(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法であって、
下記（工程１）〜（工程６）の工程を有しており、
（工程１）
抗ＭＤＡ−ＬＤＬモノクローナル抗体を利用する免疫沈降法を適用して、被験者から採取される血液サンプル中から、ＭＤＡ−ＬＤＬを分取する工程；
（工程２）
分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質に、トリプシンを作用させ、トリプシン酵素消化された、該ＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片の群を調製する工程；
（工程３）
等電点電気泳動法を適用し、トリプシン酵素消化された、該ＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片の群を、各ペプチド断片の等電点に従って、所定の等電点の区分に分画し、等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群に分離する工程；
（工程４）
等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群について、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片の質量（Ｍpeptide）を、質量分析手段として、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法を採用して測定し、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片を、その等電点（ｐＩ）と質量（Ｍpeptide）に基づき、それぞれ、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）と特定し、各ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）を測定する工程；
（工程５）
特定されたペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の一群中から、下記の表１−１に示すアミノ酸残基位置のＬｙｓ残基、ならびに、表１−２に示すアミノ酸残基位置のＭｅｔ残基からなる群より選択される、少なくとも一つのＬｙｓ残基またはＭｅｔ残基を含み、該Ｌｙｓ残基またはＭｅｔ残基が酸化を受けている、ＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片に相当する酸化ペプチド断片を少なくとも一つ選択する工程；
【表１−１】
0005857312.tif 000024
【表１−２】
0005857312.tif 000025
（工程６）
選択された酸化ペプチド断片に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の測定値、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）measuredに基づき、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する工程；
前記工程６において、酸化の進行度の評価は、
（サブ・ステップ６−１）
特定されたペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の一群に含まれるペプチド断片の種類の総数をＮtotal-peptideとし、特定されたペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の一群に含まれる、総数Ｎtotal-peptide種類のペプチド断片に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の測定値に基づき、平均化を行って、ピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の平均値、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）avを算出する工程；
（サブ・ステップ６−２）
選択された酸化ペプチド断片に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の測定値、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）measuredと、算出されたピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の平均値、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）avとを対比し、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質中において、選択された酸化ペプチド断片を内在する酸化ＡｐｏＢ１００タンパク質の含有比率を推定する工程；
（サブ・ステップ６−３）
分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質中における、選択された酸化ペプチド断片を内在する酸化ＡｐｏＢ１００タンパク質の含有比率が高いほど、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度は高いと評価する工程；
上記、（サブ・ステップ６−１）〜（サブ・ステップ６−３）の工程に基づき、酸化の進行度の評価を行う
ことを特徴とする、評価方法。
【請求項２】
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法であって、
下記（工程１）〜（工程６）の工程を有しており、
（工程１）
抗ＭＤＡ−ＬＤＬモノクローナル抗体を利用する免疫沈降法を適用して、被験者から採取される血液サンプル中から、ＭＤＡ−ＬＤＬを分取する工程；
（工程２）
分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質に、トリプシンを作用させ、トリプシン酵素消化された、該ＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片の群を調製する工程；
（工程３）
等電点電気泳動法を適用し、トリプシン酵素消化された、該ＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片の群を、各ペプチド断片の等電点に従って、所定の等電点の区分に分画し、等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群に分離する工程；
（工程４）
等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群について、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片の質量（Ｍpeptide）を、質量分析手段として、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法を採用して測定し、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片を、その等電点（ｐＩ）と質量（Ｍpeptide）に基づき、それぞれ、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）と特定し、各ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）を測定する工程；
（工程５）
特定されたペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の一群中から、下記の表２に示すアミノ酸残基を含むペプチド断片からなる群より選択される、ペプチド断片を少なくとも一つ選択する工程；
【表２】
0005857312.tif 000026
（工程６）
選択されたペプチド断片に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の測定値、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）measuredに基づき、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する工程；
前記工程６において、酸化の進行度の評価は、
（サブ・ステップ６−１）
特定されたペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の一群に含まれるペプチド断片の種類の総数をＮtotal-peptideとし、特定されたペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の一群に含まれる、総数Ｎtotal-peptide種類のペプチド断片に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の測定値に基づき、平均化を行って、ピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の平均値、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）avを算出する工程；
（サブ・ステップ６−２）
選択されたペプチド断片に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の測定値、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）measuredと、算出されたピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の平均値、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）avとを対比し、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質中において、選択されたペプチド断片をトリプシン消化により生成する酸化ＡｐｏＢ１００タンパク質の含有比率を推定する工程；
（サブ・ステップ６−３）
分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質中における、選択されたペプチド断片をトリプシン消化により生成する酸化ＡｐｏＢ１００タンパク質の含有比率が高いほど、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度は高いと評価する工程；
上記、（サブ・ステップ６−１）〜（サブ・ステップ６−３）の工程に基づき、酸化の進行度の評価を行う
ことを特徴とする、評価方法。
【請求項３】
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法であって、
下記（工程１）〜（工程６）の工程を有しており、
（工程１）
抗ＭＤＡ−ＬＤＬモノクローナル抗体を利用する免疫沈降法を適用して、被験者から採取される血液サンプル中から、ＭＤＡ−ＬＤＬを分取する工程；
（工程２）
分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質に、トリプシンを作用させ、トリプシン酵素消化された、該ＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片の群を調製する工程；
（工程３）
等電点電気泳動法を適用し、トリプシン酵素消化された、該ＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片の群を、各ペプチド断片の等電点に従って、所定の等電点の区分に分画し、等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群に分離する工程；
（工程４）
等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群について、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片の質量（Ｍpeptide）を、質量分析手段として、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法を採用して測定し、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片を、その等電点（ｐＩ）と質量（Ｍpeptide）に基づき、それぞれ、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）と特定し、各ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）を測定する工程；
（工程５）
特定されたペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の一群中から、下記の表３に示すＭＤＡ化Ｌｙｓ残基をその内部に含むペプチド断片、表４に示すＤＨＰ化Ｌｙｓ残基をその内部に含むペプチド断片、表５に示すＭＤＡ化Ｌｙｓ残基をそのＣ末端に含むペプチド断片、ならびに、表６に示す酸化されたＭｅｔ残基を含むペプチド断片からなる群より選択される、少なくともＬｙｓ残基またはＭｅｔ残基が酸化を受けているペプチド断片に相当する酸化ペプチド断片を少なくとも一つ選択する工程；
【表３】
0005857312.tif 000027
【表４】
0005857312.tif 000028
【表５】
0005857312.tif 000029
【表６】
0005857312.tif 000030
（工程６）
選択された酸化ペプチド断片に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の測定値、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）measuredに基づき、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する工程；
前記工程６において、酸化の進行度の評価は、
（サブ・ステップ６−１）
特定されたペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の一群に含まれるペプチド断片の種類の総数をＮtotal-peptideとし、特定されたペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の一群に含まれる、総数Ｎtotal-peptide種類のペプチド断片に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の測定値に基づき、平均化を行って、ピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の平均値、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）avを算出する工程；
（サブ・ステップ６−２）
選択された酸化ペプチド断片に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の測定値、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）measuredと、算出されたピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の平均値、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）avとを対比し、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質中において、選択された酸化ペプチド断片を内在する酸化ＡｐｏＢ１００タンパク質の含有比率を推定する工程；
（サブ・ステップ６−３）
分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質中における、選択された酸化ペプチド断片を内在する酸化ＡｐｏＢ１００タンパク質の含有比率が高いほど、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度は高いと評価する工程；
上記、（サブ・ステップ６−１）〜（サブ・ステップ６−３）の工程に基づき、酸化の進行度の評価を行う
ことを特徴とする、評価方法。
【請求項４】
工程５において、選択される酸化ペプチド断片の少なくとも一つは、
前記表３に示すＭＤＡ化Ｌｙｓ残基をその内部に含むペプチド断片の一群から選択する
ことを特徴とする、請求項３に記載の評価方法。
【請求項５】
工程１における、免疫沈降法によるＭＤＡ−ＬＤＬの分取に利用される、抗ＭＤＡ−ＬＤＬモノクローナル抗体は、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＭＤＡ化を受けたＡｐｏＢ１００タンパク質に特異的なモノクローナル抗体である
ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項６】
また、工程３における、等電点電気泳動法を適用するペプチド断片の分画は、等電点タンパク質分離チップを利用して実施する
ことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項７】
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該ＭＤＡ−ＬＤＬがＬＤＬから生成される過程の酸化ストレスの水準の高低を推定する方法であって、
下記の工程Ａと工程Ｂを含み
（工程Ａ）
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度の評価を、請求項１に記載のＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法を利用して行う工程；
（工程Ｂ）
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該ＭＤＡ−ＬＤＬがＬＤＬから生成される過程において、該ＭＤＡ−ＬＤＬの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準の高低を推定する工程；
前記工程Ｂにおいて、酸化ストレスの水準の推定は、
分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質中における、酸化の進行度が高いほど、該ＭＤＡ−ＬＤＬがＬＤＬから生成される過程において、該ＭＤＡ−ＬＤＬの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準は高いと推定する
ことを特徴とする、推定方法。
【請求項８】
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該ＭＤＡ−ＬＤＬがＬＤＬから生成される過程の酸化ストレスの水準の高低を推定する方法であって、
下記の工程Ａと工程Ｂを含み
（工程Ａ）
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度の評価を、請求項２に記載の上記本発明のＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法を利用して行う工程；
（工程Ｂ）
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該ＭＤＡ−ＬＤＬがＬＤＬから生成される過程において、該ＭＤＡ−ＬＤＬの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準の高低を推定する工程；
前記工程Ｂにおいて、酸化ストレスの水準の推定は、
分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質中における、酸化の進行度が高いほど、該ＭＤＡ−ＬＤＬがＬＤＬから生成される過程において、該ＭＤＡ−ＬＤＬの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準は高いと推定する
ことを特徴とする、推定方法。
【請求項９】
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該ＭＤＡ−ＬＤＬがＬＤＬから生成される過程の酸化ストレスの水準の高低を推定する方法であって、
下記の工程Ａと工程Ｂを含み
（工程Ａ）
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度の評価を、請求項３に記載のＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法を利用して行う工程；
（工程Ｂ）
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該ＭＤＡ−ＬＤＬがＬＤＬから生成される過程において、該ＭＤＡ−ＬＤＬの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準の高低を推定する工程；
前記工程Ｂにおいて、酸化ストレスの水準の推定は、
分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質中における、酸化の進行度が高いほど、該ＭＤＡ−ＬＤＬがＬＤＬから生成される過程において、該ＭＤＡ−ＬＤＬの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準は高いと推定する
ことを特徴とする、推定方法。
【請求項１０】
心疾患の診断に先立ち、被験者の病態を把握する目的で実施する、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する際、該評価に利用するマーカーとして、該酸化の進行度の評価に適する、ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の酸化ペプチド断片を選択する方法であって、
前記評価に利用するマーカーとして、
下記の表７−１に示すアミノ酸残基位置のＬｙｓ残基、ならびに、表７−２に示すアミノ酸残基位置のＭｅｔ残基からなる群より選択される、少なくとも一つのＬｙｓ残基またはＭｅｔ残基を含み、該Ｌｙｓ残基またはＭｅｔ残基が酸化を受けている、ＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片に相当する酸化ペプチド断片を少なくとも一つ選択する
【表７−１】
0005857312.tif 000031
【表７−２】
0005857312.tif 000032
ことを特徴とする、マーカーの選択方法。
【請求項１１】
心疾患の診断に先立ち、被験者の病態を把握する目的で実施する、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する際、該評価に利用するマーカーとして、該酸化の進行度の評価に適する、ＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片を選択する方法であって、
前記評価に利用するマーカーとして、
下記の表８に示すアミノ酸残基を含むペプチド断片からなる群より選択される、ペプチド断片を少なくとも一つ選択する
【表８】
0005857312.tif 000033
ことを特徴とする、マーカーの選択方法。
【請求項１２】
心疾患の診断に先立ち、被験者の病態を把握する目的で実施する、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する際、該評価に利用するマーカーとして、該酸化の進行度の評価に適する、ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の酸化ペプチド断片を選択する方法であって、
前記評価に利用するマーカーとして、
下記の表９に示すＭＤＡ化Ｌｙｓ残基をその内部に含むペプチド断片、表１０に示すＤＨＰ化Ｌｙｓ残基をその内部に含むペプチド断片、表１１に示すＭＤＡ化Ｌｙｓ残基をそのＣ末端に含むペプチド断片、ならびに、表１２に示す酸化されたＭｅｔ残基を含むペプチド断片からなる群より選択される、少なくともＬｙｓ残基またはＭｅｔ残基が酸化を受けているペプチド断片に相当する酸化ペプチド断片を少なくとも一つ選択する
【表９】
0005857312.tif 000034
【表１０】
0005857312.tif 000035
【表１１】
0005857312.tif 000036
【表１２】
0005857312.tif 000037
ことを特徴とする、マーカーの選択方法。
【請求項１３】
選択される酸化ペプチド断片の少なくとも一つは、
前記表９に示すＭＤＡ化Ｌｙｓ残基をその内部に含むペプチド断片の一群から選択する
ことを特徴とする、請求項１２に記載のマーカーの選択方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心疾患、特に、虚血性心疾患の疾患進行度を反映する、血液中に可溶性成分として含有される、マーカー・タンパク質の酸化の進行度の評価方法と、該マーカー・タンパク質の酸化の進行度の評価に利用される、該マーカー・タンパク質由来の酵素消化ペプチド断片に関する。より具体的には、本発明は、虚血性心疾患の疾患進行度を反映する、血液中に可溶性成分として含有される、マーカー・タンパク質である、酸化を受けた低比重リポタンパク質（ＬＤＬ；low-density lipoprotein）中、特に、マロンジアルデヒド化ＬＤＬ（ＭＤＡ−ＬＤＬ）中に含まれるApolipoprotein B100（ＡｐｏＢ１００タンパク質）の酸化の進行度の評価方法と、該ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質の酸化の進行度の評価に利用される、酸化変性を受けたＡｐｏＢ１００タンパク質由来の酵素消化ペプチド断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学的技術の近年の急激な進展により、従来では得られなかった、疾患に関与する生体分子の情報が急速に蓄積しつつある。なかでも、疾患に罹患した患者から採取される臨床サンプル中に含まれる生体分子の詳細な情報は、個別の疾患の病理的側面を反映している。従って、個別の疾患の病理的側面を反映する、生体分子の詳細な情報は、対象疾患の予防、診断、治療方法の開発、および治療に対する感受性の予測などに応用できることが期待されている。具体的には、対象疾患に関与する生体分子の情報を応用した、個別化医療に向けた研究が活発に行われるようになっている。近年、生活習慣病がクローズアップされており、生活習慣病に関与する生体分子の特定と、特定された生体分子の情報に基づく、分子レベルでの病態把握の重要性が認識されている。
【０００３】
動脈硬化性疾患は、生活習慣病の一つである。実際、動脈硬化性疾患は、現在先進国での死因の高位を占めており（日本では第２位、心疾患１５．９％、脳血管疾患１１．８％、米国では第１位）、その予防対策は医学的・社会的に重要な課題となっている。動脈硬化、特に、アテローム性動脈硬化（Atherosclerosis）の病態の進展、悪化の過程では、ＬＤＬが酸化・変性・糖化することに伴い、ＬＤＬ受容体への親和性を失い、一方、マクロファージは、そのスキャベンジャー受容体を介して酸化・変性・糖化を受けたＬＤＬを結合し、細胞内に取り込み、泡沫細胞（foam cell）を形成する過程が、中心的な役割を果たしている。従って、血液中に可溶性成分として含有されるＬＤＬ中、酸化・変性・糖化を受けたＬＤＬの含有濃度、特には、酸化ＬＤＬの含有濃度、ならびに、その酸化部位を検出する手法の開発は、アテローム性動脈硬化における、分子レベルでの病態把握を可能とすると考えられる。
【０００４】
実際、動脈硬化と酸化ＬＤＬの関連性の研究から、血漿中の酸化ＬＤＬ濃度を上昇させる酸化ストレスが、アテローム性動脈硬化、ならびに、動脈硬化が起因となる心血管疾患の病態において、中心的な役割を果たすことが示唆されている（非特許文献１、非特許文献２参照）。よって、動脈硬化症、ならびに、動脈硬化が起因となる心血管疾患の病態を把握する目的から、臨床サンプル中の酸化ＬＤＬ濃度の高精度測定の意義は大きい。
【０００５】
ＬＤＬと共存している、酸化ＬＤＬ、変性ＬＤＬの含有量を選択的に測定する方法として、酸化ＬＤＬ、変性ＬＤＬに特異的な抗体を利用するELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)法が報告されている（非特許文献１、特許文献１参照）。
【０００６】
ELISA法は、試料中に含まれる抗体あるいは抗原の濃度を検出・定量する際に広く用いられる手法である。特に、対象となる抗原に対して、特異的な抗体を利用することで、夾雑物が多数含まれる試料中に含有される、抗原を選択的に検出、定量する目的に適している。そのため、臨床サンプル中に含まれる、対象疾患に関連するタンパク質の有無、その定量を目的とする、スクリーニング検査に広く用いられている。例えば、sandwich-ELISA法では、対象となる抗原（目的タンパク質）に特異的な二種の抗体を利用して、下記の手順（１）〜（６）により、対象となる抗原（目的タンパク質）の検出が行われている。
（１）目的タンパク質（抗原）に対する抗体（捕獲抗体）を固相に吸着させる。
（２）スキムミルクなどで固相のブロッキングを行う。
（３）固相に試料溶液および捕獲抗体とは別のエピトープを認識する一次抗体を加える。この時点で、固相 - 捕獲抗体 - 抗原 - 一次抗体という複合体が固相表面に形成される。
（４）反応しなかった抗原および一次抗体を洗い流す。
（５）一次抗体に酵素が標識されていない場合は、酵素標識済みの二次抗体を作用させる。その後、余分な二次抗体を洗い流す。
（６）標識酵素の基質（通常、発色あるいは発光試薬）を加え、酵素反応の生成物を検出する。
【０００７】
sandwich-ELISA法は、標識酵素を利用して、該標識酵素の酵素反応の生成物を検出するため、高感度の検出が可能であるため、試料中に微量含有される抗原（目的タンパク質）を定量的に検出する際、広く採用されている。しかしながら、抗体が認識する部位（エピトープ）は、抗原（目的タンパク質）の特定の部分である。そのため、抗原（目的タンパク質）のエピトープ領域以外の部位に、酸化や変性が生じ、抗原（目的タンパク質）の様子が経時的に変化する場合、その経時的に変化をトレースすることは困難であることが多い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第３１１５５８７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ITABE Hiroykuki, (2002), YAKIGAKU ZASSHI, Vol.122, No.10, p.745-753
【非特許文献２】Fogelman, A.M., Shechter, I., Seager, J., Hokom, M., Childe, J.S., Edward, P.A., (1980 April) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, No.4, p.2214-2218
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記のsandwich-ELISA法を利用する、対象抗原（目的タンパク質）の検出、定量方法は、捕獲抗体の認識部位（第一のエピトープ）、一次抗体認識部位（第二のエピトープ）がそれぞれ特異的であるため、この二つの認識部位以外の領域に、酸化や変性が生じているか、否かの判定はできない。
【００１１】
従って、酸化ＬＤＬ、変性ＬＤＬのうち、捕獲抗体の認識部位（第一のエピトープ）ならびに一次抗体認識部位（第二のエピトープ）を共に保持する酸化ＬＤＬ、変性ＬＤＬの総量を定量する目的に利用されている。具体的には、捕獲抗体として、酸化ＬＤＬ、変性ＬＤＬを認識するが、ＬＤＬは認識しない特異的な抗体を採用し、一方、一次抗体として、酸化ＬＤＬ、変性ＬＤＬ、ＬＤＬのいずれも認識する抗体を採用する検出系が報告されている（非特許文献１、特許文献１参照）。
【００１２】
前記酸化ＬＤＬ、変性ＬＤＬを認識するが、ＬＤＬは認識しない特異的な抗体として、例えば、抗酸化ＬＤＬモノクローナル抗体「ＤＬＨ３」が報告されている（非特許文献１参照）。該「ＤＬＨ３」抗体は、未処理のＬＤＬ、アセチル化ＬＤＬ、ＭＤＡ−ＬＤＬ、糖化ＬＤＬとは結合せず、また、ＬＤＬに含まれるリン脂質のホスファチジルコリン（ＰＣ）、あるいは、その他の脂質（コレステロールエステルなど）とも結合せず、ＰＣの酸化で生じる、アルデヒド型酸化ＰＣと結合する。さらに、前記酸化ＬＤＬ、変性ＬＤＬを認識するが、ＬＤＬは認識しない特異的な抗体として、例えば、ヒト・ＭＤＡ−ＬＤＬに対するモノクローナル抗体も報告されている（特許文献１参照）。ヒト・ＭＤＡ−ＬＤＬは、ＬＤＬの核となるタンパク質であるＡｐｏＢ１００タンパク質に対して、マロンジアルデヒド（malondialdehyde, MDA）が結合したものである。ＬＤＬの酸化過程では、例えば、ＰＣの過酸化過程に伴い、その高度不飽和脂肪酸の炭素鎖の酸化産物として、ＭＤＡを含む各種のアルデヒド分子が生成される。生成するＭＤＡは、ＣＨ2（ＣＨＯ）2⇔ＨＯ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨＯのケト−エノール互変異性が可能であり、タンパク質に含まれるＬｙｓ残基の側鎖上にあるアミノ基（−ＮＨ2）との反応により、例えば、−ＮＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨＯの形状の修飾を行う。
【００１３】
従って、酸化ＬＤＬでは、少なくとも、含まれるリン脂質、例えば、ＰＣの酸化と、ＡｐｏＢ１００タンパク質に対するＭＤＡ化とが進行している。ＬＤＬと、ＬＤＬ受容体との結合は、ＬＤＬ受容体に対するＡｐｏＢ１００タンパク質の結合に因っている。ＡｐｏＢ１００タンパク質に対するＭＤＡ化が進行すると、ＬＤＬ受容体に対するＡｐｏＢ１００タンパク質の結合能が損なわれる。一方、マクロファージは、そのスキャベンジャー受容体を介して、酸化ＬＤＬを結合し、細胞内に取り込み、泡沫細胞を形成する。
【００１４】
生活習慣病の予防対策が政策の一つに挙げられるように、その対策の効果は、社会的・経済的に大きく波及する。なかでも、動脈硬化症は、虚血性心疾患、脳梗塞などの主因となる。従って、動脈硬化症の予防的対策は、医学的、社会的に重要な課題である。
【００１５】
動脈硬化は、次のような機序で進行すると考えられている。血管内皮下層にコレステロールエステルが蓄積する。コレステロールエステルの蓄積が生じた部位には、平滑筋細胞、結合組織なども集まってくる。次いで、粥腫（アテローム）と呼ばれる状態を形成し、粥腫の形成に伴い、さらに肥厚する。最終的に、粥腫の形成部位では、血管は硬化し、動脈の機能が低下する。
【００１６】
前述の動脈硬化の進行過程中、粥腫の形成段階は、泡沫細胞が主に関与している。粥腫の形成に関与する泡沫細胞は、マクロファージが、酸化ＬＤＬを取り込むことにより生じると報告されている。マクロファージによる酸化ＬＤＬの取り込みは、ＬＤＬ受容体に対する親和性を失った酸化ＬＤＬを、スキャベンジャー受容体を介して、該酸化ＬＤＬを結合し、その細胞内に取り込む機構に因っている。すなわち、該酸化ＬＤＬは、ＭＤＡがＬＤＬの主成分タンパク質であるＡｐｏＢ１００に結合して形成されるＭＤＡ−ＬＤＬの形状となっている。従って、酸化ＬＤＬ、特には、ＭＤＡ−ＬＤＬが、動脈硬化の初期病変に関与していることを査証する結果が報告されている（非特許文献２参照）。
【００１７】
以上の動脈硬化症の進行の機序を考慮し、血液中の酸化ＬＤＬ、特に、ＭＤＡ−ＬＤＬの検出、定量を目的として、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を利用するＥＬＩＳＡ法による検査が実用化されている（特許文献１参照）。しかしながら、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を利用するＥＬＩＳＡ法による酸化ＬＤＬの検出は、酸化ＬＤＬの血中濃度の把握が主な目的であり、酸化ＬＤＬ、特に、ＭＤＡ−ＬＤＬ中、ＡｐｏＢ１００タンパク質中の酸化部位（ＭＤＡ化部位）の特定には、利用できない。従って、酸化ＬＤＬ、特に、ＭＤＡ−ＬＤＬ中、ＡｐｏＢ１００タンパク質中の酸化部位（ＭＤＡ化部位）と、動脈硬化症、さらには、虚血性心疾患を含め、アテローム性動脈硬化に起因する心疾患の病態との関連付けなどには、利用できない。その理由は、ＥＬＩＳＡ法による検査で利用する捕獲抗体は、抗原（目的タンパク質）の特定の部位（エピトープ）を高い選択性で認識するものであり、該特定の部位（エピトープ）以外の部分を俯瞰するには、本来、不向きであるためである。
【００１８】
以上の状況から、現時点では、酸化ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質に対する修飾状態と、動脈硬化の進行度や動脈硬化発症機序の詳細など、所謂、臨床情報との関連について、明確な報告は少ない。
【００１９】
この現状を考慮した結果、本発明者らは、下記の課題が存在することを見出した。
【００２０】
動脈硬化の進行、特には、アテローム性動脈硬化の進行は、酸化ストレスによるＬＤＬの酸化の結果、酸化ＬＤＬの血中濃度の上昇と、酸化ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質に対する修飾（ＭＤＡ化）の結果、ＬＤＬ受容体に対する親和性を失うことに起因している。従って、酸化ＬＤＬの血中濃度の測定に加えて、酸化ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質における修飾（ＭＤＡ化）状態を測定することは、酸化ストレスの水準を推定することを可能とする。加えて、酸化ＬＤＬの血中濃度の測定、酸化ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質における修飾（ＭＤＡ化）状態の測定を同時に行い、動脈硬化の進行度や動脈硬化発症機序の詳細など、所謂、臨床情報との関連を見出すと、動脈硬化の進行度を合理的に推定する際に有効な、臨床的検査手段の開発に役立つ。
【００２１】
本発明は、前記の課題を解決するものである。すなわち、本発明の目的は、まず、酸化ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質における酸化部位、修飾部位（ＭＤＡ化部位）のうち、動脈硬化の進行度を反映して、酸化、修飾を受ける確率が明確に変化する、特異的な「酸化部位、修飾部位（ＭＤＡ化部位）」の一群を特定することにある。同時に、本発明の目的は、特定される特異的な「酸化部位、修飾部位（ＭＤＡ化部位）」の一群について、各「酸化部位、修飾部位（ＭＤＡ化部位）」が酸化、修飾を受けているか、否かを、簡便に、高い確度で定量的に検出することが可能な、該特異的な「酸化部位、修飾部位（ＭＤＡ化部位）」の酸化、修飾状態の検出方法を提供することにある。
【００２２】
加えて、本発明の目的は、酸化ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質における、該特異的な「酸化部位、修飾部位（ＭＤＡ化部位）」の酸化、修飾状態の検出方法を利用し、該特異的な「酸化部位、修飾部位（ＭＤＡ化部位）」が酸化、修飾を受けている比率を測定し、測定された比率に基づき、動脈硬化の進行度を統計的に推定する方法を提供することにある。
【００２３】
従来、アテローム性動脈硬化を示す動脈硬化症、さらには、アテローム性動脈硬化に起因する心疾患、特には、虚血性心疾患の病態の進行度、すなわち、冠動脈病変枝数（ACI-TIPI score）の評価を行う際、しばしば、カテーテル検査が、冠動脈におけるアテローム性動脈硬化の進行の程度の評価に利用されていた。
【００２４】
従って、本発明の目的は、前記冠動脈におけるアテローム性動脈硬化の進行の程度の評価に利用されているカテーテル検査に代えて、患者から採取した血液サンプルを用いて、該血液サンプル中に含まれる、酸化ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質における、該特異的な「酸化部位、修飾部位（ＭＤＡ化部位）」が酸化、修飾を受けている比率を測定し、測定された比率に基づき、冠動脈病変枝数の評価に利用可能な、動脈硬化の進行度を統計的に推定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明者らは、前記課題を解決すべく、酸化ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質における酸化部位、修飾部位（ＭＤＡ化部位）のうち、動脈硬化の進行度を反映して、酸化、修飾を受ける確率が明確に変化する、特異的な「酸化部位、修飾部位（ＭＤＡ化部位）」の一群の特定を進めた。
【００２６】
先ず、本発明者らは、以下の予想を行った。
【００２７】
酸化ＬＤＬの血中濃度の上昇は、酸化ストレスに起因するＬＤＬの酸化により引き起こされる。その過程では、ＬＤＬに含有される脂質を構成する、脂肪酸の炭素鎖、特には、高度不飽和脂肪酸の炭素鎖の酸化に伴い、酸化産物として、ＭＤＡを含む各種のアルデヒド分子が生成される。酸化ストレスの水準の高低に依存して、生成されるアルデヒド分子の量、例えば、ＭＤＡの量が異なる。ＭＤＡは、ＡｐｏＢ１００タンパク質中のＬｙｓ残基側鎖のアミノ基と反応し、ＭＤＡ化を行うが、生成されるＭＤＡの量が増すと、ＭＤＡ化されるＬｙｓ残基数が増す。すなわち、酸化ストレスの水準の高低に依存して、酸化ＬＤＬの血中濃度が変動するのみでなく、生成する酸化ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質中のＭＤＡ化Ｌｙｓ残基（ＭＤＡ化部位）の総数も変動することが予想される。
【００２８】
加えて、生成する酸化ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質において、Ｍｅｔ残基の側鎖−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ3のイオウ原子の酸化も進行する。酸化ストレスの水準が高くなるとともに、酸化を受けるＭｅｔ残基数が増す。すなわち、酸化ストレスの水準の高低に依存して、酸化ＬＤＬの血中濃度が変動するのみでなく、生成する酸化ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質中の酸化されたＭｅｔ残基（酸化部位）の総数も変動することも予想される。
【００２９】
その際、酸化ストレスの水準が低い状況下で生成される酸化ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質中に見出されるＭＤＡ化Ｌｙｓ残基は、酸化ストレスの水準が高い状況下で生成される酸化ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質中においても、同様にＭＤＡ化Ｌｙｓ残基となっている。一方、酸化ストレスの水準が低い状況下で生成される酸化ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質中では見出されない、複数個のＭＤＡ化Ｌｙｓ残基が、酸化ストレスの水準が高い状況下で生成される酸化ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質中には存在すると予想される。
【００３０】
同様に、酸化ストレスの水準が低い状況下で生成される酸化ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質中に見出される酸化化Ｍｅｔ残基（酸化部位）は、酸化ストレスの水準が高い状況下で生成される酸化ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質中においても、同様に酸化Ｍｅｔ残基となっている。一方、酸化ストレスの水準が低い状況下で生成される酸化ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質中では見出されない、複数個の酸化Ｍｅｔ残基が、酸化ストレスの水準が高い状況下で生成される酸化ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質中には存在すると予想される。
【００３１】
次に、報告されている、ヒト・ＭＤＡ−ＬＤＬに対するモノクローナル抗体（抗ＭＤＡ−ＬＤＬモノクローナル抗体）は、酸化ＬＤＬ中のＭＤＡ化ＡｐｏＢ１００タンパク質に選択的に結合することに着目した。具体的には、酸化ＬＤＬ中のＭＤＡ化ＡｐｏＢ１００タンパク質中に存在する、複数個のＭＤＡ化Ｌｙｓ残基のうち、特定のＭＤＡ化Ｌｙｓ残基が、該抗ＭＤＡ−ＬＤＬモノクローナル抗体のエピトープ中に含まれることに着目した。その際、該抗ＭＤＡ−ＬＤＬモノクローナル抗体が、酸化ストレスの水準が低い状況下で生成される酸化ＬＤＬ中のＭＤＡ化ＡｐｏＢ１００タンパク質と、酸化ストレスの水準が高い状況下で生成される酸化ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質の双方に結合する場合、エピトープ中に含まれる、特定のＭＤＡ化Ｌｙｓ残基は、酸化ストレスの水準の高低に依存せず、共通にＭＤＡ化を受けるＬｙｓ残基（共通ＭＤＡ化部位）の一つであると判断される。
【００３２】
