(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムを配列決定して、複数の配列データからなる配列解析の結果を得るステップ、
前記配列解析の結果を、参照ゲノム配列と対比させて、前記配列の参照ゲノム配列における分布を判断するステップであって、前記参照ゲノム配列は標準ヒトゲノムの参照配列又は既知のゲノム配列の一部である、ステップ、
前記配列の参照ゲノム配列における分布に基づいて、前記参照ゲノム配列において両側の配列数に有意差がある複数の破過点を決めるステップ、
前記複数の破過点に基づいて、前記参照ゲノム配列において検定対象となるウィンドウを決めるステップ、
前記検定対象となるウィンドウに入る配列に基づいて、第一パラメータを決定するステップ、及び
前記第一パラメータと所定の閾値の差に基づいて、前記ゲノムに前記検定対象となるウィンドウに対するコピー数変異の有無を判断するステップ、
を含み、
前記参照ゲノムにおいて破過点を決めるのは、更に、
前記参照ゲノム配列を、所定の長さを有する一次ウィンドウにそれぞれ分割して、各一次ウィンドウに入るシーケンシング配列を判断するステップ、
前記参照ゲノム配列に位置している少なくとも１つのサイトに対して、該サイトの両側に位置している同じ数の一次ウィンドウに入るシーケンシング配列の数を判断するステップ、
前記サイトの両側のシーケンシングデータの数に有意差の有無を示すｐ値を、求めるステップ、及び
前記サイトのｐ値が終端ｐ値より小さいと、このサイトを破過点と判断するステップ、
を含み、
前記サイトの両側のシーケンシングデータの数に有意差の有無を示すｐ値を求めることは、更に、
前記サイトに対して、それぞれ、前記サイトの両側に同じ数を有する一次ウィンドウを取り、各一次ウィンドウの相対的なシーケンシング配列の数Ｒｉ（ｉは、一次ウィンドウの番号を表す）を算出するステップと、
前記各一次ウィンドウの相対的なシーケンシング配列の数Ｒｉを連検定して、該サイトのｐ値を求めるステップと、を含み、
前記相対的なシーケンシング配列の数は、
【数１】
0005938484.tif 000059
（但し、ｒｉは、ｉ番目の一次ウィンドウに入るシーケンシング配列の数を表し、
【数２】
0005938484.tif 000060
ｎは、一次ウィンドウの総数を表す）
により求められ、
前記検定対象となるウィンドウに入る配列に基づいて、第一パラメータを決定するステップは、前記参照ゲノム配列を、所定の長さを有する一次ウィンドウにそれぞれ分割して、前記検定対象となるウィンドウに含まれている一次ウィンドウにおける、標準化されたシーケンシング配列の平均数
【数３】
0005938484.tif 000061
を、第一パラメータとして求めることを特徴とするゲノムのコピー数変異の有無を判断する方法。
【請求項２】
更に、生体試料からゲノムを抽出するステップを含み、
前記生体試料は単細胞に由来し、
さらに、前記単細胞の全ゲノムを放出させるように該単細胞を溶解させるステップと、
前記全ゲノムを増幅させることにより、前記生体試料を得るステップと、
を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記コピー数変異は、染色体異数性、染色体欠失、染色体重複、微小欠失、及び微小重複から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記各一次ウィンドウに入るシーケンシング配列は、前記参照ゲノム配列に対する唯一適合のものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
それぞれ、前記サイトの両側で一次ウィンドウを１００個ずつ取ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記各一次ウィンドウの長さは、ともに１００−２００Ｋｂｐであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記終端ｐ値は１．１×１０−５０であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記各一次ウィンドウの相対的なシーケンシング配列の数を連検定するのは、更に、
各一次ウィンドウにおけるシーケンシング配列に対する各一次ウィンドウの数Ｒｉを、ＧＣ含有量について補正して、補正された相対的なシーケンシング配列の数
【数４】
0005938484.tif 000062
を算出するステップ、
前記補正された相対的なシーケンシング配列の数に基づいて、各一次ウィンドウにおける標準化されたシーケンシング配列の数Ｚｉを求めるステップ、及び、
すべての一次ウィンドウにおける標準化されたシーケンシング配列の数Ｚｉを、連検定するステップ、
を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記補正された相対的なシーケンシング配列の数
【数５】
0005938484.tif 000063
は、
各一次ウィンドウにおけるＧＣ含有量を算出し、
０．００１に準じて、ＧＣ含有量を複数の領域に分割するとともに、各領域での相対的なシーケンシング配列の数の平均値であるＭｓ（ｓは、ＧＣ領域の番号である）を算出し、
次の式により、該補正された相対的なシーケンシング配列の数
【数６】
0005938484.tif 000064
を算出し、
【数７】
0005938484.tif 000065
標準化されたシーケンシング配列の数Ｚｉは、
【数８】
0005938484.tif 000066
（ただし、
【数９】
0005938484.tif 000067
【数１０】
0005938484.tif 000068
）により算出されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
複数の破過点に基づいて、参照ゲノムにおいて、検定対象となるウィンドウを決めるのは、更に、
１）前と後の両方にも他の破過点がある候補破過点を複数決めるステップ、
２）各候補破過点のｐ値を求めるとともに、ｐ値の一番大きい候補破過点を捨てるステップ、
３）残りの候補破過点のｐ値がともに終端ｐ値を下回るまでに、これらの候補破過点に対して、ステップ２）を繰り返して、候補破過点を一部捨てて、残りのものをスクリーニングされた候補破過点として用いるステップ、及び、
４）隣接しているスクリーニングされた候補破過点の間にある領域を、検定対象となるウィンドウとして選定するステップ、
を含み、
前記候補破過点のｐ値は、
候補破過点とその直前の破過点との間にある領域を第一候補領域として、前記候補破過点とその直後の破過点との間にある領域を第二候補領域として選定するステップと、
第一候補領域と第二候補領域に含まれている、標準化されたシーケンシング配列の数であるＺｉを、連検定して、前記候補破過点のｐ値を求めるステップと、
により求められ、
前記終端ｐ値は、
候補破過点の数がゼロになるまでに、対照サンプルが配列解析された結果によって、参照ゲノムにおいて、検定対象となるウィンドウを選定する手順を、繰り返すとともに、毎回捨てられた候補破過点のｐ値を記録するステップと、
捨てられた候補破過点のｐ値の分布に基づいて、前記終端ｐ値を求めるステップと、
により求められ、
前記終端ｐ値は１．１×１０−５０である、
ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記所定の閾値では、−１．６４５を第一閾値として、１．６４５を第二閾値として、設定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記参照ゲノム配列は、ヒトの２１番染色体、１８番染色体、１３番染色体、Ｘ染色体、及びＹ染色体から選ばれる少なくとも１種の配列であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ゲノムを配列決定して、複数の配列データからなる配列解析の結果を得る配列決定装置と、
該配列決定装置に接続されており、前記配列解析の結果に基づいて、前記ゲノムのコピー数変異の有無を判断する分析装置とを含み、
前記分析装置は、更に、
前記配列解析の結果を、参照ゲノム配列と対比させて、前記配列の参照ゲノム配列における分布を判断する対比ユニットであって、前記参照ゲノム配列は標準ヒトゲノムの参照配列又は既知のゲノム配列の一部である、対比ユニット、
該対比ユニットに接続されており、前記配列の参照ゲノム配列における分布に基づいて、前記参照ゲノム配列において両側の配列数に有意差がある複数の破過点を決めるのに適する破過点決定ユニット、
前記破過点決定ユニットに接続されており、前記複数の破過点に基づいて、前記参照ゲノム配列において検定対象となるウィンドウを決めるのに適する検定対象となるウィンドウ決定ユニット、
前記検定対象となるウィンドウ決定ユニットに接続されており、前記検定対象となるウィンドウに入る配列に基づいて、第一パラメータを決定するのに適するパラメータ決定ユニット、及び、
前記パラメータ決定ユニットに接続されており、前記第一パラメータと所定の閾値の差に基づいて、前記ゲノムに前記検定対象となるウィンドウに対するコピー数変異があるかどうかを判断する判断ユニット、
を含み、
前記破過点決定ユニットは、更に、
前記参照ゲノム配列を、所定の長さを有する一次ウィンドウにそれぞれ分割して、各一次ウィンドウに入るシーケンシング配列を判断するユニット、
前記参照ゲノム配列に位置している少なくとも１つのサイトに対して、該サイトの両側に位置している同じ数の一次ウィンドウに入るシーケンシング配列の数を判断するユニット、
前記サイトの両側のシーケンシングデータの数に有意差の有無を示すｐ値を、求めるユニット、及び
前記サイトのｐ値が終端ｐ値より小さいと、このサイトを破過点と判断するユニット、
を含み、
前記サイトの両側のシーケンシングデータの数に有意差の有無を示すｐ値を求めるユニットは、更に、
前記サイトに対して、それぞれ、前記サイトの両側に同じ数を有する一次ウィンドウを取り、各一次ウィンドウの相対的なシーケンシング配列の数Ｒｉ（ｉは、一次ウィンドウの番号を表す）を算出するユニットと、
前記各一次ウィンドウの相対的なシーケンシング配列の数Ｒｉを連検定して、該サイトのｐ値を求めるユニットと、を含み、
前記相対的なシーケンシング配列の数は、
【数１１】
0005938484.tif 000069
（但し、ｒｉは、ｉ番目の一次ウィンドウに入るシーケンシング配列の数を表し、
【数１２】
0005938484.tif 000070
ｎは、一次ウィンドウの総数を表す）
により求められ、
前記パラメータ決定ユニットは、前記参照ゲノム配列を、所定の長さを有する一次ウィンドウにそれぞれ分割して、前記検定対象となるウィンドウに含まれている一次ウィンドウにおける、標準化されたシーケンシング配列の平均数
【数１３】
0005938484.tif 000071
を、第一パラメータとして求めることを特徴とするゲノムのコピー数変異の有無を判断するシステム。
【請求項１４】
更に、生体試料からゲノムを抽出するためのゲノム抽出装置を含むことを特徴とする請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記配列決定装置は、更に、
ゲノムを増幅させるために用いられるゲノムの増幅ユニットと、
ゲノムの増幅ユニットに接続されているとともに、全ゲノムシーケンシングライブラリを、増幅されたゲノムで構築するシーケンシングライブラリの構築ユニットと、
前記シーケンシングライブラリの構築ユニットに接続されているとともに、前記シーケンシングライブラリを配列決定するために用いられる配列決定ユニットと、
を含むことを特徴とする請求項１３に記載のシステム。
【請求項１６】
前記配列決定ユニットは、次世代法シークエンシング技術又は単一分子シークエンシング装置であることを特徴とする請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
コンピューターに、
ゲノムを配列決定して得た複数の配列データからなる配列解析の結果を、参照ゲノム配列と対比させて、前記配列の参照ゲノム配列における分布を判断するステップであって、前記参照ゲノム配列は標準ヒトゲノムの参照配列又は既知のゲノム配列の一部である、ステップ、
