(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式（１）で表される化合物を産生する能力を有する微生物であって、前記微生物がストレプトミセス  エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＭＫ７３０−６２Ｆ２−３−７（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−１１９６）であることを特徴とする微生物。
【化１】
0005922936.tif 000006
【請求項２】
下記構造式（１）で表される化合物を産生する能力を有するストレプトミセス  エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＭＫ７３０−６２Ｆ２−３−７（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−１１９６）を培養して前記構造式（１）で表される化合物を製造することを特徴とするカプラゾールの製造方法。
【化２】
0005922936.tif 000007
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カプラゾールを産生する新規微生物及び前記カプラゾールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カプラゾールに対して化学的に脂肪酸エステルを付加したカプラゾールの脂肪酸エステル体は、結核菌をはじめとする各種細菌に対して優れた抗菌活性を示すことが報告されており、結核の治療や各種感染症の治療への応用が期待されている（特許文献１参照）。
【０００３】
前記カプラゾールは、カプラザマイシンの３’’’位のアシル基が脱離して水酸基に変換された化合物である。前記カプラザマイシンは、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＭＫ７３０−６２Ｆ２株）を培養することにより得ることができる。このとき、少量のカプラゾールも得ることができるが、その産生量は十分満足できるものではなかった。
【０００４】
前記カプラゾールを大量に得る方法としては、前記ＭＫ７３０−６２Ｆ２株を培養して前記カプラザマイシを得た後、得られたカプラザマイシをアセトン等の有機溶媒を使用して精製し、精製したカプラザマイシンをアルカリ加水分解する、といった多段階の工程を経て得る方法が提案されている（特許文献１及び２参照）。
しかし、この提案の方法では、工程数が多いため操作が煩雑である点で問題である。また、有機溶媒を使用するため、安全性やコストの面でも問題である。
【０００５】
したがって、カプラゾールを簡便で安全に高収率で得ることができ、低コストで製造できるカプラゾールの製造方法の提供が強く望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００４／０６７５４４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／０１２６４３号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、カプラゾールを簡便で安全に高収率で得ることができ、低コストで製造できるカプラゾールの製造方法及び該カプラゾールを産生する微生物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の微生物において、ｃｐｚ２３遺伝子が、カプラゾールの３’’’位の水酸基と脂肪酸とのエステル化反応を触媒すること、前記ｃｐｚ２３遺伝子を欠損したストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の微生物の培養液中にはカプラゾールが好適に産生されることを知見し、本発明の完成に至った。
【０００９】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  下記構造式（１）で表される化合物を産生する能力を有する微生物であって、前記微生物がストレプトミセス  エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＭＫ７３０−６２Ｆ２−３−７（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−１１９６）であることを特徴とする微生物である。
【化１】
0005922936.tif 000002
＜２＞  下記構造式（１）で表される化合物を産生する能力を有するストレプトミセス  エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＭＫ７３０−６２Ｆ２−３−７（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−１１９６）を培養して前記構造式（１）で表される化合物を製造することを特徴とするカプラゾールの製造方法である。
【化２】
0005922936.tif 000003
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、カプラゾールを簡便で安全に高収率で得ることができ、低コストで製造できるカプラゾールの製造方法及び該カプラゾールを産生する微生物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１Ａは、ｐＵＣ１１８ａｐｒ−ｐｒｅ−ｐｏｓｔにおいて、ｐｒｅ配列及びｐｏｓｔ配列が挿入されていることを確認したアガロースゲル電気泳動の写真である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ｐＵＣ１１８ａｐｒ−ｐｒｅ−ｐｏｓｔにおいて、ｐｒｅ配列及びｐｏｓｔ配列が挿入されていることを確認したアガロースゲル電気泳動の写真である。
【図２】図２は、ｃｐｚ２３遺伝子破壊用プラスミドの作製方法の概略説明図である。
【図３Ａ】図３Ａは、ＭＫ７３０−６２Ｆ２株（野生株）とｃｐｚ２３欠損株との対比を示す概略説明図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ｃｐｚ２３欠損株において、ｃｐｚ２３遺伝子が欠損していることを確認したアガロースゲル電気泳動の写真である。
【図４】図４は、ｃｐｚ２３欠損株において、カプラザマイシンＢが産生されないことを確認したＨＰＬＣチャートの一例を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、ｃｐｚ２３欠損株において、カプラザマイシンＡ及び／又はカプラザマイシンＢが産生されないことを確認したＬＣ／ＭＳチャートの一例を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ｃｐｚ２３欠損株において、カプラゾールが産生されることを確認したＬＣ／ＭＳチャートの一例を示す図である。
