(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ１アデノシン受容体均一時間分解蛍光（ＴＲＦ）アッセイを用いてサンプル中のリポ多糖（ＬＰＳ）レベルを測定する方法であって、それぞれドナーまたはアクセプターフルオロフォアに抱合された２つの異なる部分の結合、ドナーフルオロフォアの励起、ドナーフルオロフォアによる光の吸収、ドナーおよびアクセプターフルオロフォア間の共鳴エネルギー移動、ならびに共鳴エネルギー移動によって生じた時間分解蛍光を用いる方法であり、
ａ）Ａ１アデノシン受容体タンパク質源を選択すること；
ｂ）  ｉ．  タグ；
ｉｉ．  代謝標識；
ｉｉｉ．  タンパク質標識；
ｉｖ．  タグ、代謝標識、またはタンパク質標識についての抗体；
ｖ．  Ａ１アデノシン受容体タンパク質またはペプチドについての抗体；
ｖｉ．  Ａ１アデノシン受容体タンパク質またはペプチド；
ｖｉｉ．  Ａ１アデノシン受容体シグナル伝達経路のタンパク質またはペプチド；
ｖｉｉｉ．  Ａ１アデノシン受容体シグナル伝達経路のタンパク質またはペプチドに対する抗体；
ｉｘ．  Ａ１アデノシン受容体リガンド；
ｘ．  シグナル伝達分子；
ｘｉ．  Ａ１アデノシン受容体シグナル伝達経路の分子；
ｘｉｉ．  Ａ１アデノシン受容体シグナル伝達経路の分子に対する抗体；および
ｘｉｉｉ．  Ａ１アデノシン受容体シグナル伝達経路において測定されうる分子；
からなる群から選択される異なる部分とそれぞれ結合したドナーおよびアクセプターＴＲＦフルオロフォアを選択すること；ならびに
ｃ）Ａ１アデノシン受容体タンパク質源；それぞれ異なる選択された部分と結合したドナーおよびアクセプターＴＲＦフルオロフォア；ならびにサンプルを利用して、
ｉ．アッセイにＡ１アデノシン受容体タンパク質源を添加すること；
ｉｉ．サンプルを添加すること；
ｉｉｉ．それぞれ異なる選択された部分と結合したドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォアを添加すること；
ｉｖ．アッセイをインキュベーションすること；ならびに
ｖ．励起ならびにドナーおよびアクセプターフルオロフォア間の共鳴エネルギー移動後、時間分解蛍光を読み取ること
を含む様式にて均一ＴＲＦアッセイを行うこと
を含む方法。
【請求項２】
ドナーおよびアクセプターフルオロフォアがグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、Ａ１アデノシン受容体タンパク質またはペプチド、Ａ１アデノシン受容体タンパク質またはペプチドについての抗体、タグ、タンパク質標識、タグまたはタンパク質標識に対する抗体、トロンボキサン、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、およびトロンボキサンまたはｃＡＭＰに対する抗体からなる群から選択される異なる部分とそれぞれ結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ａ１アデノシン受容体が細胞内または細胞膜上で発現している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
サンプルが生物学的サンプルである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
サンプル中のＬＰＳレベルが定性的測定値である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
サンプル中のＬＰＳレベルが定量的測定値である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
サンプル中のＬＰＳレベルが、均一ＴＲＦアッセイおよび既知濃度のＬＰＳを含有するサンプルを使用して作成したＬＰＳ標準曲線から得られるものであり、サンプルの時間分解蛍光を読み取り、それをＬＰＳ標準曲線についての時間分解蛍光測定値と比較し、サンプル中のＬＰＳレベルを決定することによって得られる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、
ａ）Ａ１アデノシン受容体タンパク質源；
ｂ）少なくとも１つのフルオロフォア；および
ｃ）ＬＰＳ標準
を含むキット。
【請求項９】
フルオロフォアがＧＴＰにキレートされているランタニドフルオロフォアである、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
ランタニドがユーロピウムである、請求項９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１０年９月１５日に出願された米国仮出願第６１／３８２，９９０号の優先権を主張するものであって、その全体において参照することによって本明細書に包含される。
【０００２】
著作権表示
この特許の開示の一部は、著作権保護の対象である材料を含有する。著作権所有者は、特許商標庁の特許ファイルまたは記録に現れる場合に何人かによる特許文献または特許開示の複製に対する異議を唱えることはできないが、それ以外はいかなるものであっても全著作権を保有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
発明の分野
本発明は、リポ多糖（ＬＰＳ）の測定のための使用方法、ならびに敗血症およびＬＰＳ関連状態の診断のための使用方法に関する。特に、本発明は、ＬＰＳの測定のための時間分解蛍光（ＴＲＦ）ベースのアッセイ、ならびに敗血症およびＬＰＳ関連状態を診断するためのＬＰＳの測定のための使用方法に関する。
【０００４】
関連技術の記載
リポ多糖（ＬＰＳ）はグラム陰性細菌の外壁の主要成分であり、炎症性サイトカインの放出を含む免疫応答を誘導することができる。十分に高い濃度では、ＬＰＳは敗血症、敗血症ショック、および臓器障害を生じるメディエーターの放出を誘導することができる。それゆえ、ＬＰＳは敗血症の重要なバイオマーカーとして機能しうる。さらに、ＬＰＳは発熱物質、すなわち熱誘発物質として作用しうる。さらに、臓器、例えば眼、膀胱、もしくは耳の中のグラム陰性細菌感染から放出されたＬＰＳ、または腸内のグラム陰性細菌から放出された血漿中に循環しているＬＰＳは、膀胱炎、中耳炎、またはアルツハイマー病を含むＬＰＳ関連状態の原因となりうる。
【０００５】
現在、しばしばエンドトキシンと呼ばれるＬＰＳを測定するためのＦＤＡに認可された試験は２つのみである。リムルスアメボサイトライセート（Limulus amebocyte lysate（ＬＡＬ））アッセイは、ヒトおよび動物の非経口薬物、生物学的製剤、ならびにヒト使用のためのＦＤＡクリアランス用医療機器におけるＬＰＳ／エンドトキシンの検出用にＦＤＡに認可されている。しかしながら、工業溶液、例えばヒト使用のためのＦＤＡに認可された製剤および血液製剤中のＬＰＳを測定するためのＬＡＬ試験と関連する高い固有の誤り率がある。さらに、ＬＡＬエンドトキシン試験は、ヒト使用のためのこれらの製剤のクリアランスのための信頼性の低いウサギ発熱物質試験の使用を必要とする生物学的製剤、例えば抗体中のＬＰＳを測定するには適していない。さらに、偽陽性および偽陰性試験結果をもたらすＬＡＬ  ＬＰＳ／エンドトキシン試験を増強または阻害する多数の妨害物質が血液中に存在しているため、この試験は、敗血症の危険性があり、または敗血症を患う患者の血液中のＬＰＳ／エンドトキシンを検出または測定するための臨床診断用としてＦＤＡに認可されていない。
【０００６】
スペクトラル・ダイアグノスティス社（トロント、カナダ）は、そのＬＰＳ／エンドトキシンアッセイ、エンドトキシン・アクティビティ・アッセイ（ＥＡＡ（商標））を市販するためのＦＤＡ認可を受けている。このエンドトキシンアッセイは、血中のＬＰＳ／エンドトキシンのレベルの指標としての好中球からの酸素ラジカル放出を測定する化学発光試験である。この試験は特異性が欠如し得、さらに全血における使用に限定されている。
【０００７】
敗血症は、最も大きな未だ対処されていない医学的ニーズの１つである。敗血症は、急速にショック、臓器不全、および死をもたらしうる感染に対する抗し難い全身性応答によって特徴付けられる医学症候群である。米国では、敗血症は全体で１０番目に多い死因であり、毎年７５０，０００件以上の症例、２１５，０００名の死亡、および１７０億ドルの医療費を占めている（Angus et al., Crit Care Med 29:1303-1310; 2001）。さらに、敗血症の発生率は、集団の年齢増加、免疫力がない患者数の増加、生命維持技術の使用、および抗菌剤に対する細菌の耐性増加のために上昇しうる。さらに、クリティカル・ケア・メディシンの進歩、抗生物質の改善、およびイーライ・リリー・アンド・カンパニー社の抗敗血症治療薬ザイグリス（Ｘｉｇｒｉｓ（登録商標））の認可にもかかわらず、敗血症による死亡率は５０年以上にわたって本質的に変わっていない。今日、敗血症の治療は、抗生物質、感染が疑わしい部位の外科的ドレナージ、心臓および血圧を支えるための変力物質および昇圧剤、ならびに集中治療室（ＩＣＵ）における支持療法、例えば人工呼吸を含む。新たな抗菌剤および改善された支持療法が利用できるにもかかわらず、重度敗血症および敗血症ショックの死亡率は３０〜６０％と高いままであり、敗血症を乗り切る患者の長期予後は芳しくない。これらの悲観的な統計は、敗血症に対するこの従来のアプローチへの追加療法（補助的療法）、すなわち、ショック、多臓器機能障害および不全症、ならびに死をもたらす敗血症事象の複雑なカスケードを妨害する治療の必要性を示唆している。
【０００８】
ＦＤＡに最初に認可された敗血症用の補助的治療は、２００１年１１月に認可された。イーライ・リリーによって開発および販売されているこの薬物、ザイグリス（Ｘｉｇｒｉｓ）（ドロトレコギンアルファ［活性化］、組換えヒト活性化タンパク質Ｃ）は、敗血症の終末事象、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、すなわち重度のびまん性出血をもたらす血中凝固の異常を標的にしている。その最も信頼のおける大規模臨床試験において、ザイグリス（Ｘｉｇｒｉｓ）は、プラセボと比較して、絶対的死亡率をほんの６％減少させたに過ぎなかった（Bernard et al., New Eng J Med 344:699-709, 2001）。さらに、ザイグリス（Ｘｉｇｒｉｓ）は高価であり、出血の重篤な有害副作用を有している。安全かつ効果的な抗敗血症治療薬についての未だ対処されていない医学的ニーズのために、多数の他の製薬会社が、抗エンドトキシン、抗サイトカイン、および他の抗敗血症治療を含む補助的抗敗血症治療の開発を試みては失敗している。これらの試みは、多数の理由のために、予後における有益な効果の実証に失敗している。これらの失敗の第一の理由は、これらの臨床試験における治療について患者を正しく同定／階層化するための高感度で特異的なバイオマーカー／診断法の欠如であった。現在、敗血症を患い、もしくは敗血症の危険性がある患者を同定するための、信頼できる高感度で特異的なバイオマーカー、または敗血症を治療するための安全かつ効果的な抗敗血症治療薬はない。
【０００９】
プロカルシトニンおよびＣ反応性タンパク質を含む敗血症についての１７０種以上の異なるバイオマーカーが、臨床試験において評価されてきた；しかしながら、これらのバイオマーカーおよびそれらの診断試験は、医師が敗血症を診断し、特定の抗敗血症治療について患者を同定／階層化するためのルーチン的な臨床使用のための、または臓器傷害および生存、ならびに治療応答についての予後の指標として使用するための感度または特異性を欠いている（Pierrakos and Vincent, Critical Care 14:R15 - R33, 2010）。これまで、患者が敗血症を患っていると同定するための信頼できる臨床診断法またはバイオマーカーはなく、その結果、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）の非特異的徴候および症状を呈する患者が、敗血症と疑われる者に含まれることになっている。ＳＩＲＳを患う全患者が感染しているわけではない。現在、敗血症を診断するために陽性細菌血液培養ドキュメンティング菌血症（positive bacterial blood culture documenting bacteremia）が一般的に用いられる；しかしながら、この試験は信頼できるものではなく、敗血症と疑われる症例の３０％未満で陽性の結果を与える。
【００１０】
ＥＡＡは現在、敗血症が疑われる患者におけるＬＰＳ／エンドトキシンの検出および測定のための臨床診断法としてＦＤＡに認可されている。このエンドトキシンアッセイは、補体オプソニン化ＬＰＳ−ＩｇＭ免疫複合体を介した好中球からの酸素ラジカル放出を測定する化学発光試験である。これらの免疫複合体の存在下でのルミノール反応は、光エネルギーを放射する。ルミノメーターによって測定される相対発光量（ＲＬＵ）は、血液サンプル中のＬＰＳの尺度であり、全可能活性（０〜１００％）ＥＡ値のパーセンテージとして表される。ヒトでは、このＬＰＳアッセイを使用した場合に、０.４０未満のＥＡ値はグラム陰性感染がないことを支持し、より高いＥＡ値（＞０.５９）はＩＣＵ中にいる間の死亡の危険性の増加と関連する。このＥＡＡ  ＬＰＳ試験は特異性が欠如していると信じられている；使用も全血に限定されており、血液が採取された直後にその場で行われなければならない（結果は迅速ではあるが）。ロシュ・ダイアグノスティック社のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ＳｅｐｔｉＦａｓｔ試験、すなわち敗血症が疑われる患者の血中の病原体について細菌および真菌ＤＮＡを検出するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの試験は、米国では入手できない。その高感度のために、この試験での偽陽性率は高い。最終的に、敗血症を患う患者から摂取したサンプルのゲノム分析に基づいて、ＳＩＲＳ−Ｌａｂ社は、敗血症を患う患者の血中の細菌および真菌ＤＮＡを測定するための、ＶＹＯＯ（登録商標）を含むチップ上の敗血症用分子バイオマーカーを開発している。ＶＹＯＯは、米国で臨床使用のためにＦＤＡに認可されたものではない。最終的に、ＬＡＬエンドトキシン試験は米国で臨床使用のためにＦＤＡに認可されたものではない。
