(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物の対象において、ａ）硝子体索切断を促進することにより、ｂ）硝子体液の液化を引き起こすことにより、ｃ）硝子体網膜剥離を引き起こすことにより、ｄ）細胞ＲＧＤ結合部位への接着を阻害することにより、またはｅ）インテグリン表出性腫瘍に標識または抗腫瘍薬を誘導させることにより、疾患を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、
有効量の直鎖状または環状の非天然アミノ酸であってグリシン−アルギニン−グリシン−システイン酸−トレオニン−プロリンを含む非天然アミノ酸のみからなるか、または有効量の直鎖状または環状の非天然アミノ酸であってグリシン−アルギニン−グリシン−システイン酸−トレオニン−プロリンを含む非天然アミノ酸を含む、医薬組成物。
【請求項２】
以下の構造式：
【化１】
0005912082.tif 000026
を有する化合物を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記対象の眼への投与に適するものである請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記対象の眼の硝子体内注入に適するものである請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記非天然アミノ酸は多量体型である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記多量体型の非天然アミノ酸は抗腫瘍薬に付着されるものであり、かつ前記医薬組成物はインテグリン表出性腫瘍を治療するためのものである、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記多量体型の非天然アミノ酸は放射性標識剤に付着されるものであり、かつ前記医薬組成物はインテグリン表出性腫瘍を放射性標識するためのものである、請求項５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して化学および医学の分野に関連し、より具体的には、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（「ＲＧＤ」トリペプチド）結合部位への細胞接着を阻害するために使用可能な組成物および方法、並びに関連する、炎症、創傷治癒、瘢痕形成の防止、血栓症、癌転移および腫瘍、増殖性または非増殖性糖尿病性網膜症、硝子体液の液化、後部硝子体網膜剥離（ＰＶＤ：ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｖｉｔｒｅｏ−ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ）の誘発、硝子体網膜疾患、例えば、飛蚊症（ｆｌｏａｔｅｒｓ）、特発性黄斑円孔、硝子体黄斑牽引、加齢性黄斑変性、滲出型黄斑変性などの病因、脈絡膜血管新生、硝子体網膜手術、静脈閉塞、角膜血管新生、虚血性視神経、虹彩血管新生（ｒｕｂｉｏｓｉｓ  ｉｒｉｄｉｓ）、および緑内障手術における瘢痕形成の防止のような疾患の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＧＤトリペプチド配列は、多くのタンパク質中に見られ、そこで細胞接着に関与する。ＲＧＤトリペプチド配列が存在するタンパク質の例としては、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ：ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ）、特定のジスインテグリン、および特定のジスコイジンが挙げられる。
【０００３】
インテグリンは、露出したＲＧＤ配列を有する配位子に結合することによって細胞と細胞外マトリックス（ＥＣＭ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）との間の接着を媒介するヘテロ二量体性細胞表面受容体である。正常なインテグリン−ＲＧＤ結合は、細胞の成長、移動および生存に関わる遺伝子発現に関与すると考えられている。そのような細胞の成長、移動および生存の不完全な調節は、血栓形成、炎症および癌を含む多くの病態をもたらし得る。したがって、ＲＧＤペプチドは、細胞接着タンパク質の可能な模倣体として、またインテグリンに結合するそれらの能力について、アポトーシス、血管新生、および腫瘍形成の阻害のような治療目的のため、内部放射線治療薬並びに癌造影剤としてのそれらの多量体形態における使用のため、並びにそれらの抗癌剤輸送能力について、研究されてきた。
【０００４】
眼において、インテグリンは、眼発生（ｏｃｕｌａｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、細胞移動、治癒およびいくつかの病的過程を含む多くの過程に影響を与える。インテグリンはまた、眼組織において、炎症および血栓形成を調節し得る。硝子体内に注入されたＲＧＤペプチドはまた動物モデルにおいて後方硝子体網膜剥離を引き起こすことが報告されており、したがって、特定の網膜障害の治療および／または硝子体切除術における硝子体の除去を容易にするため有用であり得る（非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】オリベラ、エル．ビー．（Ｏｌｉｖｅｒａ，Ｌ．Ｂ．）ら、ＲＧＤ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｖｉｔｒｅｃｔｏｍｙ  ｔｏ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  Ｖｉｔｒｅｏｕｓ  Ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ：ａ  Ｎｅｗ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｖｉｔｒｅｏｌｙｓｉｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（８）：第３３３−４０頁（２００２年１２月２５日）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はＲ−Ｇ−システイン酸（すなわちＲ−Ｇ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２−ＳＯ３Ｈ）ＣＯＯＨまたはＡｒｇ−Ｇｌｙ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２−ＳＯ３Ｈ）ＣＯＯＨ）およびその誘導体を含む（医薬として許容される塩、水和物、立体異性体、多量体、環状型、直鎖状型、薬物複合体、プロドラッグおよびそれらの誘導体を含む）新規な化合物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ヒトまたは動物の対象において、対象に対してＲ−Ｇ−システイン酸ペプチドまたはその誘導体（医薬として許容される塩、水和物、立体異性体、多量体、環状型、直鎖状型（ｌｉｎｅａｒ  ｆｏｒｍｓ）、薬物複合体、プロドラッグおよびそれらの誘導体を含む）を含有する有効量の組成物を投与することによって、ＲＧＤ結合部位への細胞接着を阻害するため、またはＲＧＤ結合部位に他の診断用薬または治療薬を送達するための組成物および方法を提供する。
【０００８】
本発明のＲ−Ｇ−システイン酸ペプチドの特定の例としては、直鎖状型のＡｒｇ−Ｇｌｙ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２−ＳＯ３Ｈ）ＣＯＯＨ（本願で化合物１と称される例）および環状型のＡｒｇ−Ｇｌｙ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２−ＳＯ３Ｈ）ＣＯＯＨ（本願で化合物２と称される例）が挙げられる。
【０００９】
本発明のＲ−Ｇ−システイン酸誘導体の一般式としては、下記のような一般式Ｉ〜ＶＩＩを有する化合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
一般式Ｉ：
【００１０】
【化１】
0005912082.tif 000002
前記式中、ＸはＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｐｈ、またはＳＯ３Ｈから選択され、かつＹ＝ＯＨまたはＮＨ２である。
【００１１】
一般式ＩＩ：
【００１２】
【化２】
0005912082.tif 000003
前記式中、ＸはＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｐｈ、またはＳＯ３Ｈから選択される。
【００１３】
一般式ＩＩＩ：
【００１４】
【化３】
0005912082.tif 000004
前記式中、ＸはＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｐｈ、またはＳＯ３Ｈから選択され、かつＺはＨまたはＳＯ３Ｈから選択される。
【００１５】
一般式ＩＶ：
【００１６】
【化４】
0005912082.tif 000005
前記式中、ＸはＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｐｈ、またはＳＯ３Ｈから選択され、ＹはＯＨまたはＮＨ２から選択される。
【００１７】
一般式Ｖ：
【００１８】
【化５】
0005912082.tif 000006
前記式中、ＸはＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｐｈ、またはＳＯ３Ｈから選択される。
【００１９】
一般式ＶＩ：
【００２０】
【化６】
0005912082.tif 000007
前記式中、ＸはＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｐｈ、またはＳＯ３Ｈから選択される。
【００２１】
一般式ＶＩＩ：
Ｘ１−Ｒ−Ｇ−システイン酸−Ｘ
前記式中、ＸおよびＸ１は環状または直鎖状の−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ、−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ、−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、−Ｐｈｅ−Ｖａｌ、またはＡｒｇ、Ｇｌｙ、システイン酸（Ｃｙｓｔｅｉｃ）、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、ＴｈｒのＤ−異性体またはＬ−異性体の任意の組み合わせの任意の塩から選択される。
【００２２】
一般式ＶＩＩの環状型の例としては
【００２３】
【化７】
0005912082.tif 000008
が挙げられるが、必ずしもこれに限定されるものではない。
【００２４】
前記式中、Ｘ’はＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｐｈ、またはＳＯ３Ｈから選択され、ＺはＨまたはＭｅから選択され、ＹはＯＨまたはＮＨ２から選択される。
スルホン酸は対応するカルボン酸より強力な酸である。このスルホン酸基のより高い極性はより強力な分子間結合をもたらす。例えば、より分極したＯ−Ｈ結合を有するＲ−Ｇ−システイン酸は、比較的分極に劣るＯ−Ｈ結合を有するＲ−Ｇ−アスパラギン酸（ＲＧＤペプチド）よりも強力な水素結合をインテグリン結合部位のタンパク質のアミド基と形成し、かつ／または、インテグリン結合部位において錯体を形成する金属イオンとのより強力な相互作用を有し得る。
【００２５】
本明細書においてより詳細に別記するように、一般式ＶＩＩの１つの特定の例であるグリシニル−アルギニル−グリシニル−システイン酸−トレオニル−プロリン−ＣＯＯＨ（Ｇｌｙｃｉｎｙｌ−Ａｒｇｉｎｙｌ−Ｇｌｙｃｉｎｙｌ−Ｃｙｓｔｅｉｃ−Ｔｈｒｅｏｎｙｌ−Ｐｒｏｌｉｎｅ−ＣＯＯＨ）（ＧＲＤシステイン酸ＴＰ、下記で化合物１と称する）を合成して動物において試験したところ、該化合物は、インテグリン−細胞外マトリックス（ＥＣＭ）相互作用を阻害することにより、網膜表面からの後部硝子体剥離（ＰＶＤ）を誘発するのに有効であることが判明した。また本明細書においてより詳細に別記するように、化合物１は、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いた創傷治癒のモデルにおいて試験したところ、環状ＲＧＤペプチドによる４０％の阻害と比較して、１２時間で細胞接着を７４％阻害することが示された。これらの研究は、グリシニル−アルギニル−グリシニル−システイン酸−トレオニル−プロリン−ＣＯＯＨが、インテグリンに対して、ＲＧＤペプチド自身よりも、さらにより強力に結合し得る論理的根拠を示唆および確証する。
【００２６】
Ｒ−Ｇ−システイン酸ペプチド配列は、Ｌ型またはＤ型のいずれかであり得、インテグリン−ＥＣＭ相互作用の競合的阻害剤である。Ｒ−Ｇ−システイン酸ペプチド配列は、プロテアーゼ耐性誘導体もしくは環状誘導体のもの、またはプロドラッグ誘導体、もしくは薬物送達システムに関連するもの、またはモノクローナル抗体のものであり得る。
【００２７】
本発明の組成物は血管新生を阻害するために使用可能であり、血管新生の阻害は、炎症、創傷治癒、血栓症、癌転移および腫瘍を治療するために有用であり得る。さらに有用な用途は、増殖性または非増殖性糖尿病性網膜症、硝子体の液化（ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｉｔｒｅｏｕｓ）、後部硝子体網膜剥離（ＰＶＤ）の誘発、例えば特発性黄斑円孔、硝子体黄斑牽引、加齢性黄斑変性、滲出型黄斑変性などの硝子体網膜疾患の病因、脈絡膜血管新生、硝子体網膜手術、静脈閉塞、並びに緑内障手術における瘢痕形成の防止を含む眼科学に見られ得る。さらに、本発明の多量体性かつ／または放射性標識された組成物は、腫瘍の検出のための診断用薬／造影剤、および腫瘍の治療のための放射線治療薬として、並びにそれらの腫瘍指向性による抗癌剤担体として、使用可能である。