従って、血液中に含まれる酸化ＬＤＬの定量に利用される、上記抗ＭＤＡ−ＬＤＬモノクローナル抗体は、酸化ストレスの水準の高低に依存せず、共通にＭＤＡ化を受けるＬｙｓ残基（共通ＭＤＡ化部位）の一つを、そのエピトープ中に含んでいると判断される。換言すると、上記抗ＭＤＡ−ＬＤＬモノクローナル抗体を捕獲抗体として使用する、免疫沈降法を適用すると、酸化ストレスの水準の高低に依存せず、共通にＭＤＡ化を受けるＬｙｓ残基（共通ＭＤＡ化部位）の一つを有するＭＤＡ化ＡｐｏＢ１００タンパク質を含んでいる酸化ＬＤＬ（ＭＤＡ−ＬＤＬ）を選択的に分離できると判断される。
【００３３】
一方、従来から、酸化ＬＤＬの血中濃度を測定する際には、採取された血液サンプルから、細胞成分を除去した、血漿（blood plasma）、あるいは、細胞成分、繊維素原、凝固因子を除去した、血清（blood serum）を調製する。次いで、該血漿サンプル、または、血清サンプル中に含まれる酸化ＬＤＬの濃度を、ＥＬＩＳＡ法により測定している。該血漿サンプル、または、血清サンプル中には、酸化されていないＬＤＬと、酸化ＬＤＬが含まれている。酸化ストレスの水準が高い状況下においても、酸化されていないＬＤＬの含有濃度ＣLDLと、酸化ＬＤＬの含有濃度ＣOxLDLの比率は、（ＣOxLDL／ＣLDL）＜１ｎｇ/μｇＬＤＬの範囲に留まる。実際、冠動脈病変枝数が高い、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）患者において測定される（ＣOxLDL／ＣLDL）AMIと、冠動脈病変枝数が低い、健常者において測定される（ＣOxLDL／ＣLDL）normalを比較すると、その平均値は、（ＣOxLDL／ＣLDL）AMI／（ＣOxLDL／ＣLDL）normalは３．５程度であると報告されている（非特許文献１参照）。
【００３４】
免疫沈降法を適用することで分離される、酸化ＬＤＬは、実際は、その酸化の程度にある範囲の分布を有する、酸化ＬＤＬの混合物となっている。酸化ストレスの水準の高低に依存して、生成される酸化ＬＤＬの混合物中における、酸化の程度の分布が相違している。その酸化の程度の分布の相違に起因して、生成する酸化ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質中のＭＤＡ化Ｌｙｓ残基の総数の分布、ならびに、酸化Ｍｅｔ残基の総数の分布に相違が生じていると予想される。
【００３５】
ビーズ担体、例えば、磁気ビーズの表面に、抗ＭＤＡ−ＬＤＬモノクローナル抗体を固定化した、抗体固定ビーズを用いる免疫沈降法を適用して、酸化ＬＤＬ中、ＭＤＡ−ＬＤＬを選択的に抗体に結合した後、固液分離によりビーズを回収し、洗浄すると、酸化ＬＤＬのうち、ＭＤＡ−ＬＤＬのみを分離することができる。
【００３６】
抗ＭＤＡ−ＬＤＬモノクローナル抗体に選択的に結合されている、酸化ＬＤＬ（ＭＤＡ−ＬＤＬ）は、ＭＤＡ化ＡｐｏＢ１００タンパク質と、酸化を受けた脂質とで構成されている。その際、結合されている酸化ＬＤＬ（ＭＤＡ−ＬＤＬ）に、切断部位特異性を有するプロテアーゼを用いた消化処理、例えば、トリプシン消化処理を施すと、ＭＤＡ化ＡｐｏＢ１００タンパク質はペプチド断片化される。生成される一群のペプチド断片は、液相中に溶出される。ＭＤＡ化ＡｐｏＢ１００タンパク質の断片化に伴い、液相に溶出する、一群のペプチド断片は、脂質成分とも分離される。固液分離により、液相とビーズを分離し、液相を回収すると、回収された液相中に、ＭＤＡ化ＡｐｏＢ１００タンパク質の酵素消化で生成する、一群のペプチド断片が回収される。ＡｐｏＢ１００タンパク質自体は、４５６３アミノ酸残基からなる巨大タンパク質であるため、ＡｐｏＢ１００タンパク質のトリプシン消化処理で生成する、一群のペプチド断片の総数は、４００種類を超える。
【００３７】
従って、一群のペプチド断片を全て分離した上で、個々のペプチド断片中に、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基（ＭＤＡ化部位）あるいは、酸化されたＭｅｔ残基（酸化部位）が存在するか、否かを判定することは、原理的には不可能ではないが、技術的には困難である。その点を考慮し、４００種類を超える一群のペプチド断片を、その等電点（ｐＩ）に基づき、複数のグループに分画すると、分画された個々のグループは、２０種類程度のペプチド断片からなる群とできることを見出した。また、各グループを構成する、２０種類程度のペプチド断片は、その等電点（ｐＩ）は類似しているが、偶々、分子量（Ｍpeptide）が一致している二種のペプチド断片が、同じグループに含まれる確率は、殆ど皆無であることに想到した。
【００３８】
従って、その等電点（ｐＩ）が類似している、各グループを構成する、２０種類程度のペプチド断片について、質量分析法を利用して、ペプチド断片の分子量（Ｍpeptide）を測定すると、各ペプチド断片は、（ｐI,Ｍpeptide）のペプチド断片として、検出できることを見出した。
【００３９】
その際、各ペプチド断片のアミノ酸配列は、ＡｐｏＢ１００タンパク質のアミノ酸配列中の部分アミノ酸配列である。例えば、トリプシン消化処理では、Ａｒｇ残基またはＬｙｓ残基のＣ末端側でペプチド鎖の切断がなされるので、各ペプチド断片のＣ末端のアミノ酸残基は、Ａｒｇ残基またはＬｙｓ残基であり、各ペプチド断片のＮ末端のアミノ酸残基は、ＡｐｏＢ１００タンパク質のアミノ酸配列中、Ａｒｇ残基またはＬｙｓ残基のＣ末側に位置するアミノ酸残基となっている。
【００４０】
ＡｐｏＢ１００タンパク質のアミノ酸配列中、前記の条件を満足する部分アミノ酸配列を選別して、該部分アミノ酸配列からなる「推定ペプチド断片」の一群を作製し、各「推定ペプチド断片」について、「部分アミノ酸配列」から推定される分子量（Ｍpredicted-peptide）を算出する。測定された（ｐＩ,Ｍpeptide）のペプチド断片の分子量（Ｍpeptide）と、測定誤差範囲内で一致する、「部分アミノ酸配列」から推定される分子量（Ｍpredicted-peptide）が見出されると、測定された（ｐＩ,Ｍpeptide）のペプチド断片のアミノ酸配列は、その「部分アミノ酸配列」であると、高い確度で推定できることを見出した。
【００４１】
一方、測定された（ｐＩ,Ｍpeptide）のペプチド断片が、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基（ＭＤＡ化部位）または酸化Ｍｅｔ残基（酸化部位）を含む場合、測定された分子量（Ｍpeptide）と、測定誤差範囲内で一致する、「部分アミノ酸配列」から推定される分子量（Ｍpredicted-peptide）が見出される確率は、殆ど皆無であることに想到した。換言すると、測定された（ｐＩ,Ｍpeptide）のペプチド断片のうち、測定された分子量（Ｍpeptide）と、測定誤差範囲内で一致する、「部分アミノ酸配列」から推定される分子量（Ｍpredicted-peptide）が見出されないものは、そのアミノ酸配列中に、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基（ＭＤＡ化部位）または酸化Ｍｅｔ残基（酸化部位）を含む可能性があることに想到した。測定された（ｐI,Ｍpeptide）のペプチド断片のうち、測定された分子量（Ｍpeptide）と、測定誤差範囲内で一致する、「部分アミノ酸配列」から推定される分子量（Ｍpredicted-peptide）が見出されないものは、そのアミノ酸配列中に、少なくとも、何らかの修飾を受けたアミノ酸残基を含む可能性が高いことに想到した。
【００４２】
酸化ストレスの水準の高低に依存して、生成される酸化ＬＤＬの混合物中における、酸化の程度の分布が相違している。その酸化の程度の分布の相違に起因して、生成する酸化ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質中のＭＤＡ化Ｌｙｓ残基の総数の分布、ならびに、酸化Ｍｅｔ残基の総数の分布に相違が生じていると予想される。
【００４３】
従って、酸化ストレスの水準の高低に依存して、酸化ＬＤＬ中、特に、ＭＤＡ−ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質に由来する、一群のペプチド断片中、そのアミノ酸配列中にＭＤＡ化Ｌｙｓ残基または酸化Ｍｅｔ残基を含んでいるペプチド断片（ｐＩ,Ｍpeptide）の含有濃度Ｃ（ｐＩ,Ｍpeptide）も、変動すると予測される。例えば、ＭＤＡ−ＬＤＬの含有濃度ＣMDA-LDLと、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基または酸化Ｍｅｔ残基を含んでいるペプチド断片（ｐＩ,Ｍpeptide）の含有濃度Ｃ（ｐＩ,Ｍpeptide）との比、（Ｃ（ｐＩ,Ｍpeptide）／ＣMDA-LDL）は、酸化ストレスの水準の高低に依存して、変動すると予測される。その際、酸化ストレスの水準の高低に依存せず、ＭＤＡ−ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質中に共通して見出される、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基または酸化Ｍｅｔ残基を含んでいるペプチド断片（ｐI,Ｍpeptide）では、（Ｃ（ｐＩ,Ｍpeptide）／ＣMDA-LDL）は、酸化ストレスの水準の高低に起因する変動は小さいと予想される。一方、酸化ストレスの水準の高低に依存して、ＭＤＡ−ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質中に見出される確率が大きく変動する、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基または酸化Ｍｅｔ残基を含んでいるペプチド断片（ｐＩ,Ｍpeptide）では、（Ｃ（ｐＩ,Ｍpeptide）／ＣMDA-LDL）は、酸化ストレスの水準の高低に起因する変動は大きいと予想される。
【００４４】
前記の予想を考慮して、本発明者らは、ＭＤＡ−ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質のアミノ酸配列中に、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基または酸化Ｍｅｔ残基を含む可能性があると推定されるペプチド断片（ｐＩ,Ｍpeptide）の群を選別し、さらに、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基または酸化Ｍｅｔ残基を含む可能性があると推定されるペプチド断片（ｐＩ,Ｍpeptide）の群のうち、（Ｃ（ｐＩ,Ｍpeptide）／ＣMDA-LDL）における、酸化ストレスの水準の高低に起因する変動が一定水準を超えている、部分群の選別を進めた。
【００４５】
その際、酸化ＬＤＬである、ＭＤＡ−ＬＤＬの１粒子には、ＡｐｏＢ１００タンパク質が１分子のみ含まれている点に着目して、ＭＤＡ−ＬＤＬの含有濃度ＣMDA-LDLの測定に代えて、ＭＤＡ−ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質分子の含有濃度ＣMDA-LDL-ApoB100と、ペプチド断片（ｐＩ,Ｍpeptide）の含有濃度Ｃ（ｐＩ,Ｍpeptide）との比、（Ｃ（ｐＩ,Ｍpeptide）／ＣMDA-LDL-ApoB100）を採ると、（Ｃ（ｐＩ,Ｍpeptide）／ＣMDA-LDL-ApoB100）＝（Ｃ（ｐＩ,Ｍpeptide）／ＣMDA-LDL）と見做すことが可能であることを見出した。
【００４６】
酸化ＬＤＬである、ＭＤＡ−ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質の酵素消化で生成する、総種類数Ｎpeptideの一群のペプチド断片（ｐＩ,Ｍpeptide）の含有濃度Ｃ（ｐＩ,Ｍpeptide）の平均値、Ｃ（ｐＩ,Ｍpeptide）av.＝（ΣＣ（ｐＩ,Ｍpeptide））／Ｎpeptideは、ＭＤＡ−ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質分子の含有濃度ＣMDA-LDL-ApoB100とほぼ等しくなる、すなわち、Ｃ（ｐＩ,Ｍpeptide）av.≒ＣMDA-LDL-ApoB100となる。
【００４７】
また、等電点電気泳動により、その等電点（ｐＩ）に基づき、グループ化した後、各グループを構成するペプチド断片の群から、質量分析によって、（ｐＩ,Ｍpeptide）のペプチド断片として分別された、（ｐＩ,Ｍpeptide）のペプチド断片由来のイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）は、該（ｐＩ,Ｍpeptide）のペプチド断片の含有濃度Ｃ（ｐＩ,Ｍpeptide）に比例している。（ｐＩ,Ｍpeptide）のペプチド断片から、該ペプチド断片由来のイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+の生成効率（イオン化効率）ｐ（ｐＩ,Ｍpeptide）を考慮すると、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）≒ｐ（ｐＩ,Ｍpeptide）・Ｃ（ｐＩ,Ｍpeptide）と近似的に表記できる。
【００４８】
総種類数Ｎpeptideの一群のペプチド断片（ｐＩ,Ｍpeptide）について、測定された該（ｐＩ,Ｍpeptide）のペプチド断片由来のイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+について、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）／ｐ（ｐＩ,Ｍpeptide）≒Ｃ（ｐＩ,Ｍpeptide）の平均値、｛Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）／ｐ（ｐＩ,Ｍpeptide）｝av.＝（Σ｛Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+））／ｐ（ｐＩ,Ｍpeptide）｝／Ｎpeptide≒（ΣＣ（ｐＩ,Ｍpeptide））／Ｎpeptideは、ＭＤＡ−ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質分子の含有濃度ＣMDA-LDL-ApoB100に比例する。すなわち、｛Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）／ｐ（ｐＩ,Ｍpeptide）｝av.∝ＣMDA-LDL-ApoB100の比例関係が成り立つ。
【００４９】
さらには、測定された該（ｐＩ,Ｍpeptide）のペプチド断片由来のイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）と、｛Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）／ｐ（ｐＩ,Ｍpeptide）｝av.の比；Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）／｛Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）／ｐ（ｐＩ,Ｍpeptide）｝av.は、（Ｃ（ｐＩ,Ｍpeptide）／ＣMDA-LDL-ApoB100）に比例する。すなわち、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）／｛Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）／ｐ（ｐＩ,Ｍpeptide）｝av.∝（Ｃ（ｐＩ,Ｍpeptide）／ＣMDA-LDL-ApoB100）の比例関係が成り立つ。
【００５０】
上記の比例関係を利用して、本発明者らは、（ｐＩ,Ｍpeptide）のペプチド断片由来のイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク位置m/Z＝（Ｍpeptide＋１）/１から特定される分子量（Ｍpeptide）に基づき、そのアミノ酸配列中に、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基または酸化Ｍｅｔ残基を含む可能性があると推定されるペプチド断片（ｐＩ,Ｍpeptide）の群を選別し、さらに、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基または酸化Ｍｅｔ残基を含む可能性があると推定されるペプチド断片（ｐＩ,Ｍpeptide）の群のうち、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）／Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）av.における、酸化ストレスの水準の高低に起因する変動が一定水準を超えている、部分群の選別を行った。Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）／Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）av.∝（Ｃ（ｐＩ,Ｍpeptide）／ＣMDA-LDL-ApoB100）の比例関係を考慮すると、選別される部分群は、（Ｃ（ｐＩ,Ｍpeptide）／ＣMDA-LDL）における、酸化ストレスの水準の高低に起因する変動が一定水準を超えている、部分群と実質的に等価となる。
【００５１】
特に、質量分析法として、Matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS)法を採用すると、トリプシン消化処理により得られる、そのＣ末端のアミノ酸残基は、Ａｒｇ残基またはＬｙｓ残基であるペプチド断片に由来する、イオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+の生成効率（イオン化効率）ｐ（ｐＩ,Ｍpeptide）は相対的に高い。そのため、測定された該（ｐＩ,Ｍpeptide）のペプチド断片由来のイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の測定確度も高くなることを確認した。
【００５２】
加えて、トリプシン消化処理により得られる、ペプチド断片は、Ａｒｇ残基またはＬｙｓ残基のＣ末端側で酵素消化されているため、原則的に、そのＣ末端のＡｒｇ残基またはＬｙｓ残基以外に塩基性アミノ酸残基を有していない。従って、トリプシン消化処理により得られる、ペプチド断片の等電点ｐＩは、概ね、塩基性アミノ酸のＡｒｇまたはＬｙｓのいずれか一つと、含まれている酸性アミノ酸のＡｓｐとＧｌｕの総数に依存する。その特徴を利用すると、含有される酸性アミノ酸の総数が０である部分群、含有される酸性アミノ酸の総数が１である部分群、含有される酸性アミノ酸の総数が２以上である部分群に区分でき、それぞれの部分群は、ｐＩに基づき、分離可能であることを確認した。すなわち、偶々、ペプチド断片の分子量（Ｍpeptide）が一致している場合、該ペプチド断片中に含有される酸性アミノ酸の総数が相違すると、そのｐＩは有意な差異を示すので、それぞれのペプチド断片（ｐＩ,Ｍpeptide）は、等電点電気泳動により、予め分離することが可能であることを確認した。
【００５３】
さらに、そのアミノ酸配列中に、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基を含む場合、トリプシン消化処理を施した際、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基のＣ末端側で酵素消化される確率は、ＭＤＡ化を受けていないＬｙｓ残基のＣ末端側で酵素消化される確率と比較して、有意に低くなることも確認した。従って、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基のＣ末端側で酵素消化を受けず、連続する二つのペプチド断片が連結された形状の、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基を内部に含有する特異なペプチド断片が得られることも確認した。すなわち、ＭＤＡ化の進行とともに、連続する二つのペプチド断片が連結された形状の、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基を内部に含有する特異なペプチド断片の濃度が相対的に上昇することも確認した。
【００５４】
一方、Ｌｙｓ残基がＭＤＡ化を受けていない場合、そのＬｙｓ残基のＣ末端側で酵素消化されない確率は、一般に低いため、連続する二つのペプチド断片が連結された形状のペプチド断片の濃度は、通常、低い水準に留まる。また、連続する二つのペプチド断片が連結された形状のペプチド断片と、連続する二つのペプチド断片が連結された形状の、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基を内部に含有する特異なペプチド断片とは、含まれる酸性アミノ酸の総数は等しいは、塩基性アミノ酸の数に相違があるため、その等電点（ｐＩ）は明確に相違している。従って、この二つのペプチド断片は、等電点電気泳動により、予め分離することが可能である。
【００５５】
同時に、ＭＤＡ化の進行とともに、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基のＣ末端側で酵素消化を受けることで生成するペプチド断片の濃度も、相対的に上昇することも確認した。但し、トリプシン消化処理を施した際、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基のＣ末端側で酵素消化される確率は、一般に低いため、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基のＣ末端側で酵素消化を受けることで生成するペプチド断片の濃度は、通常、低い水準に留まる。しかし、ＭＤＡ化の進行が顕著となると、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基のＣ末端側で酵素消化を受けることで生成するペプチド断片の濃度は、相当の水準に達する。ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基のＣ末端側で酵素消化を受けることで生成するペプチド断片は、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基を有していない、同じアミノ酸配列を有するペプチド断片と、含有する酸性アミノ酸の総数は同じであるが、Ｌｙｓ残基に代えて、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基を有しており、その等電点（ｐＩ）は酸性側に有意に偏移している。従って、この二つのペプチド断片は、等電点電気泳動により、予め分離することが可能である。
【００５６】
酸化Ｍｅｔ残基を含むペプチド断片と、酸化Ｍｅｔ残基を含まず、同じアミノ酸配列を有するペプチド断片は、含有する酸性アミノ酸の総数は等しいため、類似する等電点（ｐＩ）を示す。勿論、酸化Ｍｅｔ残基と酸化を受けていないＭｅｔ残基の質量は相違しているため、質量分析により、この二つのペプチド断片を区別することが可能である。Ｍｅｔ残基の酸化の進行とともに、酸化Ｍｅｔ残基を含むペプチド断片の濃度が上昇し、一方、酸化Ｍｅｔ残基を含まず、同じアミノ酸配列を有するペプチド断片の濃度は減少する。酸化Ｍｅｔ残基を含むペプチド断片の濃度上昇は、Ｍｅｔ残基の酸化の進行を反映する指標となる。
【００５７】
以上の点を考慮すると、そのアミノ酸配列中に、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基または酸化Ｍｅｔ残基を含むペプチド断片（ｐＩ,Ｍpeptide）のうち、特に、酸化Ｍｅｔ残基を含むペプチド断片、連続する二つのペプチド断片が連結された形状の、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基を内部に含有する特異なペプチド断片、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基のＣ末端側で酵素消化を受けることで生成するペプチド断片の濃度変化に基づき、酸化ストレスの水準の推定を行うことが可能であると判断した。
【００５８】
以上の検討の後、ヒトの血液中に含有される、ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質のうち、酸化ＬＤＬ、特には、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質中に存在するＭＤＡ化Ｌｙｓ残基、ならびに酸化Ｍｅｔ残基のうち、酸化ストレスの水準の差異に起因して、ＭＤＡ化を受ける確率が明確に変化するＭＤＡ化Ｌｙｓ残基、ならびに、酸化を受ける確率が明確に変化する明確に変化する酸化Ｍｅｔ残基の選別を行った。
【００５９】
「酸化ストレスの水準」に代えて、虚血性心疾患の病態の進行度、すなわち、冠動脈病変枝数（ACI-TIPI score）の評価結果が、冠動脈病変枝数３と判定された患者群から採血した血液サンプル、冠動脈病変枝数０と判定された健常者群から採血した血液サンプルを、それぞれ、「酸化ストレスが高水準」の血液サンプル、「酸化ストレスが低水準」の血液サンプルと見做す。「酸化ストレスが高水準」の血液サンプル中に含有される、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質と、「酸化ストレスが低水準」の血液サンプル中に含有される、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質を比較した際、ＭＤＡ化を受ける確率が明確に相違しているＭＤＡ化Ｌｙｓ残基（ＭＤＡ化部位）、ならびに、酸化を受ける確率が明確に相違している酸化Ｍｅｔ残基の選別を行った。
【００６０】
その際、ＭＤＡによる、Ｌｙｓ残基側鎖のアミノ基（−ＮＨ2）に対する修飾には、ＭＤＡ一分子が関与する修飾である、Ｌｙｓ残基のＭＤＡ化（−ＮＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨＯ）に加えて、ＭＤＡ複数分子が関与する修飾に相当する、Ｌｙｓ残基のＤＨＰ（dihydroxypyridine）化も存在することが確認された。Ｌｙｓ残基のＤＨＰ化は、ＭＤＡ複数分子が関与する修飾に相当しており、「酸化ストレスの水準」が高い場合に、起こると推断される。従って、「酸化ストレスが高水準」の血液サンプル中に含有される、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質と、「酸化ストレスが低水準」の血液サンプル中に含有される、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質を比較した際、ＤＨＰ化を受ける確率が明確に相違しているＤＨＰ化Ｌｙｓ残基（ＤＨＰ化部位）の選別も行った。
【００６１】
本発明者らは、上記の選別の結果、「酸化ストレスが高水準」の血液サンプル中に含有される、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質と、「酸化ストレスが低水準」の血液サンプル中に含有される、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質を比較した際、ＭＤＡ化を受ける確率が明確に相違しているＭＤＡ化Ｌｙｓ残基（ＭＤＡ化部位）、ＤＨＰ化を受ける確率が明確に相違しているＤＨＰ化Ｌｙｓ残基（ＤＨＰ化部位）、ならびに、酸化を受ける確率が明確に相違している酸化Ｍｅｔ残基（酸化部位）として、ＡｐｏＢ１００タンパク質のアミノ酸配列中、後述の表１−１、表１−２に示す、アミノ酸残基位置のＬｙｓ残基、ならびに、Ｍｅｔ残基を選別した。
【００６２】
すなわち、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、アミノ酸残基の酸化、ならびにＭＤＡによる修飾の進行の程度（酸化の進行度）を評価する際、採取されたＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質の中、表１−１、表１−２に示す、アミノ酸残基位置のＬｙｓ残基、ならびに、Ｍｅｔ残基において、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基、ＤＨＰ化Ｌｙｓ残基へと修飾、あるいは、酸化Ｍｅｔ残基へと酸化が生じている比率に基づき、「酸化の進行度」を高い確度で評価可能であることを見出した。
【００６３】
ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、アミノ酸残基の酸化、ならびにＭＤＡによる修飾の進行の程度（酸化の進行度）は、「酸化ストレスの水準」に依存しているので、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、「酸化の進行度」の評価結果に基づき、「酸化ストレスの水準」の高低を高い信頼性で推定することが可能であることを見出した。
【００６４】
さらに、「酸化ストレスの水準」は、冠動脈におけるアテローム性動脈硬化の進行に関連しており、「酸化ストレスの水準」の高低を高い信頼性で推定した結果は、冠動脈におけるアテローム性動脈硬化の進行の程度を評価する際、病態を反映する指標の一つとして利用可能である。すなわち、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、「酸化の進行度」の評価結果を、冠動脈におけるアテローム性動脈硬化の進行の程度を評価する際、「酸化ストレス」に由来する病態を反映する指標の一つとして利用可能であることを見出した。換言するならば、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、「酸化の進行度」の評価に利用可能な「ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質に由来するペプチド断片」は、心疾患の病態を反映するバイオマーカー、具体的には、冠動脈におけるアテローム性動脈硬化の進行の程度を反映するバイオマーカーとして利用可能であることを見出した。
【００６５】
本発明者らは、以上の述べた一連の知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【００６６】
まず、本発明の第一の形態は、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、アミノ酸残基の酸化、ならびにＭＤＡによる修飾の進行の程度（酸化の進行度）を評価する方法の発明である。
【００６７】
本発明の第一の形態の第一の態様にかかるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法は、
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法であって、
下記（工程１）〜（工程６）の工程を有しており、
（工程１）
抗ＭＤＡ−ＬＤＬモノクローナル抗体を利用する免疫沈降法を適用して、被験者から採取される血液サンプル中から、ＭＤＡ−ＬＤＬを分取する工程；
（工程２）
分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質に、トリプシンを作用させ、トリプシン酵素消化された、該ＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片の群を調製する工程；
（工程３）
等電点電気泳動法を適用し、トリプシン酵素消化された、該ＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片の群を、各ペプチド断片の等電点に従って、所定の等電点の区分に分画し、等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群に分離する工程；
（工程４）
等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群について、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片の質量（Ｍpeptide）を、質量分析手段として、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法を採用して測定し、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片を、その等電点（ｐＩ）と質量（Ｍpeptide）に基づき、それぞれ、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）と特定し、各ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）を測定する工程；
（工程５）
特定されたペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の一群中から、下記の表１−１に示すアミノ酸残基位置のＬｙｓ残基、ならびに、表１−２に示すアミノ酸残基位置のＭｅｔ残基からなる群より選択される、少なくとも一つのＬｙｓ残基またはＭｅｔ残基を含み、該Ｌｙｓ残基またはＭｅｔ残基が酸化を受けている、ＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片に相当する酸化ペプチド断片を少なくとも一つ選択する工程；
【００６８】
【表１−１】
0005857312.tif 000002
【００６９】
【表１−２】
0005857312.tif 000003
【００７０】
（工程６）
選択された酸化ペプチド断片に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の測定値、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）measuredに基づき、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する工程；
前記工程６において、酸化の進行度の評価は、
（サブ・ステップ６−１）
特定されたペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の一群に含まれるペプチド断片の種類の総数をＮtotal-peptideとし、特定されたペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の一群に含まれる、総数Ｎtotal-peptide種類のペプチド断片に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の測定値に基づき、平均化を行って、ピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の平均値、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）avを算出する工程；
（サブ・ステップ６−２）
選択された酸化ペプチド断片に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の測定値、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）measuredと、算出されたピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の平均値、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）avとを対比し、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質中において、選択された酸化ペプチド断片を内在する酸化ＡｐｏＢ１００タンパク質の含有比率を推定する工程；
（サブ・ステップ６−３）
分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質中における、選択された酸化ペプチド断片を内在する酸化ＡｐｏＢ１００タンパク質の含有比率が高いほど、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度は高いと評価する工程；
上記、（サブ・ステップ６−１）〜（サブ・ステップ６−３）の工程に基づき、酸化の進行度の評価を行う
ことを特徴とする、評価方法である。
【００７１】
本発明の第一の形態の第二の態様にかかるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法は、
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法であって、
下記（工程１）〜（工程６）の工程を有しており、
（工程１）
抗ＭＤＡ−ＬＤＬモノクローナル抗体を利用する免疫沈降法を適用して、被験者から採取される血液サンプル中から、ＭＤＡ−ＬＤＬを分取する工程；
（工程２）
分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質に、トリプシンを作用させ、トリプシン酵素消化された、該ＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片の群を調製する工程；
（工程３）
等電点電気泳動法を適用し、トリプシン酵素消化された、該ＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片の群を、各ペプチド断片の等電点に従って、所定の等電点の区分に分画し、等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群に分離する工程；
（工程４）
等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群について、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片の質量（Ｍpeptide）を、質量分析手段として、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法を採用して測定し、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片を、その等電点（ｐＩ）と質量（Ｍpeptide）に基づき、それぞれ、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）と特定し、各ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）を測定する工程；
（工程５）
特定されたペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の一群中から、下記の表２に示すアミノ酸残基を含むペプチド断片からなる群より選択される、ペプチド断片を少なくとも一つ選択する工程；
【００７２】
【表２】
0005857312.tif 000004
【００７３】
（工程６）
選択されたペプチド断片に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の測定値、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）measuredに基づき、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する工程；
前記工程６において、酸化の進行度の評価は、
（サブ・ステップ６−１）
特定されたペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の一群に含まれるペプチド断片の種類の総数をＮtotal-peptideとし、特定されたペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の一群に含まれる、総数Ｎtotal-peptide種類のペプチド断片に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の測定値に基づき、平均化を行って、ピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の平均値、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）avを算出する工程；
（サブ・ステップ６−２）
選択されたペプチド断片に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の測定値、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）measuredと、算出されたピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の平均値、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）avとを対比し、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質中において、選択されたペプチド断片をトリプシン消化により生成する酸化ＡｐｏＢ１００タンパク質の含有比率を推定する工程；
（サブ・ステップ６−３）
分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質中における、選択されたペプチド断片をトリプシン消化により生成する酸化ＡｐｏＢ１００タンパク質の含有比率が高いほど、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度は高いと評価する工程；
上記、（サブ・ステップ６−１）〜（サブ・ステップ６−３）の工程に基づき、酸化の進行度の評価を行う
ことを特徴とする、評価方法である。
【００７４】
本発明の第一の形態の第三の態様にかかるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法は、
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法であって、
下記（工程１）〜（工程６）の工程を有しており、
（工程１）
抗ＭＤＡ−ＬＤＬモノクローナル抗体を利用する免疫沈降法を適用して、被験者から採取される血液サンプル中から、ＭＤＡ−ＬＤＬを分取する工程；
（工程２）
分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質に、トリプシンを作用させ、トリプシン酵素消化された、該ＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片の群を調製する工程；
（工程３）
等電点電気泳動法を適用し、トリプシン酵素消化された、該ＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片の群を、各ペプチド断片の等電点に従って、所定の等電点の区分に分画し、等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群に分離する工程；
（工程４）
等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群について、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片の質量（Ｍpeptide）を、質量分析手段として、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法を採用して測定し、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片を、その等電点（ｐＩ）と質量（Ｍpeptide）に基づき、それぞれ、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）と特定し、各ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）を測定する工程；
（工程５）
特定されたペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の一群中から、下記の表３に示すＭＤＡ化Ｌｙｓ残基をその内部に含むペプチド断片、表４に示すＤＨＰ化Ｌｙｓ残基をその内部に含むペプチド断片、表５に示すＭＤＡ化Ｌｙｓ残基をそのＣ末端に含むペプチド断片、ならびに、表６に示す酸化されたＭｅｔ残基を含むペプチド断片からなる群より選択される、少なくともＬｙｓ残基またはＭｅｔ残基が酸化を受けているペプチド断片に相当する酸化ペプチド断片を少なくとも一つ選択する工程；
【００７５】
【表３】
0005857312.tif 000005
【００７６】
【表４】
0005857312.tif 000006
【００７７】
【表５】
0005857312.tif 000007
【００７８】
【表６】
0005857312.tif 000008
【００７９】
（工程６）
選択された酸化ペプチド断片に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の測定値、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）measuredに基づき、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する工程；
前記工程６において、酸化の進行度の評価は、
（サブ・ステップ６−１）
