(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離したスパイダーシルクタンパク質の重合体を産生する方法であって：
（ｉ）１７０ないし７６０のアミノ酸残基からなり：
スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片由来の１００ないし１６０のアミノ酸残基のうちの少なくとも１の断片からなり、前記Ｎ末端断片が配列番号６と少なくとも８０％同一であるＮ末端断片と；
スパイダーシルクタンパク質の反復断片由来の７０ないし３００のアミノ酸残基であって、Ｌ（ＡＧ）ｎＬ、Ｌ（ＡＧ）ｎＡＬ、Ｌ（ＧＡ）ｎＬ、Ｌ（ＧＡ）ｎＧＬの群から選択されるタンパク質断片であり；
ｎが２ないし１０の整数であり；
各々の独立したＡセグメントが８ないし１８のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、０ないし３の前記アミノ酸残基がＡｌａではなく、残余の前記アミノ酸残基がＡｌａであり；
各々の独立したＧセグメントが１２ないし３０のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、少なくとも４０％のアミノ酸残基がＧｌｙであり；
各々の独立したＬセグメントが０ないし２０のアミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列である反復断片と；
スパイダーシルクタンパク質のＣ末端断片由来の７０ないし１２０のアミノ酸残基であって、前記Ｃ末端断片が配列番号７と少なくとも８０％同一であるＣ末端断片と；
を含むスパイダーシルクタンパク質を提供するステップと；
（ｉｉ）ｐＨが６．４以上であり、かつ／あるいは前記スパイダーシルクタンパク質の重合を阻止するイオン組成である液体培地において、前記スパイダーシルクタンパク質の溶液を提供するステップであって、リポ多糖類及び他の発熱物質の除去を含むステップと；
（ｉｉｉ）６．３以下のｐＨ、及び前記スパイダーシルクタンパク質の重合を可能にするイオン組成に、前記液体培地の特性を調節するステップと；
（ｉｖ）前記スパイダーシルクタンパク質が前記液体培地において重合体を形成できるようにするステップであって、前記液体培地はｐＨが６．３以下であり、かつ前記スパイダーシルクタンパク質の重合を可能にするイオン組成であるステップと；
（ｖ）前記スパイダーシルクタンパク質の重合体を前記液体培地から単離するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片が配列番号６と少なくとも９０％同一であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記スパイダーシルクタンパク質のＣ末端断片が配列番号７と少なくとも９０％同一であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法において、ステップ（ｉｉｉ）及びステップ（ｉｖ）の前記液体培地のｐＨが６．２以下かつ／あるいはステップ（ｉｉｉ）及びステップ（ｉｖ）の前記液体培地のｐＨが３以上であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法において、ステップ（ｉｉｉ）及びステップ（ｉｖ）の前記液体培地のｐＨが６．０以下であり、かつ／あるいは、ステップ（ｉｉｉ）及びステップ（ｉｖ）の前記液体培地のｐＨが４．２以上であることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法において、ステップ（ｉｉｉ）及びステップ（ｉｖ）の前記液体培地のイオン強度の範囲が１ないし２５０ｍＭであることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法において、ステップ（ｉｉ）の前記液体培地のｐＨが６．７以上であることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法において、ステップ（ｉｉ）の前記液体培地のｐＨが７．０以上であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法において、ステップ（ｉｉ）の前記液体培地のｐＨの範囲が６．４ないし６．８であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法において、前記重合体が繊維、薄膜、発泡樹脂、ネット、又はメッシュであることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法において、前記タンパク質が式ＮＴ２−ＲＥＰ−ＣＴ、ＮＴ−ＲＥＰ−ＣＴ、ＮＴ２−ＲＥＰ、及びＮＴ−ＲＥＰによって規定されるタンパク質の群から選択され；
ＮＴが１００ないし１６０のアミノ酸残基であって、スパイダーシルクタンパク質由来のＮ末端断片であるタンパク質断片であり；
ＲＥＰが７０ないし３００のアミノ酸残基であり；
ＣＴが７０ないし１２０のアミノ酸残基であって、スパイダーシルクタンパク質由来のＣ末端断片であるタンパク質断片である；
ことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、前記スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片が配列番号６と少なくとも９０％同一であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法において、前記スパイダーシルクタンパク質のＣ末端断片が配列番号７と少なくとも９０％同一であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の方法において、前記タンパク質が式ＮＴ２−ＲＥＰ−ＣＴ及びＮＴ−ＲＥＰ−ＣＴによって規定されるタンパク質の群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１５】
単離したスパイダーシルクタンパク質であって、１７０ないし７６０のアミノ酸残基からなり、式ＮＴ２−ＲＥＰ−ＣＴ及びＮＴ−ＲＥＰ−ＣＴによって規定されるタンパク質の群から選択され；
ＮＴが１００ないし１６０のアミノ酸残基であって、スパイダーシルクタンパク質由来のＮ末端断片であるタンパク質断片であり、前記Ｎ末端断片が配列番号６と少なくとも８０％同一であり；
ＲＥＰが７０ないし３００のアミノ酸残基であって、Ｌ（ＡＧ）ｎＬ、Ｌ（ＡＧ）ｎＡＬ、Ｌ（ＧＡ）ｎＬ、Ｌ（ＧＡ）ｎＧＬからなる群から選択されるタンパク質断片であり；
ｎが２ないし１０の整数であり；
各々の独立したＡセグメントが８ないし１８のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、０ないし３の前記アミノ酸残基がＡｌａではなく、残余の前記アミノ酸残基がＡｌａであり；
各々の独立したＧセグメントが１２ないし３０のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、少なくとも４０％のアミノ酸残基がＧｌｙであり；
各々の独立したＬセグメントが０ないし２０のアミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列であり；
ＣＴが７０ないし１２０のアミノ酸残基であって、スパイダーシルクタンパク質由来のＣ末端断片であるタンパク質断片であり、前記Ｃ末端断片が配列番号７と少なくとも８０％同一であることを特徴とする、単離したスパイダーシルクタンパク質。
【請求項１６】
請求項１５に記載の単離したスパイダーシルクタンパク質において、前記スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片が配列番号６と少なくとも９０％同一であることを特徴とする単離したスパイダーシルクタンパク質。
【請求項１７】
請求項１５に記載の単離したスパイダーシルクタンパク質において、前記スパイダーシルクタンパク質のＣ末端断片が配列番号７と少なくとも９０％同一であることを特徴とする単離したスパイダーシルクタンパク質。
【請求項１８】
請求項１５に記載の単離したスパイダーシルクタンパク質が、配列番号３ないし５、１７、１９ないし２３、２５及び３１からなる群から選択されることを特徴とする、単離したスパイダーシルクタンパク質。
【請求項１９】
スパイダーシルクタンパク質の重合体であって、該タンパク質が請求項１５ないし１８のいずれか１項に記載の単離したスパイダーシルクタンパク質であることを特徴とする、スパイダーシルクタンパク質の重合体。
【請求項２０】
請求項１９に記載のスパイダーシルクタンパク質の重合体において、前記重合体が繊維、薄膜、発泡樹脂、ネット、又はメッシュであることを特徴とする、スパイダーシルクタンパク質の重合体。
【請求項２１】
請求項２０に記載のスパイダーシルクタンパク質の重合体において、前記重合体は、直径が０．１μｍを超え、長さが５ｍｍを超える繊維であることを特徴とする、スパイダーシルクタンパク質の重合体。
【請求項２２】
請求項１５ないし１８のいずれか１項に記載の単離したスパイダーシルクタンパク質を含む組成物であって、ｐＨが６．４以上で、かつ／あるいは前記スパイダーシルクタンパク質の重合を阻止するイオン組成である液体培地において溶解されることを特徴とする組成物。
【請求項２３】
核酸分子であって：
（ｉ）配列番号１４ないし１６、１８及び２４の核酸配列と；
配列番号３ないし５、１７、１９ないし２３、２５及び３１をコードする核酸配列と；
請求項１５ないし１８に記載のスパイダーシルクタンパク質をコードする核酸配列と；
からなる群から選択される一の核酸配列で指定される一の領域；および
（ｉｉ）（ｉ）の領域に相補的な一の領域
を含むことを特徴とする核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質の組換え産生の分野、特にスパイダーシルクタンパク質（スピドロイン）の組換え産生に関する。本発明は単離型のスパイダーシルクタンパク質の重合体を産生する方法を提供する。更に、新規のスパイダーシルクタンパク質、ならびに、このようなタンパク質及びその重合体を産生するための方法及びポリ核酸分子が提供される。
【背景技術】
【０００２】
スパイダーシルクは天然の高性能重合体であり、強度と弾性との組合せによって顕著な靱性及び伸展性が得られる。クモには力学的性質及び機能が異なる多様な種類のシルクを産生する別個の最大７の腺がある。牽引糸のシルクは大嚢状腺で産生され、最高靱性の繊維であり、重量基準で抗張力鋼といった人工材料よりも性能が優れている。牽引糸のシルクの特性は、医用目的又は技術目的の新規の材料の開発の点で魅力的である。
【０００３】
牽引糸のシルクは２の主要なポリペプチドからなり、通常、ＭａＳｐ１（大嚢状腺スピドロイン１）及びＭａＳｐ２（大嚢状腺スピドロイン２）と称されるが、例えばニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）においてはＡＤＦ−３及びＡＤＦ−４と称される。これらのタンパク質の分子量は２００ないし７２０ｋＤａの範囲にある。クロゴケグモ（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｕｓ）の牽引糸タンパク質をコードする遺伝子は完全に特徴づけられた唯一のものであり、ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２遺伝子はそれぞれ、３１２９のアミノ酸、及び３７７９のアミノ酸をコードする（Ａｙｏｕｂ  ＮＡら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ２（６）：ｅ５１４，２００７）。牽引糸のシルクのポリペプチドの特性は「Ｈｕｅｍｍｅｒｉｃｈ，Ｄら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１４，２０７０−２０７４（２００４）」に述べられている。
【０００４】
クモの牽引糸のシルクタンパク質又はＭａＳｐは３分子の組成物：非反復性のＮ末端ドメイン；多くのポリＡｌａ／Ｇｌｙの反復セグメントを含む反復性の中央領域；及び非反復性のＣ末端ドメイン；を有する。一般的には、反復領域はシルク繊維における分子間接触を形成すると考えられているが、末端ドメインの正確な機能はほとんど明確ではない。更に、繊維形成と関連して、反復領域はランダムコイル構造及びαへリックス構造からβシート構造への構造変換を受けると考えられている。スピドロインのＣ末端領域は一般的にはクモ種及びシルクの種類の間で維持される。スパイダーシルクのＮ末端ドメインは最大の保存領域であるが、その機能は理解されていない。「Ｒｉｓｉｎｇ，Ａら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ７，３１２０−３１２４（２００６）」はＥｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ（キシダグモ科のクモ）のＭａＳｐ１遺伝子の５’末端を特性づけし、対応するアミノ酸配列を推定している。ＭａＳｐ１タンパク質のＮ末端ドメインは組換え発現されている。
【０００５】
スパイダーシルクタンパク質及びその断片は可溶形態で組換え産生するのが困難である。人工的なスパイダーシルク繊維を産生するための最も以前の試みは非生理学的な溶媒における溶解ステップを具えている。いくつかの因子は牽引糸のシルクの発現を複雑にする。遺伝子の反復性が高く、同時にタンパク質のアミノ酸組成物が限定されるため、転写及び翻訳エラーが生じる。タンパク質合成の中途終止を引き起こし、次いで翻訳が不連続となる、微生物発現系におけるｔＲＮＡプールの枯渇は別の理由となりうる。タンパク質合成の開裂で論じされる他の理由はｍＲＮＡの副次的な構造形成と、遺伝子組換えである。２．５ｋｂを超える天然ＭａＳｐ遺伝子は細菌性の宿主において不安定なことが示されている。更には、可溶形態で組換えシルクタンパク質を維持するのは、天然由来の牽引糸のシルク断片と、設計したブロック共重合体、特にＭａＳｐ１／ＡＤＦ−４由来のタンパク質との双方が無構造性の凝集体に容易に自己組織化されてタンパク質の沈殿及び損失を引き起こすため、困難である。「Ｈｕｅｍｍｅｒｉｃｈ，Ｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４３，１３６０４−１３６１２（２００４）」及び「Ｌａｚａｒｉｓ，Ａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２９５，４７２−４７６（２００２）」参照。
【０００６】
人工のスパイダーシルクを産生するための試みは、牽引糸のシルクタンパク質をコードする天然性又は合成性の遺伝子断片を用いてきた。組換え型の牽引糸のシルクタンパク質は、細菌、酵母、哺乳類細胞、植物、昆虫細胞、トランスジェニックカイコ、及びトランスジェニックヤギを含む多様な系で発現されてきた。例えば「Ｌｅｗｉｓ，Ｒ．Ｖら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．７，４００−４０６（１９９６）」、「Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ，Ｓ．Ｒ．＆Ｉｒｗｉｎ，Ｓ．Ｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４７，２３−３２（１９９７）」、「Ａｒｃｉｄｉａｃｏｎｏ，Ｓら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９，３１−３８（１９９８）」、「Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ，Ｓ．Ｒ．＆Ｂｅｄｚｙｋ，Ｌ．Ａ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４７，３３−３９（１９９７）」、及び「Ｌａｚａｒｉｓ，Ａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２９５，４７２−４７６（２００２）」参照。
【０００７】
「Ｈｕｅｍｍｅｒｉｃｈ，Ｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４３，１３６０４−１３６１２（２００４）」は合成遺伝子「（ＡＱ）１２ＮＲ３」を開示しており、ＡｌａリッチでかつＧｌｙ／Ｇｌｎリッチな反復性の断片と非反復断片とをコードし、その総てはオニグモ属のＡＤＦ３に由来する。凝集するが、重合体又は繊維を形成しない可溶タンパク質で、遺伝子は発現される。
【０００８】
国際公開第０３／０５７７２７号は、哺乳類細胞株及び動物における可溶性の組換えシルクポリペプチドの発現を開示する。得られたシルクポリペプチドは水溶性培地において難溶性を呈示し、かつ／あるいは沈殿を形成する。得られたシルクポリペプチドは自発的に重合されないため、紡績が重合体又は繊維を得るのに要求される。発現したシルクポリペプチドは、複数の反復ユニットと、スパイダーシルクタンパク質のカルボキシル末端領域由来の非反復ユニットとを含む。
【０００９】
国際公開第０７／０７８２３９号、及び「Ｓｔａｒｋ，Ｍら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ８，１６９５−１７０１，（２００７）」は、Ａｌａ及びＧｌｙの含有量が高い反復断片とタンパク質のＣ末端断片とからなる微小のスパイダーシルクタンパク質、ならびにスパイダーシルクタンパク質を含む可溶性の融合タンパク質とを開示している。スパイダーシルクタンパク質の繊維はその融合パートナーからのスパイダーシルクタンパク質の遊離時に自発的に得られる。小さな融合ユニットは繊維形成に必要十分である。
【００１０】
「Ｈｅｄｈａｍｍａｒ，Ｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４７，３４０７−３４１７，（２００８）」は組換え型のＮ末端及びＣ末端のスピドロインドメイン、及びポリＡｌａ及びＧｌｙリッチな４のブロック共重合体（ｃｏ−ｂｌｏｃｋ）を含む反復スピドロインドメインの構造ならびに凝集及び／又は重合に対する温度、ｐＨ、及び塩の効果を調査している。Ｎ末端ドメインの二次構造及び三次構造はｐＨに関係なく不変であり、Ｎ末端ドメインによって形成される、唯一検出した安定構造が二量体であることを開示している。一方、Ｃ末端ドメインはスパイダーシルクタンパク質の構築に主要な役割を担うことが示唆されている。
