(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血漿から部分的に精製されたIgG溶液からIgG組成物を得るための方法であって、
a)部分的に精製されたIgG溶液を透析濾過するステップと;
b)ステップa)で得られた溶液を安定化させるステップと;
c)ステップb)で得られた溶液を熱処理するステップと;
d)陽イオンクロマトグラフィーを通じて、ステップc)で熱処理された溶液から高分子量凝集体および/またはポリマーを選択的に吸着するステップと;
e)ステップd)で得られた溶液を透析濾過および製剤化するステップと
を含む方法であって、
前記透析濾過ステップ(a)が、エタノール濃度が0.5%(重量/体積)未満になるまで実施され、
前記透析濾過ステップ(a)が、非変性沈殿試薬、オクタン酸、適合性非イオン性界面活性剤、またはこれらの任意の混合物の濃度がステップc)の後に2%(重量/体積)未満になるまで実施されることを特徴とする、方法。
【請求項２】
全タンパク質に関して95%超のIgG含量を有するヒト血漿から精製されたIgG溶液から開始して実施されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
全タンパク質に関して97%超のIgG含量を有するヒト血漿から精製されたIgG溶液から開始して実施されることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
透析濾過ステップ(a)が、いかなる場合にも、ステップc)の後に、3%超のポリマーを生じさせなくなるまで実施されることを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
透析濾過ステップ(a)が、出発IgG溶液のイオン強度が1mS/cm未満になるまで実施されることを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ(a)の最後におけるpH値が4.2〜6.0の範囲内であることを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
透析濾過ステップ(a)が、注射用水または低イオン強度の緩衝溶液を用いて実施されることを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
低イオン強度の緩衝溶液が、4.0〜5.0の間のpHを有する酢酸または酢酸ナトリウムの5mM以下の溶液であることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
透析濾過ステップ(a)が、10kDa〜100kDaの間の分子カットオフを有する膜を通過させて、接線流モードで実施されることを特徴とする、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
透析濾過ステップ(a)において、タンパク質が、5%(重量/体積)を超えない濃度まで濃縮されることを特徴とする、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ソルビトールが、安定化ステップ(b)における安定化剤として使用されることを特徴とする、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
安定化ステップ(b)において使用されるソルビトールの濃度が、50%(重量/重量)未満であることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
pHが、安定化ステップ(b)において4.6〜5.2の間に調整されることを特徴とする、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
熱処理(ステップc)が、55℃〜63℃の間の温度で、1〜24時間の間の時間実施されることを特徴とする、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
熱処理(ステップc)が、60±1℃の温度で、10〜11時間実施されることを特徴とする、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
選択的な吸着ステップが、強陽イオン交換クロマトグラフィーカラムで実施されることを特徴とする、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
強陽イオン交換樹脂が、粒径が20〜100μmの間で様々であるポリメタクリレートまたはポリスチレンを含む不溶性合成パーフュージョンマトリックスに共有結合した陽イオン性スルホン基のうちの少なくとも1つを含むことを特徴とする、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
選択された吸着ステップにおいて、注入流量が5〜30カラム体積/時間であることを特徴とする、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
塩化ナトリウムが、ステップc)で熱処理された溶液に、0.2〜0.5M(mol/リットル)の間の最終濃度まで添加されることを特徴とする、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
塩化ナトリウムを添加した後、ステップc)における溶液のpHが、4.2〜5.5の間に調整されることを特徴とする、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
選択的吸着ステップにおいて、1〜10リットルの間の樹脂が、精製を必要とするIgG(乾燥)1kg毎に使用され、これは、樹脂1ml当たり100〜1000mgの間のIgGのローディングと等価であることを特徴とする、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
選択的吸着ステップにおいて、溶出が、漸減する食塩水勾配を使用して実施されることを特徴とする、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも1つの追加のウイルス不活化/排除処理ステップを含むことを特徴とする、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
追加のウイルス不活化/排除処理ステップが、熱処理ステップの前または後に実施されることを特徴とする、請求項21に記載の方法。
【請求項２５】
追加のウイルス不活化/排除処理ステップが、ペプシンの存在下もしくは非存在下での酸性pHでのインキュベーションによって、または非イオン性界面活性剤、イオン性溶媒を用いた処理によって、またはナノ濾過によって実施されることを特徴とする、請求項21に記載の方法。
【請求項２６】
透析濾過ステップ(e)が、注射用水または低イオン強度の緩衝溶液を用いて実施されることを特徴とする、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
透析濾過ステップ(e)において、最終的な製剤のための安定剤が添加されることを特徴とする、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
最終的な製剤のpHが4.6〜5.8の間であることを特徴とする、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
透析濾過ステップ(e)が、10kDa〜100kDaの間の分子カットオフを有する膜を通して、接線流モードで実施されることを特徴とする、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
透析濾過ステップ(e)において、タンパク質が、5%〜22%(w/v)の間の値に濃縮されることを特徴とする、請求項1から29のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト血漿から部分的に精製されたIgG溶液からIgG組成物を得るための新規方法であって、中間熱処理ステップを適用することによって、高分子量凝集体/ポリマーおよび/またはタンパク質を沈殿させるための試薬を使用することなく、本方法の間に生成されるIgGポリマーのほとんど完全な排除が達成される方法に関する。これに加えて、本方法は、先行技術における方法と比較して、高い生産性、より低い生産コスト、およびより容易な実施をもたらす。また、液体中の最終生成物の安定性が、本方法の使用を通じて付与される。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンG(IgG)は、全免疫グロブリンの約80%を占める、ヒト血清中で最も豊富な免疫グロブリンのアイソタイプである(8〜16mg/ml)。IgGは、様々な疾患、例えば、とりわけ、原発性免疫不全、特に、先天性無ガンマグロブリン血症および低ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病、川崎病の治療および骨髄の移植におけるアジュバントとして、小児患者におけるHIV感染症の治療の一部としての慢性リンパ性白血病に関連した低ガンマグロブリン血症などの治療に適応される。
【０００３】
現時点において、広いスペクトルのヒト抗体に関して多価であり、インタクトな分子(結晶化可能なFc断片の完全性)に関して総合機能性(中和能、オプソニン化、保存された平均寿命)、特に少数サブクラス(IgG3およびIgG4)について、天然の血漿と同一または等価であるIgGサブクラスの通常の分布を有する免疫グロブリンG(IgG)の高い需要がある。
【０００４】
IgGの治療的投与の経路は、静脈内、皮下、および筋肉内とすることができ、これに加えて、IgGは、他のあまり慣例的でない経路、例えば、経口、吸入、または局所的な経路などによっても投与することができる。
【０００５】
それにもかかわらず、静脈内投与は、原発性免疫不全の治療のためであっても、多様な一般的な免疫不全症(IgGサブクラスおよびIgAサブクラスの欠損)(Espanol, T.、「Primary immunodeficiencies」、Pharmaceutical Policy and Law、2009; 11(4): 277〜283頁)、続発性または後天性の免疫不全(例えば、サイトメガロウイルスなどのウイルスによる感染症、帯状疱疹、ヒト免疫不全症)、および自己免疫起源の疾患(例えば、血小板減少性紫斑病、川崎症候群)(Koski, C.、「Immunoglobulin use in management of inflammatory neuropathy」、Pharmaceutical Policy and Law、2009; 11(4): 307〜315頁)のためであっても、最も有用な治療指標をもたらす。
【０００６】
理想的には、静脈内用途(IGIV)のためのIgGは、液体中で、高濃度で製剤化されるべきであり、好ましくは、製品の保存および即時の注入を促進するために、最大約30℃まで貯蔵可能であるべきである。
【０００７】
