(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）金属ステントの表面に下記式１で表されるチタン酸化物をコーティングする酸化チタンコーティングステップと、
２）前記コーティングされた酸化チタン層の表面を改質してヒドロキシ基を導入させる表面改質ステップと、
３）薬物の官能基を前記酸化チタン層のヒドロキシ基と結合させ、前記表面が改質された酸化チタン層の上部に薬物を付着させて、薬物層を形成する薬物付着ステップ、および
４）オリゴヌクレオチドを前記薬物と結合させ、前記薬物層の上部にオリゴヌクレオチドを付着させて、オリゴヌクレオチド層を形成するオリゴヌクレオチド付着ステップ
を含むことを特徴とするチタン酸化物薄膜コーティングを用いた遺伝子伝達ステントの製造方法。
【化１】
0005922674.tif 000005
【請求項２】
前記チタン酸化物は、ＴｉＯ２、ＴｉＯ２−ｘＮｘ（０．００１≦ｘ≦１）またはこれらの混合物であることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記１）の酸化チタンコーティングステップは、プラズマ真空チャンバー内にチタン前駆体、搬送ガスおよび反応ガスを移送し、プラズマを発生させて、１時間〜６時間金属ステントの表面に酸化チタン薄膜をコーティングすることを特徴とする、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記金属ステントは、ステンレス鋼、ニチノール、タンタル、白金、チタニウム、コバルト、クロム、コバルト−クロム合金またはコバルト−クロム−モリブデン合金であることを特徴とする、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記２）の表面改質ステップは、プラズマ真空チャンバー内に水蒸気、または酸素および水素を移送し、低温プラズマを発生させて、１０分〜２時間酸化チタン薄膜の表面を改質することを特徴とする、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項６】
前記チタン前駆体は、チタニウムブトキシド、テトラエチルメチルアミノチタニウム、チタニウムエトキシド、チタニウム−イソプロポキシドおよびテトラ−メチル−ヘプタ−ジエン−チタニウムからなる群から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項３に記載の製造方法。
【請求項７】
前記搬送ガスは、窒素、アルゴン、ヘリウムからなる群から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項３に記載の製造方法。
【請求項８】
前記反応ガスは、水蒸気、オゾン、および酸素から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項３に記載の製造方法。
【請求項９】
前記反応ガスに窒素を添加することによって窒素がドープされた酸化チタンが形成されることを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記３）ステップの薬物は、アブシキシマブ、ＡＬＡ、ヘパリンのうちいずれか一つ以上が選択されて付着していることを特徴とする、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記４）ステップのオリゴヌクレオチドは、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｐＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記４）のオリゴヌクレオチド付着ステップは、オリゴヌクレオチドにある官能基が前記薬物にある官能基との間に水素結合、双極子−双極子結合、誘起双極子結合、およびジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）のうちいずれか一つ以上の結合によって付着していることを特徴とする、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項１３】
金属ステントの表面がＴｉＯ２、ＴｉＯ２−ｘＮｘ（０．００１≦ｘ≦１）またはこれらの混合物でコーティングされ、前記コーティングされた表面を改質させてヒドロキシ基を導入した酸化チタン層と、
薬物の官能基が前記酸化チタン層のヒドロキシ基と結合して、薬物が前記酸化チタン層の上部に付着している薬物層、および
前記薬物層の上部にオリゴヌクレオチドが前記薬物と結合して付着しているオリゴヌクレオチド層
を含むことを特徴とするチタン酸化物薄膜コーティングを用いた遺伝子伝達ステント。
【請求項１４】
前記酸化チタン層は、二酸化チタン薄膜または窒素がドープされた酸化チタン（ＴｉＯ２−ｘＮｘ（０．００１≦ｘ≦１））薄膜であることを特徴とする、請求項１３に記載の遺伝子伝達ステント。
【請求項１５】
前記薬物は、アブシキシマブ、ＡＬＡ、ヘパリンのうちいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項１３に記載の遺伝子伝達ステント。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドは、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｐＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンス−オリゴヌクレオチドからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の遺伝子伝達ステント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チタン酸化物薄膜コーティングを用いた遺伝子伝達ステントおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管挿入用ステントは、主に動脈硬化斑、新生組織、血餅などによって血管内径が減少して血流の流れが閉鎖されたか円滑でない疾患部位に移植して、血管の内径を増加させる治療の目的で用いられる体内挿入物である。
【０００３】
このようなステントが主に用いられる疾患は心血管疾患であって、全世界の死亡原因の３０％以上を占めており、毎年１７５０万人以上が死亡している。このような心臓疾患のうち最も大きい比重を占める虚血性心臓疾患は、心臓筋肉に血液を供給する冠状動脈に問題（動脈硬化斑、新生組織、血餅）が発生するものであるが、これに対する治療方法は、大きく、非侵襲的（薬物治療）な方法と侵襲的な方法（血管形成術）に分けられる。この中、侵襲的な方法である従来の血管形成術に用いられる血管移植用ステント（ｂａｒｅ  ｍｅｔａｌ  ｓｔｅｎｔ）は、冠状動脈の内径を拡張して固定させる優れた治療効果を有しているが、移植後に発生する再狭窄が最も大きい問題として学界および臨床治療分野で報告されている。
