(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドナーにおける幹細胞産生を増加させるために使用するための医薬組成物であって、
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）ペプチドと高分子修飾基との間の共有結合共役体である、ある量のペプチドを含み、
Ｇ−ＣＳＦペプチドは、
【化１】
0005922065.tif 000060
の構造を有し、
式中、ｑは０または１であり、
Ｓｉａ−ＰＥＧは、
【化２】
0005922065.tif 000061
の構造を有し、式中、ｎは４００〜５００の整数であり、
前記量は、１ｍｇから２０ｍｇの範囲であるか、または、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、および２００μｇ／ｋｇから選択される単位用量である、医薬組成物。
【請求項２】
前記Ｇ−ＣＳＦペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ｑは０である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
骨髄移植に対して適格な対象における顆粒球の数を増加させるために使用するための医薬組成物であって、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）ペプチドと高分子修飾基との間の共有結合共役体である、ある量のペプチドを含み、
Ｇ−ＣＳＦペプチドは、
【化３】
0005922065.tif 000062
の構造を有し、
式中、ｑは０または１であり、
Ｓｉａ−ＰＥＧは、
【化４】
0005922065.tif 000063
の構造を有し、式中、ｎは４００〜５００の整数であり、
前記Ｇ−ＣＳＦペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を有し、
前記量は、１ｍｇから２０ｍｇの範囲であるか、または、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、および２００μｇ／ｋｇから選択される単位用量である、医薬組成物。
【請求項５】
対象における幹細胞産生を増加させるために使用するための医薬組成物であって、
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）ペプチドと、ポリ（エチレングリコール）である高分子修飾基との間の共有結合共役体である、ある量のペプチドを含み、
Ｇ−ＣＳＦペプチドは、
【化５】
0005922065.tif 000064
の構造を有し、
式中、ｑは０または１であり、
Ｓｉａ−ＰＥＧは、
【化６】
0005922065.tif 000065
の構造を有し、式中、ｎは４００〜５００の整数であり、
前記量は、１ｍｇから２０ｍｇの範囲であるか、または、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、および２００μｇ／ｋｇから選択される単位用量である、医薬組成物。
【請求項６】
対象における造血を増加させるため、または対象における造血始原細胞の数を増加させるために使用するための医薬組成物であって、
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）ペプチドと高分子修飾基との間の共有結合共役体である有効量のペプチドを含み、
Ｇ−ＣＳＦペプチドは、
【化７】
0005922065.tif 000066
の構造を有し、
式中、ｑは０または１であり、
Ｓｉａ−ＰＥＧは、
【化８】
0005922065.tif 000067
の構造を有し、式中、ｎは４００〜５００の整数であり
前記量は、１ｍｇから２０ｍｇの範囲であるか、または、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、および２００μｇ／ｋｇから選択される単位用量である、医薬組成物。
【請求項７】
骨髄の安定した生着を提供する方法に使用するための医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）ペプチドと高分子修飾基との間の共有結合共役体であるペプチドを含み、
Ｇ−ＣＳＦペプチドは、
【化９】
0005922065.tif 000068
の構造を有し、
式中、ｑは０または１であり、
Ｓｉａ−ＰＥＧは、
【化１０】
0005922065.tif 000069
の構造を有し、式中、ｎは４００〜５００の整数であり、前記共有結合共役体であるペプチドは、１ｍｇから２０ｍｇの範囲の量であるか、または、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、および２００μｇ／ｋｇから選択される単位用量であり、
前記方法が、
（ａ）前記骨髄のドナーに、前記Ｇ−ＣＳＦペプチドを投与すること、
（ｂ）前記ドナーから前記骨髄を単離すること、および
（ｃ）前記骨髄をレシピエントに注入すること、を含む、医薬組成物。
【請求項８】
対象における造血始原細胞の数を増加させるために使用するための医薬組成物であって、（ａ）１，１’−［１，４−フェニレン−ビス−（メチレン）−ビス−１，４，８，１］−テトラアザシクロテトラデカン（ＡＭＤ３１００）である、式（１）の化合物を含む第１の組成物と、
（ｂ）顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）ペプチドと高分子修飾基との間の共有結合共役体であるペプチドを含む第２の組成物であって、Ｇ−ＣＳＦペプチドが、
【化１１】
0005922065.tif 000070
の構造を有し、
式中、ｑは０または１であり、
Ｓｉａ−ＰＥＧは、
【化１２】
0005922065.tif 000071
の構造を有し、式中、ｎは４００〜５００の整数であり、前記共有結合共役体であるペプチドが、１ｍｇから２０ｍｇの範囲の量であるか、または、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、および２００μｇ／ｋｇから選択される単位用量である、前記第２の組成物と、を含む医薬組成物。
【請求項９】
（ａ）顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）ペプチドと水溶性ポリマーの間の共有結合共役体であるペプチドであって、Ｇ−ＣＳＦペプチドが、
【化１３】
0005922065.tif 000072
の構造を有し、式中、ｑは０または１であり、
Ｓｉａ−ＰＥＧは、
【化１４】
0005922065.tif 000073
の構造を有し、式中、ｎは４００〜５００の整数であり、前記共有結合共役体であるペプチドが、１ｍｇから２０ｍｇの範囲の量であるか、または、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、および２００μｇ／ｋｇから選択される単位用量である、前記共有結合共役体であるペプチド、
（ｂ）界面活性剤、
（ｃ）脂肪酸、および
（ｄ）腸溶材料、を成分として含む経口剤であって、前記成分（ａ），（ｂ）および（ｃ）は、液相で混合されると共に成分（ｄ）との混合前に凍結乾燥される、経口剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを用いた治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、好中性顆粒球始原細胞および成熟好中球の生存、増殖、分化、および機能を刺激する糖タンパク質である。臨床用途における、組換え型ヒトＧ−ＣＳＦの２つの形態は、好中球の顆粒球形成の強力な刺激剤であり、いくつかの好中球減少状態の感染性合併症を防止するのに有効であることが実証されている。これらは、骨髄抑制療法からの好中球の回復を加速させるために用いることもできる。
【０００３】
Ｇ−ＣＳＦは、発熱性好中球減少症の発症を低減することにより癌化学療法の病的状態を低減し、骨髄移植によって支持される高用量化学療法の病的状態を低減し、重篤な慢性好中球減少症の患者における感染症の発症と持続を低減する。さらに、Ｇ−ＣＳＦは、心筋梗塞の発病後に投与された場合に治療効果を奏することが示されている。
【０００４】
細胞毒性を有する化学療法の結果としての急性骨髄抑制は、癌治療における用量制限因子としてよく認識されている。他の正常な組織が悪影響を受けることもあるが、骨髄は、化学療法や放射線治療などの増殖特異的治療に対して特に感受性がある。癌患者によっては、造血毒性が、化学療法用量の増加の好機を制限することもしばしばある。化学療法の反復または高用量サイクルが、造血幹細胞やそれらの子孫の幹細胞枯渇をもたらすこともある。
【０００５】
化学療法および放射線治療の副作用の防止および該副作用からの保護は、癌患者に対して大きな利益となるであろう。Ｇ−ＣＳＦおよび他の成長因子は、正常な重要（ｃｒｉｔｉｃａｌ）標的細胞、特に造血始原細胞の数を増加させることにより、そうした副作用を軽減することが明らかにされている。
【０００６】
Ｇ−ＣＳＦのヒト型は、１９８６年に日本および米国のグループによってクローン化された（たとえば、非特許文献１を参照のこと）。天然のヒト糖タンパク質は、１７５アミノ酸からなるもの、および１７８アミノ酸からなるものの２つの型で存在している。より豊富に存在し、活性が高い方の１７５アミノ酸型が、組み替えＤＮＡ技術による医薬品の開発に用いられてきた。
【０００７】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系において合成された組み替え型ヒトＧ−ＣＳＦは、フィルグラスチムと呼ばれている。フィルグラスチムの構造は、天然糖タンパク質とはわずかに異なっている。組換え型ヒトＧ−ＣＳＦの他の型は、レノグラスチムと呼ばれており、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において合成されている。
【０００８】
ｈＧ−ＣＳＦは、２つのＧ−ＣＳＦ分子と２つの受容体の２：２複合体の形成によって、Ｇ−ＣＳＦ受容体を二量体化する単量体タンパク質である（非特許文献２）。以下のｈＧ−ＣＳＦ残基が、受容体結合インターフェースの一部としてＸ線結晶学研究によって同定されている：Ｇ４，Ｐ５，Ａ６，Ｓ７，Ｓ８，Ｌ９，Ｐ１０，Ｑ１１，Ｓ１２，Ｌ１５，Ｋ１６，Ｅ１９，Ｑ２０，Ｌ１０８，Ｄ１０９，Ｄ１１２，Ｔ１１５，Ｔ１１６，Ｑ１１９，Ｅ１２２，Ｅ１２３，およびＬ１２４（たとえば、非特許文献３参照）。
【０００９】
市販の形態のｒｈＧ−ＣＳＦは、短期間の薬理効果しか有さず、持続する白血球減少状態のためには、１日に二回以上の投与を行わなければならない。より長い循環半減期を有
する分子であれば、白血球減少症を軽減するのに必要な投与回数を減らすことができ、結果として生じる感染症を防ぐことができると思われる。現在入手可能なｒＧ−ＣＳＦ製品の別の問題としては、用量依存性の骨痛が起こることである。骨痛は、ｒＧ−ＣＳＦによる治療の顕著な副作用として患者が経験するものであるため、この作用を本質的に有さない製品、または、骨痛を引き起こさないよう十分な低容量で有効な製品のいずれかによって、骨痛を引き起こさないｒＧ−ＣＳＦ製品を提供することが望ましいであろう。このように、改良された組換え型Ｇ−ＣＳＦ分子が明らかに必要とされている。
【００１０】
ｈＧ−ＣＳＦのタンパク質工学的バリアントが報告されている（特許文献１−４および非特許文献４）。天然のポリペプチドと比べて少なくとも１つの追加の炭水化物を導入するための、ｈＧ−ＣＳＦおよび他のポリペプチドの修飾も報告されている（特許文献５）。さらに、ＰＥＧ基の付着を含む、天然のｈＧ−ＣＳＦのポリマー修飾が報告および研究されている（たとえば、非特許文献５、非特許文献６、特許文献６〜１０を参照のこと）。
【００１１】
糖タンパク質治療剤の薬理学的特性を高める試みにおいて、ペプチド骨格に合成ポリマーを付着させることは、当該技術分野では公知である。ペプチドに共役されるポリマーとしては、たとえば、ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）があげられる。ＰＥＧを使用してペプチド治療剤を誘導体化することにより、ペプチドの免疫原性が低減されることが実証されている。たとえば、特許文献１１は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールに連結された酵素およびペプチドホルモンなどの非免疫原性ポリペプチドを開示している。免疫原性の低減に加えて、当該ポリペプチドのＰＥＧ共役体のサイズの増大により、循環におけるクリアランス時間が引き延ばされる。
【００１２】
ＰＥＧ（およびその誘導体）をペプチドに付着させる一つの様式としては、ペプチドアミノ酸残基を介した非特異的結合がある（たとえば、特許文献１２〜１６参照）。ＰＥＧをペプチドに付着させる他の様式としては、糖ペプチド上のグリコシル残基の非特異的酸化を介するものがある（たとえば特許文献１７参照）。
【００１３】
これらの非特異的方法では、ポリ（エチレングリコール）が、ペプチド骨格上の反応性残基に対して、ランダムかつ非特異的な方法で付加される。もちろん、ＰＥＧ分子のランダム付加は、最終産物の均質性の欠如、およびペプチドの生物学的または酵素的活性の低下の可能性を含む欠点を有している。したがって、治療用ペプチドの生産のためには、特異的に標識され、容易にキャラクタライズでき、本質的に均質な産物が形成されるような、誘導体化戦略がより優れている。そのような方法はすでに開発されている。
【００１４】
特異的に標識された均質なペプチド治療剤は、酵素の作用を介してｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造することができる。合成ポリマーまたは他の標識をペプチドに付着させる典型的な非特異的方法とは違い、酵素に基づく合成は、位置選択性および立体選択性の利点を有している。標識ペプチドの合成に用いられる酵素の主たる２つのクラスは、グリコシルトランスフェラーゼ（たとえば、シアリルトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）、およびグリコシダーゼである。これらの酵素は、治療的部分を含むように続いて修飾されてもいい糖類の特異的付着のために用いることができる。あるいは、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾グリコシダーゼは、修飾された糖類をペプチド骨格に直接転移させるために用いることもできる（たとえば、特許文献１８〜２３を参照のこと。これら文献のそれぞれは参照により本願に組み込まれる。化学的合成要素と酵素的合成要素の両者を組み合わせた方法も知られている（たとえば、非特許文献７および参照により本願に組み込まれる特許文献２４を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第５，５８１，４７６号
【特許文献２】米国特許第５，２１４，１３２号
【特許文献３】米国特許第５，３６２，８５３号
【特許文献４】米国特許第４，９０４，５８４号
【特許文献５】米国特許第５，２１８，０９２号
【特許文献６】米国特許第５，８２４，７７８号
【特許文献７】米国特許第５，８２４，７８４号
【特許文献８】ＷＯ９６／１１９５３
【特許文献９】ＷＯ９５／２１６２９
【特許文献１０】ＷＯ９４／２００６９
【特許文献１１】米国特許第４，１７９，３３７号（Ｄａｖｉｓら）
【特許文献１２】米国特許第４，０８８，５３８号
【特許文献１３】米国特許第４，４９６，６８９号
【特許文献１４】米国特許第４，４１４，１４７号
【特許文献１５】米国特許第４，０５５，６３５号
【特許文献１６】ＰＣＴ  ＷＯ８７／０００５６
【特許文献１７】ＷＯ９４／０５３３２
【特許文献１８】米国特許第６，３９９，３３６号
【特許文献１９】米国特許出願広報２００３００４００３７
【特許文献２０】米国特許出願広報２００４０１３２６４０
【特許文献２１】米国特許出願広報２００４０１３７５５７
【特許文献２２】米国特許出願広報２００４０１２６８３８
【特許文献２３】米国特許出願広報２００４０１４２８５６
【特許文献２４】米国特許出願２００４０１３７５５７
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｎａｇａｔａら．Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：４１５〜４１８頁（１９８６年）
【非特許文献２】Ｈｏｒａｎら．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５（１５）：４８８６〜９６頁（１９９６年）
【非特許文献３】Ａｒｉｔｏｍｉら（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：７１３
【非特許文献４】Ｒｉｅｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：９０３４〜９０４１頁（１９９６年）
【非特許文献５】Ｓａｔａｋｅ−Ｉｓｈｉｋａｗａら（１９９２年）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  １７：１５７
【非特許文献６】Ｂｏｗｅｎら（１９９９年）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２７：４２５
【非特許文献７】Ｙａｍａｍｏｔｏら．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３０５：４１５−４２２（１９９８年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
改良型治療用Ｇ−ＣＳＦの要求に応えて、本発明は、治療活性のあるグリコＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦであって、グリコＰＥＧ化されていない同一または非常に類似したＧ−ＣＳＦペプチドに比べて、薬物動態パラメータおよび特性が向上したグリコＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを提供する。さらに、本発明は、対象、特に、放射線または化学療法を受けたかこれから受ける対象において、造血を増加させる方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
したがって、一態様において、本発明は、骨髄移植レシピエントにおける幹細胞産生を動員する方法および組成物を提供する。これらの方法および組成物は、骨髄移植レシピエントに、ある量のＧ−ＣＳＦペプチドと高分子修飾基との間の共有結合共役体であるペプチドを投与することを含む。一態様において、高分子修飾基は、ペプチドのグリコシルまたはアミノ酸残基において、インタクトなグリコシル連結基を介して、ペプチドに共有結合されている。
【００１９】
別の態様において、本発明は、対象における顆粒球の数を増加させる方法および組成物を提供する。本方法は、対象に、ある量のＧ−ＣＳＦペプチドと高分子修飾基との間の共有結合共役体であるペプチドを投与する工程を含む。一態様において、Ｇ−ＣＳＦペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有し、高分子修飾基は１２６位のグリシンから１４３位のセリンに亘るアミノ酸配列の領域にあるＧ−ＣＳＦペプチドに共有結合される。
【００２０】
さらに別の態様において、本発明は、対象における幹細胞産生を増加させる方法および組成物を提供する。本発明は、対象に、ある量のＧ−ＣＳＦペプチドと高分子修飾基との間の共有結合共役体であるペプチドを投与する工程を含む。さらなる態様において、Ｇ−ＣＳＦペプチドは、式
【００２１】
【化１】
0005922065.tif 000002
（式中、
ｑは０または１であり、
Ｓｉａ−ＰＥＧは、
【００２２】
【化２】
0005922065.tif 000003
（式中ｎは１〜２０００の整数）の構造を有する）の構造を有する。
【００２３】
一態様において、本発明は、骨髄抑制、とりわけ癌治療に起因する骨髄抑制を予防、治療および軽減する方法を提供する。一態様において、本方法は、レシピエントに、Ｇ−ＣＳＦペプチドと高分子修飾基との間の共有結合共役体である、ある量のペプチドを投与することを含む。共有結合共役体の高分子修飾基は、Ｇ−ＣＳＦペプチドのグリコシルまたはアミノ酸残基において、インタクトなグリコシル連結基を介して、Ｇ−ＣＳＦペプチドに共有結合されていてもよい。
【００２４】
別の態様において、本発明は対象において、白血球産生不全を特徴とする状態を治療する方法を提供する。一態様において、状態を治療する方法は、対象に、ある量のＧ−ＣＳＦペプチドと高分子修飾基との間の共有結合共役体であるペプチドを投与する工程を含む。共有結合共役体の高分子修飾基は、Ｇ−ＣＳＦペプチドのグリコシルまたはアミノ酸残基において、インタクトなグリコシル連結基を介して、Ｇ−ＣＳＦペプチドに共有結合されていてもよい。対象に投与されるペプチドの量は、対象における状態を改善するのに有効なものである。
【００２５】
さらに別の態様において、本発明は、哺乳動物における好中球減少症の治療方法を提供する。これらの方法は、医薬として有効な量のＧ−ＣＳＦペプチドと高分子修飾基との間の共有結合共役体であるペプチドを投与する工程を含む。共有結合共役体の高分子修飾基は、Ｇ−ＣＳＦペプチドのグリコシルまたはアミノ酸残基において、インタクトなグリコシル連結基を介して、Ｇ−ＣＳＦペプチドに共有結合されていてもよい。
【００２６】
さらに別の態様において、本発明は、哺乳動物における血小板減少症の治療方法を提供する。これらの方法は、医薬として有効な量のＧ−ＣＳＦペプチドと高分子修飾基との間の共有結合共役体であるペプチドを投与する工程を含む。共有結合共役体の高分子修飾基は、Ｇ−ＣＳＦペプチドのグリコシルまたはアミノ酸残基において、インタクトなグリコシル連結基を介して、Ｇ−ＣＳＦペプチドに共有結合されていてもよい。
【００２７】
一態様において、本発明は、培養中の造血幹細胞を拡張する方法を提供する。これらの方法、幹細胞に、有効量のＧ−ＣＳＦペプチドと高分子修飾基との間の共有結合共役体であるペプチドを投与する工程を含む。共有結合共役体の高分子修飾基は、Ｇ−ＣＳＦペプチドのグリコシルまたはアミノ酸残基において、インタクトなグリコシル連結基を介して、Ｇ−ＣＳＦペプチドに共有結合されていてもよい。
【００２８】
別の態様において、本発明は、対象における造血を刺激する方法を提供する。これらの方法は、対象に、有効量の、Ｇ−ＣＳＦペプチドと高分子修飾基との間の共有結合共役体であるペプチドを投与する工程を含む。共有結合共役体の高分子修飾基は、Ｇ−ＣＳＦペプチドのグリコシルまたはアミノ酸残基において、インタクトなグリコシル連結基を介して、Ｇ−ＣＳＦペプチドに共有結合されていてもよい。
【００２９】
さらに別の態様において、本発明は、対象における造血始原細胞の数を増加させる方法を提供する。これらの方法は、対象に、有効量の、Ｇ−ＣＳＦペプチドと高分子修飾基との間の共有結合共役体であるペプチドを投与する工程を含む。共有結合共役体の高分子修飾基は、Ｇ−ＣＳＦペプチドのグリコシルまたはアミノ酸残基において、インタクトなグリコシル連結基を介して、Ｇ−ＣＳＦペプチドに共有結合されていてもよい。
【００３０】
一態様において、本発明は、ドナーにおける幹細胞産生を動員する方法を提供する。これらの方法は、ドナーに、有効量のＧ−ＣＳＦペプチドと高分子修飾基との間の共有結合共役体であるペプチドを投与する工程を含む。共有結合共役体の高分子修飾基は、Ｇ−ＣＳＦペプチドのグリコシルまたはアミノ酸残基において、インタクトなグリコシル連結基を介して、Ｇ−ＣＳＦペプチドに共有結合されていてもよい。
【００３１】
別の態様において、本発明は、レシピエントに提供された骨髄の長期生着を増強する方法を提供する。これらの方法は、骨髄レシピエントに、Ｇ−ＣＳＦペプチドと高分子修飾基との間の共有結合共役体であるペプチド投与する工程を含む。共有結合共役体の高分子修飾基は、Ｇ−ＣＳＦペプチドのグリコシルまたはアミノ酸残基において、インタクトなグリコシル連結基を介して、Ｇ−ＣＳＦペプチドに共有結合されていてもよい。
【００３２】
さらに別の態様において、本発明は、対象における造血始原細胞を動員する方法を提供する。これらの方法は、式１，１’−［１，４−フェニレン−ビス−（メチレン）−ビス−１，４，８，１］−テトラアザシクロテトラデカン（ＡＭＤ３１００）の化合物を含む第１の組成物と、Ｇ−ＣＳＦペプチドと高分子修飾基との間の共有結合共役体であるペプチドを含む第２の組成物とを、対象に投与する工程を含む。高分子修飾基は、Ｇ−ＣＳＦペプチドのグリコシルまたはアミノ酸残基において、インタクトなグリコシル連結基を介して、Ｇ−ＣＳＦペプチドに共有結合されていてもよい。第１および第２の組成物は、対象に対して、任意の順序で順次投与してもよいし、同時に投与してもよい。
【００３３】
一態様において、本発明は、経口剤形を提供する。この経口剤形は、次の成分（ａ）〜（ｄ）を含んでいてもよい：（ａ）Ｇ−ＣＳＦペプチドと高分子修飾基との間の共有結合共役体であるペプチド。高分子修飾基は、Ｇ−ＣＳＦペプチドのグリコシルまたはアミノ酸残基において、インタクトなグリコシル連結基を介して、Ｇ−ＣＳＦペプチドに共有結合されていてもよい。（ｂ）界面活性剤、（ｃ）脂肪酸、および（ｄ）腸溶材料。一態様において、成分（ａ），（ｂ）および（ｃ）は、液相において混合され、成分（ｄ）との混合前に凍結乾燥される。
【００３４】
別の態様において、本発明は、ドナーにおける幹細胞産生を増加させる方法を提供する。方法は、ドナーに、ある量のＧ−ＣＳＦペプチドと高分子修飾基との間の共有結合共役体であるペプチドを投与する工程を含む。さらなる態様において、高分子修飾基は、ペプチドのグリコシルまたはアミノ酸残基において、グリコシル連結基を介して、ペプチドに共有結合される。さらなる態様において、ドナーに投与されるペプチドの量は、約１ｍｇから約２０ｍｇの範囲である。
【００３５】
さらに別の態様において、本発明は、ドナーにおける幹細胞産生を増加させる方法を提供する。方法は、ドナーに、ある量のＧ−ＣＳＦペプチドと高分子修飾基との間の共有結合共役体であるペプチドを投与する工程を含む。さらなる態様において、高分子修飾基は、ペプチドのグリコシルまたはアミノ酸残基において、グリコシル連結基を介して、ペプチドに共有結合される。さらなる態様において、ドナーに投与されるペプチドの量は、単位用量の剤形である。一実施形態において、単位用量は、２５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇおよび２００μｇ／ｋｇから選択される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＸＭ２２（２５μｇ／ｋｇ；５０μｇ／ｋｇ；１００μｇ／ｋｇ）およびニューラスタ（１００μｇ／ｋｇ）に応答した、絶対好中球数（ＡＮＣ）に関するデータを示す図。
【図２】ＸＭ２２（２５μｇ／ｋｇ；５０μｇ／ｋｇ；１００μｇ／ｋｇ）およびニューラスタ（１００μｇ／ｋｇ）に応答した、ＣＤ３４＋細胞数に関するデータを示す図。
【図３】４つの異なる試験群に対する薬物動態パラメータに関するデータの表。
【図４】ＸＭ２２（６ｍｇ）およびニューラスタ（６ｍｇ）に応答した、絶対好中球数（ＡＮＣ）に関するデータを示す図。
【図５】ＸＭ２２（６ｍｇ）およびニューラスタ（６ｍｇ）に応答した、ＣＤ３４＋細胞数に関するデータを示す図。
【図６】カニクイザルにおけるＧ−ＣＳＦ、グリコＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ、ニューラスタ、および対照組成物に応答した好中球数に関する薬物動態データを示す図。
【図７】カニクイザルにおける図示した化合物の血漿濃度に関する薬物動態データを示す図。
【図８】グリコ−ＰＥＧ−ＧＣＳＦおよびその受容体の構造の模式図。
【図９】異なる３用量のＸＭ２２、および１００μｇ／ｋｇのニューラスタの投与後における、ＸＭ２２およびニューラスタの血清濃度に関するデータを示す図。
【図１０】６ｍｇのＸＭ２２および６ｍｇのニューラスタの投与後のＸＭ２２およびニューラスタの血清濃度に関するデータを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
略語
ＰＥＧ，ポリ（エチレングリコール）；
ＰＰＧ，ポリ（プロピレングリコール）；
Ａｒａ，アラビノシル；
Ｆｒｕ，フルクトシル；
Ｆｕｃ，フコシル；
Ｇａｌ，ガラクトシル；
ＧａｌＮＡｃ，Ｎ−アセチルガラクトサミニル；
Ｇｌｃ，グルコシル；
ＧｌｃＮＡｃ，Ｎ−アセチルグルコサミニル；
Ｍａｎ，マンノシル；
ＭａｎＡｃ，酢酸マンノサミニル；
Ｘｙｌ，キシロシル；および
ＮｅｕＡｃ，シアリル（Ｎ−アセチルニューラミニル）；
Ｍ６Ｐ，マンノース−６−ホスフェート；
Ｓｉａ，シアル酸，Ｎ−アセチルニューラミニル，およびその誘導体および類似体。
【００３８】
「Ｇ−ＣＳＦ」は、顆粒球コロニー刺激因子を示す。
定義
特に定義しない限り、本明細書中で用いるすべての技術的および科学的用語は、一般に、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。一般に、本明細書において用いる命名法および細胞培養、分子生物学、有機化学および核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験手順は、当該技術分野において周知であり一般的に用いられているものである。核酸およびペプチド合成に対しては標準的な技術が用いられる。技術および手順は、当該技術分野における、また、本文献を通して提供される、様々な一般参照にある従来の方法にしたがって、一般的に実施される（一般的に、参照により本願に組み込む、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室マニュアル、第２版（１９８９）、コールドスプリングハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨークを参照）。本明細書中で用いる命名法および分析化学における実験手順、および以下に記載の有機合成は、当該技術分野において周知であり、一般的に用いられている。標準技術、またはそれを改変したものが、化学合成および化学分析のために用いられる。
【００３９】
本明細書中に記載のすべてのオリゴ糖は、非還元サッカリドに対する名称または略称（すなわち、Ｇａｌ）、次にグリコシド結合の配置（αまたはβ）、環結合（１または２）、結合に関与する還元サッカリドの環位置（２，３，４，６または８）、そして還元サッカリドの名称または略称（すなわちＧｌｃＮＡｃ）で表記されている。それぞれのサッカリドは、好ましくはピラノースである。標準的な糖生物学的命名法の検討には、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖａｒｋｉら編、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９年）を参照のこと。
【００４０】
オリゴ糖は、還元端にあるサッカリドが実際に還元糖であるかどうかに関わりなく、還元端と非還元端を有していると考えられている。許容される命名法にしたがって、本明細書においては、オリゴ糖は、左側を非還元端、右側を還元端として描かれている。
【００４１】
「シアル酸」という用語は、９個の炭素からなるカルボキシル化糖のファミリーの任意のメンバーのことをいう。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノス−１−オニン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、またはＮＡＮＡと略されることも多い）である。ファミリーの第２のメンバーは、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基が水酸化されているＮ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）である。第３のシアル酸ファミリーのメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）（Ｎａｄａｎｏら、（１９８６年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１５５０〜１１５５７頁；Ｋａｎａｍｏｒｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８１１〜２１８１９頁（１９９０年））である。また、９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃや９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃなどの９−０−Ｃ1−Ｃ6アシル−Ｎｅｕ５Ａｃなどの９−置換シアル酸も含まれる。シアル酸ファミリーの検討には、たとえば、Ｖａｒｋｉ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２：２５〜４０頁（１９９２年）；「シアル酸：化学、代謝および機能」Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ニューヨーク（１９９２年））を参照のこと。シアリル化法におけるシアル酸化合物の合成と使用は、１９９２年１０月１日公表の国際出願ＷＯ９２／１６６４０に開示されている。
【００４２】
「ペプチド」とは、アミノ酸をモノマーとし、それらがアミド結合を介して互いに連結されているポリマーのことをいい、あるいは、ポリペプチドとも呼ばれる。さらに、非天然アミノ酸、たとえばβ−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニンも含まれる。遺伝子でコードされないアミノ酸も、本発明において用いてもよい。さらに、反応性基、グリコシル化部位、ポリマー、治療的部分、生体分子などを含むように修飾されたアミノ酸も本発明において使用してもよい。本発明において使用されるすべてのアミノ酸は、Ｄ型またはＬ型異性体のいずれであってもよい。Ｌ型異性体が一般的には好ましい。さらに、本発明においては他のペプチド模倣体も有用である。本明細書における「ペプチド」は、グリコシル化されたペプチドとグリコシル化されていないペプチドの両方のことをいう。また、ペプチドを発現する系によって不完全にグリコシル化されたペプチドも含まれる。一般参照として、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，の「アミノ酸，ペプチド、およびタンパク質の化学および生化学」、Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ニューヨーク、２６７頁（１９８３年）を参照のこと。
【００４３】
