(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物検体を分析するための活性シーブデバイスであって、前記デバイスは、前記生物検体の検体粒子を支持するための基板を備え、該基板は、複数の相互接続部および複数の領域を有し、各領域は、
ホールと、
前記ホールの周りに設けられた２つの電極と、
前記基板に埋め込まれ、前記２つの電極のそれぞれおよび前記複数の相互接続部の少なくとも１つに動作可能に接続された少なくとも１つのトランジスタと、
前記基板の表面に対して略垂直な方向に延び、前記２つの電極をそれぞれ前記トランジスタに接続する導電性経路とを備える活性シーブデバイス。
【請求項２】
前記トランジスタは、前記２つの電極のそれぞれおよび前記複数の相互接続部の少なくとも１つとの間にスイッチを構成する請求項１記載の活性シーブデバイス。
【請求項３】
前記２つの電極は、前記検体粒子のインピーダンスを測定するように構成された請求項１記載の活性シーブデバイス。
【請求項４】
マルチプレクサ、アナログ−デジタル変換器、デジタル−アナログ変換器、処理ユニット、高速フーリエ変換装置、および通信制御装置、ならびに／または他のデジタル回路をさらに備える請求項１記載の活性シーブデバイス。
【請求項５】
前記各領域は、前記ホールに隣接配置された先細り形状の誘導エレメントをさらに備える請求項１記載の活性シーブデバイス。
【請求項６】
前記複数の領域は、前記基板の正平面部分を形成するように配置した請求項１記載の活性シーブデバイス。
【請求項７】
前記２つの電極を駆動して磁気的操作または電気的操作を実施することによりマルチパラメータ分離を可能にするための駆動手段をさらに備える請求項１記載の活性シーブデバイス。
【請求項８】
細胞を計数し、動作させ、および／または溶解させることに適合した制御装置をさらに備える請求項１記載の活性シーブデバイス。
【請求項９】
光学的に細胞にアドレスするための手段をさらに備える請求項１記載の活性シーブデバイス。
【請求項１０】
所定のコンポーネントについて、結合特性を化学的に変更することに適合した表面層をさらに備える請求項１記載の活性シーブデバイス。
【請求項１１】
生物検体を分析するための活性シーブデバイスを製造するための方法であって、
前記生物検体の検体粒子を支持するための基板を取得することと、
前記基板上に、複数のトランジスタを備えるトランジスタ層を設けることと、
前記基板上に、それぞれが少なくとも１つのトランジスタと動作可能に接続した複数の電極を備える電極層を設けることと、
前記基板の表面に対して略垂直な方向に延びる導電性経路を設け、前記２つの電極をそれぞれ前記トランジスタに接続することと、
前記基板内に、それぞれ前記２つの電極と電気的に結合した複数のホールを設けることとを含む方法。
【請求項１２】
直流電流に対して大きいインピーダンスを有する不動態材料から成る少なくとも１つの層を付加することをさらに含み、
前記不動態材料は、ＳｉＯ２、ＳｉＮ、Ｔａ２Ｏ５、パリレン、ＳＵ８、テフロンおよびポリアミドから成る群から選択される請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記基板の上部に、少なくとも１つの先細り形状の誘導エレメントを設けることをさらに含む請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の活性シーブデバイスを用いて生物検体を分析するための方法であって、
前記生物検体を含む媒質を、前記活性シーブデバイスに導入することと、
前記活性シーブデバイスを用いて前記生物検体を分離することと、
前記トランジスタを駆動することによって、前記分離した生物検体上で測定を実施することと、
前記測定に従って、標的とした生物検体を特定することとを含む方法。
【請求項１５】
前記標的とした生物検体を計数し、動作させ、かつ／または溶解させ、下流側でポリメラーゼ連鎖反応を実施することをさらに含む請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物検体もしくは細胞の分離および特性化の分野に関する。より具体的には、本発明は、生物検体(bio-analyte)および／もしくは細胞の分離、検出、計数、ならびに／または特性化に関し、ならびにかかるデバイスの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的サンプルは、しばしば複雑なマトリクスの中に存在する。したがって、興味ある細胞または標的を他の生物学的材料と区別することは、最も重要である。例えば、診断のセッティングにおけるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）の実施は、しばしば抑制化合物の存在によって制限され、有効なサンプル準備プロトコルが要求される。細胞について同様に、さまざまな細胞亜種を濃縮し(enrich)、計数し、選別さえも行うための有効なテクニックが依然必要とされている。ふるい分けまたは誘電泳動のテクニックを含む、小型のデバイス上で細胞を分離する種々のアプローチが既に記載されてきた(Tan et al., Biomed. Microdevices, 11 (2009), 883; Mohamed et al., J. Chromatogr. A, 1216 (2009), 8289)。他の手法は、親和性をベースにしている。これらについて、典型的には、特定の抗体を蛍光標識し（即ち、免疫蛍光）、または磁気ビーズと結合させて（即ち、免疫磁性）、特性化が開始可能になる前に、興味ある細胞を（複雑で乱雑な）マトリックスから分離する。
【０００３】
米国特許公報第２００４／０１３０３３９号において、細胞分析のためのシステムおよび方法が開示されており、所望の方法で配置された、複数のホールを有する有孔キャリアが設けられ、各ホールは、例えばホールの大きさに対応した所定の最小サイズを有する細胞を、受容および保持することに好適である。その後、キャリアに支持される細胞は、ホールの中に延びる２つの電極に電流および電圧を印加することによって分析され、その結果、電流または電界が生体細胞を通過して、細胞の存在を検出し、または生体細胞内で特性反応を生じさせる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の実施形態の目的は、生物検体および／もしくは細胞の分離、検出、計数ならびに／または特性化するための優れたふるい分け(seiving)デバイスを提供することである。本発明に係る前記ふるい分けデバイスは、さらには「活性シーブ」(active sieve)と呼ぶこともある。上記目的は、本発明の実施形態に係る活性シーブデバイスおよび本発明の実施形態に従ってかかる活性デバイスを製造するための方法によって達成される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の態様において、本発明は、生物検体の分離および／または特性化のための活性シーブデバイスを提供する。本発明の実施形態に係る活性シーブデバイスは、生物検体を支持するための基板を備え、該基板は、複数の相互接続部および複数の領域を有し、各領域は、
ホールと、
ホールと電気的に結合した電極であって、基板に内蔵され、または基板上に配置された少なくとも１つの電極と、
前記基板内に集積され、少なくとも１つの電極および複数の相互接続部の少なくとも１つに作動可能に接続された少なくとも１つのトランジスタとを備える。
【０００６】
本発明の実施形態に係るデバイス内部でのトランジスタの集積は、ＥＩＳ測定の感度を維持するために好都合である。この目的のために、本発明の実施形態に従って、トランジスタは、すべてのホールの近くに設置する。測定感度の問題は別にして、本発明の実施形態は、信号伝送線路を短くするという更なる利点をもたらす。
【０００７】
本発明の実施形態の利点は、細胞濃縮のためのふるい分けデバイスを提供することである。
【０００８】
本発明の実施形態の利点は、単細胞の電気的な読み出しを提供できることである。
【０００９】
本発明の実施形態の利点は、生物検体および／または細胞を、分離し、計数し、区別し、および／または溶解させてもよいことである。
【００１０】
本発明の実施形態に係る活性シーブデバイスにおいて、少なくとも１つのトランジスタを基板に内蔵してもよく、基板主面に対する法線に実質的に沿った方向に配置された導電性経路を介して、少なくとも１つの電極を前記トランジスタに接続してもよい。
【００１１】
本発明の実施形態に係る活性シーブデバイスにおいて、少なくとも１つの電極は、例えばインピーダンス測定を可能にするように配置した、少なくとも２つの極板を備えてもよい。代替として、１つの極板のみが存在する場合、静電容量測定を実行してもよい。
【００１２】