【０００４】
前記のような再狭窄を防止するために開発されたものが薬剤溶出性ステント（ＤＥＳ）であり、患者の再狭窄発生率を画期的に減少させた。しかし、抗血栓剤（アスピリンおよびクロピドグレル）を用いた治療を併行するにもかかわらず、薬剤溶出性ステントは、移植３年あるいは５年以上の患者から、以前の動物実験ではよく現れなかった後期血栓形成が現れている。これは、薬剤溶出性ステントが血管平滑筋細胞の増殖または炎症反応などを効果的に抑制したりもするが、同時に血管内皮細胞の成長も過度に抑制し、その結果、ステント表面を覆う治療過程（ｒｅ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｚａｔｉｏｎ）が遅れて起こるという仮説が現在までは有力に受け取られている。
【０００５】
このような理由により、血管平滑筋細胞の増殖を抑制し、且つ、血管内皮細胞の成長は妨害しない理想的な方法を探すための努力が国内外で持続しているが、基本的に薬剤溶出性ステントのために用いられる薬物は、化学物質の特性上、特定細胞にのみ影響を及ぼすことは不可能である。そこで、代案として提示されたものが、比較的に細胞特異的発現が可能な遺伝子を用いた治療方法である。国内外でこれと関連して色々な研究が行われており、その結果として、２０００年、非分解性高分子中、ポリ乳酸−ポリグリコール酸（ＰＬＧＡ）、コラーゲン−ポリ乳酸−ポリグリコール酸を共に用い、ステント表面にコーティングして、ＤＮＡ放出制御型ステント（ＤＮＡ  ｃｏｎｔｒｏｌｃｏｄｇｌｙｃｏｌｉｅ  ｓｔｅｎｔ）を製造して、レポーター遺伝子であるＧＦＰ遺伝子をステントの外部に放出する方法が報告された（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００６】
また、２００６年には、Ｉｌｉａ  Ｆｉｓｈｂｅｉｎらにより、水溶性高分子であるポリアラミン  ビスホスフォネート（ＰＡＡ−ＢＰ）を金属ステントの表面にコーティングした後、アデノウイルスを結合剤を用いてさらに結合させる方法でｉＮＯＳ遺伝子を伝達して新生内膜の形成を減少させる効果を報告することにより、遺伝子伝達ステントを用いた再狭窄の抑制可能性を報告した（非特許文献３）。
【０００７】
しかし、現在までの大半の技術は、ステンレス鋼材の金属ステントに遺伝子複合体を付着するためには、金属表面に遺伝子複合体が結合できるコーティング層を生成するために非分解性有機高分子やまたは分解性コラーゲンを用いるか、あるいは遺伝子の移入効率を高めるためにウイルスベクターを用いた。
【０００８】
従来の高分子を用いた遺伝子放出ステント製造技術の場合、有機高分子の使用による過敏症、炎症反応などの問題が台頭しており、生体適合性に優れた高分子を探す問題が何よりも困難であると報告されている。また、ウイルスベクターを用いて製造された場合、依然として癌の誘発可能性および免疫反応の誘導から自由ではない。
【０００９】
これにより、遺伝子複合体コーティングのための他のコーティング物質の導入に対する必要性が台頭している。特に、このコーティング層は、遺伝子複合体が十分に結合できる適切な官能基を有し、表面が均一であり、且つ、抗血栓性および抗炎症性などの生体適合性に優れなければならない。この他にもコーティングされた高分子層が基材との接合性に優れ、機械的強度に優れてこそ、高分子薄膜が施術および消毒する過程やまたは施術後に処する強い血流を長時間耐えることができる。
【００１０】
したがって、遺伝子付着ステント施術の成功率を高めるためには、このような問題点を抱いていない薄膜材料の選択およびそのコーティング技術と遺伝子複合体付着技術の開発が必須である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｂｒｕｃｅ  Ｄ．ら，Ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｒｏｍ  ａ  ＤＮＡ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ  ｓｔｅｎｔ  ｉｎ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｉｅｓ．，ＮＡＴＵＲＥ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ．２０００年，第１８巻，ｐ１１８１−１１８４
【非特許文献２】Ｉｌｉａ  Ｆｉｓｈｂｅｉｎら，Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｌ  ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｏｆ  ｓｔｅｎｔｓ．，ＰＮＡＳ．２００６年，第１０３巻，ｐ１５９−１６４
【非特許文献３】Ｉ  Ｐｅｒｌｓｔｅｉｎら．，ＤＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｔｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｅｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ−ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｃｏａｔｉｎｇ：  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．，Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．２００３年，第１０巻，ｐ１４２０−１４２８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
そこで、本発明は、前記のようなことを認識して導き出されたものであり、より詳しくは、体内移植用金属ステントの表面をチタン酸化物でコーティングし、チタン酸化物がコーティングされた酸化チタン層の表面を改質して、その表面に薬物と遺伝子を付着させて製造することにより、後期血栓症や金属過敏症を減少できるだけでなく、細胞の成長を抑制できる遺伝子の細胞内導入を可能にすることによってステント内の血管再狭窄を防止できる効果を確認し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明の目的は、後期血栓症や金属過敏症を減少できるだけでなく、細胞の成長を抑制できる遺伝子の細胞内導入を可能にすることによってステント内の血管再狭窄を防止することができる、チタン酸化物薄膜コーティングを用いた遺伝子伝達ステントおよびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記のような目的を達成するために、本発明は、後期血栓症や金属過敏症を減少できるだけでなく、細胞の成長を抑制できる遺伝子の細胞内導入を可能にすることによってステント内の血管再狭窄を防止することができる、チタン酸化物薄膜コーティングを用いた遺伝子伝達ステントの製造方法を提供する。
