(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変抗ＣＤ２０抗体又はその抗原結合断片であって、当該抗体又はその抗原結合断片が以下の：
配列番号１２５の重鎖可変領域配列を含む第一ポリペプチド；
配列番号４８の軽鎖可変領域配列を含む第二ポリペプチド
を含み、当該抗体又はその抗原結合断片が、マウスＢ−Ｌｙ１抗体がＣＤ２０と複合体化した場合と比較して、ＣＤ２０と複合化した場合に、高いレベルのアポトーシスを誘導する、
前記改変抗ＣＤ２０抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
前記抗体又はその抗原結合断片が、バイセクト型複合体オリゴ糖の量が増加するように糖鎖改変されたFc領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
前記抗体又はその抗原結合断片が、フコース残基の量が低下するように糖鎖改変されたFc領域を含む、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗体又はその抗原結合断片が、少なくとも１のエフェクター機能を増加するか、Fc受容体結合親和性を増加するか、又は少なくとも１のエフェクター機能の増加しかつFc受容体結合親和性を増加するように改変されたN-結合オリゴ糖を有するFc領域を含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項５】
前記抗体又はその抗原結合断片のFc領域におけるオリゴ糖の少なくとも２０％が、バイセクト化され、非フコース化されている、請求項４に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項６】
前記Fc領域におけるオリゴ糖の少なくとも５０％が、非フコース化されている、請求項４に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項７】
請求項２〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を発現するための宿主細胞であって、当該宿主細胞が、前記重鎖及び軽鎖をコードする１又は複数のポリヌクレオチド、及び前記Ｆｃ領域を糖鎖改変するために十分な量で発現されるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする１又は複数のポリヌクレオチドを含む、前記宿主細胞。
【請求項８】
前記宿主細胞が、マンノシダーゼＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記宿主細胞により産生される前記抗体又はその抗原結合断片が、前記糖鎖改変の結果として増大されたＦｃ受容体結合親和性を示す、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
前記Ｆｃ受容体が、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体である、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
前記宿主細胞により産生される前記抗体又はその抗原結合断片が、前記糖鎖改変の結果として、増大されたエフェクター機能を示す、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
前記増大されたエフェクター機能が、増大されたFc媒介性細胞毒性である、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
前記増大されたエフェクター機能が、増大された抗体依存性細胞毒性である、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
配列番号１２５の重鎖可変領域配列を含む第一ポリペプチド；
配列番号４８の軽鎖可変領域配列を含む第二ポリペプチド
をコードする、少なくとも１のトランスフェクトされたポリヌクレオチドであって、ヒト免疫グロブリンのFc領域に等価の領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
悪性血液疾患又は自己免疫疾患の治療のための医薬組成物であって、有効量の請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、及び医薬として許容される担体を含む、前記医薬組成物。
【請求項１６】
悪性血液疾患又は自己免疫疾患の治療のための医薬組成物であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、及び医薬として許容される担体を含む、前記医薬組成物。
【請求項１７】
前記悪性血液疾患が、B細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、又はB細胞慢性リンパ性白血病である、請求項１５又は１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記自己免疫疾患が、リュウマチ様関節炎又は紅斑性狼瘡である、請求項１５又は１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記悪性血液疾患が、B細胞リンパ腫である、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
配列番号１２５の重鎖可変領域配列をコードする配列及び配列番号４８の軽鎖可変領域配列をコードする配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項２０に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２３】
改変されたオリゴ糖を有し、そして増大されたエフェクター機能を有するように改変されたＦｃ領域を有する、抗ＣＤ２０抗体又はその抗原結合断片を宿主細胞において製造する方法であって、当該方法が、以下の：
当該抗体又はその抗原結合断片をコードする１又は複数の核酸、及びβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１の核酸を発現するように遺伝子操作された宿主細胞を培養し；そして
当該抗体又はその抗原結合断片を単離する
を含み、当該抗体又はその抗原結合断片が、請求項２〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片である、前記方法。
【請求項２４】
前記宿主細胞が、マンノシダーゼII活性を有するポリペプチドをコードする核酸を発現するようにさらに遺伝子操作される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記改変されたオリゴ糖が、非改変オリゴ糖と比較して、フコースが低減されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記宿主細胞により産生される前記抗体又はその抗原結合断片が、Fc領域において増大されたバイセクト化、非フコース化オリゴ糖の増大された割合を有する、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原結合分子(ＡＢＭ)に関する。具体的な実施態様では、本発明は、組換えモノクローナル抗体又は断片、例えばキメラ、霊長類化又はヒト化抗体又は断片であって、標的抗原による細胞シグナル活性を媒介する改変された能力及び/又は１以上の標的抗原の架橋を媒介する改変された能力を有するものに関する。さらに、本発明は、このようなＡＢＭをコードする核酸分子及びベクター、並びにこのような核酸分子を含む宿主細胞に関する。本発明はさらに、本発明のＡＢＭの製造方法、並びに疾患の治療においてこれらのＡＢＭを用いる方法に関する。さらに、本発明は、改善された治療性質を有する改変されたグリコシル化を有するＡＢＭに関し、高いＦｃ受容体結合性及び高いエフェクター機能を有する抗体を含む。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンとも呼ばれる抗体は、４個のポリペプチド鎖を含む基本構造を有する。２個の同一重鎖は、２個の同一軽鎖と対になっている。各重鎖及び軽鎖は、可変領域(それぞれＶＨ及びＶＬ)及び定常領域(それぞれＣＨ及びＣＬ)を含む。ＣＨ領域は３個のドメイン(ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３)を有する一方、それより小さいＣＬ領域は１のドメイン(単にＣＬと呼ばれる)しか有さない。各ＶＨ及びＶＬ領域は、以下の順番で４個のフレームワーク領域に隣接された３個の相補性決定領域(ＣＤＲ)を含む：ＦＲ１-ＣＤＲ１-ＦＲ２-ＣＤＲ２-ＦＲ３-ＣＤＲ３-ＦＲ４。ＣＤＲは、Ｖ領域の最も変動する部分であり、そして抗体の抗原特異性を決定する。対になったＶＨとＶＬは、一緒になって抗原結合部分を形成し、そして２価の抗体は、このような抗原結合部位を２つ有する。この基本的な抗体の構造は、所望の機能及び/又は抗原結合活性を保持又はさらに改善する一方、様々な方法(例えば、当該構造の断片を作成することにより)改変できる。
【０００３】
ＶＨとＣＨ１ドメインの間の境界は、保存アミノ酸を含む。この接触領域は、「分子玉継ぎ手(molecular ball-and-socket joint)」として記載されることがある。この継ぎ手は、「肘の動き」を決定し、そしていわゆるＣＨ１及びＣＬ領域に対するＶＨ及びＶＬ領域の「肘角度(elbow angle)」を決定し、そして固定された接触がＶ領域とＣ領域との間で形成することを妨げる(Lesk and Chothia, Nature (1988) 335(8): 188-190))。玉継ぎ手のソケットは、VHフレームワーク領域のアミノ酸残基、特に１１、１１０、及び１１２の位置の残基により形成される(Kabatら、(1987) 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、第四版 (Public Health Services, NIH, Washington, DC)の番号付けシステムに従う)、(Lesk and Chothia, Nature (1988) 335(8): 188-190.を参照のこと)。当該玉継ぎ手の「玉」は、ＣＨ１ドメインに存在し、そして１４８及び１４９位の２個のアミノ酸により主に形成された(Landolfiら、J. Immunol. (2001) 166:1748-1754; Lesk and Chothia, Nature (1988) 335(8):188-190を参照のこと(当該文献で、「玉」を形成するＣＨ１残基は、それぞれ１４９及び１５０と番号付けられた)）。これらの位置でのアミノ酸の違いは、Ｖ領域とＣ領域との間で形成される肘角度を決定付けることができ、その結果、ＶＨ-ＶＬダイマーの向きを決定することができる(Lesk and Chothia、Nature (1988) 335(8): 188-190を参照のこと)。これらのＶＨ位を占めるアミノ酸残基は、免疫グロブリン配列をとおして高度に保存されている(例えば、Lesk and Chothia, Nature (1988) 335(8):188-190)。当該継ぎ手に関わる全ての残基(例えば、残基１１、１１０、及び１１２、１４８及び１４９)は、フレームワーク領域(例えば、残基１１、１１０、及び１１２)に位置するか、又は定常ドメイン(例えば１４８及び１４９位(Landolfiらに従う)Lesk and Chothiaに従うと１４９位及び１５０位)に位置し、そして抗原結合に直接関与するかは明らかではない(Landolfi et al, J. Immunol. (2001) 166:1748-1754)。
【０００４】
抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)及び補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)などの媒介エフェクター機能に加え、モノクローナル抗体は、細胞シグナル経路を誘導又は阻害することにより細胞機能を調節することができる。例えば、モノクローナル抗体は、抗原架橋を媒介し、死受容体(death receptor)を活性化することが示され(受容体のオリゴマー化を促進するか又はリガンドの結合を模倣することによる)、そして細胞増殖分化及び/又は増殖経路においてリガンド媒介性の細胞シグナル伝達を阻害することが示された(例えば、Ludwigら、Oncogene (2003) 22: 9097- 9106を参照のこと)。
【０００５】
アポトーシス、つまりプログラムされた細胞死は、いくつもの異なるメカニズムにより引き起こされうる。例えば、細胞膜に結合された「死受容体」、例えば腫瘍ネクローシス因子受容体(ＴＮＦＲ)スーパーファミリーのメンバー、を通してシグナル経路を活性化することは、アポトーシスの誘導を導きうる。同様に、表面抗原、例えばＣＤ２０の二量化又は架橋は、アポトーシスを誘導しうる(例えば、Ludwigら、Oncogene (2003) 22: 9097-9106を参照のこと)。
【０００６】
霊長類、例えば非限定的にヒトの疾患の治療のための、非限定的にアポトーシスの誘導を含む細胞シグナル伝達に関与する抗原を標的化する高度な治療アプローチについての必要性が残っている。
【発明の概要】
【０００７】
標的抗原による細胞シグナル活性を媒介する改変された能力及び/又は１以上の標的抗原の架橋を媒介する改変された能力を有する改変抗原結合分子(ＡＢＭ)の著しい治療潜在性を認識したので、本発明者は、このようなＡＢＭ、並びにこのようなＡＢＭを製造する方法を開発した。とりわけ、本方法は、その組換え体、キメラ抗体、又はキメラ断片の製造に関する。これらの改変ＡＢＭの効力は、抗体Ｆｃ領域のグリコシル化プロファイルを操作することによりさらに高められる。
【０００８】
従って一の態様では、本発明は、親抗原結合分子の重鎖又は軽鎖可変領域に比べて重鎖又は軽鎖可変領域の少なくとも１のフレームワーク領域において少なくとも１のアミノ酸残基置換を含む重鎖又は軽鎖を含む改変抗原結合分子であって、当該置換が、当該改変抗原結合分子が当該標的抗原と複合体形成する場合に、標的抗原の細胞シグナル活性の変化をもたらす前記分子に関する。具体的な実施態様では、変化された細胞シグナル活性はアポトーシスである。１の実施態様では、改変抗原結合分子は、アポトーシスを誘導する高い能力を有する。別の実施態様では、改変抗原結合分子は、アポトーシスを誘導する低い能力を有する。
【０００９】
別の態様では、親抗原結合分子の重鎖又は軽鎖可変領域に比べて重鎖又は軽鎖可変領域の少なくとも１のフレームワーク領域において、少なくとも１のアミノ酸残基置換を含む重鎖又は軽鎖を含む、改変抗原結合分子であって、当該改変抗原結合分子が、当該置換の結果として１以上の標的抗原の架橋を媒介する能力の変化を有する、前記分子に関する。
【００１０】
１の実施態様では、本発明の改変抗原結合分子は、重鎖可変領域のＦＲ１において置換を含む。別の実施態様では、置換は、少なくとも２、少なくとも３、又は少なくとも４個のアミノ酸からなる群から選ばれる置換を含む。
【００１１】
１の実施態様では、置換は、重鎖可変領域の全てのＦＲ１の置換を含む。さらなる実施態様では、全てのＦＲ１は、生殖細胞系列ＶＨＦＲ１により置き換えられる。具体的な実施態様では、生殖細胞系列ＶＨＥＲ１は、以下の：配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、及び配列番号１０５からなる群から選ばれる８〜１３カバット位(Kabat position)でのアミノ酸配列を含む。
【００１２】
１の実施態様では、改変ＡＢＭは、８、９、１０、１１、１２又は１３カバット位の１以上においてアミノ酸の置換を含む重鎖可変領域のＦＲ１における置換を含む。
【００１３】
特定の実施態様では、重鎖可変領域のＦＲ１における置換は、８カバット位でアミノ酸残基の置換を含む。より具体的な実施態様では、重鎖可変領域のＦＲ１における置換は、８カバット位のアミノ酸を、アルギニン及びグリシンからなる群から選ばれるアミノ酸残基で置換することを含む。
【００１４】
別の特定の実施態様では、重鎖可変領域のＦＲ１における置換は、９カバット位でアミノ酸残基を置換することを含む。より具体的な実施態様では、重鎖可変領域のＦＲ１の置換は、９カバット位のアミノ酸残基をアラニン、プロリン、グリシン、セリン及びヒスチジンからなる群から選ばれるアミノ酸残基で置換することを含む。
【００１５】
１の特定の実施態様では、重鎖可変領域のＦＲ１における置換は、１０カバット位でのアミノ酸残基を置換することを含む。より具体的な実施態様では、重鎖可変領域のＦＲ１の置換は、９カバット位のアミノ酸残基をグルタミン酸、スレオニン、グリシン、アラニン及びバリンからなる群から選ばれるアミノ酸残基で置換することを含む。
【００１６】
別の具体的な実施態様では、重鎖可変領域のＦＲ１における置換は、１１カバット位でのアミノ酸置換を含む。具体的な実施態様では、当該置換は、１１カバット位でのアミノ酸残基をロイシン以外の任意のアミノ酸と置換することを含む。別の具体的な実施態様では、置換は、１１カバット位のアミノ酸残基を非極性アミノ酸で置換することを含む。別の具体的な実施態様では、置換は、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、及びフェニルアラニンからなる群から選ばれるアミノ酸残基で置換することを含む。具体的な実施態様では、当該置換は、１１カバット位のアミノ酸残基をロイシンで置換することを含む。
【００１７】
別の特定の実施態様では、重鎖可変領域のＦＲ１における置換は、１２カバット位のアミノ酸残基の置換を含む。具体的な実施態様では、置換は、１２カバット位のアミノ酸残基をリジン、バリン、ロイシン及びイソロイシンからなる群から選ばれるアミノ酸残基で置換することを含む。
【００１８】
別の特定の実施態様では、重鎖可変領域のＦＲ１における置換は、１１及び１２カバット位のアミノ酸残基の置換を含む。具体的な実施態様では、置換は、１１カバット位のアミノ酸残基をバリンで置換し、そして１２カバット位のアミノ酸残基をリジンで置換すること；１１カバット位のアミノ酸残基をロイシンで置換し１２カバット位でのアミノ酸残基をバリンで置換すること；１１カバット位のアミノ酸残基をバリンで置換し、そして１２カバット位のアミノ酸残基をイソロイシンで置換すること；或いは１１カバット位のアミノ酸残基をバリンで置換し、そして１２カバット位でバリンで置換することを含む。
【００１９】
別の具体的な実施態様では、重鎖可変領域のＦＲ１の置換は、１３カバット位のアミノ酸残基の置換を含む。具体的な実施態様では、置換は、１３カバット位のアミノ酸残基をリジン、アルギニン、グルタミン及びグルタミン酸からなる群から選ばれるアミノ酸残基で置換することを含む。
【００２０】
本発明の別の態様では、ＡＢＭにおける置換は、重鎖可変領域のＦＲ４の少なくとも１のアミノ酸の置換を含む。特定の実施態様では、重鎖可変領域のＦＲ４の置換は、１１０又は１１２カバット位の１以上のアミノ酸残基を置換することを含む。
【００２１】
特定の実施態様では、置換は、１１０カバット位におけるアミノ酸残基をロイシン、イソロイシン、スレオニン又はセリンからなる群から選ばれるアミノ酸で置換することを含む。より具体的な実施態様では、置換は、１１０カバット位におけるアミノ酸残基をイソロイシンで置換することを含む。
【００２２】
別の実施態様では、置換は、１１２カバット位におけるアミノ酸残基をバリン、ロイシン、イソロイシン、又はスレオニンからなる群から選ばれるアミノ酸で置換することを含む。より具体的な実施態様では、置換は、１１２カバット位におけるアミノ酸残基をイソロイシンで置換することを含む。
【００２３】
１の態様では、本発明はさらに、親ポリペプチドのＣＨ１ドメインに比べて、少なくとも１のアミノ酸残基置換を含むＣＨ１ドメインを含む改変抗原結合分子であって、当該置換が、改変された抗原結合分子が標的抗原と複合体形成する場合、標的抗原の細胞シグナル活性の変化をもたらす、前記分子に関する。
【００２４】
別の態様では、本発明は、親ポリペプチドのＣＨ１ドメインに比べて、少なくとも１のアミノ酸残基置換を含むＣＨ１ドメインを含む改変抗原結合分子であって、当該抗原結合分子が、置換の結果として１以上の標的抗原の架橋を媒介する変化された能力を有する、前記分子に関する。
【００２５】
具体的な実施態様では、ＣＨ１の置換基は、１４８、１４９又は１５０位のうちの１以上においてアミノ酸残基の置換を含む。より具体的な実施態様では、置換は、１４９位におけるアミノ酸残基をロイシンで置換することを含む。別の実施態様では、置換は全てのＣＨ１ドメインの置換を含む。別の実施態様では、置換はＩｇＧのＣＨ１ドメインをＩｇＭのＣＨ１ドメインで置換することを含む。
【００２６】
別の態様では、本発明は、少なくとも１のアミノ酸置換を含む改変抗原結合分子であって、当該置換が可変領域と定常領域との間の境目の領域の軽鎖におけるアミノ酸残基を置換することを含み、ここで当該置換が、当該改変結合分子が当該標的抗原と複合体を形成する際に標的抗原結合分子の細胞シグナル活性の変化をもたらす、前記分子に関する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、少なくとも１のアミノ酸置換を含む改変抗原結合分子であって、当該置換が可変領域と定常領域との間の境目の領域の軽鎖におけるアミノ酸残基を置換することを含み、ここで当該改変抗原結合分子が、当該置換の結果として１以上の標的抗原の架橋を媒介する能力の変化を有する、前記分子に関する。
【００２８】
特定の実施態様では、ＡＢＭの軽鎖可変領域における置換は、１０、１２、３９、４０、４１、８０、８１、８３、８４、１０３、１０５、１０６、及び１０８カバット位のうちの１以上におけるアミノ酸置換を含む。具体的な実施態様では、ＡＢＭの軽鎖可変領域の置換は、４０、８０、８３、１０５又は１０６カバット位の１以上におけるアミノ酸残基の置換を含む。
【００２９】
別の具体的な実施態様では、ＡＢＭの軽鎖における置換は、４０、８０、８３、１０５又は１０６カバット位の１以上におけるアミノ酸を非極性アミノ酸で置換することを含む。
【００３０】
別の具体的な実施態様では、ＡＢＭの軽鎖における置換は、４０カバット位のアミノ酸残基をアラニンで置換することを含む。
【００３１】
別の好ましい実施態様では、ＡＢＭの軽鎖における置換は、８０カバット位のアミノ酸残基をプロリンで置換することを含む。
【００３２】
別の好ましい実施態様では、ＡＢＭの軽鎖における置換は、８３カバット位のアミノ酸残基をフェニルアラニンで置換することを含む。
【００３３】
別の好ましい実施態様では、ＡＢＭの軽鎖における置換は、１０５カバット位のアミノ酸残基をアラニンで置換することを含む。
【００３４】
別の好ましい実施態様では、ＡＢＭの軽鎖における置換は、１０６カバット位のアミノ酸残基をアラニンで置換することを含む。より特定の実施態様では、ＡＢＭの軽鎖における置換は、１０６カバット位におけるアミノ酸残基を置換することを含み、ここで当該抗原結合分子は、アポトーシスを誘導するその能力の点で低減される。
【００３５】
幾つかの実施態様では、本発明の置換は、本明細書に記載される重鎖及び/又は軽鎖可変領域及び/又は定常領域における任意のアミノ酸残基置換の組合せを含む。
【００３６】
１の態様では、本発明の改変ＡＢＭにおけるアミノ酸置換は、当該改変ＡＢＭが標的抗原と複合体形成する場合、標的抗原の細胞シグナル活性の変化をもたらす。
【００３７】
本発明の１の態様では、細胞シグナル活性の変化は、アゴニスト活性の増加である。１の実施態様では、アゴニスト活性の増加は、アポトーシスの誘導及び細胞分化の誘導からなる群から選ばれる。
【００３８】
本発明の別の態様では、細胞シグナル活性の変化は、アンタゴニスト活性の増加である。１の実施態様では、アンタゴニスト活性は、細胞生存、細胞成長、細胞増殖及び欠陥新生からなる群から選ばれる細胞のシグナル経路の遮断である。
【００３９】
さらなる実施態様では、本発明の改変抗原結合性分子は、ヒトＣＤ２０に特異的に結合する。別の態様では、改変抗原結合分子は、ヒトＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーに特異的に結合する。特定の実施態様では、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーは、ＴＮＦＲ１、ＣＤ９５、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＥＤＡＲ、及びｐ７５ＮＧＦＲからなる群から選ばれる。
【００４０】
本発明の別の態様では、改変抗原結合分子は、受容体チロシンキナーゼに特異的に結合する。特定の実施態様では、受容体チロシンキナーゼは、ＨＥＲ１(ＥＧＦＲ１)、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＩＧＦ-１Ｒ、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、及びＶＥＧＦＲ３からなる群から選ばれる。より具体的な実施態様では、受容体チロシンキナーゼは、ＨＥＲ１(ＥＧＦＲ１)である。
【００４１】