本発明の実施形態に係る活性シーブはさらに、マルチプレクサ、アナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ）、デジタル−アナログ変換器（ＤＡＣ）、処理ユニット、高速フーリエ変換（ＦＦＴ）装置、および通信制御装置、ならびに／または他のデジタル回路を備えてもよい。
【００１３】
本発明の実施形態に係る活性シーブデバイスにおいて、各領域はさらに、ホールに隣接配置した誘導エレメントを備えてもよい。本発明の実施形態の利点は、マイクロシーブデバイスへの所定の誘導経路に沿って生物検体を導き、ホール間の間隔に起因して損失を制限できることである。
【００１４】
本発明の実施形態に係る活性シーブデバイスにおいて、例えば基板の正平面(regular planar)部分を形成するように、複数の領域を配置してもよい。
【００１５】
本発明の実施形態に係る活性シーブデバイスは、生物検体に対する磁気的操作または電気的操作を実施することによって、マルチパラメータ分離を可能にするように、前記少なくとも１つの電極を駆動するための駆動手段をさらに備えてもよい。
【００１６】
本発明の実施形態に係る活性シーブデバイスは、細胞および／または生物検体を、計数し、動作させ、および／または溶解させることに適合した制御装置をさらに備えてもよい。
【００１７】
本発明の実施形態に係る活性シーブデバイスは、細胞を光学的にアドレスするための手段をさらに備えてもよい。
【００１８】
本発明の実施形態に係る活性シーブデバイスは、所定のコンポーネントについて、結合特性を化学的に変更することに適合した表面層をさらに備えてもよい。
【００１９】
第２の態様において、本発明は、活性シーブデバイスを製造するための方法を提供する。該方法は、
基板を取得することと、
前記基板上に、複数のトランジスタを備えるトランジスタ層を設けることと、
前記基板上に、少なくとも１つのトランジスタにそれぞれ作動可能に接続した複数の電極を備える電極層を設けることと、
前記基板内に、少なくとも１つの電極にそれぞれ電気的に結合した複数のホールを設けることとを含む。
【００２０】
本発明の実施形態の利点は、従来の加工ステップ、特に半導体加工ステップを、活性シーブの様々なコンポーネントを製造するために使用できることである。
【００２１】
本発明の実施形態に係る方法は、直流に対する大きいインピーダンスを有する不動態材料から成る少なくとも１層を付加することをさらに含んでもよい。
【００２２】
本発明の実施形態に係る方法は、基板の上部に、少なくとも１つの誘導エレメントを設けることをさらに含んでもよい。
【００２３】
第３の態様において、本発明は、活性シーブデバイスを用いて生物検体を分析するための方法を提供する。活性シーブデバイスは、生物検体を支持するための基板を備え、該基板は、複数の相互接続部および複数の領域を有する。各領域は、ホールと、ホールと電気的に結合した電極であって、基板に内蔵され、または基板上に配置された少なくとも１つの電極と、前記基板内に集積され、少なくとも１つの電極および複数の相互接続部の少なくとも１つと作動可能に接続した少なくとも１つのトランジスタとを備える。該方法は、
活性シーブデバイス（１）内に、前記生物検体を含む媒質を導入することと、
該活性シーブデバイスを用いて前記生物検体を分離することと、
前記トランジスタを駆動することによって、前記分離した生物検体上で測定を実施することと、
前記測定に従って、標的とする生物検体を特定することとを含む。
【００２４】
本発明の実施形態に従って生物検体を分析するための方法は、前記の標的とした生物検体を、計数し、動作させ、および／または溶解させることをさらに含んでもよい。
【００２５】
本発明の特定の好ましい態様は、添付する独立請求項および従属請求項において詳説する。従属請求項の特徴は、独立請求項の特徴および他の従属請求項の特徴と、適切および単に請求項に明記されただけでないものとして組み合わせてもよい。
【００２６】
本発明および先行技術を上回って達成される利点を要約するために、本発明の特定を上述してきた。本発明のいずれかの特定の実施形態に従って、必ずしもかかる目的または利点のすべてを達成することができるわけではないことは当然理解されることになる。したがって、例えば、必ずしもここで教示され提案された他の目的または利点を達成することなしに、ここで教示された１つの利点または利点の集まりを達成または最適化する方法で具現化または実行してもよい、と当業者は理解することになる。
【００２７】
本発明の上記の、または他の態様は、これ以降で記載する実施形態から明らかになり、またはそれらを基に解明される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
本発明は、添付図面に関連して、これ以降でさらに例として説明される。
【００２９】
【図１】先行技術に係る、電気インピーダンス分光法（ＥＩＳ）測定のための回路モデルの概略図を示す。
【図２】内皮細胞がある場合とない場合について、周波数の関数として細胞インピーダンスを示す。
【図３Ａ】本発明に係る活性シーブの構造の一実施形態を表しており、ホールは、オンチップマルチプレクサを有する行列(Row-column)アドレスまたはＲＣＭアドレスと呼ばれる本発明の実施形態に従って、チップ上でマルチプレクサと結合した不活性マトリックスによって接続可能である。
【図３Ｂ】図３Ａ内の活性シーブの１ホールの構造の断面図を示す。
【図４】磁性粒子を使用した細胞分離の適用に使用できるホールの断面図を示す。ＭＰは磁性粒子を表す。
【図５Ａ】本発明の実施形態に係る細胞捕捉のための、誘電泳動（ＤＥＰ）力と流体力との組み合わせを有する活性シーブ内のホールの概略図である。
【図５Ｂ】本発明の代替の実施形態に係る細胞捕捉のための、磁力と流体力との組み合わせを有する活性シーブ内のホールの概略図である。
【図６Ａ】標的細胞または非標的(irrelevant)細胞の選択的遊離の、いずれの細胞の遊離もしていない状態を示す概略図である。
【図６Ｂ】標的細胞または非標的細胞の選択的遊離の、非標的細胞が遊離した状態を示す概略図である。
【図６Ｃ】標的細胞または非標的細胞の選択的遊離の、標的細胞が遊離した状態を示す概略図である。
【図７】複数の機能を実行するための、または換言すると、本発明の実施形態に係る、細胞のふるい分け、インピーダンス測定、計数および／または溶解の決定方法を可能にするための、本発明の実施形態に従った、活性シーブのホールに適用可能な測定フローを示す。
【図８Ａ】本発明の実施形態に係る活性シーブの個々のホール内で、電気的インピーダンス分光法（ＥＩＳ）測定を実施するために採用可能な電極形状パターンの概略図である。
【図８Ｂ】本発明の実施形態に係る活性シーブの個々のホール内で、電気的インピーダンス分光法（ＥＩＳ）測定を実施するために採用可能な電極形状パターンの概略図である。
【図８Ｃ】本発明の実施形態に係る活性シーブの個々のホール内で、電気的インピーダンス分光法（ＥＩＳ）測定を実施するために採用可能な電極形状パターンの概略図である。
【図９】本発明の実施形態に係る活性シーブ内のホールの概略図であり、前記ホールは、両側に電極を有する。
【図１０】本発明の実施形態に係る活性シーブ内の２つのホールの概略図であり、前記ホールは、動作電極および包括的(global)対向電極を有する。
【図１１】本発明の実施形態に係る活性シーブを使用して電気穿孔法を実施するための、好適なスイッチ回路を示す。
【図１２】本発明の実施形態に係る活性シーブ内のホールへ向かう生物検体の流れの、想定される側面図を示す。
【図１３】免疫磁性濃縮した生物検体に対するサンプル準備ステップの組み合わせを示しており、最初に、生物検体を、磁気ビーズを使用して臨床サンプルから分離し、次に、活性シーブのホールを通過させることによって流し去る。一方、より大きい細胞は、マトリックスによって保持され、次に、本発明の実施形態に係る活性シーブ内の個々のホール上に存在する電極を使用して、個々に分析される。
【図１４】電気インピーダンス分光法（ＥＩＳ）電極製造の前の、前工程（front end of line：ＦＥＯＬ）および後工程（back end of line：ＢＥＯＬ）についての断面図を示す。
【図１５】前面からホールを開口する前の、本発明の実施形態に係るシーブ内のホールを示す。
【図１６Ａ】単一エッチングステップによってホールを開口した後の、本発明の実施形態に係るシーブ内のホールを示す。
【図１６Ｂ】前面ホールをエッチングした後の、本発明の実施形態に係るシーブ内のホールを示す。
【図１７】マイクロ構造の製造目的で前面に堆積した不動態材料層を有する、本発明の実施形態に係るシーブ内のホールを示す。
【図１８】不動態材料をエッチングして前面にマイクロ構造を形成した後の、本発明の実施形態に係るシーブ内のホールを示す。
【図１９】不動態材料をエッチングして前面ホールを開口した後の、本発明に係るシーブ内のホールを示す。
