(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルチモダリティ画像生成のための検査用装置であって、
光学的な第１のモダリティ及び光学的な第２のモダリティにおいて少なくとも一部が共用して用いられる光学手段を含み、スペクトル符号化共焦点顕微鏡技術（ＳＥＣＭ）である前記第１のモダリティに基づいて少なくとも一つのサンプルの少なくとも一つの部位から前記光学手段を介して受信した第１の信号に関連する第１のデータと、前記第１のモダリティとは異なる前記第２のモダリティに基づいて前記少なくとも一つのサンプルから前記光学手段を介して受信した第２の信号に関連する第２のデータと、前記第１のモダリティ及び前記第２のモダリティとは異なる第３のモダリティに基づき、かつ、前記少なくとも一つのサンプルから受信した第３の信号に関連する、少なくとも一つの第３のデータと、を送出するように構成された第１の機器と、
前記第１のデータに基づいた表示のための第４のデータを生成し、前記第２のデータに基づいた表示のための第５のデータを生成し、前記第３のデータに基づいた表示のための第６のデータを生成するように構成された第２の機器と、を備え、
前記第１の信号、前記第２の信号及び前記第３の信号は、電磁放射線を放射する光源によって放射された前記電磁放射線によって生成される、
検査用装置。
【請求項２】
前記第２のモダリティが、蛍光画像生成技術である、請求項１記載の検査用装置。
【請求項３】
前記第１の機器及び前記第２の機器と関連付けられた顕微鏡装置である、請求項１記載の検査用装置。
【請求項４】
電磁放射を前記少なくとも一つの部位に向けて照射するように構成されたビーム走査機構を備える、請求項１記載の検査用装置。
【請求項５】
前記第２の機器は、（ｉ）二次元画像又は（ｉｉ）三次元画像の少なくとも一つを時間の関数として生成する、請求項１記載の検査用装置。
【請求項６】
前記第１のデータ及び前記第２のデータは、前記少なくとも一つのサンプルの略同一の位置に関連付けられる、請求項１記載の検査用装置。
【請求項７】
前記第１の機器及び前記第２の機器は、一つのプローブ又は単一の筐体の少なくとも一つに設けられる、請求項１記載の検査用装置。
【請求項８】
前記第１の機器の複数のモダリティに対応する複数の光学機器は、共通の部品を有する、請求項１記載の検査用装置。
【請求項９】
前記共通の部品は、波長掃引光源装置に存在する、請求項８記載の検査用装置。
【請求項１０】
前記第１の機器は、スペクトル符号化共焦点顕微鏡検査情報を取得するように構成された、請求項１記載の検査用装置。
【請求項１１】
前記第１の機器は、明視野、暗視野、位相コントラスト、偏光、上部反射性（ｅｐｉｒｅｆｉｅｃｔａｎｃｅ）又は反射顕微鏡検査情報の少なくとも一つを取得するように構成された、請求項１記載の検査用装置。
【請求項１２】
一のモダリティから前記一のモダリティとは異なるモダリティに変更するように構成された更なる装置を備える、請求項１記載の検査用装置。
【請求項１３】
前記第１の機器は、複数の波長を有する光源装置から提供される信号に関連する光コヒーレンストモグラフィー情報を取得するように構成され、
サンプルアームと基準アームとの間のスペクトル干渉を前記複数の波長の関数として検出するように構成された複数の検出器を更に備える、請求項１記載の検査用装置。
【請求項１４】
前記第１の機器は、波長が時間とともに変化する光源装置から提供される信号に関連する光コヒーレンストモグラフィー情報を取得するように構成された、請求項１記載の検査用装置。
【請求項１５】
前記第１のデータ及び前記第２のデータに基づいて画像を生成するように構成された少なくとも一つの第４の機器を備える、請求項１記載の検査用装置。
【請求項１６】
前記第１のデータに基づいて少なくとも一つの第１の画像を、前記第２のデータに基づいて少なくとも一つの第２の画像を生成するように構成された少なくとも一つの第５の機器を備え、前記第１の画像と前記第２の画像は、前記第１のデータと前記第２のデータの関数としてお互いに関連付けられている、請求項１記載の検査用装置。
【請求項１７】
前記第１の機器は、光コヒーレンストモグラフィー情報を取得するように構成された、請求項１記載の検査用装置。
【請求項１８】
前記第１の機器は、光周波数領域干渉分光情報を取得するように構成された、請求項１記載の検査用装置。
【請求項１９】
マルチモダリティ画像生成のための検査用装置であって、
光学的な第１のモダリティ及び光学的な第２のモダリティにおいて少なくとも一部が共用して用いられる光学手段を含み、スペクトル符号化共焦点顕微鏡技術（ＳＥＣＭ）である前記第１のモダリティに基づいて少なくとも一つのサンプルの少なくとも一つの部位から前記光学手段を介して受信した第１の信号に関連する第１のデータと、前記第１のモダリティとは異なる第２のモダリティに基づいて前記少なくとも一つのサンプルから前記光学手段を介して受信した第２の信号に関連する第２のデータと、各々が前記第１のモダリティ及び第２のモダリティとは異なる更なるモダリティに基づき、かつ、前記少なくとも一つのサンプルから受信した第２の信号に関連する、少なくとも一つの第３のデータとを送出するように構成された第１の機器と、
前記第１のデータ及び前記第３のデータに基づいた表示のための第４のデータを生成し、前記第２のデータに基づいた表示のための第５のデータを生成するように構成された第２の機器とを備え、前記第１の信号及び前記第２の信号は、電磁放射線を放射する光源によって放射された前記電磁放射線によって生成される、検査用装置。
【請求項２０】
前記第１の機器が、光コヒーレンストモグラフィー情報を取得するように構成された、請求項１９記載の検査用装置。
【請求項２１】
前記第１の機器が、光コヒーレンス顕微鏡検査情報を取得するように構成された、請求項１９記載の検査用装置。
【請求項２２】
前記第１の機器が、全域（ｆｕｌｌ  ｆｉｅｌｄ）光コヒーレンス顕微鏡検査情報を取得するように構成された、請求項１９記載の検査用装置。
【請求項２３】
マルチモダリティ画像生成のための検査用装置であって、
第１のスペクトル符号化モダリティに基づいて少なくとも一つのサンプルの少なくとも一つの部位から、少なくとも一部が共用して用いられる光学手段を介して受信した第１の信号に関連する第１のデータと、第２の非スペクトル符号化モダリティに基づいて前記少なくとも一つのサンプルから前記光学手段を介して受信した第２の信号に関連する第２のデータとを送出するように構成された第１の機器と、
前記第１のデータに基づいて第３のデータを生成し、前記第２のデータに基づいて第４のデータを生成するように構成された第２の機器とを備え、
前記第１のデータと前記第２のデータは、前記第１の機器により略同時に送出され、前記第１のデータに基づく第３のデータと前記第２のデータに基づく第４のデータとは前記第２の機器により共に表示され、前記第１の信号及び前記第２の信号は、電磁放射線を放射する光源によって放射された前記電磁放射線によって生成される、検査用装置。
【請求項２４】
請求項１に記載の検査用装置によって実行される検査方法であって、
前記第１の機器が、スペクトル符号化共焦点顕微鏡技術（ＳＥＣＭ）である前記第１のモダリティに基づいて少なくとも一つのサンプルの少なくとも一つの部位から前記光学手段を介して受信した第１の信号に関連する第１のデータと、前記第１のモダリティとは異なる第２のモダリティに基づいて前記少なくとも一つのサンプルから前記光学手段を介して受信した第２の信号に関連する第２のデータと、前記第１のモダリティ及び前記第２のモダリティとは異なる第３のモダリティに基づき、かつ、前記少なくとも一つのサンプルから受信した第３の信号に関連する、少なくとも一つの第３のデータとを送出するステップと、
前記第２の機器が、前記第１のデータに基づいた表示のための第４のデータを生成し、前記第２のデータに基づいた表示のための第５のデータを生成し、前記第３のデータに基づいた表示のための第６のデータを生成するステップと、を含み、
前記第１の信号、前記第２の信号及び前記第３の信号は、電磁放射線を放射する光源によって放射された前記電磁放射線によって生成される、
検査方法。
【請求項２５】
請求項１９に記載の検査用装置によって実行される検査方法であって、
前記第１の機器が、スペクトル符号化共焦点顕微鏡技術（ＳＥＣＭ）である前記第１のモダリティに基づいて少なくとも一つのサンプルの少なくとも一つの部位から前記光学手段を介して受信した第１の信号に関連する第１のデータと、前記第１のモダリティとは異なる第２のモダリティに基づいて前記少なくとも一つのサンプルから前記光学手段を介して受信した第２の信号に関連する第２のデータと、各々が、前記第１のモダリティ及び前記第２のモダリティとは異なる更なるモダリティに基づき、前記少なくとも一つのサンプルから受信した第２の信号に関連する、少なくとも一つの第３のデータと、を送出するステップと、
前記第２の機器が、前記第１のデータ及び前記第３のデータに基づいた表示のための第４のデータを生成し、前記第２のデータに基づいた表示のための第５のデータを生成するステップと、を含み、前記第１の信号及び前記第２の信号は、電磁放射線を放射する光源によって放射された前記電磁放射線によって生成される、検査方法。
【請求項２６】
請求項２３に記載の検査用装置によって実行される検査方法であって、
前記第１の機器が、第１のスペクトル符号化モダリティに基づいて少なくとも一つのサンプルの少なくとも一つの部位から、少なくとも一部が共用して用いられる光学手段を介して受信した第１の信号に関連する第１のデータと、第２の非スペクトル符号化モダリティに基づいて前記少なくとも一つのサンプルから前記光学手段を介して受信した第２の信号に関連する第２のデータと、を送出するステップと、
前記第２の機器が、前記第１のデータに基づいて第３のデータを生成し、前記第２のデータに基づいて第４のデータを生成するステップと、を含み、
前記送出するステップにおいて、前記第１のデータと前記第２のデータは略同時に送出され、
前記生成するステップにおいて、前記第１のデータに基づく第３のデータと前記第２のデータに基づく第４のデータとは前記第２の機器により共に表示され、前記第１の信号及び前記第２の信号は、電磁放射線を放射する光源によって放射された前記電磁放射線によって生成される、検査方法。
【請求項２７】
前記第４のデータはサンプルの構造データであり、前記第５のデータはサンプルの機能的データである、請求項１に記載された検査用装置。
【請求項２８】
前記第４のデータはサンプルの構造データであり、前記第５のデータはサンプルの機能的データである、請求項１９に記載された検査用装置。
【請求項２９】
前記第３のデータはサンプルの構造データであり、前記第４のデータはサンプルの機能的データである、請求項２３に記載された検査用装置。
【請求項３０】
前記第４のデータはサンプルの構造データであり、前記第５のデータはサンプルの機能的データである、請求項２４に記載された検査方法。
【請求項３１】
前記第４のデータはサンプルの構造データであり、前記第５のデータはサンプルの機能的データである、請求項２５に記載された検査方法。
【請求項３２】
前記第３のデータはサンプルの構造データであり、前記第４のデータはサンプルの機能的データである、請求項２６に記載された検査方法。
【請求項３３】
マルチモダリティ画像生成のための検査用装置であって、
電磁放射線を放射する光源と、
次の(a)と(b)とを送出するように構成された第１の機器と、
(a)スペクトル符号化共焦点顕微鏡技術（SECM）である第１の光モダリティに基づいて、少なくとも部分的に共通の光学的手段を介して、少なくとも一つのサンプルの少なくとも一つの部位から受信した第１の信号に関連付けられた第１のデータ、
(b)前記第１のモダリティとは異なる第２のモダリティに基づいて、少なくとも部分的に共通の前記光学手段を介して少なくとも一つの前記サンプルから受信した第２の信号に関連する第２のデータ、
前記第１のデータに基づいた表示のための第３のデータを生成し、前記第２のデータに基づいた表示のための第４のデータを生成するように構成された第２の機器とを備え、
ここで、前記第１の機器のモダリティは、対物レンズではないレンズのためのスライダによって変更され、
ここで、前記第１の信号および前記第２の信号は、前記光源によって放射された前記電磁放射線によって生成される、検査用装置。
【請求項３４】
請求項３３に記載の検査用装置によって実行される検査方法であって、
光源が電磁放射線を放射するステップと、
前記第１の機器が、次の(a)と(b)とを送出するステップと、
(a)スペクトル符号化共焦点顕微鏡技術（SECM）である前記第１の光モダリティに基づいて、少なくとも部分的に共通の前記光学的手段を介して、少なくとも一つの前記サンプルの少なくとも一つの部位から受信した第１の信号に関連付けられた第１のデータ、
(b)前記第１のモダリティとは異なる第２のモダリティに基づいて、少なくとも部分的に共通の前記光学手段を介して少なくとも一つの前記サンプルから受信した第２の信号に関連する第２のデータ、
前記第２の機器が、前記第１のデータに基づいた表示のための第３のデータを生成し、前記第２のデータに基づいた表示のための第４のデータを生成するステップとを含み、
ここで、前記第１の機器のモダリティは、対物レンズではないレンズのためのスライダによって変更され、
ここで、前記第１の信号および前記第２の信号は、前記光源によって放射された前記電磁放射線によって生成される、検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１以上の生物学的構造体のマルチモダリティ顕微鏡画像生成のための装置及び方法に関し、特に、例えば、スペクトル符号化共焦点顕微鏡検査（ＳＥＣＭ）、蛍光ＳＥＣＭ、光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）、スペクトル領域（ＳＤ）−ＯＣＴ、光周波数領域干渉分光法（ＯＦＤＩ）及び光コヒーレンス顕微鏡検査（ＯＣＭ）を含む手法を用いて生物検体の反射顕微鏡検査、及び／又は蛍光顕微鏡検査の実施に関する。
（関連出願の相互参照）
【０００２】
本出願は、２００５年９月２９日出願の米国特許出願第６０／７２１，８０２号に基づき優先権を主張するものであり、この全ての開示内容を本明細書の一部として援用する。
【背景技術】
【０００３】
一般的に、遺伝子変化の分子基盤と表現型との関係を決定するには、生物検体の微細構造の二次元及び三次元の高精度特徴解析が用いられる。しかしながら、多くの場合、生きている生体検体の動きや微細構造を評価することはもっと困難である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
光学技術は、生物検体を高分解能で画像化できる可能性を有している。ある種の用途に対しては、内生的コントラストに基づいた光学的画像生成手法は、外生的に薬物を使用する必要がある技術よりも有利である。これは、このような手法には、わずかな検体を用いて自然状態の検体を多数の時点にわたり分析できうるという利点があるからである。ここに、胚芽期心臓の微細構造の視覚化に用いられる内生的コントラストを用いた画像生成モダリティをいくつか例示する。代表的な光コヒーレンストモグラフィ（ＯＣＴ）には２方式があって、Ｄ．Ｈｕａｎｇ、ｅｔ  ａｌ．、“Ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ”（光コヒーレンストモグラフィー）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４、ＰＰ．１１７８−１１８１（１９９１）、Ｓ．Ａ．Ｂｏｐｐａｒｔ、ｅｔ  ａｌ．、“Ｉｎｖｅｓｔｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ｕｓｉｎｇ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ”（光コヒーレンストモグラフィーを用いた発生期胚芽形態の研究  ），Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １１１、ｐｐ．５４−６３（１９９６）に記載されているような時間領域光コヒーレンストモグラフィー（ＴＤ−ＯＣＴ）、及び光周波数領域画像生成に関するＭ．Ａ．Ｃｈｏｍａ、ｅｔ  ａｌ，“Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｏｆ  ｓｗｅｐｔ  ｓｏｕｒｃｅ  ａｎｄ  Ｆｏｕｒｉｅｒ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ”  （掃引光源およびフーリエ領域光コヒーレンストモグラフィーの感度優位性）、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  １１、  ｐｐ．２１８３−２１８９（２００３）」；及びＳ．Ｈ．Ｙｕｎ，ｅｔ  ａｌ、“Ｈｉｇｈ−ｓｐｅｅｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ−ｄｏｍａｉｎ  ｉｍａｇｉｎｇ”  （光周波数領域高速画像生成）、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  １１、  ｐｐ２９５３−２９６３（２００３）が挙げられる。
