(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の結合特異性または機能を有するポリペプチドを同定するための方法であって、
（ｉ）種々の結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている、ポリヌクレオチドの多様なコレクションを生成すること、ここで前記ポリヌクレオチドは、少なくとも１種のトランスポサーゼ酵素によって認識され、かつ、これと機能する第一の逆方向末端反復配列と第二の逆方向末端反復配列の間に配置されている、ポリペプチドをコードしている配列を含み；
（ｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドの多様なコレクションを宿主細胞に導入すること；
（ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドの多様なコレクションが宿主細胞のゲノムに組み込まれ、種々の結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている前記ポリヌクレオチドの多様なコレクションを発現する宿主細胞の集団が生じるように、前記逆方向末端反復配列と機能する少なくとも１種のトランスポサーゼ酵素を前記宿主細胞中で発現させること；
（ｉｖ）所望の結合特異性または機能を有するポリペプチドを発現している宿主細胞を同定するために前記宿主細胞をスクリーニングすること；および
（ｖ）前記宿主細胞から、前記ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を単離すること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、プラスミドベクターまたは二本鎖ＤＮＡのＰＣＲ増幅産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、
ａ）受容体のリガンド結合配列または結合分子の標的結合配列、
ｂ）抗体の抗原結合配列、
ｃ）抗体のＶHもしくはＶL領域、またはその抗原結合断片をコードしている配列、
ｄ）抗体のＶH領域と抗体のＶL領域をコードしている配列、
ｅ）完全長の免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖、またはその抗原結合断片をコードしている配列、および／または
ｆ）一本鎖のＦｖまたはＦａｂドメインをコードしている配列、
を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドの多様なコレクションを生成することが、Ｖ領域の遺伝子配列を突然変異誘発条件下におけるＰＣＲにかけることを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｉｉ）が、
ａ）別々のベクターにコードされている、免疫グロブリンのＶHもしくはＶL領域、またはその抗原結合断片、および／または
ｂ）別々のベクター上にある、完全長の免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖、またはその抗原結合断片、
ｃ）抗体のＶH鎖およびＶL鎖をコードしている配列を含んでいるベクター、
ｄ）完全長の免疫グロブリン重鎖および完全長の免疫グロブリン軽鎖をコードしている配列を含んでいるベクター、
をコードしている配列を含んでいるポリヌクレオチドを前記宿主細胞に導入することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記発現させる工程（ｉｉｉ）が、少なくとも１種の逆方向末端反復配列を認識し、かつ、これと機能するトランスポサーゼ酵素をコードしている発現ベクターを前記宿主細胞に導入することを含み、ここで前記トランスポサーゼ酵素が前記宿主細胞中で一過的に発現される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記スクリーニングする工程（ｉｖ）が、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、固相表面に固定した分子に対するパニング、細胞性の、天然または人工的に再構成した脂質二重膜に組み込まれた細胞膜関連分子への結合に関する選抜、またはマルチウェルフォーマットでの、所望の機能または結合表現型に関する個々の細胞のクローンの高処理スクリーニングを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
所望の結合特異性または機能を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列単離する前記工程（ｖ）が、ゲノムＰＣＲ増幅もしくはＲＴ−ＰＣＲ増幅または次世代ディープシークエンシングを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ａ）前記逆方向末端反復配列がピギーバックのトランスポゾン系またはスリーピングビューティーのトランスポゾン系に由来するものであり、および／または
ｂ）工程（ｉｉｉ）が、機能性のピギーバックトランスポサーゼまたはスリーピングビューティートランスポサーゼをコードしている配列を含んでいるベクターを前記宿主細胞に導入することを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記逆方向末端反復配列が、ピギーバック（ＰｉｇｇｙＢａｃ）、スリーピングビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ）、フロッグプリンス（Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ）、ハイマー１（Ｈｉｍａｒ１）、パスポート（Ｐａｓｓｐｏｒｔ）、ミノス（Ｍｉｎｏｓ）、ｈＡＴ、トール１（Ｔｏｌ１）、トール２（Ｔｏｌ２）、Ａｃ／Ｄｓ、ＰＩＦ、ハービンジャー（Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ）、ハービンジャー３−ＤＲ（Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ３−ＤＲ）、およびＨｓｍａｒ１からなる群より選択される少なくとも１種のトランスポサーゼによって認識され、かつ、これと機能する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
複数のポリヌクレオチド分子を含んでおり、種々の結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド分子のライブラリーであって、前記ポリヌクレオチド分子が、少なくとも１種のトランスポサーゼ酵素によって認識され、かつ、これと機能する逆方向末端反復配列の間に配置されている、結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている配列を含む、ライブラリー。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドが、
ａ）抗体の抗原結合配列をコードしている少なくとも１つの配列、
ｂ）抗体のＶHもしくはＶL領域またはその抗原結合断片をコードしている配列、
ｃ）抗体のＶH領域と抗体のＶL領域をコードしている配列、
ｄ）完全長の免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖、またはその抗原結合断片をコードしている配列、
ｅ）一本鎖のＦｖまたはＦａｂドメインをコードしている配列、
を含む、請求項１１に記載のライブラリー。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチド分子が、プラスミドまたは二本鎖ＤＮＡのＰＣＲ増幅産物である、請求項１１または１２に記載のライブラリー。
【請求項１４】
前記プラスミドまたは二本鎖ＤＮＡのＰＣＲ増幅産物が、逆方向末端反復配列を認識し、かつ、これと機能するトランスポサーゼ酵素をコードしている配列をさらに含む、請求項１３に記載のライブラリー。
【請求項１５】
種々の結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている配列を含んでいるポリヌクレオチドの多様なコレクションを生成することを含む、種々の結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている転位性ポリヌクレオチドのライブラリーを生成するための方法であって、ここで前記ポリヌクレオチドは、少なくとも１種のトランスポサーゼ酵素によって認識され、かつ、これと機能する逆方向末端反復配列の間に配置されている、結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている配列を含む、方法。
【請求項１６】
種々の結合特異性または機能を有するポリペプチドを発現することが可能な
宿主細胞の集団であって、
前記宿主細胞は、種々の結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている配列を含んでいるポリヌクレオチドの多様なコレクションを含み、ここで前記ポリヌクレオチドは、少なくとも１種のトランスポサーゼ酵素によって認識され、かつ、これと機能する逆方向末端反復配列の間に配置されている、結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている配列を含む、前記宿主細胞の集団。
【請求項１７】
種々の結合特異性または機能を有するポリペプチドを発現することが可能な宿主細胞の集団を生成するための方法であって、
（ｉ）種々の結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている配列を含んでいるポリヌクレオチドの多様なコレクションを生成すること、ここで前記ポリヌクレオチドは、少なくとも１種のトランスポサーゼ酵素によって認識され、かつ、これと機能する逆方向末端反復配列の間に配置されている、結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている配列を含み；および
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドの多様なコレクションを宿主細胞に導入すること、
を含む方法。
【請求項１８】
ＶH配列を含んでいるベクターが、ＶL配列を含んでいるベクターに含まれている逆方向末端反復配列を認識するものとは別のトランスポサーゼ酵素によって認識される逆方向末端反復配列を含む、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
宿主細胞が脊椎動物の細胞である、請求項１〜１０、１７及び１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
宿主細胞が、哺乳類の細胞、ヒトまたは齧歯類の細胞、リンパ細胞、Ｂ細胞、プロ（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）Ｂ細胞またはプレ（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）Ｂ細胞である、請求項１〜１０、１７及び１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
宿主細胞が、エーベルソン−マウス白血病ウイルスで形質転換したプロＢ細胞またはプレＢ細胞、または初期免疫グロブリン−ヌルＥＢＶで形質転換したヒトプロＢ細胞およびプレＢ細胞である、請求項１〜１０、１７及び１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
宿主細胞が脊椎動物の細胞である、請求項１６に記載の宿主細胞の集団。
【請求項２３】
宿主細胞が哺乳類の細胞、ヒトまたは齧歯類の細胞、リンパ細胞、Ｂ細胞、プロ（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）Ｂ細胞またはプレ（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）Ｂ細胞である、請求項１６に記載の宿主細胞の集団。
【請求項２４】
宿主細胞が、エーベルソン−マウス白血病ウイルスで形質転換したプロＢ細胞またはプレＢ細胞、または初期免疫グロブリン−ヌルＥＢＶで形質転換したヒトプロＢ細胞およびプレＢ細胞である、請求項１６に記載の宿主細胞の集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（ａ）特異的な機能性タンパク質および結合タンパク質を同定するための技術
【背景技術】
【０００２】
抗体およびその断片などの標的に特異的なタンパク質の発見には強い商業的関心が寄せられている。なぜならば、抗体およびその断片などの高度に選択的な機能性タンパク質または結合タンパク質の選抜は、生物学的過程を非常に特異的に統合または干渉し、それ故に標準的な新規化学物質（ＮＣＥ）よりも副作用が少ないと予測される新しい治療特性を有する新規生物由来物質（ＮＢＥ）の開発において高い潜在能力をもつためである。この点において、特に標的に高度に特異的な治療用抗体および抗体を使用した治療薬の開発は高い効力をもつ新規治療の出現を可能にした。その結果、過去１０年間で治療用モノクローナル抗体は創薬の分野において最も急成長している領域となった。現在では、世界中で約５００億米ドルもの収益を生み出しており、世界の医薬品市場においてかなりの部分を占めている。
【０００３】
そのため、非常に強力ではあるが、耐用性の高い治療用タンパク質、具体的には抗体を用いた治療薬の発見を可能にするための効率的かつ革新的な技術が強く求められている。
【０００４】
所望の機能、または抗体の場合には特異的な結合特性を有するタンパク質を同定するためには、抗体およびその断片を含むタンパク質の大規模で多様なコレクションまたはライブラリーを作成し、機能的に発現させ、そして、所望される機能特性または標的との結合特異性に関してスクリーニングすることが必要である。過去２０年の間に、様々なタンパク質のライブラリーを、宿主細胞かあるいはウイルスおよびファージ粒子中で発現させることを可能にする方法や、所望の機能特性または結合表現型に関してそれらをスクリーニングための高処理スクリーニング法および／またはパニング法が多数開発された。
【０００５】
通例、所望の機能特性を有する標的に特異的な結合剤またはタンパク質を同定するための最先端の技術としては、例えば、固相表面への結合（パニング）および／または他の濃縮技術と組み合わせたファージディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、バクテリアディスプレイ、酵母ディスプレイおよび様々な哺乳類細胞のディスプレイ技術がある。これらの技術は全て、種々の特許や係属特許出願によって保護されている。
【０００６】
ファージおよび原核生物を使ったディスプレイの系が確立されており、バイオ産業や学術研究機関において、抗体断片などの標的に特異的な結合剤の同定に広く利用されているが（フーゲンブーム（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ），ネイチャー・バイオテクノロジー２３，１１０５−１１１６（２００５））、これらのディスプレイ系には、より大きな完全長のタンパク質（完全長抗体など）を発現させることは不可能であること、翻訳後修飾が正確に行われないこと、脊椎動物のシャペロンによる折り畳みが正確に行われないこと、そして抗体の場合には、重鎖と軽鎖の人為的な組み合わせなど、様々な制約がある。そのためこれらの方法によって発見された抗体の場合には、完全長抗体に「再編成」し、そして哺乳類の細胞で発現させることが必要となる。上述したような制約により、このことはしばしば、好ましくない生物物理学的な特性（例えば安定性が低い、凝集しやすい、親和性が弱い）を有する抗体が生じ、このようなタンパク質の治療上および診断上の可能性を限定している。このことから、一方ではこれらの方法によって生成されたリード分子の開発における減少率が大きくなり、他方では、創薬をさらに進めるために、これらのタンパク質の生物物理的および分子的なマイナスを修正するための多大な努力を要求される。
【０００７】
そのためタンパク質および抗体を発見するための技術は、（ｉ）完全長抗体などの、より大きく完全長のタンパク質が発現でき、（ｉｉ）好ましいまたは正常な翻訳後修飾が行え、および、（ｉｉｉ）抗体の場合には、重鎖と軽鎖が正しく組み合わせられる、下等な真核生物（例えば酵母）を使って開発されてきた（ビエリ（Ｂｅｅｒｌｉ）およびラダー（Ｒａｄｅｒ），ｍＡｂｓ  ２，３６５−３７８（２０１０））、さらに近年では、所望の特性を有するタンパク質を同定するための哺乳類細胞の発現系が開発された。これらのことにより、全体として、創薬および治療用途でより高い可能性をもつ、好ましい生物物理学的特性を有するタンパク質が選抜される。
【０００８】
より大きな治療用タンパク質、例えば抗体を生産するためには、脊椎細胞（例えばハムスターＣＨＯ、ヒトＨＥＫ−２９３、またはニワトリＤＴ４０細胞）が好ましい発現系であるため、タンパク質を脊椎細胞内で発現させ、スクリーニングすることが最も望ましいが、これらの技術は現在のところ様々な制約とも関連しているため、これらの技術は学術分野や産業界にあまり浸透していない。
【０００９】
第一に、脊椎細胞は、例えば原核生物や酵母などの下等な真核細胞のようには効率的かつ安定的に遺伝的改変されない。そのため、その中から所望の特性または最も高い結合親和性を有する候補を同定することができる、脊椎細胞を使用した十分に多様な（複雑な）タンパク質ライブラリーを生成するという課題が残る。第二に、所望の特性を有するタンパク質を効率的に単離するためには一般的に、細胞濃縮の過程を繰り返し行うことが必要である。プラスミドの一過的な遺伝子導入（ヒグチら、米国免疫学会誌（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ）２０２，１９３−２０４（１９９７））、または一過性のウイルス発現系、例えばシンドビスウイルスまたはワクチニアウイルス（ビエリら、ＰＮＡＳ  １０５，１４３３６−１４３４１（２００８）および国際公開第０２１０２８８５号）の発現系のいずれかによる哺乳類細胞での発現では、より特異的なタンパク質を効率的に濃縮するのに必要とされる細胞選抜の過程を複数回行うことができない。そのためこれらの方法では、小規模の予め濃縮しておいたタンパク質ライブラリーのスクリーニングに限定されるという制約があるか、または、退屈なウイルス単離／細胞の再感染の工程を繰り返す必要がある。
【００１０】
脊椎細胞内で、結合タンパク質や抗体を安定に発現させるためには（これにより、安定な遺伝子型−表現型対に基づいた選抜を複数回実施することが可能になる）、特定のリコンビナーゼ（ｆｌｐ／ｆｒｔリコンビナーゼシステム、チョウ（Ｚｈｏｕ）ら、ｍＡｂｓ  ５，５０８−５１８（２０１０））、またはレトロウイルスベクター（国際公開第２００９１０９３６８号）を用いた技術が開発されている。しかしながら、ｆｌｐ／ｆｒｔ組換えは、脊椎宿主細胞のゲノムに遺伝子を安定に組み込むには効率の低い系なため、ここでも、小規模で、予備選抜を行ったライブラリー、または選抜したタンパク質または抗体候補の最適化のみに適用可能である。
【００１１】
ｆｌｐ／ｆｒｔの組換え系とは対照的に、レトロウイルスベクターを使えば、脊椎宿主細胞のより効率的な安定な遺伝的改変と、より複雑な細胞ライブラリーの生成が可能である。しかしながら、（ｉ）レトロウイルスの使用は、選択された許容できる細胞株のみに制限されており、（ｉｉ）ヒトの細胞を使用する場合にはバイオセイフティーに関するリスクがあり、（ｉｉｉ）逆転写の忠実度が低いため、レトロウイルス発現ベクターはライブラリー配列の不必要な突然変異生成が生じることがあり、（ｉｖ）ベクターをレトロウイルス粒子中にパッケージングする前にレトロウイルスゲノムのスプライシングが起こるため、レトロウイルスベクターでは、完全なイントロン／エクソン構造を保ったままゲノム発現カセットを組み込むことができず、（ｖ）レトロウイルスはウイルスゲノムのパッケージング中に、制御不可能で好ましくないライブラリー配列の相同的組換えを生じることがあり、（ｖｉ）レトロウイルスサイレンシングを起こすことがあり、および（ｖｉｉ）面倒な２段階のパッケージング−細胞の遺伝子導入／宿主−細胞感染の工程が必要とされる。これらの制約は全て大きな課題と制限になっており、標的に特異的なタンパク質または抗体を効率的に発見するための、高品質で多様性の高い脊椎細胞ライブラリーの生成におけるレトロウイルスベクターに基づく方法の利用を非常に複雑にしている。
【００１２】
そのため、抗体およびその断片などの多様なタンパク質のライブラリーであって、そこから高度に特異的な機能特性および／または結合特性および高い親和性を有するタンパク質を単離することができる、脊椎細胞を使用した高品質で多様性の高いライブラリーの生成を可能にする、より効率的で、より制御可能で、簡単な技術へのニーズが明らかに存在する。
【００１３】
（ｂ）トランスポザーゼ／遺伝子転位：
トランスポゾン、すなわち転位因子（ＴＥ）は、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれる能力を有する遺伝要素であり、この過程は遺伝子転位と呼ばれている（イビクス（Ｉｖｉｃｓ）ら、Ｍｏｂｉｌｅ  ＤＮＡ  １，２５（２０１０））（その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる）。ＴＥは、バーバラ・マクリントック（Ｂａｒｂａｒａ  ＭｃＣｌｉｎｔｏｃ）によるトウモロコシの遺伝的研究において、すでに１９５０年代には提唱されていたが、細菌のＴＥの遺伝子転位の機能的モデルが最初に説明されたのは１９７０年代の終わりであった（シャピロ（Ｓｈａｐｉｒｏ），ＰＮＡＳ  ７６，１９３３−１９３７（１９７９））（その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【００１４】
それと同時には、ＴＥは全ての生命体のゲノム中に存在することが明らかになり、ゲノム配列決定によって、ヒトゲノムのおよそ４５％がトランスポゾン由来であることが分かった（国際ヒトゲノム配列決定コンソーシアム、ネイチャー  ４０９：８６０−９２１（２００１））（その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる）。しかしながら、機能をもつ（または自律的な）ＴＥが同定されている無脊椎動物（図１ａ）とは異なり、ヒトおよび多くの高等脊椎動物は機能性ＴＥを含んでいない。ＴＥの変異原性に対する進化の選択圧が、進化の間、数百年前に機能の不活性化を誘導したと仮定されている。
【００１５】
自律的なＴＥは、２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）の間に位置しているトランスポサーゼ酵素をコードしているＤＮＡを含んでいる。このＩＴＲは、ＩＴＲの間にある配列によってコードされているトランスポサーゼ酵素によって認識され、そして、任意の二本鎖ＤＮＡ配列中へのＴＥの遺伝子転位を触媒することができる（図１ａ）。トランスポゾンには２つのクラスがある：クラスＩ、つまりレトロトランスポゾンはＲＮＡ中間体を介した「コピー・アンド・ペースト」の機構で移動し（図２ｂ）、クラスＩＩ、つまりＤＮＡトランスポゾンは切り出しと挿入、つまり「カット・アンド・ペースト」の機構を介して移動する（図２ａ）（イビクスら、ネイチャー・メソッヅ  ６，４１５−４２２（２００９））（その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【００１６】
細菌、下等な真核生物（例えば酵母）および無脊椎動物のトランスポゾンは非常に種特異的で、脊椎細胞におけるＤＮＡの効率的な遺伝子転位には使用できないと考えられる。最初、魚由来の不活性なＴＥの配列シャッフリングによって活性なトランスポゾンが人為的に再構築された（そのため、「スリーピングビューティー（ＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙ）」と呼ばれている（イビクスら、セル  ９１，５０１−５１０（１９９７））（その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる））。その後すぐ、ヒト細胞を含む脊椎細胞への遺伝子転位によるＤＮＡの組み込みを成功させることができるようになった。スリーピングビューティーは、トランスポゾンのＴｃ１／マリナー（ｍａｒｉｎｅｒ）ファミリーに属す、クラスＩＩのＤＮＡトランスポゾンである（ニー（Ｎｉ）ら、機能性ゲノミクスおよびプロテオミクスの概要（Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  Ｆｕｎｃｔ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）７，４４４−４５３（２００８））（その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる）。また、その他の機能性トランスポゾンが、ショウジョウバエ、カエル、さらにはヒトゲノムなどの別の種から同定または再構築された。これらは全て、脊椎細胞およびヒト宿主細胞ゲノムへのＤＮＡの遺伝子転位を可能にすることが分かっている（図３）。これらのトランスポゾンにはそれぞれ、遺伝子転位の効率、発現の安定性、遺伝的負荷の許容量などの点で長所と短所がある。
【００１７】
これまでのところ、抗体およびその断片などの標的特異的な機能性結合タンパク質を単離する目的で、抗体およびその断片などのタンパク質の多様なライブラリーを脊椎宿主細胞内で発現させるためにトランスポゾンを利用した技術は先行技術としては開示されていない。
【発明の概要】
【００１８】
本明細書で開示の方法は、所望の機能および／または結合表現型に関して所望の結合特異性および／または機能を有するポリペプチド、例えば抗原結合分子（抗体およびその断片など）を、比類ない効率、柔軟性、実用性および早さで発見および最適化するための新規技術を説明するものである。この新規方法は、転位性構築物および転位性のベクターにクローニングされた多様なＤＮＡライブラリー、ならびに機能性トランスポサーゼ酵素の一過性な発現を伴って、それらを宿主細胞に遺伝子導入することに基づいている。このことによって、一工程で確実に、トランスポゾンに基づく発現ベクターが脊椎宿主細胞に効率的かつ安定的に導入され、これを発現したタンパク質の所望の機能または結合表現型に関してスクリーニングすることができ、その後、抗体およびその断片などの発現タンパク質に関連するコード配列を標準的なクローニング技術やＤＮＡ配列決定技術によって同定することができる。