【００２８】
Ｒ−Ｇ−システイン酸ペプチドを組込む生体材料はまた、細胞の長期生存および増殖に対して、および組織工学および再生医療における応用のための生体組織工学に対して、合成接着微小環境（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）を提供することができる。Ｒ−Ｇ−システイン酸ペプチドは、インテグリン接着受容体を結合するそれらの特性によって、生体材料またはスキャフォールド上に拘束されると、接着促進信号を提供することができる。Ｒ−Ｇ−システイン酸に基づく物質は、細胞接着、細胞の拡張および移動を媒介する。さらに、インテグリン媒介細胞接着（ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）は細胞増殖および生存を促進し、多細胞構造および組織の集合および構築において重要な役割を果たす。
【００２９】
ルセンティス（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）およびアバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）のような黄斑変性の治療のための薬剤は、他の場合には新たな血管の成長、血管新生を引き起こし、従って黄斑浮腫の一因となるＶＥＧＦを阻害することに基づく。小さなペプチドＲＧＤは、ブルックスらに付与された米国特許第６，５００，９２４号に示されているように、競合的結合によって細胞外マトリックス１への細胞付着を阻害することにより、アポトーシスを誘発し得ることが知られている。
【００３０】
ＲＧＤペプチド結合または認識モチーフは、ＲＧＤ接着エピトープを認識することによって細胞の細胞内細胞骨格（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ）をＥＣＭと結び付ける細胞外マトリックスおよびインテグリンのタンパク質中に見られ得る。例えば、フース、アール  ワイ．（Ｆｏｏｓ，Ｒ  Ｙ．），Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．（１９７２年）第１１巻、第８０１−８０８頁を参照されたい。細胞は、通常、ＥＣＭへ付着することなく、アポトーシスを受ける。
【００３１】
一般に、線維芽細胞と細胞外マトリックスの糖タンパク質成分との間の相互作用は、主に細胞表面インテグリン上で相互作用するＲＧＤ含有アミノ酸配列によって媒介される深刻な瘢痕形成を引き起こす。また、ＲＧＤ配列は炎症反応およびホメオスタシス反応の間の細胞−ＥＣＭ相互作用に関与し（ヘルシュコビッツ、エス．エム．（Ｈｅｒｓｈｋｏｖｉｚ，Ｓ．Ｍ．）ら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．、（１９９４年）、第３５巻、第２５８５−２５９１頁参照）、インテグリンは、創傷治癒または病的過程における細胞移動、並びに炎症および血栓形成の調節に重要な役割を果たすことも知られている。したがって、ＲＧＤペプチドのような強力なインテグリンアンタゴニストは、抗炎症剤、抗転移剤、または抗血栓剤のような薬物として非常に有用であり得る（エルナー、エス．ジー．（Ｅｌｎｅｒ，Ｓ．Ｇ．）およびエルナー、ヴィー．エム．（Ｅｌｎｅｒ，Ｖ．Ｍ．）、ＩＯＶＳ（１９９６）第３７巻：第６９６−７０１頁参照）。ヒアルロン酸の受容体であるＣＤ４４は、ヒアルロン酸に対するその親和性によって、おそらくまたオステオポンチン、コラーゲンおよびマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のような他の配位子に対するその親和性によって、細胞−細胞および細胞−基質相互作用を媒介することも文献に報告されている。
【００３２】
ヒアルロナンとの接着は、細胞移動、腫瘍の成長および進行に重要な役割を果たし、またリンパ球の活性化、再循環、およびホーミング、並びに造血にも関与する。発現変化（ａｌｔｅｒｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）または機能不全は多くの病理表現型を引き起こす（例えば、ジャン、ディー．（Ｊｉａｎｇ  Ｄ．）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．（２００７年）第２３巻：第４３５−４６１頁；およびナドソン、ダブリュ．（Ｋｎｕｄｓｏｎ，Ｗ．）ら、Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏ．（２００２年）、第２１巻：第１５−２３号参照）。
【００３３】
最近、ＣＤ４４と細胞マトリックス成分（例えばＨＡ）との相互作用が様々な炎症性疾患の発症に大きな役割を果しており、また、ヒアルロナン−ＣＤ４４相互作用の断絶は脈絡膜血管新生の改善をもたらすことが示された（ヒロシ  モチマル（Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｍｏｃｈｉｍａｒｕ）ら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．（２００９年）第５０巻：第４４１０−４４１５頁参照）。
【００３４】
これらの証拠は、ＲＧＤペプチドまたはＣＤ４４のような接着分子が細胞−細胞および細胞−ＥＣＭ相互作用において多くの病原性疾患（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）の発症に重要な役割を果たし、前記相互作用の阻害がその疾患を治療および治癒する上における新規な治療標的であり得ることを示している。
【００３５】
合成ペプチドもまたインテグリンおよび成長因子に結合することが示されている。ＲＧＤ配列を含む環状ペンタペプチドは、ビトロネクチンのαｖβ３インテグリン（ｉｎｔｅｇｉｎ）への結合（マイケル  エイ．デチャンストレイター（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ａ．Ｄｅｃｈａｎｔｓｒｅｉｔｅｒ）ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９９年）第４２巻：第３０３３−３０４０頁参照）、およびビトロネクチンおよびフィブロネクチンの双方のαｖβ３およびαＩＩｂβ３インテグリンへの結合（ローランド  ハウブナー（Ｒｏｌａｎｄ  Ｈａｕｂｎｅｒ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，（１９９６年）第１１８巻：第７４６１−７４７２頁参照）を阻害することが明らかとなった。この阻害は、多くの関連のない疾患の治療に有用であるこが示された。ハムスターによる研究において、環状ペンタペプチドは、対照動物と比較して、腫瘍の成長およびメタセシスを遅延させた（エム．エイ．バークル（Ｍ．Ａ．Ｂｕｅｒｋｌｅ）ら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  （２００２年）第８６巻：第７８８−７９５頁参照）。ペンタペプチドはまた、鎌状赤血球細胞の血管内皮への結合を低減し、血行動態挙動を改善したことが示されている（アイリーン  エム．フィンネガン（Ｅｉｌｅｅｎ  Ｍ．Ｆｉｎｎｅｇａｎ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，（２００７年）第２９３巻：第Ｈ１０３８−Ｈ１０４５頁参照）。ＲＧＤ配列を含む別の環状ペプチドは、炎症反応性および免疫反応における白血球結合（ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ）に関与することが知られているインテグリンであるα４β１に強力に結合することが示された。（ピーナ  エム．カルダレッリ（Ｐｉｎａ  Ｍ．Ｃａｒｄａｒｅｌｌｉ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４年）第２６９巻：１８６６８−１８６７３頁参照）。合成硫酸化テトラペプチド（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ，ｓｕｌｆａｔｅｄ  ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ）はＶＥＧＦに強力に結合することが示されている（メイナード、ジェイ．エイ．ハベル（Ｍａｙｎａｒｄ，Ｊ．Ａ．Ｈｕｂｂｅｌｌ）、Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ（２００５年）第１巻：第４５１−４５９頁参照）。
【００３６】
さらに、重要で有用な用途において、二量体ＲＧＤペプチド−薬物複合体は、腫瘍を標的とするためのインテグリン標的薬物送達に有用であることが証明されている（チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，（２００５年）第４８（４）巻：第１０９８−１１０６頁参照）。
【００３７】
別の等しく重要かつ有用な用途において、多量体放射性標識ＲＧＤペプチドは、腫瘍検出のための診断用薬／造影剤として、並びにインテグリンαｖβ３を標的とすることによる腫瘍に特異的なターゲティングおよび治療のための放射線治療薬として有用であることが証明されている（ツィ−ボ  リ（Ｚｉ−Ｂｏ  Ｌｉ）ら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，（２００７年）第４８巻：第１１６２−１１７１頁参照）。
【００３８】
眼科学において、線維芽細胞による創傷治癒における瘢痕形成は、特に緑内障において、主な問題のうちの１つである。これは線維芽細胞とＥＣＭの糖タンパク質成分と間の相互作用に起因する。ＥＣＭ糖タンパク質の認識は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（すなわちＲＧＤ）配列のような、接着エピトープに特異的な細胞表面インテグリンを介して起こる。フィブロネクチン（ＦＮ）およびビトロネクチン（ＶＮ）を含む血漿たんぱくのいくつかのマトリックス中に存在するＲＧＤ配列は、炎症反応およびホメオスタシス反応の間に生じる細胞−ＥＣＭ相互作用に関係する。線維芽細胞とＥＣＭの糖タンパク質との間の相互作用の抑制は瘢痕形成を緩和した（ラミ  ヘルシュコビッツ（Ｒａｍｉ  Ｈｅｒｓｈｋｏｖｉｚ）ら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．（１９９４年）第３５巻：第２５８５−２５９１頁参照）。
【００３９】
後部硝子体皮質の膠原細線維は、硝子体網膜界面、特に網膜表面の内境界層（ｉｎｎｅｒ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｌａｍｉｎａ）に付着する（セバーグ  ジェイ．（Ｓｅｂａｇ  Ｊ．）、Ｅｙｅ（１９９２年）、第６巻：第５４１−５５２頁参照）。硝子体基部、視神経円板（ｏｐｔｉｃ  ｄｉｓｃ）における、主要な網膜血管に沿った、後極全体に対して面での（ｉｎ  ｆａｃｉａｌ  ｍａｎｎｅｒ）付着は、特発性黄斑円孔、硝子体黄斑牽引、増殖性糖尿病性網膜症などのような硝子体網膜疾患の病因において重要な役割を果たす（アキバ  ジェイ．（Ａｋｉｂａ  Ｊ．）  キロス  エム．エイ．（Ｑｕｉｒｏｚ  Ｍ．Ａ．）ら、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．（１９９０年）第９７巻、第１６１９−１６５５頁）。
【００４０】
血管新生抑制は、ともに眼血管の過剰成長に起因する糖尿病性網膜症および黄斑変性について早期に有望であることが示されている。これらの疾患において、前記血管は眼内の正常組織に干渉したり、またはそれらの血管は光が眼の後部へ到達するのを遮断したりする。新たな血管はそれら自身が主な病的状態であり、血管成長の停止が失明を防止し得る。したがって、血管抑制（ａｎｇｉｏｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）は、単に病気の治療だけではなく、治癒になり得る。更に、網膜からの硝子体の分離は黄斑の牽引を緩和して、黄斑円孔の形成の危険性を低減し得ると仮定されてきた。従って、硝子体網膜界面上のインテグリンに結合するフィブロネクチンおよびラミニンの抑制による後部硝子体剥離は、糖尿病性網膜症および網膜静脈閉塞を有する眼における網膜血管新生を防止し得る（アキバ  ジェイ．（Ａｋｉｂａ  Ｊ．）、キロス  エムエイ（Ｑｕｉｒｏｚ  ＭＡ）、  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．（１９９０年）第９７巻、第１６１９−１６５５頁；ケリー  エヌ．イー．（Ｋｅｌｌｙ  Ｎ．Ｅ．）ら、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．（１９９１年）第１０９巻、第６５４−６５９頁；およびカド  エム（Ｋａｄｏ  Ｍ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．（１９８８年）第１０５巻：第２０−２４頁参照）。
【００４１】
