酸配列を導入され、次いで、対象とする遺伝子を発現させることができる細胞を指すよう使用される。この用語は、後代が、元の親と形態学において、または遺伝子構造において同一であろうと、そうでなかろうと、遺伝子が存在する限り、親細胞の後代を含む。好ましい実施形態では、宿主細胞は、真核細胞、より好ましくは、哺乳動物細胞であり、最も好ましくは、げっ歯類またはヒト細胞である。
【００５２】
適当な標的細胞の選択は、適当な宿主細胞の選択について上記で論じられた種々の因子に応じて変わる。さらに、標的細胞は、本発明の方法によって治療される患者に影響を及ぼす疾患または状態に基づいて選択され得る。
【００５３】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来または外因性ＤＮＡの取り込みを指すよう使用され、細胞は、外因性ＤＮＡが細胞の内側に導入されている場合に、「トランスフェクト」されている。いくつかのトランスフェクション技術が、当技術分野で周知であり、本明細書において開示されている。例えば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２巻：４５６頁；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；Ｄａｖｉｓら、１９８６年、ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）；およびＣｈｕら、１９８１年、Ｇｅｎｅ  １３巻：１９７頁参照のこと。このような技術は、適した宿主細胞に外因性ＤＮＡを導入するために使用され得る。
【００５４】
用語「薬剤」は、本明細書において、化合物、化合物の混合物、生物学的高分子または生物学的材料から製造された抽出物を示すよう使用される。
【００５５】
本明細書において、用語「医薬組成物」とは、薬学的に許容される担体、賦形剤もしくは希釈液および化合物、ペプチドを含む組成物または患者に適宜投与された場合に、所望の治療効果を導入できる本明細書に記載される組成物を指す。
【００５６】
用語「治療上有効な量」とは、哺乳動物において治療反応を生じると決定された、本発明の成長ホルモンもしくは医薬組成物または本発明のスクリーニング方法において同定された化合物の量を指す。このような治療上有効な量は、当業者によって、本明細書に記載される方法を使用して容易に確認される。
【００５７】
本明細書において、「実質的に純粋な」とは、存在する主な種である（すなわち、モルベースで、組成物中の任意のその他の個々の種よりも豊富である）目的種を意味する。特定の実施形態では、実質的に精製された画分は、目的種が、存在するすべての高分子種の、少なくとも約５０パーセント（モルベースで、または重量もしくは数ベースで）を含む組成物である。特定の実施形態では、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種の約８０％、８５％、９０％、９５％または９９％超を含む。特定の実施形態では、目的種は、組成物が本質的に単一の高分子種からなる、本質的な均一性に（従来の検出方法によっては組成物中に混入する種が検出され得ない）精製される。
【００５８】
用語「患者」は、ヒトおよび動物対象を含む。
【００５９】
本明細書において、用語「腫瘍成長」および「腫瘍細胞増殖」は、腫瘍細胞の成長を指すよう使用される。本明細書において、用語「腫瘍細胞」とは、腫瘍性である細胞を指す。腫瘍細胞は、良性、すなわち、転移を形成せず、隣接する正常組織を浸潤および破壊しないものである場合も、悪性、すなわち、周囲組織を浸潤し、転移を生じることができ、試みられた除去後に再発し得、宿主の死亡を引き起こす可能性が高いものである場合もある。本発明の方法に付される腫瘍細胞は、皮膚細胞、肺細胞、腸上皮細胞、結腸上皮細胞、精巣細胞、乳房細胞、前立腺細胞、脳細胞、骨髄細胞、血液リンパ細胞、卵巣細胞または胸腺細胞に由来する腫瘍細胞などの上皮由来腫瘍細胞であることが好ましい。
【００６０】
本発明の好ましい実施形態は、薬物、ＥＶＩ１遺伝子から発現されたＲＮＡの一部を認識する配列を有するヌクレオチドを含む。細胞内でのＥＶＩ１の発現の阻害は、細胞の分裂の阻止および／またはアポトーシスの活性化を引き起こす。本発明の一実施形態では、ヌクレオチドは、ＥＶＩ１遺伝子配列とワトソン−クリック配列相補性によって結合して、その発現を阻止する。ヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡレベルでＥＶＩ１遺伝子の発現を阻害するのに十分な長さのＤＮＡオリゴヌクレオチドであり得る。別の実施形態では、ヌクレオチドは、ＲＮＡプロセシング機序と関連して、ＥＶＩ１の発現を下方制御する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり得る。このｄｓＲＮＡは、およそ２０塩基対の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり得る。
【００６１】
本発明の別の実施形態では、ＥＶＩ１を阻害するヌクレオチドは、循環血液中でヌクレオチドを保護し、標的とされる組織においてヌクレオチドを濃縮できるリポソームまたはナノ粒子に被包されている。リポソームは、ヌクレオチドを囲む層を形成する脂質表面分子である。通常、負に帯電しているヌクレオチドを被包するためにカチオン性リポソームが使用される。ナノ粒子は、通常、ヌクレオチドを包み、血液中で分子を安定化させる化学的に基づいたシェル構造である。ナノ粒子は、通常、糖、デキストラン、リン酸カルシウム、キトサン、ペプチドおよび／またはプラスチックポリマーを含む。
【００６２】
本発明のさらなる実施形態では、ターゲッティングリガンドは、ＥＶＩ１を阻害する分子を含有するリポソームまたはナノ粒子と会合し、アポトーシス破壊のために指定された腫瘍細胞上の受容体を標的とする。リポソームは、循環におけるリポソームの寿命を延長するためにポリエチレングリコールで被覆（すなわち、ＰＥＧ化）されてもよい。同様に、ナノ粒子もそのように被覆されてもよい。
【００６３】
ターゲッティング分子は、標的細胞の表面上の受容体と特異的に結合するアプタマーと呼ばれる有機化学リンカーであり得る。アプタマーは、共有結合によってリポソームの脂質またはナノ粒子のポリマーと結合され得る。リポソームまたはナノ粒子を腫瘍細胞にターゲッティングするために使用されるその他の分子として、腫瘍細胞の表面上の特異的受容体に向けられるペプチド、タンパク質または抗体がある。本発明の好ましい実施形態では、リポソームまたはナノ粒子は、急性骨髄性白血病、肺、卵巣、皮膚またはその他の種類のがん細胞に向けられ得る。
【００６４】
特定の実施形態では、本出願は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）およびＲＮＡｉ構築物に関する。本明細書において、用語「ｄｓＲＮＡ」とは、ｓｉＲＮＡを含めた、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）できる二本鎖ＲＮＡ分子を指す。さらに、ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が特異的に、転写後に遺伝子発現を阻止する、植物および寄生虫において観察された現象に最初に適用された用語である。ＲＮＡｉは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子発現を阻害または低減する有用な方法を提供する。
【００６５】
本明細書において、用語「短鎖干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」または「短鎖干渉核酸」とは、細胞によって適宜プロセシングされると、ＲＮＡｉまたは遺伝子サイレンシングを媒介できる任意の核酸を指す。例えば、ｓｉＲＮＡは、自己相補性センスおよびアンチセンス領域を含み、アンチセンス領域が、標的遺伝子に対して相補性を含む、二本鎖ポリヌクレオチド分子であり得る。ｓｉＲＮＡは、自己相補性センスおよびアンチセンス領域を有し、アンチセンス領域が、標的遺伝子に対する相補性を含む、一本鎖ヘアピンポリヌクレオチドであり得る。ｓｉＲＮＡは、２以上のループ構造と、自己相補性センスおよびアンチセンス領域を含むステムを有し、アンチセンス領域が、標的遺伝子に対して相補性を含む、環状一本鎖ポリヌクレオチドであり得、ここで、環状ポリヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかでプロセシングされて、ＲＮＡｉを媒介し得る活性なｓｉＲＮＡを生成し得る。ｓｉＲＮＡはまた、標的遺伝子に対して相補性を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含む場合もあり、一本鎖ポリヌクレオチドは、５’−リン酸または５’，３’−二リン酸などの末端リン酸基をさらに含み得る。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、標的核酸と結合し、標的核酸の活性を変更する非酵素性核酸である。ｓｉＲＮＡの結合および／または活性は、１種または複数のタンパク質またはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（またはＲＩＳＣ）などのタンパク質複合体との相互作用によって促進され得る。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、標的配列と相補的である配列を、ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖の単一の連続配列に沿って含む。
【００６６】
場合により、本出願のｓｉＲＮＡは、阻害される遺伝子（「標的」遺伝子）のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部のヌクレオチド配列と、生理的条件下で（例えば、細胞環境において）ハイブリダイズするヌクレオチド配列を含有する。二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡｉを媒介する能力を有する天然ＲＮＡに対して十分に類似していることのみが必要である。したがって、本出願は、遺伝子突然変異、株多型または進化的分岐のために予想され得る配列変動を許容できるという利点を有する。標的配列とｓｉＲＮＡ配列間の許容されるヌクレオチドミスマッチの数は、５塩基対中１以下または１０塩基対中１以下または２０塩基対中１以下または５０塩基対中１以下である。ｓｉＲＮＡ二本鎖の中心のミスマッチは、最も決定的であり、標的ＲＮＡの切断を本質的に無効にする場合がある。対照的に、標的ＲＮＡと相補的であるｓｉＲＮＡ鎖の３’末端のヌクレオチドは、標的認識の特異性に大きくは寄与しない。配列同一性は、当技術分野で公知の配列比較およびアラインメントアルゴリズムおよび例えば、デフォルトパラメータを使用するＢＥＳＴＦＩＴソフトウェアプログラムにおいて実行されるようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムによってヌクレオチド配列間の相違パーセントを算出することによって最適化され得る。ｓｉＲＮＡと標的遺伝子の一部の間の９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％超の配列同一性、またはさらに１００％の配列同一性が好ましい。あるいは、ＲＮＡの二本鎖領域は、ストリンジェントな条件（例えば、１２〜１６時間の、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃ハイブリダイゼーションと、それに続く洗浄）下で標的遺伝子転写物の一部とハイブリダイズできるヌクレオチド配列として機能的に定義され得る。
【００６７】
ｄｓＲＮＡの二本鎖構造は、単一の自己相補性ＲＮＡ鎖、２つの相補性ＲＮＡ鎖、またはＤＮＡ鎖と相補性ＲＮＡ鎖によって形成され得る。場合により、ＲＮＡ二本鎖形成は、細胞の内側または外側のいずれかで開始され得る。ＲＮＡは、細胞あたり少なくとも１つのコピーの送達を可能にする量で導入され得る。高用量（例えば、細胞あたり少なくとも５、１０、１００、５００または１０００コピー）の二本鎖物質は、より効果的な阻害をもたらし得る一方で、特定の適用のためには、低用量もまた有用であり得る。阻害は、ＲＮＡの二本鎖領域に対応するヌクレオチド配列が、阻害のためにターゲッティングされる点で配列特異的である。
【００６８】
本明細書に記載されるように、対象ｓｉＲＮＡは、約１９〜３０ヌクレオチド長の、約２１〜２７ヌクレオチド長の、約２１〜２５ヌクレオチド長の、または約２１〜２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を含む。ｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼ複合体を動員し、複合体を、特異的配列と対形成することによって標的遺伝子転写物に導くと理解される。結果として、標的遺伝子転写物は、タンパク質複合体中のヌクレアーゼによって分解される。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、３’ヒドロキシル基を含む。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ構築物は、例えば、酵素ダイサーの存在下での長い二本鎖ＲＮＡのプロセシングによって生じ得る。一実施形態では、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系が使用される。この実施形態では、ｄｓＲＮＡは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ胚に由来する可溶性抽出物と組み合わされ、それによって、組合せが生じる。組合せは、ｄｓＲＮＡが、約２１〜約２７ヌクレオチドのＲＮＡ分子にプロセシングされる条件下で維持される。ｓｉＲＮＡ分子は、当業者に公知のいくつかの技術を使用して精製され得る。例えば、ｓｉＲＮＡを精製するためにゲル電気泳動が使用され得る。あるいは、非変性カラムクロマトグラフィーなどの非変性法がｓｉＲＮＡを精製するために使用され得る。さらに、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）、グリセロール勾配遠心分離、抗体を用いるアフィニティー精製がｓｉＲＮＡを精製するために使用され得る。