アミノ酸またはペプチドの核酸配列は、これらの両者間にある程度の配列同一性がある場合には、互いに「相同性」がある。好ましくは、相同配列は、参照配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは、参照アミノ酸またはヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％〜１００％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、少なくとも約９２％の配列同一性、少なくとも約９３％の配列同一性、少なくとも約９４％の配列同一性、さらに好ましくは、少なくとも約９５％〜９９％の配列同一性、好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性、および約１００％の配列同一性を有する。
【００４４】
「ペプチド共役体」という用語は、ペプチドが本明細書に列挙するような修飾された糖と共役した本発明の種のことをいう。
「アミノ酸」という用語は、天然および合成のアミノ酸だけでなく、天然のアミノ酸と類似した様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体のこともいう。天然のアミノ酸としては、遺伝子暗号によってコードされるものだけでなく、後で修飾されたアミノ酸、たとえば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンもある。アミノ酸類似体とは、天然のアミノ酸と同一の基本化学構造、すなわち、水素に結合したα炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基を有する化合物、たとえば
、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムのことをいう。このような類似体は修飾されたＲ基（たとえば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を持つものの、天然のアミノ酸と同じ基本化学構造を維持している。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有しながらも、天然のアミノ酸と類似の様式で機能する化学化合物のことをいう。
【００４５】
本明細書中で用いる「修飾された糖」とは、本発明のプロセスにおいて、ペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基上に酵素的に付加された天然または非天然の炭水化物のことをいう。この修飾された糖は、特に限定はされないが、糖ヌクレオチド（一、ニ、および三リン酸塩）、活性化糖（たとえば、ハロゲン化グリコシル、メシル酸グリコシル）、および活性化されておらず、ヌクレオチドでもない糖を含む酵素基質から選択される。「修飾された糖」は、「修飾基」によって共有結合的に官能化されている。有用な修飾基としては、限定はされないが、ＰＥＧ部分、治療的部分、診断的部分、生体分子などが挙げられる。修飾基は、天然、または非修飾炭水化物でないことが好ましい。修飾基による官能化の場所は、「修飾された糖」が酵素的にペプチドに付加されることが妨害されないように選択する。
【００４６】
「水溶性」という用語は、水中で何らかの検出可能な程度の溶解性を有する部分のことをいう。水溶性を検出および／または定量する方法は、当該技術分野において周知である。水溶性ポリマーの例としては、ペプチド、サッカリド、ポリ（エーテル）、ポリ（アミン）、ポリ（カルボン酸）などが挙げられる。ペプチドは、ポリ（リジン）などの、１つのアミノ酸からなる混合配列を有していてもよい。ポリサッカリドの例としては、ポリ（シアル酸）が挙げられる。ポリ（エーテル）の例としては、ポリ（エチレングリコール）が挙げられる。ポリ（エチレンイミン）はポリアミンの例であり、ポリ（アクリル）酸は、代表的なポリ（カルボン酸）である。
【００４７】
水溶性ポリマーのポリマー骨格は、ポリ（エチレングリコール）（すなわちＰＥＧ）であってよい。しかしながら、本発明の実施に用いるのには他の関連ポリマーも適していること、およびＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）という用語の使用はその点で包括的であり排他的ではないことを理解すべきである。ＰＥＧという用語は、アルコキシＰＥＧ、二官能性ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、櫛形（ｆｏｒｋｅｄ）ＰＥＧ、分枝ＰＥＧ、懸垂ＰＥＧ（すなわち、ポリマー骨格に懸垂した１つ以上の官能基を有するＰＥＧまたは関連ポリマー）、または分子内に分解可能な結合を有するＰＥＧを含む、そのあらゆる形態のポリ（エチレングリコール）を含む。
【００４８】
ポリマー骨格は、線形または分枝状のいずれであってもよい。分枝ポリマー骨格は、当該技術分野において一般的に知られている。典型的には、分枝ポリマーは、中央分枝コア部分と、この中央分枝コアに結合した複数の線形ポリマー鎖とを有する。ＰＥＧは、酸化エチレンを、グリセロール、ペンタエリスリトール、ソルビトールなどの様々なポリオールに加えることによって調製可能な分枝形態で用いられるのが一般的である。中央分枝コア部分もまた、リジンなどのいくつかのアミノ酸から誘導されたものであってよい。分枝ポリ（エチレングリコール）は、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍ（式中、Ｒはグリセロールまたはペンタエリスリトールなどのコアを示し、ｍはアームの数を示す）などの一般的な形態で表すことができる。参照によりその全体を本願に組み込む米国特許第５，９３２，４６２号に記載されているような、マルチアームＰＥＧ分子もまたポリマー骨格として用いることができる。
【００４９】
多くの他のポリマーも本発明に適している。２〜約３００末端を有する非ペプチド性で水溶性のポリマー骨格が、本発明においては特に有用である。適切なポリマーとしては、限定はされないが、たとえば、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）などの他の
ポリ（アルキレングリコール）、エチレングリコールやプロピレングリコールなどのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、参照によりその全体を本願に組み込む米国特許第５，６２９，３８４号に記載されるようなポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、およびそのコポリマー、ターポリマー、および混合物が挙げられる。ポリマー骨格の各鎖の分子量は様々であってよいが、典型的には約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａ、しばしば約６，０００Ｄａから約８０，０００Ｄａの範囲である。
【００５０】
患者にペプチド薬を投与する文脈において用いる「曲線下面積」または「ＡＵＣ」とは、患者内の体循環における薬物の濃度をゼロから無限大までの時間の関数として表す曲線の下側の全面積として定義される。
【００５１】
本明細書中、患者にペプチド薬を投与する文脈において使用する「半減期」または「ｔ1／2」は、患者中の薬物の血漿濃度が半分に低下するまでに要する時間として定義される。複数のクリアランス機構、再分布および当該技術分野において周知の他の方法に応じて、ペプチド薬に関連する半減期が２つ以上ある場合もある。通常、αおよびβ半減期は、α期が再分布に関連し、β期がクリアランスに関連するように、定義される。しかしながら、大部分が血流に封じ込められている状態で、少なくとも２つのクリアランス半減期がありうる。いくつかのグリコシル化ペプチドに対して、急速なβ期クリアランスは、マクロファージ上、または末端ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノースまたはフコースを認識する内皮細胞上の受容体によって媒介され得る。有効半径＜２ｎｍ（約６８ｋＤ）の分子に対して腎糸球体濾過、および／または組織における特異的または非特異的取込みおよび代謝を介して、より遅いβ期クリアランスが起こり得る。グリコＰＥＧ化が、末端糖（たとえば、ガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミン）に蓋をすることによって、これらの糖を認識する受容体を介した急速なα期クリアランスを阻止している可能性がある。また、これがより大きな有効半径を与えて、分布容積および組織の取込みを低減することにより、後期β期を延長するのかもしれない。このように、α期およびβ期半減期に対するグリコＰＥＧ化の正確な影響は、当該技術分野において周知のように、大きさ、グリコシル化の状態および他のパラメータに応じて変わりうる。「半減期」についてのさらなる説明は、製薬バイオテクノロジー（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１９９７年、ＤＦＡ  Ｃｒｏｍｍｅｌｉｎ  ａｎｄ  ＲＤ  Ｓｉｎｄｅｌａｒ編，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１０１〜１２０頁）に見いだすことができる。
【００５２】
本明細書中で用いる「グリコ共役」とは、本発明のたとえばＧ−ＣＳＦペプチドなどのポリペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基へ、修飾された糖が酵素によって共役されることをいう。「グリコ共役」の亜属が、修飾された糖の修飾基がポリ（エチレングリコール）、およびそのアルキル誘導体（たとえば、ｍ−ＰＥＧ）または反応性誘導体（たとえば、Ｈ２Ｎ−ＰＥＧ，ＨＯＯＣ−ＰＥＧ）である「グリコＰＥＧ化」である。
【００５３】
「大規模」および「工業規模」という用語は互換的に用いられており、１回の反応サイクルの終了時に、少なくとも約２５０ｍｇ、好ましくは少なくとも約５００ｍｇ、より好ましくは少なくとも約１グラムのグリコ共役体を生産する反応サイクルのことをいう。
【００５４】
本明細書中で用いる「グリコシル連結基」という用語は、修飾基（たとえば、ＰＥＧ部分、治療的部分、生体分子）が共有結合したグリコシル残基のことをいい、このグリコシル連結基が、修飾基を共役体の残りの部分に繋いでいる。本発明の方法において、「グリコシル連結基」は、グリコシル化または非グリコシル化ペプチドに共有結合され、これに
より、物質をペプチド上のアミノ酸および／またはグリコシル残基に架橋する。「グリコシル連結基」は、一般に、「修飾された糖」のペプチドのアミノ酸および／またはグリコシル残基への酵素的付着によって「修飾された糖」から誘導される。グリコシル連結基は、修飾基で修飾された糖カセット（たとえば、酸化→シッフ塩基形成→還元）の形成中に分解されるサッカリドから派生する構造であってよく、または、グリコシル連結基は、無傷であってもよい。「インタクトなグリコシル連結基」とは、修飾基を共役体の残りの部分に連結するサッカリドモノマーが、たとえばメタ過ヨウ素酸ナトリウムによって、分解、たとえば酸化されていないグリコシル部分から誘導される連結基のことをいう。本発明の「インタクトなグリコシル連結基」は、天然のオリゴ糖から、グリコシル単位の付加、または親サッカリド構造からの１つ以上のグリコシル単位の除去によって得られるものであってよい。
【００５５】
本明細書中で用いる「ターゲティング部分」という用語は、体内の特定の組織または部位に選択的に局在化する種のことをいう。局在化は、分子決定因子の特異的認識、標的物質または共役体の分子サイズ、イオン相互作用、疎水性相互作用などを介するものである。物質が特定の組織または部位を標的とする他のメカニズムは、当業者によって知られている。ターゲティング部分としてはたとえば、抗体、抗体断片、トランスフェリン、ＨＳ−糖タンパク質、凝固因子、血清タンパク質、β−糖タンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ，ＥＰＯなどが挙げられる。
【００５６】
本明細書中で用いる「治療的部分」は、限定はされないが、抗生物質、抗炎症物質、抗腫瘍薬、細胞毒素、および放射性物質を含む治療に有用な任意の物質を意味する。「治療的部分」は、生物活性物質、たとえば多価物質などの、２つ以上の治療的部分が担体に結合された構造物のプロドラッグも含む。治療的部分には、タンパク質およびタンパク質を含む構造物も含まれる。タンパク質の例としては、限定はされないが、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、インターフェロン（たとえば、インターフェロン−α，−β，−γ）、インターロイキン（たとえば、インターロイキンＩＩ）、血清タンパク質（たとえば、因子ＶＩＩ，Ｖｉｌａ，ＶＩＩＩ，ＩＸ，およびＸ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）および抗体融合タンパク質（たとえば、腫瘍新生因子受容体（（ＴＮＦＲ）／Ｆｃドメイン誘導タンパク質））が挙げられる。
【００５７】
本明細書中で用いる「医薬として許容される担体」には、共役体と組み合わせた場合に、共役体の活性を維持するとともに、対象の免疫系に非反応性である任意の材料が含まれる。その例としては、限定はされないが、任意の標準薬学的担体、たとえば、リン酸緩衝生理的食塩水、水、油／水エマルションなどのエマルション、および様々なタイプの湿潤化剤が挙げられる。他の担体としては、滅菌溶液、タブレットおよびカプセルを含む錠剤も挙げられる。典型的には、上記担体は、デンプン、ミルク、糖、あるタイプの粘土、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、ステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム、タルク、植物油脂、ガム類、グリコール類、または他の既知の賦形剤を含んでいてもよい。上記担体は、香料および着色添加剤または他の成分を含んでいてもよい。このような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって調製される。
【００５８】
本明細書中で用いる「投与する」とは、経口投与、座薬としての投与、局所接触、静脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内、鼻腔内または皮下投与、または、たとえばミニ浸透圧ポンプなどの持続放出機器を対象に移植することを意味する。投与は、非経口、経粘膜（たとえば、経口、経鼻、経腟、経腸、または経皮）を含む任意の経路で行われる。非経口投与としては、たとえば、静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、心室内、および頭蓋内が挙げられる。さらに、注射が腫瘍を治療するため、たとえば、アポトーシスを誘導するためのものである場合、投与は腫瘍および／または腫瘍を囲む組織内に直接行って
もよい。他の送達様式としては、限定はされないが、リポソーム製剤、静脈内注射、経皮貼布などの使用が挙げられる。
【００５９】
「改善する」という用語は、症状の軽減、寛解または逓減または患者の肉体または精神の健康における改善などの任意の目的または対象パラメータを含む、病状または状態の治療における成功の任意の兆候のことをいう。症状の改善は、身体検査および／または精神鑑定の結果を含む目的または対象とするパラメータに基づくものであってよい。
【００６０】
「治療」という用語は、当該疾病にかかりやすい傾向があるが、当該疾病の症状をまだ経験していないか示していない動物において、当該疾病または状態が起こるのを防ぐこと（予防的治療）、当該疾病を阻害すること（その進行を遅らせるか止める）、当該疾病の症状または副作用に軽減を与えること（緩和治療を含む）、および疾病を和らげること（疾病を退行させる）を含む疾病または状態を「治療する」こと、またはその「治療」のことをいう。
【００６１】
「有効量」という用語、または「〜に有効な量」または「治療的に有効な量」またはあらゆる文法的に同一の用語は、疾病を治療するために動物に投与された場合に、当該疾病に対する治療を発揮するのに十分である量を意味する。
【００６２】
「単離された」という用語は、当該材料を製造するために用いられた成分から実質的または本質的に遊離されている材料のことをいう。本発明のペプチド共役体に対して、「単離された」という用語は、当該ペプチド共役体を調製するために用いられる混合物中で通常は当該材料に付随する成分から、実質的または本質的に遊離されている材料のことをいう。「単離された」および「純粋な」は互換的に用いる。典型的には、本発明の単離されたペプチド共役体は、好ましくは一範囲として示される一定レベルの純度を有する。ペプチド共役体の純度の範囲の下端は、約６０％、約７０％または約８０％であり、純度の範囲の上端は約７０％、約８０％、約９０％または約９０％を超える。
【００６３】
ペプチド共役体が約９０％を超える純度であれば、それらの純度は好ましくは一範囲としても示される。純度の範囲の下端は約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％である。純度の範囲の上端は、純度約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％である。
【００６４】
純度は、任意の当該技術分野で認識されている分析方法（たとえば、銀染色ゲル上でのバンド強度、ポリアクリルアミド電気泳動、ＨＰＬＣまたは同様の手段）によって決定される。
【００６５】
本明細書中で用いる「本質的に当該集団の各メンバー」とは、ペプチドに付加された選択されたパーセンテージの修飾された糖がペプチド上の複数の同一の受容体部位に付加されている、本発明のペプチド共役体の集団の特徴を説明するものである。「本質的に当該集団の各メンバー」は、修飾された糖に共役されたペプチド上の部位の「均一性」についていい、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％均一である本発明の共役体のことをいう。「均一性」とは、修飾された糖が共役されている受容体部分の集団を通しての構造的一貫性のことをいう。このように、各修飾された糖部分が、他のそれぞれの修飾された糖が共役されている受容体部位と同じ構造を有する受容体部位に共役されている、本発明のペプチド共役体において、当該ペプチド共役体は約１００％均一であると言える。均一性は、典型的には範囲として表される。ペプチド共役体に対する均一性の範囲の下端は、約６０％、約７０％または約８０％であり、純度の範囲の上端は、約７０％、約８０％、約９０％または約９０％を超える。
【００６６】
ペプチド共役体が、約９０％以上均一である場合、それらの均一性もまた好ましくは範囲として表される。均一性の範囲の下端は約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％である。純度の範囲の上端は約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％の均一性である。ペプチド共役体の純度は典型的には、たとえば、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤ−ＴＯＦ）、キャピラリー電気泳動など当業者周知の１つ以上の方法によって決定される。
【００６７】
糖ペプチド種について言及する際の「実質的に同一の糖型」または「実質的に同一のグリコシル化パターン」とは、該当するグリコシルトランスフェラーゼ（たとえば、フコシルトランスフェラーゼ）によってグリコシル化される受容体部分のパーセンテージのことをいう。たとえば、α１，２フコシルトランスフェラーゼの場合、Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒおよびそのシアリル化類似体の実質的にすべて（以下に定義する）が本発明のペプチド共役体中でフコシル化されていれば、実質的に同一のフコシル化パターンが存在する。本明細書中に列挙するフコシル化構造において、Ｆｕｃ−ＧｌｃＮＡｃ結合は一般にα１，６またはα１，３であり、α１，６が一般的には好ましい。出発材料がグリコシル化受容体部分（たとえば、フコシル化Ｇａｌβ１，４−ＧｌｕＮａｃ−Ｒ部分）を含んでいてもよいことは、当業者であれば理解するであろう。このように、算出されたグリコシル化パーセンテージは、本発明の方法によってグリコシル化された受容体部分、ならびに、出発材料においてすでにグリコシル化されていた受容体部分を含むことになる。
【００６８】
「実質的に同一の」の上記定義における「実質的に」という用語は、一般的には、ある特定のグリコシルトランスフェラーゼに対して、少なくとも約４０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、またはより好ましくは少なくとも約９０％、およびさらに好ましくは少なくとも約９５％の受容体部分がグリコシル化されていることを意味する。
【００６９】
置換基が、左から右へ書かれるそれらの従来の化学式によって特定される場合、それらは、構造を右から左に書くことにより生じる化学的に同一の置換基をも同一に含意する。たとえば、−ＣＨ2Ｏ−は、−ＯＣＨ2−をも示すものとする。
【００７０】
「アルキル」という用語は、それ自体によってまたは別の置換基の一部として、特記しない限り、完全飽和、モノまたはポリ不飽和のいずれであってもよく、指定の数の炭素原子を有する（すなわち、Ｃ１−Ｃ１０は１〜１０炭素を意味する）二価または多価ラジカルを含んでいてもよい直鎖または分枝鎖、または環状炭化水素基、またはその組み合わせを意味する。飽和炭化水素基の例としては、限定はされないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチルなどの基、たとえばｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの同族体および異性体などが挙げられる。不飽和アルキル基は、１つ以上の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例としては、限定されないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブダジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、およびより高次の同族体および異性体が挙げられる。
【００７１】
「アルキル」という用語は、特記しない限り、「ヘテロアルキル」などの以下により詳細に定義するアルキルの誘導体を含む意味をもつ。炭化水素基に限定されるアルキル基は、「ホモアルキル」と呼ぶ。
【００７２】
「アルキレン」という用語は、それ自体または別の置換基の一部として、限定はされないがたとえば−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−などのアルカンから誘導される二価基を意味し、
「ヘテロアルキレン」として以下に記載する基をさらに含む。典型的には、アルキル（またはアルキレン）基は、１〜２４炭素原子を有し、本発明においては、炭素数が１０以下である基が好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、一般に炭素数が８以下のより短い鎖アルキルまたはアルキレン基である。
【００７３】
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）という用語は、それらの従来の意味で用いられ、それぞれ酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を介して分子の残りの部分に付着されたアルキル基のことをいう。
【００７４】
「ヘテロアルキル」という用語は、それ自体で、または別の用語との組み合わせにおいて、特記しない限り、指定数の炭素原子と、Ｏ、Ｎ、ＳｉおよびＳからなる群より選択される少なくとも１つのヘテロ原子とからなる、安定な直鎖または分枝鎖、または環状炭化水素基、またはその組み合わせを意味し、窒素および硫黄原子は任意選択で酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は任意選択で四級化されていてもよい。ヘテロ原子Ｏ、ＮおよびＳおよびＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置に配置されていてよく、またはアルキル基が分子の残りの部分に付着されている位置に配置されていてもよい。その例としては、限定はされないが、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ3、−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）2−ＣＨ3、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ3、−Ｓｉ（ＣＨ3）3、−ＣＨ2−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ3、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ3が挙げられる。たとえば、−ＣＨ2−ＮＨ−ＯＣＨ3および−ＣＨ2−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ3）3のように、２つまでのヘテロ原子が連続していてもよい。同様に、「ヘテロアルキレン」という用語は、それ自体または別の置換基の一部として、特に限定されないが、たとえば、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−および−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ2−などのようなヘテロアルキルから誘導される二価基を意味する。ヘテロアルキレン基については、ヘテロ原子が、鎖の末端の一方または両方を占めていてもよい（たとえば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基については、該連結基の式が書かれている方向によって、該連結基の配向は一切含意されない。たとえば、式−Ｃ（Ｏ）2Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）2Ｒ’−および−Ｒ’Ｃ（Ｏ）2−の両方を示す。
【００７５】
「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」という用語は、それら自体または他の用語と組み合わせて、特記しない限り、それぞれ、「アルキル」および「ヘテロアルキル」を環状にしたものである。さらに、ヘテロシクロアルキルについては、ヘテロ原子が、ヘテロ環が分子の残りの部分に付着されている位置を占めていてもよい。シクロアルキルの例としては、限定はされないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例としては、限定はされないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられる。
【００７６】
「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、それら自体によって、あるいは別の置換基の一部として、特記しない限り、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むものとする。たとえば、「ハロ（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル」という用語は、限定はされないが、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを含むものとする。
【００７７】
「アリール」という用語は、特記しない限り、互いに融合または共有結合された、単環または多環（好ましくは１〜３環）ポリ不飽和、芳香族置換基を意味する。「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個から４個のヘテロ原子を含むアリール基（または環）を示し、これにおいて窒素および硫黄原子は任意選択で酸化されており、窒素原子は任意選択で四級化されている。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残りの部分に付着されていてもよい。アリールおよびヘテロアリール基の非限定的な例として、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリルチアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、テトラゾリル、ベンゾ［ｂ］フラニル、ベンゾ［ｂ］チエニル１，２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル、ベンゾ［１，３］ジオキソル−５−イル、および６−キノリルが挙げられる。上記それぞれのアリールおよびヘテロアリール環系に対する置換基は、以下に示す許容される基の中から選択される。
【００７８】
簡潔化のために、他の用語（たとえば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）と組み合わせて用いられる場合の用語「アリール」は、上記で定義したアリールおよびヘテロアリール基の両方を包含する。従って、「アリールアルキル」という用語は、炭素原子（たとえばメチレン基）が、たとえば酸素原子によって置換されているアルキル基（たとえば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）を含む、アリール基がアルキル基に付着されている基（たとえば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）を含意する。
【００７９】
上記の用語のそれぞれ（たとえば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」）は、示された基の置換および非置換形を含意する。各タイプの基に対する好ましい置換基を以下に示す。
【００８０】
アルキルおよびヘテロアルキル基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと呼ばれることも多い基を含む）に対する置換基は、一般に「アルキル基置換基」と呼び、それらは、限定はされないが、ゼロから（２ｍ’＋１）（ｍ’は当該基内の炭素原子の数である）の数の、以下に示すものから選択される１つ以上の様々な基であってよい。−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ2Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（０）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）2Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ2Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ2。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’はそれぞれ好ましくは独立して水素、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、たとえば、１〜３個のハロゲンで置換されたアリール、置換または非置換アルキル、アルコキシまたはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基のことをいう。本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含む場合、たとえば、Ｒ基のそれぞれは独立して、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’基のそれぞれが、これらの基が１つを超えて存在する際と同様に、選択される。Ｒ’およびＲ’’が同一の窒素原子に付着される場合、それらは窒素原子と組み合わさって、５，６または７員環を形成してもよい。たとえば、−ＮＲ’Ｒ’’は、限定は
されないが、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含意する。置換基についての上記の議論から、当業者であれば「アルキル」という用語は、水素基以外の基に結合された炭素原子を含む基、たとえばハロアルキル（たとえば、−ＣＦ3および−ＣＨ2ＣＦ3）およびアシル（たとえば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ3、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ3、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ2ＯＣＨ3など）を含意することを理解するであろう。
【００８１】
アルキル基に対して記載した置換基と同様に、アリールおよびヘテロアリール基に対する置換基は、一般に「アリール基置換基」と呼ぶ。置換基は、たとえば、ハロゲン、−ＯＲ’、＝０、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ2Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）2Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ2Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ2、−Ｒ’、−Ｎ3、−ＣＨ（Ｐｈ）2、フルオロ（Ｃ1〜Ｃ4）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ1〜Ｃ4）アルキルの中から、ゼロから芳香族環系上の開いた原子価（ｏｐｅｎ  ｖａｌｅｎｃｅｓ）の総数の間の数で選択され、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は好ましくは独立して、水素、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから選択される。本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含む場合には、たとえば、Ｒ基のそれぞれは独立して、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’基のそれぞれが、これらの基が１つを超えて存在する際と同様に選択される。以下に示すスキームにおいて、符号Ｘは上記のような「Ｒ」を示す。
【００８２】
アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つが、任意選択で、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｕ−Ｕ−（式中、ＴおよびＵは独立して−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−または単結合であり、ｕは０〜３の整数である）の置換基によって置換されていてもよい。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つが、任意選択で、式−Ａ−（ＣＨ2）ｒ−Ｂ−（式中、ＡおよびＢは独立して、−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）2−、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ’−または単結合であり、ｒは１〜４の整数である）の置換基によって置換されていてもよい。このように形成される新しい環の単結合のうちの１つが、任意選択で二重結合に置き換えられていてもよい。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つが、任意選択で、式−（ＣＲＲ’）ｚ−Ｘ−（ＣＲ’’Ｒ’’’）d−（式中、ｚおよびｄが独立して０〜３の整数であり、Ｘは−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）2−または−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ’−である）の置換基によって置換されていてもよい。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、好ましくは独立して水素または置換または非置換（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルから選択される。
【００８３】
本明細書中で用いる「ヘテロ原子」という用語は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）およびケイ素（Ｓｉ）を含意する。
「幹細胞」とは、自身のコピーを無限に作り出すことができ、体内の様々な組織に対して特殊化されたものになりうる「包括的な（ｇｅｎｅｒｉｃ）」または未分化細胞のことをいう。幹細胞は、赤血球、白血球および血小板を含む正常な血液成分を生じさせることができる。幹細胞は、通常は骨髄中および血液中に存在し、移植のために採取可能である。
【００８４】
「造血細胞」という用語は、血液細胞の形成に関連する細胞のことをいう。この用語は、上記で定義した「幹細胞」と互換的に用いることができる。
本明細書中で用いる「幹細胞産生を動員する」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて幹細胞数を増加させるあらゆるプロセスを含意する。幹細胞数の増加は、
始原細胞数の増加の結果でもありうる。この用語には、骨髄へのまたは骨髄からの幹細胞の移植のプロセスも含まれる。
【００８５】
同様に、「造血細胞産生を動員する」という用語は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて造血細胞を増加させるあらゆるプロセスを含意する。造血細胞数の増加は、始原細胞数の増加、多能性幹細胞から造血細胞への成熟速度の増加、およびその何らかの組み合わせの結果でありうる。この用語には、骨髄へのまたは骨髄からの造血細胞の移植のプロセスも含まれる。
【００８６】
「顆粒球」という用語は、その細胞質中に顆粒が存在することを特徴とする白血球のことをいう。
序論
本発明は、化学療法、放射線治療、および血小板減少症にしばしば起因する造血欠乏症に関連する疾患および状態を予防、軽減および治療するために、グリコシル化Ｇ−ＣＳＦを投与する方法を包含する。Ｇ−ＣＳＦは主に骨髄に作用して炎症性白血球の産生を増大させるとともに、さらに、炎症性機能の間に消費される好中球の補充を開始させる内分泌ホルモンとしても機能する。Ｇ−ＣＳＦは、化学療法後の骨髄交換における臨床的用途も有する。
【００８７】
本発明は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を含む共役体を提供する。本発明は、顆粒球コロニー刺激活性を有するグリコシル化または非グリコシル化ペプチドを含む共役体も包含する。共役体は、治療的部分、診断的部分、ターゲティング部分などの様々な種によってさらなる共役によりさらに修飾されていてもよい。本明細書に記載するＧ−ＣＳＦ共役体に対して、高分子修飾基は、Ｇ−ＣＳＦペプチドのグリコシルまたはアミノ酸残基にあるＧ−ＣＳＦペプチドに、好ましくはグリコシル連結基を介して付着されてもよい。例示的実施形態において、高分子修飾基は水溶性ポリマーである。さらなる実施形態において、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）である。
【００８８】
例示的実施形態において、本発明のＧ−ＣＳＦペプチドは、原因にかかわらず重篤な慢性または相対白血球減少症の治療のために、末梢血始原細胞移植における採取のために始原細胞を動員するように、および急性骨髄性白血病患者の治療を支持するように、放射線治療、化学療法、および骨髄移植骨髄移植を受けている癌患者における感染を予防する目的で、患者に投与されてもよい。さらに、ポリペプチド共役体または本発明の組成物は、ＡＩＤＳまたは他の免疫欠損疾患、ならびに細菌感染症、心臓疾患、Ａ型、Ｂ型およびＣ型肝炎の治療のために用いてもよい。
【００８９】
一実施形態において、本発明のＧ−ＣＳＦペプチド共役体は、造血を増加させるために対象に投与してもよい。造血は、前駆細胞が、赤血球、白血球および血小板を含む成熟血液細胞に発展するプロセスである。正常な造血は、コロニー刺激因子などの糖タンパク質を含む様々な調節因子によって調整される。このような調節因子は、始原および前駆細胞の生存、増殖および分化、ならびに成熟細胞の活性化状態を調節する。造血に障害が起きているとき、結果として血液細胞および血小板の産生が低下し、免疫性が損なわれ、創傷や感染からの治癒ができなくなる。
【００９０】
本発明は、対象における造血を刺激する方法および組成物を提供する。本発明の方法は、対象に、有効量の、Ｇ−ＣＳＦペプチドと高分子修飾基との間の共有結合共役体であるペプチドを投与する工程を含む。
【００９１】
一態様において、造血の刺激は、対象における造血始原細胞の数を増加させることを含み、結果として成熟造血細胞（血液細胞）の数も増加する。造血始原細胞は骨髄と往来し
て、骨髄内に保持され、そこで成熟して赤血球や白血球になることができる。本発明の造血始原細胞の数を刺激する方法は、対象に有効量のＧ−ＣＳＦペプチドと高分子修飾基との間の共有結合共役体であるペプチドを投与する工程を含む。一実施形態において、ペプチドの適用によって増加する造血始原細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。
骨髄抑制
骨髄抑制は、血液細胞産生の減少である。正常な血液は、酸素を運ぶための背血球や感染と戦うための白血球を含む多数の細胞を含んでいる。正常な血液には、血液の凝固を開始させる小さな細胞断片である血小板も含まれている。これらの細胞および断片は、いくつかの骨の中心に見いだされる物質である骨髄において作られる。健康な骨髄は日々、多数の赤血球、白血球および血小板を作っている。骨髄抑制においては、これらの細胞が非常にわずかにしか作られない。本発明は、骨髄抑制を治療、軽減および予防する方法および組成物を提供する。
【００９２】
骨髄抑制の１つの特徴は、対象における白血球産生に障害が生じることである。このような白血球産生障害は、ある種の治療、とりわけ化学療法や放射線治療などの癌治療に起因しうる。白血球産生障害は、特発性血小板減少性紫斑病などの疾病によって引き起こされることもある。一つの態様において、本発明の共役体は、白血球産生障害を特徴とする疾病を治療および軽減するために用いられる。
【００９３】
骨髄抑制に起因する疾病としては、好中球減少症（発熱性好中球減少症を含む）および血小板減少症がある。好中球減少症は、血液中の好中球（白血球の最も一般的な型）の数の異常な減少を特徴とする。この減少は相対的なものであっても絶対的なものであってもよい。一態様において、本発明は、哺乳動物における好中球減少症の治療の方法を提供する。これらの方法は、医薬として有効な量の本発明のＧ−ＣＳＦ共役体を投与する工程を含む。Ｇ−ＣＳＦは、発熱性好中球減少症および成人癌患者の死亡率に影響を及ぼすことが示されている（Ｋｕｄｅｒｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃ．（２００７年）、２５（２１）：３１５８〜６７頁）。
【００９４】
血小板減少症は、血中の血小板数が異常に少なく、しばしば異常な出血を伴うという疾患である。本発明の方法は、哺乳動物における血小板減少症の治療を含む。これらの方法は、医薬として有効な量の本発明のＧ−ＣＳＦ共役体を投与する工程を含む。本明細書中で用いる血小板減少症という用語は、起源が分かっている疾患だけでなく、特発性血小板減少症も包含する。血小板減少症および特発性血小板減少症は、本明細書中では、「血小板減少性紫斑病」および「特発性血小板減少性紫斑病」ともいう。
幹細胞動員
骨髄抑制と戦うための１つの方法は、幹細胞産生を動員することである。幹細胞産生の動員には、造血始原細胞の数と、好中球および好酸球を含む顆粒球の数とを含む、幹細胞の数を増加させることが含まれる。幹細胞産生の動員には、骨髄から末梢血への幹細胞の輸送を増加させることが含まれる。末梢血は骨髄よりも容易にアクセスできることから、このような動員は、ドナーから幹細胞を採取する際の助けとなる。一態様において、本発明は、対象における幹細胞産生を動員する方法を提供する。
【００９５】
別の態様において、対象中の造血始原細胞を動員することにより、本発明の方法および組成物を用いて、骨髄抑制が予防、軽減および、治療される。造血始原細胞の動員には、造血始原細胞の数を増加させること、ならびに該細胞の骨髄へまたは骨髄からの輸送を増加することが含まれる。
【００９６】
ＣＤ３４＋細胞などの造血始原細胞は、成熟、分化して、血液の成分、すなわち赤血球および白血球となる。本発明は、対象中で造血始原細胞を動員する方法を提供し、該方法は、対象に以下のものを投与する工程を含む。（ｉ）式（１）１，１’−［１，４−フェ
ニレン−ビス−（メチレン）−ビス−１，４，８，１］−テトラアザシクロテトラデカン（ＡＭＤ３１００）の化合物を含む第１の組成物、およびｎ（２）Ｇ−ＣＳＦペプチドと高分子修飾基の共有結合共役体であるペプチドを含む第２の組成物。一実施形態において、第１の組成物および第２の組成物は、任意の順序で順次に対象に投与される。別の実施形態において、第１の組成物および第２組成物は同時に投与される。一実施形態において、両組成物は対象に皮下投与される。
【００９７】
ＡＭＤ３１００は、正常な対象および癌患者の両方において、循環中のＣＤ３４＋細胞の有意数を動員することが証明されているバイシクラム誘導体である。（Ｌｉｌｅｓら、Ｂｌｏｏｄ、（２００３年）、１０２：２７２８〜３０頁；Ｄｅｖｉｎｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ、（２００４年）、２２：１０９５〜１１０２頁）。ＡＭＤ３１００を非グリコシル化型のＧ−ＣＳＦと組み合わせることで、Ｇ−ＣＳＦ単独による場合よりも循環中に多数のＣＤ３４＋細胞が動員されることが研究によって証明されている（Ｆｌｏｍｅｎｂｅｒｇら、Ｂｌｏｏｄ、（２００５年）、１０６（５）：１８６７〜１８７４頁）。
【００９８】
一実施形態において、幹細胞産生は、骨髄または造血細胞ドナーとなる対象において動員される。ドナーには上述のようなペプチド共役体が与えられる。ドナーからの幹細胞は、その数が増大し、骨髄から末梢血中へ移動するように動員される。このような細胞は、当該技術分野において知られる方法を用いてドナーから容易に単離される。そのような実施形態におけるドナーは、骨髄または造血細胞のレシピエントと同じ（自己ドナー）であってもよいし、ドナーは、レシピエントではない対象（同種異系ドナー）であってもよい。
【００９９】
別の態様において、本発明のペプチド共役体は、少なくとも１つの化学治療剤と組み合わせて提供される。
骨髄移植
いくつかの態様において、本発明は、骨髄移植レシピエントにおいて幹細胞産生を動員する方法および組成物を提供する。これらの方法は、レシピエントに、ある量のＧ−ＣＳＦペプチドと高分子修飾基との間の共有結合共役体であるペプチドを投与する工程を含む。一実施形態において、高分子修飾基は、Ｇ−ＣＳＦペプチドのグリコシルまたはアミノ酸残基において、Ｇ−ＣＳＦペプチドに、好ましくはインタクトなグリコシル連結基を介して、共有結合することのできる、水溶性ポリマーである。当該ペプチドは、レシピエントに、骨髄の移植前、移植後、または移植と同時のいずれに投与してもよい。
【０１００】
移植を成功させるために、長期にわたる生着が重要である。「生着」という用語は、注入または移植されたドナー幹細胞が、レシピエントの髄を居としてすべての型の血液細胞を産生する過程のことをいう。生着は、幹細胞移植後に、レシピエントの血液中において新しい白血球、赤血球および血小板が出現して初めて明らかになる。長期生着とは、注入または移植されたドナー細胞がレシピエントの髄にとどまり、レシピエントの免疫系による拒絶なく、長期間にわたって血液細胞を産生し続ける過程をいう。移植片に中間および後期始原細胞を含めることにより、ドナーに由来する成熟細胞の産生を加速し、生着過程を支援することができる。
【０１０１】
したがって、本発明は、レシピエントに提供される骨髄の長期生着を高める方法および組成物を提供する。一例示的実施形態において、本発明のペプチドは、骨髄移植の前にドナーに投与される。ペプチドは、ドナーにおける造血を増加させ、特に、始原細胞の数を増加させることで、骨髄および／または造血細胞がレシピエントに移植された際の生着の成功と寿命を高める。移植される骨髄は、レシピエント自身の骨髄（自己）であってもよいし、骨髄は同種のドナーから移植することもできる（同種異系）。
【０１０２】
別の実施形態において、本発明のペプチドは、当該骨髄がレシピエント自身からのものか、別の個体からのものかに応じて、提供された骨髄の長期生着を高めるために、骨髄のレシピエントに投与される。レシピエントへのペプチドの適用は、提供された骨髄を造血始原細胞の産生を高めるように刺激することにより、レシピエントにおける造血を高めて、生着を高める役割を果たす。
造血細胞移植
造血細胞の移植は、様々な遺伝性または悪性の疾病に対する一般的な治療である。移植手法によっては、全骨髄集団を利用するものもあるが、別の手法では、幹細胞に対する富化を行ったより限定された集団を利用する。骨髄に加えて、上記のような細胞は、末梢血や新生児の臍帯血などの他の供給源から得ることもできる。末梢血からの幹細胞を用いる一つの利点は、これらの細胞が、骨髄においてよりも、末梢血において、より容易にアクセス可能であることである。しかしながら、末梢血幹細胞移植に対する制限因子は、循環する多能性幹／始原細胞の数が少ないことである。したがって、移植においての使用のために、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて幹細胞を拡張することが必要である。
【０１０３】
したがって、本発明は、培養において造血細胞を拡張する方法を提供する。このような方法は、例示的実施形態において、本発明の有効量のペプチドを造血細胞の培養に投与することを含む。このようなペプチドは、例示的実施形態において、Ｇ−ＣＳＦペプチドと高分子修飾基との共役体である。一実施形態において、高分子修飾基は、Ｇ−ＣＳＦペプチドのグリコシルまたはアミノ酸残基において、好ましくはインタクトなグリコシル連結基を介して、Ｇ−ＣＳＦペプチドへ共有結合可能な水溶性ポリマーである。一実施形態において、本発明は、移植に使用可能な、幹細胞、ならびに始原細胞の集団を拡張する方法を提供する。これらの方法は、幹細胞の培養に、有効量の本発明のペプチドを投与する工程を含む。
臓器移植
骨髄移植と同様に、肝臓、腎臓、心臓および肺などの固体臓器移植片は、レシピエントにおいて様々な免疫反応を引き起こしうる。そのような免疫反応は、これらの移植片の急性拒絶につながることもある。Ｇ−ＣＳＦおよび他の造血成長因子を、そのような反応を治療するために用いることができる（米国特許第５，７１８，８９３号）。したがって、本発明の方法および組成物は、患者における臓器移植の急性拒絶の発生を予防または低減するために用いることができる。
心臓疾患
一実施形態において、本発明の方法および組成物は、心疾患を軽減し、心機能を向上させるために用いることができる。一実施形態において、本発明の方法および組成物は、血管形成幹細胞の放出を刺激するために用いられる。Ｇ−ＣＳＦによる治療は、複数の外科手術を受けた患者、および最大投与量の従来の医薬品を受けた患者を含む、心疾患患者における狭心症を減らすことができる（たとえば、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｎｅｗｓ  Ｔｏｄａｙ，２００７年６月４日、「重篤な心疾患患者に新たな希望（Ｓｅｖｅｒｅ  Ｈｅａｒｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｏｆｆｅｒｅｄ  Ｎｅｗ  Ｈｏｐｅ）」を参照のこと）。他の研究には、Ｇ−ＣＳＦが心筋を救済および保護して、心疾患によって当該筋肉が損傷を受けている場合でも、これらの筋肉が死ぬことを防ぐことができることが示されている（たとえば、Ｓｕｎｄａｙ  Ｔｅｌｅｇｒａｐｈ  Ｎｅｗｓ，２００７年８月５日，「自身を救う我が世界初の心臓（Ｏｕｒ  Ｗｏｒｌｄ−ｆｉｒｓｔ  ｈｅａｒｔｓ  ｔｈａｔ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｔｈｅｍｓｅｌｖｅｓ）」を参照のこと）。Ｇ−ＣＳＦは、単独、または患者からの成人幹細胞と組み合わせて、心臓内の死んだ組織を修復し、新しい血管を生み出すための治療として用いることができる。
神経疾患
一実施形態において、本発明の方法および組成物は、特に限定はされないが、アルツハイマー病や他の退行性脳障害などの神経疾患を治療するために用いることができる。アル
ツハイマー病のマウスモデルにおける研究から、Ｇ−ＣＳＦがこれらのモデルにおいてアルツハイマー様症状を逆転させることができることが示された（たとえば、Ｔｓａｉら、（２００７年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０４（６）：１２７３〜８０頁）。これらの研究は、血流中へのＧ−ＣＳＦの注射が、骨髄からの造血幹細胞の放出を容易にするということを示している。これらの幹細胞は、血流から脳内へと渡り、ここで、損傷部位に付着して、新しい細胞に分化する。Ｇ−ＣＳＦの適用は、ニューロン損傷が最も大きい場所での、新しい細胞の成長をもたらす。
Ｇ−ＣＳＦ共役体
上述の方法のいくつかによれば、ペプチドは、Ｇ−ＣＳＦペプチドと高分子修飾基との間の共有結合共役体である。高分子修飾基は、Ｇ−ＣＳＦペプチドのグリコシルまたはアミノ酸残基において、好ましくはグリコシル連結基を介して、Ｇ−ＣＳＦペプチドに共有結合されることができる。一実施形態において、グリコシル連結基は、インタクトなグリコシル連結基である。好ましい実施形態において、高分子修飾基およびグリコシル連結基は、リンカーを介して共有結合される。例示的実施形態において、高分子修飾基はポリ（エチレングリコール）などの水溶性ポリマーである。
【０１０４】
Ｇ−ＣＳＦについては、クローニングと配列決定がすでになされている。例示的実施形態において、Ｇ−ＣＳＦは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。当業者であれば、本発明は、本明細書に表す配列に限定されないことを容易に理解するであろう。
【０１０５】
本発明は、さらに、当該技術分野において周知のＧ−ＣＳＦバリアントも包含する。一例として、本発明を何ら限定する意味はないが、Ｇ−ＣＳＦバリアントは、米国特許第６，１６６，１８３号に記載されており、該文献には、リジン残基の天然成分からなり、１つまたは２つのポリエチレングリコール分子にさらに連結されたＧ−ＣＳＦが記載されている。さらに、米国特許第６，００４，５４８号、第５，５８０，７５５号、第５，５８２，８２３号、および第５，６７６，９４１号には、１７，３６，４２，６４および７４位のシステイン残基のうちの１つ以上がアラニンあるいはセリンによって置換されているＧ−ＣＳＦバリアントが記載されている。米国特許第５，４１６，１９５号には、１７位のシステイン、２７位のアスパラギン酸、および６５位および６６位のセリンが、それぞれセリン、セリン、プロリン、およびプロリンによって置換されているＧ−ＣＳＦ分子が記載されている。他のバリアントは当該技術分野において周知であり、たとえば、米国特許第５，３９９，３４５号に記載されている。さらなるバリアントは、配列番号３〜１１から選択されるアミノ酸を有する。
【０１０６】
本発明の修飾Ｇ−ＣＳＦ分子の発現および活性は、当該技術分野において周知の方法、およびたとえば、米国特許第４，８１０，６４３号に記載の方法によって調べることができる。一例として、活性は放射性標識チミジン取込み検定によって測定することができる。簡単に説明すると、健康なドナーからのヒト骨髄に対して、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（１．０７７ｇ／ｍＬ、ファルマシア、ニュージャージー州ピスカタウェイ）による密度カットを行い、低密度細胞を、１０％仔ウシ血清、グルタミンおよび抗生物質を含むイスコーブ培地（ＧＩＢＣＯ，カリフォルニア州ラ・ホーヤ）中に懸濁する。約２×１０4ヒト骨髄細胞を対照培地または本発明のＧ−ＣＳＦとともに、９６ウェル平底プレート中にて、５％ＣＯ2中、３７℃で約２日間インキュベートする。培養物を０．５μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ、マサチューセッツ州ボストン）で約４時間パルスし、取込みを、たとえば、Ｖｅｎｔｕａら（１９８３年、Ｂｌｏｏｄ  ６１：７８１）に記載のように測定する。対照化合物で処理した骨髄細胞と比べて、ヒト骨髄細胞へのＨ−チミジン取込みが増加していることは、活性がある有効なＧ−ＣＳＦ化合物であることの指標となる。
【０１０７】
本発明の共役体は、修飾された糖をグリコシル化または非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦペプ
チドに酵素的に付着させることによって形成される。修飾された糖は、Ｇ−ＣＳＦペプチドと糖上の修飾基との間に介在する場合、本明細書中でたとえば「インタクトなグリコシル連結基」として称してもよいものになる。グリコシルトランスフェラーゼなどの酵素の優れた選択性を用いて、本発明は、１つ以上の特定位置に所望の基を有するペプチドを提供する。したがって、本発明によれば、修飾された糖は、Ｇ−ＣＳＦペプチド鎖上の選択された場所に直接付着されるか、あるいは、修飾された糖は、糖ペプチドの炭水化物部分上に付加される。修飾された糖が糖ペプチド炭水化物に結合し、かつ、Ｇ−ＣＳＦペプチド骨格のアミノ酸残基に直接結合しているペプチドも、本発明の範囲に含まれる。
【０１０８】
既知の化学的および酵素的ペプチド加工（ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ）戦略とは対照的に、本発明の方法を用いて、実質的に均質の誘導体化パターンを有するペプチドおよび糖ペプチドを構築することができる。本発明によって使用される酵素は、一般にはＧ−ＣＳＦペプチドの特定のアミノ酸残基またはアミノ酸残基の組み合わせに対して選択的である。このような方法は、修飾ペプチドおよび糖ペプチドの大量生産に適用することもできる。したがって、本発明の方法は、あらかじめ選択された均一な誘導体化パターンを有する糖ペプチドの大量調製のための実用的手段を提供する。本方法は、限定はされないが、細胞培養細胞（たとえば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞または原核細胞）またはトランスジェニック植物または動物における産生中に不完全にグリコシル化された糖ペプチドを含む、治療用ペプチドの修飾に特に適している。
【０１０９】
本発明は、たとえば、クリアランス速度の低下、または免疫または網内系（ＲＥＳ）による取込み速度の低下により、治療半減期が増大したグリコシル化および非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦペプチドの共役体も提供する。さらに、本発明の方法は、ペプチド上の抗原性決定因子をマスキングして、当該ペプチドに対する宿主免疫反応を低減または排除するための手段を提供する。ターゲティング物質の選択的付着は、ペプチドを、該特定のターゲティング物質に特異的な特定の組織または細胞表面受容体を標的とするようにするために使用できる。
【０１１０】
一実施形態において、本発明は、選択された修飾基とＧ−ＣＳＦペプチドとの共役体を提供する。ペプチドと修飾部分との間の連結は、ペプチドと選択部分との間に介在したグリコシル連結基を含む。本明細書中で議論するように、選択された修飾部分は、サッカリド単位に付着されて、修飾された糖をペプチドまたはそれに付着されたグリコシル基上に付加する適当なトランスフェラーゼ酵素によって認識される「修飾された糖」をもたらすことのできる本質的に任意の種である。修飾された糖のサッカリド成分は、ペプチドと選択部分との間に介在された場合、「グリコシル連結基」、たとえば「インタクトなグリコシル連結基」になる。グリコシル連結基は、修飾基による修飾後に、修飾された糖をペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に付加する酵素に対する基質となる、任意のモノまたはオリゴサッカリドから形成される。
【０１１１】
グリコシル連結基は、修飾基の付加前または付加中に分解的に修飾されるサッカリド部分であってもよいし、それを含んでいてもよい。たとえば、グリコシル連結基は、たとえばメタ過ヨウ素酸塩の作用を介した、インタクトなサッカリドから対応するアルデヒドへの酸化的分解によって生成され、続いて適当アミンによってＳｃｈｉｆｆ塩基に変換された後に対応するアミンに還元されるサッカリド残基から誘導することができる。
【０１１２】
本発明の共役体は、典型的には次の一般的構造に対応する。
【０１１３】
【化３】
0005922065.tif 000004
ここで、ａ，ｂ，ｃ，ｄおよびｓの符号は、ゼロ以外の正の整数であり、ｔは０または正の整数のいずれかである。「作用物質」とは、典型的には、水溶性の部分、たとえばＰＥＧ部分である。リンカーは、以下に示す幅広い連結基のいずれかであってよい。あるいは、リンカーは、単結合であるか、または「ゼロ次リンカー」であってよい。
【０１１４】
修飾基は、本明細書中でさらに議論するように、サッカリド単位に付着させることができる任意の種を含んでいてよい。このような基は、水溶性および水不溶性ポリマーを含むポリマーを含み、治療的部分、診断的部分、ターゲティング部分、毒素部分などをさらに含んでもよい。例示的実施形態において、選択された修飾基は、水溶性ポリマー、たとえばＭ−ＰＥＧである。水溶性ポリマーは、アミノ酸残基またはＧ−ＣＳＦペプチドのグリコシル残基に共有結合されたグリコシル連結基を介して、Ｇ−ＣＳＦペプチドに共有結合されてもよい。本発明は、アミノ酸残基およびグリコシル残基がグリコシル連結基で修飾された共役体も提供する。
【０１１５】
本発明のペプチドは、少なくともＮ−またはＯ−結合されたグリコシル化部位を含む。酵素的に付加されたグリコシル連結基を介して形成された共役体を提供することに加えて、本発明は、それらの置換パターンにおいて高度に均質な共役体を提供する。本発明の方法を用いて、本質的に本発明の共役体集団にわたるすべての修飾された糖部分が、構造的に同一のアミノ酸またはグリコシル残基の複数のコピーに付着されているペプチド共役体を形成することができる。したがって、一態様において、本発明は、インタクトなグリコシル連結基を介してＧ−ＣＳＦペプチドに共有結合された、水溶性ポリマー部分の集合を有するペプチド共役体を提供する。本発明の共役体の例示的実施形態において、水溶性ポリマー部分の集合の本質的に各メンバーが、グリコシル連結基を介して、Ｇ−ＣＳＦペプチドのグリコシル残基に結合され、グリコシル連結基が付着されているＧ−ＣＳＦペプチドの各グリコシル残基は同じ構造を有している。
【０１１６】
グリコシル連結基を介して共有結合された水溶性ポリマー部分の集合を有するペプチド共役体も提供される。一実施形態において、水溶性ポリマー部分の集合の本質的にすべてのメンバーは、グリコシル連結基を介してＧ−ＣＳＦペプチドのアミノ酸残基に結合され、グリコシル連結基が付着された各アミノ酸残基は同じ構造を有する。
【０１１７】
本発明は、Ｇ−ＣＳＦペプチドが治療的部分、診断的部分、ターゲティング部分、毒素部分などにインタクトなグリコシル連結基を介して共役された上述の共役体類似体も提供する。上に挙げた部分のそれぞれは、小分子、天然ポリマー（たとえば、ポリペプチド）または合成ポリマーであってよい。
修飾された糖
本発明は、修飾された糖、修飾された糖ヌクレオチド、および修飾された糖の共役体を提供する。本発明の修飾された糖化合物において、糖部分は好ましくは、サッカリド、デオキシサッカリド、アミノサッカリドまたはＮ−アシルサッカリドである。「サッカリド」という用語およびそれに同一の「サッカリル」、「糖」および「グリコシル」とは、モノマー、ダイマー、オリゴマーおよびポリマーのことをいう。糖分子もまた、修飾基で官
能化される。修飾基は、典型的には、糖上のアミン、スルフヒドリル、またはヒドロキシルたとえば一級ヒドロキシル部分との共役を介して、糖部分に共役される。例示的実施形態において、修飾基は、糖上のアミン部分を介して、たとえば、修飾基の反応性誘導体とアミンの反応を介して形成されたアミド、ウレタンまたは尿素を介して付着される。
【０１１８】
本発明の共役体の糖コアとしては任意の糖を用いることができる。本発明の組成物を形成するのに有用な糖コアとしては、限定はされないが、たとえば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、およびシラン酸が挙げられる。他の有用な糖としては、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、シアル酸の５−アミン類似体などのアミノ糖が挙げられる。糖コアは、自然界に見いだされる構造であってもよいし、修飾基を共役するための部位を提供するように修飾されていてもよい。たとえば、一実施形態において、本発明は、９−ヒドロキシ部分がアミンで置換されているシアル酸誘導体を含むペプチド共役体を提供する。該アミンは選択された修飾基の活性化類似体によって容易に誘導体化される。
グリコシル連結基
上述の任意の方法のペプチド共役体によれば、ペプチド共役体のいくつかの実施形態は、シアル酸残基であるグリコシル連結基を含む。
【０１１９】
Ｇ−ＣＳＦペプチドと水溶性ポリマーなどの選択された部分（以下、選択部分）との間の連結は、ペプチドと選択部分の間に介在されたインタクトなグリコシル連結基を含む。本明細書中で議論するように、選択部分は、サッカリド単位に付着可能で、修飾された糖をＧ−ＣＳＦペプチド上に付加する適当なトランスフェラーゼ酵素によって認識される「修飾された糖」をもたらすような本質的に任意の種である。修飾された糖のサッカリド成分は、Ｇ−ＣＳＦペプチドと選択部分の間に介在された場合に、「インタクトなグリコシル連結基」になる。グリコシル連結基は、選択部分で修飾後に、適当なトランスフェラーゼに対する基質となるような、任意のモノまたはオリゴサッカリドから形成される。
【０１２０】
一実施形態において、グリコシル連結基は、下記の式による構造を有するシアル酸残基である。
【０１２１】
【化４】
0005922065.tif 000005
（式中、Ｒは水溶性ポリマーであり、水溶性ポリマーが前記リンカーを介してシアル酸残基に付着されている。）
別の実施形態において、グリコシル連結基は、下記の式による構造を有するシアル酸残基である。
【０１２２】
【化５】
0005922065.tif 000006
（式中、ｎは１〜２０００の整数である。）
さらに別の実施形態において、グリコシル連結基は、下記の式を有する修飾シアリル残基を含む。
【０１２３】
【化６】
0005922065.tif 000007
（式中、Ｒ2はＨ、ＣＨ2ＯＲ7，ＣＯＯＲ7またはＯＲ7であり、
Ｒ7はＨ、置換または非置換アルキルまたは置換または非置換ヘテロアルキルを表し；
Ｒ3およびＲ4は、独立してＨ、置換または非置換アルキル、ＯＲ8，ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ9から選択されたメンバーであり、
Ｒ8およびＲ9は独立して、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルまたはシアル酸から選択され；
Ｌaは結合、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるリンカーであり；
Ｒ16およびＲ17は、独立して、高分子アームから選択され；
Ｘ2およびＸ4は、独立して選択されるポリマー部分Ｒ16およびＲ17をＣに接合する連結断片であり；
Ｘ5は非反応性基である。
【０１２４】
さらなる実施形態において、アミノ酸残基はセリンまたはスレオニンから選択されたメンバーである。さらに別の実施形態において、アミノ酸残基は、配列番号１の１３３位のスレオニンである。
【０１２５】
一実施形態において、グリコシル連結基は、
【０１２６】
【化７】
0005922065.tif 000008
より選択されるサブ構造を含む。
（式中、
Ｒ15は、修飾されたシアリル残基であり、ｐは１〜１０の整数である。）
さらなる実施形態において、グリコシル連結基は、
【０１２７】
【化８】
0005922065.tif 000009
から選択される式を有する。
（式中、
ＡＡは前記ペプチドのアミノ酸残基であり；
ｔは０または１の整数であり；
ｐは１〜１０の整数であり；
Ｒ15は、Ｈ、ＯＨ、シアル酸、前記修飾されたシアリル残基およびＳｉａ−Ｓｉａpから選択されたメンバーであり、
Ｓｉａｐは、前記修飾されたシアリル残基であり、
少なくとも１つのＲ15は、前記修飾されたシアリル残基およびＳｉａ−Ｓｉａpから選択される。）一実施形態において、アミノ酸残基は、アスパラギン残基である。
【０１２８】
別の実施形態において、前記Ｇ−ＣＳＦペプチドは、下記の式による構造を含む。
【０１２９】
【化９】
0005922065.tif 000010
（式中、ｑは０または１であり；Ｓｉａ−Ｓｉａpは下記の式による構造を有し、
【０１３０】
【化１０】
0005922065.tif 000011
（式中、ｎは１〜２０００の整数である）。さらなる実施形態において、ｎは４００〜５００の整数である。さらに別の実施形態において、Ｇ−ＣＳＦペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を有する。
【０１３１】