【００１９】
一態様において本発明は、所望の結合特異性または機能を有するポリペプチドを同定するための方法を広く指向し、この方法は、
【００２０】
（ｉ）種々の結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの多様なコレクションを生成すること、ここで前記ポリヌクレオチドは、少なくとも１種のトランスポサーゼ酵素によって認識され、かつ、これと機能する第一と第二の逆方向末端反復配列の間に配置されている、ポリペプチドのコード配列を含み；
【００２１】
（ｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドの多様なコレクションを宿主細胞に導入すること；
【００２２】
（ｉｉｉ）種々の結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの前記多様なコレクションを発現している宿主細胞集団を生じさせるために、ポリヌクレオチドの前記多様なコレクションが宿主細胞ゲノムに組み込まれるように、前記宿主細胞中で前記逆方向末端反復配列と機能する少なくとも１種のトランスポサーゼ酵素を発現させること；
【００２３】
（ｉｖ）所望の結合特異性または機能を有するポリペプチドを発現している宿主細胞を同定するために、前記宿主細胞をスクリーニングすること；および
【００２４】
（ｖ）前記宿主細胞から前記ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を単離すること、を含む。
好ましい態様では、ポリヌクレオチドはＤＮＡ分子である。一態様では、ポリヌクレオチドの多様なコレクションは受容体のリガンド結合配列、または結合分子の標的結合配列を含む。好ましい態様では、ポリヌクレオチドは、抗原結合分子、例えば抗体ＶＨもしくはＶＬドメイン、またはその抗原結合断片、または完全長の抗体重鎖または抗体軽鎖（つまり、定常領域を含む）をコードしている配列を含む。一定の態様では、ポリヌクレオチドは、ＶH領域とＶL領域の両方、または抗体重鎖と抗体軽鎖の両方をコードしている配列を含んでいてもよい。別の態様では、ポリヌクレオチドは、一本鎖ＦｖまたはＦａｂドメインをコードしている配列を含む。
一態様では、Ｖ領域の遺伝子配列を突然変異誘発条件下でのＰＣＲにかけることによって、例えば、脊椎動物のＢ細胞由来のＶ領域レパートリーをＰＣＲで増幅することによって、ポリヌクレオチドの多様なコレクションを生成する。別の態様では、遺伝子合成（例えば、既知の結合特異性および／または機能を有するポリペプチドをコードしている配列を無作為化すること）によって、ポリヌクレオチドの多様なコレクションを生成する。有用な一態様では、ポリヌクレオチドの多様なコレクションはプラスミドベクターを含む。別の有用な態様では、ポリヌクレオチドの多様なコレクションは二本鎖ＤＮＡのＰＣＲ増幅産物を含む。プラスミドベクターは、マーカー遺伝子、例えば蛍光マーカー、細胞表面マーカー、または選択マーカーをコードしている配列を含んでいてもよい。マーカー遺伝子の配列は、結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている配列の上流にあってもまたは下流にあってもよいが、逆方向末端反復配列の間にはない。あるいは、マーカー遺伝子配列が結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている前記配列の下流にあり、かつ、配列内部リボソーム進入部位によって隔てられていてもよい。
【００２５】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチドの多様なコレクションは、脊椎動物、例えば哺乳類、例えばヒトの複数の抗原結合分子をコードしている。
【００２６】
一態様では、方法の工程（ｉｉ）は、免疫グロブリンのＶHもしくはＶL領域、またはその抗原結合断片をコードしている配列を含んでいるポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することを含み、ここで前記ＶH領域とＶL領域の配列は、別々のベクターにコードされている。別の態様では、本発明の方法の工程（ｉｉ）は、完全長免疫グロブリンの重鎖もしくは軽鎖、またはその抗原結合断片をコードしている配列を含んでいるポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することを含み、ここで前記完全長重鎖配列および完全長軽鎖配列は別々のベクター上にある。ベクターを同時にまたは順次宿主細胞に導入することができる。別の態様では、ＶH領域とＶL領域または完全長重鎖と完全長軽鎖をコードしている配列は、同じベクターを使って宿主細胞に導入される。ＶHとＶLの配列または完全長の抗体重鎖および軽鎖の配列を別のベクターを使って宿主細胞に導入する場合、各ベクターにある逆方向末端反復配列が別のトランスポサーゼ酵素によって認識され、別のトランスポサーゼ酵素と機能するものであることが有用である。
【００２７】
好ましくは、宿主細胞は脊椎細胞であり、好ましくは、哺乳類の細胞、例えば齧歯類またはヒトの細胞である。リンパ細胞、例えばＢ細胞が特に有用である。Ｂ細胞は、プロ（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）Ｂ細胞またはプレ（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）Ｂ細胞であってよく、例えば、エーベルソンマウス白血病ウイルスで形質転換したプロＢ細胞またはプレＢ細胞や、初期の、免疫グロブリン−ヌル（ｎｕｌｌ）ＥＢＶで形質転換したヒトプロＢおよびプレＢ細胞であってよい。他の有用な宿主細胞としては、Ｂ細胞株、例えばＳｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、Ｘ６３細胞、およびＡｇ８６５３細胞、または一般的な哺乳類の細胞株、例えばＣＨＯ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ＢＨＫ細胞、および２９３細胞が挙げられる。
【００２８】
本発明の方法の一態様では、発現させる工程（ｉｉｉ）は、ポリヌクレオチドに含まれている少なくとも１つの逆方向末端反復配列を認識し、これと機能するトランスポサーゼ酵素をコードしている発現ベクターを、前記宿主細胞に導入することを含む。トランスポサーゼ酵素をコードしているベクターは、ポリヌクレオチドの多様なコレクションと同時に、またはコレクションの前にもしくはコレクションの後に、宿主細胞に導入することができる。一態様では、トランスポサーゼ酵素は前記宿主細胞内で一過的に発現する。あるいは、発現させる工程（ｉｉｉ）は、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれた誘導可能な発現系、例えば、テトラサイクリン誘導系またはタモキシフェン誘導系を誘導することを含んでいてもよい。好ましい態様では、工程（ｉｉｉ）は、宿主細胞中で機能性スリーピングビューティートランスポサーゼまたは機能性ピギーバック（ピギーバック）トランスポサーゼを含んでいるベクターを発現させることを含む。有用な一態様において工程（ｉｉｉ）は、前記宿主細胞中で配列番号１１を含んでいるベクターを発現させることを含む。別の有用な態様では、ベクターは、配列番号１２か、または配列番号１２と少なくとも９５％のアミノ酸配列相同性を有し、かつ、同じもしくは相同の逆方向末端反復配列特異性を有する配列をコードしている。
【００２９】
別の有用な態様では、工程（ｉｉｉ）は、配列番号１７を含んでいるベクターを前記宿主細胞内で発現させることを含む。別の有用な態様では、ベクターは配列番号１８か、または配列番号１８と少なくとも９５％のアミノ酸配列相同性をもち、かつ、同じまたは相同の逆方向末端反復配列特異性を有するもつ配列をコードしている。
【００３０】
本発明の方法の一態様では、スクリーニングの工程（ｉｖ）は、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、固相表面に固定した分子に対するパニング、天然または人工的に再構成した細胞性脂質二重膜に組み込んだ細胞膜関連分子への結合に関する選抜、または所望の機能もしくは結合表現型に関して個々の細胞クローンをマルチウェルフォーマットの高処理系でスクリーニングすること、を含む。一態様では、スクリーニングの工程（ｉｖ）は、所望の標的結合特異性または機能を有するポリペプチドを同定するためにスクリーニングすることを含む。好ましい態様では、スクリーニングの工程（ｉｖ）は、所望の抗原特異性を有する抗原結合分子を同定するためにスクリーニングすることを含む。有用な一態様では、このスクリーニングの工程は、１つ以上所望の機能特性を有する抗原結合分子を同定するためにスクリーニングすることをさらに含む。スクリーニングの工程（ｉｖ）は、個々の細胞濃縮サイクルの合間に宿主細胞の増殖を伴う、複数回の細胞濃縮サイクルを含んでいてもよい。
【００３１】
本発明の方法の一態様では、所望の結合特異性または機能を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を単離する工程（ｖ）は、ゲノムまたはＲＴ−ＰＣＲ増幅または次世代ディープシークエンシングを含む。有用な一態様では、工程（ｖ）で単離されたポリヌクレオチド配列の親和性を最適化する。これは、単離したポリヌクレオチド配列を突然変異誘発条件におけるＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲにかけることによって行うことができる。別の有用な態様では、突然変異を誘発した配列をさらに、本発明の方法の工程（ｉ）から（ｖ）にかける。好ましい態様では、（ｖ）で得られたポリヌクレオチド配列は、抗体のＶHまたはＶL領域、またはその抗原結合断片をコードしている配列を含み、かつ、前記抗体の最適化は、前記ＶHもしくはＶLの相補性決定領域またはフレームワーク領域に１つ以上突然変異を導入することを含む。
【００３２】
有用な一態様では、逆方向末端反復配列はピギーバックのトランスポゾン系に由来するものであり、かつ、ピギーバックのトランスポサーゼによって認識され、これと機能するものである。一態様では、上流のピギーバック逆方向末端反復配列をコードしている配列は配列番号１を含む。別の態様では、下流のピギーバック逆方向末端反復配列をコードしている配列は配列番号２を含む。
【００３３】
別の有用な態様では、逆方向末端反復配列はスリーピングビューティーのトランスポゾン系に由来するものであり、かつ、スリーピングビューティーのトランスポサーゼによって認識され、これと機能するものである。一態様では、上流のスリーピングビューティー逆方向末端反復配列をコードしている配列は配列番号１４を含む。別の態様では、下流のスリーピングビューティー逆方向末端反復配列をコードしている配列は配列番号１５を含む。
【００３４】
本発明の一態様では、ポリヌクレオチドは、ヒト抗ＴＮＦアルファ抗体由来の配列をコードしているＶHまたはＶL領域の配列を含む。一態様では、ヒト抗ＴＮＦアルファ抗体はＤ２Ｅ７である。
【００３５】
有用な態様では、工程（ｉｉｉ）は、機能性ピギーバックトランスポサーゼをコードしている配列を含んでいるベクターを前記宿主細胞に導入することを含む。一態様では、このベクターは配列番号１１を含む。別の態様では、ベクターは配列番号１２、または配列番号１２と少なくとも９５％のアミノ酸配列相同性を有し、かつ、同じまたは相同の逆方向末端反復配列特異性を有する配列をコードしている。
【００３６】
別の有用な態様では、工程（ｉｉｉ）は配列番号１７を含んでいるベクターを前記宿主細胞中で発現させることを含む。別の有用な態様では、ベクターは配列番号１８、または配列番号１８と少なくとも９５％のアミノ酸配列相同性を有し、かつ、同じまたは相同の逆方向末端反復配列特異性を有する配列をコードしている。
【００３７】
好ましい態様では、逆方向末端反復配列は、ピギーバック（ＰｉｇｇｙＢａｃ）、スリーピングビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ）、フロッグプリンス（Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ）、ハイマー１（Ｈｉｍａｒ１）、パスポート（Ｐａｓｓｐｏｒｔ）、ミノス（Ｍｉｎｏｓ）、ｈＡＴ、トール１（Ｔｏｌ１）、トール２（Ｔｏｌ２）、Ａｃ／Ｄｓ、ＰＩＦ、ハービンジャー（Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ）、ハービンジャー３−ＤＲ（Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ３−ＤＲ）、およびＨｓｍａｒ１からなる群より選択される少なくとも１種のトランスポサーゼによって認識され、これと機能する。
【００３８】
本発明は、種々の結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしており、複数のポリヌクレオチド分子を含んでいる、ポリヌクレオチド分子のライブラリーをさらに指向し、ここで前記ポリヌクレオチド分子は、少なくとも１種のトランスポサーゼ酵素によって認識され、これと機能する逆方向末端反復配列の間に配置されており、結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている配列を含む。ポリヌクレオチドがＤＮＡ分子であり、受容体のリガンド結合配列または結合分子の標的結合配列を含むことが好ましい。特に好ましい態様では、ライブラリーはポリヌクレオチドを含み、ここで各ポリヌクレオチドは、抗体の抗原結合配列をコードしている配列を含む。一態様では、ライブラリーは、抗体のＶHもしくはＶL領域、またはその抗原結合断片をコードしているポリヌクレオチドを含む。あるいは、ポリヌクレオチドは、ＶH領域とＶL領域をコードしていてもよい。好ましい態様では、ライブラリーのポリヌクレオチドは、完全長の抗体重鎖もしくは抗体軽鎖（つまり定常領域を含む）またはその抗原結合断片をコードしている配列を含む。あるいは、ポリヌクレオチドは、完全長免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の両方をコードしていてもよい。他の態様では、ライブラリーのポリヌクレオチドは、一本鎖ＦｖまたはＦａｂドメインをコードしている配列を含む。好ましい態様では、ライブラリーのポリヌクレオチドはプラスミドまたは二本鎖ＤＮＡのＰＣＲ増幅産物の形態をとっている。一定の態様では、ライブラリーのプラスミドは、マーカー遺伝子を含む。別の態様では、プラスミドは、逆方向末端反復配列を認識し、これと機能するトランスポサーゼ酵素をコードしている配列を含む。一態様では、本発明のライブラリーは、抗体重鎖の天然のイントロン／エクソン構造を含む、完全長免疫グロブリン重鎖をコードしているポリヌクレオチドを含む。完全長免疫グロブリン重鎖は、内生の膜アンカードメインを含んでいてもよい。
【００３９】
本発明はまた、種々の結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている転位性ポリヌクレオチドのライブラリーを生成する方法を指向し、この方法は、（ｉ）種々の結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている配列を含んでいるポリヌクレオチドの多様なコレクションを生成すること、ここで前記ポリヌクレオチドは、少なくとも１種のトランスポサーゼ酵素によって認識され、かつ、これと機能する逆方向末端反復配列の間に配置されており、結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている配列を含む。
【００４０】
本発明はまた、少なくとも１種のトランスポサーゼ酵素によって認識され、かつ、これと機能する逆方向末端反復配列の間に配置されており、抗体のＶHもしくはＶL領域またはその抗原結合部分をコードしている配列を含んでいるベクターを指向する。一定の態様では、このベクターは、免疫グロブリンの完全長重鎖または軽鎖をコードしている。好ましくは、ＶHもしくはＶLまたは重鎖もしくは軽鎖をコードしている配列は、例えば突然変異誘発条件におけるＰＣＲ増幅か、または遺伝子合成によって生成された、無作為化された配列である。一態様では、ベクターは、ピギーバックトランスポサーゼによって認識され、これと機能する逆方向末端反復配列を含む。別の態様では、逆方向末端反復配列はスリーピングビューティートランスポサーゼによって認識され、これと機能する。一態様では、ベクターは、抗ＴＮＦアルファ抗体、例えばＤ２Ｅ７などに由来するＶＨまたはＶＬ領域配列を含む。一定の態様では、ベクターは、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、および配列番号４１からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む。
【００４１】
本発明はまた、上述した本発明のベクターを含んでいる宿主細胞を指向する。好ましい態様では、この宿主細胞は、前記ＶHまたはＶL領域配列をコードしているベクター中に含まれている少なくとも１つの逆方向末端反復配列を認識し、かつ、これと機能するトランスポサーゼをコードしている配列を含んでいる発現ベクターをさらに含む。
【００４２】
本発明はその上さらに、請求項１を含む方法によって産生される抗原結合分子、例えば、抗体を指向する。
【００４３】
本発明はまた、種々の結合特異性または機能を有するポリペプチドを発現することが可能な宿主細胞集団を生成する方法を指向し、この方法は、
【００４４】
（ｉ）種々の結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている配列を含んでいるポリヌクレオチドの多様なコレクションを生成すること、ここで前記ポリヌクレオチドは、少なくとも１種のトランスポサーゼ酵素によって認識され、かつ、これと機能する逆方向末端反復配列の間に配置されており、結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている配列を含み；および
【００４５】
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドの多様なコレクションを宿主細胞に導入すること、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ａ）この図は、任意の標的ＤＮＡ配列中に転位または「ジャンプ」することができる自律性の転位要素（ＴＥ）の配置を示している。ＴＥの鍵となる構成要素は、トランスポサーゼ酵素自体の配列の上流および下流に隣接している逆方向末端反復（ＩＴＲ）を認識する活性なトランスポサーゼ酵素である。ＴＥは、ＴＥのコピーまたは切り出し、および関連のない標的ＤＮＡ配列への組み込みを触媒する。ｂ）この図は、トランスポゾンベクター系の配置を示しており、この場合、ＴＥそのものには結合していない発現ベクターによって、活性なトランスポサーゼ酵素が発現する。代わりに、ＴＥは、ＩＴＲの上流と下流の間にクローニングされた目的の配列または目的の遺伝子のいずれを含んでもよい。任意の目的の配列または目的の遺伝子（例えば、タンパク質のライブラリーをコードしているＤＮＡライブラリー）を含有しているＴＥは、トランスポサーゼ酵素の発現が、例えばこの図で示すように別々のトランスポサーゼ発現構築物によってトランスとなる場合には、関連のない標的ＤＮＡ配列に組み込まれ得る。
【図２】ａ）この図では、ＴＥがどのように関連のない標的ＤＮＡ中に「ジャンプ」または転位するかについて、２種類の様式を示している。ＩＩ群のトランスポゾンでは、第一工程において、トランスポサーゼ酵素が転位性要素のＩＴＲを認識し、ＤＮＡからのＴＥの切り出しを触媒する。第二工程では、切り出されたＴＥが、関連のない標的ＤＮＡ配列中に挿入される。この過程もトランスポサーゼ酵素によって触媒される。これらの工程により、遺伝子転位の「カット・アンド・ペースト」機構が生じる。Ｉ群のトランスポゾン（ｂに示す）では、最初に、ＴＥのコード情報が複製され（レトロトランスポゾンの場合には、例えば、転写および逆転写により）、その後、複製されたＴＥが関連のない標的ＤＮＡ配列に組み込まれる。この過程もトランスポサーゼ酵素によって触媒される。これにより、遺伝子転位の「コピー・アンド・ペースト」機構がもたらされる。
【図３】この図では、休止状態の、不活性なＴＥから同定および／または再構成され、表に示したように、種々のヒト細胞を含む脊椎細胞に遺伝子転位を生じることが可能であることが分かっている、活性なトランスポサーゼ酵素の概要を示している。表は、ニーら、機能性ゲノミクスおよびプロテオミクスの概要  ７，４４４−４５３（２００８）（その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる）の表Ｉを改変したものである。
【図４】この図では、所望の機能、例えば、ここで示したように、目的の標的と結合する機能を有する抗体およびその断片などのタンパク質のコード情報を単離するための、本明細書で開示した方法の原理の概要を示している。目的の遺伝子、例えば、転位性構築物の逆方向末端反復（ＩＴＲ）の間にクローニングされていて、抗体ポリペプチド鎖またはその断片などのタンパク質をコードしている多様な転位性ＤＮＡのライブラリーを、活性なトランスポサーゼ酵素の発現ベクターと共に、脊椎宿主細胞に導入する（図の一番上を参照のこと）。前記宿主細胞内でトランスポゾン酵素がトランスで発現することと、トランスポサーゼ酵素によって認識され得るＩＴＲの間にクローニングされた目的の遺伝子が存在することによって、ＩＴＲに隣接した目的の遺伝子を宿主細胞のゲノム中に安定に組み込むことができ、それによって、目的の遺伝子によってコードされている目的のタンパク質を安定に発現させることができる。その後、目的のタンパク質を発現している細胞ライブラリーを、発現しているタンパク質の所望の機能、例えば、これらには限定されないが、目的の標的タンパク質との結合に関して、ここで示したように、スクリーニングすることができる。当該分野において知られている細胞分離技術、例えばＭＡＣＳまたはＦＡＣＳによって、所望の表現型を有し、その結果対応する遺伝子型を含む目的のタンパク質を発現している細胞を単離することができ、当該分野において知られているクローニング技術、例えば、これらには限定されないが、ここに示したようにゲノムＰＣＲクローニングによって、目的の遺伝子のコード情報を単離した細胞から回収することができる。
【図５ａ】この図では、実施例１で示した転位性ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）カッパ軽鎖（ＬＣ）発現ベクターの生成に関するクローニング戦略の概要を示している。図５ａ）は、ピギーバックトランスポゾン由来の５’−および３’−ＩＴＲを、哺乳類の発現ベクターであるｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（インビトロジェン、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）に挿入するためのクローニング戦略を示している。ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰはそもそも、哺乳類細胞の強力なプロモーター要素であるｐＣＭＶ（ＩＥ）（ＣＭＶ最初期プロモーター）と哺乳類の宿主細胞で強く発現させるためのイントロン／ポリＡシグナルを含有している。加えて、目的の遺伝子をクローニングすることができ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩを含むマルチプルクローニングサイトの下流には、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、その下流に高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のＯＲＦとを含むｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰがあり、このｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰは、ＩＲＥＳの上流にクローニングされた目的の遺伝子の発現と連動する。同時に、大腸菌内でプラスミドを増幅・選抜するための細菌由来の機能要素（アンピシリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性）および細菌の複製起点（Ｃｏｌ  Ｅ１）も示している。生じるピギーバックＩＴＲ含有プラスミドは、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２と命名する。図５ｂ）では、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１−Ｔ２に１つしか存在しないＥｃｏＲＶ制限酵素部位への、合成したヒトＩｇカッパＬＣ遺伝子の挿入を示している。これにより、ヒトＩｇカッパＬＣがＩＲＥＳ−ＥＧＦＰカセットの上流に配置され、その結果、ヒトＩｇカッパＬＣの発現がＥＧＦＰマーカー遺伝子の発現と連動する。ヒトＩｇカッパＬＣを挿入することにより、転位性ヒトＩｇカッパＬＣ発現ベクターであるｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２−ＩｇＬが生じる。図では、プラスミドに存在する、単一の制限酵素部位をいくつかと、クローニングの工程によって複数になった部位のうちのいくつかを示している。