【００６９】
対象ｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の製造は、化学合成法によって、または組換え核酸技術によって実施され得る。処理された細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼは、ｉｎ  ｖｉｖｏで転写を媒介する場合があり、またはクローニングされたＲＮＡポリメラーゼが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写に使用される場合もある。本明細書において、本出願のｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡのみを含有する分子に限定される必要はなく、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含する。例えば、ｄｓＲＮＡは、例えば、細胞ヌクレアーゼに対する感受性を低下させ、バイオアベイラビリティを改善し、製剤特徴を改善し、および／またはその他の薬物動態特性を変化させるための、リン酸−糖骨格またはヌクレオシドいずれかの修飾を含み得る。例示するために、天然ＲＮＡのホスホジエステル結合は、少なくとも１個の窒素または硫黄へテロ原子を含むよう修飾されてもよい。ＲＮＡ構造の修飾は、ｄｓＲＮＡに対する遺伝子応答を避けながら特異的遺伝子阻害を可能にするように仕立てられる。同様に、塩基は、アデノシンデアミナーゼの活性を遮断するよう修飾され得る。ｄｓＲＮＡは、酵素的に、または部分的／完全有機合成によって製造されてもよく、任意の修飾されたリボヌクレオチドが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素的合成または有機合成によって導入され得る。ＲＮＡ分子を化学的に修飾する方法が、ｄｓＲＮＡを修飾するのに適応され得る。単に例示するために、ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの骨格は、ホスホロチオエート、ホスホルアミダート、ホスホジチオエート、キメラメチルホスホネート−ホスホジエステル、ペプチド核酸、５−プロピニル−ピリミジン含有オリゴマーまたは糖修飾（例えば、２’−置換リボヌクレオシド、ａ−立体配置）を用いて修飾され得る。特定の場合には、本出願のｄｓＲＮＡは、２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠く。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、ホスホロチオエートセンス鎖を含む。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、ホスホジエステルアンチセンス鎖を含む。
【００７０】
特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、約１〜約１０ヌクレオチド長、約１〜５ヌクレオチド長、約１〜３ヌクレオチド長または約２〜４ヌクレオチド長の３’オーバーハングを有する。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、３’オーバーハングを有する一方の鎖を含み得、もう一方の鎖は３’末端で平滑末端である（例えば、３’オーバーハングを有さない）。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、両鎖で３’オーバーハングを含む場合もある。オーバーハングの長さは、各鎖について同一である場合も、異なる場合もある。ｓｉＲＮＡの安定性をさらに増強するために、３’オーバーハングが分解に対して安定化されてもよい。一実施形態では、ＲＮＡは、アデノシンまたはグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドを含むことによって安定化される。あるいは、修飾された類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、２’−デオキシチニジン（ｄｅｏｘｙｔｈｙｉｎｉｄｉｎｅ）によるウリジンヌクレオチド３’オーバーハングの置換は、許容され、ＲＮＡｉの効率に影響を及ぼさない。２’ヒドロキシルがないことは、組織培養培地におけるオーバーハングのヌクレアーゼ耐性を大幅に増強し、ｉｎ  ｖｉｖｏで有利であり得る。
【００７１】
別の特定の実施形態では、対象ｄｓＲＮＡは、長い二本鎖ＲＮＡの形態であり得る。例えば、ｄｓＲＮＡは、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００または４００塩基である。いくつかの場合には、ｄｓＲＮＡは、４００〜８００塩基長である。場合により、ｄｓＲＮＡは細胞内で消化されて、例えば、細胞中にｓｉＲＮＡ配列が生じる。しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏでの長い二本鎖ＲＮＡの使用は、おそらくは、配列非依存性ｄｓＲＮＡ反応によって引き起こされ得る有害な作用のために常に実用的ではない。このような実施形態では、局所送達系および／またはインターフェロンまたはＰＫＲの効果を低減する薬剤の使用が好ましい。
【００７２】
さらなる特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、短鎖ヘアピン構造（ｓｈＲＮＡ）の形態である。ｓｈＲＮＡは、外因的に合成され得る、またはｉｎ  ｖｉｖｏでＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターから転写することによって形成され得る。好ましくは、このようなｓｈＲＮＡは、標的遺伝子の持続的な、安定した抑制を確実にするよう、細胞において、または動物において遺伝子操作される。ｓｉＲＮＡは、細胞においてヘアピンＲＮＡをプロセシングすることによって生じ得るということは当技術分野で公知である。
【００７３】
好ましい実施形態では、ＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡは、ヒトＥＶＩ１コード配列（配列番号１）のヌクレオチド残基２４６〜２６６（配列番号１７〜５６）、９６９〜１００２（配列番号５７〜１２０）、２９００〜２９２０（配列番号１２１〜１６０）または２９８４〜３００４（配列番号１６１〜２００）に対応するｓｉＲＮＡの製造を記載する、本明細書に記載されるように設計され、構築される。本明細書に記載されたＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡは、本明細書に示されるヌクレオチド配列を有する例示的ＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡ分子である。あるいは、ＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡは、参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｌｂａｓｈｉｒら  （２００１年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １５巻：１８８〜２００頁；２００１年、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１巻：４９４〜４９８頁）に記載される方法を使用して構築されてもよい。
【００７４】
特定の実施形態では、本発明によって提供されるＥＶＩ１阻害剤は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の種である。本明細書において用語「短鎖干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」とは、例えば、Ｂａｓｓ、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１巻：４２８〜４２９頁；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１巻：４９４〜４９８頁；およびＫｒｅｕｔｚｅｒら、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／４４８９５；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚら、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／３６６４６；Ｆｉｒｅ、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／３２６１９；Ｐｌａｅｔｉｎｃｋら、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／０１８４６；ＭｅｌｌｏおよびＦｉｒｅ、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／２９０５８；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／０７４０９；およびＬｉら、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／４４９１４に開示されるような、ＲＮＡ干渉または「ＲＮＡｉ」できる二本鎖核酸分子を指す。本明細書において、ｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡのみを含有する分子に制限される必要はなく、ＲＮＡｉ能または活性を有する化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含し得る。
【００７５】
ＲＮＡ干渉とは、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって媒介される、動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す（Ｆｉｒｅら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１巻：８０６頁）。細胞における長いｄｓＲＮＡの存在は、「ダイサー」と呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性を刺激する。ダイサーは、長いｄｓＲＮＡの、ｄｓＲＮＡの短片であるｓｉＲＮＡへのプロセシングに関与している（Ｂｅｒｓｔｅｉｎら、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ  ４０９巻：３６３頁）。ダイサー活性に由来する短鎖干渉ＲＮＡは、通常、約２１〜２３ヌクレオチド長であり、約１９塩基対二本鎖を含む。ダイサーはまた、翻訳制御に関与している保存された構造の前駆体ＲＮＡからの２１および２２ヌクレオチドの小さい一時的なＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）の切り出しにも関与している（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３巻：８３４頁）。ＲＮＡｉ反応はまた、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と一般的に呼ばれる、ｓｉＲＮＡを含有するエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とし、これは、ｓｉＲＮＡに対して相同な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二本鎖のガイド配列と相補的である領域の中央で起こる（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５巻：１８８頁）。
【００７６】
短鎖干渉ＲＮＡによって媒介されるＲＮＡｉは、種々の系で研究されてきた。Ｆｉｒｅらは、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）においてＲＮＡｉを観察した最初の人たちであった（１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１巻：８０６頁）。ＷｉａｎｎｙおよびＧｏｅｔｚは、マウス胚におけるｄｓＲＮＡによって媒介されるＲＮＡｉを記載した（１９９９年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２巻：７０頁）。Ｈａｍｍｏｎｄらは、ｄｓＲＮＡでトランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞におけるＲＮＡｉを記載した（２０００年、Ｎａｔｕｒｅ  ４０４巻：２９３頁）。Ｅｌｂａｓｈｉｒらは、ヒト胎児由来腎臓およびＨｅＬａ細胞を始めとする培養哺乳動物細胞における合成２１−ヌクレオチドＲＮＡの二本鎖の導入によって誘導されたＲＮＡｉを記載した（２００１年、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１巻：４９４頁）。