【図６Ａ】図６Ａは、ｃｐｚ２３欠損株において、ｃｐｚ２３遺伝子発現用プラスミドの導入によりカプラザマイシンＡ及び／又はカプラザマイシンＢの産生性が回復することを確認したＬＣ／ＭＳチャートの一例を示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ｃｐｚ２３欠損株において、ｃｐｚ２３遺伝子発現用プラスミドの導入によりカプラゾールの産生が抑制されることを確認したＬＣ／ＭＳチャートの一例を示す図である。
【図７】図７は、ＭＫ７３０−６２Ｆ２株（野生株）、ｃｐｚ２３欠損株、及びｃｐｚ２３相補株におけるカプラゾールの産生量の経時的変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（微生物）
本発明の微生物は、ストレプトミセス  エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＭＫ７３０−６２Ｆ２−３−７（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−１１９６）である。前記微生物は、下記構造式（１）で表される化合物を産生する能力を有する。下記構造式（１）で表される化合物は、「カプラゾール」とも称する。下記構造式（１）で表される化合物は、好ましくは、下記構造式（２）で表される化合物である。
なお、前記ＭＫ７３０−６２Ｆ２−３−７は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に平成２４年１月１８日に受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−１１９６として受託された。
【化３】
0005922936.tif 000004
【化４】
0005922936.tif 000005
【００１３】
前記ＭＫ７３０−６２Ｆ２−３−７としては、前記カプラゾールを産生する能力を有する限り、例えば、前記ＭＫ７３０−６２Ｆ２−３−７に由来する突然変異株（例えば、紫外線、エックス線、放射線、薬品等の変異処理により取得できる人工変異株や、自然変異株）、形質接合体、遺伝子組換体なども本発明の微生物に含まれる。
【００１４】
前記微生物が前記カプラゾールを産生する能力を有することを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、該微生物の培養物、好ましくは培養上清中の成分中の前記カプラゾールを、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）法、液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）法等の各種分析法により検出する方法などが挙げられる。
【００１５】
（カプラゾールの製造方法）
本発明のカプラゾールの製造方法は、前記構造式（１）で表される化合物（カプラゾール）を産生する能力を有するストレプトミセス  エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＭＫ７３０−６２Ｆ２−３−７（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−１１９６）を培養して前記構造式（１）で表される化合物を製造する方法である。前記ＭＫ７３０−６２Ｆ２−３−７（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−１１９６）は、本発明の前記微生物である。
本発明のカプラゾールの製造方法によれば、カプラゾールを高収率で得ることができるだけでなく、少ない工程数で簡便に、かつ安全に低コストで得ることができる。
【００１６】
前記ＭＫ７３０−６２Ｆ２−３−７の培養方法としては、前記カプラゾールを産生することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＭＫ７３０−６２Ｆ２−３−７を栄養培地（以下、単に「培地」と称することがある）中に接種し、前記カプラゾールの産生に良好な温度で培養する方法などが挙げられる。
【００１７】
前記栄養培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、従来放線菌の培養に利用されている公知のものを使用することができ、液体培地であってもよく、寒天培地であってもよい。
前記栄養培地に添加する栄養源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、窒素源として、市販されている大豆粉、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、硫酸アンモニウムなどが使用でき、炭素源として、トマトペースト、グリセリン、でん粉、グルコース、ガラクトース、デキストリン、バクトソイトン等の炭水化物、脂肪などが使用できる。更に、食塩、炭酸カルシウム等の無機塩を培地に添加して使用することもでき、その他、必要に応じて微量の金属塩を培地に添加して使用することもできる。
これらの材料は、前記ＭＫ７３０−６２Ｆ２−３−７が利用し、前記カプラゾールの産生に役立つものであればよく、公知の培養材料は全て用いることができる。
【００１８】
前記カプラゾールの産生のための種母としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、寒天培地上や斜面培地上で前記ＭＫ７３０−６２Ｆ２−３−７を培養した生育物などを使用することができる。
【００１９】
前記培養の温度としては、前記ＭＫ７３０−６２Ｆ２−３−７の発育が実質的に阻害されずに、前記カプラゾールを産生しうる範囲であれば、特に制限はなく、使用する産生菌に応じて適宜選択することができるが、２５℃〜３５℃が好ましい。
前記培養の期間としては、特に制限はなく、前記カプラゾールの蓄積等に合わせて適宜選択することができる。
【００２０】
前記カプラゾールは、前記栄養培地で培養された培養物のまま使用されてもよいが、前記培養物から分離及び／又は精製されてもよい。
【００２１】
ここで、前記培養物としては、前記培養方法により得られ、前記カプラゾールを含むものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、菌体、培養上清、及びこれらの混合物などが挙げられる。これらの中でも、前記カプラゾールは、培養上清中に多く含まれる。
【００２２】
なお、前記培養物として、前記菌体を用いる場合は、適当な有機溶媒を用いた抽出方法や、菌体破砕による溶出方法などにより、前記カプラゾールを菌体から抽出し、これを分離及び／又は精製に供してもよい。
【００２３】
前記培養物から前記カプラゾールを分離及び／又は精製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、国際公開第２００４／０６７５４４号パンフレットに記載されたような前記カプラゾールの物理化学的性質に応じた方法、通常微生物の産生する代謝物を採取するのに用いられる方法などの中から適宜選択することができる。
前記分離及び／又は精製する方法の具体例としては、溶媒抽出法、各種吸着剤に対する吸着親和性の差を利用する方法、クロマトグラフィー法などが挙げられる。これらの方法を単独又は適宜組み合せて、場合によっては反復使用することにより、前記カプラゾールを分離及び／又は精製することができる。
