(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高血糖障害の治療が必要な被験体において、高血糖障害を治療するための薬学的組成物であって、高血糖障害が治療されるように、有効量のアポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質またはアポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質に少なくとも９０％の同一性を有するその生物学的活性類似体を含む、前記薬学的組成物。
【請求項２】
高血糖障害を有する被験体において、血糖レベルを低下させるための薬学的組成物であって、血糖レベルが低下するように、有効量のアポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質またはアポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質に少なくとも９０％の同一性を有するその生物学的活性類似体を含む、前記薬学的組成物。
【請求項３】
高血糖障害が、インスリン耐性障害または高血糖に関連する内分泌障害である、請求項１または２の薬学的組成物。
【請求項４】
高血糖障害が、前糖尿病、メタボリックシンドローム、多嚢胞性卵巣疾患、Ａ型症候群、および妊娠糖尿病からなる群より選択されるインスリン耐性障害である、請求項３の薬学的組成物。
【請求項５】
高血糖障害が、クッシング病、グルカゴン分泌性腫瘍、および先端巨大症からなる群より選択される高血糖に関連する内分泌障害である、請求項３の薬学的組成物。
【請求項６】
前糖尿病が、耐糖能不全または絶食時グルコース不全のいずれかによって特徴付けられる、請求項４の薬学的組成物。
【請求項７】
多嚢胞性卵巣疾患に関連する高血糖またはインスリン耐性を治療する必要がある被験体において、多嚢胞性卵巣疾患に関連する高血糖またはインスリン耐性を治療するための薬学的組成物であって、多嚢胞性卵巣疾患に関連する高血糖またはインスリン耐性が治療されるように、有効量のアポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質またはアポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質に少なくとも９０％の同一性を有するその生物学的活性類似体を含む、前記薬学的組成物。
【請求項８】
その生物学的活性類似体が、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質に少なくとも９９％の同一性を有する、請求項１〜７のいずれか一項の薬学的組成物。
【請求項９】
被験体がヒトである、請求項１〜８のいずれか一項の薬学的組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項の薬学的組成物であって、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶのアミノ酸配列が
ａ）以下の配列：
【化１】
0006033433.tif 000005
式中、Ｘ１は、Ｇ、Ａ、Ｖであるかまたは存在せず；
Ｘ２はＥまたはＫであり；
Ｘ３はＴまたはＳであり；そして
Ｘ４はＱまたはＨである
であるかまたはその生物学的活性断片である；
ｂ）全長ヒト・アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質である；あるいは、
ｃ）以下の配列：
【化２】
0006033433.tif 000006
である、
前記薬学的組成物。
【請求項１１】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質のアミノ酸配列が：
【化３】
0006033433.tif 000007
である、請求項１〜９のいずれか一項の薬学的組成物。
【請求項１２】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質が、配列番号１、３、４、または６〜５０のいずれか１つに示すようなアミノ酸配列、あるいはその生物学的活性断片を含む、請求項１〜１１のいずれか一項の薬学的組成物
【請求項１３】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質が、配列番号１、３、４、または６〜５０のいずれか１つに示す配列、あるいはその生物学的活性断片の任意の１つに、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項の薬学的組成物。
【請求項１４】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質が、配列番号１、３、４、または６〜５０のいずれか１つに示す配列、あるいはその生物学的活性断片の任意の１つに、９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項の薬学的組成物。
【請求項１５】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、またはその生物学的活性類似体が、グリコシル化されていない、請求項１〜１４のいずれか一項の薬学的組成物。
【請求項１６】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質、またはその生物学的活性類似体を全身投与する、請求項１〜１５のいずれか一項の薬学的組成物。
【請求項１７】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質、またはその生物学的活性類似体を、１〜１０μｇ／ｇの用量で投与する、請求項１〜１６のいずれか一項の薬学的組成物。
【請求項１８】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質、またはその生物学的活性類似体を、１日１回投与する、請求項１〜１７のいずれか一項の薬学的組成物。
【請求項１９】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質、またはその生物学的活性類似体を、１日２回投与する、請求項１〜１７のいずれか一項の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本開示は、高血糖に関連する状態を治療する方法に関する。より具体的には、本開示は、有効量のアポリポタンパク質Ａ−ＩＶを投与することによって、インスリン耐性および内分泌障害を含む、高血糖障害を治療する方法に関する。
【０００２】
関連出願
[0002]本出願は、米国仮特許出願第６１／６７５，５４９号、２０１２年７月２５日出願に優先権を請求する。優先出願の内容は、その全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
[0003]糖尿病の発生は広範であり、米国人口のおよそ８％が糖尿病を患う。糖尿病は、体が有効にインスリンを産生しそして／または用いることができないことに起因する高血糖によって特徴付けられる慢性疾患である。糖尿病は、多様な身体的合併症を導く可能性もあり、これらには、限定されるわけではないが、腎不全、失明、神経損傷、心疾患、睡眠時無呼吸、およびセリアック病が含まれる。例えば、米国において、糖尿病は、腎不全、失明、切断、脳卒中、および心臓発作の主因である。やはり米国において、糖尿病は、死因の六番目であり、そして中年成人の平均余命を約５〜１０年減少させることが示されてきている。
【０００４】
[0004]糖尿病の最も一般的な型は、高血糖、インスリン耐性、β細胞機能不全、および肝臓糖新生制御不全に関連する、２型糖尿病である。２型糖尿病を患うヒトは、インスリン分泌の第一期において、貯蔵されたインスリン顆粒のβ細胞からの放出不全に関連するグルコース刺激性インスリン分泌喪失を経験する。インスリン分泌の第二期において、２型糖尿病を患うヒトは、グルコース刺激に反応してインスリンを能動的に合成する能力の漸次喪失を経験する。
【０００５】
[0005]ＩＩ型糖尿病に加えて、全体集団においてやはり増加しつつある高血糖によって定義される、多くの関連状態がある。例えば、２００５年〜２００８年、２０歳またはそれより高齢の米国成人の３５パーセントは、前糖尿病（絶食時グルコースまたはＡ１Ｃレベルによって定義される；ＣＤＣを参照されたい）を有した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
こうしたものとして、高血糖に関連する状態を有効に治療するための新規療法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
[0006]本開示は、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶが、高血糖によって特徴付けられる障害（または高血糖障害）を治療するために有効であるという驚くべき発見に基づく。
[0007]アポリポタンパク質Ａ−ＩＶは、食後耐糖能に寄与し、そして耐糖能の改善における、以前は認識されていなかった仲介因子として働く。したがって、１つの態様において、高血糖障害の治療が必要な被験体において、高血糖障害を治療する方法を開示する。１つの態様において、インスリン耐性障害または高血糖に関連する内分泌障害を含む高血糖障害の治療が必要な被験体において、インスリン耐性障害または高血糖に関連する内分泌障害を含む高血糖障害を治療する方法を開示する。１つの態様において、クッシング病、グルカゴン分泌性腫瘍、グルカゴン過剰、および先端巨大症を含む高血糖に関連する内分泌障害の治療が必要な被験体において、クッシング病、グルカゴン分泌性腫瘍、グルカゴン過剰、および先端巨大症を含む高血糖に関連する内分泌障害を治療する方法を開示する。別の態様において、多嚢胞性卵巣疾患を有する被験体において高血糖を治療する方法を開示する。別の態様において、前糖尿病、メタボリックシンドローム、多嚢胞性卵巣疾患、Ａ型症候群、および妊娠糖尿病からなる群より選択されるインスリン耐性障害を有する被験体において、高血糖を治療する方法を開示する。該方法は、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、あるいはアポリポタンパク質Ａ−ＩＶに少なくとも９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一性を有するその生物学的活性類似体の有効量を被験体に投与する工程を含む。
【０００８】
[0008]別の態様において、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶを含む薬学的組成物を開示する。該薬学的組成物は、高血糖障害の治療のために被験体に投与するため配合された、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、あるいはアポリポタンパク質Ａ−ＩＶに少なくとも９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一性を有するその生物学的活性類似体を含む。
【０００９】
[0009]さらに別の態様において、耐糖能を実質的に回復する必要がある被験体において、耐糖能を実質的に正常レベルに回復するための方法を開示する。該方法は、例えば、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体を全身投与することによって、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、あるいはアポリポタンパク質Ａ−ＩＶに少なくとも９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一性を有するその生物学的活性類似体の有効量を被験体に投与する工程を含む。
【００１０】