【００１１】
リポ多糖（ＬＰＳ）レベルは敗血症を患う患者の血漿中で上昇する（Parsons et al., Am Rev Respir Dis 140:294-301, 1989; Brandtzaeg et al., J Infect Dis 159:195-204, 1989; Danner et al., Chest 99:169-175, 1991）。さらに、ＬＰＳはＡ１アデノシン受容体に結合し、活性化する（Wilson and Batra, J Endotoxin Res 8:263-27; 2002）。ＬＰＳ／エンドトキシンがＡ１アデノシン受容体に結合するという発見に基づいて、エンドトキシンを測定するアッセイについての特許がいくつかの国で発行された［米国特許第５，７７３，３０６号、米国特許第６，９０８，７４２号；国際公開第９７／０４４６６５号；カナダ特許第２，２５３，２３６号；欧州第９７９２６６９５．４号（オーストリア、フランス、ドイツ、イタリア、スペイン、スイスおよびリヒテンシュタイン、ならびに英国）；日本特許第３，１９７，２８０号］。現在知られているアッセイは、Ａ１アデノシン受容体に対する、ＬＰＳの結合についての、タグ付けした高親和性Ａ１アデノシン受容体リガンド、例えばＢＷ  Ａ８４４Ｕ−ビオチンとの置換または競合に基づいている。敗血症が疑われる患者の血漿を含む血漿中のＬＰＳを測定するこのＡ１アデノシン受容体リガンド結合アッセイの実験室および臨床評価に基づき、ＬＰＳ測定についてのカットオフ値に基づく以前の報告も参酌すると、ＬＰＳは敗血症および急性肺傷害が疑われる患者についての高感度で特異的なバイオマーカーである。しかしながら、この分光光度法（または蛍光）ベースのＡ１アデノシン受容体リガンド結合アッセイにおけるＬＰＳについて、競合するＡ１アデノシン受容体リガンド、ＢＷ  Ａ８４４Ｕにつけられたタグ、例えばビオチンまたは蛍光タグ、例えばＣｙ３Ｂについての高バックグラウンドノイズのために、その商業化が妨げられてきた。高バックグラウンドノイズ、すなわち低シグナル／ノイズ比のために、低信頼性かつ低再現性のアッセイとなった。高い商業的価値を有する臨床使用のために、敗血症バイオマーカー／診断法は高感度、特異性、および信頼性基準を満たさなければならない。さらに、このバイオマーカーを測定するアッセイは使いやすくなければならず、結果は、敗血症が疑われる患者のケアをしている医師に適時様式にて提供されなければならない。高バックグラウンドノイズのあるアッセイは信頼できず、再現性がなく、ＬＰＳを測定するために用いられ、または商業的に開発することができない。最適な光物理的特性、例えば高エネルギー移動効率を有し、生体分子に抱合されうるフルオロフォアを含む時間分解蛍光（ＴＲＦ）技術の導入、ならびに蛍光測定の従来法と比較した計測手段およびゲーティング技術の改善は、新世代の蛍光ベースのアッセイ、例えばＴＲＦベースのアッセイの基礎を提供している。時間分解蛍光（不均一および均一）ベースのアッセイは、限定されるものではないがＴＲＦ、均一ＴＲＦ（ＨＴＲＦ）、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）、解離増強ランタニド蛍光イムノアッセイ（ＤＥＬＦＩＡ（登録商標））、時間分解増幅クリプテート発光（ＴＲＡＣＥ）、およびランタニドキレート励起（ＬＡＮＣＥ（登録商標））アッセイを含み、高感度で、特異的で、信頼でき、頑健で、使いやすく、高シグナル／ノイズ比を有し、多数の異なる形式��例えばマイクロタイタープレートベース形式、小型形式、およびハイスループットアッセイ形式にて開発されうる。さらに、これらのアッセイを溶液中で、例えばマイクロタイタープレートのウェル内で行うことに加えて、これらのアッセイは固相形式を使用する形式にすることもでき、例えば、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、例えばＡ１アデノシン受容体を発現している膜が固相に被膜される。固相はマイクロタイタープレート、ビーズ、カード、ディップ・スティック（dipsticks）、チップ、およびナノ粒子などを含んでよい。
【００１２】
したがって、工業用の非生物学的溶液、血液製剤、および生体液におけるＬＰＳを測定するために用いられうる、高シグナル／ノイズ比および低い固有の誤り率を有する、高感度で、高度に正確で、信頼でき、特異的で、再現性のある、非放射性アッセイが必要である。さらに、抗敗血症治療のために敗血症を診断し、または敗血症の危険性がある患者を同定し、敗血症が疑われる患者を階層化するのに十分な敗血症に対する高特異性を有する、患者の血漿または他の臨床サンプル中のバイオマーカーとしてのＬＰＳを測定するための臨床使用のための形式にすることができる、高シグナル／ノイズ比を有する高感度で信頼できるアッセイが必要である。さらに、ＬＰＳ関連状態を患う患者から採取した臨床サンプル中のＬＰＳを測定するために用いられうる高感度で信頼できるアッセイが必要である。
【００１３】
これまで、そのような高感度で特異的な敗血症バイオマーカーおよびアッセイが大いに必要とされ、非常に多数の敗血症バイオマーカーが知られ、多数の定量的かつ定性的アッセイがこの１０年間以上にわたって知られているにもかかわらず、敗血症の危険性があり、または敗血症もしくは他のＬＰＳ関連状態を有する患者を確実に同定することができ、目的のはっきりした、または目的に向かった治療、例えば抗敗血症治療薬、例えばＬＰＳの効果を遮断する抗ＬＰＳ治療薬による治療について患者を階層化することができるものは知られておらず、または入手可能ではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の概略
現在では、Ａ１アデノシン受容体のＬＰＳ活性化は、明確なシグナルをＴＲＦベースのアッセイにおいて誘導し、それは生物学的および非生物学的溶液の両方、例えば水、緩衝液、他の工業溶液、血液製剤から採取したサンプル、ならびに血漿、他の体液、または感染が疑われる臨床現場から採取したサンプル、敗血症の危険性または敗血症を有する患者から採取したサンプル中のＬＰＳを測定するために、十分に高感度で、正確で、信頼できるものであることが発見されている。さらに、ＴＲＦアッセイで測定されたＬＰＳは、敗血症の危険性を有し、または敗血症を患う患者を特異的治療、例えば抗敗血症治療薬について階層化するための、高感度で信頼できるバイオマーカーおよび定量的な決定要因としての機能を果たすであろう。さらに、ＴＲＦアッセイで測定されたＬＰＳは、ＬＰＳ関連状態を治療するための抗ＬＰＳ治療薬について患者を階層化するための、高感度で特異的なバイオマーカーとしての機能を果たすであろう。１つの特定の実施態様は、ＬＰＳについてのＴＲＦベースの結合アッセイにおける、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）ランタニドキレートおよびＡ１アデノシン受容体タンパク質源の使用を含む。
【００１５】
したがって、本発明の１つの実施態様では、サンプル中の定量的ＬＰＳレベルを測定する方法であって、
ａ）Ａ１アデノシン受容体タンパク質源を選択すること；
ｂ）  ｉ．  タグ；
ｉｉ．  代謝標識；
ｉｉｉ．  タンパク質標識；
ｉｖ．  タグ、代謝標識、またはタンパク質標識に対する抗体；
ｖ．  Ａ１アデノシン受容体タンパク質またはペプチドに対する抗体；
ｖｉ．  Ａ１アデノシン受容体タンパク質またはペプチド；
ｖｉｉ．  Ａ１アデノシン受容体シグナル伝達経路のタンパク質またはペプチド；
ｖｉｉｉ．  Ａ１アデノシン受容体シグナル伝達経路のタンパク質またはペプチドに対する抗体；
ｉｘ．  Ａ１アデノシン受容体リガンド；
ｘ．  シグナル伝達分子；
ｘｉ．  Ａ１アデノシン受容体シグナル伝達経路の分子；
ｘｉｉ．  Ａ１アデノシン受容体シグナル伝達経路の分子に対する抗体；および
ｘｉｉｉ．  Ａ１アデノシン受容体シグナル伝達経路において測定されうる分子
を含む群から選択される部分と結合した少なくとも１つのＴＲＦフルオロフォアを選択すること；ならびに
ｃ）Ａ１アデノシン受容体タンパク質源；結合した少なくとも１つのＴＲＦフルオロフォア；およびサンプルを利用して、蛍光の測定がＬＰＳの定量的レベルと相関する様式にてＴＲＦアッセイを行うこと
を含む、Ａ１アデノシン受容体ＴＲＦアッセイを用いる方法がある。
【００１６】
さらに別の実施態様では、サンプル中の定量的ＬＰＳレベルを測定する方法であって、
ａ）Ａ１アデノシン受容体タンパク質源を選択すること；
ｂ）  ｉ．  タグ；
ｉｉ．  代謝標識；
ｉｉｉ．  タンパク質標識；
ｉｖ．  タグ、代謝標識、またはタンパク質標識に対する抗体；
ｖ．  Ａ１アデノシン受容体タンパク質またはペプチドに対する抗体；
ｖｉ．  Ａ１アデノシン受容体タンパク質またはペプチド；
ｖｉｉ．  Ａ１アデノシン受容体シグナル伝達経路のタンパク質またはペプチド；
ｖｉｉｉ．  Ａ１アデノシン受容体シグナル伝達経路のタンパク質またはペプチドに対する抗体；
ｉｘ．  Ａ１アデノシン受容体リガンド；
ｘ．  シグナル伝達分子；
ｘｉ．  Ａ１アデノシン受容体シグナル伝達経路の分子；
ｘｉｉ．  Ａ１アデノシン受容体シグナル伝達経路の分子に対する抗体；および
ｘｉｉｉ．  Ａ１アデノシン受容体シグナル伝達経路において測定されうる分子；を含む群から選択される異なる部分とそれぞれ結合した第１および第２ＴＲＦフルオロフォアを選択することであって、２つのフルオロフォア間に、ＴＲＦアッセイにおける励起後、測定されうるエネルギー移動があるように選択すること；ならびに
ｃ）Ａ１アデノシン受容体タンパク質源；結合した第１および第２ＴＲＦフルオロフォア；ならびにサンプルを利用して、蛍光の測定がＬＰＳの定量的レベルと相関する様式にてＴＲＦアッセイを行うこと
を含むＡ１アデノシン受容体ＴＲＦアッセイを用いる方法がある。
【００１７】
別の実施態様では、敗血症、グラム陰性細菌感染、またはＬＰＳ関連状態の存在について患者を診断する方法であって、患者から採取した生物学的サンプル中のＬＰＳを測定することを含む方法であり、
ａ）Ａ１アデノシン受容体タンパク質源を選択すること；
ｂ）アッセイがＬＰＳについて定量的である、少なくとも１つのＴＲＦフルオロフォアを利用する定量的ＴＲＦアッセイを選択すること；
ｃ）サンプルでアッセイを行うこと；
ｄ）アッセイにおいてサンプルについての蛍光の量を測定すること；
ｅ）該サンプルについての蛍光測定と、既知量のＬＰＳを添加したサンプルを使用したステップａ）〜ｄ）のアッセイによって作成されたＬＰＳについての標準曲線を比較することによって、蛍光の量から該サンプル中のＬＰＳの量を決定すること；および
ｆ）サンプル中のＬＰＳ量から患者の状態を診断すること
を含む方法がある。
【００１８】
さらに別の実施態様では、サンプル中のＬＰＳ量を決定するためのキットであって
ａ）少なくとも１つのフルオロフォアを利用する選択されたＴＲＦアッセイ；
ｂ）Ａ１アデノシン受容体タンパク質源；および
ｃ）ＬＰＳ標準
を含むキットがある。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、Ａ１アデノシン受容体ＴＲＦユーロピウム（Ｅｕ）−ＧＴＰ結合アッセイで測定されたＬＰＳについての標準曲線を表すデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な記載
この発明は多くの異なる形態において実施態様の影響を受けやすく、図面において示され、本明細書で詳細な特定の実施態様に記載されている一方、該実施態様の開示は原理の一例として考えられるべきであり、示され、記載されている特定の実施態様に本発明を限定することは意図していないと理解されたい。この詳細な記載は本明細書で用いられる用語の意味を定義しており、当業者が本発明を実施するために実施態様を具体的に記載している。
【００２１】
定義
本明細書で用いられている用語「ａ」または「ａｎ」は、１または２以上を意味するものとして定義されている。本明細書で用いられている用語「複数」は、２または３以上を意味するものとして定義されている。本明細書で用いられている用語「別の」は、少なくとも第２またはそれ以上のものを意味するものとして定義されている。本明細書で用いられている用語「含む」および／または「有する」は、含むこと（すなわち、オープンランゲージ）として定義されている。本明細書で用いられている用語「共役した」は、必ずしも直接的ではなく、必ずしも機械的ではないが、結合しているものとして定義されている。
【００２２】
用語「約」は、±１０パーセントを意味する。
【００２３】
この文書の全体を通して、「１つの実施態様」、「特定の実施態様」、および「実施態様」または類似の用語への言及は、実施態様に関連して記載される特定の特色、構造、または特徴が本発明の少なくとも１つの実施態様に含まれることを意味する。それゆえ、この明細書を通じた様々な場所における該語句の出現は、必ずしも全て同一の実施態様を指すわけではない。さらに、特定の特色、構造、または特徴は、１つ以上の実施態様で限定されることなく、いずれかの適切な様式で組み合わせられてよい。
【００２４】
本明細書で用いられている用語「または」は、いずれか１つまたはいずれかの組み合わせの意味が含まれるものと解釈されたい。それゆえ、「Ａ、ＢまたはＣ」は、以下のいずれかを意味する：「Ａ；Ｂ；Ｃ；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣ；Ａ、ＢおよびＣ」。この定義の例外は、要素、機能、ステップまたは作用の組み合わせが何らかの本質的に相互排他的なものである場合にのみ生じるであろう。
【００２５】
