(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に向かって電子線を放出する電子銃と、前記電子線を結像する電磁対物レンズと、前記電磁対物レンズを通過した前記電子線が入射する検出部とを備える透過型電子顕微鏡と、
前記試料に照射される励起光を出射する光源と、前記試料から発せられた蛍光を集光する光学対物レンズと、前記蛍光が入射する光学検出部とを備える蛍光顕微鏡と、
直径が前記電子線のビーム径よりも大きい設置中心孔を備えた反射鏡と、を有し、
前記電磁対物レンズは、筒状のコイルと、前記コイルを覆うヨークとで構成されており、
前記ヨークには、ポールピースを構成する切り欠きが形成されており、
前記反射鏡は、前記ポールピースの上極と下極との間の前記電子線の進行経路上に配置されており、
前記電子線は前記反射鏡の前記設置中心孔を通過し、
前記励起光は前記反射鏡により前記試料に向けて反射され、
前記蛍光は前記反射鏡により前記光学対物レンズに向けて反射され、
前記試料に対して電子線照射と励起光照射とが同軸上で行われて、
前記電子顕微鏡及び前記蛍光顕微鏡による同時観察が可能な複合顕微鏡装置。
【請求項２】
前記反射鏡の設置中心孔の直径は０．１〜１ｍｍである請求項１記載の複合顕微鏡装置。
【請求項３】
前記反射鏡の傾斜角度を調整する角度調整機構を有する請求項１又は請求項２のいずれか１項記載の複合顕微鏡装置。
【請求項４】
前記光学対物レンズを調整するレンズ調整機構を有する請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の複合顕微鏡装置。
【請求項５】
前記ポールピースを構成する前記ヨークの切り欠き部分の端部は、前記電子線の進行経路に向かって突き出しており、前記電子線の通路の径が絞られている前記請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の複合顕微鏡装置。
【請求項６】
前記光学対物レンズは、前記電磁対物レンズ内の前記電子線の進行経路から離間した位置に配置されている請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の複合顕微鏡装置。
【請求項７】
前記蛍光顕微鏡には、前記光源から出射された励起光を前記光学対物レンズに向けて反射すると共に前記光学対物レンズを透過した蛍光を前記光学検出部に向けて透過するダイクロイックミラーが設けられており、
前記ダイクロイックミラーと、前記光学対物レンズと、前記光学検出部とは、前記進行経路と交差する直線上に並べられ、
前記励起光は前記光学対物レンズ及び前記反射鏡を介して前記試料に照射される請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の複合顕微鏡装置。
【請求項８】
前記電磁対物レンズは真空槽内部に配置され、
前記真空槽の内部空間のうち、前記試料の周囲の部分には、反射防止膜が形成された請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の複合顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は電子線を利用した理科学機器に関し、特に、透過型電子顕微鏡、電子線解析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、走査型電子顕微鏡と光学顕微鏡を組み合わせた装置はすでに実用化されている。透過型電子顕微鏡と光学顕微鏡を組み合わせた装置としては、例えば特願昭５３−１６１２１５（特開昭５５−９００４６）に開示された装置がある。【０００３】
図８Ａ、図８Ｂに、従来の複合顕微鏡装置を示す。図８Ａの装置は、光学顕微鏡を電子顕微鏡本体に隣接させ、試料を光学顕微鏡と電子顕微鏡の電子光軸間で水平移動させることにより、光学顕微鏡と電子顕微鏡とで切り替えて観察する。【０００４】
