(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−デオキシ−ｓｃｙｌｌｏ−イノソース合成酵素が不活化されている、ストレプトマイセス属に属するカナマイシン生産菌株と、ストレプタミンおよび／またはｍｙｏ−イノシトールとを含む、組合せ物であって、
前記不活化された２−デオキシ−ｓｃｙｌｌｏ−イノソース合成酵素をコードする遺伝子が、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１３６番目のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異を有するアミノ酸配列をコードするものである、組合せ物。
【請求項２】
前記カナマイシン生産菌株が２−デオキシストレプタミン依存性である、請求項１に記載の組合せ物。
【請求項３】
前記カナマイシン生産菌株がストレプトマイセス・カナマイセティカスである、請求項１または２に記載の組合せ物。
【請求項４】
式（I）で表される化合物を産生するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組合せ物：
【化１】
0006033732.tif 000006
（式中、Ｒはアミノ基または水酸基を表す）。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本特許出願は、２００７年１１月３０日に出願された日本国特許出願２００７−３１０６１８号に基づく優先権の主張を伴うものであり、かかる先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【発明の背景】
【０００２】
本発明は、新規アミノグリコシド抗生物質、その製造法およびその医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
アミノグリコシド抗生物質とは、アミノ糖またはアミノサイクリトールを含む配糖体抗生物質の総称であり、マクロライド、ヌクレオシドおよびアントラサイクリンなどの抗生物質群は除外される。これまでに数多くのアミノグリコシド抗生物質が放線菌や細菌の培養物から発見されているが、このうちストレプトマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、ゲンタミシン、リボスタマイシン、トブラマイシンなどが有用な化学療法剤として使用されている。一方、臨床で広範に使用されるが故、アミノグリコシド抗生物質に耐性を示す菌が出現し問題となっている。
【０００４】
カナマイシン（カナマイシンＡ、カナマイシンＢ、カナマイシンＣ）は、ストレプトミセス・カナマイセティカス（Streptomyces kanamyceticus）が生産するアミノグリコシド系抗生物質である。カナマイシンは広範囲な抗菌力を示すが、多くの感染菌が速やかに耐性化するため、近年は、臨床適応が結核症を中心に限られたものとなっている。
【０００５】
カナマイシンにおいては耐性機構に関する研究に基づき、耐性菌にも有効なジベカシン、アミカシンおよびアルベカシンといったカナマイシン誘導体が開発されているが、これらの薬剤に対する耐性菌も出現しつつある。このような現状の下、耐性菌に有効でありかつアミノグリコシド抗生物質に共通な問題である腎毒性が低減され得る、新規アミノグリコシド抗生物質の開発が期待されている。
【０００６】
２−デオキシストレプタミンを構成糖の一つとするアミノグリコシド抗生物質に関し、２−デオキシストレプタミン依存的にアミノグリコシド抗生物質を生産する変異株を取得し、これに２−デオキシストレプタミンアナログを添加培養することによって、新規なアミノグリコシド抗生物質を生産させる研究が行われてきた。カナマイシンにおいても、２−デオキシストレプタミン依存性カナマイシン生産の表現型を示す変異株が取得され、２−エピストレプタミンを添加培養した時に、カナマイシンとは異なる抗生物質が生産されることが報告されている（ＵＳ３，６６９，８３８号公報）。また、２−デオキシストレプタミン依存性カナマイシン生産の表現型を示す変異株に、１−Ｎ−メチル-デオキシストレプタミンまたはｍｙｏ−イノサジアミン−１，３（２−エピストレプタミン）を添加培養した時に、４−Ｏ−（α−Ｄ−グルコピラノシル）６−Ｏ−（３−アミノ−３-デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル）１−Ｎ−メチル-２-デオキシストレプタミンまたは４−Ｏ−（α−Ｄ−グルコピラノシル）６−Ｏ−（３−アミノ−３-デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル）２−エピ-ストレプタミンがそれぞれ生産されること（Ｋｏｊｉｍａ，Ｍ．およびＳａｔｏｈ，Ａ著，「ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）」，（日本），１９７３年，第２６巻，ｐ．７８４−７８６）が報告されている。さらに、２−デオキシストレプタミン依存性カナマイシン生産の表現型を示す変異株に、ストレプタミンを添加培養した時に、４−Ｏ−（６−アミノ−６-デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル）６−Ｏ−（３−アミノ−３−デオキシ-α−Ｄ−グルコピラノシル）ストレプタミン（ＬＬ-ＢＭ２７α）および４−Ｏ−（６−アミノ−６-デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル）６−Ｏ−（α−Ｄ−グルコピラノシル）ストレプタミン（ＬＬ-ＢＭ２７β）が生産されること（Ｂｏｒｄｅｒｓ，Ｄ．Ｂ．ら著，「ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）」，（日本），１９８２年，第３５巻，ｐ．１１０７−１１１０）が報告されている。ここで、ＬＬ-ＢＭ２７αは、２−ヒドロキシカナマイシンＡと同義である。