別の態様では、本発明は、さらに、非限定的に、全抗体、Ｆａｂ断片、又はその融合タンパク質、Ｆ(ａｂ')２断片、又はその融合タンパク質、ミニボディ、ジアボディ、トリアボディ、及びテトラボディからなる群から選ばれ得る改変ＡＢＭに関する。特定の実施態様では、改変ＡＢＭは、キメラ又は完全にヒト化抗体である。より特有実施態様では、キメラ改変ＡＢＭはヒト化されている。別の特定の実施態様では、改変ＡＢＭは多特異的である。より特定の実施態様では改変ＡＢＭは二特異的である。
【００４２】
別の態様では、本発明の親抗原結合分子は、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、及び配列番号６２からなる群から選ばれる重鎖可変領域を含む。
【００４３】
別の態様では、本発明に記載される親抗原結合分子は、配列番号４８、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、及び配列番号１３４からなる群から選ばれる軽鎖を含む。
【００４４】
さらなる態様では、本発明は、ヒトＦｃ領域をさらに含む改変ＡＢＭにも関する。１の実施態様に従うと、改変ＡＢＭのＦｃ領域は、改変オリゴ糖を有するように改変された。より具体的な実施態様では、Ｆｃ領域は、非改変Ｆｃ領域に比べてフコース残基の割合が低くなるように改変された。具体的な実施態様では、Ｆｃ領域は、非改変Ｆｃ領域に比べて高い割合の切断されたオリゴ糖(bisected oligosaccharides)を有する。別の具体的な実施態様では、改変オリゴ糖は、切断された複合体である。別の具体的な実施態様では、改変されたオリゴ糖は、非改変Ｆｃ領域に比べてＦｃ領域において高い割合の切断されフコース化されていないオリゴ糖を有する。別の具体的な実施態様では、Ｆｃ領域は、非改変Ｆｃ領域に比べて、改変Ｆｃ領域においてフコース残基に対する高い割合のＧｌｃＮＡｃ残基を有する。別の具体的な実施態様では、切断されフコース化されていないオリゴ糖はハイブリッドである。別の具体的実施態様では、切断されフコース化されていないオリゴ糖は複合体である。
【００４５】
別の態様では、本発明の標的抗原は、膜輸送受容体、Ｇ-タンパク質結合受容体、及び酵素結合受容体からなる群から選ばれる細胞表面受容体である。特定の実施態様では、膜輸送受容体は、チャネル結合受容体である。別の特定の実施態様では、酵素結合受容体は、受容体グアニリル・シクラーゼ、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ関連受容体、受容体チロシンホスファターゼ及び受容体セリン/スレオニン・キナーゼからなる群から選ばれる。
【００４６】
別の態様では、本発明は、本発明の改変ＡＢＭを含む医薬組成物に関する。医薬組成物が、医薬として許容される担体、アジュバント、又はそれらの組合せをさらに含み得るということが考慮される。
【００４７】
本発明は、患者において細胞シグナル活性を変化させることにより治療可能な疾患を治療する方法であって、当該方法が、本発明に記載される改変ＡＢＭ及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物の治療効量を当該患者に投与することを含む、前記方法に関する。
【００４８】
別の態様では、本発明は、重鎖又は軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、当該重鎖又は軽鎖可変領域が、親重鎖又は軽鎖可変領域に比べて少なくとも１のフレームワーク領域において少なくとも１のアミノ酸置換を含み、そして当該ポリペプチドが標的抗原と複合体を形成する場合に、当該置換が標的抗原の細胞シグナル活性の変化をもたらす、前記ポリヌクレオチドに関する。
【００４９】
さらなる態様では、本発明は、重鎖又は軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、当該重鎖又は軽鎖可変領域が、親重鎖又は軽鎖可変領域に比べて少なくとも１のフレームワーク領域において少なくとも１のアミノ酸残基置換を含み、そして当該ポリペプチドが、置換の結果として１以上の標的抗原の架橋を媒介する能力の変化を有する、前記ポリヌクレオチドに関する。
【００５０】
１の実施態様では、本発明に記載されるポリヌクレオチドは、抗体重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを含む。別の実施態様では、本発明に記載されるポリヌクレオチドは、融合タンパク質を含むポリペプチドをコードする。本発明は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドにも関する。
【００５１】
本発明は、本発明に記載されるポリヌクレオチドを含むベクター、並びに当該ベクターを含む宿主細胞にも関する。
【００５２】
本発明は、さらに、親抗原結合分子の重鎖又は軽鎖に比べて、重鎖又は軽鎖領域の少なくとも１のフレームワーク領域において少なくとも１のアミノ酸置換を含む重鎖又は軽鎖可変領域を含むポリペプチドであって、当該ポリペプチドが本発明の改変ＡＢＭである、ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００５３】
本発明はまた、宿主細胞により産生されるポリペプチドのＦｃ領域においてオリゴ糖を改変するために十分な量でβ(１,４)-Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１の核酸を発現するように遺伝子操作された宿主細胞であって、当該ポリペプチドが、本発明に記載される改変ＡＢＭである、前記宿主細胞に関する。１の実施態様では、β(１,４)-Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を有するポリペプチドは融合ポリペプチドである。具体的な実施態様では、当該融合ポリペプチドが、β(１,４)-Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩの触媒ドメインを含む。別の実施態様では、当該融合ポリペプチドは、さらに、異種のゴルジ内在性ポリペプチド(heterologous Golgi resident polypeptide)のゴルジ局在化ドメインをさらに含む。ゴルジ局在ドメインは、非限定的に、マンノシダーゼＩＩの局在化ドメイン、β(１,２)-Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの局在ドメイン、β(１,２)-Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの局在ドメイン、マンノシダーゼＩの局在ドメイン、及びα１-６フコシルトランスフェラーゼの局在ドメインからなる群から選ばれる。
【００５４】
別の実施態様では、当該改変ＡＢＭは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に同等である領域を含む。
【００５５】
さらなる実施態様では、本発明の宿主細胞により産生される改変ＡＢＭは、Ｆｃ受容体結合親和性の増加及び/又はオリゴ糖修飾の結果としてエフェクター機能の増加を示す。本発明に従うと、エフェクター機能の増加は、Ｆｃ媒介性細胞性細胞傷害性の増加、ＮＫ細胞への結合性の増加、マクロファージへの結合性の増加、多形核球細胞への結合性の増加、モノサイトへの結合性の増加、アポトーシスを誘導する直接シグナル伝達の増加、樹状細胞の変異の増加、及びＴ細胞の刺激性からなる群から選ばれる。１の実施態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ活性化受容体である。別の実施態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγＲＩＩＩＡ受容体である。
【００５６】
本発明の宿主細胞は、非限定的にＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３-ＥＢＮＡ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２/０細胞、ＹＯミエローマ細胞、Ｐ３Ｘ６４マ売るミエローマ細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ.Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞を含む群から選ばれ得る。
【００５７】
別の態様では、本発明は、親ＡＢＭの重鎖又は軽鎖可変領域と比較して重鎖又は軽鎖可変領域の少なくとも１のフレームワーク領域において少なくとも１のアミノ酸残基の置換を含む重鎖又は軽鎖可変領域を含む改変ＡＢＭを産生する方法であって、当該置換が、当該改変ＡＢＭが標的抗原と複合体形成した場合に標的抗原の細胞シグナル伝達活性の変化をもたらし、当該方法が以下の：(ｉ)当該ポリヌクレオチドの発現を許容する条件下で本発明の宿主細胞を培養し；そして(ｉｉ)当該培養培地から改変ＡＢＭを回収する、を含む、前記方法に関する。
【００５８】
さらなる態様では、本発明は、親抗原結合分子の重鎖又は軽鎖可変領域に比較して重鎖又は軽鎖可変領域の少なくとも１のフレームワーク領域において少なくとも１のアミノ酸残基の置換を含む重鎖又は軽鎖可変領域を含む改変ＡＢＭを生産する方法であって、当該改変抗原結合分子が、置換の結果として架橋を媒介する能力の変化を有し、当該方法が以下の：(ｉ)上記ポリヌクレオチドの発現を許容する条件下で本発明の宿主細胞を培養し、そして(ｉｉ)当該培養培地から改変ＡＢＭを回収する、を含む前記方法に関する。
【００５９】
さらなる態様では、本発明は、ＡＢＭの標的抗原を含む複合体の形成を促進するためにＡＢＭの能力を変化させる方法であって、当該方法が以下の：親ＡＢＭの少なくとも１の重鎖又は軽鎖可変領域フレームワーク領域において、少なくとも１のアミノ酸残基を置換することを含む、前記方法に関する。１の実施態様では、ＡＢＭは、標的抗原を発現する細胞においてアポトーシスの誘導を増加させる。別の実施態様では、ＡＢＭは、標的抗原を発現する細胞において細胞分化の誘導を増加させる。
【００６０】
本発明はまた、細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、当該方法が、親ＡＢＭの重鎖又は軽鎖可変領域に比べて、重鎖又は軽鎖可変領域の少なくとも１のフレームワーク領域における少なくとも１のアミノ酸残基の置換を含む、重鎖又は軽鎖可変領域を含む改変ＡＢＭと細胞を接触させることを含む、前記方法に関する。特定の実施態様では、当該細胞は腫瘍細胞である。１の実施態様では、接触はｉｎ ｖｉｖｏで生じる。
【００６１】
別の実施態様では、ＡＢＭは、標的抗原を発現する細胞において細胞分化の誘導を増加させる。
【００６２】
別の態様では、本発明は、標的抗原の細胞シグナル伝達活性の変化により治療可能である疾患又は障害の治療方法であって、当該方法が、治療を必要とする対象に、治療有効量の改変ＡＢＭを投与することを含み、ここで、当該改変ＡＢＭが、親ＡＢＭの重鎖又は軽鎖可変領域に比べて、重鎖又は軽鎖可変領域の少なくとも１のフレームワーク領域における少なくとも１のアミノ酸の置換を含む重鎖又は軽鎖可変領域を含み、そして当該置換が、改変されたＡＢＭが標的抗原と複合体を形成する場合、標的抗原の細胞シグナル活性の変化をもたらす、前記方法にも関する。
【００６３】
更なる態様では、本発明は、１以上の標的抗原の架橋を媒介する能力の変化により治療できる疾患又は障害の治療方法であって、当該方法が、治療を必要とする対象に、治療有効量の改変ＡＢＭを投与することを含み、ここで当該改変されたＡＢＭが、親ＡＢＭの重鎖又は軽鎖可変領域に比べて、重鎖又は軽鎖可変領域の少なくとも１のフレームワーク領域における少なくとも１のアミノ酸の置換を含む重鎖又は軽鎖可変領域を含み、そして当該改変ＡＢＭが、置換の結果として１以上の標的抗原の架橋を媒介する能力の変化を有する、前記方法に関する。
【００６４】
特定の実施態様では、本発明に従って投与される改変ＡＢＭは、配列番号４、配列番号３６、及び配列番号３８からなる群から選ばれる重鎖可変領域を含む。
【００６５】
１の態様では、本発明の改変ＡＢＭで治療される疾患又は障害は、細胞増殖性障害である。１の実施態様では、細胞増殖障害は癌である。別の態様では、本発明の改変ＡＢＭで治療される疾患又は障害は、Ｂ細胞障害である。具体的な実施態様では、Ｂ細胞障害は、Ｂ細胞リンパ腫である。
【００６６】
本発明は、癌の治療又は予防のための医薬の製造のための本発明に記載される改変ＡＢＭの使用に関する。
【００６７】
具体的な実施態様では、本発明はまた、癌の治療又は予防のための医薬の製造のための本発明に記載される改変ＡＢＭの使用であって、当該癌が、Ｂ細胞リンパ腫、乳癌、膀胱癌、頭部及び頸部癌、皮膚癌、膵臓癌、肺癌、子宮癌、大腸癌、前立腺癌、腎臓癌、及び脳癌からなる群から選ばれる使用に関する。
【００６８】
別の特定の実施態様では、本発明は、癌の治療又は予防用の医薬の製造のための本発明に記載される改変ＡＢＭの使用であって、当該抗原結合分子が、約１.０ｍｇ/ｋｇ〜約１５ｍｇ/ｋｇの治療有効量で使用される、前記使用に関する。さらなる実施態様では、治療有効量が、約１.５ｍｇ/ｋｇ〜約１２ｍｇ/ｋｇである。さらなる実施態様では、治療有効量は、約１.５ｍｇ/ｋｇ〜約４.５ｍｇ/ｋｇである。さらなる実施態様では、治療有効量は、約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約１２ｍｇ／ｋｇである。さらなる実施態様では、治療有効量は約４．５ｍｇ／ｋｇである。さらなる実施態様では、治療有効量は約１２ｍｇ／ｋｇである。
【００６９】
本発明は、癌の治療又は予防方法であって、治療有効量の本発明の医薬組成物を治療を必要とする患者に投与することを含む前記方法に関する。特定の実施態様では、癌は、Ｂ細胞リンパ腫、乳癌、膀胱癌、頭部及び頸部癌、皮膚癌、膵臓癌、肺癌、子宮癌、大腸癌、前立腺癌、腎臓癌、及び脳癌からなる群から選ばれる。
【００７０】
本発明はまた、前癌症状又は前癌病変の治療又は予防方法であって、治療有効量の請求項８５又は１５８の医薬組成物を治療を必要とする患者に投与することを含む、前記方法に関する。特定の実施態様では、前癌症状又は前癌病変は、口腔白板症、日光角化症 (日光性角化症)、結腸又は直腸の前癌性ポリープ、胃の上皮性異形成、腺腫性異形成、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌(ＨＮＰＣＣ)、バレット食道、膀胱異形成、及び前癌性頚部症状からなる群から選ばれる。
【００７１】
本発明は、癌の治療又は予防における使用のための本発明の改変抗原結合分子にも関する。具体的な実施態様では、癌は、Ｂ細胞リンパ腫、乳癌、膀胱癌、頭部及び頸部癌、皮膚癌、膵臓癌、肺癌、子宮癌、大腸癌、前立腺癌、腎臓癌、及び脳癌からなる群から選ばれる。
【００７２】
本発明はまた、前癌症状又は前癌病変の治療又は予防において使用するための本発明の改変抗原結合分子にも関する。具体的な実施態様では、当該前癌症状又は前癌病変は、口腔白板症、日光角化症 (日光性角化症)、結腸又は直腸の前癌性ポリープ、胃の上皮性異形成、腺腫性異形成、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌(ＨＮＰＣＣ)、バレット食道、膀胱異形成、及び前癌性頚部症状からなる群から選ばれる。
【００７３】
本発明は、細胞シグナル活性の変化及び/又は１以上の標的抗原の架橋の変化に関する障害の治療において使用するための本発明に記載される改変抗原結合分子にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、様々な抗-ＣＤ２０抗体重鎖可変領域構築物のアミノ酸配列アライメントである。モノクローナル抗体１Ｆ５の重鎖可変領域のアミノ酸シーケンスが参照配列として使用される。１Ｆ５とのアミノ酸の差異を影付きで表す。
【図２】図２は、Ｒａｊｉ Ｂ細胞に対するヒト化抗ＣＤ２０抗体の結合を示す。親の(キメラ)Ｂ-ｌｙ１が、強力なアポトーシスを誘導すると同定された２個のヒト化重鎖バリアント、並びにこの効果を保持すると仮定された(ヒト化、非アポトーシス誘導性)Ｂ-ＨＬ８の誘導体と比較される。全てのヒト化重鎖バリアントを、同じＢＫＶ１ヒト化軽鎖バリアントと対形成させた。
【図３】図３は、ＲａｊｉＢリンパ腫細胞上のＣＤ２０に対するリツキシマブ(Ｏ)及びｃｈＢ-ｌｙ１(Δ)の結合性を示す。
【図４】図４は、３個の抗-ＣＤ２０抗体による抗体依存性アポトーシスの比較を示す。ｃｈＢ-ｌｙ１ｗｔは、マウス可変領域及びヒト定常領域を有するキメラＢ-ｌｙ１抗体コンストラクトを表す。ＢＨＨ２-ＢＫＶ１は、マウスＢ-ｌｙ１のＣＤＲｓ、及び重鎖についてのＶＨ１クラスヒト生殖細胞系列Ｖ遺伝子に由来し、そしてＢＫＶ１ヒト化Ｂ-ｌｙ１軽鎖と対形成されたヒトフレームワーク領域を含むヒト化バリアントを表す。ＢＨＬ８-ＢＫＶ１ｗｔは、マウスＢ-ｌｙ１ＣＤＲ及び２個の異なるヒト生殖細胞系列Ｖ遺伝子に由来し、そしてＢＫＶ１ヒト化Ｂ-ｌｙ１軽鎖と対形成されたヒトフレームワーク領域を含むヒト化バリアントを表す。
【図５】図５は、Ｂ-ｌｙ１抗-ＣＤ２０抗体の５個のヒト化バリアントによる抗体依存性アポトーシスの比較を示す。ＢＨＨ２-ＢＫＶ１は、マウスＢ-ｌｙ１のＣＤＲｓ、及び重鎖(ＢＨＨ２)についてのＶＨ１クラスヒト生殖細胞系列Ｖ遺伝子に由来し、そしてＢＫＶ１ヒト化Ｂ-ｌｙ１軽鎖と対形成されたヒトフレームワーク領域を含むヒト化バリアントを表す。ＢＨＬ８-ＢＫＶ１ｗｔは、マウスＢ-ｌｙ１ＣＤＲ及び２個の異なるヒト生殖細胞系列Ｖ遺伝子に由来し、そしてＢＫＶ１ヒト化Ｂ-ｌｙ１軽鎖と対形成されたヒトフレームワーク領域を含むヒト化バリアントを表す。ＢＨＬ１４-ＢＫＶ１は、１２カバット位でバリンをリジンに置換し、そして重鎖可変領域の４８カバット位でバリンをメチオニンに置換し、そしてＢＫＶ１軽鎖コンストラクトと対形成されたＢＨＬ８誘導体を表す。ＢＨＬ１５-ＢＫＶ１Ｗ１は、１６カバット位でグリシンをセリンに置換し、そして重鎖可変領域の４８カバット位でバリンをメチオニンに置換し、そしてＢＫＶ１軽鎖コンストラクトと対形成されたＢＨＬ８に由来する。ＢＨＬ１６-ＢＫＶ１Ｗ１は、２０カバット位でロイシンをバリンに置換し、そして重鎖可変領域の４８カバット位でバリンをメチオニンに置換し、そしてＢＫＶ１軽鎖コンストラクトと対形成されたＢＨＬ８に由来する。ＢＨＬ１７-ＢＫＶ１Ｗ１は、重鎖可変領域の４８カバット位でバリンをメチオニンに置換し、そしてＢＫＶ１軽鎖コンストラクトと対形成されたＢＨＬ８に由来する。
【図６】図６は、Ｃ２Ｂ８抗ＣＤ２０モノクローナル抗体及びＢ-ｌｙ１抗体の２個のヒト化バリアント：ＢＨＨ２-ＢＫＶ１及びＢＨＬ１３-ＢＫＶ１によるＺ-１３８細胞における抗体依存性アポトーシスの比較を示す。ＢＨＨ２-ＢＫＶ１は、マウスＢ-ｌｙ１のＣＤＲｓ、及び重鎖(ＢＨＨ２)についてのＶＨ１クラスヒト生殖細胞系列Ｖ遺伝子に由来し、そしてＢＫＶ１ヒト化Ｂ-ｌｙ１軽鎖と対形成されたヒトフレームワーク領域を含むヒト化バリアントを表す。ＢＨＬ１３-ＢＫＶ１は、１１カバット位でロイシンをバリンに置換し、そして重鎖可変領域の４８カバット位でバリンをメチオニンに置換し、そしてＢＫＶ１軽鎖と対形成されたＢＨＬ８(図５を参照のこと)に由来する。
【図７】図７は、ＦｃγＲＩＩＩａ-１５８Ｖ/Ｆ遺伝子型の以下の３種のクラスの全血におけるリツキシマブ(白菱形)及びｃｈＢ-ｌｙ１(黒四角)によるＢ細胞の欠乏を示す。(Ａ)ａＦ/Ｆドナー由来の全血、低い親和性受容体についてホモ接合、(Ｂ)Ｆ/Ｖドナー由来の全血、低い親和性受容体についてホモ接合、(Ｃ)Ｖ/Ｖドナー由来の全血、高親和性受容体についてホモ接合。
【図８Ａ】図８は、糖鎖操作されたキメラＢ-ｌｙ1抗体のＭＡＬＤＩ-ＴＯＦプロファイルを示す。(Ａ)特異的ピークの割合を扱う表を示す。
【図８Ｂ】図８は、糖鎖操作されたキメラＢ-ｌｙ1抗体のＭＡＬＤＩ-ＴＯＦプロファイルを示す。 (Ｂ)糖鎖操作されたキメラＢ-ｌｙ１のスペクトルを示す。
【図８Ｃ】図８は、糖鎖操作されたキメラＢ-ｌｙ1抗体のＭＡＬＤＩ-ＴＯＦプロファイルを示す。 (Ｃ)エンド-Ｈで処理された糖鎖操作されたキメラＢ-Ｌｙ１のスペクトルを示す。
【図９】図９は、様々なヒト化抗ＣＤ２０抗体のＲａｊｉＢ細胞への結合性を示す。Ｂ-ＨＨ２コンストラクトと、Ｂ-ＨＬ８及びＢ-ＨＬ１１コンストラクトとの間の差異がフレームワーク１及び２の領域に位置しており、３個のＣＤＲはすべて同一である。Ｂ-ＨＬ８及びＢ-ＨＬ１１は、ヒトＶＨ３クラスに由来するそのＦＲ１及びＦＲ２配列を有し、ここで完全なＢ-ＨＨ２フレームワークは、ヒトＶＨ１由来である。Ｂ-ＨＬ１１は、Ｂ-ＨＬ８の誘導体であり、Ｇｌｕ１Ｇｌｎの１変異を有し、ここでＧｌｎはＢ-ＨＨ２コンストラクトのアミノ酸残基である。このことは、Ｇｌｕ１Ｇｌｎ交換が、結合親和性又は強度を変化させないことを意味する。Ｂ-ＨＨ２とＢ-ＨＬ８の間の他の差異は、１４のＦＲ残基であり、これらの中から１以上は、当該抗体の抗原結合性の挙動にに影響するであろう。
【図１０】図１０は、Ｒａｊｉ標的細胞におけるヒト化抗ＣＤ２０抗体ＢＨＬ４-ＢＫＶ１の結合性を示す。Ｂ-ＨＬ４コンストラクトは、ＢＨＨ２のＦＲ１を、ヒト生殖細胞系列配列ＩＧＨＶ１-４５(受託番号Ｘ９２２０９)のＦＲ１と置換することによりＢＨＨ２抗体から生成された。ＦＲ１内の４個の位置でのみ異なるアミノ酸を有するにも関わらず、当該コンストラクトはかなり低い抗原結合能力しか示さない。これらの残基は、カバットの番号付けに従って、２、１４、２８、及び３０位に位置する。これらのうちで、２８位及び３０位が影響力のある位置である。なぜならこれらは、ＣＤＲ１のＣｈｏｔｈｉａ定義の一部であるからである。
【図１１】図１１は、ＢＨＨ１、ＢＨＨ２、ＢＨＨ３(これらすべては、ＢＫＶ１ヒト化Ｂ-ｌｙ１と対形成される)、及び親抗体Ｂ-ｌｙ１との間の結合挙動の比較を示す。当該データにより、全ての抗体が似通ったＥＣ５０値を示すが、ＢＨＨ１コンストラクトがＢＨＨ２及びＢＨＨ３バリアントよりも低い強度/化学両論で結合することが示される。ＢＨＨ１は、そのヒトＣＤＲ１とＣＤＲ２領域(カバットの定義)により、並びに２８位(カバットの番号付け)でＡｌａ/Ｔｈｒ多型により部分的にＢＨＨ２とＢＨＨ３とから区別され得る。これにより、２８位、完全ＣＤＲ１及び/又は完全ＣＤＲ２のいずれかが、抗体/抗原相互作用に重要であるということが示唆される。
【図１２】図１２は、ＢＨＬ１、ＢＨＨ１、及びＢ-ｌｙ１親抗体との間の結合挙動の比較を示す。当該データにより、ＢＨＬ１コンストラクトにおいて全ての結合活性がないことが示され、そしてＢ-ｌｙ１に比較すると約半分のＢ-ＨＨ１結合強度/化学両論が示される。Ｂ-ＨＬ１並びにＢ-ＨＨ１の両方が、ヒトＶＨ１クラスに由来するアクセプターフレームワークに基いて設計されている。他の差異の中で、Ｂ-ＨＬ１コンストラクトの７１位(カバットの番号付け)が特に異なっており、抗原結合について推定の重要性を示す。
【図１３】図１３は、抗ＣＤ２０抗体重鎖コンストラクトＢＨＬ２とＢＨＬ３とのその抗原に対する結合挙動の比較を示す。両方の場合、ＶＬ配列は、ヒト化重鎖と組合わされた。当該データにより、ＢＨＬ２とＢＨＬ３コンストラクトが、ＣＤ-２０結合活性を示さないということが示される。
【図１４】図１４は、Ｚ１３８ＭＣＬ細胞に対する抗ＣＤ２０抗体のアポトーシス効果を示す。
【図１５】図１５は、抗ＣＤ２０抗体によるアポトーシスを示す。アッセイの詳細：５×１０5細胞/ウェルを培養培地を入れた２４ウェルプレート(５×１０5細胞/ｍｌ)に蒔いた。それぞれの抗体(終濃度１０μｇ/ｍｌ)、陰性対照についてはＰＢＳ、又は陽性対照には５ｍＭカンプトテシン(ＣＰＴ)をウェルに加えた。サンプルを一晩(１６時間)インキュベートし、アネキシンＶ-ＦＩＴＣで染色し、そしてＦＡＣＳにより分析した。アッセイを３回行った。(＊)：ＰＢＳのみについてのシグナルを差し引いた(ＰＢＳのみは、ＰＲ-１細胞について８％ＡｎｎＶ＋、そしてＺ-１３８細胞について２％ＡｎｎＶ＋を与えた)。使用される抗体は：Ｃ２Ｂ８(キメラ、非糖鎖操作)；ＢＨＨ２-ＢＫＶ１(ヒト化、非糖鎖操作)であった。注：本アッセイは、更なる効果細胞を含まず、標的＋抗体又は対照を標的とする。
【図１６】図１６は、免疫効果細胞と供に抗ＣＤ２０抗体による標的細胞殺傷を示した。アッセイの詳細：一晩インキュベートし、そしてＦＡＣＳによりＣＤ１９＋／ＣＤ３＋について分析することによって通常全血におけるＢ細胞減少を測定した。効果細胞としてＰＢＭＣと４時間のインキュベート、２５：１の効果細胞：標的細胞比で用いてＡＤＣＣを測定した。界面活性剤の溶解に対するＣａｌｃｅｉｎ保持(１００％)及び抗体無しでの溶解に対するＣａｌｃｅｉｎ保持(０％)により標的細胞殺傷を測定した。用いられる抗体は、Ｃ２Ｂ８(キメラ、非糖鎖操作形態)；ＢＨＨ２-ＢＫＶ１-ｗｔ(ヒト化、ＢＨＨ２-ＢＫＶ１の非糖鎖操作形態)；ＢＨＨ２-ＢＫＶ１-ＧＥ(ヒト化、ＢＨＨ２-ＢＫＶ１の糖鎖操作形態)であった。
【図１７】図１７は、未改変、非糖鎖操作ＢＨＨ２-ＢＫＶ１ヒト化ＩｇＧ１ Ｂ-ｌｙ１抗ヒトＣＤ２０抗体のＰＮＧａｓｅＦ放出されたＦｃオリゴ糖のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ-ＭＳを示す。
【図１８】図１８は、糖鎖操作されたＢＨＨ２-ＢＫＶ１ｇ１ヒト化ＩｇＧ１ Ｂ-ｌｙ１抗ヒトＣＤ２０抗体のＰＮＧａｓｅＦ-関連Ｆｃオリゴ糖のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ-ＭＳを示す。抗体遺伝子、並びにβ-１,４-Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ(ＧｎＴ-ＩＩＩ)触媒活性を有する酵素をコードする遺伝子を宿主細胞で共発現することにより糖鎖操作を行った。
