(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
油脂成分生産能を有する藻類の藻類株であるシュードコリシスチス  エリプソイディア（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）Ｎ１株、またはシュードコリシスチス  エリプソイディア（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）Ｏｂｉ株を培地で培養する培養方法において、
前記藻類株の培養を開始し、前記藻類株を培養する前記培地の光学濃度が飽和状態を示す光学濃度の３５分の４に達してから３分の１に達するまでの間に前記培地にＮａＣｌを投入する工程を含む、
ことを特徴とする藻類の培養方法。
【請求項２】
前記培地にＮａＣｌを投入した後の前記培地のＮａＣｌ濃度は０．２重量％〜３重量％である
ことを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の培養方法によって前記藻類株を培養し、前記藻類株から油脂成分を取り出すことを特徴とする油脂成分の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炭化水素類生産能を有する微細藻類（以下、藻類と表記する）の培養方法、及び炭化水素類の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
藻類が産生する油脂などの炭化水素類は、バイオ燃料の原料となることが明らかとなっている。藻類細胞の油脂（炭化水素類）産生能力は、藻類の培養液中に塩を加えるなどの環境ストレスを与えることによって向上することが報告されている（例えば、非特許文献１）。その他にも、例えば、特表２０１０−５１４４４６号公報（特許文献１）には、藻類細胞あたりの脂質生成を増加させるために、高密度の藻類培養物に対して、藻類の収穫前に何らかの形態の環境的ショック（温度、ｐＨ、光、塩分、１つ以上の化学物質または制御化合物の濃度）を加えることが記載されている。また、Ｓｉａｕｔら（２０１１）は、緑藻クラミドモナス  レインハードチイ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、以下、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉとする）の野生株ＣＣ１２４を培養し、培養が対数増殖中期に達した培養液に塩（ＮａＣｌ）を加えてさらに２日間培養することによって、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの野生株ＣＣ１２４の細胞あたりの油脂蓄積量が向上することを報告している（非特許文献２）。なお、非特許文献２では、塩ストレスによってＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの野生株ＣＣ１２４の成長が止まることも報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２０１０−５１４４４６号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ranga Rao A, Dayananda C, Sarada R, Shamala T.R., Ravishankar G.A. (2007) Effect of salinity on growth of green alga Botryococcus braunii and its constituents. Bioresource Technolgy 98:560-564
【非特許文献２】Magali Siaut, Stephan Cuine, Caroline Cagnon, Boris Fessler, Mai Nguyen, Patrick Carrier, Audrey Beyly, Fred Beisson, Christian Triantaphylides, Yonghua Li-Beisson, Gilles Peltier, Oil accumulation in the model green alga Chlamydomonas reinhardtii: characterization, variability between common laboratory strains and relationship with starch reserves, BMC Biotechnology, 2011, 11:7