【００１５】
また、本発明は、前記方法によって製造されたチタン酸化物薄膜コーティングを用いた遺伝子伝達ステントを提供する。
【００１６】
本発明による遺伝子伝達ステントは、金属ステントの表面に二酸化チタン（ＴｉＯ２）、ＴｉＯ２−ｘＮｘ（０．００１≦ｘ≦１）またはこれらの混合物からなる酸化チタン層と、前記酸化チタン層の表面を改質してヒドロキシ基を導入した酸化チタン層と薬物の官能基が前記酸化チタン層のヒドロキシ基と結合して、薬物が前記酸化チタン層の上部に付着している薬物層、および前記薬物層の上部にオリゴヌクレオチドが前記薬物と結合して付着しているオリゴヌクレオチド層を含むことを特徴とする。
【００１７】
より詳しくは、金属ステントの表面にＰＥＣＶＤ方法によって二酸化チタン、ＴｉＯ２−ｘＮｘ（０．００１≦ｘ≦１）またはこれらの混合物からなるチタン酸化物薄膜を５０〜１００ｎｍ厚さで均一にコーティングし、コーティングされた酸化チタン層の表面に十分な量の遺伝子複合体を付着するために、前記酸化チタン層を水を用いたプラズマ工程によって表面を改質して、コーティングされた酸化チタン層の表面に親水性官能基を導入させ、レオ・プロ（ＲｅｏＰｒｏ）、ヘパリン（Ｈｅｐａｒｉｎ）およびα−リポ酸（ａｌｐｈａ−ｌｉｐｏｉｃ  ａｃｉｄ）から選択される１種以上の薬物を各々独立に付着し、前記薬物の表面に遺伝子を物理的に付着して製造する。
【００１８】
本発明による遺伝子伝達ステントは、前記方法によって製造されることによって酸化チタン薄膜／薬物／遺伝子複合体構造を有することができ、前記複合体の構造は、抗炎症および抗血栓の作用がある薬物の搭載と同時に血管平滑筋細胞の増殖を抑制できる遺伝子を伝達できるという長所がある。
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明は、
１）金属ステントの表面に下記式１で表されるチタン酸化物をコーティングする酸化チタンコーティングステップと、
２）前記コーティングされた酸化チタン層の表面を改質してヒドロキシ基を導入させる表面改質ステップと、
３）薬物の官能基を前記酸化チタン層のヒドロキシ基と結合させ、前記表面が改質された酸化チタン層の上部に薬物を付着させて、薬物層を形成する薬物付着ステップ、および
４）オリゴヌクレオチドを前記薬物と結合させ、前記薬物層の上部にオリゴヌクレオチドを付着させて、オリゴヌクレオチド層を形成するオリゴヌクレオチド付着ステップ、
を含むことを特徴とするチタン酸化物薄膜コーティングを用いた遺伝子伝達ステントの製造方法を提供する。図１を参照する。
【００２１】
【化１】
0005922674.tif 000002
【００２２】
本発明において、前記式１は、二酸化チタン、ＴｉＯ２−ｘＮｘ（０．００１≦ｘ≦１）またはこれらの混合物であることを特徴とする。
【００２３】
本発明において、前記金属ステントは、形態、長さ、重さなどを考慮せずに公知の金属ステントを用い、好ましくは、前記金属ステントの骨格は、血管内で長期間滞留する間に血管の圧力やその他の環境の影響によってその形態が変化せず、運動性に優れるように弾性を有する形態がよく、材質は、腐食性がなく、無害であるものが好ましい。例えば、韓国特許第１０−２０００−００６９５３６号、韓国特許第１０−１９９９−００３５９２７号、韓国特許第１０−１９９９−００８７４７２号、韓国特許第１０−２００２−００９３６１０号、韓国特許第１０−２００４−００５５７８５号などに公知されたステントを用いることができる。
【００２４】
より詳しくは、前記金属ステントは、その材質がステンレス鋼、ニチノール（ｎｉｔｉｎｏｌ）、タンタル、白金、チタニウム、コバルト、クロム、コバルト−クロム合金またはコバルト−クロム−モリブデン合金などの生体適合性の金属材質を有することが好ましく、この他に公知の生体適合性の金属材質、または生体適合性の金属材質と結合された材質を含む。
【００２５】
本発明において、前記１）の酸化チタンコーティングステップは、プラズマ真空チャンバー内にチタン前駆体、搬送ガスおよび反応ガスを移送し、プラズマを発生させて、１時間〜６時間金属ステントの表面に酸化チタン薄膜をコーティングすることを特徴とする。
【００２６】
前記チタン前駆体は、チタニウムブトキシド、テトラエチルメチルアミノチタニウム、チタニウムエトキシド、チタニウム−イソプロポキシドおよびテトラ−メチル−ヘプタ−ジエン−チタニウムからなる群から選択される１種以上であるものを用いることができ、プラズマ化学蒸着法によって金属ステントにチタン酸化物を蒸着する時、優れた蒸着特性を有するチタン前駆体は、公知のいかなるチタン前駆体を用いてもよい。
【００２７】
本発明において、前記搬送ガスは、窒素、アルゴン、ヘリウムからなる群から選択される１種以上を用いることができ、前記反応ガスは、水蒸気、オゾン、および酸素から選択される１種以上を用いることができ、前記反応ガスに窒素を添加することによって窒素がドープされた酸化チタンが形成されることを特徴とする。
【００２８】
より詳しくは、本発明では、チタン前駆体をプラズマ化学蒸着法によって金属ステントの表面にチタン酸化物を蒸着するが、これは、公知のプラズマ化学蒸着装置を利用することができる。例えば、韓国特許出願第１０−２００５−００５８９２６号、韓国特許出願第１０−２００１−０００７０３０号、韓国特許出願第１０−１９９０−００１３６４３号などに公知されたプラズマ化学蒸着装置を利用することができる。好ましくは、図２に示すように、プラズマチャンバー内にステントＨを固定できるチタンワイヤーＧが設けられ、プラズマチャンバーに減圧ポンプＢが連結され、プラズマチャンバー内にチタン前駆体蒸気が気体と共に投入できるように前駆体が入ったバブラーＤおよびガスタンク（ＥおよびＦ）が連結され、バブラーは他のガスタンクＤと連結されている形態のプラズマ化学蒸着装置を利用することが好ましい。
【００２９】
前記金属ステントに酸化チタンを蒸着する前に、プラズマ真空チャンバー内に金属ステントを固定し、金属ステントの表面を前処理して洗浄する過程を含む。前記前処理過程は、ステントと酸化チタン薄膜の蒸着力を向上するために行われ、プラズマ真空チャンバー内に温度を２００〜６００℃に維持し、アルゴンおよび酸素の混合気体を流すことによって行われる。
【００３０】