本発明に続く議論では、選択されたシアル酸誘導体の使用を参照して説明を行う。当業者であれば、本議論の焦点は説明の明確化であって、そこで挙げる構造および組成は、サッカリド基、活性化修飾サッカリド基および修飾サッカリド基の共役体の類全体に対して一般的に適用可能であることを理解するであろう。
【０１３２】
例示的実施形態において、本発明は、下記の式を有する修飾された糖アミンを含むペプチド共役体を提供する。
【０１３３】
【化１１】
0005922065.tif 000012
（式中、Ｇはグリコシル部分であり、Ｌは結合またはリンカーであり、Ｒ1は修飾基である。）
結合は、たとえば、グリコシル部分上のＮＨ2と、修飾基上の相補的な活性基との間で形成されるものである。したがって、結合としては、限定はされないが、たとえば、ＮＨＲ1、ＯＲ1、ＳＲ1などが挙げられる。たとえば、Ｒ1がカルボン酸部分を含む場合には、この部分は活性化されて、グリコシル残基上のＮＨ2部分と結合されて、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１の構造を有する結合を与えることができる。同様に、ＯＨおよびＳＨ基は、それぞれ対応するエーテルまたはチオエーテル誘導体に変換可能である。
【０１３４】
リンカーとしては、たとえば、アルキルおよびヘテロアルキル部分が挙げられる。リンカーは連結基、たとえば、アシルに基づく連結基、たとえば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−などを含む。連結基は、本発明の種の成分の間、たとえば、グリコシル部分とリンカー（Ｌ）の間、またはリンカーと修飾基（Ｒ1）の間で形成される結合である。
他の連結基はエーテル、チオエーテルおよびアミンである。たとえば、一実施形態において、リンカーはグリシン残基などのアミノ酸残基である。グリシンのカルボン酸部分は、グリコシル残基上のアミンとの反応によって対応するアミドに変換され、グリシンのアミンは、修飾基の活性化されたカルボン酸またはカルボン酸塩との反応により対応するアミドまたはウレタンに変換される。
【０１３５】
別のリンカーの例としては、ＰＥＧ部分または、アミノ酸残基で官能化されたＰＥＧ部分が挙げられる。ＰＥＧは、一方のＰＥＧ末端においてアミノ酸残基を介してグリコシル基に、他方のＰＥＧ末端を介してＲ1に結合される。あるいは、アミノ酸残基は、Ｒ1に結合され、アミノ酸に結合されていないＰＥＧ末端がグリコシル基に結合される。
【０１３６】
ＮＨ−Ｌ−Ｒ1に対する例示的な種は、次の式を有する。−ＮＨ｛Ｃ（Ｏ）（ＣＨ2）ａＮＨ｝s｛Ｃ（Ｏ）（ＣＨ2）b（ＯＣＨ2ＣＨ2）cＯ（ＣＨ2）dＮＨ｝tＲ1（式中、添え字ｓおよびｔは独立して０または１である）。添え字ａ，ｂおよびｄは、独立して０〜２０の整数であり、ｃは１〜２５００の整数である。他の同様のリンカーは、−ＮＨ部分が、たとえば、−Ｓ，−Ｏおよび−ＣＨ2に置き換えられた種に基づいている。
【０１３７】
より詳細には、本発明はＮＨ−Ｌ−Ｒ1が、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ａＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ2）b（ＯＣＨ2ＣＨ2）cＯ（ＣＨ2）dＮＨＲ1、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ2）b（ＯＣＨ2ＣＨ2）cＯ（ＣＨ2）dＮＨＲ1、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ2）b（ＯＣＨ2ＣＨ2）cＯ（ＣＨ2）dＮＨＲ1、ＮＨ（ＣＨ2）ａＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ2）b（ＯＣＨ2ＣＨ2）cＯ（ＣＨ2）dＮＨＲ1、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ2）ａＮＨＲ1、ＮＨ（ＣＨ2）ＮＨＲ1、およびＮＨＲ1である化合物を含むペプチド共役体を提供する。これらの式において、添え字ａ，ｂおよびｄは独立して０〜２０、好ましくは１〜５の整数より選択される。添え字ｃは１〜２５００の整数である。
【０１３８】
説明的実施形態において、Ｇはシアル酸であり、本発明の選択化合物は、次の式を有する。
【０１３９】
【化１２】
0005922065.tif 000013
当業者によって理解されるように、上記例示的化合物におけるシアル酸部分は、限定はされないが、たとえば、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、それらのＮ−アセチル誘導体などの他の任意のアミノサッカリドに置き換えられていてもよい。
【０１４０】
別の説明的実施形態において、糖の一級ヒドロキシル部分は、修飾基によって官能化されていてもよい。たとえば、シアル酸の９−ヒドロキシは、対応するアミンに変換されていてもよく、本発明の化合物を提供するように官能化されている。本実施形態による式は、次のものを含む。
【０１４１】
【化１３】
0005922065.tif 000014
さらなる例示的実施形態において、本発明は、上記のようなリンカー修飾基カセットを有する、６−ヒドロキシ位が対応するアミン部分に変換された修飾された糖を含むペプチド共役体を提供する。上記修飾された糖のコアとして用いることのできる例示的サッカリル基には、Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ、Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃ、Ｘｙｌ、Ｍａｎなどが含まれる。本実施形態の各修飾された糖は次の式を有する。
【０１４２】
【化１４】
0005922065.tif 000015
（式中、Ｒ3〜Ｒ5およびＲ7は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ3、ＮＨ、およびＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ3から独立して選択されたメンバーであり、Ｒ6は、上述のＯＲ1、ＮＨＲ1またはＮＨ−Ｌ−Ｒ1である。）
本発明の選択される共役体は、マンノース、ガラクトースまたはガラクトースに基づくものであるか、またはマンノース、ガラクトースまたはガラクトースの立体化学を有する種に基づく。これらの共役体の一般式は次のとおりである。
【０１４３】
【化１５】
0005922065.tif 000016
別の実施形態において、本発明は対応するヌクレオチド糖として活性化される上記化合物を提供する。本発明においてその修飾形態で用いることのできる糖ヌクレオチドとしては、たとえば、ヌクレオチド一、ニ、または三リン酸またはその類似体が挙げられる。一実施形態において、修飾された糖ヌクレオチドはＵＤＰ−グリコシド、ＣＭＰ−グリコシド、またはＧＤＰ−グリコシドから選択される。より好ましくは、修飾された糖ヌクレオチドの糖ヌクレオチド部分は、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−ガラクトサミン、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−グルコサミン、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−フコース、ＣＭＰ−シアル酸、またはＣＭＰ−ＮｅｕＡｃから選択される。例示的実施形態において、ヌクレオチドリン酸塩はＣ−１に付着される。
【０１４４】
したがって、グリコシル部分がシアル酸である例示的実施形態において、本発明は、次の式を有する化合物を用いて形成されるペプチド共役体を形成する。
【０１４５】
【化１６】
0005922065.tif 000017
（式中、Ｌ−Ｒ1は上述の通りであり、Ｌ1−Ｒ1は修飾基に結合したリンカーを示す。）
Ｌに関して、Ｌ1によるリンカー種の例としては、結合、アルキルまたはヘテロアルキル部分が挙げられる。
【０１４６】
別の例示的実施形態において、本発明は、本発明の修飾された糖と、基質、たとえばペプチド、脂質、アグリコンなどの間の共役体、より詳細には、修飾された糖と糖ペプチドまたは糖脂質のグリコシル残基の間の共役体を提供する。本実施形態において、修飾された糖の糖部分は、基質と修飾基の間に介在されたグリコシル連結基になる。グリコシル連結基としては、たとえば、連結基を形成するグリコシル部分が化学物質（たとえばメタ過ヨウ素酸ナトリウム）または酵素（たとえばオキシダーゼ）によって分解されていない、インタクトなグリコシル連結基が挙げられる。本発明の選択される共役体は、たとえば、マンノサミン、グルコサミン、ガラクトサミン、シアル酸などのアミノサッカリドのアミノ部分に付着された修飾基を含む。本モチーフによる例示的な修飾基−インタクトなグリ
コシル連結基カセットは、次の式を有するようなシアル酸構造に基づく。
【０１４７】
【化１７】
0005922065.tif 000018
（式中、Ｒ1，Ｌ1およびＬ2は上述の通りである。）
さらに別の例示的実施形態において、基質と、修飾基がサッカリル部分の６−炭素位においてリンカーを介して付着されているサッカリル部分の１位との間で共役体が形成される。したがって、本実施形態による説明的共役体は次の式を有する。
【０１４８】
【化１８】
0005922065.tif 000019
（それぞれの基は上述した通りである）。当業者であれば、前記修飾サッカリル部分は、２、３、４、または５つの炭素原子において基質に共役されてもよいことを理解するであろう。
【０１４９】
本実施形態による説明的化合物は、次の式を有する化合物を含む。
【０１５０】
【化１９】
0005922065.tif 000020
（式中、Ｒ基および添え字は上述のとおりである）。
【０１５１】
本発明は、６−炭素位においてＬ−Ｒ1で修飾された糖ヌクレオチドも提供する。本実施形態による種としては、たとえば、
【０１５２】
【化２０】
0005922065.tif 000021
（式中、Ｒ基およびＬは、上述したような部分を示す）が挙げられる。添え字「ｙ」は、０，１または２である。
【０１５３】
ＧＤＰマンノースの立体化学を有する種に基づく、本発明のさらなる例示的ヌクレオチド糖は次の構造を有する。
【０１５４】
【化２１】
0005922065.tif 000022
さらなる例示的実施形態において、本発明は、ＵＤＰガラクトースの立体化学に基づく、共役体を提供する。本実施形態による例示的化合物は次の構造を有する。
【０１５５】
【化２２】
0005922065.tif 000023
別の例示的実施形態において、ヌクレオチド糖は、グルコースの立体化学に基づいている。本実施形態による例示的な種は次の式を有する。
【０１５６】
【化２３】
0005922065.tif 000024
修飾基，Ｒ1は、限定はされないが、水溶性ポリマー、水不溶ポリマー、治療用物質、診断用物質などを含む多数の種のいずれかである。例示的修飾基の特徴については、以下に詳細に議論する。
水溶性ポリマー
いくつかの実施形態において、本発明のＧ−ＣＳＦ共役体の高分子修飾基は、水溶性ポリマーである。これらの水溶性ポリマーは、線形または分枝状ポリマーであってよい。一実施形態において、水溶性ポリマーは、本質的に均質に分散された分子量分布を有する。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、本発明の共役体は、ポリ（エチレングリコール）、たとえばメトキシポリ（エチレングリコール）である水溶性ポリマーを含む。本発明において用いるポリ（エチレングリコール）は、何ら特定の形態または分子量範囲に限定されることはない。非分枝状ポリ（エチレングリコール）分子に対しては、分子量は好ましくは５００〜１００，０００である。２，０００〜６０，０００の分子量が好ましく用いられ、約５，０００〜約３０，０００の分子量がより好ましい。
【０１５８】
別の実施形態において、ポリ（エチレングリコール）は、２つ以上のＰＥＧ部分が付着された分枝状ＰＥＧである。分枝状ＰＥＧの例は、米国特許第５，９３２，４６２号；米国特許第５，３４２，９４０号；米国特許第５，６４３，５７５号；米国特許第５，９１９，４５５号；米国特許第６，１１３，９０６号；米国特許第５，１８３，６６０号；ＷＯ０２／０９７６６；Ｋｏｄｅｒａ  Ｙ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５：２８３〜２８８頁（１９９４年）；および  Ｙａｍａｓａｋｉら，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５２：２１２５〜２１２７頁（１９９８年）に記載されている。他の有用な分枝状ＰＥＧ構造は本明細書中に開示する。
【０１５９】
例示的実施形態において、分枝状ＰＥＧの各ポリ（エチレングリコール）の分子量は、約２，０００、５，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、４０，０００または６０，０００ダルトン以上である。
【０１６０】
多くの水溶性ポリマーが当業者によって知られており、本発明の実施に有用である。水溶性ポリマーという用語は、サッカリド類（たとえば、デキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリ（シアル酸）、ヘパラン、ヘパリンなど）；ポリ（アミノ酸）、たとえばポリ（アスパラギン酸）やポリ（グルタミン酸）；核酸；合成ポリマー（たとえば、ポリ（アクリル酸），ポリ（エーテル）、たとえば、ポリ（エチレングリコール）；ペプチド
、タンパク質など）などの種も包含する。本発明は、ポリマーが共役体の残りの部分を付着させることのできる点を有していなければならない、という一つの制限はあるが、任意の水溶性ポリマーによって実施することができる。
【０１６１】
ポリマーの活性化の方法は、ＷＯ９４／１７０３９、米国特許第５，３２４，８４４号、ＷＯ９４／１８２４７、ＷＯ９４／０４１９３、米国特許第５，２１９，５６４号、米国特許第５，１２２，６１４号、ＷＯ９０／１３５４０、米国特許第５，２８１，６９８号、さらにＷＯ９３／１５１８９にも見ることができ、活性化ポリマーとペプチドの共役については、たとえば、凝固因子ＶＩＩＩ（ＷＯ９４／１５６２５）、ヘモグロビン（ＷＯ９４／０９０２７）、酸素運搬分子（米国特許第４，４１２，９８９号）、リボヌクレアーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ（Ｖｅｒｏｎｅｓｅら，Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１：１４１〜４５頁（１９８５年））が挙げられる。
【０１６２】
本発明の一実施形態において、使用される水溶性ポリマーは、ポリマーの試料中のポリマー分子の実質的割合がほぼ同じ分子量のものであり、そのようなポリマーは「均質分散（ｈｏｍｏ−ｄｉｓｐｅｒｓｅ）」である。
【０１６３】
本発明を、ポリ（エチレングリコール）共役体への言及によってさらに説明する。ＰＥＧの官能化と共役についてのいくつかのレビューおよびモノグラフが入手可能である。たとえば、Ｈａｒｒｉｓ，Ｍａｃｒｏｎｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ２５：３２５〜３７３頁（１９８５年）；Ｓｃｏｕｔｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３５：３０〜６５頁（１９８７年）；Ｗｏｎｇら，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８６６〜８７４頁（１９９２年）；Ｄｅｌｇａｄｏら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ９：２４９〜３０４頁（１９９２年）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６：１５０〜１６５頁（１９９５年）；およびＢｈａｄｒａら，Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，５７：５〜２９頁（２００２年）を参照のこと。反応性ＰＥＧ分子を調製し、該反応性分子を用いて共役体を形成するための経路は、当該技術分野において知られている。たとえば、米国特許第５，６７２，６６２号は、線形または分枝状ポリ（アルキレンオキサイド）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、およびポリ（アクリロモルホリン）から選択されるポリマー酸の活性エステルの水溶性かつ単離可能な共役体を開示している。
【０１６４】
米国特許第６，３７６，６０４号は、ポリマーの末端ヒドロキシルを、有機溶媒中でジ（１−ベンゾトリアゾイル）カーボネートと反応させることにより、水溶性および非ペプチド性ポリマーの水溶性１−ベンゾトリアゾリルカーボネートエステルを調製する方法を記載している。活性エステルは、タンパク質やペプチドなどの生物活性物質と共役体を形成するために用いられる。
【０１６５】
ＷＯ９９／４５９６４は、生物活性物質と、安定な結合を介してポリマー骨格に連結された少なくとも１つの末端を有するポリマー骨格を含む活性化水溶性ポリマーとからなる共役体を記載しており、該共役体において、少なくとも１つの末端は分枝部分を含み、分枝部分は該分枝部分に連結された基端反応性基を有し、基端側反応性基の少なくとも１つに生物活性物質が連結される。他の分枝状ポリ（エチレングリコール）は、ＷＯ９６／２１４６９に記載されている。米国特許第５，９３２，４６２号は、反応性官能基を含む分枝状末端を含む分枝状ＰＥＧ分子が形成された共役体を記載している。遊離の反応性基は、タンパク質やペプチドなどの生物活性種と反応させて、ポリ（エチレングリコール）と生物活性種の間の共役体を形成するために利用可能である。米国特許第５，４４６，０９０号は、二官能性ＰＥＧリンカーと、各ＰＥＧリンカー末端にペプチドを有する共役体の形成における該リンカーの使用について記載している。
【０１６６】
分解可能なＰＥＧ連結を含む共役体は、ＷＯ９９／３４８３３；およびＷＯ９９／１４２５９、ならびに米国特許第６，３４８，５５８号にも記載されている。このような分解可能な連結を本発明において適用可能である。
【０１６７】
当該技術分野において認識されている上記ポリマー活性化の方法は、本明細書中に挙げる分枝状ポリマーの形成において、およびこれらの分枝状ポリマーを、たとえば糖、糖ヌクレオチドなどの他の種に共役化するために、本発明の内容において有用である。
【０１６８】
本発明において用いるポリ（エチレングリコール）分子としては、限定はされないが、たとえば、次の式を有するものが挙げられる。
【０１６９】
【化２４】
0005922065.tif 000025
（式中、Ｒ8はＨ、ＯＨ、ＮＨ2、置換または非置換アルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、たとえば、アセタール、ＯＨＣ−、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）q−、ＨＳ−（ＣＨ2）q、または−（ＣＨ2）qＣ（Ｙ）Ｚ1である）。添え字「ｅ」は、１〜２５００の整数を表す。添え字ｂ，ｄ，およびｑは独立して、０〜２０の整数を表す。符号ＺおよびＺ1は、独立して、ＯＨ、ＮＨ2、脱離基、たとえばイミダゾール、ｐ−ニトロフェニル、ＨＯＢＴ、テトラゾール、ハライド、Ｓ−Ｒ9、活性化エステルのアルコール部分；−（ＣＨ2）ｐＣ（Ｙ1）Ｖ、または−（ＣＨ2）ｐＵ（ＣＨ2）sＣ（Ｙ1）vを表す。符号Ｙは、Ｈ（２）、＝Ｏ、＝Ｓ、＝Ｎ−Ｒ1０を表す。符号Ｘ、Ｙ、Ｙ1、Ａ1およびＵは
、独立して部分Ｏ、Ｓ、Ｎ−Ｒ11を表す。符号Ｖは、ＯＨ、ＮＨ2、ハロゲン、Ｓ−Ｒ12、活性化エステルのアルコール成分、活性化アミドのアミン成分、糖−ヌクレオチド、およびタンパク質を表す。添え字ｐ、ｑ、ｓおよびｖは、０〜２０の整数から独立して選択されたメンバーである。符号Ｒ9、Ｒ1０、Ｒ11およびＲ12は、独立してＨ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロシクロアルキルおよび置換または非置換ヘテロアリールを表す。
【０１７０】
他の例示的実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、以下のものから選択される。
【０１７１】
【化２５】
0005922065.tif 000026
本発明の共役体を形成するのに有用なポリ（エチレングリコール）は、線形または分枝状のいずれかである。本発明における使用に適した分枝状ポリ（エチレングリコール）分子としては、限定はされないが、たとえば下記の式で記述されるものが挙げられる。
【０１７２】
【化２６】
0005922065.tif 000027
（式中、Ｒ8およびＲ8’は、Ｒ8に対して上記で定義された基から独立して選択されたメンバーである。Ａ1およびＡ2は、Ａ1に対して上記で定義された基から独立して選択されたメンバーである。添え字ｅ、ｆ、ｏおよびｑは、上述の通りである。ＺおよびＹは上述の通りである。Ｘ1およびＸ1’は、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、（Ｏ）ＣＮＨおよびＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨから独立して選択されたメンバーである。
【０１７３】
他の例示的実施形態において、分枝状ＰＥＧは、システイン、セリンまたはジ−リジンコアに基づいている。したがって、さらなる分枝状ＰＥＧの例としては次のものが含まれる。
【０１７４】
【化２７】
0005922065.tif 000028
さらに別の実施形態において、分枝状ＰＥＧ部分は、トリ−リジンペプチドに基づいている。トリ−リジンは、モノ−、ジ−、トリ−またはテトラ−ＰＥＧ化されていてもよい。本実施形態による例示的な種は、次の式を有する。
【０１７５】
【化２８】
0005922065.tif 000029
（式中、ｅ、ｆおよびｆ’は、独立して１〜２５００の整数から選択され；ｑ，ｑ’およびｑ’’は、独立して１〜２０の整数から選択される。）
本発明の例示的実施形態において、ＰＥＧはｍ−ＰＥＧ（５ｋＤ、１０ｋＤ、または２０ｋＤ）である。分枝状ＰＥＧ種としては、たとえば、ｍ−ＰＥＧが２０ｋＤｍ−ＰＥＧであるセリン−またはシステイン−（ｍ−ＰＥＧ）2が挙げられる。
【０１７６】
当業者には明らかであろうが、本発明において用いる分枝状ポリマーには、上記の主題に基づく変形が含まれる。たとえば、上記ジ−リジン−ＰＥＧＦ共役体は、３つの高分子サブユニットを含んでいてもよく、その三番目が上記構造において非修飾として示したα−アミンに結合されるものであってもよい。同様に、３つまたは４つの高分子サブユニットで官能化されたトリ−リジンを使用することも本発明の範囲に含まれる。
【０１７７】
本発明による特定の実施形態は、以下のものと、
【０１７８】
【化２９】
0005922065.tif 000030
下記に示すような、上記種のカーボネートおよび活性エステルを含む。
【０１７９】
【化３０】
0005922065.tif 000031
本明細書中に示す化合物を調製する際に用いられる線形ＰＥＧを活性化するのに適した他の活性化または脱離基としては、たとえば、限定はされないが、次の種が挙げられる。
【０１８０】
【化３１】
0005922065.tif 000032
これらおよび他の種によって活性化されるＰＥＧ分子、および活性化ＰＥＧの作成方法は、ＷＯ０４／０８３２５９に記載されている。
【０１８１】
当業者であれば、分枝状ポリマーのｍ−ＰＥＧアームのうちの１つ以上を、たとえばＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ2、Ｃ2〜Ｃ10−アルキルなどの異なる末端を持つＰＥＧ部分で置換してもよいことを理解するであろう。さらに、上記構造は、α−炭素原子と側鎖の官能基の間にアルキルリンカーを挿入する（または炭素原子を除去する）ことにより、容易に修飾される。このように、「ホモ」誘導体および高度なホモログ、ならびに低度なホモログが、本発明において用いる分枝状ＰＥＧに対するコアの範囲に含まれる。
【０１８２】
本明細書中に記載する分枝状ＰＥＧ種は、下記のスキームにおいて記載するような方法によって容易に調製される。
【０１８３】
【化３２】
0005922065.tif 000033
（式中、ＸaはＯまたはＳであり、ｒは１〜５の整数である。）添え字ｅおよびｆは、独立して１〜２５００の整数から選択される。
【０１８４】
したがって、本スキームによれば、天然または非天然のアミノ酸を、活性化ｍ−ＰＥＧ誘導体との誘導体、この場合はトシレートと接触させ、側鎖のヘテロ原子Ｘaをアルキル化することにより、１を形成する。一官能化ｍ−ＰＥＧアミノ酸を反応性ｍ−ＰＥＧ誘導体とのＮ−アシル化条件にかけ、分枝状ｍ−ＰＥＧ２を集合させる。当業者には明らかなように、トシレート脱離基は、任意の適切な脱離基、たとえば、ハロゲン、メシレート、トリフレートなどに置き換え可能である。同様に、アミンをアシル化するために用いられる反応性カーボネートは、活性エステル、たとえば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどに置き換え可能であり、または酸は、ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾールなどの脱水剤を用いてｉｎ  ｓｉｔｕで活性化してもよい。
【０１８５】
例示的実施形態において、修飾基は、ＰＥＧ部分であるが、任意の修飾基、たとえば水溶性ポリマー、水不溶性ポリマー、治療的部分などを適切な結合を介してグリコシル部分内に組み込んでもよい。修飾された糖は、酵素的手段、化学的手段またはその組み合わせによって形成され、これにより、修飾された糖を生産する。例示的実施形態において、糖は、修飾部分の付着を許容しつつも、糖が、修飾された糖をＧ−ＣＳＦペプチドに連結するこのできる酵素に対する基質としてなお機能できるような任意の位置において、活性アミンに置換されている。例示的実施形態において、ガラクトサミンが、修飾された糖である場合、アミン部分は６位において炭素原子に付着されている。
【０１８６】
治療的糖ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのＰＥＧ部分によって増強することもできる。たとえば、ＰＥＧによるタンパク質の化学的修飾（ＰＥＧ化）は、それらの分子サイズを増加させ、それらの表面および官能基アクセシビリティを低下させ、そのそれぞれはタンパク質に付着されるＰＥＧのサイズに依存する。これにより、血漿半減期とタンパク分解安定性が向上し、免疫原性と肝取込みが減少する（Ｃｈａｆｆｅｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１６４３〜１６５１頁（１９９２年）；Ｆｙａｔａｋら、Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｃｈｅｍ．Ｐａｔｈｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：１１３〜１２７頁（１９８０年））。インターロイキン−２をＰＥＧ化すると、そのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効力が高まることが報告されており（Ｋａｔｒｅら．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：１４８７〜１４９１頁（１９８７年））、モノクローナル抗体Ａ７に由来するＦ（ａｂ’）２のＰＥＧ化はその腫瘍局所化を高める（Ｋｉｔａｍｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８：１３８７〜１３９４頁（１９９０年））。したがって、別の実施形
態において、本発明の方法によってＰＥＧ部分により誘導体化されたペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は、誘導体化されていないペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期に比べて増大する。
【０１８７】
ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の増大は、この量における増加百分率範囲として最適に表される。増加百分率範囲の下端は、約４０％、約６０％、約８０％、約１００％、約１５０％または約２００％である。範囲の上端は、約６０％、約８０％、約１００％、約１５０％であるか、または約２５０％を超える。
Ｇ−ＣＳＦペプチド
任意の配列を有する、本質的に任意の顆粒球コロニー刺激因子ペプチドまたは物質が、本発明の共役体のペプチド成分として使用される。顆粒球コロニー刺激因子は、クローニングされ、配列決定されている。例示的実施形態において、Ｇ−ＣＳＦペプチドは、配列番号１で示される配列を有する。
【０１８８】
ＭＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡＬＱＥＫＬＣＡＴＹＫＬＣＨＰＥＥＬＶＬＬＧＨＳＬＧＩＰＷＡＰＬＳＳＣＰＳＱＡＬＱＬＡＧＣＬＳＱＬＨＳＧＬＦＬＹＱＧＬＬＱＡＬＥＧＩＳＰＥＬＧＰＴＬＤＴＬＱＬＤＶＡＤＦＡＴＴＩＷＱＱＭＥＥＬＧＭＡＰＡＬＱＰＴＱＧＡＭＰＡＦＡＳＡＦＱＲＲＡＧＧＶＬＶＡＳＨＬＱＳＦＬＥＶ  ＳＹＲＶＬＲＨＬＡＱＰ（配列番号１）
別の例示的実施形態において、Ｇ−ＣＳＦペプチドは、配列番号２で示される配列を有する。
【０１８９】
ＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡＬＱＥＫＬＣＡＴＹＫＬＣＨＰＥＥＬＶＬＬＧＨＳＬＧＩＰＷＡＰＬＳＳＣＰＳＱＡＬＱＬＡＧＣＬＳＱＬＨＳＧＬＦＬＹＱＧＬＬＱＡＬＥＧＩＳＰＥＬＧＰＴＬＤＴＬＱＬＤＶＡＤＦＡＴＴＩＷＱＱＭＥＥＬＧＭＡＰＡＬＱＰＴＱＧＡＭＰＡＦＡＳＡＦＱＲＲＡＧＧＶＬＶＡＳＨＬＱＳＦＬＥＶＳＹＲＶＬＲＨＬＡＱＰ（配列番号２）
他の例示的実施形態において、Ｇ−ＣＳＦペプチドは、下記の配列番号３〜１１で示される配列を有する。
【０１９０】
ＭＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡＬＱＥＫＬＶＳＥＣＡＴＹＫＬＣＨＰＥＥＬＶＬＬＧＨＳＬＧＩＰＷＡＰＬＳＳＣＰＳＱＡＬＱＬＡＧＣＬＳＱＬＨＳＧＬＦＬＹＱＧＬＬＱＡＬＥＧＩＳＰＥＬＧＰＴＬＤＴＬＱＬＤＶＡＤＦＡＴＴＩＷＱＱＭＥＥＬＧＭＡＰＡＬＱＰＴＱＧＡＭＰＡＦＡＳＡＦＱＲＲＡＧＧＶＬＶＡＳＨＬＱ  ＳＦＬＥＶＳＹＲＶＬＲＨＬＡＱＰ（配列番号３）
ＭＡＧＰＡＴＱＳＰＭＫＬＭＡＬＱＬＬＬＷＨＳＡＬＷＴＶＱＥＡＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡＬＱＥＫＬＣＡＴＹＫＬＣＨＰＥＥＬＶＬＬＧＨＳＬＧＩＰＷＡＰＬＳＳＣＰＳＱＡＬＱＬＡＧＣＬＳＱＬＨＳＧＬＦＬＹＱＧＬＬＱＡＬＥＧＩＳＰＥＬＧＰＴＬＤＴＬＱＬＤＶＡＤＦＡＴＴＩＷＱＱＭＥＥＬＧＭＡＰＡＬＱＰＴＱＧＡＭＰＡＦＡＳＡＦＱＲＲＡＧＧＶＬＶＡＳＨＬＱＳＦＬＥＶＳＹＲＶＬＲＨＬＡＱＰ（配列番号４）
ＭＡＧＰＡＴＱＳＰＭＫＬＭＡＬＱＬＬＬＷＨＳＡＬＷＴＶＱＥＡＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡＬＱＥＫＬＶＳＥＣＡＴＹＫＬＣＨＰＥＥＬＶＬＬＧＨＳＬＧＩＰＷＡＰＬＳＳＣＰＳＱＡＬＱＬＡＧＣＬＳＱＬＨＳＧＬＦＬＹＱＧＬＬＱＡＬＥＧＩＳＰＥＬＧＰＴＬＤＴＬＱＬＤＶＡＤＦＡＴＴＩＷＱＱＭＥＥＬＧＭＡＰＡＬＱＰＴＱＧＡＭＰＡＦＡＳＡＦＱＲＲＡＧＧＶＬＶＡＳＨＬＱＳＦＬＥＶＳＹＲＶＬＲＨＬＡＱＰ（配列番号５）
ＭＶＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡＬＱＥＫＬＣＡＴＹＫＬＣＨＰＥＥＬＶＬＬＧＨＴＬＧＩＰＷＡＰＬＳＳＣＰＳＱＡＬＱＬＡＧＣＬＳＱＬＨＳＧＬＦＬＹＱＧＬＬＱＡＬＥＧＩＳＰＥＬＧＰＴＬＤＴＬＱＬＤＶＡＤＦＡＴＴＩ
ＷＱＱＭＥＥＬＧＭＡＰＡＬＱＰＴＱＧＡＭＰＡＦＡＳＡＦＱＲＲＡＧＧＶＬＶＡＳＨＬＱＳＦＬＥＶＳＹＲＶＬＲＨＬＡＱＰ（配列番号６）
ＭＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡＬＱＥＫＬＣＡＴＹＫＬＣＨＰＥＥＬＶＬＬＧＨＴＬＧＩＰＷＡＰＬＳＳＣＰＳＱＡＬＱＬＡＧＣＬＳＱＬＨＳＧＬＦＬＹＱＧＬＬＱＡＬＥＧＩＳＰＥＬＧＰＴＬＤＴＬＱＬＤＶＡＤＦＡＴＴＩＷＱＱＭＥＥＬＧＭＡＰＡＬＱＰＴＱＧＡＭＰＡＦＡＳＡＦＱＲＲＡＧＧＶＬＶＡＳＨＬＱＳＦＬＥＶＳＹＲＶＬＲＨＬＡＱＰ（配列番号７）
ＭＶＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡＬＱＥＫＬＣＡＴＹＫＬＣＨＰＥＥＬＶＬＬＧＳＳＬＧＩＰＷＡＰＬＳＳＣＰＳＱＡＬＱＬＡＧＣＬＳＱＬＨＳＧＬＦＬＹＱＧＬＬＱＡＬＥＧＩＳＰＥＬＧＰＴＬＤＴＬＱＬＤＶＡＤＦＡＴＴＩＷＱＱＭＥＥＬＧＭＡＰＡＬＱＰＴＱＧＡＭＰＡＦＡＳＡＦＱＲＲＡＧＧＶＬＶＡＳＨＬＱＳＦＬＥＶＳＹＲＶＬＲＨＬＡＱＰ（配列番号８）
ＭＱＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡＬＱＥＫＬＣＡＴＹＫＬＣＨＰＥＥＬＶＬＬＧＨＳＬＧＩＰＷＡＰＬＳＳＣＰＳＱＡＬＱＬＡＧＣＬＳＱＬＨＳＧＬＦＬＹＱＧＬＬＱＡＬＥＧＩＳＰＥＬＧＰＴＬＤＴＬＱＬＤＶＡＤＦＡＴＴＩＷＱＱＭＥＥＬＧＭＡＰＡＬＱＰＴＱＧＡＭＰＡＦＡＳＡＦＱＲＲＡＧＧＶＬＶＡＳＨＬＱＳＦＬＥＶＳＹＲＶＬＲＨＬＡＱＰ（配列番号９）
ＭＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡＬＱＥＫＬＣＡＴＹＫＬＣＨＰＥＥＬＶＬＬＧＨＳＬＧＩＰＷＡＰＬＳＳＣＰＳＱＡＬＱＬＡＧＣＬＳＱＬＨＳＧＬＦＬＹＱＧＬＬＱＡＬＥＧＩＳＰＥＬＧＰＴＬＤＴＬＱＬＤＶＡＤＦＡＴＴＩＷＱＱＭＥＥＬＧＭＡＰＡＬＱＰＴＱＧＡＭＰＡＦＡＳＡＦＱＲＲＡＧＧＶＬＶＡＳＨＬＱＳＦＬＥＶＳＹＲＶＬＲＨＬＡＱＰＴＱＧＡＭＰ（配列番号１０）および
ＭＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡＬＱＥＫＬＣＡＴＹＫＬＣＨＰＥＥＬＶＬＬＧＳＳＬＧＩＰＷＡＰＬＳＳＣＰＳＱＡＬＱＬＡＧＣＬＳＱＬＨＳＧＬＦＬＹＱＧＬＬＱＡＬＥＧＩＳＰＥＬＧＰＴＬＤＴＬＱＬＤＶＡＤＦＡＴＴＩＷＱＱＭＥＥＬＧＭＡＰＴＴＴＰＴＱＴＡＭＰＡＦＡＳＡＦＱＲＲＡＧＧＶＬＶＡＳＨＬＱＳＦＬＥＶＳＹＲＶＬＲＨＬＡＱＰ（配列番号１１）
本発明は、本明細書中に記載の配列には限定されない。
【０１９１】
例示的実施形態において、本発明のＧ−ＣＳＦペプチドは、ＰＥＧ部分を含むグリコシル残基でグリコシル化された、少なくとも１つのＯ−結合型グリコシル化部位を含む。ＰＥＧは、インタクトなグリコシル連結基を介してＧ−ＣＳＦペプチドに共有結合される。グリコシル連結基は、Ｇ−ＣＳＦペプチドのアミノ酸残基またはグリコシル残基のいずれかに共有結合される。あるいは、グリコシル連結基は、糖ペプチドの１つ以上のグリコシル単位に付着される。本発明は、グリコシル連結基が、アミノ酸残基とグリコシル基の両方に付着された共役体も提供する。