[0010]さらに別の態様において、血糖レベルを低下させる必要がある被験体において、血糖レベルを低下させるための方法を開示する。該方法は、例えば全身投与によって、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、あるいはアポリポタンパク質Ａ−ＩＶに少なくとも９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一性を有するその生物学的活性類似体の有効量を、治療が必要な被験体に投与する工程を含む。「有効量」は以下に記載するとおりであり、そしてこれには、アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体の、例えば約０．２５〜２μｇ／ｇが含まれる。１つの態様において、有効量は約０．１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇである。別の態様において、有効量は約１〜１０００ｍｇの固定用量である。さらなる態様において、有効量は約１〜１０ｍｇの固定用量である。
【００１１】
[0011]さらなる態様において、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体はグリコシル化されていない。
[0012]１つの態様において、本明細書に開示する方法および組成物には、配列番号１、３、４または６〜５１のいずれか１つに示すようなアミノ酸配列、あるいはその生物学的活性断片を含むアポＡ−ＩＶタンパク質が含まれる。１つの態様において、本明細書に開示する方法および組成物には、配列番号１、３、４または６〜５１に示すような配列に９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列、あるいはその生物学的活性断片を含む、アポＡ−ＩＶタンパク質が含まれる。
【００１２】
[0013]本開示にしたがったこれらのおよび他の多様な態様のこれらのおよび他の特徴および利点は、本明細書に提供する図、詳細な説明、および請求項を考慮すると、より明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
[0014]本開示の態様の以下の詳細な説明は、以下の図と組み合わせて読んだ際、よりよく理解可能であり、ここで同様の構造を同様の参照数字で示し、そしてこの中で：
【図１】[0015]図１は、本開示の態様にしたがった、薬学的組成物の容器およびシリンジを有するデバイスの側面斜視図である。
【図２】[0016]図２は、腹腔内耐糖能試験に関する、雄アポリポタンパク質Ａ−ＩＶノックアウトおよび野生型マウスにおける、時間（分）に対する血漿グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
【図３】[0017]図３は、腹腔内耐糖能試験に関する、１６ヶ月齢のアポリポタンパク質Ａ−ＩＶ野生型およびノックアウト動物における、時間（分）に対する血漿グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
【図４】[0018]図４は、腹腔内耐糖能試験に関する、組換えアポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（μｇ／ｇ）または生理食塩水溶液を腹腔内投与した後の、雄アポリポタンパク質Ａ−ＩＶノックアウトマウスにおける、時間（分）に対する血漿グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
【図５】[0019]図５は、腹腔内耐糖能試験に関する、組換えアポリポタンパク質Ａ−Ｉまたは生理食塩水溶液を腹腔内投与した後の、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶノックアウトマウスにおける、時間（分）に対する血漿グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
【図６】[0020]図６は、組換えアポリポタンパク質Ａ−Ｉまたは生理食塩水溶液を腹腔内投与した後の、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶノックアウトマウスにおける、時間（分）に対するインスリン分泌（ｎｇ／ｍＬ）のグラフである。
【図７】[0021]図７は、腹腔内耐糖能試験に関する、長期高脂肪食餌を与えたアポリポタンパク質Ａ−ＩＶノックアウトおよび野生型マウスにおける、時間（分）に対する血漿グルコース（ｍｇ／ｍＬ）のグラフである。
【図８】[0022]図８は、腹腔内耐糖能試験に関する、長期高脂肪食餌を与えたアポリポタンパク質Ａ−ＩＶノックアウトマウスにおける、組換えマウス・アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（１μｇ／ｇ）または生理食塩水溶液を腹腔内投与した後の、時間（分）に対する血漿グルコース（ｍｇ／ｍＬ）のグラフである。
【図９】[0023]図９は、腹腔内耐糖能試験に関する、糖尿病マウスにおける、組換えマウス・アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（１μｇ／ｇ）または生理食塩水溶液を腹腔内投与した後の、時間（分）に対する血漿グルコース（ｍｇ／ｍＬ）のグラフである。
【図１０】[0024]図１０は、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶノックアウトマウス、野生型マウス、およびアポリポタンパク質Ａ−Ｉノックアウトマウスにおける、血清アミロイドＡタンパク質構成要素レベルのウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図１１】[0025]図１１は、腹腔内耐糖能試験（ＩＰＧＴＴ）中の、雌アポリポタンパク質Ａ−ＩＶノックアウトおよび野生型マウスにおける、時間（分）に対する血漿グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
【図１２】[0026]図１２は、腹腔内耐糖能試験中の、野生型マウスにおける、１．０μｇ／ｇヒト・アポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたは生理食塩水溶液を腹腔内投与した後の、時間（分）に対する血漿グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
【図１３】[0027]図１３は、腹腔内耐糖能試験中の、雌野生型マウスにおける、１．０μｇ／ｇ組換えマウス・アポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたは生理食塩水溶液を腹腔内投与した後の、時間（分）に対する血漿グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
【図１４】[0028]図１４は、３ｍＭまたは２０ｍＭグルコースの存在下で、３０ｍＭ  ＫＣｌおよび２５０μＭジアゾキシドによって脱分極されたヒト膵島に対する１０μｇ／ｇヒト・アポＡ−ＩＶの影響を示す棒グラフである。
【図１５】[0029]図１５は、全長野生型ヒト・アポリポタンパク質Ａ−ＩＶのアミノ酸配列（配列番号１）を持つタンパク質である。
【図１６】[0030]図１６は、全長野生型マウス・アポリポタンパク質Ａ−ＩＶのアミノ酸配列（配列番号２）を持つタンパク質である。
【図１７】[0031]図１７は、Ｎ末端にグリシンが付加された全長野生型ヒト・アポリポタンパク質Ａ−ＩＶのアミノ酸配列（配列番号３）を持つタンパク質である。
【図１８】[0032]図１８は、多型置換Ｔ３４７Ｓ、Ｑ３６０Ｈ、および／またはＥ１６５Ｋ、ならびにＮ末端へのグリシン、アラニンまたはバリンの場合による付加を示す、ヒト・アポリポタンパク質Ａ−ＩＶのアミノ酸配列（配列番号４）を持つタンパク質である。
【図１９】[0033]図１９は、全長野生型ヒト・アポリポタンパク質Ａ−ＩＶをコードするポリヌクレオチド（配列番号５）である。
【００１４】
[0034]当業者は、図面の要素は単純にそして明確にするために例示され、そして必ずしも縮尺通りに描かれていないことを認識する。例えば、本開示の多様な態様の理解を改善するのを補助するため、図面中の要素のいくつかの寸法は、他の要素に比較して強調されるとともに、慣用的な部分が除去される可能性もある。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
[0035]以下の用語を本出願において用いる：
[0036]本明細書において、「高血糖障害」または「高血糖に関連する障害」は、被験体の血糖が上昇している障害を指す。生じた血糖増加は、正常範囲の外にレベルを上昇させる可能性もあり、そして被験体に対して不都合な健康上の影響を引き起こす可能性もある。高血糖障害の例には、限定されるわけではないが、インスリン耐性に関連する疾患（限定されるわけではないが、前糖尿病、メタボリックシンドローム、Ａ型インスリン耐性症候群、多嚢胞性卵巣疾患に関連する高血糖またはインスリン耐性、妊娠糖尿病）、および内分泌異常に関連する高血糖（限定されるわけではないが、クッシング病、グルカゴン分泌性腫瘍、および先端巨大症）が含まれる。１つの態様において、高血糖障害にはＩＩ型糖尿病は含まれない。
【００１６】
[0037]本明細書において、用語「インスリン耐性に関連する障害」は、インスリンが血糖を低下させる際により有効でなくなる状態を指す。例には、限定されるわけではないが、前糖尿病、メタボリックシンドローム、Ａ型インスリン耐性症候群、多嚢胞性卵巣疾患に関連する高血糖またはインスリン耐性、妊娠糖尿病が含まれる。
【００１７】
[0038]本明細書において、用語「高血糖に関連する内分泌障害」は、高血糖によって特徴付けられる内分泌系の障害を指す。高血糖に関連する内分泌障害の例には、限定されるわけではないが、クッシング病、グルカゴン分泌性腫瘍、および先端巨大症が含まれる。
【００１８】
[0039]本明細書において、用語「前糖尿病」は、以下の要因の１またはそれより多くによって特徴付けられる状態を意味する：抗ランゲルハンス島細胞免疫学的マーカーの存在、ランゲルハンス島細胞数の障害、インスリン分泌初期ピークの抑制、耐糖能障害、絶食時糖血症障害および／またはいずれかの糖尿病リスク要因。前糖尿病は、耐糖能または絶食時グルコース障害のいずれかによって特徴付けられ、そしてしばしば、血糖の正常レベルおよび糖尿病レベルの間の「グレー領域」と記載される。前糖尿病は、しばしば、２型糖尿病に先行する。
【００１９】
[0040]本明細書において、用語「有効量」は、望ましい生物学的影響を達成するのに必要なまたは十分な量を記載する。任意の特定の適用に関する有効量は、限定されるわけではないが、投与する特定の組成物、被験体のサイズ、ならびに／あるいは治療中の疾患および／または状態の重症度を含む、多様な要因に応じて多様でありうる。１つの態様において、「有効量」は、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体の約０．２５〜１０μｇ／ｇの用量である。あるいは、「アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体の有効量」は、約１〜１０μｇ／ｇ、約０．２５〜２μｇ／ｇ、約１μｇ／ｇ、または０．１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇである。別の態様において、有効量は約１〜１０００ｍｇの固定用量である。さらなる態様において、有効量は約１〜１０ｍｇの固定用量である。アポＡ−ＩＶまたは生物学的活性類似体を１日１回投与する。あるいは、アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体を１日約２回投与する。さらに別の代替法において、アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体を、１日２回より多く、例えば１日３回投与する。さらに別の代替法において、アポＡ−ＩＶを２日、３日、４日、５日または６日ごとに１回、あるいは週１回投与する。
【００２０】
