(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４の４７４番目のアミノ酸のチロシン残基（Ｙ４７４）が異なるアミノ酸で置換されることによって、Ｙ４７４の変異を有しない同等のＣｌｆＡポリペプチドと比較して、フィブリノゲン結合活性が減少するように変異しているＣｌｆＡポリペプチド。
【請求項２】
前記異なるアミノ酸が塩基性アミノ酸である、請求項１に記載のＣｌｆＡポリペプチド。
【請求項３】
前記異なるアミノ酸がヒスチジンである、請求項１または２に記載のＣｌｆＡポリペプチド。
【請求項４】
Ｎ２ドメインおよびＮ３ドメインを含むフィブリノゲン結合ドメインを含むＣｌｆＡポリペプチドの断片であって、配列番号４のＹ４７４が異なるアミノ酸で置換されることによって、Ｙ４７４の変異を有しない同等のＣｌｆＡポリペプチドと比較して、フィブリノゲン結合活性が減少するように変異している、上記断片。
【請求項５】
前記異なるアミノ酸が塩基性アミノ酸である、請求項４に記載の断片。
【請求項６】
前記異なるアミノ酸がヒスチジンである、請求項４または５に記載の断片。
【請求項７】
配列番号８〜１２のいずれか１つのアミノ酸配列からなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＣｌｆＡポリペプチドまたは請求項４〜６のいずれか１項に記載の断片。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＣｌｆＡポリペプチドまたは断片を含む融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項４〜７のいずれか１項記載の断片または請求項８に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＣｌｆＡポリペプチドおよび医薬的に許容される賦形剤を含む免疫原性組成物。
【請求項１１】
請求項４〜７のいずれか１項に記載のＣｌｆＡポリペプチドの断片および医薬的に許容される賦形剤を含む免疫原性組成物。
【請求項１２】
請求項８に記載の融合タンパク質および医薬的に許容される賦形剤を含む免疫原性組成物。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のＣｌｆＡポリペプチド、断片または融合タンパク質に、医薬的に許容される賦形剤を添加するステップを含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を作製する方法。
【請求項１４】
ブドウ球菌の感染もしくは疾患の治療または予防において使用するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＣｌｆＡポリペプチド、断片もしくは融合タンパク質。
【請求項１５】
ブドウ球菌の感染もしくは疾患の治療または予防において使用するための、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
ブドウ球菌疾患の治療または予防のための医薬の製造における、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＣｌｆＡポリペプチド、断片もしくは融合タンパク質または請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブドウ球菌フィブリノゲン結合タンパク質、特に、クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）の変異体の分野に関し、そのフィブリノゲン結合は、このブドウ球菌フィブリノゲン結合タンパク質の非変異型と比較して減少する。かかるタンパク質を含む免疫原性組成物およびかかる免疫原性組成物の製造法、ならびにかかる免疫原性組成物を用いる予防法または治療法についても記載する。
【背景技術】
【０００２】
黄色ブドウ球菌感染は抗生物質（最適な薬物はペニシリン）で治療されるが、バンコマイシンはメチシリン耐性分離株に対して使用される。抗生物質に広範な耐性を示すブドウ球菌株の割合は１９８０年代以後増加しており（Ｐａｎｌｉｌｏ ｅｔ ａｌ １９９２,Ｉｎｆｅｃｔ.Ｃｏｎｔｒｏｌ.Ｈｏｓｐ.Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ.１３；５８２）、効果的な抗菌薬治療に対して脅威となっている。さらに、最近のバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌株の出現は、効果的な治療がないメチシリン耐性黄色ブドウ球菌株が出現し、蔓延する恐れを喚起している。
【０００３】
受動免疫療法でブドウ球菌抗原に対する抗体を用いる代替的アプローチが研究されている。ポリクローナル抗血清の投与を含む治療が開発中である（ＷＯ００／１５２３８、ＷＯ００／１２１３２）。
【０００４】
代替的アプローチは、ブドウ球菌に対する免疫反応を引き起こすために活性ワクチンを使用する。ワクチン成分として含有するためのいくつかの候補が同定されている。これらには、フィブロネクチン結合タンパク質（米国特許第５８４０８４６号）、ＭＨＣ ＩＩ類似体（米国特許第５６４８２４０号）、フィブリノゲン結合タンパク質のＣｌｆＡおよびＣｌｆＢ（米国特許第６００８３４１号、ＷＯ９９／２７１０９）、ＧｅｈＤ（米国特許公開第２００２／０１６９２８８号）、コラーゲン結合タンパク質（米国特許第６２８８２１４号）、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＦ、ＳｄｒＧおよびＳｄｒＨ（ＷＯ９９／２７１０９、ＷＯ００／１２６８９、ＷＯ０８／１９１６２）、ＳＥＡおよびＳＥＢ外毒素変異体（ＷＯ００／０２５２３）、５２ｋＤａのビトロネクチン結合タンパク質（ＷＯ０１／６０８５２）、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣおよびＩｓｄＨ（ＷＯ０５／０９３７９、ＷＯ０８／１５２４４７）が含まれる。
【０００５】
クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）は、黄色ブドウ球菌のフィブリノゲン結合タンパク質と同定され（米国特許第６００８３４１号）、多糖類の有望な担体タンパク質と同定され、これを用いてブドウ球菌感染に対して免疫することができた（ＷＯ０４／８０４９０）。
【０００６】
近年、ＣｌｆＡのアミノ酸Ｐ３３６およびＹ３３８がフィブリノゲン結合部位として認められ、これらの変異はフィブリノゲン結合の喪失をもたらす（Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ ２００８,ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ｖｏｌｕｍｅ ３,Ｉｓｓｕｅ ５,ｐａｇｅ１−７）。これらの変異体のフィブリノゲン結合の喪失は、免疫マウスの敗血症による死を防ぐ能力の増加につながり、組換えＣｌｆＡのワクチンの可能性は、フィブリノゲンに結合するＣｌｆＡの能力を取り除くことによって改善されるという結論を導く。
【０００７】
ブドウ球菌疾患から身を守るワクチンを開発するニーズが依然としてある。黄色ブドウ球菌の莢膜多糖体を用いるアプローチは規制認可を獲得することができず（ＷＯ０３／６１５５８）、追加のブドウ球菌成分を含むより複雑なワクチンは、効果的な予防を与えることを要求され得る。
【発明の概要】
【０００８】
したがって、ＣｌｆＡポリペプチド、その断片またはその融合タンパク質を提供し、その中のアミノ酸Ｙ４７４またはＹ４７４に隣接するアミノ酸は、Ｙ４７４またはＹ４７４に隣接するアミノ酸が変異していない同等のＣｌｆＡ（すなわち、関連する野生型ＣｌｆＡ）ポリペプチド、その断片またはその融合タンパク質と比較して、フィブリノゲン結合活性が減少するように変異している。
【０００９】
本発明の第２の態様において、ＣｌｆＡポリペプチド、その断片またはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供し、その中のアミノ酸Ｙ４７４またはＹ４７４に隣接するアミノ酸は、Ｙ４７４またはＹ４７４に隣接するアミノ酸が変異していない同等のＣｌｆＡ（すなわち、関連する野生型ＣｌｆＡ）ポリペプチド、その断片またはその融合タンパク質と比較して、フィブリノゲン結合活性が減少するように変異している。
【００１０】
本発明の第３の態様において、ＣｌｆＡポリペプチドならびに医薬的に許容される賦形剤を含む免疫原性組成物を提供し、そのＣｌｆＡポリペプチドのアミノ酸Ｙ４７４またはＹ４７４に隣接するアミノ酸は、Ｙ４７４またはＹ４７４に隣接するアミノ酸が変異していない同等のＣｌｆＡ（すなわち、関連する野生型ＣｌｆＡ）ポリペプチド、その断片またはその融合タンパク質と比較して、フィブリノゲン結合活性が減少するように変異している。
【００１１】
本発明の第４の態様において、このＣｌｆＡのポリペプチド、断片または融合タンパク質に、医薬的に許容される賦形剤を添加するステップを含む、本発明の免疫原性組成物を作製する方法を提供し、その中のアミノ酸Ｙ４７４またはＹ４７４に隣接するアミノ酸は、Ｙ４７４またはＹ４７４に隣接するアミノ酸が変異していない同等のＣｌｆＡ（すなわち、関連する野生型ＣｌｆＡ）ポリペプチド、その断片またはその融合タンパク質と比較して、フィブリノゲン結合活性が減少するように変異している。
【００１２】
本発明の第５の態様において、ブドウ球菌の感染もしくは疾患の治療または予防に使用するためのＣｌｆＡのポリペプチド、断片または融合タンパク質を提供し、その中のアミノ酸Ｙ４７４またはＹ４７４に隣接するアミノ酸は、Ｙ４７４またはＹ４７４に隣接するアミノ酸が変異していない同等のＣｌｆＡ（すなわち、関連する野生型ＣｌｆＡ）ポリペプチド、その断片またはその融合タンパク質と比較して、フィブリノゲン結合活性が減少するように変異している。
【００１３】
本発明の第６の態様において、ブドウ球菌疾患の治療または予防のための医薬の製造における、ＣｌｆＡのポリペプチド、断片または融合タンパク質の使用を提供し、その中のアミノ酸Ｙ４７４またはＹ４７４に隣接するアミノ酸は、Ｙ４７４またはＹ４７４に隣接するアミノ酸が変異していない同等のＣｌｆＡ（すなわち、関連する野生型ＣｌｆＡ）ポリペプチド、その断片またはその融合タンパク質と比較して、フィブリノゲン結合活性が減少するように変異している。
【００１４】
本発明の第７の態様において、ＣｌｆＡのポリペプチド、断片または融合タンパク質を、それを必要としている患者に投与することを含むブドウ球菌疾患の治療法または予防法を提供し、その中のアミノ酸Ｙ４７４またはＹ４７４に隣接するアミノ酸は、Ｙ４７４またはＹ４７４に隣接するアミノ酸が変異していない同等のＣｌｆＡ（すなわち、関連する野生型ＣｌｆＡ）ポリペプチド、その断片またはその融合タンパク質と比較して、フィブリノゲン結合活性が減少するように変異している。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＣｌｆＡコーティングプレートへのフィブリノゲン接着を測定する接着アッセイの結果を示すグラフである。ダイヤモンドマークの線はＣｌｆＡ Ｎ１２３の４７４変異体へのフィブリノゲン結合を示し、四角マークの線はＣｌｆＡ  Ｎ１２３の野生型へのフィブリノゲン結合を示す。
【図２】フィブリノゲンコーディングプレートへのＣｌｆＡ接着を測定する接着アッセイの結果を示すグラフである。暗いダイヤモンドマークの線はフィブリノゲンへのＣｌｆＡ  Ｎ１２３の野生型の結合を示し、明るいダイヤモンドマークの線はフィブリノゲンへのＣｌｆＡ  Ｎ１２３の４７４変異体の結合を示し、四角マークの線は陰性対照を示す。
【図３】ＣｌｆＡ  Ｎ１２３コーティングプレートへのフィブリノゲンの結合を阻害する、ＣｌｆＡ  Ｎ１２３の野生型および４７４変異体に対して作られた抗体の能力を示すグラフである。
【図４】ＣｌｆＡ  Ｎ１２３コーティングプレートへの黄色ブドウ球菌の結合を阻害する、ＣｌｆＡの野生型および４７４変異体に対して作られた抗体の能力を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、ＣｌｆＡポリペプチド、任意に、組換え型ＣｌｆＡポリペプチド、単離したＣｌｆＡポリペプチド、または精製したＣｌｆＡポリペプチドを提供し、その中のアミノ酸Ｙ４７４またはＹ４７４に隣接するアミノ酸は、Ｙ４７４またはＹ４７４に隣接するアミノ酸の変異を有しない同等のＣｌｆＡポリペプチドまたはその断片と比較して、フィブリノゲン結合活性が減少するように変異している。
【００１７】
このアミノ酸Ｙ４７４は、黄色ブドウ球菌株ＮＣＴＣ８３２５由来のＣｌｆＡの全長配列を表す配列番号３の４７４番目のアミノ酸である。同様に、全体として、本出願の中のアミノ酸の番号づけは配列番号３に関するので、アミノ酸４６４は、配列番号３の４６４番目のアミノ酸を表す。異なる株由来のＣｌｆＡ、またはＣｌｆＡの断片もしくは融合タンパク質を用いる場合において、Ｙ４７４は、配列番号３のＹ４７４と合わせたチロシン残基を表す。他のアミノ酸についての言及は、同様に、すなわち、配列番号３と合わせたアミノ酸に関して理解されるべきである。
【００１８】
Ｙ４７４に隣接するアミノ酸は、Ｙ４７４の隣のＮ末端側もしくはＣ末端側にあるアミノ酸か、またはＹ４７４に対してＮ末端側もしくはＣ末端側に２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個離れたアミノ酸のいずれ一方を表す。
【００１９】
「変異」とは、Ｙ４７４または隣接アミノ酸が異なるアミノ酸残基で置換されるか、もしくは除去されるか、または追加のアミノ酸がＹ４７４のＮ末端側もしくはＣ末端側のいずれか一方に挿入されるかのいずれかを意味する。
【００２０】
「同等のＣｌｆＡ」とは、この同等のＣｌｆＡが、４７４番目または４７４番目に隣接するアミノ酸の位置での変異（複数可）を除いて、本発明のＣｌｆＡポリペプチド、断片または融合タンパク質と同じアミノ酸配列を有することを意味する。
【００２１】
フィブリノゲン結合活性を、実施例２に記載のアッセイなどの接着アッセイを用いて測定することができる。本発明のＣｌｆＡポリペプチドはフィブリノゲン結合活性を有し、この活性は、このポリペプチドの大部分にわたって同一配列であるが、アミノ酸Ｙ４７４またはＹ４７４に隣接するアミノ酸の位置に野生型配列を有するＣｌｆＡポリペプチドのフィブリノゲン結合活性よりも弱い。
【００２２】
本発明の一実施形態において、本発明のＣｌｆＡポリペプチドは、アミノ酸Ｙ４７４またはＹ４７４にすぐ隣接するアミノ酸の位置で変異している。「Ｙ４７４にすぐ隣接する」とは、Ｙ４７４の隣のアミノ酸を表すことを意味する。任意に、すぐ隣接するアミノ酸残基の両方が変異している。
【００２３】
本発明の一実施形態において、このＣｌｆＡポリペプチドは、４７４番目のアミノ酸のチロシン残基が異なるアミノ酸で置換されることにより、４７４番目のアミノ酸に変異を含む。異なるアミノ酸は、もともとその位置に存在するアミノ酸以外の任意にアミノ酸である。異なるアミノ酸の例として、セリン、スレオニン、アスパラギンもしくはグルタミンなどの極性はあるが無電荷の残基、リジン、アルギニンもしくはヒスチジンなどの正電荷（塩基性）の残基、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸などの負電荷（酸性）の残基、システイン、グリシンもしくはプロリンなどの特別なアミノ酸、またはアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンもしくはバリンなどの別の疎水性残基が挙げられる。
【００２４】
本発明の一実施形態において、このＣｌｆＡポリペプチドは、塩基性アミノ酸、例えば、ヒスチジンへのＹ４７４の変異を含む。
【００２５】
本発明の一実施形態において、このＣｌｆＡポリペプチドを、Ｙ４７４に隣接するアミノ酸の置換によって変異させる。例えば、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３および／または４８４番目のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換される。
【００２６】
本発明の一実施形態において、Ｙ４７４と少なくとも１つの隣接アミノ酸の両方が、異なるアミノ酸で置換される。例えば、アミノ酸Ｙ４７４、ならびに４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３および／または４８４の少なくとも１つ（のアミノ酸）が異なるアミノ酸で置換される。例えば、Ｙ４７４を含む少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸が除去される。
【００２７】
本発明の一実施形態において、少なくともアミノ酸Ｙ４７４が、ＣｌｆＡポリペプチドのアミノ酸から除去される。例えば、Ｙ４７４が除去されるか、または４６４〜４７４、４６５〜４７４、４６６〜４７４、４６７〜４７４、４６８〜４７４、４６９〜４７４、４７０〜４７４、４７１〜４７４、４７２〜４７４、４７３〜４７４、４７４〜４７５、４７４〜４７６、４７４〜４７７、４７４〜４７８、４７４〜４７９、４７４〜４８０、４７４〜４８１、４７４〜４８２、４７４〜４８３、４７３〜４７５、４７２〜４７６、４７１〜４７７、４７０〜４７８または４６９〜４７９番目のアミノ酸が除去される。
【００２８】
本発明の一実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸が、このＣｌｆＡポリペプチドのＹ４７４に隣接するか、またはすぐ隣接する位置に挿入される。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸が、Ｙ４７４のＮ末端側またはＣ末端側のいずれか一方のＹ４７４に隣接する位置に挿入される。本発明の一実施形態において、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸が、Ｙ４７４のＮ末端側またはＣ末端側のいずれか一方のＹ４７４にすぐ隣接する位置に挿入される。
【００２９】
一実施形態において、本発明のＣｌｆＡポリペプチド、その断片またはその融合タンパク質は、Ｙ４７４またはＹ４７４に隣接するアミノ酸の変異を除いて同一のアミノ酸配列を有するＣｌｆＡポリペプチド、その断片またはその融合タンパク質が起こす免疫反応よりも防御性が高い免疫反応を引き起こすことができる。
【００３０】
本発明の一実施形態において、このＣｌｆＡポリペプチド、その断片またはその融合タンパク質は、フィブリノゲン結合活性を減少させる複数の変異を含む。例えば、４７４の変異は、ＣｌｆＡのＰ３３６および／またはＹ３３８の変異と組み合わせてもよい。
【００３１】
本発明のさらなる態様は、フィブリノゲン結合ドメインを含む、本発明のポリペプチドのうちのＣｌｆＡポリペプチドの断片を提供する。ＣｌｆＡのＮ１、Ｎ２およびＮ３ドメインはフィブリノゲン結合に関与し、Ｎ１ドメインは４０〜２２０番目のアミノ酸に、Ｎ２ドメインは２２１〜３６９番目のアミノ酸に、Ｎ３ドメインは３７０〜５５９番目のアミノ酸に存在する。これらのドメインは、もう１つの方法として、配列番号３のポリペプチド配列のわずかに短い断片と定義することができ、上記で述べたドメインサイズよりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０または２５個少ないアミノ酸を有している。
【００３２】
一実施形態において、本発明の断片はＮ３ドメインを含む。例えば、この断片は、配列番号３などのＣｌｆＡ配列の３７０〜５５９、３７０〜５５０、３７０〜５４５、３６５〜５５９、３６５〜５５０または３６５〜５４５番目のアミノ酸を含む。
【００３３】
一実施形態において、本発明の断片はＮ２ドメインを含む。例えば、この断片は、配列番号３などのＣｌｆＡ配列の２２１〜３６９、２１７〜３６９、２２９〜３６９、２１７〜３６４、２２１〜３６４、２２９〜３６４、２１７〜５４５、２２１〜５４５、２２９〜５４５、２１７〜５５０、２２１〜５５０、２２９〜５５０、２１７〜５５９、２２１〜５５９または２２９〜５５９番目のアミノ酸を含む。
【００３４】
一実施形態において、本発明の断片はＮ１ドメインを含む。例えば、この断片は、配列番号３などのＣｌｆＡ配列の４１〜２１６、４１〜２２０、４１〜２２８、４１〜３６９、４１〜３６４、４１〜５４５、４１〜５５０、２２１〜５５０または４１〜５５９番目のアミノ酸を含む。
【００３５】
本発明は、上記に記載の本発明のＣｌｆＡ断片を含むポリペプチドも包含する。かかるポリペプチドは、このポリペプチドの精製に有用な配列の付加、異種ポリペプチド由来の追加配列の付加を含み、融合タンパク質の形成をもたらす。この異種タンパク質は、黄色ブドウ球菌のタンパク質（特に、以下に記載のタンパク質）または異なる種由来のタンパク質であってもよい。