【発明の概要】
【００１１】
スパイダーシルクタンパク質の重合体を産生する方法であって、スパイダーシルクタンパク質の溶解度及び重合が制御される方法を提供することが本発明の目的である。
【００１２】
更に、スパイダーシルクタンパク質の繊維を産生する方法であって、スパイダーシルクタンパク質の溶解度および繊維形成が制御される方法を提供することが本発明の目的である。
【００１３】
新規性があり、スパイダーシルクの繊維、薄膜、発泡樹脂、ネット及びメッシュを提供できるスパイダーシルクタンパク質を提供することが本発明の別の目的である。
【００１４】
水溶性であって、所望の時点（ａｔ  ｗｉｓｈ）で繊維に重合するよう容易に操作されうるスパイダーシルクタンパク質を提供することが本発明の一目的である。この特性によって総ての以下のステップを生理学的条件下で行うことが可能となり、毒性及びタンパク質変性に対するリスクを低減する。
【００１５】
新規のスパイダーシルクタンパク質の繊維を提供することが本発明の更に別の目的である。
【００１６】
所望の時点で繊維に重合するよう容易に操作されうるスパイダーシルクタンパク質を大規模に提供することが本発明の一目的である。
【００１７】
更に、スパイダーシルクタンパク質とスパイダーシルクタンパク質の繊維とを産生する方法を提供することが本発明の目的である。
【００１８】
以下の開示から明確になるこれらの目的、及び他の目的のために、本発明は第１の態様によって、単離したスパイダーシルクタンパク質の重合体を産生し、
（ｉ）１７０ないし７６０のアミノ酸残基からなり：
スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片由来の１００ないし１６０のアミノ酸残基のうちの少なくとも１の断片からなるＮ末端断片と；
スパイダーシルクタンパク質の反復断片由来の７０ないし３００のアミノ酸残基の反復断片と；
を含み；
７０ないし１２０のアミノ酸残基であって、スパイダーシルクタンパク質のＣ末端断片由来であるＣ末端断片；
を任意に含むスパイダーシルクタンパク質を提供するステップと；
（ｉｉ）ｐＨが６．４以上であり、かつ／あるいは前記スパイダーシルクタンパク質の重合を阻止するイオン組成である液体培地において、前記スパイダーシルクタンパク質の溶液を提供するステップであって、リポ多糖類及び他の発熱物質の除去を任意に含むステップと；
（ｉｉｉ）６．３以下のｐＨ、及び前記スパイダーシルクタンパク質の重合を可能にするイオン組成に、前記液体培地の特性を調節するステップと；
（ｉｖ）スパイダーシルクタンパク質が前記液体培地において重合体、好適には、固形重合体を形成できるようにするステップであって、前記液体培地はｐＨが６．３以下であり、かつ前記スパイダーシルクタンパク質の重合を可能にするイオン組成であるステップと；
（ｖ）スパイダーシルクタンパク質の重合体を前記液体培地から単離するステップと；
を具える方法を提供する。
【００１９】
一実施形態においては、ステップ（ｉｉｉ）及びステップ（ｉｖ）の液体培地のｐＨは６．２以下、例えば６．０以下である。一実施形態においては、ステップ（ｉｉｉ）及びステップ（ｉｖ）の液体培地のｐＨは３以上、例えば４．２以上である。特定の実施形態においては、ステップ（ｉｉｉ）及びステップ（ｉｖ）の液体培地のイオン強度の範囲は１ないし２５０ｍＭである。
【００２０】
ある実施形態においては、ステップ（ｉｉ）の液体培地のｐＨは６．７以上、例えば７．０以上である。一実施形態においては、ステップ（ｉｉ）の液体培地のｐＨの範囲は６．４ないし６．８である。
【００２１】
別の態様によると、本発明はスパイダーシルクタンパク質の重合体を提供し、該タンパク質は１７０ないし７６０のアミノ酸残基からなり：
スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片由来の１００ないし１６０のアミノ酸残基のうちの少なくとも１の断片からなるＮ末端断片と；
スパイダーシルクタンパク質の反復断片由来の７０ないし３００のアミノ酸残基の反復断片と；
を含み、
７０ないし１２０のアミノ酸残基であって、スパイダーシルクタンパク質のＣ末端断片由来であるＣ末端断片；
を任意に含んでいる。
【００２２】
これらの２の態様の特定の実施形態において、スパイダーシルクタンパク質は１７０ないし６００のアミノ酸残基からなり、スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片由来の１００ないし１６０のアミノ酸残基の単一のＮ末端断片を含んでいる。これらの２の態様の特定の他の実施形態においては、スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片は、スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片由来の１００ないし１６０のアミノ酸残基のうちの少なくとも２の断片を含んでいる。
【００２３】
これらの２の態様の好適な実施形態においては、タンパク質は式ＮＴ２−ＲＥＰ−ＣＴ、ＮＴ−ＲＥＰ−ＣＴ、ＮＴ２−ＲＥＰ、及びＮＴ−ＲＥＰによって規定されるタンパク質の群から選択され；
ＮＴは１００ないし１６０のアミノ酸残基であって、スパイダーシルクタンパク質由来のＮ末端断片であるタンパク質断片であり；
ＲＥＰは７０ないし３００のアミノ酸残基であって、Ｌ（ＡＧ）ｎＬ、Ｌ（ＡＧ）ｎＡＬ、Ｌ（ＧＡ）ｎＬ、Ｌ（ＧＡ）ｎＧＬの群から選択されるタンパク質断片であり；
ｎは２ないし１０の整数であり；
各々の独立したＡセグメントは８ないし１８のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、０ないし３のアミノ酸残基はＡｌａではなく、残余のアミノ酸残基はＡｌａであり；
各々の独立したＧセグメントは１２ないし３０のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、少なくとも４０％のアミノ酸残基はＧｌｙであり；
各々の独立したＬセグメントは０ないし２０のアミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列であり；
ＣＴは７０ないし１２０のアミノ酸残基であって、スパイダーシルクタンパク質由来のＣ末端断片であるタンパク質断片である。
【００２４】
ある実施形態においては、重合体は重合した該タンパク質の二量体からなる。
【００２５】
好適な実施形態においては、リポ多糖類及び他の発熱物質の含量は単離したタンパク質の１ＥＵ／ｍｇ以下である。
【００２６】
一実施形態においては、重合体は繊維、薄膜、発泡樹脂、ネット、又はメッシュである。好適な実施形態においては、重合体は直径が０．１μｍを超え、長さが５ｍｍを超える繊維である。
【００２７】
一態様によると、本発明は単離したスパイダーシルクタンパク質の二量体を産生する方法であって：
（ｉ）１７０ないし７６０のアミノ酸残基のスパイダーシルクタンパク質を提供するステップであって、該タンパク質が：
スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片由来の１００ないし１６０のアミノ酸残基のうちの少なくとも１の断片からなるＮ末端断片と；
スパイダーシルクタンパク質の反復断片由来の７０ないし３００のアミノ酸残基の反復断片と；
を含み、
７０ないし１２０のアミノ酸残基であって、スパイダーシルクタンパク質のＣ末端断片由来であるＣ末端断片；
を任意に含むステップと；
（ｉｉ）ｐＨが６．４以上であり、かつ／あるいは前記スパイダーシルクタンパク質の重合を阻止するイオン組成である液体培地において、スパイダーシルクタンパク質の二量体の溶液を提供するステップと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で得られた二量体を単離するステップであって、リポ多糖類及び他の発熱物質の除去を任意に含むステップ；
とを具える方法を提供する。
【００２８】
ある実施形態においては、ステップ（ｉｉ）の液体培地のｐＨは６．７以上、例えば７．０以上である。一実施形態においては、ステップ（ｉｉ）の液体培地のｐＨの範囲は６．４ないし６．８である。
【００２９】
一実施形態においては、前記スパイダーシルクタンパク質を提供するステップ（ｉ）は：
（ａ）好適な宿主において前記スパイダーシルクタンパク質をコードするポリ核酸分子を発現するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）で得られたタンパク質を単離するステップであって、リポ多糖類及び他の発熱物質の除去を任意に含むステップと；
を具える。
【００３０】
ある態様によると、本発明はスパイダーシルクタンパク質の二量体を提供し、該タンパク質は１７０ないし７６０のアミノ酸残基からなり：
スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片由来の１００ないし１６０のアミノ酸残基のうちの少なくとも１の断片からなるＮ末端断片と；
スパイダーシルクタンパク質の反復断片由来の７０ないし３００のアミノ酸残基の反復断片と；
を含み、
７０ないし１２０のアミノ酸残基であって、スパイダーシルクタンパク質のＣ末端断片由来であるＣ末端断片；
を任意に含んでいる。
【００３１】
これらの２の態様の特定の実施形態において、スパイダーシルクタンパク質は１７０ないし６００のアミノ酸残基からなり、スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片由来の１００ないし１６０のアミノ酸残基の単一のＮ末端断片を含んでいる。これらの２の態様の特定の他の実施形態においては、スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片は、スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片由来の１００ないし１６０のアミノ酸残基のうちの少なくとも２の断片を含んでいる。
【００３２】
別の態様によると、本発明は単離したスパイダーシルクタンパク質を提供し、１７０ないし７６０のアミノ酸残基からなり、式ＮＴ２−ＲＥＰ−ＣＴ、ＮＴ−ＲＥＰ−ＣＴ、ＮＴ２−ＲＥＰ、及びＮＴ−ＲＥＰによって規定されるタンパク質の群から選択され；
ＮＴは１００ないし１６０のアミノ酸残基であって、スパイダーシルクタンパク質由来のＮ末端断片であるタンパク質断片であり；
ＲＥＰは７０ないし３００のアミノ酸残基であって、Ｌ（ＡＧ）ｎＬ、Ｌ（ＡＧ）ｎＡＬ、Ｌ（ＧＡ）ｎＬ、Ｌ（ＧＡ）ｎＧＬの群から選択されるタンパク質断片であり；
ｎは２ないし１０の整数であり；
各々の独立したＡセグメントは８ないし１８のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、０ないし３のアミノ酸残基がＡｌａではなく、残余のアミノ酸残基がＡｌａであり；
各々の独立したＧセグメントは１２ないし３０のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、少なくとも４０％のアミノ酸残基がＧｌｙであり；
各々の独立したＬセグメントは０ないし２０のアミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列であり；
ＣＴは７０ないし１２０のアミノ酸残基であって、スパイダーシルクタンパク質由来のＣ末端断片であるタンパク質断片である。
【００３３】
一実施形態においては、スパイダーシルクタンパク質は１７０ないし６００のアミノ酸残基からなり、式ＮＴ−ＲＥＰ−ＣＴ及びＮＴ−ＲＥＰによって規定されるタンパク質の群から選択される。
【００３４】
特定の実施形態においては、スパイダーシルクタンパク質は配列番号３ないし５、１７、１９ないし２３、２５、及び３１からなる群から選択される。
【００３５】
ある態様によると、本発明はスパイダーシルクタンパク質の二量体を産生するための、本発明のスパイダーシルクタンパク質の使用を提供する。
【００３６】
一態様によると、本発明はスパイダーシルクタンパク質の重合体を産生するための、本発明のスパイダーシルクタンパク質の使用を提供する。
【００３７】
ある態様によると、本発明は単離したスパイダーシルクタンパク質の重合体を産生するための、本発明によるスパイダーシルクタンパク質の二量体の使用を提供する。
【００３８】
これらの態様の好適な実施形態においては、前記重合体は、ｐＨが６．３以下であり、かつ前記スパイダーシルクタンパク質の重合を可能にするイオン組成である液体培地において産生される。
【００３９】
一態様によると、本発明は、ｐＨが６．４以上であり、かつ／あるいは前記スパイダーシルクタンパク質の重合を阻止するイオン組成である液体培地において溶解される、本発明による単離したスパイダーシルクタンパク質を含む組成物を提供する。
【００４０】
ある実施形態においては、液体培地のｐＨは７．０以上である。一実施形態においては、液体培地のｐＨの範囲は６．４ないし６．８である。
【００４１】
特定の実施形態においては、組成物におけるリポ多糖類及び他の発熱物質の含量は単離したタンパク質の１ＥＵ／ｍｇ以下である。
【００４２】
別の態様によると、本発明は：
配列番号１４ないし１６、１８及び２４からなる群から選択される核酸配列と；
配列番号３ないし５、１７、１９ないし２３、２５及び３１をコードする核酸配列と；
本発明によるスパイダーシルクタンパク質をコードする核酸配列と；
その相補的な核酸配列と；
を含む、単離したポリ核酸分子を提供する。
【００４３】
更に別の態様によると、本発明は、本発明によるスパイダーシルクタンパク質を産生する方法であって：
（ｉ）好適な宿主において前記スパイダーシルクタンパク質をコードするポリ核酸分子を発現するステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で得られたタンパク質を単離するステップであって、リポ多糖類及び他の発熱物質の除去を任意に含むステップと；
を具える方法を提供する。
【００４４】
更に、１種類の分子又は異なる数種類の分子の重合体又は低重合体を可逆形成する方法であって：
（ｉ）前記分子を提供するステップであって、各々の分子が：
（ａ）スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片由来の１００ないし１６０のアミノ酸残基の少なくとも１の第１の結合成分と；
（ｂ）タンパク質、核酸、炭水化物、及び脂質から別個に選択される第２の成分と；
を含むステップと；
（ｉｉ）ｐＨが６．４以上であり、かつ／あるいは前記結合成分を介して該１以上の分子の重合又は低重合を阻止するイオン組成である液体培地に、前記分子の溶液を提供するステップと；
（ｉｉｉ）６．３以下のｐＨ、及び前記結合成分を介して前記分子の重合又は低重合を可能にするイオン組成に、前記液体培地の特性を調節するステップと；
（ｉｖ）前記分子が液体培地において、前記結合成分を介して重合体又は低重合体を形成できるようにするステップと；
を具える方法が提供され、前記液体培地はｐＨが６．３以下であり、前記結合成分を介して前記分子の重合又は低重合を可能にするイオン組成である。
【００４５】
ある実施形態においては、ステップ（ｉ）の前記分子は同一であり、ステップ（ｉｖ）の前記重合体又は低重合体は同種重合体又は同種低重合体（ｈｏｍｏｏｌｉｇｏｍｅｒ）である。別の実施形態においては、ステップ（ｉ）の前記分子は同一ではなく、ステップ（ｉｖ）の前記重合体又は低重合体が異種重合体又は異種低重合体（ｈｅｔｅｒｏｏｌｉｇｏｍｅｒ）である。
【００４６】
好適な実施形態においては、ステップ（ｉｖ）の前記重合体又は低重合体は、ｐＨが６．３以下であり、かつ前記分子の重合又は低重合を可能にするイオン組成である前記液体培地において溶解される。
【００４７】
一実施形態においては、ステップ（ｉｉｉ）及びステップ（ｉｖ）の液体培地のｐＨは６．２以下、例えば６．０以下であり、かつ／あるいは、ステップ（ｉｉｉ）及びステップ（ｉｖ）の液体培地のｐＨは３以上、例えば４．２以上である。
【００４８】
特定の実施形態においては、ステップ（ｉｖ）の液体培地のイオン強度の範囲は１ないし２５０ｍＭである。
【００４９】
ある実施形態においては、ステップ（ｉｉ）の液体培地のｐＨは６．７以上、例えば７．０以上である。一実施形態においては、ステップ（ｉｉ）の液体培地のｐＨの範囲は６．４ないし６．８である。
【００５０】
好適な実施形態においては、前記第２の成分はタンパク質である。
【００５１】
一実施形態においては、本方法は更に：
（ｖ）６．４以上のｐＨ、及び／又は前記重合体若しくは低重合体を分解すべく前記分子の重合若しくは低重合を阻止するイオン組成に、前記液体培地の特性を調節するステップ；
を具える。
【００５２】
ある実施形態においては、ステップ（ｉｉ）及び／又はステップ（ｖ）の液体培地のｐＨは６．７以上、例えば７．０以上である。一実施形態においては、ステップ（ｉｉ）及び／又はステップ（ｖ）の液体培地のｐＨの範囲は６．４ないし６．８である。
【００５３】
好適な実施形態においては、ステップ（ｉｖ）の重合体又は低重合体は相互作用の調査、選別、酵素複合体の誘発活性、又はＦＲＥＴ分析に用いられる。
【００５４】
一実施形態においては、ステップ（ｉ）の少なくとも１の分子型は固形担体又はアフィニティ培地の基質に固定化される。
【００５５】
分子の集合に含まれる分子の部分集合間の結合相互作用を検出する方法であって：
（ｉ）前記分子の集合を提供するステップであって、各々の分子が：
（ａ）スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片由来の１００ないし１６０のアミノ酸残基の少なくとも１の第１の結合成分と；
（ｂ）タンパク質、核酸、炭水化物、及び脂質から別個に選択される第２の成分と；
を含むステップと；
（ｉｉ）ｐＨが６．４以上であり、かつ／あるいは前記分子の重合又は低重合を阻止するイオン組成である液体培地に、前記分子の集合の溶液を提供するステップと；
（ｉｉｉ）６．３以下のｐＨ、及び前記分子の重合又は低重合を可能にするイオン組成に、前記液体培地の特性を調節するステップと；
（ｉｖ）前記分子が液体培地において、前記結合成分を介して重合体又は低重合体を形成できるようにするステップであって、前記液体培地はｐＨが６．３以下であり、前記分子の重合又は低重合を可能にするイオン組成であるステップと；
