(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーター、および哺乳動物宿主の腸上皮細胞をグルコース応答性インスリン分泌細胞に再プログラミングすることができるシグナルタンパク質またはペプチドをコードするコード配列を含む組換え乳酸桿菌属細菌であって、ここで、
前記プロモーターおよび前記シグナルタンパク質またはペプチドをコードするコード配列が、配列番号１９を含む、
組換え乳酸桿菌属細菌。
【請求項２】
糖尿病を処置するための、請求項１に記載の組換え乳酸桿菌属細菌を含む組成物。
【請求項３】
１型糖尿病、２型糖尿病またはメタボリックシンドロームから選択される疾患を処置するための、請求項１に記載の組換え乳酸桿菌属細菌を含む組成物。
【請求項４】
哺乳動物宿主において腸上皮細胞をグルコース応答性インスリン分泌細胞に分化させるための、請求項１に記載の組換え乳酸桿菌属細菌を含む組成物。
【請求項５】
前記組換え乳酸桿菌属細菌の量が、前記宿主の体重１ｋｇあたり少なくとも約１０４ＣＦＵであるように、前記組成物が投与される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記組換え乳酸桿菌属細菌の量が、１日あたり少なくとも約５ｇ〜約１５ｇまたは１日あたり少なくとも約５０ｍｇ〜約１５０ｍｇであるように、前記組成物が投与される、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記宿主が高血糖性であり、前記組成物を前記高血糖性宿主に投与することにより外因性インスリンを前記宿主に治療的に投与する必要性が低下するか、または排除される、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
２型糖尿病またはメタボリックシンドロームを処置するための組成物であって、前記組成物は、プロモーター、およびシグナルタンパク質またはペプチドをコードするコード配列を含む組換え乳酸桿菌属細菌を含み、ここで、前記シグナルタンパク質またはペプチドは、分泌タグおよびＧＬＰ−１（１〜３７）を含み、前記シグナルタンパク質またはペプチドは、哺乳動物宿主の腸上皮細胞をグルコース応答性インスリン分泌細胞に再プログラミングすることができる、組成物。
【請求項９】
前記組換え乳酸桿菌属細菌が、配列番号１９を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記プロモーターが、ＳｌｐＡプロモーターである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記分泌タグが、ＵＳＰ４５配列およびＬＥＥＩＳＳ配列を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組換え乳酸桿菌属細菌の量が、前記宿主の体重１ｋｇあたり少なくとも約１０４ＣＦＵであるように、前記組成物が投与される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組換え乳酸桿菌属細菌の量が、１日あたり少なくとも約５ｇ〜約１５ｇまたは１日あたり少なくとも約５０ｍｇ〜約１５０ｍｇであるように、前記組成物が投与される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１４】
プロモーター、および哺乳動物宿主の腸上皮細胞をグルコース応答性インスリン分泌細胞に再プログラミングすることができるシグナルタンパク質またはペプチドをコードするコード配列を含む組換え乳酸桿菌属細菌を含む組成物であって、ここで、
前記プロモーターがＳｌｐＡプロモーターであり、前記シグナルタンパク質またはペプチドがＧＬＰ−１（１〜３７）である、
組成物。
【請求項１５】
前記シグナルタンパク質またはペプチドが、分泌タグをさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記分泌タグが、ＵＳＰ４５分泌タグおよびＬＥＥＩＳＳ分泌タグを含む、請求項１５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、同時係属中の２０１０年１０月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／３９３，６１８号、および２０１１年９月２６日に出願された同第６１／５３９，１２１号（これらの各々は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権およびそれらの利益を主張する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
該当せず
１．技術分野
本発明は、概して、内分泌障害、胃腸障害または自己免疫障害を処置するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．発明の背景
真性糖尿病は、高血糖；脂質、炭水化物およびタンパク質の代謝の変更；ならびに血管疾患による合併症の危険度の上昇によって特徴付けられる疾患である。糖尿病は、年齢の上昇および肥満の増加の両方に伴うので、ますます増加している公衆衛生問題である。
【０００４】
２種類の主要な糖尿病がある：１）インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）としても公知であるＩ型、および２）インスリン非依存性（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）またはインスリン非依存性（ｎｏｎ−ｉｎｓｕｌｉｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）糖尿病（ＮＩＤＤＭ）としても公知であるＩＩ型。どちらの種類の真性糖尿病も、循環インスリンの量が不十分であること、および末梢組織のインスリンに対する応答が減少することに起因する。
【０００５】
Ｉ型糖尿病は、体の細胞を「開き」、グルコースの進入を可能にし、細胞に燃料を供給するホルモンであるインスリンを体が産生することができないことに起因する。Ｉ型糖尿病の合併症としては、心疾患および脳卒中；網膜症（眼疾患）；腎疾患（腎症）；ニューロパチー（神経損傷）；ならびに良好な皮膚、足および口の健康の維持が挙げられる。
【０００６】
ＩＩ型糖尿病は、体が十分なインスリンを産生することができないこと、または、体によって自然に産生されるインスリンを細胞が使用することができないことに起因する。体がインスリンを最適に使用することができない状態は、インスリン抵抗性と称されている。ＩＩ型糖尿病は、多くの場合、高血圧を伴い、これが心疾患の一因となり得る。ＩＩ型真性糖尿病の患者では、ストレス、感染症、およびコルチコステロイドなどの）薬物によっても血糖レベルが激しく上昇し得る。脱水を伴い、ＩＩ型糖尿病の患者における激しい血糖の上昇により、血液重量オスモル濃度が上昇し得る（高浸透圧状態）。この状態は昏睡に至る可能性がある。
【０００７】
インスリンは、筋肉および脂肪組織によるグルコースの取り込みおよび代謝を刺激することによって血液中のグルコースの濃度を低減させる。インスリンは、グルコースの、肝臓におけるグリコーゲンとしての貯蔵、および脂肪組織におけるトリグリセリドとしての貯蔵を刺激する。インスリンは、また、筋肉におけるグルコースのエネルギーとしての利用を促進する。したがって、血液中のインスリンレベルが不十分であること、またはインスリンに対する感度の低下により、血液中に過剰に高レベルのグルコースおよびトリグリセリドが生じる。
【０００８】
未治療真性糖尿病の初期の症状は血糖レベルの上昇、および尿中のグルコースの損失に関連づけられる。尿中の多量のグルコースにより、尿量の増加が引き起こされ、脱水に至る可能性がある。脱水により、口渇および水の消費の増加が引き起こされる。グルコースエネルギーを利用することができないことにより、最終的に、食欲は増加するにもかかわらず体重が減少する。一部の未治療糖尿病患者は、疲労、悪心、および嘔吐も訴える。糖尿病の患者では、膀胱、皮膚、および膣の領域の感染症が発生しやすい。血中グルコースレベルのゆらぎにより霧視が導かれ得る。グルコースレベルの極端な上昇により嗜眠および昏睡（糖尿病性昏睡）が導かれ得る。
【０００９】
グルコースレベルが正常と糖尿病の間である人は耐糖能障害（ＩＧＴ）を有する。この状態は、糖尿病前症またはインスリン抵抗性シンドロームとも称される。ＩＧＴの人は糖尿病を有さないが、正常よりは高いが糖尿病と診断されるほどは高くない血中グルコースレベルを有する。彼らの体はますますインスリンを作るが、組織はそれに応答しないので、彼らの体は糖を適正に使用することができない。最近の試験により、ＩＧＴ自体が心疾患発生の危険因子である可能性があることが示された。糖尿病前症の人は正常な血中グルコースを有する人と比較して１．５倍の心臓血管疾患の危険度を有すると推定されている。糖尿病の人は心臓血管疾患の危険度が２〜４倍上昇する。
【００１０】
グルコースおよびトリグリセリドの血中レベルが高いことにより、毛細血管基底膜の肥厚が引き起こされ、その結果、血管腔の進行性の狭小化がもたらされる。血管病変（ｖａｓｃｕｌｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）により、糖尿病性網膜症などの状態が生じ、それにより、失明、冠動脈心疾患（coronary heart disease）、毛細管内糸球体硬化症、ニューロパチー、ならびに四肢の潰瘍および壊疽がもたらされる恐れがある。
【００１１】
グルコースの血漿レベルが過剰であることの毒作用としては、細胞および組織のグリコシル化が挙げられる。グリコシル化産物は組織内に蓄積し、最終的に、架橋したタンパク質を形成する可能性があり、架橋したタンパク質は終末糖化産物と称される。非酵素的グリコシル化が血管マトリックスの拡大および糖尿病の血管合併症に直接関与する可能性がある。例えば、コラーゲンのグリコシル化により、過剰な架橋がもたらされ、その結果、アテローム硬化性血管が生じる。また、グリコシル化されたタンパク質がマクロファージに取り込まれることにより、これらの細胞による炎症促進性サイトカインの分泌が刺激される。サイトカインは、間葉細胞および内皮細胞における、それぞれ分解カスケードおよび増殖カスケードを活性化または誘導する。
【００１２】
ヘモグロビンのグリコシル化により、血糖状態の統合指標を決定するための都合のよい方法がもたらされる。グリコシル化されたタンパク質のレベルは、ある期間にわたるグルコースのレベルを反映し、ヘモグロビンＡ１（ＨｂＡ１ｃ）アッセイと称されるアッセイの基礎になっている。
【００１３】
ＨｂＡ１ｃは、過去１２０日間の血中グルコースレベルの加重平均を反映し、過去３０日間の血漿グルコースがＨｂＡ１ｃアッセイの最終的な結果に約５０％寄与する。Ａ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ、グリコヘモグロビン、または糖化ヘモグロビンとしても公知である）の検査により、ここ数ヶ月にわたって糖尿病がいかによく制御されたかが示される。Ａ１ｃが６％に近いほど、糖尿病がよりよく制御されている。Ａ１ｃ血中グルコースが３０ｍｇ／ｄｌ増加するごとに、Ａ１ｃが１％上昇し、合併症の危険度が増す。
【００１４】
高血糖症の毒作用についての別の説明としてはソルビトールの形成が挙げられる。細胞内のグルコースは、酵素であるアルドース還元酵素により、その対応する糖アルコールであるソルビトールに還元され、ソルビトールの産生の速度は周囲のグルコース濃度によって決定される。したがって、水晶体、網膜、動脈壁および末梢神経のシュワン細胞などの組織は高濃度のソルビトールを有する。
【００１５】
高血糖症はまた、グルコースはミオイノシトールと競合し、その結果、細胞濃度が低下し、したがって、神経の機能の変更およびニューロパチーがもたらされるので、神経組織の機能も害する。
【００１６】
トリグリセリドレベルの上昇も、インスリン欠乏の結果である。トリグリセリドレベルが高いことは、血管疾患にも関連づけられる。
【００１７】
したがって、血中グルコースおよびトリグリセリドレベルを制御することは、望ましい治療的目標である。いくつもの経口抗高血糖作用剤が公知である。膵臓によるインスリンの産出量を増加させる薬物としては、スルホニル尿素系（クロルプロパミド［Ｏｒｉｎａｓｅ（登録商標）］、トルブタミド［Ｔｏｌｉｎａｓｅ（登録商標）］、グリブリド［Ｍｉｃｒｏｎａｓｅ（登録商標）］、グリピジド［Ｇｌｕｃｏｔｒｏｌ（登録商標）］、およびグリメピリド［Ａｍａｒｙｌ（登録商標）］を含む）およびメグリチニド（レパグリニド（ｒｅｐａｒｇｌｉｎｉｄｅ）［Ｐｒａｎｄｉｎ（登録商標）］およびナテグリニド［Ｓｔａｒｌｉｘ（登録商標）］を含む）が挙げられる。肝臓により産生されるグルコースの量を減少させる薬物としては、ビグアナイド系化合物（メトホルミン［Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ（登録商標）］を含む）が挙げられる。インスリンに対する細胞の感度を上昇させる薬物としては、チアゾリジンジオン（ｔｈａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅ）（トログリタゾン［Ｒｅｓｕｌｉｎ（登録商標）］、ピオグリタゾン［Ａｃｔｏｓ（登録商標）］およびロシグリタゾン［Ａｖａｎｄｉａ（登録商標）］を含む）が挙げられる。腸からの炭水化物の吸収を減少させる薬物としては、アルファグルコシダーゼ阻害剤（アカルボース［Ｐｒｅｃｏｓｅ（登録商標）］およびミグリトール［Ｇｌｙｓｅｔ（登録商標）］を含む）が挙げられる。ピオグリタゾンおよびロシグリタゾンは、糖尿病患者のコレステロールパターンを変化させることができる。これらの薬物に対してＨＤＬ（または善玉コレステロール）が増加する。アカルボースは、腸で働き、その作用は、スルホニル尿素系などの他の部位で働く糖尿病薬物に対して相加的である。高血圧症または糖尿病の人において高血圧を制御するため、心不全を処置するため、および腎損傷を予防するために、ＡＣＥ阻害剤を使用することができる。ＡＣＥ阻害剤またはＡＣＥ阻害剤と利尿薬の配合剤、例えば、ヒドロクロロチアジド（ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｏｔｈａｚｉｄｅ）などが販売されている。しかし、これらの治療薬はどれも、多くの副作用を伴い短期治療が提起されるので、理想的ではない。
【００１８】
血圧を制御することにより、心臓血管疾患（例えば、心筋梗塞および脳卒中）をおよそ３３％〜５０％減らすことができ、また、微小血管疾患（眼、腎臓、および神経の疾患）をおよそ３３％減らすことができる。疾病予防管理センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、収縮期血圧が水銀（ｍｍＨｇ）が１０ミリメートル低下するごとに、糖尿病に関連する任意の合併症に対する危険度が１２％低下することを見いだした。コレステロールおよび脂質（例えば、ＨＤＬ、ＬＤＬ、およびトリグリセリド）の制御を改善することにより、心血管系合併症を２０％〜５０％減らすことができる。
【００１９】
健康なヒトでは、総コレステロールは２００ｍｇ／ｄｌ未満であるべきである。高密度リポタンパク質（ＨＤＬまたは「善玉」コレステロール）の標的レベルは、男性では４５ｍｇ／ｄｌ超、女性では５５ｍｇ／ｄｌ超であり、一方、低密度リポタンパク質（ＬＤＬまたは「悪玉」コレステロール）は、１００ｍｇ／ｄｌ未満に維持されるべきである。女性および男性の標的トリグリセリドレベルは１５０ｍｇ／ｄｌ未満である。
【００２０】
糖尿病の患者のおよそ５０％において、糖尿病になって１０年後にある程度の糖尿病性網膜症が発生し、糖尿病患者の８０％が、１５年後に網膜症を有する。
【００２１】
国立糖尿病・消化器・腎疾病研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）（ＮＩＤＤＫ）により行われた試験（ＤＣＣＴ試験）により、血中グルコースレベルをできるだけ正常に近く維持することにより、糖尿病によって引き起こされる眼疾患、腎臓疾患、および神経疾患の発症および進行が遅くなることが示された。
【００２２】
糖尿病予防プログラム（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ）（ＤＰＰ）臨床試験では、２型糖尿病患者が試験された。ＤＰＰ試験では、３年間の試験にわたって、食事および運動により、ＩＧＴの人に糖尿病が発生する可能性が急激に低下することが見いだされた。メトホルミン（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ（登録商標））を投与することによっても、それほど劇的にではないが、危険度が低下した。
【００２３】
ＤＣＣＴ試験により、ＨｂＡ１ｃと平均血中グルコースの間の相関が示された。ＤＰＰ試験により、ＨｂＡ１ｃが有害な転帰の危険度と強く相関することが示された。
【００２４】
米国心臓学会予防会議（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ’ｓ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ）ＶＩ：糖尿病および心臓血管疾患（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ）からの一連の報告では、糖尿病の人の約３分の２が、最終的に心疾患または血管疾患で死亡することが報告された。この試験により、糖尿病に伴う心臓血管疾患の危険度の上昇は、個体の危険因子、例えば、肥満、高コレステロール、および高血圧などを制御することによって軽減することができることも示された。
【００２５】
糖尿病に罹患している人にとっては、心臓血管疾患、網膜症、腎症、およびニューロパチーなどの合併症の危険度を低下させることが重要である。糖尿病患者にとっては、総コレステロールおよびトリグリセリドレベルを低下させて、心血管系合併症を減少させることも重要である。これらの可能性のある合併症の危険度を低下させることは、ＩＧＴに罹患している人（前糖尿病患者）にとっても重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
したがって、血中グルコースレベルを制御することができれば、心臓血管疾患、網膜症、腎症、およびニューロパチーなどの合併症の危険度を低下させること、またはそれらの発症を遅延させることができる。総コレステロールおよびトリグリセリドレベルを低下させることができれば、心血管系合併症を減少させることができる。
【００２７】
セクション２または本出願の任意の他のセクションの任意の参照の引用または同定は、そのような参照が本発明に対する先行技術として利用可能であると容認するものとみなされるべきではない。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
３．発明の概要
組換え細胞が提供される。一実施形態では、組換え細胞は、シグナル配列およびプロモーターを含み、
ａ．シグナル配列は、宿主における標的核酸のシグナル依存性発現を調節し、
ｂ．組換え細胞は腸内細菌または共生細菌に由来し、
ｃ．シグナル配列は、ＧＬＰ−２、その断片、もしくはその類似体、またはそれらの組合せである。
【００２９】
別の実施形態では、組換え細胞は、シグナル配列およびプロモーターを含み、
ａ．シグナル配列は、宿主における標的核酸のシグナル依存性発現を調節し、
ｂ．組換え細胞は腸内細菌または共生細菌に由来し、
ｃ．標的核酸は、宿主の第１の細胞を第２の細胞に再プログラミングすることができる哺乳動物因子をコードする。
【００３０】
別の実施形態では、宿主は哺乳動物である。
【００３１】
別の実施形態では、第２の細胞は、β様細胞、甲状腺細胞、肝細胞または免疫応答性細胞である。
【００３２】
別の実施形態では、宿主の第１の細胞は、腸上皮細胞である。
【００３３】
別の実施形態では、第２の細胞は、グルコース応答性インスリン分泌細胞である。
【００３４】
別の実施形態では、シグナル配列は、環境刺激に応答して標的核酸のシグナル依存性発現を調節する。
【００３５】
別の実施形態では、プロモーターは、グルコース応答性プロモーターである。
【００３６】
別の実施形態では、プロモーターは、当技術分野で公知の任意の誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターであってよい。
【００３７】
別の実施形態では、シグナル配列は、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ、ＰＤＸ−１、１つまたは複数のその断片、その類似体、およびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００３８】
別の実施形態では、シグナル配列は、ＧＬＰ−１、ＰＤＸ−１、ＧＩＰ、ＧＬＰ−２、インスリン、成長ホルモン、プロラクチン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン、血管作動性腸管ポリペプチド、トレフォイルファクター（trefoil factor）、細胞および組織修復因子（cell and tissue repairfactor）、トランスホーミング増殖因子β、ケラチノサイト成長因子；逆平行４αヘリックス束構造をとる構造的第１群サイトカインであるＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＩＦＮ−γ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ、ＧＨ、ＰＲＬ、ＩＦＮα／β；構造的第２群サイトカインであるＴＮＦ−ファミリーサイトカイン、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＦＡＳリガンド、ＩＬ−１−ファミリーサイトカイン、線維芽細胞成長因子、血小板由来増殖因子、トランスホーミング増殖因子ｐ、神経成長因子；短鎖α／β分子を含む構造的第３群サイトカインである上皮成長因子ファミリーサイトカイン、Ｃ−ＣケモカインまたはＣ−Ｘ−Ｃケモカイン、インスリン関連サイトカイン；構造的第４群サイトカインであるヘレグリン（heregulin）、ニューレグリン（neuregulin）、ＥＧＦ、免疫グロブリン様ドメイン、クリングルドメイン（kringle domain）；１つまたは複数のその断片、その類似体、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される。
【００３９】
別の実施形態では、シグナル配列およびプロモーターは組換え細胞内のプラスミドにコードされている。
【００４０】
別の実施形態では、細胞はプロバイオティクス細菌（probiotic bacterium）に由来する。
【００４１】
別の実施形態では、細胞は、エシェリキア属、シュードモナス属、バクテロイデス属、乳酸桿菌属、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属、プロテウス属、ビフィドバクテリウム属、連鎖球菌属、ブドウ球菌属、およびコリネバクテリウム属からなる群より選択される細菌である。
【００４２】
別の実施形態では、標的核酸は、宿主における生理的プロセスの所望の機能を促進することができる、または、宿主における非感染性の疾患を処置することができる哺乳動物因子をコードする。
【００４３】
別の実施形態では、非感染性の疾患は、自己免疫疾患、癌、内分泌疾患、胃腸癌およびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００４４】
別の実施形態では、非感染性の疾患は糖尿病である。
【００４５】
別の実施形態では、糖尿病は１型糖尿病、２型糖尿病またはメタボリックシンドロームである。
【００４６】
別の実施形態では、非感染性の疾患は、クローン病、肥満症、フェニルケトン尿症、カエデシロップ病、ヒスチジン血症、高血糖症、糖尿病性網膜症、冠動脈心疾患、毛細管内糸球体硬化症、腎症、ニューロパチー、四肢の潰瘍または壊疽、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高血圧、高タンパク血症、タンパク尿症、骨粗鬆症、貧血、高リポタンパク血症、ケトアシドーシス、高トリグリセリド血症、乳酸アシドーシス、心筋症、ウィルソン病、白質ジストロフィー、フコース蓄積症、癌、化学療法誘導性下痢、炎症性腸疾患、心室細動および心房細動、術後臓器不全、過敏性腸症候群、間質性膀胱炎／膀胱疼痛症候群（bladder pain syndrome）、短腸症候群、潰瘍性大腸炎、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される。
【００４７】
別の実施形態では、癌は胃腸癌、胃癌、胆嚢癌、消化管間質腫瘍、肝臓癌、膵癌、または結腸癌である。
【００４８】
別の実施形態では、哺乳動物因子は、腸の傷害または外科手術後の生理的プロセスの所望の機能を促進する。
【００４９】
別の実施形態では、組換え細胞は、宿主の体循環内に吸収されることなく腸絨毛に到達することができる。
【００５０】
別の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターである。
【００５１】
別の実施形態では、プロモーターは、ｆｌｉＣプロモーターである。
【００５２】
別の実施形態では、組換え細胞は、分泌タグをさらに含む。
【００５３】
別の実施形態では、分泌タグはｆｌｉＣ分泌タグである。
【００５４】
別の実施形態では、分泌タグはアルファ溶血素（ＨｌｙＡ）分泌タグである
別の実施形態では、組換え細胞は、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）配列をさらに含む。
【００５５】
別の実施形態では、組換え細胞は、シグナル配列を、シグナル配列にコードされるシグナルおよび細胞透過性ペプチド配列にコードされる細胞透過性ペプチドを含む融合タンパク質として発現する。
【００５６】
宿主における糖尿病を処置するための方法も提供され、この方法は、宿主に、シグナル配列およびプロモーターを含む組換え細胞を投与するステップを含み、
ａ．シグナル配列は、宿主における標的核酸のシグナル依存性発現を調節し、
ｂ．組換え細胞は腸内細菌または共生細菌に由来し、
ｃ．標的核酸は、宿主の第１の細胞を第２の細胞に再プログラミングすることができる哺乳動物因子をコードする。
【００５７】
一実施形態では、標的シグナル配列は、疾患予防因子の発現を刺激する、または糖尿病の原因因子の発現を阻害する。
【００５８】
別の実施形態では、糖尿病は、１型糖尿病、２型糖尿病またはメタボリックシンドロームである。
【００５９】
別の実施形態では、シグナル配列は、環境刺激に応答して標的核酸のシグナル依存性発現を調節する。
【００６０】
別の実施形態では、環境刺激はグルコースである。
【００６１】
別の実施形態では、疾患予防因子はインスリンを含む。
【００６２】
別の実施形態では、標的核酸は、宿主における血中グルコースレベルの低下を促進する哺乳動物因子をコードする。
【００６３】
別の実施形態では、標的核酸は、宿主における血中インスリンレベルの上昇を促進する哺乳動物因子をコードする。
【００６４】
