(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象から採取した生物学的サンプル中の肺癌および結腸直腸癌に特異的なＢＡＲＤ１アイソフォームの存在を検出するための方法であって
配列番号１、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームπ、および
配列番号２、その生物学的活性フラグメント、または配列番号２と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームκ、
を含む群から選択される肺癌および結腸直腸癌に特異的なＢＡＲＤ１アイソフォームの少なくとも１つを前記サンプル中に検出する段階を含み、前記対象に由来するサンプル中の前記の肺癌および結腸直腸癌に特異的なＢＡＲＤ１アイソフォームの存在が前記対象が肺癌および／または結腸直腸癌に罹患し、肺癌および／または結腸直腸癌のリスク上昇を有し、かつ／または肺癌および／または結腸直腸癌に対する治療後の再発のリスクを有することの指標であることを特徴とする前記方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記方法が前記生物学的サンプル中に配列番号１からなるＢＡＲＤ１アイソフォームπおよび配列番号２からなるＢＡＲＤ１アイソフォームκを検出する段階を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記方法が
配列番号１０５、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１０５と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームπ’、
配列番号５、その生物学的活性フラグメント、または配列番号５と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームβ、
配列番号６、その生物学的活性フラグメント、または配列番号６と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームδ、および
配列番号７、その生物学的活性フラグメント、または配列番号７と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームγ、
配列番号１０６、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１０６と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームβ’を含む群から選択される前記ＢＡＲＤ１アイソフォームの少なくとも１つを前記生物学的サンプル中に検出することをさらに含むことを特徴とする前記方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記方法が配列番号１からなるＢＡＲＤ１アイソフォームπ、配列番号２からなるＢＡＲＤ１アイソフォームκおよび配列番号５からなるＢＡＲＤ１アイソフォームβを前記生物学的サンプル中に検出することを含むことを特徴とする前記方法。
【請求項５】
請求項１から４に記載の方法であって、前記生物学的サンプルが生検サンプル、組織学サンプル、肺液、凍結組織サンプル、腫瘍組織サンプル、糞便サンプル、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）および血液サンプルを含む群から選択されることを特徴とする前記方法。
【請求項６】
請求項１から５に記載の方法であって、前記対象がヒトであることを特徴とする前記方法。
【請求項７】
請求項１から６に記載の方法であって、前記ＢＡＲＤ１アイソフォームの存在が前記ＢＡＲＤ１アイソフォームに特異的な抗体を用いることにより検出されることを特徴とする前記方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記抗体が配列番号１〜７、１０５〜１０６、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１〜７、１０５〜１０６と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む前記ＢＡＲＤ１アイソフォームの少なくとも１つの相異なるエピトープと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントの組み合わせであることを特徴とする前記方法。
【請求項９】
請求項１から６に記載の方法であって、前記ＢＡＲＤ１アイソフォームの存在が配列番号１〜７、１０５〜１０６、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１〜７、１０５〜１０６と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む前記ＢＡＲＤ１アイソフォームの少なくとも１つをコードするｍＲＮＡのレベルを検出することによって検出されることを特徴とする前記方法。
【請求項１０】
請求項１から６に記載の方法であって、前記ＢＡＲＤ１アイソフォームの存在が前記対象より採取した前記血液サンプル中に前記ＢＡＲＤ１アイソフォームに特異的な自己免疫抗体の存在を検出することによって検出されることを特徴とし、かつ前記ＢＡＲＤ１アイソフォームに特異的な前記自己免疫抗体を検出するために配列番号１３〜８０を含む群から選択される少なくとも４つの抗原が用いられることを特徴とする前記方法。
【請求項１１】
請求項１から６に記載の方法であって、前記ＢＡＲＤ１アイソフォームの存在が
配列番号１〜７、１０５〜１０６、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１〜７、１０５〜１０６と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む前記ＢＡＲＤ１アイソフォームの少なくとも１つをコードするｍＲＮＡのレベルを検出すること、および
前記対象より採取した前記血液サンプル中に前記ＢＡＲＤ１アイソフォームに特異的な自己免疫抗体の存在を検出することであって、かつ前記ＢＡＲＤ１アイソフォームに特異的な前記自己免疫抗体を検出するために配列番号１３〜８０を含む群から選択される少なくとも４つの抗原が用いられることを特徴とする検出することによって検出されることを特徴とする前記方法。
【請求項１２】
配列番号１、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むＢＡＲＤ１アイソフォームπである、分離および／または精製されたポリペプチド、又は、該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡから成る、肺癌および結腸直腸癌に特異的なバイオマーカー。
【請求項１３】
配列番号２、その生物学的活性フラグメント、または配列番号２と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むＢＡＲＤ１アイソフォームκである、分離および／または精製されたポリペプチド、又は、該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡから成る、肺癌および結腸直腸癌に特異的なバイオマーカー。
【請求項１４】
対象より採取されるサンプル中に肺癌および結腸直腸癌に特異的なＢＡＲＤ１アイソフォームπ又はκの存在を検出するためのキットであって
少なくとも１つのポリヌクレオチドプライマーまたはプローブが配列番号１又は２、その生物学的活性フラグメント、および／または配列番号１又は２と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含むＢＡＲＤ１アイソフォームの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドに対して特異的であることを特徴とする、前記ポリヌクレオチドプライマーまたはプローブ、および／または
配列番号１又は２、その生物学的活性フラグメント、および／または配列番号１又は２と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＢＡＲＤ１アイソフォームの相異なるエピトープと特異的に結合するその抗体またはフラグメントの組み合わせ、および／または
配列番号１６、１７、１８、２３、５９〜６７、６８、６９、７４、７５、７６〜８０を含む群から選択される少なくとも１つのペプチドを含む前記キット。
【請求項１５】
肺癌および結腸直腸癌を婦人科癌と識別するための方法であって、
配列番号１、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームπ、および
配列番号２、その生物学的活性フラグメント、または配列番号２と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームκ
を含む群から選択される肺癌および結腸直腸癌に特異的なＢＡＲＤ１アイソフォームの少なくとも１つを対象から採取した生物学的サンプル中に検出する段階を含み、前記の肺癌および結腸直腸癌に特異的なＢＡＲＤ１アイソフォームの存在が肺癌および／または結腸直腸癌の指標であることを特徴とする前記方法。
【請求項１６】
ＢＡＲＤ１アイソフォームπに特異的に含まれる配列番号１４４に記載されるエピトープと結合するＢＡＲＤ１アイソフォームπに特異的な抗体またはそのフラグメントから成る肺癌および結腸直腸癌に特異的なバイオマーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺癌および結腸直腸癌に特異的な新規ＢＡＲＤ１アイソフォーム、その検出のための方法、および肺癌および結腸直腸癌を治療するおよび／または予防するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、全世界の癌死亡の主な原因である。手術以外の治療法はあまり効率的でなく、かつ抵抗性を引き起こす。したがって、肺癌の病因およびその進行に対する洞察が早急に必要とされている。結腸直腸癌は癌関連死亡のもう１つの主な原因であり、かつ世界で４番目に多い癌である。結腸直腸癌患者の生存および予後は診断時の腫瘍の病期に依存する。初期の結腸直腸癌は治癒が可能である。残念ながら、５７％以上が診断時に疾患の局所的または遠隔拡散を有する。癌の管理には多額の投資が行われかつ多大な進歩があるものの、末期結腸直腸癌患者の５年生存率は１５％に過ぎない。
【０００３】
最近、多くのグループが腫瘍におけるタンパク質、ＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡを健康組織と比較することにより肺癌を発生させる機構に取り組んでいる。肺癌において最も頻繁に欠失または変異する遺伝子ＴＰ５３に加え、ｐ５３−ＡＲＦ経路の成分も一貫して欠失、変異または後成的に修飾される。結腸直腸癌に関しては、困難であるのは分子的な基盤を理解すること、および発生を開始しかつ進行に駆り立てる因子を決定することである。結腸直腸癌の発生および転移の進行に関与する分子的な事象は、部分的に解明されているにすぎない。最近の研究により、結腸直腸癌において、転帰および化学療法に対する反応を予測するためのＭＬＨ１、ＭＳＨ２、β−カテニンおよびｐ５３などの分子的および生化学的マーカーの使用の可能性が明らかになっている。
【０００４】
ＥＲＣＣ１、ＲＲＭ１、およびＢＲＣＡ１などのＤＮＡ損傷修復に関与する遺伝子を含めた分子的プロフィールが、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）における予測および予後判定パラメータとして浮上しつつある。アップレギュレートされた乳癌素因遺伝子ＢＲＣＡ１の発現が、ＮＳＣＬＣにおける予後判定および治療に対する反応の予測マーカーとして提唱された。結腸直腸癌については、ＢＲＣＡ１の研究は主として結腸直腸癌リスクとＢＲＣＡ１変異に限定されている。数件の研究がＢＲＣＡ１変異と結腸直腸癌リスクを相関させようと試みたものの、明確な結論は得られていない。現在入手できる限定的なエビデンスによれば、ＢＲＣＡ変異保有者は結腸直腸癌のリスクが高いと見なすべきである。しかし、結腸直腸癌におけるＢＲＣＡ１発現の具体的な役割は不明である。
【０００５】
ＢＲＣＡ１は多くの増殖組織に発現し、かつＤＮＡ修復経路および細胞周期制御において腫瘍抑制因子として作用する。ＢＲＣＡ１タンパク質の安定性および機能はそのＢＡＲＤ１（ＢＲＣＡ１会合ＲＩＮＧドメインタンパク質１）との相互作用に依存する。ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１ヘテロ二量体はＥ３ユビキチンリガーゼ活性を有し、これによりユビキチン化を介して主要な標的タンパク質の安定性を制御する。ＢＡＲＤ１は、大半の肺癌において欠損するｐ５３依存性アポトーシスにも関与する。ＢＡＲＤ１はｐ５３を安定化しかつそのリン酸化を促進し、またＢＡＲＤ１の発現はアポトーシスに向かうシグナリングにおけるｐ５３の適切な機能に必要とされる。したがって、ＢＡＲＤ１は腫瘍抑制においてＢＲＣＡ１およびｐ５３の両者の結合相手として二重の役割を果たす。いくつかの研究により、有糸分裂中のＢＡＲＤ１は、転写時はＥ２Ｆにより、また翻訳後はリン酸化によってアップレギュレートされ、また重要なことにそのことが有糸分裂にとって不可欠であることが示されている。他の研究によると、ＢＲＣＡ１もＢＡＲＤ１も遺伝性非ポリープ性結腸直腸癌（ＨＮＰＣＣ）と関係することの多い遺伝子ｈＭＳＨ２と相互作用することが示され、かつｈＭＳＨ２の変異はＨＮＰＣＣの約３０〜４０％を説明するとみられる。ＢＲＣＡ１−ｈＭＳＨ２シグナリングプロセスの欠損は腫瘍の発生しやすさの増大につながる。
【０００６】
国際公開第９８／１２３２７号（テキサス大学群理事会）は、乳癌タンパク質ＢＲＣＡ１との結合に基づくスクリーニング分析において同定された数種類の遺伝子を開示する。これらの遺伝子の１つはＢＡＲＤ１と命名され、ＢＲＣＡ１と相互作用するＲＩＮＧタンパク質であり、特に乳癌、卵巣癌および子宮癌と結びついた多様な癌関連診断および治療法における使用が想定される。
【０００７】
国際公開第２００８／１１９８０２号（ジュネーブ大学）は、婦人科癌において欠失を有するＢＡＲＤ１のアイソフォームが細胞質に過剰発現かつ異常局在すること、および乳癌および卵巣癌における予後不良と相関するその発現を開示する。これらのアイソフォームの構造解析により、これらはＢＲＣＡ１と相互作用するかまたはアポトーシスを誘導する領域を欠くことが示された。これらのアイソフォームは婦人科癌に特異的であり、またアイソフォームα、β、η、γ、ε、φ、δおよびθと命名される。
【０００８】
肺癌および結腸直腸癌の重症度および不治性により、これらの癌の鑑別を可能にし、かつさらにその治療または予防のための有効な方法および組成物の開発をさらに可能とするような有効な検出法を開発することのニーズが未だにある。主な問題は、今日この問題を克服するために効率的な方法または戦略が開発されていないことである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、対象から採取した生物学的サンプル中に肺癌および結腸直腸癌に特異的なＢＡＲＤ１アイソフォームの存在を検出するための方法であって、
配列番号１、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームπ、および
配列番号２、その生物学的活性フラグメント、または配列番号２と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームκ、
を含む群から選択される肺癌および結腸直腸癌に特異的なＢＡＲＤ１アイソフォームの少なくとも１つを前記サンプル中に検出する段階を含み、前記対象に由来するサンプル中の前記の肺癌および結腸直腸癌に特異的なＢＡＲＤ１アイソフォームの存在が、前記対象が肺癌および／または結腸直腸癌に罹患し、肺癌および／または結腸直腸癌のリスク上昇を有し、かつ／または肺癌および／または結腸直腸癌に対する治療後の再発のリスクを有することの指標であることを特徴とする方法を提供する。
【００１０】
本発明は、請求項１から６の方法におけるバイオマーカーとしての使用のための、配列番号１、その活性フラグメント、または配列番号１と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む分離かつ／または精製したポリペプチド、および請求項１から６の方法におけるバイオマーカーとしての使用のための、配列番号２、その活性フラグメント、または配列番号２と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む分離かつ／または精製したポリペプチドをさらに提供する。
【００１１】
本発明の他の対象は、本発明のＢＡＲＤ１アイソフォームの存在を検出するための方法において用いるための配列番号１３から８０を含む群から選択されるペプチドである。
【００１２】
本発明のさらなる対象は、対象から採取したサンプル中の肺癌および結腸直腸癌に特異的なＢＡＲＤ１アイソフォームの存在を検出するためのキットであって、
少なくとも１つのポリヌクレオチドプライマーまたはプローブが、配列番号１〜７、１０５〜１０６、その生物学的活性フラグメント、および／または配列番号１〜７、１０５〜１０６と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含むＢＡＲＤ１アイソフォームの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドに対して特異的であることを特徴とする前記のポリヌクレオチドプライマーまたはプローブ、および／または
配列番号１〜７、１０５〜１０６、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１〜７、１０５〜１０６と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＢＡＲＤ１アイソフォームの相異なるエピトープと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントの組み合わせ、および／または
配列番号１３から８０を含む群から選択される少なくとも１つのペプチドを含むキットである。
【００１３】
本発明は、肺癌および結腸直腸癌を婦人科癌と識別するための方法であって前記方法が、
配列番号１、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームπ、および
配列番号２、その生物学的活性フラグメント、または配列番号２と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームκ、
を含む群から選択される肺癌および結腸直腸癌に特異的なＢＡＲＤ１アイソフォームの少なくとも１つを対象から採取した生物学的サンプル中に検出する段階を含み、前記の肺癌および結腸直腸癌に特異的なＢＡＲＤ１アイソフォームが肺癌および／または結腸直腸癌の指標であることを特徴とする方法にも関する。