（ｖ）６．４以上のｐＨ、及び／又は前記重合体若しくは低重合体を分解すべく前記分子の重合若しくは低重合を阻止するイオン組成に、前記液体培地の特性を調節するステップと；
（ｖｉ）２以上の異なる分子間で前記結合成分を介して媒介されず、前記分子の部分集合を形成する結合相互作用の存在を判定するステップと；
を具える方法が更に提供される。
【００５６】
新規性のある１以上の分子の使用であって、各々が：
（ａ）スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片由来の１００ないし１６０のアミノ酸残基の少なくとも１の第１の結合成分と；
（ｂ）タンパク質、核酸、炭水化物、及び脂質から別個に選択される第２の成分と；
を含み、ｐＨが６．３以下であり、かつ前記分子の重合又は低重合を可能にするイオン組成である溶液において、前記結合成分を介して前記分子の重合体又は低重合体を可逆形成するための使用が更に提供される。
【００５７】
好適な実施形態においては、重合体又は低重合体は相互作用の調査、選別、酵素複合体の誘発活性、又はＦＲＥＴ分析に用いられる。
【００５８】
別の態様においては、本発明は基質と、当該基質と結合した親和性相互作用のためのリガンドとを含むアフィニティ培地を提供し、そのリガンドはスパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片由来の１００ないし１６０のアミノ酸残基のうちの少なくとも１の断片を含んでいる。
【００５９】
好適な実施形態においては、基質は粒子及びフィルタからなる群から選択される。
【００６０】
本発明の他の態様及び実施形態は説明により明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、スピドロインのＮ末端断片の配列アライメントを示す。
【図２】図２は、スピドロインのＣ末端断片の配列アライメントを示す。
【図３】図３は、ｐＨ誘導性及び塩依存性のＮＴ４Ｒｅｐ、ＮＴ４ＲｅｐＣＴ、４Ｒｅｐ、及び４ＲｅｐＣＴの重合を例示する。
【図４】図４は、異なるｐＨでのＮＴ及びＮＴ４Ｒｅｐの比濁分析を示す。
【図５】図５は、ｐＨ６及び７での動的なＮＴの光散乱を示す。
【図６】図６は、多様なイオン組成におけるｐＨ６．１ないし７．２での動的なＮＴの光散乱を示す。
【図７】図７は、ＮＴ融合タンパク質のｐＨ依存性の形成を概略的に示す。
【図８】図８は、融合タンパク質の電気泳動ゲルを示す。
【００６２】
［添付の配列のリスト］
配列番号
１      ４Ｒｅｐ
２      ４ＲｅｐＣＴ
３      ＮＴ４Ｒｅｐ
４      ＮＴ５Ｒｅｐ
５      ＮＴ４ＲｅｐＣＴＨｉｓ
６      ＮＴ
７      ＣＴ
８      コンセンサスＮＴ配列
９      コンセンサスＣＴ配列
１０    Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓのＭａＳｐ１由来の反復配列
１１    コンセンサスＧセグメント配列１
１２    コンセンサスＧセグメント配列２
１３    コンセンサスＧセグメント配列３
１４    ＮＴ４Ｒｅｐ（ＤＮＡ）
１５    ＮＴ４ＲｅｐＣＴ（ＤＮＡ）
１６    ＮＴ５Ｒｅｐ（ＤＮＡ）
１７    ＮＴ４ＲｅｐＣＴＨｉｓ２
１８    ＮＴ４ＲｅｐＣＴＨｉｓ２（ＤＮＡ）
１９    ＺｂａｓｉｃＮＴ４ＲｅｐＣＴ
２０    ＮＴ４ＲｅｐＣＴ
２１    ＨｉｓＴｒｘＨｉｓＴｈｒＮＴ４ＲｅｐＣＴ
２２    ＮＴ４ＲｅｐＣＴ２
２３    ＨｉｓＮＴＮＴ４ＲｅｐＣＴ
２４    ＨｉｓＮＴＮＴ４ＲｅｐＣＴ（ＤＮＡ）
２５    ＮＴ８ＲｅｐＣＴ
２６    ＨｉｓＮＴＭｅｔＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕ
２７    ＨｉｓＮＴＭｅｔＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕ（ＤＮＡ）
２８    ＨｉｓＮＴＮＴＭｅｔＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕ
２９    ＨｉｓＮＴＮＴＭｅｔＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕ（ＤＮＡ）
３０    ＮＴＨｉｓ
３１    ＮＴＮＴ８ＲｅｐＣＴ
３２    ＮＴＮＴＢｒｉｃｈｏｓ
【発明を実施するための形態】
【００６３】
本発明は一般的には、これまで理解が不十分であったスパイダーシルクタンパク質のＮ末端の非反復断片がこれらのタンパク質の重合において関与しているという発明の見識、特にこの断片を含む重合体の形成が特定のパラメータを変えることによって密に制御できるという発明の見識による。この見識は単離したスパイダーシルクタンパク質の重合体を産生する新規の方法に発展している。実施例は必然的に特定のタンパク質、この場合にはＥｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓの大嚢状腺（ｍａｊｏｒ）スピドロイン１（ＭａＳｐ１）由来のタンパク質に関連づけているが、本明細書中に開示の方法は重合体を産生する目的で任意の類似するタンパク質に適用可能であることは考慮すべきである。
【００６４】
この見識は更に、新規のスパイダーシルクタンパク質モチーフの、スパイダーシルク繊維を組換え産生するのに十分な同定に通じている。新規のスパイダーシルクタンパク質モチーフは、本明細書中に報告するような、新規のスパイダーシルクタンパク質及び遺伝子の構成の開始点として有用であると導かれる。新規のスピドロインから得られるタンパク質で形成される重合体は、その物理学的特性、特に強度の高さ、弾性、及び重量の軽さの有用な組合せについて有用である。更に、細胞接着及び増殖を支持する性能について有用である。牽引糸のシルクの特性は医用目的又は技術目的のための新規の材料の開発の点で魅力的である。特に、本発明によるスパイダーシルクは移植片といった医用デバイス、ならびに創傷閉止システム、バンドエイド、縫合糸、創傷ドレッシング剤、及び組織操作及び細胞再産生の誘導用の骨格といった医用製品に有用である。本発明によるスパイダーシルクは更に、パラシュート、防弾衣、シートベルト等といった生地又は織物として用いるのに特に有用である。この方法を用いると、開裂剤を用いて重合が所望されるプロセス中に開裂される開裂可能な融合パートナーの導入を必要としなくなる。このことによって、スパイダーシルクタンパク質及びその重合体の産生及び収率が向上し、工業上の産生プロセスに利点を与える。
【００６５】
本明細書中で用いられるような用語「繊維（ｆｉｂｅｒ）」は、厚さが少なくとも０．１μｍの重合体、好適にはヒトの肉眼で認識できるマクロ的な重合体、すなわち１μｍの重合体と関連付けられ、その厚さと比べて長さが相当に、好適には５ｍｍを超えて伸展する。用語「繊維」は不定形の凝集体又は沈殿物を包含しない。
【００６６】
用語「スピドロイン（ｓｐｉｄｒｏｉｎ）」及び「スパイダーシルクタンパク質（ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」は本記載にわたって互換的に用いられ、総ての既知のスパイダーシルクタンパク質を包含し、ニワオニグモの場合には一般的には「ＭａＳｐ」又は「ＡＤＦ」と略記される大嚢状腺スパイダーシルクタンパク質を含む。これらの大嚢状腺スパイダーシルクタンパク質は一般的には１型と２型の２種類ある。これらの用語は更に、添付の特許請求の範囲及び項目別の実施形態に規定されるような、本発明による新規のタンパク質と、既知のスパイダーシルクタンパクと同一度及び／又は類似度が高い、他の非天然性のタンパク質とを含む。
【００６７】
従って、本発明は単離したスパイダーシルクタンパク質の重合体を産生する方法を提供する。第１のステップにおいて、組換え型のスパイダーシルクタンパク質が提供される。スパイダーシルクタンパク質は一般的には１７０ないし６００のアミノ酸残基といった１７０ないし７６０のアミノ酸残基、好適には３００ないし４００のアミノ酸残基といった２８０ないし６００のアミノ酸残基、更に好適には３４０ないし３８０のアミノ酸残基からなる。スパイダーシルクタンパク質が長くなると、不定形の凝集体を形成し、可溶化及び重合のための強い（ｈａｒｓｈ）溶媒の使用が必要となる傾向があるため大きさは小さいのが有利である。組換え型のスパイダーシルクタンパク質は特に、スパイダーシルクタンパク質がスパイダーシルクタンパク質のＮ末端部分由来の２を超える断片を含む場合においては、７６０を超える残基を含んでもよい。スパイダーシルクタンパク質は、スパイダーシルクタンパク質の対応する部分由来の少なくとも１の断片（ＮＴ）と、スパイダーシルクタンパク質の対応する内部断片由来の反復断片（ＲＥＰ）とを含む。任意に、スパイダーシルクタンパク質は、対応するスパイダーシルクタンパク質断片由来のＣ末端断片（ＣＴ）を含む。スパイダーシルクタンパク質は一般的には、スパイダーシルクタンパク質のＮ末端部分由来の単一断片（ＮＴ）を含むが、好適な実施形態においては、Ｎ末端断片はスパイダーシルクタンパク質のＮ末端部分由来の少なくとも２の、例えば２の断片（ＮＴ）を含む。このように、スピドロインは概略的に式ＮＴｍ−ＲＥＰ、代替的にはＮＴｍ−ＲＥＰ−ＣＴで表現できる。ここで、ｍは１以上、例えば２以上の、好適には１ないし２、１ないし４、１ないし６、２ないし４、又は２ないし６の範囲にある整数である。好適なスピドロインは概略的に式ＮＴ２−ＲＥＰ又はＮＴ−ＲＥＰ、代替的にはＮＴ２−ＲＥＰ−ＣＴ又はＮＴ−ＲＥＰ−ＣＴで表現できる。タンパク質断片は一般的にはペプチド結合を介して共有結合される。一実施形態においては、スパイダーシルクタンパク質はＲＥＰ断片に結合した１以上のＮＴ断片からなり、そのＲＥＰ断片は任意にＣＴ断片と結合する。
【００６８】
ＮＴ断片はスパイダーシルクタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列と類似度が高い。図１に示すように、このアミノ酸配列は多様な種及びスパイダーシルクタンパク質の間で都合良く維持されており、ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２を含んでいる。図１においては、以下のスピドロインのＮＴ断片は配列され、該当する場合にはＧｅｎＢａｎｋアクセス項目で表示される。
【００６９】
［表１：スピドロインのＮＴ断片］
【表１】
0005912077.tif 000002
【００７０】
Ｎ末端断片に対応する部分のみが、各々の配列で示されており、シグナルペプチドを省略している。Ｎｃフラッグ部及びＮｌｍフラッグ部は「Ｒｉｓｉｎｇ  Ａら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ７，３１２０−３１２４（２００６）」で翻訳及び編集されている。
【００７１】
ＮＴは酸性残基及び塩基性残基が対向する極のクラスターに局在化する場合に双極子モーメントが明確になることが観察される。限定を所望しないが、観察したＮＴの重合は、ＮＴ二量体の線形アレイの形成に関与し、アレイにおける隣の二量体において、１のサブユニットの負の表面が隣接するサブユニットの正の表面に対面して、極が向かい合って積層されることは予測されよう。
【００７２】
ＮＴ断片が完全には欠損していない限りにおいては、特定のＮＴ断片が本発明によるスパイダーシルクタンパク質に存在することは重要ではない。従って、本発明によるＮＴ断片は図１に示されるアミノ酸配列、あるいは類似度の高い配列のいずれかから選択できる。広範で多様なＮ末端配列は本発明によるスパイダーシルクタンパク質で用いることができる。図１の相同配列によると、配列：
ＱＡＮＴＰＷＳＳＰＮＬＡＤＡＦＩＮＳＦ（Ｍ／Ｌ）ＳＡ（Ａ／Ｉ）ＳＳＳＧＡＦＳＡＤＱＬＤＤＭＳＴＩＧ（Ｄ／Ｎ／Ｑ）ＴＬＭＳＡＭＤ（Ｎ／Ｓ／Ｋ）ＭＧＲＳＧ（Ｋ／Ｒ）ＳＴＫＳＫＬＱＡＬＮＭＡＦＡＳＳＭＡＥＩＡＡＡＥＳＧＧ（Ｇ／Ｑ）ＳＶＧＶＫＴＮＡＩＳＤＡＬＳＳＡＦＹＱＴＴＧＳＶＮＰＱＦＶ（Ｎ／Ｓ）ＥＩＲＳＬＩ（Ｇ／Ｎ）Ｍ（Ｆ／Ｌ）（Ａ／Ｓ）ＱＡＳＡＮＥＶ（配列番号８）
；はコンセンサスＮＴアミノ酸配列を構成する。
【００７３】
本発明によるＮＴ断片の配列は、コンセンサスアミノ酸配列の配列番号８と少なくとも５０％同一、好適には少なくとも６０％同一であり、図１のアミノ酸配列に基づいている。好適な実施形態においては、本発明によるＮＴ断片の配列は、コンセンサスアミノ酸配列の配列番号８と少なくとも６５％同一、好適には少なくとも７０％同一である。好適な実施形態においては、本発明によるＮＴ断片は更に、コンセンサスアミノ酸配列の配列番号８と７０％、好適には８０％類似している。
【００７４】
本発明による代表的なＮＴ断片は、Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ配列の配列番号６である。本発明の好適な実施形態においては、ＮＴ断片は配列番号６又は図１における任意の別個のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である。本発明の好適な実施形態においては、ＮＴ断片は配列番号６又は図１における任意の別個のアミノ酸配列と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％同一である。本発明の好適な実施形態においては、ＮＴ断片は配列番号６又は図１における任意の別個のアミノ酸配列、特にＥａ  ＭａＳｐ１と同一である。
【００７５】
ＮＴ断片は１００ないし１６０のアミノ酸残基を含む。ＮＴ断片は少なくとも１００の、又は１１０を超え、好適には１２０を超えるアミノ酸残基を含むことが好適である。ＮＴ断片は最大で１６０の、又は１４０未満のアミノ酸残基を含むことが更に好適である。一般的なＮＴ断片は約１３０ないし１４０のアミノ酸残基を含む。
【００７６】
スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片が、スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片由来の２以上の断片（ＮＴ）を含む場合、更に１以上のリンカーペプチドを含んでもよい。１以上のリンカーペプチドは２のＮＴ断片の間に配置され、スペーサーを提供できる。
【００７７】
タンパク質断片ＲＥＰの特徴は反復性であり、アラニンリッチな伸展部ないしグリシンリッチな伸展部が交互に現れる。ＲＥＰ断片は一般的には７０を超え、例えば１４０を超え、かつ３００未満、好適には２４０未満、例えば２００未満のアミノ酸残基を含み、以下に更に詳細に説明されるように、それ自体が数個のＬ（リンカー）セグメント、Ａ（アラニンリッチ）セグメント、及びＧ（グリシンリッチな）セグメントに分割できる。一般的には、前記リンカーセグメントは任意であり、ＲＥＰ断片の末端に配置されるが、残余のセグメントはアラニンリッチ部とグリシンリッチ部が交互となる。従って、ＲＥＰ断片は一般的には以下の構造：
Ｌ（ＡＧ）ｎＬ、例えばＬＡ１Ｇ１Ａ２Ｇ２Ａ３Ｇ３Ａ４Ｇ４Ａ５Ｇ５Ｌ；
Ｌ（ＡＧ）ｎＡＬ、例えばＬＡ１Ｇ１Ａ２Ｇ２Ａ３Ｇ３Ａ４Ｇ４Ａ５Ｇ５Ａ６Ｌ；
Ｌ（ＧＡ）ｎＬ、例えばＬＧ１Ａ１Ｇ２Ａ２Ｇ３Ａ３Ｇ４Ａ４Ｇ５Ａ５Ｌ；又は、
Ｌ（ＧＡ）ｎＧＬ、例えばＬＧ１Ａ１Ｇ２Ａ２Ｇ３Ａ３Ｇ４Ａ４Ｇ５Ａ５Ｇ６Ｌ
のいずれかとなる。ここでｎは整数である。アラニンリッチセグメント及びグリシンリッチセグメントのいずれがＮ末端又はＣ末端のリンカーセグメントに隣接しているかは重要ではないと導かれる。ｎが、２ないし１０、好適には２ないし８、好適には４ないし８、更に好適には４ないし６の整数であること、すなわち、ｎ＝４、ｎ＝５、又はｎ＝６であることが好適である。
【００７８】
好適な実施形態においては、本発明によるＲＥＰ断片のアラニン成分は２０％超、好適には２５％超、更に好適には３０％超であり、かつ５０％未満、好適には４０％未満、更に好適には３５％未満である。アラニン成分が高くなると、繊維が硬くなり、かつ／あるいは、強くなり、かつあるいは伸展性が低くなることが予期されるため有効である。
【００７９】
特定の実施形態においては、ＲＥＰ断片はプロリン残基を欠いている。すなわち、ＲＥＰ断片においてＰｒｏ残基がない。
【００８０】
本発明によるＲＥＰ断片を構成するセグメントによると、各々のセグメントは独立であることは強調すべきであろう。すなわち、特定のＲＥＰ断片の任意の２のＡセグメント、任意の２のＧセグメント、任意の２のＬセグメントは同一であっても、あるいは同一でなくてもよい。従って、各々の種類のセグメントが特定のＲＥＰ断片で同一であることは本発明の一般的な特徴ではない。逆に、以下の開示によって、当業者は別個のセグメントの設計方法及びＲＥＰ断片への集結方法の指針が提供され、それは、本発明によるスパイダーシルクタンパク質の機能性の一部となる。
【００８１】
各々の独立したＡセグメントのアミノ酸配列は８ないし１８のアミノ酸残基である。各々の独立したＡセグメントは１３ないし１５のアミノ酸残基を含むことが好適である。更に、多数又は３以上のＡセグメントが１３ないし１５のアミノ酸残基を含み、少数、例えば１又は２のＡセグメントは８ないし１８のアミノ酸残基、例えば８ないし１２又は１６ないし１８のアミノ酸残基を含むことが可能である。これらのアミノ酸残基の大多数はアラニン残基である。更に特異的なことに、０ないし３のアミノ酸残基はアラニン残基ではなく、残余のアミノ酸残基はアラニン残基である。従って、各々の独立したＡセグメントにおける総てのアミノ酸残基は、例外なく、あるいは１、２、又は３のアミノ酸残基が任意のアミノ酸にできることを除いては、アラニン残基である。アラニンで置換した１以上のアミノ酸は天然アミノ酸であることが好適であり、好適にはセリン、グルタミン酸、システイン、及びグリシンからなる群から別個に選択され、更に好適にはセリンである。当然ながら、１以上のＡセグメントは総てがアラニンセグメントであるが、残余のＡセグメントは１ないし３の非アラニン残基、例えばセリン、グルタミン酸、システイン、又はグリシンを含むことが可能である
【００８２】
好適な実施形態においては、各々のＡセグメントは１３ないし１５のアミノ酸残基を含み、上述のように１０ないし１５のアラニン残基と０ないし３の非アラニン残基とを含む。更に好適な実施形態においては、各々のＡセグメントは１３ないし１５のアミノ酸残基を含み、上述のように１２ないし１５のアラニン残基と、０ないし１の非アラニン残基とを含む。
