(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素活性が低下した、不活性化内在性脂肪酸デサチュラーゼまたは変異内在性脂肪酸デサチュラーゼを有する微細藻類に由来し、少なくとも６０％のＣ１８：１、および７％未満のＣ１８：２を含む脂肪酸プロフィールを有するか、又は
酵素活性が低下した、不活性化内在性ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼまたは変異内在性ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼを有する微細藻類に由来し、少なくとも３５％の飽和脂肪酸を含む脂肪酸プロフィールを有する、微細藻類トリグリセリド油であって、
前記微細藻類が、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の微細藻類であり、かつ、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子を含む、微細藻類トリグリセリド油。
【請求項２】
少なくとも７０％、少なくとも７５％、又は少なくとも８０％のＣ１８：１を含む、請求項１に記載の油。
【請求項３】
５％未満、３％未満、又は１％未満のＣ１８：２を含む、請求項１または２に記載の油。
【請求項４】
少なくとも６０％、又は少なくとも６５％の飽和脂肪酸を含む、請求項１に記載の油。
【請求項５】
少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％の飽和脂肪酸を含む、請求項４に記載の油。
【請求項６】
前記脂肪酸プロフィールが、少なくとも１％のＣ８：０、少なくとも１％のＣ１０：０、少なくとも１％のＣ１２：０、少なくとも２％のＣ１４：０、少なくとも３０％のＣ１６：０、および少なくとも５％のＣ１８：０のうちの一つ又は複数をさらに含む、請求項１に記載の油。
【請求項７】
前記油の前記脂肪酸プロフィールが、天然に存在する油の脂肪酸プロフィールの上位２つのトリグリセリドの少なくとも＋／−１５％を含み、前記天然に存在する油が、カカオバター、ココナッツ油、パーム油、パーム核油、牛脂及びラードからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の油。
【請求項８】
１％未満のβ−シトステロールを含む、請求項１に記載の油。
【請求項９】
前記微細藻類が、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の油。
【請求項１０】
１つ又は複数の他の食用成分とともに、請求項１〜９のいずれか一項に記載の油を含む、食品組成物。
【請求項１１】
サラダドレッシング、卵製品、焼成製品、パン、バー、スナックチップ、パスタ、ソース、スープ、飲料、冷菓、バター又はスプレッドである、請求項１０に記載の食品組成物。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の油を、少なくとも一つの他の食用成分と組み合わせる工程を含む、食品組成物の製造方法。
【請求項１３】
ａ．従来の食品中の非藻類油、非藻類脂肪又は卵の量を決定する工程；及び、
ｂ．前記非藻類油、非藻類脂肪又は卵の一部を、特定量の前記微細藻類トリグリセリド油に置き換えるか、又は前記非藻類油、非藻類脂肪又は卵に特定量の前記微細藻類トリグリセリド油を補う工程
とをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記食品組成物に非藻類油、非藻類脂肪又は卵を加えない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
微細藻類トリグリセリド油の前記量が、前記の従来の食品中の前記非藻類油、非藻類脂肪又は卵の質量又は容積の０．２５倍〜４倍である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の微細藻類トリグリセリド油を生成する方法であって、
前記微細藻類の細胞の集団を培地中で培養する工程と、
前記微細藻類の細胞から前記微細藻類トリグリセリド油を単離する工程と
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願の相互参照）
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１０年５月２８日に出願した米国仮出願第６１／３４９，７７４号、２０１０年８月１８日に出願した米国仮出願第６１／３７４，９９２号、２０１０年１１月１６日に出願した米国仮出願第６１／４１４，３９３号、２０１０年１２月２９日に出願した米国仮出願第６１／４２８，１９２号の優先権を主張する。これらの出願は、それぞれ、あらゆる目的のために内容全体が参照により組み込まれる。
【０００２】
（配列表の参照）
本出願は、添付した１〜１９５ページに配列表を含む。
【０００３】
本発明は、微生物から作られる、食品組成物、油、燃料、油脂化学品の生成に関する。特定的には、本開示は、油を生み出す微細藻類、脂質、脂肪酸エステル、脂肪酸、アルデヒド、アルコール、及びアルカンといったバイオマス及び有用な化合物を産生するために微生物を育てる方法、並びに、上述の微生物の遺伝子を組み換えて、微細藻類による油の産生効率を高め、産生される油の種類及び組成物を変える方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
人口増加が続くにつれて、さらなる食糧源、特に、安価に生産され栄養価の高い食糧源の必要性が高まっている。さらに現在、少なくとも最先進国では、多くの食事の基本食として肉に依存していることが温室効果ガス放出の大きな一因となっており、味も栄養価も同じで、生産の際に環境への悪影響が少ない新たな食糧が必要とされている。食糧、特に、味が良く栄養価の高い食糧を、藻類を含めた微生物から安価にかつ効率的に大規模で生産する方法が依然として必要とされている。本発明はこれらのおよびその他の要求を満たすものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、異なる脂質プロフィールを有する油産生微生物細胞、好ましくは微細藻類細胞を提供し、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのようなタンパク質をコードする外来遺伝子を発現する組み換え細胞を含む。また本発明はまた、かかる細胞からバイオディーゼル、再生可能なディーゼル及びジェット燃料のような燃料を含めた脂質及び油脂系製品を製造する方法も提供する。
【０００６】
第１の態様では、本発明は、少なくとも１％又は少なくとも５％、好ましくは少なくとも３％のＣ８：０という脂質プロフィールを有する油産生微生物細胞、好ましくは微細藻類細胞を提供する。ある場合には、脂質プロフィールは、少なくとも１０％又は少なくとも１５％、好ましくは少なくとも１２％のＣ８：０である。ある実施形態では、細胞は組み換え細胞である。ある場合には、組み換え細胞は、鎖長がＣ８の脂肪族アシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解活性を有するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードする外来遺伝子を含む。ある実施形態では、外来遺伝子は、Ｃｕｐｈｅａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする。ある場合には、細胞はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の細胞である。ある場合には、細胞は、表１で同定される微細藻類から選択される微細藻類の属又は種である。
【０００７】
第２の態様では、本発明は、少なくとも４％のＣ１０：０という脂質プロフィールを有する油産生微生物細胞、好ましくは微細藻類細胞を提供する。ある場合には、脂質プロフィールは、少なくとも２０％、少なくとも２５％又は少なくとも３０％、好ましくは少なくとも２４％のＣ１０：０である。ある場合には、Ｃ１０：０とＣ１２：０の比が少なくとも６：１である。ある実施形態では、細胞は組み換え細胞である。ある場合には、組み換え細胞は、鎖長がＣ１０の脂肪族アシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解活性を有するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードする外来遺伝子を含む。ある実施形態では、外来遺伝子は、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ及びＵｌｍｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎａからなる群から選択される種由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードする。ある場合には、細胞はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の細胞である。ある実施形態では、細胞は、表１で同定される微細藻類から選択される微細藻類の属又は種である。
【０００８】
第３の態様では、本発明は、少なくとも１０％又は少なくとも１５％、好ましくは少なくとも１３％のＣ１２：０という脂質プロフィールを有する油産生微生物細胞、好ましくは微細藻類細胞を提供する。ある場合には、脂質プロフィールは、少なくとも３０％、少なくとも３５％又は少なくとも４０％、好ましくは少なくとも３４％のＣ１２：０である。ある場合には、Ｃ１２とＣ１４の比が少なくとも５：１である。ある場合には、細胞は組み換え細胞である。ある実施形態では、組み換え細胞は、鎖長がＣ１２の脂肪族アシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解活性を有するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードする外来遺伝子を含む。ある場合には、組み換え細胞は、鎖長がＣ１２の脂肪族アシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解活性を有する、Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ及びＣｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒａ由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードする、少なくとも２つの外来遺伝子を含む。ある実施形態では、細胞はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の細胞である。
【０００９】
第４の態様では、本発明は、少なくとも５％又は少なくとも１５％、好ましくは少なくとも１０％のＣ１４：０という脂質プロフィールを有する油産生微生物細胞、好ましくは微細藻類細胞を提供する。ある場合には、脂質プロフィールは、少なくとも４０％、少なくとも４５％又は少なくとも５０％、好ましくは少なくとも４３％のＣ１４：０である。ある場合には、Ｃ１４：０とＣ１２：０の比が少なくとも７：１である。ある場合には、細胞は組み換え細胞である。ある実施形態では、組み換え細胞は、鎖長がＣ１４の脂肪族アシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解活性を有するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードする外来遺伝子を含む。ある実施形態では、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質は、Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒａ及びＵｌｍｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎａからなる群から選択される種に由来する。ある場合には、細胞はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の細胞である。ある実施形態では、細胞は、表１で同定される微細藻類から選択される微細藻類の属又は種である。
【００１０】
第５の態様では、本発明は、少なくとも１０％又は少なくとも２０％、好ましくは少なくとも１５％のＣ１６：０という脂質プロフィールを有する油産生微生物細胞、好ましくは微細藻類細胞を提供する。ある場合には、脂質プロフィールは、少なくとも３０％、少なくとも３５％又は少なくとも４０％、好ましくは少なくとも３７％のＣ１６：０である。ある場合には、細胞は組み換え細胞である。ある実施形態では、組み換え細胞は、鎖長がＣ１６の脂肪族アシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解活性を有するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードする外来遺伝子を含む。ある実施形態では、組み換え細胞は、鎖長がＣ１６の脂肪族アシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解活性を有するＵｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ及びＣｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒａ由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードする、少なくとも２つの外来遺伝子を含む。ある場合には、細胞はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の細胞である。
【００１１】
第６の態様では、本発明は、少なくとも５５％又は少なくとも６５％、好ましくは少なくとも６０％の飽和脂肪酸という脂質プロフィールを有する油産生微生物細胞、好ましくは微細藻類細胞を提供する。ある場合には、細胞は、少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９０％、好ましくは少なくとも８６％の飽和脂肪酸という脂質プロフィールを有する。ある場合には、細胞は組み換え細胞である。ある実施形態では、組み換え細胞は、鎖長がＣ１０〜Ｃ１６の脂肪族アシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解活性を有するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードする外来遺伝子を含む。ある実施形態では、細胞は、ケトアシル合成酵素タンパク質をコードする外来遺伝子を含む。ある場合には、細胞はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の細胞である。
【００１２】
第７の態様では、本発明は、変異内在性デサチュラーゼ遺伝子を含む油産生微生物細胞、好ましくは微細藻類細胞を提供し、ここで、遺伝子又はデサチュラーゼは変異により不活性になっている。ある場合には、細胞は、少なくとも４０％又は少なくとも５０％、好ましくは少なくとも４５％の飽和脂肪酸という脂質プロフィールを有する。ある場合には、細胞は、少なくとも１５％、少なくとも２０％又は少なくとも２５％、好ましくは少なくとも１９％のＣ１８：０という脂質プロフィールを有する。ある実施形態では、細胞は、野性型細胞に比べてＣ１８：０脂肪酸を少なくとも２倍に増加させる変異内在性デサチュラーゼ遺伝子を含む。ある場合には、微細藻類細胞は、１％以下又は５％以下、好ましくは２％以下のＣ１８：２という脂質プロフィールを有する。ある実施形態では、微細藻類細胞は、５％以下又は１０％以下、好ましくは７％以下の１８：１という脂質プロフィールを有する。
【００１３】
本明細書で述べられている組み換え細胞のいくつかの実施形態では、細胞は、遺伝子又はデサチュラーゼが変異により不活性になっている、変異内在性デサチュラーゼ遺伝子を含んでなる。
【００１４】
第８の態様では、本発明は、脂質を製造する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、（ａ）細胞が、乾燥重量で少なくとも１５％又は少なくとも２５％、好ましくは少なくとも２０％の脂質になるまで上述の細胞を培養することと、（ｂ）水溶性のバイオマス成分から脂質を分離することとを含む。
【００１５】
第９の態様では、本発明は、脂質を製造する別の方法を提供する。一実施形態では、この方法は、（ａ）２つの異なるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子を含む油産生微生物細胞、好ましくは微細藻類細胞であって、脂質プロフィールが（ｉ）外来遺伝子を有さない細胞のプロフィール及び（ｉｉ）外来遺伝子を１つだけ有する細胞のプロフィールとは異なる細胞を培養することと、（ｂ）水溶性のバイオマス成分から脂質を分離することとを含む。ある場合には、外来遺伝子の少なくとも１つは、表４で同定されるチオエステラーゼからなる群から選択される脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする。
【００１６】
第１０の態様では、本発明は、油脂系製品を製造する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、（ａ）上述のように、細胞が乾燥重量で少なくとも５％又は少なくとも１５％、好ましくは少なくとも１０％の脂質になるまで細胞を培養することと、（ｂ）水溶性のバイオマス成分から脂質を分離することと、（ｃ）脂質を、鹸化；メタセシス；酸加水分解；アルカリ加水分解；酵素加水分解；触媒的加水分解；加圧熱水による加水分解；脂質がグリセロールと脂肪酸に分解される触媒的加水分解反応；脂肪族窒素化合物が生成されるアミノ化反応；一塩基性及び二塩基性酸が生成されるオゾン分解反応；酵素分解及び加圧分解からなる群から選択されるトリグリセリド分解反応；加水分解反応の後の縮合反応；水素化処理反応；水素化処理反応と脱酸素反応、又は水素化処理反応の前若しくは水素化処理反応と同時の縮合反応；ガス除去反応；水素化分解反応、水素化、水素化−水素化分解の連続反応、水素化分解−水素化の連続反応及び水素化−水素化分解反応の組み合わせからなる群から選択される脱酸素反応；脱酸素反応の後の縮合反応；エステル化反応；インターエステル化反応；トランスエステル化反応；ヒドロキシル化反応；及びヒドロキシル化反応の後の縮合反応からなる群から選択される少なくとも１つの化学反応に供することにより、油脂系製品を生成することとを含む。
【００１７】
ある場合には、油脂系製品は、石鹸又は燃料製品から選択される。ある実施形態では、油脂系製品は、バイオディーゼル、再生可能なディーゼル及びジェット燃料からなる群から選択される燃料製品である。ある場合には、燃料製品は、以下の特性を１つ又はそれ以上有するバイオディーゼルである：（ｉ）０．０１〜０．５ｍｃｇ／ｇ、０．０２５〜０．３ｍｃｇ／ｇ、好ましくは０．０５〜０．２４４ｍｃｇ／ｇの総カロチノイド；（ｉｉ）０．０１ｍｃｇ／ｇ未満、０．００５ｍｃｇ／ｇ未満、好ましくは０．００３ｍｃｇ／ｇ未満のリコピン；（ｉｉｉ）０．０１ｍｃｇ／ｇ未満、０．００５ｍｃｇ／ｇ未満、好ましくは０．００３ｍｃｇ／ｇ未満のβ−カロチン；（ｉｖ）０．０１〜０．５ｍｃｇ／ｇ、０．０２５〜０．３ｍｃｇ／ｇ、好ましくは０．０４５〜０．２６８ｍｃｇ／ｇのクロロフィルＡ；（ｖ）１〜５００ｍｃｇ／ｇ、３５〜１７５ｍｃｇ／ｇ、好ましくは３８．３〜１６４ｍｃｇ／ｇのγ−トコフェロール；（ｖｉ）１％未満、０．５％未満、好ましくは０．２５％未満のブラシカステロール、カンペステロール、スチグマステロール若しくはβ−シトステロール；（ｖｉｉ）１００〜５００ｍｃｇ／ｇ、２２５〜３５０ｍｃｇ／ｇ、好ましくは２４９．６〜３２５．３ｍｃｇ／ｇの総トコトリエノール；（ｖｉｉｉ）０．００１〜０．１ｍｃｇ／ｇ、０．００２５〜０．０５ｍｃｇ／ｇ、好ましくは０．００３〜０．０３９ｍｃｇ／ｇのルテイン；又は（ｉｘ）１０〜５００ｍｃｇ／ｇ、５０〜３００ｍｃｇ／ｇ、好ましくは６０．８〜２６１．７ｍｃｇ／ｇのトコフェロール。ある場合には、燃料製品は、少なくとも２０℃、４０℃又は６０℃のＴ１０−Ｔ９０を有する再生可能なディーゼルである。ある場合には、燃料製品は、ＨＲＪ−５及び／又はＡＳＴＭ規格Ｄ１６５５を満たすジェット燃料である。
【００１８】
第１１の態様では、本発明は、以下のものを含むトリグリセリド油を提供する：（ａ）少なくとも３％のＣ８：０、少なくとも４％のＣ１０：０、少なくとも１３％のＣ１２：０、少なくとも１０％のＣ１４：０及び／又は少なくとも６０％の飽和脂肪酸という脂質プロフィール、並びに（ｂ）以下の特性の１つ以上：（ｉ）０．０１〜０．５ｍｃｇ／ｇ、０．０２５〜０．３ｍｃｇ／ｇ、好ましくは０．０５〜０．２４４ｍｃｇ／ｇの総カロチノイド；（ｉｉ）０．０１ｍｃｇ／ｇ未満、０．００５ｍｃｇ／ｇ未満、好ましくは０．００３ｍｃｇ／ｇ未満のリコピン；（ｉｉｉ）０．０１ｍｃｇ／ｇ未満、０．００５ｍｃｇ／ｇ未満、好ましくは０．００３ｍｃｇ／ｇ未満のβ−カロチン；（ｉｖ）０．０１〜０．５ｍｃｇ／ｇ、０．０２５〜０．３ｍｃｇ／ｇ、好ましくは０．０４５〜０．２６８ｍｃｇ／ｇのクロロフィルＡ；（ｖ）１〜３００ｍｃｇ／ｇ、３５〜１７５ｍｃｇ／ｇ、好ましくは３８．３〜１６４ｍｃｇ／ｇのγ−トコフェロール；（ｖｉ）１％未満、０．５％未満、好ましくは０．２５％未満のブラシカステロール、カンペステロール、スチグマステロール若しくはβ−シトステロール；（ｖｉｉ）１００〜５００ｍｃｇ／ｇ、２２５〜３５０ｍｃｇ／ｇ、好ましくは２４９．６〜３２５．３ｍｃｇ／ｇの総トコトリエノール；（ｖｉｉｉ）０．００１〜０．１ｍｃｇ／ｇ、０．００２５〜０．０５ｍｃｇ／ｇ、好ましくは０．００３〜０．０３９ｍｃｇ／ｇのルテイン；又は（ｉｘ）１０〜５００ｍｃｇ／ｇ、５０〜３００ｍｃｇ／ｇ、好ましくは６０．８〜２６１．７ｍｃｇ／ｇのトコフェロール。
【００１９】
第１２の態様では、本発明は、微細藻類から単離された油で、Ｃ８：Ｃ１０脂肪酸比が少なくとも５：１である油を提供する。関連する態様では、本発明は、微細藻類から単離された油で、飽和脂肪酸が少なくとも５０％〜７５％、好ましくは少なくとも６０％の油を提供する。別の関連する態様では、本発明は、微細藻類から単離された油で、Ｃ１６：１４脂肪酸比が約２：１の油を提供する。さらに別の関連する態様では、本発明は、微細藻類から単離された油で、Ｃ１２：Ｃ１４脂肪酸比が少なくとも５：１である油を提供する。ある実施形態では、微細藻類は少なくとも１つの外来遺伝子を含む。ある場合には、微細藻類はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属である。
【００２０】
第１３の態様では、本発明は、以下のものを含むトリグリセリド油を提供する：（ａ）５％未満又は２％未満、好ましくは１％未満の＜Ｃ１２；１％〜１０％の間、好ましくは２％〜７％の間のＣ１４：０；２０％〜３５％の間、好ましくは２３％〜３０％の間のＣ１６：０；５％〜２０％の間、好ましくは７％〜１５％の間のＣ１８：０；３５〜６０％の間、好ましくは４０〜５５％の間のＣ１８：１；及び１％〜２０％の間、好ましくは２〜１５％の間のＣ１８：２脂肪酸という脂質プロフィール；並びに（ｂ）以下の特性の１つ又はそれ以上：（ｉ）０．０１〜０．５ｍｃｇ／ｇ、０．０２５〜０．３ｍｃｇ／ｇ、好ましくは０．０５〜０．２４４ｍｃｇ／ｇの総カロチノイド；（ｉｉ）０．０１ｍｃｇ／ｇ未満、０．００５ｍｃｇ／ｇ未満、好ましくは０．００３ｍｃｇ／ｇ未満のリコピン；（ｉｉｉ）０．０１ｍｃｇ／ｇ未満、０．００５ｍｃｇ／ｇ未満、好ましくは０．００３ｍｃｇ／ｇ未満のβ−カロチン；（ｉｖ）０．０１〜０．５ｍｃｇ／ｇ、０．０２５〜０．３ｍｃｇ／ｇ、好ましくは０．０４５〜０．２６８ｍｃｇ／ｇのクロロフィルＡ；（ｖ）１〜３００ｍｃｇ／ｇ、３５〜１７５ｍｃｇ／ｇ、好ましくは３８．３〜１６４ｍｃｇ／ｇのγ−トコフェロール；（ｖｉ）１％未満、０．５％未満、好ましくは０．２５％未満のブラシカステロール、カンペステロール、スチグマステロール若しくはβ−シトステロール；（ｖｉｉ）１００〜５００ｍｃｇ／ｇ、２２５〜３５０ｍｃｇ／ｇ、好ましくは２４９．６〜３２５．３ｍｃｇ／ｇの総トコトリエノール；（ｖｉｉｉ）０．００１〜０．１ｍｃｇ／ｇ、０．００２５〜０．０５ｍｃｇ／ｇ、好ましくは０．００３〜０．０３９ｍｃｇ／ｇのルテイン；又は（ｉｘ）１０〜５００ｍｃｇ／ｇ、５０〜３００ｍｃｇ／ｇ、好ましくは６０．８〜２６１．７ｍｃｇ／ｇのトコフェロール。
【００２１】
ある場合には、トリグリセリド油は、１つ又はそれ以上の外来遺伝子を含んでなる微生物から単離される。ある実施形態では、１つ又はそれ以上の外来遺伝子は脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする。ある場合には、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、鎖長がＣ１４の脂肪族アシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解活性を有する。ある実施形態では、微生物は、遺伝子又はデサチュラーゼが変異により不活性になっている、変異内在性デサチュラーゼ遺伝子をさらに含む。
【００２２】
第１４の態様では、本発明は、５％未満又は２％未満、好ましくは１％未満の＜Ｃ１２；１％〜１０％の間、好ましくは２％〜７％の間のＣ１４：０；２０％〜３５％の間、好ましくは２３％〜３０％の間のＣ１６：０；５％〜２０％の間、好ましくは７％〜１５％の間のＣ１８：０；３５％〜６０％の間、好ましくは４０〜５５％の間のＣ１８：１；及び１％〜２０％の間、好ましくは２〜１５％の間のＣ１８：２脂肪酸という脂質プロフィールを含むトリグリセリド油を生成する方法を提供し、ここで、トリグリセリド油は、１つ又はそれ以上の外来遺伝子を含む微生物から単離される。ある場合には、トリグリセリド油は、１％〜１０％、好ましくは３〜５％のＣ１４：０；２０％〜３０％、好ましくは２５〜２７％のＣ１６：０；５％〜２０％、好ましくは１０〜１５％のＣ１８：０；及び３５％〜５０％、好ましくは４０〜４５％のＣ１８：１という脂質プロフィールを含む。ある実施形態では、１つ又はそれ以上の外来遺伝子は脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする。ある場合には、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、鎖長がＣ１４の脂肪族アシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解活性を有する。ある場合には、微生物は、遺伝子又はデサチュラーゼが変異により不活性になっている、変異内在性デサチュラーゼ遺伝子をさらに含む。ある場合には、１つ又はそれ以上の外来遺伝子はショ糖インベルターゼである。ある実施形態では、変異内在性デサチュラーゼ遺伝子はステアロイル−アシルキャリアータンパク質デサチュラーゼ（ＳＡＤ）である（例えば、配列番号：１９９〜２００）。ある実施形態では、変異内在性デサチュラーゼ遺伝子は脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ）である。
【００２３】
第１５の態様では、本発明は、トリグリセリド油を含む油産生微生物細胞、好ましくは微細藻類細胞を提供し、ここで、トリグリセリド油の脂肪酸プロフィールは、少なくとも約１％のＣ８：０、少なくとも約１％のＣ１０：０、少なくとも約１％のＣ１２：０、少なくとも約２％のＣ１４：０、少なくとも約３０％のＣ１６：０、少なくとも約５％のＣ１８：０、少なくとも約６０％のＣ１８：１、約７％未満のＣ１８：２及び少なくとも約３５％の飽和脂肪酸からなる群から選択される。ある場合には、油産生微生物細胞は外来遺伝子を含んでなり、場合により、油産生微生物細胞の内在性デサチュラーゼが不活性化されるか又は変異して酵素活性が低下している。
【００２４】
ある場合には、トリグリセリド油の脂肪酸プロフィールは、天然に存在する油の脂肪酸プロフィールと類似している。ある場合には、天然に存在する油は、カカオバター、ココナツ油、パーム油、パーム核油、シアバター、牛脂及びラードからなる群から選択される。ある場合には、トリグリセリド油の脂肪酸プロフィールは、Ｃ８：０とＣ１０：０の総合計量が少なくとも約１０％である、Ｃ１０：０とＣ１２：０とＣ１４：０の総合計量が少なくとも約５０％である、Ｃ１６：０とＣ１８：０とＣ１８：１の総合計量が少なくとも約６０％である、Ｃ１８：０とＣ１８：１とＣ１８：２の総合計量が少なくとも約６０％である、Ｃ１４：０とＣ１６：０とＣ１８：０とＣ１８：１の総合計量が少なくとも約６０％である、及びＣ１８：１とＣ１８：２の総合計量が約３０％未満であることからなる群から選択されるプロフィールを含む。ある場合には、トリグリセリド油の脂肪酸プロフィールは、少なくとも約５〜１であるＣ８：０とＣ１０：０の比、少なくとも約６〜１であるＣ１０：０とＣ１２：０の比、少なくとも約５〜１であるＣ１２：０とＣ１４：０の比、少なくとも約７：１であるＣ１４：０とＣ１２：０の比、及び少なくとも約１〜２であるＣ１４：０とＣ１６：０の比からなる群から選択される脂肪酸比を含む。
【００２５】
ある場合には、内在性デサチュラーゼは、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ及びデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼからなる群から選択される。ある場合には、外来遺伝子は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される。ある場合には、外来遺伝子は、表４で同定されるものからなる群から選択されるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする。ある場合には、油産生微生物細胞は、ショ糖インベルターゼをコードする遺伝子をさらに含む。
【００２６】
様々な実施形態では、油産生微生物細胞は、Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ａｇｍｅｎｅｌｌｕｍ、Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ  ｈｙａｌｉｎｅ、Ａｍｐｈｏｒａ  ｃｏｆｆｅｉｆｏｒｍｉｓ、Ａｍｐｈｏｒａ  ｃｏｆｆｅｉｆｏｒｍｉｓ  ｌｉｎｅａ、Ａｍｐｈｏｒａ  ｃｏｆｆｅｉｆｏｒｍｉｓ  ｐｕｎｃｔａｔａ、Ａｍｐｈｏｒａ  ｃｏｆｆｅｉｆｏｒｍｉｓ  ｔａｙｌｏｒｉ、Ａｍｐｈｏｒａ  ｃｏｆｆｅｉｆｏｒｍｉｓ  ｔｅｎｕｉｓ、Ａｍｐｈｏｒａ  ｄｅｌｉｃａｔｉｓｓｉｍａ、Ａｍｐｈｏｒａ  ｄｅｌｉｃａｔｉｓｓｉｍａ  ｃａｐｉｔａｔａ、Ａｍｐｈｏｒａ  ｓｐ．、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ、Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ  ｆａｌｃａｔｕｓ、Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａ  ｈｏｏｇｌａｎｄｉｉ、Ｂｏｒｏｄｉｎｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ、Ｃａｒｔｅｒｉａ、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ  ｓｕｂｓａｌｓｕｍ、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ａｎｉｔｒａｔａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ａｕｒｅｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｃａｐｓｕｌａｔｅ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｄｅｓｉｃｃａｔｅ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｆｕｓｃａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｆｕｓｃａ  ｖａｒ．ｖａｃｕｏｌａｔａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｇｌｕｃｏｔｒｏｐｈａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｉｎｆｕｓｉｏｎｕｍ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｉｎｆｕｓｉｏｎｕｍ  ｖａｒ．ａｃｔｏｐｈｉｌａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｉｎｆｕｓｉｏｎｕｍ  ｖａｒ．ａｕｘｅｎｏｐｈｉｌａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｏｂｏｐｈｏｒａ（ＳＡＧ  ３７．８８株）、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ  ｖａｒ．ａｕｒｅｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ  ｖａｒ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｉｎｉａｔａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｕｔａｂｉｌｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｎｏｃｔｕｒｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐａｒｖａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｈｏｔｏｐｈｉｌａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍｉｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ（ＵＴＥＸ株１８０６、４１１、２６４、２５６、２５５、２５０、２４９、３１、２９、２５並びにＣＣＡＰ株２１１／１７及び２１１／８ｄのいずれも含む）、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ  ｖａｒ．ａｃｉｄｉｃｏｌａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｒｅｇｕｌａｒｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｒｅｇｕｌａｒｉｓ  ｖａｒ．ｍｉｎｉｍａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｒｅｇｕｌａｒｉｓ  ｖａｒ．ｕｍｂｒｉｃａｔａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｒｅｉｓｉｇｌｉｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｈｌｏｒｅｌ���ａ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ  ｖａｒ．ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｉｍｐｌｅｘ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐｈａｅｒｉｃａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｏｒａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖａｎｎｉｅｌｌｉｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｆ．ｔｅｒｔｉａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｖａｒ．ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｖａｒ．ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｖａｒ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｖａｒ．ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｆ．ｔｅｒｔｉａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｖａｒ．ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｆ．ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｘａｎｔｈｅｌｌａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｉｄｅｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｉｎｆｕｓｉｏｎｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ、Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｐ．、Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｐ．、Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｍｅｎｅｇｈｉｎｉａｎａ、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｂａｒｄａｗｉｌ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｂｉｏｃｕｌａｔａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｇｒａｎｕｌａｔｅ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｍａｒｉｔｉｍｅ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｐａｒｖａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｐｅｉｒｃｅｉ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｐｒｉｍｏｌｅｃｔａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｒｉｃｏｌａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ、Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ  ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｐ．、Ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｏｎ  ｓｐ．、Ｅｕｇｌｅｎａ、Ｆｒａｎｃｅｉａ  ｓｐ．、Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ  ｃｒｏｔｏｎｅｎｓｉｓ、Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ  ｓｐ．、Ｇｌｅｏｃａｐｓａ  ｓｐ．、Ｇｌｏｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ  ｓｐ．、Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ａｆｆ．ｇａｌｂａｎａ、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ、Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ、Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ、Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ（ＵＴＥＸ  ＬＢ  ２６１４）、Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ、Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ  ｓｐ．、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｓｐ．、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓａｌｉｎａ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ａｃｃｅｐｔａｔａ、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｂｉｓｋａｎｔｅｒａｅ、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｐｓｅｕｄｏｔｅｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓｐ．、Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｓｐ．、Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ  ｓｐ．、Ｎｉｔｓｃｈｉａ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ａｌｅｘａｎｄｒｉｎａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｄｉｓｓｉｐａｔａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｆｒｕｓｔｕｌｕｍ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｈａｎｔｚｓｃｈｉａｎａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｉｎｃｏｎｓｐｉｃｕａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｍｉｃｒｏｃｅｐｈａｌａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｐｕｓｉｌｌａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｐｕｓｉｌｌａ  ｅｌｌｉｐｔｉｃａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｐｕｓｉｌｌａ  ｍｏｎｏｅｎｓｉｓ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｑｕａｄｒａｎｇｕｌａｒ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｏｏｃｙｓｔｉｓ  ｐａｒｖａ、Ｏｏｃｙｓｔｉｓ  ｐｕｓｉｌｌａ、Ｏｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｌｉｍｎｅｔｉｃａ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ．、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｕｂｂｒｅｖｉｓ、Ｐａｓｃｈｅｒｉａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌａ、Ｐａｖｌｏｖａ  ｓｐ．、Ｐｈａｇｕｓ、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ、Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｃａｒｔｅｒａｅ、Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｄｅｎｔａｔｅ、Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｓｐ．、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｐｏｒｔｏｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ、Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ、Ｓａｒｃｉｎｏｉｄ  ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔｅ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ａｒｍａｔｕｓ、Ｓｐｉｒｏｇｙｒａ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｔｅｔｒａｅｄｒｏｎ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｐ．、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａ、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｗｅｉｓｓｆｌｏｇｉｉ並びにＶｉｒｉｄｉｅｌｌａ  ｆｒｉｄｅｒｉｃｉａｎａから選択される微生物属又は種の細胞である。
【００２７】
ある場合には、油産生微生物細胞はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の細胞である。ある場合には、油産生微生物細胞はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ属の細胞である。
【００２８】
ある場合には、油産生微生物細胞は油産生酵母細胞である。ある場合には、油産生微生物細胞は油産生細菌細胞である。
【００２９】
ある場合には、天然に存在する油はカカオバターであり、外来遺伝子はＣａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｕｓチオエステラーゼ遺伝子を含む。ある場合には、天然に存在する油はココナツ油である。ある場合には、天然に存在する油はパーム油であり、外来遺伝子はＥｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｉｅｎｓｉｓチオエステラーゼ遺伝子、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａチオエステラーゼ遺伝子、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ  ＫＡＳ  ＩＶ遺伝子とＣｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ  ＦＡＴＢ２遺伝子との組み合わせ、又は内在するＫＡＳ  ＩＩ遺伝子を破壊するように設計された構築物を含む。ある場合には、天然に存在する油はパーム核油であり、外来遺伝子は、Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ  ＦＡＴＢ２遺伝子と、内在するＳＡＤ２Ｂ遺伝子を破壊するように設計された構築物との組み合わせを含む。ある場合には、天然に存在する油はシアバターである。ある場合には、天然に存在する油は牛脂である。ある場合には、天然に存在する油はラードであり、外来遺伝子は、Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａチオエステラーゼ遺伝子と、内在するＳＡＤ２Ｂ遺伝子を破壊するよう設計された構築物との組み合わせ、Ｇａｒｃｉｎｉａ  ｍａｎｇｏｓｔａｎａチオエステラーゼ遺伝子と、内在するＳＡＤ２Ｂ遺伝子を破壊するように設計された構築物との組み合わせ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓチオエステラーゼ遺伝子、又はＣｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａチオエステラーゼ遺伝子を含む。
【００３０】
第１６の態様では、本発明は、油産生微生物トリグリセリド油組成物を提供し、ここで、トリグリセリド油の脂肪酸プロフィールは、少なくとも約１％のＣ８：０、少なくとも約１％のＣ１０：０、少なくとも約１％のＣ１２：０、少なくとも約２％のＣ１４：０、少なくとも約３０％のＣ１６：０、少なくとも約５％のＣ１８：０、少なくとも約６０％のＣ１８：１、約７％未満のＣ１８：２及び少なくとも約３５％の飽和脂肪酸からなる群から選択される。様々な実施形態では、トリグリセリド油組成物は、培地中で油産生微生物細胞又は組み換え油産生微生物細胞の集団を培養することにより生成され、ここで、油産生微生物細胞は、上記の通りであり、特に本発明の第十五の態様に関連して先に記載されたものである。
【００３１】
ある場合には、油産生微生物トリグリセリド油組成物は、（ｉ）０．３ｍｃｇ／ｇ未満の総カロチノイド；（ｉｉ）０．００５ｍｃｇ／ｇ未満のリコピン；（ｉｉｉ）０．００５ｍｃｇ／ｇ未満のβ−カロチン；（ｉｖ）０．３ｍｃｇ／ｇ未満のクロロフィルＡ；（ｖ）１７５ｍｃｇ／ｇ未満のγ−トコフェロール；（ｖｉ）０．２５％未満のブラシカステロール、カンペステロール、スチグマステロール若しくはβ−シトステロール；（ｖｉｉ）３５０ｍｃｇ／ｇ未満の総トコトリエノール；（ｖｉｉｉ）０．０５ｍｃｇ／ｇ未満のルテイン；又は（ｉｘ）２７５ｍｃｇ／ｇ未満のトコフェロールからなる群から選択される特性をさらに含む。
【００３２】
第１７の態様では、本発明は、少なくとも約１％のＣ８：０、少なくとも約１％のＣ１０：０、少なくとも約１％のＣ１２：０、少なくとも約２％のＣ１４：０、少なくとも約３０％のＣ１６：０、少なくとも約５％のＣ１８：０、少なくとも約６０％のＣ１８：１、約７％未満のＣ１８：２及び少なくとも約３５％の飽和脂肪酸からなる群から選択される脂肪酸プロフィールを有する、油産生微生物トリグリセリド油組成物を生成する方法を提供し、この方法は、（ａ）油産生微生物細胞の細胞乾燥重量の少なくとも１０％がトリグリセリド油になるまで油産生微生物細胞の集団を培地中で培養する工程と、（ｂ）油産生微生物細胞からトリグリセリド油組成物を単離する工程とを含む。様々な実施形態では、トリグリセリド油組成物は、上記の油産生微生物細胞又は組み換え油産生微生物細胞、特に本発明の第十五の態様に関連して先に記載されたものの集団を培養することにより生成される。
【００３３】
第１８の態様では、本発明は、油脂系製品を製造する方法を提供し、この方法は、（ａ）本発明の第十六の態様に関連して先に記載された、油産生微生物トリグリセリド油組成物に、鹸化；メタセシス；酸加水分解；アルカリ加水分解；酵素加水分解；触媒的加水分解；加圧熱水による加水分解；脂質がグリセロールと脂肪酸に分解される触媒的加水分解反応；脂肪族窒素化合物が生成されるアミノ化反応；一塩基性及び二塩基性酸が生成されるオゾン分解反応；酵素分解及び加圧分解からなる群から選択されるトリグリセリド分解反応；加水分解反応の後の縮合反応；水素化処理反応；水素化処理反応と脱酸素反応、又は水素化処理反応の前若しくは水素化処理反応と同時の縮合反応；ガス除去反応；水素化分解反応、水素化、水素化−水素化分解の連続反応、水素化分解−水素化の連続反応及び水素化−水素化分解反応の組み合わせからなる群から選択される脱酸素反応；脱酸素反応の後の縮合反応；エステル化反応；インターエステル化反応；トランスエステル化反応；ヒドロキシル化反応；及びヒドロキシル化反応の後の縮合反応からなる群から選択される少なくとも１つの化学反応を受けさせる工程と、（ｂ）反応生成物を他の成分から分離する工程とを含む。
【００３４】
ある場合には、油脂系製品は、石鹸、燃料、誘電性流体、油圧油、可塑剤、滑沢剤、熱媒体流体及び金属加工油剤からなる群から選択される。ある場合には、油脂系製品は、（ａ）バイオディーゼル；（ｂ）再生可能なディーゼル；及び（ｃ）ジェット燃料からなる群から選択される燃料製品である。
【００３５】
ある場合には、燃料製品は、以下の特性を１つ又はそれ以上有するバイオディーゼルである：（ｉ）０．３ｍｃｇ／ｇ未満の総カロチノイド；（ｉｉ）０．００５ｍｃｇ／ｇ未満のリコピン；（ｉｉｉ）０．００５ｍｃｇ／ｇ未満のβ−カロチン；（ｉｖ）０．３ｍｃｇ／ｇ未満のクロロフィルＡ；（ｖ）１７５ｍｃｇ／ｇ未満のγ−トコフェロール；（ｖｉ）０．２５％未満のブラシカステロール、カンペステロール、スチグマステロール若しくはβ−シトステロール；（ｖｉｉ）３５０ｍｃｇ／ｇ未満の総トコトリエノール；（ｖｉｉｉ）０．０５ｍｃｇ／ｇ未満のルテイン；又は（ｉｘ）２７５ｍｃｇ／ｇ未満のトコフェロール。
【００３６】
ある場合には、燃料製品は、少なくとも２０℃、４０℃又は６０℃のＴ１０−Ｔ９０を有する再生可能なディーゼルである。
【００３７】
ある場合には、燃料製品は、ＨＲＪ−５及び／又はＡＳＴＭ規格Ｄ１６５５を満たすジェット燃料である。
【００３８】
別の態様では、本発明の油産生微生物細胞は食用である。また本発明のトリグリセリド油も食用である。ある場合には、適正製造基準（ＧＭＰ）の条件下で微生物株を育て、加工する。油産生微生物細胞を食品又は食品成分として丸ごと摂取することができる。あるいは、微生物バイオマスを微生物のフレーク、粉末又は粒粉に加工する。細胞を完全に又は部分的に粉末の形態に溶解させることにより、微生物粒粉を調製する。微生物粒粉に加工する場合、溶解した微生物バイオマスの平均粒径は約１〜３０μｍの間である。溶解した微生物細胞を塊にして、より大きな１，０００μｍ以下の粒子を形成することができる。一実施形態では、粒粉は、フロー剤、抗酸化剤などをさらに含む。本発明の微生物細胞及び微生物油を単独で摂取することができる。あるいは、本発明の微生物細胞及び微生物油を、少なくとも１つの他の成分と組み合わせることができる。例として、微生物細胞及び微生物油を食用成分、例えば、卵、卵製品、乳、乳製品、肉、穀物、他の食用脂、天然甘味料、人工甘味料などと組み合わせることができる。また、微生物細胞及び微生物油を、加工食品に添加される保存剤及びその他の成分と組み合わせることもできる。
【００３９】
本明細書に記載のすべての工程を、ＧＭＰ又は同等の規制に従って行うことができる。米国では、ヒト用食品を製造、包装又は保持するためのＧＭＰ規制が、米国連邦規則集第２１編第１１０部に成文化されている。これらの条項及びそこで参照されている補助的な条項は、あらゆる目的のために、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。米国のＧＭＰ条件及び他の管轄区域の同等の条件は、食品が粗悪品である（その食品が食品に適さない条件下で製造された）か否か、あるいは汚染されている可能性がある又は健康を損なう可能性がある不衛生な条件下で調製、包装又は保持されたか否かを判定する際に適用される。ＧＭＰ条件は、疾病管理；人員の清潔度及び訓練；建物・設備の維持及び衛生管理；適切な衛生設備・施設の設置；装置・器具の設計、構築、維持及び清潔度；任意の源からの汚染を予防するため適切な衛生原則に則り、食品の受取り、検査、輸送、分別、調理、製造、包装及び保管においてあらゆる適切な事前措置を執るための適切な品質管理方法の提供；並びに、物理的汚染、化学的汚染又は望ましくない微生物による汚染、並びに食品及び容器の劣化から食品を保護する条件下での最終食品の保管・輸送を統制する規制の遵守を含み得る。
【００４０】
ある実施形態では、油産生微生物細胞は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ属又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の種の藻類細胞である。一実施形態では、藻類はＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓである。別の実施形態では、藻類はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓである。ある場合には、バイオマスは、元の株に比べて着色が少ない着色変異体である藻類に由来する。着色の少ない変異体は典型的には、標準的な変異誘発法を用いて調製される。着色が少ない変異体を生成する個別支払い方式の研究所が多数存在する。ある実施形態では、微生物を従属栄養的に、場合により光なしで培養することにより、微生物バイオマスを調製する。
【００４１】
一実施形態では、微細藻類株は、２００９年１０月１３日、アメリカ培養細胞系統保存機関(Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ)に寄託名ＰＴＡ−１０３９７で寄託されたＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ３３〜５５である。一実施形態では、微細藻類株は、２００９年１０月１３日、アメリカ培養細胞系統保存機関に寄託名ＰＴＡ−１０３９６で寄託されたＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ２５〜３２である。ある場合には、バイオマスを提供する微細藻類株は、適正製造基準（ＧＭＰ）の条件下で育てられ、加工されたものである。
【００４２】
別の態様では、本発明は、食品として使用するのに適した組み換え油産生微生物バイオマスを調製する方法を提供する。これらの方法では、組み換え油産生微生物を従属栄養条件下で発酵させるため、他の組み換え藻類由来の食品の特徴である緑色色素を欠くか、又はその量が著しく減少している。一実施形態では、組み換え油産生微生物は、任意の色素を欠くか、又は色素の量が著しく減少している。本発明の一態様は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ属及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ属の組み換え微細藻類を提供する。ある実施形態では、本発明は、組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ属の微細藻類である。別の実施形態は、食品及び食品成分中で使用するための組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓを提供する。一実施形態では、脂質に富むバイオマスを得るよう発酵条件を操作する。別の実施形態では、タンパク質に富むバイオマスを提供するよう発酵条件を操作する。すべての実施形態において、これらの方法は、安価かつ効率的に、大規模に（４５００Ｌ以上の発酵槽で生産されるバイオマス）実施することが可能である。
【００４３】
別の態様では、本発明は、ヒト用食品に組み込むのに適した組み換え油産生微生物バイオマス、好ましくは微細藻類バイオマスを提供する。一実施形態では、この組み換え微生物バイオマスは、本発明のバイオマス調製方法から直接得られる濃縮バイオマスである。別の実施形態では、このバイオマスは、かかるバイオマス調製物を乾燥させて、例えばドラム乾燥させて得られる乾燥フレークの形態である。この後者の実施形態では、乾燥工程前に抗酸化剤をバイオマスに添加して、バイオマス及びかかるバイオマスを含有する食品の有効期間を延長させることができる。
【００４４】
本発明のさらに別の態様は、バイオマスをさらにフレーク又はホモジネートに加工する方法を提供する。一実施形態では、乾燥フレークを脱イオン水で戻して懸濁物を作製する。次いでこの懸濁物を、平均粒径が２０μｍ未満、好ましくは１０μｍの大きさになるように高圧ホモジナイザーで微粒子化して、ホモジネートを作製する。
【００４５】
本発明のさらなる態様は、組み換え油産生微生物バイオマス、好ましくは微細藻類バイオマスを、健康に良い油を食品に加え、また焼成製品のような食品に構造上の利点をもたらすという点で多機能性である食品成分に加工する方法を提供する。一実施形態では、この工程は、バイオマス調製物を空気乾燥（例えば、噴霧乾燥又は気流乾燥）させて、インタクトな組み換え細胞を大きな割合で含有する粉末を形成することを含む。別の実施形態では、最初にバイオマスを微粒子化して細胞を破壊してから空気乾燥を行って、インタクトな細胞を少しの割合だけ含有する（又はまったく含有しない）粒粉を形成し、ある実施形態では、乾燥工程の前にフロー剤又は分散剤を加える。
【００４６】
さらに別の態様では、本発明は、ヒトが摂取するのに適した油又は油含有組み換え油産生微生物バイオマスを生成する方法に関する。ある実施形態では、本プロセスは、バイオマスから脂質（トリグリセリド）を抽出して油を形成することを含む。一実施形態では、本方法は、微生物を提供し、該微生物をヒトが摂取するのに適した食品組成物に由来しない原材料の存在下で培養することとを含み、前記微生物は原材料の少なくとも一部をトリグリセリド油に変換する。ある場合には、トリグリセリド油は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％のＣ１８：１脂質を含む。
【００４７】
本発明はさらに、組み換え微生物粉末、組み換え微生物粒粉及び／又は組み換え微生物油を組み込んだ食品を提供する。一実施形態では、食品は、焼成製品、ドレッシング、ソース又はマヨネーズであり、これらの食品では、従来の調理法を用いて製造された同じ食品に対し、卵又はバターの全部又は一部が油分の豊富な組み換え微生物粒粉に置き換わっている。別の実施形態では、食品は、油分の豊富な組み換え微生物粒粉を含有する粉末卵製品である。別の実施形態では、食品は、油分の豊富な微生物粒粉を含有する液卵製品である。別の実施形態では、食品は、微生物のタンパク質、繊維及び油を含有する液乳製品である。別の実施形態では、食品は、これまでに入手可能であった肉製品に対し、肉の一部又は全部（肉代用品）が、タンパク質の豊富な組み換え微生物粒粉、組み換え微生物粉末又は組み換え微生物フレークに置き換わっている肉製品である。
【００４８】
また本発明は、微生物繊維、並びに、場合により微生物タンパク質及び／又は微生物油を含有する組み換え微生物食品又は微生物食品成分を提供することにより、満腹感を誘発する方法も提供する。
本発明の好ましい実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
少なくとも０．１％ｗ／ｗの組み換え藻類バイオマスと、１つ又はそれ以上の他の成分とを含み、前記組み換え藻類バイオマスが、少なくとも約１０重量％のトリグリセリド油を含み、従属栄養条件で培養される、食品組成物。
（項目２）
前記トリグリセリド油が、少なくとも約１％のＣ８：０、少なくとも約１％のＣ１０：０、少なくとも約１％のＣ１２：０、少なくとも約２％のＣ１４：０、少なくとも約３０％のＣ１６：０、少なくとも約５％のＣ１８：０、少なくとも約６０％のＣ１８：１、約７％未満のＣ１８：２及び少なくとも約３５％の飽和脂肪酸からなる群から選択される脂肪酸プロフィールを含む、項目１に記載の食品組成物。
（項目３）
藻類トリグリセリド油の脂肪酸プロフィールが、天然に存在する油の脂肪酸プロフィールに類似している、項目１に記載の食品組成物。
（項目４）
前記の天然に存在する油が、カカオバター、ココナツ油、パーム油、牛脂及びラードからなる群から選択される、項目３に記載の食品組成物。
（項目５）
前記藻類トリグリセリド油の脂肪酸プロフィールが、少なくとも６０％のＣ１８：１である、項目１に記載の食品組成物。
（項目６）
前記藻類トリグリセリド油の脂肪酸プロフィールが、少なくとも８０％のＣ１８：１である、項目５に記載の食品組成物。
（項目７）
前記組み換え藻類バイオマスの大部分がインタクトな細胞である、項目１に記載の食品組成物。
（項目８）
前記組み換え藻類バイオマスの大部分が溶解した細胞である、項目１に記載の食品組成物。
（項目９）
前記組み換え藻類バイオマスがホモジネートである、項目８に記載の食品組成物。
（項目１０）
前記組み換え藻類バイオマスが粉末である、項目８に記載の食品組成物。
（項目１１）
前記組み換え藻類バイオマスが粉末の形態であり、かつ前記組み換え藻類バイオマスが乾燥重量で少なくとも約４０％のトリグリセリド油をんでなるむ、項目８に記載の食品組成物。
（項目１２）
サラダドレッシング、卵製品、焼成製品、パン、バー、スナックチップ、パスタ、ソース、スープ、飲料、冷菓、バター又はスプレッドである、項目１に記載の食品組成物。
（項目１３）
前記粉末の平均粒径が約０．２〜約２０ミクロンである、項目１０に記載の食品組成物。
（項目１４）
前記組み換え藻類バイオマスが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ属又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の種である、項目１に記載の食品組成物。
（項目１５）
前記組み換え藻類バイオマスが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓからなる群から選択される、項目１４に記載の食品組成物。
（項目１６）
従属栄養的に栽培された、少なくとも１０重量％のトリグリセリド油を含む組み換え藻類バイオマスと、少なくとも１つの他の成分とを組み合わせることを含んでなる、食品組成物の製造方法。
（項目１７）
前記トリグリセリド油が、少なくとも約１％のＣ８：０、少なくとも約１％のＣ１０：０、少なくとも約１％のＣ１２：０、少なくとも約２％のＣ１４：０、少なくとも約３０％のＣ１６：０、少なくとも約５％のＣ１８：０、少なくとも約６０％のＣ１８：１、約７％未満のＣ１８：２及び少なくとも約３５％の飽和脂肪酸からなる群から選択される脂肪酸プロフィールを含んでなる、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
ａ．従来の食品中の非藻類油、非藻類脂肪又は卵の量を決定する工程；及び、
ｂ．前記非藻類油、非藻類脂肪又は卵の一部を、特定量の組み換え藻類バイオマスに置き換えるか、又は前記非藻類油、非藻類脂肪又は卵に特定量の組み換え藻類バイオマスを補う工程
とを含む、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記食品組成物に非藻類油、非藻類脂肪又は卵を加えない、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
組み換え藻類バイオマスの量が、前記の従来食品中の非藻類油、非藻類脂肪又は卵の質量又は容積の約０．２５倍〜約４倍である、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記組み換え藻類バイオマスの大部分が溶解しており、かつ粉末又はホモジネートの形態である、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記組み換え藻類バイオマスが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ属又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の種である、項目１６に記載の方法。
（項目２３）
前記組み換え藻類バイオマスが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓからなる群から選択される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
少なくとも約０．１％ｗ／ｗの組み換え藻類バイオマスと、１つ又はそれ以上の他の成分とを含み、前記組み換え藻類バイオマスが、色変異株であり、かつ乾燥重量で少なくとも約１０％のトリグリセリド油を含む、食品組成物。
（項目２５）
前記トリグリセリド油が、少なくとも約１％のＣ８：０、少なくとも約１％のＣ１０：０、少なくとも約１％のＣ１２：０、少なくとも約２％のＣ１４：０、少なくとも約３０％のＣ１６：０、少なくとも約５％のＣ１８：０、少なくとも約６０％のＣ１８：１、約７％未満のＣ１８：２及び少なくとも約３５％の飽和脂肪酸からなる群から選択される脂肪酸プロフィールを含む、項目２４に記載の食品組成物。
（項目２６）
前記組み換え藻類バイオマスが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ属又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の種である、項目２４に記載の食品組成物。
（項目２７）
前記組み換え藻類バイオマスが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓからなる群から選択される、項目２６に記載の食品組成物。
（項目２８）
前記組み換え藻類バイオマスがＧＭＰ条件下で培養される、項目２４に記載の食品組成物。
（項目２９）
少なくとも０．１％ｗ／ｗの藻類トリグリセリド油と、１つ又はそれ以上の他の成分とを含み、前記藻類トリグリセリド油が、従属栄養条件下で培養された組み換え藻類バイオマスから単離される、食品組成物。
（項目３０）
前記トリグリセリド油が、少なくとも約１％のＣ８：０、少なくとも約１％のＣ１０：０、少なくとも約１％のＣ１２：０、少なくとも約２％のＣ１４：０、少なくとも約３０％のＣ１６：０、少なくとも約５％のＣ１８：０、少なくとも約６０％のＣ１８：１、約７％未満のＣ１８：２及び少なくとも約３５％の飽和脂肪酸からなる群から選択される脂肪酸プロフィールを含む、項目２９に記載の食品組成物。
（項目３１）
前記組み換え藻類トリグリセリド油のプロフィールが、天然に存在する油のトリグリセリドプロフィールに類似している、項目２９に記載の食品組成物。
（項目３２）
前記の天然に存在する油が、カカオバター、ココナツ油、パーム油、牛脂及びラードからなる群から選択される、項目３１に記載の食品組成物。
（項目３３）
前記藻類トリグリセリド油のプロフィールが、少なくとも６０％のＣ１８：１である、項目２９に記載の食品組成物。
（項目３４）
前記藻類トリグリセリド油のプロフィールが、少なくとも８０％のＣ１８：１である、項目３３に記載の食品組成物。
（項目３５）
前記組み換え藻類バイオマスが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ属又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の種である、項目２９に記載の食品組成物。
（項目３６）
前記組み換え藻類バイオマスが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓからなる群から選択される、項目３５に記載の食品組成物。
（項目３７）
サラダドレッシング、卵製品、焼成製品、パン、バー、スナックチップ、パスタ、ソース、スープ、飲料、冷菓、バター又はスプレッドである、項目２９に記載の食品組成物。
【００４９】
本発明のこれら及びその他の態様及び実施形態を、添付図面、その直後の図面の簡単な説明、その後に続く発明を実施するための形態に記載し、またその後の実施例において例示する。上述及び本出願全体で述べられている任意の又はあらゆる特性を、本発明の様々な実施形態において組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａトリグリセリド油から生成する、再生可能なディーゼル油のクロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ及び特定の関連する微生物が、油、燃料、及び他の炭化水素又は脂質組成物を経済的に大量に産生するという有利な性質を予想外にも有しているという発見と、これらの性質を改良するために、上述の微生物を遺伝的に変えるための方法及び試薬の発見とから生じたものである。これらの微生物によって産生される油は、他の用途の中でもとりわけ、輸送燃料、油脂化学、並びに／又は食品及び化粧品産業で使用することができる。脂質のトランスエステル化によって、バイオディーゼルに有用な長鎖脂肪酸エステルが得られる。他の酵素プロセス及び化学プロセスを、脂肪酸、アルデヒド、アルコール、アルカン、およびアルケンを生成するように調節することができる。いくつかの用途では、再生可能なディーゼル、ジェット燃料、又は他の炭化水素化合物を生成する。また、本発明は、生産性を高め、脂質収量を増やし、及び／又は、本明細書に記載される組成物を高い費用効率で生成するために、微細藻類を培養する方法を提供する。
【００５２】
読者が読みやすいように、発明を実施するための形態をいくつかの節に分けている。第Ｉ節は、本明細書で用いる用語の定義を記載している。第ＩＩ節は、本発明の方法で有用な培養条件を記載している。第ＩＩＩ節は、遺伝子操作の方法及び材料を記載している。第ＩＶ節は、ショ糖を利用することが可能となるように微生物（例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の遺伝子操作を記載している。第Ｖ節は、脂質生合成を改変するための微生物（例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａの遺伝子操作を記載している。第ＶＩ節は、燃料及び化学物質の製造方法を記載している。第ＶＩＩ節は、組み換え微生物バイオマスの調製方法を記載している。第ＶＩＩＩ節は、組み換え微生物バイオマスを最終食品に加工する方法を記載している。第ＩＸ節は、組み換え微生物バイオマス又はこれに由来する原料を他の食品成分と組み合わせる方法を記載している。第Ｘ節は、本発明の実施例及び実施形態を開示している。発明を実施するための形態の後に、本発明の種々の態様及び実施形態を説明する実施例が続く。
【００５３】
（Ｉ．定義）
特段の定義がない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び化学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解している意味を有する。以下の参考文献は、当業者に、本発明で用いられる多くの用語に関する一般的な定義を与えるものである。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版、１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ編集、１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第５版、Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（編集）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；Ｈａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ、Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、以下の用語は、それらに帰属する意味を有する。
【００５４】
「微細藻類内で活性」は、微細藻類内で機能を発揮する核酸を指す。例えば、トランスジェニック微細藻類に抗生物質耐性を付与するために、抗生物質耐性遺伝子を動かすために用いられるプロモーターは、微細藻類内で活性である。
【００５５】
「アシルキャリアータンパク質」又は「ＡＣＰ」は、脂肪酸合成中に成長していくアシル鎖に、４’−ホスホパンテテイン部分の末端チオールにおいてチオールエステルとして結合するタンパク質であり、脂肪酸シンターゼ複合体の成分を含む。
【００５６】
「アシル−ＣｏＡ分子」又は「アシル−ＣｏＡ」は、補酵素Ａの４’−ホスホパンテテイン部分の末端チオールの位置で、チオールエステル結合によって補酵素Ａに共有結合したアシル部分を含む分子である。
【００５７】
「面積百分率」は、サンプル中の全ての脂肪酸を、検出前に脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）に変換し、ＦＡＭＥ  ＧＣ／ＦＩＤ検出法を用いて観察したピークの面積を指す。例えば、不飽和部のない炭素原子１４個の脂肪酸（Ｃ１４：０）について、分離したピークが、Ｃ１４：１などの任意の他の脂肪酸と比較して観察される。それぞれの種類のＦＡＭＥに対するピーク面積は、混合物中のその組成物における割合と正比例しており、サンプル中に存在する全ピークの合計に基づいて算出される（すなわち、［特定のピークの面積／測定した全ピークの合計面積］×１００）。本発明の油及び細胞の脂質プロフィールについて述べる場合、「Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも４％」は、細胞中、又は抽出したグリセロ脂質組成物中の総脂肪酸のうち、少なくとも４％が、炭素原子８個、１０個、１２個又は１４個の鎖長を有することを意味している。
【００５８】
「純培養」は、他の生物によって汚染されていない、微生物の培養物である。
【００５９】
「焼成製品」は、パン屋で一般に見られる、オーブンを用いて調理された食品を意味する。焼成製品としては、限定されないが、ブラウニー、クッキー、パイ、ケーキ及びペストリーが挙げられる。
【００６０】
「パン」は、小麦粉、液体及び膨張剤を含有する食品を意味する。パンは典型的には、オーブンで焼いて調理されるが、他の調理方法も許容される。膨張剤は、天然の化学物質又はオーガニックであってよい。典型的には、オーガニックの膨張剤は酵母である。膨張剤が天然の化学物質（ベーキングパウダー及び／又は重曹など）である場合、これら食品は「速成パン」と呼ばれる。
【００６１】
「バイオディーゼル」は、ディーゼルエンジンの燃料として使用するのに適した、生物によって生成された脂肪酸アルキルエステルである。
【００６２】
「バイオマス」は、細胞の成長及び／又は増殖によって生成する物質である。バイオマスは、細胞及び／又は細胞内成分、並びに、細胞によって分泌された化合物を含むがこれに限定されない細胞外物質を含有していてもよい。
【００６３】
「バイオリアクター」は、細胞を培養し、場合により懸濁物の状態で培養する、閉じられた筐体又は部分的に閉じられた筐体である。
【００６４】
「触媒」は、生成物に対し、その生成物の一部分とならずに反応剤を容易に化学反応させる又は促進することができる、分子又は高分子複合体などの薬剤である。触媒は、反応速度を高め、その後で、前記触媒が別の反応剤に作用して生成物を形成することもある。触媒は、一般に、反応に必要な合計活性化エネルギーを小さくし、その結果、反応がすばやく進行するか、又は低い温度で進行する。従って、反応の平衡状態にすばやく達し得る。触媒の例としては、生体触媒である酵素；生体触媒ではない熱；石油精製プロセスで用いる金属が挙げられる。
【００６５】
「セルロース系材料」は、セルロースを消化して得られる物質であり、グルコース及びキシロース、場合により、二糖類、オリゴ糖、リグニン、フルフラール類及び他の化合物などの追加の化合物を含む。セルロース系材料の供給源の非限定的な例としては、サトウキビの絞りかす、テンサイパルプ、トウモロコシ茎葉、木片、おがくず、スイッチグラスが挙げられる。
【００６６】
「共生培養」、及び「共生生育」及び「共生発酵」などのこの用語の変形は、同じバイオリアクター内に２種類又はそれ以上の細胞が存在することを指す。２種類又はそれ以上の細胞は、全てが微細藻類のような微生物であってもよく、異なる細胞種と共に培養された微細藻類細胞であってもよい。培養条件は、２種類以上の細胞の成長及び／又は増殖を進めるような条件であってもよく、又は、２種類又はそれ以上の細胞のうち１種類又は部分的な集合の成長及び／又は繁殖を容易にしつつ、残りの細胞の成長を維持するという条件であってもよい。
【００６７】
「補因子」は、酵素がその酵素活性を発揮するのに必要な、基質以外の任意の分子である。
【００６８】
「相補的ＤＮＡ」又は「ｃＤＮＡ」は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の逆転写又は増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）を介する）によって通常得られるｍＲＮＡのＤＮＡ複写物である。
【００６９】
「従来の食品」は、藻類バイオマス又はその他の藻類成分を含まず、食品に通常付随する成分、具体的には植物油、動物脂肪及び／又は卵（１つ又は複数）を他の食用成分とともに含む、例えばヒトが摂取することを意図した組成物を意味する。従来の食品は、店やレストランで販売されている食品及び家庭で調理される食品を含む。従来の食品は多くの場合、他の食用成分（１つ又は複数）とともに藻類以外の入手源及び／又は卵（１つ又は複数）由来の油又は脂肪を含むことを明記した従来の調理法に従って調理される。
【００７０】
「調理済み製品」は、一定時間、例えばオーブンで加熱された食品を意味する。
【００７１】
「クリーム状サラダドレッシング」は、高粘度かつ低流速の安定な分散であるサラダドレッシングを意味する。一般に、クリーム状サラダドレッシングは不透明である。
【００７２】
「栽培された」、及びこの語句の別の言い方である「培養された」、「発酵された」は、選択した条件及び／又は制御された条件を利用することによって、１つ又はそれ以上の細胞の成長（細胞の大きさ、細胞成分が増え、及び／又は細胞活性が高まる）及び／又は増殖（有糸分裂によって細胞の数が増える）を意図的に進めることを指す。成長と増殖を組み合わせて、繁殖と呼ぶ場合もある。選択した条件及び／又は制御された条件の例としては、定義されている培地（ｐＨ、イオン強度、炭素源のような既知の特徴を有する）、特定の温度、酸素圧、二酸化炭素濃度、バイオリアクター内の成長を用いることが挙げられる。「栽培された」は、微生物の成長又は増殖が自然に起こること、又は人の介入なしに起こることを指さず、例えば、微生物が最終的に化石化し、未精製油を生成するような天然の成長は、栽培とは言わない。
【００７３】
「細胞溶解」は、低張な環境における細胞の溶解である。細胞溶解は、細胞内側への過剰な浸透作用、又は水の移動によって生じる（水分過剰）。細胞は、内部の水の浸透圧に耐えられず、爆発する。
【００７４】
「脱脂食」及び「脱脂微生物バイオマス」は、機械的な力を使って（すなわち、連続圧搾機で圧縮して）、又は溶媒抽出を利用して、又は両者を使って、油（脂質を含む）を抽出又は単離した後の微生物バイオマスである。脱脂した食料は、微生物バイオマスから油／脂質を抽出又は単離する前と比較して、油／脂質の量が減っているが、油／脂質はいくらか残っている。
【００７５】
「食物繊維」は、微細藻類を含む、細胞壁を有する植物及びその他の生物体で見られる非デンプン炭水化物である。食物繊維は可溶性（水に溶ける）又は不溶性（水に溶かすことができない）であり得る。総食物繊維は可溶性及び不溶性の食物繊維で構成される。
【００７６】
「可消化粗タンパク質」は、胃の酵素で消化された後に得られる、又は遊離窒素（アミノ酸）へ変換され得るタンパク質の一部を意味する。可消化粗タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定は、ペプシンのような胃の酵素を用いて試料を消化し、消化後の遊離アミノ酸を測定することにより行われる。可消化粗タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ測定は、飼料／食物試料中のタンパク質レベルを測定してからその試料を動物に与え、動物の糞中で収集される窒素の量を測定することにより行われる。
【００７７】
「乾燥重量」及び「細胞乾燥重量」は、水の相対的非存在下で決定される重量を意味する。例えば、組み換え微細藻類バイオマスが乾燥重量で特定の百分率の特定成分を含むという場合、その百分率は、実質的に全水分が除去された後のバイオマスの重量に基づき計算されたことを意味する。
【００７８】
「食用成分」は、食用に適した任意の物質又は組成物を意味する。「食用成分」としては、穀物、果物、野菜、タンパク質、ハーブ、香辛料、炭水化物及び脂肪が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
「発現ベクター」、「発現構築物」、「プラスミド」又は「組み換えＤＮＡ構築物」は、例えば、組み換え手段又は直接的な化学合成を含む、人の介入により生成された核酸を指し、該核酸は、宿主細胞内で特定の核酸を転写及び／又は翻訳することができる一連の特定の核酸エレメントを有する。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス又は核酸フラグメントの一部分であり得る。典型的には、発現ベクターは、プロモーターに動作可能に連結した、転写対象の核酸を含む。
【００８０】
「外来遺伝子」は、細胞に導入された（「形質転換された」）ＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現をコードする核酸である。形質転換された細胞は、組み換え細胞と呼ばれることもあり、この細胞に、さらなる外来遺伝子が導入されてもよい。外来遺伝子は、形質転換される細胞と異なる種に由来していてもよく（つまり、異種）、同じ種に由来していてもよい（つまり、同種）。従って、外来遺伝子は、内在する遺伝子複製物に対し、細胞のゲノムでは異なる位置を占める、又は、異なる制御下にある同種遺伝子を含むことができる。外来遺伝子は、前記細胞の２種類以上の複製物中に存在していてもよい。外来遺伝子は、ゲノムへの挿入物として、又はエピソーム分子として細胞中に維持されてもよい。
