(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性小分子阿膠混合物であって、前記混合物の重量平均分子量が５８０〜１３００Ｄａであり、ペプチドの分子量が２００〜３０００Ｄａ、主に２００〜１０００Ｄａに分布しており、複合プロテアーゼを用いて阿膠液の酵素加水分解を行うことによって、前記混合物が調製され、前記複合プロテアーゼがパパイン及びプロリンプロテアーゼを含む活性小分子阿膠混合物。
【請求項２】
前記複合プロテアーゼが更に、ブロメラインプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、ペプシン、フレーバーザイムからなる群から選択したプロテアーゼを１つ、又は複数、又は全て含む、請求項１に記載の活性小分子阿膠混合物。
【請求項３】
前記混合物の製剤が粉末又は液体である、請求項１又は２に記載の活性小分子阿膠混合物。
【請求項４】
請求項１、２、又は３のいずれか一項に記載の前記活性小分子阿膠混合物を作製する方法であって、
（１）補助材を含まない阿膠液を室温で３０〜５５℃まで冷まし、ｐＨを５〜８に調節し、この液に複合プロテアーゼを加えて、加水分解反応を０．５〜２時間行うことによって、阿膠液の加水分解物を得る工程で、前記複合プロテアーゼがパパイン及びプロリンプロテアーゼを含み、かつ、前記補助材が黄酒、氷砂糖、及び大豆油を含む工程と、
（２）工程（１）で得た阿膠液の加水分解物を１０〜３０分間煮続けて、前記酵素を不活性化することによって、不活性化煎出物を得る工程と、
（３）前記不活性化煎出物を遠心分離して不純物を除去することによって、活性小分子阿膠混合物の液体製剤を得る工程と、
を含む方法。
【請求項５】
得られた前記活性小分子阿膠混合物の液体製剤を噴霧乾燥によって更に処理して粉末製剤にする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程（１）における前記阿膠液の濃度が１０％〜５０％である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記複合プロテアーゼが更に、ブロメラインプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、ペプシン、及びフレーバーザイムからなる群から選択したプロテアーゼを１つ、又は複数、又は全てを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
加える複合プロテアーゼの重量が阿膠液の重量の５％〜３％であり、前記複合プロテアーゼを加える順序が、複数の酵素を順に一定の間隔で加えるか、又は、加水分解反応の初期段階に、複数の酵素を同時に加えるかである、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
加える前記複合プロテアーゼ中の構成酵素の重量比が、パパイン：プロリンプロテアーゼ＝２：１、又はパパイン：プロリンプロテアーゼ：ブロメライン、中性プロテアーゼ、ペプシン、若しくはフレーバーザイムのいずれか１つ＝５：２：１である、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
健康食品の調製における請求項１〜３のいずれか一項に記載の活性小分子阿膠混合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性小分子混合物、並びに、その調製方法及び用途に関し、具体的には、阿膠液の酵素加水分解により得られる活性小分子ペプチド混合物、並びに、その適用方法及び用途に関する。本発明は、食品バイオテクノロジーの分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