【図２０Ａ】前面で、マイクロ構造を有しないシーブをキャリアウエハに接着した後の、本発明の実施形態に係るシーブ内のホールを示す。
【図２０Ｂ】前面で、マイクロ構造を有するシーブをキャリアウエハに接着した後の、本発明の実施形態に係るシーブ内のホールを示す。
【図２１】スルーホールの製造の後、更なる不動態層を堆積した、本発明の実施形態に係るシーブ内のホールを示す。
【図２２】本発明の実施形態に係る、細胞の分離、特性化および溶解のための動作フローを示す。
【図２３】本発明の実施形態に従って、活性シーブデバイスを製造するための例示的な方法を示す。
【図２４】異なる詳細スケールでの、本発明の実施形態に係るシーブを示す。
【図２５】誘導エレメントを設けた、本発明の実施形態に係るシーブの断面図を示す。
【図２６】マイクロ流体チャネルの前側の流れの側面図を示す。
【図２７】本発明の実施形態に係るシーブの一部の断面図を示しており、細胞がシーブ内を流れるように誘導するために、隣接する細孔の間に孤立構造を有する。
【図２８】さまざまな媒質中の細胞に対する、ＤＥＰスペクトルについてのＣＭ因子の実部を示している。
【図２９】本発明の実施形態に係るシーブを用いて実行可能なインピーダンス測定の等価回路モデルを示している。
【図３０】本発明の実施形態に従ったインピーダンス測定のシュミレーション結果を示している。
【００３０】
記載した図面は概略的なものに過ぎず、限定的でない。図面において、いくつかのエレメントのサイズは、説明目的のため、誇張し、およびスケールどおり描いていないことがある。異なる図面において、同一の参照符号は、同一または類似のエレメントを参照する。
【００３１】
請求項中のどの参照符号も、範囲を限定するものと解釈すべきでない。
【００３２】
異なる図面において、同じ参照符号は同一または類似のエレメントを参照する。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、特定の実施形態について特定の図面を参照しながら説明するが、本発明はこれらに限定されず、請求項によってのみ限定される。記載した図面は概略的なものに過ぎず、限定的でない。図面において、いくつかのエレメントのサイズは、説明目的のため、誇張し、およびスケールどおり描いていないことがある。寸法および相対寸法は、本発明の実際の実施化と対応していない。
【００３４】
さらに、説明および請求項での用語「第１」「第２」等は、類似のエレメントを区別するための使用しており、必ずしもシーケンスを時間的、空間的に、序列で、または他のどの様式で表したものでもない。こうして用いた用語は、好適な状況下で交換可能であり、本発明の実施形態は、ここで説明したり図示したものとは別の順番で動作可能であると理解すべきである。
【００３５】
さらに、説明および請求項での用語「上(top)」「下(under)」等は、説明目的で使用しており、必ずしも相対的な位置を記述するためのものでない。こうして用いた用語は、好適な状況下で交換可能であって、ここで説明した本発明の実施形態がここで説明または図示した以外の他の向きで動作可能であると理解すべきである。
【００３６】
請求項で使用する用語「備える、含む(comprising)」は、それ以降に列挙された手段に限定されるものと解釈すべきでなく、他のエレメントまたはステップを除外していない。記述した特徴、整数、ステップまたはコンポーネントの存在を、参照したように特定するように解釈する必要があるが、１つ以上の他の特徴、整数、ステップまたはコンポーネント、あるいはこれらのグループの存在または追加を除外していない。したがって、「手段ＡおよびＢを備えるデバイス」という表現の範囲は、コンポーネントＡおよびＢだけからなるデバイスに限定すべきでない。本発明に関して、デバイスの関連したコンポーネントだけがＡおよびＢであることを意味する。
【００３７】
この明細書を通じての「一実施形態(one embodimentまたはan embodiment)」の参照が意味するのは、該実施形態と関連して説明される特定の特徴、構造または特性は、本発明の少なくとも一実施形態に含まれるということである。したがって、この明細書を通じてさまざまな場所で現れるフレーズ「一実施形態(one embodimentまたはan embodiment)」は、必ずしもすべてが同じ実施形態を参照するわけではないが、参照してもよい。さらに、特定の特徴、構造または特性は、この開示から当業者にとって明らかなように、１以上の実施形態において、好適な方法で組み合わせることができる。
【００３８】
同様に、本発明の例示の実施形態の説明において、本発明の種々の特徴は、開示を効率化し、１以上のさまざまな発明の態様を理解することを助ける目的で、時には単一の実施形態、図面、またはその説明の中に一緒にグループ化されることを認識するべきである。しかしながら、この開示の方法は、請求項記載の発明が、各請求項に明確に記載されたものより多くの特徴を必要とするという意図を反映していると解釈すべきではない。むしろ、以下の請求項が示すように、発明の態様は、先に開示された単一の実施形態のすべての特徴より少なくなる。したがって、詳細な説明に続く請求の範囲は、これにより詳細な説明中に明確に包含され、各請求項は、この発明の別々の実施形態としてそれ自身で成立する。
【００３９】
さらに、ここに記載したいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれるいくつかの特徴は含むが、他の特徴は含まない。一方、当業者が理解することになるように、異なる実施形態の特徴の組み合わせは、本発明の範囲内であることを意味し、異なる実施形態を形成する。例えば、以下の請求の範囲において、請求項記載の実施形態のいずれもが、任意の組み合わせで使用可能である。
【００４０】
ここでされる説明において、多くの具体的詳細が明記される。しかしながら、本発明の実施形態はこれらの具体的詳細なしに実践してもよいことが理解される。他の例において、周知の方法、構造、および技術は、この説明の理解を不明瞭にしないために、詳細には示さない。
【００４１】
次のパラグラフで、本発明と組み合わせて、ならびに生物検体の分離および特性化に関連して使用するデバイスおよび方法の定義および説明を記載する。
【００４２】
本発明の実施形態において「生物検体」について言及する場合、他で言及しない限り、ウイルス、バクテリア、原核細胞および／または真核細胞を指す。
【００４３】
マイクロホールまたはナノホールを製造する最先端の技術は、ホールにナノメートル精度に近い精度を提供する。かかる技術の多くは、標準のフォトリソグラフィ後の、異方性エッチングのような技術を使用した、より大きいナノホールの製造から開始し、続いて、異方性エッチングを伴う電子ビームリソグラフィによって、底部を小さく形成する。本発明の実施形態に係るマイクロシーブについて、リソグラフィプロセスおよび／または異方性エッチングによって得られるホールは、以降でさらに説明するように、充分な解像度を示すことができる。
【００４４】
マイクロ流体システムにおいて、細胞純化(purification)または細胞濃縮(enrichment)のために、さまざまな物理法則を使用してもよい。見通し的な(perspective)分類において、これらの手法は、細胞の物理的特性および／または生化学的特性、例えば大きさ、圧縮率、電磁的特性または表面マーカ表示をベースとしてもよい。
【００４５】
大きさをベースとして、異なる細胞種を分離するために、専用の機械構造を設計してもよい。デバイス平面内または該平面に垂直な方向に、所定の寸法を有する種々の形状の堤部(dam)またはホールを製造して大きな細胞を保持し、小さな細胞は通過させてもよい。大きさの違いによって、放物線状流れの中の異なる横断流セグメントに細胞を配置してもよく、したがって流体力学的な細胞分離が可能になる。図２６に示すように、流れの前面の外形２７０は放物線状であり、中央部でより速く、側壁２７１でより遅い。したがって、大きい細胞２７２は、チャネルの中央、即ち、流れの外形２７０のより速い部分を流れる可能性がより大きい。あるいは換言すると、それらは、チャネルの側壁２７１、即ち、外形２７０の遅い部分付近を流れる可能性がより小さい。小さい細胞２７３に対しては、この逆が当てはまる。細胞はまた、密度および圧縮率の関数として、異なる音響放射力を受ける。細胞は、大きさおよび誘電率の変化に伴って、交流電界中、異なる移動度または移動パターンで誘電泳動（ＤＥＰ）を受ける。走磁性を有する生物検体、および磁気標識とも呼ばれる、磁性粒子と接合した生物検体について、検体を磁力で動作させた場合は、同様の運動が生じるだろう。これは磁気泳動（ＭＡＰ）と呼ばれる。例えば抗体−抗原認識による、細胞と粒子との接合が、標的細胞の表面バイオマーカに特有のものである場合は、標的細胞を、ＭＡＰを用いて明確に分離してもよい。
【００４６】