【図５ｂ】この図では、実施例１で示した転位性ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）カッパ軽鎖（ＬＣ）発現ベクターの生成に関するクローニング戦略の概要を示している。図５ａ）は、ピギーバックトランスポゾン由来の５’−および３’−ＩＴＲを、哺乳類の発現ベクターであるｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（インビトロジェン、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）に挿入するためのクローニング戦略を示している。ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰはそもそも、哺乳類細胞の強力なプロモーター要素であるｐＣＭＶ（ＩＥ）（ＣＭＶ最初期プロモーター）と哺乳類の宿主細胞で強く発現させるためのイントロン／ポリＡシグナルを含有している。加えて、目的の遺伝子をクローニングすることができ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩを含むマルチプルクローニングサイトの下流には、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、その下流に高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のＯＲＦとを含むｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰがあり、このｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰは、ＩＲＥＳの上流にクローニングされた目的の遺伝子の発現と連動する。同時に、大腸菌内でプラスミドを増幅・選抜するための細菌由来の機能要素（アンピシリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性）および細菌の複製起点（Ｃｏｌ  Ｅ１）も示している。生じるピギーバックＩＴＲ含有プラスミドは、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２と命名する。図５ｂ）では、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１−Ｔ２に１つしか存在しないＥｃｏＲＶ制限酵素部位への、合成したヒトＩｇカッパＬＣ遺伝子の挿入を示している。これにより、ヒトＩｇカッパＬＣがＩＲＥＳ−ＥＧＦＰカセットの上流に配置され、その結果、ヒトＩｇカッパＬＣの発現がＥＧＦＰマーカー遺伝子の発現と連動する。ヒトＩｇカッパＬＣを挿入することにより、転位性ヒトＩｇカッパＬＣ発現ベクターであるｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２−ＩｇＬが生じる。図では、プラスミドに存在する、単一の制限酵素部位をいくつかと、クローニングの工程によって複数になった部位のうちのいくつかを示している。
【図６】この図では、ヒトＩｇカッパＬＣのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）とヒトＩｇガンマ１ＨＣのＯＲＦで置き換えることで生成することができる、転位性のヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）ガンマ１重鎖（ＨＣ）発現ベクターのクローニングの概要を示している。最終的なＩｇガンマ１ＨＣのＯＲＦは、可変（Ｖ）領域と定常（Ｃ）コード領域とを隔てている単一のＥｃｏ４７ＩＩＩ制限酵素部位の改変という点でも同様であり、このことによって、実施例３で説明するように、単一の抗体Ｖコード領域を、抗体Ｖコード領域の多様なライブラリーで置き換えることができる。
【図７】この図では、実施例４で記載した、哺乳類ピギーバックトランスポサーゼ酵素発現ベクターのクローニングを示している。哺乳類の発現ベクターの骨格としてはｐＣＤＮＡ３．１（＋）ｈｙｇｒｏを用い、１つしか含まれていないＥｃｏＲＶ制限酵素部位に合成したピギーバックトランスポサーゼのＯＲＦの遺伝子をクローニングし、ピギーバックトランスポゾン発現ベクターであるｐＣＤＮＡ３．１（＋）ｈｙｇｒｏ−ＰＢを得た。この図では、他の哺乳類の機能要素（ＣＭＶ−ＩＥプロモーター、ＢＧＨ−ポリＡシグナル、ＳＶ４０−ポリＡセグメント、ハイグロマイシンＢのＯＲＦ）および細菌の機能要素（アンピシリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性、複製起点、Ｃｏｌ  Ｅ１）、ならびに関連する制限酵素認識部位のうちのいくつかの相対的な位置も示している。
【図８】この図では、実施例５に記載した、スリーピングビューティーの転位性ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖（Ｉｇ−カッパＬＣ）発現ベクターのクローニングを示している。このクローニングは、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２−ＩｇＬ構築物中のピギーバック５’および３’ＩＴＲを順次、スリーピングビューティー５’および３’ＩＴＲで置き換えることで行うことができる。またこの図では、他の哺乳類の機能要素（ＣＭＶ−ＩＥプロモーター、ＢＧＨ−ポリＡシグナル、ＳＶ４０−ポリＡセグメント、ハイグロマイシンＢのＯＲＦ）および細菌の機能要素（アンピシリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性、複製起点、Ｃｏｌ  Ｅ１）、ならびに関連する制限酵素認識部位のうちのいくつかの相対的な位置も示している。
【図９】この図は、実施例６で示した哺乳類スリーピングビューティートランスポサーゼ酵素発現ベクターのクローニングを示している。哺乳類発現ベクターの骨格としてはｐＣＤＮＡ３．１（＋）ｈｙｇｒｏを用い、これにスリーピングビューティートランスポサーゼ由来の合成したＯＲＦの遺伝子を、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）ｈｙｇｒｏに唯一のＥｃｏＲＶ制限酵素部位を使ってクローニングし、スリーピングビューティートランスポゾン発現ベクターであるｐＣＤＮＡ３．１（＋）ｈｙｇｒｏ−ＳＢを得た。この図では、他の哺乳類の機能要素（ＣＭＶ−ＩＥプロモーター、ＢＧＨ−ポリＡシグナル、ＳＶ４０−ポリＡセグメント、ハイグロマイシンＢのＯＲＦ）および細菌の機能要素（アンピシリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性、複製起点、Ｃｏｌ  Ｅ１）、ならびに関連する制限酵素認識部位のうちのいくつかの相対的な位置も示している。
【図１０】この図は、ピギーバックまたはスリーピングビューティーのいずれかのトランスポサーゼを使った遺伝子転位が可能になるよう両方「空の」ＩｇＨ鎖発現ベクターをクローニングするために実施例４で用いた、遺伝子合成したＤＮＡ断片１）および２）における機能要素の配置と単一の制限酵素部位のうちのいくつかの位置を示している。機能要素の由来は実施例の説明で詳細を開示している。
【図１１】この図は、ヒト用の転位性発現ベクターである膜結合型Ｉｇ−ガンマ１重鎖（左図）とヒトＩｇカッパ軽鎖（右図）の最終的な設計とプラスミド地図を示している。ＩｇＨ発現ベクターでは、ＶH−コード領域を、このベクターのＶHコード領域に隣接している単一の制限酵素部位であるＮｏｔＩおよびＮｈｅＩを使って、他の任意のモノクローナル抗体のＶHコード領域またはＶH−遺伝子ライブラリーで置き換えてもよい。ＩｇＬ発現ベクターでは、ＶL−コード領域を、このベクターのＶLコード領域に隣接している単一の制限酵素部位であるＮｏｔＩとＢｓｉＷＩを使って、他の任意のモノクローナル抗体のＶLコード領域またはＶL−遺伝子ライブラリーで置き換えてもよい。実施例４で詳しく開示したピギーバックおよびスリーピングビューティーの転位性ＩｇＨベクターおよびＩｇＬベクターの８つのベクター構築物は全て、この基本設計を共通して有している。ここに示した２つのベクター地図はｐＰＢ−ＥＧＦＰ−ＨＣ−Ａｃ１０（左図）とｐＰＢ−ＥＧＦＰ−ＬＣ−Ａｃ１０（右図）のベクター地図に対応しており、また、ピギーバックのＩＴＲまたはスリーピングビューティーのＩＴＲのいずれかを含有しているｈＢＵ１２重鎖（ＨＣ）または軽鎖（ＬＣ）のこの他のベクターを下の表に挙げた。この図に示した全てのベクターの配列は、実施例４で説明している。
【図１２】この図では、遺伝子を導入し転位させたＩｇＨＣ発現ベクターおよびＩｇＬＣ発現ベクターに由来するヒトＩｇＧの表面発現を、ＲＡＧ−２欠損マウス由来の６３−１２Ａ−ＭｕＬＶ形質転換マウスのプロＢ細胞の表面で検出したものの二次元ＦＡＣＳのドットプロットを示している。「ＴＦ後２日」は、ベクター構築物を６３−１２細胞に遺伝子導入した２日後にＦＡＣＳ解析を実施したことを意味している。左列のＦＡＣＳプロットは、遺伝子導入に関する陰性対照と陽性対照である。陰性対照は、プラスミドＤＮＡを含まない、細胞への見せかけのエレクトロポレーションの結果を示している。ｐＥＧＦＰ−Ｎ３は、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３対照ベクターを使った遺伝子導入の対照であり、遺伝子導入された細胞を緑色で表すことで、遺伝子導入の効率を確認するものである。左から２列目のＦＡＣＳプロットは、ピギーバックのトランスポサーゼベクターであるｐＰＢ−ＥＧＦＰ−ＨＣ−Ａｃ１０とｐＰＢ−ＥＧＦＰ−ＬＣ−Ａｃ１０ベクター（上段）、またはピギーバックのトランスポサーゼベクターであるｐＰＢ−ＥＧＦＰ−ＨＣ−ｈＢＵ１２とｐＰＢ−ＥＧＦＰ−ＬＣ−ｈＢＵ１２ベクター（中段）、またはスリーピングビューティーのトランスポサーゼベクターであるｐＳＢ−ＥＧＦＰ−ＨＣ−Ａｃ１０とｐＳＢ−ＥＧＦＰ−ＬＣ−Ａｃ１０ベクター（下段）のいずれかを同時に遺伝子導入した６３−１２細胞のプロットを示している。「ＴＦ後２日」と表示した左から２列目の図は、前述した通り、ベクターの同時遺伝子導入を行って２日後の、細胞表面でＩｇＧ（Ｙ軸）を発現している細胞についての解析およびＥＧＦＰの発現（Ｘ軸）を示している。長方形の枠で示したように、表面ＩｇＧおよびＥＧＦＰの二重陽性細胞をＦＡＣＳで分取した。「９日目、１回分取」と表示した右から２列目の図は、遺伝子導入２日後の、同様に解析した細胞集団におけるＩｇＧとＥＧＦＰの表面発現の解析結果を示している。二回目のＦＡＣＳ分取に関するソートゲートも同様に長方形の枠で示している。右列の「１６日目、２回分取」と表示した図は、遺伝子導入の９日後に再分取し、これまでの実験と同様にＩｇＧおよびＥＧＦＰの表面での発現について解析した細胞集団の細胞表面におけるＩｇＧとＥＧＦＰの発現の解析結果を示している。
【図１３】この図は、６３−１２の細胞表面にＣＤ３０特異的ＩｇＧを発現しているプロＢ細胞をＣＤ３０抗原で特異的に染色・検出することができること、および特異性のない表面ＩｇＧ（ここではＣＤ１９）を発現している細胞の大規模集団から、この場合ＣＤ３０特異的細胞はより低頻度でしか出現しなかったが、ＣＤ３０特異的細胞を検出・再単離することができることを示している。上段のＦＡＣＳのドットプロットは、安定に転位させ、ヒト抗ＣＤ３０  ＩｇＧ（クローンＡｃ１０）の発現に関して２回分取を行った６３−１２陽性対照細胞の細胞表面におけるＩｇＧ（抗カッパＬＣ染色による）とＣＤ３０結合（ＣＤ３０−抗原を使った染色による）の検出を示している。予測通り、ＦＡＣｓドットプロットの右上の象限に、ＩｇＧ陽性／ＣＤ３０−反応性の非常に均一の集団（９７．３％）が検出できた。各ＦＡＣＳプロットの上に示した数値は、それぞれの実験で得られた、ＦＳＣ／ＳＳＣゲーティングに基づく生存細胞の数を示している。中段の図は、ＩｇＧ陽性／ＣＤ１９特異的細胞のバックグランドがある中で検出されるＩｇＧ陽性／ＣＤ３０反応性細胞のＦＡＣＳ解析の結果である。イベント数の上に示した数値は、抗ＣＤ１９−ｍＡｂ−ＩｇＧ陽性細胞のバックグランド中で、抗ＣＤ３０−ｍＡｂ−ＩｇＧ陽性細胞として「出現した」集団を生成するのに使用した、抗ＣＤ３０特異的ＩｇＧ陽性細胞の希釈因数を示している。出現した集団からＩｇＧ陽性／ＣＤ３０抗原反応性細胞を特異的に単離するのに用いたソートゲートを示している。ＩｇＧ陽性／ＣＤ３０細胞をより希釈した状態での検出・単離を可能にするためには、より多くのイベントの獲得が必要である。下段のＦＡＣＳプロットは、細胞を１２日間増殖させた後、同じ指標に沿って（ＩｇＧ−発現とＣＤ３０抗原特異性）分取した細胞の再解析の結果を示している。
【図１４】この図は、ゲノム構造をとっているヒトＩｇ−ガンマ１重鎖（ＨＣ）の、転位性ベクターへのクローニングを示している。上部の直線上の断片は、膜結合型Ｉｇ−ガンマ１−ＨＣのヒトガンマ１のエクソンとイントロン、そして隣接した位置に、Ｉｇ−ガンマ１ＨＣ  ｃＤＮＡベクターｐＰＢ−ＥＧＦＰ−ＨＣ−Ａｃ１０とのライゲーションを可能にするために加えられたＮｈｅＩおよびＢｓｔＢＩ制限酵素部位を示している。Ｈはヒンジ領域のエクソン、Ｍ１およびＭ２は表面に発現したＩｇ重鎖の膜貫通領域をコードしているエクソンを示している。簡潔な一工程のライゲーションにより、転位性のヒト重鎖ベクターのＣ−ガンマ１領域のｃＤＮＡを、図に示すように、そのゲノム対応物で置き換える。この戦略を用い、ＶHコード領域をヒトＣ−ガンマ１のＣH１をコードしているエクソンにインフレームで接続する。
【図１５】この図は、カッパ軽鎖ライブラリーの配列と全体の設計を示している。ＣＤＲ３コード領域を下線で示す。有用な制限酵素部位を示した。
【図１６】この図は、ガンマ重鎖ライブラリーの配列と全体の設計を、ＮＮＫ４無作為化戦略を使って無作為化したライブラリー断片を例として示している。ＮＮＫ６、ＮＮＫ８およびＮＮＫ１０無作為化戦略を用いて無作為化したガンマ重鎖ライブラリーの断片は、ＨＣＤＲ３領域中に含まれる無作為化されたアミノ酸残基の数だけが異なるものである。ＨＣＤＲ３コード領域を下線で示す。ＡＲＧコドンはリシンおよびアルギニンをコードしている。有用な制限酵素部位を示した。
【図１７】この図では、プライマーを用いた増幅の前に行う、ＰＣＲ鋳型の制限消化を示している。（Ａ）ｐＵＣ５７＿Ｊカッパ２−Ｃカッパを、制限エンドヌクレアーゼであるＳｃａＩで消化すると、ＬＣＤＲ３−ＮＮＫ６−Ｆプライマーでのプライミングに適した平滑末端のＤＮＡ断片が生じる。（Ｂ）ｐＵＣ５７＿ＪH４を制限エンドヌクレアーゼであるＤｒｄＩで消化すると、ＨＣＤＲ３−ＮＮＫ４−Ｆ、ＨＣＤＲ３−ＮＮＫ６−Ｆ、ＨＣＤＲ３−ＮＮＫ８−Ｆ、およびＨＣＤＲ３−ＮＮＫ１０−Ｆプライマーでのプライミングに適したＤＮＡ断片が生じる。
【図１８】この図は、無作為化したＰＣＲ増幅産物のＬ−ＣＤＲ３領域とＨ−ＣＤＲ３領域の電気泳動図を示している。ＰＣＲ増幅産物は、実施例１２と１３にそれぞれ開示したように、ＶカッパについてはＮＮＫ−６戦略でＬ−ＣＤＲ３領域を多様化し（Ａ）、ＶHについてはＮＮＫ４戦略でＨ−ＣＤＲ３領域を多様化したものである（Ｂ）。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
定義
【００４８】
本明細書で使用する場合、「多様なコレクション」は、コードヌクレオチド配列または一次アミノ酸配列中に違いがあり、そのような違いが種々の機能または結合特性を定義している、特定の機能性タンパク質または結合タンパク質の複数の変異型または突然変異体を意味する。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「ライブラリー」は、種々の結合特異性および／または機能を有しているポリペプチドをコードしている複数のポリヌクレオチドを意味する。一定の態様では、ライブラリーは、少なくとも１０2、少なくとも１０3、少なくとも１０4、少なくとも１０5、少なくとも１０6、少なくとも１０7、少なくとも１０8、または少なくとも１０9種類の固別のポリペプチド、例えば完全長の抗体重鎖もしくは軽鎖、またはＶＨもしくはＶＬドメインなどをコードしているポリヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「逆方向末端反復配列」または「ＩＴＲ」は、トランスポザーゼによって認識され、ＩＴＲの遺伝子転位を仲介する（あるＤＮＡ構築物または遺伝子座に由来するコード情報を別のＤＮＡ構築物または遺伝子座に挿入することを含む）、転位因子の５’または３’末端に見いだされる配列を意味する。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「トランスポサーゼ」は、ＩＴＲを認識してこれに結合する能力を有し、ある標的ＤＮＡ配列由来の転位性の要素が別の標的ＤＮＡ配列に移行するのを仲介する酵素を意味する。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「抗原結合分子」はその最も広義において、抗原決定因子に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の非限定的な例としては、抗体または、抗原に特異的な結合を保持しているその断片がある。「特異的に結合する」とは、その結合が抗原に選択的で、かつ、望ましくないまたは非特異的な相互作用とは区別できることを意味する。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、モノクローナル、ポリクローナルおよび多重特異性（例えば、二重特異性）抗体などの完全な抗体分子、ならびにＦｃ領域を有し、かつ、結合特異性を保持している抗体断片、および免疫グロブリンのＦｃ領域と同等な領域を含み、かつ、結合特異性を保持している融合タンパク質を含むことを意図している。また、ＶＨ断片、ＶＬ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ミニボディ、ディアボディ、トリアボディ、およびテトラボディを含むがこれらには限定されない、結合特異性を保持している抗体断片も包含される（例えば、ハドソン（Ｈｕｄｓｏｎ）およびスリユ（Ｓｏｕｒｉａｕ），ネイチャー・メソッヅ  ９：１２９−１３４（２００３）を参照のこと）（参照によりその全体が組み込まれる）。
【００５４】
本明細書で開示の発明の態様は、抗体鎖またはその断片を含むがこれらには限定されない、特異的な機能ポリペプチドまたは結合ポリペプチドを同定するための方法であり（図４）、この方法は、
ｉ．抗体ポリペプチド鎖またはその断片などのタンパク質をコードしている多様な転位性のＤＮＡライブラリーを、転位因子由来で、少なくとも１種のトランスポサーゼ酵素に認識され、これと機能する逆方向末端反復（ＩＴＲ）の間にクローニングすること、
ｉｉ．工程（ｉ）の多様な転位性のＤＮＡライブラリーを１つ以上、当該分野で知られている標準的な方法によって、脊椎動物の宿主細胞に導入すること、
ｉｉｉ．前記１つ以上多様な転位性ＤＮＡライブラリーが脊椎動物の宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれ、それにより、次に抗体鎖またはその断片などのタンパク質の多様なライブラリーを安定に発現する脊椎動物の宿主細胞の集団が生じるように、前記脊椎動物の宿主細胞中で、少なくとも１つの機能トランスポサーゼ酵素のトランスでの一時的な発現を誘導すること、
ｉｖ．抗体またはその断片などのタンパク質を安定に発現している前記多様な細胞ライブラリーを、当該分野で知られている方法により、所望の機能または結合表現型に関してスクリーニングすること、
ｖ．必要に応じて、所望の結合または機能表現型に関し、安定に遺伝的改変を行った脊椎動物の宿主細胞を、繰り返し濃縮するサイクルを含み、および
ｖｉ．濃縮した宿主細胞から、当該分野で知られている標準的なクローニング法により、例えば、これらには限定されないが、１つ以上の転位したＤＮＡライブラリー構築物に含まれている配列に特異的なプライマーを使ったＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、により、所望の結合または機能表現型をコードしている対応する遺伝子を単離すること、
を含む。
【００５５】
工程（ｉ）の好ましい態様は、当該分野で知られている方法による、遺伝子合成または、多様なタンパク質コード領域に適切なプライマーと抗体もしくはその断片などの多様な結合タンパク質を含んでいるＤＮＡ鋳型とを使ったポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のいずれかによって、多様な転位性のＤＮＡライブラリーを生成することである。
【００５６】
多様な抗体ライブラリーを生成するために、Ｖ領域コード配列の特定の位置が、例えば、これらには限定されないが、抗体重鎖または軽鎖Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）のいずれかまたは全てが無作為化されていてもよい抗体重鎖および軽鎖配列の多様なコレクションを、標準的な遺伝子合成によって生成してもよい。多様性は、Ｖ領域のそれぞれのＣＤＲ、またはフレームワークの特定のもしくは複数の位置、および／または１つ以上のＣＤＲ領域の特定の位置に限定することができる。上述したような所定の多様性を有するＶ領域を、少なくとも１つの所望のトランスポサーゼ酵素と機能する逆方向末端反復に挟まれた形の抗体重鎖または軽鎖全体をコードしている断片として合成することができる。好ましくは、抗体重鎖または軽鎖のＶ領域をコードしている多様な可変ドメインを含有しているＤＮＡライブラリーを生成し、適切なクローニング部位、これらには限定されないが、抗体重鎖または軽鎖発現ベクターのクローニング部位と適合する制限酵素認識部位で挟む。本発明の方法で使用するのに有用なトランスポゾンの発現系としては、例えば、米国特許第６，２１８，１８５号；同第６，５５１，８２５号；同第６，９６２，８１０号；同第７，１０５，３４３号；および同第７，９３２，０８８号（それぞれの内容の全体が参照することにより本明細書に組み込まれる）などに記載されているピギーバックのトランスポゾン系や、米国特許第６，４８９，４５８号；同第７，１４８，２０３号；同第７，１６０，６８２号；米国特許出願第２０１１１１７０７２号；同第２００４０７７５７２号；および同第２００６２５２１４０号（それぞれの内容の全体が参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されているスリーピングビューティーのトランスポゾン系がある。
【００５７】
多様な抗体重鎖のライブラリーおよび軽鎖のライブラリーはまた、所望の脊椎動物種、好ましくはヒトから、好ましくは、Ｂ細胞を含有する細胞画分、例えばこれらには限定されないが、末梢血または臍帯血、およびリンパ器官、例えば骨髄、脾臓、扁桃腺およびリンパ節組織を含有する細胞成分から単離されたＢ細胞の集団から得ることもできる。この場合、抗体重鎖および軽鎖の多様な抗体Ｖ領域の配列は、リーダー配列の配列内もしくは上流の相同な配列、またはＶ領域フレームワーク内もしくは上流の相同な配列に結合する上流のプライマーと、可変ドメインのコード領域のＪ連結遺伝子セグメントの配列内もしくはその下流の相同な領域、または抗体重鎖または軽鎖の定常領域のコード領域の配列内もしくはその下流の相同な領域に結合する下流のプライマーを提供することで、大部分のＶ領域ファミリーを増幅することができる抗体重鎖および軽鎖に特異的な縮重ＰＣＲプライマー対を用いたＲＴ−ＰＣＲまたはゲノムＰＣＲによって単離することができる。
【００５８】
多様な可変コード領域の増幅に用いるＰＣＲプライマーのセットは、適切なクローニング部位、例えば、これらには限定されないが、抗体重鎖または軽鎖発現ベクター中のクローニング部位と適合する制限酵素認識部位を含んでいてもよい。
【００５９】
抗体およびその抗体断片などの多様なタンパク質をコードしている、工程（ｉ）の転位性のＤＮＡライブラリーを、合成遺伝子またはＰＣＲで増幅した転位性のＤＮＡライブラリーを、前述の通り適切なクローニング部位にクローニングしたプラスミドライブラリーの形態で提供することもできる。あるいは、結合タンパク質、例えば抗体およびその断片の多様なライブラリーをコードしている転位性のＤＮＡライブラリーを、ＤＮＡ合成の結果として、またはＰＣＲ増幅の結果として直接、直線状の二本鎖ＤＮＡ構築物として提供することもできる。転位性のＤＮＡライブラリーを、発現ベクターまたはプラスミドにクローニングされていない直線状の二本鎖ＤＮＡのＰＣＲ増幅産物として提供する後者のアプローチには（他の全ての脊椎細胞発現系とは異なり）、転位性ＤＮＡライブラリーの分子の複雑さが最大に維持され、かつ、発現ベクターへの制限のあるクローニングまたはライゲーションによって損なわれないという利点がある。対照的に、ライゲーションか、または別の方法によるプラスミド発現ベクターまたはシャトルベクターへのクローニングは、他のプラスミドを使用したまたはウイルスベクターを使用した脊椎細胞の発現系全てにとって、必須の中間工程である。
【００６０】
しかしながら、抗体およびその抗体断片などの多様な結合タンパク質をコードしている多様な転位性のＤＮＡライブラリーを含有しているプラスミドを使用したトランスポゾン発現ベクターの利用には、これらの発現ベクターは、転位した脊椎宿主細胞内にトランスポゾン発現ベクターを安定に組み込むために、安定に転位した脊椎宿主細胞に関するスクリーニングあるいは選抜を可能にするその他の機能要素を加えるように改変できるという利点がある。
【００６１】
これは、多様な転位性のＤＮＡライブラリーに、蛍光マーカータンパク質（例えば、当該分野で知られている、緑色、黄色、赤色、または青色蛍光タンパク質およびその高感度版）を含むがこれらには限定されないマーカー遺伝子の発現カセット、または、特定の診断用抗体または他の診断ツールが使用可能なＣＤマーカーを含むがこれらには限定されない細胞表面マーカー用の発現カセットを操作可能に連結する、つまり、トランスポゾン発現ベクターにシスでクローニングすることで達成される。
【００６２】
あるいは、転位した脊椎動物の宿主細胞を、ピューロマイシン、ハイグロマイシンＢ、ブレオマイシン、ネオマイシン耐性を含むがこれらには限定されない抗生物質耐性に関して選抜することを可能にする選択マーカーの発現カセットを、多様な転位性のＤＮＡライブラリーに操作可能に連結することが、つまりトランスポゾン発現ベクターにシスでクローニングすることができる。
【００６３】
操作可能な連結は、マーカー遺伝子または抗生物質耐性マーカーの前記発現カセットを、前記多様な転位性のＤＮＡライブラリーを含んでいるコード領域の上流または下流のいずれかであるが、トランスポゾンベクターの２つの逆方向末端反復配列の間にクローニングすることによって達成できる。
【００６４】
あるいは、操作可能な連結は、前記マーカーまたは抗生物質耐性遺伝子のコード領域を、前記多様な転位性のＤＮＡライブラリーを含んでいるコード領域の下流であるが、配列内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列によって隔たれている位置にクローニングすることで達成できる。このことにより、前記多様な転位性のＤＮＡライブラリーの前記マーカーまたは抗生物質耐性遺伝子を伴った発現の転写の連動が確保され、その結果、安定に転位した脊椎宿主細胞のスクリーニングまたは選抜が可能になる。
【００６５】