【００２４】
前記溶媒抽出法に用いる溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酢酸エチル、ｎ−ブタノールなどが挙げられる。
【００２５】
前記吸着剤としては、特に制限はなく、公知の吸着剤の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリスチレン系吸着樹脂などが挙げられる。
前記吸着剤の市販品の具体例としては、アンバーライトＸＡＤ（ローム・アンド・ハース社製）、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学株式会社製）などが挙げられる。
【００２６】
前記クロマトグラフィー法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薄層クロマトグラフィー法、順相あるいは逆相カラムを用いた分取用高速液体クロマトグラフィー（分取ＨＰＬＣ）法などが挙げられる。
前記クロマトグラフィー法に用いる担体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゲル濾過、シリカゲル、アルミナ、活性炭などが挙げられる。
前記ゲル濾過クロマトグラフィー法に用いる担体の市販品の具体例としては、トヨパールＨＷ−４０Ｆ（東ソー株式会社製）、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ＬＨ−２０（ＧＥ社製）などが挙げられる。
【００２７】
前記吸着剤や前記クロマトグラフィーにおける担体から前記カプラゾールを溶出させる方法としては、特に制限はなく、該吸着剤や該担体の種類や性質等に応じて適宜選択することができる。例えば、ポリスチレン系吸着樹脂の場合には、溶出溶媒として、含水アルコール、含水アセトン等を用いて溶出する方法などが挙げられる。
【００２８】
前記培養物、若しくは前記分離及び／又は精製された前記カプラゾールは、更に洗浄や精製等の処理が施されてもよい。前記洗浄及び前記精製は、公知の方法で適宜行われる。
【実施例】
【００２９】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００３０】
（実施例１）
＜ｃｐｚ２３欠損株の作製＞
＜＜ｃｐｚ２３遺伝子破壊用プラスミドの作製＞＞
−ｐｒｅ配列の調製−
ＭＫ７３０−６２Ｆ２株（工業技術院生命工学工業技術研究所にブダペスト条約の規約下にＦＥＲＭ  ＢＰ−７２１８の受託番号で寄託）のゲノムＤＮＡを、実験書  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  Ｎｏｒｗｉｃｈ，  ＵＫ，  ＩＳＢＮ  ０−７０８４−０６２３−８に記載の方法に基づき調製した。
このゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号１で表されるプライマー配列ｃｐｚ２３  ｐｒｅ＿ｆｗ（５’末端側にＥｃｏＲＶサイトを有する）及び下記配列番号２で表されるプライマー配列ｃｐｚ２３  ｐｒｅ＿ｒｖ（３’末端側にＨｉｎｄＩＩＩサイトを有する）、並びにｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製；本実施例において、以下同様のものを使用した。）を用いてＰＣＲ（９５℃・５分間を１サイクル、９５℃・３０秒間、６５℃・３０秒間、及び７２℃・２分間を３０サイクル、７２℃・１０分間を１サイクル）を行った。
これにより、ＭＫ７３０−６２Ｆ２株のカプラザマイシン生合成遺伝子クラスター（日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）アクセッションナンバー  ＦＪ４９０４０９）におけるｃｐｚ２３遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に設定した除去配列の５’末端側から２，０００ｂｐの塩基配列（ＭＫ７３０−６２Ｆ２株のカプラザマイシン生合成遺伝子クラスターの５’末端側から１５，８６４塩基〜１７，８６３塩基）（以下、「ｐｒｅ配列」と称することがある）を増幅させた。前記ｐｒｅ配列は、配列番号３で表される塩基配列である。
［プライマー配列］
ｃｐｚ２３  ｐｒｅ＿ｆｗ：５’−ＧＧＧＧＡＴＡＴＣＧＡＣＣＧＴＧＴＧＴＴＧＴＴＣＡＣＣＧＴＣ−３’（配列番号１）
ｃｐｚ２３  ｐｒｅ＿ｒｖ：５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＴＴＣＧＧＧＧＣＣＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＣ−３’（配列番号２）
【００３１】
増幅させたｐｒｅ配列をプラスミド（ｐＴ７  Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ、Ｎｏｖａｇｅｎ製）に挿入した。以下、ｐｒｅ配列を挿入したプラスミドを「ｐＴ７  Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｐｒｅ」と称することがある。このｐＴ７  Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｐｒｅを用いて、コンピテントセル（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α、タカラバイオ株式会社製）の形質転換を行いクローニングし、大腸菌からアルカリ法でＤＮＡを抽出した。抽出したｐＴ７  Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｐｒｅのシーケンス解析を行い、ｐＴ７  Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｐｒｅに挿入されたｐｒｅ配列のＤＮＡ配列が正しいことを確認した。
【００３２】
このｐＴ７  Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｐｒｅを、ＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ株式会社製；本実施例において、以下同様のものを使用した。）及びＥｃｏＲＶ（タカラバイオ株式会社製；本実施例において、以下同様のものを使用した。）で同時消化した後、０．８質量％アガロースゲルで電気泳動した。次いで、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を使用し、製品のプロトコールに従ってｐｒｅ配列を切り出して取得した。
【００３３】
−ｐｏｓｔ配列の調製−
前記ｐｒｅ配列の調製において、プライマー配列ｃｐｚ２３  ｐｒｅ＿ｆｗ及びｃｐｚ２３  ｐｒｅ＿ｒｖを、下記配列番号４で表されるプライマー配列ｃｐｚ２３  ｐｏｓｔ＿ｆｗ（５’末端側にＨｉｎｄＩＩＩサイトを有する）及び下記配列番号５で表されるプライマー配列ｃｐｚ２３  ｐｏｓｔ＿ｒｖ（３’末端側にＥｃｏＲＶサイトを有する）に変えたこと以外は、前記ｐｒｅ配列のクローニングと同様の方法で、ＰＣＲを行った。