近年、硝子体外科手術は、硝子体網膜牽引を軽減し、かつ網膜浮腫を低減するために非常に改善されてきた。外科技術および機器における継続的な改善にもかかわらず、網膜裂孔、網膜剥離および網膜神経繊維損傷などのような合併症により、特に一部の糖尿病性網膜症の患者および小児患者において、硝子体皮質の非外傷性除去を達成することは依然として困難なままである（セバーグ  ジェイ．（Ｓｅｂａｇ  Ｊ．）、Ａｒｃｈ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．（１９８７年）第２２５巻：第８９−９３頁；ハン  ディ．ピー．（Ｈａｎ  Ｄ．Ｐ．）ら、Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．（１９９８年）第１０６巻：９９８−１０００頁参照）。したがって、網膜を損なうことなく、硝子体界面を選択的に切り裂く外傷の少ないアプローチは非常に望ましい。近年、硝子体網膜界面の分離のための多くの薬物に関する報告が文献に現れてきている（トレーズ  エム．ティ．（Ｔｒｅｓｅ  Ｍ．Ｔ．）、Ｅｙｅ．（２００２年）第１６巻：第３６５−３６８頁；ガンドルファー  エイ．（Ｇａｎｄｏｒｆｅｒ  Ａ．）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．（２００２年）第１３３巻：第１５６−１５９頁；およびヘッセ  エル．（Ｈｅｓｓｅ  Ｌ）ら、Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．（２０００年）第７０巻：第３１−３９頁参照）。ヒアルロニダーゼ（カラジョージアン（Ｋａｒａｇｅｏｚｉａｎ）らに付与された米国特許第６，８６３，８８６号参照）および自己由来プラスミン（サクマ  ティ（Ｓａｋｕｍａ  Ｔ）ら、日本眼科学会雑誌（２００３年）、第１０７巻：第７０９−７１８頁）のような酵素を用いた薬理学的硝子体索切断は、細胞外マトリックスの消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）を促進し、後部硝子体剥離を誘発することがこれまでに研究されてきた。しかしながら、用いられた酵素による隣接組織の非特異的な破壊が、それらの治療適用の成功を妨げている。ここ数年において、尿素のような非酵素薬物（ｎｏｎ−ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）（ニッカーソン、シー．（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，Ｃ．）ら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ、（２００８年）第４１巻：第１８４０−１８４６頁、およびＭａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．（２００５年）：第１８３−１８９頁参照）およびＲＧＤペプチド（レオナルド  ビー．オリビエラ（Ｌｅｏｎａｒｄｏ  Ｂ．Ｏｌｉｖｉｅｒａ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．（２００２年）第２５巻：第３３３−３４０頁参照）を用いた新規なアプローチが、硝子体網膜界面の分離に注目することによって研究されてきている。ＲＧＤペプチドの合成類似体は、インビトロ（ウィリアムズ  ジェイ．エイ．（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｊ．Ａ．）、Ｐａｔｈｏｌ．Ｂｉｏ．（１９９２年）第４０巻：第８１３−８２１頁；ゲールセン  ケイ．アール（Ｇｅｈｌｓｅｎ  Ｋ．Ｒ．）ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８年）第１０６巻：第９２５−９３０頁；ピアシュバッヘル、エム．ディ．（Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ，Ｍ．Ｄ．）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．ＣＨｅｍ．，（１９８７年）第２６２巻：第１７２９４−１７２９８頁；およびゾーン  エル．エル．（Ｚｈｏｎ  Ｌ．Ｌ．）ら、ＩＯＶＳ．（１９９６年）第３７巻：第１０４−１１３頁）およびインビボで、ＥＣＭタンパク質のＲＧＤモチーフがインテグリン−ＥＣＭ相互作用を妨害し、かつ付着を緩めるのに競合することが示されている。従って、可溶性ＲＧＤペプチドの硝子体内注入は、ウサギモデルにおいて、網膜表面の不溶性ＥＣＭタンパク質からのＲＧＤエピトープの解放をもたらし、従って非酵素ＰＶＤを容易にした。明らかに、これらの結果は、硝子体網膜界面が、ＥＣＭのＲＧＤモチーフへのインテグリン接続、並びに硝子体皮質コラーゲンの内境界層（ＩＬＬ：ｉｎｎｅｒ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｌａｍｅｌｌａ）への接着に関与することを示している。ＲＧＤペプチドおよびその誘導体は、創傷における上皮細胞の移動を促進し（ピー．エム．メルツ（Ｐ．Ｍ．  Ｍｅｒｔｚ）ら、Ｊ．Ｂｕｒｎ  Ｃａｒｅ  Ｒｅｓ．（１９９６年）第１７巻：第１９９−２０６頁参照）、ヒドロゲル（エムピー  ルットルフ（ＭＰ  Ｌｕｔｏｌｆ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００３年）第１００巻：第５４１３−５４１８頁：エムピー  ルットルフ（ＭＰ  Ｌｕｔｏｌｆ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００３年）第２１巻：第５１３−５１８頁参照）、他のポリマーマトリクス（ホーン−バン  リン（Ｈｏｒｎｇ−Ｂａｎ  Ｌｉｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒｉａｌ．Ｒｅｓ．（２００４年）第２８巻：第３２９−３４２頁参照）のような合成生体材料に組み込まれた場合、または固い物質（ｈａｒｄ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）上の表面膜として（ディ．エム．フェリス（Ｄ．Ｍ．Ｆｅｒｒｉｓ）ら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（１９９９年）第２０巻：第２３２３−２３３１頁）、それらの生物活性を維持する。ＲＧＤペプチドはまた、ペプチド配列で被覆された人工血管（ケイ．ワルシェク（Ｋ．Ｗａｌｌｕｓｃｈｅｃｋ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｖａｓｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｇｅｒｙ（１９９６年）第１２巻：第３２１−３３０頁参照）および他の人工臓器（ジェスケ、ブリゲッテ（Ｊｅｓｃｈｋｅ，Ｂｒｉｇｅｔｔｅ）、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２００２年）第２３巻：第３４５５−３４６３頁）への上皮細胞または内皮細胞の増大した接着を促進し、神経再生を支持することが示されている（エム．ラフィウディン  アフマッド（Ｍ．Ｒａｆｉｕｄｄｉｎ  Ａｈｍｅｄ）ら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．（２００３年）第９９３巻：第２０８−２１６頁参照）。前記人工器官の生物活性表面は合成樹脂繊維またはポリマーを含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】創傷治癒の動態における、３つのペプチド、すなわち、環状ＲＧＤペプチド、Ｒ−Ｇ−システイン酸ペプチド（化合物１）、ＲＧＥペプチドの効果を示す図。
【図２】Ｒ−Ｇ−システイン酸ペプチド（化合物１）のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図。
【図３】Ｒ−Ｇ−システイン酸ペプチド（化合物１）のエレクトロスプレー質量クロマトグラムを示す図。
【図４】環状Ｒ−Ｇ−システイン酸ペプチド（化合物２）のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図。
【図５】環状Ｒ−Ｇ−システイン酸ペプチド（化合物２）のエレクトロスプレー質量クロマトグラムを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明は、上記の一般式Ｉ〜ＶＩＩの化合物を含む新規な化合物を提供する。本発明の特定の例としては、直鎖状型のＡｒｇ−Ｇｌｙ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２−ＳＯ３Ｈ）ＣＯＯＨ（本願では化合物１と称される例）および環状型のＡｒｇ−Ｇｌｙ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２−ＳＯ３Ｈ）ＣＯＯＨ（本願では化合物２と称される例）、並びに、医薬として許容される塩、水和物、立体異性体、多量体（ｍｕｔｉｍｅｒｓ）、環状型、直鎖状型、多量体型（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ  ｆｏｒｍｓ）、薬物複合体、プロドラッグおよびそれらの誘導体を含む、それらの誘導体が挙げられる。
【００４４】
化合物１および２の合成
当業者に既知の従来の固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ：ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、アール．ビー．メリフィールド（Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９６３年）第８５（１４）巻：第２１４９−２１５４頁）が実施され得る。ＳＰＰＳは高収率なので好ましい合成の方法である。一般に、固相ペプチド合成技術の第１段階は、高分子支持体（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｓｕｐｐｏｒｔ）上における保護されたアミノ酸誘導体によるペプチド鎖集合から成る。前記技術の第２段階は、粗製自由ペプチドを与える、すべての側鎖保護基の同時切断による樹脂支持体からのペプチドの切断である。ＳＰＰＳの一般的な原理は、カップリング−脱保護の繰返しサイクルのうちの１つである。固相付着ペプチドの自由Ｎ末端アミンは、単一のＮ−保護アミノ酸ユニットに結合される。次に、このユニットは脱保護され、新たなＮ末端基アミンを表す。前記Ｎ末端基アミンにはさらにアミノ酸が付着され得る。合成、保護および脱保護の方法については、Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、フォン  ジー．エム．コッポラ（Ｖｏｎ  Ｇ．Ｍ．Ｃｏｐｐｏｌａ）およびＨ．Ｆ．シュースター（Ｈ．Ｆ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ）著、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク、１９８７年を、保護および脱保護の方法については、Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ピーター  ジー．エム．ウッツ（Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ）およびシアドーラ  ダブリュ．グリーン（Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著（第二版）、ジェイ．ワイリー・アンド・サンズ（Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）（１９９１年）を参照されたい。
【００４５】
固相ペプチド合成の２つの主に用いられる形態、すなわちＦｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル；塩基に不安定な（ｂａｓｅ  ｌａｂｉｌｅ）アルファ−アミノ保護基）およびｔ−Ｂｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル；酸に不安定な保護基）のうち、本ペプチドの合成には、好ましくはＦｍｏｃが用いられ得る。各方法は、異なる樹脂およびアミノ酸側鎖保護、並びに結果として生ずる切断／脱保護工程を伴う。前記樹脂からの切断後、ペプチドは、通常、Ｃ−１８、Ｃ−８およびＣ−４のようなカラムを用いた逆相ＨＰＬＣによって精製される。
【００４６】
固相ペプチド合成の例
下記は、塩基に不安定な９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基を用いて、固体保持体としてのワング樹脂（Ｗａｎｇ  ｒｅｓｉｎ）上におけるペプチド合成のための合成工程の概要である。
【００４７】
Ｆｍｏｃ脱保護
０．０８ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ワング樹脂を、プラスチックキャップを装備したフリットカラム（ｆｒｉｔｔｅｄ  ｃｏｌｕｍｎ）内に充填する。前記樹脂を２×３ｍＬ量のＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）で各々１分間にわたって洗浄する。次に、約３ｍＬの２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を添加し、Ｆｍｏｃ脱保護を１５分間にわたって継続させる。この時間の間、カラムを優しく回すか、または撹拌して、確実に完全に混合する。反応が完了した後（約１５分）、反応カラムを流出させて、前記樹脂をＤＭＦ（４×３ｍＬ）で再び洗浄する。
【００４８】
アミド結合カップリング
次に、所望のＦｍｏｃ保護アミノ酸であるＦｍｏｃ−Ｔｈｒ−ｔＢｕ（３当量：供給者によって表示された樹脂充填量に対して）およびＤＩＥＡ（６当量）のＤＣＭ溶液（アミノ酸に対して０．５Ｍ）を前記樹脂に添加する。その混合物を−２０°Ｃで２０分間にわたって冷却する。次に、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢＯＰ）、固相ペプチド合成に用いられるペプチドカップリング試薬（３当量）を前記反応に添加する。−２０°Ｃで８時間にわたって振盪した後、反応混合物を流出させて、前記樹脂をＤＣＭ（３×）で洗浄する。
【００４９】
２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を用いたＦｍｏｃ脱保護（１５分）およびＤＭＦ（３×）による洗浄の後、次のＦｍｏｃ保護アミノ酸（３当量；樹脂充填量に対して）であるＰｙＢｏｐを上記と同じ方法でカップリングする。
【００５０】
切断