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非特許文献２に記載の方法では、塩を加えることで藻類細胞の成長が止まってしまうことが報告されている。そのため藻類の種類によっては藻類細胞の成長が止まってしまったり、抑制されてしまったりする可能性がある。したがって、塩を加えることで、藻類細胞あたりの脂質生成は増加しても、藻類細胞の成長が止まる又は抑制されることにより、藻類が最終的に炭化水素類を生産できる能力を示す藻類の炭化水素類生産能は増加しないといった問題がある。さらに、藻類の炭化水素類生産能を向上させるために、培養中のどの段階で塩を加えるのが効果的であるかは明らかになっていない。
【０００６】
本発明は以上の点に鑑みなされたものであり、藻類の炭化水素類生産能を向上することができる藻類の培養方法、及び炭化水素類の生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
請求項１に係る発明の藻類の培養方法は、炭化水素類生産能を有する藻類を培地で培養する培養方法において、前記藻類の培養を開始してから、前記藻類を培養する前記培地の光学濃度が飽和状態を示す光学濃度の２分の１の光学濃度に達する間に前記培地に塩を投入する工程を含む、ことを特徴とする。
【０００８】
本発明の培養方法によれば、塩を投入する期間を、藻類を培養する培地の光学濃度が飽和状態を示す光学濃度の２分の１の光学濃度に達する間に設定することによって、藻類の炭化水素類生産能を向上することができる。
【０００９】
なお、藻類の炭化水素類生産能は、単位体積当たりの藻の重量と、藻類重量あたりの炭化水素類の含有率との積で表される炭化水素類収率で示される。炭化水素類収率の増加は、藻類の炭化水素類生産能の向上を示す。
【００１０】
本発明の培養方法において、光学濃度（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）とは、ｌｏｇ（Ｉ0／Ｉ）で表され、半透明媒質の不透明の程度を示す指標になる。Ｉ0は培地に照射する光である入射光の強さ、Ｉは培地を透過した光である透過光の強さを示す。光学濃度は、培養中の培地を適宜取り出して、培地を透過した透過光の強さを、吸光光度計を使用して測定することによって求められる。培養を開始すると培地の不透明度は増すので、培地の光学濃度の増加は藻類の増殖を示す指標となる。
【００１１】
飽和状態とは、藻類がこれ以上培地で増殖できなくなった状態のことを示す。飽和状態を示す光学濃度の決定には、コントロール培地が使用される。コントロール培地とは、塩が投入されない以外は、同一の培養条件となる培地である。コントロール培地が飽和状態に達すると藻類が増殖できない状態になるので、培地の光学濃度は、一定の値を示す。本発明において、この一定の値が、飽和状態を示す光学濃度である。なお、一定とは、藻類の増殖が緩やかになり、培地の光学濃度の変動が緩やかになっている状態も含まれる。
【００１２】
本発明で藻類が生産する炭化水素類は、例えば、飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素であり、炭素数や不飽和結合の数などは特に限定されない。例えば炭素数が１０〜２５個で不飽和結合をそれぞれ０個〜３個備える脂肪族炭化水素の１種または２種以上の混合物が挙げられる。また、前記炭化水素類には脂肪酸がグリセロールとエステル結合した化合物であるアシルグリセライドも含む。これら炭化水素類は前記藻類が産生する油脂成分であり、バイオ燃料として活用することができる。
【００１３】
本発明で使用される塩は、藻類にストレスを与えて藻類の増殖に影響を与えるストレス因子であり、塩としては、例えばＮａＣｌ等が挙げられる。
本発明で使用される培地は、藻類の培養に通常使用されているものでよく、例えば、各種栄養塩、微量金属塩、ビタミン等を含む培地である。栄養塩としては、窒素源となるＮａＮＯ3、ＫＮＯ3、ＮＨ4Ｃｌ、尿素等や、リン源となるＫ2ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ４、グリセコリン酸ナトリウム等が挙げられる。微量金属塩としては、鉄、マグネシウム、マンガン、カルシウム、亜鉛等が挙げられる。ビタミンとしては、ビタミンＢ1、ビタミンＢ12等が挙げられる。培地中のｐＨは、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲内であれば特に制限はないが、例えばｐＨ３〜６とすることが好ましい。