図８Ｂのように、２つの顕微鏡の一体化した装置も知られており、この装置は、試料を９０°回転させて、光学顕微鏡画像の観察を行う(J. Struct. Biol. 164(2008)183-189)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭５５−９００４６号公報
【特許文献２】特開２０１０−８４０６号公報
【特許文献３】特開平５−１１３４１８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Journal of Structural Biology, Volume 164, 2008年,183-189頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記特許文献１、非特許文献１に記載された技術では、光学顕微鏡と透過型電子顕微鏡の一体化は実現したが、電子線と、光の電子光軸とが一致せず、試料の並進、回転等の移動により、別々に観察が行われる。従って、光学顕微鏡と電子顕微鏡で、同一試料を同時に観察することは不可能であった。【０００８】
例えば、蛍光染色ウィルスを細胞中で探索する操作は蛍光顕微鏡で行われ、探索したウィルスを拡大して固定（撮影）する操作は電子顕微鏡で行われるが、従来の装置では、探索と固定を同時に行うことは不可能である。このように、従来の装置では、検知対象物を素早く検出して固定する、いわゆるハイスループット操作には不向きであった。【０００９】
上記特許文献２、３にも、電子顕微鏡と光学顕微鏡を組み合わせて、同一試料を観察する装置は開示されているが、これらの技術は走査型電子顕微鏡用のものであって、透過型電子顕微鏡と光学顕微鏡の組み合わせで、同一試料を同時観察可能な技術は未だ提供されていない。【００１０】
そこで、本発明は、特に透過型電子顕微鏡と光学顕微鏡との組合せで、同一試料を同時に観察可能な装置を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の複合顕微鏡装置は、透過型の電子顕微鏡と、光学顕微鏡とを有する。電子顕微鏡は、試料に向かって電子線を放出する電子銃と、電子線を結像する電磁対物レンズと、電磁対物レンズを通過した前記電子線が入射する検出部とを有し、電子線の進行経路の途中には反射鏡を配置し、光学顕微鏡には進行経路から離間した位置に配置された光学対物レンズを具備させる。反射鏡の反射面は、試料と光学対物レンズに向かって傾斜させる。
反射鏡の、進行経路と交差する位置には、反射鏡を貫通する設置中心孔を形成する。設置中心孔の直径は０．１〜１ｍｍにすることが望ましい。
反射鏡の傾斜角度を調整する角度調整機構を具備させることが望ましく、また、光学対物レンズを調整するレンズ調整機構を具備させることがより望ましい。
電磁対物レンズは、筒状のコイルと、前記コイルを覆うヨークとを具備するものを用いることができる。ヨークの一部には切り欠きを形成し、ヨークの切り欠きが形成された部分は、コイルの内側に突き出す形状とし、電磁対物レンズ内部に間隙が形成することができる。その間隙には、光学対物レンズと、試料が配置される試料ホルダとを配置できる。
光学顕微鏡は、光源と、ダイクロイックミラーと、光学検出部とを有するものを用いることができる。ダイクロイックミラーと、光学対物レンズと、光学検出部とは、進行経路と交差する直線上に並べることができる。ダイクロイックミラーの反射面を、光学対物レンズと、光源に向かって傾斜させることが望ましい。光学対物レンズには、蛍光顕微鏡用レンズを用いることができる。
光学顕微鏡には、進行経路上に配置された照明用反射鏡と、進行経路から離間して配置された光源とを具備させることもでき、照明用反射鏡は、試料を挟んで反射鏡と反対側に位置させることが望ましい。照明用反射鏡の反射面を、試料と光源に向かって、進行経路から傾斜させ、照明用反射鏡の進行経路が交差する位置に、照明用反射鏡を貫通する設置中心孔を形成することが望ましい。