哺乳動物宿主において腸の細胞を別の細胞型に分化させるための方法であって、宿主に、シグナル配列およびプロモーターを含む組換え細胞を投与するステップを含み、
ａ．シグナル配列は、宿主における標的核酸のシグナル依存性発現を調節し、
ｂ．組換え細胞は腸内細菌または共生細菌に由来し、
ｃ．標的核酸は、宿主の第１の細胞を第２の細胞に再プログラミングすることができる哺乳動物因子をコードする方法。
【００６５】
別の実施形態では、別の細胞型は、β様細胞、甲状腺細胞、肝細胞または免疫応答性細胞である。
【００６６】
別の実施形態では、β様細胞は、グルコース応答性細胞である。
【００６７】
別の実施形態では、組換え細胞を有効量で投与する。
【００６８】
別の実施形態では、組換え細胞の有効量は少なくとも約１０４ＣＦＵ／ｋｇである。
【００６９】
別の実施形態では、組換え細胞を、相乗効果を有する化合物と組み合わせて投与する。
【００７０】
別の実施形態では、相乗効果を有する化合物は、ＤＰＰ−４阻害剤、ＧＬＰ−２、ＧＬＰ−１アゴニスト、ジメチルスルホキシド、インスリン、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤、プラムリンチド、メグリチニド、レパグリニド、ナテグリニド、クロルプロパミド、メトホルミン、スルホニル尿素、グリピジド、グリブリド、グリメピリド、チアゾリジンジオン、その類似体、その断片、およびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００７１】
別の実施形態では、シグナル配列は、ＧＬＰ−１、ＰＤＸ−１、ＧＩＰ、ＧＬＰ−２、インスリン、成長ホルモン、プロラクチン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン、血管作動性腸管ポリペプチド、トレフォイルファクター、細胞および組織修復因子、トランスホーミング増殖因子β、ケラチノサイト成長因子；逆平行４αヘリックス束構造をとる構造的第１群サイトカインであるＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＩＦＮ−γ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ、ＧＨ、ＰＲＬ、ＩＦＮα／β；構造的第２群サイトカインであるＴＮＦ−ファミリーサイトカイン、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＦＡＳリガンド、ＩＬ−１−ファミリーサイトカイン、線維芽細胞成長因子、血小板由来増殖因子、トランスホーミング増殖因子ｐ、神経成長因子；短鎖α／β分子を含む構造的第３群サイトカインである上皮成長因子ファミリーサイトカイン、Ｃ−ＣケモカインまたはＣ−Ｘ−Ｃケモカイン、インスリン関連サイトカイン；構造的第４群サイトカインであるヘレグリン、ニューレグリン、ＥＧＦ、免疫グロブリン様ドメイン、クリングルドメイン；１つまたは複数のその断片、その類似体、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される。
【００７２】
別の実施形態では、シグナル配列は、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、ＰＤＸ−１、その断片、その類似体、およびそれらの組合せである。
【００７３】
宿主において腸の細胞をグルコース応答性インスリン分泌細胞に再プログラミングするための方法も提供され、この方法は、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ、ＰＤＸ−１、その断片、その類似体、およびそれらの組合せからなる群より選択されるシグナル配列、ならびにプロモーターを含む組換え細胞を投与するステップを含む。
【００７４】
一実施形態では、宿主は高血糖であり、組換え細胞を高血糖宿主に投与することにより、外因性インスリンを宿主に治療的投与する必要性が低下するまたは排除される。
例えば、本願発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
シグナル配列およびプロモーターを含む組換え細胞であって、
ａ．上記シグナル配列が、宿主における標的核酸のシグナル依存性発現を調節し、
ｂ．上記組換え細胞が腸内細菌または共生細菌に由来し、
ｃ．上記シグナル配列が、ＧＬＰ−２、その断片、もしくはその類似体、またはそれらの組合せである、組換え細胞。
（項目２）
シグナル配列およびプロモーターを含む組換え細胞であって、
ａ．上記シグナル配列が、宿主における標的核酸のシグナル依存性発現を調節し、
ｂ．上記組換え細胞が腸内細菌または共生細菌に由来し、
ｃ．上記標的核酸が、上記宿主の第１の細胞を第２の細胞に再プログラミングすることができる哺乳動物因子をコードする、組換え細胞。
（項目３）
上記宿主が哺乳動物である、項目１または２に記載の組換え細胞。
（項目４）
上記第２の細胞がβ様細胞、甲状腺細胞、肝細胞または免疫応答性細胞である、項目２に記載の組換え細胞。
（項目５）
上記宿主の上記第１の細胞が腸上皮細胞である、項目２に記載の組換え細胞。
（項目６）
上記第２の細胞がグルコース応答性インスリン分泌細胞である、項目２に記載の組換え細胞。
（項目７）
上記シグナル配列が、環境刺激に応答して標的核酸のシグナル依存性発現を調節する、項目１または２に記載の組換え細胞。
（項目８）
上記プロモーターがグルコース応答性プロモーターである、項目７に記載の組換え細胞。
（項目９）
上記シグナル配列が、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ、ＰＤＸ−１、１つまたは複数のその断片、その類似体、およびそれらの組合せからなる群より選択される、項目２に記載の組換え細胞。
（項目１０）
上記シグナル配列が、ＧＬＰ−１、ＰＤＸ−１、ＧＩＰ、ＧＬＰ−２、インスリン、成長ホルモン、プロラクチン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン、血管作動性腸管ポリペプチド、トレフォイルファクター、細胞および組織修復因子、トランスホーミング増殖因子β、ケラチノサイト成長因子；逆平行４αヘリックス束構造をとる構造的第１群サイトカインであるＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＩＦＮ−γ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ、ＧＨ、ＰＲＬ、ＩＦＮα／β；構造的第２群サイトカインであるＴＮＦ−ファミリーサイトカイン、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＦＡＳリガンド、ＩＬ−１−ファミリーサイトカイン、線維芽細胞成長因子、血小板由来増殖因子、トランスホーミング増殖因子ｐ、神経成長因子；短鎖α／β分子を含む構造的第３群サイトカインである上皮成長因子ファミリーサイトカイン、Ｃ−ＣケモカインまたはＣ−Ｘ−Ｃケモカイン、インスリン関連サイトカイン；構造的第４群サイトカインであるヘレグリン、ニューレグリン、ＥＧＦ、免疫グロブリン様ドメイン、クリングルドメイン；１つまたは複数のその断片、その類似体、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される、項目２に記載の組換え細胞。
（項目１１）
上記シグナル配列および上記プロモーターが上記組換え細胞内のプラスミドにコードされている、項目１または２に記載の組換え細胞。
（項目１２）
プロバイオティクス細菌に由来する、項目１または２に記載の組換え細胞。
（項目１３）
エシェリキア属、シュードモナス属、バクテロイデス属、乳酸桿菌属、ラクトコッカス属、バチルス属、プロテウス属、ビフィドバクテリウム属、連鎖球菌属、ブドウ球菌属、およびコリネバクテリウム属からなる群より選択される細菌である、項目１または２に記載の組換え細胞。
（項目１４）
上記標的核酸が、上記宿主における生理的プロセスの所望の機能を促進することができる、または上記宿主における非感染性の疾患を処置することができる哺乳動物因子をコードする、項目１または２に記載の組換え細胞。
（項目１５）
上記非感染性の疾患が、自己免疫疾患、癌、内分泌疾患、胃腸疾患、癌およびそれらの組合せからなる群より選択される、項目１４に記載の組換え細胞。
（項目１６）
上記非感染性の疾患が糖尿病である、項目１４に記載の組換え細胞。
（項目１７）
上記糖尿病が１型糖尿病、２型糖尿病またはメタボリックシンドロームである、項目１６に記載の組換え細胞。
（項目１８）
上記非感染性の疾患が、クローン病、肥満症、フェニルケトン尿症、カエデシロップ病、ヒスチジン血症、高血糖症、糖尿病性網膜症、冠動脈心疾患、毛細管内糸球体硬化症、腎症、ニューロパチー、四肢の潰瘍または壊疽、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高血圧、高タンパク血症、タンパク尿症、骨粗鬆症、貧血、高リポタンパク血症、ケトアシドーシス、高トリグリセリド血症、乳酸アシドーシス、心筋症、ウィルソン病、白質ジストロフィー、フコース蓄積症、癌、化学療法誘導性下痢、炎症性腸疾患、心室細動および心房細動、術後臓器不全、過敏性腸症候群、間質性膀胱炎／膀胱疼痛症候群、短腸症候群、潰瘍性大腸炎、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される、項目１４に記載の組換え細胞。
（項目１９）
上記癌が胃腸癌、胃癌、胆嚢癌、消化管間質腫瘍、肝臓癌、膵癌、または結腸癌である、項目１８に記載の組換え細胞。
（項目２０）
上記哺乳動物因子が、腸の傷害または外科手術後の生理的プロセスの所望の機能を促進する、項目１４に記載の組換え細胞。
（項目２１）
上記宿主の体循環内に吸収されることなく腸絨毛に到達することができる、項目２に記載の組換え細胞。
（項目２２）
上記プロモーターが誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターである、項目１または２に記載の組換え細胞。
（項目２３）
上記プロモーターがｆｌｉＣプロモーターである、項目１または２に記載の組換え細胞。
（項目２４）
分泌タグをさらに含む、項目１または２に記載の組換え細胞。
（項目２５）
上記分泌タグがｆｌｉＣ分泌タグである、項目１または２に記載の組換え細胞。
（項目２６）
上記分泌タグがアルファ溶血素（ＨｌｙＡ）分泌タグである、項目１または２に記載の組換え細胞。
（項目２７）
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）配列をさらに含む、項目１に記載の組換え細胞。
（項目２８）
上記シグナル配列を、上記シグナル配列にコードされるシグナルおよび上記細胞透過性ペプチド配列にコードされる細胞透過性ペプチドを含む融合タンパク質として発現する、項目２６に記載の組換え細胞。
（項目２９）
宿主における糖尿病を処置するための方法であって、上記宿主に項目２に記載の組換え細胞を投与するステップを含む、方法。
（項目３０）
標的シグナル配列が、疾患予防因子の発現を刺激する、または糖尿病の原因因子の発現を阻害する、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
上記糖尿病が１型糖尿病、２型糖尿病またはメタボリックシンドロームである、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
上記シグナル配列が、環境刺激に応答して標的核酸のシグナル依存性発現を調節する、項目２９に記載の方法。
（項目３３）
上記環境刺激がグルコースである、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
上記疾患予防因子がインスリンを含む、項目３０に記載の方法。
（項目３５）
上記標的核酸が、上記宿主における血中グルコースレベルの低下を促進する哺乳動物因子をコードする、項目２９に記載の方法。
（項目３６）
上記標的核酸が、上記宿主における血中インスリンレベルの上昇を促進する哺乳動物因子をコードする、項目２９に記載の方法。
（項目３７）
哺乳動物宿主において腸の細胞を別の細胞型に分化させるための方法であって、上記宿主に項目２に記載の組換え細胞を投与するステップを含む、方法。
（項目３８）
上記別の細胞型がβ様細胞、甲状腺細胞、肝細胞または免疫応答性細胞である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
上記β様細胞がグルコース応答性細胞である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
有効量の上記組換え細胞が投与される、項目２９または３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
上記組換え細胞の上記有効量が少なくとも約１０４ＣＦＵ／ｋｇである、項目２９または３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
上記組換え細胞を、相乗効果を有する化合物と組み合わせて投与する、項目２９または３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
上記相乗効果を有する化合物が、ＤＰＰ−４阻害剤、ＧＬＰ−２、ＧＬＰ−１アゴニスト、ジメチルスルホキシド、インスリン、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤、プラムリンチド、メグリチニド、レパグリニド、ナテグリニド、クロルプロパミド、メトホルミン、スルホニル尿素、グリピジド、グリブリド、グリメピリド、チアゾリジンジオン、その類似体、その断片、およびそれらの組合せからなる群より選択される、項目２９または３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
上記シグナル配列が、ＧＬＰ−１、ＰＤＸ−１、ＧＩＰ、ＧＬＰ−２、インスリン、成長ホルモン、プロラクチン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン、血管作動性腸管ポリペプチド、トレフォイルファクター、細胞および組織修復因子、トランスホーミング増殖因子β、ケラチノサイト成長因子；逆平行４αヘリックス束構造をとる構造的第１群サイトカインであるＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＩＦＮ−γ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ、ＧＨ、ＰＲＬ、ＩＦＮα／β；構造的第２群サイトカインであるＴＮＦ−ファミリーサイトカイン、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＦＡＳリガンド、ＩＬ−１−ファミリーサイトカイン、線維芽細胞成長因子、血小板由来増殖因子、トランスホーミング増殖因子ｐ、神経成長因子；短鎖α／β分子を含む構造的第３群サイトカインである上皮成長因子ファミリーサイトカイン、Ｃ−ＣケモカインまたはＣ−Ｘ−Ｃケモカイン、インスリン関連サイトカイン；構造的第４群サイトカインであるヘレグリン、ニューレグリン、ＥＧＦ、免疫グロブリン様ドメイン、クリングルドメイン；１つまたは複数のその断片、その類似体、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される、項目２９または３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
上記シグナル配列がＧＩＰ、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、ＰＤＸ−１、その断片、その類似体、およびそれらの組合せである、項目２９または３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
宿主において腸の細胞をグルコース応答性インスリン分泌細胞に再プログラミングするための方法であって、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ、ＰＤＸ−１、その断片、その類似体、およびそれらの組合せからなる群より選択されるシグナル配列、ならびにプロモーターを含む組換え細胞を投与するステップを含む、方法。
（項目４７）
上記宿主が高血糖性であり、上記組換え細胞を上記高血糖性宿主に投与することにより外因性インスリンを上記宿主に治療的に投与する必要性が低下するか、または排除される、項目４６に記載の方法。
【００７５】
４．図面の簡単な説明
ここで、本発明を、いくつかの図全体を通して同様の参照符号が同様の要素を示す付属図を参照して説明する。いくつかの場合には、本発明の種々の態様は、本発明の理解を容易にするために誇張または拡大して示されていることがあることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、試験のために作製したプラスミドを示す。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α由来のＰ０／Ｐ１プロモーターを試験するために、２種のプラスミドを作製した（ｐＦＤ１およびｐＦＤ２）。ｐＦＤ１は高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の発現を駆動するためのＰ０／Ｐ１領域全体をコードした。ｐＦＤ２は、ＥＧＦＰの上流のプロモーターのＰ０領域のみをコードした。Ｃａｃｏ−２細胞におけるインスリン分泌を刺激するための、組換え細菌からのインスリン分泌性タンパク質の分泌の有効性を試験するために、プラスミドｐＦＤ−ＰＤＸ、ｐＦＤ−ＧＬＰ、およびｐＦＤ−２０を構築した。
【図２】図２は、グルコースに対するＰ０応答およびＰ０／Ｐ１応答を示す。ＥＧＦＰの発現を用いて、異なる培地条件に対するＰ０プロモーターおよび／またはＰ１プロモーターの応答を測定した。Ｐ０＝Ｐ０のみ；Ｐ０＋Ｐ１＝Ｐ０プラスＰ１フランキング領域；ＤＨ５α＝ｌａｃオペロン対照。
【図３】図３は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅによる組換えインスリン分泌性タンパク質の分泌を示す。
【図４】図４Ａは、ＧＬＰ−１（Ｇ）、ＰＤＸ−１−ＣＰＰ（Ｐ）、ＧＬＰ−１とＰＤＸ−１−ＣＰＰの両方（ＧＰ）、もしくは対照プラスミド（「２０」で示される試料）を発現しているＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅの一晩培養物由来の無細胞培地（ＣＦＭ）と一緒に、または合成ＧＬＰ−１（アミノ酸１〜３７；「３７」で示される試料）と一緒にインキュベートし、その後グルコース（「ｇ」）またはグリセロールのいずれかを用いて刺激したＣａｃｏ−２細胞の逆転写ＰＣＲを示す。図４Ｂは、刺激されたＣａｃｏ−２細胞によるインスリン分泌の酵素結合免疫吸着検定法を示す。エラーバーは、少なくとも３回の実験についての１標準偏差を示す。Ｐ値はスチューデントｔ検定（ｎ＝３）による。
【図５】図５は、ｆｌｉＣプロモーターおよび分泌タグを用いてＧＬＰ−１を分泌するように工学的に操作されたＮｉｓｓｌｅからのＧＬＰ−１の分泌と、ｐＫＤ３染色体挿入カセットを伴わない同じ配列を含有するプラスミド担持株からのＧＬＰ−１の分泌の比較を示す。
【図６】図６は、ｆｌｉＣプロモーターおよび分泌タグを用いてＧＬＰ−１を分泌するように工学的に操作されたＮｉｓｓｌｅで処置したマウスと、ｐＫＤ３染色体挿入カセットを伴わない同じ配列を含有するプラスミド担持株からのＧＬＰ−１の分泌の間のグルコースレベルのｉｎ  ｖｉｖｏにおける試験を示す。
【図７】図７は、１型糖尿病のマウスモデルにおける血中グルコースレベルの低下を示す。
【図８】図８Ａ〜Ｂは、インスリンを示す、マウスの腸切片の免疫組織学的検査を示す。ＧＬＰ−１を発現しているＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ１９１７を摂食させた糖尿病マウス（Ａ）およびランダムなペプチドを発現しているＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ１９１７を摂食させた糖尿病マウス（Ｂ）をセクション６．５、実施例５に記載の実験の最後に屠殺した。腸切片をインスリンの存在について染色した（赤色）。Ａでは高濃度のインスリンが矢印で示されている。
【図９】図９Ａ〜Ｅは、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１もしくはＮｉｓｓｌｅのいずれかで処置した後、または処置しなかったマウスについての測定値を示す。β細胞質量を測定した（Ａ）。マウスのランダムなグルコースレベル（Ｂ）および体重（Ｃ）を８０日にわたってモニターした。血中インスリンをグルコース注射した後、３０分ごとに１．５時間にわたって測定し（Ｄ）、血中グルコースをグルコース注射した後、３０分ごとに１．５時間にわたって測定した（Ｅ）。
【図１０−１】図１０Ａ〜Ｆは、マウスの腸におけるインスリン含有細胞のポケットの相対的な発生頻度を示す。マウスの腸の免疫染色により、Ｎｉｓｓｌｅを摂食させたマウスまたは対照マウス（Ｂ）ではなく、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウス（Ａ）においてインスリン含有細胞が明らかになった。細胞を、４種の細胞型のそれぞれの代表的なタンパク質に対する抗体を用いて青色で共染色した：パネート細胞についてはＮＯＤ−２（Ｃ）、杯細胞についてはムチン−２（ＭＵＣ−２）（Ｄ）、吸収細胞についてはスクロースイソマルターゼ（ＳＩ）（Ｅ）、および腸内分泌細胞についてはクロモグラニンＡ（Ｃｈｒ−Ａ）（Ｆ）。４種類の腸の細胞のそれぞれの代表的なタンパク質に対する抗体を用いた共染色により、これらの細胞の系列が腸内分泌細胞に関連することが示唆された。
【図１０−２】図１０Ａ〜Ｆは、マウスの腸におけるインスリン含有細胞のポケットの相対的な発生頻度を示す。マウスの腸の免疫染色により、Ｎｉｓｓｌｅを摂食させたマウスまたは対照マウス（Ｂ）ではなく、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウス（Ａ）においてインスリン含有細胞が明らかになった。細胞を、４種の細胞型のそれぞれの代表的なタンパク質に対する抗体を用いて青色で共染色した：パネート細胞についてはＮＯＤ−２（Ｃ）、杯細胞についてはムチン−２（ＭＵＣ−２）（Ｄ）、吸収細胞についてはスクロースイソマルターゼ（ＳＩ）（Ｅ）、および腸内分泌細胞についてはクロモグラニンＡ（Ｃｈｒ−Ａ）（Ｆ）。４種類の腸の細胞のそれぞれの代表的なタンパク質に対する抗体を用いた共染色により、これらの細胞の系列が腸内分泌細胞に関連することが示唆された。
【図１１】図１１Ａは、同様にＮｉｓｓｌｅを摂食させた健康なマウス（ＳＴＺ処置していない）およびＮｉｓｓｌｅ  ＧＬＰ−１を摂食させた健康なマウス（ＳＴＺ処置していない）の経時的な血中グルコースレベルを示す。図１１Ｂは、同様にＮｉｓｓｌｅを摂食させた健康なマウス（ＳＴＺ処置していない）およびＮｉｓｓｌｅ  ＧＬＰ−１を摂食させた健康なマウス（ＳＴＺ処置していない）の経時的な体重変化を示す。
【図１２】図１２は、Ｎｉｓｓｌｅ、プラスミド由来のＧＬＰ−１を発現しているＮｉｓｓｌｅまたはＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させた系統のマウスの糞便におけるＮｉｓｓｌｅ生存性の測定値を示す。
【図１３】図１３は、ダミープラスミドを伴うＮｉｓｓｌｅ、同じプラスミド由来のＧＬＰ−１（１〜３７）を伴うＮｉｓｓｌｅのいずれかを用いたＮｉｓｓｌｅ処置後、または処置もＳＴＺもなし（対照）のランダムな血中グルコースレベルを示す。
【図１４】図１４は、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスに、Ｎｉｓｓｌｅ、ＧＬＰ−１を染色体性に発現しているＮｉｓｓｌｅ（１〜３７）を１日２回摂食させた後の、または処置しなかったＮＯＤマウスの空腹時血中グルコースレベルを示す。マウスを、血中グルコースを測定する直前の４時間絶食させた。時間は、処置を開始した後の日数を示す。
【図１５】図１５は、組換え細胞の推定作動方法を示す。左：粘膜Ｍの内部および上部の内腔Ｂ内に細菌を伴う正常な腸陰窩。腸内分泌細胞（Ｅ）は固有層（ＬＰ）および脈管構造Ｖ内にホルモンを分泌する。右：本明細書の実施形態の組換え細胞（ＥＢ）は、ＧＬＰ−１（ＥＢから出ている点）を陰窩内に分泌して、初期の腸内分泌細胞をインスリン分泌細胞（ＲＥ）に再プログラミングする。次いで、グルコースに応答してインスリン（Ｉｎｓ、星印）が血流中に分泌される。
【図１６】図１６Ａ〜Ｄは、マウスの腸上部における細菌によって分泌されたＧＬＰ−１を示す。６０日にわたってマウスに１日２回摂食させたＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ１９１７からＧＬＰ−１（１〜３７）が分泌された（Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１）。ａ、マウスの腸上部の切片の免疫蛍光法により、腸粘膜へのＧＬＰ−１の結合が明らかになった。白い矢印は、腸内分泌細胞からのＧＬＰ−１発現を示す。灰色の矢印は、上皮に付着した、細菌によって分泌されたＧＬＰ−１を示す。ｂ、ダミーペプチド（Ｎｉｓｓｌｅ）を発現しているＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ１９１７を摂食させたマウスでは、粘膜のＧＬＰ−１染色は示されなかった。白い矢印は、腸内分泌細胞を示す。ｃ、ＧＬＰ−１結合（％適用範囲（coverage））を画像解析によって数量化した。値は、少なくとも３匹のマウスから取得した画像の平均であり、エラーバーは１標準偏差を示す。ＧＬＰ−１＝Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１；Ｎｉｓｓｌｅ＝ダミーペプチドを発現しているＥｃＮ。ｐ値はスチューデントのｔ検定による（ｎ＝３）。ｄ、マウス全腸からの細菌の総数：腸上部（洗浄していない）、大腸（下部ＧＩ、ＰＢＳで穏やかに洗浄した後）または糞便中の総数のいずれか。＊糞便中の総数は糞便１グラム当たりである。値は、３匹のマウスについての平均であり、エラーバーは１標準偏差を示す。