【００１４】
さらに、本発明は、肺癌および結腸直腸癌を治療するおよび／または予防するための方法における使用のための本発明のＢＡＲＤ１アイソフォームの抗体、組換えｓｉＲＮＡおよび生物学的活性のモジュレーターにも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】ＮＳＣＬＣにおけるＢＡＲＤ１発現を示す。ＢＡＲＤ１抗体を有するＮＳＣＬＣ１００例に対してＮ１９、Ｃ２０、ＰＶＣ、ＷＦＳおよびＢＲＡＣＡ１を用いた免疫組織化学検査を実施した。（Ａ）上記にＲＩＮＧフィンガー（ＲＩＮＧ）、アンキリン反復配列（ＡＮＫ）およびＢＲＣＴドメインとして示されたタンパク質モチーフを有するＢＡＲＤ１エクソン（１〜１１）の模式的提示。多様な抗体によって認識されるエピトープのおおよその位置が指定される（Ｎ１９、ＰＶＣ、ＷＦＳ、Ｃ２０）。
【図１Ｂ】（Ｂ〜Ｄ）ＢＡＲＤ１抗体およびＢＲＣＡ１抗体を用いた免疫組織化学染色の例。ＢＡＲＤ１  Ｎ１９およびＣ２０は細胞質顆粒染色を示し、時に同じ細胞または領域内に共存した。ＢＡＲＤ１  ＰＶＣおよびＷＦＳ染色は細胞質染色または核および細胞質拡散染色であった。ＢＲＣＡ１染色はＢＡＲＤ１  Ｎ１９染色と共存した（Ｂ）。
【図１Ｃ】ＰＶＣおよびＷＦＳでほとんど染色されなかった例（Ｃ）。
【図１Ｄ】Ｎ−１９およびＣ２０でごくわずかに染色された例（Ｄ）。縮尺棒を表示する（上図＝２００μｍ；下図＝１００μｍ）。
【図１Ｅ】（Ｅ）ＮＳＣＬＣ症例１００例のうちＮ１９、ＰＶＣ、ＷＦＳおよびＣ２０がすべて立証された７３例に観察された染色。「＋」は陽性染色を、「−」は陰性染色を示す。全４抗体に対する陽性染色は最も頻度の高い発現パターンであった。
【図１Ｆ】（Ｆ）ＢＡＲＤ１  Ｎ１９、ＰＶＣ、ＷＦＳおよびＣ２０染色の対比較。ＢＡＲＤ１  Ｎ１９とＣ２０およびＰＶＣとＷＦＳは強く相関した。Ｎ１９とＰＶＣ、Ｎ１９とＷＦＳ、Ｃ２０とＰＶＣ、Ｃ２０とＷＦＳにはほとんど相関が認められなかった。
【図２ａ】腫瘍組織と腫瘍周囲組織のＢＡＲＤ１発現の比較および臨床像との相関を示す。（Ａ）ＮＳＣＬＣ患者２０例（女性１０例および男性１０例）の腫瘍組織と腫瘍周囲組織とのＢＡＲＤ１  Ｎ１９、ＢＡＲＤ１  Ｃ２０およびＢＲＣＡ１染色の比較。腫瘍組織では全抗体による染色が「正常」組織と比較して上昇した。（Ｂ）女性１０例および男性１０例のＮＳＣＬＣ患者の腫瘍組織でＢＡＲＤ１  Ｎ１９、ＢＡＲＤ１  Ｃ２０およびＢＲＣＡ１染色を試験した。女性由来の腫瘍では全抗体による染色が男性患者と比較して上昇した。（Ｃ）ＮＳＣＬＣ１００例におけるＢＡＲＤ抗体染色と腫瘍型の比較。非腺癌（ＡＣ）（扁平上皮癌および大細胞癌を含む）では陽性染色の頻度がＡＣよりも高かった。ＰＶＣおよびＷＦＳ染色の上昇は統計的に有意であった。（Ｄ〜Ｅ）ＢＡＲＤ１発現と患者の生存との相関。（Ｄ）図１Ｅに定義する４抗体陽性染色の組み合わせと４抗体未満陽性染色の組み合わせによる無病生存率（ＤＦＳ）のカプラン−メイヤー分析。（Ｅ）図１Ｅに定義する４抗体陽性染色の組み合わせと４抗体未満の組み合わせによる陽性染色による全生存（ＯＳ）のカプラン−メイヤー分析。
【図２ｂ】同上。
【図３Ａ−Ｂ】肺癌誘発の実験マウスモデルにおけるＢＡＲＤ１アイソフォーム発現の経時変化を示す。（Ａ）ウレタン処理動物の形態学的に正常な組織（正常）におけるＢＡＲＤ１発現。第１６週（ｗｋ）には、一部のＩＩ型表現型にＢＡＲＤ１  ＰＶＣおよびＷＦＳエピトープが検出されたが、Ｉ型表現型には検出されなかった。第２４週および３２週にはＩＩ型およびＩ型表現型においてすべてのエピトープが発現し、また第２４週から３２週までは発現がアップレギュレートされた。Ｃ２０染色は他と反対であり：染色は１６週目に強く、２４週目には弱く、３２週目にはほぼ陰性であった。（Ｂ）腫瘍におけるＢＡＲＤ１発現。腫瘍領域においては、１６週目から３２週目にＢＡＲＤ１  ＰＶＣおよび特異的にＷＦＳ発現がアップレギュレートされる一方、Ｃ２０発現は１６週目から３２週目までダウンレギュレートされた。
【図３Ｃ−Ｄ】（Ｃ〜Ｄ）３匹のマウスの正常組織（Ｃ）および腫瘍組織（Ｄ）におけるＢＡＲＤ１エピトープの発現パターンを要約する。染色スコア、陽性細胞の割合を示す（０は陰性染色、１から４は強度および陽性染色細胞数の増加を示す）。
【図４Ａ−Ｄ】ヒト肺腫瘍組織および腫瘍周辺組織におけるＢＡＲＤ１転写物の発現および構造を示す。（Ａ〜Ｄ）ＢＡＲＤ１コード領域全体またはエクソン１−４または１−６を含む領域を増幅するプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した。対照ＲＴ−ＰＣＲとしてＧＡＰＤＨを増幅した。分子量マーカー（Ｍ）を左に示す。推定されるＦＬ  ＢＡＲＤ１および選択的スプライシングアイソフォームを右に示す。（Ａ）正常肺組織におけるＢＡＲＤ１  ＲＮＡ発現。良性肺疾患を有する者の肺生検に対して実施したＲＴ−ＰＣＲ（「方法」の節を参照）は、大半のサンプルにおいてＢＡＲＤ１発現が、かつ８例中５例において個別のアイソフォーム（γ、δ、η）の増幅が存在しないことを示す。（Ｂ）エクソン１において順方向プライマーを用い、かつエクソン１１またはエクソン４において逆方向プライマーを用いたＦＬ  ＢＡＲＤ１および／または切断アイソフォームの増幅。男性および女性患者由来の組織について正常腫瘍周辺組織（Ｎ）および腫瘍組織（Ｔ）の対の例を示す。推定されるＦＬ  ＢＡＲＤ１および選択的スプライシングアイソフォームを右に示す。正常組織と腫瘍組織は同じアイソフォームパターンを発現する。（Ｃ）ＦＬ  ＢＡＲＤ１、βおよび新規アイソフォームκおよびπを識別するために、エクソン１から６の増幅を実施した。アイソフォームπは腫瘍に特異的に発現するが、正常組織においては発現しないかまたは弱く発現する。（Ｄ）ＲＴ−ＰＣＲによって決定されたエストロゲン受容体αの発現は大半の症例で確認された。正常組織と腫瘍、男性サンプルと女性サンプルで同様の発現レベルが認められた。
【図４Ｅ】（Ｅ）既知のＢＡＲＤ１アイソフォームおよび肺癌特異的新型アイソフォームκおよびπの構造。ＦＬ  ＢＡＲＤ１のエクソン（１から１１）構造模式図およびタンパク質像（ＲＩＮＧ、ＡＮＫ、ＢＲＩＣＴ）および核局在シグナル（ＮＬＳ）およびプライマーの位置を示す。アイソフォームの推定タンパク構造模式図を下に灰色で、非コードエクソンを白で、選択的オープンリーディングフレーム（β、γおよびη）を薄い灰色のドット（…）で示す。新規アイソフォームκはエクソン３、推定翻訳開始部位（ＡＴＧ）はエクソン４の欠失によって示される。新規アイソフォームπはエクソン４の欠失によって設計され、また既知のＢＡＲＤ１変異およびこの領域に位置する多型が示される。アイソフォームに付けられた名称を左側に、サイズ（アミノ酸）および分子量（ＭＷ）を右側に示す。
【図５】男性および女性ＮＳＣＬＣ患者の形態学的に正常な腫瘍周辺組織（左）と腫瘍組織（右）ＢＡＲＤ１、ＢＲＣＡ１およびＡｕｒｏｒａ  Ｂ発現の比較を示す。免疫組織化学検査にはＢＡＲＤ１（Ｎ１９およびＣ２０）およびＣ末端特異的抗体ｐ８、ＢＲＣＡ１およびＡｕｒｏｒａ  Ｂ抗体染色を用いた。表示ｎ＝核染色。
【図６】エクソン４における選択的スプライシングおよび／または転写開始を示す。（Ａ）エクソン（Ｅｘ）４、エクソン５、およびエクソン６内の順方向プライマー（左側）、およびエクソン１１における逆方法プライマー（右側）によって増幅されたＢＡＲＤ１の多様なフラグメントの図。プライマーの位置および増幅バンドの予想サイズを括弧内に表示する（ｂｐ）。（Ｂ）Ａで示したプライマーを用いた、男性（左図）および女性（右図）ＮＳＣＬＣ患者のヒト肺腫瘍組織（Ｔ）および正常腫瘍周辺組織（Ｎ）におけるＢＡＲＤ１転写物の増幅を示す。エクソン４内のプライマーによる増幅は相異なるサンプルで変動するものの、すべてのサンプルはエクソン５またはエクソン６におけるプライマーを用いて増幅することができることに留意されたい。ＢＡＲＤ１  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現の変動は、この領域において選択的スプライシングされたか、または選択的に開始された転写が原因であるかもしれない。
【図７Ａ−Ｄ】女性および男性患者の腫瘍組織（Ｔｕｍｏｕｒ）と腫瘍周囲組織（Ｎｏｒｍａｌ）のＢＡＲＤ１  ｍＲＮＡアイソフォーム発現の比較および相関を示す。男性１０例および女性１０例を含む、２０対の腫瘍組織／形態学的正常組織サンプルのＦＬ  ＢＡＲＤ１およびＢＡＲＤ１アイソフォームをスコアリングして提示した。発現はＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量した（「方法」の節を参照）。結果は数値の平均±ＳＥ（標準誤差）として数字で示す。（Ａ）腫瘍周辺組織と腫瘍組織におけるＦＬ  ＢＡＲＤ１およびアイソフォームの比較。アイソフォームβおよびκを除くすべての形態は腫瘍内で統計的に有意にアップレギュレートされる。（Ｂ〜Ｃ）男性（Ｂ）も女性（Ｃ）も、腫瘍組織中のＦＬ  ＢＡＲＤ１およびＢＡＲＤ１アイソフォームが腫瘍周辺組織よりも多い。
【図７Ｅ−Ｆ】（Ｄ／Ｅ）腫瘍組織（Ｄ）および正常組織（Ｅ）における男女間のＢＡＲＤ１発現の比較。腫瘍組織および腫瘍周辺組織において、ＢＡＲＤ１アイソフォームβおよびκは女性由来組織よりも男性由来組織の方により発現する。これは統計的に有意である。腫瘍組織および腫瘍周辺組織において、ＦＬ  ＢＡＲＤ１およびＢＡＲＤ１アイソフォームγ、ε、およびηが男性由来組織より女性由来組織の方により発現することもあるが、これは統計的に有意でない。（Ｆ）若年（＜６０歳）患者群と高齢（＞６０歳）患者群間のＦＬ  ＢＡＲＤ１およびアイソフォームの比較。若年（＜６０歳）患者ではＦＬ  ＢＡＲＤ１およびアイソフォームγがアップレギュレートされる。これは統計的に有意である。
【図８Ａ−Ｂ】結腸直腸癌におけるＢＡＲＤ１およびＢＲＣＡ１発現の免疫組織化学検査の例を示す。ＢＡＲＤ１抗体Ｎ１９、Ｃ２０、ＰＶＣ、ＷＦＳおよびＢＲＣＡ１を有する結腸直腸癌１４８例のサンプルに対して免疫組織化学検査を実施した。各症例について、すべてのサンプルを四分割画面の組織マイクロアレイとして提示した。免疫組織化学分析後、１４５サンプルが分析に適していた。  （Ａ）ＢＡＲＤ１およびＢＲＣＡ１に対する抗体を有する陽性染色例の頻度。４種類の抗体の陽性染色率にはそれぞれ変動があった。ＢＡＲＤ１  Ｎ１９およびＣ２０染色、さらにＢＲＣＡ１染色の頻度はより低かった。ＢＡＲＤ１  ＰＶＣおよびＷＦＳ陽性染色は、結腸直腸癌症例の大半に認められた。（Ｂ）結腸直腸癌におけるＢＡＲＤ１発現パターン。各症例についての陽性（＋）染色および陰性（−）染色に基づき、４つのＢＡＲＤ１抗体による発現パターンを得た。ＰＶＣおよびＷＦＳ陽性染色かつＮ１９およびＣ２０陰性染色が最も頻度の高い発現パターンであり、「４抗体すべて陽性」染色の頻度は２番目に高く、Ｎ１９陰性でありながらＰＶＣ、ＷＦＳおよびＣ２０陽性染色が３番目に高い頻度で認められる発現パターンであった。
【図８Ｃ】（Ｃ〜Ｆ）ＢＡＲＤ１抗体およびＢＲＣＡ１抗体を用いた免疫組織染色の例。ＢＡＲＤ１  Ｎ１９およびＣ２０は細胞質顆粒染色を示し、かつ同一細胞または領域内に共存した。ＢＡＲＤ１  ＰＶＣおよびＷＦＳ染色は細胞質拡散染色であった。ＢＲＣＡ１染色は細胞質および核顆粒染色であった。ＢＡＲＤ１抗体およびＢＲＣＡ１抗体に陽性染色（Ｃ）、Ｎ−１９およびＣ２０にわずかに染色（Ｄ）、４つのＢＡＲＤ１抗体すべてに陽性染色（Ｅ）およびＮ１９に陰性染色の例を示す。縮尺棒を表示する（上図＝２００μｍ；下図＝５０μｍ）。
【図８Ｄ】同上。
【図８Ｅ】同上。
【図８Ｆ】同上。
【図９Ａ−１】結腸直腸癌におけるＢＡＲＤ１とＢＲＣＡ１の特徴的な抗体染色の相関を示す。（Ａ）ＢＡＲＤ１  Ｎ１９、ＰＶＣ、ＷＦＳおよびＣ２０染色の相関。ＢＡＲＤ１  Ｎ１９とＣ２０染色は強く相関し、ＰＶＣとＷＦＳ、ＰＶＣとＣ２０、およびＷＦＳとＣ２０染色は弱く相関した。Ｎ１９とＰＶＣおよびＮ１９とＷＦＳには相関が認められなかった。
【図９Ａ−２】同上。
【図９Ｂ】（Ｂ）ＢＲＣＡ１とＢＡＲＤ１の抗体染色の相関。ＢＲＣＡ１染色は４つのＢＡＲＤ１抗体染色のいずれとも相関しなかった。
【図１０Ａ−Ｄ】結腸直腸癌におけるＢＡＲＤ１およびＢＲＣＡ１発現の特徴的エピトープの臨床的変数との相関を示す。ＢＡＲＤ１  Ｎ１９陽性染色の頻度は女性の方が高かった（Ｐ＝０．０１４）（Ａ）。ＢＡＲＤ１およびＢＲＣＡ１染色の種々の抗体に、腫瘍病理組織学分類（Ｇｒａｄｅ）（Ｂ）、腫瘍のサイズまたは近傍組織浸潤（Ｔｕｍｏｕｒ）（Ｃ）、リンパ節転移（Ｎｏｄｅ）（Ｄ）。
【図１０Ｅ−Ｆ】遠隔転移（Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）（Ｅ）および腫瘍病期（Ｓｔａｇｅ）（Ｆ）との相関は認められなかった。ｐ値はχ２検定により算出する。
【図１１】結腸直腸癌組織（Ｔ）および正常腫瘍周辺組織（Ｎ）におけるＢＡＲＤ１転写物の発現および構造を示す。（Ａ）エクソン１において順方向プライマーを用い、かつエクソン１１（Ｅｘ  １−１１）またはエクソン４（Ｅｘ  １−４）において逆方向プライマーを用いたＦＬ  ＢＡＲＤ１および／または切断アイソフォームの増幅。例として、男性患者５例および女性患者５例の腫瘍周辺組織と腫瘍組織の対を示す。標準として、同じサンプルのグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）発現を示す。分子量マーカー（Ｍ）を左に示す。推定されるＦＬ  ＢＡＲＤ１および切断されたアイソフォームを右に示す。腫瘍周辺および腫瘍組織は相異なるアイソフォームのパターン：腫瘍周辺組織における腫瘍組織よりも低い発現頻度を発現した。同様にＮＳＣＬＣにおいて同定された２つの新規アイソフォームκおよびπも結腸直腸癌において発現した。（Ｂ）同じサンプルにおけるエストロゲン受容体α（ＥＲα）の増幅、ＭＣＦ−７をポジティブコントロール（右）として用いた。結腸直腸組織では、男性および女性の腫瘍周辺組織にも腫瘍組織にもＥＲα発現は認められなかった。
【図１２】男性および女性結腸直腸癌患者の腫瘍組織（Ｔｕｍｏｕｒ）と腫瘍周囲組織（Ｎｏｒｍａｌ）のＢＡＲＤ１  ｍＲＮＡアイソフォーム発現の比較を示す。男性１０例および女性１０例を含む、結腸直腸癌の腫瘍組織／腫瘍周囲組織サンプル２０対のＦＬ  ＢＡＲＤ１および  ＢＡＲＤ１アイソフォームをスコアリングして提示した。発現は、各腫瘍周辺サンプルまたは腫瘍サンプルにおける（Ａ）、および各アイソフォーム（Ｂ、Ｃ、Ｄ）についての発現の有無に基づいて定量した。（Ａ）いずれかの形態のＢＡＲＤ１の有無に基づく男性、女性および混合サンプルを含む腫瘍周辺組織および腫瘍組織におけるＢＡＲＤ１発現の比較。腫瘍周辺より腫瘍由来組織の方が（ｐ＝０．０００３）、女性（ｐ＝０．００１０）でも男性（ｐ＝０．０６７９）でもＢＡＲＤ１発現量が多くかつ頻度が高かった。（Ｂ）腫瘍周辺組織と腫瘍組織におけるＦＬ  ＢＡＲＤ１とアイソフォームの発現の比較。すべての形態が腫瘍内で統計的に有意にアップレギュレートされた（すべてｐ＜０．０５）。（Ｃ／Ｄ）男性および女性に由来する結腸直腸組織におけるＦＬ  ＢＡＲＤ１とアイソフォームの発現の比較。腫瘍周囲組織（Ｃ）でも腫瘍組織（Ｄ）でも男性由来組織および女性由来組織におけるＦＬ  ＢＡＲＤ１およびアイソフォームの発現は同様であった（すべてｐ＞０．０５）。ｐ値はχ２検定により算出する。
【図１３Ａ−Ｄ】結腸直腸癌におけるＦＬ  ＢＡＲＤ１およびアイソフォームのｍＲＮＡ発現と臨床病理学的変数との相関を示す。（Ａ）若年（≦６０歳）患者と高齢（＞６０歳）患者間のＦＬ  ＢＡＲＤ１およびアイソフォーム発現の比較。ＦＬ  ＢＡＲＤ１およびアイソフォームβを除くすべてのアイソフォームは、若年患者よりも高齢患者でよりアップレギュレートされた。具体的には、アイソフォームφ、δおよびπの発現は高齢患者と有意に関連した（ｐ＜０．０１）。（Ｂ〜Ｅ）ＦＬ  ＢＡＲＤ１およびアイソフォームの発現と原発腫瘍およびリンパ節の状態、および腫瘍の病期および分類との相関。ＢＡＲＤ１アイソフォームκの発現は、大きな腫瘍サイズまたは近傍組織の浸潤（Ｂ）、リンパ節転移（Ｃ）、および末期（ステージＩＩＩおよびＩＶ）（Ｄ）と有意に関連した。
【図１３Ｅ】ＢＡＲＤ１アイソフォーム発現と腫瘍組織病理学分類の間に相関は認められなかった（Ｅ）。ｐ値はχ２検定により算出する。ｐ＞０．０５の比較は提示しなかった。
【図１４】血液または血清中のＢＡＲＤ１アイソフォーム特異抗体検出のためのＥＬＩＳＡ試験の例を示す。
【図１５】ＡＴＧおよびアイソフォームπにおける欠失連結部にプライマーを有するアイソフォームπの増幅を示す。エクソン２のさらなる欠失に由来する第２のアイソフォームπ’が同定される。
【図１６】ＨｅＬａ、ＭＣＦ７、ＲＰＥ１およびＮＬＦ細胞上の抗Ｂａｒｄ１抗体のウェスタンブロットを示す。Ａｂ  Ｂｅｔｈｙｌ  ＢＬ５１８（ＢＬ）はエクソン４中央部にコードされるエピトープを認識する。エクソン１におけるβ特異的選択的ＯＲＦによってコードされるエピトープに対してＡｂ  ＰＧＰが形成された。ＢＡＲＤ１アイソフォームβおよびＢＡＤＲ１アイソフォームβ−ｄ−５（β’）およびＢＡＲＤ１アイソフォームηを認識する。
【図１７】ＢＡＲＤ１アイソフォームのｓｉＲＮＡ抑制を示す。Ａ）ｓｉＲＮＡターゲット配列の位置。エクソン４内の２つのｓｉＲＮＡ、Ｋ４０１およびＫ４２３を用いた。Ｋ４０１はアイソフォームｐｉの欠失内に位置し、Ｋ４２３は欠失の上流にある。Ｂ〜Ｃ）Ｋ４０１はＫ４２３よりも増殖に対する影響が少なかった。Ｂ）ｓｉＲＮＡ発現をＧＦＰ発現と対にする。陽性細胞の多くはＤ４０１発現細胞中で増殖し、Ｋ４２３発現細胞中で増殖するものは少ない。Ｃ）成長曲線より、Ｋ４２３は、先に報告されたすべての形態のＢＡＲＤ１を標的とするＫ７８と同様に効率的に細胞増殖を抑制することが確認される。
【図１８】ＢＡＲＤ１およびＢＡＲＤ１アイソフォーム発現に影響するマイクロＲＮＡを示す。ＲＴ−ＰＣＲはあらゆる形態のＢＡＲＤ１がｍｉＲ−２０３によってわずかに抑制されることを示す。ウェスタンブロットは、ｍｉＲ−２０３の過剰発現によるＦＬ、βおよびπの強い抑制を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書に記載のものと同様または同等の方法および材料を本発明の実践または試験に用いることができ、適切な方法および材料は以下に記載される。本明細書で言及するすべての出版物、特許明細書、特許および他の参照文献は、その全文を本明細書に参照文献として援用する。本明細書に論じる出版物および特許明細書は、本明細書の出願日以前の開示のみを目的として提供される。本明細書中には、先行発明によって本発明がそのような出版物の日付に先行することが許されることの承認として解釈されるべき記載はない。さらに、材料、方法および実施例は例示的であるのみであり、制限的であることを意図していない。
【００１７】
抵触の場合、定義を含めて本明細書が管理する。
【００１８】
特に定義されない場合、本明細書で用いられるすべての技術的および科学的用語は、本明細書の主題が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に用いられる以下の定義は、本発明の理解を容易にすることを目的として提供される。