特定されたペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の一群に含まれるペプチド断片の種類の総数をＮtotal-peptideとし、特定されたペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の一群に含まれる、総数Ｎtotal-peptide種類のペプチド断片に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の測定値に基づき、平均化を行って、ピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の平均値、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）avを算出する工程；
（サブ・ステップ６−２）
選択された酸化ペプチド断片に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の測定値、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）measuredと、算出されたピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の平均値、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）avとを対比し、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質中において、選択された酸化ペプチド断片を内在する酸化ＡｐｏＢ１００タンパク質の含有比率を推定する工程；
（サブ・ステップ６−３）
分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質中における、選択された酸化ペプチド断片を内在する酸化ＡｐｏＢ１００タンパク質の含有比率が高いほど、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度は高いと評価する工程；
上記、（サブ・ステップ６−１）〜（サブ・ステップ６−３）の工程に基づき、酸化の進行度の評価を行う
ことを特徴とする、評価方法である。
【００８０】
本発明の第一の形態の第三の態様にかかるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法において、
工程５において、選択される酸化ペプチド断片の少なくとも一つは、
前記表３に示すＭＤＡ化Ｌｙｓ残基をその内部に含むペプチド断片の一群から選択することが好ましい。
【００８１】
本発明の第一の形態の評価方法において、
工程１における、免疫沈降法によるＭＤＡ−ＬＤＬの分取に利用される、抗ＭＤＡ−ＬＤＬモノクローナル抗体は、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＭＤＡ化を受けたＡｐｏＢ１００タンパク質に特異的なモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００８２】
また、工程３における、等電点電気泳動法を適用するペプチド断片の分画は、等電点タンパク質分離チップを利用して実施することができる。
【００８３】
次ぎに、本発明の第二の形態は、上記の本発明の第一の形態にかかる「ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、アミノ酸残基の酸化、ならびにＭＤＡによる修飾の進行の程度（酸化の進行度）を評価する方法」を利用して、「ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度」を評価し、その「酸化の進行度」の評価結果に基づき、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬがＬＤＬから生成される過程の「酸化ストレスの水準」の高低を推定する方法の発明である。
【００８４】
本発明の第二の形態の第一の態様にかかるＭＤＡ−ＬＤＬがＬＤＬから生成される過程の「酸化ストレスの水準」の高低を推定する方法は、
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該ＭＤＡ−ＬＤＬがＬＤＬから生成される過程の酸化ストレスの水準の高低を推定する方法であって、
下記の工程Ａと工程Ｂを含み
（工程Ａ）
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度の評価を、上記本発明の第一の形態の第一の態様にかかるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法を利用して行う工程；
（工程Ｂ）
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該ＭＤＡ−ＬＤＬがＬＤＬから生成される過程において、該ＭＤＡ−ＬＤＬの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準の高低を推定する工程；
前記工程Ｂにおいて、酸化ストレスの水準の推定は、
分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質中における、酸化の進行度が高いほど、該ＭＤＡ−ＬＤＬがＬＤＬから生成される過程において、該ＭＤＡ−ＬＤＬの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準は高いと推定する
ことを特徴とする、推定方法である。
【００８５】
本発明の第二の形態の第二の態様にかかるＭＤＡ−ＬＤＬがＬＤＬから生成される過程の「酸化ストレスの水準」の高低を推定する方法は、
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該ＭＤＡ−ＬＤＬがＬＤＬから生成される過程の酸化ストレスの水準の高低を推定する方法であって、
下記の工程Ａと工程Ｂを含み
（工程Ａ）
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度の評価を、上記本発明の第一の形態の第二の態様にかかるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法を利用して行う工程；
（工程Ｂ）
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該ＭＤＡ−ＬＤＬがＬＤＬから生成される過程において、該ＭＤＡ−ＬＤＬの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準の高低を推定する工程；
前記工程Ｂにおいて、酸化ストレスの水準の推定は、
分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質中における、酸化の進行度が高いほど、該ＭＤＡ−ＬＤＬがＬＤＬから生成される過程において、該ＭＤＡ−ＬＤＬの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準は高いと推定する
ことを特徴とする、推定方法である。
【００８６】
本発明の第二の形態の第三の態様にかかるＭＤＡ−ＬＤＬがＬＤＬから生成される過程の「酸化ストレスの水準」の高低を推定する方法は、
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該ＭＤＡ−ＬＤＬがＬＤＬから生成される過程の酸化ストレスの水準の高低を推定する方法であって、
下記の工程Ａと工程Ｂを含み
（工程Ａ）
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度の評価を、上記本発明の第一の形態の第三の態様にかかるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法を利用して行う工程；
（工程Ｂ）
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該ＭＤＡ−ＬＤＬがＬＤＬから生成される過程において、該ＭＤＡ−ＬＤＬの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準の高低を推定する工程；
前記工程Ｂにおいて、酸化ストレスの水準の推定は、
分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質中における、酸化の進行度が高いほど、該ＭＤＡ−ＬＤＬがＬＤＬから生成される過程において、該ＭＤＡ−ＬＤＬの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準は高いと推定する
ことを特徴とする、推定方法である。
【００８７】
本発明の第三の形態は、心疾患、特には、虚血性心疾患の主要因である、冠動脈におけるアテローム性動脈硬化の進行の程度を評価する際、病態を反映する指標の一つとして、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を使用する方法である。具体的には、冠動脈におけるアテローム性動脈硬化の進行の程度の評価に先立ち、被験者の病態を把握する目的で実施する、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する際、該酸化の進行度の評価に適する、ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の酸化ペプチド断片を、その評価に利用するマーカーとして選択する方法の発明である。
【００８８】
従って、本発明の第三の形態は、「心疾患診断に利用可能な診断マーカーの選択方法」に相当する発明であり、より具体的には、心疾患の診断に先立ち、被験者の病態を把握する目的で実施する、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する際、該評価に利用するマーカーとして、該酸化の進行度の評価に適する、ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の酸化ペプチド断片を選択する方法の発明である。
【００８９】
本発明の第三の形態の第一の態様にかかる「心疾患診断に利用可能な診断マーカーの選択方法」は、
心疾患の診断に先立ち、被験者の病態を把握する目的で実施する、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する際、該評価に利用するマーカーとして、該酸化の進行度の評価に適する、ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の酸化ペプチド断片を選択する方法であって、
前記評価に利用するマーカーとして、
下記の表７−１に示すアミノ酸残基位置のＬｙｓ残基、ならびに、表７−２に示すアミノ酸残基位置のＭｅｔ残基からなる群より選択される、少なくとも一つのＬｙｓ残基またはＭｅｔ残基を含み、該Ｌｙｓ残基またはＭｅｔ残基が酸化を受けている、ＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片に相当する酸化ペプチド断片を少なくとも一つ選択する
【００９０】
【表７−１】
0005857312.tif 000009
【００９１】
【表７−２】
0005857312.tif 000010
【００９２】
ことを特徴とする、マーカーの選択方法である。
【００９３】
本発明の第三の形態の第二の態様にかかる「心疾患診断に利用可能な診断マーカーの選択方法」は、
心疾患の診断に先立ち、被験者の病態を把握する目的で実施する、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する際、該評価に利用するマーカーとして、該酸化の進行度の評価に適する、ＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片を選択する方法であって、
前記評価に利用するマーカーとして、
下記の表８に示すアミノ酸残基を含むペプチド断片からなる群より選択される、ペプチド断片を少なくとも一つ選択する
【００９４】
【表８】
0005857312.tif 000011
【００９５】
ことを特徴とする、マーカーの選択方法である。
【００９６】
本発明の第三の形態の第三の態様にかかる「心疾患診断に利用可能な診断マーカーの選択方法」は、
心疾患の診断に先立ち、被験者の病態を把握する目的で実施する、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する際、該評価に利用するマーカーとして、該酸化の進行度の評価に適する、ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の酸化ペプチド断片を選択する方法であって、
前記評価に利用するマーカーとして、
下記の表９に示すＭＤＡ化Ｌｙｓ残基をその内部に含むペプチド断片、表１０に示すＤＨＰ化Ｌｙｓ残基をその内部に含むペプチド断片、表１１に示すＭＤＡ化Ｌｙｓ残基をそのＣ末端に含むペプチド断片、ならびに、表１２に示す酸化されたＭｅｔ残基を含むペプチド断片からなる群より選択される、少なくともＬｙｓ残基またはＭｅｔ残基が酸化を受けているペプチド断片に相当する酸化ペプチド断片を少なくとも一つ選択する
【００９７】
【表９】
0005857312.tif 000012
【００９８】
【表１０】
0005857312.tif 000013
【００９９】
【表１１】
0005857312.tif 000014
【０１００】
【表１２】
0005857312.tif 000015
【０１０１】
ことを特徴とする、マーカーの選択方法である。
【０１０２】
本発明の第一の形態の第三の態様にかかる「心疾患診断に利用可能な診断マーカーの選択方法」において、
選択される酸化ペプチド断片の少なくとも一つは、
前記表９に示すＭＤＡ化Ｌｙｓ残基をその内部に含むペプチド断片の一群から選択することが好ましい。
【発明の効果】
【０１０３】
本発明の方法によれば、血清・血漿などの比較的患者の精神的・肉体的負担のかからないサンプルから心疾患の病態にかかわるバイオマーカーを迅速かつ容易に検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】本発明の第三の形態にかかる「心疾患診断に利用可能な診断マーカーの選択方法」における「診断マーカー」として利用可能な酸化ペプチド断片の一群、すなわち、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する際、該酸化の進行度の評価に適する、ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の酸化ペプチド断片の一群を探索する過程に採用した、探索プロセスのステップ構成を模式的に示す図である。
【図２】図１に示す「診断マーカー」として利用可能な酸化ペプチド断片の一群の探索プロセスのステップ構成中、「サンプル前処理」１０１のステップを実施する際に採用した一連のサブ・ステップの構成を模式的に示す図である。
【図３】図１に示す「診断マーカー」として利用可能な酸化ペプチド断片の一群の探索プロセスのステップ構成中、「等電点電気泳動」１０２のステップを実施する際に採用した、「等電点タンパク質分離チップ」の構成を模式的に示す図である。
【図４】図１に示す「診断マーカー」として利用可能な酸化ペプチド断片の一群の探索プロセスのステップ構成中、「等電点電気泳動」１０２のステップを実施する際、「等電点タンパク質分離チップ」を用いる等電点電気泳動に適合する電気泳動装置、ならびに、「等電点タンパク質分離チップ」中に保持した状態での凍結乾燥処理に適合する乾燥装置とで構成される、「等電点タンパク質分離チップ」に適合する電気泳動装置・乾燥装置の全体構成を模式的に示す図である。
【図５】図３にその構成を模式的に示した「等電点タンパク質分離チップ」の具体例を例示する図であり、複数の流路を具える「等電点タンパク質分離チップ」の構成の一例を示す図である。
【図６】図４にその全体構成を模式的に示した、「等電点タンパク質分離チップ」に適合する電気泳動装置・乾燥装置の具体例を例示する図であり、該装置の外観を示す画像である。
【図７】図１に示す「診断マーカー」として利用可能な酸化ペプチド断片の一群の探索プロセスのステップ構成中、「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ質量分析」１０３のステップにおいて、「等電点電気泳動」により分画された「単一の区画（ｐＩ）」に含まれる、複数種のペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク位置（m/z）peakを、測定される「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ質量分析」スペクトルに基づき、特定する操作、ならびに、そのピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）を求める操作を模式的に示す図である。
【図８】図１に示す「診断マーカー」として利用可能な酸化ペプチド断片の一群の探索プロセスのステップ構成中、「サンプルプロファイニング」１０４のステップにおいて、「等電点電気泳動」１０２のステップにおける、各ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）のスポットの「流路方向の拡がり」の状況を、連続した「単一の区画（ｐＩ）」複数において、測定された「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ質量分析」スペクトルの信号強度Ｉ（ｐＩ，m/z）を、（ｐＩ，m/z）面上にプロットし、各ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）のスポット中心のｐＩmeanを決定し、各ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+を特定する（ｐＩmean，（m/z）peak）と、該イオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のトータル・ピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）totalを求める操作を模式的に示す図である。
【図９】表２中に、「心疾患診断に利用可能な診断マーカー」として利用可能なペプチド断片として記載する、m/z＝1306のイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+を与える、ＡｐｏＢ１００タンパク質のトリプシン酵素消化により生成する、Ｌｙｓ残基とＭｅｔ残基を含まないアミノ酸配列IISDYHQQFRのペプチド断片（アミノ酸番号4487-4496の断片）について、虚血性心疾患と診断された患者群（冠動脈病変枝数３）１０名、非患者群（冠動脈病変枝数０）２３名、合計３３名に由来するサンプルおける、該m/z＝1306のイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+の正規化ピーク強度に付いて、合計３３名に由来するサンプル群中において、Ｚスコア化した値（Ｚスコア）を、患者群（冠動脈病変枝数３）１０名に由来するサンプル、非患者群（冠動脈病変枝数０）２３名に由来するサンプルの二つの部分群に区分して、プロットしたグラフであり、前記二つの部分群間において、Ｚスコア化した値（Ｚスコア）の分布に統計的に有意な差異があることを示す図である。
【図１０】マロンジアルデヒドによる、Ｌｙｓ側鎖のアミノ基（−ＮＨ2）に対する修飾、具体的には、ＭＤＡ一分子が関与する修飾である、アミノ基（−ＮＨ2）のＭＤＡ化により生成するＭＤＡ化Ｌｙｓ、ならびに、ＭＤＡ二分子が関与する修飾に相当する、アミノ基（−ＮＨ2）のＤＨＰ（dihydroxypyridine）化により生成するＤＨＰ化Ｌｙｓの分子構造を示す図である。
【図１１−１】ＡｐｏＢ１００タンパク質のアミノ酸配列中、１〜１０００番目の範囲を示す図である。
【図１１−２】ＡｐｏＢ１００タンパク質のアミノ酸配列中、１００１〜２０００番目の範囲を示す図である。
【図１１−３】ＡｐｏＢ１００タンパク質のアミノ酸配列中、２００１〜３０００番目の範囲を示す図である。
【図１１−４】ＡｐｏＢ１００タンパク質のアミノ酸配列中、３００１〜４０００番目の範囲を示す図である。
【図１１−５】ＡｐｏＢ１００タンパク質のアミノ酸配列中、４００１〜４５６３番目の範囲を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１０５】
以下に、本発明の第一の形態〜第三の形態に関して、より詳しく説明する。
【０１０６】
まず、本発明の第一の形態〜第三の形態は、いずれも、本発明者らが、心疾患、特には、虚血性心疾患の主要因である、冠動脈におけるアテローム性動脈硬化の進行の程度を評価する際、病態を反映する指標の一つとして、新たに見出した「心疾患診断マーカー」を利用する発明に相当している。
【０１０７】
本発明において利用されている「心疾患診断マーカー」は、下記の探索手順により、患者（被験者）における、虚血性心疾患の病態の進行度を反映して、明確な「量的変化」を示す「マーカー」として特定されたものである。具体的には、虚血性心疾患の病態の進行度の高い患者（被験者）群、具体的には、冠動脈病変枝数３と判定された患者群と、冠動脈病変枝数０と判定された健常者（非患者）群を比較した際、健常者（非患者）群において検出される量を基準として、患者群において検出される量は、「有意に高い」、または、「有意に低い」という、統計学的検定結果を示す「マーカー」として特定されたものである。
【０１０８】
本発明において利用されている「心疾患診断マーカー」と、その探索手順、ならびに、特定された「心疾患診断マーカー」が、実際に、健常者（非患者）群において検出される量を基準として、患者群において検出される量は、「有意に高い」、または、「有意に低い」という、統計学的検定の結果について、より詳しく説明する。
【０１０９】
本発明者らは、虚血性心疾患の病態の進行度を反映する指標として、被験者から採血した血液中における、酸化されていないＬＤＬの含有濃度ＣLDLと、酸化ＬＤＬの含有濃度ＣOxLDLの比率、（ＣOxLDL/ＣLDL）が、実際に利用可能であると、既に検証がなされている点に着目した（非特許文献１参照）。加えて、酸化ＬＤＬ、特には、ＭＤＡ−ＬＤＬが、動脈硬化の初期病変に関与していることを査証する結果が報告されている点にも着目した（非特許文献２参照）。従って、虚血性心疾患の病態の進行度、具体的には、冠動脈におけるアテローム性動脈硬化の進行の程度を反映する指標として、被験者から採血した血液中における、ＭＤＡ−ＬＤＬの含有濃度ＣMDA-LDLと、酸化されていないＬＤＬの含有濃度ＣLDLの比率も、利用可能であると判断した。
【０１１０】
その際、体内において、ＬＤＬから、ＭＤＡ−ＬＤＬが生成される過程では、ＬＤＬの酸化に伴って生成される、ＭＤＡがＬＤＬ中に含有されるＡｐｏＢ１００タンパク質、特に、該ＡｐｏＢ１００タンパク質中のＬｙｓ残基に作用し、Ｌｙｓ残基側鎖のアミノ基（−ＮＨ2）に対する修飾が起こる。具体的には、Ｌｙｓ残基は、図１０に示すように、ＭＤＡ一分子が関与する修飾である、アミノ基（−ＮＨ2）のＭＤＡ化により生成するＭＤＡ化Ｌｙｓ残基、あるいは、ＭＤＡ複数分子が関与する修飾に相当する、アミノ基（−ＮＨ2）のＤＨＰ（dihydroxypyridine）化により生成するＤＨＰ化Ｌｙｓ残基に変換される。
【０１１１】
「酸化ストレス」によって、ＬＤＬの酸化が進行するため、ＬＤＬ中に含有されるＡｐｏＢ１００タンパク質中のアミノ酸残基、例えば、Ｍｅｔ残基側鎖の−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ3の酸化も進行し、−ＣＨ2−ＳＯ−ＣＨ3（一酸化体：Ｍｅｔ（Ｏ））、ならびに、−ＣＨ2−ＳＯ2−ＣＨ3（二酸化体：Ｍｅｔ（Ｏ2））に変換される。
【０１１２】
「酸化ストレス」の水準が高いほど、ＬＤＬの酸化が進行するため、ＭＤＡ−ＬＤＬの生成量は増加し、同時に、生成したＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質における、ＭＤＡによる修飾量、具体的には、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基、ＤＨＰ化Ｌｙｓ残基の含有比率も増加する。勿論、「酸化ストレス」の水準が高いほど、生成したＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化修飾を受けたＭｅｔ残基の含有比率も増加する。
【０１１３】
本発明者らは、被験者から採血した血液中に含有される、ＭＤＡ−ＬＤＬを分取し、分取されたＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質における、ＭＤＡによる修飾量、具体的には、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基、ＤＨＰ化Ｌｙｓ残基の含有比率の測定結果に基づき、ＬＤＬからＭＤＡ−ＬＤＬが生成する過程において、「酸化ストレス」の水準が高い環境であったか、「酸化ストレス」の水準が低い環境であったかを、判定することが可能であることに想到した。この手法では、被験者から採血した血液中に含有される、ＭＤＡ−ＬＤＬを全量回収する必要はなく、ＭＤＡ−ＬＤＬの一部をサンプリングし、このサンプル中に含まれるＭＤＡ−ＬＤＬについて、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基、ＤＨＰ化Ｌｙｓ残基の含有比率、あるいは、酸化修飾を受けたＭｅｔ残基の含有比率を測定する形態を利用できる。
【０１１４】
ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質は、三次構造を形成しており、ＡｐｏＢ１００タンパク質中に含まれる、複数のＬｙｓ残基のうち、三次構造の内部に位置するものは、ＭＤＡによる修飾を受けず、三次構造の表面に露呈しているＬｙｓ残基が、ＭＤＡによる修飾を受ける。また、ＡｐｏＢ１００タンパク質中に含まれる、複数のＭｅｔ残基のうち、三次構造の内部に位置するものは、酸化修飾を受けず、三次構造の表面に露呈しているＭｅｔ残基が、酸化修飾を受ける。
【０１１５】
さらには、ＡｐｏＢ１００タンパク質の三次構造表面に露呈している、複数個のＬｙｓ残基のうちでも、ＭＤＡによる修飾を受ける確率に差異が存在するため、「酸化ストレス」の水準の高低に依存して、ＡｐｏＢ１００タンパク質全体において、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基、ＤＨＰ化Ｌｙｓ残基の含有比率が変化する。また、ＡｐｏＢ１００タンパク質の三次構造表面に露呈している、複数個のＭｅｔ残基のうちでも、酸化修飾を受ける確率に差異が存在するため、「酸化ストレス」の水準の高低に依存して、ＡｐｏＢ１００タンパク質全体において、酸化修飾を受けたＭｅｔ残基の含有比率が変化する。
【０１１６】
換言すると、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質全体における、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基、ＤＨＰ化Ｌｙｓ残基の含有比率の測定結果に代えて、ＡｐｏＢ１００タンパク質の三次構造表面に露呈している、複数個のＬｙｓ残基のうち、「酸化ストレス」の水準の高低に依存して、ＭＤＡによる修飾を受ける確率が明確に変動する、特定のＬｙｓ残基部位を選別し、その選別されたＬｙｓ残基部位における、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基、あるいは、ＤＨＰ化Ｌｙｓ残基へ変換される比率の測定結果に基づき、ＬＤＬからＭＤＡ−ＬＤＬが生成する過程におえる「酸化ストレス」の水準の高低を、判定することが可能であることに想到した。また、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質全体における、酸化修飾を受けたＭｅｔ残基の含有比率の測定結果に代えて、ＡｐｏＢ１００タンパク質の三次構造表面に露呈している、複数個のＭｅｔ残基のうち、「酸化ストレス」の水準の高低に依存して、酸化修飾を受ける確率が明確に変動する、特定のＭｅｔ残基部位を選別し、その選別されたＭｅｔ残基部位における、酸化修飾を受けたＭｅｔ残基へ変換される比率の測定結果に基づき、ＬＤＬからＭＤＡ−ＬＤＬが生成する過程におえる「酸化ストレス」の水準の高低を、判定することが可能であることに想到した。
【０１１７】
加えて、ＡｐｏＢ１００タンパク質全体において、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基、ＤＨＰ化Ｌｙｓ残基の含有比率が増加すると、本来トリプシン消化を受け易い切断部位のＬｙｓ残基が、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基、ＤＨＰ化Ｌｙｓ残基に変換される確率が上昇する。その際、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基、ＤＨＰ化Ｌｙｓ残基への変換に起因して、かかる本来トリプシン消化を受け易い部位におけるトリプシン消化の確率は減少する。一方、かかる部位の周囲に存在する、Ｌｙｓ残基、Ａｒｇ残基におけるトリプシン消化の確率は、相対的に上昇する場合があることに想到した。換言すると、「酸化ストレス」の水準の高低に依存して、本来トリプシン消化を受け易い切断部位のＬｙｓ残基が酸化修飾を受ける確率が明確に変動する結果、該部位の周囲に存在する、Ｌｙｓ残基、Ａｒｇ残基におけるトリプシン消化効率の変動が誘起される場合がある。従って、「酸化ストレス」の水準の上昇により誘起される、前記トリプシン消化効率の相対的上昇に伴って、生成効率が上昇するペプチド断片の量の相対的変化の測定結果に基づき、ＬＤＬからＭＤＡ−ＬＤＬが生成する過程におえる「酸化ストレス」の水準の高低を、判定することが可能であることに想到した。なお、前記トリプシン消化効率の相対的上昇に伴って、生成効率が上昇するペプチド断片自体は、そのＣ末端は、修飾を受けていないＬｙｓ残基、Ａｒｇ残基であり、さらに、該ペプチド断片中にＭＤＡ化Ｌｙｓ残基、ＤＨＰ化Ｌｙｓ残基、あるいは、酸化修飾を受けたＭｅｔ残基を内在している必要は無いことにも想到した。
【０１１８】
例えば、後述する表１３に記載する「ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基、ＤＨＰ化Ｌｙｓ残基、ならびに、酸化修飾を受けたＭｅｔ残基を含んでいない」ペプチド断片であっても、「酸化ストレス」の水準の上昇に伴って、該ペプチド断片の周囲に存在する、Ｌｙｓ残基、Ａｒｇ残基におけるトリプシン消化効率の変動が誘起されると、かかるペプチド断片の生成効率が相対的に上昇することがあることにも想到した。
【０１１９】
本発明において利用されている「心疾患診断マーカー」は、前記の選別基準に基づき、「酸化ストレス」の水準の高低に依存して、当該アミノ酸残基部位における、ＭＤＡによる修飾を受ける確率、あるいは、酸化修飾を受ける確率が明確に変動する部位として選別された、特定のアミノ酸残基部位を含む、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片の一群に相当している。
【０１２０】
本発明において利用されている「心疾患診断マーカー」である、前述の特定のアミノ酸残基部位を含む、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片における、当該アミノ酸残基部位における、ＭＤＡによる修飾を受けている確率、あるいは、酸化修飾を受けている確率の測定結果は、勿論、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を反映している。
【０１２１】
従って、本発明の第一の形態は、「心疾患診断マーカー」として選別された、特定のアミノ酸残基部位を含むペプチド断片における、当該アミノ酸残基部位における、ＭＤＡによる修飾を受けている確率、あるいは、酸化修飾を受けている確率の測定結果に基づき、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、アミノ酸残基の酸化、ならびにＭＤＡによる修飾の進行の程度（酸化の進行度）を評価する方法の発明である。
【０１２２】
本発明の第二の形態は、「心疾患診断マーカー」として選別された、特定のアミノ酸残基部位を含むペプチド断片における、当該アミノ酸残基部位における、ＭＤＡによる修飾を受けている確率、あるいは、酸化修飾を受けている確率の測定結果に基づき、「酸化の進行度」を評価し、その「酸化の進行度」の評価結果を利用して、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬがＬＤＬから生成される過程の「酸化ストレスの水準」の高低を推定する方法の発明である。すなわち、本発明の第二の形態にかかる「酸化ストレスの水準」の高低を推定する方法は、評価対象の血液サンプルを採取した被験者の体内の「酸化ストレスの水準」の高低を推定する方法に相当している。
【０１２３】
本発明の第三の形態は、心疾患、特には、虚血性心疾患の主要因である、冠動脈におけるアテローム性動脈硬化の進行の程度を評価する際、病態を反映する指標の一つとして、被験者の体内の「酸化ストレスの水準」の高低の推定結果を利用することを意図した発明である。その際、本発明の第三の形態では、前記本発明の第二の形態にかかる「酸化ストレスの水準」の高低を推定する方法、すなわち、評価対象の血液サンプルを採取した被験者の体内の「酸化ストレスの水準」の高低を推定する方法を適用して、被験者の体内の「酸化ストレスの水準」の高低の推定を行う。本発明の第二の形態では、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価し、その「酸化の進行度」の評価結果に基づき、「酸化ストレスの水準」の高低の推定を行う。本発明の第二の形態にかかる「酸化の進行度」の評価方法では、上記の選別基準に基づき、選別された、特定のアミノ酸残基部位を含むペプチド断片を、「酸化の進行度」の評価に適合する「マーカー」として利用している。
【０１２４】
本発明の第三の形態は、冠動脈におけるアテローム性動脈硬化の進行の程度の評価に先立ち、被験者の病態を把握する目的で実施する、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する際、その評価に利用する「マーカー」を、上記の選別基準に基づき、選別された、特定のアミノ酸残基部位を含むペプチド断片の一群から、選択する方法の発明である。従って、本発明の第三の形態は、上記の選別基準に基づき、選別された「心疾患診断マーカー」の一群から、「心疾患診断に利用可能な診断マーカーを選択する方法」に相当している。
【０１２５】
冠動脈におけるアテローム性動脈硬化の進行の程度の評価に先立ち、被験者の病態を把握する目的で実施する、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度を評価する。その際、その評価に利用する「マーカー」として、先に説明したように、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質全体における、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基、ＤＨＰ化Ｌｙｓ残基の含有比率、酸化修飾を受けたＭｅｔ残基の含有比率、あるいは、酸化修飾を受けたその他のアミノ酸残基（例えば、Ｔｙｒ残基）の含有比率を高い確度で推定することが可能な「マーカー」のいずれも利用可能である。その多様な「マーカー」の群のうち、本発明の第三の形態では、上記の選別基準に基づき、選別された「心疾患診断マーカー」の一群から、評価に利用する「マーカー」を選択する点に、技術的な特徴がある。
【０１２６】
上記の選別基準に基づき、本発明において利用されている「心疾患診断マーカー」の選別の手順を以下に説明する。
【０１２７】
「心疾患診断マーカー」の選別の手順、すなわち、「マーカー探索」プロセスの全体構成を、図１に示す。該プロセスは、「サンプル前処理」工程１０１、「等電点電気泳動」工程１０２、「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  質量分析」工程１０３、「サンプルプロファイリング」工程１０４、「データ解析・マーカー特定」工程１０５の五つの工程で構成されている。
【０１２８】
本発明では、選別された「心疾患診断マーカー」について、「心疾患診断」に先立ち、被験者から採取される血液サンプルを用いて、その量を測定することを最終目的とする。従って、被験者から採取される血液サンプルの量を考慮し、少量の血液サンプルを利用する測定に適する、「サンプル前処理」、「等電点電気泳動」、「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  質量分析」の条件を選択し、その条件において、「心疾患診断マーカー」の選別を行っている。従って、「心疾患診断マーカー」の選別の際に採用する、「サンプル前処理」、「等電点電気泳動」、「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  質量分析」の条件と同じ条件を用いて、「心疾患診断」に先立ち、被験者から採取される血液サンプルを用いて、その量を測定することが可能となる。
【０１２９】
具体的には、「等電点電気泳動」工程では、後述する「等電点タンパク質分離チップ」を利用する「等電点電気泳動」を行い、その後、該「等電点タンパク質分離チップ」内に保持した状態で乾燥処理を施し、さらに、乾燥処理を施した「等電点タンパク質分離チップ」内に保持した状態で、「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  質量分析」を実施する形態を採用している。
【０１３０】
（１）「サンプル前処理」工程
「サンプル前処理」工程１０１は、図２に示す、４つのステップ：血液サンプルから「血清」を調製する「血清調製」ステップ２０１；抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を用いる「免疫沈降」法を利用して、血清中から、ＭＤＡ−ＬＤＬを分取する「免疫沈降処理」ステップ２０２；トリプシン消化処理を利用して、分取されたＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片群を調製する「断片化」処理ステップ２０３；調製されたペプチド断片群を含む、トリプシン消化処理反応液中の溶媒を除去し、調製されたペプチド断片群全量を含む乾燥物として回収する「断片化ペプチド回収」ステップ２０４で構成されている。
【０１３１】
(1-1) 「血清調製」ステップ２０１
まず、「心疾患診断マーカー」の選別を行う対象は、被験者から採血した血液中に含有される、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質である。血液中、ＭＤＡ−ＬＤＬは、血清中に溶存しているので、定法に従って、被験者から採血した血液サンプルから、血清を調製する。血液の凝固処理後、遠心分離により、血餅（沈澱物）を分離し、血清を回収する。
【０１３２】
回収された血清を保存する際には、−８０℃以下の温度で冷凍保存する。すなわち、前記冷凍保存を行うことで、保存する間に、血清中に含まれるＭＤＡ−ＬＤＬに対して、さらに、ＭＤＡ化、酸化が進行することを防止する。
【０１３３】
(1-2) 「免疫沈降処理」ステップ２０２
回収された血清中に、種々の可溶性タンパク質、脂質が溶解している。特に、ＭＤＡ−ＬＤＬ以外に、ＭＤＡ化されていない酸化ＬＤＬ、酸化を受けていないＬＤＬも、該血清中に共存している。血清中から、ＭＤＡ−ＬＤＬのみを選択的に分取するため、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を用いる「免疫沈降」法を利用する。
【０１３４】
抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を担体上に固定化した、アフィニティー担体を、血清中に加え、抗原抗体反応により、ＭＤＡ−ＬＤＬのみを選択的に抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体と反応させ、捕獲する。その後、固液分離により、アフィニティー担体を回収することで、血清中に含有されている、ＭＤＡ−ＬＤＬのみを分取する。
【０１３５】
なお、血清中に含有されている、ＭＤＡ−ＬＤＬの濃度は不明であるが、血清中に含有されている、ＭＤＡ−ＬＤＬの全量を回収する必要は無いので、通常、使用するアフィニティー担体の量は、血清１００μＬ当たり、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体の添加量が、２μｇ〜４μｇの範囲となるように選択することができる。抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を固定化する担体として、例えば、ＩｇＧ抗体の固定化に適する磁気ビーズを利用すると、抗原抗体反応後、固液分離により、アフィニティー担体を回収する際、該磁気ビーズを、磁力を利用して、選択的に回収できるので好ましい。
【０１３６】
血清中には、ＭＤＡ−ＬＤＬ以外に、ＭＤＡ化受けていないＬＤＬ、例えば、酸化に起因する修飾を全く受けていないＬＤＬが大量に共存している。一般に、血清中に含まれる酸化ＬＤＬの含有濃度は、１０μｇ／ｄＬ以上、１００μｇ／ｄＬ未満であるが、全ＬＤＬの含有濃度は、５０〜１００ｍｇ／ｄＬ程度であると報告されている。従って、血清中における、ＭＤＡ−ＬＤＬの含有濃度Ｃ［ＭＤＡ−ＬＤＬ］と、全ＬＤＬの含有濃度Ｃ［totalＬＤＬ］の比率；Ｃ［ＭＤＡ−ＬＤＬ］／Ｃ［totalＬＤＬ］は、通常、Ｃ［ＭＤＡ−ＬＤＬ］／Ｃ［totalＬＤＬ］＜０．２％の範囲と推定される。アフィニティー担体を回収する際、非選択的に担体の表面に吸着した、ＭＤＡ化受けていないＬＤＬ、例えば、酸化に起因する修飾を全く受けていないＬＤＬが混入することを防止するため、固液分離後、アフィニティー担体を十分に洗浄する。十分な洗浄を終えた時点では、回収されたアフィニティー担体の表面には、未反応の抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体と、ＭＤＡ−ＬＤＬと複合体を形成している抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体のみが固定化されている。
【０１３７】
該「免疫沈降処理」ステップ２０２で利用する抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体として、例えば、抗体No.29225（積水メディカル社）などの抗ＭＤＡ−ＬＤＬモノクローナル抗体が好適である。
【０１３８】
ヒト・ＭＤＡ−ＬＤＬを免疫原として、マウスを免疫することにより、抗ヒト・ＭＤＡ−ＬＤＬモノクローナル抗体を創製する手法は、既に報告されている（特許第３１１５５８７号公報参照）。該手法で創製される抗ヒト・ＭＤＡ−ＬＤＬモノクローナル抗体のうち、ヒト・ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ヒト・ＡｐｏＢ１００タンパク質と特異的な反応性を示すものを選別し、該「免疫沈降処理」ステップ２０２で利用する抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体として利用することができる。
【０１３９】
(1-3) 「断片化」処理ステップ２０３
洗浄後、回収されたアフィニティー担体の表面に固定化された、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体と複合体を形成している、ＭＤＡ−ＬＤＬを、トリプシンを用いて酵素消化し、分取されたＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片群を調製する。
【０１４０】
酵素消化に先立ち、アフィニティー担体の表面に固定化された、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体と複合体を形成している、ＭＤＡ−ＬＤＬを、該抗体から分離し、アフィニティー担体の表面に固定化された、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を固液分離して、液相にＭＤＡ−ＬＤＬを回収する操作を施すことが、一般に望ましい。
【０１４１】
抗体から、その抗原を遊離する手段としては、抗体の抗原に対する反応性を低下する処理が利用される。通常、抗原中に存在するエピトープ（抗原性決定基）と、抗体中のＣＤＲ（相補性決定領域）の結合は、疎水的相互作用に因っている。例えば、抗原中に存在するエピトープ（抗原性決定基）と、抗体中のＣＤＲ（相補性決定領域）の相互作用を低下させるため、アセトニトリルなどの極性有機溶媒を添加して、抗体中のＣＤＲ（相補性決定領域）を該極性有機溶媒によって、溶媒和（被覆）する手段が利用可能である。また、ＳＤＳなどの界面活性剤型のタンパク質変性剤を添加することで、抗体の可変領域を変性させ、抗原中に存在するエピトープ（抗原性決定基）に対する親和性を消失させる手法も利用可能である。
【０１４２】