[0041]本明細書において、用語「望ましい生物学的影響」は、疾患または状態の影響を減少させ、これらを妨げ、そして／または排除することを記載する。例えば、高血糖障害の背景において、望ましい生物学的影響には、限定されるわけではないが、血糖低下、耐糖能改善、耐糖能の正常レベルへの実質的な回復、インスリン分泌改善、および／またはインスリン分泌の正常レベルへの実質的な回復が含まれる。
【００２１】
[0042]本明細書において、用語「正常レベル」は、治療の必要がない被験体におけるレベルと実質的に同じレベルを記載する。例えば、高血糖障害を治療する背景において、血糖の正常レベルは、食事前に約７０ｍｇ／ｄＬ〜約１３０ｍｇ／ｄＬ、そして食事の約１〜２時間後に約１８０ｍｇ／ｄＬ未満、または食事前に約７０ｍｇ／ｄＬ〜約１００ｍｇ／ｄＬ、そして食事の約１〜２時間後に約１４０ｍｇ／ｄＬ未満である。高血糖障害を治療する背景における別の例において、耐糖能の正常レベルは、血糖レベルが食事前に約７０ｍｇ／ｄＬ〜約１３０ｍｇ／ｄＬ、そして食事の約１〜２時間後に約１８０ｍｇ／ｄＬ未満、または食事前に約７０ｍｇ／ｄＬ〜約１００ｍｇ／ｄＬ、そして食事の約１〜２時間後に約１４０ｍｇ／ｄＬ未満であるように、被験体が炭水化物を代謝する能力を記載する。高血糖障害を治療する背景におけるさらに別の例において、インスリン分泌の正常レベルは、耐糖能の正常レベルを維持するために必要な量であり、インスリン分泌レベルは、食事の約１５時間後に、約１ｎｇ／ｍＬより高い。さらなる態様において、血糖の正常レベルは午前絶食血糖試験に関して、約７０ｍｇ／ｄｌ〜１００ｍｇ／ｄｌである。
【００２２】
[0043]血糖レベルの背景において、用語「回復する」は、被験体の血糖レベルが正常レベルに変化することを記載する。同様に、耐糖能の背景において、用語「回復する」は、被験体の耐糖能が正常レベルに変化することを記載する。また、インスリン分泌の背景において、「回復する」は、被験体のインスリン分泌を、正常レベルまで、または血糖を低下させるのに十分なレベルに変化することを記載する。
【００２３】
[0044]アポリポタンパク質Ａ−ＩＶの背景において、用語「生物学的活性断片」は、高血糖障害を有する被験体において、望ましい生物学的影響を達成することが可能な、例えば耐糖能を回復するアポリポタンパク質Ａ−ＩＶの断片を記載する。用語「生物学的活性類似体」は、高血糖障害を有する被験体において、望ましい生物学的影響を達成することが可能な、例えば耐糖能を回復するアポリポタンパク質Ａ−ＩＶの類似体を記載する。１つの例において、望ましい生物学的影響は、実施例２に記載するように、アポＡ−ＩＶノックアウトマウスにおいて、耐糖能を回復することである。望ましい生物学的影響の別の例は、実施例７に記載するマウスモデルなどの、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）の動物モデルにおいて、異常なグルコースレベルの統計的に有意な低下を引き起こすことである。
【００２４】
[0045]句「同一のパーセント」または「同一性パーセント」は、少なくとも２つの異なる配列間の類似性（例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）を指す。この同一性パーセントは、標準的整列アルゴリズム、例えば、Ａｌｔｓｈｕｌら（（１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−１０）に記載される基本的局所整列検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）（ＢＬＡＳＴ）；  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（（１９７０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４４−５３）のアルゴリズム；またはＭｅｙｅｒｓら（（１９８８）  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  ４：１１−１７）のアルゴリズムによって決定可能である。パラメータセットは、例えば、１２のギャップペナルティ、４のギャップ伸長ペナルティ、および５のフレームシフトギャップペナルティを伴う、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２スコアリングマトリックスであってもよい。２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性はまた、ＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（（１９８９）  ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７）のアルゴリズムを用いても決定可能であり、該アルゴリズムは、ＰＡＭ１２０加重残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に取り込まれている。
【００２５】
[0046]用語「組換えタンパク質」は、組換えＤＮＡから発現されるタンパク質分子を指す。例えば、組換えアポＡ−ＩＶタンパク質は、組換え宿主細胞において発現されるものである。
【００２６】
[0047]本明細書において、用語「肥満」は、被験体が正常体重をはるかに超えている状態を指す。１つの特定の例において、用語、肥満は、被験体が理想体重を約２０％より多く超えており、そして／または約３０または約３０より高い肥満度指数を有する状態を指す。１つの態様において、治療される被験体は肥満であり；別の態様において、治療される被験体は肥満ではなく；そしてさらに別の態様において、治療される被験体は正常体重を有する。
【００２７】
[0048]本開示の態様は、高血糖障害の治療が必要な被験体において高血糖障害を治療するための方法、および高血糖障害の治療のための薬学的組成物に関する。１つの態様において、糖尿病を治療する方法を開示する。１つの特定の態様において、高血糖障害を治療する必要がある被験体において高血糖障害を治療する方法であって、有効量のアポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体を被験体に投与する工程を含む、前記方法を開示する。
【００２８】
[0049]１つの態様において、高血糖障害を治療する方法は、被験体の血糖レベルを低下させるのに有効である。１つの特定の態様において、方法は、被験体の血糖レベルを約２０〜６０％低下させるのに有効である。さらなる態様において、方法は、被験体の血糖レベルを約７０％低下させるのに有効である。さらなる態様において、方法は、被験体の血糖レベルを約４０％低下させるのに有効である。さらにさらなる態様において、方法は、血糖レベルを、以前のレベルより低いレベルに、または正常レベルに、実質的に回復させるのに有効である。
【００２９】
[0050]１つの態様において、高血糖障害を治療する方法は、被験体の血糖レベルの低下を生じる。１つの特定の態様において、方法は、投薬間隔の経過に渡り被験体の血糖レベルを、ベースラインレベルから、約１ｍｇ／ｄｌ、２ｍｇ／ｄｌ、３ｍｇ／ｄｌ、４ｍｇ／ｄｌ、５ｍｇ／ｄｌ、６ｍｇ／ｄｌ、７ｍｇ／ｄｌ、８ｍｇ／ｄｌ、９ｍｇ／ｄｌ、１０ｍｇ／ｄｌ、１１ｍｇ／ｄｌ、１２ｍｇ／ｄｌ、１３ｍｇ／ｄｌ、１４ｍｇ／ｄｌ、１５ｍｇ／ｄｌ、１６ｍｇ／ｄｌ、１７ｍｇ／ｄｌ、１８ｍｇ／ｄｌ、１９ｍｇ／ｄｌ、２０ｍｇ／ｄｌ、４０ｍｇ／ｄｌ、６０ｍｇ／ｄｌ、８０ｍｇ／ｄｌ、１００ｍｇ／ｄｌ、１２０ｍｇ／ｄｌ、１４０ｍｇ／ｄｌ、１６０ｍｇ／ｄｌ、１８０ｍｇ／ｄｌ、２００ｍｇ／ｄｌ、２２０ｍｇ／ｄｌ、または２４０ｍｇ／ｄｌ、低下させるのに有効である。
【００３０】
[0051]別の態様において、高血糖障害を治療する方法は、被験体の耐糖能を正常レベルに実質的に回復させるのに有効である。１つの特定の態様において、方法は、アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体の用量を投与した後、約２時間以内に、被験体の耐糖能を正常レベルに実質的に回復させるのに有効である。別の態様において、方法は、アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体の用量を投与した後、約３時間以内または約４時間以内に、被験体のグルコースレベルを正常レベルに実質的に回復させるのに有効である。別の態様において、被験体の耐糖能は、約８〜１２時間、正常レベルに実質的に回復される。
【００３１】
[0052]さらに別の態様において、治療は、インスリン分泌を正常レベルに実質的に回復させるのに有効である。１つの特定の態様において、治療は、アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体の用量を投与した後、約２時間以内に、インスリン分泌を正常レベルに実質的に回復させるのに有効である。別の態様において、インスリン分泌は、約８〜１２時間、正常レベルに実質的に回復される。さらに別の態様において、治療は、Ｃ反応性タンパク質のレベルを低下させるのに有効である。
【００３２】
[0053]上記のように、高血糖障害の例には、限定されるわけではないが、インスリン耐性に関連する障害が含まれる。インスリン耐性障害の例には、限定されるわけではないが、前糖尿病、メタボリックシンドローム、多嚢胞性卵巣疾患、Ａ型症候群および他のインスリン耐性遺伝子障害、ならびに妊娠糖尿病が含まれる。
【００３３】
[0054]１つの態様において、本発明は、アポＡ−ＩＶを投与することによって、被験体において前糖尿病を治療する方法を提供する。前糖尿病を有するヒトは、正常より高いが、２型糖尿病と分類されるのに十分なほどは高くない血糖レベルを有する。前糖尿病は、多くの試験を通じて特徴付け可能である。例えば、糖化ヘモグロビン（Ａ１Ｃ）試験を用いて前糖尿病を診断することも可能である。Ａ１Ｃ血液試験は、被験体の過去２〜３ヶ月間の平均血糖レベルを示す。６〜６．５パーセントの間のＡ１Ｃレベルは前糖尿病性と見なされ、一方、２つの別個の試験で、６．５パーセントまたはそれより高いレベルは、糖尿病を示す。
【００３４】
[0055]前糖尿病の他の試験には、絶食時血糖試験および耐糖能試験が含まれる。絶食時グルコース障害は、少なくとも８時間または一晩の絶食後、グルコースレベルを測定することによって決定される。絶食時グルコース障害は、１００〜１２５ｍｇ／ｄＬ（５．６〜６．９ｍｍｏｌ／Ｌ）と定義され、一方、デシリットルあたり１００ミリグラム（ｍｇ／ｄＬ）より低い血糖レベル−リットルあたり５．６ミリモル（ｍｍｏｌ／Ｌ）−は正常である。１２６ｍｇ／ｄＬ（７．０ｍｍｏｌ／Ｌ）またはそれより高い血糖レベルは糖尿病を示す可能性もある。
【００３５】
[0056]あるいは、前糖尿病は、耐糖能障害試験によって特徴付けられることも可能であり、この場合、糖溶液の消費後（一般的に摂取２時間後）にグルコースレベルを測定する。耐糖能障害試験のため、１４０ｍｇ／ｄＬ（７．８ｍｍｏｌ／Ｌ）未満の血糖レベルは正常であり、一方、１４０〜１９９ｍｇ／ｄＬ（７．８〜１１．０ｍｍｏｌ／Ｌ）の血糖レベルは前糖尿病性と見なされ、そしてしばしば耐糖能障害（ＩＧＴ）と称される。２００ｍｇ／ｄＬ（１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ）またはそれより高い血糖レベルは、糖尿病を示す可能性もある。こうしたものとして、本発明は、アポＡ−ＩＶの投与によって前糖尿病を治療するための手段を提供する。
【００３６】