【００７７】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ胚溶解物における最近の研究によって、効率的なＲＮＡｉ活性を媒介するのに必須であるｓｉＲＮＡの長さ、構造、化学組成および配列についての特定の必要条件が示された。これらの研究は、２１ヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ二本鎖は、２つのヌクレオチド３’−オーバーハングを含有する場合に最も活性であることを示した。さらに、２’−デオキシまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドでのｓｉＲＮＡ鎖の一方または両方の置換は、ＲＮＡｉ活性を無効にするが、３’−末端ｓｉＲＮＡヌクレオチドのデオキシヌクレオチドでの置換は、許容されることがわかった。ｓｉＲＮＡ二本鎖の中央のミスマッチ配列もまた、ＲＮＡｉ活性を無効にすることがわかった。さらに、これらの研究はまた、標的ＲＮＡ中の切断部位の位置が、ｓｉＲＮＡガイド配列の３’−末端よりも５’−末端によって規定されることも示す（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１年、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２０巻：６８７７頁）。その他の研究は、ｓｉＲＮＡ二本鎖の標的相補鎖上の５’−リン酸が、ｓｉＲＮＡ活性にとって必要であること、およびｓｉＲＮＡ上のＳ’−リン酸部分を維持するのに、細胞ではＡＴＰが利用されることを示した（Ｎｙｋａｎｅｎら、２００１年、Ｃｅｌｌ  １０７巻：３０９頁）。しかし、５’−リン酸を欠くｓｉＲＮＡ分子は、外因性に導入された場合は活性であり、これは、ｓｉＲＮＡ構築物の５’−リン酸化がｉｎ  ｖｉｖｏで起こり得ることを示唆する。
【００７８】
本発明のＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡ分子は、自己相補性センスおよびアンチセンス領域を含み、アンチセンス領域が、ＥＶＩ１のヌクレオチド配列の一部と相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域が、ＥＶＩ１核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する二本鎖ポリヌクレオチド分子であり得る。ＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡ分子は、２つの別個のオリゴヌクレオチドから組み立てられることができ、これでは、一方の鎖がセンス鎖であり、もう一方がアンチセンス鎖であり、アンチセンスおよびセンス鎖は、自己相補性である。ＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡ分子はまた、核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーによって連結された自己相補性センスおよびアンチセンス領域を有する単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられることができる。ＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡ分子は、ポリヌクレオチドであり得る、実質的に対称な二本鎖、非対称な二本鎖、ヘアピンまたは非対称なヘアピン二次構造を形成し得る。ＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡ分子はまた、ＥＶＩ１ヌクレオチド配列またはその一部と相補的であるヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含む場合もあり、これでは、一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００２、Ｃｅｌｌ  １１０巻：５６３〜５７４頁およびＳｃｈｗａｒｚら、２００２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ：Ｃｅｌｌ  １０巻：５３７〜５６８頁において論じられるように、５’，３’−二リン酸または５’−リン酸などの末端リン酸基をさらに含み得る。
【００７９】
一本鎖ヘアピン構造を含む本発明のＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡ分子は、相補配列のハイブリダイゼーションを可能にするスペーサー配列によって分離された約１５〜約３０ヌクレオチドの２つの相補配列を有する、約３６〜約７０ヌクレオチド長であることが好ましい。したがって、一本鎖ヘアピン構造は、分子の二本鎖部分を含む約１５〜約３０塩基対を有する。一実施形態では、ヘアピンｓｉＲＮＡは、相補性ｓｉＲＮＡ配列のハイブリダイゼーションに対応する長さの二本鎖部分およびループ部分において約１８、１９、２０または２１塩基対を有する。
【００８０】
特定の実施形態では、本発明は、ＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡ分子の発現を可能にする方法で、本発明の少なくとも１種のＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する。例えば、ベクターは、二本鎖を含むＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡ分子の両鎖をコードする配列（複数可）を含有し得る。ベクターはまた、自己相補性であり、したがって、ＥＶＩ１ヘアピンｓｉＲＮＡ分子を形成する単一の核酸分子をコードする配列（複数可）を含有し得る。このような発現ベクターの限定されない例は、Ｐａｕｌら、２００２年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９巻：５０５頁；ＭｉｙａｇｉｓｈｉおよびＴａｉｒａ、２００２年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９巻：４９７頁；Ｌｅｅら、２００２年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９巻：５００頁；およびＮｏｖｉｎａら、２００２年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、オンライン公開６月３日に記載されている。
【００８１】
その他の実施形態では、本発明は、本発明の発現ベクターを含む哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞を提供する。さらなる実施形態では、本発明の前記細胞を含む発現ベクターは、ヒトＥＶＩ１コード配列の少なくとも一部と相補的であるｓｉＲＮＡ分子の配列を含み、ここで、細胞における前記ｓｉＲＮＡの発現は、そこでのＥＶＩ１発現を阻害する。その他の実施形態では、本発明の発現ベクターは、同一であっても、異なっていてもよい２種以上のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。本発明のその他の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子、好ましくは、ＥＶＩ１特異的ｓｉＲＮＡ分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入された転写単位から発現される。
【００８２】
特定の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、対象に投与するための、とりわけ、リポソームを含む送達媒体；担体および希釈剤およびその塩を含んでもよく；医薬組成物中に存在し得る。核酸分子の送達方法は、例えば、Ａｋｈｔａｒら、１９９２年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．２巻：１３９頁；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ａｋｈｔａｒ編、１９９５年、Ｍａｕｒｅｒら、１９９９年、Ｍｏｌ．  Ｍｅｍｂｒ．  Ｂｉｏｌ．１６巻：１２９〜１４０頁；ＨｏｆｌａｎｄおよびＨｕａｎｇ、１９９９年、Ｈａｎｄｂ．  Ｅｘｐ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１３７巻：１６５〜１９２頁；およびＬｅｅら、２０００年、ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．７５２巻：１８４〜１９２頁に記載されており、そのすべては、参照により本明細書に組み込まれる。Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、米国特許第６，３９５，７１３号およびＳｕｌｌｉｖａｎら、ＰＣＴ  ＷＯ９４／０２５９５には、核酸分子を細胞および組織中に送達するための一般的な方法がさらに記載されている。これらのプロトコールは、細胞中への実質的にいずれの核酸分子の送達にも利用され得る。核酸分子は、それだけには限らないが、リポソーム中の被包、イオン導入法による、またはハイドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセルおよび生体接着性マイクロスフェアなどのその他の送達媒体中への組み込みによる、またはタンパク質性ベクターによる方法を含めた、当業者に公知の種々の方法によって細胞に投与され得る（例えば、Ｏ’ＨａｒｅおよびＮｏｒｍａｎｄ、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／５３７２２参照のこと）。
【００８３】
あるいは、核酸／媒体組合せは、直接注射によって、または注入ポンプの使用によって局所送達され得る。皮下、筋肉内または皮内にかかわらず、本発明の核酸分子の直接注射は、標準的なニードルおよびシリンジ法を使用して、またはＣｏｎｒｙら、１９９９年、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５巻：２３３０〜２３３７頁およびＢａｒｒｙら、国際ＰＣＴ公開番号  ＷＯ９９／３１２６２に記載されたものなどのニードルを含まない技術によって行われ得る。当技術分野における多数の実施例が、浸透圧ポンプ（Ｃｈｕｎら、１９９８年、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２５７巻：１３５〜１３８頁、Ｄ’  Ａｌｄｉｎら、１９９８年、Ｍｏｌ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５巻：１５１〜１６４頁、Ｄｒｙｄｅｎら、１９９８年、Ｊ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １５７巻：１６９〜１７５頁、Ｇｈｉｒｎｉｋａｒら、１９９８年、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２４７巻：２１〜２４頁参照のこと）または直接注入（Ｂｒｏａｄｄｕｓら、１９９７年、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  Ｆｏｃｕｓ  ３巻、論文４）によるオリゴヌクレオチドの送達方法を記載している。その他の送達経路として、それだけには限らないが、経口送達（錠剤または丸剤形態でなど）および／またはくも膜下腔内送達（Ｇｏｌｄ、１９９７年、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ７６巻：１１５３〜１１５８頁）が挙げられる。核酸送達および投与のより詳細な説明は、Ｓｕｌｌｉｖａｎら、ＰＣＴ  ＷＯ９４／０２５９５、Ｄｒａｐｅｒら、ＰＣＴ  Ｗ０９３／２３５６９、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、ＰＣＴ  ＷＯ９９／０５０９４およびＫｌｉｍｕｋら、ＰＣＴ  ＷＯ９９／０４８１９に提供されており、それらのすべては、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８４】
あるいは、本発明の特定のｓｉＲＮＡ分子は、細胞内で真核細胞プロモーターから発現され得る（例えば、ＩｚａｎｔおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９巻：３４５頁；ＭｃＧａｒｒｙおよびＬｉｎｄｑｕｉｓｔ、１９８６年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３巻：３９９頁；Ｓｃａｎｌｏｎら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８巻：１０５９１〜５頁；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔら、１９９２年、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．  Ｄｅｖ．  ２巻：３〜１５頁；Ｄｒｏｐｕｌｉｃら、１９９２年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６巻：１４３２〜４１頁；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅら、１９９１年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６５巻：５５３１〜４頁；Ｏｊｗａｎｇら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９巻：１０８０２〜６頁；Ｃｈｅｎら、１９９２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０巻：４５８１〜９頁；Ｓａｒｖｅｒら、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７巻：１２２２〜１２２５頁；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３巻：２２５９頁；Ｇｏｏｄら、１９９７年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４巻：４５頁参照のこと。当業者ならば、適当なＤＮＡ／ＲＮＡベクターを使用して任意の核酸が真核細胞において発現され得ることは認識するであろう。このような核酸の活性は、酵素的核酸による一次転写物からのその放出によって増強され得る（Ｄｒａｐｅｒら、ＰＣＴ  ＷＯ９３／２３５６９およびＳｕｌｌｉｖａｎら、ＰＣＴ  ＷＯ９４／０２５９５；Ｏｈｋａｗａら、１９９２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．  ２７：１５〜６頁；Ｔａｉｒａら、１９９１年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９巻：５１２５〜３０頁；Ｖｅｎｔｕｒａら、１９９３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１巻：３２４９〜５５頁；Ｃｈｏｗｒｉｒａら、１９９４年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９巻：２５８５６頁）。