これにより、ＭＫ７３０−６２Ｆ２株のカプラザマイシン生合成遺伝子クラスター（日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）アクセッションナンバー  ＦＪ４９０４０９）におけるｃｐｚ２３遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に設定した除去配列の３’末端側から２，０００ｂｐの塩基配列（ＭＫ７３０−６２Ｆ２株のカプラザマイシン生合成遺伝子クラスターの５’末端側から１７，９６３塩基〜１９，９６２塩基）（以下、「ｐｏｓｔ配列」と称することがある）を増幅させた。前記ｐｏｓｔ配列は、配列番号６で表される塩基配列である。
［プライマー配列］
ｃｐｚ２３  ｐｏｓｔ＿ｆｗ：５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴＣＴＧＧＴＧＴＣＧＧＴＧＧＣＴ−３’（配列番号４）
ｃｐｚ２３  ｐｏｓｔ＿ｒｖ：５’−ＧＧＧＧＡＴＡＴＣＧＣＧＡＧＧＣＡＣＣＧＧＧＴＧＡＣＣＴＣＧ−３’（配列番号５）
【００３４】
−アプラマイシン耐性ｐＵＣ１１８（ｐＵＣ１１８ａｐｒ）の調製−
ｐＵＣ１１８ａｐｒ（公立大学法人  福井県立大学  生物資源学部  濱野吉十博士より供与、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｏｌｏｇｉｃａ，  ２００６，  ２０，  ３５−４１参照）をＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、両末端をＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて平滑化し、更にＢＡＰＣ７５（タカラバイオ株式会社製）で脱リン酸化した。次いで、脱リン酸化したｐＵＣ１１８ａｐｒを０．８質量％アガロースゲルで電気泳動し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてＨｉｎｄＩＩＩで切断されたｐＵＣ１１８ａｐｒを切り出して取得した。
【００３５】
−ｃｐｚ２３遺伝子破壊用プラスミドの作製−
前記ｐｒｅ配列と、前記ｐｏｓｔ配列と、前記ＨｉｎｄＩＩＩで切断されたｐＵＣ１１８ａｐｒとを混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションを行った（以下、「ｐＵＣ１１８ａｐｒ−ｐｒｅ−ｐｏｓｔ」と称することがある）。このｐＵＣ１１８ａｐｒ−ｐｒｅ−ｐｏｓｔを用いて、大腸菌（ＤＨ５α、タカラバイオ株式会社製）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬアンピシリン（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製；以下、同様のものを使用した。）を含むＬＢ寒天培地〔１．０質量％Ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ＢＤ製）、０．５質量％Ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（ＢＤ製）、０．５質量％塩化ナトリウム、１．５質量％Ｂａｃｔｏ  ａｇａｒ（ＢＤ製）、残部  水；以下、同様のものを使用した。〕に植菌し、３７℃で１８時間静置培養してコロニー（形質転換体）を形成させた。
【００３６】
得られたコロニーを鋳型とし、前記配列番号１で表されるプライマー配列ｃｐｚ２３  ｐｒｅ＿ｆｗ及び前記配列番号２で表されるプライマー配列ｃｐｚ２３  ｐｒｅ＿ｒｖ、並びにＧｏ  Ｔａｑ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いてコロニーＰＣＲ（９５℃・５分間を１サイクル、９５℃・３０秒間、６５℃・３０秒間、及び７２℃・２分間を３０サイクル、７２℃・１０分間を１サイクル）を行った。
ＰＣＲ産物を０．８質量％アガロースゲルで電気泳動したところ、ｐＵＣ１１８ａｐｒ−ｐｒｅ−ｐｏｓｔにおけるｐｒｅ配列の挿入が確認された。このコロニーからアルカリ法でＤＮＡを抽出し、ｐＵＣ１１８ａｐｒ−ｐｒｅ−ｐｏｓｔを取得した。
【００３７】
次に、ｐＵＣ１１８ａｐｒ−ｐｒｅ−ｐｏｓｔを鋳型とし、前記配列番号４で表されるプライマー配列ｃｐｚ２３  ｐｏｓｔ＿ｆｗ及び前記配列番号５で表されるプライマー配列ｃｐｚ２３  ｐｏｓｔ＿ｒｖ、並びにｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製）を用いてＰＣＲ（９５℃・５分間を１サイクル、９５℃・３０秒間、６５℃・３０秒間、及び７２℃・２分間を３０サイクル、７２℃・１０分間を１サイクル）を行った。ＰＣＲ産物を０．８質量％アガロースゲルで電気泳動したところ、ｐＵＣ１１８ａｐｒ−ｐｒｅ−ｐｏｓｔにおけるｐｏｓｔ配列の挿入が確認された。
【００３８】
また、ｐＵＣ１１８ａｐｒ−ｐｒｅ−ｐｏｓｔをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、０．８質量％アガロースゲルで電気泳動したところ、図１Ａに示すように、正しいサイズ（８．４ｋｂｐ）の１本の断片が確認された。更に、ｐＵＣ１１８ａｐｒ−ｐｒｅ−ｐｏｓｔをＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで同時消化し、０．８質量％アガロースゲルで電気泳動したところ、図１Ｂに示すように、２本の断片（５．１ｋｂｐと３．３ｋｂｐ）が確認された。
なお、図１Ａ及び図１Ｂにおいて、「Ｍ」は、λ−ＨｉｎｄＩＩＩマーカー（タカラバイオ株式会社製）を表す。また、図１Ａにおいて、「１」は、ｐＵＣ１１８ａｐｒ−ｐｒｅ−ｐｏｓｔの未消化のもの、「２」はｐＵＣ１１８ａｐｒ−ｐｒｅ−ｐｏｓｔをＨｉｎｄＩＩＩで消化したものであり、図１Ｂにおいて、「１」は、ｐＵＣ１１８ａｐｒ−ｐｒｅ−ｐｏｓｔをＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化したもの、「２」は、ｐＵＣ１１８ａｐｒ−ｐｒｅ−ｐｏｓｔの未消化のものである。
【００３９】
次に、ｐＵＣ１１８ａｐｒ−ｐｒｅ−ｐｏｓｔを脱メチル化するため、ｐＵＣ１１８ａｐｒ−ｐｒｅ−ｐｏｓｔを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＢＡＡ−５２５（ＡＴＣＣより入手）を形質転換し、この形質転換体を５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ液体培地〔１．０質量％Ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ＢＤ製）、０．５質量％Ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（ＢＤ製）、０．５質量％塩化ナトリウム、残部  水〕に植菌して３７℃で一晩振騰培養した。得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いて、脱メチル化したｐＵＣ１１８ａｐｒ−ｐｒｅ−ｐｏｓｔをプラスミド溶液として調製した。以下、ｐＵＣ１１８ａｐｒ−ｐｒｅ−ｐｏｓｔを「ｃｐｚ２３遺伝子破壊用プラスミド」と称することがある。ｃｐｚ２３遺伝子破壊用プラスミドの作製方法の概略説明図を図２に示す。