【００８１】
「外部から与えられた」は、細胞培養物の培養培地に与えられた分子を指す。
【００８２】
「エキスペラ−圧搾機」は、大豆や菜種のような原材料から油を抽出する機械的な方法である。エキスペラ−圧搾機は、スクリュー型の機械であり、ケージで覆われた円筒形様の空洞を通すことによって材料を圧縮する。原材料は、圧搾機の片側から入り、ケーキが他方から出ていく間に、ケージ内にあるバーの間から油がしみ出て、集められる。この機械は、スクリューからの摩擦及び連続的な圧力を利用し、原材料を動かし、圧縮する。油は、固形物が通過することができない小さな開口部からしみ出る。原材料が圧縮されていくと、典型的には、摩擦によって熱が発生する。
【００８３】
「脂肪」は、通常の室温及び圧力において一般に固体である脂質又は脂質の混合物を意味する。「脂肪」としては、ラード及びバターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
「脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ」は、脂質合成中に、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）から脂肪酸が開裂するのを触媒する酵素である。
【００８５】
「脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素」は、アシル−ＣｏＡ分子から一級アルコールへの還元を触媒する酵素である。
【００８６】
「脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素」は、アシル−ＣｏＡ分子からアルデヒドへの還元を触媒する。
【００８７】
「脂肪族アルデヒド脱炭酸酵素」は、脂肪族アルデヒドからアルカンへの変換を触媒する酵素である。
【００８８】
「脂肪族アルデヒド還元酵素」は、アルデヒドから一級アルコールへの還元を触媒する酵素である。
【００８９】
「繊維」は、多糖形態の非デンプン炭水化物を意味する。繊維は、水溶性又は非水溶性であり得る。多くの微細藻類が、通常は細胞壁中に存在する可溶性及び不溶性の繊維を産生する。
【００９０】
「最終食品」及び「最終食品成分」は、包装、使用又は摂取の準備ができた食品成分を意味する。例えば、「最終食品」は調理されていてもよく、また「最終食品」を構成する成分は互いに混合されていてもよく、又は統合されていてもよい。典型的には、「最終食品成分」を他の成分と組み合わせて使用し食品を形成する。
【００９１】
「固定炭素源」は、培養培地中で、周囲温度及び周囲圧力で固体又は液体の形態として存在し、該培養培地で培養されている微生物が利用できる炭素含有分子、典型的には有機分子である。
【００９２】
「食物」、「食品組成物」、「食品」及び「食料品」は、栄養源及び／又はカロリー源としてヒトにより摂取されることが意図される又は予想される任意の組成物を意味する。食品組成物は、主として炭水化物、脂肪、水及び／又はタンパク質から構成され、実質的にヒトの１日のカロリー摂取のすべてを占めている。「食品組成物」の最小重量は、典型的な錠剤又はカプセルの重量（典型的な錠剤／カプセルの重量は、１００ｍｇ以下〜１５００ｍｇまでの範囲である）の少なくとも１０倍である。「食品組成物」は、カプセル化されておらず、また錠剤形態でもない。
【００９３】
「適正製造基準」及び「ＧＭＰ」は、米国連邦規則集第２１編第１１０部（ヒト用食品に関する）及び第１１１部（栄養補助食品に関する）に記載されている規制又は米国以外の場所で定められている同等の規制スキームにより定められた条件を意味する。米国の規制は、ヒト摂取用の食品及び栄養補助食品の製造業者、加工業者及び包装業者を規制するために、連邦食品・医薬品・化粧品法の権限の下、米国食品医薬品局により公布されている。
【００９４】
「ホモジネート」は、物理的に破壊されたバイオマスを意味する。均質化は、粒子を小型で均一な大きさにさらに細分化して、さらなる工程に供し得る分散を形成することを含む、流体力学的工程である。均質化は、いくつかの食品及び乳製品の安定性、有効期間、消化及び味を向上させる処理において使用される。
【００９５】
「炭化水素」は、水素原子と炭素元素のみを含む分子であり、炭素原子は、直鎖、分枝鎖、環状、又は部分的に環状の骨格を形成するように共有結合しており、この骨格に水素原子が接続している。炭化水素化合物の分子構造は、天然ガスの構成成分であるメタン（ＣＨ４）形式の最も単純なものから、未精製油、石油、及びビチューメン中にみられるアスファルテンのようなある種の分子のように、非常に重く、非常に複雑なものまでさまざまである。炭化水素は、気体、液体又は固体の形態であってもよく、これらの形態を任意に組み合わせた形態であってもよく、骨格内の隣接する炭素原子間に１つ又はそれ以上の二重結合又は三重結合を有していてもよい。従って、この用語には、直鎖、分枝鎖、環状、又は部分的に環状のアルカン、アルケン、脂質、及びパラフィンが含まれる。例としては、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、オクタン、及びスクアレンが挙げられる。
【００９６】
「水素：炭素比」は、原子単位であらわした、分子中の水素原子と炭素原子との比率である。この比率は、炭化水素分子中の炭素原子及び水素原子の数を述べるときに用いられ得る。例えば、最も大きな比率を有する炭化水素は、メタンＣＨ４（４：１）である。
【００９７】
「疎水性画分」は、水相と比較して、疎水相での溶解性が高いような、物質の一部分又は画分である。疎水性画分は、実質的に水には溶解せず、通常は非極性である。
【００９８】
「脂質収量の増加」は、例えば、培養物１リットルあたりの細胞乾燥重量が増加すること、脂質を構築する細胞の割合が増えること、又は、単位時間あたりの培養容積１リットルあたりの合計脂質量が増えることなどにより、微生物培養物の生産性が増加することを指す。
【００９９】
「誘発性プロモーター」は、特定の刺激に応答し、動作可能に連結した遺伝子の転写に介在するプロモーターである。かかるプロモーターの例は、ｐＨ又は窒素レベルの変化という条件で誘発されるプロモーター配列であり得る。
【０１００】
「動作可能に連結した状態で」は、制御配列（典型的には、プロモーター）および連結した配列（典型的には、タンパク質をコードする配列で、コード配列とも呼ばれる）などの、２個の核酸配列間の機能的な連結である。プロモーターは、遺伝子の転写に介在することができる場合、外来遺伝子と動作可能に連結した状態である。
【０１０１】
「系中」は、「その場で」又は「その元々の位置で」という意味である。
【０１０２】
「栄養物の制限濃度」は、培養している微生物の増殖を制限するような、培養物中の化合物の濃度である。「栄養物の非制限濃度」は、所与の培養期間中に、最大限の増殖を支援するような濃度である。従って、所与の培養期間中に生成する細胞数は、栄養物が非制限濃度である場合よりも、制限濃度の栄養物に存在する場合の方が少なくなる。栄養物が、最大限の増殖を支援する濃度よりも高濃度で存在する場合には、培養物中に栄養物が「過剰で」あると言われる。
【０１０３】
「リパーゼ」は、非水溶性脂質基質内のエステル結合の加水分解を触媒する水溶性酵素である。リパーゼは、脂質がグリセロール及び脂肪酸に加水分解されるのを触媒する。
【０１０４】
「脂質改変酵素」は、脂質の共有結合構造を変える酵素を指す。脂質改変酵素の例としては、リパーゼ、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素、脂肪族アルデヒド還元酵素、ステアロイルキャリアータンパク質デサチュラーゼ（ＳＡＤ）および脂肪族アシルデサチュラーゼを含めたデサチュラーゼ、脂肪族アルデヒド脱炭酸酵素、が挙げられる。
【０１０５】
「脂質経路の酵素」は、脂質代謝、すなわち、脂質合成、改変又は変性のいずれかにおいて役割を担っている任意の酵素であり、脂質を化学的に改変する任意のタンパク質、及びキャリアータンパク質である。
【０１０６】
「脂質」は、非極性溶媒（例えば、エーテル及びクロロホルム）に可溶性であり、水には比較的又は完全に不溶性の分子の種類である。脂質分子は、主として、疎水性の性質を有する長い炭化水素鎖かららなるため、これらの性質を有している。脂質の例としては、脂肪酸（飽和及び不飽和）；グリセリド又はグリセロ脂質（例えば、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド又は天然の脂肪、ホスホグリセリド、又はグリセロリン脂質）；グリセリド以外のもの（スフィンゴ脂質、コレステロール及びステロイドホルモンを含むステロール脂質、テルペノイド、脂肪族アルコール、ワックス、ポリケツドを含むプレノール脂質）；及び、複雑な脂質誘導体（糖に連結した脂質、又は糖脂質、及びタンパク質に連結した脂質）が挙げられる。「脂肪」は、「トリアシルグリセリド」と呼ばれる脂質の下位集団である。
【０１０７】
「溶解物」は、溶解した細胞内容物を含む溶液である。
【０１０８】
「溶解」は、多くは生物有機体の統一性を失わせるような機械的機構、ウイルス機構、又は浸透性機構によって、生物有機体の原形質膜、場合により、細胞壁を、その細胞内成分を少なくともいくらか放出させるのに十分な程度まで破壊することである。
【０１０９】
「溶解すること」は、生物有機体又は細胞の原形質膜、場合により、細胞壁を、その細胞内成分を少なくともいくらか放出させるのに十分な程度まで、分断することである。
【０１１０】
「微細藻類」は、葉緑体又はプラスチドを含み、場合により、光合成を行うことができる真核性微生物であるか、又は、光合成を行うことができる原核性微生物である。微細藻類には、固定炭素源をエネルギーとして代謝することができない偏性光合成独立栄養生物と、固定炭素源がないと単に生存できない従属栄養生物とが存在する。微細藻類には、細胞分裂の直後に、妹細胞から分離するＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓなどの単細胞有機体、２種類の別個の細胞型を有する単純な多細胞光合成細菌である、例えば、Ｖｏｌｖｏｘなどの細菌が含まれる。微細藻類は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａのようななどの細胞を含む。また、微細藻類には、Ａｇｍｅｎｅｌｌｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ、及びＰｙｒｏｂｏｔｒｙｓなどの、細胞−細胞接着性を示す他の光合成細菌も含まれる。また、微細藻類には、特定の渦鞭毛藻（dinoflagellate algae）種、及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の種など、光合成を行う能力が失われている偏性従属栄養微生物も含まれる。
【０１１１】
「微生物バイオマス」、「微細藻類バイオマス」「藻類バイオマス」及び「バイオマス」は、微生物細胞又は微細藻類細胞の成長及び／又は増殖によって生成される物質を意味する。バイオマスは、細胞及び／又は細胞内成分、並びに細胞外物質を含有していてもよい。細胞外物質としては、細胞により分泌される化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
「微粒子化された」は、少なくとも５０％の粒径の最長寸法が１０μｍ以下になるように、高圧（又は同等のプロセス）下で均質化されたバイオマスを意味する。典型的には、かかる粒子の少なくとも５０％〜９０％又はそれ以上の最長寸法が５μｍ未満である。いかなる場合にも、微粒子化されたバイオマスの平均粒径は、インタクトな組み換え微細藻類細胞よりも小さい。
【０１１３】
「微生物」及び「細菌」は、微細な単細胞有機体である。
【０１１４】
「自然に共発現する」は、２種類のタンパク質あるいは遺伝子に関して、例えば、２種類のタンパク質をコードする遺伝子が、共通の制御配列の制御下にあるため、又は、上述の２種類のタンパク質をコードする遺伝子が、同じ刺激に応答して発現するため、そのタンパク質又はその遺伝子が、これらが誘導される組織又は有機体で自然に共発現することを意味する。
【０１１５】
「油」は、微細藻類、他の植物及び／又は動物を含めた生物体により産生される任意のトリアシルグリセリドを意味する。「脂肪」と区別される「油」は、別途明記されない限り、通常の室温及び圧力において一般に液体である脂質を指す。例えば、「油」としては、大豆、菜種、キャノーラ、パーム、パーム核、ココナツ、トウモロコシ、オリーブ、ヒマワリ、綿実、クフェア、ピーナッツ、カメリナ・サティバ、カラシの種子、カシューナッツ、オーツ麦、ハウチワマメ、ケナフ、キンセンカ、麻、コーヒー、亜麻仁、ヘーゼルナッツ、ユーホルビア、カボチャの種、コリアンダー、ツバキ、ゴマ、ベニバナ、イネ、アブラギリ、ココア、コプラ、ケシ（ｐｉｕｍ  ｐｏｐｐｙ）、トウゴマの実、ピーカン、ホホバ、ジャトロファ、マカダミア、ブラジルナッツ及びアボカド、並びにこれらの組み合わせに由来する油を含むがこれらに限定されない、植物由来の植物油又は種子油が挙げられる。
【０１１６】
「浸透圧衝撃」は、浸透圧が突然下がることによって、細胞が溶液中で破裂することである。時に、浸透圧衝撃が誘発され、かかる細胞の細胞成分が溶液内に放出される。
【０１１７】
「低温殺菌」は、食品中の微生物の増殖を遅らせることを目的とした加熱のプロセスを意味する。典型的には、低温殺菌は高温（ただし、沸点より低い温度）で短時間行われる。本明細書に記載のように、低温殺菌により、食品中の望ましくない微生物の数が減少するだけでなく、食品中に存在する特定の酵素も不活性化され得る。
【０１１８】
「多糖分解酵素」は、任意の多糖の加水分解又は糖化を触媒することができる任意の酵素である。例えば、セルラーゼは、セルロースの加水分解を触媒する。
【０１１９】
「多糖類」又は「グリカン」は、単糖類がグリコシド結合によって接続したもので構成される炭水化物である。セルロースは、特定の植物細胞壁を構成する多糖である。セルロースは、酵素によって解重合し、キシロース及びグルコースなどの単糖類や、これより大きな二糖類及びオリゴ糖を生成し得る。
【０１２０】
「ポート」は、気体、液体及び細胞などの材料の流入又は流出が可能なバイオリアクターの開口部を意味し、通常は管に接続されている。
【０１２１】
「大部分が封入された」は、５０％を超える、通常は７５％〜９０％を超える、言及される成分、例えば藻類油が、言及される容器内に隔離されていることを意味し、この容器は、例えば組み換え微細藻類細胞を含み得る。
【０１２２】
「大部分がインタクトな細胞」及び「大部分がインタクトなバイオマス」は、５０％を超える、多くの場合は７５、９０及び９８％を超えるインタクトな細胞を含んでなる細胞の集団を意味する。「インタクトな」は、この文脈においては、細胞の細胞内成分を封入する細胞膜及び／又は細胞壁の物理的な連続性が、培養中の細胞膜の透過性を超える程度まで細胞の細胞内成分を放出するようないかなる形でも破壊されていないことを意味する。
【０１２３】
「大部分が溶解した」は、５０％を超える、通常は７５％〜９０％を超える細胞が、細胞の細胞内成分が細胞膜内でもはや完全に封入されることのないように破壊されている細胞の集団を意味する。
【０１２４】
「繁殖」は、成長と増殖の両方を合わせたものを意味する。
【０１２５】
「プロモーター」は、核酸の転写に指示する核酸制御配列である。本明細書で使用される場合、プロモーターは、転写開始部位の近くに、必要な核酸配列を含み、例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合には、ＴＡＴＡエレメントを含む。また、プロモーターは、場合により、遠位エンハンサーエレメント又はリプレッサーエレメントを含み、これらは、転写開始部位から数千塩基対も離れた位置にあってもよい。
【０１２６】
「増殖」は、有糸分裂又はその他の細胞分裂により細胞数が増加することを意味する。
【０１２７】
「近似分析」は、食品の脂肪、窒素／タンパク質、粗繊維（主成分としてセルロース及びリグニン）、水分及び灰分を分析することを意味する。近似分析の既知の値の合計を１００から減じることにより、可溶性炭水化物（総食物繊維及び遊離糖）を計算することができる（差による炭水化物）。
【０１２８】
「組み換え体」は、外来核酸の導入又は天然核酸の改変のために修飾された細胞、核酸、タンパク質又はベクターである。従って、例えば、組み換え細胞は、この細胞の天然の（組み換えされていない）形態にはみられない遺伝子を発現するか、又は、非組み換え細胞によって発現する前記遺伝子とは異なる天然遺伝子を発現する。「組み換え核酸」とは、一般には、例えば、ポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼなどを用いた核酸の操作により、本来はｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成される核酸か、、又はそうでなければ、通常は天然には存在しない形態核酸のことである。組み換え核酸を生成し、例えば、２種類又はそれ以上の核酸を動作可能に連結した状態に配置することもできる。従って、天然では通常は接続していないＤＮＡ分子を結合させることによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した核酸又は発現ベクターの単離物は、両方とも本発明の目的では組み換えであると考える。組み換え核酸が作られ、宿主細胞又は有機体に導入されると、宿主細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ細胞機構を用いて複製し得るが、かかる核酸は、いったん組み換え状態で産生すると、その後に細胞内で複製されたものであっても、本発明の目的では組み換えと考える。同様に、「組み換えタンパク質」は、組み換え技術を用いて、すなわち、組み換え核酸の発現によって作られるタンパク質である。
【０１２９】
「組み換え微生物油」、「組み換え微細藻類油」及び「藻類油」は、それぞれ組み換え微生物又は微細藻類細胞又は藻類細胞により産生される、トリアシルグリセロールを含めた任意の脂質成分を意味する。
【０１３０】
「再生可能なディーゼル」は、脂質の水素化及び脱酸素によって生成されるアルカン混合物（例えば、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０）である。
【０１３１】
「糖化」は、バイオマス、通常はセルロース系バイオマス又はリグノセルロース系バイオマスを、グルコース及びキシロースなどの単糖類に変換するプロセスである。「糖化された」又は「解重合された」セルロース系材料又はバイオマスは、糖化によって単糖類に変換されたセルロース系材料又はバイオマスを指す。
【０１３２】
用語「類似した」は、天然に存在する油との比較という文脈で、さらなる限定条件なしに使用される場合、天然に存在する油と比較した油が、天然に存在する油の上位２つのトリグリセリドの約＋／−１５％又は＋／−１０％を含有することを意味する。例えば、シアバター（Ｂ．Ｐａｒｋｉｉの油）は、最も一般的に存在する２つのトリグリセリド成分として４１．２〜５６．８％のＣ１８：０及び３４．０〜４６．９％のＣ１８：１を含有する（表５を参照）。＋／−１０％以内にある「類似した」油は、最も一般的な２つのトリグリセリド成分として、約３７％〜約６２％のＣ１８：０及び３１％〜約５２％のＣ１８：１を含み得る。この文脈で使用される場合、用語「類似した」は、＋／−９％、＋／−８％、＋／−７％、＋／−６％、＋／−５％、＋／−４％、＋／−３％、＋／−２％又は＋／−１％を包含し、また天然に存在する油の上位３つ若しくは上位４つのトリグリセリド、又は上位３つのトリグリセリドのうちの２つ、又は上位４つのトリグリセリドのうちの３つとの比較をさらに表し得る。
【０１３３】
「超音波処理」は、音波エネルギーを用いることによって、細胞などの生体材料を破壊する過程である。
【０１３４】
「フルフラール種」は、２−フランカルボキサアルデヒド、又は同じ基本構造の特徴を保持しする誘導体である。
【０１３５】
「茎葉」は、穀物を収穫した後に残る、作物の茎及び葉を乾燥させたものである。
【０１３６】
「ショ糖利用遺伝子」は、発現すると、ショ糖をエネルギー源として利用する能力を補助する遺伝子である。ショ糖利用遺伝子によってコードされるタンパク質は、本明細書では「ショ糖利用酵素」と呼ばれ、ショ糖トランスポーター、ショ糖インベルターゼ、並びにグルコキナーゼ及びフルクトキナーゼなどのヘキソキナーゼを含む。
【０１３７】
「ヒトの摂取に適した」は、組成物が、健康への悪影響なしにヒトの食事摂取として消費され得、消化管内での消化物質取り込みによって有意なカロリー摂取をもたらし得ることを意味する。
【０１３８】
「未調理製品」は、加熱されていない組成物を意味するが、予め過熱された成分を１つ又はそれ以上含んでいてもよい。
【０１３９】
容積での割合に関連する「Ｖ／Ｖ」又は「ｖ／ｖ」は、組成物中の１つの物質の容積と、組成物の容積との比を意味する。例えば、５％ｖ／ｖの組み換え微細藻類油を含む組成物という場合、組成物の容積の５％が組み換え微細藻類油で占められ（例えば、容積１００ｍｍ３の組成物は５ｍｍ３の組み換え微細藻類油を含有する）、組成物の残りの容積（例えば、この例では９５ｍｍ３）は他の成分で占められていることを意味する。
【０１４０】
重量での割合に関連する「Ｗ／Ｗ」又は「ｗ／ｗ」は、組成物中の１つの物質の重量と、組成物の重量との比を意味する。例えば、５％ｗ／ｗの組み換え微細藻類バイオマスを含む組成物という場合、組成物の重量の５％が組み換え微細藻類バイオマスで占められ（例えば、重量１００ｍｍｇの組成物は５ｍｍｇの組み換え微細藻類バイオマスを含有する）、組成物の残りの重量（例えば、上の例では９５ｍｍｇ）は他の成分で占められていることを意味する。
【０１４１】
（ＩＩ．栽培）
本発明は、一般的には、脂質を産成させるために、微生物（例えば、微細藻類、油産生酵母、真菌及び細菌）、特にＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株を含めた組み換え微細藻類株を栽培することに関する。読者が読みやすいように、本節をいくつかの項に分けている。第１項は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａの種と株、並びに、ゲノムＤＮＡ比較によるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａの新種と新株及び関連する微細藻類、並びに他の微生物の同定方法について記載する。第２項は、栽培に有用なバイオリアクターについて記載する。第３項は、栽培用培地について記載する。第４項は、本発明の例示的な栽培方法に従った油の産生成について記載する。これらの記載はまた、さらに一般的に他の微生物にも適用され得る。
【０１４２】
（１．Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａの種及び株、並びに他の微生物）
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａは、高濃度の脂質、特に、燃料生成に適した脂質を産生することができるため、脂質の産成に使用するのに卓越した微生物である。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａによって産生される脂質は、他の微細藻類によって産生される脂質よりも鎖長が短く、飽和度が高い炭化水素鎖を含んでいる。さらに、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａの脂質は、一般的に、色素を含まず（クロロフィル及び特定のカロチノイドの濃度が検出不可能なほど低く）、いかなる状況でも、他の微細藻類から得られる脂質よりもかなり色素の含有量が低い。さらに、本発明によって与えられる組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞を用い、他の微生物から脂質を産生する場合と比較して、低コストで、高収率及び高効率で脂質を生成させることができる。本発明の方法で用いる具体的なＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株としては、が挙げられる。それに加え、この微細藻類は、従属栄養性で成長し、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ（ＵＴＥＸ  ３２７を含む）、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｐｏｒｔｏｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ株１４４１、１４３５を含む）、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉとして遺伝子操作することができる。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の種は、偏性従属栄養生物である。
【０１４３】
本発明で使用するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａの種は、ゲノムの特定標的領域を増幅させることによって同定することができる。例えば、特定のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ種又は株の同定は、プライマーと、任意のゲノム領域を用いた方法とを用い、例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｏｔ．Ｂｕｌｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｎ．（２００１）４２：１１５−１２１  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓに記載されている方法を用いて、核及び／又は葉緑体のＤＮＡ増幅及び配列決定によって達成され得る。当業者であれば、リボソームの内部に転写されたスペーサー（ＩＴＳ１及びＩＴＳ２  ｒＤＮＡ）、２３Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、及び他の保存されたゲノム領域の増幅および配列決定などの十分に確率された系統発生解析の方法を用いて、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａだけではなく、類似の脂質プロフィール及び産生能を有する他の炭化水素及び脂質を産生する有機体の種を同定することができる。例えば、藻類の同定法及び分類法の例として、例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年８月；１７０（４）：１６０１−１０及びＲＮＡ、２００５年４月；１１（４）：３６１−４を参照のこと。
【０１４４】
従って、ゲノムＤＮＡ比較を用い、本発明で使用する微細藻類の適切な種を同定することができる。本発明で使用する好ましい微細藻類に分類学的に関連する微細藻類の種をスクリーニングするために、、例えば、２３ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡなど、だがこれに限定されない、保存されたゲノムＤＮＡ領域を、微細藻類の種から増幅させ、コンセンサス配列を比較することができる。かかるＤＮＡ配列をプロトテカ（Prototheca)属に含まれる種と比較した例を以下に示す。ゲノムＤＮＡ比較は、株の収集中に誤って同定した微細藻類の種を同定するのにも有用であり得る。株の収集では、表現型及び形態学的特徴に基づいて、微細藻類の種を同定することが多いだろう。これらの特徴を使用すると、微細藻類の種又は属を間違ってカテゴリー分けしてしまうことがある。ゲノムＤＮＡ比較のり用は、系統発生的関係に基づいて微細藻類種をカテゴリー分けするより良好な方法であり得る。
【０１４５】
本発明で使用する微細藻類は、典型的には、配列番号１１〜１９に記載の少なくとも１つの配列に対するヌクレオチド同一性が少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は少なくとも８５％の２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡ配列を有する。
【０１４６】
ヌクレオチド同一性又はアミノ酸同一性の割合を決定するために配列を比較する場合、典型的には、ある配列を参照配列として作用させ、これと試験配列とを比較する。配列比較アルゴリズムを用いた場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、部分配列の座標を指定し、必要な場合、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムが、指定したプログラムパラメーターに基づいて、試験配列を参照配列と比較して配列同一性の割合を算出する。
【０１４７】
例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局地的ホモロジーアルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）のと類似検索法によって、これらのアルゴリズムをコンピュータ化実装することによって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩの、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ）、又は、視覚的な観察（一般的に、上記のＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．を参照）によって、比較のための最適な配列アラインメントを行うことができる。
【０１４８】
配列同一性の割合及び配列類似性を決定するのに適した別のアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ウェブアドレスはｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に公開されている。このアルゴリズムは、検索配列の中で、文字列の長さＷの短い文字列を同定することにより、スコアの高い配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを含み、該文字列は、データベース配列中の同じ長さの文字列と整列させたときに、ある正の値である閾値Ｔとマッチするか、又は閾値Ｔを満足するかのいずれかである。。Ｔは、近隣の文字列スコアの閾値と呼ばれる（Altschul et al.、上記）。これらの初期の近隣の文字列ヒットが、これらの配列に含まれるもっと長いＨＳＰを見つけるための初期検索の出発点として作用する。その後、この文字列のヒットを、累積アラインメントスコアが増加していく限りは、それぞれの配列に沿って両方向に拡張していく。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメーターＭ（マッチングした残基対に対するリワードスコア；常に０より大きい）及びパラメーターＮ（マッチングしない残基に対するペナルティースコア；常に０より小さい）を用いて算出される。アミノ酸配列の場合、スコアの行列を用いて累積スコアを算出する。それぞれの方向への文字列ヒットの拡張は、累積アラインメントスコアが、到達した最大値からＸの大きさだけ下がった場合、１つ又は以上のマイナス値のスコアをもつ残基のアラインメントの累積のため、累積スコアが０又は０未満になった場合、又は、いずれかの配列が末端まできた場合に中止される。核酸又はポリペプチドが本発明の範囲内にあるかどうかを同定するためには、ＢＬＡＳＴプログラムのデフォルトパラメーターが適している。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、文字列長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４をデフォルトとして用い、両鎖を比較する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプロフラムを、文字列長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列をデフォルトとして用いる。ＴＢＬＡＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のタンパク質配列を用いる）は、文字列長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列をデフォルトとして用いる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）を参照）。
【０１４９】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、配列同一性の割合を算出することに加え、２つの配列間の類似性の統計分析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって与えられる類似性の測定値は、ひとつには最小合計確率（Ｐ（Ｎ））があり、この値は、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列が偶然マッチする確率の指標を与える。例えば、試験核酸と参照核酸とを比較したときの最小合計確率が、約０．１未満、より好ましくは、約０．０１未満、最も好ましくは、約０．００１未満であるときに、この核酸は、参照配列と類似していると考える。
【０１５０】
本発明で用いるための微生物の選択に影響を及ぼす他の考慮事項としては、油、燃料、及び油脂化学品を産成するのに適した脂質又は炭化水素の産成に加え、（１）細胞重量に対する脂質含有率が高いこと；（２）成長が容易であること；（３）遺伝子操作が容易であること；及び（４）バイオマスの処理が容易であることが挙げられる。特定の実施形態では、野生型の微生物又は遺伝子操作された微生物から、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、又は少なくとも７０％、又はそれ以上が脂質である細胞が得られる。好ましい有機体は、従属栄養的に成長する有機体である（光の非存在下で、糖上で）。
【０１５１】
本発明を実施するために使用し得る藻類の例としては、表１に記載の以下の藻類が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５２】
【表１−１】
0005996527.tif 000002
【表１−２】
0005996527.tif 000003
【０１５３】
本発明を実施するために使用し得る油産生酵母の例としては、表２６に記載の以下の油産生酵母が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５４】
【表２６】
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【０１５５】
本発明を実施するために使用し得るその他の真菌の例としては、表２７に記載の以下の真菌が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５６】
【表２７】
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【０１５７】
本発明のある実施形態では、微生物は細菌である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌内での外来遺伝子発現の例はよく知られており、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（第３版，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ)を参照されたい。
【０１５８】
（２．バイオリアクター）
微生物を、遺伝子操作及び炭化水素（例えば、脂質、脂肪酸、アルデヒド、アルコール、及びアルカン）の産成という目的で培養する。前者の種類の培養では、小スケールで実施し、最初は、少なくとも、原料微生物が成長可能な条件下で実施する。炭化水素を産成させるための培養は、通常は、バイオリアクター中、大スケールで実施する（例えば、１０，０００リットル、４０，０００リットル、１００，０００リットル、又はそれより大きなバイオリアクター）。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種を含めた微細藻類は、典型的には、バイオリアクター内の液体培地にて、本発明の方法で培養する。典型的には、バイオリアクターには光を入れない。
【０１５９】
バイオリアクター又は発酵槽を用い、生理学的周期の種々の段階を経て、油産生微生物細胞、好ましくは微細藻類細胞を培養する。バイオリアクターは、従属栄養成長及び増殖方法で用いると多くの利点がある。食品において用いるためのバイオマスを産成させるために、微細藻類を、好ましくは、液体中で、一例として懸濁培養物中で、大量に発酵させる。鋼鉄製発酵槽などのバイオリアクターは、非常に大きな容積の培養物を収容することができる（本発明の様々な実施形態では、４０，０００リットル以上の容量を有するバイオリアクターを用いる）。また、バイオリアクターは、典型的には、温度、ｐＨ、酸素圧、及び二酸化炭素濃度などの培養条件を制御することができる。例えば、バイオリアクターは、典型的には、例えば、酸素又は窒素のような気体成分を液体培養物にバブリングすることが可能な配管に接続したポートを用いて構築する。また、培養培地のｐＨ、微量元素同定および濃度、並びに他の培地構成要素など、その他の培養パラメーターは、バイオリアクターを用いてより簡単に操作することもできる。
【０１６０】
バイオリアクターは、微細藻類が繁殖し、その数が増える間ずっと、培養培地がバイオリアクターを流れるような構成することができる。ある実施形態では、例えば、播種した後であるが、細胞が所望の密度になる前に、培地をバイオリアクターに注入することができる。別の場合では、培養開始時にバイオリアクターを培養培地で満たし、培養物を播種した後には、それ以上培養培地を注入しない。言い換えると、微細藻類が繁殖され、その数が増える間ずっと、微細藻類のバイオマスを水性媒地で培養する。しかし、この間ずっと、水性培地はバイオリアクターを流れない。従って、ある実施形態では、水性培地は、播種後にはバイオリアクターを流れない。
【０１６１】
スピニングブレード及びインペラー、揺動機構、攪拌棒、加圧気体を注入する手段などのデバイスを備えたバイオリアクターを用い、微細藻類の培養物を混合することができる。混合は、連続的であってもよく、断続的であってもよい。例えば、ある実施形態では、微細藻類が望ましい数に増えるまで微細藻類を繁殖させるために、気体及び培地注入における乱流の流動様式は維持されない。
【０１６２】
バイオリアクターポートを用いて、気体、固体、半固体、及び液体を、微細藻類を含むバイオリアクターチャンバーに導入又はそれらを抽出することができる。多くのバイオリアクターは、２個以上のポートを備えているが（例えば、１つは培地注入のため、他方はサンプリングのため）、１個のポートにつき１種類の物質のみを出入りさせるという必要はない。例えば、１個のポートを、バイオリアクターに培地を流し、その後で、サンプリング、ガス注入、ガス放出、又はその他の目的に使用することができる。培養物の純培養性を損なうことなく、サンプリングポートを繰り返し用いることができることが好ましい。サンプリングポートは、サンプルの流れの停止及び開始、又は連続サンプリングの手段を提供するバルブ又は他のデバイスを備えた構成であり得る。バイオリアクターは、典型的には、培養物の播種が可能な少なくとも１個のポートを備えており、かかるポートを、培地又は気体の注入など、その他の目的に用いることもできる。
【０１６３】
バイオリアクターポートによって、微細藻類の培養物の気体内容物を操作することができる。説明のために、バイオリアクターの容積の一部分は、液体ではなく気体であり得、バイオリアクターの気体注入口から、ポンプによって気体をバイオリアクターに入れることができる。ポンプによるバイオリアクターへの注入が有利となり得る気体としては、空気、空気／ＣＯ２混合物、アルゴンなどの希ガス、及び他の気体が挙げられる。バイオリアクターは、典型的には、バイオリアクターにガスを注入する速度をユーザーが制御することができるよう装備されている。上述のように、バイオリアクターへの気体の流れを増やすことによって、培養物の混合性を高めることができる。
【０１６４】
気体の流れを増やすことは、培地の濁度にも影響を及ぼす。乱流は、バイオリアクターに注入された気体が培地表面でバブリングするように、水性培地の液量より低いところに気体注入ポートを配置することによって起こすことができる。１種類又はそれ以上の気体放出ポートから気体が外に逃げ、それにより、バイオリアクター中に圧力が蓄積されるのを防ぐ。気体放出ポートは、バイオリアクターに汚染微生物が侵入するのを防ぐよう「一方向」バルブにつながっていることが好ましい。
【０１６５】
（３．培地）
微細藻類の培地は、典型的には、固定窒素源、固定炭素源、微量元素、場合により、ｐＨを維持するための緩衝液、及びホスフェート（典型的には、リン酸塩として与えられる）などのな成分を含有する。他の成分は、特に、海水微細藻類の場合には、塩化ナトリウムなどの塩を含み得る。窒素源としては、有機窒素源及び無機窒素源が挙げられ、例えば、分子状窒素、硝酸エステル、硝酸塩、アンモニア（純水なもの、又は塩形態、例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４及びＮＨ４ＯＨ）、タンパク質、大豆ミール、コーンスティープリカー、及び酵母抽出物が挙げられるが、これらに限定されない。微量元素の例としては、亜鉛、ホウ素、コバルト、銅、マンガン、モリブデンが挙げられ、例えば、それぞれＺｎＣｌ２、Ｈ３ＢＯ３、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、及び（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏの形態である。
【０１６６】
本発明の方法で有用な微生物は、世界中の種々の場所及び環境で発見されている。他の種からの単離し、それにより得られる進化多様性の結果として、脂質及び／又は炭化水素構成要素の最適な成長及び生成のための特定の成長培地は、予測が困難な場合がある。ある場合には、特定の微生物株は、ある種の阻害成分が存在するか、又は、特定の微生物株が必要とするある種の必須栄養分が存在しないために、特定の成長培地上で成長することができない場合がある。
【０１６７】
固体及び液体の成長培地は、一般的に、さまざまな供給源から入手可能であり、さまざまな微生物株に適した特定の培地を調製法の説明は、例えば、オンラインでは、藻類の培養物を収集するためのＡｕｓｔｉｎ、１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ａ６７００、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ、７８７１２−０１８３のテキサス大学によって運営されているサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｔｅｘ．ｏｒｇ／で見つけることができる（ＵＴＥＸ）。例えば、種々の淡水培地及び塩水培地としては、国際公開第２００８／１５１１４９号に記載されているものが挙げられ、この文献は参照により組み込まれる。
【０１６８】
特定の例では、プロテオース培地は、純培養の培地に適しており、培地１リットル（ｐＨ約６．８）は、１ｇのプロテオースペプトンを、１リットルのＢｒｉｓｔｏｌ  Ｍｅｄｉｕｍに加えることによって調製することができる。Ｂｒｉｓｔｏｌ  ｍｅｄｉｕｍは、水溶液中に、２．９４ｍＭのＮａＮＯ３、０．１７ｍＭのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．３ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４３ｍＭ、１．２９ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、及び１．４３ｍＭのＮａＣｌを含む。１．５％寒天培地の場合、寒天１５ｇを上述の溶液１リットルに加えればよい。この溶液に蓋をし、オートクレーブにかけ、次いで、使用するまで冷蔵温度で保存する。別の例は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ単離培地（ＰＩＭ）であり、１０ｇ／Ｌのフタル酸水素カリウム（ＫＨＰ）、０．９ｇ／Ｌの水酸化ナトリウム、０．１ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、０．２ｇ／Ｌのリン酸水素カリウム、０．３ｇ／Ｌの塩化アンモニウム、１０ｇ／Ｌのグルコース、０．００１ｇ／Ｌの塩酸チアミン、２０ｇ／Ｌの寒天、０．２５ｇ／Ｌの５−フルオロシトシンを含み、ｐＨ範囲が５．０〜５．２である（Ｐｏｒｅ、１９７３、Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２６：６４８−６４９を参照）。本発明の方法で用いるのに適した他の培地は、上記のＵＲＬを閲覧することによって、又はＳＡＧ、ＣＣＡＰ又はＣＣＡＬＡなど、微生物の培地を保有している他の機関に助言を求めることによって、簡単に特定することができる。ＳＡＧは、ゲッティンゲン大学（ドイツ、ゲッティンゲン）のＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅを指し、ＣＣＡＰは、Ｓｃｏｔｔｉｓｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（英国、スコットランド）によって管理されている藻及び原生動物の培養株保存機関を指し、ＣＣＡＬＡは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ（トシェボニュ、チェコ共和国）の藻研究所の培養株保存機関を指す。さらに、米国特許第５，９００，３７０号は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種の従属栄養性発酵に適した培地の処方及び条件について記載している。
【０１６９】
油の生成について、油産成を経済的なものにするのに十分なほど固定炭素源のコストを低くしなければならないため、固定炭素源の選択が重要である。従って、適切な炭素源には、例えば、アセテート、フロリドシド、フルクトース、ガラクトース、グルクロン酸、グルコース、グリセロール、ラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ラムノース、ショ糖、及び／又はキシロースを含むが、これらの化合物を含有する原材料の選択は、本発明の方法の重要な態様である。本発明の方法で有用となる適切な原材料としては、例えば、黒液、トウモロコシデンプン、解重合されたセルロース系材料、乳清、糖液、ジャガイモ、ソルガム、ショ糖、テンサイ、サトウキビ、イネ、及び小麦が挙げられる。また、炭素源は、混合物として、例えば、ショ糖と解重合されたテンサイパルプの混合物として与えられてもよい。１つ又はそれ以上の炭素源は、１つ又はそれ以上の外から与えられた固体炭素源の少なくとも約５０μＭ、少なくとも約１００μＭ、少なくとも約５００μＭ、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約５０ｍＭ、少なくとも約５００ｍＭの濃度で供給されてもよい。本発明の目的のために特に対象となる炭素源としては、セルロース（解重合された形態で）、グリセロール、ショ糖、ソルガムが挙げられ、これらについては、以下にさらに詳細に記載する。
【０１７０】
本発明によれば、原材料として解重合されたセルロース系バイオマスを用い、微生物を培養してもよい。セルロース系バイオマス（例えば、トウモロコシ茎葉のような茎葉）は安価であり、入手が容易であるが、この物質を酵母のための原材料として使用する試みは長年失敗している。特に、かかる原材料は、酵母の成長を阻害することがわかっており、酵母は、セルロース系材料から生成した五炭糖（例えば、ヘミセルロースから生成したキシロース）を用いることができない。対照的に、微細藻類は、処理したセルロース系材料上で成長することができる。セルロース系材料は、一般的に、約４０〜６０％のセルロースと、約２０〜４０％のヘミセルロースと、１０〜３０％のリグニンとを含む。
【０１７１】
適切なセルロース系材料としては、草及び木のエネルギー作物、及び農業用作物から得られた残渣、すなわち、主要な食品又は繊維製品の分野から除去されなかった植物の一部、主に茎及び葉が挙げられる。例としては、農業廃棄物、例えば、サトウキビの絞りかす、モミ殻、トウモロコシ繊維（茎、葉、皮及び穂軸を含む）、麦わら、稲わら、テンサイパルプ、シトラスパルプ、柑橘類の皮；森林の廃棄物、例えば、硬材及び軟材の間伐、伐採作業から得られる硬材及び軟材の残渣；木材廃棄物、例えば、製材工場の廃棄物（木片、おがくず）、パルプ工場の廃棄物；都市廃棄物、例えば、都市固形廃棄物の紙片、都会の廃材、都市の伐採した草のような、都市の緑廃棄物；木材製造の廃棄物が挙げられる。さらなるセルロース含有材料としては、スイッチグラス、ハイブリッドポプラ材、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ、テンサイ繊維、及びソルガム繊維などの専用のセルロース含有作物が挙げられる。かかる材料から産成される五炭糖としては、キシロースが挙げられる。
【０１７２】
細菌が上述の材料を含む糖類を利用できる効率を高めるために、セルロース系材料を処理する。本発明は、上述の材料を、細菌（例えば、微細藻類及び油産生酵母）の従属栄養性培養物で用いるのに適しているように酸爆発させた後、セルロース系材料を処理するための新規方法を提供する。上述のように、リグノセルロース系バイオマスは、セルロース、β１，４結合したグルコース（六炭糖）の結晶性ポリマー、ヘミセルロース、主にキシロース（五炭糖）で構成され、少量のマンノース、ガラクトース、アラビノース、リグニンで構成されている、より緩やかに連結したポリマー、α１，４結合したポリガラクツロン酸の直鎖であるペクチンのような、種々の画分で構成されている。セルロース及びヘミセルロースがポリマー構造であるため、これらの中に含まれる糖類（例えば、単糖類のグルコース及びキシロース）は、多くの細菌によって有効に使用する（代謝する）ことができるような形態ではない。このような細菌の場合、セルロース系バイオマスをさらに処理し、このポリマーを構成している単糖類を作成することは、セルロース系材料を原材料（炭素源）として有効に利用するのに非常に役立つ場合がある。
【０１７３】
セルロース又はセルロース系バイオマスを「爆発」と呼ばれるプロセスに処し、このプロセスで、バイオマスは、高温高圧で、希硫酸（又は他の酸）で処理される。このプロセスは、セルロース系及びヘミセルロース系の画分をグルコースモノマー及びキシロースモノマーにする酵素加水分解を効率よく行うことができるようにバイオマスを調節する。得られた単糖類は、セルロース系糖と呼ばれる。その後に、セルロース系糖が微生物に利用され、種々の代謝物（例えば、脂質）が生成される。酸爆発工程によって、ヘミセルロース画分が、構成成分である単糖類へと部分的に加水分解する。これらの糖類を、さらなる処理によって、バイオマスから完全に遊離させることができる。ある実施形態では、さらなる処理は、爆発した材料を熱水で洗浄することを含む熱水処理であり、これによって、塩のような混入物質が除去される。セルロース系エタノール発酵では、該プロセスで用いられる糖の濃度はもっと希釈であるため、この工程は必要ではない。他の実施形態では、さらなる処理は、追加の酸処理である。さらに他の実施形態では、さらなる処理は、爆発した材料の酵素加水分解である。また、これらの処理を任意の組み合わせで用いてもよい。この種の処理は、遊離する糖の種類（例えば、五炭糖対六炭糖）、このプロセス中で糖類が遊離する段階に影響を及ぼす場合がある。その結果、五炭糖又は六炭糖のどちらかが主成分の異なる糖の流れを作成することができる。よって、これらの五炭糖又は六炭糖を豊富に含む流れは、異なる炭素利用能を有する特定の微生物用に向けることができる。
【０１７４】
本発明の方法は、典型的には、エタノール発酵で達成されるものよりも高い細胞密度になるまで発酵することを含む。従属栄養セルロース系の油を産成するための培養物の密度が高いため、固定炭素源（例えば、セルロース系から誘導される糖の流れ）は、好ましくは、濃縮された形態である。解重合されたセルロース系材料のグルコース濃度は、好ましくは、栽培工程前では、少なくとも３００ｇ／Ｌ、少なくとも４００ｇ／Ｌ、少なくとも５００ｇ／Ｌ、又は少なくとも６００ｇ／Ｌであり、場合により、細胞が成長し、脂質を蓄積する間ずっと、上述の物質を細胞に供給するようなフェッドバッチ栽培する。セルロース系糖の流れは、セルロース系エタノールの産成においては、この濃度範囲又はこの濃度範囲付近で用いられない。従って、リグノセルロース系の油を産成している間、非常に高密度の細胞を生成し、維持するために、炭素原材料を、非常に濃縮された形態で従属栄養培養物に運ばなければならない。しかし、油産生微生物の基質ではなく、油産生微生物によって代謝されないような供給物流中の任意の成分は、バイオリアクター中に蓄積し、その成分が、所望の最終製品を産生するのに毒性であるか又は阻害的である場合には、問題となり得るであろう。リグニン及びリグニンから誘導される副産物、フルフラール類及びヒドロキシメチルフルフラール類などの炭水化物由来副産物、セルロース系材料生成由来の塩（爆発プロセス及びそれに続く中和プロセスの両方で）、さらに、代謝されていないペントース／ヘキソース糖ですら、エタノール発酵では問題となり得、これらの影響は、初期原材料中のこれらの物質の濃度が高いプロセスでは、顕著に大きくなる。本明細書に記載されるリグノセルロース系油の大量産成に用い得る六炭糖について、３００ｇ／Ｌの範囲（又はそれ以上）の糖濃度を達成するために、これら有毒物質の濃度は、典型的には、セルロース系バイオマスのエタノール発酵中に存在する濃度の２０倍より高くなり得る。
【０１７５】
セルロース系材料の爆発プロセスによる処理は、かなりの量の硫酸、熱、及び圧力を利用するため、炭水化物の副産物、つまり、フルフラール類及びヒドロキシメチルフルフラール類が遊離する。フルフラール類及びヒドロキシメチルフルフラール類は、ヘミセルロースの加水分解中に、キシロースを水和してフルフラール及び水にすることによって産成される。本発明のいくつかの実施形態では、これらの副産物（例えば、フルフラール類及びヒドロキシメチルフルフラール類）は、バイオリアクターに注入する前に、糖化されたリグノセルロース系材料から除去される。本発明の特定の実施形態では、炭水化物の副産物を除去するプロセスは、爆発したセルロース系材料の熱水処理である。それに加え、本発明は、リグノセルロース系油の産成に、フルフラール類又はヒドロキシメチルフルフラール類などの化合物に耐え得る株を用いる方法を提供する。別の実施形態では、本発明はまた、発酵培地中のフルフラール類に耐え得るだけでなく、リグノセルロース系油を産成させている間に、実際には、これらの副産物を代謝することができる方法及び微生物も提供する。
【０１７６】
また、この爆発プロセスは、顕著な量の塩も生じる。例えば、爆発の典型的な条件によって、爆発したセルロース系バイオマスを、水：固形分（乾燥重量）が１０：１の比率で再懸濁させた場合、５ｍＳ／ｃｍを超える導電率が生じ得る。本発明の特定の実施形態では、爆発した希釈バイオマスに対し、酵素による糖化を行い、得られた上澄みを、バイオリアクター中で使用するために最大２５倍まで濃縮する。濃縮糖の流れの中の塩濃度（導電率で測定した場合）は、許容できないほど高い場合がある（最大１．５Ｍ  Ｎａ＋に相当）。同様に、その後の酵素糖化プロセスのために、爆発した物質を中和すると、追加の塩が生成される。本発明は、結果として得られた、前記濃縮セルロース系糖の流れを、リグノセルロース系油の産成のために、従属栄養プロセスで使用することができるように、これらの塩を除去する方法を提供する。ある実施形態では、これらの塩を除去する方法は、ＤＯＷＥＸ  Ｍａｒａｔｈｏｎ  ＭＲ３など、だがこれに限定されない、樹脂を用いた脱イオン化である。特定の実施形態では、樹脂を用いた脱イオン化工程は、糖の濃縮前に行うか、又は、糖化の前のバイオマスのｐＨ調節及び熱水処理の前に行うか、又はこれらの任意の組み合わせであり、他の実施形態では、この工程は、これらの１つ又はそれ以上のプロセスの後に行う。他の実施形態では、許容範囲を超えた高濃度で塩が生成するのを避けるために、爆発プロセス自体を変更する。例えば、セルロース系バイオマスの硫酸（又は他の酸）爆発に代わる好適な代替法は、セルロース系バイオマスの酵素加水分解（糖化）に対する感受性を高くする機械的なパルプ化である。さらに他の実施形態では、高濃度の塩に耐性の天然微生物株、又は高濃度の塩に耐性を有するように遺伝子操作された株を用いる。
【０１７７】
油産生細菌を用いて従属栄養性のリグノセルロース系油の産成で使用するための、爆発したセルロース系バイオマスを調製するプロセスに好ましい実施形態。第１の工程は、爆発したセルロース系バイオマスを再懸濁させたもののｐＨを、５．０〜５．３の範囲に調節した後、セルロース系バイオマスを３回洗浄することを含む。この洗浄工程は、脱塩性及びイオン交換性の樹脂、逆浸透膜、熱水処理（上述のようなもの）の使用、又は、脱イオン水に再懸濁させ、遠心分離するのを単に繰り返す、といった種々の手段によって達成することができる。この洗浄工程によって、セルロース系の流れの導電率が１００〜３００μＳ／ｃｍになり、かなりの量のフルフラール類及びヒドロキシメチルフルフラール類が除去される。この洗浄工程からのデカンと物を、ヘミセルロース画分から遊離した五炭糖を濃縮するために保存することができる。第２の工程は、洗浄したセルロース系バイオマスを酵素によって糖化することを含む。好ましい実施形態では、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を用いる。第３の工程は、糖化されたバイオマスを遠心分離するか、又はデカンテーションし、次いですすぐことによる、糖の回収を含む。得られたバイオマス（固形分）は、エネルギー密度が高く、リグニンを豊富に含む成分であり、これを燃料として使用してもよく、廃棄するために送ってもよい。遠心分離／デカンテーション及びすすぎを行うプロセス中で回収された糖の流れを集める。第４の工程は、透過物の回収をしつつ、混入した固形物を除去する精密濾過を含む。第５の工程は、減圧エバポレーターを用いることによって達成され得る濃縮工程を含む。この工程は、場合により、Ｐ’２０００（Ｓｉｇｍａ／Ｆｌｕｋａ）などの消泡剤の添加を含み、この作業は、得られる糖原料のタンパク質含有量のため、時に必要である。
【０１７８】
本発明の方法の別の実施形態では、炭素源は、バイオディーゼルのトランスエステル化から得られる、酸性化グリセロール及び非酸性化グリセロールを含むグリセロールである。一実施形態では、炭素源は、グリセロールと、少なくとも１つの他の炭素源とを含んでいる。ある場合には、グリセロール及び少なくとも１つの他の固定炭素源の全てが、発酵開始時に微生物に与えられる。ある場合には、グリセロール及び少なくとも１つの他の固定炭素源が、微生物に対して所定の比率で同時に与えられる。ある場合には、グリセロール及び少なくとも１つの他の固定炭素源が、発酵している間、所定の速度で細菌に供給される。
【０１７９】
ある種の微細藻類では、グルコース存在下よりも、グリセロール存在下ですばやく細胞分裂が行われる（国際公開第２００８／１５１１４９号）。これらの場合、細胞密度をすばやく上昇させるために、まず細胞にグリセロールを供給し、次いで、脂質の蓄積を高めるためにグルコースを供給するという二段階成長プロセスによって、脂質産生の効率が改善される。トランスエステル化プロセスのグリセロール副産物を使用することによって、この物質が産成プロセスに戻されると、経済的に顕著な利点を与える。例えば、グリセロール及びグルコースの混合物など、他の供給方法も同様に与えられる。また、かかる混合物を供給することによって、同じ経済的な利点が得られる。それに加え、本発明は、ショ糖など、グリセロールとの種々の組み合わせで、微細藻類粉末類への代替糖の供給方法を提供する。
【０１８０】
本発明の方法の別の実施形態では、炭素源は転化糖である。転化糖は、ショ糖をその単糖成分であるフルクトースとグルコースに分解することにより産成される。転化糖の産成は、当該技術分野で知られているいくつかの方法により達成することができる。このような方法の１つが、ショ糖水溶液の加熱である。ショ糖から転化糖への変換を促進するために触媒を用いることが多い。このような触媒として、生物学的なもの、例えば、インベルターゼなどの酵素が可能であり、スクラーゼをショ糖に添加して加水分解反応を促進し、転化糖を産成することができる。酸は非生物学的触媒の例であり、加熱と組み合わせて加水分解反応を促進することができる。転化糖が生成されると、転化糖はショ糖に比べて結晶化しにくいため保管及びフェッドバッチ発酵において有利であり、、微細藻類を含めた微生物の従属栄養培養の場合、濃縮された炭素源が必要である。一実施形態では、炭素源は転化糖であり、培養工程の前に、好ましくは少なくとも８００ｇ／リットル、少なくとも９００ｇ／リットル、少なくとも１０００ｇ／リットル又は少なくとも１１００ｇ／リットルに濃縮された形態であることが好ましく、前記培養工程は、場合によりフェドバッチ培養である。転化糖は、好ましくは濃縮形態で、細胞が成長し、脂質を蓄積する間ずっと、細胞に供給される。
【０１８１】
本発明の方法の別の実施形態では、炭素源はショ糖であり、ショ糖を含む複雑な原材料、例えば、サトウキビの処理から得られる濃いサトウキビ汁を含む。従属栄養的な油産成のための培養物の密度が高いため、固定炭素源（例えば、ショ糖、グルコースなど）は、培養工程の前に、好ましくは少なくとも５００ｇ／リットル、少なくとも６００ｇ／リットル、少なくとも７００ｇ／リットル又は少なくとも８００ｇ／リットルの固定炭素源である濃縮形態であることが好ましく、前記培養工程は、場合により、細胞が成長し、脂質を蓄積する間ずっと細胞に原料を供給するフェドバッチ培養である。いくつかの場合には、炭素源は濃いサトウキビ汁の形態のショ糖であり、培養工程の前に、好ましくは固体が少なくとも６０％若しくは糖が約７７０ｇ／リットル、固体が少なくとも７０％若しくは糖が約９２５ｇ／リットル、又は固体が少なくとも８０％若しくは糖が約１１２５ｇ／リットルの濃縮形態であることが好ましく、前記培養工程は、場合により、フェドバッチ培養である。濃縮された濃いサトウキビ汁は、細胞が成長し、脂質を蓄積する間ずっと細胞に供給される。
【０１８２】
一実施形態では、培養培地は、少なくとも１つのショ糖利用酵素をさらに含む。ある場合には、培養培地は、ショ糖インベルターゼを含む。一実施形態では、ショ糖インベルターゼ酵素は、微生物の集団が発現する外来のショ糖インベルターゼ遺伝子によってコードされる分泌可能なショ糖インベルターゼ酵素である。従って、いくつかの場合では、以下の第ＩＶ節にさらに詳細に記載されるように、微細藻類は、ショ糖トランスポーター、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、又はフルクトキナーゼなどのショ糖利用酵素を発現するように遺伝子操作されている。
【０１８３】
ショ糖を含有する複雑な原材料としては、サトウキビの処理から得られる廃棄糖液が挙げられ、サトウキビ処理による価値の低い上述の廃棄生成物によって、炭化水素及び他の油の産成において、顕著に費用を節約することができる。本発明の方法で有用な、ショ糖を含有する別の複雑な原材料は、ソルガムであり、ソルガムシロップ及び純粋なソルガムを含む。ソルガムシロップは、甘いソルガムの茎の汁から産成する。ソルガムシロップの糖プロフィールは、主に、グルコース（デキストロース）、フルクトース、及びショ糖からなる。
【０１８４】
（４．油の生成）
本発明の方法に従って油を産成する場合、例えば、光が培養物にあたらないようにする、きわめて大きな（４０，０００リットル以上の）発酵槽を使う場合、いつものように、細胞を暗い場所で培養することが好ましい。プロトテカ（Prototheca)種は、固定炭素源を含有する培地内で、光の非存在下で、油を産成するように成長し、増殖する。かかる成長は、従属栄養性の成長として知られている。
【０１８５】
一例として、脂質を産成する油産生微生物細胞、好ましくは微細藻類細胞の播種物質が培地に入れられ、細胞が増殖し始めるまでに遅延期間（遅延期）が存在する。遅延期間の後、増殖速度は徐々に上がっていき、対数期すなわち指数増殖期に入る。次いで、指数増殖期の後、窒素などの栄養物の減少、毒性基質の増加、菌体数感知機構のために増殖が遅くなる。このように増殖が遅くなった後、増殖が止まり、細胞に与えられている特定の環境に応じて、細胞は静止期又は安定成長状態に入る。脂質を豊富に含むバイオマスを得るために、培養物は、典型的には、指数増殖期が終わった後に良好に収穫され、該指数増殖期は、窒素又は別の鍵となる栄養物（炭素以外のもの）を枯渇させ、細胞が過剰に存在する炭素源を脂質に変換するよう強制することによって初期に終わらせてもよい。。培養条件のパラメーターを操作して、油の合計産成量、産成される脂質種の組み合わせ、及び／又は特定の油の産成を最適にすることができる。
【０１８６】
上述のように、バイオリアクター又は発酵槽を用いて、細胞が成長周期の種々の期間を経るようにする。一例として、脂質を産成する細胞の播種物質が培地に入れられ、細胞が増殖し始めるまでに遅延期間（遅延期）が存在する。遅延期間の後、増殖速度は徐々に上がっていき、対数期すなわち指数増殖期に入る。次いで、指数増殖期の後、栄養物の減少、及び／又は毒性基質の増加のために増殖が遅くなる。このように増殖が遅くなった後、増殖が止まり、細胞に与えられている特定の環境に応じて、細胞は静止期又は安定成長状態に入る。本明細書に開示されている細胞による脂質の産成は、細胞分裂の非存在下で、脂質を産成し続けるように、栄養物を供給するか、又は栄養物がまだ利用可能であるような静止期を含め、対数期又はその後に起こり得る。
【０１８７】
好ましくは、本明細書に記載されている条件及び当該技術分野で既知の条件を用いて成長させた微生物は、脂質を少なくとも約２０重量％、好ましくは、少なくとも約４０重量％、より好ましくは、少なくとも約５０重量％、最も好ましくは、少なくとも約６０重量％含む。プロセスの条件は、特定の用途に適した脂質の収量を高めるように、及び／又は、産成費用を減らすように調節することができる。例えば、特定の実施形態では、微細藻類を、グルコースなど固定炭素エネルギーを過剰量与えつつ、制限濃度の１つ以上の栄養物、例えば、窒素、リン又は硫黄などの存在下で培養する。窒素による制限は、窒素が過剰に与えられている培地における微生物脂質収量に対し、微生物脂質収量を増やす傾向がある。特定の実施形態では、脂質収量の増加は、少なくとも約１０％、約５０％、約１００％、約２００％、又は約５００％である。全培養期間の一部又は全期間にわたって、制限量の栄養物の存在下で細菌を培養してもよい。特定の実施形態では、栄養物の濃度は、全培養期間の間に、制限濃度及び非制限濃度の間の周期を少なくとも２回繰り返す。過剰量の炭素を与えつつ、窒素量を制限するか、又はまったく窒素を含まない状態で、時間を延長させて培養を続けることによって、細胞の脂質含有量を増やすことができる。
【０１８８】
別の実施形態では、脂質経路酵素（例えば、脂肪酸合成酵素）のための１つ又はそれ以上の補因子（複数を含む）存在下で、脂質を産生する微生物（例えば、微細藻類）を培養することによって、脂質収量を増やす。一般的に、補因子（複数を含む）の濃度は、補因子（複数を含む）の非存在下での微生物脂質収量に対し、微生物脂質（例えば、脂肪酸）の量を増やすのに十分な濃度である。特定の実施形態では、補因子（複数を含む）をコードする外来遺伝子を含有する微生物（例えば、微細藻類）を培養物に含むことによって、培養物に補因子（複数を含む）を与える。又は、補因子の合成に関与するタンパク質をコードする外来遺伝子を含有する微生物（例えば、微細藻類）を含むことによって、培養物に補因子（複数を含む）を与えてもよい。特定の実施形態では、適切な補因子は、例えば、ビオチン、パントテン酸化合物などの、脂質経路酵素に必要な任意のビタミンを含む。本発明での使用に適した補因子をコードする遺伝子、又はこのような補因子の合成に関与する遺伝子は、十分に知られており、上述のような構築物及び技術を用い、微生物（例えば、微細藻類）に導入することができる。
【０１８９】
本明細書に記載されているバイオリアクター、培養条件、並びに従属栄養性成長及び増殖方法の特定の例を任意の適切な様式で組み合わせ、微生物の成長効率、並びに脂質及び／又はタンパク質の産成効率を高めることができる。
【０１９０】
乾燥重量で、油／脂質の蓄積率の高い微細藻類のバイオマスは、異なる培養方法を用いて生成されており、この方法は、当該技術分野で知られている（国際公開第２００８／１５１１４９号）。本明細書に記載されている培養方法で生成され、本発明で有用な微細藻類のバイオマスは、乾燥重量で、少なくとも１０％の微細藻類の油を含む。ある実施形態では、微細藻類のバイオマスは、乾燥重量で、微細藻類の油を少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、又は少なくとも６０％含む。ある実施形態では、微細藻類のバイオマスは、乾燥重量で、微細藻類の油を１０〜９０％、２５〜７５％、４０〜７５％、又は５０〜７０％含有する。
【０１９１】
本明細書に記載されているバイオマスの微細藻類の油、又は本発明の方法及び組成物で使用するために、バイオマスから抽出された微細藻類の油は、１つ又はそれ以上の別個の脂肪酸エステル側鎖を有するグリセロ脂質を含む。グリセロ脂質は、１個、２個又は３個の脂肪酸分子でエステル化されたグリセロール分子から成り、脂肪酸分子は、長さはさまざまであってもよく、種々の飽和度を有していてもよい。脂肪酸分子（及び微細藻類の油）の長さ及び飽和度の特徴によって、以下の第ＩＶ節にさらに詳細に記載されるように、培養条件又は脂質経路の操作によって、本発明の微細藻類油中の脂肪酸分子の性質又は比率を改変するように操作することができる。従って、藻類油の特定のブレンドは、２種類又はそれ以上の微細藻類種に由来するバイオマス又は藻類油を混合することによって、１種類の藻種の中で調製されることもでき、又は、本発明の藻類油を、大豆、菜種、キャノーラ、パーム、パーム核、ココナツ、トウモロコシ、野菜くず、ナンキンハゼ、オリーブ、ヒマワリ、綿実、鶏脂、牛脂、豚脂、微細藻類、大型藻類、クフェア、亜麻、ピーナッツ、上質のホワイトグリース、ラード、カメリナ・サティバ、カラシの種子、カシューナッツ、オーツ麦、ハウチワマメ、ケナフ、キンセンカ、麻、コーヒー、亜麻仁（亜麻）、ヘーゼルナッツ、ユーホルビア、カボチャの種、コリアンダー、ツバキ、ゴマ、ベニバナ、イネ、アブラギリ、ココア、コプラ、ケシ（ｐｉｕｍ  ｐｏｐｐｙ）、トウゴマの実、ピーカン、ホホバ、ジャトロファ、マカダミア、ブラジルナッツ、アボカド、石油、又は上述のいずれかの油の蒸留留分など、他の供給源に由来する油とブレンドすることによって調製することもできる。
【０１９２】
また、油の組成、すなわち、グリセロ脂質の脂肪酸構成要素の性質及び比率も、少なくとも２種類の別個の微細藻類種に由来するバイオマス又は油を混ぜあわせることによって操作することができる。ある実施形態では、少なくとも２種類の別個の微細藻類種は、異なるグリセロ脂質プロフィールを有している。この別個の微細藻類種を、好ましくは、従属栄養条件下で、本明細書に記載の通りに一緒に又は別個に培養してそれぞれの油を生成することができる。異なる種類の微細藻類は、細胞のグリセロ脂質の構成成分である別個の脂肪酸を異なる割合で含有できる。
【０１９３】
一般的に、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ株は、鎖長がＣ８〜Ｃ１４の脂肪酸をほとんど含まないか、まったく含まない。例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｋｒｕｇａｎｉ（ＵＴＥＸ  ３２９）、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ（ＵＴＥＸ  １４４２）、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ（ＵＴＥＸ  １４３８）は、Ｃ８脂肪酸をまったく含まず（又は検出可能な量含まず）、Ｃ１０脂肪酸を０〜０．０１％、Ｃ１２脂肪酸を０．０３〜２．１％、Ｃ１４脂肪酸を１．０〜１．７％含んでいる。
【０１９４】
ある場合には、鎖長がＣ８又はＣ８〜１０の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含むＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株は、鎖長Ｃ８の脂肪酸を少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１２％又は少なくとも１５％又はそれ以上有している。他の場合には、鎖長がＣ１０の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含むＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株は、鎖長Ｃ１０の脂肪酸を少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２４％又は少なくとも２５％又はそれ以上有している。他の場合には、鎖長がＣ１２の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含むＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株は、鎖長Ｃ１２の脂肪酸を少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３４％、少なくとも３５％又は少なくとも４０％又はそれ以上有している。他の場合には、鎖長がＣ１４の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含むＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株は、鎖長Ｃ１４の脂肪酸を少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも３０％、少なくとも４３％又は少なくとも４５％又はそれ以上有している。
【０１９５】
非限定的な例では、鎖長がＣ８の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含むＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株は、鎖長Ｃ８の脂肪酸を１％〜２５％、又は１％〜１５％、好ましくは１．８〜１２．２９％有している。他の非限定的な例では、鎖長がＣ１０の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含むＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株は、鎖長Ｃ１０の脂肪酸を１％〜５０％、又は１％〜２５％、好ましくは１．９１〜２３．９７％有している。他の非限定的な例では、鎖長がＣ１２の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含むＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株は、鎖長Ｃ１２の脂肪酸を５％〜５０％、又は１０％〜４０％、好ましくは１３．５５〜３４．０１％有している。他の非限定的な例では、鎖長がＣ１４の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含むＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株は、鎖長Ｃ１４の脂肪酸を１％〜６０％、又は２％〜４５％、好ましくは２．５９〜４３．２７％有している。他の非限定的な例では、様々な炭素鎖長の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対する広範な特異性を有する脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含むＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株は、鎖長が１６の脂肪酸を最大３０％、最大３５％、又は好ましくは最大３９．４５％まで有している。ある場合には、鎖長がＣ８及びＣ１４の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含むＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株は、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１４）脂肪酸を１％〜７５％、又は２％〜６０％、好ましくは２．６９〜５７．９８％有している。ある場合には、鎖長がＣ１２〜Ｃ１４の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含むＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株は、鎖長がＣ１２〜Ｃ１４の脂肪酸を少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも４９％有している。ある場合には、トランスジェニックＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株を、外来遺伝子を保持するような一定で高選択的な圧力下で保持することは、特定の鎖長を有する望ましい脂肪酸が増えるため、有益である。また、高濃度の外来遺伝子を保持することは、本明細書に開示されている相同組み換えベクター及び相同組み換え法を用い、細胞の核染色体に外来遺伝子を挿入することによっても達成することができる。外来遺伝子が核染色体に組み込まれた組み換え細胞は、本発明の目的のひとつである。
【０１９６】
また微細藻類の油には、微細藻類が産生する他の構成要素、又は培養培地由来の微細藻類油に組み込まれた他の構成要素が含まれ得る。これらの他の構成要素は、微細藻類を培養するために用いられる培養条件、微細藻類の種、バイオマスから微細藻類油を回収するのに用いられる抽出方法、微細藻類の油組成に影響を与え得る他の因子に応じて、様々な量で存在し得る。かかる構成要素の非限定的な例としては、０．０１〜０．５ｍｃｇ／油ｇ、０．０２５〜０．３ｍｃｇ／油ｇ、好ましくは０．０５〜０．２４４ｍｃｇ／油ｇで存在するカロチノイド；０．０１〜０．５ｍｃｇ／油ｇ、０．０２５〜０．３ｍｃｇ／油ｇ、好ましくは０．０４５〜０．２６８ｍｃｇ／油ｇで存在するクロロフィルＡ；０．１ｍｃｇ／油ｇ未満、０．０５ｍｃｇ／油ｇ未満、好ましくは０．０２５ｍｃｇ／油ｇ未満の総クロロフィル；１〜３００ｍｃｇ／油ｇ、３５〜１７５ｍｃｇ／油ｇ、好ましくは３８．３〜１６４ｍｃｇ／油ｇで存在するγ−トコフェロール；１０〜５００ｍｃｇ／油ｇ、５０〜３００ｍｃｇ／油ｇ、好ましくは６０．８〜２６１．７ｍｃｇ／油ｇで存在する総トコフェロール；１％未満、０．５％未満、好ましくは０．２５％未満のブラシカステロール、カンペステロール、スチグマステロール若しくはβ−シトステロール；４００ｍｃｇ／油ｇ未満、好ましくは３００ｍｃｇ／油ｇ未満の総トコトリエノール；又は１００〜５００ｍｃｇ／油ｇ、２２５〜３５０ｍｃｇ／油ｇ、好ましくは２４９．６〜３２５．３ｍｃｇ／油ｇで存在する総トコトリエノールが挙げられる。
【０１９７】
他の構成要素としては、限定されないが、リン脂質、トコフェロール、トコトリエノール、カロチノイド（例えば、α−カロチン、β−カロチン、リコピンなど）、キサントフィル（例えば、ルテイン、ゼアキサンチン、α−クリプトキサンチン及びβ−クリトキサンチン（ｃｒｙｔｏｘａｎｔｈｉｎ））、及び様々な有機又は無機化合物が挙げられる。ある場合には、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種から抽出される油は、０．００１〜０．０１ｍｃｇ／油ｇ、０．００２５〜０．０５ｍｃｇ／油ｇ、好ましくは０．００３〜０．０３９ｍｃｇ／油ｇのルテイン、０．０１ｍｃｇ／油ｇ未満、０．００５ｍｃｇ／油ｇ未満、好ましくは０．００３ｍｃｇ／油ｇ未満のリコピン；及び０．０１ｍｃｇ／油ｇ未満、０．００５ｍｃｇ／油ｇ未満、好ましくは０．００３ｍｃｇ／油ｇ未満のβ−カロチンを含む。
【０１９８】
ある実施形態では、本発明は、トリグリセリド油を含む油産生微生物細胞を提供し、該トリグリセリド油の脂肪酸プロフィールは、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約７％、少なくとも約１０％又は少なくとも約１５％のＣ８：０；少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％又は少なくとも約３０％のＣ１０：０；少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％又は少なくとも約８０％のＣ１２：０；少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％又は少なくとも約５０％のＣ１４：０；少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％又は少なくとも約９０％のＣ１６：０；少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％又は少なくとも約５０％のＣ１８：０；少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％又は少なくとも約９０％のＣ１８：１；約７％未満、約５％未満、約３％未満、約１％未満又は約０％のＣ１８：２；及び少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％又は少なくとも約９０％の飽和脂肪酸からなる群から選択される。
【０１９９】
ある実施形態では、油産生微生物細胞は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％であるＣ８：０とＣ１０：０の総合計量；少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％であるＣ１０：０とＣ１２：０とＣ１４：０の総合計量；少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％であるＣ１６：０とＣ１８：０とＣ１８：１の総合計量；少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％であるＣ１８：０とＣ１８：１とＣ１８：２の総合計量；少なくとも約６０％、少なくとも約７０ｓ％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％であるＣ１４：０とＣ１６：０とＣ１８：０とＣ１８：１の総合計量；及び約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満又は約０％であるＣ１８：１とＣ１８：２の総合計量からなる群から選択される脂肪酸プロフィールを含むトリグリセリド油を含んでなる。
【０２００】
ある実施形態では、油産生微生物細胞は、少なくとも約５〜１、少なくとも６〜１、少なくとも７〜１、少なくとも８〜１、少なくとも９〜１又は少なくとも１０〜１であるＣ８：０とＣ１０：０の比；少なくとも約６〜１、少なくとも７〜１、少なくとも８〜１、少なくとも９〜１又は少なくとも１０〜１であるＣ１０：０とＣ１２：０の比；少なくとも約５〜１、少なくとも６〜１、少なくとも７〜１、少なくとも８〜１、少なくとも９〜１又は少なくとも１０〜１であるＣ１２：０とＣ１４：０の比；少なくとも７〜１、少なくとも８〜１、少なくとも９〜１又は少なくとも１０〜１であるＣ１４：０とＣ１２：０の比；及び少なくとも１〜２、少なくとも１〜３、少なくとも１〜４、少なくとも１〜５、少なくとも１〜６、少なくとも１〜７、少なくとも１〜８、少なくとも１〜９又は少なくとも１〜１０であるＣ１４：０とＣ１６：０の比からなる群から選択される脂肪酸比を含む脂肪酸プロフィールを有するトリグリセリド油を含んでなる。
【０２０１】
ある実施形態では、本発明は、油産生微生物トリグリセリド油組成物を提供し、該トリグリセリド油の脂肪酸プロフィールは、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約７％、少なくとも約１０％又は少なくとも約１５％のＣ８：０；少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％又は少なくとも約３０％のＣ１０：０；少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％又は少なくとも約８０％のＣ１２：０；少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％又は少なくとも約５０％のＣ１４：０；少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％又は少なくとも約９０％のＣ１６：０；少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％又は少なくとも約５０％のＣ１８：０；少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％又は少なくとも約９０％のＣ１８：１；約７％未満、約５％未満、約３％未満、約１％未満又は約０％のＣ１８：２；及び少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％又は少なくとも約９０％の飽和脂肪酸からなる群から選択される。
