(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む細胞であって、前記キシロースイソメラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、且つ前記ヌクレオチド配列が前記宿主にとって異種である、細胞。
【請求項２】
酵母細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列が、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の細胞から得られる、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クロエケラ属（Ｋｌｏｃｋｅｒａ）、シュワンニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）又はヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の酵母細胞である、請求項２又は３に記載の細胞。
【請求項５】
前記酵母細胞が、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）、Ｓ．バルネッチ（Ｓ．ｂａｒｎｅｔｔｉ）、Ｓ．エクシグウス（Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ）、Ｓ．ウバルム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）、Ｓ．ジアスタチカス（Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．マルクシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）又はＫ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）の種である、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
前記細胞が、
ａ．キシルロースキナーゼ活性の増加；
ｂ．ペントースリン酸経路を通じる流束の増加；
ｃ．アルドースレダクターゼ活性の減少；又は
ｄ．カタボライト抑制に対する感受性の減少；
をもたらす１つ以上の遺伝子修飾を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
前記１つ以上の遺伝子修飾が、前記ペントースリン酸経路の非酸化的部分の酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の過剰発現をもたらす、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
前記遺伝子が、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼ又はトランスアルドラーゼをコードする遺伝子である、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
前記１つ以上の遺伝子修飾が、キシルロースキナーゼをコードする遺伝子の過剰発現をもたらす、請求項６〜８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１０】
前記１つ以上の遺伝子修飾が、前記細胞における非特異的アルドースレダクターゼ活性の減少をもたらす、請求項６〜９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】
Ｌ−アラビノースを使用する能力を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞であって、遺伝子ＴＡＬ１、ＴＫＬ１、ＲＰＥ１及びＲＫＩ１が過剰発現する、細胞。
【請求項１２】
ＧＲＥ３遺伝子のコード領域が、前記コード領域を遺伝子ＴＡＬ１、ＴＫＬ１、ＲＰＥ１及びＲＫＩ１を含むヌクレオチド配列に置換することにより不活性化される、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３】
ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来の遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢ及びａｒａＤが発現する、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４】
１つ以上の構成的に発現した又は構成的に過剰発現した遺伝子が、前記細胞のゲノムに安定に組み込まれる、請求項６〜１３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５】
発酵生成物の生成方法において、キシロース供給源を含有する培地を、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の細胞で発酵させる工程であって、前記細胞によりキシロースが前記発酵生成物に発酵される工程を含む方法。
【請求項１６】
前記発酵生成物が、エタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパンジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質及びセファロスポリンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
嫌気的である、請求項１５又は１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、キシロースをキシルロースに異性化する能力を有する細胞に関する。本発明はまた、かかる細胞が発酵生成物、例えばエタノールの生成に用いられる方法にも関する。
【０００２】
［発明の背景］
ここ数十年における従来の化石燃料（石油系燃料）の大量消費は、高レベルの汚染の一因となっている。これにより、世界の化石燃料資源には限りがあるという認識及び高まりつつある環境意識と相まって、エタノールなどの代替燃料の実現可能性を調査する新たな試みが活発化している。エタノールは、粒子状物質を生じない燃焼の燃料供給源であり、毎リットル基準で無鉛ガソリンと比べて放出するＣＯ２が少ない。
【０００３】
バイオマス由来のエタノールは、多くの異なる供給源から得られるヘキソース糖類の発酵により製造し得るが、ショ糖及びコーンスターチなど、燃料アルコールを商業規模で製造するために典型的に用いられる基質は高価である。従って燃料エタノールの増産には、より低価な供給原料の使用が必要となり得る。
【０００４】
現在、現行のエタノール製造に用いられる作物の代替とするのに十分な量で利用可能であるのは、植物バイオマス由来のリグノセルロース系の供給原料のみである。ほとんどのリグノセルロース系材料において、グルコースに次ぐ二番目に多い糖はキシロースである。従って、経済的に見合う燃料生産プロセスとするには、ヘキソース及びペントースの双方の糖を発酵させてエタノールを形成しなければならない。酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）はロバストで、エタノール製造によく適合しているものの、キシロースを炭素源として使用してエタノールを生成することができない。また、高いエタノール収率並びに高いエタノール生産性でキシロースをエタノールに発酵することのできる天然に存在する生物は、知られていない。
【０００５】
従って、リグノセルロース系供給原料からの商業的に実行可能なエタノール製造が可能となるように、これらの特性を備えた生物が必要とされている。
【０００６】
［発明の概要］
本発明によれば、発酵能、例えばアルコール発酵能を有し、且つキシロースを炭素源として使用する能力を有する細胞が提供される。かかる細胞は、キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、ここでキシロースイソメラーゼのアミノ酸配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％の配列同一性を有し、且つヌクレオチド配列は宿主にとって異種である。かかる細胞は、キシロースを炭素源として使用するとき、野生型糸状菌類と比較してより多量のエタノールを生成する。
【０００７】
本発明はまた、以下も提供する：
−発酵生成物の生成方法、この方法は、キシロース供給源を含有する培地を本発明の細胞で発酵させる工程であって、細胞によりキシロースが発酵生成物に発酵される工程を含む；
−発酵生成物の生成方法、この方法は、少なくともキシロース供給源及びＬ−アラビノース供給源を含有する培地を、Ｌ−アラビノースの利用能もまた有する本発明の定義されるとおりの細胞で発酵させる工程であって、細胞によりキシロース及びＬ−アラビノースが発酵生成物に発酵される工程を含む；及び
−発酵生成物の生成方法、この方法は、少なくともキシロース供給源及びＬ−アラビノース供給源を含有する培地を、本発明の細胞及びＬ−アラビノースを使用する能力がある細胞で発酵させる工程であって、それにより各細胞がキシロース及び／又はアラビノースを発酵生成物に発酵する工程を含む。
【０００８】
ある実施形態では、細胞は、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の細胞、例えばクロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）細胞から得られるキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、ヌクレオチドは野生型であってもよく、又はコドン最適化されていてもよく、又はコドンペア最適化されていてもよい。
【０００９】
本発明はさらに、発酵生成物の生成方法における本発明の細胞の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現用のクロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）由来のキシロースイソメラーゼをコードするｐ４２７−ＴＥＦのプラスミドマップを示す。ＣｐＯは、コドンペア最適化されていることを意味する。
【図２】単一炭素源としての２％キシロース上におけるｐＰＷＴ２１５で形質転換したＢＩＥ１０４Ｐ１、及びプラスミドにおいてＤＮＡなしに形質転換した参照株（モック形質転換）の増殖曲線を示す。数字「１」及び「２」は、培養物のアリコートを新鮮培地に移し替えたことを示す。最後の一つ（２回目の移し替え後）を除き、全ての培養物は空気の存在下でインキュベートした。
【図３】実施例６からの、株ＢＩＥ２９２ＸＩ（Ｃ．ベイジェリンキ（Ｃ．ｂｅｙｅｒｉｎｃｋｉｉ））（黒色の線）及びモック株（灰色の線）の増殖曲線を示す。
【００１１】
［配列表の簡単な説明］
配列番号１は、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）由来のコドンペア最適化キシロースイソメラーゼ配列を示す。
【００１２】
配列番号２は、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）由来のキシロースイソメラーゼのアミノ酸配列を示す。
【００１３】
配列番号２は、フォワードプライマーの配列を示す。
【００１４】
配列番号４は、リバースプライマーの配列を示す。
【００１５】
［発明の詳細な説明］
本明細書及び添付の特許請求の範囲の全体を通して、語句「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「〜を包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び変化形、例えば「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「〜を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「〜を包含している（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、包含的に解釈されるべきである。すなわちこれらの語句には、文脈上許容される場合に、具体的に記載されない他の要素又は完全体が包含される可能性があることを伝える意図がある。