【０００５】
更に、例として二つの反射型顕微鏡検査技術を例を挙げることができる。例えば、Ｅ．Ｂｅａｕｒｅｐａｉｒｅ、ｅｔ  ａｌ、“Ｆｕｌｌ−Ｆｉｅｌｄ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”（全域光コヒーレンス顕微鏡検査）、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２３、ｐｐ．２４４−２４６（１９９８）；Ａ．Ｄｕｂｏｉｓ、ｅｔ  ａｌ、「Ｕｌｔｒａｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｕｌｌ−ｆｉｅｌｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（超高分解能全域光コヒーレンストモグラフィー）」、Ａｐｐｌ  Ｏｐｔ  ４３、ｐｐ．２８７４−２８８３（２００４）；と、Ｇ．Ｍｏｎｅｒｏｎ，ｅｔ  ａｌ、“Ｓｔｒｏｂｏｓｃｏｐｉｃ  ｕｌｔｒａｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｕｌｌ−ｆｉｅｌｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ”、（ストロボスコープ型超高分解能全域光コヒーレンストモグラフィー）、Ｏｐｔ  Ｌｅｔｔ  ３０、ｐｐ．１３５１−１３５３（２００５）に記載の全域光コヒーレンストモグラフィー（ＦＦＯＣＭ）と、Ｇ．Ｊ．Ｔｅａｒｎｅｙ、ｅｔ  ａｌ、“Ｓｐｅｃｔｒａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”（スペクトル符号化共焦点顕微鏡検査）、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２３、ｐｐ．１１５２−１１５４（１９９８）；と、Ｃ．Ｂｏｕｄｏｕｘ、ｅｔ  ａｌ、“Ｒａｐｉｄ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ−ｓｗｅｐｔ  ｓｐｅｃｔｒａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”（高速波長掃引スペクトル符号化共焦点顕微鏡検査）、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ３、ｐｐ．８２１４−８２２１（２００５）に記載のスペクトル符号化共焦点顕微鏡検査（ＳＥＣＭ）がある。
【０００６】
例えば、ＴＤ−ＯＣＴ技術は、低コヒーレンス干渉分光法を用いて断面画像を〜１０ミクロンの分解能で、２ミリメートルの深さまで測定することができるものである。（Ｓ．Ａ．Ｂｏｐｐａｒｔ、ｅｔ  ａｌ、“Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ａｓｓｅｓｍｅｎｔ  ｏｆｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｃａｌｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｕｓｉｎｇ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ”、（光コヒーレンストモグラフィーを用いたアフリカツメガエルの心臓血管系非侵襲評価）、  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｄ  ＵＳＡ  ９４、ｐｐ．４２５６−４２６１（１９９７）；Ｓ．Ｙａｚｄａｎｆａｒ  ｅｔ  ａｌ、“Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｌｏｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ”（カラー・ドップラー・光コヒーレンストモグラフィーを用いた生体心臓運動の高分解能画像生成）、Ｏｐｔｉｃｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  １、ｐｐ．４２４−４３１（１９９７）；Ｔ．Ｍ．Ｙｅｌｂｕｚ、ｅｔ  ａｌ、“Ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：  ａ  ｎｅｗ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｃｈｉｃｋ  ｅｍｂｒｙｏｓ”（光コヒーレンストモグラフィー：鶏胚における心臓発生研究のための新高分解能画像生成技術）、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６、ｐｐ．２１１１−２１１４（２００２）；Ｖ．Ｘ．Ｄ．Ｙａｎｇ、ｅｔ  ａｌ、“Ｈｉｇｈ  ｓｐｅｅｄ、ｗｉｄｅ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｒａｎｇｅ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  ｏｐｔｅｉｃａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ｐａｒｔＩＩ）”：Ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  アフリカツメガエル）（高速、広範囲速度ダイナミックレンジドップラー・光コヒーレンストモグラフィー（第２部）：アフリカツメガエルの生体心臓運動の画像生成）、及びＷ．Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｍｕｒｉｎｅ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍ”、（胚芽期マウスの心臓血管系三次元光コヒーレンストモグラフィー）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｏｐｔｉｃｓ  １１、０２１０１４（２００６）を参照）。
【０００７】
代表的なＯＦＤＩ技術は、Ｒ．Ｈｕｂｅｒ、ｅｔａｌ．，“Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｃ−ｍｏｄｅ  ＯＣＴ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｍｐａｃｔ、ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｓｗｅｐｔ  ｌａｓｅｒ  ｓｏｕｒｃｅ  ａｔ  １３００ｎｍ”（１３００ｎｍ周波数掃引レーザ光源を用いたコンパクトな三次元・ＣモードＯＣＴ画像生成）、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  １３、ｐｐ．１０５２３−１０５３８（２００５）に記載されているように、ＴＤＯＣＴ技術から派生したものと考えられ、非常に高速のフレームレートでの画像の取得を可能にするものである。ＯＦＤＩ技術の有する高速性は真の四次元（４Ｄ）顕微鏡測定（例えば、時間の関数としての三次元顕微鏡検査）を実施可能とするものである。全域光コヒーレンス顕微鏡検査（ＦＦＯＣＭ）技術には、全三次元にわたり細胞下レベルの分解能を実現するために、低コヒーレンス干渉分光法および大開口数対物レンズを用いることができる。このようなＦＦＯＣＭ技術は、ＯＦＤＩ技術より大幅に低速となりやすい。代表的なＳＥＣＭ技術には反射型共焦点顕微鏡検査技術があり、この技術により、ミクロンレベルの分解能の二次元画像をＦＦＯＣＭ技術を用いるよりも遥かに高速度で取得することができる。
【０００８】
これらの自然状態コントラスト手法は、それぞれ単独で胚芽期心臓の微細構造の画像生成に用いることができるが、組み合わせて用いることにより初期心筋形態及び動態を二次元、三次元及び四次元的に特徴付ける強力な手段となりうるものである。これらの異なるモダリティを組み合わせて一体の顕微鏡検査用装置として用いることにより、更なる利点が生じる。例えば（ａ）異なるフォーマット、異なる分解能および視野による画像の比較、（ｂ）構造的並びに機能的情報の同時取得、及び／又は、（ｃ）これらの作業を一台の装置を用いて検体を移動、変更することなく達成できる、等である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、（上述のものを含む）従来技術の欠点および課題を解決して、一以上の生物学的構造体のマルチモダリティ顕微鏡画像を生成する代表的な実施の形態を提供することを一つの目的とする。このような代表的な実施の形態は、スペクトル符号化共焦点顕微鏡検査（ＳＥＣＭ）、蛍光ＳＥＣＭ、光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）、スペクトル領域（ＣＤ）ＯＣＴ、光周波数領域干渉分光法（ＯＦＤＩ）及び光コヒーレンス顕微鏡検査（ＯＣＭ）手法を用いた生物検体の反射及び／又は蛍光顕微鏡検査を実行できる。
【００１０】
例えば、生物検体の分析は一般的に、その微細構造と機能の可視化を行うが、検体の変化の少ない方がよい。本発明の代表的な実施の形態では、一つの顕微鏡装置に、様々な画像生成モダリティを組み合わせることができる。本発明の代表的な実施の形態による代表的な技術は、それぞれ、高速（例えば、毎秒１０００フレーム）で高い軸方向分解能（４−１６μｍ）の生体断面画像生成、真の生体四次元画像生成、等方性細胞（例えば、１−２μｍ）の分解能の体外三次元顕微鏡検査、生体二次元細胞下画像生成、を含む個別又は補完的な画像生成機能を提供できる。これらの代表的な画像生成モダリティは組み合わせると、生物検体の生態学的及び動的な画像を一層完全にすることができる。
【００１１】
このため、本発明の代表的な実施の形態は、マルチモダリティ顕微鏡データを取得する装置及び方法を含む。例えば、一つの代表的な実施の形態によると、固有の広帯域幅又は高速波長掃引光源、及び走査機構と結像レンズの間に設けられる光学部品を組み合わせて使用することができる。データは、例えば、検体を移動させずに、同時及び／又は連続して取得できる。例えば、様々なモダリティから取得したデータは、重ね合わせる（ｃｏ−ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ）ことによって、並べて、及び／又は重ねて表示することができる。データセットの全てから補完し合って定量的情報を取得することができる。
【００１２】
このため、本発明の代表的な実施の形態に従って方法及び装置を提供することができる。例えば、第１のモダリティに基づいて、少なくとも一つのサンプルの少なくとも一つの部位から受信した第１の信号に関連する第１のデータを送出でき、前記第１のモダリティとは異なる第２のモダリティに基づいて前記少なくとも一つのサンプルから受信した第２の信号に関連する第２のデータを送出できる。基準に関連する第３のデータを受信できる。前記第１のデータ、前記第２のデータ及び前記第３のデータに基づいて更なるデータを生成できる。加えて、少なくとも一つのサンプルから受信した第２の信号に関連する第３のデータを取得できる。第３のデータの各々は、第１のモダリティ及び第２のモダリティとは異なる更なるモダリティに基づくことができ、更なるデータは、第３のデータに基づいて決定できる。更に、第１のモダリティをスペクトル符号化モダリティ、第２のモダリティを非スペクトル符号化モダリティとすることができる。
【００１３】
本発明の他の代表的な実施の形態では、第１のモダリティを蛍光画像生成技術とすることができる。顕微鏡装置及び／又はビーム走査装置を設けることができる。ビーム走査装置は、電磁放射を少なくとも一つの部位に放射するように構成してもよい。更に、二次元画像及び／又は三次元画像を、更なるデータの関数として生成することができる。第１のデータ及び第２のデータは、ほぼ同時に取得してもよい。更に、第１のデータ及び第２のデータは、サンプルのほぼ同一の位置に関連付けてもよく、及び／又は第１のデータ及び第２のデータの他方を用いて取得できる。
【００１４】
本発明の更なる代表的な実施の形態によると、装置は、一つのプローブ及び／又は単一の筐体に設けることができる。このような代表的な装置及び方法を用いて、スペクトル符号化顕微鏡検査情報、明視野、暗視野、位相コントラスト、偏光、上部反射性（ｅｐｉｒｅｆｉｅｃｔａｎｃｅ）及び／又は反射顕微鏡検査情報を取得することができる。このような代表的な装置及び方法を用いて第１のモダリティを第２のモダリティに変更することができる。複数の波長を有する光源装置から提供される信号に関連する光コヒーレンストモグラフィー情報を取得することができる。第２の信号と第３の信号の間のスペクトル干渉を複数の波長の関数として検出するように構成された複数の検出器を備えることができる。
【００１５】
波長が時間とともに変化する光源装置から提供される信号に関連する光コヒーレンストモグラフィー情報を取得することができる。少なくとも一つの画像は、第１のデータ及び第２のデータに基づいて生成することができる。更に、第１の画像は、第１のデータに基づいて生成することができ、第２の画像は、第２のデータに基づいて生成することができる。第１の画像と第２の画像は、第１のデータと第２のデータの関数としてお互いに関連付けてもよい。光コヒーレンストモグラフィー情報及び／又は光周波数領域干渉分光法情報を取得することができる。
【００１６】
本発明のその他の特徴及び長所は、添付の本発明の特許請求の範囲とともに、以下の実施の形態の詳細な説明から明らかになる。
【００１７】
本発明の更なる目的、特徴、及び利点は、以下に例示する本発明の実施の形態を示す添付の図面を参照する、以下の詳細な説明から明らかになる。
【００１８】
図面において、図示の実施の形態の同様の特徴、構成、部品、又は部分には同様の参照番号及び符号を付した。本発明について以下、例示の実施の形態を用いて図面を参照して詳細に説明する。添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲及び趣旨を逸脱することなく、本書に記載の実施の形態に変更及び修正を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】広帯域幅光源を用いた代表的なＳＥＣＭシステムの概略図である。
【図２】代表的なスペクトル領域（ＳＤ）ＯＣＴシステムの概略図である。
【図３】広帯域幅光源を用いた代表的な光コヒーレンス顕微鏡検査法（ＯＣＭ）システムの概略図である。
【図４】広帯域幅光源を用いた代表的なＦＦＯＣＭシステムの概略図である。
【図５】広帯域幅光源を用いた代表的な蛍光ＳＥＣＭシステムの概略図である。
【図６】波長同調光源を用いた代表的なＳＥＣＭシステムの概略図である。
【図７】波長同調／変調光源を用いた代表的なＯＦＤＩシステムの概略図である。
【図８】波長変調／同調光源を用いた代表的なＯＣＭシステムの概略図である。
【図９】波長変調／同調光源を用いた代表的なＦＦＯＣＭシステムの概略図である。
【図１０】本発明の第１の代表的な実施の形態による、広帯域幅光源を用いた代表的な混合ＳＥＣＭ／ＳＤ−ＯＣＴ／ＯＣＭシステムの概略図である。
【図１１】本発明の第２の代表的な実施の形態による、広帯域幅光源を用いた代表的な混合ＳＥＣＭ／ＳＤ−ＯＣＴ／ＦＦＯＣＭシステムの概略図である。
【図１２】本発明の特定の代表的な実施の形態による、代表的なマルチモダリティ顕微鏡スライダの概略図である。
【図１３】本発明の第３の代表的な実施の形態による、波長同調光源を用いた代表的な混合ＳＥＣＭ／ＯＦＤＩ／ＯＣＭシステムの概略図である。
【図１４】本発明の第３の代表的な実施の形態による、波長同調光源を用いた代表的な混合ＳＥＣＭ／ＯＦＤＩ／ＦＦＯＣＭシステムの概略図である。
【図１５ａ】代表的な実施の形態の生体ＴＤＯＣＴ及びＯＦＤＩ手法を用いた、アフリカツメガエルの心臓（ステージ４９）の代表的な画像の一つである。
【図１５ｂ】代表的な実施の形態の生体ＴＤＯＣＴ及びＯＦＤＩ手法を用いた、アフリカツメガエルの心臓（ステージ４９）の代表的な画像の一つである。
【図１５ｃ】代表的な実施の形態の生体ＴＤＯＣＴ及びＯＦＤＩ手法を用いた、アフリカツメガエルの心臓（ステージ４９）の代表的な画像の一つである。
【図１５ｄ】代表的な実施の形態の生体ＴＤＯＣＴ及びＯＦＤＩ手法を用いた、アフリカツメガエルの心臓（ステージ４９）の代表的な画像の一つである。
【図１５ｅ】代表的な実施の形態の生体ＴＤＯＣＴ及びＯＦＤＩ手法を用いた、アフリカツメガエルの心臓（ステージ４９）の代表的な画像の一つである。
【図１５ｆ】代表的な実施の形態の生体ＴＤＯＣＴ及びＯＦＤＩ手法を用いた、アフリカツメガエルの心臓（ステージ４９）の代表的な画像の一つである。
【図１５ｇ】代表的な実施の形態の生体ＴＤＯＣＴ及びＯＦＤＩ手法を用いた、アフリカツメガエルの心臓（ステージ４９）の代表的な画像の一つである。
【図１５ｈ】代表的な実施の形態の生体ＴＤＯＣＴ及びＯＦＤＩ手法を用いた、アフリカツメガエルの心臓（ステージ４９）の代表的な画像の一つである。
【図１５ｉ】代表的な実施の形態の生体ＴＤＯＣＴ及びＯＦＤＩ手法を用いた、アフリカツメガエルの心臓（ステージ４９）の代表的な画像の一つである。