図面で特徴付けられている図は、本発明の特定の好都合な実施態様を説明する目的で提供されており、それに限定されるものとして考えられるべきではない。動作の現在分詞に先行する用語「意味する」は所望の機能を示し、そのために所望の機能を達成するための１つ以上の実施態様、すなわち、１つ以上の方法、装置、または器具があり、当業者は本明細書の開示を考慮してこれらまたはそれらの均等物から選択することができ、用語「意味する」の使用は限定すること意図していない。
【００２６】
本明細書で用いられている「リポ多糖」（ＬＰＳ）（エンドトキシンとしても知られている）は、グラム陰性細菌の外壁の主要な成分である糖脂質を指す。それは通常、動物の血中に低濃度で見られる。それは、レベルが血中で上昇し、他の体液に低濃度でも存在している場合、疾患状態の指標として知られる。それは、炎症性サイトカインの放出を含む免疫応答を誘導することができる。十分に高い濃度では、ＬＰＳは敗血症、敗血症ショック、および臓器障害、ならびに不全症を生じるメディエーターの放出を誘導することができる。さらに、ＬＰＳは発熱物質、すなわち、熱誘発物質として作用しうる。さらに、臓器、例えば眼、膀胱、耳の中のグラム陰性細菌感染から放出されたＬＰＳ、または腸内のグラム陰性細菌から放出された血漿中に循環しているＬＰＳは、ＬＰＳ関連状態の原因となりうる。したがって、ＬＰＳは発熱物質、グラム陰性細菌感染、敗血症、およびＬＰＳ関連状態の存在または活性の指標として知られている。
【００２７】
本明細書で用いられている用語「タンパク質」は、アミノ酸を含有するいずれかの分子を含み、ＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＤＮＡベクター、ＤＮＡ断片、ＤＮＡプロモーター、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）、クロマチン、アンチセンス、オリゴヌクレオチド、エピトープ、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、および酵素などを含む。タンパク質は自然に生じたものでもよく、自然に組換えられたものでもよく、または遺伝的に操作されたものでもよい。タンパク質は可溶化または精製されていてよい。タンパク質は糖または脂質に抱合されていてよい。それは、別のタンパク質に結合してタンパク質複合体または融合タンパク質を形成していてよい。タンパク質にはタグがつけられていてよい。タンパク質は二量体またはタンパク質のサブユニット、例えばＧタンパク質のサブユニットであってよい。さらに、タンパク質はナノ粒子に結合していてよい。タンパク質源は、限定されるものではないが哺乳類、魚類、爬虫類、植物、昆虫、細菌、酵母、および真菌を含む。タンパク質源は、植物、酵母、昆虫、または哺乳類に由来する組織および細胞または組織もしくは細胞から調製された膜、例えば最適なタンパク質、例えばＡ１アデノシン受容体タンパク質を発現しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＳｆ９昆虫細胞を含む。
【００２８】
本明細書で用いられている用語「シグナル伝達分子」は、限定されるものではないが、タグを有しまたは有さないいずれかの物質を含み、Ａ１アデノシン受容体の活性化後に測定されうるタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、エピトープ、酵素、キナーゼ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス分子、ホスファターゼ、トロンボキサン、インターロイキン、サイトカイン、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、ＧＴＰ、核内因子κβ（ＮＦ−κβ）、ＮＦ−κβのサブユニット、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、熱ショックタンパク質、マトリックスメタロプロテアーゼ（matrix metaloproteinanses）、増殖因子、および他の分子を含む。
【００２９】
本明細書で用いられている用語「敗血症（sepsis）」は、敗血症（sepsis）、敗血症（septicemia）（菌血症／内毒血症）、重度敗血症、敗血症ショック、および関連状態、ならびにこれらの状態のそれぞれと関連する臨床症状および合併症を含む。
【００３０】
用語「ＬＰＳ関連状態」は、サンプル中のＬＰＳのレベルが状態の存在と相関する状態を含む。例えば、１）羊水において、ＬＰＳのレベルは妊娠中の早期破水の発生率と相関する（Hazan et al., Acta Ostet Gynecol Scand 74:275-280, 1995）；２）術後の患者の血中において、ＬＰＳレベルは呼吸器および腎臓合併症の発生率と相関する（Berger et al., E Surg Res 28:130-139, 1996）；３）喘息において、ハウスダスト中のＬＰＳレベルは喘息の重症度と相関する（Michel et al., Am J Resp Crit Care Med 154:1641-1646, 1996）；４）壊死性腸炎を患う新生児の便において、ＬＰＳレベルは腸粘膜疾患の重症度と相関する（Duffy et al., Digestive Dis and Sci 42:359-365, 1997）；５）尿中において、ＬＰＳレベルはグラム陰性感染の存在と相関する（Hurley and Tosolini, J Microbiol Methods 16: 91-99, 1992）；６）インビトロ受精についての培地において、ＬＰＳレベルは胚の生存と相関する（Nagatta and Shirakawa, Fertility and Sterility 65:614-619, 1996）；ならびに、７）持続的携帯型腹膜透析（ＣＡＰＤ）患者の腹水において、ＬＰＳレベルはグラム陰性腹膜炎の診断について１００％の感度および特異性を有する（Ishizaki et al., Advances in Peritoneal Dialysis 12:199-202, 1996）。血漿または他の患者サンプル中のＬＰＳレベルは、他の状態、例えば神経変性疾患、例えばアルツハイマー病もしくはパーキンソン病、または線維症および硬化症をもたらす疾患、例えば炎症および自己免疫疾患と関連しうる（Jaeger et al., Brain Behav Immun 23:507-517, 2009; Villaran et al., J Neurochem 114:1687-1700, 2010）。さらなる例およびＬＰＳ関連状態の言及については、米国特許第６，１１７，４４５号（参照することによって本明細書に援用される）を参照のこと。
【００３１】
血液または体内の感染が疑われる部位から採取したサンプルについて細菌培養報告を得るには２４〜４８時間を要するため、ＬＰＳの検出および測定についての高感度で特異的な適時アッセイは多数の臨床状態および状況において貴重である。血液、体液、腔、および組織中のＬＰＳの測定は、医師がグラム陰性細菌感染の存在を診断し、広域スペクトル抗生物質の使用を避けながらグラム陰性細菌感染に対するより特異的な治療をより早く処方することを可能にするであろう。さらに、耳の細菌培養が陰性である場合、耳の中のＬＰＳレベルはグラム陰性細菌感染および中耳炎の存在を示唆しうる。さらに、脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＬＰＳレベルは、ＣＳＦ細菌培養が陰性である場合、グラム陰性細菌感染および髄膜炎の存在を示しうる。また、腹部大手術後の腹水中にＬＰＳレベルが検出された場合、これは外科的ドレナージを必要とする腹腔内感染の存在を示唆しうる。最終的に、特定の抗生物質または抗生物質の組み合わせがグラム陰性細菌からのＬＰＳの放出を誘導することが報告されている（Hurley, Drug Safety 12:183-195, 1995）。ＬＰＳの検出および測定のための高感度で特異的なアッセイは、この重要な医薬の分野および抗生物質処方の実施についての研究を可能にし、おそらく抗生物質治療の開発に影響を与えるであろう。
【００３２】
ＬＰＳを検出および測定するためのＴＲＦアッセイを使用する臨床分野は、限定されるものではないが、敗血症、グラム陰性細菌感染、ＬＰＳ関連状態についての臨床診断、心肺バイパス手術、手術前にサンプル、例えば血液中のＬＰＳのレベルを決定する手術前試験、血液製剤のスクリーニング、妊娠の尿路感染および無症候性細菌尿を診断するポイント・オブ・ケア試験、透析液（肝臓および腹膜）のスクリーニング、低（ｐｇ／ｍｌ）ＬＰＳレベルが胚の死と相関するインビトロ受精（上記のNagatta and Shirakawa）；ならびにＬＰＳレベルが臓器移植の不全と相関しうる臓器移植バスを含む。
【００３３】
ＬＰＳを検出および測定するＴＲＦアッセイを使用する非臨床分野は、限定されるものではないが、研究使用限定（ＲＵＯ）および工業使用を含む。工業使用は：ヒト使用のためにＦＤＡに要求されるＬＰＳレベルについて薬物、医療機器、および生物製剤をスクリーニングすること、レジオネラについて冷却システム中の水を試験すること、加湿器、例えば換気装置を接続されたものの中の水を試験すること、半導体製造施設についての水を試験すること、飲料水を試験すること、コンタクトレンズ液をモニターすること、ならびにＬＰＳ混入について化粧品を試験することを含む。
【００３４】
したがって、本発明の方法およびキットは、動物におけるＬＰＳのレベルを決定し、これらの状態を診断するために用いられうる。「動物」は限定されるものではないが、哺乳類、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、および有袋類を含むことを意味し、１つの実施態様ではヒトである。それゆえ、動物由来のサンプル中のＬＰＳの存在およびレベルを測定することによって、上記の状態を迅速かつ正確に診断することができる。
【００３５】
本明細書で用いられている用語「サンプル」は、限定されるものではないが、動物に由来する生物学的サンプル、例えば全血、血漿、血清、ＣＳＦ、尿、唾液、耳液、子宮液、眼液、胸水、腹水、気管支肺胞洗浄液、心膜液、滑液、洞液、および嚢胞からの液、胚培地、ならびに非生物学的サンプル、例えば臓器バス、医薬溶液および製剤、血液製剤、医療機器、透析液、ならびに工業溶液および製剤を指す。本発明のサンプルはＴＲＦアッセイにて試験することが可能な状態になければならず、それゆえ一般的にサンプルは液体状態、例えば溶液または懸濁液の状態であろう。
【００３６】
「時間分解蛍光アッセイ」は、時間分解検出（励起と発光検出の間の遅延）と組み合わせた１つ以上の長寿命フルオロフォアの使用を含み、大きな蛍光干渉なく検出することを可能にする。これらのアッセイは、現在、不均一または均一のいずれかの性質を有する。本発明のアッセイは、Ａ１アデノシン受容体の使用を含む。Ａ１アデノシン受容体を用いたＴＲＦアッセイを調整することは、当業者の技術の範囲内である。全てのＧＰＣＲｓは、最適な結合のために、例えばＧＴＰ結合のために異なる条件を必要とする。それゆえ、当業者は、特異的ＧＰＣＲ、例えば本発明で利用されるＡ１アデノシン受容体のための緩衝液条件を最適化するであろう。これらの緩衝液条件は、当該技術分野で知られているように、Ａ１アデノシン受容体のタンパク質源、例えば細胞もしくは細胞、組織、植物、もしくは細菌に由来する膜内で安定に発現し、または細胞、組織、植物、もしくは細菌に由来する膜から可溶化もしくは精製された組換えＡ１アデノシン受容体に基づいて異なってよい。
【００３７】
ＴＲＦアッセイは全て、部分、例えばタンパク質またはリガンドと結合した少なくとも１つのフルオロフォアを有する。本発明に有用なフルオロフォアは周知であり、適合するように容易に選択されうる。フルオロフォアが選択されると、例えば、タグ、代謝標識、Ａ１アデノシン受容体タンパク質についてのＡ１アデノシン受容体タンパク質もしくはペプチドに対する抗体、またはＡ１アデノシン受容体タンパク質もしくはペプチド、またはアッセイのタイプと一貫性があるものなどにキレート化することによって結合することができる。１つの実施態様では、フルオロフォアはＧＴＰにキレートされている。１つの周知のＴＲＦ結合アッセイは、不均一および均一ＴＲＦアッセイの両方で利用されうるＧＴＰ結合アッセイである。ＧＴＰ−ランタニド部分を利用すると、典型的には、蛍光は６２０ｎｍで測定されうる。該部分の１つの実施態様は、ユーロピウムにキレートされているＧＴＰ（Ｅｕ−ＧＴＰ）である。ＧＴＰ結合アッセイは一般的に周知であり、Ａ１アデノシン受容体およびＬＰＳを用いる本発明への適用は、この開示を考慮すると、当業者の技術の範囲内である。本明細書で用いられているように、フルオロフォアと結合するように選択される部分は、
ａ）  タグ；
ｂ）  代謝標識；
ｃ）  タンパク質標識；
ｄ）  タグ、代謝標識、またはタンパク質標識に対する抗体； 
ｅ）  Ａ１アデノシン受容体タンパク質またはペプチドに対する抗体；
ｆ）  Ａ１アデノシン受容体タンパク質またはペプチド；
ｇ）  Ａ１アデノシン受容体シグナル伝達経路のタンパク質またはペプチド；
ｈ）  Ａ１アデノシン受容体シグナル伝達経路のタンパク質またはペプチドに対する抗体；
ｉ）  Ａ１アデノシン受容体リガンド；
ｊ）  シグナル伝達分子；
ｋ）  Ａ１アデノシン受容体シグナル伝達経路の分子；
ｌ）  Ａ１アデノシン受容体シグナル伝達経路の分子に対する抗体；および
ｍ）  Ａ１アデノシン受容体シグナル伝達経路において測定されうる分子
を含む群から選択される。
【００３８】
不均一アッセイはフルオロフォアでタグ付けした１つの試薬を利用し、それゆえ分析物、例えばＬＰＳを測定するために用いられる。このアッセイは、非結合標識パートナー（unbound labeled partner）から結合標識パートナー（bound）を分離するために、洗浄および濾過ステップを必要とする。これらのタイプのアッセイは、多くの場合において、ランタニド系列の希土類元素の蛍光特性を利用する。これらのアッセイに通常用いられるランタニドは、サマリウム、ユーロピウム、テルビウム、およびジスプロシウムである。これらの実施態様は、他のフルオロフォアと比較して大きなストークシフトおよび極度に長い発光半減期を有するため、利用される。これらのアッセイのタイプは、競合性の、または結合性のタイプになる傾向がある。