可能性があるIgG不耐性反応を低減するために、免疫グロブリンA(IgA)および免疫グロブリンM(IgM)、ならびに血液型凝集素は、存在しない、または検出不可能な量であるべきであることが記載されている。製品は、とりわけ、プラスミンもしくはプラスミノーゲン、またはプレカリクレインもしくはその活性化因子、キニンもしくはキニノーゲン、または第XI因子/第XIa因子などの凝固因子のいずれの存在を通じても酵素活性を実質的に含まないべきであることも必須である。
【０００８】
一方、多価IgGを得るためのヒト起源の出発血漿では、ウイルスまたは病原体の伝播を通じた感染症のリスクを最小に低減することが必要になる。Fernandesら(ES500121)、およびHirao, Y.ら(EP196761およびEP253313)によって記載されているように、溶液(液体)中のIgGの熱処理、または低温殺菌は、IgGの変性に対する防護剤(例えば、サッカロース、ソルビトール、アミノ酸)の存在下で有効に実施することができる。この目的のために、溶液は、約60℃の温度まで少なくとも10時間程度上昇され、最も危険な病原体を不活性化または弱毒化する。これらの病原体は、とりわけ、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、およびB型肝炎ウイルス(HBV)など、脂質コートを有する場合があり、またはポリオウイルス、A型肝炎ウイルス(HAV)、およびパルボウイルスなど、裸である場合がある(Uemura Y.ら、「Inactivation and elimination of viruses during the fractionation of an intravenous immunoglobulin preparation」、Vox Sang.、1989; 56: 155〜161頁)。
【０００９】
それにもかかわらず、低温殺菌は、安定剤の存在下および最良のプロセス条件下でさえ、出発IgGの純度に応じて、より高い比率またはより低い比率で、非可逆性高分子量タンパク質凝集体、例えば、IgGポリマーおよび/または他の付随するタンパク質のポリマーなどの形成を必然的にもたらす(Hirao, Y.ら、上記;ならびにRistol, P.ら、EP1225180およびES2091161)。
【００１０】
1960〜1970年の10年の間に、IgGポリマーとして知られている非可逆性高分子量凝集体の存在は、IgGの静脈内投与の間の、補体を活性化するための補体の消費(抗補体活性、ACA)と関連づけられ、この現象は、観察された重度の不耐性またはアナフィラキシー反応と関係した(Barandum, S.ら、Vox Sang.、7: 157〜174頁、1962)。このために、保健局は、IGIV中のポリマー、または二量体より高次の分子形態の最大含量を、3%の限度に規制した(Eur.Ph. Monograph 6.3;およびCMP Core SPC for normal immunoglobulin for intravenous administration: CPMP/BPWG/859/95改訂2)。この3%の限度は、最大で製品の有効期限まで維持されなければならないので、この考慮事項は、液体製剤にとって特に重要である。したがって、製品が長期間にわたって劣化しないことを保証し、可能性がある最高貯蔵温度を保証するために、これらのIgGポリマーの実質的に完全な非存在が、低温殺菌後および得られる最終生成物中の両方で達成されなければならない。
【００１１】
現時点において、市場で入手可能であり、アミノ酸とともに製剤化される液体IgGのほとんどは、凝集を回避するために酸性pHで(Uemura, Y.、「Dissociation of aggregated IgG and denaturation of monomeric IgG by acid treatment」、Tohoku J. Exp. Med.、1983; 141: 337〜349頁)、好ましくは4.0〜5.0のpHの間で(Tenold, R.ら、US-4396608)、かつ貯蔵の間の分子凝集を最小限にするために、Gamunex(登録商標)(Grifols SA、スペイン)、Kiovig(登録商標)もしくはGammagard(登録商標)Liquid(ともにBaxter、米国製)の商標名で知られているものなど、これらが0.2Mもしくは0.25Mのグリシンで安定化される場合、2〜8℃の温度で、またはPrivigen(登録商標)(CSL Behring、ドイツ)など、0.25Mのプロリンで安定化される場合、最大25℃で維持しなければならない(Jolles, S.ら、「Clinical uses of intravenous immunoglobulin」、Clin. Exp. Immunol.、2005年10月; 142(1): 1〜11頁; Hooper, J.A.、「Intravenous immunoglobulins: evolution of commercial IVIG preparations」、Immunol Allergy Clin. North Am.、2008; 28(4): 765〜778頁)。
【００１２】
長期間にわたって過剰に酸性のpHに曝露すると、例えば、4.5以下のpHおよび比較的高温、例えば、30℃で、IgGの断片化を促進することが実証されている(Vermeer, A.ら、「Thermal stability of immunoglobulin: Unfolding and aggregation of a multi-domain protein」、Biophys. J.、2000; 78: 394〜404頁; Shukla, A.ら、「Strategies to address aggregation during protein A chromatography」、Bioprocess International、2005年5月)。したがって、例えば、4.8±0.2のpHで、L-プロリンとともに製剤化された10%のIGIV組成物は、分子凝集に関しては十分に安定であるが、曝露時間とともに断片化の傾向が観察されることが、文献で報告されている。したがって、25℃の温度で、断片は、36カ月後に、平均で3.9%の量になる(Cramer, M.ら、「Stability over 36 months of a new liquid 10% polyclonal immunoglobulin product (IgPro10, Privigen (R)) stabilised with L-proline」、Vox Sang.、2009. DOI: 10.1111/j.1423-0410.2008.01143.x)。
【００１３】
ポリオールまたはポリアルコール、例えば、マルトースおよびソルビトールを用いてIgGを製剤化すると凝集が防止され(Katakam, M.ら: Aggregation of proteins and its prevention by carbohydrate excipients: Albumins and globulin. J. Pharm. Pharmacol.、1995; 47: 103〜107頁)、この特性のために、最大25℃(10%のマルトースを含む、商標名Octagam(登録商標))、および最大30℃(5%のソルビトールを含む、商標名Flebogamma(登録商標)DIF)まで安定なIgG溶液が、5.0〜6.0の間のわずかに酸性pH範囲で製剤化された(Hirao, Y.ら、欧州特許第278422号)ことが記載されている。
【００１４】
しかし、重篤な腎不全のいくつかの症例が、サッカロースを含有するIgG調製物の注入と関連づけられているので、IgG製剤中の一部の糖または誘導体の存在が、近年疑問視されている(Szenczi, A.ら: The effect of solvent environment on formation and stability of human polyclonal in solution、Biologicals、2006; 34(1): 5〜14頁)。特定の糖(サッカロース)およびある高濃度のポリオール(10%のマルトース)を含むいくつかの免疫グロブリン組成物によって提示され得る他の不利点は、溶液を注入する際に血液粘度を上昇させる相対的な能力であり、これは、以前に疾患があり、または患者がリスクに曝されている場合、血管内血栓症および急性心筋梗塞のいくつかの非常に重篤な症例と関係づけられる(Radosevich, M.およびBurnouf, T.、「Intravenous immunoglobulin G: Trends in production methods, quality control and quality assurance」、Vox Sang.、2009; 1〜17頁; Katz, U.およびShoenfeld, Y.: Review: intravenous immunoglobulin therapy and thromboembolic complications、Lupus、2005; 14(10): 802〜808頁)。
【００１５】
いくつかの商業的なIGIV製品は、活性な凝血促進性(procoagulating)酵素、顕著な血栓塞栓性作用(TEE)を有する、これらの製品の精製過程からの残遺物を含有することも発見されており、TEEと第XI因子/第XIa因子および/または他の凝血促進性因子(例えば、カリクレインなど)との間の関連が証明されている。血栓塞栓性能力の排除は、トレランスおよび安全性の保証を最大にして、IGIV注入のために履行されなければならない義務である。
【００１６】
いずれの特定の理論にも関連づけられることなく、本発明者らは、現在市販されているIGIVの間の主な差異は、配合(アミノ酸、糖、およびポリオール、ならびにpH)だけでなく、例えば、他の特性の中でも、貯蔵の間の凝集および断片化を防止するのに、液体中の製品の最終保存条件(温度-時間)に影響を与えることになる、IgGを得るためのプロセスにも起因し得ると考える。液体IgG製剤の安定性と、これらの精製過程との間のこの依存性は、他の著者(Cramer, M.ら、上記)によっても観察されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】ES500121
【特許文献２】EP196761
【特許文献３】EP253313
【特許文献４】EP1225180
【特許文献５】ES2091161
【特許文献６】US-4396608
【特許文献７】欧州特許第278422号
【特許文献８】米国特許第4093606号
【特許文献９】米国特許第4165370号
【特許文献１０】スペイン特許第506679号
【特許文献１１】欧州特許第246579号
【特許文献１２】EP-0893450
【特許文献１３】米国特許第514375号
【特許文献１４】スペイン特許第200100101号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Espanol, T、「Primary immunodeficiencies」、Pharmaceutical Policy and Law、2009; 11(4): 277〜283頁