本明細書で開示の方法の工程（ｉｉ）では、抗体およびその断片などのタンパク質の多様なライブラリーをコードしている前記多様な転位性のＤＮＡライブラリーは、リポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリエチレンイミド（ＰＥＩ）磁気粒子を用いたＤＮＡ−遺伝子導入、またはプロトプラスト融合、物理的なもしくは弾道学的な方法（遺伝子銃）などの機械的な遺伝子導入、またはヌクレオフェクションを含むがこれらには限定されない、脊椎動物の細胞膜を横断してＤＮＡを効率的に輸送するための当該分野で知られている方法によって、所望の脊椎動物宿主細胞に導入される。上述した方法のうちのいずれかおよびＤＮＡを脊椎動物の宿主細胞に導入するのに適切な他の方法は、個別に、または本明細書で開示の方法の工程（ｉｉ）への組み合わせによって利用することができる。
【００６６】
抗体およびその断片を含むがこれらには限定されない二量体タンパク質の場合、それぞれ独立して脊椎動物の宿主細胞に導入することができる別々の転位性ベクターに含まれている抗体重鎖または軽鎖の多様な転位性のＤＮＡライブラリーおよび／またはトランスポゾンベクターを導入することが、本明細書で開示の方法の有用な態様である。これによって、抗体重鎖または軽鎖の多様な転位性のＤＮＡライブラリーを前記細胞に順次導入すること、または抗体重鎖または軽鎖の多様な転位性のＤＮＡライブラリーを同時に導入することのいずれかが可能になり、いずれの場合においても、少なくとも２つの別々の多様な転位性ＤＮＡライブラリーによってコードされている任意の抗体重鎖と任意の抗体軽鎖の無作為なシャッフリングが可能になる。
【００６７】
前述した態様の別の有用な態様は、抗体重鎖および軽鎖の別々のトランスポゾンベクターおよび／または多様なＤＮＡ転位性ライブラリーを使用することであり、この場合、前記構築物またはライブラリーは異なるトランスポサーゼ酵素によって認識される複数の転位性ベクターに含まれる（図３）。１つの転位性ベクターが、それに特異的なトランスポサーゼ酵素によってのみ認識され、そして転位するため、２種類の異なるトランスポサーゼ酵素の間を干渉することなく抗体重鎖および抗体軽鎖構築物のそれぞれ独立した遺伝子転位が可能となる。抗体重鎖または軽鎖をコードしている転位性のベクターまたはＤＮＡライブラリーを順次遺伝子転位させる場合、異なるＩＴＲ配列を有する異なるトランスポサーゼ酵素を使用することの利点は、二回目の遺伝子転位イベントの際に、第一の既に安定に転位している構築物が再度移動してさらなる遺伝子転位をおこさないということである。
【００６８】
この態様はまた、ガイド選抜（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）の方法による抗体の発見も可能にする（グオ・チャン（Ｇｕｏ−Ｑｉａｎｇ）ら、分子生物学の手法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ）．５６２，１３３−１４２（２００９））（その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる）。ガイド選抜は例えば、所望の標的／エピトープ特異性に特異的で所望の機能を有する任意の非ヒト抗体を、完全長ヒト抗体に変換するのに用いることができ、この場合、同じ標的／エピトープ特異性と機能が保持される。ガイド選抜の原理は、参照（「ガイド」）抗体の単一の鎖（重鎖または軽鎖）を、相補的な抗体鎖（つまり、軽鎖または重鎖のそれぞれ）の多様なライブラリーと組み合わせて発現させること、および所望の機能または結合表現型に関してこれらの重鎖と軽鎖の組み合わせをスクリーニングすることを伴う。この方法では、第一の抗体鎖が、所望の機能または結合表現型に関し、多様なライブラリーからの１つ以上相補的な抗体鎖の選抜を「ガイド」する。新規の相補的抗体鎖が１つ以上単離されれば、それらを発現ベクターにクローニングし、多様な抗体鎖ライブラリーから二番目の相補的な抗体鎖を選抜するための「ガイド」として、再度利用することができる。この２工程の最終的な結果は、参照抗体の本来の抗体重鎖および軽鎖の両方が、多様なライブラリーに由来する、関連がなく、かつ新規の抗体鎖配列によって置き換えられるが、新規抗体重鎖と軽鎖組み合わせも、最初の参照抗体と同じまたは相同の機能または結合特性を示すというものである。そのためこの方法では、抗体重鎖および軽鎖の構築物またはライブラリーを脊椎動物の宿主細胞中で独立して発現する能力が必要であり、これは、異なるトランスポゾン酵素によって認識される異なる転位性のベクター系に入った抗体重鎖および軽鎖発現カセットを提供するための好ましい態様によって達成することができる。
【００６９】
しかしながら、多様な転位性のＤＮＡライブラリーは、抗体およびその断片などの多量体タンパク質のコード領域を同じトランスポゾンベクターに含める方法によって、つまり、多量体タンパク質、例えばＶHおよびＶL領域または完全長重鎖および軽鎖の少なくとも２つの異なるサブユニットの発現を、それぞれの発現カセットまたはコード領域を同じ転位性のベクターにクローニングすることで操作可能に連結する方法によっても構築することができる。
【００７０】
工程（ｉｉ）の、転位性の構築物および／または転位性のＤＮＡライブラリーの導入に有用な脊椎動物の宿主細胞は、不死化させることができるかまたは不死化しており、適切な細胞培地中で当該分野において知られている条件で培養することができる、脊椎動物種由来の細胞である。これらには、例えば、これらには限定されないが、カエル、サカナ、トリ由来、しかし好ましくは、これらには限定されないが、齧歯類、反芻動物、非ヒト霊長類種およびヒトを含む哺乳類種由来する細胞が含まれ、齧歯類またはヒト由来の細胞が好ましい。
【００７１】
上述した種に由来する有用な細胞型としては、これらには限定されないが、懸濁液中、高密度で培養することができるリンパ系の細胞が挙げられ、Ｂ細胞系由来の細胞では必要とされる全てのタンパク質、因子、シャペロン、および、多くのタンパク質、具体的には抗体、または抗体に基づくタンパク質の最適な発現に関する翻訳後酵素が内生で発現されるので、Ｂ細胞系由来の細胞が好ましい。脊椎動物の細胞に由来するＢ細胞系の中でも、分化の初期段階に存在し、プロ（ｐｒｏ、ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）Ｂ細胞またはプレ（ｐｒｅ、ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）Ｂ細胞として知られているＢ細胞が好ましい。なぜならば、前記プロＢ細胞またはプレＢ細胞は多くの場合、本明細書で開示の方法の一部である、外生のまたは異種の抗体鎖の発現を干渉し得る内生の抗体鎖を発現しないためである。
【００７２】
齧歯類由来の有用なプロＢおよびプレＢ系列の細胞としては、エーベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭｕＬＶ）で形質転換したプロＢおよびプレＢ細胞がある（アルト（Ａｌｔ）ら、セル  ２７，３８１−３９０（１９８１）（その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる））。これらの細胞は、Ｂ細胞受容体の構成成分であるＩｇ−アルファ（ＣＤ７９ａ、またはｍｂ−１）、およびＩｇ−ベータ（ＣＤ７９ｂ、またはＢ−２９）（ホンバッハ（Ｈｏｍｂａｃｈ）ら、ネイチャー  ３４３，７６０−７６２（１９９０））（その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる）を含む、抗体の発現とその正確な表面沈着に必須の要素の全てを発現しているが、前述の通り、大抵の場合、抗体または免疫グロブリン鎖の内生の発現を欠損している。そのため、組換え活性化遺伝子−１（ＲＡＧ−１）、または組換え活性化遺伝子−２（ＲＡＧ−２）に欠損のあるマウス突然変異体、またはＶ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な遺伝子、例えばＸＲＣＣ４、ＤＮＡ−リガーゼＩＶ、Ｋｕ７０、またはＫｕ８０、アルテミス（Ａｒｔｅｍｉｓ）、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ、触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫcs）の遺伝子に他の突然変異が生じていて、そのため、抗体ポリペプチドを正常に内生発現する能力を欠いている動物を含むがこれらには限定されない突然変異マウス由来の、Ａ−ＭｕＬＶで形質転換したプロＢ細胞およびプレＢ細胞が好ましい。
【００７３】
そのほかの有用なプロ（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ、ｐｒｏ）Ｂおよびプレ（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ、ｐｒｅ）Ｂ系列細胞としては、これもまた、外生抗体の発現、翻訳後修飾、および表面での発現に必要な全て（ＣＤ７９ａおよびＣＤ７９ｂなど）を発現している、初期免疫グロブリン−ヌル（Ｉｇ−ヌル）ＥＢＶで形質転換したヒトプロＢおよびプレＢ細胞がある（カワグチら、ＰＮＡＳ  ８５，８７５−８７９（１９８８））（その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【００７４】
Ｂ細胞系の形質細胞の分化段階を構成している宿主細胞、好ましくは、これらには限定されないが、Ｉｇ−ヌル骨髄腫細胞株（Ｓｐ２／０、ＮＳＯ、Ｘ６３、Ａｇ８６５３など）、および、当該分野で知られている他の骨髄腫細胞および形質細胞腫細胞などの他のＢ系列の宿主細胞も使用することができる。必要に応じて、外生発現した抗体の最適な方面沈着が所望される場合には、Ｂ細胞受容体の構成要素であるＩｇ−アルファ（ＣＤ７９ａ、またはｍｂ−１）、およびＩｇ−ベータ（ＣＤ７９ｂ、またはＢ−２９）を過剰発現させるために、これらの細胞株を遺伝子導入以外の方法によって、安定に遺伝子導入するかまたは遺伝的に改変してもよい。
【００７５】
また、非リンパ系の哺乳類細胞株、これらには限定されないが、ＣＨＯ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ＢＨＫ細胞および２９３細胞を含むがこれらには限定されない、業界標準の抗体発現用宿主細胞を本明細書で開示の方法で宿主細胞として使用してもよく、また、これらの細胞のそれぞれも、外生発現した抗体の最適な表面沈着が所望される場合には、必要に応じて、Ｂ細胞受容体の構成要素であるＩｇ−アルファ（ＣＤ７９ａ、またはｍｂ−１）、およびＩｇ−ベータ（ＣＤ７９ｂ、またはＢ−２９）を過剰発現させるために、安定に遺伝子導入または安定に遺伝的改変することができる。
【００７６】
本質的に、遺伝子の導入が可能であれば、いかなる脊椎動物の宿主細胞をも本明細書で開示の方法において使用することができ、このことは、これらには限定されないが、ワクチニアウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはシンドビスウイルス発現系などのいずれのウイルス発現系と比較しても、大きな利点である。なぜならば、本明細書で開示の方法には、ウイルスの特定の種または細胞型への指向性による宿主細胞の制約がなく、さらに、ヒト細胞を含む全ての脊椎動物の細胞を、最も低いバイオセーフティレベルで、汎用性を加えながら、使用できるためである。
【００７７】
本明細書で開示の方法の工程（ｉｉｉ）では、機能性トランスポサーゼ酵素を一時的にまたは一過的に発現させることにより、所望の脊椎動物宿主細胞が工程（ｉｉ）の転位性の構築物で安定に遺伝的改変され、前記構築物によってコードされているタンパク質の多様なライブラリーを発現している脊椎動物宿主細胞の安定な集団が生成される。
【００７８】
工程（ｉｉｉ）の有用な態様は宿主細胞に一過的な導入を行うことであり、好ましくは、上述したように、機能トランスポサーゼ酵素をコードしている脊椎動物の発現ベクターを、前記少なくとも１つの多様な転位性のＤＮＡライブラリーと共に遺伝子導入することである。トランスポサーゼ発現ベクターの一過的な同時遺伝子導入または同時組み込みは、転位性の構築物および／または多様な転位性のＤＮＡライブラリーを脊椎動物の宿主細胞に導入するのと同時に、またはその直前もしくは直後のいずれかで実施され、そのため、一過的に発現されるトランスポサーゼが、転位性のＤＮＡライブラリーを脊椎動物宿主細胞のゲノムに組み込むために工程（ｉｉ）の一過的に導入された転位性のベクターを至適に使用することができると理解される。
【００７９】
工程（ｉｉｉ）の別の有用な態様は、既に脊椎動物宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれている機能性トランスポサーゼ酵素を、当該分野で知られている誘導性の発現系によって一過的に発現させることで、工程（ｉｉ）の転位性のベクターおよび／または転位性のＤＮＡライブラリーを安定に組み込むことである。そのような誘導性のおよび一過性の機能性トランスポサーゼの発現は、例えば、当該分野において知られている、テトラサイクリン誘導性（ｔｅｔ−ｏｎ／ｔｅｔ−ｏｆｆ）またはタモキシフェン誘導性のプロモーター系によって達成してもよい。この場合には、１つ以上転位性のベクターまたはＤＮＡライブラリーだけを宿主細胞のゲノム中に導入する必要があり、構築物の安定な遺伝子転位や１つ以上転位性のベクターまたはＤＮＡライブラリーによってコードされているタンパク質の安定な発現は、機能性トランスポサーゼ酵素の宿主細胞中での発現を一過的に誘導することで行われる。
【００８０】
本明細書で開示の方法の工程（ｉｖ）では、所望の機能または結合表現型を有するタンパク質を発現している転位した脊椎動物宿主細胞の単離を行う。
【００８１】
工程（ｉｖ）の好ましい態様は、抗体およびその断片などの所望のタンパク質を発現している工程（ｉｉｉ）の転位した宿主細胞を、標的結合アッセイや、当該分野で知られている標準的な細胞分離技術、例えば磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）または高速蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）でスクリーニングおよび単離することである。具体的には、大量の細胞を処理する必要がある、転位した脊椎動物宿主細胞の特定の集団の最初の濃縮工程では、ＭＡＣＳに基づく技術によって、大量の非特異的細胞から特異的な標的細胞を単離することが好ましい。
【００８２】
具体的には、より少ない量の細胞を処理する必要が生じる可能性のある、さらに繰り返し行う細胞濃縮サイクルではＦＡＣＳでの濃縮が好ましい。なぜならば、多経路フローサイトメトリーでは、これらには限定されないが、２種類以上の特定の標的への結合などの複数の機能に関する濃縮を同時に行うこと、または、エピトープに特異的な競合抗体を用いたＦＡＣＳスクリーニングにおいて、特定のエピトープに関する特異的なスクリーニングが可能になるためである。
【００８３】
抗体およびその断片などのタンパク質が可溶性の結合パートナーと相互作用することが分かっている場合、細胞分離技術を適用可能にするために、これらの結合パートナーを、二次試薬、例えば、それら自体が磁気で（ＭＡＣＳに基づく細胞濃縮の場合）または蛍光で（ＦＡＣＳに基づく細胞濃縮の場合）標識されているストレプトアビジンまたは抗体を含むがこれらには限定されない二次試薬で検出することができる特定の標識またはタグ、例えばビオチン、ｍｙｃ、またはＨＡ−タグなどを含むがこれらには限定されない、当該分野で知られている特定の標識またはタグで標識することが好ましい。
【００８４】
抗体およびその断片などのタンパク質が、可溶性タンパク質として発現させるのが簡単ではない膜結合型タンパク質に対して、例えば、これらには限定されないが、テトラスパニン類、７回膜貫通型タンパク質（Ｇタンパク質共役受容体など）、またはイオンチャネルなどに対して発見される場合、これらをウイルス粒子中で発現させるか、あるいは、特定の細胞株中で過剰発現させてもよく、これらを次に、抗体およびその断片などの転位した構築物由来のタンパク質を発現している脊椎動物宿主細胞を濃縮することができる、当該分野で知られている標識法またはパニング法に使用する。
【００８５】
安定に転位した脊椎動物宿主細胞集団における、遺伝子型と表現型の安定な結びつきにより、工程（ｖ）の有用な態様は、所望の機能または結合表現型に関連がある明確な細胞集団が得られるまで、所望の機能または結合表現型に関して細胞濃縮サイクルを繰り返すことである。特定の所望の機能または結合表現型と関連のある個々の細胞クローンから転位したＤＮＡ情報を回収するために、必要に応じて、個々の細胞クローンを、例えば、これらには限定されないが、フローサイトメトリー技術を用いたシングルセルソーティングまたは限界希釈法によって単離することができる。
【００８６】
機能性の標的に特異的な抗体の同定には、特定の結合表現型についてスクリーニングすることおよび選抜することだけでなく、それに加えて、標的特異的抗体のその他の機能特性についてスクリーニングすること、具体的には生物学的なアッセイにおける拮抗作用または刺激作用についてスクリーニングすることが好ましい場合が多い。
【００８７】
そのため、機能アッセイに用いる十分量の特定の抗体クローンを産生するために、脊椎動物宿主細胞における細胞膜結合型の抗体発現を、十分な量の分泌型の抗体発現へと効率よく「転換」できることが望まれる。
【００８８】
天然のＢ系列細胞では、膜結合型から分泌型の抗体発現への転換は、プレＢ細胞およびＢ細胞において、最後の重鎖定常領域のエクソンの３’末端付近にある選択的スプライシング供与部位が、重鎖定常領域のエクソンの下流にある膜アンカーのエクソンのスプライシング受容部位へと優先的にスプライシングされる選択的スプライシングの機序を介して起こる。この様式では、重鎖を、つまりそれによって、重鎖と軽鎖を含有している抗体全体を細胞膜に繁留する、伸長したＣ末端、膜貫通ドメインを有する抗体重鎖がＢ細胞内で産生される。Ｃ末端、膜貫通ドメインはまた、膜貫通型の構成要素であるＩｇ−アルファ（ＣＤ７９ａまたはｍｂ−１）およびＩｇ−ベータ（ＣＤ７９ｂまたはＢ２９）と非共有的に相互作用し、それによって、より強く膜に結合し、Ｂ系列細胞では免疫グロブリンが表面でより強く発現するようである。
【００８９】
Ｂ細胞がさらに形質細胞の段階へと分化すると選択的スプライシングはそれ以上起こらず、最後の重鎖定常領域の３’末端付近にある選択的スプライシング供与部位はそれ以上認識も利用もされず、ｍＲＮＡ鋳型は重鎖定常領域終止コドンの下流で終結し、そして分泌型抗体の重鎖が翻訳される。
【００９０】
選択的スプライシングおよび、発現した抗体の膜結合型から分泌型発現への「転換」の天然の機序を利用するために、膜貫通ドメインをコードしているエクソンを含む抗体重鎖定常領域の天然のイントロン／エクソン構造を維持する方法で、抗体またはその断片などのタンパク質をコードしている転位性のベクターおよび多様なＤＮＡライブラリーを構築することが、本明細書で開示の方法の有用な態様である。レトロウイルスの発現系では、レトロウイルスベクターのゲノムはレトロウイルスの粒子にパッケージングされる前に既にスプライシングされており、かつ、宿主細胞のゲノム中に安定に導入されることから、この態様は、レトロウイルスの発現系に対して明らかな利点を有している。
【００９１】
他のウイルス性のベクター系は、ベクターに組み込むことができるＤＮＡ挿入物の長さに制約がある場合があり、そのため、より大きなゲノム領域をそれらの発現ベクターにクローニングすることが不可能で、その結果、選択的スプライシングによる抗体発現の膜結合型から分泌型への天然の「転換」が利用できない。特定のトランスポゾン（例えばトール２、図３を参照のこと）が、遺伝子転位効率を少しも減ずることなく、１０ｋｂを上回るＤＮＡ断片を脊椎動物の宿主細胞に効率的に転位させることができることが分かっている（カワカミ、ゲノム生物学（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．）８，Ｓｕｐｐｌ  Ｉ，Ｓ７（２００７））（その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる）。そのため、より良くかつ正確な発現と、抗体の発現を膜結合型から分泌型へと転換する天然の制御に関するゲノムのエクソン／イントロン構造を含む転位性の発現ベクターを構築することが、本明細書で開示の方法の有用な態様である。本発明の方法は、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、少なくとも１０ｋｂの大きさのＤＮＡ断片を宿主細胞のゲノムに転位させるのに有用である。
【００９２】
膜結合型の抗体発現が優勢なより初期のＢ系列の分化段階から、分泌型の抗体発現が優勢なより後期の、形質細胞段階への分化を、Ｂ細胞分化因子、例えば、これらには限定されないがＣＤ４０／ＩＬ４の誘導、または有糸分裂促進因子、例えばこれらには限定されないが、リポ多糖類（ＬＰＳ）もしくは他のポリクローナル活性化因子、黄色ブドウ球菌コワン（Ｃｏｗａｎ）株（ＳＡＣ）活性化因子、およびＣｐＧヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせによって刺激することで、誘導することができる。
【００９３】
この分化は、チロシン阻害剤であるグリベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）によってエーベルソンチロシンキナーゼが特異的に阻害されているＡ−ＭｕＬＶで形質転換したマウスプレＢ細胞について記載されている通り（ムルジョ（Ｍｕｌｊｏ）ら、ネイチャー・イムノロジー  ４，３１−３７（２００３））（その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる）、正しいＢ細胞の分化を再度起こすことができるように、増殖を人工的に抑制できる、形質転換した細胞内で行われることが好ましい。そのため、この方法に、グリベックで処理するとより成熟した段階のＢ細胞、例えば形質細胞に再度分化することができ、その後、ゲノム重鎖発現構築物の選択的スプライシングに基づくさらなる機能試験に用いるのに十分な量の分泌型抗体を分泌する、Ｉｇ−ヌルＡ−ＭｕＬＶで形質転換したマウスプレＢ細胞を使用するのが好ましい態様である。当該分野において知られている抗アポトーシス因子、例えばこれらには限定されないが、ｂｃｌ−２またはｂｃｌ−ｘLを安定に過剰発現させることで、このようなＢ細胞系列性の細胞分化をさらに改善することが、本明細書で開示の方法の好ましい態様である。
【００９４】
工程（ｉｖ）の後、上述した通り、転位した脊椎動物宿主細胞の濃縮を行った。必要に応じて、所望の機能および／または結合特性を有する抗体およびその断片などのタンパク質を発現している細胞集団または個々の細胞が単離されるまで、上述した方法による細胞濃縮をさらに行ってもよい（工程（ｖ））。
【００９５】
次いで、所望の機能および／または結合特性に関して単離された転位した脊椎動物の宿主細胞に含まれている関連するコード情報を単離するために、本明細書で開示の方法の工程（ｖｉ）を実施する。
【００９６】
単離した細胞に含まれている、抗体またはその抗体断片などの所望の機能性タンパク質または結合タンパク質の関連するコード情報の単離、クローニングおよび配列決定に関する工程（ｖｉ）の有用な態様は、転位したＤＮＡ構築物に含まれている関連するコード情報に特異的プライマー対を用いたゲノムＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ増幅を用いること、およびゲノムＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲの増幅産物を直接、または当該分野で知られている配列決定用のベクター、例えば、これらには限定されないが、ＴＡ−またはゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）クローニングベクターにサブクローニングした後に、配列決定することである。
【００９７】
前の段落で記載したような、ゲノムＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ増幅による、抗体またはその抗体断片などの所望の機能性タンパク質または結合タンパク質に関連するコード情報のクローニングおよび配列決定は、本明細書で開示したように哺乳類の宿主細胞中に安定な遺伝子転位を起こした時に、結合タンパク質のコード領域を同定することはだけはできないが、同時に発現もされる転位性のＩｇＨおよびＩｇＬ発現ベクターを使っても実施することができる。この場合、分泌型抗体を発現させるためには、ＩｇＨ膜貫通型コード領域を欠損している転位性のＩｇ重鎖発現ベクターを用いることだけが要求される。
【００９８】
工程（ｖｉ）の別の有用な態様は、転位したＤＮＡ構築物に含まれているコード情報に関する数千種の配列の代表的な組を直接かつ一工程で回収するために、工程（ｉｖ）または（ｖ）の、所望の機能または結合表現型を示す濃縮した細胞集団を、次世代（「ディープ」）配列決定にかけることである（レディ（Ｒｅｄｄｙ）ら、ネイチャー・バイオテクノロジー  ２８，９６５−９６９（２０１０））（その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる）。濃縮した細胞集団の中から同定した配列の相対頻度の生物情報学的な解析に基づき、どの配列が、抗体またはその断片などの機能性タンパク質または結合タンパク質をコードしていたかを予測することができる（レディら、ネイチャー・バイオテクノロジー  ２８，９６５−９６９（２０１０））（その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる）。その後、統計的に大きな比率を示していた配列を、それらの機能または結合特性を解析するために、再合成し、組換えタンパク質、抗体またはその断片として発現させるために、発現ベクターにクローニングする。この方法は、機能および表現型に基づいて濃縮した、機能または標的特異的な特性を有するタンパク質を発現している細胞集団に含まれている、関連する配列の同定を有意に促進することができる。
【００９９】
本明細書で開示の方法の一層さらに別の有用な態様は、所望のタンパク質に突然変異を生成するためにおよび所望のタンパク質を最適化するために、例えば抗体およびその断片の親和性を最適化するために、抗体またはその断片などのタンパク質の遺伝子転位介在性の脊椎動物細胞での発現を利用することである。
【０１００】
これは、抗体鎖またはその断片などのタンパク質をコードしている遺伝子を、工程（ｉｖ）で開示した方法に従って所望の結合または機能表現型に関して濃縮し、転位させた脊椎動物細胞の集団から単離することによって、例えば、これらには限定されないが、当該分野で知られている、突然変異誘発条件下でのゲノムＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ増幅によって達成することができる。その後、これらを本明細書で開示の方法による改善された機能または結合特性に関するスクリーニングにかけるために、突然変異した配列を遺伝子転位ベクターに再びクローニングし、次いで脊椎動物の宿主細胞中に再度転位させることができる。