阿膠は、血液を補い、気を養うのに有効な薬物である。阿膠は、後漢の時代に早くも、高名な薬物書「神農本草経」に「上品」として記載されているとともに、「長期間服用すると、気を補い、身体を軽く感じるようになる」と書かれている。阿膠の特徴は「甘」、「平」であり、その主な機能は、血液を補うとともに、陰を養って、乾燥状態を改善し、止血することである。阿膠は、血液不足による皮膚の黄化、めまい、動悸、筋委縮及び脱力、情緒的過敏、不眠、虚風内動、肺の乾燥による咳、労咳、喀血、吐血及び血尿、血便、切迫流産等を治療するのに用いる。２０１０年版中国薬典によれば、阿膠は、ウマ科のロバの乾皮又は未加工の皮膚を煮てから、その煎出物を濃縮することによって作られる固体ゼラチンである。しかしながら、コラーゲンタンパク質の分子量は非常に大きく（数万〜数十万）、脾臓及び胃の弱い患者は吸収できず、その結果、阿膠の機能が充分に発揮されない。同時に、近年、ロバの飼育頭数が減っており、これにより、必然的にロバの皮膚の供給量が不足するとともに、阿膠の価格が上昇している。ロバの皮膚材の深刻化する供給不足のため、市場の需要を満たすことができないが、阿膠液の酵素加水分解によって得られる小分子阿膠は、阿膠の生物学的利用能を大幅に高めることができるので、供給と需要のギャップを解消するための良好な手段となり得る。
【０００３】
近年、阿膠の酵素分解に関する研究はいくらか進展しており、（１）中国特許出願公開第１２３７４２１Ａ号「酵素分解による液体阿膠の調製方法」、（２）中国特許出願公開第１８０７６５３Ａ号「活性阿膠コラーゲンペプチド生成物」、（３）中国特許出願公開第１０１２６９０９０Ａ号「低分子量を有する阿膠加水分解物の調製方法」を含め、多くの特許が公開されている。これらの３つの発明はいずれも、阿膠のプロテアーゼ消化によるコラーゲンペプチドの作製を報告している。既存の技術に基づき、本発明は、阿膠における特徴的に高いプロリン及びヒドロキシプロリン含有量を利用して、初めて、プロリンプロテアーゼを用いて阿膠を酵素消化することを提案し、その結果、過去の特許で報告されたものよりも、加水分解効果が有意に高くなる。上述の３つの特許では、大半の生成物の分子量は、５０００Ｄａ未満、更には１００００Ｄａ未満の範囲に分布していた。加えて、上記のいずれの特許でも、分子量分布と遊離アミノ酸含有量の正確な測定結果は報告されていないが、本発明では、ペプチド分子量は２００〜３０００Ｄａの範囲、主に２００〜１０００Ｄａの範囲に分布している。中国特許出願公開第１２３７４２１Ａ号及び中国特許出願公開第１８０７６５３Ａ号では、いずれも、消化原料として加えた補助材とともに、阿膠の塊を用いていたが、本発明では、プロセスを簡素化し、コストを抑え、良好な溶解性と高い生物学的利用能を有する生成物を得るために、酵素分解の原料として阿膠液を用いており、ＤＰＰＨラジカル及びＡＢＴＳラジカルの消去率は１００％に近い。
【０００４】
文献（Ａｄｉｂｉ  Ａ  Ｓ．Ａｍｅｒｉｃａ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，１９８４，２５：１１１４−１１２２、ＤＢＡ  Ｓｉｌｋ  Ｇｕｔ，１９７４，１５：４９４−５０１）内の多くの報告では、分子量が２００〜１０００Ｄａの範囲であるペプチドは、他のサイズのペプチド及び遊離アミノ酸よりも、吸収性及び効能が優れていることが示されている。本発明は、生成物中の遊離アミノ酸含有量と、生成物の分子量分布を正確に割り出すために、原料としての補助材なしに阿膠液を用いることを提案し、生成物に含まれる小ペプチドは大体、２００〜１０００Ｄａの範囲に分布するので、吸収性と効能が高い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
既存の技法における問題を解決するために、本発明の目的の１つは、活性小分子阿膠混合物を提供することである。
【０００６】
本発明の第２の目的は、活性小分子阿膠混合物の作製方法を提供することである。
【０００７】
本発明の第３の目的は、小分子ペプチド食品及び健康食品の製造に前記活性小分子阿膠混合物を適用することを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の目的を達成するために、本発明では、下記の技術的手段を採用する。
【０００９】
本発明で提案する活性小分子阿膠混合物であって、生成物の重量平均分子量が５８０〜１３００Ｄａであり、ペプチドが、２００〜３０００Ｄａ、主に２００〜１０００Ｄａに分布する活性小分子阿膠混合物。
【００１０】