【００１４】
本発明の培養方法は、藻類の培養に用いられる一般的培養手段を用いることができる。例えば、培地をフラスコ等の培養容器に入れて、藻類を培地に加えた後、通気条件下、ＣＯ2の供給と共に攪拌すればよい。その際、培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲内であれば特に制限はないが、室温で培養することが好ましい。光条件は、光合成可能な条件であれば特に制限はないが連続光とすることが好ましい。
【００１５】
本発明の培養方法において、塩は藻類の培養を開始してから、藻類を培養する培地の光学濃度が飽和状態を示す光学濃度の２分の１の光学濃度に達する間、好ましくは５分の２の光学濃度に達する間、さらに好ましくは３分の１の光学濃度に達する間に投入される。また、塩は、藻類を培養する培地の光学濃度が飽和状態を示す光学濃度の好ましくは９分の１の光学濃度に達してから、さらに好ましくは４分の１に達してから投入される。
【００１６】
本発明で培養する藻類は、炭化水素類生産能を有する藻類であり、例えば淡水に生息する藻類が挙げられる。本発明で培養する淡水に生息する藻類としては、例えば、シュードコリシスチス  エリプソイディア（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）、ボトリオコッカス  ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ）等がある。また、本発明で培養する藻類の藻類株としては、シュードコリシスチス  エリプソイディア（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）Ｎ１株やシュードコリシスチス  エリプソイディア（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）Ｏｂｉ株が好ましい。シュードコリシスチス  エリプソイディア（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）Ｎ１株は、２００６年１月１８日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室）に寄託されている。国際受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４８５である。シュードコリシスチス  エリプソイディア（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）Ｏｂｉ株は、２００５年２月１５日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室）に寄託されている。その後、２００６年１月１８日に、国際寄託へ移管されている。国際受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４８４である。
【００１７】
培地に塩を投入した後の前記培地の塩濃度は、０．２重量％〜３重量％であることが好ましく、０．２重量％〜１重量％であるとさらに好ましく、０．２重量％〜０．６重量％であるとさらに好ましく、０．２重量〜０．４重量％であるとさらに好ましい。前記培地の塩濃度が０．２重量％〜３重量％であることにより藻類の炭化水素類生産能を一層向上させることができる。
【００１８】
本発明の炭化水素類の生産方法は、上述した培養方法によって効率よく培養された藻類を使用する。使用された藻類は、藻類の炭化水素類生産能が向上しているので、この藻類を使用した生産方法は、炭化水素類を効率よく生産することができる。
【００１９】
本発明の炭化水素類の生産方法において、藻類から炭化水素類を取り出す方法は、常法に従って行うことができる。例えば、ホモジナイザーなどの一般的な方法により細胞を破砕してから、ｎ−ヘキサン等の適当な有機溶媒によって抽出した後、減圧又は常圧下で、加温又は常温で抽出後の溶媒を除去することにより炭化水素類を取り出す方法等がある。また、細胞をガラス繊維等のフィルター上に回収し、乾燥させてから、有機溶媒などによって抽出した後、抽出後の溶媒を上記と同様の方法によって除去することにより炭化水素類を取り出す方法等も可能である。また、細胞を遠心分離で回収し、凍結乾燥して粉末化し、その粉末から有機溶媒で抽出した後、抽出後の溶媒を上記と同様の方法によって除去することにより炭化水素類を取り出す方法等も可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】コントロール培地で培養した場合の増殖曲線を示すグラフである。