【図１７】図１７Ａ〜Ｄは、ＳＴＺ処置したマウスにおける１型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）の減少を示す。ａ、マウスの膵臓を試験終了時に回収し、インスリンについて染色したＩＨＣ切片からβ細胞質量を決定した。群当たり３匹のマウスからの画像を解析し、各群について平均のβ細胞質量が示されている。エラーバーは標準偏差を示し、ｐ値はスチューデントのｔ検定による（ｎ＝３）。Ｎｉｓｓｌｅを摂食させたマウス（Ｎｉｓｓｌｅ）、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウス（ＧＬＰ−１）、細菌を摂食させなかったマウス（ＳＴＺ）、ＳＴＺで処置せず、細菌も摂食させていないマウス（対照）を本文に記載の通り処置した。ｂ、マウスの血中グルコースレベルを６０日後に測定した。処置を開始した時点（０日目）および６０日後の平均値が示されている。提示されている値は、少なくとも４匹のマウスの平均である。エラーバーは１標準偏差を示す。ｐ値はスチューデントのｔ検定による（ｎ＝４）。ｃ、ＳＴＺで処置していない健康なマウスに、Ｎｉｓｓｌｅ（Ｎｉｓｓｌｅ）およびＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１（ＧＬＰ−１）を、９２日の期間にわたって、１日２回摂食させた。比較のために、細菌を摂食させなかった対照マウスを同じ期間にわたって用いた（対照）。３つの時点が示されている（０日目、５７日目および９２日目）。ｐ値はスチューデントのｔ検定による（ｎ＝４）。ｄ、β細胞質量のＳＴＺによる枯渇に続いて細菌で処置した６０日後に、マウスを、１０時間絶食させ、次いでグルコースを注射する（体重１ｋｇ当たり２５ｍｇ）耐糖能検査に供した。血中インスリンレベル（上のパネル）および血中グルコースレベル（下のパネル）を３０分ごとに、１．５時間にわたって測定した。
【００７７】
【化１】
0006033780.tif 000002
【図１８】図１８Ａ〜Ｈは、Ｎｉｓｓｌｅを摂食させたマウスおよびＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスにおけるβ細胞および上皮のマーカーを示す。ＳＴＺ処置した（ａ、ｂ、ｅ〜ｆ）、および健康な（ｃ、ｄ）、Ｎｉｓｓｌｅ（ａ、ｃ）またはＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１（ｂ、ｄ、ｅ〜ｆ）を摂食させたマウス由来の腸の切片を、インスリンの存在について緑色で免疫染色し（ａ〜ｈ）、核酸について青色で共染色し（ＤＡＰＩ、ａ〜ｈ）、ＰＤＸ−１（ａ〜ｄ）、ＣｈｒＡ（ｅ、ｆ）、リゾチーム（Ｌｙｓ、ｇ）またはスクロースイソマルターゼ（ＳＩ、ｈ）のいずれかについて赤色で共染色した。画像ｅ〜ｆの右矢印は、インスリンを発現している再プログラミングされた細胞を指す。ｂの左矢印およびｄの全ての矢印は、インスリンを発現している細胞を指す。ｅおよびｆの左矢印および下矢印は、ＣｈｒＡを発現し、インスリンを発現していない細胞を指す。ｇの上矢印はＬｙｓを発現しているパネート細胞を指す。ｈの左矢印および上矢印はＳＩを指す。ｂ、ｅおよびｆの挿入パネルは、インスリン産生細胞が現れる画像内の、インスリン産生細胞の高拡大率の画像である。ａ、ｅおよびｈのスケールバーは２５μｍであり、他の全てのパネルのスケールバーは１００μｍである。Ａ＝自己蛍光。
【図１９】図１９は、工学的に操作された共生細菌からのＧＬＰ−１の分泌を示す。上：染色体への挿入によってＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ１９１７をＧＬＰ−１分泌細胞株に形質転換するために使用したカセットの概略図が示されている。カセットはｆｌｉＣの５’非翻訳領域、その後に６ヒスチジンタグ、エンテロキナーゼ部位（ＥＫ）、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）と融合したＧＬＰ−１（１〜３７）および染色体への挿入のために使用するｐＫＤ３の切片を含んだ。下：ウエスタンブロット法は、染色体を改変したＮｉｓｓｌｅ（染色体）またはプラスミド上にカセットを有するＮｉｓｓｌｅ（プラスミド）のいずれかの、分泌されたＧＬＰ−１の量（Ｍ）または細胞ペレット中のＧＬＰ−１の量（Ｃ）を示す。
【図２０】図２０Ａ〜Ｂは、Ｔ１ＤＭ実験についてのマウスの体重のレベルを示す。ａ、ＳＴＺ処置したマウスの体重を、Ｎｉｓｓｌｅ（Ｎｉｓｓｌｅ）、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１（ＧＬＰ−１）のいずれかを摂食させ、または細菌を摂食させず（ＳＴＺ）、その後６０日目に測定した。対照として、マウスをＳＴＺで処置せず、細菌も摂食させなかった（対照）。処置を開始した時点（０日目）および６０日後の平均値が示されている。提示されている値は、少なくとも４匹のマウスの平均である。エラーバーは１標準偏差を示す。ｂ、雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）に１日２回、ＮｉｓｓｌｅかＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１のいずれかを摂食させた、または細菌を摂食させなかった。示されている通り体重を測定した。値は、５匹のマウスの平均である。エラーバーは標準偏差を示す（ｎ＝５）。
【図２１】図２１は、ＮＯＤマウスの血中グルコースレベルを示す。ＮＯＤマウスに、１日２回、４６日間Ｎｉｓｓｌｅ（Ｎｉｓｓｌｅ）もしくはＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１（ＧＬＰ−１）を摂食させた、または細菌を摂食させなかった（対照）。毎日の摂食開始後１１日目、２１日目、３０日目および４６日目に、空腹時血中グルコースを測定した。値は、明記された日における各群のマウスの平均である。エラーバーは１標準偏差を示す。ｐ値は４６日目のデータ（ｎ＝２）に対するスチューデントのｔ検定による。
【図２２】図２２は、ＮＯＤマウスの体重を示す。ＮＯＤマウスに、１日２回、４６日間、Ｎｉｓｓｌｅ（Ｎｉｓｓｌｅ）もしくはＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１（ＧＬＰ−１）を摂食させた、または細菌を摂食させなかった（対照）。毎日の摂食開始後１１日目、２１日目、３０日目および４６日目にマウスの体重を測定した。値は、明記された日における各群のマウスの平均である。エラーバーは１標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
５．発明の詳細な説明
工学的に操作されたシグナル伝達能力を有する遺伝子操作された微生物（例えば、細菌）が提供される。工学的に操作された微生物（またはそれに由来する組換え細胞）を、疾患または障害を緩和する生体シグナル伝達（ｂｉｏｓｉｇｎａｌｉｎｇ）分子または生体化合物（ｂｉｏｃｏｍｐｏｕｎｄ）を発現させるために使用するための方法。グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１））、ＰＤＸ、ＧＩＦまたはグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２））またはそれらの断片、類似体または組合せを分泌するように工学的に操作された共生細菌株も提供される。そのような工学的に操作された細菌株を用いて高血糖症および／または真性糖尿病（ＤＭ）および他の疾患を緩和するための方法も提供される。
【００７９】
グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、ＰＤＸ、ＧＩＦ、その断片、その類似体、またはそれらの組合せを分泌するように工学的に操作された共生細菌株を用いて、腸の細胞をグルコース応答性インスリン分泌細胞に再プログラミングするための方法がさらに提供される。グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）を分泌するように工学的に操作された共生細菌株を用いて、腸機能を増強するため、傷害、例えば、炎症性エピソード、外科手術などの後に腸の上皮表面を再生させるため、および腸の内層の治癒を促進するための方法も提供される。
【００８０】
開示を明瞭にするために、また、限定する目的ではなく、発明の詳細な説明は下記の小節に分けられる。
【００８１】
５．１．用語法
本組成物および方法を説明する前に、記載されている特定のプロセス、組成物、または方法体系は変動し得るので、本発明は、これらに限定されないことが理解されるべきである。本明細書で使用される用語法は、特定の見解または実施形態を説明するためだけのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことも理解される。別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似した、またはそれと等しい任意の方法および材料を本発明の実施形態の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法、デバイス、および材料がここに記載されている。本明細書で言及されている全ての刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における全てが、本発明が先行発明の理由でそのような開示に先立つ権利が与えられないことを容認するものと解釈されるべきではない。
【００８２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、および「ｔｈｅ（その）」は、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、複数の参照を含むことにも留意しなければならない。したがって、例えば、「組換え細胞」への言及は、１つまたは複数の組換え細胞および当業者に公知のその等価物への言及などである。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、使用されている数字の数値のプラスマイナス１０％を意味する。したがって、約５０％とは、４５％〜５５％の範囲内を意味する。
【００８４】
「投与すること」とは、治療薬と同時に使用される場合、治療薬を標的組織内もしくは標的組織上に直接投与すること、または、治療薬を患者に投与し、それにより、治療薬が標的とする組織に正に影響を与えることを意味する。したがって、本明細書で使用される場合、「投与すること」という用語は、組換え細胞と同時に使用される場合、これに限定されないが、経口投与、組換え細胞を標的組織内または標的組織上にもたらすこと；組換え細胞を患者に、例えば、静脈内注射によって全身的にもたらし、それにより、治療薬を標的組織に到達させること；組換え細胞を、それのコード配列の形態で標的組織にもたらすこと（例えば、いわゆる遺伝子療法の技法によって）を包含し得る。
【００８５】
組成物を「投与すること」は、経口的に、注射、局所投与によって、または、他の公知の技法と組み合わせた任意の方法によって実現することができる。
【００８６】
「動物」または「患者」または「宿主」または「被験体」という用語は、本明細書で使用される場合、これらに限定されないが、ヒトおよび非ヒト脊椎動物、例えば、野生動物、家畜動物および農場動物などを包含する。「動物」または「患者」または「宿主」または「被験体」という用語は、哺乳動物を指すことが好ましく、ヒトを指すことがより好ましい。
【００８７】
「改善する」という用語は、本発明により、本発明が提供される、適用されるまたは投与される組織の外観、形態、特性および／または物理的属性のいずれかが変化することを伝えるために使用される。形態の変化は、以下のいずれかの単独または組合せによって実証することができる：腸上皮細胞のインスリン分泌細胞への変換、治療的シグナルの分泌、標的核酸の発現、または、癌、自己免疫性障害、内分泌障害もしくは心血管障害などの標的障害の症状の緩和、予防もしくは低減。
【００８８】
「阻害すること」という用語は、症状の発症を妨げるため、症状を軽減するため、または疾患、状態もしくは障害を排除するために本発明の組換え細胞を投与することを包含する。
【００８９】
「薬学的に許容される」とは、担体、希釈剤または賦形剤が、製剤の他の成分と適合しなければならず、かつそのレシピエントに対して有害であってはならないことを意味する。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「治療薬」という用語は、患者の望ましくない状態または疾患を処置する、それと闘う、それを緩和する、予防する、または改善するために利用される作用剤を意味する。部分的に、本発明の実施形態は、糖尿病の治療またはインスリン産生の増加、または、癌、自己免疫性障害、内分泌障害もしくは心血管障害の治療を対象とする。
【００９１】
組成物の「治療有効量」または「有効量」は、所望の効果を実現するため、すなわち、癌、自己免疫性障害、内分泌障害、または心血管障害の症状を予防、緩和または低減するために算出された所定量である。本方法により意図される活性は、必要に応じて、医学的な治療的治療および／または予防的治療の両方を含む。治療効果および／または予防効果を得るために本発明に従って投与される組換え細胞の特定の用量は、当然、例えば、投与しようとするコードされるタンパク質、投与経路、および治療されている状態を含めた、その事例を取り巻く特定の状況によって決定される。組換え細胞は、広い投与量の範囲にわたって有効であり得る。しかし、投与される有効量は、治療される状態、投与しようとするコードされるタンパク質の選択、および選択された投与経路を含めた関連する状況を考慮して医師が決定し、したがって、上記の投与量の範囲は、本発明の範囲をいかなる形でも限定するものではないことが理解されよう。本発明の組換え細胞の治療有効量は、一般には、それを生理的に許容できる賦形剤組成物中に入れて投与すると、有効な全身濃度または組織における局部濃度が実現されるのに十分な量である。
【００９２】
本明細書で使用される「処置する」、「治療された」、または「治療している」という用語は、治療的治療および予防的措置または予防措置の両方を指し、その目的は、望ましくない生理的状態、障害もしくは疾患を予防することもしくは遅くする（和らげる）こと、または、有益なもしくは所望の臨床結果を得ることである。「治療」という用語は、本明細書で使用される場合、望ましくない生理的状態、障害または疾患の発症、確立および蔓延を予防することも包含する。本開示の目的に関して、有益なまたは所望の臨床結果としては、これらに限定されないが、症状の軽減；状態、障害または疾患の程度の減弱；状態、障害または疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）；状態、障害または疾患の発症の遅延または進行の減速；状態、障害または疾患の状態の緩和；および検出可能であろうと検出不可能であろうと寛解（部分的であろうと完全であろうと）、または状態、障害もしくは疾患の増強もしくは改善が挙げられる。治療とは、過剰なレベルの副作用を伴わずに臨床的に有意な応答を引き出すことを包含する。治療とは、治療を受けない場合に予測される生存と比較した生存の延長も包含する。
【００９３】
一般的に言うと、「組織」という用語は、特定の機能の実行に一体化された同様に特殊化した細胞の任意の集合体を指す。
【００９４】
５．２．ＧＬＰ−１、ＰＤＸ−１、ＧＩＰおよびＧＬＰ−２
３種のタンパク質、ＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド１）、ＰＤＸ−１（膵臓および十二指腸ホメオボックス遺伝子１）、および胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）は、グルコースに応答して（ＧＩＰおよびＧＬＰ−１）、およびグルコースレベルに関係なく（ＰＤＸ−１）、腸上皮細胞を刺激して、インスリンを合成させることができる。第４のタンパク質であるＧＬＰ−２は、消化（ＧＩ）管においていくつもの作用を有することが当技術分野で公知である。
【００９５】
ＧＬＰ−１
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、プログルカゴン遺伝子の転写産物に由来する。体内のＧＬＰ−１の主要な供給源は、ＧＬＰ−１を消化管ホルモンとして分泌する腸のＬ細胞である。ＧＬＰ−１（１〜３７）は、ＧＬＰ−１の細胞内前駆体であり、プログルカゴンから切断され、その後、Ｎ末端から最初の６アミノ酸が除去されて、生理活性ペプチドを形成する。主要な生物学的活性型のＧＬＰ−１は、ＧＬＰ−１（７〜３７）および優勢な循環活性型のＧＬＰ−１（７〜３６）アミドである。ＧＬＰ−１は、グルコースおよび他の栄養分に応答して、遠位小腸の腸上皮から分泌される。ＧＬＰ−１は非常に短い半減期を有し、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−４）によるその分解が血管において起こり腸粘膜が排出される。ＧＬＰ−１は、膜受容体ＧＬＰ−１Ｒに結合することによって膵臓のβ細胞におけるインスリン合成を活性化し、１型糖尿病および２型糖尿病の両方を処置するための治療薬になる可能性がある。驚いたことに、ＧＬＰ−１を注射した腸上皮細胞はグルコース応答性インスリン分泌細胞になり得、その後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＧＬＰ−１で刺激した上皮細胞を宿主に外科的に埋め込むことにより、宿主における真性糖尿病が逆転し得ることが見いだされた。本明細書に開示されている通り、生物学的に不活性型であるＧＬＰ−１（１〜３７）により、腸の細胞をグルコース応答性インスリン分泌細胞に再プログラミングすることができると考えられている。
【００９６】
ＧＩＰ
ＧＩＰ（グルコース依存性インスリン分泌刺激ペプチドとしても公知である）は、インスリン分泌を誘導し、主に十二指腸におけるグルコースの高浸透圧により刺激され得る。ＧＩＰはまた、脂肪細胞においてリポタンパク質のリパーゼ活性を刺激することにより、脂肪酸代謝に対して有意な効果を有すると考えられている。ＧＩＰは、ＧＩＰ遺伝子にコードされる１５３アミノ酸のプロタンパク質に由来し、生物学的に活性な４２アミノ酸のペプチドとして循環する。ＧＩＰは、消化管の十二指腸および空腸の粘膜において見いだされるＫ細胞により合成される。全ての内分泌ホルモンと同様に、ＧＩＰは血液により輸送される。胃抑制ポリペプチド受容体は膵臓のベータ細胞上に見いだされる７−膜貫通タンパク質である。
【００９７】
ＰＤＸ−１
さらに、転写活性化因子ＰＤＸ−１は、β細胞および腸上皮の両方におけるインスリン分泌を刺激する。サプリメントの腸細菌が「プロバイオティクス」として広範に利用可能であり、一般に、食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）により安全であるとみなされている。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける組換え遺伝子発現のために共生株を用いることの潜在的利点としては、それらが宿主（特に宿主の免疫系）と適合すること、それらが腸において制御可能に持続すること、および、それらを経口的に投薬することができることが挙げられる。動物モデルにおける共生細菌による種々の組換えサイトカインおよび組換え抗原の発現が報告されている。
【００９８】
幹細胞をβ細胞またはインスリン分泌の潜在力を有する細胞に再プログラミングすることは、ここ１０年にわたり、いくつかの試験の対象になってきた。移植するための幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成すること、ならびに膵臓特異的幹細胞または他の組織特異的幹細胞のいずれかを、ｉｎ  ｖｉｖｏでβ細胞に変換させることに焦点があてられてきた。理論に束縛されることを望むものではないが、不活性型のグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１（１〜３７））は、発達中の腸の幹細胞および成人の腸の幹細胞を刺激して、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を通じてグルコース応答性インスリン分泌細胞にさせることができると考えられている。ＧＬＰ−１と一緒にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートし、成体糖尿病ラットに外科的に埋め込んだ発達初期の空腸（Ｅ１４．５）は、ＳＴＺ誘導性１型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）を逆転させることができたが、成体腸細胞の分化（腸陰窩から起こる）では有意な数のインスリン産生細胞が生じず、β様機能性を有する細胞に有意に分化するためには発達中の胎児（Ｅ１７前）の増殖細胞および多列細胞が必要であると思われる。
【００９９】
ＧＬＰ−２
全長のグルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）は、小腸および大腸の腸内の分泌細胞からＧＬＰ−１と一緒に分泌される３３アミノ酸のペプチドである。ＧＬＰ−１と同様に、活性型ＧＬＰ−２（１〜３３）はプロテアーゼＤＰＰＩＶにより切断されて不活性型ＧＬＰ−２（３〜３３）になる。ＧＬＰ−２は、小腸および大腸の粘膜の成長の刺激、腸細胞の抑制および陰窩細胞のアポトーシス、腸細胞のグルコース輸送およびＧＬＵＴ−２発現の刺激、栄養吸収の増加、胃内容排出および胃酸分泌の阻害、腸透過性の低下、腸の血流の刺激、ならびに腸管平滑筋の弛緩を含めた、消化（ＧＩ）管におけるいくつもの作用を有することが当技術分野で公知である（www.glucagon.com、２０１１／１０／３訪問）。ＧＬＰ−２は、ラット星状膠細胞培養物における細胞増殖の刺激を含めた、ＧＩ管の外側での作用も有する（グルカゴン様ペプチド−２は培養されたラット星状膠細胞の増殖を刺激する。EurJ Biochem. ２００３年７月；２７０巻（１４号）：３００１〜９頁；www.glucagon.comに挙げられている、２０１１／１０／３訪問）。げっ歯類またはヒトにおいて、血漿グルコースはＧＬＰ−２投与した後に変化しないが、薬理学的レベルのＧＬＰ−２（正常よりも約１０倍高い）は、正常なヒト宿主における絶食および食後の状態におけるグルカゴンの循環レベルの上昇を伴う（ヒトにおいて、グルカゴン様ペプチド２はグルカゴンの分泌を刺激し、脂質の吸収を増強し、胃酸分泌を阻害する；Gastroenterology.２００６年１月；１３０巻（１号）：４４〜５４頁；www.glucagon.comに挙げられている、２０１１／１０／３訪問））。理論に束縛されることを望むものではないが、ＧＬＰ−２は腸における腸細胞の細胞増殖を刺激すると考えられている。
【０１００】
５．３．組換え細胞
本明細書に記載の実施形態は、概して、内分泌障害、心血管障害または自己免疫障害を直接または間接的に処置するための、単離された、工学的に操作された組換え細胞の使用に関する。
【０１０１】
複数の実施形態が、シグナル配列およびプロモーターを含む組換え細胞を対象とし得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、組換え細胞によって発現させることができ得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、組換え細胞の細胞質からの治療的タンパク質の分泌を引き起こし得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、標的核酸のシグナル依存性発現を調節することができ得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、環境刺激に応答して標的核酸のシグナル依存性発現を調節することができ得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列およびプロモーターは、組換え細胞内のプラスミドにコードされている。いくつかの実施形態では、シグナル配列およびプロモーターは、組換え細胞の核酸にコードされている。
【０１０２】
さらなる実施形態では、シグナル配列は、標的核酸の発現を調節し得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、環境刺激に応答して標的核酸の発現を調節し得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１、ＰＤＸ−１、その断片、その類似体、またはそれらの組合せであってよい。いくつかの実施形態では、標的シグナル配列は、疾患予防因子の発現を刺激すること、または疾患の原因因子の発現を阻害することができ得る。複数の実施形態では、環境刺激はグルコースであり得る。いくつかの実施形態では、疾患予防因子はインスリンを含み得る。いくつかの実施形態では、組換え細胞を投与することにより、健康な被験体における血中インスリンレベルの上昇は引き起こされない。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、シグナル配列は、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）またはその断片もしくは類似体を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ−１は、ＧＬＰ−１（１〜３７）、ＧＬＰ−１（７〜３７）、ＧＬＰ−１（７〜３６）アミドまたはそれらの組合せを含んでよい。ＧＬＰ−１の類似体は当技術分野で公知であり、下に記載されている。上に開示されている通り、ＧＬＰ−１は、プログルカゴン遺伝子の転写産物に由来する。体内のＧＬＰ−１の主要な供給源は、ＧＬＰ−１を消化管ホルモンとして分泌する腸のＬ細胞である。生物学的活性型のＧＬＰ−１は、ＧＬＰ−１−（６〜３７）、ＧＬＰ−１−（７〜３７）およびＧＬＰ−１−（７〜３６）ＮＨ２である。これらのペプチドは、プログルカゴン分子の選択的な切断から生じる。ある特定の実施形態では、長さが４〜７アミノ酸、７〜１０アミノ酸、１０〜１３アミノ酸、１３〜１６アミノ酸、１６〜１９アミノ酸、１９〜２２アミノ酸、２２〜２５アミノ酸、２５〜２８アミノ酸、２８〜３１アミノ酸、３１〜３４アミノ酸または３４〜３７アミノ酸のＧＬＰ−１の断片も使用することができる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、シグナル配列は、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）またはその断片もしくは類似体を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ−２は、ＧＬＰ−２（１〜３３）、ＧＬＰ−２（３〜３３）、または、疾患予防因子の発現を刺激すること、もしくは疾患の原因因子の発現を阻害することができる任意の他の断片もしくは類似体を含み得る。ＧＬＰ−２の類似体は当技術分野で公知であり、下に記載されている。循環中では、ＧＬＰ−２は、２つの分子形態、ＧＬＰ−２（１〜３３）およびＧＬＰ−２（３〜３３）で存在する。ＧＬＰ−１と同様に、活性型ＧＬＰ−２（１〜３３）はプロテアーゼＤＰＰＩＶにより切断されて不活性型ＧＬＰ−２（３〜３３）になる。ＧＬＰ−２は、胃腸機能（消化、吸収、運動性、上皮の成長、および血流）および骨吸収の調節において重要な役割を果たすことが示されている。したがって、ＧＬＰ−２またはその類似体は、クローン病および骨粗鬆症などの疾患を処置するための治療的潜在性を有し得る。ある特定の実施形態では、長さが４〜７アミノ酸、７〜１０アミノ酸、１０〜１３アミノ酸、１３〜１６アミノ酸、１６〜１９アミノ酸、１９〜２２アミノ酸、２２〜２５アミノ酸、２５〜２８アミノ酸、２８〜３１アミノ酸、または３１〜３３アミノ酸であるＧＬＰ−２の断片も使用することができる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、組換え細胞は、任意の形質転換可能な細菌細胞であってよい。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、腸内細菌または共生細菌に由来し得る。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、プロバイオティクス細菌に由来し得る。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、これらに限定されないが、エシェリキア属、シュードモナス属、バクテロイデス属、乳酸桿菌属、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属、プロテウス属、ビフィドバクテリウム属、連鎖球菌属、ブドウ球菌属、およびコリネバクテリウム属を含めた、種々のグラム陽性ファミリーおよびグラム陰性ファミリーから選択される細菌であってよい。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの株であってよい。特定の実施形態では、組換え細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅまたは乳酸桿菌属であってよい。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、標的核酸は、宿主における生理的プロセスの正常な機能を促進する、または宿主における非感染性の疾患の発症、確立、もしくは蔓延の予防において有効である哺乳動物因子をコードしてよい。いくつかの実施形態では、宿主における非感染性の疾患は、自己免疫疾患、内分泌疾患、癌、心臓血管疾患またはそれらの組合せを含んでよい。いくつかの実施形態では、非感染性の疾患は、糖尿病を含んでよい。いくつかの実施形態では、非感染性の疾患は、１型糖尿病を含んでよい。いくつかの実施形態では、非感染性の疾患は、２型糖尿病を含んでよい。