一方、ＭＤＡ−ＬＤＬを抗体から分離することなく、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体と複合体を形成している、ＭＤＡ−ＬＤＬに、トリプシンを作用させ、酵素消化し、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片群を調製する形態を採用することも可能である。その場合には、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片群に加えて、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体由来のペプチド断片群も生成される。抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体由来のペプチド断片群は、別途特定できるため、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片群と、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体由来のペプチド断片群の混合物から、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片群を特定することが可能である。
【０１４３】
その他、トリプシンを用いる酵素消化を行う際には、トリプシンの自己消化に起因して、トリプシン由来のペプチド断片群も生成される。このトリプシンの自己消化に起因する、トリプシン由来のペプチド断片群も、別途特定できるため、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片群、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体由来のペプチド断片群、トリプシン由来のペプチド断片群の混合物から、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片群を特定することが可能である。
【０１４４】
「断片化」処理ステップ２０３においては、分取されたＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質の全量を、トリプシンを用いる酵素消化により断片化する。その際、トリプシンは、Ａｒｇ残基のＣ末側のペプチド結合、Ｌｙｓ残基のＣ末側のペプチド結合を切断するが、一般に、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基、ＤＨＰ化Ｌｙｓ残基のＣ末側のペプチド結合が切断される効率は、修飾を受けていないＬｙｓ残基のＣ末側のペプチド結合が切断される効率より低い。特定の部位のＬｙｓ残基が、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基、ＤＨＰ化Ｌｙｓ残基に変換されている比率を調べる際には、前記の切断効率の差異が明確になる反応条件を選択することが望ましい。すなわち、Ａｒｇ残基のＣ末側のペプチド結合、修飾を受けていないＬｙｓ残基のＣ末側のペプチド結合の切断は完了するが、ＭＤＡ化Ｌｙｓ残基、ＤＨＰ化Ｌｙｓ残基のＣ末側のペプチド結合の切断の進行比率は、明確に劣っている反応条件を選択することが望ましい。
【０１４５】
従って、トリプシンを用いる酵素消化の反応条件を、例えば、反応液中のトリプシン濃度を５０ｎｇ/μＬ〜１００ｎｇ/μＬの範囲に選択し、反応液の攪拌を行いつつ、液温を３５℃〜３８℃の範囲に、反応時間を１２時間〜２４時間の範囲に選択することが望ましい。また、例えば、血清３００μＬ中から分取されたＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質に対するトリプシンを用いる酵素消化を行う際、反応液全体の液量は、１５μＬ〜４０μＬの範囲に選択することが望ましい。
【０１４６】
ＭＤＡ−ＬＤＬを抗体から分離する処理を施した場合、トリプシンを用いた酵素消化反応液は、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片群、トリプシン由来のペプチド断片群と、トリプシンを含んでいる。
【０１４７】
ＭＤＡ−ＬＤＬを抗体から分離することなく、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体と複合体を形成している、ＭＤＡ−ＬＤＬを使用する場合、トリプシンを用いた酵素消化反応液は、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片群、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体由来のペプチド断片群、トリプシン由来のペプチド断片群と、トリプシン、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を担持しているアフィニティー担体を含んでいる。抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を担持しているアフィニティー担体を、固液分離により除去すると、残る液相中には、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片群、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体由来のペプチド断片群、トリプシン由来のペプチド断片群と、トリプシンが含まれている。
【０１４８】
いずれの場合も、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体由来のペプチド断片群の全量を含む液相部分を、「断片化」処理済みの試料液として回収する。回収される「断片化」処理済みの試料液の液量は、実質的に前記酵素消化反応液全体の液量と等しい。
【０１４９】
(1-4) 「断片化ペプチド回収」ステップ２０４
回収された「断片化」処理済みの試料液中に含まれる溶媒除去し、調製されたペプチド断片群全量を含む乾燥物として回収する。
【０１５０】
回収される「断片化」処理済みの試料液の液量が、１５μＬ〜４０μＬの範囲である場合、溶媒除去による乾燥に、例えば、遠心エバポレーターを利用することができる。乾燥処理を行った後、調製されたペプチド断片群全量を含む乾燥物を保存する場合、例えば、−３０℃以下の温度で冷蔵保存する。
【０１５１】
（２）  「等電点電気泳動」工程
一般に、血清中に含まれる酸化ＬＤＬの含有濃度は、１０μｇ／ｄＬ以上、１００μｇ／ｄＬ未満であるので、血清３００μＬ中に含有されている酸化ＬＤＬは、３０ｎｇ以上、３００ｎｇ未満である。酸化ＬＤＬ１粒子中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質の重量比率は、２５質量％程度であり、含有されている酸化ＬＤＬが、３０ｎｇ以上、３００ｎｇ未満であると、含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質は、８ｎｇ以上、８０ｎｇ未満と見積もられる。
【０１５２】
回収される「調製されたペプチド断片群全量を含む乾燥物」サンプル中には、一サンプル当たり（血清３００μＬ当たり）、合計で、８ｎｇ以上、８０ｎｇ未満の範囲のＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質に由来するペプチド断片群が含有されている。換言すると、一サンプル当たり（血清３００μＬ当たり）、０．０１５ｐｍｏｌ以上、０．１５ｐｍｏｌ未満の範囲のＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質をトリプシン消化することで得られるペプチド断片の一群が含有されている。一サンプル中に含まれる、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質に由来する、各ペプチド断片は、ＡｐｏＢ１００タンパク質一分子から、それぞれ断片が切り出されるので、各ペプチド断片の分子数は、ＡｐｏＢ１００タンパク質の分子数または、それ以下である。従って、血清３００μＬから調製される、一サンプル中に含まれる、各ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の含有量Ｍ（ｐＩ，Ｍpeptide）は、０．０１５ｐｍｏｌ以上、０．１５ｐｍｏｌ未満の範囲になっていると推定される。
【０１５３】
一方、「等電点電気泳動」で分離される、各ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）のスポットについて、各ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+の「m/z」値と、各スポットにおける「流路方向の拡がり」の状況を示す、該イオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の分布を、「ＭＡＬＤＩ-ＭＳ  質量分析」を利用して、十分な精度と確度で測定する必要がある。その際、一サンプル中に含まれる、各ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の総量Ｍ（ｐＩ，Ｍpeptide）は、各ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）のスポットの「流路方向の拡がりσpI」と、流路の幅Ｗの積、（Ｗ×σpI）で示されるスポットの面積Ｓ（ｐＩ，Ｍpeptide）内に存在すると見做せる。Ｍ（ｐＩ，Ｍpeptide）／Ｓ（ｐＩ，Ｍpeptide）は、該スポットにおける、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の平均的な面密度に相当する。各スポットにおける「流路方向の拡がり」の状況を示す、該イオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の分布を、「ＭＡＬＤＩ-ＭＳ  質量分析」を利用して、十分な精度と確度で測定するためには、該スポットにおける、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の平均的な面密度、Ｍ（ｐＩ，Ｍpeptide）／Ｓ（ｐＩ，Ｍpeptide）を十分に水準にことが必要である。
【０１５４】
従って、「等電点電気泳動」を行う際、「等電点タンパク質分離チップ」を利用することで、各ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）のスポットの面積Ｓ（ｐＩ，Ｍpeptide）を狭くし、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の平均的な面密度、Ｍ（ｐＩ，Ｍpeptide）／Ｓ（ｐＩ，Ｍpeptide）を十分な水準としている。具体的には、「等電点タンパク質分離チップ」の流路の長さＬを３５ｍｍとして、その流路に沿って、ｐＩが３〜１０の範囲のペプチド断片をそれぞれのスポットに分離することにより、「流路方向の拡がりσpI」が、σpI＝０．２程度である際、そのスポットの長さδＬを、１ｍｍ程度としている。
【０１５５】
「等電点電気泳動」工程１０２では、回収される「調製されたペプチド断片群全量を含む乾燥物」サンプル中に含まれる、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片群、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体由来のペプチド断片群、トリプシン由来のペプチド断片群と、トリプシンを、等電点電気泳動により、それぞれのスポットに分離する。その後、「等電点タンパク質分離チップ」の流路に沿って、分離されているスポットを保持した状態で、「等電点タンパク質分離チップ」全体を、−３０℃に冷却することで、流路内の「泳動後のサンプル溶液」を氷結する。さらに、氷結された「泳動後のサンプル溶液」を流路内に保持した状態で、凍結乾燥処理を施す。該凍結乾燥処理の結果、「等電点タンパク質分離チップ」の流路に沿って、分離されているスポットから、その位置において、凍結乾燥処理済みのペプチド断片のスポットへと変換される。
【０１５６】
「凍結乾燥処理済みのペプチド断片のスポット」は、該ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の等電点ｐIを中心として、「流路方向の拡がりσpI」を示す。すなわち、スポットを構成する凍結乾燥処理済みのペプチド断片の面密度は、等電点ｐIを中心とする、ガウス分布と近似できる、流路方向の変化を示し、該ガウス分布の標準偏差が、「流路方向の拡がりσpI」に相当している。
【０１５７】
「ＭＡＬＤＩ-ＭＳ  質量分析」を適用して、スポットの形成している、該ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のイオン強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）を測定し、流路方向の分布を解析することで、該スポットの中心ｐＩmeanを特定することが可能である。また、該ｐＩmeanを中心とするガウス分布を仮定し、測定されたイオン強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）分布を良く近似できる標準偏差を算出し、「流路方向の拡がりσpI」とすることが可能である。
【０１５８】
「等電点電気泳動」においては、その流路に沿って、ｐＩが３〜１０の範囲のペプチド断片をそれぞれのスポットに分離する。その間を、７１の区画に分割して、各区画内に存在しているペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のｍ／ｚと、そのイオン強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）を測定する。各区画のｐＩの差分ΔｐＩは、（１０−３）／７０＝０．１程度と見做すことが可能である。実際には、「等電点電気泳動」を行った際、流路に沿って形勢されるｐＨの勾配（ｄｐＨ/ｄＬ）は、若干のバラツキを示すため、泳動用のサンプル液中に、ｐＩが既知のペプチド、タンパク質を複数、ｐＩ標準物質として添加し、該ｐＩ標準物質複数種のスポット位置を基準として、流路に沿って、各スポット位置のｐＩを推定する。
【０１５９】
一方、「ＭＡＬＤＩ-ＭＳ  質量分析」を適用して、各区画に存在しているペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+の測定を行うため、使用される「ＭＡＬＤＩ-ＭＳ  質量分析装置」が利用するレーザ光の照射スポット径ｄlaserを基準として、各区画の長さΔＬを、ΔＬ≧ｄlaserを満たすように設定する。同時に、流路の幅Ｗも、該レーザ光の照射スポット径ｄlaserを基準として、Ｗ≧ｄlaserを満たすように設定する。各区画に存在しているペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+の測定は、各区画の中央に、照射スポット径ｄlaserのレーザ光を照射して、該照射スポット径ｄlaser内に存在するペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）をイオン化させる。
【０１６０】
「等電点電気泳動」工程１０２で利用する、「等電点タンパク質分離チップ」と「電気泳動・乾燥装置」の構成と、その使用法の概要を以下に説明する。
【０１６１】
(2-1) 「等電点タンパク質分離チップ」
図３に、「等電点電気泳動」工程１０２で利用する「等電点タンパク質分離チップ」の構成の一例を、模式的に示す。図３に模式的に示す構成例では、1本の流路３０２を設ける単一流路構成であるが、同時の複数のサンプルについて、「等電点電気泳動」を実施するため、複数本の流路３０２を並行に配置するマルチ流路構成を採用することもできる。図３の（Ａ）は、フタ３０４の上面図を、図３の（Ｂ）は、基板３０３の上面図を、図３の（Ｃ）は、組み立てたチップ３００のＡ-Ａ'断面図をそれぞれ示す。図３の（Ｄ）は、基板３０３に形成されている、流路３０２の拡大図を示す。流路３０２の底面部には、複数の親水性の柱状体３０１が形成されており、底面部の両側に側壁部が形成され、溝状構造を構成している。流路３０２の両端には、リザーバ３０５ａ、３０５ｂが設けられる。
【０１６２】
フタ３０４は、平板状のフタ基材部３０６と、フタ基材部３０６の下面に位置し、基板３０３と接するフタ樹脂部３０７とで構成される。また、フタ３０４には、流路３０２両端のリザーバ３０５ａ、３０５ｂに対応する位置に、溶液注入用の貫通穴が形成されている。組み立てたチップ３００では、基板３０３上面にフタ３０４を重ねる際、流路３０２両端のリザーバ３０５ａ、３０５ｂと、フタ３０４に形成されている溶液注入用の貫通穴が一致する配置とする。その際、流路３０２の上面は、フタ３０４のフタ樹脂部３０７で覆われる。フタ３０４のうち、この流路３０２の上面を覆い、少なくとも流路３０２内に導入されるサンプル溶液と接する表面は、疎水性または撥水性とされている。特には、フタ３０４のフタ樹脂部３０７の下面の表面全体を、疎水性または撥水性とすることが好ましい。
【０１６３】
「等電点電気泳動」を行う際には、流路３０２の両端を利用して、流路３０２内に導入されるサンプル溶液に対して、高電圧を印加する。印加される高電圧によって、流路３０２内に導入されるサンプル溶液中に、流路３０２に沿った電位勾配（電界）を形成する。そのため、流路３０２内に導入されるサンプル溶液から、基板３０３を絶縁しておく必要がある。従って、基板３０３自体を、高絶縁性材料を使用して作製することが望ましい。また、フタ３０４のフタ樹脂部３０７の下面も、流路３０２内に導入されるサンプル溶液と接するため、流路３０２内に導入されるサンプル溶液から、フタ３０４のフタ樹脂部３０７を絶縁しておく必要がある。従って、少なくとも、フタ３０４のフタ樹脂部３０７自体を、高絶縁性材料を使用して作製することが望ましい。また、フタ３０４の基材部３０６自体も、高絶縁性材料を使用して作製することが望ましい。
【０１６４】
基板３０３には、流路３０２を形成するため、その流路構造を加工するにあたって、十分な精度で加工可能な高絶縁性材料を使用して作製することが望ましい。前記の要件を満足する高絶縁性材料の一例として、石英もしくはガラス、更には、ＰＣ（ポリカーボネイト）、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）等の高い絶縁特性を有するプラスチック材料を挙げることができる。
【０１６５】
なお、図３に例示する流路３０２は直線状流路であり、流路３０２内に導入されるサンプル溶液中に、流路３０２に沿った電位勾配（電界）を形成する際、適する形状である。が、基板３０３の上面に複数本の流路を併設する、なお、流路３０２内に導入されるサンプル溶液中に、流路３０２に沿った電位勾配（電界）を形成することが可能である限り、直線状流路以外の平面形状を採用することもできる。流路３０２自体の平面形状、流路の配置、流路の長さは、利用されるサンプルや電気泳動の条件に応じて、適宜選択される。具体的には、流路３０２の断面形状は、流路の幅Ｗ、流路の深さＤが３μｍ〜２０００μｍの範囲に選択されることが望ましい。流路の全長Ｌ、流路の幅Ｗ、ならびに、流路の深さＤは、質量分析を行い際に必要とされる単位底面積あたりのペプチド断片の量の要件を満足できる範囲に選択する。同時に、前記流路のサイズは、「等電点電気泳動」時、流路内で発生するジュール熱の放散に十分な熱効率による温度制御と高効率な流体制御を可能とできる範囲に選択する必要もある。前記二つの要件を満たすとともに、基板３０３の作製に使用する材料の加工精度等を考慮して、前記流路のサイズの選択を行う。
【０１６６】
フタ基材部３０６を作製する材料としては、該フタの機械的強度の保持や、貫通穴作製などの加工が可能で、絶縁特性に優れている材料が好適に利用される。フタ基材部３０６の作製に、例えば、石英もしくはガラス、ポリカーボネイト、ＰＭＭＡなどのアクリル樹脂、ＰＤＭＳなどのシリコーン樹脂をはじめとした高分子樹脂材料を利用することができる。
【０１６７】
一方、フタ樹脂部３０７は、流路の上面を覆い、流路の側壁部の上面と、フタ樹脂部３０７の下面と密着させ、該流路内に充填されるサンプル溶液の漏洩、染み出しを生じさせない構成を採用している。同時に、フタ剥離を行う際、フタ３０４のうち、少なくともフタ樹脂部３０７は弾性変形して剥離の境界部に撓み構造を設ける。
【０１６８】
このため、フタ樹脂部３０７の作製には、弾性変形性が高い絶縁性材料を用いることが好ましい。例えば、フタ樹脂部３０７の基材に利用する、弾性変形性が高い絶縁性材料として、ＰＤＭＳや、ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）、ＰＰ（ポリプロピレン）、ＰＥ（ポリエチレン）、ポリ塩化ビニルなどのポリオレフィン、またはポリエステルなどを挙げることができる。加えて、フタ樹脂部３０７の下面のうち、少なくとも、流路上面に相当する領域は、疎水性または撥水性を示す表面とすることが好ましい。従って、フタ樹脂部３０７の下面を疎水性または撥水性を示す表面とするとするため、特に、ＰＤＭＳ等のシリコーン樹脂、ＰＴＦＥ等のフッ素系樹脂などの撥水性を有する材料による被覆が好適に利用できる。あるいは、これら撥水性を有し、弾性変形性が高い絶縁性材料を、フタ樹脂部３０７の基材として利用してもよい。
【０１６９】
また、少なくとも、フタ３０４の外形の一端部には、基板３０３の外形より張り出した部分を設ける。この張り出した一端部は、フタ剥離のための外力の印加に利用される。基板３０３を固定して押さえつつ、フタ３０４の一端部に外力を印加すれば、フタ剥離が進行する。例えば、矩形の基板３０３、フタ３０４を選択した場合、基板３０３の長辺方向に該フタの剥離方向を選択する場合、フタ３０４の外形は、かかる長辺方向の長さを、該基板の長辺よりも長くする。フタ３０４の長辺方向に張り出した部分に外力を印加すると、その部分に外力の作用点が設定される。さらにはフタ３０４の剥離を終えた後、該フタを保持し、基板３０３上面から移動させ、除去する操作を行う際、フタ３０４の端部を支えるための領域をかかる張り出し部分に設定することが可能となる。また、フタ３０４を剥離・除去する際、外力を印加する部位として、基板３０３の長辺と沿って設ける、フタ３０４の短辺方向の張り出し部分を利用する形態を選択することも可能である。
【０１７０】
なお、基板３０３上面とフタ樹脂層３０７との密着強度は、基板３０３の上面に形成される流路３０２から、流路内に充填される溶液の漏洩、染み出しを生じさせない程度の密着状態達成には十分だが、所定の外力を加えることで、この密着面で剥離が進行する。また、基板３０３上面とフタ樹脂層３０７との緻密な密着状態の維持においては、フタ樹脂層３０７自体の密着性は低くし、両者間を密着させる外的な力の負荷に依る形態で補うことも可能である。
【０１７１】
上記のフタ剥離を行う手法として、例えば、国際公開第２００６／０８５５３９号パンフレットに開示される方法を採用することもできる。
【０１７２】
(2-2) 「電気泳動・乾燥装置」
上述の「等電点タンパク質分離チップ」を利用する「等電点電気泳動」と、その後の「凍結乾燥処理」の操作に使用される電気泳動・乾燥装置の構成を以下に説明する。
【０１７３】
図４は、「等電点タンパク質分離チップ」に適合する電気泳動・乾燥装置４００の全体構成を模式的に示す図である。電気泳動・乾燥装置４００は、少なくとも、チップを収容する機構４０１と、「等電点電気泳動」の際、チップ中の流路に電圧を印加するための電源４０２・電極部４０３と、チップの温度を制御する機構４０４とを備えている。また、「等電点電気泳動」後、前記流路上において分離され、各スポットを形成しているペプチド断片、ならびに、タンパク質を、当該スポットを保持した状態で凍結乾燥処理して、「凍結乾燥処理済みのペプチド断片のスポット」として固定化する、乾燥機構４０５を備えている。
【０１７４】
該電気泳動・乾燥装置４００を用いて、「等電点タンパク質分離チップ」の流路内のサンプル溶液を等電点電気泳動した後、温度制御機構４０４を用いて、流路内のサンプル溶液を急速凍結する。急速凍結することで、流路内のサンプル溶液中において、各スポットを形成しているペプチド断片、ならびに、タンパク質の分離状態を固定する。急速凍結を終えた後、その冷却温度に保持した状態で、フタ３０４を基板３０３から剥離し、除去する。その結果、基板３０３上に形成されている流路内に保持されている、「泳動後のサンプル溶液」の氷結体が露呈される。該氷結体は、凝固した液体成分（水）を含んでおり、流路内で凍結状態に保持したまま、乾燥機構４０５を用いて、凝固した液体成分（水）を除去し、凍結乾燥処理を施す。この凍結乾燥処理の際、温度制御装置４０４を利用して、凍結状態に保持し、凝固した液体成分（水）の除去は、密閉槽や減圧機構等を備えた乾燥機構４０５を用いて実施される。該凍結乾燥処理の結果、「等電点タンパク質分離チップ」の流路に沿って、分離されている各スポットは、その位置を保持したまま、「凍結乾燥処理済みのペプチド断片のスポット」として、乾燥固定される。
【０１７５】
次に、より具体的な例示により、「等電点タンパク質分離チップ」に適合する電気泳動・乾燥装置を構成する各機構とその機能を説明する。なお、「等電点タンパク質分離チップ」に適合する電気泳動・乾燥装置の構成は、下記の具体的な実施態様に示す構成に限定されるものではない。
【０１７６】
「等電点電気泳動」を行う際、「等電点タンパク質分離チップ」の基板３０３上面とフタ樹脂層３０７との緻密な密着状態を維持する。その際、両者間に外力を負荷して、両者の緻密な密着状態を維持する手法を採用することが好ましい。両者間に加える外力の負荷手段として、フタ３０４の上面から荷重を負荷する形態である、負荷荷重印加機構を利用することができる。この負荷荷重印加機構は、基板３０３とフタ樹脂層３０７との密着面全面に実質的に均等な負荷荷重の分散が可能な形態を選択することが望ましい。
【０１７７】
緻密な密着状態を維持することにより、流路３０２に導入されるサンプル溶液が、基板３０３上面とフタ樹脂層３０７下面の接する部位から流路外に漏れ出す「液漏れ」を防止する。従って、サンプル溶液の流路３０２への導入に先立ち、前記負荷荷重印加機構を動作させて、緻密な密着状態を維持する。「等電点電気泳動」を終了した後、急速凍結により、「泳動後のサンプル溶液」の氷結体を作製すると、「液漏れ」を防止する必要が無くなる。従って、急速凍結を終えた後、前記負荷荷重印加機構を用いた外力負荷を終える。その結果、急速凍結を終えた後、フタ３０４を剥離する操作を実施する際には、フタ３０４の上面は、荷重が負荷されていない状態となる。
【０１７８】
基板３０３を安定的に固定するには、基板３０３の底面、あるいは基板３０３の上面を固定する形式が望ましい。例えば、基板３０３の底面を平坦な平面に加工した上で、真空チャック方式の固定ステージ上の所定位置に基板３０３の底面を固定する形式が好適に利用される。また、基板３０３上面を圧迫固定することも、容易な手法であり、好適である。この場合、基板３０３上面のフタ３０４がない部分を圧迫固定することが望ましい。
【０１７９】
なお、基板３０３を安定的に固定する目的では、基板３０３上面のフタ３０４がある部分を圧迫固定する形態を採用することも可能である。
【０１８０】
基板３０３を固定した状態で、基板３０３からフタ３０４を剥離・除去する。従って、基板３０３上面のフタ３０４がある部分を圧迫固定し、フタ３０４を剥離する際に、その圧迫固定を解除する形態を採用すると、フタ３０４を剥離する時点で、基板３０３を安定的に固定することが困難となる。基板３０３上面のフタ３０４がある部分を圧迫固定する形式を採用する場合には、フタ３０４を剥離する際、基板３０３の底面を固定する形式、あるいは、基板３０３上面のフタ３０４がない部分を圧迫固定する形式を使用する。
【０１８１】
基板３０３からフタ３０４を剥離・除去する際には、基板３０３を固定した上で、フタ３０４の一端部に外力を印加し、基板３０３とフタ３０４との密着面に対して実質的に垂直方向に、そのフタ３０４の一端部を強制的に変位させる。この一端部の変位に付随して、フタ３０４は、接着面に対して撓み構造を有するものとなる。その外力を印加した段階において基板３０３の移動を防止するため、上記の通り、基板３０３を固定する。
【０１８２】
乾燥機構は、流路内で凍結状態に保持したまま、「泳動後のサンプル溶液」の氷結体に対して、凍結乾燥処理を施すことが可能である限り、その構成に特に制限はない。例えば、基板３０３からフタ３０４を剥離・除去した後、露出された「泳動後のサンプル溶液」の氷結体を流路内で。凍結状態に保持するための温度調節機構、ならびに、該「泳動後のサンプル溶液」の氷結体中に含まれる、凝固した液体成分（水）を昇華させる、あるいは、蒸散させるための密閉槽と減圧機構等を備えた凍結乾燥機構が挙げられる。前記凍結乾燥機構を使用して、密閉槽中に基板３０３を配置し、密閉槽内を減圧することにより、「泳動後のサンプル溶液」の氷結体中に含まれる、凝固した液体成分（水）を昇華させ、流路３０２に沿って、分離されている各スポットは、その位置を保持したまま、「凍結乾燥処理済みのペプチド断片のスポット」として、乾燥固定される。
【０１８３】
「等電点タンパク質分離チップ」に適合する電気泳動・乾燥装置は、操作の容易性の観点から、さらに制御部を備えることが好ましい。制御部は、「等電点電気泳動」を行う際、電流モニター部を用いて、流路３０２内のサンプル溶液中を流れる電流値をモニターし、電源４０２から供給する電圧を制御するために用いることができる。さらに、制御部は、電流値のモニター、電圧の印加時間、使用電力量に基づき、「等電点電気泳動」の終了を判断するために、また、冷却機構の動作を制御するために用いることができる。さらに、制御部は、フタ３０４を吸着する、あるいは、基板３０３の上面にフタ３０４を接触・固定する機と、基板３０３を吸着する、あるいはチップ台上に基板３０３を接触・固定する機構と、固定した基板３０３の上面から、フタ３０４を剥離した後、相対的に遠ざける移動機構の動作を制御し、流路３０２を露出させる一連の操作を実行するために用いることができる。さらに、制御部は、溶液注入機構として、差圧を発生させる減圧・加圧機構を制御するために、また、乾燥機構として、温度調節機構や減圧機構を制御するために、あるいは、信号検出部として、「等電点電気泳動」による、ペプチド断片の分離状態を確認するために用いることができる。
【０１８４】
上記「等電点タンパク質分離チップ」に適合する「電気泳動・乾燥装置」を使用する際、その使用方法について、以下に簡単に記述する。
【０１８５】
まず、チップ３００を、チップ・ガイドに沿ってチップ収容部に設置する。チップ収容部は、チップ台と密閉槽で構成される。チップ３００は、チップ台上に固定される。固定されているチップ３００の温度制御は、このチップ台を通して熱の授受を行い、温度制御機構（温度センサー、ペルチェ素子等）を用いて行う。温度制御機構は、「等電点電気泳動」時にチップの温度を一定に保持するため、「急速凍結」時にチップを冷却するため、「凍結乾燥処理」時にチップ温度を加熱する、あるいは「凍結」状態に保持するため、氷点以下の温度に維持するために用いられる。
【０１８６】
次に、フタ３０４を基板３０３の上面に圧迫させて、フタ３０４を固定し、密着状態を保持する。流路３０２の両端に設けるリザーバ３０５ａ、３０５ｂの一方に、サンプル溶液を注入する。その後、吸引操作等を行い、流路３０２全体にサンプル溶液を満たす。続けて、流路３０２の両端に設けるリザーバ３０５ａ、３０５ｂに、それぞれ陰極液、陽極液を注入する。以上の操作、フタ３０４の圧迫固定、サンプル溶液の注入後、吸引操作等の各操作に利用される機構は、全て、制御部で、それらの機構の動作を制御し、実行させることもできる。
【０１８７】
さらに、フタ３０４の溶液注入用の貫通穴を介して、電極部の陽極・陰極を、それぞれ、陽極液、陰極液に接するように配設する。電源から配線を通じて電極部に電圧を印加し、電流モニター部を用いて電極部の陽極・陰極間の電流値を測定する。流路３０２に導入されているサンプル溶液中を流れる電流は、電圧印加時から徐々に減少するため、この電流値あるいは電力値を測定し、その時間的変化をモニターすることにより、等電点電気泳動による分離終了を判断できる。
【０１８８】
「等電点電気泳動」を終了した直後に、温度制御機構を用いて、チップ３００を冷却し、流路３０２内の「泳動後のサンプル溶液」を凍結させる。流路３０２内の「泳動後のサンプル溶液」中では、流路３０２に沿って、「等電点電気泳動」によって分離された、ペプチド断片やタンパク質が、それぞれスポットを形成して溶解している状態となっている。その溶媒は水であるが、流路３０２内にｐＨ勾配を形成するために使用された、酸、塩基、両性担体成分などが溶解しており、凝固点降下のため、氷結が開始する温度は氷点（０℃）よりも低くなっている。そのため、流路３０２内の「泳動後のサンプル溶液」全体を、氷結が開始する温度よりも有意に低い温度まで急速に冷却し、一旦過冷却状態とすることで、溝状の流路３０２内の「泳動後のサンプル溶液」全体を一気に氷結させることが望ましい。すなわち、チップ台に接する、チップ３００の基板３０３の底面から、流路３０２全体を均一な温度となるように急速に冷却し、氷結が開始する温度よりも有意に低い温度とすることで、一旦過冷却状態とする基板冷却機構、つまり、温度制御機構４０４を利用することが好ましい。この冷却機構は、基板３０３の底面全体を均一に冷却するため、基板３０３の底面全体と均一に熱的接触する配置を採ることが望ましく、チップ台と温度制御機構とを一体化する形態が望ましい。
【０１８９】
次に、基板３０３の上面からフタ３０４を剥離する。このとき、チップ収容部にある、チップ３００を冷却し続けることで、「泳動後のサンプル溶液」の氷結体を流路３０２内に保持したまま、基板３０３上面を露出することができる。
【０１９０】
基板３０３上面とフタ３０４下面とを密着させ、所定の配置で接着状態を達成している接着力を開放するため、基板３０３上面に対して実質的に垂直な方向成分を有する外力を、フタ３０４の端部に印加して、フタ３０４を撓ませ、この撓みを所定の曲率に保持しつつ、フタ３０４の端部を上方に持ち上げる形式で所望の速度で剥離を進める。このフタ３０４の剥離の過程で、フタ３０４のフタ樹脂部３０７の下面と接触している、溝状流路３０２内の「泳動後のサンプル溶液」の氷結体上面でも、速やかに剥離が進み、「泳動後のサンプル溶液」の氷結体は溝状流路３０２内に残された状態で、フタ３０４の剥離を完了させる。その後、分離されたフタ３０４は、例えば、フタ３０４の端部をツマミ部でチャックした状態に保持し、ツマミ部を移動させることで、基板３０３上面から取り除かれる。
【０１９１】
「泳動後のサンプル溶液」の氷結体は流路３０２内に残され、露呈された状態となっており、そのまま、「凍結乾燥処理」を行うことが可能である。フタ３０４の剥離後、「泳動後のサンプル溶液」の氷結体を凍結状態に保持しつつ、チップ３００を加熱するか、あるいは、チップ３００の温度を制御しつつ、密閉槽であるチップ収容部の減圧を行って、「凍結乾燥処理」を実施する。「泳動後のサンプル溶液」の氷結体中に含まれる、凝固した液体成分（水）を除去する「凍結乾燥処理」が完了すると、流路３０２に沿って、分離されている各スポットは、その位置を保持したまま、「凍結乾燥処理済みのペプチド断片のスポット」として、乾燥固定される。「凍結乾燥処理」の完了後、チップ３００の温度を、外気に含まれる水蒸気が結露する温度（露点温度）を超える温度に上昇した後、チップ収容部の内圧を大気圧にまで戻す。
【０１９２】
「サンプル前処理」工程１０１において「調製されたペプチド断片群全量を含む乾燥物」サンプルに対して、上述の手順に従って、「等電点タンパク質分離チップ」に適合する「電気泳動・乾燥装置」を使用する「等電点電気泳動」工程１０２を実施する。その結果、「調製されたペプチド断片群全量を含む乾燥物」サンプル中に含まれる、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質をトリプシン消化することで得られるペプチド断片の一群は、流路３０２に沿って、分離され、そのスポット位置を保持したまま、「凍結乾燥処理済みのペプチド断片のスポット」の一群として、流路３０２上に乾燥固定される
(2-3) 「等電点電気泳動」条件
「等電点電気泳動」の対象となるトリプシン消化による生成される、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片群は、下記の６つのタイプに大別される。
（タイプＡ−０）Ｃ末にＡｒｇ残基又はＬｙｓ残基を有し、酸性アミノ酸残基を含まないペプチド断片；
（タイプＡ−１）Ｃ末にＡｒｇ残基又はＬｙｓ残基を有し、酸性アミノ酸残基一つを含むペプチド断片；
（タイプＡ−２）Ｃ末にＡｒｇ残基又はＬｙｓ残基を有し、酸性アミノ酸残基二つ以上を含むペプチド断片；
（タイプＡ’−０）Ｃ末にＭＤＡ化Ｌｙｓ残基を有し、酸性アミノ酸残基を含まないペプチド断片；
（タイプＡ’−１）Ｃ末にＭＤＡ化Ｌｙｓ残基を有し、酸性アミノ酸残基一つを含むペプチド断片；
（タイプＡ’−２）Ｃ末にＭＤＡ化Ｌｙｓ残基を有し、酸性アミノ酸残基二つ以上を含むペプチド断片；
これら（タイプＡ−０）〜（タイプＡ’−２）のペプチド断片のｐＩは、恐らくは、（タイプＡ−０）＞（タイプＡ−１）＞（タイプＡ’−０）＞（タイプＡ−２）＞（タイプＡ’−１）＞（タイプＡ’−２）の序例で小さくなり、少なくとも、ｐＩ３〜１０の範囲に含まれると予測される。
【０１９３】
従って、「等電点電気泳動」においては、ｐＩ３〜１０の範囲のペプチド断片を分離する条件を採用する。「陽極液」として、アルカリ溶液、例えば、４０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液（ｐＨ１２）、「陰極液」として、酸溶液、例えば、１００ｍＭリン酸水溶液（約ｐＨ２）を利用し、流路内にｐＨ勾配を形成する。なお、Ｈ3ＰＯ4（オルトリン酸）のｐＫａは、pKa1=2.12, pKa2=7.21, pKa3=12.67 （２５℃）と報告されている。
【０１９４】
「等電点電気泳動」のサンプル溶液は、「サンプル前処理」工程１０１において「調製されたペプチド断片群全量を含む乾燥物」サンプルを、下記の「等電点電気泳動」用サンプル調製溶液中に溶解して調製する。
【０１９５】
「等電点電気泳動」用サンプル調製溶液は、例えば、６６％(v/v)ｃIEF gel、３％(v/v) Carrier ampholyte (pI 3-10)を含む水溶液を利用する。該サンプル調製溶液中には、ｐＩと分子量Ｍが既知のタンパク質をｐＩの標準として添加し、「等電点電気泳動」後、流路に沿ってスポットの形成しているペプチド断片のｐＩを推定する際、その基準に利用する。例えば、該サンプル調製溶液中に、500 fmol/μL angiotensin II（ｐＩ６．７４）、500 fmol/μL fibrinopeptide B（ｐＩ４．０）を添加する。加えて、必要に応じて、２％(v/v) 蛍光マーカー（ｐＩ４，５．５，９の３種類）を、該サンプル調製溶液中に添加することもできる。該蛍光マーカー三種は、「等電点電気泳動」後、流路に沿って、酸側からアルカリ側に向かって、ｐＩ４、ｐＩ５．５、ｐＩ９に相当する位置にスポットを形成する。従って、流路に沿って、酸側からアルカリ側に向かって、蛍光顕微鏡により、各蛍光マーカーのスポットからの蛍光を観察することで、流路に沿って、酸側からアルカリ側に向かって、ｐＩ４、ｐＩ５．５、ｐＩ９に相当する位置を判別する際、利用できる。
【０１９６】
「サンプル前処理」工程１０１において、例えば、血清３００μＬ中に含まれる、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質を分取して「調製されたペプチド断片群全量を含む乾燥物」サンプルを、前記サンプル調製溶液８μＬ中に溶解することができる。
【０１９７】
「等電点タンパク質分離チップ」の流路３０２の全長Ｌは、例えば、３５ｍｍ、また、流路の幅Ｗは、例えば、２ｍｍに選択する。後述するように、「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  質量分析」工程１０３では、流路３０２の全長Ｌを７１の区画に分割して、各区画において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルを測定する際、各区画の長さΔＬは、約０．５ｍｍ、各区画のｐＩの変化量ΔｐＩは、０．１程度となる。
【０１９８】
流路３０２の底面部に形成される柱状体３０１の形状、長さＬpillar、幅Ｗpillar、高さＨpillarは、通常、Ｌpillar＞Ｈpillar＞Ｗpillarとなるように選択する。柱状体の長さＬpillarは、前記各区画の長さΔＬの1/10以下に選択することが望ましい。また、柱状体の幅Ｗpillarは、流路の幅Ｗの1/10以下に選択することが望ましい。
【０１９９】
この柱状体は、流路３０２を作製する際、同時に作製される。従って、流路３０２の深さＤは、該流路３０２の底面部に形成される柱状体の形状、長さＬpillar、幅Ｗpillar、高さＨpillarを考慮し、流路３０２の深さＤは、２Ｈpillar＞Ｄ≧Ｈpillarの範囲に選択することが望ましい。例えば、流路３０２の深さＤを、Ｄ＝Ｈpillarとなるように選択することがより望ましい。該柱状体の側壁面は、親水性を示すことが望ましく、例えば、柱状体の側壁面上に、親水性コートを施すことが好ましい。また、流路３０２の底面部に形成される柱状体を規則的に配置し、親水性の側壁面を有する柱状体間に生じる隙間が、サンプル溶液に対して、毛管現象を生起するに十分な狭さを示すものとすることが望ましい。
【０２００】
流路３０２中にサンプル溶液を導入する際、一方のリサーバに注入したサンプル溶液は、親水性の流路３０２の底面に濡れ拡がり、さらに、流路３０２の底面部に形成される柱状体間の狭い隙間を、毛管現象を利用することで進行することで、流路３０２の底面部全体に濡れ拡がることができる。最終的に、一方のリサーバに注入したサンプル溶液は、流路３０２中、底面部に柱状体３０１が形成されている領域全体に進入するため、流路３０２全体に均一に導入された状態となる。この毛管現象を利用する、サンプル溶液の導入手段を利用するので、吸引操作を使用することなく、サンプル溶液を流路３０２全体に均一に導入することができる。
【０２０１】
その後、流路３０２の両端に設けるリザーバ３０５ａ、３０５ｂに、それぞれ注入される「陰極液」、「陽極液」は、流路３０２内に既に充填されている、サンプル溶液と流路３０２の両端で接する状態となる。
【０２０２】
リザーバ３０５ａ、３０５ｂに、それぞれ注入される「陰極液」、「陽極液」の間に電圧を印加すると、流路に沿って、電圧勾配（電界）が形成され、また、ｐＨの勾配も形成される。流路に沿って形成される、電圧勾配（電界）とｐＨの勾配を利用して、流路３０２中に導入されているサンプル溶液中に含有されるペプチド断片、タンパク質、ならびに、蛍光マーカーの「等電点電気泳動」がなされる。
【０２０３】
「等電点電気泳動」時には、「陰極液」、「陽極液」の間の電圧印加は、例えば、１．５ｋＶ、６０ｓ；０Ｖ、３０ｓ；３．０ｋＶ、７２０ｓとすることで、まず、サンプル溶液中に含有されるペプチド断片、タンパク質、ならびに、蛍光マーカーを電圧勾配（電界）を利用し、流路の中央部に集積した後、形成されるｐＨの勾配と電圧勾配（電界）を利用して、それぞれのｐＩに従って、分離し、スポットを形成させる。
【０２０４】
（３）  「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  質量分析」工程
「凍結乾燥処理済みのペプチド断片のスポット」の一群として、流路３０２上に乾燥固定されている、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質をトリプシン消化することで得られるペプチド断片の一群について、「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  質量分析」を利用して、各ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のｍ／ｚ、該イオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のイオン強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の流路方向の分布を測定する。
【０２０５】
具体的には、流路３０２に沿って、酸側からアルカリ側に向かって、ｐＩが３〜１０の範囲で、乾燥固定されている各スポットを構成するペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）のｐＩは増加している。従って、流路３０２に沿って、酸側からアルカリ側に向かって、７１の区画に分割して、各区画内に存在しているペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のｍ／ｚと、そのイオン強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）を測定する。
【０２０６】
各スポットを構成しているペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）は、そのｐＩに相当する区画において、該ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のイオン強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）は極大を示し、そのスポットの流路方向の分布に伴って、その前後の区画で測定されるイオン強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）は減少する。各区画ｊの中央のｐＩ値をｐＩj（ｊ＝１〜７１）、該区画ｊにおいて検出される（m/z）＝（（Ｍk＋１）/１）のイオン種［Ｍk＋Ｈ］+のイオン強度Ｉ（ｐＩj,［Ｍk＋Ｈ］+）を、（ｐＩj，（m/z））平面上に二次元プロットすると、図８に例示するように、各スポットを構成しているペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+は、該（ｐＩj，（m/z））平面上において、（ｐＩmean，（Ｍpeptide＋１）/１）に極大点を示すイオン強度分布を与えるはずである。