【０００７】
しかしながら、これらの添加培養によって得られるアミノグリコシド抗生物質は微量で産業上の実用性は低い。したがって、臨床上有用な、優れた抗菌活性を有する新規アミノグリコシド抗生物質が依然として求められているといえる。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、今般、ストレプトマイシン属由来のカナマイシン生産株を特定の２−デオキシストレプタミンアナログとともに培養することにより、優れた抗菌活性を有する新規なアミノグリコシド抗生物質を得られるとの知見を得た。本発明はかかる知見に基づくものである。
【０００９】
したがって、本発明は、優れた抗菌活性を有する新規なアミノグリコシド抗生物質およびその製造方法の提供をその目的とする。
【００１０】
そして、本発明によるアミノグリコシド抗生物質は、式（I）で表される化合物、その薬理学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物である。
【化１】
0006033732.tif 000002
（式中、Rはアミノ基または水酸基を表す）
【００１１】
また、本発明による式（I）で表される化合物の製造方法は、ストレプトマイセス(Streptomyces)属に属するカナマイシン生産菌株を、ストレプタミンおよび／またはｍｙｏ−イノシトールを含む培地中で培養し、上記化合物を産生することを含んでなる。
【００１２】
本発明による化合物は、種々の感染症の起因菌に対して優れた抗菌活性を有し、感染症の治療において有利に利用することができる。また、本発明による製造方法によれば、上記化合物を簡易かつ安定に供給することが可能となる。
【発明の具体的説明】
【００１３】
寄託
本発明による菌株S. Kanamyceticus-DOSは、原寄託日を平成１９（２００７）年１１月１日として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-１１０５２のもと寄託されている。
【００１４】
定義
本明細書において、「２−ヒドロキシカナマイシンＡ」とは、カナマイシンＡの２位に水酸基が導入された化合物をいう。また、「２−ヒドロキシカナマイシン」とは、カナマイシン（カナマイシンＡ、カナマイシンＢおよびカナマイシンＣ）の２位に水酸基が導入された一群の化合物をいい、具体的には、２−ヒドロキシカナマイシンＡ、２-ヒドロキシカナマイシンＢおよび２−ヒドロキシカナマイシンＣを包含する。
【００１５】
また、本明細書において、「デオキシストレプタミン依存性」であるカナマイシン生産菌株とは、カナマイシン生産菌のうち、デオキシストレプタミンを添加することにより、カナマイシンを生産する能力を回復するようになった変異株をいう。
【００１６】
また、本明細書において、「機能的に同等な活性を有する」ポリペプチドとは、以下のものをいう。
ポリペプチドには、これをコードする遺伝子の多型や変異の他、修飾反応等によって、アミノ酸配列中に構造的な変異が起こりうる。しかしながら、これら変異を有するにもかかわらず、変異を有しないポリペプチドと実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように、構造的に差異があっても、その機能については大きな違いが認められないものを「機能的に同等な活性を有する」ポリペプチドという。
【００１７】
式（Ｉ）で表される化合物、その薬理学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物
本発明による式（Ｉ）で表される化合物は、カナマイシンＢまたはＣにおいて、その２位に水酸基が導入されていることを一つの特徴とする。かかる構造を有する上記化合物は、グラム陽性菌から緑膿菌を含むグラム陰性菌までの幅広い抗菌スペクトラムを有し、優れた抗菌活性を示すことができる。
【００１８】
そして、本発明の一つの態様によれば、式（Ｉ）で表される化合物において、Ｒはアミノ基である。かかる化合物（以下、「ヒドロキシカナマイシンＢ」という）の構造は、下記式（１）の通りである。
【００１９】
【化２】
0006033732.tif 000003
【００２０】
また、本発明の別の態様によれば、式（Ｉ）で表される化合物において、Ｒは水酸基である。かかる化合物（以下、「２−ヒドロキシカナマイシンＣ」という）の構造は、下記式（２）の通りである。
【００２１】
【化３】
0006033732.tif 000004
【００２２】
また、式（Ｉ）で表される化合物は、塩として存在することができる。その塩としては、例えば、薬学的に許容される塩が挙げられる。それらの塩の具体例としては、フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩またはヨウ化水素酸塩等のハロゲン化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、過塩素酸塩または炭酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ヒドロキシ酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、安息香酸塩、マンデル酸塩、酪酸塩、マレイン酸塩、プロピオン酸塩、ギ酸塩またはリンゴ酸塩等のカルボン酸塩、アルギニン酸塩、アスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩等のアミノ酸塩、あるいはメタンスルホン酸塩またはp−トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩等が挙げられ、好ましくは、塩酸塩等のハロゲン化水素酸塩、硫酸塩等の無機酸塩である。