【０１９２】
ＰＥＧ部分は、インタクトなグリコシルリンカーに直接、または非グリコシルリンカー、たとえば置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルを介して、付着される。
【０１９３】
例示的実施形態において、Ｇ−ＣＳＦペプチドは、式Ｉの式を有する部分を含む。
【０１９４】
【化３３】
0005922065.tif 000034
式Ｉ
（式中、Ｄは−ＯＨおよびＲ1−Ｌ−ＨＮ−から選択されたメンバーであり；ＧはＲ1−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルから選択されたメンバーであり；Ｒ1は、直鎖または分枝状ポリ（エチレングリコール）残基を含む部分から選択されたメンバーからなる部分であり、Ｌは、ＤがＯＨのときにＧがＲ1−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルのときにＤがＲ1Ｌ−ＮＨ−となるように、結合、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されたメンバーであるリンカーである。本明細書に挙げる修飾されたシアル酸構造において、ＣＯＯＨは、ＣＯＯ−および／またはその塩も表す。）
一実施形態において、Ｒ1−Ｌは次の式を有する。
【０１９５】
【化３４】
0005922065.tif 000035
（式中、ａは０〜２０の整数である）。
【０１９６】
例示的実施形態において、Ｒ1は、以下のものから選択されたメンバーである構造を有する。
【０１９７】
【化３５】
0005922065.tif 000036
（式中、ｅおよびｆは、独立して１〜２５００から選択される整数であり；ｑは、１〜２０の整数である。）他の実施形態において、Ｒ1は以下のものから選択されたメンバーである構造を有する。
【０１９８】
【化３６】
0005922065.tif 000037
（式中、ｅおよびｆは、独立して１〜２５００から選択される整数であり；ｑは、１〜２０の整数である。）他の実施形態において、Ｒ1は以下のものから選択されたメンバーである構造を有する。
【０１９９】
【化３７】
0005922065.tif 000038
（式中、ｅ，ｆおよびｆ’は、独立して１〜２５００から選択される整数であり；ｑおよびｑ’は、独立して１〜２０から選択される整数である。）
さらに別の実施形態において、本発明は、Ｒ1が、以下のものから選択されたメンバーである構造を有するＧ−ＣＳＦペプチドを提供する。
【０２００】
【化３８】
0005922065.tif 000039
（式中、ｅ，ｆおよびｆ’は、独立して１〜２５００から選択される整数であり；ｑ，ｑ’およびｑ’’は、独立して１〜２０から選択される整数である。）
他の実施形態において、Ｒ1は、
【０２０１】
【化３９】
0005922065.tif 000040
（式中、ｅおよびｆは、独立して１〜２５００から選択される整数である）
から選択されたメンバーである構造を有する。
【０２０２】
別の例示的実施形態において、本発明は、次の式を有する部分を含むペプチドを提供する。
【０２０３】
【化４０】
0005922065.tif 000041
Ｇａｌを、アミノ酸またはアミノ酸に直接または間接的に（たとえば、グリコシル残基を介して）付着されたグリコシル残基に付着させることができる。
【０２０４】
別の実施形態において、当該部分は次の式を有する。
【０２０５】
【化４１】
0005922065.tif 000042
ＧａｌＮＡｃを、アミノ酸またはアミノ酸に直接または間接的に（たとえば、グリコシル残基を介して）付着されたグリコシル残基に付着させることができる。
【０２０６】
さらなる例示的実施形態において、ペプチドは、下記の式による部分を含む。
【０２０７】
【化４２】
0005922065.tif 000043
（式中、ＡＡは、上記各構造における前記ペプチドのアミノ酸残基であり、ＤおよびＧは、本明細書中に記載の通りである）。
【０２０８】
上記種の１つ以上を共役することのできるＧ−ＣＳＦペプチドのアミノ酸残基としては、たとえば、セリンおよびスレオニン、たとえば配列番号１のスレオニン１３３が挙げられる。
【０２０９】
別の例示的実施形態において、本発明は、下記の式を有するグリコシル残基を含むＧ−ＣＳＦ共役体を提供する。
【０２１０】
【化４３】
0005922065.tif 000044
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｉ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕは、独立して０および１から選択される
整数である。添え字ｑは１である。添え字ｅ、ｆ、ｇおよびｈは独立して０〜６から選択される整数である。添え字ｊ、ｋ、ｌおよびｍは、独立して０〜１００の整数から選択される。添え字ｖ、ｗ、ｘおよびｙは、独立して０および１から選択される整数であり、ｖ、ｗ、ｘおよびｙのうちの少なくとも１つが１である。符号ＡＡは、Ｇ−ＣＳＦペプチドのアミノ酸残基を表す。
符号Ｓｉａ−（Ｒ）は、下記の式を有する基を表す。
【０２１１】
【化４４】
0005922065.tif 000045
式中、Ｄは、−ＯＨおよびＲ1−Ｌ−ＨＮ−から選択される。符号ＧはＲ1−Ｌ−または−Ｃ（Ｏ）（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルを表す。Ｒ1は、直鎖または分枝状ポリ（エチレングリコール）残基を含む部分を表す。Ｌは、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されたメンバーであるリンカーである。一般に、ＤがＯＨの場合、ＧはＲ1−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルの場合、ＤはＲ1−Ｌ−ＮＨ−である。
【０２１２】
別の例示的実施形態において、本発明の共役体中のＰＥＧ−修飾されたシアル酸部分は、次の式を有する。
【０２１３】
【化４５】
0005922065.tif 000046
式中、添え字「ｓ」は０〜２０の整数を表し、ｎは１〜２５００の整数を表す。一実施形態において、ｓは１であり、ｍ−ＰＥＧ部分は約２０ｋＤの分子量を有する。
【０２１４】
さらなる例示的実施形態において、ＰＥＧ−修飾されたシアル酸は、次の式を有する。
【０２１５】
【化４６】
0005922065.tif 000047
式中、Ｌは、シアル酸部分とＰＥＧ部分を連結する、置換または非置換アルキルまたは置換または非置換ヘテロアルキルリンカー部分である。
【０２１６】
一実施形態において、上で指名したアスパラギン残基のうちの少なくとも２つ、より好ましくは３つの、さらに好ましくは４つが、上に示したＮ−結合グリカン鎖で官能化されている。
【０２１７】
本発明の共役体は、１価または多価のインタクトなグリコシル連結基（たとえば、アンテナ構造）を含む。したがって、本発明の共役体は、選択部分が１価のグリコシル連結基および多価連結基を介してペプチドに付着された種の両方を含む。本発明には、２つ以上の選択部分が多価連結基を介してペプチドに付着されている共役体も含まれる。
水不溶性ポリマー
別の実施形態において、上記で議論したものと同様に、修飾された糖は、水溶性ポリマーではなく水不溶性ポリマーを含む。本発明の共役体は、１つ以上の水不溶性ポリマーを含んでいてもよい。治療的ペプチドを制御された様式で送達するための媒体としての共役体を使用することにより、本発明の本実施形態を説明する。高分子薬剤送達系は当該技術分野において知られている。たとえば、Ｄｕｎｎら編、高分子薬物および薬物送達系（ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ  ＤＲＵＧＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ）、ＡＣＳシンポジウムシリーズ第４６９巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（ワシントンＤ．Ｃ．）（１９９１年）を参照のこと。当業者であれば、実質的にあらゆる既知の薬剤送達系を本発明の共役体に適用できることを理解するであろう。
【０２１８】
Ｒ1、Ｌ−Ｒ1、Ｒ15、Ｒ15’および他の基に対する上に挙げたモチーフは、当業者が容易に使用しうる化学を用いて制限なく線形および分枝状構造に組み込み可能な、水溶性ポリマーに同様に適用可能である。
【０２１９】
代表的な水不溶性ポリマーとしては、限定はされないが、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキサイド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキサイド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（
酢酸ビニル）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プルロニックおよびポリビニルフェノールおよびそのコポリマーが挙げられる。
【０２２０】
本発明の共役体において使用される合成的に修飾された天然ポリマーとしては、限定はされないが、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、およびニトロセルロースが挙げられる。広いクラスの合成的に修飾された天然ポリマーの特に好ましいメンバーとしては、限定はされないが、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、トリ酢酸セルロース、硫酸セルロースナトリウム塩、およびアクリルまたメタクリルエステルのポリマーおよびアルギン酸が挙げられる。
【０２２１】
本明細書中で議論するこれらおよび他のポリマーは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（ミズーリ州セントルイス）、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ（ペンシルベニア州ウォレントン）、Ａｌｄｒｉｃｈ（ウィスコンシン州ミルウォーキー）、Ｆｌｕｋａ（ニューヨーク州ロンコンコマ）、およびＢｉｏＲａｄ（カリフォルニア州リッチモンド）などの商業的供給源から容易に調達できるか、またはこれらの供給者から得たモノマーから標準的な技術を用いて合成される。
【０２２２】
本発明の共役体において用いる代表的な生分解性ポリマーとしては、限定はされないが、ポリラクチド、ポリグリコリド、およびそのコポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、その混合物およびコポリマーが挙げられる。とりわけ用いられるのが、コラーゲン、プルロニックなどを含む、ゲルを形成する組成物である。
【０２２３】
本発明において使用するポリマーには、その構造の少なくとも一部内に生吸収性分子を有する水不溶性材料を含む「ハイブリッド」ポリマーが含まれる。そのようなポリマーの例としては、ポリマー鎖ごとに、生吸収性領域と、親水性領域と、複数の架橋可能な官能基とを有する水不溶性コポリマーを含むものがある。
【０２２４】
本発明の目的のために、「水不溶性材料」には、水または水含有環境において実質的に不溶の材料が含まれる。したがって、コポリマーのある領域またはセグメントが親水性もしくは水溶性であっても、ポリマー分子は全体として、実質的な程度として水に溶解することはない。
【０２２５】
本発明の目的のために、「生吸収性分子」という用語には、体による正常な排泄ルートを介して代謝または分解および吸収および／または排除されうる領域が含まれる。好ましくは、このような代謝または分解産物は、実質的に体に対して無毒である。
【０２２６】
生吸収性領域は、コポリマー組成物が全体として水溶性になるものでなければ、疎水性または親水性のいずれであってもよい。したがって、生吸収性領域は、ポリマーが全体として水不溶性のままであるような優先性に基づいて選択され、したがって、反応性性質、すなわち、含まれる官能基の種類、および生吸収性領域と親水性領域の反応性割合が、有用な生吸収性組成物を確実に水不溶性のままにするように選択される。
【０２２７】
例示的な生吸収性ポリマーとしては、たとえば、ポリ（α−ヒドロキシ−カルボン酸）／ポリ（オキシアルキレン）の合成的に生産される吸収性ブロックコポリマーが挙げられる（Ｃｏｈｎら，米国特許第４，８２６，９４５号を参照のこと）。これらのコポリマー
は、架橋されておらず、水溶性であるので、体は分解されたブロックコポリマー組成物を排泄することができる。Ｙｏｕｎｅｓら、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２１：１３０１〜１３１６頁（１９８７年）；およびＣｏｈｎら、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２２：９９３〜１００９頁（１９８８年）を参照のこと。
【０２２８】
現時点において好ましい生吸収性ポリマーは、ポリ（エステル）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミド）、ポリ（エステル−アミド）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（カーボネート）、ポリ（ホスファジン）、ポリ（ホスホエステル）、ポリ（チオエステル）、ポリサッカリドおよびその混合物から選択される１つ以上の成分を含む。より好ましくは、生吸収性ポリマーは、ポリ（ヒドロキシ）酸成分を含む。ポリ（ヒドロキシ）酸のなかでも、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロン酸、ポリ酪酸、ポリ吉草酸およびそのコポリマーおよび混合物が好ましい。
【０２２９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ  で吸収される（「生吸収される」）断片を形成することに加えて、本発明の方法において用いるための好ましい高分子コーティングは、排泄可能なおよび／または代謝可能な断片を形成することもできる。
【０２３０】
より高次のコポリマーも本発明において使用することができる。たとえば、Ｃａｓｅｙら、１９８４年３月２０日公表の米国特許第４，４３８，２５３号は、ポリ（グリコール酸）とヒドロキシル末端化ポリ（アルキレングリコール）のエステル交換によって生成されるトリ−ブロックコポリマーを開示している。このような組成物は、吸収性モノフィラメント構造として用いることが開示されている。このような組成物の可撓性は、オルト炭酸テトラ−ｐ−トリルなどの芳香族オルト炭酸塩をコポリマー構造中に組み込むことにより調節される。
【０２３１】
乳酸および／またはグリコール酸に基づく他のポリマーもまた用いることができる。たとえば、１９９３年４月１３日公表のＳｐｉｎｕの米国特許第５，２０２，４１３号は、オリゴマージオールまたはジアミン残基のいずれか上へのラクチドおよび／またはグリコリドの開環重合と、それに続くジイソシアネート、ジアシルクロライドまたはジクロロシランなどの二官能性化合物による鎖延長によって生成されるポリラクチドおよび／またはポリグリコリドの連続規則性ブロックを有する生分解性マルチブロックコポリマーを開示している。
【０２３２】
本発明において有用なコーティングの生吸収性領域は、加水分解的および／または酵素的に開裂可能なように設計することができる。本発明の目的のために、「加水分解的に開裂可能」とは、コポリマー、特に生吸収性領域の、水中または水含有環境における加水分解の受けやすさのことをいう。同様に、本明細書中で用いる「酵素的に開裂可能な」とは、コポリマー、特に生吸収性領域の、内在または外来酵素による開裂の受けやすさのことをいう。
【０２３３】
体内に配置された場合、親水性領域は、排泄可能なおよび／または代謝可能な断片に処理されることができる。したがって、親水性領域は、たとえば、ポリエーテル、ポリアルキレンオキサイド、ポリオール、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アルキルオキサゾリン）、ポリサッカリド、炭水化物、ペプチド、タンパク質、およびコポリマーおよびその混合物を含んでいてよい。さらに、親水性領域は、たとえば、ポリ（アルキレン）オキシドであってもよい。そのようなポリ（アルキレン）オキシドとしては、たとえば、ポリ（エチレン）オキシド、ポリ（プロピレン）オキシドおよびその混合物およびコポリマーが挙げられる。
【０２３４】
ヒドロゲルの成分であるポリマーも本発明において有用である。ハイドロゲルは、比較的大量の水を吸収することのできる高分子材料である。ハイドロゲル形成化合物としては、限定はされないが、たとえば、ポリアクリル酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、カラギーナンおよび他のポリサッカリド、ヒドロキシエチレンメタクリル酸（ＨＥＭＡ）、ならびに、その誘導体などが挙げられる。ハイドロゲルは、安定で、生分解性かつ生吸収性のものとして生産することができる。さらに、ハイドロゲル組成物は、これらの特性の１つ以上を示すサブユニットを含んでいてもよい。
【０２３５】
架橋によってその統合性を調節することのできる生物適合性ハイドロゲル組成物が知られており、現時点で本発明の方法において使用するのに好ましい。たとえば、１９９５年４月２５日公表のＨｕｂｂｅｌｌらの米国特許第５，４１０，０１６号、および１９９６年６月２５日公表の第５，５２９，９１４号は、２つの加水分解的に不安定な延長部に挟まれた水溶性中央ブロックセグメントを有する架橋されたブロックコポリマーである水溶性系を開示している。このようなコポリマーは、光重合可能なアクリレート官能性でさらにエンドキャップされる。架橋されると、上記系はハイドロゲルになる。このようなコポリマーの水溶性中心ブロックとしては、ポリ（エチレングリコール）を含んでいてよく、一方で、加水分解的に不安定な延長部は、ポリグリコール酸またはポリ乳酸などのポリ（α−ヒドロキシ酸）であってよい。Ｓａｗｈｎｅｙら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２６：５８１〜５８７頁（１９９３年）を参照のこと。
【０２３６】
別の好ましい実施形態において、ゲルは熱可逆性ゲルである。プルロニック、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、ポリサッカリド、ポリウレタンハイドロゲル、ポリウレタン−尿素ハイドロゲルおよびその組み合わせなどの成分を含む熱可逆性ゲルが現時点において好ましい。
【０２３７】
さらに別の例示的実施形態において、本発明の共役体は、リポソームの成分を含む。リポソームは、たとえばＥｐｐｓｔｅｉｎらの米国特許第４，５２２，８１１号に記載のような、当業者に知られる方法に従って調製することができる。たとえば、リポソーム調剤は、適当な脂質（ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイル（ａｒａｃｈａｄｏｙｌ）ホスファチジルコリン、およびコレステロールなど）を無機溶媒中に溶解し、該溶媒を蒸発させて容器の表面上に乾燥した脂質の薄膜が残るようにすることで調製することができる。その後、活性化合物またはその医薬として許容される塩の水溶液を容器に導入する。それから容器を手でぐるぐると回し、脂質材料を容器の側面から外して、脂質凝集体を分散させることにより、リポソーム懸濁液を作る。
【０２３８】
上記の微粒子および微粒子の調製方法を一例としてあげるが、それらは、本発明において用いる微粒子の範囲を規定するものではない。当業者であれば、様々な方法によって製作した数々の微粒子を本発明において有用であることを理解するであろう。
【０２３９】
上記水溶性ポリマーの文脈中で議論した直鎖および分枝状という構造上の両様式は、水不溶性ポリマーに関しても同様に一般的に適用できる。したがって、たとえば、システイン、セリン、ジリジン、およびトリリジン分枝コアを２つの水不溶性ポリマー部分で官能化することができる。これらの種を製造するために用いられる方法は、一般には水溶性ポリマーを製造するために用いられるものと非常に類似している。
Ｇ−ＣＳＦ共役体の調製方法
上で議論した共役体に加えて、本発明はこれらおよび他の共役体を調製する方法も提供する。したがって、一態様において、本発明は選択部分とＧ−ＣＳＦペプチドとの間の共有結合的共役体を形成する方法を提供する。さらに、本発明は、本発明の共役体が、体内
の特定の組織または領域を標的とするようにする方法を提供する。
【０２４０】
例示的実施形態において、共役体は、ＰＥＧ部分（またはＰＥＧ部分を含む酵素的に転移可能なグリコシル部分）と、グリコシル化または非グリコシル化ペプチドとの間で形成される。ＰＥＧは、Ｇ−ＣＳＦペプチドとＰＥＧ部分との間に介在され、その両方に共有結合されたインタクトなグリコシル連結基を介してＧ−ＣＳＦペプチドに共役されるか、ＰＥＧ−非−グリコシルリンカー（たとえば、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル）構築物に共役される。本方法は、Ｇ−ＣＳＦペプチドを、修飾された糖および修飾された糖を基質とするグリコシルトランスフェラーゼ含む混合物と接触させることを含む。反応は、修飾された糖とＧ−ＣＳＦペプチドの間に共有結合を形成するのに十分な条件下で行われる。修飾された糖の糖部分は、ヌクレオチドでもなく活性化もされていない、ヌクレオチド糖、活性化糖および糖から選択される。
【０２４１】
アプセプターペプチド（グリコシル化または非グリコシル化）は、典型的にはｄｅ  ｎｏｖｏ合成されるか、原核細胞（たとえば、大腸菌などの細菌細胞）中またはほ乳類、酵母、昆虫、真菌または植物細胞などの真核細胞中で組み替え発現される。Ｇ−ＣＳＦペプチドは、全長タンパク質または断片のいずれであってもよい。さらに、Ｇ−ＣＳＦペプチドは、野生型または変異型ペプチドであってよい。例示的実施形態において、Ｇ−ＣＳＦペプチドは、１つ以上のＮ−またはＯ−結合されたグリコシル化部位をペプチド配列に加える変異を含んでいてもよい。
【０２４２】
例示的実施形態において、ＩＸ因子は、次のようにして、Ｏ−グリコシル化され、水溶性ポリマーで官能化される。ペプチドは、入手可能なアミノ酸グリコシル化部位を用いて製造するか、もしグリコシル化されていれば、そのグリコシル部分を切り取ってアミノ酸を露出させる。たとえば、セリンまたはスレオニンは、α−１Ｎ−アセチルアミノガラクトシル化（ＧａｌＮＡｃ）であり、ＮＡｃ−ガラクトシル化ペプチドは、ＳＴβＧａｌＮＡｃＴｌを用いてシアル酸−修飾基カセットでシアリル化される。あるいは、ＮＡｃ−ガラクトシル化ペプチドは、コア−１−ＧａｌＴ−１を用いてガラクトシル化され、その生成物は、ＳＴ３ＧａｌＴ１を用いてシアル酸−修飾基カセットによってシアリル化される。本発明による例示的共役体は、以下の結合を有する。
Ｔｈｒ−α−ｌ−ＧａｌＮＡｃ−β−１，３−Ｇａｌ−α２，３−Ｓｉａ＊
（式中、Ｓｉａ＊は、シアル酸−修飾基カセットである）
複数の酵素とサッカリル供与体を用いる上記のような本発明の方法において、個々のグリコシル化工程は、別々に行ってもよいし、「シングルポット」反応において組み合わせてもよい。たとえば、上述の３つの酵素反応において、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ、ＧａｌＴおよびＳｉａＴおよびそれらの供与体は、単一の容器中で組み合わせてもよい。あるいは、ＧａｌＮＡｃ反応を単独で行い、ＧａｌＴおよびＳｉａＴの両者および適当なサッカリル供与体を１つの工程として加えてもよい。反応を実行する別の様式は、各酵素、次いて適当な供与体を添加し、「シングルポット」モチーフにおいて反応を行うことを含む。上述の方法のそれぞれを組み合わせることは、本発明の化合物を調製するのに有用である。
【０２４３】
本発明の共役体において、特にグリコシル化Ｎ−結合グリカン、Ｓｉａ−修飾基カセットは、α−２，６，またはα−２，３結合においてＧａｌに連結することができる。
本発明の方法は、組み替えによって生産された不完全にグリコシル化されたペプチドをも提供する。本発明の方法において修飾された糖を利用して、Ｇ−ＣＳＦペプチドを同時にさらにグリコシル化して、たとえばＰＥＧ部分、治療剤などで誘導体化することができる。修飾された糖の糖部分は、完全にグリコシル化されたペプチドにおいて適切に受容体に共役されるであろう残基であってもよいし、または所望の特性を有する別の糖部分であってもよい。
【０２４４】
本発明の方法によって修飾されるＧ−ＣＳＦペプチドは、合成または野生型ペプチドであってよく、あるいは、部位特異的変異などの当該技術分野で知られている方法によって製造された変異ペプチドであってもよい。ペプチドのグリコシル化は典型的には、Ｎ−結合またはＯ−結合されている。Ｎ−結合の例としては、アスパラギン残基の側鎖への修飾等の付着が挙げられる。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着に対する認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのいずれかのトリペプチド配列が存在することにより、潜在的グリコシル化部位が作られる。Ｏ−結合型グリコシル化とは、１つの糖（たとえば、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、マンノース、ＧｌｃＮＡｃ、グルコース、フコースまたはキシロース）が、ヒドロキシアミノ酸、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンを用いてもよいが、好ましくはセリンまたはスレオニンのヒドロキシ側鎖に付着することをいう。
【０２４５】
一例示的実施形態において、Ｇ−ＣＳＦは、哺乳動物系において発現され、シアリダーゼの処理によって末端シアル酸残基をトリミングするように修飾され、続いてＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸のドナーを用いてＰＥＧ化される。
【０２４６】
別の例示的実施形態において、哺乳動物細胞において発現されたＧ−ＣＳＦをまずシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基をトリミングしてから、ＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を用いてＰＥＧ化を行い、その後、ＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸供与体を用いてシアリル化する。
【０２４７】
哺乳動物系中で発現されるＧ−ＣＳＦは、シアリダーゼおよびガラクトシダーゼで処理して、そのシアル酸およびガラクトース残基をトリミングし、ガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを用いてガラクトシル化し、その後、ＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を用いてＰＥＧ化することができる。
【０２４８】
別の例示的実施形態において、Ｇ−ＣＳＦは、最初にシアリダーゼで処理されるのではなく、修飾基−シアル酸カセットとＳＴ３Ｇａｌ３などの酵素とによるシアル酸転移反応を用いてグリコシル化される。
【０２４９】
さらなる例示的実施形態において、Ｇ−ＣＳＦを昆虫細胞中で発現させ、次の手順によって修飾する。まず最初に適当なＮ−アセチルグルコサミン供与体と、ＧｎＴ−Ｉ、ＩＩ、ＩＶおよびＶのうちの１つ以上とを用いてＮ−アセチルグルコサミンをＧ−ＣＳＦに付加し；次に、ＰＥＧ−ガラクトースの供与体と、ガラクトシルトランスフェラーゼとを用いて、Ｇ−ＣＳＦをＰＥＧ化する。
【０２５０】
酵母中で産生されたＧ−ＣＳＦをグリコＰＥＧ化してもよい。たとえば、まずＧ−ＣＳＦをエンドグリカナーゼで処理してグリコシル基をトリミングし、ガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを用いてガラクトシル化し、その後、ＳＴ３Ｇａｌ３と、ＰＥＧ−シアル酸の供与体とを用いてＰＥＧ化する。
【０２５１】
ペプチドまたは他の構造へのグリコシル化部位の付加は、従来、アミノ酸配列を、１つ以上のグリコシル化部位を含むように改変することによって行われている。この付加は、−ＯＨ基を与える１つ以上の種、好ましくはセリンまたはスレオニン残基を、Ｇ−ＣＳＦペプチドの配列内に組み込むことによって行ってもよい（Ｏ−結合型グリコシル化部位について）。この付加は、Ｇ−ＣＳＦペプチドの突然変異または完全な化学合成によって行ってもよい。Ｇ−ＣＳＦペプチドのアミノ酸配列は、好ましくは、ＤＮＡレベルでの変更によって、特に、ペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において、所望のア
ミノ酸に翻訳されるコドンが作られるように、突然変異させることによって、改変される。突然変異は好ましくは当該技術分野において知られる方法を用いて行われる。
【０２５２】
例示的実施形態において、グリコシル化部位は、ポリヌクレオチドのシャッフリングによって付加される。候補ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡシャッフリングプロトコールによって修飾することができる。ＤＮＡシャッフリングは、関連遺伝子のプールのランダム断片化と、それに続くポリメラーゼ連鎖反応様工程による断片の再集合によって実施される、再帰的組み替えおよび突然変異のプロセスである。たとえば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７〜１０７５１頁（１９９４年）；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９〜３９１頁（１９９４年）；および米国特許第５，６０５，７９３号、第５，８３７，４５８号、第５，８３０，７２１号および第５，８１１，２３８号を参照のこと。
【０２５３】
本発明は、１つ以上の選択されたグリコシル残基をペプチドに付加（または除去）する手段も提供し、その後、修飾された糖は、このペプチドの選択されたグリコシル残基のうちの少なくとも１つに共役される。本実施形態は、たとえば、修飾された糖を、ペプチド上に存在しないかペプチド上に所望の量で存在しない選択されたグリコシル残基に共役させることが望まれる場合に有用である。したがって、修飾された糖をペプチドに連結するのに先立って、選択されたグリコシル残基を酵素的または化学的結合によって、Ｇ−ＣＳＦペプチドに共役する。別の実施形態において、糖ペプチドのグリコシル化パターンは、糖ペプチドから炭水化物残基を除去することによって、修飾された糖の共役の前に変えられる。たとえば、ＷＯ９８／３１８２６を参照のこと。
【０２５４】
糖ペプチドに存在する炭水化物部分の付加または除去は、化学的または酵素的のいずれかによって行われる。化学的脱グリコシル化は、好ましくは、ポリペプチドバリアントを化合物トリフルオロメタンスルホン酸または同一の化合物に暴露することによって行われる。この処理により、ペプチドは無傷で残しながら、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外の殆どまたはすべての糖が開裂される。化学的脱グリコシル化については、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２（１９８７年）およびＥｄｇｅらによるＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１（１９８１年）に記載されている。ポリペプチドバリアント上の炭水化物部分の酵素的開裂は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７年）によって記載されるような、様々なエンドおよびエキソグリコシダーゼを用いて達成することができる。
【０２５５】
グリコシル部分の化学的付加は、任意の当該技術分野において理解されている方法によって行われる。糖部分の酵素的付加は、好ましくは、本明細書中に挙げる方法の改変法を用いて、天然のグリコシル単位を本発明において用いる修飾された糖に置換することで行われる。糖部分を付加する他の方法は、米国特許第５，８７６，９８０号、第６，０３０，８１５号、第５，７２８，５５４号、および第５，９２２，５７７号に記載されている。
【０２５６】
選択されたグリコシル残基に対する付着点としては、限定はされないが、たとえば（ａ）Ｎ−およびＯ−グリコシル化に対するコンセンサス部位；（ｂ）グリコシルトランスフェラーゼに対する受容体である末端グリコシル部分；（ｃ）アルギニン、アスパラギンおよびヒスチジン；（ｄ）遊離のカルボキシル基；（ｅ）システインなどの遊離のスルフヒドリル基；（ｆ）セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンなどの遊離のヒドロキシル基；（ｇ）フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンなどの芳香族残基；または（ｈ）グルタミンのアミド基が挙げられる。本発明において用いる方法の例が、１９８７年９月１１日公表のＷＯ８７／０５３３０、およびＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ，
ＣＲＣ  ＣＲＩＴ．ＲＥＶ．ＢＩＯＣＨＥＭ．，２５９〜３０６頁（１９８１年）に記載されている。
【０２５７】
例示的実施形態において、本発明は、下記の部分を含むＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの作成方法を提供する。
【０２５８】
【化４７】
0005922065.tif 000048
（式中、Ｄは−ＯＨまたはＲ1−Ｌ−ＨＮ−である）
符号Ｇは、Ｒ1−Ｌ−または−Ｃ（Ｏ）（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルを表し、Ｒ1は直鎖または分枝状ポリ（エチレングリコール）残基を含む部分である。符号Ｌは、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるリンカーを示す。一般に、ＤがＯＨである場合、ＧはＲ1−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ1〜Ｃ6）アル
キルである場合、ＤはＲ1−Ｌ−ＮＨ−である。本発明の方法は、（ａ）基質Ｇ−ＣＳＦペプチドをＰＥＧ−シアル酸供与体と、ＰＥＧ−シアル酸部分を供与体から基質Ｇ−ＣＳＦペプチドへ転移させることのできる酵素とに接触させることを含む。
【０２５９】
ＰＥＧ−シアル酸供与体としては、たとえば、下記の式を有するようなヌクレオチド糖と、
【０２６０】
【化４８】
0005922065.tif 000049
転移に適した条件下において、ＰＥＧ−シアル酸をＧ−ＣＳＦペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に転移させる酵素とが挙げられる。