【０１０７】
生理活性化合物を腸上部の管腔（絨毛）側に送達するための方法が提供される。この方法は、腸に定植し、生理活性化合物を分泌する共生細菌をもたらすことを含んでよい。この手法により、外科手術の潜在的な落とし穴または血流内での分解が回避される。
【０１０８】
この方法により、シグナルを連続的にまたは局部刺激に応答して発現させ、その後、血液ではなく腸粘膜を通じて輸送することが可能になる。
【０１０９】
複数の実施形態は、シグナル配列およびプロモーターを含む組換え細胞を対象とし得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、組換え細胞によって発現させることができ得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、組換え細胞の細胞質からの治療的タンパク質の分泌を引き起こし得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、標的核酸のシグナル依存性発現を調節することができ得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、環境刺激に応答して標的核酸のシグナル依存性発現を調節することができ得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列およびプロモーターは、組換え細胞内のプラスミドにコードされている。いくつかの実施形態では、シグナル配列およびプロモーターは、組換え細胞の核酸にコードされている。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、組換え細胞は、任意の形質転換可能な細菌細胞であってよい。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、腸内細菌または共生細菌であってよい。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、プロバイオティクス細菌であってよい。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、エシェリキア属、シュードモナス属、バクテロイデス属、乳酸桿菌属、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属、プロテウス属、ビフィドバクテリウム属、連鎖球菌属、ブドウ球菌属、およびコリネバクテリウム属からなる群より選択される細菌であってよい。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの株であってよい。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅであってよい。いくつかの実施形態では、標的核酸は、宿主における生理的プロセスの正常な機能を促進する、または宿主における非感染性の疾患の発症、確立、もしくは蔓延の予防において有効である哺乳動物因子をコードしてよい。いくつかの実施形態では、宿主における非感染性の疾患は、癌、または自己免疫疾患、内分泌疾患、心臓血管疾患またはそれらの組合せを含んでよい。いくつかの実施形態では、非感染性の疾患は、糖尿病を含んでよい。いくつかの実施形態では、非感染性の疾患は、１型糖尿病を含んでよい。いくつかの実施形態では、非感染性の疾患は、２型糖尿病を含んでよい。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、組換え細胞は、プロモーターおよびシグナル配列を含む。当技術分野で公知の任意の適切なプロモーターを使用することができる。プロモーターは、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターであってよい。特定の実施形態では、プロモーターは、グルコース応答性プロモーターである。
【０１１２】
一実施形態では、シグナル配列は、ＧＬＰ−１またはその断片もしくは類似体を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ−１の類似体は、タスポグルチド、エクセナチド、エキセンディン−４、リラグルチド、アルビグルチド、（Ｖａｌ８）ＧＬＰ−１、ＮＮ９９２４、ＣＪＣ−１１３１、ＡＶＥ０１０、ＬＹ５４８８０６、米国特許第５，５４５，６１８号に記載の類似体などからなる群より選択することができる。
【０１１３】
他の実施形態では、シグナル配列は、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）またはその類似体を含んでよい。ＧＬＰ−２は、小腸および大腸の腸内の分泌細胞からＧＬＰ−１と一緒に分泌される３３アミノ酸のペプチドである。げっ歯類またはヒトにおいて、血漿グルコースはＧＬＰ−２を投与した後に変化しないが、薬理学的レベルのＧＬＰ−２（正常よりも約１０倍高い）は、正常なヒト被験体における絶食および食後の状態におけるグルカゴンの循環レベルの上昇を伴う。ＧＬＰ−２は、小腸および結腸の増殖因子としての役割も果たし得る。シグナル配列がＧＬＰ−２である、本明細書に開示されている方法は、例えば、１型糖尿病および２型糖尿病、肥満に関連する糖尿病、化学療法誘導性下痢；炎症性腸疾患、心室細動および心房細動、術後臓器不全、過敏性腸症候群、間質性膀胱炎／膀胱疼痛症候群、短腸症候群、潰瘍性大腸炎、メタボリックシンドローム、クローン病、骨粗鬆症などの疾患を処置するために用いることができる、またはあらゆる種類の腸の外科手術後の宿主を処置するために用いることができる。
【０１１４】
ＧＬＰ−２の類似体は当技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ−２の類似体は、脊椎動物に天然に存在するＧＬＰ−２および天然に存在する形態のＧＬＰ−２の類似体からなる群より選択することができ、ＧＬＰ−２の類似体は腸栄養（ｉｎｔｅｓｔｉｎｏｔｒｏｐｈｉｃ）作用を引き出し、また、所与の脊椎動物ＧＬＰ−２と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、置換により、またはアミノ酸（複数可）へのブロック基の組み込みにより構造的に変更されている。他のＧＬＰ−２の類似体は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８３４，４２８号；同第５，９９４，５００号に記載されている。
【０１１５】
ＧＬＰ−２の種々の脊椎動物の形態としては、例えば、ウシ（ｏｘ）ＧＬＰ−２を含めたラットＧＬＰ−２およびその相同体、ブタＧＬＰ−２、デグーＧＬＰ−２、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）ＧＬＰ−２、モルモットＧＬＰ−２、ハムスターＧＬＰ−２、ヒトＧＬＰ−２、ニジマスＧＬＰ−２、およびニワトリＧＬＰ−２が挙げられ、その配列は、Buhlら、J. Biol. Chem.、１９８８年、２６３巻（１８号）：８６２１頁、NishiおよびSteiner、Mol.Endocrinol.、１９９０年、４巻：１１９２〜８頁、ならびにIrwinおよびWong、Mol. Endocrinol.、１９９５、９巻（３号）：２６７〜７７頁を含め、多くの著者により報告されている。脊椎動物ＧＬＰ−２の類似体は、全て本明細書において提供される手引きに従って、ペプチド化学の標準の技法を用いて生成することができ、腸栄養活性について評価することができる。本発明の特に好ましい類似体は、以下のヒトＧＬＰ−２の配列に基づくものである：
【０１１６】
【化２】
0006033780.tif 000003
ここで、１つまたは複数のアミノ酸残基は、類似体が依然として脊椎動物における小腸の成長、膵島の成長、および／または陰窩／絨毛の高さの増大などの腸栄養活性を維持する限りは別のアミノ酸残基で保存的に置換される。任意の天然に存在するＧＬＰ−２、好ましくはヒトＧＬＰ−２配列における保存的置換は、以下の５群のいずれかの範囲内の交換と定義される：
I. Ala、Ser、Thr、Pro、Gly
II. Asn、Asp、Glu、Gln
III. His、Arg、Lys
IV. Met、Leu、Ile、Val、Cys
V. Phe、Tyr、Trp。
【０１１７】
任意の脊椎動物ＧＬＰ−２配列におけるアミノ酸の非保存的置換は、非保存的置換が異なる種から単離されたＧＬＰ−２において変動することが公知であるアミノ酸位で起こるのであれば包含される。非保存的な残基の位置は、公知の脊椎動物ＧＬＰ−２配列の全てをアラインメントすることによって容易に決定される（例えば、Buhlら、J. Biol. Chem.、１９８８年、２６３巻（１８号）：８６２１頁、NishiおよびSteiner、Mol. Endocrinol.、１９９０年、４巻：１１９２〜８頁を参照されたい）。哺乳動物において変動するアミノ酸位および非保存的な残基で置換することができるアミノ酸位は、いくつかの実施形態では、１３位、１６位、１９位、２０位、２７位、および２８位であり得る。脊椎動物において変動する追加的なアミノ酸残基および非保存的な残基で置換することもできる追加的なアミノ酸残基は、２位、５位、７位、８位、９位、１０位、１２位、１７位、２１位、２２位、２３位、２４位、２６位、２９位、３０位、３１位、３２位、および３３位に現れる。
【０１１８】
あるいは、非保存的置換は、アラニンスキャニング突然変異誘発により、アミノ酸残基をアラニンで置換することにより全ての腸栄養活性が破壊されないという点で突然変異に対するいくらかの耐容能が示される任意の位置でなされてよい。アラニンスキャニング突然変異誘発の技法は、CunninghamおよびWells、Science、１９８９年、２４４巻：１０８１頁に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。大多数のＧＬＰ−２配列がおよそ３３アミノ酸のみからなる（また、ヒトＧＬＰ−２ではアラニンがすでに４位に現れる）ので、当業者は、残りの位置のそれぞれにおけるアラニン類似体を腸栄養性作用について下記の実施例に教示されている通り容易に試験することができる。
【０１１９】
脊椎動物ＧＬＰ−２の公知の配列をアラインメントすることにより、これらのＧＬＰ−２種の中の有意な配列相同性ならびに種間で変動することが公知である残基を考慮に入れた一般式が構築された。この式を使用して、置換、付加、欠失、またはアミノ酸ブロック基を加えることによる修飾のための特定の好ましい非保存的な残基の選択を手引きすることができる。したがって、本発明に包含される特定の脊椎動物ＧＬＰ−２の類似体は、その態様のうちの１つによると、以下に配列番号２として示される一般式に合致する脊椎動物ＧＬＰ−２の類似体およびＧＬＰ−２の類似体である。
【０１２０】
【化３】
0006033780.tif 000004
ここで、ａａとは、任意のアミノ酸残基を指し、ａａ１〜ａａ６は、異なる種から得たＧＬＰ−２配列の間で変動することが公知である残基の位置であり、
Ｘは、群ＩＩＩから選択される１つまたは２つのアミノ酸、例えば、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＡｒｇ−Ａｒｇなどであり、
Ｙは、群ＩＩＩから選択される１つまたは２つのアミノ酸、例えば、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＡｒｇ−Ａｒｇなどであり、
ｍは、０または１であり、
ｎは、０または１であり、
Ｒ１は、ＨまたはＮ末端ブロック基であり、
Ｒ２は、ＯＨまたはＣ末端ブロック基である。
【０１２１】
本発明の実施形態のいくつかでは、ａａ１〜ａａ６は下で定義される通りである：
ａａ１は、群ＩＶから選択され、
ａａ２は、群ＩまたはＩＩから選択され、
ａａ３は、群Ｉから選択され、
ａａ４は、群ＩＩＩから選択され、
ａａ５は、群ＩＶから選択され、
ａａ６は、群ＩＩまたはＩＩＩから選択される。
【０１２２】
本発明の特に好ましい実施形態では、ａａ１〜ａａ６は、以下の通り、異なる種から単離されたＧＬＰ−２のその位置に現れることが公知である残基の群から選択される：
ａａ１はＩｌｅまたはＶａｌであり、
ａａ２はＡｓｎまたはＳｅｒであり、
ａａ３はＡｌａまたはＴｈｒであり、
ａａ４はＬｙｓまたはＡｒｇであり、
ａａ５はＩｌｅまたはＬｅｕであり、
ａａ６はＧｌｎまたはＨｉｓである。
【０１２３】
ヒトＧＬＰ−２とラットＧＬＰ−２は、１９位のアミノ酸残基のみが互いと異なる。ヒト配列では、この残基はアラニンであり、ラットＧＬＰ−２では、１９位はトレオニンである。したがって、本発明に包含される特定のＧＬＰ−２またはＧＬＰ−２の類似体は、１９位に可変性の残基を含有する。本発明のこれらの実施形態では、ＧＬＰ−２ペプチドは以下に示される配列番号３に合致する：
【０１２４】
【化４】
0006033780.tif 000005
ここで、ａａ３、Ｙ、ｍ、Ｘ、ｎ、Ｒ１およびＲ２は上で定義された通りである。
【０１２５】
他の実施形態では、シグナル配列は、これらに限定されないが、ＧＬＰ−１、ＰＤＸ−１、ＧＩＰ、ＧＬＰ−２、インスリン、成長ホルモン、プロラクチン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン、血管作動性腸管ポリペプチド、トレフォイルファクター、細胞および組織修復因子、トランスホーミング増殖因子β、ケラチノサイト成長因子；逆平行４αヘリックス束構造をとる構造的第１群サイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＩＦＮ−γ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ、ＧＨ、ＰＲＬまたはＩＦＮα／βなど；多くの場合、細胞表面結合性であり、対称のホモ三量体を形成し、サブユニットが特定のウイルスコートタンパク質に関して説明されるβゼリーロールのコンフォメーションをとる構造的第２群サイトカイン、例えば、サイトカインのＴＮＦファミリー、例えば、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＣＤ４０、ＣＤ２７またはＦＡＳリガンド、サイトカインのＩＬ−１ファミリー、線維芽細胞成長因子ファミリー、血小板由来増殖因子、トランスホーミング増殖因子ｐおよび神経成長因子など；大きな膜貫通前駆体分子として産生され、それぞれが細胞外領域に少なくとも１つのＥＧＦドメインを含有する短鎖α／β分子を含む構造的第３群サイトカイン、例えば、サイトカインの上皮成長因子ファミリー、保存されたシステイン残基の周りに群分けされたアミノ酸配列を保有することによって特徴付けられるケモカイン（Ｃ−ＣまたはＣ−Ｘ−Ｃケモカインサブグループ）またはインスリン関連サイトカイン；異なるドメイン、例えば、ＥＧＦ、免疫グロブリン様およびクリングルドメインで構成されるヘレグリンまたはニューレグリンなどのモザイク構造を示す構造的第４群サイトカインを含めた、分泌されたペプチドまたはその類似体、断片もしくは部分を含んでよい。これらの分泌されたペプチドの生物学的に活性な類似体、断片および部分は、当技術分野で公知である。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、組換え細胞は、誘導性プロモーターを含んでよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、グルコース応答性プロモーターであってよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ｆｌｉＣプロモーターであってよい。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、分泌タグをさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、分泌タグは、ｆｌｉＣ分泌タグであってよい。いくつかの実施形態では、分泌タグは、アルファ溶血素（ＨｌｙＡ）分泌タグであってよい。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）配列をさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、シグナル配列を、シグナル配列にコードされるシグナルおよび細胞透過性ペプチド配列にコードされる細胞透過性ペプチドを含む融合タンパク質として発現することができ得る。
【０１２７】
５．４．治療方法
疾患または障害を処置するための方法が提供される。一実施形態では、方法は、疾患予防因子の発現を刺激するため、または疾患の原因因子の発現を阻害するために有効な条件下で細胞を宿主に投与することを含んでよい。いくつかの実施形態では、疾患は、自己免疫疾患、癌、内分泌疾患、代謝疾患、心臓血管疾患またはそれらの組合せであってよい。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、疾患または障害は、糖尿病（これらに限定されないが、１型糖尿病、２型糖尿病および肥満に関連する糖尿病を含む）、肥満症、メタボリックシンドローム、クローン病、フェニルケトン尿症、カエデシロップ病、ヒスチジン血症、高血糖症、糖尿病性網膜症、冠動脈心疾患、毛細管内糸球体硬化症、腎症、ニューロパチー、四肢の潰瘍もしくは壊疽、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高血圧、高タンパク血症、タンパク尿症、骨粗鬆症、貧血、高リポタンパク血症、ケトアシドーシス、高トリグリセリド血症、乳酸アシドーシス、心筋症、ウィルソン病、白質ジストロフィー、フコース蓄積症、ならびに、胃腸癌、胃癌、胆嚢癌、消化管間質腫瘍、肝臓癌、膵癌、結腸癌などの癌、化学療法誘導性下痢；炎症性腸疾患、心室細動および心房細動、術後臓器不全、過敏性腸症候群、間質性膀胱炎／膀胱疼痛症候群、短腸症候群、潰瘍性大腸炎、または骨粗鬆症であってよい（またはそれを含んでよい）。
【０１２９】
本明細書に開示されている方法は、あらゆる種類の腸の外科手術後の宿主を処置するためにも用いることができる。
【０１３０】
本明細書に開示されている方法に従って投与される細胞の有効量（または「治療有効」量）は、当技術分野で公知の方法を用いて決定することができる。有効量は、望ましくない生理的状態もしくは疾患の病期、投与経路および／または当業者に公知の他の因子に左右され得る。例えば、種々の実施形態では、細胞の有効量は、少なくとも約１０４ＣＦＵ／ｋｇ、少なくとも約１０５ＣＦＵ／ｋｇ、少なくとも約１０６ＣＦＵ／ｋｇ、または少なくとも約１０７ＣＦＵ／ｋｇであり得る。他の実施形態では、細胞の有効量は、宿主の体重１ｋｇ当たり約１０４〜１０１４ＣＦＵ、１０９〜１０１２ＣＦＵ、または１０１０〜１０１１ＣＦＵである。別の実施形態では、細胞の有効量は、宿主の体重１ｋｇ当たり約１×１０１０ＣＦＵ、２×１０１０ＣＦＵ、３×１０１０ＣＦＵ、４×１０１０ＣＦＵ、５×１０１０ＣＦＵ、６×１０１０ＣＦＵ、７×１０１０ＣＦＵ、８×１０１０ＣＦＵ、９×１０１０ＣＦＵまたは１０×１０１０ＣＦＵである。
【０１３１】
例えば、一実施形態では、有効量は、以下の通り算出することができる。８×１０１０ＣＦＵ／ｋｇの所望量がおよそ４．０×１０１１ＣＦＵ／ｇ（市販されている通り）のプロバイオティクスサプリメントで投与されると仮定し、ヒトの体重範囲を小児について２５ｋｇ〜成人について７５ｋｇと仮定すると、これは、５〜１５ｇ／ｄの１日用量を意味することになる。しかし、コロニー形成効率が２桁高い場合には（報告されている通り、Rao、S.ら、Toward a live microbial microbicide for HIV: Commensalbacteria secreting an HIV fusion inhibitor peptide；Proc Natl Acad Sci USA １０２巻、１１９９３〜１１９９８頁（２００５年）を参照されたい）、用量は５０〜１５０ｍｇ／ｄになる。他の実施形態では、用量は、１０〜１００ｍｇ／ｄ、１００〜２００ｍｇ／ｄ、２００〜３００ｍｇ／ｄ、３００〜４００ｍｇ／ｄ、４００〜５００ｍｇ／ｄ、５００〜６００ｍｇ／ｄ、６００〜７００ｍｇ／ｄ、７００〜８００ｍｇ／ｄ、８００〜９００ｍｇ／ｄ、９００〜１０００ｍｇ／ｄまたは１０００〜２０００ｍｇ／ｄである。
【０１３２】
腸上皮細胞をグルコース応答性インスリン分泌細胞に再プログラミングするための方法も提供される。一実施形態では、該方法は、プロモーターおよびシグナル配列を含む組換え細胞を投与するステップを含んでよい。複数の実施形態は、プロモーターおよびシグナル配列を含む組換え細胞を投与することによって糖尿病を処置する方法を対象とし得る。さらなる実施形態では、シグナル配列は、標的核酸の発現を調節し得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、環境刺激に応答して標的核酸の発現を調節し得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、ＰＤＸ−１、その断片、その類似体、またはそれらの組合せであってよい。いくつかの実施形態では、標的シグナル配列は、疾患予防因子の発現を刺激すること、または疾患もしくは障害の原因因子の発現を阻害することができ得る。いくつかの実施形態では、環境刺激はグルコースであり得る。いくつかの実施形態では、疾患予防因子は、インスリンを含んでよい。いくつかの実施形態では、組換え細胞を投与することにより、健康な宿主における血中インスリンレベルの上昇は引き起こされない。
【０１３３】
血中グルコースレベルを低下させるための方法も提供される。一実施形態では、該方法は、有効量の組換え細胞を、それを必要とする宿主に投与することを含んでよい。いくつかの実施形態では、該方法により、血中グルコースレベルが低下し、その結果、宿主は血糖正常のレベルを有する。いくつかの実施形態では、該方法により、血中グルコースレベルが、処置の３０日後に、約２０％〜約８０％、約３０〜約７０％、または約４０％〜約６０％低下する。いくつかの実施形態では、宿主が高血糖である場合、組換え細胞を投与することにより、外因性インスリンを宿主に治療的投与する必要性が減少する、または排除される。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、宿主におけるグルコースのレベルに応答する。例えば、いくつかの実施形態では、宿主のグルコースレベルがほんのわずかに上昇している場合、組換え細胞は、グルコースレベルを、血糖正常のレベルに到達するようにだけ低下させ、グルコース欠乏を引き起こさないように働く。
【０１３４】
血中インスリンレベルを上昇させるための方法も提供される。一実施形態では、該方法は、有効量の組換え細胞を、それを必要とする宿主に投与することを含む。いくつかの実施形態では、血中インスリンレベルを上昇させる方法により、宿主が血糖正常のレベルを有するようになる。いくつかの実施形態では、該方法により、グルコースに応答して血中インスリンレベルが上昇する。いくつかの実施形態では、該方法により、処置の３０日後に、血中インスリンレベルが約２０％〜約８０％、約３０〜約７０％、または約４０％〜約６０％上昇する。
【０１３５】
腸の細胞を再プログラミングする（または分化させる）ための方法も提供される。一実施形態では、腸の細胞は、腸上皮細胞、例えば、腸内分泌細胞、パネート細胞、吸収腸細胞または杯細胞である。一実施形態では、該方法は、有効量の組換え細胞を腸の細胞に投与することまたは局在化させることを含む。そのような方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。該方法は、そのような再プログラミングされた、分化した、または前処理された腸の細胞を、それを必要とする宿主または患者に投与することをさらに含んでよい。該方法は、そのような再プログラミングされた、分化した、または前処理された腸の細胞を、それを必要とする宿主または患者に移植することをさらに含んでよい。
【０１３６】
腸上皮細胞を再プログラミングするための方法も提供される。そのような方法は、より伝統的なウイルスに媒介される手法を超えるいくつかの有利な点を有し得る。理論に束縛されることを望むものではないが、ＧＬＰ−１を送達するために共生細菌を使用することによって、例えば、腸粘膜が排出される、脈管構造におけるＧＬＰ−１の酵素による分解が回避され得る。ＧＬＰ−１は、血液に曝露されることなく管腔側面から腸陰窩に直接浸透し得る。腸陰窩では、腸の幹細胞が４種類の腸細胞に発達する。腸細胞の１種類である腸内分泌細胞は、脈管構造内にホルモンを分泌する。理論に束縛されることを望むものではないが、腸内分泌細胞は細菌によって分泌されたＧＬＰ−１の存在下でインスリン分泌性になると考えられる。そのような細菌株を開発して、基本的に体の他の部分では欠けていると思われる機能を交換しながら腸の幹細胞をいくつかの異なる種類の細胞に分化させることができる。例としては、β細胞以外の他の膵臓の機能（例えばα細胞）、さらには、おそらく、甲状腺機能、肝細胞機能または免疫応答性機能が挙げられる。
【０１３７】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている細胞を再プログラミングする方法をｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いて、細胞を再プログラミングし、それらを増殖させることができる。そのような再プログラミングされた細胞は、その後回収し、当技術分野で公知の方法を用いて宿主に投与する（または埋め込む）ことができる。