【００２３】
また、式（Ｉ）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩は、それらの溶媒和物として存在することができる。溶媒和物の好適な例としては、水和物、メタノール和物またはエタノール和物等が挙げられる。
【００２４】
生産菌株
また、式（Ｉ）で表される化合物は、種々の方法により製造することが可能であるが、上述の通り、ストレプトマイセス属に属するカナマイシン生産菌株を、ストレプタミンおよび／またはｍｙｏ−イノシトールを含む培地中で培養することにより、製造することができる。
【００２５】
そして、上記生産菌株の好適な例としては、デオキシストレプタミン依存性カナマイシン生産菌株が挙げられるが、グルコース−６−リン酸から２−デオキシストレプタミン生合成の最初の反応を触媒する２−デオキシ−ｓｃｙｌｌｏ−イノソース合成酵素が不活化されているストレプトマイセス属に属する菌株がより好ましい。かかる菌株をデオキシストレプタミンアナログとともに培養する場合、カナマイシンを産生することなく、本発明による化合物を選択的に生産しうることは、意外な事実である。
したがって、本発明の別の態様によれば、式（Ｉ）で表される化合物を産生しうる、ストレプトマイセス属に属するカナマイシン生産菌株であって、２−デオキシ−ｓｃｙｌｌｏ−イノソース合成酵素が不活化されているカナマイシン生産菌株が提供される。
【００２６】
上記のような変異生産菌株は、例えば、ストレプトミセス・カナマイセティカスをはじめとするストレプトマイセス属由来のカナマイシン生産菌を、紫外線（ＵＶ）照射やニトロソグアニジン（ＮＴＧ）をはじめとする人工的変異方法などで処理することによって取得することができる。所望の変異株が取得できたことの確認は、例えば、デオキシストレプタミン依存性カナマイシン生産菌株を取得した後、各変異株の細胞内の２−デオキシ−ｓｃｙｌｌｏ−イノソース合成酵素活性を公知の方法（クドウ（Ｋｕｄｏ，Ｆ．）ら著，「ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）」，（日本），１９９９年，第５２巻，ｐ．８１−８８）に基づいて測定し、酵素活性を示さない変異株を選択する方法が挙げられる。
【００２７】
また、２−デオキシ−ｓｃｙｌｌｏ−イノソース合成酵素が不活化されている上記カナマイシン生産菌株は、２−デオキシ−ｓｃｙｌｌｏ−イノソース合成酵素をコードする遺伝子が既に明らかにされている（特開２００４−１７３５３７号公報）ことから、遺伝子組換え技術を用いても取得することも可能である。例えば、２−デオキシ−ｓｃｙｌｌｏ−イノソース合成酵素をコードする遺伝子を破壊することによって所望の変異株を取得してもよい。また、不活性型の２−デオキシ−ｓｃｙｌｌｏ−イノソース合成酵素となるようなアミノ酸置換を有する変異遺伝子を作成し、これを染色体上の野生型遺伝子と遺伝子置換することによっても上記変異株を得ることができる。遺伝子を破壊若しくは置換する方法としては、放線菌で一般的に使用される手法が利用でき（プラクティカル・ストレプトマイセス・ジェネティックス（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」，「ザ・ジョーン・イネス・ファンデーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）」，（英国），ノルウィック（Ｎｏｒｗｉｃｋ），２０００年，ｐ．３１１−３３８）、かる文献の内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【００２８】
２−デオキシ−ｓｃｙｌｌｏ−イノソース合成酵素が不活性化される変異の一例としては、例えば、配列番号１で表される上記合成酵素のアミノ酸配列の１３６番目のアスパラギン酸をアスパラギンに置換する変異が挙げられる。よって、式（I）で表される化合物を生産しうる上記菌株は、上記変異を有するポリペプチドまたはそれと機能的に同等なアナログをコードする遺伝子を菌株に組み込むことによって、取得しうる。
【００２９】
そして、本発明の好ましい態様によれば、式（Ｉ）で表される化合物を生産しうる、カナマイシン生産菌株は、以下の（ａ）〜（ｃ）から選択されるポリペプチドをコードする遺伝子が組み込まれてなる：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１３６番目のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）（ａ）に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、欠失、付加または挿入しているアミノ酸配列からなり、前記（ａ）に記載のポリペプチドと機能的に同等な活性を有する、ポリペプチド、
（ｃ）（ａ）に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、前記（ａ）に記載のポリペプチドと機能的に同等な活性を有する、ポリペプチド。
【００３０】
上記（ａ）に対応するカナマイシン生産菌株の好適な例としては、S. Kanamyceticus-DOSが挙げられる。
【００３１】
また、上記（ｂ）において、「１以上のアミノ酸」の範囲は、好ましくは１〜４０個であり、より好ましくは１〜８個であり、さらに好ましくは１〜４個である。
【００３２】
また、上記（ｄ）において、相同性は、好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上である。