【０２０７】
「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  質量分析」工程１０３では、流路３０２に沿って、分離され、そのスポット位置を保持したまま、「凍結乾燥処理済みのペプチド断片のスポット」の一群を特定するため、流路３０２に沿って、酸側からアルカリ側に向かって、７１の区画に分割して、各区画ｊ（ｊ＝１〜７１）において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルを測定する。各区画ｊにおいて測定されるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルに基づき、該区画ｊにおいて検出される、複数のイオン種ｋの（m/z）＝（（Ｍk＋１）/１）と、そのイオン強度Ｉ（ｐＩj,［Ｍk＋Ｈ］+）を決定することができる。
【０２０８】
以下に、「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  質量分析」工程１０３において、流路３０２に沿って、酸側からアルカリ側に向かって、７１の区画に分割して、各区画ｊ（ｊ＝１〜７１）において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルを測定する手順を、説明する。
【０２０９】
「等電点電気泳動チップ」の流路上には、「等電点電気泳動」工程１０２において、分離され、そのスポット位置を保持したまま、「凍結乾燥処理済みのペプチド断片のスポット」の一群として、乾燥固定されている。該「等電点電気泳動チップ」の流路に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの測定で利用されるマトリックス剤溶液を塗布し、乾燥処理して、測定用マトリックスを流路上に形成する。
【０２１０】
測定用マトリックスを形成した後、流路に沿って、酸側からアルカリ側に向かって、７１の区画に分割された、各区画ｊ（ｊ＝１〜７１）について、順次、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルを測定する。
【０２１１】
以下に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの測定で利用されるマトリックス剤溶液、マトリックス剤溶液の塗布に利用する「溶液塗布装置」、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルの測定に利用される「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  質量分析装置」について、説明する。
【０２１２】
（3-1） 「マトリックス剤溶液」
ＡｐｏＢ１００タンパク質自体は、アミノ酸数が４５００を超える巨大タンパク質であるが、測定対象は、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質をトリプシン消化することで得られるペプチド断片であるため、アミノ酸数は５０以下であり、マトリックス剤として、シナピン酸（3,5-ジメトキシ-4-ヒドロキシケイ皮酸）、ＣＨＣＡ（α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸）、ＤＨＢ（2,5-ジヒドロキシ安息香酸）等が好適に用いられる。
【０２１３】
一方、測定を行う、各区画ｊ（ｊ＝１〜７１）に存在している、ペプチド断片に由来するイオン種［Ｍk＋Ｈ］+の（m/z）＝（（Ｍk＋１）/１）を高い確度で決定する必要がある。従って、各区画ｊ（ｊ＝１〜７１）で測定されるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル中に、そのm/z値の更正に利用される、質量（Ｍ）が既知のペプチド、タンパク質に起因するイオン種［Ｍ＋Ｈ］+のピークを複数含むことが好ましい。例えば、質量更正用ペプチドとして、900 fmol/μL Bradykinin fragment 1-7（Ｍ＝757.3997）、200 fmol/μL ACTH fragment18-39 (human)（Ｍ＝2465.1986）、200 fmol/μL Insulin B chain oxidized (bovine) （Ｍ＝3494.6513）を含有させる。
【０２１４】
「等電点電気泳動」において、スポットを形成しているペプチド断片は、通常、電気的に中性となっている。また、凍結乾燥処理を行った時点でも、ペプチド断片は、通常、電気的に中性となっている。凍結乾燥処理後、通常、該ペプチド断片中に存在するカルボキシル基は、−ＣＯＯＨとなっているが、一部、金属塩型の−ＣＯＯ-Ｎａ+の形態となっているものが混入する場合がある。質量分析に先立ち、金属塩型の−ＣＯＯ-Ｎａ+を−ＣＯＯＨの形態に変換することが望ましい。その目的で、マトリックス剤溶液中には、プロトン供与体となる、トリフルオロ酢酸を僅かに加える。
【０２１５】
また、マトリックス剤溶液を塗布した後、含まれる溶媒の蒸散を容易に行うため、水より沸点が有意に低く、水と均一に混合する極性溶媒と、水との混合溶媒を使用する。
【０２１６】
マトリックス剤溶液として、例えば、20 μmol/μL sinnamic acid、0.05% (v/v) TFA、2% (v/v) formamide、70% acetonitrile（沸点８２℃）、900 fmol/μL Bradykinin fragment 1-7、200 fmol/μL ACTH fragment18-39 (human)、200 fmol/μL Insulin B chain oxidized(bovine)を含む水溶液を利用することができる。
【０２１７】
前記組成のマトリックス剤溶液を使用する際には、深さＤの流路３０２、例えば、深さ１０μｍの流路に対して、マトリックス剤溶液の塗布膜厚は、該流路３０２の深さＤを超えない範囲に選択する。上述する質量更正用ペプチド、マトリックス剤の含有濃度を選択することにより、測定に必要とされる、単位面積当たりのマトリックス剤の量、添加されている質量更正用ペプチドの量を満足することが可能である。
【０２１８】
「等電点電気泳動チップ」の流路内に、マトリックス剤溶液を均一な塗布膜厚で塗布する。なお、マトリックス剤溶液の塗布膜厚は、流路の深さＤを超えない範囲に選択される。従って、流路とその両端に設けるリザーバ部分からなる、窪み領域全体として、塗布されるマトリックス剤溶液の液量の合計は、該窪み領域の全容量を超えない範囲に選択される。
【０２１９】
（3-2） 「溶液塗布装置」
流路内に、マトリックス剤溶液を均一な塗布膜厚で塗布するため、溶液塗布装置が利用される。通常、溶液塗布装置は、微細な円筒から、シリンジあるいはガスによる圧力でマトリックス剤溶液を適量ずつ押し出す機構と、前記微細な円筒とチップとの相対位置を変える機構とを具えるディスペンサーの構成をとる。
【０２２０】
該溶液塗布装置を利用して、各流路に対して、流路とその両端に設けるリザーバ部分からなる、窪み領域全体に対して、所定のマトリックス剤溶液液量を供給する。流路の底面部は、親水性であるため、供給されるマトリックス剤溶液は、流路の底面部全体を均一に覆うように濡れ拡がる。
【０２２１】
塗布されたマトリックス剤溶液の乾燥は、マトリックス剤溶液中に含まれる溶媒成分の蒸散を促進するため、加熱して行う。その際、加熱温度Ｔdryingは、マトリックス剤溶液中に含まれる溶媒成分の沸点Ｔbpに対して、Ｔdrying＜Ｔbpの範囲に選択される。例えば、上に例示するマトリックス剤溶液の場合、溶媒成分として、ホルムアルデヒド、アセトニトリル、水を含んでおり、そのうち、最も低い沸点を有するアセトニトリルの沸点８２℃よりも低い、８０℃に加熱温度Ｔdryingを設定することができる。すなわち、溶媒成分の沸点を超えると、気泡が発生し、均一に乾燥処理されたマトリックスの形成が困難とすることを回避する。
【０２２２】
（3-3） 「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  質量分析装置」
流路に沿って、分離され、そのスポット位置を保持したまま、「凍結乾燥処理済みのペプチド断片のスポット」の一群を特定するため、流路に沿って、酸側からアルカリ側に向かって、７１の区画に分割して、各区画ｊ（ｊ＝１〜７１）において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルを測定する。各区画のｐＩの変化量ΔｐＩは０．１程度であるため、スポットを構成するペプチド断片（ｐＩmean，Ｍpeptide）に由来するイオン種は、該スポットの「流路方向の拡がりσpI」を考慮すると、ｐＩmeanに相当する区画に加えて、その前後、ｐＩmean±σpIの範囲に相当する、複数の区画においても、検出される。また、各区画ｊのｐＩの範囲に、ｐＩmeanを示すペプチド断片（ｐＩmean，Ｍpeptide）も複数種存在する。従って、各区画ｊにおいて測定されるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル中には、相当数のペプチド断片に由来するイオン種［Ｍk＋Ｈ］+のピークが含まれる。
【０２２３】
これら相当数のペプチド断片に由来するイオン種［Ｍk＋Ｈ］+のピークについて、その（m/z）＝（（Ｍk＋１）/１）を高い確度で決定するとともに、そのイオン強度Ｉ（ｐＩj,［Ｍk＋Ｈ］+）を高い精度で測定する必要がある。少なくとも、（m/z）＝（（Ｍk＋１）/１）については、測定誤差Δ（m/z）=０．２程度の確度であることが望ましい。
【０２２４】
また、スポットを構成するペプチド断片（ｐＩmean，Ｍpeptide）について、スポットの「流路方向の拡がりσpI」に起因する、イオン強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）の分布に基づき、該スポットの中心のｐＩmeanを特定する際、隣接する区画で測定される、イオン強度Ｉ（ｐＩj,［Ｍk＋Ｈ］+）の比較を行う必要がある。各区画で測定されるスペクトル間でピーク強度の比較を行うため、マトリックス剤溶液中に添加されている内部標準のペプチドに由来するイオン種のイオン強度を基準として、各区画で測定されるスペクトル中のピーク強度の標準化を行う。このピーク強度の標準化に利用する、内部標準のペプチドとして、上述の質量更正用ペプチドの一つを使用することが望ましい。例えば、先に例示したマトリックス剤溶液の場合、質量更正用ペプチドのうち、Bradykinin fragment 1-7の添加量を高く設定し、ピーク強度の標準化に利用する、内部標準のペプチドとしても利用している。
【０２２５】
測定に使用する「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  質量分析装置」は、チップを質量分析装置内にセットするターゲットホルダーと、レーザ光照射位置に、チップ上の流路に沿って区画している、各区画を移動させ、レーザ光を照射する光照射機構と、各区画に対するレーザ光照射によりイオン化される、ペプチド断片に由来するイオン種［Ｍk＋Ｈ］+を検出し、質量スペクトルを得る解析機構とを具えている。
【０２２６】
レーザ光の照射スポット径ｄlaserは、５０μｍ〜２００μｍの範囲に選択する。利用するマトリックス剤の種類に応じて、「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ」で利用する、パルス・レーザ光の波長を選択する。パルス・レーザ光照射を繰り返し、検出される、イオン種［Ｍk＋Ｈ］+のイオン強度を積算することで、各区画の質量スペクトルを測定する。パルス・レーザ光照射の繰り返し回数は、ピーク強度の標準化に利用する、内部標準のペプチドに起因するイオン種のピーク強度が、所定の強度範囲になるように選択される。
【０２２７】
測定するイオン種［Ｍk＋Ｈ］+の（m/z）の範囲は、対象のペプチド断片は、アミノ酸数５以上のペプチド断片に限定するため、４００＜（m/z）＜１５０００の範囲に設定する。
【０２２８】
例えば、測定されるスペクトル上における、上記の三種質量更正用ペプチドに由来するイオン種［ＭMass-standard＋Ｈ］+のピーク位置に基づき、（m/z）の更正を行う。また、各区画ｊにおいて測定される、質量更正用ペプチドのうち、Bradykinin fragment 1-7に由来するイオン種［ＭBradykinin＋Ｈ］+のピーク強度Ｉj（Bradykinin）を基準として、ペプチド断片に由来するイオン種［Ｍk＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩj,［Ｍk＋Ｈ］+）を標準化し、相対値（Ｉ（ｐＩj,［Ｍk＋Ｈ］+）/Ｉj（Bradykinin））×１００≡Irel.（ｐＩj,［Ｍk＋Ｈ］+）を利用して、異なる区画のスペクトルの比較を行う。
【０２２９】
（４）  「サンプルプロファイリング」工程１０４
「サンプルプロファイリング」工程１０４では、流路に沿って、７１の区画に分割して、各区画ｊ（ｊ＝１〜７１）において測定された、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルに基づき、「等電点電気泳動」工程において、分離されている、各スポットを形成しているペプチド断片（ｐＩmean，Ｍpeptide）について、そのｐＩmeanと分子量Ｍpeptideを特定する。
【０２３０】
(4-1) 各区画ｊのｐI値（ｐＩj）の推定
まず、流路に沿って、７１の区画に分割して、各区画ｊ（ｊ＝１〜７１）について、該区画ｊ中、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルの測定の際、レーザ光照射位置、区画ｊ（ｊ＝１〜７１）の中央位置、Ｌmean（ｊ）のｐＩ値（ｐＩj）を推定する。
【０２３１】
「等電点電気泳動」を行う際、サンプル溶液中に添加した、蛍光マーカー（ｐＩ４，５．５，９の３種類）は、「等電点電気泳動」が終了した時点で、流路に沿って、ｐＩ４，５．５，９に相当する位置にそれぞれスポットを形成している。「凍結乾燥処理」を終えた時点で、蛍光顕微鏡を用いて、これら蛍光マーカーに起因する蛍光を発している位置を特定する。各蛍光マーカーのスポットの中心位置、Ｌ（ｐＩ＝４）、Ｌ（ｐＩ＝５．５）、Ｌ（ｐＩ＝９）は、各区画ｊ（ｊ＝１〜７１）の中央位置、Ｌmean（ｊ）のいずれと一致しているかを特定する。前記Ｌ（ｐＩ＝４）、Ｌ（ｐＩ＝５．５）、Ｌ（ｐＩ＝９）と、それぞれ一致している、区画ｊの中央位置、Ｌmean（ｊ）のｐＩ値（ｐＩj）は、それぞれ、ｐＩj≒４、ｐＩj≒５．５、ｐＩj≒９である。
【０２３２】
また、ｐＩを推定する際、その基準に利用するｐＩ標準ペプチド、angiotensin II（ｐＩ６．７４、Ｍangiotensin II＝１０４５．５３４）、fibrinopeptide B（ｐＩ４．０、Ｍfibrinopeptide B＝１５６９．６６９）のスポットを特定する。蛍光マーカーのスポット位置から決定された、ｐＩj≒４、ｐＩj≒５．５、ｐＩj≒９の各区画を基準として、前記二つのｐＩ標準ペプチドのスポットの中心が位置する区画を推定する。推定された区画を中心として、前後５つの区画で測定されるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル中、angiotensin IIに由来するイオン種（［Ｍangiotensin II＋Ｈ］+）のピーク（m/z）＝（Ｍangiotensin II＋１）、ならびに、fibrinopeptide Bに由来するイオン種［Ｍfibrinopeptide B＋Ｈ］+）のピーク（m/z）＝（Ｍfibrinopeptide B＋１）を、それぞれ特定する。
【０２３３】
特定されたangiotensin IIに由来するイオン種［Ｍangiotensin II＋Ｈ］+）のピーク強度相対値Irel.（ｐＩj,［Ｍangiotensin II＋Ｈ］+）を比較すると、ピーク強度相対値Irel.（ｐＩj,［Ｍangiotensin II＋Ｈ］+）が極大を示す、一つの区画を見出すことができる。angiotensin IIのスポット中心が見出される、区画ｊの中央位置、Ｌmean（ｊ）のｐＩ値（ｐＩj）は、ｐＩj≒６．７４である。特定されたfibrinopeptide Bに由来するイオン種［Ｍfibrinopeptide B＋Ｈ］+）のピーク強度相対値Irel.（ｐＩj,［Ｍfibrinopeptide B＋Ｈ］+）を比較すると、ピーク強度相対値Irel.（ｐＩj,［Ｍfibrinopeptide B＋Ｈ］+）が極大を示す、一つの区画を見出すことができる。fibrinopeptide Bのスポット中心が見出される、区画ｊの中央位置、Ｌmean（ｊ）のｐＩ値（ｐＩj）は、ｐＩj≒４．０である。
【０２３４】
また、流路の両端の区画の中央位置、すなわち、区画１の中央位置Ｌmean（１）のｐＩ値（ｐＩ1）、区画１の中央位置Ｌmean（７１）のｐＩ値（ｐＩ71）は、それぞれ、「陰極液」、例えば、１００ｍＭリン酸水溶液の約ｐＨ２、「陽極液」、例えば、４０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液のｐＨ１２から、ｐＩ1≒２、ｐＩ71≒１２である。
【０２３５】
以上の操作によって、計７つの区画の中央位置、Ｌmean（ｊ）のｐＩ値（ｐＩj）が特定される。流路に沿って、区画されている、各区画ｊの中央位置、Ｌmean（ｊ）のｐＩ値（ｐＩj）は、特定された計７つの区画の中央位置、Ｌmean（ｊ）のｐＩ値（ｐＩj）に基づき、内挿することにより、推定される。推定された各区画ｊの中央位置、Ｌmean（ｊ）のｐＩ値（ｐＩj）の誤差は、±０．１程度である。
【０２３６】
「等電点電気泳動」を行う、サンプル溶液中には、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体由来のペプチド断片群、トリプシン由来のペプチド断片群と、トリプシンも含まれている。抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体由来のペプチド断片群、トリプシン由来のペプチド断片群と、トリプシンについてが、そのｐＩと分子量Ｍは予め判明しているので、そのスポット位置と、イオン種のピーク位置（m/z）も、上記ｐＩ標準ペプチドに適用した手法を用いて、特定される。
【０２３７】
以上に述べた、ｐＩと分子量Ｍが既知である、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体由来のペプチド断片群、トリプシン由来のペプチド断片群と、トリプシンに由来するイオン種のピーク強度相対値Irel.（ｐＩj,［Ｍk＋Ｈ］+）は、いずれのサンプル溶液でも、原則的には同じである。
【０２３８】
(4-2) ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片群の（ｐＩmean、Ｍpeptide）の決定
次に、流路に沿って、７１の区画に分割して、各区画ｊ（ｊ＝１〜７１）において測定された、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル中から、トリプシン消化による生成される、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片群に由来するイオン種のピークを抽出し、該ペプチド断片が形成するスポットの中心のｐＩmeanを特定する手順について、説明する。すなわち、トリプシン消化による生成される、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片群について、該ペプチド断片を特定する（ｐＩmean、Ｍpeptide）を決定する手順について、説明する。
【０２３９】
(4-2-1) ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル中のイオン種のピークの抽出
サンプル溶液中に含まれる、トリプシン消化による生成される、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片の濃度が低い場合があり、含有濃度の低いペプチド断片に由来するイオン種のピーク強度は小さくなる。このようにピーク強度が小さなイオン種のピークも、各区画ｊ（ｊ＝１〜７１）において測定された、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル中から抽出するため、測定されたスペクトルのスムージングを行う。
【０２４０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルは、実際には、飛行時間ｔiとｔi＋δｔの間（時間窓幅δｔ）に検出系に到達したイオン種の個数Ｎ（ｔi）をカウントしたものである。従って、実際は、（ｔi，Ｎ（ｔi））の形式の離散的なデータ列となっている。ｔiの増分Δｔiに対して、δｔを十分に狭く設定している。各レーザ光パルスによりイオン化され、この時間窓幅δｔの間に、検出系に到達するイオン種の個数Ｎm（ｔi）は、中心値Ｎmean（ｔi）のポワソン分布に従っている。レーザ光パルス多数回（ｍ）について、各回のカウント数Ｎm（ｔi）を積算した、ΣＮm（ｔi）＝Ｎ（ｔi）は、ポワソン分布によるバラツキが平均化され、積算回数ｍが増すとともに、ｍ・Ｎmean（ｔi）に近くなる。ポワソン分布におけるバラツキの程度は、中心値Ｎmean（ｔi）に対して、（Ｎmean（ｔi））1/2程度であり、（Ｎmean（ｔi））1/2／Ｎmean（ｔi）は、中心値Ｎmean（ｔi）が小さくなると、顕著に大きくなる。そのため、ピーク強度が小さなイオン種のピークでは、本来のピーク中心の位置（ｔi-peak）において、ΣＮm（ｔi）が極大値を示さず、見かけ上、極大を示す点が若干ずれる場合がある。測定されたスペクトルのスムージングを行うことにより、本来のピーク中心の位置（ｔi-peak）を推定することができる。
【０２４１】
加えて、検出系に到達したイオン種の個数をカウントする際、ノイズ成分が存在しており、ピーク強度が小さなイオン種のピークでは、元来、Ｓ／Ｎ比が相対的に低く、測定されたスペクトルのスムージングを行うことにより、ノイズの影響を相対的に低減することが可能である。
【０２４２】
測定されたスペクトルのスムージングは、原理的には、（ｔi、Ｎ（ｔi））の形式の離散的なデータ列に対して、移動平均を取ることに相当している。
【０２４３】
実際的には、Savitzky-Golay filterを用いて、指定した数ごとにスペクトルのm/zとシグナル値（ｔi、Ｎ（ｔi））の平均をとることで、質量スペクトルのスムージングを行う。図７に、測定されたスペクトルのスムージングを行った結果の一例を示す。
【０２４４】
スムージング処理後、極大を示す（ｔi-peak-obs、Ｎ（ｔi-peak-obs））を選び、該ピークの（ｍ／ｚ）の測定値とする。スムージング処理に伴い、本来のピーク中心の（ｔi- peak、Ｎ（ｔi-peak））に対して、該ピークの（ｍ／ｚ）の測定値は、±０．２程度の系統的誤差δ(m/z)を示す場合がある。一方、同じスペクトル上に観測されるピーク間の（ｍ／ｚ）の差は、最小でも、±１であるため、隣接するピークは、十分に分離されている。
【０２４５】
隣接する区画で測定されるスペクトルを比較する場合には、二つのスペクトル上で観測されている、（ｍ／ｚ）が誤差範囲内で一致するピークが、同じペプチド断片に由来するイオン種であるか、否かの判断を行う必要がある。
【０２４６】
「等電点電気泳動」により、流路に沿って、分離される、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）は、ｐＩmeanを中心とし、「流路方向の拡がりσpI」を示すスポットを形成している。該スポットにおける、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の量の分布は、ｐＩmeanを中心とし、「流路方向の拡がりσpI」を示すガウス分布と見做せる。従って、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のイオン強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）を測定すると、ｐＩmeanを中心とし、「流路方向の拡がりσpI」を示すガウス分布様の強度変化を示す。
【０２４７】
各区画で測定されるスペクトル上に見出される、ピーク（ｐＩj,（m/z）k）のピーク強度相対値Irel.（ｐＩj,（m/z）k）を、（ｐＩj，（m/z））平面上に二次元プロットすると、スポットを形成しているペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度相対値Irel.（ｐＩ,［Ｍk＋Ｈ］+）は、ガウス分布様の強度変化を示す。スムージング処理に伴い、ピークの（ｍ／ｚ）の測定値は、±０．２程度の系統的誤差を示すことを考慮すると、ピークの（ｍ／ｚ）kの測定値が±０．２以内で一致し、ピーク強度相対値Irel.（ｐＩj,（m/z）k）がガウス分布様の強度変化しているピークは、同じペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピークと判断することができる。
【０２４８】
図８に、上記の判断基準に従って、（ｐＩj，（m/z））平面上に二次元プロットした、ピーク（ｐＩj,（m/z）k）のピーク強度相対値Irel.（ｐＩj,（m/z）k）の分布に基づき、同じペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピークを特定した例を示す。
【０２４９】
その際、各スポットの「流路方向の拡がりσpI」は、中心値ｐＩmeanがほぼ同じ場合には、「流路方向の拡がりσpI」の程度もほぼ同じになる。標準的な「流路方向の拡がりσpI」は、各ｐＩ領域では、それぞれ、蛍光マーカー、ｐＩ標準ペプチドのスポットで見出される「流路方向の拡がりσpI」とほぼ等しくなる。
【０２５０】
例えば、分子量Ｍpeptideが等しく、ｐＩmeanの差ΔｐＩmeanが、「流路方向の拡がりσpI」に対して、ΔｐＩmean≒σpIである、二つのペプチド断片（ｐＩmean，Ｍpeptide）、（ｐＩmean＋ΔｐＩmean，Ｍpeptide）が分離されている場合、このｐＩ領域で見出される、（m/z）＝（Ｍpeptide＋１）のピークのピーク強度相対値Irel.（ｐＩj, Ｍpeptide＋１）の分布は、「流路方向の拡がりσpI」が異常に広いスポットを示す。このような場合であっても、このｐＩ領域における、標準的な「流路方向の拡がりσpI」を有する、二つの中心値を有するガウス分布の重なりとして、分離することで、二つのペプチド断片（ｐＩmean，Ｍpeptide）、（ｐＩmean＋ΔｐＩmean，Ｍpeptide）に由来するイオン種のピークを抽出することが可能である。
【０２５１】
換言するならば、それぞれのｐＩ領域における、標準的な「流路方向の拡がりσpI」を有する、ガウス分布を仮定して、（ｐＩj，（m/z））平面上に二次元プロットした、ピーク（ｐＩj,（m/z）k）のピーク強度相対値Irel.（ｐＩj,（m/z）k）の分布を解析することにより、単一のペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）がスポットを形成しているか、偶々、分子量が一致しており、僅かにｐＩmeanが異なるペプチド断片のスポットが重なりあっているかの判定を行うことができる。
【０２５２】
但し、偶々、分子量Ｍpeptideが一致しており、ｐＩmeanの差ΔｐＩmeanが、０．１≧ΔｐＩmeanである場合には、前記の判定手順では、複数のペプチド断片のスポットが重なりあっているか、否かの判定は不能である。
【０２５３】
上述の「ピークの抽出」処理を行うと、その流路に沿って、分離されているトリプシン消化による生成される、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）のスポット中心のｐＩmeanと、該ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度相対値Ｉrel.（ｐＩ,［Ｍk＋Ｈ］+）が決定される。
【０２５４】
その際、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）のスポット中心のｐＩmeanの特定の誤差は、そのｐＩ領域における、標準的な「流路方向の拡がりσpI」を超えることは無いが、誤差δｐＩmeanは、±1/2（σpI）程度となっている。従って、誤差δｐＩmeanは、最大、±０．４となる。
【０２５５】
(4-2-2) 複数の血清サンプル間における、抽出されたピークの対応付け（同定）
複数の血清サンプル間において、トリプシン消化による生成される、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の量を比較するため、各血清サンプルから調製されるサンプル溶液を同一の条件で、「等電点電気泳動」と「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  質量分析」を行う。各血清サンプルから調製されるサンプル溶液の「等電点電気泳動」を行った、各流路に沿って、「ピークの抽出」がなされた、ペプチド断片（ｐＩmean，Ｍk）について、同じペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）であるか、否かの対応付け（同定）を行う。
【０２５６】
上記の手順に従って、それぞれの流路に沿って、「ピークの抽出」がなされた、ペプチド断片（ｐＩmean，Ｍk）では、各区画ｊのｐＩjを内挿法で推定しているため、ｐＩjの推定値は、±０．１程度の誤差δｐＩiを有し、また、スポット中心のｐＩmeanの特定時の誤差δｐＩmeanは、最大、±０．４となっている。従って、任意の二つの流路間で、「ピークの抽出」がなされた、同じペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）について、そのスポット中心のｐＩmeanの特定結果を比較すると、両者のｐＩmean推定値の「見かけ上の相違」は、最大、δｐＩi＋δｐＩmean、±０．５に達する場合がある。一方、スムージング処理に伴う、系統的誤差δ(m/z)は、最大±０．２であることを考慮すると、両者の分子量Ｍkの推定値の「見かけ上の相違」は、最大、±０．３に達する場合がある。
【０２５７】
従って、任意の二つの流路間で、それぞれ、流路に沿って、分離され、「ピークの抽出」がなされた、ペプチド断片（ｐＩmean，Ｍk）について、前記のｐＩmean推定値の「見かけ上の相違」、分子量Ｍkの推定値の「見かけ上の相違」を考慮して、同じペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）であるか、否かの対応付け（同定）を行う。
【０２５８】
「等電点電気泳動」により分離される、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）のスポットの流路内での相対順序は、本来のｐＩの順序に従うため、任意の二つの流路間で、相対順序が逆転することは無い。従って、「ピークの抽出」がなされた、ペプチド断片（ｐＩmean，Ｍk）について、流路内における（ｐＩmean，Ｍk）の相対順序に従って、対応関係を決定することが可能である。
【０２５９】
具体的には、流路に沿って、ｐＩ  ３〜ｐＩ  １０の範囲を、各蛍光マーカーのスポットの中心位置、Ｌ（ｐＩ＝４）、Ｌ（ｐＩ＝５．５）、Ｌ（ｐＩ＝９）、ｐＩ標準ペプチド、angiotensin II（ｐＩ６．７４）、fibrinopeptide B（ｐＩ４．０）のスポットの中心位置、Ｌ（ｐＩ＝６．７４）、Ｌ（ｐＩ＝４．０）において、５つの領域（３）に分割する。それぞれの流路について、分割された各領域中において、「ピークの抽出」がなされた、ペプチド断片（ｐＩmean，Ｍk）の一群に関して、（ｐＩmean，Ｍk）の相対順序を決定する。
【０２６０】
同じペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）である場合、分子量Ｍkの推定値の「見かけ上の相違」が±０．３以内であるという条件を考慮しつつ、分割された領域中における（ｐＩmean，Ｍk）の相対順序が従って、二つの流路間において、「ピークの抽出」がなされた、ペプチド断片（ｐＩmean，Ｍk）が同じペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）であるか、否かの対応付け（同定）を進める。
【０２６１】
同じペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）と対応付け（同定）される際には、二つの流路に沿って、「ピークの抽出」がなされた、ペプチド断片（ｐＩmean，Ｍk）の由来するイオン種のピーク強度相対値Irel.（ｐＩj,（m/z）k）の極大点座標（ｐＩmean,（m/z）k）を、それぞれ、（ｐＩj，（m/z））平面上に二次元プロットすると、二つの二次元プロット上において、ｐＩjの推定に伴う、系統誤差δｐＩiと、スムージング処理に伴う、系統的誤差δ(m/z)の範囲内で、極大点座標（ｐＩmean,（m/z）k）は対応している。
【０２６２】
ｐＩjの推定に伴う、系統誤差δｐＩiと、スムージング処理に伴う、系統的誤差δ(m/z)の範囲内で、対応する極大点座標（ｐＩmean,（m/z）k）が見出されないペプチド断片（ｐＩmean，Ｍk）は、一方のサンプル溶液中にしか含まれていないペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）と判断される。
【０２６３】
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度の差異を反映する、ペプチド断片を選別するため、複数の個人から提供された血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質の試料について、それぞれ、上記の手順で、複数の血清サンプル間における、抽出されたピークの対応付け（同定）を行う。
【０２６４】
（５）  「データ解析・マーカー特定」工程
各個人から提供された血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質の試料について、上記の手順で、トリプシン消化による生成される、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に対応すると対応付け（同定）された、ペプチド断片（ｐＩmean，Ｍk）の由来するイオン種のピーク強度相対値Irel.（ｐＩj,（m/z）k）は、当該個人において特定された、トリプシン消化による生成される、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質由来のペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度相対値Irel.（ｐＩ，Ｍpeptide＋１）である。
【０２６５】
各個人に対して、同定されたペプチド断片（ｐＩmean，Ｍk）に由来するイオン種のピーク強度相対値Irel.（ｐＩj,（m/z）k）の極大点座標（ｐＩmean,（m/z）k）は、上述するように、ｐＩjの推定に伴う、系統誤差δｐＩiと、スムージング処理に伴う、系統的誤差δ(m/z)を含んでいる。従って、複数の個人、具体的には、虚血性心疾患と診断された患者群（冠動脈病変枝数３）１０名、非患者群（冠動脈病変枝数０）２３名、合計３３名に対して、同定されたペプチド断片（ｐＩmean，Ｍk）の由来するイオン種のピーク強度相対値Irel.（ｐＩj,（m/z）k）の極大点座標（ｐＩmean,（m/z）k）を平均して、その平均値（ｐＩmean,（m/z）k）Av.を、対応付け（同定）されたペプチド断片のｐＩと、該ペプチド断片に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+の(m/z)＝（Ｍpeptide＋１）とする。
【０２６６】
前記３３名の各個人に対して、対応付け（同定）されたペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種のピーク強度相対値Irel.（ｐＩ，Ｍpeptide＋１）と、極大点座標（ｐＩ，Ｍpeptide＋１）のリストを作成している。このリストに記載されるペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）は、ピーク強度相対値Irel.（ｐＩ，Ｍpeptide＋１）は別として、前記３３名の各個人のいずれでも、サンプル溶液中に存在することが確認されたものとなっている。勿論、このリストに記載されるペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）は、各個人から提供された血液サンプル中から、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質をトリプシン消化することで生成されるペプチド断片である。
【０２６７】
また、患者群（冠動脈病変枝数３）１０名、非患者群（冠動脈病変枝数０）２３名の間では、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質における、酸化の進行度は明確に相違しており、患者群（冠動脈病変枝数３）１０名では、「酸化の進行度」は高く、非患者群（冠動脈病変枝数０）２３名では、「酸化の進行度」は低くなっている。
【０２６８】
一方、合計３３名から提供された血液サンプル中から分取される、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質の量は、各個人によって、異なっているため、前記リストに記載される、ピーク強度相対値Irel.（ｐＩ，Ｍpeptide＋１）は、直接比較することはできない。各個人のリストに記載する、ピーク強度相対値Irel.（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）を、それぞれ、サンプル溶液の調製に利用した血清サンプルから、分取されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質の量に対して、正規化する必要がある。
【０２６９】
サンプル溶液を調製する際、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質をトリプシン消化することで生成されるペプチド断片の量（モル量）は、用いたＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質の量（モル量）に、比例している。そのため、リストに記載する、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の全てについて、そのペプチド断片の量（モル量）を平均すると、その平均値も、用いたＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質の量（モル量）に比例している。勿論、リストに記載する、ピーク強度相対値Irel.（ｐＩ，Ｍpeptide＋１）は、そのペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の量（モル量）に、比例している。
【０２７０】
一方、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）は、サンプル溶液中のペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の濃度；Ｃ（ｐＩ，Ｍpeptide）と、該イオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+の生成効率（イオン化効率）ｐ（ｐＩ,Ｍpeptide）を用いて、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）＝ｐ（ｐＩ，Ｍpeptide）・Ｃ（ｐＩ，Ｍpeptide）と表記することができる。
【０２７１】
「データ解析・マーカー特定」工程１０５で、好適に利用可能な解析手順を以下に説明する。
【０２７２】
対応付け（同定）がなされたペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の一群について、各ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に対して、上記平均値（ｐＩmean,（m/z）k）Av.を算出し、対応付け（同定）された該ペプチド断片のｐＩと、該ペプチド断片に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+の(m/z)＝（Ｍpeptide＋１）としている。
【０２７３】
一方、各個人のリストに記載する、ピーク強度相対値Irel.（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）は、各区画ｊにおいて測定される、質量更正用ペプチドのうち、Bradykinin fragment 1-7に由来するイオン種［ＭBradykinin＋Ｈ］+のピーク強度Ｉj（Bradykinin）を基準として、ペプチド断片に由来するイオン種［Ｍk＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩj,［Ｍk＋Ｈ］+）を標準化し、相対値（Ｉ（ｐＩj,［Ｍk＋Ｈ］+）/Ｉj（Bradykinin））×１００≡Irel.（ｐＩj,［Ｍk＋Ｈ］+）とされている。
【０２７４】
各個人のリストに記載する、ピーク強度相対値Irel.（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）は、前記標準化処理を施した「標準化済ピーク強度」であるが、合計３３名から提供された血液サンプル中における定量的な比較を行うため、次の手順(5-1)、(5-2)に従って、各個人Sm(Sm＝１〜３３)のリストに記載する、「標準化済ピーク強度」Irel.（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Smに、「対数変換」処理と、「正規化」処理を施し、「正規化ピーク強度」I（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）normal- Smを算出する。
【０２７５】
(5-1) 「対数変換」処理
各個人Sm(Sm＝１〜３３)のリストに記載する、「標準化済ピーク強度」Irel.（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Smの対数変換を行い、「対数標準化済ピーク強度」ln（Irel.（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Sm）に変換する。
【０２７６】
各流路のサンプル溶液中のペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の濃度；Ｃ（ｐＩ，Ｍpeptide）Smと、該イオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+の生成効率（イオン化効率）ｐ（ｐＩ,Ｍpeptide）を用いて、Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）Sm＝ｐ（ｐＩ，Ｍpeptide）・Ｃ（ｐＩ，Ｍpeptide）Smと表記することができる。該イオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+の生成効率（イオン化効率）ｐ（ｐＩ,Ｍpeptide）は、本来、同じイオン種に対しては、等しい。また、各流路で測定されるBradykinin fragment 1-7に由来するイオン種［ＭBradykinin＋Ｈ］+のピーク強度Ｉj（Bradykinin）は、原則的に等しくなっている。
【０２７７】
従って、「対数標準化済ピーク強度」ln（Irel.（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Sm）＝ln（Ｃ（ｐＩ，Ｍpeptide）Sm）+ln（ｐ（ｐＩ,Ｍpeptide））-ln（Ｉj（Bradykinin））のうち、｛ln（ｐ（ｐＩ,Ｍpeptide））-ln（Ｉj（Bradykinin））｝の部分は、本来、何れの流路でも、等しいはずである。
【０２７８】
(5-2) 「正規化」処理
まず、各個人Sm(Sm＝１〜３３)について、対応付け（同定）がなされたペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の一群（Npeak種類）において、「対数標準化済ピーク強度」ln（Irel.（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Sm）の「平均値」、ln（Ｉrel.（ｐＩ,Ｍpeptide＋１））av.-Sm＝（1/Npeak）Σln（Ｉrel.（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Sm）と、該「平均値」に対する、「標準偏差：σ（ln（Ｉrel.（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）））Sm」を算出する。