【図１５ｊ】代表的な実施の形態の生体ＴＤＯＣＴ及びＯＦＤＩ手法を用いた、アフリカツメガエルの心臓（ステージ４９）の代表的な画像の一つである。
【図１５ｋ】代表的な実施の形態の生体ＴＤＯＣＴ及びＯＦＤＩ手法を用いた、アフリカツメガエルの心臓（ステージ４９）の代表的な画像の一つである。
【図１５ｌ】代表的な実施の形態の生体ＴＤＯＣＴ及びＯＦＤＩ手法を用いた、アフリカツメガエルの心臓（ステージ４９）の代表的な画像の一つである。
【図１５ｍ】代表的な実施の形態の生体ＴＤＯＣＴ及びＯＦＤＩ手法を用いた、アフリカツメガエルの心臓（ステージ４９）の代表的な画像の一つである。
【図１６ａ】代表的な実施の形態のＦＦＯＣＭ手法を用いた、ツメガエルの心臓の代表的な三次元画像の一つである。
【図１６ｂ】代表的な実施の形態のＦＦＯＣＭ手法を用いた、ツメガエルの心臓の代表的な三次元画像の一つである。
【図１６ｃ】代表的な実施の形態のＦＦＯＣＭ手法を用いた、ツメガエルの心臓の代表的な三次元画像の一つである。
【図１６ｄ】代表的な実施の形態のＦＦＯＣＭ手法を用いた、ツメガエルの心臓の代表的な三次元画像の一つである。
【図１６ｅ】代表的な実施の形態のＦＦＯＣＭ手法を用いた、ツメガエルの心臓の代表的な三次元画像の一つである。
【図１６ｆ】代表的な実施の形態のＦＦＯＣＭ手法を用いた、ツメガエルの心臓の代表的な三次元画像の一つである。
【図１６ｇ】代表的な実施の形態のＦＦＯＣＭ手法を用いた、ツメガエルの心臓の代表的な三次元画像の一つである。
【図１６ｈ】代表的な実施の形態のＦＦＯＣＭ手法を用いた、ツメガエルの心臓の代表的な三次元画像の一つである。
【図１６ｉ】代表的な実施の形態のＦＦＯＣＭ手法を用いた、ツメガエルの心臓の代表的な三次元画像の一つである。
【図１６ｊ】代表的な実施の形態のＦＦＯＣＭ手法を用いた、ツメガエルの心臓の代表的な三次元画像の一つである。
【図１６ｋ】代表的な実施の形態のＦＦＯＣＭ手法を用いた、ツメガエルの心臓の代表的な三次元画像の一つである。
【図１６ｌ】代表的な実施の形態のＦＦＯＣＭ手法を用いた、ツメガエルの心臓の代表的な三次元画像の一つである。
【図１６ｍ】代表的な実施の形態のＦＦＯＣＭ手法を用いた、ツメガエルの心臓の代表的な三次元画像の一つである。
【図１７ａ】代表的な実施の形態のＳＥＣＭ手法を用いた、生体内で取得した代表的な高分解能共焦点画像の一つである。
【図１７ｂ】代表的な実施の形態のＳＥＣＭ手法を用いた、生体内で取得した代表的な高分解能共焦点画像の一つである。
【図１７ｃ】代表的な実施の形態のＳＥＣＭ手法を用いた、生体内で取得した代表的な高分解能共焦点画像の一つである。
【図１７ｄ】代表的な実施の形態のＳＥＣＭ手法を用いた、生体内で取得した代表的な高分解能共焦点画像の一つである。
【図１７ｅ】代表的な実施の形態のＳＥＣＭ手法を用いた、生体内で取得した代表的な高分解能共焦点画像の一つである。
【図１７ｆ】代表的な実施の形態のＳＥＣＭ手法を用いた、生体内で取得した代表的な高分解能共焦点画像の一つである。
【図１７ｇ】代表的な実施の形態のＳＥＣＭ手法を用いた、生体内で取得した代表的な高分解能共焦点画像の一つである。
【図１７ｈ】代表的な実施の形態のＳＥＣＭ手法を用いた、生体内で取得した代表的な高分解能共焦点画像の一つである。
【図１８ａ】本発明の代表的な実施の形態の方法及び装置を用いて取得したツメガエルの心臓の動脈瘤壁拡張の代表的な画像の一つである。
【図１８ｂ】本発明の代表的な実施の形態の方法及び装置を用いて取得したツメガエルの心臓の動脈瘤壁拡張の代表的な画像の一つである。
【図１８ｃ】本発明の代表的な実施の形態の方法及び装置を用いて取得したツメガエルの心臓の動脈瘤壁拡張の代表的な画像の一つである。
【図１８ｄ】本発明の代表的な実施の形態の方法及び装置を用いて取得したツメガエルの心臓の動脈瘤壁拡張の代表的な画像の一つである。
【図１８ｅ】本発明の代表的な実施の形態の方法及び装置を用いて取得したツメガエルの心臓の動脈瘤壁拡張の代表的な画像の一つである。
【図１９】本発明の代表的な実施の形態の方法及び装置を用いたエタノール暴露による異常心臓の形成の代表的な画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
代表的なＳＥＣＭ技術は、細胞下レベルの分解能で組織または生物検体の画像を提供しうるものである。或いは、ＳＥＣＭ画像は、サンプルからの蛍光発光或いは反射率の何れかを表すことができる。図１に広帯域幅光源を用いた代表的なＳＥＣＭ装置の概略図を示す。この代表的な構成図において、準単色光または広帯域幅光１００でサーキュレータ１１１０を照射するか、またはビームスプリッタを照射してよい。一実施の形態では、このサーキュレータ或いはビームスプリッタに光ファイバ結合が用いられている。光ファイバのコアは共焦点顕微鏡システム用のピンホールとしての役割を果たすことができる。或いは、ファイバは、例えば、サンプルを励起する光は単一モード、収集する光は多重モードとなるように光を伝送するための多重クラッディングを有してもよい。この素子からの光は、サンプルを１回以上の横断的に走査をするように、ビーム角度を走査するための走査機構１１５に投射される。走査機構は共振スキャナ、ガルバノメータスキャナ、ポリゴン走査鏡、音響光スキャナ（ａｃｏｕｓｔｏ−ｏｐｔｉｃ  ｓｃａｎｎｅｒ）等の何れか一つで構成してもよい。対物レンズ１３０の後焦点面に走査軸を作るために望遠鏡器材を用いてもよい。走査機構からの光は、次いで、透過回折格子、プリズム、回折プリズム、双対回折プリズム（ｄｕａｌ  ｐｒｉｓｍ  ｇｒａｔｉｎｇ：ＤＰ−  ＧＲＩＳＭ）等で構成された波長分散素子１２０へ投射することができる。この代表的な素子は、広帯域幅光源を様々な波長に分散し、対物レンズ１３０に波長に応じて様々な角度で入射するようにしている。
【００２１】
一代表的な実施の形態では、レンズは微小な焦点を結ぶことができる開口数を有することができる。或いは、レンズはＮＡ＞０．２となる高い開口数を有する。対物レンズ１３０は、各波長領域毎にサンプルに焦点を結ぶ。サンプル１６０の各波長領域は、空間的に異なる位置であってもよい。回折格子及び対物レンズについて、これらの代表的な素子は、サンプル上に波長符号化ライン１４０（ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｌｉｎｅ）を形成することができる。このラインの各位置は、波長領域に従って符号化されている。サンプル１６０からの光は図１に示す代表的なシステムを通して反射される。焦点外れの光は光ファイバのクラッディングにより除去され、他方、焦点が合った（つまり共焦点の）光はサーキュレータ／ビームスプリッタ１１０を通して送り返され、帰還光１４５のスペクトル成分を測定する分光計に戻る。このスペクトルを測定することにより、共焦点光は空間位置の関数として画像上に一列に復号される。一連のラインは走査機構１１５の角度位置毎に形成され、スペクトル符号化共焦点顕微鏡検査画像を生成する。
【００２２】
図２は、代表的なスペクトル領域ＯＣＴシステムの概略図である。代表的なＳＥＣＭシステムと異なり、代表的なＳＤ−ＯＣＴは、フーリエ領域のコヒーレンス回折を用いて生物検体の断面画像を提供することができる。一般的に、ＳＤ−ＯＣＴ画像は分解能が低く（〜３〜１０μｍ）、他方視野は広い（数ｍｍ）。この代表的なＳＤ−ＯＣＴシステムでは、広帯域幅即ち準単色光源２００を干渉計に投射することができる。干渉計は光ファイバで構成することができる。ファイバに連結された光は、サーキュレータ２１０及びビームスプリッタ２２０へ送られる。サーキュレータ２１０に接続された光は、好ましくは、ビームスプリッタ２２０によって、その一部が基準アーム２２５に送られまた一部がサンプルアーム２３５へ送られるようで分配することができる。基準アーム２２５から送られた光はミラー２３０（基準ミラー）によってビームスプリッタ２２０へ反射することができる。或いは、即ちビームスプリッタ２２０へ返送することができる。一代表的な実施の形態として、スプリッタ２２０は光の大部分をサンプルアーム２３５へ送るように構成することができる。次いで、サンプルアームのファイバからの光はレンズ及び走査機構２４０へ導かれる。走査機構はサンプルアーム２３５の光を任意の一次元又は二次元のパターンとして走査することができる。光は走査機構からレンズ２５０へ送られる。レンズ２５０は、一代表的な実施の形態では、共焦点パラメータが生物検体或いはサンプル２６０の断面画像を生成するために十分に大きくなる、開口数ＮＡを有することができる。
【００２３】
サンプルからの光は、一連の光学器材を通してサーキュレータ／ビームスプリッタ２１０へ返送され、また分光計２８０へ導かれる。反射率は、組織内の深度（Ａ−ライン）の関数として、中央演算処理装置或いはコンピュータ２９０により、バックグラウンド除去、λ―スペースからｋ−スペースへの再マッピング、およびスペクトル干渉信号の逆フーリエ変換の処理を行って、再度構築される。一連のＡ−ラインは、走査機構の位置毎に連続して取得され、その結果サンプルの断面画像が再構築される。当技術分野で周知の代替の代表的な実施の形態には、スペクトル干渉の短時間フーリエ変換（ＳＴＦＴ）によるサンプルからのスペクトル情報の取得機能、ドップラー検出型ＳＤ−ＯＣＴ機能、及び偏光検出型ＳＤ−ＯＣＴ機能が含まれ、これらもまた吸収率、流れ（ｆｌｏｗ）、複屈折等生物検体から他の情報を抽出するために利用してよい。
【００２４】
図３は代表的な光コヒーレンス顕微鏡検査法（ＯＣＭ）システムの概略図である。代表的なＯＣＭシステムは、共焦点顕微鏡検査法並びにＯＣＴ技術を組み合わせて用いることが効果的である。これは、代表的なこれら両技術の軸上点拡がり関数が大幅に増強され、より広範囲の光学切片化がなされうるからである。一代表的な実施の形態のＯＣＭシステムでは、広帯域幅光源からの光を変調素子３１０へ入力して、変調周波数が干渉計のスペクトル干渉周波数を近似するようにすることができる。この代表的な変調素子はマイケルソン干渉計、パルス整形器、スペクトルフィルタなどの何れか一つであってもよい。スペクトルの干渉成分のみを抽出するために連続スペクトルを除去するよう、変調により時間に従ってスペクトル位相をある値シフトさせてもよい。変調素子に従って、光はサーキュレータ／ビームスプリッタ３２０、次いで、サーキュレータを使用する場合には、ビームスプリッタ３３０へ送られる。光は再度基準アーム３３５およびサンプルアーム３４５へ送ることができる。基準アーム３３５からの光はミラー３４０で反射される。サンプルアーム３４５からの光は、共振スキャナ、ガルバノメータスキャナ、ポリゴン走査鏡、音響光スキャナなどの何れか一つ或いはこれらの組み合わせで構成することができる、ｘ−ｙスキャナ３５０へ送られる。
【００２５】
スキャナ３５０からの光は対物レンズ３５５へ導かれ、サンプル内でしっかりと焦点が合ったスポットを走査することができる。或いは、対物レンズ又はサンプル３６０を３つの次元の何れかで走査して、当該サンプル内の異なる部位から容易にデータ収集できるようにしてもよい。光はサンプル３６０からサーキュレータ／ビームスプリッタ３２０、続いて検出器へ戻され、続けて検出器装置に送られる。一実施の形態では、検出器は分光計で構成され、ＯＣＭデータは代表的なＳＤ−ＯＣＴと同様の方法でサンプルからＡ−ラインを取り出すことにより取得される。スペクトル変調の実施の形態では、検出器は光ダイオード又は光源変調素子３１０に同期したその他の単一の検出器で構成することができる。代表的なロックイン技術或いは減算技術が用いてＯＣＭ信号を抽出することもできる。
【００２６】
全域光可干渉顕微鏡検査法は通常、広帯域幅光源を用いて生物検体の光学的断面を横断的に高分解能で得る、自由空間干渉計技術である。図４Ａは代表的なＦＦＯＣＭシステムの概略図である。広帯域幅光４００はビームスプリッタ４１０へ放射され、サンプルアーム４２３と基準アーム４２２へ分割される。一代表的な実施の形態では、基準アーム４２２の光は４１５によって基準用対物レンズ４２０および軸方向に移動可能なミラー４２５へ向けて導かれる。サンプルアーム４２３内の光はサンプル用対物レンズ４３０並びにサンプル４４０へ導かれる。一代表的な実施の形態では、基準用対物レンズ４２０とサンプル用対物レンズ４３０は類似した特性を有する。
【００２７】
他の代表的な実施の形態では、基準用対物レンズ４２０とサンプル用対物レンズ４３０は、サンプルと類似の屈折率を有する浸漬液を用いて最適化される。サンプルは三次元に移動可能なステージ４４３に連結することができる。基準アーム４２２及びサンプルアーム４２３からの光はレンズ４４５によりＣＣＤカメラ４５０に結像する。基準アーム４２２とサンプルアーム４２３との干渉により生じた干渉縞はＣＣＤカメラ４５０で検出される。通常、基準アームのミラー４２５の位置を変えることによって複数の画像を検出することができる。代表的な画像を数学的に組み合わせて処理して、サンプル内の光学的断面から情報を抽出してもよい。
【００２８】
図４Ｂに示す、他の代表的な実施の形態のＦＦＯＣＭシステムでは、広帯域幅の光源４５１はマイケルソン干渉計又はその他の干渉計（例えば、マッハーゼンダー：Ｍａｃｈ−Ｚｈｅｎｄｅｒ、サグナック：Ｓａｇｎａｃ型）、又はスペクトル変換ユニットなどの変調素子に接続することができる。マイケルソン干渉計の場合、光源４５１からの光はビームスプリッタ４５２へ送られる。光は次いで代表的アームＡ４５３及びアームＢ４５５用に２分割される。アームＡ４５３からの光はミラー送られ、背面反射されてビームスプリッタへ戻される。アームＢ４５５からの光は、同様にミラー４５６へ送られ、背面反射されてビームスプリッタ４５２へ戻される。アームＡの光路長ＬａとアームＢの光路長Ｌｂとの差、｜Ｌａ−Ｌｂ｜は、第２の干渉渉計の基準アームとサンプルアームとの光路差とほぼ等しくなるように設定することができる。少なくともアームＡ又はアームＢの一方を、光路長を変更する、或いは光の位相をシフトするように構成してもよい。一体表的な実施の形態では、光路長を、ミラー又は高速走査光学遅延ラインの何れかを移動することによって変更するようにしてもよい。この移動は、圧電変換器、検流計、リニアモータなどにより駆動してもよい。或いは、光路長の変更を、音響光学変調器または電気光学変調器の何れかにより行ってもよい。
【００２９】
基準アーム光とサンプルアーム光の両方は、ビームスプリッタで結合処理され、ビームスプリッタ４５９を有する他の固定干渉計に送られて、それぞれ基準アーム４５８とサンプルアーム４５７と分割される。二つのアーム４５７及び４５８からの光は、ほぼ同様の、対物レンズ４６０と４７０とにそれぞれ入射する。基準アーム４５８では、基準用対物レンズ４６０は、通常は固定された反射体４６５上に焦点を結ぶようにすることができ、一方サンプルアームでは、サンプル対物レンズ４７０によりサンプルアーム光がサンプル４８０上或いはその内部に焦点を結ぶ。サンプル４８０又はサンプル対物レンズ４７０を載物台４８１に搭載して、載物台４８１を手動又はコンピュータ制御により三次元のいずれの方向へも動かせるようにしてもよい。
【００３０】
基準アーム４５８とサンプルアーム４５７の光路長差は第一の干渉計の｜Ｌａ−Ｌｂ｜とほぼ等しく設定してもよい。基準アーム４５８とサンプルアーム４５７からの光はそれぞれ、ビームスプリッタ４５９で混合され、次いでレンズ４８５を通してＣＣＤアレイ４９０または検出器アレイ上に結像できる。ＦＦＯＣＭ画像即ちデータは、ミラー４５６を移動させながら或いは異なる位置に配置して、ＣＣＤ４９０により取得した画像を線形結合して生成することができる。ＦＦＯＣＭ画像の処理、表示及び保存はＣＰＵ４９５が実行する。加算処理又は平均処理を利用して信号対雑音比を改善する。
【００３１】
図５に、広帯域幅光源を用いた代表的な蛍光検出用のＳＥＣＭシステムを示す。例えば、光源５００からの光はビームスプリッタ５１０へ送られ、二つの経路５１５及び５２０に分割される。二つのアーム／経路はミラー５２０及び５２５を終端に有し、少なくとも一つのアームは、経路長又は位相が時間とともに変化するようになっている。二つのアーム５３０から戻された光はビームスプリッタ５１０に結合され、５３５により格子或いは分散素子５４０、及び対物レンズ５５０を含むＳＥＣＭプローブへ送られる。既に説明したように、格子および対物レンズ５５０からなる装置は、検体５６２上又はその内部にスペクトル符号化ライン５６０の焦点を結ぶ。検体５６２は三次元の載物台に配置してもよい。サンプル内部の蛍光は照明光によって励起して発光し、対物レンズ５５０を通過して戻され、他のレンズ５６５によって検出器５７０上に結像する。検出光はデジタル化され、処理装置（例えばＣＰＵ）５８０により画像内のラインに変換される。ビーム走査機構５３７は様々な位置で、画像内に別のラインを発生させてもよい。可動ミラーの非線形性は、同じ可動ミラー５２０を照射する狭帯域幅光源を有する代表的な干渉計５２１によって修正できる。
【００３２】