【非特許文献２】Koski, C、「Immunoglobulin use in management of inflammatory neuropathy」、Pharmaceutical Policy and Law、2009; 11(4): 307〜315頁
【非特許文献３】Uemura Y.ら、「Inactivation and elimination of viruses during the fractionation of an intravenous immunoglobulin preparation」、Vox Sang.、1989; 56: 155〜161頁
【非特許文献４】Barandum, S.ら、Vox Sang.、7: 157〜174頁、1962
【非特許文献５】Eur.Ph. Monograph 6.3
【非特許文献６】CMP Core SPC for normal immunoglobulin for intravenous administration: CPMP/BPWG/859/95改訂2
【非特許文献７】Uemura, Y.、「Dissociation of aggregated IgG and denaturation of monomeric IgG by acid treatment」、Tohoku J. Exp. Med.、1983; 141: 337〜349頁
【非特許文献８】Jolles, S.ら、「Clinical uses of intravenous immunoglobulin」、Clin. Exp. Immunol.、2005年10月; 142(1): 1〜11頁
【非特許文献９】Hooper, J.A.、「Intravenous immunoglobulins: evolution of commercial IVIG preparations」、Immunol Allergy Clin. North Am.、2008; 28(4): 765〜778頁
【非特許文献１０】Vermeer, A.ら、「Thermal stability of immunoglobulin: Unfolding and aggregation of a multi-domain protein」、Biophys. J.、2000; 78: 394〜404頁
【非特許文献１１】Shukla, A.ら、「Strategies to address aggregation during protein A chromatography」、Bioprocess International、2005年5月
【非特許文献１２】Cramer, M.ら、「Stability over 36 months of a new liquid 10% polyclonal immunoglobulin product (IgPro10, Privigen (R)) stabilised with L-proline」、Vox Sang.、2009. DOI: 10.1111/j.1423-0410.2008.01143.x
【非特許文献１３】Katakam, M.ら: Aggregation of proteins and its prevention by carbohydrate excipients: Albumins and globulin. J. Pharm. Pharmacol.、1995; 47: 103〜107頁
【非特許文献１４】Szenczi, A.ら: The effect of solvent environment on formation and stability of human polyclonal in solution、Biologicals、2006; 34(1): 5〜14頁
【非特許文献１５】Radosevich, M.およびBurnouf, T.、「Intravenous immunoglobulin G: Trends in production methods, quality control and quality assurance」、Vox Sang.、2009; 1〜17頁
【非特許文献１６】Katz, U.およびShoenfeld, Y.: Review: intravenous immunoglobulin therapy and thromboembolic complications、Lupus、2005; 14(10): 802〜808頁
【非特許文献１７】Cohn, E.J.ら、Separation into Fractions of the Protein and Lipoprotein Components、J. Am. Chem. Soc.、1946; 68: 459〜475頁
【非特許文献１８】Oncley, J.L.ら: The separation of the antibodies, isoagglutinins, prothrombin, plasminogen and beta-1 lipoprotein into subfractions of human plasma、J. Am. Chem. Soc.、1949; 71: 541〜550頁
【非特許文献１９】Kistler, P.およびNitschmann, Hs.、Large Scale Production of Human Plasma Fractions、Vox Sang.、1962; 7: 414〜424頁
【非特許文献２０】Teschner, W.ら: A new liquid, intravenous immunoglobulin product (10% IGIV) highly purified by a state-of-the-art process、Vox sang.、2007; 92(1): 42〜55頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
したがって、本発明は、先に述べた現況技術における問題を克服するIgG調製物を得るための方法を提供する。本発明による方法は、従来法によって精製されたIgGを含有する物質から開始し、これが、安定化剤、タンパク質濃度、伝導率、pH、ならびにタンパク質不純物およびタンパク質分解酵素不純物を低減することを可能にする先の沈殿ステップからの残留試薬濃度の特定の条件下で、低温殺菌としても知られている熱処理によってさらに精製される。不純物および酵素のこの低減は、この処理の間および/または凝集したタンパク質の選択的吸着の後のステップの間に行われるが、いずれにしても、これらの2つのステップのみが、沈殿を使用する分離技法を導入することなく、最終精製として使用される。
【００２０】
先行技術は、例えば、Coval, L.(米国特許第4093606号および同第4165370号)ならびにUemura, Y.ら(スペイン特許第506679号および欧州第246579号)によって記載されたものなどの、凝集体/ポリマー沈殿およびクロマトグラフィー分離の組合せの工業規模での使用を含み、これらの文献には、ポリエチレングリコール(PEG)を使用する沈殿方法、使用される方法によって大いに変動するIgG単量体/二量体(共沈)の高い回収率損失を引き起こす選択性の低い方法が記載されている。例えば、十分に精製されていないIgG溶液中で熱処理が実施される場合、IgGの回収率(単量体/二量体)は、通常、70〜80%の間となる(Uemura, Y.ら上記)。精製されたIgG溶液の場合では、80〜90%のより良好な回収率結果を得ることができるが、このためには、先行技術(Ristol, P.ら、上記)に記載されているように、接線流マイクロ濾過(TFF)などの複雑な分離技法を使用することが必要である。しかし、TFF方法は、沈殿試薬(PEG)、安定剤(ソルビトール)、および注射用水の高い消費量、ならびに装置が必然的に再使用される場合に考慮されなければならない、いくつかの洗浄-衛生化作業を伴う。これは、長い工程所要時間をさらに伴い、取り扱いが困難となり得、消耗品および/またはエネルギーに伴うコストは高く、IgG単量体/二量体の回収率は、常に90%未満である。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本著者らは、先行技術において記載された、高分子量凝集体/ポリマーおよび/またはタンパク質を沈殿させるための試薬の使用を省いた方法を開発し、驚くべきことに、先行技術における方法と比較して高い生産性、より低い生産コスト、および容易な実施を伴って、生成されるポリマーの実質的に完全な排除を達成した。さらに、この方法を使用することによって、好ましくはアミノ酸または多価アルコールの存在下で製剤化された、液体中の最終生成物について安定性が達成された。これは、2〜30℃の間の温度ならびに4.6以上および最大5.8のpHで、少なくとも1年間液体中に保持することができる。
【００２２】
したがって、本発明は、ヒト血漿から部分的に精製されたIgG溶液からIgG組成物を得るための方法であって、
a)部分的に精製されたIgG溶液を透析濾過するステップと;
b)ステップa)で得られた溶液を安定化させるステップと;
c)ステップb)で得られた溶液を熱処理するステップと;
d)陽イオンクロマトグラフィーを通じて、ステップc)で熱処理された溶液から高分子量凝集体および/またはポリマーを選択的に吸着するステップと;
e)ステップd)で得られた溶液を透析濾過および製剤化するステップと
を含む方法に関する。
【００２３】
この方法を使用することによって、高分子量凝集体/ポリマー含量、すなわち、IgGの二量体より高次のもの、および他の不安定なタンパク質の著しい低減が達成され、わずかに酸性の媒質中で製剤化することができ、不安定性の顕著な徴候を伴うことなく周囲温度で、液体中で保持することができ、その好ましくは静脈内、または皮下、または筋肉内用途のために確立された規格に適合するIgG単量体/二量体を本質的に含有する溶液を生じさせる。
【００２４】
好ましくは、本発明による方法は、欧州薬局方において記載された方法に従って、酢酸セルロース、デンプン黒色染料(starch black tinction)中で電気泳動によって求められ、濃度測定で(densitometrically)定量されて、全タンパク質に対して95%超、より好ましくは97%超のIgG含量を有するヒト血漿の精製IgG溶液から開始して実施される。
【００２５】
出発原料として、本特許は、IgGに富む画分(当技術分野で知られている従来法によってアルブミンを得るためにヒト血漿の分画から分離された)の使用、その後の、本発明による方法を開始するためのこれらの適切な精製を考慮に入れる。
【００２６】