【図１９】図１９は、糖鎖操作されたＢＨＨ２-ＢＫＶ１ｇ２ヒト化ＩｇＧ１ Ｂ-ｌｙ１抗ヒトＣＤ２０抗体のＰＮＧａｓｅＦ-関連Ｆｃオリゴ糖のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ-ＭＳを示す。抗体遺伝子、並びにβ-１,４-Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ(ＧｎＴ-ＩＩＩ)触媒活性を有する酵素をコードし、そしてＧｏｌｇｉ αマンノシダーゼＩＩ触媒活性を有する酵素をコードする遺伝子を宿主細胞で共発現することにより糖鎖操作を行った。
【図２０】図２０は、組換えＣＤ１６を発現するＣＨＯ細胞の表面上に提示されたヒトＦｃγＲＩＩＩａに対する、糖鎖操作されるか又は糖鎖操作されていない抗体(ｇ２バージョン、グリコシル化プロファイルについては図１７〜１９を参照のこと)の結合性を示す。
【図２１】図２１は、Ｚ１３８ＭＣＬ細胞における非Ｆｃ操作及びＦｃ操作抗ＣＤ２０抗体のアポトーシス効果を示す。アッセイの詳細：５×１０５細胞／ウェルを、細胞培地中に２４ウェルプレート(５×１０5細胞／ｍｌ)で蒔いた。それぞれの抗体の１０μｇ／ｍｌの最終濃度又は陰性対照についてのＰＢＳをウェルに加えた。サンプルを一晩(１６時間)インキュベートし、ＡｎｎＶ-ＦＩＴＣで染色し、そしてＦＡＣＳにより分析した。アッセイを３回行った。使用される抗体は：Ｃ２Ｂ８＝リツキシマブ(キメラ、非糖鎖操作形態)；ＢＨＨ２-ＢＫＶ１(ヒト化、非糖鎖操作形態、グリコシル化プロファイルについては図１７〜１９を参照のこと。)；ＢＨＨ２-ＢＫＶ１ｇ１(ヒト化、糖鎖操作)；ＢＨＨ２-ＢＫＶ１ｇ２(ヒト化、糖鎖操作)であった。注意)：このアッセイは、追加の効果細胞を含まず、標的＋抗体又は対照のみに関する。(＊)：ＰＢＳのみについてのシグナルを差し引いた。
【図２２】図２２は、様々なヒト化抗ＣＤ２０抗体のＲａｊｉＢ細胞への結合を示す。ヒト化重鎖コンストラクトＢＨＨ２は、その誘導体ＢＨＨ４及びＢＨＨ７と比較される。２８及び３０カバット位の影響を示すバリアントも示される(ＢＨＨ８及びＢＨＨ９)。
【図２３】図２３は、Ｚ-１３８ＭＣＬ細胞に対する抗ＣＤ２０抗体によるアポトーシスについての１アミノ酸置換の効果を示す。アッセイの詳細：５×１０5細胞／ウェルを培養培地をいれた２４ウェルプレート(５×１０5細胞／ｍｌ)中に蒔いた。終濃度１０μｇ／ｍｌのそれぞれの抗体、又は陰性対照のＰＢＳ(抗体なし)をウェルに加えた。サンプルを一晩(１６時間)インキュベートし、ＡｎｎＶ-ＦＩＴＣで染色し、そしてＦＡＣＳにより分析した。アッセイを３回行った。使用した抗体は、Ｃ２Ｂ８(キメラ、糖鎖操作なし)、ＢＨＨ２(ヒト化、糖鎖操作なし)、ＢＨＨ２-Ａ(１１カバット位でバリンをロイシンに置換したＢＨＨ２の誘導体)、及びＢＨＨ２-Ｂ(１２カバット位でリジンをバリンへと置換したＢＨＨ２誘導体)、これらの最後の３個についてＢＫＶ１軽鎖と対形成されたものであった。抗原結合のＫDは、置換により未変換のままであった。注：このアッセイは、追加の効果細胞を含まず、標的と抗体又は対照のみを含んだ。
【図２４】図２４は、Ｚ-１３８ＭＣＬ細胞に対する以前は不活性であった抗ＣＤ２０抗体によるアポトーシスについての１アミノ酸置換の効果を示す。アッセイの詳細：５×１０5細胞／ウェルを培養培地をいれた２４ウェルプレート(５×１０5細胞／ｍｌ)中に蒔いた。終濃度１０μｇ／ｍｌのそれぞれの抗体、又は陰性対照のＰＢＳ(抗体なし)をウェルに加えた。サンプルを一晩(１６時間)インキュベートし、ＡｎｎＶ-ＦＩＴＣで染色し、そしてＦＡＣＳにより分析した。アッセイを３回行った。使用した抗体は、Ｃ２Ｂ８(キメラ、糖鎖操作なし)、ＢＨＬ２(ヒト化、糖鎖操作なし)、ＢＨＬ１３(１１カバット位でロイシンをバリンに置換し、そして４８カバット位でバリンをメチオニンへと置換したＢＨＬ８の誘導体)、及びＢＨＬ１４(１２カバット位でバリンをリジンへと置換し、そして４８カバット位でバリンをメチオニンへと置換したＢＨＬ８誘導体)、これらの最後の３個についてＢＫＶ１軽鎖と対形成されたものであった。注：このアッセイは、追加の効果細胞を含まず、標的と抗体又は対照のみを含んだ。
【図２５】図２５は、Ｚ-１３８ＭＣＬ細胞に対する抗ＣＤ２０抗体によるアポトーシスについての軽鎖内の１アミノ酸置換の効果を示す。アッセイの詳細：培養培地をいれた２４ウェルプレート(５×１０5細胞／ｍｌ)中に５×１０5細胞／ウェルを蒔いた。終濃度１０μｇ／ｍｌのそれぞれの抗体、陰性対照のＰＢＳ(抗体なし)、又は陽性対照の５ｍＭのカンプトテシン(ＣＰＴ)をウェルに加えた。サンプルを一晩(１６時間)インキュベートし、ＡｎｎＶ-ＦＩＴＣで染色し、そしてＦＡＣＳにより分析した。アッセイを３回行った。使用した抗体は、ＢＫＶ１軽鎖と対形成されたＢＨＨ２-Ａ(１１カバット位でバリンをロイシンに置換したＢＨＨ２の誘導体)、ＢＫＶ１軽鎖と対形成されたＢＨＨ６(３４カバット位でメチオニンをイソロイシンへと置換したＢＨＨ２誘導体)、及びＢＫＶ１４軽鎖(１０６カバット位のイソロイシンをアラニンに置換したＢＫＶ１の誘導体)と対形成されたＢＨＨ６であった。
【図２６】図２６は、ＶＨとＣＨ１ドメインの間の境界における分子「玉継ぎ手」を３次元で表したものである。
【００７５】
以下及び本明細書に別に定義されない限り、語句は、一般的に使用されるように本明細書に使用される。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
本明細書に使用される場合、抗原結合分子(ＡＢＭ)という語句は、その最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。「特異的に結合する」は、当該結合が抗原に対して選択的であり、そして不所望又は非特異的相互作用から区別することができる。本明細書に使用される場合、改変抗原結合分子(つまり改変ＡＢＭ)は、重鎖可変領域及び/又はＣＨ１領域における少なくとも１のアミノ酸残基の置換、及び/又は軽鎖可変領域及び/又はＣＬ領域の少なくとも１のアミノ酸残基置換を含むＡＢＭを指す。
【００７７】
本明細書に使用される場合、抗体という語句は、モノクローナル、ポリクローナル、及び多特異的(例えば二特異的)抗体を含む全抗体分子、並びにＦｃ領域を有しかつ結合特異性を保持する抗体断片、並びに免疫グロブリンのＦｃ領域に同等の領域を含みかつ結合特異性を保持する融合タンパク質を含むことが意図される。非限定的に、ＶH断片、ＶL断片、Ｆａｂ断片、Ｆ(ａｂ')2断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ミニバディ、ジアボディ、トリアボディ、及びテトラボディを含む結合特異性を保持する抗体断片もまた包含される(例えば、Hudson and Souriau, Nature Med. 9: 129-134 (2003)を参照のこと。当該文献はその全てを本明細書に援用される)。ヒト化、霊長類化、及びキメラ抗体も包含される。本明細書に使用される場合、全抗体は、２個の重鎖及び２個の軽鎖を含む免疫グロブリンを指し、それらの各々は、可変及び定常領域を含む。
【００７８】
本明細書に使用される場合、可変領域という語句は、免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖のＮ-末端ドメインを指すことが意図される。本発明の１の実施態様に従って、改変ＡＢＭは、様々な領域の機能的断片を含むことができる。
【００７９】
本明細書に使用される場合、重鎖可変領域という語句は、免疫グロブリン重鎖のＮ末端ドメインを指すことが意図される。１の例では、重鎖可変領域は、カバット位１〜１１３により定義される(Kabatら、U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)により、名づけられた特定の残基において潜在的な挿入を有する)。本発明の１の実施態様では、改変ＡＢＭは、重鎖可変領域の機能断片を含むことができる。
【００８０】
本明細書に使用される場合、重鎖定常領域という語句は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端ドメインを指すことが意図される。重鎖定常領域には天然の５個のクラス：ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、及びＩｇＭが存在する。１の例では、重鎖定常領域は、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。
【００８１】
本明細書に使用される場合、ＣＨ１領域は、可変領域のちょうどＣ末端及びヒンジ領域のＮ末端に存在する免疫グロブリンの重鎖のドメインをさす。ＩｇＧ型の免疫グロブリンでは、例えば、ＣＨ１は１１カバット位４〜２２８により通常定義される。
【００８２】
本明細書に使用される場合、アポトーシスという用語は、プログラムされた細胞死を指し、これは、核断片化及び/又は細胞質、原形質膜及び/又は細胞小器官の凝集によるアポトーシス体の形成によって特徴付けられる。
【００８３】
本明細書に使用される場合、アゴニスト活性という用語は、細胞表面に付随する分子と相互作用し、そして反応を開始又は誘導する場合、薬剤(例えば、抗原結合分子)の活性を指すことを意図する。
【００８４】
本明細書に使用される場合、アンタゴニスト活性という用語は、細胞上の分子と相互作用(例えば結合)し、そして反応の開始又は誘導を妨げるか又は継続中の反応を断続させる場合、薬剤(例えば、抗原結合分子)の活性を指すことを意図する。
【００８５】
本明細書に使用される場合、融合及びキメラという用語は、ＡＢＭなどのポリペプチドに関して使用される場合、２以上の異種ポリペプチド、例えば異なる種由来の抗体の部分などに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。キメラＡＢＭでは、例えば、非抗原結合成分は、チンパンジー及びヒトを含む多様な種に由来してもよい。キメラＡＢＭの定常領域は、最も好ましくは、実質的に、天然のヒト抗体の定常領域に実質的に同一であり；キメラ抗体の可変領域は、最も好ましくは、目的の抗原を特異的に結合する非ヒト(つまりドナー)抗原結合分子に由来する。キメラＡＢＭは、全ドナー可変領域を含んでもよく、或いは、キメラ抗体は、ヒト化又は霊長類化抗体を含んでもよい。ヒト化抗体は、融合又はキメラ抗体の特に好ましい形態である。
【００８６】
本明細書に使用される場合、ヒト化という用語は、非ヒト抗原結合分子に由来する抗原結合性分子、例えば、親分子の抗原結合性質を保持又は実質的に保持するが、ヒトにおいて免疫原生の低いマウス抗体を指すために使用される。これは、(ａ)非ヒト可変ドメイン全体を、ヒト定常領域に移植して、キメラ抗体を生成し、(ｂ)非ヒトＣＤＲのみを重要なフレームワーク残基(例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を保持するために重要である残基)を維持して又は維持せずに、ヒトフレームワーク及び定常領域上に非ヒトＣＤＲのみを移植し、又は(ｃ)非ヒト化可変ドメインを移植するが、表面残基を置換することによりヒト様部分でこれらを「覆い隠す」を含む様々な方法により達成され得る。このような方法は、Jonesら, Morrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855 (1984); Morrison及びOi, Adv. Immunol, 44:65-92 (1988); Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)に開示される。これらの全ての文献を、その全てを本明細書に援用する。
【００８７】
一般的に３の相補性決定領域、つまりＣＤＲ(ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３)が、抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインの各々に存在し、これらは、抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインの各々において、４個のフレームワーク部分領域(ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４)に隣接している：ＦＲ１-ＣＤＲ１-ＦＲ２-ＣＤＲ２-ＦＲ３-ＣＤＲ３-ＦＲ４。ヒト化抗体についての議論は、特に、米国特許第6,632,927号において、及び米国出願公開第2003/0175269号で見ることができる。両文献は、その全てを本明細書に援用される。
【００８８】
同様に、本明細書に使用される場合、ヒト化という語句は、非ヒト化抗原結合分子、例えばマウス抗体に由来する抗原結合分子であって、親分子の抗原結合性質を保持又は実質的に保持するが、霊長類において免疫原生の低い抗原結合分子を指す。
【００８９】
当該技術分野において使用され及び/又は認められている用語の２以上の定義が存在する場合、本明細書に使用される用語の定義は、そうではないと明確に記載されない限り、すべてこの様な意味を含むことが意図される。具体的な例は、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内で見られる非連続抗原を意味する「相補性決定領域」(ＣＤＲ)の使用である。この特有の領域は、Kabatら、U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)及びChothiaら, J MoI Biol. 196:901-917 (1987)により記載された。当該文献は、本明細書に援用される。ここで当該定義は、互いに対して比較されると、アミノ酸残基の重複又は部分セットを含む。それにもかかわらず、抗体又はそのバリアントのＣＤＲを指す定義の適用は、本明細書に定義され、そして使用される用語の範囲内であると意図される。上記引用文献の各々により定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として以下の表１に記載されている。特有のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及び大きさに依存して変化するであろう。当業者は、どちらの残基が、当該抗体の可変領域のアミノ酸配列を規定する特有のＣＤＲを含むかを通常決定することができる。
【００９０】
【表１】
0005912090.tif 000002
【００９１】
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用できる可変ドメイン配列についての番号付けシステムを定義した。当業者は、任意の可変ドメイン配列に、配列自体を超えた実験データに基くことなく、「カバット番号」を明確に割り当てることができる。本明細書に使用される場合、「カバット番号」は、Ｋａｂａｔら、U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)に記載された番号付けシステムを指す。他に記載がない限り、ＡＢＭにおける具体的なアミノ酸残基位の番号についての記載は、カバット番号付けシステムにしたがっている。配列表の配列は、カバット番号付けシステムに従って番号を付されてはいない。
【００９２】
本明細書に使用される場合、「ＧｎＴＩＩＩ活性」を有するポリペプチドは、β-１-４結合で、Ｎ-アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)残基を、Ｎ結合オリゴ糖のトリマンノシル・コアのβ-結合マンノシドへと加えることを触媒できるポリペプチドを指す。これは、特有の生物学的アッセイにおいて用量依存性を伴って又は伴わずに計測された場合に、非限定的に国際生化学分子生物学連合の命名委員会に従ってβ-１,４-マンノシル-糖タンパク質４-β-Ｎ-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼ(ＥＣ２.４.１.１４４)としても知られているβ(１,４)-Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩに類似するが、必ずしも同一ではない酵素活性を示す融合ポリペプチドを含む。用量依存性の用量が存在する場合、ＧｎＴＩＩＩの用量依存性と同一である必要はないが、実質的にＧｎＴＩＩＩに比べて所定の活性における用量依存性に実質的に類似する(つまり、候補ポリペプチドは、約２５倍未満、そして好ましくは１０倍未満、そして最も好ましくは約３倍未満である優れた活性を示すであろう)。
【００９３】
本明細書に使用される場合、バリアント(又はアナログ)という用語は、例えば組換えＤＮＡ技術を用いて作製された、アミノ酸挿入、欠失、及び置換により、本発明の特別に引用されたポリペプチドから分化したポリペプチドを指す。本発明のＡＢＭのバリアントは、キメラ、霊長類化、又はヒト化抗原結合分子を含み、ここで１または幾つかのアミノ酸残基が、抗原結合親和性に実質的に影響しないこのような様式で置換、添加及び/又は欠失することにより改変される。目的の活性を損なうことなくどのアミノ酸残基が置換され、加えられ、又は欠失されうるかを決定する指針は、特定のポリペプチドの配列を異種ペプチドの配列と比較し、そしてホモロジーの高い領域(保存領域)においてなされたアミノ酸配列の変化の数を最小にすることにより、又はアミノ酸をコンセンサス配列と置換することにより、発見されてもよい。
【００９４】
或いは、これらの同一又は類似のポリペプチドをコードする組換えバリアントは、遺伝コードの「縮重」を利用することにより合成又は選択されてもよい。様々な制限部位をもたらすサイレント変化などの様々なコドン置換は、プラスミド又はウイルスベクターへのクローニングを最適化するため、又は原核又は真核システムでの発現を最適化するために導入されてもよい。ポリヌクレオチド配列の変異は、当該ポリペプチドを反映するか、又はリガンド結合親和性、鎖内親和性、又は変性/回転率などの特徴を変化させるためポリペプチドの任意の部分の性質を改変するためにポリペプチドに加えられるほかのペプチドのドメインを反映しうる。
【００９５】
本明細書に使用される場合、アミノ酸残基置換は、参照配列(例えば、親分子、例えば抗原結合分子)の１以上のアミノ酸の置換を指すことを意図する。１の実施態様では、アミノ酸残基の置換は、例えば、親配列に比べてポリペプチドをコードする核酸配列における点突然変異により達成されうる。別の実施態様では、アミノ酸残基の置換は、親ポリペプチドの全体のフレームワーク領域を、例えば、親を参照して置換される位置で所望のアミノ酸を含む生殖細胞系列ＶＨ配列由来のフレームワーク領域で置換することにより達成され得る。
【００９６】
「保存」アミノ酸置換は、１のアミノ酸を、同様の構造及び/又は化学的性質を有する別のアミノ酸で置換することによりなされる置換、つまり保存的アミノ酸置換であり、そして関与する残基の極性、荷電、可溶性、疎水性、親水性、及び/又は両親媒性の類似に基いてなされ得る。例えば、非極性(疎水性)アミノ酸として、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンが挙げられ；極性天然アミノ酸として、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが挙げられ；正に荷電された(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、リジン、及びヒスチジンが挙げられ；そして負に荷電された(酸性)アミノ酸として、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。「挿入」又は「欠失」は、好ましくは、約１〜２０アミノ酸の範囲であり、より好ましくは１〜１０のアミノ酸の範囲である。許容される変化は、組換えＤＮＡ技術を用いてポリペプチド分子内に挿入、欠失、又は置換を系統的に製造し、そして得られた組換えバリアントを活性についてアッセイすることにより実験的に測定されうる。
【００９７】
本明細書に使用される場合、親抗原結合分子又は親分子という語句は、ポリヌクレオチド配列によりコードされる特有のアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。当該親分子の配列(つまり、親配列)は、細胞シグナル活性及び/又は抗原の架橋を誘導又は阻害するように、得られた分子(例えば、改変抗原結合ドメイン)の能力を改変するアミノ酸残基置換をするための参照配列として機能する。同様に、本分子の活性は、置換が細胞シグナル活性及び/又は抗原の架橋に影響を与えたか、そして関連する場合に当該効果の程度を決定する場合の参照として役立つ。本発明(例えば、改変ＡＢＭ)に比較して１以上のアミノ酸置換を含む配列は、次にさらなる置換についての親配列として役立ちうる。
【００９８】
本明細書に使用される場合、細胞シグナル活性の変化という用語は、標的抗原の細胞シグナル活性を誘導又は阻害するためにＡＢＭの能力を増加又は低下させることを指す。
【００９９】
本明細書に使用される場合、１以上の標的抗原の架橋の変化という用語は、互いに近位に、及び/又は他の膜関連分子と近位に、及び/又は(例えば、タンパク質、又は膜関連受容体のオリゴマー化を通して)複合体を形成して細胞シグナル経路を形成できる相互作用標的抗原のより好ましい立体配置に至らせるＡＢＭの能力の増加又は低下を指すことを意図する。
【０１００】
本明細書に使用される場合、細胞シグナルメカニズム又は細胞シグナル活性は、具体的な細胞事象又は生物学的機能、並びに経路に沿った任意のシグナルステップを指すことを意図する。
【０１０１】
本発明の参照ヌクレオチド配列に、例えば少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドという記載により、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の１００個のヌクレオチドあたり５個の点突然変異を含んでもよいということを除いて、参照配列に同一であるということが意図される。言い換えると、参照ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中に最大５％のヌクレオチドが、欠失又は他のヌクレオチドで置換されてもよいし、或いは参照配列中の全ヌクレオチドの最大５％の多くのヌクレオチドが、参照配列中に挿入されてもよい。
【０１０２】
実際に、任意の特有の核酸分子又はポリペプチドが、本発明のヌクレオチド配列又はポリペプチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるかは、既知のコンピュータープログラムを用いて慣用的に決定できる。クエリー配列(本発明の配列)と対象配列との間の最適な全体適合を決定する好ましい方法、全体配列アライメントとも呼ばれる、は、Brutlagら、Comp. App. Biosci.6:237-245 (1990)のアルゴリズムに基いたＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを用いて測定できる。配列アライメントでは、クエリーと対象配列は、両方ともＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することにより比較することができる。当該全体の配列アライメントの結果は、同一性割合で表される。同一性割合を計算するためのＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアライメントにおいて使用される好ましいパラメーターは、Matrix＝Unitary、k-tuple＝４、Mismatch Penalty＝１、Joining Penalty＝３０、Randomization Group Length＝０、Cutoff Score＝１、Gap Penalty＝５、Gap Size Penalty ０.０５、Window Size＝５００又は対象ヌクレオチド配列の長さ(いずれか短い方)である。
【０１０３】
対象配列が５'又は３'の欠失のためであって、内部欠失のためではなくクエリー配列よりも短い場合、結果に対して手動による訂正をしなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、同一性割合を計算する場合、対象配列の５'切り詰め及び３'切り詰めを計上しないからである。クエリー配列に対して５'又は３'末端において切り詰められた対象配列では、同一性割合は、適合/整列されていない対象配列の５'及び３'にあたるクエリー配列の塩基の数を、クエリー配列の全体の塩基の割合として計算することにより補正される。 ヌクレオチドが適合/整列するかについては、ＦＡＳＴＤＢ配列アライメントの結果により決定される。この割合は次に、特定のパラメーターを用いて上記ＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算された同一性割合から引かれて、最終的な同一性割合のスコアを達成する。この補正されたスコアは、本発明の目的について使用されるスコアである。ＦＡＳＴＤＢアライメントにより示された場合に、クエリー配列と適合/整列されていない対象配列の５'及び３'塩基の外側の塩基のみが、同一性割合のスコアを手動で調節する目的のために計算される。