本発明において、前記金属ステント上に蒸着される前記式１のチタン酸化物は２つの形態を有する。その一つはチタニウムと酸素が結合して形成された二酸化チタンであり、他の一つはチタニウムと酸素が結合して形成された二酸化チタンに窒素がドープされたＴｉＯ２−ｘＮｘ（０．００１≦ｘ≦１）形態を有する。
【００３１】
前記二酸化チタンは、その結晶構造がルチル、アナターゼ、板チタン石などのいかなる形態であってもよい。前記２つの形態のチタン酸化物は、プラズマ化学蒸着法によって金属ステントに酸化チタン薄膜コーティングを蒸着するために搬送ガスとチタン前駆体をチャンバー内に導入し、反応ガスを流し、プラズマを発生することによって金属ステントの表面に酸化チタン薄膜をコーティングするが、この時に流す反応ガスの種類と流量比率に応じて決められる。この時、搬送ガスとして窒素、アルゴン、ヘリウムからなる群から選択される１種以上の気体をチタン前駆体と共に流すことによってプラズマチャンバー内に搬送ガスとチタン前駆体が導入され、それと同時に酸素だけを流してプラズマを発生させると、二酸化チタンが金属ステントの表面に蒸着するようになり、酸素と共に窒素を流すと、窒素がドープされたＴｉＯ２−ｘＮｘ（０．００１≦ｘ≦１）が金属ステントの表面に蒸着するようになる。
【００３２】
したがって、二酸化チタンを金属ステントに蒸着するためには、搬送ガスの選択において窒素を含まない搬送ガスを選択することが好ましい。二酸化チタンは、前記で言及したように、生物学的、生化学的に生体安定性が立証され、窒素がドープされたＴｉＯ２−ｘＮｘ（０．００１≦ｘ≦１）は、Ｋａｓｒｔａｒｉ  Ａ外１２人によって（Ｋａｓｔｒａｔｉ  Ａ、  Ｍｅｈｉｌｌｉ  Ｊ、  Ｐａｃｈｅ  Ｊ、  Ｋａｉｓｅｒ  Ｃ、  Ｖａｌｇｉｍｉｇｌｉ  Ｍ、  Ｋｅｌｂａｅｋ  Ｈ、  Ｍｅｎｉｃｈｅｌｌｉ  Ｍ、  Ｓａｂａｔｅ  Ｍ、  Ｓｕｔｔｏｒｐ  ＭＪ、  Ｂａｕｍｇａｒｔ  Ｄ、  Ｓｅｙｆａｒｔｈ  Ｍ、  Ｐｆｉｓｔｅｒｅｒ  ＭＥ、  Ｓｃｈｏｍｉｇ  Ａ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、  ３５６、  １０３０、  ２００７．）、二酸化チタンに窒素をドープする場合、抗血栓性がより向上すると既に報告されたことがある。
【００３３】
本発明は、チタン前駆体をプラズマチャンバーに導入するためにバブラーを利用して気相として発生させて導入することが好ましく、バブラーは、常温〜チタン前駆体の沸点範囲で気相として発生させるのに好適な温度に予熱し、搬送ガスをバブラーに通過させることによってプラズマチャンバーに移送することができる。この時、酸素を共に混合して移送するか、酸素および窒素を混合して移送することによって、二酸化チタンおよび窒素がドープされたＴｉＯ２−ｘＮｘ（０．００１≦ｘ≦１）を形成することができる。チタン前駆体、搬送ガスおよび反応ガスがプラズマチャンバーに導入されれば、プラズマチャンバーではプラズマを発生して金属ステントの表面に化学蒸着をするようになる。この時、搬送ガスの流量は５０〜５００ｓｃｃｍ、好ましくは１００〜２００ｓｃｃｍが好適であり、反応ガスは搬送ガスの１０％レベルの流量が好適であり、好ましくは１０〜１００ｓｃｃｍ程度で注入することがよく、搬送ガスが酸素の単一種でない酸素および窒素の異種の混合気体である場合、酸素：窒素の流量は１〜９：９〜１の流量比で注入することが好ましい。
【００３４】
本発明は、プラズマ真空チャンバー内にチタン前駆体、搬送ガスおよび反応ガスが導入され、プラズマを発生させることによって、金属ステントの表面に酸化チタンが蒸着される。前記プラズマの放電電圧は１Ｗ〜３００Ｗ（ワット）を発生させ、反応時間は１時間〜６時間実施し、好ましくは５Ｗ〜２００Ｗで３時間〜５時間実施することが好ましい。
【００３５】
前記過程を終え、得られた酸化チタン層がコーティングされた金属ステントは、酸化チタン層の厚さが１０〜５００ｎｍ、好ましくは５０〜１００ｎｍであることを特徴とする。
【００３６】
本発明において、前記２）の表面改質ステップは、プラズマ真空チャンバー内に水蒸気、または酸素および水素を移送し、低温プラズマを発生させて、１０分〜２時間酸化チタン薄膜の表面を改質することを特徴とする。
【００３７】
本発明において、前記３）ステップの薬物は、アブシキシマブ（Ａｂｃｉｘｉｍａｂ）、ＡＬＡ、ヘパリンのうちいずれか一つ以上が選択されて付着していることを特徴とする。
【００３８】
より詳しくは、前記プラズマ化学蒸着法によって酸化チタン層がコーティングされた金属ステントは、酸化チタン層の表面に薬物を付着するために酸化チタン層の表面をヒドロキシ基（−ＯＨ）が導入された形態に改質する。前記表面改質方法は、前記酸化チタンの形成のために用いられたプラズマ真空チャンバー内で行われ、プラズマ真空チャンバー内に１×１０−３〜１ｔｏｒｒ、好ましくは１×１０−２〜１×１０−１ｔｏｒｒ減圧状態でプラズマ真空チャンバーと連結された外部導入管から水蒸気（Ｈ２Ｏ）を移送するか、水蒸気の代わりに水素と酸素を混合した混合気体を用いることもできる。この時、水蒸気、または水素と酸素の混合気体は、ステント単位体に対して１〜５０ｓｃｃｍが好適である。前記水蒸気、または水素と酸素の混合気体をプラズマチャンバー内に導入し、プラズマを発生すると、図２のように二酸化チタンまたは窒素がドープされたＴｉＯ２−ｘＮｘ（０．００１≦ｘ≦１）層の表面酸素がヒドロキシ基に改質化される。
【００３９】
この時、反応条件として、プラズマ放電電力は、１〜３００Ｗ範囲で１０分〜２時間反応することによって二酸化チタンまたは窒素がドープされたＴｉＯ２−ｘＮｘ（０．００１≦ｘ≦１）層の表面をヒドロキシ基が導入された表面に改質することができる。
【００４０】
前記金属ステントの表面にコーティングされた酸化チタン層をヒドロキシ基が導入された表面に改質する理由は、本発明の薬物の化学構造的な特性を見てみれば、カルボキシル基、アルデヒド基またはアルコール基などの官能基を有しているため、酸性条件で改質された酸化チタン表面のヒドロキシ基と化学反応させることによって、脱水反応を利用して酸化チタンの表面に薬物との結合を容易にすることができるためである。
【００４１】
また、前記原理によって結合された薬物と酸化チタン層は、薬物が結合された後、薬物内の様々な官能基がステント表面との物理的な結合によって薬物がいくつかの層にステントの表面に付着できるため、体内血管に薬剤溶出性ステントの挿入時に薬剤溶出性ステントから物理的に結合された薬物が脱離して薬物が遅延放出されるだけでなく、酸化チタンと薬物本来の構造を維持することができるため、薬物放出が完了した後にも金属表面に安定的に残っていることができるという長所がある。
【００４２】
本発明において、薬物は、新生内膜過多増殖や血栓付着を抑制できる薬物を意味し、その例としては、坑癌薬物、抗炎症薬物、平滑筋細胞成長抑制剤および血栓抑制剤などからなる群から選択される１種以上の薬物を含む。
【００４３】