【００３９】
Ａ１アデノシン受容体についてのＴＲＦアッセイにおいて、フルオロフォアは次のようなタグにキレートされ、共役し、抱合され、または結合していてよい：例えばＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）、クラスＩＩ関連インバリアント鎖ペプチド（ＣＬＩＰ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、もしくはＡＣＰ／ＭＣＰタグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＦＬＡＧ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒスチジン（ＨＩＳ）、酸アジドホモアラニン（ＡＨＡ）またはＨＰＧタグ、もしくは代謝標識、例えばアジドもしくはアルキンタグを有する生体分子で、Ａ１アデノシン受容体タンパク質、Ｇタンパク質、Ｇタンパク質の二量体もしくはサブユニット、Ｇタンパク質、Ｇタンパク質の二量体もしくはサブユニットについてのペプチド、Ａ１アデノシン受容体についてのシグナル伝達経路アッセイ、例えばＧＴＰ結合アッセイに関与する他のタンパク質、またはこれらのタンパク質についてのペプチド、オリゴヌクレオチドまたはエピトープに挿入されているもの。あるいは、ＴＲＦアッセイにおいて、フルオロフォアはＡ１アデノシン受容体シグナル伝達経路のタンパク質または分子、例えば限定されるものではないが、Ａ１アデノシン受容体タンパク質またはペプチド、Ｇタンパク質、Ｇタンパク質の二量体もしくはサブユニット、Ｇタンパク質、Ｇタンパク質の二量体もしくはサブユニットについてのペプチド、これらのタンパク質についての他のタンパク質、融合タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、もしくはエピトープ、もしくはＡ１アデノシン受容体についてのシグナル伝達経路アッセイに関与する分子、またはこれらのタンパク質または分子に挿入または共役したタグにキレートされ、抱合され、結合し、または共役していてよい。
【００４０】
あるいは、ＴＲＦアッセイにおいて、フルオロフォアはＡ１アデノシン受容体シグナル伝達経路のタンパク質または分子、例えば限定されるものではないが、Ａ１アデノシン受容体タンパク質またはペプチド、Ｇタンパク質、Ｇタンパク質の二量体、もしくはサブユニット、Ｇタンパク質、Ｇタンパク質の二量体、もしくはサブユニットのペプチド、これらのタンパク質についての他のタンパク質、融合タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、もしくはエピトープ、もしくはＡ１アデノシン受容体についてのシグナル伝達経路アッセイに関与する分子、またはこれらのタンパク質もしくは分子に挿入または共役したタグに対する抗体にキレートされ、抱合され、結合し、または共役していてよい。
【００４１】
ＴＲＦアッセイにおいて使用するためのフルオロフォアを結合またはキレートするために用いられうる付加的タグは、可溶化タグ、チオレドキシンおよびポリ（ＮＡＮＰ）を含み、細菌内で発現している組換えタンパク質用に用いられうる。ＴＲＦアッセイのためのフルオロフォアを結合またはキレートするのに有用な他のタグは、エピトープタグ、例えばＶ５タグ、ｃ−ｍｙｃタグ、およびＨＡタグを含む。ＴＲＦアッセイにおいてフルオロフォアをタンパク質、ペプチド、分子、エピトープ、またはオリゴヌクレオチドに共役、結合、またはキレート化するための付加的タグは、イソペプタグ（isopeptag）、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（ＢＣＣＰ）、カルモジュリンタグ、ｎｕｓタグ、Ｓタグ、ソフタグ１（Softag 1）、ソフタグ２（Softag 2）、ストレプタグ（strep-tag）、ＳＢＴタグ、およびＴｙタグを含む。
【００４２】
あるいは、ＴＲＦアッセイにおいて、フルオロフォアは、他のタンパク質、例えばストレプトアビジン、例えばＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）製品に見られるタンパク質にキレートされ、共役し、抱合され、または結合していてよく、それは、ビオチンに対するその高親和性のために、ビオチンタグ付けしたタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、もしくはエピトープ、ビオチンタグ付けしたタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、もしくはエピトープに対する抗体、ビオチンタグ付けしたタグに対する抗体、またはビオチンタグ付けしたＡ１アデノシン受容体結合またはシグナル伝達経路に関与するこれらの分子についての他の分子または抗体と反応しうる。例えば、１つのそのようなＴＲＦアッセイにおいて、フルオロフォアはストレプトアビジンに結合し得、ついでＧαｉサブユニットタンパク質についてのビオチン化ペプチドに結合しうる。あるいは、ＴＲＦアッセイにおいて、フルオロフォアはＥＬＩＳＡｓに通常用いられ、アッセイ開発の当業者に知られている酵素または酵素についての基質にキレートされ、共役し、または結合していてよい。酵素のいくつかの例は、限定されるものではないが、グリコシダーゼ、ホスファターゼ、オキシダーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、α−グリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、カタラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、リボヌクレアーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ウレアーゼ、および酵母アルコールデヒドロゲナーゼを含む。酵素についての基質のいくつかの例は、限定されるものではないが、テトラメチルベンゼン（ＴＭＢ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、クマリン基質、例えば７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン（４−メチルウンベリフェロン、４−ＭＵ）の有機および無機エステルならびにグリコシドならびに７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）のアミド、フルオレセイン基質、ナフチル基質、およびレゾルフィンに由来する基質などを含む。例えば、ＴＲＦアッセイにおいて、フルオロフォアは、ＮＦ−κβサブユニット、ｐ６５組換えタンパク質に挿入されたタグ、例えばＧＳＴタグに対する抗体にキレートされていてよい。別のＴＲＦアッセイでは、第１結合パートナーフルオロフォアにキレートされている抗ＧＳＴ抗体は、ＮＦ−κβサブユニット、ｐ６５組換えタンパク質に挿入されたＧＳＴタグと相互作用し、次いで第２結合パートナーフルオロフォアで標識されたストレプトアビジンと結合したビオチン化ＮＦ−κβ特異的ｄｓＤＮＡと相互作用する。
【００４３】
あるいは、ＴＲＦアッセイにおいて、フルオロフォアは、Ａ１アデノシン受容体に結合するアンタゴニストおよびアゴニストを含むＡ１アデノシン受容体リガンド、例えばＬＰＳにキレートされ、抱合され、結合し、共役し、またはタグ付けされていてよい。あるいは、ＴＲＦアッセイ形式において、フルオロフォアは、Ａ１アデノシン受容体についてのシグナル伝達経路アッセイでＡ１アデノシン受容体の活性化後に測定されうるシグナル伝達分子、ＧＴＰ、Ｇタンパク質、Ｇタンパク質の二量体、もしくはサブユニット、Ｇタンパク質またはＧタンパク質の二量体もしくはサブユニットのペプチド、タンパク質、例えばインターロイキン−６（ＩＬ−６）もしくはＮＦ−κβについてのサブユニット、または他のシグナル伝達経路分子、例えばｃＡＭＰもしくはトロンボキサンにキレートされ、共役し、またはタグ付けされていてよい。あるいは、ＴＲＦアッセイ形式において、フルオロフォアは、タンパク質、例えばＩＬ−６もしくはＮＦ−κβについてのサブユニット、該タンパク質についてのペプチド、エピトープ、もしくはオリゴヌクレオチド、該タンパク質に挿入されたタグ、またはシグナル伝達分子、ＧＴＰ、もしくは他のシグナル伝達経路分子、例えばｃＡＭＰまたはトロンボキサンに対する抗体にキレートされ、またはタグ付けされていてよい。
【００４４】
Ａ１アデノシン受容体ＴＲＦアッセイにおいてフルオロフォアと共役しうるＡ１アデノシン受容体リガンドのリストは、限定されるものではないが、Ａ１アデノシン受容体を活性化するアゴニスト、例えばＮ６シクロペンチルアデノシン（ＣＰＡ）、２−クロロ−Ｎ６−シクロペンチルアデノシン（ＣＣＰＡ）、２−クロロ−Ｎ６−［（Ｒ）−［（２−ベンゾチアゾリル）チオ］−２−プロピル］−アデノシン）（ＮＮＣ−２１−０１３６）、２’−Ｏ−メチル−Ｎ６−シクロヘキシルアデノシン（ＳＤＺ  ＷＡＧ９４）、［１Ｓ−［１α，２β，３β，４α（Ｓ＊）］］−４−［７−［［１−［（３−クロロチエン−２−イル）メチル］プロピル］アミノ］−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリド−３−イル］Ｎ−エチル２，３−ジヒドロキシシクロペンタンカルボキサミド（ＡＭＰ５７９）、テカデノソン（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）−２−（ヒドロキシメチル）−５−（６−（（Ｒ）−テトラヒドロフラン−３−イルアミノ）−９Ｈ−プリン−９−イル）テトラヒドロフラン−３，４−ジオール）、セロデノソン（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−５−（６−（シクロペンチルアミノ）−９Ｈ−プリン−９−イル）−Ｎ−エチル−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−カルボキサミド）およびＰＪ−８７５、２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−２−（（２−フルオロフェニルチオ）メチル）−５−（６−（（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンチル−アミノ）−９Ｈ−プリン−９−イル）テトラヒドロフラン−３，４−ジオール（ＣＶＴ−３６１９）、３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（６−（（１Ｓ，２Ｓ）−２−ヒドロキシシクロペンチルアミノ）−９Ｈ−プリン−９−イル）−５−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン−３，４−ジオール（ＧＲ７９２３６）、１Ｓ，２Ｒ，３Ｒ）−３−（（トリフルオロメトキシ）メチル）−５−（６−（１−（５−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イル）ピロリジン−３−イルアミノ）−９Ｈ−プリン−９−イル）シクロペンタン−１，２−ジオール（ＡＲＡ）、カパデノソン（２−アミノ−６−（（２−（４−クロロフェニル）チアゾール−４−イル）メチルチオ）−４−（４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル）ピリジン−３，５−ジカルボニトリル、Ｂａｙ−６８−４９８６）、２−アミノ−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）（４−クロロフェニル）メタノン（Ｔ−６２）またはＬＰＳを含む。
【００４５】
Ａ１アデノシン受容体ＴＲＦアッセイにおいてフルオロフォアと共役しうるＡ１アデノシン受容体リガンドのこのリストは、限定されるものではないが、Ａ１アデノシン受容体アンタゴニスト、例えば１、３  ジプロピル−８−シクロペンチルアデノシン（ＤＰＣＰＸ）、１，３−ジプロピル−８−（２−（５，６−エポキシ）ノルボルニル）キサンチン（ＢＧ−９７１９）、３−［４−（２，６−ジオキソ−１，３−ジプロピル−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−プリン−８−イル）−ビシクロ［２．２．２］オクト−１−イル］−プロピオン酸（ＢＧ−９９２８）、８−ノルアダマンチル−１，３−ジプロピルキサンチン（ＫＷ３９０２）、３−［２−（４−アミノフェニル）−エチル］−８−ベンジル−７−｛２−エチル−（２−ヒドロキシ−エチル）−アミノ］−エチル｝−１−プロピル−３，７−ジヒドロ−プリン−２，６−ジオン（Ｌ−９７−１）、４−（２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルアミノ）シクロヘキサノール（ＳＬＶ３２０）、３−（４−アミノ）フェネチル−１−プロピル−８−シクロペンチルキサンチン（ＢＷ  Ａ８４４Ｕ）、８−シクロペンチル−３−（３−（（４−フルオロスルホニルベンゾイル）−オキシ）プロピル）−１−プロピルキサンチン（ＦＳＣＰＸ）、バミフィリン、Ｎ６エンドノルボルナン−２−イル−９−メチルアデニン（Ｎ−０８６１）、およびＣ８−（Ｎ−メチルイソプロピル）−アミノ−Ｎ６−（５’−エンドヒドロキシ）−エンドノルボルナン−２−イル−９−メチルアデニン（ＷＲＣ−０５７１）も含む。
【００４６】