本発明では、複合プロテアーゼを用いて阿膠液の酵素加水分解を行うことによって、活性小分子阿膠混合物を調製する。前記複合プロテアーゼは、パパイン及びプロリンプロテアーゼを含み、前記複合プロテイナーゼは更に、ブロメラインプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、ペプシン、及びフレーバーザイムからなる群から選択したプロテアーゼを１つ、又は複数、又は全て含むのが好ましい。
【００１１】
本発明では、前記活性小分子阿膠混合物を処理して粉末又は液体製剤にすることができる。
【００１２】
本発明で提案する活性小分子阿膠混合物の特徴は、（１）処理して経口投与用の粉末又は液体製剤にできること、（２）溶解性が良好で、冷水への溶解速度も速いこと、（３）遊離アミノ酸の含有量が少なく（わずか４％）、分子量が２００〜１０００Ｄａの範囲である小ペプチドが全体の８１％を占め、１０００〜３０００Ｄａのペプチドが１４％を占め（図１参照）、重量平均分子量が７６５Ｄａであること、（４）生物学的利用能については、小分子阿膠の生物学的利用能が、通常の阿膠の３．５倍であり、生物消化した阿膠の２．２倍であること（図２参照）、（５）抗酸化効果の面では、小分子阿膠は、ＤＰＰＨ及びＡＢＴＳを含むラジカルを除去する優れた効能を有し、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、消去率を１００％近くにできること（図３及び４参照）である。
【００１３】
本発明は、活性小分子阿膠混合物を作製する方法であって、
（１）補助材を含まない阿膠液を室温で３０〜５５℃まで冷まし、ｐＨを５〜８に調節し、この液に複合プロテアーゼを加えて、加水分解反応を０．５〜２時間行うことによって、阿膠液の加水分解物を得る工程と、
（２）工程（１）で得た阿膠液の加水分解物を１０〜３０分間煮て、上記の酵素を不活性化することによって、不活性化煎出物を得る工程と、
（３）この不活性化煎出物を遠心分離して不純物を除去することによって、活性小分子阿膠混合物の液体製剤を得る工程と、
を含む方法も提供する。
【００１４】
本発明で提案する前記活性小分子阿膠混合物を調製するための方法は、前記液体製剤を噴霧乾燥して、活性小分子阿膠混合物の粉末製剤を作製する工程を更に含んでもよい。
【００１５】
本発明で提案する方法では、前記補助材は、黄酒、氷砂糖、及び大豆油を含み、前記補助材を含まない阿膠液は、黄酒、氷砂糖、又は大豆油が無添加の阿膠液である。
【００１６】
本発明の実施形態では、工程（１）における阿膠液の濃度は１０％〜５０％（ｗ／ｗ）である。
【００１７】
本発明の実施形態では、前記複合プロテアーゼは、パパイン及びプロリンプロテアーゼを含み、前記複合プロテイナーゼは更に、ブロメラインプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、ペプシン、及びフレーバーザイムからなる群から選択したプロテアーゼを１つ、又は複数、又は全て含むのが好ましい。
【００１８】
工程（１）で加える複合プロテアーゼの量が阿膠液の５重量％〜３重量％（ｗ／ｗ）である本発明の実施形態では、複合プロテアーゼの添加順については、上記の酵素を順に一定の間隔で加えるか、又は、加水分解反応の初期段階に、上記の酵素を同時に加えるかである。
【００１９】
本発明の特定の実施形態では、重量によれば、複合プロテアーゼの各々の添加比は、パパイン：プロリンプロテアーゼ＝２：１、又はパパイン：プロリンプロテアーゼ：ブロメライン、中性プロテアーゼ、ペプシン、若しくはフレーバーザイムのいずれか１つ＝５：２：１である。その他の比については詳述しない。当業者は、いかなる創造的作業もせずに、適用時の実際の状況に基づき、多種多様な選択をすることができる。
【００２０】
本発明は更に、活性小分子阿膠混合物を小分子ペプチド食品及び健康食品の調製に適用することを提供する。小分子活性ペプチド混合物により、吸収性が向上し、非常に良好な溶解性と非常に良好な抗酸化効果を示すので、粉末又は液体製剤の食品、並びに、抗酸化機能及び老化遅延機能を有する健康食品の開発に有用である。
【００２１】
既存の技法と比べた場合の本発明の利点は以下のとおりである。
【００２２】