【０２０２】
ある実施形態では、油産生微生物トリグリセリド油組成物は、Ｃ１０：０とＣ１２：０とＣ１４：０の総合計量が少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％である；Ｃ１６：０とＣ１８：０とＣ１８：１の総合計量が少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％である；Ｃ１８：０とＣ１８：１とＣ１８：２の総合計量が少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％である；Ｃ１４：０とＣ１６：０とＣ１８：０とＣ１８：１の総合計量が少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％である；Ｃ８：０とＣ１０：０の総合計量が約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満又は約０％であるという脂肪酸プロフィールを含むトリグリセリド油を含む。
【０２０３】
ある実施形態では、油産生微生物トリグリセリド油組成物は、少なくとも約５〜１、少なくとも約６〜１、少なくとも約７〜１、少なくとも約８〜１、少なくとも約９〜１又は少なくとも約１０〜１であるＣ８：０とＣ１０：０の比；少なくとも約６〜１、少なくとも約７〜１、少なくとも約８〜１、少なくとも約９〜１又は少なくとも約１０〜１であるＣ１０：０とＣ１２：０の比；少なくとも約５〜１、少なくとも約６〜１、少なくとも約７〜１、少なくとも約８〜１、少なくとも約９〜１又は少なくとも約１０〜１であるＣ１２：０とＣ１４：０の比；少なくとも約７〜１、少なくとも約８〜１、少なくとも約９〜１又は少なくとも約１０〜１であるＣ１４：０とＣ１２：０の比；少なくとも約１〜２、少なくとも約１〜３、少なくとも約１〜４、少なくとも約１〜５、少なくとも約１〜６、少なくとも約１〜７、少なくとも約１〜８、少なくとも約１〜９又は少なくとも約１〜１０であるＣ１４：０とＣ１６：０の比からなる群から選択される脂肪酸比を含む脂肪酸プロフィールを有するトリグリセリド油を含む。
【０２０４】
ある実施形態では、本発明は、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約７％、少なくとも約１０％又は少なくとも約１５％のＣ８：０；少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％又は少なくとも約３０％のＣ１０：０；少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％又は少なくとも約８０％のＣ１２：０；少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％又は少なくとも約５０％のＣ１４：０；少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％又は少なくとも約９０％のＣ１６：０；少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％又は少なくとも約５０％のＣ１８：０；少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％又は少なくとも約９０％のＣ１８：１；約７％未満、約５％未満、約３％未満、約１％未満又は約０％のＣ１８：２；及び少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％又は少なくとも約９０％の飽和脂肪酸からなる群から選択される脂肪酸プロフィールを有する油産生微生物トリグリセリド油組成物を産成する方法を提供し、本方法は、（ａ）油産生微生物細胞の細胞乾燥重量の少なくとも１０％がトリグリセリド油になるまで油産生微生物細胞の集団を培地中で栽培する工程と、（ｂ）油産生微生物細胞からトリグリセリド油組成物を単離する工程とを含む。
【０２０５】
ある実施形態では、油産生微生物トリグリセリド油組成物を産成する方法により、Ｃ１０：０とＣ１２：０とＣ１４：０の総合計量が少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％である；Ｃ１６：０とＣ１８：０とＣ１８：１の総合計量が少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％である；Ｃ１８：０とＣ１８：１とＣ１８：２の総合計量が少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％である；Ｃ１４：０とＣ１６：０とＣ１８：０とＣ１８：１の総合計量が少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％である；Ｃ８：０とＣ１０：０の総合計量が約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満又は約０％であるという脂肪酸プロフィールを含むトリグリセリド油が得られる。
【０２０６】
ある実施形態では、油産生微生物トリグリセリド油組成物を生成する方法により、少なくとも約５〜１、少なくとも約６〜１、少なくとも約７〜１、少なくとも約８〜１、少なくとも約９〜１又は少なくとも約１０〜１であるＣ８：０とＣ１０：０の比；少なくとも約６〜１、少なくとも約７〜１、少なくとも約８〜１、少なくとも約９〜１又は少なくとも約１０〜１であるＣ１０：０とＣ１２：０の比；少なくとも約５〜１、少なくとも約６〜１、少なくとも約７〜１、少なくとも約８〜１、少なくとも約９〜１又は少なくとも約１０〜１であるＣ１２：０とＣ１４：０の比；少なくとも約７〜１、少なくとも約８〜１、少なくとも約９〜１又は少なくとも約１０〜１であるＣ１４：０とＣ１２：０の比；及び少なくとも約１〜２、少なくとも約１〜３、少なくとも約１〜４、少なくとも約１〜５、少なくとも約１〜６、少なくとも約１〜７、少なくとも約１〜８、少なくとも約１〜９又は少なくとも約１〜１０であるＣ１４：０とＣ１６：０の比からなる群から選択されるトリグリセリド油比を含む脂肪酸プロフィールを有するトリグリセリド油が得られる。
【０２０７】
（ＩＩＩ．遺伝子操作方法及び材料）
本発明は、本発明の方法で有用なＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞と、組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｋｒｕｇａｎｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ宿主細胞を含むがこれらに限定されない、組み換え宿主細胞とを含めた微生物を遺伝的に改変する方法及び材料を提供する。読者が読みやすいように、これらの方法及び材料の記載をいくつかの節に分けている。第１節では、形質転換方法について記載している。第２節では、相同組み換えを用いた遺伝子操作方法について記載している。第３節では、発現ベクター及び成分について記載している。
【０２０８】
本発明の特定の実施形態では、微生物を遺伝的に改変して脂質産生を増強する、微生物により生成される成分の特性若しくは割合を改変する、又は各種の原材料物質でのｄｅ  ｎｏｖｏ成長特性を向上させる若しくはこれをもたらすことが望ましい。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、特に、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉが本明細書に記載の遺伝子操作方法で使用するのに好ましい微生物であるが、他のＣｈｌｏｒｅｌｌａ種及びその他の様々な微生物も使用することができる。
【０２０９】
天然の入手源から単離されるフラグメントを用いたクローン化技術により、プロモーター、ｃＤＮＡ及び３’ＵＴＲ、並びに他のベクターのエレメントを作製することができる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（第３版，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ)；及び米国特許第４，６８３，２０２号を参照）。あるいは、既知の方法を用いて合成により、エレメントを作製することができる（例えば、Ｇｅｎｅ．１９９５  Ｏｃｔ  １６；１６４（１）：４９−５３を参照）。
【０２１０】
（１．操作方法−形質転換）
細胞は、例えば、微粒子銃、エレクトロポレーション（Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８：８２１−８２６を参照）、ガラスビーズによる形質転換、及び炭化ケイ素ウィスカーによる形質転換を含む、任意の適切な技術によって形質転換され得る。使用可能な別の方法として、プロトプラストを作成し、ＣａＣｌ２及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用い、組み換えＤＮＡを微細藻類細胞に導入することが含まれる（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）、Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：６３−７３、この論文は、Ｃｈｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａを形質転換するために、この方法を用いることを報告している）。微細藻類の共形質転換を利用し、２種類の別個のベクター分子を細胞に同時に導入することができる（例えば、Ｐｒｏｔｉｓｔ  ２００４  Ｄｅｃ；１５５（４）：３８１−９３）。
【０２１１】
微粒子銃による方法（例えば、Ｓａｎｆｏｒｄ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９８８）６：２９９  ３０２、米国特許第４，９４５，０５０号；エレクトロポレーション（Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９８５）８２：５８２４  ５８２８）；レーザービーム、マイクロインジェクション、又はＤＮＡを微細藻類に導入することが可能な任意の他の方法を用いて、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞を形質転換することができる。
【０２１２】
Ｃｈｏｒｅｌｌａなどの微生物にトランス遺伝子を導入するのに都合の良い任意の技術を本発明で使用することができる。Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）（上記）は、微小発射ボンバードメント（ｍｉｃｒｏ−ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）を使用して、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ由来の硝酸還元酵素（ＮＲ）遺伝子をＮＲ欠損Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ変異体に導入し、安定な形質転換体を得ることについて記載している。簡潔には、０．４ミクロンのタングステンビーズをプラスミドでコーティングし、３×１０７個のＣ．ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ細胞を非選択寒天培地の中央の１／３に播種し、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（登録商標）システム（バイオ・ラッド社）で粒子を撃ち込んだ。
【０２１３】
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａなどの微生物にトランス遺伝子を導入するための好ましい方法は、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：６３−７３により記載されている方法である。Ｋｉｍは、ＣａＣｌ２とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いたＣｈｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａのプロトプラストの形質転換について報告している。具体的には、Ｃ．ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ細胞を１〜２×１０８／ｍｌの密度まで増殖させてプロトプラストを作製した。１６００ｇで５分間の遠心分離により細胞を回収及び洗浄し、０．６Ｍのソルビトール、０．６Ｍのマンニトール、４％（重量／容積）のセルロース（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、２％（重量／容積）のマセラーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）及び５０単位のペクチナーゼ（Ｓｉｇｍａ）を含有する５ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中に再び懸濁させた。細胞懸濁物を２５℃で１６時間、暗所で穏やかに振とうしながらインキュベートした。得られたプロトプラストを、４００ｇで５分間の遠心分離により回収した。ペレットを０．６Ｍのソルビトールと０．６Ｍのマンニトールを含有する５ｍｌのｆ／２培地中に穏やかに再び懸濁させ、４００ｇで５分間遠心分離した。このペレットを、５０ｍＭのＣａＣｌ２を含有する０．６Ｍソルビトール／マンニトール溶液１ｍｌ中に再び懸濁させた。次いで、０．４ｍｌ中１０７〜１０８個のプロトプラストに、５ｍｇのトランス遺伝子ＤＮＡを２５μｇの仔ウシ胸腺ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）とともに加えた。室温で１５分後、２００μＬのＰＮＣ（４０％のポリエチレングリコール４０００、０．８ＭのＮａＣｌ、５０ＭｍのＣａＣｌ２）を加え、室温で３０分間、穏やかにかき混ぜた。この後、０．６Ｍソルビトール／マンニトール溶液、１％酵母抽出物及び１％グルコースを添加した０．６ｍｌのｆ／２培地を加え、細胞壁再生のために、形質転換細胞を２５℃で１２時間、暗所でインキュベートした。Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）（上記）は同様の方法を用いて、水銀還元酵素をコードするトランス遺伝子をＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．ＤＴ．に導入した。
【０２１４】
Ｃｈｏｒｅｌｌａなどの微生物を形質転換するために、エレクトロポレーションも用いられてきた。Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８：８２１−８２６（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）の報告によれば、静止期の細胞から作製したＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ  ｃ−２１１−１ａのプロトプラストにトランス遺伝子を導入するためにこの技術が用いられた。６００〜９００Ｖ／ｃｍの間の電界強度及び約４００ｍｓのパルス持続時間で、導入プラスミドの一過性発現が見られ、７０ｋＤａのＦＩＴＣ−デキストランに対する高い膜透過性が確認された。
【０２１５】
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａなどの微生物におけるトランス遺伝子発現の例が文献に見いだされる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３５（１９９７），ｐｐ．３５６−３６２；Ｓｈｅｎｇ  Ｗｕ  Ｇｏｎｇ  Ｃｈｅｎｇ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ．２０００  Ｊｕｌ；１６（４）：４４３−６；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３８（１９９９），ｐｐ．３３５−３４１；Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００６）７２：１９７−２０５；Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４，６３−７３，２００２；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３９：５，３６５−３７０（２００１）；Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １８：９，７７８−７８０，（１９９９）；Ｂｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｉｕｍ  ４２（２）：２０９−２１６，（１９９９）；Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ．Ｊ  ２１（１）：１３−２０，（２００５）を参照）。また本明細書の実施例も参照されたい。
【０２１６】
油産生酵母（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるトランス遺伝子発現の例が文献に見いだされる（例えば、Ｂｏｒｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｊｕｎ  ２７（２００７）を参照)。真菌（例えば、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎｅ、Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）におけるトランス遺伝子発現の例も文献に見いだされる（例えば、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｌ；１５３（Ｐｔ．７）：２０１３−２５（２００７）；Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｊｕｎ；２７１（５）：５９５−６０２（２００４）；Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ，Ｍａｒ；２１（３）：２１５−２３（１９９２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３０（２）：８３−８６（１９９５）；Ｓａｋｕｒａｄａｎｉ，ＮＩＳＲ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒａｎｔ，「Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｕｓｅｆｕｌ  Ｌｉｐｉｄ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ」（２００４）;及び国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１２０２１号を参照)。大腸菌(Ｅ．ｃｏｌｉ)などの細菌における外来遺伝子発現の例がよく知られており、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（第３版，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。
【０２１７】
本発明による微生物の形質転換のためのベクターを、当業者によく知られた既知の技術により調製することができる。複数のＣｈｌｏｒｅｌｌａ種の形質転換に使用される構築物のヌクレオチド配列は配列番号８に対応する。一実施形態では、微細藻類などの微生物内でのリパーゼ遺伝子発現のための例示的なベクターの設計は、微細藻類内で活性なプロモーターと動作可能に連結したリパーゼをコードする遺伝子を含む。あるいは、ベクターが、目的の遺伝子と動作可能に連結したプロモーターを含まない場合、遺伝子を、ベクターの組み込み位置で内在するプロモーターに動作可能に連結するように、細胞内で形質転換することができる。プロモーターを用いずに形質転換する方法は、微細藻類でうまく働くことがわかっている（例えば、Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １４：４，（１９９８），ｐｐ．４４１−４４７Pを参照）。またベクターは、例えば抗生物質又は除草剤、すなわち選択マーカーに対する耐性を付与するタンパク質をコードする第２の遺伝子も含み得る。場合により、一方又は両方の遺伝子の後に、ポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳配列が続く。２つの遺伝子をコードする発現カセットは、ベクター内で物理的に連結されているか、又は別々のベクター上にあり得る。また微細藻類の共形質転換を利用することもでき、この方法では、別個のベクター分子を同時に用いて細胞を形質転換する（例えば、Ｐｒｏｔｉｓｔ  ２００４  Ｄｅｃ；１５５（４）：３８１−９３を参照）。耐性カセットを欠く細胞が成長しない条件下、抗生物質又はその他の選択マーカーの存在下で成長する能力に基づいて、形質転換細胞を任意に選択することができる。
【０２１８】
（２．操作方法−相同組み換え）
相同組み換えは、相補的ＤＮＡ配列を整列させ、相同領域の置き換えを可能にすることである。標的となるゲノム配列（「テンプレート」）と同種の配列を含むトランスジェニックＤＮＡ（「ドナー」）を有機体に導入し、次いで、対応するゲノム同種配列の部位にあるゲノムで組み換えが起こる。このプロセスの機構的な工程は、ほとんどの場合、（１）同種ＤＮＡセグメントを対にすることと；（２）ドナーＤＮＡ分子内に二本鎖開裂部分を導入することと；（３）自由になったドナーＤＮＡ末端が、テンプレートＤＮＡ分子に侵入した後、ＤＮＡ合成が起こることと；及び（４）二本鎖開裂部分の修復事象が起こり、最終的な組み換え産物が得られることとを含む。
【０２１９】
宿主生物で相同組み換えを行う能力は、分子の遺伝子レベルで行うことができ、用途に応じた油を産生することができる油産生微生物の生成に有用であるといった多くの実用的意義がある。相同組み換えは、それ自体の本来の性質により、正確な遺伝子標的事象であり、従って、同じ標的配列を用いて作られたほとんどのトランスジェニック系は、表現型の観点では本質的に同一であり、それほど多くの形質転換事象をスクリーニングする必要はない。また、相同組み換えは、遺伝子が宿主の染色体に挿入される事象を標的としており、これにより、遺伝子の選択が存在しない状態であっても、優れた遺伝子安定性が得られる。染色体上の遺伝子座が異なることは、異種プロモーター／ＵＴＲに由来するものであっても、遺伝子発現に影響を与えると考えられるため、相同組み換えは、よく知られていないゲノム環境にある遺伝子座を検索し、これらの環境が遺伝子発現に与える影響を評価する方法になり得る。
【０２２０】
相同組み換えを用いる特に有用な遺伝子操作は、プロモーター／ＵＴＲなどの選択特異的な宿主制御エレメントが、非常に特異的な様式で異種遺伝子を発現させることである。例えば、選択マーカーをコードする異種遺伝子を用いたデサチュラーゼ遺伝子／遺伝子ファミリーの切除又はノックアウトにより、宿主細胞内で産生される飽和脂肪酸の全体的な百分率が増加すると予想される。実施例１１は、相同組み換え標的構築物、及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおいて生じるかかるデサチュラーゼ遺伝子の切除又はノックアウトの実施例を記載している。
【０２２１】
相同組み換えが、正確な遺伝子標的事象であるため、十分なフランキング領域が特定されていれば、目的の遺伝子又は領域の中にある任意のヌクレオチドを正確に改変するために用いることができる。従って、相同組み換えは、ＲＮＡ及び／又はタンパク質の遺伝子発現に影響を及ぼす制御配列を改変する手段として用いることもできる。また、相同組み換えは、基質特異性、親和性及びＫｍなどの酵素活性を改変する試みにおいて、タンパク質コード領域を改変するために用いることもでき、これにより、宿主細胞の代謝に望ましい変化を起こすことができる。相同組み換えは、遺伝子標的化、遺伝子変換、遺伝子欠失、遺伝子重複、遺伝子反転を生じるようにホストゲノムを操作し、プロモーター、エンハンサー、３’ＵＴＲなどの遺伝子発現制御エレメントを交換するための強力な手段を与える。
【０２２２】
相同組み換えは、内在する宿主細胞ゲノム内にある目的の遺伝子又は領域を「標的とする」ために、内在する配列の一部を含む標的構築物を用いることによって行うことができる。かかる標的配列は、目的の遺伝子又は領域の５’末端又は目的の遺伝子／領域の３’末端に位置することができ、又は目的の遺伝子／領域に隣接することさえもできる。かかる標的構築物を、さらなるベクター骨格を有する超らせん構造のプラスミドＤＮＡ、ベクター骨格を有さないＰＣＲ産物、又は線状分子のいずれかとして宿主細胞内で形質転換できる。ある場合には、まず制限酵素を用いて、トランスジェニックＤＮＡ（ドナーＤＮＡ）内にある同種配列にさらすことが有益となり得る。この工程によって、組み換え効率が増し、望ましくない事象の発生を減らすことができる。組み換え効率を高める他の方法としては、処理されるゲノム配列に対して同種の線状末端を含有する形質転換されたトランスジェニックＤＮＡを作成するためにＰＣＲを用いることが挙げられる。
【０２２３】
非限定的な例示の目的で、相同組み換えに有用なドナーＤＮＡ配列の領域としては、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓのＤＮＡのＫＥ８５８領域が挙げられる。ＫＥ８５８は１．３ｋｂのゲノムフラグメントであり、タンパク質のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）ファミリーと相同性を共有するタンパク質のコード領域の一部を含む。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ１４３５）ゲノム内にＫＥ８５８配列が単一コピーで存在することが、サザンブロット法により示されている。この領域及びこの領域を相同組み換え標的化で使用した例が、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／６６１４２号に記載されている。ドナーＤＮＡの別の有用な領域は、６Ｓ領域ゲノム配列の一部分である。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｍｉｓの相同組み換えにおけるこの配列の使用を、以下の実施例に記載する。
【０２２４】
（３．ベクター及びベクター成分）
本発明に従う微生物の形質転換用ベクターは、本明細書の開示を考慮して、当業者には有名な既知の技術によって調製することができる。ベクターは、典型的には、１つ又はそれ以上の遺伝子を含有しており、それぞれの遺伝子は、望ましい産成物（遺伝子産物）を発現するようにコードし、この遺伝子発現を制御し、組み換え細胞内の特定の位置に向かうように遺伝子産物を標的化する、１つ又はそれ以上の制御配列に動作可能に連結している。読者の助けとなるように、本節をいくつかの項に分けている。Ａ項は、制御配列、典型的には、ベクター上に含まれている制御配列、及び本発明によって提供される新規制御配列について記載している。Ｂ項は、遺伝子、典型的には、ベクターに含まれる遺伝子、及び新規コドン最適化方法、及び本発明によって提供される方法によって調製される遺伝子について記載している。
【０２２５】
（Ａ．制御配列）
制御配列は、コード配列の発現を制御するか、又は遺伝子産物を、細胞内又は細胞外の特定の位置に向かわせる核酸である。発現を制御する制御配列としては、例えば、コード配列の転写を制御するプロモーター、コード配列の転写を止めるターミネーターが挙げられる。別の制御配列は、コード配列の末端に位置する３’非翻訳配列であり、ポリアデニル化シグナルをコードする。遺伝子産物を特定の位置に向かわせる制御配列としては、シグナルペプチドをコードする配列が挙げられ、この配列は、細胞内又は細胞外の特定の位置に、この配列が結合したタンパク質を向かわせる。
【０２２６】
従って、微細藻類において外来遺伝子を発現するような例示的なベクターの設計は、望ましい遺伝子産物（例えば、選択可能なマーカー、脂質経路改変酵素、又はショ糖利用酵素）のためのコード配列を、微細藻類内で活性なプロモーターと動作可能に連結した状態で含む。又は、ベクターが、目的のコード配列と動作可能に連結したプロモーターを含まない場合、コード配列を、ベクターの組み込み位置で内在するプロモーターに動作可能に連結するように、細胞内で形質転換することができる。プロモーターを用いずに形質転換する方法は、微細藻類でうまく働くことがわかっている（例えば、Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １４：４、（１９９８）、ｐｐ．４４１−４４７を参照）。
【０２２７】
多くのプロモーターは、微細藻類内で活性であり、形質転換される藻に内在するプロモーター、形質転換される藻に内在しないプロモーター（すなわち、他の藻に由来するプロモーター、高等植物に由来するプロモーター、植物ウイルス又は藻ウイルスに由来するプロモーター）を含む。微細藻類内で活性な、具体的な外来のプロモーター及び／又は内在するプロモーター（微細藻類中で機能する抗生物質耐性のある遺伝子）は、国際公開第２００８／１５１１４９号及びこの明細書に引用されている参考文献に記載されている）。
【０２２８】
外来遺伝子を発現させるために用いられるプロモーターは、その外来遺伝子に天然で連結しているプロモーター又は異種遺伝子であり得る。ある種のプロモーターは、複数の微細藻類種において活性である。他のプロモーターは、種に特異的である。具体的なプロモーターとしては、以下の実施例で用いられる、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉに由来するβ−チューブリンなどのプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣＭＶ）及びクロレラウイルスなどの、微細藻類の複数の種の中で活性であることが示されているウイルスプロモーターが挙げられる（例えば、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２００５  Ｍａｒ；２３（１０−１１）：７２７−３５；Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５  Ａｕｇ；４３（４）：３６１−５；Ｍａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（ＮＹ）．２００２  Ｊａｎ；４（１）：６３−７３）。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ内で外来遺伝子を発現させるのに適切な別のプロモーターは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａグルタミン酸脱水素酵素プロモーター／５’ＵＴＲである。場合により、これらの配列のうち、プロモーターを含有し、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、又は６０ヌクレオチド、又はそれ以上が使用される。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ内で外来遺伝子を発現させるのに有用な代表的なプロモーターは、本明細書の配列表に列挙されており、例えば、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ＨＵＰ１遺伝子のプロモーター（配列番号１）、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ硝酸還元酵素プロモーター（配列番号２）がある。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａウイルスプロモーターを、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ内で遺伝子を発現させるために用いることもでき、例えば、米国特許第６，３９５，９６５号の配列番号１〜７が挙げられる。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ内で活性なさらなるプロモーターは、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９４  Ｏｃｔ  １４；２０４（１）：１８７−９４；Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９４  Ｏｃｔ；２６（１）：８５−９３；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００４  Ａｕｇ  １５；３２６（１）：１５０−９；及び、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００４  Ｊａｎ  ５；３１８（１）：２１４−２３に見いだすことができる。他の有用なプロモーターは、下の実施例に詳細に記載されている。
【０２２９】
プロモーターは、一般的に、構成的であるか又は誘発性であると特徴づけることができる。構成的プロモーターは、一般的に、常に（又は、細胞周期の特定の時期に）同じレベルで活性であるか又は発現誘導的に機能する。誘発性プロモーターは、これとは異なり、刺激に応答したときのみ活性（若しくは不活性化）であるか、又は顕著に上方調節若しくは下方調節される。どちらの種類のプロモーターも、本発明の方法での用途がある。本発明で有用な誘発性プロモーターとしては、例えば、外から与えられる低分子（例えば、配列番号１の場合には、グルコース）、温度（熱いか、又は冷たい）、培養培地中の窒素不足などの刺激に応答して、動作可能に連結した遺伝子の転写に介在するプロモーターが挙げられる。適切なプロモーターは、本質的にサイレント遺伝子である遺伝子の転写を活性化させることができるか、又は、低濃度で転写されるような動作可能に連結した遺伝子の転写を上方調節し、好ましくは、かなり上方調節することができる。以下の実施例は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞において有用なさらなる誘発性プロモーターを記載している。
【０２３０】
停止領域の制御配列の包含は任意であり、利用される場合には、停止領域は比較的置き換え可能であるため、その選択は、主に簡便なものである。停止領域は、転写開始領域（プロモーター）に由来するものであってもよく、目的のＤＮＡ配列に由来するものであってもよく、又は、別の供給源から得られるものであってもよい。例えば、Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｒｏｚｃｏ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８８）１６：８４１１。
【０２３１】
また、本発明は、制御配列及び組み換え遺伝子及び両者を含むベクターを提供し、これらは目的の遺伝子の区画化された発現を提供する。標的とするための細胞小器官は、葉緑体、プラスチド、ミトコンドリア、小胞体である。それに加え、本発明は、制御配列及び組み換え遺伝子及び両者を含むベクターを提供し、これらは細胞の外側でタンパク質を分泌する。
【０２３２】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａの核ゲノム内で発現するタンパク質は、プラスチド標的シグナルを用い、プラスチドを標的とすることができる。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａに内在するプラスチド標的配列は知られており、例えば、プラスチドを標的とするタンパク質をコードする、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ核ゲノム内の遺伝子、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ６４６１９７及びＡＦ４９９６８４が挙げられ、一実施形態では、かかる制御配列を本発明のベクターで使用し、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａプラスチドでのタンパク質発現を標的とする。
【０２３３】
以下の実施例は、宿主細胞の正しい区画に異種タンパク質を向かわせるために、プラスチド標的配列を使用することを記載している。ｃＤＮＡライブラリーは、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｄｉｅｓ細胞を用いて作られ、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号に記載されている。
【０２３４】
本発明の別の実施形態では、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ内でのポリペプチドの発現は、小胞体を標的としている。発現ベクター内の適切な保持シグナル又は選別シグナルによって、タンパク質が確実に小胞体（ＥＲ）に保持され、ゴルジ体の下流には行かない。例えば、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ  ＵＲ−Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのＩＭＰＡＣＴベクター１．３ベクターは、周知のＫＤＥＬ保持シグナル又は選別シグナルを含んでいる。このベクターを用いてＥＲを保持すると、発現レベルが５倍又はそれ以上に改善されると報告されているという点で、実益がある。この現象の主な理由は、ＥＲが、細胞質に存在するプロテアーゼより低い濃度のプロテアーゼを含んでいるか、及び／又は、細胞質に存在するプロテアーゼとは異なる、発現タンパク質の翻訳後分解に関与するプロテアーゼを含んでいるからだと思われる。緑色微細藻類内で機能するＥＲ保持シグナルが知られている。例えば、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００５  Ａｐｒ  ２６；１０２（１７）：６２２５−３０を参照。
【０２３５】
本発明の別の実施形態では、ポリペプチドは、細胞から出て、培地に分泌することを標的としている。本発明の方法に従ってＰｒｏｔｏｔｈｅｃａで使用することが可能な、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ内で活性な分泌シグナルの例については、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３８（１９９９）、ｐｐ．３３５−３４１を参照。
【０２３６】
多くのプロモーターは微細藻類内で活性であり、形質転換される藻類に内在するプロモーター、並びに形質転換される藻に内在しないプロモーター（すなわち、他の藻類由来のプロモーター、高等植物由来のプロモーター、植物ウイルス又は藻ウイルス由来のプロモーター）を含む。微細藻類内で活性な外来のプロモーター及び／又は内在するプロモーター、並びに微細藻類中で機能する抗生物質耐性遺伝子は、例えば、Ｃｕｒｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９７  Ｄｅｃ；３５（６）：３５６−６２（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）；Ｍａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（ＮＹ）．２００２  Ｊａｎ；４（１）：６３−７３（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）；Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１９９６  Ｏｃｔ  １６；２５２（５）：５７２−９（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）；Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９６  Ａｐｒ；３１（１）：１−１２（Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ）；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９４  Ｎｏｖ  ２２；９１（２４）：１１５６２−６（Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ）；Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅ  Ａ，Ｃａｓｏｔｔｉ  Ｒ，Ｌｅｂｌａｎｃ  Ｃ，Ａｂｒｅｓｃｉａ  Ｃ，Ｂｏｗｌｅｒ  Ｃ，ＰＭＩＤ：１０３８３９９８，１９９９  Ｍａｙ；１（３）：２３９−２５１（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｔａｚｉｏｎｅ  Ｚｏｏｌｏｇｉｃａ，Ｖｉｌｌａ  Ｃｏｍｕｎａｌｅ，Ｉ−８０１２１  Ｎａｐｌｅｓ，Ｉｔａｌｙ）（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ及びＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｗｅｉｓｓｆｌｏｇｉｉ）；Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００２  Ｍａｙ；１２９（１）：７−１２．（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００３  Ｊａｎ  ２１；１００（２）：４３８−４２．（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９０  Ｆｅｂ；８７（３）：１２２８−３２．（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）；Ｎｕｃｌｅｉｄ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９２  Ｊｕｎ  ２５；２０（１２）：２９５９−６５；Ｍａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（ＮＹ）．２００２  Ｊａｎ；４（１）：６３−７３（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ．１９９５  Ａｕｇ；３６（５）：１０２５−３５（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）；Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５  Ａｕｇ；４３（４）：３６１−５（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）；Ｙｉ  Ｃｈｕａｎ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ．２００５  Ａｐｒ；３２（４）：４２４−３３（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）；Ｍａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（ＮＹ）．１９９９  Ｍａｙ；１（３）：２３９−２５１．（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ及びＰｈａｅｄａｃｔｙｌｕｍ）；Ｋｏｋｓｈａｒｏｖａ，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００２  Ｆｅｂ；５８（２）：１２３−３７（様々な種）；Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００４  Ｆｅｂ；２７１（１）：５０−９（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃ���ｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｅｓ）；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（２０００），１８２，２１１−２１５；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２００３  Ａｐｒ  ２５；２２１（２）：１５５−９；Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９４  Ｊｕｎ；１０５（２）：６３５−４１；Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９５  Ｄｅｃ；２９（５）：８９７−９０７（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２）；Ｍａｒ  Ｐｏｌｌｕｔ  Ｂｕｌｌ．２００２；４５（１−１２）：１６３−７（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９８４  Ｍａｒ；８１（５）：１５６１−５（Ａｎａｂａｅｎａ（様々な株））；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００１  Ｍａｒ  ２７；９８（７）：４２４３−８（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）；Ｗｉｒｔｈ，Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  １９８９  Ｍａｒ；２１６（１）：１７５−７（様々な種）；  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００２  Ｊｕｎ；４４（６）：１５１７−３１及びＰｌａｓｍｉｄ，１９９３  Ｓｅｐ；３０（２）：９０−１０５（Ｆｒｅｍｙｅｌｌａ  ｄｉｐｌｏｓｉｐｈｏｎ）；Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｇｅｎｅ  １２４：７５−８１（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）；Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏ．２２：１５−２０；Ｊａｒｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔ．１９：３１７−３２２（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）により記載されており、さらなるプロモーターに関しては、米国特許第６，０２７，９００号の表１も参照されたい。
【０２３７】
外来遺伝子を発現させるために用いられるプロモーターは、その遺伝子に天然で連結しているプロモーター又は異種遺伝子であり得る。ある種のプロモーターは、複数の微細藻類種において活性である。他のプロモーターは種特異的である。好ましいプロモーターとしては、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉに由来するＲＢＣＳ２などのプロモーター、並びにカリフラワーモザイクウイルス（ＣＭＶ）及びクロレラウイルスなどのウイルスプロモーターが挙げられ、これらは複数種の微細藻類において活性であることが示されている（例えば、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２００５  Ｍａｒ；２３（１０−１１）：７２７−３５；Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５  Ａｕｇ；４３（４）：３６１−５；Ｍａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（ＮＹ）．２００２  Ｊａｎ；４（１）：６３−７３を参照）。他の実施形態では、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓリンゴ酸デヒドロゲナーゼプロモーター、配列番号１５０の任意の部分を含む核酸、又はＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ＲＢＣＳ２プロモーター（配列番号１５１）を使用することができる。場合により、プロモーターを含有するこれらの配列のうち、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０又は６０ヌクレオチド、又はそれ以上のものが使用される。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ属の種に内在する好ましいプロモーターは、配列番号１及び配列番号２である。
【０２３８】
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ内で外来遺伝子を発現させるのに有用な好ましいプロモーターは、本願の配列表に列挙されており、例えば、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ＨＵＰ１遺伝子のプロモーター（配列番号１）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ硝酸還元酵素プロモーター（配列番号２）がある。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａウイルスプロモーターを使用して、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ内で遺伝子を発現させることもでき、例えば、米国特許第６，３９５，９６５号の配列番号１〜７が挙げられる。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ内で活性のプロモーターはほかに、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９４  Ｏｃｔ  １４；２０４（１）：１８７−９４；Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９４  Ｏｃｔ；２６（１）：８５−９３；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００４．２００４  Ａｕｇ  １５；３２６（１）：１５０−９；及びＶｉｒｏｌｏｇｙ．２００４  Ｊａｎ  ５；３１８（１）：２１４−２３に見いだすことができる。
【０２３９】
（Ｂ．遺伝子及びコドンの最適化）
典型的には、遺伝子は、プロモーターと、コード配列と、停止制御配列とを含む。組み換えＤＮＡ技術によって組み立てられる場合、遺伝子は、発現カセットと呼ばれることもあり、組み換え遺伝子を宿主細胞に導入するために使用されるベクターに簡便に挿入するために、制限配列に隣接していてもよい。発現カセットは、ゲノム由来のＤＮＡ配列、又は相同組み換えにいよって発現カセットをゲノムに安定に組み込みやすくすることを標的とした他の核酸に隣接していてもよい。又は、ベクター及びその発現カセットは、組み込まれないままであってもよく、この場合には、ベクターは、典型的には、異種ベクターＤＮＡを複製するために与えることができるような、複製起源を含んでいてもよい。
【０２４０】
ベクター上に存在する共通の遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子であり、この発現によって、このタンパク質を含有する組み換え細胞が、このタンパク質を発現しない細胞と分化する。このような遺伝子、及びその対応する遺伝子産物は、選択可能なマーカーと呼ばれる。任意のさまざまな選択可能なマーカーが、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａを形質転換するのに有用なトランス遺伝子構築物中で用いられてもよい。適切な選択可能なマーカーの例としては、Ｇ４１８耐性遺伝子、硝酸還元酵素遺伝子（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３５：３５６−３６２を参照）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＰＴ；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）、Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：６３−７３を参照）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、フレオマイシン対する耐性を付与するｂｌｅ遺伝子（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７２：１９７−２０５）、及びカナマイシンに対する耐性を付与するアミノグリコシド−３’−Ｏ−ホスホトランスフェラーゼ（配列番号１９４）が挙げられる。微細藻類の抗生物質に対する感度を決める方法はよく知られている。例えば、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１９９６  Ｏｃｔ  １６；２５２（５）：５７２−９。
【０２４１】
抗生物質系でない他の選択マーカーもまた、一般に、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種を含めた微細藻類を形質転換するのに有用なトランス遺伝子構築物中で用いることができる。微細藻類がこれまで利用することができなかった特定の炭素源を利用する能力を付与する遺伝子も、選択マーカーとして用いることができる。例として、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株は典型的には、ショ糖では、たとえ成長しても良好ではない。ショ糖インベルターゼ遺伝子を含む構築物を用いることにより、陽性の形質転換体がショ糖を炭素基質として成長する能力を付与することができる。他の選択マーカーとともに選択マーカーとしてショ糖利用を用いることに関するさらなる詳細は、以下の第４節で述べられている。
【０２４２】
本発明の目的のために、本発明の組み換え宿主細胞を調製するために用いられる発現ベクターは、遺伝子のひとつが選択可能なマーカーである場合、少なくとも２個、多くは３個の遺伝子を含んでいるだろう。例えば、本発明の遺伝子改変されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａは、選択可能なマーカーに加え、例えば、ショ糖インベルターゼ遺伝子又はアシルＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子のような１つ以上の外来遺伝子を含む本発明のベクターで形質転換させることによって作られてもよい。１個又は全部の遺伝子が、誘発性プロモーターを用いて発現してもよく、これにより、これらの遺伝子が発現する相対的なタイミングを制御し、脂質収量及び脂肪酸エステルへの変換を高めることができる。２種以上の外来遺伝子の発現は、同じ誘発性プロモーターで制御されていてもよく、異なる誘発性（又は構成的）プロモーターで制御されていてもよい。後者の状況では、第１の外来遺伝子の発現は、第１の期間に誘発されてもよく（この間に、第２の外来遺伝子の発現が誘発されてもよく、誘発されなくてもよく）、第２の外来遺伝子の発現は、第２の期間に誘発されてもよい（この間に、第１の外来遺伝子の発現が誘発されてもよく、誘発されなくてもよい）。
【０２４３】
他の実施形態では、２種以上の外来遺伝子（任意の選択可能なマーカーに加えて）は、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及び脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素、アルコール産物を与えるこれらの組み合わせ作用である。さらに、限定されないが、アルデヒドを生成するための脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及び脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素のような他の外来遺伝子の組み合わせも提供される。一実施形態では、ベクターは、アルカンを生成するための、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素、脂肪族アルデヒド脱炭酸酵素の組み合わせを与える。これらのそれぞれの実施形態では、１つ以上の外来遺伝子が、誘発性プロモーターを用いて発現してもよい。
【０２４４】
２種以上の外来遺伝子を発現する、他の代表的な本発明のベクターとしては、ショ糖トランスポーター及びショ糖インベルターゼ酵素の両方をコードするベクター、選択可能なマーカーと、分泌されたショ糖インベルターゼとの両方をコードするベクターが挙げられる。いずれかの種類のベクターで形質転換された組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａは、サトウキビ（サトウキビから誘導される糖類）を炭素源として使用する能力が操作されているため、低い製造コストで脂質を産生する。上述の２種類の外来遺伝子の挿入は、定方向変異誘発法及び／又はランダム変異導入法によって多糖生合成を乱すことと組み合わせることができ、脂質産生へと進む炭素の流れが大きくなる方向に進む。個々に、及び組み合わせて、栄養転換、脂質の産生を変えるような操作、外来の酵素を用いた処理によって、微生物が産生する脂質の組成が変わる。この変化によって、産生する脂質の量、他の脂質に対する的な１つ以上の炭化水素種の相対量、及び／又は微生物が産生する脂質種の種類を変えることができる。例えば、微細藻類を、ＴＡＧの量及び／又は割合を増やすように操作することができる。
【０２４５】
組み換えタンパク質の最適な発現のために、形質転換されるべき宿主細胞で優先的に用いられるコドンを用いてｍＲＮＡを生成するコード配列を利用することが有益である。従って、トランス遺伝子の適切な発現は、トランス遺伝子のコドンの使用が、トランス遺伝子を発現する有機体の特定のコドンの偏りと適合していることが必要な場合がある。この影響の元になる正確な機構は多くあるが、利用可能なアミノアシル化されたｔＲＮＡプールと、細胞内で合成されるタンパク質との適切なバランス、この要求を満たす場合に、トランスジェニックメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をもっと効果的な翻訳との組み合わせを含む。トランス遺伝子内のコドンの使用が最適化されていない場合、利用可能なｔＲＮＡプールは、異種ｍＲＮＡの効率的な翻訳を可能にするのに十分ではなく、その結果、リボソームが失速し、停止し、トランスジェニックｍＲＮＡが不安定になる場合がある。
【０２４６】
本発明は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ内で組み換えタンパク質が首尾よく発現するのに有用な、コドンが最適化された核酸を提供する。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種内のコドンの使用を、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓから単離されたｃＤＮＡ配列を研究することによって分析した。この分析から、２４，０００を超えるコドンを調べ、以下の表２にその結果を示す。
【０２４７】
【表２】
0005996527.tif 000006
【０２４８】
他の実施形態では、組み換えベクター内の遺伝子は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ株以外の微細藻類株に関して言うと、コドンが最適化されている。例えば、微細藻類内で発現させるために遺伝子を記録する方法は、米国特許第７，１３５，２９０号に記載されている。コドンの最適化に関するさらなる情報は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋのコドン利用に関するデータベースが利用可能である。
【０２４９】
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ内での他の非限定的なコドンの使用の例を、それぞれ表２８、２９及び３０に示す。
【０２５０】
【表２８】
0005996527.tif 000007
【０２５１】
【表２９】
0005996527.tif 000008
【０２５２】
【表３０】
0005996527.tif 000009
【０２５３】
（Ｃ．誘発性発現）
また本発明は、目的の遺伝子を発現させる誘発性プロモーターの使用も提供する。具体的には、例えば、細胞の破壊、反応混合物の水含有量の減少、及び／又はＴＡＧから脂肪酸エステルへの変換の促進に十分なアルコール添加後にエステル転移反応を増強するよう、必要に応じて条件が調節されていれば、リパーゼ遺伝子を発現させる誘発性プロモーターの使用により、微生物の成長後にリパーゼの産生が可能となる。
【０２５４】
本発明で有用な誘発性プロモーターとしては、例えば、外から与えられる低分子（例えば、配列番号１に記載のグルコース）、温度（熱いか、又は冷たい）、光などの刺激に応答して、動作可能に連結した遺伝子の転写に介在するプロモーターが挙げられる。適切なプロモーターは、本質的にサイレントな遺伝子の転写を活性化させることができるか、又は、低レベルで転写される動作可能に連結した遺伝子の転写を上方調節し、好ましくは大幅に上方調節することができる。後者の場合には、リパーゼの転写レベルが、リパーゼを発現する微生物の成長をあまり阻害しないことが好ましい。
【０２５５】
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａヘキソーストランスポーター遺伝子（配列番号１）を駆動するプロモーターなどのプロモーターにより、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａでのトランス遺伝子発現を誘発的に行うことができる。このプロモーターは、培養培地中にグルコースが存在することにより強力に活性化される。
【０２５６】
（Ｄ．２種又はそれ以上の外来遺伝子の発現）
さらに、遺伝子操作された微細藻類などの微生物は、例えば一方が多糖分解酵素をコードする、例えばリパーゼ遺伝子と溶解遺伝子など、２種又はそれ以上の外来遺伝子を含み、発現し得る。誘発性プロモーターを用いて一方又は両方の遺伝子を発現させることができ、これにより、これらの遺伝子が発現する相対的なタイミングを制御して、脂質収量及び脂肪酸エステルへの変換を高めることができる。２種又はそれ以上の外来遺伝子の発現は、同じ誘発性プロモーターの制御下にあっても、異なる誘発性プロモーターの制御下にあってもよい。後者の場合、第１の外来遺伝子の発現が第１の期間に誘発され得（この間、第２の外来遺伝子の発現は誘発されても、されなくてもよい）、第２の外来遺伝子の発現が第２の期間に誘発され得る（この間、第１の外来遺伝子の発現は誘発されても、されなくてもよい）。ショ糖を代謝するように脂質産生微生物を操作するためのベクター及び方法が本明細書で提供されるが、これは、操作された細胞がサトウキビ原材料を脂質に変換することを可能にするため、有利な形質である。
【０２５７】
例えば、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼと脂肪族アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素の作用の組み合わせによりアルコール産物が生成されるが、このような２種又はそれ以上の外来遺伝子を発現する、遺伝子操作された微生物株（例えば、微細藻類、油産生酵母、細菌又は真菌）も本明細書で提供される。さらに、アルデヒドを生成するための脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼと脂肪族アシル−ＣｏＡ還元酵素を含むがこれらに限定されない、外来遺伝子の他の組み合わせが提供される。さらに、本願は、アルカンを生成するための脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼと脂肪族アシル−ＣｏＡ還元酵素と脂肪族アルデヒド脱炭酸酵素の組み合せを提供する。１種又はそれ以上の外来遺伝子が誘発性プロモーターを用いて発現され得る。
【０２５８】
本発明での使用に適したさらなる改変の例としては、１つの遺伝子が固定炭素源（ショ糖など）のトランスポーターをコードし、第２の遺伝子がショ糖インベルターゼ酵素をコードする、２種又はそれ以上の外来遺伝子を発現するよう微細藻類株を遺伝子操作することが挙げられる。得られた発酵性微生物は、既知の生物学的炭化水素産成方法により得られるものよりも低い製造コストで炭化水素を産成する。上記２種の外来遺伝子の挿入を、定方向及び／又はランダム変異誘発法によって多糖生合成の崩壊と組み合わせることができ、これにより炭水化物産生へと進む炭素の流れがより大きくなる。栄養転換、炭水化物の産生を変える操作、外来酵素を用いた処理を個別に、及びそれらを組み合わせて行うことによって、微生物が産生する炭水化物の組成が改変される。この改変は、産生する炭水化物の量、産生された１つ又はそれ以上の炭化水素種の他の炭水化物に対する量、及び／又は微生物が産生する炭化水物種の種類における変化であり得る。例えば、ＴＡＧの産生量及び／又は率が上昇するよう微細藻類を操作することができる。
【０２５９】
（Ｅ．区画化された発現）
また本発明は、目的遺伝子の区画化された発現も提供する。具体的には、特定の実施形態では、リパーゼの発現を１つ以上の細胞内区画に標的化することが有利であり、この場合、リパーゼがエステル転移反応の開始まで大部分の細胞内脂質から隔離されている。標的とするのに好ましい細胞小器官は、葉緑体、ミトコンドリア及び小胞体である。
【０２６０】
（１）葉緑体での発現
本発明の一実施形態では、微生物内でのポリペプチド発現は、葉緑体を標的とする。葉緑体での異種遺伝子発現の標的化方法は既知であり、これを本発明で使用することができる。葉緑体への外来遺伝子産物の標的化方法は、Ｓｈｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８５）４：２５  ３２に記載されている。また、核遺伝子産物を葉緑体内に移動させるためのトランジットペプチドの使用に関して、Ｔｏｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３：１５１０４  １５１０９及び米国特許第４，９４０，８３５号も参照されたい。タンパク質の葉緑体への輸送を指示する方法もＫｅｎａｕｆ  ＴＩＢＴＥＣＨ（１９８７）５：４０  ４７で概説されている。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａに内在する葉緑体標的配列、例えば、葉緑体を標的とするタンパク質をコードする、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ核ゲノム内の遺伝子などが知られており、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ６４６１９７及びＡＦ４９９６８４を参照されたい。
【０２６１】
ＩＭＰＡＣＴＶＥＣＴＯＲ１．４ベクターは、ワーヘニンゲン大学の国際植物科学研究所（Wageningen UR-Plant Research International）により販売されており、これはＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍの小サブユニットタンパク質の分泌シグナルを用いて、二重膜系を横切って往復しながら異種タンパク質を葉緑体基質（細胞質）環境中に送達するものである。シグナルペプチドの適切なプロセシングを可能にするために、タンパク質が成熟ｒｕｂｉｓｃｏタンパク質の最初の１１のアミノ酸と融合されている（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０：８１−９３（１９９２））。シグナルペプチドは、ＲｂｃＳ遺伝子由来の天然のイントロンを含んでいる。
【０２６２】
別のアプローチでは、異種タンパク質を発現するように葉緑体ゲノムを遺伝子操作する。外来ＤＮＡでコーティングした高速タングステン微粒子のレシピエント細胞への撃ち込みを用いたＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ（緑藻類）葉緑体の安定な形質転換が記載されている。例えば、Ｂｏｙｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０：１５３４  １５３８；Ｂｌｏｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌ（１９８９）１：１２３−１３２及びＤｅｂｕｃｈｙ  ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８９）８：２８０３−２８０９を参照。タングステン微粒子を用いた形質転換技術は、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）（１９８７）７：７０  ７３により記載されている。植物及び微細藻類双方の葉緑体形質転換のその他の方法が知られている。例えば、米国特許第５，６９３，５０７号；第６，６８０，４２６号；及びＰｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００２  Ｍａｙ；１２９（１）：７−１２；及びＰｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ．２００７  Ｍａｙ；５（３）：４０２−１２を参照。
【０２６３】
米国特許第６，３２０，１０１号（２００１年１１月２０日、Ｋａｐｌａｎらに付与；参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、細胞あたりの葉緑体数を約１に減少するように細胞を化学的に処理することができる。次いで、葉緑体内に少なくとも１つの異種核酸分子を導入する目的で、異種核酸を粒子撃ち込みにより細胞内に導入することができる。葉緑体に内在する酵素により容易に達成される相同組み換えにより葉緑体ゲノム内に組み込まれるように異種核酸を選択する。この目的のために、異種核酸は、目的の遺伝子に加え、葉緑体ゲノムに由来する少なくとも１つの核酸配列を含む。さらに、異種核酸は典型的には、選択可能マーカーを含む。この技術に関連したさらなる詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，９４５，０５０号及び第５，６９３，５０７号に見いだされる。このようにして、葉緑体のタンパク質発現系によりポリペプチドが産生され得る。
【０２６４】
米国特許第７，１３５，６２０号（２００６年１１月１４日、Ｄａｎｉｅｌｌらに付与；参照により本明細書に組み込まれる）には、葉緑体発現ベクター及び関連する方法が記載されている。発現カセットは、コード配列と、葉緑体内でコード配列を適切に発現させるための適切な制御配列とを含むＤＮＡ構築物である。典型的な発現カセットは、以下の構成要素、すなわち、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を葉緑体内で転写及び翻訳させる、微生物遺伝子又はｐｓｂＡなどの葉緑体遺伝子由来の５’非翻訳領域；目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列；並びに導入遺伝子のＲＮＡを安定化し、これれによ外来遺伝子発現を増加させることができる、葉緑体遺伝子の３’逆方向反復領域などの翻訳及び転写停止領域を含む。カセットは、場合により、抗生物質耐性遺伝子を含み得る。
【０２６５】
典型的には、発現カセットは、適切なゲノム内への挿入に好都合な制限部位に隣接している。発現カセットは、特に相同組み換えによって、発現カセットが葉緑体ゲノムに安定的に組み込まれやすくするために、葉緑体ＤＮＡ由来のＤＮＡ配列に隣接することができる。あるいは、発現カセットは組み込まれていなくてもよく、その場合には、発現カセットは、典型的には、葉緑体内での異種ＤＮＡの複製をもたらすことができる葉緑体の複製起源を含む。
【０２６６】
発現カセットは一般に、葉緑体内で発現可能な遺伝子由来のプロモーター領域を含む。プロモーター領域は、葉緑体遺伝子から入手可能なプロモーター、例えばホウレンソウ若しくはエンドウマメ由来のｐｓｂＡ遺伝子又はトウモロコシ由来のｒｂｃＬ及びａｔｐＢプロモーター領域、並びにＲｒｎａプロモーターなどを含み得る。Ｈａｎｌｅｙ−Ｂｏｗｄｏｉｎ及びＣｈｕａ，ＴＩＢＳ（１９８７）１２：６７  ７０；Ｍｕｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ  Ｂｉｏｌ．（１９８５）４：３９  ５４；Ｈａｎｌｅｙ−Ｂｏｗｄｏｉｎ（１９８６）ＰｈＤ．Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，ｔｈｅ  Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ｋｒｅｂｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８２）１０：４９８５  ５００２；Ｚｕｒａｗａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８１）９：３２５１  ３２７０；並びにＺｕｒａｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８２）７９：７６９９  ７７０３にプロモーターの例が記載されている。プロモーターを含まないマーカー遺伝子の５’側に目的のプロモーターを置き、その有効性を、例えば比較的強力な葉緑体プロモーターであるｐｓｂＡ遺伝子由来プロモーターなどから得られる転写と比較して観察することにより、他のプロモーターを同定し、そのように同定されたプロモーターの相対的強度を評価することができる。任意の各種技術により、さらに異種遺伝子発現の効率を高めることができる。異種遺伝子の５’側に直列に挿入した複数のプロモーター、例えば二重ｐｓｂＡプロモーターの使用、エンハンサー配列の付加などがこれに含まれる。
【０２６７】
ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＣ＿００１８６５（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ葉緑体、完全ゲノム）に見いだされるプロモーターなど、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ葉緑体内で活性な多数のプロモーターを、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ葉緑体内での外来遺伝子発現に使用することができる。
【０２６８】
異種遺伝子の誘発的発現を生じさせることが望ましい場合、転写及び／又は翻訳レベルでの調節をもたらす配列を（３’末端に）含む誘発性プロモーター及び／又は５’非翻訳領域が発現カセットに含まれていてもよい。例えば、５’非翻訳領域は、光により発現が制御可能な遺伝子由来であり得る。同様に、３’逆方向反復領域を用いて、異種遺伝子のＲＮＡを安定化してもよい。誘発性遺伝子は、目的の特定刺激に応答して発現が増加するが、刺激の非存在下では発現が低下又は発現しないことにより同定され得る。例えば、光照射時に発現の増加が見られるが、その一方では、低光又は無光では発現は実質的に減少又は発現しない場合、光誘発性の遺伝子を同定することができる。緑色微細藻類由来の光制御プロモーターが知られている（例えば、Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００５  Ｄｅｃ；２７４（６）：６２５−３６を参照）。
【０２６９】
停止領域は葉緑体及び細菌の間で比較的互換性がるあるようにみえるため、停止領域の利用は、何よりもまず便利である。停止領域は、転写開始領域に由来するものであってもよく、目的のＤＮＡ配列に由来するものであってもよく、又は別の供給源から得られるものであってもよい。例えば、Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｒｏｚｃｏ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８８）１６：８４１１を参照されたい。
【０２７０】
発現カセットを、多数ある方法のいずれかにより目的の植物細胞内に形質転換してもよい。このような方法としては、例えば、微粒子銃による方法（例えば、Ｓａｎｆｏｒｄ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９８８）６：２９９  ３０２、米国特許第４，９４５，０５０号を参照）；エレクトロポレーション（Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９８５）８２：５８２４  ５８２８）；レーザービーム、マイクロインジェクション、又はＤＮＡを葉緑体に導入することが可能な任意の他の方法の使用が挙げられる。
【０２７１】
微細藻類などの微生物での使用に適した葉緑体発現ベクターに関するさらなる記載は、米国特許第７，０８１，５６７号（２００６年７月２５日、Ｘｕｅらに付与）；第６，６８０，４２６号（２００４年１月２０日、Ｄａｎｉｅｌｌらに付与）；及び第５，６９３，５０７号（１９９７年１２月２日、Ｄａｎｉｅｌｌらに付与）に見いだされる。
【０２７２】
葉緑体標的シグナルを用いて、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａの核ゲノム内で発現されるタンパク質を葉緑体に対して標的化することができる。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａに内在する葉緑体標的配列が知られており、例えば、葉緑体を標的とするタンパク質をコードする、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ核ゲノム内の遺伝子などがある（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ６４６１９７及びＡＦ４９９６８４を参照）。また、葉緑体ゲノムに遺伝子を直接挿入することにより、タンパク質をＣｈｌｏｒｅｌｌａ葉緑体内で発現させることもできる。葉緑体の形質転換は、典型的には相同組み換えによって起こり、葉緑体ゲノム配列が、標的化ベクターの作製において既知であれば実行可能である（例えば、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ葉緑体の完全ゲノム配列；Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＣ＿００１８６５を参照）。葉緑体の形質転換に関する詳細は、本明細書の前の節を参照されたい。
【０２７３】
（２）ミトコンドリアでの発現
本発明の別の実施形態では、微生物内でのポリペプチドの発現は、ミトコンドリアを標的とする。ミトコンドリアへの外来遺伝子産物の標的化方法（Ｂｏｕｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）（１９８７）３２８：３４０  ３４２）が記載されており、緑色微細藻類における方法がこれに含まれる（例えば、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１９９３  Ｊａｎ；２３６（２−３）：２３５−４４を参照）。
【０２７４】
例えば、適当な分泌シグナルをコードする発現ベクターは、異種タンパク質をミトコンドリアに対して標的化することができる。ワーヘニンゲン大学の国際植物科学研究所（Wageningen UR-Plant Research International）のＩＭＰＡＣＴＶＥＣＴＯＲ１．５ベクターは、ミトコンドリア基質内にタンパク質を送達することが示されている酵母ＣｏｘＩＶ分泌シグナルを使用する。シグナルペプチドの適切なプロセシングを可能にするために、タンパク質が酵母ＣｏｘＩＶタンパク質の最初の４つのアミノ酸と融合されている（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １１：６１３−６２１（１９９７））。緑色微細藻類内で機能するものを含めた他のミトコンドリア標的配列が知られている。例えば、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９０  Ｊａｎ  ２９；２６０（２）：１６５−８；及びＪ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００２  Ｆｅｂ  ２２；２７７（８）：６０５１−８を参照。
【０２７５】
ミトコンドリア標的シグナルを用いて、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａの核ゲノム内で発現されるタンパク質をミトコンドリアに対して標的化することができる。ミトコンドリアのタンパク質標的化及び形質転換に関する詳細は、本明細書の前の節を参照されたい。
【０２７６】
（３）小胞体での発現
本発明の別の実施形態では、微生物内でのポリペプチド発現は、小胞体を標的とする。発現ベクター内に適切な保持シグナル又は選別シグナルを含むことにより、タンパク質が確実に小胞体（ＥＲ）に保持され、下流のゴルジ体には行かない。例えば、ワーヘニンゲン大学の国際植物科学研究所（Wageningen UR-Plant Research International）のＩＭＰＡＣＴベクター１．３ベクターは、周知のＫＤＥＬ保持シグナル又は選別シグナルを含んでいる。このベクターを用いてＥＲに保持すれば、これが発現レベルを５倍又はそれ以上向上させることが報告されていることから、実用上の利点がある。この現象の主な理由は、ＥＲが、発現タンパク質の翻訳後の分解に関与するプロテアーゼを細胞質に存在するプロテアーゼよりも低い濃度で含んでいるか、及び／又は、細胞質に存在するプロテアーゼとは異なるプロテアーゼを含んでいるからだと思われる。緑色微細藻類内で機能するＥＲ保持シグナルが知られている。例えば、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００５  Ａｐｒ  ２６；１０２（１７）：６２２５−３０を参照。
【０２７７】
本発明の方法及び材料によって、外来遺伝子を微生物、例えばＰｒｏｔｏｔｈｅｃａに導入することが可能な場合、ショ糖の利用及び脂質経路の改変に関する遺伝子は、以下の章で記載するように、特に興味深い。
【０２７８】
（ＩＶ．選択可能マーカー）
（１．ショ糖の利用）
実施形態では、本発明の組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞は、１つ以上の外来のショ糖利用遺伝子をさらに含む。種々の実施形態では、１つ以上の遺伝子は、フルクトキナーゼ、グルコキナーゼ、ヘキソキナーゼ、ショ糖インベルターゼ、ショ糖トランスポーターからなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードする。例えば、ショ糖トランスポーター及びショ糖インベルターゼの発現によって、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａは、ショ糖を培地から細胞に移動させ、ショ糖を加水分解し、グルコース及びフルクトースを得ることができる。場合により、フルクトキナーゼは、内在するヘキソキナーゼ活性が、フルクトースの最大リン酸化には不十分であるような状況でも同様に発現することができる。適切なショ糖トランスポーター典枝は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＣＡＤ９１３３４、ＣＡＢ９２３０７、ＣＡＡ５３３９０である。適切なフルクトキナーゼの例は、寄託番号Ｐ２６９８４、Ｐ２６４２０、ＣＡＡ４３３２２である。
【０２７９】