【００１６】
本発明は、キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む細胞に関し、ここでキシロースイソメラーゼのアミノ酸配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有し、且つヌクレオチド配列は宿主にとって異種である。
【００１７】
キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列の存在により、細胞に対し、キシロースをキシルロースに異性化する能力が付与される。
【００１８】
「キシロースイソメラーゼ」（ＥＣ５．３．１．５）は、本明細書では、Ｄ−キシロースからＤ−キシルロースへの直接の異性化及び／又はその逆を触媒する酵素として定義される。この酵素は、Ｄ−キシロースケトイソメラーゼとしても知られる。本明細書におけるキシロースイソメラーゼはまた、Ｄ−グルコースとＤ−フルクトースとの間の変換を触媒する能力も有し得る（それに伴い、故にグルコースイソメラーゼと称することができる）。本明細書におけるキシロースイソメラーゼは、補因子として二価カチオン、例えばマグネシウム、マンガン又はコバルトを必要とし得る。
【００１９】
従って、本発明の細胞は、キシロースをキシルロースに異性化する能力を有する。キシロースをキシルロースに異性化する能力は、宿主細胞に対し、定義されたキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトで宿主細胞を形質転換することにより付与される。本発明の細胞は、キシロースからキシルロースへの直接の異性化によりキシロースをキシルロースに異性化する。これは、キシロースからキシリトール中間体を介してキシルロースに至る、それぞれキシロースレダクターゼ及びキシリトールデヒドロゲナーゼにより触媒されるとおりの二段階変換とは対照的に、キシロースイソメラーゼにより触媒される単一の反応でキシロースがキシルロースに異性化されることを意味するものと理解される。
【００２０】
キシロースイソメラーゼ活性の単位（Ｕ）は、本明細書では、Ｋｕｙｐｅｒら（２００３、ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．４：６９−７８）により記載されるとおりの条件下で毎分１ｎｍｏｌのキシルロースを生成する酵素の量として定義され得る。
【００２１】
本発明の細胞は、配列番号２のアミノ酸配列又はそれと少なくとも７４％の配列同一性を有する配列を有するキシロースイソメラーゼに関連して定義される。同様に、本発明の細胞は、かかるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であるキシロースイソメラーゼに関連して定義され得る。
【００２２】
配列番号２は、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）由来のキシロースイソメラーゼのアミノ酸配列を示す。本発明の細胞は、配列番号２のアミノ酸又はそれと少なくとも７４％の配列同一性を有するものを有するキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
好ましくは、本発明に係る細胞は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％又は少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有するキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む細胞である。本発明に係る細胞は、配列番号１に示される核酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％又は少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有する、キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【００２４】
配列同一性（又は配列類似性）は、本明細書では、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質）配列間又は２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列間の、それらの配列を比較することにより決定されるときの関係として定義される。通常、配列同一性又は類似性は比較され、典型的には配列の長さ全体にわたり比較される。しかしながら、配列は、より短い比較ウィンドウにわたり比較されてもよい。当該技術分野では、「同一性」はまた、アミノ酸配列間又は核酸配列間の、場合によってはかかる配列のストリング間を一致させることにより決定されるとおりの、配列関連性の程度も意味する。
【００２５】
同一性を決定するための好ましい方法は、試験配列間で最大の一致を得るように設計される。同一性及び類似性を決定するための方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにコード化されている。２つの配列間の同一性及び類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法としては、例えばＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡが挙げられる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）、ＮＣＢＩ及び他の供給元から公的に利用可能（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ  ２０８９４）。ＢＬＡＳＴＰを用いたアミノ酸配列比較に好ましいパラメータは、ギャップ開始１１．０、ギャップ伸長１、Ｂｌｏｓｕｍ６２行列である。ＢＬＡＳＴＰを用いた核酸配列比較に好ましいパラメータは、ギャップ開始１１．０、ギャップ伸長１、ＤＮＡ完全行列（ＤＮＡ  ｆｕｌｌ  ｍａｔｒｉｘ）（ＤＮＡ同一性行列（ＤＮＡ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｍａｔｒｉｘ））である。
【００２６】
場合により、当業者はまた、アミノ酸類似性の程度を決定するにおいて、当業者には明らかであろうとおりの、いわゆる「保存的な」アミノ酸置換を考慮に入れてもよい。
【００２７】
保存的アミノ酸置換は、同様の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有する一群のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンである；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有する一群のアミノ酸は、セリン及びスレオニンである；アミド含有側鎖を有する一群のアミノ酸は、アスパラギン及びグルタミンである；芳香族側鎖を有する一群のアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンである；塩基性側鎖を有する一群のアミノ酸は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンである；及び硫黄含有側鎖を有する一群のアミノ酸は、システイン及びメチオニンである。
【００２８】
好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。本明細書に開示されるアミノ酸配列の置換変異体は、開示される配列中の少なくとも１つの残基が取り除かれ、その代わりに異なる残基が挿入されているものである。好ましくは、アミノ酸変化は保存的である。天然に存在するアミノ酸の各々についての好ましい保存的置換は、以下のとおりである：Ａｌａからｓｅｒ；Ａｒｇからｌｙｓ；Ａｓｎからｇｌｎ又はｈｉｓ；Ａｓｐからｇｌｕ；Ｃｙｓからｓｅｒ又はａｌａ；Ｇｌｎからａｓｎ；Ｇｌｕからａｓｐ；Ｇｌｙからｐｒｏ；Ｈｉｓからａｓｎ又はｇｌｎ；Ｈｅからｌｅｕ又はｖａｌ；Ｌｅｕからｉｌｅ又はｖａｌ；Ｌｙｓからａｒｇ；ｇｌｎ又はｇｌｕ；Ｍｅｔからｌｅｕ又はｉｌｅ；Ｐｈｅからｍｅｔ、ｌｅｕ又はｔｙｒ；Ｓｅｒからｔｈｒ；Ｔｈｒからｓｅｒ；Ｔｒｐからｔｙｒ；Ｔｙｒからｔｒｐ又はｐｈｅ；及び、Ｖａｌからｉｌｅ又はｌｅｕ。
【００２９】
本発明に係るキシロースからキシルロースへの変換を触媒する酵素をコードするヌクレオチド配列はまた、中程度の、又は好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において配列番号２に示される配列又はそれと少なくとも７４％の配列同一性を有する配列を有する酵素をコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズするその能力によっても定義され得る。
【００３０】
形式上、かかるヌクレオチド配列は、配列番号２に示される配列又はそれと少なくとも７４％の配列同一性を有する配列を有する酵素をコードするヌクレオチド配列の逆相補体とハイブリダイズし、例えば配列番号１又は２の逆相補体とハイブリダイズする配列である。
【００３１】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、本明細書では、少なくとも約２５、好ましくは約５０ヌクレオチド、７５又は１００及び最も好ましくは約２００ヌクレオチド又はそれ以上の核酸配列のハイブリダイゼーションが、約１Ｍ塩、好ましくは６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム）を含む溶液又は同等のイオン強度を有する任意の他の溶液において約６５℃の温度で、及び約０．１Ｍ塩、又はそれ以下、好ましくは０．２×ＳＳＣを含む溶液又は同等のイオン強度を有する任意の他の溶液における６５℃での洗浄で可能な条件として定義される。好ましくは、ハイブリダイゼーションは一晩、すなわち少なくとも１０時間実施され、好ましくは洗浄は少なくとも１時間、少なくとも２回の洗浄溶液交換を伴い実施される。これらの条件により、通常、約９０％又はそれ以上の配列同一性を有する配列の特異的なハイブリダイゼーションが可能となり得る。
【００３２】
中程度の条件は、本明細書では、少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは約２００ヌクレオチド又はそれ以上の核酸配列のハイブリダイゼーションが、約１Ｍ塩、好ましくは６×ＳＳＣを含む溶液又は同等のイオン強度を有する任意の他の溶液において約４５℃の温度で、及び約１Ｍ塩、好ましくは６×ＳＳＣを含む溶液又は同等のイオン強度を有する任意の他の溶液における室温での洗浄で可能な条件として定義される。好ましくは、ハイブリダイゼーションは一晩、すなわち少なくとも１０時間実施され、好ましくは洗浄は少なくとも１時間、少なくとも２回の洗浄溶液交換を伴い実施される。これらの条件により、通常、最大５０％の配列同一性を有する配列の特異的なハイブリダイゼーションが可能となり得る。当業者は、これらのハイブリダイゼーション条件を修正して、５０％〜９０％の様々な同一性の配列を特異的に同定することができるであろう。
【００３３】
導入された酵素が本発明の細胞において活性型で発現する可能性を高めるため、対応するコードヌクレオチド配列を、そのコドン使用が選択した酵母細胞のコドン使用に最適化されるように適合させてもよい。いくつかのコドン最適化方法が当該技術分野において公知である。ヌクレオチド配列のコドン使用を酵母のコドン使用に最適化する好ましい方法は、国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレット及び／又は国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットに開示されるとおりのコドンペア最適化技法である。国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットは、コドンペア最適化を取り上げている。コドンペア最適化は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をそのコドン使用、特に用いられるコドンペアに関して修飾することで、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現の向上及び／又はコードされるポリペプチドの産生の向上を達成する方法である。コドンペアは、あるコード配列における２つの続くトリプレット（コドン）として定義される。