当該技術分野で知られているＡ１アデノシン受容体アンタゴニストは、例えば、米国特許第５，７８６，３６０号、米国特許第６，４８９，３３２号、米国特許第７，２０２，２５２Ｂ２号、米国特許第７，２４７，６３９Ｂ２号、および同時係属の米国出願第１０／５６０，８５３号、タイトル「Ａ１アデノシン受容体アンタゴニスト」（２００４年６月７日出願）、米国出願第１３／０１０，１５２号、タイトル「Ａ１アデノシン受容体診断プローブ」（２０１１年１月２０日出願）、およびＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８７６３８、タイトル「Ａ１アデノシン受容体アンタゴニスト」（２００８年１２月１９日出願）に記載されている化合物を含む（これらの全ては参照することによって本明細書で援用される。
【００４７】
Ａ１アデノシン受容体ＴＲＦアッセイとしての開発に適切なＡ１アデノシン受容体シグナル伝達経路のリストは、限定されるものではないが、ＧＴＰ、アデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、ホスホイノシチド−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫｓ）、細胞外受容体シグナル誘導キナーゼ（ＥＲＫ）、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）、およびタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）を含む。
【００４８】
フルオロフォアにタグ付けするのに適切なＡ１アデノシン受容体シグナル伝達経路と関連する分子は、限定されるものではないが、Ｇタンパク質、Ｇタンパク質の二量体、サブユニット、およびペプチド、Ｇタンパク質の二量体、およびサブユニット、ｃＡＭＰ、ＮＦ−κＢおよびＮＦ−κＢのサブユニット、ＩＰ３、ＤＡＧ、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ｐ３８、熱ショックタンパク質、トロンボキサン、マトリックスメタロプロテアーゼ（matrix metaloproteinanses）、ならびに増殖因子を含む。さらに、フルオロフォアでタグ付けするのに適切なＡ１アデノシン受容体シグナル伝達経路と関連する他のエフェクターは、カリウムチャネルおよびカルシウムチャネルについてのタンパク質、ならびにイオン、例えばカリウムおよびカルシウムを含む。
【００４９】
均一ＴＲＦアッセイ、例えばＴＲ−ＦＲＥＴ技術は、ドナーおよびアクセプターフルオロフォア対合、すなわち複数のフルオロフォアを含み、ＧＰＣＲｓ、例えばＡ１アデノシン受容体についてのリガンド結合アッセイおよび機能アッセイの両方を含み、不均一アッセイの洗浄および濾過または洗浄ステップを必要としない均一アッセイ形式において、バックグラウンドノイズが低く、高感度および特異性を有する。均一ＴＲ−ＦＲＥＴ（ＨＴＲＦ）アッセイにおいて、フルオロフォアを有する２つの標識パートナーがエネルギー移動に要求される。このエネルギー移動は、２つの分子が互いに直接近接している場合にのみ生じる。第１フルオロフォアはエネルギードナーとして作用し、第２フルオロフォアはエネルギーアクセプターとして作用する。エネルギー移動の効率は、長寿命蛍光ドナー色素と短寿命蛍光アクセプター色素の間の距離の関数である。ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイにおいて最もよく用いられるドナーランタニドは、ユーロピウムおよびテルビウムである。他のドナーランタニドは、サマリウムおよびジスプロシウムを含む。多数の共鳴エネルギーアクセプターがあり、ＸＬ６６５（アロフィコシアニン）、ｄ２、フィコビリタンパク質、テトラメチルローダミン、フルオレセイン、チオニン、Ｒフィコシアニン、フィコエリトロシアニン、およびＣフィコエリトリンなどを含む。本発明における使用に適切なさらなる例は、米国特許第６，９０８，７６９号（その全体において参照することによって本明細書に援用される）に見ることができる。ＨＴＲＦアッセイにおいて最もよく用いられるエネルギー移動アクセプターは、ｄ２またはＸＬ６６５である。３３７ｎｍの励起で高ＦＲＥＴ効率を生じるＨＴＲＦアッセイにおける典型的なドナー／アクセプターペアは、６２０ｎｍの発光を有するドナーとしてのユーロピウムクリプテートおよび６６５ｎｍの発光を有するアクセプターとしてのＸＬ６６５である。エネルギー移動過程における長寿命発光（ドナーとしてのユーロピウムクリプテートの長蛍光寿命のために）と比較した遊離アクセプター、ＸＬ６６５の自然な短寿命蛍光発光は、結合ＸＬ６６５（ＸＬ６６５でタグ付けした分子が、ユーロピウムクリプテートでタグ付けした分子と非常に近接したときに、エネルギー移動の間に生じる）と遊離ＸＬ６６５の間の明確な区別を可能にする。
【００５０】
ＨＴＲＦ／ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイと関連する多数の利点、例えば均一アッセイ形式、迅速性、高感度および特異性、低バックグラウンドノイズ、培地バックグラウンド、例えば血漿からの干渉が少ないという頑健性、膜内で発現しているＧＰＣＲｓでの使用において適切なこと、二価イオン、例えばＭｇ２＋または他のアッセイ添加物、例えばＤＭＳＯおよびＥＤＴＡに対する認容性、ならびにアッセイの適応性、例えばハイスループットスクリーニング、自動液体ハンドリング、および小型化への適応可能性がある。さらに、ＨＴＲＦアッセイは、特定のＧＰＣＲｓおよびタンパク質で実施することを一度開発および決定すると容易に行うことができ、それゆえ使いやすく、通常、結果が２時間以内に入手できる。
【００５１】
ＨＴＲＦ、ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイの例は、米国特許第７，６７４，５８４号、米国特許第５，９９８，１４６号、米国特許第５，５１２，４９３号、米国特許第５，５２７，６８４号、米国特許第６，３５２，６７２号、米国特許第５，２２０，０１２号、米国特許第５，４３２，１０１号、米国特許第５，４５７，１８５号、米国特許第５，５３４，６２２号、米国特許第５，３４６，９９６号、米国特許第５，１６２，５０８号、米国特許第５，５１２，４９３号、米国特許第５，６２７，０７４号、米国特許第５，５２７，６８４号、米国特許第６，５１５，１１３号、米国特許第６，８６４，１０３号、米国特許第７，４４２，５５８号、米国特許第６，４０６，２９７号、米国特許第７，０１８，８５０号、および米国特許第７，４０４，９１２号、ならびに米国特許出願第２００４０１１５１３０号、米国特許出願第２００６００２４７７５号、米国特許出願第２００６０２９２６５１号、米国特許出願第２００７０２４３５６８号、および米国特許出願第２００７０２０７５３２号に見ることができる（それらの全体において参照することによって本明細書に援用される）。
【００５２】
Ａ１アデノシン受容体タンパク質源は、本発明のアッセイと適合するいずれかの形態で提供することができる。Ａ１アデノシン受容体は、細胞、例えば限定されるものではないが、植物、酵母、ＣＨＯ、またはＳｆ９細胞に安定にトランスフェクトされた組換えタンパク質であってよい。これらの細胞などに由来する膜は、ＴＲＦアッセイのためのＡ１アデノシン受容体タンパク質源を提供するために利用することができる。他のＡ１アデノシン受容体タンパク質源は、他の細胞型、組織、植物、細菌、酵母、およびＡ１アデノシン受容体タンパク質を安定に発現している細胞、組織、植物、細菌、もしくは膜から単離された、可溶化もしくは精製されたＡ１アデノシン受容体タンパク質、または組換えＡ１アデノシン受容体タンパク質を含む。アッセイの当業者であれば、許容される形態のＡ１アデノシン受容体タンパク質を容易に決定および提供することができるであろう。
【００５３】
アッセイを行うにあたって、選択されたＴＲＦアッセイは、不均一であっても均一であっても、試験の製造者からのプロトコール、ならびにＡ１アデノシン受容体およびＬＰＳを用いるこれらのアッセイの熟練の使用者によって決定されなければならない緩衝液および溶液特性を用いて調整される。一度開発されると、試験サンプルはサンプル中に存在しているＬＰＳの量の定量についてのアッセイに導入される。その結果は、アッセイにおいて既知量のＬＰＳを含有するサンプルで作成されたＬＰＳについての標準曲線から決定することができる。サンプル中のＬＰＳの存在および量またはレベルの決定は、動物の敗血症、グラム陰性感染、またはＬＰＳ関連状態の診断に用いられうる。本発明は、サンプル中のＬＰＳの検出および測定のためのキット、ならびに動物の敗血症、グラム陰性感染、またはＬＰＳ関連状態の診断のための使用方法も提供する。キットは、サンプル中のＬＰＳレベルを測定するために提供される。これらのキットは、Ａ１アデノシン受容体タンパク質源、少なくとも１つのフルオロフォア、Ａ１アデノシン受容体ＴＲＦアッセイおよびＬＰＳに特異的な緩衝液、ならびにＬＰＳ標準を含む。１つの実施態様では、キットはＡ１アデノシン受容体ＴＲＦ  ＧＴＰ結合アッセイを行うために、フルオロフォアとしてＧＴＰ−ランタニド、例えばユーロピウムにキレートされているＧＴＰ（Ｅｕ−ＧＴＰ）を提供する。
【００５４】
以下の非限定的実施例は、本発明の実施態様をさらに説明するために提供されている。
【実施例】
【００５５】
実施例１．
組換えラットＡ１アデノシン受容体を発現しているＣＨＯ細胞からの膜の調製
１．１７０  ｘ  ｇで１０分間遠心分離することによって懸濁液からＣＨＯ細胞を収集する。
２．１容積（５０ｍＬ）のＰＢＳで細胞を２回洗浄する。
＊＊残りのステップは全て氷上または４℃で実施される＊＊
３．冷却した緩衝液Ａにペレットを再懸濁する（元々の培養容積５０ｍＬ当たり５ｍＬ）。
４．細胞をポリトロン（ブリンクマン社）で２０秒間ホモジナイズする。
５．ホモジネートを１０００  ｘ  ｇで、４℃で１０分間遠心分離する。
６．上清を収集し、３０，０００  ｘ  ｇで３０分間遠心分離する。
７．上清を捨て、ペレットを保存する。
８．緩衝液Ａでペレットを２回洗浄する。
９．ペレットを緩衝液Ｂ中でピペッティングすることによって穏やかに再懸濁し、２ｍｇタンパク質／ｍＬの最終濃度を達成する
１０．膜懸濁液を２５μＬ単位の一定分量に分注し、急速凍結（snap freeze）する。
１１．膜懸濁液の一定分量を−８０℃で保存する。
【表１】
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【００５６】
実施例２．
ＣＨＯ細胞内で発現している組換えラットＡ１アデノシン受容体についての、［３Ｈ］１，３ジプロピル−８−シクロペンチルキサンチン（ＤＰＣＰＸ）の親和性を決定するための飽和結合研究
飽和結合アッセイのために、組換えラットＡ１アデノシン受容体（５〜２０μｇタンパク質／ウェル）で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞から調製された膜を、ウェル毎に濃度を増加させた［３Ｈ］−ＤＰＣＰＸ（パーキンエルマー社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）（０．０１ｎＭ〜１０ｎＭ）と共に、２００μＬの最終アッセイ容積でインキュベートする。各濃度の［３Ｈ］−ＤＰＣＰＸについて、全結合および非特異的結合を３回決定する。全結合は競合リガンドの非存在下で定義され、非特異的結合はＤＰＣＰＸ（シグマ・アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州）（１０μＭ）の存在下で決定される。ＤＰＣＰＸストック溶液はＤＭＳＯ中で調製される（アッセイ中のＤＭＳＯの最終濃度は、≦０．０１％である）。アッセイ緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、およびアデノシンデアミナーゼ（シグマ・アルドリッチ社）（０．２ユニット／ｍＬ）からなる。全アッセイ成分をポリプロピレン製の、ディープウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ウォルサム、マサチューセッツ州）に添加し、次いでプレートを穏やかに攪拌し、成分を混合する。アッセイは無菌技術、無菌試薬、および無菌消耗品を用いて行われる。膜を６０分間２５℃でインキュベートし、次いで、自動真空マニホールド（Ｍａｃｈ  ＩＩＩ、トムテック社、ハムデン、コネチカット州）を用いて、ＧＦ／Ｂ濾過マット（パーキンエルマー社）に通す迅速濾過によってアッセイを終結させる。各ウェルを、３００μＬの氷冷洗浄緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［５０ｍＭ、ｐＨ７．４］およびＭｇＣｌ２［１０ｍＭ］）で迅速に４回洗浄する。濾過マットを乾燥し、固体シンチラント（scintillant）（パーキンエルマー社）にはめ込み、シンチレーションカウンター（１４５０Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ、パーキンエルマー社）を用いて３時間計数する。アッセイ用に希釈した膜サンプルの一定分量を、基準としてＢＳＡを用いるＢＣＡアッセイ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて全タンパク質を定量化するために用いる。［３Ｈ］−ＤＰＣＰＸの各濃度について、データを、特異的ＣＰＭ結合（CPM bound）（全ＣＰＭ結合と非特異的ＣＰＭ結合の間の差異）として表し、次いでｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質に変換する。データは［３Ｈ］−ＤＰＣＰＸの濃度に対する特異的結合（ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質）としてプロットし、次いでワンサイトモデル（one-site model）を用いる非線形回帰（曲線適合）によって分析し、ＫＤおよびＢｍａｘ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、バージョン５．０１、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）を決定する。最低でも３つの独立した実験からの最終データを、平均値±ＳＥＭとして表す。