遊離酸型のペプチドを得るために、エステル結合をＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）のような強い酸性条件を用いて切断する。前記樹脂を２〜３ｍＬのトリフルオロ酢酸および水の９５：５の溶液で処理する。その樹脂を２５分間にわたって優しく撹拌する。次に、カラムを流出させて、濾液をガラス収集容器に慎重に収集にする。
【００５１】
化合物１（ＧＲＧシステイン酸ＴＰ）の合成：
【００５２】
【化８】
0005912082.tif 000009
工程１．  樹脂の充填：プロリンで事前に充填されたｏ−クロロトリチル樹脂を出発材料として用いる。
【００５３】
工程２．  ペプチド集合：Ｆｍｏｃ合成を用いてペプチドを集合させる。保護されたアミノ酸をＰｙＢＯＰで活性化し、末端Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液で除去する。下記の保護されたアミノ酸は、それらが現われる順番で、順番に用いられる：
ａ．Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ−ｔＢｕ（Ｆｍｏｃトレオニン−ｔ−ブチルエステル）
ｂ．Ｆｍｏｃ−システイン酸−Ｐｆｐ（Ｆｍｏｃシステイン酸−ペンタフルオロフェニルエステル）
ｃ．Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（Ｆｍｏｃグリシン）
ｄ．Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ−Ｐｂｆ（Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎω−（２，２，４，６，７ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル）−Ｌ−アルギニン）
ｅ．Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（Ｆｍｏｃグリシン）
工程３．  樹脂からのペプチド切断：結果として生じたペプチドは固体支持体から切断され、保護基は８５．５％のＴＦＡ、５％のフェノール、２％の水、５％のチオアニソールおよび２．５％のエタンジチオールの溶液によって除去される。
【００５４】
工程４．  精製：高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、生じたＲ−Ｇ−システイン酸ペプチドを精製する。
上述のように調製した一定量の化合物１は、高性能液体クロマトグラフィーによって、純度＞９８％ａｒｅａ／ａｒｅａであると分析された［ＨＰＬＣ条件：  バッファーＡ：０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液、バッファーＢ：０．１％のＴＦＡアセトニトリル溶液、移動相（ＭＰ）Ａ：９７％のバッファーＡおよび３％のバッファーＢ、移動相Ｂ：７９％のバッファーＡおよび２１％のバッファーＢ、移動相Ｃ：５０％のバッファーＡおよび５０％のバッファーＢ、勾配については、下記の表１を参照のこと、流速：１．０ｍＬ／分、カラム：ウォーターズ  シンメトリー（登録商標）Ｃ１８、５μ、４．６×２５０ｍｍ、カラム温度：３０°Ｃ、検出器：ＵＶ＠２２０ｎｍ、試料注入体積：２０．０μＬ、試料調製：２０μＬの試料を１．０ｍＬの移動相Ａで希釈（約０．５ｍｇ／ｍＬ）］。対応するＨＰＬＣクロマトグラムを図２に示す。さらに、ペプチド配列の合成のための対応するアミノ酸の段階的な添加に基づいて、精製した化合物１の分子量は、エレクトロスプレイ質量分析法によって６３８．３ａｍｕであると測定され（理論質量：６３７．７ａｍｕ）、化合物１の同一性を確認した。化合物１のエレクトロスプレー質量スペクトログラムを図３に示す。
【００５５】
表１：ＨＰＬＣによる化合物１を検出するためのポンプ勾配プログラム
【００５６】
【表１】
0005912082.tif 000010
化合物２（シクロ−Ｒ−Ｇ−システイン酸ｆＮ（ＣＨ３）Ｖ）の合成：
【００５７】
【化９】
0005912082.tif 000011
工程１．  樹脂の充填：ｏ−クロロトリチル樹脂を出発材料として用いる。Ｆｍｏｃ−Ｎ  −メチル−Ｌ−Ｖａｌを樹脂に付着させる。
【００５８】
工程２．  ペプチド集合：２．Ｆｍｏｃ合成をペプチド集合に用いる。保護されたアミノ酸をＰｙＢＯＰで活性化し、末端Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液で除去する。下記の保護されたアミノ酸は、それらが現われる順番で用いられる：
ａ．Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（Ｆｍｏｃ−フェニルアラニン）
ｂ．Ｆｍｏｃ−システイン酸−ＰｆＰ（Ｆｍｏｃシステイン酸ペンタフルオロフェニルエステル）
ｃ．Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（Ｆｍｏｃ−グリシン）
ｄ．Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ−Ｐｂｆ（Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎω−（２，２，４，６，７ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル）−Ｌ−アルギニン）
工程３．  樹脂からのペプチド切断：ペプチドを酢酸／ＴＦＡ／ＤＣＭ（１：３：３）を用いて固体支持体から切断する。
【００５９】
工程４．  所望の環状ペプチドへの環化および脱保護：高希釈下のジフェニルホスホリルアジド（ｄｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｚｉｄｅ）および重炭酸ナトリウムを用いたインサイチュー活性化による環化。側鎖を、８５．５％のＴＦＡ、５％のフェノール、２％の水、５％のチオアニソール、２．５％のエタンジチオールを用いて脱保護する。
【００６０】
工程５．精製：ＨＰＬＣを精製に用いる。
上述のように調製した一定量の化合物２は、高性能液体クロマトグラフィーによって、純度＞９９％ａｒｅａ／ａｒｅａであると分析された（ＨＰＬＣ条件：  移動相Ａ：０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液、Ｂ：（８０％のアセトニトリル＋２０％の水）中に０．１％のＴＦＡ、２０分間で２６％から３６％のＢへ勾配、流速：１．０ｍＬ／分、カラム：フェノメネクス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）Ｃ１８（２）４．６×１５０ｍｍ、５μ、１００Ａ、検出器：ＵＶ＠２２０ｎｍ、試料注入体積：１００．０μＬ）。対応するＨＰＬＣクロマトグラムを図４に示す。さらに、ペプチド配列の合成のための対応するアミノ酸の段階的な添加に基づいて、精製した化合物２の分子量は、エレクトロスプレー質量分析法によって６２５．３ａｍｕであると測定され（理論質量：６２５．７７ａｍｕ）、化合物２の同一性を確認した。化合物２のエレクトロスプレー質量スペクトログラムを図５に示す。
【００６１】
細胞接着を阻害するための方法
本発明はまた、対象に有効量のＲ−Ｇ−システイン酸（すなわち、直鎖状型のＲ−Ｇ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２−ＳＯ３Ｈ）ＣＯＯＨまたは環状型のＲ−Ｇ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２−ＳＯ３Ｈ）ＣＯＯＨ）およびその誘導体（医薬として許容される塩、水和物、立体異性体、多量体、環状型、直鎖状型、薬物複合体、プロドラッグおよびそれらの誘導体を含む）を投与することによって、ヒトまたは動物の対象におけるＲＧＤ結合部位への細胞接着を阻害する方法を提供する。
【００６２】
本出願人は、ＥＣＭ成分への細胞付着を競合的に阻害することにより、本発明の合成Ｒ−Ｇ−システイン酸ペプチドがアポトーシスを誘発することを発見した。従って、本発明の合成Ｒ−Ｇ−システイン酸ペプチドおよびその誘導体は、血管新生、炎症、癌転移、血栓形成、瘢痕形成の防止および治療に対する治療薬、並びに薬学的硝子体索切断剤として、強力なインテグリンアンタゴニストとして用いることができる。さらに本発明の重要な態様において、腫瘍検出（診断用薬または造影剤）および腫瘍治療用の内部放射線治療薬として使用するための、多量体化され、かつ放射性標識されたＲ−Ｇ−システイン酸ペプチドを用いたα，βインテグリンの改善されたターゲティングが想定される。別の重要な態様において、改善されたＲ−Ｇ−システイン酸ペプチド複合体または多量体Ｒ−Ｇ−システイン酸ペプチド複合体は、薬剤担体として、例えば、効率的な腫瘍ターゲティングのための抗癌剤担体として機能する。
【００６３】
本願において別記するように、Ｒ−Ｇ−システイン酸ペプチド中のスルホン酸はＲＤＧペプチド中の対応するカルボン酸よりも強力な酸である。このスルホン酸基のより高い極性は、より強力な分子間結合をもたらす。例えば、より分極したＯ−Ｈ結合を有するＲ−Ｇ−システイン酸は、比較的分極に劣るＯ−Ｈ結合を有するＲ−Ｇ−アスパラギン酸よりも強力な水素結合をインテグリン結合部位のタンパク質のアミド基および／またはアミノ酸の側鎖と形成し、かつ／またはインテグリン結合部位において錯体を形成する金属イオンとのより強力な相互作用を有し得る。従って、本発明の新規なＲ−Ｇ−システイン酸ペプチドおよびその誘導体は、インテグリンレセプター認識および結合において、対応するＲＧＤペプチドに対して、改善された化合物および組成物を提供する。
【００６４】
加えて、高いＩＯＰに関連する慢性高血糖症を有する糖尿病患者において、開放隅角緑内障は、特に、小柱網組織におけるフィブロネクチンの蓄積に関係することが報告されており、過剰のフィブロネクチンは房水流出を阻害すると考えられる（オシタリ、ティ（Ｏｓｈｉｔａｒｉ，Ｔ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．（２００７年）第１４３巻：第３６３−３６５頁参照）。小柱網での細胞−ＥＣＭ相互作用におけるフィブロネクチンの関与は、原発性開放隅角緑内障において示されている（マーク  エス．フィラ（Ｍａｒｋ  Ｓ．Ｆｉｌｌａ）ら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．（２００２年）第４３巻：第１５１−１６１頁参照；およびチェリール  アール．ハン（Ｃｈｅｒｙｌ  Ｒ．Ｈａｎｎ）ら、Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｒｅｓ．（２００１年）第３３巻：第３１４−３２４頁参照）。シュレム管の内皮細胞は、流出能に影響を及ぼすのに細胞外マトリックスと相互作用することも報告されている（シンディー  ケイ．バーレー（Ｃｉｎｄｙ  Ｋ．Ｂａｈｌｅｒ）ら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．（２００４年）第４５巻：第２２４６−２２５４頁参照）。フィブロネクチンのような細胞外マトリックス成分の過剰の存在による房水流出の抑制を踏まえると、糖尿病患者の高いＩＯＰを治療するＲ−Ｇ−システイン酸ペプチドおよびその誘導体の適用は、糖尿病患者にとって非常に有益であろう。
【００６５】
好ましいＲ−Ｇ−システイン酸ペプチドは、融合ポリペプチド、環状または直鎖状ポリペプチド、薬物送達システムまたは例えば抗癌剤のような他の薬剤で誘導された、またはそれらと関連付けられた、またはそれらと結合されたＲ−Ｇ−システイン酸ペプチドを含む誘導ポリペプチド、多量体化Ｒ−Ｇ−システイン酸ペプチド、インテグリン結合部位またはその機能的フラグメントと免疫反応するＲ−Ｇ−システイン酸配列を含むモノクローナル抗体であり得る。
【００６６】
ポリペプチドを含むＲ−Ｇ−システイン酸は、フィブリノゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フォンヴィレブランド因子、ラミニン、トロンボスポンジンおよび同様な配位子中に存在するもののような天然インテグリン接着結合領域のアミノ酸残基配列に対応する配列を有し得る。
【００６７】
本ペプチド配列は、末端グアニジノ基、スルホン基、およびカルボン酸基を有する３つのアミノ酸と、ペプチドフラグメント、糖タンパク質、およびＰＥＧ、プルロニックおよび他のポリマー基のようなポリマー基、並びにリポソームおよびナノ粒子を含む薬物送達システムに結合および／または関連付けられたそれらの誘導体とから成る。様々な病理学的疾患の治療のためにそれらを含む医薬組成物は、注入可能な剤形、ゲル剤形、懸濁液剤形、軟膏剤形、固体剤形および液体剤形を備える。
【００６８】
フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、フィブリノゲン、トロンボスポンジンおよびフォンヴィレブランド因子のような細胞接着モチーフに関連付けられたインテグリン受容体は、Ｒ−Ｇ−システイン酸ペプチドおよびその誘導体の標的エピトープである。トリペプチドのＲ−Ｇ−システイン酸は、細胞結合ドメインによって認識可能な最小アミノ酸配列として発見された。この配列はまた、インテグリンに無関係な免疫機能に干渉することもできる。よって、合成Ｒ−Ｇ−システイン酸配列はＲＧＤ細胞結合ドメインを模倣するはずであり、アスパラギン酸のα−炭素上おける置換は、標的インテグリンへのより強力な結合親和性を与えることが発見された。Ｒ−Ｇ−システイン酸ペプチド中のスルホン酸は、ＲＤＧペプチド中の対応するカルボン酸より強力な酸である。このスルホン酸基のより高い極性はより強力な分子間結合をもたらす。例えば、より分極したＯ−Ｈ結合を有するＲ−Ｇ−システイン酸は、比較的分極に劣るＯ−Ｈ結合を有するＲ−Ｇ−アスパラギン酸よりも強力な水素結合をインテグリン結合部位のアミド基および／またはアミノ酸の側鎖と形成し、かつ／または、インテグリン結合部位において錯体を形成する金属イオンとのより強力な相互作用を有し得る。
【００６９】