【００３４】
遺伝子発現及び翻訳効率の簡易尺度として、本明細書では、Ｘｕｈｕａ  Ｘｉａ、Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００７：３  ５３−５８に記載されるとおりのコドン適応指数（Ｃｏｄｏｎ  Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ：ＣＡＩ）を使用する。この指数は、ある種由来の高発現遺伝子の参照セットを使用して各コドンの相対的なメリットを評価するもので、遺伝子のスコアが、当該の遺伝子における全てのコドンの使用頻度から計算される。この指数は、コドン使用パターンの形成において選択が有効となった程度を評価する。その点で、これは遺伝子の発現レベルの予測、ウイルス遺伝子のその宿主に対する適応の評価、及び異なる生物におけるコドン使用頻度の比較実施に有用である。この指数はまた、異種遺伝子発現が成功する可能性の近似的な指標も提供し得る。本発明に係るコドンペア最適化遺伝子では、ＣＡＩは０．６以上、０．７以上、０．８以上、０．８５以上、０．８７以上、０．９０以上、０．９５以上、又は約１．０である。
【００３５】
本発明の細胞では、キシロースイソメラーゼは典型的には細胞にとって異種である。すなわち、キシロースイソメラーゼは、それが存在する生物、細胞、ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡ配列の一部として当該の細胞に天然に存在することのない配列を有する。すなわち、キシロースイソメラーゼは細胞にとって外因性であり、又は細胞に天然には存在しない。従って、キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、形質転換された宿主細胞において活性型で典型的に発現するか、又は発現する能力を有する。
【００３６】
従って本発明の細胞は、上記に定義するとおりのキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトを含む細胞、すなわちそのような核酸コンストラクトで形質転換された細胞である。キシロースイソメラーゼコード配列を含む核酸コンストラクトは、好ましくは宿主細胞においてキシロースイソメラーゼを発現する能力を有する。
【００３７】
細胞において異種キシロースイソメラーゼ配列を発現させる方法は、当業者に公知である。
【００３８】
従って、本発明の細胞は組換え細胞である。すなわち、本発明の細胞は、当該の細胞で天然には存在しないヌクレオチド配列を含むか、又はそれで形質転換されるか、又はそれで遺伝子修飾される。
【００３９】
細胞におけるキシロースイソメラーゼの組換え発現技法、並びに本発明の細胞のさらなる遺伝子修飾技法は、当業者に公知である。典型的にかかる技法は、関連する配列を含む核酸コンストラクトによる細胞の形質転換を含む。かかる方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ（２００１）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、又はＦ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク（１９８７）などの標準的なハンドブックから公知である。真菌宿主細胞の形質転換及び遺伝子修飾の方法は、例えば欧州特許出願公開第０６３５  ５７４号明細書、国際公開第９８／４６７７２号パンフレット、国際公開第９９／６０１０２号パンフレット、国際公開第００／３７６７１号パンフレット、国際公開第９０／１４４２３号パンフレット、欧州特許出願公開第Ａ−０４８１００８号明細書、欧州特許出願公開第Ａ−０６３５５７４号明細書及び米国特許第６，２６５，１８６号明細書から公知である。
【００４０】
多くのエピソームプラスミド又は２μプラスミドは比較的不安定であり、世代を経る毎に約１０−２以上の細胞で失われる。選択的増殖条件下であっても、６０％〜９５％の細胞しかエピソームプラスミドを保持しない。多くのエピソームプラスミドのコピー数は、ｃｉｒ＋宿主の細胞あたり１０〜４０の範囲である。しかしながら、プラスミドは細胞間に均等に分布するわけではなく、集団における細胞あたりのコピー数には大きいばらつきがある。組込みプラスミドで形質転換された株は、選択圧がなくても極めて安定している。しかしながら、縦列反復ＤＮＡ間の相同組換えにより、プラスミド損失は約１０−３〜１０−４の頻度で起こることがあり、ベクター配列のループアウトが生じ得る。好ましくは、安定した組込みの場合のベクター設計は、このように、選択マーカー遺伝子の喪失時に（これもまた分子内相同組換えにより起こる）組み込まれたコンストラクトのそうしたループアウトがもはや不可能なものである。好ましくは遺伝子はこのように安定に組み込まれる。安定な組込みは、本明細書では、組み込まれたコンストラクトのループアウトがもはや不可能な場合のゲノムへの組込みとして定義される。好ましくは選択マーカーは存在しない。
【００４１】
典型的には、核酸コンストラクトはプラスミド、例えば低コピープラスミド又は高コピープラスミドであってもよい。本発明に係る細胞は、キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列の単一コピー又は複数のコピーを、例えばヌクレオチドコンストラクトの複数のコピーによるか、若しくはキシロースイソメラーゼ配列の複数のコピーを有するコンストラクトの使用により、含み得る。
【００４２】
核酸コンストラクトはエピソームに保持されてもよく、従って常染色体複製配列などの自己複製配列を含み得る。好適なエピソーム核酸コンストラクトは、例えば、酵母２μ又はｐＫＤ１プラスミド（Ｇｌｅｅｒら、１９９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９６８−９７５）、又はＡＭＡプラスミド（Ｆｉｅｒｒｏら、１９９５、Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．２９：４８２−４８９）に基づき得る。或いは、各核酸コンストラクトが１つ以上のコピーで細胞のゲノムに組み込まれてもよい。細胞のゲノムへの組込みは非相同組換えによりランダムに起こってもよいが、好ましくは、核酸コンストラクトは、当該技術分野において公知の相同組換えによって細胞のゲノムに組み込まれ得る（例えば、国際公開第９０／１４４２３号パンフレット、欧州特許出願公開第Ａ−０４８１００８号明細書、欧州特許出願公開第Ａ−０６３５  ５７４号明細書及び米国特許第６，２６５，１８６号明細書を参照のこと）。
【００４３】
典型的には、キシロースイソメラーゼコード配列は、キシロースイソメラーゼ配列の転写及び／又は翻訳を提供又は補助する能力を有する１つ以上の核酸配列に作動可能に連結され得る。
【００４４】
用語「作動可能に連結された」は、記載される構成要素が、それらのその意図された形での働きを可能にする関係で隣接して並んでいることを指す。例えば、プロモーター又はエンハンサーがコード配列に作動可能に連結され、前記プロモーター又はエンハンサーはコード配列の転写に影響を及ぼす。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、用語「プロモーター」は、遺伝子の転写開始部位の転写方向に対して上流に位置して１つ以上の遺伝子の転写を制御する働きをする核酸断片を指し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位及び当業者に周知されている任意の他のＤＮＡ配列の存在により構造的に同定される。「構成的」プロモーターは、多くの環境及び発生条件下で活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境及び発生調節下で活性なプロモーターである。
【００４６】
本発明に係る酵素をコードするヌクレオチド配列の発現を実現するために用いることのできるプロモーターは、その発現させる酵素をコードするヌクレオチド配列にとって天然でなくてもよく、すなわちそのプロモーターが作動可能に連結されるヌクレオチド配列（コード配列）にとって異種のプロモーターであってもよい。しかしながら、プロモーターは、宿主細胞にとって同種、すなわち内因性であってもよい。
【００４７】
これに関連して好適なプロモーターとしては、構成的及び誘導性天然プロモーター並びに操作されたプロモーターのいずれも含まれ、それらは当業者に周知されている。真核生物宿主細胞において好適なプロモーターは、ＧＡＬ７、ＧＡＬ１０、又はＧＡＬ１、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＡＤＨ１、ＰＧＬ、ＰＨ０５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ１、ＴＰＩ１、及びＡＯＸ１であり得る。他の好適なプロモーターには、ＰＤＣ１、ＧＰＤ１、ＰＧＫ１、ＴＥＦ１、及びＴＤＨ３が含まれる。
【００４８】
本発明の細胞において、キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド酸配列の３’末端は、好ましくは転写ターミネーター配列に作動可能に連結されている。好ましくはターミネーター配列は、選択の宿主細胞、例えば選択の酵母種において作動可能である。いずれの場合にも、ターミネーターの選択は決定的に重要なものではない；それは、例えば任意の酵母遺伝子由来であってよく、しかしながらターミネーターはときに、非酵母の真核生物遺伝子由来の場合に機能し得る。通常、キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列はターミネーターを含む。好ましくは、かかるターミネーターは、本発明の宿主細胞におけるナンセンス媒介性ｍＲＮＡ分解を阻止する突然変異と組み合わされる（例えば、Ｓｈｉｒｌｅｙら、２００２、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６１：１４６５−１４８２を参照のこと）。
【００４９】
転写終結配列は、さらに好ましくはポリアデニル化シグナルを含む。
【００５０】
場合により、本発明での使用に好適な核酸コンストラクトには、選択可能なマーカーが存在し得る。本明細書で使用されるとき、用語「マーカー」は、そのマーカーを含む宿主細胞の選択又はスクリーニングを可能にする形質又は表現型をコードする遺伝子を指す。マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子であってよく、それにより適切な抗生物質を使用して、形質転換されていない細胞の中から形質転換された細胞を選択することができる。好適な抗生物質耐性マーカーの例としては、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、３’−Ｏ−ホスホトランスフェラーゼＩＩ（カナマイシン、ネオマイシン及びＧ４１８耐性）が挙げられる。抗生物質耐性マーカーは倍数体宿主細胞の形質転換に最も好都合であり得るが、しかしながら好ましくは、栄養要求マーカー（ＵＲＡ３、ＴＲＰＩ、ＬＥＵ２）又はＳ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）ＴＰＩ遺伝子（Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｐ  Ｒ、１９８５、Ｇｅｎｅ  ４０：１２５−１３０により記載される）などの非抗生物質耐性マーカーが使用される。好ましい実施形態において、核酸コンストラクトで形質転換された宿主細胞は、マーカー遺伝子を含まない。組換えマーカー遺伝子を含まない微生物宿主細胞を構築する方法は、欧州特許出願公開第Ａ−０  ６３５  ５７４号明細書に開示され、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）遺伝子又は酵母ＵＲＡ３及びＬＹＳ２遺伝子などの双方向性マーカーの使用に基づく。或いは、緑色蛍光タンパク質、ｌａｃＬ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−グルクロニダーゼなどのスクリーニング可能なマーカーを本発明の核酸コンストラクトに組み込み、形質転換細胞の選別を可能にしてもよい。