【００３３】
また、式（Ｉ）に記載の化合物の安定な産生を考慮すれば、上記（ｂ）または（ｃ）に記載のポリペプチドは、（ａ）に記載のアミノ酸配列における１３６番目またはこれに相当する位置のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異を、保持していることが好ましい。なお、（ａ）〜（ｃ）に記載のアミノ酸配列における変異の有無や配列相同性の決定は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と、（ａ）〜（ｃ）のそれとを公知手法により比較することにより、当業者によって適宜決定される。
【００３４】
また、上記（ｂ）または（ｃ）に記載のポリペプチドと、上記（ａ）に記載のポリペプチドとの機能的な同等性は、例えば、これらポリペプチドがいずれも、上述のクドウ（Ｋｕｄｏ，Ｆ．）ら著，「ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）」，（日本），１９９９年，第５２巻，ｐ．８１−８８に記載の手法に従い、２−デオキシ−ｓｃｙｌｌｏ−イノソース合成酵素活性を測定し、測定結果を比較することにより確認することができる。また、間接的には、上記ポリペプチドをコードする遺伝子が組み込まれたカナマイシン生産菌株について、実施例２または試験例１に記載の手法により、デオキシストレプタミン依存性または抗菌活性を測定し、統計学的に測定結果を比較して、機能的同等性の確認することもできる。
【００３５】
製造方法
本発明による式（Ｉ）で表される化合物は、上述の通り、ストレプトマイシン属由来のカナマイシン生産菌株を、ストレプタミンおよびｍｙｏ−イノシトールから選択される２−デオキシストレプタミンアナログを含む培地中で培養することにより産生しうる。
【００３６】
ストレプトマイシン属由来のカナマイシン生産菌株は、式（Ｉ）で表される化合物の選択的な製造を勘案すれば、上述の通り、２−デオキシ−ｓｃｙｌｌｏ−イノソース合成酵素が不活性化されたカナマイシン生産株が好ましいが、２−デオキシ−ｓｃｙｌｌｏ−イノソース合成酵素が不活性化されていないカナマイシン生産菌株を用いることもできる。２−デオキシ−ｓｃｙｌｌｏ−イノソース合成酵素が不活化されていない菌株の好適な例としては、ストレプトミセス・カナマイセティカス等が挙げられる。
【００３７】
また、本発明による製造方法においては、カナマイシン生産菌株および培地に添加する２−デオキシストレプタミンアナログの組合せは、所望の目的化合物の種類を考慮して適宜決定することができる。
本発明の一つの態様によれば、カナマイシン生産株は、２−デオキシ−ｓｃｙｌｌｏ−イノソース合成酵素が不活性化されたものであり、培地はストレプタミンを含んでなる。上記態様によれば、式（Ｉ）で表される化合物を、２−ヒドロキシカナマイシンＡとともに産生させることができ、２−ヒドロキシカナマイシン（２−ヒドロキシカナマイシンＡ〜Ｃ）を同時に製造する上で有利である。また、本発明の別の態様によれば、カナマイシン生産株は、２−デオキシ−ｓｃｙｌｌｏ−イノソース合成酵素が不活性化されたものであり、培地はｍｙｏ−イノシトールを含んでなる。上記態様によれば、式（Ｉ）におけるＲが水酸基である２−ヒドロキシカナマイシンＣを選択的に製造することができる。
【００３８】
また、ストレプタミンまたはｍｙｏ−イノシトールの添加量はそれぞれ、培養条件によって適宜変更することができるが、好ましくは１００〜５０，０００μg/mlであり、より好ましくは１，０００〜１０，０００μg/mlである。
【００３９】
また、本発明による製造方法における培地成分としては、適宜公知物質を添加することができる。
ストレプタミンおよびｍｙｏ−イノシトール以外の培地成分としては、例えば炭素源としてはグルコース、シュクロース、水飴、デキストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動・植物油等が使用できる。また、窒素源としては大豆粉、小麦胚芽、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、肉エキス、ポリペプトン、マルトエキス、イーストエキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等が使用できる。その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、リン酸（リン酸水素２カリウム等）、硫酸（硫酸マグネシウム等）およびその他のイオンを生成することのできる無機塩類を添加することも有効である。また、必要に応じてチアミン（チアミン塩酸塩等）等の各種ビタミン、グルタミン酸（グルタミン酸ナトリウム等）、アスパラギン（ＤＬ−アスパラギン等）等のアミノ酸、ヌクレオチド等の微量栄養素、抗生物質等の選抜薬剤を添加することもできる。さらに、菌の発育を助け、２−ヒドロキシカナマイシンＢおよび２−ヒドロキシカナマイシンＣの生産を促進するような有機物および無機物を適当に添加することができる。
また、培地のｐＨは、ｐＨ５．５〜ｐＨ９程度が好ましい。
【００４０】
培養法としては、好気的条件での固体培養法、振とう培養法、通気撹拌培養法または深部好気培養法により行うことができるが、深部好気培養法が好ましい。
また、培養の適当な温度としては、例えば、１５℃〜４０℃であるが、多くの場合２５℃〜３５℃付近で生育する。
なお、式（Ｉ）で表される化合物の生産量は、培地および培養条件、使用した培養法に応じて異なるが、例えば、２日〜１５日間で最高に達する。
そして、好ましくは、培地中の式（Ｉ）で表される化合物の量が最高になった時に培養を停止し、培養物から上記化合物を採取、精製する。