【００８５】
本発明の別の態様では、本発明のＲＮＡ分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入された転写単位から発現され得る（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅら、１９９６年、ＴＩＧ１２巻：５１０頁参照のこと）。組換えベクターは、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターであり得る。ｓｉＲＮＡを発現するウイルスベクターは、それだけには限らないが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアルファウイルスをベースとして構築され得る。別の実施形態では、本発明の核酸分子を発現するためにｐｏｌ  ＩＩＩベースの構築物が使用される（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、米国特許第５，９０２，８８０号および同６，１４６，８８６号参照のこと）。ｓｉＲＮＡ分子を発現できる組換えベクターは、上記のように送達され、標的細胞において持続し得る。あるいは、核酸分子の一時的な発現を提供するウイルスベクターが使用され得る。このようなベクターは、必要に応じて反復投与され得る。ｓｉＲＮＡ分子は、ひと度発現されると、標的ｍＲＮＡと相互作用し、ＲＮＡｉ反応が生じる。ｓｉＲＮＡ分子を発現するベクターの送達は、静脈内または筋肉内投与などによって、対象から取り出された（ｅｘ−ｐｌａｎｔｅｄ）標的細胞への投与と、それに続く対象への再導入によって、または所望の標的細胞への導入を可能にする任意のその他の手段によってなど、全身性であり得る（概説については、Ｃｏｕｔｕｒｅら、１９９６年、ＴＩＧ．１２巻：５１０頁参照のこと）。
【００８６】
特定の実施形態では、本発明は、本発明の少なくとも１種のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する。発現ベクターは、ｓｉＲＮＡ二本鎖の一方の鎖または両鎖、またはｓｉＲＮＡ二本鎖に自己ハイブリダイズする単一の自己相補性鎖をコードし得る。ｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列は、ｓｉＲＮＡ分子の細胞における発現を可能にする方法で作動可能に連結され得る（例えば、Ｐａｕｌら、２００２年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９巻：５０５頁；ＭｉｙａｇｉｓｈｉおよびＴａｉｒａ、２００２年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９巻：４９７頁；Ｌｅｅら、２００２年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９巻：５００頁；およびＮｏｖｉｎａら、２００２年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、オンライン公開６月３日参照のこと）。
【００８７】
その他の態様では、本発明は、ａ）転写開始領域（例えば、真核細胞のｐｏｌ  Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ開始領域）；ｂ）転写終結領域（例えば、真核細胞のｐｏｌ  Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ終結領域）；およびｃ）本発明のｓｉＲＮＡ分子の少なくとも１種をコードする核酸配列を含み；前記配列が、ｓｉＲＮＡ分子の発現および／または送達を可能にする方法で、前記開始領域および前記終結領域に作動可能に連結された発現ベクターを提供する。ベクターは、本発明のｓｉＲＮＡをコードする配列の５’側または３’側に作動可能に連結されたタンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および／またはイントロン（介在配列）を場合により含み得る。
【００８８】
ｓｉＲＮＡ分子の転写は、真核細胞のＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ  Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）のプロモーターから駆動され得る。ｐｏｌ  ＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターからの転写物は、細胞において高レベルで発現され得、所与の細胞種における所与のｐｏｌ  ＩＩプロモーターのレベルは、近隣に存在する遺伝子調節配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に応じて変わる。原核生物のＲＮＡポリメラーゼ酵素が、適当な細胞中で発現されるという条件で、原核生物のＲＮＡポリメラーゼプロモーターも使用される（Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ、１９９０年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７巻：６７４３〜７頁；ＧａｏおよびＨｕａｎｇ  １９９３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１巻：２８６７〜７２頁；Ｌｉｅｂｅｒら、１９９３年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２１７巻：４７〜６６頁；Ｚｈｏｕら、１９９０年、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １０巻：４５２９〜３７頁）。幾人かの研究者が、このようなプロモーターから発現された核酸分子が、哺乳動物細胞において機能し得ることを実証した（例えば、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔら、１９９２年、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．  Ｄｅｖ．２巻：３〜１５頁；Ｏｊｗａｎｇら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９巻：１０８０２〜６頁；Ｃｈｅｎら、１９９２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０巻：４５８１〜９頁；Ｙｕら、１９９３年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０巻：６３４０〜４頁；Ｌ’  Ｈｕｉｌｌｉｅｒら、１９９２年、ＥＭＢＯ  Ｊ．  １１巻：４４１１〜８頁；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚら、１９９３年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ  ９０巻：８０００〜４頁；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３巻：２２５９頁；ＳｕｌｌｅｎｇｅｒおよびＣｅｃｈ、１９９３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２巻：１５６６頁）。さらに詳しくは、Ｕ６小核（ｓｎＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびアデノウイルスＶＡ  ＲＮＡをコードする遺伝子に由来するものなどの転写単位が、細胞において、高濃度のｓｉＲＮＡなどの所望のＲＮＡ分子を作製するのに有用である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  ２３巻：２２５９頁；Ｃｏｕｔｕｒｅら、１９９６年、ＴＩＧ  １２巻：５１０頁、Ｎｏｏｎｂｅｒｇら、１９９４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  ２２巻：２８３０頁；Ｎｏｏｎｂｅｒｇら、米国特許第５，６２４，８０３号；Ｇｏｏｄら、１９９７年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ４巻：４５頁；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／１８７３６。上記のｓｉＲＮＡ転写単位は、哺乳動物細胞中に導入するために、制限されるものではないが、プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（例えば、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクター）またはウイルスＲＮＡベクター（例えば、レトロウイルスベクターまたはアルファウイルスベクター）を始めとする種々のベクター中に組み込まれ得る（概説については、Ｃｏｕｔｕｒｅら、１９９６年、ＴＩＧ  １２巻：５１０頁参照のこと）。
【００８９】
本発明の実施において有用である発現ベクターとして、小さいヌクレオチドスペーサー配列によって分離されたｓｉＲＮＡ分子の２種の相補配列をコードする核酸配列を、ヘアピンループを含有するｓｉＲＮＡ分子の発現を可能にする方法で含む発現ベクターがある。一般に、有用な発現ベクターは、ａ）転写開始領域；ｂ）転写終結領域；およびｃ）小さいヌクレオチドスペーサー配列によって分離されたｓｉＲＮＡ分子の２種の相補配列をコードする核酸配列を含み；配列は、小さいヘアピンループを含有するｓｉＲＮＡ分子の発現および／または送達を可能にする方法で、開始領域および終結領域に作動可能に連結されている。
【００９０】
特定の実施形態では、本発明は、その身体中に存在する少なくとも１個の腫瘍細胞を有する動物に、本明細書において提供されるＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡ分子の治療上有効な量を治療上有効な期間、投与することを含む、動物において腫瘍成長を阻害する方法を提供し、ここで、ＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡ分子は、ＥＶＩ１遺伝子発現を阻害し得る。
【００９１】
特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物細胞においてＥＶＩ１発現を阻害する、本明細書において提供されるＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡ分子の治療上有効な量を、薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および／またはアジュバントと一緒に含む医薬組成物を提供する。本発明は、さらに、本明細書において提供されるＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡ分子を含む医薬組成物を提供する。
【００９２】
許容される製剤材料は、好ましくは、使用される投与量および濃度でレシピエントにとって非毒性である。医薬組成物は、例えば、ｐＨ、浸透圧、粘稠性、透明性、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、組成物の溶解または放出、吸着または浸透の速度を修飾、維持または保存するために製剤材料を含有し得る。適した製剤材料として、それだけには限らないが、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンなど）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなど）；バッファー（ホウ酸、重炭酸、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸、リン酸またはその他の有機酸など）；充填剤（マンニトールまたはグリシンなど）；キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）；増量剤；単糖、二糖およびその他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）；着色剤、嬌味剤および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；保存料（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック類、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０などのポリソルベート、Ｔｒｉｔｏｎ、トリメタミン、レシチン、コレステロールまたはチロキサパル（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）など）；安定性増強剤（スクロースまたはソルビトールなど）；張性増強剤（ハロゲン化アルカリ金属、好ましくは、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールまたはソルビトールなど）；送達媒体；希釈剤；賦形剤および／または製剤補助薬が挙げられる。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’  Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、第１８版、（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編）、１９９０年、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ参照のこと。