【０１３８】
５．５．診断方法および使用
いくつかの実施形態では、組換え細胞を別の治療用化合物と組み合わせて投与することができる。特定の実施形態では、組換え細胞を、相乗効果を有する化合物と組み合わせて投与することができる。他の実施形態では、組換え細胞を、ＤＰＰ−４阻害剤、ＧＬＰ−２、ＧＬＰ−１アゴニスト、ジメチルスルホキシド、インスリン、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤、プラムリンチド、メグリチニド、レパグリニド、ナテグリニド、クロルプロパミド、メトホルミン、スルホニル尿素、グリピジド、グリブリド、グリメピリド、チアゾリジンジオン、その断片、その類似体、またはそれらの組合せと併せて投与することができる。ＤＰＰ−４阻害剤の例としては、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチン、デュトグリプチン（ｄｕｔｏｇｌｉｐｔｉｎ）、ジェミグリプチン（ｇｅｍｉｇｌｉｐｔｉｎ）、アログリプチン、ベルベリンなどが挙げられる。
【０１３９】
例えば、一部の態様では、上で定義された組換え細胞、および薬学的に許容される担体もしくは希釈剤を含む医薬組成物、または上で定義された組換え細胞を含む有効量の医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１つまたは複数の安定剤をさらに含んでよい。
【０１４０】
共生細菌を使用する本明細書に開示されている方法の複数の実施形態では、追加的な利点は、ウイルスに媒介される手法には欠けるものである、ほぼ１００年プロバイオティクスとして使用されていることによって確立されたそれらの安全性である。さらに、共生細菌は、必要であれば通常の抗生物質を使用して容易に死滅させることができる。共生細菌を使用することの別の利点は、共生細胞にフィードバックループを装備させ、特異的な管腔シグナル（例えば、グルコースまたはＩＬ−８）に応じてＧＬＰ−１分泌を正確に制御させることが可能になることである。さらに、ＧＬＰ−１を使用することにより腸細胞がグルコース応答性になり、腸細胞に、健康な個体においてβ細胞によって媒介されるインスリン制御とほぼ同様にインスリン用量の制御がもたらされることが示されている。最後に、腸細胞を再プログラミングするための共生細菌の使用により、最終的に、１型糖尿病、２型糖尿病、およびメタボリックシンドロームに対する単純な経口的に投薬される有効な治療薬が導かれる。
【０１４１】
５．６．投与経路および製剤
本発明の組換え細胞は、活性が残る任意の経路によって慣習的な様式で投与することができる。組換え細胞の活性が残る有効な経路は、当技術分野で公知の方法を用いて決定することができる。組換え細胞の投与は、全身性、局所的、または経口的であってよい。例えば、投与は、これらに限定されないが、非経口経路、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、経皮経路、経口経路、頬側経路、もしくは眼経路であってよい、または膣内へのもの、吸入にもの、デポ注射によるもの、もしくは埋め込みによるものであってよい。したがって、本明細書に開示されている組換え細胞（単独で、または他の医薬品と組み合わせてのいずれかで）の投与形式は、これらに限定されないが、舌下投与形式、注射可能な投与形式（皮下または筋肉内に注射する、短時間作用形態、デポ剤形態、埋め込み形態、ビーズ形態、またはペレット形態を含む）、または膣クリーム剤、坐剤、膣坐薬、膣リング、肛門坐薬、子宮内デバイス、ならびにパッチ剤およびクリーム剤などの経皮的な形態を使用することによる投与形式であってよい。
【０１４２】
特定の投与形式は、適応症に左右される。特定の投与経路および用量レジメンの選択は、最適な臨床応答を得るために、臨床医により、臨床医に公知の方法に従って調整または用量設定される。投与される組換え細胞の量は、治療的に有効な量である。投与される投与量は、治療されている宿主の特性、例えば、治療される特定の動物、年齢、体重、健康、もしあれば、併用治療の種類、および治療の頻度に左右され、当業者（例えば、臨床医）が容易に決定することができる。
【０１４３】
組換え細胞および適切な担体を含む医薬製剤は、これらに限定されないが、有効量の組換え細胞を含む、錠剤、カプセル剤、カシェ剤、ペレット剤、丸剤、散剤および顆粒剤を含む固体剤形；これらに限定されないが、溶液、散剤、流体エマルション、流体懸濁剤、半固体、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ゲル剤およびゼリー剤、ならびに泡を含む局所用剤形；ならびにこれらに限定されないが、溶液、懸濁剤、エマルション、および乾燥散剤を含む非経口用剤形であってよい。活性成分は、そのような製剤中に、薬学的に許容される希釈剤、増量剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、界面活性物質、疎水性ビヒクル、水溶性ビヒクル、乳化剤、緩衝液、湿潤剤、保湿剤、可溶化剤、保存料などと一緒に含有されてよいことも当技術分野で公知である。投与するための手段および方法は当技術分野で公知であり、当業者は手引きのために種々の薬理的な参考文献を参照することができ、例えば、Modern Pharmaceutics、Banker & Rhodes、Marcel Dekker, Inc.（１９７９年）；およびGoodman& Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics、第６版、MacMillanPublishing Co.、New York（１９８０年）、およびRemington's: The Science and Practice ofPharmacy、第２１版、Lippincott Williams & Wilkins、Baltimore、MD（２００６年）を見ることができる。
【０１４４】
組換え細胞は、注射によって、例えば、ボーラス注射または連続注入によって非経口投与するために製剤化することができる。組換え細胞は、約１５分〜約２４時間の期間にわたって皮下に連続注入することによって投与することができる。注射用の製剤は、単位剤形で、例えば、アンプル内または複数回用量容器内に、添加した保存料とともに存在してよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、溶液またはエマルションなどの形態をとってよく、製剤化作用剤、例えば、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などを含有してよい。
【０１４５】
経口投与するために、組換え細胞は、それを当技術分野で周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって容易に製剤化することができる。そのような担体により、本発明の組換え細胞を、治療される患者が経口摂取するための錠剤、丸剤、糖剤、カプセル剤、液体、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして製剤化することができる。経口使用するための医薬調製物は、固体賦形剤を添加し、場合によって生じた混合物を粉砕し、所望であれば、錠剤または糖剤のコアを得るために適切な助剤を加えた後、顆粒剤の混合物を加工することによって得ることができる。適切な賦形剤としては、これらに限定されないが、これらに限定されないが、ラクトース、スクロース、マンニトール、およびソルビトールを含めた糖；セルロース調製物、例えば、これらに限定されないが、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、イネデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの増量剤が挙げられる。所望であれば、崩壊剤、例えば、これらに限定されないが、架橋したポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などを添加することができる。
【０１４６】
糖剤のコアに適切なコーティングをもたらすことができる。この目的のために、場合によってアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコール、および／もしくは二酸化チタンを含有し得る濃縮糖溶液、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物を使用することができる。異なる活性組換え細胞用量の組合せを同定するため、または特徴付けるために、錠剤または糖剤のコーティングに染料または色素を添加することができる。
【０１４７】
経口使用することができる医薬調製物としては、これらに限定されないが、ゼラチンで作られた押し込み型（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル剤、ならびに、ゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤で作られた軟らかい密閉されたカプセル剤が挙げられる。押し込み型カプセル剤は、ラクトースなどの増量剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および場合によって安定剤との混和物中に活性成分を含有してよい。軟カプセル剤では、活性組換え細胞は、脂肪性油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解または懸濁されていてよい。さらに、安定剤を添加することができる。経口投与するための製剤は全て、そのような投与に適した投与量であるべきである。
【０１４８】
頬側投与するために、組成物は、例えば、慣習的な様式で製剤化された錠剤またはロゼンジの形態をとってよい。
【０１４９】
一実施形態では、製剤は制御放出製剤である。米国特許第８，００７，７７７号（Borekら、２０１１年８月３０日）には、プロバイオティクスの制御放出製剤の当技術分野で公知の例が開示されている。製剤は、親水化剤（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ａｇｅｎｔ）、電解剤および多糖を含有してよく、腸系に経口的に送達するための一体化した錠剤の形態であってよい。
【０１５０】
特定の実施形態では、組換え細胞を噴霧乾燥し、乾燥した細胞を当技術分野で公知の標準の方法を用いてカプセルに入れる。カプセルに入れる前に細胞を完全に乾燥させることが好ましい。
【０１５１】
他の好ましい投与経路および製剤は、当業者が、手引きのために標準の薬理学的な参考文献を見ることにより決定することができる。例えば、Remington's: The Science and Practice of Pharmacy、第２１版、LippincottWilliams & Wilkins、Baltimore、MD（２００６年）、４５〜４７章には、本明細書に開示されている組換え細胞および方法と使用することができる適切な経口用固体剤形、薬剤形のコーティングならびに持続放出および標的化薬物送達システムが開示されている。
【０１５２】
吸入による投与については、本発明に従って使用するための組換え細胞は、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスを使用して、加圧されたパックまたはネブライザーからエアロゾルスプレープレゼンテーション（ａｅｒｏｓｏｌ  ｓｐｒａｙ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合では、投与単位は、計量された量を送達するための弁をもたらすことによって決定することができる。吸入器または吹き入れ器で使用するための、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、組換え細胞とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤の粉末混合物を含有させて製剤化することができる。
【０１５３】
本発明の組換え細胞は、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの慣習的な坐薬基剤を含有する坐剤または停留浣腸などの直腸用組成物に製剤化することもできる。
【０１５４】
上記の製剤に加えて、組換え細胞は、デポ剤として製剤化することもできる。そのような長時間作用性製剤は、埋め込みによって（例えば、皮下または筋肉内に）、または筋肉内注射によって投与することができる。
【０１５５】
デポ注射は、約１ヶ月〜約６ヶ月またはそれより長い間隔で施すことができる。したがって、例えば、組換え細胞は、適切なポリマー材料もしくは疎水性材料（例えば、許容できる油中エマルションとして）またはイオン交換樹脂と一緒に、あるいはやや難溶の誘導体として、例えば、やや難溶の塩として製剤化することができる。
【０１５６】
経皮投与では、本発明の組換え細胞は、例えば、貼付剤に適用することができる、または結果的に生物体に供給される経皮的治療系によって適用することができる。
【０１５７】
組換え細胞の医薬組成物は、適切な固体担体もしくはゲル相担体または賦形剤も含んでよい。そのような担体または賦形剤の例としては、これらに限らないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリマー、例えばポリエチレングリコールなどが挙げられる。
【０１５８】
組換え細胞は、例えば、アジュバント、プロテアーゼ阻害剤などの他の活性成分、または他の適合する薬物もしくは組換え細胞と組み合わせることが本明細書に記載の方法の所望の効果の実現に望ましいまたは有利であると思われる場合に、そのような組合せで投与することもできる。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、崩壊剤成分は、クロスカルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、クロスポビドン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸カルシウム、イオン交換樹脂、食物酸およびアルカリ性炭酸成分に基づく発泡系、粘土、タルク、デンプン、アルファ化デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、セルロースフロック、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ケイ酸カルシウム、金属炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、またはリン酸カルシウムのうちの１つまたは複数を含む。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、希釈剤成分は、マンニトール、ラクトース、スクロース、マルトデキストリン、ソルビトール、キシリトール、粉末セルロース、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、アルファ化デンプン、リン酸カルシウム、金属炭酸塩、金属酸化物、または金属アルミノケイ酸塩のうちの１つまたは複数を含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、任意選択の潤滑剤成分が存在する場合、それは、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、フマル酸ステアリルナトリウム、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、ベヘン酸グリセリル、鉱油、植物油、パラフィン、ロイシン、シリカ、ケイ酸、タルク、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ポリエトキシル化ヒマシ油、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリアルキレングリコール、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、ポリエトキシル化ステロール、ポリエトキシル化ヒマシ油、ポリエトキシル化植物油、または塩化ナトリウムのうちの１つまたは複数を含む。
【０１６２】
以下の実施例は、限定する目的ではなく、例示する目的で提供される。
【実施例】
【０１６３】
６．実施例
６．１．  実施例１:Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮｉｓｓｌｅにおけるＧＬＰ−１の構成的発現
この実施例により、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮｉｓｓｌｅにおけるＧＬＰ−１の構成的発現が実証される。
【０１６４】
プラスミド構築：クローニングは全て、以前に記載された技法を用いて実施した（Sambrook,J. & Russell. D.W.、Molecular cloning: a laboratory manual. 第３版、Cold SpringHarbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.；２００１年）。図１は、この試験において使用したプラスミドの概略図を提供する。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α由来のＰ０／Ｐ１プロモーターを試験するために、２種のプラスミドを作製した（ｐＦＤ１およびｐＦＤ２）。ｐＦＤ１は高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の発現を駆動するためのＰ０／Ｐ１領域全体をコードした。ｐＦＤ２は、ＥＧＦＰの上流のプロモーターのＰ０領域のみをコードした。Ｃａｃｏ−２細胞におけるインスリン分泌を刺激するための、組換え細菌からのインスリン分泌性タンパク質の分泌の有効性を試験するために、プラスミドｐＦＤ−ＰＤＸ、ｐＦＤ−ＧＬＰ．およびｐＦＤ−２０を本明細書に記載の通り構築した。図２は、グルコースに対するＰ０応答およびＰ０／Ｐ１応答を示す。ＥＧＦＰの発現を用いて、Ｐ０プロモーターおよび／またはＰ１プロモーターの、異なる培地条件に対する応答を測定した。Ｐ０＝Ｐ０のみ；Ｐ０＋Ｐ１＝Ｐ０プラスＰ１フランキング領域；ＤＨ５α＝ｌａｃオペロン対照。グルコースに応答して組換えタンパク質を産生させるためのグルコース応答性プロモーター系の有効性を試験するために、２つの長さのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α由来のグルコース応答性プロモーター領域をｐＧｌｏｗ−ＧＦＰの上流に、ＧＦＰとインフレームにＴＡクローニングした（図２に結果が示されている）。２種の構築物は、ＧＦＰ開始のインフレームかつ上流で、Ｐ０プロモーター、またはＰ０プロモーターとＰ１プロモーターの両方にわたる領域からなった（Ryu,S. & Garges, S.、Promoter Switch in the Escherichia coli Pts Operon. Journalof Biological Chemistry ２６９巻、４７６７〜４７７２頁（１９９４年））。簡単に述べると、Ｐ０領域をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αのゲノムＤＮＡからｐＧＬＯＷ−ＧＦＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にクローニングして（ｐＦＤ２）を作製した。Ｐ０／Ｐ１領域をｐＧＬＯＷ−ＧＦＰにクローニングしてｐＦＤ１を作製した。哺乳動物ＰＤＸ−Ｉ遺伝子をＮｉｓｓｌｅにおいて発現させるために。プラスミドｐＦＤ−ＰＤＸを以下の通り構築した。２ラウンドの高忠実度ＰＣＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて発現カセット６×ＨｉＳ−Ｘｐｒｅｓｓ−ＥＫ−ＰＤＸ−１−ＣＰＰを得た。高忠実度ＰＣＲによってＤＨ５αから全長ＦＬＩＣを得た。これらの２つの断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳにクローニングして６×ＨｉＳ−Ｘｐｒｅｓｓ−ＥＫ−ＰＤＸ−１−ＣＰＰ−ＦＬＩＣを創出した。次に、６×ＨｉＳ−Ｘｐｒｅｓｓ−ＥＫ−ＰＤＸ−１−ＣＰＰ−ＦＬＩＣ断片をｐＧＬＯＷ−Ｐ０−ＧＦＰにクローニングして、Ｅ．ｃｏｌｉのＰ０プロモーターを用いて６×ＨｉＳ−Ｘｐｒｅｓｓ−ＥＫ−ＰＤＸ−１−ＣＰＰ−ＦＬＩＣの発現を駆動するベクター（ｐＦＤ−ＰＤＸ）を創出した。
【０１６５】
タンパク質ＧＬＰ−ＩをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅにおいて構成的に発現させるために、プラスミドｐＦＤ−ＧＬＰを以下の通り構築した。配列６×ＨｉＳ−Ｘｐｒｅｓｓ−ＥＫ−ＧＬＰ−１（１〜３７）を合成により作製した（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）。この断片を高忠実度ＰＣＲによってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳに挿入してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＧＬＰを作製した。高忠実度ＰＣＲを用いて、ｐＫＳ１０４由来の５’ＵＴＲ−ＦＬＩＣ２０配列をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＧＬＰにクローニングしてｐＢｌｕｅｓｃｉｐｔ−２０−ＧＬＰを作製した。得られたベクターは、配列：５’ＵＴＲ−ＦＬＩＣ２０−６×ＨｉＳ−Ｘｐｒｅｓｓ−ＥＫ−ＧＬＰ−１（１〜３７）を含有した。この配列をｐＫＳ１２１（ＦＬＩＣの３’ＵＴＲを含有する）にクローニングして、高忠実度ＰＣＲにより構築物：５’ＵＴＲ−ＦＬＩＣ２０−６×ＨｉＳ−Ｘｐｒｃｓｓ−ＥＫ−ＧＬＰ−１（１〜３７）−３’ＵＴＲを得た。
【０１６６】
ｐＦＤ−２０を得るために、高忠実度ＰＣＲを用いて、ｐＦＤ−ＧＬＰから５’ＵＴＲ−ＦＬＩＣ２０−６×ＨｉＳ−Ｘｐｒｅｓｓ−ＥＫ配列をクローニングした。ＰＣＲ断片をｐＫＳ１２１にクローニングして、構築物：５’ＵＴＲ−ＦＬＩＣ２０−６×ＨｉＳ−Ｘｐｒｅｓｓ−ＥＫを得た。ｐＫＳ１０４およびｐＫＳ１２１は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｌｓｉｎｋｉ、Ｆｉｎｌａｎｄ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｂｅｎｉｔａ  Ｗｅｓｔｅｒｌｕｎｄ−Ｗｉｋｓｔｒｏeｍから得た。しかし、ｐＫＳ１０４およびｐＫＳ１２１の配列は、商業的な供給源から得ること、または従来の方法を用いてゲノムから直接誘導し（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbankからダウンロードされた配列）、当技術分野で公知の標準の方法を用いて構築することもできる。
【０１６７】
６．２．  実施例２：Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅを、ＧＬＰ−１またはＰＤＸ−１−ＣＰＰを分泌するように工学的操作すること
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ１９１７（市販のプロバイオティクス株、以下Ｎｉｓｓｌｅと称される）を、ｆｌｉＣプロモーターの制御下でＧＬＰ−１（アミノ酸１〜３７）またはグルコース応答性エレメントの制御下でＰＤＸ−１−ＣＰＰを分泌するように工学的に操作した。ＰＤＸ−１は、分泌後の上皮への急速な進入を容易にするために、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）との融合物として分泌させた。ＰＤＸ−１は、漏出性発現がほとんど観察されないグルコース応答性プロモーターエレメントの制御下で分泌させた。細胞を６〜８時間成長させ、６００ｎｍにおける光学濃度１に対して正規化し、遠心分離した。Ｎｉｓｓｌｅの上清中およびＮｉｓｓｌｅの細胞ペレット中の分泌タンパク質ＧＬＰ−１（上のブロット）およびＰＤＸ−１−ＣＰＰ（下のブロット）についてのウエスタンブロットが図３に示されている。図３に関して、ペレットを溶解させ、各タンパク質の量を決定した（画分「Ｃ」）。上清を保存し、同様に分析した（画分「Ｍ」）。ＰＤＸ−１−ＣＰＰを発現している細胞について、グルコース（０．４％）またはグリセロール（０．４％）を含有する培地で成長させた細胞間で比較を行った。空のプラスミドを発現している細胞（２０）を陰性対照として使用した。これらのデータから、どちらのタンパク質も分泌されたことが明らかであった。
【０１６８】
６．３．  実施例３：ＧＬＰ−１またはＰＤＸ−１−ＣＰＰを分泌するように工学的に操作されたＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅによるインスリン分泌の誘導
この実施例により、ＧＬＰ−１またはＰＤＸ−１−ＣＰＰを分泌するように工学的に操作されたＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅによるインスリン分泌の誘導が実証される。
【０１６９】
工学的に操作されたＮｉｓｓｌｅ株がヒト上皮細胞におけるインスリン分泌を誘導することができるかどうかを試験するために、Ｃａｃｏ−２細胞を、ＰＤＸ−１−ＣＰＰ、ＧＬＰ−１、または陰性対照として２０アミノ酸配列タグを発現しているＮｉｓｓｌｅ株の一晩培養物由来の無細胞培地（ＣＦＭ）で培養した。一晩培養物を、グルコースを伴わないＦ−１２Ｋ培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）（ＰＤＸ−１を産生するためにグルコースを必要とするＰＤＸ−１株は例外）で成長させた。Ｃａｃｏ−２細胞を、グルコースを伴わない新鮮なＦ−１２Ｋ培地と、ＰＤＸ−１−ＣＰＰ（「Ｐ」）、ＧＬＰ−１（「Ｇ」）、２０アミノ酸配列タグ（「２０」）、またはＰＤＸ−１−ＣＰＰ  ＣＦＭとＧＬＰ−１ＣＦＭの１：１の組合せ（「ＧＰ」）を分泌しているＮｉｓｓｌｅの一晩培養物由来のＣＦＭの１：１混合物中で１６時間培養した後、培地を除去し、Ｃａｃｏ−２細胞をグルコース（０．４％）またはグリセロール（０．４％）のいずれかを伴う培地で２時間培養した。グルコースチャレンジ後、各試料を、インスリン分泌および転写について分析した。陽性対照として、Ｃａｃｏ−２細胞を新鮮なＦ−１２Ｋ培地（グルコースを伴わない）でインキュベートし、同じく１６時間ＧＬＰ−１（アミノ酸１〜３７）を獲得した後、グルコース（０．４％）またはグリセロール（０．４％）と一緒に２時間培養した。
【０１７０】