【００３６】
本発明は、本発明のＣｌｆＡポリペプチドの免疫原性断片、すなわち、配列番号３のポリペプチド配列を含むポリペプチドと同一または実質的に同一の免疫原性活性を有するＣｌｆＡポリペプチドの連続部分も提供する。すなわち、（必要ならば、担体と結合している時）この断片は、ＣｌｆＡポリペプチドを認識する免疫反応を引き起こすことができる。かかる免疫原性断片には、例えば、Ｎ末端リーダー配列、膜貫通ドメイン、および／またはＣ末端アンカードメインを欠くＣｌｆＡポリペプチドが含まれ得る。好ましい態様において、本発明によるＣｌｆＡの免疫原性断片は、実質的に、配列番号３のポリペプチドと、前記配列の全長にわたって、少なくとも８５％の同一性、好ましくは、少なくとも９０％の同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは、少なくとも９７〜９９％の同一性を有するポリペプチドの細胞外ドメインの全てを含む。
【００３７】
断片は、本発明の任意のポリペプチドの任意のアミノ酸配列の全部ではなく一部と完全に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。断片は「独立」しているか、または断片が一部または領域を形成する巨大ポリペプチド内に含まれるか、最も好ましくは、単一巨大ポリペプチド内の単一連続領域として含まれ得る。
【００３８】
好ましい断片には、例えば、アミノ末端のアミノ酸配列を含む連続した一連の残基などの、配列番号３またはその変異体のアミノ酸配列の一部を有する切断ポリペプチドが含まれる。宿主細胞によって、または宿主細胞内で産生される本発明のポリペプチドの分解型も好ましい。αヘリックス領域およびαヘリックス形成領域、βシート領域およびβシート形成領域、回転領域および回転形成領域、コイル領域およびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、フレキシブル領域、表面形成領域、基質結合領域、ならびに高い抗原指標領域を含む断片などの構造的または機能的特質によって特徴づけられる断片がさらに好ましい。
【００３９】
さらに好ましい断片には、配列番号３のアミノ酸配列に由来する少なくとも１５、２０、３０、４０、５０または１００個の連続アミノ酸を有するアミノ酸配列を含む単離したポリペプチドが含まれる。
【００４０】
本発明のさらなる実施形態は、本発明のＣｌｆＡポリペプチドまたは断片の融合タンパク質を提供する。かかる融合タンパク質は組換えで作製されてもよく、少なくとも２、３、４、５または６個のブドウ球菌タンパク質の一部、例えば、以下にまとめたブドウ球菌タンパク質の組み合わせを含んでもよい。あるいは、融合タンパク質は、少なくとも２、３、４または５個のブドウ球菌タンパク質の複数部分を含んでもよい。これらは、同一タンパク質内の異なるブドウ球菌タンパク質またはその断片を組み合わせてもよい。あるいは、本発明には、Ｔ細胞エピトープもしくは精製タグ、例えば、βガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＦＬＡＧ、ｍｙｃタグ、ポリヒスチジンなどのエピトープタグのプロバイダー、インフルエンザウイルス赤血球凝集素などのウイルス表面タンパク質、または破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７などの細菌タンパク質などの異種配列を有する融合タンパク質として、このＣｌｆＡポリペプチドまたはその断片の個々の融合タンパク質も含まれる。この融合タンパク質は、遊離タンパク質として免疫原性組成物中に存在してもよく、または糖類と結合した担体タンパク質であってもよい。
【００４１】
一実施形態において、本発明のＣｌｆＡのポリペプチド、断片、または融合タンパク質は、配列番号８〜４４から選択される対応する配列の長さにわたって、配列番号８〜４４のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチド
本発明のさらなる態様は、本発明のポリペプチド、断片または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００４３】
本発明のポリヌクレオチドは、ブドウ球菌種、例えば、黄色ブドウ球菌に由来する完全なゲノムＤＮＡを包含しない。
【００４４】
本発明のさらなる態様として、例えば、未処理のＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、Ｂ−ＤＮＡおよびＺ−ＤＮＡを含む、ＣｌｆＡのポリペプチドおよびポリヌクレオチドをコードする、かつ／または発現する単離した核酸分子を提供する。本発明のさらなる実施形態は、生物学的に、診断的に、予防的に、臨床的にまたは治療的に有用なポリヌクレオチドおよびポリペプチド、それらの変異体、ならびにそれらを含む組成物、好ましくは、免疫原性組成物を含む。
【００４５】
本発明の別の態様は、本発明のＣｌｆＡポリペプチドをコードする少なくとも１つの全長遺伝子を含む単離したポリヌクレオチド、およびそれと密接に関連するポリヌクレオチドならびにそれらの変異体に関する。
【００４６】
本発明の別の特に好ましい実施形態は、配列番号３〜４４から選択されるアミノ酸配列含むか、もしくはそれらからなる黄色ブドウ球菌に由来する本発明のＣｌｆＡポリペプチドまたはその変異体に関する。
【００４７】
さらなる態様において、本発明は、
（ａ）配列番号２のポリヌクレオチド配列の全長にわたって、配列番号２の全ての配列と少なくとも８５％の同一性、好ましくは、少なくとも９０％の同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の同一性、さらにより好ましくは、少なくとも９７、９８もしくは９９％または正確な同一性を有するポリヌクレオチド配列；または、
（ｂ）配列番号４〜４４のアミノ酸配列の全長にわたって、配列番号４〜４４から選択される任意のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性、好ましくは、少なくとも９０％の同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の同一性、さらにより好ましくは、少なくとも９７、９８もしくは９９％または１００％正確な同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列；
を含む、またはそれらからなる単離したポリヌクレオチドを提供する。
【００４８】
当技術分野で知られる「同一性」は、場合によっては、配列を比較することによって決定される２つ以上のポリペプチド配列間または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当技術分野において、「同一性」は、場合によっては、このような配列の鎖間の整合によって決定されるポリペプチド配列間またはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, Ｌｅｓｋ, Ａ.Ｍ., ｅｄ., Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ, １９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ, Ｓｍｉｔｈ, Ｄ.Ｗ., ｅｄ.,Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ, １９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ, Ｐａｒｔ Ｉ, Ｇｒｉｆｆｉｎ, Ａ.Ｍ., ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ, Ｈ.Ｇ., ｅｄｓ., Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ, Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ, １９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, ｖｏｎ Ｈｅｉｎｅ,Ｇ.,Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ,１９８７；ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ, Ｇｒｉｂｓｋｏｖ, Ｍ.ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ, Ｊ., ｅｄｓ., Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ, １９９１；ａｎｄ Ｃａｒｉｌｌｏ, Ｈ., ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ, Ｄ., ＳＩＡＭ Ｊ. Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ., ４８：１０７３（１９８８）に記載の方法を含むが、それらに限定されない公知の方法によって容易に計算することができる。
【００４９】
同一性を決定するための方法は、調べる配列間で最大の整合性が得られるようにデザインされる。さらに、同一性を決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータープログラムで分類される。２つの配列間の同一性を決定するコンピュータープログラムの方法は、ＧＣＧプログラムパッケージの中のＧＡＰプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ, Ｊ., ｅｔ ａｌ., Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ, Ｓ.Ｆ. ｅｔ ａｌ., Ｊ.Ｍｏｌｅｃ. Ｂｉｏｌ. ２１５：４０３−４１０（１９９０）、およびＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ ８５；２４４４−２４４８（１９８８）を含むが、これらに限定されない。プログラムのＢＬＡＳＴファミリーは、ＮＣＢIおよび他の供給源から公的に入手可能である（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ, Ａｌｔｓｃｈｕｌ, Ｓ., ｅｔ ａｌ., ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ, ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ, Ｓ., ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. ２１５：４０３−４１０（１９９０））。公知のスミス−ウォーターマンアルゴリズムを用いて同一性を決定してもよい。
【００５０】
ポリペプチド配列比較のためのパラメータには、以下のものが含まれる：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ,Ｊ.Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ.４８：４４３−４５３（１９７０）
比較行列：ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ.Ｓｃｉ. ＵＳＡ.８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）のＢＬＯＳＳＵＭ６２
ギャップペナルティ：８
ギャップ長ペナルティ：２
これらのパラメータを用いるのに有用なプログラムは、ウィスコンシン州マディソンにあるＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐの「ｇａｐ」プログラムとして公的に入手可能である。前述のパラメータは、ペプチド比較のデフォルトパラメータである（末端ギャップに対するペナルティはなし）。
【００５１】
ポリヌクレオチド比較のためのパラメータには以下のものが含まれる：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ, Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. ４８：４４３−４５３（１９７０）
比較行列：整合＝＋１０、不整合＝０
ギャップペナルティ：５０
ギャップ長ペナルティ：３
ウィスコンシン州マディソンにあるＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐの「ｇａｐ」プログラムとして入手可能である。これらは、核酸比較のデフォルトパラメータである。
【００５２】
本発明は、実施例４に記載のコード配列（オープンリーディングフレーム）と、その全長にわたって同一であるポリヌクレオチド配列を提供する。本発明は、成熟ポリペプチドまたはその断片のコード配列それ自体、ならびにリーダー配列もしくは分泌配列、プレタンパク質配列、プロタンパク質配列もしくはプレプロタンパク質配列をコードする配列などの別のコード配列を有する読み枠内の成熟ポリペプチドまたは断片のコード配列も提供する。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、転写はされるが翻訳されない配列などの少なくとも１つの５’および３’非コード配列、（ｒｈｏ依存的およびｒｈｏ非依存的な終止シグナルなどの）終止シグナル、リボソーム結合部位、コザック配列、ｍＲＮＡを安定化させる配列、イントロン、ならびにポリアデニル化シグナルを含むが、これらに限定されない少なくとも１つの非コード配列も含んでもよい。このポリヌクレオチド配列は、追加のアミノ酸をコードする追加のコード配列も含んでもよい。例えば、融合ポリペプチドの精製を促進させるマーカー配列をコードすることができる。本発明のいくつかの実施形態において、このマーカー配列は、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ社）に備えられ、Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ., ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載の６つのヒスチジンペプチド、またはＨＡペプチドタグ（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ.,Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４））であり、これらの両方とも、それらに融合したポリペプチド配列を精製するのに有用であり得る。本発明のポリヌクレオチドは、構造遺伝子および遺伝子発現を制御するその天然の関連配列を含むポリヌクレオチドも含むが、これらに限定されない。
【００５３】
本発明は、さらに、実施例４の配列のいずれかの推定アミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体をコードする、本明細書に記載のポリヌクレオチドの変異体に関する。本発明のポリヌクレオチドの断片を用いて、例えば、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成してもよい。
【００５４】
好ましい断片は、Ｂ細胞またはＴヘルパーエピトープ、ならびに前記ポリヌクレオチド断片を含む組換え型キメラ遺伝子をコードするそれらのポリヌクレオチドである。
【００５５】
さらなる特定の好ましい実施形態は、ＣｌｆＡ変異体をコードし、実施例４の全ての配列のＣｌｆＡポリペプチドのアミノ酸配列を有するポリヌクレオチドであり、その中のいくつか、数個、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１個または０個のアミノ酸残基は、任意の組み合わせで、置換され、修飾され、除去され、かつ／または付加される。これらの中で、ＣｌｆＡポリプチドの特性および活性を変えないサイレントな置換、付加および除去が特に好ましい。
【００５６】
本発明のさらに好ましい実施形態は、実施例４の配列のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するＣｌｆＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドの全長にわたって少なくとも８５％同一であるポリヌクレオチド、およびかかるポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである。あるいは、ＣｌｆＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドの全長にわたって少なくとも９０％同一である領域を含むポリヌクレオチド、およびそれらと相補的なポリヌクレオチドが非常に好ましい。この関連で、ＣｌｆＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドの全長にわたって少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチドが特に好ましい。さらに、少なくとも９７％の同一性を有するポリヌクレオチドは、少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドの中でもより好ましく、これらの中でも、少なくとも９８％および少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドは、特により好ましく、少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドがさらに好ましい。
【００５７】
好ましい実施形態は、実施例４から選択されるＤＮＡ配列がコードする成熟ポリペプチドと同じ生物学的な機能または活性を実質的に保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００５８】
本発明の特定の好ましい実施形態によると、特に、ストリンジェントな条件下で、実施例４のＣｌｆＡポリヌクレオチドなどのＣｌｆＡポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。
【００５９】
本発明は、さらに、本明細書に提供するポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この点において、本発明は、特に、ストリンジェントな条件下で、本明細書に記載のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用する「ストリンジェントな条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、配列間で少なくとも９５％、好ましくは、少なくとも９７％の同一性がある場合のみに生じるハイブリダイゼーションを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の特定例として、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性し、剪断したサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、４２℃にて一晩インキュベーションし、その後、ハイブリダイゼーション支持体を０．１×ＳＳＣで、約６５℃にて洗浄することが挙げられる。ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ, ｅｔ ａｌ., Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ,Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ, Ｎ.Ｙ.,（１９８９）、特に、この中の１１章に例証されている。溶液ハイブリダイゼーションを、本発明が提供するポリヌクレオチド配列と共に用いてもよい。
【００６０】
本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、実施例４の配列のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列の完全な遺伝子を含む適切なライブラリーを、実施例４の対応する配列に記載の前記ポリヌクレオチド配列の配列、またはその断片を有するプローブでスクリーニングし、かつ前記ポリヌクレオチド配列を単離することによって得られるポリヌクレオチド配列からなる、またはそれを含むポリヌクレオチドも提供する。このようなポリヌクレオチドを取得するのに有用な断片には、例えば、本明細書のどこかに十分に記載するプローブおよびプライマーが含まれる。