【００９３】
最適医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式および所望の投与量に応じて当業者によって決定され得る。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’  Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、同著参照のこと。このような組成物は、本発明の抗体の物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出の速度およびｉｎ  ｖｉｖｏクリアランスの速度に影響を及ぼし得る。
【００９４】
医薬組成物中の主要な媒体または担体として、それだけには限らないが、おそらくは、非経口投与用の組成物において一般的なその他の材料を補給した注射水、生理食塩水溶液または人工脳脊髄液を挙げることができる。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合した生理食塩水は、さらなる例示的媒体である。医薬組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓバッファーまたは約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸バッファーを含む場合があり、これは、ソルビトールまたはその適した代替物をさらに含み得る。本発明の医薬組成物は、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で、所望の純度を有する選択された組成物を任意選択の製剤物質と混合することによって、保存用に調製され得る（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’  Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、同著）。さらに、ＥＶＩ１を阻害するｓｉＲＮＡは、スクロースなどの適当な賦形剤を使用して凍結乾燥物として製剤され得る。
【００９５】
製剤成分は、投与部位に許容される濃度で存在する。バッファーは、生理学的ｐＨで、またはわずかに低いｐＨ、通常、約５〜約８のｐＨ範囲内で、組成物を維持するよう有利に使用される。
【００９６】
本発明の医薬組成物は、非経口的に送達され得る。非経口投与が考慮される場合には、本発明において使用するための治療用組成物は、本発明の所望のｓｉＲＮＡを含む、発熱物質を含まない、非経口的に許容される水溶液の形態であり得る。調製物は、所望の分子の製剤を、製品の制御放出または持続放出を提供し得、次いで、製品がデポー注射によって送達され得る、注射用マイクロスフェア、生体侵食性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸など）、ビーズまたはリポソームなどの物質とともに含むことができる。ヒアルロン酸を有する製剤は、循環における持続期間を増進する効果を有する。所望の分子を導入するために埋め込み可能な薬物送達装置が使用され得る。
【００９７】
組成物は、吸入用に製剤されてもよい。これらの実施形態では、本発明のスクリーニング法において同定された化合物または本明細書において開示されたＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡが、吸入用ドライパウダーとして製剤される、または吸入溶液はまた、噴霧によってなど、エアゾール送達のために噴射剤を用いて製剤され得る。肺の投与は、化学修飾されたタンパク質の肺の送達を記載し、参照により組み込まれるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５にさらに記載されている。
【００９８】
本発明の医薬組成物は、経口的になど、消化管によって送達され得る。このような薬学的に許容される組成物の調製は、当業者の範囲内である。この様式で投与される本明細書に開示されたＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡは、錠剤およびカプセル剤などの固体投与形の配合において通常使用される担体とともに、またはそれらを伴わずに製剤され得る。カプセル剤は、バイオアベイラビリティが最大化され、プレシステミック分解が最小に抑えられる消化管中の時点で製剤の活性部分を放出するよう設計され得る。本明細書において開示されたＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡの吸収を促進するためにさらなる薬剤が含まれてもよい。希釈剤、嬌味剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤および結合剤も使用され得る。
【００９９】
医薬組成物は、錠剤の製造に適している非毒性賦形剤との混合物中に、有効量の本明細書において開示されたＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡを含み得る。錠剤を滅菌水または別の適当な媒体に溶解することによって、単位用量形で溶液を調製してもよい。適した賦形剤として、それだけには限らないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸ナトリウム、ラクトースもしくはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤；またはデンプン、ゼラチンもしくはアラビアガムなどの結合剤；またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸もしくはタルクなどの滑沢剤が挙げられる。
【０１００】
持続送達または制御送達製剤中に本明細書において開示されたＥＶＩ１阻害剤または本発明の化合物を含む製剤をはじめ、さらなる医薬組成物が、当業者には明らかである。リポソーム担体、生体侵食性微粒子または多孔質ビーズおよびデポー注射などの種々のその他の持続送達または制御送達手段を製剤する技術も当業者に公知である。例えば、医薬組成物の送達のための多孔質ポリマー微粒子の制御放出を記載するＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９参照のこと。持続放出調製物として、成形品の形態の半透性ポリマーマトリックス、例えば、フィルムまたはマイクロカプセル、ポリエステル、ハイドロゲル、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号およびＥＰ０５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、１９８３年、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２巻：５４７〜５５６頁）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、１９８１年、Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．  １５巻：１６７〜２７７頁）およびＬａｎｇｅｒ、１９８２年、Ｃｈｅｍ．  Ｔｅｃｈ．  １２巻：９８〜１０５頁）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、同著）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３．９８８）を挙げることができる。持続放出組成物はまた、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれによって調製されてもよいリポソームを含み得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、１９８５年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２巻：３６８８〜３６９２頁；ＥＰ０３６，６７６；ＥＰ０８８，０４６およびＥＰ１４３，９４９参照のこと。
【０１０１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される医薬組成物は、通常、無菌である。特定の実施形態では、これは、滅菌濾過メンブランを通す濾過によって達成され得る。組成物が凍結乾燥されている特定の実施形態では、この方法を使用する滅菌法は、凍結乾燥および再構成の前または後のいずれで実施されてもよい。特定の実施形態では、非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態で、または溶液で貯蔵され得る。特定の実施形態では、非経口組成物は一般に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって穴を開けることができるストッパーを有する輸液バッグまたはバイアル中に入れられる。
【０１０２】
本発明の医薬組成物は製剤されると、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体として、または脱水粉末もしくは凍結乾燥粉末としてのいずれかで滅菌バイアル中で貯蔵され得る。このような製剤は、すぐに使える形態で、または投与の前に再構成される（例えば、凍結乾燥した）形態のいずれかで貯蔵され得る。
【０１０３】
本発明は、単回用量投与単位を製造するためのキットを対象とする。本発明のキットは、各々、本発明のスクリーニング法において同定された乾燥タンパク質化合物を有する第１の容器と、例えば、単一チャンバーおよびマルチチャンバーのプレフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジ、リオシリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ）またはニードルのないシリンジ）を始めとする、水性製剤を有する第２の容器とを含有し得る。
【０１０４】
治療上使用される本発明の医薬組成物の有効量は、例えば、治療の状況および目的に応じて変わる。当業者ならば、特定の実施形態に従う、治療のための適当な投与量レベルは、したがって、幾分かは、送達される分子、医薬組成物が使用される適応症、投与経路および大きさ（体重、体表面または器官の大きさ）および／または患者の状態（年齢および全身の健康）に応じて変わることは理解するであろう。臨床医ならば、最適な治療効果を得るために、投与量を用量設定し、投与経路を改変できる。
【０１０５】
投薬頻度は、本明細書において開示されたＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡの薬物動態パラメータに応じて変わる。例えば、臨床医は、所望の効果を達成する投与量が達せられるまでｓｉＲＮＡを投与する。したがって、組成物は、単回用量として、または２以上の用量（同一量の所望の分子を含有する場合も、含有しない場合もある）として、経時的に、または移植装置もしくはカテーテルを介した連続注入として投与され得る。適当な投与量のさらなる微調整は、当業者によって日常的に行われ、彼らによって日常的に実施される課題の範囲内にある。適当な投与量は、適当な用量−応答データの使用によって確認され得る。
【０１０６】
本発明の医薬組成物の投与経路として、経口経路、静脈内、腹腔内、大脳内（柔組織内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内または病巣内経路による注射を介するもの；持続放出系によるもの、または移植装置によるものが挙げられる。医薬組成物は、ボーラス注射によって、または注入によって連続的に、または移植装置によって投与され得る。医薬組成物はまた、その上に所望の分子が吸収され、被包されているメンブレン、スポンジまたは別の適当な物質の移植を介して局所的に投与され得る。移植装置が使用される場合には、装置を任意の適した組織または器官中に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、徐放性ボーラスまたは連続投与によるものであり得る。
【０１０７】
特定の実施形態では、本明細書において開示されたＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡまたは本発明のＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡを含む医薬組成物をｅｘ  ｖｉｖｏ法で使用することが望ましいものであり得る。このような場合には、患者から摘出された細胞、組織または器官が、本発明の医薬組成物または本明細書において開示されたｓｉＲＮＡに曝露され、その後、続いて、細胞、組織および／または器官が患者に埋め戻される。
【０１０８】
本発明の医薬組成物は、単独またはその他の治療薬と組み合わせて、特に、その他のがん治療薬と組み合わせて投与され得る。このような薬剤は、一般に、放射線療法または化学療法を含む。化学療法は、例えば、以下の薬剤：アントラサイクリン、タキソール、タモキシフェン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシルおよび当業者に公知のその他の薬物のうち１種または複数を用いる治療を含み得る。
【０１０９】