【０２７９】
該「平均値」は、ln（Ｉrel.（ｐＩ,Ｍpeptide＋１））av.-Sm＝（1/Npeak）Σln（Ｉrel.（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Sm）＝｛（1/Npeak）Σln（Ｃ（ｐＩ，Ｍpeptide）Sm）｝+｛（1/Npeak）Σln（ｐ（ｐＩ,Ｍpeptide））｝-ln（Ｉj（Bradykinin））となる。そのうち、｛（1/Npeak）Σln（ｐ（ｐＩ,Ｍpeptide））｝-ln（Ｉj（Bradykinin））の部分は、本来、何れの流路でも、等しいはずである。
【０２８０】
各個人Sm(Sm＝１〜３３)について、対応付け（同定）がなされた各ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の「正規化ピーク強度」Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）normal-Smは、Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）normal-Sm＝[（ln（Ｉrel.（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Sm）−ln（Ｉrel.（ｐＩ,Ｍpeptide＋１））av.-Sm）/σ（ln（Ｉrel.（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）））Sm]と、定義される。
【０２８１】
(5-3) 「Ｚスコア化」処理
各個人Sm(Sm＝１〜３３)について、対応付け（同定）がなされたペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の一群（Npeak種類）に対して、それぞれ、「正規化ピーク強度」Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）normal-Smを算出した後、各ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の「正規化ピーク強度」Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）normal-Smに、下記の手順に従って、「Ｚスコア化」処理を施す。
【０２８２】
各個人Sm(Sm＝１〜３３)に対して算出された、各ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の「正規化ピーク強度」Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）normal-Smに付いて、合計３３名の個人Sm(Sm＝１〜３３)のサンプルからなる、全サンプル群中において、その「全サンプル群中の平均値」；Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）normal-av.＝（1/33）ΣＩ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）normal-Smと、該「全サンプル群中の平均値」に対する、「全サンプル群中の標準偏差：σ（Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）normal）」を算出する。
【０２８３】
次いで。算出される「全サンプル群中の平均値」と「全サンプル群中の標準偏差」用いて、各個人Sm(Sm＝１〜３３)に対して算出された、該ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）の「正規化ピーク強度：Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）normal-Sm」について、[Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）normal-Sm）−Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）normal-av.）/σ（Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）nprmal）]を算出し、Ｚ値（Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Z-score-Sm）とする。
【０２８４】
各個人Sm(Sm＝１〜３３)に対して算出された、それぞれのペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）のＺ値（Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Z-score-Sm）を利用して、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルについて、算出された「Ｚ値：Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Z-score-Sm」の平均値を算出し、該疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルの部分群における、算出された「Ｚ値：Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Z-score-Sm」の平均値が、少なくとも、０．６０以上、好ましくは、０．７０以上である「ピーク」を選別する。
【０２８５】
前記の基準に基づき選別される「ピーク」は、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルと比較して、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルにおいて、「正規化ピーク強度：Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）normal-Sm」が統計的に有意に大きい「ピーク」に相当している。実際、合計３３サンプルの全てについて、「Ｚ値」を合計すると、０であるので、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルの部分群における、算出された「Ｚ値：Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Z-score-Sm」の平均値は、−（０．６５）×（１０／２３）≒−０．２８よりも、さらに負な値となっている。従って、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルにおける、算出された「Ｚ値：Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Z-score-Sm」の平均値と、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルの部分群における、算出された「Ｚ値：Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Z-score-Sm」の平均値との差は、少なくとも「全サンプル群中の標準偏差：σ（Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）normal）」の０．９３以上であり、統計的に有意な差があると見做すことが可能である。
【０２８６】
各個人Sm(Sm＝１〜３３)に対して算出された、それぞれのペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）のＺ値（Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Z-score-Sm）を利用して、receiver operating characteristic (ROC)解析を行う。各個人Sm(Sm＝１〜３３)に由来するサンプルの測定結果から算出した、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）のＺ値（Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Z-score-Sm）を、大きい順に並べると、１位〜３３位までの「順位付け」がなされる。
【０２８７】
疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプル中、Ｚ値（Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Z-score-Sm）が上位Ｎth位以内であるサンプル数の割合（True positive rateまたはSensitivity）：ＴＰＲ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１：Ｎth）；
コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプル中、Ｚ値（Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Z-score-Sm）が上位Ｎth位以内であるサンプル数の割合（False positive rate）：ＦＰＲ(ｐＩ,Ｍpeptide＋１：Ｎth);
コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプル中、Ｚ値（Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Z-score-Sm）が上位Ｎth位以内に入っていないサンプル数の割合（True negative rateまたはSpecificity）、ＴＮＲ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１：Ｎth）；
以上の３つの確率を算出する。勿論、ＦＰＲ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１：Ｎth）＋ＴＮＲ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１：Ｎth）＝１となっている。
【０２８８】
Ｘ軸をＴＮＲ、Ｙ軸をＴＰＲとする、ＲＯＣ空間上に、算出される（ＴＮＲ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１：Ｎth）、ＴＰＲ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１：Ｎth））（Ｎth＝１〜３３）をプロットする。（ＴＮＲ，ＴＰＲ）で表記されるＲＯＣ空間上、（０，１）と（１，０）ならびに、前記３３個のプロット点を通るＲＯＣ曲線を描く。描かれるＲＯＣ曲線と、Ｘ軸（Specificity）とで挟まる領域の面積Ａplotを数値積分により算出する。算出される面積Ａplotは、AUC“area under the ROC curve”に相当している。前記のＲＯＣ解析により算出される「AUC値」が、少なくとも、０．６０以上、好ましくは、０．７０以上であるという基準に基づき、疾患群（冠動脈病変枝数３）とコントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）の推定に有効なペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）を選別することができる。
【０２８９】
なお、総数３３個のサンプルは、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルとコントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルで構成されているので、Ｎth＝１０の場合のプロット点（ＴＮＲ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１：１０）、ＴＰＲ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１：１０））が、ＲＯＣ空間上、perfect predictionに相当する（１，１）に一致すると、「AUC値」は１となる
さらには、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルにおける、算出された「Ｚ値：Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Z-score-Sm」の平均値が、少なくとも、０．６５以上であるという基準に基づき、選別される「ピーク」も、疾患群（冠動脈病変枝数３）とコントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）の推定に有効なペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に相当している。
【０２９０】
上記のＲＯＣ解析により算出される「AUC値」に基づく選別基準に基づき、「AUC値」が、少なくとも、０．６０以上と算出される「ピーク」を選別する。選別される「ピーク」について、該「ピーク」を与える、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質からトリプシン消化により生成する、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）のアミノ酸配列を特定する。
【０２９１】
(5-4) 選別される「ピーク」を与える、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）のアミノ酸配列の特定
選別される「ピーク」は、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質をトリプシン消化することで生成するペプチド断片に由来している。ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質は、ＭＤＡが関与する化学修飾、あるいは、活性酸素種自体が関与する酸化を受けていることが想定される。
【０２９２】
その際、Ｌｙｓ残基の側鎖のアミノ基（−ＮＨ2）は、直接ＭＤＡ化を受け、−ＮＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨＯに変換されていることが想定される。Ｌｙｓ残基に対するＭＤＡによる酸化がさらに進行すると、Ｌｙｓ残基の側鎖のアミノ基（−ＮＨ2）は、最終的に、dihydorxypyridine(DHP)となる。これらＭＤＡが関与する化学修飾によるリジンの分子量の変化は、ＭＤＡ化＋５４、ＤＨＰ化＋１３４である。図１０に、ＬｙｓがＭＤＡ化を受けたときの構造、ＤＨＰ化を受けたときの構造をそれぞれ示す。
【０２９３】
また、Ｍｅｔ残基の酸化も想定される。Ｍｅｔ残基が酸化されて化学修飾を受けた場合、その側鎖の−Ｓ−が、−ＳＯ−、−ＳＯ2−に変換され、＋１６、＋３２の分子量変化が生じる。
【０２９４】
選別された「ピーク（ｐＩav.,（m/z）av）」は、全て、電荷数ｚ＝１のイオン種、すなわち、イオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+型のピークである。その（m/z）avは、４００＜（m/z）av＜１５０００の範囲であり、すなわち、４００＜Ｍpeptide＋１＜１５０００の範囲である、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピークであると仮定する。
【０２９５】
少なくとも、４００＜Ｍpeptide＋１＜１５０００の範囲である、ペプチド断片（ｐＩav.，Ｍpeptide）のアミノ酸配列は、アミノ酸残基数は、４以上、５０以下の範囲である。
【０２９６】
まず、酸化を受けていないＡｐｏＢ１００タンパク質のトリプシン消化に起因して生成する可能性を有する、アミノ酸残基数が５０以下のペプチド断片の一群を、ＡｐｏＢ１００タンパク質のアミノ酸配列情報に基づき、予測する。具体的には、ＡｐｏＢ１００タンパク質のアミノ酸配列中に含まれる、Ｌｙｓ残基ならびにＡｒｇ残基において、トリプシン消化が起こる結果、生成する可能性がある、アミノ酸残基数が５０以下の全てのペプチド断片を予測し、ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の「理論的予測ペプチド断片」の群とする。ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の「理論的予測ペプチド断片」の群に含まれる、各ペプチド断片のアミノ酸配列に基づき、その分子量Ｍpeptideを計算する。前記ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の「理論的予測ペプチド断片」は、ＡｐｏＢ１００タンパク質のアミノ酸配列中に含まれる、Ｌｙｓ残基ならびにＡｒｇ残基の内、任意の二つを選択して、トリプシン消化を行うことで生成され、その間の部分アミノ酸配列のアミノ酸残基数が５０以下である、ペプチド断片である。従って、該「理論的予測ペプチド断片」のＣ末端は、Ｌｙｓ残基またはＡｒｇ残基であるが、そのアミノ酸残基数が５０以下のアミノ酸配列中に、さらに、Ｌｙｓ残基またはＡｒｇ残基を含むものも含まれている。
【０２９７】
前記ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の「理論的予測ペプチド断片」の群に含まれる、Ｌｙｓ残基を含むペプチド断片について、含まれるＬｙｓ残基の一つが、ＭＤＡ化修飾を受けた際の分子量（Ｍpeptide＋５４）を計算する。さらに、複数のＬｙｓ残基を含むペプチド断片について、含まれるＬｙｓ残基のｎ1個が、ＭＤＡ化修飾を受けた際の分子量（Ｍpeptide＋５４×ｎ1）を計算する。
【０２９８】
同様に、前記ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の「理論的予測ペプチド断片」の群に含まれる、Ｌｙｓ残基を含むペプチド断片について、含まれるＬｙｓ残基の一つが、ＤＨＰ化修飾を受けた際の分子量（Ｍpeptide＋１３４）を計算する。さらに、複数のＬｙｓ残基を含むペプチド断片について、含まれるＬｙｓ残基のｎ2個が、ＤＨＰ化修飾を受けた際の分子量（Ｍpeptide＋１３４×ｎ2）を計算する。
【０２９９】
加えて、前記ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の「理論的予測ペプチド断片」の群に含まれる、複数のＬｙｓ残基を含むペプチド断片について、含まれるＬｙｓ残基のｎ2個が、ＤＨＰ化修飾を受け、含まれるＬｙｓ残基のｎ1個が、ＭＤＡ化修飾を受けた際の分子量（Ｍpeptide＋５４×ｎ1＋１３４×ｎ2）を計算する。
【０３００】
前記ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の「理論的予測ペプチド断片」の群に含まれる、Ｍｅｔ残基を含むペプチド断片について、含まれるＭｅｔ残基の一つが、酸化を受け、一酸化体（Ｍｅｔ（Ｏ））に変換された際の分子量（Ｍpeptide＋１６）を計算する。さらに、複数のＭｅｔ残基を含むペプチド断片について、含まれるＭｅｔ残基のｎ3個が、酸化を受け、一酸化体（Ｍｅｔ（Ｏ））に変換された際の分子量（Ｍpeptide＋１６×ｎ3）を計算する。
【０３０１】
前記ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の「理論的予測ペプチド断片」の群に含まれる、Ｍｅｔ残基を含むペプチド断片について、含まれるＭｅｔ残基の一つが、酸化を受け、二酸化体（Ｍｅｔ（Ｏ2））に変換された際の分子量（Ｍpeptide＋３２）を計算する。さらに、複数のＭｅｔ残基を含むペプチド断片について、含まれるＭｅｔ残基のｎ4個が、酸化を受け、二酸化体（Ｍｅｔ（Ｏ2））に変換された際の分子量（Ｍpeptide＋３２×ｎ4）を計算する。
【０３０２】
加えて、前記ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の「理論的予測ペプチド断片」の群に含まれる、複数のＭｅｔ残基を含むペプチド断片について、含まれるＭｅｔ残基のｎ4個が、二酸化体（Ｍｅｔ（Ｏ2））に変換され、含まれるＭｅｔ残基のｎ3個が、一酸化体（Ｍｅｔ（Ｏ））に変換された際の分子量（Ｍpeptide＋１６×ｎ3＋３２×ｎ4）を計算する。
【０３０３】
上記ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の「理論的予測ペプチド断片」の群に含まれる、酸化修飾が無いペプチド断片の分子量（Ｍpeptide）；
含まれるＬｙｓ残基にＭＤＡ化修飾またはＤＨＰ化修飾が生じているペプチド断片の分子量（Ｍpeptide＋５４×ｎ1＋１３４×ｎ2）；
含まれるＭｅｔ残基が、一酸化体（Ｍｅｔ（Ｏ））または二酸化体（Ｍｅｔ（Ｏ2））に変換されているペプチド断片の分子量（Ｍpeptide＋１６×ｎ3＋３２×ｎ4）；
以上の計算された「分子量の予測値（Ｍcal.）」リスト中から、実際に、「分子量の予測値（Ｍcal.）」が、４００＜Ｍcal.＋１＜１５０００の範囲内であるものを選抜し、候補ペプチド断片の「分子量の予測値（Ｍcal.）」リストを作成する。
【０３０４】
かかる候補ペプチド断片の「分子量の予測値（Ｍcal.）」リスト中から、選別された「ピーク（ｐＩav.,（m/z）av）」の（m/z）avから推定される、分子量Ｍobs.＝（m/z）av−１と、測定誤差範囲（±０．３）で一致する、「分子量の予測値（Ｍcal.）」の候補を選別する。
【０３０５】
すなわち、選別された「ピーク（ｐＩav.,（m/z）av）」に対して、分子量の類似性のみに基づき、「分子量の予測値（Ｍcal.）」の候補の特定と、該候補ペプチド断片のアミノ酸配列の決定（帰属）を行うことが可能である。
【０３０６】
後述する「実施態様」中において、より具体的に説明するように、「AUC」値が０．６５以上の基準を満たす、表１３、表１４〜１７に示すペプチド断片が、本発明にかかる「バイオマーカー」として、選別されている。
【０３０７】
（実施態様）
本実施態様では、図１に示す「診断マーカー」として利用可能な酸化ペプチド断片の一群の探索プロセスに従って、「診断マーカー」として利用可能なペプチド断片の一群を探索した結果と、実際に、その探索に利用した「等電点タンパク質分離チップ」、「電気泳動・乾燥装置」、「溶液塗布装置」、「質量分析計」、「解析プログラム用コンピューター」、ならびに、具体的な解析過程を以下に示す。
【０３０８】
本実施態様においては、解析対象のペプチド断片は、「トリプシンによる断片化」により採取されるため、探索された「診断マーカー」として利用可能なペプチド断片の一群は、表１３、表１４〜表１７に記載するように、該ペプチド断片の切断末端は、トリプシン消化に特異的なものとなっている。
【０３０９】
本実施態様においては、「診断マーカー」として利用可能な酸化ペプチド断片の一群として、表１８−１、表１８−２に記載される修飾アミノ酸を含むペプチド断片が利用可能であることを明らかにしている。本実施態様では、解析対象のペプチド断片は、「トリプシンによる断片化」により採取されるため、表１８−１、表１８−２に記載される修飾アミノ酸を含むペプチド断片として、該ペプチド断片の切断末端は、トリプシン消化に特異的なもの、例えば、表１４〜表１７に記載される一群の酸化ペプチド断片が選別されている。
【０３１０】
表１８−１、表１８−２に記載される修飾アミノ酸を含むペプチド断片は、トリプシン以外の消化酵素を利用して断片化した際にも、「診断マーカー」として利用可能な酸化ペプチド断片となる。本発明にかかる「心疾患診断マーカー」の技術的範囲は、表１８−１、表１８−２に記載される修飾アミノ酸を含むペプチド断片全般を含み、トリプシン以外の消化酵素を利用して断片化された、表１８−１、表１８−２に記載される修飾アミノ酸を含むペプチド断片の一群をも包含している。
【０３１１】
また、図１に示す「診断マーカー」として利用可能な酸化ペプチド断片の一群の探索プロセスは、解析対象のペプチド断片は、「トリプシンによる断片化」により採取される形態は勿論のこと、解析対象のペプチド断片が、トリプシン以外の消化酵素を利用して断片化されている形態でも、本発明にかかる「心疾患診断マーカー」を探索する際、同様に有効な手法である。
【０３１２】
以下に、図１に示す「診断マーカー」として利用可能な酸化ペプチド断片の一群の探索プロセスに従って、「診断マーカー」として利用可能なペプチド断片の一群を探索した結果と、具体的な解析過程を示す。
【０３１３】
まず、本実施態様の探索に利用した「等電点タンパク質分離チップ」、「電気泳動・乾燥装置」、「溶液塗布装置」、「質量分析計」、「解析プログラム用コンピューター」を以下に説明する。
【０３１４】
〈１〉等電点タンパク質分離チップ
図５は、該実施態様において使用される、等電点タンパク質分離チップの具体的な構成を示す。図５の（Ｂ）に、等電点タンパク質分離チップの外観を示す。図５の（Ａ）に、該チップ基板上に設ける流路の配置と、該流路の幅Ｗと全長Ｌを示す。図５の（Ｃ）に、チップ基板と、チップのフタの断面形状を模式的に示し、フタを装着した時点の流路の深さＤ、ならびに、流路両端のリザーバの位置を示す。図５の（Ｄ）は、流路の底面に形成されるピラー構造（柱状体）の周期的な配置の概要とそのサイズを示し、図５の（Ｅ）は、流路の底面に形成されるピラー構造（柱状体）の別の一例を示す。該実施態様において使用される、等電点タンパク質分離チップでは、流路のサイズは、幅Ｗ２ｍｍ、全長Ｌ３５ｍｍ、深さＤ１０μｍに選択されている。該流路の底面に形成されているピラー構造（柱状体）は、個々のピラーのサイズは、幅Ｗpillar３．７５μｍ、長さＬpillar１２．５μｍ、高さＨpillar１０μｍであり、該ピラーは、その長手方向を、流路の長手方向と一致させて、等間隔で周期的に配置されている。流路内壁面（側壁と底面）、ならびにピラー構造（柱状体）の壁面には、線形ポリアクリルアミドがコートされている。線形ポリアクリルアミド・コートにより流路は親水性を保ち、同時に、等電点電気泳動時の電気浸透流も抑えられている。
【０３１５】
なお、該実施態様で使用している、流路と、該流路に設ける柱状構造（ピラー構造）のサイズについて、具体的な数値を記載しているが、これらの数値は、本発明の実施に利用可能な等電点タンパク質分離チップの流路ならびに、該流路に設ける柱状構造（ピラー構造）の一例を示すものであり、かかる具体例の構造に限定されるものではない。
【０３１６】
〈２〉電気泳動・乾燥装置
図６は、該実施態様において使用される、電気泳動・乾燥装置の具体的構成を示す。チップ台（不図示）に等電点タンパク質分離チップが設置されている。温度制御機構（不図示）にて、チップ台を通して、チップ温度を制御する。図６に示す電気泳動・乾燥装置の乾燥機構は、凍結乾燥機構であり、密閉槽構築のための密閉用ガラス蓋と、減圧装置（不図示）と、真空排気口とで構成されている。電極は、流路両端のリザーバに挿入され、配線(不図示)によって、電源やコントローラ（不図示）と電気的に接続される。
【０３１７】
〈３〉溶液塗布装置（不図示）
MUSASHI ENGINEERING製ディスペンサー装置であるSuperSigmaCM-V2を用いている。本実施態様で使用するマトリックス溶液は、20 μmol/μL sinnamic acid、0.05% (v/v) TFA、2% (v/v) formamide、70% acetonitrile（沸点８２℃）、さらに質量更正用ペプチドとして、900 fmol/μL Bradykinin fragment1-7（Ｍ＝７５７．３９９７）、200 fmol/μL ACTH fragment18-39 (human)（Ｍ＝２４６５．１９８９）、200 fmol/μL Insulin B chain oxidized (bovine)（Ｍ＝３４９４．６５１３）を含む水溶液である。
【０３１８】
〈４〉質量分析計（不図示）
Shimadzu社製MALDI-TOF MSであるKratos AXIMA-CFR plusを用いている。タンパク質分離チップを質量分析計に設置する際には、専用のターゲットプレートを利用している。該専用のターゲットプレートは、Shimadzu社より提供される標準ターゲットプレートを参考にして、前述の等電点タンパク質分離チップがセットできるように採寸した窪みを有するターゲットプレートに加工したものである。該専用のターゲットプレートの窪み内に、マトリックス塗布済みの等電点タンパク質分離チップをセットし、質量分析計本体内に設置する。レーザ光走査は、流路の端から端までを７１の区画に分け、各区画に、パルス・レーザ光照射を一定回数行い、各パルス・レーザ光照射により得られるスペクトルを積算して、該区画の質量分析スペクトルの測定結果としている。
【０３１９】
〈５〉解析プログラム用コンピューター(不図示)
解析プログラム用コンピューターを使用して、後述のデータ解析を行った。
【０３２０】
各区画の質量分析スペクトルの測定結果ごとに、ピーク強度標準化を行っている。ピーク強度の標準化は、質量更正用ペプチドとしてマトリックス中に予め一定濃度で添加しているBradykinin fragment1-7のピーク強度を、内部標準として利用し、各区画で測定されるBradykinin fragment1-7のピーク強度に対する相対値を、標準化済ピーク強度とする。
【０３２１】
≪サンプル解析工程≫
サンプル前処理（捕捉・断片化・回収）
１−１．抗MDA-LDL抗体を用いた、血清サンプルに対する免疫沈降・消化・回収操作
（操作１−１−Ｉ）
Invitrogen社の磁気ビーズDynaBeads（マグネットを用いることで、溶液と磁気ビーズを容易に分離可能）を用いている。懸濁液状態の磁気ビーズDynaBeadsを、血清サンプル１検体当たり20μL用意する。
【０３２２】
（操作１−１−II）
抗MDA-LDL抗体（血清サンプル１検体当たり8 μg、積水メディカル社）を磁気ビーズに吸着させる。
【０３２３】
抗MDA-LDL抗体を吸着させた後、該磁気ビーズ懸濁液20μL に、300 μL の血清サンプルと、900 μL のHEPESバッファー(0.1% SDS) を加えて懸濁し、室温で抗原抗体反応を１時間行う。
【０３２４】
使用する抗MDA-LDL抗体として、特許第３１１５５８７号公報に記載する方法に従って、マウスをＭＤＡ−ＬＤＬで免疫することで創製された抗ヒト・ＭＤＡ−ＬＤＬモノクローナル抗体：抗体No.29225（積水メディカル社）が好適である。
【０３２５】
（操作１−１−III）
抗原抗体反応後、磁気ビーズをHEPESバッファーで一度洗浄する。次いで、磁気ビーズをPBSバッファーで洗浄する。さらに、磁気ビーズを10倍希釈のPBSバッファーで再洗浄する。
【０３２６】
（操作１−１−IV）
抗原抗体反応・洗浄処理済の磁気ビーズに対して、20 μL のトリプシン溶液（72 ng/μL, 25mM ammonium bicarbonate）を加えて、３７℃、１６時間、1200 rpmの振動を与えながら、消化反応を行う。消化反応後、マグネットを使用して磁気ビーズと消化産物であるペプチド溶液とを分離し、ペプチド溶液を回収する。回収したペプチド溶液を、遠心エバポレーターを使用して乾燥する。乾燥処理済みのペプチド・サンプルは、チップによる等電点電気泳動を行うまでの間、-30℃にて保管する。
【０３２７】
等電点電気泳動
１−２．等電点タンパク質分離チップを用いた等電点電気泳動
（操作１−２−Ｉ）
66% (v/v) cIEF gel、3% (v/v) Carrier ampholyte (ｐＩ 3-10)、500 fmol/μL angiotensin II（ｐＩ６．７４）、500 fmol/μL fibrinopeptide B（ｐＩ４．０）、必要に応じて、2% (v/v) 蛍光マーカー(ｐＩ 4, 5.5, 9 の３種類)を添加してなる水溶液を調合する。この水溶液をチップ用のサンプル調製溶液として使用する。なお、既知の等電点を有する標準ペプチド、angiotensin II（ｐＩ６，７４）、fibrinopeptide B（ｐＩ４．０）は、等電点の指標として、利用される。
【０３２８】
（操作１−２−II）
乾燥処理済みのペプチド・サンプル１検体を、サンプル調製溶液8 μLに溶解させる（以下、サンプル溶液と称する）。更に、ボルテックスを使用して、該サンプル溶液を３分間撹拌し、氷温に30分間静置する。
【０３２９】
（操作１−２−III）
等電点電気泳動の直前に、ボルテックスを用いて、サンプル溶液を３分間撹拌する。等電点タンパク質分離チップの流路端に位置するリザーバに、サンプル溶液 1μLをアプライする。該リザーバから流路に、サンプル溶液を導入する。
【０３３０】
（操作１−２−IV）
流路の両端に位置する酸側リザーバとアルカリ側リザーバに、電極液である100mMリン酸溶液（約ｐＨ２）と40mM 水酸化ナトリウム溶液（ｐＨ１２）とを、各々7μLアプライする。
【０３３１】
（操作１−２−V）
流路の両端に位置する各リザーバに電極をセットし、電圧1.5kV、0V、3.0kVを、それぞれ60s、30s、720s印加する。
【０３３２】
（操作１−２−VI）
電気泳動終了後、直ちにチップを-30℃に冷却する。分離状態を保持しつつ、サンプル溶液を氷結させる。
【０３３３】
（操作１−２−VII）
氷結したサンプル溶液を流路内に保持させたまま、等電点タンパク質分離チップのフタを取り外す。
【０３３４】
（操作１−２−VIII）
フタを取り外すことにより、流路上端が開放されたチップを、冷却した状態で密閉環境下に置き、真空引きする。冷却した状態で、真空引きすることにより、サンプルを凍結乾燥する。
【０３３５】
（操作１−２−IX）
凍結乾燥後、蛍光スキャナーあるいは蛍光顕微鏡を用いて、各流路における蛍光マーカーの分離状態をモニターする。
【０３３６】
MALDI-TOF-MS質量分析
１−３．MALDI-TOF-MSを用いた質量分析
（操作１−３−Ｉ）
マトリックス溶液を調合する。調合するマトリックス溶液は、20 μmol/μL sinnamic acid、0.05% (v/v) TFA、2% (v/v) formamide、70% acetonitrile の水溶液であり、さらに質量更正用ペプチドとして、900 fmol/μL Bradykinin fragment 1-7（Ｍ＝757.3997）、200 fmol/μL ACTH fragment18-39 (human)（Ｍ＝2465.1986）、200 fmol/μL Insulin B chain oxidized (bovine) （Ｍ＝3494.6513）を含有する。
【０３３７】
（操作１−３−II）
各流路における蛍光マーカーの分離状態のモニターを終えた後、80℃に保たれたチップステージに、サンプルの凍結乾燥を行った等電点タンパク質分離チップを載せて固定する。溶液塗布装置を使用して、等電点タンパク質分離チップの流路上にマトリックス溶液を塗布する。溶液塗布装置の圧力設定を調整し、等電点タンパク質分離チップの各流路あたり、約7.5 μL のマトリックス溶液を塗布する。
【０３３８】
（操作１−３−III）
塗布されたマトリックス溶液を乾燥させる。乾燥後、専用のターゲットプレートを利用して、等電点タンパク質分離チップを質量分析計に設置するまでの間、等電点タンパク質分離チップが、-30℃にて保管する。
【０３３９】
（操作１−３−IV）
専用のターゲットホルダーの窪み内に等電点タンパク質分離チップを固定し、該専用のターゲットホルダーごと、質量分析計本体内に設置する。
【０３４０】
（操作１−３−V）
全長Ｌ３５ｍｍの流路を、０．５ｍｍ間隔の区画に分割し、酸側の区画からアルカリ側の区画まで計７１の区画に順次、パルス・レーザ光照射をして、区画ごとに質量分析スペクトルを測定する。
【０３４１】
解析１
「解析１」では、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプル、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプル、合計３３サンプルについて、各サンプルの流路の区画ごとに測定された質量分析スペクトルの測定結果を用いて、下記の手順に従って、「サンプルプロファイリング」、「データ解析・マーカー特定」を行っている。
【０３４２】
「データ解析・マーカー特定」の過程では、各サンプルSmにおいて測定される、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク強度Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）Smを定量的に比較する必要がある。そのため、サンプル毎に、「標準化済ピーク強度：Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）relative-Sm」を用いて、「正規化」処理を行い、「正規化ピーク強度：Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）normal-Sm」を算出する。
【０３４３】
さらに、各サンプルSm（Sm=１〜３３）において測定される、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+に対する、「正規化ピーク強度：Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）normal-Sm」を用いて、合計３３サンプルからなる、全サンプル群中において、「正規化ピーク強度：Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）normal-Sm」に対して、「Ｚスコア化」処理を行い、各サンプルにおいて測定される、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+の「ピーク強度：Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）」のＺ値（Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）Z-score-Sm）を算出する。
【０３４４】
「正規化」処理と、「Ｚスコア化」処理の手順は、次のとおりである。
（１）標準化済ピーク強度（Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）relative-Sm）の対数変換（ｌｎ（Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）relative -Sm））を行う。
（２）各サンプルSm（Sm=１〜３３）の流路内で抽出された、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+の「対数標準化済ピーク強度：ｌｎ（Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）relative -Sm）」の平均；ｌｎ（Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）relative）av.-Sm＝（1/Npeak）Σｌｎ（Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）relative -Sm）と、該「平均値」に対する、「標準偏差：σ（ｌｎ（Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）relative））Sm」を算出する。各サンプルSm（Sm=１〜３３）で算出される「平均値：ｌｎ（Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）relative）av.-Sm」と、「標準偏差：σ（ｌｎ（Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）relative））Sm」を用いて、「対数標準化済ピーク強度：ｌｎ（Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）relative-Sm）」について、[（ｌｎ（Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）relative-Sm）−ｌｎ（Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）relative）av.-Sm）/σ（ｌｎ（Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）relative））Sm]を算出し、「正規化ピーク強度：Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）normal-Sm」とする。
（３）各サンプルSm（Sm=１〜３３）に対して算出された、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+の「正規化ピーク強度：Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）normal-Sm」に付いて、合計３３サンプルからなる、全サンプル群中において、その「全サンプル群中の平均値」；Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）normal-av.＝（1/33）ΣＩ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）normal-Smと、該「全サンプル群中の平均値」に対する、「全サンプル群中の標準偏差：σ（Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）normal）」を算出する。次いで。算出される「全サンプル群中の平均値」と「全サンプル群中の標準偏差」用いて、各サンプルに対して算出された「正規化ピーク強度：Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）normal-Sm」について、[Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）normal-Sm）−Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）normal-av.）/σ（Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）nprmal）]を算出し、Ｚ値（Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）Z-score-Sm）とする。
【０３４５】
「サンプルプロファイリング」と「データ解析・マーカー特定」
I.  合計３３サンプルの全てについて、各サンプルSm（Sm=１〜３３）の流路において、各区画で測定される質量分析スペクトルをデータベースに格納する。
【０３４６】
II.  各サンプルSm（Sm=１〜３３）の流路において、該流路の各区画におけるｐＩ値を推定する。サンプル溶液に含まれている、既知のｐＩを示す蛍光マーカー、ならびに、意図的に加えた等電点指標ペプチド：angiotensin II（ｐＩ６．７４）とfibrinopeptide B（ｐＩ４．０）や、例えば、トリプシンの自己消化に由来する既知のペプチド断片など、全サンプル溶液に共通する、等電点が既知のペプチド群のスポット位置情報（ｐＩ，Ｍ）を利用して、各区画におけるｐＩ値を算出（推定）する。
【０３４７】
III.  各サンプルSm（Sm=１〜３３）の流路において、スポットを形成している、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質からトリプシン消化により生成する、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピークを抽出する。該流路の各区画ｉ（ｉ＝１〜７１）において測定される質量分析スペクトルのイオン強度データ（Ｉ(m/z)i）と、該区画におけるｐＩ値の推定値（ｐＩ(i)）に基づき、下記の手順III-1〜III-3に従って、スポットを形成している、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピークを抽出する。
【０３４８】
III-1.  Savitzky-Golay filterを用いて、各区画で測定される質量分析スペクトルのイオン強度データ（Ｉ(m/z)i）について、指定した数毎に、m/zとイオン強度（Ｉ(m/z)i）の平均（移動平均）をとることで、各区画で測定される質量分析スペクトルのスムージングを行う。図７に、スムージング処理を施した質量分析スペクトル（Ｉ(m/z)i-smoothing）の一例を示す。
【０３４９】
III-2.  各区画ｉについて、前記スムージング処理を施した、該区画iの質量分析スペクトル（Ｉ(m/z)i-smoothing）中、極大値を示す部分を「ピークの候補」として抽出する。
【０３５０】