一実施形態では、本発明は、ショ糖インベルターゼを分泌するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ宿主細胞を提供する。ショ糖インベルターゼの分泌は、ショ糖を細胞に移動させることが可能なトランスポーターを発現する必要性をなくす。というのは、分泌されたインベルターゼが、ショ糖分子をグルコース分子及びフルクトース分子に変換するのを触媒し、これらの分子が運ばれ、本発明によって提供される最近によって利用されるからである。例えば、分泌シグナル（例えば、配列番号４（酵母に由来する）、配列番号５（高等植物に由来する）、配列番号６（真核性のコンセンサス分泌シグナルなど）、配列番号７（高等植物及び真核性のコンセンサスに由来するシグナル配列の組み合わせ）を用いたショ糖インベルターゼ（例えば、配列番号３）の発現によって、インベルターゼ活性が細胞外で発生する。このようなタンパク質の発現は、本明細書に開示されている遺伝子操作方法によって可能となるが、それによって細胞外グルコースをエネルギー源としてすでに利用可能な細胞が、ショ糖を細胞外エネルギー源として利用することができる。
【０２８０】
ショ糖を含有する培地中でインベルターゼを発現するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ種は、油を生成するのに好ましい微細藻類の種である。この完全に活性なタンパク質の発現及び細胞外での標的化によって、得られた宿主細胞がショ糖を用いて成長し、一方、形質転換されていない対応する細胞は、ショ糖を用いて成長することができない。従って、本発明は、コドンが最適化されたインベルターゼ遺伝子、限定されないが、酵母インベルターゼ遺伝子が、インベルターゼ活性及びショ糖の加水分解によって評価される場合に、インベルターゼ遺伝子が発現するようにゲノムに組み込まれたものを含むＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ組み換え細胞を提供する。また、本発明は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ組み換え細胞がショ糖を用いて成長することが可能であり、形質転換されていない対応する細胞は、ショ糖を用いて成長することができないため、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ組み換え細胞内で選択可能なマーカーとして有用なインベルターゼ遺伝子も提供し、さらに、藻の分子の遺伝子学のために選択可能な強力なマーカーとしてインベルターゼを用いて、組み換え宿主細胞を選別する方法も提供する。
【０２８１】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ内でショ糖インベルターゼを首尾よく発現することも、異種（組み換え）タンパク質を、藻の細胞内で発現させることができ、細胞から外に出し、完全に活性で機能的な形態で培地に首尾よく移すことができるという点で、本発明の別の態様を示している。従って、本発明は、微細藻類内でさまざまで多様なタンパク質を発現させ、これらのタンパク質を宿主細胞の外で集める方法及び試薬を提供する。このようなタンパク質としては、例えば、工業用酵素、例えば、リパーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ（例えば、配列番号１９０〜１９１）、エステラーゼ、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ラクターゼ、異性化酵素、インベルターゼ、及び治療用タンパク質、例えば、成長因子、サイトカイン、２個の軽鎖と２個の重鎖を含む全長抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ（一本鎖可変フラグメント）、ｃａｍｅｌｌｉｄ型抗体、抗体フラグメント、抗体フラグメント融合物、抗体−受容体重合物、インスリン、インターフェロン、インスリン様成長因子が挙げられる。
【０２８２】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ内でショ糖インベルターゼを首尾よく発現させることも、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ内でタンパク質を分泌させるために、藻の中で真菌トランジットペプチドを使用するための方法及び試薬を提供し、あるペプチドを機能させるかどうかを決定する方法及び試薬、また、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞内でトランジットペプチドとして機能させる能力を提供するという点で、本発明の別の態様を示している。本発明の方法及び試薬を、タンパク質を細胞の外側に首尾よく移動させることができ、酵母インベルターゼがこれらの方法で大きな有用性を有するような他のトランジットペプチドを同定するためのツール及びプラットフォームとして用いることができる。この例で示されているように、内在する酵母インベルターゼトランジットペプチドの除去、及び宿主である藻に内在するか、又は他の供給源（真核性、原核性、ウイルス）に由来する他のトランジットペプチドによる置き換えによって、任意の目的のペプチドが、細胞から出て行くタンパク質を導くトランジットペプチドとして機能させることが可能かどうかを特定することができる。
【０２８３】
適切なショ糖インベルターゼの例としては、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＣＡＢ９５０１０、ＮＰ＿０１２１０４、ＣＡＡ０６８３９で特定されるものが挙げられる。適切なインベルターゼの非限定的な例を以下の表３に列挙している。それぞれの列挙したインベルターゼのアミノ酸配列は、以下の配列表に含まれている。ある場合には、本発明の方法及びベクターで使用するのに適した外来のショ糖利用遺伝子は、表３から選択されるショ糖インベルターゼとのアミノ酸同一性が少なくとも４０％、５０％、６０％、７５％、又は９０％、又はそれ以上であるショ糖インベルターゼをコードする。
【０２８４】
【表３】
0005996527.tif 000010
【０２８５】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａによって、インベルターゼを培地に分泌させると、細胞は、純粋な試薬グレードのグルコースを用いても成長するため、サトウキビの処理から得た廃棄糖液を用いても同様に細胞を成長させることができる。サトウキビ処理の価値の低い廃棄産物を用いることによって、脂質及び他の油の生成において、費用を顕著に節約することができる。従って、本発明は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ微生物の集合を含む微生物の培養物を提供し、この培養物は、（ｉ）ショ糖と、（ｉｉ）ショ糖インベルターゼ酵素とを含む。種々の実施形態では、培養物中のショ糖は、ソルガム、テンサイ、サトウキビ、糖液、又は解重合されたセルロース系材料に由来するものである（場合により、リグニンを含んでいてもよい）。別の態様では、本発明の方法及び試薬は、組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａが利用可能な原材料の数及び種類を顕著に増やす。ここに例示した細菌は、ショ糖を利用することができるように変えられているが、セルロース系のような原材料を、セルラーゼ、ペクチナーゼ、異性化酵素などを分泌する能力を有する本発明の操作された宿主細菌が利用することができるように、本発明の方法及び試薬を適用してもよく、その結果、酵素反応の分解産物に単純に耐え得るというだけではなく、宿主が炭素源として利用する。この一例が、以下に、並びに分泌型α−ガラクトシダーゼを発現するように操作され、農業廃棄物流中に見られる２つのオリゴ糖であるラフィノース及びスタキオースに含有されるものなど、オリゴ糖内のα−ガラクトシル結合を加水分解する能力を付与する微生物の実施例に記載されている。
【０２８６】
（２．α−ガラクトシダーゼ発現）
上記のように、ショ糖インベルターゼの発現により、炭素源としてショ糖をより効率的に利用する（二糖類であるショ糖のフルクトース分子とグルコース分子の間のα結合を加水分解する酵素を介した）能力がＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞に付与されるのに対し、オリゴ糖の他の種類のα結合を加水分解する他の酵素の発現により、他の炭素源を利用する能力がＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞に付与され得る。これらの炭素源で成長することができる陽性クローンの選択を可能にすることによって、これらの酵素の発現（及び結果として得られる、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ及びその他の微細藻類細胞が通常利用できない炭素源を利用する能力）を、上記のトランスジェニックＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞の選択可能マーカーとして用いることができる。
【０２８７】
ある実施形態では、本発明の組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞は、多糖分解酵素をコードする１種又は以上の外来遺伝子をさらに含む。様々な実施形態では、多糖分解酵素をコードする１種又はそれ以上の遺伝子は、分泌型α−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子である。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞での外来の分泌型α−ガラクトシダーゼの発現により、単糖単位のガラクトースとグルコースの間のα結合など、Ｄ−ガラクトシル結合を含む糖（炭素源）で成長する能力がかかる形質転換株に付与される。外来の分泌型α−ガラクトシダーゼを発現するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株は、メリビオース（α−Ｄ−ガラクトース−グルコースからなる二糖）などの二糖類を利用することができる。
【０２８８】
テンサイパルプ（ラフィノース）及び大豆ミール（スタキオース）などの農業廃棄物流中には、ラフィノース（α結合したガラクトース−グルコース−フルクトースからなる三糖）及びスタキオース（α結合した２つのＤ−ガラクトース単位と、それに続くα結合したグルコースとフルクトースとからなる四糖）のような糖がかなりの割合で存在する。かかる農業残渣には、それを利用することができる微生物（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａを含む）により油へ変換するための未利用の炭素源がかなり存在する。
【０２８９】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ株は、ラフィノース及びスタキオースなどのオリゴ糖を任意の相当量利用することは不可能であるか又はまったく利用不可能である。ラフィノース及びスタキオースの場合、ショ糖インベルターゼを発現するトランスジェニック株（上記のような）は、ショ糖のα−ガラクトシル誘導体のフルクトースとグルコースの間のα結合を加水分解する能力はあるが、ショ糖インベルターゼは前記糖の残りのα結合を切断せず、生じた二糖が利用できないため、残りのオリゴ糖は未利用のままである。別の実施形態では、本発明の組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞は、ショ糖インベルターゼをコードする外来遺伝子とα−ガラクトシダーゼをコードする外来遺伝子の両方を含む。したがって、ショ糖インベルターゼとα−ガラクトシダーゼの両方を発現する株は、ラフィノース及びスタキオースなどのオリゴ糖を完全に加水分解することが可能となり、モノマー成分を消費することができる。さらに、α−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を、形質転換の選択可能マーカーとして用いてもよい。外来性α−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むクローンは、メリビオースで成長する能力を有するようになる。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ株での使用に適したα−ガラクトシダーゼ遺伝子の例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓ由来のＭＥＬ１遺伝子、Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のＡｇｌＣ遺伝子が挙げられる。興味深いことに、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ株において好ましいコドンの使用に従って遺伝子を最適化しても、すべてのα−ガラクトシダーゼ遺伝子がＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ種で機能するわけではない。以下の実施例は、高等植物のＣｙａｍｏｐｓｉｓ  ｔｅｔｒａｇｏｎｏｂｏｌａ（グァー豆）由来のα−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子ではなく、コドンが最適化されたＳ．ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓ由来のＭＥＬ１遺伝子及びＡ．ｎｉｇｅｒ由来のＡｇｌＣ遺伝子で形質転換した場合にトランスジェニックＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞がメリビオースで成長する能力を有することを示している。
【０２９０】
（３．チアミン栄養要求性の補完）
Ｐｒｏｔｏｔｈｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓを含めたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株は、チアミン栄養要求性であることが知られており（例えば、Ｃｉｆｅｒｒｉ，Ｏ．（１９５６）Ｎａｔｕｒｅ，ｖ．１７８，ｐｐ．１４７５−１４７６を参照）、このことは、これらの株が成長するためには栄養培地中にチアミンを必要とするということを意味する。チアミン栄養要求性は、チアミン生合成経路の酵素の変異又は発現欠如の結果であり得る。チアミン生合成経路で欠けている酵素（１つ又は複数）を発現する補完されたトランスジェニック株はチアミンを添加しなくても成長することができ、よって、栄養培地のコストが低減されるだけでなく、得られる微細藻類バイオマスは動物栄養の観点からもより望ましいものとなる。またトランスジェニック遺伝子が、チアミンを含有しないプレート／培地で成長する能力を付与することから、チアミン生合成経路酵素による補完を選択可能マーカーとして用いてもよい。
【０２９１】
一実施形態では、本発明の組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞は、チアミン生合成経路の酵素をコードする１種又はそれ以上の外来遺伝子をさらに含む。別の実施形態では、本発明の組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞は、藻類、植物又はラン藻の供給源由来のヒドロキシメチルピリミジンホスフェート合成酵素をコードする外来遺伝子（例えば、配列番号１９２）を含む。さらに他の実施形態では、ヒドロキシメチルピリミジンホスフェート合成酵素は、ＴＨＩＣ遺伝子によりコードされている。さらに他の実施形態では、ＴＨＩＣ遺伝子は、Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ  Ｃ−１６９  ＴＨＩＣ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＨＩＣ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３  ＴＨＩＣ又はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ｓｔｒ．ＴＨＩＣ（配列番号１９３）である。以下の実施例では、チアミン原栄養性を回復したＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５の操作について詳述されている。
【０２９２】
（４．その他の選択可能マーカー）
多種多様な選択可能マーカーのいずれも、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａなどの微生物の形質転換に有用なトランス遺伝子構築物に用いることができる。適当な選択可能マーカーの例としては、硝酸還元酵素遺伝子、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＰＴ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、及びフレオマイシン耐性を付与するｂｌｅ遺伝子が挙げられる。微細藻類の抗生物質に対する感度決定方法はよく知られている。例えば、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１９９６  Ｏｃｔ  １６；２５２（５）：５７２−９。
【０２９３】
より具体的には、Ｄａｗｓｏｎら（１９９７），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３５：３５６−３６２（その内容全体が本明細書に参照により組み込まれる）は、ＮＲ欠損Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ変異株の選択可能マーカーとしてＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ由来の硝酸還元酵素（ＮＲ）遺伝子を使用することを記載している。Ｋｉｍら（２００２），Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：６３−７３（その内容全体が本明細書に参照により組み込まれる）は、Ｃｈｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの形質転換のための選択可能マーカーとしてＨＰＴ遺伝子を使用することを開示している。Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７２：１９７−２０５（その内容全体が本明細書に参照により組み込まれる）は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．ＤＴの選択可能マーカーとしてＳｈ  ｂｌｅを使用することを報告している。
【０２９４】
（Ｖ．脂質経路の操作）
ショ糖を含有する原材料のような原材料をＰｒｏｔｏｔｈｅｃａなどの微生物（例えば、油産生酵母、真菌又は細菌）が利用する能力を変えることに加え、本発明は、産生する脂質の性質及び／又は割合を変えるように改変された組み換え微生物（例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）も提供する。上述の経路は、さらに、又は上述のことに変えて、脂質の酵素処理によって産生する種々の脂質分子及び脂肪酸経路の中間体の性質及び／又は割合を変えるように改変されてもよい。種々の実施形態では、本発明の組み換え微生物（例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞）は、形質転換されていない対応する細胞と比較して、単位容積あたり及び／又は単位時間あたりの脂質収量が最適化されており、炭素鎖長（例えば、再生可能なディーゼルを生成するための、又は、脂質原材料を必要とする産業的な化学用途のための）を有しており、二重結合又は三重結合の数が減っており、場合によりゼロになっており、特定の脂質種又は個々の脂質の集合について、水素：炭素比が大きくなっている。さらに、かかる高品質の又は特異性の高い成分を生成するように、所望の炭化水素を生成する微生物を操作してもよい。
【０２９５】
微細藻類の場合、いくつかの野性型細胞は既に良好な成長特性を有しているが、所望の種類又は量の脂質を産生しない。例としては、Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ、Ａｇｍｅｎｅｌｌｕｍ、Ｃａｒｔｅｒｉａ、Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ、Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ、Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ｅｕｇｌｅｎａ、Ｓｐｉｒｏｇｙｒａ、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ、Ｔｅｔｒａｅｄｒｏｎ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ、Ｐｈａｇｕｓ及びＣｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍが挙げられるがこれらに限定されず、これらは都市の下水又は廃水で成長するという望ましい成長特性を有する。かかる細胞、及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａなどの種を操作して、脂質産生特性を向上させることができる。所望の特性としては、単位容積あたり及び／又は単位時間あたりの脂質収量、炭素鎖長（例えば、バイオディーゼル生成のための、又は、炭化水素原材料を必要とする産業用途のための）が最適化され、、二重結合又は三重結合の数が減少、場合によりゼロになり、環及び環状構造が除去されり、かつ特定の脂質種又は個々の脂質の集合について、水素：炭素比が上昇していることが挙げられる。さらに、適当な炭化水素を産生する微細藻類を操作して、炭化水素生産量をさらに望ましいものとすることができる。このような微細藻類の例としては、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ属及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の種が挙げられる。
【０２９６】
特定の実施形態では、脂肪酸の合成に対し、代謝における分岐点を制御するような１つ以上の鍵となる酵素を上方調節するか、又は下方調節し、脂質の産生を高める。上方調節は、例えば、転写を増やす強力なプロモーターエレメント及び／又はエンハンサーエレメントを用い、例えば、目的の酵素をコードする遺伝子が発現するような発現構築物を用いて細胞を形質転換することによって達成することができる。このような構築物は、形質転換体を選択することができるような選択可能なマーカーを含んでいてもよく、それにより、構築物が増幅され、コードされた酵素の発現量が増える。本発明の方法に従って上方調節するのに適した酵素の例としては、ピルビン酸をアセチル−ＣｏＡに変換する役割を担うピルビン酸脱水素酵素（例えば、微細藻類由来のもの、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＰ＿４１５３９２；ＡＡＡ５３０４７；Ｑ１ＸＤＭ１；ＣＡＦ０５５８７を含む）が挙げられる。ピルビン酸脱水素酵素を上方調節すると、アセチル−ＣｏＡの産生量が増え、それによって脂肪酸の合成量が増える。アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼは、脂肪酸合成の最初の工程を触媒する。従って、この酵素を上方調節すると、脂肪酸の産生量を増やすことができる（例えば、微細藻類由来のもの、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＢＡＡ９４７５２；ＡＡＡ７５５２８；ＡＡＡ８１４７１；ＹＰ＿５３７０５２；ＹＰ＿５３６８７９；ＮＰ＿０４５８３３；ＢＡＡ５７９０８を含む）。また、脂肪酸合成中に、アシル鎖を成長させるアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）を上方調節することによって、脂肪酸産生量を増やすこともできる（例えば、微細藻類由来のもの、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ａ０Ｔ０Ｆ８；Ｐ５１２８０；ＮＰ＿８４９０４１；ＹＰ＿８７４４３３を含む）。グリセロール−３−ホスフェートアシルトランスフェラーゼは、脂肪酸合成の律速工程を触媒する。この酵素を上方調節すると、脂肪酸の産生量を増やすことができる（例えば、微細藻類由来のもの、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＡＡ７４３１９；ＡＡＡ３３１２２；ＡＡＡ３７６４７；Ｐ４４８５７；ＡＢＯ９４４４２を含む）。
【０２９７】
遺伝子の上方調節及び／又は下方調節は、脂肪酸の生合成経路に関する遺伝子の発現を制御する包括的な制御因子に適用することができる。従って、脂肪酸合成の１つ以上の包括的な制御因子を、適切な場合に上方調節するか、又は下方調節し、それぞれ、複数の脂肪酸合成遺伝子の発現を阻害するか、又は高め、最終的に、脂質の産生量を増やすことができる。例としては、ステロール制御エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）、例えば、ＳＲＥＢＰ−１ａ及びＳＲＥＢＰ−１ｃ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＰ＿０３５６１０及びＱ９ＷＴＮ３を参照）。
【０２９８】
また、本発明は、脂質改変酵素、例えば、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、Ｃ．ｃａｌｌｏｐｈｙｌｌａ（配列番号１４５および配列番号１４６；表４も参照））、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素（表６を参照）、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素（表７を参照）、脂肪族アルデヒド脱炭酸酵素（表８を参照）、脂肪族アルデヒド還元酵素、デサチュラーゼ（例えば、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（例えば、コドンが最適化されたＲ．ｃｏｍｍｕｎｉｓの  ＳＡＤ、配列番号１４７および配列番号１４８）及び脂肪族アシルデサチュラーゼ及びスクアレンシンターゼ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ２０５７９１を参照）をコードする１つ以上の外来遺伝子を含むように改変された組み換え微生物（例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞）を提供する。ある実施形態では、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼと、自然に共発現するアシルキャリアータンパク質とをコードする遺伝子が、場合により、他の脂質改変酵素をコードする１つ以上の遺伝子とともに、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞内で形質転換される。他の実施形態では、ＡＣＰ及び脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、これらが特定の組織及び有機体で自然に共発現するか否かにかかわらず、両者が本発明の細菌及び方法で一緒に用いられると、利点を付与するような親和性を互いに有していてもよい。従って、本発明は、自然に共発現するこれらの酵素対、及び、ＡＣＰから特定の長さの炭素鎖が開裂しやすくなるように、互いに相互作用する親和性を有している酵素対を包含している。
【０２９９】
さらに他の実施形態では、デサチュラーゼをコードする外来遺伝子を、脂質の飽和度を変える他の脂質改変酵素をコードする１つ以上の遺伝子とともに、微生物（例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞）内で形質転換する。他の実施形態では、微生物（例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞）内で、内在するデサチュラーゼ遺伝子を過剰発現させる（例えば、遺伝子の追加のコピーを導入することにより）。ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＡＦ１５３０８；ＡＢＭ４５９１１；ＡＡＹ８６０８６）は、例えば、ステアロイル−ＡＣＰからオレイル−ＡＣＰへの変換を触媒する。この遺伝子を上方調節すると、細胞が産生する一価飽和脂肪酸の比率を増やす事ができ、一方、下方調節すると、一価不飽和物の比率を減らすことができる。例示目的で挙げれば、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）は、Ｃ１８：０前駆体からのＣ１８：１脂肪酸合成に関与する。デサチュラーゼの別のファミリーは、デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ（Δ１２ＦＡＤ）を含めた脂肪族アシルデサチュラーゼ（ＦＡＤ）である。これらのデサチュラーゼも脂質飽和に関する改変をもたらす。例示目的で挙げれば、デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼは、Ｃ１８：１前駆体からのＣ１８：２脂肪酸合成に関与する。同様に、例えば、ω−６脂肪酸デサチュラーゼ、ω−３脂肪酸デサチュラーゼ、又はω−６−オレイン酸デサチュラーゼのような１つ以上のグリセロ脂質デサチュラーゼの発現によって、飽和脂肪酸に対する不飽和脂肪酸の比率を変えるように制御することができる。ある実施形態では、デサチュラーゼは、望ましい炭素鎖長によって選択することができ、デサチュラーゼは、特定の炭素鎖を有する基質、又は特定の範囲内にある炭素長を有する基質の中で、位置特異的に改変させることができる。別の実施形態では、所望の脂肪酸プロフィールが一価不飽和物（Ｃ１６：１  及び／又はＣ１８：１）の増加である場合、ＳＡＤの過剰発現又は異種ＳＡＤの発現を、脂肪族アシルデサチュラーゼ（ＦＡＤ）のサイレンシング又は不活性化（例えば、内在するデサチュラーゼ遺伝子の変異、ＲＮＡｉ、ノックアウトなどにより）と組み合わせることができる。
【０３００】
他の実施形態では、微生物（例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞）は、変異内在性デサチュラーゼ遺伝子を有するように改変されており、ここで、変異により遺伝子又はデサチュラーゼ酵素が不活性になっている。ある場合には、変異内在性デサチュラーゼ遺伝子は脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ）である。他の場合には、変異内在性デサチュラーゼ遺伝子はステアロイルアシルキャリアータンパク質デサチュラーゼ（ＳＡＤ）である。以下の実施例１１では、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ及びデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼの標的化された削除又はノックアウトについて記載されている。
【０３０１】
ある場合には、所望の脂質プロフィールを生じるトランスジェニック細胞を得るために、１つ又はそれ以上の遺伝子操作技術を組み合わせることが有利であり得る。一実施形態では、微生物（例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞）は、変異内在性デサチュラーゼ遺伝子と１種又はそれ以上の外来遺伝子とを含む。非限定的な例では、変異内在性デサチュラーゼ遺伝子を有するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞は、外来の脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子及び／又はショ糖インベルターゼ遺伝子も発現することができる。以下の実施例１１では、内在するＳＡＤの標的化された削除又はノックアウトを含み、またＣｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒａ  Ｃ１４選択性のチオエステラーゼ及びショ糖インベルターゼも発現するトランスジェニックＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞について記載されている。この場合、獣脂で見られる脂質プロフィールに極めて近い脂質プロフィールが、トランスジェニックＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞から生じる。獣脂は、典型的には、溶かした牛肉脂肪又は羊肉脂肪から得られ、室温下で固体であり、食品、化粧品及び化学産業の各種用途で利用される。獣脂の脂肪酸プロフィールは、４％のＣ１４：０；２６％のＣ１６：０；３％のＣ１６：１；１４％のＣ１８：０；４１％のＣ１８：１；３％のＣ１８：２；及び１％のＣ１８：３である。以下の実施例１１に示されるように、内在するＳＡＤの、標的化された削除又はノックアウトを有し、Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒａ  Ｃ１４選択性のチオエステラーゼを発現するトランスジェニックＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞のクローンは、１％未満のＣ１２及びこれより短い炭素鎖長の脂肪酸；２．７４％〜６．１３％のＣ１４：０；２３．０７％〜２５．６９％のＣ１６：０；７．０２％〜１１．０８％のＣ１８：０；４２．０３％〜５１．２１％のＣ１８：１；及び９．３７％〜１３．４５％のＣ１８：２（面積百分率で表した）という脂質プロフィールを有する。ある場合には、トランスジェニックＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞は、３〜５％のＣ１４：０；２５〜２７％のＣ１６：０；１０〜１５％のＣ１８：０；及び４０〜４５％のＣ１８：１という脂質プロフィールを有する。
【０３０２】
従って、特定の実施形態では、本発明の細菌を、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素、脂肪族アルデヒド還元酵素、脂肪族アルデヒド脱炭酸酵素、又は自然に共発現するアシルキャリアータンパク質から選択される１つ以上の外来遺伝子を発現するように遺伝子操作する。適切な発現方法は、リパーゼ遺伝子の発現に関して上に記載されており、他の方法の中で、特に、誘発的発現及び区画化された発現が挙げられる。脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、脂質合成中に、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）から脂肪酸を開裂させる。さらなる酵素処理によって、開裂した脂肪酸と補酵素とが組み合わさって、アシル−ＣｏＡ分子が得られる。このアシル−ＣｏＡは、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素が酵素活性を発揮してアルデヒドを生じるための基質であり、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素が酵素活性を発揮してアルコールを生じるための基質である。上述のように特定した、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素の作用によって産生するアルデヒドは、さらに、脂肪族アルデヒド還元酵素が酵素活性を発揮してアルコールを生じるための基質であるか、又は、脂肪族アルデヒド脱炭酸酵素が酵素活性を発揮してアルカン又はアルケンを生じるための基質である。
【０３０３】
ある実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成する脂肪酸、グリセロ脂質、又は対応する一級アルコール、アルデヒド、アルカン又はアルケンは、８個、１０個、１２個、又は１４個の炭素原子を含む。ディーゼル、バイオディーゼル、再生可能なディーゼル又はジェット燃料を生成するために好ましい脂肪酸、又は工業用途のための、対応する一級アルコール、アルデヒド、アルカン及びアルケンは、８〜１４個の炭素原子を含む。特定の実施形態では、上述の脂肪酸、及び他の対応する炭化水素分子は、飽和であり（炭素−炭素二重結合又は三重結合を含まない）；一価飽和であり（二重結合が１個）；多価不飽和であり（２種以上の二重結合）；直鎖であるか（環状ではない）、又は分枝鎖である。燃料生成の場合、飽和度が高い方が好ましい。
【０３０４】
すぐ上に記載されている酵素は、特定の数の炭素原子を含む基質の加水分解に対し、優先的な特異性を有する。例えば、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、炭素原子を１２個含む脂肪酸をＡＣＰから優先的に開裂させ得る。ある実施形態では、ＡＣＰ及び長さ特異的なチオエステラーゼは、組み合わせると特に有用なような、お互いに対する親和性を有する場合がある（例えば、外来のＡＣＰ及びチオエステラーゼ遺伝子は、これらが誘導される特定の組織又は有機体で自然に共発現する場合がある）。従って、種々の実施形態では、本発明の組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞は、酵素活性（例えば、ＡＣＰからの脂肪酸開裂、アシル−ＣｏＡをアルデヒド又はアルコールに還元すること、又は、アルデヒドからアルカンへの変換）を、基質に含まれる炭素原子の数によって特異的に触媒するようなタンパク質をコードする外来遺伝子を含んでいてもよい。この酵素の特異性は、種々の実施形態では、炭素原子を８〜３４個、好ましくは、８〜１８個、より好ましくは、８〜１４個有する基質に対する特異性であり得る。好ましい特異性は、炭素原子が少ない、すなわち１２個から、多い、すなわち１８個含む基質に対する特異性である。
【０３０５】
本発明の微生物及び方法とともに用いるのに適した他の脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼとしては、表４に列挙されたものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０６】
【表４−１】
0005996527.tif 000011
【表４−２】
0005996527.tif 000012
【表４−３】
0005996527.tif 000013
【０３０７】
以下の実施例は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種のＣｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ、Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｎ  ｃａｍｐｈｏｒａ、Ｃｕｐｈｅａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｃｕｐｈｅａ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ、Ｉｒｉｓ  ｇｅｒｍａｎｉｃａ、Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ  ｆｒａｇｒａｎｓ及びＵｌｍｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎａに由来する異種脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを首尾よく標的化し、発現させることについて記載している。さらに、宿主細胞で異種脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを発現させると、脂肪酸プロフィールが変わることが確認された。これらの結果は、一般的には、藻と高等植物のチオエステラーゼとの配列同一性がなく、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼと、上に列挙した異種脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼとにも配列同一性がないことから、本当に予想できない結果であった。実施例で示されるように、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａにおけるこれらの異種チオエステラーゼの発現により、たとえ複数の種子作物油をブレンドしたとしても、現時点では市販の種子作物から入手不可能な極めて独創的な脂肪酸プロフィールを有する油／脂質を産成することができる、トランスジェニック藻類が生成される。一般的な市販の種子油の脂肪酸プロフィールを表５に示す。以下の市販の種子油はすべて、ＵＳ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏｄｅｓ、第７版、２０１０−２０１１から集めたものである。獣脂のデータは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ：Ｆａｔ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（１９７６）のものである。
【０３０８】
【表５−１】
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【表５−２】
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【０３０９】
例として、一般的なこれらの種油の中にはＣ８又はＣ１０脂肪酸の含有量が高いものはなく、ココナツ油及びパーム核油は最大の供給源であるが、ともに１：１（Ｃ８：Ｃ１０脂肪酸）の比である。実施例で示されているように、Ｃｕｐｈｅａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  Ｃ：８選択性のチオエステラーゼで形質転換されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａでは、１２％を超えるＣ８脂肪酸レベルが達成されたことに加え、Ｃ８：Ｃ１０脂肪酸の比が約５：１であった。脂肪酸レベルの変化は、多様な商業的用途に応じた脂肪酸プロフィールを含む油の産成に有用である。さらに、異なる脂肪酸鎖長間の比の変化は、さらにコストのかかる化学プロセス（例えば、エステル化、蒸留、分別及び再エステル化など）を経ていない油では商業的に得られなかったことである。別の例として、パーム油は最も高いＣ１６：０脂肪酸（３２〜４７％）を含有する油であるが、Ｃ１４：０脂肪酸が極めて少ない。Ｕ．ａｍｅｒｉｃａｎａチオエステラーゼを含むＰｒｏｔｏｔｈｅｃａでは、約３３〜３８％のＣ１６：０脂肪酸及び約１０〜１６％のＣ１４：０脂肪酸（約２：１のＣ１６：０：Ｃ１４：０比）が達成された。高１６：０脂肪酸の種油は通常、１４：０脂肪酸をあまり含まないため、この脂肪酸プロフィールは、既存の油をブレンドしても商業レベルで達成されるものではない。
【０３１０】
また、以下の実施例では、１つのクローンにおいて少なくとも２種の脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを標的化し、発現させた成功例について初めて記載する。これらのクローンにおいて脂肪酸プロフィールの変化が確認され、また１つのクローンにおいてどの２種のチオエステラーゼが共発現されたかによって、脂肪酸プロフィールが様々な影響を受けた。例として、上の表５では、ココナツ油及びパーム核油はともに、約３：１のＣ１２：Ｃ１４比である。以下の実施例に記載されているように、２種の異種チオエステラーゼ遺伝子を含むＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ形質転換体は、約５：１の比のＣ１２：Ｃ１４脂肪酸レベルを産成することができた。このようなＣ１２：Ｃ１４脂肪酸比は、商業レベルで（すなわち、種油のブレンドによって）はこれまで達成不可能であった。
【０３１１】
トランスジェニック微細藻類により産成される油の別の新たな態様は、脂肪酸の飽和度である。パーム油は現在、飽和油の最大の供給源であり、飽和油と不飽和油の合計は５２％〜４８％である。以下の実施例で示されるように、Ｕ．ａｍｅｒｉｃａｎａ及びＣ．ｃａｍｐｈｏｒａ由来の異種チオエステラーゼを有するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａでは、生成された油中、６０％超の総飽和油レベルが達成された。また以下の実施例では、Ｕ．ａｍｅｒｉｃａｎａ由来の異種チオエステラーゼを有するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａにおいて、生成された油中、８６％超の総飽和レベル達成も示されている。
【０３１２】
本発明の細菌及び方法とともに用いるのに適した脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素としては、限定されないが、表６に列挙したものが挙げられる。
【０３１３】
【表６】
0005996527.tif 000016
【０３１４】
本発明の細菌及び方法とともに用いるのに適した脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素としては、限定されないが、表７に列挙したものが挙げられる。
【０３１５】
【表７】
0005996527.tif 000017
【０３１６】
本発明の細菌及び方法とともに用いるのに適した脂肪族アルデヒド脱炭酸酵素としては、限定されないが、表８に列挙したものが挙げられる。
【０３１７】
【表８】
0005996527.tif 000018
【０３１８】
自然に共発現する脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びアシルキャリアータンパク質の組み合わせは、本発明の細菌及び方法とともに用いるのに適している。
【０３１９】
炭化水素改変酵素又は脂質改変酵素のさらなる例としては、以下のいずれかの米国特許に含まれるか、以下のいずれかの米国特許で参照されているか、又は以下のいずれかの米国特許に含まれるか又は参照されている核酸配列によってコードされるアミノ酸配列が挙げられる：第６，６１０，５２７号；第６，４５１，５７６号；第６，４２９，０１４号；第６，３４２，３８０号；第６，２６５，６３９号；第６，１９４，１８５号；第６，１１４，１６０号；第６，０８３，７３１号；第６，０４３，０７２号；第５，９９４，１１４号；第５，８９１，６９７号；第５，８７１，９８８号；第６，２６５，６３９号、さらに、以下のＧｅｎＢａｎｋ寄託番号で記載されているもの：ＡＡＯ１８４３５；ＺＰ＿００５１３８９１；Ｑ３８７１０；ＡＡＫ６０６１３；ＡＡＫ６０６１０；ＡＡＫ６０６１１；ＮＰ＿１１３７４７；ＣＡＢ７５８７４；ＡＡＫ６０６１２；ＡＡＦ２０２０１；ＢＡＡ１１０２４；ＡＦ２０５７９１；ＣＡＡ０３７１０。
【０３２０】
脂質生合成経路のその他の酵素も、本発明の微生物及び方法での使用に適している。例えば、ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（Ｋａｓ）酵素は、脂質生合成経路において、上に挙げたいくつかの酵素とともに働く。異なる種類のＫａｓ酵素が存在し、ＫａｓＩは、増加し続けるアシルＡＣＰ鎖とマロニル−ＡＣＰとの間の連続的な縮合段階に関与する。ＫａｓＩＩは、典型的には最終的な縮合段階に関与し、マロニル−ＡＣＰを組み込みながら、Ｃ１６：０−ＡＣＰからＣ１８：０−ＡＣＰへと導く。したがって、主としてＣ１６〜Ｃ１８：０脂肪酸（及びその不飽和誘導体）を合成する高等植物及び一部の微細藻類種／株では、ＫａｓＩＩ酵素は、ＦａｔＡ遺伝子の産物（アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ）と相互作用する。
【０３２１】
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、高等植物（及び一部の微細藻類種）の脂肪酸生合成のターミネーターであり、大部分の植物種では、これは、Ｃ１６：０〜Ｃ１８：０段階において伸長を停止させる役割のＦａｔＡ遺伝子ファミリーのメンバーによって行われる。短鎖脂肪酸を合成する種（例えば、Ｃｕｐｈｅａ、Ｅｌａｅｉｓ、Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ又はＵｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａなど）では、ＦａｔＢ遺伝子によりコードされている異なるグループのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼがこの停止段階を行う（例えば、コドンが最適化されたＣｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ  ＦａｔＢ３−Ｂのコード領域、配列番号１８９を参照）。ＫａｓＩＩ酵素とアシル−ＡＣＰチオエステラーゼとの間の相互作用は、脂肪酸鎖の伸長を的確に停止させるのに重要である。その結果、短鎖脂質の生合成が可能なＦａｔＢ遺伝子を進化させた高等植物種（及び微細藻類種）では、これに対応する、ＫａｓＩＶ遺伝子と呼ばれるさらなる種類のＫａｓ遺伝子の共進化が起こった。ＫａｓＩＶ遺伝子は、長さが４〜１４個の炭素である特定の大きさの範囲の脂肪酸の鎖長伸長に関与する。
【０３２２】
本発明の細菌及び方法とともに用いるのに適した他の酵素としては、表４、６〜８に列挙したタンパク質の１つとのアミノ酸同一性が少なくとも７０％であり、対応する望ましい酵素活性（例えば、アシルキャリアータンパク質からの脂肪酸の開裂、アシル−ＣｏＡからアルデヒド又はアルコールへの還元、又はアルデヒドからアルカンへの変換）を示すものが挙げられる。さらなる実施形態では、酵素活性は、上述の望ましい配列の１つとの同一性が少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の配列に存在し、これらは全て、完全に記載されているかのように、参照により組み込まれる。
【０３２３】
発現させるべき外来遺伝子の望ましい組み合わせを選択することによって、細菌が生成する産物を用途に応じて調節することができ、次いで、この産物を水系バイオマスから抽出してもよい。例えば、細菌は、（ｉ）脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子と；場合により、（ｉｉ）自然に共発現するアシルキャリアータンパク質、又は脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼとの親和性を有する（又はその逆の）それ以外のアシルキャリアータンパク質と；場合により、（ｉｉｉ）脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素又は脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素をコードする外来遺伝子と；場合により、（ｉｖ）脂肪族アルデヒド還元酵素又は脂肪族アルデヒド脱炭酸酵素をコードする外来遺伝子とを含んでいてもよい。細菌は、本明細書に記載の培養条件で、ＡＣＰに結合した脂肪酸を合成し、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、ＡＣＰから脂肪酸を開裂させることを触媒し、さらなる酵素処理によって脂肪酸アシル−ＣｏＡ分子を与える。存在する場合、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素は、アシル−ＣｏＡからアルコールへの還元を触媒する。同様に、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素が存在する場合、この酵素は、アシル−ＣｏＡからアルデヒドへの還元を触媒する。脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素をコードする外来遺伝子が存在し、発現してアルデヒド産物を与えるような実施形態では、第３の外来遺伝子によってコードされる脂肪族アルデヒド還元酵素が、アルデヒドからアルコールへの還元を触媒する。同様に、脂肪族アルデヒド脱炭酸酵素が存在する場合、この触媒は、アルデヒドからアルカン又はアルケンへの変換を触媒する。
【０３２４】
別の実施形態では、微生物は、（ｉ）脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子；（ｉｉ）場合により、自然に共発現するアシルキャリアータンパク質、又は脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼとの親和性を有するアシルキャリアータンパク質；（ｉｉｉ）デサチュラーゼノックアウトなど、変異によりデサチュラーゼ遺伝子又はデサチュラーゼタンパク質が不活性となっている変異内在性デサチュラーゼ遺伝子；（ｉｖ）内在するステアロイルアシルキャリアータンパク質デサチュラーゼの過剰発現又は異種ＳＡＤの発現；及び（ｖ）上記の任意の組み合わせを含み得る。
【０３２５】
肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼなどの酵素をコードするこのような遺伝子は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓのような、顕著な量の脂質産生を示すことがすでに知られている細胞から得ることができる。脂質産生の役割を担うことがすでに知られている遺伝子、例えば、二重結合を飽和させる酵素をコードする遺伝子は、レシピエント細胞内で個々に形質転換されてもよい。しかし、本発明を実施するために、どの遺伝子が必要となるかといった推測的仮定を行う必要はない。微細藻類において脂質産生を変える（向上させる）ことが可能な遺伝子を特定する方法は、ＰＣＴ公開番号第２００８／１５１１４９号に記載されている。
【０３２６】
従って、本発明は、同じ種の野生型細胞と比較して、異なるレベルで脂質経路に関連する酵素を発現するように遺伝子操作された微生物（例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞）を提供する。ある場合には、遺伝子操作された細胞は、野生型細胞と同じ条件で成長させた場合に、野生型細胞と比べて脂質を多く産生する。ある場合には、上述の細胞は、野生型細胞よりも高いレベルで脂質経路に関連する酵素を発現するように遺伝子操作されているか、及び／又は、野生型細胞よりも高いレベルで脂質経路に関連する酵素を発現するように選択される。ある場合には、脂質経路に関連する酵素は、ピルビン酸脱水素酵素、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、アシルキャリアータンパク質、グリセロール−３ホスフェートアシルトランスフェラーゼからなる群から選択される。ある場合には、上述の細胞は、野生型細胞よりも低いレベルで脂質経路に関連する酵素を発現するように遺伝子操作されているか、及び／又は、野生型細胞よりも低いレベルで脂質経路に関連する酵素を発現するように選択される。細胞が、脂質経路に関連する酵素を低いレベルで発現する少なくとも１つの実施形態では、脂質経路に関連する酵素は、クエン酸シンターゼを含む。
【０３２７】
ある実施形態では、上述の細胞は、野生型細胞と比べ、異なるレベルで脂肪酸合成の包括的な制御因子を発現するように遺伝子操作されている、及び／又は、異なるレベルで脂肪酸合成の包括的な制御因子を発現するように選択され、それにより、複数の脂肪酸合成遺伝子の発現レベルは、野生型細胞と比べて変化している。ある場合では、脂質経路に関連する酵素は、脂肪酸を改変する酵素を含む。ある場合では、脂質経路に関連する酵素は、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ、グリセロ脂質デサチュラーゼから選択される。ある場合には、細胞は、脂質経路に関連する酵素を低レベルで発現するか、又は特定の脂質経路に関連する酵素を全く発現しないように（すなわち、脂質経路酵素がノックアウトされているか、又は外来遺伝子に置き換わっている）、遺伝子操作及び／又は選択されている。
【０３２８】
ある微細藻類は、相当量の非脂質代謝、例えば多糖などを産生する。多糖生合成では、細胞が利用可能な全代謝エネルギーのかなりの割合が使用され得るため、脂質産生細胞の変異誘発と、それに続く多糖産生の減少又は削除のスクリーニングにより、脂質を高収量で産生することができる新規株が得られる。
【０３２９】
他の実施形態では、本発明は、１つ以上の外来遺伝子を含有する油産生細菌に関し、ここで、外来遺伝子は、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素、脂肪族アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素、脂肪族アルデヒド脱炭酸酵素、デサチュラーゼ及びアシルキャリアータンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする。別の実施形態では、内在するデサチュラーゼ遺伝子は、１つ又はそれ以上の上記外来遺伝子を含む微生物内で過剰発現される。一実施形態では、外来遺伝子は、プロモーターに動作可能に連結した状態であり、刺激に応答して、誘発的であるか、又は抑制的である。ある場合では、刺激は、外から与えられる低分子、熱さ、冷たさ、培地中の窒素が制限されていること、又は窒素がないことからなる群から選択される。ある場合では、外来遺伝子は、細胞内のある区画で発現する。ある実施形態では、細胞内の区画は、葉緑体、プラスチド、ミトコンドリアからなる群から選択される。ある実施形態では、細菌は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｋｒｕｇａｎｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ、又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉである。
【０３３０】
一実施形態では、外来遺伝子は、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする。ある場合では、外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼは、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）から、炭素が８〜１８の脂肪酸が開裂することを触媒する。ある場合では、外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼは、ＡＣＰから、炭素が１０〜１４の脂肪酸が開裂することを触媒する。一実施形態では、外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼは、ＡＣＰから、炭素が１２の脂肪酸が開裂することを触媒する。
【０３３１】
一実施形態では、外来遺伝子は、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素をコードする。ある場合では、外来遺伝子によってコードされる還元酵素は、炭素が８〜１８の脂肪酸アシル−ＣｏＡを、対応する一級アルコールへと還元することを触媒する。ある場合では、外来遺伝子によってコードされる還元酵素は、炭素が１０〜１４の脂肪酸アシル−ＣｏＡを、対応する一級アルコールへと還元することを触媒する。一実施形態では、外来遺伝子によってコードされる還元酵素は、炭素が１２の脂肪酸アシル−ＣｏＡをドデカノールへと還元することを触媒する。
【０３３２】
また、本発明は、２個の外来遺伝子を含有する組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞も提供しており、第１の外来遺伝子は、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードし、第２の外来遺伝子は、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素、アシルキャリアータンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする。ある場合では、この２個の外来遺伝子は、それぞれプロモーターに動作可能に連結した状態であり、刺激に応答して誘発的である。ある場合では、それぞれのプロモーターは、培地中の窒素が制限されているか、又は窒素がないといった同じ刺激に応答して誘発的である。培地中の窒素が制限されているか、又は全くないことによって、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種のようなある種の微生物では油の産生が刺激され、油をより高いレベルで産生のを誘発する引き金として用いることができる。本明細書に開示されている遺伝子操作方法と組み合わせて用いる場合、脂質量は、細胞乾燥重量の割合として、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％のような高いレベルまで引き上げられ得；本明細書に開示されている方法は、このようなレベルの脂質を有する細胞を提供し、ここで、脂質は、Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも１％〜５％、好ましくは少なくとも４％であり、Ｃ８が少なくとも０．２５％〜１％、好ましくは少なくとも０．３％であり、Ｃ１０が少なくとも１％〜５％、好ましくは少なくとも２％であり、Ｃ１２が少なくとも１％〜５％、好ましくは少なくとも２％であり、Ｃ１４が少なくとも１％〜５％、好ましくは少なくとも２％である。ある実施形態では、細胞は、細胞乾燥重量で脂質が１０％を超えるか、１５％を超えるか、２０％を超えるか、又は２５％を超え、Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも５％、少なくとも１０％、又は少なくとも１５％、Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、又は少なくとも３０％、Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、Ｃ８〜Ｃ１４が５％〜４０％、好ましくは１０〜３０％、及びＣ８〜Ｃ１４が１０％〜４０％、好ましくは２０〜３０％である脂質を含む。
【０３３３】
本明細書に開示されている新しい油は、ヤシ油、パーム核油、ココナツ油のような中鎖脂肪酸が多い他の天然に存在する油とは明らかに異なっている。例えば、カロチノイドのような混入物質の濃度は、ヤシ油やパーム核油において、本発明の油におけるよりもはるかに高い。パーム油及びパーム核油は、特に、本発明の油よりも、α−カロチン、β−カロチン、リコピンを非常に多く含んでいる。それに加え、パーム油及びパーム核油では、２０種類を超える異なるカロチノイドが見つかっているが、一方、実施例からは、本発明の油は、含有するカロチノイド種の種類が非常に少なく、濃度も非常に低いことが示されている。それに加え、トコトリエノールのようなビタミンＥ化合物の濃度は、パーム油、パーム核油、ココナツ油では、本発明の油と比べてかなり大きい。
【０３３４】
一実施形態では、第１の外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼは、ＡＣＰから、炭素が８〜１８の脂肪酸が開裂することを触媒する。ある実施形態では、第２の外来遺伝子は、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素をコードし、この酵素は、炭素が８〜１８の脂肪酸アシル−ＣｏＡを、対応する一級アルコールへと還元するのを触媒する。ある場合では、第１の外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼは、ＡＣＰから、炭素が１０〜１４の脂肪酸が開裂することを触媒し、第２の外来遺伝子によってコードされる還元酵素は、炭素が１０〜１４の脂肪酸アシル−ＣｏＡを、対応する一級アルコールへと還元するのを触媒し、ここで、チオエステラーゼと還元酵素は、同じ炭素鎖長に作用する。一実施形態では、第１の外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼは、ＡＣＰから、炭素が１２の脂肪酸が開裂することを触媒し、第２の外来遺伝子によってコードされる還元酵素は、炭素が１２の脂肪酸アシル−ＣｏＡをドデカノールへと還元することを触媒する。ある実施形態では、第２の外来遺伝子は、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素をコードし、この酵素は、炭素が８〜１８の脂肪酸アシル−ＣｏＡを、対応するアルデヒドへと還元することを触媒する。ある実施形態では、第２の外来遺伝子は、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ内で必然的に一緒に発現するアシルキャリアータンパク質をコードする。
【０３３５】
ある実施形態では、第２の外来遺伝子は、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素をコードし、細菌は、脂肪族アルデヒド脱炭酸酵素をコードする第３の外来遺伝子をさらに含む。ある場合では、第１の外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼは、ＡＣＰから、炭素が８〜１８の脂肪酸が開裂することを触媒し、第２の外来遺伝子によってコードされる還元酵素は、炭素が８〜１８の脂肪酸アシル−ＣｏＡを、対応する一級アルデヒドへと還元するのを触媒し、第３の外来遺伝子によってコードされる脱炭酸酵素は、炭素が８〜１８の脂肪族アルデヒドから対応するアルカンへの変換を触媒し、ここで、チオエステラーゼ、還元酵素、脱炭酸酵素は、同じ炭素鎖長に作用する。
【０３３６】
ある実施形態では、第２の外来遺伝子は、アシルキャリアータンパク質をコードし、細菌は、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素からなる群から選択されるタンパク質をコードする第３の外来遺伝子をさらに含む。ある場合では、第３の外来遺伝子は、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素をコードし、細菌は、脂肪族アルデヒド脱炭酸酵素をコードする第４の外来遺伝子をさらに含む。
【０３３７】
また、本発明は、培地中で、組み換え微生物（例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞）の集合を培養することを含む、アルコールを生成する方法を提供し、ここで、細胞は、（ｉ）脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする第１の外来遺伝子と、（ｉｉ）脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素をコードする第２の外来遺伝子とを含み、細胞は、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）に結合した脂肪酸を合成し、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、ＡＣＰから脂肪酸が開裂するのを触媒し、さらなる処理によって脂肪酸アシル−ＣｏＡが得られ、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素は、アシル−ＣｏＡからアルコールへの還元を触媒する。
【０３３８】
また、本発明は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞内で脂質分子を生成する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、培地中で微生物（例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞）の集合を培養することを含み、ここで、この細胞は、（ｉ）脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする第１の外来遺伝子と、（ｉｉ）脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素をコードする第２の外来遺伝子とを含み、細菌は、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）に結合した脂肪酸を合成し、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、ＡＣＰから脂肪酸が開裂するのを触媒し、さらなる処理によって脂肪酸アシル−ＣｏＡが得られ、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素は、アシル−ＣｏＡからアルデヒドへの還元を触媒する。
【０３３９】
また、本発明は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞内で、特定の炭素鎖長を有する脂肪酸分子を生成する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、培地中で微生物（例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞）の集合を培養することを含み、ここで、この細胞は、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子を含み、特定の炭素鎖長、例えば、炭素原子が８個、１０個、１２個、又は１４個の炭素鎖長に対して特異的であるか、これらの鎖長を好む活性を有しており、細菌は、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）に結合した脂肪酸を合成し、チオエステラーゼは、脂肪酸が特定の炭素鎖長を有するように合成された場合には、ＡＣＰから、その脂肪酸を開裂することを触媒する。
【０３４０】
上述の種々の実施形態では、微生物（例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞）は、脂質経路に関連する酵素をコードする少なくとも１つの外来遺伝子を含むことができる。ある場合では、脂質経路に関連する酵素は、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ、グリセロ脂質デサチュラーゼ、ピルビン酸脱水素酵素、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、アシルキャリアータンパク質、グリセロール−３ホスフェートアシルトランスフェラーゼからなる群から選択される。他の場合では、微生物（例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞）は、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素、脂肪族アルデヒド還元酵素、脂肪族アルデヒド脱炭酸酵素、及び／又はアシルキャリアータンパク質からなる群から選択される脂質改変酵素を含有する。
【０３４１】
本明細書で述べられている種々の脂質経路酵素及び脂質改変酵素を発現させるために使用される、数多くの例示的な形質転換カセット又は構築物が実施例に記載されている。その他の有用な構築物を以下の表３７に列挙するが、これらに限定されない。
【０３４２】
【表３７−１】
0005996527.tif 000019
【表３７−２】
0005996527.tif 000020
【０３４３】
（ＶＩ．燃料及び化学物質の生成）
本発明の方法に従って燃料を生成する場合、本発明の細胞が産生する細胞を収穫するか、又は任意の従来の方法によって、それ以外の方法で集める。全細胞の抽出によって脂質を単離することができる。まず、細胞を破壊し、次いで、例えば、上述のような遠心分離を用いることによって、細胞内の脂質及び細胞膜／細胞壁に関連する脂質、及び細胞外の炭化水素を細胞塊から分けることができる。微生物中で生成する細胞内脂質を、ある実施形態では、微生物の細胞を溶解させた後に抽出する。抽出したら、脂質をさらに精製し、油、燃料又は油脂化学品を作り出す。
【０３４４】
培養が終了したら、微生物を発酵ブロスから分離することができる。場合により、分離は、遠心分離によって行い、濃縮ペーストを作成する。遠心分離によって、微生物に由来するかなりの量の細胞内の水が除去されず、この工程は乾燥工程ではない。次いで、バイオマスを場合により、洗浄溶液（例えば、脱イオン水）を用いて洗浄し、発酵ブロス及び発酵片を取り除く。場合により、洗浄した微生物バイオマスを乾燥させ（乾燥機で乾燥させる、凍結乾燥させる、など）、その後に細胞を破壊してもよい。又は、発酵が完全に終わっている場合には、細胞を発酵ブロスの一部又は全部と分離することなく溶解させてもよい。例えば、細胞を溶解させたときに、細胞と細胞外の液体とのｖ：ｖ比が１：１未満であってもよい。
【０３４５】
脂質を含有する微生物を溶解し、溶解物を作成してもよい。本明細書で詳細に記載するように、微生物を溶解する工程（細胞溶解とも呼ばれる）は、熱による溶解、塩基を加えること、酸を加えること、プロテアーゼのような酵素、アミラーゼのような多糖分解酵素を用いること、超音波を用いること、機械的な溶解、浸透圧衝撃を用いること、溶解性ウイルスに感染させること、及び／又は１つ以上の溶解遺伝子の発現を含む、任意の簡便な手段によって行うことができる。溶解を行い、微生物によって産生された細胞内分子を放出させる。微生物を溶解させるための、これらのそれぞれの方法を単独の方法として用いてもよく、同時又は連続して、組み合わせとして用いてもよい。細胞の破壊度は、顕微鏡分析によって観察することができる。本明細書に記載した１つ以上の方法を用い、典型的には、７０％を超える細胞の破壊が観察される。好ましくは、細胞の破壊は、８０％を超えており、より好ましくは、９０％を超えており、最も好ましくは、約１００％である。
【０３４６】
特定の実施形態では、成長した後に微生物を溶解させ、例えば、抽出又はさらなる処理のために、細胞内の脂質及び／又は炭化水素がさらされる程度を増やす。リパーゼ発現（例えば、誘発性プロモーターによる）又は細胞溶解のタイミングは、脂質及び／又は炭水化物の収量を最適化するように調節することができる。以下に、いくつかの溶解技術を記載している。これらの技術を個々に用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。
【０３４７】
本発明の一実施形態では、微生物を溶解する工程は、微生物を含有する細胞懸濁物を加熱することを含む。この実施形態では、微生物を含む発酵ブロス（又は、発酵ブロスから単離した微生物の懸濁物）を、微生物、すなわち、微生物の細胞壁及び細胞膜が分解するか、又は破壊するまで加熱する。典型的には、かけられる温度は、少なくとも５０℃である。もっと効率よく細胞を溶解させるために、もっと高い温度、例えば、少なくとも３０℃、少なくとも６０℃、少なくとも７０℃、少なくとも８０℃、少なくとも９０℃、少なくとも１００℃、少なくとも１１０℃、少なくとも１２０℃、少なくとも１３０℃、又はそれ以上の温度を使用する。熱処理によって細胞を溶解することは、微生物を沸騰させることによって行ってもよい。又は、熱処理（沸騰させない）をオートクレーブ中で行ってもよい。熱処理された溶解物を、さらなる処理のために冷却してもよい。また、細胞の破壊は、蒸気による処理によって、すなわち、加圧した蒸気を加えることによって行ってもよい。細胞を破壊するための微細藻類の蒸気処理は、例えば、米国特許第６，７５０，０４８号に記載されている。ある実施形態では、蒸気処理は、蒸気を発酵槽に吹き込み、ブロスを所望の温度に約９０分未満、好ましくは約６０分未満、より好ましくは約３０分未満維持することによって行ってもよい。
【０３４８】
本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、微生物を含有する細胞懸濁物に塩基を加えることを含む。塩基は、少なくとも、使用した微生物の水系タンパク質化合物の一部分を加水分解するのに十分なほど強いことが必要である。タンパク質を溶解するのに有用な塩基は、化学分野で知られている。本発明の方法で有用な、例示的な塩基としては、限定されないが、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムの水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、及びこれらの混合物が挙げられる。好ましい塩基はＫＯＨである。細胞を破壊するための微細藻類の塩基処理は、例えば、米国特許第６，７５０，０４８号に記載されている。
【０３４９】
本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、微生物を含有する細胞懸濁物に酸を加えることを含む。酸による溶解は、１０〜５００ｍＮの濃度、又は好ましくは、４０〜１６０ｎＭの濃度の酸を用いて行うことができる。酸による溶解は、好ましくは、室温より高い温度（例えば、４０〜１６０℃、好ましくは、５０〜１３０℃の温度）で行われる。中程度の温度（例えば、室温〜１００℃、特に、室温〜６５℃）の場合、酸による処理は、有益には、超音波処理又は他の細胞破壊方法と組み合わせてもよい。
【０３５０】
本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、酵素を用いることによって微生物を溶解することを含む。微生物を溶解するのに好ましい酵素は、プロテアーゼ、及びヘミセルラーゼのような多糖分解酵素（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒに由来するヘミセルラーゼ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、モントリオール；＃Ｈ２１２５）、ペクチナーゼ（例えば、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．に由来するペクチナーゼ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、モントリオール；＃Ｐ２４０１）、Ｍａｎｎａｗａｙ  ４．０Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、セルラーゼ（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅに由来するセルロース；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、モントリオール；＃Ｃ９４２２）、ドリセラーゼ（例えば、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｓｐ．に由来するドリセラーゼ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、モントリオール；＃Ｄ９５１５）である。
【０３５１】
本発明の他の実施形態では、溶解は、例えば、多糖分解酵素のようなセルラーゼ、場合により、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ又はＣｈｌｏｒｅｌｌａウイルスに由来するもの、又は、プロテアーゼ、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓプロテアーゼ、キモトリプシン、プロテイナーゼＫ、Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ  ｂｙ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ、Ｏｄａ  Ｙｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、第８巻、Ｎｕｍｂｅｒ  １、２０００年１月、ｐｐ．２９−３２（４）、Ａｌｃａｌａｓｅ  ２．４  ＦＧ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、に列挙されているプロテアーゼ、Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ  １００Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）のような酵素によって行われる。先に示したプロテアーゼ及び多糖分解酵素の任意の組み合わせを含む、プロテアーゼと多糖分解酵素の任意の組み合わせを用いてもよい。
【０３５２】
別の実施形態では、溶解は、連続圧搾機を用いて行うことができる。このプロセスでは、バイオマスに、高圧状態で、スクリュー型デバイスを用いて力を加え、細胞を溶解させ、細胞内脂質を放出させ、細胞内のタンパク質及び繊維（及び他の成分）と分離させる。
【０３５３】
本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、超音波を用いて、すなわち、超音波処理によって行われる。従って、高周波数の音を用いて細胞を溶解させることができる。音は、電子的に発生させ、適切に濃縮した細胞懸濁物に対し、金属片を介して伝搬させてもよい。この超音波処理は、細胞懸濁物中に空洞を作り出すことに基づいて、細胞の一体性を破壊する。
【０３５４】
本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、機械的な溶解によって行われる。細胞は、機械的に溶解されてもよく、場合により、炭化水素（例えば、脂質）を集めやすいように均質化してもよい。例えば、加圧による破壊を利用し、細胞を含有するスラリーを制水型オリフィス弁にポンプで圧送してもよい。高圧（１５００ｂａｒまで）をかけ、その後、出口ノズルを通して瞬間的に拡散させてもよい。細胞の破壊は、弁での衝撃、オリフィス内での大きな液体剪断力、放出による急な圧力低下といった３種類の異なる機構によって行われ、これにより、細胞が爆発する。この方法によって、細胞内の分子が放出される。又は、ボールミルを用いてもよい。ボールミルの場合、ビーズのような小さな研磨粒子を含む懸濁物中で細胞を攪拌する。細胞は、剪断力、ビーズ間で研磨されること、ビーズと衝突することによって破壊される。ビーズは、細胞を破壊して、細胞内容物を放出させる。また、細胞は、細胞を破壊するためのブレンド（例えば、例として高速ブレンダー又はＷａｒｉｎｇブレンダー）を用いるか、フレンチプレスを用いるか、又は細胞壁が弱い場合には、遠心分離を用い、剪断力によって破壊されてもよい。
【０３５５】
本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、浸透圧衝撃を与えることによって行われる。
【０３５６】
本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、微生物を溶解性ウイルスに感染させることを含む。本発明で用いるのに微生物を溶解するのに適したさまざまなウイルスが知られており、特定の微生物に特定の溶解性ウイルスを選択し、使用することは、当業者の知識の範囲内である。例えば、ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ  ｂｕｒｓａｒｉａ  ｃｈｌｏｒｅｌｌａウイルス（ＰＢＣＶ−１）は、特定の単細胞性の、真核性のクロレラに似た緑色の藻の中で複製し、溶解させる、大きな２０面体のプラークを形成する二本鎖ＤＮＡウイルスのグループ（Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科、クロロウイルス属）の原型である。従って、培養物を任意の適切なクロレラウイルスに感染させることによって、任意の感染しやすい微細藻類を溶解させることができる。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種を、クロレラウイルスを用いて感染させる方法は知られている。例えば、Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．２００６；６６：２９３−３３６；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９９年４月２５日；２５７（１）：１５−２３；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００４年１月５日；３１８（１）：２１４−２３；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２０００；（４４）：１６１−２；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００６年３月；８０（５）：２４３７−４４；Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９；５３：４４７−９４を参照。
【０３５７】