【０２６１】
一実施形態において、基質Ｇ−ＣＳＦペプチドは、本発明の共役体の形成に先立って宿主細胞中で発現される。宿主細胞の例としては、哺乳動物細胞が挙げられる。他の実施形態において、宿主細胞は昆虫細胞、植物細胞、細菌または真菌である。
【０２６２】
本明細書に示す方法は、上に挙げたＧ−ＣＳＦ共役体のそれぞれに対して適用可能であ
る。
本発明の方法によって修飾されたＧ−ＣＳＦペプチドは、合成または野生型ペプチドのいずれであってもよく、あるいは、部位特異的変異などの当該技術分野において知られる方法によって製造される変異ペプチドであってもよい。ペプチドのグリコシル化は、典型的にはＮ−結合されているか、Ｏ−結合されている。Ｎ−結合の例としては、アスパラギン残基の側鎖への修飾された糖の付着が挙げられる。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着に対する認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのいずれかのトリペプチド配列が存在することにより、潜在的グリコシル化部位が作られる。Ｏ−結合型グリコシル化とは、１つの糖（たとえば、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、マンノース、ＧｌｃＮＡｃ、グルコース、フコースまたはキシロース）が、異常または非天然のアミノ酸、たとえば５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンを用いてもよいが、好ましくはセリンまたはスレオニンのヒドロキシ側鎖に付着することをいう。
【０２６３】
ペプチドまたは他の構造へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を１つ以上のグリコシル化部位を含むように改変することにより、本発明にしたがって達成することができる。グリコシル化部位の付加は、−ＯＨ基を提示する１つ以上の種、好ましくはセリンまたはスレオニン残基を、ペプチドの配列中に組み込むことによって達成することができる（Ｏ−結合されたグリコシル化部位に対して）。この付加は、ペプチドの突然変異または完全な化学合成によって行ってもよい。ペプチドのアミノ酸配列は、いくつかの実施形態においては、好ましくは、ＤＮＡレベルでの変更によって、特に、ペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが作られるように、突然変異させることによって、改変される。突然変異は好ましくは当該技術分野において知られる方法を用いて行われる。
【０２６４】
例示的実施形態において、グリコシル化部位は、ポリヌクレオチドのシャッフリングによって付加する。候補ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡシャッフリングプロトコールによって修飾することができる。ＤＮＡシャッフリングは、関連遺伝子のプールのランダム断片化と、それに続くポリメラーゼ連鎖反応様工程による断片の再集合によって行われる再帰的組み替えおよび突然変異のプロセスである。たとえば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７〜１０７５１頁（１９９４年）；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９〜３９１頁（１９９４年）；および米国特許第５，６０５，７９３号、第５，８３７，４５８号、第５，８３０，７２１号および第５，８１１，２３８号を参照のこと。
【０２６５】
グリコシル化部位を付加または除去する、およびグリコシル構造またはサブ構造を付加または除去する方法の例は、ＷＯ０４／０９９２３１、ＷＯ０３／０３１４６４および関連する米国およびＰＣＴ出願に詳細に記載されている。
【０２６６】
本発明は、１つ以上の選択されたグリコシル残基をＧ−ＣＳＦペプチドに付加（または除去）する手段も利用し、その後、修飾された糖は、ペプチドの選択されたグリコシル残基のうちの少なくとも１つに共役される。このような技術は、たとえば、修飾された糖を、Ｇ−ＣＳＦペプチド上に存在しないかペプチド上に所望の量で存在しない選択されたグリコシル残基に共役させることが望まれる場合に有用である。したがって、修飾された糖をペプチドに連結するのに先立って、選択されたグリコシル残基を酵素的または化学的結合によって、Ｇ−ＣＳＦペプチドに共役する。別の実施形態において、糖ペプチドのグリコシル化パターンは、糖ペプチドから炭水化物残基を除去することによって、修飾された糖の共役の前に変えられる。たとえば、ＷＯ９８／３１８２６を参照のこと。
【０２６７】
選択されたグリコシル残基に対する付着点としては、限定はされないが、たとえば（ａ）Ｎ−結合型グリコシル化に対するコンセンサス部位、およびＯ−結合型グリコシル化に対する部位；（ｂ）グリコシルトランスフェラーゼに対する受容体である末端グリコシル部分；（ｃ）アルギニン、アスパラギンおよびヒスチジン；（ｄ）遊離のカルボキシル基；（ｅ）システインなどの遊離のスルフヒドリル基；（ｆ）セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンなどの遊離のヒドロキシル基；（ｇ）フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンなどの芳香族残基；または（ｈ）グルタミンのアミド基が挙げられる。本発明において用いる方法の例が、１９８７年９月１１日公表のＷＯ８７／０５３３０、およびＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ  ＣＲＩＴ．ＲＥＶ．ＢＩＯＣＨＥＭ．，２５９〜３０６頁（１９８１年）に記載されている。
【０２６８】
本発明によれば、ＰＥＧ修飾された糖は、グリコシル化または非グリコシル化ペプチドに、共役を媒介する適切な酵素を用いて共役される。好ましくは、修飾された供与体糖、酵素、および受容体ペプチドの濃度は、所望の程度の受容体の修飾が達成されるまでグリコシル化が進むように選択される。シアリルトランスフェラーゼ（シアル酸転移酵素）の文脈において挙げる、以下で議論する事項は、他のグリコシルトランスフェラーゼ反応にも一般的に提供可能であることがわかるであろう。
【０２６９】
グリコシルトランスフェラーゼを用いて所望のオリゴサッカリド構造を合成する数々の方法が知られており、本発明に一般的に適用することができる。例示的な方法は、たとえば、ＷＯ９６／３２４９１，Ｉｔｏら，Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６５：７５３（１９９３年）、米国特許第５，３５２，６７０号、第５，３７４，５４１号、第５，５４５，５５３号、および共同所有された米国特許第６，３９９，３３６号および第６，４４０，７０３号に記載されており、それらは参照により本願に組み込む。
【０２７０】
本発明は、単一のグリコシルトランスフェラーゼまたは複数のグリコシルトランスフェラーゼの組み合わせを用いて実施される。たとえば、シアリルトランスフェラーゼとガラクトシルトランスフェラーゼの組み合わせを用いることもできる。２つ以上の酵素を用いる実施形態において、酵素および基質は好ましくは最初の反応混合物中で混合されるか、酵素と第２の酵素反応に対する試薬を、いったん第１の酵素反応が終了または終了しかけている時に反応媒体に加える。２つの酵素反応を１つの容器中で順番に行うことにより、中間体種を単離する手順に比べて、全収率が向上する。さらに、過剰な溶媒および副産物の掃除と処分が削減される。
【０２７１】
一実施形態において、第１および第２の酵素のそれぞれが、グリコシルトランスフェラーゼである。別の好ましい実施形態において、一方の酵素がエンドグリコシダーゼである。別の実施形態において、本発明の修飾された糖タンパク質を集合させるために３つ以上の酵素が用いられる。酵素は、修飾された糖をペプチドに付加する前または後のいずれかにおいてＧ−ＣＳＦペプチド上のサッカリド構造を変えるために用いられる。
【０２７２】
さらに別の実施形態において、本発明の方法は、１つ以上のエキソまたはエンドグリコシダーゼを用いる。グリコシダーゼは、グリコシル結合を破裂されることなく形成するか、形成するように設計された変異体および／またはバリアントであってよい。このような変異体グリカナーゼは、一般には活性部位の酸性アミノ酸残基に対するアミノ酸残基の置換を含んでいる。たとえば、エンドグリカナーゼがエンド−Ｈである場合、置換される活性部位残基は典型的には１３０位のＡｓｐ、１３２位のＧｌｕまたはその組み合わせである。アミノ酸は一般にはセリン、アラニン、アスパラギン、またはグルタミンで置換される。
【０２７３】
このような変異体酵素は、エンドグリカナーゼ加水分解工程の逆反応と類似の合成工程
によって反応を触媒することができる。このような実施形態において、グリコシル供与体分子（たとえば、所望のオリゴまたはモノサッカリド構造）は、脱離基を含み、反応によって、供与体分子がタンパク質上のＧｌｃＮＡｃ残基に付加される。たとえば、脱離基は、フルオリドなどのハロゲンであってもよい。他の実施形態において、脱離基は、Ａｓｎ、またはＡｓｎ−ペプチド部分である。さらなる実施形態において、グリコシル供与体分子上のＧｌｃＮＡｃ残基は修飾されている。たとえば、ＧｌｃＮＡｃ残基は、１，２オキサゾリン部分を含んでいてもよい。
【０２７４】
一実施形態において、本発明の共役体を製造するために用いられる酵素が触媒量で存在する。各酵素の触媒量は、酵素の基質の濃度、ならびに温度、時間およびｐＨなどの反応条件によって変わる。予め選択された基質濃度および反応条件の下での、所与の酵素に対する触媒量の決定手段は、当業者によって周知である。
【０２７５】
本発明の反応が行われる温度は、凍結温度のすぐ上から、最も敏感な酵素が変性する温度までの範囲であってよい。好ましい温度範囲は、約０℃から約５５℃であり、より好ましくは約２０℃から約３７℃である。別の例示的実施形態において、本方法の１つ以上の要素が、好熱性酵素を用いてより高い温度で行われる。
【０２７６】
一態様において、反応混合物は、受容体がグリコシル化され、所望の共役体を形成するのに十分な時間のあいだ維持される。共役体によっては数時間後でもよく検出されるものもあるが、回収可能な量は通常２４時間以内に得られる。当業者であれば、反応速度が、選択された系に対して最適化される多くの可変因子（たとえば、酵素濃度、供与体濃度、受容体濃度、温度、溶媒体積）によって決まることを理解するであろう。
【０２７７】
本発明は、修飾ペプチドの工業規模での生産も提供する。本明細書中で用いる「工業規模」とは、少なくとも１グラムの最終精製共役体を生産することをいう。
以下に示す議論において、本発明は、修飾されたシアル酸部分のグリコシル化ペプチドへの共役によって例示する。例示的な修飾されたシアル酸はＰＥＧで標識されている。以下に示すＰＥＧ−修飾されたシアル酸およびグリコシル化ペプチドの使用に対する議論は、説明を明確化することに焦点を合わせており、本発明をこれらの２つのパートナーの共役体に限定することを意味するものではない。当業者であれば、この議論がシアル酸以外の修飾グリコシル部分の付加に一般的に適用可能であることを理解するであろう。さらに、この議論は、他のＰＥＧ部分、治療的部分および生体分子を含むＰＥＧ以外の物質によるグリコシル単位の修飾にも同様に適用可能である。
【０２７８】
酵素的アプローチを、ＰＥＧ化またはＰＰＧ化された炭水化物をペプチドまたは糖ペプチド上に選択的に導入するために用いることもできる。本方法はＰＥＧ，ＰＰＧまたはマスク化された反応性官能基を含む修飾された糖を利用し、適当なグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシンターゼと組み合わせられる。所望の炭水化物連結をつくるグリコシルトランスフェラーゼを選択し、供与体基質として修飾された糖を用いることにより、ＰＥＧまたはＰＰＧを、Ｇ−ＣＳＦペプチド骨格上、糖ペプチドの既存の糖残基上、またはペプチドに付加された糖残基上へ、直接導入することができる。
【０２７９】
シアリルトランスフェラーゼに対する受容体は、本発明の方法によって修飾すべきＧ−ＣＳＦペプチド上に、天然に存在する構造として、または組み替え的に、酵素的にまたは化学的に配置されたものとして存在する。適切な受容体としては、たとえば、ガラクトシル受容体、たとえばＧａｌβ１、４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１、４ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβｌ、３ＧａｌＮＡｃ、ラクト−Ｎ−テトラオース、Ｇａｌβ１、３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβｌ、３Ａｒａ、Ｇａｌβ１、６ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１、４Ｇｌｃ（ラクトース）、および他の当業者によって知られる受容体が挙げられる（たとえば、Ｐａｕｌｓｏｎら
，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：５６１７〜５６２４頁（１９７８年）を参照のこと）。
【０２８０】
一実施形態において、シアリルトランスフェラーゼに対する受容体は、糖ペプチドのｉｎｖｉｖｏ合成時に、修飾すべき糖ペプチド上に存在する。このような糖ペプチドは、糖ペプチドのグリコシル化パターンの前修飾なしに、本願発明を用いてシアリル化することができる。あるいは、本発明の方法は、適切な受容体を含まないペプチドをシアリル化するために用いることができる。すなわち、まずＧ−ＣＳＦペプチドを当業者によって知られる方法により受容体を含むように修飾する。例示的実施形態において、ＧａｌＮＡｃ残基は、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの作用によって付加される。
【０２８１】
例示的実施形態において、ガラクトシル受容体は、ガラクトース残基をＧ−ＣＳＦペプチドに連結されたたとえばＧｌｃＮＡｃなどの適当な受容体に付着させることにより、組み立てられる。本方法は、修飾すべきＧ−ＣＳＦペプチドを、適量のガラクトシルトランスフェラーゼ（たとえば、ｇａｌβ１，３またはｇａｌβ１，４）と、適当なガラクトシル供与体（たとえば、ＵＤＰ−ガラクトース）とを含む反応混合物とともにインキュベートすることを含む。反応は実質的に完了まで進めさせるか、あるいは、予め選択された量のガラクトース残基が付加された時点で反応を終了する。選択されたサッカリド受容体を会合させる他の方法は、当業者には明らかであろう。
【０２８２】
さらに別の実施形態において、糖ペプチドを連結したオリゴサッカリドをまず最初に全体または一部トリミングして、シアリルトランスフェラーゼに対する受容体または適切な受容体を得るために１つ以上の適当な残基を付加しうる部分のいずれかを露出させる。グリコシルトランスフェラーゼやエンドグリコシダーゼなどの酵素（たとえば、米国特許第５，７１６，８１２号を参照）も、付着およびトリミング反応に有用である。
【０２８３】
以下の議論において、本発明の方法は、ＰＥＧ部分が付着された修飾された糖を使用することによって例証する。議論の主眼は、説明を明確化することにある。当業者には、この議論が、修飾された糖が治療的部分、生体分子などを持っている実施形態にも同一に適切であることが明らかであろう。
【０２８４】
修飾された糖の付加前に炭水化物残基がトリミングされている本発明の例示的実施形態において、高マンノースが第一世代二分岐構造までトリミングされている。ＰＥＧ部分を持つ修飾された糖は、「トリミング」によって露出された糖残基の１つ以上と共役される。一例において、ＰＥＧ部分は、ＰＥＧ部分に共役されたＧｌｃＮＡｃ部分を介して付加される。修飾されたＧｌｃＮＡｃは、二分岐構造の末端マンノースの一方または両方に付加される。あるいは、修飾されたＧｌｃＮＡｃは、分岐した種の末端の一方または両方に付加することもできる。
【０２８５】
別の例示的実施形態において、ＰＥＧ部分は、末端マンノース残基上に付加されたＧｌｃＮＡｃ残基に共役された、ガラクトース残基を有する修飾された糖を介して二分岐構造の一方または両方の末端マンノース残基に付加される。あるいは、非修飾Ｇａｌは、一方または両方の末端ＧｌｃＮＡｃ残基に付加することもできる。
【０２８６】
さらなる例において、ＰＥＧ部分は、修飾されたシアル酸を用いてＧａｌ残基上に付加される。
別の例示的実施形態において、高マンノース構造は、二分岐構造が枝分かれするマンノースまで「トリミング」される。一例において、ＰＥＧ部分は、ポリマーで修飾したＧｌｃＮＡｃを介して付加される。あるいは、非修飾ＧｌｃＮＡｃをマンノースに付加してから、ＰＥＧ部分の付加したＧａｌを付加してもよい。さらに別の実施形態において、非修
飾ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌ残基が順にマンノースに付加され、次にＰＥＧ部分で修飾されたシアル酸部分が付加される。
【０２８７】
さらなる例示的実施形態において、高マンノースは、第１のマンノースが付着されたＧｌｃＮＡｃまで「トリミング」される。ＧｌｃＮＡｃは、ＰＥＧ部分をもつＧａｌ残基に共役される。あるいは、非修飾ＧａｌをＧｌｃＮＡｃに付加してから、水溶性糖で修飾されたシアル酸が付加される。さらなる例において、末端ＧｌｃＮＡｃがＧａｌと共役され、ＧｌｃＮＡｃが続いて、ＰＥＧ部分をもつ修飾フコースでフコシル化される。
【０２８８】
高マンノースは、ペプチドのＡｓｎに付着された第１のＧｌｃＮＡｃまでトリミングしてもよい。一例において、ＧｌｃＮＡｃ−（Ｆｕｃ）ａ残基のＧｌｃＮＡｃを可溶性ポリマーを持つＧｌｃＮＡｃと共役する。別の例において、ＧｌｃＮＡｃ−（Ｆｕｃ）ａ残基のＧｌｃＮＡｃを水溶性ポリマーを持ったＧａｌで修飾する。さらなる実施形態において、ＧｌｃＮＡｃをＧａｌで修飾し、続いて、Ｇａｌを、ＰＥＧ部分で修飾したシアル酸と共役させる。
【０２８９】
他の例示的実施形態は、共同所有の米国特許出願公報：２００４０１３２６４０；２００４００６３９１１；２００４０１３７５５７；米国特許出願番号：１０／３６９，９７９；１０／４１０，９１３；１０／３６０，７７０；１０／４１０，９４５およびＰＣＴ／ＵＳ０２／３２２６３に記載されており、そのそれぞれを参照により本願に組み込む。
【０２９０】
上記に挙げた例は、本明細書中に記載の方法の力の説明を提供するものである。本明細書中に記載の方法を用いて、実質的に任意の所望の構造の炭水化物残基を「トリミング」し、構築することができる。修飾された糖は、上述のような炭水化物部分の末端に付加することもできるし、または、ペプチドコアと炭水化物の末端の間に介在されることもできる。
【０２９１】
例示的実施形態において、シアリダーゼを用いて既存のシアル酸をＧ−ＣＳＦ糖ペプチドから除去し、それにより、その下にあるガラクトシル残基のすべてまたは殆どのマスキングを外す。あるいは、ペプチドまたは糖ペプチドを、ガラクトース残基、またはガラクトース単位で終結するオリゴサッカリド残基で標識する。ガラクトース残基の露出または付加に続いて、適当なシアリルトランスフェラーゼを用いて修飾されたシアル酸を付加する。この手法についてスキーム１にまとめる。
スキーム１
【０２９２】
【化４９】
0005922065.tif 000050
スキーム２にまとめるさらなる手法において、マスクされた反応性官能性がシアル酸上に存在する。マスクされた反応性基は、修飾されたシアル酸をＧ−ＣＳＦに付着させるために用いられる条件によって影響を受けないことが好ましい。修飾されたシアル酸をＧ−ＣＳＦペプチドに共有結合させた後、マスクを除去し、Ｇ−ＣＳＦペプチドをＰＥＧなどの物質と共役させる。物質は、修飾された糖残基上のマスクされていない反応性基との反応により、特異的にペプチドに共役される。
スキーム２
【０２９３】
【化５０】
0005922065.tif 000051
本明細書に挙げるどの修飾された糖も、糖ペプチドのオリゴサッカリド側鎖の末端糖に応じて、その適当なグリコシルトランスフェラーゼとともに用いることができる（表１）。上で議論したように、ＰＥＧ化構造の導入のために必要とされる糖ペプチドの末端糖は、発現中に自然に導入されるか、適当なグリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、またはグリコシダーゼとグリコシルトランスフェラーゼの混合物を用いて発現後に作ることもできる。
【０２９４】
【表１】
0005922065.tif 000052
さらなる例示的実施形態において、ＵＤＰ−ガラクトース−ＰＥＧを牛乳β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼと反応させることにより、修飾ガラクトースを適当な末端Ｎ−アセチルグルコサミン構造に転移させる。糖ペプチド上の末端ＧｌｃＮＡｃ残基は、哺乳動物、昆虫、植物または真菌などの発現系において起こるように、発現中に産生されてもよいが、糖ペプチドは、必要に応じてシアリダーゼおよび／またはグリコシダーゼおよび／またはグリコシルトランスフェラーゼで処理することにより生産することもできる。
【０２９５】
別の例示的実施形態において、ＧＮＴ１−５などのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを用いて、ＰＥＧ化−ＧｌｃＮを糖ペプチド上の末端マンノース残基に転移させる。さらなる例示的実施形態において、Ｎ−および／またはＯ−結合型グリカン構造を酵素的に糖ペプチドから除去して、アミノ酸または末端グリコシル残基を露出し、次にこれを修飾された糖と共役される。たとえば、エンドグリカナーゼを用いて糖ペプチドのＮ−結合型構造
を除去し、末端ＧｌｃＮＡｃを糖ペプチド上のＧｌｃＮＡｃが結合したＡｓｎとして露出させる。ＵＤＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧおよび適当なガラクトシルトランスフェラーゼを用いて、露出したＧｌｃＮＡｃ上にＰＥＧ−ガラクトース官能性を導入する。
【０２９６】
代替実施形態において、修飾された糖を、糖残基をペプチド骨格に転移させることが知られているグリコシルトランスフェラーゼを用いて、Ｇ−ＣＳＦペプチド骨格に直接付加する。この例示的実施形態は、スキーム３に示す。本発明を実施するのに有用なグリコシルトランスフェラーゼとしては、限定はされないが、たとえば、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃＴ１−１４）、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼなどが挙げられる。この手法を用いることで、炭水化物を含まないペプチド上に、あるいは既存の糖ペプチド上に、修飾された糖を直接付加することが可能になる。いずれの場合においても、修飾された糖の付加は、グリコシルトランスフェラーゼの基質特異性によって定義されるようなペプチド骨格上の特定位置に起こり、化学的手法を用いたタンパク質のペプチド骨格の修飾中に起こるようなランダムな様式では起こらない。一連の物質は、グリコシルトランスフェラーゼ基質ペプチド配列を含まないタンパク質または糖ペプチドに、適当なアミノ酸配列をポリペプチド鎖中に設計することにより導入することもできる。
スキーム３
【０２９７】
【化５１】
0005922065.tif 000053
上記例示的実施形態のそれぞれにおいて、修飾された糖のペプチドへの共役に続いて、１つ以上の追加の化学的または酵素的修飾工程を用いてもよい。例示的実施形態において、酵素（たとえば、フコシルトランスフェラーゼ）を用いて、グリコシル単位（たとえば、フコース）を、Ｇ−ＣＳＦペプチドに付着された末端修飾された糖上へ追加する。別の例において、酵素的反応を用いて、修飾された糖が共役できない部位を「キャップ」する。あるいは、化学反応を用いて、共役された修飾された糖の構造を変える。たとえば、共役された修飾された糖を、修飾された糖が付着されるペプチド成分との結合を安定化または不安定化させる物質と反応させる。別の例において、修飾された糖の成分を、そのペプチドへの共役後に脱保護する。当業者には、修飾された糖がＧ−ＣＳＦペプチドに共役された後の段階において、本発明の方法において用いるのに有用な様々な酵素的および化学的手順があることが明らかであろう。修飾された糖−ペプチド共役体のさらなる加工は本発明の範囲内である。
酵素
アシル結合した共役体を形成する文脈中、上記で議論した酵素に加えて、共役体と初発基質（たとえば、ペプチド、脂質）のグリコシル化パターンを加工したり、トリミングしたり、または他の酵素を用いた方法によって修飾することができる。糖供与体を受容体に転移させる酵素を用いてペプチドおよび脂質を改作する方法は、ＤｅＦｒｅｅｓ，２００３年４月１７日公表のＷＯ０３／０３１４６４Ａ２のなかに非常に詳細に議論されている
。本発明において用いる選択された酵素を以下に簡単にまとめる。
グリコシルトランスフェラーゼ（糖転移酵素）
グリコシルトランスフェラーゼは、活性化糖（供与体ＮＤＰ−またはＮＭＰ−糖）の、タンパク質、糖ペプチド、脂質または糖脂質、または成長中のオリゴサッカリドの非還元末端への付加を段階的に触媒する。Ｎ−結合型糖ペプチドは、トランスフェラーゼおよび脂質が結合したオリゴサッカリド供与体Ｄｏｌ−ＰＰ−ＮＡＧ2Ｇｌｃ3Ｍａｎ9を介したエンブロック転移と、その後のコアのトリミングによって合成される。この場合、「コア」サッカリドの性質は、その後の付着とは幾分異なっている。非常に多くのグリコシルトランスフェラーゼが、当該技術分野において知られている。
【０２９８】
本発明において用いるグリコシルトランスフェラーゼは、糖供与体として修飾された糖を利用できるものであれば、どんなものであってもよい。そのような酵素としては、たとえば、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、グルクロノニルトランスフェラーゼなどのＬｅｌｏｉｒ経路グリコシルトランスフェラーゼが挙げられる。
【０２９９】
グリコシルトランスフェラーゼ反応を伴う酵素的サッカリド合成のために、グリコシルトランスフェラーゼをクローン化してもよいし、任意の供給源から単離してもよい。多くのクローン化されたグリコシルトランスフェラーゼが、それらのポリヌクレオチド配列として知られている。たとえば、Ｔｈｅ  ＷＷＷ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｅｉ．ｃｏ．ｕｋ／ＴＧＮ／ｇｔ＿ｇｕｉｄｅ．ｈｔｍ）を参照のこと。グリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列および、グリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列であってそこからアミノ酸配列を推定することのできるヌクレオチド配列もまた、ＧｅｎＢａｎｋ，Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ，ＥＭＢＬ他を含む様々な公に利用できるデータベースに見いだされる。
【０３００】
本発明の方法において用いることのできるグリコシルトランスフェラーゼとしては、限定はされないが、たとえば、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノニルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼ、およびオリゴサッカリルトランスフェラーゼが挙げられる。適切なグリコシルトランスフェラーゼとしては、真核細胞由来のもの、ならびに原核細胞由来のものが挙げられる。
【０３０１】
グリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡは、化学合成により、適当な細胞または細胞系列培養からのｍＲＮＡの逆転写物をスクリーニングすることにより、適当な細胞のゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、またはこれらの方法の組み合わせにより得ることができる。ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのスクリーニングは、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列から作成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて行ってもよい。プローブは、既知の手順に従って、蛍光基、放射活性原子または化学発光基などの検出可能な基で標識し、従来のハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いてもよい。あるいは、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列は、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列から作成されるＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて得てもよい。Ｍｕｌｌｉｓらに付与された米国特許第４，６８３，１９５号およびＭｕｌｌｉｓに付与された米国特許第４，６８３，２０２号を参照のこと。
【０３０２】
グリコシルトランスフェラーゼは、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを含むベクターで形質転換された宿主細胞中で合成されてもよい。ベクターは、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを増幅するために、および／またはグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを発現するために用いられる。発現ベクターは、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列が、適切な宿主中でグリコシルトランスフェラーゼ酵素を発現させることのできる適切な制御配列に作用的に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結されている、複製可能なＤＮＡ構築物である。このような制御配列に対する必要性は、選択される宿主および選択される形質転換方法によって変わる。一般に、制御配列は、転写プロモータ、転写を制御するための随意のオペレータ配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、および転写と翻訳の終結を制御する配列を含む。増幅ベクターは、発現制御ドメインを必要としない。必要とされるのは、通常は複製の起点によって与えられる、宿主中で複製する能力と、形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子だけである。
【０３０３】
例示的実施形態において、本発明は、原核生物酵素を利用する。そのようなグリコシルトランスフェラーゼには、多くのグラム陰性細菌によって産生される、リポオリゴサッカリド（ＬＯＳ）の合成に関与する酵素が含まれる（Ｐｒｅｓｔｏｎら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ
Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２３（３）：１３９〜１８０頁（１９９６年））。このような酵素としては、限定はされないが、β１，６ガラクトシルトランスフェラーゼやβ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼを含む、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ）やネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などの種のｒｆａオペロンのタンパク質（たとえば、ＥＭＢＬアクセス番号Ｍ８０５９９およびＭ８６９３５（大腸菌）；ＥＭＢＬアクセス番号Ｓ５６３６１（ネズミチフス菌）を参照のこと）、グルコシルトランスフェラーゼ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセス番号Ｐ２５７４０（大腸菌）、β１，２−グルコシルトランスフェラーゼ（ｒｆａＪ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセス番号Ｐ２７１２９（大腸菌）およびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセス番号Ｐ１９８１７（ネズミチフス菌））、ならびにβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ｒｆａＫ）（ＥＭＢＬアクセス番号Ｕ０００３９（大腸菌）が挙げられる。アミノ酸配列の知られている他のグリコシルトランスフェラーゼとしては、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、大腸菌、ネズミチフス菌、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｅｎｔｅｒｉｃａ）、腸炎エルシニア菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ライ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒｏｓｕｍ）などの生物においてキャラクタライズされているｒｆａＢのようなオペロンによって，および緑膿菌のｒｈｌオペロンによってコードされるものが含まれる。
【０３０４】
本発明において使用するのに適しているものは、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル−β−１，３−Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｄ−グルコースを含む構造の産生に関与しているグリコシルトランスフェラーゼ、Ｐｋ血液型トリサッカリド配列、Ｄ−ガラクトシル−α−１，４−Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｄ−グルコースであり、これらは粘膜病原菌である淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｎｏｒｈｏｅａｅ）および髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＬＯＳにおいて同定されている（Ｓｃｈｏｌｔｅｎら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：２３６〜２４３頁（１９９４年））。上記構造の生合成に関与するグリコシルトランスフェラーゼをコードする髄膜炎菌および淋菌からの遺伝子は、髄膜炎菌免疫型Ｌ３およびＬｌ（Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、ＭｏＩ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：７２９〜７４０頁（１９９５年））および淋菌変異体Ｆ６２から同定されている（Ｇｏｔｓｈｌｉｃｈ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２１８１〜２１９０頁（１９９４年））。髄膜炎菌において、３つの遺伝子、ＩｇｔＡ、ＩｇｔＢおよびＩｇＥからなる遺伝子座は、ラ