１：提案する方法は、いずれの補助材も原料として含まない阿膠液を用いることによって、プロセスの簡易化、省エネルギー、コスト削減、高効率の加水分解、並びに、噴霧乾燥生成物の構造及び特性の安定性の確保をもたらす。
【００２３】
２：提案する方法は、遠心分離によって生成物中の脂肪及び不純物を取り除き、生成物の溶解性が高くなるように、かつ、生成物が、関連する食品及び健康食品の開発の助けとなるようにする。
【００２４】
３：提案する方法では、噴霧乾燥を用いて粉末原料を得て、低い保管コストと、カプセル剤及び顆粒製品の開発しやすさを確保する。
【００２５】
４：提案する方法では、生成物の試験技法を進歩させ、遊離アミノ酸の含有量とペプチドの分布を正確に割り出せるようにする。
【００２６】
５：提案する方法では、酵素分解技術が進展し、生成物中のペプチドの分子量は主に２００〜１０００Ｄａに分布しており、この分子量範囲は、公開されているプロセスによって得られるものよりも低く、これにより、更に高い吸収性と機能的効果が確保される。
【００２７】
６：本発明で提案する作製技術は進展しているとともに、実用的であり、阿膠から高収率の小分子混合物が確保される。例えば、原料として４０％阿膠液を１Ｌ用いて、酵素分解とその後のプロセスの後に得られた粉末生成物は約３６０ｇで、収率は９０％であった。
【００２８】
７：得られた物質の生物学的利用能と抗酸化効果を予備的に割り出したところ、非常に良好な結果を示した。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】アミノ酸分析技法と組み合わせて、高速ゲルクロマトグラフィーを用いて測定した、活性小分子阿膠混合物の分子量分布である。
【図２】本発明による生成物、及び、異なる技法による生成物を与えた後のマウスの血中のヒドロキシルプロリン含有量を比較することによって、生物学的利用能を比較した結果であり、通常の阿膠は、通常の未処理の阿膠サンプルであり、生物消化した阿膠は、ヒトの胃腸管での消化を模して、ペプシン及び腸内トリプシンを用いて、阿膠を酵素分解したものであり、小分子阿膠は、本発明で提案する方法を用いることによって得た活性小分子阿膠混合物である。
【図３】本発明に従って得た活性小分子阿膠混合物が、ＤＰＰＨラジカルを除去する効果である。
【図４】本発明に従って得た活性小分子阿膠混合物がＡＢＴＳラジカルを除去する効果である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下では、本発明を実施形態によって更に説明する。本発明の長所及び特徴は、この説明によって明らかになる。これらの実施形態は実例に過ぎず、本発明の保護範囲を制限するものでは決してないと理解されたい。当業者であれば、本発明の趣旨及び範囲から逸脱せずに、本発明の細部及び形状を修正又は置換できることが分かるであろうし、そのような修正形態及び置換形態はいずれも、本発明の保護範囲内である。
【００３１】
本発明の実施形態に関連する実験材料の供給源は以下のとおりである。
【００３２】
１：黄酒、氷砂糖、及び大豆油を含まない阿膠液は、Ｓｈａｎｄｏｎｇ  Ｄｏｎｇ−Ｅ  Ｄｏｎｋｅｙ−ｈｉｄｅ  ｇｅｌａｔｉｎ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。
【００３３】
２：各種酵素
フレーバーザイム、中性プロテアーゼ、及びブロメラインは、Ｐａｎｇｂｏ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｎａｎｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａから購入し、パパイン及びペプシンは、Ｋｅｙｕａｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入し、プロリンプロテアーゼはＳｈａｎｇｈａｉ  Ｙｕａｎｄａ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｌｔｄ．から購入した。
【００３４】
３：ＡＢＴＳラジカル及びＤＰＰＨラジカルは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。