【０１０１】
この方法の有用な一態様では、突然変異誘発条件下における、隣接したＩＴＲを含む完全長の転位した構築物のＰＣＲ増幅を可能にする、特異的なプライマーが使用される。
【０１０２】
この方法では、機能または表現型に関して選抜された転位した細胞から、所定の平均頻度で無作為な突然変異の入った変異型のＰＣＲ増幅産物が生成される。元の鋳型に制御された突然変異の入った前記ＰＣＲ増幅産物（変異型）をここで直接、工程（ｉｉ）に適用可能な方法において開示された好ましい態様に従って、新しい脊椎動物の宿主細胞中に再び転位させることができる。
【０１０３】
脊椎動物の細胞を遺伝的に改変する他の方法と比較した場合のこの方法の主な利点は、この技術では、突然変異した配列をスクリーニングの別の工程にかける場合には他の全てのプラスミドを用いた発現系もしくはウイルスの発現系で強制的に必要とされる、突然変異したＰＣＲ増幅産物の発現ベクターへの時間のかかる再クローニングや、突然変異した配列の時間のかかる品質管理が必要でないということである。
【０１０４】
ＤＮＡの遺伝子転位では、ＩＴＲが目的の遺伝子のコード領域を挟むようにして存在することだけが必要であるため、ＰＣＲで増幅した突然変異したＰＣＲ増幅産物を直接、特性の向上したおよび／または親和性成熟した突然変異体を発現させ、スクリーニングするために、新規脊椎動物の宿主細胞中に再導入および再転位させることができる。
【０１０５】
まとめると、転位性の構築物および／または抗体およびその断片などのタンパク質をコードしている多様な転位性のＤＮＡライブラリーで脊椎動物の宿主細胞を安定に遺伝的改変するためにＴＥを使用する本明細書で開示の方法は、前記タンパク質を発見し、最適な所望の機能または結合表現型に関して最適化するための類を見ない効率、適応性、有効性および速度を提供する。
【実施例】
【０１０６】
実施例１：ピギーバックトランスポサーゼ酵素と適合するヒト抗体カッパ軽鎖用の基本的なピギーバック転位性軽鎖発現ベクターのクローニングに関する説明
【０１０７】
ヒトカッパ軽鎖用の基本的な転位性の発現ベクターは、ピギーバックトランスポゾン由来のＩＴＲをヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖の発現カセットの上流および下流にクローニングすることで生成することができる。
【０１０８】
これには、第一工程として、ピギーバックトランスポゾンの上流および下流のＩＴＲの最小配列をｐＸＬ  ＢａｃＩＩ（米国特許第７，１０５，３４３号で公開されている）（その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる）から得ることができ、その後、哺乳の発現ベクターであるｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（ＰＴ３１５７−５、注文番号６０６４−１、インビトロジェン・ライフテクノロジーズ、カールスバッド、カリフォルニア、米国）にクローニングするための隣接した制限酵素部位を含む遺伝子を合成することができる。
【０１０９】
５’末端反復配列を含むピギーバックの上流のＩＴＲ配列を、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰに１つだけ含まれているＭｕｎＩ制限酵素部位を適合するように、隣接するＭｕｎＩ制限酵素配列と、正確な制限酵素消化を可能にするその他４つの無作為なヌクレオチド（小文字で表した）を含めた形で遺伝子合成しなくてはならない。この配列を配列番号１として示す。
【０１１０】
３’末端反復配列を含むピギーバックの下流のＩＴＲ配列を、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰに１つだけ含まれているＸｈｏＩ制限酵素部位と適合するように、隣接するＸｈｏＩ制限酵素配列と、正確な制限酵素消化を可能にするその他４つの無作為なヌクレオチドを含めた形で遺伝子合成しなくてはならない。この配列を配列番号２として示す。遺伝子合成した配列番号１をＭｕｎＩで制限酵素消化すると、このＤＮＡ断片を直線化したｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰのＭｕｎＩにライゲーションすることができ、当該分野で知られている標準的な方法に従って、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ＴＲ１が生成される。診断的な制限酵素消化および／またはクローニングした構築物（図５ａ）のＤＮＡ配列決定により、挿入物の向きが正しいかを確認することができる。
【０１１１】
次の工程で、ピギーバックの両方のＩＴＲをＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ発現カセットの上流および下流に含むｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２を生成するために（図５ｂ）、遺伝子合成し、ＸｈｏＩで消化した配列番号２のＤＮＡ断片を、直線化したｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１（図５ａ）のＸｈｏＩに、当該分野で知られている方法によってライゲーションすることができる。診断的な制限酵素消化および／またはクローニングした構築物（図５ｂ）のＤＮＡ配列決定により、挿入物の向きが正しいかを確認することができる。
【０１１２】
ヒト免疫グロブリンのカッパ軽鎖をｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２ベクターにクローニングするためには、欧州特許出願第１２８５９３０Ａ２号（その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる）から得ることができるヒト抗ＴＮＦ−アルファ特異的抗体Ｄ２Ｅ７由来のヒトＩｇカッパ軽鎖を合成することができる。
【０１１３】
Ｄ２Ｅ７のＶ領域をＶｋ１−２７リーダー配列（ジェンバンク登録番号：Ｘ６３３９８．１、これは、Ｄ２Ｅ７のＶカッパと最も近い関係にある生殖系遺伝子のＶ−カッパファミリーのメンバーである）とヒトカッパ定常領域（ジェンバンク登録番号：Ｊ００２４１）にインフレームで融合させたヒト抗ＴＮＦ−アルファ特異的抗体Ｄ２Ｅ７のヒトＩｇカッパ軽鎖のコード領域は、配列番号３として示す以下のヌクレオチド配列を有している。
【０１１４】
配列番号３のヌクレオチド配列は、配列番号４のアミノ酸配列に翻訳される。Ｄ２Ｅ７のＩｇカッパ軽鎖をコードしている配列番号３のＤＮＡ断片を遺伝子合成し、平滑末端ライゲーションによって、単一のＥｃｏＲＶ（これも平滑末端を生じる）制限酵素部位に当該分野で知られている方法により直接ライゲーションし、構築物ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２−ＩｇＬ（図５ｂ）を得ることができる。
【０１１５】
Ｖ−カッパおよびＣ−カッパコード領域（太字および下線で強調した）の間に唯一のＥｃｏ４７ＩＩＩ制限酵素部位を含むように配列番号３を改変した。このことにより、この構築物中のＶ−カッパ領域を、構築物のＶ−カッパコード領域の上流にある単一の制限酵素とＥｃｏ４７ＩＩＩを使用することで、他のＶ−カッパ領域またはＶ−カッパライブラリーと置き換えることができる。診断的な制限酵素消化および／またはクローニングした構築物（図５ｂ）のＤＮＡ配列決定により、カッパ軽鎖の向きが正しいかを確認することができる。
【０１１６】
転位性のヒト抗体カッパ軽鎖ベクターであるｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２−ＩｇＬの全体の配列を、配列番号５として示す。
【０１１７】
実施例１で参照される配列
【０１１８】
配列番号１（長さ３２７ｂｐのピギーバック５’−ＩＴＲ配列。各末端にあるＭｕｎＩ制限酵素部位を下線および太字で示し、その端に加えた無作為なヌクレオチドを小文字で示している）
【０１１９】
配列番号２（長さ２６４ｂｐのピギーバック３’−ＩＴＲ配列。各末端にあるＸｈｏＩ制限酵素部位を下線および太字で示し、その端に加えた無作為なヌクレオチドを小文字で示している）
【０１２０】
配列番号３（長さ７１１ｂｐの抗ＴＮＦ−アルファ−特異的ｍＡｂ、Ｄ２Ｅ７のＩｇ−カッパＬＣコード領域）
【０１２１】
配列番号４（長さが２３６アミノ酸の配列である、抗ＴＮＦ−アルファ−特異的ｍＡｂ、Ｄ２Ｅ７）
【０１２２】
配列番号５（長さ６４３６ｂｐのＤＮＡ配列である、ピギーバック転位性のＩｇ−カッパ−ＬＣ発現ベクター、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２−ＩｇＬ）
実施例２：膜貫通型ヒト抗体ガンマ１重鎖用の基本的なピギーバック転位性重鎖発現ベクターのクローニングに関する説明
【０１２３】
転位性のＩｇ重鎖発現ベクターをクローニングするためには、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２−ＩｇＬ（配列番号５）由来のカッパ軽鎖のＯＲＦを、完全長ヒトＩｇＧ１重鎖のコード領域をコードしているＯＲＦと交換する必要がある。
【０１２４】
ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２−ＩｇＬベクターに含まれているヒトカッパ軽鎖をヒト免疫グロブリンガンマ１重鎖で置き換えるためには、ヒトＴＮＦ−アルファ特異的抗体Ｄ２Ｅ７のＶH領域（欧州特許出願第１２８５９３０Ａ２号を参照のこと）（その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる）を合成することができる。そのためには、近い関係にある生殖系ＶH３−領域ファミリーメンバーのリーダー配列を抗体Ｄ２Ｅ７のＶH領域にインフレームで融合させ、これを次に、膜貫通型エクソン（ジェンバンク：Ｘ５２８４７）を含むヒトガンマ１定常領域（ジェンバンク：Ｊ００２２８）のコード領域にインフレームで融合させる。ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２−ＩｇＬからのヒトＩｇカッパ軽鎖の置き換えを可能にするためには、単一のＣｌａＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位がそれぞれ、この配列の５’および３’末端に存在する必要がある（下線部）。加えて、制限酵素部位に隣接した４つのヌクレオチド（配列の端にあり、小文字で強調した）により、遺伝子合成したＤＮＡ断片の正確な制限酵素消化と、標準的な方法による、直線化したｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２−ＩｇＬ骨格のＣｌａＩ−ＮｏｔＩ部位へのライゲーションが可能となる。遺伝子合成する必要のある配列を配列番号６に示す。
【０１２５】
配列番号６の１１番目にある開始コドン（太字で強調した）から、このヌクレオチド配列は抗ＴＮＦ−アルファに特異的なクローンＤ２Ｅ７のヒトＩｇＧ１重鎖に翻訳されるが（欧州特許出願第１２８５９３０Ａ２号を参照のこと）（その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる）、ヒトガンマ１膜貫通型エクソンＭ１およびＭ２も含んでいる。配列番号６のタンパク質翻訳物を配列番号７に示す。Ｄ２Ｅ７のＩｇガンマ１重鎖をコードしている配列番号６のＤＮＡ断片をＣｌａＩとＮｏｔＩ制限酵素で二重消化して、直線化したｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２−ＩｇＬのＣｌａＩおよびＮｏｔＩ部位に方向性をもってライゲーションし、構築物ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２−ＩｇＨを得ることができる（図６）。
【０１２６】
配列番号６をさらに改変して、Ｖ重鎖可変およびＣ−ガンマ１定常コード領域（配列番号７の中の太字および下線で強調している部分）の間に、唯一のＥｃｏ４７ＩＩＩ制限酵素部位を含めた。これにより、構築物中のＶ重鎖コード領域の上流にある単一の制限酵素とＥｃｏ４７ＩＩＩを使用することで、この構築物中のＶ重鎖領域を他のＶ重鎖領域またはＶ重鎖ライブラリーと置き換えることができる。診断的な制限酵素消化および／またはクローニングした構築物（図６）のＤＮＡ配列決定により、挿入物が正しくライゲーションされたかを確認することができる。
【０１２７】
転位性のヒト抗体ガンマ１重鎖ベクターであるｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２−ＩｇＨの全長の配列を配列番号８として示す。
【０１２８】
実施例１および２では、本発明の実施を具体化するために用いることができる、ヒト抗体のカッパ軽鎖およびヒトガンマ１重鎖（膜結合型）の、結果として、完全長膜結合型ヒトＩｇＧ１の基本的なピギーバックの転位性発現ベクターのクローニングに関する説明を提供する。
【０１２９】
実施例２で参照される配列
【０１３０】
配列番号６（抗ＴＮＦ−アルファ−特異的ｍＡｂ、Ｄ２Ｅ７の膜結合型Ｉｇ−ガンマ１−ＨＣのコード領域を含有している長さ１６４２ｂｐのＤＮＡ断片）
【０１３１】
配列番号７（長さが５３９アミノ酸の配列である、抗ＴＮＦアルファ抗体の膜結合型Ｉｇ−ガンマ１−ＨＣ
【０１３２】
配列番号８（長さ７３４１ｂｐのＤＮＡ配列である、ピギーバックの転位性ヒトＩｇ−ガンマ１−膜型−ＨＣ発現ベクター、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２−ＩｇＨ）
実施例３：スリーピングビューティーのトランスポサーゼ酵素に適合するヒト抗体カッパ軽鎖用の基本的な転位性の軽鎖発現ベクターのクローニングに関する説明
【０１３３】
転位性のベクターに含まれているヒト免疫グロブリンの重鎖発現ベクターおよび軽鎖発現ベクターをそれぞれ独立して宿主細胞中に転位させるために、スリーピングビューティートランスポサーゼによって認識される異なる逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を有する転位性の免疫グロブリン軽鎖構築物を構築することができる。
【０１３４】
それには、実施例１のヒトＩｇ−カッパ軽鎖発現ベクターであるｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２−ＩｇＬ（配列番号５）を用い、このベクターに含まれているピギーバックトランスポゾン系の５’ＩＴＲと３’ＩＴＲを、スリーピングビューティートランスポゾン系の５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲと置き換えることができる。スリーピングビューティーのトランスポサーゼによって認識され、これと機能するスリーピングビューティー５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの配列は、米国特許第７１６０６８２Ｂ１／ＵＳ２００３１５４５００Ａ１号から得ることができる。
【０１３５】
５’末端反復配列を含むスリーピングビューティーの上流のＩＴＲ配列を隣接するＭｕｎＩ制限酵素配列を含めた形で遺伝子合成しなくてはならない。これにより、実施例１のｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２−ＩｇＬ（配列番号５）構築物に含まれているＭｕｎＩと隣接したピギーバックの５’ＩＴＲと、スリーピングビューティーの５’ＩＴＲの配列が置き換えられる。この配列を下記に、この実施例の最後に、配列番号１４として示す。
【０１３６】
３’末端反復配列を含むスリーピングビューティーの下流のＩＴＲ配列（これも米国特許第７１６０６８２Ｂ１／ＵＳ２００３１５４５００Ａ１号で公開されている）を、隣接したＸｈｏＩ制限酵素配列を含めた形で遺伝子合成しなくてはならない。これにより、実施例１のｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２−ＩｇＬ構築物（配列番号５）に含まれているＸｈｏＩに隣接したピギーバックの３’ＩＴＲを、スリーピングビューティーの３’ＩＴＲ配列で置き換えることができる。この配列を下記に、この実施例の最後に、配列番号１５として示す（ＸｈｏＩ制限酵素部位を太字で強調し、遺伝子合成した断片を正確に制限酵素消化するために隣接して加えた４つの無作為なヌクレオチドを小文字で表した）。
【０１３７】
第一工程では、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２−ＩｇＬ（配列番号５）をＭｕｎＩ制限酵素で消化し、配列番号１４由来のＭｕｎＩ消化した合成遺伝子断片を、ＭｕｎＩで直線化したベクター骨格ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２−ＩｇＬ（配列番号５）にライゲーションすることで、構築物ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２−ＩｇＬ（配列番号５）に含まれているＭｕｎＩに隣接したピギーバック５’ＩＴＲをスリーピングビューティー５’ＩＴＲで置き換えなくてはならない。診断的な制限酵素消化および／またはＤＮＡ配列決定により、スリーピングビューティー５’ＩＴＲの向きが正しいかを確認することができる。生じるプラスミドは、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｓｂＴ１−ｐｂＴ２−ＩｇＬと呼ばれる（図８）。
【０１３８】
第二工程では、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｓｂＴ１−ｐｂＴ２−ＩｇＬをＸｈｏＩ制限酵素で消化し、配列番号１５由来のＸｈｏＩで消化した合成遺伝子断片を、ＸｈｏＩで直線化したベクター骨格ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｓｂＴ１−ｐｂＴ２−ＩｇＬにライゲーションすることで、構築物ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｓｂＴ１−ｐｂＴ２−ＩｇＬに残っているＸｈｏＩに隣接したピギーバック３’ＩＴＲをスリーピングビューティーの３’ＩＴＲで置き換えなくてはならない。診断的な制限酵素消化および／またはＤＮＡ配列決定により、スリーピングビューティー３’ＩＴＲの向きが正しいかを確認することができる。生じるプラスミドはｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｓｂＴ１Ｔ２−ＩｇＬと呼ばれる（図８）。
【０１３９】
スリーピングビューティーのトランスポサーゼを使って転位させることができるＩｇ−カッパＬＣ発現ベクターｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｓｂＴ１Ｔ２−ＩｇＬの全長の配列を、下記に、この実施例の最後に、配列番号１６として示す。
【０１４０】
実施例３で参照される配列
【０１４１】
配列番号１４（スリーピングビューティートランスポゾン系の５’ＩＴＲを含有している長さ２４６ｂｐのＤＮＡ断片。隣接しているＭｕｎＩ制限酵素部位を太字および下線で示している）
【０１４２】
配列番号１５（スリーピングビューティートランスポゾン系の３’ＩＴＲを含有している長さ２４８ｂｐのＤＮＡ断片）
【０１４３】
配列番号１６（長さ６３３９ｂｐのＤＮＡ配列。スリーピングビューティー転位性Ｉｇ−カッパ−ＬＣ発現ベクター、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｓｂＴ１Ｔ２−ＩｇＬ）
実施例４：膜結合型ヒトＩｇＧ1用のピギーバックおよびスリーピングビューティーの転位性ベクターのクローニング
【０１４４】
実施例１および２で提供した基本的なピギーバックの転位性ＩｇＨおよびＩｇＬ発現ベクターに関する説明、および実施例３で提供した基本的なスリーピングビューティーの転位性ＩｇＬ発現ベクターの構築に加えて、本発明を具体化するために、キメラ抗ヒトＣＤ３０  ｍＡｂおよびヒト化抗ヒトＣＤ１９  ｍＡｂ用に、改良したピギーバックおよびスリーピングビューティーの転位性のＩｇＨおよびＩｇＬ発現ベクターをさらにクローニングした。
【０１４５】
このために、第一工程で、以下の２種類の遺伝子断片を合成した（ジェンスクリプト（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、ピスカタウェイ、ニュージャージー、米国に委託）。
【０１４６】
１）発現カセットを含有している４９７５ｂｐのＤＮＡ断片。この断片では、ヒト膜結合型ＩｇＧ1重鎖の発現はＥＦ１−アルファプロモーターで誘導され（クロンテックの発現ベクターｐＥＦ１−アルファ−ＩＲＥＳ、カタログ番号６３１９７０の１〜１３３５塩基対）、かつ、Ｉｇ鎖の発現は配列内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を介してＥＧＦＰの発現と連動している。ＩＲＥＳおよびＥＧＦＰ領域のＤＮＡ配列は、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰに由来するものを使用した（それぞれ、クロンテック発現ベクターｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（カタログ番号６０６４−１、ライフ・テクノロジーズ）の１２９９〜１８８４塩基対と１９０５〜２６２１塩基対）。また、合成したＤＮＡ断片には、その配列がｐＣＩ哺乳類発現ベクター（プロメガ、カタログ番号＃Ｅ１７３１の８５７〜９８９塩基対）由来のキメライントロンを含め、これをＩｇ定常コード領域とＩＲＥＳ配列の間に配置した。合成した断片の発現カセットの３’末端には、その配列がｐＣＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ（＋）発現ベクター（インビトロジェン・ライフテクノロジーズ、カタログ番号＃Ｖ８７０−２０の１０２１〜１２３５塩基対）由来の、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨ−ポリＡ）を含めた。発現カセットの上流および下流には、上記配列番号１および配列番号２で既に開示したピギーバックトランスポゾンのＩＴＲを配置した。
【０１４７】
発現カセットの機能要素のいずれかを切り出し、または置き換えるのに使用することができるさらに付け加えた単一の制限酵素部位など、遺伝子合成したＤＮＡ断片に含まれている構成要素およびその配置図を図１０に示している。
【０１４８】
長さ４９７５ｂｐの合成した遺伝子断片の配列を、以下に、この実施例の最後に配列番号２０として示す。
【０１４９】
ここで、配列番号２０で示したヒトＩｇＨ鎖用のこの遺伝子合成した発現カセットには、唯一制限酵素部位であるＮｏｔＩとＮｈｅＩを使用して、所望のＶHコード領域および／またはＶHコード遺伝子ライブラリーのいずれかを挿入するのにこの構築物を使用することができるように、意図的に、ＶHドメインのコード領域をまだ含めなかったことに留意されたい。そのため、この構築物を「空の」Ｉｇ−ガンマ１−ＨＣ発現カセットと呼ぶ。
【０１５０】
２）配列番号２０の転位性発現カセットのプラスミド骨格を提供するために、細菌のＣｏｌ  Ｅ１複製起点とアンピシリン耐性遺伝子を含む長さ２７７４ｂｐのＤＮＡ断片を遺伝子合成した（ジェンスクリプト、ピスカタウェイ、ニュージャージー、米国が実施）。これらのプラスミド骨格の構成成分の配列情報は、発現ベクターｐＣＩ（プロメガ、カタログ番号＃Ｅ１７３１）のプラスミド骨格に由来するものを使用した。合成した遺伝子断片はさらに、配列番号１４および配列番号１５でそれぞれ既に開示している、スリーピングビューティートランスポゾンの５’ＩＴＲと３’ＩＴＲを含むものであった。この断片は環状化する必要があり、また、Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点とアンピシリン耐性遺伝子を含むことから、自律的なプラスミドとして大腸菌内で増殖させることができた。
【０１５１】
発現ベクターの機能要素を切り出し、または置き換えるのに使用することができる、さらに付け加えた唯一の制限酵素部位など、遺伝子合成したＤＮＡ断片に含まれる構成要素（）とその配置図を図１０に示している。
【０１５２】
長さ２７７４ｂｐの合成した遺伝子断片の配列を以下に、この実施例の最後に、配列番号２１として示している。
【０１５３】
これら２つの遺伝子断片によって、以下に示すように、異なる制限酵素で消化し、その後ライゲーションすることによって、これらのベクター由来の断片をライゲーションすることを介した、ピギーバックおよびスリーピングビューティー両方の転位性ベクターの構築が可能になった。
【０１５４】
得られる構築物が、ピギーバックのＩＴＲに隣接した配列番号２０の全長の発現カセットと、配列番号２１のスリーピングビューティーＩＴＲを除いたＣｏｌ  Ｅ１−ａｍｐを含有している骨格を含むように、配列番号２０および配列番号２１由来のＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ断片をライゲーションすることによって、ピギーバックの転位性ベクターをクローニングした。逆に言えば、配列番号２０および配列番号２１由来のＸｂａＩ−ＭｌｕＩ断片同士をライゲーションすることで、ピギーバックのＩＴＲを含まない発現カセットが、スリーピングビューティーのＩＴＲを含む配列番号２１の直線化したプラスミド骨格へとライゲーションされた。２つのライゲーションで得られたプラスミドをミニプレップし、正確にライゲーションされたプラスミドを同定するために、ＸｈｏＩ−ＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩとさらにＰｖｕＩ制限酵素の組み合わせによる診断的制限酵素消化で分析した。それぞれのライゲーションから選択したＤＮＡクローンを１つ大腸菌に再度導入し、ＤＮＡをマキシプレップで生成し、これをプラスミドの全長の配列決定を可能にする配列決定用プライマーを用いたＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１５５】
上述したように生成し、ＤＮＡの配列決定で確認した、ピギーバックおよびスリーピングビューティーの転位性ベクターの全長の配列（「空の」ヒトガンマ１−ＨＣ発現カセットを含む）を以下に、この実施例の最後に、配列番号２２（ピギーバックの転位性ベクター）および配列番号２３（スリーピングビューティーの転位性ベクター）として示す。