本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、自己消化を含む。この実施形態では、本発明の微生物を、微生物を溶解する溶解性タンパク質を生成するように遺伝子操作する。この溶解遺伝子を、誘発性プロモーターを用いて発現させ、まず、細胞は、発酵槽内で望ましい密度まで成長し、その後、プロモーターの誘発によって、細胞を溶解させる溶解遺伝子が発現する。一実施形態では、溶解遺伝子は、多糖分解酵素をコードしている。特定の他の実施形態では、溶解遺伝子は、溶解性ウイルスに由来する遺伝子である。従って、例えば、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａウイルスに由来する溶解遺伝子を、藻の細胞中で発現させてもよい。Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６０、３０８−３１５（１９９９）；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １８０（１９９９）４５−５３；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６３、３７６−３８７（１９９９）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３０、３６１−３６８（１９９７）を参照。溶解遺伝子の発現は、好ましくは、誘発性プロモーター、例えば、低分子、光、熱及び他の刺激の存在のような刺激によって誘発される、微細藻類内で活性なプロモーターを用いてなされる。
【０３５８】
上述の方法によって生成した細胞溶解物から脂質を分離するための種々の方法が利用可能である。例えば、脂質及び脂質誘導体、例えば、脂肪族アルデヒド、脂肪族アルコール、アルカンのような炭化水素を、疎水性溶媒、例えば、ヘキサンで抽出してもよい（Ｆｒｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．１９８９、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１１：７１７を参照）。また、脂質及び脂質誘導体を、液化によって抽出してもよく（例えば、Ｓａｗａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．１９９９、Ｂｉｏｍａｓｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ  １７：３３−３９、及びＩｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９３、Ｂｉｏｍａｓｓ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ  ６（４）：２６９−２７４を参照）；油の液化によって抽出してもよく（例えば、Ｍｉｎｏｗａ  ｅｔ  ａｌ．１９９５、Ｆｕｅｌ  ７４（１２）：１７３５−１７３８を参照）；超臨界ＣＯ２抽出によって抽出してもよい（例えば、Ｍｅｎｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００３、Ｉｎｏｒｇａｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３５６：３２８−３３４を参照）。Ｍｉａｏ及びＷｕは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｏｃｏｉｄｅｓの培養物から、微細藻類の脂質を回収するプロトコルを記載しており、このプロトコルでは、細胞を遠心分離処理によって集め、蒸留水で洗浄し、凍結乾燥によって乾燥させた。得られた細胞粉末を乳鉢で細かく粉砕し、次いで、ｎ−ヘキサンで抽出した。Ｍｉａｏ及びＷｕ、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６）９７：８４１−８４６。
【０３５９】
従って、本発明の微生物によって生成した脂質、脂質誘導体、炭化水素を、有機溶媒を用いた抽出によって回収することができる。ある場合では、好ましい有機溶媒は、ヘキサンである。典型的には、事前に溶解物成分を分離させることなく、溶解物に有機溶媒を直接加える。一実施形態では、上述の１つ以上の方法によって生成した溶解物を、脂質及び／又は炭化水素成分が有機溶媒と溶液を形成するのに十分な時間、有機溶媒と接触させる。ある場合では、溶液をその後にさらに精製し、特定の望ましい脂質成分又は炭化水素成分を回収する。ヘキサンによる抽出方法は、当該技術分野でよく知られている。
【０３６０】
本明細書に記載されるように、細胞によって産生される脂質及び脂質誘導体、例えば、脂肪族アルデヒド、脂肪族アルコール、アルカンのような炭化水素を、上述のように、リパーゼのような１つ以上の酵素を用いて改変してもよい。炭化水素が、細胞の外の環境に存在する場合、１つ以上の酵素を、この酵素が炭化水素を改変しするか、又は炭化水素前駆体からの合成を完結させるような条件下で、この環境に加えてもよい。又は、炭化水素を、細胞材料から部分的又は完全に単離してから、酵素のような１つ以上の触媒を加えてもよい。このような触媒は、外から加えられ、触媒の活性は、細胞の外で生じるか、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じる。
【０３６１】
従って、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞によって産生されるか、又は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで酵素によって改変される脂質及び炭化水素は、本明細書に記載されるように、従来の手段によってさらに処理されてもよい。処理は、「クラッキング」して、炭化水素分子を小さくし、水素：炭素比を大きくすることを含んでいてもよい。触媒によるクラッキング方法及び熱によるクラッキング方法は、炭化水素及びトリグリセリド油の処理において通常用いられる。触媒による方法は、固体酸触媒のような触媒の使用を含む。触媒は、シリカ−アルミナ又はゼオライトであってもよく、この触媒により、炭素−炭素結合が不均衡又は非対称に破壊され、カルボカチオンとヒドリドアニオンが生じる。これらの反応性中間体は、次いで、転移するか、又は別の炭化水素にヒドリドが移動する。このように、この反応によって、中間体が再生し、自己連鎖的な機構を生じ得る。また、炭化水素を処理し、炭化水素中の炭素−炭素二重結合又は三重結合を減らしてもよく、場合によりゼロにしてもよい。また、炭化水素を処理し、炭化水素中の環又は環状構造を除去するか、又は取り除いてもよい。また、水素：炭素比が大きくなるように、炭化水素を処理してもよい。この処理は、水素添加（「水素化」）及び／又は炭化水素を小さな炭化水素にする「クラッキング」を含んでいてもよい。
【０３６２】
熱による方法は、炭化水素を小さくするために、高温及び高圧の使用を含む。約８００℃の高温及び約７００ｋＰａの高圧を用いてもよい。これらの条件によって「軽質」のものが発生し、軽質との用語は、水素を多く含む炭化水素分子を指すために用いられ（光量子束によって区別する場合）、また、縮合により、水素が相対的に失われた、重い炭化水素分子によっても生成する。この方法によって、均衡、又は対称的に破壊され、アルケンを生じ、このアルケンは、場合により、上述のように酵素によって飽和になってもよい。
【０３６３】
触媒による方法及び熱による方法は、植物において、炭化水素の処理及び油の精製を行うのに標準的な方法である。従って、本明細書に記載されるような細胞が産生した炭化水素を集め、従来の手段によって処理するか、又は精製することができる。微細藻類が産生した炭化水素のハイドロクラッキングに関する論文は、Ｈｉｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖｏｌ．ＸＸＩＶ：１９３−２０５（１９８２））を参照。代替的な実施形態では、画分を、有機化合物、熱及び／又は無機化合物のような別の触媒で処理する。バイオディーゼル内の脂質を処理する場合、本節の以下に記載されているトランスエステル化プロセスを使用する。
【０３６４】
本発明の方法によって生成する炭化水素は、さまざまな工業用途で有用である。例えば、ほぼあらゆる種類の洗浄剤及び洗浄調製物で用いられるイオン系界面活性剤である直鎖アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）の生成は、一般的に、炭素原子が１０〜１４の鎖を含む炭化水素を利用する。例えば、米国特許第６，９４６，４３０号；第５，５０６，２０１号；第６，６９２，７３０号；第６，２６８，５１７号；第６，０２０，５０９号；第６，１４０，３０２号；第５，０８０，８４８号；第５，５６７，３５９号を参照。例えば、米国特許第５，９４２，４７９号；第６，０８６，９０３号；第５，８３３，９９９号；第６，４６８，９５５号；第６，４０７，０４４号に記載されるように、界面活性剤、例えば、ＬＡＳを、パーソナルケア組成物及び洗浄剤で用いてもよい。
【０３６５】
再生可能な生物由来の出発物質を、化石燃料から誘導される出発物質と置き換えて利用可能であり、その使用が望ましいために、バイオディーゼル、再生可能なディーゼル、ジェット燃料といった燃料に、生物由来の炭化水素成分を用いることに関心が高まっている。生物由来の材料から炭化水素成分を生成する方法が緊急に必要とされている。本発明は、本明細書に記載の方法によって生成した脂質を生物由来の原料として用い、バイオディーゼル、再生可能なディーゼル、ジェット燃料を生成するような、バイオディーゼル、再生可能なディーゼル、ジェット燃料を生成する方法を提供することによって、この要求を満たす。
【０３６６】
従来のディーゼル燃料は、パラフィン系炭化水素を豊富に含む石油留分である。これらの沸点範囲は、３７０°Ｆ〜７８０°Ｆ（約１８８°Ｃ〜約４１６°Ｃ）と広範囲であり、ディーゼルエンジン車のような圧縮点火エンジンでの燃焼に適している。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（ＡＳＴＭ）は、例えば、セタン価、曇り点、引火点、粘度、アニリン点、硫黄含有量、含水量、灰分、銅板腐食、炭素残渣のような他の燃料特性の許容範囲とともに、沸点範囲に従って、ディーゼルのグレードを確立している。技術的には、バイオマス、又は適切なＡＳＴＭ仕様を満たすそれ以外のものから誘導される任意の炭化水素留分を、ディーゼル燃料（ＡＳＴＭ  Ｄ９７５）、ジェット燃料（ＡＳＴＭ  Ｄ１６５５）、又は脂肪酸メチルエステルである場合にはバイオディーゼル（ＡＳＴＭ  Ｄ６７５１）と定義できる。
【０３６７】
抽出の後、本明細書に記載されているような微生物バイオマスから回収した脂質成分及び／又は炭化水素成分を、化学処理し、ディーゼル車及びジェットエンジン用の燃料を製造することができる。
【０３６８】
バイオディーゼルは、生成物の原材料に依存して、金色から濃い褐色までの色をした液体である。実質的に水には混和せず、高い沸点を有し、蒸気圧が低い。バイオディーゼルは、ディーゼルエンジン車で使用するために、ディーゼルと等価な処理した燃料を指す。バイオディーゼルは、生分解性であり、毒性がない。従来のディーゼル燃料に比べて、バイオディーゼルのさらなる利点は、エンジンの摩耗が少ないことである。典型的には、バイオディーゼルは、Ｃ１４〜Ｃ１８のアルキルエステルを含む。種々のプロセスによって、バイオマス又は脂質が生成し、本明細書に記載されるように、単離してディーゼル燃料にする。バイオディーゼルを生成する好ましい方法は、本明細書に記載されるような脂質のトランスエステル化である。バイオディーゼルで用いるのに好ましいアルキルエステルは、メチルエステル又はエチルエステルである。
【０３６９】
本明細書に記載の方法によって生成するバイオディーゼルは、単独で用いてもよく、ほとんどのディーゼルエンジン車における任意の濃度で、従来のディーゼル燃料とブレンドしてもよい。従来のディーゼル燃料（石油ディーゼル）とブレンドする場合、バイオディーゼルは、約０．１％〜約９９．９％存在してもよい。世界のほとんどで、燃料混合物中のバイオディーゼルの量を述べるために、「Ｂ」ファクターとして知られるシステムを用いる。例えば、２０％のバイオディーゼルを含む燃料は、Ｂ２０というラベルが付けられる。純粋なバイオディーゼルは、Ｂ１００と呼ばれる。
【０３７０】
また、バイオディーゼルを、家庭用ボイラ及び商業用ボイラの加熱燃料として用いてもよい。既存の灯油式ボイラは、ゴム部材を備える可能性があり、バイオディーゼルで動かすために改造する必要がある。改造プロセスは、通常は、比較的単純なものであり、バイオディーゼルが強い溶媒であるため、ゴム部材を合成部材と交換することを含む。バイオディーゼルの溶媒力が強いため、バイオディーゼルを燃やすと、ボイラの効率は上がるだろう。バイオディーゼルを、純粋な超低硫黄ディーゼル（ＵＬＳＤ）燃料の潤滑性を向上させるために、ディーゼル配合物の添加剤として用いてもよく、バイオディーゼルは硫黄を含有しないため、有益である。バイオディーゼルは、石油系ディーゼルよりも良好な溶媒であり、石油系ディーゼルで走っていた車両の燃料ラインに残る残留分の沈殿を分解するために用いてもよい。
【０３７１】
バイオディーゼルは、油を豊富に含むバイオマスに含まれるトリグリセリドのトランスエステル化によって生成することができる。従って、本発明の別の態様では、バイオディーゼルを生成する方法が提供されている。好ましい実施形態では、バイオディーゼルを生成する方法は、（ａ）本明細書に開示されている方法を用い、脂質を含有する微生物を育てる工程と、（ｂ）脂質を含有する微生物を溶解させ、溶解物を生成する工程と、（ｃ）溶解した微生物から脂質を単離する工程と、（ｄ）脂質組成物をトランスエステル化する工程とを含み、これによってバイオディーゼルが生成する。微生物を成長させ、微生物を溶解させ、溶解物を生成し、有機溶媒を含む培地中、溶解物を処理し、不均一な混合物を生成し、処理した溶解物を脂質組成物に分離する方法は、上に記載されており、バイオディーゼルを生成する方法でも用いることができる。
【０３７２】
バイオディーゼルの脂質プロフィールは、通常は、原材料である油の脂質プロフィールと類似している。本発明の方法及び組成物によって与えられる他の油をトランスエステル化し、（ａ）Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも１％〜５％、好ましくは少なくとも４％であり；（ｂ）Ｃ８が少なくとも０．２５％〜１％、好ましくは少なくとも０．３％であり；（ｃ）Ｃ１０が少なくとも１％〜５％、好ましくは少なくとも２％であり；（ｄ）Ｃ１２が少なくとも１％〜５％、好ましくは少なくとも２％であり；及び（３）Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも２０％〜４０％、好ましくは少なくとも３０％である脂質プロフィールを有するバイオディーゼルを得ることができる。
【０３７３】
脂質組成物をトランスエステル化し、バイオディーゼルとして有用な長鎖脂肪酸エステルを得ることができる。好ましいトランスエステル化反応について、以下に概略を説明しており、塩基触媒によるトランスエステル化と、組み換えリパーゼを用いたトランスエステル化を含む。塩基触媒によるトランスエステル化プロセスでは、トリアシルグリセリドを、アルカリ触媒、典型的には、水酸化カリウム存在下、メタノール又はエタノールのようなアルコールと反応させる。この反応から、メチルエステル又はエチルエステルと、副生成物としてグリセリン（グリセロール）とが生成する。
【０３７４】
動物性油及び植物性油は、典型的には、遊離脂肪酸と三価アルコールであるグリセロールとのエステルであるトリグリセリドから作られる。トランスエステル化において、トリアシルグリセリド（ＴＡＧ）中のグリセロールを、メタノール又はエタノールのような短鎖アルコールと交換する。典型的な反応スキームは、以下の通りである。
【化１】
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【０３７５】
この反応では、アルコールを塩基で脱プロトン化し、もっと強い求核試薬にする。一般的に、エタノール又はメタノールを大過剰に用いる（最大５０倍まで）。通常は、この反応は、非常にゆっくりと進むか、まったく進まないであろう。反応をもっとすばやく進めるために、熱とともに、酸又は塩基を用いてもよい。トランスエステル化反応によって酸又は塩基は消費されず、従って、これらは反応剤ではなく、触媒である。ほとんど全てのバイオディーゼルは、低い温度及び低い圧力のみを必要とし、変換収率が９８％を超えるため、塩基触媒による技術を用いて生成されている（但し、出発原料の油は、水分量が低く、遊離脂肪酸の量が少ないことを条件とする）。
【０３７６】
また、トランスエステル化は、塩基の代わりに、リパーゼのような酵素を用いて上述のように行われる。リパーゼによって触媒されるトランスエステル化は、例えば、ＴＡＧと低級アルコールとのモル比が、１：１より大きく、好ましくは約３：１の比率で、室温〜８０℃の温度で行われて得る。トランスエステル化で用いるのに適したリパーゼとしては、限定されないが、表９に列挙されるものが挙げられる。トランスエステル化に有用なリパーゼの他の例は、例えば、米国特許第４，７９８，７９３号；第４，９４０，８４５号、第５，１５６，９６３号；第５，３４２，７６８号；第５，７７６，７４１号、ＷＯ８９／０１０３２号に見いだされる。このようなリパーゼとしては、限定されないが、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈｕｍｉｃｏｌａの微生物によって産生されるリパーゼ及び膵臓リパーゼが挙げられる。
【０３７７】
【表９】
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【０３７８】
バイオディーゼルに適した脂肪酸エステルを生成するために、リパーゼを用いることの課題の１つは、リパーゼの価格が、強塩基プロセスで用いる水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の価格よりもかなり高いことである。この課題は、リサイクル可能な固定化されたリパーゼを用いることによって対処される。しかし、固定化されたリパーゼの活性は、生成費用の観点で、リパーゼによるプロセスが、強塩基プロセスと匹敵するようになるような最低限のサイクル数リサイクルした後にも維持されていなければならない。固定化されたリパーゼは、典型的には、トランスエステル化で用いられる低級アルコールによって毒化されやすい。米国特許第６，３９８，７０７号（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．に対し、２００２年６月４日発行）は、固定化されたリパーゼを高める方法、及び活性が低下した、固定化されたリパーゼを再生する方法を記載している。いくつかの適切な方法は、固定化されたリパーゼを、炭素原子数が３個未満のアルコールに所定時間、好ましくは、０．５〜４８時間、より好ましくは、０．５〜１．５時間浸すことを含む。また、いくつかの適切な方法は、不活性化した、固定化されたリパーゼを、炭素原子が３個を超えないアルコールで洗浄し、次いで、この不活性化した、固定化されたリパーゼを、植物油に０．５〜４８時間浸すことを含む。
【０３７９】
特定の実施形態では、組み換えリパーゼを、リパーゼが作用して脂質を産生する同じ微生物中で発現する。適切な組み換えリパーゼとしては、上の表９に列挙されているもの、及び／又は上の表９に列挙されているＧｅｎｂａｎｋ寄託番号を有するもの、又は、上の表９に列挙されているリパーゼの１つとのアミノ酸同一性が少なくとも７０％であり、リパーゼ活性を示すポリペプチドが挙げられる。さらなる実施形態では、酵素活性は、上に記載した配列の１つとの同一性が少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の配列に存在し、これらは全て、完全に記載されているかのように参照により組み込まれる。リパーゼ及び選択可能なマーカーをコードするＤＮＡは、好ましくは、コドンが最適化されたｃＤＮＡである。微細藻類において発現させるための遺伝子を書き換える方法は、米国特許第７，１３５，２９０号に記載されている。
【０３８０】
バイオディーゼルに関する一般的な国際標準は、ＥＮ  １４２１４である。ＡＳＴＭ  Ｄ６７５１は、米国及びカナダで参照されている最も一般的なバイオディーゼル標準である。ドイツは、ＤＩＮ  ＥＮ  １４２１４を使用しており、英国は、ＢＳ  ＥＮ  １４２１４の順守が必要である。上述の製品がこれらの標準を満たしているか否かを決定するための基本的な工業用試験としては、典型的には、ガスクロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどが挙げられる。上述の品質表寿を満たすバイオディーゼルは、非常に毒性が低く、毒性の評価（ＬＤ５０）は、５０ｍＬ／ｋｇより大きい。
【０３８１】
ＡＳＴＭ標準を満たすバイオディーゼルは、毒性が低くなければならないが、堆積物として溶液から結晶化し、及び／又は沈殿し、沈む傾向のある混入物質が存在している場合がある。堆積物の生成は、バイオディーゼルが低い温度で使用される場合、特に問題である。堆積物又は沈殿は、燃料の流れを減らし、燃料ラインを詰まらせ、フィルターを詰まらせるなどの問題を引き起こす場合がある。もっと品質の高い製品を製造するために、バイオディーゼル中の上述の混入物質及び堆積物を除去することに特に対処するプロセスが、当該技術分野でよく知られている。このようなプロセスの例としては、限定されないが、リン脂質及び遊離脂肪酸のような混入物質を除去するための、油の前処理（例えば、ガム状物質の除去、苛性ソーダによる精製、シリカ吸着剤による濾過）及び冷却状態での濾過が挙げられる。冷却状態での濾過は、生成した後のバイオディーゼル中に存在する任意の粒状物及び堆積物を除去するために特に開発されたプロセスである。このプロセスは、バイオディーゼルを冷却し、低い温度で燃料を用いる場合に生成するかもしれない任意の堆積物又は沈殿を濾別する。このようなプロセスは、当該技術分野でよく知られており、米国特許公開第２００７−０１７５０９１号に記載されている。適切な方法は、バイオディーゼルを約３８℃より低い温度まで冷却し、不純物及び混入物質をバイオディーゼル液体中、粒状物として析出させる。次いで、この冷却したバイオディーゼル材料に、珪藻土又は他の濾過材料を加えてスラリーを作成し、次いで、これを葉状圧力フィルター又は他の種類のフィルターで濾過し、粒状物を除去する。次いで、濾過したバイオディーゼルを、最終的なバイオディーゼル製品が得られるように、研磨フィルターに通し、残った任意の堆積物及び珪藻土を除去する。
【０３８２】
実施例１３は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓに由来するトリグリセリド油を用いた、バイオディーゼルの生成について記載している。実施例１３で生成したバイオディーゼルのＡＳＴＭ  Ｄ６７５１  Ａ１法による、Ｃｏｌｄ  Ｓｏａｋ  Ｆｉｌｔｅｒａｂｉｌｉｔｙは、容積３００ｍｌで１２０秒であった。この試験は、Ｂ１００  ３００ｍｌを濾過し、４０°Ｆ（約４．５°Ｃ）で１６時間冷却し、室温まで加温し、減圧下、ステンレス鋼の支持材を取り付けた０．７マイクロメートルガラス繊維を用いて濾過する。本発明の油を、トランスエステル化し、冷状態浸漬時間が、１２０秒未満、１００秒未満、９０秒未満のバイオディーゼルを得ることができる。
【０３８３】
バイオディーゼルが、特定の冷温で使用される場合、次のプロセスを用いてもよい。このようなプロセスは、脱ろう及び画分化を含む。両プロセスは、曇り点（バイオディーゼルが結晶化し始める温度）を下げることによって、冷状態での流動性を高め、冬の燃料の性能を高める。バイオディーゼルを脱ろうするために、いくつかのアプローチが存在する。アプローチのひとつは、バイオディーゼルと、石油ディーゼルとをブレンドすることである。別のアプローチは、バイオディーゼルの曇り点を下げることが可能な添加剤を使用することである。別のアプローチは、添加剤中で混合し、飽和物質を結晶化させ、次いで結晶を濾別することによって、飽和メチルエステルを無差別に除去することである。画分化は、メチルエステルを個々の成分又は画分に選択的に分離し、これにより、特定のメチルエステルを除去するか、又は含むようにすることができる。画分化方法は、尿素による画分化、溶媒による画分化、熱による蒸留が挙げられる。
【０３８４】
本発明の方法によって提供される別の価値の高い燃料は、再生可能なディーゼルであり、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、Ｃ１６：０及びＣ１８：０のようなアルカンを含み、従って、バイオディーゼルとは区別することができる。高品質の再生可能なディーゼルは、ＡＳＴＭ  Ｄ９７５の標準に適合している。本発明の方法によって生成する脂質は、再生可能なディーゼルを製造する原材料として役立たせることができる。従って、本発明の別の態様では、再生可能なディーゼルを製造する方法が提供される。再生可能なディーゼルは、熱水で処理すること（熱水処理）；水素化処理；間接的な液化といった、少なくとも３種類のプロセスで製造することができる。これらのプロセスによって、エステルではない留分が得られる。これらのプロセスの間、本明細書に記載されるように生成し、単離されたトリアシルグリセリドを、アルカンへと変換する。
【０３８５】
一実施形態では、再生可能なディーゼルを生成する方法は、（ａ）脂質を含有する微生物を本明細書に開示されている方法を用いて育てることと、（ｂ）微生物を溶解させ、溶解物を生成する工程と、（ｃ）溶解した微生物から脂質を単離する工程と、（ｄ）脂質を脱酸素し、熱水処理してアルカンを生成することとを含み、これによって再生可能なディーゼルが得られる。再生可能なディーゼルを製造するのに適した脂質は、ヘキサンのような有機溶媒を用い、微生物バイオマスから抽出することによって、又は米国特許第５，９２８，６９６号に記載されるような他の方法によって得ることができる。いくつかの適切な方法は、機械的に加圧し、遠心分離処理することを含んでいてもよい。
【０３８６】
いくつかの方法では、まず、微生物脂質を、熱処理と組み合わせてクラッキングし、それぞれ、炭素鎖長を短くし、二重結合を飽和させる。次いで、この物質を異性化し、これも熱水処理と組み合わせる。次いで、ナフサ画分を蒸留によって除去し、次いで、さらに蒸留し、ＡＳＴＭ  Ｄ９７５の標準を満たすように、ディーゼル燃料中の望ましい成分を蒸気にし、蒸留しつつ、Ｄ９７５の標準を満たすのに望ましいものよりも重い成分は残す。トリグリセリド油を含む油を化学的に改変する熱水処理方法、ハイドロクラッキング方法、脱酸素方法、異性化方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｐａｔｅｎｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ＥＰ１７４１７６８（Ａ１）；ＥＰ１７４１７６７（Ａ１）；ＥＰ１６８２４６６（Ａ１）；ＥＰ１６４０４３７（Ａ１）；ＥＰ１６８１３３７（Ａ１）；ＥＰ１７９５５７６（Ａ１）；米国特許第７，２３８，２７７号；第６，６３０，０６６号；第６，５９６，１５５号；第６，９７７，３２２号；第７，０４１，８６６号；第６，２１７，７４６号；第５，８８５，４４０号；第６，８８１，８７３号を参照。
【０３８７】
再生可能なディーゼルを生成する方法の一実施形態では、脂質を処理してアルカンを得ることは、脂質組成物の熱水処理によって行われる。熱水処理において、典型的には、バイオマスを、高温高圧下、水中で反応させて、油と残留する固体を生成させる。変換温度は、典型的には、３００°Ｆ〜６６０°Ｆ（約１４９°Ｃ〜約３４９°Ｃ）であり、圧力は、水が主に液体のままであるのに十分な圧力であり、１００〜１７０標準大気圧（ａｔｍ）である。反応時間は、１５〜３０分程度である。反応が終了した後、有機物を水から分離する。それにより、ディーゼルに適した留分が得られる。
【０３８８】
再生可能なディーゼルを製造するいくつかの方法では、トリグリセリドを処理する第１の工程は、二重結合を飽和させる水素化処理であり、次いで、水素及び触媒存在下、高温で脱酸素させる。いくつかの方法では、水素化及び脱酸素は、同じ反応中に起こる。他の方法では、水素化の前に脱酸素が起こる。次いで、場合により、これも水素及び触媒が存在する条件で、異性化を行う。ナフサ成分は、好ましくは、蒸留によって除去される。例えば、米国特許第５，４７５，１６０号（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ）；第５，０９１，１１６号（ｄｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ，ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇａｓ  ｒｅｍｏｖａｌ）；第６，３９１，８１５号（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ）；第５，８８８，９４７号（ｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を参照。
【０３８９】
トリグリセリドを水素化するのに適した方法のひとつは、銅、亜鉛、マグネシウム、ランタニウムの塩の水溶液と、アルカリ金属、又は好ましくは、炭酸アンモニウムの別の溶液とを調製することを含む。この２種類の溶液を、約２０℃〜約８５℃の温度まで加熱し、触媒を生成させるために、沈殿容器のｐＨが５．５〜７．５に維持されるように、沈殿容器に秤量しながら一緒に加える。沈殿容器にさらなる水を最初に入れておいてもよく、又は、塩溶液及び沈殿溶液と同時に入れてもよい。得られた沈殿を十分に洗浄し、乾燥させ、約３００℃で焼結し、約１００℃〜約４００℃の範囲の温度で、水素で活性化する。次いで、容器中、１つ以上のトリグリセリドを接触させ、上述の触媒存在下、水素と反応させてもよい。この反応槽は、トリクルベッド反応槽、固定床気体−固体反応槽、充填気泡反応槽、連続攪拌型タンク反応槽、スラリー相反応槽、又は当該技術分野で既知の任意の他の適切な反応槽であってもよい。このプロセスは、バッチ式で行ってもよく、連続的な様式で行ってもよい。反応温度は、典型的には、約１７０℃〜約２５０℃の範囲であり、一方、反応圧力は、典型的には、約３００ｐｓｉｇ（約２，０００ｋＰｈａ）〜約２，０００ｐｓｉｇ（約１３，０００ｋＰｈａ）の範囲内にある。さらに、本発明のプロセスにおいて、水素とトリグリセリドとのモル比は、典型的には、約２０：１〜約７００：１の範囲にある。このプロセスは、典型的には、約０．１ｈｒ−１〜約５ｈｒ−１の範囲の重量空間速度（ＷＨＳＶ）で行われる。当業者は、反応に必要な時間は、使用する温度、水素とトリグリセリドとのモル比、水素の分圧によってさまざまであることを認識するだろう。このような水素化プロセスで生成する生成物は、脂肪族アルコール、グリセロール、微量のパラフィン及び未反応のトリグリセリドを含む。これらの生成物を、典型的には、例えば、蒸留、抽出、濾過、結晶化などの従来の手段によって分離する。
【０３９０】
石油精製業者は、水素化処理を利用し、原料を水素で処理することによって不純物を除去する。水素化処理による変換温度は、典型的には、３００°Ｆ〜７００°Ｆ（約１４９°Ｃ〜約３７１°Ｃ）である。圧力は、典型的には、４０〜１００ａｔｍである。反応時間は、典型的には、１０〜６０分程度である。固体触媒を利用し、特定の反応速度を上げ、特定の生成物の選択性を上げ、水素の消費量を最適化する。
【０３９１】
油を脱酸素するのに適した方法は、油を約３５０°Ｆ〜約５５０°Ｆ（約１７７°Ｃ〜約２８８°Ｃ）の範囲の温度まで加熱することと、少なくとも大気圧よりも高い圧力で、少なくとも５分間、加熱した油を窒素と連続的に接触させることとを含む。
【０３９２】
異性化に適した方法は、アルカリ異性化、及び当該技術分野で既知の他の油異性化を含む。
【０３９３】
熱水処理及び水素化処理によって、最終的に、トリグリセリド供給物の分子量が低下する。トリグリセリド分子は、水素化処理条件で、プロパン分子と、３種類のこれより重い炭化水素分子、典型的には、Ｃ８〜Ｃ１８の範囲の炭化水素分子の４種類の炭化水素へと還元される。
【０３９４】
従って、一実施形態では、本発明の脂質組成物で行われる１つ以上の化学反応の生成物は、ＡＳＴＭ  Ｄ９７５の再生可能なディーゼルを有するアルカン混合物である。微生物による炭化水素の産生は、Ｍｅｔｚｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００５）６６：４８６−４９６及びＡ  Ｌｏｏｋ  Ｂａｃｋ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ’ｓ  Ａｑｕａｔｉｃ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ：Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  ｆｒｏｍ  Ａｌｇａｅ、ＮＲＥＬ／ＴＰ−５８０−２４１９０、Ｊｏｈｎ  Ｓｈｅｅｈａｎ、Ｔｅｒｒｉ  Ｄｕｎａｈａｙ、Ｊｏｈｎ  Ｂｅｎｅｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ  Ｒｏｅｓｓｌｅｒ（１９９８）にまとめられている。
【０３９５】
ディーゼル燃料の蒸留特性は、Ｔ１０−Ｔ９０（それぞれ、容積で１０％及び９０％が留出した温度）の観点で記載される。再生可能なディーゼルは、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓトリグリセリド油から作られ、実施例１３に記載されている。実施例１３で作られた物質のＴ１０−Ｔ９０は、５７．９℃であった。本明細書に開示されている油の水素化処理、異性化、他の共有結合の改変、及び、本明細書に開示されている蒸留及び画分化（例えば、冷状態での濾過）を利用し、本明細書に開示されている方法に従って作られるトリグリセリド油を用い、他のＴ１０−Ｔ９０範囲、例えば、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、６０℃、６５℃の再生可能なディーゼル組成物を生成することができる。
【０３９６】
実施例１３で作られる材料のＴ１０は、２４２．１℃であった。本明細書に開示されている油の方法水素化処理、異性化、他の共有結合の改変、及び、本明細書に開示されている蒸留及び画分化（例えば、冷状態での濾過）を利用し、他のＴ１０値、例えば、Ｔ１０が１８０〜２９５、１９０〜２７０、２１０〜２５０、２２５〜２４５、少なくとも２９０の再生可能なディーゼル組成物を生成してもよい。
【０３９７】
実施例１３で作られる材料のＴ９０は、３００℃であった。本明細書に開示されている油の方法水素化処理、異性化、他の共有結合の改変、及び、本明細書に開示されている蒸留及び画分化（例えば、冷状態での濾過）を利用し、他のＴ９０値、例えば、Ｔ９０が２８０〜３８０、２９０〜３６０、３００〜３５０、３１０〜３４０、少なくとも２９０の再生可能なディーゼル組成物を生成してもよい。
【０３９８】
実施例１３で作られる材料の最終沸点（ＦＢＰ）は、３００℃であった。本明細書に開示されている油の方法は、水素化処理、異性化、他の共有結合の改変、及び、本明細書に開示されている蒸留及び画分化（例えば、冷状態での濾過）を利用し、他のＦＢＰ値、例えば、ＦＢＰが２９０〜４００、３００〜３８５、３１０〜３７０、３１５〜３６０、少なくとも３００の再生可能なディーゼル組成物を生成してもよい。
【０３９９】
本発明の方法及び組成物によって提供される他の油に、水素化処理、異性化、他の共有結合の改変を組み合わせて行ってもよく、（ａ）Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも１％〜５％、好ましくは少なくとも４％；（ｂ）Ｃ８が少なくとも０．２５％〜１％、好ましくは少なくとも０．３％；（ｃ）Ｃ１０が少なくとも１％〜５％、好ましくは少なくとも２％；（ｄ）Ｃ１２が少なくとも１％〜５％、好ましくは少なくとも２％；及び（３）Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも２０％〜４０％、好ましくは少なくとも３０％の脂質プロフィールを有する油を含む。
【０４００】
従来の超低硫黄ディーゼルは、２工程プロセスによって、バイオマスの任意の形態から製造してもよい。第１に、バイオマスを、水素及び一酸化炭素を豊富に含む気体状混合物である合成ガスに変換する。次いで、この合成ガスを、触媒によって液体に変換する。典型的には、液体の生成は、Ｆｉｓｃｈｅｒ−Ｔｒｏｐｓｃｈ（ＦＴ）合成を用いて行われる。この技術は、石炭、天然ガス、重油に応用される。従って、再生可能なディーゼルを製造する方法のさらに別の好ましい実施形態では、脂質組成物を処理し、アルカンを得ることは、脂質組成物を間接的に液状化することによって行われる。
【０４０１】
また、本発明は、ジェット燃料を生成する方法を提供する。ジェット燃料は、透明から麦わら色である。最も一般的な燃料は、航空機Ａ−１と分類される、鉛を含んでいない／パラフィン油系の燃料であり、国際的な標準化された一連の仕様を満たすように製造される。ジェット燃料は、多種類の異なる炭化水素の混合物であり、おそらく、数千種類以上が含まれているだろう。これらの物質の大きさの範囲（分子量又は炭素数）は、例えば、凍結点又は発煙点のような生成物の要求によって制限される。ケロシン（Ｋｅｒｏｓｏｎｅ）型の航空機燃料（Ｊｅｔ  Ａ及びＪｅｔ  Ａ−１を含む）は、炭素数が約８〜１６の炭素分布を有する。ワイドカット型又はナフサ型の航空機燃料（Ｊｅｔ  Ｂを含む）は、典型的には、炭素数が約５〜１５の炭素分布を有する。
【０４０２】
両方の航空機燃料（Ｊｅｔ  Ａ及びＪｅｔ  Ｂ）は、多くの添加剤を含み得る。有用な添加剤としては、限定されないが、酸化防止剤、帯電防止剤、腐食阻害剤、燃料計凍結阻害（ＦＳＩＩ）剤が挙げられる。酸化防止剤は、ガム化を防ぎ、通常は、アルキル化フェノール系のものであり、例えば、ＡＯ−３０、ＡＯ−３１又はＡＯ−３７である。帯電防止剤は、静電気を発散させ、火花を防ぐ。ジノニルナフチルスルホン酸（ＤＩＮＮＳＡ）を活性な成分として含むＳｔａｄｉｓ  ４５０は、一例である。腐食阻害剤、例えば、ＤＣＩ−４Ａは、民間用燃料及び軍事用燃料に用いられ、ＤＣＩ−６Ａは、軍事用燃料に用いられる。ＦＳＩＩ剤としては、例えば、Ｄｉ−ＥＧＭＥが挙げられる。
【０４０３】
本発明の一実施形態では、ジェット燃料は、藻の燃料と、既存のジェット燃料とをブレンドすることによって作られる。本発明の方法によって生成した脂質を、原材料として使い、ジェット燃料を製造する。従って、本発明の別の態様では、ジェット燃料を生成する方法が提供される。これとともに、本発明の方法によって生成される脂質からジェット燃料を製造する、流体触媒クラッキング（ＦＣＣ）及び水素化脱酸素（ＨＤＯ）の２つの方法が提供される。
【０４０４】
流体触媒クラッキング（ＦＣＣ）は、重い未精製画分から、オレフィン、特にプロプレンを製造するのに用いられる方法のひとつである。本発明の方法によって生成した脂質を、オレフィンへと変換することができる。このプロセスは、生成した脂質をＦＣＣゾーンに流すことと、ジェット燃料として有用な、オレフィンを含む生成物流を集めることとを含む。生成した脂質を、クラッキング条件で、クラッキング触媒と接触させ、ジェット燃料として有用なオレフィン及び炭化水素を含む生成物流を得る。
【０４０５】
一実施形態では、ジェット燃料を生成する方法は、（ａ）脂質を含有する微生物を、本明細書に開示されている方法を用いて育てることと、（ｂ）微生物を溶解させ、溶解物を生成する工程と、（ｃ）溶解した微生物から脂質を単離する工程と、（ｄ）脂質組成物を処理することとを含み、それによって、ジェット燃料が作られる。ジェット燃料を生成する方法の一実施形態では、脂質組成物は、流体触媒クラッキングゾーンへと流れてもよく、一実施形態では、脂質組成物と、クラッキング触媒とをクラッキング条件で接触させ、Ｃ２〜Ｃ５オレフィンを含む生成物流を得てもよい。
【０４０６】
この方法の特定の実施形態では、脂質組成物に存在し得る任意の混入物質を除去することが望ましい場合がある。従って、脂質組成物を、流体触媒クラッキングゾーンに流す前に、脂質組成物を前処理する。前処理は、脂質組成物と、イオン交換樹脂とを接触させることを含み得る。イオン交換樹脂は、ＡｍｂｅｒｌｙｓｔＴＭ−１５のような酸性イオン交換樹脂であり、脂質組成物が上向又は下向に流れる、反応槽中の床として用いてもよい。他の前処理は、脂質組成物を、硫酸、酢酸、硝酸又は塩酸のような酸と接触させることによる、穏和な酸洗浄を含んでいてもよい。接触は、通常は、周囲温度及び周囲圧力で、希釈酸溶液を用いて行われる。
【０４０７】
脂質組成物は、場合により前処理されており、これをＦＣＣゾーンに流し、このゾーンで、炭化水素系成分をクラッキングしてオレフィンにする。触媒クラッキングは、反応ゾーンで、脂質組成物を、細かく分割した粒状物質で構成される触媒と接触させることによって行われる。反応は、ハイドロクラッキングとは対照的な触媒クラッキングであり、水素を加えない状態で行われるか、又は水素を消費する状態で行われる。クラッキング反応が進むにつれて、かなりの量のコークスが触媒上に蓄積する。再生ゾーンで、触媒から高温でコークスを燃焼させることによって、触媒は再生する。コークスを含有する触媒は、本明細書では「コークス化触媒」と呼ばれ、反応ゾーンから再生ゾーンへと連続的に移動し、再生し、再生ゾーンから、本質的にコークスを含まない再生された触媒に置き換わる。種々の気体流によって触媒粒子を流動化すると、反応ゾーンと再生ゾーンとの間を触媒が移動することができる。炭化水素をクラッキングする方法、例えば、流動化した触媒流の中で本明細書に記載の脂質組成物の炭化水素をクラッキングし、反応ゾーンと再生ゾーンとの間を触媒が移動し、再生槽でコークスを燃焼させる方法は、ＦＣＣプロセスの分野で当業者には周知である。例示的なＦＣＣ用途、及びＣ２〜Ｃ５オレフィンを得るために、脂質組成物をクラッキングするのに有用な触媒は、米国特許第６，５３８，１６９号、第７，２８８，６８５号に記載されており、これらの文献は、内容全体が参照により組み込まれる。
【０４０８】
適切なＦＣＣ触媒は、一般的に、少なくとも２つの成分を含み、この２つの成分は、同じマトリックス上にあってもよく、同じマトリックス上になくてもよい。ある実施形態では、２つの成分は、両方とも、反応容器全体を循環していてもよい。第１の成分は、一般的に、流動化した触媒クラッキングの分野で用いられる、よく知られている任意の触媒、例えば、活性アモルファスクレイ型触媒及び／又は高い活性を有する結晶性分子ふるいを含んでいる。分子ふるい触媒は、望ましい生成物に対する選択性がかなり向上しているため、アモルファス触媒よりも好ましい場合がある。いくつかの好ましい実施形態では、ゼオライトを、ＦＣＣプロセスの分子ふるいとして用いてもよい。好ましくは、第１の触媒成分は、大きな孔のゼオライト、例えば、Ｙ型ゼオライト、活性アルミナ材料、シリカ又はアルミナのいずれかを含むバインダー材料、カオリンのような不活性フィラーを含んでいる。
【０４０９】
一実施形態では、本発明の脂質組成物のクラッキングは、ＦＣＣゾーンのライザー部分、又はリフト部分で起こる。脂質組成物は、ノズルによってライザー部分に導入され、その結果、脂質組成物がすばやく蒸気になる。触媒を接触させる前に、脂質組成物は、一般的には、約１４９℃〜約３１６℃（３００°Ｆ〜６００°Ｆ）の温度を有しているであろう。この触媒は、ブレンド容器からライザー部分に流れ、この部分で、約２秒又はそれより短い時間、脂質組成物と接触する。
【０４１０】
ブレンドされた触媒及び反応した脂質組成物の蒸気は、出口を通って、ライザー上部から排出され、オレフィンを含むクラッキングした生成物の蒸気流の中で分離し、かなりの量のコークスで覆われた、一般的に「コークス触媒」と呼ばれる触媒粒子を集める。望ましい生成物が望ましくない他の生成物にさらに変換されるのを促進するおそれがある、脂質組成物と触媒とが接触している時間を最小限にする試みにおいて、旋回アームの配置のような、セパレーターの配置を利用し、生成物流からコークス化触媒をすばやく離すことができる。セパレーター、例えば、旋回アームセパレーターは、チャンバの下側部分に位置するストリッピングゾーンを備えるチャンバの上側部分に位置している。旋回アームの配置から離れた触媒は、ストリッピングゾーンに落ちる。軽質オレフィン及びいくつかの触媒を含む、クラッキングした炭化水素を含むクラッキングした生成物の蒸気流は、サイクロンとつながった管を通ってチャンバを出る。サイクロンは、生成物の蒸気流から、残留する触媒粒子を除去し、粒子の濃度を非常に低いレベルまで下げる。次いで、生成物の蒸気流は、分離容器の上側を出る。サイクロンによって分離された触媒は、分離容器に戻り、次いで、ストリッピングゾーンに戻る。ストリッピングゾーンは、蒸気と向流で接触させることによって、触媒表面から吸着した炭化水素を除去する。
【０４１１】
炭化水素の分圧は、低い状態で軽質オレフィンを生成しやすくするように働く。従って、ライザーの圧力は、約１７２〜約２４１ｋＰａ（２５〜３５ｐｓｉａ）に設定し、炭化水素の分圧は約３５〜１７２ｋＰａ（５〜２５ｐｓｉａ）に設定し、好ましい炭化水素の分圧は、約６９〜１３８ｋＰａ（１０〜２０ｐｓｉａ）である。このように比較的低い炭化水素の分圧は、希釈剤が脂質組成物の１０〜５５ｗｔ％、好ましくは、約１５ｗｔ％になる程度まで、蒸気を希釈剤として用いることによって達成される。同等な炭化水素分圧を達成するために、乾燥ガスのような他の希釈剤を用いてもよい。
【０４１２】
ライザー出口でのクラッキングした蒸気の温度は、約５１０℃〜６２１℃（９５０°Ｆ〜１１５０°Ｆ）であろう。しかし、ライザー出口の温度が５６６℃（１０５０°Ｆ）より高いと、もっと気体は乾燥し、もっとオレフィンが増える。一方、ライザー出口の温度が５６６℃（１０５０°Ｆ）より低いと、エチレン及びプロピレンが減る。従って、約５６６℃〜約６３０℃の好ましい温度で、約１３８ｋＰａ〜約２４０ｋＰａ（２０〜３５ｐｓｉａ）の好ましい圧力で、ＦＣＣプロセスを行うことが好ましい。このプロセスの別の条件は、脂質組成物に対する触媒の比率であり、この比率は、約５〜約２０、好ましくは、約１０〜約１５の間で異なる。
【０４１３】
ジェット燃料を生成する方法の一実施形態では、脂質組成物は、ＦＣＣ反応槽のリフト部分に導入される。リフト部分での温度は、非常に熱く、約７００℃（１２９２°Ｆ）〜約７６０℃（１４００°Ｆ）の範囲であり、脂質組成物に対する触媒の比率は、約１００〜約１５０であろう。脂質組成物をリフト部分に導入すると、かなりの量のプロピレン及びエチレンを生成するであろうことが予測される。
【０４１４】
本明細書で記載されるように生成した脂質組成物及び脂質を用い、ジェット燃料を生成する方法の別の実施形態では、脂質組成物又は脂質の構造は、水素化脱酸素（ＨＤＯ）と呼ばれるプロセスによって破壊される。ＨＤＯは、水素を用いて酸素を除去することを意味し、つまり、この材料の構造を破壊しつつ、酸素を除去することを意味する。オレフィン系二重結合を水素化し、任意の硫黄化合物及び窒素化合物を除去する。硫黄の除去は、水素化脱硫黄（ＨＤＳ）と呼ばれる。原材料（脂質組成物又は脂質）の前処理及び純度は、触媒の寿命に関わる。
【０４１５】
一般的に、ＨＤＯ／ＨＤＳ工程において、水素を、供給原料（脂質組成物又は脂質）と混合し、この混合物を、並流として、単一成分又は二成分の供給原料として触媒床に流す。ＨＤＯ／ＭＤＳ工程の後、生成物の画分を分離し、別個の異性化反応槽に流す。生物学的出発物質のための異性化反応槽は、並流反応槽として文献に記載されている（ＦＩ  １００  ２４８）。
【０４１６】
供給される炭化水素、例えば、本明細書の脂質組成物又は脂質を水素化することによって燃料を生成するプロセスは、脂質組成物又は脂質を、第１の水素化ゾーンを通って水素ガスとともに並流として流すことによって行われ、その後に、水素ガスを、炭化水素流出物に対して向流で第２の水素化ゾーンに流すことによって、炭化水素流出物を第２の水素化ゾーンでさらに水素化する。Ｃ２〜Ｃ５オレフィンを生成するために、脂質組成物をクラッキングするのに有用な、例示的なＨＤＯ用途及び触媒は、米国特許第７，２３２，９３５号に記載されており、内容全体が参照により組み込まれる。
【０４１７】
典型的には、水素化脱酸素工程において、本明細書の脂質組成物又は脂質のような生物学的成分の構造は分解され、酸素化合物、窒素化合物、リン化合物、硫黄化合物、軽質炭化水素が気体として除去され、オレフィン性結合は水素化される。このプロセスの第２の工程、すなわち、いわゆる異性化工程では、炭化水素鎖を分岐させ、低温でパラフィンの性能を向上させるために、異性化が起こる。
【０４１８】
クラッキングプロセスの第１の工程、すなわち、ＨＤＯ工程では、水素ガス及び水素化されるべき本明細書の脂質組成物又は脂質は、ＨＤＯ触媒床系に向かって並流又は向流で流れ、この触媒床系は、１つ以上の触媒床、好ましくは、１〜３個の触媒床を有する。ＨＤＯ工程は、典型的には、並流の様式で操作される。２種以上の触媒床を含むＨＤＯ触媒床系の場合には、床のうち１つ以上を、向流の原理を用いて操作してもよい。ＨＤＯ工程では、圧力は、２０〜１５０ｂａｒを変動し、好ましくは、５０〜１００ｂａｒを変動し、温度は、２００〜５００℃で変動し、好ましくは、３００〜４００℃の範囲で変動する。ＨＤＯ工程では、周期律表のＶＩＩ族及び／又はＶＩＢ族の金属を含む既知の水素化触媒を用いてもよい。好ましくは、水素化触媒は、担持されたＰｄ、Ｐｔ、Ｎｉ、ＮｉＭｏ又はＣｏＭｏの触媒であり、担持体は、アルミナ及び／又はシリカである。典型的には、ＮｉＭｏ／Ａｌ２Ｏ３触媒及びＣｏＭｏ／Ａｌ２Ｏ３触媒を用いる。
【０４１９】
ＨＤＯ工程の前に、本明細書の脂質組成物又は脂質を、場合により、穏和な条件下で前水素化することにより処理し、二重結合の副作用を避けることができる。このような前水素化は、前水素化触媒存在下、温度が５０〜４００℃、水素圧が１〜２００ｂａｒ、好ましくは、１５０〜２５０℃の温度で、水素圧が１０〜１００ｂａｒで行われる。触媒は、周期律表のＶＩＩＩ族及び／又はＶＩＢ族の金属を含んでいてもよい。好ましくは、前水素化触媒は、担持されたＰｄ、Ｐｔ、Ｎｉ、ＮｉＭｏ又はＣｏＭｏの触媒であり、担持体は、アルミナ及び／又はシリカである。
【０４２０】
ＨＤＯ工程からの水素を含む気体の流れを冷却し、次いで、一酸化炭素、二酸化炭素、窒素化合物、リン化合物、硫黄化合物、気体状軽質炭化水素及び他の不純物をここから除去する。圧縮した後、精製された水素又はリサイクルされた水素を第１の触媒床に戻すか、及び／又は、触媒床の間に戻し、抜き取られた気体の流れを構成する。圧縮された液体から水が取り除かれる。この液体を第１の触媒又は触媒床の間に流す。
【０４２１】
ＨＤＯ工程の後、生成物に対し、異性化工程を行う。このプロセスにとって、炭化水素を異性化触媒と接触させる前に、可能な限り完全に不純物が除去されることが重要である。異性化工程は、場合により、ストリッピング工程を含んでおり、ＨＤＯ工程の反応生成物を、水蒸気又は軽質炭化水素、窒素又は水のような適切な気体を用いてストリッピングすることによって精製してもよい。この場合によって行われるストリッピング工程は、異性化触媒の上流にあるユニットで、向流様式で行われ、気体及び液体が互いに接触するか、又は向流の原理を利用する別個のストリッピングユニット中、実際の異性化反応槽の前に行われる。
【０４２２】
ストリッピング工程の後、水素ガス及び本明細書の水素化された脂質組成物又は脂質と、場合により、ｎ−パラフィン混合物は、１個又は複数個の触媒床を含む反応異性化ユニットを通る。異性化工程の触媒床は、並流又は向流の様式で操作されてもよい。
【０４２３】
このプロセスについて、異性化工程に向流の原理が適用されることが重要である。異性化工程では、このことは、場合により行われるストリッピング工程、又は異性化反応工程、又はこの両方の工程を向流の様式で行うことによってなされる。異性化工程では、圧力は、２０〜１５０ｂａｒ、好ましくは、２０〜１００ｂａｒの範囲で変動し、温度は、２００〜５００℃、好ましくは、３００〜４００℃である。異性化工程では、当該技術分野で知られている異性化触媒を用いてもよい。適切な異性化触媒は、分子ふるい及び／又はＶＩＩ属の金属及び／又はキャリアを含んでいる。好ましくは、異性化触媒は、ＳＡＰＯ−１１又はＳＡＰＯ４１又はＺＳＭ−２２又はＺＳＭ−２３又はフェライト、Ｐｔ、Ｐｄ又はＮｉ、Ａｌ２Ｏ３又はＳｉＯ２を含む。典型的な異性化触媒は、例えば、Ｐｔ／ＳＡＰＯ−１１／Ａｌ２Ｏ３、Ｐｔ／ＺＳＭ−２２／Ａｌ２Ｏ３、Ｐｔ／ＺＳＭ−２３／Ａｌ２Ｏ３、Ｐｔ／ＳＡＰＯ−１１／ＳｉＯ２である。異性化工程及びＨＤＯ工程は、同じ加圧容器で行われてもよく、別個の加圧容器で行われてもよい。場合により行われる前水素化は、ＨＤＯ工程及び異性化工程と加圧容器で行われてもよく、別個の加圧容器で行われてもよい。
【０４２４】
従って、一実施形態では、１つ又はそれ以上の化学反応の生成物は、ＨＲＪ−５を含んでなるアルカン混合物である。別の実施形態では、１つ以上の化学反応の生成物は、ＡＳＴＭ  Ｄ１６５５ジェット燃料を含むアルカン混合物である。ある実施形態では、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料の仕様に適合する組成物は、硫黄含有量が１０ｐｐｍ未満である。他の実施形態では、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料の仕様に適合する組成物は、蒸留曲線のＴ１０値が、２０５℃未満である。別の実施形態では、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料の仕様に適合する組成物は、最終沸点（ＦＢＰ）が３００℃未満である。別の実施形態では、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料の仕様に適合する組成物は、引火点が少なくとも３８℃である。別の実施形態では、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料の仕様に適合する組成物は、密度が７７５Ｋ／Ｍ３〜８４０Ｋ／Ｍ３である。さらに別の実施形態では、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料の仕様に適合する組成物は、凍結点が−４７℃未満である。別の実施形態では、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料の仕様に適合する組成物は、正味の燃焼熱が、少なくとも４２．８ＭＪ／Ｋである。別の実施形態では、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料の仕様に適合する組成物は、水素含有量が、少なくとも１３．４質量％である。別の実施形態では、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料の仕様に適合する組成物は、定量重量分析ＪＦＴＯＴで、２６０℃で試験した場合、熱安定性を有し、Ｈｇ３ｍｍ未満である。別の実施形態では、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料の仕様に適合する組成物は、存在するガム状物が７ｍｇ／ｄｌ未満である。
【０４２５】
したがって、本発明は、微細藻類脂質の化学的改変を行って、各種の工業などの用途に有用な生成物を得るための各種方法を開示する。本明細書に開示される方法により生成された油を改変するプロセスの例としては、油の加水分解、油の水素化処理、及び油のエステル化が挙げられるが、これらに限定されない。微細藻類脂質のその他の化学的改変としては、エポキシ化、酸化、加水分解、硫酸化、スルホン化、エトキシル化、プロポキシル化、アミド化及び鹸化が挙げられるが、これらに限定されない。微細藻類油の改変により、所望の機能のために選択された誘導体の油脂化学品へとさらに改変することが可能な、基本的な油脂化学品が得られる。燃料生成プロセスに関して上で述べたもの同様の様式で、これらの化学的な改変を、本明細書に記載されている微生物の培養物から生成した油に対して行ってもよい。基本的な油脂化学品の例としては、石鹸、脂肪酸、脂肪族エステル、脂肪族アルコール、脂肪族窒素化合物、脂肪酸メチルエステル及びグリセロールが挙げられるが、これらに限定されない。誘導体の油脂化学品としては、脂肪族ニトリル、エステル、ダイマー酸、四級アンモニウムカチオン、界面活性剤、脂肪族アルカノールアミド、脂肪族アルコールサルフェート、樹脂、乳化剤、脂肪族アルコール、オレフィン、掘削泥水、ポリオール、ポリウレタン、ポリアクリル酸、ゴム、ろうそく、化粧品、金属石鹸、石鹸、α−スルホン化メチルエステル、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエトキシレート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、イミダゾリン、界面活性剤、洗剤、エステル、四級アンモニウムカチオン、オゾン分解産物、脂肪族アミン、脂肪族アルカノールアミド、エトキシサルフェート、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド（中鎖脂肪酸トリグリセリドを含む）、滑沢剤、油圧油、グリース、誘電性流体、離型剤、金属加工油剤、熱媒体流体、その他の機能液、工業化学製品（例えば、洗浄剤、繊維加工助剤、可塑剤、安定化剤、添加剤）、表面塗装剤、塗料及びラッカー、電気配線絶縁体、並びに高級アルカンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４２６】
本発明の方法によって生成するグリセロ脂質に由来する脂肪酸構成要素を加水分解することによって、他の有用な化学物質を生成するように誘導体化することが可能な遊離脂肪酸が得られる。加水分解は、水及び触媒の存在下で起こり、触媒は、酸であっても、塩基であってもよい。以下に報告されているように、放出された遊離脂肪酸を誘導体化して、種々の生成物を得ることができる。米国特許第５，３０４，６６４号（Ｈｉｇｈｌｙ  ｓｕｌｆａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ）；第７，２６２，１５８号（Ｃｌｅａｎｓｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）；第７，１１５，１７３号（Ｆａｂｒｉｃ  ｓｏｆｔｅｎｅｒ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）；第６，３４２，２０８号（Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｓｋｉｎ）；第７，２６４，８８６号（Ｗａｔｅｒ  ｒｅｐｅｌｌａｎｔ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）；第６，９２４，３３３号（Ｐａｉｎｔ  ａｄｄｉｔｉｖｅｓ）；第６，５９６，７６８号（Ｌｉｐｉｄ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｒｕｍｉｎａｎｔ  ｆｅｅｄｓｔｏｃｋ）；第６，３８０，４１０号（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｌｅａｎｅｒｓ）。
【０４２７】
加水分解に関し、本発明の一実施形態では、トリグリセリド油を、場合により、まず、水又は水酸化ナトリウムのような液体培地中で加水分解し、グリセロール及び石鹸を得る。種々の適切なトリグリセリド加水分解方法が存在し、限定されないが、鹸化、酸加水分解、アルカリ加水分解、酵素加水分解（本明細書で、分解とも呼ばれる）、加圧熱水を用いた加水分解が挙げられる。当業者は、油脂化学品を生成するためにトリグリセリド油を加水分解する必要はないことを理解するだろう。むしろ、油を、他の既知のプロセスによって、望ましい油脂化学品に直接変換してもよい。例えば、トリグリセリド油を、エステル化によって、メチルエステル脂肪酸に直接変換してもよい。
【０４２８】
ある実施形態では、本明細書に開示されている方法によって生成した油の触媒的加水分解は、油をグリセロールと脂肪酸とに分解することによって起こる。上述のように、脂肪酸を、誘導体の油脂化学品を得るためのいくつかの他の改変によって、さらに処理してもよい。例えば、一実施形態では、脂肪酸は、アミノ化反応を受け、脂肪族窒素化合物を生成してもよい。別の実施形態では、脂肪酸は、オゾン分解を受け、一塩基酸及び二塩基酸を生成してもよい。
【０４２９】
他の実施形態では、加水分解は、本明細書で生成した油の分解によって起こり、油脂化学品を生成してもよい。いくつかの本発明の好ましい実施形態では、トリグリセリド油を分解してから、他のプロセスを行ってもよい。当業者は、限定されないが、酵素分解及び加圧分解を含む多くの適切なトリグリセリド分解方法が存在することを認識しているであろう。
【０４３０】
一般的に、酵素による油分解方法は、酵素リパーゼを、水／油混合物に作用する生体触媒として使用する。次いで、酵素分解によって、油又は脂肪を、それぞれグリセロールと遊離脂肪酸とに分解する。次いで、グリセロールは、水相に移動し、一方、有機相には、遊離脂肪酸が豊富に含まれる。
【０４３１】
酵素分解反応は、一般的に、有機相と水相との間の相の境界で起こり、酵素は、相の境界にしか存在しない。相の境界に来たトリグリセリドが、分解反応に寄与するか、又は分解反応に参加する。反応が進むにつれて、脂肪酸の占有密度又は濃度が、遊離脂肪酸と比較すると、まだグリセリドと化学的に結合しており、相の境界での占有密度又は濃度が低くなり、その結果、反応が遅くなる。特定の実施形態では、酵素分解を室温で行ってもよい。当業者は、所望な脂肪酸へと分解するのに適切な条件を知っているであろう。
【０４３２】
例として、反応速度は、界面の境界面が増えることによって速くすることができる。反応が終了したら、遊離脂肪酸を、有機相から酵素を含まずに分離し、まだグリセリドと化学的に結合した脂肪酸を含む残渣を、再び再び供給するか、又はリサイクルし、分解させるべき新しい油又は脂肪と混合する。この様式で、リサイクルされたグリセリドについて、次いで、さらなる酵素分解プロセスを行う。ある実施形態では、遊離脂肪酸を、このような様式で部分的に分解した油又は脂肪から抽出する。この様式で、化学的に結合している脂肪酸（トリグリセリド）が、分解プロセスに戻されるか、又は再び供給される場合、酵素の消費を顕著に減らすことができる。
【０４３３】
分解度は、測定した酸価を、所与の油又は脂肪からコンピュータで割り出すことが可能な理論的に可能な酸価で割った比率として決定される。好ましくは、酸価は、標準的な一般的な方法による滴定手段によって測定される。又は、グリセロール水相の密度は、分解度の測定値として測ることができる。
【０４３４】
一実施形態では、本明細書に記載されているような分解プロセスは、生成した油のアルカリ精製プロセスから得られる、いわゆる石鹸ストックに含まれるモノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリドを分解するのにも適している。このように、石鹸ストックは、それより前に天然の油が脂肪酸へと鹸化されることなく、定量的に変換することができる。この目的で、石鹸に化学的に結合している脂肪酸は、好ましくは、酸を加えることによって、分解の前に放出される。特定の実施形態では、分解プロセスのために、水及び酵素に加えて、緩衝溶液を用いる。
【０４３５】
一実施形態では、本発明の方法に従って生成した油に対し、加水分解方法として鹸化を行うことができる。動物性油及び植物性油は、典型的には、遊離脂肪酸と三価アルコールであるグリセロールとのエステルであるトリグリセリド（ＴＡＧ）から作られる。アルカリ加水分解反応において、ＴＡＧ中のグリセロールが除去され、ナトリウム又はカリウムのようなアルカリ金属と会合し、脂肪酸塩を生成することができる、３個のカルボン酸アニオンが残る。このスキームで、カルボン酸の構成要素が、グリセロール部分から開裂し、ヒドロキシル基によって置き換えられる。この反応で用いられる塩基（例えば、ＫＯＨ）の量は、望ましい鹸化度によって決定される。目的が、例えば、ＴＡＧ組成物に元も存在している油をいくらか含んでいる石鹸を生成することである場合、ＴＡＧの全てを脂肪酸に変換するのには十分でない塩基の量が、反応混合物に入れられる。通常は、この反応は水溶液中で行われ、ゆっくりと進むが、熱を加えて反応を速め得る。脂肪酸塩の沈殿は、例えば、水溶性のアルカリ金属ハロゲン化物（例えば、ＮａＣｌ又はＫＣｌ）のような塩を反応混合物に加えることによって促進され得る。好ましくは、塩基は、ＮａＯＨ又はＫＯＨのようなアルカリ金属の水酸化物である。又は、例えば、トリエタノールアミン及びアミノメチルプロパノールを含め、アルカノールアミンのような他の塩基を反応スキームで用いてもよい。ある場合では、これらの代替法は、透明な石鹸製品を作るのに好ましい場合がある。一実施形態では、鹸化を施す液体組成物は、本明細書に記載されている通りに生成された獣脂模倣物（すなわち、獣脂の液体組成物に類似した液体組成物）、又は獣脂模倣物と別のトリグリセリド油とのブレンドである。
【０４３６】
いくつかの方法では、化学的な改変の第１の工程は、二重結合を飽和させるための水素化処理であってもよく、次いで、水素及び触媒が存在する条件下、高温で脱酸素を行う。他の方法では、水素化及び脱酸素は、同じ反応で行ってもよい。さらに他の方法では、脱酸素は、水素化の前に行う。次いで、場合により、異性化を行ってもよく、これも水素及び触媒の存在下で行ってもよい。最後に、所望の場合、気体及びナフサ成分を除去することができる。例えば、米国特許第５，４７５，１６０号（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ）；第５，０９１，１１６号（ｄｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ，ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇａｓ  ｒｅｍｏｖａｌ）；第６，３９１，８１５号（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ）；第５，８８８，９４７号（ｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を参照。
【０４３７】
本発明のある実施形態では、トリグリセリド油を、部分的に脱酸素するか、又は完全に脱酸素する。脱酸素反応によって、限定されないが、脂肪酸、脂肪族アルコール、ポリオール、ケトン、アルデヒドのような所望な生成物が得られる。一般的に、いかなる特定の理論によっても限定されないが、脱酸素反応は、限定されないが、水素化分解、水素化、連続的な水素化−水素化分解、連続的な水素化分解−水素化、水素化−水素化分解反応の組み合わせを含む種々の異なる反応経路の組み合わせを含んでおり、その結果、脂肪酸又は脂肪酸エステルから酸素が少なくとも部分的に除去され、脂肪族アルコールのような反応生成物が生成し、さらなるプロセスによって、この生成物を所望な化学物質へと簡単に変換することができる。例えば、一実施形態では、脂肪族アルコールを、ＦＣＣ反応によってオレフィンへと変換してもよく、縮合反応によって高級アルカンへと変換してもよい。
【０４３８】
このような化学的な改変のひとつは水素化であり、水素化は、グリセロ脂質又は遊離脂肪酸の脂肪酸構成要素中にある二重結合に水素を添加することである。水素化プロセスによって、液体の油が、特定の用途ではさらに適切な場合がある半固体又は固体の脂肪へと変換される。
【０４３９】
本明細書に記載の方法によって生成する油の水素化は、米国特許第７，２８８，２７８号（Ｆｏｏｄ  ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  ｏｒ  ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ）；第５，３４６，７２４号（Ｌｕｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）；第５，４７５，１６０号（Ｆａｔｔｙ  ａｌｃｏｈｏｌｓ）；第５，０９１，１１６号（Ｅｄｉｂｌｅ  ｏｉｌｓ）；第６，８０８，７３７号（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｆａｔｓ  ｆｏｒ  ｍａｒｇａｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｓｐｒｅａｄｓ）；第５，２９８，６３７号（Ｒｅｄｕｃｅｄ−ｃａｌｏｒｉｅ  ｆａｔ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ）；第６，３９１，８１５号（Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ  ｃａｔａｌｙｓｔ  ａｎｄ  ｓｕｌｆｕｒ  ａｄｓｏｒｂｅｎｔ）；第５，２３３，０９９号及び第５，２３３，１００号（Ｆａｔｔｙ  ａｌｃｏｈｏｌｓ）；第４，５８４，１３９号（Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ  ｃａｔａｌｙｓｔｓ）；第６，０５７，３７５号（Ｆｏａｍ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）；第７，１１８，７７３号（Ｅｄｉｂｌｅ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｓｐｒｅａｄｓ）に報告されているように、本明細書で提供している１つ以上の方法及び／又は材料と組み合わせて行うことができる。
【０４４０】
当業者は、種々のプロセスを用いて炭水物を水素化してもよいことを認識するだろう。適切な方法のひとつは、炭水化物を、水素化反応槽中で、水素化生成物を得るのに十分な条件で、水素又は適切な気体と混合した水素及び触媒と接触させることを含む。水素化触媒は、一般的に、Ｃｕ、Ｒｅ、Ｎｉ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｒｕ、Ｐｄ、Ｒｈ、Ｐｔ、Ｏｓ、Ｉｒ、及びこれらの合金又は任意の組み合わせを、単独で、又は、Ｗ、Ｍｏ、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｒ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｓｎ、Ｂ、Ｐ、Ｂｉ、及びこれらの合金又は任意の組み合わせのようなプロモーターとともに含んでいてもよい。他の有効な水素化触媒材料としては、レニウムで改変された、担持されたニッケル又はルテニウムが挙げられる。一実施形態では、水素化触媒も、触媒の望ましい機能性に依存して、任意の担持体を含んでいてもよい。水素化触媒を、当業者に既知の方法によって調製してもよい。
【０４４１】
ある実施形態では、水素化触媒は、担持されたＶＩＩＩ属の金属触媒、金属スポンジ材料（例えば、スポンジニッケル触媒）を含んでいる。ラネーニッケルは、本発明で用いるのに適した、活性化されたスポンジニッケルの一例である。他の実施形態では、本発明の水素化反応は、ニッケル−レニウム触媒又はタングステンによって改変されたニッケル触媒を含む触媒を用いて行われる。本発明の水素化反応に適切な触媒の一例は、炭素に担持されたニッケル−レニウム触媒である。
【０４４２】
一実施形態では、適切なラネーニッケル触媒を、適切な等重量のニッケル及びアルミニウムの合金を、アルカリ水溶液、例えば、約２５重量％の水酸化ナトリウムを含むアルカリ水溶液で処理することによって調製し得る。アルミニウムを、アルカリ水溶液によって選択的に溶解し、ほとんどがニッケルで、少量のアルミニウムを含むスポンジ型の材料を得る。最初の合金は、生成したスポンジニッケル触媒に約１〜２重量％が残るような量で、プロモーター金属（すなわち、モリブデン又はクロム）を含んでいる。別の実施形態では、水素化触媒は、ニトロシル硝酸ルテニウム（ＩＩＩ）、塩化ルテニウム（ＩＩＩ）の水溶液を用い、適切な支持材料に含浸させて調製する。次いで、この溶液を乾燥させ、含水量が約１重量％未満の固体を得る。次いで、回転式のボール型炉で、水素を流しつつ、３００℃（焼成しない）〜４００℃（焼成する）で４時間かけて、この固体を大気圧で還元してもよい。冷却し、触媒を窒素で不活性化した後、窒素中、５容積％の酸素を触媒に２時間流す。
【０４４３】
特定の実施形態では、記載されている触媒は、触媒担持体を含む。触媒担持体は、触媒を安定化し、担持する。使用される触媒担持体の種類は、選択した触媒及び反応条件に依存する。本発明に適した担持体としては、限定されないが、炭素、シリカ、シリカ−アルミナ、ジルコニア、チタニア、セリア、バナジア、窒化物、窒化ホウ素、ヘテロポリ酸、ヒドロキシアパタイト、酸化亜鉛、クロミア、ゼオライト、カーボンナノチューブ、炭素フラーレン、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０４４４】
本発明で用いられる触媒は、当業者に既知の従来の方法を用いて調製することができる。適切な方法としては、限定されないが、初期湿潤法、蒸発させ、含浸させる方法、化学蒸着法、洗浄−コーティング、マグネトロンスパッタリング技術などが挙げられる。
【０４４５】
水素化反応を行う際の条件は、出発物質及び望ましい生成物の種類によって変わるだろう。当業者は、本開示の利益とともに、適切な反応条件を認識しているであろう。一般的に、水素化反応は、８０℃〜２５０℃の温度で行われ、好ましくは、９０℃〜２００℃、最も好ましくは、１００℃〜１５０℃の温度で行われる。ある実施形態では、水素化反応は、５００ＫＰａ〜１４０００ＫＰａの圧力で行われる。
【０４４６】
本発明の水素化分解反応で用いられる水素としては、外から加えられる水素、リサイクルした水素、系中で生成した水素、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。本明細書で使用される場合、用語「外から加えられる水素」は、バイオマス反応自体に由来する水素ではなく、別の供給源からシステムに加えられた水素を指す。
【０４４７】
本発明のある実施形態では、出発物質の炭水化物を、小さな分子に変換することが望ましく、この小さな分子は、望ましい高級炭化水素へと簡単に変換されるだろう。この変換の適切な方法のひとつは、水素化分解反応によるものである。炭水化物の水素化分解を行う種々のプロセスが知られている。適切な方法のひとつは、水素化分解反応槽中で、小さな分子又はポリオールを含む反応生成物を得るのに十分な条件で、水素又は適切な気体と混合した水素及び水素化分解触媒と接触させることを含む。本明細書で使用される場合、用語「小さな分子又はポリオール」は、小さな分子量を有する任意の分子を含み、出発の炭水化物よりも炭素原子又は酸素原子の数が少ないものを含み得る。一実施形態では、この反応生成物は、ポリオール及びアルコールを含む小さな分子を含む。当業者は、水素化分解反応を行うのに適切な方法を選択することができるであろう。
【０４４８】
ある実施形態では、５炭糖及び／又は６炭糖又は糖アルコールを、水素化分解触媒を用い、プロピレングリコール、エチレングリコール、グリセロールに変換してもよい。水素化分解触媒としては、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｗ、Ｒｅ、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｃｄ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｉｒ、Ｏｓ及びこれらの合金又は任意の組み合わせを、単独で、又は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｒ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｓｎ、Ｂｉ、Ｂ、Ｏ、及びこれらの合金又は任意の組み合わせのようなプロモーターとともに含んでいてもよい。また、水素化分解触媒は、遷移金属（例えば、クロム、モリブデン、タングステン、レニウム、マンガン、銅、カドミウム）又はＶＩＩＩ族の金属（例えば、鉄、コバルト、ニッケル、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、イリジウム、オスミウム）を含む炭素系パイロポリマー触媒を含んでいてもよい。特定の実施形態では、水素化分解触媒は、上述の金属を、アルカリ土類金属酸化物と組み合わせたもの、又は、触媒活性のある担持体に接着したものを含んでいてもよい。特定の実施形態では、水素化分解反応で記載されている触媒は、水素化反応について上に記載したような触媒担持体を含んでいてもよい。
【０４４９】
水素化分解反応を行う際の条件は、出発物質及び望ましい生成物の種類によって変わるだろう。当業者は、本開示の利益とともに、この反応を行うのに適切な反応条件を認識しているであろう。一般的に、水素化分解反応は、１１０℃〜３００℃の温度で行われ、好ましくは、１７０℃〜２２０℃、最も好ましくは、２００℃〜２２５℃の温度で行われる。ある実施形態では、水素化分解反応は、塩基性条件で行われ、好ましくは、ｐＨが８〜１３、さらにより好ましくは、ｐＨが１０〜１２の条件で行われる。ある実施形態では、水素化分解反応は、６０ＫＰａ〜１６５００ＫＰａの範囲の圧力で、好ましくは、１７００ＫＰａ〜１４０００ＫＰａ、さらにより好ましくは、４８００ＫＰａ〜１１０００ＫＰａの圧力で行われる。
【０４５０】
本発明の水素化分解反応で用いられる水素としては、外から加えられる水素、リサイクルした水素、系中で生成した水素、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０４５１】
ある実施形態では、上述の反応生成物を、縮合反応槽中、縮合反応によって高級な炭化水素へと変換されてもよい。このような実施形態では、反応生成物の縮合は、高級な炭化水素を生成することが可能な触媒が存在する条件で行われる。理論によって限定されることを意図していないが、高級な炭化水素の生成は、炭素−炭素結合、又は炭素−酸素結合の生成を含む、段階的な付加反応によって進むと考えられる。得られた反応生成物は、以下にさらに詳細に記載されるように、これらの部分を含む任意の数の化合物を含んでいる。
【０４５２】
特定の実施形態では、適切な縮合触媒としては、酸触媒、塩基触媒、又は酸／塩基触媒が挙げられる。本明細書で使用される場合、用語「酸／塩基触媒」は、酸と塩基の両方の機能を有する触媒を指す。ある実施形態では、縮合触媒としては、限定されないが、ゼオライト、カーバイド、窒化物、ジルコニア、アルミナ、シリカ、アルミノシリケート、ホスフェート、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化バナジウム、酸化ランタン、酸化イットリウム、酸化スカンジウム、酸化マグネシウム、酸化セリウム、酸化バリウム、酸化カルシウム、水酸化物、ヘテロポリ酸、無機酸、酸で改変された樹脂、塩基で改変された樹脂、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。ある実施形態では、縮合触媒としては、改変剤も含まれる。適切な改変剤としては、Ｌａ、Ｙ、Ｓｃ、Ｐ、Ｂ、Ｂｉ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。ある実施形態では、縮合触媒は、金属を含んでいてもよい。適切な金属としては、Ｃｕ、Ａｇ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｒｕ、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｇａ、Ｉｎ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｉｒ、Ｒｅ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｗ、Ｓｎ、Ｏｓ、合金、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【０４５３】
特定の実施形態では、縮合反応で記載されている触媒は、水素化反応について上に記載した触媒担持体を含んでいてもよい。特定の実施形態では、縮合触媒は、自立型である。本明細書で使用される場合、用語「自立型」は、触媒が、担持体として機能する別の材料を必要としないことを意味する。他の実施形態では、縮合触媒を、触媒を担持するのに適した別個の担持体と組み合わせて使用する。一実施形態では、縮合触媒担持体は、シリカである。
【０４５４】
縮合反応が起こる条件は、出発物質及び望ましい生成物の種類によって変わるだろう。当業者は、本開示の利益とともに、この反応を行うのに適切な反応条件を認識しているであろう。ある実施形態では、縮合反応は、提示されている反応の熱力学が好ましくなるような温度で行われる。縮合反応の温度は、出発物質の特定のポリオール又はアルコールによって変わるだろう。ある実施形態では、縮合反応の温度は、８０℃〜５００℃の範囲であり、好ましくは、１２５℃〜４５０℃、最も好ましくは、１２５℃〜２５０℃の範囲である。ある実施形態では、縮合反応は、０Ｋｐａ〜９０００ＫＰａの範囲の圧力で行われ、好ましくは、０ＫＰａ〜７０００ＫＰａ、さらにより好ましくは、０ＫＰａ〜５０００ＫＰａの範囲の圧力で行われる。
【０４５５】
本発明で得られる高級なアルカンとしては、限定されないが、炭素原子が４〜３０個の分枝鎖又は直鎖のアルカン、炭素原子が４〜３０個の分枝鎖又は直鎖のアルケン、炭素原子が５〜３０個のシクロアルカン、炭素原子が５〜３０個のシクロアルケン、アリール、縮合アリール、アルコール、ケトンが挙げられる。適切なアルカンとしては、限定されないが、ブタン、ペンタン、ペンテン、２−メチルブタン、ヘキサン、ヘキセン、２−メチルペンタン、３−メチルペンタン、２，２，−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、ヘプテン、オクタン、オクテン、２，２，４−トリメチルペンタン、２，３−ジメチルヘキサン、２，３，４−トリメチルペンタン、２，３−ジメチルペンタン、ノナン、ノネン、デカン、デセン、ウンデカン、ウンデセン、ドデカン、ドデセン、トリデカン、トリデセン、テトラデカン、テトラデセン、ペンタデカン、ペンタデセン、ノニルデカン、ノニルデセン、エイコサン、エイコセン、ウンエイコサン、ウンエイコセン、ドエイコサン、ドエイコセン、トリエイコサン、トリエイコセン、テトラエイコサン、テトラエイコセン、及びこれらの異性体が挙げられる。これらの生成物のいくつかは、燃料として用いるのに適し得る。
【０４５６】
ある実施形態では、シクロアルカン及びシクロアルケンは置換されていない。他の実施形態では、シクロアルカン及びシクロアルケンは、一置換されている。さらに他の実施形態では、シクロアルカン及びシクロアルケンは、多置換されている。置換されたシクロアルカン及びシクロアルケンを含む実施形態では、置換された基としては、限定されないが、炭素原子が１〜１２個の分枝鎖又は直鎖のアルキル、炭素原子が１〜１２個の分枝鎖又は直鎖のアルキレン、フェニル、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。適切なシクロアルカン及びシクロアルケンとしては、限定されないが、シクロペンタン、シクロペンテン、シクロヘキサン、シクロヘキセン、メチル−シクロペンタン、メチル−シクロペンテン、エチル−シクロペンタン、エチル−シクロペンテン、エチル−シクロヘキサン、エチル−シクロヘキセン、及びこれらの異性体、及び任意のこれらの組み合わせが挙げられる。
【０４５７】
ある実施形態では、生成したアリールは、置換されていない。別の実施形態では、生成したアリールは、一置換されている。置換アリールを含む実施形態では、置換された基としては、限定されないが、炭素原子が１〜１２個の分枝鎖又は直鎖のアルキル、炭素原子が１〜１２個の分枝鎖又は直鎖のアルキレン、フェニル、及び任意のこれらの組み合わせが挙げられる。本発明に適したアリールとしては、限定されないが、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、パラキシレン、メタキシレン、及び任意のこれらの組み合わせが挙げられる。
【０４５８】
本発明で生成したアルコールは、炭素原子を４〜３０個有している。ある実施形態では、アルコールは環状である。他の実施形態では、アルコールは、分岐している。別の実施形態では、アルコールは、直鎖である。本発明に適したアルコールとしては、限定されないが、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデカノール、ヘキサデカノール、ヘプチルデカノール、オクチルデカノール、ノニルデカノール、エイコサノール、ウンエイコサノール、ドエイコサノール、トリエイコサノール、テトラエイコサノール、及びこれらの異性体が挙げられる。
【０４５９】
本明細書で生成するケトンは、炭素原子を４〜３０個有している。一実施形態では、ケトンは環状である。別の実施形態では、ケトンは、分岐している。別の実施形態では、ケトンは、直鎖である。本発明に適したケトンとしては、限定されないが、ブタノン、ペンタノン、ヘキサノン、ヘプタノン、オクタノン、ノナノン、デカノン、ウンデカノン、ドデカノン、トリデカノン、テトラデカノン、ペンタデカノン、ヘキサデカノン、ヘプチルデカノン、オクチルデカノン、ノニルデカノン、エイコサノン、ウンエイコサノン、ドエイコサノン、トリエイコサノン、テトラエイコサノン、及びこれらの異性体が挙げられる。
【０４６０】