【００６１】
本発明のポリヌクレオチドアッセイに関して本明細書のどこかで論じるように、例えば、本発明のポリヌクレオチドを、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとして用いて、ＣｌｆＡをコードする全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離することができ、かつこのＣｌｆＡ遺伝子に高い同一性、特に高い配列同一性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離することができる。かかるプローブは、一般に、少なくとも１５個のヌクレオチド残基または塩基対を含む。好ましくは、かかるプローブは少なくとも３０個のヌクレオチド残基または塩基対を有し、少なくとも５０個のヌクレオチド残基または塩基対を有してもよい。特に好ましいプローブは、少なくとも２０個のヌクレオチド残基または塩基対を有し、３０個未満のヌクレオチド残基または塩基対を有する。
【００６２】
本発明は、（例えば、成熟型が２つ以上のポリペプチド鎖を有する時に、）成熟タンパク質＋アミノ末端もしくはカルボキシル末端の追加のアミノ酸、またはこの成熟ポリペプチドの内部のアミノ酸であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。かかる配列は、前駆体から成熟型へのタンパク質のプロセシングの役割を果たし、タンパク質輸送を可能にし、タンパク質の半減期を長くもしくは短くするか、またはとりわけ、アッセイもしくは産生するためのタンパク質の操作を容易にすることができる。一般的に、インビボの場合、この追加のアミノ酸は、細胞の酵素によって成熟タンパク質からプロセシングされ、取り除かれ得る。
【００６３】
本発明の各々のおよび全てのポリヌクレオチドに対して、それと相補的なポリヌクレオチドを提供する。これらの相補的なポリヌクレオチドは、それらが相補的な各々のポリヌクレオチドと完全に相補的であることが好ましい。
【００６４】
本発明の態様に従って、治療的または予防的な目的での、特定の遺伝子免疫における本発明のポリヌクレオチドの使用を提供する。
【００６５】
遺伝子免疫における本発明のポリヌクレオチドの使用は、好ましくは、プラスミドＤＮＡの筋肉内への直接注射（Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ., Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ（１９９２）１：３６３, Ｍａｎｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ., Ｈｕｍ. Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ.（１９８３）４：４１９）、特定のタンパク質担体と複合体を形成させたＤＮＡの送達（Ｗｕ ｅｔ ａｌ.,Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ.（１９８９）２６４：１６９８５）、ＤＮＡとリン酸カルシウムとの共沈殿（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ＆Ｒｅｓｈｅｆ, ＰＮＡＳ ＵＳＡ,（１９８６）８３：９５５１）、様々な形態のリポソームへのＤＮＡの封入（Ｋａｎｅｄａ ｅｔ ａｌ., Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４３：３７５）、微粒子銃（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）３５６：１５２, Ｅｉｓｅｎｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ., ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９９３）１２：７９１）およびクローン化したレトロウイルスベクターを用いるインビボ感染（Ｓｅｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ., ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１９８４）８１：５８４９）などの適切な送達法を用いる。
【００６６】
ベクター、宿主細胞、発現系
本発明は、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作した宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生にも関する。無細胞翻訳系を用いて、本発明のＤＮＡコンストラクト由来のＲＮＡを用いてかかるタンパク質を産生することもできる。
【００６７】
本発明の組換えポリペプチドは、当該技術者に公知の方法によって、発現系を含む遺伝子操作した宿主細胞から調製することができる。したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む発現系、かかる発現系を用いて遺伝子操作した宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に関する。
【００６８】
本発明のポリペプチドの組換え産生のために、宿主細胞を遺伝子操作して、発現系もしくはその一部または本発明のポリヌクレオチドを組込むことができる。この宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は、Ｄａｖｉｓ, ｅｔ ａｌ.,ＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ,（１９８６）およびＳａｍｂｒｏｏｋ,ｅｔ ａｌ., ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ, ２ｎｄ Ｅｄ., Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ, Ｎ.Ｙ.（１９８９）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載の方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、接合、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）法、弾丸導入および感染によって達成され得る。
【００６９】
適切な宿主の代表例として、連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、大腸菌、ストレプトマイセス、シアノバクテリア、枯草菌、髄膜炎菌、インフルエンザ菌およびカタル球菌の細胞などの細菌細胞、酵母、クリベロマイセス、サッカロマイセス、ピチア、担子菌、カンジダ・アルビカンスおよびアスペルギルスの細胞などの真菌細胞、ショウジョウバエＳ２およびスポドプテラＳｆ９の細胞などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３、ＣＶ−１およびＢｏｗｅｓメラノーマの細胞などの動物細胞、ならびに裸子植物または被子植物の細胞などの植物細胞が挙げられる。
【００７０】
多種多様な発現系を用いて、本発明のポリペプチドを産生することができる。かかるベクターには、特に、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、トランスポゾン由来のベクター、酵母エピソーム由来のベクター、挿入因子由来のベクター、酵母染色体エレメント由来のベクター、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ピコルナウイルス、レトロウイルスおよびアルファウイルスなどのウイルス由来のベクター、ならびにプラスミドおよび（コスミドおよびファージミドなどの）バクテリオファージ遺伝因子由来のベクターなどのこれらの組み合わせ由来のベクターが含まれる。これらの発現系コンストラクトは、発現を調節し、かつ発現を生じさせる制御領域を含んでもよい。一般に、宿主においてポリヌクレオチドを維持するか、増やすか、もしくは発現させるのに適し、かつ／またはポリペプチドを発現させるのに適する任意の系またはベクターを、この点に関して、発現に用いることができる。適切なＤＮＡ配列を、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ., ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ, Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（上記）に記載の技術などの様々な公知の、日常的な技術のいずれかによって、この発現系に挿入することができる。
【００７１】
真核生物の組換え発現系において、翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔に、細胞膜周辺腔に、または細胞外環境に分泌させるために、適切な分泌シグナルをこの発現ポリペプチドに組み入れることができる。これらのシグナルはこのポリペプチドに対して内因性であってもよく、またはそれらは異種シグナルであってもよい。
【００７２】
本発明のポリペプチドを、硫酸アンモニウム沈殿もしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む公知の方法によって、組換え細胞培養から回収および精製することができる。最も好ましくは、イオン金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）が精製に用いられる。このポリペプチドが細胞内合成、単離および／または精製中に変性する場合には、タンパク質をリフォールディングさせる公知の技術を用いて、活性型高次構造を再び作ることができる。
【００７３】
この発現系は、ウイルスまたは細菌などの組換え型の生きた微生物であってもよい。目的とする遺伝子を、生きた組換え型ウイルスまたは組換え型細菌のゲノムに挿入することができる。この生きたベクターを用いた接種およびインビボ感染は、抗原のインビボ発現および免疫反応の誘導をもたらす。この目的に用いられるウイルスおよび細菌は、例えば、ボックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、カナリアポックス）、アルファウイルス（シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、ライノウイルス）、ヘルペスウイルス（水痘帯状疱疹ウイルスなど）、リステリア、サルモネラ、シゲラ、ＢＣＧ、連鎖球菌である。これらのウイルスおよび細菌は病原性があるか、または生ワクチンを取得するために様々な方法で弱毒化され得る。このような生ワクチンも本発明の一部をなす。
【００７４】
免疫原性組成物におけるＣｌｆＡおよび追加抗原の組み合わせ
本発明のさらなる態様は、組み合わせた時、ブドウ球菌感染に対する効果的な免疫原性組成物をもたらすブドウ球菌抗原の特定の組み合わせを開示する。この免疫原性組成物の有効性は、主に、黄色ブドウ球菌に対する防御反応を引き起こすその能力によって決定されるが、それらの免疫原性組成物は、表皮ブドウ球菌などの関連細菌に対する防御効果も生じさせることが好ましい。
【００７５】
ブドウ球菌抗原の好ましい組み合わせは、免疫原性組成物またはワクチンに組み合わせる場合、異なるブドウ球菌の機能がこの免疫反応によって標的にされることを可能にする。このような免疫反応は、ブドウ球菌感染をさらに望ましく治療または予防することができる。例えば、既知の病原性因子には、ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、ＳａｓＡ、ＳａｓＢ、ＳａｓＣ、ＳａｓＤ、ＳａｓＥ、ＳａｓＦ、ＳａｓＧ、ＦｎｂｐＡおよびＦｎｂｐＢのようなアドヘシンが含まれ、これらは、宿主細胞へのブドウ球菌の付着に関わる。ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢなどの毒素は宿主の免疫系を無能にするのに関与し、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣおよびＩｓｄＨは、鉄スカベンジャーの機能を果たす。
【００７６】
特に、異なるクラスの特定抗原の組み合わせは、これらのいくつかは宿主細胞への接着に関与し、これらのいくつかは鉄獲得に関与し、これらのいくつかはオートトランスポーターであり、これらのいくつかは毒素であるが、感染を持続させるのに必要とされるブドウ球菌の複数機能に対して防御する免疫反応を引き起こすことができる。このような抗原の組み合わせは、細菌の２つ以上の機能がこの免疫反応によって標的にされる場合、驚くほど、ブドウ球菌感染に対するワクチンの有効性の改善をもたらすことができる。好ましくは、このワクチンの有効性の改善は、黄色ブドウ球菌および／または表皮ブドウ球菌に対するものである。
【００７７】
本発明のさらなる態様は、本発明のＣｌｆＡポリペプチド、その断片またはその融合タンパク質を含み、さらに、ブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質またはその断片を含む免疫原性組成物を提供する。一実施形態において、この細胞外成分結合タンパク質は、ラミニン受容体、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、自己溶菌酵素、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、リパーゼＧｅｈＤ、ＳａｓＡ、ＳａｓＢ、ＳａｓＣ、ＳａｓＤ、ＳａｓＥ、ＳａｓＦ、ＳａｓＧ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、Ｃｎａ、ＣｌｆＢ、ＦｂｐＡ、Ｎｐａｓｅ、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＳｓａＡ、ＥＰＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノゲン結合タンパク質、コアグラーゼ、ＦｉｇおよびＭＡＰからなる群から選択される。
【００７８】
細胞外成分結合タンパク質は、宿主の細胞外成分に結合するタンパク質である。この用語はアドヘシンを含むが、これに限定されない。配列を含む細胞外結合成分についての詳細は、ＷＯ０７／１１３２２２、ＷＯ０８／１９１６２、ＥＰ１６３６２３、ＷＯ０５／１１６０６４、ＵＳ６００８３４１、ＷＯ９９／２７１０９、ＷＯ９７／４８７２７、ＷＯ０２／５９１４８、ＷＯ０５／１１５１１３、ＷＯ０６／１２１６６４、ＷＯ０７／０１３６１で見つかる。
【００７９】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、さらに、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣおよびＨａｒＡからなる群から選択されるブドウ球菌トランスポータータンパク質またはその断片を含む。ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣおよびＨａｒＡまたはＩｓｄＨについては、ＷＯ０７／１１３２２２、ＷＯ０８／１９１６２、ＷＯ０８／１５２４４７およびＷＯ０６／５９２４７に記載されている。
【００８０】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、さらに、ＲＮＡ ＩＩＩ活性化タンパク質（ＲＡＰ）、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢまたはＥｓｘＡとＥｓｘＢ、ＥｓａＣとＥｓａＢの組み合わせからなる群から選択されるブドウ球菌の病原性調節因子、毒素またはその断片を含む。これらの病原性調節因子および毒素については、ＷＯ０７／１１３２２２、ＷＯ０８／１９１６２、ＷＯ０７／１４５６８９、ＷＯ０５／０９３９６、ＷＯ１０／１４３０４およびＷＯ０２／５９１４８に記載されている。
【００８１】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、任意に、黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌のタンパク質である追加的ブドウ球菌タンパク質を含む。一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、さらに、ＷＯ０６／３２４７５またはＷＯ０７／１１３２２２に記載のタンパク質の１つ以上を、任意にその中に記載されている配列（参照により組込まれる）またはそれらの免疫原性断片と共に含む。これらのタンパク質の多くが、細胞外成分結合タンパク質、トランスポータータンパク質または毒素および病原性調節因子のカテゴリーに分類される。本発明の免疫原性組成物は、任意に、さらに、ブドウ球菌の細胞外成分結合タンパク質、ブドウ球菌のトランスポータータンパク質またはブドウ球菌の毒素もしくは病原性調節因子を含む。本発明の免疫原性組成物は、任意に、少なくともまたは正確に、１、２、３、４、５もしくは６つのブドウ球菌タンパク質を含む。
【００８２】
本発明の好ましい免疫原性組成物は、ブドウ球菌内で異なる機能を有する少なくとも２つの異なるタンパク質のカテゴリーから選択される複数のタンパク質を含む。タンパク質のかかるカテゴリーの例として、細胞外結合タンパク質、鉄獲得タンパク質などのトランスポータータンパク質、毒素または病原性調節因子および他の免疫優勢タンパク質が挙げられる。
【００８３】
好ましい実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、さらに、
グループａ）細胞外成分結合タンパク質；
グループｂ）トランスポータータンパク質；
グループｃ）毒素または病原性調節因子
グループｄ）構造タンパク質
から選択される２、３または４つの異なるグループから選択される２、３、４、５または６以上のいくつかのタンパク質を含む。
【００８４】
好ましい実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、さらに、以下のグループの２、３または４から選択される２、３、４、５または６以上のいくつかのタンパク質を含む：
グループａ）ラミニン受容体、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、ＳａｓＦ、リパーゼＧｅｈＤ、ＳａｓＡ、ＳａｓＢ、ＳａｓＣ、ＳａｓＤ、ＳａｓＫ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、Ｃｎａ、ＣｌｆＢ、ＦｂｐＡ、Ｎｐａｓｅ、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＳｓａＡ、ＥＰＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノゲン結合タンパク質、コアグラーゼ、ＦｉｇおよびＭＡＰからなる群から選択される少なくとも１つのブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質またはその断片；
グループｂ）免疫優性ＡＢＣトランスポーター、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、Ｍｇ２＋トランスポーター、ＨａｒＡ、ＳｉｔＣおよびＮｉ ＡＢＣトランスポーターからなる群から選択される少なくとも１つのブドウ球菌トランスポータータンパク質またはその断片；
グループｃ）ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、ＲＮＡ ＩＩＩ活性化タンパク質（ＲＡＰ）からなる群から選択される少なくとも１つのブドウ球菌の病原性調節因子、毒素またはその断片；
グループｄ）ＭＲＰＩＩおよび自己溶菌酵素からなる群から選択される少なくとも１つのブドウ球菌構造タンパク質またはその免疫原性断片。
【００８５】
本発明の免疫原性組成物中に存在する任意の組み合わせには、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢとＥｓａＣ；ＳｄｒＣ、ＩｓｄＡとＥｓａＣ；ＩｓｄＡとＥｓｘＡ；ＩｓｄＢとＥｓｘＡ；ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢとＥｓｘＡ；ＳｄｒＣ、ＩｓｄＡとＥｓｘＡ；ＣｌｆＡ、ＩｓｄＡとＥｓｘＢ；ＩｓｄＢとＥｓｘＢ；ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢとＥｓｘＢ；ＳｄｒＣ、ＩｓｄＡとＥｓｘＢ；ＳｄｒＤ、ＩｓｄＡとＩｓｄＢ；ＳｄｒＣ、ＩｓｄＡとＩｓｄＢ；ＳｄｒＥ、ＩｓｄＡとＩｓｄＢ；ＳｄｒＧ、ＩｓｄＡとＩｓｄＢ；ＩｓｄＡとＩｓｄＢ；ＣｌｆＢ、ＩｓｄＡとＩｓｄＢ；ＥｓａＣとＩｓｄＡ；ＥｓａＣとＩｓｄＢ；ＥｓａＣとＥｓｘＡ；ＥｓａＣとＥｓｘＢ；ＥｓａＣとＳｄｒＣが含まれる。