【００８３】
各々の独立したＡセグメントは、配列番号１０のアミノ酸残基７ないし１９、４３ないし５６、７１ないし８３、１０７ないし１２０、１３５ないし１４７、１７１ないし１８３、１９８ないし２１１、２３５ないし２４８、２６６ないし２７９、２９４ないし３０６、３３０ないし３４２、３５７ないし３７０、３９４ないし４０６、４２１ないし４３４、４５８ないし４７０、４８９ないし５０２、５１７ないし５２９、５５３ないし５６６、５８１ないし５９４、６１８ないし６３０、６４８ないし６６１、６７６ないし６８８、７１２ないし７２５、７４０ないし７５２、７７６ないし７８９、８０４ないし８１６、８４０ないし８５３、８６８ないし８８０、９０４ないし９１７、９３２ないし９４５、９６９ないし９８１、９９９ないし１０１３、１０２８ないし１０４２、及び１０６０ないし１０７３の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、好適には少なくとも９０％、更に好適には９５％、もっとも好適には１００％同一であることが好適である。この群の各配列は、Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓのＭａＳｐ１タンパク質の天然に存在する配列のセグメントに対応し、対応するｃＤＮＡのクローン化で推定される。国際公開第２００７／０７８２３９号参照。代替的に、各々の独立したＡセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基１４３ないし１５２、１７４ないし１８６、２０４ないし２１８、２３３ないし２４７、及び２６５ないし２７８の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、好適には少なくとも９０％、更に好適には９５％、もっとも好適には１００％同一である。この群の各配列は、発現した本発明による非天然のタンパク質のセグメントに対応し、そのタンパク質は好適な条件下でシルク繊維を形成する能力がある（実施例２参照）。従って、本発明による特定の実施形態においては、各々の独立したＡセグメントは上述のアミノ酸セグメントから選択されるアミノ酸配列と同一となる。任意の特定の理論によって結びつけられることを望まないが、本発明によるＡセグメントがヘリックス構造又はβシートを形成することは予測される。
【００８４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲にわたって用いられるような用語「同一度（〜％同一：％  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は以下のように算出される。問い合わせ配列はＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．、及びＧｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３−４６８０（１９９４））を用いて標的配列に整列される。比較は整列した配列のうち最短のものに対応する領域にわたってなされる。各々の位置でのアミノ酸残基を比較し、標的配列において同一に対応する問い合わせ配列における位置の割合が、同一度として報告されている。
【００８５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲にわたって用いられるような用語「類似度（〜％類似：％  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」は、疎水性残基Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、及びＣｙｓが類似であり、塩基性残基Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓが類似であり、酸性残基Ｇｌｕ及びＡｓｐが類似であり、疎水性の非荷電性残基Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＴｙｒが類似であることを除いては、「同一度」に記載のように算出される。残余の天然アミノ酸Ｇｌｙはこの状況においてはその他のアミノ酸と類似ではない。
【００８６】
本記載にわたって、本発明による代替的な実施形態は、特定の同一性の割合に代わって、対応する類似性の割合を実現する。他の代替的な実施形態は、特定の同一性の割合、ならびに、各配列に対する好適な同一性の割合の群から選択される別の高類似性の割合を実現する。例えば、ある配列は別の配列と７０％類似であってもよく、別の配列と７０％同一であってもよく、別の配列と７０％同一及び９０％類似であってもよい。
【００８７】
更に、各々の独立したＧセグメントが１２ないし３０のアミノ酸残基のアミノ酸配列であることを実験データから結論づけている。各々の独立したＧセグメントは１４ないし２３のアミノ酸残基からなることが好適である。各Ｇセグメントの少なくとも４０％のアミノ酸残基はグリシン残基である。一般的には、各々の独立したＧセグメントのグリシン成分の範囲は４０ないし６０％である。
【００８８】
各々の独立したＧセグメントは、配列番号１０のアミノ酸残基２０ないし４２、５７ないし７０、８４ないし１０６、１２１ないし１３４、１４８ないし１７０、１８４ないし１９７、２１２ないし２３４、２４９ないし２６５、２８０ないし２９３、３０７ないし３２９、３４３ないし３５６、３７１ないし３９３、４０７ないし４２０、４３５ないし４５７、４７１ないし４８８、５０３ないし５１６、５３０ないし５５２、５６７ないし５８０、５９５ないし６１７、６３１ないし６４７、６６２ないし６７５、６８９ないし７１１、７２６ないし７３９、７５３ないし７７５、７９０ないし８０３、８１７ないし８３９、８５４ないし８６７、８８１ないし９０３、９１８ないし９３１、９４６ないし９６８、９８２ないし９９８、１０１４ないし１０２７、１０４３ないし１０５９、及び１０７４ないし１０９２の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、好適には少なくとも９０％、更に好適には９５％、もっとも好適には１００％同一であることが好適である。この群の各配列は、Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓのＭａＳｐ１タンパク質の天然に存在する配列のセグメントに対応し、対応するｃＤＮＡのクローン化で推定される。国際公開第２００７／０７８２３９号参照。代替的に、各々の独立したＧセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基１５３ないし１７３、１８７ないし２０３、２１９ないし２３２、２４８ないし２６４、及び２７９ないし２９６の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、好適には少なくとも９０％、更に好適には９５％、もっとも好適には１００％同一である。この群の各配列は、発現した本発明による非天然のタンパク質のセグメントに対応し、そのタンパク質は好適な条件下でシルク繊維を形成する能力がある（実施例２参照）。従って、本発明による特定の実施形態においては、各々の独立したＧセグメントは上述のアミノ酸セグメントから選択されるアミノ酸配列と同一となる。
【００８９】
特定の実施形態においては、本発明による各々のＧセグメントの最初の２のアミノ酸残基は−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−ではない。
【００９０】
本発明によるＧセグメントの３の亜類型がある。この分類はＥｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓのＭａＳｐ１タンパク質配列の正確な分析に基づいており（国際公開第２００７／０７８２３９号）、情報は新規で非天然のスパイダーシルクタンパク質の構成で使用及び検証されている。
【００９１】
本発明によるＧセグメントの第１の亜類型は、アミノ酸１文字表記のコンセンサス配列ＧＱＧ（Ｇ／Ｓ）ＱＧＧ（Ｑ／Ｙ）ＧＧ（Ｌ／Ｑ）ＧＱＧＧＹＧＱＧＡＧＳＳ（配列番号１１）で表される。一般的には最長であるこの第１のＧセグメントの亜類型は、一般的には２３のアミノ酸残基を含むが、１７程度の短いアミノ酸残基を含んでもよく、荷電性残基がなくても１の荷電性残基を含んでもよい。従って、この第１のＧセグメントの亜類型は１７ないし２３のアミノ酸残基を含むことが好適であるが、１２程度の少ないあるいは３０程度の多いアミノ酸残基を含みうることを予期すべきである。任意の特定の理論によって結びつけられることを望まないが、この亜類型はコイル構造又は３１へリックス構造を形成することは予想すべきである。この第１の亜類型の代表的なＧセグメントは、配列番号１０のアミノ酸残基２０ないし４２、８４ないし１０６、１４８ないし１７０、２１２ないし２３４、３０７ないし３２９、３７１ないし３９３、４３５ないし４５７、５３０ないし５５２、５９５ないし６１７、６８９ないし７１１、７５３ないし７７５、８１７ないし８３９、８８１ないし９０３、９４６ないし９６８、１０４３ないし１０５９、及び１０７４ないし１０９２である。特定の実施形態においては、本発明によるこの第１の亜類型の各々のＧセグメントの最初の２のアミノ酸残基は−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−ではない。
【００９２】
本発明によるＧセグメントの第２の亜類型は、アミノ酸１文字表記のコンセンサス配列ＧＱＧＧＱＧＱＧ（Ｇ／Ｒ）ＹＧＱＧ（Ａ／Ｓ）Ｇ（Ｓ／Ｇ）Ｓ（配列番号１２）で表される。一般的には中程度の大きさであるこの第２のＧセグメントの亜類型は、一般的には１７のアミノ酸残基を含み、荷電性残基がないか、あるいは１の荷電性残基を含んでいる。この第２のＧセグメントの亜類型は１４ないし２０のアミノ酸残基を含むことが好適であるが、１２程度の少ないあるいは３０程度の多いアミノ酸残基を含みうることを予期すべきである。任意の特定の理論によって結びつけられることを望まないが、この亜類型はコイル構造を形成することは予想すべきである。この第２の亜類型の代表的なＧセグメントは、配列番号１０のアミノ酸残基２４９ないし２６５、４７１ないし４８８、６３１ないし６４７、及び９８２ないし９９８、ならびに配列番号３のアミノ酸残基１８７ないし２０３である。
【００９３】
本発明によるＧセグメントの第３の亜類型は、アミノ酸１文字表記のコンセンサス配列Ｇ（Ｒ／Ｑ）ＧＱＧ（Ｇ／Ｒ）ＹＧＱＧ（Ａ／Ｓ／Ｖ）ＧＧＮ（配列番号１３）で表される。この第３のＧセグメントの亜類型は一般的に１４のアミノ酸残基を含み、一般的には本発明によるＧセグメントの亜類型のうちで最短である。この第３のＧセグメントの亜類型は１２ないし１７のアミノ酸残基を含むことが好適であるが、２３程度の多いアミノ酸残基を含みうることを予期すべきである。任意の特定の理論によって結びつけられることを望まないが、この亜類型はターン構造を形成することは予想すべきである。この第３の亜類型の代表的なＧセグメントは、配列番号１０のアミノ酸残基５７ないし７０、１２１ないし１３４、１８４ないし１９７、２８０ないし２９３、３４３ないし３５６、４０７ないし４２０、５０３ないし５１６、５６７ないし５８０、６６２ないし６７５、７２６ないし７３９、７９０ないし８０３、８５４ないし８６７、９１８ないし９３１、１０１４ないし１０２７、ならびに配列番号３のアミノ酸残基２１９ないし２３２である。
【００９４】
従って好適な実施形態においては、各々の独立したＧセグメントは配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、好適には９０％、更に好適には９５％同一である。
【００９５】
ＲＥＰ断片のＡセグメント及びＧセグメントの交互配列の好適な実施形態においては、総ての第２のＧセグメントは第１の亜類型であるが、残余のＧセグメントは第３の亜類型、例えば：
．．．Ａ１ＧｓｈｏｒｔＡ２ＧｌｏｎｇＡ３ＧｓｈｏｒｔＡ４ＧｌｏｎｇＡ５Ｇｓｈｏｒｔ．．．；
である。ＲＥＰ断片の別の好適な実施形態においては、第２の亜類型の１のＧセグメントが挿入部、例えば：
．．．Ａ１ＧｓｈｏｒｔＡ２ＧｌｏｎｇＡ３ＧｍｉｄＡ４ＧｓｈｏｒｔＡ５Ｇｌｏｎｇ．．．；
を介してＧセグメントの規則性を断続している。
【００９６】
各々の独立したＬセグメントは任意のリンカーアミノ酸配列を表し、０ないし２０のアミノ酸残基、例えば０ないし１０のアミノ酸残基を含んでもよい。このセグメントは任意であり、スパイダーシルクタンパク質で機能上重要ではないが、その存在によって更に、完全に機能的なスパイダーシルクタンパク質を可能にし、本発明によるスパイダーシルク繊維を形成する。更に、Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来のＭａＳｐ１タンパク質の推定アミノ酸配列の反復部分（配列番号１０）に存在するリンカーアミノ酸配列がある。特に、リンカーセグメントのアミノ酸配列は、記載のＡセグメント又はＧセグメントのいずれかに類似しうるが、通常は本明細書中に規定のような基準に十分には合致しない。
【００９７】
国際公開第２００７／０７８２３９号に示されるように、ＲＥＰ断片のＣ末端部分に配置されたリンカーセグメントは、アミノ酸１文字表記のコンセンサス配列ＡＳＡＳＡＡＡＳＡＡＳＴＶＡＮＳＶＳ及びＡＳＡＡＳＡＡＡで表すことができ、アラニンリッチである。実際に、第２の配列は本発明によるＡセグメントと認識されうるが、第１の配列は本発明によるＡセグメントに対する類似度が高くなる。本発明によるリンカーセグメントの別の例の１文字表記のアミノ酸配列はＧＳＡＭＧＱＧＳであり、グリシンリッチであり、本発明によるＧセグメントに対する類似度が高くなる。リンカーセグメントの別の例はＳＡＳＡＧである。
【００９８】
代表的なＬセグメントは、配列番号１０のアミノ酸残基１ないし６及び１０９３ないし１１１０、ならびに配列番号３のアミノ酸残基１３８ないし１４２であるが、当該技術分野の当業者はこれらのセグメントに好適な多くの代替的なアミノ酸配列があることは容易に理解するであろう。本発明によるＲＥＰ断片の一実施形態においては、Ｌセグメントのうちの一方が０のアミノ酸を含む。すなわち、Ｌセグメントのうちの１つは空隙部となる。本発明によるＲＥＰ断片の別の実施形態においては、双方のＬセグメントが０のアミノ酸を含む。すなわち双方のＬセグメントは空隙部となる。従って、本発明によるＲＥＰ断片のこれらの実施形態は：（ＡＧ）ｎＬ、（ＡＧ）ｎＡＬ、（ＧＡ）ｎＬ、（ＧＡ）ｎＧＬ；Ｌ（ＡＧ）ｎ、Ｌ（ＡＧ）ｎＡ、Ｌ（ＧＡ）ｎ、Ｌ（ＧＡ）ｎＧ；及び（ＡＧ）ｎ、（ＡＧ）ｎＡ、（ＧＡ）ｎ、（ＧＡ）ｎＧ；として概略的に表される。これらのＲＥＰ断片のいずれかは以下に規定のような任意のＣＴ断片で用いるのに好適である。
【００９９】
本発明によるスパイダーシルクタンパク質の任意のＣＴ断片は、スパイダーシルクタンパク質のＣ末端のアミノ酸配列に対する類似度が高い。国際公開第２００７／０７８２３９号に示されるように、このアミノ酸配列は多様な種及びスパイダーシルクタンパク質の間で都合良く維持されており、ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２を含んでいる。ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２のＣ末端領域のコンセンサス配列は配列番号９として与えられる。図２においては、以下のＭａＳｐタンパク質は配列され、該当する場合にはＧｅｎＢａｎｋアクセス項目で表示される。
【０１００】
［表２：スピドロインのＣＴ断片］
【表２】
0005912077.tif 000003
【０１０１】
特定のＣＴ断片が本発明によるスパイダーシルクタンパク質に存在することは、存在したとしても重要ではない。従って、本発明によるＣＴ断片は図２及び表２に示されるアミノ酸配列、あるいは類似度の高い配列のいずれかから選択できる。広範で多様なＣ末端配列は本発明によるスパイダーシルクタンパク質で用いることができる。
【０１０２】
本発明によるＣＴ断片の配列は、コンセンサスアミノ酸配列の配列番号９と少なくとも５０％同一、好適には少なくとも６０％同一、更に好適には少なくとも６５％同一、更には少なくとも７０％同一であり、図２のアミノ酸配列に基づいている。
【０１０３】
本発明による代表的なＣＴ断片は、Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ配列の配列番号７である。従って、本発明の好適な態様によると、ＣＴ断片は配列番号７又は図２及び表２における任意の別個のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好適には少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％同一である。本発明の好適な態様においては、ＣＴ断片は配列番号７又は図２及び表２における任意の別個のアミノ酸配列と同一である。
【０１０４】
ＣＴ断片は一般的には７０ないし１２０のアミノ酸残基からなる。ＣＴ断片は少なくとも７０の、又は８０を超え、好適には９０を超えるアミノ酸残基を含むことが好適である。ＣＴ断片は最大で１２０の、又は１１０未満のアミノ酸残基を含むことが更に好適である。一般的なＣＴ断片は約１００のアミノ酸残基を含む。
【０１０５】
一実施形態においては、単離したスパイダーシルクタンパク質の重合体を産生する方法の第１のステップは、大腸菌といった好適な宿主でスパイダーシルクタンパク質をコードするポリ核酸分子の発現を含む。このように得られたタンパク質は標準的な手順を用いて単離される。任意にリポ多糖類及び他の発熱物質はこの段階で能動的に除去される。
【０１０６】
単離したスパイダーシルクタンパク質の重合体を産生する方法の第２のステップにおいては、液体培地におけるスパイダーシルクタンパク質の溶液が提供される。用語「可溶な（ｓｏｌｕｂｌｅ）」及び「溶液における（ｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）」によって、タンパク質が見かけ上凝集されず、６００００×ｇで溶媒から沈殿しないことを示している。液体培地は水溶性培地といった任意の好適な培地、好適には生理学的培地、一般的には１０ないし５０ｍＭのトリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）緩衝液又はリン酸緩衝液といった緩衝した水溶性培地にできる。液体培地はｐＨが６．４以上であり、かつ／あるいはスパイダーシルクタンパク質の重合を阻止するイオン組成である。すなわち、液体培地はｐＨが６．４以上であるか、あるいはスパイダーシルクタンパク質の重合を阻止するイオン組成であるか、あるいはその双方である。