図６は、波長同調光源６００を用いた代表的な実施の形態のＳＥＣＭシステムの概略図である。例えば、光源６００をサーキュレータ／ビームスプリッタ６１０に結合することができる。代表的な一実施の形態では、スプリッタ６１０からの光は光ファイバを経由してスキャナへ送られる。このスキャナは、対物レンズ６２５の後焦点面に走査軸を投影する望遠鏡レンズ画像生成システムを備えてもよい。走査機構からの光は、（回折格子、プリズム、ＧＲＩＳＭ、又はＤＰ−ＧＲＩＳＭ等の）分散素子６２０へ送られる。６２０からの光は、サンプル６３５の内部にビームの焦点を結ばせる対物レンズ６２５へ送られる。このレンズは大きな開口数を有することが好適である。どの時点においても、波長掃引光源６００から放射されるそれぞれの波長の光により、サンプルの明確に異なる部分が照射される。掃引光源６００の波長が時間に従って変化する毎に、ビームはサンプル６３５内部をライン６３０に沿って走査することができる。サンプル６３５から送られた光は、それぞれ素子６２５、６２０、および６１５を通って、光ファイバまたはピンホールにより空間的にフィルタされてサーキュレータビームスプリッタ６１０へ戻ることができる。スプリッタ６１０からの光は、検出器６４０へ送られて処理装置（例えば、ＣＰＵ）６５０によりデジタル化され、表示されるとともにデジタルで記憶される。波長同調光源を一回完全に掃引することにより画像内の一つのラインが得られる。走査機構の様々な位置で複数のラインが取得されて画像が構築される。波長同調型光源６００により励起されてサンプルから送出された蛍光は、或いは、検出器６６０によって検出して蛍光画像を構築することもできる。
【００３３】
図７は代表的なＯＦＤＩシステムの概略図である。一実施の形態のこの代表的なＯＦＤＩシステムにおいて、波長同調型光源は光ファイバを用いたサーキュレータ７０５及びビームスプリッタ７１０に接続してもよい。サーキュレータ７０５からの光は、好適な実施の形態では、大半の光をサンプルアーム７２５へ送るように構成されたビームスプリッタ７１０に送出される。こうして分割されて基準アーム７１５へ送られた光は、終端の反射鏡７２０に至り、次いでビームスプリッタ７１０及びサーキュレータ７０５へ送り返される。サンプルアーム７２５の光は、走査機構７３０及び生物検体の断面画像を生成することができる十分小さな開口数の結像レンズへ送られる。基準ミラー７２０とサンプル７４０とから反射された光は、サーキュレータ７０５で再結合され、光ファイバ７５０によって検出器７５５へ導かれる。代表的な実施の形態では、検出器７５５は、二重平衡検出器を含むことができる。
【００３４】
検出器７５５により光はデジタル化され、デジタル信号としてＣＰＵ７６０へ伝達される。スペクトル干渉は代表的なＳＤ−ＯＣＴシステム／方法を用いた場合の処理方法と同様に処理される。即ち、背景を除去し、λ空間をｋ空間に変換し、かつ逆フーリエ変換を実行してＡ−ラインを生成する。Ａ−ラインを走査機構の位置の関数として取得し、ＯＦＤＩ断面画像が生成することができる。或いは、スペクトル干渉の短時間フーリエ変換（ＳＴＦＦ）、複素スペクトル領域処理、ドップラー検出型ＯＦＤＩおよび偏光検出ＯＦＤＩによってサンプルからスペクトル情報を取得する機能を含む当技術分野で周知の代表的な実施の形態を利用して、生物検体から更に吸収率、フロー、複屈折などの情報を抽出してもよい。
【００３５】
図８は、波長同調／変調光源を利用した代表的な実施の形態のＯＣＭシステムの概略図である。例えば、波長変調装置８０５は、サンプルアームと基準アームとの干渉により生じたスペクトル干渉による変調に対応して、時間の経過に従って変更しうる、スペクトルの正弦波変調など、光源のスペクトルパターンを生成してもよい。光源８００及び／又は変調装置８０５からの光は、光ファイバサーキュレータ／ビームスプリッタ８１０に結合して、次いでビームスプリッタ８１５へ送ることができる。このビームスプリッタは光の大部分をサンプルアーム８３０へ送ることが好ましい。
【００３６】
基準アーム８２０の光は、基準反射体８２５又は伝送用素子（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）に導かれる。サンプルアーム８３０の光は、一以上の検流計、共振スキャナ、多面鏡スキャナ、音響光スキャナ、電気光学スキャナなどを含むＸ−Ｙスキャナへ送ることができる。スキャナからの光は、或いは、望遠鏡８３７及び、好ましくは開口数の大きい対物レンズ８４０へ送ることができる。対物レンズ８４０は、三次元載物台８４７に固定したサンプル８４５内に光を集める。光はサンプルから、素子８４０、８３７および８３５を経由して送り返され、次いで、好ましくは、光ファイバのコア或いはサンプルアーム８３１のピンホールと結合して、焦点外れの光を除去する。光は、サーキュレータ８１０に導かれ、次いで検出器８５５に送られてデジタル化され、ＣＰＵ８６０へ送出される。
【００３７】
一代表的な実施の形態では、ＯＣＭデータは、代表的なＯＦＤＩシステム及び方法を用いた場合と同様の方法を用いて、サンプルからＡ−ラインを取得して得ることができる。例えば、代表的なスペクトル変調システム及び方法では、検出器は光源変調素子８０５と同期することができる。この場合、ＯＣＭ信号を抽出するために、ロックインまたは減算技術を用いることができる。代表的な画像は、Ｘ−Ｙ走査機構８３５の位置毎にデータを取得して生成することができる。サンプルからの蛍光は、二色性ミラー又はフィルタ８５３及び第二検出器８６５を用いて更に検出することができる。
【００３８】
図９に、波長同調／変調光源９００を用いた代表的な実施の形態のＦＦＯＣＭシステムを示す。光源は、その帯域幅にわたって同調するか、或いは干渉計のスペクトル干渉変調により生じた周波数とほぼ等しいスペクトル変調周波数を有するように変調してもよい。光源９００からの光は、ビームスプリッタ９０５に結合され、次いでそれぞれサンプルアーム９１０及び基準アーム９１５へ送られる。これらのアームはそれぞれ終端に対物レンズ９２０及び９３０を有している。基準アームの対物レンズ９２０は基準アームの光を反射器に集束させる。この光は続いてビームスプリッタ９０５へ戻る。サンプルアーム光は、９３０により検体９３５の上或いは内部に集束される。サンプルから発せられた光は９０５で基準アーム光と混合され、次いでレンズ９４０によりＣＣＤアレイ９５０上に結像する。画像は、波長掃引光源の波長毎に、又は様々な光源変調パターン毎に取得され、ＣＰＵ９６０により数学的に組み合わされ、代表的なＦＦＯＣＭ光学断面を再構築する。
【００３９】
本発明の代表的な実施の形態によると、上記の代表的なシステム及び代替の代表的な実施の形態を組み合わせて、マルチモダリティ画像生成システム（ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌｉｔｙ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）を構成することができる。このシステム及び／又は装置の代表的な組み合わせは、別々のシステムを生成し、それらの光学部品を構成して、生体検体の同一の部分から画像を取得できるようにする。このようなモダリティを組み合わせたシステムによって、異なる波長、走査及び検出機構に対応することができる。或いは、機器が異なっても多くの共通部品を使用して実施することができるので、効率が高く、費用対効果の優れた装置を提供することができる。
【００４０】
図１０は、広帯域幅光源１０００と分光計１０８０を用いて、同時で、かつ重ね合わされた（ｃｏ−ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ）ＳＤ−ＯＣＴ，ＯＣＭ，ＳＥＣＭ，及び蛍光ＳＥＣＭデータ及び／又は画像を提供する本発明の代表的な実施の形態のマルチモダリティシステムの概略図である。例えば、広帯域幅光源１０００からの光はスペクトル変調ユニット１００５へ結合することができる。スペクトル変調ユニット１００５からの光はサーキュレータ１０１０及びビームスプリッタ１０１５に結合される。サーキュレータを使用する場合、ビームスプリッタ１０１５へ送られる。ビームスプリッタ１０１５はサーキュレータ１０１０からの光の大部分をサンプルへ送ることが好ましい。基準アーム１０２０の光は基準反射体１０２５へ送られる。基準反射体１０２５は、可動であってもよく、或いは、１０２０の光路長を変化可能で、及び／又は非可動であってもよい。基準アームが可動である場合、通常の時間領域ＯＣＴ（例えば、ＴＤ−ＯＣＴ）装置及び／又は手法を実施してもよく、或いは代表的なＳＤ−ＯＣＴ装置及び／又は当技術分野で周知の処理を用いて複素スペクトル領域を取得してもよい。
【００４１】
サンプルアーム１０３０の光は、フィルタ／二色性（ｄｉｃｈｒｏｉｃ）／ＷＤＭ器材１０３５へ送られ、サンプルアーム光はビームスプリッタからサンプル方向へ導かれる。１０３５からの光は、高速または低速でビームを二つの方向に走査することができるビーム走査機構１０４０へ送られる。ビーム走査機構１０４０は、レンズ１０５５の後焦点面上にスキャナ出力を結像させる望遠鏡を備えてもよい。走査機構１０４０からの光は、複数の光学素子を含むスライダ１０４５へ送ることができる。例えば、スライダ１０４５を、明確に異なる位置に設定することにより、ＳＤ−ＯＣＴ，ＯＣＭ，ＳＥＣＭ及び／又は蛍光ＯＣＭ装置／方法の１つ以上、又はそれらの組み合わせを実施できる。スライダ１０４５からの光は、レンズターレットに搭載された対物レンズ１０５５に送ることができる。一実施の形態では、レンズターレットの対物レンズは交換可能である。スライダ１０４５及び／又はターレット１０５０は、画像生成モダリティを自動選択するようにコンピュータ制御されてもよい。光は、対物レンズ１０５５により、コンピュータ制御の三次元並進搭載台１０６５に搭載されたサンプル１０６０の上または内部に集束される。反射光は、光学器材を通してサーキュレータ１０１０まで戻り、再び分光計に導かれる。検出された反射光は、本明細書に記載の装置及び／又は方法を用いて処理されて代表的なＳＤ−ＯＣＴ、ＯＣＭ、ＳＥＣＭ画像が生成される。
【００４２】
図１０に示すように、蛍光は、フィルタ／二色性ミラー／ＷＤＭ装置１０３５を経由して第二検出器１０７５へ送られる。１０７５からの蛍光を用いて生物サンプル１０６０の蛍光共焦点画像が再構築される。不可視の近赤外線光を用いる場合、可視の照準光を代表的なシステムに組み込むことにより、近赤外線と同期して画像生成の位置を可視化することができる。これに加えて、或いは、顕微鏡上の別の画像生成用ポートを用いることにより検査中の検体の白色光画像を生成することができる。或いは、スペクトル干渉の短時間フーリエ変換（ＳＴＦＴ）、ドップラー検出型ＳＤ−ＯＣＴ及び偏光検出型ＳＤ−ＯＣＴによってサンプルからスペクトル情報を取得する機能を含む、当技術分野で周知の代表的な実施の形態を用いて、吸収率、フロー、複屈折などその他の情報を生物検体から取得してもよい。
【００４３】
他の三つのモダリティとは異なる波長を用いてＳＤ−ＯＣＴ，ＯＣＭ，ＳＥＣＭ，ＦＦＯＣＭ画像及びデータを生成するように構成された、本発明による代表的な実施の形態のマルチモダリティを図１１に示す。この代表的な実施の形態では、広帯域幅光源１１００はスペクトル変調ユニット１１０５に結合されている。スペクトル変調ユニット１１０５からの光はサーキュレータ１１１０及びビームスプリッタ１１１５に結合される。サーキュレータ１１１０を使用する場合、サーキュレータ１１１０からの光を、ビームスプリッタ１１１５に送ることができる。ビームスプリッタ１１１５は、受光した光の大部分をサンプルに送ることが好ましい。基準アーム１１２０の光は、基準反射体１１２５へ送られる。基準反射体１１２５は、固定されている、及び／又は、基準アーム１１２０の光路長を変化させることができる。基準アーム１１２０が可動である場合、当技術分野で周知の方法によって、既存の代表的な時間領域ＯＣＴ（ＴＤ−ＯＣＴ）方法または複素スペクトル領域方法をＳＤ−ＯＣＴに利用してもよい。サンプルアーム１１３０の光は、ビームを二つ方向に高速又は低速で走査することが出来るビーム走査機構１１３５へ送られる。ビーム走査機構１１３５は、レンズ１１６０の後焦点面にスキャナを結像させる望遠鏡を具備してもよい。この走査機構１１３５からの光は二色スプリッタ／ＷＤＭ１１４０に送られる。二色スプリッタ／ＷＤＭ１１４０は、ＳＤ−ＯＣＴ，ＯＣＭ、及びＥＣＭのモダリティ用の励起光を透過する一方で、ＦＦＯＣＭ光を反射することができる。
【００４４】
例えば、図３と類似の代表的なＦＦＯＣＭシステムは、１１４０を介してビーム経路に結合できる。１１４０からの光は、複数の光学素子を有するスライダ１１５０へ導かれる。スライダの異なる位置に応じて、ＳＤ−ＯＣＴ，ＯＣＭ，ＳＥＣＭ又はＦＦＯＣＭの何れか一つ或いはそれらの組み合わせが得られる。スライダ１１５０からの光はレンズターレット１１５５に搭載された対物レンズ１１６０へ送られる。一実施の形態では、レンズターレット１１５５の対物レンズは交換可能である。画像生成のモダリティを自動選択するようにスライダ１１５０及び／又はターレット１１５５はコンピュータで制御してもよい。光は、対物レンズ１１６０によってサンプル上又はサンプル内に収束する。サンプルは、コンピュータ制御の三次元並進載物台１１７０に載置してもよい。反射光は、光学器材を通過してサーキュレータ１１１０へ戻る。サーキュレータ１１１０は光を分光計へ再び導く。検出された反射光は、処理されて本明細書に記載の方法により代表的なＳＤ−ＯＣＴ，ＯＣＭ、ＳＥＣＭ画像を形成する。ＦＦＯＣＭ光は、フィルタ／二色性ミラー／ＷＤＭ器材１１４０を経由して、ＦＦＯＣＭシステム１１７５へ再び導かれてもよい。
【００４５】
不可視の近赤外光を利用する場合、可視の照準光を図１１に示す代表的なシステムに可視照準ビームを結合し、近赤外光と同期させて、画像生成位置の可視化を行うようにしてもよい。これに加えて、或いは、顕微鏡上の代替の画像生成用ポートを用いることによって検査する検体の白色光画像を生成するようにしてもよい。スペクトル干渉の短時間フーリエ変換（ＳＴＦＴ）、ドップラー検出型ＳＤ−ＯＣＴ及び偏光検出型ＳＤ−ＯＣＴを用いてサンプルからスペクトル情報を取得する機能を含む当技術分野で周知の代表的な実施の形態を用いて、吸収率、フロー、複屈折などその他の情報を生物検体から抽出してもよい。
【００４６】
図１２に、本発明のマルチモダリティ画像生成に利用してもよい代表的な実施の形態のスライダ装置を示す。例えば、光学素子は、手動、コンピュータ、又は自動制御により並進可能なハウジング１２００内部に収容することができる。各スライダは異なるスライダ位置１２０５、１２１０、１２３０及び１２６０で終端することができ、これにより一以上の画像生成用のモダリティが得られる。スライダ位置１２０５、１２１０、１２３０、１２６０は対物レンズターレットに結合してもよい。一代表的な実施の形態では、スライダ位置１２０５には光学素子がない（空）、又は光学素子窓を含まない。この代表的な構成では、顕微鏡がＦＦＯＣＭを実行するように構成される。スライダ位置１２１０では、レンズ器材１２１２及び１２１３は、ビームを拡大させて透過型回折格子１２２０を囲む２つのプリズム１２１５と１２２５を含むＤＰ−ＧＲＩＳＭを照射するように構成できる。この代表的な構成により、ＳＥＣＭ画像生成を行うことが可能となる。代表的なＯＣＭ手法は、この位置で、サンプルを横断してスペクトル符号化ラインを走査する走査機構を行うことができる。スライダ位置１２３０では、ビームを拡大する場合、拡大しない場合ともに、レンズ器材１２４０、１２５０はビーム角度の画像を生成するように構成できる。このスライダ位置１２３０では、代表的なＳＤＯＣＴ手法を用いた画像生成を行うことができる。スライダ位置１２６０では、レンズ器材１２７０，１２８０は、走査されたビームを拡大して、代表的なＯＣＭ手法を用いて画像生成を行えるように構成される。
【００４７】
ある実施の形態のマルチモダリティ画像生成システムでは広帯域幅光源を用いているが、代表的な実施の形態の結合システムもまた、波長同調／変調光源及び単一或いは複数の検出器を使用した構成を含むことができる。この代表的な実施の形態を図１３に示す。例えば、図１３において、波長同調／変調光源１３００は、サーキュレータ１３０５及びビームスプリッタ１３１０に結合される。サーキュレータを用いる場合、サーキュレータ１３０５からの光は、好ましくは、大部分の光をサンプルへ送るビームスプリッタ１３１０に送られる。基準アーム１３１５の光は基準反射体１３２０へ送られる。基準反射体１３２０は、固定されていてもよく、或いは基準アーム１３１５の光路長を変化させることができてもよい。基準アームが可動の場合、当該技術分野で周知の方法によって、従来の代表的な時間領域ＯＣＴ（ＴＤ−ＯＣＴ）手法を実施して、又は複素スペクトル領域を利用して、ＯＦＤＩマルチモダリティを実行してもよい。サンプルアーム１３２５の光は、サンプルアーム光をビームスプリッタからサンプルの方向で透過する、フィルタ／二色性（ｄｉｃｈｒｏｉｃ）／ＷＤＭ器材１３３０へ送られる。１３３０からの光は、二つの方向に高速又は低速でビームを走査することができるＸ−Ｙビーム走査機構１３３５に導かれる。
【００４８】
ビーム走査機構１３３５はまた、スキャナをレンズ１３５３の後焦点面上へ結像する望遠鏡をも有してもよい。走査機構１３３５からの光は、複数の光学素子を含むスライダ１３４０へ送られる。スライダの異なる位置に応じて、ＯＦＤＩ、ＯＣＭ、ＳＥＣＭ又は蛍光ＯＣＭモダリティの何れか一つ、又はそれらの組み合わせを得ることができる。スライダ１３４０からの光はレンズターレット１３５０に搭載された対物レンズ１３５３へ送られる。一実施の形態では、レンズターレット１３５０の対物レンズは交換可能である。画像生成のモダリティを自動選択するようにスライダ１３４０及び／又はターレット１３５０は手動又はコンピュータで制御してもよい。光は、対物レンズ１３５３によってサンプル１３５５上又はサンプル１３５５内に収束する。サンプルは、コンピュータ制御の三次元並進載物台１３６０に載置してもよい。反射光は、光学器材を通過してサーキュレータ１３０５へ戻る。サーキュレータ１３０５は光を、ＯＦＤＩ、波長同調ＯＣＭ又はＳＥＣＭ信号、画像及び／又はデータを検出するために好適な検出機器１３８０へ再び導く。検出された反射光は、ＣＰＵ１３８５によって処理されて上述の方法により代表的なＯＦＤＩ、ＯＣＭ、ＳＥＣＭ画像を形成する。