本発明のＲ−Ｇ−システイン酸配列用の最も一般的な式は、以下の通りである。
式Ａ：
【００７０】
【化１０】
0005912082.tif 000012
前記式中、Ｘ＝−ＣＨ（Ｒ１）−Ｓ（＝Ｏ）２−Ｙ、−ＣＨ（Ｒ１）−ＳＨ、−ＣＨ（Ｒ１）−ＯＺ、−ＣＨ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）Ｙ、−ＣＨ（Ｒ１）−Ｏ−Ｓ（＝Ｏ）２−ＯＸ１、および−ＣＨ（Ｒ１）−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）２ＯＸ１であり、かつ
前記式中、Ｙ＝ＯＸ１、ＮＨ２であり、Ｘ１＝−Ｈ、Ｃ１−Ｃ６直鎖アルキル、フェニルであり；
Ｒ１＝Ｈ、Ｃ１−Ｃ６直鎖アルキル、フェニルまたはＳＯ３Ｈであり；
Ｚ＝Ｈ、ＳＯ３Ｈである。
【００７１】
式Ｂ：
【００７２】
【化１１】
0005912082.tif 000013
前記式中、Ｘ＝−ＣＨ（Ｒ１）−Ｓ（＝Ｏ）２−Ｙ、−ＣＨ（Ｒ１）−ＳＨ、−ＣＨ（Ｒ１）−ＯＺ、−ＣＨ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）Ｙ、−ＣＨ（Ｒ１）−Ｏ−Ｓ（＝Ｏ）２−ＯＸ１、および−ＣＨ（Ｒ１）−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）２ＯＸ１であり、かつ
前記式中、Ｙ＝ＯＸ１、ＮＨ２であり、Ｘ１＝−Ｈ、Ｃ１−Ｃ６直鎖アルキル、フェニルであり、Ｒ１＝Ｈ、Ｃ１−Ｃ６直鎖アルキル、フェニルまたはＳＯ３Ｈであり、Ｚ＝Ｈ、ＳＯ３Ｈであり、かつ、Ａ２は、−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ、−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ、−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、−Ｐｈｅ−Ｖａｌ、またはそれらの塩もしくはＮ−アルキル化誘導体のうちから選択される。Ａｒｇ、Ｇｌｙ、システイン酸、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、ＴｈｒのＤ型またはＬ型、並びに上記配列の環状型の任意の組み合わせを用いることができる。
【００７３】
環状型の例としては下記式Ｃが挙げられる。
式Ｃ：
【００７４】
【化１２】
0005912082.tif 000014
前記式中、Ｘ’は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｐｈ、ＳＯ３Ｈのうちから選択され、Ｙ＝ＯＨ、ＮＨ２であり、かつＺ＝Ｈ、ＣＨ３である。
【００７５】
環状型としては、ペンタペプチドおよびヘプタペプチド、例えば下記に示される一般式Ｃの特定な化合物、すなわち、化合物２（シクロＲ−Ｇ−システイン酸ｆＮ（ＣＨ３）Ｖ）も挙げられる。
【００７６】
【化１３】
0005912082.tif 000015
式Ａは、本願に別記する一般式Ｉ〜ＶＩを包含する。式Ｂは、本願に別記する一般式ＶＩＩを包含する。
【００７７】
式Ｄ：
Ａ１−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＮＨ−ＣＨ（Ｘ）−ＣＯ−Ａ２
前記式中、Ｘ＝−ＣＨ（Ｒ１）−Ｓ（＝Ｏ）２−Ｙ、−ＣＨ（Ｒ１）−ＳＨ、−ＣＨ（Ｒ１）−ＯＺ、−ＣＨ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）Ｙ、−ＣＨ（Ｒ１）−Ｏ−Ｓ（＝Ｏ）２−ＯＸ１、および−ＣＨ（Ｒ１）−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）２ＯＸ１であり、かつ
前記式中、Ｙ＝ＯＸ１、ＮＨ２であり、Ｘ１＝−Ｈ、Ｃ１−Ｃ６直鎖アルキル、フェニルであり、Ｒ１＝Ｈ、Ｃ１−Ｃ６直鎖アルキル、フェニルまたはＳＯ３Ｈであり、Ｚ＝Ｈ、ＳＯ３Ｈであり、かつ、Ａ１およびＡ２は、−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ、−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ、−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、−Ｐｈｅ−Ｖａｌ、またはそれらの塩もしくはＮ−アルキル化誘導体のうちから選択される。Ａｒｇ、Ｇｌｙ、システイン酸、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、ＴｈｒのＤ型またはＬ型、並びに上記配列の環状型の任意の組み合わせを用いることができる。
【００７８】
置換Ｒ−Ｇ−システイン酸配列としては、環状Ｒ−Ｇ−システイン酸類似体が挙げられる。
Ｒ−Ｇ−システイン酸およびその誘導体の投与は、薬物送達システムまたは任意の医薬として許容される剤形の注入製剤または固体製剤または軟膏製剤を用いることにより、皮下に、皮膚科学的に、眼科的に、および全身的に行うことができる。
【００７９】
本発明の化合物は、経口、直腸、静脈内、動脈内、皮内、皮下、筋肉内、鞘内、舌下、口腔内、鼻腔内、経粘膜、経皮的、局所的、眼内、硝子体内、他の腸内、他の非経口、および／または他の可能な投与経路を含むが、これらに限定されない、意図した治療効果をもたらすのに適当な任意の経路によって投与され得る。
【００８０】
本発明の化合物は、副作用または有毒作用を回避しながら、意図した治療効果を提供するいかなる投与量で投与されてもよい。本発明の化合物のヒト対象に投与されてもよい典型的な投与量は、約１ｎｇ／ｋｇ〜約１．０ｇ／ｋｇの範囲にある。
【００８１】
可能かつ適当な場合には、本発明の化合物は、任意でリポソームまたはナノ粒子（例えばナノカプセル）の形態で調製されていてもよい。リポソームの形成および使用は、一般に当業者には知られている。リポソームは、それらが多重ラメラ小胞（ＭＬＶｓ：ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）と称される場合がある多重ラメラ同心状二層小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ  ｂｉｌａｙｅｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）を自発的に形成するように、水性媒体中に分散されたリン脂質から形成される。ＭＬＶは、典型的には２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。超音波で処理した場合、ＭＬＶは、水溶液を含む核を有する、直径約２００〜５００オングストロームの小さな単層小胞（ＳＵＶｓ：ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）を形成する。一般に、リン脂質は、水性媒体中に分散された場合、脂質の水に対するモル比に応じて、リポソーム以外の様々な構造を形成することができる。脂質対水のモル比が低い場合には、リポソームが形成するであろう。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、張度、および２価カチオンの有無に依存する。リポソームは、１）飲食作用（例えば、マクロファージおよび好中球のような細胞によるリポソームの食作用）、細胞表面への吸着、２）細胞表面成分との相互作用、３）原形質膜へのリポソームの脂質二重層の挿入による原形質細胞膜との融合、または４）リポソーム脂質の細胞膜または細胞内膜への移動またはその逆の移動、を含む様々な機構によって細胞と相互作用し得る。リポソーム製剤を変更することによって、同リポソームが副鼻腔、鼻粘膜などにおいて細胞と相互作用する機構を変更することができる。
【００８２】
ナノカプセルは、外殻と、所望の物質が配置され得る空間とから成る任意のナノ粒子である。ナノカプセルを形成するための技術は当該技術分野において知られている。高分子ナノカプセルは特定の寸法および形状で製造され得る。前記高分子ナノカプセルは、物理的および化学的性質を正確に定めた単分散粒子として生成され得、したがって、ｐＨ、粘液の流れ、あるいはデバイスが植え込まれる副鼻腔内または耳、鼻もしくは咽喉の他の領域内に存在する他の条件のような特定の二分子トリガー機構（ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ）に応答して、治療用または診断用物質の放出を容易にするように作られ得る。ナノカプセルは、本発明において、特定の標的細胞（例えば、癌細胞または炎症状態に関連する細胞）に結合する特異的な化学的受容体または結合部位を有する「スマートドラッグ」として用いることができる。
【００８３】
下記は、本発明の化合物を含有する医薬品のための処方の非限定的な例である。また、細胞接着の阻害においてＲ−Ｇ−システイン酸ペプチドまたは誘導体を用いて示された安全性および／または有効性の例が含まれている。本願において、「Ｒ−Ｇ−システイン酸ペプチド」、「ＲＧＣｙｓ−ペプチド」および、「本発明の化合物」という用語は、本明細書に記載される一般式Ｉ〜ＶＩＩおよび化合物１および３〜５によって定義されるものを含むが、これらに限定されるものではない、Ｒ−Ｇ−システイン酸配列を含む組成物およびそれらの誘導体を同義的に意味するものとする。
【実施例１】
【００８４】
医薬製剤
下記は、本明細書に記載される一般式Ｉ〜ＶＩＩによって定義されるもののいずれか、または化合物１〜５のうちのいずれかのような本発明のＲ−Ｇ−システイン酸ペプチドを含有する医薬製剤Ｉ〜Ｘの実施例である。
【００８５】
【表２】
0005912082.tif 000016
0005912082.tif 000017
0005912082.tif 000018
【実施例２】
【００８６】
ウサギにおけるＲＧＤペプチドおよびグリシル−アルギニル−グリシル−システイン酸−トレオニル−プロリン−ＣＯＯＨ（ＧＲＧシステイン酸ＴＰ；化合物１）のＰＶＤ誘発効果の比較
この実施例では、ＲＧＤペプチドおよびグリシル−アルギニル−グリシル−システイン酸−トレオニル−プロリン−ＣＯＯＨ（Ｒ−Ｇ−システイン酸ペプチド；ＧＲＧシステイン酸ＴＰ；化合物１）のＰＶＤ誘発効果をウサギにおいて比較した。この研究のための手順は以下の通りであった。
【００８７】
手順：
動物モデル
ａ）２０匹の雄および雌のウサギ
ｂ）体重  約１．５〜２．５ｋｇ
ｃ）２つのグループに分ける。
【００８８】
ｉ）１０匹のウサギに、ｐＨ＝６．５の２．５％ＲＧＤ溶液を硝子体内に注入した。
ａ）１０匹の右眼に２．５％ＲＧＤ溶液を注入した。
ｂ）５匹の左眼はＢＳＳ対照として用いた。
【００８９】
ｃ）５匹の左眼にｐＨ＝６．５の２．５％ＲＧＤ＋０．０２％ＥＤＴＡを注入した。
ｉｉ）１０匹のウサギに、ｐＨ＝６．５の２．５％Ｒ−Ｇ−システイン酸溶液を硝子体内に注入した。
【００９０】
ａ）１０匹の右眼にｐＨ＝６．５の２．５％Ｒ−Ｇ−システイン酸溶液を注入した。
ｂ）１０匹の左眼にｐＨ＝６．５の２．５％Ｒ−Ｇ−システイン酸溶液＋０．０２％ＥＤＴＡを注入した。
【００９１】
活性薬品
ｄ）ＥＤＴＡナトリウム−９９．０〜１００．５％、スペクトラム  ケミカル  コーポレイション（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．）より入手
ｅ）Ｒ−Ｇ−システイン酸−ｃＧＭＰ供給者（純度＞９８％）
ｆ）ＲＧＤ−ｃＧＭＰ供給者（純度＞９８％）
ｇ）ＢＳＳ溶液
Ｒ−Ｇ−システイン酸、ＲＧＤの双方、Ｒ−Ｇ−システイン酸＋ナトリウムＥＤＴＡ、ＲＧＤ＋ナトリウムＥＤＴＡおよびＢＳ溶液は、手術の２４時間前に硝子体腔内に注入した。ウサギ（１０ｍｇ／ｋｇ体重）は、キシラジン（１００ｍｇ／ｍＬ）および塩酸ケタミン（１００ｍｇ／ｍＬ）の１：１の合剤２．０ｍＬの筋肉内注入によって麻酔した。瞳は、局所的な塩酸シクロペントラート１％および塩酸フェニレフリン１０％で拡張される。
【００９２】
先在する硝子体網膜異常を有する動物を除外するために、すべての動物を、最初に細隙灯生体顕微鏡検査および間接検眼によって検査した。０．１０ｃｃの硝子体内注入は、１．０ｃｃ注入器に取り付けられた３０ゲージ針を用いて、鼻上象限（ｓｕｐｒａｎａｓａｌ  ｑｕａｄｒａｎｔ）における縁に対して２ｍｍ後方に投与された。水晶体または網膜への損傷を避けるために注意しなければならない。
【００９３】
注入後２４時間かつ機械的硝子体切除の開始直前に、後部硝子体の状態、また硝子体の液化の状態を測定するために、Ｂ−スキャン超音波検査を行った。２ポート経毛様体扁平部硝子体切除術（ｔｗｏ−ｐｏｒｔ  ｐａｒｓ  ｐｌａｎａ  ｖｉｔｒｅｃｔｏｍｙ）は、注入光ファイバー、および硝子体切除ユニットに取り付けられた硝子体カッターを用いて行なった。３０秒の中心部硝子体切除術に続いて、硝子体カッターを乳頭周囲網膜の表面に導き、そこで、低吸引（＜３０ｍｍＨｇ）を用いて、網膜表面からの後部硝子体皮質の分離を４象限において試みた。強膜切開を縫合し、各象限に見られる任意のＰＶＤの存在および範囲を測定するために術後Ｂ−スキャン超音波検査を行なった。前記動物は心臓内ペントバルビタールナトリウム注射によって安楽死させ、直ちに眼を摘出した。
【００９４】
術後Ｂ−スキャン超音波検査に基づいて、ＰＶＤの範囲を評価するために、この格付けシステムに従って、硝子体の液化およびＰＶＤの等級を格付けした。
等級０．  ａ）後部硝子体の剥離は観察されない。
【００９５】
ｂ）硝子体液化
等級１．  ａ）硝子体が２つ以下の象限において分離されている眼から成る。
ｂ）硝子体液化
等級２．  ａ）硝子体が３つ以上の象限において分離されているが、放射組織（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｒａｙｓ）に沿って局所的な付着（ｆｏｃａｌ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔｓ）が残存する眼から成る。
【００９６】
ｂ）  硝子体液化
等級３．  ａ）硝子体が網膜表面から完全に分離されている眼から成る。
ｂ）硝子体液化