【００１９】
用語「含む」は、一般的に含むという意味で用いられ、すなわち１つまたはそれ以上の特性または構成要素の存在を許容する。
【００２０】
本明細書および請求項に用いられる単数形「１つの」「１つの」および「その」は、文脈が明確にそうでないと指示しない場合、複数という意味を含む。たとえば、１つのＢＡＲＤ１アイソフォームは少なくとも１つのＢＡＲＤ１アイソフォームを意味する。
【００２１】
本明細書に用いる用語「アイソフォーム」は、本発明におけるＢＡＲＤ１タンパク質などといった、同じタンパク質の相異なるいくつかの形態のうちのいずれかである。ＢＡＲＤ１といったタンパク質の相異なる形態は、関連遺伝子より産生されることもあれば、または同じ遺伝子から選択的スプライシングにより発生することもある。一塩基多型またはＳＮＰによって多数のアイソフォームが生成され、同じ遺伝子のアレル間の遺伝子的な差は小さい。これらは遺伝子内の特定の個別ヌクレオチドの位置によって発生する。
【００２２】
本明細書で用いる用語「対象」または「患者」は技術上十分認識されており、本明細書では哺乳類、最も好ましくはヒトを指すために用いられる。一部の実施形態においては、対象は治療を必要とする対象または肺癌および／または結腸直腸癌を有する対象である。しかし、他の実施形態においては、対象は肺癌および／または結腸直腸癌症状を発症していない正常対象であることも、または肺癌および／または結腸直腸癌に対する治療をすでに受けている対象であることもある。当該用語は特定の年齢または性別を示さない。したがって、男性であれ女性であれ、成人および新生児対象が包含されることを意図している。
【００２３】
本明細書で用いる用語「ペプチド」、「タンパク質」、「ポリペプチド」、「ポリペプチドの」、および「ペプチドの」は、互換的に、隣接する残基のα−アミノ基とカルボキシ基の間のペプチド結合によって他のアミノ酸残基と結合する一連のアミノ酸残基を指す。
【００２４】
予想されたこととは異なり、出願人は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）１００例および結腸直腸癌１６５例の患者コホートに由来する各サンプルに、驚くべきことにすでに既知のアイソフォームα、β、η、γ、ε、φ、δおよびθ以外に２つの追加的新規ＢＡＲＤ１アイソフォームを同定している。もう１つの驚くべき特性は、ＮＳＣＬＣ  １００例および結腸直腸癌１６５例の患者コホートの各サンプル中にアイソフォームαが存在しなかったことである。これらの新規アイソフォームはκおよびπと表示された。実際に、ＮＳＣＬＣおよび結腸直腸癌の腫瘍組織においてＢＡＲＤ１アイソフォームは同様のパターンを発現し、それらはすべて、婦人科癌で同定されたＢＡＲＤ１アイソフォーム（国際公開第２００８／１１９８０２号）と異なる２つの新規アイソフォームκおよびπを発現した。この所見は、ＢＡＲＤ１の異常な発現は、女性ホルモン依存性組織と女性ホルモン非依存性組織で異なることもありうることを示した。
【００２５】
新規アイソフォームκはエクソン３の欠失を担持し、エクソン２からエクソン４への翻訳はインフレームでないが、エクソン４内で翻訳が開始されることもある。生成するタンパク生成物は抗体反応性がアイソフォームβと同様となるであろう。
【００２６】
新規アイソフォームπは、エクソン４内のアミノ酸３０１から４３６をコードする４０８ｂｐの欠失を担持する。アイソフォームπを翻訳すると、抗体ＰＶＣおよびＷＦＳと反応するが重要なＮＬＳを欠くタンパク質が生成されるであろう（図４Ｃ、Ｅおよび図６）。アイソフォームπは、エクソン４の部分的欠失を生成するが、エクソン１〜３およびエクソン４の開始部分を保持することでＢＲＣＡ１結合ＲＩＮＧフィンガードメインを維持する新規スプライシング機構に由来する。アイソフォームπはエクソン１から３およびエクソン４の開始部分を保持するので、他のいかなるアイソフォームにも認められないエピトープの組み合わせであるＰＶＣおよびＷＦＳによって認識されるエピトープを保持する。アイソフォームπは抗体ＰＶＣおよびＷＦＳを用いて検出することができ；これらの抗体はマウス末期肺腫瘍において染色の増加を示す。したがって、アイソフォームπはＮＳＣＬＣにおける腫瘍進行の発癌ドライバーとなりうる。アイソフォームπにおけるエクソン４の部分的欠失は、ＰＶＣおよびＷＦＳ染色の細胞質局在を説明することもありうる、数種類の癌関連変異およびＮＬＳ（図４Ｅ）を提供することから、重要な領域であることもありうる。異常な細胞内局在は、たとえばリン酸化およびタンパク質−タンパク質相互作用などのタンパク質修飾を変化させる可能性もある。
【００２７】
アイソフォームπは、腫瘍組織で有意にアップレギュレートされかつ腫瘍周辺組織には存在しないかまたはわずかに発現するに過ぎない唯一のアイソフォームである一方、他のすべてのＢＡＲＤ１アイソフォームは腫瘍組織および腫瘍周辺組織に同様に発現したことから（図４Ｂ；図７）、肺癌にとって特に重要とみられる。エクソン４の部分的欠失は、細胞質局在を説明することもありうるＢＡＦＤ１に対して重要なＮＬＳの欠乏につながる。
【００２８】
エクソン２の欠失に由来するもう１つのアイソフォームπ’は、肺癌および結腸直腸癌においてアイソフォームπと共発現していた。
【００２９】
出願人は、腫瘍組織および正常腫瘍周囲組織においてＦＬ  ＢＡＲＤ１（ＢＡＲＤ１全長）およびスプライシングアイソフォームが発現し、かつ腫瘍の開始および進行に寄与することもありうることを示した。しかし、アイソフォームπは腫瘍に特異的に発現し、発癌の進行に関与するかもしれない。ＦＬ  ＢＡＲＤ１はｍＲＮＡレベルで発現するものの、ＦＬ  ＢＡＲＤ１のタンパク質翻訳はない。したがって、タンパク質レベルでは、ＮＳＣＬＣ  １００例および結腸直腸癌１６５例の患者コホートに由来する各サンプルにＢＡＲＤ１アイソフォームは発現するが、ＦＬ  ＢＡＲＤ１は発現しない。アイソフォーム発現および局在はＢＲＣＡ１と相関せず、両種類の癌においてＢＲＡＣＡ１−ＢＡＲＤ１ヘテロ二量体のＥ３ユビキチンリガーゼ機能が損傷されることを示す。ＢＲＣＡ１タンパク質の安定性および局在は、ＢＡＲＤ１に大きく依存する。ＦＬ  ＢＡＲＤ１の不在はＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１の腫瘍サプレッサー機能の不在を引き起こし、ゲノムの不安定性およびアポトーシスへの抵抗性につながる。このＦＬ  ＢＡＥＤ１減少作用以外にも、選択的スプライシングＢＡＲＤ１アイソフォームの過剰発現は腫瘍発生のドライバーとなりうる。
【００３０】
選択的スプライシングは肺癌において頻繁に認められる現象であり、多くの調節タンパク質について証明されている。スプライシングアイソフォームは、拮抗的機能を有する異常タンパク質アイソフォームに翻訳されることがある。これは、Ａｕｒｏｒａ  Ｂを安定化させることによる、およびＥＲαに対してのＦＬ  ＢＡＲＤ１機能に拮抗的に作用する２つのＢＡＲＤ１スプライシング変異体ＢＡＲＤ１βおよびＢＡＲＤ１γについて証明されている。したがって、ＮＳＣＬＳにおけるＢＡＲＤ１アイソフォーム発現は単なる傍観者ではないこともありうるが、しかし腫瘍発生のドライバーとなりうる。実際、マウス肺癌誘発モデルでは、抗体ＰＶＣおよびＷＦＳによってそれぞれ認識されるエクソン３および４に位置するエピトープの発現が肺腫瘍の侵襲期に増加する（図３）。
【００３１】
すべての肺腫瘍組織および腫瘍周囲組織サンプルは婦人科癌に認められるアイソフォーム；具体的にはアイソフォームδも発現する。ＢＡＲＤ１アイソフォームδは、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１ヘテロ二量体の機能とは反対に、ＥＲαと結合およびこれを安定化する。ＥＲαもすべてのサンプルに発現するので、ＢＡＲＤ１アイソフォームはエストロゲンによってアップレギュレートされかつ肺癌のエストロゲンシグナリングに関与することもありうる。したがって、いくつかのＢＡＲＤ１アイソフォームは発癌と関連するとみられる。
【００３２】
癌細胞は増殖するためにＢＡＲＤ１またはＢＡＲＤ１アイソフォームを必要とするため、ＮＳＣＬＣおよび結腸直腸癌におけるＢＡＲＤ１アイソフォーム発現は単なる傍観者ではなく、腫瘍発生のドライバーとなりうる。特に、エクソン３および４に位置するエピトープを発現するアイソフォームは、ＮＳＣＬＣにおいても結腸直腸癌においても短い生存と相関するとみられる。これらのエピトープは、マウス肺癌モデルの侵襲的腫瘍においてアップレギュレートされた。ＮＳＣＬＣおよび結腸直腸癌で発現するＢＡＲＤ１アイソフォームは選択的スプライシングに由来する。たとえば、スプライシングアイソフォームは拮抗的機能を有する異常タンパク質アイソフォームに翻訳されることもある。
【００３３】
すべての肺腫瘍サンプルおよび腫瘍周囲組織サンプルはＥＲαおよびアイソフォームδを発現する。しかし、結腸直腸癌連続症例にＥＲα  ｍＲＮＡ発現はなく、かつＢＡＲＤ１アイソフォーム発現および性別に差異は認められなかった。
【００３４】
しかし、興味深いことに、結腸直腸癌においてＮ１９陽性染色の高い頻度は女性と有意に関連し（ｐ＝０．０１４）、かつこの所見はＮＳＣＬＣにおける女性と相関するＢＡＲＤ１  Ｎ末端エピトープの発現と一致する（統計的有意性は境界的で、ｐ＝０．０５１）。ＮＳＣＬＣにおいては、ＢＡＲＤ１アイソフォームγ、ε、およびηは女性において高いｍＲＮＡレベルの発現が認められた一方、アイソフォームβおよびκは男性において過剰発現した。アイソフォームγおよびεの発現はＢＡＲＤ１  Ｎ１９で検出することができたが、アイソフォームβ、κおよびηは検出できなかった。したがって、ＢＡＲＤ１アイソフォーム発現のタンパク質レベルとｍＲＮＡレベルは互換的であり、これらの癌において性別特異的ＢＡＲＤ１アイソフォームが発現することを示唆した。
【００３５】
ＢＡＲＤ１アイソフォームは、ＮＳＣＬＳと結腸直腸癌において腫瘍周辺組織と比較して異なる腫瘍組織の発現パターンを示した。ＮＳＣＬＣにおいては、アイソフォームπを除くすべてのアイソフォームが腫瘍周辺組織に発現し、腫瘍組織ではわずかな上昇に過ぎなかったが、良性肺疾患より採取した対照組織においては、いずれの形態のＢＡＲＤ１も発現がより低いかまたは発現が認められなかった。一方結腸直腸癌では、ＢＡＲＤ１アイソフォームの発現頻度は腫瘍組織の方が高かったが、腫瘍周辺組織の発現頻度はより低いかまたは発現しなかった。この結果は、外部刺激または一定の病理学的条件および／または肺と結腸直腸組織間のＥＲα発現の差に対応し、細胞の種類の違いに応じた選択的スプライシングの多様なモジュレーションによって説明されることもありうる。
【００３６】
ＰＶＣ抗体またはＷＦＳ抗体のいずれかまたはその両者によって得られた陽性染色は、ＮＳＣＬＣ患者の生存の減少と相関する。しかし、結腸直腸癌における４抗体陽性染色パターン、さらにはＮ１９陽性染色の例はより長い生存と有意に相関し；その一方ＰＶＣおよびＷＦＳ陽性染色パターンはより短い生存と強く相関したが、その個々の陽性染色は相関しなかった。事実、相異なる発現パターンは相異なるＢＡＲＤ１アイソフォームの発現のみならず、アイソフォームの組み合わせも反映する。ＢＡＲＤ１発現の種々のエピトープの相関に応じて、いくつかのＢＡＲＤ１アイソフォーム：ＮＳＣＬＣおよび結腸直腸癌の両者におけるＮ末端およびＣ末端切断型および内部欠失型、および結腸直腸癌におけるさらなる形態のＮ末端消失が認められるとみられる。４抗体陽性染色発現パターンはアイソフォームπの発現を示さないが、ＢＡＲＤ１の相異なるアイソフォームの同時発現を反映しているかもしれない。
【００３７】
実際に、ＢＡＲＤ１アイソフォームπの発現は、他のアイソフォームには認められないエピトープの組み合わせであるＰＶＣおよびＷＦＳによって認識されるエピトープと一致する。事実、ＰＶＣおよびＷＦＳ染色は細胞質染色である。ＰＶＣおよびＷＦＳの発現はＮＳＣＬＣおよび結腸直腸癌において予後不良と明らかに関連し、ＰＶＣおよびＷＦＳ染色はマウス肺癌モデルにおいても癌の進行と相関した。
【００３８】
ＰＶＣおよびＷＦＳ反応性エピトープの強い発現は、Ｎ末端およびＣ末端エピトープの弱い発現と一致したが、これらのエピトープが立体化学的配置および／またはタンパク質−タンパク質相互作用によって遮断されることを示すこともありうる。転写後調節またはＦＬ  ＢＡＲＤ１とＢＡＲＤ１アイソフォームの間のタンパク質安定性の違いも、ＦＬ  ＢＡＲＤ１がｍＲＮＡレベルで存在しながらタンパク質レベルでは存在しないことを説明することもありうる。
【００３９】
出願人は、ＢＡＲＤ１アイソフォームの発現はＮＳＣＬＣおよび結腸直腸癌で共通であることを証明した。これらのアイソフォームの発現は、ＮＳＣＬＣおよび結腸直腸癌において、予後不良または予後向上のいずれかの予後と有意に関連し、かつＢＡＲＤ１アイソフォームが腫瘍発生、進行および致死性に関与することを強く示唆する。したがって、ＢＡＲＤ１およびそのアイソフォームは、より積極的な治療を行うために予後不良の可能性のある者を特定するためのみならず、有効な分子標的化療法を探索するための新たな方向を示すための、有望な診断および予後判定マーカーとなる可能性もある。たとえば、κおよびπなどのＢＡＲＤ１アイソフォームは、肺癌および結腸直腸癌治療のための新たな戦略のための標的となる可能性もある。
【００４０】
特異的アイソフォームκおよびπを検出することは、その後の補助的化学療法による治療の対象を選択する上で決定的な段階となるので、治癒的となる可能性のある外科療法の前および／または後のＮＳＣＬＣおよび結腸直腸癌による死亡のリスクが最も高い対象の特定にとって有用である。
【００４１】
本発明は、対象から採取した生物学的サンプル中の肺癌および結腸直腸癌に特異的なＢＡＲＤ１アイソフォームの存在を検出するための方法であって
配列番号１、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームπ、および
配列番号２、その生物学的活性フラグメント、または配列番号２と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームκ、
を含む群から選択される肺癌および結腸直腸癌に特異的なＢＡＲＤ１アイソフォームの少なくとも１つを前記サンプル中に検出する段階を含み、前記対象に由来するサンプル中の前記の肺癌および結腸直腸癌に特異的なＢＡＲＤ１アイソフォームの存在が、前記対象が肺癌および／または結腸直腸癌に罹患し、肺癌および／または結腸直腸癌のリスク上昇を有し、かつ／または肺癌および／または結腸直腸癌に対する治療後の再発のリスクを有することの指標であることを特徴とする方法を提供する。
【００４２】
好ましくは、検出する段階は、配列番号１、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームπ、および配列番号２、その生物学的活性フラグメント、または配列番号２と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームκの両者を検出する段階を含む、
【００４３】
また好ましくは、本発明の方法は前記生物学的サンプル中に、配列番号１からなるＢＡＲＤ１アイソフォームπおよび配列番号２からなるＢＡＲＤ１アイソフォームκを検出する段階を含む。
【００４４】
本発明の方法は、前記生物学的サンプル中に
配列番号１０５、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１０５と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームπ’、
配列番号５、その生物学的活性フラグメント、または配列番号５と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームβ、
配列番号６、その生物学的活性フラグメント、または配列番号６と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームδ、および
配列番号７、その生物学的活性フラグメント、または配列番号７と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームγ、
配列番号１０６、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１０６と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームβ’を含む群から選択されるＢＡＲＤ１アイソフォームの少なくとも１つを検出することをさらに含む。
【００４５】
好ましくは、本発明の方法は、前記生物学的サンプル中に
配列番号１０５、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１０５と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームπ’、
配列番号５、その生物学的活性フラグメント、または配列番号５と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームβ、
配列番号１０６、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１０６と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームβ’を含む群から選択されるＢＡＲＤ１アイソフォームの少なくとも１つを検出することをさらに含む。
【００４６】
また好ましくは、本発明の方法は、配列番号１からなるＢＡＲＤ１アイソフォームπ、配列番号２からなるＢＡＲＤ１アイソフォームκおよび配列番号５からなるＢＡＲＤ１アイソフォームβを前記生物学的サンプル中に検出する段階を含む。
【００４７】
本発明の文脈において、「生物学的活性フラグメント」は、たとえばＢＡＲＤ１アイソフォームの拮抗的機能などの、正常な機能にとって必要である本発明のＢＡＲＤ１アイソフォームの領域を指す。生物学的活性フラグメントは、全長ＢＡＲＤ１アイソフォームよりも少数のアミノ酸を含み、かつ少なくとも１つの拮抗活性を示す、配列番号１から７、１０５から１０６のアミノ酸配列と十分に相同であるかまたはこれに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。典型的には、生物学的活性フラグメントは、少なくとも１つの拮抗活性を有するドメインまたはモチーフを含む。本発明のＢＡＲＤ１アイソフォームの生物学的活性フラグメントは、たとえば長さが１０、２５、５０、１００個またそれ以上のアミノ酸残基であるポリペプチドであることができる。さらに、他の領域が欠失している他の生物学的活性フラグメントを組換え技術によって調製し、かつ本発明の天然ＢＡＲＤ１アイソフォームの１つまたはそれ以上の機能的活性について評価することができる。
【００４８】
たとえば、アイソフォームπの１つの生物学的活性フラグメントは配列番号３にあってもよく、アイソフォームκの生物学的活性フラグメントは配列番号４にあってもよく、かつアイソフォームβの活性フラグメントは配列番号４にあってもよい。