進行経路上の、照明用反射鏡と試料との間の位置には、光学コンデンサレンズを配置することが望ましく、光学コンデンサレンズの進行経路が交差する位置には、光学コンデンサレンズを貫通する設置中心孔を形成することが望ましい。
反射鏡の表面と、反射鏡の設置中心孔内壁面と、照明用反射鏡の表面と、照明用反射鏡の設置中心孔内壁面と、採光用反射鏡の表面と、採光用反射鏡の設置中心孔内壁面と、光学コンデンサレンズの表面と、光学コンデンサレンズの設置中心孔内壁面と、光学対物レンズの表面のうち、いずれか一箇所以上の面には、透明導電材料の膜を形成することが望ましい。
電磁対物レンズを真空槽内部に配置し、真空槽の内部空間のうち、光源の周囲の部分には、反射防止膜を形成することが望ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、同一試料について、同時に、電子顕微鏡画像と光学顕微鏡画像とを観察（撮影）することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は本発明の複合顕微鏡を模式的に示す断面図である。
【図２】図２は電磁対物レンズの一例を示す模式的な断面図である。
【図３】図３は光学顕微鏡の一例を示す模式的な断面図である。
【図４】図４は光学顕微鏡の他の例を示す模式的な断面図である。
【図５】図５は本発明の複合顕微鏡装置の具体例を示す写真である。
【図６】図６は本発明の複合顕微鏡装置による撮影像である。
【図７】図７ａは蛍光顕微鏡の撮影像であり、図７ｂは低倍率の電子顕微鏡撮影像であり、図７ｃ、図７ｄ、図７ｅは高倍率の電子顕微鏡撮影像である。
【図８】図８Ａは従来技術の複合型顕微鏡を説明するための模式図であり、図８Ｂは従来技術の複合型顕微鏡を説明するための側面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための形態について、詳細に説明する。なお、本発明は、以下に説明する実施形態に限定されるものではない。
【００１５】
図１の符号１は本発明の複合顕微鏡装置の一例を示しており、この複合顕微鏡装置１は、電子顕微鏡２と、光学顕微鏡４とを有している。電子顕微鏡２の構造は特に限定されないが、例えば、真空槽２０と、電子銃２１と、収束レンズ２２と、対物レンズ２５と、投射レンズ３１と、検出部３０とを有している。真空槽２０には不図示の真空ポンプが接続されており、真空槽２０内部には真空雰囲気が形成される。
【００１６】
電子銃２１は電子線（電子ビーム）の放出口が真空槽２０の内部空間に向けられ、電子線は真空雰囲気が形成された真空槽２０内部を進行する。図１の符号Ｃは電子銃２１から放出される電子線の進行経路（電子光軸）を示している。収束レンズ２２、対物レンズ２５、投射レンズ３１、及び検出部３０は、電子銃２１に近い側から記載した順番に電子光軸Ｃに沿って並べられている。電子線は収束レンズ２２で収束され、対物レンズ２５で結像され、投射レンズ３１で拡大された後、検出部３０に入射する。
【００１７】
本発明に用いる電子顕微鏡２は透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）であって、観察対象の試料は、電子光軸Ｃ上に配置される。以下に、試料と光学顕微鏡４の配置について、対物レンズ２５の具体例と共に説明する。
【００１８】
図２は対物レンズ２５の拡大断面図である。対物レンズ２５は、例えば電磁レンズ（磁界レンズ）である。後述する光学顕微鏡４の対物レンズと区別するため、電子顕微鏡２の対物レンズ２５を電磁対物レンズ２５と称する。電磁対物レンズ２５は、コイル２４と、コイル２４を被覆するヨーク２３とを有している。コイル２４の形状は筒状（リング状）であって、電磁対物レンズ２５全体の形状も筒又になっている。
【００１９】