【００５１】
本発明での使用に好適な核酸コンストラクトに存在し得る任意選択のさらなる要素としては、限定はされないが、１つ以上のリーダー配列、エンハンサー、組込み因子、及び／又はレポーター遺伝子、イントロン配列、セントロメア、テロメア及び／又はマトリックス結合（ＭＡＲ）配列が挙げられる。本発明の核酸コンストラクトは、ＡＲＳ配列などの自己複製配列をさらに含み得る。
【００５２】
好ましくは、キシロースイソメラーゼは細胞質で発現する。細胞質発現は、ミトコンドリア又はペルオキシソーム標的シグナルの欠失又は修飾により実現され得る。
【００５３】
本発明の細胞は、任意の好適な細胞、例えば原核細胞、例えば細菌、又は真核細胞であってよい。典型的には、細胞は真核細胞、例えば酵母又は糸状菌類であり得る。
【００５４】
酵母は、本明細書では真核微生物として定義され、主に単細胞形態で増殖する真菌植物亜門（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）のあらゆる種（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．、１９６２、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク）が含まれる。
【００５５】
酵母は、単細胞葉状体の出芽により増殖し得るか、或いは生物の分裂により増殖し得る。本発明の細胞として好ましい酵母は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クロエケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、シュワンニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）又はヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）に属し得る。好ましくは酵母は、嫌気的発酵能を有するもの、より好ましくは嫌気的アルコール発酵能を有するものである。
【００５６】
糸状菌類は、本明細書では、全ての糸状形態の真菌植物亜門（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）を包含する真核微生物として定義される。これらの真菌類は、キチン、セルロース、及び他の複合多糖類から構成される栄養菌糸により特徴付けられる。
【００５７】
本発明の細胞としての使用に好適な糸状菌類は、酵母とは形態学的、生理学的、及び遺伝的に異なる。多くの糸状菌類が繁殖に無菌条件を必要とせず、且つバクテリオファージ感染に対して非感受性であるため、糸状菌細胞は有利に用いられ得る。糸状菌類による栄養増殖は菌糸伸長により、ほとんどの糸状菌類の炭素異化が偏性好気性である。本発明の宿主細胞として好ましい糸状菌類は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウラ属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｒｒａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）又はペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）に属し得る。より好ましくは、糸状菌細胞は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、又はリゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）細胞であってもよい。
【００５８】
長年にわたり、作物砂糖からバイオエタノールを生産するための様々な生物の導入が提案されてきた。しかしながら実際には、主要なバイオエタノール生産プロセスは全て、エタノール産生株としてサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の酵母を使用し続けている。これは、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種に、工業プロセスに魅力的な多くの特徴、すなわち、強酸耐性、エタノール耐性及び浸透圧耐性、嫌気的増殖能、及び当然ながらその高いアルコール発酵能があるためである。宿主細胞として好ましい酵母種には、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）、Ｓ．バルネッチ（Ｓ．ｂａｒｎｅｔｔｉ）、Ｓ．エクシグウス（Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ）、Ｓ．ウバルム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）、Ｓ．ジアスタチカス（Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．マルクシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）又はＫ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）が含まれる。
【００５９】
本発明の細胞は、植物バイオマス、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、ラムノース、ガラクトース、フコース、マルトース、マルトデキストリン、リボース、リブロース、又はデンプン、デンプン誘導体、スクロース、ラクトース及びグリセロールを、例えば発酵性糖類に変換する能力があってよい。従って、本発明の細胞は、セルロースからグルコース単量体への変換、及びヘミセルロースからキシロース及びアラビノース単量体への変換に必須のセルラーゼ（エンドセルラーゼ又はエキソセルラーゼ）、ヘミセルラーゼ（エンド又はエキソキシラナーゼ又はアラビナーゼ）、ペクチンからグルクロン酸及びガラクツロン酸への変換能力があるペクチナーゼ、又はデンプンをグルコース単量体に変換するアミラーゼなどの１つ以上の酵素を発現し得る。
【００６０】
本発明の細胞は、好ましくは細胞への能動的又は受動的キシロース輸送能を有する宿主である。
【００６１】
好ましくは、本発明の細胞は：
能動的解糖能を有し；及び／又は
ペントースリン酸経路を経る流束を示し；及び／又は
キシロースから異性化されたキシルロースがピルビン酸塩に代謝され得るようなキシルロースキナーゼ活性を呈する。
【００６２】
細胞は、さらに好ましくは、ピルビン酸塩を所望の発酵生成物、例えば、エタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパンジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質又はセファロスポリンに変換するのに必要な酵素活性を含む。
【００６３】
本発明の好ましい細胞は、アルコール発酵能、好ましくは嫌気的アルコール発酵能を天然で有する細胞である。本発明の細胞は、好ましくは高いエタノール耐性、高い低ｐＨ耐性（すなわち約５、約４、約３、又は約２．５より低いｐＨでの増殖能）並びに乳酸、酢酸又はギ酸などの有機酸及び／又はフルフラール及びヒドロキシメチルフルフラールなどの糖分解産物に対する耐性、及び／又は高い高温耐性を有する。
【００６４】
本発明の細胞の上記特性又は活性のいずれも、細胞に天然に存在してもよく、又は遺伝子修飾によって導入若しくは修飾されてもよい。
【００６５】
キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、形質転換宿主細胞において活性型で典型的に発現するか、又は発現する能力を有する。従って、宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現により、典型的には約３０℃でタンパク質１ｍｇあたり少なくとも約１０Ｕ、好ましくは約３０℃で１ｍｇあたり少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約５００、少なくとも約７５０又は少なくとも約１０００Ｕのキシロースイソメラーゼ活性の比活性を有する活性なキシロースイソメラーゼが生成される。形質転換宿主細胞において発現するキシロースイソメラーゼの比活性は、本明細書では、宿主細胞の無細胞ライセート、例えば無酵母細胞ライセートのタンパク質１ｍｇあたりのキシロースイソメラーゼ活性単位の量として定義される。キシロースイソメラーゼ活性、タンパク質の量の測定及び無細胞ライセートの調製は、本明細書に記載されるとおりである。好ましくは、宿主細胞におけるキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列の発現により、キシロースに対するＫｍが５０、４０、３０又は２５ｍＭ未満であるキシロースイソメラーゼが生成され、より好ましくは、キシロースに対するＫｍは約２０ｍＭ以下である。
【００６６】
本発明の細胞は、ペントースリン酸経路の流束を増加させる１つ又は複数の遺伝子修飾を含み得る。特に、このような１つ又は複数の遺伝子修飾は、非酸化的部分のペントースリン酸経路の流束増加をもたらし得る。ペントースリン酸経路の非酸化的部分の流束増加を生じさせる遺伝子修飾とは、本明細書では、流束の増加を生じさせる遺伝子修飾を除き遺伝学的に同一の株における流束と比較したとき、流束を少なくとも約１．１倍、約１．２倍、約１．５倍、約２倍、約５倍、約１０倍又は約２０倍に増加させる修飾を意味するものと理解される。ペントースリン酸経路の非酸化的部分の流束は、キシロースを単一炭素源として修飾宿主を増殖させ、キシロース比消費速度を決定し、且つ任意のキシリトールが生成される場合、キシリトール比生産速度をキシロース比消費速度から減じることにより計測され得る。しかしながら、ペントースリン酸経路の非酸化的部分の流束は、キシロースを単一炭素源とした増殖速度、好ましくはキシロースを単一炭素源とした嫌気的増殖速度に比例する。キシロースを単一炭素源とした増殖速度（μｍａｘ）とペントースリン酸経路の非酸化的部分の流束との間には、直線関係がある。糖上でのバイオマス収率は一定であるため、キシロース比消費速度（Ｑｓ）は、増殖速度（μ）を糖上でのバイオマス収率（Ｙｘｓ）で除したものに等しい（所与の条件：嫌気性、増殖培地、ｐＨ、株の遺伝的背景等の下で；すなわちＱｓ＝μ／Ｙｘｓ）。従ってペントースリン酸経路の非酸化的部分の流束増加は、輸送の場合を除き（取り込みが限定的である）これらの条件下における最大増殖速度の増加から推定されてもよい。
【００６７】
ペントースリン酸経路の流束を増加させる１つ以上の遺伝子修飾は、様々な方法で宿主細胞に導入され得る。それらには、例えば、キシルロースキナーゼ及び／又は非酸化的部分のペントースリン酸経路の酵素のうち１つ以上の定常状態活性レベルの上昇、及び／又は非特異的アルドースレダクターゼ活性の定常状態レベルの低下を達成することが含まれる。定常状態活性レベルのこれらの変化は、突然変異体（自発的なもの、又は化学物質若しくは放射線により誘導されるもの）の選択によるか、及び／又は例えば酵素をコードする遺伝子又はそれらの遺伝子を調節する因子の、それぞれ過剰発現又は不活性化による組換えＤＮＡ技術により、もたらすことができる。
【００６８】