本発明のｓｉＲＮＡを細胞中に導入することは、当技術分野で公知の、または本明細書に記載された任意の方法を使用して達成され得る。例えば、ＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡの局所送達は、直接注射によって、またはその他の適当なウイルス性または非ウイルス性送達ベクターによって達成され得る（Ｈｅｆｔｉ、１９９４年、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２５巻：１４１８〜３５頁）。例えば、ＥＶＩ１ポリペプチドをコードする核酸分子は、標的とされる細胞への送達のためにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター中に含有され得る（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／３４６７０；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１７８参照のこと）。本発明の教示に従って使用される組換えＡＡＶゲノムは、通常、機能性プロモーターおよびポリアデニル化配列と作動可能に連結した、ＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に隣接するＡＡＶ逆方向末端反復配列を含有する。
【０１１０】
代替の適したウイルスベクターとして、それだけには限らないが、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、肝炎ウイルス、パルボウイルス、パポーバウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルスおよびパピローマウイルスベクターが挙げられる。米国特許第５，６７２，３４４号には、組換え神経栄養性ＨＳＶ−１ベクターを含むｉｎ  ｖｉｖｏウイルス媒介性遺伝子導入系が記載されている。米国特許第５，３９９，３４６号は、治療タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを挿入するようｉｎ  ｖｉｔｒｏで処理されたヒト細胞の送達によって患者に治療タンパク質を提供する方法の例を提供する。遺伝子療法技術を実施するためのさらなる方法および材料が、米国特許第５，６３１，２３６号（アデノウイルスベクターを含む）、同５，６７２，５１０号（レトロウイルスベクターを含む）および同５，６３５，３９９号（サイトカインを発現するレトロウイルスベクターを含む）に記載されている。
【０１１１】
非ウイルス性送達方法として、それだけには限らないが、リポソーム媒介性移動、裸のＤＮＡの送達（例えば、直接注射による）、受容体媒介性移動（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿および微粒子銃（例えば、遺伝子銃）が挙げられる。遺伝子療法材料および方法はまた、誘導プロモーター、組織特異的エンハンサー−プロモーター、部位特異的組込みのために設計されＤＮＡ配列、親細胞を上回る選択的利点を提供できるＤＮＡ配列、形質転換された細胞を同定するための標識、負の選択系および発現制御系（安全対策）、細胞特異的結合物質（細胞ターゲッティングのための）、細胞特異的内部移行因子およびベクターによる発現を増強するための転写因子ならびにベクター製造の方法も含み得る。遺伝子療法技術を実施するためのこのようなさらなる方法および材料は、米国特許第４，９７０，１５４号（エレクトロポレーション技術を含む）、同５，６７９，５５９号（遺伝子送達のためのリポタンパク質含有系を記載する）、同５，６７６，９５４号（リポソーム担体を含む）、同５，５９３，８７５号（リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法を記載する）および同４，９４５，０５０号（生物学的に活性な粒子が、細胞で、粒子が細胞の表面を貫通し、細胞の内部に組み込まれるようになる速度で推進される（ａｙｅ  ｐｒｏｐｅｌｌｅｄ）方法を記載する）およびＰＣＴ公開番ＷＯ９６／４０９５８（核リガンドを含む）に記載されている。
【０１１２】
以下の実施例は、上記の方法および有利な結果の特定の態様を例示する。以下の実施例は、例示として示されるものであって、制限としてではない。
【実施例】
【０１１３】
本明細書に記載される発明のために、ＥＶＩ１の機能を混乱させるヌクレオチド分子が、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍量および腫瘍の大きさを低減するために使用される。ＥＶＩ１は、がん細胞において過剰発現され、非がん性細胞では発現されない。例えば、ＥＶＩ１は、雌の生殖器系の腫瘍において過剰発現される（図４および５）。腫瘍組織（左）および隣接する正常組織（右）のホモジネートが、ＳｏｍａＰｌｅｘ（商標）がん組織溶解物タンパク質マイクロアレイスライド（Ｇｅｎｔｅｌ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）において、３連でポリビニルジフルオリドメンブレン上にスポットされている。アレイを、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから購入した抗ＥＶＩ１モノクローナル抗体を用いてプローブした。スライバー（ｓｌｉｖｅｒ）コーティングされたヤギ抗マウス二次抗体を使用して組織ホモジネート中のＥＶＩ１レベルを可視化した。各スポット中のＥＶＩ１タンパク質の量に相当する濃度測定容積を、写真スキャニングを使用して定量化し、相対発現が図５に図で示されている。ＥＶＩ１は、同一対象から得た隣接する正常組織と比較して、雌の生殖組織に由来する腫瘍サンプルにおいて高度に上昇していることがわかった。これらの結果は、ＥＶＩ１の過剰発現は、組織の腫瘍化特性と関連しており、推定抗がん標的であることを示唆する。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイ：
ＰＣＲアッセイは、本明細書に記載されたｓｉＲＮＡ試薬の存在下でＥＶＩ１遺伝子発現の変化を検出するよう実施される。これらのアッセイのために、使用されるＰＣＲ反応条件は、６０秒間９５℃の融解温度；３０秒間９５℃、３０秒間６０℃および３０秒間７２℃で２５〜３０サイクルの熱サイクリングおよび６０秒間７２℃の伸長である。
【０１１４】
これらのアッセイでは、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｅｎｅＪＥＴキットを使用して全ＲＮＡが単離される。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、標的特異的プローブおよびＩＤＴから得られたプライマーを使用して実施される。ＥＶＩ１およびβ−アクチンｍＲＮＡのプライマーおよびリポーターは、ＣｌｏｎｅＭａｎａｇｅｒプログラムを使用して設計されている。フォワードおよびリバースプライマーの配列は、以下に示されている。ＰＣＲ鋳型は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｖｅｒｓｏ  ｃＤＮＡ合成キットを使用して調製されている。すべてのｑＰＣＲ試薬は、全ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを使用して、３対数範囲の核酸濃度にわたって、サンプル濃度と増幅速度論間の直線関係を実証することによって検証されている。ＰＣＲ反応にはＴａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）が使用され、増幅データは、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを使用して集められ、ＡＢＩ製のＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍソフトウェア（ＳＤＳ  Ｖ２．０）を使用して分析されている。特に断りのない限り、ｍＲＮＡの存在量は、β−アクチンΔＣＴ＝ＣＴ標的−ＣＴβ−アクチンに対する標準化によって算出され、未処理腫瘍細胞におけるｍＲＮＡ存在量に対して較正されている（ΔΔＣＴ＝ΔＣＴＥＶＩＲＮＡΔＣＴｓｉＧｌｏ）。データは、ＨＴ−２９中の個々のｍＲＮＡの存在量が１．０として表されるよう、２−ΔΔＣＴとして表されている（ΔＣＴＨＴ−２９＝０および２−０＝１．０）。結腸がん細胞中のＥＶＩ１  ｍＲＮＡの存在量は、β−アクチンに対して標準化され、ＨＦＣ細胞に対して較正されている。ＱＰＣＲ結果の統計分析は、Ｓｉｇｍａ  Ｓｔａｔのマンホイットニー順位和分析関数を使用して実施されている。
【０１１５】
【化１】
0006033218.tif 000002
（実施例１）
本発明の好ましい実施形態では、ＥＶＩ１阻害剤は、２１ｂｐの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。ＥＶＩ１発現をサイレンシングできる強力である可能性のあるｓｉＲＮＡを同定するアルゴリズムを使用して、ヒトＥＶＩ１アイソフォームｌｂ  ｍＲＮＡのコンピュータによる解析を実施した。ｓｉＲＮＡが強力なＥＶＩ１下方制御因子を提供する、５種のコア標的配列が表１に示されている（配列番号２〜６）。これらの標的部位Ａ（配列番号７〜８）、Ｂ（配列番号９〜１０）、Ｃ（配列番号１１〜１２）、Ｄ（配列番号１３〜１４）およびＥ（配列番号１５〜１６）に対応するｓｉＲＮＡが、表２に示されている。２５６コア（配列番号２）の周囲の着目された配列が表３に示されている（配列番号１７〜５６）。９７９コア（配列番号３）および９９２コア（配列番号４）の周囲の着目された配列が表４に示されている（配列番号５７〜１２０）。２９１０コア（配列番号５）の周囲の着目された配列が表５に示されている（配列番号１２１〜１６０）。２９９４コア（配列番号６）の周囲の着目された配列が表６に示されている（配列番号１６１〜２００）。
【０１１６】
表２中に示される５種のｓｉＲＮＡ二本鎖の各々を、５０ｎＭの濃度で卵巣腫瘍細胞の培養物中に入れた。試験された卵巣腫瘍細胞の特性が表４に示されている。手短には、５万〜１０万個の腫瘍細胞を、６ウェルプレートの各ウェルに加え、表面に付着させ、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地中で１８時間成長させた。２ｍｌの総容量の培地中、１マイクロリットルのＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）試薬を使用して、合計１００ｐｍｏｌの各ｓｉＲＮＡを細胞に入れた。細胞をｓｉＲＮＡとともに９６時間インキュベートした。トリパンブルー排出染色後に、血球算定器を用いて細胞を計数することによって卵巣腫瘍細胞の生存力を評価した。結果が表５に示されている。５種の配列の各々が、少なくとも１種の卵巣腫瘍細胞株において生存細胞数を少なくとも４０％低減させた（対照ｓｉＲＮＡ処理細胞と比較して）。
【０１１７】
（実施例２）
有効ながん治療薬である物質については、極めて低い濃度で頑強ながん死滅効果が必要であり、ｓｉＲＮＡにとっては、細胞培養物中、ナノモル以下の濃度であると理解されよう。卵巣腫瘍細胞の成長を５０％阻害したｓｉＲＮＡの濃度（ＩＣ５０）は、培養中の同数の腫瘍細胞に、種々の用量レベルのｓｉＲＮＡのうち１種を添加した９６時間後に細胞生存力を測定することによって決定した。図６Ａは、ＥＳ−２細胞についてのｓｉＥＶＩ１−９７９（配列番号９〜１０）のＩＣ５０が、約２．５ｎＭであり、ｓｉＥＶＩ１−２９１０（配列番号１３〜１４）のＩＣ５０が、約０．５ｎＭであることを示す。ＴＯＶ−１１２Ｄ細胞については、ｓｉＥＶＩ１−９７９（配列番号９〜１０）のＩＣ５０は、約４ｎＭであり、ｓｉＥＶＩ１−２９１０（配列番号１３〜１４）のＩＣ５０は、約０．８ｎＭである。さらに同定するために、卵巣腫瘍細胞の成長を阻害する強力な配列、ｓｉＥＶＩ１−２９１０（配列番号１２１〜１６０）の最大１０ｂｐ上流および１０ｂｐ下流の配列を調製し、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴトランスフェクション試薬を使用して、２．５ｎＭの濃度で、ＥＳ−２およびＴＯＶ−１１２Ｄ卵巣腫瘍細胞に投与した。図７Ａは、トランスフェクション対照に対するＴＯＶ−１１２Ｄ卵巣腫瘍細胞の成長阻害パーセントの結果を表す。ｓｉＲＮＡ配列（配列番号１２１〜１２４、１２７〜１３２、１３３〜１３６および１３７〜１３８）は、２．５ｎＭ以下の濃度で、ＴＯＶ−１１２Ｄ卵巣腫瘍細胞の成長を阻害するとわかった。図７Ｂは、トランスフェクション対照に対するＥＳ−２卵巣腫瘍細胞の成長阻害パーセントの結果を表す。ｓｉＲＮＡ配列（配列番号１２１〜１２６、１２９〜１３０、１３３〜１４２、１４７〜１４８および１５１〜１５２）は、２．５ｎＭ以下の濃度でＥＳ−２卵巣腫瘍細胞の成長を阻害するとわかった。
【０１１８】
（実施例３）
ＥＶＩ１の強力なｓｉＲＮＡ阻害剤は、腫瘍中への直接注射後に、マウスにおいて腫瘍の成長を低減させることができる。ｓｉＲＮＡの効力を評価するために、３００万個の卵巣転移性腫瘍細胞を雌のヌードマウスに皮下に注射し、腫瘍を１０日間にわたって成長させた。リポソームナノ粒子中に被包された１ｎｍｏｌのｓｉＲＮＡを各々含有する１０マイクロリットルの最大５回の注射を、腫瘍のすぐ下に、週に２回、３週間注射する。陰性対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ配列を含有するナノ粒子を用いて、同様の腫瘍を有する等数のマウスに注射する。３週間の投薬の後に腫瘍を採取し、測定し、秤量する。強力なｓｉＲＮＡ種については、ＥＶＩ１をターゲッティングするｓｉＲＮＡを投薬したマウスにおける腫瘍は、スクランブルｓｉＲＮＡ配列を投薬されたものの平均して約１０％の大きさの腫瘍を有すると思われる。これらの結果は、ＥＶＩ１をターゲッティングするｓｉＲＮＡの、抗がん療法としての有効性および効力の実証を提供する。腫瘍におけるＥＶＩ１の全体の発現は、例えば、抗ＥＶＩ１抗体を用いてプローブされた腫瘍ホモジネートのウエスタンブロットによって明らかなように、７０％超低減すると思われる。ＥＶＩ１  ｍＲＮＡの発現はまた、ＥＶＩ１エキソン１４の３００ｂｐ領域を増幅するプライマーを用いたＥＶＩ１遺伝子発現の定量的ＰＣＲ分析によって明らかなように、数倍減少すると思われる。