より詳しくは、モルシドミン、リンシドミン、ニトログリセリン、ヒドララジン、ベラパミル、ジルチアゼム、ニフェジピン、ニモジピン、カプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、キナプリル、ロサルタン、カンデサルタン、イルベサルタン、バルサルタン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾン、コルチコステロイド、１７β−エストラジオール、シクロスポリン、ミコフェノール酸、トラニラスト、メロキシカム、セレブレックス、インドメタシン、ジクロフェナク、イブプロフェン、ナプロキセン、セルピン、ヒルジン、ヒルログ、アグラトロバン、シロリムス、ラパマイシン、ラパマイシン誘導体、パクリタキセル、７−ヘキサノイル−タキソール、シスプラチン、ビンブラスチン、ミトキサントロン、コンブレタスタチンＡ４、トポテカン、メトトレキサート、フラボピリドール、アクチノマイシン、レオ・プロ（アブシキシマブ）、α−リポ酸、ヘパリン、ワルファリン、アスピリン、フルルビプロフェンおよびプロスタサイクリンなどから選択される１種以上の薬物を用いることができ、好ましくは、ヘパリン、レオ・プロ（アブシキシマブ）、α−リポ酸、シロリムス、ラパマイシン、アクチノマイシン、モルシドミン、リンシドミンおよびパクリタキセルなどから選択される１種以上のものを用いることができる。
【００４４】
すなわち、酸化チタン層に付着される薬物は、抗炎症効果を有するα−リポ酸（ＡＬＡ）あるいは抗血栓効果を有するアブシキシマブとヘパリンを用いることによって、ステントの生体内移植時に抗炎症および抗血栓の効果を可能にする。
【００４５】
前記薬物は、１種を酸化チタン層の表面に物理的、化学的に結合して体内から放出させるか、互いに作用が異なる２種以上の薬物を独立に酸化チタン層の表面に結合させて２種以上の薬物が放出される多重薬剤溶出性ステントに製造することができる。
【００４６】
仮に前記薬物が２種以上の混合薬物である場合、表面改質された酸化チタン層上に直接的にそれぞれの薬物が分散して表面に結合されるか、または２種以上の薬物が薬物間の静電気的な引力や水素結合などの物理的、化学的に相互結合した形態で酸化チタン層に結合して体内に放出されることができる。図３を参照する。例えば、リポ酸とレオ・プロを共に酸化チタン層に結合させれば、リポ酸は抗炎症性を有するものの抗血栓性が不足するため、レオ・プロが抗血栓性を向上できるという長所がある。
【００４７】
本発明において、３）の薬物付着ステップは、２）の表面改質ステップからヒドロキシ基が導入された酸化チタン層を含む金属ステントを収得して独立した公知の反応器に投入して薬物と混合し、必要に応じて蒸留水または有機溶媒をさらに投入し、酸性溶液および不活性気体雰囲気下で攪拌して反応するようになる。
【００４８】
本発明において、前記４）ステップのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡとＲＮＡおよびこれらの合成同族体を包括することができる。より詳しくは、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）からなる群から選択されることができる。
【００４９】
前記オリゴヌクレオチドは自然に存在するか合成することができ、ヒト、動物、植物、バクテリア、ウイルスなどに起因する。これらは当分野で公知の方法を利用して獲得することができる。
【００５０】
本発明において、前記４）のオリゴヌクレオチド付着ステップは、オリゴヌクレオチドにある官能基と前記薬物にある官能基との間に水素結合、双極子−双極子結合、誘起双極子結合、およびジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）のうちいずれか一つ以上の結合によって付着していることを特徴とする。
【００５１】
前記薬物層の上部に付着しているオリゴヌクレオチド層は、前記結合によって細胞内オリゴヌクレオチドが効率的に伝達可能であり、さらには、抗血栓性および抗炎症性などの副作用なしで血管平滑筋細胞の増殖を抑制できるという長所がある。
【００５２】
本発明は、金属ステントの表面がＴｉＯ２、ＴｉＯ２−ｘＮｘ（０．００１≦ｘ≦１）またはこれらの混合物でコーティングされ、前記コーティングされた表面を改質させてヒドロキシ基を導入した酸化チタン層と、薬物の官能基が前記酸化チタン層のヒドロキシ基と結合して、薬物が前記酸化チタン層の上部に付着している薬物層、および前記薬物層の上部にオリゴヌクレオチドが前記薬物と結合して付着しているオリゴヌクレオチド層、を含むことを特徴とするチタン酸化物薄膜コーティングを用いた遺伝子伝達ステントを提供する。
【００５３】
前記本発明による遺伝子伝達ステントは、酸化チタン層が二酸化チタン薄膜または窒素がドープされた酸化チタン（ＴｉＯ２−ｘＮｘ（０．００１≦ｘ≦１））薄膜であることを特徴とする。
【００５４】
前記本発明による遺伝子伝達ステントは、薬物がアブシキシマブ、ＡＬＡ、ヘパリンのうちいずれか一つ以上であることを特徴とする。
【００５５】
前記本発明による遺伝子伝達ステントは、オリゴヌクレオチドがｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｐＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンス−ヌクレオチド（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）からなる群から選択されることを特徴とする。
【発明の効果】
【００５６】
本発明のチタン酸化物薄膜コーティングを用いた遺伝子伝達ステントは、体内移植用金属ステントの表面をチタン酸化物でコーティングし、そのコーティング層の表面を改質して、その表面に薬物と遺伝子を付着させて製造することにより、遺伝子および薬物の放出が完了した後にも酸化チタン層および抗炎症または抗血栓性の薬物が金属表面に安定的に残っているため、後期血栓症や金属過敏症を減少できるだけでなく、細胞の成長を抑制できる遺伝子の細胞内導入を可能にすることによってステント内の血管再狭窄を防止できるという長所がある。
【００５７】
前記方法によって製造された本発明のチタン酸化物薄膜コーティングを用いた遺伝子伝達ステントは、抗炎症および抗血栓の作用がある薬物の搭載と同時に血管平滑筋細胞の増殖を抑制できる遺伝子の伝達を同時に可能にすることによって、後期血栓症や金属過敏症を減少できるだけでなく、ステント内の血管再狭窄を防止することができるため、血管挿入用ステントの治療効果を増大できるという長所がある。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明の一実施例によるチタン酸化物薄膜コーティングを用いた遺伝子伝達ステントにおいて、金属ステントの表面に酸化チタン層、薬物を順にコーティングし、さらに、オリゴヌクレオチドをコーティングする過程を示す図面である。