転写および酵素結合免疫吸着検定法の両方のデータにより、ヒト上皮を、一緒または別々のＧＬＰ−１およびＰＤＸ−１−ＣＰＰ由来のＣＦＭと一緒にインキュベートすると、インスリンを産生するように刺激されたことが示された（図４Ａ〜Ｂ）。ＧＬＰ−１（アミノ酸１〜３７）ＣＦＭとのインキュベーションについて最大量のインスリン産生が一貫して見られた。ＰＤＸ−１−ＣＰＰ  ＣＦＭにより、単独で添加しようとＧＬＰ−１と一緒に添加しようと、グルコース応答性インスリン分泌が刺激された。ＧＬＰ−１−媒介性インスリン分泌とＰＤＸ−１媒介性インスリン分泌の両方がグルコースに応答して起こった。２０アミノ酸配列タグ一晩培養物由来のＣＦＭで培養した陰性対照の上皮ではグルコース応答性インスリン産生は示されなかった（図４Ａ〜Ｂ）。ＰＤＸ−１−ＣＰＰ処置によりＣａｃｏ−２細胞におけるグルコース応答性インスリン分泌がもたらされたこと（図４Ａ〜Ｂ）は予想外であった。
【０１７１】
血液中のインスリンレベルは、１０６ＣＦＵ  ｍＬ〜１０９ＣＦＵ  ｍＬにわたるＮｉｓｓｌｅ生存レベルに対して、それぞれ１６４ｆｍｏｌ／リットル〜１６４ｐｍｏｌ／リットルであることが推定された。成人の非糖尿病患者について食後の血清インスリン濃度が４００ｐｍｏｌリットルまでの高さになり得るとすれば、最適化されていない工学的に操作された細菌は、インスリン放出を少なくとも正常な代謝に必要であるのと同じ桁の範囲内で刺激することができ得る。
【０１７２】
６．４．  実施例４：腸の細胞のグルコース応答性インスリン分泌細胞への再プログラミング
この実施例により、腸の細胞のグルコース応答性インスリン分泌細胞への再プログラミングが実証される。
【０１７３】
Ｎｉｓｓｌｅを、上記の通り、ｆｌｉＣプロモーターおよび分泌タグを使用して、ＧＬＰ−１（１〜３７）を分泌するように工学的に操作した。Ｎｉｓｓｌｅに挿入したカセットが図５に示されている。この株の培養物におけるＧＬＰ−１の分泌を検証し、ｐＫＤ３染色体挿入カセットを伴わず同じ配列を含有するプラスミド担持株からの分泌と比較した（図５）。Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１についての分泌量はプラスミド担持株の分泌量のおよそ半分であり、ｉｎ  ｖｉｖｏで試験することにより、いずれの株で処置したマウスの間でもグルコースレベルには有意差がないことが明らかになった（図６）。したがって、これらの調査の全体を通して、プラスミドにＧＬＰ−１を担持する株の代わりにＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を使用した。Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスではｉｎ  ｖｉｖｏで組換えタンパク質の有意な発現が実証された（ヒスチジンタグ染色によって決定された通り）（図５）。
【０１７４】
ＧＬＰ−１を分泌するように工学的に操作されたヒト共生細菌株を単純に経口投薬することにより、１型糖尿病のマウスモデルにおける高血糖症が、腸の細胞がグルコース応答性インスリン分泌細胞に再プログラミングされることによって緩和されるかどうかを調査するために、ストレプトゾトシン（ストレプトゾシン、Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標））（ＳＴＺ）処置したマウスに、ＧＬＰ−１（１〜３７）を分泌するように工学的に操作された共生細菌（Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１）を毎日摂食させた。耐糖能検査において、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１により、マウスの血中グルコースレベルが有意に低下し、インスリンレベルが有意に増加した。Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させた健康な（非糖尿病）マウスでは血中グルコースレベルまたは体重に変化はなかった。Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１で処置したマウスでは腸上部の絨毛内でインスリン分泌細胞が発生した。クロモグラニンＡ（Ｃｈｒ−Ａ）を用いたインスリン分泌細胞の共免疫染色により、腸内分泌細胞の「β様」細胞への細菌媒介性再プログラミングが示唆されている。これらの結果により、ＧＬＰ−１を分泌するように工学的に操作されたヒト共生細菌株を投与することを含む、１型糖尿病を治療または緩和するための方法を、非常に低い費用で経口的に実行することができることが実証される。
【０１７５】
６．５．  実施例５：ＧＬＰ−１を発現しているＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ１９１７細菌を用いたストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導性糖尿病マウスの治療
この実施例では、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導性糖尿病マウスを、ＧＬＰ−１を発現しているＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ１９１７細菌を用いて処置するための典型的な方法を記載している。
【０１７６】
６〜８週齢の雄のストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導性糖尿病マウス（Ｃ５７Ｂ６）に、細胞透過性ペプチドを有するＧＬＰ−１を発現しているＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ１９１７細菌（ＳＴＺ＋ＧＬＰ）、またはランダムな２０アミノ酸配列を発現しているＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ１９１７細菌（ＳＴＺベクター）のいずれかを摂食させた。「対照」マウスは、ＳＴＺで処置しなかった。図７に関して、「Ｎｉｓｓｌｅ前」の測定値は、ＳＴＺ処置により血中グルコースレベルが有意に上昇した後、ＳＴＺ処置したマウスにＮｉｓｓｌｅ細菌を摂食させる前に取得した。全ての細菌の摂食を３０日後に停止した。細菌の摂食を開始した６０日後に血中グルコースを再度測定した（「６０日」）。値は、４匹のマウスの平均を示す。エラーバーは１標準偏差を示す。ｐ値はスチューデントのｔ検定による（ｎ＝４）。結果は、ＧＬＰ−１分泌細菌を摂食させた糖尿病マウスは処置の３０日後に血糖正常のレベルに戻ったことを示す。驚いたことに、これらのマウスでは、さらに３０日間、いかなる処置もせずに血中グルコースの正常なレベルが維持された。
【０１７７】
これらのマウスの解剖および免疫組織学的検査により、それらの腸組織におけるインスリンのレベルが、ランダムなペプチド配列を分泌する共生細菌のみを摂食させた対照と比較して高かったことが示された（図８Ａ〜Ｂ）。図８Ａに関して、高濃度のインスリンは矢印で示されている。
【０１７８】
６．６．  実施例６：１型糖尿病マウスの、ＧＬＰ−１を発現しているＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ１９１７細菌を用いた治療
この実施例では、１型糖尿病マウスを、ＧＬＰ−１を発現しているＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ１９１７細菌を用いて処置するための典型的な方法を記載している。
【０１７９】
Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１の１型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）に対する効果を決定するために、Ｔ１ＤＭのＳＴＺマウスモデルを作製した。雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）マウスを、高用量のＳＴＺで処置し、高血糖症が発症したら（ランダムなグルコースレベル＞３５０ｍｇ／ｄＬ）、マウスにＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１もしくはＮｉｓｓｌｅのいずれかを摂食させた、または処置しなかった。共生細菌の摂食は、１日２回、およそ８時間の間隔を空けて行った。血糖正常の対照として、マウスの１つの群にはＳＴＺ処置もせず、共生細菌も摂食させなかった（対照）。マウスのランダムなグルコースレベル（図９Ｂ）および体重（図９Ｃ）を８０日にわたってモニターした。β細胞質量を測定した（図９Ａ）。Ｎｉｓｓｌｅ単独の摂食は、ＳＴＺ処置し、共生細菌を与えなかったマウスと比較してランダムな血中グルコースレベルに対する有意な効果を有さなかった（図９Ｂ）。しかし、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスは、摂食を始めてから１６日以内に、有意に低いランダムな血中グルコースレベルを示した。８０日の期間にわたって、試験に含まれたマウスのいずれにおいても体重に有意差はなく、マウスのいずれにおいても有意な体重増加はなかった。
【０１８０】
共生細菌処置した８９日後に、マウスを耐糖能検査に供した。マウスを１０時間絶食させた後、グルコースをｉ．ｐ．注射した。グルコース注射した後、３０分ごとに１．５時間にわたって血中のインスリンレベルおよびグルコースレベルを測定した（それぞれ図９Ｄおよび９Ｅ）。０．５時間および１．５時間の時点で、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスとＳＴＺのみのマウスの間でインスリンレベルの有意差が見られた。いずれの時点でも、Ｎｉｓｓｌｅ  ＧＬＰ−１を摂食させたマウスと処置しなかった対照マウスの間でインスリンレベルに有意差はなかった（図９Ｄ）。実験全体を通して、マウスの４つの群全ての間で血中グルコースレベルに有意差があった。Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスは、耐糖能検査全体を通してＳＴＺのみのマウスの５０％未満の血中グルコースレベルを示したが、ＳＴＺを与えなかった対照マウスの２倍の高さの血中グルコースレベルを有した（図９Ｅ）。興味深いことに、グルコースを注射する前（時間＝０）には、Ｎｉｓｓｌｅ処置したマウスの血中グルコースはＳＴＺ処置したマウスと有意差がなかったが、グルコース注射した１時間後には、Ｎｉｓｓｌｅ処置したマウスは、ＳＴＺ処置したマウスよりもほぼ３３％低い血中グルコースレベルを示した。
【０１８１】
マウスの腸を、インスリンの存在について免疫染色した （図１０Ａ〜Ｆ）。インスリン含有細胞のポケットがＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１で処置したマウスにおいて見いだされたが、この試験に用いた他のマウスのいずれにおいても見いだされなかった。これらのポケットの相対的な発生頻度が示されている（図１０Ａ〜Ｂ）。全体的な上皮細胞集団の百分率として、ポケットは１％未満を構成すると推定される（図１０Ｂ）。予測通り、ＳＴＺはＴ１ＤＭ応答を引き出すことに有効であった。β細胞質量は、ＳＴＺ処置したマウスについて有意に低く（図９Ａ）、またＳＴＺ処置したマウスの血中のグルコースレベルおよびインスリンレベルはＴ１ＤＭと一致した（図９Ｂ、Ｄ、Ｅ）。ＳＴＺ処置したマウス全てについてβ細胞質量が同等に低下したことにより、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスにおける膵臓のβ細胞の再生はインスリンを増加させる、または血中グルコースを低下させる機構ではないことが示された。
【０１８２】
どの種類の腸細胞（パネート細胞、吸収細胞、杯細胞または腸内分泌細胞）が、再プログラミングされてインスリン含有細胞になったかを決定するために、細胞を、４種の細胞型のそれぞれの代表的なタンパク質に対する抗体を用いて青色で共染色した：パネート細胞についてはＮＯＤ−２、杯細胞についてはムチン−２（ＭＵＣ−２）、吸収細胞についてはスクロースイソマルターゼ（ＳＩ）、および腸内分泌細胞についてはクロモグラニンＡ（Ｃｈｒ−Ａ）。ＮＯＤ−２、ＭＵＣ−２、またはＳＩについて重複した染色は見られなかった（それぞれ図１０Ｃ、ＤおよびＥ）。しかし、Ｃｈｒ−Ａについてインスリンと重複した染色が見られた（図１０Ｆ）。マウスの腸の免疫染色により、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスではインスリン含有細胞が示され（図１０Ａ）、Ｎｉｓｓｌｅを摂食させたマウスまたは対照マウスではインスリン含有細胞は示されなかった（図１０Ｂ）。４種類の腸内細胞のそれぞれの代表的なタンパク質に対する抗体を用いた共染色により、これらの細胞の系列が腸内分泌細胞に関連することが示唆された（図１０Ｆ）。この結果により、血液中へのホルモンの分泌は通常、腸内分泌細胞の機能であり、他の３つの細胞型の機能ではないと予測された。
【０１８３】
健康なマウス（ＳＴＺ処置していない）にもＮｉｓｓｌｅおよびＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させ、それらの血中グルコースレベルは、共生細菌を摂食させなかった健康なマウスの血中グルコースレベルと有意に異ならなかった（図１１Ａ〜Ｂ）。結果は、９４日の期間にわたって、処置していない健康なマウス（対照）といずれの処置マウスとの間にもランダムなマウスの血中グルコースレベルに有意な変化はないことを示している（図１１Ａ）。マウスの体重変化にも、この時間にわたって差異はなかった（図１１Ｂ）。Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させた健康なマウス（図１１）について血中グルコースまたは体重に変化がないことを示すデータを、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１により血中グルコースレベルが有意に低下し得ることを示すデータと並べて検討すると、全体像は、糖尿病に対する有効かつ安全な潜在的治療の１つであり、これは、グルコース応答性であり、非糖尿病系と同様のインスリンカイネティクスを伴うものである（図９Ｄ）。すなわち、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスにおけるインスリンレベルの変化は、健康なマウスにおいて起こるインスリンレベルの変化より少ない程度ではあるが、同じタイミングで起こる。
【０１８４】
これらのデータは、糖尿病マウスにＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させることにより、グルコース応答性インスリン産生が引き起こされ、血中グルコースレベルが有意に低下し得ることを示唆している。理論に束縛されることを望むものではないが、インスリン分泌の機構は、再プログラミングされた腸の細胞のポケット由来のものであると思われる。これらのポケットは、インスリンに加えてＣｈｒ−Ａを発現し、これは、これらのポケットが腸内分泌細胞に由来することを示唆している。Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させた健康なマウスからの結果を考慮すると、証拠により、この治療は、たとえ非糖尿病患者が受けたとしても安全であると思われることが示唆される。
【０１８５】
６．７．  実施例７：染色体を改変したＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅと、プラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ  ＮｉｓｓｌｅにおけるＧＬＰ−１の発現
この実施例では、染色体を改変したＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅと、プラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ  ＮｉｓｓｌｅにおけるＧＬＰ−１の発現の比較について記載している。
【０１８６】
ＧＬＰ−１発現を維持するために選択圧力が必要ない細菌を工学的に操作した。株の比較において、染色体を改変したＮｉｓｓｌｅから培地中に分泌されるＧＬＰ−１の相対的な濃度は、プラスミド由来のＧＬＰ−１を発現しているＮｉｓｓｌｅから分泌されるＧＬＰ−１の相対的な濃度よりも低いことが見いだされた。しかし、染色体からＧＬＰ−１を発現しているＮｉｓｓｌｅは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてプラスミド由来のＧＬＰ−１を発現しているＮｉｓｓｌｅと同様に有効であった（図５）。細菌培養物において分泌されたＧＬＰ−１の量とｉｎ  ｖｉｖｏにおける血中グルコースレベルが低下したことの間に相関がないことにはいくつかの理由があり得る。マウスの腸におけるＮｉｓｓｌｅの生存性を測定することにより、Ｎｉｓｓｌｅ、プラスミド由来のＧＬＰ−１を発現しているＮｉｓｓｌｅまたはＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させた株間に差異がないことが明らかになった（図１２）。腸粘膜におけるＧＬＰ−１安定性は、粘膜プロテアーゼにより損なわれ、それによって有効な輸送が分泌速度よりもはるかに低下する可能性がある。マウス消化管内の理想より劣る成長条件（ｐＨ、栄養分など）（Ｎｉｓｓｌｅは、ヒトプロバイオティクスである）により、いずれの株についても最適より劣る遺伝子発現が導かれる場合もあり得た。
【０１８７】
グルコース応答試験におけるインスリン分泌のカイネティクスは、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスおよび対照マウスについて同様であると思われたが（図９Ｄ）、血中グルコースの低下はＳＴＺで処置したマウスの全てにおいて遅延した（図９Ｅ）。しかし、Ｎｉｓｓｌｅを摂食させたマウスは対照マウスと同一のカイネティクスを示した。この結果は予想外であり、別の機構によって説明できる可能性がある。Ｎｉｓｓｌｅを摂食させたマウスについて、ＳＴＺのみのマウスと比較して、グルコース応答試験において血中グルコースがより急速に低下したことも予想外であった（図９Ｅ）。これは、Ｎｉｓｓｌｅ単独によるある程度の保護を示す。この保護はランダムなグルコースレベルでは現れなかったが、これは、血中グルコースのスパイクの影響を弱めると思われる。グルコースをｉ．ｐ．注射すると見られるように、腸のグルコースの細菌による消費は可能性のある機構として除外することができる。
【０１８８】
６．８．  実施例８：血中グルコースレベルに対するＮｉｓｓｌｅの摂食の効果
この実施例により、マウスにおける、血中グルコースレベルに対するＮｉｓｓｌｅの摂食の効果が実証される。
【０１８９】
実験の開始時に、マウスにＳＴＺを５日間摂食させた（体重１ｋｇ当たり４０ｍｇ）（ＳＴＺ処置は「ＳＴＺ停止」で終了する）。３００ｍｇ／ｄＬを超えるランダムな血中グルコースレベルが持続し始めた後、マウスに、ダミープラスミドを発現しているＮｉｓｓｌｅ単独で（ＳＴＺ＋ベクター）、同じプラスミド由来のＧＬＰ−１（１〜３７）を発現しているＮｉｓｓｌｅ（ＳＴＺ＋ＧＬＰ）のいずれかを含めたＮｉｓｓｌｅ処置を開始した、またはＳＴＺなしで処置もしなかった（対照）。タイムラインにおいて摂食は「Ｎｉｓｓｌｅ開始」で示されている。Ｎｉｓｓｌｅを、「Ｎｉｓｓｌｅ停止」で示されている時間まで１日２回摂食させた。マウスは、基本的に、この時点で、「Ｎｉｓｓｌｅ１回」で示されている時間まで放置した（通常の世話外）。その時点で血中グルコースを測定し、Ｎｉｓｓｌｅをマウスに１回摂食させた。次いで、マウスを最後の時点まで放置し、そこで血中グルコースを測定した。図１３を参照されたい。平均が提示されており（ｎ＝３）、エラーバーは１標準偏差を示す。
【０１９０】
非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスにＮｉｓｓｌｅ単独で、ＧＬＰ−１（１〜３７）を染色体性に発現しているＮｉｓｓｌｅのいずれかを１日２回摂食させた、または処置しなかった。マウスを、血中グルコースを測定する直前の４時間絶食させた。図１４に関して、時間は、処置を開始した後の日数を示す。平均が提示されており（ｎ＝少なくとも３）、エラーバーは１標準偏差を示す。ｐ値はスチューデントのｔ検定による。
【０１９１】
図１５は、組換え細胞の推定作動方法を示す。左：粘膜Ｍの内部および上部の内腔Ｂ内に細菌を伴う正常な腸陰窩である。腸内分泌細胞（Ｅ）は固有層（ＬＰ）および脈管構造Ｖ内にホルモンを分泌する。右：本明細書の実施形態の組換え細胞（ＥＢ）は、ＧＬＰ−１（ＥＢから出ている点）を陰窩内に分泌して、初期の腸内分泌細胞をインスリン分泌細胞（ＲＥ）に再プログラミングする。次いで、グルコースに応答してインスリン（Ｉｎｓ、星印）が血流中に分泌される。
【０１９２】
理論に束縛されることを望むものではないが、組換え共生株を単純な経口投薬で、有意なバックグラウンド発現はなく、グルコース応答性を伴い使用することにより、インスリン注射の必要性を有意に低下させること、または、排除することさえでき、その使用が、宿主インスリン合成の交換により、糖尿病患者によって示される長期合併症の減少に役立ち得ると考えられている。
【０１９３】
６．９．  実施例９：ＧＬＰ−１試験のための元の構築物および新しい構築物の配列
本明細書に開示されている方法に従って以下の構築物を使用することができる。
【０１９４】
実施例１〜１１において使用した元のＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１構築物
【０１９５】
【化５】
0006033780.tif 000006
ここで、
【０１９６】
【化６】
0006033780.tif 000007
使用することができる別のプロモーターＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１構築物
【０１９７】
【化７】
0006033780.tif 000008
ここで、
【０１９８】
【化８】
0006033780.tif 000009
乳酸桿菌属構築物
【０１９９】
【化９】
0006033780.tif 000010
ここで、
【０２００】
【化１０】
0006033780.tif 000011
６．１０．  実施例１０：糖尿病マウスにおいて、共生細菌により分泌されるＧＬＰ−１により腸の細胞が再プログラミングされて、高血糖症が減少する
細菌によって分泌されたＧＬＰ−１を糖尿病マウスに、腸に摂食させることより、グルコース応答性インスリン産生が引き起こされ、血中グルコースレベルが有意に低下し得る。インスリン分泌の機構は、再プログラミングされた腸の細胞によるものであると思われる。これらの細胞は、ＰＤＸ−１をほとんど発現せず、ほんの一部のみがインスリンに加えてＣｈｒＡを発現するという点で大多数の膵臓のβ細胞とは別個のものである。
【０２０１】
導入
グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）は、マウスの腸上皮細胞のインスリン分泌細胞への変換を刺激する。本発明者らは、ＧＬＰ−１を分泌するように工学的に操作されたヒト共生細菌株を単純に経口投薬することにより、腸の細胞がグルコース応答性インスリン分泌細胞に再プログラミングされることによって１型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）のマウスモデルにおける高血糖症が緩和され得るかを調査した。糖尿病マウスに、ＧＬＰ−１を分泌するように工学的に操作された共生細菌（Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１）を毎日摂食させた。Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスは、インスリンレベルの有意な増加を示し、また耐糖能が有意に大きかった。これらのマウスでは、腸上部に、健康なマウスに見いだされる膵臓のβ細胞のおよそ８２％が置き換わるために十分な数のインスリン産生細胞が発生した。驚いたことに、ＰＤＸ−１の発現は、再プログラミングされた細胞において、上皮周囲よりも定性的に低かった。さらに、再プログラミングされた細胞のサブセットをクロモグラニンＡ（ＣｈｒＡ、腸内分泌およびβ細胞に対するマーカー）について共染色した。健康な（非糖尿病の）Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスは同様に再プログラミングされた細胞を示したが、処置した後９０日間を超えてさえ、血中グルコースレベルの変化はなく、体重は増加し、それは対照マウスと区別できないものであった。これらの結果は、Ｔ１ＤＭに対する潜在的な経口的治療を指し、腸内細胞の運命を媒介するための細菌のシグナル伝達の概念を導入する。
【０２０２】
非β細胞をβ細胞またはインスリン分泌の潜在力を有する細胞に再プログラミングすることは、ここ１０年にわたり、いくつかの試験の対象になってきた。研究は、移植するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで膵臓細胞系列（腺房細胞など）および肝臓細胞系列からβ細胞を生成すること、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏで膵臓特異的細胞または他の組織特異的細胞のβ細胞への変換を引き起こすことを含めたいくつもの領域に焦点を合わせている。以前は不活性であると考えられていたグルカゴン様ペプチド１の形態（ＧＬＰ−１（１〜３７））が、ラット腸上皮細胞を刺激して、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を通じてグルコース応答性インスリン分泌細胞にさせ得るという発見（Suzuki, A.、Nakauchi, H. & Taniguchi, H.、Glucagon-like peptide 1(1-37) converts intestinal epithelial cells into insulin-producing cells. ProcNatl Acad Sci USA １００巻、５０３４〜５０３９頁（２００３年））により、この後者の手法の潜在性が実証された。Ｓｕｚｕｋｉは、胎生期１０．５日（Ｅ１０．５）に、母親にＧＬＰ−１を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した発達中のラット胚の腸上部にいくつかのインスリン産生細胞が示されることを報告した。成体ラット（１０週間）は、ＧＬＰ−１を毎日、９日間注射すると、いくつかの（ずっと少ないが）腸インスリン産生細胞を有した。これにより、未分化の腸上皮（ラットにおける分化はＥ１５後に起こる）を有するラットは、腸の細胞を「β様」細胞に分化させることができることが示唆された。この試験により、発達初期の空腸（Ｅ１４．５）を、ＧＬＰ−１と一緒にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートし、成体糖尿病ラットに外科的に埋め込むことにより、ＳＴＺ誘導性Ｔ１ＤＭを逆転させることができることも実証された。著者らは、成体腸細胞分化（腸陰窩から起こる）では有意な数のインスリン産生細胞が生じないこと、ならびにβ様機能性を有する細胞に有意に分化するためには発達中の胎児（Ｅ１７前）の増殖細胞および多列細胞が必要になる可能性が高いことを結論づけた。
【０２０３】