電磁対物レンズ２５は、筒の一端開口が電子銃２１に向けられ、筒の中心軸線が電子線の電子光軸Ｃと平行になるよう配置されている。従って、筒の内側の空間が電子線の通路２９となり、電子線は、筒の一端（上端）から電磁対物レンズ２５内部に進入し、筒の他端（下端）から下方へ放出される。
【００２０】
ヨーク２３には切り欠き２６が形成されている。切り欠き２６の形状や位置は特に限定されないが、切り欠き２６は、筒（電磁対物レンズ２５）の内側、上端、もしくは下端に形成することができる。いずれの場合も、切り欠き２６の形状は、電子線を取り囲むリング状にすることが好ましい。
【００２１】
図３は、図２の符号Ａで示した部分の拡大断面図である。ヨーク２３の切り欠き２６が形成された部分は、コイル２４よりも筒の内側に突き出され、通路２９の径が絞られている。ヨーク２３の突き出された部分（ポールピース）のうち、電子銃２１に近い側を上極２７、電子銃２１から遠い側を下極２８として区別する。
【００２２】
ヨーク２３のうち、少なくとも上極２７、下極２８を構成する部分は、鉄コバルト（ＦｅＣｏ）等の高磁率材料で構成されている。通電したコイル２４により形成される磁力線は、上極２７、下極２８から通路２９内に漏洩し、漏洩磁界により電子線が回転、屈折する。ポールピースの形状及び／又は大きさ、コイル２４の通電量等の調整で、漏洩磁界を制御し、電子線の結像位置を変更させる。
【００２３】
切り欠き２６の部分が内側に突き出されることで、電磁対物レンズ２５のポールピース部分には間隙が形成されている。その間隙には、試料ホルダ１１が配置されている。試料ホルダ１１は、試料１０が設置される部分が切り欠き２６から通路２９に突き出され、通路２９を通る電子線は、試料１０を透過して検出部３０側へ向かう。
【００２４】
電磁対物レンズ２５と試料１０との距離（作動距離）が長くなると焦点距離も長くなるため、収差が大きくなるが、図３に示すように、試料１０を電磁対物レンズ２５の内側（通路２９）に配置すると収差が小さくなり、分解能が高くなる。
【００２５】
通路２９には反射鏡４１が配置され、その反射鏡４１には貫通孔（設置中心孔）４２が形成されている。設置中心孔４２は電子光軸Ｃ上に位置し、その直径は０．１〜１ｍｍであって、電子線のビーム径よりも大きい。従って、電子線は反射鏡４１で反射されずに設置中心孔４２を通過する。なお、反射鏡４１は試料１０よりも検出部３０側、又は、電子銃２１側のいずれに配置してもよく、試料１０を透過した電子線、又は試料１０を透過する前の電子線が設置中心孔４２を通過する。
【００２６】
反射鏡４１は、上極２７と下極２８との間に位置する。電磁対物レンズ２５の間隙には、試料ホルダ１１の他に、光学顕微鏡４の一部又は全部が配置されている。光学顕微鏡４は対物レンズ４３と、光源４５と、光学検出部４６を有しており、少なくとも対物レンズ４３は電磁対物レンズ２５の間隙に配置され、対物レンズ４３が反射鏡４１と対面する。以下、電磁対物レンズ２５と区別するため、光学顕微鏡４の対物レンズ４３を光学対物レンズと称する。
【００２７】
光源４５は例えば水銀ランプであって、光源４５から放出された光は、照射レンズ４７で電子光軸Ｃと平行な平行光にされる。平行光の進行方向の先には、分光手段が配置されている。分光手段は、例えばダイクロイックミラー５２を有する。ダイクロイックミラー５２の反射面は、光学対物レンズ４３と光源４５に向かって、電子光軸Ｃと平行な方向から所定角度（ここでは４５°）傾けられている。
【００２８】
平行光のうち、所定波長の光（励起光）は進行方向を光学対物レンズ４３側に曲げられて、電子光軸Ｃと交差する方向（ここでは直交方向）に進行するが、励起光外の波長の光は直進する。従って、励起光が光学対物レンズ４３に入射することになる。なお、ダイクロイックミラー５２と照射レンズ４７の間に、励起フィルター５１を配置し、予め励起光を抽出することがより望ましい。
【００２９】