【００４１】
培養物から本発明の化合物を採取するためには、その性状を利用した通常の分離手段を用いることができる。分離手段としては、例えば、溶剤抽出法、イオン交換樹脂法、吸着または分配カラムクロマトグラフィー法、ゲル濾過法、透析法、沈殿法、結晶化法、またはそれらの組み合わせが挙げられる。例えば、上記培養物をろ過して得られたろ液をアンバーライトＩＲＣ-５０やＦＰＣ３５００などの陽イオン交換樹脂に吸着し、アンモニア水で溶離する。溶離液はさらにダウエックス５０ＷやアンバーライトＣＧ-５０などの陽イオン交換樹脂を用いて精製し、必要に応じてダウエックス１を用いたイオン排除クロマトグラフィーやＨＰ２０ｓｓを用いた吸着クロマトグラフィーで精製を行うことにより、式（Ｉ）で表される各２−ヒドロキシカナマイシンを単離することができる。
【００４２】
用途
また、本発明による化合物は、優れた抗菌活性を有し、ヒトを含む動物に医薬として投与することが有用である。したがって、本発明の好ましい態様によれば、式（Ｉ）で表される化合物、その薬理学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物を含んでなる、医薬組成物が提供される。また、上記組成物は、好ましくは抗菌剤として用いられる。  
また、本発明の別の好ましい態様によれば、医薬組成物の製造における、式（Ｉ）で表される化合物、その薬理学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物の使用が提供される。また、さらに別の態様によれば、抗菌剤の製造における、式（Ｉ）で表される化合物、その薬理学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物の使用が提供される。
【００４３】
本発明による化合物を医薬組成物として用いる場合、種々の投与形態あるいは使用形態に合わせて、常法に従い製剤化することができる。経口投与のための製剤としては、錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、舌下剤等が挙げられる。また非経口投与のための製剤としては、注射剤、経皮吸収剤、吸入剤、坐剤等が挙げられる。製剤化に際しては、界面活性剤、賦形剤、安定化剤、湿潤剤、崩壊剤、溶解補助剤、等張剤、緩衝剤、着色料、着香料等の医薬用添加剤を適宜使用する。
【００４４】
また、上記医薬組成物における担体としては、製薬学上許容されるものを用いることができ、その種類および組成は投与経路や投与方法によって適宜決定することができる。例えば、液状担体として水、アルコール、大豆油、ゴマ油などを用いることができる。固体担体として、マルトース、スクロースなどの糖類、リジンなどのアミノ酸類、シクロデキストリンなどの多糖類、ステアリン酸マグネシウムなどの有機酸塩類、ヒドロキシルプロピルセルロースなどのセルロース誘導体を使用できる。
【００４５】
また、抗菌活性を有する本発明による化合物は、感染症の治療または予防に好ましく用いられる。したがって、本発明の別の態様によれば式（Ｉ）で表される化合物、その薬理学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物の有効量を、ヒトを含む動物に投与すること含んでなる、感染症の治療または予防方法が提供される。ここで、「治療」とは、確立された病態を改善することを意味する。また、「予防」とは、将来における病態の確立を防止することを意味する。
【００４６】
また、本発明による化合物は、種々の感染症に起因菌に対して適用することが可能である。そして、感染症の起因菌としては、例えば、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、腸球菌、大腸菌、緑膿菌、枯草菌、サルモネラまたはアシネトバクター等が挙げられるが、好ましくは黄色ブドウ球菌、大腸菌または緑膿菌である。
【００４７】
また、式（Ｉ）で表される化合物が２−ヒドロキシカナマイシンＢである場合、上記感染症の起因菌は、好ましくは黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、腸球菌、大腸菌、緑膿菌、枯草菌、サルモネラまたはアシネトバクターであり、より好ましくは黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、腸球菌、大腸菌、枯草菌、サルモネラまたはアシネトバクターであり、さらに好ましくは黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、大腸菌、枯草菌、サルモネラまたはアシネトバクターである。
【００４８】
また、式（Ｉ）で表される化合物が２−ヒドロキシカナマイシンＣである場合、上記感染症の起因菌は、好ましくは黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、大腸菌、枯草菌、サルモネラまたはアシネトバクターであり、より好ましくは表皮ブドウ球菌、大腸菌、枯草菌、サルモネラまたはアシネトバクターであり、さらに好ましくは表皮ブドウ球菌、枯草菌、サルモネラまたはアシネトバクターである。
【００４９】
また、本発明による化合物の有効量としては、患者の年齢、体重、疾病の種類や程度、投与経路に応じて医師により適宜決定されるが、ヒトに経口投与する場合には、例えば、成人一人当たり一日に０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、静脈投与の場合には同じく０．００１〜１００ ｍｇ／ｋｇの範囲内で投与することができる。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を実施例によって、より具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでない。