これまでに、IgGに富む画分を分離するためのCohn(Cohn, E.J.ら、Separation into Fractions of the Protein and Lipoprotein Components、J. Am. Chem. Soc.、1946; 68: 459〜475頁)による方法6に基づくエタノールを用いた血漿の低温分画が、主に使用し続けられ、工業規模で継続している。多様な純度(通常、他のタンパク質に関して35〜65%の間のIgG)の、IgGおよび血漿のほとんど(90%以上)を含有するこの画分(Fr-II+III)または等価物(Fr-I+II+III)は、濃縮された免疫グロブリン画分(Fr-II、または濃縮されたFr-IIIの上清)が得られるまで、Cohn-Oncley法9(Oncley, J.L.ら: The separation of the antibodies, isoagglutinins, prothrombin, plasminogen and beta-1 lipoprotein into subfractions of human plasma、J. Am. Chem. Soc.、1949; 71: 541〜550頁)として知られているエタノールを用いた沈殿を通じて、より大規模に精製されなければならない。別の実行可能な選択肢は、沈殿物A(もしくは等価物の沈殿物A+I)まで、Kistler-Nistchmann法(Kistler, P.およびNitschmann, Hs.、Large Scale Production of Human Plasma Fractions、Vox Sang.、1962; 7: 414〜424頁)を使用し、次いでこれを精製することによってGG沈殿物、または沈殿物Bの濃縮上清(限外濾過液)を得ることである。
【００２７】
エタノールを用いた両沈殿手順を使用して、IgG溶液が本発明による方法において出発原料として使用することができるように要求される、95%以上のIgG(酢酸セルロース上の電気泳動を通じて)、好ましくは97%以上のIgGの最小純度特性と適合するIgG溶液(Fr-III上清、Fr-I+III、Fr-II、沈殿物GG、または沈殿物Bの上清から)を得ることが可能である。これにより、筋肉内または皮下経路に許容されるIgGが、静脈内経路に耐容可能な調製物に変換される。
【００２８】
いずれにしても、現時点において、例えば、大部分の混入物の沈殿、ならびに/または陰イオン性樹脂および/もしくは無機吸着剤(ポリエチレングリコール、オクタン酸、イオン交換クロマトグラフィー、ベントナイト、真珠岩)上のこれらの吸着によって、他の好適な組合せが、出発原料(例えば、Fr-II+IIIまたは沈殿物A)の純度を増大させるのに使用される。Ristol, P.ら、EP-1225180; Lebing, W.ら、EP-0893450; Teschner, W.ら: A new liquid, intravenous immunoglobulin product (10% IGIV) highly purified by a state-of-the-art process、Vox sang.、2007; 92(1): 42〜55頁の文書は、本特許における精製処理に進む前の、最大95%以上のIgG、好ましくは97%以上のIgGまで中間のIgG画分(例えば、Fr-II+III)の純度を増大させるために、イオン交換クロマトグラフィーと組み合わせたエタノール、PEG、またはオクタン酸を用いた沈殿を通じて精製するための有効な方法に関する。
【００２９】
本発明による方法のステップにおける透析濾過は、標準的なIgG精製法に由来する望ましくない成分の濃度を、本発明による方法に影響し得る濃度値未満に低減する目的で実施される。例えば、1つの望まれない成分はエタノールであり、この透析濾過ステップ(a)を通じて、これは、0.5%(重量/体積)未満、好ましくは0.1%未満の濃度に低減されるはずである。他の非変性沈殿試薬、例えば、PEG、オクタン酸、適合性非イオン性界面活性剤、またはこれらの任意の混合物などが存在する場合、これらの濃度も、2%(重量/体積)未満、いずれにしても、これらが、ステップc)の後に、3%超のポリマーを生じさせなくなるまで低減されなければならない。
【００３０】
さらに、この透析濾過ステップにおいて、好ましくは、両方の場合において、出発IgG溶液は、伝導率が1mS/cm未満であるイオン強度に調整することができ、pHは、4.0〜5.5の間に調整される。透析濾過は、注射用水、あるいは好ましくは、5mM以下の酢酸の溶液、またはアルカリもしくは希酸でpH4.0〜5.0に調整された酢酸ナトリウム溶液などの低イオン強度の緩衝溶液を用いて実施することができる。
【００３１】
透析濾過ステップ(a)は、10kDa〜100kDaの間の分子カットオフを使用して、例えば、ポリエーテルスルホンまたは均等物の限外濾過膜を通過させて、接線流モードで実施されることが好ましい。有益には、本発明による方法において、透析濾過ステップ(a)は、タンパク質を、5%以下(重量/体積)、好ましくは2%〜4%(重量/体積)の間の濃度まで濃縮する役割も果たす。
【００３２】
ステップ(a)の溶液が得られた後、これは、例えば、50%(重量/重量)、好ましくは30重量%〜35重量%の間の最大濃度まで、安定化剤としてソルビトールを添加することによって安定化される。これに加えて、当技術分野で知られている様式で、酸(例えば、塩酸もしくは酢酸)またはアルカリ(例えば、水酸化ナトリウム)を添加することによって、pHが、4.2〜6.0の間、好ましくはpH4.6〜5.2の間に調整される。
【００３３】
本発明による方法のステップ(c)における溶液の熱処理または加熱は、低温殺菌としても知られている特別な手順であり、55℃〜63℃の間の温度で、1〜24時間の間の時間実施される。溶液は、上述した範囲内の任意の温度および任意の時間で熱処理され得るが、熱処理は、60±1℃で10〜11時間実施されることが好ましい。いずれにしても、3%以下、好ましくは1%〜2%の間の高分子量ポリマー/凝集体が生成されるはずである。同様に、当技術分野で記載されているように、異なる基質(S-2302、S-2288、およびS-2238)について発色によって(chromogenically)測定される(実施例3を参照)、凝血促進性因子、例えば、第XI因子/第XIa因子、または他のプロテアーゼの可能性のある存在に起因するタンパク質分解活性は、その初期の含量と比較すると、少なくとも5分の1に低減される。
【００３４】
引き続いて、溶液は、好ましくは18℃〜30℃の間に冷却され、好ましくは少なくとも33%(重量による)の注射用水で、またはより好ましくは、好ましくは20mM以下の濃度で適合性の塩(例えば、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなど)を含有する緩衝溶液で希釈される。希釈されると、溶液は、5重量%以上のソルビトール濃度、および5mg/ml以上のタンパク質濃度を含有する。完全にイオン性適合性の塩、好ましくは、固体としての、または例えば、3M(mol/リットル)の濃縮溶液中の塩化ナトリウムが、0.20M(mol/リットル)〜0.50M(mol/リットル)の間、好ましくは0.25M(mol/リットル)〜0.40M(mol/リットル)の間の塩化ナトリウム溶液が得られるまで、この溶液に添加される。必要であれば、好ましくは、希塩酸もしくは希酢酸および/または水酸化ナトリウムを添加することによって、pHを4.2〜5.5の間、好ましくは4.5〜5.0の間に再調整することができる。
【００３５】
上述した様式でコンディショニングされた、すなわち、希釈され、塩濃度およびpHが調整された後の、最大5%の二量体を含有する溶液は、ポリメタクリレートまたはポリスチレンの剛体粒子を備え、好ましくは20〜100μmの間のポリスチレン、ポリビニルベンゼンの粒子のマトリックスまたは支持体を備える合成不溶性の、実質的に非圧縮性のパーフュージョンマトリックス(perfusion matrix)に、共有結合された陽イオン性スルホン酸基(スルホニル、スルホン酸、またはスルホプロピル:S基、HS基、SP基)のうちの少なくとも1つを有する強陽イオン交換パーフュージョン樹脂を含有するクロマトグラフィーカラム中に注入される。樹脂は、充填に適した直径の円柱状軸流カラム中に充填して、樹脂が好ましくは5〜20cm程度の間の高さを占め、または好ましくは10〜15cmの間の経路を有する放射状流カラム中に充填することができる。両方の場合において、少なくとも1リットル、好ましくは1〜10リットルの間のその樹脂が、精製されなければならない(乾燥)IgG 1kg毎に使用され、これは、ゲル1ml当たり100〜1000mgの間のIgGのローディングと等価である。好ましくは、使用されるカラム中に充填される樹脂の量は、IgG 1kg当たり2〜5リットルの間である(ゲル1ml当たり200〜500mgの間のIgGのローディングと等価)。生成物を注入する前に、カラムは、好ましくは、約5〜50mM(ミリモル)の間、より好ましくは、10mM(ミリモル/リットル)の酢酸ナトリウム、および生成物の塩化ナトリウム濃度とほぼ等しいか、等価である塩化ナトリウム濃度(これが、生成物に添加される選ばれた塩である場合)を含有する緩衝溶液で平衡化される。好適な注入流量は、50カラム体積/時間以下、より好ましくは5〜30カラム体積/時間の間であり、好適な温度は18℃〜30℃である。IgG単量体/二量体は、カラムを自由に通過し、全単量体と適用された二量体の90%超が流出液中に回収され(吸着は、単量体/二量体の10%未満である)、好ましくは、93%以上の回収率が達成され、この流出液は、適切な体積までプール中に回収される。
【００３６】
同時に、凝集体/ポリマーは、熱処理に由来する物質中の初期含量の1/5を超える低減、好ましくは95%以上(1/20以下)の低減と等価である、凝集体/ポリマーの初期含量の85%以上の量まで樹脂によって捕捉され、0.3%以下のポリマー、好ましくは0.1%以下または0.06%以下がカラム流出液プール中に見出される(未吸着)。同様に、カラム中のローディング量を適切に増加させ、例えば、カラムを平衡化するのに使用されたものに等しい、または等価である、少なくとも2カラム体積の溶液で後洗浄(post-washing)を施すことによって、単量体/二量体回収率を、最も好ましくは最大95%以上に上昇させることさえできる。したがって、適切に希釈され、初期のローディングで使用された条件、またはより低いイオン強度の条件に調整された再生画分を同じカラム中に再注入して、95%以上の回収率を達成することができる。既に示したように、勾配を減少させることによって注入しても、IgG単量体/二量体の回収率が促進され、当業者は、このようにして、または同様の方法を使用して95%以上の生成物回収率を容易に達成することができる。これを行うために、ローディングは、適用される最初の体積における強い吸着現象を最小限にするために、pHによって最大塩濃度から開始され、ローディング体積が完全になるまで、イオン強度が減少するにつれて樹脂の能力を徐々に増大させる。例えば、ローディングの開始時に選択された生成物の塩濃度と、ローディングの最後におけるものとの間で、最大15%の漸減勾配を、好ましくは使用することができる。
【００３７】