【０１０７】
スパイダーシルクタンパク質の重合を阻止するイオン組成は、本明細書中に開示の方法を用いて当業者によって容易に調製されうる。スパイダーシルクタンパク質の重合を阻止する好適なイオン組成のイオン強度は３００ｍＭを超えている。スパイダーシルクタンパク質の重合を阻止するイオン組成の特異的な例は、３００ｍＭを超えるＮａＣｌと、１００ｍＭのホスファートと、スパイダーシルクタンパク質の重合に所望の阻止の効果を及ぼすこれらのイオンの組合せ、例えば１０ｍＭのホスファートと３００ｍＭのＮａＣｌとの組合せとを含む。
【０１０８】
驚くべきことに、ＮＴ断片の存在によって溶液の安定性が改善され、これらの条件下での重合体の形成が阻止されることが見出された。このことは即時の重合が所望されない場合、例えばタンパク質精製時、大きな処理単位の調製時、又は他の条件が最適化される必要がある場合に有益である。液体培地のｐＨは６．７以上、例えば７．０以上、又は更に８．０以上、例えば最大１０．５に調節して、スパイダーシルクタンパク質の溶解度を高くすることが好適である。更には、液体培地のｐＨの範囲は６．４ないし６．８に調節するのが有益であり、それによってスパイダーシルクタンパク質を十分に溶解できるが、後の６．３以下へのｐＨの調節を促進できる。
【０１０９】
第３のステップにおいては、液体培地の特性は６．３以下のｐＨ及び重合を可能にするイオン組成に調節される。すなわち、スパイダーシルクタンパク質が溶解される液体培地のｐＨが６．４以上の場合、ｐＨを６．３以下に低下する。当業者はこれを実現する多様な方法、一般的には強酸又は弱酸の添加を含む多様な方法を十分に承知している。スパイダーシルクタンパク質を溶解した液体培地が重合を阻止するイオン組成である場合、イオン組成は重合を可能にするように変化する。当業者はこれを実現する多様な方法、例えば希釈、透析、又はゲル濾過を十分に承知している。必要に応じて、このステップは液体培地のｐＨを６．３以下に低下するステップと、重合を可能にするようにイオン組成を変化させるステップとの双方を具える。液体培地のｐＨは６．２以下、例えば６．０以下に調節されることが好適である。特に、実用的な観点から直前のステップにおける６．４又は６．４ないし６．８から、このステップにおける６．３又は６．０ないし６．３、例えば６．２にｐＨの低下を限定することは有益となりうる。好適な実施形態においては、このステップの液体培地のｐＨは３以上、例えば４．２以上となる。４．２ないし６．３等の得られたｐＨの範囲は、迅速な重合を促進する。
【０１１０】
第４のステップにおいては、スパイダーシルクタンパク質は、ｐＨが６．３以下であり、かつスパイダーシルクタンパク質の重合を可能にするイオン組成である液体培地において、重合するのが可能となる。驚くべきことに、ＮＴ断片の存在によって６．４以上のｐＨ及び／又はスパイダーシルクタンパク質の重合を阻止するイオン組成で溶液の安定性が改善されるが、イオン組成によってスパイダーシルクタンパク質の重合が可能となる場合に６．３以下のｐＨで重合体の形成が促進されることが見出された。得られた重合体は好適には固体かつマクロ的であり、ｐＨが６．３以下であり、かつスパイダーシルクタンパク質の重合を可能にするイオン組成である液体培地において形成される。好適な実施形態においては、このステップの液体培地のｐＨは３以上、例えば４．２以上である。４．２ないし６．３等の得られたｐＨの範囲は、迅速な重合を促進する。好適な重合体の形状は繊維、薄膜、発泡樹脂、ネット、又はメッシュを含む。重合体は直径が０．１μｍを超え、好適には１μｍを超え、長さが５ｍｍを超える繊維であることが好適である。
【０１１１】
スパイダーシルクタンパク質の重合を可能にするイオン組成は、本明細書中に開示の方法を用いて当業者によって容易に調製されうる。スパイダーシルクタンパク質の重合を可能にする好適なイオン組成のイオン強度は３００ｍＭ未満である。スパイダーシルクタンパク質の重合を可能にするイオン組成の特異的な例は、１５０ｍＭのＮａＣｌと、１０ｍＭのホスファートと、２０ｍＭのホスファートと、スパイダーシルクタンパク質の重合での阻止の効果をなくすこれらのイオンの組合せ、例えば１０ｍＭのホスファート又は２０ｍＭのホスファートと１５０ｍＭのＮａＣｌとの組合せとを含む。この液体培地のイオン強度の範囲は１ないし２５０ｍＭに調節されることが好適である。
【０１１２】
任意の特定の理論に限定されることを所望しないが、ＮＴ断片が対向して荷電する極を有し、環境でのｐＨの変化が重合の前にタンパク質の表面の荷電平衡に影響を与える一方、塩が同一の事象を抑制することは予想すべきである。
【０１１３】
中性のｐＨで、酸性の極の過剰な負電荷を相殺するエネルギーコストは重合を阻止するために予測してもよい。しかしながら、二量体が低いｐＨで等電点に接近する場合、静電引力が最終的に優位となり、ＮＴ及びＮＴを含むミニスピドロイン（ｍｉｎｉｓｐｉｄｒｏｉｎ）の、観察した塩及びｐＨ依存性の重合の挙動が説明される。我々はｐＨ誘導性のＮＴ重合及びＮＴ−ミニスピドロインの繊維形成効率の増加が表面の静電電位の変化によるものであること、及び重合の遷移が６．３以下のｐＨ値で生じるように、ＮＴの一方の極での酸性残基のクラスター形成が荷電平衡をシフトすることを提唱する。
【０１１４】
第５の最終ステップにおいては、好適には固体の、得られたスパイダーシルクタンパク質の重合体は前記液体培地から単離される。任意に、このステップはリポ多糖類及び他の発熱物質をスピドロインの重合体から能動的に除去するステップを具える。
【０１１５】
任意の特定の理論に限定されることを所望しないが、スピドロインの重合体の形成が水溶性のスピドロインの二量体の形成を介して進展することが観察された。従って、本発明は更に、単離したスパイダーシルクタンパク質の二量体を産生する方法を提供し、最初の２のステップは上述の通りである。スパイダーシルクタンパク質はｐＨが６．４以上であり、かつ／あるいは前記スパイダーシルクタンパク質の重合を阻止するイオン組成である液体培地において二量体として存在する。第３のステップは第２のステップで得られた二量体を単離するステップと、任意にリポ多糖類及び他の発熱物質の除去とを具える。好適な実施形態においては、本発明のスパイダーシルクタンパク質の重合体は重合したタンパク質の二量体からなる。従って本発明は、スパイダーシルクタンパク質の二量体を産生するためのスパイダーシルクタンパク質、好適には本明細書中に開示したものの新規の使用を提供する。
【０１１６】
別の態様によると、本発明は本明細書中に開示したようなスパイダーシルクタンパク質の重合体を提供する。好適な実施形態においては、このタンパク質の重合体は、そのための本発明による方法のいずれか１つによって取得可能である。従って、スパイダーシルクタンパク質の重合体を産生するためのスパイダーシルクタンパク質、好適には本明細書中に開示したものの新規の使用を提供する。一実施形態によると、本発明は、単離したスパイダーシルクタンパク質の重合体を産生するためのスパイダーシルクタンパク質の二量体、好適には本明細書中に開示したものの新規の使用を提供する。これらの使用においては、ｐＨが６．３以下であり、かつ前記スパイダーシルクタンパク質の重合を可能にするイオン組成である液体培地において産生されることが好適である。好適な実施形態においては、液体培地のｐＨは３以上、例えば４．２以上である。４．２ないし６．３等の得られたｐＨの範囲は、迅速な重合を促進する。
【０１１７】
本発明の１以上の方法を用いて、重合プロセスを制御することが可能であり、このことによって、所望の特性及び形状のシルク重合体を得るためのパラメータの最適化が可能となる。
【０１１８】
本発明によるスピドロインタンパク質の重合体はマクロ的な大きさの繊維、すなわち直径が０．１μｍを超え、好適には１μｍを超え、長さが５ｍｍを超える繊維であることが好適である。繊維は直径の範囲が１ないし４００μｍ、好適には６０ないし１２０μｍであり、長さの範囲が０．５ないし３００ｃｍ、好適には１ないし１００ｃｍであることが好適である。他の好適な範囲は０．５ないし３０ｃｍ、及び１ないし２０ｃｍである。本発明によるスピドロインタンパク質の繊維といった重合体は更に、引張り強さが１ＭＰａを超え、好適には２ＭＰａを超え、更に好適には１０ＭＰａ以上であることが好適である。本発明によるスピドロインタンパク質の繊維といった重合体は、引張り強さが１００ＭＰａを超え、更に好適には２００ＭＰａ以上であることが好適である。繊維は物理的動作中に無傷で維持する性能がある。すなわち、紡績、機織り、加撚、かぎ針編み、及び類似の製法で用いることができる。
【０１１９】
他の好適な実施形態においては、本発明によるスピドロインタンパク質の重合体は発泡樹脂、ネット、メッシュ、又は薄膜を形成する。
【０１２０】
別の態様によると、本発明は配列番号１４ないし１６といった、本発明によるスパイダーシルクタンパク質又はその相補的な核酸配列をコードする核酸配列を含む単離したポリ核酸分子を提供する。これらのポリ核酸分子、ならびに本明細書中に開示の多様なタンパク質（配列番号１ないし７、１０ないし１３）をコードするポリ核酸分子は、非天然のスピドロインタンパク質又はそのための産生系の更なる開発に有用である。
【０１２１】
本発明によるポリ核酸分子はＤＮＡ分子にでき、ｃＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子を含んでいる。当業者が承知のように、核酸配列は同様にその相補的な核酸配列によって記載されうる。従って、本発明による核酸配列に対して相補的な核酸配列は更に、本発明の保護範囲によって包含される。
【０１２２】
一態様によると、本発明は、本発明によるスパイダーシルクタンパク質を産生する方法を提供する。第１のステップにおいては、本発明によるスパイダーシルクタンパク質をコードするポリ核酸分子は好適な宿主で発現される。第２のステップにおいては、このように得られた可溶性のタンパク質は例えば、クロマトグラフィ及び／又は濾過を用いて単離される。任意に可溶性のスパイダーシルクタンパク質を単離する前記第２のステップはＬＰＳ及び他の発熱物質の除去を含む。
【０１２３】
本発明によるスパイダーシルクタンパク質は一般的には、細菌、酵母、哺乳類細胞、植物、昆虫細胞、及び遺伝子導入動物といった、多様な好適な宿主を用いて組換え産生される。本発明によるスパイダーシルクタンパク質は細菌において産生されることが好適である。
【０１２４】
生体内での生体材料としての使用に必須の、発熱成分が少ないタンパク質を得るために、リポ多糖類（ＬＰＳ）の除去で最適化される精製プロトコルが開発されている。ＬＰＳの遊離による混入を阻止するために、産生するバクテリア細胞はＣａＣｌ２とＥＤＴＡとを交互にした洗浄ステップを受ける。細胞溶解後、総ての後の精製ステップは標的タンパク質とＬＰＳとの間での疎水性の相互作用を最小化するために、低伝導率の緩衝液で行われる。ＬＰＳ成分は更にタンパク質溶液のＥｎｄｏｔｒａｐカラムの通過によって最小化され、そのリガンドは特異的にＬＰＳを吸収する。ＬＰＳ及び他の発熱物質の成分が一定に低いことを確認するために、総ての処理単位は生体外での発熱物質試験（ＩＰＴ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｙｒｏｇｅｎ  ｔｅｓｔ）及び／又はカブトガニ血球抽出成分（ＬＡＬ：Ｌｉｍｕｌｕｓ  ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ）での動態アッセイを用いて分析される。グラム陰性菌の宿主で産生されるが、組換え型のスピドロインタンパク質はＬＰＳ及び発熱物質の残留レベルが動物試験で要求される限界未満、すなわち、移植片につき２５ＥＵ未満となるように精製できる。本発明による特定の実施形態においては、単離したスパイダーシルクタンパク質におけるＬＰＳ及び他の発熱物質はタンパク質の１ＥＵ／ｍｇ以下となる。本発明による特定の実施形態においては、単離したスパイダーシルクタンパク質におけるＬＰＳ及び他の発熱物質の含量はタンパク質の１ＥＵ／ｍｇ以下、好適にはタンパク質の０．２５ＥＵ／ｍｇ以下である。
【０１２５】
一態様によると、本発明はｐＨが６．４以上であり、かつ／あるいは、前記スパイダーシルクタンパク質の重合を阻止するイオン組成である液体培地に溶解される単離したスパイダーシルクタンパク質、好適には本明細書中に開示したものを含む組成物を提供する。液体培地は水溶性培地といった任意の好適な培地、好適には生理学的培地、一般的には１０ないし５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液又はリン酸緩衝液といった緩衝した水溶性培地にできる。液体培地はｐＨが６．４以上であり、かつ／あるいはスパイダーシルクタンパク質の重合を阻止するイオン組成である。すなわち、液体培地はｐＨが６．４以上であるか、あるいはスパイダーシルクタンパク質の重合を阻止するイオン組成であるか、あるいはその双方である。スパイダーシルクタンパク質の重合を阻止する好適なイオン組成のイオン強度は３００ｍＭを超えている。スパイダーシルクタンパク質の重合を阻止するイオン組成の特異的な例は、３００ｍＭを超えるＮａＣｌと、１００ｍＭのホスファートと、スパイダーシルクタンパク質の重合に所望の阻止の効果を及ぼすこれらのイオンの組合せ、例えば１０ｍＭのホスファートと３００ｍＭのＮａＣｌとの組合せとを含む。液体培地のｐＨは６．７以上、例えば７．０以上、又は更に８．０以上、例えば最大１０．５に調節して、スパイダーシルクタンパク質の溶解度を高くすることが好適である。更には、液体培地のｐＨの範囲は６．４ないし６．８に調節するのが有益であり、それによってスパイダーシルクタンパク質を十分に溶解できるが、後の６．３以下へのｐＨの調節を促進できる。リポ多糖類及び他の発熱物質の含量は液体培地において単離したタンパク質の１ＥＵ／ｍｇ以下であることが好適である。
【０１２６】
スパイダーシルクタンパク質のＮ末端の非反復断片がこれらのタンパク質の重合において関与しており、この断片を含む重合体の形成が特定のパラメータを変えることによって密に制御できるという発明の見識は更に、Ｎ末端の非反復スピドロイン断片由来の少なくとも１の断片を保有する分子の重合体又は低重合体を可逆形成する新規の方法に発展している。実施例は必然的に、この場合にはＥｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓの大嚢状腺スピドロイン１（ＭａＳｐ１）由来のタンパク質を含む特定のタンパク質に関連づけているが、本明細書中に開示の方法は重合体又は低重合体を産生する目的で任意の類似するタンパク質に適用可能であることは考慮すべきである。
【０１２７】
この態様によると、本発明は１種類の分子又は異なる数種類の分子の重合体又は低重合体を可逆形成する方法を提供する。第１の方法ステップは前記分子を提供するステップを具える。各々の分子は：（ａ）少なくとも１の第１の結合成分と；（ｂ）調査又は利用すべき生理活性を保有している第２の成分と；を含んでいる。好適な実施形態においては、分子は単一の結合成分（ａ）を含んでいる。他の好適な実施形態においては、分子は少なくとも２の、例えば２の結合成分（ａ）を含んでいる。各分子は一般的には、１ないし２、１ないし４、１ないし６、２ないし４、及び２ないし６の範囲から選択される多数の結合成分（ａ）を含んでいる。各々の結合成分（ａ）は１００ないし１６０のアミノ酸残基からなり、スパイダーシルクタンパク質のＮ末端（ＮＴ）断片由来である。ＮＴ断片はスパイダーシルクタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列と類似度が高い。表１及び図１に示されるように、このアミノ酸配列は多様な種及びスパイダーシルクタンパク質の間で都合良く維持されており、ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２を含んでいる。
【０１２８】
ＮＴは酸性残基及び塩基性残基が対向する極のクラスターに局在化する場合に双極子モーメントが明確になることが観察される。限定を所望しないが、観察したＮＴの重合は、ＮＴ二量体の線形アレイの形成に関与し、アレイにおける隣の二量体において、１のサブユニットの負の表面が隣接するサブユニットの正の表面に対面して、極が向かい合って積層されることは予測されよう。
【０１２９】
ＮＴ断片が完全には欠損していない限りにおいては、特定の１以上のＮＴ断片が本発明のこの態様による１以上の分子型に存在することは重要ではない。従って、本発明のこの態様による１以上のＮＴ断片は、表１又は図１に示されるアミノ酸配列、あるいは類似度の高い配列のいずれかから選択できる。広範で多様なＮ末端配列は本発明のこの態様による１以上の分子型で用いることができる。
【０１３０】
本発明によるＮＴ断片の配列は、コンセンサスアミノ酸配列の配列番号８と少なくとも５０％同一、好適には少なくとも６０％同一であり、図１のアミノ酸配列に基づいている。好適な実施形態においては、本発明によるＮＴ断片の配列は、コンセンサスアミノ酸配列の配列番号８と少なくとも６５％同一、好適には少なくとも７０％同一である。好適な実施形態においては、本発明によるＮＴ断片は更に、コンセンサスアミノ酸配列の配列番号８と７０％、好適には８０％類似している。
【０１３１】
本発明による代表的なＮＴ断片は、Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ配列の配列番号６である。本発明の好適な実施形態においては、ＮＴ断片は配列番号６又は図１における任意の別個のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である。本発明の好適な実施形態においては、ＮＴ断片は配列番号６又は図１における任意の別個のアミノ酸配列と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％同一である。本発明の好適な実施形態においては、ＮＴ断片は配列番号６又は図１における任意の別個のアミノ酸配列と同一である。
【０１３２】