[0057]１つの態様において、本発明は、アポＡ−ＩＶの投与によって、被験体においてメタボリックシンドロームを治療する方法を提供する。メタボリックシンドローム（シンドロームＸまたはインスリン耐性シンドロームとも称される）は、冠動脈疾患、脳卒中、および２型糖尿病とともに生じ、そしてこれらに対するヒトのリスクを増加させるリスク要因群の名称である。メタボリックシンドロームは、米国においてますます一般的になってきている一方、該症候群がただ１つの原因によるかどうかは不明であるが、該シンドロームのリスクはすべて肥満に関連する。メタボリックシンドロームの２つの最も重要なリスク要因は、１．体の中部および上部周囲の余分な体重（中央部肥満）、および２．体がインスリンを有効に使用できないインスリン耐性である。米国心臓協会および米国心肺血液研究所によれば、メタボリックシンドロームは、以下の徴候の３つまたはそれより多くを有する場合に存在する：  １．  １３０／８５ｍｍＨに等しいかまたはそれより高い血圧；  ２．  １００ｍｇ／ｄに等しいかまたはそれより高い絶食時血糖（グルコース）；  ３．男性に関しては４０インチまたはそれより多い、そして女性に関しては３５インチまたはそれより多いと定義される、大きな胴囲（ウェスト周囲の長さ）；  ４．男性に関しては４０ｍｇ／ｄｌ未満、そして女性に関しては５０ｍｇ／ｄｌ未満と定義される、低ＨＤＬコレステロールレベル；および５．  １５０ｍｇ／ｄＬに等しいかまたはそれより多いトリグリセリド。こうしたものとして、本発明は、アポＡ−ＩＶの投与によってメタボリックシンドロームを治療するための手段を提供する。
【００３７】
[0058]１つの態様において、本発明は、アポＡ−ＩＶの投与によって、多嚢胞性卵巣疾患を有する被験体において、インスリン耐性および高血糖を治療する方法を提供する。多嚢胞性卵巣疾患（スタイン・レベンタール症候群または多濾胞性卵巣疾患とも称される）は、女性が女性ホルモンの不均衡を有する状態であり、そしてこれは月経周期変化、卵巣中の嚢胞、受胎能力の問題、および他の健康状態の変化を導きうる。多嚢胞性卵巣疾患の原因は、完全には理解されていないが、多嚢胞性卵巣症候群の大きな生化学的特徴の１つは、代償性高インスリン血症（絶食時血液インスリンレベルの上昇）が付随するインスリン耐性である。実際、ＩＩ型糖尿病は、しばしば、該疾患に関連する長期合併症である。したがって、本発明は、アポＡ−ＩＶの投与によって、多嚢胞性卵巣疾患を有する被験体において、インスリン耐性および高血糖を治療するための手段を提供する。
【００３８】
[0059]さらなる態様において、本発明の方法および組成物を用いて、限定されるわけではないが、ドナヒュー症候群、ラブソン・メンデンホール症候群、およびＡ型インスリン耐性を含む、極端なインスリン耐性に関連する遺伝子障害を治療することもまた可能である。ドナヒュー症候群は、他の状態の中でも、子宮内胎児発育遅延、出生後成長不全、グルコース恒常性欠損および高インスリン血症によって特徴付けられる。ドナヒュー症候群と診断された患者は、短縮された平均余命を有し、そして一般的に１年より長くは生きられない。ラブソン・メンデンホール症候群は、他の症状の中でも、成長遅延および高インスリン血症によって特徴付けられる。Ａ型インスリン耐性は、多毛症、皮下脂肪減少、糖尿病、黒色表皮症、および高インスリン血症、ならびに女性における無月経および多嚢胞性卵巣とともに示されうる。インスリン耐性の生物学的マーカーである高インスリン血症は、しばしば、疾患の経過に渡る耐糖能欠損、および進行性に起こる糖尿病を伴う。こうしたものとして、アポＡ−ＩＶを用いて、極度のインスリン耐性、例えばＡ型インスリン耐性症候群に関連する先天性疾患を有する患者を治療することも可能である。
【００３９】
[0060]さらなる態様において、本発明の方法および組成物を用いて、妊娠糖尿病を治療することもまた可能である。妊娠糖尿病は、高血糖レベルとして特徴付けられる（妊娠糖尿病を決定するために使用することもまた可能な、前糖尿病に関する上記試験を参照されたい）。妊娠糖尿病は、一般的に、子供の誕生の際に消失するが、母親および赤ん坊の健康のため、糖レベルは、妊娠中、維持されなければならない。さらに、妊娠糖尿病は、しばしば、前糖尿病の前兆である。したがって、アポＡ−ＩＶを用いて、妊娠糖尿病を有する被験体において、糖レベルを低下させることも可能である。
【００４０】
[0061]上述のように、高血糖障害の例には、限定されるわけではないが、高血糖に関連する内分泌障害が含まれる。高血糖に関連する内分泌障害の例には、限定されるわけではないが、クッシング病、グルカゴン分泌増加、および先端巨大症が含まれる。
【００４１】
[0062]１つの態様において、本発明の方法および組成物を用いて、クッシング病を治療することも可能である。クッシング病は、副腎による過剰なコルチゾール産生によって特徴付けられる。症状には、高血圧、疲労、体上部の肥満ならびに脚および腕の細長さを伴う高血糖レベルが含まれる。
【００４２】
[0063]別の態様において、本発明の方法および組成物を用いて、グルカゴン分泌性腫瘍を治療することも可能である。グルカゴン分泌性腫瘍はまた、グルカゴン産生腫瘍とも称され、そしてホルモンであるグルカゴンの最大１０００倍の過剰産生を生じる、膵臓アルファ細胞の稀な腫瘍である。グルカゴン産生腫瘍の主な生理学的影響は、ペプチドホルモンであるグルカゴンの過剰産生であり、これによって、それぞれ糖新生および脂質分解を含む同化および異化プロセスの活性化を通じて血糖レベルが増進される。
【００４３】
[0064]さらに別の態様において、本発明の方法および組成物を用いて、先端巨大症を治療してもよい。先端巨大症は、ヒト成長ホルモンの過剰産生を生じる、下垂体腫瘍によって引き起こされる代謝性障害である。
【００４４】
[0065]１つの態様において、本発明には、前述の障害の１つを有する被験体をまず選択し、そして前記障害の治療のため、アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性断片を投与する方法が含まれる。
【００４５】
[0066]１つの態様において、アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体を全身投与する。アポＡ−ＩＶまたはその類似体の全身投与は、経口、皮下、静脈内、筋内、および腹腔内投与からなる群より選択される。
【００４６】
[0067]別の態様において、薬学的組成物を開示する。１つの特定の態様において、薬学的組成物は、アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体を含む。別の態様において、アポＡ−ＩＶまたはその類似体を、高血糖障害の治療に関して被験体に投与するために配合する。この特定の態様において、高血糖障害を治療する必要がある被験体において高血糖障害を治療するための方法であって、被験体に、有効量の薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法も提供する。
【００４７】
[0068]「アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ」（本明細書において、「アポＡ−ＩＶ」とも称される）は、哺乳動物アポＡ−ＩＶを指し、そして全長アポＡ−ＩＶおよびアポＡ−ＩＶの生物学的活性断片を含む。全長ヒト・アポＡ−ＩＶは３７６アミノ酸タンパク質（配列番号１）であり、そのアミノ酸配列を図１５に示し；全長マウス・アポＡ−ＩＶのアミノ酸配列（配列番号２）を図１６に示す。用語「アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ」にやはり含まれるのは、全長ヒト配列のアポリポタンパク質Ａ−ＩＶのＮ末端にグリシンが付加された既知の類似体（配列番号３、図１７に示すようなもの）、およびＮ末端グリシンに関する保存的置換（例えばアラニンおよびバリン）を有するその類似体である。「アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ」には、また、配列番号１に示すヒト配列または配列番号３の対応する位に対するＴ３４７Ｓ、Ｑ３６０Ｈ、またはＥ１６５Ｋ置換を含む、その多型型も含まれる。こうしたものとして、「アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ」には、図１８に示す、配列番号４のタンパク質が含まれる。アポＡ−ＩＶの変異体型もまた、本発明の方法および組成物中に含まれ、そしてこれには、以下のミスセンス突然変異：Ｐ３９３Ｈ、Ｑ３８５Ｋ、Ｑ３８１Ｋ、Ｑ３８０Ｈ、Ｑ３７７Ｐ、Ｔ３６７Ｓ、Ｓ３５３Ａ、Ｎ３５２Ｙ、Ｖ３３６Ｍ、Ｄ３３５Ｈ、Ｇ３１１Ｒ、Ｖ３０７Ｌ、Ｒ３０５Ｃ、Ｒ３０４Ｑ、Ｅ２９１Ｇ、Ｖ２７４Ｍ、Ｖ２７４Ａ、Ｒ２６４Ｑ、Ａ２６０Ｔ、Ｅ２５０Ｋ、Ｎ２３５Ｓ、Ｑ２３１Ｋ、Ｒ２２０Ｃ、Ｑ２１４Ｈ、Ｅ２０７Ｋ、Ｔ２０２Ｍ、Ｒ２００Ｃ、Ｄ１９１Ｎ、Ｄ１８４Ｎ、Ｐ１８１Ｌ、Ａ１７２Ｔ、Ｒ１６９Ｗ、Ａ１６１Ｓ、Ｒ１５４Ｗ、Ｔ１４８Ｍ、Ｓ１４７Ｎ、Ａ１３９Ｅ、Ｎ１２７Ｋ、Ｓ９５Ｌ、Ｒ９０Ｃ、Ｔ８５Ａ、Ｑ７７Ｈ、Ｇ７４Ｓ、Ｖ１３Ｍ、またはＶ６Ｍを含有する変異体（配列番号６〜５０を参照されたい）が含まれる。配列番号５１は、シグナル配列を有するアポＡ−ＩＶのアミノ酸配列を示す。配列番号１、３、４、および６〜５１に記載するアミノ酸配列、またはその生物学的活性断片に、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアポＡ−ＩＶタンパク質もまた、本発明の方法において意図される。
【００４８】
[0069]アポリポタンパク質Ａ−ＩＶの生物学的活性類似体は、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶに少なくとも９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一性を有する。先の段落に記載するように、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶには、全長哺乳動物アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（例えばヒトまたは哺乳動物）、その多型型、配列番号３および４のタンパク質、ならびに前述のいずれかの生物学的活性断片が含まれる。生物学的活性類似体におけるアミノ酸変動は、好ましくは、野生型配列に対して保存的置換を有する。「保存的置換」は、同じ純電荷、ならびにほぼ同じサイズおよび形状を有する、別のアミノ酸でのアミノ酸の置換である。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を持つアミノ酸残基は、側鎖中の炭素およびヘテロ原子の総数が、約４より多く異ならない場合には、ほぼ同じサイズを有する。これらは、側鎖中の分枝の数が１より多く異ならない場合には、ほぼ同じ形状を有する。側鎖中にフェニルまたは置換フェニル基を持つアミノ酸残基は、ほぼ同じサイズおよび形状を有すると見なされる。以下に列挙するのは、アミノ酸の５つの群である。同じ群由来の別のアミノ酸残基でアミノ酸残基を置換すると、保存的置換を生じる：
群Ｉ：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、およびＣ１〜Ｃ４脂肪族またはＣ１〜Ｃ４ヒドロキシル置換脂肪族側鎖（直鎖または一分枝）を持つ非天然存在アミノ酸。
【００４９】
群ＩＩ：グルタミン酸、アスパラギン酸およびカルボン酸置換Ｃ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（非分枝または一分枝点）を持つ非天然存在アミノ酸。
群ＩＩＩ：リジン、オルニチン、アルギニン、およびアミンまたはグアニジノ置換Ｃ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（非分枝または一分枝点）を持つ非天然存在アミノ酸。
【００５０】
群ＩＶ：グルタミン、アスパラギン、およびアミド置換Ｃ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（非分枝または一分枝点）を持つ非天然存在アミノ酸。
群Ｖ：フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシンおよびトリプトファン。
【００５１】
[0070]アポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体はグリコシル化されていてもまたはグリコシル化されていなくてもよい。組換え非グリコシル化ヒトおよびマウス・アポリポタンパク質Ａ−ＩＶの調製を実施例１１に記載する。全長野生型ヒト・アポリポタンパク質（配列番号１）のポリヌクレオチド配列を図１９の配列番号５として示す。実施例１〜１１で用いるアポリポタンパク質Ａ−ＩＶはグリコシル化されていない。アポＡ−ＩＶは、分子生物学分野に知られる方法にしたがって調製可能である。例えば、アポＡ−ＩＶは、伝統的な分子クローニング技術を通じて調製可能である。