好ましい宿主細胞では、遺伝子修飾は、（非酸化的部分の）ペントースリン酸経路の少なくとも１つの酵素の過剰発現を含む。好ましくは酵素は、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼをコードする酵素からなる群から選択される。（非酸化的部分の）ペントースリン酸経路の酵素の様々な組み合わせを過剰発現させてもよい。例えば過剰発現させる酵素は、少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ及びリブロース−５−リン酸エピメラーゼ；又は少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ及びトランスケトラーゼ；又は少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ及びトランスアルドラーゼ；又は少なくとも酵素リブロース−５−リン酸エピメラーゼ及びトランスケトラーゼ；又は少なくとも酵素リブロース−５−リン酸エピメラーゼ及びトランスアルドラーゼ；又は少なくとも酵素トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼ；又は少なくとも酵素リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼ；又は少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼ；又は少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、及びトランスアルドラーゼ；又は少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、及びトランスケトラーゼであってもよい。本発明の一実施形態において、酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼの各々が、宿主細胞において過剰発現する。より好ましくは、遺伝子修飾が少なくとも酵素トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼの両方の過剰発現を含む宿主細胞であって、従って宿主細胞が既にキシロースでの嫌気的増殖能を有する宿主細胞である。実際、一部の条件下では、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼのみを過剰発現する宿主細胞は、これらの酵素の４つ全て、すなわちリブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼを過剰発現する宿主細胞と同じキシロースにおける嫌気的増殖速度を既に有する。さらに、酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ及びリブロース−５−リン酸エピメラーゼの両方を過剰発現する宿主細胞は、イソメラーゼのみ又はエピメラーゼのみを過剰発現する宿主細胞と比べると、これらの酵素の一方のみの過剰発現は代謝不均衡を生じ得るため、好ましい。
【００６９】
酵素「リブロース５−リン酸エピメラーゼ」（ＥＣ５．１．３．１）は、本明細書では、Ｄ−キシルロース５−リン酸からＤ−リブロース５−リン酸への、及びその逆のエピマー化を触媒する酵素として定義される。この酵素は、ホスホリブロースエピメラーゼ；エリトロース−４−リン酸イソメラーゼ；ホスホケトペントース３−エピメラーゼ；キシルロースリン酸３−エピメラーゼ；ホスホケトペントースエピメラーゼ；リブロース５−リン酸３−エピメラーゼ；Ｄ−リブロースリン酸−３−エピメラーゼ；Ｄ−リブロース５−リン酸エピメラーゼ；Ｄ−リブロース−５−Ｐ３−エピメラーゼ；Ｄ−キシルロース−５−リン酸３−エピメラーゼ；ペントース−５−リン酸３−エピメラーゼ；又はＤ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼとしても知られる。リブロース５−リン酸エピメラーゼは、そのアミノ酸配列によってさらに定義され得る。同様にリブロース５−リン酸エピメラーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によっても、並びにリブロース５−リン酸エピメラーゼをコードする基準ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によっても定義され得る。リブロース５−リン酸エピメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書ではＲＰＥ１と命名される。
【００７０】
酵素「リブロース５−リン酸イソメラーゼ」（ＥＣ５．３．１．６）は、本明細書では、Ｄ−リボース５−リン酸からＤ−リブロース５−リン酸への、及びその逆の直接の異性化を触媒する酵素として定義される。この酵素は、ホスホペントースイソメラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｎｔｏｓｉｓｏｍｅｒａｓｅ）；ホスホリボイソメラーゼ；リボースリン酸イソメラーゼ；５−ホスホリボースイソメラーゼ；Ｄ−リボース５−リン酸イソメラーゼ；Ｄ−リボース−５−リン酸ケトール−イソメラーゼ；又はＤ−リボース−５−リン酸アルドース−ケトース−イソメラーゼとしても知られる。リブロース５−リン酸イソメラーゼは、そのアミノ酸配列によってさらに定義され得る。同様にリブロース５−リン酸イソメラーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によっても、並びにリブロース５−リン酸イソメラーゼをコードする基準ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によっても定義され得る。リブロース５−リン酸イソメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書ではＲＰＩ１と命名される。
【００７１】
酵素「トランスケトラーゼ」（ＥＣ２．２．１．１）は、本明細書では、反応：Ｄ−リボース５−リン酸＋Ｄ−キシルロース５−リン酸＜−＞セドヘプツロース７−リン酸＋Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸及びその逆を触媒する酵素として定義される。この酵素は、グリコールアルデヒドトランスフェラーゼ又はセドヘプツロース−７−リン酸：Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸グリコールアルデヒドトランスフェラーゼとしても知られる。トランスケトラーゼは、そのアミノ酸によってさらに定義され得る。同様にトランスケトラーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によっても、並びにトランスケトラーゼをコードする基準ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によっても定義され得る。トランスケトラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書ではＴＫＬ１と命名される。
【００７２】
酵素「トランスアルドラーゼ」（ＥＣ２．２．１．２）は、本明細書では、反応：セドヘプツロース７−リン酸＋Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸＜−＞Ｄ−エリトロース４−リン酸＋Ｄ−フルクトース６−リン酸及びその逆を触媒する酵素として定義される。この酵素は、ジヒドロキシアセトントランスフェラーゼ；ジヒドロキシアセトンシンターゼ；ホルムアルデヒドトランスケトラーゼ；又はセドヘプツロース−７−リン酸：Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸グリセロントランスフェラーゼとしても知られる。トランスアルドラーゼは、そのアミノ酸配列によってさらに定義され得る。同様にトランスアルドラーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によっても、並びにトランスアルドラーゼをコードする基準ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によっても定義され得る。トランスケトラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書ではＴＡＬ１と命名される。
【００７３】
本発明の細胞における酵素の発現及び過剰発現には、様々な手段が当業者に公知である。特に、例えば、宿主細胞のゲノムに遺伝子のさらなるコピーを組み込むことによるか、エピソーム多コピー発現ベクターから遺伝子を発現させることによるか、又は遺伝子の複数のコピーを含むエピソーム発現ベクターを導入することによって、宿主細胞におけるその酵素をコードする遺伝子のコピー数を増加させることにより、酵素を過剰発現させてもよい。
【００７４】
或いは、本発明の宿主細胞における酵素の過剰発現は、過剰発現させる酵素をコードする配列にとって天然でないプロモーター、すなわちそれが作動可能に連結されるコード配列にとって異種のプロモーターを用いることにより実現してもよい。プロモーターは好ましくは、それが作動可能に連結されるコード配列にとって異種であるが、プロモーターが宿主細胞にとって同種である、すなわち内因性であることもまた好ましい。好ましくは異種プロモーターは、好ましくはキシロース又はキシロース及びグルコースを炭素源として、より好ましくは主要な炭素源として（すなわち利用可能な炭素源の５０％超がキシロース又はキシロース及びグルコースからなる）、最も好ましくは単一炭素源として利用可能な条件下で、コード配列にとって天然のプロモーターと比べて、コード配列を含む転写物のより高い定常状態レベルを生じさせる能力を有する（又は単位時間あたりより多い転写物分子、すなわちｍＲＮＡ分子を産生する能力を有する）。これに関連して好適なプロモーターには、構成的及び誘導性天然プロモーター並びに操作されたプロモーターのいずれも含まれる。本発明での使用に好ましいプロモーターは、さらにカタボライト（グルコース）抑制に対して非感受性であり、及び／又は好ましくは誘導にキシロースを必要としない。これらの特徴を備えるプロモーターは広く利用可能であり、当業者に周知されている。かかるプロモーターの好適な例には、例えば、ホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ、ＴＤＨ３又はＧＡＰＤＨ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）などの解糖系遺伝子由来のプロモーター、酵母又は糸状菌類由来のプロモーターが含まれる；酵母由来のかかるプロモーターに関するさらなる詳細は、（国際公開第９３／０３１５９号パンフレット）に見出すことができる。他の有用なプロモーターは、リボソームタンパク質をコードする遺伝子プロモーター、ラクターゼ遺伝子プロモーター（ＬＡＣ４）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＡＤＨＩ、ＡＤＨ４など）、及びエノラーゼプロモーター（ＥＮＯ）である。構成的及び誘導性の双方の他のプロモーター、及びエンハンサー又は上流活性化配列が、当業者に周知されているであろう。本発明の宿主細胞に用いられるプロモーターは、必要であれば、その制御特性に影響を及ぼすように修飾されてもよい。
【００７５】
上述の酵素の過剰発現に用いられるコード配列は、好ましくは本発明の宿主細胞にとって同種であり得る。しかしながら、本発明の宿主細胞にとって異種のコード配列が用いられてもよい。
【００７６】
酵素の過剰発現とは、遺伝子修飾された宿主細胞における酵素の生成に関連するとき、同じ条件下の非修飾宿主細胞と比較して、その酵素が高い比酵素活性レベルで生成されることを意味する。通常これは、同じ条件下の非修飾宿主細胞と比較して、酵素的に活性なタンパク質（又はマルチサブユニット酵素の場合、複数のタンパク質）がより多量に生成される、又はむしろより高い定常状態レベルで生成されることを意味する。同様にこれは、通常、同じ条件下の非修飾宿主細胞と比較して、酵素的に活性なタンパク質をコードするｍＲＮＡがより多量に産生される、又はここでもむしろより高い定常状態レベルで産生されることを意味する。従って酵素の過剰発現は、好ましくは、本明細書に記載されるとおりの適切な酵素アッセイを用いて宿主細胞における酵素の比活性レベルを計測することにより決定される。
【００７７】
或いは、酵素の過剰発現は、酵素タンパク質の特異的な定常状態レベルを、例えばその酵素に特異的な抗体を用いて定量化することによるか、又は酵素をコードするｍＲＮＡの特異的な定常レベルを定量化することにより、間接的に決定されてもよい。後者は、酵素に対する基質が市販されていないために酵素的アッセイを容易に実行できないペントースリン酸経路の酵素に特に好適であり得る。好ましくは本発明の宿主細胞において、過剰発現させる酵素は、過剰発現を生じさせる遺伝子修飾を除いては遺伝的に同一である株と比較したとき、少なくとも約１．１倍、約１．２倍、約１．５倍、約２倍、約５倍、約１０倍又は約２０倍過剰発現する。これらの過剰発現レベルは、酵素の活性の定常状態レベル、酵素のタンパク質の定常状態レベル並びに酵素をコードする転写物の定常状態レベルに適用され得ることが理解されるべきである。
【００７８】