【０１５６】
キメラ抗ヒトＣＤ３０抗体ブレンツキシマブ（クローンＡｃ１０）のＶHおよびＶLコード領域は、米国特許出願第２００８２１３２８９Ａ１号の配列１および９から得ることができ、それぞれを配列番号２４および配列番号２５として以下に示す。
【０１５７】
ヒト化抗ヒトＣＤ１９抗体ｈＢＵ１２のＶHおよびＶLコード領域を、米国特許第８，２４２，２５２Ｂ２号からそれぞれ配列変異体ＨＦおよびＬＧとして回収し、かつ、以下にこの実施例の最後に配列番号２６および配列番号２７として示している。
【０１５８】
最終的なピギーバックおよびスリーピングビューティーの転位性抗ＣＤ３０および抗ＣＤ１９  ＩｇＨＣ発現ベクターの構築を可能にするために、ＶHドメインのＤＮＡ断片を、隣接したＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位を含むように消化した。加えて、抗ＣＤ３０抗体ブレンツキシマブ（クローンＡｃ１０）のＶHをコードしているヌクレオチド配列を哺乳類細胞での発現用のリーダー配列を含むように改変した。抗ＣＤ３０および抗ＣＤ１９  ｍＡｂのＶHをコードしているＮｏｔＩ−ＮｈｅＩ断片のＤＮＡ配列をこの実施例の最後に配列番号２８および配列番号２９として示している。ＤＮＡ断片は（ＮｏｔＩおよびＮｈｅＩ部位を下線で示している）、ジーンアート（ＧｅｎｅＡｒｔ）、レーゲンスブルク、ドイツで遺伝子合成した。
【０１５９】
ピギーバックまたはスリーピングビューティーのトランスポサーゼのいずれかと転位可能な抗ＣＤ３０  ＩｇＨ鎖発現ベクターと抗ＣＤ１９  ＩｇＨ鎖発現ベクターを生成するために、配列番号２８配列番号２９のＮｏｔＩとＮｈｅＩで消化した断片をそれぞれ、配列番号２２または配列番号２３で開示したベクターをＮｏｔＩとＮｈｅＩで直線化したものにライゲーションした。この結果、抗ＣＤ３０  ｍＡｂブレンツキシマブ（クローンＡｃ１０）の機能性の完全長重鎖（ＨＣ）と抗ＣＤ１９  ｍＡｂ  ｈＢＵ１２の機能性の完全長重鎖を含む４つのベクターが得られ、これらの構築物を、ｐＰＢ−ＥＧＦＰ−ＨＣ−Ａｃ１０、ｐＰＢ−ＥＧＦＰ−ＨＣ−ｈＢＵ１２、ｐＳＢ−ＥＧＦＰ−ＨＣ−Ａｃ１０、およびｐＳＢ−ＥＧＦＰ−ＨＣ−ｈＢＵ１２と命名した。これらのベクター地図を図１１に示している。これらのベクターは具体的には、重鎖の表面発現が可能となるように、そして軽鎖が同時に発現した場合にはＩｇＧの表面発現が可能になるように設計された。しかしながら、Ｉｇ重鎖の膜貫通領域のコード領域を簡単に削除するだけで、分泌型ＩｇＧの転位性発現ベクターになり得る。
【０１６０】
ピギーバックまたはスリーピングビューティーのトランスポサーゼのいずれかと転位可能な抗ＣＤ３０  ＩｇＬ鎖発現ベクターと抗ＣＤ１９  ＩｇＬ鎖発現ベクターを生成するためには、配列番号２２および配列番号２３で開示したベクター由来のＩｇＨ定常領域遺伝子を、抗ＣＤ３０抗体および抗ＣＤ１９抗体のＩｇＬ鎖コード領域で置き換える必要があった。これは、ヒト定常カッパ軽鎖コード領域にインフレームで融合させた配列番号２５および配列番号２７で開示したＶLコード領域を含有している遺伝子断片を、５’末端にリーダー配列を含み、かつ、ＮｏｔＩ−ＢｓｔＢＩクローニング部位に挟まれた形で遺伝子合成することによって達成した。ＮｏｔＩとＢｓｔＢＩを含めることで、ＮｏｔＩ−ＢｓｔＢＩ消化断片をＮｏｔＩとＢｓｔＢＩで直線化した配列番号２２および配列番号２３で開示のベクターにライゲーションすることが可能となり、それによって、配列番号２２および配列番号２３のＩｇＨ定常コード領域を抗ＣＤ３０  ｍＡｂ  Ａｃ１０および抗ＣＤ１９  ｍＡｂ  ｈＢＵ１２のＩｇＬコード領域と置き換えられる。
【０１６１】
抗ＣＤ３０  ｍＡｂ  Ａｃ１０および抗ＣＤ１９  ｍＡｂ  ｈＢＵ１２のＩｇＬコード領域とリーダー配列を含み、ＮｏｔＩ−ＢｓｔＢＩクローニング部位に隣接している遺伝子断片を以下に、この実施例の最後に、配列番号３０および配列番号３１として開示する。これらのＤＮＡ断片の遺伝子合成は、ジェンスクリプト（ピスカタウェイ、ニュージャージー、米国）で行われた。
【０１６２】
ピギーバックまたはスリーピングビューティーのトランスポサーゼのいずれかと転位可能な抗ＣＤ３０  ＩｇＬ鎖発現ベクターと抗ＣＤ１９  ＩｇＬ鎖発現ベクターを生成するために、配列番号３０および配列番号３１のＮｏｔＩ−ＢｓｔＢＩ消化断片を、ＮｏｔＩとＢｓｔＢＩで直線化した配列番号２２または配列番号２３で開示したベクターにライゲーションした。その結果、４つのベクターが得られ、これらを、ｐＰＢ−ＥＧＦＰ−ＬＣ−Ａｃ１０、ｐＰＢ−ＥＧＦＰ−ＬＣ−ｈＢＵ１２、ｐＳＢ−ＥＧＦＰ−ＬＣ−Ａｃ１０、およびｐＳＢ−ＥＧＦＰ−ＬＣ−ｈＢＵ１２と命名した。これらのベクター地図を図１１に示す。
【０１６３】
ピギーバックおよびスリーピングビューティーの抗ＣＤ３０および抗ＣＤ１９  ＩｇＨおよびＩｇＬ構築物（８つの組み合わせ）の完全な配列を以下に、この実施例の最後で、配列番号３２（ｐＰＢ−ＥＧＦＰ−ＨＣ−Ａｃ１０）、配列番号３３（ｐＰＢ−ＥＧＦＰ−ＨＣ−ｈＢＵ１２）、配列番号３４（ｐＳＢ−ＥＧＦＰ−ＨＣ−Ａｃ１０）、配列番号３５（ｐＳＢ−ＥＧＦＰ−ＨＣ−ｈＢＵ１２）、および配列番号３６（ｐＰＢ−ＥＧＦＰ−ＬＣ−Ａｃ１０）、配列番号３７（ｐＰＢ−ＥＧＦＰ−ＬＣ−ｈＢＵ１２）、配列番号３８ｐＳＢ−ＥＧＦＰ−ＬＣ−Ａｃ１０）、および配列番号３９（ｐＳＢ−ＥＧＦＰ−ＬＣ−ｈＢＵ１２）として示している。
【０１６４】
本実施例で参照される配列
【０１６５】
配列番号２０（ピギーバックＩＴＲに隣接した発現カセットを含有している長さ４９７５ｂｐのＤＮＡ配列。膜貫通型ヒトＩｇ−ガンマ１重鎖用）
【０１６６】
配列番号２１（ベクター骨格の構成要素Ｃｏｌ  Ｅ１およびアンピシリン耐性を含有し、５’および３’がスリーピングビューティーのＩＴＲに隣接している、長さ２７７４ｂｐのＤＮＡ配列）
【０１６７】
配列番号２２（長さ７２４２ｂｐの配列。ピギーバックの転位性の「空の」ヒトガンマ１−ＨＣベクター）
【０１６８】
配列番号２３（長さ７１４６ｂｐの配列。スリーピングビューティーの転位性の「空の」ヒトガンマ１−ＨＣベクター）
【０１６９】
配列番号２４（長さ３５１ｂｐの抗ヒトＣＤ３０抗体ブレンツキシマブのＶHコード領域）
【０１７０】
配列番号２５（長さ３３３ｂｐの抗ヒトＣＤ３０抗体ブレンツキシマブのＶLコード領域）
【０１７１】
配列番号２６（長さ４１７ｂｐの抗ヒトＣＤ１９  ｍＡｂ  ｈｕＢ１２のＶHコード領域。リーダーを含有している）
【０１７２】
配列番号２７（長さ３７５ｂｐの抗ヒトＣＤ１９  ｍＡｂ  ｈｕＢ１２のＶLコード領域。リーダーを含有している）
【０１７３】
配列番号２８（ＮｏｔＩ−ＮｈｅＩに隣接した抗ヒトＣＤ３０  ｍＡｂブレンツキシマブのＶHコード領域を含有している長さ４２３ｂｐのＤＮＡ断片）
【０１７４】
配列番号２９（ＮｏｔＩ−ＮｈｅＩに隣接した抗ヒトＣＤ１９  ｍＡｂ  ｈＢＵ１２のＶHコード領域を含有している長さ４３２ｂｐのＤＮＡ断片）
【０１７５】
配列番号３０（抗ＣＤ３０  ｍＡｂ  Ａｃ１０のＩｇＬコード領域を含有しており、かつ、ＮｏｔＩおよびＢｓｔＢＩ制限酵素部位に隣接している長さ７３３ｂｐのＤＮＡ断片）
【０１７６】
配列番号３１（抗ＣＤ１９  ｍＡｂ  ｈＢＵ１２のＩｇＬコード領域を含有しており、かつ、ＮｏｔＩおよびＢｓｔＢＩ制限酵素部位に隣接している長さ７１８ｂｐのＤＮＡ断片）
【０１７７】
配列番号３２（７６４５ｂｐ配列のｐＰＢ−ＥＧＦＰ−ＨＣ−Ａｃ１０）
【０１７８】
配列番号３３（７６５４ｂｐ配列のｐＰＢ−ＥＧＦＰ−ＨＣ−ｈＢＵ１２）
【０１７９】
配列番号３４（７５４９ｂｐ配列のｐＳＢ−ＥＧＦＰ−ＨＣ−Ａｃ１０）
【０１８０】
配列番号３５（７５５８ｂｐ配列ｏｆｐＳＢ−ＥＧＦＰ−ＨＣ−ｈＢＵ１２）
【０１８１】
配列番号３６（長さ６７４２ｂｐのｐＰＢ−ＥＧＦＰ−ＬＣ−Ａｃ１０の配列）
【０１８２】
配列番号３７（長さ６７２７ｂｐのｐＰＢ−ＥＧＦＰ−ＬＣ−ｈＢＵ１２の配列）
【０１８３】
配列番号３８（長さ６６４６ｂｐのｐＳＢ−ＥＧＦＰ−ＬＣ−Ａｃ１０の配列）
【０１８４】
配列番号３９（長さ６６３１ｂｐのｐＳＢ−ＥＧＦＰ−ＬＣ−ｈＢＵ１２の配列）
実施例５：ピギーバックトランスポサーゼ発現ベクターのクローニングに関する説明
【０１８５】
ピギーバックの機能性トランスポサーゼ酵素のＯＲＦは、米国特許第７，１０５，３４３Ｂ１号（その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる）から得ることができ、下記配列番号１１として、この実施例の最後に示す。配列番号１１のＤＮＡ配列のアミノ酸への翻訳産物である配列番号１２も、本実施例の最後に示している。
【０１８６】
ピギーバックトランスポサーゼ酵素用の脊椎動物細胞発現ベクターを生成するためには、このＯＲＦを遺伝子合成し、平滑末端を有するＤＮＡとして、標準的な脊椎動物細胞用発現ベクターであるｐＣＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ（＋）（カタログ番号Ｖ８７０−２０、インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア、米国）を単一の平滑末端を生じる制限酵素部位ＥｃｏＲＶで消化したものに、当該分野で知られている方法によって、クローニングすることができる。ｐＣＤＮＡ３プロモーターに対してピギーバックＯＲＦのライゲーションが正しいかを、診断的制限酵素消化および／またはクローニングしたピギーバック発現構築物ｐＣＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ（＋）−ＰＢ（図７）のＤＮＡ配列決定によって確認することができる。ピギーバック発現ベクターの構築を本明細書に記載したように行い、診断的制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定によってベクターの設計を確認した。
【０１８７】
ピギーバック発現構築物ｐＣＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ（＋）−ＰＢの配列を以下に、この実施例の最後に配列番号１３として示す。
【０１８８】
本実施例５で参照される配列
【０１８９】
配列番号１１（ピギーバックトランスポサーゼのＯＲＦ）
【０１９０】
配列番号１２（ピギーバックトランスポサーゼのアミノ酸配列）
【０１９１】
配列番号１３（ｐＣＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ（＋）−ピギーバック発現ベクター）
実施例６：スリーピングビューティートランスポサーゼ発現ベクターのクローニングに関する説明
【０１９２】
スリーピングビューティーのトランスポサーゼ酵素のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、特許参考文献ＵＳ７１６０６８２Ｂ１／ＵＳ２００３１５４５００Ａ１に見ることができる。この配列を以下に、この実施例の最後に配列番号１７として示す。このＤＮＡ配列、配列番号１７のアミノ酸配列への翻訳産物である配列番号１８も、この実施例の最後、以下に示している。
【０１９３】
スリーピングビューティートランスポサーゼ酵素用の脊椎動物細胞発現ベクターを生成するために、このＯＲＦを遺伝子合成し、平滑末端のＤＮＡとして、標準的な脊椎動物細胞用の発現ベクターであるｐＣＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ（＋）（カタログ番号Ｖ８７０−２０、インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア、米国）を単一の、平滑末端を生じる制限酵素部位ＥｃｏＲＶで消化したものに、当該分野で知られている方法によってクローニングすることができる。ｐＣＤＮＡ３プロモーターに対してスリーピングビューティーＯＲＦのライゲーションが正しいかを、診断的制限酵素消化および／またはクローニングしたスリーピングビューティー発現構築物ｐＣＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ（＋）−ＳＢ（図９）のＤＮＡ配列決定によって確認することができる。
【０１９４】
スリーピングビューティー発現構築物ｐＣＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ（＋）−ＳＢの配列を以下に、この実施例の最後に配列番号１９として示す。
【０１９５】
スリーピングビューティー発現ベクターの構築を本明細書に記載したように行い、診断的制限酵素消化とＤＮＡ配列決定によってベクターの設計を確認した。ピギーバックおよびスリーピングビューティートランスポサーゼ酵素のコード領域は、ジェンスクリプト、ピスカタウェイ、ニュージャージー、によって遺伝子合成されたものである。８種類のピギーバックおよびスリーピングビューティートランスポザーゼ用の転位性のＩｇＨおよびＩｇＬの発現ベクター、ならびにピギーバックおよびスリーピングビューティートランスポサーゼ酵素用のｐＣＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ（＋）発現ベクターの全てを、抗ＣＤ３０および抗ＣＤ１９抗体を哺乳類細胞の細胞表面で発現できるように生成した。
【０１９６】
実施例６で参照される配列
【０１９７】
配列番号１７（スリーピングビューティートランスポサーゼ酵素のＯＲＦ）
【０１９８】
配列番号１８（スリーピングビューティートランスポサーゼのアミノ酸配列）
【０１９９】
配列番号１９（スリーピングビューティー発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ（＋）−ＳＢのＤＮＡ配列）
実施例７：安定に転位した発現ベクター由来の膜結合型ヒトＩｇＧを安定に発現しているマウスプレＢ細胞の生成
【０２００】
哺乳類細胞中におけるヒトＩｇＧ抗体の安定な発現を実証するために、転位性のヒトＩｇＨおよびＩｇＬの発現構築物を、エーベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭｕＬＶ）で形質転換したプロＢ細胞株６３−１２に導入した。この細胞株は元々、ＲＡＧ−２欠損マウス（シンカイ（Ｓｈｉｎｋａｉら、（１９９２）セル  ６８，８５５−８６７）由来で、そのためＶ（Ｄ）Ｊ組換えを開始することができない。この宿主細胞株は、Ｂ細胞受容体補助因子Ｉｇ−アルファ（ＣＤ７９ａまたはｍｂ−１）やトランス膜結合型免疫グロブリンの膜貫通型アミノ酸と相互作用するＩｇ−ベータ（ＣＤ７９ｂまたはＢ２９）など、膜結合型抗体の最適な発現のための全ての細胞要素を発現しているＢ細胞系のリンパ球細胞型を構成している。そのため、これらの細胞は、ＩｇＧ分子を、細胞表面の膜のトランス−膜貫通型領域に最適に繁留する。６３−１２細胞を、２％のＦＣＳ、０．０３％のプリマトン（Ｐｒｉｍａｔｏｎｅ）（登録商標）ＲＬ−ＵＦ（シェフィールド・バイオサイエンス（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０μＭの２−メルカプトエタノールを添加したＩＭＤＭ懸濁培地に入れ、３７℃、１０％ＣＯ2雰囲気の加湿インキュベーター内で静置培養した。トランスポゾン発現ベクター（実施例５または６）と転位性のＩｇＨおよびＩｇＬ発現ベクター（実施例４）を同時に遺伝子導入するためには、遺伝子導入する時点までに細胞の成長が対数期に入っているようにするため、細胞を遺伝子導入の２４時間前に継代し、５×１０5細胞／ｍｌの密度で播種した。
【０２０１】
遺伝子導入の当日、６３−１２細胞を遠心によって回収し、添加物や血清をいずれも含まないＲＰＭＩ１６４０培地に５×１０6細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。この細胞懸濁液４００μｌ（２×１０6細胞相当）を０．４ｃｍのエレクトロポレーション用キュベット（バイオラッド、注文番号１６５−２０８１）に移し、所望のプラスミドＤＮＡ（またはプラスミド混合物）を含む４００μｌのＲＰＭＩ１６４０培地と混合した。次いで、バイオラッド社のジーンパルサーＩＩを９５０μＦ／３００Ｖの設定で使用して細胞に遺伝子を導入し、エレクトロポレーションパルスを一回与えた後５分間、室温でインキュベートした。その後、細胞を５ｍｌのＩＭＤＭを基本とした成長培地に移し、細胞残渣とエレクトロポレーションからのＤＮＡを除去するために１回遠心し、その後細胞を、ＩＭＤＭを基本とした成長培地に移し、回復させ、導入されたプラスミド由来のタンパク質を発現させた。
【０２０２】
エレクトロポレーションの設定は、Ａ−ＭｕＬＶ形質転換したプロＢ細胞株６３−１２に対する最適な遺伝子導入条件として決定した。この設定では慣習的に、３０〜４０％の効率で一過性の遺伝子導入が起こる。エレクトロポレーションによるこれらの遺伝子導入の結果は、図１２に示すＦＡＣＳ分析の中で示している。この図では、遺伝子導入の対照、遺伝子導入の２日後を左側に図示している。ＤＮＡを含まない見せかけのエレクトロポレーションを行った陰性対照（ＮＣと表示）では、予測された通り、緑色蛍光を示す細胞は全く見られなかったが、１５μｇのｐＥＧＦＰ−Ｎ３プラスミド（クロンテック、注文番号６０８０−１）を導入した遺伝子導入対照では、高感度緑色蛍光タンパク質を発現している細胞によって検出されたように、３８．８％の細胞に遺伝子が一過的に導入されたことが認められた（右下の象限の細胞を参照のこと）。予想通り、遺伝子導入対照はＩｇ−カッパのシグナルは全く示していない。これは、遺伝子導入対照はいずれも、Ｉｇ−発現構築物と同時には導入されていないためである。
【０２０３】
ＩｇＨ発現ベクターとＩｇＬ発現ベクターを遺伝子転位させるために、６３−１２細胞に、それぞれ５μｇの転位性のＩｇＨ発現ベクター、５μｇの転位性のＩｇＬ発現ベクター、ならびにＩｇＨとＩｇＬ発現ベクターの遺伝子転位を仲介するトランスポサーゼを発現させる５μｇの発現ベクターの混合物をエレクトロポレーションによって導入した。この遺伝子導入の結果も図１２に示している。
【０２０４】
細胞表面でのヒトＩｇＧの発現を、ストレプトアビジン−アロフィコシアニン（ｓｔｒｅｐ−ＡＰＣ）（アフィメトリクス、イーバイオサイネンス、注文番号１７−４３１７−８２）によって検出されるビオチン化抗ヒトカッパ軽鎖特異的抗体（アフィメトリクス、イーバイオサイネンス、注文番号１３−９９７０−８２）によって検出し、これをＦＡＣＳドットプロットのＹ軸に示している。図１０の左から２列目の図に見られる測定値は、ＩｇＨ＋ＩｇＬ＋トランスポサーゼ発現ベクターを導入し、遺伝子導入後２日目の細胞の解析結果を示している（「ＴＦ後２日」と表示）。遺伝子導入して２日後のＦＡＣＳ解析は、１．８％〜２．８％の細胞が細胞表面にヒトＩｇＨ＋ＩｇＬを発現していることを示している。これは、ＩｇＬの発現は、ＩｇＨ鎖が細胞中で同時に発現し、完全なＩｇＧが細胞表面で発現される場合にしか細胞表面では検出されないためである。
【０２０５】
このデータから、およそ３８％の細胞に遺伝子が一過的に導入された場合には、これらの細胞のうちのおよそ５〜７．５％にＩｇＨ発現ベクターとＩｇＬ発現ベクターの両方が導入されたことが推測される。この実験から、転位性のＩｇＨおよびＩｇＬ発現構築物によって、マウスＡ−ＭｕＬＶで形質転換したプロＢ細胞の表面にヒトＩｇＧを高レベルで発現させることができ、これは、ヒト末梢Ｂリンパ球を同じ抗体染色試薬で染色して得られた表面ＩｇＧのシグナルと同程度である（データは示さない）と結論づけられる。
【０２０６】
予測された通り、ＩｇＧ発現を示している細胞は、ＥＧＦＰの発現も示した。これは、ＥＧＦＰの発現が、ＩＲＥＳ配列を介してＩｇＨまたはＩｇＬの発現と転写レベルで連動していたためである。しかしながら、ＥＧＦＰの発現は、予想通り、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３対照プラスミド由来のＥＧＦＰ発現よりは有意に低かった。これは、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３のＥＧＦＰの発現は強力な構成的プロモーターから直接誘導されるが、転位性のＩｇＨおよびＩｇＬ発現ベクターでのＥＧＦＰの発現は、配列内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を介して転写レベルで連動しているＩｇＨおよびＩｇＬのコード領域によるためである。それにもかかわらず、予想通り、ＩｇＧをより強く発現している細胞は、より強いＥＧＦＰシグナルを示していた（Ｉｇ−カッパ+／ＥＧＦＰ+の集団をやや斜め方向に導いている）。このことは、両者の発現レベルが連動していることをはっきりと示している。
【０２０７】
遺伝子導入の１週間後に、セルソーティングを用いずに細胞を解析した時には、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３対照を導入した細胞内でＥＧＦＰのシグナルはもはや検出できなかった（データは示さない）。このことは、これらの細胞が発現構築物を有意な頻度では安定に組み込まないことを示している。対照的に、転位性のＩｇＨおよびＩｇＬベクターとトランスポサーゼ発現ベクターを同時に導入した細胞では、僅かではあるが、およそ１〜２％のＩｇＧ−ＥＧＦＰ二重陽性の細胞集団が維持されていた。遺伝子を一過的に導入した細胞のうちのおよそ３〜６％が、転位性のＩｇＨ発現ベクターとＩｇＬ発現ベクターを同時にそれらのゲノム中に安定に組み込むことが既に示されている（データは示さない）。
【０２０８】
これらの安定に転位した細胞を濃縮するために、ソートゲート（左から２列目のＦＡＣＳドットプロット内に示す黒の長方形）で示したように、Ｉｇ−カッパ軽鎖とＥＧＦＰの二重陽性細胞を遺伝子導入の２日後にＦＡＣＳで分取した。図１２に示すように、ピギーバックの転位体からは、このゲートに入った各５，０００個の細胞を、抗ＣＤ３０  ｍＡｂ  Ａｃ１０のＩｇＨとＩｇＬ（上段）、および抗ＣＤ１９  ｍＡｂ  ｈＢＵ１２のＩｇＨとＩｇＬ（中段）を含むものとして、および３’０００個の細胞をスリーピングビューティー遺伝子転位体から抗ＣＤ３０  ｍＡｂ  Ａｃ１０のＩｇＨとＩｇＬ（下段）を含むものとして分取した。
【０２０９】
ＦＡＣＳで分取した細胞を１週間増殖させ（遺伝子導入の９日目としている）、上述したようにＩｇＧを抗カッパ軽鎖抗体で検出することで表面でのＩｇＧの発現を再解析した。図１０に見られるように（右から２列目）、１回分取した細胞の３０％、５０％および５％超がＩｇＧを安定に細胞表面で発現していた。同時にこれらの細胞は、予想通りＥＧＦＰ陽性でもあった。このことは、ＩｇＨとＩｇＬを同時に一過的に遺伝子導入した細胞のかなりの割合が、ＩｇＧの発現を安定に維持することを示している。この実験設定におけるピギーバック介在性の遺伝子転位は、スリーピングビューティー介在性の遺伝子転位よりもおよそ６〜１０倍高い効率で起こるようである。
【０２１０】
この遺伝子転位実験からは、さらにいくつかの結論を導き出すことができる。第一に、遺伝子導入２日後に分取したＩｇＧ／ＥＧＦＰ二重陽性細胞からは、ピギーバック遺伝子転位体のうち約７５％の細胞が安定にＥＧＦＰ＋を維持し、同時に、ＰＢ−Ａｃ１０とＰＢ−ｈＢＵ１２との遺伝子転位体のおよそ４０％〜３０％がＩｇＧを表面に発現していないＥＧＦＰ＋細胞を生成した。これらの細胞ではおそらく、ＩｇＧを細胞表面で発現することはできないが、細胞がＥＧＦＰ陽性を表すには十分な２つの転位性のＩｇＨおよびＩｇＬ発現ベクターのうちの１つが安定に転位したのだろう。このことはまた、最初、一過的に遺伝子が導入されたおよそ３８％の細胞のうちの少なくとも５％に、少なくとも１つの転位性のＩｇ発現ベクターが安定に転位することを意味している。
【０２１１】
スリーピングビューティーの遺伝子転位では、安定に転位した細胞の数はピギーバックの遺伝子転位で転位した細胞数よりも少なく、ＩｇＨ＋ＩｇＬ＋トランスポサーゼを同時導入した細胞の１回目のＦＡＣＳ分取の後、安定にＩｇＧを発現している細胞は僅か約５％しか得られなかった。しかしながら、安定なＥＧＦＰ陽性細胞についても考慮すれば、スリーピングビューティートランスポサーゼを用いた１回目のＦＡＣＳ分取の後には、約９％の安定に転位した細胞が得られた。
【０２１２】
これらの安定にＩｇＧ陽性およびＩｇＨ／ＩｇＬが転位した細胞を再度ＦＡＣＳで分取すると、９９％を超える安定にＩｇＧを発現している細胞が得られ（図１２、右列）、安定な発現表現型は、ＩｇＧ＋細胞のパーセンテージが変化することなく（データは示さない）、４週間にわたって維持された。そのため、本発明で開示のヒトＩｇＨおよびＩｇＬ鎖用の転位性発現ベクターは機能性で、かつ、哺乳類の宿主細胞ゲノムに高効率で安定に組み込むことができると結論づけられる。
実施例８：特異的な抗原結合を介した、安定にＩｇＧが転位し、かつ、安定にＩｇＧが発現している細胞の濃縮
【０２１３】
前記実施例７で開示したように、ＩｇＨおよびＩｇＬ発現ベクターの遺伝子転位によって生成したヒトＩｇＧを発現しているプロＢ細胞を、抗原特異的細胞の単離に使用できるかを実証するために、抗ＣＤ３０  ｍＡｂを発現している少量のプロＢ細胞株６３−１２（図１２のｄ１６、２回分取、６３−１２＋ＰＢ−Ａｃ１０を参照のこと）を、抗ＣＤ１９  ｍＡｂを発現しているプロＢ細胞株６３−１２（図１２のｄ１６、２回分取、６３−１２＋ＰＢ−ｈＢＵ１２を参照のこと）と１０-2、１０-3、１０-4、１０-5、１０-6の割合で混合した（図１３を参照のこと）。合計で１０7個の細胞を、２％のＦＣＳを添加した１ｍｌのＰＢＳ中、氷上で３０分間、以下の試薬と共に染色した。
−０．１μｇの６×Ｈｉｓタグ化、組換えヒトＣＤ３０（シノ・バイオロジカル社（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）、北京、中国、注文番号１０７７７−Ｈ０８Ｈ）、および
−１０μｌのマウス抗ヒトＩｇ−カッパＬＣ−ＡＰＣ標識抗体（ライフ・テクノロジーズ、インビトロジェン、注文番号ＭＨ１０５１５）。
【０２１４】
これらの一次試薬を遠心と２％のＦＣＳを添加したＰＢＳでの洗浄によって細胞から除去した後、２％のＦＣＳ添加した１ｍｌのＰＢＳ中、氷上で３０分間、以下の試薬と共に二次染色を行った。
−０．１μｇのビオチン化抗Ｈｉｓ−タグ抗体（ＩＢＡライフ・サイエンシズ、ゲッティンゲン、ドイツ、注文番号２−１５９０−００１）
−遠心と２％のＦＣＳを添加したＰＢＳでの洗浄によってこの二次試薬を細胞から除去した後、ＣＤ３０−６×Ｈｉｓ／抗Ｈｉｓ−タグ−ｂｉｏの結合物を１ｍｌの２％ＦＣＳ添加ＰＢＳ中、氷上で３０分間い、以下の試薬と共に染色することで検出した。
−１／５００に希釈したストレプトアビジン−フィコエリトリン（ｓｔｒｅｐ−ＰＥ）（アフィメトリクスイーバイオサイネンス、注文番号１２−４３１７−８７）試薬。