【００５１】
なお、以下の実施例に用いたＬＣ/ＭＳの分析条件は、下記の通りである。
ＬＣ/ＭＳの分析条件
（ＨＰＬＣ部：Waters 2690）
カラム：  Capcell Pak C18 MG  、4.6×150mm、5μm（資生堂社製）
移動相：  Ａ：0.2％ペンタフルオロプロピオン酸水溶液
Ｂ：アセトニトリル
Ｃ：H2O  
直線グラジェント：0分（A/B/C=10/10/80）→15分（A/B/C=10/30/60）
流速：0.4 ml/分、温度：30℃
【００５２】
（ＭＳ部：Waters ZQ）ESI法
Ion source Temp.：100℃
Desolvation Temp.：380℃
Desolvation Gas Flow：350L/hr
Cone Gas Flow：50L/hr
Capillary電圧：3.5kV
Cone電圧：Positive：30V
【００５３】
実施例1：ストレプトマイセス・カナマイセティカスの２−デオキシ−ｓｃｙｌｌｏ−イノソース合成酵素遺伝子（orf11）変異導入用プラスミドpDDOIの構築
２−デオキシ−ｓｃｙｌｌｏ−イノソース合成酵素（配列番号１）は基質、グルコース6-リン酸への結合に重要なアミノ酸残基として保存されている136番目のアスパラギン酸をアスパラギンに換えることにより、酵素タンパクの不活化を図ることとし、pKM9（特開２００４−１７３５３７号公報、実施例２、ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１１７参照）を鋳型としてPCR法により作成した。
利用したカナマイシン生合成クラスター領域は、配列番号２に示す。
プライマーは、以下のようにHind III、またはXba I消化部位を含むものと、DOI synthase遺伝子の開始コドンから136番目のアスパラギン酸（GAT）の位置がアスパラギン（AAC）に変異されるようにデザインしたものを用いた。
【００５４】
Km-Mu-Hind III
5 ’-GGGAAGCTTGACCTTGGAGGTATGTGT-3’（配列番号３）
Km-Mu-L
5 ’-GTTCAGCATGGCCACCACGGTGGT-3’（配列番号４）
（下線部は変異導入部分を示す）
Km-Mu-R
5 ’-TCGGTGCTCTCGCTCAAGCAG-3’（配列番号：５）
Km-Mu-Xba I
5 ’-GGGTCTAGATGCCGTCCTGGTGGTAGT-3’（配列番号：６）
【００５５】
PCR反応は、プライマーKm-Mu-Hind III（配列番号３）とKm-Mu-L（配列番号４）、Km-Mu-R （配列番号５）とKm-Mu-Xba I（配列番号６）の組み合わせでそれぞれ行った。反応条件は、約１μgのゲノムDNAと0.3μMの各プライマー、KOD Plus DNAポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製）を使用して、94℃・２分間、（94℃・15秒間、50℃・30秒間、68℃・１分30秒間）×25回のサイクル条件で行った。その結果、それぞれ約1.5kbpのDNA断片が特異的に増幅された。各DNA断片は、QIAquick PCR Purification Kit（キアゲン株式会社製）を用いて精製し、平滑末端をリン酸化し（ニッポン・ジーン社製）、Hind IIIおよびXba Iでそれぞれ消化しpUC119のHind IIIおよびXba I部位にクローニングした。クローニングしたDNA断片の塩基配列の解析を行い、目的とするアスパラギンへの置換が挿入された２−デオキシ−ｓｃｙｌｌｏ−イノソース合成酵素（orf11）遺伝子（配列番号７）を含むDNA断片であることを確認した。
【００５６】
放線菌の接合伝達用プラスミドpSET152（ビアマン（Ｂｉｅｒｍａｎ，Ｍ．）ら著，「ジーン（Ｇｅｎｅ）」，（蘭国），１９９２年，第１１６巻，ｐ．４３−４９）をSphI消化し、T4 DNAポリメラーゼで平滑化した後、HindIIIリンカー（宝酒造株式会社製）を連結してpSET153を構築した。pSET153由来の約２．８ｋｂｐのHindIII−XbaI断片と、アミノ酸置換された遺伝子を含む約３ｋｂｐのHindIII−XbaI断片を連結して、接合伝達可能なorf11遺伝子変異導入用プラスミド pDDOIを得た。
【００５７】
実施例２：orf11遺伝子変異導入用プラスミドpDDOIによるデオキシストレプタミン非生産株の創出
カナマイシン生産菌のストレプトマイセス・カナマイセティカスをＭＳ寒天培地（２％S大豆粉、２％マンニトール、２％寒天 ）に塗布し、２８℃にて３日培養した。培養後、２０％グリセロール３ｍｌで菌糸をかきとり、回収し、宿主の菌糸液を調製した。
【００５８】
一方、プラスミドpDDOIを保持する大腸菌（Escherichia coli）ET12567/pUZ8002株をクロラムフェニコール、カナマイシンおよびアプラマイシンをそれぞれ２５μg/ml 、２５μg/ml および５０μg/mlの濃度で含む１００mlのＬＢ液体培地（１％ディフコバクトトリプトン、０．５％ディフコイーストエキストラクト、０．５％ＮａＣｌ、０．１％グルコース）に植菌し、３７℃で一晩培養して前培養液を調製した。前培養液を終濃度１％となるように前培養時と同一の液体培地に植菌し、３７℃で約４時間培養した後、ＬＢ液体培地で２回洗浄し、最終的に１０mlのＬＢ液体培地に懸濁して大腸菌液とした。
【００５９】
上記の通り調製した宿主の菌糸液５００μlと大腸菌液５００μlを混合して集菌した後、終濃度１０ｍＭとなるようにＭｇＣｌ２を添加したＭＳ寒天培地に塗布した。２８℃、２０時間培養後、アプラマイシン１ｍｇおよびナリジキシン酸１．５ｍｇを含む滅菌水１ｍｌを重層し、さらに２８℃、５日間培養してアプラマイシン耐性株を得た。