任意選択により、本発明による方法は、溶液の熱処理を補完する、ウイルス不活化/排除処理のうちの1つまたは複数を含むことができる。本発明による方法において使用することができるウイルス不活化処理の中では、酸性pHでのインキュベーション(例えば、37±2℃でpH3.8〜4.2、ペプシン、またはPluronic、Triton、Tweenなどの非イオン性界面活性剤の存在下または非存在下で4〜24時間の間);リン酸アルキル有機溶媒(0.3%のリン酸トリ-n-ブチルまたはTNBP)を用いた処理;好ましくは、IgG溶液をpH4.2〜6.0に、かつ温度を4〜30℃に調整し、1〜12時間、より好ましくは25±2℃で6時間程度インキュベートすることによる界面活性剤(1%のTriton X-100、またはTriton X-45)(Neurathら、米国特許第514375号);および最後にナノ濾過を伴った、好ましくは50nm以下、約10〜50nmの間、好ましくは15〜35nm程度の間の孔サイズ、好ましくは20±2nmの孔サイズを通じたカセットもしくはサンドイッチ(平面)、カートリッジ(折り畳み式、シート、ディスク)、または中空ファイバーの形態での、接線流または末端流(terminal flow)によるウイルス保持膜ナノ濾過(再生セルロース、ポリエーテルスルホン、フッ化ポリビニリデン)である。これらの不活化/排除ステップは、熱処理の前に使用されるべきであることが好ましいナノ濾過を使用する場合を除いて、熱処理ステップの前または後に実施することができる。
【００３８】
本発明による方法のステップ(d)が完了した後、得られた溶液は、注射用水、または好ましくは、例えば、4.0〜5.5のpHの5mM以下の酢酸、および任意選択により最終的な製剤のための安定剤もしくは賦形剤を含有することができる、低イオン強度の緩衝溶液で透析濾過される。最終的な透析濾過は、好ましくは10kDa〜100kDaの間、より好ましくは30kDa〜50kDaの間の分子カットオフを使用して、ポリエーテルスルホンまたは等価物の限外濾過膜を通じた接線流によって実施される。適切な数の透析濾過体積で、好ましくは2mS/cm以下の伝導率に塩濃度を低減した後、タンパク質は、5%、10%、16%、もしくは20%の名目上の濃度、または約5%〜22%(w/v)の間の任意の他の中間の濃度に濃縮されることが好ましい。溶液は、多価アルコール(ポリオール)またはアミノ酸を添加することによって安定化されることが好ましい。いずれにしても、得られる溶液のオスモル濃度は、240mOsm/kg以上となり、ほぼ等張性となる。好ましくは、pHは、5.2±0.6に調整され、これが4.6〜5.8の間にあることを保証するために確認が行われ、必要であれば、希酸またはアルカリを用いて再調整される。
【００３９】
調整された溶液は、当技術分野で知られている様式で、0.2μmの孔サイズの無水膜(absolute membrane)を通して滅菌濾過される。得られた溶液は、適切な容器中に無菌的に計測して入れられ、好ましくは、計測して入れられた各個々のユニットにおける不安定性または混入の任意の徴候を観察するために、25±5℃で14日以上のインキュベーション(検疫)にかけられる。入れられた生成物は、検疫の場合と同じ条件下(周囲温度の25±5℃)で、または低温チャンバー(5±3℃)内に貯蔵される。本発明による方法によって得られる生成物は、その物理的特性(外観、色、濁度、沈殿物、粒子、もしくは繊維)、または例えば、欧州薬局方によるその規格分析パラメータ(高分子量凝集体、断片、抗補体活性もしくはACA、プレカリクレイン活性化因子もしくはPKA、IgGのサブクラスなど)の劣化を明らかにするいずれの徴候も示すことなく、2〜30℃の間の温度で、少なくとも1年間安定なままである(本質的に不変)。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
実施例を参照して、本発明を以下でより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明の技術的範囲を制限することを意図していない。
【００４１】
(実施例)
(実施例1)
分画に適した凍結ヒト血漿の混合物から開始して、これを、0〜4℃の間の温度で寒冷沈降させた。この寒冷沈降物を、同じ寒冷沈降反応温度で、連続フロー遠心(Westfalia遠心分離機)によって分離した。Fr-II+IIIが得られるまで、冷エタノールを使用して、Cohn分画法6(Cohnら、上記)によって上清を処理した。得られた、または沈降したペースト(Fr-II+III)をプレス濾過によって分離し、20℃以下で凍結させた。引き続いて、Fr-IIが得られるまで、Cohn-Oncley分画法9(Oncley, J.ら、上記)によって、Fr-II+IIIを処理した。得られたFr-IIを20℃以下で貯蔵した。
【００４２】
Fr-IIをグリシンおよび塩化ナトリウムの等張液中に懸濁し、ほぼ中性のpHに調整した。この溶液を無機吸着剤で処理し、遠心(RINA遠心分離機)によって分離し、次いで0.5μm以下の孔深さのフィルターで清澄化した。
【００４３】
濾液を、0.5MのHClを使用して5.5〜6.0の間のpHに調整し、10kDaの名目上の分子カットオフを有するポリスルホン膜を通して限外濾過した。体積を最初に低減し、次いで2〜8℃で、注射用水を用いて一定体積で透析濾過を開始した。これが完了した後、限外濾過装置を後洗浄し、溶液を、60±5AUのタンパク質の光学密度(280nmにおける)に調整した。存在する溶液1kgそれぞれについて0.5kgの量で固体ソルビトールを添加し、溶解させた後、溶液のpHを、0.5MのHClを使用して5.5±0.5に調整した。
【００４４】
次いで溶液の熱処理を、生成物が60〜61℃の間に上昇し、そこで10〜11時間保持されるように、ジャケットを通じて加熱流体を再循環させて、恒温容器内で実施した。次いで、溶液を2〜8℃に冷却した。
【００４５】
3つの別個のロットの平均について得られた結果をTable 1(表1)に示す。
【００４６】
【表１】
0006048936.tif 000002
【００４７】
上記結果は、熱処理の間の凝集に対する、Fr-II+IIIの事前精製(電気泳動による97%以上のFrII懸濁液)、および変性剤(エタノール)の低減の効果を示し、ポリマーはわずか1.58%であり、合成陽イオン性樹脂によるその後の吸着を可能にしている。
【００４８】
(実施例2)
ヒト血漿のプールから開始し、方法は、Fr-II+IIIを得(試験a)、Fr-II(試験b)に継続するまで、実施例1について説明したのと同じであった。熱処理の間の重合に対する精製、ならびに変性剤の存在の効果を確立するための手順は、以下の通りであった。
a)Fr-II+IIIを、1:3.5の重量比率で、2〜8℃で注射用水中に懸濁させ、均質な懸濁液を得た後、0.5MのHClを用いて、pHを5.25±0.25まで上昇させた。引き続いて、これをデカンター内で遠心分離し(200g〜1000gの間の遠心力)、清澄懸濁液を得た。
b)深いフィルターによって清澄化された溶液が得られるまで、Fr-IIを実施例1と同様に処理した。
【００４９】
出発上清1kg当たり0.5kgの量で固体ソルビトールを添加することによって、上記溶液のそれぞれを安定化させた。ソルビトールが溶解した後、必要であれば、pHを5.5±0.5に調整した。各溶液を60〜61℃に10〜11時間加熱した。次いでこれを2〜8℃に冷却した。
【００５０】
試験a)およびb)における低温殺菌した生成物から得られた結果を、実施例1と比較してTable 2(表2)に示す。
【００５１】
【表２】
0006048936.tif 000003
【００５２】
試験a)および試験b)の結果は、出発IgGの純度の効果、および97%以上の値を得るための必要性を実証する。一方、試験b)を実施例1の方法と比較すると、エタノール分画に由来する残留エタノールの作用、およびこれを排除する必要性が明白である。したがって、実施例1の条件のみが、本発明による方法に許容されることが推定される。
【００５３】
(実施例3)
血漿を、Fr-II+IIIまで、実施例1と同様に分画し、十分に純粋な生成物が得られるまで、PEGまたは陰イオン交換樹脂でこの物質を精製した。
【００５４】
欧州特許第1225180号の説明に記載されたのと同じプロセス条件を、Fr-II+IIIのこの初期精製に適用した。より詳細には、本実施例では、すべてのIgGが有効に溶解されるまで、ソルビトール、リン酸二ナトリウム、および酢酸を含有する水溶液中にFr-II+IIIを懸濁した。主な付随するタンパク質を、最大4%のPEGを添加することによって沈殿させた。この無機吸着剤および濾過の後、コアジュバントを添加した。プレス濾過(セルロースプレスフィルター)によって沈殿物を分離する前に、pHを5.0±0.5に再調整した。ペーストを分離し、濾液プールを収集した。カラムに入れる直前にpHを調整し、最大0.5μm以下の清澄化勾配濾過(clarifying gradient filtration)を行った後、DEAE-Sepharose(登録商標)(Amersham Biosciences、スウェーデン)型陰イオン交換樹脂を含有するクロマトグラフィーカラム内に注入を行った。精製IgGを含有する生成物をローディングする間に得られたすべての流出液を収集した。
【００５５】
上記流出液を、0.5MのHClを用いてpH4.4±0.2に調整し、100kDaの名目上の分子カットオフを有するポリスルホン膜に通して限外濾過した。最初に、2%のタンパク質の濃度を得るように4分の1程度に体積を低減し、次いで、0.5MのNaOHを用いてpH4.2±0.2に調整した、4mMの酢酸(ミリモル/リットル)および5%のソルビトールを含む4体積の注射用水を用いて一定体積で、透析濾過を2〜8℃で開始した。これが完了した後、限外濾過装置を後洗浄し、55±5AUのタンパク質の光学密度(280nmにおける)の溶液を得た。引き続いて、0.5MのHClを4.0±0.1のpHまで添加し、その後、37±1℃で4時間インキュベートした。
【００５６】
次いで存在する溶液1kg毎に0.43kgの量(33%  重量/重量)で固体ソルビトールを添加し、これが溶解した後、溶液のpHを、0.5MのNaOHを用いて4.9±0.1に調整した。
【００５７】
熱処理を、生成物が60〜61℃に上昇し、そこで10〜11時間保持されるように、ジャケットを通じて加熱流体を再循環させて、サーモスタット付き容器内で実施した。次いで溶液を2〜8℃に冷却した。この方法をモニターするための分析用組成物の結果をTable 3(表3)に示す。
【００５８】
【表３】
0006048936.tif 000004
【００５９】
Table 3(表3)中の結果は、0.8%の残留PEG含量は、熱処理の間の重合の程度(1.5%のポリマー)に影響しないことを示す。同様に、この重合は、エタノールを単独で使用しても、エタノール+PEG+陰イオンクロマトグラフィーを使用しても、以前に使用された精製方法によって影響されず(実施例1および実施例2を参照)、ただし、達成される純度は、同じ程度(97%以上のIgG)である。
【００６０】
同様に、様々な発色性基質に対する分析的決定を、この実施例3で先に記載したのと同様に処理した分取スケールの他のロットで実施することによって、タンパク質分解酵素、主に凝血原を不活化する能力を有するステップを評価した。基質S-2302、S-2288、およびS-2238(プロトロンビン複合体についての凝固因子、トロンビン、プラスミノーゲン/プラスミン、FXI/FXIa、FXII、PKAなどに特異的)を、現況技術によって記載された技法に基づいて使用し、適用したタンパク質濃度(g/ml)に関して、1分(min)当たりの光学密度(O.D.)吸収単位で、発色反応のカイネティクスの勾配を計算した。低温殺菌前後のステップにおける比(O.D./min)/(g/ml)をTable 4(表4)に示す。