【００４９】
さらなる実施形態においては、本発明のＢＡＲＤ１アイソフォームは、配列番号１から７、１０５から１０６を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％、好ましくは９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１から７、１０５から１０６を含むＢＡＲＤ１アイソフォームの活性を保持するポリペプチドである。
【００５０】
２つのアミノ酸配列の相同性の百分率を決定することを目的として、最適比較のために配列を整合させる（例：第２のアミノ酸配列との最適アラインメントのために第１のアミノ酸配列にギャップを導入することがある）。次に、対応するアミノ酸位にあるアミノ酸残基を比較する。第１の配列における位置が第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基で占められている場合、分子はその位置において相同である。アラインメントおよび相同性百分率は、たとえば『分子生物学最新プロトコル』（F. M. Ausubel他（編）1987, Supplement 30, section 7.7.18）に記載されるもののような、技術上既知である任意の適切なソフトウェアプログラムを用いて判定することができる。好ましいプログラムはＧＣＧ  Ｐｉｌｅｕｐプログラム、ＦＡＳＴＡ（Pearson他、（1988）Proc. Natl, Acad. Sci USA 85:2444-2448）、およびＢＬＡＳＴ（『ＢＬＡＳＴマニュアル』Altschul他、Natl. Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med.（NCIB NLM NIH），Bethesda, Md.、およびAltschul他（1997）NAR 25:3389-3402）を含む。もう１つの好ましいアラインメントプログラムはＡＬＩＧＮ  Ｐｌｕｓ（サイエンティフィックアンドエデュケーションソフトウェアScientific and Educational Software、ペンシルベニア州）であり、デフォルトパラメータを用いることが好ましい。使用が確認されているその他の配列決定ソフトウェアプログラムは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅソフトウェアパッケージバージョン６．０（ウィスコンシン大学ジェネティクスコンピュータグループGenetics Computer Group、ウィスコンシン州マジソン）で利用可能であるＴＦＡＳＴＡ  Ｄａｔａ  Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  Ｐｒｏｇｒａｍである。
【００５１】
フラグメントは、本発明のＢＡＲＤ１アイソフォームの各配列と少なくとも４０％のアミノ酸の長さを共有する配列である。これらの配列は、たとえば拮抗活性などの、それらが由来する天然配列と同じ生物学的特性を示す限り使用することができる。好ましくは、これらの配列はその由来する各配列と長さ７０％を超える、好ましくは８０％を超える、具体的には９０％を超える、かつ最も好ましくは９５％のアミノ酸を共有する。これらのフラグメントは、たとえば化学合成などの技術上既知である多様な方法および技術によって調製することができる。
【００５２】
本発明はＢＡＲＤ１アイソフォームの変異体も包含する。変異体とは、天然配列ペプチドまたはポリペプチドとある程度異なるアミノ酸配列であって、保存的アミノ酸置換によって天然配列から変異し、これにより１つまたはそれ以上のアミノ酸が同じ性質および立体配置的役割を有する他のアミノ酸によって置換されるアミノ酸配列である。アミノ酸配列変異体は、天然アミノ酸配列のアミノ酸配列中の一定の位置に置換、欠失、側鎖修飾および／または挿入を有する。本明細書においては、保存的アミノ酸置換は以下の５群のうち１つの中での交換と定義する：
Ｉ．小分子脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ
ＩＩ．極性、正荷電残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
ＩＩＩ．極性、負荷電残基：およびそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
ＩＶ．大分子、芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
Ｖ．  大分子、脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ。
【００５３】
一部の非在来アミノ酸も、天然産生アミノ酸の適切な置換基となりうることを理解すべきである。たとえば、Ｌｙｓ残基はオルニチン、ホモアルギニン、ｎｏｒ−Ｌｙｓ、Ｎ−メチル−Ｌｙｓ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌｙｓ、およびＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−Ｌｙｓによって置換しうる。Ｌｙｓ残基は、Ｎ−１−（２−ピラゾリニル）−Ａｒｇ、２−（４−ピペリニル）−Ｇｌｙ、２−（４−ピペリニル）−Ａｌａ、２−［３−（２Ｓ）ピロリニニル］−Ｇｌｙおよび２−［３−（２Ｓ）ピロリニニル］−Ａｌａを含むがこれに限定されない合成塩基性アミノ酸によって置換することもできる。Ｔｙｒ残基は、４−メトキシチロシン（ＭｅＹ）、メタ−Ｔｙｒ、オルト−Ｔｙｒ、ｎｏｒ−Ｔｙｒ、１２５１−Ｔｙｒ、モノ−ハロ−Ｔｙｒ、ジ−ハロ−Ｔｙｒ、Ｏ−スルホ−Ｔｙｒ、Ｏ−ホスホ−Ｔｙｒ、およびニトロ−Ｔｙｒによって置換しうる。
【００５４】
Ｔｙｒ残基は、３−ヒドロキシルまたは２−ヒドロキシル異性体（それぞれメタ−Ｔｙｒまたはオルト−Ｔｙｒ）および対応するＯ−スルホおよびＯ−ホスホ誘導体によっても置換しうる。Ｔｙｒ残基は、４−ヒドロキシメチル−Ｐｈｅ、４−ヒドロキシフェニル−Ｇｌｙ、２，６−ジメチル−Ｔｙｒおよび５−アミノ−Ｔｙｒを含むがこれに限定されない合成ヒドロキシル含有アミノ酸によって置換することもできる。脂肪族アミノ酸は、ｎが１から最高８までの数字である非天然脂肪族分岐または線形側鎖ＣｎＨ２ｎ＋２を担持する合成誘導体によって置換しうる。非在来アミノ酸による適切な保存的置換の例は、国際公開第０２／０６４７４０号に示される。
【００５５】
挿入は、１つまたはそれ以上の天然産生または非在来アミノ酸残基の付加を包含する。欠失は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の欠失を包含する。
【００５６】
さらに、天然ペプチド（Ｌ型）の固有の問題は天然プロテアーゼによる分解であることから、本発明の生理学的活性タンパク質はペプチドのＤ型および／または「レトロ−インベルソ異性体」を含むよう調製されることもある。好ましくは、本発明の生理学的活性タンパク質の短い一部、変異体または組み合わせのレトロ−インベルソ異性体が調製される。レトロ−インベルソペプチドは、たとえばFASEB J. 1997 May;11(6):449-56に公表された総説においてSelaおよびZismanが報告した既知の配列のペプチドについて調製する。「レトロ−インベルソ異性体」は、配列の向きが逆転しかつかつ各アミノ酸残基のキラリティが反転し；これにより末端基の相補性がない線型ペプチドの異性体を意味する。
【００５７】
本発明は、１つまたはそれ以上のペプチド結合が、ペプチダーゼによる開裂に感受性のない代替的な種類の共有結合（「ペプチドミメティクス」）によって置換されている類似体も含む。対象に注射した後でペプチドがタンパク質分解により分解することが問題である場合、特に感受性の高いペプチド結合を非開裂性ペプチドミメティクスで置換すれば、生成するペプチドは活性物質としてより安定であり、かつこれによってより有用となるであろう。そのようなミメティクス、およびペプチドにそれらを組み入れる方法は技術上周知である。
【００５８】
生物学的サンプルは、好ましくは生検サンプル、組織学サンプル、肺液、凍結組織サンプル、腫瘍組織サンプル、糞便サンプル、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）および血液サンプルを含む群から選択され；かつ対象は好ましくはヒトである。最も好ましくは、生物学的サンプルは対象より採取した血液サンプルに由来する血清である。
【００５９】
本発明のＢＡＲＤ１アイソフォームの存在を検出することは、タンパク質免疫染色、タンパク質免疫沈降、免疫電気泳動、免疫ブロット法、ＢＣＡタンパク質分析、ウェスタンブロット法、分光光度法などの従来法によって遂行することができる。ＢＡＲＤ１アイソフォームの存在は、ノーザンブロット法、ヌクレアーゼタンパク質分析法（ＮＰＡ）、インサイチューハイブリダイゼーション、および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）などの従来法によって、その対応するｍＲＮＡの存在を介して検出することもできる。好ましくは、ＢＡＲＤ１アイソフォーム特異的ＲＮＡは血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）中に検出される。
【００６０】
本発明の１つの実施形態においては、ＢＡＲＤ１アイソフォームの存在は本発明のＢＡＲＤ１アイソフォームに特異的な抗体を用いて検出される。前記抗体は、好ましくは配列番号１〜７、１０５〜１０６、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１〜７、１０５〜１０６と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含むＢＡＲＤ１アイソフォームの少なくとも１つと特異的に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体またはそのフラグメントである。また好ましくは、前記抗体は、配列番号１〜７、１０５〜１０６、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１〜７、１０５〜１０６と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＢＡＲＤ１アイソフォームの相異なるエピトープと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントの組み合わせである。好ましくは、前記エピトープはエクソン３および４である。
【００６１】
前記ポリクローナルまたはモノクローナル抗体または前記抗体の組み合わせは、好ましくは配列番号１および２、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１〜２と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含むＢＡＲＤ１アイソフォームの少なくとも１つと特異的に結合する。
【００６２】
たとえば、本発明のＢＡＲＤ１アイソフォームの検出を可能とする抗体は以下のものである：
−Ｎ１９、Ｃ２０およびＨ３００（サンタクルーズバイオテクノロジー、カリフォルニア州サンタクルーズ）、
−ＰＶＣおよびＷＳＦ（エクソン４の開始部）は、過去に報告された通りに（Irminger-Finger I他Mol Cell 8:1255-66, 2001; Feki A他Oncogene 24:3726-36, 2005; Hayami R他Cancer Res 65:6-10, 2005; Li L他Int J Biochem Cell Biol 39:1659-72, 2007; Redente EF他Anticancer Res 29:5095-101, 2009; Fabbro M他J Biol Chem 277:21315-24, 2002）生成および適用され、
−ＢＬ（ベシーラボラトリーズBethy Laboratories）、
−ＪＨ２およびＪＨ３（Gautier他、Cancer Rsearch, 2000）、
−ＰＧＰ（Ryser他、 Cancer Research, 2000）、
−出願人が生成したＥＬＳおよびＫＰＤ
−ＭＩＱ（Irminger-Finger他、JCB 1998）
【００６３】
検出は免疫組織化学検査によって遂行することができ、表１に要約される：
−ＢＡＲＤ１アイソフォームπは、Ｎ１９（またはＰＶＣまたはＭＩＱ）のいずれかおよびＢＬ（またはＷＦＳ）のいずれかに対して陽性でありかつＪＨ２に対して陰性でなければならない。アイソフォームπをπ’（ｐｉ−ｄ−２）と識別するためには、これはウェスタンブロット上でサイズによってのみ行うことができる。
−ＢＡＲＤ１アイソフォームκは、ＢＬ（またはＷＦＳ）に対して陽性でありかつＮ１９（またはＰＶＣまたはＭＩＱ）に対して陰性でなければならない。
−ＢＡＲＤ１アイソフォームβはＰＧＰ、およびＷＦＳまたはＢＬのいずれかに対して陽性でなければならない。アイソフォームβをβ’（β−ｄ−５）から識別するため、アイソフォームβはＥＬＳに陽性である。
−ＢＡＲＤ１アイソフォームδは、Ｎ１９に対して陽性でありかつＰＶＣ（またはＭＩＱ）のいずれかに対して陰性でありかつＢＬ（またはＷＦＳ）に対して陰性でなければならない。
−ＢＡＲＤ１アイソフォームγは、Ｎ１９およびＰＶＣ（またはＭＩＱ）のいずれかに対して陽性でありながらもＣ２０（またはＫＰＤ）に対して陰性でなければならない。
【００６４】
【表１】
0005938406.tif 000002
β−Ｄ−５はアイソフォームβ’の別名であり、かつｐｉ−Ｄ−５はアイソフォームπ’の別名である。
【００６５】
本発明の他の実施形態においては、前記ＢＡＲＤ１アイソフォームの存在は、配列番号１〜７、１０５〜１０６、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１〜７、１０５〜１０６と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含むＢＡＲＤ１アイソフォームの少なくとも１つをコードするｍＲＮＡのレベル（発現）を検出することによって検出される。好ましくは、前記ｍＲＮＡは配列番号１および２、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１〜２と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含むＢＡＲＤ１アイソフォームの少なくとも１つをコードする。前記ｍＲＮＡの発現は、好ましくは対象より採取した血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）においてインビトロで遂行される。
【００６６】
本発明のさらなる実施形態においては、前記ＢＡＲＤ１アイソフォームの存在は、対象から採取した血液サンプル、好ましくはヒト血清中に本発明のＢＡＲＤ１アイソフォームに特異的な自己免疫抗体の存在を検出することによって検出される。好ましくは、自己免疫抗体はＢＡＲＤ１アイソフォームπおよびκに特異的な抗体である。
【００６７】
本発明の文脈においては、「自己免疫抗体」または「自己抗体」は、本発明のＢＡＲＤ１アイソフォームが実際には対象に由来しているにも関わらず前記対象の免疫系が異物として認識する、これらのＢＡＲＤ１アイソフォームに向けられた自然発生抗体を指す。したがってこれらのＢＡＲＤ１アイソフォームは免疫応答を惹起する。好ましくは、前記ＢＡＲＤ１アイソフォームはアイソフォームπおよびκである。
【００６８】
自己免疫抗体は、たとえば種々のＥＬＩＳＡ技術、（抗体がプレート表面に固定されるか、または抗原がプレート表面に固定されて抗体を捕捉する）ラジオイムノアッセイなど（『イムノアッセイ』E. DiamandisおよびT. Christopoulus、アカデミックプレス社（Academic Press Inc.）、カリフォルニア州サンディエゴ、1996を参照）などの、技術上周知である従来のイムノアッセイによって検出することができる。特定の免疫学的特異性を有する抗体の検出のためのイムノアッセイは、一般に、試験される抗体と特異的な免疫学的反応性を示す試薬（抗原）の使用を必要とする。分析法の形式に応じて、この抗原は固形支持体に固定されることがある。抗体の存在について試験しようとするサンプル（たとえば血液サンプルなど）は、抗原と接触させられ、必要とされる免疫学的、特異性の抗体がサンプル中に存在すれば、それらは抗原と免疫学的に反応して抗体−抗原複合体を形成し、これらはその後検出されるかまたは定量的に測定される。
【００６９】
したがって、本発明の１つの実施形態によれば、前記ＢＡＲＤ１アイソフォームの存在は、対象より採取した血液サンプルにおいて前記ＢＡＲＤ１アイソフォームに特異的な自己免疫抗体の存在を検出することであって、前記ＢＡＲＤ１アイソフォームに特異的な前記自己免疫抗体を検出するために、配列番号１３〜８０を含む群から選択される少なくとも１つの抗原（ペプチド）、好ましくは少なくとも４つの抗原（ペプチド）を用いることを特徴とする検出することによって検出される。前記ＢＡＲＤ１アイソフォームは、アイソフォームα、β、β’、η、γ、ε、φ、δ、θ、π、π’およびκを含む群から選択される。好ましくは、前記ＢＡＲＤ１アイソフォームは、アイソフォームβ、β’、δ、γ、π、π’およびκを含む群から選択される。より好ましくは、前記ＢＡＲＤ１アイソフォームは、アイソフォームβ、π、およびκを含む群から選択される。最も好ましくは、前記ＢＡＲＤ１アイソフォームは、アイソフォームπおよびκを含む群から選択される。自己免疫抗体の検出は、好ましくは対照より採取した血液サンプルに対して、好ましくは血清においてインビトロで遂行される。
【００７０】
より好ましくは、ＢＡＲＤ１アイソフォームは肺癌および結腸直腸癌に特異的なアイソフォームπおよびκであり、かつ抗原は配列番号１６、１７、１８、２３、５９〜６７、６８、６９、７４、７５、７６〜８０を含む群から選択される。最も好ましくは、抗原は配列番号１６、１７、１８、２３、６８、６９、７４および７５を含む群から選択される。
【００７１】
１つの実施形態においては、本発明は、本発明のＢＡＲＤ１アイソフォームの存在を検出するための方法における使用のための、配列番号１３から８０を含む群から選択されるペプチドを提供する。
【００７２】
出願人らは、配列番号１３〜８０を含む群から選択される抗原が、アイソフォームα、β、β’、η、γ、ε、φ、δ、θ、π、π’およびκを含む群から選択されるＢＡＲＤ１アイソフォームに特異的な自己免疫抗体の存在の検出によって、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、神経芽細胞腫および白血病の中から選択されるその他の癌を検出するためにも用いることができることも証明している。たとえば、配列番号１３、１４、１５、２３、５９〜６７、６９、７０、７５〜８０を含む群から選択される抗原は、乳癌、卵巣癌および前立腺癌を検出するために有用であることがある。
【００７３】