【００６０】
得られたアプラマイシン耐性株よりMagExtractorゲノムＤＮＡ抽出機器（東洋紡績株式会社製）を用いてプロトコールに従ってゲノムＤＮＡを調製し、pDDOIが相同組換えにより染色体に挿入されていることをＰＣＲおよびサザンブロット解析で確認した。
【００６１】
上記相同組換え体を改変ＹＥＭＥ培地（５０ｍｌ）に植菌し２８℃、２日間振とう培養し、その１ｍｌをさらに新たな改変ＹＥＭＥ培地（５０ｍｌ）に植菌して継代培養した。この操作を５回繰り返した後、適当な生菌数となるように希釈した培養液をＭＳ寒天培地に塗布し、２８℃で４日培養した。生育したコロニーを２０μg/mlのアプラマイシンを含むＭＳ寒天培地と無添加のＭＳ寒天培地にレプリカし、アプラマイシン含有培地では生育できない、アプラマイシン感受性株を１８株選抜した。
【００６２】
得られたアプラマイシン感受性株のゲノムＤＮＡを調製し、プライマーKm33（5'-CTTCGTGAATCCCCCTT-3'：配列番号８）とKm３５（5'-GCCCACCGCCTCGATCA-3'：配列番号９）の組合せでＰＣＲ反応を行い、約３．５ｋｂｐの増幅ＤＮＡ断片を得た。これらの増幅ＤＮＡ断片の塩基配列の解析を行った。その結果、１株がデザイン通りにアスパラギンに置換された変異株であり、１７株は元の塩基配列のままであった。
【００６３】
また、これらの株についてカナマイシンの生産性を確認するため、２５０ｍｌ容の三角フラスコに調製した液体生育培地（ウメザワ（Umezawa，H．）ら著，「ザ・ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）」，（日本），１９７７年，第３０巻，ｐ．１８１−１８８）３０mlに植菌し、２８℃で２日培養後、培養液１ｍｌを液体生産培地（スターチを１．２％から６％に増量）３０mlに植菌し、２６℃、７日間振とう培養した。生産物を解析するため、培養液を５０％Ｈ２ＳＯ４でｐH２．５に調製し、１．５mlのエッペンチューブにいれ、１７,４００×ｇ、１０分間遠心し、その上清をLC/MS分析に供した。その結果、１株のorf11変異導入株についてはカナマイシン類の生産は認められず、親株と同一の塩基配列に戻った１７株は、カナマイシンＡ（保持時間8.2分、ｍ/ｚ485）およびカナマイシンＢ（保持時間10.4分、ｍ/ｚ  484）を生産していた。
【００６４】
次に、このカナマイシン非生産株を、１／２に希釈した上述の液体培地に濃度２００μg/mlになるようにデオキシストレプタミンを添加したアガー培地に、塗布し、２８℃、７日間培養した。その後、アガーを凍結融解することにより生産物質を抽出し、生物検定を行った。検定菌はBacillus subtilis ATCC6633を用いた。その結果、無添加培養区では抗菌活性を示さなかったのに対し、デオキシストレプタミン添加培養区は抗菌活性を示す阻止円を検出した。よって、LC/MS分析に供した。その結果、カナマイシンＡおよびカナマイシンＢを検出することができた。よって、orf11の１３６番目のアミノ酸置換によりデオキシストレプタミン依存性カナマイシン生産菌株S. Kanamyceticus-DOSを創出したことを確認した。
【００６５】
実施例３：デオキシストレプタミン依存性カナマイシン生産株を利用したストレプタミン添加培養
実施例２で得られたデオキシストレプタミン依存性カナマイシン生産株を上述の液体生産培地にて２６℃、７日間培養した。その間２、３日目に、終濃度2,000μg/mlになるように調製したストレプタミンを添加した。
【００６６】
培養液2,000Ｌにラヂオライト＃８００を加えてろ過し、得られたろ液を50ｍｌ容量のアンバーライトＦＰＣ3500（NH4+型、ローム・アンド・ハース社）に吸着した。樹脂を水洗後、0.5Ｎアンモニア水で溶離した。溶離液をpH６に調整後、50ｍｌ容量のダウエックス５０Ｗ（NH4+型、ムロマチテクノス社）に吸着し、0.04Ｎ〜0.2Ｎのアンモニア水で溶離して、２−ヒドロキシカナマイシンＡ 57.6ｍｇ、２−ヒドロキシカナマイシンＢ 32.8ｍｇおよび２−ヒドロキシカナマイシンＣ 513.2ｍｇを得た。それぞれの構造は、HR-FAB/MS（JEOL JMS-700、日本電子）およびＮＭＲ（JEOL JNM-LA400、日本電子）スペクトルの解析によって決定した。
【００６７】
実施例４：デオキシストレプタミン依存性カナマイシン生産株を利用したｍｙｏ−イノシトール添加培養
実施例２で得られたデオキシストレプタミン依存性カナマイシン生産株を、濃度500μg/mlになるようにｍｙｏ−イノシトールを添加した上述のアガー培地に塗布し、28℃、7日間培養した。その後、アガーを凍結融解し生産物質を抽出し、ＬＣ/ＭＳで解析した。その結果、２−ヒドロキシカナマイシンＣ（保持時間8.3分、m/z 501）のピークを検出した。
【００６８】
実施例５：カナマイシン生産菌におけるストレプタミンまたはｍｙｏ−イノシトール添加培養
カナマイシン生産菌（ストレプトマイシン・カナマイセティカス）において、濃度500μg/mlのストレプタミンまたはｍｙｏ−イノシトール添加のアガー培養を実施例４と同様の方法で行い、生産物質をＬＣ/ＭＳで解析した。その結果、いずれの添加においてもカナマイシンＡ（保持時間8.2分、m/z 485）およびカナマイシンＢ（保持時間10.4分、m/z 484）の他に、２−ヒドロキシカナマイシンＢ（保持時間10.7分、m/z 500）および２−ヒドロキシカナマイシンＣ（保持時間8.3分、m/z 501）を生産していることを検出した。
【００６９】
実施例６：ヒドロキシカナマイシンＢおよびＣの物理化学的性状の確認