【０１１９】
（実施例４）
本発明の試薬の有効な実施形態については、ｓｉＲＮＡは、ナノモル以下の濃度での腫瘍中への直接注射後に、マウスにおいて腫瘍の成長を低減させる。ｓｉＲＮＡの効力を評価するために、３００万個の卵巣転移性腫瘍細胞を、雌のヌードマウスに腹腔内に注入し、腫瘍を２１日間成長させた。リポソームナノ粒子中に被包された１００マイクロリットルの量の１ｎｍｏｌ  ｓｉＲＮＡを、マウス尾静脈中に、週に２回、３週間注射する。陰性対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ配列を含有するナノ粒子を用いて、同様の腫瘍を有する等数のマウスに注射する。３週間の投薬の後に腫瘍を採取し、測定し、秤量する。強力なｓｉＲＮＡ種については、ＥＶＩ１をターゲッティングするｓｉＲＮＡを投薬したマウスから得た腫瘍は、スクランブルｓｉＲＮＡ配列を投薬されたマウスから得たものの平均して約１０％の大きさの腫瘍を有すると思われる。これらの結果は、ＥＶＩ１をターゲッティングするｓｉＲＮＡの、抗がん療法としての有効性および効力の実証を提供する。腫瘍におけるＥＶＩ１の全体の発現は、例えば、抗ＥＶＩ１抗体を用いてプローブされた腫瘍ホモジネートのウエスタンブロットによって明らかなように、７０％超低減すると思われる。ＥＶＩ１  ｍＲＮＡの発現はまた、ＥＶＩ１エキソン１４の３００ｂｐ領域を増幅するプライマーを用いたＥＶＩ１遺伝子発現の定量的ＰＣＲ分析によって明らかなように、数倍減少すると思われる。
【０１２０】
（実施例５）
本明細書に示されるように、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、ＥＶＩ１発現をサイレンシングできる強力である可能性のあるｓｉＲＮＡを同定するアルゴリズムを使用して実施されるヒトＥＶＩ１アイソフォームｌｂ  ｍＲＮＡのコンピュータによる解析から提供される。ｓｉＲＮＡが強力なＥＶＩ１下方制御因子を提供する、５種のコア標的配列が表１に示されている（配列番号２〜６）。これらの標的部位Ａ（配列番号７〜８）、Ｂ（配列番号９〜１０）、Ｃ（配列番号１１〜１２）、Ｄ（配列番号１３〜１４）およびＥ（配列番号１５〜１６）に対応するｓｉＲＮＡが、表２に示されている。２５６コア（配列番号２）の周囲の着目された配列が表３に示されている（配列番号１７〜５６）。９７９コア（配列番号３）および９９２コア（配列番号４）の周囲の着目された配列が表４に示されている（配列番号５７〜１２０）。２９１０コア（配列番号５）の周囲の着目された配列が表５に示されている（配列番号１２１〜１６０）。２９９４コア（配列番号６）の周囲の着目された配列が表６に示されている（配列番号１６１〜２００）。
【０１２１】
表２中に示される５種のｓｉＲＮＡ二本鎖の各々を、５０ｎＭの濃度で前立腺腫瘍細胞の培養物中に入れた。試験された前記前立腺腫瘍細胞の特性が表９に示されている。手短には、５万〜１０万個の腫瘍細胞を、６ウェルプレートの各ウェルに加え、表面に付着させ、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地中で１８時間成長させた。２ｍｌの総容量の培地中、１マイクロリットルのＤｈａｒｍａＦＥＣＴ試薬を使用して、合計２００ピコモルの各ｓｉＲＮＡを細胞に入れた。細胞をｓｉＲＮＡとともに９６時間インキュベートした。トリパンブルー排出染色後に、血球算定器を用いて細胞を計数することによって前立腺腫瘍細胞の生存力を評価した。結果が表１０に示されている。５種の配列の各々が、少なくとも１種の前立腺腫瘍細胞株において生存細胞数を少なくとも４０％低減させた（対照ｓｉＲＮＡ処理細胞と比較して）。
【０１２２】
（実施例６）
有効ながん治療薬である物質については、極めて低い濃度で頑強ながん死滅効果が必要であり、ｓｉＲＮＡにとっては、細胞培養物中、ナノモル以下の濃度であると理解されよう。前立腺腫瘍細胞の成長を５０％阻害したｓｉＲＮＡの濃度（ＩＣ５０）は、培養中の同数の腫瘍細胞に、漸増用量のｓｉＲＮＡを添加した９６時間後に細胞生存力を測定することによって決定した。
【０１２３】
（実施例７）
表２中に示される５種のｓｉＲＮＡ二本鎖の各々を、５０ｎＭの濃度で乳房腫瘍細胞の培養物中に入れた。試験された乳房腫瘍細胞の特性が表１１に示されている。手短には、５万〜１０万個の腫瘍細胞を、６ウェルプレートの各ウェルに加え、表面に付着させ、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地中で１８時間成長させた。２ｍｌの総容量の培地中、１マイクロリットルのＤｈａｒｍａＦＥＣＴ試薬を使用して、合計２００ピコモルの各ｓｉＲＮＡを細胞に入れた。細胞をｓｉＲＮＡとともに９６時間インキュベートした。トリパンブルー排出後に、血球算定器を用いて細胞を計数することによって乳房腫瘍細胞の生存力を評価した。結果が表１２に示されている。５種の配列の各々が、少なくとも１種の卵巣腫瘍細胞株において生存細胞数を少なくとも４０％低減させた（対照ｓｉＲＮＡ処理細胞と比較して）。
【０１２４】
（実施例８）
乳房腫瘍細胞の成長を５０％阻害したｓｉＲＮＡの濃度（ＩＣ５０）は、培養中の同数の腫瘍細胞に、漸増用量のｓｉＲＮＡを添加した９６時間後に細胞生存力を測定することによって決定した。
【０１２５】
（実施例９）
本発明の試薬の有効な実施形態については、ｓｉＲＮＡは、ナノモル以下の濃度での腫瘍中への直接注射後に、マウスにおいて腫瘍の成長を低減させる。ｓｉＲＮＡの効力をさらに評価するために、３００万個の前立腺転移性腫瘍細胞を、雌のヌードマウスに皮下に注射し、腫瘍を１０日間にわたって成長させた。リポソームナノ粒子中に被包された１ｎｍｏｌのｓｉＲＮＡを各々含有する１０マイクロリットルの最大５回の注射を、腫瘍のすぐ下に、週に２回、３週間注射した。陰性対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ配列を含有するナノ粒子を用いて、同様の腫瘍を有する等数のマウスに注射した。３週間の投薬の後に腫瘍を採取し、測定し、秤量した。ＥＶＩ１をターゲッティングするｓｉＲＮＡを投薬したマウスにおける腫瘍は、スクランブルｓｉＲＮＡ配列を投薬されたものの平均して約１０％の大きさの腫瘍を有していた。結果は、ＥＶＩ１をターゲッティングするｓｉＲＮＡの、抗がん療法としての有効性および効力を実証する。腫瘍におけるＥＶＩ１の全体の発現は、抗ＥＶＩ１抗体を用いてプローブされた腫瘍ホモジネートのウエスタンブロットによって明らかなように、７０％超低減した。ＥＶＩ１  ｍＲＮＡの発現はまた、ＥＶＩ１エキソン１４の３００ｂｐ領域を増幅するプライマーを用いたＥＶＩ１遺伝子発現の定量的ＰＣＲ分析によって明らかなように、数倍減少した。
【０１２６】
（実施例１０）
ｓｉＲＮＡの効力をさらに評価するために、３００万個の前立腺転移性腫瘍細胞を、雌のヌードマウスに腹腔内に注入し、腫瘍を２１日間にわたって成長させた。リポソームナノ粒子中に被包された１００マイクロリットルの量の１ｎｍｏｌ  ｓｉＲＮＡを、マウス尾静脈中に、週に２回、３週間注射した。陰性対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ配列を含有するナノ粒子を用いて、同様の腫瘍を有する等数のマウスに注射した。３週間の投薬の後に腫瘍を採取し、測定し、秤量した。ＥＶＩ１をターゲッティングするｓｉＲＮＡを投薬したマウスから得た腫瘍は、平均すると、スクランブルｓｉＲＮＡ配列を投薬されたマウスから得たものの約１０％の大きさであった。結果は、ＥＶＩ１をターゲッティングするｓｉＲＮＡの、抗がん療法としての有効性および効力を実証した。これらの腫瘍におけるＥＶＩ１の全体の発現は、抗ＥＶＩ１抗体を用いてプローブされた腫瘍ホモジネートのウエスタンブロット分析によって明らかなように、７０％超低減した。ＥＶＩ１  ｍＲＮＡの発現はまた、ＥＶＩ１エキソン１４の３００ｂｐ領域を増幅するプライマーを用いたＥＶＩ１遺伝子発現の定量的ＰＣＲ分析によって明らかなように、数倍減少した。
【０１２７】
（実施例１１）
表２中に示される５種のｓｉＲＮＡ二本鎖の各々を、５０ｎＭの濃度で肺腫瘍細胞の培養物中に入れる。試験された肺巣腫瘍細胞の特性が表１３に示されている。手短には、５万〜１０万個の腫瘍細胞を、６ウェルプレートの各ウェルに加え、表面に付着させ、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地中で１８時間成長させた。２ｍｌの総容量の培地中、１マイクロリットルのＤｈａｒｍａＦＥＣＴ試薬を使用して、合計２００ピコモルの各ｓｉＲＮＡを細胞に入れる。細胞をｓｉＲＮＡとともに９６時間インキュベートする。トリパンブルー排出染色後に、血球算定器を用いて細胞を計数することによって肺腫瘍細胞生存力を評価する。５種の配列の各々が、少なくとも１種の卵巣腫瘍細胞株において生存細胞数を少なくとも４０％低減させる（対照ｓｉＲＮＡ処理細胞と比較して）と思われる。
【０１２８】
（実施例１２）
肺腫瘍細胞の成長を５０％阻害したｓｉＲＮＡの濃度（ＩＣ５０）は、培養中の同数の腫瘍細胞に、漸増用量のｓｉＲＮＡを添加した９６時間後に細胞生存力を測定することによって決定する。
【０１２９】
（実施例１３）
ｓｉＲＮＡの効力をさらに評価するために、３００万個の肺転移性腫瘍細胞を、雌のヌードマウスに皮下に注射し、腫瘍を１０日間にわたって成長させた。リポソームナノ粒子中に被包された１ｎｍｏｌのｓｉＲＮＡを各々含有する１０マイクロリットルの最大５回の注射を、腫瘍のすぐ下に、週に２回、３週間注射した。陰性対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ配列を含有するナノ粒子を用いて、同様の腫瘍を有する等数のマウスに注射した。３週間の投薬の後に腫瘍を採取し、測定し、秤量した。ＥＶＩ１をターゲッティングするｓｉＲＮＡを投薬したマウスにおける腫瘍は、平均して、スクランブルｓｉＲＮＡ配列を投薬されたマウスの約１０％の大きさであった。結果は、ＥＶＩ１をターゲッティングするｓｉＲＮＡの、抗がん療法としての有効性および効力を実証した。腫瘍におけるＥＶＩ１の全体の発現は、抗ＥＶＩ１抗体を用いてプローブされた腫瘍ホモジネートのウエスタンブロットによって明らかなように、７０％超低減した。ＥＶＩ１  ｍＲＮＡの発現はまた、ＥＶＩ１エキソン１４の３００ｂｐ領域を増幅するプライマーを用いたＥＶＩ１遺伝子発現の定量的ＰＣＲ分析によって明らかなように、数倍減少した。
【０１３０】
（実施例１４）
ｓｉＲＮＡの効力をさらに評価するために、３００万個の肺転移性腫瘍細胞を、雌のヌードマウスに腹腔内に注入し、腫瘍を２１日間にわたって成長させた。リポソームナノ粒子中に被包された１００マイクロリットルの量の１ｎｍｏｌ  ｓｉＲＮＡを、マウス尾静脈中に、週に２回、３週間注射した。陰性対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ配列を含有するナノ粒子を用いて、同様の腫瘍を有する等数のマウスに注射した。３週間の投薬の後に腫瘍を採取し、測定し、秤量した。ＥＶＩ１をターゲッティングするｓｉＲＮＡを投薬したマウスから得た腫瘍は、平均すると、スクランブルｓｉＲＮＡ配列を投薬されたマウスから得たものの約１０％の大きさであった。これらの結果は、ＥＶＩ１をターゲッティングするｓｉＲＮＡの、抗がん療法としての有効性および効力を実証した。これらの腫瘍におけるＥＶＩ１の全体の発現は、抗ＥＶＩ１抗体を用いてプローブされた腫瘍ホモジネートのウエスタンブロットによって明らかなように、７０％超低減した。ＥＶＩ１  ｍＲＮＡの発現はまた、ＥＶＩ１エキソン１４の３００ｂｐ領域を増幅するプライマーを用いたＥＶＩ１遺伝子発現の定量的ＰＣＲ分析によって明らかなように、数倍減少した。
【０１３１】
（実施例１５）
表２中に示される５種のｓｉＲＮＡ二本鎖の各々を、５０ｎＭの濃度で結腸腫瘍細胞の培養物中に入れる。試験された結腸腫瘍細胞の特性が表１４に示されている。手短には、５万〜１０万個の腫瘍細胞を、６ウェルプレートの各ウェルに加え、表面に付着させ、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地中で１８時間成長させた。２ｍｌの総容量の培地中、１マイクロリットルのＤｈａｒｍａＦＥＣＴ試薬を使用して、合計２００ピコモルの各ｓｉＲＮＡを細胞に入れる。細胞をｓｉＲＮＡとともに９６時間インキュベートする。トリパンブルー排出染色後に、血球算定器を用いて細胞を計数することによって結腸腫瘍細胞生存力を評価する。５種の配列の各々が、少なくとも１種の卵巣腫瘍細胞株において生存細胞数を少なくとも４０％低減させる（対照ｓｉＲＮＡ処理細胞と比較して）と思われる。
【０１３２】
（実施例１６）
有効ながん治療薬である物質については、極めて低い濃度で頑強ながん死滅効果が必要であり、ｓｉＲＮＡにとっては、細胞培養物中、ナノモル以下の濃度であると理解されよう。結腸腫瘍細胞の成長を５０％阻害したｓｉＲＮＡの濃度（ＩＣ５０）は、培養中の同数の腫瘍細胞に、漸増用量のｓｉＲＮＡを添加した９６時間後に細胞生存力を測定することによって決定した。
【０１３３】
（実施例１７）
ｓｉＲＮＡの効力をさらに評価するために、３００万個の結腸転移性腫瘍細胞を、雌のヌードマウスに皮下に注射し、腫瘍を１０日間にわたって成長させた。リポソームナノ粒子中に被包された１ｎｍｏｌのｓｉＲＮＡを各々含有する１０マイクロリットルの最大５回の注射を、腫瘍のすぐ下に、週に２回、３週間注射する。陰性対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ配列を含有するナノ粒子を用いて、同様の腫瘍を有する等数のマウスに注射する。３週間の投薬の後に腫瘍を採取し、測定し、秤量する。ＥＶＩ１をターゲッティングするｓｉＲＮＡを投薬したマウスにおける腫瘍は、平均して、スクランブルｓｉＲＮＡ配列を投薬されたマウスから得た腫瘍の約１０％の大きさであると思われる。結果は、ＥＶＩ１をターゲッティングするｓｉＲＮＡの、抗がん療法としての有効性および効力を実証すると思われる。腫瘍におけるＥＶＩ１の全体の発現は、例えば、抗ＥＶＩ１抗体を用いてプローブされた腫瘍ホモジネートのウエスタンブロットによって明らかなように、７０％超低減すると思われる。ＥＶＩ１  ｍＲＮＡの発現はまた、ＥＶＩ１エキソン１４の３００ｂｐ領域を増幅するプライマーを用いたＥＶＩ１遺伝子発現の定量的ＰＣＲ分析によって明らかなように、数倍減少すると思われる。