【００８６】
糖類
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、ブドウ球菌の糖抗原および変異ＣｌｆＡポリペプチドを含む。例えば、この免疫原性組成物は、任意に担体タンパク質に結合している黄色ブドウ球菌の５型および／または８型の莢膜糖類を含む。
【００８７】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、任意に担体タンパク質に結合しているＰＮＡＧを含む。任意に、このＰＮＡＧは、５０％、４０％、３０％、２０％または１０％未満がＮアセチル化されている。
【００８８】
一実施形態において、この免疫原性組成物は、表皮ブドウ球菌の３３６抗原またはＩ型、ＩＩ型もしくはＩＩ型の莢膜糖類を含む。
【００８９】
ポリＮ−アセチル化グルコサミン（ＰＮＡＧ）
ＰＮＡＧは多糖細胞間アドヘシンであり、任意に、Ｎ−アセチルおよび／またはＯ−スクシニル構成要素で置換されたβ−（１→６）結合グルコサミンのポリマーで構成されている。この多糖は黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌の両方に存在し、いずれかの供給源から単離することができる（Ｊｏｙｃｅ ｅｔ ａｌ ２００３, Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３８；９０３；Ｍａｉｒａ−Ｌｉｔｒａｎ ｅｔ ａｌ ２００２,Ｉｎｆｅｃｔ.Ｉｍｕｎ.７０；４４３３）。例えば、ＰＮＡＧは、黄色ブドウ球菌株ＭＮ８ｍから単離することができる（ＷＯ０４／４３４０７）。ｄＰＮＡＧの調製については、ＷＯ０４／４３４０５に記載されている。
【００９０】
以前にポリ−Ｎ−スクシニル−β−（１→６）−グルコサミン（ＰＮＳＧ）として知られた多糖は、Ｎ−スクシニル化の同定が不正確であったため、予想される構造を持たないことが最近示された（Ｍａｉｒａ−Ｌｉｔｒａｎ ｅｔ ａｌ ２００２, Ｉｎｆｅｃｔ. Ｉｍｕｎ. ７０；４４３３）。したがって、正式にはＰＮＳＧとして知られ、現在はＰＮＡＧであると判明した多糖も、ＰＮＡＧという用語に包含される。
【００９１】
ＰＮＡＧは、４００ｋＤａ超、７５〜４００ｋＤａ、１０〜７５ｋＤａのサイズから、（任意に、Ｎ−アセチルおよびＯ−スクシニル構成要素で置換されたβ−（１→６）結合グルコサミンの）最高で３０個の反復単位で構成されるオリゴ糖にまで変化する異なるサイズのものであってもよい。ＰＮＡＧ多糖またはオリゴ糖の全てのサイズを、本発明の免疫原性組成物に用いることができ、例えば、４０ｋＤａ超のサイズを用いることができる。サイズ化は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、微小流動化、超音波照射または化学的切断によって達成することができる（ＷＯ０３／５３４６２、ＥＰ４９７５２４、ＥＰ４９７５２５）。
【００９２】
ＰＮＡＧのサイズ範囲は、例えば、４０〜４００ｋＤａ、５０〜３５０ｋＤａ、４０〜３００ｋＤａ、６０〜３００ｋＤａ、５０〜２５０ｋＤａおよび６０〜２００ｋＤａである。
【００９３】
ＰＮＡＧは、酢酸によるアミノ基上での置換により、アセチル化の程度が異なり得る。インビトロで生成したＰＮＡＧは、ほぼ完全にアミノ基上で置換されている（９５〜１００％）。あるいは、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％または５％未満のＮ−アセチル化を有する脱アセチル化ＰＮＡＧを用いることができる。脱アセチル化ＰＮＡＧの使用により、グラム陽性細菌、任意に、黄色ブドウ球菌および／または表皮ブドウ球菌（ＷＯ０４／４３４０５）のオプソニン殺傷が可能になる。一実施形態において、このＰＮＡＧは、４０ｋＤａ〜３００ｋＤａの間のサイズを有し、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％または５％未満のアミノ基がＮ−アセチル化されるように脱アセチル化される。
【００９４】
一実施形態において、このＰＮＡＧはＯ−スクシニル化されていないか、または２５、２０、１５、１０、５、２、１または０．１％未満の残基上でＯ−スクシニル化されている。
【００９５】
脱アセチル化ＰＮＡＧ（ｄＰＮＡＧ）という用語は、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％または５％未満のアミノ基がアセチル化されたＰＮＡＧの多糖またはオリゴ糖を表す。
【００９６】
本明細書で使用するＰＮＡＧという用語は、糖類のアセチル化形態および脱アセチル化形態の両方を包含する。
【００９７】
一実施形態において、ＰＮＡＧは脱アセチル化され、天然多糖を化学的に処理することによってｄＰＮＡＧを形成する。例えば、天然のＰＮＡＧを、ｐＨが１０以上に上昇するように塩基溶液で処理する。例えば、このＰＮＡＧを、０．１〜５Ｍ、０．２〜４Ｍ、０．３〜３Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．７５〜１．５Ｍもしくは１ＭのＮａＯＨ、ＫＯＨまたはＮＨ４ＯＨで処理する。処理は、２０〜１００、２５〜８０、３０〜６０、３０〜５０または３５〜４５℃の温度で、少なくとも１０もしくは３０分間、または１、２、３、４、５、１０、１５もしくは２０時間ある。ｄＰＮＡＧは、ＷＯ０４／４３４０５に記載される通りに調製され得る。
【００９８】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物に含まれる多糖（複数可）は、以下に記載の担体タンパク質に結合しているか、あるいは結合してない。
【００９９】
黄色ブドウ球菌由来の５型多糖および８型多糖
ヒトに感染を引き起こす黄色ブドウ球菌のほとんどの株は、５型多糖または８型多糖のいずれか一方を含む。ヒト株の約６０％が８型であり、約３０％が５型である。５型および８型の莢膜多糖抗原の構造については、Ｍｏｒｅａｕ ｅｔ ａｌ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ. ２０１；２８５（１９９０）およびＦｏｕｒｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ Ｉｎｆｅｃｔ. Ｉｍｍｕｎ. ４５；８７（１９８４）に記載されている。両方ともそれらの反復単位中にＦｕｃＮＡｃｐおよびＭａｎＮＡｃＡを有し、ＭａｎＮＡｃＡはスルフヒドリル基を導入するために用いることができる。
【０１００】
最近（Ｊｏｎｅｓ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４０、１０９７−１１０６（２００５）)、ＮＭＲ分光法によりこれらの莢膜多糖の構造が以下のように修正された：
５型
→４）−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ−（１→４）−α−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ（３ＯＡｃ）−（１→３）−β−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→
８型
→３）−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ（４ＯＡｃ）−（１→３）−α−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ（１→３）−α−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ（１→
多糖は、例えば、米国特許第６２９４１７７号またはＩｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９０）５８（７）；２３６７に記載の通りに、当該技術者に公知の方法を用いて、黄色ブドウ球菌の適切な株から抽出することができる。例えば、ＡＴＣＣ１２９０２は５型黄色ブドウ球菌株であり、ＡＴＣＣ１２６０５は、８型黄色ブドウ球菌株である。
【０１０１】
多糖類は天然サイズのものであるか、あるいは、例えば、微小流動化、超音波照射または化学的処理によってサイズ化され得る。本発明は、黄色ブドウ球菌の５型多糖および８型多糖に由来するオリゴ糖も対象とする。
【０１０２】
糖類の重量平均分子量は、１０００〜２００００００、５０００〜１００００００、１００００〜５０００００、５００００〜４０００００、７５０００〜３０００００、または１０００００〜２０００００であり得る。本明細書に記載の糖類の分子量または平均分子量は、結合前に測定された糖類の重量平均分子量（Ｍｗ）を表し、ＭＡＬＬＳによって測定される。このＭＡＬＬＳ技術は当該技術分野で公知であり、典型的には、実施例２に記載の通りに実行される。糖類のＭＡＬＬＳ分析には、２つのカラム（ＴＳＫＧ６０００および５０００ＰＷｘｌ）を組み合わせて用いることができ、糖類を水中に溶出させる。糖類を、光散乱検出器（例えば、４８８ｎｍでの１０ｍＷのアルゴンレーザーを備えるＷｙａｔｔ Ｄａｗｎ ＤＳＰ）および干渉屈折計（例えば、Ｐ１００セルおよび４９８ｎｍでの赤色フィルターを備えたＷｙａｔｔ Ｏｔｉｌａｂ ＤＳＰ）を用いて検出する。一実施形態において、糖類の多分散性は、１〜１．５、１〜１．３、１〜１．２、１〜１．１または１〜１．０５であり、担体タンパク質への結合後には、この複合体の多分散性は、１．０〜２．５、１．０〜２．１．０〜１．５、１．０〜１．２、１．５〜２．５、１．７〜２．２または１．５〜２．０である。全ての多分散性測定はＭＡＬＬＳによる。
【０１０３】
本発明の免疫原性組成物中に含まれる５型および／もしくは８型の莢膜多糖またはオリゴ糖は、Ｏ−アセチル化されている。一実施形態において、５型の莢膜多糖またはオリゴ糖のＯ−アセチル化の程度は、１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％、６０〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％または８０〜９０％である。一実施形態において、８型の莢膜多糖またはオリゴ糖のＯ−アセチル化の程度は、１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％、６０〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％または８０〜９０％である。一実施形態において、５型および８型の莢膜多糖またはオリゴ糖のＯ−アセチル化の程度は、１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％、６０〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％または８０〜９０％である。
【０１０４】
この多糖またはオリゴ糖のＯ−アセチル化の程度を、当該技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、プロトンＮＭＲ（Ｌｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ １９９６, Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓａｒｃｈ ２９６；８３−９６, Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｌｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒ ２００２, Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ３０；１２３３−１２４７、ＷＯ０５／０３３１４８またはＷＯ００／５６３５７）によって決定することができる。さらに一般的に用いられる方法は、Ｈｅｓｔｒｉｎ（１９４９）Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.１８０；２４９−２６１に記載されている方法である。
【０１０５】
Ｏ−アセチル基を加水分解によって、例えば、無水ヒドラジンなどの塩基での処理（Ｋｏｎａｄｕ ｅｔ ａｌ １９９４；Ｉｎｆｅｃｔ. Ｉｍｍｕｎ. ６２；５０４８−５０５４）または１〜８時間、０．１ＮのＮａＯＨでの処理によって除去することができる。５型および／または８型の多糖またはオリゴ糖上で高レベルのＯ−アセチル化を維持するために、Ｏ−アセチル基の加水分解をもたらす処理を最小限にする。例えば、極端なｐＨでの処理を最小限にする。
【０１０６】
本発明の免疫原性組成物中に含まれる５型および８型の多糖は、任意に、以下に記載の担体タンパク質に結合しているか、あるいは結合してない。
【０１０７】
あるいは、本発明の免疫原性組成物は、５型多糖または８型多糖のいずれか一方を含む。
【０１０８】
黄色ブドウ球菌３３６抗原
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、米国特許第６２９４１７７号に記載の黄色ブドウ球菌３３６抗原を含む。
【０１０９】
この３３６抗原はβ結合ヘキソサミンを含み、Ｏ−アセチル基を含まず、ＡＴＣＣ５５８０４の登録番号で寄託された３３６型黄色ブドウ球菌に対する抗体に特異的に結合する。
【０１１０】
一実施形態において、この３３６抗原は天然サイズのものであるか、あるいは、例えば、微小流動化、超音波照射または化学的処理によってサイズ化され得る多糖である。本発明は、３３６抗原由来のオリゴ糖も対象である。
【０１１１】
本発明の免疫原性組成物中に含まれる３３６抗原は、任意に、以下に記載の担体タンパク質に結合しているか、あるいは結合してない。
【０１１２】
表皮ブドウ球菌のＩ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型の多糖
表皮ブドウ球菌のＡＴＣＣ−３１４３２株、ＳＥ−３６０株およびＳＥ−１０株は、それぞれ、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型の３つの異なる莢膜型の特徴を示す（Ｉｃｈｉｍａｎ ａｎｄ Ｙｏｓｈｉｄａ １９８１, Ｊ. Ａｐｐｌ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ. ５１；２２９）。表皮ブドウ球菌の各血清型から抽出された莢膜多糖は、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型の多糖を構成する。多糖類は、米国特許第４１９７２９０号に記載の方法またはＩｃｈｉｍａｎ ｅｔ ａｌ １９９１, Ｊ. Ａｐｐｌ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ. ７１；１７６に記載の方法を含むいくつかの方法によって抽出され得る。
【０１１３】
本発明の一実施形態において、この免疫原性組成物は、表皮ブドウ球菌のＩ型および／もしくはＩＩ型および／もしくはＩＩＩ型の多糖またはオリゴ糖を含む。
【０１１４】
多糖類は天然サイズのものであるか、あるいは、例えば、微小流動化、超音波照射または化学的切断によってサイズ化され得る。本発明は、表皮ブドウ球菌から抽出されたオリゴ糖も対象である。
【０１１５】
これらの多糖類は結合していないか、または、任意に、以下に記載の通りに結合している。
【０１１６】
多糖類の結合
ワクチン接種における多糖類の使用に関連する問題の中に、多糖類それ自体が弱い免疫原であるという事実がある。この免疫原性の欠如を克服するように設計されている戦略には、バイスタンダーＴ細胞ヘルプ（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ Ｔ−ｃｅｌｌ ｈｅｌｐ）を提供する巨大タンパク質担体への多糖の結合が含まれる。一実施形態において、本明細書で利用する多糖を、バイスタンダーＴ細胞ヘルプを提供するタンパク質担体に結合させる。多糖またはオリゴ糖の免疫原と結合させるのに用いられ得るこれらの担体の例として、ジフテリアおよび破傷風トキソイド（ＤＴ、ＤＴ Ｃｒｍ１９７およびＴＴ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、緑膿菌エキソプロテインＡ（ｒＥＰＡ）およびツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、インフルエンザ菌のプロテインＤ、ニューモリシンまたは上記のいずれかの断片が挙げられる。使用に適する断片には、ヘルパーＴエピトープを包含する断片が含まれる。特に、プロテインＤ断片は、任意に、このタンパク質のＮ末端の１／３を含む。プロテインＤは、インフルエンザ菌のＩｇＤ結合タンパク質である（ＥＰ０ ５９４ ６１０ Ｂ１）。
【０１１７】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物に用いられる担体タンパク質は、上記に記載のブドウ球菌Ｉｓｄタンパク質の断片、ブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質の断片または本発明の融合タンパク質の断片を含むか、またはこれらの断片からなる。
【０１１８】
一実施形態において、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、ＥｓａＣまたはＥｓａＢは、結合していないタンパク質または遊離タンパク質として本発明の免疫原性組成物中に存在する（ＷＯ０８／１９１６２、ＷＯ１０／１４３０４）。
【０１１９】
これらの多糖類は、任意の公知の方法（例えば、Ｌｉｋｈｉｔｅによる米国特許第４，３７２，９４５号、Ａｒｍｏｒらによる米国特許第４，４７４，７５７号、Ｊｅｎｎｉｎｇｓらによる米国特許第４，３５６，１７０号）によって、この担体タンパク質（複数可）に結合することができる。任意に、ＣＤＡＰ結合化学が実行される（ＷＯ９５／０８３４８参照）。
【０１２０】
ＣＤＡＰにおいて、シアニル化剤の１−シアノ−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）が、任意に、多糖−タンパク質複合体の合成に用いられる。このシアニル化反応を比較的穏やかな条件下で行うことができ、これによって、アルカリ感受性多糖の加水分解を阻止する。この合成により、担体タンパク質への直接結合が可能になる。
【０１２１】
この多糖を、水溶液または生理食塩水に可溶化することができる。ＣＤＡＰをアセトニトリルに溶解させ、すぐにこの多糖溶液に添加してもよい。このＣＤＡＰはこの多糖のヒドロキシル基と反応して、シアネートエステルを形成する。活性化ステップ後、この担体タンパク質を添加する。リジンのアミノ基がこの活性化多糖と反応して、イソ尿素共有結合を形成する。この結合反応後、過剰のグリシンを添加し、残留活性化官能基をクエンチングする。その後、この生成物をゲル浸透カラムに透過させ、未反応担体タンパク質および残留試薬を除去する。
【０１２２】
組成物
本発明は、本発明のＣｌｆＡのポリペプチド、断片または融合タンパク質および医薬的に許容される賦形剤を含む免疫原性組成物またはワクチンを提供する。
【０１２３】
本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、特に、高齢者集団における使用だけでなく幼児集団における使用を対象とする時に、アジュバンド化することができる。適切なアジュバントには、水酸化アルミニウムゲルまたはリン酸アルミニウムまたはミョウバンなどのアルミニウム塩が含まれるが、カルシウム、マグネシウム、鉄または亜鉛の塩などの他の金属塩であってもよく、またはアシル化チロシン、もしくはアシル化糖、陽イオン誘導体化糖もしくは陰イオン誘導体化糖、またはポリフォスファゼンの不溶性懸濁液であってもよい。
【０１２４】
ＴＨ１型の反応の優先的な誘導因子であるアジュバントが選択されることが好ましい。かかる高レベルのＴｈ１型サイトカインは、特定の抗原に対して細胞媒介性免疫反応の誘導を助ける傾向があるが、高レベルのＴｈ２型サイトカインは、この抗原に対して体液性免疫反応の誘導を助ける傾向がある。
【０１２５】