【実施例】
【００３５】
実施例１
補助材を加えていない１Ｌの阿膠液（４０％（ｗ／ｗ））を室温で３５℃まで冷まし、そのｐＨを６．５に調節した。この液に、５％（ｗ／ｗ）の複合プロテアーゼ（パパイン：プロリンプロテアーゼ＝２：１（ｗ／ｗ））を加え、加水分解反応を２時間行い、この液を煮るために加熱し、２０分間煮続けて上記の酵素を不活性化してから、遠心分離して不溶性不純物と脂肪を除去して、活性小分子阿膠混合物の液体調製物を得た。この生成物の分子量を割り出したところ、ペプチドの大半は２００〜３０００Ｄａの範囲であり、全体の８３％を占めた。
【００３６】
実施例２
補助材を加えていない１Ｌの阿膠液（４０％（ｗ／ｗ））を室温で３５℃まで冷まし、そのｐＨを６．５に調節した。この液に、５％（ｗ／ｗ）の複合プロテアーゼ（パパイン：プロリンプロテアーゼ＝２：１（ｗ／ｗ））を加え、加水分解反応を２時間行い、この液を２０分間煮続けて上記の酵素を不活性化してから、遠心分離して不溶性不純物と脂肪を除去し、最後にこの液体を噴霧乾燥して、３６０ｇの粉末活性小分子阿膠混合物を得た。この生成物の分子量を割り出したところ、ペプチドの大半は２００〜３０００Ｄａの範囲であり、全体の８３％を占めた。
【００３７】
実施例３
補助材を加えていない１Ｌの阿膠液（４０％（ｗ／ｗ））を室温で４０℃まで冷まし、そのｐＨを５．５に調節した。この液に１％（ｗ／ｗ）の複合プロテアーゼ（パパイン：プロリンプロテアーゼ：ペプシン＝５：２：１（ｗ／ｗ））を加えて、加水分解反応を２時間行い、この液を２０分間煮続けて上記の酵素を不活性化してから、遠心分離して不溶性不純物と脂肪を除去し、最後にこの液体を噴霧乾燥して、３６０ｇの粉末活性小分子阿膠混合物を得た。この生成物の分子量を割り出したところ、ペプチドの大半は２００〜３０００Ｄａの範囲であり、全体の８６％を占めた。
【００３８】
実施例４
補助材を加えていない１Ｌの阿膠液（１０％（ｗ／ｗ））を室温で３５℃まで冷まし、そのｐＨを６に調節した。この液に２％（ｗ／ｗ）の複合プロテアーゼ（パパイン：プロリンプロテアーゼ：中性プロテアーゼ：ペプシン：フレーバーザイム＝６：３：１：１：１（ｗ／ｗ））を加え、加水分解反応を２時間行い、この液を２０分間煮続けて上記の酵素を不活性化してから、遠心分離して不溶性不純物と脂肪を除去し、最後にその液体を噴霧乾燥して、３６０ｇの粉末活性小分子阿膠混合物を得た。この生成物の分子量を割り出したところ、ペプチドの大半は２００〜３０００Ｄａの範囲であり、全体の７５％を占めた。
【００３９】
実施例５
補助材を加えていない１Ｌの阿膠液（４０％（ｗ／ｗ））を室温で５０℃まで冷まし、そのｐＨを６．５に調節した。この液に３％（ｗ／ｗ）の複合プロテアーゼ（パパイン：プロリンプロテアーゼ：ペプシン：中性プロテアーゼ：フレーバーザイム＝６：２：２：１：１（ｗ／ｗ））を加え、加水分解反応を２時間行い、この液を２０分間煮続けて上記の酵素を不活性化してから、遠心分離して不溶性不純物と脂肪を除去し、最後にその液体を噴霧乾燥して、３６０ｇの粉末活性小分子阿膠混合物を得た。この生成物の分子量を割り出したところ、ペプチドの大半は２００〜３０００Ｄａの範囲であり、全体の９５％を占めた。
【００４０】
実施例６
補助材を加えていない１Ｌの阿膠液（４０％（ｗ／ｗ））を室温で４０℃まで冷まし、そのｐＨを６．５に調節した。この液に３％（ｗ／ｗ）の複合プロテアーゼ（パパイン：プロリンプロテアーゼ：ペプシン：中性プロテアーゼ：フレーバーザイム＝６：２：２：１：１（ｗ／ｗ））を加え、加水分解反応を０．５時間行い、この液を煮るために加熱し、２０分間煮続けて上記の酵素を不活性化してから、遠心分離して不溶性不純物と脂肪を除去し、最後にこの液体を噴霧乾燥して、３６０ｇの粉末活性小分子阿膠混合物を得た。この生成物の分子量を割り出したところ、ペプチドの大半は２００〜３０００Ｄａであり、全体の８３％を占めた。
【００４１】
実施例７