Ｓｕｚｕｋｉの研究により、腸の細胞の再プログラミングを媒介し得る生理活性化合物を、外科手術をせずに送達することの難しさが実証された。ＧＬＰ−１自体の血液中の半減期はたった数分である。この短い半減期が、ＧＬＰ−１が腸陰窩に到達するために循環中に長く生存しなければならない成体ラットにおいて再プログラミング速度が低いことの理由になってきた。外科手術の潜在的な落とし穴または血流内での分解を回避する、生理活性化合物を腸上部の管腔（絨毛）側に送達する１つの方法は、腸に定植している共生細菌からシグナルを分泌させることである。この手法により、シグナルを連続的にまたは局部刺激に応答して発現させ、その後、血液ではなく腸粘膜を通じて輸送することが可能になる。
【０２０４】
工学的に操作された共生細菌により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＧＬＰ−１（１〜３７）をヒトの腸の細胞に送達し、グルコース応答性インスリン分泌を刺激することができる（Duan, F.、Curtis, K. L. & March, J. C.、Secretion ofinsulinotropic proteins by commensal bacteria: rewiring the gut to treatdiabetes. Appl Environ Microbiol ７４巻、７４３７〜７４３８頁（２００８年））。その研究では、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ１９１７（ＥｃＮ）を、外因性誘導因子に応答してプラスミドからＧＬＰ−１（１〜３７）を分泌するように形質転換した。この調査では、ＥｃＮ染色体を、ＧＬＰ−１（１〜３７）を構成的に分泌するように改変することにより（Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１）、Ｔ１ＤＭのマウスモデルにおいて正常血糖が回復するかどうかを試験した。本発明者らの目的は、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を毎日摂食させることによってマウスの腸の細胞をグルコース応答性インスリン分泌細胞に再プログラミングすることであった。本発明者らは、β細胞および腸内分泌マーカーの同時発現も測定して、再プログラミングの程度ならびに再プログラミングされた細胞の系列を決定した。
【０２０５】
ＥｃＮを、ｆｌｉＣプロモーター、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）および分泌タグを用いて、ＧＬＰ−１（１〜３７）を分泌するように工学的に操作した（図１９の上）。この株の培養物におけるＧＬＰ−１の分泌を検証し、ｐＫＤ３染色体挿入カセットを伴わず同じ配列を含有するプラスミド担持株からの分泌と比較した（図１９の下）。Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１についての分泌量は、プラスミド担持株の分泌量のおよそ５０％であった。したがって、生じた差異は有意とみなされず、本発明者らはこれらの実験においてプラスミドを維持するための選択圧力を含めることを望まなかったので、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験のためにプラスミド担持株ではなくＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を使用した。免疫蛍光法（ＩＦ）により明らかになった通り、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスは、腸上部でＧＬＰ−１について陽性に染色されたが、「ダミー」ペプチドを発現しているＥｃＮを摂食させたマウス（Ｎｉｓｓｌｅ）では同様の染色が示されなかった（図１６ａ、ｂ）。粘液層を守るために、腸の切片はパラホルムアルデヒドに固定するのではなく、凍結させた。画像解析により、ＧＬＰ−１染色は、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスにおいて、Ｎｉｓｓｌｅを摂食させたマウスよりも有意に高いことが示された（図１６ｃ）。
【０２０６】
Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１またはＮｉｓｓｌｅを摂食させたマウスの腸中および糞便中の細菌の総数を測定した。Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスおよびＮｉｓｓｌｅを摂食させたマウスの腸の細菌の総数および糞便の細菌の総数は同じであり（図１６ｄ）、これは、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスの切片について観察されたＧＬＰ−１の増加は組換えＧＬＰ−１の発現に由来し、ＥｃＮ由来株が存在することによってもたらされる内在性のＧＬＰ−１産生に由来するものではない可能性が高いことを示している。糞便中ではなく大腸におけるコロニーを決定するために、下部ＧＩ管の切片を穏やかにこすり取り、洗浄して糞便を除去した。残った細菌の総数を得る。本発明者らによる小腸および糞便における細菌の総数は他で報告されているものほど高くなかったが、これは、マウスの品種が異なること、および代替の抗生物質前処理に起因する可能性がある。
【０２０７】
本発明者らは薬物誘導性Ｔ１ＤＭマウスモデルおよび遺伝的な非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスモデルにおいて、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１により、正常血糖を回復させることができるかどうかを試験した（ＮＯＤモデルからの結果がセクション６．１１．（実施例１１）に要約されている。薬物誘導性Ｔ１ＤＭモデルの雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）マウスに、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を高用量（体重１ｋｇ当たり４０ｍｇまたは５０ｍｇ）で５日間継続的に注射した。高血糖症が発症した（空腹時血糖レベル＞２５０ｍｇ／ｄＬ）マウスにＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１もしくはＮｉｓｓｌｅのいずれかを摂食させた、または処置しなかった。共生細菌の摂食は、１日２回、およそ８時間の間隔を空けて行った。正常血糖対照として、マウスの１つの群にはＳＴＺ処置もせず、共生細菌も摂食させなかった（対照）。血中グルコースレベルおよび体重を６０日にわたってモニターした。
【０２０８】
膵臓の形態計測解析により、ＳＴＺ処置したマウスのβ細胞質量が、対照マウスと比較して有意に減少したことが示された（図１７ａ）。Ｎｉｓｓｌｅ単独の摂食は、ＳＴＺ処置し、共生細菌を与えなかったマウスと比較して、血中グルコースレベルに対する有意な効果を有さなかった（図１７ｂ）。しかし、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスは、摂食を始めた６０日後に有意に低い（ｐ＝．００００１７）血中グルコースレベルを示した（図１７ｂ）。Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスについての血中グルコースレベルは、正常血糖対照と有意に異ならなかった（ｐ＝．４６）。さらに、６０日の期間中、試験に含めたマウスのいずれについても体重に有意な変化はなかった（図２０Ａ〜Ｂ）。ＳＴＺを摂食させたマウスの全てにおいてβ細胞質量が同等に減少したことにより、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスの血中グルコースレベルの低下がβ細胞再生の結果である可能性が除外された。
【０２０９】
健康な、ＳＴＺ処置していないマウスにもＮｉｓｓｌｅおよびＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させ、それらの血中グルコースレベルは、共生細菌を摂食させなかった健康なマウスの血中グルコースレベルと有意に異ならなかった（図１７ｃ）。９２日の期間にわたって、いずれの複数の処置と処置していない健康なマウス（対照）との間にもマウスの血中グルコースレベルに有意な変化はなかった（図１７ｃ）。同じ期間にわたってマウスの体重変化にも差異はなかった（図２０Ａ〜Ｂ）。
【０２１０】
共生細菌で処置した６０日後に、マウスの全群を耐糖能検査に供した。マウスを１０時間絶食させた後、グルコース（体重１ｋｇ当たり２５ｇ）をｉ．ｐ．注射した。グルコース注射した後、３０分ごとに１．５時間にわたって血中のインスリンレベルおよびグルコースレベルを測定した（図１７ｄ）。Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスとＳＴＺのみの群の間に、０．５時間および１．５時間の時点でインスリンレベルの有意差が見られたが、Ｎｉｓｓｌｅ  ＧＬＰ−１を摂食させたマウスと処置しなかった対照マウスの間では、いずれの時点でもインスリンレベルに有意差は検出されなかった（図１７ｄ）。耐糖能検査全体を通して、マウスの４つの群全てにわたって血中グルコースレベルに有意差があった。Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスは、耐糖能検査全体を通して、ＳＴＺのみのマウスの５０％未満の血中グルコースレベルを示したが、ＳＴＺを与えなかった対照マウスの２倍の高さの血中グルコースレベルを有した（図１７ｄ）。Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスの血中グルコースレベルは、正常血糖対照よりは高いが、耐糖能検査全体を通して２７５ｍｇ／ｄＬを超えなかった（ＳＴＺのみのマウスの６００ｍｇ／ｄＬと比較して）。興味深いことに、血中グルコースについて、Ｎｉｓｓｌｅ処置したマウスでは基礎レベル（時間＝０）においてはＳＴＺ処置したマウスとの有意差が示されなかったが、グルコース注射した１時間後には、Ｎｉｓｓｌｅ処置したマウスは、ＳＴＺ処置したマウスよりもほぼ３３％低い血中グルコースレベルを示した。この保護は、高レベルのグルコースを注射していないマウスでは明白ではなかったが、Ｎｉｓｓｌｅにより、血中グルコースのスパイクの影響がいくらかの程度緩和され得ると思われる。グルコースをｉ．ｐ．注射したとすると、内腔内のグルコースの細菌による消費は可能性のある機構としては除外することができる。この知見を説明するためにはさらなる試験が必要である。
【０２１１】
処置した６０日後（および耐糖能検査後）に、マウス小腸の切片を固定し、種々のマーカーについて免疫蛍光によりプロービングした。インスリン含有細胞のポケットが、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１で処置したマウスの小腸において見いだされたが、この試験に用いた他の群のいずれにおいても見いだされなかった（図１８ａ〜ｄ）。画像解析から、インスリン産生細胞の相対的な発生頻度が小腸の細胞集団全体のおよそ０．０１３％（±０．００２％）（または上皮細胞１０，０００個中１個）であると推定された。予測通り、試験に含めた全てのマウスで腸上部においてＰＤＸ−１産生が見られた（図１８ａ〜ｄの赤色の染色）。しかし、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１で処置したマウスのインスリン産生細胞は高レベルのＰＤＸ−１について染色されず、さらには、周囲の細胞よりも（図１８ｂおよびｄ）、または対照マウス由来の膵ベータ細胞よりも（データは示していない）、ＰＤＸ−１発現が少ないとも思われた。これは興味深い転帰であるが、β細胞質量におけるＰＤＸ−１／インスリン分泌に不均一性が存在することが公知であるので、これらの細胞がβ細胞様の機能性を有するという可能性が残る。
【０２１２】
健康な（非糖尿病）マウスにＮｉｓｓｌｅおよびＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させた、より長期間の対照実験では、腸を、再プログラミングされた細胞の存在についても染色した。Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させた健康なマウスでは、インスリン染色が見られ、インスリン産生細胞におけるＰＤＸ−１の発現は同様に周囲の細胞より少なかった（図１８ｄ）。Ｎｉｓｓｌｅを摂食させた健康なマウスでは再プログラミングされた細胞は示されなかった（図１８ｃ）。
【０２１３】
再プログラミングされた細胞の生理機能をよりよく理解するために、マウスの腸の切片においてクロモグラニンＡ（ＣｈｒＡ）およびインスリンについて共染色した。ＣｈｒＡは、通常、神経内分泌細胞、腸内分泌細胞によって発現され、島β細胞の分泌顆粒中にある。いくつかの場合には、インスリン染色はＣｈｒＡ染色（赤色）と重複し（図１８ｅ）、観察されたインスリン産生細胞のおよそ８０％において、ＣｈｒＡは同じ細胞に局在しなかった（図１８ｆ）。図１８ｅおよびｆは、正常な腸内分泌細胞（ＣｈｒＡ陽性、インスリン染色なし）およびインスリン産生（インスリン染色）細胞を示す。正常な腸内分泌細胞がインスリン産生細胞の極めて近傍に存在することは、腸内分泌細胞からインスリン産生細胞にいくらか変換されているにもかかわらず腸内分泌機能性が動物全体で保存されていることを示唆している。本発明者らによってインスリンとリゾチームの共局在は観察されず（図１８ｇ）、これにより、再プログラミングされた細胞がパネート細胞ではなかったことが示唆される。インスリンとスクラーゼイソマルターゼの同時発現（ＳＩ、図１８ｈ）により、再プログラミングされた細胞がそれらの吸収力を維持することが示される。
【０２１４】
Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させた健康なマウスについて血中グルコース（図１７ｃ）または体重（図２０Ａ〜Ｂ）に変化がないことを示すデータと、２種のＴ１ＤＭのげっ歯類モデルにおいてＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１により血中グルコースレベルが有意に低下し得ることを示すデータ（図１７ｂおよび２１）を並べると、この手法が糖尿病に対する有効かつ安全な治療であり得ることが示唆され、これは非糖尿病系と同様のインスリンカイネティクスを有し、グルコース応答性である（図１７ｄ）、すなわち、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスにおいて、血清インスリンレベルは低いが、インスリンレベルの変化が健康なマウスと同じタイミングで起こるものである。この試験で実現される再プログラミング効率の推定値（下の「再プログラミングされた細胞の数の算出および推定値」において詳述される）は、再プログラミングされた細胞が、健康なマウスの膵臓におけるβ細胞の数のおよそ８２％の数に達することを示している。この数は、なぜマウスが日常条件下で正常化された血中グルコースレベルを示すことができたが、より厳しい耐糖能検査条件下では健康なマウスの血糖対照よりもわずかに低かったかを潜在的に説明する。ヒト患者が、本明細書で提示されたマウスに関する結果と同じ結果を実現するために毎日消費しなければならない細菌の量の推定値は、現在市場に出ている市販のプロバイオティクス製剤中に存在する細菌の量を考慮すると、１日およそ５〜１５ｇである。しかし、コロニー形成数がより高ければ、１日の摂取量は５０ｍｇまでの低さになり得る。
【０２１５】
この手法に伴う考慮すべき問題は、腸において新しく生成したβ様細胞に対する免疫応答が引き出される潜在性である。他の再生手法と同様にこれが起こる有意な潜在性が存在する。しかし、これらの細胞の生理機能（ＣｈｒＡをわずかに発現し、ＰＤＸ−１の発現が比較的少ない）は、β細胞とは別個であり、したがって、これらの細胞は免疫系から検出されない可能性がある。さらに、患者を、この試験でのマウスと同様に、ＧＬＰ−１を分泌する細菌で毎日処置する場合、インスリン分泌細胞が永久的に再生することにより、おそらく、新しく形成されたβ様細胞が免疫学的に破壊されるにもかかわらず、継続した血中グルコースの低下が可能になる。４６日後にさえ、ＮＯＤマウス（膵臓のβ細胞の免疫破壊を提示する）における保護作用を示す本発明者らのデータを用いて、ヒト上皮細胞がおよそ２日ごとに交換されることを考えると、腸上部において再プログラミングされた細胞に対する免疫系による有意な応答はない可能性がある。しかし、そのような攻撃がある場合、粘膜の表面の永久的な炎症がもたらされ得る。この手法の免疫学的影響を決定するためには、さらなる試験が必要である。
【０２１６】
本発明者らは、本明細書において提示されているデータから、糖尿病マウスにＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させることにより、グルコース応答性インスリン産生が引き起こされ、血中グルコースレベルが有意に低下し得ると結論づける。さらなる特徴付けが必要ではあるが、インスリン分泌の機構は、再プログラミングされた腸の細胞に由来すると思われる。これらの細胞は、ＰＤＸ−１をほとんど発現せず、これらの細胞の一部のみがインスリンに加えてＣｈｒＡを発現するという点で、大多数の膵臓のβ細胞とは別個である。マウスに、β細胞のインスリン分泌を刺激しない不活性型のＧＬＰ−１を摂食させるとし、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスが、Ｎｉｓｓｌｅのみを摂食させたマウスまたは細菌を摂食させなかったマウスと同じレベルの膵臓のインスリン産生を有するとすると、この手法により、残りのβ細胞からのインスリン産生が増加する見込みはない。Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させた健康なマウスからの結果を考慮すると、証拠により、この治療が、たとえ非糖尿病患者が受けたとしても安全であると思われることが示唆される。今後の研究により、インスリン産生細胞の生理機能およびこの治療の詳細な長期の薬物動態がより綿密に検査される。
【０２１７】
材料および方法
プラスミド構築
別段の指定のない限り、化学物質および試薬は全て、ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）から購入した。クローニングは全て標準の技法を用いて行った（Sambrook, J. & Russell, D. W.、Molecular cloning: a laboratorymanual.、第３版（Cold Spring Harbor Laboratory Press、２００１年））。以前に記載されている通り、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）と融合したｇｌｐ−１（１〜３７）をｆｌｉＣプロモーターの制御下で発現させるためのプラスミドを構築して、ｐＦＤ−ＧＬＰを作製した（Duan,F. & March, J. C.、Interrupting Vibrio cholerae infection of humanepithelial cells with engineered commensal bacterial signaling. BiotechnolBioeng １０１巻（１号）：１２８〜３４頁（２００８年））。配列６×ＨｉＳ−ＥＫ−ｇｌｐ−１（１〜３７）−ＣＰＰを合成により作製した（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）。この断片を、高忠実度ＰＣＲ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）によってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳに挿入して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＧＬＰを作製した。得られたベクターは、配列：５’ＵＴＲ−Ｆｌｉｃ２０−６×ＨｉＳ−ＥＫ−ｇｌｐ−１（１〜３７）−ＣＰＰを含有した。この配列をｐＫＳ１２１（ｆｌｉＣの３’ＵＴＲを含有する）にクローニングして、高忠実度ＰＣＲにより構築物：５’ＵＴＲ−Ｆｌｉｃ２０−６×ＨｉＳ−ＥＫ−ｇｌｐ−１（１〜３７）−ＣＰＰ−３’ＵＴＲを得た。ｐＦＤベクターを得るために、高忠実度ＰＣＲを用いて、ｐＦＤ−ＧＬＰ由来の５’ＵＴＲ−ＦＬＩＣ２０−６×ＨｉＳ−ＥＫ配列をクローニングした。ＰＣＲ断片をｐＫＳ１２１にクローニングして、構築物：５’ＵＴＲ−Ｆｌｉｃ２０−６×ＨｉＳ−ＥＫ−３’ＵＴＲを得た。ｐＫＳ１０４およびｐＫＳ１２１はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｌｓｉｎｋｉ、ＦｉｎｌａｎｄのＢｅｎｉｔａ  Ｗｅｓｔｅｒｌｕｎｄ−Ｗｉｋｓｔｒｏeｍからの好意の寄贈品であった。
【０２１８】
ｇｌｐ−１（１〜３７）−ＣＰＰをネイティブなｆｌｉＣプロモーターの制御下で染色体に挿入するために、確立された方法を用いて構築物ｐＦＤ−ＧＬＰＣを調製した（Datsenko, K. A. & Wanner, B. L.、One-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl AcadSci USA ９７巻、６６４０〜６６４５頁（２０００年））。構築物のマップが、クローニングステップおよび使用したプライマーの詳細な説明と一緒に下に記載されている。簡単に述べると、一段階不活化を用いて、Ｆｌｉｃ２０−６×ＨｉＳ−ＥＫ−ｇｌｐ−１（１〜３７）−ＣＰＰ遺伝子を、Ｎｉｓｓｌｅ染色体に、ｆｌｉＣプロモーター領域の下流のｆｌｉＣの代わりに挿入した。本発明者らは、Ｎｉｓｓｌｅ染色体のｆｌｉＤ遺伝子をノックアウトした。この技法では、３つのプラスミド、ｐＫＤ３（クロラムフェニコール耐性を付与する）、ｐＫＤ４（カナマイシン耐性を付与する）、およびｐＫＤ４６（アンピシリン耐性を付与する）を使用する（Datsenko,K. A. & Wanner, B. L.、One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA ９７巻、６６４０〜６６４５頁（２０００年））。染色体に挿入した後に生じた株はＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１と称した。
【０２１９】
ウエスタンブロット
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ１９１７（ＥｃＮ）は、現在販売されているプロバイオティクスであるＭｕｔａｆｌｏｒ（商標）から、以前に記載されている通り得た（Duan, F. & March, J. C.、Interrupting Vibrio cholerae infectionof human epithelial cells with engineered commensal bacterial signaling.Biotechnol Bioeng １０１巻（１号）：１２８〜３４頁（２００８年））。ｐＦＤベクターを有するＥｃＮ、ｐＦＤ−ＧＬＰおよびｐＦＤ−ＧＬＰＣの染色体挿入を伴うＮｉｓｓｌｅを、ＬＢ中、３７℃、２２５ｒｐｍで振とうしながら２４時間成長させた。２４時間後に、全ての細菌を遠心分離した。上清を濾過した（０．２μｍ、ＰＡＬＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。無細胞培地（ＣＦＭ）を同じＯＤ６００までＬＢで希釈し、プロテアーゼを阻害するために、１０ｎｇ／ｍＬのロイペプチン、０．０４ｍＭのＰＭＳＦおよび５ｎｇ／ｍＬのアプロチニンに加えた。不純物を取り除いた上清（１４ｍＬ）を、１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ、ＶＷＲ）を用いて３０分間、氷上で沈殿させ、ペレットを氷冷したエタノール／エーテル（１：１）で２回洗浄した。上清ペレットを真空下で乾燥させ、試料緩衝液（２％ＳＤＳ、５０ｍＭのトリス、ｐＨ６．８、２０％グリセロール、１０％メルカプトエタノール、ブロモフェノールブルー）５０μｌに溶解させ、９５℃で５分間煮沸した。細胞ペレットを（１４ｍＬの培養物から）、プロテアーゼ阻害剤（１０ｎｇ／ｍＬのロイペプチン、２００μＭのＰＭＳＦおよび５ｎｇ／ｍＬのアプロチニン）を伴う５００μｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用し、室温で穏やかにボルテックスすることによりＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘに再懸濁させた。細胞浮遊液を、室温で、振とうプラットフォーム（ＶＷＲ、Ｂｒｉｓｔｏｌ、ＣＴ）上、遅い設定で１０〜２０分インキュベートした。５×試料緩衝液１２５μｌを各試料に加えた後、９５℃で１０分間煮沸した。
【０２２０】
ＧＬＰ−１の発現量および分泌量を推定するために、ウエスタンブロットの標準の技法を用いた。簡単に述べると、試料５０μｌをポリアクリルアミドゲルにローディングし、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＰＳＱ転写膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）にブロッティングした。膜を、マウス抗ｈｉｓ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に対して１：１，０００でプロービングした。膜を、ＨＲＰ−コンジュゲートした抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）と一緒にインキュベートし、高感度化学発光（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により展開し、Ｘ線フィルム（Ｐｈｏｅｎｉｘ、Ｃａｎｄｌｅｒ、ＮＣ）に曝露させた。
【０２２１】
マウスコロニー形成実験
この試験において用いたマウスは全て、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入し、Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ＳｃｈｏｏｌのＥａｓｔ  Ｃａｍｐｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＥＣＲＦ）に収容した。試験は、Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＩＡＣＵＣにより承認されたプロトコールに従って行った。
【０２２２】
ＳＴＺモデル