前記配列の参照ゲノム配列における分布に基づいて、前記参照ゲノム配列において両側の配列数に有意差がある複数の破過点を決めるステップ、
前記複数の破過点に基づいて、前記参照ゲノム配列において検定対象となるウィンドウを決めるステップ、
前記検定対象となるウィンドウに入る配列に基づいて、第一パラメータを決定するステップ、及び、
前記第一パラメータと所定の閾値の差に基づいて、前記ゲノムに前記検定対象となるウィンドウに対するコピー数変異があるかどうかを判断するステップ、を実行させるためのプログラムを記録したコンピューター読み取り可能な記憶媒体において、
前記参照ゲノムにおいて破過点を決めるのは、更に、
前記参照ゲノム配列を、所定の長さを有する一次ウィンドウにそれぞれ分割して、各一次ウィンドウに入るシーケンシング配列を判断するステップ、
前記参照ゲノム配列に位置している少なくとも１つのサイトに対して、該サイトの両側に位置している同じ数の一次ウィンドウに入るシーケンシング配列の数を判断するステップ、
前記サイトの両側のシーケンシングデータの数に有意差の有無を示すｐ値を、求めるステップ、及び
前記サイトのｐ値が終端ｐ値より小さいと、このサイトを破過点と判断するステップ、
を含み、
前記サイトの両側のシーケンシングデータの数に有意差の有無を示すｐ値を求めることは、更に、
前記サイトに対して、それぞれ、前記サイトの両側に同じ数を有する一次ウィンドウを取り、各一次ウィンドウの相対的なシーケンシング配列の数Ｒｉ（ｉは、一次ウィンドウの番号を表す）を算出するステップと、
前記各一次ウィンドウの相対的なシーケンシング配列の数Ｒｉを連検定して、該サイトのｐ値を求めるステップと、を含み、
前記相対的なシーケンシング配列の数は、
【数１４】
0005938484.tif 000072
（但し、ｒｉは、ｉ番目の一次ウィンドウに入るシーケンシング配列の数を表し、
【数１５】
0005938484.tif 000073
ｎは、一次ウィンドウの総数を表す）
により求められ、
前記検定対象となるウィンドウに入る配列に基づいて、第一パラメータを決定するステップは、前記参照ゲノム配列を、所定の長さを有する一次ウィンドウにそれぞれ分割して、前記検定対象となるウィンドウに含まれている一次ウィンドウにおける、標準化されたシーケンシング配列の平均数
【数１６】
0005938484.tif 000074
を、第一パラメータとして求めるコンピューター読み取り可能な記憶媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノムのコピー数変異の有無を判断する方法、この方法を実行することに適するシステム、及びコンピューター読み取り可能な記憶媒体に関する。
【背景技術】
【０００２】
科学研究と応用分野において、単一又はいくつかの細胞や、微量な核酸試料を分析する必要がある場合が多く、例えば、生殖補助技術の分野において、着床前スクリーニング検査（ＰＧＳ）及び着床前診断（ＰＧＤ）で、単一の生殖細胞、単一の卵割球、胚細胞を分析すること、非侵襲的出生前診断の技術分野において、母体の末梢血から微量の胎児由来細胞を単離して検出すること、メタゲノミクスにおいて、環境に存在する単一または微量な細胞を分析すること、並びに、疾患または生理学の研究において、組織や体液に存在する単一の細胞を分析することがある。
【０００３】
しかしながら、従来のゲノムのコピー数変異の有無を判断する方法は、改善される必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、先行技術に存在する技術問題点の少なくとも１つを解決することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一態様によれば、本発明は、ゲノムのコピー数変異の有無を判断する方法を提供する。本発明の実施例によれば、前記方法は、ゲノムを配列決定して、複数の配列データからなる配列解析の結果を得るステップ、上述した配列解析の結果を、参照ゲノム配列と対比させて、前記配列の参照ゲノム配列における分布を判断するステップ、前記配列の参照ゲノム配列における分布に基づいて、前記参照ゲノム配列において両側の配列数に有意差がある複数の破過点を決めるステップ、前記複数の破過点に基づいて、前記参照ゲノム配列において検定対象となるウィンドウ（窓口）を決めるステップ、前記検定対象となるウィンドウに入る配列に基づいて、第一パラメータを決定するステップ、及び、前記第一パラメータと所定の閾値の差に基づいて、前記ゲノムに前記検定対象となるウィンドウに対するコピー数変異の有無を判断するステップを含む。本発明の実施例によるゲノムのコピー数変異の有無を判断する方法によれば、ゲノムのコピー数変異の有無を効果的に判断することができ、様々なコピー数変異に適用され、染色体異数性、染色体欠失、染色体重複、微小欠失、微小重複が含まれるが、これらに限定されない。
【０００６】
本発明の第二の態様によれば、本発明は、ゲノムのコピー数変異の有無を判断するシステムを提供する。本発明の実施例によれば、このシステムは、ゲノムを配列決定して、複数の配列データからなる配列解析の結果を得る配列決定装置と、該配列決定装置に接続されており、上述した配列解析の結果に基づいて、前記ゲノムにコピー数変異があるかどうかを判断する分析装置とを含む。前記分析装置は、更に、上述した配列解析の結果を、参照ゲノム配列と対比させて、前記配列の参照ゲノム配列における分布を判断する対比ユニット、該対比ユニットに接続されており、前記配列の参照ゲノム配列における分布に基づいて、前記参照ゲノム配列において両側の配列数に有意差がある複数の破過点を決めるのに適する破過点決定ユニット、前記破過点決定ユニットに接続されており、前記複数の破過点に基づいて、前記参照ゲノム配列において検定対象となるウィンドウを決めるのに適する検定対象となるウィンドウ決定ユニット、前記検定対象となるウィンドウ決定ユニットに接続されており、前記検定対象となるウィンドウに入る配列に基づいて、第一パラメータを決定するのに適するパラメータ決定ユニット、及び、前記パラメータ決定ユニットに接続されており、前記第一パラメータと所定の閾値の差に基づいて、前記ゲノムに前記検定対象となるウィンドウに対するコピー数変異があるかどうかを判断する判断ユニットを含む。本発明の実施例によるゲノムにコピー数変異があるかどうかを判断するシステムによれば、ゲノムにコピー数変異があるかどうかを判断する方法が効果的に実施でき、ゲノムにコピー数変異があるかどうかを効果的に判断でき、様々なコピー数変異に適用され、染色体異数性、染色体欠失、染色体重複、微小欠失、微小重複が含まれるが、これらに限定されない。
【０００７】
本発明の第三の態様によれば、本発明は、コンピューター読み取り可能な記憶媒体を提供する。本発明の実施例によれば、当該コンピューター読み取り可能な記憶媒体は、プロセッサで実行された後、次のステップにより、ゲノムにコピー数変異があるかどうかを判断するのに適する命令を格納している。詳細は、ゲノムを配列決定して得た複数の配列データからなる配列解析の結果を、参照ゲノム配列と対比させて、前記配列の参照ゲノム配列における分布を判断するステップ、前記配列の参照ゲノム配列における分布に基づいて、前記参照ゲノム配列において両側の配列数に有意差がある複数の破過点を決めるステップ、前記複数の破過点に基づいて、上述した参照ゲノムにおいて検定対象となるウィンドウを決めるステップ、前記検定対象となるウィンドウに入る配列に基づいて、第一パラメータを決定するステップ、及び、前記第一パラメータと所定の閾値の差に基づいて、前記ゲノムに前記検定対象となるウィンドウに対するコピー数変異があるかどうかを判断するステップを含む。コンピューター読み取り可能な記憶媒体によれば、本発明の実施例によるゲノムにコピー数変異があるかどうかを判断する方法が効果的に実施でき、ゲノムにコピー数変異があるかどうかを効果的に判断でき、様々なコピー数変異に適用され、染色体異数性、染色体欠失、染色体重複、微小欠失、微小重複が含まれるが、これらに限定されない。
【０００８】
本発明の実施の形態のさらなる態様および利点が、一部は以下の説明に提示され、一部は以下の説明から明らかになり、あるいは本発明の実施の形態を実施することによって習得される。
【０００９】
本発明の実施の形態のこれらの態様および利点ならびに他の態様および利点が、添付の図面を参照しつつ行われる以下の説明から明らかになり、より容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の実施例によるゲノムにコピー数変異があるかどうかを判断する方法を示すフローチャートである。
【図２】本発明の実施例によるゲノムにコピー数変異があるかどうかを判断するシステムを模式的に示す構成図である。
【図３】本発明の別の実施例によるゲノムにコピー数変異があるかどうかを判断する方法を示すフローチャートである。
【図４】本発明の実施例によるサンプルＳ１の染色体のデジタル核型分析の画像を示す。左の図は、胚単細胞に全ゲノム増幅を行った後、コピー数変異を本発明により検出した結果であり、右の図は、同一の胚細胞にＤＮＡを抽出したまま、配列解析した（ＷＧＡを行わない）結果である。
【図５】本発明の実施例によるサンプルＳ２の染色体のデジタル核型分析の画像を示す。左の図は、胚単細胞に全ゲノム増幅を行った後、コピー数変異を本発明により検出した結果であり、右の図は、同一の胚細胞にＤＮＡを抽出したまま、配列解析した（ＷＧＡを行わない）結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の実施の形態を詳しく言及する。図面を参照して本明細書において説明される実施の形態は、説明用であり、例示にすぎず、本発明の大まかな理解のために用いられる。これらの実施の形態を、本発明を限定するものとして解釈してはならない。同じまたは類似の構成要素ならびに同じまたは類似の機能を有する構成要素は、説明の全体を通して、類似の参照番号によって指し示される。
【００１２】
なお、「第一」、「第二」などの用語は、本発明の説明を簡単にするためにそこで説明されており、相対的な重要性を指示及び示唆したり、技術的な特徴の数を暗示したりするわけではないことを、理解すべきである。それにより、「第一」、「第二」と定義された特徴が暗示的にも明示的にも一つ以上ものを含んでもよい。説明において、とくに限定されない限り、「複数」、「いくつ」は二又は二以上を指し示す。本発明の式、記号において、特に明記しない限り、文字は、同一のものと同じ意味を表す。
【００１３】
１、ゲノムのコピー数変異の有無を判断する方法
本発明の一態様によれば、本発明は、ゲノムのコピー数変異の有無を判断する方法を提供する。本発明で使用される「コピー数変異（ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ，ＣＮＶ）」という用語は、染色体又は染色体断片のコピー数が異常であることを意味する。染色体異数性、染色体欠失、染色体重複、微小欠失、微小重複が含まれるが、これらに限定されない。
【００１４】
図１を参照すると、本発明の実施例によるゲノムのコピー数変異の有無を判断する方法は、次のステップを含む；
Ｓ１００：ゲノムを配列決定して、複数の配列データからなる配列解析の結果を得る
本発明の実施例によれば、本発明の方法で使用できるゲノムの種類としては、特に制限がないが、全ゲノムでもゲノムの一部でもよい。例えば、染色体又は染色体断片でもよい。また、本発明の実施例によれば、ゲノムを配列決定する前には、更に、生体試料からゲノムを抽出するステップを含む。それにより、生体試料を原料として直接使用して、当該生体試料にコピー数変異があるかどうかに関するデータを得ることができ、生体の健康状態を示すようにする。本発明の実施例によれば、本発明において使用できる生体試料としては、特に制限がない。本発明のいくつかの具体例によれば、当該生体試料としては、血液、尿、唾液、組織、生殖細胞、受精卵、卵割球、及び胚から選ばれるいずれかの１種である。当業者に理解できるように、疾患によって異なる生体試料を利用して分析することができる。これにより、生体からサンプルを便利に採取して、ある疾患に対するサンプルを具体的に採用でき、ある特定の疾患に対する特定の分析手法を採用できる。例えば、特定の癌に罹患している可能性がある試験対象では、当該組織又はその周辺からサンプルを採取して、更に、細胞を単離した後、分析することにより、できるだけ早期に、該組織ががん化するかどうかを正確に知らせることができる。本発明の具体的な実施例によれば、単細胞を生体試料として使用できる。本発明の実施例によれば、生体試料から単細胞を単離する方法及びデバイスは、特に制限がない。本発明のいくつかの具体例によれば、希釈法、口ピペットによる単離法、顕微操作（好ましくは、顕微切断）、ストレスフリーな細胞分離法、及びマイクロ流体方法から選ばれる少なくとも１種により、生体試料から単細胞を単離することができる。それにより、生体試料から単細胞を効果的かつ簡単に獲得して、続く操作を行うことができる。それにより、ゲノムのコピー数変異の有無を判断する効率を更に向上させることができる。