本発明の細胞は、特異的キシルロースキナーゼ活性を増加させる１つ以上の遺伝子修飾を含み得る。好ましくは１つ又は複数の遺伝子修飾は、例えばキシルロースキナーゼをコードするヌクレオチド配列の過剰発現により、キシルロースキナーゼの過剰発現を生じさせる。キシルロースキナーゼをコードする遺伝子は、宿主細胞にとって内因性であってもよく、又は宿主細胞にとって異種のキシルロースキナーゼであってもよい。本発明の宿主細胞におけるキシルロースキナーゼの過剰発現に用いられるヌクレオチド配列は、キシルロースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
【００７９】
酵素「キシルロースキナーゼ」（ＥＣ２．７．１．１７）は、本明細書では、反応ＡＴＰ＋Ｄ−キシルロース＝ＡＤＰ＋Ｄ−キシルロース５−リン酸を触媒する酵素として定義される。この酵素は、リン酸化キシルロキナーゼ、Ｄ−キシルロキナーゼ又はＡＴＰ：Ｄ−キシルロース５−ホスホトランスフェラーゼとしても知られる。本発明のキシルロースキナーゼは、そのアミノ酸配列によってさらに定義され得る。同様にキシルロースキナーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によっても、並びにキシルロースキナーゼをコードする基準ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によっても定義され得る。
【００８０】
本発明の細胞では、特異的キシルロースキナーゼ活性を増加させる１つ又は複数の遺伝子修飾が、上記に記載したとおりのペントースリン酸経路の流束を増加させる修飾のいずれかと組み合わされてもよい。しかしながら、これは必須ではない。
【００８１】
従って、本発明の宿主細胞は、特異的キシルロースキナーゼ活性を増加させる１つ又は複数の遺伝子修飾のみを含み得る。本発明の宿主細胞におけるキシルロースキナーゼの過剰発現を実現及び分析する当該技術分野において利用可能な様々な手段は、上記にペントースリン酸経路の酵素について記載したものと同じである。好ましくは本発明の宿主細胞において、過剰発現させるキシルロースキナーゼは、過剰発現を生じさせる１つ又は複数の遺伝子修飾を除いては遺伝的に同一である株と比較したとき、少なくとも約１．１倍、約１．２倍、約１．５倍、約２倍、約５倍、約１０倍又は約２０倍過剰発現する。これらの過剰発現レベルは、酵素の活性の定常状態レベル、酵素のタンパク質の定常状態レベル並びに酵素をコードする転写物の定常状態レベルに適用され得ることが理解されるべきである。
【００８２】
本発明の細胞は、宿主細胞における非特異的アルドースレダクターゼ活性を低下させる１つ以上の遺伝子修飾を含み得る。好ましくは、非特異的アルドースレダクターゼ活性は、宿主細胞において、非特異的アルドースレダクターゼをコードする遺伝子の発現を低下させるか、又はそれを不活性化する１つ以上の遺伝子修飾によって低下する。好ましくは、１つ又は複数の遺伝子修飾は、宿主細胞における非特異的アルドースレダクターゼをコードする遺伝子の各内因性コピーの発現を低下させ、又は不活性化する。宿主細胞は、二倍性、多倍数性又は異数性の結果として、非特異的アルドースレダクターゼをコードする遺伝子の複数のコピーを含むことができ、及び／又は宿主細胞は、アミノ酸配列が異なり、且つ各々が異なる遺伝子によりコードされる、アルドースレダクターゼ活性を有するいくつかの異なる（イソ）酵素を含み得る。また、かかる例では、好ましくは非特異的アルドースレダクターゼをコードする各遺伝子の発現は低下し、又は不活性化される。好ましくは、遺伝子は、遺伝子の少なくとも一部の欠失によるか、又は遺伝子の破壊により不活性化され、ここでこれに関連して用語の遺伝子には、コード配列の上流又は下流の任意の非コード配列も含まれ、その（部分的）欠失又は不活性化により、宿主細胞における非特異的アルドースレダクターゼ活性の発現の低下が得られる。
【００８３】
本発明の宿主細胞においてその活性を低下させるべきアルドースレダクターゼをコードするヌクレオチド配列は、アルドースレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
【００８４】
本発明の宿主細胞において、宿主細胞における非特異的アルドースレダクターゼ活性を低下させる遺伝子修飾は、上記に記載したとおり宿主細胞においてペントースリン酸経路の流束を増加させる修飾のいずれか、及び／又は特異的キシルロースキナーゼ活性を増加させる修飾のいずれかと組み合わされてもよい。しかしながら、これは必須ではない。
【００８５】
従って、宿主細胞における非特異的アルドースレダクターゼ活性を低下させる１つ又は複数の遺伝子修飾のみを含む本発明の宿主細胞は、明確に本発明に包含される。
【００８６】
酵素「アルドースレダクターゼ」（ＥＣ１．１．１．２１）は、本明細書では、キシロース又はキシルロースをキシリトールに還元する能力を有する任意の酵素として定義される。本発明の文脈ではアルドースレダクターゼは、本発明の宿主細胞にとって天然の（内因性の）、且つキシロース又はキシルロースをキシリトールに還元する能力を有する任意の非特異的アルドースレダクターゼであってよい。非特異的アルドースレダクターゼは、以下の反応を触媒する：
アルドース＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ＋⇔アルジトール＋ＮＡＤ（Ｐ）＋
【００８７】
この酵素は広い特異性を有し、アルドースレダクターゼ；ポリオールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）；アルジトール：ＮＡＤＰオキシドレダクターゼ；アルジトール：ＮＡＤＰ＋１−オキシドレダクターゼ；ＮＡＤＰＨ−アルドペントースレダクターゼ；又はＮＡＤＰＨ−アルドースレダクターゼとしても知られる。
【００８８】
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）にとって内因性であり、且つＧＲＥ３遺伝子によりコードされるかかる非特異的アルドースレダクターゼの詳細な例（Ｔｒａｆｆら、２００１、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：５６６８−７４）。従って、本発明のアルドースレダクターゼは、そのアミノ酸配列によってさらに定義され得る。同様にアルドースレダクターゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によっても、並びにアルドースレダクターゼをコードする基準ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によっても定義され得る。
【００８９】
本発明の細胞は、キシロース上、好ましくは単一炭素源としてのキシロース上での、且つより好ましくは嫌気的条件下での増殖に関して、自然突然変異体か、或いは（例えば放射線若しくは化学物質による）誘導突然変異体を選択することにより、キシロース利用に適合され得る。突然変異体の選択は、例えばＫｕｙｐｅｒら（２００４、ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．４：６５５−６６４）により記載されるとおりの培養物の連続継代を含む技法によるか、又は選択圧下におけるケモスタット培養での培養により実施されてもよい。本発明の好ましい宿主細胞では、突然変異体の選択により得られる修飾を含め、上記に記載される遺伝子修飾の少なくとも１つが、炭素源としての、好ましくは単一炭素源としてのキシロース上で、且つ好ましくは嫌気的条件下で増殖する能力を宿主細胞に付与する。好ましくは、修飾された宿主細胞は本質的にキシリトールを生成せず、例えば生成されるキシリトールは検出限界未満、又は例えばモル基準で消費炭素の約５、約２、約１、約０．５、又は約０．３％未満である。
【００９０】
本発明の細胞は、単一炭素源としてのキシロース上で好気的条件下において少なくとも約０．０５、約０．１、約０．２、約０．２５又は約０．３ｈ−１の速度、又は該当する場合、嫌気的条件下において少なくとも約０．０３、約０．０５、約０．０７、約０．０８、約０．０９、約０．１、約０．１２、約０．１５又は約０．２ｈ−１の速度で増殖する能力を有し得る。好ましくは修飾宿主細胞は、単一炭素源としてのグルコース及びキシロース（１：１重量比）の混合物上で好気的条件下において少なくとも約０．０５、約０．１、約０．２、約０．２５又は約０．３ｈ−１の速度、又は該当する場合、嫌気的条件下において少なくとも約０．０３、約０．０５、約０．１、約０．１２、約０．１５、又は約０．２ｈ−１の速度で増殖する能力を有し得る。
【００９１】
本発明の細胞は、少なくとも約２００、約２５０、約３００、約３４６、約３５０、約４００、約５００、約６００、約７５０、又は約１０００ｍｇキシロース／ｇ細胞／ｈのキシロース比消費速度を有し得る。本発明の細胞は、キシロース上での発酵生成物（エタノールなど）の収率が、その宿主細胞のグルコース上での発酵生成物（エタノールなど）の収率の少なくとも約４０、約５０、約５５、約６０、約７０、約８０、約８５、約９０、約９５、約９８又は約９９％である。より好ましくは、キシロース上での本発明の細胞の発酵生成物（エタノールなど）の収率は、その細胞のグルコース上での発酵生成物（エタノールなど）の収率と同程度であり得る。同様に、細胞のキシロース上でのバイオマス収率は、宿主細胞のグルコース上でのバイオマス収率の少なくとも約４０、約５０、約５５、約６０、約７０、約８０、約８５、約９０、約９５、約９８又は約９９％であり得る。より好ましくは、細胞のキシロース上でのバイオマス収率は、宿主細胞のグルコース上でのバイオマス収率と同程度であり得る。グルコース上及びキシロース上の収率比較では、いずれの収率も、好気的条件下で比較されるか、又はいずれも嫌気的条件下で比較されることが理解される。
【００９２】
本発明の細胞は、アラビノースを使用する能力を有し得る。従って、本発明の細胞は、Ｌ−アラビノースをＬ−リブロース及び／又はキシルロース５−リン酸に変換する、及び／又は所望の発酵生成物、例えば本明細書で言及されるうちの一つに変換する能力を有し得る。
【００９３】
Ｌ−アラビノースからエタノールを生成する能力がある生物、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株は、好適な供給源由来のａｒａＡ（Ｌ−アラビノースイソメラーゼ）、ａｒａＢ（Ｌ−リブロキナーゼ）及びａｒａＤ（Ｌ−リブロース−５−Ｐ４−エピメラーゼ）遺伝子を導入して細胞を修飾することにより生成されてもよい。かかる遺伝子は、本発明の細胞に、それがアラビノースを使用する能力を有するようにするため導入され得る。かかる手法は国際公開第２００３／０９５６２７号パンフレットに記載されている。
【００９４】
本発明の細胞は、エタノールの生成に好適な細胞であってよい。しかしながら本発明の細胞は、エタノール以外の発酵生成物の生成に好適であってもよい。かかる非エタノール発酵生成物には、原則的に、酵母又は糸状菌類などの真核微生物により生成可能な任意のバルク化学品又はファインケミカルが含まれる。
【００９５】
かかる発酵生成物は、例えば、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパンジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質又はセファロスポリンであってよい。非エタノール発酵生成物の生成に好ましい本発明の修飾宿主細胞は、アルコールデヒドロゲナーゼ活性の減少をもたらす遺伝子修飾を含む宿主細胞である。
【００９６】
さらなる態様において、本発明は、キシロースなどの、キシロース供給源を含む炭素源の発酵に本発明の修飾宿主細胞が用いられる発酵方法に関する。キシロース供給源に加えて、発酵培地中の炭素源はグルコース供給源も含み得る。キシロース又はグルコースの供給源は、キシロース又はグルコースそれ自体であってもよく、或いはキシロース又はグルコース単位を含む任意の炭水化物オリゴポリマー又はポリマー、例えばリグノセルロース、キシラン、セルロース、デンプンなどであってもよい。かかる炭水化物からキシロース又はグルコース単位を遊離させるため、適切なカルボヒドラーゼ（キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼなど）が発酵培地に添加されてもよく、又は修飾宿主細胞によって生成されてもよい。後者の場合、修飾宿主細胞は、かかるカルボヒドラーゼを生成して分泌するように遺伝子操作され得る。オリゴポリマー又はポリマーのグルコース供給源を使用するさらなる利点は、例えば律速量のカルボヒドラーゼを使用することにより、発酵中における遊離グルコースの低い（より低い）濃度の維持が可能になることである。これにより、ひいては、キシロースなどの非グルコース糖類の代謝及び輸送に必要な系の抑制が回避され得る。