ＮＴ断片は１００ないし１６０のアミノ酸残基を含む。ＮＴ断片は少なくとも１００の、又は１１０を超え、好適には１２０を超えるアミノ酸残基を含むことが好適である。ＮＴ断片は最大で１６０の、又は１４０未満のアミノ酸残基を含むことが更に好適である。一般的なＮＴ断片は約１３０ないし１４０のアミノ酸残基を含む。
【０１３３】
特定の方法の総ての分子の結合成分（ａ）は一般的には共通であるが、本明細書中に記載のｐＨ及びイオン強度の条件下で相互に結合する能力を維持する限りにおいては、その差異が異なる成分（ａ）の使用に属する場合、分子型が異なることが可能となる。一般的には、第２の成分（ｂ）は調査又は利用すべき生理活性を保有し、方法が２以上の分子型を含む場合に異なるのが一般的にはこの第２の成分である。第２の成分（ｂ）はタンパク質、核酸、炭水化物、及び脂質から別個に選択される。好適には、第２の成分（ｂ）は更にタンパク質である。
【０１３４】
好適な実施形態においては、第１のステップの分子は同一、すなわち単一型であり、ひいては得られた重合体（低重合体）は同種重合体（同種低重合体）である。別の好適な実施形態においては、第１のステップの分子は同一ではなく、ひいては得られた重合体（低重合体）は異種重合体（異種低重合体）である。上述のように、分子の異種性は結合成分（ａ）、生理活性成分（ｂ）、又は双方に属しうる。
【０１３５】
第２の方法ステップにおいては、液体培地における分子の溶液が提供される。液体培地は水溶性培地といった任意の好適な培地、好適には生理学的培地、一般的には１０ないし５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液又はリン酸緩衝液といった緩衝した水溶性培地にできる。液体培地はｐＨが６．４以上であり、かつ／あるいは結合成分を介した分子の重合又は低重合を阻止するイオン組成である。すなわち、液体培地はｐＨが６．４以上であるか、あるいは結合成分を介した分子の重合又は低重合を阻止するイオン組成であるか、あるいはその双方である。
【０１３６】
結合成分を介した分子の重合又は低重合を阻止するイオン組成は、本明細書中に開示の方法を用いて当業者によって容易に調製されうる。結合成分を介した分子の重合又は低重合を阻止する好適なイオン組成のイオン強度は３００ｍＭを超えている。結合成分を介した分子の重合を阻止するイオン組成の特異的な例は、３００ｍＭを超えるＮａＣｌと、１００ｍＭのホスファートと、結合成分を介した分子の重合に所望の阻止の効果を及ぼすこれらのイオンの組合せ、例えば１０ｍＭのホスファートと３００ｍＭのＮａＣｌとの組合せとを含む。
【０１３７】
驚くべきことに、少なくとも１のＮＴ断片の存在によって溶液の安定性が改善され、これらの条件下での重合体及び低重合体の形成が阻止されることが見出された。このことは即時の重合又は低重合が所望されない場合、例えばタンパク質精製時、大きな処理単位の調製時、又は他の条件が最適化される必要がある場合に有益である。液体培地のｐＨは６．７以上、例えば７．０以上、又は更に８．０以上、例えば最大１０．５に調節して、分子の溶解度を高くすることが好適である。更には、液体培地のｐＨの範囲は６．４ないし６．８に調節するのが有益であり、それによって分子を十分に溶解できるが、後の６．３以下へのｐＨの調節を促進できる。
【０１３８】
第３の方法ステップにおいては、前記液体培地の特性は結合成分を介して分子の重合又は低重合を可能にするように調節される。従って、液体培地の特性は６．３以下のｐＨ及び重合を可能にするイオン組成に調節される。すなわち、分子が溶解される液体培地のｐＨが６．４以上の場合、ｐＨを６．３以下に低下する。当業者はこれを実現する多様な方法、一般的には強酸又は弱酸の添加を含む多様な方法を十分に承知している。分子を溶解した液体培地が重合又は低重合を阻止するイオン組成である場合、イオン組成は結合成分を介して分子の重合又は低重合を可能にするように変化する。当業者はこれを実現する多様な方法、例えば希釈、透析、又はゲル濾過を十分に承知している。必要に応じて、このステップは液体培地のｐＨを６．３以下に低下するステップと、重合又は低重合を可能にするようにイオン組成を変化させるステップとの双方を具える。液体培地のｐＨは６．２以下、例えば６．０以下に調節されることが好適である。特に、実用的な観点から直前のステップにおける６．４又は６．４ないし６．８から、このステップにおける６．３又は６．０ないし６．３、例えば６．２にｐＨの低下を限定することは有益となりうる。好適な実施形態においては、このステップの液体培地のｐＨは３以上、例えば４．２以上となる。４．２ないし６．３等の得られたｐＨの範囲は、迅速な重合を促進する。
【０１３９】
第４の方法ステップにおいては、分子は液体培地における結合成分を介して重合体又は低重合体を形成可能となる。液体培地は、ｐＨが６．３以下であり、かつ結合成分を介して分子の重合又は低重合を可能にするイオン組成である。驚くべきことに、結合成分の存在によって６．４以上のｐＨ及び／又は分子の重合又は低重合を阻止するイオン組成で分子の安定性が改善されるが、イオン組成によって分子の重合又は低重合が可能となる場合に６．３以下のｐＨで重合又は低重合の形成が促進されることが見出された。好適な実施形態においては、このステップの液体培地のｐＨは３以上、例えば４．２以上である。４．２ないし６．３等の得られたｐＨの範囲は、迅速な重合を促進する。本方法の好適な実施形態においては、第４のステップで得られた重合体又は低重合体は可溶に維持される。すなわち、ｐＨが６．３以下であり、分子の重合又は低重合を可能にするイオン組成である液体培地に溶解される。
【０１４０】
結合成分を介して分子の重合又は低重合を可能にするイオン組成は、本明細書中に開示の方法を用いて当業者によって容易に調製されうる。結合成分を介して分子の重合を可能にする好適なイオン組成のイオン強度は３００ｍＭ未満である。結合成分を介した分子の重合を可能にするイオン組成の特異的な例は、１５０ｍＭのＮａＣｌと、１０ｍＭのホスファートと、２０ｍＭのホスファートと、結合成分を介した分子の重合での阻止の効果をなくすこれらのイオンの組合せ、例えば１０ｍＭのホスファート又は２０ｍＭのホスファートと１５０ｍＭのＮａＣｌとの組合せとを含む。この液体培地のイオン強度の範囲は１ないし２５０ｍＭに調節されることが好適である。
【０１４１】
好適な実施形態においては、本発明のこの態様による方法は、重合体又は低重合体の形成を逆転させる第５のステップを具えうる。本方法ステップは６．４以上のｐＨ、及び／又は前記分子の重合又は低重合を阻止するイオン組成に、液体培地の特性を調節するステップを具える。このことによって、液体培地に存在する重合体又は低重合体は液体培地において分解及び溶解される。第５の方法ステップの液体培地の組成は、第２の方法ステップの液体培地で記載のものと同一にできる。例えば、第５の方法ステップの液体培地のｐＨは６．７以上、例えば７．０以上、又は更に８．０以上、例えば最大１０．５である。代替的には、第５の方法ステップの液体培地のｐＨの範囲は６．４ないし６．８である。
【０１４２】
ステップ（ｉｖ）の重合体又は低重合体は相互作用の調査、選別、酵素複合体の誘発活性、又はＦＲＥＴ分析で有益に用いることができる。特定の用途においては、第１の方法ステップの少なくとも１の分子型は固形担体、あるいは以下に記載のようなアフィニティ培地の基質に固定化される。
【０１４３】
一態様によると、本発明は更に分子の集合に含まれる分子の部分集合間の結合相互作用を検出する方法を提供する。第１の方法ステップにおいては、分子の集合が提供される。この集合の各分子は上に詳述したように設計される。すなわち、（ａ）少なくとも１の第１の結合成分と、（ｂ）調査又は利用すべき生理活性を保有する第２の成分とを含んでいる。好適な実施形態においては、分子は単一の結合成分（ａ）を含んでいる。他の好適な実施形態においては、分子は少なくとも２の、例えば２の結合成分（ａ）を含んでいる。各々の分子は一般的には１ないし２、１ないし４、１ないし６、２ないし４、及び２ないし６の範囲から選択される多数の結合成分（ａ）を含む。各々の結合成分（ａ）は１００ないし１６０のアミノ酸残基からなり、上述のようにスパイダーシルクタンパク質のＮ末端（ＮＴ）断片由来である。各々の生理活性成分（ｂ）はタンパク質、核酸、炭水化物、及び脂質、好適にはタンパク質から別個に選択される。
【０１４４】
第２の方法ステップにおいては、液体培地における前記分子の集合の溶液が提供される。上述のように、液体培地はｐＨが６．４以上であり、前記分子の重合又は低重合を阻止するイオン組成である。液体培地の好適な組成は以前の開示で明らかである。
【０１４５】
第３の方法ステップにおいては、液体培地の特性は分子の重合又は低重合を可能にするように調節される。上述のように、液体培地はｐＨが６．３以下であり、分子の重合又は低重合を可能にするイオン組成である。液体培地の好適な組成は以前の開示で明らかである。
【０１４６】
第４の方法ステップにおいては、この集合の分子は液体培地において、前記結合成分を介して重合体又は低重合体を形成可能にする。上述のように、液体培地はｐＨが６．３以下であり、分子の重合又は低重合を可能にするイオン組成である。液体培地の好適な組成は以前の開示で明らかである。
【０１４７】
第５の方法ステップにおいては、液体培地の特性は重合体又は低重合体を分解するように調節される。上述のように、液体培地はｐＨが６．４以上であり、かつ／あるいは、前記分子の重合又は低重合を阻止するイオン組成である。液体培地の好適な組成は以前の開示で明らかである。これによって、ＮＴ由来の結合成分を介した連結を阻止することによる重合体又は低重合体の分解を引き起こす。
【０１４８】
最後かつ第６の方法ステップにおいては、２以上の異なる分子間での前記結合成分を介した２以上の異なる分子間で前記結合成分を介して媒介されない結合相互作用の存在が判定される。このことによって、ＮＴ由来の結合成分を介して媒介したｐＨ／塩で調節した重合又は低重合を含まない分子の部分集合間での結合相互作用を同定する。
【０１４９】
本発明の関連する態様は、ｐＨが約７から６に、更に特異的には６．４超から６．３未満に低下した場合に、ＮＴ断片が大きな溶解可能な集合体を形成するという見識に基づいている。この集合体はｐＨが４．２超、すなわち４．２ないし６．３、例えば４．２ないし６の範囲で最も効率的に生じる。この特性は例えば、ＮＴがカラムに固定化された場合に、アフィニティ精製のために用いられうる。ｐＨが約６から７に上昇した場合に集合体は分解されるため、このアプローチは生理学的に関連する間隔でのｐＨシフトによって、結合タンパク質が遊離可能となる。
【０１５０】
本発明による方法の好適な実施形態においては、スパイダーシルクタンパク質を単離するステップは、ＮＴ成分を固定化したアフィニティ培地、例えばアフィニティカラムでのスパイダーシルクタンパク質の精製を含む。アフィニティ培地でのスパイダーシルクタンパク質の精製は６．３以下、好適には４．２ないし６．３の範囲のｐＨで、ＮＴ成分を固定化したアフィニティ培地に結合し、次いでｐＨが６．４以上であり、かつ／あるいはイオン強度が高い所望の解離培地でアフィニティ培地から解離することで好適には行われる。イオン強度が高い解離培地のイオン強度は一般的には３００ｍＭを超え、例えば３００ｍＭを超えるＮａＣｌである。
【０１５１】
これらの親和性（アフィニティ）による手順は本発明によるＮＴ成分の固有の特性を用いている。特に興味深いのは、６．３未満、特に４．２ないし６．３の範囲のｐＨで結合するスピドロインのＮＴタンパク質断片の強い性質である。これは強力なアフィニティ精製ツールとして用いるのに有益であり、複合混合物から本発明によるスパイダーシルクタンパク質のワンステップでの精製が可能となる。クロマトグラフィが好適であるが、クロマトグラフィ以外の他のアフィニティ系の精製方法、例えば表面が官能基化した磁気ビーズ又は表面が官能基化したフィルタは当然利用できる。
【０１５２】
従って、本発明によるスパイダーシルクタンパク質を産生する方法は、ＮＴ成分を固定化したアフィニティ培地でのスパイダーシルクタンパク質の精製を含みうる。好適には、アフィニティ培地での融合タンパク質の精製は６．３以下のｐＨでＮＴ成分を固定化したアフィニティ培地に結合し、次いでｐＨが６．４以上であり、かつ／あるいはイオン強度が高い所望の解離培地でアフィニティ培地から解離することで行われる。精製は一般的にはカラムにおいて、表面が官能基化した磁気ビーズで、あるいは表面が官能基化したフィルタで生じる。
【０１５３】
本発明は更に、基質と当該基質に結合した親和性相互作用のためのリガンドとを、任意にスペーサーアーム部を介して含むアフィニティ培地を提供する。リガンドは本発明の記載に述べているようにスパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片由来の１００ないし１６０のアミノ酸残基のうちの少なくとも１の断片を含んでいる。好適な実施形態においては、リガンドは単一の断片を具えている。他の好適な実施形態においては、リガンドは少なくとも２の断片等を含んでいる。各リガンドは一般的には、１ないし２、１ないし４、１ないし６、２ないし４、及び２ないし６の範囲から選択される多数の断片を含んでいる。基質は一般的には、多糖粒子等の粒子、及びフィルタからなる群から選択される。粒子の例は、アガロース、セファロース、及びスーパーロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）等の多糖ビーズと、磁気ビーズとを含む。
【０１５４】
関連する態様によると、本発明は１以上の分子の新規の使用を提供する。上述のように、各々の分子は：（ａ）スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片由来の１００ないし１６０のアミノ酸残基の少なくとも１の第１の結合成分と；（ｂ）タンパク質、核酸、炭水化物、及び脂質から別個に選択される第２の成分と；を含んでいる。好適な実施形態においては、分子は単一の結合成分（ａ）を含んでいる。他の好適な実施形態においては、分子は少なくとも２の、例えば２の結合成分（ａ）を含んでいる。各分子は一般的には、１ないし２、１ないし４、１ないし６、２ないし４、及び２ないし６の範囲から選択される多数の結合成分（ａ）を含んでいる。分子はｐＨが６．３以下であり、かつ前記分子の重合又は低重合を可能にするイオン組成である溶液において、結合成分を介して分子の重合体又は低重合体を可逆形成するのに用いられる。好適な実施形態においては、溶液のｐＨは３以上、例えば４．２以上である。４．２ないし６．３等の得られたｐＨの範囲は、迅速な重合を促進する。好適には、得られた重合体又は低重合体は相互作用の調査、選別、酵素複合体の誘発活性、又はＦＲＥＴ分析に用いられる。
【０１５５】
本明細書中に開示の結果及び結論は分子レベルでのスパイダーシルクの形成に新規の見識を与える。任意の特定の理論で限定されることを所望しないが、ＮＴの極性及び非平衡な荷電分布は理想的には、ｐＨ及び塩濃度によって簡単に制御されうる重合可能なモジュールの産生に好適である。このことによって更には、中途での凝集を阻止し、かつｐＨが低下したときに重合を始動することによって、ＮＴはクモのシルクの排出管を通って生じると認知されるものに類似するシルク形成を制御可能となる。
【０１５６】
本発明は以下において、以下の限定しない実施例によって更に例示されるであろう。
【０１５７】
［材料及び方法］
《タンパク質発現及び生成》
発現ベクターは、Ｈｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６に対するＣ末端融合物としてそれぞれ、ＮＴ（配列番号６）、ＮＴΔＨｉｓ６、ＮＴ５Ｒｅｐ（配列番号４）、ＮＴ４Ｒｅｐ（配列番号３）、及び４ＲｅｐＣＴ（配列番号２）、ならびにＨｉｓ６へのＮ末端融合物としてのＮＴ４ＲｅｐＣＴ（配列番号５）を産生するように構成した。別個のベクターはカナマイシンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地で３０℃で成長させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を１程度のＯＤ６００に形質転換するのに用いられ、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドで誘発され、更に最大４時間室温でインキュベートした。溶解、固定化金属アフィニティ精製、及びＨｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６−タグのタンパク質分解性の除去は「Ｈｅｄｈａｍｍａｒ，Ｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４７，３４０７−３４１７（２００８）」に記載のように行われた。
【０１５８】
《動的な光散乱（ＤＬＳ）》
ＮＴ及びＮＴΔＨｉｓ６の流体力学直径でのｐＨ及びイオン強度の効果は（ｐＨ依存型の効果が位置６でのＨｉｓにより生じることを除外するために）、６３３ｎｍのＨｅＮｅレーザを装備したＭａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社（英国ウスターシア州）から入手可能なＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｓにおいて、２５±０．１℃で測定した。緩衝液は使用前にナイロンのフィルタを通して濾過された。試料の容量は５０μｌであり、小さなガラスキュベットであるＺＥＮ２１１２を用いた。キュベットの壁部からの減衰及び測定の位置（４．６５ｍｍ）は、総ての分析について一定に維持された。６の走査が各々の試料で実行された。総ての試料は三組で分析された。流体力学直径（ｄＨ）はＤＬＳ分析のためにＭａｌｖｅｒｎソフトウェアでの「Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｕｒｐｏｓｅ（汎用）」アルゴリズムを用いて算出され、ストークス・アインシュタイン（Ｓｔｏｋｅｓ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎ）の式：
ｄＨ＝ｋＢＴ／３πηＤ
を通して流体力学直径に対して拡散係数を相関づけた。ここで、ｋＢはボルツマン定数であり、Ｔは温度であり、ηは粘度であり、Ｄは並進拡散係数である。溶媒の粘度及び屈折率の値はＭａｌｖｅｒｎソフトウェアで得た。「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｎａｒｒｏｗ  Ｍｏｄｅｓ」アルゴリズムは「Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｕｒｐｏｓｅ」アルゴリズムによって得た結果を検証するのに用いた。ＮＴ及びＮＴΔＨｉｓ６の試料は０．８ｍｇ／ｍｌの濃度で分析した。