したがって、さらなる実施形態において、本発明は、対象から採取された生物学的サンプル中にＢＡＲＤ１アイソフォームの存在を検出するための方法であって、前記ＢＡＲＤ１アイソフォームの存在が前記ＢＡＲＤ１アイソフォームに特異的な自己免疫抗体の存在を検出することによって検出されることを特徴とし、かつ前記サンプル中の前記ＢＡＲＤ１アイソフォームの前記存在が、対象が癌に罹患していることを示す指標であることを特徴とする方法における抗原としての使用のための、配列番号１３〜８０を含む群から選択されるペプチドを提供する。前記ＢＡＲＤ１アイソフォームは、アイソフォームα、β、β’、η、γ、ε、φ、δ、θ、π、π’およびκを含む群から選択される。
【００７４】
ＢＡＲＤ１アイソフォームに特異的な自己免疫抗体の存在を検出するために少なくとも１つの抗原を使用しなければならない。好ましくは少なくとも４つの抗原が用いられ；より好ましくは４から１０の抗原が用いられ；最も好ましくは４から６つの抗原が用いられる。
【００７５】
本発明の抗原は、ベースラインを得るためにネガティブコントロールサンプル（健常対象血液サンプル）を接触させることが可能であり、これにより癌対象と健常対象の識別が容易となる（実施例−肺癌患者血液中の抗ＢＡＲＤ１自己免疫抗体の検出を参照）。本発明の抗原は、任意に、明確な陽性結果を得るために、ポジティブコントロールサンプル（確認された癌血液サンプル）と接触させることもできる。
【００７６】
他の実施形態においては、対象に由来する血液サンプルを本発明のＢＡＲＤ１アイソフォーム、好ましくはπアイソフォームπおよびκまたはそのフラグメントと接触させることができる。その後、自己免疫抗体と前記ＢＡＲＤ１アイソフォームの間の特異的な結合は、自己免疫抗体と前記ＢＡＲＤ１アイソフォームの間の特異的結合の量に基づいた肺癌および／または結腸直腸癌の有無の判定を可能としながら検出することができる。自己免疫抗体の検出は、好ましくは対照より採取した血液サンプルに対して、好ましくは血清においてインビトロで遂行される。
【００７７】
代替的に、本発明の１つの実施形態によれば、本発明のＢＡＲＤ１アイソフォームの存在は
配列番号１〜７、１０５〜１０６、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１〜７、１０５〜１０６と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含むＢＡＲＤ１アイソフォームの少なくとも１つをコードするｍＲＮＡのレベルを検出すること、および
対象より採取した血液サンプル中に前記ＢＡＲＤ１アイソフォームに特異的な自己免疫抗体を検出することであって、かつ前記ＢＡＲＤ１アイソフォームに特異的な前記自己免疫抗体を検出するために配列番号１３〜８０を含む群から選択される少なくとも４つの抗原を用いることを特徴とする検出することによって検出される。
【００７８】
本発明は、本発明の方法におけるバイオマーカーとしての使用のための配列番号１、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む分離かつ／または精製したポリペプチド；および本発明の方法におけるバイオマーカーとしての使用のための配列番号２、その活性フラグメント、または配列番号２と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む分離かつ／または精製したポリペプチドをさらに提供する。
【００７９】
本発明は、ＢＡＲＤ１アイソフォームπ上の配列番号１４３に記載されるエピトープ（ＤＴＫＳＲＮＥＶＶＴＰＩＫＧＤＩＰＳＶＥＹＬＬＱＮＧＳ）と結合する抗体またはそのフラグメントも提供する。好ましくは、本発明は配列番号１４４に記載されるエピトープ（ＮＥＶＶＴＰＩＫＧＤＩＰＳＶＥＹ）と結合する抗体またはそのフラグメントも提供する。
【００８０】
本発明は、肺癌および結腸直腸癌を治療するおよび／または予防するための方法における使用のための配列番号１４３に記載されるエピトープと結合する抗体またはそのフラグメントをさらに提供する。好ましくは、本発明は肺癌および結腸直腸癌を治療するおよび／または予防するための方法における使用のための配列番号１４４に記載されるエピトープと結合する抗体またはそのフラグメントを提供する。
【００８１】
本発明は、肺癌および結腸直腸癌を治療するおよび／または予防するための方法における使用のための配列番号１〜７、１０５〜１０６、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１〜７、１０５〜１０６と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含むＢＡＲＤ１アイソフォームの少なくとも１つと特異的に結合し、かつ以下の抗体が除外されることを特徴とするポリクローナルまたはモノクローナル抗体またはそのフラグメントも包含する：Ｎ１９、Ｃ２０、Ｈ３００、ＰＶＣ、ＷＳＦ、ＢＬ、ＪＨ２、ＪＨ３、ＰＧＰ、ＥＬＳ、ＫＰＤ、ＭＩＱ。
【００８２】
同様に本発明に包含される、肺癌および結腸直腸癌を治療するおよび／または予防するための方法における使用のための、配列番号１〜７、１０５〜１０６、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１〜７、１０５〜１０６と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＢＡＲＤ１アイソフォームの相異なるエピトープと特異的に結合し、かつ以下の抗体が除外されることを特徴とする、抗体またはそのフラグメントの組み合わせ：Ｎ１９、Ｃ２０、Ｈ３００、ＰＶＣ、ＷＳＦ、ＢＬ、ＪＨ２、ＪＨ３、ＰＧＰ、ＥＬＳ、ＫＰＤ、ＭＩＱ。
【００８３】
本発明の抗体は、対象の組織サンプル、対象の体液、または対象の血液中の循環細胞において、配列番号１〜７、１０５〜１０５、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１〜７、１０５〜１０６と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含むＢＡＲＤ１アイソフォームを検出するためにも用いることができる。
【００８４】
好ましくは、前記ポリクローナルまたはモノクローナル抗体または前記抗体の組み合わせは、配列番号１および２、その生物学的活性フラグメント、または少なくとも９５％の配列番号１〜２相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含むＢＡＲＤ１アイソフォームの少なくとも１つと特異的に結合する。
【００８５】
本明細書で用いられる用語「抗体」は、抗体を合成するために用いられた抗原（たとえば本発明のＢＡＲＤ１アイソフォーム）またはこれと密接に関連する抗原とのみ相互作用（すなわち結合）する特異的な構造を有する免疫グロブリン分子を指す。さらに、抗体は、マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質の１つまたはそれ以上と結合する限り、抗体のフラグメントまたは修飾抗体であることもできる。たとえば抗体フラグメントは、そこにおいてＨ鎖およびＬ鎖由来のＦｖフラグメントが適切なリンカーで連結されているＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖまたは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であることもできる（Huston J. S.他（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-83）。より具体的には、抗体フラグメントは、パパインまたはペプシンを含む酵素で抗体を処理することによって生成することができる。代替的に、抗体フラグメントをコードする遺伝子を構築し、発現ベクターに挿入し、かつ適切な宿主細胞に発現させることもできる（Co M. S他（1994）J. Immunol. 152: 2968-76; Better M.およびHorwitz A. H.（1989）Methods Enzymol. 178: 476-96.; Pluckthun A.およびSkerra A.（1989）Methods Enzymol. 178: 497-515.; Lamoyi E.（1986）Methods Enzymol. 121 : 652-63.; Rousseaux J.他（1986）Methods Enzymol. 121 : 663-9.; Bird R. E.およびWalker B. W.（1991）Trends Biotechnol. 9:132-7などを参照）。
【００８６】
抗体は、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの多様な分子とのコンジュゲーションによって修飾することができる。修飾された抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。そのような修飾法は当該分野において一般的である。
【００８７】
代替的に、非ヒト抗体に由来する可変領域およびヒト抗体に由来する定常領域を有するキメラ抗体、または非ヒト抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域（ＦＲ）および定常領域を含むヒト化抗体を含むことができる。このような抗体は既知の技術を用いて調製することができる。ヒト化は、対応するヒト抗体の配列をげっ歯類の複数または１つのＣＤＲ配列で置換することによって実施することができる｛たとえばVerhoeyen他（1988）Science 239:1534-6などを参照）。したがって、このようなヒト化抗体はキメラ抗体であって、１つのヒト未変化ドメインを相当下回って非ヒト種に由来する対応する配列で置換されていることを特徴とするキメラ抗体である。ヒトフレームワークおよび定常領域に加えてヒト可変領域を含む完全なヒト抗体も用いることができる。そのような抗体は、技術上既知である多様な技術を用いて生成することができる。たとえばインビトロ法は、バクテリオファージ上に提示されるヒト抗体フラグメントの組換えライブラリーの利用を包含する（例：HoogenboomおよびWinter（1992）J. MoI. Biol. 227:381-8）。同様に、ヒト抗体は、たとえば内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたマウスなどのトランスジェニック動物に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによって生成することができる。これらの手法は、たとえば米国特許第６，１５０，５８４号；第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６などに記載される。このような抗体は既知の技術を用いて調製することができる。
【００８８】
本発明は、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ分子と結合する組換えｓｉＲＮＡ分子であって、前記一本鎖または二本鎖ＲＮＡ分子が配列番号１〜７、１０５〜１０６、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１〜７、１０５〜１０６と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含むＢＡＲＤ１アイソフォームの少なくとも１つをコードするｍＲＮＡを含み、かつこれにより前記ＢＡＲＤ１アイソフォームの発現が阻害されることを特徴とする、肺癌および結腸直腸癌を治療するおよび／または予防するための方法における使用のための組換えｓｉＲＮＡ分子も提供する。
【００８９】
好ましくは、前記ｍＲＮＡは、配列番号１および２、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１〜２と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含むＢＡＲＤ１アイソフォームの少なくとも１つをコードする。
【００９０】
本発明の文脈において、ｓｉＲＮＡ（ＲＮＡインターフェレントまたは小分子干渉ＲＮＡ）は、ＢＡＲＤ１アイソフォームの発現を阻害するかまたは減少させる。好ましくは、前記アイソフォームはπ、π’、κ、β、β’、δおよびγであり；より好ましくはπ、κ、βであり、かつ最も好ましくはπおよびκである。本明細書において、用語「ｓｉＲＮＡ」は、標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害する二本鎖ＲＮＡ分子を指す。通常、ｓｉＲＮＡは、配列番号１〜７、１０５〜１０６、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１〜７、１０５〜１０６と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含むＢＡＲＤ１アイソフォームの１つまたはそれ以上の発現に対するセンス核酸配列およびアンチセンス核酸配列を含む。
【００９１】
一般的に、ｓｉＲＮＡは分離することが可能である。「分離された」ｓｉＲＮＡはその元の環境から取出されるものである。たとえば、ｓｉＲＮＡは天然環境の一部でないベクターにクローニングされる場合に分離されるとみなされる。
【００９２】
ｓｉＲＮＡは完全に合成的に構築されかつ２つの相補的な一本鎖ＲＮＡより構成されるか、または生合成的に構築される。ｓｉＲＮＡは、単一の転写物が標的遺伝子に由来するセンス配列および相補的アンチセンス配列の両者を有するように構築される、（例：シングルヘアピンＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）。ＤＮＡがそこからＲＮＡが転写されるテンプレートである技術を含む、ｓｉＲＮＡを細胞に導入するための標準的な技術を用いることができる。
【００９３】
通常、一本鎖ＲＮＡ分子と結合するｓｉＲＮＡであって、前記一本鎖ＲＮＡ分子が、配列番号１〜７、１０５〜１０６、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１〜７、１０５〜１０６と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含むＢＡＲＤ１アイソフォームの少なくとも１つをコードするｍＲＮＡを含み、通常は一本鎖であるｍＲＮＡ転写物と会合することにより、これによって翻訳に干渉し、かつこれによりＢＡＲＤ１アイソフォームの発現に干渉することを特徴とするｓｉＲＮＡ。したがって、本発明のｓｉＲＮＡは、配列番号１〜７、１０５〜１０６、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１〜７、１０５〜１０６と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含むＢＡＲＤ１アイソフォームの少なくとも１つをコードするｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズするその能力によって定義することができる。
【００９４】
本発明の文脈においては、ｓｉＲＮＡは長さが好ましくは５００ヌクレオチド未満、好ましくは２００ヌクレオチド未満、より好ましくは１００ヌクレオチド未満、さらにより好ましくは５０ヌクレオチド未満、または最も好ましくは２５ヌクレオチド未満である。より好ましくは、ｓｉＲＮＡは長さが約１９から約２５ヌクレオチドである。ｓｉＲＮＡの阻害活性を促進するために、１つまたはそれ以上のウリジン（「ｕ」）ヌクレオチドを、標的配列のアンチセンス鎖の３’末端に付加することができる。付加する「ｕ」の数は少なくとも２個、一般的には２から１０個、好ましくは２から５個である。付加した「ｕ」は、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端で１本鎖を形成する。
【００９５】
本発明のｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ転写物と結合することのできる形態で細胞に直接導入することができる。これらの実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ分子は典型的には技術上既知の方法で修飾される。他の修飾も可能であり、たとえば、コレステロールコンジュゲートｓｉＲＮＡは向上した薬理学的特性を示している。Song他、Nature Med. 9:347-51（2003）。代替的に、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡをベクター内に担持することができる。
【００９６】
いくつかの有用なｓｉＲＮＡが同定されている。たとえば、エクソン９内のｓｉＲＮＡ（図１Ａおよび図４Ｅを参照されたい）は効率的でありかつ増殖停止につながる。他の実施例においては、エクソン４内でｓｉＲＮＡを用いることは、ＢＡＲＤ１アイソフォームπにとって重要である（図１７参照）。いくつかの有用なｓｉＲＮＡは：
Ｋ３４：ＣＡＴＴＣＴＧＡＧＡＧＡＧＣＣＴＧＴＧ（配列番号１０７）
Ｋ４２３：ＧＴＧＣＴＣＡＧＣＡＡＧＡＣＴＣＡＴＡ（配列番号１０８）
Ｋ４０１：ＡＡＧＴＣＴＣＴＴＴＡＣＣＡＴＴＧＧＣＴＧ（配列番号１０９）
Ｋ７８：ＡＡＧＴＧＴＡＴＧＣＴＴＧＧＧＡＴＴＣＴＣ（配列番号１１０）
である。
【００９７】
本発明は、肺癌および結腸直腸癌を治療するおよび／または予防するための方法における使用のための、配列番号１〜７、１０５〜１０６、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１〜７、１０５〜１０６と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含むＢＡＲＤ１アイソフォームの生物学的活性のモジュレーターをさらに提供する。好ましくは、前記ＢＡＲＤ１アイソフォームは、配列番号１および２、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１〜２と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００９８】
ＢＡＲＤ１アイソフォームの生物学的活性のモジュレーターは競合物質であることができる。好ましくは、前記競合物質は前記ＢＡＲＤ１アイソフォームとその受容体の間の相互作用を妨げることのできる化合物である。たとえば、競合物質は阻害物質または拮抗物質であることもある。用語「阻害物質」または「拮抗物質」は、タンパク質またはポリペプチドと結合することによってその機能を阻害する分子を指す。阻害物質または拮抗物質などの競合物質は、本発明のＢＡＲＤ１アイソフォームとその天然リガンドおよび／または受容体の間の相互作用を直接阻害し、受容体の生化学的または生物学的機能を妨げることができる。競合的阻害は、阻害物質の結合がリガンドの結合を阻害しかつリガンドの結合が阻害物質の結合を阻害する阻害の形態である。競合的阻害においては、阻害物質は反応を受けることなく天然リガンドと同じ活性部位に結合する。リガンド分子は阻害物資が活性部位にある間はそこに入ることができず、また阻害物質はリガンドがその部位にあるときそこに入ることができない。タンパク質の「生物学的活性または機能」は、多様な細胞機能を遂行し、かつ他の分子と特異的かつ強固に結合する能力を指す。