【図２】本発明の一実施例によるチタン酸化物薄膜コーティングを用いた遺伝子伝達ステントに用いられる二酸化チタンまたは窒素がドープされたＴｉＯ２−ｘＮｘ（０．００１≦ｘ≦１）チタン酸化物コーティングのためのＰＥＣＶＤ装置の模式図である。
【図３】本発明の一実施例によるチタン酸化物薄膜コーティングを用いた遺伝子伝達ステントにおいて、α−リポ酸（ＡＬＡ）が酸化チタン層に付着される状態を示す模式図である。
【図４】本発明の一実施例によるチタン酸化物薄膜コーティングを用いた遺伝子伝達ステントにおいて、５Ｗ、４ｈ、４００℃で蒸着されたＴｉＯ２薄膜のＥＳＣＡグラフである。
【図５】本発明の一実施例によるチタン酸化物薄膜コーティングを用いた遺伝子伝達ステントにおいて、５Ｗ、４ｈ、４００℃で蒸着された窒素ドープＴｉＯ２薄膜のＥＳＣＡグラフである。
【図６】本発明の一実施例によるチタン酸化物薄膜コーティングを用いた遺伝子伝達ステントにおいて、表面改質に適用された放電電力に応じた接触角の変化を示すグラフである。
【図７】本発明の一実施例によるチタン酸化物薄膜コーティングを用いた遺伝子伝達ステントにおいて、コーティングされるプラスミドとしてβ−ガラクトシダーゼを生成するようにすることによって遺伝子の移入の成功有無が分かるプラスミドの簡単な模式図である。
【図８】本発明の一実施例によるチタン酸化物薄膜コーティングを用いた遺伝子伝達ステントにおいて、３つの薬物（アブシキシマブ、ヘパリン、ＡＬＡ）それぞれのコーティング層にコーティングされた遺伝子の量を示すグラフである。
【図９】本発明の一実施例によるチタン酸化物薄膜コーティングを用いた遺伝子伝達ステントにおいて、酸化チタン／アブシキシマブ／プラスミド、酸化チタン／ヘパリン／プラスミド、酸化チタン／ＡＬＡ／プラスミドそれぞれの複合層に遺伝子の機能が破壊されずに安全に遺伝子がコーティングされており、遺伝子（ｇ−Ｗｉｚ  ｌａｃＺ  プラスミド）がいずれも細胞内で正常に発現していることを示す写真である。
【図１０】本発明の一実施例によるチタン酸化物薄膜コーティングを用いた遺伝子伝達ステントにおいて、酸化チタン／アブシキシマブ／プラスミド、酸化チタン／ヘパリン／プラスミド、酸化チタン／ＡＬＡ／プラスミドそれぞれの複合層がコーティングされた金属片を実験用ラットの体内に移植して遺伝子が組織内に移入されたことを示す写真である。
【図１１】本発明の一実施例によるチタン酸化物薄膜コーティングを用いた遺伝子伝達ステントにおいて、酸化チタン／アブシキシマブ／プラスミド、酸化チタン／ヘパリン／プラスミド、酸化チタン／ＡＬＡ／プラスミドそれぞれの複合層がコーティングされた金属片を実験用ラットの体内に移植して遺伝子が移入された組織の断面図である。
【図１２】酸化チタン／アブシキシマブ／プラスミド複合層をコーティングした金属片上に豚の冠状動脈平滑筋細胞を培養した時に細胞内に遺伝子が導入されることを示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
（１）金属表面の酸化チタン薄膜コーティング
ステントとして用いられる材質のうち、ステンレス鋼を１ｃｍ×１ｃｍ大きさのディスク状の金属プレートに製作し、その金属プレートの表面に酸化チタン薄膜コーティングを実施した。
【００６０】
プラズマを発生させるＲＦプラズマ発生器と真空ポンプが連結された真空チャンバーに金属プレートを図２に示されたステントＨのようにプラズマ発生器に固定し、プラズマチャンバーの温度を４００℃に維持する。先ず、金属プレートの基材と薄膜との間の接着力向上のために薄膜コーティング前にアルゴンおよび酸素を流し、プラズマ前処理過程を経て、金属の表面を洗浄する。バブラー蒸発器にチタニウムイソプロポキシドを入れ、バブラーの温度を５０℃に維持し、搬送ガスであるアルゴン（Ａｒ）を用いてチタニウムイソプロポキシドを反応ガスである酸素と混合した後に反応チャンバーに導入し、プラズマを生成させ、４時間反応させて、金属プレートの表面に二酸化チタン薄膜をコーティングする。この時、搬送ガスであるアルゴンの供給速度は１００ｓｃｃｍであり、反応ガスである酸素の供給速度は２０ｓｃｃｍを維持した。放電電圧は５から２００Ｗまで様々に適用して薄膜をコーティングした。窒素がドープされた二酸化チタン薄膜を製造するためには、上記の実験条件と同様に維持し、アルゴンを１００ｓｃｃｍ、酸素の供給は１０ｓｃｃｍ、窒素は１ｓｃｃｍに変更して供給した。
【００６１】
二酸化チタン薄膜をコーティングするのに放電電圧は５から２００Ｗまで様々に適用することができるが、放電電圧が大きいほど表面粗さが増加する結果を確認し、放電電圧を５、１０、１５Ｗに変化させ、４時間製造された薄膜のＡＦＭ結果Ｒｍｓ（Ｒｏｏｔ  ｍｅａｎ  ｓｑｕａｒｅ）値を下記の表１に示す。
【００６２】
【表１】
0005922674.tif 000003
【００６３】
上記の表１から確認できるように、二酸化チタン薄膜よりは窒素がドープされた薄膜の場合、表面がより均一であることが確認され、放電電力が低いほどより均一な薄膜を得ることができることを確認することができた。血液適合性には薄膜の粗さが影響を及ぼすが、表面粗さが減るほど血液適合性に優れると知られている。
【００６４】
また、５Ｗにおいて製造された薄膜での表面粗さが最も低いため、表面改質のための二酸化チタン薄膜蒸着はいずれも放電電力を５Ｗに固定し、蒸着時間は４時間、温度は４００℃に一定に維持して、二酸化チタンがコーティングされたステントを製造した。
【００６５】
図４は、５Ｗにおいて製造された二酸化チタン薄膜のＥＳＣＡ結果であり、４５８．８ｅＶ（２ｐ３／２）と４６４．７ｅＶ（２ｐ１／２）において、ＴｉＯ２においてＴｉ４＋該当するゼロ結果確認され、５３０．４ｅＶにおいて、ＴｉＯ２のＴｉ−Ｏ結合に該当するＯ１ｓピークが確認された。
【００６６】
図５は、窒素がドープされた二酸化チタン薄膜のＥＳＣＡ結果であり、二酸化チタン薄膜と類似する位置にＴｉピークとＯ１ｓピークが確認され、３９９ｅＶにおいて、０．８％含量比でＮ１ｓピークが確認されて、二酸化チタンの表面に窒素がドープされたことを確認することができた。
【００６７】
（２）ヒドロキシ基生成のための酸化チタン薄膜コーティング層の改質
コーティングされた二酸化チタンの表面に薬物を化学的に付着するためには、薬物分子の官能基と化学的結合が可能な官能基が酸化チタンの表面に存在しなければならない。
【００６８】
したがって、本発明では、薬物と化学的結合が可能な−ＯＨ基を二酸化チタンの表面に導入するために、薄膜の表面を低温プラズマで蒸留水（Ｈ２Ｏ）を用いて表面改質した。パイレックス（登録商標）で製作された管状低温プラズマ反応器に二酸化チタンがコーティングされた金属プレートを固定させ、バブラーに３次蒸留水を満たした後、水蒸気１０ＳＣＣＭをプラズマ反応器内に導入させ、放電電力を１０〜１００Ｗまで変化させ、１０分間低温プラズマ工程を利用して二酸化チタン薄膜を改質した。