【００１５】
また、本発明の実施例によれば、ゲノムを配列決定する方法としては、特に制限がない。本発明の一実施例によれば、ゲノムを配列決定するのは、更に次のステップを含む。まず、ゲノムを増幅して、増幅された全ゲノムを得る。そして、増幅されたゲノムで、配列決定用のライブラリーを構築する。最終的に、得られた配列決定用のライブラリーを、配列決定することにより、配列データからなる配列解析の結果を得る。それにより、ゲノムの全ゲノム情報を効果的に得て、単細胞のゲノム又は微量の核酸試料を効果的に配列決定することができ、更に、ゲノムにコピー数変異があるかを判断する効率を高めることができる。当業者は、ゲノムシーケンシングの具体的な技術により、シーケンシングライブラリの構築方法を選択してもよく、ゲノムシーケンシングライブラリを構築する詳細方法は、配列決定ための機器製造者、例えば、イルミナ会社が提供したマニュアルを参照できる。例えば、イルミナ会社からのＭｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ（Ｐａｒｔ＃１００５３６１；Ｆｅｂ  ２０１０）やＰａｉｒｅｄ−Ｅｎｄ  ＳａｍｐｌｅＰｒｅｐ  Ｇｕｉｄｅ（Ｐａｒｔ＃１００５０６３；Ｆｅｂ  ２０１０）を参照できる。参照によりその内容をここに援用する。
【００１６】
本発明の実施例によれば、単細胞を生体試料としてゲノムを抽出するのは、さらに、単細胞を溶解させて、前記単細胞の全ゲノムを放出させるステップを含んでもよい。本発明のいくつかの具体例によれば、単細胞を溶解させて、前記単細胞の全ゲノムを放出させるための方法としては、特に制限がなく、単細胞を、好ましくは、十分に溶解させることができればよい。本発明の具体例によれば、前記単細胞を、アルカリ性の溶解液で、溶解させて、前記単細胞の全ゲノムを放出させてもよい。発明者は、これにより、効果的に前記単細胞を溶解させて、前記単細胞の全ゲノムを放出させることができ、放出された全ゲノムを配列決定する時、精度を高めることができ、更に、ゲノムのコピー数変異の有無を判断する効率を高めることができることを発見した。本発明の実施例によれば、単細胞の全ゲノムを増幅させる方法としては、特に制限がなく、ＰＣＲによる方法、例えば、ＰＥＰ−ＰＣＲ、ＤＯＰ−ＰＣＲ、やＯｍｎｉＰｌｅｘ  ＷＧＡを利用してもよいし、ＰＣＲによらない方法、例えば、ＭＤＡ（多重置換増幅）を利用してもよい。本発明の具体例によれば、ＰＣＲによる方法、例えば、ＯｍｎｉＰｌｅｘ  ＷＧＡ法、を利用することが好ましい。市販キットとしては、ＧｅｎｏｍｅＰｌｅｘ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）ＰｉｃｏＰｌｅｘ（Ｒｕｂｉｃｏｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、ＲＥＰＬＩ−ｇ（Ｑｉａｇｅｎ）やｉｌｌｕｓｔｒａ  ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）など適用できるが、これらに限定されない。本発明の具体例によれば、シーケンシングライブラリを構築する前には、単細胞全ゲノムを、ＯｍｎｉＰｌｅｘ  ＷＧＡで増幅させてもよい。それにより、全ゲノムを効果的に増幅させることができ、更に、ゲノムのコピー数変異の有無を判断する効率を高めることができる。本発明の実施例によれば、前記次世代法シークエンシング技術、例えば、Ｈｉｓｅｑシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）（登録商標）、Ｍｉｓｅｑシステム（登録商標）、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＡ）システム（登録商標）、４５４  ＦＬＸ（Ｒｏｃｈｅ社製）（登録商標）、ＳＯＬｉＤシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）（登録商標）、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）（登録商標）などから選ばれる少なくとも１種により、全ゲノムのシーケンシングライブラリを配列決定することができる。それにより、ハイスループットや大規模シークエンシングを特徴とする配列決定装置を利用すれば、単細胞の染色体異数性を判断する効率を更に高めることができる。他の配列決定法及び装置、例えば、第三世代のシーケンシング技術、即ち単一分子のシークエンシング技術、例えば、ＨｅｌｉＳｃｏｐｅシステム（Ｈｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ＲＳシステム（ＰａｃＢｉｏ社製）などのいずれかの１種、及び、将来開発される進歩的なシーケンシング技術で、全ゲノムを配列決定してもよいのは、当業者にとって自明なことである。本発明の実施例によれば、全ゲノムを配列決定することにより得たシーケンシングデータの長さとしては、特に制限がない。本発明の一具体例によれば、前記複数シーケンシングデー���は、平均長さが約５０ｂｐである。発明者は、シーケンシングデータは平均長さが約５０ｂｐである場合、シーケンシングデータの分析を容易にし、分析の効率を向上させることができるとともに、分析のコストを顕著に削減させることができることを発見した。更に、単細胞の染色体異数性を判断する効率を高め、単細胞の染色体異数性を判断するコストを削減させる。ここで使用される「平均長」という用語は、各シーケンシングデータの長さの平均値であることを意味する。
【００１７】
Ｓ２００：配列解析の結果を、参照ゲノム配列と対比させて、配列の参照ゲノム配列における分布を判断する
ゲノムを配列決定した後、複数のシーケンシング配列からなる配列解析の結果を得る。得られた配列解析の結果を、参照ゲノム配列と対比させ、得られたシーケンシング配列の参照ゲノム配列における位置を判断できる。本発明の実施例によれば、こられのシーケンシングデータの総数を、公知の方法や手段に基いて対比して算出できる。例えば、シーケンシング機器製造会社からのソフトウェアを利用して解析してもよい。短いオリゴヌクレオチド解析パッケージ（Ｓｈｏｒｔ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、ＳＯＡＰ）や、ＢＷＡ対比（Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ）で、シーケンシング配列を参照配列と対比させて、シーケンシング配列の参照ゲノムにおける位置を検知することが好ましい。配列対比は、プログラムで提供されるデフォルトのパラメータを使用して行われてもよく、また、当業者は、必要に応じて、パラメータを選択してもよい。本発明の一実施の形態において、用いられる対比用ソフトウェアがＳＯＡＰａｌｉｇｎｅｒ／ｓｏａｐ２である。
【００１８】
本発明の実施例によれば、参照ゲノムの配列は、ＮＣＢＩデータベースからの標準ヒトゲノムの参照配列（例えば、ｈｇ１８（ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３６）でもよい）である。既知のゲノム配列の一部でもよく、例えば、２１番染色体、１８番染色体、１３番染色体、Ｘ染色体、及びＹ染色体から選ばれる少なくとも１種の配列でもよい。
【００１９】
本発明の実施例によれば、参照ゲノムの配列から選ばれる唯一適合の配列解析の結果を、参照ゲノムの配列と対比させて、続く解析を行うことにより、重複の配列が解析の妨害になるのを避けて、ゲノムのコピー数変異の有無を判断する効率を更に向上させることができる。
【００２０】
Ｓ３００：配列の参照ゲノム配列における分布に基づいて、参照ゲノム配列において複数の破過点を決める
本明細書で使用される「破過点」という用語は、ゲノム配列において、両側に位置している同じ断片の間でシーケンシング配列の数に有意差があるサイトを指す。シーケンシング配列（ｒｅａｄｓ）がゲノムに由来しているため、ゲノムにおける特定の領域にコピー数変異が見える時、当該領域に対応しているシーケンシング配列の数は大幅に変化する。これにより、複数の破過点を決めた後、隣接している２破過点の間での断片にコピー数変異があることは可能であるとの予備的判断を明らかにした。
【００２１】
本発明の実施例によれば、参照ゲノムにおいて破過点を決めるのは、更に、次のステップを含んでもよい；
まず、参照ゲノムの配列を、所定の長さを有する一次ウィンドウにそれぞれ分割して、各一次ウィンドウに入るシーケンシング配列を判断する。本発明の具体例によれば、通常の対比用プログラムで、得られた配列解析の結果に含まれるシーケンシング配列を、参照ゲノムの配列と対比させて、各一次ウィンドウに入るシーケンシング配列を判断することができる。例えば、前述したステップＳ２００で達成してもよい。本発明の具体例によれば、各一次ウィンドウに入るシーケンシング配列は、唯一適合のものであるため、重複の配列が解析の妨害になるのを避けて、ゲノムのコピー数変異の有無を判断する効率を更に向上させることができる。
【００２２】
次いで、参照ゲノムの配列に位置している少なくとも１つのサイトに対して、サイトの両側に位置している同じ数の一次ウィンドウに入るシーケンシング配列の数を判断する。本発明の実施例によれば、参照ゲノムの配列に位置している全てのサイトを分析することができる。必要に応じて、２１番染色体、１８番染色体、１３番染色体、Ｘ染色体、及びＹ染色体から選ばれる少なくとも１種のものに位置している全てのサイトを分析してもよい。本発明の実施例によれば、これらの一次ウィンドウの長さは、同一でもよいし、相違でもよいし、各一次ウィンドウの間に重なってもよい。各一次ウィンドウに関する情報は既知であればよいが、各一次ウィンドウの長さは、同一であることが好ましい。本発明の実施例によれば、各一次ウィンドウの長さは、ともに１００−２００Ｋｂｐであり、好ましく、１５０Ｋｂｐである。本発明の実施例によれば、サイトの両側に位置している一次ウィンドウの数としては、特に制限がない。具体例によれば、それぞれ、サイトの両側で一次ウィンドウを１００個ずつ取ってもよい。
【００２３】
そして、統計的分析を行うことにより、シーケンシングデータが研究対象となるサイトの両側に分布するｐ値を求めることができる。このｐ値は、両側のシーケンシングデータの数に有意差があるかどうかを示すことができる。前述サイトのｐ値が終端ｐ値より小さいと、このサイトを破過点と判断する。本発明の実施例によれば、終端ｐ値の範囲は、既知の配列を有するサンプルを、並行分析することにより、求めることができる。本発明の一具体例によれば、終端ｐ値は１．１×１０−５０である。
【００２４】
本発明の一実施例によれば、サイトの両側に分布するシーケンシングデータの数に有意差の有無を示すｐ値を求めることは、更に、次のステップを含む；
選択されたサイトに対して、それぞれ、サイトの両側に同じ数を有する一次ウィンドウを取り、各一次ウィンドウの相対的なシーケンシング配列の数であるＲｉを算出する。ただし、ｉは、一次ウィンドウの番号を表す。
各一次ウィンドウの相対的なシーケンシング配列の数であるＲｉを連検定して、該サイトのｐ値を求める。
【００２５】
ただし、上述した相対的なシーケンシング配列の数は、下述式により求められる。
【数１】
0005938484.tif 000002
ただし、ｒｉは、ｉ番目の一次ウィンドウに入るシーケンシング配列の数を表し、
【数２】
0005938484.tif 000003
ｎは、一次ウィンドウの総数を表す。
【００２６】