クト−Ｎ−ネオテトラオース鎖における最後の３つの糖を付加するのに必要なグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする（Ｗａｋａｒｃｈｕｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９１６６〜７３頁（１９９６年））。細菌、ＩｇｔＢおよびＩｇｔＡ遺伝子産物の酵素活性が実証され、これは、それらの提案されていたグリコシルトランスフェラーゼ機能についての最初の直接的証拠を提供するものであった（Ｗａｋａｒｃｈｕｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（４５）：２８２７１〜２７６頁（１９９６年））。淋菌においては、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース構造の末端ガラクトースの３位に付加するＩｇｔＤと、末端α−Ｄ−Ｇａｌを切断型ＬＯＳのラクトース要素に付加して、Ｐｋ血液型抗原構造を創出するＩｇｔＣとのさらに２つの遺伝子がある（前掲のＧｏｔｓｈｌｉｃｈ（１９９４年））。髄膜炎菌において、別の免疫型Ｌ１もまた、Ｐｋ血液型抗原を発現し、ＩｇｔＣ遺伝子を担持することが示されている（前掲のＪｅｎｎｉｎｇｓら，（１９９５年））。ナイセリアグリコシルトランスフェラーゼおよび関連遺伝子は、米国特許第５，５４５，５５３号（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ）にも記載されている。ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）からのα１，２−フコシルトランスフェラーゼおよびα１，３−フコシルトランスフェラーゼに対する遺伝子は、すでにキャラクタライズされている（Ｍａｒｔｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２１３４９〜２１３５６頁（１９９７年））。本発明において有用なものとしては、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）のグリコシルトランスフェラーゼもある（たとえば、ｈｔｔｐ：／／ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／〜ｐｅｄｒｏ／ＣＡＺＹ／ｇｔｆ＿４２．ｈｔｍｌを参照のこと）。
フコシルトランスフェラーゼ（フコシル基転移酵素）
いくつかの実施形態において、本発明の方法において用いられるグリコシルトランスフェラーゼは、フコシルトランスフェラーゼである。フコシルトランスフェラーゼは、当業者に知られている。フコシルトランスフェラーゼの例としては、Ｌ−フコースをＧＤＰ−フコースから受容体糖のヒドロキシ位に転移させる酵素が挙げられる。非ヌクレオチド糖を受容体に転移させるフコシルトランスフェラーゼもまた、本発明において有用である。
【０３０５】
いくつかの実施形態において、受容体糖は、たとえば、オリゴサッカリドグリコシド中のＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ−基におけるＧｌｃＮＡｃである。本反応に対する適切なフコシルトランスフェラーゼとしては、人乳から初めてキャラクタライズされたＧａｌβ（ｌ→３，４）ＧｌｃＮＡｃβｌ−α（ｌ→３，４）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＩＩＥ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６５）（Ｐａｌｃｉｃら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．１９０：１〜１１頁（１９８９年）；Ｐｒｉｅｅｌｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１０４５６〜１０４６３頁（１９８１年）；およびＮｕｎｅｚら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．５９：２０８６〜２０９５頁（１９８１年）を参照）およびヒト血清中で見つかったＧａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃβ−αフコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＶ，ＦＴＶ，ＦＴＶＩ）が挙げられる。ＦＴＶＩＩ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６５）、すなわちシアルα（２→３）Ｇａｌβ（（１→３）ＧｌｃＮＡｃβフコシルトランスフェラーゼもまたキャラクタライズされている。Ｇａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ−α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼの組換え型もまたキャラクタライズされている（Ｄｕｍａｓら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １：４２５〜４２８頁（１９９１年）およびＫｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ４：１２８８〜１３０３頁（１９９０年）を参照のこと）。フコシルトランスフェラーゼの他の例としては、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６９）が挙げられる。酵素的フコシル化は、Ｍｏｌｌｉｃｏｎｅら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９１：１６９〜１７６頁（１９９０年）または米国特許第５，３７４，６５５号に記載の方法によって行うことができる。フコシルトランスフェラーゼを産生するために用いられる細胞もまた、ＧＤＰ−フコースを合成するための酵素系を含んでいるであろう。
ガラクトシルトランスフェラーゼ（ガラクトシル基転移酵素）
別の群の実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼはガラクトシルトランスフェラーゼである。ガラクトシルトランスフェラーゼとしては、たとえば、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．１５１，たとえば、Ｄａｂｋｏｗｓｋｉら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．２５：２９２１（１９９３年）およびＹａｍａｍｏｔｏら．Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：２２９〜２３３頁（１９９０年）、ウシ（ＧｅｎＢａｎｋ  ｊ０４９８９，Ｊｏｚｉａｓｓｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２９０〜１４２９７頁（１９８９年））、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ  ｍ２６９２５；Ｌａｒｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２２７〜８２３１頁（１９８９年））、ブタ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌ３６１５２；Ｓｔｒａｈａｎら，Ｉｍｍｕｎｏ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４１：１０１〜１０５頁（１９９５年）を参照）が挙げられる。別の適切なα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼは、血液型Ｂ抗原の合成に関与するものである（ＥＣ２．４．１．３７，Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１４６〜１１５１頁（１９９０年）（ヒト））。ガラクトシルトランスフェラーゼのさらなる例は、コアＧａｌ−Ｔ１である。
【０３０６】
本発明の方法における使用に適したものとして、たとえばＥＣ２．４．１．９０（ＬａｃＮａｃ合成酵素）およびＥＣ２．４．１．２２（ラクトース合成酵素）を含むβ（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼ（ウシ（Ｄ’Ａｇｏｓｔａｒｏら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：２１１〜２１７頁（１９８９年））、ヒト（Ｍａｓｒｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５７：６５７〜６６３頁（１９８８年））、マウス（Ｎａｋａｚａｗａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４：１６５〜１６８（１９８８年））、ならびに、Ｅ．Ｃ．２．４．１．３８およびセラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．４５，Ｓｔａｈｌら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３８：２３４〜２４２頁（１９９４年））がある。他の適切なガラクトシルトランスフェラーゼとしては、たとえば、α１，２ガラクトシルトランスフェラーゼ（たとえばＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ由来、Ｃｈａｐｅｌｌら，Ｍｏｌ
Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  ５：５１９〜５２８頁（１９９４年））が挙げられる。
シアリルトランスフェラーゼ（シアル酸転移酵素）
シアリルトランスフェラーゼは、本発明の組み替え細胞および反応混合物において有用な別のタイプのグリコシルトランスフェラーゼである。組換えシアリルトランスフェラーゼを産生する細胞は、シアリルトランスフェラーゼに対するシアル酸供与体であるＣＭＰ−シアル酸も産生する。本発明において使用するのに適したシアリルトランスフェラーゼの例としては、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ（たとえば、ラットまたはヒトＳＴ３ＧａｌＩＩＩ）、ＳＴ３ＧａｌＩＶ、ＳＴ３ＧａｌＩ、ＳＴ３ＧａｌＩＩ、ＳＴ６ＧａｌＩ、ＳＴ３ＧａｌＶ、ＳＴ６ＧａｌＩＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩ、およびＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩＩ（本明細書中で用いるシアリルトランスフェラーゼの命名法は、Ｔｓｕｊｉら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６：ｖ−ｘｉｖ（１９９６年）に記載されている）が挙げられる。α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）と呼ばれる例示的なα（２，３）シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸をＧａｌβ１→３Ｇｌｃジサッカリドまたはグリコシドの非還元末端Ｇａｌに転移させる。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１５９（１９８１年）、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５（１９８２）およびＷｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１（１９９２）を参照のこと。別の例示的α２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．４）は、シアル酸をジサッカリドまたはグリコシドの非還元端Ｇａｌに転移させる。Ｒｅａｒｉｃｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：４４４４（１９７９年）およびＧｉｌｌｅｓｐｉｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１００４（１９９２年）を参照のこと。さらなる酵素の例としては、Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃα−２，６シアリルトランスフェラーゼ（Ｋｕｒｏｓａｗａら  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：３７５〜３８１頁（１９９４年）を参照のこと）が挙げられる。
【０３０７】
糖ペプチドの炭水化物のグリコシル化のために、シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸を、完全にシアリル化された炭水化物構造上の末端シアル酸の下敷きとなる最も一般的な最後から二番目の配列である配列Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−に転移させることができることが好ましい（たとえば、表２を参照のこと）。
【０３０８】
【表２】
0005922065.tif 000054
請求される方法において有用なシアリルトランスフェラーゼの例として、α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）とも呼ばれるＳＴ３ＧａｌＩＩＩがある。この酵素は、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃグリコシドのＧａｌへのシアル酸の転移を触媒し（たとえば、Ｗｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１（１９９２年）；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２５６：３１５９（１９９１年）を参照のこと）、糖ペプチド中のアスパラギンと結合されたオリゴサッカリドのシアリル化に関与している。シアル酸は、Ｇａｌに結合されて、２つのサッカリド間のα結合を形成する。サッカリド間の結合は、Ｎｅｕａｃの２位とＧａｌの３位の間である。この特定の酵素は、ラット肝臓から単離することができ（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５（１９８２年））；ヒトｃＤＮＡ（Ｓａｓａｋｉら（１９９３年）Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６８：２２７８２〜２２７８７頁；Ｋｉｔａｇａｗａ＆Ｐａｕｌｓｏｎ（１９９４年）Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９：１３９４〜１４０１頁）およびゲノム（Ｋｉｔａｇａｗａら（１９９６年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９３１〜９３８頁）ＤＮＡ配列が知られており、組み替え発現によるこの酵素の生産を容易にしている。一実施形態において、請求されるシアリル化方法は、ラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩを用いる。
【０３０９】
本発明において用いる他のシアリルトランスフェラーゼの例としては、ＣＳＴ−ＩおよびＣＳＴ−ＩＩを含むカンピロバクター・ジェジュニから単離されたもの、およびα（２，３）結合を作るものが挙げられる。たとえば、ＷＯ９９／４９０５１を参照のこと。
【０３１０】
表２に挙げたもの以外のシアリルトランスフェラーゼもまた、商業的に重要な糖ペプチドのシアリル化に対する経済的かつ効率的な大量プロセスにおいて有用である。これらの他の酵素の実用性を知るための単純な試験として、様々な量の各酵素（１〜１００ｍＵ／ｍｇタンパク質）をアシアロ−α1ＡＧＰ（１〜１０ｍｇ／ｍＬ）と反応させて、注目の
シアリルトランスフェラーゼが糖ペプチドをシアリル化する能力を、ウシＳＴ６ＧａｌＩ、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩのいずれかまたは両シアリルトランスフェラーゼと比べて比較する。あるいは、他の糖ペプチドまたは糖ペプチド，またはペプチド骨格から酵素的に遊離されたＮ−結合オリゴサッカリドを、この評価のために、アシアロ−α1ＡＧＰの代わりに用いることもできる。糖ペプチドのＮ−結合オリゴサッカリドを、ＳＴ６ＧａｌＩよりも効率的にシアリル化する能力を有するシアリルトランスフェラーゼが、ペプチドシアリル化に対する実用的な大量プロセスにおいて有用である。
ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ
Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、本発明を実施するにあたって、特にＧａｌＮＡｃ部分をペプチドのＯ−結合型グリコシル化部位のアミノ酸に結合させるのに有用である。適切なＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼとしては、限定はされないが、たとえば、α（１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β（１，４）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｎａｇａｔａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２０８２〜１２０８９頁（１９９２年）およびＳｍｉｔｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９：１５１６２（１９９４年））およびポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｈｏｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２６０９（１９９３年））が挙げられる。
【０３１１】
クローン化された遺伝子からの、遺伝子工学による酵素ＧａｌＮＡｃＴＩ−ＸＸなどのタンパク質の産生は、周知である。たとえば、米国特許第４，７６１，３７１号を参照のこと。ある方法においては、十分な試料を回収してから、酵素のアミノ酸配列をＮ末端シーケンシングにより決定することを伴う。次にこの情報を用いて、昆虫細胞系列Ｓｆ９において発現された場合に完全に活性な酵素が合成される全長（膜結合）トランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡクローンを単離する。次に、１６の異なるタンパク質において、既知のグリコシル化部位を取り巻くアミノ酸の半定量的分析を用いて、酵素の受容体特異性を決定し、続いて、合成ペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏグリコシル化実験を行う。この作業によって、あるアミノ酸残基がグリコシル化ペプチドセグメントにおいて過剰発現されていること、およびグリコシル化されたセリンおよびスレオニン残基を取り囲む特定位置にある残基が、他のアミノ酸部分よりも受容体効率により顕著な影響を有することが実証される。
細胞結合グリコシルトランスフェラーゼ
別の実施形態において、本発明の本方法において用いられる酵素は、細胞に結合したグリコシルトランスフェラーゼである。多くの可溶性グリコシルトランスフェラーゼが知られているが（たとえば、米国特許第５，０３２，５１９号を参照のこと）、グリコシルトランスフェラーゼは、細胞に結合しているときは、一般に膜に結合した形態である。これまでに研究されてきた膜に結合した酵素の多くは、内在性タンパク質であると考えられている。すなわち、それらは超音波処理によって膜から遊離することはなく、可溶化には界面活性剤が必要である。表面グリコシルトランスフェラーゼが、脊椎動物および無脊椎動物の細胞の表面上で同定されており、これらの表面トランスフェラーゼは、生理的条件下において触媒活性を維持することが理解されている。しかしながら、細胞表面グリコシルトランスフェラーゼのよりよく理解されている機能は、細胞間認識に対するものである（Ｒｏｔｈ，細胞上の現象に対する分子アプローチ（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＰＰＲＯＡＣＨＥＳ  ｔｏ  ＳＵＰＲＡＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＰＨＥＮＯＭＥＮＡ），１９９０年）。
【０３１２】
細胞によって発現されるグリコシルトランスフェラーゼを改変する方法が開発されている。たとえば、Ｌａｒｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２２７〜８２３１頁（１９８９年）は、細胞表面オリゴサッカリド構造およびそれらの同族グリコシルトランスフェラーゼの発現を決定するクローン化ｃＤＮＡ配列を単離するための遺伝子的手法を報告している。ＵＤＰ−ガラクトース、すなわち、β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニドα−１，３−ガラクトシルトラン
スフェラーゼを発現することが知られているマウス細胞系列から単離されたｍＲＮＡから作成したｃＤＮＡライブラリをＣＯＳ−１細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を培養し、α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ活性について分析した。
【０３１３】
Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２７１３〜２７１７頁（１９９２年）は、β−ラクタマーゼを大腸菌の外表面に繋留する方法を開示している。（ｉ）外側の膜タンパク質の単一配列、（ｉｉ）外側の膜タンパク質の膜貫通部分、および（ｉｉｉ）完全な成熟β−ラクタマーゼ配列からなる三者融合体が作成されて、活性表面が結合したβ−ラクタマーゼ分子ができる。しかしながら、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏの方法では、原核細胞系だけに限られており、著者によっても認識されているように、正しい機能のためには完全な三者融合体が必要である。
スルホトランスフェラーゼ（硫酸転移酵素）
本発明は、硫酸化分子を含むペプチド、たとえば、ヘパリンなどの硫酸化ポリサッカリド、硫酸ヘパラン、カラギーナン、および関連化合物などを製造する方法も提供する。適切なスルホトランスフェラーゼとしては、たとえば、コンドロイチン−６−スルホトランスフェラーゼ（Ｆｕｋｕｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１８５７５〜１８５８０頁（１９９５年）によって記載されるトリｃＤＮＡ；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｄ４９９１５）、グリコサミノグリカンＮ−アセチルグルコサミンＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スフフォトランスフェラーゼ１（Ｄｉｘｏｎら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２６：２３９〜２４１頁（１９９５年）；ＵＬ１８９１８）、およびグリコサミノグリカンＮ−アセチルグルコサミンＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２（Ｏｒｅｌｌａｎａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２２７０〜２２７６頁（１９９４年）およびＥｒｉｋｓｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１０４３８〜１０４４３頁（１９９４年）に記載のマウスｃＤＮＡ；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｕ２３０４に記載のヒトｃＤＮＡ）が挙げられる。
グリコシダーゼ
本発明は、野生型および変異グリコシダーゼを使用することも包含する。変異β−ガラクトシダーゼ酵素は、α−グリコシルフルオリドのガラクトシル受容体分子への連結を介してジサッカリドの形成を触媒することが実証されている（Ｗｉｔｈｅｒｓ，２００１年９月４日公表の米国特許第６，２８４，４９４号）。本発明において用いる他のグリコシダーゼとしては、たとえば、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−マンノシダーゼ、β−アセチルグルコサミニダーゼ、β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、β−キシロシダーゼ、β−フコシダーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ、マンナナーゼ、ヘミセルラーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−マンノシダーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトース−アミニダーゼ、アミニダーゼ、α−キシロシダーゼ、α−フコシダーゼ、およびノイラミニダーゼ／シアリダーゼが挙げられる。
固定化酵素
本発明は、固体支持体および／または可溶性支持体上に固定化された酵素の使用も提供する。例示的実施形態において、本発明の方法にしたがって、インタクトなグリコシルリンカーを介してＰＥＧに共役されたグリコシルトランスフェラーゼが提供される。ＰＥＧ−リンカー−酵素共役体は、任意選択で固体支持体に付着されてもよい。本発明の方法において固体に支持された酵素を使用することにより、反応混合物のワークアップと、反応生成物の精製が簡単になり、酵素の簡便な回収が可能になる。グリコシルトランスフェラーゼ共役体は、本発明の方法において利用される。他の酵素と支持体の組み合わせも当業者には明らかであろう。
融合タンパク質
他の例示的実施形態において、本発明の方法は、所望の糖ペプチド共役体の合成に関与する２つ以上の酵素活性を有する融合タンパク質を利用する。融合ポリペプチドは、たとえば、アクセサリ酵素の触媒的に活性なドメインと接合された、グリコシルトランスフェ
ラーゼの触媒的に活性なドメインで構成される。アクセサリ酵素の触媒ドメインは、たとえば、グリコシルトランスフェラーゼに対する供与体であるヌクレオチド糖の形成における工程を触媒するか、グリコシルトランスフェラーゼサイクルに含まれる反応を触媒する。たとえば、グリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを、インフレームで、ヌクレオチド糖合成に関与する酵素をコードするポリヌクレオチドと接合することもできる。得られる融合タンパク質は、ヌクレオチド糖の合成だけでなく、糖部分の受容体分子への転移をも触媒することができる。融合タンパク質は、１つの発現可能なヌクレオチド配列中に連結された２つ以上のサイクル酵素であってもよい。他の実施形態において、融合タンパク質は、２つ以上のグリコシルトランスフェラーゼの触媒的に活性なドメインを含んでいてもよい。たとえば、米国特許第５，６４１，６６８号を参照のこと。本発明の修飾された糖ペプチドは、様々な適切な融合タンパク質を利用して容易に設計および製造することができる（たとえば、１９９９年６月２４日公表のＷＯ９９／３１２２４である、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＣＡ９８／０１１８０を参照のこと）。
修飾された糖の調製
本発明の方法は、一般に修飾された糖を利用する。一態様において、糖部分または糖部分−リンカーカセットと、ＰＥＧまたはＰＥＧ−リンカーカセット基とが、反応性基を使用して互いに連結され、典型的にはかかる連結プロセスにより新しい有機官能基または非反応性種へ変換される。糖反応性官能基は、糖部分上の任意の位置に配置されている。反応性基と、本発明を実施するのに有用な反応のクラスは、一般にバイオコンジュゲート化学の分野において周知のものとする。反応性糖部分によって利用できる現時点において好ましい反応のクラスは、比較的穏やかな条件において進行するものである。これらには、限定はされないが、求核置換（たとえば、アミンおよびアルコールのハロゲン化アシル、活性エステルとの反応）、求電子置換（たとえば、エナミン反応）、および炭素−炭素結合、および炭素−ヘテロ原子多重結合への付加（たとえば、Ｍｉｃｈａｅｌ反応、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ付加）が挙げられる。これらおよび他の有用な反応は、たとえば、Ｍａｒｃｈ，「先進有機化学（ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）」，第３版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ニューヨーク、１９８５年；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，アカデミックプレス，サンジエゴ、１９９６年；およびＦｅｅｎｅｙら，「タンパク質の修飾（ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ）；Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ．１９８，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，ワシントンＤ．Ｃ．、１９８２年の中に開示されている。
【０３１４】
糖核または修飾基から懸垂する有用な反応性官能基としては、限定はされないが、以下のものが挙げられる。
（ａ）限定はされないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニルおよび芳香族エステルを含むカルボキシル基およびその様々な誘導体；
（ｂ）たとえば、エステル、エーテル、アルデヒドなどに変換可能なヒドロキシル基；
（ｃ）ハライドを、後で、たとえばアミン、カルボキシレートアニオン、チオールアニオン、カルバニオン、またはアルコキシドイオンなどの求核基で置換することができ、当該ハロゲン原子の官能基において新しい基が共有結合することになるような、ハロアルキル基；（ｄ）ディールス・アルダー（Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ）反応に関与することのできる、たとえばマレイミド基などのジエノフィル基；
（ｅ）たとえばイミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンまたはオキシムなどのカルボニル誘導体の形成を介して、またはグリニヤール付加またはアルキルリチウム付加などのメカニズムを介して、その後の誘導体化が可能なような、アルデヒドまたはケトン基；
（ｆ）たとえばスルホンアミドを形成するための、その後のアミンとの反応のためのスルホニルハライド基；
（ｇ）たとえばジスルフィドに変換できるか、ハロゲン化アシルと反応できる、チオール基；
（ｈ）たとえばアシル化、アルキル化または酸化されうる、アミンまたはスルフヒドリル基；
（ｉ）たとえばシクロ付加、アシル化、マイケル付加などを受けることのできる、アルケン；および
（ｊ）たとえばアミンおよびヒドロキシル化合物と反応できる、エポキシド。
【０３１５】
反応性官能基は、反応性糖核または修飾基を組み立てるのに必要な反応に関与しないか、妨げないように選択することができる。あるいは、反応性官能基は、保護基の存在によって反応に関与することから保護することもできる。当業者であれば、特定の官能基を、該基が選択された一連の反応条件を妨げないように、保護する方法を理解しているであろう。有用な保護基の例として、たとえば、Ｇｒｅｅｎｅら，「有機合成における保護基（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ニューヨーク、１９９１年を参照のこと。
【０３１６】
以下の議論においては、本発明を実施するのに有用な修飾された糖の多数の具体例が挙げられている。例示的実施形態において、修飾基が付着される糖核として、シアル酸誘導体が用いられている。シアル酸誘導体についての議論の焦点は、説明を明確化することだけであり、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。当業者であれば、シアル酸を例に用いて示したものと同様にして、様々な他の糖部分を活性化することができ、誘導体化することができることを理解するであろう。たとえば、いくつか例をあげると、ガラクトース、グルコース、Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびフコースといった当該技術分野で認識されている方法によって容易に修飾されるものを、修飾するために様々な方法を利用することができる。たとえば、Ｅｌｈａｌａｂｉら、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：９３（１９９９年）；およびＳｃｈａｆｅｒら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６５：２４（２０００年））を参照のこと。
【０３１７】
例示的実施形態において、本発明の方法によって修飾されるＧ−ＣＳＦペプチドは、哺乳動物細胞（たとえばＣＨＯ細胞）またはトランスジェニック動物において産生され、したがって、不完全にシアリル化されたＮ−および／またはＯ−結合型オリゴサッカリド鎖を含む糖ペプチドである。シアル酸を含まず末端ガラクトース残基を含む糖ペプチドのオリゴサッカリド鎖は、ＰＥＧ化、ＰＰＧ化、またはいずれにせよ修飾されたシアル酸によって修飾することができる。
【０３１８】