【０１３４】
（実施例１８）
ｓｉＲＮＡの効力をさらに評価するために、３００万個の結腸転移性腫瘍細胞を、雌のヌードマウスに腹腔内に注入し、腫瘍を２１日間にわたって成長させた。リポソームナノ粒子中に被包された１００マイクロリットルの量の１ｎｍｏｌ  ｓｉＲＮＡを、マウス尾静脈中に、週に２回、３週間注射する。陰性対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ配列を含有するナノ粒子を用いて、同様の腫瘍を有する等数のマウスに注射する。３週間の投薬の後に腫瘍を採取し、測定し、秤量する。ＥＶＩ１をターゲッティングするｓｉＲＮＡを投薬したマウスにおける腫瘍は、平均して、スクランブルｓｉＲＮＡ配列を投薬されたマウスから得た腫瘍の約１０％の大きさであると思われる。これらの結果は、ＥＶＩ１をターゲッティングするｓｉＲＮＡの、抗がん療法としての有効性および効力を実証すると思われる。腫瘍におけるＥＶＩ１の全体の発現は、例えば、抗ＥＶＩ１抗体を用いてプローブされた腫瘍ホモジネートのウエスタンブロットによって明らかなように、７０％超低減すると思われる。ＥＶＩ１  ｍＲＮＡの発現はまた、ＥＶＩ１エキソン１４の３００ｂｐ領域を増幅するプライマーを用いたＥＶＩ１遺伝子発現の定量的ＰＣＲ分析によって明らかなように、数倍減少すると思われる。
【０１３５】
（実施例１９）
ｓｉＲＮＡの効力をさらに評価するために、３００万個の乳房転移性腫瘍細胞を、雌のヌードマウスに皮下に注射し、腫瘍を１０日間にわたって成長させた。リポソームナノ粒子中に被包された１ｎｍｏｌのｓｉＲＮＡを各々含有する１０マイクロリットルの最大５回の注射を、腫瘍のすぐ下に、週に２回、３週間注射した。陰性対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ配列を含有するナノ粒子を用いて、同様の腫瘍を有する等数のマウスに注射した。３週間の投薬の後に腫瘍を採取し、測定し、秤量した。ＥＶＩ１をターゲッティングするｓｉＲＮＡを投薬したマウスにおける腫瘍は、平均して、スクランブルｓｉＲＮＡ配列を投薬されたマウスから得た腫瘍の約１０％の大きさであった。結果は、ＥＶＩ１をターゲッティングするｓｉＲＮＡの、抗がん療法としての有効性および効力を実証した。腫瘍におけるＥＶＩ１の全体の発現は、抗ＥＶＩ１抗体を用いてプローブされた腫瘍ホモジネートのウエスタンブロットによって明らかなように、７０％超低減した。ＥＶＩ１  ｍＲＮＡの発現はまた、ＥＶＩ１エキソン１４の３００ｂｐ領域を増幅するプライマーを用いたＥＶＩ１遺伝子発現の定量的ＰＣＲ分析によって明らかなように、数倍減少した。
【０１３６】
（実施例２０）
ｓｉＲＮＡの効力をさらに評価するために、３００万個の乳房転移性腫瘍細胞を、雌のヌードマウスに腹腔内に注入し、腫瘍を２１日間にわたって成長させた。リポソームナノ粒子中に被包された１００マイクロリットルの量の１ｎｍｏｌ  ｓｉＲＮＡを、マウス尾静脈中に、週に２回、３週間注射した。陰性対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ配列を含有するナノ粒子を用いて、同様の腫瘍を有する等数のマウスに注射した。３週間の投薬の後に腫瘍を採取し、測定し、秤量した。ＥＶＩ１をターゲッティングするｓｉＲＮＡを投薬したマウスから得た腫瘍は、平均すると、スクランブルｓｉＲＮＡ配列を投薬されたマウスから得た腫瘍の約１０％の大きさであった。これらの結果は、ＥＶＩ１をターゲッティングするｓｉＲＮＡの、抗がん療法としての有効性および効力を実証した。これらの腫瘍におけるＥＶＩ１の全体の発現は、抗ＥＶＩ１抗体を用いてプローブされた腫瘍ホモジネートのウエスタンブロットによって明らかなように、７０％超低減した。ＥＶＩ１  ｍＲＮＡの発現はまた、ＥＶＩ１エキソン１４の３００ｂｐ領域を増幅するプライマーを用いたＥＶＩ１遺伝子発現の定量的ＰＣＲ分析によって明らかなように、数倍減少した。
【０１３７】
（実施例２１）
表２中に示される５種のｓｉＲＮＡ二本鎖の各々を、５０ｎＭの濃度で黒色腫腫瘍細胞の培養物中に入れる。試験された黒色腫腫瘍細胞の特性が表１５に示されている。手短には、５万〜１０万個の腫瘍細胞を、６ウェルプレートの各ウェルに加え、表面に付着させ、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地中で１８時間成長させた。２ｍｌの総容量の培地中、１マイクロリットルのＤｈａｒｍａＦＥＣＴ試薬を使用して、合計２００ピコモルの各ｓｉＲＮＡを細胞に入れる。細胞をｓｉＲＮＡとともに９６時間インキュベートする。トリパンブルー排出染色後に、血球算定器を用いて細胞を計数することによって黒色腫腫瘍細胞生存力を評価する。５種の配列の各々が、少なくとも１種の黒色腫腫瘍細胞株において生存細胞数を少なくとも４０％低減させる（対照ｓｉＲＮＡ処理細胞と比較して）と思われる。
【０１３８】
（実施例２２）
黒色腫腫瘍細胞の成長を５０％阻害するｓｉＲＮＡの濃度（ＩＣ５０）は、培養中の同数の腫瘍細胞に、漸増用量のｓｉＲＮＡを添加した９６時間後に細胞生存力を測定することによって決定する。
【０１３９】
（実施例２３）
ｓｉＲＮＡの効力をさらに評価するために、３００万個の黒色腫転移性腫瘍細胞を、雌のヌードマウスに皮下に注射し、腫瘍を１０日間にわたって成長させた。リポソームナノ粒子中に被包された１ｎｍｏｌのｓｉＲＮＡを各々含有する１０マイクロリットルの最大５回の注射を、腫瘍のすぐ下に、週に２回、３週間注射する。陰性対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ配列を含有するナノ粒子を用いて、同様の腫瘍を有する等数のマウスに注射する。３週間の投薬の後に腫瘍を採取し、測定し、秤量する。ＥＶＩ１をターゲッティングするｓｉＲＮＡを投薬したマウスにおける腫瘍は、平均して、スクランブルｓｉＲＮＡ配列を投薬されたマウスから得た腫瘍の約１０％の大きさであると思われる。結果は、ＥＶＩ１をターゲッティングするｓｉＲＮＡの、抗がん療法としての有効性および効力を実証すると思われる。腫瘍におけるＥＶＩ１の全体の発現は、例えば、抗ＥＶＩ１抗体を用いてプローブされた腫瘍ホモジネートのウエスタンブロットによって明らかなように、７０％超低減すると思われる。ＥＶＩ１  ｍＲＮＡの発現はまた、ＥＶＩ１エキソン１４の３００ｂｐ領域を増幅するプライマーを用いたＥＶＩ１遺伝子発現の定量的ＰＣＲ分析によって明らかなように、数倍減少すると思われる。
【０１４０】
（実施例２４）
ｓｉＲＮＡの効力をさらに評価するために、３００万個の黒色腫転移性腫瘍細胞を、雌のヌードマウスに腹腔内に注入し、腫瘍を２１日間にわたって成長させた。リポソームナノ粒子中に被包された１００マイクロリットルの量の１ｎｍｏｌ  ｓｉＲＮＡを、マウス尾静脈中に、週に２回、３週間注射する。陰性対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ配列を含有するナノ粒子を用いて、同様の腫瘍を有する等数のマウスに注射する。３週間の投薬の後に腫瘍を採取し、測定し、秤量する。ＥＶＩ１をターゲッティングするｓｉＲＮＡを投薬したマウスから得た腫瘍は、平均すると、陰性対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ配列を投薬されたマウスから得た腫瘍の約１０％の大きさであると思われる。結果は、ＥＶＩ１をターゲッティングするｓｉＲＮＡの、抗がん療法としての有効性および効力を実証すると思われる。腫瘍におけるＥＶＩ１の全体の発現は、例えば、抗ＥＶＩ１抗体を用いてプローブされた腫瘍ホモジネートのウエスタンブロット分析によって明らかなように、７０％超低減すると思われる。ＥＶＩ１  ｍＲＮＡの発現はまた、ＥＶＩ１エキソン１４の３００ｂｐ領域を増幅するプライマーを用いたＥＶＩ１遺伝子発現の定量的ＰＣＲ分析によって明らかなように、数倍減少すると思われる。
【０１４１】
（実施例２４）
ｓｉＲＮＡの効力をさらに評価するために、３００万個の黒色腫転移性腫瘍細胞を、雌のヌードマウスに腹腔内に注入し、腫瘍を２１日間にわたって成長させた。リポソームナノ粒子中に被包された１００マイクロリットルの量の１ｎｍｏｌ  ｓｉＲＮＡを、マウス尾静脈中に、週に２回、３週間注射する。陰性対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ配列を含有するナノ粒子を用いて、同様の腫瘍を有する等数のマウスに注射する。３週間の投薬の後に腫瘍を採取し、測定し、秤量する。ＥＶＩ１をターゲッティングするｓｉＲＮＡを投薬したマウスから得た腫瘍は、平均すると、スクランブルｓｉＲＮＡ配列を投薬されたマウスから得た腫瘍の約１０％の大きさであると思われる。結果は、ＥＶＩ１をターゲッティングするｓｉＲＮＡの、抗がん療法としての有効性および効力を実証すると思われる。腫瘍におけるＥＶＩ１の全体の発現は、例えば、抗ＥＶＩ１抗体を用いてプローブされた腫瘍ホモジネートのウエスタンブロットによって明らかなように、７０％超低減すると思われる。ＥＶＩ１  ｍＲＮＡの発現はまた、ＥＶＩ１エキソン１４の３００ｂｐ領域を増幅するプライマーを用いたＥＶＩ１遺伝子発現の定量的ＰＣＲ分析によって明らかなように、数倍減少すると思われる。
【０１４２】
（実施例２５）
表２中に示される５種のｓｉＲＮＡ二本鎖の各々を、５０ｎＭの濃度でＨＥＬ白血病細胞の培養物中に入れる。試験されたＨＥＬ白血病細胞の特性が表１６に示されている。手短には、５万〜１０万個のＨＥＬ細胞を、６ウェルプレートの各ウェルに加え、表面に付着させ、１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ培地中で１８時間成長させた。２ｍｌの総容量の培地中、１マイクロリットルのＤｈａｒｍａＦＥＣＴ試薬を使用して、合計２００ピコモルの各ｓｉＲＮＡを細胞に入れる。細胞をｓｉＲＮＡとともに９６時間インキュベートする。トリパンブルー排出染色後に、血球算定器を用いて細胞を計数することによって白血病細胞生存力を評価する。５種の配列の各々が、少なくとも１種のＨＥＬ白血病腫瘍細胞株において生存細胞数を少なくとも４０％低減させる（対照ｓｉＲＮＡ処理細胞と比較して）と思われる。
【０１４３】
（実施例２６）
ＥＶＩ１に感染した骨髄細胞を移植したＣ５７ＢＬ／Ｌｙ５．２マウス（Ｂｕｏｎａｍｉｃｉ、２００４年）は、急性骨髄性白血病と同様の致死的骨髄異形成疾患を発生する。マウスを、ナノ粒子製剤中の抗ＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡを用いて処理し、脾臓および骨髄におけるアポトーシスの程度ならびにＴｅｒ１１９陽性骨髄細胞数を測定した。抗ＥＶＩ１  ｓｉＲＮＡを投与されているマウスは生存が延長し、Ｔｅｒ１１９細胞数が減少した。
【０１４４】
【表１】
0006033218.tif 000003
【０１４５】
【表２】
0006033218.tif 000004
【０１４６】
【表３】
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【０１４７】
【表４−１】
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【０１４８】
【表４−２】
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【０１４９】
【表５−１】
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【０１５０】
【表５−２】
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【０１５１】
【表５−３】
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【０１５２】
【表６−１】
0006033218.tif 000011
【０１５３】
【表６−２】
0006033218.tif 000012
【０１５４】
【表７】
0006033218.tif 000013
【０１５５】
【表８】
0006033218.tif 000014
【０１５６】
【表９】
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【０１５７】
【表１０】
0006033218.tif 000016
【０１５８】
【表１１】
0006033218.tif 000017
【０１５９】
【表１２】
0006033218.tif 000018
【０１６０】
【表１３】
0006033218.tif 000019
【０１６１】
【表１４】
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【０１６２】
【表１５】
0006033218.tif 000021
【０１６３】
【表１６】
0006033218.tif 000022
前記の開示内容は、本発明の特定の具体的な実施形態を強調するが、すべての改変形態またはそれと均等な代替形態が、添付の特許請求の範囲に示される発明の趣旨および範囲内にあるということは理解されなくてはならない。
【０１６４】
【化２−１】
0006033218.tif 000023
【０１６５】
【化２−２】
0006033218.tif 000024
【０１６６】
【化２−３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0006033218.tif 000031
【図７Ａ】
0006033218.tif 000032
【図７Ｂ】
0006033218.tif 000033
【図８】
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【配列表】
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