【００５２】
[0071]１つの態様において、細菌宿主を用いて、非グリコシル化アポＡ−ＩＶを産生することも可能である。細菌宿主の例には、限定されるわけではないが、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＢＬ−２１、ＢＬ−２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１−ＡＩＴＭ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ＢＬ２１  ＳｔａｒＴＭ（ＤＥ３）、およびＢＬ２１  ＳｔａｒＴＭ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）もまた、アポＡ−ＩＶを発現するための宿主細胞として使用可能である。細菌宿主内への形質転換前に、アポＡ−ＩＶまたはその類似体をコードするＤＮＡセグメントを、細菌宿主内への形質転換のための任意の適切な発現ベクターに取り込んでもよい。適切な発現ベクターには、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  １９８９に記載されるような、当業者に多様に知られる、プラスミドベクター、コスミドベクター、およびファージベクターが含まれる。発現ベクターの例には、ｐＥＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＥＳＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＳＥＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＪｅｘｐｒｅｓｓベクター（ＤＮＡ２．０  Ｉｎｃ．）が含まれる。１つの態様において、大腸菌ＢＬ−２１（ＤＥ３）を、アポＡ−ＩＶをコードする遺伝子を含有するｐＥＴ３０発現ベクターで形質転換する。
【００５３】
[0072]原核生物に加えて、真核微生物、例えば糸状菌または酵母は、アポＡ−ＩＶをコードするベクターの適切なクローニングまたは発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または一般的なパン酵母が、より低次の真核宿主微生物の中で、最も一般的に用いられる。しかし、多くの他の属、種、および株が一般的に利用可能であり、そして本明細書において有用であり、これには例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）；クロイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主、例えばＫ．ラクティス（Ｋ．  ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラジリス（Ｋ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ウィッカーラミー（Ｋ．  ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ワルティー（Ｋ．  ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．  ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ  ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、およびＫ．マルキシアヌス（Ｋ．  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウィナ属（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ  ４０２，２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ  １８３，０７０）；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・リーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ  ２４４，２３４）；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）；シュワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；ならびに糸状菌、例えばニューロスポラ属、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えばＡ．ニジュランス（Ａ．  ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびＡ．ニガー（Ａ．  ｎｉｇｅｒ）が含まれる。
【００５４】
[0073]アポＡ−ＩＶの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス株および変異体、ならびに宿主、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）、およびカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）由来の対応する許容昆虫宿主細胞が同定されてきている。トランスフェクション用の多様なウイルス株、例えばオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異体およびカイコＮＰＶのＢｍ−５株が公的に入手可能であり、そしてこうしたウイルスは、本発明にしたがって本明細書のウイルスとして、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクション用に使用可能である。
【００５５】
[0074]ワタ（ｃｏｔｔｏｎ）、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、ジャガイモ（ｐｏｔａｔｏ）、ダイズ（ｓｏｙｂｅａｎ）、ペチュニア（ｐｅｔｕｎｉａ）、トマト（ｔｏｍａｔｏ）、およびタバコ（ｔｏｂａｃｃｏ）の植物細胞培養物もまた宿主として利用可能である。
【００５６】
[0075]アポＡ−ＩＶタンパク質を産生するための別の適切な宿主細胞は、脊椎動物細胞である。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚性腎臓株（例えば、２９３または懸濁培養中での増殖のため、サブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら，  Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  ３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、例えばＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；限定されるわけではないが、ＣＨＯ  Ｋ１、ＣＨＯ  ｐｒｏ３−、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＣＨＯ  ＤＵＸＢ１１、Ｌｅｃ１３、Ｂ−Ｌｙ１およびＣＨＯ  ＤＰ１２細胞を含み、好ましくはＣＨＯ  ＤＵＸ（ＤＨＦＲ−）またはそのサブクローン（本明細書において、「ＣＨＯ  ＤＵＸ」と称する）を含む、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；Ｃ１２７細胞、マウスＬ細胞；Ｌｔｋ．ｓｕｐ．−細胞；マウス・セルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏ  ｒａｔ）肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス骨髄腫細胞；ＮＳ０；ハイブリドーマ細胞、例えばマウス・ハイブリドーマ細胞；ＣＯＳ細胞；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；  ＴＲ１細胞（Ｍａｔｈｅｒら，  Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ３８３：４４−６８（１９８２））；  ＭＲＣ  ５細胞；  ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞腫株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【００５７】
[0076]宿主細胞を、アポＡ−ＩＶタンパク質産生用の発現またはクローニングベクターで形質転換し、そしてプロモーターを誘導し、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された、慣用的な栄養培地中で培養する。
【００５８】
[0077]実施例で用いるアポリポタンパク質Ａ−ＩＶノックアウトマウスは、その全解説が本明細書に援用される、Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．  １９９７  Ｓｅｐ；３８（９）：１７８２−９４に開示される方法にしたがって生成された。
【００５９】
[0078]１つの特定の態様において、薬学的組成物は、薬学的に許容されうるキャリアーをさらに含んでもよい。薬学的に許容されうるキャリアーには、広い範囲の既知の希釈剤（すなわち溶媒）、充填剤、増量剤、結合剤、懸濁剤、崩壊剤、界面活性剤、潤滑剤、賦形剤、湿潤剤および本分野で一般的に用いられる同様のものが含まれる。薬学的組成物は、好ましくは水性であり、すなわち液体配合物であり、そして好ましくは発熱物質不含水を含む。薬学的調製物の形にしたがって、これらのキャリアーを単独でまたは組み合わせて用いてもよい。生じる調製物は、必要であれば、１またはそれより多い可溶化剤、緩衝剤、保存剤、着色剤、香料、フレーバー剤および薬剤調製の分野で広く用いられる同様のものを取り込んでもよい。
【００６０】
[0079]アポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体を、錠剤、カプセル、顆粒、丸剤、注射剤、溶液、エマルジョン、懸濁物、およびシロップからなる群より選択される投薬型に配合してもよい。薬学的組成物のための型および投与経路は限定されず、そして適切に選択可能である。例えば、錠剤、カプセル、顆粒、丸剤、シロップ、溶液、エマルジョン、および懸濁物を経口投与してもよい。さらに、注射剤（例えば皮下、静脈内、筋内、および腹腔内）を単独で、またはグルコース、アミノ酸等を含有する慣用的補充剤と組み合わせて静脈内投与してもよいし、あるいは筋内、皮内、皮下および／または腹腔内に単独で投与してもよい。
【００６１】
[0080]薬学的に許容されうるキャリアーを用いて、この種類の薬学的分野で知られる方法にしたがって、高血糖を治療するための本発明の薬学的組成物を調製してもよい。例えば、錠剤、カプセル、顆粒、丸剤等の経口型を、賦形剤、例えばショ糖、ラクトース、グルコース、デンプン、マンニトール等；結合剤、例えばシロップ、アラビアゴム、ソルビトール、トラガカント、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等；崩壊剤、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロースまたはそのカルシウム塩、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール等；潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、シリカ等；ならびに湿潤剤、例えばラウリン酸ナトリウム、グリセロール等を用いて、既知の方法にしたがって調製する。