【００９７】
好ましい方法では、修飾宿主細胞がキシロース及びグルコースの双方を、好ましくは同時に発酵し、同時に発酵する場合には好ましくは、ジオーキシー増殖を回避するため、グルコース抑制に対して非感受性の修飾宿主細胞が用いられる。炭素源としてのキシロース（及びグルコース）の供給源に加えて、発酵培地は、修飾宿主細胞の増殖に必要とされる適切な成分をさらに含み得る。
【００９８】
酵母などの微生物を増殖させる発酵培地の組成は、当該技術分野において周知されている。発酵方法は、例えばエタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパンジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質、例えばペニシリンＧ又はペニシリンＶ及びそれらの発酵性誘導体、及びセファロスポリンなどの発酵生成物の生成方法である。
【００９９】
発酵方法は、好気的又は嫌気的発酵方法であってよい。嫌気的発酵方法は、本明細書では、酸素の非存在下で実行される発酵方法、又は実質的に酸素が消費されない、好ましくは約５、約２．５又は約１ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満、より好ましくは０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈが消費される（すなわち酸素消費が検出不能である）発酵方法として定義され、ここでは有機分子が電子供与体及び電子受容体の双方として働く。酸素の非存在下では、解糖及びバイオマス形成において生じるＮＡＤＨは、酸化的リン酸化によっては酸化されることができない。この問題を解決するため、多くの微生物がピルビン酸塩又はその誘導体のうちの一つを電子及び水素受容体として使用し、それによりＮＡＤ＋を再生する。
【０１００】
従って、好ましい嫌気的発酵方法では、ピルビン酸塩が電子（及び水素受容体）として使用され、エタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アミノ酸、１，３−プロパンジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質及びセファロスポリンなどの発酵生成物に還元される。
【０１０１】
発酵方法は、好ましくは修飾宿主細胞に最適な温度で実行される。従って、ほとんどの酵母又は真菌宿主細胞について、発酵方法は約４２℃未満、好ましくは約３８℃未満の温度で実施される。酵母又は糸状菌宿主細胞について、発酵方法は、好ましくは、約３５、約３３、約３０又は約２８℃未満の温度、且つ約２０、約２２、又は約２５℃より高い温度で実施される。
【０１０２】
好ましい方法は、エタノールの生成方法において、（ａ）キシロース供給源を含有する培地を上記に定義するとおりの修飾宿主細胞で発酵させる工程であって、それにより宿主細胞がキシロースをエタノールに発酵する工程；及び場合により、（ｂ）エタノールを回収する工程を含む方法である。発酵培地はまた、同様にエタノールに発酵されるグルコースの供給源も含み得る。本方法において、エタノール容積生産性は、好ましくは少なくとも約０．５、約１．０、約１．５、約２．０、約２．５、約３．０、約５．０又は約１０．０ｇエタノール毎リットル毎時である。本方法におけるキシロース及び／又はグルコース上でのエタノール収率は、好ましくは少なくとも約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約９５又は約９８％である。エタノール収率は、本明細書では、理論上の最大収率に対する割合として定義される。
【０１０３】
本発明はまた、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパンジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質及びセファロスポリンからなる群から選択される生成物などの発酵生成物の生成方法にも関する。本方法は、好ましくは、キシロース供給源を含有する培地を、本明細書において上記に定義するとおりの修飾宿主細胞で発酵させる工程であって、それにより宿主細胞がキシロースを発酵生成物に発酵する工程を含む。
【０１０４】
本発明はまた、エタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパンジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質及びセファロスポリンからなる群から選択される生成物などの発酵生成物の生成方法も提供する。本方法は、好ましくは、少なくともキシロース供給源及びＬ−アラビノース供給源を含有する培地を、キシロース及びＬ−アラビノースの両方を使用する能力がある上記に定義するとおりの細胞で発酵させる工程であって、細胞によりキシロース及びＬ−アラビノースが発酵生成物に発酵される工程を含む。
【０１０５】
本発明はまた、エタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパンジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質及びセファロスポリンからなる群から選択される生成物などの発酵生成物の生成方法も提供する。本方法は、好ましくは、少なくともキシロース供給源及びＬ−アラビノース供給源を含有する培地を、上記に定義するとおりの細胞及びＬ−アラビノースを使用する能力がある細胞で発酵させる工程であって、それにより各細胞がキシロース及び／又はアラビノースを発酵生成物に発酵する工程を含む。
【０１０６】
本発明の方法はまた、発酵生成物の回収も含み得る。本方法が実施される培地はまた、グルコース供給源も含有し得る。
【０１０７】
本発明に係る方法は、好気的及び嫌気的条件下で実行され得る。好ましくは、本方法は、微好気的条件下又は酸素制限条件下で実施される。
【０１０８】
嫌気的発酵方法は、本明細書では、酸素の非存在下で実行される発酵方法、又は実質的に酸素が消費されない、好ましくは約５、約２．５又は約１ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満しか消費されない発酵方法として定義され、ここでは有機分子が電子供与体及び電子受容体の双方として働く。
【０１０９】
酸素制限発酵方法は、気体から液体への酸素移動により酸素消費が制限される方法である。酸素制限の程度は、流入ガスフローの量及び組成並びに使用される発酵機器の実際の混合／物質移動特性により決定される。好ましくは、酸素制限条件下の方法において、酸素消費速度は少なくとも約５．５、より好ましくは少なくとも約６、例えば少なくとも７ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである。
【０１１０】
以下の実施例は、本発明を例示する。
【０１１１】
［実施例］
［一般的な分子生物学技法］
特に指示がない限り、用いられる方法は標準の生化学的技法である。好適な一般的手法のテキストブックの例としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．が挙げられる。
【０１１２】
本例に示すとおり糖類を補足したＶｅｒｄｕｙｎ培地（Ｖｅｒｄｕｙｎ、１９９２）又はＹＥＰｈ培地（１０ｇ／ｌ酵母エキス、２０ｇ／ｌフィトン（ｐｈｙｔｏｎｅ））のいずれかを使用して、増殖実験を実施した。固形ＹＥＰｈ培地については、滅菌前に液体培地に２０ｇ／ｌ寒天を加えた。
【０１１３】
［環状ＤＮＡでの酵母細胞の形質転換］
プラスミドＤＮＡの場合、Ｃｈｅｎら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９２）、第２１巻、第１号、８３〜８４頁）により記載される方法により、酵母形質転換を行った。
【０１１４】
［電気穿孔による線状ＤＮＡ断片での酵母細胞の形質転換］
２％グルコースを含有する２５ｍｌのＹＥＰｈ培地に単一酵母コロニーを接種することにより、酵母細胞を培養した。フラスコを３０℃、２８０ｒｐｍで一晩インキュベートした。
【０１１５】
６００ｎｍの光学濃度を決定し、０．２の光学濃度を達成するのに必要な量を１００ｍｌの２％グルコース含有ＹＥＰｈ培地に移した。細胞を、約１．２〜１．３の光学濃度に達するまで（これは２〜３世代に相当する）、３０℃、２８０ｒｐｍで４〜５時間増殖させた。遠心により細胞を回収し、２８ｍｌのＴＥ（１０ｍＭ  トリス．ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に再懸濁した。３ｍｌの１Ｍ  ＬｉＡＣ溶液（希ＨＡｃでｐＨ７．５に設定）を添加した。細胞を回転式インキュベーター（１５０ｒｐｍ、３０℃）において４５分間、穏やかに振盪した。５００μｌの１Ｍ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール）溶液を添加した後、これらの条件下で細胞をもう１回、１５分間インキュベートした。容積を滅菌氷冷ミリＱ（ｍｉｌｌｉＱ）水で１００ｍｌに構成した。遠心により細胞を回収した。
【０１１６】
上清を廃棄し、ペレット状の細胞を５０ｍｌの滅菌氷冷ミリＱ水で洗浄し、遠心により回収した。続く洗浄処理を、３０ｍｌの氷冷１Ｍソルビトール溶液で行った。遠心後、上清を廃棄し、細胞ペレットを４ｍｌの氷冷１Ｍソルビトール溶液に再懸濁した。遠心後、上清を廃棄し、細胞ペレットを３００μｌの氷冷１Ｍソルビトール溶液に再懸濁した。
【０１１７】
形質転換毎に、４０μｌの細胞懸濁液を氷冷エッペンドルフ管に移し替えた。形質転換ＤＮＡ及び５μｇのサケ精子ＤＮＡ（担体ＤＮＡとして）を、合わせて最大容積２０μｌで添加した。ＤＮＡはＴＥに溶解しなければならない。エッペンドルフ管を慎重に軽く叩いて、内容物を穏やかに混合した。続いて、内容物を予め（氷上で）冷却した０．２ｃｍ間隔の電気穿孔キュベットに移し替え、１．５ｋＶ、２００Ｏｈｍ及び２５μＦのパルスを（例えばＢｉｏＲａｄ電気穿孔装置を使用して）印加した。パルス時間は約５ｍｓでなければならない。
【０１１８】
細胞を直ちに２００μｌの１Ｍソルビトールに移し替えた。続いて、４ｍｌのＹＥＰｈ  ２％グルコースを添加し、細胞懸濁液を３０℃で１時間インキュベートした。この時間の後、遠心により細胞を回収し、上清を廃棄し、ペレットを４ｍｌの１Ｍソルビトールに再懸濁した。細胞を再び遠心により回収し、上清を廃棄し、ペレットを３００μｌの１Ｍソルビトールに再懸濁した。細胞を適宜希釈し、選択培地で使用した。
【０１１９】
［エタノール生成］
１００ｍｌ振盪フラスコ中の２％グルコースを補足した２５ｍｌのＶｅｒｄｕｙｎ培地（Ｖｅｒｄｕｙｎら、Ｙｅａｓｔ  ８：５０１−５１７、１９９２）に、凍結ストック培養物又は寒天プレートからの単一コロニーを接種することにより、前培養物を調製した。オービタルシェーカー（２８０ｒｐｍ）において３０℃で約２４時間インキュベートした後、この培養物を収集し、二酸化炭素発生の測定及びエタノール生成実験に使用した。
【０１２０】
エタノール生成用の培養は、ＢＡＭ（バイオロジカル・アクティビティ・モニタ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒ）、Ｈａｌｏｔｅｃ、オランダ）において１００ｍｌの合成モデル培地（５％グルコース、５％キシロース、３．５％アラビノース、１％ガラクトース及び０．５％マンノースを含むＶｅｒｄｕｙｎ培地（Ｖｅｒｄｕｙｎら、Ｙｅａｓｔ  ８：５０１−５１７、１９９２））中、３０℃で実施した。培地のｐＨを２Ｍ  ＮａＯＨ／Ｈ２ＳＯ４で４．２に調整した後、滅菌した。嫌気性培養用の合成培地は、エタノールに溶解した０．０１ｇ／ｌエルゴステロール及び０．４２ｇ／ｌツイーン８０を補足した（Ａｎｄｒｅａｓｅｎ  ａｎｄ  Ｓｔｉｅｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４１：２３−３６、１９５３；及びＡｎｄｒｅａｓｅｎ  ａｎｄ  Ｓｔｉｅｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４３：２７１−２８１、１９５４）。培地は約２の初期ＯＤ６００で接種した。培養物はマグネチックスターラで撹拌した。培養物は曝気しなかったため、発酵中、嫌気的条件が急速に生じた。二酸化炭素の生成を常に観測した。糖変換及び生成物形成（エタノール、グリセロール）をＮＭＲにより分析した。ＬＫＢ  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  Ｋ分光光度計で６００ｎｍの培養物光学濃度を追跡することにより増殖を観測した。