【０２１５】
最後のＦＡＣＳ染色の後、細胞を再度、２％のＦＣＳを添加し、氷冷したＰＢＳ中で２回洗浄し、次いで、２％ＦＣＳ添加ＰＢＳ（１．０ｍｌ）に再懸濁した。その後、細胞をＦＡＣＳ解析とＩｇ−カッパＬＣ／ＣＤ３０陽性細胞の細胞分取にかけた（図１３を参照のこと）。
【０２１６】
図１３に開示している結果に見られるように、ＩｇＧ陽性かつ抗ＣＤ３０反応性の特異的な細胞集団が陽性対照のＦＡＣＳプロットの右上の象限に検出される。また、予想通り、表面ＩｇＧのＦＡＣＳシグナルの強度（抗Ｉｇ−カッパ−ＡＰＣを介して検出した）は抗ＣＤ３０のＦＡＣＳシグナルと相関しており、この集団に関する斜め方向の染色パターンを生じている。
【０２１７】
抗ＣＤ３０  ｍＡｂ細胞と抗ＣＤ１９  ｍＡｂ発現細胞の混合物では、特異的抗ＣＤ３０  ｍＡｂ発現細胞の希釈レベルは、右上の象限においてＣＤ３０抗原特異的細胞の頻度をよく反映しており、かつ、ＦＡＣＳのソートゲートを厳密に定義している（右上の象限にある黒い長方形）。特異的細胞の希釈倍率が高い場合（１：１０，０００、１：１００，０００、１：１，０００，０００）のＣＤ３０反応性／ＩｇＧ陽性細胞に相当する非常に少数のイベントは、個々のドットプロットの上に表記したように、より多くのイベントが得られたとしてもこのＦＡＣＳドットプロットの印刷ではよく見えない。しかしながら、ＣＤ３０が検出可能な細胞の頻度は、希釈因数から予想した通り、それらの頻度と強い相関があった。この結果から、ここに示したように、哺乳類細胞およびプロＢ細胞の表面に遺伝子転位介在性ヒトＩｇＧを発現させるという手段によって抗原特異的抗体発現細胞を提示させること、およびこれらを抗原特異的に検出することは確実に実施可能であると結論づけられる。
【０２１８】
図１３の下段のＦＡＣＳドットプロットは、異なる出現を示す希釈実験からＦＡＣＳで分取した細胞の再解析の結果を示している。結果から分かるとおり、１：１００、１：１，０００および１：１０，０００希釈の実験からＦＡＣＳ分取した細胞の再解析の結果、ほぼ同じ細胞集団が濃縮され、これはおよそ９０〜９５％の抗原反応性細胞を示している。１：１００，０００希釈からＦＡＣＳで分取された細胞は、ＩｇＧ陽性／ＣＤ３０反応性細胞のゲートに入らない別の集団を少量含んでいたが、この実験では、およそ８５％のＦＡＣＳ分取後細胞が抗原特異的なＩｇＧを発現している細胞であった。驚くことに、ＣＤ３０への反応性およびＩｇＧの発現に関して最高純度の細胞がＦＡＣＳ分取で得られた。この場合、たったの１，０００，０００分の１がＣＤ３０抗原特異的で、およそ１４個の細胞だけが分取された。このことは、分取された細胞はＩｇＧ陽性−ＣＤ３０反応性細胞由来の混合物ではなく、小数のクローンの全てがＩｇＧ陽性−ＣＤ３０反応性細胞を表しているというように、効果がほぼ均一であったと見なす必要があるということのみで説明することができる。
【０２１９】
それでもなお、特異的抗原介在性染色、抗原特異的抗体を発現している細胞の同定、および分取ＦＡＣＳ介在性セルソーティングによってそれらをうまく濃縮できたという結果は、所望の結合表現型を有する抗体を発現している細胞の単離に関する本明細書で開示の方法の実現可能性をはっきりと示している。
実施例９：抗体の発現を膜結合型から分泌型に転換するのに使用することができる転位性のＩｇＨ発現ベクターの生成と使用に関する説明
【０２２０】
実施例１から４で開示した転位性のＩｇ発現ベクターは、抗体の結合表現型が容易に同定でき、細胞への抗原結合に関して、実施例８で例示したようなＦＡＣＳ法によって、または細胞のパニングまたはバッチ濃縮法（例えば磁気ビーズ活性化セルソーティング、ＭＡＣＳ）によって濃縮できるように、ヒトＩｇＧを哺乳類細胞の表面で発現させることができるだけである。しかしながら、細胞によって溶液中に分泌型として提示された所与の抗体の抗原結合特性を迅速に解析することも望まれることが多い。分泌型ＩｇＧ発現用の発現ベクターにクローニングされた抗原特異的細胞の関連するＶHおよびＶLコード領域をＰＣＲで増幅することも可能であるが、この方法では時間と手間がかかる。
【０２２１】
本発明の詳細な説明で既に、抗体発現の、ゲノムＩｇＨ鎖構築物の選択的スプライシングに基づいた膜結合型から分泌型への天然の「転換」を利用する、転位性のＩｇＨ発現構築物が使用できることを開示した。
【０２２２】
この膜結合型から分泌型への抗体発現の転換は、以下のように達成することができる。
【０２２３】
ヒトＩｇ−ガンマ１重鎖のｃＤＮＡに基づく発現カセットの代わりに、ヒトＩｇ−ガンマ１遺伝子座の本来のゲノム構造を、前記実施例４で開示したＩｇＨ発現ベクターにクローニングする必要がある。生殖系列の免疫グロブリン遺伝子座の全長配列は、１４番染色体に局在しているヒトＩｇ重鎖遺伝子座を包含しているヒトゲノムプロジェクトの連結断片ＮＴ＿０１０１６８から得ることができる。５’末端にあるＣH１ドメインの第一アミノ酸から始まり、３’末端にある第二の膜貫通部分のエクソンであるガンマ１−Ｍ２の終始コドンの５００ｂｐ下流までを含むヒトＩｇ−ガンマ１重鎖遺伝子座は長さが５８０７塩基対で、内部にＮｈｅＩ部位もＢｓｔＢＩ部位も有していない。そのためこの遺伝子座を、ＮｈｅＩおよびＢｓｔＢＩ部位に挟まれた形で合成することができ、これを方向性のあるクローニングに用いることができる。次に、そのように遺伝子合成した断片を、ｐＰＢ−ＥＧＦＰ−ＨＣ−Ａｃ１０（配列番号３２）に含まれている膜結合型ガンマ１−定常コード領域のｃＤＮＡコード領域と置き換えるのに直接使用することができる。
【０２２４】
合成すべきゲノムヒトＩｇ−ガンマ１断片のＤＮＡ配列を以下に、この実施例の最後に配列番号４０として示している（５’のＮｈｅＩと３’のＢｓｔＢＩを太字で強調している）。
【０２２５】
膜貫通型エクソンＭ１およびＭ２を含むヒトＩｇ−ガンマ１−重鎖生殖系遺伝子座のエクソンおよびイントロンの構造を図１４に示す。元のゲノム構造を維持しているこのゲノム遺伝子断片のコード領域と非コード領域は、ｍＲＮＡがプロセシングされる過程であるＢ系列細胞の分化段階に応じたＩｇ−ガンマ１  ｍＲＮＡの選択的スプライシングを可能にするのに必要な全てのシス制御因子を含んでいるはずである（ピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）ら、（２００２）分子細胞生物学（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）２２，５６０６−５６１５）。断片配列番号４０の転位性Ｉｇ−ガンマ１ＨＣ発現ベクターへのクローニングは、ｐＰＢ−ＥＧＦＰ−ＨＣ−Ａｃ１０をＮｈｅＩ制限酵素とＢｓｔＢＩ制限酵素で消化し、配列番号４０のゲノム断片をＮｈｅＩ−ＢｓｔＢＩ消化断片として、ＮｈｅＩとＢｓｔＢＩで直線化したｐＰＢ−ＥＧＦＰ−ＨＣ−Ａｃ１０のベクター断片にライゲーションすることにより、ｐＰＢ−ＥＧＦＰ−ＨＣ−Ａｃ１０中のＣ−ガンマ１コード領域を置き換えることで行うことができる。
【０２２６】
このライゲーションの結果を図１４に模式的に、また、この構築物の配列を配列番号４１として、この実施例の最後に示している。
【０２２７】
Ａ−ＭｕＬＶで形質転換したプロＢ細胞、例えば６３−１２細胞は、Ａｂｌ−キナーゼの形質転換活性が阻害されていれば、これらの細胞の表現型の分化を誘導し、より成熟したＢ細胞系列性細胞にすることが可能なため、ゲノムＩｇ−ガンマ１ＨＣ構築物の天然の選択的スプライシングの機序を利用するのに好適な細胞株である。このことは具体的には、Ａｂｌ−キナーゼ阻害剤のグリベック（イマチニブまたはＳＴＩ−５７１としても知られている）（ムルジョおよびシュリセル（Ｓｃｈｌｉｓｓｅｌ）（２００３）ネイチャー・イムノロジー  ｌ．４，３１−３７）を用いることで達成することができる。しかしながら、Ａ−ＭｕＬＶ形質転換プロＢ細胞をグリベックで処理すると、それらはより成熟した段階のＢ系列へと表現型分化を開始するだけでなく、この過程は、アポトーシスの誘導とも関連している（未発表の結果）。これは、まずｂｃｌ−２発現ベクターが安定に遺伝子導入された６３−１２  Ａ−ＭｕＬＶ形質転換細胞株を確立することで防止することができる。
【０２２８】
マウスｂｃｌ−２のｍＲＮＡ配列はＮＣＢＩ−ジェンバンク登録番号ＮＭ＿００９７４１に見ることができ、この実施例の最後に示した配列番号４２の配列を有している。このオープンリーディングフレームは配列番号４３のアミノ酸配列へと翻訳され、これも以下に、この実施例の最後に示している。
【０２２９】
哺乳類ｂｃｌ−２の発現ベクターを生成するために、マウスｂｃｌ−２コード領域をＫｐｎＩとＸｈｏＩ制限酵素部位を含む形（これらはｂｃｌ−２のコード領域には存在していない）で遺伝子合成することができる。そして安定なｂｃｌ−２形質導入体を選抜するため、６３−１２細胞中に安定に導入することができるｂｃｌ−２の哺乳類の発現ベクターを生成するために、ＫｐｎＩとＸｈｏＩで二重消化した遺伝子合成したＤＮＡ断片を前述したｐＣＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ（＋）にライゲーションすることができる。
【０２３０】
マルチプルクローニングサイトのＫｐｎＩおよびＸｈｏＩ制限酵素部位に挿入されたマウスｂｃｌ−２遺伝子を含有しているｐＣＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ（＋）発現ベクターの全長配列を以下に、この実施例の最後に配列番号４４として示している。
【０２３１】
安定な形質導入体の生成を促進するためには、このベクターを例えば、ベクターを細菌のアンピシリン耐性遺伝子の途中で直線化する酵素ＦｓｐＩを使って、ｂｃｌ−２またはハイグロマイシンＢの発現カセットの外側で直線化することができる。このようにして直線化したベクター２０μｇを２×１０6個の６３−１２細胞に、転位性ベクターの遺伝子導入に関して前述したのと丁度同じように、エレクトロポレーションにより、９５０μＦ／３００Ｖで遺伝子導入することができる。エレクトロポレーションの後、細胞を１００ｍｌの成長培地で希釈し、５枚の９６−ウェルプレートに、各ウェルにつき２００μｌになるように（これにより、１ウェル当たりおよそ４×１０3個細胞になる）分注することができる。
【０２３２】
次いで、遺伝子導入の４８時間後に８００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを添加することで、安定な形質導入体を選抜することができる。安定に遺伝子が導入された個別の細胞クローン（１回の実験で２０〜１００が得られると予想される）を、２〜３週間後に得ることができる。安定にｂｃｌ−２遺伝子が導入された細胞クローンを、０．１〜１ｍＭのグリベック（イマチニブまたはＳＴＩ−５７１）に暴露した場合の個々のクローンの生存率を測定することで、アポトーシスから細胞を保護する能力に関しても、最も良くその機能が評価できる。グリベック（イマチニブまたはＳＴＩ−５７１）に対して高い耐性をもつ６３−１２の安定なｂｃｌ−２形質導入体を同定すれば、このクローンを、例えば配列番号４１および配列番号３６のベクターを使用した転位性のゲノムＩｇ−ガンマ１ＨＣおよびＩｇ−カッパＬＣ発現ベクター由来のヒトＩｇＧを発現させるための宿主細胞として使用することができる。
【０２３３】
これらのベクターは、ピギーバック発現ベクター（配列番号１３）と同時に、安定なＢｃｌ−２導入６３−１２細胞へと遺伝子導入することができ、安定に転位しており、かつ、ＩｇＧを発現している細胞を前述したように確立することができる（実施例７と同等）。プロＢ細胞は分化段階を表しているため、内生の免疫グロブリンが膜結合型の免疫グロブリンとして発現している場合には、ゲノム構造をとっている転位性Ｉｇ−ガンマ１ＨＣ発現ベクターから発現されるＩｇ−ＨＣも膜結合型として発現されるだろうと予想することができる。
【０２３４】
しかしながら、細胞を０．１〜１ｍＭのグリベック（イマチニブまたはＳＴＩ−５７１）で処理すると、Ａ−ＭｕＬＶによってコードされているＡｂｌ−キナーゼは特異的に阻害され、細胞はそれ以上形質転換できず、より成熟した分化段階のＢ細胞への固有の分化プログラムを継続しない。インビトロでは、この分化は機能的に発現されるＩｇタンパク質に依存しない（グラウンダー（Ｇｒａｗｕｎｄｅｒ）ら、（１９９５）国際免疫学会誌（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）７，１９１５−１９２５）。形質転換されていないプロＢ細胞はインビトロでの分化によって、Ｔ細胞由来抗ＩＬ４およびＣＤ４０の刺激に対して応答するようになり、その上、細胞はクラス転換組換えを起こしている最中の形質細胞期の細胞に分化もし、この段階で、これらの細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを生成することができることが分かっている（ローリンク（Ｒｏｌｉｎｋ）ら、（１９９６）免疫（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）５，３１９−３３０）。
【０２３５】
このことは、ｂｃｌ−２が安定に発現していることによってアポトーシス耐性となっているＡ−ＭｕＬＶ形質転換６３−１２細胞も、ローリンクら、（１９９６）免疫５，３１９−３３０に明確に記載されているように、グリベックで処理し、１０μｇ／ｍｌの刺激性抗ＣＤ４０抗体、および１００Ｕ／ｍｌの組換えＩＬ４と共にインキュベートした場合には、形質細胞期の細胞に分化できることを意味している。
【０２３６】
この処理によって細胞分化のプログラムに変化が起こり、それによって、ゲノム構造をとっているＩｇ  ＨＣ発現構築物に由来する膜結合型ＩｇＧ発現から分泌型ＩｇＧ発現へと、細胞の選択的スプライシングのプログラムも変化する。これにより、選抜した細胞クローンのＶHおよびＶLコード領域を再度クローニングする必要も、それらを分泌型ＩｇＧ抗体用の発現ベクターにライゲーションする必要もなく、表面提示および抗原結合によって同定・単離したレプリカ平板からの細胞クローン由来の、分泌型抗体の産生が可能になる。これは、大部分の哺乳類細胞の発現系には容易に組み込むことができないベクターの、特に、そのような長いゲノム発現ベクターを容易に挿入することができないウイルスを基礎とした発現系の多くに組み込むことができないベクターの機能特性である。
【０２３７】
実施例９で参照される配列
【０２３８】
配列番号４０（長さ５８１２ｂｐのヒトＩｇ−ガンマ１−重鎖のゲノム遺伝子）
【０２３９】
配列番号４１（ゲノム構造をとっている、転位性のＩｇ−ガンマ１−ＨＣ発現ベクター）
【０２４０】
配列番号４２（マウスｂｃｌ−２のコード領域）
【０２４１】
配列番号４３（マウスＢｃｌ−２タンパク質のアミノ酸配列）
【０２４２】
配列番号４４（ｐＣＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ（＋）−ｂｃｌ２、哺乳類用の発現ベクター）
実施例１０：基本的なヒト抗体重鎖および軽鎖ライブラリーをコードしているベクターのピギーバック転位性ベクターとしての生成に関する説明
【０２４３】
ヒト抗体重鎖および軽鎖ライブラリーをコードしている、単純な転位性のＤＮＡライブラリーを生成するには、転位性のベクターである実施例２のｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２−ＩｇＬおよび実施例３のｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２−ＩｇＨそれぞれに由来するＶLおよびＶH領域を置き換える必要があるだけである。この操作は、ヒトＶHおよびＶLコード領域を、ＣｌａＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩ制限酵素部位で挟まれた形で、遺伝子合成し、そして、以下にこの実施例の最後で配列番号９（可変重鎖ドメインのライブラリーをコードしている）および配列番号１０（可変軽鎖ドメインのライブラリーをコードしている）として示すようにＨＣＤＲおよびＬＣＤＲの特定の位置にヌクレオチドの変異が入るようにすることで行うことができる。これらの配列は両方とも、ＨＣＤＲ３（太字）およびＬＣＤＲ３（太字）のそれぞれに、Ｎを多く含む配列を含んでいる。配列番号９と配列番号１０の配列は両方とも、ＣｌａＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩ制限酵素（下線）のそれぞれで挟まれており、制限酵素部位は横に、遺伝子合成したＤＮＡ断片の正確な制限酵素消化と、直線化したｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２−ＩｇＨおよびｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｔ１Ｔ２−ＩｇＬ骨格それぞれのＣｌａＩ−Ｅｃｏ４７ＩＩＩへの方向性をもったライゲーションを可能にする４つのヌクレオチドを含んでいる（配列の末尾を小文字で表すことで強調している）。
【０２４４】
この様式では、別々のベクター上に抗体の重鎖および軽鎖がコードされており、抗体鎖の発現が転写性で、その結果、緑色蛍光マーカータンパク質に操作可能に連結される、多様な転位性のＤＮＡライブラリーを生成することができる。
【０２４５】
配列番号９（ＬＣＤＲ３をコードしている配列の複数の位置に種々のＮ−配列を含むＶＬドメインのコード領域）
【０２４６】
配列番号１０（ＨＣＤＲ３をコードしている配列の複数の位置に種々のＮ−配列を含むＶHドメインのコード領域）
実施例１１：基本的なスリーピングビューティーの転位性ヒトＩｇ−カッパ軽鎖発現ライブラリーの生成に関する説明
【０２４７】
ヒト抗体軽鎖ライブラリーをコードしている多様なスリーピングビューティーの転位性ＤＮＡライブラリーを生成するためには、実施例５のスリーピングビューティーの転位性ベクター、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｓｂＴ１Ｔ２−ＩｇＬのＶL領域を多様なＶL遺伝子のレパートリーと置き換える必要がある。これは、ヒトＶLコード領域を、ＣｌａＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩ制限酵素部位に挟まれた形で遺伝子合成し、その後、既に配列番号１０として上述したように、ＨＣＤＲとＬＣＤＲの特定の位置を様々なヌクレオチドにすることによって行うことができる。配列番号１０の配列は、直線化したｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｓｂＴ１Ｔ２−ＩｇＬのＣｌａＩ−Ｅｃｏ４７ＩＩＩへの方向性のあるライゲーションを可能にするＣｌａＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩ制限酵素に挟まれている。このようにして、多様なヒト抗体軽鎖をコードしているスリーピングビューティーの転位性ＤＮＡライブラリーを生成することができる。
【０２４８】
この様式では、抗体重鎖および軽鎖が別々のベクターにコードされており、抗体鎖の発現が転位性で、その結果、緑色蛍光マーカータンパク質に操作可能に連結される、多様な転位性のＤＮＡライブラリーを生成することができる。
実施例１２：転位性のＩｇＬ鎖発現ライブラリーのクローニング
【０２４９】
下記のように、無作為化したＬＣＤＲ３領域を有するＶ−カッパ軽鎖のライブラリーを構築した。６つのアミノ酸残基つまり、ＮＮＫ（Ｎは任意ヌクレオチド；ＫはＴまたはＧ）のコドンによってコードされているアミノ酸を無作為化した。このコドンはそれぞれ、２０種類のアミノ酸となる。ライブラリーは、生殖系のヒトＶカッパ１〜５およびＪカッパ２の遺伝子セグメントに基づくものとし、フレームワーク３領域の末端に保存されているシステインとＪカッパ２に基づくフレームワーク４領域の間を、グルタミン−グルタミン−（ＮＮＫ）6−スレオニンのように無作為化した。カッパ軽鎖ライブラリーの配列と全体の設計を図１５に示す。
【０２５０】
カッパ軽鎖ライブラリーをコードしている直鎖ＤＮＡ分子をＰＣＲで生成した。このために、遺伝子全体を合成することで、２種類の鋳型を生成した（ジェンスクリプト、ピスカタウェイ、ニュージャージー、米国で実施）。一方では、ｐＵＣ５７（ジェンスクリプト、注文番号ＳＤ１１７６）、ｐＵＣ５７＿Ｖカッパ１−５（配列番号４５）のＥｃｏＲＶ部位にクローニングされたＶカッパ１−５遺伝子セグメントを含む合成構築物を生成し、他方で、Ｃカッパコード領域に融合させ、ｐＵＣ５７、ｐＵＣ５７＿Ｊカッパ２−Ｃカッパ（配列番号４６）のＥｃｏＲＶにクローニングしたＪカッパ２遺伝子セグメントを含む合成構築物を生成した。
【０２５１】
ｐＵＣ５７＿Ｖカッパ１−５から、プライマーｐＵＣ５７−１（５’−ＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’）およびＬＣＤＲ３−Ｂ（５’−ＣＴＧＴＴＧＧＣＡＧＴＡＡＴＡＡＧＴＴＧＣ−３’）を使って、Ｖカッパ１−５遺伝子セグメントを含む第一の直鎖ＤＮＡをＰＣＲで増幅した。無作為化したＣＤＲ３領域（Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−（ＮＮＫ）6−Ｔｈｒ）、Ｊカッパ２遺伝子セグメントおよびＣカッパ定常領域を含む第二の直鎖ＤＮＡは、ｐＵＣ５７＿Ｊカッパ２−Ｃカッパから、プライマーＬＣＤＲ３−ＮＮＫ６−Ｆ（５’−ＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＡＣＡＧＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＡＣＴＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧ−３’）およびｐＵＣ５７−２（５’−ＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧ−３’）を使って増幅した。プライマーＬＣＤＲ３−ＮＮＫ６−Ｆの無作為化した領域をプライミングすることによる、ｐＵＣ５７＿Ｊカッパ２−Ｃカッパへの配列バイアスの導入を防ぐため、プラスミドは最初にＳｃａＩ制限酵素で消化して直線化した（図１７Ａ）。
【０２５２】
得られたＤＮＡ分子（配列番号４７および配列番号４８）には２１ｂｐの重複があり、これらをプライマーｐＵＣ５７−１およびｐＵＣ５７−２を使ったオーバーラップエクステンションＰＣＲで組み合わせ、図１５に示すような、ＮｏｔＩおよびＡｓｕＩＩ（＝ＢｓｔＢＩ）制限酵素部位に挟まれたカッパ軽鎖ライブラリーを含むＤＮＡ分子を生成した。Ｖ−カッパ軽鎖ライブラリーのＰＣＲ増幅産物をＰＣＲ−断片の配列決定にかけ、その結果を図１８に示す。この結果は、無作為な位置で見られる重複した電気泳動シグナルから分かるように、予想した通りの多様性が実際に、設計通りＬＣＤＲ３の様々な位置に導入されたことを示している。このＰＣＲ断片を制限エンドヌクレアーゼであるＮｏｔＩとＢｓｔＢＩ（ＡｓｕＩＩのイソ制限酵素）で消化し、ピギーバックの転位性ベクター、ｐＰＢ−ＥＧＦＰ＿ＨＣ−ｇ１にクローニングし（配列番号０４９）、５．２×１０7個の独立したクローンからなるライブラリーを得た。このライブラリーの大きさは、ライゲーション反応の規模を大きくすることにより、因数１０で容易に大きくすることができる。
【０２５３】
個別の無作為化設計を組み込んだ軽鎖ライブラリー、または本実施例で用いたもの以外のＶカッパおよびＪカッパ遺伝子セグメントを含んでいる軽鎖ライブラリーも同じ様式で生産することができる。同様に、本明細書に記載した戦略は、Ｖラムダ軽鎖ライブラリーの生産にも利用することができる。
【０２５４】
実施例１２で参照される配列
【０２５５】
配列番号４５（ｐＵＣ５７＿Ｖカッパ１−５）
【０２５６】
配列番号４６（ｐＵＣ５７＿Ｊカッパ２−Ｃ−カッパ）
【０２５７】
配列番号４７（Ｖカッパ１−５ＰＣＲ産物）
【０２５８】
配列番号４８（ＮＮＫ６−Ｊカッパ２−Ｃ−カッパＰＣＲ産物）
実施例１３：様々な長さのＨＣＤＲ３を有する転位性のＩｇＨ鎖発現ライブラリーのクローニング
【０２５９】
無作為化したＨＣＤＲ３領域を有するヒトガンマ１重鎖ライブラリーを下記のように構築した。複数のアミノ酸残基、つまり、ＮＮＫ（Ｎは任意のヌクレオチド；ＫはＴまたはＧ）コドンでコードされているアミノ酸残基を無作為化した。このコドンはそれぞれ、２０種類のアミノ酸となる。ライブラリーは、ＶH３−３０およびＪH４遺伝子セグメントに基づくものとし、フレームワーク３領域の末端に保存されているシステインとＪH４に基づくフレームワーク４領域の間を、アラニン−リジン／アルギニン−（ＮＮＫ）n−アスパラギン酸−ＮＮＫのように無作為化した。ｎが４、６、８、または１０の様々な長さのＨＣＤＲ３が生じた（ＮＮＫ４、ＮＮＫ６、ＮＮＫ８、およびＮＮＫ１０無作為化）。ガンマ重鎖ライブラリーの配列と全体の設計を図１６に示す。
【０２６０】
重鎖可変領域（ＶH）のライブラリーをコードしている直鎖ＤＮＡ分子をＰＣＲで生成した。このために、遺伝子全体的を合成することで、２種類の鋳型を生成した（ジェンスクリプト、ピスカタウェイ、ニュージャージー、米国で実施）。一方では、ｐＵＣ５７、ｐＵＣ５７＿ＶH３−３０（配列番号４９）のＥｃｏＲＶ部位にクローニングされたＶH３−３０遺伝子セグメントを含む合成構築物を生成し、他方で、ｐＵＣ５７、ｐＵＣ５７＿ＪH４（配列番号５０）のＥｃｏＲＶ部位にクローニングされたＪH４遺伝子セグメントを含む合成構築物を生成した。
【０２６１】