【００４０】
＜＜ＭＫ７３０−６２Ｆ２株へのｃｐｚ２３遺伝子破壊用プラスミドの導入と脱離＞＞
−ＭＫ７３０−６２Ｆ２株のプロトプラスト化−
ＭＫ７３０−６２Ｆ２株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２１８）をＴＳＢ液体培地〔３質量％Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  ｓｏｙａ  ｂｒｏｔｈ（ＯＸＯＩＤ製、残部  水）；本実施例において、以下同様のものを使用した。〕１０ｍＬに植菌し、３０℃で２日間振騰培養して前培養を行った。次いで、０．５質量％のグリシンを含むＲ２ＹＥ液体培地４０ｍＬに対して、前記前培養を行った前培養液を２質量％植菌し、２日間３０℃にて振騰培養を行った。
なお、前記Ｒ２ＹＥ液体培地は、下記組成のものを調製して使用した（本実施例において、以下同様のものを使用した）。
［Ｒ２ＹＥ液体培地］
Ｒ２ＹＥ液体培地は、下記組成Ａに水を添加し、８５０ｍＬとし、オートクレーブ滅菌後、下記組成Ｂを添加した。
［［組成Ａ］］
・スクロース  １０３ｇ
・硫酸カリウム  ０．２５ｇ
・グルコース  １０ｇ
・塩化マグネシウム  １０ｇ
・カザミノ酸  ０．１ｇ
・トレースエレメントソリューション（Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）＊１  ２ｍＬ
・酵母エキス（Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、ＢＤ製）  ５ｇ
・ＴＥＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、株式会社同仁化学研究所製）  ５．７３ｇ
［［組成Ｂ］］
・０．５質量％リン酸二水素カリウム  １０ｍＬ
・５Ｍ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）  ４ｍＬ
・２０質量％プロリン  １５ｍＬ
・１Ｎ水酸化ナトリウム  ７ｍＬ
［［Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ＊１］］
・塩化亜鉛  ４質量％
・塩化鉄（ＩＩＩ）６水和物（ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ）  ２０質量％
・塩化第２銅（ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）  １質量％
・塩化マンガン４水和物（ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）  １質量％
・ホウ砂（ＮａＢ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ）  １質量％
・７モリブデン酸６アンモニウム４水和物（（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ）  ４質量％
・水  残部
【００４１】
培養したＭＫ７３０−６２Ｆ２株を用いて、以下に示すプロトプラスト法の操作に従い、ＭＫ７３０−６２Ｆ２株のプロトプラスト化を行った。
ＭＫ７３０−６２Ｆ２株の培養液２０ｍＬを３，５００ｒｐｍにて４℃で１０分間遠心分離した後、上清を捨て、２０ｍＬの１０．３質量％スクロースに懸濁した。この懸濁液を３，５００ｒｐｍにて４℃で１０分間遠心分離した後、上清を捨て、１０ｍＬのＰ−Ｂｕｆｆｅｒに懸濁した。ここに、４ｍｇ／ｍＬのＬｙｓｏｚｙｍｅを含有するＰ−Ｂｕｆｆｅｒを１０ｍＬ加え、穏やかに混合した。３０℃で３０分間インキュベートした後、顕微鏡で観察し、ＭＫ７３０−６２Ｆ２株がプロトプラスト化したことを確認した。
インキュベート後の溶液を綿栓で濾過した。濾液を３，５００ｒｐｍにて４℃で１０分間遠心分離し、上清を捨てた。ＭＫ７３０−６２Ｆ２株の菌体を１０ｍＬのＰ−Ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、再び綿栓で濾過して、濾液を３，５００ｒｐｍにて４℃で１０分間遠遠心分離し、上清を捨てた。このプロトプラスト化したＭＫ７３０−６２Ｆ２株の菌体を回収し、１ｍＬのＰ−Ｂｕｆｆｅｒに懸濁して、プロトプラスト溶液を調製した。
なお、前記Ｐ−Ｂｕｆｆｅｒは、下記組成のものを調製して使用した（本実施例において、以下同様のものを使用した）。
［Ｐ−Ｂｕｆｆｅｒ］
Ｐ−Ｂｕｆｆｅｒは、下記組成Ｃに水を添加し、８０ｍＬとし、オートクレーブ滅菌後、下記組成Ｄを添加した。なお、組成Ｃにおいて、Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎは、Ｒ２ＹＥ液体培地と同様のものを使用した。
［［組成Ｃ］］
・スクロース  １０．３ｇ
・硝酸カリウム  ０．０２５ｇ
・塩化マグネシウム６水和物（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）  ０．２０２ｇ
・Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ＊１  ０．２ｍＬ
［［組成Ｄ］］
・５．７３質量％ＴＥＳ（ｐＨ７．２）  １０ｍＬ
・３．６８質量％塩化カルシウム２水和物（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）  １０ｍＬ
・０．５質量％リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）  １ｍＬ
【００４２】
−ＰＥＧ溶液の調製−
オートクレーブ滅菌した１．０ｇのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１４５０（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）に３．７５ｍＬのＰ−Ｂｕｆｆｅｒを加え、２５質量％ＰＥＧ溶液を作製した。
【００４３】
−ＭＫ７３０−６２Ｆ２株へのｃｐｚ２３遺伝子破壊用プラスミドの導入−
前記プロトプラスト溶液１００μＬに５μＬの前記プラスミド溶液（ｃｐｚ２３遺伝子破壊用プラスミドの溶液）を添加し、素早く２５質量％ＰＥＧ溶液を５００μＬ加えた。室温（約２５℃）で１分間静置した後、更にＰ−Ｂｕｆｆｅｒを８００μＬ加え、３００μＬずつＲ２ＹＥ寒天培地〔前記Ｒ２ＹＥ液体培地の組成ＡにおいてＡｇａｒ（ナカライテスク株式会社製）２２ｇを添加したもの；本実施例において、以下同様のものを使用した。〕に塗布した。これを３０℃で１６時間培養した後、１ｍＬの滅菌水に溶解したアプラマイシン（６００μｇ／ｍＬ）を重層して、更に３０℃で培養を続けた。培養後、コロニーを形成した形質転換体を取得した。