具体的には、各一次ウィンドウの相対的なシーケンシング配列の数を連検定するのは、更に、各一次ウィンドウの相対的なシーケンシング配列の数であるＲｉを、ＧＣ含有量について補正して、補正された相対的なシーケンシング配列の数である
【数３】
0005938484.tif 000004
（以下、「Ｒｉ〜」と表記することもある。）を算出するステップ、補正された相対的なシーケンシング配列の数に基づいて、各一次ウィンドウにおける標準化されたシーケンシング配列の数であるＺｉを求めるステップ、及び、一次ウィンドウにおける標準化されたシーケンシング配列の数であるＺｉを、全体に連検定するステップを含む。
【００２７】
より具体的には、上述した補正された相対的なシーケンシング配列の数であるＲｉ〜は、次のステップにより求められる；
まず、各一次ウィンドウにおけるＧＣ含有量を算出する。
次いで、所定の値に準して、ＧＣ含有量を、複数の領域に分割するとともに、各領域での相対的なシーケンシング配列の数の平均であるＭｓを出す。ｓは、ＧＣ領域の番号である。本発明の実施例によれば、所定の値は、０．０００５−０．０１の範囲内の任意の値でもよいが、好ましくは、０．００１である。その対応している領域は、サイズが５０ｋ−３００ｋである。これにより、最適化された補正の強度（ｐｏｗｅｒ）を実現するようになる。
【００２８】
そして、次の式により、上述した補正された相対的なシーケンシング配列の数を算出する。
【数４】
0005938484.tif 000005
最終的に、次の式により、標準化されたシーケンシング配列の数であるＺｉを求める。
【数５】
0005938484.tif 000006
ただし、
【数６】
0005938484.tif 000007
【数７】
0005938484.tif 000008
【００２９】
これにより、シーケンシング配列の数をＧＣ含有量で検定できる。それにより、ゲノムの増幅傾向が妨害になることを取り除くことができ、ゲノムのコピー数変異の有無を判断する精度及び効率を更に向上させることができる。
【００３０】
複数の破過点を決めた後、隣接している２破過点の間での断片にコピー数変異があることは可能性として予備的に判断できる。そのため、コピー数変異の有無を更に判断するように、これらの断片を検定用のウィンドウとして利用する。破過点が多いと予備的に判断する場合、破過点にスクリーニングを更に行ってもよい。これにより、本発明の実施例によれば、複数の破過点に基づいて、参照ゲノムにおいて、検定対象となるウィンドウを決めるのは、更に、
１）前と後の両方にも他の破過点がある候補破過点を複数決めるステップ、
２）各候補破過点のｐ値を求めるとともに、ｐ値の一番大きい候補破過点を捨てるステップ、
３）残りの候補破過点のｐ値がともに終端ｐ値を下回るまでに、これらの候補破過点に対して、ステップ２）を繰り返して、候補破過点を一部捨てて、残りのものをスクリーニングされた候補破過点として用いるステップ、及び、
４）隣接しているスクリーニングされた候補破過点の間にある領域を、検定対象となるウィンドウとして選定するステップ、が含まれている。
【００３１】
本発明の実施例によれば、次のステップにより、候補破過点のｐ値を求めることができる；
候補破過点とその直前の破過点との間にある領域を第一候補領域として、前述候補破過点とその直後の破過点との間にある領域を第二候補領域として選定する。
【００３２】
第一候補領域と第二候補領域に含まれている、標準化されたシーケンシング配列の数であるＺｉを、連検定して、前述候補破過点のｐ値を求める。ただし、いわゆる連検定とは、ノンパラメトリック検定の一つであり、二つのグループにある要素を混合させた分布の均一性により、これらのグループに有意差の有無を調べることを指す。詳細は、Ｗａｌｄ  Ａ．  ＷＪ．  Ｏｎ  ａ  Ｔｅｓｔ  Ｗｈｅｔｈｅｒ  Ｔｗｏ  Ｓａｍｐｌｅｓ  ａｒｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．  Ｔｈｅ  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  １９４０；  １１：１４７−１６２を参照でき、参照によりその内容をここに援用する。
【００３３】
本発明の実施例によれば、終端ｐ値は、次のステップにより求められる；
候補破過点の数がゼロになるまでに、対照サンプルが配列解析された結果によって、参照ゲノムにおいて、検定対象となるウィンドウを選定する手順を、繰り返すとともに、毎回捨てられた候補破過点のｐ値を記録する。ここで使用される「対照サンプル」という用語は、既知の核酸配列にコピー数変異がないサンプルであることを指す。
【００３４】
捨てられた候補破過点のｐ値の分布に基づいて、前述終端ｐ値を求める。例えば、捨てられた候補破過点のｐ値の分布図を作成して、変化傾向の最大であるｐ値を、終端ｐ値（Ｐｆｉｎａｌ）として選定する。本発明の具体例によれば、終端ｐ値は１．１×１０−５０であってもよい。
【００３５】
Ｓ４００：検定対象となるウィンドウに入る配列に基づいて、第一パラメータを決定する
検定対象となるウィンドウを選定したあと、検定対象となるウィンドウに含まれているシーケンシング配列を統計して分析することにより、検定対象となるウィンドウのコピー数変異の有無を判断できる。本発明の一実施例によれば、検定対象となるウィンドウに入る配列に基づいて、第一パラメータを決定するのは、更に、検定対象となるウィンドウに含まれている一次ウィンドウにおける、標準化されたシーケンシング配列の平均数である
【数８】
0005938484.tif 000009
を、第一パラメータとして求めるステップが含まれている。標準化されたシーケンシング配列の数については前述したので詳しい説明を省略する。
【００３６】
Ｓ５００：前記第一パラメータと所定の閾値の差に基づいて、前記ゲノムに前記検定対象となるウィンドウに対するコピー数変異の有無を判断する
本発明の実施例によれば、得られた第一パラメータを所定の閾値と比較させ、第一パラメータと所定の閾値の差に基づいて、ゲノムに前記検定対象となるウィンドウに対するコピー数変異の有無を判断することができる。ゲノムを配列決定して得た結果では、特定のウィンドウに対するシーケンシングデータの数と全ゲノムにおける、染色体又はゲノムに含まれる当該ウィンドウの含有量との間に正の相関があるので、配列解析の結果における、特定の染色体のシーケンシングデータの数を統計して分析することにより、ゲノムに当該検定対象となるウィンドウに対するコピー数変異の有無を効果的に判断できる。本明細書で使用される「所定の閾値」という用語は、ゲノムが正常であるゲノムサンプルに、上述したステップ及び分析を繰り返して得た、特定のウィンドウに関するデータを意味する。同じシークエンシングの反応条件及び数学的方法により、それぞれ特定のウィンドウと正常細胞とに関するパラメータを得ることができるのは、当業者とって自明なことである。ここに、正常細胞に関するパラメータを所定の閾値として使用してもよい。また、本明細書で使用される「所定の」という用語は、広く理解されるべきであり、予め実験により決定しておいてもよいし、生体サンプルを分析している際、並列実験により得てもよい。ここで使用される「並列実験」という用語は、広義に理解されるべきであり、未知試料と既知試料とを、同時に配列決定及び分析をするのであっても、順に同じ条件で配列決定及び分析をするのであってもよい。本発明の実施例によれば、上述した所定の閾値としては、第一閾値及び第二閾値を使用する。第一パラメータ
【数９】
0005938484.tif 000010
を所定の第一閾値及び第二閾値と比較して、第一閾値を下回ると、コピー数が減少し（即ち、染色体欠失）、第二閾値を上回ると、コピー数が増加した（即ち、染色体重複）と意味する。それにより、コピー数変異の種類を判断できる。本発明の具体例によれば、α＝０．０５を重要な限界として、−１．６４５を第一閾値として、１．６４５を第二閾値として、設定することにより、コピー数変異の種類をより効果的に判断できる。
【００３７】
本発明の実施例によるゲノムのコピー数変異の有無を判断する方法によれば、ゲノムのコピー数変異の有無を効果的に判断することができ、様々なコピー数変異に適用され、染色体異数性、染色体欠失、染色体重複、微小欠失、微小重複が含まれるが、これらに限定されない。コピー数変異は、先天性欠損症を引き起こす主な要因となり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの胚においても、非常に多発するので、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生殖障害の主な原因である。また、コピー数変異は、多くの疾患、例えば、ガンの発症因子である。全ゲノム増幅は、単一またはいくつかの細胞や、微量な核酸試料に全ゲノム増幅を行う技術であり、全ゲノムの特徴を維持するようにサンプルのサイズを所望のサイズに増加させることができる。しかしながら、一般には、全ゲノム増幅は、増幅バイアスの問題があるので、その後の解析にエラーをもたらす可能性がある。本発明の実施例によるゲノムのコピー数変異の有無を判断する方法によれば、単一の細胞や、微量な核酸試料に全ゲノム増幅を行った後、シークエンシング技術によりデータを得て、コピー数変異を解析する。これにより、全ゲノム増幅で単一の細胞や、微量な核酸の試料分析の困難な問題を解決できる。一方で、全ゲノム増幅がコピー数変異の解析にエラーをもたらすのを避け、検出を幅広く、正確にし、特に、検出の効率を、ＧＣ含有量について補正することにより、更に向上させることができる。また、本発明の実施例によれば、異なる試料でライブラリーを構築するプロセスにおいて、異なるタグを導入することにより、同時に複数の試料を検定し、ゲノムのコピー数変異の有無を判断する効率を更に向上させることができる。本発明の実施例によるゲノムのコピー数変異の有無を判断する方法によれば、着床前にコピー数変異についてスクリーニング検査及び診断を行ったり、非侵襲的出生前胎児にコピー数変異についてスクリーニング検査したりすることができ、遺伝学相談と臨床決定の根拠を与えるのに役立つ。出産前の診断は、病気の胚着床及び病児出産を効果的に防ぐことができる。
【００３８】
２、ゲノムのコピー数変異の有無を判断するシステム
本発明の第二の態様によれば、本発明は、ゲノムのコピー数変異の有無を判断するシステムを提供する。このシステムによれば、上述したゲノムにコピー数変異があるかどうかを判断する方法を効果的に実施でき、ゲノムにコピー数変異があるかどうかを効果的に判断できる。
【００３９】
図２を参照すると、本発明の実施例により、ゲノムのコピー数変異の有無を判断するシステム１０００は、配列決定装置１００と分析装置２００とが含まれている。
【００４０】
本発明の実施例によれば、配列決定装置１００は、ゲノムを配列決定して、複数の配列データからなる配列解析の結果を得るものである。本発明の実施例によれば、ゲノムのコピー数変異の有無を判断するシステム１０００は、更に、配列決定装置１００にゲノムを提供するように、生体試料からゲノムを抽出し、配列決定装置に接続されているゲノム抽出装置（図示せず）を含んでもよい。これにより、生体試料をそのままで原料として使用し、当該生体試料にコピー数変異があるかどうかに関するデータを得て、生体の健康状態を示すことができる。本発明の実施例によれば、配列決定装置は、更に、ゲノムを増幅させるために用いられるゲノムの増幅ユニットと、ゲノムの増幅ユニットに接続されているとともに、全ゲノムシーケンシングライブラリを、増幅されたゲノムで構築するシーケンシングライブラリの構築ユニットと、上述したシーケンシングライブラリの構築ユニットに接続されているとともに、前述シーケンシングライブラリを配列決定するために用いられる配列決定ユニットとを含んでもよい。本発明の実施例によれば、配列決定ユニットは、次世代法シークエンシング技術、例えば、Ｈｉｓｅｑシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）（登録商標）、Ｍｉｓｅｑシステム（登録商標）、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＡ）システム（登録商標）、４５４  ＦＬＸ（Ｒｏｃｈｅ社製）（登録商標）、ＳＯＬｉＤシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）（登録商標）、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）（登録商標）、及び単一分子シークエンシング装置から選ばれる少なくとも１種である。それにより、ハイスループットや大規模シークエンシングを特徴とするこれらの配列決定装置を利用して、単細胞の染色体異数性を判断する効率を更に高めることができる。