分離方法の選択は、分離純度、特異性、効率性、マイクロ流体集積化、処理適合性(processing compatibility)、費用などのような因子などに依存するだろう。通常、より多くの細胞特性を使用する方法が、より優れた細胞分離につながるが、より優れた制御能力を要求し、したがって再現性が低く、より複雑になりやすいであろう。
【００４７】
機械的ふるい分けは、その単純さ、比較的製造が容易であること、および充分な再現性のために、細胞分離および／または細胞濃縮を実施するための一般的な方法であろう。しかしながら、純粋に機械的ふるい分けを行うと、細胞の大きさが同程度である異なる細胞種を区別することができない可能性がある。更なる機能性を、蛍光染色または電気インピーダンス分光法（ＥＩＳ）のような、更なる細胞同定に適合させてもよい。
【００４８】
電気インピーダンス分光法（ＥＩＳ）は、生物検体での生理学的研究のための非常に有用なツールである。該テクニックは、生体分子に加えて、電気的メカニズムが、生きた細胞の活動に対して重要な役割を果たすという理論に依存する。この仮説は、ＥＩＳ実験、例えば細胞癌化の検出によって支持されている。通常の細胞と比較した場合、癌細胞は、通常の細胞よりも低い膜電位およびインピーダンスを示す。より低いインピーダンス、即ちより高い透過率は、トランス膜の集まり、例えばイオン、およびエネルギー、例えばＡＴＰ（アデノシン３リン酸）、の輸送に対する制御能力の損失の理由となる可能性がある。
【００４９】
電気的見地から、細胞は、抵抗、容量性コンポーネントまたは誘導性コンポーネントのネットワークによって表すことができる。同様に、所定の媒質中で、細胞を少なくとも１つの電極の近くに設置した場合、いくつかの追加のコンポーネントが存在してもよい。図１は、媒質中の導電性キャリア１０４、例えば金キャリア上でのＥＩＳ測定に好適な等価回路モデルを示す。Ｃｍは膜の静電容量を、Ｒｂは細胞内部の抵抗を、αは細胞基板の粘着力を示す。図２は、内皮細胞がある場合とない場合の細胞インピーダンスを示す。インピーダンススペクトルは、細胞−電解質−電極モデルによって説明できる。周波数の小さい、ｆ＜１０Ｈｚの範囲では、インピーダンスは、電極表面、および媒質中の細胞周囲の電流経路での電気二重層（ＥＤＬ）によって主に決定する。細胞体は、細胞膜および細胞内含有物を絶縁する、大きい抵抗を有する該細胞膜に主に起因して、電気信号に「盲目」(blind)になる。膜の抵抗および静電容量は、中間周波数帯、１０Ｈｚ＜ｆ＜１ＭＨｚにおいて重要な役割を果たし始める。インピーダンスは、周波数の増加に伴って小さくなる。周波数が充分大きい場合、膜は容量結合し、したがって細胞小器官および電解質もまた、全インピーダンスに寄与する。中間の周波数帯は、最も情報が豊かな周波数帯である。非常に大きな周波数ｆ＞１ＭＨｚでは、細胞インピーダンスは、寄生容量および寄生インダクタンスのような系統的回路誤差と比較して、支配的でなくなり始める。さまざまな周波数での細胞の生体外インピーダンス測定をチップ上で実施し、異常細胞と通常の細胞とを区別してきた。細胞の数を電気的に測定するための商業的製品が、ＥＣＩＳ（登録商標）（Applied Biophysics Inc., NYから取得できる）およびＲＴ−ＣＥＳ（登録商標）（ACEA Biosciences, CAから取得できる）のようなマーケットで手に入る。かかる製品のすべてではないにしても、大部分は、基板表面上で剥き出しになった電極アレイを備え、電極は個々に、または全体としてアドレス可能である。電極アレイは、基板上方に存在する細胞集団のインピーダンスを測定する。
【００５０】
超高電界による細胞膜の破壊は、細胞電気穿孔法と呼ばれる。最初に、電界を細胞膜に印加した場合、完全な電圧降下、即ち、細胞の脂質二分子膜（ＢＬＭ）、バクテリアなど、細胞がカプセル化した物全体で、またはウイルスのエンベロープ全体で印加した電圧が、かかるカプセル化物またはエンベロープの非常に大きい抵抗に起因して減少する。しかしながら、いったんカプセル化物またはエンベロープ、例えばＢＬＭが破裂すると、電圧降下は、カプセル化物もしくはエンベロープ、媒質および電極によって決定する。なぜなら、それらの抵抗を比較できるようになるからである。いくつかの機構において、しばしば短期間に強い電界を印加して、熱的効果を最小化している。大きい抵抗を有するカプセル化物、または細胞のエンベロープ、例えばＢＬＭは、該ＢＬＭ全体の電界が充分大きい場合に絶縁破壊する。電気穿孔法に使用される電界は、典型的にＶ／μｍのオーダーであり、印加時間は、１ミリ秒未満である。より弱い電界では、より長い印加時間を必要とし、おおよそ双曲線の関係に従う。
【００５１】
典型的な電気穿孔法は、２つの連続的な段階を含む。即ち、透過性の劇的な増大、および機械的破裂である。前半段階は、通常、電極を流れる一様な電流を伴い、後半段階は、大きな電流変動を示す。通常、該破裂は、膜上で絶縁破壊強度が最も低いであろう小さい領域で起こる。不可逆な破裂は、膜全体での化学物質および分子の制御不能な輸送、即ち細胞溶解を引き起こす。
【００５２】
第１の態様において、本発明は、生物検体もしくは細胞の分離および特性化に好適な活性シーブデバイス１に関する。このデバイス１は、生物検体１３を支持するための基板７を備える。基板７は、複数の領域１０を有し、例えばかかる領域のアレイまたはグリッドを備える。各領域１０は、１つのホール２を有し、例えば複数のホール２は、ホールのアレイを形成するようにする。各領域１０は、ホール２と電気的に結合した少なくとも１つの電極３をさらに備え、電極３は、基板７に内蔵または基板７上に配置してもよく、例えば、基板７の上部に堆積してもよく、その結果、使用中に、少なくとも１つの電極３は、ホール２の内部または上に存在する粒子によって電気的にアクセス可能である。
【００５３】
ホール２と結合した電極３はさらに、複数の電気的相互接続部４を通じて個々にアドレス可能である。各領域１０は、基板７内に集積され、少なくとも１つの電極３および複数の相互接続部４の少なくとも１つと作動可能に接続した、少なくとも１つのトランジスタ９を備える。少なくとも１つのトランジスタ９は、接続して、少なくとも１つの電極４と複数の相互接続部４の少なくとも１つとの間にスイッチを形成してもよい。例えば、各ホール２の近くにある各領域１０において、少なくとも１つのトランジスタ９が電極３の近くにあることによって、ＥＩＳ測定の感度を維持することを容易にすることができる。測定感度の問題は別にして、本発明は、オンチップ信号伝送経路の全長を短くするという更なる利点を提供することができる。
【００５４】
少なくとも１つの電極３と少なくとも１つのトランジスタ９との間に短い伝送経路長を設けるために、トランジスタ９は、電極３の少なくとも一部の下の位置で基板７に内蔵してもよく、その結果、少なくとも１つの電極３を、例えば実質的に基板７の主面に垂直な方向に沿って配置した導電性経路１２を介して、少なくとも１つのトランジスタ９に接続してもよい。
【００５５】
本発明の第１の態様の第１の実施形態を、図３Ａに斜視図で示しており、単一領域１０を、図３Ｂに断面図で詳細に示している。トランジスタ９は、いずれの好適なトランジスタでも可能であり、例えば信号増幅しないアナログのバッファトランジスタも可能である。次に、電極３がとらえた信号は、信号マルチプレクサ８を経由して１以上のアンプに送信され、例えばデジタルデータに変換するために、アナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ）に到達してもよい。マルチプレクサを配置して、例えば少なくとも１つのトランジスタ９に集積させることによって、ホールに個々にアドレスしてもよい。さらに、ＡＤＣ、デジタル−アナログ変換器（ＤＡＣ）、例えばフェーズ・ロック・ループまたは高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を実行するための信号処理ユニット、および通信制御装置、例えばＲＳ４８５を、前記少なくとも１つのトランジスタ９内に集積してもよい。
【００５６】
図３Ｂは、単一領域１０の実施形態の断面図であり、電極３は基板７に内蔵され、また、電極３は、ホール２の上部に存在する粒子、即ちシーブの動作によってはふるい分けされず、ホール２を横切ってシーブ１の上部に横たわり続ける粒子、によって電気的にアクセス可能である。トランジスタ構造９は、基板７に内蔵される。電極３は、基板７に内蔵された導電性経路１２を介してトランジスタ構造９と接続する。かかるホールの更なる断面図を、トランジスタと一緒に図４に示している。
【００５７】