【００６２】
[0081]注射剤、溶液、エマルジョン、懸濁剤、シロップ等を、活性成分を溶解するための溶媒、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ゴマ油等；界面活性剤、例えばソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン、レシチン等；懸濁剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース等を含むセルロース誘導体、トラガカント、アラビアゴム等を含む天然ゴム；ならびに保存剤、例えばパラヒドロキシ安息香酸エステル、塩化ベンザルコニウム、ソルビン酸塩等を適切に用いて、既知の方法にしたがって調製可能である。
【００６３】
[0082]高血糖障害を治療するための本発明の薬学的組成物中に含有されるべき活性成分の比率は、広い範囲から適切に選択可能である。
[0083]本発明の方法にやはり含まれるのは、高血糖障害を治療するための併用療法である。アポリポタンパク質Ａ−ＩＶと組み合わせて使用可能なさらなる療法剤の例には、限定されるわけではないが、スルホニル尿素、メグリチニド、ビグアナイド、チアゾリジンジオン、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤、ＤＰＰ−４阻害剤、インクレチン擬似体およびインスリンが含まれる。さらなる療法剤を、治療が必要な被験体への、アポＡ−ＩＶの投与の前に、それと同時に、またはそれに続いて投与してもよい。
【００６４】
[0084]高血糖に関連する障害の治療のために被験体に投与されるアポＡ−ＩＶの有効量は、例えば、重量に基づく用量（例えばｍｇ／ｋｇ）であってもよいし、または別の例において、固定用量（重量非依存性）であってもよい。１つの態様において、約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、または０．１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇのアポＡ−ＩＶを、治療が必要な被験体に投与する。別の態様において、治療が必要な被験体に投与するアポＡ−ＩＶの有効量は、約１〜１０００ｍｇの固定用量である。さらなる態様において、有効量は、治療が必要な被験体に投与されるアポＡ−ＩＶの固定用量であり、約１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７ｍｇ、１８ｍｇ、１９ｍｇ、２０ｍｇ、２１ｍｇ、２２ｍｇ、２３ｍｇ、２４ｍｇ、２５ｍｇ、２６ｍｇ、２７ｍｇ、２８ｍｇ、２９ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１２０ｍｇ、１４０ｍｇ、１６０ｍｇ、１８０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇ、８００ｍｇ、８５０ｍｇ、９００ｍｇ、９５０ｍｇ、または１０００ｍｇである。
【００６５】
[0085]１つの特定の態様において、高血糖障害の治療が必要な被験体は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ、ブタ、およびウサギ類（ｌａｇｏｍｏｒｐｈ）からなる群より選択されてもよい。１つの特定の態様において、哺乳動物はヒトである。別の態様において、アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体を、高血糖障害の治療のために、肥満である被験体に投与してもよい。あるいは、アポＡ−ＩＶを、高血糖障害の治療のために、肥満でない被験体に投与してもよい。
【００６６】
[0086]図１に関して、さらに別の態様において、デバイス１を開示する。１つの態様において、デバイス１は、上記に先に論じた薬学的組成物の容器１０を含む。さらなる態様において、容器１０はバイアル１２を含む。バイアル１２は、薬学的組成物の機能を阻害しない、任意の素材で形成されていてもよい。例えば、バイアル１２は、ガラスおよび／またはプラスチックを含んでもよい。さらに、バイアル１２は、貫通可能な隔壁１４を含んでもよく、これを通じて薬学的組成物を取り出すことも可能である。使用の際、バイアルの隔壁１４をシリンジ２０の針２２によって貫通し、バイアル１２からシリンジ２０によって薬学的組成物を取り出し、そして該組成物を必要とする被験体に、注射を通じて薬学的組成物を投与する。
【実施例】
【００６７】
[0087]以下の限定されない実施例は、本開示の方法を例示する。
実施例１：アポＡ−ＩＶノックアウトマウスの耐糖能障害
[0088]実験プロトコル。雄アポＡ−ＩＶノックアウト（以後、「ＫＯ」）マウスを得た。野生型（以後、「ＷＴ」）マウスを対照として利用した。アポＡ−ＩＶ  ＫＯおよびＷＴマウスを、シンシナティ大学（オハイオ州シンシナティ）に維持されるコロニーから得た。アポＡ−ＩＶ  ＫＯおよびＷＴマウスには固形飼料を与えた。耐糖能試験を行う前に、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスおよびＷＴマウスを５時間絶食させた。耐糖能試験において、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスおよびＷＴマウスに、グルコース約２ｍｇ／ｇ体重の用量で、腹腔内注射し、そしてグルコース注射の約０、１５、３０、６０、および１２０分後に、血漿グルコースを測定した。耐糖能試験を２回行い、３ヶ月齢で１回、そして再び、１６ヶ月齢で行った。
【００６８】
[0089]実験結果。図２に示すように、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスは、ＷＴマウスに比較して非耐糖性であった。具体的には、図２は、グルコースの腹腔内注射後、２時間、ＷＴマウスにおける血漿グルコースレベルが、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルよりも低かったことを示す。理論によって束縛されるのではないが、これらの研究は、アポＡ−ＩＶが正常グルコース恒常性に必要である（少なくとも雄において）ことを暗示する。さらに、図３に示すように、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスは、１６ヶ月齢で試験した際に、耐糖能障害の増加を示した。具体的には、図３は、１６ヶ月齢で試験したアポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルが、３ヶ月齢で試験したアポＡ−ＩＶ  ＫＯにおける血漿グルコースレベルより高かったことを示す。理論によって束縛されるのではないが、これらの研究は、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスの耐糖能は、年齢とともに悪化することを暗示した。
【００６９】
[0090]雌野生型およびアポＡ−ＩＶノックアウトマウスでの実験
雌アポＡ−ＩＶ野生型およびノックアウトマウスを、本実施例１に先に記載するような、雄アポＡ−ＩＶ  ＫＯおよびＷＴマウスに関して用いたものと同じ腹腔内耐糖能試験に供した。結果を図１１に示す。雌アポＡ−ＩＶ−／−マウスは、腹腔内グルコースに曝露されると、雌ＷＴ動物に比較して、増加した血漿グルコースレベルを有するが、統計的に有意な相違はない。一方、雄はＷＴおよびＫＯ動物間に有意な相違を有する。
【００７０】
実施例２：アポＡ−ＩＶノックアウトマウスにおける耐糖能の回復
[0091]実験プロトコル。アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスが非耐糖性であることを立証する際、一連の広範な研究を行い、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスへのアポＡ−ＩＶの投与が、耐糖能を正常レベルに回復させるかどうかを決定した。具体的には、一連の研究を行って、投与しようとするアポＡ−ＩＶの量だけでなく、耐糖能試験を行う前にアポＡ−ＩＶを投与するのに最適な時間も決定した。
【００７１】
[0092]アポＡ−ＩＶ雄ＫＯマウスに、重量約０．２５、０．５、１、および２μｇ／ｇの用量のアポＡ−ＩＶを腹腔内注射した。アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにはまた、対照として働く生理食塩水溶液を腹腔内注射した。マウス・アポＡ−ＩＶまたは生理食塩水溶液の注射後、先に論じるように、３ヶ月齢で耐糖能試験を行った。具体的には、アポＡ−ＩＶまたは生理食塩水溶液の注射の約２時間後に耐糖能試験を行った。実験結果は、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおいて耐糖能を回復するのに最適な時間は、耐糖能試験を実施する約２時間前にアポＡ−ＩＶを投与することであることを示した。
【００７２】
[0093]実験結果。図４に示すように、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスへのアポＡ−ＩＶの投与は、耐糖能を正常レベルに回復させた。具体的には、図４は、アポＡ−ＩＶを注射したアポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルが、生理食塩水溶液を注射したアポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルよりも低かったことを示す。さらに、図４に示すように、アポＡ−ＩＶを注射したアポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルは、最高投薬量のアポＡ−ＩＶを注射したアポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおいて最低であり；同様に、アポＡ−ＩＶを注射したアポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルは、最低投薬量のアポＡ−ＩＶを注射したアポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおいて最高であった。したがって、耐糖能の改善の度合いは、投与するアポＡ−ＩＶ用量に依存し、より高い用量は、耐糖能改善を生じることが発見された。
【００７３】
実施例３：アポＡ−ＩＶノックアウトマウスにおいて耐糖能を回復させる際のアポＡ−ＩＶの特異性
[0094]実験プロトコル。アポＡ−ＩＶの特異性を評価するため、本発明者らは、アポリポタンパク質ＡＩ（以後、「アポＡ−Ｉ」）をアポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスに投与した。アポＡ−Ｉは、やはりアポＡ−ＩＶも産生する小腸上皮細胞によって作製されるタンパク質である。アポＡ−Ｉは、アポＡ−ＩＶの機能の多くを共有する。アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスに、重量１μｇ／ｇの用量のアポＡ−Ｉを腹腔内注射した。アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにはまた、対照として働く生理食塩水溶液も腹腔内注射した。先に論じるように、３ヶ月齢で、アポＡ−Ｉまたは生理食塩水溶液を注射した後、耐糖能試験を行った。具体的には、アポＡ−Ｉまたは生理食塩水溶液を注射した約２時間後に、耐糖能試験を行った。
【００７４】
[0095]実験結果。図５に示すように、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスへのアポＡ−Ｉの投与は、耐糖能を回復するかまたは改善するのに失敗した。
実施例４：アポＡ−ＩＶノックアウトマウスにおける耐糖能の回復の機構