【００６９】
二酸化チタン薄膜の表面にヒドロキシ基を導入するために、Ｈ２Ｏを用いて表面を改質した後、表面を蒸留水で１回洗浄した後に接触角を測定した。改質のために適用された放電電圧と接触角間の結果を図６に示す。
【００７０】
その結果、図６からも確認できるように、全体的に改質前より接触角が４０°程度低くなって表面に親水性官能基が導入されたことを確認することができ、また、適用された放電電力が２０〜５０Ｗ範囲で接触角が低くなり、放電電力が６０Ｗ以上高くなるほど接触角が高くなる傾向を確認することができた。
【００７１】
前記結果は、放電電力が高くなるほどプラズマによって改質対象である二酸化チタン薄膜が多少エッチングされたか、二酸化チタンの構造に変化が起こったためであると推測される。
【００７２】
（３）薬物付着
用いられた試薬は次の通りである。
【００７３】
（１）α−リポ酸（Ｔｈｉｏｃｔｉｃａｉｄ（ＡＬＡ）；  Ｂｕｋｗａｎｇ  Ｐｈａｒｍ．  Ｃｏ．  Ｌｔｄ）
【００７４】
（２）アブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ；  ＥｌｉＬｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、  Ｉｎｄｉａｎａ）
【００７５】
（３）ヘパリンナトリウム塩（Ｇｒａｄｅ１−Ａ、  Ｆｒｏｍ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｍｕｃｏｓａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
【００７６】
（４）１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドメチオジド（ＤＣＣ；  ９８％、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）
【００７７】
（５）４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ；  ９９％、  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）
【００７８】
（６）炭酸水素ナトリウム（９９％、  Ｄａｅ  Ｊｕｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＆  Ｍｅｔａｌｓ  Ｃｏ．，  ＬＴＤ）
【００７９】
二酸化チタンコーティング層の表面にＡＬＡを付着するために、０．０１２４ｇのＡＬＡ、０．００５ｇの炭酸水素ナトリウムを各々蒸留水２ｍＬを入れて十分に溶かしてＡＬＡ溶液を製造して準備し、０．８９１５ｇのＤＣＣと０．０７ｇのＤＭＡＰを蒸留水１５０ｍＬに各々溶かして準備した。準備したＡＬＡ溶液２ｍＬ、ＤＭＡＰ＋ＤＣＣ混合溶液は１．５ｍＬを各々取って容器に入れて混合した後、前記混合溶液を３５℃で１時間放置して活性化させ、活性化した混合溶液に前記（２）で製造した表面改質された金属プレートを入れ、３５℃で２時間保管して、二酸化チタンの表面に薬物を付着させた。
【００８０】
ヘパリンの付着は、０．００６５ｇのヘパリンナトリウム塩に先に製造したＤＭＡＰ＋ＤＣＣ混合溶液１．５ｍＬを入れ、前記と同様の方法によって付着させた。
【００８１】
アブシキシマブの付着は、アブシキシマブ  ０．２５ｍＬにＤＭＡＰ＋ＤＣＣ混合溶液１．５ｍＬを入れ、前記と同様の工程によって付着させた。
【００８２】
（４）遺伝子付着
【００８３】
二酸化チタンがコーティングされた金属プレートの表面に付着している薬物は色々な種類の化学的な官能基を有する。その特徴としては、カルボキシ基、アミン基、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ）などがある。ｐＨ６〜７に維持された水溶液にプラスミドを入れ、薬物が付着しているステントを入れて常温で一定時間（１〜５時間）維持させる。この場合、二酸化チタン薄膜がコーティングされた金属プレートの表面に付着している薬物にある様々な官能基とプラスミドに存在する官能基との間に様々な物理的な相互作用が起こり、いくつかの層にプラスミドが金属プレートの表面に付着するようになる。
【００８４】
前記方法によって製造された二酸化チタン／薬物／遺伝子複合体で構成された金属プレートの遺伝子の伝達有無を確認するために、ｇＷＩＺ−β−ｇａｌプラスミドをＧｅｎｌａｎｔｉｓ社から購入した。ｇＷＩＺ−β  ｇａｌ  プラスミドが細胞内に伝達されれば、細胞はβ−ガラクトシダーゼ  を生成するが、β−ガラクトシダーゼ  はβ−ガラクトシドを加水分解する酵素であり、真核生物遺伝子導入実験においてレポーター遺伝子  として利用される。遺伝子が移入された細胞では、β−ガラクトシダーゼ  が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）を切断して青色沈殿物を作り出す。この青色は、組織あるいは細胞において顕微鏡あるいは肉眼でも観察することができるため、遺伝子の移入有無を判断できるようになる。
【００８５】
図７は、前記で説明したｇＷＩＺ−β−ｇａｌプラスミドとしてβガラクトシダーゼを生成するようにすることにより、遺伝子の移入の成功有無が分かるプラスミドの簡単な模式図を示すものである。
【００８６】
［実験例１］付着している遺伝子の定量
前記実施例（１）〜（３）の方法によって製造された金属プレートを１２ウェルプレートに位置させ、フラスコ上に遺伝子を含む溶液（プラスミド総含量：２０ｕｇ／２００ｕｌ  ＤＷ）を入れる。８〜１２時間放置後、再び滅菌された３次蒸留水（脱イオン水：ＤＷ）２００ｕｌに３０分間浸して非特異的こ付いている余分のＤＮＡを除去した。洗浄液（洗浄ＤＷ）は、ナノドロップＮＤ−１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を利用して洗浄液内のプラスミドの濃度を測定した。プレートは洗浄して滅菌ベンチにおいて乾燥させた後、以後の実験を行った。フラスコに付着しているＤＮＡの量は、下記数学式１のように、初めの２０ｕｇのプラスミドから洗浄液内で測定されたＤＮＡ量を算術的に引いて予測した。
【００８７】
【数１】
0005922674.tif 000004
【００８８】
図８は、本発明の一実施例によるチタン酸化物薄膜コーティングを用いた遺伝子伝達ステントにおいて、３つの薬物（アブシキシマブ、ヘパリン、ＡＬＡ）それぞれのコーティング層にコーティングされた遺伝子の量を示すグラフであり、各々、ＴｉＯ２単独コーティンググループの場合は約２．７ｕｇ、アブシキシマブは約７．２ｕｇ、ヘパリンは５．６ｕｇ、ＡＬＡは２．５ｕｇのプラスミドが１ｃｍ２の面積にコーティングされることを確認することができる。