【０１０４】
例えば、９０塩基の対象配列を、１００塩基のクエリー配列に整列させて同一性割合を決定する。対象配列の５'末端において欠失が生じているので、ＦＡＳＴＤＢアライメントは、５'末端の最初の１０塩基の適合/整列を示すことはない。１０個の対形成しない塩基は、配列の１０％(５'及び３'末端での対形成しない塩基数  ／  クエリー配列中の全塩基数)を表し、ＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算された同一性割合のスコアから１０％が差し引かれる。残りの９０塩基が完全に適合していたならば、最終的な同一性割合は９０％となる。別の例では、９０塩基の対象配列は、１００塩基のクエリー配列と比較される。今回は、欠失が内部欠失であり、その結果対象配列の５'又は３'末端上にクエリー配列と適合／整列しない塩基は存在しなかった。この場合、ＦＡＳＴＤＢにより計算される同一性割合は、手動で補正されることはない。今一度記載すると、クエリー配列と適合／整列しない対象配列の５'及び３'末端の塩基のみが、手動で補正されるのである。他の手動の補正は、本発明の目的のためになされることはない。
【０１０５】
本発明のクエリーアミノ酸配列に、例えば少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドにより、当該対象のポリペプチドのアミノ酸配列が、クエリーアミノ酸配列の各１００個のアミノ酸につき最大で５個のアミノ酸の変化を含むことを除き、クエリー配列と同一であることを意図する。言い換えると、クエリーアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、対象配列中の最大で５％のアミノ酸残基が、挿入、欠失、又は他のアミノ酸で置換されてもよい。これらの参照配列の変化は、参照アミノ酸配列のアミノ末端またはカルボキシ末端位置において生じてもよいし、末端部分の間のどこにでも、参照配列の残基間で個別に、又は参照配列内の１以上の連続基で分散されてもよい。
【０１０６】
慣用される様式として、任意の特定のポリペプチドが、参照ポリペプチドに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかは、既知のコンピューター・プログラムを用いて慣用的に決定することができる。クエリー配列(本発明の配列)と全体配列アライメント(global sequence alignment)として言及される対象配列との間で全体の最良適合を測定する好ましい方法は、Brutlagら、Comp. App. Biosci. (5:237-245 (1990)のアルゴリズムに基いたＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを用いて決定することができる。配列アライメントにおいて、クエリー及び対象配列は、両方のヌクレオチド配列であるか、又は両方のアミノ酸配列である。当該全体配列アライメントの結果は、同一性割合で表される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アライメントにおいて使用される好ましいパラメーターは、Matrix＝PAM0、k-tuple＝2、Mismatch Penalty＝１、Joining Penalty＝２０、Randomization Group Length＝Ｏ、Cutoff Score＝１、Window Size＝配列長、Gap Penalty＝５、Gap Size Penalty＝０.０５、Window Size＝５００又は対象アミノ酸長(いずれか短い方)である。
【０１０７】
対象配列が、内部欠失のためではなくＮ末端及びＣ末端の欠失のためクエリー配列より短い場合、手動の補正が結果になされなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体の同一性割合を計算する場合、対象配列のＮ末端及びＣ末端の切り詰めを計上できないからである。クエリー配列に対してＮ末端及びＣ末端で切り詰められた対象配列では、同一性割合は、対応する対象残基と適合／整列されていない対象配列のＮ末端及びＣ末端にあるクエリー配列の残基数をクエリー配列の全塩基の割合として計算することにより補正される。残基が適合／整列しているかは、ＦＡＳＴＤＢ配列アライメントの結果により決定される。この割合は、次に、最終的な同一性割合のスコアを達成するために、所定のパラメーターを用いて上記ＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算される同一性割合から差し引かれる。この最終同一性割合のスコアは、本発明の目的のために使用されるスコアである。クエリー配列に適合／整列しない対象配列のＮ末端及びＣ末端について、つまり対象配列のＮ及びＣ末端残基の外側のクエリー残基の位置の残基のみが、同一性割合のスコアを手動で調節する目的について考慮される。
【０１０８】
例えば、９０個のアミノ酸残基の対象配列を、１００残基のクエリー配列と整列させて同一性割合が決定される。欠失が対象配列のＮ末端に生じ、その結果、ＦＡＳＴＤＢアライメントは、Ｎ末端での最初の１０残基の適合／整列を示さなかった。１０個の対形成していない残基は、配列の１０％(Ｎ及びＣ末端での対形成していない残基の数  ／  クエリー配列の総残基数)を表し、ＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算された同一性割合のスコアから差し引かれる。残りの９０残基が完全に適合する場合、最終的な同一性割合は９０％となる。別の例では、欠失が内部欠失であり、Ｎ又はＣ末端にクエリーと適合／整列していない対象配列の残基がない９０残基の対照配列が、１００残基のクエリー配列と比較される。この場合、ＦＡＳＴＤＢにより計算される同一性割合は、手動で補正されることはない。今一度記載すると、ＦＡＳＴＤＢ整列において示された場合に、クエリー配列と適合／整列しない対象配列のＮ及びＣ末端の外側の残基のみが、手動で補正される。他の手動の補正が、本発明の目的のためになされることはない。
【０１０９】
本明細書に使用される場合、本発明の核酸配列に「ストリンジェント条件下でハイブリダイズする」核酸核酸は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ(７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム)、５０ｍＭのリン酸ナトリウム(ｐＨ７.６)、５×デンハート溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌの変性せん断された鮭精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩インキュベートし、続いて約６５℃で０.１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄した際にハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。
【０１１０】
本明細書に使用される場合、Ｆｃ領域という用語は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を指すように意図される。ＩｇＧ鎖重鎖のＦｃ領域の境界が、少しだけ変わりうるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常Ｃｙｓ２２６位でのアミノ酸からカルボキシル末端に広がるように定義される。
【０１１１】
本明細書に使用される場合、免疫グロブリンのＦｃ領域に同等の領域という用語は、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然アレルバリアント、並びに置換、付加、又は欠失をもたらすが、エフェクター機能(例えば抗体依存性細胞傷害性)を媒介する免疫グロブリンの能力を実質的に低下させない変化を有するバリアントを含むことが意図される。例えば、１以上のアミノ酸は、生物学的機能を実質的に失うことなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から欠失することができる(例えば、Bowie, J. U.ら、Science 247:1306-10 (1990)を参照のこと)。１の実施態様では、Ｆｃ領域に同等な領域は、異種融合タンパク質の部分を形成できる。幾つかの実施態様では、Ｆｃ領域に同等である領域は、免疫グロブリン重鎖の別のクラスに対応する領域を包含する(例えば、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、及びＩｇＭ)。
【０１１２】
本明細書に使用される場合、ゴルジ局在化ドメインという語句は、ゴルジ複合体内に位置するポリペプチドを留まらせるのに関与するゴルジ内在ポリペプチドのアミノ酸配列を指す。一般的に局在化ドメインは、酵素のアミノ末端「テール」を含む。
【０１１３】
本明細書に使用される場合、エフェクター機能は、抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列バリアントＦｃ領域)に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例として、非限定的に、Ｆｃ受容体結合親和性、抗体依存性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)、抗体依存性細胞貪食(ＡＤＣＰ)、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体依存性抗原取り込み、細胞表面受容体の下方制御などが挙げられる。
【０１１４】
本明細書に使用される場合、操作、操作された、操作する、糖鎖操作、糖鎖操作された、糖鎖操作する、及びグリコシル化を操作するという語句は、天然又は組換えポリペプチド、例えば抗原結合分子(ＡＢＭ)又はその断片の糖鎖付加パターンの全ての操作を含むことが考慮される。グリコシル化の操作は、細胞のグリコシル化機構の代謝操作を含み、細胞において発現される糖タンパクのグリコシル化の変化を達成するオリゴ糖合成経路の遺伝的操作を含む。１の実施態様では、グリコシル化の操作は、グリコシルトランスフェラーゼ活性の変化である。特定の実施態様では、操作は、グルコサミニルトランスフェラーゼ活性及び／又はフコシルトランスフェラーゼ活性の変化をもたらす。
【０１１５】
本明細書に使用される場合、宿主細胞という語句は、本発明のポリペプチド及び抗原結合分子を生成するように遺伝子操作できる任意の種類の細胞システムをカバーする。宿主細胞は、培養細胞、例えば哺乳動物培養細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３-ＥＢＮＡ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、Ｙ０ミエローマ細胞、Ｐ３Ｘ６３マウスミエローマ細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ.Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含み、２、３例を挙げると、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織内に含まれる細胞が挙げられる。１の実施態様では、宿主細胞は、改変された糖型を有する抗原結合分子の生産を許容するように操作される。好ましい実施態様では、抗原結合分子は、抗体、抗体断片、又は融合タンパク質である。特定の実施態様では、宿主細胞は、さらに、ＧｎＴＩＩＩ活性を有する１以上のポリペプチドの高いレベルを発現するようにさらに操作された。別の実施態様では、宿主細胞は、α１,６-フコシルトランスフェラーゼ活性を削除、低減、又は阻害するように操作された。コアα１,６-フコシルトランスフェラーゼ活性という語句は、コアα-１,６-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、並びにコア１,６-フコシルトランスフェラーゼ酵素とその基質との相互作用の両方を包含する。
【０１１６】
本明細書に使用される場合、Ｆｃ媒介性細胞傷害性という語句は、抗体依存性細胞傷害性及びヒトＦｃ領域を含む可溶性Ｆｃ融合タンパク質により媒介される細胞傷害性を含む。Ｆｃ媒介性細胞傷害性は、「ヒト免疫効果細胞」による「抗体標的化細胞」の溶解を導く免疫メカニズムである。
【０１１７】
ここで、ヒト免疫効果細胞は、その表面上のＦｃ受容体を提示する白血球の集合であり、当該Ｆｃ受容体を通して、当該細胞は抗体のＦｃ領域又はＦｃ融合タンパク質に結合し、そしてエフェクター機能を発揮する。このような集合は、非限定的に、末梢血単核球(ＰＢＭＣ)及び／又はナチュラルキラー(ＮＫ)細胞を含み得る。
【０１１８】
抗体標的化細胞は、抗体又はＦｃ融合タンパク質により結合される細胞である。抗体又はＦｃ融合タンパク質は、タンパク質のＮ末端部分を介してＦｃ領域に結合する。
【０１１９】
本明細書に使用される場合、Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増加という語句は、上で定義されるＦｃ媒介性細胞傷害性のメカニズムにより、標的細胞の周囲の培地において抗体又はＦｃ融合タンパク質の所定の濃度で所定の時間において溶解される「抗体標的化細胞」の数の増加、及び／又はＦｃ媒介性細胞傷害性のメカニズムにより、所定の時間抗体標的化細胞の所定の数の溶解を達成するために必要とされる標的細胞の周囲の培地における抗体又はＦｃ融合タンパク質の濃度の低下のいずれかとして定義される。Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増加は、当業者に知られている同じ標準生産、精製、剤形及び貯蔵方法を用いて同じタイプの宿主細胞により産生されるが、本明細書に記載される方法によりグリコシルトランスフェラーゼＧｎＴＩＩＩを発現するように操作された宿主細胞によって産生されたものではない同じ抗体又はＦｃ融合タンパク質により媒介される細胞傷害性と比べられる。
【０１２０】
高い抗体依存性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)を有する抗体は、当業者に知られている任意の適切な方法により決定される高いＡＤＣＣを有すると本明細書で定義される抗体を意味する。１の認められたＡＤＣＣアッセイは、以下の本明細書に記載される実施例で記載される。別の認められたｉｎ ｖｉｔｒｏＡＤＣＣアッセイは以下の通りである：
１)当該アッセイは、抗体の抗原結合領域により認識される標的抗原を発現することが知られている標的細胞を用い；
２)当該アッセイは、効果細胞として、ランダムに選択された健常ドナーの血液から単離されたヒト末梢血液単核細胞を使用し；
３)当該アッセイは、以下のプロトコル：
ｉ)  標準的な密度遠心法を用いてＰＢＭＣを単離され、そしてＲＰＭＩ細胞培養培地中に５×１０6細胞／ｍｌで懸濁し；
ｉｉ)  標的細胞を標準的組織培養法により生育させ、９０％より高い生存度を有する指数増殖期から回収し、ＲＰＭＩ細胞培養培地中で洗浄し、１００μキュリーの51Ｃｒで標識し、細胞培養培地で２回洗浄し、そして１０5細胞／ｍｌの密度で細胞培養培地中に懸濁する標準組織培養法により生育させ；
ｉｉｉ)  １００μｌの最終標的細胞懸濁液を、９６ウェルマイクロタイター・プレートの各ウェルに移し、
ｉｖ)  抗体を細胞培養培地中に４０００ｎｇ／ｍｌ〜０.０４ｎｇ／ｍｌで連続希釈し、５０μｌの得られた抗体溶液を９６ウェルマイクロタイタープレートの標的細胞に加え、上記全濃度範囲をカバーする様々な抗体濃度を三回試験し；
ｖ)  最大放出(ＭＲ)対照では、標識された標的細胞を含むプレートの３個の追加のウェルは、抗体溶液(上記ｉｖ)の代わりに、非イオン性界面活性剤(Nonidet, Sigma, St. Louis)の２％(Ｖ／Ｖ)水溶液(５０μｌ)を受容し；
ｖｉ)  自発的放出(ＳＲ)対照では、標識された標的細胞を含むプレートの３個の追加ウェルは、抗体溶液(上記ｉｖ)の代わりに５０μｌのＲＰＭＩ細胞培養培地を受容し；
ｖｉｉ)  次に、９６ウェルマイクロタイタープレートを５０×ｇで１分間遠心し、そして１時間４℃でインキュベートし、
ｖｉｉｉ)  ５０μｌのＰＢＭＣ懸濁液(上記（ｉ）)は、２５：１の効果細胞：標的細胞の比をもたらすように各ウェルに加えられ、そして当該プレートは、３７℃で４時間、５％ＣＯ2雰囲気下のインキュベーター内に配置され；
ｉｘ)  各ウェルからの細胞を含まない懸濁液を回収し、そして実験的に放出された放射活性(ＥＲ)をγカウンターを用いて定量し；
ｘ)  特定の可溶性の割合を式：
(ＥＲ-ＭＲ)／(ＭＲ-ＳＲ)×１００
[式中、
ＥＲは、抗体濃度について定量された平均放射活性(上記ｉｘを参照のこと)であり、
ＭＲは、ＭＲ対照(上記ｖを参照のこと)について定量された平均放射活性(上記ｉｘを参照のこと)であり、そして
ＳＲは、ＳＲ対照(上記ｖｉを参照のこと)について定量された平均放射活性(上記ｉｘを参照のこと)である]
に従って各抗体濃度を計算する、
に従って行われ、
４)「高いＡＤＣＣ」は、上で試験された抗体濃度範囲内で観察された具体的な溶解の最大割合の増加、及び／又は上で試験された抗体濃度範囲内で観察された具体的な溶解の最大割合の半分を達成するために必要とされる抗体の濃度の低下のいずれかとして定義される。ＡＤＣＣの増加は、当業者に知られている同じ標準生産、精製、剤形及び貯蔵方法を用いて宿主細胞の同じタイプにより精製されたが、ＧｎＴＩＩＩを過発現するように操作されていない宿主細胞により産生されなかった同じ抗体により媒介される上記アッセイで計測されたＡＤＣＣと比較される。
【０１２１】
重鎖及び／又は軽鎖アミノ酸置換を有する抗原結合分子
１の態様では、本発明は、改変重鎖及び／又は軽鎖のＶ領域及び／又はＣ領域を含むＡＢＭに関し、そしてこれらのＡＢＭが標的抗原の細胞シグナル活性を誘導し、及び／又は標的抗原の架橋を媒介する能力がこのような改変により増大(つまり誘導又は増加)されるか、又は低減(つまり阻害又は低下)されるということに関する。こうして、本発明は、改変された重鎖及び／又は軽鎖のＶ領域及び／又はＣ領域を有するＡＢＭ、このようなポリペプチドをコードする核酸配列(例えば、ベクター)、改変重鎖及び／又は軽鎖のＶ領域及び／又はＣ領域を有するポリペプチドを精製させる方法、及び様々な疾患及び障害の治療において同じモノを使用する方法を提供する。
【０１２２】
幾つかのメカニズムは、抗体依存性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)、補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)、及び増殖の停止又はアポトーシスの誘導、並びに細胞成長、細胞増殖、細胞生存及び／又は他の細胞事象の遮断又は阻害を含む、抗体の治療効力に関することが知られている。例えば、アゴニスト性モノクローナル抗体による細胞死及び細胞シグナル事象の誘導の例が報告された。Cerisanoらは、膜貫通糖タンパク質ＣＤ９９に対する抗体(例えば、抗ＣＤ９９ ０１３ＭＡｂ及びＯ６６２Ｍａｂ)で刺激することによって、アポトーシス様の特徴(例えば、ホスファチジル-セリン(ＰＳ)の露出、形態的変化、及び／又はプロピジウム・ヨージド取り込み)により特徴付けられるカスパーゼ非依存性の細胞死の誘導、並びにユーイング肉腫細胞の同型の凝集を示した(Cerisanoら、Oncogene 23: 5664-5674 (2003))。同様に、Hahnらは、ＣＤ９９を抗ＣＤ９９モノクローナル抗体(例えば、ＤＮ１６及びＹＧ３２)と接触させることによりＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性化を報告した。当該活性化は、細胞の同型凝集を導いた(Hahnら、FEBS Letters 470: 350-354 (2000))。Pettersenらは、抗ＣＤ９９モノクローナル抗体であるＡＤ２０により活性化されうるＣＤ９９の新たな機能ドメインを同定し、その活性化は形質転換されたＴ細胞のアポトーシスを誘導した (Pettersen ら、J. Immunol. 166:4931-4942 (2001))。ＣＤ４７に対するモノクローナル抗体(例えば、Ｂ６Ｈ１２)は、細胞骨格認識シグナル伝達経路と関連するカスパーゼに非依存性の細胞死を誘導できる(Mateoら、Blood 100:2882-2890(2002))。上記参考文献の各々は、その全てを本明細書に援用される。
【０１２３】
別の例では、ＣＤ２０に対する特定の抗体(例えば、リツキシマブおよびトシツモマブ)及びＣＤ５２に対する特定の抗体(ＣＡＭＰＡＴＨ-１Ｈ)は、腫瘍細胞にアポトーシスを直接誘導することが示されてきた。Ludwigら、Oncogene 22: 9097-9106 (2003)を参照のこと。シグナル活性をほとんど持たないか又は全く持たないリツキシマブ及び幾つかのほかのモノクローナル抗体(抗ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２２及びＨｅｒ２)について、アポトーシス又は成長停止を誘導する能力は、当該抗体をＩｇＧ-ＩｇＧホモダイマーへと化学的に変換することにより高められた(Ghetieら、Proc. Natl. Acad. Sci 94:7509-14 (1997)。この亢進は、四価の抗体ホモダイマーによるハイパー架橋(hypercrosslinking)のために生じたということが推測された(Ghetie ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 94:7509-14 (1997))。架橋及びアポトーシスの増加は、二次抗体又はＦｃ受容体を有するアクセサリー細胞の使用を通して達成された。Jazhirehi及びBonavida、Oncogene 24:2121-43 (2005)を参照のこと。上記参考文献の各々は、その全てを援用される。
【０１２４】
論理により束縛されることを望まず、本発明者により、抗原結合分子の肘ヒンジ領域におけるアミノ酸残基の改変が、標的抗原のシグナル活性化及び/又は架橋を誘導又は阻害するＡＢＭの能力に影響できるということが決定された。肘ヒンジ領域の角度は、免疫グロブリンのＣ領域に対するＶ領域の配向を制御し、そしてそのようなものとして、抗体と、抗原及びエフェクタータンパク質の相互作用を促進する。Lesk及びChothia, Nature 335: 188-90 (1988)を参照のこと。Lesk及びChothiaは、抗体の肘ヒンジ領域の分子玉継ぎ手を作り上げる残基を同定した。つまり、ＶＨ領域において１１、１１０、及び１１２カバット位であり、そしてＣＨ１領域の１４９及び１５０位であり、そしてこの継ぎ手を作り上げる残基を有する抗体を通して高い程度に保存されていることが示された(Lesk and Chothia, Nature 335: 188-90 (1988)を参照のこと、本明細書にその全てが援用される。しかしながら、彼らは、玉継ぎ手残基、又はその近辺の残基について変更をしなかった。Landolfiらは、ヒトＩＦＮγに対する中和抗体であるＡＦ２において１０〜１３カバット位への改変を示して、抗体活性の中和の有意な低下をもたらしたが、その標的抗原に対する抗体の結合に影響しなかった。Landolfiら、J. Immunol. 166: 1748-54 (2001)(その全てを本明細書に援用される)。しかしながら、Landolfiらは、細胞シグナル伝達を誘導するか、又は抗原架橋を媒介する抗体の能力について影響を示さなかった。
【０１２５】
多価ＡＢＭでは、抗原結合部位の配向を変化させる能力は、当該ＡＢＭが複数の抗原結合部位と複合体形成される場合、結合された抗原のユニットの接近の調節を可能にする。互いに対して抗原ユニットの近接は、抗原ユニット間での高い又は低い相互作用を促進する(例えば架橋、二量化など)。例えば、ＡＢＭにおける各ＶＨ/ＶＬ-ＣＨ１/ＣＬ対の肘角度は、当該抗原結合部位が互いに対して接近するように配向されるならば、結合された抗原ユニット(例えば、細胞表面受容体分子)は、互いに対して接近させるか、又は相互作用により好ましい立体配置にした。この接近に又は立体配置の変化は、結合抗原との間の架橋及びオリゴマー化を媒介することができる。他方、抗原結合部位がひき離されるか又はより好ましくない立体位置を有するように抗原結合部位を配向することは、相互作用を妨げることができる。
【０１２６】
ＶＬ-ＣＬ界面でのアミノ酸残基は、抗原結合部分の向きに影響を与えるように改変することができる。例えば、軽鎖可変領域フレームワークにおけるカバット残基４０、８０、８３、１０５、及び１０６は、ＶＬ/ＣＬの境界に位置する。
【０１２７】
任意の細胞シグナルメカニズムの活性は、本発明のＡＢＭにより影響され得る(つまり、誘導されるか又は阻害される)。本発明の１の態様では、関与する細胞シグナルメカニズムは、イオンチャネル結合、Ｇタンパク質結合、及び酵素結合細胞表面受容体タンパク質を含む細胞表面受容体を通して開始する。一般的に、MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELLの第15章：細胞シグナル伝達、Albertsら共編(第三版1994)を参照のこと。当該文献は本明細書に援用される。こうして、例えば、本発明の細胞シグナル活性は、非限定的に、アポトーシス、細胞分化、細胞成長、細胞増殖及び細胞生存をもたらす活性を含み、並びに当該経路に沿ったシグナル伝達ステップのいずれをもたらす活性を含む。１の実施態様では、細胞シグナル活性は、具体的な実施態様における酵素結合受容体を通して生じ、酵素結合受容体は、受容体チロシンキナーゼである。別の実施態様では、細胞シグナル活性は、イオンチャネル結合受容体を通して活性化される。