【００９９】
本発明の文脈においても、本発明のＢＡＲＤ１アイソフォームの生物学的活性のモジュレーターは、好ましくは遺伝子発現をモジュレートするマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であることができる。出願人らは、ＢＡＲＤ１が多くのマイクロＲＮＡの標的であることができることを確認した。特定のマイクロＲＮＡの外因的発現によってＢＡＲＤ１発現が抑制される（図１８参照）。より好ましくは、本発明の文脈においては、マイクロＲＮＡは：ｈｓａ−ｍｉｒ−１０ａ  ＭＩ００００２６６：（配列番号１１１）；ｈｓａ−ｍｉｒ−１０ｂ  ＭＩ００００２６７（配列番号１１２）；ｈｓａ−ｍｉｒ−１３０ａ  ＭＩ００００４４８（配列番号１１３）；ｈｓａ−ｍｉｒ−１３０ｂ  ＭＩ００００７４８（配列番号  １１４）；ｈｓａ−ｍｉｒ−１３４  ＭＩ００００４７４（配列番号１１５）；ｈｓａ−ｍｉｒ−１４４  ＭＩ００００４６０（配列番号１１６）；ｈｓａ−ｍｉｒ−１４８ａ  ＭＩ００００２５３（配列番号１１７）；ｈｓａ−ｍｉｒ−１４８ｂ  ＭＩ００００８１１（配列番号１１８）；ｈｓａ−ｍｉｒ−１５２  ＭＩ００００４６２（配列番号１１９）；ｈｓａ−ｍｉｒ−１８１ａ−２  ＭＩ００００２６９（配列番号１２０）；ｈｓａ−ｍｉｒ−１８１ａ−１  ＭＩ００００２８９（配列番号１２１）；ｈｓａ−ｍｉｒ−１８１ｂ−１  ＭＩ００００２７０（配列番号１２２）；ｈｓａ−ｍｉｒ−１８１ｂ−２  ＭＩ００００６８３（配列番号１２３）；ｈｓａ−ｍｉｒ−１９ａ  ＭＩ０００００７３（配列番号１２４）；ｈｓａ−ｍｉｒ−１９ｂ−１  ＭＩ０００００７４（配列番号１２５）；ｈｓａ−ｍｉｒ−１９ｂ−２  ＭＩ０００００７５（配列番号１２６）；ｈｓａ−ｍｉｒ−２０３  ＭＩ００００２８３（配列番号１２７）；ｈｓａ−ｍｉｒ−３０１ａ  ＭＩ００００７４５（配列番号１２８）；ｈｓａ−ｍｉｒ−３０１ｂ  ＭＩ０００５５６８（配列番号１２９）；ｈｓａ−ｍｉｒ−４５２  ＭＩ０００１７３３（配列番号１３０）；ｈｓａ−ｍｉｒ−４５４  ＭＩ０００３８２０（配列番号１３１）；ｈｓａ−ｍｉｒ−５１７ａ  ＭＩ０００３１６１（配列番号１３２）；ｈｓａ−ｍｉｒ−５１７ｃ  ＭＩ０００３１７４（配列番号１３３）；ｈｓａ−ｍｉｒ−５５３  ＭＩ０００３５５８（配列番号１３４）；ｈｓａ−ｍｉｒ−５７０  ＭＩ０００３５７７（配列番号１３５）；ｈｓａ−ｍｉｒ−５７６  ＭＩ０００３５８３（配列番号１３６）；ｈｓａ−ｍｉｒ−５７９  ＭＩ０００３５８６（配列番号１３７）；ｈｓａ−ｍｉｒ−５８０  ＭＩ０００３５８７（配列番号１３８）；ｈｓａ−ｍｉｒ−６１３  ＭＩ０００３６２６（配列番号１３９）；ｈｓａ−ｍｉｒ−６１８  ＭＩ０００３６３２（配列番号１４０）を含む群から選択される。
【０１００】
通常、マイクロＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡ転写物（ｍＲＮＡ）上の相補的配列と結合し、通常は翻訳抑制または標的の分解および遺伝子のサイレンシングを引き起こすことのできる、少なくとも２２ヌクレオチド、好ましくは約６０から約１００ヌクレオチドを有する短いリボ核酸（ＲＮＡ）分子である。
【０１０１】
本発明は、肺癌および結腸直腸癌を婦人科癌と識別するための方法であって前記方法が
配列番号１、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームπ、および
配列番号２、その生物学的活性フラグメント、または配列番号２と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むアイソフォームκ。
を含む群から選択される肺癌および結腸直腸癌に特異的なＢＡＲＤ１アイソフォームの少なくとも１つを対象から採取した生物学的サンプル中に検出する段階を含み、前記の肺癌および結腸直腸癌に特異的なＢＡＲＤ１アイソフォームの存在が肺癌および／または結腸直腸癌の指標であることを特徴とする方法をさらに含む。
【０１０２】
肺癌および結腸直腸癌を婦人科癌と識別するために有用な他の性質は、ＢＡＲＤ１アイソフォームαが肺癌および結腸直腸癌に不在であることである。ＢＡＲＤ１アイソフォームαのアミノ酸配列は、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５３８８１号明細書から既知である。したがって前記方法は、任意に、ＢＡＲＤ１アイソフォームα、その生物学的活性フラグメント、またはＢＡＲＤ１アイソフォームαと少なくとも９５％相同性を有する配列を前記サンプル中に検出することであって、前記ＢＡＲＤ１アイソフォームαの不在が前記対象が肺癌および／または結腸直腸癌に罹患していないことの指標であることを特徴とする検出することをさらに含む。
【０１０３】
好ましくは、婦人科癌は女性生殖系の各種悪性疾患の群である。最も多い種類の婦人科悪性疾患は子宮頸癌、卵巣癌、および子宮内膜（子宮体）癌である。他には膣の癌、外陰部の癌、妊娠性絨毛腫瘍、およびファロピウス管癌を含むより頻度の低い婦人科癌がある。本発明の文脈においては、乳癌も婦人科癌に含まれる。
【０１０４】
本発明は、肺癌および結腸直腸癌に特異的なＢＡＲＤ１アイソフォームの存在を対象より採取されるサンプル中に検出するためのキットであって、
少なくとも１つのポリヌクレオチドプライマーまたはプローブであって、前記ポリヌクレオチドプライマーまたはプローブが配列番号１〜７、１０５〜１０６、その生物学的活性フラグメント、および／または配列番号１〜７、１０５〜１０６と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＢＡＲＤ１アイソフォームをコードするポリヌクレオチドに対して特異的であることを特徴とするポリヌクレオチドプライマーまたはプローブ、および／または
配列番号１〜７、１０５〜１０６、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１〜７、１０５〜１０６と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含むＢＡＲＤ１アイソフォームの少なくとも１つの相異なるエピトープと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントの組み合わせ、および／または
配列番号１３から８０を含む群より選択される少なくとも１つのペプチドを含むキットをさらに提供する。
【０１０５】
好ましくは、前記ＢＡＲＤ１アイソフォームは、配列番号１〜２２、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１〜２と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１０６】
少なくとも１つのＢＡＲＤ１アイソフォームをコードするポリヌクレオチドは、配列番号８（アイソフォームπ）、配列番号９（アイソフォームκ）、配列番号１０（アイソフォームβ）、配列番号１１（アイソフォームδ）、配列番号１２（アイソフォームγ）、配列番号１４１（アイソフォームπ’）、配列番号１４２（アイソフォームβ’）を含む群から選択される核酸配列、好ましくは配列番号８および９を含む群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドである。
【０１０７】
プライマー、プローブおよび／または抗体は、他の必要な検出試薬とともにパッケージ化してキットの形態とすることができる。たとえば、核酸または抗体（固形マトリクスと結合されているか、またはそれらをマトリクスと結合させるための試薬と個別に包装されている）、コントロール試薬（ポジティブまたはネガティブ）、および／または検出可能な標識などとともに個別の容器にパッケージ化することができる。検出を遂行するための指示（例：書面、テープ、ＶＣＲ、ＣＤ−ＲＯＭなど）もキットに含めることができる。
【０１０８】
本発明はワクチンおよびワクチン接種法も包含する。たとえば、肺癌および／または結腸直腸癌に罹患した対象において前記癌を治療するかまたは予防する方法は、
配列番号１〜７、１０５〜１０６、その生物学的活性フラグメント、配列番号１〜７、１０５〜１０６と少なくとも９５％の相同性を有する配列、または免疫学的に活性なそのフラグメントを含む群から選択されるアミノ酸配列を含むＢＡＲＤ１アイソフォームの１つまたはそれ以上、
または配列番号１３から８０を含む群から選択されるペプチド（抗原）の１つまたはそれ以上を含むワクチン組成物を対象に投与することを包含することができる。
【０１０９】
好ましくは、前記ＢＡＲＤ１アイソフォームは、配列番号１〜２、その生物学的活性フラグメント、または配列番号１〜２と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ前記ペプチドは配列番号１６、１７、１８、２３、５９〜６７、６８、６９、７４、７５、７６〜８０を含む群から選択される。
【０１１０】
本発明の文脈においては、免疫学的活性フラグメントは、たとえばＢＡＲＤ１アイソフォームの１つのような天然発生タンパク質全長よりも長さが短いものの、全長タンパク質が誘導するものと類似した免疫応答を誘導するポリペプチドである。たとえば、免疫学的活性フラグメントは少なくとも長さが８残基であり、かつたとえばＴ細胞またはＢ細胞などの免疫細胞を刺激することができなければならない。免疫細胞の刺激は、細胞増殖、サイトカイン（例：ＩＬ−２）の同化、または抗体の産生によって測定することができる。たとえばHarlowおよびLane『抗体の使用：実験マニュアル』１９９８年コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、およびColigan他『免疫学最新プロトコル』１９９１〜２００６年ジョンウィレイアンドサンズ（John Wiley & Sons）などを参照されたい。
【０１１１】
本発明は、肺癌および／または結腸直腸癌に罹患している対象における前記癌の治療または予防のための医薬組成物であって、前記組成物が医薬品として有効な量の本発明の抗体を含むことを特徴とする前記組成物も含む。
【０１１２】
本発明は、肺癌および／または結腸直腸癌に罹患している対象における前記癌の治療または予防のための医薬組成物であって、前記組成物が医薬品として有効な量の本発明のｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする前記組成物をさらに含む。
【０１１３】
本発明は、肺癌および／または結腸直腸癌に罹患している対象における前記癌の治療または予防のための医薬組成物であって、前記組成物が医薬品として有効な量の本発明によるモジュレーターを含むことを特徴とする前記組成物をさらに包含する。好ましくは、前記モジュレーターは、遺伝子発現をモジュレートするマイクロＲＮＡである。
【０１１４】
「治療」は、治療的な処置および予防的または防止的手段の両者を含む。治療を必要とするものは、肺癌および／または結腸直腸癌などの障害をすでに有する者、さらには障害を予防しようとする者を含む。したがって、本明細書で治療しようとする哺乳類、好ましくはヒトは、肺癌および／または結腸直腸癌などの障害を有していると診断されていても、または障害の素因があるかまたは感受性があってもよい。
【０１１５】
本明細書で用いられる「予防」は、本発明に記載されたモジュレーター、ｓｉＲＮＡおよび／または抗体の投与によって、肺癌および／または結腸直腸癌のリスクが高い対象が実際に前記の癌を発症する確度または確率の低下がもたらされることを意味する。
【０１１６】
「医薬品として有効な量」は、ヒトまたは動物生体に投与されるとき検出可能な薬理的および／または生理的効果を誘発する活性成分（たとえば化学的または生物学的物質）を指す。
【０１１７】
それぞれの医薬品としての有効量は、治療しようとする個々の患者、治療しようとする疾患、および投与方法に依存することがある。治療は、通常は数時間、数日、または数週間の間隔をおいた、医薬組成物の複数回の投与を通常含む。本発明の抗体、ｓｉＲＮＡまたはモジュレーターといった活性成分の医薬品として有効な量の用量単位は、通常は治療しようとする対象の体重１ｋｇあたり０．００１ｎｇから１００ｍｇの範囲にある。本発明の活性成分の適切な用量は、受容者の年齢、性別、健康、および体重、共存治療がある場合はその種類、および所望の効果の性質に依存的となるであろうことが理解される。
【０１１８】
全身投与については、治療的に有効な量または用量は、始めはインビトロ分析によって推定することができる。たとえば、細胞培養において決定されたＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するためにある用量を動物モデルに処方することができる。そのような情報を用いてヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。
【０１１９】
初回用量は、技術上周知の技術を用いて、たとえば動物モデルなどのインビボデータから推定することもできる。当業者は、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化することも可能であり、また、当然ながら、治療しようとする対象、対象の体重、障害の重症度、投与の様態、および処方医の判断に依存するであろう。
【０１２０】
本発明において適用するところの「投与すること」は、医薬組成物の対象、好ましくはヒトとの接触を指す。
【０１２１】
医薬組成物は、たとえば静脈内、皮下または筋肉内注射または静脈内点滴による非経口的投与などのために、当業者に周知の医薬品として許容できる担体に溶解または分散しうる。
【０１２２】
非経口投与のための医薬組成物については、賦形剤、アジュバント、結合剤、崩壊剤、分散剤、滑沢剤、希釈剤、吸収促進剤、緩衝剤、界面活性剤、可溶化剤、防腐剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、注射用可溶化剤、ｐＨ調節剤などの任意の従来の添加剤を用いうる。
【０１２３】
活性化合物を加工して医薬品として使用できる製剤とすることを促進する許容できる担体、希釈剤およびアジュバントは、使用する用量および濃度において受容者に対して無毒性であり、かつリン酸、クエン酸およびその他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼチオニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンなどの単糖類、二糖類、およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例：Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【０１２４】
医薬組成物の投与の形態は全身的であっても局所的であってもよい。たとえば、そのような医薬組成物の投与は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、経皮、バッカル経路などの多様な非経口経路であっても、または移植デバイスを介してもよく、かつ蠕動性の手段によって送達してもよい。
【０１２５】
本発明の活性成分を含む医薬組成物は、生体吸収性マトリクスに組み入れるかまたは含浸するとともに、マトリクスをマトリクスの懸濁液、ゲルまたは固形支持体の形態で投与することもできる。さらに、マトリクスは生体ポリマーより構成されてもよい。
【０１２６】
徐放性製剤を調製することもある。徐放性製剤の適切な例は、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半浸透性マトリクスであって、当該マトリクスがたとえばフィルム、またはマイクロカプセルなどの成形物の形態にあるマトリクスを含む。徐放性マトリクスの例は、ポリエステル、ハイドロゲル（たとえばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ酪酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチルＬ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（登録商標）（酪酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なマイクロスフェア）などの分解性酪酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。
【０１２７】
インビトロ投与を目的として用いようとする製剤は無菌でなければならない。これは、たとえば無菌濾過膜による濾過などによって容易に達成される。
【０１２８】
当業者は、本明細書に記載された本発明が、具体的に記載されたもの以外の変法および変更を受け得ることを認識するであろう。本発明がその精神または不可欠な特性から乖離することなくそのような変法および変更をすべて含むことを理解すべきである。本発明は、本明細書に個別にまたは包括的に言及あるいは指示されたすべての段階、特性、組成物および化合物、および前記段階または特性のうち任意の２つまたはそれ以上の任意のすべての組み合わせも含む。したがって本開示は、すべての面において例示的であって制限的でないとみなすべきであり、本発明の範囲は付属の請求項によって示され、かつ意味内および同等性の範囲内で起こるすべての変更はその中に包含されることを意図している。
【０１２９】
前述の記載は以下の実施例と関連してより完全に理解されるであろう。しかしそのような実施例は、本発明を実施する方法の例示であり、かつ本発明の範囲を制限することを意図していない。
【実施例】
【０１３０】
（Ｉ−患者−肺癌）
異なる２つの医療機関でＮＳＣＬＣ患者１００例より腫瘍組織を採取した（表１）。すべての患者は情報を提供されかつ現地の倫理委員会より承認を得た。良性肺疾患症例８例（男性５例および女性３例、年齢範囲２４から６６歳（年齢中央値３８歳）；肺気腫５例、残りは肺結核およびカルチノイド異形成）を、ＢＡＲＤ１発現の対照サンプルとして用いた。
【０１３１】
ナポリの患者６０例中４８例より経過観察記録が入手できた；経過観察は１から６９ヶ月であった；２例の患者は周術期に死亡し、また１０例の患者についてのデータは入手できなかった。経過観察記録のある４８例のうち１７例は手術のみで治療され、４例は術後に化学療法を実施、１例は術後に化学療法と放射線療法を実施、患者７例は化学療法および放射線療法で治療し、４例は化学療法で治療し、また１例は放射線療法のみで治療し、また残り１４例は最終経過観察または死亡まで治療しなかった。これら４８例のうち３５例は死亡し、１３例は最終経過観察期間中にまだ生存していた。
【０１３２】