【００４９】
蛍光は、フィルタ／二色性ミラー／ＷＤＭ器材１３３０を介して第二の検出器１３７０へ再び導かれてもよい。１３７０からの蛍光を利用して、生物サンプル１３５５の蛍光共焦点画像を再構築する。不可視の近赤外光を利用する場合、可視の照準光をシステムに結合し、近赤外線光と同期させて、画像生成位置の可視化を行うようにしてもよい。これに加えて、或いは、顕微鏡上の代替の画像生成用ポートを用いることによって検査する検体の白色光画像を生成するようにしてもよい。スペクトル干渉の短時間フーリエ変換（ＳＴＦＴ）、ドップラー検出型ＳＤ−ＯＣＴ及び偏光検出型ＳＤ−ＯＣＴを用いてサンプルからスペクトル情報を取得する機能を含む当技術分野で周知の代表的な実施の形態を用いて、吸収率、フロー、複屈折などその他の情報を生物検体から抽出してもよい。
【００５０】
図１４に、ＦＦＯＣＭ信号が他の３モダリティとは異なる波長で与えられた場合のＯＦＤＩ、ＯＣＭ、ＳＥＣＭ及びＦＦＯＣＭ画像、データ及びその他の情報を提供する、本発明による代表的なマルチモダリティの別の実施の形態のシステム構成を示す。この代表的な実施の形態では、波長同調光源１４００はスペクトル変調ユニット１４０５に結合されている。変調ユニット１４０５からの光は、サーキュレータ１４１０及びビームスプリッタ１４１５に結合される。サーキュレータ１４１０を使用する場合、サーキュレータ１４１０からの光は、ビームスプリッタ１４１５に送られる。ビームスプリッタ１４１５は、受光した光の大部分をサンプルに送る。基準アーム１４２０の光は、基準反射体１４２５へ送られる。基準反射体１４２５は、固定されていてもよく、又は、基準アーム１４２０を移動させる、又は基準アーム１４２０の光路長を変化させることができてもよい。基準アーム１４２０が可動である場合、当技術分野で周知の方法によって、従来の時間領域ＯＣＴ（ＴＤ−ＯＣＴ）方法及びモダリティを設ける、又は複素スペクトル領域を取得してＳＤ−ＯＣＴに利用してもよい。サンプルアーム１４３０の光は、ビームを二つ方向に高速又は低速で走査するビーム走査機構１４３５へ送られる。ビーム走査機構１４３５は、レンズ１４６５の後焦点面にスキャナを結像させる望遠鏡を具備してもよい。この走査機構１４３５からの光は二色スプリッタ／ＷＤＭ１４４５に送られる。二色スプリッタ／ＷＤＭ１４４５は、ＳＤ−ＯＣＴ，ＯＣＭ、及びＥＣＭに励起光を透過する一方で、ＦＦＯＣＭ光を反射する。
【００５１】
図３及び／又は図４のシステムに類似の代表的なＦＦＯＣＭは、二色スプリッタ／ＷＤＭ１４４５によってビーム経路に結合することができる。二色スプリッタ／ＷＤＭ１４４５からの光は、複数の光学素子を含むスライダ１４４５に導かれる。スライダ１４５５の異なる位置に応じて、ＯＦＤＩ，ＯＣＭ，ＳＥＣＭ又はＦＦＯＣＭデータ及び／又は画像の何れか一つ、又はそれらの組み合わせが得られる。スライダ１４５５からの光はレンズターレット１４６０に搭載された対物レンズ１４６５へ送られる。一代表的な実施の形態では、レンズターレット１４６０は対物レンズを交換する機能を有する。画像生成のモダリティを自動選択するようにスライダ１４５５及び／又はターレット１４６０はコンピュータで制御してもよい。光は、対物レンズ１４６５によってサンプル１４７０上又はサンプル１４７０内に収束することができる。サンプルは、コンピュータ制御の三次元並進載物台１４７５に載置してもよい。
【００５２】
反射光は、光学器材を通過してサーキュレータ１４１０へ戻る。サーキュレータ１４１０は光を分光計へ再び導く。検出された反射光は、処理されて本明細書に記載の方法によりＯＦＤＩ、ＯＣＭ、ＳＥＣＭ画像を生成する。ＦＦＯＣＭ光を、フィルタ／二色性ミラー／ＷＤＭ器材１４４５を経由して、ＦＦＯＣＭシステム１４５０へ再び導いてもよい。不可視の近赤外光を利用する場合、可視の照準光を代表的なシステムに結合し、近赤外光と同期させて、画像生成位置の可視化を行うようにしてもよい。これに加えて、或いは、顕微鏡上の代替の画像生成用ポートを用いることによって検査する検体の白色光画像を生成するようにしてもよい。スペクトル干渉の短時間フーリエ変換（ＳＴＦＴ）、ドップラー検出型ＯＦＤＩ及び偏光検出型ＯＦＤＩによってサンプルからスペクトル情報を取得する機能を含む当技術分野で周知の代表的な実施の形態を代替に用いて、吸収率、フロー、複屈折などその他の情報を生物検体から抽出してもよい。
【００５３】
本発明のその他の代表的な実施の形態では、サンプルの両側から画像生成が行えるように顕微鏡を構成することができる。例えば、ＳＤＯＣＴ、ＳＥＣＭ及びＯＣＭ方法をサンプルの上方から実行することができ、サンプルの下方からサンプルを照射する画像生成レンズを用いてＦＦＯＣＭ手法を実行してもよい。このような代表的な構成では、両側から画像生成を行うことができるように、サンプルは顕微鏡のスライドと薄いカバーガラスとの間に載せることができる。
【００５４】
本明細書に記載の代表的なシステムは、諸種の異なる形式、速度、分解能、視野及びコントラストの機構で生物検体のマルチモダリティ画像生成を行うことができる。各画像データセットは、二次元又は三次元であり、他のそれぞれの画像生成モダリティのデータセットと組み合わせて重ね合わされる（ｃｏ−ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ）。データセットは当該技術分野で周知のコンピュータ処理方法を用いて、三次元立体に可視化、四次元に表現する、又は、重要な関心領域をするようにして処理した二次元、三次元および四次元データセットとして表示するなど、様々な画像形式で表示してもよい。一以上のデータセットを他のデータセットに対して表示してもよく、個別のデータセットを組み合わせて包括的データセットを導き出してもよい。定量的な情報を該データセットからこれらの二次元、三次元及び四次元の関係から導き出してもよい。画像データを、従来の生物検体の蛍光画像又は明視野画像と組み合わせても用いてもよい。
（実施例）
【００５５】
以下の実施例は、本発明の代表的な画像生成モダリティを複数用いて検査をして、アフリカツメガエルの発生器の心臓の画像を画像化したものである。
代表的な方法
卓上型典型ＯＣＴシステムとＯＦＤＩシステム
【００５６】
代表的なＴＤＯＣＴ構成では、軸方向の照準合わせ（ｒａｎｇｉｎｇ）は、時間的に連続して個々の深度ポイントを検査する低コヒーレンス反射率測定法を用いて実行する。組織（ｎ＝１．４）内の軸方向分解能を〜１０μｍとして、１．３μｍを中心とする広帯域幅（５０ｎｍ）光源を用いた場合について説明する。このフレームレートは毎秒２０フレーム（２ＫＨｚ  Ａ−ラインレート、画素数１００ｘ５００ピクセル）であった。
【００５７】
代表的なＯＦＤＩ方法及びシステムでは、全ての深度ポイントを同時に取得する周波数領域屈折率測定法を用いることができる。この技術は、Ｍ．Ａ．Ｃｈｏｍａ、ｅｔ  ａｌ．“Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｏｆ  ｓｗｅｐｔ  ｓｏｕｒｃｅ  ａｎｄ  Ｆｏｕｒｉｅｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ“（掃引光源とフーリエ領域光コヒーレンストモグラフィーの利点）、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  １１、ｐｐ２１８３−２１８９（２００３）、及びＳ．Ｈ．Ｙｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｉｇｈ―ｓｐｅｅｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ−ｄｏｍａｉｎ  ｉｍａｇｉｎｇ“（高速光周波数領域画像生成）、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  １１、ｐｐ．２９５３−２９６３（２００３）に記載されているように、信号体雑音比（ＳＮＲ）を数百倍改善する。この代表的なＯＦＤＩシステム及び方法は、光源に高速掃引、波長可変レーザを用いることができる。キャビティ内スペクトルフィルタを用いた外部共振型（ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｃａｖｉｔｙ）半導体レーザについては、Ｍ．Ａ．Ｃｈｏｍａ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｏｆ  ｓｗｅｐｔ  ｓｏｕｒｃｅ  ａｎｄ  Ｆｏｕｒｉｅｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ”（掃引光源およびフーリエ領域光コヒーレンストモグラフィーの検出感度の利点）、“Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  １１、ｐｐ．２１８３−２１８９（２００３）、  Ｃ．Ｂｏｕｄｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．、”Ｒｐｉｄ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ−ｓｗｅｐｔ  ｓｐｅｃｔｒａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ“（高速波長掃引スペクトル符号化共焦点顕微鏡検査法）、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  １３、ｐｐ．８２１４−８２２１（２００５）に記載されている。
【００５８】
このレーザの特徴は、６４ｋＨｚ迄の掃引反復レート（ｓｗｅｅｐ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）、中心周波数１３２０ｎｍで１１１ｎｍの広同調範囲、及び３０ｍＷの高い平均出力（組織上では７ｍＷ）であり、その軸方向分解能は組織中で１０μｍであった。このシステム更には、Ｓ．Ｈ．Ｙｕｎ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｒｅｍｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｅｐｔｈ−ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ  ｉｎ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｓｈｉｆｔｉｎｇ”（周波数遷移を伴う光周波数領域画像生成における深度方向縮退の除去法）、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  １２、ｐｐ．４８２２−４８２８（２００４）に記載のように、周波数領域屈折率測定法に固有の深度方向の縮退を除去するため、音響光周波数シフタ（２５ＭＨｚ）を有するものであった。光ファイバを用いたＯＦＤＩシステムにおける偏光アーチファクトを除去するため、偏光ダイバーシティ検出を実施した。レーザ光の強度雑音を除去して画像生成の感度を改善するため、二重平衡受光器を使用した。この受光器の出力は、サンプリングレート１００ＭＨｚ、分解能１４ビットの２チャンネルアナログデジタル変換器でデジタル化された。
【００５９】
代表的なＴＤＯＣＴ及び高速ＯＦＤＩ構成を、解剖用光学顕微鏡に組み込んだ。この走査システムは、コリメーティングレンズ（ビーム径５ｍｍ）、２組の横軸走査用の同期検流計型スキャナ、集束レンズ（焦点距離５０ｍｍ）、およびビームをサンプルに向けて下方へ屈折させる小型ミラーを有していた。代表的なＴＤＯＣＴ及びＯＦＤＩ構成では、横断方向の分解能は共焦点パラメータが３３０μｍで１６μｍであった。
【００６０】
局所的な心臓の運動に関係する変位は、フレーム単位で拡張末期の心臓の表面位置から収縮期末期の表面位置を差し引くことにより、体積（Ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ）データから直接に決定した。変位はカラールックアップテーブルを用いて表示した。体積レンダリング（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｒｅｎｄｅｒｉｎｇ）及び三次元可視化は、ＯｓｉｒｉＸソフトウェアを用いて実行した。
【００６１】
高分解能ＯＦＤＩ方法は、Ｗ．Ｙ．Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｗｉｄｅ  ｔｕｎｉｎｇ  ｒａｎｇｅ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ−ｓｗｅｐｔ  ｌａｓｅｒ  ｗｉｔｈ  ｔｗｏ  ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｏｐｔｉｃａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｒｅｓ”（２半導体光増幅器を用いた広同調範囲波長掃引レーザ）、／ＥＥＥ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １７、ｐｐ．６７８−６８０（２００５）に記載されているように、ゲインメディアとして２組の半導体光増幅器を利用した、同調範囲２００ｎｍ、中心波長１２５０ｎｍのレーザ光源を用いて実行した。組織内の軸方向分解能は４μｍであった。その横断方向の分解能は、ＮＡ＝０．２の対物レンズを使用して２μｍであった。画像生成速度（ｉｍａｇｉｎｇ  ｒａｔｅ）は、Ａ―ラインレート２０ＫＨｚ（毎フレーム５００Ａ−ライン）で、毎秒４０フレームであった。偏光ダイバーシティ及び二重平衡検出を実行して、受光器出力はサンプリングレート１０ＭＨｚ、分解能１２ビットの２チャンネルのアナログデジタル変換器でデジタル化した。
代表的ＦＦＯＣＭシステム
【００６２】
一実施例として、ＦＦＯＣＭは、Ａ．Ｄｕｂｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｕｌｔｒａｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｕｌｌ―ｆｉｅｌｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  コヒーレンス  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ”（超高分解能全域光コヒーレンストモグラフィー）、Ａｐｐ；  Ｏｐｔ  ４３、ｐｐ．２８７４−２８８３（２００４）、及びＡ．Ｄｕｂｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌｕｌａｒ−ｌｅｖｅｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｆｕｌｌ−ｆｉｅｌｄ  ｏｐｔｉｖａｌ  コヒーレンス  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ”、Ｐｈｙｓ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ４９、ｐｐ．１２２７−１２３４（２００４）に記載されているように、二次元並列検出を利用して生物検体内の反射光の細胞下分解能画像を提供する干渉法技術で実施してもよい。この代表的なＦＦＯＣＭシステムは、キセノンアーク燈からの空間的にインコヒーレントの広帯域幅の光を利用して、２組のＮＡ＝０．３で等しい浸水型顕微鏡対物レンズを有するＬｉｎｎｉｋ干渉顕微鏡の基準ミラーとサンプルとを照射した。干渉画像が、中心スペクトル感度６５０ｎｍのＣＭＯＳ面走査カメラで撮像された。その横断方向の分解能は２μｍ、軸方向分解能は１．１μｍであった。画像収集時間は、約７００μｍｘ７００μｍの横断方向視野に対して、フレーム当たり２秒であった。サンプルを１μｍ刻みで焦点を通過するように移動させて三次元データそ取得した。体積レンダリング及び可視化はＯｓｉｒｉＸソフトウェアを用いて行った。
代表的なＳＥＣＭシステム
【００６３】