[0096]実験プロトコル。アポＡ−ＩＶがアポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおいて耐糖能を改善する機構を評価するため、本発明者らは、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおけるグルコース誘導性インスリン分泌を測定した。より具体的には、本発明者らは、先に論じるように、３ヶ月齢で、耐糖能試験中、グルコース誘導性インスリン分泌を測定した。本研究において、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスに、耐糖能試験を行う２時間前に、重量約１μｇ／ｇの用量のマウス・アポＡ−ＩＶを腹腔内注射した。アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスに、耐糖能試験を行う約２時間前に生理食塩水を注射して、対照として利用した。
【００７５】
[0097]実験結果。図６に示すように、Ｉ期インスリン分泌は、生理食塩水を注射したアポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスには存在しなかった。しかし、図６に示すように、Ｉ期インスリン分泌は、耐糖能試験を実行する２時間前にアポＡ−ＩＶを腹腔内注射した際、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおいて回復した。
【００７６】
実施例５：高脂肪食餌を与えられたアポＡ−ＩＶノックアウトおよび野生型マウスにおけるアポＡ−ＩＶの有効性
[0098]実験プロトコル。アポＡ−ＩＶ  ＫＯおよびＷＴマウスに、長期間、Ｄｙｅｔｓ（ペンシルバニア州ベツレヘム）より購入した高脂肪半精製の栄養的に完全な実験食餌（ＡＩＮ−９３Ｍ）を１０週間与えた。高脂肪食餌は、１００ｇの食餌あたり、約２０ｇの脂肪（すなわち約１９ｇのバター脂肪および必須脂肪酸を提供するための１ｇのダイズ油）を含有する。アポＡ−ＩＶ  ＫＯおよびＷＴマウスを、温度（約２２±１℃）および光（約１２時間明期／１２時間暗期）を調節した動物施設において、トウモロコシの穂軸（ｃｏｒｎｃｏｂ）の寝藁を入れた個々のタブ・ケージ中で飼育した。先に論じるように、３ヶ月齢で耐糖能試験を行った。耐糖能試験を行う前に、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスおよびＷＴマウスを５時間絶食させた。耐糖能試験において、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスおよびＷＴマウスに、約２ｍｇ／ｇ体重の用量のグルコースを腹腔内注射した。
【００７７】
[0099]実験結果。図７に示すように、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスは、ＷＴマウスに比較して、より大きい耐糖能障害を示した。具体的には、図７は、グルコースの腹腔内注射後、２時間、ＷＴマウスにおける血漿グルコースレベルが、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルより低かったことを示す。
【００７８】
実施例６：高脂肪食餌を与えられたアポＡ−ＩＶノックアウトおよび野生型マウスにおける耐糖能の回復
[00100]実験プロトコル。３ヶ月齢で、１４週間、高脂肪食餌（重量２０％の脂肪、１９％のバター脂肪および１％のベニバナ（ｓａｆｆｌｏｗｅｒ）油）を与えたアポＡ−ＩＶ  ＫＯおよびＷＴマウスへのアポＡ−ＩＶの投与に関する、一連の研究を行った。具体的には、アポＡ−ＩＶ  ＫＯおよびＷＴマウスに、約１μｇ／ｇ体重の用量のマウス・アポＡ−ＩＶを腹腔内注射した。アポＡ−ＩＶ  ＫＯおよびＷＴマウスにまた、対照として働く生理食塩水溶液を腹腔内注射した。アポＡ−ＩＶまたは生理食塩水を注射した後、耐糖能試験を行った。具体的には、アポＡ−ＩＶまたは生理食塩水溶液注射の２時間後に、耐糖能試験を行った。
【００７９】
[00101]実験結果。図８に示すように、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおけるアポＡ−ＩＶの投与は、耐糖能を有意に改善した。具体的には、図８は、アポＡ−ＩＶを注射したアポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルが、生理食塩水溶液を注射したアポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルよりも低かったことを示す。［先の文は、次の文が同じことを記載しているため、冗長である。本明細書にデータは含まれないが、高脂肪食餌を長期間与えられたＷＴマウスにおけるアポＡ−ＩＶの投与がまた、耐糖能を有意に改善することもまた発見された。
【００８０】
実施例７：２型糖尿病を有するマウスにおける耐糖能の回復
[00102]実験プロトコル。アポＡ−ＩＶが２型糖尿病を有する動物における耐糖能を促進する際に有効であることを確証するため、ヘテロ接合体ＫＫ  Ｃｇ−Ａ／Ｊ（以後、「Ｃｇ−Ａ／Ｊ」）マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（メイン州バーハーバー）から得た。Ｃｇ−Ａ／Ｊマウスは、８週齢までに、高血糖、高インスリン血症、肥満、および耐糖能障害を発展させる。これらのマウスにおける糖尿病の主因は、アグチ関連タンパク質であり、そしてメラノコルチン−ＩＶ受容体のアンタゴニストをコードする、Ａｙ突然変異を伴う多遺伝子相互作用によって生じるインスリン耐性である。Ｃｇ−Ａ／Ｊマウスには固形飼料を与えた。さらに、固形飼料を与えて１０〜１４週間に、血糖の顕著な増加があった。
【００８１】
[00103]１４週齢で、Ｃｇ−Ａ／Ｊマウスに、腹腔内注射を通じて、マウス・アポＡ−ＩＶ（約１μｇ／ｇ体重）または生理食塩水溶液（対照として働く）のいずれかを投与した。次いで、血漿グルコースを約０、０．５、１、２、３、４、５、７、１１、および２４時間で測定した。
【００８２】
[00104]実験結果。図９に示すように、アポＡ−ＩＶは、生理食塩水対照に比較して、Ｃｇ−Ａ／Ｊマウスの血糖レベルを低下させる際に顕著な効果を有する。生理食塩水溶液を注射されたＣｇ−Ａ／Ｊマウスが、研究の２４時間の期間全体で、定常の血漿グルコースレベルを維持する一方、アポＡ−ＩＶを注射されたＣｇ−Ａ／Ｊマウスは、１０時間に渡る血漿グルコース減少を経験し、そしてこの期間の大部分の間、血漿グルコースレベルは、研究していたＣ５７ＢＬ／６Ｊ動物に匹敵した。この研究から、本発明者らは、アポＡ−ＩＶの投与は、Ｃｇ−Ａ／Ｊマウスにおいて血漿グルコースを低下させるのに有効であると結論づける。
【００８３】
実施例８：アポＡ−ＩＶ  ＫＯ、アポＡ−Ｉ  ＫＯ、およびＷＴマウスにおける血清アミロイドＰ構成要素のレベル
[00105]実験プロトコル。アテローム生成食餌を与えたアポＡ−ＩＶ  ＫＯ、アポＡ−Ｉ  ＫＯ、およびＷＴマウスにおいて、血清アミロイドＡタンパク質構成要素（以後、「ＳＡＰ」）のレベルを決定することに関連する一連の研究を行った。アポＡ−ＩＶ  ＫＯ、アポＡ−Ｉ  ＫＯ、およびＷＴマウスを、シンシナティ大学から得た。ＳＡＰは、アミロイドＰ構成要素（以後、「ＡＰ」）の血清型であり、アミロイドと称されるｉｎ  ｖｉｖｏ病理学的沈着の五角形構成要素として最初に同定された、２５ｋＤａ五量体タンパク質である。ＳＡＰは、ヒトにおいて、Ｃ反応性タンパク質のように振る舞う。具体的には、アテローム生成食餌を１２週間与えた後、アポＡ−ＩＶ  ＫＯ、アポＡ−Ｉ  ＫＯ、およびＷＴマウスにおいて、アポＡ−ＩＶ  ＫＯ、アポＡ−Ｉ  ＫＯ、およびＷＴマウスにおける血漿ＳＡＰレベルを測定した。血漿ＳＡＰレベルをウェスタンブロット分析を通じて測定した。
【００８４】
[00106]実験結果。図１０に示すように、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウス（マウス番号１、８、および１０に対応する）におけるＳＡＰのレベルは、アポＡ−Ｉ  ＫＯマウス（マウス番号２８、２９、および３０に対応する）およびＷＴマウス（マウス番号１９、２０、および２５に対応する）におけるＳＡＰのレベルに比較して増加した。
【００８５】
[00107]本開示を記載し、そして定義する目的のため、用語「約」および「実質的に」は、本明細書において、定量的比較、値、測定、または他の提示いずれかに起因しうる内在性の不確実性の度合いを表すように利用されることが注目される。用語「約」および「実質的に」はまた、本明細書において、問題となっている主題の基本的機能において変化を生じることなく、定量的提示が、言及する参照から多様でありうる度合いを提示するためにも利用される。
【００８６】
[00108]上記説明および図面は、本開示の特徴および利点を達成する例示的な態様の例示としてのみ考慮されるべきである。本開示の意図および範囲から逸脱することなく、記載する特徴および工程に、修飾および置換を行うことも可能である。したがって、本開示は、前述の説明および図によって限定されると見なされてはならず、付随する請求項の範囲によってのみ限定される。
【００８７】
実施例９：ヒト・アポＡ−ＩＶは、腹腔内耐糖能試験を受けている野生型マウスにおいて、血糖レベルを低下させる
[00109]実験プロトコル。野生型マウスにヒト・アポＡ−ＩＶを投与すると、耐糖能試験を受けているマウスにおける血糖レベルが影響を受けるかどうかを決定する研究を行った。
【００８８】
[00110]３ヶ月齢の野生型マウスに、重量１μｇ／ｇの用量のヒト・アポＡ−ＩＶを腹腔内注射した。対照として、別の群の野生型マウスに、生理食塩水溶液を腹腔内注射した。ヒト・アポＡ−ＩＶまたは生理食塩水溶液を注射した後、耐糖能試験を行った。具体的には、耐糖能試験を、アポＡ−ＩＶまたは生理食塩水溶液を注射した約２時間後、そして絶食５時間後に行った。尾の血液を収集し、そして糖測定装置（ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ）によって測定した。
【００８９】
[00111]実験結果。図１２に示すように、ヒト・アポＡ−ＩＶは、耐糖能試験を受けている野生型マウスにおいて、血糖を低下させるのに有効であった。
実施例１０：腹腔内耐糖能試験を受けている野生型雌マウスにおけるマウス・アポＡ−ＩＶの影響
[00112]実験プロトコル。雌野生型マウスへのマウス・アポＡ−ＩＶの投与が、耐糖能試験を受けているマウスにおいて、血糖レベルに影響を及ぼすかどうかを決定する研究を行った。
【００９０】
[00113]３ヶ月齢の雌野生型マウスに、重量約１μｇ／ｇの用量のマウス・アポＡ−ＩＶを腹腔内注射した。対照として、別の群の雌野生型マウスに、生理食塩水溶液を腹腔内注射した。ヒト・アポＡ−ＩＶまたは生理食塩水溶液を注射した後、耐糖能試験を行った。具体的には、アポＡ−ＩＶまたは生理食塩水を注射した約２時間後、そして絶食５時間後、耐糖能試験を行った。尾の血液を収集し、そして糖測定装置によって測定した。
【００９１】
[00114]実験結果。図１３に示すように、マウス・アポＡ−ＩＶは、耐糖能試験を受けている野生型雌マウスにおいて、血糖を低下させるのに有効であった。
実施例１１  ヒト・アポＡ−ＩＶは、ヒト膵島において、インスリン放出を刺激する
[00115]高純度ヒト膵島は、バージニア大学、Ａｘｏｎ  Ｃｅｌｌｓによって提供された。１０％ＦＢＳおよび１１ｍＭグルコースを含有するＲＰＭＩ  １６４０中で、９５％空気および５％ＣＯ２の加湿大気中、３７℃で４８時間、膵島を培養した。次いで、５０  ＩＥＱ膵島の４つの群を、３．０ｍＭグルコースを含有する通常のＫＲＢ（１２９ｍＭ  ＮａＣｌ、４．８ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび０．２％  ＢＳＡ）中で、３７℃で１時間、プレインキュベーションした。最初の２群の膵島を、次いで、３．０ｍＭグルコースを含有する通常のＫＲＢ中で、１０μｇ／ｍｌヒトＡ−ＩＶの存在下または非存在下で、１時間インキュベーションし、そしてさらに、２０ｍＭグルコースと、１０μｇ／ｍｌヒトＡ−ＩＶの存在下または非存在下で、さらに１時間インキュベーションした。最後の２群の膵島を、３．０ｍＭグルコースを含有する２５０μｍｏｌ／ｌジアゾキシドを加えた、３０ｍＭ  ＫＣｌ  ＫＲＢ（１０３．８ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび０．２％  ＢＳＡ）中で、１０μｇ／ｍｌヒトＡ−ＩＶの存在下または非存在下で、１時間インキュベーションし、そしてさらに、２０ｍＭグルコースと、１０μｇ／ｍｌヒトＡ−ＩＶの存在下または非存在下で、さらに１時間インキュベーションした。各１時間のインキュベーションの終わりに、培地を収集した。インスリンレベルをＥＬＩＳＡキット（Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ）によって測定した。