すべての眼は、固定剤の迅速な浸透を保証するために、摘出直後に、毛様体扁平部に隣接した（ｓｕｂ−ａｄｊａｃｅｎｔ）上極（ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｐｏｌｅ）において鋭利なカミソリの侵入を受けた。隣接する網膜および水晶体への損傷を避けるように注意した。その眼を２％パラホルムアルデヒド＋２．５％グルタルアルデヒドに摂氏４度で最短２４時間にわたって浸漬した。固有の後部眼球（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｃａｌｏｔｔｅ）を取り出し、メタノール中で脱水し、二酸化炭素中で臨界点まで乾燥させ、金でスパッタコートして、走査電子顕微鏡を用いて撮影した。
【００９７】
結果
注入：２．５％Ｒ−Ｇ−システイン酸
グループ１．ベースラインにおいて、すべての動物は両眼にＰＶＤを有していない。
【００９８】
【表３】
0005912082.tif 000019
注入：２．５％のＲＧＤ
グループ２．ベースラインにおいて、すべての動物は両眼にＰＶＤを有していない。
【００９９】
【表４】
0005912082.tif 000020
注入：２．５％Ｒ−Ｇ−システイン酸＋０．０２％ＮａＥＤＴＡ
グループ３．ベースラインにおいて、すべての動物は両眼にＰＶＤを有していない。
【０１００】
【表５】
0005912082.tif 000021
注入：２．５％ＲＧＤ＋０．０２％ＮａＥＤＴＡ
グループ４．ベースラインにおいて、すべての動物は両眼にＰＶＤを有していない。
【０１０１】
【表６】
0005912082.tif 000022
この研究の実施例４における動態研究の結果は、ＲＧＤおよびＲ−Ｇ−システイン酸（ＧＲＧシステイン酸ＴＰ；化合物１）が同様の特性を有し、２．５％Ｒ−Ｇ−システイン酸の硝子体内への注入は、２４時間で網膜からの硝子体の完全な分離を生じ、さらにＲＧＤのウサギおよびＲ−Ｇ−システイン酸のウサギの双方の硝子体は、完全に液化されることを示している。
【０１０２】
全体にわたって、Ｒ−Ｇ−システイン酸の活性は、ウサギでの完全なＰＶＤの誘発および硝子体の液化において、ＲＧＤのそれと同等であるか、または若干良好である。これは、恐らく、インテグリン細胞外マトリックス相互作用の結合部位に対して、ＲＧＤと比較して、より強力な競合的結合能力による。本明細書で別記するように、スルホン酸は対応するカルボン酸より強力な酸である。このスルホン酸基のより高い極性はより強力な分子間結合をもたらす。例えば、より分極したＯ−Ｈ結合を有するＲ−Ｇ−システイン酸は、比較的分極に劣るＯ−Ｈ結合を有するＲ−Ｇ−アスパラギン酸よりも強力な水素結合をインテグリン結合部位のアミド基および／またはアミノ酸の側鎖と形成し、かつ／または、インテグリン結合部位において錯体を形成する金属イオンとのより強力な相互作用を有し得る。
【０１０３】
前記結果はまた、これらの化合物が０．０２％のエデト酸ナトリウムと共に投与される場合、ＲＧＤおよびＲ−Ｇ−システイン酸の双方の活性は変化しないことを示している。
前記結果はまた、Ｒ−Ｇ−システイン酸化合物の化合物１またはＲＧＤ化合物の硝子体内注入による副作用または有害な安全性効果はなかったことを示している。
【実施例３】
【０１０４】
ウサギの眼におけるＲＧＣペプチド化合物１（ＧＲＧシステイン酸ＴＰ）の多数回注入の安全性の検討
この実施例では、ＲＧＣペプチド化合物１の多数回の注入を、体重約１．５〜２．５ｋｇの５匹の雄および４匹の雌のニュージーランドウサギの眼に投与し、その眼を下記に記載の通りに試験した。
【０１０５】
研究手順は以下の通りであった。
Ａ）ベースライン試験：ベースラインにおいて、９匹のウサギのすべての右眼および左眼を細隙灯生体顕微鏡検査法および間接検眼法で検査して、前記動物が先在する硝子体網膜異常を有していないことを確認した。さらに、９匹の動物すべての左眼および右眼に対して、β−スキャン超音波検査並びにＥＲＧスキャンを行って、ベースライン読み取り値を得た。
【０１０６】
Ｂ）実験的治療：次に、９匹のウサギすべてに、ＲＧＣ溶液または生理食塩水（対照）のいずれかの硝子体内注入を受けさせた。治療溶液は以下のように調製した。
ＲＧＣ溶液：０．０２ｍｇのＥＤＴＡ二ナトリウム＋０．８０ｍｇの塩化ナトリウムと、ｐＨ６．５に調整されたＵＳＰ滅菌注入用蒸留水（ＵＳＰ  ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｗａｔｅｒ  ｆｏｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）とを含有する、２．５ｍｇ／１００μＬのＲＧＣ化合物１の溶液。
【０１０７】
生理食塩水（対照）：ｐＨ６．５に調整されたＵＳＰ無菌等張食塩水液（ＵＳＰ  Ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ｓｔｅｒｉｌｅ  ｓａｌｉｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）。
投薬は以下の通りに進めた。
【０１０８】
１）９匹の各ウサギの右眼に、１００μＬの２．５ｍｇ／１００μＬ  ＲＧＣ溶液（投与量＝２．５ｍｇの化合物１を送達）を硝子体内に注入した。
２）９匹の各ウサギの左眼に、１００μＬの生理食塩水（対照）を硝子体内に注入した。
【０１０９】
３）最初の硝子体内注入後１日に、前記ウサギのうちのいずれかが前記注入による何らかの副作用を有していないかをチェックするために、細隙灯生体顕微鏡検査および間接検眼によって、９匹のウサギすべての右眼および左眼を検査した。
【０１１０】
４）１回目の硝子体内注入後の７日目に、前記ウサギのうちのいずれかが前記注入による副作用を呈していないかを判定するために、細隙灯生体顕微鏡検査および間接検眼によって、９匹のウサギすべての右眼および左眼を再び検査した。さらに、ベースラインからの何らかの変化があったかを判定するために、すべての動物の右眼および左眼のすべてについてＥＲＧスキャンを実施した。
【０１１１】
５）次に、９０１番、９０４番および９０９番の３匹のウサギのグループを無作為に選択し、後部硝子体の状態を判定するために、これらの３匹の選択した動物の右眼および左眼に対して機械的硝子体切除を実施した。
【０１１２】
６）３匹の無作為に選択した動物（９０１番、９０４番、および９０９番）を心臓内ペントバルビタールナトリウム注入によって安楽死させて、直ちに眼を摘出した。前記眼はすべて、固定剤の迅速な浸透を保証するために、摘出直後に毛様体扁平部に隣接する上極において鋭利な鋭いカミソリの侵入を受けた。隣接する網膜および水晶体への損傷を避けるために注意した。前記眼を２％パラホルムアルデヒド＋２．５％グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）中に摂氏４度で最短２４時間にわたって浸漬した。固有の後部眼球を取り出し、メタノール中で脱水し、二酸化炭素中で臨界点まで乾燥させ、金でスパッタコートして、走査電子顕微鏡を用いて撮影した。他の試料は病理組織検査に供した。
【０１１３】
９０２番、９０３番、９０５番、９０６番、９０７番、および９０８番の残りの６匹のウサギには、最初の注入後７日に第２回目を注入した。
１）６匹の各ウサギの右眼に、１００μＬの２．５ｍｇ／１００μＬ  ＲＧＣ溶液（２回目の化合物１の２．５ｍｇ投与量を送達）を硝子体内に再び注入した。
【０１１４】
２）６匹の各ウサギの左眼に、１００μＬの生理食塩水（対照）を再び硝子体内に注入した。
３）２回目の硝子体内注入後１日に、前記ウサギのうちのいずれかが前記注入による何らかの副作用を有していないかをチェックするために、細隙灯生体顕微鏡検査および間接検眼によって、６匹の残りのウサギすべての右眼および左眼を検査した。
【０１１５】
４）２回目の硝子体内注入後７日目に、前記注入による何らかの副作用をチェックするために、細隙灯生体顕微鏡検査および間接検眼によって、６匹の残りのウサギすべての右眼および左眼を再び検査した。さらに、ベースラインからの何らかの変化があったかを判定するために、すべての動物の左眼および右眼のＥＲＧスキャンを実施した。
【０１１６】
５）次に、残りの６匹から９０２番、９０３番および９０７番の３匹のウサギのグループを無作為に選択し、後部硝子体の状態を判定するために、これらの３匹の無作為に選択した動物の右眼および左眼に対して機械的硝子体切除を実施した。
【０１１７】
６）９０２番、９０３番、および９０７番の３匹の無作為に選択した動物を心臓内ペントバルビタールナトリウム注入によって安楽死させて、直ちに眼を摘出した。前記眼はすべて、固定剤の迅速な浸透を保証するために、摘出直後に毛様体扁平部に隣接する上極において鋭利な鋭いカミソリの侵入を受けた。隣接する網膜および水晶体への損傷を避けるように注意した。前記眼を２％パラホルムアルデヒド＋２．５％グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）に摂氏４度で最短２４時間にわたって浸漬した。固有の後部眼球を取り出し、メタノール中で脱水し、二酸化炭素中で臨界点まで乾燥させ、金でスパッタコートして、走査電子顕微鏡を用いて撮影した。他の試料は病理組織検査に供した。
【０１１８】
次に、残りのグループの９０５番、９０６番、および９０８番の３匹のウサギには、最初の注入後１４日に３回目の注入を以下の通りに行った。
１）３匹の残りの各ウサギの右眼に、１００μＬの２．５ｍｇ／１００μＬ  ＲＧＣ溶液を硝子体内に再び注入した（３回目の化合物１の２．５ｍｇ投与量を送達）。
【０１１９】
２）３匹の残りの各ウサギの左眼に、１００μＬの生理食塩水（対照）を硝子体内に再び注入した。
３）３回目の硝子体内注入後１日に、前記ウサギのうちのいずれかが前記注入による何らかの副作用を有していないかをチェックするために、細隙灯生体顕微鏡検査および間接検眼によって、６匹の残りのウサギすべての右眼および左眼を検査した。
【０１２０】
４）３回目の硝子体内注入後７日目に、前記注入による何らかの副作用をチェックするために、細隙灯生体顕微鏡検査および間接検眼によって、３匹の残りのウサギすべての右眼および左眼を再び検査した。さらに、ベースラインからの何らかの変化があったかを判定するために、すべての動物の左眼および右眼のＥＲＧスキャンを実施した。
【０１２１】
５）後部硝子体の状態を判定するために、３匹の残りの動物（９０５番、９０６番、および９０８番）の右眼および左眼に対して機械的硝子体切除を行った。
６）３匹の残りの動物（９０５番、９０６番、および９０８番）を心臓内ペントバルビタールナトリウム注入によって安楽死させて、直ちに眼を摘出した。前記眼はすべて、固定剤の迅速な浸透を保証するために、摘出直後に毛様体扁平部に隣接する上極において鋭利な鋭いカミソリの侵入を受けた。隣接する網膜および水晶体への損傷を避けるように注意した。前記眼を２％パラホルムアルデヒド＋２．５％グルタルアルデヒドに摂氏４度で最短２４時間にわたって浸漬した。固有の後部眼球を取り出し、メタノール中で脱水し、二酸化炭素中で臨界点まで乾燥させ、金でスパッタコートして、走査電子顕微鏡を用いて撮影した。他の試料は病理組織検査に供した。
【０１２２】
３）活性薬品
この研究に用いた活性薬品は以下の通りであった。
ａ．ＥＤＴＡ二ナトリウム−９９．０〜１００．５％、スペクトル  ケミカル  コーポレイションより
ｂ．ＲＧＣペプチド（化合物１）
ｃ．ＵＳＰ無菌等張食塩水液
４）研究製剤
ａ）ＲＧＣ溶液：０．０２ｍｇのＥＤＴＡ二ナトリウム＋０．８０ｍｇの塩化ナトリウムおよびｐＨ６．５に調整されたＵＳＰ滅菌注入用蒸留水を含有する、２．５ｍｇ／１００μＬ  ＲＧＣ化合物１の溶液。０．２２μフィルタを通して２．０ｍＬバイアルへ無菌濾過。
【０１２３】
生理食塩水（対照）：ｐＨを６．５に調整されたＵＳＰ無菌等張食塩水。０．２２μフィルタを通して無菌バイアル内へ滅菌濾過。
５）注入準備のための麻酔
ａ．２．０ｍＬのキシラジン（１００ｍｇ／ｍＬ）および塩酸ケタミン（１００ｍｇ／ｍＬ）の１：１の合剤の筋肉内注入。
【０１２４】
ｂ．瞳は、局所的な塩酸シクロペントラート１％および塩酸フェニレフリン１０％によって拡張した。
６）硝子体内注入の準備：
２．５ｍｇ／１００μＬを含むＲＧＣ溶液およびｐＨが６．５に調整された無菌等張食塩液を収容する無菌バイアルを用意した。
【０１２５】
注入前に、研究者は、１．０ｃｃの注入器内に０．１０ｃｃ（１００マイクロリットル）の溶液が存在することを確認した。
７）注入手順：
硝子体内注入がウサギの正常な日常活動を妨げるのに十分なレベルの視覚障害を生じないので、これは、視覚眼科学協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｖｉｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ）ガイドラインの動物決議に従ってメイジャー・サバイバル・プロシージャ（ｍａｊｏｒ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）とは見なされない。
【０１２６】
細隙灯生体顕微鏡検査法、検眼鏡検査法およびＥＲＧのベースライン試験が前記ウサギに対して完了した後、ＲＧＣ溶液並びに無菌食塩液の双方を硝子体腔内に注入した。前記ウサギ（１０ｍｇ／ｋｇ体重）をキシラジン（１００ｍｇ／ｍＬ）および塩酸ケタミン（１００ｍｇ／ｍＬ）の１：１の合剤２．０ｍＬの筋肉内注入によって麻酔した。瞳は、局所的な塩酸シクロペントラート１％および塩酸フェニレフリン１０％で拡張させた。
【０１２７】
先在する硝子体網膜異常を備えたいかなる動物も除外するために、動物はすべて、最初に細隙灯生体顕微鏡検査および間接検眼（ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｏｐｔｈａｌｍｏｓｃｏｐｙ）によって検査した。０．１０ｃｃの硝子体内注入は、１．０ｃｃの注入器に取り付けられた３０ゲージ針を用いて、鼻上象限（ｓｕｐｒｏｎａｓａｌ  ｑｕａｄｒｅｎｔ）における縁に対して２ｍｍ後方に投与された。水晶体または網膜への損傷を避けるために注意した。
【０１２８】