一実施例として、ＳＥＣＭは、可視光を用いた共焦点顕微鏡と比較する、Ｒ．Ｒ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｔｈｅ  ｏｐｔｉｃｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ”（人間皮膚の光学）、Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ７７、ｐｐ．１３−１９（１９８１）に記載されているように、組織に一層深く侵入することができる近赤外光を用いている、反射共焦点顕微鏡検査法技術で実施してもよい。代表的なＳＥＣＭ技術は、Ｇ．Ｊ．Ｔｅａｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｓｐｅｃｔｒａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”（スペクトル符号化共焦点顕微鏡検査法）、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２３、  ｐｐ．１１５２−１１５４（１９９８）に記載されているように、異なる波長をサンプルの異なる位置へ投影する点において、従来のレーザ走査共型焦点顕微鏡検査法とは異なる。サンプルから戻ってきたスペクトルを高速で収集することにより、高速で画像を再構築することを可能にしている。ＳＥＣＭシステムでは、Ｃ．Ｂｏｕｄｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｒａｐｉｄ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ−ｓｗｅｐｔ  ｓｐｅｃｔｒａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”（高速波長掃引スペクトル符号化共焦点顕微鏡検査法）、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  １３、ｐｐ．８２１４−８２２１（２００５）に記載されているように、近赤外線の高速波長同調光源からの光（中心波長１．３２μｍ、瞬時ライン幅０．１ｎｍ、全帯域幅７０ｎｍ、反復レート１５．７ｋＨｚ以下）が、回折格子（１ｍｍ当たり１１００ライン）上に平行光線となって照射され、ＮＡ＝１．２、６０ｘ対物レンズ倍率（オリンパス  ＵＰｌａｎＡｐｏ／ＩＲ  ６０Ｘ／１．２０Ｗ）を用いて集光された。多重モードファイバを、信号収集に用いたところ、横断方向０．９μｍ、軸方向２．５μｍの解像度が得られた。毎秒１０フレームで５００ｘ５００ピクセルの画像が得られた。その最大画像生成深度は、対物レンズの２８０μｍ動作距離の範囲に制限された。
検体作成、エタノール処理および組織学
【００６４】
アフリカツメガエルはＮａｓｃｏ社（フォート・アトキンソン、ウィスコンシン州）から購入した。動物を用いる手法は、マサチュセッツ・ジェネラル・ホスピタル研究動物ケアー小委員会承認の手順に準拠した。胚は体外受精により得て、（Ｊ．Ｎｅｗｐｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、“Ａ  ｍａｊｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｍｎｔ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｅｍｂｒｙｏｓ（アフリカツメガエルにおける胚芽初期の主要な発生の推移））：１．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｉｍｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｈａｎｇｅ  ａｔ  ｔｈｅ  ｍｉｄｂｌａｓｔｕｌａ  ｓｔａｇｅ（１．中期胞胚変位段階における細胞変化の特徴付けと時期）“、Ｃｅｌｌ  ３０、ｐｐ．６７５−６８９，１９８２）に記載されているように、０．１ｘマーク（Ｍａｒｃ）氏変性リンゲル（Ｒｉｎｇｅｒ）氏培地（ＭＭＲ）で培養し、Ｎｉｅｕｗｋｏｏｐ―Ｆａｂｅｒ表（Ｐ．Ｄ．Ｎｉｅｕｗｋｏｏｐ  ａｎｄ  Ｊ．Ｆａｂｅｒ、Ｎｏｒｍａｌ  ｔａｂｌｅ  ｏｆ  アフリカツメガエル、Ｄａｕｄｉｎ、Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９６７参照）に従ってステージを分類した。  
【００６５】
エタノール処理は０．１Ｘ  ＭＭＲ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で（Ｒ．Ｙｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、“エタノール暴露  ａｆｆｅｃｔｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｏｒｇａｎｉｚｅｒ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｅｖｅｌ”（エタノール暴露は胚形成体の遺伝子発現に影響を与え、レチノイン酸レベルを低減させる）、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２７９、ｐｐ。１９３−２０４（２００５）参照）、中期胞胚転移（ステージ８．５）直後から画像生成まで行った。体内画像生成に先立ち、胚は０．０２％  ３−アミノ安息香酸エチルエステル（Ａ−５０４０、Ｓｉｇｍａ）で麻酔処置をした。ＴＤＯＣＴ及びＯＦＤＩ画像生成技術並びにシステムでは、胚は腹部側を上に向けて１．５％アガロースゲルプレート上に配置し、麻酔標準液をかけた。代表的なＳＥＣＭシステムを用いた画像生成では、胚は腹部側を麻酔緩衝液に向けてカバースリップに配置し、下側から画像を生成した。代表的なＦＦＯＣＭ手法及び／又はシステムによる体外画像生成では、ＭＥＭＦＡ（０．１Ｍ  ＭＯＰＳ〔ｐＨ７．４〕、２ｍＭ  ＥＧＴＡ，１ｍＭ  ＭｇＳｏ４及び３．７％ホルムアルデヒド）中に１時間超にわたり固定して開始した。画像生成に先立ち、固定された胚は、Ｉｘ  ＰＢＳ（８ｇｒ  ＮａＣｌ、０．２ｇｒ  ＫＣｌ、１．４４ｇｒ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．２４ｇｒ  ＫＨ２ＰＯ４）を満たしたシャーレに移し、その腹部側を上向きに置き、粘土で支持した。
【００６６】
更に、（Ａ．Ｍ．Ｇｌａｕｅｒｔ，“Ｆｉｘａｔｉｏｎ，Ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  検体”（生物検体の固化、脱水および包埋）、Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９８６に記載されているように）Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ‘ｓ  Ｆｉｘａｔｉｖｅ（ＫＩＩ）中に固定及びｔＥｐｏｎ−８１２（Ｔｏｕｓｉｍｉｓ社製）への包埋を行った後に、可塑性組織切片を得た。厚さ１μｍの切片をＲｅｉｃｈｅｒｔ  Ｕｌｔｒａｃｕｔ  Ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ（ライヘルト・超ミクロトーム）で切り出し、ホウ素塩緩衝剤（Ｔｏｕｓｉｍｉｓ社製）中でメチレンブルー／トルイジンブルーで染色した。パラフィン切片（厚さ５μｍ）は、ヘマトキシリン＆エオシン染色法で染色した。
代表的な結果
生体ＯＦＤＩ技法を用いた胎児心臓の四次元画像化
【００６７】
拍動する心臓の高速体積画像生成は、心周期の三次元形態及び機能評価を可能とするものである。代表的なＯＦＤＩシステム及び手法によれば、（図１５ａ及び１５ｂに示すように）体内断面画像生成を行うＴＤＯＣＴと比べて遥かに高速なフレームレートで、カーディアックゲーティング（ｃａｒｄｉａｃ  ｇａｔｉｎｇ）を用いずとも拍動心の四次元画像を生成することができる。アフリカツメガエルの心臓のＯＦＤＩ体積画像（ステージ４９）は、（図１５ｃ−１５ｇに示すように）毎秒２０組の三次元データ速度で生成された。ＯＦＤＩ手順を用いることにより、収縮末期では心室は体積が最小になることが実証された。反対に、心房および総動脈幹（ＴＡ）の体積は最小であった（図１５ｃ、１５ｄ参照）。拡張末期では、心室の体積は拡張して最大となる一方で、心房及びＴＡの体積は最小となった（図１５ｅ、１５ｆ参照）。四次元データセットから得た心臓の三次元レンダリングは（図１５ｇ参照）、同じ心臓を精査した明視野写真に対応する（図１５ｈ参照）。
生体胎児心臓に対する高分解能ＯＦＤＩ手法
【００６８】
代表的なＯＦＤＩシステムは四次元画像を生成することが可能であったが、僅かな形態的及び機能的異常を同定するために更に高い分解能が要求される場合がある。分解能を向上させるために、Ｗ．Ｙ．Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｗｉｄｅ  ｔｕｎｉｎｇ  ｒａｎｇｅ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ−ｓｗｅｐｔ  ｌａｓｅｒ  ｗｉｔｈ  ｔｗｏ  ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｏｐｔｉｃａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｒｅ”（２半導体光増幅器を用いた広同調範囲波長掃引レーザ）“、ＩＥＥＥ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒ  １７、ｐｐ．６７８−６８０（２００５）に記載されているように、広帯域波長（例えば、２００ｎｍ）の波長掃引光源を用いて、アフリカツメガエルのステージ４９心臓のＯＦＤＩ断面を生体で得た（図１５ｉ―１５ｍ参照）。前述の分解能が横断方向１６μｍおよび軸方向１０μｍのＴＤＯＣＴおよびＯＦＤＩ手法及びシステムと比べて、高分解能ＯＦＤＩの横断方向および軸方向分解能はそれぞれ２μｍおよび４μｍであった。３房室を有するアフリカツメガエルの心臓内部の詳細はこの高分解能ＯＦＤＩ手法及びシステムを用いて、房室弁運動（（図１５ｉ−１５ｋ参照）、心室収縮および小柱運動（図１５ｍ参照）を含め、明確に解明された。房室弁を介して心房から心室へ流れる個々の血球も見ることができる（図１５ｋ参照）。
体外ＦＦＯＣＭ手法を用いた胎児心臓の高分解能三次元画像の生成
【００６９】
代表的なＦＦＯＣＭ手法及びシステムは、ほぼ等方性細胞レベルの分解能で、胎児心臓の微細構造の画像を生成する機能を提供する。ＦＦＯＣＭの体積画像は、その視野が７００ｘ７００ｘ１０００μｍ（軸）に広がるものであった。横断方向および軸方向の分解能は、それぞれ２μｍ及び１．１μｍであった。収集時間は、一つの正面切片に対しては２秒、また全体積に対しては３３分であった。代表的なＦＦＯＣＭ断面図では、アフリカツメガエルの心臓（ステージ４９）の心室小柱（図１６ａ及び１６ｃ参照）、螺旋弁（図１６ｂ、１６ｄの矢印を参照）、及び心房中隔の一部（図１６ｄの矢印参照）を、代表的なＴＤＯＣＴ又はＯＦＤＩ手法又はシステムを用いるよりも遥かに詳細に可視化することができる。心臓の部分的な透視体積レンダリング（図１６ｅ−１６ｈ参照）は、ＴＡを斜めにした環流圧縮構造（図１６ｅ参照）、大動脈弓（図１６ｆ、１６ｇ参照）及び心房薄壁（図１６ｇと１６ｈを参照）を、それぞれの三次元の関係において明らかにしている。断面図（図１６ｅ参照）は、小柱（図１６ｉ、１６ｊ参照）及び房室弁（図１６ｋ参照）を含む微細な三次元内部構造を表している。対応する同一の胚の組織切片（図１６ｍ参照）の次に示した房室弁の拡大図（図１６ｌに示されている）は、ニ尖の形態を明らかにしている。
生体ＳＥＣＭ手法による胎児心臓の高速画像生成
【００７０】
代表的なＳＥＣＭ手法及びシステムは、ＦＦＯＣＭに相当する横断方向分解能を発揮するが、フレームレートはこれよりも高速であり、体内における心臓の顕微鏡検査を可能とするものである。アフリカツメガエルの心筋（ステージ４９）の体内の画像生成を、代表的なＳＥＣＭ手法及びシステムを用いて、フレームレート１０／ｓ、視野２２０ｘ２２０μｍ、横断方向と軸方向の分解能をそれぞれ１．２μｍおよび６μｍとして行った。最大貫入深度は２８０μｍであった。代表的な同じ蛙の幼生（オタマジャクシ）（ステージ４９）のＴＤ−ＯＣＴ手法及びシステムによる可視化例（図１５ａ及び１５ｂ参照）及びＦＦＯＣＭ手法及びシステムによる可視化例（図１６ａ―１６ｍ参照）は、腹側面下方約２８０μｍにある房室弁の薄い心臓弁膜尖（図１７ａ参照）、及び心室空間内の個々の血球を含む心室とＴＡの一部（図１７ｃに表示されている）を表している。ＳＥＣＭ画像は、対応する組織断面とよい相関を持っていた（図１７ｂ及び１７ｄ参照）。他の蛙の幼生（ステージ４７）から得られた一連のフレームは螺旋弁の閉じた状態（図１７ｅ参照）と開いた状態（図１７ｆ及び１７ｇ参照）を、ＴＡから大動脈分岐へ向かう血流を、単一の細胞のレベルで示している。小柱内の血球も明らかである（図１７ｈ参照）。細胞核および細胞小器官を表す個々の筋細胞内部の特徴を観察できる。
アフリカツメガエル幼生の動脈瘤壁拡張
【００７１】
胚（ステージ４７）の１つでは、ＴＡ壁から発生した突出が識別されている。体内の異なる２つの深度で取ったＳＥＣＭ断面図（図１８ａ及び１８ｂ参照）では、その嚢状形、螺旋弁に対する位置、更には異常部を通過する個々の血球の流れが明らかに認められる。この異常は、代表的な生体ＴＤＯＣＴ手法及びシステムを用いても観察された（図１８ａに示す。挿入図参照）。この幼生は、次いで固定され、代表的なＦＦＯＣＭ手法及びシステムを用いて画像化した。ＦＦＯＣＭ断面（図１８ｃ参照）及びＦＦＯＣＭ体積データセットの三次元レンダリング（図１８ｄ参照）は、心臓全体の状況の中の膨張を表している。従来の明視野顕微鏡検査では観察が困難であったが（図１８ｅ参照）、代表的ＴＤＯＣＴ、ＦＦＯＣＭ及びＳＥＣＭ手法及びシステムにより明確に可視化され、心臓は他の点では正常表現型のように見えるが、この突起部はＴＡの嚢状動脈瘤膨張を表すと思われる。
エタノール暴露による心異常
【００７２】
心血管奇形は、遺伝的因子（Ｋ．Ｌ．Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｈｅａｒｔ  ｄｅｆｅｃｔ”（転写因子と先天性心臓欠陥））、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ６８、ｐｐ。９７−１２１（２００６）に記載）及び催奇形性因子（Ｓ．Ｍ．Ｍｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍ：ｐｒｅｎａｔａｌ  ｐｅｒｉｏｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｃｅ”、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １１３、ｐｐ．１０５８−１０６９（２００４）（心臓血管系に与える環境暴露の影響：出産前から青年期まで）に記載）により引き起こされる。エタノールは周知の催奇形性物質である；妊娠期間のヒトの胚のアルコール（エタノール）暴露は、胎児性アルコール症候群（ＦＡＳ）と関連がある（Ｋ．Ｌ．Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｅｔａｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｉｎｆａｎｃｙ“（早期乳児期における胎児アルコール症候群の評価）、Ｌａｎｃｅｔ  ２、ｐｐ．９９９−１００１（１９７３）、およびＪ．Ｄ．Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ、”Ａｌｃｏｈｏｌ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｆｅｔｕｓ――  ａ  ｒｅｖｉｅｗ“（アルコールおよび発生期の胎児−−概説）、Ｍｅｄ  Ｓｄ  Ｍｏｎｉｔ  ６、ｐｐ．１０３１−１０４１（２０００）を参照）。ある推定によると、ＦＡＳの子供の５３％が心臓欠損を煩っている（Ｅ．Ｌ．Ａｂｅｌ、Ｆｅｔａｌ  Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｂｏｏｋｓ、Ｏｒａｄｅｌｌ、ＮＪ、１９９０を参照）。
【００７３】
アフリカツメガエルの心臓の発生に与えるエタノールの催奇形効果を調べるために、幼生を中期胞胚転移期（ステージ８．５）から異なる濃度（０．５％−２．５％）のエタノールに暴露した（Ｒ．Ｙｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、“エタノール暴露  ａｆｆｅｃｔｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｏｒｇｅｎｉｚｅｒ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｅｖｅｌ“（エタノール暴露は胚形成体の遺伝子発現に影響を与えレチノイン酸レベルを削減する）、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２７９、ｐｐ．１９３−２０４（２００５）を参照）。同一条件で発育中の同胞であってエタノール暴露をしていない幼生グループを、対照として用いた。その発育過程で、我々は、催奇形性効果の範囲を特定しかつ質的評価を行うために、代表的ＴＤＯＣＴ手法及びシステムを用いて幼生の心臓の部位のスクリーニングを行った。０．５％エタノール処理グループ（ｎ＝１６）と対照グループ（ｎ＝４２）との間に形態的差異は観察されなかった。対照グループと比較して、形態に実質的変化を有した完全成熟として定義される中等度催奇形性効果が、１％エタノールに暴露した幼生（ｎ＝２８）の少数群（２５％）、及び１．５％エタノールに暴露した幼生（ｎ＝２７）の多数群（７４％）に見られた。心管の著しく異常な回旋及び／又は不完全成熟として定義される重度の影響が、２．０％のグループ及び２．５％のグループ（それぞれｎ＝１７、ｎ＝７）の全幼生に見られた。最重度の奇形幼生も含め、全幼生で心臓の運動が明らかに認められた。