【００５７】
実施例３．
［３Ｈ］−ＤＰＣＰＸで標識されたＣＨＯ細胞由来の膜内で発現している組換えラットＡ１アデノシン受容体についての、ＢＷ  Ａ８４４Ｕ−Ｅｕの親和性（Ｋｉ）を決定するための競合結合研究
競合結合アッセイ用に、組換えラットＡ１アデノシン受容体（５〜２０μｇタンパク質／ウェル）で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞から調製された膜を、［３Ｈ］−ＤＰＣＰＸ（飽和結合研究で定義されているＫＤで）と共に、２００μＬの最終アッセイ容積でインキュベートする。全結合は競合リガンドの非存在下で定義され、非特異的結合はＤＰＣＰＸ（１０μＭ）の存在下で決定される。アッセイ緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、およびアデノシンデアミナーゼ（０．２ユニット／ｍＬ）からなる。ユーロピウムと共役したＢＷ  Ａ８４４Ｕ（ＢＷ  Ａ８４４Ｕ−Ｅｕ）を、０．０１ｎＭ〜１０μＭの範囲の濃度で評価する。ＢＷ  Ａ８４４Ｕ−Ｅｕストック溶液をＤＭＳＯ中で調製する（アッセイ中のＤＭＳＯの最終濃度は、≦０．０１％である）。コントロールリガンドはＣＰＡ（Ｎ６−シクロペンチルアデノシン）（シグマ・アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州）（０．０１ｎＭ〜１０μＭ）およびＤＰＣＰＸ（０．０１ｎＭ〜１０μＭ）である。ＤＰＣＰＸおよびＣＰＡのストック溶液は、ＤＭＳＯ中で調製する（アッセイ中のＤＭＳＯの最終濃度は、≦０．０１％である）。各アッセイポイントを３回評価する。全アッセイ成分をポリプロピレン製の、ディープウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に添加し、プレートを穏やかに攪拌し、成分を混合する。アッセイは、無菌技術、無菌試薬、および無菌消耗品を用いて行われる。膜を６０分間２５℃でインキュベートし、次いで真空マニホールド（Ｍａｃｈ  ＩＩＩ、トムテック社、ハムデン、コネチカット州）を用いて、ＧＦ／Ｂ濾過マット（パーキンエルマー社）に通す迅速濾過によってアッセイを終結させる。各ウェルを３００μＬの氷冷洗浄緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［５０ｍＭ、ｐＨ７．４］およびＭｇＣｌ２［１０ｍＭ］）で迅速に４回洗浄する。濾過マットを乾燥し、固体シンチラント（scintillant）（パーキンエルマー社）にはめ込み、次いでシンチレーションカウンター（１４５０Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ、パーキンエルマー社）を用いて３時間計数する。各濃度の試験リガンドについて、パーセント特異的結合を、［（結合−非特異的結合）／（全結合−非特異的結合）］＊１００として計算する。データを競合リガンドのｌｏｇ濃度に対するパーセント特異的結合としてプロットする。競合的結合モデルを用いる非線形回帰（曲線適合）によってデータを分析し、Ｋｉ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、バージョン５．０１）を決定する。最低でも３つの独立した実験からの最終データを、平均値±ＳＥＭとして表す。
【００５８】
実施例４．
ＣＨＯ細胞由来の膜内で発現している組換えラットＡ１アデノシン受容体についての、ＢＷ  Ａ８４４Ｕ−Ｅｕに対する親和性（ＫＤ）を決定するための時間分解蛍光（ＴＲＦ）飽和結合研究
ＴＲＦ飽和結合アッセイのために、組換えラットＡ１アデノシン受容体（５〜２０μｇタンパク質／ウェル）で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞から調製された膜を、ウェル毎に濃度を増加させたＢＷ  Ａ８４４Ｕ−Ｅｕ（０．０１ｎＭ〜１μＭ）と共に２００μＬの最終アッセイ容積でインキュベートする。ＢＷ  Ａ８４４Ｕ−Ｅｕストック溶液をＤＭＳＯ中で調製する（アッセイ中のＤＭＳＯの最終濃度は、≦０．０１％である）。ＢＷ  Ａ８４４Ｕ−Ｅｕの各濃度について、全結合および非特異的結合を決定する。全結合は競合リガンドの非存在下で定義される。非特異的結合はＮ６−Ｒ−フェニルイソプロピルアデノシン（Ｒ−ＰＩＡ、シグマ・アルドリッチ社）（１００μＭ）の存在下で決定される。Ｒ−ＰＩＡストック溶液は、エンドトキシンを含まない水で調製する。アッセイ緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、およびアデノシンデアミナーゼ（０．２ユニット／ｍＬ）からなる。各アッセイポイントは３回評価する。全アッセイ成分をＡｃｒｏｗｅｌｌ（商標）９６ウェルフィルタープレート（ポール・ライフ・サイエンス社、アナーバー、ミシガン州）に添加し、プレートを穏やかに攪拌し、成分を混合する。アッセイは無菌技術、無菌試薬、および無菌消耗品を用いて行われる。膜を６０分間２５℃でインキュベートし、次いで真空マニホールド（ポール・ライフ・サイエンス社）を用いるＡｃｒｏｗｅｌｌ（商標）フィルタープレートのＢｉｏＴｒａｃｅポリビニリデンフルオライドフィルターを通す迅速濾過によって、アッセイを終結させる。各ウェルを３００μＬの氷冷洗浄緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［５０ｍＭ、ｐＨ７．４］およびＭｇＣｌ２［１０ｍＭ］）で迅速に４回洗浄する。各ウェルの蛍光は、ＴＲＦが可能なマイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ−２００  ＰＲＯ、テカン社、グレーディヒ、オーストリア）で、３２０ｎｍの励起および６２０ｎｍの発光で測定する。アッセイ用に希釈した膜サンプルの一定分量を、基準としてＢＳＡを用いるＢＣＡアッセイ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて全タンパク質を定量化するために用いる。ＢＷ  Ａ８４４Ｕ−Ｅｕの各濃度について、データは特異的結合（全結合と非特異的結合の間の差異）として表し、次いでｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質に変換する。データをＢＷＡ８４４Ｕ−Ｅｕの濃度に対する特異的結合（ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質）としてプロットし、次いで、ワンサイトモデル（one-site model）を用いる非線形回帰（曲線適合）によって分析し、ＫＤおよびＢｍａｘを決定する（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、バージョン５．０１）。少なくとも３つの独立した実験からの最終データは、平均値±ＳＥＭとして表す。
【００５９】
実施例５．
リポ多糖（ＬＰＳ）／エンドトキシンについてのＡ１アデノシン受容体ＴＲＦ競合結合アッセイ
競合結合アッセイのために、組換えラットＡ１アデノシン受容体（５〜２０μｇタンパク質／ウェル）で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞から調製された膜を、ＢＷ  Ａ８４４Ｕ−Ｅｕと共に、上記の飽和結合研究によって決定されたＫＤでインキュベートする。全結合は競合リガンドの非存在下で定義される。非特異的結合はＮ６−Ｒ−フェニルイソプロピルアデノシン（Ｒ−ＰＩＡ）（１００μＭ）の存在下で決定される。Ｒ−ＰＩＡストック溶液はエンドトキシンを含まない水で調製される。アッセイ緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、およびアデノシンデアミナーゼ（０．２ユニット／ｍＬ）からなる。試験リガンドはＬＰＳ／エンドトキシン（ＵＳＰ社、ロックビル、メリーランド州）（０.０１−７５０ｎｇ／ｍＬ）［またはポジティブコントロールとしてのＣＰＡ）（０.０１ｎＭ−１μＭ）］である。ＬＰＳストック溶液は、１０，０００エンドトキシンユニット（１０００ｎｇに相当）を、３３３μＬのエンドトキシンを含まない水に溶解することによって調製される。ＣＰＡストック溶液は、ＤＭＳＯ中で調製される（アッセイ中のＤＭＳＯの最終濃度は、≦０.０１％である）。最終アッセイ容積は２００μＬである。各アッセイポイントを３回評価する。全アッセイ成分をＡｃｒｏｗｅｌｌ（商標）９６ウェルフィルタープレート（ポール・ライフ・サイエンス社）に添加し、次いでプレートを穏やかに攪拌し、成分を混合する。アッセイは無菌技術、無菌試薬、および無菌消耗品を用いて行われる。アッセイ成分を６０分間２５℃でインキュベートし、次いで真空マニホールド（ポール・ライフ・サイエンス社）を用いるＡｃｒｏｗｅｌｌ（商標）フィルタープレートのＢｉｏＴｒａｃｅポリビニリデンフルオライドフィルターを通す迅速濾過によって、アッセイを終結させる。各ウェルを３００μＬの氷冷洗浄緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［５０ｍＭ、ｐＨ７．４］およびＭｇＣｌ２［１０ｍＭ］）で迅速に２〜４回洗浄する。各ウェルの蛍光を、ＴＲＦが可能なマイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ−２００  ＰＲＯ、テカン社、グレーディヒ、オーストリア）で、３２０ｎｍの励起および６２０ｎｍの発光で測定する。各濃度の試験リガンドについて、パーセント特異的結合を、［（結合−非特異的結合）／（全結合−非特異的結合）］＊１００として計算する。データは競合リガンドの濃度［ｌｏｇモル濃度（ＣＰＡ）およびｌｏｇ  ｇ／ｍＬ（ＬＰＳ）］に対するパーセント特異的結合としてプロットし、次いで競合的結合モデルを用いた非線形回帰（曲線適合）によって分析し、Ｋｉ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、バージョン５．０１）を決定する。最低でも３つの独立したアッセイからの最終データは、平均値±ＳＥＭとして表す。
【００６０】
実施例６．
フルオロフォア、Ｕ−Ｌｉｇｈｔでタグ付けした組換えラットＡ１アデノシン受容体アクセプターについてのポリクローナル抗体の、［３Ｈ］ＤＰＣＰＸの結合に対する効果を測定するためのＡ１アデノシン受容体飽和結合研究
組換えラットＡ１アデノシン受容体（５〜２０μｇタンパク質／ウェル）で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞から調製された膜を、ウェル毎に濃度を増加させた［３Ｈ］−ＤＰＣＰＸ（パーキンエルマー社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）（０．０１ｎＭ〜１０ｎＭ）と共に、アクセプターフルオロフォア、ＵＬｉｇｈｔ（パーキンエルマー社）でタグ付けした組換えラットＡ１アデノシン受容体についてのポリクローナル抗体（１：１０〜１：１０，０００）の存在下または非存在下でインキュベートする。各濃度の［３Ｈ］−ＤＰＣＰＸについて、抗体有りおよび無しで、全結合および非特異的結合を決定する。全結合は競合リガンドの非存在下で定義される。非特異的結合はＤＰＣＰＸ（シグマ・アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州）（１０μＭ）の存在下で決定される。ＤＰＣＰＸストック溶液はＤＭＳＯ中で調製される（アッセイ中のＤＭＳＯの最終濃度は、≦０．０１％である）。アッセイ緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、およびアデノシンデアミナーゼ（シグマ・アルドリッチ社）（０．２ユニット／ｍＬ）からなる。全アッセイ容積は２００μＬである。各アッセイポイントは３回評価する。全アッセイ成分をポリプロピレン製の、ディープウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ウォルサム、マサチューセッツ州）に添加し、次いでプレートを穏やかに攪拌し、成分を混合する。アッセイは無菌技術、無菌試薬、および無菌消耗品を用いて行われる。膜を６０分間２５℃でインキュベートし、次いで、自動真空マニホールド（Ｍａｃｈ  ＩＩＩ、トムテック社、ハムデン、コネチカット州）を用いてＧＦ／Ｂ濾過マット（パーキンエルマー社）を通す迅速濾過によって、アッセイを終結させる。各ウェルを３００μＬの氷冷洗浄緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［５０ｍＭ、ｐＨ７．４］およびＭｇＣｌ２［１０ｍＭ］）で迅速に４回洗浄する。濾過マットを乾燥し、固体シンチラント（scintillant）（パーキンエルマー社）にはめ込み、シンチレーションカウンター（１４５０Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ、パーキンエルマー社）を用いて３時間計数する。アッセイ用に希釈した膜サンプルの一定分量を、基準としてＢＳＡを用いるＢＣＡアッセイ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて全タンパク質を定量化するために用いる。データは特異的ＣＰＭ結合（全ＣＰＭ結合と非特異的ＣＰＭ結合の間の差異）として表し、［３Ｈ］−ＤＰＣＰＸの濃度に対する特異的結合（ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質）としてプロットし、次いでワンサイトモデル（one-site model）を用いる非線形回帰（曲線適合）によって分析し、ＫＤおよびＢｍａｘ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、バージョン５．０１、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）を決定する。最低でも３つの独立した実験からの最終データ（ＫＤおよびＢｍａｘ）は、平均値±ＳＥＭとして表す。アクセプターフルオロフォア、ＵＬｉｇｈｔでタグ付けした組換えラットＡ１アデノシン受容体についてのポリクローナル抗体の、Ａ１アデノシン受容体リガンド認識部位に対する効果を評価するために、独立データ（unpaired data）についてのスチューデントｔ−検定を用い、［３Ｈ��−ＤＰＣＰＸのＫＤおよびＢｍａｘを抗体の非存在下および存在下で比較する。Ｐ値＜０．０５であれば、有意に異なると考えられる。