ｐＵＣ５７＿ＶH３−３０から、プライマーＶH３−３０−Ｆ（５’−ＧＡＴＡＴＣＣＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧ−３’）およびＨＣＤＲ３−Ｂ（５’−ＣＧＣＡＣＡＧＴＡＡＴＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＧ−３’）を使って、ＶH３−３０遺伝子セグメントを含む第一の直鎖ＤＮＡをＰＣＲで増幅した。ＪH４遺伝子セグメントに融合させた無作為化したＨＣＤＲ３領域（アラニン−リジン／アルギニン−（ＮＮＫ）4−Ａｓｐ−ＮＮＫ、アラニン−リジン／アルギニン−（ＮＮＫ）6−Ａｓｐ−ＮＮＫ、アラニン−リジン／アルギニン−（ＮＮＫ）8−Ａｓｐ−ＮＮＫ、またはアラニン−リジン／アルギニン−（ＮＮＫ）10−アスパラギン酸−ＮＮＫ）を含むさらなる直鎖ＤＮＡ分子を、ｐＵＣ５７＿ＪＨ４から、それぞれプライマーＨＣＤＲ３−ＮＮＫ４−Ｆ（５’−ＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＲＧＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＡＣＮＮＫＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣ−３’）、ＨＣＤＲ３−ＮＮＫ６−Ｆ（５’−ＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＲＧＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＡＣＮＮＫＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣ−３’）、ＨＣＤＲ３−ＮＮＫ８−Ｆ（５’−ＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＲＧＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＡＣＮＮＫＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣ−３’）、またはＨＤＲ３−ＮＮＫ１０−Ｆ（５’−ＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＲＧＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＡＣＮＮＫＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣ−３’）をプライマーｐＵＣ５７−３（５’−ＣＡＧＧＴＴＴＣＣＣＧＡＣＴＧＧＡＡＡＧ−３’）と組み合わせて使用して増幅した。プライマーＨＣＤＲ３−ＮＮＫ４−Ｆ、ＨＣＤＲ３−ＮＮＫ６−Ｆ、ＨＣＤＲ３−ＮＮＫ８−ＦおよびＨＣＤＲ３−ＮＮＫ１０−Ｆの無作為化した領域をプライミングすることによる、ｐＵＣ５７＿ＪH４への配列バイアスの導入を防ぐため、プラスミドは最初にＤｒｄＩ制限酵素で消化して直線化した（図１７Ｂ）。
【０２６２】
得られたＶH３−３０のＰＣＲ産物（配列番号５１）には、ＮＮＫ４−ＪH４、ＮＮＫ６−ＪH４、ＮＮＫ８−ＪH４およびＮＮＫ１０−ＪH４のＰＣＲ産物（配列番号５２〜５５）と２２ｂｐの重複があり、これを、プライマーＶH３−３０−ＦおよびｐＵＣ５７−３を使った４回の個別の反応によるオーバーラップエクステンションＰＣＲによって、それぞれ組み合わせた。得られたＤＮＡ分子は、図１６に示すように、ＮｏｔＩとＮｈｅＩ制限酵素によって挟まれたＶHライブラリーを含むものであった。ＮＮＫ４−ＪH４、ＮＮＫ６−ＪH４、ＮＮＫ８−ＪH４およびＮＮＫ１０−ＪH４縮重オリゴを用いたＰＣＲから得られたＰＣＲ増幅産物を全て直接ＤＮＡ配列決定にかけ、ＨＣＤＲ３の設計した位置が予想通り無作為化されたことを確認した。これを一例として図１８（Ｂ）に示す。この図では、ＨＣＤＲ３に渡る領域の電気泳動図を示している。無作為化した位置は予想された配列ピークの重複を示しており、このことは、これらの位置のヌクレオチドが多様であることを示している（図１８）。４種類のＶHライブラリーＤＮＡを等モル比で混合し、制限エンドヌクレアーゼであるＮｏｔＩとＮｈｅＩで消化し、そしてピギーバックの転位性ベクター、ｐＰＢ−ＥＧＦＰ＿ＨＣ−ガンマ１（配列番号２２）のガンマ１重鎖定常領域の上流にクローニングして３．７×１０7個の独立したクローンからなるライブラリーを得た。このライブラリーの大きさは、ライゲーション反応の規模を大きくすることにより、因数１０で容易に大きくすることができる。
【０２６３】
個別の無作為化設計を組み込んだ重鎖ライブラリー、または本実施例で用いたもの以外のＶHおよびＪH遺伝子セグメントを含んでいる重鎖ライブラリーも同じ様式で生産することができる。
【０２６４】
ＤＮＡ実施例１３で参照される配列
【０２６５】
配列番号４９（ｐＵＣ５７＿ＶＨ３−３０）
【０２６６】
配列番号５０（ｐＵＣ５７＿ＪH４）
【０２６７】
配列番号５１（ＶH３−３０のＰＣＲ産物）
【０２６８】
配列番号５２（ＮＮＫ４−ＪH４のＰＣＲ産物）
【０２６９】
配列番号５３（ＮＮＫ６−ＪH４のＰＣＲ産物）
【０２７０】
配列番号５４（ＮＮＫ８−ＪH４のＰＣＲ産物）
【０２７１】
配列番号５５（ＮＮＫ１０−ＪH４のＰＣＲ産物）
実施例１４：抗原反応性でかつ濃縮された安定に転位した宿主細胞からの、可変軽鎖コード領域および可変重鎖コード領域の同定
【０２７２】
抗体重鎖および軽鎖をコードしている転位性の発現ベクターを宿主に安定に組み込んだことにより、可変重鎖コード領域および可変軽鎖コード領域を、標準的なＰＣＲ増幅とＰＣＲ増幅産物を直接配列決定することによる正攻法によって、または、再クローニングした場合には、再クローニングしたプラスミドベクターの配列を決定することによって、再単離することができる。このために、抗原特異的抗体を発現している単離した細胞または細胞クローンを５分間、１２００×ｇで遠心する。ＴＲＩｚｏｌ試薬（シグマ・アルドリッチ）を使用し、これらの細胞からトータルＲＮＡを単離する。パワースクリプト（ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ）（クロンテック−ライフ・テクノロジーズ）とオリゴ−ｄＴプライマーを使用して、一本鎖ｃＤＮＡを合成することができる。その後、軽鎖コード領域を、プライマーＳＰ−Ｆ（５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＡＡＴＴＴＴＧＧＡＣ−３’）およびＣＫ−ｒｅｖ（５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＣＧＡＡＡＧＣＧＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣ−３’）を使用してＰＣＲで増幅することができる。これらのプライマーを用いることで、ＰＣＲ増幅産物に含まれるＶ−カッパ領域によるが、およそ７４０ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られる。必要に応じて、その後の配列決定用に個々のＰＣＲ増幅産物をサブクローニングするために、このＰＣＲ増幅産物を制限エンドヌクレアーゼのＮｏｔＩとＢｓｔＢＩで消化し、ｐＰＢ−ＥＧＦＰ＿ＨＣ−ｇ１ベクター（配列番号２２）にクローニングすることができる。個々のＶ−カッパ領域のクローンをその後、クローニングしたＶ−コード領域の上流のＥＦ１−アルファプロモーターに結合するプライマーｐＰＢ−ｓｅｑ１３（５’−ＧＧＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧＡＴＧ−３’）を使った配列決定にかけることができる。
【０２７３】
プライマーＳＰ−Ｆ（５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＡＡＴＴＴＴＧＧＡＣ−３’）およびＣＧ−ｒｅｖｓｅｑ−１（５’−ＧＴＴＣＧＧＧＧＡＡＧＴＡＧＴＣＣＴＴＧ−３’）を使ったＰＣＲにより、上述のように生成したｃＤＮＡから重鎖可変領域を増幅することができる。これらのプライマーを使用すると、ＰＣＲ増幅産物に含まれるＶH−領域の長さによるが、予想サイズがおよそ５３０ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られる。必要に応じて、このＰＣＲ増幅産物を制限エンドヌクレアーゼのＮｏｔＩとＮｈｅＩで消化し、ｐＰＢ−ＥＧＦＰ＿ＨＣ−ｇ１ベクター（配列番号２２）にクローニングすることができる。その後、個々のクローンを、クローニングしたＶ−コード領域の上流のＥＦ１−アルファプロモーターに結合するプライマーｐＰＢ−ｓｅｑ１３（５’−ＧＧＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧＡＴＧ−３’）を使ったＶH−領域の配列決定かける。
【０２７４】
発明の態様
１．所望の結合特異性または機能を有するポリペプチドを同定するための方法であって、この方法は、
（ｉ）種々の結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの多様なコレクションを生成すること、ここで前記ポリヌクレオチドは、少なくとも１種のトランスポサーゼ酵素によって認識される第一のおよび第二の逆方向末端反復配列の間に配置されており、かつ、これと機能するポリペプチドをコードしている配列を含み、
（ｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドの多様なコレクションを宿主細胞に導入すること；
（ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドの多様なコレクションが宿主細胞のゲノムに組み込まれ、種々の結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている前記ポリヌクレオチドの多様なコレクションを発現する宿主細胞が生じるように、前記逆方向末端反復配列と機能する少なくとも１種のトランスポサーゼ酵素を前記宿主細胞中で発現させること；
（ｉｖ）所望の結合特異性または機能を有するポリペプチドを発現している宿主細胞を同定するために、前記宿主細胞をスクリーニングすること；および
（ｖ）前記ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を前記宿主細胞から単離すること、
を含む。
２．前記ポリヌクレオチドがＤＮＡ分子である、１に記載の方法。
３．前記ポリヌクレオチドが受容体のリガンド結合配列または結合分子の標的結合配列を含む、１に記載の方法。
４．前記ポリヌクレオチドが抗体の抗原結合配列を含む、１に記載の方法。
５．前記ポリヌクレオチドが、抗体のＶＨもしくはＶＬ領域またはその抗原結合断片をコードしている配列を含む、１に記載の方法。
６．前記ポリヌクレオチドが抗体のＶＨ領域と抗体のＶＬ領域をコードしている配列を含む、１に記載の方法。
７．前記ポリヌクレオチドが完全長の免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖またはその抗原結合断片をコードしている配列を含む、１に記載の方法。
８．前記ポリヌクレオチドが一本鎖ＦｖまたはＦａｂドメインをコードしている配列を含む、１に記載の方法。
９．前記ポリヌクレオチドの多様なコレクションを生成することが、Ｖ領域遺伝子配列を突然変異誘発条件下でのＰＣＲにかけることを含む、１に記載の方法。
１０．前記ポリヌクレオチドの多様なコレクションを生成することが、遺伝子合成を含む、１に記載の方法。
１１．前記ポリヌクレオチドの多様なコレクションを生成することが、脊椎動物のＢ細胞由来のＶ領域レパートリーをＰＣＲで増幅することを含む、１に記載の方法。
１２．前記ポリヌクレオチドの多様なコレクションがプラスミドベクターを含む、１に記載の方法。
１３．前記ポリヌクレオチドの多様なコレクションが二本鎖ＤＮＡのＰＣＲ増幅産物を含む、１に記載の方法。
１４．前記抗原結合配列が脊椎動物のものである、４に記載の方法。
１５．前記抗原結合配列が哺乳類のものである、４に記載の方法。
１６．前記抗原結合配列がヒトのものである、４に記載の方法。
１７．前記プラスミドベクターがさらにマーカー遺伝子をコードしている、１２に記載の方法。
１８．前記マーカーが、蛍光マーカー、細胞表面マーカーおよび選択マーカーからなる群より選択される、１７に記載の方法。
１９．前記マーカー遺伝子配列が、結合特異性または機能を有しているポリペプチドをコードしている配列の上流または下流にあるが、逆方向末端反復配列の間にはない、１７に記載の方法。
２０．前記マーカー遺伝子配列が、結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている前記配列の下流にあり、かつ、配列内部リボソーム進入部位で隔てられている、１７に記載の方法。
２１．工程（ｉｉ）が、免疫グロブリンのＶＨもしくはＶＬ領域、またはその抗原結合断片をコードしている配列を含んでいるポリヌクレオチドを前記宿主細胞に導入することを含み、ここで前記ＶＨおよびＶＬ領域配列が別々のベクターにコードされている、１に記載の方法。
２２．工程（ｉｉ）が完全長の免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖、またはその抗原結合断片をコードしている配列を含んでいるポリヌクレオチドを前記宿主細胞に導入することを含み、ここで前記完全長の重鎖および軽鎖配列が別々のベクター上にある、２１に記載の方法。
２３．ＶＨ配列を含んでいる前記ベクターとＶＬ配列を含んでいる前記ベクターが前記宿主細胞に同時に導入される、２１に記載の方法。
２４．ＶＨ配列を含んでいる前記ベクターとＶＬ配列を含んでいる前記ベクターが前記宿主細胞に順次導入される、２１に記載の方法。
２５．工程（ｉｉ）が抗体のＶＨ鎖とＶＬ鎖をコードしている配列を含んでいる一本のベクターを前記宿主細胞に導入することを含む、１に記載の方法。
２６．工程（ｉｉ）が完全長免疫グロブリン重鎖と完全長免疫グロブリン軽鎖をコードしている配列を含んでいる一本のベクターベクターを前記宿主細胞に導入することを含む、１に記載の方法。
２７．ＶＨ配列を含んでいる前記ベクターが、ＶＬ配列を含んでいるベクターに含まれている逆方向末端反復配列とは別のトランスポサーゼ酵素によって認識される逆方向末端反復配列を含むＶＨ配列を含んでいる、２１に記載の方法。
２８．工程（ｉｉ）の宿主細胞が脊椎動物の細胞である、１に記載の方法。
２９．前記宿主細胞が哺乳類のものである、２８に記載の方法。
３０．前記宿主細胞がヒトまたは齧歯類の細胞である、２９に記載の方法。
３１．前記脊椎動物の宿主細胞がリンパ細胞である、２８に記載の方法。
３２．前記宿主細胞がＢ細胞である、３１に記載の方法。
３３．前記宿主細胞がプロ（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）Ｂ細胞またはプレ（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）Ｂ細胞である、３２に記載の方法。
３４．前記宿主細胞が、エーベルソン−マウス白血病ウイルスで形質転換したプロＢ細胞もしくはプレＢ細胞、ならびに初期免疫グロブリン−ヌルＥＢＶで形質転換したヒトプロＢおよびプレＢ細胞からなる群より選択される、３３に記載の方法。
３５．前記宿主細胞が、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、Ｘ６３細胞、およびＡｇ８６５３細胞からなる群より選択される、３２に記載の方法。
３６．前記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ＢＨＫ細胞、および２９３細胞からなる群より選択される、２９に記載の方法。
３７．前記発現させる工程（ｉｉｉ）が、少なくとも１種の逆方向末端反復配列を認識し、これと機能するトランスポサーゼ酵素をコードしている発現ベクターを前記宿主細胞に導入することを含む、１に記載の方法。
３８．前記トランスポサーゼ酵素をコードしている前記ベクターが、ポリヌクレオチドの多様なコレクションと同時に、またはポリヌクレオチドの多様なコレクションの前にもしくは後に前記宿主細胞に導入される、３７に記載の方法。
３９。前記トランスポサーゼ酵素が前記宿主細胞中で一過的に発現される、３７に記載の方法。
４０．前記発現させる工程（ｉｉｉ）が、宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれている誘導性の発現系を誘導することを含む、１に記載の方法。
４１．前記誘導性の発現系が、テトラサイクリン誘導性またはタモキシフェン誘導性である、４０に記載の方法。
４２．前記スクリーニングする工程（ｉｖ）が、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、固相表面に固定した分子に対するパニング、細胞性の、天然または人工的に再構成した脂質二重膜に組み込まれた細胞膜関連分子への結合に関する選抜、またはマルチウェルフォーマットでの、所望の機能または結合表現型に関する個々の細胞クローンの高処理スクリーニングを含む、１に記載の方法。
４３．前記スクリーニングする工程（ｉｖ）が、所望の標的結合特異性または機能を有するポリペプチドを同定するためにスクリーニングすることを含む、１に記載の方法。
４４．前記スクリーニングする工程（ｉｖ）が、所望の抗原特異性を有する抗原結合分子を同定するためにスクリーニングすることを含む、１に記載の方法。
４５．前記スクリーニングする工程が、１つ以上の所望の機能特性を有する抗原結合分子を同定するためにスクリーニングすることをさらに含む、４４に記載の方法。
４６．前記スクリーニングする工程（ｉｖ）が、個々の細胞濃縮サイクルの間に宿主細胞を増殖させることを伴う、複数回の細胞濃縮サイクルを含む、１に記載の方法。
４７．所望の結合特異性または機能を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を単離する前記工程（ｖ）が、ゲノムＰＣＲ増幅もしくはＲＴ−ＰＣＲ増幅または次世代ディープシークエンシングを含む、１に記載の方法。
４８．（ｖ）で得られたポリヌクレオチド配列の（ｖｉ）親和性を最適化することをさらに含む、１に記載の方法。
４９．前記親和性の最適化が突然変異誘発条件下でのゲノムＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲを含む、４８に記載の方法。
５０．突然変異を生成した配列を、１の（ｉ）から（ｖ）の工程にかけることをさらに含む、４９に記載の方法。
５１．前記逆方向末端反復配列がピギーバックのトランスポゾン系に由来する、１に記載の方法。
５２．上流のピギーバック逆方向末端反復配列をコードしている配列が配列番号１を含む、５１に記載の方法。
５３．下流のピギーバック逆方向末端反復配列をコードしている配列が配列番号２を含む、５１に記載の方法。
５４．前記ＶＨまたはＶＬ領域配列が、ヒト抗ＴＮＦアルファ抗体由来の配列をコードしている、５に記載の方法。
５５．前記ヒト抗ＴＮＦアルファ抗体がＤ２Ｅ７である、５４に記載の方法。
５６．Ｄ２Ｅ７のＶＨ領域およびＶＬ領域が別々の転位性のベクターによってコードされている、５５に記載の方法。
５７．前記ＶＬ領域配列を含んでいる前記ベクターが配列番号５を含む、５６に記載の方法。
５８．前記ＶＨ領域配列を含んでいる前記ベクターが配列番号８を含む、５６に記載の方法。
５９．前記ＶＨ領域配列を含んでいる前記ベクターが配列番号９に示す無作為化した配列を含む、５６に記載の方法。
６０．前記ＶＬ領域配列を含んでいる前記ベクターが配列番号１０に示す無作為化した配列を含む、５６に記載の方法。
６１．工程（ｉｉｉ）が、機能性ピギーバックトランスポサーゼをコードしている配列を含んでいるベクターを前記宿主細胞に導入することを含む、１に記載の方法。
６２．前記ベクターが配列番号１１を含む、６１に記載の方法。
６３．前記ベクターが、配列番号１２、または配列番号１２と少なくとも９５％のアミノ酸配列相同性を有し、かつ、同じまたは相同の逆方向末端反復配列特異性を有する配列をコードしている、６１に記載の方法。
６４．前記逆方向末端反復配列が、ピギーバック（ＰｉｇｇｙＢａｃ）、スリーピングビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ）、フロッグプリンス（Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ）、ハイマー１（Ｈｉｍａｒ１）、パスポート（Ｐａｓｓｐｏｒｔ）、ミノス（Ｍｉｎｏｓ）、ｈＡＴ、トール１（Ｔｏｌ１）、トール２（Ｔｏｌ２）、Ａｃ／Ｄｓ、ＰＩＦ、ハービンジャー（Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ）、ハービンジャー３−ＤＲ（Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ３−ＤＲ）、およびＨｓｍａｒ１からなる群より選択される少なくとも１種のトランスポサーゼによって認識され、かつ、それと機能する、１に記載の方法。
６５．種々の結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている、複数のポリヌクレオチド分子を含んでいるポリヌクレオチド分子のライブラリーであって、ここで前記ポリヌクレオチド分子は、少なくとも１種のトランスポサーゼ酵素によって認識され、かつ、これと機能する逆方向末端反復配列の間に配置されている結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている配列を含む、ポリヌクレオチド分子のライブラリー。
６６．前記ポリヌクレオチドがＤＮＡ分子である、６５に記載のライブラリー。
６７．前記ポリヌクレオチドが受容体のリガンド結合配列または結合分子の標的結合配列を含む、６５に記載のライブラリー。
６８．前記ポリヌクレオチドが抗体の抗原結合配列をコードしている少なくとも１種の配列を含む、６５に記載のライブラリー。
６９．前記ポリヌクレオチドが抗体のＶＨもしくはＶＬ領域またはその抗原結合断片をコードしている配列を含む、６５に記載のライブラリー。
７０．前記ポリヌクレオチドが抗体のＶＨ領域および抗体のＶＬ領域をコードしている配列を含む、６５に記載のライブラリー。
７１．前記ポリヌクレオチドが完全長の免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖、またはその抗原結合断片をコードしている配列を含む、６５に記載のライブラリー。
７２．前記ポリヌクレオチドが一本鎖ＦｖまたはＦａｂドメインをコードしている配列を含む、６５に記載のライブラリー。
７３．前記ポリヌクレオチド分子がプラスミドである、６５に記載のライブラリー。
７４．前記ポリヌクレオチド分子は二本鎖ＤＮＡのＰＣＲ増幅産物である、６５に記載のライブラリー。
７５．前記プラスミドがマーカー遺伝子をコードしている配列をさらに含む、７３に記載のライブラリー。
７６．前記プラスミドが逆方向末端反復配列を認識し、これと機能するトランスポサーゼ酵素をコードしている配列をさらに含む、７３に記載のライブラリー。
７７．種々の結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている転位性ポリヌクレオチドのライブラリーを生成するための方法であって、この方法は、
（ｉ）種々の結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている配列を含んでいるポリヌクレオチドの多様なコレクションを生成することを含み、ここで前記ポリヌクレオチドは、少なくとも１種のトランスポサーゼ酵素によって認識され、かつ、これと機能する逆方向末端反復配列の間に配置されている、結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている配列を含む。
７８．少なくとも１種のトランスポサーゼ酵素によって認識され、かつ、これと機能する逆方向末端反復配列の間に配置されている、抗体のＶＨもしくはＶＬ領域、またはその抗原結合部分をコードしている配列を含んでいるベクター。
７９．免疫グロブリンの完全長重鎖または軽鎖をコードしている配列を含んでいる、７８に記載のベクター。
８０．前記ＶＨまたはＶＬ領域の配列が無作為化されている、７８に記載のベクター。
８１．前記逆方向末端反復配列がピギーバックのトランスポサーゼによって認識され、かつ、これと機能する、７８に記載のベクター。
８２．前記ＶＨまたはＶＬ領域の配列が抗ＴＮＦアルファ抗体に由来するものである、７８に記載のベクター。
８３．前記抗体がＤ２Ｅ７である、８２に記載のベクター。
８４．配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１９からなる群より選択される少なくとも１種の配列を含んでいる、７８に記載のベクター。
８５．７８〜８４のいずれか１項に記載のベクターを含んでいる宿主細胞。
８６．前記ＶＨまたはＶＬ領域配列をコードしているベクターに含まれている少なくとも１つの逆方向末端反復配列を認識し、かつ、これと機能するトランスポサーゼをコードしている配列を含んでいる発現ベクターをさらに含む、８５に記載の宿主細胞。
８７．１を含む方法によって産生される抗体。
８８．前記逆方向末端反復配列がスリーピングビューティーのトランスポゾン系に由来するものである、１に記載の方法。
８９．上流のスリーピングビューティー逆方向末端反復配列をコードしている配列が配列番号１４を含む、８８に記載の方法。
９０．下流のスリーピングビューティー逆方向末端反復配列をコードしている配列が配列番号１５を含む、８８に記載の方法。
９１．工程（ｉｉｉ）が、機能性のスリーピングビューティートランスポサーゼを含んでいるベクターを前記宿主細胞中で発現させることを含む、８８に記載の方法。
９２．（ｖ）で得られた前記ポリヌクレオチド配列が抗体のＶＨもしくはＶＬ領域、またはその抗原結合断片をコードしている配列を含む４８に記載の方法であって、ここで前記抗体の最適化は、前記ＶＨまたはＶＬの相補性決定領域またはフレームワーク領域に１つ以上の突然変異を導入することを含む。
９３．前記完全長の免疫グロブリン重鎖が抗体重鎖の天然のイントロン／エクソン構造を含む、７１に記載のライブラリー。
９４．前記完全長の免疫グロブリン重鎖が内生の膜アンカードメインを含む、９３に記載のライブラリー。
９５．種々の結合特異性または機能を有するポリペプチドを発現することができる宿主細胞集団を生成するための方法であって、
（ｉ）種々の結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている配列を含んでいるポリヌクレオチドの多様なコレクションを生成すること、ここで前記ポリヌクレオチドは、少なくとも１種のトランスポサーゼ酵素によって認識され、かつ、これと機能する逆方向末端反復配列の間に配置されている、結合特異性または機能を有するポリペプチドをコードしている配列を含み；および
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドの多様なコレクションを宿主細胞に導入すること、
を含む、宿主細胞集団を生成するための方法。
９６．前記逆方向末端反復配列がスリーピングビューティーのトランスポサーゼによって認識され、かつ、これと機能する、７８に記載のベクター。
９７．工程（ｉｉｉ）が、配列番号１７を含むベクターを前記宿主細胞中で発現させることを含む、９１に記載の方法。
９８．前記ベクターが、配列番号１８、または配列番号１８と少なくとも９５％のアミノ酸配列相同性を有し、かつ、同じまたは相同の逆方向末端反復配列特異性を有する配列をコードしている、９１に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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