III-3.  隣接する区画で測定される質量分析スペクトル中で抽出された「ピークの候補」のイオン強度（Ｉ(m/z)i-smoothing）を、m/zと各区画ｉにおけるｐＩ値の推定値（ｐＩ(i)）の二次元座標（ｐＩ，m/z）上にプロットし、連結した上で、最終的な「ピーク」の抽出を行う。各区画ｉで抽出された「ピークの候補」に対して、隣接区画にほぼ同一のm/zの「ピークの候補」がある場合、二次元座標（ｐＩ，m/z）上において、これらの「ピークの候補」を連結して、質量分析スペクトル中において、共通の１つの「ピーク位置（m/z）」を示す「ピーク」とする。この「ピーク」抽出操作により、１つの流路において、各区画で測定される質量分析スペクトルのイオン強度データ（Ｉ(m/z)i）のセットから、二次元座標（ｐＩ，m/z）上にプロットした際、「ピーク位置（m/z）」は共通し、ｐＩ方向に広がりを示す「スポットを形成している、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク」を抽出することが可能になる。図８に、「ピークの候補」の連結によって、「ピーク」を抽出した一例を示す。抽出した「ピーク」において、ｐＩ方向において、イオン強度の極大を示すｐＩを探索し、該「ピーク」のスポット中心のｐＩ値（ｐＩmean-Sm）とする。また、該「ピーク」のスポット中心のｐＩ値（ｐＩmean-Sm）における、「ピーク位置（m/z）」を、抽出された「ピーク」の中心位置（m/z）mean-Smとする。
【０３５１】
IV.  異なる流路間から抽出された「スポットを形成している、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピーク（ｐＩmean-Sm，（m/z）mean-Sm）」の対応付け（シグナルマッチング）を行う。ｐＩとm/zの許容範囲（等電点方向±１、分子量方向±０．３）を設定し、その範囲内に存在する「ピーク」を同一「ピーク」と見做す。許容範囲内に対応する「ピーク」が存在しない流路については、その流路では対応する「ピーク」は存在していないと見做す。
【０３５２】
V.  合計３３サンプルの全てについて、異なる流路間で対応付けされた「ピーク」に対して、その中心ｐＩ値（ｐＩmean-Sm）の平均値（ｐＩav.）と（m/z）mean-Smの平均値（（m/z）av.）からなる二次元座標（ｐＩav.，（m/z）av.）を示す「ピーク」として、その「標準化済ピーク強度：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）relative-Sm」のリストを作成する。各サンプルSm（Sm=１〜３３）の流路間において、対応付けされた「ピーク」のピーク強度の比較を行うため、「標準化済ピーク強度」に対して、上述の「正規化」処理を施し、「正規化ピーク強度：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-Sm」を算出する。合計３３サンプルの全てについて、対応付けされた「ピーク」に対して、二次元座標（ｐＩav.，（m/z）av.）を示す「ピーク」として、その「正規化ピーク強度：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-Sm」のリストを作成する。
【０３５３】
VI.  合計３３サンプルの全てについて、対応付けされた、二次元座標（ｐＩav.，（m/z）av.）を示す「ピーク」の一群について、その「正規化ピーク強度：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-Sm」のリストに基づき、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプル、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルの二つの部分群間において、「正規化ピーク強度：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-Sm」が統計的に有意な差異を有するか、否かを調べる。具体的には、対応付けされた、二次元座標（ｐＩav.，（m/z）av.）を示す「ピーク」の一群中から、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルと比較して、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルにおいて、「正規化ピーク強度：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-Sm」が統計的に有意に大きい「ピーク」を選別する。あるいは、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルと比較して、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルにおいて、「正規化ピーク強度：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-Sm」が統計的に有意に小さい「ピーク」を選別する。
【０３５４】
合計３３サンプルの全てについて、対応付けされた、二次元座標（ｐＩav.，（m/z）av.）を示す「ピーク」の一群について、その「正規化ピーク強度：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-Sm」の比較をより効率的に行うため、「正規化ピーク強度：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-Sm」に対して、上述の「Ｚスコア化」処理を施し、「Ｚ値：Ｉ（ｐＩ,［Ｍpeptide＋Ｈ］+）Z-score-Sm」を算出する。
【０３５５】
「Ｚ値」が正の値である場合、その「正規化ピーク強度：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-Sm」は、「全サンプル群中の平均値」；Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-av.＝（1/33）ΣＩ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-Smよりも大きいことを意味している。疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルについて、算出された「Ｚ値：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）Z-score-Sm」の平均値を算出し、該疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルの部分群における、算出された「Ｚ値：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）Z-score-Sm」の平均値が、少なくとも、０．６５以上である「ピーク」を選別する。
【０３５６】
前記の基準に基づき選別される「ピーク」は、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルと比較して、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルにおいて、「正規化ピーク強度：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-Sm」が統計的に有意に大きい「ピーク」に相当している。実際、合計３３サンプルの全てについて、「Ｚ値」を合計すると、０であるので、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルの部分群における、算出された「Ｚ値：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）Z-score-Sm」の平均値は、−（０．６５）×（１０／２３）≒−０．２８よりも、さらに負な値となっている。従って、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルにおける、算出された「Ｚ値：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）Z-score-Sm」の平均値と、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルの部分群における、算出された「Ｚ値：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）Z-score-Sm」の平均値との差は、少なくとも「全サンプル群中の標準偏差：σ（Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal）」の０．９３以上であり、統計的に有意な差があると見做すことが可能である。
【０３５７】
各個人Sm(Sm＝１〜３３)に対して算出された、それぞれのペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）のＺ値（Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Z-score-Sm）を利用して、receiver operating characteristic (ROC)解析を行う。各個人Sm(Sm＝１〜３３)に由来するサンプルの測定結果から算出した、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）のＺ値（Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Z-score-Sm）を、大きい順に並べると、１位〜３３位までの「順位付け」がなされる。
【０３５８】
疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプル中、Ｚ値（Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Z-score-Sm）が上位Ｎth位以内であるサンプル数の割合（True positive rateまたはSensitivity）：ＴＰＲ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１：Ｎth）；
コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプル中、Ｚ値（Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Z-score-Sm）が上位Ｎth位以内であるサンプル数の割合（False positive rate）：ＦＰＲ(ｐＩ,Ｍpeptide＋１：Ｎth);
コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプル中、Ｚ値（Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Z-score-Sm）が上位Ｎth位以内でないサンプル数の割合（True negative rateまたはSpecificity）、ＴＮＲ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１：Ｎth）；
以上の３つの確率を算出する。勿論、ＦＰＲ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１：Ｎth）＋ＴＮＲ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１：Ｎth）＝１となっている。
【０３５９】
Ｘ軸をＴＮＲ、Ｙ軸をＴＰＲとする、ＲＯＣ空間上に、算出される（ＴＮＲ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１：Ｎth）、ＴＰＲ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１：Ｎth））（Ｎth＝１〜３３）をプロットする。（ＴＮＲ，ＴＰＲ）で表記されるＲＯＣ空間上、（０，１）と（１，０）、ならびに、前記３３個のプロット点を通るＲＯＣ曲線を描く。描かれるＲＯＣ曲線と、Ｘ軸（Specificity）とで挟まる領域の面積Ａplotを数値積分により算出する。算出される面積Ａplotは、AUC“area under the ROC curve”に相当している。前記のＲＯＣ解析により算出される「AUC値」が、少なくとも、０．６０以上、好ましくは、０．７０以上であるという基準に基づき、疾患群（冠動脈病変枝数３）とコントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）の推定に有効なペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）を選別することができる。
【０３６０】
なお、総数３３個のサンプルは、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルとコントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルで構成されているので、Ｎth＝１０の場合のプロット点（ＴＮＲ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１：１０）、ＴＰＲ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１：１０））が、ＲＯＣ空間上、perfect predictionに相当する（１，１）に一致すると、「AUC値」は１となる。
【０３６１】
更には、前記３３個のプロット点（Ｎth＝１〜３３）のうち、ＲＯＣ空間上、perfect predictionに相当する（１，１）に最も近い点で採用される「推定基準」が、「順位付け」を利用する「推定」手法において、最も高い確度の「推定」結果を与える「推定基準」と見做すことができる。
【０３６２】
上記の「順位付け」を利用する「推定」手法で採用される、「上位Ｎth位以内である」という閾値の設定は、そのサンプルのＺ値（Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Z-score-Sm）が、「Ｎth位のＺ値（Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Z-score-Sm）」と等しいか、より大きいという閾値の設定に相当している。従って、サンプルのＺ値（Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Z-score-Sm）が、設定される閾値のＺ値：Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Z-score-Nthに対して、Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Z-score-Sm≧Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Z-score-Nthであるという「推定基準」を利用する「推定」手法に対して、ＲＯＣ解析を行っても、本質的に同じ結果となる。
【０３６３】
上記のＲＯＣ解析により算出される「AUC値」に基づく選別基準に基づき、「AUC値」が、少なくとも、０．６０以上と算出される「ピーク」を選別する。選別される「ピーク」について、後述する「解析２」において、該「ピーク」を与える、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質からトリプシン消化により生成する、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）のアミノ酸配列を特定した結果を記載する。
【０３６４】
さらには、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルにおける、算出された「Ｚ値：Ｉ（ｐＩ,Ｍpeptide＋１）Z-score-Sm」の平均値が、少なくとも、０．６５以上であるという基準に基づき、選別される「ピーク」も、疾患群（冠動脈病変枝数３）とコントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）の推定に有効なペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）に相当している。
【０３６５】
疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルの部分群における、算出された「Ｚ値：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）Z-score-Sm」の平均値が、少なくとも、０．６５以上であるという基準に基づき、選別される「ピーク」についても、後述する「解析２」において、該「ピーク」を与える、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質からトリプシン消化により生成する、ペプチド断片（ｐＩ，Ｍpeptide）のアミノ酸配列を特定した結果を記載する。
【０３６６】
実際に、前記「AUC値」に基づく選別基準に基づき選別される「ピーク」の一つ、その二次元座標（ｐＩav.，（m/z）av.）が（ｐＩav.＝６．７４，（m/z）av.＝１３０６）のピークについて、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルと比較して、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルにおいて、算出された「Ｚ値：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）Z-score-Sm」が統計的に有意に大きいことを、ｔ検定により検証した結果を、図９に示す。
【０３６７】
図９には、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルついて、算出された「Ｚ値：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）Z-score-Sm」と、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルにおいて、算出された「Ｚ値：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）Z-score-Sm」を区分して、プロットしている。コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルついて、算出された「Ｚ値：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）Z-score-Sm」の分布と、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルにおいて、算出された「Ｚ値：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）Z-score-Sm」の分布との間に、統計的に有意な差異があるか、否かを、ｔ検定により判定すると、ｐ＝０．００７で、有意な差異があると判定された。
【０３６８】
VII.  前記（m/z）av.＝１３０６のイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+を与える、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質からトリプシン消化により生成する、ペプチド断片について、別途、LC-MS/MS法を適用し、そのアミノ酸配列に関して、内部配列情報を取得した。その結果から、該断片は、ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質からトリプシン消化により生成する、ペプチド断片の一つである、そのアミノ酸配列はIISDYHQQFR(4487-4496, アミノ酸残基番号については、ＡｐｏＢ１００タンパク質のアミノ酸配列を参照)である断片であると同定される。
【０３６９】
「解析２」
「解析１」において、前記「AUC値」に基づく選別基準に基づき選別される「ピーク」は、「ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質からトリプシン消化により生成する、ペプチド断片」中、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルと比較して、より酸化を受けていると推断される、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプル中で、その生成比率が有意に高いものと判断される。
【０３７０】
加えて、「解析１」において、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルの部分群における、算出された「Ｚ値：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）Z-score-Sm」の平均値が、少なくとも、０．６５以上であるという基準に基づき、選別される「ピーク」も、「ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質からトリプシン消化により生成する、ペプチド断片」中、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルと比較して、より酸化を受けていると推断される、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプル中で、その生成比率が有意に高いものと判断される。
【０３７１】
また、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を使用する免疫沈降では、ＭＤＡ−ＬＤＬが選択的に分取され、回収されるＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質は、ＭＤＡが関与する化学修飾、あるいは、活性酸素種自体が関与する酸化を受けていることが想定される。
【０３７２】
その際、Ｌｙｓ残基の側鎖のアミノ基（−ＮＨ2）は、直接ＭＤＡ化を受け、−ＮＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨＯに変換されていることが想定される。Ｌｙｓ残基に対するＭＤＡによる酸化がさらに進行すると、Ｌｙｓ残基の側鎖のアミノ基（−ＮＨ2）は、最終的に、dihydorxypyridine(DHP)となる。これらＭＤＡが関与する化学修飾によるリジンの分子量の変化は、ＭＤＡ化＋５４、ＤＨＰ化＋１３４である。図１０に、ＬｙｓがＭＤＡ化を受けたときの構造、ＤＨＰ化を受けたときの構造をそれぞれ示す。
【０３７３】
また、Ｍｅｔ残基の酸化も想定される。Ｍｅｔ残基が酸化されて化学修飾を受けた場合、その側鎖の−Ｓ−が、−ＳＯ−、−ＳＯ2−に変換され、＋１６、＋３２の分子量変化が生じる。
【０３７４】
「解析２」では、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルと比較して、より酸化を受けていると推断される、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプル中で、その生成比率が有意に高い「ピーク」として、「解析１」で選別された「ピーク（ｐＩav.,（m/z）av）」全てについて、該「ピーク」を与える「ＭＤＡ−ＬＤＬ中に含まれる、ＡｐｏＢ１００タンパク質からトリプシン消化により生成する、ペプチド断片」の同定を行っている。
【０３７５】
「解析１」で選別された「ピーク（ｐＩav.,（m/z）av）」は、全て、電荷数ｚ＝１のイオン種、すなわち、イオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+型のピークであると仮定する。その（m/z）avは、４００＜（m/z）av＜１５０００の範囲であり、すなわち、４００＜Ｍpeptide＋１＜１５０００の範囲である、ペプチド断片（ｐＩav.，Ｍpeptide）に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピークであると仮定する。
【０３７６】
少なくとも、４００＜Ｍpeptide＋１＜１５０００の範囲である、ペプチド断片（ｐＩav.，Ｍpeptide）のアミノ酸配列は、アミノ酸残基数は、４以上、５０以下の範囲である。
【０３７７】
まず、酸化を受けていないＡｐｏＢ１００タンパク質のトリプシン消化に起因して生成する可能性を有する、アミノ酸残基数が５０以下のペプチド断片の一群を、ＡｐｏＢ１００タンパク質のアミノ酸配列情報に基づき、予測する。具体的には、ＡｐｏＢ１００タンパク質のアミノ酸配列中に含まれる、Ｌｙｓ残基ならびにＡｒｇ残基において、トリプシン消化が起こる結果、生成する可能性がある、アミノ酸残基数が５０以下の全てのペプチド断片を予測し、ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の「理論的予測ペプチド断片」の群とする。ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の「理論的予測ペプチド断片」の群に含まれる、各ペプチド断片のアミノ酸配列に基づき、その分子量Ｍpeptideを計算する。前記ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の「理論的予測ペプチド断片」は、ＡｐｏＢ１００タンパク質のアミノ酸配列中に含まれる、Ｌｙｓ残基ならびにＡｒｇ残基の内、任意の二つを選択して、トリプシン消化を行うことで生成され、その間の部分アミノ酸配列のアミノ酸残基数が５０以下である、ペプチド断片である。従って、該「理論的予測ペプチド断片」のＣ末端は、Ｌｙｓ残基またはＡｒｇ残基であるが、そのアミノ酸残基数が５０以下のアミノ酸配列中に、さらに、Ｌｙｓ残基またはＡｒｇ残基を含むものも含まれている。
【０３７８】
前記ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の「理論的予測ペプチド断片」の群に含まれる、Ｌｙｓ残基を含むペプチド断片について、含まれるＬｙｓ残基の一つが、ＭＤＡ化修飾を受けた際の分子量（Ｍpeptide＋５４）を計算する。さらに、複数のＬｙｓ残基を含むペプチド断片について、含まれるＬｙｓ残基のｎ1個が、ＭＤＡ化修飾を受けた際の分子量（Ｍpeptide＋５４×ｎ1）を計算する。
【０３７９】
同様に、前記ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の「理論的予測ペプチド断片」の群に含まれる、Ｌｙｓ残基を含むペプチド断片について、含まれるＬｙｓ残基の一つが、ＤＨＰ化修飾を受けた際の分子量（Ｍpeptide＋１３４）を計算する。さらに、複数のＬｙｓ残基を含むペプチド断片について、含まれるＬｙｓ残基のｎ2個が、ＤＨＰ化修飾を受けた際の分子量（Ｍpeptide＋１３４×ｎ2）を計算する。
【０３８０】
加えて、前記ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の「理論的予測ペプチド断片」の群に含まれる、複数のＬｙｓ残基を含むペプチド断片について、含まれるＬｙｓ残基のｎ2個が、ＤＨＰ化修飾を受け、含まれるＬｙｓ残基のｎ1個が、ＭＤＡ化修飾を受けた際の分子量（Ｍpeptide＋５４×ｎ1＋１３４×ｎ2）を計算する。
【０３８１】
前記ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の「理論的予測ペプチド断片」の群に含まれる、Ｍｅｔ残基を含むペプチド断片について、含まれるＭｅｔ残基の一つが、酸化を受け、一酸化体（Ｍｅｔ（Ｏ））に変換された際の分子量（Ｍpeptide＋１６）を計算する。さらに、複数のＭｅｔ残基を含むペプチド断片について、含まれるＭｅｔ残基のｎ3個が、酸化を受け、一酸化体（Ｍｅｔ（Ｏ））に変換された際の分子量（Ｍpeptide＋１６×ｎ3）を計算する。
【０３８２】
前記ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の「理論的予測ペプチド断片」の群に含まれる、Ｍｅｔ残基を含むペプチド断片について、含まれるＭｅｔ残基の一つが、酸化を受け、二酸化体（Ｍｅｔ（Ｏ2））に変換された際の分子量（Ｍpeptide＋３２）を計算する。さらに、複数のＭｅｔ残基を含むペプチド断片について、含まれるＭｅｔ残基のｎ4個が、酸化を受け、二酸化体（Ｍｅｔ（Ｏ2））に変換された際の分子量（Ｍpeptide＋３２×ｎ4）を計算する。
【０３８３】
加えて、前記ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の「理論的予測ペプチド断片」の群に含まれる、複数のＭｅｔ残基を含むペプチド断片について、含まれるＭｅｔ残基のｎ4個が、二酸化体（Ｍｅｔ（Ｏ2））に変換され、含まれるＭｅｔ残基のｎ3個が、一酸化体（Ｍｅｔ（Ｏ））に変換された際の分子量（Ｍpeptide＋１６×ｎ3＋３２×ｎ4）を計算する。
【０３８４】
上記ＡｐｏＢ１００タンパク質由来の「理論的予測ペプチド断片」の群に含まれる、酸化修飾が無いペプチド断片の分子量（Ｍpeptide）；
含まれるＬｙｓ残基にＭＤＡ化修飾またはＤＨＰ化修飾が生じているペプチド断片の分子量（Ｍpeptide＋５４×ｎ1＋１３４×ｎ2）；
含まれるＭｅｔ残基が、一酸化体（Ｍｅｔ（Ｏ））または二酸化体（Ｍｅｔ（Ｏ2））に変換されているペプチド断片の分子量（Ｍpeptide＋１６×ｎ3＋３２×ｎ4）；
以上の計算された「分子量の予測値（Ｍcal.）」リスト中から、実際に、「分子量の予測値（Ｍcal.）」が、４００＜Ｍcal.＋１＜１５０００の範囲内であるものを選抜し、候補ペプチド断片の「分子量の予測値（Ｍcal.）」リストを作成する。
【０３８５】
かかる候補ペプチド断片の「分子量の予測値（Ｍcal.）」リスト中から、「解析１」で選別された「ピーク（ｐＩav.,（m/z）av）」の（m/z）avから推定される、分子量Ｍobs.＝（m/z）av−１と、測定誤差範囲（±０．３）で一致する、「分子量の予測値（Ｍcal.）」の候補を選別する。
【０３８６】
前記の選別操作によって、「解析１」で選別された「ピーク（ｐＩav.,（m/z）av）」の（m/z）avから推定される、分子量Ｍobs.＝（m/z）av−１に対して、選別された「分子量の予測値（Ｍcal.）」の候補を、下記の表１３、表１４〜表１７に示す。
【０３８７】
表１３には、「解析１」で選別された「ピーク（ｐＩav.,（m/z）av）」中、「酸化修飾が無いペプチド断片」に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピークと同定されるものが纏められている。
【０３８８】
【表１３−１】
0005857312.tif 000016
【０３８９】
なお、前記表１３に記載する各ペプチド断片について、その等電点ｐＩと分子量Ｍｗを下記の表１３−２に示す。
【０３９０】
【表１３−２】
0005857312.tif 000017
【０３９１】
表１４には、「解析１」で選別された「ピーク（ｐＩav.,（m/z）av）」中、「ペプチド鎖中に含まれるＬｙｓ残基にＭＤＡ化修飾が生じているペプチド断片」に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピークと同定されるものが纏められている。
【０３９２】
【表１４】
0005857312.tif 000018
【０３９３】
表１５には、「ペプチド鎖中に含まれるＬｙｓ残基にＤＨＰ化修飾が生じているペプチド断片」に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピークと同定されるものが纏められている。
【０３９４】
【表１５】
0005857312.tif 000019
【０３９５】
表１６には、「解析１」で選別された「ピーク（ｐＩav.,（m/z）av）」中、「ペプチド鎖のＣ末端のＬｙｓ残基にＭＤＡ化修飾が生じているペプチド断片」に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピークと同定されるものが纏められている。
【０３９６】
【表１６】
0005857312.tif 000020
【０３９７】
表１７には、「解析１」で選別された「ピーク（ｐＩav.,（m/z）av）」中、「ペプチド鎖中に含まれるＭｅｔ残基に酸化修飾が生じているペプチド断片」に由来するイオン種［Ｍpeptide＋Ｈ］+のピークと同定されるものが纏められている。
【０３９８】
【表１７】
0005857312.tif 000021
【０３９９】
なお、表１７中、番号６０１のペプチド断片「GISTSAASPAVGTVGMDMDEDDDFSK」と、番号６０３のペプチド断片「HEQDMVNGIMLSVEK」中に含まれるＭｅｔ残基に酸化修飾は、その分子量の増加から、一酸化体（Ｍｅｔ（Ｏ））と判断される。
【０４００】
一方、表１７中、番号６０２のペプチド断片「FNEFIQNELQEASQELQQIHQYIMALR」中に含まれるＭｅｔ残基に酸化修飾は、分子量の増加が、＋３２である、二酸化体（Ｍｅｔ（Ｏ2））であると判断される。
【０４０１】
表１３、表１４〜表１７中では、各「ピーク」に対して選別された「分子量の予測値（Ｍcal.）」の候補を、その候補ペプチドのアミノ酸配列、ならびに、ＡｐｏＢ１００タンパク質中における存在位置（アミノ酸残基番号）を用いて、記載している。また、各「ピーク」に対して、上記「解析１」における選別時に選別基準とした「AUC」の値も併せて記載する。
【０４０２】
表１４に示す「候補ペプチドのアミノ酸配列」中では、ＡｐｏＢ１００タンパク質のアミノ酸配列中、
４１４５番目、２４０２番目、４４６１番目、１３１１番目、３２２９番目、１８５２番目、１１７番目、３４０４番目、
１２９１番目、１２９５番目、２８２５番目、２８２９番目、３５３１番目、３５３７番目、６１６番目、６２０番目、３２２１番目、３２２７番目、２４２６番目、２４２８番目、２００２番目、２００４番目、２４０３番目、２４１０番目、２４１８番目、２４２５番目、３９９５番目、４０２１番目、４０３４番目、
以上の位置のＬｙｓ残基が、ＭＤＡ化修飾を受けていることが判る。
【０４０３】
表１５に示す「候補ペプチドのアミノ酸配列」中では、ＡｐｏＢ１００タンパク質のアミノ酸配列中、
５３９番目、１０３４番目、７４５番目、６１６番目、１１４番目、１５７番目、４２６１番目、２９３番目、３９７３番目、２１３９番目、４１８７番目、２５７５番目、７３２番目、
２３６９番目、２３７１番目、４２７４番目、４２７８番目、３９４４番目、３９４６番目、３６７３番目、３６８２番目、２４１８番目、２４２５番目、６１２番目、６１３番目、３５３７番目、３５４７番目、４４７８番目、４４８５番目、
以上の位置のＬｙｓ残基が、ＤＨＰ化修飾を受けていることが判る。
【０４０４】
表１６に示す「候補ペプチドのアミノ酸配列」中では、ＡｐｏＢ１００タンパク質のアミノ酸配列中、
５５７番目、１７２４番目、２００２番目、２２０８番目、３２２１番目、１３４４番目、
以上の位置のＬｙｓ残基が、ＭＤＡ化修飾を受けていることが判る。
【０４０５】
表１７に示す「候補ペプチドのアミノ酸配列」中では、ＡｐｏＢ１００タンパク質のアミノ酸配列中、
４０１１番目、４０１３番目、４３８２番目、７５０番目、７５５番目、
以上の位置のＭｅｔ残基が、酸化修飾を受けていることが判る。
【０４０６】
従って、表１４〜表１７に示す「候補ペプチドのアミノ酸配列」は、下記の表１８−１に示すアミノ酸残基位置のＬｙｓ残基に対する、ＭＤＡ化修飾あるいはＤＨＰ化修飾の進行度、ならびに、下記の表１８−２に示すアミノ酸残基位置のＭｅｔ残基に対する、酸化修飾の進行度を評価する際、「評価マーカー」として適する、酸化ペプチド断片であると判断される。
【０４０７】
【表１８−１】
0005857312.tif 000022
【０４０８】
【表１８−２】
0005857312.tif 000023
【０４０９】
解析３
「解析２」では、「解析１」で選別された「ピーク（ｐＩav.,（m/z）av）」について、該「ピーク」の（m/z）avに基づき、推定される分子量Ｍobs.＝（m/z）av−１と、測定誤差範囲（±０．３）で一致する、「分子量の予測値（Ｍcal.）」の候補、該候補ペプチドのアミノ酸配列の特定を行っている。上記表１３、表１４〜表１７中に記載する「ピーク（ｐＩav.,（m/z）av）」は、何れも、その「AUC」の値は、少なくとも、０．６４以上の範囲となっている。すなわち、「解析１」で利用した、合計３３サンプル中、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルと比較して、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプル中で、その生成比率が有意に高いものと判断される。
【０４１０】
さらに、「解析１」で選別された「ピーク（ｐＩav.,（m/z）av）」を複数種組み合わせ、該複数種の「ピーク」の「正規化ピーク強度：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-Sm」の和｛ΣＩ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-Sm｝について、上述の「Ｚスコア化」処理を施し、複数種の「ピーク」の組み合わせに対する、「Ｚ値：｛ΣＩ（ｐＩav.,（m/z）av）｝Z-score-Sm」を算出する。かかる複数種の「ピーク」の組み合わせに対する、「Ｚ値：｛ΣＩ（ｐＩav.,（m/z）av）｝Z-score-Sm」に関して、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルにおける分布と、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルにおける分布を比較すると、その分布には有意な差異が見出される。
【０４１１】
例えば、表１３中に示す、番号２０７のピーク：LYSILK（2758-2763）、表１４中に示す、番号３０１のピーク：GASGTTGTYQEWKDK（4133-4147）、表１５中に示す、番号４５１のピーク：ELLKDLSKEAQEVFK（4271-4285）の組み合わせを考慮する。
【０４１２】
番号２０７のピーク：LYSILK（2758-2763）の「正規化ピーク強度」を、Ｉ（207）normal-Smと表記し、該Ｉ（207）normal-Smの「全サンプル群中の平均値」を、Ｉ（207）normal-av.＝（1/33）ΣＩ（207）normal-Smと、該「全サンプル群中の平均値」に対する、「全サンプル群中の標準偏差」をσ（Ｉ（207）normal）と表記する。また、番号２０７のピークの「正規化ピーク強度」Ｉ（207）normal-Smについて、上述の「Ｚスコア化」処理を施すことで算出される、「Ｚ値」を、Ｉ（207）Z-score-Smと表記する。合計３３サンプル中、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルと、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルについて、該Ｉ（207）Z-score-Smを用いて、ＲＯＣ解析を行い算出される、表１３中に記載する、番号２０７のピークに関する「AUC」値は、０．６７３である。
【０４１３】
番号３０１のピーク：GASGTTGTYQEWKDK（4133-4147）の「正規化ピーク強度」を、Ｉ（301）normal-Smと表記し、該Ｉ（301）normal-Smの「全サンプル群中の平均値」を、Ｉ（301）normal-av.＝（1/33）ΣＩ（301）normal-Smと、該「全サンプル群中の平均値」に対する、「全サンプル群中の標準偏差」をσ（Ｉ（301）normal）と表記する。また、番号３０１のピークの「正規化ピーク強度」Ｉ（301）normal-Smについて、上述の「Ｚスコア化」処理を施すことで算出される、「Ｚ値」を、Ｉ（301）Z-score-Smと表記する。合計３３サンプル中、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルと、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルについて、該Ｉ（301）Z-score-Smを用いて、ＲＯＣ解析を行い算出される、表１４中に記載する、番号３０１のピークに関する「AUC」値は、０．７６９である。
【０４１４】
番号４５１のピーク：ELLKDLSKEAQEVFK（4271-4285）の「正規化ピーク強度」を、Ｉ（451）normal-Smと表記し、該Ｉ（451）normal-Smの「全サンプル群中の平均値」を、Ｉ（451）normal-av.＝（1/33）ΣＩ（451）normal-Smと、該「全サンプル群中の平均値」に対する、「全サンプル群中の標準偏差」をσ（Ｉ（451）normal）と表記する。また、番号４５１のピークの「正規化ピーク強度」Ｉ（451）normal-Smについて、上述の「Ｚスコア化」処理を施すことで算出される、「Ｚ値」を、Ｉ（451）Z-score-Smと表記する。合計３３サンプル中、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルと、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルについて、該Ｉ（451）Z-score-Smを用いて、ＲＯＣ解析を行い算出される、表１５中に記載する、番号４５１のピークに関する「AUC」値は、０．７２７である。
【０４１５】
各個人Sm(Sm＝１〜３３)に対して算出された、Ｉ（207）Z-score-Sm、Ｉ（301）Z-score-Sm、Ｉ（451）Z-score-Smを利用して、receiver operating characteristic (ROC)解析を行う。各個人Sm(Sm＝１〜３３)対して算出された、Ｉ（207）Z-score-Sm、Ｉ（301）Z-score-Sm、Ｉ（451）Z-score-Smを、それぞれ、大きい順に並べると、１位〜３３位までの「順位付け」がなされる。
【０４１６】
疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプル中、Ｚ値Ｉ（207）Z-score-Smが上位Ｎth位以内である、Ｚ値Ｉ（301）Z-score-Smが上位Ｎth位以内である、Ｚ値Ｉ（451）Z-score-Smが上位Ｎth位以内である、そのいずれかの条件を満たすサンプル数の割合（True positive rateまたはSensitivity）：ＴＰＲ（207+301+451：Ｎth）；
コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプル中、Ｚ値Ｉ（207）Z-score-Smが上位Ｎth位以内である、Ｚ値Ｉ（301）Z-score-Smが上位Ｎth位以内である、Ｚ値Ｉ（451）Z-score-Sm＞０が上位Ｎth位以内である、そのいずれかの条件を満たすサンプル数の割合（False positive rate）：ＦＰＲ(207+301+451：Ｎth);
コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプル中、Ｚ値Ｉ（207）Z-score-Smが上位Ｎth位以内でない、Ｚ値Ｉ（301）Z-score-Smが上位Ｎth位以内でない、Ｚ値Ｉ（451）Z-score-Sが上位Ｎth位以内でない、この三条件を満たすサンプル数の割合（True negative rateまたはSpecificity）、ＴＮＲ（207+301+451：Ｎth）；
以上の３つの確率を算出する。勿論、ＦＰＲ（207+301+451：Ｎth）＋ＴＮＲ（207+301+451：Ｎth）＝１となっている。
【０４１７】
Ｘ軸をＴＮＲ、Ｙ軸をＴＰＲとする、ＲＯＣ空間上に、算出される（ＴＮＲ（207+301+451：Ｎth）、ＴＰＲ（207+301+451：Ｎth））（Ｎth＝１〜３３）をプロットする。ＲＯＣ空間上、（０，１）、（１，０）と、前記３３個のプロット点を通るＲＯＣ曲線を描く。描かれるＲＯＣ曲線と、Ｘ軸（Specificity）とで挟まる領域の面積Ａplotを数値積分により算出する。算出される面積Ａplotは、AUC“area under the ROC curve”に相当している。前記のＲＯＣ解析により算出される「AUC値」は、「番号２０７のピーク、番号３０１のピーク、番号４５１のピークの組み合わせ」に関する「AUC」値であり、０．８５８となることが判った。
【０４１８】
この結果は、上記合計３３サンプルからなる群においては、
「番号２０７のピーク、番号３０１のピーク、番号４５１のピークの組み合わせ」に基づき、例えば、Ｎth＝１０の条件、「Ｚ値Ｉ（207）Z-score-Smが上位１０位以内である、Ｚ値Ｉ（301）Z-score-Smが上位１０位以内である、Ｚ値Ｉ（451）Z-score-Sm＞０が上位１０位以内である、そのいずれかの条件を満たす場合、「冠動脈病変枝数３」の被験者のサンプルと推定する」という推定基準に基づき、各サンプルに関して、「冠動脈病変枝数３」の被験者のサンプルか、否かの推定を行うと、より高い確度の推定がなされることが判る。
【０４１９】
具体的には、「番号２０７のピーク、番号３０１のピーク、番号４５１のピークの組み合わせ」を採用することで、個々の「ピーク」における「バラツキ」に起因する「誤った推定」を排除でき、「組み合わせ」全体では、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルであるか、否かの推定が、より高い確度で行えることを査証している。
【０４２０】