【０１５９】
《比濁分析》
混濁度はＯＬＩＳ社の電子装置及びソフトウェアを装備した分光蛍光光度計ＳＬＭ４８００Ｓ（ジョージア州ボガートのＯＬＩＳ社）において、２５℃、様々なｐＨ値で、タンパク質（０．８ｍｇ／ｍｌ）の３４０ｎｍでの見かけ上の吸収度から概算した。ＮＴ、ＮＴ４Ｒｅｐ、及びＮＴΔＨｉｓ６は実質的に同様の結果で分析した。
【０１６０】
《繊維形成及び走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）》
繊維形成のための条件は本質的に「Ｓｔａｒｋ，Ｍら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ８，１６９５−１７０１（２００７）」に記載のとおりである。約２５μｍの各タンパク質はｐＨ７又は６での、３００ｍＭのＮａＣｌがある、あるいは無い、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液でインキュベートした。様々な時点で、試料はＳＥＭスタブに塗布され、空気乾燥し、金及びパラジウムで真空コーティングした。試料は５ｋＶの加速電圧を用いて顕微鏡ＬＥＯ１５５０ＦＥＧ（独国オーバーコーヘンのＣａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社）で撮影した。
【実施例１】
【０１６１】
《ＮＴ及びミニスピドロインの発現及び精製》
発現ベクター（配列番号１４ないし１６他）は、Ｈｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６に対するＣ末端融合物としてそれぞれ、ＮＴ（配列番号６）、ＮＴΔＨｉｓ６、ＮＴ５Ｒｅｐ（配列番号４）、ＮＴ４Ｒｅｐ（配列番号３）、及び４ＲｅｐＣＴ（配列番号２）、ならびにＨｉｓ６へのＮ末端融合物としてのＮＴ４ＲｅｐＣＴ（配列番号５）を産生するように構成した。別個のベクターはカナマイシンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地で３０℃で成長させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を１程度のＯＤ６００まで形質転換するのに用いられ、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドで誘発され、更に最大４時間室温でインキュベートした。その後、細胞はリゾチーム及びデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ  Ｉ）を補充した２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で回収及び再懸濁した。完全溶解後、１５０００ｇの上澄部は、Ｎｉ−ＮＴＡセファロースで満たされたカラム（スウェーデン国ウプサラのＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に充填した。カラムは結合タンパク質を３００ｍＭのイミダゾールで溶出する前に広範に洗浄した。標的タンパク質を含む画分は貯蔵し、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で透析した。ＭａＳｐ１タンパク質は、比率が１：１０００（ｗ／ｗ）のトロンビン：融合タンパク質を用いて、室温で１ないし２時間、タンパク質開裂によってタグから遊離した。遊離したＨｉｓＴｒｘＨｉｓタグを除去するため、開裂混合物は更なるＮｉ−ＮＴＡセファロースカラムに充填し、通過画分を回収した。タンパク質試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して選別され、次いでクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。タンパク質は５ｋＤａの分子量遮断型のセルロースフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いた限外濾過によって濃縮した。
【実施例２】
【０１６２】
《ＮＴ及びミニスピドロインのｐＨ依存性の重合》
ＮＴがある（ＮＴ４ＲｅｐＣＴ又はＮＴ４Ｒｅｐ）あるいはＮＴがない（４ＲｅｐＣＴ又は４Ｒｅｐ）ミニスピドロインの重合はｐＨ７（図３、時間尺度の上方）又はｐＨ６（図３、時間尺度の下方）で行われた。
【０１６３】
反復領域からなる微小なスピドロインは、Ｃ末端断片があってもなくても、環境の変化、例えばｐＨのゆらぎに対して感受性を示さない（４Ｒｅｐ及び４ＲｅｐＣＴ、図３）。ｐＨ依存型のスピドロインの重合に関与するのがＮ末端断片であるという仮説を試験するために、Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来の大嚢状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）１のＮ末端断片を包含するいくつかの構造（ＮＴ、ＮＴ４Ｒｅｐ、及びＮＴ４ＲｅｐＣＴ；図３）は、精製した組換えタンパク質を得るのに用いられた（実施例１）。動的な光散乱、比濁分析、及び走査型電子顕微鏡はＮＴのみの、ならびにミニスピドロイン構造の安定性及び重合に対するｐＨ及び塩濃度の効果を証明するのに用いた。
【０１６４】
ＮＴ及びＮＴ４Ｒｅｐは様々なｐＨ値で比濁分析に供した。ＮＴ４Ｒｅｐ（丸形）及びＮＴ（矩形）の平均値（±標準偏差（ＳＤ）、ｎ＝３）は図４に示す。同様の結果はＮＴ５Ｒｅｐで得られた。
【０１６５】
ＮＴは６ないし７のｐＨ、及び０ないし３００ｍＭのＮａＣｌで動的な光散乱を受けた。３の実験の代表例は図５に示している。表３参照のこと。
【０１６６】
［表３：動的な光散乱によって定量されるタンパク質形成の大きさ］
【表３】
0005912077.tif 000004
【０１６７】
単独では、ＮＴはｐＨ７．０で顕著に可溶な（２１０ｍｇ／ｍｌを超える）二量体を形成するが、直ちにｐＨ６．４未満で流体力学的サイズが７００ｎｍ程度の重合体を形成する（図４及び５）。ＮＴの重合はｐＨの増加によって容易に逆行し、高レベルの塩によって遮断される（図５及び６）。これらの特性はＮＴΔＨｉｓ６で維持され（比濁分析）、ＮＴ断片（ＮＴ４ＲｅｐＣＴ、ＮＴ４Ｒｅｐ、ＮＴＴＮＴ４ＲｅｐＣＴ、及びＮＴ５Ｒｅｐ）を含むミニスピドロインで増殖し、これによってｐＨ７で溶解性が得られ、ｐＨ６で迅速に重合する（図３）。
【０１６８】
図３における矢印は、マクロな形成が最初に検出されたときに、ｐＨ７でＮＴの存在が重合を遅延させるが、ｐＨ６で重合を促進させることを示す目的である。これはＣ末端断片（黒丸）が存在するか、否か（縞模様の丸印によって示す）と無関係である。ＮＴの存在によって、更に規則正しい重合が得られ、図３に走査型電子顕微鏡写真で例示されており、ｐＨ７での総ての構造に対する（時間尺度の上方）、あるいはｐＨ６でのＮＴ４ＲｅｐＣＴに対する（時間尺度の下方）典型的な初期の重合体である。ｐＨ及び塩の観察された効果はスピドロインの重合がＮＴが関与する静電相互作用に依存することを示唆する。
【実施例３】
【０１６９】
《ｐＨ依存性かつ可逆性の相互作用の媒介物としてのＮＴ》
Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓの牽引糸由来の大嚢状腺スピドロイン１のＮ末端断片（ＮＴ）は、ｐＨ７で可溶性が高い（２１０ｍｇ／ｍｌを超える）が、ｐＨ値が６．４未満で電荷相互作用を介して７００ｎｍ程度の重合体に重合する（動的な光散乱及び比濁分析で示される）。ＮＴの重合はｐＨの増加によって容易に逆行し、高レベルの塩によって遮断される。これらの重合特性はＮＴ断片（例えば、ＮＴ−Ｘ及びＮＴ−Ｙ）を含む融合タンパク質で増殖し、これによってｐＨ７で溶解性が得られ、ｐＨ６で迅速に重合する（図７）。２の異なるタンパク質を形成するこの可逆的方法は、タンパク質、核酸、炭水化物、又は脂質間の相互作用の調査、例えば、蛍光共鳴エネルギー転移を用いたタンパク質間の相互作用の分析において、あるいは活性、例えば酵素活性の誘発において、あるいはタンパク質、核酸、炭水化物、又は脂質の局在化又は固定化のために、あるいは例えばアレイ技術を用いたタンパク質、核酸、炭水化物、又は脂質の分析又は選別において用いることができる。
【実施例４】
【０１７０】
《ＭｅｔＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕ融合タンパク質の産生》
発現ベクターはＨｉｓ６（配列番号２６、２７）に対する融合物としてＮＴ−ＭｅｔＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕをコードする遺伝子を含んで構成した。ベクターはカナマイシンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地で３０℃で成長させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を０．９ないし１のＯＤ６００まで形質転換するのに用いられ、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発され、更に３時間２５℃でインキュベートした。細胞は遠心分離によって回収され、ｐＨ８の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌで再懸濁した。
【０１７１】
リゾチームを添加し、細胞は氷上で３０分間インキュベートした。Ｔｗｅｅｎ（ツイーン）は０．７％の最終濃度まで添加した。細胞は氷上で５分間、２秒間のオン状態と２秒間のオフ状態を交互にして、超音波処理で破壊した。細胞の溶解産物は２００００×ｇで３０分間遠心分離した。上澄部はＮｉ−ＮＴＡセファロースカラムに充填し、０．７％のＴｗｅｅｎを含むｐＨ８の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡にした。カラムは０．７％のＴｗｅｅｎを含むｐＨ８の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で洗浄し、結合タンパク質は０．７％のＴｗｅｅｎを含むｐＨ８の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌの３００ｍＭのイミダゾール緩衝液で溶出した。
【０１７２】
溶出物は還元条件下で１２％のＴｒｉｓ−グリシンゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。融合タンパク質に対応する主要なバンドは図８Ａで矢印によって示している。収率は１のＯＤ６００まで成長した１リットル振盪フラスコの培養由来の精製したタンパク質をｍｇ単位で定量した。収率は６４ｍｇ／ｌであった。単一のＮＴ成分を含む融合タンパク質によって、細胞の溶解産物における洗浄剤の存在下で驚くべき高収率が得られると結論づけている。
【実施例５】
【０１７３】
《ＭｅｔＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕ融合タンパク質の産生》
発現ベクターはＨｉｓ６（配列番号２８、２９）に対する融合物としてＮＴ２−ＭｅｔＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕ（すなわち、ＮＴＮＴ−ＭｅｔＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕ）をコードする遺伝子を含んで構成した。ベクターはカナマイシンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地で３０℃で成長させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を０．９ないし１のＯＤ６００まで形質転換するのに用いられ、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発され、更に３時間２５℃でインキュベートした。細胞は遠心分離によって回収され、ｐＨ８の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌで再懸濁した。
【０１７４】
リゾチームを添加し、細胞は氷上で３０分間インキュベートした。Ｔｗｅｅｎは添加しないか、０．７％の最終濃度まで添加するかのいずれかであった。細胞は氷上で５分間、２秒間のオン状態と２秒間のオフ状態を交互にして、超音波処理で破壊した。細胞の溶解産物は２００００×ｇで３０分間遠心分離した。上澄部はＮｉ−ＮＴＡセファロースカラムに充填し、ｐＨ８の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液±０．７％のＴｗｅｅｎで平衡にした。カラムはｐＨ８の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液±０．７％のＴｗｅｅｎで洗浄し、結合タンパク質はｐＨ８の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌの３００ｍＭのイミダゾール緩衝液±０．７％のＴｗｅｅｎで溶出した。
【０１７５】
溶出物は還元条件下で１２％のＴｒｉｓ−グリシンゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。左側の２のレーンにおける融合タンパク質に対応する主要なバンドは図８Ｂで矢印によって示している。収率は１のＯＤ６００まで成長した１リットル振盪フラスコの培養由来の精製したタンパク質をｍｇ単位で定量した。収率はＴｗｅｅｎの不存在下で４０ｍｇ／ｌであり、０．７％のＴｗｅｅｎの存在下で６８ｍｇ／ｌであった。２の連続したＮＴ成分を含む融合タンパク質によって、細胞の溶解産物における洗浄剤の不存在下で驚くべき高収率が得られ、細胞の溶解産物における洗浄剤の存在下で収率が更に増加すると結論づけている。
【実施例６】
【０１７６】
《ＮＴセファロースの産生》
ＣｙｓＨｉｓ６ＮＴ構造は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を形質転換するのに用いられた。細胞はカナマイシンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地で３０℃で０．８ないし１のＯＤ６００まで成長させ、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発され、更に最大４時間室温でインキュベートした。その後、細胞は回収され、ｐＨ８の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌで再懸濁し、リゾチーム及びデオキシリボヌクレアーゼＩを補充した。完全溶解後、１５０００ｇの上澄部は、Ｎｉセファロースで満たされたカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に充填した。カラムは広範に洗浄し、その後結合タンパク質は１００ないし３００ｍＭのイミダゾールで溶出した。標的タンパク質を含む画分は貯蔵し、ｐＨ８．０の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌで透析した。精製したＣｙｓ−Ｈｉｓ６−ＮＴタンパク質は標準的なプロトコル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて活性化したチオールセファロースと結合する。
【実施例７】
【０１７７】
《ＮＴセファロースを用いた融合タンパク質の精製》
実施例４及び５由来の細胞の溶解産物はＮＴセファロースで満たされたカラムに充填され、ｐＨ６の２０ｍＭのリン酸ナトリウムで事前に平衡にする。カラムはｐＨ６の２０ｍＭのリン酸ナトリウムで広範に洗浄し、その後結合タンパク質はｐＨ７の２０ｍＭのリン酸ナトリウムで溶出する。標的タンパク質を含む画分は貯蔵する。タンパク質試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで選別し、その後クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色する。タンパク質成分は２８０ｎｍでの吸光度から判定している。
【実施例８】
【０１７８】
《ＮＴ−ＲＥＰ４−ＣＴの産生》
発現ベクターはＨｉｓ６（配列番号１７、１８）に対するＮ末端融合物としてＮＴ−ＲＥＰ４−ＣＴを産生するように構成した。ベクターはカナマイシンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地で３０℃で成長させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を１程度のＯＤ６００まで形質転換するのに用いられ、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発され、更に最大４時間室温でインキュベートした。その後、細胞は回収され、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で再懸濁し、リゾチーム及びデオキシリボヌクレアーゼＩを補充した。
【０１７９】
完全溶解後、１５０００ｇの上澄部は、セファロースで満たされたカラム（スウェーデン国ウプサラのＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に充填した。カラムは結合タンパク質を３００ｍＭのイミダゾールで溶出する前に広範に洗浄した。標的タンパク質を含む画分は貯蔵し、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で透析した。
【０１８０】
タンパク質試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥで選別し、その後クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。得られたＮＴ−ＲＥＰ４−ＣＴタンパク質は５ｋＤａの分子量遮断型のセルロースフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いた限外濾過によって濃縮した。