これを更に２５μｇ／ｍＬアプラマイシン（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製；本実施例において、以下同様のものを使用した。）を含むＴＳＢ寒天培地〔３質量％Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  ｓｏｙａ  ｂｒｏｔｈ（ＯＸＯＩＤ製）、３質量％Ａｇａｒ  ｐｏｗｄｅｒ（ナカライテスク株式会社製）、残部  水；本実施例において、以下同様のものを使用した。〕に植え継ぎ、３０℃にて２日間培養し、アプラマイシン耐性を獲得したプラスミド導入株（以下、「ａｐｒ耐性ＭＫ７３０−６２Ｆ２株」と称することがある）を取得した。
【００４４】
−ａｐｒ耐性ＭＫ７３０−６２Ｆ２株からのｃｐｚ２３遺伝子破壊用プラスミドの脱離−
前記ａｐｒ耐性ＭＫ７３０−６２Ｆ２株を、２５μｇ／ｍＬアプラマイシン及び０．５質量％のグリシンを添加したＲ２ＹＥ液体培地２０ｍＬに植菌し、３０℃にて２日間振騰培養した。
前記ＭＫ７３０−６２Ｆ２株のプロトプラスト化において、ＭＫ７３０−６２Ｆ２株の培養液２０ｍＬを、前記ａｐｒ耐性ＭＫ７３０−６２Ｆ２株を前記条件で２日間培養した培養液２０ｍＬに変えたこと以外は、前記ＭＫ７３０−６２Ｆ２株のプロトプラスト化と同様の方法で、ａｐｒ耐性ＭＫ７３０−６２Ｆ２株のプロトプラスト化を行い、プロトプラスト溶液を調製した。
前記プロトプラスト溶液１ｍＬを採取し、前記Ｐ−Ｂｕｆｆｅｒで１０−１倍〜１０−５倍希釈した希釈液を用い、３００μＬをＲ２ＹＥ寒天培地に塗布し、３０℃で２日間培養した。得られたシングルコロニーをＴＳＢ寒天培地に植え継ぎ、３０℃で２日間培養した。ＴＳＢ寒天培地に植え継いだコロニーを更に２５μｇ／ｍＬアプラマイシンを添加したＴＳＢ寒天培地に植菌し、３０℃で２日間培養して、アプラマイシン耐性遺伝子を欠損したＭＫ７３０−６２Ｆ２株（以下、「ｃｐｚ２３欠損株」と称することがある）を取得した。
なお、前記ｃｐｚ２３欠損株は、ＭＫ７３０−６２Ｆ２−３−７として、独立行政法人製品評価技術基盤機構に平成２４年１月１８日に受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−１１９６で受託された。
【００４５】
下記配列番号７で表されるプライマー配列ｃｐｚ２３＿ｆｗ及び下記配列番号８で表されるプライマー配列ｃｐｚ２３＿ｒｖ、並びにＧｏ  Ｔａｑ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いてコロニーＰＣＲ（９５℃・５分間を１サイクル、９５℃・３０秒間、６５℃・３０秒間、及び７２℃・１分間を３０サイクル、７２℃・１０分間を１サイクル）を行った。
また、前記コロニーＰＣＲの際、同時にポジティブコントロールとして前記ｃｐｚ２３遺伝子破壊用プラスミド、及びネガティブコントロールとしてＭＫ７３０−６２Ｆ２株のゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行った。
各ＰＣＲ産物の半量をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、このＨｉｎｄＩＩＩで消化したＰＣＲ産物と、未消化のＰＣＲ産物とをそれぞれ０．８質量％アガロースゲルで電気泳動を行った。
［プライマー配列］
ｃｐｚ２３＿ｆｗ：５’−ＧＴＧＡＡＧＴＣＧＴＴＧＡＣＧＣＡＣＧＧＣＧＡＧＧ−３’（配列番号７）
ｃｐｚ２３＿ｒｖ：５’−ＧＴＴＣＡＴＣＣＧＡＧＧＣＡＣＴＴＣＣＧＧＡＴＧＣ−３’（配列番号８）
【００４６】
図３Ａに示すように、前記ｃｐｚ２３欠損株において、ＰＣＲ産物がＨｉｎｄＩＩＩによって切断されれば、ｃｐｚ２３遺伝子が欠損していることが確認できる。
前記アガロースゲル電気泳動の結果を図３Ｂに示す。この結果より、前記ｃｐｚ２３欠損株において、ｃｐｚ２３遺伝子が破壊されていることが確認された。
なお、図３Ｂにおいて、「１」は、未消化のｃｐｚ２３欠損株、「２」は、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｃｐｚ２３欠損株、「３」は、未消化のポジティブコントロール、「４」は、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したポジティブコントロール、「５」は、未消化のネガティブコントロール、「６」は、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したネガティブコントロール、「Ｍ」は分子量マーカー（φＸ１７４  ＨｉｎｃＩＩマーカー、タカラバイオ株式会社製）をそれぞれ示す。
【００４７】
（試験例１）
＜ｃｐｚ２３欠損株の解析＞
＜＜ＨＰＬＣによる分析＞＞
ＭＫ７３０−６２Ｆ２株（野生株）と、ｃｐｚ２３欠損株とをそれぞれＴＳＢ培地に植菌し、３０℃で２日間振騰培養して前培養を行った。この前培養液をＣＰＺ培地〔２．４質量％トマトペースト（商品名：トマトペースト、カゴメ株式会社製）、２．４質量％デキストリン（関東化学株式会社製）、１．２質量％Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（オリエンタル酵母工業株式会社製）、０．０００６質量％塩化コバルト（ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、残部  水；本実施例において、以下同様のものを使用した。〕に２体積％植菌し、２７℃で６日間振騰培養して本培養を行った。この本培養液を５，０００ｒｐｍにて４℃で１０分間遠心分離し、上清を捨て、菌体のみを回収した。菌体に１００ｍＬのメタノールを加え、常温で一晩静置して抽出を行った。これを濾紙（ＦＩＬＴＥＲ  ＰＡＰＥＲ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）で濾過して菌体を取り除き、得られた濾液をエバポレーターで濃縮した。残渣を少量の水に懸濁して回収した後、分液漏斗を用いて２００ｍＬのクロロホルムによる抽出を行った。回収したクロロホルム層をエバポレーターによって揮発させた。残渣を少量のメタノールで溶解させて回収し、減圧化でメタノールを揮発させ、乾燥状態の抽出物を得た。得られた抽出物をメタノールに懸濁して回収した後、１０ｍＬに定容して、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用のサンプルとした。
このＨＰＬＣ用のサンプルと、メタノールに懸濁して０．１６ｍｇ／ｍＬに調製したカプラザマイシンＢ標品とを用い、それぞれ下記条件にて高速液体クロマトグラフィーによる分析を行った。
なお、前記カプラザマイシンＢ標品は、国際公開第０１／０１２６４３号パンフレット、「抗生物質カプラザマイシン類およびその製造法」に記載の方法に従って製造した。カプラザマイシンＢ標品としては、以下の試験例においても同様のものを使用した。
［ＨＰＬＣ条件］
・ポンプ：ＰＵ−２０８９  Ｐｌｕｓ（日本分光株式会社製）
・ＰＤＡ検出器：ＭＤ−２０１０  Ｐｌｕｓ（日本分光株式会社製）
・オートサンプラ：ＡＳ−２０５７  Ｐｌｕｓ（日本分光株式会社製）
・コントローラー：ＬＣ−Ｎｅｔ  ＩＩ／ＡＤＣ（日本分光株式会社製）