【００４１】
本発明の実施例によれば、分析装置２００は、配列決定装置に接続されており、上述した配列解析の結果に基づいて、前記ゲノムにコピー数変異があるかどうかを判断する。本発明の実施例によれば、分析装置２００は、更に、対比ユニット２０１、破過点決定ユニット２０２、検定対象となるウィンドウ決定ユニット２０３、パラメータ決定ユニット２０４、及び、判断ユニット２０５が含まれている。対比ユニット２０１は、配列解析の結果を、参照ゲノム配列と対比させて、前記配列の参照ゲノム配列における分布を判断するために用いられる。本発明の実施例によれば、対比ユニット２０１に記憶されている対照ゲノム配列は、既知のゲノム配列の一部であり、例えば、２１番染色体、１８番染色体、１３番染色体、Ｘ染色体、及びＹ染色体から選ばれる少なくとも１種の配列でもよい。破過点決定ユニット２０２は、該対比ユニット２０１に接続されており、前記配列の参照ゲノム配列における分布に基づいて、前記参照ゲノム配列において両側の配列数に有意差がある複数の破過点を決めるのに適する。検定対象となるウィンドウ決定ユニット２０３は、破過点決定ユニット２０２に接続されており、これらの破過点に基づいて、参照ゲノム配列において検定対象となるウィンドウを決めるのに適する。パラメータ決定ユニット２０４は、検定対象となるウィンドウ決定ユニット２０３に接続されており、検定対象となるウィンドウに入る配列に基づいて、第一パラメータを決定するのに適する。判断ユニット２０５は、パラメータ決定ユニット２０４に接続されており、第一パラメータと所定の閾値の差に基づいて、ゲノムに決定された検定対象となるウィンドウに対するコピー数変異があるかどうかを判断する。
【００４２】
本発明の実施例によれば、破過点決定ユニット２０２は、破過点を決めるように、更に、次の手順の実行を含んでもよい；
参照ゲノムの配列を、それぞれ、所定の長さを有する一次ウィンドウに複数分割して、各一次ウィンドウに入るシーケンシング配列を判断する。
【００４３】
まず、参照ゲノムの配列を、それぞれ、所定の長さを有する一次ウィンドウに複数分割して、各一次ウィンドウに入るシーケンシング配列を判断する。本発明の具体例によれば、通常の対比用プログラムで、得られた配列解析の結果に含まれるシーケンシング配列を、参照ゲノムの配列と対比させて、各一次ウィンドウに入るシーケンシング配列を判断することができる。本発明の実施例によれば、これらの一次ウィンドウの長さは、同一でもよいし、相違でもよいし、各一次ウィンドウの間に重なってもよい。各一次ウィンドウに関する情報は既知であればよいが、各一次ウィンドウの長さは、同一であることが好ましい。本発明の実施例によれば、各一次ウィンドウの長さは、ともに１００−２００Ｋｂｐであり、好ましくは、１５０Ｋｂｐである。本発明の実施例によれば、サイトの両側に位置している一次ウィンドウの数としては、特に制限がない。具体例によれば、それぞれ、サイトの両側で一次ウィンドウを１００個ずつ取ってもよい。
【００４４】
そして、前述サイトに対してｐ値を求める。このｐ値は、両側のシーケンシングデータの数に有意差があるかどうかを示すことができる。前述サイトのｐ値が終端ｐ値より小さいと、このサイトを破過点と判断する。本発明の実施例によれば、終端ｐ値の範囲は、既知の配列を有するサンプルを、並行分析することにより、求めることができる。本発明の一具体例によれば、終端ｐ値は１．１×１０−５０である。
【００４５】
本発明の実施例によれば、破過点決定ユニット２０２は、ｐ値を求めるように、更に、次の手順の実行を含んでもよい；
選択されたサイトに対して、それぞれ、サイトの両側に同じ数を有する一次ウィンドウを取り、各一次ウィンドウの相対的なシーケンシング配列の数であるＲｉを算出する。ただし、ｉは、一次ウィンドウの番号を表す。各一次ウィンドウの相対的なシーケンシング配列の数であるＲｉを連検定して、該サイトのｐ値を求める。
【００４６】
ただし、上述した相対的なシーケンシング配列の数は、下述式により求められる。
【数１０】
0005938484.tif 000011
ただし、ｒｉは、ｉ番目の一次のウィンドウに入るシーケンシング配列の数を表し、
【数１１】
0005938484.tif 000012
ｎは、一次ウィンドウの総数を表す。
【００４７】
本発明の実施例によれば、破過点決定ユニット２０２は、各一次ウィンドウの相対的なシーケンシング配列の数を連検定するように、更に、次の手順の実行を含んでもよい；
各一次ウィンドウの相対的なシーケンシング配列の数であるＲｉを、ＧＣ含有量について補正して、補正された相対的なシーケンシング配列の数であるＲｉ〜を得る。
補正された相対的なシーケンシング配列の数に基づいて、各一次ウィンドウにおける標準化されたシーケンシング配列の数であるＺｉを求める。及び、一次ウィンドウにおける標準化されたシーケンシング配列の数であるＺｉ全体を、連検定する。
【００４８】
本発明の実施例によれば、上述した補正された相対的なシーケンシング配列の数であるＲｉ〜は、次の手順を実行することにより、求められる；
各一次ウィンドウにおけるＧＣ含有量を算出する。
所定の値に準じて、ＧＣ含有量を、複数の領域に分割するとともに、各領域での相対的なシーケンシング配列の数の平均であるＭｓを出す。ｓは、ＧＣ領域の番号である。本発明の実施例によれば、所定の値は、０．０００５−０．０１の範囲内の任意の値でもよい。その対応している領域は、サイズが５０ｋ−３００ｋであるが、好ましくは、０．００１である。これにより、最適化された補正の強度（ｐｏｗｅｒ）を実現するようになる。
【００４９】
次の式により、上述した補正された相対的なシーケンシング配列の数であるＲｉ〜を算出する。
【数１２】
0005938484.tif 000013
標準化されたシーケンシング配列の数であるＺｉは、次の式により求められる。
【数１３】
0005938484.tif 000014
ただし、
【数１４】
0005938484.tif 000015
【数１５】
0005938484.tif 000016
【００５０】
複数の破過点を決めた後、隣接している２破過点の間での断片にコピー数変異があることは可能性として予備的に判断できる。そのため、コピー数変異の有無を更に判断できるように、これらの断片を検定対象となるウィンドウとして利用する。破過点が多いと予備的に判断する場合、破過点にスクリーニングを更に行ってもよい。これにより、本発明の実施例によれば、複数の破過点に基づいて、参照ゲノムにおいて、検定対象となるウィンドウを決めるように、更に、次の手順の実行を含む；
１）前と後の両方にも他の破過点がある候補破過点を複数決める。
２）各候補破過点のｐ値を求めるとともに、ｐ値の一番大きい候補破過点を捨てる。
３）残りの候補破過点のｐ値がともに終端ｐ値を下回るまでに、これらの候補破過点に対して、ステップ２）を繰り返して、候補破過点を一部捨てて、残りのものをスクリーニングされた候補破過点として用いる。及び、
４）隣接しているスクリーニングされた候補破過点の間にある領域を、検定対象となるウィンドウとして選定する。
【００５１】
本発明の実施例によれば、次のステップにより、候補破過点のｐ値を求める；
候補破過点とその直前の破過点との間にある領域を第一候補領域として、前述候補破過点とその直後の破過点との間にある領域を第二候補領域として選定する。
第一候補領域と第二候補領域に含まれている、標準化されたシーケンシング配列の数であるＺｉを、連検定して、前述候補破過点のｐ値を求める。
【００５２】
本発明の実施例によれば、終端ｐ値は、次のステップにより求められる；
候補破過点の数がゼロになるまでに、対照サンプルが配列解析された結果によって、参照ゲノムにおいて、検定対象となるウィンドウを選定する手順を、繰り返すとともに、毎回捨てられた候補破過点のｐ値を記録する。ここで使用される「対照サンプル」という用語は、既知の核酸配列にコピー数変異がないサンプルであることを指す。
捨てられた候補破過点のｐ値の分布に基づいて、前述終端ｐ値を求める。例えば、捨てられた候補破過点のｐ値の分布図を作成して、変化傾向の最大であるｐ値を、終端ｐ値（Ｐｆｉｎａｌ）として選定する。本発明の具体例によれば、終端ｐ値は１．１×１０−５０であってもよい。
【００５３】
本発明の実施例によれば、パラメータ決定ユニット２０４は、更に、次の手順の実行を含んでもよい；検定対象となるウィンドウに含まれている一次ウィンドウにおける、標準化されたシーケンシング配列の平均数である
【数１６】
0005938484.tif 000017
を、第一パラメータとして求める。更に、判断ユニット２０５は、第一パラメータ
【数１７】
0005938484.tif 000018
を所定の第一閾値及び第二閾値と比較して、検定対象となるウィンドウにコピー数変異の有無を判断できるように、所定の閾値を記憶している。本発明の実施例によれば、上述した所定の閾値としては、第一閾値及び第二閾値を使用する。第一パラメータ
【数１８】
0005938484.tif 000019
を所定の第一閾値及び第二閾値と比較して、第一閾値を下回ると、コピー数が減少し（即ち、染色体欠失）、第二閾値を上回ると、コピー数が増加した（即ち、染色体重複）と意味する。それにより、コピー数変異の種類を判断できる。本発明の具体例によれば、α＝０．０５を重要な限界として、−１．６４５を第一閾値として、１．６４５を第二閾値として、設定することにより、コピー数変異の種類をより効果的に判断できる。
【００５４】
これにより、本発明の実施例によるゲノムにコピー数変異があるかどうかを判断するシステムによれば、ゲノムにコピー数変異があるかどうかを判断する方法が効果的に実施でき、ゲノムにコピー数変異があるかどうかを効果的に判断でき、様々なコピー数変異に適用され、染色体異数性、染色体欠失、染色体重複、微小欠失、微小重複が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
なお、前述した、ゲノムのコピー数変異の有無を判断する方法の特徴及び利点は、ゲノムのコピー数変異の有無を判断するシステムにも該当することは、当業者とって自明なことであるので、便宜のために詳しい説明を省略する。
【００５６】
３、コンピューター読み取り可能な記憶媒体
本発明の第三の態様によれば、本発明は、コンピューター読み取り可能な記憶媒体を提供する。本発明の実施例によれば、当該コンピューター読み取り可能な記憶媒体は、プロセッサで実行された後、次のステップにより、ゲノムにコピー数変異があるかどうかを判断するのに適する命令を格納している。詳細は、ゲノムを配列決定して得た複数の配列データからなる配列解析の結果を、参照ゲノム配列と対比させて、前記配列の参照ゲノム配列における分布を判断するステップ、前記配列の参照ゲノム配列における分布に基づいて、前記参照ゲノム配列において両側の配列数に有意差がある複数の破過点を決めるステップ、前記複数の破過点に基づいて、上述した参照ゲノムにおいて検定対象となるウィンドウを決めるステップ、前記検定対象となるウィンドウに入る配列に基づいて、第一パラメータを決定するステップ、及び、前記第一パラメータと所定の閾値の差に基づいて、前記ゲノムに前記検定対象となるウィンドウに対するコピー数変異があるかどうかを判断するステップを含む。コンピューター読み取り可能な記憶媒体によれば、本発明の実施例によるゲノムにコピー数変異があるかどうかを判断する方法が効果的に実施でき、ゲノムにコピー数変異があるかどうかを効果的に判断でき、様々なコピー数変異に適用され、染色体異数性、染色体欠失、染色体重複、微小欠失、微小重複が含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
なお、前述した、ゲノムのコピー数変異の有無を判断する方法の特徴及び利点は、当該コンピューター読み取り可能な記憶媒体にも該当することは、当業者とって自明なことであるので、便宜のために詳しい説明を省略する。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例により本発明の形態を説明する。なお、これらの実施例は単に説明のためのもので、本発明を限定するものではないのが理解されるべきである。