ダイクロイックミラー５２と、光学対物レンズ４３と、反射鏡４１は、上極２７と下極２８の間の位置で、電子光軸Ｃと直交する直線上、すなわち、励起光の経路上に並べられている。反射鏡４１の反射面は、試料１０及び光学対物レンズ４３に向かって電子光軸Ｃから所定角度（ここでは４５°）傾斜しており、励起光は光学対物レンズ４３を通過後、反射鏡４１で反射され、試料１０に入射する。
【００３０】
試料１０は蛍光物質で染色されており、励起光の入射により発光する。その蛍光光は反射鏡４１で反射され、光学対物レンズ４３に入射する。光学検出部４６は、光学対物レンズ４３を挟んで反射鏡４１と反対側の位置に配置されている。光学対物レンズ４３と光学検出部４６の間にはダイクロイックミラー５２があるが、蛍光光は励起光と波長が異なるので、ダイクロイックミラー５２で反射されずに通過する。
【００３１】
光学検出部４６とダイクロイックミラー５２の間に、吸収フィルター５３と結像レンズ５４が配置してもよい。この場合、蛍光光は、吸収フィルター５３で励起光や散乱光が除去され、結像レンズ５４で結像されて光学検出部４６に入射する。光学検出部４６は、例えば、ＣＣＤカメラ等であって、コンピュータなどの処理装置に接続され、光学検出部４６で捉えた蛍光光を演算処理し、出力装置に出力（画像表示、印刷等）する。このように、図３の光学顕微鏡４は、ダイクロイックミラー５２により、励起光と蛍光光とを分離し、試料１０を観察及び／又は撮影可能な、いわゆる落射型蛍光顕微鏡である。
【００３２】
電磁対物レンズ２５を通る電子線のビーム径は小さく、十分な光量の励起光及び蛍光光が反射鏡４１で反射されるように設置中心孔４２の径を０．１〜１．０ｍｍ程度に小さくしても、設置中心孔４２を通過可能である。従って、複合顕微鏡装置１は、試料１０に対し、電子線照射と、光照射とを同軸上で行うことが可能であり、同一試料１０に対し、透過型の電子顕微鏡２による観察、撮影と、光学顕微鏡４による観察、撮影を同時に行うことができる。
【００３３】
本発明に用いる光学顕微鏡４は蛍光顕微鏡に限定されるものではない。以下、光学顕微鏡の他の例について説明する。図４の符号８は、明視野型の光学顕微鏡であり、図３と同じ構成の部材は同じ符号を付して以下に説明する。この光学顕微鏡８では、光学検出部４６及び光学対物レンズ４３を、図３の光学顕微鏡４と同じ構造、同じ配置にすることができるが、光源８５の配置が異なる。
【００３４】
光源８５は、例えば、上極２７の上方に配置される。光源８５は電子光軸Ｃに向けられ、電子光軸Ｃの光源８５と対向する位置には照明用反射鏡８１が配置されている。試料１０は、図３と同様、電磁対物レンズ２５内側の通路２９に配置することができる。照明用反射鏡８１の反射面は、試料１０及び光源８５に向かって、電子光軸Ｃから所定角度（ここでは４５°）傾斜している。
【００３５】
光源８５と照明用反射鏡８１の間には照射レンズ８７が配置され、光源８５からの光は、照射レンズ８７で照明用反射鏡８１の反射面に集光され、反射面で試料１０に向かって反射される。
【００３６】
照明用反射鏡８１は上極２７から離間して配置され、試料１０までの距離が長い。このような場合は、照明用反射鏡８１と試料１０との間に光学コンデンサレンズ（集光レンズ）８３を配置する。ここでは光学コンデンサレンズ８３は上極２７に取り付けられ、光は光学コンデンサレンズ８３で集光されてから、試料１０に入射する。
【００３７】
試料１０を挟んで、照明用反射鏡８１と反対側の位置には、採光用反射鏡８８が配置されている。採光用反射鏡８８は、図３の反射鏡４１と同様、反射面が、試料１０及び光学対物レンズ４３に向かって、電子光軸Ｃから所定角度（ここでは４５°）傾斜している。従って、試料１０を透過した透過光は、採光用反射鏡８８で反射され、光学対物レンズ４３に入射する。透過光の進行方向の先には、第一例（図３）と同様に光学検出部４６が配置されており、透過光は直接、又は吸収フィルター５３、結像レンズ５４を通過後に光学検出部４６に入射する。
【００３８】