・カラム：ＰＥＧＡＳＩＬ  ＯＤＳ  ＳＰ１００（内径：４．６ｍｍ、長さ：２５０ｍｍ、株式会社センシュー科学製）
・ＵＶ−ＶＩＳ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ：２６０ｎｍ
・流速：０．１ｍＬ／分間
・溶媒：〔Ａ溶媒〕０．１質量％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）−アセトニトリル溶液
〔Ｂ溶媒〕０．１質量％ＴＦＡ水溶液
・溶出条件：Ａ溶媒の２体積％から９８体積％の直線グラジエントで３０分間、次いで９８体積％のＡ溶媒で１５分間、次いで２体積％Ａ溶媒で１５分間。
【００４８】
ＨＰＬＣで分析した結果を図４に示す。この結果より、ｃｐｚ２３欠損株では、カプラザマイシンＢの産生が確認されなかった。
【００４９】
＜＜ＬＣ／ＭＳによる分析＞＞
ＭＫ７３０−６２Ｆ２株（野生株）とｃｐｚ２３欠損株をＴＳＢ液体培地に植菌し、３０℃で２日間振騰培養して前培養を行った。この前培養液をＣＰＺ培地に２体積％植菌し、２７℃で６日間振騰培養して本培養を行った。この本培養液１００ｍＬに対して２００ｍＬのアセトンを加え、常温で一晩静置して抽出を行った。これを濾紙（ＦＩＬＴＥＲ  ＰＡＰＥＲ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）で濾過して菌体や不溶物を取り除き、得られた濾液をエバポレーターで濃縮した。残渣を少量の水に懸濁して回収した後、２０ｍＬに定容して、液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）用のサンプルとした。このＬＣ／ＭＳ用サンプルと、メタノールに懸濁して０．１６ｍｇ／ｍＬに調製した前記カプラザマイシンＢ標品又はカプラゾール標品とを用い、下記条件にてＬＣ／ＭＳによる分析を行った。
なお、前記カプラゾール標品は、国際公開第２００４／０６７５４４号パンフレット「新規化合物カプラゼンとカプラゼン誘導体、ならびに新規化合物カプラゾールとカプラゾール誘導体」に記載の方法に従って製造した。カプラゾール標品としては、以下の試験例においても同様のものを使用した。
［ＬＣ／ＭＳ条件］
・装置：ＡＰＩ３０００（アプライドバイオシステムズ製）
・カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ  ＡＲ−５（内径：２．０ｍｍ、長さ：１５０ｍｍ、野村化学株式会社製）
・流速：０．２ｍＬ／分間
・溶媒：〔Ａ溶媒〕０．１質量％無水ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）−アセトニトリル溶液
〔Ｂ溶媒〕０．１質量％ＨＦＢＡ水溶液
・溶出条件：Ａ溶媒の２体積％から９８体積％の直線グラジエントで３０分間、次いで９８体積％のＡ溶媒で１５分間、次いで２体積％Ａ溶媒で１５分間。
【００５０】
ＬＣ／ＭＳで分析した結果、図５Ａ及び図５Ｂに示すように、ｃｐｚ２３欠損株は、カプラザマイシンＡ及びカプラザマイシンＢの産生性が完全に失われていた（図５Ａ）。一方、ｃｐｚ２３欠損株は、カプラザマイシンの３’’’位のアシル基が脱離して水酸基に変換された前記構造式（１）で表される化合物（カプラゾール）の産生が確認された（図５Ｂ）。このことから、ｃｐｚ２３遺伝子がカプラザマイシン生合成に関与していることが明らかとなった。
また、ＭＫ７３０−６２Ｆ２株（野生株）においては、カプラザマイシンＡ及びカプラザマイシンＢの産生に加えて、カプラゾールの産生が若干確認されたが、カプラゾールの産生量は、ｃｐｚ２３欠損株による産生量よりも明らかに少なかった（図５Ｂ）。
なお、ＭＫ７３０−６２Ｆ２株（野生株）では、カプラザマイシンＢと共にカプラザマイシンＢの異性体であるカプラザマイシンＡが産生されることが知られている（国際公開第０１／０１２６４３号パンフレット参照）。それを裏付けるように、試験例１においても、図５Ａに示すＬＣ／ＭＳによるピークから判断して、ＭＫ７３０−６２Ｆ２株（野生株）では、カプラザマイシンＡとカプラザマイシンＢの産生が認められた。
【００５１】
（試験例２）
＜ｃｐｚ２３相補株の作製及び分析＞
ｃｐｚ２３欠損株におけるカプラザマイシン産生性の欠損やカプラゾール産生量の増加といった変化が、ｃｐｚ２３遺伝子の欠損のみによるものかどうかを検証するために、下記に示す方法でｃｐｚ２３欠損株にｃｐｚ２３遺伝子発現用プラスミドを導入したｃｐｚ２３相補株を作製し、カプラザマイシンの産生性が回復するかどうかを検証した。
【００５２】
＜＜ｃｐｚ２３遺伝子の調製＞＞
ＭＫ７３０−６２Ｆ２株（野生株）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号９で表されるプライマー配列ｃｐｚ２３ｐ＿ｆｗ（５’末端側にＨｉｎｄＩＩＩサイトを有する）及び下記配列番号１０で表されるプライマー配列ｃｐｚ２３ｐ＿ｒｖ（３’末端側にＸｂａＩサイトを有する）、並びにｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製）を用いてＰＣＲ（９５℃・５分間を１サイクル、９５℃・３０秒間、６５℃・３０秒間、及び７２℃・１分間を３０サイクル、７２℃・１０分間を１サイクル）を行い、ｃｐｚ２３遺伝子の上流（５’末端側）１２０ｂｐから終始コドンまでの配列（ｃｐｚ２３遺伝子配列）を増幅した。
［プライマー配列］
ｃｐｚ２３ｐ＿ｆｗ：５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＣＧＧＧＡＧＧＡＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣ−３’（配列番号９）
ｃｐｚ２３ｐ＿ｒｖ：５’−ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＴＴＣＡＴＣＣＧＡＧＧＣＡＣＴＴＣＣＧＧ  −３’（配列番号１０）
【００５３】
増幅した断片を、実施例１と同様の方法でｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ製）にクローニングした後、増幅したｃｐｚ２３遺伝子の塩基配列が正しいことを確認した。
次に、クローニングしたプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで同時消化した後、０．８質量％アガロースゲルで電気泳動した。次いで、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を使用し、製品のプロトコールに従ってｃｐｚ２３遺伝子配列を切り出して取得した。
【００５４】