補助材を加えていない１Ｌの阿膠液（４０％（ｗ／ｗ））を室温で４０℃まで冷まし、そのｐＨを６．５に調節した。この液に５％（ｗ／ｗ）の複合プロテアーゼ（パパイン：プロリンプロテアーゼ：ペプシン：中性プロテアーゼ：フレーバーザイム＝６：２：２：１：１（ｗ／ｗ））を加え、加水分解反応を２時間行い、この液を煮るために加熱し、２０分間煮続けて上記の酵素を不活性化してから、遠心分離して不溶性不純物と脂肪を除去し、最後に液体を噴霧乾燥して、３６０ｇの粉末活性小分子阿膠混合物を得た。この生成物の分子量を割り出したところ、ペプチドの大半は２００〜３０００Ｄａであり、全体の７１％を占めた。
【００４２】
実施例８
補助材を加えていない１Ｌの阿膠液（４０％（ｗ／ｗ））を室温で４０℃まで冷まし、そのｐＨを６．５に調節した。この液に１．５％（ｗ／ｗ）の複合プロテアーゼ（パパイン：プロリンプロテアーゼ＝２：１（ｗ／ｗ））を加え、加水分解反応を０．５時間行ってから、５％（ｗ／ｗ）のペプシンを加え、加水分解を０．５時間続け、続いて、５％（ｗ／ｗ）の複合プロテアーゼ（中性プロテアーゼ：フレーバーザイム＝１：１（ｗ／ｗ））を加えることによって加水分解を１時間続け、この液を煮るために加熱し、２０分間煮続けて上記の酵素を不活性化してから、遠心分離して不溶性不純物と脂肪を除去し、最後にこの液体を噴霧乾燥して、３６０ｇの粉末活性小分子阿膠混合物を得た。この生成物の分子量を割り出したところ、ペプチドの大半は２００〜３０００Ｄａの範囲であり、全体の８７％を占めた。
【００４３】
実施例９
補助材を加えていない１Ｌの阿膠液（４０％（ｗ／ｗ））を室温で５０℃まで冷まし、そのｐＨを６．５に調節した。この液に３％（ｗ／ｗ）の複合プロテアーゼ（パパイン：ペプシン：中性プロテアーゼ：フレーバーザイム：ブロメライン＝６：２：２：１：１（ｗ／ｗ））を加え、加水分解反応を２時間行い、この液を煮るために加熱し、２０分間煮続けて上記の酵素を不活性化してから、遠心分離して不溶性不純物と脂肪を除去し、最後にこの液体を噴霧乾燥して、３６０ｇの粉末活性小分子阿膠混合物を得た。この生成物の分子量を割り出したところ、ペプチドの大半は、２００〜３０００Ｄａの範囲であり、全体の６５％を占めた。
【００４４】
本発明の実施形態の実施例５に従って調製した粉末活性小分子阿膠混合物を下記の試験分析で用いた。
【００４５】
実施例１０：活性小分子阿膠混合物中のペプチドの分布の試験
１．１：高速ゲルクロマトグラフィーを用いた試験
試験装置：
液体系：Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００、効率的なゲルカラム：ＴＳＫ−Ｇ２０００  ＳＫｗｌ（３００ｍｍ×７．８ｍｍ、平均孔径５００Å）
試験手順：
１ｍｌの加水分解サンプルを量りとり、１０，０００ｇで２分間遠心分離し、上清を０．４５μｍの使い捨てフィルターバイアルでろ過してから、サンプルをクロマトグラフに導入した。カラム温度は２７℃で、移動相は０．０５モル／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で、その流速は０．５ｍｌ／分であり、検出波長は２８０ｎｍ、導入体積は２０μｌであった。
【００４６】
１．２：遊離アミノ酸含有量の試験
試験装置：
ＭＳ：３２００  Ｑ  Ｔｒａｐ、ＬＣシステム、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＵＦＬＣシステム、カラム：アミノ酸分析専用のＡＢ  Ｓｃｅｉｘ、ガードカラム：Ｃ１８（４．０×３．０ｍｍ、５ｍｍ）、ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＣｏ．
手順：
均一に混合した２０μＬの液体サンプルに５μＬの沈殿剤を加え、均一に混合し、２分間、１０，０００ｇで遠心分離し、２０μＬの標識バッファーを５μＬの上清に加え、均一になるまで混合し、２．５μＬの標識試薬とともに５μＬの上清を加え、均一になるまで混合し、室温で３０分反応させ、反応後、２．５μＬのヒドロキシルアミンを加え、均一になるまで混合し、４０℃で窒素を吹き付けて乾燥し、１６μＬの内部標準液を加えることによって再構成し、均一になるまで混合し、１６μＬを量りとってサンプルバイアルに入れ、５μＬをクロマトグラフに導入してアミノ酸の濃度を測定した。
【００４７】
１．３：結果