特定の実施形態において、活性シーブ１の個々のホール２、例えばホールの電極３は、個々にアドレスされ、それゆえに、オンチップ多重化を用いた行列アドレス（ＲＣＭ）を使用する。ホール２は、チップ上のマルチプレクサと結びついた不活性マトリックスによって接続してもよい。ＲＣＭアドレスは、チップ上にマルチプレクサ８を実装することによって、インターフェイスコンタクトの数、例えば接合パッド５の数を制限するが、それは、論理デバイス、例えばＭＯＳの集積を必要とするので、より費用がかかる可能性がある。読み出し回路に接続するための接続コンタクトの総数は、加工技術および包装技術の両方によって制限される。一方、信号品質は、より少ないコンタクトを使用した場合、ホール−ホール(hole-to-hole)干渉に起因して、低下する可能性がある。
【００５８】
図３Ａは、可能な接続スキームを有する、かかる活性シーブマトリックス１の概略図である。活性シーブの個々のホール２、例えばベースの膜を穿孔する基板７を、例えば穿孔するホールの電極３は、オンチップマルチプレクサ８を用いた行列アドレス（ＲＣＭ）により、個々にアドレス可能である。導電性の、例えば金属製の電極３は、優れた電気的不動態化のために、好ましくはホール２に近いところだけが露出し、少なくとも１つのトランジスタ９、および任意に導電性経路１２を介して、導電性の、例えば金属製の相互接続部４に接続し、例えばクロストークおよび容量結合を避けることができる。図３Ａはさらに、先に既定した導電性の、例えば金属製の電極３を、不動態化した導電性の、例えば金属製の相互接続部４を通じて結合させる、導電性の接合パッド５、例えば金の接合パッドを示している。活性シーブ１を収容する基板７の外部表面は、表面層６、例えば上部の不動態層６によって、さらに不動態化してもよい。
【００５９】
本発明の実施形態に従って、活性シーブ１は、サンプル準備ステップ、例えば、特に、磁性ビーズを使用して、複雑なサンプルマトリックスから細胞を濃縮する免疫磁性分離技術と組み合わせて使用してもよく、それゆえに、該シーブ１を使用して、細胞を保持し濃縮してもよい。それゆえに、好適なホールの大きさを規定することによって、非結合磁性粒子がシーブ１を流れることになり、該粒子を簡単に取り除くことができることは利点である。
【００６０】
本発明の実施形態に従って、活性シーブ１は、表面層６をさらに備えてもよく、該層は、所定のコンポーネント、例えば化学修飾したインターフェイスに対する結合特性を化学的に変更することに適合し、増大特異結合または減少非特異結合を達成してもよい。このように、標的細胞は、変化した、表面に対する結合親和性を有することができる。例えば、癌細胞は結合するが、白血球は結合しない。さまざまな表面修飾プロトコルが知られており、例えばタンパク質の非特異相互作用を最小化し、「不活性」無機表面を構築することに好適である。これらは、それに限定されないが、マンニトール、オリゴ糖、アルブミン、ヘパリン、リン脂質、デキストラン、またはポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）を含む。多くのケースにおいて、ＰＥＯは最も成功してきており、活性化表面でのポリマー接合、物理吸着、表面重合および自己集積化を含む、ＰＥＯ機能的表面コーティングを準備するためのいくつかのアプローチが報告されてきている。
【００６１】
シーブ１の基板７は、非常に薄くてもよいので、シーブ１は、それらの間に所定の間隔を有する複数のセグメントに分割し、機械的に安定した頑丈なシーブ１を提供するために、該間隔領域において充分なチップの厚さを確保してもよい。これは、図２４に図示している。図２４の左上部分に、シーブ１を備えるチップを図示している。シーブ１は、複数のセグメント２５０に分割する。かかるセグメントの４つを、図２４の右上部分により詳細に図示している。各セグメント２５０は、複数の領域１０を有し、
それぞれがホール２と、
ホール２と電気的に結合した少なくとも１つの電極３と、
基板７内に集積され、少なくとも１つの電極３、および、例えば動作させ、または測定するための電気回路に少なくとも１つの電極３を相互接続させるための複数の相互接続部４の少なくとも１つに作動可能に接続した少なくとも１つのトランジスタ（図２４には図示していない）とを備える。隣接するセグメント２５０間の、実質的に直交する間隔Ｄ１，Ｄ２は、対応する方向のセグメント２５０の寸法に対して、例えば少なくとも２０％、例えば約半分の割合を有するであろう。隣接する領域１０の、実質的に直交する間隔Ｄ３、Ｄ４は、対応する寸法の領域１０の寸法と、ほとんど同じであり、例えばその８０％〜１２０％であろう。
【００６２】
デバイス１の各領域１０は、図２５に断面図で示すような、ホール２に隣接配置した誘導エレメント１１、例えばマイクロ誘導捕捉構造を備えてもよい。誘導エレメント１１の形状はさらに、シーブアレイ間の間隔領域における損失なしに、確実にすべての細胞が、シーブホール２へ流れるようにしてもよく、例えば誘導エレメント１１の先端を細くしてもよい。図４は、誘導エレメント１１に設けた、活性シーブアレイの領域１０の断面図を示す。
【００６３】
本発明の実施形態に従って、集積した電極３を有する活性シーブ１は、マルチパラメータ細胞分離を可能にする。それゆえに、細胞の大きさの選択は、最適なシーブホールの寸法によって、磁気的操作および／または電気的操作と連動する。いずれの追加の力もない場合、細胞は通常、流体力および重力によってホール２内に捕捉される。追加の磁力および／またはＤＥＰ力は合力を変化させ、したがって効率性、特に細胞分離の効率を変化させる。力の略図を、図５Ａおよび図５Ｂに、ＤＥＰ力および磁力についてそれぞれ示している。誘電泳動は、ＡＣ電界内で電気的に分極した物体の運動である。物体は、電界が空間的に均一でない場合は、クーロン力によって動作する。粒子の極性および電荷量は、粒子の相対誘電率および周囲の媒質に依存する。従来のＤＥＰ力は、式［１］に従って算出できる。ここで、ωは角周波数であり、Ｒは細胞の流体力学的半径、εｍは媒質の誘電率、Ｅは電界を表す。ＲＥ[ｆＣＭ（ω）]は、クラウジウス−モソッティ（ＣＭ）因子（式［２］参照）の実部を表し、τｍ＝εｍ／σｍ、τｓ＊＝ＣｓＤ／２σｍである。Ｃｓは膜の静電容量（Ｆ／ｍ２）、σｃは細胞質の伝導率、εｃは細胞質の誘電率、σｍは媒質の伝導率である。細胞は通常、薄い殻によってコーティングされた球とみなされ、それぞれ細胞質と細胞膜を表す。これは、しばしばプロトプラストモデルと呼ばれる。このモデルにおいて、ＣＭ因子は、追加の静電容量および細胞膜のコンダクタンスを考慮する。プロトプラストモデルに従って、ＤＥＰ力は、細胞膜および細胞内含有物の両方の極性によって決定する。したがって、ＤＥＰスペクトルは、ある程度、細胞の種類に特有のものである。このために、ＤＥＰは通常、標識を必要としないが、追加の標識によって、より優れた制御能力を得ることができる。ＤＥＰ力が正の場合、細胞は電極に引き付けられ、この逆も成立する。
【００６４】
【数１】
0005922361.tif 000002
【００６５】
図２８に示すように、正のＣＭ因子の実部に対する充分広いウインドウが存在し、伝導率の低い媒質、例えばスクロース緩衝液または１ｍＭのＮａＣｌ中では、ＤＥＰ力は引力である。それに対して、負のみの（即ち斥力）ＤＥＰ力は、伝導率の高い媒質、例えばＰＢＳ、または細胞培地に対して存在する。したがって、媒質の低い伝導率は、本発明の実施形態に係る活性シーブを用いる使用に対して利点がある。さもなければ、ＥＩＳ測定中、細胞は、ＤＥＰ力によって電極から反発力を受けることになるからである。
【００６６】
インピーダンス測定の等価回路モデルを図２９に示しており、ＲＩＣＭは細胞内マトリックスの抵抗であり、ＣＩＣＭは細胞内マトリックスの静電容量であり、ＲＭＥＭは細胞膜の抵抗であり、ＣＭＥＭは細胞膜の静電容量であり、ＲＧＡＰは細胞−電極ギャップの抵抗であり、ＣＧＡＰは細胞−電極ギャップの静電容量であり、ＲＳＯＬは媒質ギャップを介した電極−電極抵抗であり、ＣＳＯＬは媒質ギャップを介した電極−電極静電容量であり、ＲＤＬは電極−電解質インターフェイスの抵抗であり、ＣＤＬは電極−電解質インターフェイスの静電容量であり、ＣＳＵＢは基板を介した２つの電極の寄生容量であり、ＣＴＲＡは単一伝送ラインの寄生容量である。
【００６７】
１ｍＭのイオン強度について、インピーダンス測定のシュミレーションを図３０に示している。周波数の小さい領域（＜１ｋＨｚ）において、インピーダンスは主に電極−電解質インピーダンスに支配される。中間周波数領域（１ｋＨｚ−１ＭＨｚ）において、電極−電解質インターフェイスのインピーダンスは無視できるようになる。したがって、細胞膜のインピーダンスおよび媒質ギャップ（細胞と電極との間の）が支配的になる。ギャップが充分小さい場合、細胞膜インピーダンスは主な貢献をする。より大きい周波数領域（＞１ＭＨｚ）においてでさえ、細胞膜は容量結合し、よって細胞内マトリックスは、全インピーダンスを支配する。細胞の特製化について、細胞膜インピーダンスが大きく関係している。即ち、１ｋＨｚ〜１ＭＨｚの中間周波数領域で測定を実施することには利点がある。図２８および図３０を比較すると、この領域においてＤＥＰ力は正であり、即ち、細胞は電極に引きつけられることがわかる。換言すると、引力は細胞と電極との間のギャップ、したがってギャップインピーダンスに起因する影響を最小化するのに役立つ。