【００９２】
[00116]図１４からわかるように、ヒト膵島を３０ｍＭ  ＫＣｌに加えて２５０μＭジアゾキシドによって最大限に脱分極させると、１０μｇ／ｍｌ  ｈＡ−ＩＶは、インスリン分泌に対して有意な刺激性の影響を示した。
【００９３】
実施例１２  非グリコシル化アポＡ−ＩＶの調製
[00117]ヒトおよびマウス・アポＡ−ＩＶ  ｃＤＮＡはｐＳＰ６５維持ベクター中に含有され、そして成熟アポＡ−ＩＶタンパク質のコーディング配列のすぐ５’を操作してＡｆｌＩＩＩ制限酵素部位を作製した。遺伝子を維持ベクターから切り出し、そしてｐＥＴ３０発現ベクター内に連結した。構築物を大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＢＬ−２１（ＤＥ３）細胞にトランスフェクションし、そしてカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を補ったルリア−ベルタニ培養中で、３７℃で増殖させた。細胞におけるアポＡ−ＩＶタンパク質合成の誘導の後、細胞を採取し、そして超音波処理した。Ｈｉｓ結合アフィニティカラムクロマトグラフィーおよび透析によって、溶解物由来のアポＡ−ＩＶタンパク質を精製した。生じたアポＡ−ＩＶタンパク質を、生理食塩水中、１．０ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで希釈した。
【００９４】
援用
本明細書に引用するすべての参考文献および特許の内容は、その全体が本明細書に援用される。
【００９５】
同等物
当業者は、ルーチンの実験方法を超えるものを用いずに、本明細書に記載する本発明の特定の態様に対する多くの同等物を認識するかまたは確認することが可能であろう。こうした同等物は、以下の請求項に含まれると意図される。
本発明は、非限定的に以下の態様を含む。
［態様１］
高血糖障害の治療が必要な被験体において、高血糖障害を治療するための方法であって、高血糖障害が治療されるように、被験体に、有効量のアポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質またはアポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質に少なくとも９０％の同一性を有するその生物学的活性類似体を投与する工程を含む、前記方法。
［態様２］
高血糖障害が、インスリン耐性障害または高血糖に関連する内分泌障害である、態様１の方法。
［態様３］
インスリン耐性障害が、前糖尿病、メタボリックシンドローム、多嚢胞性卵巣疾患、Ａ型症候群、および妊娠糖尿病からなる群より選択される、態様２の方法。
［態様４］
高血糖に関連する内分泌障害が、クッシング病、グルカゴン分泌性腫瘍、および先端巨大症からなる群より選択される、態様２の方法。
［態様５］
高血糖障害を有する被験体において、血糖レベルを低下させる方法であって、血糖レベルが低下するように、被験体に、有効量のアポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質またはアポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質に少なくとも９０％の同一性を有するその生物学的活性類似体を投与する工程を含む、前記方法。
［態様６］
高血糖障害が、インスリン耐性障害または高血糖に関連する内分泌障害である、態様５の方法。
［態様７］
インスリン耐性障害が、前糖尿病、メタボリックシンドローム、多嚢胞性卵巣疾患、Ａ型症候群、および妊娠糖尿病からなる群より選択される、態様６の方法。
［態様８］
高血糖に関連する内分泌障害が、クッシング病、グルカゴン分泌性腫瘍、および先端巨大症からなる群より選択される、態様６の方法。
［態様９］
前糖尿病が、耐糖能不全または絶食時グルコース不全のいずれかによって特徴付けられる、態様３または７の方法。
［態様１０］
多嚢胞性卵巣疾患に関連する高血糖またはインスリン耐性を治療する必要がある被験体において、多嚢胞性卵巣疾患に関連する高血糖またはインスリン耐性を治療する方法であって、多嚢胞性卵巣疾患に関連する高血糖またはインスリン耐性が治療されるように、被験体に、有効量のアポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質またはアポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質に少なくとも９０％の同一性を有するその生物学的活性類似体を投与する工程を含む、前記方法。
［態様１１］
その生物学的活性類似体が、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質に少なくとも９５％の同一性を有する、態様１〜１０のいずれか一項の方法。
［態様１２］
その生物学的活性類似体が、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質に少なくとも９９％の同一性を有する、態様１〜１０のいずれか一項の方法。
［態様１３］
被験体がヒトである、態様１〜１２のいずれか一項の方法。
［態様１４］
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶのアミノ酸配列が
【化１】
0006033433.tif 000002
式中、Ｘ１は、Ｇ、Ａ、Ｖであるかまたは存在せず；
Ｘ２はＥまたはＫであり；
Ｘ３はＴまたはＳであり；そして
Ｘ４はＱまたはＨである
であるかまたはその生物学的活性断片である、態様１〜１０のいずれか一項の方法。
［態様１５］
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質が全長ヒト・アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質である、態様１〜１０のいずれか一項の方法。
［態様１６］
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質のアミノ酸が、
【化２】
0006033433.tif 000003
である、態様１５の方法。
［態様１７］
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質のアミノ酸配列が：
【化３】
0006033433.tif 000004
である、態様１〜１０のいずれか一項の方法。
［態様１８］
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質が、配列番号１、３、４、または６〜５０のいずれか１つに示すようなアミノ酸配列、あるいはその生物学的活性断片を含む、態様１〜１０のいずれか一項の方法。
［態様１９］
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質が、配列番号１、３、４、または６〜５０のいずれか１つに示す配列、あるいはその生物学的活性断片の任意の１つに、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、態様１〜１０のいずれか一項の方法。
［態様２０］
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質が、配列番号１、３、４、または６〜５０のいずれか１つに示す配列、あるいはその生物学的活性断片の任意の１つに、９６％同一であるアミノ酸配列を含む、態様１〜１０のいずれか一項の方法。
［態様２１］
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質が、配列番号１、３、４、または６〜５０のいずれか１つに示す配列、あるいはその生物学的活性断片の任意の１つに、９７％同一であるアミノ酸配列を含む、態様１〜１０のいずれか一項の方法。
［態様２２］
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質が、配列番号１、３、４、または６〜５０のいずれか１つに示す配列、あるいはその生物学的活性断片の任意の１つに、９８％同一であるアミノ酸配列を含む、態様１〜１０のいずれか一項の方法。
［態様２３］
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質が、配列番号１、３、４、または６〜５０のいずれか１つに示す配列、あるいはその生物学的活性断片の任意の１つに、９９％同一であるアミノ酸配列を含む、態様１〜１０のいずれか一項の方法。
［態様２４］
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、またはその生物学的活性類似体が、グリコシル化されていない、態様１〜２３のいずれか一項記載の方法。
［態様２５］
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質、またはその生物学的活性類似体を全身投与する、態様１〜２４のいずれか一項記載の方法。
［態様２６］
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質、またはその生物学的活性類似体の全身投与が、経口、皮下、静脈内、筋内、および腹腔内投与からなる群より選択される、態様２５記載の方法。
［態様２７］
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質、またはその生物学的活性類似体を、約１〜約１０μｇ／ｇの用量で投与する、態様１〜２６のいずれか一項記載の方法。
［態様２８］
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質、またはその生物学的活性類似体を、約０．２５〜約２μｇ／ｇの用量で投与する、態様１〜２６のいずれか一項記載の方法。
［態様２９］
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質、またはその生物学的活性類似体を、約１μｇ／ｇの用量で投与する、態様１〜２６のいずれか一項記載の方法。
［態様３０］
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質、またはその生物学的活性類似体を、約１〜１０００ｍｇの固定用量として投与する、態様１〜２６のいずれか一項記載の方法。
［態様３１］
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質、またはその生物学的活性類似体を、１日１回投与する、態様１〜３０のいずれか一項記載の方法。
［態様３２］
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質、またはその生物学的活性類似体を、１日約２回投与する、態様１〜３０のいずれか一項記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
0006033433.tif 000019
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図１０】
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【配列表】
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