【図２】（ａ）は、各ＯＤに達した時にＮａＣｌを投入した場合のシュードコリシスチス  エリプソイディアＮ１株の乾燥重量を示すグラフである。（ｂ）は、各ＯＤに達した時にＮａＣｌを投入した場合のシュードコリシスチス  エリプソイディアＮ１株の炭化水素類含有率を示すグラフである。（ｃ）は、各ＯＤに達した時にＮａＣｌを投入した場合のシュードコリシスチス  エリプソイディアＮ１株の炭化水素類収率を示すグラフである。
【図３】コントロール培地で培養した場合の炭化水素類組成を示すグラフである。
【図４】ＮａＣｌ濃度が０．４重量％である場合の炭化水素類組成を示すグラフである。
【図５】生産されたトリグリセリド中の脂肪酸組成を示すグラフである。
【図６】（ａ）は、各ＮａＣｌ濃度におけるシュードコリシスチス  エリプソイディアＮ１株の乾燥重量を示すグラフである。（ｂ）は、各ＮａＣｌ濃度におけるシュードコリシスチス  エリプソイディアＮ１株の炭化水素類含有率を示すグラフである。（ｃ）は、各ＮａＣｌ濃度におけるシュードコリシスチス  エリプソイディアＮ１株の炭化水素類収率を示すグラフである。
【図７】各ＮａＣｌ濃度におけるシュードコリシスチス  エリプソイディアＮ１株の増殖曲線を示すグラフである。
【図８】（ａ）は、各ＮａＣｌ濃度におけるシュードコリシスチス  エリプソイディアＯｂｉ株の乾燥重量を示すグラフである。（ｂ）は、各ＮａＣｌ濃度におけるシュードコリシスチス  エリプソイディアＯｂｉ株の炭化水素類含有率を示すグラフである。（ｃ）は、各ＮａＣｌ濃度におけるシュードコリシスチス  エリプソイディアＯｂｉ株の炭化水素類収率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
次に、本発明の実施形態について一例を挙げて説明する。但し、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
［第１実施形態］
１．［シュードコリシスチス  エリプソイディア（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）Ｎ１株の培養方法、及び炭化水素類の生産方法］
（１−１）培地の調製
ＡＦ６培地を５００ｍL調製した。なお、ＡＦ６培地の組成は以下に示す通りである。
【００２２】
NaNO3 14mg/L, NH4NO3 2.2mg/L, MgSO4/7H2O 3mg/L, KH2PO4 1mg/L, K2HPO4 0.5mg, CaCl2/2H2O 1mg/L, CaCO3 1mg/L, Fe-citrate 0.2mg/L, Citric acid 0.2mg/L, Biotin 0.2μg/L, Thiamine HCl 1μg/L, Vitamin B6 0.1μg/L, Vitamin B12 0.1μg/L, Trace metals 0.5mL/L, Distilled water 99.5mL/L
（１−２）シュードコリシスチス  エリプソイディアＮ１株の培養、及び炭化水素類の生産
４つの５００ｍL扁平フラスコを準備し、それぞれをフラスコ１、フラスコ２、フラスコ３、フラスコ４とした。各フラスコに（１−１）に記載の培地を入れて、藻類株としてシュードコリシスチス  エリプソイディアＮ１株をそれぞれの培地に加えた後、蛍光灯で光をあてながら通気条件下、ＣＯ2の供給と共に室温で攪拌することによって培養を開始した。各フラスコについて培地の光学濃度（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ、以下、ＯＤとも訳す）が、フラスコ１では１．２ＯＤに達した時に、フラスコ２では３．５ＯＤに達した時に、フラスコ３では５ＯＤに達した時に、フラスコ４では８．８ＯＤに達した時に、それぞれのフラスコに培地のＮａＣｌ濃度が０．４重量％になるように、ＮａＣｌを投入した。光学濃度（ＯＤ）については後述する。培養を９日間行った後、フラスコ１〜フラスコ４の培地をそれぞれ遠心分離し、上澄みを除去した後シュードコリシスチス  エリプソイディアＮ１株の沈殿物を回収した。フラスコ１〜フラスコ４の培地から得られた沈殿物はそれぞれについて以下に記載の処理を行って炭化水素類を得た。沈殿物を乾燥後、その乾燥体を入れた試験管にｎ−ヘキサンを加え、３０分間静置した。その後、超音波をかけて乾燥体に含まれる炭化水素類をｎ−ヘキサン中に抽出した。抽出液のみをフラスコに移した。残渣には再度ｎ−ヘキサンを加え、上記と同様にして炭化水素類を抽出した。抽出液を上記フラスコに移した。この操作を、残渣に加えたヘキサン層が、超音波をかけた後でも透明となるまで繰り返した。その後、上記フラスコに集めた抽出液中のｎ−ヘキサンを、遠心エバポレーターを用いて除去することによって、炭化水素類を得た。