【００６１】
【表４】
0006048936.tif 000005
【００６２】
低温殺菌方法の特定の条件下で、タンパク質分解活性(主に凝血促進性因子)は、使用した3つの異なる発色性基質で得られた値によれば、初期含量(限外濾過された溶液)と比較して、1/5より少なく低減することができることが、Table 4(表4)中の結果から分かる。
【００６３】
(実施例4)
それぞれについて低温殺菌された溶液が得られるまで、実施例3と同様に処理した3つの異なる生産ロットが利用可能であった。生成物を0.4M(mol/リットル)の最終濃度にするのに必要とされる量のNaClを添加して、10AU程度の光学密度(280nmにおける)、および8重量%程度のソルビトール濃度を達成するように、20〜25℃程度で、10mM(ミリモル/リットル)の酢酸ナトリウム溶液を用いて、各溶液を4倍程度に希釈した。希HCl(0.1M〜0.5M)を添加することによって、この溶液をpH4.5に調整した。
【００６４】
8ml程度の体積のポリスチレン強陽イオンクロマトグラフィーカラム(POROS HS(登録商標)50μm、Applied Biosystems、米国)(高さ10cm×0.8cm2の断面)中に溶液を注入した。ロードされる生成物のものと等しいpHおよびNaCl濃度の、酢酸ナトリウム溶液の10mMの緩衝溶液10カラム体積程度を用いて、カラムを平衡化した。生成物は、20カラム体積/時間程度の流量で注入し、注入開始からの、カラムからのすべての流出液を収集した。ゲル1ml当たり155mg程度のIgGのローディングに対応する、16カラム体積の固定体積の流出液試料を得、タンパク質をO.D.(280nm)によって求め、ポリマー含量をHPLCによって求めることによって、達成されたIgG(単量体/二量体)の%回収率、およびポリマーの%低減を計算した。Table 5(表5)は、得られた結果を示す。
【００６５】
【表５】
0006048936.tif 000006
【００６６】
以前の結果と一貫して、94%〜95%の間の、非常に著しく、一貫したポリマー含量の低減が得られ、1.8%〜2.5%の間の初期ポリマー含量に対して、0.09〜0.15の間の最終含量が得られた。一方、96%のIgG回収率(単量体/二量体)が、ゲル1ml当たりIgG 100mgを超えるローディング能力、および2時間未満の工程所要時間(平衡化およびローディング)とともに、注目されるべきである。
【００６７】
(実施例5)
使用した方法は、実施例4と同じであったが、実施例4で確立した条件下で、異なる注入体積でのローディング能力を調査した。異なる適用体積について、流出液の試料を採取し、O.D.(280nm)によってタンパク質を求め、HPLCによってポリマー含量を求め、異なるローディング値(mg IgG/mlゲル)について達成されたIgG(単量体/二量体)の%回収率およびポリマーの%低減を計算した。結果をTable 6(表6)に示す。
【００６８】
【表６】
0006048936.tif 000007
【００６９】
結果は、ゲル1ml当たりIgG 360mgのローディング値を、1時間当たり最大20カラム体積の通常の流量条件下で、最大のIgG回収率を伴って達成することができ、持続した様式で、最大50適用カラム体積まで、ポリマーを0.3%の限度未満に低減する能力を維持することを非常に有意に実証する。利用したローディングのための工程所要時間は、3時間を超えなかった。
【００７０】
(実施例6)
4.5の設定されたpHにおけるNaCl濃度の作動範囲を知り、IgG回収率を最大化することによってポリマー排除を最適化するための手順は、実施例4の通りであったが、0.35〜0.425Mの間の様々なNaCl濃度を試験し、2CV、25CV、および50CVでカラム流出液をサンプリングして、O.D.(280nm)によってタンパク質を求め、HPLCによってポリマーを求めることによって、タンパク質の%回収率およびポリマー低減を計算した。得られた結果をTable 7(表7)に示す。
【００７１】
【表７】
0006048936.tif 000008
【００７２】
Table 8(表8)は、最終的な最大適用ローディング値(50CV)についての流出液中のIgG回収率およびポリマー低減の結果を示す。
【００７３】
【表８】
0006048936.tif 000009
【００７４】
上記結果は、最良のNaCl濃度条件下で、ポリマーの低減は、最大50CV(またはゲル1ml当たりIgG 360mg)まで適用ローディング量を増加させることによって低下しないことを実証する。同様に、0.40M〜0.35Mの範囲のNaClを使用することによって、最小ポリマー含量(0.06%以下〜0.31%の)、および90.8%〜94.2%の間のIgG回収率(単量体/二量体)を伴って最大ローディング能力を得ることができることが立証された。
【００７５】
4.5のpH、0.375MのNaCl濃度で、O.D.(280nm)による10AUの濃度、および20CV/hの注入流量で、最良の結果が得られる。残留ポリマーは、50CV(ゲル1ml当たりIgG 360mg)で0.06%以下(二つ組の試験)であり、IgG回収率は93.2%〜94.2%であることが示された。工程所要時間は、3時間を超えなかった。
【００７６】
(実施例7)
0.35Mの安定なNaCl濃度を使用することができるpH範囲を知り、IgG回収率を最大化することによってポリマーの排除を最適化するために、実施例4と同様の手順を使用し、4.5〜5.0の間のpH範囲を試験し、カラム流出液の試料を、2CV、21〜25CV、および50CVの最後に得ることによって、O.D.(280nm)によってタンパク質を求め、HPLCによってポリマーを求め、%タンパク質回収率およびポリマー低減を計算した。結果をTable 9(表9)に示す。
【００７７】
【表９】
0006048936.tif 000010
【００７８】
Table 10(表10)は、最終的な最大適用ローディング値(50CV)における流出液中のIgG回収率およびポリマー低減の計算、ならびに最大ローディングの半分(約25CV)における流出液中のポリマー低減の結果を示す。
【００７９】
【表１０】
0006048936.tif 000011
【００８０】
上記結果は、最小のIgG損失を伴った有効なポリマー低減について、pHとNaClの間の強い依存性を実証する。0.35MのNaClの濃度で、試験した範囲内で最も適切なpHは、約4.76〜4.50の間であることが判明し、その結果、残留ポリマーは、0.06%以下〜0.24%の間(21〜50CVを適用)であり、IgG回収率は、90.8%〜94.3%の間であった。工程所要時間は、2〜4時間の間であった。
【００８１】
(実施例8)
手順は、実施例6と同じであったが、4.85〜4.88の間のpHを設定することによって、0.1M〜0.4Mの間の最良のNaCl濃度条件を調査した。結果をTable 11(表11)に示す。
【００８２】
【表１１】
0006048936.tif 000012
【００８３】
Table 12(表12)は、最終的な最大適用ローディング値(50CV)における流出液中のIgG回収率およびポリマー低減の計算結果を示す。
【００８４】
【表１２】
0006048936.tif 000013
【００８５】
上記結果は、この方法が、最大ローディング能力(50CV、またはゲル1ml当たりIgG 360mg)に対して、0.325M〜0.275MのNaClの範囲内で、pH4.85〜4.88で実行可能であり、最小残留ポリマー含量(0.06%以下〜0.17%)、および92.5%〜94.9%の間のIgG回収率(単量体/二量体)を伴うことを示す。最良の結果は、0.3MのNaCl濃度で得られ、93.7%の回収率、および流出液中に0.13%の最大残留ポリマーが達成された。0.1Mのより低いNaCl濃度で、ポリマーは完全に低減されたが、IgG回収率は90%未満であった。
【００８６】
この実施例8の結果を実施例6の結果と比較すると、pHとNaClの間の強い依存性が明白であり、これらのパラメータは、最適なポリマー低減値およびIgG回収率値を達成するために、適切な範囲内に調整されなければならない。上記実施例は、0.3%以下の残留ポリマー、85%以上の低減、および90%以上のIgG回収率(単量体/二量体)に関して、所望の結果は、0.275M〜0.4MのNaCl濃度で、pH4.5〜pH4.9の間で得られることを実証する。
【００８７】
(実施例9)
この試験の目的は、後続の溶出のためのすべてのIgGの吸着を暗示する、通常のクロマトグラフィー法を使用する場合のPOROS HS(登録商標)樹脂(Applied Biosystems、米国)のローディング能力を評価し、その後、本発明の以前の実施形態で得られた結果と比較することであった。通常のクロマトグラフィー法は、様々な注入流量で、樹脂が飽和するまでの全IgG吸着のための条件下で実施した。
【００８８】
低温殺菌された溶液を得るまで実施例3と同様に処理した生産ロットから開始して、20〜25℃程度で、10mM(ミリモル/リットル)の酢酸ナトリウム溶液で4倍程度に溶液を希釈することによって、約8%(w/w)のソルビトールとともに10AU程度の光学密度(280nmにおける)をもたらした。希HCl(0.1M〜0.5M)を添加することによって、溶液をpH4.5に調整した。
【００８９】
4ml程度の体積(高さ4cmおよび断面1cm2)のポリスチレン合成樹脂強陽イオンクロマトグラフィーカラム(POROS HS(登録商標)、50μm、Applied Biosystems、米国)中に注入を行った。10カラム体積程度の、4.5のpHの10mMの酢酸ナトリウム緩衝溶液でカラムを平衡化した。5〜20カラム体積/時間の間の様々なローディング流量で生成物を注入した。カラム流出液の試料を、初期注入から様々なカラム体積まで採取し、O.D.(280nm)によってタンパク質を求めることによって、注入される溶液中、5%のおおよそのタンパク質値における動的流量条件下での最大ローディング能力を計算した。得られた結果をTable 13(表13)に示す。
【００９０】
【表１３】
0006048936.tif 000014
【００９１】
結果から、通常のクロマトグラフィー法において最良の流動力学条件下でのIgGの全吸着に使用された樹脂の最大能力は、樹脂1ml当たりIgG約60mgで見出され、5〜20CV/hの試験した注入流量にわたって実質的に変化しないままであることが推定される。この結果が、本発明によるプロセス条件を適用した実施例6および実施例8で得られた、ゲル1ml当たりIgG 360mg超より非常に遠く離れている(1/6程度低い)ことを考慮すると、本発明による方法の生産性は、先行技術に記載された通常のクロマトグラフィーの生産性よりはるかに優れていることが実証されている。
【００９２】
(実施例10)