実施例３〜５において取得された、ヒドロキシカナマイシンＢおよびＣの物理化学的性状を確認したところ、以下の通りであった。
【００７０】
２−ヒドロキシカナマイシンＢの物理化学的性状
(1) 色および性状：無色粉末
(2) 分子式：C18H37N5O11
(3) マススペクトル (HR-FAB/MS)：実測値 500.2563 (M+H)+、計算値 500.2568
(4) 比旋光度：[α]D25 = + 127.1° (c = 1, H2O)
(5) 紫外線吸収スペクトル λmax nm：末端吸収 (H2O)
(6) 赤外線吸収スペクトル νmax cm-1 (KBr)：3351, 2910, 1585, 1477,1368,1032 
【００７１】
(7) 1H-NMRスペクトル (400MHz, D2O) δ(ppm)：2.87 (1H, dd, H-1), 3.14 (1H, dd, H-2), 2.84 (1H, dd, H-3), 3.40 (1H, dd, H-4), 3.77 (1H, dd, H-5), 3.32 (1H, dd, H-6), 5.37 (1H, d, H-1’), 2.79 (1H, dd, H-2’), 3.58 (1H, dd, H-3’), 3.32 (1H, dd, H-4’), 3.81 (1H, m, H-5’), 2.84 (1H, dd, H-6’a), 3.06 (1H, m, H-6’b), 5.05 (1H, d, H-1”), 3.52 (1H, dd, H-2”), 3.02 (1H, dd, H-3”), 3.35 (1H, dd, H-4”), 3.93 (1H, dt, H-5”), 3.78 (2H, br d, H-6”)
[TSP = 0 ppm]
【００７２】
(8) 13C- NMRスペクトル (100MHz, D2O) δ(ppm)：57.0 (d, C-1), 73.5 (d, C-2), 55.7 (d, C-3), 82.9 (d, C-4), 74.7 (d, C-5), 84.7 (d, C-6), 100.7 (d, C-1’), 55.9 (d, C-2’), 74.1 (d, C-3’), 72.0 (d, C-4’), 73.3 (d, C-5’), 42.1 (t, C-6’), 100.7 (d, C-1”), 72.4 (d, C-2”), 54.9 (d, C-3”), 69.8 (d, C-4”), 72.7 (d, C-5”), 60.9 (t, C-6”)
[dioxane = 67.4 ppm]
(9) 溶解性：水に可溶、酢酸エチル、クロロホルムに不溶
【００７３】
２−ヒドロキシカナマイシンＣの物理化学的性状
(1) 色および性状：無色粉末
(2) 分子式：C18H36N4O12
(3) マススペクトル (HR-FAB/MS)：実測値 501.2398 (M+H)+、計算値 501.2408
(4) 比旋光度：[α]D25 = + 114.3° (c = 1, H2O)
(5) 紫外線吸収スペクトル λmax nm：末端吸収 (H2O)
(6) 赤外線吸収スペクトル νmax cm-1 (KBr)：3358, 2920, 1591, 1457, 1369, 1032
【００７４】
(7) 1H-NMRスペクトル (400MHz, D2O) δ(ppm)：2.88 (1H, dd, H-1), 3.14 (1H, dd, H-2), 2.83 (1H, dd, H-3), 3.39 (1H, dd, H-4), 3.76 (1H, dd, H-5), 3.33 (1H, dd, H-6), 5.32 (1H, d, H-1’), 2.81 (1H, dd, H-2’), 3.60 (1H, dd, H-3’), 3.41 (1H, dd, H-4’), 3.86 (1H, m, H-5’), 3.76 (1H, dd, H-6’a), 3.88 (1H, m, H-6’b), 5.06 (1H, d, H-1”), 3.54 (1H, dd, H-2”), 3.04 (1H, dd, H-3”), 3.37 (1H, dd, H-4”), 3.94 (1H, dt, H-5”), 3.79 (2H, br d, H-6”)
[TSP = 0 ppm]
【００７５】
(8) 13C-NMRスペクトル (100MHz, D2O) δ(ppm)：57.1 (d, C-1), 73.5 (d, C-2), 56.0 (d, C-3), 83.6 (d, C-4), 74.8 (d, C-5), 84.8 (d, C-6), 101.1 (d, C-1’), 56.1 (d, C-2’), 74.3 (d, C-3’), 70.6 (d, C-4’), 73.7 (d, C-5’), 61.4 (t, C-6’), 100.9 (d, C-1”), 72.4 (d, C-2”), 55.1 (d, C-3”), 69.7 (d, C-4”), 72.8 (d, C-5”), 60.9 (t, C-6”) 
[dioxane = 67.4 ppm]
(9) 溶解性：水に可溶、酢酸エチル、クロロホルムに不溶
【００７６】
試験例１：２−ヒドロキシカナマイシンＢおよび２−ヒドロキシカナマイシンＣの抗菌活性
２−ヒドロキシカナマイシンＢおよび２−ヒドロキシカナマイシンＣの抗菌活性を、寒天希釈法による最小発育阻止濃度（MIC）として測定した。増殖用培地で一夜培養した試験菌を106 cells/mlに調整し、その１白金耳を、２−ヒドロキシカナマイシンＢまたは２−ヒドロキシカナマイシンＣを含むミュラーヒントンアガー培地（Difco社製）に接種し、3 7℃で18〜20時間培養した。
結果を表１に示す。
【００７７】
【表１】
0006033732.tif 000005
【配列表】
0006033732000001.app