別のこのような化学的な改変は、インターエステル化である。天然で生成するグリセロ脂質は、脂肪酸の構成要素が均一に分布していない。油に関しては、インターエステル化は、異なるグリセロ脂質の２個のエステル間のアシル基が交換することを指す。インターエステル化のプロセスは、グリセロ脂質の混合物の脂肪酸構成要素を、分布パターンを改変するように再配置することができるという機構を与える。インターエステル化は、よく知られている化学プロセスであり、一般的には、アルカリ金属又はアルカリ金属アルキレート（例えば、ナトリウムメトキシド）のような触媒存在下、油混合物を所定時間（例えば、３０分）加熱すること（約２００℃まで）を含む。このプロセスを用い、油混合物の脂肪酸構成要素の分布パターンをランダム化することができ、又は、望ましい分布パターンを作成するようにすることができる。このような脂質の化学的な改変方法は、本明細書に与えられている材料、例えば、細胞乾燥重量の割合で、脂質として少なくとも２０％含む微生物バイオマスで行うことができる。
【０４６１】
脂肪酸の特定の分布パターンを求める、方向性を持ったインターエステル化は、油混合物を、融解が起こり得るいくつかのＴＡＧの融点よりも低い温度に維持することによって行うことができる。これにより、これらのＴＡＧが選択的に結晶化し、それらが結晶化する際に、反応混合物から効果的に除去される。このプロセスを、例えば、油中のほとんどの脂肪酸が沈殿するまで行ってもよい。方向性を持ったインターエステル化を、例えば、長鎖脂肪酸を、これよりも鎖が短い対応する脂肪酸と置き換えることによって、カロリー含有量が低い生成物を得るために使用してもよい。また、方向性を持ったインターエステル化を用い、望ましくないｔｒａｎｓ異性体を生じてしまう可能性がある水素化を行うことなく、所望の融解特性を有しており、食品添加物又は製品（例えば、マーガリン）中で求められている構造的特徴を有するような脂肪混合物を含む生成物を得ることができる。
【０４６２】
本明細書で記載されている方法によって生成する油のインターエステル化は、１つ以上の方法及び／又は材料、又は米国特許第６，０８０，８５３号（Ｎｏｎｄｉｇｅｓｔｉｂｌｅ  ｆａｔ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）；第４，２８８，３７８号（Ｐｅａｎｕｔ  ｂｕｔｔｅｒ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）；第５，３９１，３８３号（Ｅｄｉｂｌｅ  ｓｐｒａｙ  ｏｉｌ）；第６，０２２，５７７号（Ｅｄｉｂｌｅ  ｆａｔｓ  ｆｏｒ  ｆｏｏｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）；第５，４３４，２７８号（Ｅｄｉｂｌｅ  ｆａｔｓ  ｆｏｒ  ｆｏｏｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）；第５，２６８，１９２号（Ｌｏｗ  ｃａｌｏｒｉｅ  ｎｕｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）；第５，２５８，１９７号（Ｒｅｄｕｃｅ  ｃａｌｏｒｉｅ  ｅｄｉｂｌｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）；第４，３３５，１５６号（Ｅｄｉｂｌｅ  ｆａｔ  ｐｒｏｄｕｃｔ）；第７，２８８，２７８号（Ｆｏｏｄ  ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  ｏｒ  ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ）；第７，１１５，７６０号（Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）；第６，８０８，７３７号（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｆａｔｓ）；第５，８８８，９４７号（Ｅｎｇｉｎｅ  ｌｕｂｒｉｃａｎｔｓ）；第５，６８６，１３１号（Ｅｄｉｂｌｅ  ｏｉｌ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ）；第４，６０３，１８８号（Ｃｕｒａｂｌｅ  ｕｒｅｔｈａｎｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）で報告されているように、生成物を生成するための１つ以上の方法及び材料と組み合わせて行うことができる。
【０４６３】
一実施形態では、本発明によれば、上に記載されているように、油をトランスエステル化した後に、米国第６，４６５，６４２号で報告されているように、ポリオールポリオールを用いてトランスエステル化した生成物の反応を行う。このようなエステル化及び分離プロセスは、石鹸存在下、低級アルキルエステルとポリオールとを反応させる工程と；生成物の混合物から、残った石鹸を除去する工程と；生成物の混合物を水で洗浄し、乾燥させ、不純物を取り除く工程と；生成物の混合物を精製のために漂白する工程と；生成物の混合物中のポリオール脂肪酸ポリエステルから、未反応の低級アルキルエステルの少なくとも一部分を分離する工程と；未反応の低級アルキルエステルを分離させたものをリサイクルする工程とを含んでいてもよい。
【０４６４】
また、トランスエステル化は、米国特許第６，２７８，００６号に報告されているように、短鎖脂肪酸エステルを有する微生物バイオマスを用いて行ってもよい。一般的に、トランスエステル化は、適切な触媒存在下、短鎖脂肪酸エステルを、油に加え、この混合物を加熱することによって行われてもよい。ある実施形態では、油は、反応混合物の約５重量％〜約９０重量％含まれる。ある実施形態では、短鎖脂肪酸エステルは、反応混合物の約１０重量％〜約５０重量％含まれていてもよい。触媒の非限定的な例としては、塩基触媒、ナトリウムメトキシド、硫酸及び酸性クレイのような無機酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸のような有機酸、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ  １５のような酸性樹脂を含む酸触媒が挙げられる。ナトリウム及びマグネシウムのような金属、金属ヒドリドも有用な触媒である。
【０４６５】
別のこのような化学的な改変は、ヒドロキシル化であり、二重結合に水を付加し、飽和状態にし、ヒドロキシル部分を組み込むことを含む。ヒドロキシル化プロセスは、グリセロ脂質の１つ以上の脂肪酸構成要素をヒドロキシ脂肪酸に変換する機構を与える。ヒドロキシル化は、例えば、米国特許第５，５７６，０２７号に報告されている方法によって行うことができる。ヒマシ油及びその誘導体を含むヒドロキシル化脂肪酸は、食品添加物、界面活性剤、色素湿潤剤、消泡剤、撥水添加剤、可塑剤、香粧品用乳化剤及び／又は消臭剤、及びエレクトロニクス、医薬、塗料、インク、接着剤、滑沢剤のような、いくつかの工業用途での成分として有用である。グリセリドのヒドロキシル化をどのように行うかの一例を以下に示す。脂肪を、好ましくは、ヘプタンと組み合わせて約３０〜５０℃の温度まで加熱し、この温度に３０分以上維持してもよく；次いで、この混合物に酢酸を加えた後、硫酸水溶液を加え、次いで、過酸化水素水溶液を１時間かけて混合物に少量ずつ加えてもよく；過酸化水素水溶液を加えた後、温度を少なくとも約６０℃まで上げ、少なくとも６時間攪拌してもよく；攪拌した後、この混合物を静置し、反応によって生成した下側の水層を除去しつつ、反応によって生成した上側のヘプタン層を約６０℃の温度を有する熱水で洗浄してもよく；次いで、洗浄したヘプタン層を水酸化カリウム水溶液でｐＨが約５〜７になるまで中和し、次いで、減圧下で蒸留によって除去してもよく；次いで、反応生成物を減圧下、１００℃で乾燥させ、乾燥した生成物を、減圧条件下、蒸気で消臭し、珪藻土を用いて約５０℃〜６０℃で濾過してもよい。
【０４６６】
本明細書に記載されている微生物油のヒドロキシル化を、１つ以上の方法及び／又は材料と組み合わせて行ってもよく、米国特許第６，５９０，１１３号（Ｏｉｌ−ｂａｓｅｄ  ｃｏａｔｉｎｇｓ  ａｎｄ  ｉｎｋ）；第４，０４９，７２４号（Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）；第６，１１３，９７１号（Ｏｌｉｖｅ  ｏｉｌ  ｂｕｔｔｅｒ）；第４，９９２，１８９号（Ｌｕｂｒｉｃａｎｔｓ  ａｎｄ  ｌｕｂｅ  ａｄｄｉｔｉｖｅｓ）；第５，５７６，０２７号（Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｅｄ  ｍｉｌｋ）；第６，８６９，５９７号（Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ）で報告されているように、生成物を生成するための１つ以上の方法及び材料と組み合わせて行ってもよい。
【０４６７】
ヒドロキシル化されたグリセロ脂質をエストライドに変換することができる。エストライドは、ヒドロキシル化された脂肪酸構成要素が、別の脂肪酸分子でエステル化されたグリセロ脂質からなる。ヒドロキシル化されたグリセロ脂質をエストライドに変換することは、Ｉｓｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、ＪＡＯＣＳ  ７１（２）：１６９−１７４（１９９４）に記載されるように、グリセロ脂質及び脂肪酸の混合物を加熱し、この混合物を鉱物酸と接触させることによって行うことができる。エストライドは、米国特許第７，１９６，１２４号（エラストマー材料および床仕上げ材）；第５，４５８，７９５号（高温度での用途のための濃化油）；第５，４５１，３３２号（工業用途のための液体）；第５，４２７，７０４号（燃料添加剤）；第５，３８０，８９４号（潤滑油、グリース、可塑剤、印刷インク）で報告されているものに限定されないが、種々の用途で有用である。
【０４６８】
もう一つ別のかかる化学的改変は、オレフィンメタセシスである。オレフィンメタセシスでは、触媒がアルケン（オレフィン）内でアルキリデン炭素を切断して、それぞれを異なるアルキリジン炭素と対にすることにより新たなアルケンを形成する。オレフィンメタセシス反応は、エテノリシスによるアルケンでの不飽和脂肪酸アルキル鎖の短縮、自己メタセシスによるアルケン結合を介した脂肪酸の架橋、及び誘導体化されたアルケンを用いたクロスメタセシスによる脂肪酸への新たな官能基の組み込みなどのプロセスの機序をもたらす。
【０４６９】
エステル転移反応及び水素化などの他の反応とともに、オレフィンメタセシスは、不飽和グリセロ脂質を多様な最終産物に変換することができる。このような産物としては、ワックス用のグリセロ脂質オリゴマー；滑沢剤用の短鎖グリセロ脂質；化学製品及びポリマー用のホモ及びヘテロ二官能性アルキル鎖；バイオ燃料用の短鎖エステル；並びにジェット燃料用の短鎖炭化水素が挙げられる。オレフィンメタセシスは、例えば、米国特許第７，１１９，２１６号、米国特許出願公開第２０１０／０１６０５０６号及び米国特許出願公開第２０１０／０１４５０８６号に報告されている触媒及び方法を用いて、トリアシルグリセロール及び脂肪酸誘導体に対して行うことができる。
【０４７０】
バイオ油のオレフィンメタセシスは一般に、他のアルケンの存在下（クロスメタセシス）又は非存在下（自己メタセシス）で、不活性条件下、約１０〜２５０ｐｐｍの負荷量で不飽和脂肪酸エステルにＲｕ触媒の溶液を添加することを含んでなる。典型的には、反応を数時間〜数日間進行させ、最終的には、ある配分のアルケン産物が得られる。脂肪酸誘導体に対してオレフィンメタセシスを行い得る方法の１つの例は以下の通りである：第１世代触媒Ｇｒｕｂｂｓ（ジクロロ［２（１−メチルエトキシ−α−Ｏ）フェニル］メチレン−α−Ｃ］（トリシクロヘキシル−ホスフィン）をトルエンに溶かした、触媒負荷量が２２２ｐｐｍの溶液を、脱気し乾燥させたオレイン酸メチルを含む容器に加え得る。次いで、容器を約６０ｐｓｉｇのエチレンガスで加圧し、約３時間、約３０℃以下に維持することにより、収率約５０％の９−デセン酸メチルが生成され得る。
【０４７１】
本明細書に記載の方法により産成された油のオレフィンメタセシスを、１つ又はそれ以上の方法及び／又は物質とともに、又は産物を産成するために、以下で報告されている通りに行うことができる：国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０７／０８１４２７号（α−オレフィン脂肪酸）及び米国特許出願第１２／２８１，９３８号（石油クリーム）、第１２／２８１，９３１号（ペイントボール銃カプセル）、第１２／６５３，７４２号（可塑剤及び滑沢剤）、第１２／４２２，０９６号（二官能性有機化合物）及び第１１／７９５，０５２号（ろうそくのロウ）。
【０４７２】
微生物油で行うことが可能な他の化学反応としては、米国特許第６，０５１，５３９号で報告されているように、トリアシルグリセロールをシクロプロパン化剤と反応させて流動性及び／又は酸化安定性を高めること；米国特許第６，７７０，１０４号で報告されているように、トリアシルグリセロールからワックスを製造すること；及び、「Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｅｐｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’Ｓｏｃｉｅｔｙ、７９：１、５９−６３（２００１）及びＦｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３７：１、１０４−１１４（２００４）に報告されているように、トリアシルグリセロールをエポキシ化することが挙げられる。
【０４７３】
上述のような燃料及び化学製品のために、含油微生物バイオマスを生成すると、脱脂バイオマス食料が産成される。脱脂食料は、藻類油を調製したときの副産物であり、例えば、反すう動物、鳥類、ブタ、及び水産養殖などの飼育動物用の動物飼料として有用である。得られた食料は、油含有量が減ってはいるが、高品質のタンパク質、炭水化物、繊維、灰分、残留油、及び動物飼料に適した他の栄養物は依然として含まれている。油分離プロセスによって細胞は大部分が溶解しているため、脱脂食料は、かかる動物により簡単に消化される。脱脂食料を、場合により、例えば、動物飼料中の穀物など、他の成分と混ぜ合わせることができる。脱脂食料は均一な粉末であるため、押出機、エクスパンダー又は市販されている別の種類の機械を用いて圧縮してペレットにすることができる。
【０４７４】
本発明について上に詳細に説明し、以下の実施例で例示するが、これらは説明のために与えられたものであり、特許請求の範囲に書かれた発明を限定するために与えられているのではない。
【０４７５】
（ＶＩＩ．組み換え微細藻類バイオマスの調製方法）
本発明は、脂質及び／又はタンパク質構成要素を含めた栄養素に富んだ、ヒトが摂取するのに適した組み換え微生物、好ましくは藻類のバイオマスと、これを食用成分及びその他の成分を含めた成分と混ぜ合わせる方法と、並びにこれを含有する食品組成物とを提供する。以下の記述の多くは藻類バイオマス又は藻類油に関するものであるが、一般に微生物バイオマス又は微生物油にも同様に適用されることを意図するものである。本発明は、部分的には、高油含有量及び／又は高機能性の組み換え藻類バイオマスを調製し、得られたバイオマスを食品中に組み込んで、従来の食品中に存在する油及び／又は脂肪及び／又はタンパク質の全部又は一部を、バイオマスに含まれる油及び／又はタンパク質に置き換えることができるという発見から生まれた。藻類油は、主として単価飽和油を含んでなり得、従来の食品中によく見られる飽和脂肪、水素化脂肪（トランス脂肪）及び多価不飽和脂肪に比べて、健康上の利益を提供する。また、藻類油を、トランス脂肪を含まない健康に良い安定な食用油として使用することもできる。残った藻類バイオマスは、少なくとも食品を調理するまで油を封入することができるため、油の有効期間が延びる。細胞がインタクトなままの未調理製品では、バイオマスは油中に認められる天然の抗酸化剤とともに、不快な臭い、味及び質感を生じかねない酸化から油を保護する。またバイオマスは、油及び／又はタンパク質に加え、いくつかの有益な微量栄養素、例えば藻類由来の食物繊維（可溶性及び不溶性双方の炭水化物）、リン脂質、糖タンパク質、フィトステロール、トコフェロール、トコトリエノール及びセレンなども提供する。
【０４７６】
（１．本発明の方法で使用するための微細藻類）
高レベルの適切な油及び／又は脂質及び／又はタンパク質を天然で生成する微細藻類が好ましいが、本発明の方法に従って、適切な油及び／又は脂質及び／又はタンパク質を産成する様々な種の微細藻類を使用することができる。本発明で使用する微細藻類の選択に影響する考慮事項としては、食品の製造に適した油、脂質又はタンパク質の産成に加え、（１）細胞重量の百分率での脂質（タンパク質）含有量が高いこと；（２）成長が容易であること；（３）増殖が容易であること；（４）バイオマスの処理が容易であること；（５）グリセロ脂質プロフィール；及び（６）藻類毒素を含まないこと（以下の実施例５では、乾燥組換え微細藻類バイオマス、及びバイオマスから抽出された油又は脂質が藻類毒素を含まないことが示されている）が挙げられる。
【０４７７】
ある実施形態では、活性な成分を放出させるために、又は消化のために、食品加工中（例えば、調理中）に微細藻類の細胞壁を破壊しなければならなず、このような実施形態では、特に藻類バイオマスを未調理の食品中で使用する場合、動物、例えばヒト又は他の単胃動物の消化管で消化されやすい細胞壁を有する微細藻類株が好ましい。細胞壁のセルロース／ヘミセルロース含有量が高い組み換え微細藻類株では、一般に消化性が低下する。標準的なペプシン消化アッセイを用いて、消化性を評価することができる。
【０４７８】
（２．色素沈着を欠く、又は色素沈着が極めて少ない微細藻類株の作製方法）
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａなどの微細藻類は、光合成又は従属栄養のいずれかで成長可能である。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａは偏性従属栄養生物である。炭素源が固定炭素源である従属栄養条件で、かつ光の非存在下で成長させた場合、通常の緑色をした微細藻類は黄色くなり、緑色の色素沈着を欠くか、又は色素沈着が極めて少ない。緑色の色素沈着の少ない（又はそれを欠く）微細藻類は、食品成分として有利であり得る。緑色の色素沈着の少ない（又はそれを欠く）微細藻類の１つの利点は、微細藻類のクロロフィルの風味が少ないということである。緑色の色素沈着の少ない（又はそれを欠く）微細藻類のもう１つの利点は、微細藻類を食品成分として食料品に加えても、消費者の受けが悪くなりかねない緑色に着色しないということである。従属栄養条件下で成長させた微細藻類の緑色の色素沈着の減少は、一時的なものである。光合成による成長に戻すと、光合成及び従属栄養双方で成長可能な微細藻類は、緑色の色素沈着を回復する。さらに、従属栄養的に成長した微細藻類は、たとえ緑色色素が少なくても黄色い色をしており、このことは、消費者が食料品の色が白色又は淡色であることを期待する一部の食品の用途には向かないかもしれない。したがって、従属栄養による成長が可能であり（したがって、緑色の色素沈着を欠くか、又はそれが少ない）、かつ黄色の色素沈着も少ない（したがって、食品用途において無彩色なる）微細藻類株を作製するのが有利である。
【０４７９】
このような、色素沈着を欠くか又はそれが極めて少ない微細藻類株を作製する方法は、変異誘発及びそれに続く所望の表現型のスクリーニングによるものである。変異誘発法はいくつか知られており、当該技術分野において実施されている。例えば、Ｕｒａｎｏら（Ｕｒａｎｏら，Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２０００）ｖ．９０（５）：ｐｐ．５６７−５６９）は、ＵＶ照射により作製されたＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの黄色及び白色の変異株について記載している。Ｋａｍｉｙａ（Ｋａｍｉｙａ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９８９）ｖ．３０（４）：５１３−５２１）は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓの無色株１１ｈ（Ｍ１２５）について記載している。
【０４８０】
また、ＵＶ照射による変異誘発に加えて、色素沈着が少ない（又は色素沈着を欠く）微細藻類を作製するために、化学的変異誘発を使用することもできる。メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）又はＮ−メチル−Ｎ’ニトロ−Ｎ−ニトログアニジン（ＮＴＧ）などの化学的変異原は、酵母、真菌、マイコバクテリア及び微細藻類を含めた種々の微生物に対して効果的な化学変異原であることが示されている。また、複数のラウンドで変異誘発を行うことも可能であり、この場合、微細藻類を変異原（ＵＶ若しくは化学物質又はその両方）に曝露した後、色素沈着の少ない所望の表現型に関してスクリーニングする。次いで、変異が一世代から次世代へと安定するように、またコロニーが純粋であり、混合集団ではないように、所望の表現型を有するコロニーをプレート上で画線し再分離する。
【０４８１】
特定の例では、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓでＵＶと化学的変異誘発を組み合わせて使用し、色素沈着を欠くか、又は色素沈着が少ない株を作製した。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓに対してＮＴＧによる化学的変異誘発を１ラウンド行い、コロニーを色変異株に関してスクリーニングした。次いで、色変異を示さないコロニーに対してＵＶ照射を１ラウンドを行い、色変異株に関して再びスクリーニングした。一実施形態では、色素沈着を欠くＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ株が単離され、これは２００９年１０月１３日、ブダペスト条約に従って、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９のアメリカ培養細胞系統保存機関に特許寄託指定番号ＰＴＡ−ＸＸＸＸで寄託されたＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ３３−５５である。別の実施形態では、色素沈着の少ないＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ株が単離され、これは２００９年１０月１３日、ブダペスト条約に従って、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９のアメリカ培養細胞系統保存機関に特許寄託指定番号ＰＴＡ−ＸＸＸＸで寄託されたＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ２５−３２である。
【０４８２】
微細藻類由来の高脂質バイオマスは、食品組成物に同じ量の脂質を組み込むのに組み換え微細藻類バイオマスの添加が少なくて済むため、低脂質バイオマスに比べて、食品に含ませるのに有利な原材料である。高脂質微細藻類由来の健康に良い油は、低脂質バイオマスに比べて、質感及び味などの他の特性を変えることなく食品に添加できるため、このことは有利である。本発明の方法により提供される脂質に富むバイオマスは、典型的には、脂質が細胞乾燥重量で少なくとも２５％である。処理条件を調節して、脂質の細胞重量百分率を増加させることができる。例えば、特定の実施形態では、微細藻類を、グルコースなどの固定炭素エネルギーを過剰に与えつつ、例えば、窒素、リン又は硫黄など、１つ又はそれ以上の制限濃度の窒素物の存在下で培養する。窒素を制限すると、微生物脂質収量が、窒素を過剰に与えて培養したときよりも増加する傾向がある。特定の実施形態では、脂質収量の増加は、少なくとも約１０％、５０％、１００％、２００％又は５００％である。全培養期間の一部又は全期間にわたって、制限量の栄養物が存在下で微生物を培養することができる。ある実施形態では、全培養期間の間に、栄養物の濃度を、制限濃度と非制限濃度との間で少なくとも２巡させる。
【０４８３】
藻類由来の高タンパク質バイオマスは、食品に含ませるのに有利なもう１つの原材料である。本発明の方法はまた、タンパク質の細胞乾燥重量が少なくとも２０％、３０％、４０％又は５０％であるバイオマスも提供し得る。成長条件を調節して、タンパク質の細胞重量百分率を増加させることができる。好ましい実施形態では、微細藻類を、窒素に富む環境で、グルコース又は上記の他の任意の炭素源などの固定炭素エネルギーが過剰な状態で培養する。窒素が過剰な条件では、微生物のタンパク質収量が、窒素を過剰に与えずに培養したときよりも増加する傾向がある。最大限のタンパク質産生のためには、微生物を全培養期間中、過剰な窒素存在下で培養することが好ましい。微細藻類に適した窒素源は、有機窒素源及び／又は無機窒素源に由来し得る。
【０４８４】
本明細書に記載の方法に従って作製される組み換え微細藻類培養物は、発酵培地中で組み換え微細藻類バイオマスを産出する。食品組成物として使用するバイオマスを調製するために、発酵培地からバイオマスを濃縮又は回収する。発酵培地から組み換え微細藻類バイオマスを回収する時点では、バイオマスは主に、水性媒体中に懸濁したインタクトな細胞を含む。バイオマスを濃縮するために脱水工程を行う。脱水又は濃縮は、バイオマスを発酵ブロス又は他の液体培地から分離することを指し、固体−液体分離も同様である。したがって、脱水の過程では、培養培地をバイオマスから除去する（例えば、バイオマスを保持するフィルターに発酵ブロスを通すことにより）か、又はバイオマスを別の方法で培養培地から取り出す。脱水に共通するプロセスとしては、遠心分離、濾過、及び機械的圧力の使用が挙げられる。これらのプロセスを、個々に又は任意に組み合わせて用いることができる。
【０４８５】
濃縮後、組み換え微細藻類バイオマスを本明細書に記載の通りに加工し、真空包装ケーキ、藻類フレーク、藻類ホモジネート、藻類粉末、藻類粒粉又は藻類油を産生する。
【０４８６】
（３．組み換え微細藻類バイオマスの化学組成）
本明細書に記載の培養方法により生成された組み換え微細藻類バイオマスは、組み換え微細藻類油及び／又はタンパク質、並びに発酵過程で微生物が生成した、又は微生物が培養培地から取り入れた他の構成要素を含む。
【０４８７】
従属栄養的成長により、クロロフィル含有量が比較的低くなる（戸外の池又は密閉された光バイオリアクターシステムなどの光合成システムに比べて）。一般にクロロフィル含有量が減少すると、微細藻類の官能特性が向上するため、藻類バイオマス（又はそれから調製される油）を食品により多く組み込むことが可能となる。また、従属栄養的に成長した微細藻類（例えば、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）で見られるクロロフィル含有量の減少により、光栄養的に成長した微細藻類よりもバイオマスの緑色が減少する。したがって、クロロフィル含有量の減少により、光栄養的に成長した微細藻類を含有する食品に付随する、多くの場合望ましくない緑色の着色が避けられ、食品中に藻類バイオマスを組み込む、又はより多く組み込むことが可能となる。少なくとも１つの実施形態では、食品は、光栄養的に成長した微細藻類よりもクロロフィル含有量の少ない、従属栄養的に成長した微細藻類を含有する。
【０４８８】
本発明に記載されているバイオマスの（又はバイオマスから抽出された）組み換え微細藻類油は、１つ又はそれ以上の別個の脂肪酸エステル側鎖を有するグリセロ脂質を含み得る。グリセロ脂質は、１個、２個又は３個の脂肪酸分子とエステル化されたグリセロール分子からなり、該脂肪酸分子は、長さはさまざまであり得、種々の飽和度を有することができる。藻類油の特定のブレンドを１種類の藻類の中で調製するか、２種類又はそれ以上の微細藻類に由来するバイオマス（又は藻類油）を混合するかのいずれかで調製することができる。
【０４８９】
したがって、油の組成、すなわち、グリセロ脂質の脂肪酸構成要素の特性及び比率も、少なくとも２種類の別個の微細藻類に由来するバイオマス（又は油）を混ぜあわせることによって操作することもできる。ある実施形態では、少なくとも２種類の別個の微細藻類が、異なるグリセロ脂質プロフィールを有している。この別個の種類の微細藻類を、好ましくは従属栄養条件下で、本明細書に記載されるように一緒に又は別個に培養し、それぞれの油を生成することができる。異なる種類の微細藻類は、細胞のグリセロ脂質中に別個の脂肪酸構成成分を異なる割合で含有することができる。
【０４９０】
ある実施形態では、組み換え微細藻類油は、主に一価不飽和油からなる。ある場合には、藻類油は、重量で少なくとも２０％の一価不飽和油である。様々な実施形態では、藻類油は、重量又は容積で少なくとも２５％、５０％、７５％又はそれ以上の一価不飽和油である。ある実施形態では、一価不飽和油は１８：１、１６：１、１４：１又は１２：１である。ある実施形態では、組み換え微細藻類油は、重量又は容積で少なくとも１０％、２０％、２５％若しくは５０％、又はそれ以上のエステル化オレイン酸又はエステル化α−リノレン酸を含む。少なくとも１つの実施形態では、藻類油は、エステル化されたドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ（２２：６））を、重量若しくは容積で１０％未満、５％未満、３％未満、２％未満若しくは１％未満含むか、又は実質的に含まない。例えば、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉなどの高ＤＨＡ含有微細藻類の産生に関しては、米国特許第７，２５２，９７９号、第６，８１２，００９号及び第６，３７２，４６０号を参照されたい。
【０４９１】
高タンパク質の組み換え微細藻類バイオマスが、様々な培養方法を用いて生成されている。タンパク質含有率の高い組み換え微細藻類バイオマスは、本発明において有用である。例えば、様々な種の微細藻類のタンパク質含有量が報告されている（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ（２００７）２５：２０７−２１０の表１を参照）。Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａの半連続的光独立栄養培養における再生速度の制御が細胞あたりのタンパク質含有量に影響を及ぼすことが報告されており、最も高いタンパク質含有率は約２２．８％である（Ｆａｂｒｅｇａｓら，Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００１）３：２５６−２６３）。
【０４９２】
本明細書に記載の培養方法により生成され、高タンパク質に関連する本発明の実施形態において有用な組み換え微細藻類バイオマスは、典型的には、細胞乾燥重量で少なくとも３０％のタンパク質を含む。ある実施形態では、組み換え微細藻類バイオマスは、細胞乾燥重量で少なくとも４０％、５０％、７５％又はそれ以上のタンパク質を含む。ある実施形態では、組み換え微細藻類バイオマスは、細胞乾燥重量で３０〜７５％のタンパク質、又は細胞乾燥重量で４０〜６０％のタンパク質を含む。ある実施形態では、組み換え微細藻類バイオマス中のタンパク質は、少なくとも４０％の可消化粗タンパク質を含む。他の実施形態では、組み換え微細藻類バイオマス中のタンパク質は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％又は少なくとも９０％の可消化粗タンパク質を含む。ある実施形態では、組み換え微細藻類バイオマス中のタンパク質は、４０〜９０％の可消化粗タンパク質、５０〜８０％の可消化粗タンパク質、又は６０〜７５％の可消化粗タンパク質を含む。
【０４９３】
また組み換え微細藻類バイオマス（及びそこから抽出される油）は、微細藻類により産成された、又は培養培地からバイオマスに取り込まれた他の構成要素も含み得る。これらの他の構成要素は、使用する培養条件、及び微細藻類の種（及び該当する場合は、バイオマスから組み換え微細藻類油を回収するために使用する抽出方法）に応じて、様々な量で存在し得る。他の構成要素としては、リン脂質（例えば、藻類レシチン）、炭水化物、可溶性及び不溶性の繊維、糖タンパク質、フィトステロール（例えば、β−シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、エルゴステロール及びブラシカステロール）、トコフェロール、トコトリエノール、カロチノイド（例えば、α−カロチン、β−カロチン及びリコピン）、キサントフィル（例えば、ルテイン、ゼアキサンチン、α−クリプトキサンチン及びβ−クリプトキサンチン）、タンパク質、多糖類（例えば、アラビノース、マンノース、ガラクトース、６−メチルガラクトース及びグルコース）、並びに様々な有機化合物又は無機化合物（例えば、セレン）を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０４９４】
ある場合には、組み換え微細藻類バイオマスは、少なくとも１０％の可溶性繊維を含む。他の実施形態では、組み換え微細藻類バイオマスは、少なくとも２０％〜２５％の可溶性繊維を含む。ある実施形態では、組み換え微細藻類バイオマスは、少なくとも３０％の不溶性繊維を含む。他の実施形態では、組み換え微細藻類バイオマスは、少なくとも５０％〜少なくとも７０％不溶性繊維を含む。総食物繊維は、可溶性繊維と不溶性繊維の合計である。ある実施形態では、組み換え微細藻類バイオマスは、少なくとも４０％の総食物繊維を含む。他の実施形態では、組み換え微細藻類バイオマスは、少なくとも５０％、５５％、６０％、７５％、８０％、９０％から９５％までの総食物繊維を含む。
【０４９５】
（ＶＩＩＩ．組み換え微細藻類バイオマスの最終食品成分への加工）
本発明の方法に従って産成される濃縮された組み換え微細藻類バイオマスは、それ自体が最終食品成分であり、さらに改変することなく、又は最小限の改変のみを行って、食料品に使用してもよい。例えば、ケーキを真空包装するか凍結させてもよい。あるいは、真空にした凍結乾燥室でバイオマスを凍結させる「フリーズドライ」プロセスである、親油性部分のエステル化により、バイオマスを乾燥させてもよい。凍結乾燥室に真空にすることで、バイオマスからの水の昇華（一次乾燥）及び脱離（二次乾燥）が生じる。しかし、本発明は、濃縮された組み換え微細藻類バイオマスに適用可能な本発明の加工方法を実施することにより増強された特性を有する、様々な組み換え微細藻類由来の最終食品成分を提供する。
【０４９６】
大部分がインタクト又はホモジネート形態のいずれかである組み換え微細藻類バイオマスを乾燥させることは、さらなる加工を容易にするのに、又は本明細書に記載の方法及び組成物にバイオマスを使用するのに有利である。乾燥は、大部分がインタクトなバイオマスから水分／水を除去若しくはその表面から除去すること、又は均質化した（例えば、微粒子化により）バイオマスのスラリーから表面の水を除去することを指す。藻類バイオマスを乾燥させるか否か、また乾燥させるのであれば乾燥方法によって、異なる質感及び風味を食品にもたらすことができる。本明細書に記載の培養微細藻類から生成されたバイオマスを乾燥させることにより、最終食品又は最終食品成分に望ましくない構成要素となり得る水が除去される。ある場合には、バイオマスを乾燥させることで、より効率的な組み換え微細藻類油の抽出プロセスが促進され得る。
【０４９７】
一実施形態では、本節のＡに記載されているように、濃縮された組み換え微細藻類バイオマスをドラム乾燥によりフレーク形態にして、藻類フレークを製造する。別の実施形態では、本節のＢに記載されているように、濃縮された微細藻類バイオマスを噴霧乾燥又は気流乾燥させて（すなわち、空気乾燥プロセスに供して）、大部分がインタクトな細胞を含有する粉末を形成し、藻類粉末を製造する。別の実施形態では、本節のＣに一部記載されているように、濃縮された組み換え微細藻類バイオマスを微粒子化（均質化）して、大部分が溶解した細胞のホモジネートを形成し、次いで、これを噴霧乾燥又は気流乾燥させて、藻類粒粉を製造する。別の実施形態では、本節のＤに記載されているように、濃縮された組み換え微細藻類バイオマスから油を抽出して藻類油を形成する。
【０４９８】
（１．藻類フレーク）
濃縮された組み換え微細藻類バイオマスを回転する加熱ドラムの表面にフィルムとして貼り付けて、本発明の藻類フレークを調製する。次いで、乾燥した固体をナイフ又は刃物で削り取って、小さなフレーク状にする。米国特許第６，６０７，９００号には、事前に遠心分離（濃縮）工程を行わない、ドラム乾燥機を用いた組み換え微細藻類バイオマスの乾燥について記載されており、かかるプロセスを本発明の方法に従って使用してもよい。
【０４９９】
バイオマスは乾燥プロセスの間に高温に曝される得るため、乾燥前に抗酸化剤をバイオマスに加えることが有利であり得る。抗酸化剤の添加は、乾燥の間、バイオマスを保護するだけでなく、乾燥させた組み換え微細藻類バイオマスを保管する際に、その有効期間も長くする。好ましい実施形態では、乾燥又は均質化などの後工程の前に、抗酸化剤を組み換え微細藻類バイオマスに加える。使用に適した抗酸化剤については、以下で詳細に述べる。
【０５００】
さらに、脱水した組み換え微細藻類バイオマスの産生と次の加工工程の間の時間が長い場合、乾燥前にバイオマスを低温殺菌するのが有利な場合がある。バイオマスの産生と乾燥のとの間の時間が長い場合、リパーゼにから遊離脂肪酸が形成され得る。バイオマスの低温殺菌は、これらリパーゼを不活性化し、また得られた乾燥バイオマス製品における「石鹸のような」風味の形成を防ぐ。したがって、一実施形態では、本発明は、低温殺菌された組み換え微細藻類バイオマスを提供する。別の実施形態では、低温殺菌された組み換え微細藻類バイオマスは、藻類フレークである。
【０５０１】
（２．藻類粉末）
本発明の藻類粉末を、濃縮された組み換え微細藻類バイオマスから空気乾燥機又は噴霧乾燥機を用いて調製する（例えば、米国特許第６，３７２，４６０号を参照）。噴霧乾燥機内で、液体懸濁中の原料を微細な液滴分散で熱風流中に噴霧する。飛沫同伴された原料が急速に乾燥して、乾燥粉末を形成する。ある場合には、パルス燃焼乾燥機を用いて、最終乾燥原料において粉末のような質感を得てもよい。他の場合には、噴霧乾燥と、それに続く流動床乾燥機の利用を組み合わせて使用し、乾燥微生物バイオマスにとって最適な条件を達成する（例えば、米国特許第６，２５５，５０５号を参照）。別の方法として、空気乾燥機を藻類粉末の製造に用いてもよい。空気乾燥機は、乾燥させる原料を熱風流中に引き込むか、又は飛沫同伴する。原料が熱風に飛沫同伴されている間に、水分が急速に除去される。次いで、乾燥させた原料を湿った空気から分離し、その後、この湿った空気をさらに乾燥させるために再循環する。
【０５０２】
（３．藻類粒粉）
本発明の藻類粒粉を、機械的に溶解及び均質化された、濃縮組換え微細藻類バイオマス、並びに噴霧乾燥又は気流乾燥された（又は別の空気乾燥システムを用いて乾燥された）ホモジネートから調製する。藻類粒粉の製造には、細胞が溶解してその油が放出されること、並びに細胞壁及び細胞内成分が、平均径２０μｍ以下、好ましくは１０μｍまで微粒子化されているか、又は粒径が小さくなっていることが必要である。溶解した微生物細胞は、凝集して１，０００μｍ以下のより大きな粒子を形成し得る。乾燥前に油が分散から分離しないように、得られた油、水及び微粒子化された粒子を乳化する。例えば、圧力式破砕機を用いて、細胞を含有するスラリーを、ポンプで制御型のオリフィス弁から噴出させて、細胞を溶解させる。高圧（１５００ｂａｒまで）をかけ、次いで出口ノズルから瞬間的に拡散させる。細胞の破壊は、３つの異なる機構、すなわち、弁への衝突、オリフィス内での大きな液体剪断力、及び放出による急な圧力低下によって行われ、これにより細胞が破裂する。この方法によって、細胞内の分子が放出される。Ｎｉｒｏ（ＧＥＡグループＮｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ社）ホモジナイザー（又は他の任意の高圧ホモジナイザー）を用いて細胞を処理し、大部分が０．２〜５ミクロンの長さの粒子となるようにする。高圧下（約１０００ｂａｒ）での藻類バイオマスの処理は、典型的には、９０％を超える細胞が溶解し、粒径が５ミクロン未満まで小さくなる。
【０５０３】
あるいは、ボールミルを用いることもできる。ボールミル中では、ビーズなどの小さな研磨粒子を含む懸濁物中で細胞が攪拌される。剪断力、ビーズとビーズの間での粉砕、及びビーズとの衝突により、細胞が破壊される。ビーズが細胞を破壊し、細胞内容物が放出される。一実施形態では、Ｄｙｎｏ−ｍｉｌｌ  ＥＣＭ  Ｕｌｔｒａ（ＣＢ  Ｍｉｌｌｓ）ボールミルを用いて、藻類バイオマスを破壊し安定な乳濁液にする。また、ブレンディング（例として、高速ブレンダー又はＷａｒｉｎｇブレンダーなどを用いて）、フレンチプレス、又は細胞壁が弱い場合は遠心分離までを用いて、剪断力により細胞を破壊することができる。特定のボールサイズ及びブレードを含む適切なボールミルが、米国特許第５，３３０，９１３号に記載されている。
【０５０４】
均質化直後の産成物は、大きさが元の細胞よりも小さい粒子が油及び水の中に懸濁しているスラリーである。この粒子は細胞残屑に相当する。油及び水は細胞から放出される。均質化前の細胞を含有する水性媒質から水がさらに生じることもある。粒子は、微粒子化されたホモジネートの形態であることが好ましい。そのまま放置すると、一部の小型の粒子が合体し得る。しかし、微結晶性セルロースなどの微結晶性安定化剤を種晶として加えることにより、小型粒子の分散でも保存することができる。
【０５０５】
藻類粒粉を形成するために、スラリーを噴霧乾燥又は気流乾燥させて水を除去し、細胞残屑と油とを含有する乾燥粉末を残す。粉末の油含有量は、乾燥粉末の重量で少なくとも１０、２５又は５０％であり得るが、粉末の感触及び外見は、油っぽいというよりも乾燥しており（例えば、肉眼では油が見えない）、かつ振ったときに自由に流れるものであり得る。また様々なフロー剤（シリカ系製品を含む）を加えることもできる。乾燥後、粉末の水又は水分含有量は、典型的には、１０重量％未満、５重量％未満、３重量％未満又は１重量％未満である。空気乾燥機又はパルス燃焼乾燥機などの他の乾燥機を用いて藻類粒粉を製造することもできる。
【０５０６】
藻類粒粉の油含有量は、藻類バイオマスの油の百分率によって様々であり得る。藻類粒粉は、様々な油含有量の藻類バイオマスから製造することができる。特定の実施形態では、同じ油含有量の藻類バイオマスから藻類粒粉を製造する。他の実施形態では、異なる油含有量の藻類バイオマスから藻類粒粉を製造する。後者の場合、様々な油含有量の藻類バイオマスを組み合わせてから、均質化工程を行ってもよい。他の実施形態では、様々な油含有量の藻類粒粉をまず製造し、次に、最終的に所望の油含有量を含む藻類粒粉製品を得るために様々な比率でブレンドする。さらなる実施形態では、異なる脂質プロフィールの藻類バイオマスを組み合わせてから均質化し、藻類粒粉製造する。別の実施形態では、異なる脂質プロフィールの藻類粒粉をまず製造し、次に、最終的に所望の脂質プロフィールを含む藻類粒粉製品を得るために様々な比率でブレンドする。
【０５０７】
本発明の藻類粒粉は、広範な食品調理に有用である。油含有量、繊維含有量及び微粒子化された粒子のため、藻類粒粉は多機能性の食品成分である。藻類粒粉を、焼成製品、速成パン、酵母生地製品、卵製品、ドレッシング、ソース、栄養飲料、藻類のミルク、パスタ、及び無グルテン製品に使用することができる。藻類粒粉を用いたこれらの食品などの製造のさらなる詳細は、以下の実施例に記載されている。
【０５０８】
従来の脂肪源（例えば、油、バター又はマーガリン）及び卵の代わりに、藻類粒粉を焼成製品に使用することができる。焼成製品及び無グルテン製品は、優れた水分含有量、並びにバター及び卵を用いて製造される従来の焼成製品と区別できないパン状構造を有する。優れた水分含有量のため、これらの焼成製品は、藻類粒粉を用いずに製造された従来の焼成製品に比べ、有効期間が長く、また元の質感が長く保持される。
【０５０９】
藻類粒粉はまた、スムージー、ソース又はドレッシングで使用すれば、脂肪増量剤としても機能し得る。藻類粒粉の組成物は、高脂肪含有量の食品に匹敵する官能特性及び食感を与えるその能力が独特である。藻類粒粉を用いて製造されたドレッシング、ソース及び飲料は、これらの食品が含有する脂肪／油のレベルは約半分であるにも関わらず、従来の高脂肪の調理法に近いレオロジー及び不透明度を有する。また藻類粒粉は優れた乳化剤でもあり、ソース、ドレッシング及びスープなどの濃厚さ、不透明さ及び粘り気を必要とする食品の調理での使用に適している。さらに、本明細書に記載されている本発明の藻類粒粉で見られる脂質プロフィールは、トランス脂肪を含有せず、また、バター又はマーガリン（又は他の動物性脂肪）に比べて、健康に良い不飽和脂肪のレベルがより高い。したがって、藻類粒粉を用いて製造された食品は、従来の脂肪源を使用した従来の調理法を用いて製造された同じ食品の食感及び官能特性を犠牲にすることなく、脂肪含有量がより低くなっている（また健康によい脂肪を含む）。
【０５１０】
また藻類粒粉を、典型的には食品サービス業界で出される粉末卵又は液卵に加えてもよい。藻類粒粉の添加により、粉末卵及び液卵の外見、質感及び食感が向上し、また、調理済みの卵をスチームテーブルに置いたままでも、改善された外観、質感及び食感の向上が長持ちする。具体的な調合及び官能パネルの結果が下の実施例に記載されている。
【０５１１】
（４．藻類油）
一態様では、本発明は、乾燥重量で少なくとも１５％の油を含む藻類バイオマスから、ＧＭＰ条件下で藻類油を回収することにより藻類油を調製する方法に関し、ここで、藻類油は５０％を超える１８：１脂質である。ある場合には、藻類バイオマスは、少なくとも２種の異なる微細藻類種の混合物を含んでなる。ある場合には、少なくとも２種の異なる微細藻類種は、別々に培養されたものである。少なくとも１つの実施形態では、少なくとも２種の異なる微細藻類種は、異なるグリセロ脂質プロフィールを有する。ある場合には、藻類バイオマスは、従属栄養的に成長させた藻類に由来する。ある場合には、少なくとも２種の異なる微細藻類種はすべて、乾燥重量で少なくとも１５％の油を含有する。
【０５１２】
一態様では、本発明は、乾燥重量で少なくとも１０％又は少なくとも１５％の油を含有する藻類細胞から得られた藻類油を、１つ又はそれ以上の他の食用成分と組み合わせて、食品組成物を形成することを含む、食品組成物の製造方法に関する。ある場合には、この方法は、ＧＭＰ条件下での藻類油の調製をさらに含む。
【０５１３】
（各種用途の中でも特に）食品で使用するために、溶解したバイオマスから藻類油を分離できる。油抽出後に残った藻類バイオマスは、脱脂食と呼ばれる。脱脂食は、抽出前に微細藻類が含有していたものよりも、乾燥重量又は容積で少ない油を含有する。典型的には、５０〜９０％の油が抽出されるため、脱脂食は、例えば、抽出前のバイオマスの油含有量の１０〜５０％を含有する。しかし、バイオマスは、上記タンパク質及びその他の構成要素の含有量に関しては、依然として栄養価が高い。したがって、脱脂食を動物の飼料又はヒトの食用の用途で使用することができる。
【０５１４】
本方法のある実施形態では、藻類油は少なくとも５０％ｗ／ｗのオレイン酸であり、かつ５％未満のＤＨＡを含有する。本方法のある実施形態では、藻類油は少なくとも５０％ｗ／ｗのオレイン酸であり、かつ０．５％未満のＤＨＡを含有する。本方法のある実施形態では、藻類油は少なくとも５０％ｗ／ｗオレイン酸であり、かつ１８よりも長い炭素鎖長を含むグリセロ脂質を５％未満含有する。ある場合には、藻類油の供給である藻類細胞は、少なくとも２種の異なる微細藻類種の細胞の混合物を含む。ある場合には、少なくとも２種の異なる微細藻類種は、別々に培養されたものである。少なくとも１つの実施形態では、少なくとも２種の異なる微細藻類種は、異なるグリセロ脂質プロフィールを有する。ある場合には、藻類細胞を従属栄養条件下で培養する。ある場合には、少なくとも２種の異なる微細藻類種はすべて、乾燥重量で少なくとも１０％又は少なくとも１５％の油を含有する。
【０５１５】
一態様では、本発明は、ＧＭＰ条件下で調製された、少なくとも５０％の一価不飽和油を含有し、かつ１％未満のＤＨＡを含有する藻類油に関する。ある場合には、一価不飽和油は１８：１脂質である。ある場合には、藻類油を、単位用量の油を送達するためのカプセルに詰める。ある場合には、藻類油は、少なくとも２種の異なる微細藻類種の混合物に由来する。ある場合には、少なくとも２種の異なる微細藻類種は、別々に培養されたものである。少なくとも１つの実施形態では、少なくとも２種の異なる微細藻類種は、異なるグリセロ脂質プロフィールを有する。ある場合には、藻類油は、従属栄養条件下で培養された藻類細胞に由来する。
【０５１６】
一態様では、本発明は、６０％を超える１８：１と、少なくとも０．２０ｍｇ／ｇのトコトリエノールとを含む油に関する。
【０５１７】
一態様では、本発明は、６０％を超える１８：１エステルと、少なくとも０．２０ｍｇ／ｇのトコトリエノールとを含む脂肪酸アルキルエステル組成物に関する。
【０５１８】
本発明の藻類油は、濃縮し洗浄した組み換え微細藻類バイオマスから抽出により調製される。抽出前にバイオマス中の細胞を溶解させる。場合により、溶解（細胞破壊）の前に微生物バイオマスを乾燥（オーブン乾燥、凍結乾燥など）させてもよい。あるいは、発酵が終了時に、細胞を発酵ブロスの一部又は全部から分離せずに溶解させてもよい。例えば、細胞は、細胞溶解時に、細胞と細胞外液の比が１：１（ｖ：ｖ）未満の状態であり得る。
【０５１９】
脂質を含有する微細藻類を溶解させて、溶解物を作製してもよい。本明細書で詳細に記載するように、微生物を溶解させる工程（細胞溶解とも呼ばれる）を、熱誘導溶解、塩基の添加、酸の添加、プロテアーゼ及び多糖分解酵素（アミラーゼなど）などの酵素の使用、超音波、機械的な圧力による溶解、及び浸透圧衝撃を用いた溶解の使用を含めた、任意の簡便な手段によって行うことができる。微生物を溶解させるためのこれらの方法は、それぞれ単独の方法として、又は同時若しくは連続して組み合わせて用いることができる。細胞の破壊度は、顕微鏡分析によって観察することができる。上記の１つ又はそれ以上の方法を用いれば、典型的には、７０％を超える細胞の破壊が観察される。好ましくは、細胞の破壊は、８０％を超えており、より好ましくは９０％を超えており、最も好ましくは約１００％である。
【０５２０】
本発明に従って微細藻類により生成された脂質及び油は、抽出により回収できる。ある場合には、有機溶媒若しくは油を用いて、又は無溶媒抽出法を用いて抽出を行うことができる。
【０５２１】
組み換え微細藻類油の有機溶媒抽出では、好ましい有機溶媒はヘキサンである。典型的には、溶解物成分を事前に分離させずに、有機溶媒を直接溶解物に直接加える。一実施形態では、上記の１つ又はそれ以上の方法により生成された溶解物を、脂質成分が有機溶媒で溶液を形成するようになるのに十分な時間、有機溶媒と接触させる。ある場合には、溶液をその後さらに精製し、特定の所望の脂質成分を回収する。次いで、混合物を濾過し、例えば回転蒸発によりヘキサンを除去する。ヘキサン抽出法は当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｆｒｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１１：７１７（１９８９）を参照。
【０５２２】
Ｍｉａｏ及びＷｕは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓの培養物から組み換え微細藻類脂質を回収するプロトコルを記載しており、このプロトコルでは、細胞を遠心分離により回収し、蒸留水で洗浄し、凍結乾燥により乾燥させた。得られた細胞粉末を乳鉢で細かく粉砕し、次いでｎ−ヘキサンで抽出した。Ｍｉａｏ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９７：８４１−８４６（２００６）。
【０５２３】
ある場合には、液状化（例えば、Ｓａｗａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｓｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ  １７：３３−３９（１９９９）及びＩｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｓｓ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ  ６（４）：２６９−２７４（１９９３）を参照）；油の液状化（例えば、Ｍｉｎｏｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｅｌ  ７４（１２）：１７３５−１７３８（１９９５）を参照）；又は超臨界ＣＯ２抽出（例えば、Ｍｅｎｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３５６：３２８−３３４（２００３）を参照）を用いて組み換え微細藻類油を抽出できる。
【０５２４】
油抽出は、溶解物成分を事前に分離させずに、油を直接溶解物に加えることを含む。油を加えた後、溶解物は、自然に又は遠心分離などの結果のいずれかで、異なる層に分離する。これらの層は、密度の高いものから順に、重い固体のペレット、水相、エマルション相、及び油相を含み得る。エマルション相は、脂質と水相のエマルションである。加えた油の溶解物に対する割合（ｗ／ｗ又はｖ／ｖ）、遠心分離をすればその遠心分離力、水性媒質の容積及びその他の因子によっては、エマルション相と油相のいずれか又は両方が存在し得る。微生物により産成された脂質が油中で安定化するのに十分な時間を使って、細胞溶解物又はエマルション相を油でインキュベーション又は処理をし、不均一な混合物を形成する。
【０５２５】
様々な実施形態では、抽出プロセスで使用する油は、大豆、菜種、キャノーラ、パーム、パーム核、ココナツ、トウモロコシ、廃棄植物油、ナンキンハゼ、オリーブ、ヒマワリ、綿実、鶏脂、牛脂、豚脂、微細藻類、大型藻類、クフェア、亜麻、ピーナッツ、上質のホワイトグリース（ラード）、カメリナ・サティバ、カラシの種子、カシューナッツ、オーツ麦、ハウチワマメ、ケナフ、キンセンカ、、麻、コーヒー、亜麻仁（亜麻）、ヘーゼルナッツ、ユーホルビア、カボチャの種、コリアンダー、ツバキ、ゴマ、ベニバナ、イネ、アブラギリ、ココア、コプラ、ケシ（ｐｉｕｍ  ｐｏｐｐｙ）、トウゴマの実、ピーカン、ホホバ、ジャトロファ、マカダミア、ブラジルナッツ及びアボカド由来の油からなる群から選択される。溶解物に加える油の量は、典型的には、油と混合する溶解物の５％（ｖ／ｖ及び／又はｗ／ｗにより測定）を超える。したがって、油の好ましいｖ／ｖ又はｗ／ｗは、細胞溶解物の５％、１０％、２０％、２５％、５０％、７０％、９０％を超えるか、又は少なくとも９５％である。
【０５２６】
また、溶解物を冷却することにより、有機溶媒又は油を実質的に又はまったく使用しない無溶媒抽出法で、脂質を溶解物から抽出することもできる。また、特に温度が室温〜６５℃の間であれば、超音波処理を用いることもできる。かかる溶解物は、遠心分離又は沈降するといくつかの層に分離し、その１つが水：脂質層である。他の層は、固体ペレット、水層及び脂質層を含み得る。エマルションを凍結融解又は冷却することにより、脂質をエマルション層から抽出することができる。このような方法では、有機溶媒又は油をまったく加える必要がない。溶媒又は油を加えるのであれば、溶解物の５％ｖ／ｖ又はｗ／ｗ未満であり得る。
【０５２７】
（ＩＸ．組み換え微細藻類バイオマス又はそれに由来する原料と、他の食品成分との組み合わせ）
一態様では、本発明は、少なくとも０．１％ｗ／ｗの藻類バイオマスと、１つ又はそれ以上の他の食用成分とを含む食品組成物に関するものであり、ここで、藻類バイオマスは、乾燥重量で少なくとも１０％のトリグリセリドを含み、場合により、少なくとも９０％の油がグリセロ脂質である。藻類細胞を従属栄養的に、場合により、加えて光の非存在下で育てるる。ある実施形態では、藻類バイオマスは、乾燥重量で少なくとも２５％、４０％、５０％又は６０％の油を含有する。ある場合には、藻類バイオマスは、乾燥重量で１０〜９０％、２５〜７５％、４０〜７５％又は５０〜７０％の油を含有し、ここで場合により、少なくとも９０％の油がグリセロ脂質である。少なくとも１つの実施形態では、少なくとも５０重量％の油が一価不飽和のグリセロ脂質油である。ある場合には、少なくとも５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％又は９０重量％の油のがＣ１８：１脂質である。ある実施形態では、藻類トリグリセリド油の脂質プロフィールは、天然に存在する油に類似している。天然に存在する油が表５にいくつか記載されている。一実施形態では、本発明により産成された藻類トリグリセリドは、カカオバター、ココナツ油、パーム油、牛脂又はラードに類似している。ある場合には、５重量％未満の油がドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）（２２：６）である。少なくとも１つの実施形態では、１重量％未満の油がＤＨＡである。バイオマスの化学的安定性を確保するために、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）レベルが低い藻類脂質含有量が好ましい。好ましい実施形態では、藻類バイオマスを従属栄養条件下で成長させて、緑色色素の沈着を少なくする。他の実施形態では、微細藻類は、色素沈着を欠くか、又は色素沈着が少ない色変異株である。
【０５２８】
また本発明は、従属栄養条件下で育てた組み換え藻類細胞から単離された少なくとも０．１％ｗ／ｗの藻類トリグリセリド油と、１つ又はそれ以上の他の成分とを含んでなる食品組成物も提供する。組み換え藻類細胞は、場合により、暗所で育てる。ある実施形態では、藻類トリグリセロール油のトリグリセリドプロフィールは、天然に存在する油のトリグリセリドプロフィールに類似している。天然に存在する油が表５にいくつか記載されている。本発明のある実施形態では、本発明により生成される藻類トリグリセリドは、カカオバター、ココナツ油、パーム油、牛脂又はラードに類似している。少なくとも１つの実施形態では、少なくとも５０重量％の油が一価不飽和のグリセロ脂質油である。ある場合には、少なくとも５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％又は９０重量％の油がＣ１８：１脂質である。
【０５２９】
別の態様では、本発明は、少なくとも０．１％ｗ／ｗの藻類バイオマスと、１つ又はそれ以上の他の食用成分とを含む食品組成物に関するものであり、ここで、藻類バイオマスは、乾燥重量で少なくとも３０％のタンパク質、乾燥重量で少なくとも４０％のタンパク質、乾燥重量で少なくとも４５％のタンパク質、乾燥重量で少なくとも５０％のタンパク質、乾燥重量で少なくとも５５％のタンパク質、乾燥重量で少なくとも６０％のタンパク質、又は乾燥重量で少なくとも７５％のタンパク質を含む。ある場合には、藻類バイオマスは、乾燥重量で３０〜７５％又は４０〜６０％のタンパク質を含有する。ある実施形態では、少なくとも４０％の粗タンパク質が可消化性であるか、少なくとも５０％の粗タンパク質が可消化性であるか、少なくとも６０％の粗タンパク質が可消化性であるか、少なくとも７０％の粗タンパク質が可消化性であるか、少なくとも８０％の粗タンパク質が可消化性であるか、又は少なくとも９０％の粗タンパク質が可消化性である。ある場合には、藻類バイオマスを従属栄養条件下で成長させる。少なくとも１つの実施形態では、藻類バイオマスを富窒素条件下で成長させる。他の実施形態では、微細藻類は、色素沈着を欠くか、又は色素沈着が少ない変異株である。
【０５３０】
ある場合には、藻類バイオマスは、大部分がインタクトな細胞を含む。ある実施形態では、食品組成物は、大部分が又は全部がバイオマスの細胞の中に封入されている油を含む。ある場合には、食品組成物は、大部分がインタクトな組み換え微細藻類細胞を含む。ある場合には、藻類油は、大部分がバイオマスの細胞内に封入されている。他の場合には、バイオマスは、大部分が溶解した細胞（例えば、ホモジネート）を含む。上述のように、かかるホモジネートは、スラリー、フレーク、粉末又は粒粉として提供される。
【０５３１】
食品組成物ある実施形態では、藻類バイオマスは、少なくとも１０ｐｐｍのセレンをさらに含む。ある場合には、バイオマスは、少なくとも１５％ｗ／ｗの藻類多糖をさらに含む。ある場合には、バイオマスは、少なくとも５％ｗ／ｗの藻類糖タンパク質をさらに含む。ある場合には、バイオマスは、０〜１１５ｍｃｇ／ｇの間の総カロチノイドを含む。ある場合には、バイオマスは、少なくとも０．５％ｗ／ｗの藻類リン脂質を含む。上述のすべての場合において、上記成分は純粋な細胞成分であり、細胞外成分ではない。
【０５３２】
ある場合には、食品組成物の藻類バイオマスは、抗酸化性を有する成分を含有する。強力な抗酸化性は、藻類バイオマス中に存在する複数の抗酸化剤に起因するものであり得、このような抗酸化剤としては、カロチノイド、必須ミネラル、例えば亜鉛、銅、マグネシウム、カルシウム及びマンガンなどが挙げられるが、これらに限定されない。また藻類バイオマスは、トコトリエノール及びトコフェロールのような他の抗酸化剤も含むことが示されている。このようなビタミンＥファミリーのメンバーは重要な抗酸化剤であり、他の健康上の有用性、例えば脳卒中による損傷からの保護作用、動脈閉塞の好転、乳癌及び前立腺癌細胞の増殖の抑制、コレステロールレベルの減少、ＩＩ型糖尿病のリスクの低減、及び緑内障による損傷からの保護作用などを有する。トコトリエノール及びトコフェロールの天然源は、パーム、ヒマワリ、トウモロコシ、大豆及びオリーブ油から産成される油において見られ得るが、本明細書で提供される組成物は、これ以前に記載した既知の原料よりも著しく高レベルのトコトリエノールを提供する。
【０５３３】
ある場合には、本発明の食品組成物は、少なくとも０．０５ｍｇ／ｇ、少なくとも０．０７ｍｇ／ｇ又は少なくとも０．０８ｍｇ／ｇの総トコフェロールを含む藻類油を含有する。ある場合には、本発明の食品組成物は、少なくとも０．１５ｍｇ／ｇ、少なくとも０．２０ｍｇ／ｇ又は少なくとも０．２５ｍｇ／ｇの総トコトリエノールを含む藻類油を含有する。
【０５３４】
上記組成物及び／又は方法の特定の実施形態では、微細藻類はカロチノイドを産成し得る。ある実施形態では、微細藻類により産成されたカロチノイドを、微細藻類により産成された脂質又は油と一緒に抽出することができる（すなわち、油又は脂質はカロチノイドを含有している）。ある実施形態では、微細藻類により産成されるカロチノイドはキサントフィルである。ある実施形態では、微細藻類により産成されるカロチノイドはカロチンである。ある実施形態では、微細藻類により産成されるカロチノイドは、カロチンとキサントフィルの混合物である。様々な実施形態では、微細藻類により生成されるカロチノイドは、アスタキサンチン、ルテイン、ゼアキサンチン、α−カロチン、ｔｒａｎｓ−β−カロチン、ｃｉｓ−β−カロチン、リコピン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのカロチノイドを含む。
【０５３５】
食品組成物のある実施形態では、藻類バイオマスは、適正製造基準（ＧＭＰ）条件下で培養し、乾燥させた藻類に由来する。ある場合には、藻類バイオマスを、限定されないが、穀物、果物、野菜、タンパク質、脂質、ハーブ及び／又は香辛料成分を含めた１つ又はそれ以上の他の食用成分を組み合わせる。ある場合には、食品組成物は、サラダドレッシング、卵製品、焼成製品、パン、バー、パスタ、ソース、スープ飲料、飲料、冷菓、バター又はスプレッドである。特定の実施形態では、食品組成物は錠剤でも粉末でもない。ある場合には、本発明による食品組成物は、少なくとも５０ｇ又は少なくとも１００ｇの重さである。
【０５３６】
バイオマスを１つ以上の他の食用成分を組み合わせて、食品を製造できる。バイオマスは、単一の藻類源（例えば、株）又は複数の供給源（例えば、様々な株）由来の藻類バイオマス由来であり得る。またバイオマスは、単一の藻類種だが、異なる組成物プロフィールを有する藻類種由来であり得る。例えば、製造者は、油含有量の高い微細藻類をタンパク質含有量の高い微細藻類とブレンドして、最終食品で望まれる正確な油とタンパク質の含有量にすることができる。食品製造者が組み合わせを行って、小売又は食品サービス用途のための最終製品を製造することができる。あるいは、製造者が藻類バイオマスを製品として販売し、消費者が、例えば従来の調理法を改変することにより、藻類バイオマスを食品中に組み込むこともできる。いずれの場合にも、藻類バイオマスは、典型的には、多くの従来の食品で使用される油、脂肪、卵などの全部又は一部の代わりに使用される。
【０５３７】
一態様では、本発明は、少なくとも０．１％ｗ／ｗ藻類のバイオマスと、１つ又はそれ以上の他の食用成分とを含む食品組成物に関し、ここで、乾燥重量で少なくとも４０％のタンパク質を含有する藻類バイオマスと、乾燥重量で４０％の脂質を含有する藻類バイオマスをブレンドすることにより藻類バイオマスを調合して、乾燥重量で所望の割合でブレンドされたタンパク質と脂質を得る。ある実施形態では、バイオマスは同じ株の藻類由来である。あるいは、乾燥重量で少なくとも４０％の脂質を含有し、その脂質の１％未満をＤＨＡとして含有する藻類バイオマスと、乾燥重量で少なくともの２０％の脂質を含有し、その脂質の少なくとも５％をＤＨＡとして含有する藻類バイオマスとブレンドして、凝集物中に乾燥重量で少なくとも１０％の脂質と１％のＤＨＡとを含有する乾燥バイオマスのブレンドを得る。
【０５３８】
一態様では、本発明は、ＧＭＰ条件下で、藻類培養物を乾燥させて乾燥重量で少なくとも１５％の油を含む藻類バイオマスを得ることによる、藻類バイオマスの調製方法に関するものであり、ここで、藻類油は、５０％を超える一価不飽和脂質である。
【０５３９】
一態様では、本発明は、ＧＭＰ条件下で製造される、乾燥重量で少なくとも１５％の油を含有する藻類バイオマスに関するものであり、ここで、藻類油は、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％を超えるＣ１８：１脂質である。一態様では、本発明は、ＧＭＰ条件下で製造される、乾燥重量で少なくとも４０％の油を含有する藻類バイオマスに関する。一態様では、本発明は、ＧＭＰ条件下で製造される、乾燥重量で少なくとも５５％の油を含有する藻類バイオマスに関する。ある場合には、藻類バイオマスは、１単位用量のバイオマスを送達する錠剤として包装される。ある場合には、藻類バイオマスは、藻類バイオマスと他の食用成分を組み合わせるための指示を与えるラベルとともに包装されるか、又は別の方法でそれを有する。
【０５４０】
一態様では、本発明は、上記組み換え微細藻類バイオマス及び／又はそれに由来する原料を、下記の少なくとも１つの他の最終食品成分と組み合わせて、食品組成物又は食料品を形成する方法に関する。様々な実施形態では、本発明の方法により形成される食品組成物は、卵製品（粉末又は液体）、パスタ製品、ドレッシング製品、マヨネーズ製品、ケーキ製品、パン製品、エネルギーバー、乳製品、ジュース製品、スプレッド又はスムージーを含む。ある場合には、食品組成物は錠剤でも粉末でもない。様々な実施形態では、食品組成物は、少なくとも１０ｇ、少なくとも２５ｇ、少なくとも５０ｇ、少なくとも１００ｇ、少なくとも２５０ｇ若しくは少なくとも５００ｇ、又はそれを超える重さである。ある実施形態では、組み換え微細藻類バイオマス及び／又はそれに由来する製品の組み合わせにより形成される食品組成物は、未調理製品である。他の場合には、食品組成物は調理済み製品である。
【０５４１】
他の場合には、食品組成物は調理済み製品である。ある場合には、食品組成物は、藻類バイオマスに由来する油を除き２５重量％未満の油又は脂肪を含有する。マーガリンなどのスプレッドを製造するとき行われるように植物油を水素化すると、飽和トリグリセリド（ＴＡＧ又はトランス脂肪）の形態の脂肪が生成される。藻類バイオマス中に含有される脂肪には、トランス脂肪が存在しない。ある場合には、食品組成物は、バイオマスに由来する油を除き１０重量％未満の油又は脂肪を含有する。少なくとも１つの実施形態では、食品組成物は、バイオマスに由来する油を除き、油又は脂肪を含まない。ある場合には、食品組成物は、バイオマス由来の油以外の油を含まない。ある場合には、食品組成物は卵又は卵製品を含まない。
【０５４２】
一態様では、本発明は、従来の食品中の脂肪又は油の全部又は一部が、少なくとも１０重量％の油を含有する藻類バイオマスに置き換わっている食品組成物の製造方法に関する。一実施形態では、本方法は、バイオマス中の藻類油と従来の食品中の油又は脂肪の量との比率を用いて、置換用藻類バイオマスの量を決定し、藻類バイオマスを、少なくとも１つの他の食用成分と、従来の食品中に含有されるよりも少ない量の油又は脂肪とを組み合わせて、食品組成物を形成することを含む。ある場合には、少なくとも１つの他の成分を組み合わせた藻類バイオマスの量は、従来の食品中の油及び／又は脂肪の質量又は容積の１〜４倍である。
【０５４３】
ある実施形態では、上記方法は、油又は脂肪と組み合わせた少なくとも１つの他の食用成分を含有する従来の食品のための調理法を提供し、従来食品中の脂肪又は油の質量又は容積として、１〜４倍の質量又は容積の藻類バイオマスを少なくとも１つの他の食用成分と混ぜ合わせることをさらに含む。ある場合には、本方法は、ＧＭＰ条件下で藻類バイオマスを調製することをさらに含む。
【０５４４】
ある場合には、組み換え微細藻類バイオマス及び／又はそれに由来する生成物の組み合わせにより形成される食品組成物は、ｗ／ｗ又はｖ／ｖで、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、又は少なくとも５０％の組み換え微細藻類バイオマス又は組み換え微細藻類油を含む。ある実施形態では、本明細書に記載されている通りに形成された食品組成物は、ｗ／ｗで、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の組み換え微細藻類バイオマス又はそれに由来する生成物を含む。ある場合には、食品組成物は、重量又は容積で、５〜５０％、１０〜４０％、又は１５〜３５％の藻類バイオマス又はそれに由来する生成物を含む。
【０５４５】
上記のように、本来であれば食品に従来より含まれ得る他の成分を、組み換え微細藻類バイオマスで置き換えることができる。ある実施形態では、食品組成物は、バイオマスに起因する又は組み換え微細藻類源由来の組み換え微細藻類油を除き、５０重量％未満、４０重量％未満、又は３０重量％未満の油又は脂肪を含有する。ある場合には、食品組成物は、バイオマスに起因する又は組み換え微細藻類源由来の組み換え微細藻類油を除き、２５重量％未満、２０重量％未満、１５重量％未満、１０重量％未満、又は５重量％未満の油又は脂肪を含有する。少なくとも１つの実施形態では、食品組成物は、バイオマスに起因する又は組み換え微細藻類源由来の組み換え微細藻類油を除き、油又は脂肪を含まない。ある場合には、食品組成物は、卵、バター若しくは他の脂肪／油、又は相当する従来の食品中に元々含まれ得る少なくとも１つの他の成分を含まない。ある食品は乳製品（例えば、バター、クリーム及び／又はチーズ）を含まない。
【０５４６】
食品組成物を調製するために使用する藻類バイオマスの量は、従来の食品中の置き換えられる非藻類油、脂肪、卵などの量、及び藻類バイオマス中の油の百分率によって決まる。したがって、少なくとも１つの実施形態では、本発明の方法は、バイオマス中の油の割合、及び従来の食品中の少なくとも１つの他の食用成分と元々組み合わさっている油及び／又は脂肪の割合から、少なくとも１つの他の食用成分と組み合わせる藻類バイオマスの量を決定することを含む。例えば、藻類バイオマスが５０％ｗ／ｗの組み換え微細藻類油であり、かつ従来の調理法での油又は脂肪を完全に置き換えることを望むのであれば、油を、例えば２：１の比で置き換える。比は質量により測定してもよいが、実用目的では、多くの場合、計量用のカップ又はスプーンを用いて容積を測定する方が容易であり、かつ置き換えを容積で行うことができる。一般的な場合、置き換える油又は脂肪の容積又は質量を、藻類バイオマスの（１００／１００−Ｘ）容積又は質量で置き換え、ここでＸは、バイオマス中の組み換え微細藻類油の百分率である。一般に、従来の調理法において置き換えられる油及び脂肪を、すべて藻類バイオマスに置き換えることができる。但し、すべてを置き換える必要はなく、任意の所望の割合の油及び／又は脂肪を保持し、残りを味及び栄養上の必要性に応じて置き換えることができる。藻類バイオマスは、乳化剤として機能するタンパク質及びリン脂質を含有するため、卵などの品目を全部又は一部、藻類バイオマスに置き換えることができる。卵を全部バイオマスに置き換えるのであれば、追加の乳化剤（１つ又は複数）で食品組成物中の乳化特性を増強する、及び／又は追加の水若しくは他の液体（１つ又は複数）を加えて、本来なら卵により与えられ得るこれらの成分の損失を補うことが望ましい、又は必要である場合がある。卵はすべてが脂肪というわけではないので、卵を置き換えるために使用するバイオマスの量は、純粋な油又は脂肪を置き換えるために使用する量よりも少なくてよい。平均的な卵の重量は約５８ｇであり、約１１．２％の脂肪を含む。したがって、５０重量％の組み換え微細藻類油を含む約１３ｇの藻類バイオマスを用いて、全卵の全脂肪部分を置き換えることができる。食品中の全部又は一部の卵を置き換えることは、コレステロールを低下させるというさらなる利点を有する。
【０５４７】
簡単にするために、置き換えの比率は、バイオマスの質量又は容積で置き換えられる油、脂肪及び／又は卵の質量又は容積で表すことができる。ある方法では、従来の調理法での油、脂肪及び／又は卵の質量又は容積を、５〜１５０％、２５〜１００％、又は２５〜７５％の油、脂肪及び／又は卵の質量又は容積で置き換える。置き換えの比は、種々の因子、例えば食品、食品の所望の栄養プロフィール、食品の全体的な質感及び外見、並びにバイオマスの油含有量などによって決まる。
【０５４８】
調理済み食品では、調理前又は後に百分率（すなわち、重量又は容積）を決定できる。藻類バイオマスの百分率は、液体の喪失により調理プロセスの間に増加し得る。調理プロセスの間に一部の藻類バイオマス細胞が溶解し得るため、調理済み製品中の藻類バイオマスの含有量を直接測定することが困難な場合がある。しかし、最終製品の重量又は容積の百分率（バイオマスの乾燥固体に基づく）として、未加工製品に入っているバイオマスの質量又は容積から、また藻類バイオマスに固有の成分、例えば、ゲノム配列、又は特定のカロチノイドなど、藻類バイオマスによってのみ送達される化合物などを分析する方法により、含有量を間接的に決定することができる。
【０５４９】
ある場合には、藻類バイオマスを、従来の食品中に存在する油、脂肪、卵などの一定比率の量を超える量で、少なくとも１つの他の食用成分と組み合わせることが望ましい場合もある。例えば、従来の食品中の油及び／又は脂肪の質量又は容積を、その１、２、３、４倍又はそれを超える量の藻類バイオマスで置き換えてもよい。本発明の方法のある実施形態は、油又は脂肪と組み合わせた少なくとも１つの他の食用成分を含有する従来食品の調理法を提供して、従来食品中の脂肪又は油の質量又は容積として、１〜４倍の質量又は容積の藻類バイオマスを少なくとも１つの他の食用成分と混ぜ合わせることを含む。  
【０５５０】
藻類バイオマス（大部分がインタクトな、又は均質化若しくは微粒子化された）及び／又は藻類油を、少なくとも１つの他の食品成分を組み合わせて食品を形成する。ある食品では、藻類バイオマス及び／又は藻類油を、１〜２０種、２〜１０種又は４〜８種の他の食用成分と組み合わせる。食用成分は、限定されないが、果物、野菜、豆類、肉、魚、穀物（例えば、小麦、米、オーツ麦、コーンミール、大麦）、ハーブ、香辛料、水、野菜の煮汁、ジュース、ワイン及び食酢を含めるがこれらに限定されない、あらゆる主要な食品群から選択され得る。ある食品組成物では、藻類バイオマス又は藻類油のほかに少なくとも２種、３種、４種又は５種の食品群が表される。
【０５５１】
また、油、脂肪、卵などを食品組成物に入れることもできるが、上で述べたように、これら通常は、従来の食品と比べて少ない量（例えば、質量又は容積で、５０％未満、２５％未満又は１０％未満の油、脂肪又は卵）で存在する。本発明のある食品は、藻類バイオマス及び／又は藻類油によりもたらされる油以外の油を含まない。ある食品は、藻類バイオマスによりもたらさせる油以外の油を含まない。ある食品は、藻類バイオマス又は藻類油によりもたらされる脂肪以外の脂肪を含まない。ある食品は、藻類バイオマスによりもたらさせる脂肪以外の脂肪を含まない。ある食品は、藻類バイオマス又は藻類油によりもたらされる油及び脂肪以外の油及び脂肪を両方とも含まない。ある食品は、藻類バイオマスによりもたらされる油及び脂肪以外の油及び脂肪を両方とも含まない。ある食品は卵を含まない。ある実施形態では、微細藻類により生成される油を、特定の脂肪酸の成分（１つ又は複数）又はレベルを含むように培養条件又は株選択により調整できる。
【０５５２】
ある場合には、食品組成物の製造で使用する藻類バイオマスは、少なくとも２つの異なる微細藻類種の混合物を含む。ある場合には、少なくとも２つの異なる微細藻類種は、別々に培養されたものである。少なくとも１つの実施形態では、少なくとも２つの異なる微細藻類種は、異なるグリセロ脂質プロフィールを有する。ある場合には、上記方法は、従属栄養条件下で藻類を培養し、その藻類からバイオマスを調製することをさらに含む。ある場合には、少なくとも２つの異なる微細藻類種はすべて、乾燥重量で少なくとも１０％又は少なくとも１５％の油を含有する。ある場合には、食品組成物は、同じ種の２つの異なるバイオマス調製物のブレンドを含有し、ここで、一方の調製物は乾燥重量で少なくとも３０％の油を含有し、第２の調製物は乾燥重量で１５％未満の油を含有する。ある場合には、食品組成物は、同じ種の２つの異なるバイオマス調製物のブレンドを含有し、ここで、一方の調製物は乾燥重量で少なくとも５０％の油を含有し、第２の調製物は乾燥重量で１５％未満の油を含有し、さらに藻類種はＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓである。
【０５５３】
本来なら従来の食品中に存在する油、脂肪又は卵の代わりとして藻類バイオマスを使用することに加え、スムージーなど、通常は油を含まない食品中の栄養補助剤として、藻類バイオマスを使用することができる。油を炭水化物が主である製品と組み合わせることには、油に関連する利益があり、また、炭水化物の血糖指数を低下させることにより油と炭水化物の組合せから利益が得られる。バイオマス中に封入された油を加えることは、油を酸化から保護する点で有利であり、またスムージーの味及び質感を向上させることもできる。
【０５５４】
藻類バイオマスから抽出された油を、バイオマス自体と同じ方法で、すなわち、従来の調理法での油、脂肪、卵などの代わりとして使用することができる。油を用いて、従来の油及び／又は脂肪を約１：１（重量／重量又は容積／容積）で置き換えることができる。油を、場合により追加の水及び／又は乳化剤（平均５８ｇの卵の脂肪は約１１．２％、藻類油の密度は約０．９１５ｇ／ｍｌ、小さじの容積は約５ｍｌ、すなわち、卵１個あたり小さじ１．２杯分の藻類油である）と組み合わせて、卵１個あたりおよそ小さじ１杯の藻類油と置き換えることにより、卵の代わりに用いることができる。また油を、ドレッシング、ソース、スープ、マーガリン、クリーマー、ショートニングなどに組み込むこともできる。油は、油と他の食品成分を組み合わせて所望の味、質感及び／又は外見にする必要がある食品に特に有用である。食品中の、重量又は容積による油含有量は、少なくとも５、１０、２５、４０又は５０％であり得る。
【０５５５】
少なくとも１つの実施形態では、藻類バイオマスから抽出された油は、食用油として、食品製造業者、レストラン及び／又は消費者が使用できる。かかる場合には、藻類油を、例えばベニバナ油、キャノーラ油、オリーブ油、ブドウ種子油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、ココナツ油、パーム油又は従来用いられている他の任意の食用油などの従来の食用油の代わりにすることができる。藻類バイオマスから得られた油を、他の種類の油と同様にさらに精製して、調理への適合性を高めることができる（例えば、発煙点の上昇）。油を苛性ソーダで中和して、遊離脂肪酸を除去することもできる。遊離脂肪酸は、除去可能なスープストックを形成する。カーボンブラック及び漂白土などの化学物質を用いた漂白により、油の着色を取り除くこともできる。漂白土及び化学物質を濾過により油から分離することができる。また、蒸気処理により油を脱臭することもできる。
【０５５６】
大部分がインタクトなバイオマス、均質化又は微粒子化されたバイオマス（スラリー、フレーク、粉末又は粒粉として）及び精製された藻類油はすべて、他の食品成分と組み合わせて食品を形成することが可能である。すべて、好ましい栄養プロフィールを有する（一価不飽和含有量が比較的高い）油源である。また大部分がインタクトな、均質化された、及び微粒子化されたバイオマスは、上述のような高品質のタンパク質（バランスの取れたアミノ酸組成物）、炭水化物、繊維及びその他の栄養素を供給する。これらの任意の生成物を組み込んだ食品は、完全菜食主義又は菜食主義用の形態で製造され得る。組み換え微細藻類バイオマス（大部分がインタクトな、若しくは均質化された（若しくは微粒子化された）バイオマス、又はその両方）をタンパク質源としてを使用するもう１つの利点は、それが、大豆、卵又は乳製品などの主要な対立遺伝子源に由来しない完全菜食主義／菜食主義用のタンパク質源であるということである。
【０５５７】
本発明に従って藻類バイオマス及び／又は藻類油と組み合わせることができる他の食用成分としては、穀物、果物、野菜、タンパク質、肉、ハーブ、香辛料、炭水化物及び脂肪が挙げられるが、これらに限定されない。藻類バイオマス及び／又は藻類油と組み合わせて食品組成物を形成する他の食用成分は、製造する食品、並びに該食品の味、質感及びその他特性によって決まる。
【０５５８】
一般に、これらの任意の藻類油供給源は、任意の食品で使用することができるが、好ましい供給源は、部分的には、油が食品の質感、外見又は味よりも、主として栄養目的若しくはカロリー目的で存在するのか、あるいは、他の食品成分と組み合わせる油が、食品の栄養プロフィール若しくはカロリープロフィールを向上させると同時に、又はその代わりに、食品の所望の味、質感又は外見に寄与することを目的とするのかによって決まる。
【０５５９】
必要に応じて、食品を従来の方法で調理できる。調理プロセスの長さ及び温度によっては、一部の細胞壁が破壊されて油が放出され、それが混合物中の他の成分と組み合わさる場合がある。しかし、多くの場合、少なくとも一部の藻類細胞は調理されてもインタクトなままである。あるいは、調理せずに食品を使用することもできる。この場合、藻類の細胞壁はインタクトなままで、油を酸化から保護する。
【０５６０】
藻類バイオマスは、大部分がインタクトな細胞を含む形態で、又はホモジネート粉末として提供された場合、それが乾燥成分として提供されて、粒粉などの他の乾燥成分との混合が容易になり得るという点で、油、脂肪又は卵とは異なる。一実施形態では、藻類バイオマスは、乾燥重量で２５〜４０％の間の油を含有する乾燥ホモジネートとして提供される。また、バイオマスホモジネートは、スラリーとしても提供され得る。乾燥成分（及び使用する場合は、バイオマスホモジネートスラリー）を混合した後に、水などの液体を加えることもできる。ある食品では、バイオマスの非油成分により、及び／又は卵などの他の成分により水が供給されないため、必要な液体の量が従来の食品よりも若干多い。しかし、水の量は、従来の調理と同様に容易に決定され得る。
【０５６１】
一態様では、本発明は、乾燥重量で少なくとも１０％の藻類油を含有する少なくとも０．５％ｗ／ｗの藻類バイオマスと、少なくとも１つの他の食品成分とを含む、食品成分組成物に関するものであり、ここで、食品成分組成物に液体を加えることにより、食品成分を復元された食品に変化させ得る。一実施形態では、液体は水である。
【０５６２】
均質化又は微粒子化された高油バイオマスは、バイオマスに起因する油が他の液体とエマルションを形成する液体及び／又は乳化食品（油中水型及び水中油型エマルション）、例えばソース、スープ、飲料、サラダドレッシング、バター、スプレッドなどにおいて特に有利である。レオロジーを向上させることで有用となる製品、例えばドレッシング、ソース及びスプレッドについては、以下の実施例に記載されている。均質化されたバイオマスを用いれば、所望の質感（例えば、食感）、味及び外見（例えば、不透明度）を有するエマルションは、従来の油を用いた従来の製品の場合に比べて、低い油含有量（製品全体の重量又は容積で）で形成され得るため、脂肪増量剤として用いることができる。このことは、低カロリー（すなわち、ダイエット用）製品に有用である。また精製された藻類油もこのような液体及び／又は乳化製品に有利である。均質化又は微粒子化された高油バイオマスと精製された藻類油はともに、焼成製品中の他の食用成分とうまく混ざり、従来の油、脂肪及び／又は卵で製造された他の類似の製品と同等かそれ以上の味、外見及び質感を達成し、しかも栄養プロフィールは向上する（例えば、単価飽和油の含有量の増加、並びに／又タンパク質の含有量又は質の増加、並びに／又は繊維及び／若しくは他の栄養素の含有量の増加）。
【０５６３】
大部分がインタクトなバイオマスは、食品の栄養プロフィールの変更又は増加（例えば、油含有量の増加、異なる油成分（例えば、一価不飽和油が多い）、タンパク質含有量の増加、カロリー含有量の増加、他の栄養素の含有量の増加）が望まれる状況において特に有用である。かかる食品は、例えば、運動選手、又は消耗性疾患の患者に有用であり得る。大部分がインタクトなバイオマスを増量剤として使用できる。例えば、より高価な食品の量を増大させるために（例えば、肉増量材（ｍｅａｔ  ｈｅｌｐｅｒ）など）、又は菜食主義者用の肉代替品などの擬似食品若しくは模倣食品に増量剤を用いることができる。模擬食品又は模倣食品は、通常は、異なる供給源から風味やかさ提供されるという点で、天然の食品とは異なる。例えば、肉などの天然食品の風味は、風味を保持する増量剤に付与することができる。大部分がインタクトなバイオマスは、かかる増量剤として使用され得る。また大部分がインタクトなバイオマスは、水との結合性に優れ、パスタのような乾燥食品の再水和を促進し得ることから、このような食品においても特に有用である。また大部分がインタクトなバイオマスは、例えば焼成製品の保存剤としても有用である。大部分がインタクトなバイオマスの保水性が向上するため、有効期間が伸び得る。