照明用反射鏡８１と、光学コンデンサレンズ８３と、採光用反射鏡８８は、それぞれ電子線の電子光軸Ｃ上に並べられ、電子線の進行経路に当たる部分に貫通孔（設置中心孔）８２、８４、８９がそれぞれ形成されている。図３の反射鏡４１と同様に、これらの設置中心孔８２、８４、８９の径も、電子線の通過を妨げない程度（０．１〜１ｍｍ）にされている。従って、図４の光学顕微鏡８においても、同一試料１０に対し、透過型の電子顕微鏡２による観察、撮影と、光学顕微鏡８による観察、撮影を同時に行うことができる。
【００３９】
なお、光源８５と、照明用反射鏡８１は、下極２８よりも下方（即ち検出部３０側）に配置してもよい。この場合、採光用反射鏡８８を試料１０よりも上極２７側に配置し、下方から試料１０を透過した光を採光する。
【００４０】
また、図４の装置において、光源８５と照明用反射鏡８１の間に分光手段（ダイクロイックミラー、励起フィルター等）を配置して、励起光を抽出することにより、蛍光顕微鏡として使用することもできる。この場合、試料１０から採光用反射鏡８８側に放出された蛍光光を検出する。
【００４１】
本発明に用いる光学対物レンズ４３は特に限定されず、市販の長作動距離タイプの対物レンズと同等品を用いることができる。試料１０と光学対物レンズ４３の間に反射鏡４１、８８を設置可能な程度の作動距離を有するものを使用することが望ましい。
【００４２】
そのほか、光学対物レンズ４３の設置場所は強磁界且つ真空中になるので、非磁性、耐真空性能が必要である。つまり、光学対物レンズ４３を保持するレンズケースボディを、真鍮製から非磁性のもの（例えばリン青銅）に変え、ガラスレンズの空間と周囲真空部が通じるようにレンズケースボディに小さな孔を設けることが望ましい。
【００４３】
また、電子顕微鏡２の収束レンズ２２や投射レンズ３１も特に限定されないが、例えば、電磁対物レンズ２５と同様の構造を有する磁界レンズを用いることができる。反射鏡４１、８１、８８の表面及び／又は設置中心孔４２、８２、８９の内壁面、光学コンデンサレンズ８３の表面及び／又はその設置中心孔８４の内壁面、光学対物レンズ４３の表面には、導電コーティングを施し、電子線による帯電を防止することが望ましい。導電コーティングの材料は、光透過率の高い材料、たとえば酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）と、酸化亜鉛（ＩＺＯ）と、酸化インジウム−ガリウム−亜鉛（ＩＧＺＯ）とからなる群より選択されるいずれか１種以上の透明導電材料を使用する。
【００４４】
本発明の複合顕微鏡装置１は、電子線の通路内に光学観察用の光を放出するので、電子顕微鏡２のうち、光（励起光、蛍光光、反射光等）が放出される場所の部材、すなわち、試料１０の周辺の部材の表面に反射防止処理（反射防止膜）を施すことが望ましい。
【００４５】
反射防止処理は、例えば、黒色処理である。黒色処理は、例えば、試料ホルダ１０、電磁対物レンズ２５のポールピース部分、電子顕微鏡２の試料汚染防止冷却ファン、電子顕微鏡２５の絞り装置（特に電磁対物レンズ２５用）の先端部、電磁対物レンズ２５の絞りをセットする部分、電磁対物レンズ２５周囲の真空槽２０等の壁面に施すことが、反射防止の観点から有効である。黒色処理に用いる材料は、低反射性の非磁性材料であれば特に限定されず、チタンブラック等種々のものを用いることができる。
【００４６】
反射鏡４１、８１、８８を、角度調整機構９１に接続し、真空槽２０の外部からの操作で、反射鏡４１、８１、８８の傾斜角度を変更可能にすることが望ましい。この場合、試料１０の種類や配置場所、蛍光物質の種類や励起光等に合わせて、反射鏡４１、８１、８８の角度を微調整することが可能であり、多様な試料１０の観察・撮影を行うことができる。
【００４７】
また、光学対物レンズ４３にレンズ調整機構９２に接続し、真空槽２０の外部からの操作で、光学対物レンズ４３から反射鏡４１、８８までの距離等を変更可能にすることが望ましい。この場合、試料１０の種類等に合わせて、光学対物レンズ４３のピントを微調整することができ、多様な試料１０の観察・撮影を行うことができる。