結果は図１に示されている。図１から分かるように、サンプルは、分子量が２００〜１０００Ｄａの範囲のペプチドを高い含有量（８１％）で含んでおり、１０００〜３０００Ｄａのペプチドの部分は全体の１４％を占め、遊離アミノ酸含有量は非常に少なく、わずか４％であった。重量平均分子量は７６５Ｄａであった。本発明の背景技術の部分に記載されているように、分子量が２００〜１０００Ｄａのペプチドは、他のサイズのペプチド及び遊離アミノ酸と比べて吸収性と効能が高いので、他のコラーゲンペプチド生成物と比べて、本発明による生成物は、吸収速度及び機能的効能に関して優れているとみなすことができる。
【００４８】
実施例１１  生物学的利用能試験
材料：
通常の阿膠：通常の未処理の阿膠サンプル
生物消化した阿膠：ヒトの胃腸管での消化を模して、ペプシン及び腸内トリプシンを用いて、阿膠を酵素分解したもの
小分子阿膠：本発明で提案する方法を用いることによって得た活性小分子阿膠混合物
２４匹の健常マウス（雄１２匹、雌１２匹、体重２００〜２５０ｇ）を用い、無作為にグループＡ、Ｂ、及びＣに分けた。１２時間絶食させてから投薬した。翌朝、グループＡに通常の阿膠溶液、グループＢに生物消化した阿膠溶液、グループＣに小分子阿膠を胃内投与し（それぞれサンプル１ｍｇ／体重１０ｇ）、投与の４時間後に給餌を再開した。投与の０時間後、０．２５時間後、０．５時間後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１０時間後、１２時間後、１８時間後、２４時間後に眼窩血液サンプルを採取した。前処理後に、アミノ酸分析を用いて血液サンプルを分析して、血中ヒドロキシルプロリン含有量を得、サンプルの生物学的利用能を標定した（ヒドロキシルプロリンは、コラーゲンの特徴的アミノ酸である）。
【００４９】
結果は図２に示されており、図２から、本発明で提案する活性小分子阿膠混合物の生物学的利用能は、通常の阿膠の３．５倍、生物消化から得られる生成物の２．２倍であることが分かる。これらのデータにより、本発明で提案する活性小分子阿膠混合物が、小分子の特徴と高い吸収速度を有することが示された。
【００５０】
実施例１２  抗酸化効果に関する試験
１．１：ＤＰＰＨラジカルを除去する効果に関する調査
手順
１．５ｍＬのサンプル溶液と１．５ｍＬのＤＰＰＨ溶液を共栓試験管に加え、遮光下で３０分、振とうして反応させ、５１７ｎｍにおける吸光度（ＡＳ）を測定し、同時に、０．１ｍモル／ＬのＤＰＰＨ溶液１．５ｍＬとエタノール１．５ｍＬとの混合物の吸光度（ＡＣ）、及び、サンプル溶液１．５ｍＬとエタノール１．５ｍＬとの混合物の吸光度（ＡＢ）を割り出した。下記の式に従って消去率を計算した。
【００５１】
【数１】
0005996668.tif 000002
【００５２】
式中、ＡＳはサンプル溶液間の反応物質の吸光度、ＡＣは、ＤＰＰＨ溶液とエタノールとの混合物の吸光度、ＡＢは、サンプル溶液とエタノールとの混合物の吸光度である。
【００５３】
１．２：ＡＢＴＳラジカルを除去する効果に関する調査
試験手順
８８μＬの過硫酸カリウム溶液を５ｍＬのＡＢＴＳ溶液と遮光下で１６時間反応させてから、吸光度が０．７±０．００２になるまで、その反応物質をエタノールで希釈する。２００μＬ（２ｍＬ）のＡＢＴＳ反応溶液を１００μＬ（１ｍＬ）のサンプル溶液と９６ウェルプレートで１０分間反応させ、７３４ｎｍにおける吸光度を測定した。下記の式に従って消去率を計算した。
【００５４】
【数２】
0005996668.tif 000003
【００５５】
式中、Ａ０は、ＡＢＴＳ・＋溶液の吸光度であり、Ａは、サンプル溶液を加えた後のＡＢＴＳ・＋溶液の吸光度である。
【００５６】
１．３：結果
結果は図３及び図４に示されている。図３及び４から分かるように、様々な濃度の小分子阿膠溶液の小分子はいずれも、ＡＢＴＳラジカル及びＤＰＰＨラジカルを除去する効果を示し、濃度が１０ｍｇ／ｍｌの小分子阿膠溶液は、いずれのラジカルに対しても１００％近い消去率を示し、本発明による生成物が一定の抗酸化効果を有することが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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