「解析１」で選別された「ピーク（ｐＩav.,（m/z）av）」は、何れも、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルにおける分布と、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルにおける分布を比較すると、有意な「分布の差異」が見出される。先に例示したように、「複数種のピークの組み合わせ」を採用すると、個々の「ピーク」における「バラツキ」に起因する「誤った推定」を排除でき、「複数種のピークの組み合わせ」全体では、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルにおける分布と、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルにおける分布を比較すると、その二つの部分群間に存在する「分布の差異」が、より明確化される。従って、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）と、疾患群（冠動脈病変枝数３）の二つの部分群間における、「病態」の進行度の差異を識別する目的で利用する「診断マーカー」として、先に例示するような「複数種のピークの組み合わせ」の利用はより効果的であることが示される。
【０４２１】
例えば、選別された「診断マーカー」を利用して、被験者Sm-testが、疾患群（冠動脈病変枝数３）に属するか、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）に属するかの推定を行う手順を説明する。
【０４２２】
先ず、上述する手法に準じて、該被験者Sm-testから採取した血液サンプル中から分取される、ＭＤＡ−ＬＤＬ中のＡｐｏＢ１００タンパク質に由来するペプチド断片の「ピーク（ｐＩav.,（m/z）av）」について、「正規化ピーク強度：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-Sm-test」を算出する。
【０４２３】
「診断マーカー」の「ピーク（ｐＩav.,（m/z）av）」に関して、設定される「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th」と、該被験者Sm-testの「正規化ピーク強度：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-Sm-test」を比較する。
【０４２４】
その比較の結果、判定条件：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-Sm-test≧Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-thを満たす場合、該被験者Sm-testは、疾患群（冠動脈病変枝数３）に属する；前記判定条件を満たさない場合、該被験者Sm-testは、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）に属すると、推定を行う。
【０４２５】
前記推定操作に利用する、「ピーク（ｐＩav.,（m/z）av）」に対する「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th」は、例えば、下記の手順に従って設定することが可能である。
【０４２６】
具体的には、「解析１」において、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルと疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルからなる、合計３３サンプル中の、各個人Sm(Sm＝１〜３３)に対して、それぞれ、算出される、該「ピーク（ｐＩav.,（m/z）av）」の「正規化ピーク強度：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-Sm」を利用して、「交差検定（Cross-valodation）」の手法を応用して、「ピーク（ｐＩav.,（m/z）av）」に対する「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th」の最適化を行うことが可能である。
【０４２７】
例えば、“leave-one-out cross-validation”の手法を応用することで、下記の手順により、「ピーク（ｐＩav.,（m/z）av）」に対する「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th」の最適化を行うことができる。
【０４２８】
合計３３サンプル中、１個人Sm(Sm＝ｔ；ｔ＝１〜３３)を取り出し、「テスト事例（testing set）」とし、残る３２個人からなる群Sm(Sm≠ｔ)を、「訓練事例（training set）」とする。「テスト事例（testing set）」とする、１個人Sm(Sm＝ｔ；ｔ＝１〜３３)は、３３種類あり、それに対応して、「訓練事例（training set）」Sm(Sm≠ｔ；ｔ＝１〜３３)も、３３種類作成される。
【０４２９】
「テスト事例（testing set）」とする、１個人Sm(Sm＝ｔ；ｔ＝１〜３３)が、疾患群（冠動脈病変枝数３）に属する場合、「訓練事例（training set）」Sm(Sm≠ｔ；ｔ＝１〜３３)は、疾患群（冠動脈病変枝数３）に属する９サンプルと、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルで構成される。一方、「テスト事例（testing set）」とする、１個人Sm(Sm＝ｔ；ｔ＝１〜３３)が、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）に属する場合、「訓練事例（training set）」Sm(Sm≠ｔ；ｔ＝１〜３３)は、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルと、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）に属する２２サンプルで構成される。
【０４３０】
作成される「訓練事例（training set）」Sm(Sm≠ｔ；ｔ＝１〜３３)に対して、判定条件：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-Sm≧Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-thを満たす場合、該被験者Smは、疾患群（冠動脈病変枝数３）に属する；前記判定条件を満たさない場合、該被験者Smは、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）に属すると、推定を行う。
【０４３１】
該「訓練事例（training set）」Sm(Sm≠ｔ；ｔ＝１〜３３)が、疾患群（冠動脈病変枝数３）に属する９サンプルと、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルで構成されている場合、
疾患群（冠動脈病変枝数３）９サンプル中、前記判定条件を満たすサンプル数の割合（True positive rateまたはSensitivity）：ＴＰＲ（Sm≠ｔ：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th）；
コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプル中、前記判定条件を満たすサンプル数の割合（False positive rate）：ＦＰＲ(Sm≠ｔ：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th);
コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプル中、前記判定条件を満たさないサンプル数の割合（True negative rateまたはSpecificity）、ＴＮＲ（Sm≠ｔ：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th）；
以上の３つの確率を算出する。勿論、ＦＰＲ（Sm≠ｔ：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th）＋ＴＮＲ（Sm≠ｔ：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th）＝１となっている。
【０４３２】
該「訓練事例（training set）」Sm(Sm≠ｔ；ｔ＝１〜３３)が、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルと、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）に属する２２サンプルで構成されている場合、
疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプル中、前記判定条件を満たすサンプル数の割合（True positive rateまたはSensitivity）：ＴＰＲ（Sm≠ｔ：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th）；
コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２２サンプル中、前記判定条件を満たすサンプル数の割合（False positive rate）：ＦＰＲ(Sm≠ｔ：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th);
コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２２サンプル中、前記判定条件を満たさないサンプル数の割合（True negative rateまたはSpecificity）、ＴＮＲ（Sm≠ｔ：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th）；
以上の３つの確率を算出する。勿論、ＦＰＲ（Sm≠ｔ：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th）＋ＴＮＲ（Sm≠ｔ：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th）＝１となっている。
【０４３３】
作成される合計３３種類の「訓練事例（training set）」Sm(Sm≠ｔ；ｔ＝１〜３３)について、それぞれ、算出されるＴＰＲ（Sm≠ｔ：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th）とＴＮＲ（Sm≠ｔ：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th）の組み合わせ、合計３３の組み合わせを、Ｘ軸をＴＮＲ、Ｙ軸をＴＰＲとする、ＲＯＣ空間上に、プロットする。ＲＯＣ空間上、（０，１）、（１，０）と、前記３３個のプロット点（ＴＮＲ（Sm≠ｔ：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th），ＴＰＲ（Sm≠ｔ：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th））を通るＲＯＣ曲線を描く。描かれるＲＯＣ曲線と、Ｘ軸（Specificity）とで挟まる領域の面積Ａplotを数値積分により算出する。算出される面積Ａplotは、AUC“area under the ROC curve”に相当している。前記のＲＯＣ解析により算出される「AUC値」は、「ピーク（ｐＩav.,（m/z）av）」に対する「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th」に基づく、上記判定条件に対する「AUC値」、AUC(Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th)と見做す。
【０４３４】
合計３３サンプル中の、各個人Sm(Sm＝１〜３３)に対して、それぞれ、算出される、該「ピーク（ｐＩav.,（m/z）av）」の「正規化ピーク強度：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-Sm」を、大きい順に並べると、１位〜３３位までの「順位付け」がなされる。「順位付け」された１位〜３３位までの「正規化ピーク強度：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-Sm」を、それぞれ、「ピーク（ｐＩav.,（m/z）av）」に対する「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th」として、前記のＲＯＣ解析により算出される、上記判定条件に対する「AUC値」、AUC(Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th＝Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av)を求める。
【０４３５】
求められる、３３種類のAUC(Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th＝Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av)を、「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th」として採用した、「正規化ピーク強度：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-Sm」の順位に従って、横軸を「順位」、縦軸をAUC(Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th＝Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av)としてプロットする。すると、「順位」が１０位の近辺で、AUC(Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th＝Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av)が極大となる。この極大を示す、AUC(Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th＝Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av)を与える、「ピーク（ｐＩav.,（m/z）av）」に対する「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th」は、最適化された「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-th」と見做すことが可能である。
【０４３６】
例えば、「番号２０７のピーク、番号３０１のピーク、番号４５１のピークの組み合わせ」に基づき、被験者Sm-testが、疾患群（冠動脈病変枝数３）に属するか、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）に属するかの推定を行う際には、下記のような判定条件を設定することができる。
【０４３７】
「番号２０７のピーク」に対する「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（207）normal-th」、「番号３０１のピーク」に対する「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（301）normal-th」、「番号４５１のピーク」に対する「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（451）normal-th」を、それぞれ設定する。設定される「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（207）normal-th」、「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（301）normal-th」、「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（451）normal-th」と、該被験者Sm-testの「正規化ピーク強度：Ｉ（207）normal-Sm-test」、「正規化ピーク強度：Ｉ（301）normal-Sm-test」、「正規化ピーク強度：Ｉ（451）normal-Sm-test」を、それぞれ比較する。
【０４３８】
その比較の結果、判定条件「Ｉ（207）normal-Sm-test≧Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-Sm-test≧Ｉ（301）normal-th、Ｉ（451）normal-Sm-test≧Ｉ（451）normal-thのいずれかを満たす」場合、該被験者Sm-testは、疾患群（冠動脈病変枝数３）に属する；前記判定条件を満たさない場合、該被験者Sm-testは、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）に属すると、推定を行う。
【０４３９】
前記推定操作に利用する、「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（207）normal-th」、「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（301）normal-th」、「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（451）normal-th」は、例えば、下記の手順に従って設定することが可能である。
【０４４０】
具体的には、「解析１」において、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルと疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルからなる、合計３３サンプル中の、各個人Sm(Sm＝１〜３３)に対して、それぞれ、算出される、該「ピーク（ｐＩav.,（m/z）av）」の「正規化ピーク強度：Ｉ（ｐＩav.,（m/z）av）normal-Sm」を利用して、「交差検定」の手法を応用して、「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（207）normal-th」、「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（301）normal-th」、「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（451）normal-th」の最適化を行うことが可能である。
【０４４１】
例えば、“leave-one-out cross-validation”の手法を応用することで、下記の手順により、「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（207）normal-th」、「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（301）normal-th」、「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（451）normal-th」の最適化を行うことができる。
【０４４２】
合計３３サンプル中、１個人Sm(Sm＝ｔ；ｔ＝１〜３３)を取り出し、「テスト事例（testing set）」とし、残る３２個人からなる群Sm(Sm≠ｔ)を、「訓練事例（training set）」とする。「テスト事例（testing set）」とする、１個人Sm(Sm＝ｔ；ｔ＝１〜３３)は、３３種類あり、それに対応して、「訓練事例（training set）」Sm(Sm≠ｔ；ｔ＝１〜３３)も、３３種類作成される。
【０４４３】
「テスト事例（testing set）」とする、１個人Sm(Sm＝ｔ；ｔ＝１〜３３)が、疾患群（冠動脈病変枝数３）に属する場合、「訓練事例（training set）」Sm(Sm≠ｔ；ｔ＝１〜３３)は、疾患群（冠動脈病変枝数３）に属する９サンプルと、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルで構成される。一方、「テスト事例（testing set）」とする、１個人Sm(Sm＝ｔ；ｔ＝１〜３３)が、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）に属する場合、「訓練事例（training set）」Sm(Sm≠ｔ；ｔ＝１〜３３)は、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルと、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）に属する２２サンプルで構成される。
【０４４４】
作成される「訓練事例（training set）」Sm(Sm≠ｔ；ｔ＝１〜３３)に対して、判定条件「Ｉ（207）normal-Sm≧Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-Sm≧Ｉ（301）normal-th、Ｉ（451）normal-Sm≧Ｉ（451）normal-thのいずれかを満たす」場合、該被験者（サンプル）Smは、疾患群（冠動脈病変枝数３）に属する；前記判定条件を満たさない場合、該被験者Sm（サンプル）は、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）に属すると、推定を行う。
【０４４５】
該「訓練事例（training set）」Sm(Sm≠ｔ；ｔ＝１〜３３)が、疾患群（冠動脈病変枝数３）に属する９サンプルと、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプルで構成されている場合、
疾患群（冠動脈病変枝数３）９サンプル中、前記判定条件を満たすサンプル数の割合（True positive rateまたはSensitivity）：ＴＰＲ（Sm≠ｔ：Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）；
コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプル中、前記判定条件を満たすサンプル数の割合（False positive rate）：ＦＰＲ(Sm≠ｔ：Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th);
コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプル中、前記判定条件を満たさないサンプル数の割合（True negative rateまたはSpecificity）、ＴＮＲ（Sm≠ｔ：Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）；
以上の３つの確率を算出する。勿論、ＦＰＲ（Sm≠ｔ：Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）＋ＴＮＲ（Sm≠ｔ：Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）＝１となっている。
【０４４６】
該「訓練事例（training set）」Sm(Sm≠ｔ；ｔ＝１〜３３)が、疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプルと、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）に属する２２サンプルで構成されている場合、
疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプル中、前記判定条件を満たすサンプル数の割合（True positive rateまたはSensitivity）：ＴＰＲ（Sm≠ｔ：Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）；
コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２２サンプル中、前記判定条件を満たすサンプル数の割合（False positive rate）：ＦＰＲ(Sm≠ｔ：Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th);
コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２２サンプル中、前記判定条件を満たさないサンプル数の割合（True negative rateまたはSpecificity）、ＴＮＲ（Sm≠ｔ：Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）normal-th）；
以上の３つの確率を算出する。勿論、ＦＰＲ（Sm≠ｔ：Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）＋ＴＮＲ（Sm≠ｔ：Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）＝１となっている。
【０４４７】
作成される合計３３種類の「訓練事例（training set）」Sm(Sm≠ｔ；ｔ＝１〜３３)について、それぞれ、算出されるＴＰＲ（Sm≠ｔ：Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）とＴＮＲ（Sm≠ｔ：Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）の組み合わせ、合計３３の組み合わせを、Ｘ軸をＴＮＲ、Ｙ軸をＴＰＲとする、ＲＯＣ空間上に、プロットする。ＲＯＣ空間上、（０，１）、（１，０）と、前記３３個のプロット点（ＴＮＲ（Sm≠ｔ：Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th），ＴＰＲ（Sm≠ｔ：Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）を通るＲＯＣ曲線を描く。描かれるＲＯＣ曲線と、Ｘ軸（Specificity）とで挟まる領域の面積Ａplotを数値積分により算出する。算出される面積Ａplotは、AUC“area under the ROC curve”に相当している。前記のＲＯＣ解析により算出される「AUC値」は、Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-thの組み合わせに基づく、上記判定条件に対する「AUC値」、AUC(Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th)と見做す。
【０４４８】
合計３３サンプル中の、各個人Sm(Sm＝１〜３３)に対して、それぞれ、算出される「正規化ピーク強度：Ｉ（207）normal-Sm」、「正規化ピーク強度：Ｉ（301）normal-Sm」、「正規化ピーク強度：Ｉ（405）normal-Sm」を、それぞれ、大きい順に並べると、それぞれ、１位〜３３位までの「順位付け」がなされる。「順位付け」された１位〜３３位までの「正規化ピーク強度：Ｉ（207）normal-Sm」、「正規化ピーク強度：Ｉ（301）normal-Sm」、「正規化ピーク強度：Ｉ（405）normal-Sm」を、それぞれ、「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（207）normal-th」、「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（301）normal-th」、「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（451）normal-th」とすると、延べ３３×３３×３３種類の閾値の組み合わせ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）＝（Ｉ（207）normal-Sm、Ｉ（301）normal-Sm、Ｉ（450）normal-Sm）の群が作成される。
【０４４９】
延べ３３×３３×３３種類の閾値の組み合わせ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）に基づく、判定条件について、前記のＲＯＣ解析により算出される、上記判定条件に対する「AUC値」、AUC(（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）＝（Ｉ（207）normal-Sm、Ｉ（301）normal-Sm、Ｉ（450）normal-Sm）)を求める。
【０４５０】
求められる、延べ３３×３３×３３種類のAUC(（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）＝（Ｉ（207）normal-Sm、Ｉ（301）normal-Sm、Ｉ（450）normal-Sm）)を、大きい値を示す順に並べると、１位〜（３３×３３×３３）位までの「順位付け」がなされる。１位のAUC(（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）＝（Ｉ（207）normal-Sm、Ｉ（301）normal-Sm、Ｉ（450）normal-Sm）)を与える、閾値の組み合わせ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）＝（Ｉ（207）normal-Sm、Ｉ（301）normal-Sm、Ｉ（450）normal-Sm）は、最適化された閾値の組み合わせ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）と見做すことが可能である。
【０４５１】
実際には、「順位付け」されたAUC(（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）＝（Ｉ（207）normal-Sm、Ｉ（301）normal-Sm、Ｉ（450）normal-Sm）)中、上位１位〜２７位までは、「然程、値に差がない」と判断できる。
【０４５２】
上位１位〜２７位までAUC値を与える、閾値の組み合わせ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）＝（Ｉ（207）normal-Sm、Ｉ（301）normal-Sm、Ｉ（450）normal-Sm）について、それぞれ、下記の判定条件「Ｉ（207）normal-Sm≧Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-Sm≧Ｉ（301）normal-th、Ｉ（451）normal-Sm≧Ｉ（451）normal-thのいずれかを満たす」場合、該被験者（サンプル）Smは、疾患群（冠動脈病変枝数３）に属する；前記判定条件を満たさない場合、該被験者Sm（サンプル）は、コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）に属すると、合計３３サンプル中の各個人Sm(Sm＝１〜３３)に対して、推定を行う。
【０４５３】
前記上位１位〜２７位までの「閾値の組み合わせ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）」に基づく、判定条件による、合計３３サンプル中の各個人Sm(Sm＝１〜３３)に対する推定結果を用いて、それぞれ、下記の確率を算出する。
【０４５４】
各「閾値の組み合わせ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）」に基づく、判定条件を用いた推定結果から、
疾患群（冠動脈病変枝数３）１０サンプル中、前記判定条件を満たすサンプル数の割合（True positive rateまたはSensitivity）：ＴＰＲ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）；
コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプル中、前記判定条件を満たすサンプル数の割合（False positive rate）：ＦＰＲ(Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th);
コントロール（非患者）群（冠動脈病変枝数０）２３サンプル中、前記判定条件を満たさないサンプル数の割合（True negative rateまたはSpecificity）、ＴＮＲ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）；
以上の３つの確率を算出する。勿論、ＦＰＲ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）＋ＴＮＲ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）＝１となっている。
【０４５５】
上位１位〜２７位までの各「閾値の組み合わせ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）」に対して、算出されるＴＮＲ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）とＴＰＲ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）を、Ｘ軸をＴＮＲ、Ｙ軸をＴＰＲとする、ＲＯＣ空間上に、プロットする。ＲＯＣ空間上にプロットされている、合計２７個のプロット点（ＴＮＲ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th），ＴＰＲ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th））と、ＲＯＣ空間上の（１，１）との距離Ｄ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th））を算出する。算出されるＲＯＣ空間上の（１，１）との距離Ｄ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th））を、小さい順に並べると、１位〜２７位までの「順位付け」がなされる。
【０４５６】
通常、「順位付け」されたAUC(（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）＝（Ｉ（207）normal-Sm、Ｉ（301）normal-Sm、Ｉ（450）normal-Sm）)中１位の値を与える、「閾値の組み合わせ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）」が、「順位付け」された距離Ｄ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th））中、１位の距離Ｄ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th））を与えるはずである。
【０４５７】
稀に、「順位付け」された距離Ｄ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th））中、１位の距離Ｄ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th））を与える、「閾値の組み合わせ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）」は、順位付け」されたAUC(（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）＝（Ｉ（207）normal-Sm、Ｉ（301）normal-Sm、Ｉ（450）normal-Sm）)中１位の値を与える、「閾値の組み合わせ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）」と相違している場合がある。その際には、「順位付け」された距離Ｄ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th））中、１位の距離Ｄ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th））を与える、「閾値の組み合わせ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）」を、最適化された閾値の組み合わせ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）と見做すことが可能である。
【０４５８】
すなわち、“leave-one-out cross-validation”の手法を応用することで、選別される、１位の「閾値の組み合わせ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）」が、実際に、「最適な閾値の組み合わせ」に相当するか、否かを、合計３３サンプル中の各個人Sm(Sm＝１〜３３)に対する推定結果に基づき、検証することが可能である。
【０４５９】
さらに、“leave-one-out cross-validation”の手法を応用することで、選別される、１位の「閾値の組み合わせ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）」と、２位以下の「閾値の組み合わせ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）」との間の差異が、極僅かである際には、合計３３サンプル中の各個人Sm(Sm＝１〜３３)に対する推定結果に基づき、より適正な「閾値の組み合わせ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）」を、選択することが可能である。
【０４６０】
なお、「番号２０７のピーク」、「番号３０１のピーク」、「番号４５１のピーク」の個々について、それぞれ、最適化を行い、最適化済み「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（207）normal-th-opt.」、最適化済み「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（301）normal-th-opt.」、最適化済み「正規ピーク強度の閾値：Ｉ（451）normal-th-opt.」を選別し、この最適化済み閾値の組み合わせ（Ｉ（207）normal-th-opt.、Ｉ（301）normal-th-opt.、Ｉ（451）normal-th-opt.）を使用することもできる。該最適化済み閾値の組み合わせ（Ｉ（207）normal-th-opt.、Ｉ（301）normal-th-opt.、Ｉ（451）normal-th-opt.）は、少なくとも、上位１位〜８位までの「閾値の組み合わせ（Ｉ（207）normal-th、Ｉ（301）normal-th、Ｉ（450）normal-th）」に含まれている。
【０４６１】
心疾患における「病態の診断」において、本質的に重要なのは、「ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質」の酸化変化である。従って、本発明によって明らかにされた、「ＡｐｏＢ１００タンパク質の酸化程度」の相違を明確に反映する、表１８−１、表１８−２に示す「酸化部位」を含むペプチド断片であれば、表１４〜表１７に記載されるアミノ酸配列を有するペプチド断片と同様に、心疾患の「診断マーカー」として有効である。すなわち、本発明による「心疾患診断マーカー」は、表１４〜表１７に記載されるアミノ酸配列を有するペプチド断片に限定されるものではない。
【産業上の利用可能性】
【０４６２】
本発明にかかる「心疾患診断マーカー」は、心疾患における「病態の診断」において、被験者から採取される血液サンプルを利用する「血液検査」の一環して、該血液サンプルから調製される血清サンプル中に含まれる、「ＭＤＡ化ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質」の酸化変化の評価を進める際、有用なバイオマーカーである。従って、本発明は、被験者から採取される血液サンプルを利用する「血液検査」の一環して、該血液サンプルから調製される血清サンプル中に含まれる、「ＭＤＡ化ＬＤＬ中に含まれるＡｐｏＢ１００タンパク質」の酸化変化の評価を効率的に進める用途に、好適に利用される。
【０４６３】
なお、本発明にかかる「心疾患診断マーカー」では、後述する付記１〜付記１５に記載する発明の形態を採用することも可能である。
【０４６４】
（付記１）
ＡｐｏＢ１００タンパク質における、上記表１８−１、表１８−２に記載のアミノ酸配列部位に由来するペプチドであって、そのひとつ乃至複数個所のアミノ酸残基が酸化されている
ことを特徴とする、心疾患診断マーカー。
【０４６５】
（付記２）
上記表１３に記載の、ＡｐｏＢ１００タンパク質の部分配列を有するペプチドに由来する少なくともひとつのペプチド断片を含む
ことを特徴とする、心疾患診断マーカー群。
【０４６６】
（付記３）
上記表１４〜表１７に記載の、ＡｐｏＢ１００タンパク質の部分配列を有するペプチドに由来する少なくともひとつのペプチド断片を含む
ことを特徴とする、心疾患診断マーカー群。
【０４６７】
（付記４）
（付記３）に記載のペプチドであって、そのひとつ乃至複数個所のアミノ酸残基が酸化されている
ことを特徴とする、心疾患診断マーカー群。
【０４６８】
（付記５）
（付記２）および（付記３）に記載の心疾患診断マーカー群の、構成要素の量的変化を、同時に検出する工程を含む
ことを特徴とする、心疾患診断方法。
【０４６９】
（付記６）
（付記１）〜（付記４）に記載の心疾患診断マーカーを検出する方法であり、
免疫沈降法の工程を含む
ことを特徴とする、心疾患診断マーカーの検出方法。
【０４７０】
（付記７）
プロテアーゼ処理の工程をさらに含む
ことを特徴とする、（付記６）に記載の、心疾患診断マーカーの検出方法。
【０４７１】
（付記８）
前記プロテアーゼが、トリプシンである
ことを特徴とする、（付記７）に記載の、心疾患診断マーカーの検出方法。
【０４７２】
（付記９）
前記酸化が、アミノ酸残基のＭＤＡ化に起因する化学変化である
ことを特徴とする、（付記１）または（付記４）に記載の、心疾患診断マーカー。
【０４７３】
（付記１０）
前記酸化が、アミノ酸残基のＭＤＡ化に起因する化学変化である
ことを特徴とする、（付記６）〜（付記８）のいずれか一項に記載の、心疾患診断マーカーの検出方法。
【０４７４】
（付記１１）
前記酸化が、アミノ酸残基に対する酸素付加に起因する化学変化である
ことを特徴とする、（付記１）または（付記４）に記載の、心疾患診断マーカー。
【０４７５】
（付記１２）
前記酸化的変化が、アミノ酸残基に対する酸素付加に起因する化学変化である
ことを特徴とする、（付記６）〜（付記８）のいずれか一項に記載の、心疾患診断マーカーの検出方法。
【０４７６】
（付記１３）
少なくとも、等電点タンパク質・ペプチド分離チップと質量分析装置とを含む
ことを特徴とする、心疾患診断マーカーの検出システム。
【０４７７】
（付記１４）
（付記１３）に記載の心疾患診断マーカーの検出システムを含む
ことを特徴とする、心疾患診断システム。
【０４７８】
（付記１５）
（付記１４）に記載の、心疾患診断システムを利用する
ことを特徴とする、心疾患診断方法。
【符号の説明】
【０４７９】
１０１  「サンプル前処理」工程
１０２  「等電点電気泳動」工程
１０３  「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  質量分析」工程
１０４  「サンプルプロファイリング」工程
１０５  「データ解析・マーカー特定」工程
２０１  「血清調製」ステップ
２０２  「免疫沈降処理」ステップ
２０３  「断片化」処理ステップ
２０４  「断片化ペプチド回収」ステップ
３００  等電点タンパク質分離チップ
３０１  柱状体
３０２  流路
３０３  基板
３０４  フタ
３０５ａ  リザーバ
３０５ｂ  リザーバ
３０６  フタ基材部
３０７  フタ樹脂層
４００  電気泳動・乾燥装置
４０１  チップ収納部
４０２  電気泳動用電源
４０４  温度制御機構
４０５  排気ライン・乾燥機構
【図１】
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【図２】
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【図９】
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【図１０】
0005857312.tif 000041
【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0005857312.tif 000050
【図７】
0005857312.tif 000051
【図８】
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【配列表】
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