【００４８】
次に、本発明の複合顕微鏡装置１の使用例について説明する。
特定の器官や細胞を蛍光標識した生体試料を観察する場合、電子線による試料１０の損傷を防ぐため、最初は電子線を試料１０に照射せず、光学顕微鏡４、８のみで視野探しを行う。試料１０が蛍光標識されているため、電子顕微鏡２を使用する場合と比較して効率的な視野探しが可能である。
【００４９】
視野探しの途中は電子線を偏向コイルで試料１０から外れた位置にずらしておき、高分解能で観察したい対象が発見された際は、電子線を試料１０上に戻し、電子顕微鏡２による高分解能観察を行う。偏向コイルは、例えば収束レンズ２２と電磁対物レンズ２５の間に設置する。このように、試料１０損傷低減のためには、電子線を試料に照射する時間はなるべく短くすることが重要となる。
【００５０】
図５は本発明の複合顕微鏡装置１の一例の外感を撮影した写真であり、楕円で囲んだ部分が電磁対物レンズ２５に光学顕微鏡４、８を組み込んだ部分である。図６はこの複合顕微鏡装置１で、蛍光剤である無機Ｑドットを光学顕微鏡４と電子顕微鏡２とで同時観察した例である。
【００５１】
また、図７は、蛍光蛋白質融合アクチンを発現させた培養細胞を、この複合電子顕微鏡装置１の光学顕微鏡４と電子顕微鏡２とで同時観察した例である。図６、図７からも電子顕微鏡２は光学顕微鏡４よりも分解能が高いことが明らかであるが、図６の場合、Ｑドットの位置を同定するための視野探しは光学顕微鏡４の方が効率よく行えるので、電子顕微鏡２と光学顕微鏡４、８とを合わせ持つ本発明の複合顕微鏡装置１は、ハイスループットの電子顕微鏡観察を可能とする。
【００５２】
従来の電子顕微鏡で生体試料を観察する場合、視野探しの際に電子線による生体試料損傷が発生したが、本発明の複合顕微鏡装置１によれば、まず蛍光顕微鏡で蛍光のある部分を特定し（図７ａ）、そこの部分を電子顕微鏡で低倍（図７ｂ）、高倍（図７ｃ、図７ｄ、図７ｅ）と拡大していけば、蛍光分子の領域のみを高分解能で観察でき、かつ視野探しの際の試料１０の損傷を避けることができる。事実、図７の場合、高倍の電子顕微鏡撮影像において微小管やリボソームと共に蛍光顕微鏡で指示された蛍光蛋白質の存在領域にアクチン繊維が明確に見えている。
【００５３】
また、既に実用化されている電子顕微鏡用の雰囲気試料室、および位相差電子顕微鏡法を組合わせれば、生きた状態の生体試料を光顕観察しながら、同一視野を特定の瞬間だけ位相差電子顕微鏡法により高分解能・高コントラストで観察することができ、生体の機能と構造をリアルタイムで観察し、関連付けることが可能となる。
【符号の説明】
【００５４】
１        複合顕微鏡装置
２        電子顕微鏡
４、８    光学顕微鏡
１０      試料
１１      試料ホルダ
２０      真空槽
２１      電子銃
２３      ヨーク
２４      コイル
２５      電磁対物レンズ
３０      検出部
４１、８１、８８    反射鏡
４２、８２、８９    設置中心孔（貫通孔）
４３      光学対物レンズ
４５      光源
４６      光学検出部
５２      ダイクロイックミラー
８３      光学コンデンサレンズ
９１      角度調整機構
９２      レンズ調整機構
Ｃ        電子光軸（進行経路）
【図１】
0005842308.tif 000002
【図２】
0005842308.tif 000003
【図３】
0005842308.tif 000004
【図４】
0005842308.tif 000005
【図５】
0005842308.tif 000006
【図６】
0005842308.tif 000007
【図７】
0005842308.tif 000008
【図８】
0005842308.tif 000009