【０１２８】
本発明のＡＢＭの改変された重鎖又は軽鎖のＶ領域及び/又はＣ領域は、対応する非改変親ポリペプチド(例えば、親抗原結合分子)領域とは、少なくとも１個のアミノ酸置換分だけ異なっている。「親」「開始」又は「非改変」ポリペプチドは、好ましくは、少なくとも１の部分の抗体重鎖又は軽鎖を含み、そして重鎖Ｖ領域又はＣＨ１領域又はその部分及び/又は軽鎖のＶ又はＣ領域或いはその部分を含むポリペプチドを作製するために当該技術分野で利用できる技術を用いて製造することができる。具体的な実施態様では、親ポリペプチドは、抗原結合分子であり、そして少なくともＶＨ又はＶＬ領域の部分を含む。特定の実施態様では、改変された重鎖及び/又は軽鎖Ｖ領域は、(例えば、本明細書に開示される方法に従って)作製されてもよく、そして抗体Ｆｃなどの選択された異種ポリペプチドに融合されうる。本発明の１の実施態様では、改変ＡＢＭ又はその断片は、融合タンパク質を含み、ここで改変重鎖Ｖ領域又はその断片が、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、及びＩｇＭからなる群から選ばれる重鎖定常領域に融合されるか、又はその断片又は誘導体に融合される。特定の実施態様では、重鎖定常領域はＩｇＧである。本発明の別の実施態様では、改変ＡＢＭ又はその断片は、融合タンパク質を含み、ここで改変された軽鎖Ｖ領域又はその断片は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、及びＩｇＭからなる群から選ばれる軽鎖定常領域、又はその断片又は誘導体に融合される。特定の実施態様では、軽鎖定常領域はＩｇＧである。具体的な実施態様では本発明のポリペプチドは、改変された重鎖及び/又は軽鎖Ｖ領域を有する軽鎖及び重鎖を含む全抗体(例えば、ＩｇＧ)を含む。
【０１２９】
改変された重鎖Ｖ領域又はＣＨ１領域、又は軽鎖Ｖ領域又はＣＬ領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、特定の配列について本明細書の指針を用いて当業者に既知の方法により製造されてもよい。これらの方法は、ポリペプチドをコードする予め製造された核酸を、非限定的に、部位特異的(又はオリゴヌクレオチド媒介性)変異誘導、ＰＣＲ変異誘導、及びカセット変異誘導することにより製造することを含む。部位特異的変異誘導は、置換バリアントを製造するための好ましい方法である。この技術は、当業者に周知である(例えば、Carterら、Nucleic Acids Res. 13: 4431-4443 (1985)及び Kunkelら、Proc. Natl. Acad. Scｉ USA 82: 488 (1987)を参照のこと、両文献は、援用により本明細書に援用される)。簡潔に記載すると、ＤＮＡの部位特異的変異誘導を行う際に、開始ＤＮＡは、このような開始ＤＮＡの一本鎖について望ましい変異をコードするオリゴヌクレオチドを最初にハイブリダイズさせることにより改変される。ハイブリダイゼーション後に、ＤＮＡポリメラーゼは、ハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、そして開始ＤＮＡの１の鎖をテンプレートとして用いて、全体の第二ストランドを合成するために使用される。こうして、所望される変異をコードするオリゴヌクレオチドは、得られた二本鎖ＤＮＡに取り込まれる。
【０１３０】
ＰＣＲ変異誘導は、未改変開始ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントを製造するのに適している(例えば、Valletteら、Nuc Acids Res. 17:723-733(1989)を参照のこと、当該文献は本明細書に援用される)。簡潔に記載すると、少量のテンプレートＤＮＡをＰＣＲの開始物質として使用する場合、テンプレートＤＮＡの対応配列と少し異なる配列を有するプライマーを使用することができ、当該プライマーがテンプレートと異なっている部分でだけテンプレート配列とは異なる特異的ＤＮＡ断片を比較的多量に作成する。
【０１３１】
ＡＢＭバリアントの別の製造方法であるカセット変異誘導は、Wellsら、Gene 34: 315-323 (1985)に記載される技術に基づく。当該文献は本明細書に援用される。開始物質は、改変される開始ポリペプチドＤＮＡを含むプラスミド(又は他のベクター)である。変異される開始ＤＮＡにおけるコドン(単数又は複数)が、同定される。同定された変異部位のいずれかの側に固有の制限エンドヌクレアーゼ部位が存在しなければならない。このような制限部位が存在しない場合、開始ポリペプチドＤＮＡの適切な部位に制限部位を誘導するために上記オリゴヌクレオチドに媒介される変異誘導法を用いて製造されうる。プラスミドＤＮＡは、これらの部位で切断されて直線化させる。制限部位の間でＤＮＡの配列をコードするが、所望される変異を含む二本鎖オリゴヌクレオチドが、標準方法を用いて合成される。ここでオリゴヌクレオチドの二本鎖は、別々に合成され、そして次に標準技術を用いてハイブリッド形成される。この二本鎖オリゴヌクレオチドは、カセットと呼ばれる。このカセットは、直線化プラスミドの末端と適合する５’及び３’末端を有するように設計され、その結果当該カセットをプラスミドに直接ライゲーションできる。このプラスミドは、変異されたＤＮＡ配列を含む。
【０１３２】
或いは、又はさらに、ポリペプチドバリアントをコードする所望のアミノ酸配列を決定でき、そしてこのようなアミノ酸配列バリアントをコードする核酸配列は、合成的に生成することができる。
【０１３３】
親ポリペプチドのアミノ酸配列は、改変された重鎖のＶ領域及び/又は改変されたＣＨ１領域、及び/又は改変された軽鎖のＶ領域及び/又は改変されたＣＬ領域を有するＡＢＭを生成するために改変されてもよく、改変された能力は、改変されたＡＢＭが(標的抗原)と複合体形成する(例えば結合する)場合、標的抗原の細胞シグナル活性を誘導する。細胞シグナル活性は、アゴニスト活性又はアンタゴニスト活性でありうる。本発明の１の態様では、アゴニスト活性は、細胞膜媒介性受容体に結合し、そして細胞シグナル経路を開始する場合に改変された抗原結合分子により誘導される。具体的な実施態様では、細胞シグナル経路はアポトーシス経路である。別の実施態様では、細胞シグナル経路は、細胞分化経路である。本発明の別の態様では、例えば、ＡＢＭが、細胞膜関連受容体に結合し、そして細胞シグナル経路の誘導を阻害するか又は継続シグナルを停止する場合に、改変された抗原結合分子によるアンタゴニスト活性が生じる。アンタゴニスト活性は、内在性リガンドの結合を阻害し、そしてそれに続くシグナル伝達を阻害することにより、及び/又は受容体又は細胞シグナル経路の誘導に必要とされているほかの分子の架橋又はオリゴマー化を阻害することにより達成されてもよい。１の実施態様では、細胞増殖経路において阻害又は停止される細胞シグナル経路は、細胞成長経路である。別の実施態様では、阻害又は停止される細胞シグナル経路は、細胞分裂経路である。別の実施態様では、阻害又は停止される細胞シグナル経路は、細胞生存経路である。
【０１３４】
同様に、本ポリペプチドのアミノ酸配列は、改変された重鎖のＶ領域又は改変されたＣ領域(例えば改変ＣＨ１領域)及び/又は改変された軽鎖のＶ領域及び/又は改変されたＣＬ領域を有するＡＢＭを生成するように改変されてもよく、改変されたＡＢＭが標的抗原と複合体形成(例えば結合)する場合、改変された能力は１以上の標的抗原の架橋を媒介する。１の実施態様では、結合された標的抗原(例えば、細胞表面受容体分子)は、互いに接近されるか及び/又は、対応する非改変親ＡＢＭによりなされるよりもより好ましい立体配置にされ、それにより結合された抗原の間で架橋及びオリゴマー化を増大させる。別の実施態様では、結合された標的抗原(例えば、細胞表面受容体分子)は、互いに遠くに離されているか、及び/又は対応する非改変親ＡＢＭによりなされるよりも好ましくない立体配置にされ、それにより結合抗原の間の架橋及びオリゴマー化を低減又は防止する。特定の実施態様では、架橋又はオリゴマー化の増加は、アポトーシスの増加をもたらす。別の実施態様では、架橋又はオリゴマー化の増加は細胞分化の増加をもたらす。別の実施態様では、架橋又はオリゴマー化の低下は、低い細胞増殖性、低減された細胞分裂、又は低減された細胞生存をもたらす。
【０１３５】
重鎖のＶ領域又はＣＨ１領域、或いは軽鎖のＶ領域又はＣＬ領域の生物学的性質における実質的な改変は、(ａ)置換の領域における、例えばシート又はヘリックス立体配置としてのポリペプチド骨格の構造、(ｂ)標的部位での分子の荷電又は疎水性、又は(ｃ)側鎖の大きさを維持することについての影響の点で有意に異なる置換を選択することにより達成されうる。天然残基は、共通する側鎖の性質に基づいて以下のクラスに分けられる：
(１)  疎水性：メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン；
(２)  中性親水性：システイン、セリン、スレオニン
(３)  酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸；
(４)  塩基性：アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン；
(５)  鎖の向きに影響を与える残基：グリシン、プロリン；及び
(６)  芳香族：トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン。
【０１３６】
非保存的置換は、別のクラスのメンバーについてこれらのクラスのうちの１のメンバーを交換することである。保存的置換は、これらのクラスのうちの１のメンバーを、同じクラスの別のメンバーに交換することである。
【０１３７】
改変ＡＢＭを含むポリペプチドの例
１の態様では、本発明は、細胞シグナル活性を誘導するか及び／又は抗原の架橋を媒介するＡＢＭの能力を変化させるアミノ酸改変を有する抗原結合分子に関する。１の実施態様では、ＡＢＭの改変は、親分子に比べて重鎖又は軽鎖の可変領域の少なくとも１のフレームワーク領域において少なくとも１のアミノ酸残基の置換を含む。特定の実施態様では、置換は、重鎖ＦＲ１においてアミノ酸残基を置換する。好ましい実施態様では、ＡＢＭへの改変は、重鎖可変領域における８、９、１０、１１、１２、又は１３カバット位のうちの１以上のアミノ酸残基の置換を含む。別の実施態様では、ＡＢＭへの改変は、重鎖ＦＲ４におけるアミノ酸残基の置換を含む。具体的な実施態様では、ＡＢＭへの改変は、重鎖可変領域における１１０又は１１２カバット位のうちの１以上でアミノ酸残基の置換を含む。別の実施態様では、ＡＢＭへの改変は、Ｖ領域とＣ領域との間の境界で軽鎖において少なくとも１のアミノ酸残基の置換を含む。より具体的な実施態様では、ＡＢＭについての改変は、４０、８０、８３、１０５、又は１０６カバット位の１以上でのアミノ酸残基の置換を含む。
【０１３８】
１の実施態様では、アミノ酸は、親配列において、アミノ酸残基の所望の変化をもたらす点突然変異を作成することにより置換されてもよい。或いは、ＡＢＭについての改変は、親分子の全体のフレームワーク領域を特定の位置で所望されるアミノ酸を含むフレームワーク領域に置換することを含む。具体的な実施態様では、ＡＢＭへの改変は、親分子のＦＲ１を、生殖細胞系列可変遺伝子配列によりコードされるＦＲ１に置換することを含む。
【０１３９】
本発明の別の実施態様では、ＡＢＭは少なくとも１のＣＨ１領域を含み、そしてＡＢＭの改変は、親ポリペプチドに比べて少なくとも１のアミノ酸残基を含む。具体的な実施態様では、ＡＢＭの改変は、重鎖定常領域の１４８、１４９、及び／又は１５０位でのアミノ酸残基の１以上を置換することを含む。
【０１４０】
別の態様では、本発明は、親抗原結合分子の１以上の切り詰めＣＤＲを含む改変抗原結合分子に関する。このような切り詰めＣＤＲは、少なくとも、所定のＣＤＲについて特異性決定アミノ酸残基を含むであろう。特異性決定残基は、抗原との相互作用に直接関連するこれらの残基を意味する。一般的に、所定のＣＤＲの残基の約５分の１〜３分の１のみが、抗原への結合に寄与している。特定のＣＤＲの特異性決定残基は、３次元モデリングから原子間接触をコンピューターで計算し、そして例えば、Padlanら、FASEB J. P(7J:133-139 (1995)に記載される方法に従って所定の残基の位置での配列の可変性を決定することにより同定することができる。上記文献はの内容はその全てを本明細書に援用される。
【０１４１】
従って、本発明は、親分子の少なくとも１の相補性決定領域を含む単離ポリヌクレオチド、又は、少なくとも当該相補性決定領域について少なくとも特異性決定残基を含むそのバリアント若しくは切り詰め形態に関し、ここで当該単離ポリヌクレオチドは融合ポリペプチドをコードする。好ましくは、このような単離されたポリヌクレオチドは、改変抗原結合分子である融合ポリペプチドをコードする。１の実施態様では、ポリヌクレオチドは、親分子の３個の相補性決定領域、又は３の相補性決定領域の各々について少なくとも特異性決定残基を含むそのバリアント若しくは切り詰め形態を含む。別の実施態様では、ポリヌクレオチドは、キメラ(例えばヒト化)抗体の軽鎖又は重鎖の全体の可変領域をコードする。本発明はさらに、このようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドにさらに関する。
【０１４２】
別の実施態様では、本発明は、親分子の少なくとも１の抗原決定領域を含む改変抗原結合分子、或いは当該相補性決定領域についての少なくとも特異性決定残基を含むそのバリアント又は切り詰め形態を含み、そして異種ポリペプチドに由来する配列を含む、改変抗原結合分子に関する。１の実施態様では、当該改変抗原結合分子は、親分子の３個の相補性決定領域を含むか、又は当該３個の相補性決定領域のおのおのについて少なくとも特異性決定残基を含むそのバリアント又は切り詰め形態を含む。別の態様では、改変抗原結合分子は、抗体軽鎖又は重鎖の可変領域を含む。１の特に有用な実施態様では、抗原結合分子は、キメラ、例えばヒト化抗体である。本発明はまた、このような改変抗原結合分子を製造する方法にも関し、そして細胞増殖傷害を含む疾患の治療において、当該分子を使用することに関する。
【０１４３】
幾つかのメカニズムが、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)及び補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)、並びに増殖停止、細胞分化、又はアポトーシスの誘導を含む抗体の治療効力に関与することが知られている。
【０１４４】
本発明は、対応する非改変親ABMに比べてアポトーシスを誘導する高い能力を有する改変ＡＢＭに関する。例えば、アポトーシスを誘導する能力がほとんどないか又は全く有さない親ＡＢＭは、本発明に従って改変されて、アポトーシスを誘導する能力を有するか又はアポトーシスを誘導する高い能力を有する改変ＡＢＭを生成する。本発明は、対応する非改変親ＡＢＭに比べて増殖の停止又は細胞分化を誘導する高い能力を有する改変ＡＢＭに関する。例えば、増殖停止又は細胞分化を誘導する能力をほとんど有さないか又は全く有さないやＡＢＭは、本発明に従って改変されて、増殖停止又は分化を誘導する能力を有するか、又は増殖停止又は分化を誘導する高い能力を有する改変ＡＢＭを生成する。
【０１４５】
特に抗ＣＤ２０抗体に関して、例えばリツキシマブが、ＣＤＣ及びＡＤＣＣアッセイにより計測される慣用的なエフェクターメカニズムを通して作用することが、多くの実験的証拠により示される。同様に、ｉｎ ｖｉｖｏでの異なるリンパ細胞のリツキシマブへの抵抗性が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＤＣへの感受性の機能であるということが示された。対照的に、治療用途に承認された他の抗ＣＤ２０抗体であるＢ１のｉｎ ｖｉｖｏでの作用様式は、補体又はナチュラルキラー(ＮＫ)細胞活性のいずれにも必要とされない。むしろ、ｉｎ ｖｉｖｏでのＢ１の効果は、強力なアポトーシスを誘導する能力のため生じる。一般的に、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体は、リンパ細胞を根絶させる作用の効果に基いて２個の異なるカテゴリーに分けられる。Ｉ型抗ＣＤ２０抗体は、標的細胞を殺傷する補体を利用する一方、ＩＩ型抗体は、異なるメカニズムにより、主にアポトーシスを作動させる。リツキシマブ及び１Ｆ５は、Ｉ型抗ＣＤ２０抗体の例であり、一方Ｂ１はＩＩ型抗体の例である(例えば、Cragg, M.S. 及び Glennie, M.J., Blood 103(7):2738-2743 (2004年4月); Teeling, J.L.ら、Blood 104(6): 1793- 1800 (2004年９月)を参照のこと。両文献の全ての内容を本明細書に援用する。
【０１４６】
Umana らに対する米国出願公開第2005/0123546号 (当該文献は本明細書に援用される)は、Ｉ型抗ＣＤ２０抗体が、ＡＤＣＣなどの高いエフェクター効果を有し、そして強力なアポトーシス能力を生成するように操作され、効果的にＩ型抗ＣＤ２０抗体をＩＩ型抗ＣＤ２０抗体へと変化させる最初の既知の例を開示する。１の実施態様では、本発明は、Ｉ型抗ＣＤ２０抗体に比べて、重鎖又は軽鎖可変領域における置換を含む改変抗-ＣＤ２０抗体に関し、ここで当該置換が、改変された抗ＣＤ２０抗体によるアポトーシスの高い誘導をもたらす。別の実施態様では本発明は、結果として、高いエフェクター機能について操作され、そして、アポトーシスを誘導する実質的な能力を有さないように操作された結果として高いＡＤＣＣを有する操作されたＩＩ型抗ＣＤ２０抗体に関する。１の実施態様では、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、親分子に比べて重鎖又は軽鎖可変領域において１以上のアミノ酸の置換を含む。別の実施態様では、Ｉ型及び／又はＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、操作されて、Ｆｃ領域におけるグリコシル化の変化されたパターンを有する。特定の実施態様では、改変ＡＢＭの改変されたグリコシル化は、Ｆｃ領域において高いレベルの切断複合体残基を含む。別の特定の実施態様では、改変されたＡＢＭのグリコシル化の変化は、Ｆｃ領域における低レベルのフコース残基を含む。Shitaraらの米国特許出願公開第2004/0093621号を参照のこと。当該文献の全ての内容を本明細書に援用する。別の実施態様では、Ｉ型又はＩＩ型抗-ＣＤ２０抗体は、米国特許6,737,056号又は米国特許出願公開2004 0185045号(Macrogenics)又は米国特許出願公開第2004 0132101号(Xencor)に教示されるように操作を受けたポリペプチドを有する。これらの文献の内容の全てを本明細書に援用する。本発明は、さらに、このような操作されたＩ型又はＩＩ型抗体の製造方法、並びに様々なＢ細胞傷害、例えばＢ細胞リンパ腫の治療においてこのような抗体を使用する方法に関する。
【０１４７】
キメラ及びヒト化改変ＡＢＭ
キメラマウス/ヒト化抗体が記載されてきた。例えば、Morrison, S. L.ら、PNAS 11:6851-6854 (１９８４年１１月);欧州特許公報第173494号；Boulianna, G. L,ら、Nature 312:642 (１９８４年１２月); Neubeiger, M. S.ら、Nature 314:268 (１９８５年３月); 欧州特許公報第125023号；Tanら、J Immunol. 135:8564 (1985年１１月); Sun, L. Kら、Hybridoma 5(1):517 (１９８６); Sahaganら、J. Immunol. 137:1066- 1074 (1986)を参照のこと。一般的に、Muron, Nature 312:597 (１９８４年１２月); Dickson, Genetic Engineering News 5(3) (１９８５年３月); Marx, Science 229:455 (１９８５年８月);及びMorrison, Science 229:1202-1207 (１９８５年９月)を参照のこと。PCT国際公開番号第WO/88104936号でRobinsonらは、ＣＤ２０のエピトープに特異性を有するマウス可変領域とヒト定常領域を有するキメラ抗体を記載する。Robinsonの引用文献のキメラ抗体のマウス部分は、２Ｈ７マウスモノクローナル抗体(γ２ｂ,κ)に由来する。記載されたキメラ抗体がＢ細胞障害の治療用の「刺激候補」であると引用文献が示す一方、この記載は、当該示唆がこの特定の抗体について正確であるかないかを決定する示唆として当業者にみなされることはない。なぜなら、当該引用文献は、治療有効性の判定をサポートするデータを有さないからであり、そして重要なことに、霊長類又はヒトなど高等哺乳動物を用いたデータを欠くからである。
【０１４８】
キメラ抗体を作成する方法論は、当業者に利用できる。例えば、軽鎖と重鎖は、例えば別々のプラスミド中、又は１の(例えば多シストロン性の)ベクター中の免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖を用いて、別々に発現され得る。これらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで精製され、そして完全な抗体へと組み立てられる；このような組み立てを達成する方法論は記載されてきた。例えば、Scharff, M., Harvey Lectures 69:125 (1974)を参照のこと。低減され単離された軽鎖及び重鎖からのＩｇＧ抗体の形成についてのｉｎ ｖｉｔｒｏ反応パラメーターも記載された。例えば、Searsら、Biochem. 16(9):2016-25 (1977)を参照のこと。
【０１４９】
特に好ましい実施態様では、本発明のキメラＡＢＭは、ヒト化抗体である。非ヒト化抗体をヒト化する方法は、当該技術分野に知られている。例えば、本発明のヒト化ＡＢＭは、Winterに対する米国特許第5,225,539号、Queenらに対する米国特許第6,180,370号、又はAdairらに対する米国特許第6,632,927号、Footeに対する米国特許出願公開第2003/0039649号、Satoらに対する米国特許出願公開第2004/0044187号；又はLeungらに対する米国出願公開第2005/0033028号の方法に従って調製されうる。これらの内容の全ては本明細書に援用される。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒトのソースから抗体に導入された１以上のアミノ酸を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「インポート」残基と呼ばれることが多く、当該残基は典型的に、「インポート」可変ドメインから取られる。ヒト化は、Winterと共同実験者の方法に従って、高可変領域配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実質的に行われ得る(Jonesら、Nature, 321 :522-525 (1986); Riechmannら、Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyenら、Science, 239: 1534-1536 (1988))。従って、このような「ヒト化」抗体は、無傷なヒト可変ドメインが、対応するヒト以外の種由来の対応配列により置換されたキメラ抗体である(米国特許第4,816,567号)。実際、ヒト化抗体は、典型的に幾つかの高可変領域残基、そしておそらく幾つかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体の類似の部位に由来する残基により置換される。対象ヒト化抗ＣＤ２０抗体は、ヒト免疫グロブリンの定常領域を含むであろう。
【０１５０】
ヒト化抗体を製造するのに使用される軽鎖及び重鎖両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減させるためにかなり重要である。いわゆる「ベストフィット」法に従うと、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングされる。げっ歯類の配列に最も近いヒト配列は、次にヒト化抗体についてのヒトフレームワーク領域(ＦＲ)として認められる(Simsら、J. Immunol, 151 :2296 (1993); Chothiaら、J MoI. Biol, 196:901 (1987))。ヒトフレームワーク配列を選択する別の方法は、げっ歯類全長フレームワークの個々の部分領域(つまり、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４)又は個々の部分領域の幾つかの組合せ(例えば、ＦＲ１とＦＲ２)の配列を、当該フレームワーク部分領域(例えばカバットの番号付けにより決定される)に対応する既知のヒト化片領域配列に対して比較することであり、そしてげっ歯類の配列に最も近い部分領域又は組合せについてヒト配列を選択する(２００３年２月２７日に公開されたLeungの米国特許出願公開第2003/0040606A1号)。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特有の部分配列の全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を用いる。同じフレームワークは、幾つかの異なるヒト化抗体について使用されてもよい(Carterら、Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:4285 (1992); Prestaら、J Immunol., 151 :2623 (1993)、核文献の全部の内容は、その全てを本明細書に援用される)。