【００５９】
実施例において説明されていない具体的な技術、条件は、当該技術分野で記載される技術文献、条件（例えば、Ｊ．サムブルック他著，黄培堂他監訳，「分子クローニング実験ガイド」，第三版，科学出版社を参考してもよい）、或いは、操作マニュアルに従う。製造者を示さない採取の試薬や機器としては、市販のものより入手できるが、例えば、イルミナ会社から購入できる。
【００６０】
通常の方法
図３を参照すると、本発明の実施例によるゲノムのコピー数変異の有無を判断する方法は、次のステップを含む；
まず、対象である全ゲノムを増幅させて、配列決定して、シーケンシング配列（シーケンシングデータ）を得る。
そして、得られたシーケンシング配列を、ＳＯＡＰ２によりＮＣＢＩデータベースからの標準ヒトゲノムの参照配列とＳＯＡＰ２対比させて、シーケンシング配列の参照ゲノムにおける位置を知る。重複の配列が解析の妨害になるのを避けるために、標準ヒトゲノムの参照配列から選ばれる唯一適合のシーケンシング配列（ｒｅａｄｓ）のみを、選択して、続く解析を行う。
【００６１】
続いて、ゲノムの両側に分布するシーケンシングデータの数に有意差があるのを示すサイトを判断することは、次のステップを含む；
ａ）対象となるサンプル（同時に複数のサンプルを分析することができる）に相対的なシーケンシング配列の数を求める。
標準ヒトゲノムの参照配列を、ｗの長さでウィンドウ（ｗは、１以上の任意の整数であってもよいが、例えば、１０Ｋ−１０Ｍｂｐ、好ましくは５０Ｋ−１Ｍｂｐ、より好ましくは１００Ｋ−３００Ｋｂｐである。例えば、約１５０Ｋｂｐである。）に分割し、各ウィンドウに入るシーケンシング配列の数ｒｉ，ｊ、及び、各ウィンドウにおけるＧＣ含有量であるＧＣｉ，ｊ、を算出して、相対的なシーケンシング配列の数である
【数１９】
0005938484.tif 000020
を求める。ただし、ｉ及びｊは、それぞれ、ウィンドウの番号及びサンプルの番号を表し、シーケンシング配列の数の平均値は、
【数２０】
0005938484.tif 000021
である。
【００６２】
ｂ）データ補正と標準化
ＧＣ含有量を横軸にし、相対的なシーケンシング配列の数であるＲを縦軸に取った座標軸においては、ＧＣを、昇順で同じサイズの領域に分割して、各領域におけるＲの平均値であるＭｓを求める。だたし、ｓは、ＧＣ領域の番号を表す。
【００６３】
サンプルの各ウィンドウについて、補正された相対的なシーケンシング配列の数である
【数２１】
0005938484.tif 000022
を算出する。だたし、ウィンドウｉにおけるＧＣ含有量は、ｓ目のＧＣ領域にある。
【００６４】
サンプルの各ウィンドウについて、標準化された相対的なシーケンシング配列の数であるＺｉ，ｊを求める。
【数２２】
0005938484.tif 000023
ただし、
【数２３】
0005938484.tif 000024
【数２４】
0005938484.tif 000025
【００６５】
ｃ）破過点の決定とスクリーニング
破過点の決定：  参照ゲノムの配列における各サイトに対して、それぞれ、両側において、ウィンドウを、二つのグループとしてｎ個（例えば、１００個）ずつ取って、統計的分析を行う。それにより、両側に有意差があるかどうかを示すｐ値を求めることができる。破過点（Ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ）として最小のｐ値のサイトをｍ個（例えば、３０００個）残す。
【００６６】
破過点のスクリーニング：配列された破過点をＢｃ＝｛ｂ１，ｂ２，．．．，ｂｓ｝と全体記録する。各破過点の両側には断片が二つある。断片としては、破過点とそれに隣接している前の破過点との間にある領域、及び当該破過点とそれに隣接している後ろの破過点との間にある領域である。２断片の間にあるＺｉ，ｊに統計的検定（例えば、連検定を行う。連検定とは、ノンパラメトリック検定の一つであり、二つのグループにある要素を混合させた分布の均一性により、これらのグループに有意差の有無を調べることを指す。）をして得たｐ値（Ｐｋ）を、「ｂｋ破過点としての有意差」と評価する。Ｐｋの一番大きい候補破過点を除いて、残りのｐ値がともに終端ｐ値（Ｐｆｉｎａｌ）を下回るまでに、このステップを繰り返す。
【００６７】
終端ｐ値の算出：試験においては、対照試料を試験対象として、前述ステップを実行して、複数の破過点を決める。全ゲノムにおける配列された破過点をＢｃ＝｛ｂ１，ｂ２，．．．，ｂｓ｝と全体記録する。各候補破過点ｂｋの両側にはウィンドウが二つある。２ウィンドウにおけるＺｉ，ｊに統計的検定をして得たｐ値（Ｐｋ）を、「ｂｋ破過点としての有意差」と評価する。候補破過点の数がゼロになるまでに、有意差がない候補破過点を捨てるとともに、当該破過点に対応するｐ値を記録する。捨てられた候補破過点のｐ値を分布図に作成して、変化傾向の最大であるｐ値を、終端ｐ値（Ｐｆｉｎａｌ）として選定する。
【００６８】
検定対象となるウィンドウの決定と検証：スクリーニングされた破過点を得た後、検定対象となるウィンドウを決める。検定対象となるウィンドウを更に検証するために、該断片のＺｉ，ｊの平均値を
【数２５】
0005938484.tif 000026
として算出する。該断片の
【数２６】
0005938484.tif 000027
が閾値を上回ると、該断片にコピー数変異があるのと判断できる。閾値は、次のように決められる。
【００６９】
ウィンドウを組み合わせた断片に対して、対照試料の該断片への標準化された相対的なシーケンシング配列の数であるＺｉ，ｊの平均値及び標準偏差を算出する。各断片では、正規分布になるので、前述ステップで算出された平均値及び標準偏差により、コピー数変異の有無を判断する閾値として、該断片について、累積確率が０．０５になる時の閾値の範囲を算出する。
【００７０】
実施例１  胚単細胞サンプルを用いた出生前胎児の断片のコピー数変異及び染色体非整倍性の有無についての検出
１、全ゲノム増幅
本実施例では、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社からのＧｅｎｏｍｅＰｌｅｘ（登録商標）  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔによって、レーザー光線を用いて組織切片から微小細胞を切り出した、五日目の胚盤胞期における外栄養膜の単細胞である２胚単細胞に、全ゲノム増幅を行った。２胚単細胞を溶解させた後、キット製造会社の取扱説明書に従って全ゲノム増幅を行う。
【００７１】
２、配列決定
本実施例では、イルミナ社からのシーケンサーを利用して、２胚単細胞に由来する全ゲノムを増幅させたＤＮＡを、配列決定する。イルミナ社からの取扱説明書に従って、タグ配列により区別された各試料が０．３６Ｇでデータの数を取得するように、ライブラリーを構築して、配列決定する。
【００７２】
得られたシーケンシング配列を、対比用ソフトウェアであるＳＯＡＰ２によりバージョン３６（ｈｇ１８；ＮＣＢＩＢｕｉｌｄ３６）のＮＣＢＩデータベースからの標準ヒトゲノムの参照配列と対比させて、シーケンシング配列の参照ゲノムへの位置を知る。
【００７３】
３、配列解析
ａ）対象となるサンプル、及び対照試料（対照試料は正常な核型を有するものである）に相対的なシーケンシング配列の数を求める
標準ヒトゲノムの参照配列を、１５０Ｋｂｐの長さでウィンドウに分割し、ステップ２で得られたシーケンシング配列に対して、各ウィンドウに入るシーケンシング配列の数ｒｉ，ｊ、及び、各ウィンドウにおけるＧＣ含有量であるＧＣｉ，ｊ、を算出して、相対的なシーケンシング配列の数を求める。ただし、ｉ及びｊは、それぞれ、ウィンドウの番号及びサンプルの番号を表す。
【００７４】
ｂ）データ補正と標準化
ＧＣ含有量を横軸とし、相対的なシーケンシング配列の数であるＲを縦軸に取った座標軸において、表１に示すように、ＧＣを、昇順で０．００１の大きさの領域に分割して、各領域におけるＲの平均値であるＭｓを求める。だたし、ｓは、ＧＣ領域の番号を表す。
【表１−１】
0005938484.tif 000028
【表１−２】
0005938484.tif 000029
【表１−３】
0005938484.tif 000030
【００７５】
ｃ）ウィンドウの組み合わせ
破過点の決定：参照ゲノムの配列における各サイトに対して、それぞれ、両側において、ウィンドウを、二つのグループとして１００個ずつ取って、統計的分析を行う。それにより、両側に有意差があるかどうかを示すｐ値を求めることができる。破過点（Ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ）として最小のｐ値のサイトを３０００個残す。
【００７６】
破過点のスクリーニング：配列された破過点をＢｃ＝｛ｂ１，ｂ２，．．．，ｂｓ｝と全体記録する。各破過点の両側には断片が二つある。断片としては、破過点とそれに隣接している前の破過点との間にある領域、及び当該破過点とそれに隣接している後ろの破過点との間にある領域である。２断片の間にあるＺｉ，ｊに統計的検定をして得たｐ値（ｐｋ）を、「ｂｋ破過点としての有意差」と評価する。ｐｋの一番大きい候補破過点を除いて、残りのｐ値がともに終端ｐ値（１．１×１０−５０）を下回るまでに、このステップを繰り返す。
【００７７】
ｄ）スクリーニングされた破過点を得た後、隣接している２破過点の間での領域、を検定対象となるウィンドウとして決めて、ウィンドウを組み合わせる。ウィンドウを組み合わせた断片を、更にスクリーニングするために、該断片のＺｉ，ｊの平均値を
【数２７】
0005938484.tif 000031
として算出する。該断片の
【数２８】
0005938484.tif 000032
が閾値を上回ると、該断片にコピー数変異があるのと判断できる。−１．６４５を第一閾値として、１．６４５を第二閾値として、設定する。
【００７８】
４、結果
表２は、本実施例で各胚単細胞をＷＧＡ全ゲノム増幅させることにより、コピー数変異の種類を判断した結果を示す。
【表２】
0005938484.tif 000033
表２から見れば、本発明によるゲノムのコピー数変異の有無を判断する方法によれば、様々な種類のコピー数変異を効果的に判断することができる。
【００７９】
実施例２
実施例１と同じ胚を利用してＤＮＡを抽出した後、そのままで配列決定する。ＷＧＡしないこと以外は、実施例１と同様の手順にする。実施例１を実施例２と比較させた結果を、表３、図４及び図５に示す。
【表３】
0005938484.tif 000034
【００８０】
表３、染色体のデジタル核型分析の画像である図４、図５から見れば、各試料を、ＷＧＡして配列解析した結果は、ＷＧＡせずに配列解析した結果と一致する。表３において、「欠失」、「重複」に対応している出発と終わりとのサイト（コピー数変異を見える境界）の違いについては、コピー数変異を見える境界を、正確に判断しにくいので、一般的に、約１５０Ｋの一次ウィンドウでは、両方の違いが１００−３００Ｋｂにある場合、全く一致とし、３００Ｋｂ−１Ｍｂにある場合、一致とする。表３には、コピー数変異を見える境界を、両方法で判断した違いの範囲が１００−３００Ｋｂ、又は３００Ｋｂ−１Ｍｂであることが示されている。これにより、両方法よるコピー数変異を見える境界は一致とする。
【００８１】
本発明の具体的な実施態様を図示および説明したが、前記開示により、種々の変形および改変をすることができ、これらの変形および改変は、すべて、添付の請求の範囲に含まれていることは、当業者によって認識される。本発明の範囲は、添付の請求の範囲およびその均等構成を基準にする。
【００８２】
本明細書において、「一実施例」、「いくつかの実施例」、「概略の実施例」、「例示」、「具体的な例示」または「いくつかの例示」という用語は、この実施例または例示に関連して説明した特徴、構造、材料、または特性が、少なくとも本開示の実施例または例示の一つに含まれることを意味する。本明細書において、前記の概略の用語は、必ずしも同じ実施例または例示に言及していない。さらに、特徴、構造、材料、又は特性は、いずれかの実施例又は例示に、適切な方法で組み合わせることができる。
（付記）
（付記１）
ゲノムを配列決定して、複数の配列データからなる配列解析の結果を得るステップ、