【００７４】
代表的なＴＤＯＣＴ手法及びシステムを用いて、対照グループ、０．５％，１．５％、及び２．０％エタノール処理グループからそれぞれオタマジャクシを一つ（ステージ４８）を選択して標準的な表現型を明らかにした（図１９ａ−１９ｄ参照）。４つのオタマジャクシの心臓に、不完全心房中隔（図１９ａ−１９ｄ参照。隔膜は右側画像の矢印で示す）及び房室弁を確認したため、後期発生段階にあると決定した。ＴＤＯＣＴ画像は、１．５％及び２．０％のグループに、還流（ｌｏｏｐｉｎｇ）欠損の初期兆候があることを示した。更に、１．５％と２．０％のグループに心室内部からの弱いＴＤＯＣＴ信号が観察された。これはこれらの幼生の血流低下に起因するものと推定される。図１９ｅ−１９ｈに、生体オタマジャクシの腹側面から撮影した写真を示す。
【００７５】
代表的なＦＦＯＣＭ手順及びシステムを用いて生体から得られたデータの三次元レンダリングにより、高分解能での心筋構造の評価が可能となり、対照グループと０．５％幼生グループの類似性、および１．５％と２．０％幼生グループの心管還流欠陥が明確になった（図１９ｉ−１９ｌ参照）。ＦＦＯＣＭ体積データ集合による断面図により、対照グループおよび０．５％のオタマジャクシのグループ（図１９ｎ参照）と比べて、１．５％のグループ（図１９ｏ参照）及び２．０％のグループのオタマジャクシ（図１９ｐに示す）のＴＡおよび弁（矢印で示す）は小さく、かつ変形していることが明らかとなった。対照グループ及び０．５％のグループと対照して、心嚢浮腫は（図１９ｏ，１９ｐ、１９ｓおよび１９ｔに示すように）１．５％と２．０％のグループに表れた。エタノールは心室にも影響を与えた。対照グループ（図１９ｑ参照）および０．５％のグループ（図１９ｒ参照）の心臓中の発達した小柱は、１．５％のグループ（図１９ｓ参照）の発達の程度の低い小柱とは対照的であり、また、２．０％エタノール暴露の幼生グループ（図１９ｔ参照）の心室腔は肥大し、疎らで発育不良の小柱を有していた。対応する組織断面により、幼生のエタノール暴露が大きいほどその小柱の発達は乏しくなる（図１９ｕ−１９ｘ参照）ことを含む、我々の所見のいくつかを確認した。
代表的結果の考察
【００７６】
発生生物学研究における共通のパラダイムは、遺伝子型を操作しかつ表現型を監視することである。形態は、表現型の重要な一側面である。心臓においては、軽度の形態上及び循環動態上の異常であっても、心筋を正常に機能させる上で重大な影響を与えることがある。二次元及び三次元で僅かな形態的および循環動態的変化を識別する機能は、このパラダイムの感度を著しく改善することが出来る。
【００７７】
アフリカツメガエルの幼生では、心筋壁、隔膜及び弁などの心臓構造各部位の厚さは、細胞数個程に過ぎない場合がある。形態表現型を評価するには、このような微細な構造を分解するのみならず、代表的変位速度が１ｍｍ／秒のオーダーである拍動心内部のこれらの顕微鏡的特長をも可視化できることが必要である。もし画像生成速度が十分に高ければ、幼生の心臓の三次元画像を心周期内で様々な時間に取得することができる。この代表的な四次元画像生成により、ヒトの病態生理と密接な関係のある弁の位置、堅さ及びモジュラリティに加えて、１回拍出量や心臓駆出分などの動的生理学的パラメータを高い信頼度で測定することができた。高分解能および高速性は、心臓の効果的な画像生成のための唯一の要求事項ではない。アフリカツメガエルの幼生では、心臓は腹側表面下２００μｍから８００μｍ間に広がっている。従って、効果的な画像生成法は、信号および分解能をほとんど劣化させずに、これらの深度で画像生成が可能であることが好ましい。
【００７８】
発生期のアフリカツメガエルの心臓の形態は、体外で調べられ、組織断面の三次元レンダリングを用いて詳細に描写された（Ｔ．Ｊ．Ｍｏｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．、“  Ｔｈｅ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｈｅａｒｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  アフリカツメガエル”（アフリカツメガエルの心臓の発生形態）、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２１８、ｐｐ．７４−８８（２０００）参照）。しかしながら、組織の研究では、構造を忠実に保持してサンプルの作成および切片作成を行うことは困難である。結果として、無傷の幼生をその自然の環境で画像化することが好適である。生体心臓の構造の画像生成を、各種の非侵襲画像生成モダリティ、例えば、マイクロＭＲＩ（Ｄ．Ｌ．Ｋｒａｉｔｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ
ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｉｎ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ”（心筋梗塞に対する間充織幹細胞の  生体磁気共鳴画像の生成）、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０７、  ｐｐ．２２９０−２２９３）、）、及びＦ．Ｗｉｅｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｓｓ  ａｓｓｅｓｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ＭＲＩ  ｉｎｎｅｎｏｔａｌ、ｊｕｖｅｎｉｌｅ、ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｍｉｃｅ”（ＭＲＩに関わる新生、若年性および成体ハツカネズミの心機能および主要部位の発育上の変化）、ＡｍＪ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７８、ｐｐ．Ｈ６５２−６５７（２０００）参照）、マイクロＣＴ（Ｍ．Ｍａｌｙａｒ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｄｉａｍｅｔｅｒ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｕｓｅｄ  組織  ｖｏｌｕｍｅ  ｉｎ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ：  ａ  ｍｉｃｒｏ―ＣＴ−ｂａｓｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ（心筋微小循環における動脈径と分散組織の体積との相関：マイクロＣＴを用いた分析）”、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８６、ｐｐ。Ｈ２３８６−２３９２（２００４）、ａｎｄ  Ｃ．Ｔ．Ｂａｄｅａ  ｅｔ  ａｌ．“４−Ｄ  ｍｉｃｒｏ―ＣＴ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｈｅａｒｔ”（マウス心臓の４−ＤマイクローＣＴ）、Ｍｏ  Ｉ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ４、ｐｐ．１３０−１３５（２００５）、超音波（Ｓ．Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ，  ｉｎ  ｕｔｅｒｏ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ４０−ＭＨｚ  ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ”，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９８，  ｐｐ．９１２−９１８  （１９９８）参照）及びＰＥＴ（Ｌ．Ｗ．Ｄｏｂｒｕｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ”，  Ｃｕｒｒ  Ｃａｒｄｉｏｌ  Ｒｅｐ  ７，  ｐｐ．１３０−１３５  （２００５），  ａｎｄ  Ｌ．Ｓｔｅｇｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｄｉｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ＰＥＴ，”（ＰＥＴを用いたマウスの左心室肥大のモニタリング）ＪＮｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４６，  ｐｐ．１５１６−  １５２１  （２００５）を参照）を用いて実証してきた。
【００７９】
光学技術は、高分解能で胎児心臓の画像生成を可能とするものである。アフリカツメガエルの初期心臓発生の体外での画像生成には共焦点顕微鏡検査法が用いられてきた（Ｓ．Ｊ／Ｋｏｌｋｅｒ  ｅｔａｌ．、“Ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ｈｅａｒｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  アフリカツメガエル”、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ２１８、ｐｐ．６４−７３（２０００））参照）、又、生体ゼブラフィッシュ胚心臓発生における心臓内流体力の役割りを研究するために（Ｊ．Ｒ．Ｈｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｉｎｔｒａｃａｒｄｉａｃ  ｆｌｕｉｄ  ｆｏｒｃｅｓ  ａｒｅ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｃａｒｄｉｏｇｅｎｅｓｉｓ”  （心臓内流体力は胚心臓発生の必須後天的要因である）、Ｎａｔｕｒｅ  ４２１、ｐｐ．１７２−１７７（２００３）を参照）。ドップラーＴＤＯＣＴ手法及びシステムは、アフリカツメガエルの幼生の血液の流れを調べるために用いられたもので、組織表面下の定量的な速度測定が可能であった（Ｊ．Ｈ．Ｈｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｉｎｔｒａｃａｒｄｉａｃ  ｆｌｕｉｄ  ｆｏｒｃｅｓ  ａｒｅ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｃａｒｄｉｏｇｅｎｅｓｉｓ”  （心臓内流体力は胚期心臓発生の必須後天的要因である）、Ｎａｔｕｒｅ  ４２１、ｐｐ．１７２−１７７（２００３）参照）、及びＶ．Ｘ．Ｄ．Ｙａｎｇ、Ｍ．Ｌ．Ｇｏｒｄｏｎ、Ｅ．Ｓｅｎｇ−Ｙｕｅ、ｅｔ  ａｌ．、“Ｈｉｇｈ  ｓｐｅｅｄ、ｗｉｄｅ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｒａｎｇｅ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  ｏｐｔｉｃａｌ  コヒーレンス  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ｐａｒｔＩＩ）：Ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  アフリカツメガエル”（高速、広範囲速度ダイナミックレンジドップラー型光コヒーレンストモグラフィー（パート２）：アフリカツメガエルの生体心臓ダイナミックスの画像生成）、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ１１、ｐｐ．１６５０−１６５８、（２００３）を参照）。ＴＤＯＣＴはその画像生成速度が制限されるため、ＴＤＯＣＴを用いて三次元心臓の画像の生成を行うことは、主として体外での事前実証にのみ用いてきた（Ｓ．Ａ．Ｂｏｐｐａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｕｓｉｎｇ  ｏｐｔｉｃａｌ  コヒーレンス  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ”（光コヒーレンストモグラフィーを用いた、発生期アフリカツメガエルの心臓血管系の非侵襲評価）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｄ  ＵＳＡ  ９４、ｐｐ。４２５６−４２６１（１９９７））、Ｔ．Ｍ．Ｙｅｌｂｕｚ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｏｐｔｉｃａｌ  コヒーレンス  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：ａ  ｎｅｗ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｓｕｔｕｄｙ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｃｈｉｃｋ  ｅｍｂｒｙｏｓ”（光コヒーレンストモグラフィー：幼鶏胚における心臓発生を研究するための新しい高分解能画像生成技術）、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ��０６、  ｐｐ。２７７１−２７７４（２００２）、及びＷ．Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｏｐｔｉｃａｌ  コヒーレンス  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｍｕｒｉｎｅ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍ”（マウスの胚芽期心臓血管系の三次元光コヒーレンストモグラフィー）、  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｏｐｔｉｃｓ  １１、０２１０１４（２００６）を参照）。
【００８０】
既存の画像生成技術の速度による制限を回避するために、胚芽期心臓の三次元画像を心周期の異なるステージで再構築することができるゲーティング、又は収集後同期技術が用いられてきた（Ｍ．Ｗ．Ｊｅｎｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、“４Ｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ  ｕｓｉｎｇ  ｇａｔｅｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  コヒーレンス  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ”（ゲーテッド光コヒーレンストモグラフィーを用いた４Ｄ胎児カルジオグラフィー  ）、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  １４、ｐｐ．７３６−７４８（２００６）を参照されたい。）Ｍ．Ｌｉｅｂｌｉｎｇ  ａｌ．、“Ｆｏｕｒ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃａｒｄｉａｃ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｅｍｂｒｙｏｓ  ｖｉａ  ｐｏｓｔａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｇａｔｅｄ  ｓｌｉｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ”（ゲーティングされていない薄片配列の収集後同期を用いた生体胚における四次元心臓画像生成）、Ｂｉｏｍｅｄ  Ｏｐｔ  １０、０５４００１（２００５）を参照）。我々の研究室ではより容易に利用できるために、いくつかの実験ではＴＤＯＣＴを用いたが、前述の代表的なＯＦＤＩ手法及びシステムは、この代表的なＴＤＯＣＴ手法及びシステムの全ての機能を一層高速で提供できるものであった。代表的なＯＦＤＩ手法及びシステムは、心臓ゲーティングを必要とせずに、拍動心の実時間で忠実に四次元画像を生成し、心臓の周期に亘る心筋壁変位を評価するために有用であることが分かった（図１５ｃ−１５ｆ参照）。
【００８１】
我々は、ＯＦＤＩ光源を修正して、軸方向高分解能を更に高めた（４μｍ）実時間断面画像生成を行って、弁運動（図１５ｉ−１５ｋ参照）及び単一細胞血液流の可視化を可能にした。胎児心臓の細胞下レベル分解能画像生成を目的として、代表的なＦＦＯＣＭおよびＳＥＣＭ手法及びシステムの使用について詳細に研究した。ＦＦＯＣＭモダリティは、等方向性細胞（１−２μｍ）相当の分解能で、高品質三次元画像生成を可能にすることが分かった。ＳＥＣＭモダリティは、ＦＦＯＣＭモダリティに相当する分解能を有することが分かったが、更に高速で細胞下レベルの生体筋細胞、血液及び弁運動の画像生成を行うことができた。表１は、各手順の種種の機能を、それらの相補的性質を明確にして要約したものである。