スキーム４において、アミノグリコシド１を保護されたアミノ酸（たとえばグリシン）誘導体の活性エステルによって処理して、糖アミン残基を対応する保護されたアミノ酸アミド付加物に変換する。付加物をアルドラーゼで処理して、α−ヒドロキシカルボキシレート２を形成する。化合物２をＣＭＰ−ＳＡシンセターゼの作用によって対応するＣＭＰ誘導体に変換し、その後ＣＭＡＰ誘導体の触媒的水素添加によって化合物３を生成する。グリシン付加物の形成を介して導入されたアミンは、化合物３を活性化ＰＥＧまたはＰＰＧ誘導体（たとえば、ＰＥＧ−Ｃ（Ｏ）ＮＨＳ、ＰＥＧ−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−ｐ−ニトロフェニル）と反応させることにより、それぞれ４または５などの種を生成するＰＥＧ付着の場所として利用される。
【０３１９】
【化５２】
0005922065.tif 000055
表３は、ＰＥＧ部分によって誘導体化された糖一リン酸塩の代表例を示す。表３の化合物のあるものは、スキーム４の方法によって調製される。他の誘導体は、当該技術分野で認識される方法によって調製される。たとえば、Ｋｅｐｐｌｅｒら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １１：１１Ｒ（２００１年）；およびＣｈａｒｔｅｒら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０：１０４９（２０００年））を参照のこと。他のアミン反応性ＰＥＧおよびＰＰＧ類似体は市販されているか、当業者が容易に利用できる方法によって調製することができる。
【０３２０】
【表３】
0005922065.tif 000056
本発明を実施する際に使用する修飾された糖のリン酸塩は、上に示した以外の場所で置換することもできる。現時点で好ましいシアル酸の置換は、下記の式に示す通りである。
【０３２１】
【化５３】
0005922065.tif 000057
式中、Ｘは、好ましくは、−Ｏ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｓ，ＣＨ2−および−Ｎ（Ｒ）2から選択される連結基であり、各Ｒは独立してＲ1〜Ｒ5から選択されたメンバーである。符号
Ｙ，Ｚ，ＡおよびＢはそれぞれ、Ｘの正体について上記に示した群の中から選択される基を示す。Ｘ，Ｙ，Ｚ，ＡおよびＢはそれぞれ独立して選択され、同じであっても異なっていてもよい。符号Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4およびＲ5は、Ｈ、ＰＥＧ部分、治療的部分、生体分子または他の部分を表す。あるいは、これらの符号は、ＰＥＧ部分、治療的部分、生体分子または他の部分に結合されたリンカーを表す。
【０３２２】
本明細書中に開示する共役体に付着される部分の例としては、限定はされないが、ＰＥＧ誘導体（たとえば、アシル−ＰＥＧ、アシル−アルキル−ＰＥＧ、アルキル−アシル−ＰＥＧカルバモイル−ＰＥＧ、アリール−ＰＥＧ）、ＰＰＧ誘導体（たとえば、アシル−ＰＰＧ、アシル−アルキル−ＰＰＧ、アルキル−アシル−ＰＰＧカルバモイル−ＰＰＧ、アリール−ＰＰＧ）、治療的部分、診断的部分、マンノース−６−ホスフェート、ヘパリン、ヘパラン、ＳＬｅｘ、マンノース、マンノース−６−ホスフェート、シアリルＬｅｗｉｓＸ、ＦＧＦ、ＶＦＧＦ、タンパク質、コンドロイチン、ケラチン、デルマタン、アルブミン、インテグリン、アンテナ型（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）オリゴサッカリド、ペプチドなどが挙げられる。様々な修飾基をサッカリド部分に共役する方法は、当業者によって容易に利用できるものである（ポリ（エチレングリコール）化学：バイオ技術およびバイオ医学的用途（ＰＯＬＹ（ＥＴＨＹＬＥＮＥ  ＧＬＹＣＯＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ：ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ），Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂ．Ｃｏｒｐ．、１９９２年；ポリ（エチレングリコール）化学および生物用途（ＰＯＬＹ（ＥＴＨＹＬＥＮＥ  ＧＬＹＣＯＬ）ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ），Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ編，ＡＣＳシンポジウムシリーズＮｏ．６８０，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９７年；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，バイオコンジュゲート技術（ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ），アカデミックプレス、サンジエゴ、１９９６年；およびＤｕｎｎら編、高分子薬物および薬物送達系（ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ  ＤＲＵＧＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ）、ＡＣＳシンポジウムシリーズＶｏｌ．４６９，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，ワシントンＤ．Ｃ．、１９９１年）。
リンカー基（架橋基）
本発明の方法において用いる修飾された糖の調製には、糖残基へのＰＥＧ部分の付着と、好ましくは、グリコシルトランスフェラーゼに対する基質である安定な付加物を形成することが含まれる。したがって、リンカー、たとえば、ＰＥＧおよび糖部分を架橋剤と反応させてＰＥＧと糖とを共役させることによって作成されるものを用いることが好ましい。修飾基を炭水化物部分に付着させるために用いることのできる二官能性化合物としては、限定はされないが、たとえば、二官能性ポリ（エチレングリコール）、ポリアミド、ポリエーテル、ポリエステルなどが挙げられる。炭水化物を他の分子に連結するための一般的な手法は、文献中で知られている。たとえば、Ｌｅｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：１８５６（１９８９年）；Ｂｈａｔｉａら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７８：４０８（１９８９年）；Ｊａｎｄａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：８８８６（１９９０年）およびＢｅｄｎａｒｓｋｉら、ＷＯ９２／１８１３５を参照のこと。以下の議論においては、反応性基は新生修飾された糖の糖部分上で良性であるものとして扱う。議論の焦点は説明を明確化することにある。当業者であれば、議論が修飾基上の反応性基にも関係していることを理解するであろう。
【０３２３】
分子内化学架橋によって修飾された糖の成分を修飾するために様々の試薬が用いられる（架橋試薬および架橋方法の再検討には、Ｗｏｌｄ，Ｆ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５：６２３〜６５１頁，１９７２年；Ｗｅｅｔａｌｌ，Ｈ．Ｈ．およびＣｏｏｎｅｙ，Ｄ．Ａ．，Ｉｎ：ＥＮＺＹＭＥＳ  ＡＳ  ＤＲＵＧＳ（ＨｏｌｃｅｎｂｅｒｇおよびＲｏｂｅｒｔｓ編）３９５〜４４２頁、Ｗｉｌｅｙ，ニューヨーク、１９８１；Ｊｉ，Ｔ．Ｈ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９１：５８０〜６０９頁、１９８３年；Ｍａｔｔｓｏｎ
ら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１７：１６７〜１８３頁、１９９３年を参照のこと。これらのすべては参照により本願に組み込む）。好ましい架橋試薬は、様々なゼロ長、ホモ二官能性、およびヘテロ二官能性架橋試薬から派生する。ゼロ長架橋試薬は、外部材料を導入することなく、２つの内在化学基を直接共役することを含んでいる。ジスルフィド結合の形成を触媒する物質は、この範疇に属する。別の例は、カルボキシルと一級アミン基の縮合を誘導して、カルボジイミド、クロロギ酸エチル、Ｗｏｏｄｗａｒｄ’ｓ試薬Ｋ（２−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−３’−スルホネート）、およびカルボニルジイミダゾールなどのアミド結合を形成する試薬である。これらの化学試薬に加えて、酵素トランスグルタミナーゼ（グルタミル−ペプチドγ−グルタミルトランスフェラーゼ；ＥＣ２．３．２．１３）を、ゼロ長架橋剤として用いてもよい。この酵素は、タンパク質が結合したグルタミニル残基のカルボキサミド基におけるアシル転移反応を、通常は一級アミノ基を基質として触媒する。好ましいホモおよびヘテロ二官能性試薬は、それぞれ、アミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドールまたは非特異的基に対して反応性であってもよい、２つの同じまたは２つの非類似の部位を含む。
不溶性Ｇ−ＣＳＦのリフォールディング
細菌において発現される多くの組み替えタンパク質は、細菌の封入体中で、不溶性凝集体として発現される。封入体は、細菌の細胞質およびペリプラズム空間の両方において見られるタンパク質沈積物である。（たとえば、Ｃｌａｒｋ，Ｃｕｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：２０２〜２０７頁（２００１年）を参照のこと）。組み替えＧ−ＣＳＦタンパク質は細菌封入体中で発現され、これらのタンパク質をリフォールディングして活性なＧ−ＣＳＦタンパク質を産生する方法をここに示す。
活性Ｇ−ＣＳＦのリフォールディングのための条件
細菌細胞から活性Ｇ−ＣＳＦタンパク質を生産するために、Ｇ−ＣＳＦタンパク質を、細菌封入体中で発現させ、細菌を集菌して破砕し、封入体を単離し、洗浄する。一実施形態において、次の３回の洗浄を行う。ｐＨ６．０〜９．０のバッファ、一価の塩（たとえば塩化ナトリウム）、非イオン性界面活性剤（たとえばＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、イオン性界面活性剤（たとえばデオキシコール酸ナトリウム）；およびＥＤＴＡ中での第１回目の洗浄、界面活性剤を含まないバッファ中での第２回目の洗浄、およびＨ2Ｏ中での第３回目の洗浄である。次に封入体内のタンパク質を可溶化する。可溶化は、変性剤である塩化グアニジンまたは尿素、極端なｐＨ、または界面活性剤またはそれらの任意の組み合わせを用いて行うことができる。一実施形態において、５〜６ＭグアニジンＨＣｌまたは尿素を用いてＧＣＳＦを可溶化する。さらなる実施形態において、ＤＴＴが加えられる。
【０３２４】
可溶化後、変性剤をＧＣＳＦタンパク質混合物から除去する。変性剤の除去は、リフォールディングバッファでの希釈またはバッファ交換を含む様々な方法によって行うことができる。バッファ交換方法としては、透析、ダイアフィルトレーション、ゲル濾過、および固体支持体へのタンパク質の固定化が挙げられる（たとえば、Ｃｌａｒｋ，Ｃｕｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：２０２〜２０７頁（２００１年）を参照のこと）。上記方法のいずれも変性剤を除去するために組み合わせることができる。
【０３２５】
ＧＣＳＦタンパク質におけるジスルフィド結合の形成は、酸化還元対を含むリフォールディングバッファを添加することにより促進される。酸化還元対としては、還元型および酸化型グルタチオン（（−ＪＳＦ−Ｉ／ＧＳＳＧ）、システイン／シスチン、システアミン／シスタミン、ＤＴＴ／ＧＳＳＧ、およびＤＴＥ／ＧＳＳＧが挙げられる（たとえば、Ｃｌａｒｋ，Ｃｕｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：２０２〜２０７頁（２００１年）を参照のこと）。一実施形態において、酸化還元対は、１０：１比のＧＳＨ／ＧＳＳＧである。
【０３２６】
リフォールディングは、たとえばｐＨが６．０〜１０．０の範囲のバッファ中で行うことができる。リフォールディングバッファは、リフォールディングを増進するための他の
添加物、Ｌ−アルギニン（０．４〜１Ｍ）；ＰＥＧ；低濃度の変性剤、たとえば尿素（１〜２Ｍ）や塩化グアニジン（０．５〜１．５Ｍ）など；および界面活性剤（たとえば、Ｃｈａｐｓ，ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、ラウリルマルトシド，Ｔｗｅｅｎ８０，およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を含んでいてもよい。
【０３２７】
リフォールディング後、ＧＣＳＦタンパク質を透析して、酸化還元対または他の不要なバッファ成分を除去することができる。一実施形態において、透析は、酢酸ナトリウム、グリセロール、および、Ｔｗｅｅｎ−８０などの非イオン性界面活性剤を含むバッファを用いて行う。透析後、ＧＣＳＦタンパク質は、イオン交換クロマトグラフィーにより、さらに精製するか、および／または濃縮することができる。一実施形態において、ＳＰ−セファロースカチオン交換樹脂が用いられる。
【０３２８】
当業者であれば、リフォールディングされたタンパク質が検出可能な生物活性を有していれば、そのタンパク質は適切にリフォールディングされているということを理解しているであろう。ＧＣＳＦタンパク質に対しては、生物活性は、様々な方法を用いて測定することができる、たとえば、生物活性のあるＧＣＳＦタンパク質は、２００４年１月８日に提出された米国特許出願６０／５３５２８４；２００４年２月１２日に提出された６０／５４４４１１；および２００４年２月２０日に提出された代理人事件番号０１９９５７−０１８８２０ＵＳ（そのそれぞれをあらゆる目的のために参照により本願に組み込む）に記載される、Ｏ−結合型グリコシル化に対する基質である。ＧＣＳＦタンパク質活性は、細胞増殖アッセイまたはラットにおける白血球（ＷＢＣ）アッセイを用いて測定することもできる（２００４年１月８日に提出された米国特許出願６０／５３５２８４、２００４年２月１２日に提出された６０／５４４４１１、および２００４年２月２０日に提出された代理人事件番号０１９９５７−０１８８２０ＵＳ（そのそれぞれをあらゆる目的のために参照により本願に組み込む）にも記載されている。）。増殖アッセイおよびＷＢＣアッセイは、リフォールディングされたＧＣＳＦタンパク質のＯ−結合型グリコシル化の前または後に行うことができる。
本発明の共役体の単離方法
あるいは、上記の製法によって産生された生成物は、精製せずに用いてもよい。しかしながら、通常は生成物を回収することが好ましい。グリコシル化サッカリドに対する標準的な周知の回収技術、たとえば、薄層または厚層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または膜濾過などを用いることができる。膜濾過、より好ましく逆浸透膜を使用した膜濾過を使用すること、または、後で議論し、引用文献中にあるような回収のための１つ以上のカラムクロマトグラフィー技術を使用することが好ましい。たとえば、約３０００〜約１０，０００の分子量をカットオフする膜を用いた膜濾過を用いて、グリコシルトランスフェラーゼなどのタンパク質を除去することができる。次にナノ濾過または逆浸透を用いて、塩を除去、および／または生成物サッカリドを精製することができる（たとえば、ＷＯ９８／１５５８１を参照のこと）。ナノ濾過膜は、一価の塩は通すが、多価の塩および使用する膜に応じて約１００から約２，０００ダルトンより大きい非荷電溶質は留まらせるクラスの逆浸透膜である。したがって、典型的な用途において、本発明の方法によって調製されるサッカリドは、膜中に保持され、混入した塩は通過することになる。
【０３２９】
修飾されたグリコタンパク質が、細胞内で産生される場合には、第１の工程として、粒子状残骸破片、宿主細胞または溶解断片のいずれかを、たとえば、遠心分離または超遠心分離によって除去し（任意選択で、タンパク質は市販のタンパク質濃縮フィルタを用いて濃縮してもよい）、その後、免疫親和性クロマトグラフィー、イオン交換カラム分画（たとえば、カルボキシメチルまたはスルホプロピル基を含むジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）またはマトリックス上）、Ｂｌｕｅ−セファロース、ＣＭＢｌｕｅ−セファロース、ＭＯＮＯ−Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ、レンチルレクチン−セファロース、ＷＧＡ−セファロース
、Ｃｏｎ  Ａ−セファロース、エチルＴｏｙｏｐｅａｒｌ、ブチルＴｏｙｏｐｅａｒｌ、フェニルＴｏｙｏｐｅａｒｌ、またはタンパク質Ａセファロース上でのクロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィー、シリカクロマトグラフィー、クロマト分画、逆相ＨＰＬＣ（たとえば、脂肪族基が添加されたシリカゲル）、たとえば、セファデックス分子ふるいまたはサイズ排除クロマトグラフィーを用いたゲル濾過、ポリペプチドを選択的に結合するカラムによるクロマトグラフィー、およびエタノールまたは硫酸アンモニウム沈殿から選択される１つ以上の工程によって、ポリペプチドバリアントを他の不純物から分離する。
【０３３０】
培養中に産生される修飾された糖ペプチドは、通常は、細胞、酵素などからの最初の抽出によって単離され、その後、１回以上の濃縮、塩析、水性イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフィー工程を行う。さらに、修飾された糖タンパク質は、親和性クロマトグラフィーによって精製してもよい。最終的に、ＨＰＬＣを最終精製工程のために用いてもよい。
【０３３１】
タンパク分解を阻害するために、プロテアーゼ阻害剤、たとえば、フッ化メチルスルホニル（ＰＭＳＦ）が、前述のいずれの工程に含まれていてもよく、外来の混入物の成長を予防するために抗生物質が含まれていてもよい。
【０３３２】
別の実施形態において、本発明の修飾された糖ペプチドを産生する系からの上清を、まず最初に市販のタンパク質濃縮フィルタ、たとえばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅＰｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を用いて濃縮する。濃縮工程に続いて、濃縮物を適切な精製マトリックスにかけてもよい。たとえば、適切な親和性マトリックスは、適切な支持体に結合した、ペプチドに対するリガンド、レクチン、または抗体分子からなるものであってよい。あるいは、アニオン交換樹脂、たとえば、懸垂ＤＥＡＥ基を有したマトリックスまたは基板を用いてもよい。適切なマトリックスとしては、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製において一般的に用いられる他のタイプのものが挙げられる。あるいは、カチオン交換工程を用いてもよい。適切なカチオン交換体としては、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスが挙げられる。スルホプロピル基が特に好ましい。
【０３３３】
最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、たとえば懸垂メチルまたは他の脂肪族基を有したシリカゲルを用いた１つ以上のＲＰ−ＨＰＬＣ工程を使用して、ポリペプチドバリアント組成物をさらに精製してもよい。前述の精製工程のいくつかまたはすべてを、様々な組み合わせにおいて、均質な修飾された糖タンパク質を提供するために用いることができる。
【０３３４】
大量発酵で得られる本発明の修飾された糖ペプチドは、Ｕｒｄａｌら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１（１９８４年）によって開示されるようなものと同様の方法によって精製することができるが、この引例は、調製用ＨＰＬＣカラム上での、組み替えヒトＩＬ−２の精製に対する連続する２つのＲＰ−ＨＰＬＣ工程について述べている。あるいは、アフィニティクロマトグラフィーなどの技術を用いて、修飾された糖タンパク質を精製してもよい。
医薬組成物
別の態様において、本発明は、医薬組成物を提供する。医薬組成物は、医薬として許容される希釈剤と、天然には存在しない、ＰＥＧ部分、治療的部分または生体分子と、グリコシル化または非グリコシル化ペプチドの間の共有結合共役体とを含む。ポリマー、治療的部分または生体分子は、Ｇ−ＣＳＦペプチドと、ポリマー、治療的部分または生体分子の間に介在してその両方に共有結合されたインタクトなグリコシル連結基を介して、Ｇ−ＣＳＦペプチドに共役されている。
【０３３５】
本発明の医薬組成物は、様々な薬物送達系において使用するのに適している。本発明において用いるのに適した調剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルベニア州フィラデルフィア、第１７版（１９８５年）に見出すことができる。薬物送達についての方法を簡単に知るには、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７〜１５３３頁（１９９０年）を参照のこと。
【０３３６】
医薬組成物は、たとえば、局所、経口、経鼻、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下または筋肉内投与を含む任意の適切な投与方法のために調合することができる。皮下注射などの非経口投与のためには、担体は、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂質、ワックスまたはバッファからなる。経口投与のためには、上記担体のうちの任意のものまたは固体担体、たとえばマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マンガン、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロースおよび炭酸マグネシウムを用いてもよい。生分解性ミクロスフェア（たとえば、ポリラクテート、ポリグリコレート）を本発明の医薬組成物に対する担体として用いてもよい。適切な生分解性ミクロスフェアは、たとえば、米国特許第４，８９７，２６８号および第５，０７５，１０９号に開示されている。
【０３３７】
一般に、医薬組成物は、非経口的に、たとえば静脈内投与される。したがって、本発明は、許容される担体中、好ましくは水性担体、たとえば水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳなどに溶解または懸濁された化合物を含む、非経口投与のための組成物を提供する。組成物は、生理学的条件を最適化するのに必要とされるような医薬として許容される補助物質、たとえば、ｐＨ調製および緩衝物質、張性調節物質、湿潤化物質、界面活性剤などを含んでいてもよい。
【０３３８】
これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌してもよいし、細菌濾過してもよい。得られる水性溶液はそのまま使用のために充填してもよいし、凍結乾燥して、その凍結乾燥調製物を投与までは滅菌水性担体と一緒にしておくこともできる。調製物のｐＨは典型的には３〜１１、より好ましくは５〜９、最も好ましくは７〜８となる。
【０３３９】
いくつかの実施形態において、本発明の糖ペプチドは、標準的な小胞形成脂質から形成されるリポソーム中に組み込むことができる。リポソームの調製のためには、たとえば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０），米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号および第４，８３７，０２８号に記載されるような、様々な方法を利用できる。様々なターゲティング剤を用いたリポソームのターゲティング（たとえば、本発明のシアリルガラクトシダーゼ）は、当該技術分野において周知である（たとえば、米国特許第４，９５７，７７３号および第４，６０３，０４４号を参照のこと）。
【０３４０】
ターゲティング剤をリポソームに連結するための標準的な方法を用いることができる。これらの方法は、一般には、ターゲティング剤の付着のために活性化可能である、ホスファチジルエタノールアミンなどの脂質成分のリポソーム、または本発明の脂質から誘導体化された糖ペプチドなどの誘導体化親油性化合物への組み込みを含む。
【０３４１】
ターゲティング機構では、一般に、ターゲティング部分がたとえば細胞表面受容体などの標的との相互作用に利用できるような様式で、ターゲティング剤がリポソームの表面上に配置される必要がある。本発明の炭水化物は、リポソームが形成される前に、当業者によって知られる方法（たとえば、それぞれ、長鎖ハロゲン化アルキルまたは脂肪酸による、炭水化物上に存在するヒドロキシル基のアルキル化またはアシル化）を用いて付着させてもよい。あるいは、リポソームは、コネクタ部分がまず最初に膜形成時に膜に組み込ま
れるように設計してもよい。コネクタ部分は、膜中にしっかりと包埋され繋留された親油性部分を有しているはずである。また、リポソームの水性表面上で化学的に利用できる、反応性部分も有しているはずである。この反応性部分は、後で加えられるターゲティング剤または炭水化物と安定な化学結合を形成するのに化学的に適するように、選択される。場合によっては、ターゲット剤をコネクタ分子に直接付着させることもできるが、殆どの例では、化学架橋として機能する第３の分子を用いて、膜中にあるコネクタをターゲット剤または小胞表面から三次元的に延長された炭水化物と連結することがより適している。
【０３４２】
本発明の方法によって調製される化合物は、診断用試薬としての用途もある。たとえば、標識された化合物は、炎症を有することが疑われる患者における炎症または腫瘍転移の位置を特定するために用いることができる。この用途のために、化合物を125Ｉ、14Ｃ、またはトリチウムで標識することができる。
【０３４３】
本発明の医薬組成物において用いられる活性成分は、たとえば、排卵を増加させる卵胞刺激ホルモンの生物学的性質を有するグリコＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦおよびその誘導体である。好ましくは、本発明のＧ−ＣＳＦ組成物は、非経口的に（たとえば、ＩＶ（静脈内）、ＩＭ（筋肉内）、ＳＣ（皮下）またはＩＰ（腹腔内））投与される。有効投与量は、治療すべき状態および投与経路によって相当に変わることが予想されるが、体重１ｋｇあたりに約０．１μｇ（〜７Ｕ）から１００μｇ（〜７０００Ｕ）の範囲の活性物質であると予想される。貧血症状の治療のための好ましい投与量は、体重１ｋｇあたり、週に３回、約５〜約３００ユニットである。本発明は、Ｇ−ＣＳＦを増大したｉｎ  ｖｉｖｏ滞留時間のあいだ提供するので、上に述べた投与量は、本発明の組成物が投与される場合には任意選択で低くされる。
剤形
好ましい態様において、上記の任意の方法によれば、造血または骨髄抑制に関連する状態を治療するために用いられるペプチド共役体は、経口剤形で提供される。好ましい実施形態において、これらの経口剤形は以下の成分を含む。（ａ）Ｇ−ＣＳＦペプチドと水溶性ポリマーの間の共有結合共役体であるペプチドであって、水溶性ポリマーが、インタクトなグリコシル連結基を介してＧ−ＣＳＦペプチドのグリコシルまたはアミノ酸残基において、Ｇ−ＣＳＦペプチドに共有結合されているもの、（ｂ）１つ以上の界面活性剤、（ｃ）１つ以上の脂肪酸、および（ｄ）腸溶材料。特に好ましい実施形態において、ペプチド、界面活性剤および脂肪酸は、液相において混合され、腸溶材料と合わせる前に凍結乾燥される。
【０３４４】
本明細書中に記載した例および実施形態は、説明だけを目的としており、これに鑑みた様々な改変または変更が当業者には示唆され、これらは本願の精神と範囲内、および添付の請求項の範囲内で含まれるものと理解すべきである。本明細書中で引用したすべての出版物、特許および特許出願は、参照によりそれらの全体があらゆる目的のために本願に組み込まれる。
【０３４５】
以下の実施例は、本発明の組成物および方法を説明するために提供されるものであって、請求される発明を限定するものではない。
実施例
実施例１：本発明のＧ−ＣＳＦＣ共役体ペプチドに応答した、好中球数に対する薬物動態データ
本発明のＧ−ＣＳＦ共役体および市販のＧ−ＣＳＦニューラスタ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）に応答した好中球数の薬物動態研究により、本発明の組成物が、同濃度のニューラスタと同様の作用時間経過を示すことがわかった（図１）。好中球数には用量依存性が見られ、本発明のＧ−ＣＳＦ共役体（グリコ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ）の濃度を増加させていくと、活性の時間経過のピークにおける好中球数が増加した。グリコ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦは、
ニューラスタよりも約３０％大きな反応を与え、このことは、グリコ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦに対するバイオアベイラビリティが同一の用量のニューラスタに比べて、６０％高いことを示すものである。
【０３４６】
この研究には５３人の対象を含めた。各用量群は２０人の対象を含み、１５人の対象をグリコ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦに対して無作為抽出し、５人の対象をニューラスタに対して無作為抽出した。グリコ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦは一般的にはニューラスタと同様の有害事象プロファイルを持ち、良好な耐容性を示した。有害事象に対する中断は見られなかった。また、重篤な有害事象もなんら見られなかった。さらに、グリコ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦに対する抗体は検出されなかった。
【０３４７】
表４は、グリコ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ投与から２４〜１６８時間後の期間にわたって、３つの異なるグリコ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ濃度に対する各データポイントを示したものである。
【０３４８】
【表４】
0005922065.tif 000058
実施例２：本発明のＧ−ＣＳＦ共役体ペプチドに応答した、ＣＤ３４＋数に対する薬物動態データ
本発明のＧ−ＣＳＦ共役体（グリコ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ）と市販のＧ−ＣＳＦニューラスタに応答した、ＣＤ３４＋数の薬物動態研究により、本発明の組成物は、同濃度のニューラスタと同様の作用時間経過を有することが示された（図２）。グリコ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦは、同濃度のニューラスタに比べて、その活性ピークにおいて有意に高いＣＤ３４＋数を示した。
【０３４９】
細胞数には用量依存性があり、グリコ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの濃度の増加に伴い、活性の時間経過のピークにおける好中球数が増加した。
表５は、グリコ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ投与から７２〜１６８時間後の期間にわたって、３つの異なるグリコ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ濃度に対する各データポイントを示したものである。
【０３５０】
【表５】
0005922065.tif 000059
実施例３：本発明のＧ−ＣＳＦ共役体ペプチドに応答した、好中球数に対する薬物動態データ：固定用量研究
本発明のＧ−ＣＳＦ共役体（グリコ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ）と市販のＧ−ＣＳＦニューラスタに応答した、好中球数の固定用量薬物動態研究により、本発明の組成物は、ニューラスタと同様の作用時間経過を有することが示された（図４）。グリコ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦは、ニューラスタよりも約３０％大きな反応を与え、このことは、この用量において、ニューラスタに比べてグリコ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦに対するバイオアベイラビリティが、６０％高いことを示すものである。
【０３５１】
この研究では３６人の健康な対象を用いた。グリコ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦは一般には良好な耐容性を示し、ニューラスタと類似した有害事象を示した。有害事象に対する中断は無く、重篤な有害事象も見られなかった。グリコ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦに対する抗体は検出されなかった。
実施例４：本発明のＧ−ＣＳＦ共役体ペプチドに応答した、ＣＤ３４＋数に対する薬物動態データ：固定用量研究
本発明のＧ−ＣＳＦ共役体（グリコ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ）と市販のＧ−ＣＳＦニューラスタに応答した、ＣＤ３４＋数の固定用量薬物動態研究により、本発明の組成物は、ニューラスタと同様の作用時間経過を有することが示された（図５）。
実施例５：同種異系／自己由来のＣＤ３４＋末梢血始原細胞の動員
骨髄移植ドナーを１０〜２０μｇ／ｋｇのグリコシル化ＧＣＳＦ（グリコ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ）によって５日間処理して、ＣＤ３４＋細胞を休止レベル（〜２／μＬ）から、１回のアフェレーシスにつき２〜４×１０6ＣＤ３４＋細胞／ｋｇを提供するのに十分な
量である約１０／μＬまで増加させた。骨髄移植ドナーは、同種異系（レシピエントと同じ）または、自己（レシピエントと異なる）のドナーであってよい。
【図１】
0005922065.tif 000074
【図２】
0005922065.tif 000075
【図３】
0005922065.tif 000076
【図４】
0005922065.tif 000077
【図５】
0005922065.tif 000078
【図６】
0005922065.tif 000079
【図７】
0005922065.tif 000080
【図８】
0005922065.tif 000081
【図９】
0005922065.tif 000082
【図１０】
0005922065.tif 000083
【配列表】
0005922065000001.app