前記配列解析の結果を、参照ゲノム配列と対比させて、前記配列の参照ゲノム配列における分布を判断するステップ、
前記配列の参照ゲノム配列における分布に基づいて、前記参照ゲノム配列において両側の配列数に有意差がある複数の破過点を決めるステップ、
前記複数の破過点に基づいて、前記参照ゲノム配列において検定対象となるウィンドウを決めるステップ、
前記検定対象となるウィンドウに入る配列に基づいて、第一パラメータを決定するステップ、及び
前記第一パラメータと所定の閾値の差に基づいて、前記ゲノムに前記検定対象となるウィンドウに対するコピー数変異の有無を判断するステップ、
を含むことを特徴とするゲノムのコピー数変異の有無を判断する方法。
（付記２）
更に、生体試料からゲノムを抽出するステップを含むことを特徴とする付記１に記載の方法。
（付記３）
前記生体試料は、妊婦サンプル又は胎児サンプルであり、母体血漿、絨毛膜絨毛、羊水、臍帯血、胎盤、及び赤ちゃんのかかとから採取した血液から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする付記２に記載の方法。
（付記４）
前記生体試料は、血液、尿、唾液、組織、生殖細胞、受精卵、卵割球、及び胚から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする付記２に記載の方法。
（付記５）
前記ゲノムを配列決定するのは、更に、
前記ゲノムを増幅するステップと、
前記増幅されたゲノムで、配列決定用のライブラリーを構築するステップと、
前記配列決定用のライブラリーを、配列決定するステップと、
を含むことを特徴とする付記１に記載の方法。
（付記６）
さらに、前記単細胞の全ゲノムを放出させるように該単細胞を溶解させるステップを含むことを特徴とする付記４に記載の方法。
（付記７）
前記単細胞の全ゲノムを放出させるように、該単細胞を、アルカリ性の溶解液で、溶解させることを特徴とする付記６に記載の方法。
（付記８）
ＰＣＲによる全ゲノム増幅法を利用して、前記全ゲノムを増幅させることを特徴とする付記７に記載の方法。
（付記９）
前記ＰＣＲによる全ゲノム増幅法はＯｍｎｉＰｌｅｘ  ＷＧＡ法であることを特徴とする付記８に記載の方法。
（付記１０）
Ｈｉｓｅｑシステム、Ｍｉｓｅｑシステム、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＡ）システム、４５４  ＦＬＸ、ＳＯＬｉＤシステム、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシステム、及び単一分子シークエンシング装置から選ばれる少なくとも１種により、前記シーケンシングライブラリを配列決定することを特徴とする付記５に記載の方法。
（付記１１）
前記コピー数変異は、染色体異数性、染色体欠失、染色体重複、微小欠失、及び微小重複から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする付記１に記載の方法。
（付記１２）
前記参照ゲノムにおいて破過点を決めるのは、更に、
参照ゲノムの配列を、所定の長さを有する一次ウィンドウにそれぞれ分割して、各一次ウィンドウに入るシーケンシング配列を判断するステップ、
参照ゲノムの配列に位置している少なくとも１つのサイトに対して、該サイトの両側に位置している同じ数の一次ウィンドウに入るシーケンシング配列の数を判断するステップ、
前記サイトの両側のシーケンシングデータの数に有意差の有無を示すｐ値を、求めるステップ、及び
前述サイトのｐ値が終端ｐ値より小さいと、このサイトを破過点と判断するステップ、
を含むことを特徴とする付記１に記載の方法。
（付記１３）
前記各一次ウィンドウに入るシーケンシング配列は、唯一適合のものであることを特徴とする付記１２に記載の方法。
（付記１４）
それぞれ、前記サイトの両側で一次ウィンドウを１００個ずつ取ることを特徴とする付記１２に記載の方法。
（付記１５）
前記各一次ウィンドウの長さは、ともに１００−２００Ｋｂｐであり、好ましくは、１５０Ｋｂｐであることを特徴とする付記１２に記載の方法。
（付記１６）
前記終端ｐ値は１．１×１０−５０であることを特徴とする付記１２に記載の方法。
（付記１７）
前記サイトの両側のシーケンシングデータの数に有意差の有無を示すｐ値を求めることは、更に、
前記サイトに対して、それぞれ、前記サイトの両側に同じ数を有する一次ウィンドウを取り、各一次ウィンドウの相対的なシーケンシング配列の数Ｒｉ（ｉは、一次ウィンドウの番号を表す）を算出するステップと、
前記各一次ウィンドウの相対的なシーケンシング配列の数Ｒｉを連検定して、該サイトのｐ値を求めるステップと、を含み、
上述した相対的なシーケンシング配列の数は、
【数２９】
0005938484.tif 000035
（但し、ｒｉは、ｉ番目の一次ウィンドウに入るシーケンシング配列の数を表し、
【数３０】
0005938484.tif 000036
ｎは、一次ウィンドウの総数を表す）
により求められることを特徴とする付記１２に記載の方法。
（付記１８）
前記各一次ウィンドウの相対的なシーケンシング配列の数を連検定するのは、更に、
各一次ウィンドウにおけるシーケンシング配列に対する各一次ウィンドウの数Ｒｉを、ＧＣ含有量について補正して、補正された相対的なシーケンシング配列の数
【数３１】
0005938484.tif 000037
（以下、「Ｒｉ〜」も同義。）を算出するステップ、
前記補正された相対的なシーケンシング配列の数に基づいて、各一次ウィンドウにおける標準化されたシーケンシング配列の数Ｚｉを求めるステップ、及び、
すべての一次ウィンドウにおける標準化されたシーケンシング配列の数Ｚｉを、連検定するステップ、
を含むことを特徴とする付記１７に記載の方法。
（付記１９）
上述した補正された相対的なシーケンシング配列の数Ｒｉ〜は、
各一次ウィンドウにおけるＧＣ含有量を算出し、
０．００１に準じて、ＧＣ含有量を複数の領域に分割するとともに、各領域での相対的なシーケンシング配列の数の平均値であるＭｓ（ｓは、ＧＣ領域の番号である）を算出し、
次の式により、該補正された相対的なシーケンシング配列の数Ｒｉ〜を算出し、
【数３２】
0005938484.tif 000038
標準化されたシーケンシング配列の数Ｚｉは、
【数３３】
0005938484.tif 000039
（ただし、
【数３４】
0005938484.tif 000040
【数３５】
0005938484.tif 000041
）により算出されることを特徴とする付記１８に記載の方法。
（付記２０）
複数の破過点に基づいて、参照ゲノムにおいて、検定対象となるウィンドウを決めるのは、更に、
１）前と後の両方にも他の破過点がある候補破過点を複数決めるステップ、
２）各候補破過点のｐ値を求めるとともに、ｐ値の一番大きい候補破過点を捨てるステップ、
３）残りの候補破過点のｐ値がともに終端ｐ値を下回るまでに、これらの候補破過点に対して、ステップ２）を繰り返して、候補破過点を一部捨てて、残りのものをスクリーニングされた候補破過点として用いるステップ、及び、
４）隣接しているスクリーニングされた候補破過点の間にある領域を、検定対象となるウィンドウとして選定するステップ、
を含み、
前記候補破過点のｐ値は、
候補破過点とその直前の破過点との間にある領域を第一候補領域として、前述候補破過点とその直後の破過点との間にある領域を第二候補領域として選定するステップと、
第一候補領域と第二候補領域に含まれている、標準化されたシーケンシング配列の数であるＺｉを、連検定して、前述候補破過点のｐ値を求めるステップと、
により求められ、
前記終端ｐ値は、
候補破過点の数がゼロになるまでに、対照サンプルが配列解析された結果によって、参照ゲノムにおいて、検定対象となるウィンドウを選定する手順を、繰り返すとともに、毎回捨てられた候補破過点のｐ値を記録するステップと、
捨てられた候補破過点のｐ値の分布に基づいて、前述終端ｐ値を求めるステップと、
により求められ、
前記終端ｐ値は１．１×１０−５０である、
ことを特徴とする付記１９に記載の方法。
（付記２１）
検定対象となるウィンドウに入る配列に基づいて、第一パラメータを決定するのは、更に、検定対象となるウィンドウに含まれている一次ウィンドウにおける、標準化されたシーケンシング配列の平均数
【数３６】
0005938484.tif 000042
を、第一パラメータとして求めるステップを含むことを特徴とする付記２０に記載の方法。
（付記２２）
前記所定の閾値では、−１．６４５を第一閾値として、１．６４５を第二閾値として、設定することを特徴とする付記１に記載の方法。
（付記２３）
前記対照ゲノム配列は、ヒトの２１番染色体、１８番染色体、１３番染色体、Ｘ染色体、及びＹ染色体から選ばれる少なくとも１種の配列であることを特徴とする付記１に記載の方法。
（付記２４）
ゲノムを配列決定して、複数の配列データからなる配列解析の結果を得る配列決定装置と、
該配列決定装置に接続されており、上述した配列解析の結果に基づいて、前記ゲノムのコピー数変異の有無を判断する分析装置とを含み、
前記分析装置は、更に、
上述した配列解析の結果を、参照ゲノム配列と対比させて、前記配列の参照ゲノム配列における分布を判断する対比ユニット、
該対比ユニットに接続されており、前記配列の参照ゲノム配列における分布に基づいて、前記参照ゲノム配列において両側の配列数に有意差がある複数の破過点を決めるのに適する破過点決定ユニット、
前記破過点決定ユニットに接続されており、前記複数の破過点に基づいて、前記参照ゲノム配列において検定対象となるウィンドウを決めるのに適する検定対象となるウィンドウ決定ユニット、
前記検定対象となるウィンドウ決定ユニットに接続されており、前記検定対象となるウィンドウに入る配列に基づいて、第一パラメータを決定するのに適するパラメータ決定ユニット、及び、
前記パラメータ決定ユニットに接続されており、前記第一パラメータと所定の閾値の差に基づいて、前記ゲノムに前記検定対象となるウィンドウに対するコピー数変異があるかどうかを判断する判断ユニット、
を含むことを特徴とするゲノムのコピー数変異の有無を判断するシステム。
（付記２５）
更に、生体試料からゲノムを抽出するためのゲノム抽出装置を含むことを特徴とする付記２４に記載のシステム。
（付記２６）
前記配列決定装置は、更に、
ゲノムを増幅させるために用いられるゲノムの増幅ユニットと、
ゲノムの増幅ユニットに接続されているとともに、全ゲノムシーケンシングライブラリを、増幅されたゲノムで構築するシーケンシングライブラリの構築ユニットと、
上述したシーケンシングライブラリの構築ユニットに接続されているとともに、前述シーケンシングライブラリを配列決定するために用いられる配列決定ユニットと、
を含むことを特徴とする付記２４に記載のシステム。
（付記２７）
前記配列決定ユニットは、Ｈｉｓｅｑシステム、Ｍｉｓｅｑシステム、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＡ）システム、４５４  ＦＬＸ、ＳＯＬｉＤシステム、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシステム、及び単一分子シークエンシング装置から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする付記２６に記載のシステム。
（付記２８）
前記破過点決定ユニットは、破過点を決めるように、更に、
参照ゲノムの配列を、所定の長さを有する一次ウィンドウにそれぞれ分割して、各一次ウィンドウに入るシーケンシング配列を判断するステップ、
参照ゲノムの配列に位置している少なくとも１つのサイトに対して、該サイトの両側に位置している同じ数の一次ウィンドウに入るシーケンシング配列の数を判断するステップ、
前記サイトの両側のシーケンシングデータの数に有意差の有無を示すｐ値を、求めるステップ、及び、
前述サイトのｐ値が終端ｐ値より小さいと、このサイトを破過点と判断するステップ、
を実行するユニットを含むことを特徴とする付記２４に記載のシステム。
（付記２９）
前記破過点決定ユニットは、ｐ値を求めるように、更に、
選択されたサイトに対して、それぞれ、サイトの両側に同じ数を有する一次ウィンドウを取り、各一次ウィンドウの相対的なシーケンシング配列の数であるＲｉ（ｉは、一次ウィンドウの番号を表す）を算出するステップと、