注入後７日に、前記動物に対して機械的硝子体切除を行なった。２ポート経毛様体扁平部硝子体切除術は、注入光ファイバー、および硝子体切除ユニットに取り付けられた硝子体カッターを用いて行なった。３０秒の中心部硝子体切除術に続いて、硝子体カッターを乳頭周囲網膜の表面に導き、そこで、低吸引（＜３０ｍｍＨｇ）を用いて、４象限において網膜表面からの後部硝子体皮質の分離を試みた。前記動物を心臓内ペントバルビタールナトリウム注入で安楽死させ、直ちに眼を摘出した。
【０１２９】
前記眼はすべて、固定剤の迅速な浸透を保証するために、摘出直後に毛様体扁平部に隣接する上極において鋭利な鋭いカミソリの侵入を受けた。隣接する網膜および水晶体への損傷を避けるように注意した。前記眼を２％パラホルムアルデヒド＋２．５％グルタルアルデヒドに摂氏４度で最短２４時間にわたって浸漬した。固有の後部眼球を取り出し、メタノール中で脱水し、二酸化炭素中で臨界点まで乾燥させ、金でスパッタコートして、走査電子顕微鏡を用いて撮影した。
【０１３０】
結果の分析
ＲＧＣ溶液および無菌食塩液で処理した眼における安全性に関するデータを、下記技術、すなわち、ｉ）細隙灯生体顕微鏡検査法、ｉｉ）検眼鏡検査法、ｉｉｉ）ＥＲＧ、ｉｖ）組織病理学、および、ｖ）電子顕微鏡法を用いて安全性について分析した。
【０１３１】
安全性プロフィール：
９０１番、９０２番、９０３番、９０４番、９０５番、９０６番、９０７番、９０８番、９０９番の９匹のウサギのグループへの１００μＬの２．５％ＲＧＣ溶液の１回目の硝子体内投与は全時点においていかなる有意な毒性にも関係していなかった。２．５％ＲＧＣグループと等張食塩水液グループとの間には報告された副作用において有意な差異はなかった。この毒性の欠如は、臨床検査、間接検眼法、および超音波β−スキャンおよび機械的硝子体切除によって判定された。
【０１３２】
細隙灯生体顕微鏡検査法は、すべての治験検診（ｓｔｕｄｙ  ｖｉｓｉｔｓ）において行なわれ、１００μＬの２．５％ＲＧＣ溶液および等張食塩水液のグループの硝子体内注入に対して炎症反応がほぼ全くないことを示す炎症の兆候について、結膜および強膜、角膜、内皮の変更、前眼房反応、虹彩、水晶体および眼窩（ｃａｐｓｕｌｅ）、並びに前部硝子体に焦点が当てられた。すべての調査項目において、かつすべての調査グループにおいて、被験物質によって誘発された有意な毒性の兆候があるようには見えなかった。
【０１３３】
有意な網膜毒性が存在しなかったことを保証する検討を通じて、後部（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ）の臨床評価も続けられた。間接検眼並びに細隙灯眼底評価は、各評価時点において、網膜毒性の何らかの兆候に対して特に注意して行なった。後部は、硝子体密度、硝子体液化、硝子体付着および出血の可能性（ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）の変化について評価した。網膜は、ＲＰＥ毒性、網膜血管障害性網膜出血、滲出、網膜裂孔、破壊または剥離の兆候について評価した。治療前のベースラインにおけるＲＰＥの変化はなく、すべての調査項目において、かつすべての調査グループにおいて、被験物質によって誘発された有意な後部変化の兆候があるようには見えなかった。硝子体内注入前に９匹の動物に対して行なったＥＲＧスキャン、並びに注入後１日および７日にすべての前記動物に対して行ったＥＲＧスキャンは、被験物質によって誘発された有意な変化または毒性のいかなる兆候も生じないようであったことに注目することは重要である。
【０１３４】
９０２番、９０３番、９０５番、９０６番、９０７番、９０８番の６匹のウサギのグループへの１００μＬの２．５％ＲＧＣ溶液の２回目の硝子体内投与は全時点においていかなる有意な毒性にも関係していなかった。２．５％ＲＧＣグループと等張食塩水液グループとの間に報告された副作用における有意な差異はなかった。この毒性の欠如は、臨床検査、間接検眼法、および超音波β−スキャンおよび機械的硝子体切除によって判定した。
【０１３５】
細隙灯生体顕微鏡検査法は、すべての治験検診において行なわれ、１００μＬの２．５％のＲＧＣ溶液および等張食塩水液のグループの硝子体内注入に対して炎症反応がほぼ全くないことを示す炎症の兆候について、結膜および強膜、角膜、内皮の変更、前眼房反応、虹彩、水晶体および眼窩、並びに前部硝子体に焦点が当てられた。すべての調査項目において、かつすべての調査グループにおいて、被験物質によって誘発された有意な毒性の兆候があるようには見えなかった。
【０１３６】
有意な網膜毒性が存在しなかったことを保証する検討の全体にわたって、後部の臨床評価も続けられた。間接検眼並びに細隙灯眼底評価は、各評価時点において、網膜毒性の何らかの兆候に対して特に注意して行なった。後部は、硝子体密度、硝子体液化、硝子体付着および出血の可能性の変化について評価した。網膜は、ＲＰＥ毒性、網膜血管障害性網膜出血、滲出、網膜裂孔、破壊または剥離の兆候について評価した。２回目の治療の７日前のベースラインにおけるＲＰＥの変化はなく、すべての調査項目において、かつすべての調査グループにおいて、被験物質によって誘発された有意な後部変化の兆候があるようには見えなかった。硝子体内注入後２回目の６匹の動物に対して行なったＥＲＧスキャン、並びに注入後８日および１４日にすべての前記動物に対して行ったＥＲＧスキャンは、被験物質によって誘発された有意な変化または毒性の任意の兆候を生じなかったようであることに注目することは重要である。
【０１３７】
９０５番、９０６番、９０８番の６匹のウサギのグループへの１００μＬの２．５％ＲＧＣ溶液の３回目の硝子体内投与は全時点においていかなる有意な毒性にも関係していなかった。２．５％ＲＧＣグループと等張食塩水液グループとの間には、報告された副作用において有意な差異はなかった。この毒性の欠如は、臨床検査、間接検眼法、および超音波β−スキャンおよび機械的硝子体切除によって判定された。
【０１３８】
細隙灯生体顕微鏡検査法は、すべての治験検診において行なわれ、１００μＬの２．５％ＲＧＣ溶液および等張食塩水液のグループの硝子体内注入に対して炎症反応がほぼ全くないことを示す炎症の兆候について、結膜および強膜、角膜、内皮の変更、前眼房反応、虹彩、水晶体および眼窩、並びに前部硝子体に焦点が当てられた。すべての調査項目において、かつすべての調査グループにおいて、被験物質によって誘発された有意な毒性の兆候があるようには見えなかった。
【０１３９】
有意な網膜毒性が存在しなかったことを保証する検討の全体にわたって、後部の臨床評価も続けられた。間接検眼並びに細隙灯眼底評価は、各評価時点において、網膜毒性の何らかの兆候に対して特に注意して行なった。後部は、硝子体密度、硝子体液化、硝子体付着および出血の可能性の変化について評価した。網膜は、ＲＰＥ毒性、網膜血管障害性網膜出血、滲出、網膜裂孔、破壊または剥離の兆候について評価した。３回目の処理前１４日のベースラインにおけるＲＰＥの変化はなく、すべての調査項目において、かつすべての調査グループにおいて、被験物質によって誘発された有意な後部変化の兆候はあるようには見えなかった。硝子体内注入後３回目の３匹の動物に対して行なったＥＲＧスキャン、並びに注入後１５日および２１日にすべての前記動物に対して行ったＥＲＧスキャンは、被験物質によって誘発された有意な変化または毒性の任意の兆候を生じなかったようであることに注目することは重要である。
【実施例４】
【０１４０】
ＲＧＣペプチドの抗接着性：化合物１（ＧＲＧシステイン酸ＴＰ）、環状−ＲＧＤおよびＲＧＥによる創傷治癒の動態研究
この実施例では、創傷治癒のモデルにおいて、ＲＧＣペプチドは抗接着性を有し、従って、多くの病理学的硝子体網膜疾患の発症を防止することができ、またヒト黒色腫および結腸癌細胞における転移を阻害し得ることが示された。
【０１４１】
ＲＧＣペプチドの抗接着性をインビトロで試験するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ：ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）によって創傷治癒アッセイを実施した。ＨＵＶＥＣをフィブロネクチン被覆面上に播種して、コンフルエントな単層を成長させた。前記ＨＵＶＥＣ単層上で小さなピペットチップを引き摺ることによって、創傷（引っ掻き傷（ｓｃｒａｔｃｈ  ｒｉｆｔ））を形成した。次に、前記細胞を、ＲＧＣペプチド（化合物１、１０ｍＭ）を含有する新鮮な増殖培地中でインキュベートし、創傷閉鎖の動態を判定するために、創傷領域を５つの異なる範囲において様々な時点（０、４、８、１２、１６、２０、２４時間）で撮像した。創傷閉鎖のレベルは、細胞の接着、移動および増殖を通じてＨＵＶＥＣによって再び占有された元の創傷領域の画分の測定によって定量した。
【０１４２】
対照試験では、以下のペプチド、すなわち、環状ＲＧＤペプチド（１ｍＭ、陽性対照）およびＲＧＥペプチド（１ｍＭ、陰性対照）をＲＧＣ（化合物１）の代わりに用いた。
創傷治癒の動態に対するペプチドの効果を図１に示す。
【０１４３】
結果は元の面積のパーセンテージとして示されている。エラーバーは、２〜６回の独立試行における創傷サイズの標準偏差に対応する。
ＨＵＶＥＣ創傷閉鎖の動態の結果は、ＲＧＣペプチドは２４時間後にＨＵＶＥＣ創傷治癒を７０％阻害し、一方、環状ＲＧＤ（ＲＧＤに基づくペプチド；Ｎ−メチル化環状−ＲＧＤｆ−Ｎ（Ｍｅ）Ｖ；シレンジタイド（Ｃｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅ））は、２４時間後、ＨＵＶＥＣ創傷治癒を４５％阻害することを示している。これらは双方とも、２４時間後にＨＵＶＥＣ創傷治癒を０％阻害した陰性対照ＲＧＥペプチドと比較した。ＲＧＣ（化合物１）の効果は、インテグリン結合活性の定評のある阻害剤であるＲＧＤに基づくペプチドの活性に定量的に匹敵する。さらに、ＲＧＣペプチドは、ＨＵＶＥＣ細胞のアポトーシスを生じることなく、ＲＧＤに基づくペプチドの活性に類似した特性を示す。
【０１４４】
本明細書に別記するように、硝子体と網膜と間の強力な接着は、硝子体黄斑牽引、増殖性糖尿病性網膜症、黄斑円孔、加齢性黄斑変性および飛蚊症のような多くの病理学的硝子体網膜疾患の結果的な発症の原因となり得る。したがって、内部網膜表面からの硝子体の機械的分離以外に、後部硝子体剥離を達成する非外傷性の非侵襲性アプローチは非常に望ましい（テゼル、ティ．エイチ．（Ｔｅｚｅｌ，Ｔ．Ｈ．）ら、Ｒｅｔｉｎａ（１９９８年）１８：第７−１５頁、およびヴェルシュトレーテン、ティ．シー．（Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅｎ．Ｔ．Ｃ．）ら、Ａｒｃｈ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．（１９９３年）第１１１巻：第８４９−８５４頁参照）。
【０１４５】
本明細書に別記するように、ＥＣＭ成分、特に硝子体皮質の膠原細線維は、内境界層（ＩＬＬ：（ｉｎｎｅｒ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｌａｍｉｎａ）において、インテグリン結合部位を介して網膜の内面に固定されると考えられている（フース、アール．ワイ．（Ｆｏｏｓ，Ｒ．Ｙ．）、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．（１９７２年）第１１巻：第８０１−８０８頁参照）。フィブロネクチンおよびラミニンのような眼内のＩＬＬの主な接着性糖タンパク質は、ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）配列を介してインテグリンに対して強く結びつけられ（カーチス、ティ．エム．（Ｃｕｒｔｉｓ，Ｔ．Ｍ．）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、（１９９５年）第２６９巻：第Ｌ２４８−Ｌ２６０頁、エルナー、エス．ジー．（Ｅｌｎｅｒ，  Ｓ．Ｇ．）ら、ＩＯＶＳ（１９９６年）第３７巻：第６９６−７０１頁、およびホルマン、エス．エム．（Ｈｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｍ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９５年）第２６９巻：第Ｌ２４８−Ｌ２６０頁参照）、いくつかのインテグリンはＥＣＭタンパク質中に存在するＲＧＤモチーフを介して結合することも知られている。さらに、ビトロネクチンはαｖβ３−特異的であるが、フィブロネクチンはαｖβ３に加えて他のいくつかのインテグリンに結合することが知られている。
【０１４６】
インテグリンのＥＣＭへの主な接続はＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を含み、そのＲＧＤ配列は、インテグリンヘッドのα−サブユニットとβ−サブユニットとの間に位置する浅い間隙へ結合する（ション（Ｘｉｏｎｇ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２年）第２９６巻：第１５１−１５５頁参照）。そのような結合は、細胞接着、移動、分化、血管新生および創傷治癒を含む様々な細胞シグナリング経路を調節するのを助ける（ルオスラーチ、イー．（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）第２３８巻：第４９１−４９７頁；およびＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９１年）第８７巻：第１−５頁参照）。
【０１４７】
硝子体細胞外マトリックス、例えば、膠原細線維は、インテグリン結合部位によって細胞網膜（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｔｉｎａ）に接続されるので、ＲＧＣペプチド（オリゴペプチド）の硝子体内注入は、同一のインテグリン受容体部位への競合的結合によって、硝子体細胞外マトリックス（ｖｉｔｒｅｏｕｓ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）のＲＧＤモチーフを細胞網膜から解放し得る。
【０１４８】