【０１２１】
［実施例１］
［キシロースイソメラーゼ発現ベクターの構築］
一次アミノ酸配列に基づき合成コドンペア最適化ｘｙｌＡ遺伝子を設計し、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）によって合成した。コドンペア最適化は過去に記載されているとおり実施した（国際公開第２００８０００６３２号パンフレット）。ヌクレオチド配列はここに配列番号１として含まれ、対応するアミノ酸配列は配列番号２として含まれる。
【０１２２】
制限酵素ＳｐｅＩ及びＸｍａＩを使用して、オープンリーディングフレームを酵母シャトルベクターｐ４２７−ＴＥＦ（図１；ＤｕａｌＳｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ、スイス）にクローニングした。
【０１２３】
プラスミドをｐＰＷＴ２１５と命名した。
【０１２４】
［実施例２］
［ｐＰＷＴ２１５によるＢＩＥ１０４Ｐ１の形質転換］
ＧＲＥ３遺伝子がペントースリン酸経路の非酸化的部分の遺伝子に置き換えられた国際公開第２００９１０９６３３号パンフレットに開示されるとおりのＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株、ＢＩＥ１０４Ｐ１（ＭＡＴａ  ＵＲＡ３  ＨＩＳ３  ＬＥＵ２  ＴＲＰ１  ＭＡＬ２−８  ＳＵＣ２  ＧＲＥ３：：［ＴＰＩ１ｐ−ＴＡＬ１＿ＡＤＨ１ｐ−ＴＫＬ１＿ＰＧＩ１ｐ−ＲＰＥ１＿ＥＮＯ１ｐ−ＲＫＩ１］）を、Ｃｈｅｎら（１９９２）により記載されるワンステップ酵母形質転換方法を用いてプラスミドｐＰＷＴ２１５で形質転換した。陰性対照としてミリＱを使用した。形質転換手順の最終的なペレットを１ｍｌのＹＥＰｈ２％グルコース（上記参照）に再懸濁した。この形質転換混合物のうち５０μｌを、２％グルコース及び２００μｇのＧ４１８／ｍｌを補足したＹＥＰｈ寒天プレートに播いた。残りの９５０μｌは、２％キシロース、１０μｇのＧ４１８／ｍｌ及び２５０μｌのペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）溶液（Ｇｉｂｃｏ／ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補足した２５ｍｌのＶｅｒｄｕｙｎ培地が入った１００ｍｌ振盪フラスコに移し替えた。接種したフラスコ（モック形質転換及びプラスミド形質転換）を、回転式振盪機において３０℃及び２８０ｒｐｍでインキュベートした。光学濃度を経時的に追跡した。
【０１２５】
［実施例３］
［増殖実験］
形質転換後の増殖実験の進行を図２に示す。
【０１２６】
増殖実験の最初の１０日間、培養物の６００ｎｍの光学濃度はほとんど増加しなかった。２０日後（図２において「１」で示される）、プラスミド形質転換細胞培養物の光学濃度は２０より大きい値に達した。続いて、所定量の培養物を、２％キシロース、１０μｇのＧ４１８／ｍｌ及び２５０μｌのペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）を含有する２５ｍｌのＶｅｒｄｕｙｎ培地の新鮮なアリコートに移し替えた。図２から明らかなとおり、移し替えは４回行った。この増殖実験は、４回目の移し替え後の最後の培養を除いて空気の存在下で実施し、最後の培養は、ウォーターロックを備える振盪フラスコ（嫌気的条件）で実施した。
【０１２７】
図２から、ｐＰＷＴ２１５で形質転換した株ＢＩＥ１０４Ｐ１の酵母細胞が単一の炭素及びエネルギー源としてのキシロースの利用能を獲得した一方、同じ株のモック形質転換の酵母細胞は、光学濃度の増加を示さなかったことから、キシロース上では増殖することができないと結論付けることができる。
【０１２８】
［実施例４］
［ペントース発酵細胞の構築］
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）株ＢＩＥ２９２は、株ＢＩＥ２０１の誘導体である。この株の構築は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５６２４２号明細書の実施例７に開示されている。これは、形質転換及び適応進化によって効率的なアラビノース発酵に最適化された株である株ＢＩＥ２０１と、適応進化前の、その親である株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ａとの戻し交雑の結果である。株ＢＩＥ２９２は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来の遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢ及びａｒａＤ、並びに非酸化的ペントースリン酸経路遺伝子ＴＡＬＩ、ＴＫＬ１、ＲＰＥ１及びＲＫＩ１を構成的に発現し、アルドースレダクターゼをコードするＧＲＥ３遺伝子が欠失している。加えて、ＢＩＥ２９２は、染色体ＶＩＩ上でのこのアラビノースカセットの増幅及びＧＡＬ８０遺伝子におけるＳＮＰ（ヌクレオチド変化Ａ４３６Ｃ、ここでは開始コドンＡＴＧのＡが１である）を有する。
【０１２９】
続いて、株ＢＩＥ２９２を、ゲノムにおけるＴｙ１配列に対する１００ｂｐの重複領域が隣接する、プロモーター配列及びターミネーター配列を含むコドンペア最適化ｘｙｌＡ遺伝子のＰＣＲ断片で形質転換した。ｘｙｌＡ発現カセットを、ｐＰＷＴ２１５を鋳型として使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応は、プライマー配列の配列番号３及び配列番号４により、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を使用して供給者の指示を用いて実施した。増幅した発現カセットをエタノール沈殿し、使用まで−２０℃で保存した。
【０１３０】
沈殿したＤＮＡを遠心により回収し、ＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、続いて風乾した。ＤＮＡを、ＴＥ緩衝液中約１μｇ  ＤＮＡ／μｌの濃度で溶解した。
【０１３１】
２％グルコースを含有するＹＥＰｈ培地で酵母株ＢＩＥ２９２を増殖させた。上記に記載したとおり、電気穿孔用にコンピテント細胞を調製した。エレクトロコンピテント細胞を２０μｇのＰＣＲ産物で形質転換した。陰性対照としてミリＱ水を使用した。
【０１３２】
ｘｙｌＡ形質転換及びモック形質転換の両方の形質転換混合物を、２％キシロース及び２５０μｌのペニシリン−ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）を補足した２５ｍｌのＶｅｒｄｕｙｎ培地が各々入った４つの異なる振盪フラスコに直接移し替えた。優勢な選択マーカーを使用しないため、形質転換後のプレート上での正しい形質転換体の選択は実施しなかった。
【０１３３】
８つの振盪フラスコを回転式振盪機において３０℃及び２８０ｒｐｍでインキュベートした。６００ｎｍの光学濃度を高頻度で計測することにより、増殖を観測した。
【０１３４】
［実施例５］
［ペントース発酵酵母株の選択及び特性決定］
実施例４に記載される培養物が１５より大きい６００ｎｍの光学濃度に達した場合、２％キシロースを補足したＶｅｒｄｕｙｎ培地が入ったフラスコに、２５０μｌのアリコートを移し替える。６００ｎｍの光学濃度を高頻度で観測する。光学濃度データを使用して増殖速度を決定する。
【０１３５】
キシロース含有培地での数サイクルの接種後、アラビノース利用に対する選択圧を保つため、炭素源として２％アラビノースを含有するＶｅｒｄｕｙｎ培地が使用される。同様に、ヘキソース（すなわちグルコース、ガラクトース及び／又はマンノース）とペントース（すなわちアラビノース及び／又はキシロース）との混合物を補足したＶｅｒｄｕｙｎ培地が入ったフラスコを使用する。培養実験は、アラビノース及びキシロースの双方に関して、初めは好気的条件下で実施するが、続いて、例えば増殖速度が毎時約０．０７以上の値を超えたとき、嫌気的条件下で実施する。
【０１３６】
嫌気的条件下での数サイクルの増殖及び再接種の後、培養物のアリコートをミリリットルあたり約１００〜１０００コロニー形成単位（ＣＦＵ）に希釈し、続いて１０〜１００μｌのアリコートを、２％グルコースを含有するＹＥＰｈ寒天プレートに播き広げる。プレートを３０℃で少なくとも４８時間、又は単一コロニーが認められるまで、インキュベートする。
【０１３７】
単一コロニー単離物をＢＡＭ（上記参照）で試験する。単一コロニー単離物は、二酸化炭素プロファイル並びに糖類、エタノール及び副生成物のＮＭＲデータから推定されるとおりの、５つ全ての糖類を効率的に発酵する能力に基づき選択する。
【０１３８】
ＰＣＲ、サザンブロット、ＦＩＧＥ及びリシーケンシングなどの当業者に公知の遺伝学的及び分子生物学的技法により、最良の株を特徴付ける。
【０１３９】
［実施例６］
［ペントース発酵酵母株の選択及び特性決定］
実施例４に記載される培養物が１０より大きい６００ｎｍの光学濃度に達したとき、２％キシロースを補足したＶｅｒｄｕｙｎ培地が入った振盪フラスコに、２５μｌのアリコートを移し替えた。光学濃度を高頻度で観測し、それらのデータを使用して増殖速度を決定した。培養物が１５より大きい６００ｎｍの光学濃度に達したとき、培養物のアリコートを２％キシロースを補足したＶｅｒｄｕｙｎ培地が入った振盪フラスコに移し替え、振盪フラスコをウォーターロックで閉鎖し、嫌気性培養を可能にした。ここから、オービタルシェーカーにおいて３０℃及び１００ｒｐｍでインキュベーションを実施した。６００ｎｍの光学濃度を計測することにより培養物の増殖を観測し、それらのデータに基づき増殖速度を計算した。培養物の６００ｎｍの光学濃度が３．７５より大きい値に達したとき、培養物のアリコートを、２％アラビノースを補足したＶｅｒｄｕｙｎ培地が入った振盪フラスコに移し替えた。振盪フラスコをウォーターロックで閉鎖した。培養物が５より大きい値の６００ｎｍの光学濃度に達した場合、培養物のアリコートを、２％キシロースを補足したＶｅｒｄｕｙｎ培地が入った振盪フラスコに再び移し替え、この振盪フラスコをウォーターロックで閉鎖した。この増殖実験の典型的な結果を図３に提供する。
【０１４０】
図３から明らかなとおり、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｙｅｒｉｎｃｋｉｉ）由来のＸｙｌＡでＢ１Ｅ２９２を形質転換すると、この株はキシロース消費表現型を速やかに獲得することが可能であった一方、モック形質転換はキシロース消費細胞をもたらさなかった。
【０１４１】
表１は、いくつかの生物のキシロースイソメラーゼ遺伝子で形質転換したＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株の増殖速度を提供する。株ＢＩＥ２９２ＸＩ（Ｃ．ベイジェリンキ（Ｃ．ｂｅｙｅｒｉｎｃｋｉｉ））は、形質転換後における単一炭素源としてのキシロース上での増殖時、好気的条件下で最も高い増殖速度を実証した。加えて、ＢＩＥ２９２ＸＩ（Ｃ．ベイジェリンキ（Ｃ．ｂｅｙｅｒｉｎｃｋｉｉ））は、広範な進化操作を行うことなく嫌気的条件下においてキシロース上で増殖できる唯一の株であった。
【０１４２】
【表１】
0006048980.tif 000002
【０１４３】
上記の表に提供するデータは、全て異なる株バックグラウンドから得られている。−は未計測又は未試験を示す。Ｔ．サーモフィルス（Ｔ．Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＸＩを有するＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株については、キシロースの消費は観察されたものの、増殖を支えるには消費レベルが低過ぎたことが注記される。
【図１】
0006048980.tif 000003
【図２】
0006048980.tif 000004
【図３】
0006048980.tif 000005
【配列表】
0006048980000001.app