【００６１】
実施例７．
リポ多糖（ＬＰＳ）／エンドトキシンについての標準曲線を作成し、試験サンプル中のＬＰＳのレベルを測定するための、Ａ１アデノシン受容体均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）競合アッセイ
標準ＬＰＳ／エンドトキシン標準曲線を作成するために、組換えラットＡ１アデノシン受容体（５〜２０μｇタンパク質／ウェル）を発現しているＣＨＯ細胞膜を、アクセプターフルオロフォア、ＵＬｉｇｈｔ（パーキンエルマー社）でタグ付けした組換えラットＡ１アデノシン受容体についてのポリクローナル抗体（１：１０〜１：１０，０００）およびＢＷ  Ａ８４４Ｕ−Ｅｕ（０．５〜２０ｎＭ）（上記の飽和結合研究によって決定されたおおよそのＫＤ）の存在下で、Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｗｈｉｔｅ９６ウェルプレート（グライナー・バイオワン・ノースアメリカ社、モンロー、ノースカロライナ州）内でインキュベートする。全結合は試験リガンドの非存在下で定義され、非特異的結合はＲ−ＰＩＡ（１００μＭ）の添加によって定義される。活性化リガンド、ＬＰＳ／エンドトキシン（ＵＳＰ社、ロックビル、メリーランド州）は、０．０１〜７５０ｎｇ／ｍＬの範囲の８つの濃度で評価される。ＬＰＳ／エンドトキシンストック溶液は、１０，０００エンドトキシンユニット（１０００ｎｇに相当）を３３３μＬのエンドトキシンを含まない水に溶解することによって調製される。付加的アッセイ成分は、アッセイ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［５０ｍＭ、ｐＨ７．４］、ＭｇＣｌ２［１０ｍＭ］、およびアデノシンデアミナーゼ（０．２ユニット／ｍＬ）を含む。全アッセイ容積は２００μＬである。各アッセイポイントは３回評価する。全アッセイ成分をプレートに添加し、次いでプレートを穏やかに攪拌し、成分を混合する。アッセイは無菌技術、無菌試薬、および無菌消耗品を用いて行われる。膜を６０分間２５℃でインキュベートする。インキュベーション後、ＨＴＲＦが可能なマイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ−２００  ＰＲＯ、テカン社、グレーディヒ、オーストリア）で、３２０ｎｍの励起ならびに６６５および６２０ｎｍでの発光で、蛍光を測定する。全測定（total）、非特異的測定（nonspecific）、およびＬＰＳについてのデータは、６６５と６２０での測定の比（６６５／６２０）として表す。次いで、基礎活性を、全比測定と非特異的比測定の間の差異として計算する。ＬＰＳについてのパーセント（％）基礎活性は、以下のように計算する：［（試験条件−非特異的）／（基礎活性）］＊１００。ＬＰＳについての濃度反応曲線は、ＬＰＳ（ｇ／ｍＬ）のｌｏｇ濃度に対する％基礎活性の関数としてプロットする。この曲線を、勾配変化のある法面（variable slope）を有するＳ字型の用量反応曲線を用いる非線形回帰（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、バージョン５.０４、グラフパッド・ソフトウェア社、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）によって分析し、ＥＣ５０を決定する。各標準曲線は、最低でも３つの独立した実験を表し、最終データは平均値±ＳＥＭとして表す。
【００６２】
試験サンプル中のＬＰＳ／エンドトキシンレベルを測定するために、組換えラットＡ１アデノシン受容体（５〜２０μｇタンパク質／ウェル）を発現しているＣＨＯ細胞膜を、アクセプターフルオロフォア、ＵＬｉｇｈｔ（パーキンエルマー社）でタグ付けしたラットＡ１アデノシン受容体についてのポリクローナル抗体（１：１０〜１：１０，０００）およびＢＷ  Ａ８４４Ｕ−Ｅｕ（０．５〜２０ｎＭ）（上記の飽和結合研究によって決定されたおおよそのＫＤ）ならびに試験サンプルまたはＬＰＳ（１０ｐｇ／ｍＬ  １ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、および１００ｎｇ／ｍＬ）を含むポジティブコントロールの存在下で、Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｗｈｉｔｅ９６ウェルプレート（グライナー・バイオワン・ノースアメリカ社、モンロー、ノースカロライナ州）内でインキュベートする。全結合は競合リガンドの非存在下で定義される。非特異的結合はＮ６−Ｒ−フェニルイソプロピルアデノシン（Ｒ−ＰＩＡ）（１００μＭ）の存在下で決定される。Ｒ−ＰＩＡストック溶液はエンドトキシンを含まない水で調製される。ポジティブＬＰＳコントロール用に、エンドトキシンストック溶液を、１０，０００エンドトキシンユニット（１０００ｎｇに相当）を３３３μＬのエンドトキシンを含まない水に溶解することによって調製する。付加的アッセイ成分は、アッセイ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［５０ｍＭ、ｐＨ７．４］、ＭｇＣｌ２［１０ｍＭ］、およびアデノシンデアミナーゼ（０．２ユニット／ｍＬ）を含む。全アッセイ容積は２００μＬである。各アッセイポイントは３回評価する。全アッセイ成分をプレートに添加し、次いでプレートを穏やかに攪拌し、成分を混合する。アッセイは無菌技術、無菌試薬、および無菌消耗品を用いて行われる。膜を６０分間２５℃でインキュベートする。インキュベーション後、ＨＴＲＦが可能なマイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ−２００  ＰＲＯ、テカン社、グレーディヒ、オーストリア）で、３２０ｎｍの励起ならびに６６５および６２０ｎｍでの発光で蛍光を測定する。全測定（total）、非特異的測定（nonspecific）、試験サンプル、およびポジティブＬＰＳコントロールについてのデータは、６６５と６２０での測定の比（６６５／６２０）として表す。次いで、基礎活性を、全比測定と非特異的比測定の間の差異として計算する。試験サンプルまたはポジティブＬＰＳコントロールについてのパーセント（％）基礎活性は、次のように計算する：［（試験条件−非特異的）／（基礎活性）］＊１００。試験サンプルまたはポジティブコントロール中のＬＰＳのレベルは、サンプルまたはポジティブコントロールについての％基礎活性の単位で表した蛍光測定を、上記のＨＴＲＦ競合アッセイでＬＰＳについての標準曲線を作成するための既知濃度のＬＰＳを添加されたサンプルについての％基礎活性測定と比較することによって、ＬＰＳについての標準曲線から決定される。
【００６３】
実施例８．
リポ多糖（ＬＰＳ）／エンドトキシンについての標準曲線を作成し、試験サンプル中のＬＰＳのレベルを測定するための、Ａ１アデノシン受容体ＴＲＦ  Ｅｕ−ＧＴＰ結合アッセイ
標準ＬＰＳ／エンドトキシン標準曲線を作成するために、組換えラットＡ１アデノシン受容体を発現しているＣＨＯ細胞（１ユニット／ウェル、およそ２０μｇタンパク質／ウェルに相当；パーキンエルマー社、ウォルサム、マサチューセッツ州）から調製された膜を、Ａｃｒｏｗｅｌｌフィルタープレート（ポール・ライフ・サイエンス社、アナーバー、ミシガン州）内で、ＬＰＳ／エンドトキシン（ＵＳＰ社、ロックビル、メリーランド州）（０．０１〜７５０ｎｇ／ｍＬ）の存在下でプレインキュベートする。エンドトキシンストック溶液は、１０，０００エンドトキシンユニット（１０００ｎｇに相当）を３３３μＬのエンドトキシンを含まない水に溶解することによって調製される。付加的アッセイ成分は、アッセイ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［５０ｍＭ、ｐＨ７．４］、ＭｇＣｌ２［１０ｍＭ］、ＮａＣｌ［１００ｍＭ］）、ＧＤＰ（１０μＭ）、サポニン（１２５μｇ／ｍＬ）、およびアデノシンデアミナーゼ（０.２ユニット／ｍＬ）を含む。全試薬および緩衝液は、エンドトキシンを含まない水を用いて調製される。６０分間プレインキュベーションされる全容積は１５０μＬである。２５℃でのプレインキュベーション後、５０μＬのＥｕ−ＧＴＰ（パーキンエルマー社）を添加し、１０ｎＭの最終Ｅｕ−ＧＴＰ濃度を２００μＬの全容積で達成する。各アッセイポイントは３回評価する。全結合はＬＰＳの非存在下で定義され、非特異的結合はＧＴＰγＳ（１０μＭ）の添加によって定義される。アッセイは無菌技術、無菌試薬、および無菌消耗品を用いて行われる。２５℃で３０分間インキュベーションした後、真空マニホールド（ポール・ライフ・サイエンス社、アナーバー、ミシガン州）を用いる濾過によってアッセイを終結させる。フィルタープレートのＢｉｏＴｒａｃｅポリビニリデンフルオライドフィルターで膜を捕捉する。各ウェルを、３００μＬの洗浄緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［５０ｍＭ、ｐＨ７．４］およびＭｇＣｌ２［１０ｍＭ］）で２〜４回洗浄する。各ウェルの蛍光は、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ−２００  ＰＲＯ（テカン社、グレーディヒ、オーストリア）で、３２０ｎｍの励起波長、６２０ｎｍの発光波長、および１０９のゲインセッティングで蛍光トップリード（top read）を用いて決定する。Ｅｕ−ＧＴＰ基礎活性は、全Ｅｕ−ＧＴＰ結合および非特異的Ｅｕ−ＧＴＰ結合の間の差異として計算する。パーセント（％）基礎は、次のように計算される：［（試験条件−非特異的）／（基礎活性）］＊１００。ＬＰＳについての濃度反応標準曲線を、ＬＰＳ（ｇ／ｍＬ）のｌｏｇ濃度に対するＥｕ−ＧＴＰ％基礎活性の関数としてプロットする。勾配変化のある法面（variable slope）を有するＳ字型の用量反応曲線を用いる非線形回帰（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、バージョン５、グラフパッド・ソフトウェア社、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）によって標準曲線を分析し、ＥＣ５０を決定する。各標準曲線は最低でも３つの独立した実験を表し、最終データは平均値±ＳＥＭとして表す。
【００６４】
試験サンプル中のＬＰＳ／エンドトキシンレベルを測定するために、組換えラットＡ１アデノシン受容体を発現しているＣＨＯ細胞（１ユニット／ウェル、およそ２０μｇタンパク質／ウェルに相当；パーキンエルマー社、ウォルサム、マサチューセッツ州）から調製された膜を、Ａｃｒｏｗｅｌｌフィルタープレート（ポール・ライフ・サイエンス社、アナーバー、ミシガン州）内で、試験サンプルまたはＬＰＳ／エンドトキシン（ＵＳＰ社、ロックビル、メリーランド州）（１０ｐｇ／ｍＬ  １ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、および１００ｎｇ／ｍＬ））を含むポジティブコントロールの存在下でプレインキュベートする。ポジティブＬＰＳコントロール用に、エンドトキシンストック溶液を、１０，０００エンドトキシンユニット（１０００ｎｇに相当）を３３３μＬのエンドトキシンを含まない水に溶解することによって調製する。付加的アッセイ成分は、アッセイ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［５０ｍＭ、ｐＨ７．４］、ＭｇＣｌ２［１０ｍＭ］、ＮａＣｌ［１００ｍＭ］）、ＧＤＰ（１０μＭ）、サポニン（１２５μｇ／ｍＬ）、およびアデノシンデアミナーゼ（０．２ユニット／ｍＬ）を含む。全試薬および緩衝液は、エンドトキシンを含まない水を用いて調製される。６０分間プレインキュベーションする全容積は１５０μＬである。２５℃でのプレインキュベーション後、５０μＬのＥｕ−ＧＴＰ（パーキンエルマー社）を添加し、１０ｎＭの最終Ｅｕ−ＧＴＰ濃度を２００μＬの全容積で達成する。各アッセイポイントは３回評価する。全結合はＬＰＳの非存在下で定義され、非特異的結合はＧＴＰγＳ（１０μＭ）の添加によって定義される。アッセイは無菌技術、無菌試薬、および無菌消耗品を用いて行われる。２５℃で３０分間インキュベーションした後、真空マニホールド（ポール・ライフ・サイエンス社、アナーバー、ミシガン州）を用いる濾過によってアッセイを終結させる。フィルタープレートのＢｉｏＴｒａｃｅポリビニリデンフルオライドフィルターで膜を捕捉する。各ウェルを、３００μＬの洗浄緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［５０ｍＭ、ｐＨ７．４］およびＭｇＣｌ２［１０ｍＭ］）で２〜４回洗浄する。各ウェルの蛍光は、３２０ｎｍの励起波長、６２０ｎｍの発光波長、および１０９のゲインセッティングで蛍光トップリード（top read）を用いるＩｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ−２００  ＰＲＯ（テカン社、グレーディヒ、オーストリア）で決定する。Ｅｕ−ＧＴＰ基礎活性は、全Ｅｕ−ＧＴＰ結合と非特異的Ｅｕ−ＧＴＰ結合の間の差異として計算される。パーセント（％）基礎活性は、次のように計算される：［（試験条件−非特異的）／（基礎活性）］＊１００。試験サンプルまたはポジティブコントロール中のＬＰＳのレベルは、サンプルまたはポジティブコントロールについての％基礎活性の単位で表している蛍光測定を、上記のＴＲＦ  Ｅｕ−ＧＴＰ結合アッセイでＬＰＳについての標準曲線を作成するための既知濃度のＬＰＳを添加されたサンプルについての％基礎活性測定と比較することによって、ＬＰＳについての標準曲線から決定される。