【０５６４】
破壊又は微粒子化された藻類バイオマスの保水性も向上するため、有効期間が伸び得る。保湿性の増加は、無グルテン焼成製品などの無グルテン製品において特に望ましい。破壊された藻類バイオマスを用いた無グルテンクッキー調合、及びその後の有効期間の実験に関する詳細は、以下の実施例に記載されている。
【０５６５】
ある場合には、藻類バイオマスは、卵調製品に使用できる。ある実施形態では、よりクリーミーなスクランブルエッグを作るために従来の乾燥粉末の卵調製品に加えた藻類バイオマス（例えば、藻類粒粉）は、藻類バイオマスなしで調製した乾燥粉末卵よりも水分が多く、質感もよい。他の実施形態では、調製後にスチームテーブルに放置する卵の全体的な質感及び水分を向上させるために、藻類バイオマスを全液卵に加える。上記調製品の具体例が以下の実施例に記載されている。
【０５６６】
藻類バイオマス（大部分がインタクトな及び／又は均質化若しくは微粒子化された）及び／又は藻類油は、実質的に任意の食品組成物に組み込まれ得る。いくつかの例としては、焼成製品、例えばケーキ、ブラウニー、イエローケーキ、ブリオッシュを含めたパン、シュガークッキーを含めたクッキー、ビスケット及びパイなどが挙げられる。他の例としては、乾燥形態で提供されることが多い、パスタ又は粉末ドレッシング、乾燥クリーマーなどの製品、代用肉、及び肉代替品が挙げられる。大部分がインタクトなバイオマスを結合剤及び／又は増量剤としてかかる製品に組み込むと、大部分がインタクトなバイオマスの水との結合能により水和が向上し、生産量が増加し得る。また、乾燥粉末卵から作られるスクランブルエッグなどの再水和食品の質感及び栄養プロフィールも向上し得る。他の例としては、液体食品、例えばソース、スープ、ドレッシング（食べられる状態の）、クリーマー、乳飲料、ジュース飲料、スムージー、クリーマーなどが挙げられる。他の液体食品としては、ミールリプレイスメント又は藻類のミルクとして機能する栄養飲料が挙げられる。他の食品としては、ショートニング、マーガリン／スプレッド、ナッツバター、及びナチョソースなどのチーズ製品を含めた、バター又はチーズなどが挙げられる。他の食品としては、エネルギーバー、チョコレート菓子用レシチンの代替物、ミールリプレイスメントバー、グラノーラバータイプの製品が挙げられる。別のタイプの食品は、バッター及びコーティングである。食品を取り囲む油の層を与えることにより、大部分がインタクトなバイオマス、又はホモジネートが、調理媒体からの余分な油が食品に浸透するのを防ぐ。したがって、食品は、あまり望ましくない油（例えば、トランス脂肪、飽和脂肪、及び食用油由来の副生成物）を吸収することなく、一価不飽和油含有量の高いコーティングの効果を保持することができる。またバイオマスのコーティングは、食用油及びその副生成物の吸収が少ないことにより、望ましい（例えば、かりかりとした）質感及び純粋な風味を食品に与え得る。
【０５６７】
未調理食品では、バイオマス中のほとんどの藻類細胞がインタクトなままである。このことには、藻類油が酸化から保護されるという利点があり、これにより有効期間が長くなり、他の成分との有害な相互作用が最小限になる。食品の性質によっては、細胞が与えらる保護により、冷蔵、真空包装などの必要性が低減又は回避される。また、細胞がインタクトな状態に保持されることにより、油が消費者の口に直接接触するのを妨げ、油っぽい又は脂肪の多いとい望ましくない感覚が低減される。油が栄養補助食品として使用される食品では、このことは製品の官能特性を向上させるのに有利であり得る。したがって、大部分がインタクトなバイオマスは、かかる製品での使用に適している。しかし、油が所望の食感を与える（例えば、食酢のような水溶液とのエマルションとして）、サラダドレッシングなどの未調理製品では、精製された藻類油又は微粒子化されたバイオマスの使用が好ましい。調理済み食品では、元のインタクトなバイオマスの藻類細胞の一部が溶解し得るが、他の藻類細胞はインタクトなままであり得る。溶解する細胞とインタクトな細胞の割合は、調理プロセスの温度及び時間によって決まる。油と他の成分の不均一な分散が味、質感及び／又は外見にとって望ましい調理済み食品（例えば、焼成製品）では、微粒子化されたバイオマス又は精製された藻類油の使用が好ましい。藻類バイオマスを用いて、油及び／又はタンパク質並びに他の栄養素を供給する調理済み食品では、主として、質感よりも栄養又はカロリー上の有用性のために用いる。
【０５６８】
また藻類バイオマスは、藻類バイオマスなしで製造された、本来であれば類似といえる従来の製品と比較して、食品（例えば、ミールリプレイスメントの飲料又はスムージー）の満腹指数を増加させることにおいても有用であり得る。満腹指数は、同じカロリー数の異なる食品が食欲をどの程度満たすのかを表す尺度である。かかる指数は、試験対象の食品を与えた後、一定の間隔で他の食品に対する食欲を測定することにより測定することができる。その後の他の食品に対する食欲が低いほど、満腹指数は高い。満腹指数の値は、白パンの値を１００とした尺度で表すことができる。満腹指数の高い食品はダイエットに有用である。機序の理解に依存するわけではないが、藻類バイオマスは、所定のカロリー量に対して食品のタンパク質及び／又は繊維含有量を増加させることにより、食品の満腹指数を増加させると考えられる。
【０５６９】
また藻類バイオマス（大部分がインタクトで、かつ均質化又は微粒子化された）及び／又は藻類油を使って、栄養補助食品又はダイエット補助食品を製造することもできる。例えば、藻類油を、魚油と同様の方法で、消化可能なカプセル内に封入することもできる。かかるカプセルを瓶詰めにし、毎日摂取することもできる（例えば、１日１〜４錠のカプセルまた錠剤）。カプセルは、１単位用量の藻類バイオマス又は藻類油を含有し得る。同様に、バイオマスを、場合により、製薬用などの添加剤とともに圧縮して錠剤にすることもできる。錠剤を、例えば瓶詰め又はブリスターパックに包装し、例えば１日１〜４錠の用量で毎日摂取することもできる。ある場合には、錠剤などの製剤は、１単位用量のバイオマス又は藻類油を含む。カプセル及び錠剤製品などの栄養補助食品の製造は、米国連邦規則集第２１編第１１1部又は米国外の管轄区域により制定されている同等の規制で成文化されている、栄養補助食品に適したＧＭＰ条件下で行われることが好ましい。藻類バイオマスを他の粉末と混ぜ、そのまま混ぜることができる原材料（例えば、水、ジュース、ミルクなどの液体と）として小袋に入れることができる。また藻類バイオマスを、ヨーグルトのような製品に混ぜることができる。
【０５７０】
藻類バイオマス及び／又は藻類油を栄養補助食品に組み込むことはできるが、上述の機能性食品は、丸剤、カプセル又は粉末形態の典型的な栄養補助食品とは異なる。かかる食品の１人分の量は、典型的には、重量及び供給されるカロリーの両方の点で栄養補助食品よりもかなり多い。例えば、食品が１回分ずつ包装され又は一度に摂取される場合、重量は１００ｇを超え、かつ／又は少なくとも１００カロリーが供給される場合が多い。典型的には、食品は、タンパク質、炭水化物又は液体のいずれかのうち少なくとも１つの成分を含有し、多くの場合、かかる他の成分を２つ又は３つ含有する。多くの場合、食品のカロリーのうち少なくとも３０％、５０％又は６０％が、食品中のタンパク質又は炭水化物により供給される。
【０５７１】
上述のように、藻類バイオマスは、製造者によって製造され、レストラン又は個人などの消費者に販売され、商業的環境まはた家庭で使用され得る。かかる藻類バイオマスは、食品に対する適正製造基準（ＧＭＰ）条件下で製造及び包装することが好ましい。多くの場合、大部分がインタクトな形態で、又は均質化若しくは微粒子化された形態である藻類バイオマスを、粉末として密封バッグのような密閉容器内に乾燥状態で包装する。スラリー形態の均質化又は微粒子化されたバイオマスは、各種容器の中でも特に、タブ容器に包装すると好都合であり得る。場合により、有効期間を延ばすために、藻類バイオマスを真空包装することができる。包装された藻類バイオマスを冷蔵する必要はない。包装された藻類バイオマスは、従来の調理法での所与の量の油、脂肪又は卵を上述のように置き換えるために使用する藻類バイオマスの量に関する指示が記載された使用説明書を含むことができる。簡単にするために、指示には、油又は脂肪を質量又は容積で２：１の比でバイオマスに置き換え、卵１個あたりバイオマスを１１ｇ又は藻類油を小さじ１杯の割合で卵を置き換えると記載できる。上述のように、その他の比率も可能であり、例えば、従来の調理法での油及び／又は脂肪及び／又は卵の質量又は容積に対して１０〜１７５％の質量又は容積のバイオマスという比率を用いることが可能である。説明書の指示によると、密封包装を開封したら、使用者は、藻類バイオマスを市販のもので広く利用されているもの（例えば、Ｇｌａｄ）などの密閉容器に入れ、場合により冷蔵して保存する。
【０５７２】
また藻類バイオマス（大部分がインタクトな、又は均質化若しくは微粒子化された粉末）は、他の乾燥成分（例えば、糖、粒粉、乾果、香味料）と混ぜ合わせ、小分けにして包装し、最終製品が均等になるようにすることができる。次いで、前記混合物は、消費者又は食品サービス会社が、水若しくはミルクなどの液体を加え、場合によりかき混ぜ、及び／又は油若しくは脂肪を加えずに調理するだけで、食品に変えられ得る。ある場合には、液体を加えて乾燥藻類バイオマス組成物を復元する。場合により、マイクロ波オーブン、対流式オーブン、従来のオーブンを用いて、又はレンジ台で調理を行うことができる。かかる混合物を、ケーキ、パン、パンケーキ、ワッフル、飲料、ソースなどの製造に使用することができる。かかる混合物には、消費者にとって便利である、また冷蔵しなくても有効期間が長いといった利点がある。かかる混合物は、典型的には、液体を加えて混合物を食品に変化させるための説明書を有する密閉容器に梱包する。
【０５７３】
食品成分として使用する藻類油も同様に、食品に対するＧＭＰ条件下で製造及び包装することが好ましい。藻類油は、典型的には、従来使用されている油と同様に、瓶詰め又はその他の容器に梱包する。容器には、食品中の従来の油、脂肪又は卵の代わりに、及び食用油として、油を使用するための指示が記載されたラベルが貼り付けられ得る。密閉容器に包装した場合、油は実質的に劣化せず、その有効期間は長い（少なくとも１年）。開封後でも、主として一価不飽和油を含む藻類油は、急激に酸化の影響を受けることはない。しかし、冷暗所で保管すれば（例えば、戸棚のような閉所の中で）、未使用分の油は長持ちし、酸化しにくい。油に付属する指示書には、かかる保管に関する情報が含まれ得る。
【０５７４】
場合により、藻類バイオマス及び／又は藻類油は、有効期間を最大にするために、カロチノイド（例えば、アスタキサンチン、ルテイン、ゼアキサンチン、α−カロチン、β−カロチン及びリコピン）、リン脂質（例えば、Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール及びリゾホスファチジルコリン）、トコフェロール（例えば、αトコフェロール、βトコフェロール、γトコフェロール及びδトコフェロール）、トコトリエノール（例えば、αトコトリエノール、βトコトリエノール、γトコトリエノール及びδトコトリエノール）、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ポリフェノール、ロスマリン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、ソルビン酸、安息香酸、メチルパラベン、レブリン酸、アニス酸、酢酸、クエン酸及びビオフラボノイドを含むがこれらに限定されない、食品用に認可された保存剤／抗酸化剤を含んでいてもよい。
【０５７５】
大部分がインタクトなバイオマス、均質化若しくは微粒子化されたバイオマス（スラリー、フレーク、粉末粒粉）又は藻類油をヒトの栄養摂取用の食品に組み込むことに関する記述は、一般に、非ヒト動物用の食品に対しても適用される。
【０５７６】
バイオマスは、かかる食品に、高品質の油若しくはタンパク質、又はその両方を付与する。藻類油の含有量は、好ましくは、少なくとも１０又は２０重量％であり、藻類タンパク質の含有量も同様である。大部分がインタクトなバイオマスから藻類油及び／又はタンパク質少なくとも一部を得ることは、競技用のイヌ又はウマなどの能力の高い動物用飼料に有利な場合がある。また大部分がインタクトなバイオマスは、保存剤としても有用である。藻類バイオマス又は藻類油を、動物用飼料で通常見られる他の成分（例えば、肉、肉フレーバー、脂肪酸、野菜、果物、デンプン、ビタミン、ミネラル、抗酸化剤、プロバイオティック）及びその任意の組み合わせと混ぜ合わせる。かかる食品はまた、伴侶動物、特に活動的な生活様式の伴侶動物にも適している。キャットフードにはタウリンを含ませることが推奨される。従来の動物用飼料と同様に、対象とする動物に適した一口大の粒子で食品を提供することができる。
【０５７７】
脱脂食は、家畜、例えば反芻動物、家禽、ブタ、及び養殖のための動物の飼料として有用である。脱脂食は、食品用その他の目的で精製藻類油を調製したときの副生成物である。得られた食物には、油含有量は減少しているが、動物用飼料に適した高品質のタンパク質、炭水化物、繊維、灰分などの栄養素は依然として含まれている。脱脂食は、大部分の細胞が溶解しているため、かかる動物により消化されやすい。場合により、脱脂食を動物飼料中の穀物などの他の成分と組み合わせることができる。脱脂食は均一な粉末状であるため、市販の押出し機又は膨張機を用いて、それをペレットに圧縮できる。
【０５７８】
本発明の用途に応じた油を、従来の油、例えばパーム油、パーム核油、ココナツ油、カカオバター、獣脂又はラードの代わりに使用することができる。
【０５７９】
パーム油：パーム油は、世界中で、マーガリン、ショートニング，焼成製品及び菓子などに使用されている。パーム油は、およそ５０％の飽和脂肪と５０％の不飽和脂肪とで構成されているため、Ｃ１８：０と短鎖飽和脂肪酸とを含有する（固体の）パームステアリンと、Ｃ１８：１と長鎖不飽和脂肪酸とを含有する（液体の）パームオレインとに分離することができる。パームステアリンを用いて、固体の無トランス脂肪を形成することができる。油にＣ１８：１が比較的多く含まれる本発明の微生物トリグリセリド組成物は、現在一般に使用されている高トランス脂肪の部分水素化植物油にとって優れた健康的な代替物である。水素化植物油を含め、トランス脂肪含有食品は、健康に悪い食品であると広く考えられている。本発明は、Ｃ１８：１が多く、部分水素化植物油よりも健康に良い、用途に応じた油を提供する。したがって、本発明は、健康に良い油を提供するものであり、より健康的な商品を供給するようにとの、一般公衆の食品業界に対する要求を満たすものである。本発明の、用途に応じた油を、健康に悪い部分水素化植物油の代わりとして用いることができる。
【０５８０】
食品に加え、適度なリノール酸含有量と高レベルの天然の抗酸化物質を有するパーム油は、ほとんどどのような調理であっても、またフライ調理に直接使用するのにに適している。フライ油としてのパーム油を使用するのは、世界的にみて主要なパーム油の使用法である。ポテトチップ、フレンチフライ、ドーナツ、ラーメン、ナッツなどは、パーム油で揚げるのが典型的である。
【０５８１】
ポテトチップを大規模に揚げるためには、パームオレイン、又はパームオレインと大豆油若しくはナタネ油とのブレンドが好ましい。これは、最終製品の外観が向上するからである。フレンチフライは、部分揚げし冷凍された製品として購入されることが多い。
【０５８２】
パーム油は、焼成及びフライでの使用に加え、ビスケット、クラッカー、パン、シリアル、チップ、チョコレート、アイスクリーム、スープ、ソース、マヨネーズ、及びその他多数を含めた数多くのタイプの食品成分としても広く用いられている。
【０５８３】
本発明のパーム油模倣物は、ヒト用食糧供給におけるパーム油の健康に良い代替物である。
【０５８４】
パーム核油及びココナツ油：そのままのパーム核油及びココナツ油、並びにその分画された部分は、単独で又は他の油とブレンドして、カカオバター代替品などの菓子用脂肪（タフィー及びキャラメル）、ビスケットの生地及び充填クリーム、ケーキのアイシング、アイスクリーム、模倣品のホイップクリーム、乳製品を含まないクリーマー（コーヒー用クリーム）、フィルドミルク、並びに食卓用のマーガリン及びスプレッドの製造に使用されている。またこれらの油は、棒状石鹸及び液体石鹸の製造にも広く使用されている。パーム核油及びココナツ油はＣ１２：０及びＣ１４：０が高い。表５には、ココナツ油のＣ１２：０及びＣ１４：０の総量が約５０％〜７５％であることが開示されている。同様に、パーム核油のＣ１２：０及びＣ１４：０の総量は約５０％〜７０％である。本発明は、約５０％〜７５％のＣ１２：０とＣ１４：０とを含む微生物油である、パーム油模倣物を提供する。
【０５８５】
カカオバター：カカオバターは、カカオ豆から抽出される、淡黄色の純粋な食用植物脂肪である。カカオバターは、チョコレート、ビスケット、焼成製品、医薬品、軟膏及びトイレタリーに使用される。カカオバターは、歴史的には、ホワイトチョコレート及びミルクチョコレートの両商品の主成分として役立てられてきた。
【０５８６】
さらに、製薬会社は、カカオバターに特有の物理的特性を利用してきた。食用油としては室温で固体であるが、体温では融けるため、カカオバターは、例えば坐剤として、医薬成分を送達するための理想的な基剤であると考えられている。
【０５８７】
またカカオバターは、既知の脂肪の中で最も安定な脂肪の１つでもあり、酸敗を防止する天然の抗酸化物質と併用することで、その品質により、保存期間が２〜５年になる。カカオバターの滑らかな質感、良い香り及び軟化特性により、化粧品、石鹸及びローションのような肌用製品で人気のある成分となっている。
【０５８８】
カカオバターの保湿能力は、妊婦の妊娠線の予防に、皮膚及び唇の荒れの治療に、また肌の乾燥、かゆみを予防する日常の保湿剤として推奨されることが多い。
【０５８９】
実施例１４では、カカオバターに非常に類似した微生物トリグリセリド組成物が提供される。本発明のカカオバター模倣物は、カカオバターを用いるあらゆる用途において有用である。
【０５９０】
獣脂：米国の牛脂の生産及び輸出は群を抜いて最も多く、生産量は世界の油及び脂肪生産量の約２５〜３０％を占めている。過去には、牛脂は、初期の文化において照明用（牛脂に浸した木片）に使用され、また石鹸及び軟膏の製造に使用された。現在、牛脂は、脂肪酸及び脂肪族アルコールのような化学中間生成物の生産に使用されている主要な原材料である。また牛脂は、主に食用の脂肪及び油で使用されることに加え、焼成及び調理用の脂肪として、またマーガリン生産においても使用されている。牛脂は、その類似した脂肪酸スペクトルにより、かつてはカカオバターを増量するために使用されていた。
【０５９１】
食品及び調理では、獣脂は、フライ用の脂として、及びアメリカ先住民の料理であるペミカンを作るための成分として使用され得る。また獣脂は、パン及びペストリーのショートニングとして、及びマーガリンの成分の一部としても使用され得る。牛脂以外にも、獣脂はウマ、ヒツジ及びブタから得られる。肉を食べない者や菜食主義者にも、ナンキンハゼ（Ｔｒｉａｄｉｃａ  ｓｅｂｉｆｅｒｕｍ）の種子から単離されるロウを用いた独自の獣脂を利用している。また獣脂は、ニワトリ用及びブタ用飼料などの様々な動物飼料の成分の一部としても使用されている。
【０５９２】
本明細書に記載の獣脂模倣物は、獣脂の代替物として有用である。
【０５９３】
ラード：ラードはブタから単離され、高い飽和脂肪酸含有量により比較的高い発煙点を有する数少ない食用油の１つである。純粋なラードは、加熱時にほとんど煙が出ず、また他の食材と組み合わせると独特の味がするため、調理に特に有用である。多くの料理人及びパン製造者は、その用途の広さ及び味を理由に、ラードがショートニングよりも優れた調理用脂肪であると考えている。
【０５９４】
ラードでは比較的大きな脂肪結晶が見られるため、焼成におけるショートニングとして極めて有用である。ラードで作ったパイ生地は、バターで作ったものよりもフレーク状になりやすい。多くの調理人は、ペストリーに両方のタイプの脂肪を用いて、ラードのショートニング特性とバターの風味を組み合わせる。
【０５９５】
実施例１４では、ラードに類似した微生物トリグリセリド組成物が提供される。本発明のラード類似物は、ラードを用いるあらゆる用途において有用である。
【実施例】
【０５９６】
（Ｘ．実施例）
（実施例１：Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａを培養する方法）
細胞乾燥重量で高い割合の油を得るようにＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株を育てた。凍結保存した細胞を室温で解凍し、細胞５００μｌを、２％グルコースを含む培地４．５ｍｌ（４．２ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、３．１ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．２４ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２５ｇ／Ｌ  クエン酸一水和物、０．０２５ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２  ２Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌ  酵母抽出物）に入れ、６ウェルプレートで攪拌しつつ（２００ｒｐｍ）、２８℃で７日間成長させた。細胞乾燥重量は、あらかじめ秤量しておいたエッペンドルフ管中、培養物１ｍｌを１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって決定した。培養物の上澄みを棄て、得られた細胞ペレットを脱イオン水１ｍｌで洗浄した。培養物を再び遠心分離処理し、上澄みを棄て、細胞ペレットを凍結するまで−８０℃に置いた。次いで、サンプルを２４時間凍結乾燥し、細胞乾燥重量を算出した。培養物中の総脂質を決定するために、培養物３ｍｌを取り出し、Ａｎｋｏｍシステム（Ａｎｋｏｍ  Ｉｎｃ．、マセドン、ニューヨーク）を用い、製造業者のプロトコルに従って分析した。サンプルを、Ａｍｋｏｍ  ＸＴ１０抽出機を用い、製造業者のプロトコルに従って、溶媒抽出した。酸によって加水分解して乾燥させたサンプルと、溶媒抽出して乾燥させたサンプルとの質量差として、総脂質を決定した。細胞乾燥重量での油の割合を測定した値を表１０に示す。
【０５９７】
【表１０】
0005996527.tif 000023
【０５９８】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属由来の多数の株の微細藻類サンプルに対して遺伝子型解析を行った。藻のバイオマスからゲノムＤＮＡを以下のように単離した。液体培養物から、細胞（約２００ｍｇ）を１４，０００×ｇで５分間遠心分離処理した。次いで、細胞を滅菌蒸留水に再び懸濁させ、１４，０００×ｇで５分間遠心分離処理し、上澄みを棄てた。このバイオマスに、直径約２ｍｍの１個のガラスビーズを加え、この管を−８０℃で少なくとも１５分間置いた。サンプルを取り出し、研磨緩衝液（１％  Ｓａｒｋｏｓｙｌ、０．２５Ｍ  ショ糖、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、ＲＮａｓｅ  Ａ  ０．５ｕｇ／μｌ）１５０μｌを加えた。ペレットを短時間ボルテックスすることによって再び懸濁させた後、５Ｍ  ＮａＣｌ  ４０μｌを加えた。サンプルを簡単にボルテックスした後、５％  ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）６６μｌを加え、最後に短時間ボルテックスした。次いで、サンプルを６５℃で１０分間インキュベートした後、１４，０００×ｇで１０分間遠心分離処理した。新しい管に上澄みを移し、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール  １２：１２：１  ３００μｌで１回抽出し、次いで、１４，０００×ｇで５分間遠心分離処理した。０．７体積部のイソプロパノール（約１９０μｌ）を含む新たな管に、得られた水相を移し、ひっくり返すことによって混合し、室温で３０分間インキュベートするか、又は４℃で一晩インキュベートした。１４，０００×ｇで１０分間遠心分離処理することによってＤＮＡを回収した。次いで、得られたペレットを７０％エタノールで２回洗浄した後、１００％エタノールで最後に洗浄した。ペレットを室温で２０〜３０分風乾した後、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）５０μｌで再び懸濁させた。
【０５９９】
上述のように調製した藻の全ＤＮＡ５μｌを、これを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で１：５０に希釈した。最終容積が２０μｌのＰＣＲ反応を以下のように設定した。２×ｉＰｒｏｏｆ  ＨＦマスターミックス（バイオ・ラッド社）１０μｌを、０．４μｌのプライマーＳＺ０２６１３（１０ｍＭストック濃度の５’−ＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＴＧＡＧＣＣＧＧＣＧＡＣ−３’（配列番号９））に加えた。このプライマー配列は、Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ寄託番号Ｌ４３３５７の位置５６７〜５８８であり、高等植物及び藻のプラスチドゲノムにおいて高度に保存されている。次いで、これに０．４μｌのプライマーＳＺ０２６１５（１０ｍＭストック濃度の５’−ＣＡＧＴＧＡＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣＡＣＴＣ−３’（配列番号１０））を加えた。このプライマー配列は、Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ寄託番号Ｌ４３３５７の位置１１１２〜１０９３と相補性であり、高等植物及び藻のプラスチドゲノムにおいて高度に保存されている。次いで、希釈した全ＤＮＡ５μｌ及びｄＨ２Ｏ  ３．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応を以下のように行った。９８℃、４５秒；９８℃、８秒；５３℃、１２秒；７２℃、２０秒を３５サイクル繰り返した後、７２℃で１分、２５℃で保持。ＰＣＲ産物を精製するために、核反応物に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０  ２０μｌを加えた後、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール  １２：１２：１  ４０μｌで抽出し、ボルテックスし、１４，０００×ｇで５分間遠心分離処理した。ＰＣＲ反応物をＳ−４００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に入れ、３，０００×ｇで２分間遠心分離処理した。次いで、精製したＰＣＲ産物を、ＰＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯへとＴＯＰＯＧＲＡＰＨＹクローン化し、ＬＢ／Ｓｐｅｃプレートで陽性クローンを選択した。精製したプラスミドＤＮＡについて、Ｍ１３の順プライマー及び逆プライマーを用い、両方向で配列を決定した。２３Ｓ  ｒＲＮＡ  ＤＮＡの配列が決定された全部で１２種類のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株を選択し、これらの配列を、配列表に列挙している。株及び配列表の番号のまとめは、以下にある。ＵＴＥＸ  １４３５（配列番号１５）配列との全体的な違いについて、配列を分析した。最も違う配列として、２対があらわれた（ＵＴＥＸ  ３２９／ＵＴＥＸ  １５３３及びＵＴＥＸ  ３２９／ＵＴＥＸ  １４４０）。これら両者の場合で、ペアワイズアラインメントから、一対の配列同一性が７５．０％であった。ＵＴＥＸ  １４３５の配列同一性の割合も、以下に示す。
【化２】
0005996527.tif 000024
【０６００】
上に列挙した株の部分集合から得られた脂質サンプルについて、ＨＰＬＣを用いて脂質プロフィールを分析した。結果を以下の表１１に示す。
【０６０１】
【表１１】
0005996527.tif 000025
【０６０２】
溶媒抽出法により、又はエキスペラー圧搾機を用いてＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５から抽出された油のカロチノイド、クロロフィル、トコフェロール、その他のステロール、及びトコトリエノールを分析した。その結果を下の表１２にまとめる。
【０６０３】
【表１２】
0005996527.tif 000026
【０６０４】
４つの異なるロットのＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓから抽出された油を精製し、標準的な植物油処理法を用いて漂白した。簡潔には、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓから抽出された未精製油を水平デカンターで清澄化して、油から固体を分離した。次いで、清澄化された油をクエン酸と水の入ったタンクに移し、約２４時間、静置した。２４時間後、タンク内の混合物は２つの別々の層を形成していた。下の層は水とゴムからなり、次いでゴムをデカンテーションにより除去してから、脱ガム油を漂白タンクに移した。次いで、油をさらに１回分のクエン酸とともに加熱した。次いで、漂白タンクに漂白土を加え、混合物を真空下でさらに加熱して、存在する水をすべて蒸発させた。次いで、混合物をポンプで葉状濾過器に通して、漂白土を除去した。次いで、濾過した油を最後の５μｍの研磨フィルターに通した後、これを回収し、使用するまで保管した。次いで、精製及び漂白された（ＲＢ）油のカロチノイド、クロロフィル、ステロール、トコトリエノール及びトコフェロールを分析した。これらの分析結果を下の表１３にまとめる。「Ｎｄ」は検出されなかったことを表し、検出感度を以下に挙げる。
検出感度
カロチノイド（ｍｃｇ／ｇ）ｎｄ＝＜０．００３ｍｃｇ／ｇ
クロロフィル（ｍｃｇ／ｇ）ｎｄ＝＜０．０３ｍｃｇ／ｇ
ステロール（％）ｎｄ＝０．２５％
トコフェロール（ｍｃｇ／ｇ）；ｎｄ＝３ｍｃｇ／ｇ
【０６０５】
【表１３−１】
0005996527.tif 000027
【表１３−２】
0005996527.tif 000028
【表１３−３】
0005996527.tif 000029
【０６０６】
また、同じ４つのロットのＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ油の微量元素も分析し、その結果を下の表１４にまとめる。
【０６０７】
【表１４−１】
0005996527.tif 000030
【表１４−２】
0005996527.tif 000031
【０６０８】
（実施例２：微粒子銃によりＰｒｏｔｏｔｈｅｃａを形質転換する一般的な方法）
Ｓｅａｓｈｅｌｌ  Ｇｏｌｄ  Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｓ  ５５０ナノメートルを、製造業者のプロトコルに従って調製した。プラスミド（２０μｇ）を、結合緩衝液５０μｌ及びＳ５５０ｄ金担体６０μｌ（３０ｍｇ）と混合し、氷中、１分間インキュベートした。沈殿バッファー（１００μｌ）を加え、この混合物を氷中でさらに１分間インキュベートした。ボルテックスした後、ＤＮＡでコーティングされた粒子を、５４１５Ｃ微量遠心器で１０，０００ｒｐｍで１０秒間回転させることによって、ペレット状にした。この金ペレットを冷たい１００％エタノール５００μｌで洗浄し、微量遠心器で軽く攪拌することによってペレット状にし、氷冷したエタノール５０μｌで再び懸濁させた。軽く（１〜２秒）超音波処理した後、１０μｌのＤＮＡコーティングされた粒子を、すぐにキャリア膜に移した。
【０６０９】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ株を、グルコース２％を含むプロテオース培地（２ｇ／Ｌ  酵母抽出物、２．９４ｍＭ  ＮａＮＯ３、０．１７ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．３ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１．２８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．４３ｍＭ  ＮａＣｌ）中、旋回シェーカー上に置いて細胞密度が２×１０６細胞／ｍｌになるまで成長させた。この細胞を収穫し、滅菌蒸留水で１回洗浄し、培地５０μｌに再び懸濁させた。非選択的なプロテオース培地プレートの中央の１／３に１×１０７細胞を広げた。この細胞を、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で撃った。破裂ディスク（１３５０ｐｓｉ（約９，３００ｋＰｈａ））を用い、上述のプレートを、スクリーン／マクロキャリアの集合体から６ｃｍ下に置く。細胞を２５℃で１２〜２４時間回復させた。回復したら、ゴム製スパチュラで細胞をプレートから掻き取り、培地１００μｌと混合し、適切に選別した抗生物質を含むプレートに広げた。播種してから２５℃で７〜１０日経過後、形質転換された細胞を示すコロニーがプレート上に目視で確認された。コロニーを取り出し、２回目の選択のために選択的な（抗生物質又は炭素源）寒天プレートにスポットした。
【０６１０】
（実施例３：Ｃｈｌｏｒｅｌｌａの形質転換）
（ベクター構築）
ＣＭＶプロモーターと、ヒグロマイシン耐性ｃＤＮＡと、ＣＭＶ３’ＵＴＲとを含むＢａｍＨＩ−ＳａｃＩＩフラグメント（配列番号１５２、ｐＣＡＭＢＩＡ１３８０ベクターの部分配列、Ｃａｍｂｉａ、キャンベラ、オーストラリア）を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＢａｍＨＩ及びＳａｃＩＩ部位にクローン化したが、これを本明細書ではｐＨｙｇと呼ぶ。
【０６１１】
（微粒子銃によるＣｈｌｏｒｅｌｌａの形質転換）
Ｓｅａｓｈｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製のＳ５５０ｄ金担体を、製造業者のプロトコルに従って調製した。線状ｐＨｙｇプラスミド（２０μｇ）を、結合緩衝液５０μｌ及びＳ５５０ｄ金担体６０μｌ（３０ｍｇ）と混合し、氷中、１分間インキュベートした。沈殿緩衝液（１００μｌ）を加え、混合物を氷中でさらに１分間インキュベートした。ボルテックスした後、ＤＮＡでコーティングされた粒子を、エッペンドルフ５４１５Ｃ微量遠心器で１０，０００ｒｐｍで１０秒間回転させることにより、ペレット状にした。この金ペレットを冷たい１００％エタノール５００μｌで１回洗浄し、微量遠心器で短時間回転させてペレット状にし、氷冷したエタノール５０μｌで再び懸濁させた。短時間（１〜２秒）の超音波処理を行った後、１０μｌのＤＮＡコーティングされた粒子を、すぐにキャリア膜に移した。
【０６１２】
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ培養物（テキサス大学Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ２５０）を、プロテオース培地（２ｇ／Ｌ酵母抽出物、２．９４ｍＭ  ＮａＮＯ３、０．１７ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．３ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１．２８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．４３ｍＭ  ＮａＣｌ）中、７５μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１の連続光下、旋回シェーカー上で、細胞密度が２×１０６細胞／ｍｌになるまで成長させた。この細胞を回収し、滅菌蒸留水で１回洗浄し、培地５０μｌに再び懸濁させた。非選択的なプロテオース培地プレートの中央の１／３に１×１０７個の細胞を広げた。この細胞を、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙシステム（バイオ・ラッド社）で撃った。破裂ディスク（１１００ｐｓｉ及び１３５０ｐｓｉ）を使用し、プレートをスクリーン／マクロキャリアの集合体から９ｃｍ及び１２ｃｍ下に置いた。細胞を２５℃で１２〜２４時間回復させた。回復したら、ゴム製スパチュラで細胞をプレートから掻き取り、培地１００μｌと混合し、ヒグロマイシンを含むプレートに広げた（２００μｇ／ｍｌ）。２５℃で７〜１０日間インキュベートした後、形質転換された細胞を示すコロニーが、１１００ｐｓｉ及び１３５０ｐｓｉの破裂ディスクからプレート上にあるのが目視で確認され、距離は９ｃｍ及び１２ｃｍであった。コロニーを取り出し、２回目の選択のために選択的な寒天プレートにスポットした。
【０６１３】
（エレクトロポレーションによるＣｈｌｏｒｅｌｌａの形質転換）
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ培養物を、プロテオース培地中、７５μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１の連続光下、旋回シェーカー上で、細胞密度が２×１０６細胞／ｍｌになるまで成長させた。細胞を回収し、滅菌蒸留水で１回洗浄し、４×１０８細胞／ｍｌの密度になるように、５０ｍＭのショ糖を含有するｔｒｉｓ−リン酸緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０；１ｍＭリン酸カリウム）に再び懸濁させた。約２５０μｌの細胞懸濁物（１×１０８個の細胞）を、４ｍｍギャップの使い捨てエレクトロポレーションキュベットに入れた。この細胞懸濁物に、線状ｐＨｙｇプラスミドＤＮＡ５μｇ及び担体ＤＮＡ（剪断サケ精子ＤＮＡ）２００μｇを加えた。次いで、エレクトロポレーションキュベットを水浴中、１６℃で１０分間インキュベートした。次いで、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）エレクトロポレーション装置を用いて、キュベットに２５μＦのキャパシタンスで電気パルス（１１００Ｖ／ｃｍ）をかけた（エレクトロポレーション分路抵抗器は使用しなかった）。次いで、キュベットを室温で５分間インキュベートした後、細胞懸濁物を５０ｍｌのプロテオース培地に移し、施回シェーカー上で２日間、振とうさせた。回復後、低速の遠心分離により細胞を回収し、プロテオース培地に再び懸濁させ、ヒグロマイシン２００μｇ／ｍｌを添加したプレートに低密度で播種した。プレートを７５μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１の連続光下でインキュベートした。１〜２週間で形質転換体がコロニーとして現れた。コロニーを取り出し、２回目の選択のために選択的な寒天プレートにスポットした。
【０６１４】
（遺伝子型同定）
２回目の選択を生き延びたコロニーの一部を小量で培養し、回収した。約５〜１０μＬの容積のペレットを、ボルテックスして１０ｍＭのＮａＥＤＴＡ５０μＬに再び懸濁させてから、１００℃で１０インキュベートした。次いで、チューブを軽くボルテックスし、１０秒間の超音波処理を行った後、１２，０００×ｇで１分間遠心分離した。上澄み２μＬを５０μＬのＰＣＲ反応で鋳型として使用した。遺伝子型同定に使用したプライマーは、配列番号１５３及び配列番号１５４であった。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃で５分間×１サイクル；９５℃で３０秒間−５８℃で３０秒間−７２℃で１分間３０秒×３５サイクル；７２℃で１０分間×１サイクル。予想された９９２ｂｐフラグメントは、微粒子銃コロニー及び単一のエレクトロポレーションコロニー由来の１０コロニーのうち６コロニーで見られた。大きさの小さい、非特異的なバンドがすべてのレーンで見られた。増幅された９９２ｂｐフラグメントの同一性を確認するために、微粒子銃のバンド２つとエレクトロポレーションのバンドをゲルから切り出し、それぞれを配列決定した。３つのバンドすべての配列が、予想された９９２ｂｐフラグメントと一致していた。（ＤＮＡラダー：Ｂｉｏｎｅｘｕｓ（登録商標）Ａｌｌ  Ｐｕｒｐｏｓｅ  Ｈｉ−ＬｏＲ  ＤＮＡラダー、カタログ番号ＢＮ２０５０）。
【０６１５】
（実施例４：藻類から誘導されるプロモーター及び微細藻類で使用するための遺伝子）
（Ａ．Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓに由来する５’ＵＴＲ及びプロモーターの配列）
混合栄養的に成長するＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ（ＵＴＥＸ  ２５０）から、標準的な技術を用いてｃＤＮＡライブラリーを作成した。ｃＤＮＡ配列に基づいて、Ｓｅｅｇｅｎｅ’ｓ  ＤＮＡ  Ｗａｌｋｉｎｇキット（ロックビル、ＭＤ）を用い、コード領域の上流を「ウォーキングする」ために、特定の既知のハウスキーピング遺伝子においてプライマーを設計した。単離された配列は、アクチン（配列番号１５５）と、伸長因子−１ａ（ＥＦ１ａ）（配列番号１５６）プロモーター／ＵＴＲとを含み、これらは、両方とも、イントロン（小文字で示されているもの）と、エクソン（大文字のイタリックで示されている）と、予測開始部位（太字）と、２個のβ−チューブリンプロモーター／ＵＴＲエレメント：アイソフォームＡ（配列番号１５７）及びアイソフォームＢ（配列番号１５８）とを含む。
【０６１６】
（Ｂ．Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓに由来する、脂質の生合成酵素及びプラスチド標的配列）
上述のｃＤＮＡライブラリーから、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ（ＵＴＥＸ  ２５０）において、脂質代謝に機能するタンパク質をコードする３種類のｃＤＮＡを、上述の方法と同じ方法を用いてクローン化した。アシルＡＣＰデサチュラーゼ（配列番号１５９及び１６０）及び２種類のゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼ（配列番号１６１〜１６４）のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、以下の配列表に含まれている。さらに、プラスチドを標的とする推定シグナル配列を有する３種類のｃＤＮＡもクローン化した。グリセルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素（配列番号１６５及び１６６）、酸素発生複合体タンパク質ＯＥＥ３３（配列番号１６７及び１６８）、Ｃｌｐプロテアーゼ（配列番号１６９及び１７０）のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、以下の配列表に含まれている。ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列において、推定プラスチド標的配列には、下線を引いている。トランス遺伝子の産物が、細菌のプラスチド、例えば、脂質改変酵素を標的とするように仕向けるために、プラスチド標的配列を用いることができる。
【０６１７】
（実施例５：外来のショ糖インベルターゼを発現させるためのＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓの遺伝子操作）
（株及び培地）：テキサス大学のＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａ（オースチン、テキサス、米国）からＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ（ＵＴＥＸ  ２５０）を入手した。保存培養株を改変プロテオース培地で維持した。改変プロテオース培地は、１リットルあたり（ｇ／Ｌ）、ＮａＮＯ３０．２５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４０．０９ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０．１７５ｇ０．０２５ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ０．０２５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．０７５及び酵母抽出物２ｇからなる。
【０６１８】
（プラスミド構築）：分泌型のインベルターゼをＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓで発現させるために、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＵＣ２遺伝子を３つの異なるプロモーター：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣＭＶ）、クロレラウイルスプロモーター（ＮＣ−１Ａ）及びクロレラＨＵＰ１プロモーターの制御下に置いた。Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓに対して最適化されたコドンの使用を調節するために酵母ＳＵＣ２遺伝子を合成したが、これは、インベルターゼの細胞外分泌を指令するのに必要なシグナル配列を含む。各構築物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋中で構築し、特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅により、ＥｃｏＲＩ／ＡｓｃＩ、ＡｓｃＩ／ＸｈｏＩ及びＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ部位をそれぞれ、各プロモーター、インベルターゼ遺伝子及びＣＭＶ  ３’ＵＴＲに導入した。精製したＰＣＲ産物を順次、クローン化した。
【０６１９】
（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓの形質転換）：Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ培養物を、改変プロテオース培地中、７５μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１の連続光下、旋回シェーカー上で、細胞密度が６×１０６細胞／ｍｌになるまで成長させた。
【０６２０】
微粒子銃による形質転換では、Ｓｅａｓｈｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製のＳ５５０ｄ金担体を、製造業者のプロトコルに従って調製した。簡潔に述べれば、ＢｓａＩによる線状構築物（２０μｇ）を、５０μｌの結合バッファー及び６０μｌ（３ｍｇ）のＳ５５０ｄ金担体と混合し、氷中、１分間インキュベートした。沈殿緩衝液（１００μｌ）を加え、混合物を氷中でさらに１分間インキュベートした。軽くボルテックスした後、ＤＮＡでコーティングされた粒子を、エッペンドルフ微量遠心器で１０分間、１０，０００ｒｐｍで回転させることにより、ペレット状にした。この金ペレットを冷たい１００％エタノール５００μｌで１回洗浄し、微量遠心器で短時間回転させることによりペレット状にし、氷冷したエタノール５０μｌで再び懸濁させた。短時間（１〜２秒）の超音波処理を行った後、１０μｌのＤＮＡコーティングされた粒子を、すぐにキャリア膜に移した。細胞を回収し、滅菌蒸留水で１回洗浄し、５０μｌの培地に再び懸濁させ（１×１０７個の細胞）、非選択的なプロテオースプレートの中央の１／３に細胞を広げた。この細胞を、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙシステム（バイオ・ラッド社）で撃った。破裂ディスク（１１００ｐｓｉ及び１３５０ｐｓｉ）を使用し、プレートをスクリーン／マクロキャリアの集合体から９ｃｍ〜１２ｃｍ下に置いた。細胞を２５℃で１２〜２４時間回復させた。回復したら、ゴム製スパチュラで細胞をプレートから掻き取り、培地１００μｌと混合し、ショ糖１％を含む改変プロテオースプレートに広げた。暗所で７〜１０日間、２５℃でインキュベートした後、形質転換された細胞を示すコロニーが、プレート上に目視で確認された。
【０６２１】
エレクトロポレーションによる形質転換では、細胞を回収し、滅菌蒸留水で１回洗浄し、４×１０８細胞／ｍｌの密度になるように、５０ｍＭのショ糖を含有するＴｒｉｓ−リン酸リン酸緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０；１ｍＭリン酸カリウム）に再び懸濁させた。約２５０μｌの細胞懸濁液（１×１０８個の細胞）を、４ｍｍギャップの使い捨てエレクトロポレーションキュベットに入れた。この細胞懸濁液に、線状ｐＨｙｇプラスミドＤＮＡ５μｇ及び担体ＤＮＡ（剪断サケ精子ＤＮＡ）２００μｇを加えた。次いで、エレクトロポレーションキュベットを氷水浴中、１６℃で１０分間、インキュベートした。次いで、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社、カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡハーキュリーズ）エレクトロポレーション装置を用いて、キュベットに２５μＦのキャパシタンスで電気パルス（１１００Ｖ／ｃｍ）をかけた（エレクトロポレーション分路抵抗器は使用しなかった）。次いで、キュベットを室温で５分間インキュベートした後、細胞懸濁液を５０ｍｌの改変プロテオース培地に移し、施回シェーカー上で２日間、振とうさせた。回復後、低速（４０００ｒｐｍ）で細胞を回収し、改変プロテオース培地に再び懸濁させ、ショ糖１％を含む改変プロテオースプレートに低密度で播種した。暗所で７〜１０日間、２５℃でインキュベートした後、形質転換された細胞を示すコロニーが、プレート上に目視で確認された。
【０６２２】
（形質転換体のスクリーニング及び遺伝子型同定）：暗所で成長させたショ糖１％を含む改変プロテオースプレートからコロニーを取り出し、ほぼ同じ量の細胞を、ショ糖１％を含む改変プロテオース液体培地１ｍｌを含む２４ウェルプレートに移した。培養物を暗所に置き、Ｌａｂｎｅｔ（英国、バークシャー）製のオービタルシェーカーで５日間、４３０ｒｐｍで攪拌した。
【０６２３】
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ形質転換体に導入されたインベルターゼ遺伝子の存在を確認するために、各形質転換体のＤＮＡを単離し、遺伝子特異的プライマーのセット（ＣＭＶ構築物：順プライマー（ＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＴＴＣＡＡＡＧＣＡＡ）（配列番号１５３）／逆プライマー（ＴＣＣＧＧＴＧＴＧＴＴＧＴＡＡＧＴＣＣＡ）（配列番号１７１）、ＣＶ構築物：順プライマー（ＴＴＧＴＣＧＧＡＡＴＧＴＣＡＴＡＴＣＡＡ）（配列番号１７２）／逆プライマー（ＴＣＣＧＧＴＧＴＧＴＴＧＴＡＡＧＴＣＣＡ）（配列番号１７１）及びＨＵＰ１構築物：順プライマー（ＡＡＣＧＣＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＣＴＧＣＡ）（配列番号１７３）／逆プライマー（ＴＣＣＧＧＴＧＴＧＴＴＧＴＡＡＧＴＣＣＡ）（配列番号１７１））を用いて増幅した。迅速なＤＮＡ単離のために、ある量の細胞（約５〜１０μＬの大きさ）を１０ｍＭのＮａ−ＥＤＴＡ５０μＬに再び懸濁させた。細胞懸濁液を１００℃で１０分間インキュベートし、１０秒間の超音波処理を行った。１２０００ｇで１分間遠心分離した後、上澄み３μＬをＰＣＲ反応に用いた。ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ９６００）でＰＣＲ増幅を行った。製造業者の指示に従って、反応混合物（５０μＬ）は、３μＬの抽出ＤＮＡ、それぞれ１００ｐｍｏｌの上記各プライマー、２００ｕＭのｄＮＴＰ、０．５単位のＴａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（ＮＥＢ）、及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液を含んでいた。ＤＮＡの変性を、最初のサイクルでは、９５℃で５分間、次いで３０秒間行った。プライマーのアニーリング及び伸長反応を、それぞれ５８℃で３０秒間、７２℃で１分間行った。次いで、臭化エチジウムで染色した１％アガロース上でＰＣＲ産物を可視化した。
【０６２４】
（液体培養での増殖）：暗所で５日間成長させた後、遺伝子型が陽性の形質転換体は、暗所において、最小限の液体プロテオース培地＋１％ショ糖で成長を示したのに対し、野性型細胞は、暗所において、同じ培地で成長しなかった。
【０６２５】
（実施例６：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の分泌型インベルターゼによる藻類株の形質転換）
（分泌型インベルターゼ）：分泌型ショ糖インベルターゼをコードする遺伝子（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＧｅｎ  Ｂａｎｋ寄託番号ＮＰ＿０１２１０４）を１５９９ｂｐのＡｓｃ  Ｉ−Ｘｈｏフラグメントとしてｄｅ−ｎｏｖｏ合成し、次いで、ＥｃｏＲＩ／ＡｓｃＩ及びＸｈｏ／ＳａｃＩカセットとして、それぞれカリフラワーモザイクウイルス３５ｓプロモーター及び３’ＵＴＲを有するｐＵＣ１９誘導体中にこれをサブクローン化した。
【０６２６】
（藻類細胞の成長）：これらの実験で使用した培地は、液体基本培地（２ｇ／Ｌの酵母抽出物、２．９４ｍＭのＮａＮＯ３、０．１７ｍＭのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．３ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１．２８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．４３ｍＭのＮａＣｌ）、及びショ糖又はグルコース（指定された）の形態の固定炭素を１％の最終濃度で含有する固体基本培地（＋１．５％アガロース）であった。この実験で使用した株は、暗所において、追加の固定炭素源の非存在下で、基本培地では成長しなかった。複数の種をプレートに播き、暗所で２８℃で成長させた。単一のコロニーを採取して、グルコース１％を含有する５００ｍＬの液体基本培地の播種に使用し、細胞数を毎日測定しながら、暗所で対数中期まで成長させた。以下に挙げる株はそれぞれ、暗所においてショ糖を唯一の炭素源として成長するかどうかを既に試験して、成長しなかった株であり、したがって、分泌型インベルターゼによる形質転換用に選択された：（１）Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ（ＵＴＥＸ３１）；（２）Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ（ＵＴＥＸ２３４１）；及び（３）Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ（ＣＣＡＰ２１１／１５）。
【０６２７】
（粒子撃ち込みによる藻類細胞の形質転換）：約１〜５×１０８個の細胞総数を得るのに十分な培養物を遠心分離した。得られたペレットを、固定炭素源を加えていない基本培地で洗浄した。細胞を再び遠心分離し、５×１０７〜２×１０８細胞／ｍｌを得るのに十分な量の基本培地で再び懸濁させた。次いで、２５０〜ｌ０００μｌの細胞を、１％ショ糖を添加した固体基本培地に播き、滅菌フード内で、プレート上で乾燥させた。プラスミドＤＮＡを、製造業者（Ｓｅａｓｈｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カリフォルニア州ラホヤ）の推奨に従って金粒子上に沈殿させた。バイオ・ラッド社のＰＤＳ  Ｈｅ−１０００粒子送達システムを用いて、破裂ディスクホルダから９ｃｍのところにマイクロキャリアアセンブリを設置した１３５０ｐｓｉの破裂ディスクにより形質転換を行った。形質転換後、プレートを暗所で２８℃でインキュベートした。すべての株から複数の形質転換体コロニーが生じた。インベルターゼ挿入物を用いずに形質転換した以外は同じ方法で調製した形質転換の対照プレートは、コロニーを含んでいなかった。
【０６２８】
（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ形質転換体の分析）：Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ野性型細胞及び形質転換体コロニーから、ゲノムＤＮＡを以下のように抽出した：細胞を抽出緩衝液（８７．５ｍＭのＴｒｉｓ  Ｃｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、０．２５％ＳＤＳ）１００μｌに再び懸濁させ、ときどき反転させて混ぜながら、６０℃で３０分間インキュベートした。ＰＣＲ用に、試料を２０ｍＭのＴｒｉｓ  Ｃｌ、ｐＨ８．０で１：１００に希釈した。
【０６２９】
ＷＴ、形質転換体及びプラスミドＤＮＡから抽出したゲノムＤＮＡに関して遺伝子型同定を行った。マーカー遺伝子に関して試料の遺伝子同定を行った。この遺伝子型同定ＰＣＲには、プライマー２３８３（５’ＣＴＧＡＣＣＣＧＡＣＣＴＡＴＧＧＧＡＧＣＧＣＴＣＴＴＧＧＣ  ３’）（配列番号１７４）及び２２７９（５’ＣＴＴＧＡＣＴＴＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＧＡＡＴＴＴＧＴＣＧ  ３’）（配列番号１７５）を用いた。使用したＰＣＲプロフィールは以下の通りであった：９４℃での変性を５分間；９４℃−３０秒、６０℃−３０秒、７２℃−３分を３５サイクル；７２℃−５分。陽性対照（プラスミド）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ（ＵＴＥＸ  ３１）の２つの形質転換体から、大きさの同じバンドを増幅した。
【０６３０】
（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉの形質転換体の分析）：Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ＷＴ及び形質転換体から、ゲノムＤＮＡを以下のように抽出した：細胞を、１００μｌの抽出緩衝液（８７．５ｍＭのＴｒｉｓ  Ｃｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、０．２５％ＳＤＳ）に再び懸濁させ、ときどき反転させて混ぜながら、６０℃で３０分間インキュベートした。ＰＣＲ用に、試料を２０ｍＭのＴｒｉｓ  Ｃｌ、ｐＨ８．０で１：１００に希釈した。ＷＴ、形質転換体及びプラスミドＤＮＡから抽出したゲノムＤＮＡに関して遺伝子型同定を行った。マーカー遺伝子に関して試料の遺伝子同定を行った。プライマー２３３６（５’ＧＴＧＧＣＣＡＴＡＴＧＧＡＣＴＴＡＣＡＡ  ３’）（配列番号１７６）及び２２７９（５’ＣＴＴＧＡＣＴＴＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＧＡＡＴＴＴＧＴＣＧ  ３’）（配列番号１７５）は、設計されたプライマーセット２（１２１５ｂｐの予想される産物）であったのに対し、プライマー２４６５（５’ＣＡＡＧＧＧＣＴＧＧＡＴＧＡＡＴＧＡＣＣＣＣＡＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴＡＣＧＡＣＧ  ３’）（配列番号１７７）及び２４７０（５’ＣＡＣＣＣＧＴＣＧＴＣＡＴＧＴＴＣＡＣＧＧＡＧＣＣＣＡＧＴＧＣＧ  ３’）（配列番号１７８）は、設計されたプライマーセット４（１４４２ｂｐの予想される産物）であった。使用したＰＣＲプロフィールは以下の通りであった：９４℃での変性を２分間；９４℃−３０秒、６０℃−３０秒、７２℃−１分３０秒を２９サイクル；７２℃−５分。分泌型インベルターゼを含むプラスミド対照をＰＣＲ対照として用いた。
【０６３１】
インベルターゼ構築物の配列は配列番号８に対応する。
【０６３２】
（実施例７：Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種における相同組み換え）
【０６３３】
トランス遺伝子の相同組み換えは、いくつかの利点を有する。第１に、相同組み換えではないトランス遺伝子の導入は、細胞に導入されるプラスミドの複製数が制御されないので、予測不可能となり得る。また、相同組み換えではないトランス遺伝子の導入は、プラスミドがエピソームを保有し得、次の細胞分裂のときに失われるので、不安定となり得る。相同組み換えの別の利点は、遺伝子標的を「ノックアウト」し、エピトープタグを導入し、内在する遺伝子のプロモーターを切り替え、遺伝子標的をそれ以外の方法で変える（例えば、点変異の導入）ことができることである。
【０６３４】
ＫＥ８５８と呼ばれるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）ゲノムの特定領域を用い、２種類のベクターを構築した。ＫＥ８５８は、１．３ｋｂのゲノムフラグメントであり、タンパク質のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）ファミリーに対する相同性を共有するタンパク質のコード領域の一部を包含している。サザンブロットは、ＫＥ８５８配列が、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）ゲノムの単一コピーに存在することを示した。構築され、ＳＺ７２５（配列番号１７９）と呼ばれる第１の種類のベクターは、最適化された酵母インベルターゼ（ｓｕｃ２）遺伝子も含んでいるｐＵＣ１９ベクター骨格にクローン化された全１．３ｋｂのＫＥ８５８フラグメントで構成されていた。ＫＥ８５８フラグメントは、標的構築物の他の場所のどこにも生じない固有のＳｎａＢ１部位を含んでいる。構築され、ＳＺ７２６（配列番号１８０）と呼ばれる第２の種類のベクターは、ＫＥ８５８ゲノム配列のＳｎａＢ１部位に酵母インベルターゼ遺伝子（ｓｕｃ２）を挿入することによって破壊されたＫＥ８５８配列で構成されていた。酵母インベルターゼ遺伝子に隣接するＫＥ８５８配列を含む完全なＤＮＡフラグメントは、ベクター骨格からＥｃｏＲＩで消化することによって切り出され、ＫＥ８５８領域のどちらかの末端で切断されている。
【０６３５】
両方のベクターを用い、酵母インベルターゼ遺伝子（ｓｕｃ２）を、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）ゲノムの対応するＫＥ８５８領域に直接的に相同組み換えした。相同組み換えで標的とされるゲノム領域と相同性の直鎖ＤＮＡを、ベクター構築物ＳＺ７２５をＳｎａＢ１で消化し、ベクター構築物ＳＺ７２６をＥｃｏＲＩで消化することによって露出させた。次いで、消化されたベクター構築物を、上の実施例３に記載の方法を用い、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ培養物に導入した。次いで、それぞれのベクター構築物から得た形質転換体を、ショ糖プレートを用いて選択した。それぞれのベクターの形質転換から得た、１０種類の独立した、クローン的に純粋な形質転換体を、酵母インベルターゼ遺伝子が望ましいゲノム位置でうまく組み換えられているか（サザンブロットを用いる）、トランス遺伝子の安定性について分析した。
【０６３６】
ＳＺ７２５形質転換体のサザンブロット分析は、分析用に取り出した１０種類の形質転換耐のうち、４種類が、予想通りの組み換えバンドを含んでおり、このことは、ベクター上にあるＫＥ８５８配列と、ゲノム内にあるＫＥ８５８配列とで１箇所の交叉が起こったことを示している。対称的に、ＳＺ７２６形質転換体の１０種類全てが、予想通りの組み換えバンドを含んでおり、このことは、酵母インベルターゼトランス遺伝子に隣接するＫＥ８５８配列を有するｐＳＺ７２６のＥｃｏＲＩフラグメントと、ゲノムの対応するＫＥ８５８領域とで２箇所の交叉が起こったことを示している。
【０６３７】
選択せずに、１５世代にわたって形質転換体を成長させることによって、ショ糖インベルターゼ発現及びトランス遺伝子の安定性を評価した。サザンブロットによってトランス遺伝子が陽性の４種類のＳＺ７２５形質転換体及び１０種類のＳＺ２７６形質転換体を選択し、それぞれの形質転換体から、４８個の単一コロニーを、まずはグルコースを含有する培地で選択せずに成長させ、次いで、唯一の炭素源としてショ糖を含有する培地で選択しつつ成長させた。１０種類全てのＳＺ２７６形質転換体（１００％）が、１５世代後もショ糖を用いて成長する能力を保持しており、一方、ＳＺ７２５形質転換体の約９７％が、１５世代後も、ショ糖を用いて成長する能力を保持していた。２箇所の交叉が起こる（ＳＺ７２６ベクター）ことによって導入されたトランス遺伝子は、世代を超えて倍加していく間もきわめて高い安定性を有している。対称的に、１箇所の交叉が起こる（ＳＺ７２５ベクター）ことによって導入されたトランス遺伝子は、トランス遺伝子がタンデムに複写されて導入され、トランス遺伝子に隣接する繰り返し相同領域が組み換えられ、その間に位置するトランスジェニックＤＮＡを切断してしまうため、世代を超えて倍加していく間に、ある程度不安定になり得る。
【０６３８】
これらの実験は、相同組み換えをうまく使用して、異種ショ糖インベルターゼ遺伝子が有機体の核染色体に安定に組み込まれたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ形質転換体を作成することを示している。相同組み換えが成功すると、遺伝子の欠失、点変異、望ましい遺伝子産物のエピトープタグ化のようなＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ内の他のゲノム改変も可能になる。また、これらの実験は、真核性微細藻類の核ゲノムにおける相同組み換えを最初に実証した系であることも示している。
【０６３９】
（Ａ．内在するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ遺伝子をノックアウトするための、相同組み換えの使用）
上記の実施例４に記載さているようなＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ｃＤＮＡ／ゲノムのスクリーニングでは、内在するステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＰＤ）ｃＤＮＡが同定された。ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ酵素は、脂質合成経路の一部であり、脂肪酸アシル鎖に二重結合を導入する機能がある。ある場合では、脂肪酸プロフィールを変えるために、脂質経路酵素の発現をノックアウトするか、又は減らすことが有益な場合がある。内在するステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ酵素の発現を減らす（又はノックアウトする）ことができるかどうか、そして、不飽和脂肪酸の対応する減少が、宿主細胞の脂質プロフィールでみられるかどうかを評価するために、相同組み換え構築物を作成した。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）に由来するステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子の約１．５ｋｂのコード配列を同定し、クローン化した（配列番号１８１）。０．５ｋｂのＳＡＰＤコード配列を５’末端（５’標的部位）で用い、次いでＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ３’ＵＴＲを有するＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  コドンが最適化された酵母ショ糖インベルターゼｓｕｃ２遺伝子を駆動するβ−チューブリンプロモーターを用いて相同組み換え構築物を構築した。次いで、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＳＡＰＤコード配列の残り（約１ｋｂ）を、Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ  ３’ＵＴＲの後に挿入し、３’標的部位を作った。この相同組み換えカセットの配列は、配列番号１８２に記載されている。上に示されるように、微細藻類を形質転換する前にカセットを線状にし、露出されている末端を残すことによって、相同組み換えカセットを核ゲノムに組み込むのがうまくいく率が増す。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓに内在するＳＡＰＤ酵素を標的とする相同組み換えカセットを線状にし、次いで、宿主細胞（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、ＵＴＥＸ  １４３５）内で形質転換した。うまく組み込むと、二箇所の相互組み換えが起こることによって、宿主ゲノムから、内在するＳＡＰＤ酵素のコード領域が失われ、一方、新しく挿入されたｓｕｃ２遺伝子の発現は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターによって制御されるであろう。唯一の炭素源としてショ糖を含むプレート／培地を用い、得られたクローンをスクリーニングすることができる。相同組み換えカセットがうまく組み込まれたクローンは、唯一の炭素源としてショ糖を用いて成長する能力を有しており、脂質プロフィールにおける脂肪酸の最終的な飽和度が変わることは、二次的な確認因子として役立つであろう。さらに、酵母ショ糖インベルターゼｓｕｃ２遺伝子に特異的なプローブを用いたサザンブロットアッセイ、及びＲＴ−ＰＣＲによって、陽性クローンにおけるインベルターゼ遺伝子の存在及び発現を確認することができる。代替法として、β−チューブリンプロモーターを含まない同じ構築物を用い、内在するＳＡＰＤ酵素コード領域を切断することができる。この場合、新しく挿入された酵母ショ糖インベルターゼｓｕｃ２遺伝子は、内在するＳＡＰＤプロモーター／５’ＵＴＲによって制御されるであろう。
【０６４０】
（実施例８：Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａにおける様々なチオエステラーゼの発現）
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種における異種チオエステラーゼ遺伝子発現の方法及び効果は、参照により本明細書に組み込まれる、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／６６１４２号に既に記載されている。高等植物種由来の他のチオエステラーゼ遺伝子／遺伝子産物の効果をさらに調べた。これらのチオエステラーゼには、以下の高等植物のチオエステラーゼが含まれる。
【化３】
0005996527.tif 000032
【０６４１】
すべての場合において、上記の各チオエステラーゼ構築物を、微粒子銃による粒子撃ち込みを用いてＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ１４３５）内で形質転換した。国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／６６１４２号に開示されている相同組み換えを含めた、他の形質転換法も目的遺伝子の異種発現に適していると思われる。上記の各チオエステラーゼ構築物によるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ１４３５）の形質転換を、実施例２に記載されている方法を用いて行った。各構築物はＮｅｏＲ遺伝子を含み、１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を用いて陽性クローンの選択を行った。すべてのコード領域のコドンを最適化して、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ１４３５（表２を参照）核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映した。構築物に使用したアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列は共に、配列表に記載されている。高等植物チオエステラーゼそれぞれのトランジットペプチドを、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号４８）又はＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイルＡＣＰ  デサチュラーゼ（配列番号４９）由来の、コドンが最適化された藻類トランジットペプチドに置き換えた。すべてのチオエステラーゼ構築物は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍａｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのβ−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲにより駆動された。選択された陽性クローンの成長及び脂質産生を、野生型（形質転換していない）Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ１４３５）と比較した。野性型及び選択された陽性クローンを、２％グルコースＧ４１８プレートで成長させた。選択された陽性クローンの各構築物に関する脂質プロフィール分析を、下の表１５にまとめる（面積％として表す）。
【０６４２】
【表１５】
0005996527.tif 000033
【０６４３】
この結果は、発現されたすべてのチオエステラーゼが脂肪酸プロフィールにある程度の影響を及ぼすということを示している。「総飽和脂物」の行を見ると、Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒａ、及び特にＵ．ａｍｅｒｉｃａｎａ由来のものを含めたいくつかのチオエステラーゼの発現により、飽和度が大きな影響を受けている。総飽和物の百分率の変化は、高等植物由来のチオエステラーゼの異種発現が、脂質鎖長に明らかに影響を及ぼし得るだけでなく、微細藻類により得られるその他の脂質プロフィール特性、すなわち脂肪酸の飽和度にも影響を及ぼし得るという点で意外なことであった。
【０６４４】
Ｃ．ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  Ｃ８チオエステラーゼ、Ｃ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａチオエステラーゼ、Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ及びＣ．ｃａｍｐｈｏｒａチオエステラーゼで形質転換したクローンで選択されたものを、様々な量のＧ４１８（２５ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌ）及び様々な温度（２２℃〜２５℃）でさらに成長させ、これらのクローンの脂質プロフィールを決定した。各チオエステラーゼを含む代表的なクローンの脂質プロフィール（面積％）を表１６にまとめる。Ｕ．ａｍｅｒｉｃａｎａチオエステラーゼを含む第２の構築物を構築し、上記の微粒子銃による方法を用いて、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ１４３５）内で形質転換した。この第２の構築物を相同組み換えにより細胞内に導入した。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種における相同組み換えの方法は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／６６１４２号に既に記載されている。使用した相同ＤＮＡは、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ１４３５の６Ｓ領域のゲノムＤＮＡ配列に由来するものであった。選択因子は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのβ−チューブリンプロモーターにより駆動される、コドンが最適化されたＳ．  ｃｅｒｅｖｅｉｓｉａｅ由来のｓｕｃ２遺伝子を利用して、ショ糖で成長する能力であった。天然のＵ．ａｍｅｒｉｃａｎａトランジットペプチドをＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ（ＵＴＥＸ  ２５０）ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドに置き換えた。この構築物のｃＤＮＡは、配列番号５０として配列表に記載されている。２％ショ糖プレートで陽性クローンの選択を行い、また脂質プロフィール決定のために得られた培養物も、ショ糖２％を含有する培地で成長させた。相同組み換えした異種Ｕ．ａｍｅｒｉｃａｎａチオエステラーゼを含むこのＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株の代表的な脂質プロフィールを表１６にまとめる。
【０６４５】
【表１６】
0005996527.tif 000034
【０６４６】
上記クローンと同様に、異種チオエステラーゼ遺伝子を含むすべての形質転換体は、野性型（形質転換していない）Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓと比べて、ある程度の影響を受けた脂肪酸プロフィールを示し、また飽和脂肪酸の総百分率も変化していた。相同組み換えにより導入されたＵ．ａｍｅｒｉｃａｎａチオエステラーゼを含むＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓは、総飽和物の増加が最も大きかった。
【０６４７】
さらに、外来のＣ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ、Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒａ、Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ又はＵ．ａｍｅｒｉｃａｎａチオエステラーゼを含むトランスジェニッククローンを新規な脂質プロフィールに関して評価した。２２℃、２％グルコース、２５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８で成長させた、Ｃ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａチオエステラーゼを含むクローンでは、以下のような脂質プロフィールが得られた：５．１０％のＣ８：０；１８．２８％のＣ１０：０；０．４１％のＣ１２：０；１．７６％のＣ１４：０；１６．３１％のＣ１６：０；１．４０％のＣ１８：０；４０．４９％のＣ１８：１；及び１３．１６％のＣ１８：２。２５℃、２％ショ糖で成長させた、Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒａチオエステラーゼを含むクローン（外来のショ糖インベルターゼも含む）では、以下のような脂質プロフィールが得られた：０．０４％のＣ１０：０；６．０１％のＣ１２：０；３５．９８％のＣ１４：０；１９．４２のＣ１６：０；１．４８％のＣ１８：０；２５．４４％のＣ１８：１；及び９．３４％のＣ１８：２。２２℃、２％グルコース、２５〜１００ｍｇ／ｍｌのＧ４１８で成長させた、Ｕ．ｃａｌｆｏｒｎｉｃａチオエステラーゼを含むクローンでは、以下のような脂質プロフィールが得られた：０％のＣ８：０；０．１１％のＣ１０：０；３４．０１％のＣ１２：０；５．７５％のＣ１４：０；１４．０２％のＣ１６：０；１．１０％のＣ１８：０；２８．９３％のＣ１８：１；及び１３．０１％のＣ１８：２。２８℃、２％グルコースで成長させた、Ｕ．ａｍｅｒｉｃａｎａチオエステラーゼを含むクローンでは、以下のような脂質プロフィールが得られた：１．５４％のＣ１０：０；０．４３％のＣ１２：０；７．５６％のＣ１４：０；３９．４５％のＣ１６：０；２．４９％のＣ１８：０；３８．４９％のＣ１８：１；及び７．８８％のＣ１８：２。
【０６４８】
（実施例９：多数の外来異種チオエステラーゼ遺伝子によるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａの形質転換）
微細藻類株Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ１４３５）を、先に開示した方法を用いて形質転換し、単一クローン内で多数のチオエステラーゼを発現させた。単一クローン内で多数のチオエステラーゼが発現することにより、微細藻類は、任意の単一チオエステラーゼが単独で発現されたときに産生されるもの（上記の実施例で提示）とは全く異なる脂肪酸プロフィールの油を産生することが可能となる。最初に、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）を、相同組み換えを用いて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ショ糖で成長する能力により選択）由来のショ糖インベルターゼ遺伝子であるｓｕｃ２とともにＣｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒａチオエステラーゼ（Ｃ１４選択性のチオエステラーゼ）で形質転換する。この相同組み換え構築物に使用したＤＮＡは、先の第３節に記載されているように、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓゲノムＤＮＡのＫＥ８５８領域に由来するものである。この構築物の関連する部分は、配列番号５１として配列表に記載されている。ショ糖含有プレートで陽性クローンをスクリーニングした。次いで、それぞれが抗生物質Ｇ４１８に対する耐性と、及び追加のチオエステラーゼ、すなわち、（１）Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ（Ｃ８−１０選択性）由来のチオエステラーゼ遺伝子、配列番号５２；（２）Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ（Ｃ１２選択性）由来のチオエステラーゼ遺伝子、配列番号５３；又はＵｌｍｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎａ（広範；Ｃ１０〜Ｃ１６選択性）由来のチオエステラーゼ、配列番号５４とをコードする３つのカセットのうちの１つを用いて、陽性クローンを再び形質転換した。各構築物の関連する部分の配列が配列表に記載されている。両方のチオエステラーゼ遺伝子を発現するクローンを、５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むショ糖含有培地でスクリーニングした。陽性クローンを選択し、成長及び脂質プロフィールをアッセイした。代表的な陽性クローンの脂質プロフィールを表１７にまとめる（面積％として表す）。
【０６４９】
【表１７】
0005996527.tif 000035
【０６５０】
さらに、Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒａ及びＵ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａのチオエステラーゼを有する二重のチオエステラーゼクローンを、５０ｍｇ／ＬのＧ４１８を含む２％ショ糖含有培地において、２２℃で成長させた。このような成長条件下でこの株から得られた脂肪酸プロフィールは：Ｃ８：０（０）；Ｃ１０：０（０．１０）；Ｃ１２：０（３１．０３）；Ｃ１４：０（７．４７）；Ｃ１６：０（１５．２０）；Ｃ１８：０（０．９０）；Ｃ１８：１（３０．６０）；Ｃ１８：２（１２．４４）；及びＣ１８：３α（１．３８）であり、総飽和物は５４．７であった。
【０６５１】
Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒａチオエステラーゼを含む２つの相同組み換え構築物（一方は６Ｓ領域を標的とし、他方はＫＥ８５８領域を標的とする）を有する二重のチオエステラーゼクローンを作製した。代表的な陽性クローンの脂肪酸プロフィールは：０％のＣ８：０；０．０６％のＣ１０：０；５．９１％のＣ１２：０；４３．２７％のＣ１４：０；１９．６３％のＣ１６：０；０．８７％のＣ１８：０；１３．９６％のＣ１８：１；及び１３．７８％のＣ１８：２であり、総飽和物は６９．７４％であった。このクローンのＣ１２〜Ｃ１４レベルは４９％を超え、これは野性型細胞のＣ１２〜Ｃ１４レベルの３７倍超である。