【００６８】
細胞が、磁性マイクロ粒子または磁性ナノ粒子（ＭＰ）と接合している場合、磁力を印加することができる。磁界中の超常磁性体ＭＰについての磁力は、式[３］で表すことができる。ｍは磁気モーメント、Ｂは印加される磁束密度である。細胞−ＭＰの複合体の運動は磁気泳動（ＭＡＰ）と呼ばれる。多くの細胞は磁性を有しない（即ち反磁性である）。したがって、ＭＰの接合が普通は必要であり、例えば該接合のための抗体−抗原認識によって、生物学的特異性が可能になる。
【００６９】
【数２】
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【００７０】
誘電泳動および磁気泳動の両方について、運動はニュートンの第２法則（式[４]参照）によって調べられる。Ｇは質量、ｖは細胞と媒質との間の相対速度、Ｄは流体学的大きさ、ηは速度、ΣＦは、流体力学的けん引力および重力を除くすべての力の総和である。細胞がホール内に捕捉され、すべての力が互いに相殺した場合、第１項は０になる。
【００７１】
【数３】
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【００７２】
細胞捕獲だけでなく、力の組み合わせはまた、細胞遊離にも適用することができる。図６Ａは、非標的細胞と比較した、標的細胞の選択的遊離の遊離前を示しており、図６Ｂは、非標的細胞の遊離を示しており、図６Ｃは、標的細胞の遊離を示している。標的細胞４２と非標的細胞４１の異なる物理特性は、斥力の選択的利用を可能にする。したがって、標的細胞４２（正の分離）または非標的細胞４１（負の分離）のどちらかがシーブ１から反発力を受け、下流での分析のために流れによって運搬される。
【００７３】
本発明の実施形態に従って、活性シーブ１は、複数の機能、例えばふるい分けすること、インピーダンス測定、計数すること、動作させること、および／または溶解させることを有するホール２を備えてもよい。前記複数の機能は、細胞のふるい分けの意思決定方法を可能にする。図７のステップ７０に示すように、迅速で粗いＥＩＳ測定をすべての測定サイクルの第１ステップとして適用し、選択されたホール２に細胞が存在するか否かを伝えることができる。ステップ７１で、粗い測定７０が、細胞の痕跡が存在することを意味する場合のみ、精密測定が必要となり、ステップ７２および７３で、捕捉した細胞が標的細胞型か否かを決定する。ステップ７１で、細胞の存在が検出されなかった場合、時間は経過し、そしてステップ７４で次の走査を待つ。その後、ステップ７３の捕捉した細胞の細胞型の決定の後に、ステップ７５で選択的に細胞の計数を実施し、および／またはステップ７６で細胞溶解を実施する。
【００７４】
本発明の実施形態に従って、インピーダンス測定ステップ７０を使用して、個々のホール２に細胞が存在するか否かを特定してもよい。これにより、インピーダンス測定の際にシーブ１を走査することによって、シーブ１での細胞濃縮を監視することができる。
【００７５】
本発明の実施形態に従って、活性シーブ１は、インピーダンス測定を実施するのに好適なホールを備えてもよい。典型的に、細胞インピーダンス測定のための２つの検出方法、２端子検出および４端子検出がある。２端子検出は、細胞ごとに２つの電極のみの単純な構造を用いてインピーダンスを測定する。電極および導電性ワイヤの数を有効に減少させることができるが、測定は、リード線の抵抗、リード線のインダクタンスおよび浮遊容量を含む寄生インピーダンスに起因する系統的誤差を包含する。該誤差は、４ワイヤ測定を使用することによって有効に減少させることができるが、２組の電極は、局所測定位置で分かれており、１組は電流測定、もう１組は電位測定に使用する。
【００７６】
特定の実施形態において、活性シーブ１は、インピーダンス測定を実施するのに好適なホール２を備えてもよく、前記インピーダンス測定は、化学的刺激または物理的刺激の後に影響を受けてもよい。同じ刺激中または刺激後に、標的細胞４２および非標的細胞４１は、異なる方法でインピーダンス変化を示してもよく、細胞の特定および区別に使用することができる。この点で、広義の刺激はまた、例えばマイクロ粒子／ナノ粒子と細胞との結合のような標識の接合、接合という事象そのものか、これらの粒子を介してはたらく力、例えば磁力の印加か、のどちらかを含む。
【００７７】
特定の実施形態において、活性シーブ１は、インピーダンス測定を実施するのに好適なホール２を備えてもよく、前記インピーダンス測定は、インピーダンス測定のステップ７０と、細胞の特徴を特定するステップ７１との両方を、図７に示すように含む。高速で正確な測定のために、例えば等価な電気回路をモデル化することによって、両態様のために新規なアルゴリズムを開発することができる。例えば、複数周波数の多重信号を印加することができ、対応する周波数でのインピーダンスを後で抽出してもよい。シングルパルス励起を印加し、フーリエ変換（例えばＦＦＴ）後の全周波数領域のインピーダンス測定を可能にすることもできる。特に、全周波数帯に対する分光法を、離散した少数の周波数に置き換えることで、測定効率は大きく向上する。
【００７８】
本発明の実施形態に従って、さまざまな電極形状パターンを採用し、本発明の実施形態の活性シーブ１を用いたＥＩＳ測定を実施してもよい。図８Ａ−図８Ｃは、好適な電極配置および電極形状の例を示している。図８Ａ−図８Ｃにおいて、活性シーブ１の個々のホール２は、第１電極６２および第２電極６３と電気的に結合している。図８Ｃの特定の実施形態において、第１電極６２は動作電極であり、第２電極６３は対向電極である。細胞が第１電極６２を覆うのに充分大きいと仮定すると、この電極は、より大きい細胞を通じて電流を伝送し、最後に電流は媒質を通じて第２電極６３を流れる。この実施形態において、細胞は、第２電極６３を完全に覆うということはないだろうし、したがって、媒質のインピーダンスも、細胞との直列接続で測定することになることに注意する。しかしながら、これは、対向電極が充分大きい限りは重要でない。なぜなら、細胞のインピーダンスと比較して、媒質のインピーダンスを無視できるからである。最も好適な形状の選択は、高い信号対騒音比と製造の容易さとの間のトレードオフであり、更には、因子の数に依存する。該因子は、例えば細胞の大きさ、細胞の変形能、媒質の伝導性、流れ圧力、および／または流量の安定性などの物理的因子、例えば光アライメントの解像度、フォトレジストのトーン(tone)およびフォトレジストのタイプ、および／または電極パターニングのための方法などの製造の実行可能性、ならびに最小の寄生インピーダンス、ホール間のクロストークまたは設計規則における他の基準を目的とするチップレベルでの電気的特性を含んでもよい。
【００７９】
図９において、１つの設計形状を図示しており、活性シーブデバイス１の個々のホール２は、両側に電極を有し、一方の電極１００を上部に、他方の電極１０１を底部に有する。別の設計形状を図１０に示しており、その中で、本発明の実施形態に係る活性シーブデバイス１の２つのホールを図示しているが、各ホール２は、少なくとも複数のホール２に共通して、局所動作電極８１ａ、８１ｂ、および包括的対向電極８２とそれぞれ結合している。各ホール２はさらに、１組より多い組の電極を有してもよい（図１０には示していない）。
【００８０】
本発明の実施形態に従って、活性シーブ１内のホール２の個々のアドレス能力はさらに、標的細胞４２と非標的細胞４１の両方の電気穿孔法を可能にする。該電気穿孔法は、ＥＩＳ測定のための電極と同じセット、または同じホール２と結合した異なる電極によって可能になる。電極をＥＩＳ測定と電気穿孔法の両方で共有する場合、図１１に示すように、読み出し回路（ＥＩＳのための）および駆動回路（電気穿孔法のための）のための特別な切り替え回路が要求されることもある。
【００８１】
本発明の実施形態に従って、生物検体１３が、活性シーブ１のホール２を通って特性化されることを含む、流れ、例えば液体の流れは、図１２に示すように、デバイス平面と実質的に垂直方向である。マイクロホールアレイの構造に対する細胞の入射位置に依存して、いくつかの細胞、例えば図１２の中央に示す細胞は、流れて２つの隣接するホールの中央の位置に達する可能性がある。この位置は、構造の対称性に起因する、流体力学的局所エネルギーが最大となる特異な位置であり、決定的ではない横方向、例えば図１２における左または右に進み、細胞は最終的に捕捉されることになる。細胞は、位置の特異性に起因して、最終的に隣接するホール２のうちの１つへ移動する可能性があり、細胞−デバイスの付着状態が長い時間続く可能性は、精密な環境に大きく依存する。この問題は、単調な局所エネルギー場に起因して、細胞の大部分、例えば図１２の左および右の細胞には重要でないかもしれない。しかしながら、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の細胞分離は、細胞消失への非常に低い耐性に起因して、受容することができない。図１２に示す実施形態において、電極３を基板表面上に設けてホール２を形成することができる。さらに、ホール２は先の細い形状を有しており、ホールの流出側に向かって断面寸法が減少する。代替の実施形態において、他の図面で示すように、ホール２は、実質的にホール２の高さ全体を越える断面寸法を有する直線形状をとることができる。その上部、または代替として、ホール２に隣接する基板の主表面に、電極３を設けることができる。