カリアリの４０例のうち１７例は経過観察記録を有し；経過観察は５から９５ヶ月間であり；最終経過観察期間（２０１０年３月）の時点で１１例がまだ生存し、患者６例は死亡した。手術日、化学療法または放射線療法開始日、または治療しない患者については診断日から最終経過観察または死亡までの全生存を算出した。
【０１３３】
（表１  患者の特性−肺癌）
【表２】
0005938406.tif 000003
【０１３４】
（患者の特性−結腸直腸癌）
病理学的診断は、熟練した病理医によりＷＨＯ基準に基づいて実施され、米国対癌合同委員会の分類にしたがって病期判定した。すべての患者は情報を提供されかつコンプライアンスおよび現地の倫理委員会の承認を得た。
【０１３５】
カリアリの２０例およびドイツの１４８例を含む合計１６８例の結腸直腸癌症例を検討した（表２）。腫瘍組織およびその隣接する形態学的に正常な組織（腫瘍周辺）サンプルを含むカリアリの２０例を、逆転写酵素ＰＣＲ検出のために用いた。ドイツの結腸直腸癌症例１４８例は、組織アレイ上の免疫組織学検査のために用いた。これら１６８症例は、結腸癌１０６例および直腸癌６２例より構成され、すべて腺癌であった。患者は男性９３例および女性７５例、診断時の年齢の範囲は３３から７８歳であった（年齢中央値６１歳）。２１例の患者がＩ期、ＩＩ期が３４例、ＩＩＩ期が５０例、およびＩＶ期が２３例であり；残り４０例は原発腫瘍または／および所属リンパ節または／および遠隔転移を評価することができなかったので病期不明である。１０例の患者が高分化（Ｇ１）腫瘍であり、中分化（Ｇ２）腫瘍１１６例、および低分化（Ｇ３）腫瘍３８例；残り２例の患者は分類不能（ＧＸ）であった。
【０１３６】
免疫化学染色用に用いた切片は、各症例についての４分割組織マイクロアレイであった。１４８例中７５例は経過観察記録があり、経過観察は１から７２ヶ月であり、また残り７３例の患者は生存データがなかった。経過観察記録を有するこれら７５例のうち２２例は死亡し、４８例は脱落し、また５例は最終経過観察期間中にまだ生存していた。
【０１３７】
（表２  結腸直腸癌の患者の特性）
【表３】
0005938406.tif 000004
【表４】
0005938406.tif 000005
【０１３８】
（免疫組織化学）
免疫組織化学検査は、ＢＡＲＤ１の相異なる領域およびＢＲＣＡ１に対する抗体を用いて、隣接する切片に対して実施した。
【０１３９】
使用されたＢＡＲＤ１の相異なる領域に対する抗体、すなわちＮ１９（エクソン１）（ｓｃ−７３７３）およびＣ２０（エクソン１１）（ｓｃ−７３７２）はサンタクルーズ（サンタクルーズバイオテクノロジー、カリフォルニア州サンタクルーズ）より購入し、ＰＶＣ（エクソン３）およびＷＳＦ（エクソン４の開始部）は過去に報告された通りに（Irminger-Finger I他、Mol Cell 8:1255-66, 2001; Feki A他、Oncogene 24: 3726-36, 2005; Hayami R他、Cancer Res 65:6-10, 2005; Li L他、 Int J Biochem Cell Biol 39: 1659-72, 2007; Redente EF他、Anticancer Res 29: 5095-101, 2009; Fabbro M他、J Biol Chem 277: 21315-24, 2002）生成および適用した。ＢＲＣＡ１に対する抗体はサンタクルーズからのものである（Ｄ１６；サンタクルーズバイオテクノロジー、カリフォルニア州サンタクルーズ）。ＨＲＰとコンジュゲートした二次抗体（ヤギ抗ウサギ抗体またはウサギ抗ヤギ抗体）を１：１００希釈で１時間室温で適用して染色を可視化した。ＤＡＢ染色は室温で２から１５分であった。スライドは、脱水およびマウンティングの前にヘマトキシリンで対比染色した。感度および特異性を確認するために、対照切片に対する一次抗体を省略して免疫化学検査を実施した。ＢＡＲＤ１またはＢＲＣＡ１の発現を定量するために、各腫瘍切片につき異なる４つの領域を選択し；陽性細胞の百分率と染色強度を合わせて各サンプルの平均スコアを算出した。３名が臨床データを全く知ることなく独立にこの定量を実施した。
【０１４０】
肺癌誘発マウスに対して実施した免疫組織化学検査については、処置マウスおよび年齢でマッチングした未処置マウスを１６、２４、および３２週間後に屠殺して腫瘍を切除し、２匹の対照マウスおよび３匹の腫瘍担持マウスに対してＰＶＣ、ＷＦＳ、およびＣ２０抗体を用いて免疫組織化学検査により分析した。分析および定量は、ヒトサンプルについて報告したものと同様であった。
【０１４１】
ホルマリン固定およびパラフィン包埋した５μｍ組織切片をキシレン中で脱パラフィンし、エタノール濃度を低下させることにより再水和した（１００％アルコール、９５％アルコール、７０％アルコール、ｄＨ２Ｏ）。抗原を回復するために切片を電子レンジで５分間煮沸し、また内因性ペルオキシダーゼをブロックした。スライドは、非特異的エピトープをＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）ブロッキングした後、加湿チャンバー中で一次抗体とともに４℃で１晩インキュベートした。ＢＡＲＤ１の検出のために用いた一次抗体は、それぞれエクソン１、３、４および１１を認識するＮ１９（ｓｃ−７３７３、サンタクルーズバイオテクノロジー）（１：２５希釈）、ＰＶＣ（１：１００希釈）、ＷＦＳ（１：１００希釈）、およびＣ２０（ｓｃ−７３７２、カリフォルニア州サンタクルーズ）（１：２０希釈）であり；ＢＲＣＡ１抗体はＢＲＣＡ１のＣ末端エピトープを認識するＣ２０（ｓｃ−６４２、サンタクルーズバイオテクノロジー）（１：１００希釈）であった。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした二次抗体（ヤギ抗ウサギ抗体またはウサギ抗ヤギ抗体）は、１：１００希釈で１時間室温で適用した。次に、室温で最長１５分間ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）染色させた。スライドは、脱水およびマウンティングの前にヘマトキシリンで対比染色した。感度および特異性を確認するために、対照切片に対する一次抗体を省略して免疫組織化学検査を実施した。
【０１４２】
ＢＡＲＤ１およびＢＲＣＡ１の発現レベルを半定量的に測定した。染色は、強度および染色腫瘍細胞の百分率を用いてスコアリングした。染色強度の数値および陽性細胞百分率を積算して最終染色スコアを得た。各抗体の合計染色スコアは０から１００であり、２５またはそれ未満の染色スコアは陰性染色（「−」）と定義し、２５超を陽性染色（「＋」）と定義し、合計染色スコア２５超から５０、５０超から７５、および７５超に応じて「＋」、「＋＋」、および「＋＋＋」と識別した。統計分析については、染色スコアを用いた相異なる抗体の染色の相関を除き、陽性症例と陰性症例の対比のみを考察した。各腫瘍切片について異なる４つの領域を選択し、臨床データについて知識を持たない３名の観察者（Ｙ，Ｚ；Ｌ，ＬおよびＪ，Ｗ）が独立にスコアリングした。
【０１４３】
（ＲＮＡ／ＲＴ−ＰＣＲ分析）
相異なるアイソフォームの発現を定性的に判定することおよびその構造を検討するためにＲＴ−ＰＣＲを実施した。トリゾール試薬を用いて凍結組織切片よりＲＮＡを分離した。クロロホルム（０．１ｍＬ）を添加し、４℃、１４，０００ｇでサンプルを１５分間遠心分離して相を分離した。水相はＲＮアーゼを含有しないエッペンドルフチューブに移し、ＲＮＡの沈殿のために等体積のイソプロパノールを添加した。ＲＮＡペレットを７５％エタノールで洗い、２０μＬのＲＮアーゼを含有しない水に溶解した。濃度を測定してＤ２６０／Ｄ２８０比が少なくとも１．８であることを確認した。
【０１４４】
逆転写のために、１μｇのＲＮＡを、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）を１μＬ、オリゴｄＴを１μＬ、ＤＴＴ（０．１Ｍ）を２μＬ、ファーストスタンドバッファーを４μＬおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩを１μＬ含有する逆転写酵素バッファー２１μＬ中で用いた。反応は６５℃で５分間、その後４２℃で２分間、４２℃で５０分間、および７０℃で１５分間実施した。ｃＤＮＡ２μＬを相異なるプライマーによるＰＣＲのテンプレートとして用いた。
【０１４５】
アニーリング温度５６℃および伸長時間１分を用い、プライマー５’−ＡＣＡＡＧＣＧＣＣＡＧＡＧＡＧＡＴＧＡＴ−３’（配列番号８１）および５’−ＧＡＴＧＴＧＧＧＡＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＡ−３’（配列番号８２）でエストロゲン受容体α（ＥＲα）を増幅した。プライマー５’−ＡＧＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＣ−３’（配列番号８３）および５’−ＧＴＡＴＣＴＡＧＣＧＣＣＡＧＣＡＴＣＧ−３’（配列番号８４）を用い、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を内部標準として増幅した。同サイズのＢＡＲＤ１フラグメント（エクソン１−１１には２０μＬ、エクソン１−４には１０μＬ、その他には５μＬ）の分析、およびＵＶ光の下で可視化のために臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）０．１μｇ／ｍＬを含有するアガロース／ＴＢＥゲル（ＦＬには０．８％、その他には１％）上で同体積のＰＣＲ生成物を用いた。
【０１４６】
臭化エチジウムを添加した１％アガロース／ＴＡＥゲル上でＰＣＲ生成物（１０μＬ）を分析し、ＵＶ光の下で可視化した。プライマーおよび条件の完全な一覧については表３を参照されたい。
【０１４７】
ＤＮＡの精製にはＱＩＡＥＸ  ＩＩキット（キアゲン、スイス、ホンブレヒティコン）を用いた。配列決定は、内部ＢＡＲＤ１プライマーを用いて実施した。
【０１４８】
（表３）
【表５】
0005938406.tif 000006
【０１４９】
（ＰＣＲの画像分析）
画像は、Ｊａｖａベースの画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅＪ（米国国立衛生研究所http://rsbweb.nih.gov/ij/）により操作した。ＰＣＲ生成物をアガロースゲルに付し、臭化エチジウム染色で可視化し、さらに写真撮影した。画像はＪＰＧファイルとして保存した後グレイスケールに変換して分析した。画像をＩｍａｇｅＪで開き、各画像に対して較正機能を非較正ＯＤに設定した後測定した。長方形ツールを用いて同じサイズのＰＣＲバンドの測定領域を描出した。サンプル中の目的バンドのサイズに近接するＤＮＡラダー内の同じサイズのバンドを用い、長方形領域の調節に基づき相異なるゲルにおいて比較的正確な数値を得た。ピーク面積を概観した。総曲線下面積に対する百分率としてのピーク面積の割合を用いて統計分析した。
【０１５０】
（総ＲＮＡ抽出、逆転写およびＰＣＲ）
相異なるアイソフォームの発現を定性的に示すことおよびその構造を決定するために、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＲＮＡ分離のプロトコルに従い、トリゾール試薬を用いて凍結組織切片由来のＲＮＡ分離物を得た。クロロホルム（０．１ｍＬ）を添加し、４℃、１４，０００ｇでサンプルを１５分間遠心分離して相を分離した。水相はＲＮアーゼを含有しないエッペンドルフチューブに移し、さらにＲＮＡの沈殿のために同体積のイソプロパノールを添加した。ＲＮＡペレットを７５％エタノールで洗い、２０μＬのＲＮアーゼを含有しない水に溶解した。濃度を測定してＤ２６０／Ｄ２８０比が少なくとも１．８であることを確認した。
【０１５１】
逆転写のために、１．５μｇのＲＮＡを、Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴ  ５×反応バッファーを５μＬ、オリゴｄＴ（５００μｇ／ｍＬ）を２μＬ、１０  ｍＭ  ｄＮＴＰを１．５μＬ、組換えＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼ阻害剤（２５ｕ／μＬ）を１μＬおよびＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（２００ｕ／μＬ）を１μＬ含有する最終体積２５μＬ中で用いた。反応物を７０℃で５分間、その後４２℃で６０分間および７０℃で１０分間インキュベートした。ｃＤＮＡ３μＬをＦＬ  ＢＡＲＤ１の増幅用のテンプレートとして用い、さらにｃＤＮＡ２μＬを多様なＢＡＲＤ１フラグメントの増幅のために用いた。最終体積５０μＬ中でＴａｑポリメラーゼを用いてＰＣＲを実施した。一次変性（９４℃、２分）および最終伸長（７２℃、１０分）はすべてのＰＣＲ反応について同じであった。アニーリング温度および伸長時間は、相異なるプライマーおよびＢＡＲＤ１について予想される生成物の長さに応じて可変であった（表３）。
【０１５２】
アニーリング温度５６℃および伸張時間１分を用い、プライマー５’−ＡＣＡＡＧＣＧＣＣＡＧＡＧＡＧＡＴＧＡＴ−３’（配列番号８１）および５’−ＧＡＴＧＴＧＧＧＡＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＡ−３’（配列番号８２）でエストロゲン受容体α（ＥＲα）を増幅した。プライマー５’−ＡＧＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＣ−３’（配列番号８３）および５’−ＧＴＡＴＣＴＡＧＣＧＣＣＡＧＣＡＴＣＧ−３’（配列番号８４）を用い、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を内部標準として増幅した。ＵＶ光の下でのＢＡＲＤ１のフラグメント（エクソン１−１１は２０μＬ、エクソン１−４は１０μＬ、その他は５μＬ）の可視化用に臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）０．１μｇ／ｍＬを含有するアガロース／ＴＢＥゲル（ＦＬは０．８％、その他は１％）上に、同体積のＰＣＲ生成物を装填した。
【０１５３】
ＲＴ−ＰＣＲ生成物のＤＮＡ精製のために、メーカーの指示書にしたがってＱＩＡＥＸ  ＩＩキット（キアゲン、スイス、ホンブレヒティコン）を用いた後、ＰＣＲに用いた順方向および逆方向プライマー、または重複配列が生成しない場合はフラグメント内の追加的プライマーにより配列を決定した。
【０１５４】
（マウスモデル）
Redente EF, Dwyer-Nield LD, Barrett BSらが報告した通りに、ＢＡＬＢ／ｃマウスに肺腫瘍を化学的に誘発した：ＩＮＦ−γ−／−マウスにおいて肺腫瘍の増殖を刺激し、ＩＬ−４Ｒα−／−マウスにおいて阻害した。Anticancer Res 29: 5095-101, 2009。週齢６〜８週の雄性マウスに、体重１ｇあたり１ｍｇのウレタンを週１回７週間腹腔内注射した。処置より１６、２４および３２週間後にマウスを屠殺した。肺組織および腫瘍を切除し、さらに免疫化学分析用に処理した。各時点につき３匹のマウスに由来する組織を分析した。
【０１５５】
（統計分析）
スピアマンの相関係数ρを用いてＢＡＲＤ１エピトープとＢＲＣＡ１エピトープの発現レベルの相関を評価した。χ２検定を用いて、腫瘍組織と腫瘍周辺組織の陽性例の百分率、およびＢＡＲＤ１発現陽性例の臨床変数との相関を比較した。ｔ−検定を用いて、ＢＡＲＤ１発現レベルの臨床変数との相関を測定した。生存との関連については、患者をそのＢＡＲＤ１発現レベルにしたがってさらに２つの群に配置した。カプラン−マイヤー法を用いて生存の差を推定し、ログランク検定で比較した。これらすべての計算については両側検定を実施し、かつｐ＜０．０５の数値は統計的に有意であると見なした。分析はＳｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （ＳＰＳＳ）  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓバージョン１３（ＳＰＳＳ社、イリノイ州シカゴ）を用いて実施した。
【０１５６】
（ＩＩ−結果）
１００例の患者に由来する相異なる種類、分類および病期を含めた腫瘍切片に対する免疫組織学検査を実施した（表１）。ＢＡＲＤ１の異なる４つのエピトープ（エクソン１、３、４および１１に位置する）を認識する抗体を用い、これは理論的に１６種類の染色パターンをもたらす可能性があった。驚くべきことに、少数の特徴的パターンのみが認められ、かつ大半の腫瘍において４つの抗体すべてについての染色が認められた（図１Ａ〜Ｅ）。隣接切片の染色より、腫瘍切片の相異なる領域および相異なる細胞内コンパートメントにおいて異なるエピトープが発現し（図１Ｂ〜Ｄ）、単一の腫瘍においてＢＡＲＤ１の相異なるアイソフォームが発現したことを示唆した。典型的には、ＢＡＲＤ１  Ｎ１９（エクソン１）およびＣ２０（エクソン１１）は細胞質顆粒染色を示し、かつ１つの腫瘍の同じ領域内に共存した。ＢＡＲＤ１  ＰＶＣ（エクソン３）およびＷＦＳ（エクソン４）免疫染色は拡散性でかつ細胞質内にあった。染色の強度および細胞内局在のこれらの差異は、４つのエピトープすべての発現が野生型ＢＡＲＤ１の発現ではなく、むしろ異なるアイソフォームの同時発現を反映することを示唆した。
【０１５７】
Ｎ１９とＣ２０の発現レベルは、ＰＶＣとＷＦＳについての場合そうであったように、互いに強く相関したが（図１Ｆ）、他の抗体染色パターンは相関しなかった。したがって、ＮＳＣＬＣにおいてはＮ末端およびＣ末端切断型、および内部欠失を有する形態が発現すると結論づけることができた。具体的には、ＷＦＳ染色がまれであった卵巣癌に認められたエピトープ発現パターンと対照的に、ＷＦＳ（エクソン４の５’末端）の染色は多くの肺癌においてアップレギュレートされた。
【０１５８】
隣接組織切片におけるＢＲＣＡ１とＢＡＲＤ１の共発現（図１Ｂ〜Ｄ）を検討した。ＮＳＣＬＣサンプルの６６．７％においてＢＲＣＡ１が発現したが、ＢＡＲＤ１エピトープのいずれの発現とも相関しなかった。ＢＲＣＡ１はＢＡＲＤ１と共発現しないので、これらのデータよりＮＳＣＬＣにおいてはＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１ヘテロ二量体の機能が失われていることが示唆される。
【０１５９】
腫瘍組織および正常腫瘍周辺組織においてＢＡＲＤ１発現が認められたものの、腫瘍の方がより上昇していた（図２Ａ、図５）。発現は、女性由来の腫瘍の方が男性患者に由来する腫瘍よりも全般的に高かった（図２Ｂ）。
【０１６０】
個々のＢＡＲＤ１エピトープの発現は、腺癌の方が非腺癌（扁平上皮癌および大細胞癌）よりも頻度が低かった（図２Ｃ）。しかし、抗体染色の腫瘍分類および病期との相関は認められなかった（データは示さず）。
【０１６１】
経過観察データのある患者６５例における個々のＢＡＲＤ１エピトープの発現および発現パターンと無病生存（ＤＦＳ）および全生存（ＯＳ）も評価した。個々のＰＶＣおよびＷＦＳ陽性染色を有する患者は、陰性染色を有する患者よりも有意に短いＤＦＳおよび短いＯＳを有した。最も重要なことに、ＰＶＣおよびＷＦＳが同時に陽性染色するパターンは、異なる組み合わせの患者と比較して非常により短い生存期間を示した。Ｎ１９、Ｃ２０および他の染色パターンとＤＦＳまたはＯＳの間のいずれにも相関は認められなかった。