Ｔｈ１型およびＴｈ２型の免疫反応の区別は絶対的ではない。実際には、個体が、主にＴｈ１または主にＴｈ２と説明される免疫反応を支持する。しかし、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ（Ｍｏｓｍａｎｎ, Ｔ.Ｒ. ａｎｄ Ｃｏｆｆｍａｎ, Ｒ.Ｌ.（１９８９）ＴＨ１ ａｎｄ ＴＨ２ ｃｅｌｌｓ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｌｅａｄ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ.（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ, ７, ｐ１４５−１７３）がマウスＣＤ４＋ｖｅＴ細胞クローンについて記載しているような観点から、サイトカインのファミリーを考慮することが好都合である場合が多い。慣例上、Ｔｈ１型反応は、Ｔリンパ球によるＩＮＦ−γサイトカインおよびＩＬ−２サイトカインの産生と関連する。ＩＬ−１２などの、Ｔｈ１型免疫反応の誘導に直接関連する場合が多い他のサイトカインは、Ｔ細胞によって産生されない。対照的に、Ｔｈ２型反応は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０の分泌と関連する。主にＴｈ１反応を促進する適切なアジュバント系には、モノホスホリルリピドＡもしくはその誘導体（または、一般に、解毒されたリピドＡ−例えば、ＷＯ２００５１０７７９８参照）、特に、３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）（その調製については、ＧＢ２２２０２１１ Ａ参照）、およびアルミニウム塩（例えば、リン酸アルミニウムもしくは水酸化アルミニウム）または水中油型エマルションのいずれか一方とモノホスホリルリピドＡ、好ましくは３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡとの組み合わせが含まれる。かかる組み合わせにおいて、同一の粒子構造に抗原および３Ｄ−ＭＰＬを含めることにより、抗原シグナルおよび免疫賦活性シグナルのより効率的な送達が可能になる。３Ｄ−ＭＰＬがミョウバン吸着抗原の免疫原性をさらに増強することができることを複数の研究が示している（Ｔｈｏｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ. Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９８）１６：７０８−１４； ＥＰ６８９４５４−Ｂ１）。
【０１２６】
増強した系には、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体の組み合わせ、特に、ＷＯ９４／００１５３に開示されているＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組み合わせ、またはＷＯ９６／３３７３９に開示されているように、ＱＳ２１がコレステロールでクエンチングされる低反応性組成物が含まれる。水中油型エマルション中のＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含む特に効力の高いアジュバント製剤については、ＷＯ９５／１７２１０に記載されている。一実施形態において、この免疫原性組成物は、ＱＳ２１であり得るサポニンをさらに含む。この製剤は、水中油型エマルションおよびトコフェロールも含んでもよい（ＷＯ９５／１７２１０）。非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＷＯ９６／０２５５５）および他の免疫調節オリゴヌクレオチド（ＷＯ０２２６７５７およびＷＯ０３５０７８２２）も、ＴＨ１反応の好ましい誘導因子であり、本発明における使用に適する。
【０１２７】
本発明の組成物と共に用いられ得るさらなるアジュバントは、サポニン、リピドＡもしくはその誘導体、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、リン酸アルキルグルコサミニド、水中油型エマルションまたはそれらの組み合わせのグループから選択され得る。さらに好ましいアジュバントは、別のアジュバントと組み合わせた金属塩である。このアジュバントは、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、特に、Ｔｏｌｌ様受容体２、３、４、７、８もしくは９のアゴニスト、またはサポニン、特に、Ｑｓ２１であることが好ましい。このアジュバント系が、上記のリストの２種類以上のアジュバントを含むことがさらに好ましい。特に、これらの組み合わせは、好ましくは、サポニン（特に、Ｑｓ２１）アジュバントおよび／またはＣｐＧ含有免疫賦活性オリゴヌクレオチドなどのＴｏｌｌ様受容体９アゴニストを含む。他の好ましい組み合わせには、サポニン（特に、ＱＳ２１）とＴｏｌｌ様受容体４アゴニスト、例えば、モノホスホリルリピドＡもしくはその３脱アシル化誘導体３Ｄ−ＭＰＬ、またはサポニン（特に、ＱＳ２１）とＴｏｌｌ様受容体４リガンド、例えば、リン酸アルキルグルコサミニドが含まれる。
【０１２８】
特に好ましいアジュバントは、３Ｄ−ＭＰＬとＱＳ２１の組み合わせ（ＥＰ０ ６７１ ９４８ Ｂ１）、３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１を含む水中油型エマルション（ＷＯ９５／１７２１０、ＷＯ９８／５６４１４）、または他の担体で製剤化された３Ｄ−ＭＰＬ（ＥＰ０ ６８９ ４５４ Ｂ１）である。他の好ましいアジュバント系には、米国特許第６５５８６７０号、同第６５４４５１８号に記載の３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１とＣｐＧオリゴヌクレオチドの組み合わせが含まれる。
【０１２９】
一実施形態において、このアジュバントはＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４リガンド、好ましくはリピドＡ誘導体、具体的には、モノホスホリルリピドＡ、より具体的には、３脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）などのアゴニストである。
【０１３０】
３Ｄ−ＭＰＬは、北米のＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社から入手可能であり、主として、ＩＦＮ−ｇ（Ｔｈ１）表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞反応を促進する。３Ｄ−ＭＰＬは、ＧＢ ２ ２２０ ２１１ Ａに開示されている方法に従って産生することができる。化学的には、３Ｄ−ＭＰＬは、３、４、５または６つのアシル化された鎖を有する３脱アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。好ましくは、本発明の組成物において、小粒子の３Ｄ−ＭＰＬを用いる。小粒子の３Ｄ−ＭＰＬは、０．２２μｍのフィルターを通して滅菌濾過できるような粒径を有する。かかる調製物については、国際特許出願ＷＯ９４／２１２９２に記載されている。リピドＡの合成誘導体は公知であり、以下のものを含むが、これらに限定されないＴＬＲ４アゴニストであると考えられている：
ＯＭ１７４（２−デオキシ−６−ｏ−［２−デオキシ−２−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラ−デカノイルアミノ］−４−ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−α−Ｄ−グルコピラノシルジハイドロジェンホスフェート）、（ＷＯ９５／１４０２６）
ＯＭ２９４ＤＰ（３Ｓ,９Ｒ）−３−［（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９（Ｒ）−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ジオール，１，１０−ビス（ジハイドロジェンホスフェート）、（ＷＯ９９／６４３０１およびＷＯ００／０４６２）
ＯＭ１９７ＭＰ−ＡｃＤＰ（３Ｓ−，９Ｒ）−３−［（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ジオール，１−ジハイドロジェンホスフェート１０−（６−アミノヘキサノエート）、（ＷＯ０１／４６１２７）。
【０１３１】
使用することできる他のＴＬＲ４リガンドは、ＷＯ９８５０３９９または米国特許第６３０３３４７号に開示されているものなどのアルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰ）（ＡＧＰの調製方法についても開示されている）、または米国特許第６７６４８４０号に開示されているＡＧＰの医薬的に許容される塩である。いくつかのＡＧＰはＴＬＲ４アゴニストであり、いくつかはＴＬＲ４アンタゴニストである。これらの両方はアジュバントとして有用であると考えられている。
【０１３２】
本発明で使用するための別の好ましい免疫賦活剤はＱｕｉｌ Ａおよびその誘導体である。Ｑｕｉｌ Ａは、南米の木のキラヤ・サポナリア・モリナから単離されたサポニン製剤であり、最初に、１９７４年にＤａｌｓｇａａｒｄら（“Ｓａｐｏｎｉｎ ａｄｊｕｖａｎｔｓ”, Ａｒｃｈｉｖ.ｆｕｒ ｄｉｅ ｇｅｓａｍｔｅ Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇ, Ｖｏｌ.４４, Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ, Ｂｅｒｌｉｎ, ｐ２４３−２５４）によってアジュバント活性を有すると記載された。Ｑｕｉｌ Ａに付随する毒性、例えば、ＱＳ７およびＱＳ２１（ＱＡ７およびＱＡ２１とも知られる）を含まずアジュバント活性を保持するＱｕｉｌ Ａの精製断片は、ＨＰＬＣによって単離された（ＥＰ０ ３６２ ２７８）。ＱＳ−２１はキラヤ・サポナリア・モリナの樹皮に由来する天然のサポニンであり、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、Ｔｈ１細胞および主たるＩｇＧ２ａ抗体反応を誘発し、本発明の文脈における好ましいサポニンである。
【０１３３】
特に好ましいＱＳ２１の特定の製剤は、これらの製剤がさらにステロールを含むと記載されている（ＷＯ９６／３３７３９）。本発明のサポニン形成部分は、（優先的であるが、独占的ではない胆汁酸塩で）ミセル、混合ミセルの形態に分かれてもよく、またはＩＳＣＯＭ基質の形態（ＥＰ ０ １０９ ９４２ Ｂ１）、リポソームの形態、または虫様もしくは環状の多重結合複合体などの関連するコロイド構造の形態、またはコレステロールおよび脂質で製剤化された時は、脂質／層状構造およびラメラの形態、または（例えば、ＷＯ９５／１７２１０に記載の）水中油型エマルションの形態であってもよい。これらのサポニンは、好ましくは、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムなどの金属塩と結合していてもよい（ＷＯ９８／１５２８７）。好ましくは、このサポニンは、リポソーム、ＩＳＣＯＭまたは水中油型エマルションの形態で存在する。
【０１３４】
増強した系には、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体の組み合わせ、特に、ＷＯ９４／００１５３に開示されているＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組み合わせ、またはＷＯ９６／３３７３９に開示されているようにＱＳ２１がコレステロールでクエンチングされる低反応性組成物が含まれる。水中油型エマルション中にＱＳ２１および／または３Ｄ−ＭＰＬがあろうが無かろうがトコフェロールを含む特に効力の高いアジュバント製剤については、ＷＯ９５／１７２１０に記載されている。一実施形態において、この免疫原性組成物は、ＱＳ２１であり得るサポニンをさらに含む。
【０１３５】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドまたは任意の他のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）９アゴニストも用いることができる。本発明のアジュバントまたはワクチンに使用するのに好ましいオリゴヌクレオチドはＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、好ましくは、少なくとも３つ、より好ましくは、少なくとも６つ以上のヌクレオチドによって分離された２つ以上のジヌクレオチドＣｐＧモチーフを含む。ＣｐＧモチーフは、シトシンヌクレオチドに続くグアニンヌクレオチドである。本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、典型的にはデオキシヌクレオチドである。好ましい実施形態において、このオリゴヌクレオチド内のヌクレオチド間は、ホスホロジチオエート結合、またはより好ましくは、ホスホロチオエート結合であるが、ホスホジエステル結合および他のヌクレオチド間結合は本発明の範囲内にある。混合ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドも本発明の範囲に含まれる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたはホスホロジチオエートを作製する方法については、米国特許第５，６６６，１５３号、同第５，２７８，３０２号およびＷＯ９５／２６２０４に記載されている。
【０１３６】
このアジュバントは水中油型エマルションであってもよく、または他のアジュバントと組み合わせた水中油型エマルションを含んでもよい。このエマルション系の油相は、好ましくは、代謝可能な油を含む。代謝可能な油という用語の意味は当該技術分野で公知である。代謝可能は、「代謝によって変換され得る」と定義することができる（Ｄｏｒｌａｎｄ’ｓ Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ, Ｗ.Ｂ.Ｓａｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ, ２５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７４））。この油は、任意の植物油、魚油、動物性油または合成油であってもよく、これは受け手に対して毒性がなく、代謝によって変換され得る。ナッツ、種子、および穀物は一般的な植物油の供給源である。合成油類は本発明の一部でもあり、ＮＥＯＢＥＥ（登録商標）などの市販の油などを含むことができる。スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）は不飽和油であり、サメの肝油中に大量に見られ、オリーブ油、小麦胚芽油、ぬか油、および酵母中に少量見られ、本発明の使用に特に好ましい油である。スクアレンは、コレステロールの生合成の中間体であるという事実に基づき、代謝可能な油である（Ｍｅｒｃｋ ｉｎｄｅｘ, １０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ, ｅｎｔｒｙ ｎｏ.８６１９）。
【０１３７】
トコール類（例えば、ビタミンＥ）も、油エマルションアジュバント中で用いられる場合が多い（ＥＰ０ ３８２ ２７１ Ｂ１；米国特許第５６６７７８４号；ＷＯ９５／１７２１０）。本発明の油エマルション（好ましくは、水中油型エマルション）中で用いられるトコール類は、これらのトコールが、好ましくは、直径１ミクロン未満の、任意に乳化剤を含むトコール小滴の分散系であり得るという点において、ＥＰ０ ３８２ ２７１ Ｂ１に記載される通りに製剤化され得る。あるいは、これらのトコールを別の油と組み合わせて用い、油エマルションの油相を形成することができる。上記の記載の代謝可能な油などの、トコールと組み合わせて用いられ得る油エマルションの例を本明細書に記載する。
【０１３８】
水中油型エマルションアジュバントそれ自体は、アジュバント組成物として有用であることが示唆されており（ＥＰ０ ３９９ ８４３Ｂ）、水中油型エマルションと他の活性剤の組み合わせもワクチンのアジュバントとして記載されている（ＷＯ９５／１７２１０；ＷＯ９８／５６４１４；ＷＯ９９／１２５６５；ＷＯ９９／１１２４１）。油中水型エマルション（米国特許第５，４２２，１０９号；ＥＰ０ ４８０ ９８２ Ｂ２）および水中油中水型エマルション（米国特許第５，４２４，０６７号；ＥＰ０ ４８０ ９８１ Ｂ）などの他の油エマルションアジュバントについても記載されている。これらの全ては、（特に、トコール類を包含する時）アジュバントおよび本発明の組成物を形成するのに好ましい油エマルション系を形成する。
【０１３９】
最も好ましくは、この油エマルション（例えば、水中油型エマルション）は、ＴＷＥＥＮ ８０などの乳化剤および／またはコレステロールなどのステロールをさらに含む。
【０１４０】
好ましい油エマルション（好ましくは、水中油型エマルション）には、スクアラン、スクアレンなどの代謝可能な無毒の油、またはα−トコフェロールなどのトコフェロール（および、好ましくは、スクアレンおよびα−トコフェロールの両方）ならびに任意に、Ｔｗｅｅｎ ８０などの乳化剤（または界面活性剤）が含まれる。ステロール（好ましくは、コレステロール）も含まれ得る。
【０１４１】
水中油型エマルションの生成法は当該技術者に公知である。一般に、この方法は、トコール含有油相と、ＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ８０（商標）溶液などの界面活性剤とを混合し、その後、ホモジナイザーを用いて均質化することを含み、この混合物を２回注射針に通すことを含む方法が、少量の液体を均質化するのに適することは当該技術者には明らかである。同様に、当該技術者は、微小流動化装置による乳化方法（Ｍ１１０Ｓ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ｍａｃｈｉｎｅ、最大５０回通過、６ｂａｒの最大入口圧力で２分間（出口圧力約８５０ｂａｒ））を適合させて、小量または大量のエマルションを生成することができる。この適合は、必要とされる直径の油滴を有する製剤が得られるまで、得られたエマルションの測定を含む通常の実験によって達成することができる。
【０１４２】
水中油型エマルションにおいて、この油および乳化剤は水性担体中に存在するべきである。この水性担体は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水であってもよい。
【０１４３】
安定な水中油型エマルション中に見られる油滴のサイズは、光子相関分光法により測定される場合に、好ましくは、直径が１ミクロン未満であり、実質的に３０〜６００ｎｍ、好ましくは、実質的に約３０〜５００ｎｍ、最も好ましくは、直径が実施的に１５０〜５００ｎｍの範囲、特に、直径が約１５０ｎｍであり得る。この点で、数基準で油滴の８０％は好ましい範囲内にあるべきであり、より好ましくは、数基準で油滴の９０％以上、最も好ましくは、９５％以上が規定のサイズの範囲内にある。本発明の油エマルション中に存在する成分量は、従来的には、スクアレンなどの油が０．５〜２０％または２〜１０％の範囲であり、存在する時、α−トコフェロールが２〜１０％、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどの界面活性剤が０．３〜３％の範囲である。好ましくは、油（好ましくは、スクアレン）：トコール（好ましくは、α−トコフェロール）の比は、これがより安定なエマルションを提供するように１以下である。Ｔｗｅｅｎ８０またはＳｐａｎ８５などの乳化剤も、約１％のレベルで存在してもよい。いくつかの場合において、本発明のワクチンが安定剤をさらに含むことは好都合であり得る。
【０１４４】
好ましいエマルション系の例については、ＷＯ９５／１７２１０、ＷＯ９９／１１２４１およびＷＯ９９／１２５６５に記載されており、これらは、任意に、免疫賦活剤ＱＳ２１および／または３Ｄ−ＭＰＬで製剤化された、スクアレン、α−トコフェロールおよびＴＷＥＥＮ ８０に基づくエマルションアジュバントを開示している。したがって、本発明の特に好ましい実施形態において、本発明のアジュバントは、ＬＰＳもしくはその誘導体、および／またはサポニンなどのさらなる免疫賦活剤を追加的に含んでもよい。さらなる免疫賦活剤の例については、本明細書および「Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ−Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ」１９９５, Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, Ｖｏｌｕｍｅ ６, Ｅｄｓ.Ｐｏｗｅｌｌ, Ｍ.Ｆ., ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ, Ｍ.Ｊ., Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ, ＩＳＢＮ ０−３０６−４４８６７−Ｘに記載されている。