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、適用する直前に、氷冷した０．１Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．２）中に溶解させた。６〜８週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）マウスの４つの群に、ベータ細胞アポトーシスを誘導するために、５日連続して毎日、体重１ｋｇ当たり４０ｍｇまたは５０ｍｇのＳＴＺの腹腔内注射を受けさせた。クエン酸ナトリウム注射を受けるマウスの別の群を対照として用いた。最後に注射した３日後に、動物の血中グルコースレベルを、Ｂａｙｅｒ  Ｂｒｅｅｚｅ血中グルコース試験紙（Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＬＬＣ  Ｍｉｓｈａｗａｋａ、ＩＮ）を用いて、Ｂｒｅｅｚｅ（登録商標）２血中グルコースモニタリングシステム（Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＬＬＣ  Ｍｉｓｈａｗａｋａ、ＩＮ）によって決定した。血中グルコースレベルを、糖尿病のグルコースレベル（＞２５０ｍｇ／ｄＬ）に到達するまで、３日ごとにモニターした。糖尿病の血中グルコースレベルに到達しなかったＳＴＺ処置したマウスはこの試験には用いなかった。
【０２２３】
高血糖症を確立した後、常在通性細菌を排除するために、マウスに、クロラムフェニコール処理した（（１ｇ／リットル））飲料水を１８時間与えた。ｐＦＤ−ＧＬＰＣを用いて染色体を改変したＮｉｓｓｌｅ株（Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１）を、ＬＢ培地中の一晩培養５００倍希釈物からＯＤ６００＝１になるまでクロラムフェニコールと一緒に成長させた。１０００×ｇで３分遠心分離することによって細菌を採取した。生じたペレットを、１％スクロースを伴う２００μｌの滅菌ＬＢに再溶解させた。クロラムフェニコール処置後、マウスに、１０９ＣＦＵ／ｍＬ（ＯＤ６００＝２０）のルリア培地（Ｌｕｒｉａ  ｂｒｏｔｈ）で成長させたＮｉｓｓｌｅ株（ＮｉｓｓｌｅまたはＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１）を別々に含有する、１％スクロースを伴うＬＢを体重２５ｇ当たり５０μｌ摂食させた。摂食させた細菌の体積をマウスの体重により正規化した。Ｎｉｓｓｌｅ株を摂食させたマウスは全て、実験全体を通して、１日当たり２回Ｎｉｓｓｌｅを摂食させた。全てのマウスについて、７〜１０日ごとに体重およびグルコースレベルを取得した。ほとんどの場合、空腹時血糖レベルを測定した。これらの測定は、マウスのストレスレベルを最小限にするために間隔を空けた。
【０２２４】
耐糖能検査およびＥＬＩＳＡ
マウスを１０時間絶食させ、秤量し、ヘパリン添加したＭｉｃｒｏ−Ｈｅｍａｔｏｃｒｉｔ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｔｕｂｅ（Ｆｉｓｈｅｒ、ＰＡ）を使用して尾静脈から血液試料を採取した。次いで、マウスに体重１ｋｇ当たり２５ｍｇのグルコースを腹腔内注射し、０．５時間、１時間、１．５時間の時点で血液試料を取得した。Ｂｒｅｅｚｅ（登録商標）２血中グルコースモニタリングシステムを使用して血漿グルコースを測定した。Ｒａｔ／Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ）を製造者の説明書に従って使用して血漿インスリンを測定した。
【０２２５】
細菌の計数
６〜８週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）マウスに、常在通性細菌を排除するために、クロラムフェニコール（１ｇ／リットル）を飲料水に入れて１８時間与えた。Ｎｉｓｓｌｅ株（ＮｉｓｓｌｅおよびＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１）の一晩培養物をＬＢ培地中に１：５００希釈し、ＯＤ６００＝１まで成長させた。１０００×ｇで３分間遠心分離することによって細菌を採取した。生じたペレットを、１％スクロースを伴う滅菌ＬＢ中に再懸濁させてＯＤ６００＝２０にした。クロラムフェニコール処置後、マウスに、濃縮した再懸濁液を含有する、１％スクロースを伴うＬＢを体重２５ｇ当たり５０μｌで経口胃管栄養によって摂食させた（結果として生じる用量は、１日２回、動物当たり１０９ＣＦＵである）。２０日間摂食させた後、マウスを新しいケージに移して３日間置いた。新しいケージから糞便を採取し、マウスを安楽死させた。各処置から少なくとも３匹のマウスを解剖し、それらのＧＩ管を取り出した。ＧＩ管を２つの小片に切った（上部ＧＩ−小腸および下部ＧＩ−大腸）。下部ＧＩを片側にそって開き、穏やかにこすり取ることによって糞便を除去し、１×ＰＢＳで洗浄した。上部ＧＩは洗浄もこすり取ることもせずに秤量した。上部ＧＩ管および下部ＧＩ管をそれぞれ秤量し、新鮮なＬＢ培地４ｍＬ中でホモジナイズした。ホモジナイズされた組織を、対応する抗生物質を伴うＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天プレートに、段階希釈により播いた。プレートを、３７℃で一晩インキュベートし、それらのコロニーを計数した。
【０２２６】
免疫組織学的検査
この試験で用いた、処置したマウスを全て、標準のプロトコールの通りＣＯ２を用いて安楽死させた。耐糖能検査後に屠殺したマウスの消化管および膵臓の組織を４％パラホルムアルデヒドに一晩固定し、１×ＰＢＳで３回洗浄し、７０％エタノールに浸漬した。次いで、固定された組織を解剖した。
【０２２７】
脱パラフィンした後、固定された組織スライドを、ＩＨＣ−Ｔｅｋ（商標）エピトープ回収溶液（ＩＨＣ  Ｗｏｒｌｄ、Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ、ＭＤ）中で蒸し、メタノール中０．５％過酸化水素（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）に１０分間浸して、内在性のペルオキシダーゼをブロッキングした。０．０１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄した後、１０％の通常のブロッキングヤギ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を、加湿チャンバー内、室温で３０分間適用した。ＰＢＳプラス１×カゼイン（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）中に１：５０希釈したウサギ抗インスリン（Ｈ−８６、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を適用して試料をブロッキングし、次いで、その試料を加湿チャンバー内、３７℃で１．５時間インキュベートした。ＰＢＳで４回洗浄した後、ＰＢＳ中に１：２００希釈したビオチン化二次抗体ヤギＡｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ）を試料に、加湿チャンバー内、室温で２０分間適用した。試料を、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒に加湿チャンバー内、室温で２０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。試料を、ＡＥＣ色素原／基質溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒に室温でインキュベートした。色の発生を、通常の光学顕微鏡の下でおよそ５〜１５分間モニターした。蒸留Ｈ２Ｏによるすすぎを用いて反応を停止させた。
【０２２８】
一部の消化管組織および膵臓を、ヘマトキシリン（Ｆｉｓｈｅｒ）を３０秒間用いて対比染色した後、水道水で５分間すすいだ。試料を、水性封入剤であるＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して封入した。通常の光学顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、Ｂａｎｎｏｃｋｂｕｒｎ、ＩＬ）の下でカラーカメラを用いて写真を取得した。染色された膵臓組織の写真を、赤色の着色から推定されるβ細胞によるパーセント適用範囲についてＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（ＮＩＨ−ＮＣＢＩ）によって解析した。
【０２２９】
免疫蛍光法
パラフィン免疫蛍光法−インスリン、ＰＤＸ−１、ＣｈｒＡ、リゾチームおよびＳＩ
Ｎｉｓｓｌｅ株（ＮｉｓｓｌｅおよびＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１）を６０日間摂食させた後に屠殺したマウスの消化管および膵臓の組織を、４％パラホルムアルデヒドに一晩固定し、１×ＰＢＳで３回洗浄し、７０％エタノールに浸漬させた。次いで、固定された組織を解剖した。
【０２３０】
脱パラフィンした後、固定された組織スライドを、０．０１Ｍのクエン酸緩衝液中で蒸した。０．０１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄した後、１０％の通常のブロッキングロバ血清（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ）を加湿チャンバー内、室温で１時間適用した。１：５０希釈したウサギ抗インスリン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ）、およびＰＢＳプラス１×カゼイン（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）中１：５００のヤギ抗ＰＤＸ−１（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、１：５０に希釈された抗ヤギＣｈｒＡ、抗ヤギリゾチーム、または抗ヤギスクラーゼイソマルターゼ（ＳＩ）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ）のいずれかを適用して試料をブロッキングし、次いで、その試料を加湿チャンバー内、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで４回洗浄した後、ＰＢＳ中１：２００希釈した、蛍光色素とコンジュゲートした二次抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ロバ抗ウサギＩｇＧおよびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、加湿チャンバー内、室温で１．５時間、試料に適用した。ＰＢＳで３回洗浄した後、３００ｎＭのＤＡＰＩ染色溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、試料と一緒に３分間インキュベートした。次いで、試料を、ＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ退色防止（ａｎｔｉｆａｄｅ）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて封入した。検体を、各フルオロフォアについて、適切な励起波長を用いてすぐに検査した。Ｚｅｉｓｓ７１０共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて画像を取得した。
【０２３１】
凍結切片免疫蛍光法−Ｇｌｐ−１
Ｎｉｓｓｌｅ株を１０日間摂食させたマウスの腸および膵臓を回収し、ＯＣＴ化合物中でスナップ凍結させ、凍結切片にした（８μＭ）。スライドを１時間風乾し、氷冷したアセトンに５分間固定した。一晩風乾した後、スライドをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ）での３回洗浄で洗浄した。以下のプロトコールをＭ．Ｏ．Ｍ．（商標）キット染色手順（Ｖｅｃｔｏｒ）から改変した。細胞を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を用いて１５分間透過処理し、その後、ＰＢＳで２回洗浄した。Ｍ．Ｏ．Ｍ．（商標）Ｉｇブロッキング試薬の検量線用溶液中１０％の通常のロバ血清（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ）を加湿チャンバー内、室温で１時間適用した。切片を２回、２分間、それぞれＰＢＳで洗浄した。組織切片を、Ｍ．Ｏ．Ｍ．（商標）希釈剤の検量線用溶液中で５分間インキュベートした。次いで、試料を、Ｍ．Ｏ．Ｍ．（商標）希釈剤中１：１００のウサギ抗ＧＬＰ−１（１〜１９）（Ａｂｃａｍ）と一緒に３７℃で３０分間、その後ＲＴで３０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで２回洗浄し、次にＰＢＳで４回洗浄した後、ＰＢＳ中に１：２００希釈した、蛍光色素とコンジュゲートした二次抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ロバ抗ウサギＩｇＧおよびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加湿チャンバー内、室温で１時間、試料に適用した。その後ＰＢＳＴで３回洗浄した後、試料を３００ｎＭのＤＡＰＩ染色溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で３分間インキュベートした。試料をＰＢＳで３回すすぎ、ＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ退色防止試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて封入した。検体を、各フルオロフォアについて、適切な励起波長を用いてすぐに検査した。Ｚｅｉｓｓ７１０共焦点顕微鏡で写真を取得した。
【０２３２】
再プログラミングされた細胞の数の算出および推定値
Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスにおいて再プログラミングされた細胞の数を決定するための算出
マウス当たりのベータ細胞は１×１０６個であり（Bock, T.、Svenstrup,K.、Pakkenberg、B. & Buschard, K.、Unbiased estimation of total beta-cellnumber and mean beta-cell volume in rodent pancreas. Apmis １０７巻、７９１〜７９９頁（１９９９年）、腸上部１ｃｍ２当たりの細胞は１．９×１０７個である（Cheng,H. & Bjerknes, M.、Cell production in mouse intestinal epithelium measuredby stathmokinetic flow cytometry and Coulter particle counting. Anat Rec ２０７巻、４２７〜４３４頁、doi:10.1002/ar.1092070305（１９８３年）と仮定して、本発明者らはマウスの腸上部（十二指腸＋空腸、３３２．４ｃｍ２、Casteleyn,C、Rekecki, A.、Van der Aa, A.、Simoens, P. & Van den Broeck, W.、Surface areaassessment of the murine intestinal tract as a prerequisite for oral dosetranslation from mouse to man. Lab Anim ４４巻、１７６〜１８３頁、doi:10.1258/la.2009.009112（２０１０年）を参照されたい）の推定表面積に、推定の再プログラミングされた細胞の百分率（０．０００１３）を掛け、これに１ｃｍ２当たりの細胞数を掛けて、再プログラミングされた細胞の推定値を得、それは、健康なマウスにおけるベータ細胞の数のおよそ８２％であった。
【０２３３】
マウス実験に基づく推定用量の算出
本発明者らは本実施例で報告される実験では、マウスに１０９ｃｆｕ／ｍＬを１日当たり２回摂食させた。これは、マウスの体重１ｋｇ当たり８×１０１０ＣＦＵと等しい。市販されている通り、プロバイオティクスサプリメントを４．０×１０１１ＣＦＵ／ｇとし、ヒトの体重範囲を小児について２５ｋｇ〜成人について７５ｋｇと仮定すると、これは、５〜１５ｇ／ｄの１日用量を意味することになる。しかし、コロニー形成効率が２桁高い場合には（報告されている通り、Rao, S.ら、Toward a live microbial microbicide for HIV: Commensalbacteria secreting an HIV fusion inhibitor peptide. Proc Natl Acad Sci USA １０２巻、１１９９３〜１１９９８頁（２００５年）を参照されたい）、用量は５０〜１５０ｍｇ／ｄになる。
【０２３４】
６．１１．  実施例１１：ＧＬＰ−１を分泌する共生細菌を非肥満糖尿病の（ＮＯＤ）マウスに摂食させることの効果
この実施例により、ＧＬＰ−１（１〜３７）を分泌する共生細菌を、遺伝学的に実現した糖尿病マウス（非肥満糖尿病、ＮＯＤ）に摂食させることの効果が実証される。本発明者らはＮＯＤマウスに、ダミーペプチドを発現しているＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ１９１７（Ｎｉｓｓｌｅ）、ＧＬＰ−１（１〜３７）を分泌しているＮｉｓｓｌｅ（Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１）または細菌を含有しない培地を４６日間摂食させた。その結果、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスにおいて、培地のみを摂食させた対照ＮＯＤマウスと比較して（ｐ＝．０００３）、またはＮｉｓｓｌｅを摂食させたマウスと比較して（ｐ＝．０００８）、血中グルコースレベルが有意に低下した。さらに、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１マウスの尿量がはるかに低いことが観察された。Ｎｉｓｓｌｅを摂食させたマウスも、培地のみを摂食させたマウスよりも有意に低い血中グルコースレベルを示した（ｐ＝．０１）。この試験では、Ｎｉｓｓｌｅを摂食させたマウスおよび対照マウスは外見が不健康であり、血中グルコースレベルが常に４００ｍｇ／ｄＬを超えたが、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウス（同様に不健康に見える）についての血中グルコースレベルは、４６日の期間全体を通して１６０〜２５０ｍｇ／ｄＬの範囲内であった。
【０２３５】
諸言
１型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）を試験するための標準モデル生物体のうちの１つと考えられ、ＮＯＤマウスは膵ベータ細胞ならびに全身の他の内分泌系の破壊を招く遺伝的欠陥を有する。Ｔ１ＤＭ様病態に加えて、他の全身性の病状を有するので、オフターゲットの効果により、ＮＯＤマウスはＴ１ＤＭを試験するために理想的なものではなくなっている。この限定にもかかわらず、当技術分野においてＮＯＤマウスは依然として早期概念実証研究の十分なモデルであるとみなされている。
【０２３６】
この実施例に関して、ペプチドＧＬＰ−１（１〜３７）を腸上皮細胞に送達するための共生細菌の使用の、ＮＯＤマウスにおける血中グルコースレベルに対する効果について調査した。
【０２３７】
実験手順
これらの実験に用いた雌のＮＯＤマウス（ＮＯＤ／ＳｈｉＬｔＪマウス）は、Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＩＡＣＵＣにより承認されたプロトコールに従って処置した。全てのマウスをＣｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ＳｃｈｏｏｌのＥａｓｔ  Ｃａｍｐｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＥＣＲＦ）に収容した。マウスは全て、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入した。６週齢の雌のＮＯＤ／ＳｈｉＬｔＪマウスの３つの群（ｎ＝５）について、それらの血中グルコースレベルを、Ｂａｙｅｒ  Ｂｒｅｅｚｅ（登録商標）血中グルコース試験紙（Ｂａｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、Ｂｒｅｅｚｅ（登録商標）２血中グルコースモニタリングシステム（Ｂａｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＬＬＣ  Ｍｉｓｈａｗａｋａ、ＩＮ）によってモニターした。糖尿病のグルコースレベル（＞２５０ｍｇ／ｄＬ）に到達するまで、５〜７日間ごとに血中グルコースレベルを測定した。糖尿病の血中グルコースレベルに到達するには、１２〜１４週間を要した。高血糖の血中グルコースレベルに到達できなかったマウスは安楽死させた。
【０２３８】
高血糖症を確立した後、全てのマウスに、常在共生細菌を排除するために、クロラムフェニコール（１ｇ／リットル）飲料水を１８時間与えた。Ｎｉｓｓｌｅ株（Ｎｉｓｓｌｅ、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＦＰ−１）を、一晩培養物からＯＤ６００＝１まで成長させ、ＬＢ培地中に１：５００希釈した。１０００×ｇで３分間遠心分離することによって細菌を採取した。生じたペレットを、１％スクロースを伴う滅菌ＬＢ２００μＬに再溶解させた。クロラムフェニコール処置した後、マウスに、経口胃管栄養によって、１０９ＣＦＵ（ＯＤ６００＝２０）の、Ｎｉｓｓｌｅ、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を含有する、または細菌を含有しない（ただのスクロースを伴う滅菌培地）、１％スクロースを伴うＬＢを体重２５ｇ当たり５０μＬで摂食させた。株は、単独で、添加物なしでマウスに摂食させた。胃管栄養を開始したら、クロラムフェニコール処理した水はマウスゲージから除去した。Ｎｉｓｓｌｅ株またはスクロースを伴う滅菌培地を、１日２回、４６日間胃管栄養により摂食させた。細菌の摂食を開始した後１１日目、２１日目、３０日目および４６日目にマウスの体重および血中グルコースを測定した。
【０２３９】
結果
ＮＯＤマウスに１日２回、４６日間、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１もしくはＮｉｓｓｌｅを経口的に摂食させた、または細菌を摂食させなかった。表１は、実験に含まれたマウスについての生存および糖尿病発症のデータを示す。全ての処置を各々マウス５匹で開始した。Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウス以外の全てのマウスが、実験全体を通して高レベルの尿を排泄することが観察された。Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスは、尿量のレベルの上昇を示したが、他のマウスほどではなかった。
【０２４０】
Ｎｉｓｓｌｅ株の摂食を開始する前に、全てのマウスが、５００ｍｇ／ｄＬを超える血中グルコースレベルを示し、高血糖症について陽性であるとみなされた。処置当たりの平均のマウスの空腹時（６時間）血中グルコースレベルが図２１に示されている。Ｎｉｓｓｌｅを摂食させたマウスおよびＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１を摂食させたマウスのどちらとも、対照マウスとの間で血中グルコースが有意に低下した。４６日後に、Ｎｉｓｓｌｅ摂食は対照に対して有意な効果（ｐ＝.０１）を有し、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１はさらに著しい効果を有した（ｐ＝．０００３）。Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１とＮｉｓｓｌｅの間の差異も有意であった（ｐ＝．０００８）。比較は全て、スチューデントの両側ｔ検定（ｎ＝４、３または２、表１参照）を用い、同等の分散を仮定して行った。
【０２４１】
実験の間、複数の処置間または１つの処置間でマウスの体重に有意差はなかった。全てのマウスの体重が、概して経時的に減少した（図２２）。
【０２４２】
結論
これらのデータは、ＮｉｓｓｌｅおよびＮｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１のどちらによっても、ＮＯＤマウスにおける血中グルコースレベルが有意に低下し得ることを示している。しかし、これらのデータは、非常に小規模のマウスの群からのものである。４６日間までに、各群に残ったマウスは２匹のみである。それはそうとして、Ｎｉｓｓｌｅ−ＧＬＰ−１群のマウスの血中グルコースレベルは、他の２つの群よりもはるかに低く、これは、ＮＯＤマウスにより任意の再プログラミングされた細胞に対して開始され得るいかなる免疫応答もこの時間枠内では影響を有さなかったことを示している。
【０２４３】
表１：この実施例に関するマウスの生存
【０２４４】
【表１】
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本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態による範囲に限定されるものではない。実際に、当業者には、本明細書に記載のものに加えて、本発明の種々の改変および変形が前述の説明から明らかになり、本発明に対して本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくそれらを行うことができる。したがって、本発明は、それらが添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内に入るという条件で、本発明の改変および変形を包含するものとする。
【０２４５】
本明細書において引用された全ての参考文献は、個々の刊行物、特許または特許出願について、その全体があらゆる目的について具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたのと同じ程度に、その全体が参照によりあらゆる目的について本明細書に組み込まれる。
【０２４６】
いずれの刊行物の引用も出願日より前のその開示に対するものであり、本発明が、先行発明に基づいてそのような刊行物に先立つ権限がないことを容認するものと解釈されるべきではない。
【図１】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図１０Ａ−Ｂ】
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【図１０Ｃ−Ｆ】
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【図１５】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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