本実施例では、IgGの全吸着(通常のクロマトグラフィー)を用いた、完全なクロマトグラフィーサイクル条件(ローディング、洗浄、および溶出)下でのクロマトグラフィーの分解能(ポリマー分離)およびIgGの回収率を決定し、本発明による方法の先の実施例で得られた結果と比較するための試験を設計した。
【００９３】
手順は、実施例9と同じであったが、5CV/h程度の流量で、その最大能力の80%(ゲル1ml当たりIgG 50mg程度)と等価なIgG溶液の出発量をカラム中に注入した。すべての生成物をロードした後、pH4.5の10mMの酢酸ナトリウムを含む初期の平衡化された溶液に等しい、8CV程度の緩衝溶液を用いて、後洗浄を実施した。引き続いて、合計25CV程度で、pH4.5の0.5Mのグリシンを含有する0〜1M(mol/リットル)のNaCl濃度勾配を適用して、IgGを溶出した。溶出したIgGを分画して収集し、引き続いてタンパク質分析(O.D.280nm)、および分子分布の分析(HPLC)を行った。結果をTable 14(表14)に示す。
【００９４】
【表１４】
0006048936.tif 000015
【００９５】
上記結果によれば、ゲル1ml当たりIgG 50mgのローディングについて、64%のIgG(単量体/二量体)の最大回収率が0.06%以下のポリマー含量に対して得られ、IgGの大部分は、末端画分および第2の溶出ピーク中に見出された回収不能ポリマーと混合されることが実証された。この回収率値は、ポリマーの十分な排除、および90%超のIgGの回収率が実証されている、本発明による方法が適用される先の実施例で得られたものと同等ではない。
【００９６】
(実施例11)
使用することができるpHの限度およびイオン強度(NaCl)を試験し、ローディングにおけるIgG濃度の効果を知るために、追加の試験を設計した。
【００９７】
実施例3と同様に処理された様々な生産ロットに由来する低温殺菌されたIgGを用いて、様々な試験を実施した。それにもかかわらず、10mMの酢酸ナトリウム溶液を使用して、おおよそで、試験のうちの1つにおいて4倍希釈(O.D.280nm=10AUまで)を使用し、残りに1.5〜2倍希釈(O.D.280nm=20〜23AUまで)を使用し、これらのそれぞれに、0.275M〜0.45Mの間の所望の最終濃度を達成するのに必要とされるNaClを添加し、それぞれ、4.2〜5.5の間の最終pHに調整した。これらのpH調整は、希酢酸を使用して行った。調整した溶液を、実施例4に記載した独立したサイクルにおいて、POROS(登録商標)HS50カラム(Applied Biosystems、米国)中に注入したが、この場合、実施した試験において、ゲル1ml当たり約150〜750mgの間のIgGを使用した。
【００９８】
ポリマーおよび二量体含量(%)をHPLCによって求め、IgG回収率(%)を様々なローディング値について求めた。得られた値をTable 15(表15)に示す。
【００９９】
【表１５】
0006048936.tif 000016
【０１００】
3%未満と等価な、および3%未満の初期ポリマー含量を有する様々な低温殺菌されたロットに基づいて、本実施例で探索された限度内の任意の調整値(pH4.2〜5.5およびNaCl 0.20〜0.45M)について、93%〜98%以上の間の低減と等価である、最大0.06%以下〜0.12%の間の値まで選択的にポリマーを吸着することが可能であり、80%を超えるIgG回収率(pH4.2〜5.0の間で達成される91.0〜99.5%)が可能であることが実証された。同様に、カラムのローディング能力および効率は、生成物溶液中のタンパク質濃度が14.7〜16.5mgのIgG/mlと等価な23AUの280nmのO.D.値に増大する際に減少せず、ゲル1ml当たりIgG 580〜590mgのローディングが達成されることが注目されるべきである。しかし、pH範囲の上限(pH5.5)において、塩溶液は、ポリマーの著しい低減を達成するために、かなり低減されなければならない(0.45Mから0.2Mに)。同様に、より低いpH値においてよりも、より小さいローディング能力が観察され、その理由は、ゲル1ml当たりIgG 403mgが使用される場合、より多いポリマー含量が測定され、このポリマー含量の低減は、わずか86%であるためである。この作用は、pH4.2と比較すると、その比率がpHとともに増大する、pH5.5で存在するより多量の二量体分子の存在に起因し得る。
【０１０１】
(実施例12)
前の実施例6、8、および11から、POROS(登録商標)-HS50ポリスチレンパーフュージョン樹脂についての経験式(1)を求めた。この式から、使用されるpHの関数として、最終的なポリマーおよび回収率について期待される結果を得るのに必要なNaCl濃度をより高い精度で確立することが可能である。式:(1)[NaCl]=0.24+(5.2-pH)/5=1.28=0.2×pHは、試験した樹脂について確立されたpH範囲内(pH4.2〜5.5)で期待される、およその値をもたらす。実施例のデータに基づいて、好ましくは0.1%以下の最終的なポリマー、および90%以上の回収率について、様々なpH(観測値および式によって計算された値)において要求されるNaCl濃度をTable 16(表16)に示す。
【０１０２】
【表１６】
0006048936.tif 000017
【０１０３】
Table 16(表16)の結果は、末端のpH値を含めて、観測値と、この式によって計算された値との間の良好な線形相関を示す。
【０１０４】
(実施例13)
実施例1と同様に血漿を処理することによって、エタノール分画(Cohn-Oncley法による)により、精製された多価IgG溶液(97%以上の純度のIgG)を得た。得られたFr-IIを10kDaの膜に通して透析濾過して60AUにし、引き続いて、33%のd-ソルビトール(重量/重量)の存在下、および5.5±0.5のpHで低温殺菌した(60〜61℃で10〜11時間)。低温殺菌された溶液を、280nmのO.D.が42.8AUから10.7AUに変化するように、pH4.85の10mMの酢酸ナトリウム溶液で約4倍に希釈し、溶液1リットル当たり0.275モルの最終濃度が得られるまでNaClを添加し、0.1MのHClを使用してpHを4.85に調整した。HPLCによって求めたポリマーの比率は0.88%であった。その直後、ポリスチレン陽イオン交換樹脂(50μm POROS-HS(登録商標))、および8.0mlの体積(断面0.8cm2×10cmの高さ)を有するカラム中に、約20CV/時間程度の流量でこれを注入した。カラム流出液の試料を、様々な適用ローディング体積(CV)で得、最終的なプールについて、HPLCによる分子分布(高分子量ポリマー)および得られた低減を決定した。見出された値をTable 17(表17)に示す。
【０１０５】
【表１７】
0006048936.tif 000018
【０１０６】
得られた結果は、最良の吸着プロセス条件で、高注入ローディング(injection loading)(樹脂1ml当たりIgG 385mg)を用いて、エタノール分画によって先に精製されたIgGの低温殺菌で形成されたすべてのポリマーを保持することが可能である(最大0.06%以下)こと示す。
【０１０７】
(実施例14)
この試験は、1つのステップ中に異なる精製ステップが組み込まれる場合の、この方法の実行可能性を決定するために設計した。ポリマー吸着を、溶媒-界面活性剤を用いた処理、および後続のこれらの試薬の吸着という事前の任意選択のステップと組み合わせることができるか否かを決定することに決めた。
【０１０８】
これを行うために、Fr-II+IIIが出発原料であり、実施例3と同様に処理することによって、バルクの低温殺菌された溶液を得た。この溶液を希釈して28±1AUの280nmのO.D.(約2%のタンパク質)にし、リン酸トリ-n-ブチルおよびTriton X-100を含む溶媒-界面活性剤溶液の濃縮溶液(×10倍)を添加することによって、それぞれ、0.3±0.1%および1.0±0.3%の最終濃度を達成した。この溶液を25±2℃に上昇させ、30分程度ホモジナイズした。次いで、これを別の適当な容器に移して、25±2℃で6時間程度インキュベートした。処理後、この溶液を、100mMの酢酸ナトリウムおよび2.75MのNaCl溶液で10%程度に希釈し、その結果、最終濃度は、添加された最終濃度の1/10部であり、タンパク質濃度は、16.5mg/mlであった。必要であれば、0.1MのHClで溶液のpHを4.85±0.05に調整し、167mlの体積を得た。
【０１０９】
この前に、疎水性樹脂(C8炭化水素)、およびシラノール基を有するマトリックスの体積17.5mlおよび高さ10cmのカラム(PallによるSDR-HyperD(登録商標)、米国)、ならびに体積8.0mlの別のPOROS-HS(登録商標)陽イオン性樹脂カラム(50μm、Applied Biosystems、米国)をコンディショニングした。第1のカラム(SDR-HyperD(登録商標))が第2のカラム(POROS-HS(登録商標))に供給するように、2本のカラムを連続して接続し、4.85±0.05のpHの、10mMの酢酸ナトリウム、0.275MのNaClを含む平衡化溶液を、第1および第2のカラムについてそれぞれ6CV/hおよび13CV/hと等価な流量で流し通すことによってこれらをコンディショニングした。
【０１１０】
先に調製したIgG溶液(167ml)を第1のSDR-HyperD(登録商標)カラム中に注入し、このカラムからの流出液を第2のPOROS-HS(登録商標)カラムに供給した。各カラムについて計算されたローディング値は、1)SDR-HyperD(登録商標)カラムについて167ml/17.5ml=9.5CV、2)POROS-HS(登録商標)カラムについて167ml/8.0ml=21CVであった。この方法全体にわたる注入流量は、第1および第2のカラムについて、それぞれ6CV/hおよび13CV/hであった。ローディングの最後に、後洗浄を2CV程度の平衡化された溶液で実施し、カラムからのすべての流出液をプール中に収集した。
【０１１１】
各ステップについての分子分布(HPLC)およびタンパク質(280nmのO.D.による)の結果をTable 18(表18)に要約する。
【０１１２】
【表１８】
0006048936.tif 000019
【０１１３】
上記結果は、ポリマー吸着法を完全に組込み、本方法の他のステップと同時に実施することができ、その結果として、事前のコンディショニングおよび後続の洗浄における試薬消費と一緒に、全体的な時間が低減されることを示す。
【０１１４】
(実施例15)
IgG単量体/二量体に対して最良の可能な分離を達成するために、様々な市販の陽イオン性樹脂のポリマー保持能力を試験した。これを行うために、様々な起源の樹脂マトリックス、特に、アガロース(Sepharose(登録商標))に対するアクリル樹脂(Toyopearl(登録商標))を比較した。それぞれ、樹脂GigaCap Toyopearl-S650(登録商標)およびSP-Sepharose XL(登録商標)を用いて、100mmの充填高さを有する1.75cm2の断面のカラム(GE-Healthcare製のXK16(登録商標))中に樹脂を充填した。
【０１１５】