【０６５２】
上記データによると、多数のチオエステラーゼの微細藻類における同時発現は成功し得る。多数のチオエステラーゼの同時発現により、野性型株だけでなく、個々のエステラーゼのいずれか１つの発現により得られる脂肪酸プロフィールとも著しく異なる、改変された脂肪酸プロフィールが得られる。鎖長特異性が重複する多数のチオエステラーゼの発現により、これらの特定の脂肪酸の累積的増加が生じ得る。
【０６５３】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおける異種チオエステラーゼの発現（単独で又は共同で）が、宿主株の脂肪酸／脂質プロフィールを変化させるだけでなく、様々な種子作物から現在入手可能な油（表５）に比べて、これらのプロフィールは、現在入手可能な他の系では見られない極めて珍しい油のものである。トランスジェニック株は、形質転換されていない野性型株との著しい相違を示すだけでなく、表５に示されるいずれの市販の油とも著しく異なるプロフィールを有する。例として、ココナツ油及びパーム核油はともに、Ｃ８〜Ｃ１０脂肪酸のレベルが５．５〜１７％の範囲にある。Ｃ．ｐａｌｕｓｔｒｉｓのＣ８選択性チオエステラーゼ又はＣ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａのＣ１０選択性チオエステラーゼを発現するトランスジェニック株は、それぞれ３．６６〜８．６５％の範囲で蓄積する。このようなＣ８〜Ｃ１０脂肪酸レベルは、ココナツ油及びパーム核油と類似しているが、トランスジェニック藻類株では、Ｃ１２：０脂肪酸が著しく高いというわけではないが、Ｃ１６：０は極めて高い（トランスジェニック株では２３％であるのに対し、ココナツ油又はパーム核油では１１〜１６％である）及び／又は１８：１（トランスジェニック株では５０〜５７％であるのに対し、ココナツ油又はパーム核油では８〜１９％である）。
【０６５４】
（実施例１０：外来窒素依存性のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａプロモーターの同定）
（Ａ．外来窒素依存性プロモーターの同定及び特徴づけ）
プロトテカ（Prototheca)  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）から、標準的な技術を用いてｃＤＮＡライブラリーを作成した。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞を、窒素が枯渇した条件下で４８時間成長させた。次いで、５％の播種物質（ｖ／ｖ）を低窒素環境に移し、細胞を２４時間ごとに７日間採集した。培養して約２４時間後、培地への窒素の供給を完全に絶った。集めたサンプルを、ドライアイス及びイソプロパノールですぐに凍結させた。次いで、凍結した細胞ペレットサンプルから全ＲＮＡを単離し、各サンプルの一部をＲＴ−ＰＣＲ試験のために残しておいた。サンプルから採集した全ＲＮＡの残りに、ｐｏｌｙＡ選択を行った。それぞれの条件から、等モル量のｐｏｌｙＡで選択したＲＮＡを保存しておき、ベクターｐｃＤＮＡ３．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でｃＤＮＡを作成するために使用した。このようにして得られた保存しておいたｃＤＮＡライブラリーから、ほぼ１２００種類のクローンを無作為に取り出し、両方の鎖について塩基配列を決定した。これらの１２００個の配列の中から、ほぼ６８種類の異なるｃＤＮＡを選択し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ試験で使用するためのｃＤＮＡ特異的なプライマーを設計するのに使用した。
【０６５５】
保存容器に入れておいた細胞ペレットサンプルから単離したＲＮＡを、上のように作成したｃＤＮＡ特異的なプライマーセットを用い、リアルタイムＲＴ−ＰＣＴ試験で基質として使用した。この保存しておいたＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、６８個の遺伝子特異的なプライマーセットそれぞれについて、ＲＴ−ＰＣＲの基質として使用した。閾値サイクル数、つまりＣＴ数を用い、６８種のｃＤＮＡそれぞれについて、時間経過にともなって集めたそれぞれのＲＮＡサンプル内の相対的な転写産物量を示した。窒素が豊富にある状態と、窒素が枯渇している状態との間で、顕著な増加を示す（３倍以上）ｃＤＮＡを、窒素の枯渇によって発現を上方調節する有望な遺伝子としてフラグ付けした。本明細書で記載しているように、窒素の枯渇／制限は、油産生微生物が脂質産生する際の既知の誘発因子である。
【０６５６】
窒素の枯渇／制限の間、発現が上方調節されるような、ｃＤＮＡから得た推定プロモーター／５’ＵＴＲ配列を同定するために、窒素が枯渇した状態で成長させたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）から全ＤＮＡを単離し、次いで、４５４  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｃｈｅ）を用い、塩基配列を決定した。上のＲＴ−ＰＣＲ結果によって、上方調節されるとフラグ化されたｃＤＮＡを、４５４のゲノムシーケンシングリードから生じる、アセンブリしたコンティグに対し、ＢＬＡＳＴを用いて比較した。ｃＤＮＡの５’末端を特定のコンティグに対してマッピングし、可能な場合、５’フランキングＤＮＡの５００ｂｐを超える部分を使用し、プロモーター／ＵＴＲを推定した。次いで、プロモーター／５’ＵＴＲの存在を確認し、ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅を用いてクローン化した。個々のｃＤＮＡ  ５’末端を用い、３’プライマーを設計し、４５４コンティグアセンブリの５’末端を使用し、５’遺伝子特異的なプライマーを設計した。
【０６５７】
第１のスクリーニングとして、推定プロモーターの１つである、Ａａｔ２（アンモニウムトランスポーター、配列番号６３）から単離した５’ＵＴＲ／プロモーターを、Ｃ．ｓｏｒｏｋｉｎａｎａグルタミン酸脱水素酵素プロモーターの代わりに、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイルＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドを用い、Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒａ  Ｃ１４チオエステラーゼ構築物内でクローン化した。この構築物を、配列番号８１として列挙している。この推定プロモーターを試験するために、チオエステラーゼ構築物をＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞内で形質転換し、上述の方法を用い、低／無窒素状態でＣ１４／Ｃ１２脂肪酸の増加についてスクリーニングすることによって、実際のプロモーター活性を確かめた。ｃＤＮＡ／ゲノムスクリーニングから単離した推定窒素制御プロモーターを、同じ方法を用いて同様に試験することができる。
【０６５８】
ｃＤＮＡ／ゲノムスクリーニングから単離した他の推定窒素制御プロモーター／５’ＵＴＲは、以下の通りであった。
【化４】
0005996527.tif 000036
【０６５９】
何倍増加したかは、低窒素培地で２４時間培養した後のｃＤＮＡ産出量が何倍増えたかを指す。
【０６６０】
これらの推定プロモーター／５’ＵＴＲの潜在的な調節に関してさらなる洞察を得るために、次の８つの配列をさらなる試験用に選択した：（１）ＦａｔＢ／Ａ；（２）ＳｕｌｆＲｅｄ亜硫酸塩還元酵素；（３）ＳｕｇＴ  Ｓｕｇａｒトランスポーター；（４）Ａｍｔ０２−アンモニウムトランスポーター０２；（５）Ａａｔ０１−アミノ酸トランスポーター０１；（６）Ａａｔ０３−アミノ酸トランスポーター０３；（７）Ａａｔ０４−アミノ酸トランスポーター０４；及び（８）Ａａｔ０５−アミノ酸トランスポーター０５。Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のシーケンシングリードを用いて、高分解度のトランスクリプトーム解析を、Ｔ０（種）；種からの接種の２０時間後；３２時間後；４８時間後；６２時間後；及び１１４時間後の様々な時点でＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞から単離したＲＮＡに対して、行った。Ｔ０（種）における培地は富窒素の状態であったが、２０時間以後の時点では培地に窒素がほとんど、又は全く含まれていなかった。次いで、各時点で単離されたＲＮＡから作成された、集合した転写産物のコンティグを、既に同定されている８つの各転写産物とのＢＬＡＳＴにそれぞれ独立して供した。その結果を下の表１８にまとめる。
【０６６１】
【表１８】
0005996527.tif 000037
【０６６２】
上にまとめた結果から、いくつかの転写産物の蓄積は、経時的に増加しているが、興味深いことに、亜硫酸塩還元酵素ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ蓄積において明らかに経時的に減少している。
【０６６３】
これらの８つの推定プロモーター／５’ＵＴＲ領域をＣ．ｃａｍｐｈｏｒａチオエステラーゼコード領域の上流にクローン化し、その天然のトランジットペプチドを削除してＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ（ＵＴＥＸ２５０）ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ由来のトランジットペプチドに置き換えた。各推定プロモーター／５’ＵＴＲ領域構築物を、６Ｓ領域のゲノム配列由来のＤＮＡを用いた相同組み換えによりＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ１４３５に導入した。また構築物には、ショ糖含有培地／プレートでの陽性クローン選択のためのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のｓｕｃ２ショ糖インベルターゼ遺伝子も含まれていた。Ａａｔ０１に対する構築物の関連する部分のｃＤＮＡ配列は、配列番号６７として配列表に記載されている。他の構築物では、同じ骨格を使用し、唯一の可変部分は推定プロモーター／５’ＵＴＲ配列であった。Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターを用いてＣ．ｃａｍｐｈｏｒａチオエステラーゼ遺伝子の発現を駆動させる、さらなる対照トランスジェニック株を作製した。このプロモーターは、目的の遺伝子の構成的発現を駆動することが示されているため、試験された様々な推定Ｎ−制御性プロモーター／５’ＵＴＲにより駆動されたとき、同じチオエステラーゼメッセージの発現を測定するのに有用な対照を提供する。
【０６６４】
トランスジェニッククローンを作製した後、３つの別個の実験を行った。最初の２つの実験は、培養物上澄みにおいて、ＲＴ−ＰＣＲによる定常状態のチオエステラーゼｍＲＮＡレベルと、脂肪酸プロフィールと、アンモニアレベルとを測定することにより、８つのすべての推定プロモーターの潜在的な窒素制御可能性を評価するものである。最初にクローンを富窒素播種培地（１ｇ／Ｌ硝酸アンモニウム―アンモニアとしての窒素１５ｍＭ、酵母抽出物４ｇ／Ｌ）で、攪拌しながら（２００ｒｐｍ）２４〜４８時間、２８℃で成長させ、この時点で、２０ＯＤ単位（Ａ７５０）を用いて、低窒素培地（０．２ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム―アンモニアとしての窒素３ｍＭ、酵母抽出物０．２ｇ／Ｌ）５０ｍｌを接種した。細胞を６日間、２４時間ごとにサンプリングし、また低窒素条件へ切り替える直前にも試料を採取した。次いで、各試料由来の細胞の一部を、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を用いた（製造業者の指示に従って）全ＲＮＡ抽出に使用した。アンモニアアッセイにより、低窒素培地では、２４時間後に上澄みのアンモニアレベルが検出限界（約１００μＭ）を下回ることが明らかとなった。
【０６６５】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲでは、各時点に関して、すべてのＲＮＡレベルを、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ１４３５）で発現される内部の対照ＲＮＡのレベルに対して正規化した。ｃｄ１８９と呼ばれる内部の対照ＲＮＡは、Ｎ−アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼをコードするＡＲＧ９遺伝子の産物である。これらの実験でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマーセットは、以下の通りであった。
【化５】
0005996527.tif 000038
【０６６６】
各時点の各形質転換体の脂質プロフィールも作成し、ＲＴ−ＰＣＲの結果と比較した。アンモニアレベル、ＲＴ−ＰＣＲの結果、及びＣ１２〜Ｃ１４脂肪酸レベルの変化に基づき、アミノ酸トランスポーター０１（Ａａｔ−０１）、アミノ酸トランスポーター０４（Ａａｔ−０４）及びアンモニウムトランスポーター０２（Ａｍｔ−０２）配列が、機能性の窒素制御プロモーター／５’ＵＴＲを確かに含むという結論が得られた。
【０６６７】
ＲＴ−ＰＣＲの結果から、Ａａｔ−０１が、定常状態のＣ．ｃａｍｐｈｏｒａチオエステラーゼｍＲＮＡレベルを対照（Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター）の４倍まで駆動する能力が示された。またｍＲＮＡレベルは、窒素制限、及びＣ１２〜Ｃ１４脂肪酸レベルの著しい増加とも相関していた。これらの結果は、Ａａｔ−０１プロモーターに付随する５’ＵＴＲが、脂質生合成下でのタンパク質合成の駆動において、対照のＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉプロモーターよりも効率的である可能性を示している。Ａａｔ−０１プロモーターと同様に、Ａａｔ−０４プロモーターは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ対照プロモーターのｍＲＮＡ蓄積の５倍までｍＲＮＡ蓄積を促進することが可能であった。しかし、Ａａｔ−０４プロモーター構築物がＣ１２〜Ｃ１４脂肪酸レベルに影響を及ぼす能力はわずかしかなかった。これらのデータは、Ａａｔ−０４プロモーターは、窒素枯渇により明らかに制御されるが、プロモーターに付随するＵＴＲは、翻訳エンハンサーとしての機能に乏しい可能性があることを示している。最後に、Ａｍｔ−０２プロモーターは、対照プロモーターの３倍までｍＲＮＡ蓄積を促進することが可能であったという点で、Ａａｔ−０１プロモーターと類似していた。またｍＲＮＡレベルは、窒素制限、及びＣ１２〜Ｃ１４脂肪酸レベルの著しい増加とも相関していた。まとめると、これら３つのプロモーターはすべて、窒素に制御されるということが示された。
【０６６８】
（Ｂ．アンモニウムトランスポーター３（ａｍｔ０３）プロモーターのさらなる特徴づけ及び様々なチオエステラーゼの発現）
上記のように、アンモニウムトランスポーター０２及び０３（ａｍｔ０２及びａｍｔ０３）と呼ばれる部分的ｃＤＮＡが同定された。これら２つの部分的ｃＤＮＡｓとともに、アンモニウムトランスポーター０１（ａｍｔ０１）と呼ばれる第３の部分的ｃＤＮＡも同定された。部分的ｃＤＮＡと推定翻訳アミノ酸配列のアラインメントを比較した。結果は、ａｍｔ０１が３つの配列の中では遠縁であるのに対し、ａｍｔ０２とａｍｔ０３はアミノ酸１個しか違わないことを示している。
【０６６９】
上記のように、部分的ｃＤＮＡ配列と、Ｒｏｃｈｅ社４５４ゲノムＤＮＡアセンブリ及びＩｌｌｕｍｉｎａ社のトランスクリプトームアセンブリとをＢＬＡＳＴ比較することにより、最初にコンピュータによりプロモーター／５’ＵＴＲを作成した。ａｍｔ０１、ａｍｔ０２及びａｍｔ０３をコードするｃＤＮＡとの同一性を示す転写産物コンティグが同定されたが、コンティグが３つすべてに共有する配列を含んでいたため、転写産物コンティグでは３つのｍＲＮＡの区別ができなかった。Ｒｏｃｈｅ社４５４ゲノムＤＮＡアセンブリは、ａｍｔ０２及びａｍｔ０３のｃＤＮＡ配列にヒットし、Ｎ末端タンパク質配列を含んでいた。ＰＣＲを行って、５’フランキング領域をクローン化した。クローンのａｍｔ０２及びａｍｔ０３プロモーター／ＵＴＲを確認するために使用したＰＣＲプライマーは以下の通りであった：
【化６】
0005996527.tif 000039
どちらの場合も、５’及び３’プライマーは、これらのプロモーター／５’ＵＴＲ領域の機能性を確認するための発現ベクター中への予測されるクローン化に有用な制限部位を含んでいた。
【０６７０】
コンピュータによる方法とＰＣＲに基づく方法を組み合わせたこの方法でクローン化したＤＮＡと、ａｍｔ０２（配列番号６１）及びａｍｔ０３（配列番号６０）をコードする元のｃＤＮＡとの間でペアワイズアラインメントを行った。これらのアラインメントの結果は、元のｃＤＮＡとクローン化されたゲノム配列との間の有意な差を示していたが、このことは、アンモニウムトランスポーターが多様な遺伝子のファミリーであること示している。さらに、組み合わせた方法に基づくａｍｔ０３のプロモーター／５’ＵＴＲクローンは、元のａｍｔ０３配列とは異なっていたのに対し、ａｍｔ０２配列では一致していた。ａｍｔ０３プロモーター／ＵＴＲ配列（配列番号８９）を特徴づけるためにさらなる実験を行ったが、これを以下に記載する。
【０６７１】
上記の同定されたａｍｔ０３プロモーター／ＵＴＲ配列（配列番号８９）をクローン化して、４つの異なるチオエステラーゼの発現を駆動させることにより、この推定プロモーター／ＵＴＲ配列を試験した。発現カセットは、上流及び下流にゲノムの６Ｓ遺伝子座に対する相同組み換え配列（それぞれ、配列番号８２及び８４）を含んでいた。またこのカセットは、ショ糖含有培地での陽性クローン選択を可能にするＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＵＣ２ショ糖インベルターゼｃＤＮＡも含んでいた。ショ糖インベルターゼ発現は、β−チューブリンプロモーターにより駆動され、またＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲも含んでいた。次いで、ショ糖インベルターゼカセットの下流にａｍｔ０３プロモーター／ＵＴＲ配列をクローン化し、この後に４つのチオエステラーゼ遺伝子、すなわち、（１）Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒａ由来のＣ１４チオエステラーゼ；（２）Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ由来のＣ１２チオエステラーゼ；（３）Ｕ．ａｍｅｒｉｃａｎａ由来のＣ１０〜Ｃ１６チオエステラーゼ；又は（４）Ｃ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ由来のＣ１０チオエステラーゼのうちの１つに由来するインフレームのチオエステラーゼｃＤＮＡ配列が続き、またＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲも含んでいた。Ｃ１４  Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒａチオエステラーゼ、Ｃ１２  Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａチオエステラーゼ及びＣ１０〜Ｃ１６  Ｕ．ａｍｅｒｉｃａｎａはすべて、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ由来のトランジットペプチドを含んでいた。Ｃ１０  Ｃ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａチオエステラーゼは、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ）由来のトランジットペプチドを含んでいた。すべての場合において、配列は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓでの発現に対してコドンが最適化されていた。上記チオエステラーゼ構築物の配列は、配列表に記載されている。
【化７】
0005996527.tif 000040
【０６７２】
実施例２の上記の微粒子銃による野性型Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞中への形質転換法により、トランスジェニック系列を作製し、ショ糖含有プレート／培地で選択を行った。次いで、脂肪酸プロフィールの変化の程度に関して、陽性の系列をスクリーニングした。次いで、１つが上記４つの構築物それぞれから得られた４つの系列を、さらなる分析に供した。系列７６は、Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒａ  Ｃ１４チオエステラーゼを発現し、系列３７はＵ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  Ｃ１２チオエステラーゼを発現し、系列６０はＵ．ａｍｅｒｉｃａｎａ  Ｃ１０〜Ｃ１６チオエステラーゼを発現し、系列５６はＣ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ  Ｃ１０チオエステラーゼを発現した。各系列を、唯一の炭素源としてショ糖を含有する培地で４８時間成長させ、脂肪酸メチルエステルへの直接エステル転移反応と、それに続くＧＣ−ＦＩＤによる分析（上記の）により脂肪酸プロフィールを決定するために、また全ＲＮＡを単離するために、１４、２４、３６及び４８時間（種培養物）の細胞試料を採取した。４８時間の終わりに、これらの細胞を用いて、ｐＨ５．０（クエン酸により緩衝、０．０５Ｍの最終濃度）又はｐＨ７．０（ＨＥＰＥＳによる緩衝、０．１Ｍの最終濃度）に維持された無窒素又は低レベル窒素の培養物（唯一の炭素源としてショ糖を含む）に接種した。脂肪酸プロファイリング及び全ＲＮＡ単離のために、１２、２４、７２及び１０８時間（脂質産生）で培養物試料を採取した。これらの培養物のアンモニアアッセイにより、低窒素培地においては、２４時間後にアンモニアレベルが検出限界（約１００μＭ）を下回ることが明らかとなった。
【０６７３】
上で採取された各時点の全ＲＮＡに対して、チオエステラーゼのｍＲＮＡレベルに関するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを行い、すべてのｍＲＮＡレベルを、内部の対照ＲＮＡ（ｃｄ１８９）のレベルに対して正規化した。リアルタイムＰＣＲで使用したプライマーセットを下の表１９に示す。
【０６７４】
【表１９】
0005996527.tif 000041
【０６７５】
種培養相における各時点での脂肪酸プロフィールの結果はによると、チオエステラーゼによる影響はほとんどなかった。脂質生成相の開始により、脂肪酸プロフィールが著しく影響され、その増加はｐＨ５．０の培養物に比べて、ｐＨ７．０に維持された培養物の方がはるかに劇的であった。ｐＨ７．０とｐＨ５．０における対象脂肪酸蓄積の差の程度は、試験した各チオエステラーゼにより異なっていたが、全体的な効果は同じであった。すなわち、ｐＨ５．０で成長させた細胞では、蓄積された標的脂肪酸のレベルは著しく低かったが、それでも、対照の野性型細胞よりは高かった。
【０６７６】
培養物のｐＨが、各チオエステラーゼの定常状態のｍＲＮＡレベルに対して明らかに影響を及ぼしたという点で、これらの同じ試料から単離したＲＮＡの解析は、脂肪酸プロフィールのデータと非常によく相関していた。脂肪酸蓄積のデータとｍＲＮＡのデータを考え合わせると、ａｍｔ０３プロモーター／ＵＴＲにより駆動されるチオエステラーゼ遺伝子発現のｐＨによる調節が、転写、ｍＲＮＡ安定性、又はその両方のレベルにおいて媒介されることが明らかであった。さらに、Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａのｍＲＮＡの定常状態レベルがＣ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａのｍＲＮＡの定常状態レベルに比べて４対数低いということが観察された。この観察は、個々のｍＲＮＡ配列が発現の制御において役割を果たし得るという仮説と一致する。これらのデータは、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓでのａｍｔ０３ファミリーのトランスポーターによるアンモニウム取り込みがｐＨと直接関連していることを示唆している。
【０６７７】
Ｕ．ａｍｅｒｉｃａｎａ  Ｃ１０〜Ｃ１６チオエステラーゼの発現を駆動するａｍｔ０３プロモーター／ＵＴＲの構築物を用いたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞の形質転換により作製された１２の系列に関して、さらなる脂肪酸プロフィール分析を行った。上記の系列６０は、以下の分析の一部分であった。野性型対照とともに分析した１２系列のうち、３つの系列の脂質プロフィールを下の表２０に示す。
【０６７８】
【表２０】
0005996527.tif 000042
【０６７９】
上の表で示されるように、野生型と比較した系列４０の場合、総飽和物のレベルが野性型よりも２．６倍以上と劇的に増加した（分析した１２系列の総飽和物は、約６３％〜８６％以上の範囲であった）。さらに、Ｕ．ａｍｅｒｉｃａｎａチオエステラーゼがこのレベルで発現されると、不飽和物、特にＣ１８：１及びＣ１８：２のレベルが劇的に減少し（系列４０及び４４を参照）、系列４４では、野生型に比べ、Ｃ１８：１レベルが８倍以上減少している。また、Ｕ．ａｍｅｒｉｃａｎａチオエステラーゼ（ａｍｔ０３プロモーターにより駆動される）は、中鎖脂肪酸のレベルを大幅に増加させる。系列４４は、野性型株で見られるレベルよりも約４２倍高い、５６％を超えるＣ１０：０〜Ｃ１４：０レベル、及び５７％を超えるＣ８：０〜Ｃ１４：０レベルを示している。Ｕ．ａｍｅｒｉｃａｎａチオエステラーゼの発現を駆動するＡｍｔ０３プロモーターの構築物で形質転換されたさらなる株の代表的な脂質プロフィールは、０．２３％のＣ８：０；９．６４％のＣ１０：０；２．６２％のＣ１２：０；３１．５２％のＣ１４：０；３７．６３％のＣ１６：０；５．３４％のＣ１８：０；７．０５％のＣ１８：１；及び５．０３％のＣ１８：２で、総飽和物の百分率が８６．９８％であった。
【０６８０】
Ｃ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ  Ｃ１０チオエステラーゼ（配列番号９４）の発現を駆動する構築物ａｍｔ０３プロモーター／ＵＴＲ（配列番号８９）によるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞の形質転換から、さらなる脂質プロフィールが得られた。この構築物を発現する陽性クローンを選択して、ｐＨ７．０の条件で成長させた。陽性クローンの代表的な脂質プロフィールは：９．８７％のＣ８：０；２３．９７％のＣ１０：０；０．４６％のＣ１２：０；１．２４％のＣ１４：０；１０．２４％のＣ１６：０；２．４５％のＣ１８：０；４２．８１％のＣ１８：１；及び７．３２％のＣ１８：２であった。このクローンのＣ８〜Ｃ１０の百分率が３３．８４であった。
【０６８１】
まとめると、前記データによると、ｍｔ０３プロモーター／ＵＴＲ及び他の同様のプロモーターは、堅固に制御されたプロモーターとして使用され得、かかるプロモーターは潜在的に毒性のある化合物の発現に特に有用であり得、これはすなわち、厳密な遺伝子発現の実施が必要であるということを示している。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの幅広いｐＨ領域（少なくともｐＨ５．０〜７．０）で成長する能力により、この微生物は、ａｍｔ０３プロモーター／ＵＴＲのような調節エレメントと組み合わせると特に有用である。さらに、上の脂質プロフィールのデータは、ａｍｔ０３プロモーター／ＵＴＲが遺伝子発現を駆動する優れた能力を有すること示している。
【０６８２】
（実施例１１：微細藻類Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおける飽和脂肪酸のレベルの改変）
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ１４３５）由来ゲノムＤＮＡのｃＤＮＡ、Ｉｌｌｕｍｉａ社トランスクリプトーム及びＲｏｃｈｅ社４５４の配列決定によるバイオインフォマティクスに基づくアプローチを用いたゲノムスクリーニングの一部として、脂肪酸飽和に関与する２つの特定の遺伝子群であるステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）及びデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ（Δ１２ＦＡＤ）が同定された。ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ酵素は、脂質合成経路の一部であり、例えば、Ｃ１８：０脂肪酸からのＣ１８：１脂肪酸の合成のように、脂肪族アシル鎖に二重結合を導入するよう機能する。またデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼも脂質合成経路の一部であり、例えば、Ｃ１８：１脂肪酸からのＣ１８：２脂肪酸の合成のように、既に不飽和である脂肪酸に二重結合を導入するよう機能する。バイオインフォマティクスに取り組む間に同定された２種類の脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子に基づくプローブを用いたサザンブロット分析により、それぞれの種類のデサチュラーゼ遺伝子が複数のファミリーメンバーで構成される可能性があることが示された。さらに、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼをコードする遺伝子は、２つの異なるファミリーに分類される。これらの結果に基づき、デサチュラーゼ酵素の各ファミリー内で高度に保存されたコード領域を標的とすることにより複数の遺伝子ファミリーメンバーを破壊する可能性のある、３つの遺伝子破壊構築物を設計した。
【０６８３】
（１）デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ（ｄ１２ＦＡＤ）ファミリーメンバーのコード配列の高度に保存された部分と、（２）各ファミリー由来のコード配列の保存された領域をそれぞれ有する、ＳＡＤの２つの異なるファミリーをそれぞれ標的とした２つの構築物とを用いて、３つの相同組み換え標的化構築物を設計した。このストラテジーは、相同組み換えが標的遺伝子のフランキング領域を標的とする古典的な遺伝子置換ストラテジーというよりはむしろ、これらの高度に保存されたコード領域に選択マーカー遺伝子（ショ糖を加水分解する能力を付与するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のｓｕｃ２ショ糖インベルターゼカセット）を組み込む（多数のファミリーメンバーを標的とする）ものである。
【０６８４】
すべての構築物を、上記の方法を用いた微粒子銃による形質転換により細胞内に導入し、構築物は、細胞内に撃ち込む前に線状であった。ショ糖含有プレート／培地で形質転換体を選択し、上記の方法を用いて脂質プロフィールの変化をアッセイした。３つの各標的化構築物の関連する配列を以下に挙げる。
【化８】
0005996527.tif 000043
【０６８５】
各構築物による形質転換から得られた代表的な陽性クローンを選び、そのクローンの脂質プロフィールを決定した（面積％で表す）が、それを下の表２１にまとめる。
【０６８６】
【表２１】
0005996527.tif 000044
【０６８７】
各構築物は、所望の種類の脂肪酸に対して測定可能な影響を及ぼし、３つのすべての場合において、Ｃ１８：０レベルが著しく増加し、特に２つのＳＡＤノックアウトで顕著に増加した。ＳＡＤノックアウトによる多数のクローンをさらに比較したところ、ＳＡＤ２Ｂノックアウト系列のＣ１８：１脂肪酸が、ＳＡＤ２Ａノックアウト系列で見られるＣ１８：１脂肪酸レベルよりもかなり大きく減少することが示された。
【０６８８】
上記の方法を用いて、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓバックグラウンドでさらなるΔ１２脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ）ノックアウトを作製した。Δ１２ＦＡＤの潜在的な相同性を同定するために、推定ＦＡＤをコードするゲノム領域を、以下のプライマーを用いて増幅した：
プライマー１  ５’−ＴＣＡＣＴＴＣＡＴＧＣＣＧＧＣＧＧＴＣＣ−３’  配列番号１０１
プライマー２  ５’−ＧＣＧＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＧＣＴＣＧＡＡ−３’  配列番号１０２。
上記プライマーを用いてＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓゲノムＤＮＡのゲノム増幅から得られた配列は非常に類似していたが、Δ１２ＦＡＤの複数の遺伝子又は対立遺伝子がＰｒｏｔｏｔｈｅｃａに存在することを示していた。
【０６８９】
この結果に基づき、１つ以上のΔ１２ＦＡＤ遺伝子を不活性化するための、２つの遺伝子破壊構築物を設計した。このストラテジーは、古典的な遺伝子置換ストラテジーを用いるというよりはむしろ、ショ糖インベルターゼ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のｓｕｃ２）カセットを高度に保存されたコード領域に組み込んで、選択マーカーとしてのショ糖を加水分解する能力を付与するというものであった。ｐＳＺ１１２４と呼ばれる第１の構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２遺伝子の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターと、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲとに隣接する、５’及び３’ゲノム標的化配列を含んでいた（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２カセット）。ｐＳＺ１１２５と呼ばれる第２の構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２遺伝子の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターと、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲとに隣接する、５’及び３’ゲノム標的化配列を含んでいた。これらの構築物の関連する配列は、配列表に記載されている。
【化９】
0005996527.tif 000045
【０６９０】
ｐＳＺ１１２４及びｐＳＺ１１２５を、それぞれＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓバックグラウンドに導入し、ショ糖を加水分解する能力に基づいて陽性クローンを選択した。ｐＳＺ１１２４及びｐＳＺ１１２５標的化ベクターを用いた２つのトランスジェニック系列で得られた脂質プロフィール（面積％、上記の方法を用いて作成）を表２２にまとめる。
【０６９１】
【表２２】
0005996527.tif 000046
【０６９２】
ＦＡＤ２Ｂ（ｐＳＺ１１２４）構築物を含むトランスジェニックでは、脂質プロフィールにおいて、減少すると予想されたＣ１８：２レベルが約１面積％しか減少しなかったという点で、非常に興味深く予想外な結果が得られた。しかし、Ｃ１８：１脂肪酸レベルが著しく増加したのは、ほとんど例外なくＣ１６：０レベルが著しく減少したからだ。また、ＦＡＤ２Ｃ（ｐＳＺ１１２５）構築物を含むトランスジェニックにおいても脂質プロフィールが変化し、対応するＣ１８：１レベルの増加とともに、Ｃ１８：２のレベルが著しく減少した。
【０６９３】
（牛脂模倣物）
上記のＳＡＤ２Ｂノックアウト実験から作製された陽性クローンを１つ選択して、Ｃ１４選択性の脂肪族アシルＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子をさらに導入するためのバックグラウンドとして使用した。Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒａのＣ１４選択性のチオエステラーゼを導入する構築物は、６Ｓゲノム領域に対する標的化配列を含み（相同組み換えによる形質転換ＤＮＡの標的組み込みを可能にする）、またこの発現構築物は、ｎｅｏＲ遺伝子の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターとＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ、次いで、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイルＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドを有するコドン最適化Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒａチオエステラーゼの発現を駆動する、第２のＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターと、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲとを含んでいた。５’６Ｓ領域ゲノムドナー配列は配列番号８２として記載され；３’６Ｓ領域ゲノムドナー配列は配列番号８４として記載され；Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒａチオエステラーゼの関連する発現構築物は配列番号８３として記載されている。
【０６９４】
上述の微粒子銃による方法を用いて形質転換を行い、ショ糖２％を含有するプレートで細胞を２４時間回復させた。この後、選択のため、２％ショ糖及び５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するプレートに細胞を再び懸濁させ、再び播いた。作製した陽性クローンのうち９つのクローンを、脂質産生及び脂質プロフィール用に選択。この９つのトランスジェニッククローン（ＳＡＤ２Ｂ  ＫＯを有し、Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒａのＣ１４選択性のチオエステラーゼを発現）を上記のように培養し、脂質プロフィールに関して分析した。結果を下の表２３にまとめる。また獣脂の脂質プロフィールも下の表２３に含まれている（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  １９７６：Ｆａｔ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔ）。
【０６９５】
【表２３】
0005996527.tif 000047
【０６９６】
表２３からわかるように、トランスジェニック系列の脂質プロフィールは、獣脂の脂質プロフィールに極めて類似している。まとめると、このデータは、獣脂の脂質プロフィールに類似した油を産生するトランスジェニック藻類株を作製するために、特定のトランスジェニックバックグラウンド、この場合はＳＡＤ２Ｂノックアウトを、Ｃ１４選択性のチオエステラーゼ（Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒａ由来）と組み合わせることが有用であることを示している。
【０６９７】
（標的化されたノックアウトアプローチによりβ−ケトアシル合成酵素ＩＩ（ＫＡＳＩＩ）の発現を下方調節するために使用する構築物）
標的化されたノックアウトアプローチによりＫＡＳＩＩ遺伝子発現を下方調節するベクターを、古典的変異誘発したＵＴＥＸ１４３５誘導体であるＳ１３３１に導入した。選択マーカーとしてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼ遺伝子を用いて、ショ糖で成長する能力を付与した。Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターの制御下にあるインベルターゼ発現カセットを長さ３１５ｂｐのＫＡＳＩＩゲノム領域の中央に挿入して、標的組み込みを可能にした（ｐＳＺ１５０３）。
【０６９８】
ｐＳＺ１５０３中の関連する制限部位は、小文字、太字及び下線により示され、それぞれ５’−３’ＢｓｐＱ１、ＫｐｎＩ、ＡｓｃＩ、ＸｈｏＩ、、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩである。ＢｓｐＱＩ部位は、形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定めるものである。太字で小文字の配列は、ＫＡＳＩＩ遺伝子座において相同組み換えによる標的組み込みを可能にする、Ｓ１３３１由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’の方向に進むと、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子（Ｓ１３３１がショ糖を代謝する能力を付与する）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターが、枠で囲んで示されている。インベルターゼに対するイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは、大文字の太字イタリックで示され、コード領域は、小文字のイタリックで示されている。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲは、下線を施した小文字で示されている。
【０６９９】
ｐＳＺ１５０３＿［ＫＡＳＩＩ＿ｂｔｕｂ−ｙ．ｉｎｖ−ｎｒ＿ＫＡＳＩＩ］に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：
【化１０】
0005996527.tif 000048
【０７００】
ＫＡＳＩＩ対立遺伝子１及び対立遺伝子２のｃＤＮＡは、それぞれ配列番号２７９及び２８０で同定される。対立遺伝子１及び２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２８１及び２８２で同定される。
【０７０１】
脂質組成に対するＫＡＳＩＩ不活性化の影響を判定するために、ｐＳＺ１５０３ベクターＤＮＡをＳ１３３１内で形質転換して、標的化されたＫＡＳＩＩノックアウト表現型を作製した。最初の単一クローンを単離し、ｐＨ５．０の標準的な脂質産生条件下で成長させた。最も代表的なクローン及び野性型細胞から得られたプロフィールを下の表３１に示す。
【０７０２】
【表３１】
0005996527.tif 000049
【０７０３】
（実施例１２：別の選択可能マーカーによるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａの操作）
（Ａ．Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおける分泌型α−ガラクトシダーゼの発現）
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｐｅｃｉｅｓにおける異種ショ糖インベルターゼ遺伝子発現の方法及び効果は、参照により本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／６６１４２号に既に記載されている。本実施例では、他の異種多糖分解酵素の発現を調べた。α−ガラクトシダーゼをコードする以下の外来遺伝子のうちの１つを有するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ１４３５がメリビオース（α−Ｄ−ｇａｌ−ｇｌｕ）で増殖する能力を試験した。すなわち、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓ由来のＭＥＬ１遺伝子（ＮＣＢＩ寄託番号Ｐ０４８２４に対応するアミノ酸配列（配列番号１０８））、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のＡｇｌＣ遺伝子（ＮＣＢＩ寄託番号Ｑ９ＵＵＺ４に対応するアミノ酸配列（配列番号１１６））、及び高等植物Ｃｙａｍｏｐｓｉｓ  ｔｅｔｒａｇｏｂｏｂｏｌａ（グァー豆）由来のα−ガラクトシダーゼ（ＮＣＢＩ寄託番号Ｐ１４７４９に対応するアミノ酸配列（配列番号１２０）である。上記寄託番号及び対応するアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み込まれる。すべての場合において、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ内での好ましいコドンの使用に従って遺伝子が最適化されていた。発現カセットの関連する部分を、配列番号とともに以下に記載する。すべての発現カセットにおいて、安定なゲノム組み込みのための５’及び３’Ｃｌｐ相同組み換え標的化配列、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ＴＵＢ２プロモーター／５’ＵＴＲ、及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲを用いた。
【化１１】
0005996527.tif 000050
【０７０４】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞を、先の実施例２に記載されているように微粒子銃による形質転換法を用いて、Ｓ．ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓのＭＥＬ１遺伝子、Ａ．ｎｉｇｅｒのＡｌｇＣ遺伝子又はＣ．ｔｅｔｒａｇｏｎｏｂｏｌａのα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む３つの発現カセットそれぞれで形質転換した。唯一の炭素源としてメリビオース２％を含有するプレートを用いて、陽性クローンをスクリーニングした。Ｃ．ｔｅｔｒａｇｏｎｏｂｏｌａ発現カセット形質転換体のプレートには、コロニーが出現しなかった。Ｓ．ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓのＭＥＬ１形質転換体及びＡ．ｎｉｇｅｒのＡｌｇＣ形質転換体を含むプレートから陽性クローンを選択した。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓの３’ＵＴＲ及び３’Ｃｌｐ相同組み換え標的化配列の一部分を標的とするプライマーにより、ＰＣＲを用いて形質転換ＤＮＡの組み込みを確認した。
５’プライマー  Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ  ３’ＵＴＲ：下流Ｃｌｐ配列（配列番号１２３）
ＡＣＴＧＣＡＡＴＧＣＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＧＡ
３’プライマー  Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ  ３’ＵＴＲ：下流Ｃｌｐ配列（配列番号１２４）
ＴＣＣＡＧＧＴＣＣＴＴＴＴＣＧＣＡＣＴ
【０７０５】
陰性対照として、形質転換されていないＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞由来のゲノムＤＮＡもプライマーセットにより増幅した。野性型細胞由来のゲノムＤＮＡからは産物が増幅されなかった。
【０７０６】
Ｓ．ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓのＭＥＬ１形質転換体及びＡ．ｎｉｇｅｒのＡｌｇＣ形質転換体それぞれに由来するいくつかの陽性クローン（ＰＣＲにより確認）を、液体培地中、メリビオースを唯一の炭素源として成長するその能力に関して試験した。これらの選択されたクローンを、先の実施例１に記載されている条件及び基本培地でメリビオースを唯一の炭素源として３日間成長させた。いずれかのα−ガラクトシダーゼコード遺伝子を含むすべてのクローンがこの期間に安定的に成長したが、形質転換していない野生型株、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＵＣ２ショ糖インベルターゼを発現するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓはともに、メリビオース培地であまり成長しなかった。これらの結果は、α−ガラクトシダーゼコード遺伝子が形質転換の選択マーカーとして使用され得ることを示している。またこれらのデータは、タンパク質をＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞のペリプラズムに対して標的化するためには、Ｓ．ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓのＭＥＬ１（配列番号１０９）又はＡ．ｎｉｇｅｒのＡｌｇＣ（配列番号１１７）に存在する天然のシグナルペプチドが有用であることを示している。
【０７０７】
（Ｂ．ＰｒｏｔｏｔｈｅｃａにおけるＴＨＩＣ遺伝子のチアミン栄養要求性補完）
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞のチアミン原栄養性を、外来のＴＨＩＣ遺伝子の発現を用いて調べた。植物及び藻類におけるチアミン生合成は、典型的には、プラスチドで行われるのため、その産生に関与する核コートタンパク質の大部分が、プラスチドに対して効率的に標的化される必要がある。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞のＤＮＡ配列決定及びトランスクリプトーム配列決定により、ＴＨＩＣを除く、チアミン生合成酵素をコードする遺伝子がすべて、ゲノム中に存在するということが明らかとなった。チアミン栄養要求性の原因となる損傷を生化学的レベルで詳細に分析するために、次のような５つの異なる状況下でのＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞の成長を調べた。すなわち、（１）２μＭチアミン塩酸塩の存在下；（２）チアミンなし；（３）チアミンなし、２μＭヒドロキシエチルチアゾール（ＴＨＺ）あり；（４）チアミンなし、２μＭ  ２−メチル−４−アミノ−５−（アミノメチル）ピリミジン（ＰＹＲ）あり；及び（５）チアミンなし、２μＭ  ＴＨＺ及び２μＭ  ＰＹＲありである。これら５つの異なる条件下での成長実験の結果は、ＰＹＲ前駆体を与えた場合、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞はｄｅ  ｎｏｖｏ合成を行うことができるが、チアミンピロリン酸塩（ＴＰＰ）しか産生できないということを示していた。この結果は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓのチアミン栄養要求性は、ＴＨＩＣ酵素による変換触媒である、アミノイミダゾールリボヌクレオチドからヒドロキシメチルピリミジンリン酸塩（ＨＭＰ−Ｐ）の合成を行うことができないことに起因するという仮説と一致する。
【０７０８】
上記の実施例２の微粒子銃による形質転換法を用いてＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞を形質転換し、Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ  Ｃ−１６９  ＴＨＩＣ（アミノ酸配列はＪＧＩタンパク質番号３０４８１に対応し、参照により本明細書に組み込まれる）、及び選択マーカーとしてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＵＣ２ショ糖インベルターゼを発現させた。この発現構築物は、Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ  Ｃ−１６９  ＴＨＩＣ由来の天然のトランジットペプチド配列、ゲノムＤＮＡの６Ｓ領域に対する上流及び下流相同組み換え標的化配列、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＴＵＢ２プロモーター／５’ＵＴＲ領域（配列番号１０４）、並びにＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素の３’ＵＴＲ（配列番号１１５）を含んでいた。またＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＵＣ２発現も、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＴＵＢ２プロモーター／５’ＵＴＲ領（配列番号１１４）により駆動され、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素の３’ＵＴＲ（配列番号１１５）を含んでいた。遺伝子は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおいて好ましいコドンの使用に従って最適化されていた。関連する発現カセットの配列は配列表に記載されており、その詳細を以下に記載する：
【化１２】
0005996527.tif 000051
チアミンを含まず、かつ唯一の炭素源としてショ糖を含有するプレートで、陽性クローンの選択を行った。Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ  Ｃ−１６９のＴＨＩＣ遺伝子内で結合する５’プライマー、及び６Ｓ遺伝子座の形質転換ＤＮＡの下流でアニールする３’プライマーにより、ＰＣＲを用いて陽性クローンを確認した。また、ＰＣＲにより確認された陽性クローンを、サザンブロットアッセイでも確認した。
【０７０９】
野性型Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞のチアミン栄養要求性を観察するために、内部にチアミンを貯蔵している細胞を最初に枯渇させる必要があった。チアミンを含まない培地での成長を試験するために、最初にチアミン２μＭを含有する培地で細胞を静止期まで成長させてから、チアミンを含まない培地で、７５０ｎｍ（ＯＤ７５０）での吸光度が約０．０５になるまで細胞を希釈した。次いで、希釈した細胞を、チアミンを含まない培地で再び静止期まで成長させた（約２〜３日間）。これらのチアミン枯渇細胞を用いて、チアミンを含まない培地での成長実験のための培養物を播種した。炭素源としてグルコースを含む培地（チアミンを含むか、又は含まない）で野性型細胞を成長させ、天然のトランジットペプチドＣｏｃｃｏｍｙｘａのＣ−１６９  ＴＨＩＣ構築物を有する陽性クローンを、唯一の炭素源としてショ糖を含む培地で成長させた。７５０ｎｍでの吸光度をモニターすることにより、成長を測定した。成長実験の結果は、トランス遺伝子を発現する株の無チアミン培地における成長が、無チアミン培地における野性型細胞よりもかなり大きいことを示していた。しかし、チアミン含有培地においては、形質転換体の成長速度及び細胞密度は野性型細胞に及ばなかった。また、無チアミン培地における形質転換クローンの成長量と、組み込まれたＣｏｃｃｏｍｙｘａ酵素のコピー数との間には強い相関が見られた（すなわち、トランス遺伝子のコピー数が多いほど、無チアミン培地での細胞の成長が良好であった）。
【０７１０】
ＣｏｃｃｏｍｙｘａのＴＨＩＣ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのＴＨＩＣ遺伝子、及びＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．のＰＣＣ６８０３ｔｈｉＣ遺伝子を含む発現構築物を用いて、さらなる形質転換体を作製した。Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ及びＡ．ｔｈａｌｉａｎａのＴＨＩＣ遺伝子の場合、天然のトランジットペプチド配列を、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓのステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）遺伝子由来のトランジットペプチド配列に置き換えた。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．はラン藻であり、ｔｈｉＣタンパク質は天然のトランジットペプチ配列を含まない。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．のｔｈｉＣ構築物では、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓのＳＡＤ遺伝子由来のトランジットペプチ配列をＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．のｔｈｉＣのＮ−末端に融合した。すべての場合において、配列は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓでの発現に対してコドンが最適化されていた。上記３つの構築物はすべて、ゲノムの６Ｓ領域に対する上流及び下流相同組み換え標的化配列（配列番号８２及び８４）と、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓのアクチンプロモーター／５’ＵＴＲと、及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓのＥＦ１Ａ遺伝子３’ＵＴＲとを含んでいた。３つの構築物はすべて、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＴＵＢ２プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号１１４）により駆動されるｎｅｏＲ遺伝子を含み、また、Ｇ４１８による選択をもたらすＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓの３’ＵＴＲ（配列番号１１５）を含んでいた。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＴＨＩＣのアミノ酸配列はＮＣＢＩ寄託番号ＮＰ＿１８０５２４に対応し、またＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．のｔｈｉＣのアミノ酸配列はＮＣＢＩ寄託番号ＮＰ＿４４２５８６に対応しており、両配列とも参照により本明細書に組み込まれる。関連する発現カセット配列は配列表に記載されており、その詳細を以下に記載する。
【化１３】
0005996527.tif 000052
【０７１１】
Ｇ４１８を含有するプレートで陽性クローンをスクリーニングし、各形質転換によるいくつかのクローンをＰＣＲによる確認のために選択した。ＣｏｃｃｏｍｙｘａのＣ−１６９遺伝子（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓトランジットペプチドを有する）、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ及びＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．のＰＣＣ６８０３ＴＨＩＣ遺伝子をそれぞれ含む形質転換ＤＮＡ構築物のゲノム６Ｓ遺伝子座への組み込みを、次のようなプライマーのよりＰＣＲ分析を用いて確認した：
５’ＴＨＩＣ  Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ確認用プライマー配列（配列番号１４１）
ＡＣＧＴＣＧＣＧＡＣＣＣＡＴＧＣＴＴＣＣ
３’ＴＨＩＣ確認用プライマー配列（配列番号１４２）
ＧＧＧＴＧＡＴＣＧＣＣＴＡＣＡＡＧＡ
５’ＴＨＩＣ  Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ確認用プライマー配列（配列番号１４３）
ＧＣＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＡＣＡＡＧＡ
５’ｔｈｉＣ  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．確認用プライマー配列（配列番号１４４）
ＣＧＡＴＧＣＴＧＴＧＣＴＡＣＧＴＧＡ。
【０７１２】
異なる各構築物の形質転換体から選択された確認済み陽性クローンを用いて、Ｇ４１８を含有する培地におけるチアミン枯渇細胞の成長実験（上記）を行った。すべての形質転換体が無チアミン培地で成長することができた（安定性の程度は異なる）。無チアミン培地における形質転換体の成長を、チアミン含有培地における野性型細胞の成長と比較することにより、無チアミン培地での成長を支える能力に関して次のような順位が示された：（１）Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの形質転換体；（２）ＣｏｃｃｏｍｙｘａのＣ−１６９（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓトランジットペプチドを有する）の形質転換体；及び（３）Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．の形質転換体。これらの結果は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＨＩＣを単独で複製することにより、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞におけるチアミン栄養要求性を補完できるが、チアミンの非存在下での急速な成長を可能にするためには、（天然のトランジットペプチ配列又はＣ．  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ由来のトランジットペプチ配列を有する）Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ  Ｃ−１６９又はＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．のＴＨＩＣの複数複製が必要であったことを示している。異なる入手源由来の異なるＴＨＩＣの結果にばらつきがあることを考えると、任意の特定のＴＨＩＣ遺伝子が、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種に存在する損傷を完全に補完する能力は、予測することができない。
【０７１３】
３つのＴＨＩＣアミノ酸配列のアラインメントを行った。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．由来のｔｈｉＣとＣｏｃｃｏｍｙｘａ及びＡ．ｔｈａｌｉａｎａ由来のＴＨＩＣとの間に有意な配列保存（アミノ酸レベルで４１％の同一性）が存在する一方で、ラン藻類タンパク質には、藻類及び植物のタンパク質でよく保存されているＮ末端のドメインが欠けている。このドメインの欠如（及び恐らく、それにより生じる構造上の違い）にもかかわらず、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．のｔｈｉＣを発現する構築物は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞においてチアミン原栄養性を少なくとも部分的に回復することができた。
【０７１４】
（実施例１３：燃料生成）
（Ａ．連続圧搾機及び圧縮助剤を用いた、微細藻類に由来する油の抽出）
ドラム乾燥機を用い、ＤＣＷで３８％の油を含む微細藻類バイオマスを乾燥させ、得られた含水量は５〜５．５％であった。バイオマスをＦｒｅｎｃｈ  Ｌ２５０プレスに供給した。バイオマス３０．４ｋｇ（６７ｌｂｓ．）をプレスに供給したが、油は回収されなかった。同じ乾燥微生物バイオマスに、種々の割合のスイッチグラスを圧縮助剤として組み合わせ、プレスに供給した。乾燥微生物バイオマス及び２０％ｗ／ｗスイッチグラスを組み合わせることによって、最終的には最も良好な油回収率が得られた。次いで、圧縮したケーキをヘキサンで抽出し、スイッチグラスが２０％の条件で、最終収率は、６１．６％の利用可能な油（重量によって算出）の総量であった。細胞乾燥重量の５０％を超える油を有するバイオマスは、油を放出させるために、スイッチグラスのような圧縮助剤を使う必要はなかった。連続圧搾機を用いて微細藻類から油を抽出する他の方法は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／３１１０８号に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
【０７１５】
（Ｂ．Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａの油に由来するバイオディーゼルの生成）
上に記載した方法に従って生成した、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５から得た脱ガム油に、トランスエステル化を行い、脂肪酸メチルエステルを得た。結果を以下の表２４に示す。
【０７１６】
油の脂質プロフィールは、以下の通りであった。
Ｃ１０：０      ０．０２
Ｃ１２：０      ０．０６
Ｃ１４：０      １．８１
Ｃ１４．１      ０．０７
Ｃ１６：０      ２４．５３
Ｃ１６：１      １．２２
Ｃ１８：０      ２．３４
Ｃ１８：１      ５９．２１
Ｃ１８：２      ８．９１
Ｃ１８：３      ０．２８
Ｃ２０：０      ０．２３
Ｃ２０：１      ０．１０
Ｃ２０：１      ０．０８
Ｃ２１：０      ０．０２
Ｃ２２：０      ０．０６
Ｃ２４：０      ０．１０
【０７１７】
【表２４−１】
0005996527.tif 000053
【表２４−２】
0005996527.tif 000054
【０７１８】
バイオディーゼルの脂質プロフィールは、原材料油の脂質プロフィールと非常に類似していた。本発明の方法及び組成物によって与えられる他の油を、トランスエステル化し、（ａ）Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも４％であり；（ｂ）Ｃ８が少なくとも０．３％であり；（ｃ）Ｃ１０が少なくとも２％であり；（ｄ）Ｃ１２が少なくとも２％であり；（３）Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも３０％であるといった脂質プロフィールを有するバイオディーゼルを得ることができる。
【０７１９】
生成したバイオディーゼルのＡＳＴＭ  Ｄ６７５１  Ａ１法による冷状態浸漬時の濾過性は、容積３００ｍｌで１２０秒であった。この試験は、Ｂ１００  ３００ｍｌを濾過し、４０°Ｆ（約４．５°Ｃ）まで１６時間かけて冷やし、室温まで加温し、ステンレス鋼の支持板がついた０．７マイクロメートルガラス繊維フィルターを用い、減圧下で濾過することを含む。本発明の油を、トランスエステル化し、冷状態浸漬時間が１２０秒未満、１００秒未満、９０秒未満のバイオディーゼルを作成することができる。
【０７２０】
（Ｃ．再生可能なディーゼルの生成）
上に記載の方法に従って生成した、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５に由来する脱ガム油は、上の本実施例でバイオディーゼルを製造するために使用した油と同じ脂質プロフィールを有しており、この油をトランスエステル化し、再生可能なディーゼルを生成した。
【０７２１】
まず、上述の油を水素化処理し、酸素とグリセロール骨格を取り除き、ｎ−パラフィンを得た。次いで、ｎ−パラフィンをクラッキングし、異性化した。この物質のクロマトグラムを図１に示す。次いで、この物質を冷状態で濾過し、約５％のＣ１８材料を除去した。冷状態で濾過した後、材料全容積から引火点のために抜き取り、引火点、ＡＳＴＭ  Ｄ−８６の蒸留分布、曇り点、粘度を評価した。引火点は６３℃であり；粘度は２．８６ｃＳｔ（センチストークス）であり；曇り点は４℃であった。ＡＳＴＭ  Ｄ８６の蒸留値を表２５に示す。
【０７２２】
【表２５】
0005996527.tif 000055
【０７２３】
生成した物質のＴ１０−Ｔ９０は、５７．９℃であった。本明細書に開示されている油の水素化処理、異性化、及び他の共有結合改変方法、及び本明細書に開示されている蒸留及び分別の方法（例えば、冷却濾過）を使用し、本明細書に開示されている方法に従って生成したトリグリセリド油を用いて、他のＴ１０−Ｔ９０範囲、例えば、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、６５℃を有する再生可能なディーゼル組成物を作成することができる。
【０７２４】
生成した物質のＴ１０は、２４２．１℃であった。本明細書に開示されている油の水素化処理、異性化、及び他の共有結合改変方法、及び本明細書に開示されている蒸留及び分別の方法（例えば、冷却濾過）を利用し、他のＴ１０値、例えば、Ｔ１０が１８０〜２９５、１９０〜２７０、２１０〜２５０、２２５〜２４５、少なくとも２９０の再生可能なディーゼル組成物を作成することができる。
【０７２５】
生成した物質のＴ９０は、３００℃であった。本明細書に開示されている油の水素化処理、異性化、及び他の共有結合改変方法、及び本明細書に開示されている蒸留及び分別の方法（例えば、冷却濾過）を利用し、他のＴ９０値、例えば、Ｔ９０が２８０〜３８０、２９０〜３６０、３００〜３５０、３１０〜３４０、少なくとも２９０の再生可能なディーゼル組成物を作成することができる。
【０７２６】
生成した物質のＦＢＰは、３００℃であった。本明細書に開示されている油の水素化処理、異性化、及び他の共有結合改変方法、及び本明細書に開示されている蒸留及び分別の方法（例えば、冷却濾過）を利用し、他のＦＢＰ値、例えば、ＦＢＰが２９０〜４００、３００〜３８５、３１０〜３７０、３１５〜３６０、少なくとも３００の再生可能なディーゼル組成物を作成することができる。
【０７２７】
本発明の方法及び組成物によって得られる他の油を、（ａ）Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも４％であり；（ｂ）Ｃ８が少なくとも０．３％であり；（ｃ）Ｃ１０が少なくとも２％であり；（ｄ）Ｃ１２が少なくとも２％であり；（３）Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも３０％であるといった脂質プロフィールを有するを含む、水素化処理、異性化、及び他の共有結合改変を組み合わせて行うことができる。
【０７２８】
（実施例１４：用途に応じた油の生成）
本明細書に開示される方法及び材料を用いて、用途に応じた様々な油を生成した。表３２に、提示される株により生じる表現型及び様々な脂肪酸プロフィールを付与する遺伝子の株、遺伝子、並びにその遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ寄託番号を示す。株Ａ及びＢはともにＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ１４３５）株であり、両者とも個別支払い方式の研究所で古典的な変異誘発を行い、油の産生量を向上させたものである。次いで、株Ａ及びＢを、所望の遺伝子を発現するように、本明細書に記載の通りに適当なＤＮＡ構築物で遺伝子操作した。また、記載の通りに株を操作して、内在性デサチュラーゼを不活性化した。チオエステラーゼのヌクレオチド配列を、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａでの発現及び使用に対してコドンを最適化した。
【０７２９】
野性型の操作されていないＰｒｏｔｏｔｈｅｃａの脂肪酸プロフィールを、表３２の最初の行に示す。表からわかるように、脂肪酸プロフィールは、異なる株には異なる方法で劇的に改変された。例えば、遺伝子操作されていないＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞により産生されたＣ８：０の百分率は０％である。しかし、Ｃ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａチオエステラーゼを発現するように操作されたＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞では、Ｃ８：０産生が総トリグリセリドの０％から１３．２％に増加した。別の例として、操作された株におけるＣ８：０とＣ１０：０の総合計量は、総脂肪酸の約３９％であった。これに対し、野性型細胞におけるＣ８：０とＣ１０：０の総合計量は０．０１％である。別の例では、内在するＳＡＤ２ｂの発現が破壊された細胞内でのＵ．ａｍｅｒｉｃａｎａチオエステラーゼの発現により、飽和脂肪酸の合計量が約３２％から約９０％に増加した。これはほぼ３００％の増加である。
【０７３０】
以下で開示される様々な脂肪酸プロフィールは、トリグリセリド油を含めた多種多様な用途に有用である。例えば、トリグリセリド（Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、Ｃ１６：０）を含む高レベルの低炭素鎖長飽和脂肪酸は、再生可能なジェット燃料製造に特に有用である。バイオディーゼル製造には、高量のＣ１８：１が望ましい。棒状石鹸製造には、飽和レベルと短鎖脂肪酸との間の適切なバランスを制御し、達成することが望ましい。例として、高量のＣ１２：０は、長鎖で構造がしっかりしているが、泡立つ特性にとっては望ましい。一方、リノール酸含有トリグリセリド及びリノレン酸含有トリグリセリドは、酸化不安定性の一因となるため、あまり望ましくない。液体石鹸には、高量のＣ１２：０及びＣ１４：０が望ましい。さらに、棒状石鹸及び液体石鹸の製造には、ともに低量のＣ６：０、Ｃ８：０及びＣ１０：０が望ましく、それはこれらの低鎖トリグリセリドが肌刺激性であるからである。
【０７３１】
【表３２−１】
0005996527.tif 000056
【表３２−２】
0005996527.tif 000057
【表３２−３】
0005996527.tif 000058
【０７３２】
（パーム核油）
本発明者らは、パーム核油（ＰＫＯ）に類似した微生物パーム核油模倣物を生成した。パーム核油模倣物を生成するために、プラスミドを構築し、これを株Ａの形質転換に使用して、油の生成を行った。構築物ｐＳＺ１４１３（配列番号２３１）は、コドンが最適化されたＣｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉのＦＡＴＢ２遺伝子（配列番号２８４）（Ｇｅｎ  ｂａｎｋ寄託番号Ｕ５６１０６）及びＳＡＤ２Ｂ（ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ）遺伝子破壊を含んでいた。
【０７３３】
下の表３３に示されるように、パーム核油模倣物はパーム核油に類似していた。ＰＫＯ模倣物に最も多く含まれる３つの脂肪酸（Ｃ１２：０、Ｃ１４：０及びＣ１８：１）の百分率は、パーム核油のものと同じであるか、又はその１０％以内であった。
【０７３４】
【表３３】
0005996527.tif 000059
【０７３５】
（パーム油）
本発明者らは、パーム油に類似した微生物パーム油模倣物を生成した。いくつかの異なるプラスミドを構築して株Ａ中に個々に形質転換し、油の生成を行った。構築物ｐＳＺ１５０３（配列番号２８３）は、内在するＫＡＳＩＩ遺伝子を破壊するようにを設計された。構築物ｐＳＺ１４３９（配列番号２３７）は、コドンが最適化されたＥｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｉｅｎｓｉｓのＴＥ遺伝子（配列番号２０５）（Ｇｅｎ  ｂａｎｋ寄託番号ＡＡＤ４２２２０．２）を含んでいた。構築物ｐＳＺ１４２０（配列番号２２５）は、コドンが最適化されたＣｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａのＴＥ遺伝子（配列番号２０１）（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ寄託番号Ｑ３９５１３）を含んでいた。構築物ｐＳＺ１１１９（配列番号２２７）は、コドンが最適化されたＣｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａのＫＡＳＩＶ遺伝子（配列番号１８６）（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ寄託番号ＡＦ０６０５１９）及びＣｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉのＦＡＴＢ２遺伝子（配列番号１８４）（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ寄託番号Ｕ５６１０４）を含んでいた。
【０７３６】
下の表３４に示されるように、パーム油模倣物はパーム油に類似していた。パーム油模倣物に最も多く含まれる３つの脂肪酸（Ｃ１６：０、Ｃ１８：１及びＣ１８：２）の百分率は、パーム油のものと同じであるか、又はその１０％以内であった。
【０７３７】
【表３４】
0005996527.tif 000060
【０７３８】
（カカオバター）
本発明者らは、カカオバターに類似した微生物カカオバター模倣物を生成した。構築物ｐＳＺ１４５１を構築して株Ａ内で形質転換し、油の生成を行った。構築物ｐＳＺ１４５１（配列番号２３９）は、コドンが最適化されたＣａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｕｓ  ＴＥ遺伝子（配列番号１８７）（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ寄託番号ＡＡＡ３３０１９．１）を含んでいた。
【０７３９】
下の表３５に示されるように、カカオバター油模倣物はカカオバターに類似していた。カカオバター模倣物に最も多く含まれる３つの脂肪酸（Ｃ１６：０、Ｃ１８：０及びＣ１８：１）の百分率は、カカオバターのものと同じであるか、又はその１０％以内であった。
【０７４０】
【表３５】
0005996527.tif 000061
【０７４１】
（ラード）
本発明者らは、ラードに類似した微生物ラード模倣物を生成した。いくつかの異なるプラスミドを構築して株Ａ中に個々に形質転換し、油の生成を行った。構築物ｐＳＺ１４９３（配列番号２４１）は、内在するＳＡＤ  ２Ｂ遺伝子を破壊すると同時に、コドンが最適化されたＵｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａのＴＥ遺伝子（配列番号２８５）（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ寄託番号Ｍ９４１５９）を発現するように設計された。構築物ｐＳＺ１４５２（配列番号２４０）は、内在するＳＡＤ２Ｂ遺伝子を破壊し、コドンが最適化されたＧａｒｃｉｎｉａ  ｍａｎｇｏｓｔａｎａのＴＥ遺伝子（配列番号１９６）（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ寄託番号ＡＡＢ５１５２５．１）を発現するように設計された。構築物ｐＳＺ１４４９（配列番号２３８）は、コドンが最適化されたＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓのＴＥ遺伝子（配列番号１９５）（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ寄託番号ＣＡＡ５２０７０．１）を発現するように設計された。構築物ｐＳＺ１４５８のポリヌクレオチド配列は、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａのチオエステラーゼ（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ寄託番号Ｕ３９８３４）をコードする、コドンが最適化されたポリヌクレオチド配列が、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓのＴＥ遺伝子（配列番号１９５）（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ寄託番号ＣＡＡ５２０７０．１）をコードするポリヌクレオチド配列に置き換わっている以外は、ｐＳＺ１４４９と同じであった。
【０７４２】
下の表３６に示されるように、ラード模倣物はラードに類似していた。ラード模倣物に最も多く含まれる３つの脂肪酸（Ｃ１６：０、Ｃ１８：０及びＣ１８：１）の百分率は、ラードのものと同じであるか、又はその１０％以内であった。
【０７４３】
【表３６】
0005996527.tif 000062
【０７４４】
本発明を、特定の実施形態と関連させて記載してきたが、さらなる改変ができることは理解されるであろう。本明細書は、本発明の原理に一般的に従い、本発明のいかなる変更、応用又は適応をも包含することを意図しており、それらは、本発明が属する技術分野の範囲内にある知られているあるいは慣例の実践範囲内で行われ、また本明細書に記載する本質的な特徴に適用できるような、本開示からの逸脱を含む。
【０７４５】
本明細書に引用されている全ての参考文献は、Ｇｅｎｂａｎｋを含めた特許、特許明細書、刊行物を含めて、その内容がすでに具体的に組み込まれているか否かにかかわらず、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で述べられている刊行物は、本発明と組み合わせて使用することが可能な試薬、方法及び概念を記載し、開示することを目的として引用されているのであって、本明細書におけるいかなるものも、これら引用文献を本明細書に記載の本発明との関連で従来技術であると認めると解釈されるべきではない。特定的には、以下の特許明細書は、あらゆる目的のために、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。すなわち、２００８年６月２日に出願した国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６５５６３号、名称「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ」、２０１０年４月１４日に出願した国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／３１１０８号、名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｏｉｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ」、及び２００９年１１月３０日に出願した国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号、名称「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｉｌｏｒｅｄ  Ｏｉｌｓ  ｉｎ  Ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ」である。
【０７４６】
【数１】
0005996527.tif 000063
【０７４７】
【数２】
0005996527.tif 000064
【０７４８】
【数３】
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【０７４９】
【数４】
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【０７５０】
【数５】
0005996527.tif 000067
【０７５１】
【数６】
0005996527.tif 000068
【０７５２】
【数７】
0005996527.tif 000069
【０７５３】
【数８】
0005996527.tif 000070
【０７５４】
【数９】
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【０７５５】
【数１０】
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【数２７２】
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【１０１８】
【数２７３】
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【図１】
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【配列表】
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