【０１４５】
好ましい態様において、本発明によるアジュバントおよび免疫原性組成物は、上記に記載の油エマルション中に、任意に、ステロール（好ましくは、コレステロール）と共に、サポニン（好ましくは、ＱＳ２１）および／またはＬＰＳ誘導体（好ましくは、３Ｄ−ＭＰＬ）を含む。さらに、この油エマルション（好ましくは、水中油型エマルション）は、ｓｐａｎ８５および／またはレシチンおよび／またはトリカプリリンを含んでもよい。水中油型エマルション、ステロールおよびサポニンを含むアジュバントについてはＷＯ９９／１２５６５に記載されている。
【０１４６】
典型的には、ヒトへの投与には、サポニン（好ましくは、ＱＳ２１）および／またはＬＰＳ誘導体（好ましくは、３Ｄ−ＭＰＬ）は、１用量あたり１μｇ〜２００μｇ、例えば、１０〜１００μｇ、好ましくは、１０μｇ〜５０μｇの範囲のヒト用量の免疫原性組成物中に存在する。典型的には、この油エマルション（好ましくは、水中油型エマルション）は、２〜１０％の代謝可能な油を含む。好ましくは、この油エマルションは、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のα−トコフェロール、および０．３〜３％（好ましくは、０．４〜２％）の乳化剤（好ましくは、ｔｗｅｅｎ ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート））を含む。スクアレンおよびα−トコフェロールの両方が存在する時、好ましくは、スクアレン：α−トコフェロールの比は、これがより安定なエマルションを提供するように１以下である。Ｓｐａｎ ８５（ソルビタントリオレエート）も、本発明に使用するエマルション中に０．５〜１％のレベルで存在してもよい。いくつかの場合において、本発明の免疫原性組成物およびワクチンが、安定剤、例えば、カプリル酸（ｍｅｒｃｋ ｉｎｄｅｘ １０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ, ｅｎｔｒｙ ｎｏ.１７３９）（トリカプリリンが特に好ましい）を含む他の乳化剤／界面活性剤をさらに含むことは好都合であり得る。
【０１４７】
スクアレンおよびサポニン（好ましくは、ＱＳ２１）が含まれる場合、このエマルション中の油の全レベルの減少を可能にするように、この製剤にステロール（好ましくは、コレステロール）も含めることは有益である。これは、製造コストの減少、ワクチン接種の全体的な快適性の改善、および、ＩＦＮ−γ産生の改善などの結果として起こる免疫反応の定性的および定量的な改善ももたらす。したがって、本発明のアジュバント系は、典型的には、２００：１〜３００：１の範囲の代謝可能な油：サポニン（ｗ／ｗ）の比を含み、また本発明は、１：１：〜２００：１、好ましくは、２０：１〜１００：１である好ましい範囲、最も好ましくは、実質的に４８：１の「低油」形態で使用することができ、このワクチンは全ての成分の有益なアジュバント特性を保持し、反応原性プロファイルが非常に低減されている。したがって、特定の好ましい実施形態は、１：１〜２５０：１の範囲のスクアレン：ＱＳ２１（ｗ／ｗ）の比を有し、好ましい範囲は２０：１〜２００：１、好ましくは２０：１〜１００：１、最も好ましくは、実質的に４８：１である。好ましくは、本明細書に記載のサポニン：ステロールの比で存在するステロール（最も好ましくは、コレステロール）も含まれる。
【０１４８】
本発明のエマルション系は、好ましくは、サブミクロンの範囲の小さい油滴サイズを有する。最も好ましくは、この油滴サイズは、直径が１２０〜７５０ｎｍ、最も好ましくは、１２０〜６００ｎｍの範囲である。
【０１４９】
（本発明の免疫原性組成物におけるＡｌＰＯ４との最高の組み合わせのために、）特定の有力なアジュバント製剤は、ＷＯ９５／１７２１０またはＷＯ９９／１２５６５に記載のサポニン（好ましくは、ＱＳ２１）、ＬＰＳ誘導体（好ましくは、３Ｄ−ＭＰＬ）および油エマルション（好ましくは、水中油型エマルション中のスクアレンおよびαトコフェロール）（特に、実施例２の表１のアジュバント製剤１１）を含む。
【０１５０】
ＴＬＲ２アゴニストの例として、ペプチドグリカンまたはリポタンパク質が挙げられる。イミキモドおよびレシキモドなどのイミダゾキノリン類は、既知のＴＬＲ７アゴニストである。一本鎖ＲＮＡも既知のＴＬＲアゴニスト（ヒトにおいてはＴＬＲ８、およびマウスにおいてはＴＬＲ７）であるが、２本鎖ＲＮＡおよびｐｏｌｙ  ＩＣ（ポリイノシン−ポリシチジン酸−ウイルスＲＮＡの市販の合成模倣剤）は、ＴＬＲ３アゴニストの例である。３Ｄ−ＭＰＬはＴＬＲ４アゴニストの例であり、ＣＰＧはＴＬＲ９アゴニストの例である。
【０１５１】
この免疫原性組成物は、金属塩上に吸着される抗原および免疫賦活剤を含んでもよい。抗原および免疫賦活剤３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）が同一粒子上に吸着されているアルミニウムベースのワクチン製剤については、ＥＰ０ ５７６ ４７８ Ｂ１、ＥＰ０ ６８９ ４５４ Ｂ１、およびＥＰ０ ６３３ ７８４ Ｂ１に記載されている。これらの場合において、その後、抗原は、このアルミニウム塩に最初に吸着され、その後、同一のアルミニウム塩粒子上への免疫賦活剤３Ｄ−ＭＰＬの吸着が続く。かかる方法は、最初に、これらの粒子が８０〜５００ｎｍの間のサイズに達するまで、水浴中の超音波処理による３Ｄ−ＭＰＬの懸濁を含む。この抗原を、通常、撹拌しながら、室温で１時間、アルミニウム塩上に吸着させる。その後、この３Ｄ−ＭＰＬ懸濁液をこの吸着抗原に添加し、この製剤を室温で１時間インキュベートし、その後、使用するまで４℃で保つ。
【０１５２】
別の方法において、この免疫賦活剤およびこの抗原は、ＥＰ１１２６８７６に記載のとおり、別々の金属粒子上にある。改良した方法には、金属塩粒子上への免疫賦活剤の吸着、その後、別の金属塩粒子上への抗原の吸着、別の金属粒子の混合を経て、ワクチンを形成することが含まれる。本発明に使用するためのアジュバントは、金属塩粒子上に吸着させた免疫賦活剤を含むアジュバント組成物であってもよく、この金属塩粒子が実質的に他の抗原を含まないことを特徴とする。さらに、本発明はワクチンを提供し、これらのワクチンは、実質的に他の抗原を含まない金属塩の粒子上に免疫賦活剤を吸着させること、かつ抗原に吸着した金属塩の粒子は、実質的に他の免疫賦活剤を含まないことを特徴とする。
【０１５３】
したがって、本発明は、金属塩の粒子上に吸着させた免疫賦活剤を含むアジュバント製剤を提供し、この組成物が実質的に他の抗原を含まないことを特徴とする。さらに、このアジュバント製剤は、そのようなアジュバントを用いる場合、ワクチンの製造に必要とされる中間体であり得る。したがって、金属粒子上に吸着させた１種類以上の免疫賦活剤であるアジュバント組成物を抗原と混合することを含むワクチンの製造方法を提供する。好ましくは、この抗原を、金属塩上に前もって吸着させておく。前記金属塩は、この免疫賦活剤に吸着させる金属塩と同一であるか類似していてもよい。好ましくは、この金属塩は、アルミニウム塩、例えば、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムである。
【０１５４】
本発明は、さらに、金属塩の第１の粒子上に吸着させた免疫賦活剤、および金属塩上に吸着させた抗原を含み、金属塩の第１および第２の粒子が別々の粒子であることを特徴とするワクチン組成物を提供する。
【０１５５】
本明細に記載のＬＰＳもしくはＬＯＳの誘導体、またはＬＰＳもしくはＬＯＳの変異体、またはリピドＡ誘導体は、天然のリポ多糖よりも毒性が低いようにデザインされ（例えば、３Ｄ−ＭＰＬ）、本明細書に記載のこれらの部分の全ての使用に関して互換性のある同等物である。
【０１５６】
一実施形態において、本発明の組成物に使用するアジュバントは、（公知の技術によって（ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）などの）リン脂質から作られた）リポソーム担体、任意に（コレステロールなどの）ステロールを含む。かかるリポソーム担体は、（３Ｄ−ＭＰＬ（上記参照）などの）リピドＡ誘導体および／または（ＱＳ２１（上記参照）などの）サポニンを保有していてもよい。一実施形態において、このアジュバントは、（０．５ｍＬ用量あたり）リン脂質（例えば、ＤＯＰＣ）を０．１〜１０ｍｇ、０．２〜７ｍｇ、０．３〜５ｍｇ、０．４〜２ｍｇ、または０．５〜１ｍｇ（例えば、０.４〜０．６、０．９〜１．１、０．５または１ｍｇ）、ステロール（例えば、コレステロール）を０．０２５〜２．５、０．０５〜１．５、０．０７５〜０．７５、０．１〜０．３、または０．１２５〜０．２５ｍｇ（例えば、０．２〜０．３、０．１〜０．１５、０．２５または０．１２５ｍｇ）、リピドＡ誘導体（例えば、３Ｄ−ＭＰＬ）を５〜６０、１０〜５０、または２０〜３０μｇ（例えば、５〜１５、４０〜５０、１０、２０、３０、４０または５０μｇ）、およびサポニン（例えば、ＱＳ２１）を５〜６０、１０〜５０、または２０〜３０μｇ（例えば、５〜１５、４０〜５０、１０、２０、３０、４０または５０μｇ）含む。
【０１５７】
一実施形態において、本発明の組成物に使用するアジュバントは、（スクアレンなどの）代謝可能な油、（Ｔｗｅｅｎ ８０などの）乳化剤、および任意に（αトコフェロールなどの）トコールから作られた水中油型エマルションを含む。一実施形態において、このアジュバントは、（０．５ｍＬ用量あたり）（スクアレンなどの）代謝可能な油を０．５〜１５、１〜１３、２〜１１、４〜８、または５〜６ｍｇ（例えば、２〜３、５〜６、または１０〜１１ｍｇ）、（Ｔｗｅｅｎ ８０などの）乳化剤を０．１〜１０、０．３〜８、０．６〜６、０．９〜５、１〜４、または２〜３ｍｇ（例えば、０．９〜１．１、２〜３または４〜５ｍｇ）、および任意に（αトコフェロールなどの）トコールを０．５〜２０、１〜１５、２〜１２、４〜１０、５〜７ｍｇ（例えば、１１〜１３、５〜６、または２〜３ｍｇ）含む。
【０１５８】
このアジュバントは、任意に、さらに、リピドＡ誘導体（例えば、３Ｄ−ＭＰＬ）を５〜６０、１０〜５０、または２０〜３０μｇ（例えば、５〜１５、４０〜５０、１０、２０、３０、４０または５０μｇ）含んでもよい。
【０１５９】
このアジュバントは、任意に、ステロール（例えば、コレステロール）を０．０２５〜２．５、０．０５〜１．５、０．０７５〜０．７５、０．１〜０．３、または０．１２５〜０．２５ｍｇ（例えば、０．２〜０．３、０．１〜０．１５、０．２５または０．１２５ｍｇ）、リピドＡ誘導体（例えば、３Ｄ−ＭＰＬ）を５〜６０、１０〜５０、または２０〜３０μｇ（例えば、５〜１５、４０〜５０、１０、２０、３０、４０または５０μｇ）、サポニン（例えば、ＱＳ２１）を５〜６０、１０〜５０、または２０〜３０μｇ（例えば、５〜１５、４０〜５０、１０、２０、３０、４０または５０μｇ）含んでもよい。
【０１６０】
一実施形態において、本発明の組成物に使用するアジュバントは、リン酸アルミニウムおよび（３Ｄ−ＭＰＬなどの）リピドＡ誘導体を含む。このアジュバントは、（０．５ｍＬ用量あたり）リン酸アルミニウムとしてＡｌを１００〜７５０、２００〜５００、または３００〜４００μｇ、およびリピドＡ誘導体（例えば、３Ｄ−ＭＰＬ）を５〜６０、１０〜５０、または２０〜３０μｇ（例えば、５〜１５、４０〜５０、１０、２０、３０、４０または５０μｇ）含んでもよい。
【０１６１】
本発明のワクチン製剤を用いて、全身経路または粘膜経路を介して前記ワクチンを投与することによって、感染の影響を受けやすい哺乳類を防御または治療することができる。これらの投与には、筋肉内経路、腹腔内経路、皮内経路もしくは皮下経路による注射、または、口腔／消化管、気管、尿生殖路への粘膜投与による注射が含まれ得る。肺炎または中耳炎の治療には、（肺炎球菌の鼻咽頭保菌をより効果的に防ぎ、その最も早い段階で感染を弱めることができるので、）ワクチンの鼻腔内投与が好ましい。本発明のワクチンを単回用量として投与することができるが、その成分を同時にまたは異なる時点で同時投与することもできる（例えば、肺炎球菌多糖類を、それぞれに対する免疫反応を最適に協調させるために、同時に別々に投与するか、またはワクチンの任意の細菌タンパク質成分の投与後１〜２週間目に別々に投与することができる）。同時投与には、任意のＴｈ１アジュバントが、異なる投与のいずれかまたは全てに存在してもよく、例えば、Ｔｈ１アジュバントは、このワクチンの細菌タンパク質成分と組み合わせて存在してもよい。単一の投与経路に加えて、２つの異なる投与経路を用いてもよい。例えば、多糖類をＩＭ（またはＩＤ）投与し、細菌タンパク質をＩＮ（またはＩＤ）投与してもよい。さらに、本発明のワクチンを、プライミング用量についてはＩＭ投与し、追加免疫用量についてはＩＮ投与してもよい。
【０１６２】
各ワクチン用量中の結合抗原量は、典型的なワクチンにおいて非常に有害な副作用なしに免疫防御反応を起こす量として選択される。かかる量は、どの特定の免疫原が利用されること、かつどのようにそれが存在するかによって変わる。一般に、各用量は、多糖を０．１〜１００μｇ、典型的には、多糖複合体を０．１〜５０μｇ、０．１〜１０μｇ、１〜１０μｇまたは１〜５μｇ含むことが期待される。
【０１６３】
このワクチン中のタンパク質抗原の含有量は、典型的には、１〜１００μｇ、５〜５０μｇまたは５〜２５μｇの範囲である。最初のワクチン接種後、対象は１回または、適切な間隔をあけて、数回の追加免疫を受けてもよい。
【０１６４】
ワクチン製剤については、一般に、ワクチン設計（「Ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ」（ｅｄｓ Ｐｏｗｅｌｌ Ｍ.Ｆ. ＆ Ｎｅｗｍａｎ Ｍ.Ｊ.）（１９９５）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ））に記載されている。リポソーム内へのカプセル化については、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎの米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。
【０１６５】
本発明のワクチンは溶液中で保存されるか、または凍結乾燥されてもよい。任意に、この溶液は、ショ糖、トレハロースまたはラクトースなどの糖の存在下で凍結乾燥される。これらのワクチンは凍結乾燥され、使用前に即座に再構成されることが典型的である。凍結乾燥は、より安定な組成物（ワクチン）をもたらし得る。
【０１６６】
本発明のさらなる態様は、本発明のＣｌｆＡポリペプチド、その断片またはその融合タンパク質に医薬的に許容される賦形剤を添加するステップを含む、本発明の免疫原性組成物またはワクチンを作製する方法である。
【０１６７】
本発明は、ブドウ球菌感染、特に、院内感染の治療法も包含する。
【０１６８】
本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、待機手術の場合に使用するのに特に都合がよい。かかる患者は、あらかじめ手術の日が分かっており、あらかじめ接種され得る。この患者が、黄色ブドウ球菌感染または表皮ブドウ球菌感染に暴露されるか否かは分からないので、上記に記載のように、両方に効く本発明のワクチンを接種することが好ましい。典型的には、待機手術を待つ１６歳以上の成人が、本発明の免疫原性組成物およびワクチンで治療される。あるいは、待機手術を待つ３〜１６歳の子供達が本発明の免疫原性組成物およびワクチンで治療される。
【０１６９】
本発明のワクチンを医療従事者に接種することも可能である。
【０１７０】
本発明のワクチン製剤を用いて、全身経路または粘膜経路を介して前記ワクチンを投与することによって、感染の影響を受けやすい哺乳類を防御または治療することができる。これらの投与には、筋肉内経路、腹腔内経路、皮内経路もしくは皮下経路による注射、または、口腔／消化管、気管、尿生殖路への粘膜投与による注射が含まれ得る。
【０１７１】
各ワクチン用量中の抗原量は、典型的なワクチンにおいて非常に有害な副作用なしに免疫防御反応を起こす量として選択される。かかる量は、どの特定の免疫原が利用されるか、かつどのようにそれが存在するかによって変わる。このワクチンのタンパク質含有量は、典型的には、１〜１００μｇ、５〜５０μｇの範囲、典型的には、１０〜２５μｇの範囲である。特定のワクチンの最適量は、対象における適切な免疫反応の観察を含む標準的な試験によって確かめることができる。最初のワクチン接種後、対象は１回または、適切な間隔をあけて、数回の追加免疫を受けてもよい。
【０１７２】
本発明の実施形態は、本発明のＣｌｆＡのポリペプチド、断片、融合タンパク質、免疫原性組成物またはワクチンを、それを必要としている患者に投与するステップを含む、ブドウ球菌の感染もしくは疾患を予防するか、または治療する方法である。
【０１７３】
本発明のさらなる実施形態は、ブドウ球菌の感染もしくは疾患、任意に、手術後のブドウ球菌の感染もしくは疾患の治療または予防に使用する、本発明のＣｌｆＡポリペプチド、その断片、その融合タンパク質または免疫原性組成物である。
【０１７４】
本発明のさらなる実施形態は、ブドウ球菌の感染もしくは疾患、任意に、手術後のブドウ球菌感染の治療または予防のためのワクチンの製造における、本発明のＣｌｆＡポリペプチド、その断片、その融合タンパク質または免疫原性組成物の使用である。
【０１７５】
「ブドウ球菌感染」という用語は、哺乳類、任意に、ヒトの宿主において、感染を引き起こすことができる黄色ブドウ球菌および／または表皮ブドウ球菌ならびに他のブドウ球菌株によって引き起こされる感染を包含する。
【０１７６】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、本明細書で、全ての場合において、それぞれ、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」という用語と任意に代用可能であると発明者らは意図する。
【０１７７】
本明細書内で引用される全ての参考文献または特許出願は、参照により本明細書に組込まれる。
【０１７８】
本発明がよりよく理解され得るために、以下の実施例を説明する。これらの実施例は、例示のみの目的であり、いかなる方法によっても、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１７９】
実施例１  ＣｌｆＡ  Ｎ１２３ドメインの発現および精製
Ｂ２３１２：
黄色ブドウ球菌ＮＣＴＣ８３２５株由来の４０〜５５９番目のアミノ酸をコードするｃｌｆＡ遺伝子断片のコドンを最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔ（レーゲンスブルク、ドイツ）によって２つの部分に合成した。この遺伝子断片は、Ｎ１、Ｎ２およびＮ３と同定された３つの構造ドメインをコードし、ＣｌｆＡのフィブリノゲン結合活性を含む。ライゲーションができるようにするために、制限酵素部位のＮｄｅＩおよびＳａｃＩＩを第一の合成遺伝子部分の末端に加え、ＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩを第２の合成遺伝子部分に加えた。
【０１８０】
ＰＣＲ反応を用いて、ＸｈｏＩ部位のすぐ前のその３’末端にストップコドンを加え、第２の合成断片中の４７４番目の位置のチロシン残基をヒスチジン残基に置換した。このようにして、これらの２つの断片を、ｒａｐｉｄ ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ,マンハイム、ドイツ）を用いてｐＥＴ２４ｂ（＋）発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、それによって、このＤＮＡ断片およびこのプラスミドを同時に構築した。最後に、標準手順に従って、（ｍｕｔ４７４を有する）Ｎ１２３ドメインを含む発現ベクターで大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株を形質転換した後に、最終コンストラクトが作られた。
【０１８１】
大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株：Ｆ− ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ− ｍＢ−）ｇａｌ ｄｃｍ（ＤＥ３）（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）３０６：：Ｔｎ１０（ＴｅｔＲ）（Ｎｏｖａｇｅｎ）
ＢＬＲは、プラスミドモノマーの収率を改善するＢＬ２１のｒｅｃＡ−誘導体であり、反復配列を含む標的プラスミドを安定化するのを助けることができるか、またはその生成物はＤＥ３プロファージの減少をもたらすことができる。この株はテトラサイクリン耐性（１２．５μｇ/ｍｌ）である。
【０１８２】