【０１５１】
抗体が、抗原についての高い親和性及び他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化されるということがさらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法に従って、ヒト化抗体は、親配列とヒト化配列の３次元モデルを用いて、親配列及び様々な概念的ヒト化製品の分析方法により調製される。３次元の免疫グロブリンモデルは、当業者に周知のコンピュータープログラムを用いて作成することができる(例えば、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ、accelrys inc (かってのMSI)、又はSchwedeら、Nucleic Acids Res. 2003 (13):3381-3385により記載されるhttp://swissmodel.expasy.org/)。これらのモデルの予測により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の有望な役割の分析、つまり候補免疫グロブリンがその抗原を結合する能力に影響を与える残基の分析を可能にする。この方法では、ＦＲ残基が選択でき、そしてレシピエントと重要な配列から選択され、そして組み合わされ、その結果所望の抗体特徴、例えば標的抗原についての維持親和性などが達成される。一般的に、高可変性領域の残基は、直接、そして最も実質的に抗原結合性の影響に関与する。
【０１５２】
別の実施態様では、本発明の抗原結合分子は、例えば、Balintらに対する米国特許出願公開2004/0132066号に開示される方法に従って、操作された結合親和性を有するように操作される。この開示の内容の全てを、本明細書に援用する。
【０１５３】
好ましい実施態様では、本発明は、以下の表３及び/又は表５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明は、表２及び/又は表４に示されるヌクレオチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含む単離核酸にさらに関する。別の実施態様では、本発明は、以下の表３及び/又は５に記載されるアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離核酸に関する。本発明は、表３及び/又は表５のコンストラクトのいずれかのアミノ酸配列であって、保存的アミノ酸置換を有する配列を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離核酸を包含する。ある実施態様では、表２〜５のポリヌクレオチド又はポリペプチドのいずれかが除かれてもよい。その結果、例えば、ある実施態様では、改変ＡＢＭ、及び/又は改変ＡＢＭをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７又は配列番号３８のいずれか又は全てを含まない。別の例では、ある実施態様では、本発明の改変ＡＢＭは、配列番号５５〜６２のいずれか又は全てを含まない。
【０１５４】
別の実施態様では、本発明は、以下の表３及び/又は表５に示されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドに関する。本発明はさらに、以下の表２及び/又は表５に示されるヌクレオチド配列によりコードされる配列を含む単離ポリペプチドにさらに関する。別の実施態様では、本発明は、以下の表３及び/又は表５のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドに関する。本発明はまた、表３及び/又は表５のコンストラクトのいずれかのアミノ酸を含む単離ポリペプチドを包含し、保存アミノ酸置換を包含する。ある実施態様では、表２〜５のポリヌクレオチド又はポリペプチドのいずれかが除かれてもよい。その結果、例えばある実施態様では、ポリペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７又は配列番号３８のいずれか又は全てによりコードされるか又は一致するアミノ酸配列を含まない。別の例では、ある実施態様では、本発明の改変ＡＢＭは、配列番号５５〜６２のいずれか又は全てを含まない。
【０１５５】
【表２】
0005912090.tif 000003
【０１５６】
【表３】
0005912090.tif 000004
【０１５７】
【表４】
0005912090.tif 000005
【０１５８】
【表５】
0005912090.tif 000006
【０１５９】
【表６】
0005912090.tif 000007
【０１６０】
【表７】
0005912090.tif 000008
【０１６１】
【表８】
0005912090.tif 000009
【０１６２】
【表９】
0005912090.tif 000010
【０１６３】
【表１０】
0005912090.tif 000011
【０１６４】
【表１１】
0005912090.tif 000012
【０１６５】
別の特定の実施態様では、本発明は、図１及び表６に示される親配列に由来するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含み、そして少なくとも１の重鎖ＦＲ領域における少なくとも１のアミノ酸置換を含む単離ポリヌクレオチドに関する。別の実施態様では、本発明は、図１及び表６に示される親配列に由来するアミノ酸配列を含み、そして少なくとも１の重鎖ＦＲ領域に少なくとも１のアミノ酸置換を含む単離ポリヌクレオチドに関する。
【０１６６】
【表１２】
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【０１６７】
１の態様では、本発明の改変ＡＢＭは、親ＡＢＭに比べられたフレームワーク領域全体の置換を含むことができる。こうして、例えば、本発明はさらに、ヒト生殖細胞系列ＶＨ配列に由来する少なくとも１の重鎖を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離ポリヌクレオチドにさらに関する。好ましい実施態様では、ＦＲ１領域、つまり９〜１３カバット位におけるヒトＶＨ生殖細胞系列の配列は、以下の表７に同定される配列のいずれか１に由来する。これらの配列は、ＩＭＴＧデータ-ベースから利用でき(http://imgt.cines.fr:8104/textes/IMGTrepertoire)、そしてその受託番号により同定される各配列は、その全てを明確に本明細書に援用される。
【０１６８】
【表１３】
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【０１６９】
別の実施態様では、本発明は、以下の表８に示される配列のいずれか一つに従って、重鎖可変領域の８〜１３カバット位、又はその任意のサブセット(例えば、９〜１２カバット位、１０〜１２位など)でのアミノ酸列を含むポリペプチドをコードする配列を含む単離ポリヌクレオチドに関する。別の実施態様では、本発明は、以下の表８に示される配列の任意の１に従って、８〜１３カバット位、又はその任意のサブセット(例えば、９〜１２位、１０〜１２位など)のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドに関する：
【０１７０】
【表１４】
0005912090.tif 000015
【０１７１】
別の実施態様では、本発明は、重鎖可変領域の１０８〜１１３カバット位、又はその任意のサブセット(例えば１１０〜１１２位、１１０と１１２位など)でアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む単離ポリヌクレオチドに関する。特定の実施態様では、１０８〜１１３位での配列は、以下の表９に示される。別の実施態様では、本発明は、以下の表９に示される配列のうちのいずれか１に従って、１０８〜１１３カバット又はその任意のサブセット(例えば、１１０〜１１２位、１１０位と１１２位など)でのアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドに関する。
【０１７２】
【表１５】
0005912090.tif 000016
【０１７３】
別の実施態様では、本発明は、本発明の１以上の単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び/又は宿主細胞に関する。
【０１７４】
一般的に、培養された細胞系列の任意のタイプは、本発明のＡＢＭを発現するために使用できる。好ましい実施態様では、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３-ＥＢＮＡ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯミエローマ細胞、Ｐ３Ｘ６３マウスミエローマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は植物細胞は、本発明の操作された宿主細胞を作成するために基本細胞株として使用される。
【０１７５】
Ｆｃ領域及びＦｃ領域バリアントをさらに含む改変ＡＢＭ
１の実施態様では、本発明のＡＢＭは、重鎖Ｖ及び／又はＣＨ１領域及び／又は軽鎖Ｖ及び／又はＣ領域における１以上のアミノ酸を含む本発明のＡＢＭは、さらにヒトＦｃ領域を含みうる。具体的な実施態様では、ヒト定常領域はＩｇＧ１であり、配列番号８０及び８１に記載され、そして以下に記載される：
【化１】
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【化２】
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【０１７６】
しかしながら、ヒトＦｃ領域のバリアント及びイソ型は、本発明により包含される。例えば、本発明において使用するのに適しているバリアントＦｃ領域は、Prestaに対する米国特許第６,７３７,０５６号(１以上のアミノ酸修飾のため生じるエフェクター機能の変化を有するＦｃ領域バリアント)；又は米国特許出願第60/439,498号；第60/456,041号；第60/514,549号；又はWO 2004/063351号(１以上のアミノ酸改変のため高い結合親和性を有するバリアントＦｃ領域)；又は米国特許出願第10/672,280号又はWO 2004/099249号(アミノ酸改変のため生じるＦｃγＲへの結合の変化を有するＦｃバリアント)に教示される方法に従って製造できる。これらの各々の内容は、その全てを本明細書に援用される。
【０１７７】
本発明の別の態様では、重鎖Ｖ及び／又はＣＨ１領域及び／又は軽鎖Ｖ及び／又はＣ領域における１以上のアミノ酸置換を含むＡＢＭは、さらにＦｃ領域バリアントを含む。１以上のＦｃＲについて結合親和性を変更されたバリアントを製造するためにＦｃ領域を操作できる。例えば、米国仮特許出願第60/６７８,７７６号に記載される様に、ＦｃＲへの結合性を変化(例えば増加又は低減)させるため、Ｆｃ領域の１以上のアミノ酸残基を改変してもよい。当該出願は、その全てを本明細書に援用される。一般的に、このようなＦｃ領域バリアントを生成するために、ＦｃＲ結合に影響すると同定された１以上のＦｃ領域残基で、アミノ酸置換を作成する。好ましい実施態様では、１超〜約１０のＦｃ領域残基は、欠失されるか又は置換される。１以上のアミノ酸改変(例えば置換)を含む本明細書のＦｃ領域は、少なくとも約８０％、そして好ましくは少なくとも約９０％、及び最も好ましくは少なくとも約９５％のＦｃ領域配列又は天然配列ヒトＦｃ領域を保持するであろう。
【０１７８】
アミノ酸挿入で改変されたＦｃ領域を作成することができ、当該バリアントは改変されたエフェクター機能を有する。例えば、インパクティングＦｃＲ結合と本明細書で同定された１以上のＦｃ領域位置に隣接して少なくとも１のアミノ酸残基(例えば、１〜２のアミノ酸残基及び一般的に１０未満の残基)を誘導してもよい。隣接は、本明細書で同定されたＦｃ領域の残基の１〜2個のアミノ酸残基の範囲ないであることを意味する。このようなＦｃ領域バリアントは、高い又は低減されたＦｃＲ結合及び/又はエフェクター機能を示し得る。このような挿入バリアントを作成するために、例えば改変ＦｃＲ結合能力を示す改変Ｆｃ領域を合理的に設計するために、ＦｃＲ(例えば目的のＦｃＲの細胞外ドメイン)とアミノ酸残基が挿入されるＦｃ領域の結合領域を含むポリペプチドの共結晶構造を評価することができる(例えば、Sondermannら,Nature 406:267 (2000); Deisenhofer, Biochemistry 20 (9): 2361-230 (1981); 及びBurmeisterら、Nature 3442: 379-383, (1994)、これらの全ては本明細書に援用される)。
【０１７９】
適切なアミノ酸配列の改変を親Ｆｃ領域に導入することにより、(ａ)より効果的に又は効果的でなくヒト効果細胞の存在下で１以上のエフェクター機能を媒介し、及び/又は(ｂ)Ｆｃγ受容体(ＦｃγＲ)又はＦｃ新生児受容体(ＦｃＲｎ)に、親ポリペプチドよりも優れた親和性で結合するバリアントＦｃ領域を生成できる。このような改変Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域における一般的に少なくとも１のアミノ酸改変を含む。
【０１８０】
好ましい実施態様では、親ポリペプチドＦｃ領域は、ヒトＦｃ領域であり、例えば天然ヒトＦｃ領域ヒトＩｇＧ１(Ａ及び非Ａアロタイプ)、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、及び任意の種のＦｃ領域から発見され又は知られている全てのアロタイプである。このような領域は、米国仮特許出願第60/678776号に開示される配列などの配列を有する。当該開示はその全てを援用される。
【０１８１】
特定の実施態様では、重鎖のＶ及び/又はＣＨ１領域及び/又は軽鎖のＶ及び/又はＣ領域における１以上のアミノ酸を含み、そして改善されたエフェクター機能(例えば、ＡＤＣＣ)を有する改変Ｆｃ領域をさらに含むＡＢＭを作成するために、親ポリペプチドは、好ましくは、予め存在しているＡＤＣＣ活性(例えば、親ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇｇ３のＦｃ領域を含む）を有する。幾つかの実施態様では、改善されたＡＤＣＣを有する改変Ｆｃ領域は、天然配列ＩｇＧ１又はＩｇＧ３のＦｃ領域を有する抗体よりも実質的により効率的にＡＤＣＣを媒介する。
【０１８２】
特定の実施態様では、アミノ酸改変(単数又は複数)は、親Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインに導入される。
【０１８３】
改変Ｆｃ領域を有する本発明のポリペプチドは、所望されるか又は意図されるポリペプチドの用途に依存して、１以上の更なる改変にかけられてもよい。このような改変は、例えば、アミノ酸配列の更なる変更(アミノ酸残基の置換、挿入及び/又は欠失)、異種ポリペプチド(単数又は複数)への融合、及び/又は共有結合修飾を含みうる。このようなさらなる改変は、Ｆｃ受容体結合及び/又はエフェクター機能の変化をもたらす上で開示されたアミノ酸改変の前、同時、又は後で行われてもよい。
【０１８４】
或いは又はさらに、アミノ酸改変を、Ｆｃ領域のＣｌｑ結合性及び/又は補体依存性細胞傷害性機能を変更する１以上のさらなるアミノ酸改変と組み合わせることが有用でありうる。この点で本明細書中の特に関心のある開始ポリペプチドが、Ｃｌｑに結合し、そして補体依存性細胞傷害性(ＣＤＣ)を示するポリペプチドである。本明細書に記載されるアミノ酸置換は、Ｃｌｑに結合する開始ポリペプチドの能力を変化させ、及び/又はその補体依存性細胞傷害性の機能を改変するのに役立ちうる(例えば、これらのエフェクター機能を低減し、そして好ましくは損なわせる)。しかしながら、記載された位置の１以上で置換を含むポリペプチドであって、改善されたＣｌｑ結合性及び/又は補体依存性細胞傷害性(ＣＤＣ)機能を有するポリペプチドが本明細書に考慮される。例えば、開始ポリペプチドは、Ｃｌｑを結合できず、及び/又はＣＤＣを媒介できなくてもよく、そして本明細書の技術に従って、これらのさらなるエフェクター機能を獲得するように改変されてもよい。さらに、予め存在しているＣｌｑ結合活性を有し、場合によりさらにＣＤＣを媒介する能力を有するポリペプチドが改変されて、その結果１又は両方のこれらの活性が高められうる。Ｃｌｑを改変し及び/又はその補体依存性細胞障害性機能を調節するアミノ酸改変は、例えばWO00/42072に記載され、当該開示は本明細書に援用される。
【０１８５】
上に開示されるように、Ｃｌｑ結合性及び/又はＦｃＲ結合性を改変し、そしてそれによりＣＤＣ活性及び/又はＡＤＣＣ活性を変化させることによって、エフェクター機能を変化させるＦｃ領域又はその部分を設計できる。例えば、改善されたＣｌｑ結合性及び改善されたＦｃγＲＩＩＩ結合性を有する改変されたＦｃ領域を作成することができる(例えば、改変されたＡＤＣＣ活性と改善されたＣＤＣ活性の両方を有する)。或いは、エフェクター機能が低減又は損なわされることが望まれる場合、低いＣＤＣ活性及び/又は低いＡＤＣＣ活性を有する改変Ｆｃ領域を操作し得る。別の実施態様では、これらの活性のうちの１のみを増加してもよいし、そして場合により、例えば改善されたＡＤＣＣ活性を有するが、低減されたＣＤＣ活性を有するか、その逆の活性を有する改変Ｆｃ領域を作成するために、他の活性を場合により低減してもよい。
【０１８６】
別のタイプのアミノ酸置換は、ポリペプチドのグリコシル化パターンを変化するのに役立ちうる。これは、ポリペプチドにおいて見られる１以上の糖鎖部分を欠失させ、及び／又はポリペプチドにおいて見られる１以上のグリコシル部位を加えることにより達成されうる。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的に、Ｎ結合又はＯ結合される。Ｎ-結合は、アスパラギン残基の側鎖に糖鎖部分を取り付けることを指す。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここでＸはプロリン以外の任意のアミノ酸である)のペプチド配列は、糖鎖部分をアスパラギン側鎖へと酵素的に結合する認識配列である。こうして、ポリペプチドにおけるこれらのペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作成する。Ｏ結合グリコシル化は、Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースのうちの１を、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンへと結合することを指すが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンが使用されてもよい。
【０１８７】
幾つかの実施態様では、本発明は、Ｆｃ領域を有する親ポリペプチドの改変を含む組成物を提供する。ここで、改変されたＦｃ領域は、少なくとも１の表面アミノ酸残基の改変を含む(例えば、Deisenhofer, Biochemistry, 28;20(9):2361-70, 1981年4月、及びWO00/42072、両文献は本明細書に援用される)。他の実施態様では、本発明は、Ｆｃ領域を有する親ポリペプチドの改変を含む組成物であって、改変されたＦｃ領域が少なくとも１の非表面残基のアミノ酸改変を含む、上記組成物を提供する。さらなる実施態様では、本発明は、Ｆｃ領域を有する親ポリペプチドバリアントであって、当該バリアントが少なくとも１の表面アミノ酸改変及び少なくとも１の非表面アミノ酸改変を含む、バリアントを含む。
【０１８８】
本発明の改変ＡＢＭの治療効力は、さらに、少なくとも１の糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼの改変された発現を有するように糖鎖操作された宿主細胞において、当該改変ＡＢＭを産生することによりさらに高めることができる。１の実施態様では、糖鎖操作された宿主細胞は、さらに、１以上の以下の：ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポロペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はＧａｌＴ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのうちの１以上をさらに発現する。好ましい実施態様では、宿主細胞は、ＧｎＴＩＩＩ活性又はＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する。別の好ましい実施態様では、宿主細胞は、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現し、並びにＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する。さらに別の好ましい好ましい実施態様では、ＧｎｔＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、ゴルジ内在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドである。別の好ましい実施態様では、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する宿主細胞における本発明の改変ＡＢＭの発現は、高いＦｃ受容体結合親和性及び高いエフェクター機能を有する改変ＡＢＭをもたらす。従って１の実施態様では、本発明は、(ａ)ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離核酸；及び(ｂ)本発明のＡＢＭをコードする単離ポリヌクレオチド、例えばヒトＣＤ２０に結合するキメラ、霊長類化、又はヒト化抗体などの本発明のＡＢＭをコードする単離ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。好ましい実施態様では、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、ＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインを含む融合ポリペプチドであり、そしてゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩの局在化ドメインである。このような融合ポリペプチドを作成する方法、及び高いエフェクター機能を有する抗体を製造するためにそれらを使用する方法は、米国仮特許出願第60/495,142号及び米国特許出願公開第2004/0241817号に開示される。両文献の内容の全てを本明細書に援用する。別の好ましい実施態様では、キメラＡＢＭは、キメラ抗体又はマウスＢ-Ｌｙ１抗体の結合特異性を有するその断片である。特に好ましい実施態様では、キメラ抗体は、ヒトＦｃを含む。別の好ましい実施態様では、抗体は霊長類化又はヒト化されている。
【０１８９】
１の実施態様では、本発明のＡＢＭをコードする１又は幾つかのポリヌクレオチドは、構成的プロモーター、或いは制御発現システムの制御下で発現されうる。適切な制御発現システムとして、非限定的に、テトラサイクリン-制御発現システム、エクジソン誘導性発現システム、ｌａｃスウィッチ発現システム、グルココルチコイド誘導性発現システム、温度誘導性プロモーターシステム、及びメタロチオネイン金属誘導性発現システムが挙げられる。本発明のＡＢＭをコードする幾つかの異なる核酸が宿主細胞系に含まれる場合、その幾つかは構成的プロモーターの制御下で発現され、その一方、残りは、制御プロモーターの制御下で発現される。最大発現レベルは、細胞成長割合に有意に有害な効果を有さないポリペプチドの安定発現の最も高い可能なレベルであると考えられ、そして通常の実験を用いて決定されよう。発現レベルは、ＡＢＭに特異的な抗体又はＡＢＭに融合されたペプチドタグに特異的な抗体を用いたウエスタンブロット分析；及びノーザンブロット分析を含む一般的に当業者に知られている方法により決定される。さらに別の方法で、ポリヌクレオチドは、受容体遺伝子に作用可能なように結合されてもよく；親抗体と実質的に同じ結合特異性を有する改変ＡＢＭの発現レベルは、レポーター遺伝子の発現レベルと相関するシグナルを計測することにより測定される。レポーター遺伝子は、１のｍＲＮＡとして当該融合ポリペプチドをコードする核酸と一緒に転写され；そのそれぞれのコード配列は、内部リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)又はキャップ非依存的翻訳エンハンサー(ＣＩＴＥ)に結合されていてもよい。レポーター遺伝子は、１のポリペプチド鎖が形成されるように、親抗体と実質的に同じ結合特異性を有する改変ＡＢＭをコードする少なくとも１の核酸と一緒に翻訳されてもよい。本発明のＡＢＭをコードする核酸は、１のプロモーターの制御下でレポーター遺伝子に作用可能なように結合されてもよく、その結果融合ポリペプチドをコードする核酸及びレポーター遺伝子は、ＲＮＡ分子へと転写され、当該分子は或いは２個の異なるメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)分子へとスプライシングされる；得られたｍＲＮＡのうちの１は、当該レポータータンパク質へと翻訳され、そしてもう一方は当該融合ポリペプチドへと翻訳される。