【００２３】
なお、光学濃度（ＯＤ）は、ｌｏｇ（Ｉ0／Ｉ）で表され、培地の不透明の程度を示す指標になる。Ｉ0は培地に照射する光である入射光の強さ、Ｉは培地を透過した光である透過光の強さを示す。フラスコ１〜フラスコ４、それぞれについて、ＮａＣｌを投入する時の培地の光学濃度（ＯＤ）が上記に記載されているが、これらの光学濃度は、コントロール培地が飽和状態を示す光学濃度（ＯＤ）から決定した。コントロール培地とは、ＮａＣｌが投入されない以外は同一の培養条件となる培地である。
【００２４】
コントロール培地が飽和状態を示す光学濃度（ＯＤ）は、以下に記載のように決定した。
（１−１）に記載のＡＦ６培地にシュードコリシスチス  エリプソイディアＮ１株を加えて蛍光灯で光をあてながら通気条件下、ＣＯ2の供給と共に室温で攪拌して培養した。培養開始から５〜４８時間毎に培地を約１ｍＬ取り出し、吸光光度計を使用して波長７２０ｎｍにおける光学濃度を測定した。波長７２０ｎｍにおける光学濃度の変化を図１に示す。図１の横軸は培養時間、縦軸は波長７２０ｎｍにおける光学濃度である。
【００２５】
図１に示されているように培養開始から２１６時間後、培地の光学濃度は１０．５ＯＤとなってその後も一定の値を示した。この光学濃度（１０．５ＯＤ）をコントロール培地が飽和状態を示す光学濃度と決定した。
【００２６】
２．［炭化水素類生産能の評価］
シュードコリシスチス  エリプソイディアＮ１株の炭化水素類収率を算出することによって炭化水素類生産能を評価した。
【００２７】
（２−１）［乾燥重量測定］
（１−２）に記載のシュードコリシスチス  エリプソイディアＮ１株の沈殿物を乾燥後に、その乾燥体の乾燥重量を測定した。
【００２８】
測定結果を図２（ａ）に示す。図２（ａ）の横軸はＮａＣｌ投入時のＯＤ、縦軸は、乾燥重量である。それぞれの測定結果を、コントロール培地で培養した培養結果と比較した。その結果、ＮａＣｌ投入時のＯＤがいずれの場合でも、コントール培地で培養した場合と比較して乾燥重量は減少することが明らかとなった。
【００２９】
（２−２）［炭化水素類含有率の測定］
（１−２）に記載の沈殿物を乾燥後、油分分析用ＴＤ-ＮＭＲ（Ｔｉｍｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、時間領域核磁気共鳴）装置を使用して炭化水素類含有率を測定した。標準試料にオリーブ油を使用した。その結果を図２（ｂ）に示す。図２（ｂ）の横軸はＮａＣｌ投入時のＯＤ、縦軸は、炭化水素類含有率を示す。この結果から、ＮａＣｌ投入時のＯＤがいずれの場合でもコントール培地で培養した場合と比較して炭化水素類含有率は上昇することが明らかとなった。
【００３０】
（２−３）［炭化水素類収率の算出］
シュードコリシスチス  エリプソイディアＮ１株の炭化水素類収率を、（２−１）で得られた各ＯＤにおける乾燥重量及び、（２−２）で得られた各ＯＤにおける炭化水素類含有率から式１を用いて算出した。計算式を式１に示す。
（式１）炭化水素類収率［ｇ／Ｌ］＝炭化水素類含有率／１００×乾燥重量［ｇ／Ｌ］
図２（ｃ）に示されるように、ＮａＣｌ投入時のＯＤが１．２，３．５ＯＤの場合、コントロール培地で培養した場合と比較してそれぞれ炭化水素類収率が高くなり炭化水素類生産能が向上することが明らかとなった。さらにＮａＣｌ投入時のＯＤが３．５ＯＤの場合が、最も炭化水素類生産能が向上することが示された。
【００３１】
３．［炭化水素類組成の評価］
（１−２）に記載の炭化水素類の組成をＧＣ−ＭＳ（Ｇａｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｏｍｅｔｅｒ、ガスクロマトグラフ質量）分析によって評価した。
【００３２】
（３−１）［ＧＣ−ＭＳ分析用の試料調製］
（１−２）に記載の抽出液を１ｍＬ以下に濃縮した後、測定前に濃縮溶液の容量を１ｍＬにメスアップし、メチルエステル化したものをＧＣ−ＭＳ分析用の試料とした。比較対照にコントロール培地（塩濃度０重量％）で培養した培養物の試料も同様に調製した。
【００３３】
（３−２）［ＧＣ−ＭＳ分析条件］
ＧＣ−ＭＳ分析条件は以下に示す通りである。