ＤＥ３は、この宿主がＤＥ３の溶原菌であるので、ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを保因することを示す。かかる株は、ＩＰＴＧでの誘導により、ｐＥＴベクターにクローニングされた標的遺伝子からタンパク質を産生するのに適する。
【０１８３】
Ｂ２３７８：
鋳型として（ｍｕｔ４７４を有する）Ｎ１２３変異を含む発現ベクターを用いる部位特異的変異誘発（Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)により、Ｎ１２３ドメインの野生型配列（４７４番目に変異がない４０〜５５９番目のアミノ酸）を修復した。標準手順に従って、Ｎ１２３ドメイン（野生型配列）を含む発現ベクターで大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株を形質転換することにより、最終株が作られた。
【０１８４】
精製
ｐＥＴ−ＣｌｆＡコンストラクトで形質転換した大腸菌を、培養槽（ＣｌｆＡ−Ｎ１Ｎ２Ｎ３ Ｈ４７４）または振盪フラスコ（ＣｌｆＡ−Ｎ１Ｎ２Ｎ３野生型）のいずれか一方で培養し、ＩＰＴＧを用いて発現を誘導した。大腸菌細胞ペーストを収集し、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ＰＭＳＦを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２に懸濁し、ＯＤ６５０ｎｍは１２０に達した。この懸濁液を機械的に破砕し、４℃で３０分間、１２２００ｇで遠心分離して、上清を含むＣｌｆＡ Ｎ１Ｎ２Ｎ３を生成した。ＣｌｆＡを、平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ ＨＲ３００カラムを用いて上清から精製し、１０ｍＭ  ホウ酸ナトリウム  ｐＨ９．５で溶出した。ＣｌｆＡを含む画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度に基づいて選択し、収集して、０．２２μｍで滅菌濾過した。
【０１８５】
実施例２  フィブリノゲン結合実験
コーティングしたＣｌｆＡへのフィブリノゲン接着
ＣｌｆＡタンパク質を、４℃で一晩、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中１０μｇ／ｍｌで高結合マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ）上にコーティングした。これらのプレートを、振盪しながら室温で３０分間、ＰＢＳ−１％ＢＳＡでブロッキングした。
【０１８６】
洗浄後、ヒトフィブリノゲン（ｒｅｆ：ＳＩＧＭＡ Ｆ４８８３−１６）を、１ｍｇ／ｍｌの出発濃度で添加し、その後、マイクロプレート中でさらに２倍希釈し、これを振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。
【０１８７】
洗浄後、この結合したフィブリノゲンを、ＰＢＳ−０．２％ＢＳＡ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで１：５０００希釈したペルオキシダーゼ結合抗フィブリノゲンヤギポリクローナル抗体（ｒｅｆ：ＡＢＣＡＭ ７５３９−１）を用いて検出した。この検出抗体を、撹拌しながら室温で６０分間インキュベートした。
【０１８８】
ｐＨ４．５の０．１Ｍ  クエン酸緩衝液１０ｍｌあたりＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ）４ｍｇ＋Ｈ２Ｏ２  ５μｌを用いて、暗所で、室温で１５分間発色させた。この反応をＨＣｌ５０μｌで停止させ、光学密度を６２０ｎｍに対する４９０ｎｍで読みとった。
【０１８９】
これらの結果を図１に示し、図１は、ＣｌｆＡ  Ｎ１２３の４７４変異体タンパク質が、ＣｌｆＡ  Ｎ１２３の野生型タンパク質に比べてフィブリノゲンへの結合が弱いことを示す。
【０１９０】
コーティングしたフィブリノゲンへのＣｌｆＡ接着
ヒトフィブリノゲン（ｒｅｆ：ＳＩＧＭＡ Ｆ４８８３−１６）を、４℃で一晩、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中１０μｇ／ｍｌで高結合マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ）上にコーティングした。これらのプレートを、振盪しながら室温で３０分間、ＰＢＳ−１％ＢＳＡでブロッキングした。
【０１９１】
洗浄後、このＣｌｆＡを５０μｇ／ｍｌの出発濃度で添加し、その後、マイクロプレート中でさらに２倍希釈し、これを振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。
【０１９２】
洗浄後、この結合したＣｌｆＡを、ＰＢＳ−０．２％ＢＳＡ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで１：５００希釈した（ｈｉｓタグ付きＣｌｆＡ  Ｎ１２３で免疫した後に得た）抗ＣｌｆＡウサギポリクローナル（抗体）を用いて検出し、振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。
【０１９３】
洗浄後、結合したウサギ抗体を、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで１：５０００希釈したＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社のペルオキシダーゼ結合ａｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ウサギＩｇＧ（ｒｅｆ：１１１−０３５−００３）を用いて検出した。この検出抗体を、振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。
【０１９４】
ｐＨ４．５の０．１Ｍ  クエン酸緩衝液１０ｍｌあたりＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ）４ｍｇ＋Ｈ２Ｏ２  ５μｌを用いて、暗所で、室温で１５分間発色させた。この反応をＨＣｌ５０μｌで停止させ、光学密度を、６２０ｎｍに対する４９０ｎｍで読みとった。
【０１９５】
図２に示す結果は、ＣｌｆＡ  Ｎ１２３の４７４変異体タンパク質が、ＣｌｆＡ  Ｎ１２３の野生型タンパク質に比べてフィブリノゲンへの結合が弱いことを再度証明する。
【０１９６】
実施例３  コーティングしたＣｌｆＡへのフィブリノゲン接着の阻害アッセイ
２０匹のマウスのグループに、０、１４および２８日目に、アジュバントＡＳ０２Ｖで製剤化したＣｌｆＡ  Ｎ１２３またはＣｌｆＡの４７４変異体１０μｇを筋肉注射により接種した。対照グループにはアジュバントのみを接種した。
【０１９７】
４２日目に、血清をこれらのマウスから収集し、各グループから集めた血清を、コーティングしたＣｌｆＡへのフィブリノゲン接着の阻害アッセイで試験した。
【０１９８】
精製したＣｌｆＡを、４℃で一晩、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中１０μｇ／ｍｌで高結合マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ）上にコーティングした。これらのプレートを、撹拌しながら室温で３０分間、ＰＢＳ−１％ＢＳＡでブロッキングした。洗浄後、マウス抗血清を最初に１０倍希釈で添加し、その後、マイクロプレート中でさらに２倍希釈し、これを振盪しながら室温で１時間インキュベートした。洗浄ステップをせず、ヒトフィブリノゲン（Ｒｅｆ：ＳＩＧＭＡ Ｆ４８８３−１６）を、ＰＢＳ−０．２％ＢＳＡ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ中４００μｇ／ｍｌ濃度で添加し、振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。
【０１９９】
洗浄後、結合したフィブリノゲンを、ＰＢＳ−０．２％ＢＳＡ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで１：５０００希釈したペルオキシダーゼ結合抗フィブリノゲンヤギポリクローナル抗体（ｒｅｆ：ＡＢＣＡＭ ７５３９−１）を用いて検出した。この検出抗体を、撹拌しながら室温で６０分間インキュベートした。ｐＨ４．５の０．１Ｍ  クエン酸緩衝液１０ｍｌあたりＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ）４ｍｇ＋Ｈ２Ｏ２  ５μｌを用いて、暗所で、室温で１５分間発色させた。この反応をＨＣｌ  ５０μｌで停止させ、光学密度を６２０ｎｍに対する４９０ｎｍで読みとった。
【０２００】
図３に示す結果は、ＣｌｆＡ  Ｎ１２３の野生型および４７４変異体の両方に対する抗体は、ほぼ同じ程度で、ＣｌｆＡ Ｎ１２３コーティングプレートへのフィブリノゲンの結合を阻害することができたことを証明する。
【０２０１】
コーティングフィブリノゲンへの黄色ブドウ球菌接着の阻害アッセイ
２０匹のマウスのグループに、０、１４および２８日目に、アジュバントＡＳ０２Ｖで製剤化したＣｌｆＡのＮ１２３または４７４変異体１０μｇを筋肉注射により接種した。対照グループにはアジュバントのみを接種した。
【０２０２】
４２日目に、血清をこれらのマウスから収集し、各グループから集めた血清を、コーティングしたフィブリノゲンへの黄色ブドウ球菌接着の阻害アッセイで試験した。
【０２０３】
ヒトフィブリノゲン（ｒｅｆ：ＳＩＧＭＡ Ｆ４８８３−１６）を、４℃で一晩、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中１０μｇ／ｍｌで高結合マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ）上にコーティングした。これらのプレートを、振盪しながら室温で３０分間、ＰＢＳ−１％ＢＳＡでブロッキングした。
【０２０４】
この飽和ステップ中、別のマイクロプレートで、マウス抗血清の（１／１０から始める）連続２倍希釈をＰＢＳ−０．２％ＢＳＡ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで行った。その後、熱失活させたＮｅｗｍａｎ Ｄ ｓｐａ 黄色ブドウ球菌（２ １０ｅ６ ＣＦＵ／ウェル）を添加し、これらのマイクロプレートを、振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。
【０２０５】
フィブリノゲンコーティングプレートの洗浄後、抗血清−細菌混合物を添加し、振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。
【０２０６】
洗浄後、結合した細菌を、ＰＢＳ−０．２％ＢＳＡ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで１：５００００希釈した（死滅させた黄色ブドウ球菌Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎで免疫した後に得た）抗死滅全細胞ウサギポリクローナル（抗体）を用いて検出し、振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。
【０２０７】
洗浄後、結合したウサギ抗体を、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで１：５０００希釈したＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社のペルオキシダーゼ結合ａｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ウサギＩｇＧ（ｒｅｆ：１１１−０３５−００３）を用いて検出した。この検出抗体を、振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。
【０２０８】
ｐＨ４．５の０．１Ｍ  クエン酸緩衝液１０ｍｌあたりＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ）４ｍｇ＋Ｈ２Ｏ２  ５μｌを用いて、暗所で、室温で１５分間発色させた。この反応をＨＣｌ５０μｌで停止させ、光学密度を、６２０ｎｍに対する４９０ｎｍで読みとった。
【０２０９】
図４に示す結果は、ＣｌｆＡ  Ｎ１２３の野生型および４７４変異体の両方に対する抗体が、ほぼ同じ程度で、フィブリノゲンコーティングプレートへの黄色ブドウ球菌の結合を阻害することができたことを証明する。
【０２１０】
実施例４  本発明のいくつかのＣｌｆＡポリペプチドをコードする核酸配列およびポリペプチド配列
配列番号１  ＣｌｆＡ  Ｎ１Ｎ２Ｎ３の核酸
ATG
AGCGAAAACAGCGTGACCCAGAGCGATAGCGCGAGCAACGAAAGCAAAAGCAACGATAGCAGCAGCGTTAGCGC
AGCGCCGAAAACCGATGATACCAACGTGAGCGATACCAAAACCAGCAGCAACACCAACAACGGCGAAACCAGCGTGGCGC
AGAATCCGGCGCAGCAGGAAACCACCCAAAGCTCTAGCACCAACGCGACCACCGAAGAAACCCCGGTGACCGGCGAAGCG
ACCACCACGACGACCAACCAGGCGAATACCCCGGCGACCACCCAGTCTAGCAATACCAATGCGGAAGAACTGGTGAACCA
GACCAGCAACGAAACCACCTCTAATGATACCAACACCGTGAGCAGCGTGAACAGCCCGCAGAACAGCACCAATGCCGAAA
ACGTGAGCACCACCCAGGATACCAGCACCGAAGCGACCCCGAGCAACAACGAAAGCGCACCGCAAAGCACCGATGCGAGC
AACAAAGATGTGGTGAACCAGGCGGTGAATACCAGCGCACCGCGTATGCGTGCGTTTAGCCTGGCCGCGGTTGCGGCGGA
TGCGCCGGTTGCGGGCACCGATATCACCAACCAGCTGACGAACGTGACCGTGGGCATTGATAGCGGCACCACCGTGTATC
CGCATCAGGCGGGCTATGTGAAACTGAACTATGGCTTTAGCGTGCCGAACAGCGCGGTGAAAGGCGATACCTTTAAAATT
ACCGTGCCGAAAGAACTGAACCTGAACGGCGTGACCAGCACCGCGAAAGTGCCGCCGATTATGGCGGGCGATCAGGTGCT
GGCCAACGGCGTGATTGATAGCGATGGCAACGTGATTTATACCTTCACCGATTATGTGAACACCAAAGATGATGTGAAAG
CGACCCTGACCATGCCGGCGTATATTGATCCGGAAAACGTGAAAAAAACCGGCAACGTGACCCTGGCCACCGGCATTGGT
AGCACCACCGCGAACAAAACCGTGCTGGTTGATTATGAAAAATACGGCAAATTCTATAACCTGAGCATCAAAGGCACCAT
TGATCAGATCGATAAAACCAACAACACCTATCGCCAGACCATTTATGTGAATCCGAGCGGCGATAACGTGATTGCGCCGG
TGCTGACCGGCAACCTGAAACCGAACACCGATAGCAACGCGCTGATTGATCAGCAGAACACCAGCATCAAAGTGTACAAA
GTGGATAACGCGGCGGATCTGAGCGAAAGCTATTTTGTGAATCCGGAAAACTTTGAAGATGTGACCAACAGCGTGAACAT
TACCTTTCCGAATCCGAACCAGTATAAAGTGGAATTTAACACCCCGGATGATCAGATTACCACCCCGTATATTGTGGTGG
TGAACGGCCATATTGATCCGAACAGCAAAGGCGATCTGGCCCTGCGTAGCACCCTGTATGGCTATAACAGCAACATTATT
TGGCGTAGCATGAGCTGGGATAACGAAGTGGCGTTTAACAACGGCAGCGGCAGCGGTGATGGCATTGATAAACCGGTGGT
GCCGGAACAGCCGGATGAACCGGGCGAAATTGAACCGATTCCGGAATAA
配列番号２  Ｎ１Ｎ２Ｎ３  ＣｌｆＡ  Ｈｉｓ４７４の核酸
atgAGCGAAAACAGCGTGACCCAGAGCGATAGCGCGAGCAACGAAAGCAAAAGCAACGATAGCAGCAGCGTTAGCGC
AGCGCCGAAAACCGATGATACCAACGTGAGCGATACCAAAACCAGCAGCAACACCAACAACGGCGAAACCAGCGTGGCGC
AGAATCCGGCGCAGCAGGAAACCACCCAAAGCTCTAGCACCAACGCGACCACCGAAGAAACCCCGGTGACCGGCGAAGCG
ACCACCACGACGACCAACCAGGCGAATACCCCGGCGACCACCCAGTCTAGCAATACCAATGCGGAAGAACTGGTGAACCA
GACCAGCAACGAAACCACCTCTAATGATACCAACACCGTGAGCAGCGTGAACAGCCCGCAGAACAGCACCAATGCCGAAA
ACGTGAGCACCACCCAGGATACCAGCACCGAAGCGACCCCGAGCAACAACGAAAGCGCACCGCAAAGCACCGATGCGAGC
AACAAAGATGTGGTGAACCAGGCGGTGAATACCAGCGCACCGCGTATGCGTGCGTTTAGCCTGGCCGCGGTTGCGGCGGA
TGCGCCGGTTGCGGGCACCGATATCACCAACCAGCTGACGAACGTGACCGTGGGCATTGATAGCGGCACCACCGTGTATC
CGCATCAGGCGGGCTATGTGAAACTGAACTATGGCTTTAGCGTGCCGAACAGCGCGGTGAAAGGCGATACCTTTAAAATT
ACCGTGCCGAAAGAACTGAACCTGAACGGCGTGACCAGCACCGCGAAAGTGCCGCCGATTATGGCGGGCGATCAGGTGCT
GGCCAACGGCGTGATTGATAGCGATGGCAACGTGATTTATACCTTCACCGATTATGTGAACACCAAAGATGATGTGAAAG
CGACCCTGACCATGCCGGCGTATATTGATCCGGAAAACGTGAAAAAAACCGGCAACGTGACCCTGGCCACCGGCATTGGT
AGCACCACCGCGAACAAAACCGTGCTGGTTGATTATGAAAAATACGGCAAATTCTATAACCTGAGCATCAAAGGCACCAT
TGATCAGATCGATAAAACCAACAACACCTATCGCCAGACCATTTATGTGAATCCGAGCGGCGATAACGTGATTGCGCCGG
TGCTGACCGGCAACCTGAAACCGAACACCGATAGCAACGCGCTGATTGATCAGCAGAACACCAGCATCAAAGTGTACAAA
GTGGATAACGCGGCGGATCTGAGCGAAAGCTATTTTGTGAATCCGGAAAACTTTGAAGATGTGACCAACAGCGTGAACAT
TACCTTTCCGAATCCGAACCAGTATAAAGTGGAATTTAACACCCCGGATGATCAGATTACCACCCCGTATATTGTGGTGG
TGAACGGCCATATTGATCCGAACAGCAAAGGCGATCTGGCCCTGCGTAGCACCCTGTATGGCCATAACAGCAACATTATT
TGGCGTAGCATGAGCTGGGATAACGAAGTGGCGTTTAACAACGGCAGCGGCAGCGGTGATGGCATTGATAAACCGGTGGT
GCCGGAACAGCCGGATGAACCGGGCGAAATTGAACCGATTCCGGATAA
配列番号３  黄色ブドウ球菌株ＮＣＴＣ８３２５のＣｌｆＡ
MNMKKKEKHAIRKKSIGVASVLVGTLIGFGLLSSKEADASENSVTQSDSASNESKSNDSS
SVSAAPKTDDTNVSDTKTSSNTNNGETSVAQNPAQQETTQSSSTNATTEETPVTGEATTT
TTNQANTPATTQSSNTNAEELVNQTSNETTSNDTNTVSSVNSPQNSTNAENVSTTQDTST
EATPSNNESAPQSTDASNKDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPEDSDSDPGSDSGSDSNSDSGSDSGSDSTSDSGSDSASDSDSA