数人の研究者（ルオスラーチ、イー．（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）第２３８巻：第４９１−４９７頁；ハインズ、アール．エイ．（Ｈｙｎｅｓ，Ｒ．Ａ．）ら、Ｃｅｌｌ（１９９２年）第６８巻：第３０３−３２２頁；およびハンフリーズ、エム．ジェイ．（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｍ．Ｊ．）ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，（１９９０年）第９７巻：第５８５−５９２頁参照）は、多くのインテグリン（αｖβ３、α５β１、α１１β３など）はＲＧＤ配列モチーフを有する小さなペプチドによって阻害され得ることを示した。また、それらのαｖβ３およびα５β１インテグリンは、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンと同様に、ヒトメラノーマ細胞（ニップ、ジェイ．（Ｎｉｐ，Ｊ．）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，（１９９２年）第９０巻：第１４０６−１４１３頁参照）、ヒト乳癌細胞（ロン、エル．（Ｒｏｎｇ，Ｌ．）ら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．（２００９年）第５０巻：第５９８８−５９９６頁参照）、およびヒト網膜色素上皮細胞（ピーター  シー．ブルックス（Ｐｅｔｅｒ  Ｃ．Ｂｒｏｏｋｓ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，（１９９５年）第９６巻：第１８１５−１８２２頁）のような腫瘍においてアップレギュレートされることも文献で裏付けられている。したがって、ヒトメラノーマ細胞の転移能と、αｖβ３インテグリン受容体を介したメラノーマ細胞のリンパ節ビトロネクチンへの接着との間には良好な相関があり、前記接着はＲＧＤ含有ペプチドによって阻害されたことが示されている（ニップ、ジェイ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，（１９９２年）第９０巻：第１４０６−１４１３頁）。これは、ＲＧＤペプチドが重要な抗血管新生薬（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）であり得ることを示している。
【０１４９】
さらに、ヒト結腸癌細胞系において、細胞接着に有意な増大がある場合、そのとき増大した転移活性があることが示されている（レーマン、エム．（Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｍ．）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，（１９９４年）、第５４巻：第２１０２−２１０７頁）。従って、細胞接着を阻害する薬剤は、結腸癌および黒色腫が転移するのを効果的に阻害する。
【０１５０】
ＲＧＣが細胞接着を阻害することが示された創傷治癒の検討の結果に基づき、また黒色腫および結腸癌のモデルにおけるＲＧＤの転移能から推定すると、ＲＧＣペプチドおよびその誘導体は、例えば黒色腫および結腸癌において、腫瘍転移を効果的に阻害することができる。
【実施例５】
【０１５１】
腫瘍に薬剤を誘導または送達するためのＲ−Ｇ−システイン酸ペプチドの使用。
この実施例では、下記に示す二量体Ｒ−Ｇ−システイン酸ペプチドパクリタキセル複合体（化合物３）が提供される。この組成物は抗腫瘍薬として有用である。二量体Ｒ−Ｇ−システイン酸ペプチドは、特定の癌細胞において高度に発現されるインテグリン受容体に選択的に結合し、細胞接着を阻害することによって、例えば転移性乳癌のような特定の転移癌を治療するのに有用である。
【０１５２】
化合物３：
【０１５３】
【化１４】
0005912082.tif 000023
化合物３の対応するＲＧＤ類似体の合成および作用機序、生物分散、並びに腫瘍選択性は、チェン、エックス．（Ｃｈｅｎ，Ｘ．）ら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｍｅｒｉｃ  ＲＧＤ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ａｓ  ａ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、（２００５年）第４８（４）巻：第１０９８−１１０６頁に記載されている通りである。
【０１５４】
化合物３は、二量体Ｒ−Ｇ−システイン酸ペプチドに結合された特定の抗腫瘍薬剤パクリタキセルを含むが、本発明のこの態様は、腫瘍または他のインテグリン含有組織もしくは構造の診断、撮像、または治療に有用であり得る任意の実現可能な診断用薬または治療薬に結合されたＲ−Ｇ−システイン酸ペプチドの単量体型または多量体型すべてを含むことが理解されるはずである。本発明による単量体または多量体Ｒ−Ｇ−システイン酸ペプチドに結合され得る抗腫瘍物質の例としては、抗腫瘍薬（例えば癌化学療法剤、生体応答調節剤、血管新生阻害剤、ホルモン受容体遮断薬、凍結療法薬（ｃｒｙｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）、または新生組織形成もしくは腫瘍形成を破壊または阻害する他の薬剤）、例えば、それらのＤＮＡを攻撃することにより癌細胞を直接殺すアルキル化剤または他の薬剤（例えばシクロホスファミド、イソホスファミド）、細胞内ＤＮＡの修復に必要な変化を阻害することによって癌細胞を殺すニトロソウレアまたは他の薬剤（例えば、カルマスティン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）（ＢＣＮＵ）およびロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）（ＣＣＮＵ））、特定の細胞機能、通常はＤＮＡ合成、に干渉することによって癌細胞増殖を阻止する代謝拮抗物質および他の薬剤（例えば６−メルカプトプリンおよび５−フルオロウラシル（５ＦＵ））、ＤＮＡを結合するか、またはインターカレートし、ＲＮＡ合成を妨げることによって作用する抗腫瘍抗生物質および他の化合物（例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、マイトマイシン−Ｃ、およびブレオマイシン）、植物から誘導された植物（ビンカ）アルカロイドおよび他の抗腫瘍薬（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）、ホルモン感受性癌の増殖に影響を与えるステロイドホルモン、ホルモン阻害剤、ホルモン受容体アンタゴニストおよび他の薬剤（例えばタモキシフェン、ハーセプチン、アミノグルテチミド（ａｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈａｍｉｄｅ）およびホルメスタンのようなアロマターゼ阻害薬、レトロゾールおよびアナストロゾール（ａｎａｓｔｒａｚｏｌｅ）のようなトリアゾール阻害剤、エキセメスタンのようなステロイド阻害剤）、抗脈管形成タンパク質、小分子、遺伝子治療薬、および／または腫瘍の血管形成または血管新生を阻害する他の薬剤（例えばｍｅｔｈ−１，ｍｅｔｈ−２，サリドマイド）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（アバスチン（Ｒ））、スクアラミン、エンドスタチン、アンジオスタチン、アンギオザイム（Ａｎｇｉｏｚｙｍｅ）、ＡＥ−９４１（ネオバスタット（Ｎｅｏｖａｓｔａｔ）（Ｒ））、ＣＣ−５０１３（レビミド（Ｒｅｖｉｍｉｄ）（Ｒ））、ｍｅｄｉ−５２２（ビタキシン（Ｖｉｔａｘｉｎ）（Ｒ））、２−メトキシエストラジオール（２ＭＥ２、パンゼム（Ｐａｎｚｅｍ）（Ｒ））、カルボキシアミドトリアゾール（ＣＡＩ）、コンブレタスタチンＡ４プロドラッグ（ＣＡ４Ｐ：ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ  Ａ４  ｐｒｏｄｒｕｇ）、ＳＵ６６６８、ＳＵ１１２４８、ＢＭＳ−２７５２９１、ＣＯＬ−３、ＥＭＤ１２１９７４、ＩＭＣ−１Ｃ１１、ＩＭ８６２、ＴＮＰ−４７０、セレコキシブ（セレブレックス（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）（Ｒ））、ロフェコキシブ（バイオックス（Ｖｉｏｘｘ）（Ｒ））、インターフェロンアルファ、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、または参照によって本願に明示的に援用されるＳｃｉｅｎｃｅ第２８９巻、第１１９７−１２０１頁、２０００年８月１７日において特定された化合物のうちのいずれか、生体応答調節剤（例えばインターフェロン、カルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、モノクローナル抗体、インタールケン２（ｉｎｔｅｒｌｕｋｅｎ  ２）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）など）、ＰＧＤＦ受容体アンタゴニスト、ハーセプチン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、カルマスティン、クロラムブシル（ｃｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、シタラビン、ダカルバジン、エトポシド、フルカルバジン（ｆｌｕｃａｒｂａｚｉｎｅ）、フルロウラシル（ｆｌｕｒｏｕｒａｃｉｌ）、ゲムシタビン  （ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア、イホスファミド（ｉｆｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、チオグアニン、チオテパ、トミュデックス（ｔｏｍｕｄｅｘ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、トレオスルファン（ｔｒｅｏｓｕｌｆａｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ミトアジトロン（ｍｉｔｏａｚｉｔｒｏｎｅ）、オキサリプラチン、プロカルバジン、ストレプトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｃｉｎ）、タキソール、タキソテール（ｔａｘｏｔｅｒｅ）、そのような化合物の類似体／同族体および誘導体、並びにここに列記されない他の抗腫瘍薬などが挙げられ得る。
【実施例６】
【０１５５】
インテグリン表出性腫瘍の画像化用６４ＣＵ標識多量体Ｒ−Ｇ−システイン酸ペプチド
この実施例において、下記に示す本発明の６４ＣＵ標識四量体および八量体Ｒ−Ｇ−システイン酸ペプチド（それぞれ化合物４および５）は、画像化および診断の目的（例えば、ＰＥＴ走査のための腫瘍の放射性同位元素標識）のため、並びにαｖβ３インテグリンを発現する腫瘍のようなインテグリンを発現する腫瘍または他の細胞に治療薬を誘導または送達するための放射線治療薬として有用である。
【０１５６】
化合物４：
【０１５７】
【化１５】
0005912082.tif 000024
化合物５：
【０１５８】
【化１６】
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化合物４および５の対応するＲＧＤ類似体の合成および作用機序、生物分散、腫瘍選択性およびＰＥＴに関連する使用は、リ、ゼット．（Ｌｉ，Ｚ．）ら、６４ＣＵ−Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ  ａｎｄ  Ｏｃｔａｍｅｒｉｃ  ＲＧＤ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｓｍａｌｌ−Ａｎｉｍａｌ  ＰＥＴ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  αｖβ３  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．第４８（７）巻、第１１６２−１１７１頁（２００７年）に記載されている通りである。
【０１５９】
本明細書において使用される場合、疾患または疾患の治療または治療法に対するいかなる言及も、疾患または障害が生じる前または検知される前のそれらの予防または予防法、並びに疾患または障害が生じた後または検出された後のそれらの治療を含むと解釈されるものとする。
【０１６０】
本発明は本願において本発明の特定の実施例または実施形態に関して上記に記載してきたが、それらの実施例および実施形態に対して、本発明の意図した趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な追加、削除、変更および変更がなされてもよいことが理解されるはずである。例えば、一実施形態または実施例の任意の要素または特質は、そうすることがその実施形態または実施例をその目的の用途に適さないようにする場合について他に特に規定がない限り、別の実施形態または実施例に組み込まれてもよいし、またはそれらと共に用いられてもよい。また方法または過程の工程が特定の順序で記載または列記されている場合、特に他に規定されていない限り、またはそうすることが前記方法および過程をその意図した目的に対して実行不可能にしない限り、そのような工程の順序は変更されてもよい。適当な追加、削除、変更および変更はすべて、記載された実施例および実施形態の均等物と見なされ、以下の特許請求の範囲内に含まれる。本願において引用された刊行物および特許文献はすべて、これにより、参照によって、すべての目的について、あたかも各々が個々にそのように示されたのと同じ程度に余すところなく援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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