出発原料は、実施例3と同様に処理した様々なロットの低温殺菌されたIgG溶液の混合物であり、これにNaClを、最大0.275Mおよび0.20Mまで添加し、必要であれば、0.1MのHClでpHを4.85±0.05に調整した。溶液は、22AU程度のタンパク質濃度を有し、試験下のIgG溶液と同じNaCl濃度およびpH濃度で調製およびコンディショニングされたカラム中に、15CV/h程度の流量で、最大50CVを注入した。
【０１１６】
初期のポリマー回収率結果と比較した、使用した様々なカラム体積について得られたポリマー回収率をTable 19(表19)に示す。
【０１１７】
【表１９】
0006048936.tif 000020
【０１１８】
全タンパク質回収率は、SP-Sepharose XL樹脂について98%〜100%で様々であり、GigaCap-S650Mについて90〜100%で様々であった(10CVおよび0.2MのNaClで98%程度)。
【０１１９】
上記結果は、POROS-HS(登録商標)(陽イオン性ポリスチレン)のような、アクリル樹脂陽イオン性樹脂(GigaCap-S(登録商標)650Mタイプの)は、IgGの低温殺菌によって形成されたポリマーを選択的に保持することができ、ゲル1ml当たり158mgのタンパク質ローディングおよび98%の全タンパク質回収率について、存在するポリマーを85%に低減する能力(15%の回収率)を伴うことを示す。明らかに、得られた結果は、pHに関して最適化し(pHを下げる)、ローディング能力を改善することによって、例えば、25CV程度(ゲル1ml当たりタンパク質396mg)を達成することができる。
【０１２０】
アガロースタイプ(Sepharose XL)の非合成マトリックスに由来する樹脂は、ローディング流出液中のポリマーを選択的に吸着するための明確な条件下で、IgGの単量体/二量体からポリマーを分離するのに十分な分解能を有さないことが判明した。
【０１２１】
同様に、最も適切なpHおよびNaCl濃度条件は、使用される合成パーフュージョン樹脂のタイプに特定のものであることも分かる。したがって、GigaCap-S(登録商標)650Mタイプのアクリル樹脂について、pH4.85で、0.2M以下のNaClが必要とされ、一方、0.3MのNaClがPOROS-HS(登録商標)50μm樹脂について必要とされるはずである。
【０１２２】
当業者は、各タイプの合成パーフュージョン樹脂について、pHとNaCl濃度の間の最も適切な関係を見出すことができることが明らかである。
【０１２３】
(実施例16)
次いで、10%のタンパク質を含むIGIVとして配合および濃縮される最終生成物までのステップにおける本方法の拡張性を、生成物の組成特性を検討して確認した。
【０１２４】
1000リットル超の血漿プールを、エタノールを用いて分画してFr-II+IIIを得、実施例3に記載したように、低温殺菌されたバルク溶液が得られるまで精製を継続した。
【０１２５】
注射用水で希釈して27.98AU(280nm)の光学密度および0.26mS/cmの伝導率にし、そのpHが4.65であることを確認した後、上記低温殺菌された溶液6.34kg(出発血漿26.2リットル程度と等価)を採取した。3%のリン酸トリ-n-ブチルおよび10%のTriton X-100の濃縮溶液(×10倍)0.70kg程度を、活発に撹拌しながら5〜10分程度にわたって添加した。0.1MのNaOHを添加することによってpHを4.79に調整した。溶液7.04kgを得、周囲温度(18〜25℃)で最大6時間インキュベートした。リン酸トリ-n-ブチル含量を、ガスクロマトグラフィーによって、0.28%(2800ppm)であると決定した。
【０１２６】
引き続いて、pH4.85の10mMの酢酸ナトリウムを含有する1.5MのNaCl溶液を添加することによって、0.275Mの最終的なNaCl濃度に到達した。得られたpHは、4.81であった。引き続いて、溶液6930.9gを得、SDR-HyperD(登録商標)樹脂(Pall製)770mlを含有し、樹脂の高さが50mmである直径140mmのカラム中に注入した。注入は、周囲温度および6.1CV/時間の等価流量で実施し、すべての溶液が2時間未満でロードされた。得られた全ローディング比は、9CV(6.93kg/0.770L=9.0CV)であった。引き続いて、0.275MのNaClおよび10mMの酢酸ナトリウムのpH4.85の溶液3CVを使用して後洗浄を実施した。生成物溶液を注入する間に回収されたカラム流出液6.93kgが得られ、pHは4.82であり、伝導率は16.75mS/cmであった。リン酸トリ-n-ブチル含量は、ガスクロマトグラフィーによって分析的に決定して5ppm以下であった。
【０１２７】
上記流出液5.772kgを採取し、カラム直径が50mmであり、ベッド高が113mmである、POROS HS(登録商標)樹脂(50μm)の222mlのカラム中に注入した。溶液は、周囲温度で、約10CV/時間程度の流量でカラム中に注入し、その結果、このプロセスは2.5時間程度続いた。生成物をロードする間に得られるすべてのカラム流出液を収集し、pH4.85の、0.275MのNaCl、10mMの酢酸ナトリウム、および17%のソルビトール(重量/重量)を含む1CVの後洗浄液と合わせた。生成物溶液を注入する間に回収された、カラムからの流出液プール5.776kgが得られ、光学密度は18.508AU(280nm)であり、pHは4.84であり、伝導率は16.95mS/cmであった。
【０１２８】
上記流出液プールを、0.1μmに通す濾過によって清澄化し、次いで、35nm(Planova(登録商標)35N)+20nm(Planova(登録商標)20N)の孔勾配を用いて連続してナノ濾過した。生成物のナノ濾過が完了したとき、回収された体積の5%と等価な体積の、POROS HS(登録商標)カラムで使用した同じ後洗浄液を用いてこれを後洗浄し、全工程所要時間は、18時間程度であった。得られたナノ濾液の量は、6.797kgであり、pHは4.83であり、濁度は2.71NTUであり、伝導率は17.1nS/cmであった。
【０１２９】
ナノ濾過された溶液を、名目上の分子カットオフ100kDaを有するポリエーテルスルホン膜に通して限外濾過した。最初に、生成物を、14.4AU(280nm)から約50±10AU(280nm)の光学密度に3.3倍濃縮し、次いで、NaOHでpH4.2±0.2に調整された2mMの酢酸を含む約7体積の透析溶液を用いて、一定体積でこれを透析濾過した。伝導率を確認した後(220μs/cm)、十分な量の濃縮された33%のソルビトール溶液を添加して、最終的なソルビトール濃度を約5%(重量/体積)にした。最後に、これを3.5倍程度に濃縮することによって、10%程度のタンパク質と等価な140±5AU(280nm)の光学密度を達成し、0.1MのNaOHを用いてpHを5.25±0.25に調整した。5.45NTUの濁度および1.18mS/cmの伝導率を有する、5.26の最終pHの溶液552.1gが得られた。この溶液を0.22μmに通して濾過し、ボトル中に分けた。pHは5.34であり、オスモル濃度は330mOsm/kgであり、濁度は4.62NTUであり、伝導率は1.34mS/cmであった。このステップの工程所要時間は、9.5時間であった。
【０１３０】
計測して入れられたボトルを、5±3℃および25±2℃で15日超保持し、ゲル化、または濁りもしくは沈降、色の変化、または目に見える繊維もしくは粒子の出現のいずれの徴候も示さなかった。
【０１３１】
Table 20(表20)は、全体的な取得プロセスの様々なステップにおける、ポリマー、二量体、単量体、および画分についての結果を示す。
【０１３２】
【表２０】
0006048936.tif 000021
【０１３３】
上記結果から、POROSカラムの前の生成物中(低温殺菌された、SDR流出液中)の、pHおよび塩濃度を調整することによって、前の実施例において先に例示したように達成される二量体含量を制御すると(5%以下)、存在するポリマーの優れた吸着(0.06%以下)が可能になり、二量体IgGの損失が最小限になる(SDR流出液中で2.6%、およびPOROS流出液中で1.9%)ことが明らかである。
【０１３４】
IGIVを得るための全体的なプロセスは、ナノ濾過、透析濾過、および最終的な製剤化と一緒に、SD処理およびその分離を用いて凝集体/ポリマーを排除するステップを組み込むことによって、完全に実行可能で拡張可能であり、ポリマー含量(0.06%以下)、および画分(0.1%)に関して、最終生成物について優れた値が得られると結論づけられる。
【０１３５】
(実施例17)
1ボトル当たり10mlで20mlのガラスボトル中に計測して入れ、20mmφのブチルゴムストッパーで気密封止して密閉した、実施例16で得た生成物(10%のIGIV)を、周囲温度(25±5℃)で、光から保護して12カ月間貯蔵した。約1年であると設定した時間の後、これらを視覚的に検査し(物理的な外観)、安定性の最も代表的なパラメータを分析的に決定した。貯蔵の開始時(t=0)および最後(t=1年)に得た値をTable 21(表21)に示す。同様に、現況技術(スペイン特許第200100101号)を使用して工業規模で得た通常の値も含められている。
【０１３６】
【表２１】
0006048936.tif 000022
【０１３７】
視覚的な外観に関する限り、粒子(繊維、血餅、もしくは沈殿物)の存在、または濁度(透明)もしくは着色(無色)の両方の結果としての試料中の劣化はまったくないことが判明した。得られた生成物は、25±5℃の周囲温度で1年間、本質的に変化しないで(ポリマー、PKA、ACAなどの酵素など)貯蔵され、この生成物は、欧州薬局方(Eur.Ph.)で提示された値と適合していると結論づけられる。
【０１３８】
(実施例18)
ウイルス不活化ステップのシーケンスの順序を1つだけ変更して、実施例16と等価な調製スケールサイズで1ロットを処理し、その結果、SDを用いた処理を初期の透析濾過された物質に対して実施し、次いでこれらの試薬をSDR-HyperD(登録商標)樹脂で吸着し、次いで本発明による生成物を得るのに必要とされるプロセスステップの残り、すなわち、ソルビトールの存在下での低温殺菌、およびPOROS HSパーフュージョン樹脂を使用する分子凝集体の捕捉を、実施例16と同様に実施した。最後に、5%のソルビトールで安定化された、得られた生成物を、10%のタンパク質濃度のIGIVに高め、濾過によって滅菌し、20mlのガラスボトル中に計測して入れた。ブチルゴムストッパーで気密封止して密閉したボトルを、5±3℃で約1年間、低温チャンバー内で貯蔵し、次いで、安定性について最も重要なパラメータを、目視検査を含めて決定した。貯蔵の開始時(t=0)および貯蔵後(t=約1年)に得た結果を、Eur.Ph.の規格と一緒にTable 22(表22)に示す。
【０１３９】
【表２２】
0006048936.tif 000023
【０１４０】
視覚的な物理的外観に関する限り、粒子(繊維、血餅、もしくは沈殿物)の存在、または濁度(透明)もしくは着色(無色)による試料中の劣化はまったくなかったことが判明した。得られた生成物は、5±3℃の温度で約1年超の間、本質的に変化しないで(例えば、ポリマー/断片、およびPKAなどのタンパク質分解酵素)貯蔵され、この生成物は、欧州薬局方(Eur.Ph.)で指定された値と適合している。