SDSDSASDSDSASDSDSASDSDSDNDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSD
SDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSD
SDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSASDSDSDSDSDSD
SDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSESDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSASDSDSGSD
SDSSSDSDSESDSNSDSESVSNNNVVPPNSPKNGTNASNKNEAKDSKEPLPDTGSEDEAN
TSLIWGLLASIGSLLLFRRKKENKDKK
配列番号４  ＣｌｆＡ  Ｎ１Ｎ２Ｎ３のアミノ酸
MSENSVTQSDSASNESKSNDSSSVSAAPKTDDTNVSDTKTSSNTNNGETSVAQNPAQQETTQSSSTNATTEETPVTGEATTTTTNQANTPATTQSSNTNAEELVNQTSNETTSNDTNTVSSVNSPQNSTNAENVSTTQDTSTEATPSNNESAPQSTDASNKDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNTDSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPDDQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDEPGEIEPIPE
配列番号５  ＣｌｆＡ  Ｎ１−３
MNMKKKEKHAIRKKSIGVASVLVGTLIGFGLLSSKEADASENSVTQSDSASNESKSNDSS
SVSAAPKTDDTNVSDTKTSSNTNNGETSVAQNPAQQETTQSSSTNATTEETPVTGEATTT
TTNQANTPATTQSSNTNAEELVNQTSNETTSNDTNTVSSVNSPQNSTNAENVSTTQDTST
EATPSNNESAPQSTDASNKDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE
配列番号６  ＣｌｆＡ  Ｎ２３
SLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE
配列番号７  ＣｌｆＡ  Ｎ２３短鎖
GTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE
配列番号８  黄色ブドウ球菌株ＮＣＴＣ８３２５ Ｈ４７４のＣｌｆＡ
MNMKKKEKHAIRKKSIGVASVLVGTLIGFGLLSSKEADASENSVTQSDSASNESKSNDSS
SVSAAPKTDDTNVSDTKTSSNTNNGETSVAQNPAQQETTQSSSTNATTEETPVTGEATTT
TTNQANTPATTQSSNTNAEELVNQTSNETTSNDTNTVSSVNSPQNSTNAENVSTTQDTST
EATPSNNESAPQSTDASNKDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGHNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPEDSDSDPGSDSGSDSNSDSGSDSGSDSTSDSGSDSASDSDSA
SDSDSASDSDSASDSDSASDSDSDNDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSD
SDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSD
SDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSASDSDSDSDSDSD
SDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSESDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSASDSDSGSD
SDSSSDSDSESDSNSDSESVSNNNVVPPNSPKNGTNASNKNEAKDSKEPLPDTGSEDEAN
TSLIWGLLASIGSLLLFRRKKENKDKK
配列番号９  ＣｌｆＡ  Ｎ１Ｎ２Ｎ３  Ｈ４７４のアミノ酸
MSENSVTQSDSASNESKSNDSSSVSAAPKTDDTNVSDTKTSSNTNNGETSVAQNPAQQETTQSSSTNATTEETPVTGEATTTTTNQANTPATTQSSNTNAEELVNQTSNETTSNDTNTVSSVNSPQNSTNAENVSTTQDTSTEATPSNNESAPQSTDASNKDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNTDSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPDDQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGHNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDEPGEIEPIPE
配列番号１０  ＣｌｆＡ  Ｎ１−３  Ｈ４７４
MNMKKKEKHAIRKKSIGVASVLVGTLIGFGLLSSKEADASENSVTQSDSASNESKSNDSS
SVSAAPKTDDTNVSDTKTSSNTNNGETSVAQNPAQQETTQSSSTNATTEETPVTGEATTT
TTNQANTPATTQSSNTNAEELVNQTSNETTSNDTNTVSSVNSPQNSTNAENVSTTQDTST
EATPSNNESAPQSTDASNKDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGHNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE
配列番号１１  ＣｌｆＡ Ｎ２３ Ｈ４７４
SLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGHNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE
配列番号１２  ＣｌｆＡ Ｎ２３短鎖 Ｈ４７４
GTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGHNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE
配列番号１３  黄色ブドウ球菌株ＮＣＴＣ８３２５のＣｌｆＡ  ｄｅｌ
MNMKKKEKHAIRKKSIGVASVLVGTLIGFGLLSSKEADASENSVTQSDSASNESKSNDSS
SVSAAPKTDDTNVSDTKTSSNTNNGETSVAQNPAQQETTQSSSTNATTEETPVTGEATTT
TTNQANTPATTQSSNTNAEELVNQTSNETTSNDTNTVSSVNSPQNSTNAENVSTTQDTST
EATPSNNESAPQSTDASNKDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPEDSDSDPGSDSGSDSNSDSGSDSGSDSTSDSGSDSASDSDSA
SDSDSASDSDSASDSDSASDSDSDNDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSD
SDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSD
SDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSASDSDSDSDSDSD
SDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSESDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSASDSDSGSD
SDSSSDSDSESDSNSDSESVSNNNVVPPNSPKNGTNASNKNEAKDSKEPLPDTGSEDEAN
TSLIWGLLASIGSLLLFRRKKENKDKK
配列番号１４  ＣｌｆＡ Ｎ１Ｎ２Ｎ３ Ｈ４７４  Ｄｅｌのアミノ酸
MSENSVTQSDSASNESKSNDSSSVSAAPKTDDTNVSDTKTSSNTNNGETSVAQNPAQQETTQSSSTNATTEETPVTGEATTTTTNQANTPATTQSSNTNAEELVNQTSNETTSNDTNTVSSVNSPQNSTNAENVSTTQDTSTEATPSNNESAPQSTDASNKDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNTDSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPDDQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDEPGEIEPIPE
配列番号１５  ＣｌｆＡ  Ｎ１−３ Ｄｅｌ
MNMKKKEKHAIRKKSIGVASVLVGTLIGFGLLSSKEADASENSVTQSDSASNESKSNDSS
SVSAAPKTDDTNVSDTKTSSNTNNGETSVAQNPAQQETTQSSSTNATTEETPVTGEATTT
TTNQANTPATTQSSNTNAEELVNQTSNETTSNDTNTVSSVNSPQNSTNAENVSTTQDTST
EATPSNNESAPQSTDASNKDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE
配列番号１６  ＣｌｆＡ Ｎ２３ Ｈ４７４ ｄｅｌ
SLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE
配列番号１７  ＣｌｆＡ Ｎ２３短鎖 ｄｅｌ
GTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE
配列番号１８  黄色ブドウ球菌株ＮＣＴＣ８３２５のＣｌｆＡ  ｄｅｌ
MNMKKKEKHAIRKKSIGVASVLVGTLIGFGLLSSKEADASENSVTQSDSASNESKSNDSS
SVSAAPKTDDTNVSDTKTSSNTNNGETSVAQNPAQQETTQSSSTNATTEETPVTGEATTT
TTNQANTPATTQSSNTNAEELVNQTSNETTSNDTNTVSSVNSPQNSTNAENVSTTQDTST
EATPSNNESAPQSTDASNKDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPEDSDSDPGSDSGSDSNSDSGSDSGSDSTSDSGSDSASDSDSA
SDSDSASDSDSASDSDSASDSDSDNDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSD
SDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSD
SDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSASDSDSDSDSDSD
SDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSESDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSASDSDSGSD
SDSSSDSDSESDSNSDSESVSNNNVVPPNSPKNGTNASNKNEAKDSKEPLPDTGSEDEAN
TSLIWGLLASIGSLLLFRRKKENKDKK
配列番号１９  ＣｌｆＡ Ｎ１Ｎ２Ｎ３ ｄｅｌ
MSENSVTQSDSASNESKSNDSSSVSAAPKTDDTNVSDTKTSSNTNNGETSVAQNPAQQETTQSSSTNATTEETPVTGEATTTTTNQANTPATTQSSNTNAEELVNQTSNETTSNDTNTVSSVNSPQNSTNAENVSTTQDTSTEATPSNNESAPQSTDASNKDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNTDSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPDDQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDEPGEIEPIPE
配列番号２０  ＣｌｆＡ  Ｎ１−３ ｄｅｌ
MNMKKKEKHAIRKKSIGVASVLVGTLIGFGLLSSKEADASENSVTQSDSASNESKSNDSS
SVSAAPKTDDTNVSDTKTSSNTNNGETSVAQNPAQQETTQSSSTNATTEETPVTGEATTT
TTNQANTPATTQSSNTNAEELVNQTSNETTSNDTNTVSSVNSPQNSTNAENVSTTQDTST
EATPSNNESAPQSTDASNKDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE
配列番号２１  ＣｌｆＡ Ｎ２３  ｄｅｌ
SLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE
配列番号２２  ＣｌｆＡ Ｎ２３短鎖ｄｅｌ
GTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE
配列番号２３  黄色ブドウ球菌株ＮＣＴＣ８３２５のＣｌｆＡ  ｄｅｌ
MNMKKKEKHAIRKKSIGVASVLVGTLIGFGLLSSKEADASENSVTQSDSASNESKSNDSS
SVSAAPKTDDTNVSDTKTSSNTNNGETSVAQNPAQQETTQSSSTNATTEETPVTGEATTT
TTNQANTPATTQSSNTNAEELVNQTSNETTSNDTNTVSSVNSPQNSTNAENVSTTQDTST
EATPSNNESAPQSTDASNKDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPEDSDSDPGSDSGSDSNSDSGSDSGSDSTSDSGSDSASDSDSA
SDSDSASDSDSASDSDSASDSDSDNDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSD
SDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSD
SDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSASDSDSDSDSDSD
SDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSESDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSASDSDSGSD
SDSSSDSDSESDSNSDSESVSNNNVVPPNSPKNGTNASNKNEAKDSKEPLPDTGSEDEAN
TSLIWGLLASIGSLLLFRRKKENKDKK
配列番号２４  ＣｌｆＡ Ｎ１Ｎ２Ｎ３ ｄｅｌ
MSENSVTQSDSASNESKSNDSSSVSAAPKTDDTNVSDTKTSSNTNNGETSVAQNPAQQETTQSSSTNATTEETPVTGEATTTTTNQANTPATTQSSNTNAEELVNQTSNETTSNDTNTVSSVNSPQNSTNAENVSTTQDTSTEATPSNNESAPQSTDASNKDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNTDSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPDDQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDEPGEIEPIPE
配列番号２５  ＣｌｆＡ  Ｎ１−３ ｄｅｌ
MNMKKKEKHAIRKKSIGVASVLVGTLIGFGLLSSKEADASENSVTQSDSASNESKSNDSS
SVSAAPKTDDTNVSDTKTSSNTNNGETSVAQNPAQQETTQSSSTNATTEETPVTGEATTT
TTNQANTPATTQSSNTNAEELVNQTSNETTSNDTNTVSSVNSPQNSTNAENVSTTQDTST
EATPSNNESAPQSTDASNKDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE
配列番号２６  ＣｌｆＡ Ｎ２３ ｄｅｌ
SLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE
配列番号２７  ＣｌｆＡ Ｎ２３短鎖ｄｅｌ
GTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE
配列番号２８  ＣｌｆＡ Ｎ２３短鎖ｄｅｌ
GTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE
配列番号２９  ＣｌｆＡ Ｎ２３短鎖ｄｅｌ
GTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE
配列番号３０  ＣｌｆＡ Ｎ２３短鎖ｄｅｌ
GTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE
配列番号３１  ＣｌｆＡ Ｎ２３短鎖ｄｅｌ
GTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE
配列番号３２  ＣｌｆＡ Ｎ２３短鎖ｄｅｌ
GTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
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配列番号３３  ＣｌｆＡ Ｎ２３短鎖ｄｅｌ
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配列番号３４  ＣｌｆＡ Ｎ２３短鎖ｄｅｌ
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配列番号３５  ＣｌｆＡ Ｎ２３短鎖ｄｅｌ
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配列番号３６  ＣｌｆＡ Ｎ２３短鎖ｄｅｌ
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配列番号３７  ＣｌｆＡ Ｎ２３短鎖ｄｅｌ
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配列番号３８  ＣｌｆＡ Ｎ２３短鎖ｄｅｌ
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配列番号３９  ＣｌｆＡ Ｎ２３短鎖ｄｅｌ
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配列番号４０  ＣｌｆＡ Ｎ２３短鎖ｄｅｌ
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配列番号４１  ＣｌｆＡ Ｎ２３短鎖ｄｅｌ
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配列番号４２  ＣｌｆＡ Ｎ２３短鎖ｄｅｌ
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配列番号４３  ＣｌｆＡ Ｎ２３短鎖ｄｅｌ
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配列番号４４  ＣｌｆＡ Ｎ２３短鎖ｄｅｌ
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DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE
【図１】
0005922573.tif 000002
【図２】
0005922573.tif 000003
【図３】
0005922573.tif 000004
【図４】
0005922573.tif 000005
【配列表】
0005922573000001.app