表１．胎児心臓の光学的画像生成を目的とした内因性コントラストモダリティの比較
灰色の陰影を付けた細胞は、最大の横方向分解能特性、軸方向分解能特性及びフレームレート特性を持つ画像生成技術を表す。
【００８２】
【表１】
0005988383.tif 000002
【００８３】
代表的なＴＤＯＣＴとＦＦＯＣＭ手法及びシステムの貫入深度が大きいので、エタノール催奇形性表現型の一部として発達した心嚢浮腫を通して心臓の画像生成を行うことができた。我々の予備研究結果では、エタノールは心臓還流過程（図１９ｉ−１）を阻害することを示唆するものであり、これは鶉の研究結果と一致する（Ｗ．Ｏ．Ｔｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｖｅｒｓｅｓ  ｅｔｈａｎｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｑｕａｉｌ  ｅｍｂｒｙｏｓ”（レチノイン酸は、鶉幼鳥におけるエタノール誘発性異常を回復に向かわせる）、Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｅｓ  ２１、ｐｐ。１１３７−１１４３（１９９７）を参照）。本研究で報告されたＴＡサイズの縮小は、ＣａｖｉｅｒｒｅｓとＳｍｉｔｈによって予測されていたものである（Ｍ．Ｆ．Ｃａｖｉｅｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｅｆｉｃｉｔｓ  ｉｎ  ｐｒｅｎａｔａｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ”、（出生前アルコール暴露における心臓欠陥の遺伝的および発生学的調節）、Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｅｓ  ２４、ｐｐ．１０２−１０９（２０００）を参照されたい）が、観察されなかった。本報告書に記載された発達の程度が低い心室小柱（図１９ｑ−ｔを参照）は、これまで発育が阻害されてきたものと考えられる。アフリカツメガエルおよびゼブラフィッシュ（ダニオ・レリオ）では、この心室小柱はヒス・プルキンエ系と機能的に等価に働くため（Ｄ．Ｓｅｄｍｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ａｎｄ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｈｅａｒｔｓ”（ゼブラフィッシュおよびアフリカツメガエルの心臓における心室伝導系の立証）、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８４、ｐｐ．Ｈ１１５２−１１６０（２００３）を参照）、低発達の小柱であることは、エタノール処理鶉（Ｗ．Ｏ．Ｔｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｖｅｒｓｅｓ  ｅｔｈａｎｏｌ―ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｑｕａｉｌ  ｅｍｂｒｙｏｓ”（レチノイン酸は、鶉幼鳥におけるエタノール誘発性異常を回復に向かわせる）、Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｅｘｐ  Ｒｅｓ  ２１、ｐｐ．１１３７−１１４３（１９９７）を参照）、及びゼブラフィッシュ幼魚（Ｊ．Ｂｉｌｏｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．、“エタノール暴露  ａｌｔｅｒｓ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｄｅｌｏｆ  ｆｅｔａｌａｌｃｏｈｏｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ”（エタノール暴露はゼブラフィッシュの発育を変える）、Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌ  Ｔｅｒａｔｏｌ  ２６、ｐｐ。１３１−１  Ａ３（２００４）を参照）について報告されている比較上低速の心拍数であることと関連付けて決定することができる。エタノール処理に起因する血液循環の阻害（Ｗ．Ｏ．Ｔｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｖｅｒｓｅｓ  ｅｔｈａｎｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｑｕａｉｌ  ｅｍｂｒｙｏｓ”（レチノイン酸は、鶉幼鳥におけるエタノール誘発性異常を回復に向かわせる）、Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｅｓ  ２１、ｐｐ。１１３７−１１４３（１９９７）を参照）、及び  Ｘ．Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｍｅｄａｋａ（Ｏｒｙｚｉａｓ  ｌａｔｉｐｅｓ）：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ”（日本メダカ：アルコール奇形研究のための発生モデル）、Ｂｉｒｔｈ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｒｅｓ  Ｂ  Ｄｅｖ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  １１、ｐｐ．２９−３９（２００６）を参照）は、心臓腔内部からの信号損失を説明できる可能性があり、これは前記の決定とも合致するものである。
【００８４】
相対的に高い貫入深度にもかかわらず、発生初期の激しい散乱のために、従来の光学的画像生成手法はいずれも心臓器官形成開始期（心管形成、ステージ２９）の心臓の画像を生成することができなかった。しかしながら、心臓の動きの開始（ステージ３５）が観察され、また、胚が光を透過するようになるにつれて、心腔形成期（ステージ４０前後）の詳細な構造画像が得られるようになった。特に、ＦＦＯＣＭ及びＳＥＣＭモダリティについては、組織を顕微鏡検査のデータ集合と照合することが困難であった。この胚芽は、処理を行い、包埋する時に非常に壊れやすく、形態を保存することが困難であった。更に、画像は１０μｍのオーダーで組織に合わせる必要があるが、これは従来の切片製作技術では達成が困難である。
【００８５】
本発明の代表的な実施の形態による画像生成手順では、コントラストは内因性の散乱により発生したものである。更に、分子画像生成は、遺伝子および蛋白質の発現と表現型とを関連付けるために重要と思われる。それ故、本明細書に記載された代表的なシステムおよび方法は、蛍光標識および分子種の画像生成に用いることが出来る。蛍光画像生成は、光源の変調によるスペクトル符号化と電子工学的検出により行うことができることを説明した（Ｊ．Ｔ．Ｍｏｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｐｅｃｔｒａｌ−  ａｎｄ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｉｍａｇｉｎｇ”（スペクトルおよび周波数符号化画像生成）、Ｏｐｔ  Ｌｅｔｔ  ３０、ｐｐ．２７６０−２７６２（２００５）を参照）。蛍光ＳＥＣＭ手法及びシステムで用いたのと同様の原理を、内視鏡２光子画像および第二高調波画像生成にも同様に用いることができる。代表的なＴＤＯＣＴ、ＯＦＤＩ及びＦＦＯＣＭ手順並びにシステムにコヒーレント検出を用いても、蛍光を直接に検出することは困難であると思われる。しかし、数種類の分子コントラスト法については、ＯＣＴモダリティとして既に説明されている（Ｃ．Ｙａｎｇ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｏｐｔｉｃａｌ  コヒーレンス  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ”（分子コントラスト光コヒーレンストモグラフィー：概説）、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ  ８１、ｐｐ．２１５−２３７（２００５）及びＯｐｔｉｃａｌ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  技術ｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  コヒーレンス  ｉｍａｇｉｎｇ“（コヒーレンス・画像生成における分子コントラスト増進のための光ブローブと技術）、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｏｐｔ  １０、４１２０８（２００５）を参照）。
【００８６】
本研究で紹介した、自然コントラスト画像生成モダリティにより、異なる視点から胚芽期の心臓の評価を行うことが可能である。ＯＦＤＩ、ＳＥＣＭ、及びＦＦＯＣＭモダリティを組み合わせることにより、これ等の長所（テーブル１参照）が活用でき、形態的および機能的心筋表現型を更に総合的に把握できるようになる。このマルチモダリティのパラダイムは、他のシステムや動物モデルにも拡張することができる。これらの非侵襲的画像生成技術は検体を変質させるものではないため、逐次的に或いは並列に用いることができる。更に、本研究では、我々は個別の画像生成システムを用いたが、単一の波長掃引光源を用いる一つの画像生成システムとして一体化することを妨げるものではない（Ｓ．Ｈ．Ｙｕｎ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｈｉｇｈ−ｓｐｅｅｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ−ｄｏｍａｉｎ  ｉｍａｇｉｎｇ”（光周波数領域画像高速生成）、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  １１、ｐｐ．２９５３−２９６３（２００３）；Ｃ．Ｂｏｕｄｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｒａｐｉｄ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ−ｓｗｅｐｔ  ｓｐｅｃｔｒａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”（高速波長掃引スペクトル符号化顕微鏡検査法）、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  １３、ｐｐ．８２１４−８２２１（２００５）；及びＷ．Ｙ．Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｗｉｄｅ  ｔｕｎｉｎｇ  ｒａｎｇｅ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ―ｓｗｅｐｔ  ｌａｓｅｒ  ｗｉｔｈ  ｔｗｏｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｏｐｔｉｃａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｒｅｓ”（２組の半導体光増幅器を持つ広同調範囲波長掃引レーザ）、ＩＥＥＥ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １７、ｐｐ。６７８−６８０  （２００５）を参照）。
【００８７】
上述の説明は単に本発明の原理を例示したに過ぎない。本明細書の説明を考慮して、記載された実施の形態に種々の変更や改変を加えることは、当業者にとって明らかである。実際に、本発明の代表的な実施の形態による装置、システム、及び方法は、どのようなＯＣＴシステム、ＯＦＤＩシステム、ＳＤ−ＯＣＴシステム、または他の画像化システム、例えば、２００４年９月８日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２９１４８号、２００５年１１月２日出願の米国特許出願第１１／２６６，７７９号、及び２００４年７月９日出願の米国特許出願第１０／５０１，２７６号に記載のものにも適用可能であり、これらの開示の全てを本明細書の一部として援用する。従って、当業者にとっては、本明細書に明確に提示又は説明されていなくとも、本発明の原理を具現化する数多くのシステム、装置、及び方法に工夫を凝らすことが可能であり、これは本発明の趣旨と範囲内に含まれることが理解されるであろう。更に、上述の明細書に前記の先行技術の知識が明示的に援用されていない範囲においても、その全体を明示的に本明細書に援用する。本明細書で引用した上述の全ての文献は、その全体を本明細書の一部として援用する。
【図１】
0005988383.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0005988383.tif 000013
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１５ｄ】
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【図１５ｅ】
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【図１５ｆ】
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【図１５ｇ】
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【図１５ｈ】
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【図１５ｉ】
0005988383.tif 000026
【図１５ｊ】
0005988383.tif 000027
【図１５ｋ】
0005988383.tif 000028
【図１５ｌ】
0005988383.tif 000029
【図１５ｍ】
0005988383.tif 000030
【図１６ａ】
0005988383.tif 000031
【図１６ｂ】
0005988383.tif 000032
【図１６ｃ】
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【図１６ｄ】
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【図１６ｅ】
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【図１６ｆ】
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【図１６ｇ】
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【図１６ｈ】
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【図１６ｉ】
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【図１６ｊ】
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【図１６ｋ】
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【図１６ｌ】
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【図１６ｍ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１７ｄ】
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【図１７ｅ】
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【図１７ｆ】
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【図１７ｇ】
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【図１７ｈ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
0005988383.tif 000053
【図１８ｃ】
0005988383.tif 000054
【図１８ｄ】
0005988383.tif 000055
【図１８ｅ】
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【図１９】
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