前記各一次ウィンドウの相対的なシーケンシング配列の数Ｒｉを連検定して、該サイトのｐ値を求めるステップと、
を実行するユニットを含み、
前記相対的なシーケンシング配列の数は、
【数３７】
0005938484.tif 000043
（ｒｉは、ｉ一次目のウィンドウに入るシーケンシング配列の数を表し、
【数３８】
0005938484.tif 000044
ｎは、一次ウィンドウの総数を表す。）
により求められることを特徴とする付記２８に記載のシステム。
（付記３０）
前記破過点決定ユニットは、各一次ウィンドウの相対的なシーケンシング配列の数を連検定するように、更に、
各一次ウィンドウにおけるシーケンシング配列に対する各一次ウィンドウの数Ｒｉを、ＧＣ含有量について補正して、補正された相対的なシーケンシング配列の数
【数３９】
0005938484.tif 000045
（以下、「Ｒｉ〜」も同義。）を算出するステップ、
前記補正された相対的なシーケンシング配列の数に基づいて、各一次ウィンドウにおける標準化されたシーケンシング配列の数Ｚｉを求めるステップ、及び、
すべての一次ウィンドウにおける標準化されたシーケンシング配列の数Ｚｉを、連検定するステップ、
を実行するユニットを含むことを特徴とする付記２９に記載のシステム。
（付記３１）
前記補正された相対的なシーケンシング配列の数Ｒｉ〜は、
各一次ウィンドウにおけるＧＣ含有量を算出し、
０．００１に準じて、ＧＣ含有量を複数の領域に分割するとともに、各領域での相対的なシーケンシング配列の数の平均値であるＭｓ（ｓは、ＧＣ領域の番号である）を算出し、
次の式により、該補正された相対的なシーケンシング配列の数Ｒｉ〜を算出し、
【数４０】
0005938484.tif 000046
標準化されたシーケンシング配列の数Ｚｉは、
【数４１】
0005938484.tif 000047
（ただし、
【数４２】
0005938484.tif 000048
【数４３】
0005938484.tif 000049
）により算出されることを特徴とする付記３０に記載のシステム。
（付記３２）
複数の破過点に基づいて、参照ゲノムにおいて、検定対象となるウィンドウを決めるユニットは、更に、
１）前と後の両方にも他の破過点がある候補破過点を複数決めるステップ、
２）各候補破過点のｐ値を求めるとともに、ｐ値の一番大きい候補破過点を捨てるステップ、
３）残りの候補破過点のｐ値がともに終端ｐ値を下回るまでに、これらの候補破過点に対して、ステップ２）を繰り返して、候補破過点を一部捨てて、残りのものをスクリーニングされた候補破過点として用いるステップ、及び、
４）隣接しているスクリーニングされた候補破過点の間にある領域を、検定対象となるウィンドウとして選定するステップ、
を実行するユニットを含み、
前記候補破過点のｐ値は、
候補破過点とその直前の破過点との間にある領域を第一候補領域として、前述候補破過点とその直後の破過点との間にある領域を第二候補領域として選定するステップと、
第一候補領域と第二候補領域に含まれている、標準化されたシーケンシング配列の数であるＺｉを、連検定して、前述候補破過点のｐ値を求めるステップと、
により求められ、
前記終端ｐ値は、
候補破過点の数がゼロになるまでに、対照サンプルが配列解析された結果によって、参照ゲノムにおいて、検定対象となるウィンドウを選定する手順を、繰り返すとともに、毎回捨てられた候補破過点のｐ値を記録するステップと、
捨てられた候補破過点のｐ値の分布に基づいて、前述終端ｐ値を求めるステップと、
により求められ、
前記終端ｐ値は１．１×１０−５０である、
ことを特徴とする付記３１に記載のシステム。
（付記３３）
パラメータ決定ユニットは、更に、
検定対象となるウィンドウに含まれている一次ウィンドウにおける、標準化されたシーケンシング配列の平均数
【数４４】
0005938484.tif 000050
を、第一パラメータとして求めるステップ、
を実行するユニットを含むことを特徴とする付記３２に記載のシステム。
（付記３４）
パラメータ決定ユニットは、−１．６４５を第一閾値として、１．６４５を第二閾値として設定する、所定の閾値を記憶していることを特徴とする付記２４に記載のシステム。
（付記３５）
前記対比ユニットは、既知のヒトゲノム配列の一部である対照ゲノム配列（例えば、ヒトの２１番染色体、１８番染色体、１３番染色体、Ｘ染色体、及びＹ染色体から選ばれる少なくとも１種の配列である）を記憶していることを特徴とする付記２４に記載のシステム。
（付記３６）
コンピューター読み取り可能な記憶媒体に、
ゲノムを配列決定して得た複数の配列データからなる配列解析の結果を、参照ゲノム配列と対比させて、前記配列の参照ゲノム配列における分布を判断するステップ、
前記配列の参照ゲノム配列における分布に基づいて、前記参照ゲノム配列において両側の配列数に有意差がある複数の破過点を決めるステップ、
前記複数の破過点に基づいて、上述した参照ゲノムにおいて検定対象となるウィンドウを決めるステップ、
前記検定対象となるウィンドウに入る配列に基づいて、第一パラメータを決定するステップ、及び、
前記第一パラメータと所定の閾値の差に基づいて、前記ゲノムに前記検定対象となるウィンドウに対するコピー数変異があるかどうかを判断するステップ、
を実行させるためのプログラムを記録したコンピューター読み取り可能な記憶媒体。  
（付記３７）
前記参照ゲノムにおいて破過点を決めるのは、更に、
参照ゲノムの配列を、所定の長さを有する一次ウィンドウにそれぞれ分割して、各一次ウィンドウに入るシーケンシング配列を判断するステップ、
参照ゲノムの配列に位置している少なくとも１つのサイトに対して、該サイトの両側に位置している同じ数の一次ウィンドウに入るシーケンシング配列の数を判断するステップ、
前記サイトの両側のシーケンシングデータの数に有意差の有無を示すｐ値を、求めるステップ、及び
前述サイトのｐ値が終端ｐ値より小さいと、このサイトを破過点と判断するステップ、
を含むことを特徴とする付記３６に記載のコンピューター読み取り可能な記憶媒体。
（付記３８）
前述の各一次ウィンドウに入るシーケンシング配列は、唯一適合のものであることを特徴とする付記３７に記載のコンピューター読み取り可能な記憶媒体。
（付記３９）
それぞれ、前記サイトの両側で一次ウィンドウを１００個ずつ取ることを特徴とする付記３７に記載のコンピューター読み取り可能な記憶媒体。
（付記４０）
前記各一次ウィンドウの長さは、ともに１００−２００Ｋｂｐであり、好ましくは、１５０Ｋｂｐであることを特徴とする付記３７に記載のコンピューター読み取り可能な記憶媒体。
（付記４１）
前記終端ｐ値は１．１×１０−５０であることを特徴とする付記３７に記載のコンピューター読み取り可能な記憶媒体。
（付記４２）
前記サイトの両側のシーケンシングデータの数に有意差の有無を示すｐ値を求めることは、更に、
前記サイトに対して、それぞれ、前記サイトの両側に同じ数を有する一次ウィンドウを取り、各一次ウィンドウの相対的なシーケンシング配列の数Ｒｉ（ｉは、一次ウィンドウの番号を表す）を算出するステップと、
前各一次ウィンドウの相対的なシーケンシング配列の数Ｒｉを連検定して、該サイトのｐ値を求めるステップと、を含み、
前記相対的なシーケンシング配列の数は、
【数４５】
0005938484.tif 000051
（但し、ｒｉは、ｉ一次目のウィンドウに入るシーケンシング配列の数を表し、
【数４６】
0005938484.tif 000052
ｎは、一次ウィンドウの総数を表す。）
上述式により求められることを特徴とする付記３７に記載のコンピューター読み取り可能な記憶媒体。
（付記４３）
前記各一次ウィンドウの相対的なシーケンシング配列の数を連検定するのは、更に、
各一次ウィンドウにおけるシーケンシング配列に対する各一次ウィンドウの数Ｒｉを、ＧＣ含有量について補正して、補正された相対的なシーケンシング配列の数
【数４７】
0005938484.tif 000053
（以下、「Ｒｉ〜」も同義。）を得るステップ、
前記補正された相対的なシーケンシング配列の数に基づいて、各一次ウィンドウにおける標準化されたシーケンシング配列の数Ｚｉを求めるステップ、及び、
すべての一次ウィンドウにおける標準化されたシーケンシング配列の数Ｚｉを、連検定するステップ、
を含むことを特徴とする付記４２に記載のコンピューター読み取り可能な記憶媒体。
（付記４４）
上述した補正された相対的なシーケンシング配列の数Ｒｉ〜は、
各一次ウィンドウにおけるＧＣ含有量を算出し、
０．００１に準じて、ＧＣ含有量を複数の領域に分割するとともに、各領域での相対的なシーケンシング配列の数の平均値であるＭｓ（ｓは、ＧＣ領域の番号である）を算出し、
次の式により、該補正された相対的なシーケンシング配列の数Ｒｉ〜を算出し、
【数４８】
0005938484.tif 000054
標準化されたシーケンシング配列の数Ｚｉは、
【数４９】
0005938484.tif 000055
（ただし、
【数５０】
0005938484.tif 000056
【数５１】
0005938484.tif 000057
）により算出されることを特徴とする付記４３に記載のコンピューター読み取り可能な記憶媒体。
（付記４５）
複数の破過点に基づいて、参照ゲノムにおいて、検定対象となるウィンドウを決めるのは、更に、
１）前と後の両方にも他の破過点がある候補破過点を複数決めるステップ、
２）各候補破過点のｐ値を求めるとともに、ｐ値の一番大きい候補破過点を捨てるステップ、
３）残りの候補破過点のｐ値がともに終端ｐ値を下回るまでに、これらの候補破過点に対して、ステップ２）を繰り返して、候補破過点を一部捨てて、残りのものをスクリーニングされた候補破過点として用いるステップ、及び、
４）隣接しているスクリーニングされた候補破過点の間にある領域を、検定対象となるウィンドウとして選定するステップ、
を含み、
前記候補破過点のｐ値は、
候補破過点とその直前の破過点との間にある領域を第一候補領域として、前述候補破過点とその直後の破過点との間にある領域を第二候補領域として選定するステップと、
第一候補領域と第二候補領域に含まれている、標準化されたシーケンシング配列の数であるＺ候補領域と第二候補領域に含まれている、標準化されたシーケンシング配列の数であるＺｉを、連検定して、前述候補破過点のｐ値を求めるステップと、
により求められ、
前記終端ｐ値は、
候補破過点の数がゼロになるまでに対照サンプルが配列解析された結果によって、参照ゲノムにおいて、検定対象となるウィンドウを選定する手順を、繰り返すとともに、毎回捨てられた候補破過点のｐ値を記録するステップと、
捨てられた候補破過点のｐ値の分布に基づいて、前述終端ｐ値を求めるステップと、
により求められ、
前記終端ｐ値は１．１×１０−５０である、
ことを特徴とする付記４３に記載のコンピューター読み取り可能な記憶媒体。
（付記４６）
検定対象となるウィンドウに入る配列に基づいて、第一パラメータを決定するのは、更に、検定対象となるウィンドウに含まれている一次ウィンドウにおける、標準化されたシーケンシング配列の平均数
【数５２】
0005938484.tif 000058
を、第一パラメータとして求めるステップを含むことを特徴とする付記４５に記載のコンピューター読み取り可能な記憶媒体。
（付記４７）
前記所定の閾値では、−１．６４５を第一閾値として、１．６４５を第二閾値として、設定することを特徴とする付記４６に記載のコンピューター読み取り可能な記憶媒体。
（付記４８）
前記対照ゲノム配列は、ヒトの２１番染色体、１８番染色体、１３番染色体、Ｘ染色体、及びＹ染色体から選ばれる少なくとも１種の配列であることを特徴とする付記３６に記載のコンピューター読み取り可能な記憶媒体。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明によるゲノムのコピー数変異の有無を判断する方法、システム、及びコンピューター読み取り可能な記憶媒体は、ゲノムのコピー数変異の有無を判断するのために有用である。
【図１】
0005938484.tif 000075
【図２】
0005938484.tif 000076
【図３】
0005938484.tif 000077
【図４】
0005938484.tif 000078
【図５】
0005938484.tif 000079