【００６５】
図１は、ＬＰＳ（ｇ／ｍＬ）のｌｏｇ濃度に対する％基礎活性の関数としてプロットした、ＴＲＦ  Ｅｕ−ＧＴＰ結合アッセイに由来するＬＰＳについての濃度反応標準曲線を示す。ＴＲＦ  Ｅｕ−ＧＴＰ結合アッセイについての詳細は、実施例８に記載されている。この標準曲線を、勾配変化のある法面（variable slope）を有するＳ字型の用量反応曲線を用いる非線形回帰（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、バージョン５、グラフパッド・ソフトウェア社、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）によって分析し、ＥＣ５０を決定する。標準曲線は、ＬＰＳの濃度（１０ｐｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ）についての８〜１０個の独立したアッセイの平均値を表している。このアッセイの感度は１０ｐｇ／ｍＬである。
【００６６】
実施例９．
リポ多糖（ＬＰＳ）／エンドトキシンについての標準曲線を作成し、試験サンプル中のＬＰＳのレベルを測定するための、Ａ１アデノシン受容体ＨＴＲＦ  ＧＴＰ結合アッセイ
標準ＬＰＳ／エンドトキシン標準曲線を作成するために、組換えラットＡ１アデノシン受容体を発現しているＣＨＯ細胞膜（インビトロジェン社）（５〜２０μｇタンパク質／ウェル）を、ＬＰＳ／エンドトキシン（ＵＳＰ社、ロックビル、メリーランド州）（０．０１−７５０ｎｇ／ｍＬ）と共に、Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｗｈｉｔｅマイクロタイター９６ウェルプレート内でインキュベートする。ＬＰＳストック溶液は、１０，０００エンドトキシンユニット（１０００ｎｇに相当）を３３３μＬのエンドトキシンを含まない水に溶解することによって調製する。全結合はＬＰＳの非存在下で定義され、非特異的結合はＧＴＰγＳ（１０μＭ）の添加によって定義される。付加的アッセイ成分は、アッセイ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［５０ｍＭ、ｐＨ７．４］、ＭｇＣｌ２［１０ｍＭ］、ＮａＣｌ［１００ｍＭ］）、ＧＤＰ（１０μＭ）、サポニン（１２５μｇ／ｍＬ）、およびアデノシンデアミナーゼ（０.２ユニット／ｍＬ）を含む。３０〜６０分間２５℃でインキュベーション後、ＵＬｉｇｈｔ（パーキンエルマー社）でタグ付けした組換えラットＡ１アデノシン受容体についてのポリクローナル抗体（１：１０〜１：１０，０００）およびＥｕ−ＧＴＰ（パーキンエルマー社）（５〜２０ｎＭ）をアッセイに添加する。全アッセイ容積は２００μｌである。各アッセイポイントは３回評価する。アッセイは無菌技術、無菌試薬、および無菌消耗品を用いて行われる。さらに３０〜６０分間インキュベーションした後、蛍光を、テカン社製Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ−２００  ＰＲＯ（テカン社、グレーディヒ、オーストリア）で、３２０ｎｍの励起ならびに６６５および６２０ｎｍでの発光で測定する。全測定（total）、非特異的測定（nonspecific）、およびＬＰＳについてのデータは、６６５と６２０での測定の比（６６５／６２０）として表す。次いで、Ｅｕ−ＧＴＰ基礎活性を、全比測定と非特異的比測定の間の差異として計算する。ＬＰＳについてのパーセント（％）基礎活性は、次のように計算する：［（試験条件−非特異的）／（基礎活性）］＊１００。ＬＰＳについての濃度反応曲線は、ＬＰＳ（ｇ／ｍＬ）のｌｏｇ濃度に対する％基礎活性の関数としてプロットする。この曲線を、勾配変化のある法面（variable slope）を有するＳ字型の用量反応曲線を用いる非線形回帰（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、バージョン５．０４、グラフパッド・ソフトウェア社、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）によって分析し、ＥＣ５０を決定する。各標準曲線は最低でも３つの独立した実験を表し、最終データは平均値±ＳＥＭとして表す。
【００６７】
試験サンプル中のＬＰＳ／エンドトキシンレベルを測定するために、組換えラットＡ１アデノシン受容体を発現しているＣＨＯ細胞膜（インビトロジェン社）（５〜２０μｇタンパク質／ウェル）を、試験サンプルまたはＬＰＳ／エンドトキシン（ＵＳＰ社、ロックビル、メリーランド州）（１０ｐｇ／ｍＬ  １ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、および１００ｎｇ／ｍＬ））を含むポジティブコントロールと共に、Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｗｈｉｔｅマイクロタイター９６ウェルプレート内でインキュベートする。ポジティブＬＰＳコントロール用に、エンドトキシンストック溶液を、１０，０００エンドトキシンユニット（１０００ｎｇに相当）を３３３μＬのエンドトキシンを含まない水に溶解することによって調製する。全結合はＬＰＳの非存在下で定義され、非特異的結合はＧＴＰγＳ（１０μＭ）の添加によって定義される。付加的アッセイ成分は、アッセイ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［５０ｍＭ、ｐＨ７．４］、ＭｇＣｌ２［１０ｍＭ］、ＮａＣｌ［１００ｍＭ］）、ＧＤＰ（１０μＭ）、サポニン（１２５μｇ／ｍＬ）、およびアデノシンデアミナーゼ（０．２ユニット／ｍＬ）を含む。３０〜６０分間２５℃でインキュベーションした後、ＵＬｉｇｈｔ（パーキンエルマー社）でタグ付けした組換えラットＡ１アデノシン受容体についてのポリクローナル抗体（１：１０〜１：１０，０００）およびＥｕ−ＧＴＰ（パーキンエルマー社）（５〜２０ｎＭ）をアッセイに添加する。全アッセイ容積は２００μｌである。各アッセイポイントは３回評価する。アッセイは無菌技術、無菌試薬、および無菌消耗品を用いて行われる。さらに３０〜６０分間インキュベーションした後、蛍光を、テカン社製Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ−２００  ＰＲＯ（テカン社、グレーディヒ、オーストリア）で、３２０ｎｍの励起ならびに６６５および６２０ｎｍでの発光で測定する。全測定（total）、非特異的測定（nonspecific）、試験サンプル、およびポジティブＬＰＳコントロールについてのデータは、６６５と６２０での測定の比（６６５／６２０）として表す。次いで、Ｅｕ−ＧＴＰ基礎活性を、全比測定と非特異的比測定の間の差異として計算する。試験サンプルまたはポジティブＬＰＳコントロールについてのパーセント（％）基礎活性は、次のように計算する：［（試験条件−非特異的）／（基礎活性）］＊１００。試験サンプルまたはポジティブコントロール中のＬＰＳのレベルは、サンプルまたはポジティブコントロールについての％基礎活性の単位で表した蛍光測定を、上記のＨＴＲＦ  ＧＴＰ結合アッセイでＬＰＳについての標準曲線を作成するための既知濃度のＬＰＳを添加されたサンプルについての％基礎活性測定と比較することによって、ＬＰＳについての標準曲線から決定される。
【００６８】
実施例１０．
腸管穿孔モデル（ＣＬＰ）誘導性敗血症を患うラットの血中ＬＰＳを測定するための、エンドトキシン・アッセイ・アクティビティ（ＥＡＡ（商標））アッセイの感度および特異性と比較したＡ１アデノシン受容体ＨＴＲＦ  ＧＴＰ結合アッセイについての感度および特異性
ＣＬＰ誘導性敗血症のラットモデル：動物の外科手術および毎日のモニタリング
全ての外科手術および動物管理はＮＩＨガイドラインに従い、動物管理委員会によって認可されている。雄性で無菌のスプラーグドーリーラット（２７５〜３２５ｇ、ハーラン社、インディアナポリス、インディアナ州）を、実験前に食物および水に自由にアクセスできる陽圧隔離キャレル（carrels）内で飼育し、その後ＢＳＬ−２バイオハザード実験室内で飼育する。実験を通して一般的な麻酔（３％イソフルラン、９７％Ｏ２）下におき、無菌技術を用い、腹側の頸部中央部（midventral neck）に２ｃｍの切開を施し、左頸動脈および右頸静脈を露出させ、カテーテル処置をする（ＰＥ−５０；クレイ・アダムス、パーシッパニー、ニュージャージー州）。ベースラインの生命徴候（直腸温度、脈動および平均動脈圧、頸動脈の脈拍数、呼吸頻度、立毛の程度、存在（presence）もしくは眼窩周囲出血または鼻汁）を決定し、血液学、血液ガス、血漿サンプル、および培養のために初期動脈血サンプルを得る（１．０ｍＬ）。採取された血液を３ｘ容積の無菌０．９％ＮａＣｌ（生理食塩水、ＮＳ）と交換する。外科的切開を閉じ、麻酔を中止し、意識が戻るまで（典型的には３〜５分）動物をモニターし、次いでそのケージに戻す。カテーテルをステンレス鋼バネ内で遮蔽し、ケージの蓋に固定したスイベル（インステック社）に乗せ、自由に動き、食物および水にアクセスできるようにする。翌朝（１８〜２４時間後）、動物に再度麻酔をかけ、腹側中央部（midventral abdominal）に無菌で４ｃｍの切開を施し、腸を露出させる。３−０絹糸を有する回盲弁の下に腸を穏やかに格納し、次いでその腸間膜表面および腸間膜反対側表面の両方にＡ１９−ゲージ針で、その「徹底的な（through and through）」穿通によって盲腸内に２つの穿孔を空ける。穿孔処理した盲腸を、少なくとも５０μＬの糞便が穿通された表面のそれぞれに押し出されるまで穏やかに圧迫し、次いで腸を穏やかに腹部に再挿入し、切開を閉じる。液体サポートのために、１回の術後ＮＳ急速投与を提供する（５０ｍＬ／ｋｇ皮下注射）。血行動態のための動物のモニタリングは、ＣＬＰ後、少なくとも０、３、６、２４、および３２時間で記録される。ＣＬＰを乗り切った全動物をイソフルラン過量投与によって人道的に屠殺し、気胸を観察し、３２時間での最終出血の直後に検視する。
【００６９】
ＬＰＳ測定用の血漿サンプル
頸動脈の動脈血サンプルをＣＬＰ直前（ｔ＝０時間）、ならびにＣＬＰ後ｔ＝６時間、２４時間、および３２時間、または死亡が観察された時（ＴＯＤ）（このＴＯＤがＣＬＰ後３２時間よりも早い場合）に得る。頸動脈の動脈血サンプルは、正常なコントロール（ＣＬＰ無し）で同一時点にて得る。これらの動脈サンプルは、正常なコントロール（ＣＬＰ無し）（ｎ＝２５）およびＣＬＰを有する動物（ｎ＝２５）でのＬＰＳ測定のために用いられる。計画案についてのサンプルサイズ評価へのアプローチは、良性の診断特性を示す０．７５のＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有する新たな試験（ＨＴＲＦ  ＬＰＳアッセイ）に基づいた。陽性群由来の２５および陰性群由来の２５のサンプルサイズは、０．０５の有意水準で両側ｚ−検定を用いた０．５のＡＵＣ（例えば、偶然のみの基準）と比較すると、９２％検出力（power）を達成する。陽性および陰性群応答に由来する測定の標準偏差は等しいと想定される。ＡＵＣが０．８まで増加すると、検出力（Power）はより高くなる（９８％）。
【００７０】
サンプリングする前に、頸動脈の動脈カテーテルポートをベタジンで調製する。上で示した各時点で、１．０ｍＬの動脈血を採取し、ＥＡＡアッセイについての製造者の使用説明書によりバイアルに添加し、全血中のＬＰＳを測定する。全血サンプルを、製造者の使用説明書に従ってＥＡＡで試験する。同一時点での０.４ｍＬの第２の動脈血（arterial bleed）を、Ｋ３ＥＤＴＡを含有する１ｍＬのシリンジ内に収集し、すぐに氷上または冷蔵庫内に置く（４℃で１時間以下）。この血液を３０００ｒｐｍで１５分間、４℃で遠心分離し、少なくとも０．２ｍＬの血漿を得る。血漿を無菌的に無菌ピペットで無菌クライオバイアルに移し、ＨＴＲＦ  ＬＰＳアッセイで血漿中のＬＰＳを測定する。ＨＴＲＦ  ＬＰＳアッセイのために、過塩素酸法を用いて血漿からＬＰＳを抽出する（Obayashi, J Lab Clin Med 104:321-330, 1984）。各動脈サンプリング後、採取された血液の３ｘ容積を頸静脈カテーテルで無菌ＮＳと交換する。
【００７１】
ＨＴＲＦ  ＬＰＳアッセイ対ＥＡＡ  ＬＰＳアッセイについての診断感度および特異性
ＬＰＳ測定は、各アッセイについて、すなわちＨＴＲＦまたはＥＡＡアッセイについて作成されたＬＰＳについての標準曲線から決定される。真陰性、真陽性、偽陰性、および偽陽性測定は、動物についてＣＬＰ有りおよび無しで決定される。診断感度、および診断特異性は、ＨＴＲＦおよびＥＡＡアッセイについて計算され、独立データ（unpaired data）についてのスチューデントｔ検定を使用して分析しされる。
統計的有意性：データは独立データ（unpaired data）についてのスチューデントｔ検定で分析される；有意水準はＰ＜０．０５で設定される。
【００７２】
本発明が属する分野の当業者であれば、本発明の原理を利用してその精神または特徴から逸脱することなく、特に前述の教示を考慮して、他の実施態様をもたらす修正をなしうるであろう。したがって、記載された実施態様は全ての点において説明のためにのみ提供されており、限定する意図はないと考えられるべきであり、それゆえ本発明の範囲は、前述の記載または図面よりも、むしろ添付の特許請求の範囲によって示される。結果的に、本発明は特定の実施態様を参照して記載されている一方、当業者に明らかな構造、配列、および材料などの修正もまた出願人が特許請求の範囲に記載している本発明の範囲内に含まれる。
【図１】
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