【実施例９】
【０１８１】
《ＮＴ−ＲＥＰ４−ＣＴの産生》
発現ベクターはＺｂａｓｉｃ（配列番号１９）に対するＣ末端融合物としてＮＴ−ＲＥＰ４−ＣＴを産生するように構成した。ベクターはカナマイシンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地で３０℃で成長させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を１程度のＯＤ６００まで形質転換するのに用いられ、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発され、更に最大２ないし４時間室温でインキュベートした。その後、細胞は回収され、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で再懸濁し、リゾチーム及びデオキシリボヌクレアーゼＩを補充した。
【０１８２】
完全溶解後、１５０００ｇの上澄部は、陽イオン交換体（ＨｉＴｒａｐ  Ｓ、スウェーデン国ウプサラのＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に充填した。カラムは結合タンパク質を５００ｍＭのＮａＣｌで勾配溶出する前に広範に洗浄した。標的タンパク質を含む画分は貯蔵し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で透析した。ＮＴ−ＲＥＰ４−ＣＴタンパク質（配列番号２０）は、比率が１：５０（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ３Ｃ：融合タンパク質を用いて、４℃で一晩、タンパク質開裂によってＺｂａｓｉｃタグから遊離した。遊離したＺｂａｓｉｃタグを除去するため、開裂混合物は更なる陽イオン交換体に充填し、通過画分を回収した。
【実施例１０】
【０１８３】
《ＮＴ−ＲＥＰ４−ＣＴの産生》
発現ベクターはＨｉｓＴｒｘＨｉｓ（配列番号２１）に対するＣ末端融合物としてＮＴ−ＲＥＰ４−ＣＴを産生するように構成した。ベクターはカナマイシンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地で３０℃で成長させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を１程度のＯＤ６００まで形質転換するのに用いられ、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発され、更に最大２ないし４時間室温でインキュベートした。その後、細胞は回収され、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で再懸濁し、リゾチーム及びデオキシリボヌクレアーゼＩを補充した。
【０１８４】
完全溶解後、１５０００ｇの上澄部は、Ｎｉセファロースで満たされたカラム（スウェーデン国ウプサラのＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に充填した。カラムは結合タンパク質を５００ｍＭのＮａＣｌで勾配溶出する前に広範に洗浄した。標的タンパク質を含む画分は貯蔵し、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で透析した。ＮＴ−ＲＥＰ４−ＣＴタンパク質（配列番号２２）は、比率が１：１０００（ｗ／ｗ）のトロンビン：融合タンパク質を用いて、４℃で一晩、タンパク質開裂によってＨｉｓＴｒｘＨｉｓタグから遊離した。遊離したＨｉｓＴｒｘＨｉｓを除去するため、開裂混合物は更なるＮｉセファロースに充填し、通過画分を回収した。
【実施例１１】
【０１８５】
《ＮＴ２−ＲＥＰ４−ＣＴの産生》
発現ベクターはＨｉｓ６（配列番号２３、２４）に対する融合物としてＮＴ２−ＲＥＰ−ＣＴ（すなわち、ＮＴＮＴ−ＲＥＰ−ＣＴ）をコードする遺伝子を含んで構成した。ベクターはカナマイシンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地で３０℃で成長させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を０．９ないし１のＯＤ６００まで形質転換するのに用いられ、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発され、更に３時間２５℃でインキュベートした。細胞は遠心分離によって回収され、ｐＨ８．０の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌで再懸濁した。
【０１８６】
リゾチーム及びデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）を添加し、細胞は氷上で３０分間インキュベートした。細胞の溶解産物は２００００×ｇで３０分間遠心分離した。上澄部はＮｉ−ＮＴＡセファロースカラムに充填し、ｐＨ８の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡にした。カラムはｐＨ８の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で洗浄し、結合タンパク質はｐＨ８の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌの３００ｍＭのイミダゾール緩衝液で溶出した。
【０１８７】
溶出物は還元条件下で１２％のＴｒｉｓ−グリシンゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。左側の２のレーンにおける融合タンパク質に対応する主要なバンドは図８Ｃで矢印によって示している。収率は１のＯＤ６００まで成長した１リットル振盪フラスコの培養由来の精製したタンパク質をｍｇ単位で定量した。収率は３０ｍｇ／ｌであった。スピドロインの微小なタンパク質は２のＮＴ部分との融合物として有益に発現しうると結論づけている。
【実施例１２】
【０１８８】
《ＮＴ−ＲＥＰ４−ＣＴ、ＮＴ２−ＲＥＰ４−ＣＴ、及びＮＴ−ＲＥＰ８−ＣＴの産生》
発現ベクターはＮＴ−ＲＥＰ４−ＣＴ（配列番号２０及び２２）、ＮＴ２−ＲＥＰ４−ＣＴ（配列番号２３）、及びＮＴ−ＲＥＰ８−ＣＴ（配列番号２５）をそれぞれコードする遺伝子を含んで構成する。ベクターはカナマイシンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地で３０℃で成長させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を０．９ないし１のＯＤ６００まで形質転換するのに用いられ、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発され、更に３時間２５℃でインキュベートする。細胞は遠心分離によって回収され、ｐＨ８．０の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌで再懸濁する。
【０１８９】
リゾチームを添加し、細胞は氷上で３０分間インキュベートした。Ｔｗｅｅｎは添加しないか、０．７％の最終濃度まで添加するかのいずれかである。細胞の溶解産物は２００００×ｇで３０分間遠心分離する。ＮＴのアフィニティ培地は実施例６に記載のように調製している。上澄部は実施例７に従いＮＴのアフィニティカラムに充填する。ＮＴのアフィニティカラム由来の溶出物はゲル電気泳動に供する。
【実施例１３】
【０１９０】
《ＮＴＨｉｓ、ＮＴ２−ＲＥＰ８−ＣＴ、及びＮＴ２−Ｂｒｉｃｈｏｓの産生》
Ａ）ＮＴＨｉｓ
発現ベクターはＨｉｓ６（配列番号３０）に対するＮ末端融合物としてＮＴを産生するように構成した。ベクターはカナマイシンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地で３０℃で成長させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を１程度のＯＤ６００まで形質転換するのに用いられ、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発され、更に最大４時間室温でインキュベートした。その後、細胞は回収され、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で再懸濁し、リゾチーム及びデオキシリボヌクレアーゼＩを補充した。
【０１９１】
完全溶解後、１５０００ｇの上澄部は、Ｎｉセファロースで満たされたカラム（スウェーデン国ウプサラのＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に充填した。カラムは結合タンパク質を３００ｍＭのイミダゾールで溶出する前に広範に洗浄した。標的タンパク質を含む画分は貯蔵し、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で透析した。タンパク質試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥで選別し、その後クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。得られたＮＴタンパク質（配列番号３０）は５ｋＤａの分子量遮断型のセルロースフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いた限外濾過によって濃縮した。収率は１のＯＤ６００まで成長させた１リットルの振盪フラスコあたり１１２ｍｇであった。
【０１９２】
Ｂ）ＮＴ２−ＲＥＰ８−ＣＴ
発現ベクターはＨｉｓ６（配列番号３１）に対するＮ末端融合物としてＮＴ２−ＲＥＰ８−ＣＴ（ＮＴＮＴ８ＲＥＰＣＴ）を産生するように構成した。ベクターはカナマイシンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地で３０℃で成長させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を１程度のＯＤ６００まで形質転換するのに用いられ、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発され、更に最大４時間室温でインキュベートした。その後、細胞は回収され、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で再懸濁し、リゾチーム及びデオキシリボヌクレアーゼＩを補充した。タンパク質試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥで選別し、その後クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色して、タンパク質の発現を確認した。
【０１９３】
完全溶解後、１５０００ｇの上澄部は、Ｎｉセファロースで満たされたカラム（スウェーデン国ウプサラのＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に充填する。カラムは結合タンパク質を３００ｍＭのイミダゾールで溶出する前に広範に洗浄する。標的タンパク質を含む画分は貯蔵し、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で透析する。タンパク質試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで選別し、その後クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色する。
【０１９４】
Ｃ）ＮＴ２−Ｂｒｉｃｈｏｓ
発現ベクターはＨｉｓ６（配列番号３２）に対するＮ末端融合物としてＮＴ２−Ｂｒｉｃｈｏｓ（ＮＴ−ＮＴ−Ｂｒｉｃｈｏｓ）を産生するように構成した。ベクターはカナマイシンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地で３０℃で成長させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を１程度のＯＤ６００まで形質転換するのに用いられ、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発され、更に最大４時間室温でインキュベートした。その後、細胞は回収され、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で再懸濁し、リゾチーム及びデオキシリボヌクレアーゼＩを補充した。細胞は更に、氷上で５分間、２秒間のオン状態と２秒間のオフ状態を交互にして、超音波処理で破壊した。
【０１９５】
完全溶解後、１５０００ｇの上澄部は、Ｎｉセファロースで満たされたカラム（スウェーデン国ウプサラのＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に充填した。カラムは結合タンパク質を３００ｍＭのイミダゾールで溶出する前に広範に洗浄した。標的タンパク質を含む画分は貯蔵し、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で透析した。タンパク質試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して選別し、その後クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。得られたＮＴ２−Ｂｒｉｃｈｏｓタンパク質（配列番号３２）は５ｋＤａの分子量遮断型のセルロースフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いた限外濾過によって濃縮した。収率は１のＯＤ６００まで成長させた１リットルの振盪フラスコあたり２０ｍｇであった。
【実施例１４】
【０１９６】
《ｐＨ依存性で可逆性の捕捉のためのＮＴ》
〈目的〉
ＮＴの融合タンパク質を可逆的に捕捉するために共有結合的に固定化したＮＴ（及びＮＴＮＴ）を使用する。
【０１９７】
〈方法〉
ＮＴ（及びＮＴＮＴ）融合タンパク質の、ＮＴ（及びＮＴＮＴ）が共有結合した繊維（及び薄膜）へのｐＨ依存性の形成を調査する。ＮＴがない繊維及び薄膜はコントロールとして用いている。
【０１９８】
Ａ）繊維
ＮＴ−ＲＥＰ４−ＣＴ（配列番号２０）、ＮＴ２−ＲＥＰ４−ＣＴ（配列番号２３）、及びＲＥＰ４−ＣＴ（配列番号２、コントロール）の繊維（０．５ｃｍ長程度、５０ｕｇ程度）は可溶性のＮＴＨｉｓ（配列番号３０）又はＮＴ２−Ｂｒｉｃｈｏｓ（配列番号３２）の１００μｌ溶液にｐＨ８で１０分間水浸した。ｐＨは４００ｕｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰ）の添加によってｐＨ６に減少し、１０分間インキュベートして、可溶性のＮＴの繊維への形成を可能にした。繊維はｐＨ６の５００μｌのＮａＰに移され、２回洗浄した。最終的には、繊維はｐＨ７の５００μｌのＮａＰに移し、１０分間インキュベートして、可溶性のＮＴの遊離を可能にした。異なる溶液による試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０１９９】
ＮＴ２−ＲＥＰ４−ＣＴ及びＮＴ−ＲＥＰ４−ＣＴの繊維を用いて、ＮＴＨｉｓ及びＮＴ２−Ｂｒｉｃｈｏｓの双方をｐＨ６で捕捉した。ｐＨ７へのｐＨ上昇時に、ＮＴＨｉｓ及びＮＴ２−Ｂｒｉｃｈｏｓの双方が再度遊離され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出できた。３００ｍＭのＮａＣｌの添加によって、ｐＨ６での捕捉が減少した。
【０２００】
Ｂ）薄膜
ＮＴ−ＲＥＰ４−ＣＴ（配列番号２０）及びＲＥＰ４−ＣＴ（配列番号２、コントロール）の薄膜はプラスチックウェルに３ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液の５０μｌを割当てることによって調製し、一晩中乾燥させて安置した。次の日、ｐＨ８の５ｍｇ／ｍｌの可溶性のＮＴＨｉｓ（配列番号３０）の１００μｌ溶液は薄膜のウェルに添加され、１０分間安置された。ｐＨは次いで４００μｌのＮａＰの添加によって６まで低減し、１０分間インキュベートして可溶性のＮＴを薄膜へ形成可能にした。薄膜は次いでｐＨ６の５００μｌのＮａＰで２回洗浄した。可溶性のＮＴＨｉｓの遊離のために、ｐＨ７の５００μｌのＮａＰを添加して１０分間インキュベートした。同様のことが３００ｍＭのＮａＣｌの存在下で、総てのｐＨ６のＮａＰ緩衝液においてなされた。様々な溶液由来の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０２０１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分析は、ＮＴ−ＲＥＰ４−ＣＴの薄膜によってＮＴＨｉｓがｐＨ６で捕捉可能となり、ｐＨの７への上昇時に再度遊離可能となることを示した。
【実施例１５】
【０２０２】
《融合タンパク質のｐＨ依存性で可逆性の形成のためのＮＴ》
〈目的〉
タンパク質成分間の相互作用の分析を可能にする、例えば、βシートで標的となるＢｒｉｃｈｏｓ、例えばサーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）の相互作用を分析する可逆性のタグとしてＮＴを使用する。
【０２０３】
ＮＴ２−Ｂｒｉｃｈｏｓ（配列番号３２）はＮＴ２−ＭｅｔＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕ（配列番号２８）又はＮＴＨｉｓ（配列番号３０）のいずれかと、ｐＨ８で総量が１００μｌとなるまで混合する。ＮａＰ緩衝液（４００ｕｌ）を添加して、最終的なｐＨ６を得て、混合物は２０分間インキュベートして、ＮＴの形成を可能とした。ｐＨは次いで再度ｐＨ７に上昇させ、ＮＴ形成を逆行可能にする。様々な溶液由来の試料は天然ゲル及びサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）で分析する。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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