【００８２】
特定の実施形態において、特別なマイクロ構造の設計を提供して、構造の対称性を減少させ、または避け、したがって特異なエネルギー位置を避けてもよい。例えば、孤立構造２８０は、図２７に示すように、隣接する細孔の間に製造して細胞の流れを誘導することができる。孤立構造２８０は、不動態材料から、３Ｄ形状を有する誘導エレメントを形成してもよい。
【００８３】
特定の実施形態において、追加の力／場の摂動を加えてエネルギーの特異点(singularity)を避け、２つのホール２の間に付着した細胞を再度活性化させてもよい。追加の力は、例えばＤＥＰ力、磁力、音響力、または単に変化した流速および／もしくは方向のような、いずれの好適な力も可能である。
【００８４】
本発明の実施形態に従って、活性シーブ１の機械的強度は、充分大きい流速を維持することができるようにし（＞２０μｌ／ｍｉｎ、例えば、少なくとも１ｍＬ／ｍｉｎ）、シーブに細胞を供給することに使用されるマイクロ流体チャネル内のビーズの固着を避ける。シミュレーションは、１００００個の細孔（４μｍ×４μｍの開口部、厚さ０．３ｍｍ）を有するシーブに対して、１ｍＬ／ｍｉｎの流速で、３０００Ｐａの誘起圧力、および１０６Ｐａのミーゼス応力を想定した。本発明の実施形態に係るシーブは、印加される圧力、応力および力に耐えるのに充分強い必要がある。
【００８５】
本発明の実施形態に従って、活性シーブ１は、濃縮に使用してもよく、または、種々のサンプル準備ステップとさらに結びついてもよい。例えば、流体マトリックスの中に存在する大きい生体化合物、例えば牛乳内のバクテリアをシーブ１に保持することができる。一方、他のすべての、より小さい非標的化合物は、シーブを通過することができる。保持された化合物は、化合物を保持するホール２と結合した電極３と接触するので、上述のように、電気的に連続して分析することができる。保持された化合物は、少なくとも１つの電極、および該少なくとも１つの電極を分析回路に接続する複数の相互接続部に作動可能に接続した少なくとも１つのトランジスタの存在に起因して、個々に分析することができる。本発明の実施形態に係る活性シーブ１はまた、免疫磁性純化技術と結びつくことができる。複雑マトリックスに由来する化合物（例えば細胞）の免疫磁性濃縮の後、非結合磁性ビーズ（または、細胞に由来する、切断されたビーズ）を、興味ある化合物のみが分析のために保持される間に、ホール２を通過させることができる。これは図１３に示しているが、本原理を他の濃縮技術、たとえば密度遠心分離による細胞濃縮と組み合わせて適用することもできる。図１３に例示する手順は、次の連続するステップ、即ち、サンプル準備ステップ３１、複雑なマトリックスの残部に由来する、結合および非結合磁気ビーズの分離ステップ３２、ならびに標的細胞の検出ステップ３３ならびに廃棄物（非結合ビーズ）処理ステップを示す。
【００８６】
本発明の実施形態に従って、活性シーブ１は、下流の加工ステップと組み合わせて使用してもよい。例えば、細胞の電気的分析の後、それらを個々に溶解または動作させ、下流でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施してもよい。代替として、濃縮した細胞の存在を光学的に検証し、特性化してもよい。本発明の実施形態に従って、活性シーブ１内のホール２はさらに、細胞の特性化のためのインピーダンス分光法に加えて、細胞の光学的なアドレス能力に対応している（個々に）。これは、シーブを、光学的に透明なカバー、例えばスライドガラスまたはポリカーボネートの蓋で包むことによって実施可能になる。細胞は、種々の光学的標識と接合してもしなくてもよい。標識を用いない光学的観察を使用して、細胞の形態、例えば大きさ、形状、透明度などを調べることができる。特に、分子レベルの更なる情報は、特定の蛍光分子、例えば特定の抗体、プラズモン標識、または表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）標識との接合によって取得することができる。光信号は、インピーダンス分光法と組み合わせて使用し、細胞の特性化の、特異性、感度、信頼性および効率性を向上させることができる。細胞は、大きさ、透明性、形態、または蛍光／ＳＥＲＳスペクトルに従って光学的に分類し、特有のインピーダンススペクトルに従って電気的に分類することができる。異なる光学的および電気的特徴を有する細胞に対しては、どちらかのアプローチが分類のために効果的である。類似の光学的特徴を有するが、異なる電気的インピーダンススペクトルを有する細胞に対しては、電気的特徴を使用して分類することができ、この逆もまた成立する。これら２つの技術の組み合わせは、細胞の特定および分類のための、相互検証および独立検証を提供する。
【００８７】
第２の態様において、本発明は、活性シーブデバイス１を製造するための方法９０に関する。例示的な方法９０は、これ以降に記載しており、図２３に示している。
【００８８】
方法９０は、基板を提供するステップ９１を含む。本発明の文脈中、用語「基板」は、いずれの基礎となる材料、または活性シーブ１を形成するために使用する可能性のある材料、または少なくとも１つのホールと電気的に結合した少なくとも１つの電極と作動可能に接続したトランジスタを上部に形成した材料を含んでもよい。本発明の実施形態において、この「基板」は、半導体基板、例えばシリコン、ヒ化ガリウム（ＧａＡｓ）、ガリウムヒ素リン（ＧａＡｓＰ）、リン化インジウム（ＩｎＰ）、ゲルマニウム（Ｇｅ）、またはシリコンゲルマニウム（ＳｉＧｅ）、またはポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）、またはポリカーボネート（ＰＣ）基板を含んでもよい。該「基板」は、半導体基板部分に加えて、例えばＳｉＯ２またはＳｉ３Ｎ４のような絶縁体層を含んでもよい。したがって、基板という用語はまた、シリコンオングラス基板、シリコンオンサファイア基板を含む。したがって、用語「基板」は、概して、基礎となる、または興味ある層もしくは部分、特にシーブ１を形成する層のためのエレメントを定義するために使用する。例として、本発明はそれに限定されないが、基板は、シリコン−オン−インシュレータ（ＳＯＩ）ウエハ、例えば１０μｍ〜２０μｍの厚い上部シリコン層および約１０μｍの埋め込み酸化層（ＢＯＸ）を有するＳＯＩウエハでもよい。
【００８９】
本発明の実施形態に係るトランジスタ集積活性シーブ１は、半導体技術を使用して製造する。基板は、集積トランジスタの製造を可能にする。ここで、方法９０はさらに、トランジスタ層を、例えば前工程（ＦＥＯＬ）において作成するステップ９２を含む。トランジスタのタイプは、バイポーラ接合トランジスタ（ＢＪＴ）または金属酸化物半導体電界効果トランジスタ（ＭＯＳＦＥＴ）が可能であり、好ましくはＭＯＳＦＥＴであり、より好ましくは相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）である。高電圧が必要な場合は、拡散金属酸化膜半導体（ＤＭＯＳ）を使用することができる。典型的に、ＣＭＯＳベースのトランジスタ９は、例えば０．３５μｍ、０．２５μｍ、０．１８μｍ、０．１３μｍ、９０ｎｍ、６５ｎｍ、４５ｎｍ、３２ｎｍ、またはそれ以下の半導体のテクノロジーノード(node)を使用したＦＥＯＬステップで製造してもよい。ＦＥＯＬ加工後の、活性シーブチップの概略図を図１４に示しており、トランジスタ９は詳細に図示しておらず、トランジスタ層として図示している。
【００９０】
方法９０はさらに、電極層を作成するステップ９３を含む。トランジスタ９を製造した後、シーブの他の構造、例えば電極３、導電性経路１２および相互接続部４を後工程（ＢＥＯＬ）で製造してもよい。図１５に示すように、細胞インピーダンス測定および／または電気的細胞位置決め（例えばＤＥＰ）のための電極を、電極間および／または上部に絶縁部６を任意に有するチップの上部（即ち前面）に製造してもよい。
【００９１】
電極材料は、直流電流および／または交流電流を導電することができるいずれの材料も可能であり、Ａｕ、Ｐｔ、Ｗ、ＴｉＮ、ＴａＮ、ＩｒＯ、Ｃ、カーボンナノチューブ／カーボンナノシート、Ａｇ、Ａｇ／ＡｇＣｌ、グラフェン、Ａｌ、Ｃｕ、ＩＴＯを含むが、これらに限定されない。絶縁体材料は、ＳｉＯ２、ＳｉＮ、Ｔａ２Ｏ５、パリレン、ＳＵ８、ポリアミドまたは直流電流に対する大きいインピーダンスを示す他の任意の材料が可能である。