測定機器：ＧＣＭＳ−ＱＰ５０００（島津製作所），ＧＣ−ＭＳ分析用キャピラリーカラム：ＤＢ−２３，イオン化法：電子イオン化（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、ＥＩ）法、化学イオン化（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、ＣＩ）法，標準試料：スペルコ社ＦＡＭＥ  ｍｉｘ（Ｃ１４〜Ｃ２４），インジェクター温度：２８０℃，試料注入量：１μ，注入方法：スプリットレスモード，インターフェース温度：３００℃，サンプリング時間：０．５分，カラム入り口圧：１００ｋＰａ，ガス流量：５０．０ｍＬ／ｍｉｎ，キャリアーガス：ヘリウムガス，昇温条件：分析開始より５０℃で２分保持、６℃／ｍｉｎで３００℃まで昇温後、３００℃で１８分保持，イオン化電圧（ＥＩ）：７０ｃＶ，反応ガス（ＣＩ）：メタン，スキャン範囲：ｍ／ｚ  ５０〜５００
（３−３）「ＧＣ−ＭＳ分析結果」
（３−２）に記載の条件下、ＧＣ−ＭＳ分析を行い、（１−２）に記載の炭化水素類の組成を評価した。図３は、（１−２）に記載の培養方法において、ＮａＣｌが投入されない以外は同一の培養条件となるコントロール培地で生産された炭化水素類の組成を示す。図４は、（１−２）に記載の培養方法において、培地の光学濃度が３．５ＯＤを示した時に、ＮａＣｌ濃度が０．４重量％になるようにＮａＣｌを投入した場合において生産された炭化水素類の組成を示す。この結果から、ＮａＣｌ濃度が０．４重量％になるようにＮａＣｌを投入した場合に生産されたトリグリセリドの含有率は、６４．５重量％であり、コントロール培地から得られた炭化水素類に含まれるトリグリセリドの含有率（５３．８%）と比較して高くなることが明らかとなった。トリグリセリドはバイオ燃料の原料になる。したがって、培地の光学濃度が３．５ＯＤを示した時に、ＮａＣｌ濃度が０．４重量％になるようにＮａＣｌを投入することによって、効率的にバイオ燃料の原料を得ることができると考えられる。
【００３４】
なお、得られたトリグリセリドを同様にＧＣ−ＭＳ分析を行うことによって、トリグリセリドに含まれる脂肪酸組成を分析した。その結果を図５に示す。ＮａＣｌ濃度が１．６重量％になるように、培地の光学濃度が３．５ＯＤを示した時にＮａＣｌを投入した場合に得られたトリグリセリドについても同様に分析した。
【００３５】
この結果から、コントロール培地、ＮａＣｌ濃度が０．４重量％の培地、ＮａＣｌ濃度が１．６重量％の培地のいずれの場合でも、トリグリセリド中の脂肪酸組成に大きな変化はなく、軽油成分が多く含まれることが示された。さらに、培地のＮａＣｌ濃度が０．４重量％の培地、ＮａＣｌ濃度が１．６重量％とした場合には、コントロール培地から得られた脂肪酸と比較して、二重結合の数が０個又は１個の脂肪酸が含まれる割合が、ＮａＣｌ濃度が０．４重量％、１．６重量％と高くなるにつれて減少した。また、二重結合の数が２個又は３個の脂肪酸が含まれる割合が、ＮａＣｌ濃度が０．４重量％、１．６重量％と高くなるにつれて増加する傾向にあった。しがたって、培地のＮａＣｌ濃度を高くすることによってコントロール培地で培養した場合と比較して脂肪酸の流動性を高めることができると考えられる。
［第２実施形態］
前記第1実施形態と同様にしてシュードコリシスチス  エリプソイディアＮ１株を培養した。ただし、培地の光学濃度が３．５ＯＤを示したときに、ＮａＣｌ濃度がそれぞれ０．１，０．２，０．３，０．４，０．５，０．８重量％となるようＮａＣｌを投入した。それぞれのＮａＣｌ濃度で培養後、前記第１実施形態と同様にして炭化水素類を得た。
【００３６】
４．［炭化水素類生産能の評価］
上記シュードコリシスチス  エリプソイディアＮ１株について、それぞれの塩濃度で培養した場合の炭化水素類生産能を、２．の記載と同様にして評価した。
【００３７】
（４−１）［乾燥重量測定］
（２−１）記載と同様にして乾燥重量を測定した。測定結果を図６（ａ）に示す。
図６（ａ）の横軸はＮａＣｌの濃度、縦軸は、乾燥重量である。図６（ａ）に示すようにＮａＣｌ濃度が高くなるほど乾燥重量は減少することが明らかとなった。
【００３８】
また、図７に、ＮａＣｌ濃度を０，０．４，０．８，１．６重量％にした場合の波長７２０における光学濃度の変化を示す。図７からＮａＣｌ濃度が高くなるほど培養時間あたりの光学濃度が減少し、光学濃度の上昇が緩やかになることから、藻類の増殖が抑制されているが明らかとなった。
【００３９】