ｐＳＥ１０１（Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １９９５，  ５９，  １８３５−１８４１に記載の方法で調製）をＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ（タカラバイオ株式会社製）で消化した。このＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩサイトに、前記増幅したｃｐｚ２３遺伝子相配列をＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションを行った（以下、「ｃｐｚ２３遺伝子発現用プラスミド」と称することがある）。このライゲーションサンプル（ｃｐｚ２３遺伝子発現用プラスミド）を１６℃で２時間インキュベートした後、コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α、タカラバイオ株式会社製）に加えて、形質転換を行った。これを５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で１８時間静置培養してコロニー（形質転換体）を形成させた。前記形質転換体からＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドを調製し、これを「ｃｐｚ２３遺伝子発現用プラスミド」とした。
【００５５】
実施例１のＭＫ７３０−６２Ｆ２株へのｃｐｚ２３遺伝子破壊用プラスミドの導入において、ＭＫ７３０−６２Ｆ２株をｃｐｚ２３欠損株に変え、かつ、ｃｐｚ２３遺伝子破壊用プラスミド溶液を、ｃｐｚ２３遺伝子発現用プラスミド溶液に変えたこと以外は、ＭＫ７３０−６２Ｆ２株へのｃｐｚ２３遺伝子破壊用プラスミドの導入と同様の方法で、ｃｐｚ２３欠損株に対して強制的にｃｐｚ２３遺伝子を発現させた株（以下、「ｃｐｚ２３相補株」と称することがある）を取得した。
【００５６】
＜＜ｃｐｚ２３相補株の分析＞＞
取得したｃｐｚ２３相補株と、実施例１のｃｐｚ２３欠損株と、ＭＫ７３０−６２Ｆ２株（野生株）とをそれぞれＴＳＢ液体培地に植菌し、３０℃で２日間振盪培養して前培養を行った。この前培養液をＣＰＺ培地に２体積％植菌し、２７℃で６日間振盪培養して本培養を行った。なお、ｃｐｚ２３相補株のみは、前培養と本培養どちらにも３０μｇ／ｍＬチオストレプトン（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を添加したものを使用した。この本培養液１００ｍＬに対して、それぞれ２００ｍＬのアセトンを加え、常温で一晩静置して抽出を行った。これを濾紙（ＦＩＬＴＥＲ  ＰＡＰＥＲ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）で濾過して菌体や不溶物を取り除き、得られた濾液をエバポレーターで濃縮した。残渣を少量の水に懸濁して回収した後、２０ｍＬに定容して、ＬＣ／ＭＳ用サンプルとした。このＬＣ／ＭＳ用サンプルを用い、下記条件にてＬＣ／ＭＳによる分析を行った。
【００５７】
ＬＣ／ＭＳで分析した結果、図６Ａ及び図６Ｂに示すように、ｃｐｚ２３相補株においてカプラザマイシンＡ及びカプラザマイシンＢの産生性の回復が確認された（図６Ａ）。また、ｃｐｚ２３相補株におけるカプラゾールの産生量は、ｃｐｚ２３欠損株よりも大幅に減少しており、ＭＫ７３０−６２Ｆ２株（野生株）よりやや少ない程度であった（図６Ｂ）。このことから、ｃｐｚ２３欠損株におけるカプラザマイシン産生性の欠損とカプラゾール産生量の増加といった変化がｃｐｚ２３遺伝子の破壊のみによるものであることが確認できた。
【００５８】
（試験例３）
＜カプラゾール産生量の経時変化＞
ＭＫ７３０−６２Ｆ２株（野生株）と、ｃｐｚ２３欠損株と、ｃｐｚ２３相補株とにおけるカプラゾール産生量をより正確に比較するために、以下に示す方法で培養日数ごとに各菌株のカプラゾール産生量を定量した。
【００５９】
ＭＫ７３０−６２Ｆ２株（野生株）と、ｃｐｚ２３欠損株と、ｃｐｚ２３相補株とをそれぞれＴＳＢ液体培地に植菌し、３０℃で２日間振盪培養して前培養を行った。各菌株でＣＰＺ培地１００ｍＬ入りのバッフル付き三角フラスコを３本ずつ用意し、前記前培養した前培養液を２体積％植菌して２７℃にて６日間振盪培養して本培養を行った。
培養日数１日ごとにそれぞれの三角フラスコから培養液を０．５ｍＬずつ採取し、それらにアセトンを１．０ｍＬずつ添加して４℃にて保存しておいた。本培養は、６日間行った。
【００６０】
６日間全てのアセトンを含む培養液を１５，０００ｒｐｍにて４℃で１分間遠心分離し、得られた上清を液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）用サンプルとし、下記条件にてＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる分析を行った。
なお、このとき、前記カプラゾール標品（試験例１で製造したもの）を蒸留水に懸濁して、０．０８５ｎｇ、０．８５ｎｇ、４．２５ｎｇ、８．５ｎｇ、及び８５ｎｇに調製したものも下記条件にてＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析し、ｍ／ｚ３３３．３のフラグメントイオンのピーク面積をもとに検量線を作成した。
この検量線を利用して各ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ用サンプル（培養したサンプル）のピーク面積から培養液１Ｌ当たりのカプラゾール産生量を算出した。
［ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件］
・装置：ＡＰＩ３０００（アプライドバイオシステムズ製）
・カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ  ＡＲ−５（内径：２．０ｍｍ、長さ：１５０ｍｍ、野村化学株式会社製）
・流速：０．２ｍＬ／分間
・溶媒：〔Ａ溶媒〕０．１質量％ＨＦＢＡ−アセトニトリル溶液
〔Ｂ溶媒〕０．１質量％ＨＦＢＡ水溶液
・溶出条件：Ａ溶媒の２体積％から５０体積％の直線グラジエントで１５分間、次いで９８体積％のＡ溶媒で１０分間、次いで２体積％Ａ溶媒で１０分間。
【００６１】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析した結果、図７に示すように、培養３日目の時点で、ｃｐｚ２３欠損株とＭＫ７３０−６２Ｆ２株（野生株）のカプラゾール産生量に大きな差が生じた。培養６日目には、ｃｐｚ２３欠損株におけるカプラゾール産生量は、ＭＫ７３０−６２Ｆ２株（野生株）のおよそ３倍となり、培養液１Ｌ当たりで最大約１０ｍｇのカプラゾールを産生していることが確認できた。一方、ｃｐｚ２３相補株でのカプラゾール産生量は６日間を通して、ＭＫ７３０−６２Ｆ２株（野生株）の産生量に近くなっていることが確認された。
【受託番号】
【００６２】
ＮＩＴＥ  Ｐ−１１９６
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の新規微生物及びカプラゾールの製造方法は、カプラゾールを簡便で安全に高収率で得ることができ、低コストで製造できるため、結核菌をはじめとする各種細菌に対して優れた抗菌活性を示すカプラゾール誘導体の製造などに好適に利用可能である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【配列表】
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