【００９２】
方法９０はさらに、ホール２、例えばスルーホールを基板７に作成するステップ９４を含む。ホール２は、ウェットエッチング、例えばＫＯＨもしくはＴＭＡＨのようなエッチング液での異方性エッチングを使用して、またはドライエッチングを使用して製造してもよい。ドライエッチングは、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）、深堀り反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）またはイオンミリングが可能である。スルーホールは、単一ステップ（図１５および図１６）または複数のステップ（図１５、図１６Ｂおよび図１７〜図２１）におけるドライエッチングが可能である。単一ステップエッチングの場合、チップの上部に前面エッチングマスクを堆積およびパターン化し、次にエッチングによってスルーホールを開口する（図１６Ａ）。ホールの直径は、適用方法に依存してもよい。循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）分離のための典型的な大きさは、１μｍ〜１０μｍ、好ましくは３μｍ〜６μｍの範囲にある。
【００９３】
単一ステップエッチングが技術的に難しい場合、複数のステップにおいてスルーホール２をエッチングすることができる。最初、ブラインドホール２０は、前面（図１６Ｂ）から基板７内までエッチングされる。次に、デバイスは、任意に、例えば接着剤１４を用いて、前面のキャリア基板１５、例えばＳｉウエハの上に接着させてもよい。その後、第２ブラインドホール２１を、フォトリソグラフィを使用して、後面から第１ホール２０に達するまでエッチングし、スルーホールを形成する（図２０Ａ）。任意であるが、後面エッチングが達成できる最大深さに依存して、ウエハを薄くするステップを後面ホールのエッチング前に実施することができる。後面ホールの直径は、前面ホールの直径よりも大きくてもよく、例えば５μｍ〜５０μｍである。
【００９４】
例えば、いくつかの状況において、ホール２内でなくホール２の上方で細胞を物理的に捕捉する必要がある場合、例えば図１８で示すような不動態材料で形成される構造１６、または図２７で示すような孤立構造２８０のようなマイクロ構造をシーブ１上に製造することができる。ここで、典型的な実施形態として、マイクロ構造を形成するために、不動態材料層１６をシーブの前面に堆積してもよい（図１７）。リソグラフィを使用してシーブ１の上方にマイクロ構造を製造するために、２つのアプローチを適用することができる。
【００９５】
第１のアプローチにおいて、不動態材料層１６は、図１６Ｂのような構造に付加されるが、ブラインドホールが既に設けられている。最初、図１８に示すように、マイクロ構造を不動態材料層１６内でパターン化し、次に、前面ホール２０の内部で不動態材料１６をエッチングする。
【００９６】
代替として、図１５に示すような構造に、即ちホール２またはブラインドホール２を設ける前に不動態材料層１６を付加する。この場合、最初に、スルーホール（不図示）として、または図１９に示すようにブラインドホールとして、不動態材料層１６を貫通して前面ホールをエッチングする。その後、マイクロ構造を不動態材料層１６内でパターン化する。
【００９７】
前面ホールを共に開口してマイクロ構造を形成した後、どちらかのアプローチを使用して、後面からシーブを加工して、スルーホールを作成することになる。ここで、マイクロ構造を有するシーブは、図２０Ｂに示すように、接着剤１４を用いてキャリアウエハ１５に接着してもよい。必要であれば、チップを薄くすることができる。
【００９８】
方法９０は、図２１に示すように、例えば後面からコーティングされた、直流電流に対して大きいインピーダンスを有する不動態材料から成る少なくとも１つの層２２を作成するステップ９５を任意に含んでもよく、先の加工ステップに由来する欠点をカバーし、媒質からトランジスタまでの容量結合を減少させ（シーブの後面に達する際、この媒質は廃棄物、即ちシーブによってブロックされてきた興味ある細胞を主に含むので）、および／または媒質から使用中の固体デバイスまでの腐食を避ける。この作成ステップ９５は、材料の堆積または熱酸化の使用を含んでもよい。かかる不動態層は、個々の電極を分離して電極間の干渉を妨げることができる。不動態層の厚さおよび均一性は、上記目的の達成を可能にする必要があるが、シーブの機能を害しない必要がある（例えばホールのブロッキング）。不動態材料は、ＳｉＯ２、ＳｉＮ、Ｔａ２Ｏ５、パリレン、ＳＵ８、テフロン（登録商標）、ポリアミドなどが可能である。典型的な厚さは、５ｎｍ〜１μｍの範囲にあってもよく、好ましくは１０ｎｍ〜２００ｎｍである。
【００９９】
製造の後、キャリアウエハ１５は、付加する際に除去してもよい。
【０１００】
本発明の実施形態に従って活性シーブを製造するための方法はさらに、電子回路、チップ、バイオセンサ、光センサ、光刺激装置の少なくとも１つを設けるステップを含んでもよく、該方法はさらに、相互作用するための、更なる電子デバイスを設けるステップを含んでもよい。
【０１０１】
本発明の第３の態様は、活性シーブデバイス１を用いて生物検体１３を分析するための方法、例えば単細胞の電気的読み出しと組み合わせて細胞を濃縮して、細胞を分離し、計数し、および潜在的には区別までも行い、または溶解させるための方法に関する。前記方法は、ホール２を有する活性シーブ１、それと電気的に結合した電極３、および本発明の第１の態様に関する上記のような集積トランジスタの動作に関する。動作方法は、生物検体１３を含む媒質を活性シーブ１に導入することと、活性シーブ１により生物検体１３を分離することと、活性シーブデバイス１内のトランジスタ９を駆動することによって、分離した生物検体１３上で測定を実施することと、測定に従って、標的とした生物検体を特定することとを含む。
【０１０２】
細胞分離、ＥＩＳ測定、ＤＥＰ位置決め、および細胞溶解についての例示的な動作フローを図２２に示している。動作ステップは、デバイス動作と流体動作とに分類される。簡単に言うと、特定の媒質中の細胞は、シーブに誘導され、媒質の残りの部分から分離する（例えば、媒質中のより小さい細胞、タンパク質およびＤＮＡ）。その後、ＤＥＰ位置決めによって支援された状態で、細胞インピーダンスを測定する。標的細胞が特定された場合、それらを電気的に溶解してもよい。
【０１０３】
ＥＩＳ測定は、「オープン−ショート−ロード」(open-short-load)補償方法をベースにしており、信号伝送に沿って寄生インピーダンスを補償する。したがって、ＥＩＳ測定は、ホールのすべて、または一部の上で空のロード（「オープン」）を用いたインピーダンス測定で開始する。シーブは、構造が典型的な活性ホールと類似または同一である、いくつかの校正エレメントを集積してもよいが、ＥＩＳ電極は電気的に短絡している。これらの校正エレメントは、ゼロロード（「ショート」）を有するとみなすことができる。細胞が流入する前に、デバイスが媒質で湿っている場合、媒質のインピーダンスを測定することができる（「ロード」）。代替として、ＥＩＳ電極が既知のインピーダンスの回路エレメント（例えば、抵抗またはキャパシタ）によって接続されている校正エレメントから、既知の値のロードを取得することができる。その後、上記の３つの実測結果を、オープン−ショート−ロード補償に使用する。いずれのＥＩＳ測定においても、励起信号は電圧（したがって電流を測定する）または電流（したがって電圧を測定する）が可能である。いずれの状況においても、最大電圧は、媒質の電気分解を避けるために１０Ｖに制限されている。好ましくは、電圧は１Ｖ未満である。
【０１０４】
ＤＥＰ電圧は通常５０ｍＶ〜１０Ｖ、１０Ｈｚ〜１００ＭＨｚである。所望のＤＥＰ極性およびＥＩＳ周波数に依存して、ＤＥＰ信号は、ＥＩＳ信号と同時に、または異なる時に、ＤＥＰ電極を通じて印加することができる。ＥＩＳ信号が、興味ある細胞のＤＥＰスペクトルに合致する場合、ＤＥＰ力は、ＥＩＳ信号によって取得することもできる。この場合、ＤＥＰ電極を使用しなくてもよい。
【０１０５】
本発明は図面および先の説明において詳細に図示し、説明してきた。かかる図示および説明は、説明目的または励磁であり、制限的なものではない。先の説明は、本発明の特定の実施形態を詳細に述べている。しかしながら、どれほど詳細に先の説明を明細書にて行っても、本発明は多くの方法で実施できことが理解されるだろう。本発明は、開示した実施形態に限定されず、請求項の用語によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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