したがって、図６（ａ）で示される乾燥重量の減少は、ＮａＣｌによってシュードコリシスチス  エリプソイディアＮ１株の増殖が阻害されたことに起因することが明らかとなった。
【００４０】
（４−２）［炭化水素類含有率の測定］
（２−２）記載と同様にして炭化水素類含有率を決定した。その結果を図６（ｂ）に示す。図６（ｂ）の横軸はＮａＣｌ濃度、縦軸は、炭化水素類含有率を示す。この結果から、ＮａＣｌ濃度が０重量％の場合と比較して、ＮａＣｌを加えることによって炭化水素類含有率は上昇することが明らかとなった。
【００４１】
（４−３）［炭化水素類収率の算出］
（２−３）記載と同様にして、（４−１）で得られた各ＮａＣｌ濃度における乾燥重量及び、（４−２）で得られた各ＮａＣｌ濃度における炭化水素類含有率から炭化水素類収率を算出した。その結果を図６（ｃ）に示す。図６（ｃ）の横軸はＮａＣｌ濃度、縦軸は、炭化水素類収率を示す。この結果から、ＮａＣｌ濃度が０．２，０．３，０．４，０．５重量％になるようにＮａＣｌを投入した場合は、ＮａＣｌ濃度が０重量％の場合と比較して炭化水素類収率が高くなり、炭化水素類生産能が向上することが明らかとなった。さらに、ＮａＣｌ濃度が０．４重量％になるように投入した場合が、最も炭化水素類生産能が向上することが示された。
［第３実施形態］
前記第１実施形態と同様にしてシュードコリシスチス  エリプソイディア（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）Ｏｂｉ株培養した。ただし、培地の光学濃度が３．５ＯＤに達した時に、ＮａＣｌ濃度がそれぞれ１，２，３重量％となるようにＮａＣｌを投入した。それぞれのＮａＣｌ濃度で培養後、前記第１実施形態と同様にして炭化水素類を得た。
【００４２】
５．［炭化水素類生産能の評価］
シュードコリシスチス  エリプソイディアＯｂｉ株について、上記それぞれのＮａＣｌ濃度で培養した場合の炭化水素類生産能を、２．の記載と同様にして評価した。
【００４３】
（５−１）［乾燥重量測定］
（２−１）記載と同様にして乾燥重量を測定した。その結果を図８（ａ）に示す。図８（ａ）の横軸はＮａＣｌの濃度、縦軸は、乾燥重量を示す。この結果からＮａＣｌを加えてもＮａＣｌ濃度が０重量％の場合と比較して乾燥重量の変化は少なく、ＮａＣｌは増殖に影響を与えないことが示された。
【００４４】
（５−２）［炭化水素類含有率の測定］
（２−２）記載と同様にして炭化水素類含有率を決定した。その結果を図８（ｂ）に示す。図８（ｂ）の横軸はＮａＣｌ濃度、縦軸は、炭化水素類含有率を示す。この結果から、ＮａＣｌ濃度が０重量％の場合と比較してＮａＣｌを加えることによって炭化水素類含有率は上昇することが示された。
【００４５】
（５−３）［炭化水素類収率の算出］
（２−３）記載と同様にして、（５−１）で得られた各ＮａＣｌ濃度における乾燥重量及び、（５−２）で得られた各ＮａＣｌ濃度における炭化水素類含有率から炭化水素類収率を算出した。その結果を図８（ｃ）に示す。図８（ｃ）の横軸はＮａＣｌ濃度、縦軸は、炭化水素類収率を示す。この結果から、各ＮａＣｌ濃度における炭化水素類収率は、ＮａＣｌ濃度が０重量％の場合と比較して、ＮａＣｌ濃度が１，２，３重量％の場合は高くなり炭化水素類生産能は向上することが明らかとなった。しがたって、シュードコリシスチス  エリプソイディアＯｂｉ株のそれぞれのＮａＣｌ濃度における炭化水素類生産能は、ＮａＣｌを投入することによって向上し、その中でもＮａＣｌ濃度が１重量％になるように投入した場合は、炭化水素類生産能が最も向上することが示された。
【００４６】
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記の実施形態になんら限定されるものではなく、本発明を逸脱しない範囲において種々の態様で実施しうることはいうまでもない。
【符号の説明】
【００４７】
１…Ｔｏｔａｌトリグリセリド、２…モノグリセリド、３…ジグリセリド、４…Ｃ１６：０（炭素数：不飽和結合数）、５…Ｃ１８：２＋Ｃ１８：１（炭素数：不飽和結合数）、６…Ｃ１７Ｈ３６、７…ＴｏｔａｌＣ２０、８…その他。
【図２】
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【図６】
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【図８】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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