【００８９】
［実験例２］金属／二酸化チタン／薬物／遺伝子複合体から溶離した遺伝子の細胞内発現
金属プレートの表面に二酸化チタン／薬物／遺伝子（プラスミド）複合体（以下、金属フラスコと称する）の形態で遺伝子が結合した後にもプラスミドが機能学的に変形がないかを確認するために、金属フラスコの生成後に人為的に遺伝子を分離させて活性有無を測定した。
【００９０】
金属フラスコから遺伝子を溶離させるために、金属フラスコを１２ウェルプレートに入れ、再び０．１×ＴＥ  緩衝液（ｐＨ８．０）を１００ｕｌを注いで室温で３０分間放置した。３０分後、０．１×ＴＥ  緩衝液を採取して、ナノドロップＮＤ−１０００  分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、  ＵＳＡ）で溶離したプラスミドの量を測定した。
【００９１】
溶離したプラスミドが正常に活動するか否かを確認するために、インビトロの条件でＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のトランスフェクション製品であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いて細胞内に遺伝子をトランスフェクションさせた。Ｔｈは下記のようにヒト胎児由来腎臓２９３Ｔ細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）を１２ウェルプレートに細胞数１×１０５／細胞で分株して培養した。２４時間後、溶離したプラスミド  ６ｕｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｅを用いて培養液に処理し、再び４時間後に培養液を攪拌して４８時間持続的に培養した後、Ｘ−ｇａｌ染色を行った。
【００９２】
細胞を固定した後、Ｘ−ｇａｌ染色溶液を処理して３７℃、２４時間染色した後、顕微鏡で染色有無を確認すれば、陽性に染色された細胞は光学顕微鏡上で青色に観察される。
【００９３】
その結果、図９からも確認できるように、本発明の一実施例によるチタン酸化物薄膜コーティングを用いた遺伝子伝達ステント、すなわち、二酸化チタン／アブシキシマブ／プラスミド、二酸化チタン／ヘパリン／プラスミド、二酸化チタン／ＡＬＡ／プラスミドそれぞれの複合層に遺伝子の機能が破壊されることなく安全に遺伝子がコーティングされており、遺伝子（ｇ−Ｗｉｚ  ｌａｃＺ  プラスミド）のいずれも細胞内で正常に発現していることを確認することができた。
【００９４】
また、図９に示すように、アブシキシマブ、ＡＬＡ、ヘパリンの３種類の全てにおいて、各々溶離したプラスミドは正常に細胞内でβガラクトシダーゼを生成するようにすることを確認し、前記結果から、本発明においてコーティングされた遺伝子はその機能を保存していることを確認することができた。
【００９５】
［実験例３］実験用ラット（ｒａｔ）の腹壁内の遺伝子の伝達有無の確認
前記実施例で製造された金属フラスコを実験用ラット（ｒａｔ）の腹壁に各々移植した。移植７日後に腹壁の筋肉を採取し、前記実験例２で行ったＸ−ｇａｌ染色方法と同様に実施し、染色後に腹壁の筋肉を切り、染色された部位を確認した。
【００９６】
図１０は、本発明の一実施例によるチタン酸化物薄膜コーティングを用いた遺伝子伝達ステント、すなわち、二酸化チタン／アブシキシマブ／プラスミド、二酸化チタン／ヘパリン／プラスミド、二酸化チタン／ＡＬＡ／プラスミドそれぞれの複合層がコーティングされた金属片を実験用ラットの体内に移植したものであり、遺伝子が組織内に移入されたものを示す写真である。
【００９７】
図１０からも確認できるように、腹壁の組織が青色に染色される部位を肉眼で確認することができた。前記結果は、β−ｇａｌ遺伝子がコーティングされたプレートは、腹壁組織に遺伝子を成功的に移入することを示す結果である。
【００９８】
また、図１１からも確認できるように、二酸化チタン／アブシキシマブ／プラスミド、二酸化チタン／ヘパリン／プラスミド、二酸化チタン／ＡＬＡ／プラスミドそれぞれの複合層がコーティングされた金属片を実験用ラットの体内に移植して遺伝子が移入された組織の細胞は、腹壁外部の結合組織（レッド矢印）に遺伝子を伝達すると同時に結合組織下の筋肉細胞（イエロー矢印）においても染色された部位を顕微鏡所見で確認することができた。
【００９９】
［実験例４］血管平滑筋細胞内の遺伝子の伝達有無の確認
前記実験例３で確認したように、遺伝子がコーティングされたプレートが結合組織および筋肉組織の他にもステントの主な移植部位となり得る血管平滑筋細胞に遺伝子が移入できるかを確認するために、金属プレートの表面に直接血管平滑筋細胞を培養して細胞内に遺伝子が移入されるかを確認した。
【０１００】
血管平滑筋細胞は、無菌状態で分離した豚の冠状動脈から分離した。豚の心臓から冠状動脈を分離した後、血管外部の結合組織を全て除去し、血管内部を鉗子を用いて掻いて血管内部の細胞を除去する。結合組織と内皮細胞を除去した血管組織をコラゲナーゼ、エラスターゼ  、トリプターゼ  が含まれた溶液に入れ、はさみを用いて細かく切った後、振とう培養器で３７℃、６０ｒｐｍの条件で６０分間反応させて細胞を分離し、Ｇｉｂｃｏ社から出たＤＭＥ培地で培養した。培養後、継代３〜４回まで増殖させた後、ａｎｔｉ−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ  Ａｂ（ａｎｔｉ−ＳＭＣ  Ａｂ）を用いて免疫染色を行い、血管平滑筋細胞であることを確認した後、以後の実験に用いた。β−ｇａｌ遺伝子がコーティングされた金属プレートを１２ウェルプレートに置いておき、その上に血管平滑筋細胞を５×１０４／ｗｅｌｌで１０％ＦＢＳが含まれたＤＭＥ培地を用いて培養した。培養７日後、細胞が培養されて付着している金属プレートを取り出して固定した後、実験例２で行ったＸ−ｇａｌ染色方法と同様に染色を行った。
【０１０１】
染色を行った金属破片を顕微鏡下で観察した結果、図１２（二酸化チタン／アブシキシマブ／プラスミド複合層をコーティングした金属片上に豚の冠状動脈平滑筋細胞を培養した時に細胞内に遺伝子が導入されることを示す写真）からも確認できるように、金属表面に付着している細胞（矢印）が青色に観察されることを確認することができた。前記結果は金属／二酸化チタン／薬物／遺伝子複合体が血管平滑筋細胞への遺伝子移入が可能であることを確認した結果でもある。
【図１】
0005922674.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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