【０１６２】
コックス比例ハザードモデルを用いた一変量および多変量分析を実施し、分析したマーカーが独立した予後判定有意性を有するか評価した。一変量分析においては、病期はＤＦＳおよびＯＳの予測を示した（表５）。病期および考えられる他の２つの予後判定因子である組織学的種類および患者の性別を多変量モデルに入れた。この後者の分析より、個別のＰＶＣおよびＷＦＳ陽性染色、ＰＶＣおよびＷＦＳ同時陽性染色パターン、および病期は、ＤＦＳおよびＯＳの両者について独立した予後判定有意性を保持した（表５）。
【０１６３】
（表４  経過観察データを有するＮＳＣＬＣ患者６５例における生存の一変量分析）
【表６】
0005938406.tif 000007
註：ＨＲ、ハザード比；９５％ＣＩ、９５％信頼区間；Ｐ、ｐ−値；ｐｏｓ、陽性染色；ｎｅｇ、陰性染色。ＡＣ、腺癌；ｎｏｎ−ＡＣ、扁平上皮癌および大細胞眼を含む；ｏｔｈｅｒｓ、その他すべての組み合わせ
【０１６４】
（表５  経過観察データを有するＮＳＣＬＣ患者６５例における生存の多変量分析）
【表７】
0005938406.tif 000008
註：ＨＲ、ハザード比；９５％ＣＩ、９５％信頼区間；Ｐ、ｐ−値；ｐｏｓ、陽性染色；ｎｅｇ、陰性染色。ＡＣ、腺癌；ｎｏｎ−ＡＣ、扁平上皮癌および大細胞癌を含む；ｏｔｈｅｒｓ、その他すべての組み合わせ。＊  ＨＲはモデル中の他のすべての予測因子（病理、病期および性別）について調節される。
【０１６５】
本発明の他の実施例においては、実験的に誘導された肺癌においてＢＡＲＤ１発現がモニタリングされることを特徴とする、ＢＡＲＤ１アイソフォームと肺癌の発生および進行との相関が示された。ＢＡＬＢ／ｃマウスにウレタンを複数回注射すると原発性肺癌が誘発され、腺癌に進行する。この処置によって１６週目に肉眼的な腫瘍がもたらされ；それらは２４週目に大きくなり、３２週間後には正常隣接組織に浸潤する。全病期における正常組織および腫瘍領域を選択し、抗体染色をスコアリングした（図３）。対照動物においては、ＰＶＣおよびＷＦＳの発現は一貫して弱く、またＣ２０は強かった。このパターンは１６週目の腫瘍でも同様であった。しかし、２４週目の腫瘍においては、ＰＶＣおよびＷＦＳ発現はＣ２０と比較して増加し、かつ３２週目の腫瘍においては高度にアップレギュレートされた。これらの実験より、ＢＡＲＤ１発現パターンは腫瘍発生の種々の段階で変化することが示され、かつエクソン３および４に位置するＢＡＲＤ１エピトープは腫瘍の促進および侵襲期への進行に関与しうることが示唆される。
【０１６６】
女性１０例および男性１０例のサンプルから、ＢＡＲＤ１コード領域の全長を増幅するプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより、ＮＳＣＬＣに発現する種々のアイソフォームの構造を決定した。腫瘍組織および正常腫瘍周辺組織よりＲＮＡを抽出した。良性呼吸器系病態を有する患者から正常肺対照組織を採取した。正常肺にはＢＡＲＤ１発現がないかまたは非常に低かった；ＲＴ−ＰＣＲ（図４Ａ）および免疫組織化学検査（データは示さず）では対照中に弱いＢＡＲＤ１発現のみが認められた。ＮＳＣＬＣ患者由来のＲＴ−ＰＣＲは、大半の腫瘍および腫瘍周辺サンプル中にＦＬ  ＢＡＲＤ１およびそのいくつかの相異なるアイソフォームの発現を示した。大半の症例においては、ＦＬ  ＢＡＲＤ１およびアイソフォームの個々の発現パターンは、正常腫瘍周辺組織と腫瘍組織で同一であった（図４Ｂ）。
【０１６７】
同様の分子量のアイソフォームを識別するために、エクソン１および４またはエクソン１および６を増幅するプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＦＬ  ＢＡＲＤ１に加えて、α（国際公開第２００８／１１９８０２）ではなく既知のアイソフォームβの発現、およびさらに２つの新規アイソフォームκおよびπ（図４Ｂ、Ｃ、Ｅ、図  ６、および図７）の発現が確認された。
【０１６８】
女性および男性症例においてＲＴ−ＰＣＲにより得られたアイソフォームの発現を定量した。ＢＡＲＤ１アイソフォームのタンパク質レベルでの有意なアップレギュレーションと対照的に、ＦＬおよびアイソフォームは腫瘍および腫瘍周辺組織で同様に発現した（図１Ａおよび図５）。アイソフォームＢＡＲＤ１βおよびκの発現は男性において女性と比較して有意にアップレギュレートされるのに対し（ｐ＜０．０５）、アイソフォームＢＡＲＤ１η、ＢＡＲＤ１γ、およびＢＡＲＤ１εは女性において男性と比較してアップレギュレートされた（図７）。
【０１６９】
本発明の他の実施例においては、女性および男性に由来するすべての肺組織で、正常および腫瘍周辺組織の両者においてＥＲα発現が認められ（図４Ｄ）、これはＢＡＲＤ１アイソフォームがＮＳＣＬＣにおけるエストロゲンシグナリングと関連することもありうることを示唆する。
【０１７０】
（ＩＩＩ−結果）
各症例につき４分割の組織マイクロアレイとして提示する、結腸直腸癌のパラフィン包埋組織サンプル１４８件に由来する腫瘍切片に対してＩＨＣを実施することにより、結腸直腸癌におけるＢＡＲＤ１発現を検討した（表２）。ＩＨＣ分析に適していたのは１４５例であり、またそれらを本研究で分析した。ＢＡＲＤ１の相異なる領域（エクソン１、エクソン３，エクソン４およびエクソン１１）に対する４つの抗体（それぞれＮ１９、ＰＶＣ、ＷＦＳおよびＣ２０）を用い、隣接組織切片上の相異なるＢＡＲＤ１エピトープを識別した（図１Ａ）。ＢＲＣＡ１のＣ末端エピトープに対するＢＲＣＡ１  Ｃ２０抗体を用いてＢＲＣＡ１発現も検討した。
【０１７１】
結腸直腸癌においては、４つの抗体の各陽性染色率には変動があった（図９Ａ）。ＢＡＲＤ１  Ｎ１９、ＰＶＣ、ＷＦＳおよびＣ２０染色は、それぞれ結腸直腸癌３６例（２４．８％）、１２２例（８４．１％）、１２９例（８９％）および６１例（４２．１％）において陽性と分類された。１４２例は少なくとも１つの抗体陽性染色が認められ、ＢＡＲＤ１の発現が全く認められなかったのは３例のみであった（図９Ｂ）。換言すれば、結腸直腸癌の９７．９％（１４５例中１４２例）は少なくとも１つのＢＡＲＤ１エピトープを発現していた。
【０１７２】
４つのエピトープの発現には原則的に１６の組み合わせが可能であるが、３つの主要な組み合わせのみが認められた（図９Ｂ）。結腸直腸癌におけるこれら３つのＢＡＲＤ１発現パターンは含んだ：中央部のエピトープのみの発現は最も頻度が高く（３８．６％）（図２Ｂ、Ｄ）、４つの抗体すべての染色が２番目に（１８．６％）（図８Ｂ、Ｃ、Ｅ）、Ｎ末端エピトープの消失が３番目に（１７．９％）（図８Ｂ、Ｆ）高い頻度で認められた発現パターンであった。
【０１７３】
ＮＳＣＬＣ組織におけるＢＡＲＤ１発現と同様、４抗体すべての染色は細胞質的であったが領域は異なっていた。ＢＡＲＤ１  Ｎ１９およびＣ２０は顆粒染色を示す一方、ＰＶＣおよびＷＦＳは拡散染色を示し、またそれらはそれぞれ同じ細胞または同じ領域で共存していた（図８Ｃ〜Ｆ）。これをさらに検討するため、各抗体を用いて得られた発現パターンを定量しかつ結果を比較した。Ｎ１９とＣ２０の発現レベルの間には強い相関が認められた（ρ＝０．７１；ｐ＝０．０００）。その他には、ＰＶＣとＷＦＳ（ρ＝０．３９；ｐ＝０．０００）、ＰＶＣとＣ２０（ρ＝０．３６；ｐ＝０．０００）、およびＷＦＳとＣ２０（ρ＝０．２７；ｐ＝０．００１）などの比較により弱いい相関が示された。Ｎ１９とＰＶＣおよびＮ１９とＷＦＳ染色には相関が認められなかった（図１０Ａ）。
【０１７４】
相異なるエピトープの発現レベル、細胞内局在、相異なる抗体を用いた染色強度、相異なるＢＡＲＤ１エピトープの相関または非相関発現、および相異なるＢＡＲＤ１エピトープに対する４つの抗体を用いた発現パターンから、結腸直腸癌においてはＮ末端およびＣ末端切断型、Ｎ末端消失型、および本研究で用いた抗体と反応性のある４つのエピトープを含む形態が発現したと結論づけることが可能であった。
【０１７５】
（ＩＶ−ＢＡＲＤ１とＢＲＣＡ１の非協調発現）
ＢＲＣＡ１染色は、ＢＡＲＤ１とは対照的に、同じ細胞の内部で細胞質染色も核顆粒染色も示した（図８Ｃ）。ＢＲＣＡ１陽性染色は結腸直腸癌の２２．１％（１４５例中３２例）に認められたのに対し、Ｎ１９陽性染色は２４．８％（１４５例中３６例）の症例に認められた。興味深いことに、Ｎ１９陽性例６１例のうちＢＲＣＡ１陽性でもあった例はわずか７例（１１．５％）であった。さらに、ＢＲＣＡ１発現とＢＡＲＤ１発現の特徴的エピトープの間に相関は認められなかった（図１０Ｂ）。これらの結果より、結腸直腸癌におけるＢＡＲＤ１発現はＢＡＲＤ１と協調しないことが証明された。
【０１７６】
（Ｖ−ＢＡＲＤ１タンパク質の発現の臨床病理学的特性および患者予後との相関）
Ｎ１９陽性染色の頻度は女性と有意に関連し（ｐ＝０．０１４）（図１１Ａ）、これはＮＳＣＬＣにおいてＢＡＲＤ１  Ｎ１９が男性よりも女性に過剰発現していたという結果（図２ａ−Ｂ）と一致する。ＢＡＲＤ１の種々のエピトープの発現およびＢＲＣＡ１発現は、たとえば腫瘍分類、原発性腫瘍、リンパ節および遠隔転移状況、および腫瘍病期などの他の臨床病理学的変数のいずれとも相関しなかった（図４Ｂ〜Ｆ）。さらに、種々の発現パターンと臨床病理変数の間には有意な相関が認められなかった（データは示さず）。
【０１７７】
経過観察データを有する結腸直腸癌７５例において、相異なるＢＡＲＤ１発現パターン（図９Ｂ）および４つのＢＡＲＤ１およびＢＲＣＡ１の個々の発現を生存と比較することにより、ＢＡＲＤ１およびＢＲＣＡ１の発現の生存との相関も評価した。その陰性染色と比較するとき、ＢＡＲＤ１  Ｎ１９陽性染色を有する患者は１年、２年および３年生存率が高く、またＣ２０陽性患者は１年および３年生存率が高いことが確認された（表６）。ＢＡＲＤ１  ＰＶＣおよびＷＦＳ（陰性染色例はさらに比較するには不十分であった）およびＢＲＣＡ１陽性染色および陰性染色の生存との比較では差は得られなかった。
【０１７８】
発現パターンを比較として用いるとき（表７）、４抗体すべてが陽性染色の発現パターンは、中央部エピトープのみの発現の発現パターンおよび群内の他の発現パターンと比較して、より高い１年、２年および３年生存率と相関することが確認された。しかし、中央部エピトープのみの発現の発現パターン（ＰＶＣおよびＷＦＳを用いて検出）は、群内の他の発現パターンと比較して、さらには４抗体すべてが陽性染色のパターンと比較して、より低い１年、２年および３年生存率と相関した。Ｎ末端エピトープ消失の発現パターンと、４抗体すべてが陽性の発現パターンを含む他の発現パターン（１年生存率を除く）、中央部エピトープのみの発現パターン、および群内の他のすべての発現パターンを含む他の発現パターンの間には相関が認められなかった。
【０１７９】
まとめると、結腸直腸癌において、４抗体すべてが陽性染色のＢＡＲＤ１発現パターン、およびＢＡＲＤ１のＮ末端エピトープの発現は好ましい予後判定因子であり；逆に、中央部の２エピトープのみの同時発現は好ましくない予後判定因子であるが、個々のエピトープの発現はそうでないと結論づけられる。
【０１８０】
（表６  結腸直腸患者７５例におけるＢＡＲＤ１の特徴的エピトープおよびＢＲＣＡ１の発現と生存との相関）
【表８】
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註：「−」、染色陽性；「＋」、染色陰性。
ＷＦＳについては、陰性染色症例はさらなる分析には不十分であった。
【０１８１】
（表７  結腸直腸患者７５例におけるＢＡＲＤ１発現パターンと生存との相関）
【表９】
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註：  ＋＋＋＋、４Ａｂ陽性染色；−＋＋−  ＰＶＣとＷＦＳのみ陽性；−＋＋＋、Ｎ１９のみ陰性染色；ｏｔｈｅｒ比較したパターン以外
【０１８２】
（ＶＩ−結腸直腸癌に発現したＢＡＲＤ１アイソフォームの構造）
男性１０例および女性１０例を含む２０件の腫瘍組織および腫瘍周辺組織において、ＢＡＲＤ１のｍＲＮＡレベルでの発現をＲＴ−ＰＣＲにより評価した。凍結組織切片からＲＮＡを抽出した。エクソン１における順方向プライマーおよびエクソン１１およびエクソン４における逆方向プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを実施し、ＢＡＲＤ１コード領域（エクソン１からエクソン１１、およびエクソン１からエクソン４）を増幅し、ＧＡＰＤＨを対照として増幅した。同時に、ＮＳＣＬＣにおいて行ったのと同様に、これらの連続サンプルからＥＲαも増幅した（図１１Ａ）。
【０１８３】
ＮＳＣＬＳと異なり、結腸直腸におけるＢＡＲＤ１  ｍＲＮＡ発現パターンは腫瘍組織と腫瘍周辺組織の間で非常に異なっていた。大半の腫瘍サンプルにおいてＦＬ  ＢＡＲＤ１およびアイソフォームが発現される頻度は高かったが（９０％、２０例中１８例）；腫瘍周辺組織においてはＢＡＲＤ１発現なしの頻度が高く（６５％、２０例中１３例）、７例（３５％）はＦＬ  ＢＡＲＤ１のみ、および／またはより少ないアイソフォームを発現した。これは統計的に有意であった（ｐ＝０．０００３）。男性（それぞれ８／１０例対４／１０例）（ｐ＝０．０６７９）と女性（それぞれ１０／１０例対３／１０例）（ｐ＝０．００１０）の間でも同様の結果が認められた（図１２Ａ）。エクソン３の欠失を有する新規アイソフォームκおよびエクソン４の３’末端内で４０８ｂｐが欠失した新規アイソフォームπを含む、ＮＳＣＬＣ組織において発現したすべてのＢＡＲＤ１アイソフォームは、結腸直腸癌組織においても発現した。正確に言うと、腫瘍組織内ではＦＬ  ＢＡＲＤ１およびすべてのＢＡＲＤ１アイソフォームが頻繁に発現したが、腫瘍周辺組織ではほとんど発現しなかった（すべてについてｐ＜０．０５）。（図１２Ｂ）。
【０１８４】
（ＶＩＩ−男性および女性に由来する組織に認められた同様のＢＡＲＤ１発現パターン）
ＢＡＲＤ１アイソフォームβおよびκは男性由来の肺組織において有意にアップレギュレートされ、かつアイソフォームη、γおよびεは女性由来の肺組織において高度に発現した。肺組織と異なり、男性および女性由来の結腸直腸組織におけるＦＬ  ＢＡＲＤ１およびアイソフォームの発現の頻度は、腫瘍周辺組織（すべてについてｐ＞０．０５）（図１２Ｃ）および腫瘍組織（すべてについてｐ＞０．０５）（図１２Ｄ）を含めて同様であった。
【０１８５】
男性および女性の腫瘍周辺組織および腫瘍組織を含む連続サンプルの結腸直腸癌には、ＥＲα発現は認められなかった（図１１Ｂ）。この結果は、少なくとも部分的には、肺組織におけるＢＡＲＤ１発現と比較して、結腸直腸組織においてＢＡＲＤ１発現の男性および女性との相関が認められなかったことを説明することが可能であった。
【０１８６】
（ＶＩＩＩ−ＢＡＲＤ１アイソフォーム発現と臨床変数との相関）
ＦＬ  ＢＡＲＤ１およびＢＡＲＤ１アイソフォームは、６０歳を上回る年齢の患者において６０歳またはそれ未満の患者よりも高い頻度で発現することが確認された。具体的には、ＢＡＲＤ１アイソフォームφ、δおよびπの発現は高齢患者と有意に関連した（ｐ＜０．０１）（図１３Ａ）。さらに、頻繁なＢＡＲＤ１アイソフォームκの発現は、大きな腫瘍サイズまたは近傍組織の浸潤（Ｔ３およびＴ４）（ｐ＝０．００９８）、リンパ節転移（Ｎ１およびＮ２）（ｐ＝０．０４２２）、および末期（ＩＩＩ期およびＩＶ期）（ｐ＝０．０４２２）（図６Ｂ〜Ｄ）と有意に関連した。ＢＡＲＤ１発現と腫瘍病理組織学分類の間に相関は認められなかった（図１３Ｅ）。
【０１８７】
（ＩＸ−肺癌患者の血液中の抗ＢＡＲＤ１自己免疫抗体の検出）
（方法）
肺癌患者の血液中の自己免疫抗体を捕捉するために、本発明の抗原（ＢＡＲＤ１ペプチド）を用いて免疫吸収分析に基づく試験を開発した。実施した試験の方法は、標準的ＥＬＩＳＡ抗体捕捉試験の改変であった。具体的には以下のプロトコルを適用した：
−マイクロタイタープレート（９６ウェル）をＰＢＳ中で希釈したＢＡＲＤ１ペプチド［１０μｇ／ｍＬ］でコーティングし、４℃で１晩インキュベーション。
−ブロッキング剤（例：５％ＢＳＡ）を添加したリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて、室温で１時間攪拌しながらウェルをブロッキングする。
−ブロッキング剤を１％含有するＰＢＳで希釈した患者および対照の血清をウェルに加え、室温で攪拌しながら２時間のインキュベートを実施する。
−ウェルをＰＢＳで３回すすぐ。
−ＰＢＳおよび１％ブロッキング剤で希釈したＨＲＰまたはスルホタグまたは同等の検出反応性とカップリングした二次抗ヒト抗体をウェルに加え、攪拌しながら１時間室温でインキュベートする。
−ウェルをＰＢＳで３回洗う。
−ＨＲＰ基質または同等の検出法用の基質の添加によって読み出しを実施し、速やかに反応を測定する。
【０１８８】
（試験）
肺癌患者由来の血清サンプルおよび健康献血者由来の対照サンプルで以下の抗原（ペプチド）を試験した：配列番号４６、３３、４８、２０、５０、１９、２２、１６、３２、２６
【０１８９】
（結果）
図１４を参照されたい。健康対照を肺癌患者と比較した。測定した数値は任意の数値である。癌患者の数値は対照よりも全般的に高かった。いくつかのペプチドの数値の複合により、対照と癌症例の間で明確な識別がもたらされ：１１のペプチドを用いた場合感度は１００％かつ特異性は９５％。
【０１９０】
（試験の説明）
たとえば、患者に由来する血清を用いてＢＡＲＤ１アイソフォームに対する自己免疫抗体を検出することが可能である。対照サンプル（健康献血者）においては、反応数値は癌患者よりも有意に低かった。１例の対照については個々のペプチドが高い数値を示すことがあるが、ペプチドの組み合わせの使用は偽陽性の除外につながる。
【図１Ｅ】
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【図３Ｃ−Ｄ】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｆ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図４Ａ−Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｄ】
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【図７Ｅ−Ｆ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ−１】
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【図９Ａ−２】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ−Ｄ】
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【図１０Ｅ−Ｆ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ−Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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