【０１９０】
改変ＡＢＭの発現
当業者に周知である方法が、適切な転写/翻訳制御シグナルにそって親抗体と実質的に同じ結合特異性を有する改変ＡＢＭのコード配列を含む発現ベクターを構築するために使用できる。これらの方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏ組換え/遺伝子組み替えが挙げられる。例えば、Maniatisら、MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (1989)及びAusubelら、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)を参照のこと。
【０１９１】
様々な宿主発現ベクターシステムが、本発明のＡＢＭのコード配列を発現するために利用できる。好ましくは、哺乳動物細胞は、目的のタンパク質のコード配列及び融合ポリペプチドのコード配列を含む組換えプラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターでトランスフェクションされた宿主細胞システムとして使用される。最も好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３-ＥＢＮＡ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯミエローマ細胞、Ｐ３Ｘ６３マウスミエローマ細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ.Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、他の哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞が、宿主細胞システムとして用いられる。発現システムと選別方法の幾つかの例が、以下の引用文献：Borth ら、Biotechnol. Bioen. 71(4):266-73 (2000-2001)、Wernerら、Arzneimittelforschung/Drug Res. 48(8):870-80 (1998)、 Andersen及びKrummen, Curr. Op. Biotechnol. 13:117-123 (2002)、Chadd及びChamow, Curr. Op. Biotechnol. 12:188-194 (2001)、並びにGiddings, Curr. Op. Biotechnol. 12: 450-454 (2001) 、及びその中の引用文献に記載されている。代わりの実施態様では、他の真核宿主細胞系が意図されてもよく、例えば本発明のＡＢＭのコード配列をコードする組換え酵母発現ベクター、例えば米国特許出願60/344,169号及びWO03/０５６９１４号(非ヒト真核宿主細胞におけるヒト様糖タンパク質を産生する方法)(両文献の内容はその全てを本明細書に援用する)で形質転換された酵母細胞、親抗体と同じ結合特異性実質的に有する改変ＡＢＭのコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)で感染された昆虫細胞系；本発明のＡＢＭのコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ)で感染されるか、又は組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Ｔｉプラスミド)で感染された植物細胞系；米国特許第6,815,184号(遺伝子操作された浮き草から、生物的に活性なポリペプチドを発現させ、そして分泌させる方法)；WO2004/057002号(コケのプロトプラストで細胞外非植物タンパク質を生成する方法)；及び米国特許出願第60/365,769号、第60/368,047号、及びWO 2003/078614号(機能的哺乳動物ＧｎＴＩＩＩ酵素を発現する遺伝子操作植物において発現する糖タンパク質)(両文献の内容はその全てを本明細書に援用される)に教示される発現システム；又は、例えば安定的に増幅されるか(ＣＨＯ/ｄｈｆｒ)又は微小染色体対(double minute chromosome(例えば、マウス細胞株)で不安定に増幅される親抗体と実質的に同じ特異性を有する改変ＡＢＭをコードするＤＮＡの複数のコピーを含むように操作された細胞株を含む組換えウイルス発現ベクターで感染された動物細胞システム(例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス)が挙げられる。１の実施態様では、本発明のＡＢＭをコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、多シストロン性である。また、１の実施態様では、上で記載されたＡＢＭは、抗体又はその断片である。好ましい実施態様では、ＡＢＭはヒト化抗体である。
【０１９２】
本発明の方法では、安定な発現は、一般的に一過的な発現より好ましい。なぜなら、安定な発現は、一般的により再現性のある結果を達成し、そしてまた、大規模生産に適しているからである。 複製のウイルス起源を含む発現ベクターを用いるよりはむしろ、宿主細胞は、適切な発現制御エレメントにより制御されるそれぞれのコード核酸(例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネ-ター、ポリアデニル化部位など)及び選択可能なマーカーで形質転換されうる。外来ＤＮＡの導入の後に、操作された細胞は、濃縮培地中で１〜２日間増殖させ、そして次に選択培地に切り替えられる。組換えプラスミドにおける選択可能なマーカーは、選別に対する抵抗性を与え、そして当該プラスミドを安定的に染色体に組みこみ、そしてクローン化されて細胞株にまで増殖できる細胞塊を形成するように増殖する細胞の選別を可能にする。
【０１９３】
多くの選別システムが使用されてもよい。非限定的に、ヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら、Cell 11:223(1977))、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska ＆ Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962))、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら、Cell 22:817 (1980))遺伝子が含まれる。これらは、それぞれ、ｔｋ-、ｈｇｐｒｔ-、又はａｐｒｔ-細胞で使用されうる。また、抗代謝抵抗性は、メトトレキサートに対する抵抗性を与えるｄｈｆｒ(Wiglerら、Natl Acad. Sci. USA 77:3567 (1989); O'Ηareら, Proc. Natl Acad. Sci USA 78: 1527 (1981));ミコフェノール酸に対する抵抗性を与えるｇｐｔ(Mulligan & Berg, Proc. Natl Acad. Sci USA 78:2072 (1981))；アミノグリコシドＧ-４１８に対する抵抗性を与えるｎｅｏ(Colberre-Garapinら、J. Mol Biol 150:1 (1981)); 及びハイグロマイシンに対する抵抗性を与えるｈｙｇｒｏ(Santerreら、Gene 30:147 (1984)遺伝子を選別に基いて、抗代謝抵抗性を使用できる。近年、さらに選択可能な遺伝子、つまり、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ；ヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤ(Hartman & Mulligan, Proc. Natl Acad. Sci USA S5:8047 (1988)); グルタミン合成系；及びオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である２-(ジフルオロメチル)-ＤＬ-オルチニン(ＤＭＦＯ)に対する抵抗性を与えるＯＤＣ(オルニチン・デカルボキシラーゼ)(McConlogue、Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory編. (1987))が記載された。
【０１９４】
改変されたグリコシル化を有するＦｃ領域を含む改変ＡＢＭの発現
別の態様では、本発明はさらに、少なくとも１のアミノ酸置換をＶ又はＣＨ１領域に含む改変されたＡＢＭのグリコシル化プロファイルを改変する方法であって、本発明の改変ＡＢＭをコードする核酸及びＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、又はこのような核酸を含むベクターを宿主細胞中で発現させることを含む、前記方法にさらに関する。好ましくは、改変されたポリペプチドは、ＩｇＧ又はＦｃ領域を含むその断片である。特に好ましい実施態様では、ＡＢＭはヒト化抗体又はその断片である。別の実施態様では、宿主細胞は、本発明のＡＢＭ、ＧｎＴＩＩＩ及びマンノシダーゼＩＩ(ＭａｎＩＩ)を共発現するように操作される。
【０１９５】
本発明の宿主細胞により産生される改変ＡＢＭは、改変の結果としてＦｃ受容体結合親和性の増加及び／又はエフェクター機能の増加を示す。特に好ましい実施態様では、改変ＡＢＭはヒト化抗体であるか、又はＦｃ領域を含むその断片である。好ましくは、Ｆｃ受容体結合親和性の増加は、Ｆｃγ活性化受容体、例えばＦＣγＲＩＩＩa受容体に対する結合性の増加である。エフェクター機能の増加は、好ましくは以下の：抗体依存性細胞傷害性の増加、抗体依存性細胞貪食(ＡＤＣＰ)の増加、サイトカイン分泌の増加、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの増加、Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増加、ＮＫ細胞への結合性の増加、マクロファージへの結合性の増加、多角細胞(ＰＭＮ)への結合性の増加、単核細胞への結合性の増加、標的結合された抗体の架橋の増加、直接的なシグナル誘導性アポトーシスの増加、受容細胞成熟の増加、及びＴ細胞刺激による取り込みの増加のうちの１以上の増加である。
【０１９６】
エフェクター機能は、当業者に知られている様々なアッセイにより計測できるし及び／又は測定できる。Ｆｃ受容体結合親和性及び補体依存性細胞傷害性を含むエフェクター機能の様々なアッセイは、米国特許出願第2004/0241817A１号に記載される。当該文献はその全てを援用により包含される。サイトカインの分泌は、例えば、サンドウィッチＥＬＩＳＡ、例えば、McRaeら、J. Immunol. 164: 23-28 (2000)を参照のこと、及びサイトカインサンドウィッチＥＬＩＳＡ、プロトコル(www.bdbiosciences.com/pharmingen/protocols、又はTakahashiら、British J. Pharmacol. 137: 315-322 (2002)に記載される方法を用いて計測できる。上記両文献はその全てを本明細書に援用される。例えば、樹状細胞成熟は、Kalergis and Ravetch, J. Exp. Med. 195: 1653-59 (2002)に記載されるアッセイを用いて計測できる。当該文献はその全てを本明細書に援用される。貪食及び抗原取り込み／提示アッセイの例は、Greshamら、J. Exp. Med. 191: 515-28 (2000); Kraussら、 J. Immunol 153: 1769-77 (1994); wX Rafiq et al, J. Clin. Invest. 110: 71-79 (2002)、及びHamanoら、J. Immunol. 164: 6113-19 (2000)により提供される。これらの各々は、その全てを本明細書に援用される。細胞表面受容体の下方制御は、例えば、Liaoら、Blood83: 2294-2304(1994)に記載される方法により計測できる。当該文献はその全てを本明細書に記載される。一般的な方法、プロトコル及びアッセイは、CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK, Celis, J.E.編(第2版、1998)にみることができる。当該文献はその全てを援用される。本発明について使用するために上記方法、プロトコル、及びアッセイを適用することは当業者の技術の範囲内である。
【０１９７】
本発明は、宿主細胞で、改変されたオリゴ糖を有する本発明のＡＢＭを生産する方法であって、(ａ)本発明に記載されるＡＢＭの生産を許容する条件下でＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１の核酸を発現するように操作された宿主細胞を培養し、ここでＧｎＴＩＩＩ活性を有する当該ポリペプチドが、当該宿主細胞により産生される当該ＡＢＭのＦｃ領域においてオリゴ糖を改変するために十分な量で発現され；そして(ｂ)当該ＡＢＭを単離する、を含む方法に関する。好ましい実施態様では、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、ＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインを含む融合ポリペプチドである。特に好ましい実施態様では、融合ポリペプチドは、ゴルジ内在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインをさらに含む。
【０１９８】
好ましくは、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩ又はＧｎＴＩの局在化ドメインである。或いは、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩの局在化ドメイン、ＧｎＴＩＩの局在化ドメイン、及びα１-６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインからなる群から選ばれる。本発明の方法により産生されるＡＢＭは、Ｆｃ受容体結合親和性の増加及び／又はエフェクター機能の増加を有する。好ましくは、エフェクター機能の増加は、以下の：Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増加(抗体依存性細胞傷害性の増加を含む)、抗体依存性細胞貪食(ＡＤＣＰ)の増加、サイトカイン分泌の増加、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの増加、ＮＫ細胞への結合性の増加、マクロファージへの結合性の増加、単球への結合性の増加、多角細胞への結合性の増加、直接的なシグナル誘導性アポトーシスの増加、標的結合性抗体の架橋の増加、樹状細胞突然変異の増加、又はＴ細胞刺激の増加のうちの１以上である。Ｆｃ受容体結合親和性の増加は、好ましくはＦｃ活性化受容体、例えばＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加である。特に好ましい実施態様では、ＡＢＭは、ヒト化抗体であるか又はその断片である。
【０１９９】
別の実施態様では、本発明は、本発明の方法により製造された親抗体と実質的に同じ特異性を有する改変ＡＢＭであって、当該ポリペプチドのＦｃ領域における切断されたオリゴ糖の割合の増加を有するＡＢＭに関する。このようなＡＢＭが、抗体及びＦｃ領域を含むその断片を包含することが意図される。好ましい実施態様では、ＡＢＭはヒト化抗体である。１の実施態様では、ＡＢＭのＦｃ領域における切断されたオリゴ糖の割合は、全オリゴ糖の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９０〜９５％である。さらに別の実施態様では、本発明の方法により生成されるＡＢＭは、本発明の方法により、オリゴ糖の改変の結果として、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合の増加を有する。１の実施態様では、非フコシル化オリゴ糖の割合は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０〜７０％、最も好ましくは少なくとも７５％である。非フコシル化オリゴ糖は、ハイブリッド又は複合体タイプのオリゴ糖であってもよい。特に好ましい実施態様では、宿主細胞により、そして本発明の方法により産生されるＡＢＭは、Ｆｃ領域において切断された高い割合の非フコシル化オリゴ糖を有する。切断された非フコシル化オリゴ糖は、ハイブリッド又は複合体のいずれかであってもよい。具体的に、本発明の方法は、ＡＢＭのＦｃ領域におけるオリゴ糖の少なくとも１５％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３５％が切断されたハイブリッド型の非フコシル化オリゴ糖である。
【０２００】
別の実施態様では、本発明は、高いエフェクター機能及び／又は高いＦｃ受容体結合親和性を有するように操作され、本発明の方法により生成される親抗体と実質的に同じ結合特異性を有する改変ＡＢＭに関する。好ましくは、エフェクター機能の増加は、以下の：Ｆｃ-媒介性細胞傷害性の増加(抗体依存性細胞傷害性の増加を含む)、抗体依存性細胞貪食(ＡＤＣＰ)の増加、サイトカイン分泌の増加、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの増加、ＮＫ細胞への結合性の増加、マクロファージへの結合性の増加、単球への結合性の増加、多角細胞への結合性の増加、直接的なシグナル誘導性アポトーシスの増加、標的結合性抗体の架橋の増加、樹状細胞突然変異の増加、又はＴ細胞刺激の増加のうちの１以上である。好ましい実施態様では、Ｆｃ受容体結合親和性の増加は、Ｆｃ活性化受容体、最も好ましくはＦｃγＲＩＩＩａへの結合性の増加である。１の実施態様では、改変ＡＢＭは、抗体、Ｆｃ領域を含む抗体断片、又は、免疫グロブリンのＦｃ領域に等しい領域を含む融合タンパク質である。特に好ましい実施態様では、ＡＢＭはヒト化抗体である。
【０２０１】
改変ＡＢＭを含む医薬組成物
本発明は、さらに本発明の改変ＡＢＭ及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【０２０２】
任意の慣用される担体物質が利用できる。担体物質は、経腸、経皮又は非経口投与に適した有機又は無機担体でありうる。適切な担体としては、水、ゼラチン、アラビアゴム、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ポリアルキレン・グリコール、ワセリンなどが挙げられる。さらに、医薬製剤は、他の医薬として活性な薬剤を含んでもよい。さらなる添加物、例えば香味剤、安定剤、乳濁剤、緩衝剤などは医薬剤形の許容される慣用に従って加えられてもよい。
【０２０３】
「医薬として許容される」というフレーズは、本明細書に使用されて、医薬基準の範囲内であり、そしてヒト及び動物に接触して使用するのに適しており、過剰な毒性、炎症性、アレルギー応答、又は他の問題又は合併症を伴わず、合理的な利得／危険性の比で均衡したものである。
【０２０４】
本発明はさらに、癌の治療又は予防において使用するためのこのような医薬組成物にさらに関する。本発明は、治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む癌の治療又は予防法に関する。
【０２０５】
好ましくは、癌は、乳癌、膀胱癌、頭部及び頸部癌、皮膚癌、膵臓癌、歯胃癌、卵巣癌、大腸癌、前立腺癌、腎臓癌、及び脳癌からなる群から選ばれる。
【０２０６】
本発明はさらに、前癌症状又は前癌病変の治療又は予防における使用のためのこのような医薬組成物にさらに関する。本発明は、前癌症状又は前癌病変の治療又は予防のための方法であって、治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む方法にさらに関する。
【０２０７】
好ましくは、前癌症状又は前癌病変は、口腔白板症、日光角化症 (日光性角化症)、結腸又は直腸の前癌性ポリープ、胃の上皮性異形成、腺腫性異形成、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌(ＨＮＰＣＣ)、バレット食道、膀胱異形成、及び前癌性頚部症状からなる群から選ばれる。
【０２０８】
本発明は、Ｆｃ受容体結合親和性の増加、好ましくはＦｃ活性化受容体への結合性の増加を有するか、及び／又はエフェクター機能の増加、例えば抗体依存性細胞傷害性の増加を有する本発明の改変ＡＢＭの糖型の生産のための宿主細胞システムの生成及び使用のための方法を提供する。本発明の改変ＡＢＭで使用され得る糖鎖操作方法論は、かなり詳細に米国特許第6,602,684号及び米国仮特許出願第60/441,307号及びWO 2004/065540号に記載され、これらの内容の全ては、その全てを援用される。本発明の改変ＡＢＭは、EP 1 176 195 A1に開示される技術に従ってＦｃ領域に低減されたフコース残基を有するように糖鎖操作されうる。当該文献は、その全てを本明細書に援用される。
【０２０９】
グリコシル化パターンの変化を伴った改変Ａｂｍの生産のための細胞株の樹立
本発明は、改変されたグリコシル化パターンを有する本発明の改変ＡＢＭの生成のための宿主細胞発現システムを提供する。具体的には、本発明は、改善された治療価値を有する本発明の改変ＡＢＭの糖型を生成するための宿主細胞システムを提供する。その結果、本発明は、選択又は操作されて、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドを発現する宿主細胞発現を提供する。１の実施態様では、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、異種のゴルジ内在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドである。具体的に、このような宿主細胞発現システムは、構成又は制御プロモーターシステムに作用可能なように結合されたＧｎＴＩＩＩを有するポリペプチドをコードする組換え核酸分子を含むように操作されてもよい。
【０２１０】
１の特定の実施態様では、本発明は、ＧｎＴＩＩＩ活性を有し、そして異種ゴルジ内在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも１の核酸を発現するように操作された宿主細胞を提供する。１の態様では、宿主細胞は、ＧｎＴＩＩＩ活性を有しかつ異種ゴルジ残基ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む核酸分子で操作される。
【０２１１】
一般的に、上で記載される細胞株を含む任意のタイプの培養細胞株は、本発明の宿主細胞株を操作するための基礎として使用できる。好ましい実施態様では、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯミエローマ細胞、Ｐ３Ｘ６３マウスミエローマ細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ.Ｃ６細胞、又はハイブリドーマ細胞、他の哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は植物細胞が、本発明の操作された宿主細胞を樹立するための基礎細胞として使用される。
【０２１２】
本発明は、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドを発現する任意の操作された宿主細胞であって、本明細書に定義される異種ゴルジ内在性ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドを含む上記細胞を包含することが意図される。
【０２１３】
ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする１又は幾つかの核酸は、構成的プロモーター又は或いは制御発現システムの制御の元で発現されてもよい。このようなシステムは、当該技術分野に周知であり、そして上で議論されたシステムを含む。ＧｎＴＩＩＩ活性を有し、かつ異種のゴルジ内在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする幾つかの異なる核酸が宿主細胞系のなかに含まれたならば、これらの幾つかは、構成的プロモーターの制御下で発現されてもよく、一方その他のものは、関連プロモーターの制御下で発現される。ＧｎＴＩＩＩ活性を有する融合ポリペプチドの発現レベルは、一般的に当該技術分野において知られている方法、例えばウエスタンブロット分析、ノーザンブロット分析、レポーター遺伝子発現分析、又はＧｎＴＩＩＩ活性の計測により決定される。或いは、ＧｎＴＩＩＩの生合成産物に結合するレクチン、例えばＥ4-ＰＨＡレクチンが使用されてもよい。或いは、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする核酸で操作された細胞により産生される抗体により媒介されるエフェクター機能の増加又はＦｃ受容体結合性の増加を計測する機能的アッセイが使用されてもよい。
【０２１４】
改変されたグリコシル化パターンを有するタンパク質を発現するトランスフェクタント又は形質転換体の同定
本発明の改変ＡＢＭのコード配列を含み、かつ生物学的に活性な遺伝子産物を発現する宿主細胞は、少なくとも４個の一般的アプローチ：(ａ)ＤＮＡ-ＤＮＡ又はＤＮＡ-ＲＮＡハイブリダイゼーション；(ｂ)マーカー遺伝子機能の有無；(ｃ)宿主細胞においてそれぞれのｍＲＮＡ転写物の発現により計測される転写レベルの評価；そして(ｄ)免疫アッセイにより又は生物学的活性により計測される遺伝子産物の検出、により同定されてもよい。
【０２１５】
第５アプローチでは、本発明の改変ＡＢＭのコード配列及びＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドのコード配列の存在は、それぞれのコード配列に相同であるヌクレオチド配列、又はそれらの一部又は誘導体を含むプローブを用いて、ＤＮＡ-ＤＮＡ又はＤＮＡ-ＲＮＡハイブリダイゼーションにより検出できる。
【０２１６】
第二アプローチでは、組換え発現ベクター／宿主システムは、特定の「マーカー」遺伝子機能(例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、メトトレキサート耐性、トランスフォーメーション表現系、バキュロウイルスにおける封入体形成など)の有無に基いて同定され、そして選択され得る。例えば、本発明の改変ＡＢＭ又はその断片、及びＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドのコード配列がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、それぞれのコード配列を含む組換え体は、マーカー遺伝子機能が存在しないことにより同定され得る。或いは、マーカー遺伝子は、コード配列の発現を制御するために使用される同じ又は異なるプロモーターの制御下で、コード配列とタンデムに配置され得る。誘導又は選別に応答するマーカーの発現は、本発明の改変ＡＢＭ及びＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドのコード配列の発現を指す。
【０２１７】
第三のアプローチでは、本発明の改変ＡＢＭのコード領域又はその断片、並びにＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドのコード配列の転写活性は、ハイブリダイゼーションアッセイにより評価されうる。例えば、ＲＮＡは、本発明の改変ＡＢＭのコード配列又はその断片、並びにＧｎＴＩＩＩ活性又はその具体的部分を有するポリペプチドのコード配列に相同であるプローブを用いてノーザンブロットにより同定及び分析され得る。或いは、宿主細胞の全核酸は抽出され、そしてこのようなプローブに対するハイブリダイゼーションについてアッセイされ得る。
【０２１８】
第４のアプローチにおいて、タンパク質産物の発現は、例えばウエスタンブロット、放射性免疫沈澱などの免疫アッセイ、酵素結合免疫アッセイなどにより免疫学的に評価することができる。しかしながら、発現システムが成功したことについての最終試験は、生物学的に活性な遺伝子産物を検出することに関する。
【０２１９】
抗体依存性細胞傷害性を含むエフェクター機能の増加を有する改変ＡＢＭの生成及び使用
好ましい実施態様では、本発明は、マウスＢ-Ｌｙ１抗体と実質的に同じ結合特異性を有し、そして抗体依存性細胞傷害性を含むエフェクター機能の増加を有するキメラ改変ＡＢＭの糖型を提供する。抗体のグリコシル化の操作は、以前に記載された。例えば、米国特許６,６０２,６８４号を参照のこと。当該特許はその全てを本明細書に援用される。
【０２２０】
幾つかのタイプの癌の治療のための未結合(unconjugated)モノクローナル抗体(ｍＡｂ)の臨床試験は、最近、有望な結果をもたらした(Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223-25 (1997); Deoら, Immunology Today 18:127 (1997))。キメラ未結合ＩｇＧ１は、低悪性度又は濾胞性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫に承認された(Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223-25 (1997)。一方、別の未結合ｍＡｂ、固形 乳腫瘍を標的とするヒト化ＩｇＧ１は、フェーズＩＩＩの臨床試験において有望な結果を示した(Deoら、Immunology Today 18:127 (1997))。これらの２個のｍＡｂの抗原は、それぞれの腫瘍細胞において高度に発現されており、そして抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて効果細胞による強力な腫瘍崩壊を媒介する。対照的に、優れた腫瘍特異性を有する多くのほかの未結合ｍＡｂは、臨床的に有用である十分な効力のエフェクター機能を発揮することができない(Frostら、Cancer 80:317-33 (1997); Surfusら, J. Immunother. 19:184-91 (1996))。これらの弱いｍＡｂの幾つかについて、サイトカインの付加治療が現在試験されている。サイトカインの添加は、循環するリンパ球の活性及び数を増加させることにより、抗体依存性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)を刺激する事ができる(Frostら、 Cancer 80:317-33 (1997); Surfusら、J. Immunother. 19:184-91 (1996))。ＡＤＣＣ、つまり抗体に標的化された細胞における溶解性の攻撃、は、抗体の定常領域(Ｆｃ)への白血球受容体の結合の際に引き起こされる(Deoら、Immunology Today 18: 127 (1997))。
【０２２１】
未結合ＩｇＧ１のＡＤＣＣ活性を増加させる異なるが補完的なアプローチは、抗体のＦｃ領域を操作することである。タンパク質操作研究により、ＦｃＲがＩｇＧ ＣＨ２ドメインの低ヒンジ領域と相互作用することが示された(Ｌｕｎｄら、J. Immunol. 157:4963-69 (1996))。しかしながら、ＦｃγＲ結合はまた、ＣＨ２領域の保存Ａｓｎ２９７に共有結合されるオリゴ糖の存在を必要とし(Lundら、J. Immunol 157:4963- 69 (1996); Wright and Morrison, Trends Biotech. 15:26-31 (1997))、オリゴ糖及びポリペプチドの両方が直接的に相互作用部位に直接寄与すること、或いは、オリゴ糖が活性なＣＨ２ポリペプチド立体配置を維持するために必要とされるということを示唆する。オリゴ糖構造の改変は、相互作用の親和性を増加させる手段として調べられうる。
【０２２２】
ＩｇＧ分子は、各重鎖において２個のＮ結合オリゴ糖をそのＦｃ領域に有する。任意の糖タンパク質として、抗体は、同じポリペプチド骨格を共有するが、当該グリコシル化部位に結合された異なるオリゴ糖を有する糖型の集合として生産される。血清ＩｇＧのＦｃ領域において見られるオリゴ糖は、二分岐タイプの複合体であり(Wormaldら、Biochemistry 5(5:130-38 (1997))、低レベルの末端シアル酸及びバイセクティングＮ-アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)、並びに様々な程度で末端ガラクトシル化及びコアフコシル化されている。幾つかの試験により、ＦｃγＲ結合について必要とされる最小の糖鎖構造が、オリゴ糖中心内に存在することが示唆される(Lundら、 J. Immunol. 757:4963-69 (1996))。
【０２２３】
治療用未結合ｍＡｂの生産に工業的及び学術的に用いられるマウス又はハムスター由来の細胞株は、通常必要とされるオリゴ糖決定因子(oligosaccharide determinants)をＦｃ部位に取り付ける。しかしながら、これらの細胞株において発現されるＩｇＧは、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを欠き、血清ＩｇＧ中において低量しかみられない(Lifelyら, Glycobiology 375:813-22 (1995))。対照的に、ラットミエローマにより産生され、ヒト化されたＩｇＧ１(ＣＡＭＰＡＴＨ-１Ｈ)は、その糖型の幾つかにおいてバイセクティングＧｌｃＮａｃを有する(Lifelyら, Glycobiology 375:813-22 (1995))。ラット細胞由来の抗体は、標準細胞株において産生されたＣＡＭＰＴＨ-１Ｈ抗体と同様の最大ｉｎ ｖｉｔｒｏＡＤＣＣ活性を達成したが、かなり低い抗体濃度であった。
【０２２４】
ＣＡＭＰＡＴＨ抗原は、通常リンパ種細胞で高いレベルで存在し、そしてこのキメラｍＡｂは、バイセクティングＧｌｃＮＡｃの非存在下で高いＡＤＣＣ活性を有する(Lifelyら、Glycobiology 375:813-22 (1995))。Ｎ結合グリコシル化経路で、バイセクティングＧｌｃＮＡｃは、ＧｎＴＩＩＩにより付け加えられる(Schachter, Biochem. Cell Biol. 54:163-81 (1986))。
【０２２５】
以前の研究は、１の抗体を産生するＣＨＯ細胞株を用い、当該細胞株は、かなり制御された様式で、異なるレベルのクローン化ＧｎＴＩＩＩ遺伝子酵素を発現するように操作された(Umana, P.ら, Nature Biotechnol. 77:176-180 (1999))。このアプローチは、初めて、ＧｎＴＩＩＩの発現と改変抗体のＡＤＣＣ活性との間の厳密な相関を確立した。こうして、本発明は、マウスＢ-Ｌｙ１抗体の結合特異性を有する組換えキメラ抗体又はその断片であって、ＧｎＴＩＩＩ活性の増加から生じる変更されたグリコシル化を有する組換えキメラ抗体又はその断片を意図する。ＧｎＴＩＩＩ活性の増加は、改変ＡＢＭのＦｃ領域において、二分岐型の糖鎖の割合を増加させ、並びにフコース残基の割合を減少させる。この抗体又はその断片は、高いＦｃ受容体結合親和性及び高いエフェクター機能を有する。さらに、本発明は、免疫グロブリンのＦｃ領域に同等である領域を含む融合タンパク質及び抗体断片に関する。
【０２２６】
本発明の方法に従った改変ＡＢＭの治療適用
最も広い意味で、本発明の改変されたＡＢＭは、特に、標的抗原が細胞表面上に発現される場合に、当該標的抗原を発現する細胞をｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで標的するために使用できる。標的抗原を発現する細胞は、診断又は治療目的のために標的化されうる。１の態様では、本発明の改変ＡＢＭは、標的抗原を発現している細胞において細胞シグナル活性を変化させるために使用できる。別の実施態様では、本発明の改変ＡＢＭは、１以上の標的抗原の架橋及び／又はオリゴマー化を変化させるために使用できる。本発明の改変ＡＢＭについての標的抗原は、非限定的に、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＣＤ４７、ＣＤ９９、ＣＤ２、ＣＤ４５、Ｈｅｒ１(ＥＧＦＲ)、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ３、Ｈｅｒ４、ＴＲＡＩＬ受容体(例えば、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２)、ＴＮＦＲ、ＦＧＦ受容体(例えば、ＦＧＦＲ１)、ＩＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、及び他の細胞表面関連受容体を含む細胞表面受容体でありうる。特有の実施態様では、標的抗原はＣＤ２０である。本発明の改変ＡＢＭはまた、細胞周期を停止するように作用し、標的細胞(例えば腫瘍細胞)のアポトーシスを引き起こし、血管新生を阻害し、及び／又は標的細胞の分化を引き起こす。
【０２２７】
別の態様では、本発明は、標的抗原の細胞シグナル活性の変化により、及び／又は１以上の標的抗原の架橋を媒介する能力の変化により治療される疾患の治療方法であって、本発明の治療有効量の改変ＡＢＭを、治療を必要とする対象に投与することを含む、前記方法に関する。具体的な実施態様では、改変ＡＢＭは抗体である。より具体的な実施態様では、当該抗体はヒト化されている。改変されたＡＢＭが投与される疾患の例として、非限定的に、細胞増殖疾患又は障害、自己免疫疾患又は障害、及び細菌又はウイルス感染に関連する疾患又は障害が挙げられる。
【０２２８】
１の実施態様では、疾患又は障害は、細胞増殖障害である。本発明のＡＢＭにより治療され得る細胞増殖障害の例として、非限定的に、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺(副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺)、眼、頭部及び頸部、神経系(中枢及び末梢)、リンパ系、骨盤、皮膚、軟部組織、脾臓、胸部領域、及び尿生殖器系に位置する新生物、癌、悪性腫瘍及び／又は腫瘍が挙げられる。本発明のＡＢＭで治療され得る特定の新生物、癌、悪性腫瘍、及び／又は腫瘍として、非限定的に、上皮及び扁平上皮癌、神経膠腫、膵癌、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、頭頚部癌、腎細胞癌、結腸癌、直腸結腸癌、肺癌、脳腫瘍、悪性黒色腫、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、胃癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、食道癌、肝癌、皮膚癌、尿路癌腫、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、莢膜腫瘍、セルトリ間質細胞腫瘍、子宮内膜肥厚、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽細胞腫、星細胞腫、神経線維腫、乏突起細胞腫、髄芽腫、神経節芽細胞腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、過誤芽腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、甲状腺肉腫、ユーイング肉腫、及びウィルムス腫瘍が挙げられる。
【０２２９】
同様に、他の細胞増殖障害は、本発明の改変ＡＢＭで治療され得る。このような細胞増殖障害の例として、非限定的に、高ガンマグロブリン血症、リンパ球増殖性疾患、異常蛋白血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンステレーム大グロブリン血症、ゴーシェ病、組織球増殖症、及び上記器官に位置する新生物を除く他の任意の細胞増殖病が挙げられる。
【０２３０】
自己免疫疾患又は障害の例として、非限定的に、免疫媒介性血小板減少症、例えば急性 特発性血小板減少性紫斑病及び慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性 症候群、ヘノッホ・シェンライン紫斑病、レンサ球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、多形性紅斑、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓性ユビテランス(thromboangitis ubiterans)、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎/皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、多発筋痛症、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎及び線維化肺胞炎、炎症反応、例えば炎症性皮膚疾患、例えば乾癬及び皮膚炎(例えば、アトピー性皮膚炎)；全身性強皮症及び硬化症；炎症性腸疾患に関連する応答(例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎)；呼吸促迫症候群(例えば、成人呼吸促迫症候群；ＡＲＤＳ)；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ぶどう膜炎；大腸炎；糸球体腎炎；アレルギー状態、例えば湿疹及び喘息及び他の状態、例えばＴ細胞の浸潤及び慢性炎症性応答；粥状動脈硬化；白血球接着欠乏；関節リウマチ；全身性エリテマトーデス(全身性エリテマトーデス)；糖尿病(例えば１型糖尿病又はインスリン依存性糖尿病)；多発性硬化症；レイノー症候群；自己免疫性甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シューグレン症候群；若年性糖尿病；及び典型的に結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症及び血管炎に見られるサイトカイン及びＴリンパ球により媒介される急性及び遅延型過敏症に付随する免疫応答；悪性アメニア(アジソン病)；白血球血管外漏出に関する病気；中枢神経系(中枢神経系)炎症性障害；多臓器傷害症候群；溶血性貧血(例えば、非限定的に、寒冷グロブリン血症又はクームス陽性貧血)；重症筋無力症；抗原抗体複合体媒介性の病気；抗糸球体基底膜抗体病；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランバート・イートン症候群；類天疱瘡水疱性；天疱瘡；自己免疫性多腺性内分泌不全症；ライター病；全身硬直症候群；ベーチェット病；巨細胞性動脈炎；免疫複合体腎炎；ＩｇＡ腎症；ＩｇＭ多発ニューロパチー；免疫性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)又は自己免疫性血小板減少症などが挙げられる。
【０２３１】
本発明の改変ＡＢＭは、単独で使用され得るか、又は細胞シグナル活性及び／又は１以上の標的抗原の架橋を増加又は低減されることにより治療できる障害を治療するための他の治療又は治療薬剤と組み合わせて使用され得る。１の実施態様では、本発明の改変ＡＢＭは、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍細胞を標的化しそして殺傷するために単独で使用され得る。改変ＡＢＭは、ヒト癌腫を治療する適切な治療薬と併せて使用され得る。例えば、改変ＡＢＭは、化学療法、放射性治療などの標準又は慣用治療方法と組み合わせて使用できるか、又は治療薬剤又は毒素に結合又は会合されるか、並びに治療薬を癌腫の部位にデリバリーするためにリンフォカイン又は腫瘍阻害性増殖因子に結合又は会合され得る。特定の実施態様では、本発明の改変ＡＢＭのコンジュゲートは、(１)免疫トキシン(改変ＡＢＭと細胞傷害性部分とのコンジュゲート)及び(２)標識された(例えば、放射性標識、酵素標識、又はフルオロクローム標識された)改変ＡＢＭを含み、ここで当該標識が標識ＡＢＭを含む免疫複合体を同定する手段を提供する。改変ＡＢＭは、天然補体プロセスを通して溶解を誘導し、そして通常存在する抗体依存性細胞傷害性細胞と相互作用するために使用することができる。
【０２３２】
免疫毒性の細胞傷害性部分は、細胞傷害性薬剤又は酵素的に活性な細菌又は植物起源の毒素、又はかかる毒素の酵素的に活性な断片(Ａ鎖)であってもよい。酵素的に活性な毒素及び使用されるその断片は、ジフテリアＡ鎖、つまりジフテリア毒素の非結合性断片、エキソトキシンＡ鎖(シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)由来)、リチンＡ鎖、アブリンＡ鎖(abrin A chain)、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、α-サルシン(alpha-sarcin)、アレウリテス・フォルディイプロテイン(Aleurites fordii proteins)、ジアンチンプロテイン(dianthin proteins)、ピトラクカ・アメリカナプロテイン(Phytolacca americana proteins)(ＰＡＰI、ＰＡＰII及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・カランチア・インヒビター(momordica charantia inhibitor)、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス・インヒビター(sapaonaria officinalis inhibitor)、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、リストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、及びエノマイシン(enomycin)である。別の実施態様では、改変ＡＢＭは、小分子抗癌剤に会合される。改変ＡＢＭとこのような細胞傷害性部分とのコンジュゲートは、様々な２官能性タンパク質カップリング試薬を用いて製造される。このような試薬の例は、ＳＰＤＰ、ＩＴ、二官能性イミドエステルの誘導体、例えば、ジメチル・アジピミデートＨＣｌ、活性エステル類、例えばジスクシンイミジル・スベレート、アルデヒド類、例えばグルタルアルデヒド、ビス-アジド化合物例えばビス(ｐ-アジドベンジル)ヘキサンジアミン、ビスジアゾニウム誘導体例えばビス(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン、ジイソシアネート類、例えばトリレン２,６-ジイソシアネート、及びビス活性化フッ素化合物、例えば１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼンが挙げられる。毒素の細胞溶解性部分は、改変ＡＢＭのＦａｂ断片に結合させることができる。さらに適切な毒素が当該技術分野に知られており、例えば、米国出願公開第2002/0128448号に記載される。当該公開はその全てを本明細書に援用される。
【０２３３】
１の実施態様では、本発明の抗原結合分子は、追加部分、例えば放射性標識又は毒素に会合される。このような会合された改変ＡＢＭは、当該技術分野に周知である多くの方法により産生され得る。
【０２３４】
様々な放射性ヌクレオチドが本発明に適用可能であり、当業者は、どの放射性核種が様々な状況のもとで最も適切であるかを容易に決定する能力を有すると信じられている。例えば、131ヨウ素は、標的化免疫治療に使用される周知の放射性核種である。しかしながら、131ヨウ素の臨床的有用性は、以下の：８日の物理的な半減期；血中及び腫瘍部位でのヨウ素化抗体の脱ハロゲン化；及び腫瘍への局在化薬剤沈着のため最適ではない放出特性(例えば、γ線成分が多い)を含む幾つかの因子により制限され得る。優れたキレート剤の出現で、金属キレート基をタンパク質に結合するための機会は、他の放射性核種、例えば111インジウム及び90イットリウムなどを使用する機会を増大させた。90イットリウムは、放射性免疫治療適用において使用する幾つかの利点を提供する：90イットリウムの６４時間の半減期は、腫瘍による抗体の蓄積を可能にするために十分な長さであり、そして例えば131ヨウ素とは違って、90イットリウムは、その崩壊においてγ放射を伴うことなく、１００〜１０００細胞直径からなる組織の範囲で高エネルギーの純粋なβ線を放射する放射体である。さらに透過性放射線の量が少ないことは、外来患者に90イットリウム標識抗体を投与することを可能にする。さらに、標識抗体の内在化が、細胞の殺傷に必要とされず、そして局所的な電離放射線の放射は、標的抗原を欠く隣接腫瘍細胞に対して致死的であるべきである。
【０２３５】
90イットリウム標識された本発明の改変ＡＢＭの効果的な１回の治療の投与量(つまり、治療有効量)は、約５〜約７５ｍＣｉの範囲であり、より好ましくは約１０〜約４０ｍＣｉの範囲である。131ヨウ素標識された本発明のＡＢＭの脊髄破壊を引き起こさない有効な一回治療量(effective single treatment non-marrow ablative dosage)は、約５〜約７０ｍＣｉの範囲であり、より好ましくは約５〜約４０ｍＣｉの範囲である。131ヨウ素標識された本発明の抗体の有効な一回の治療破壊用量(effective single treatment ablative dosages)(つまり、自家骨髄移植を必要とし得る)は、約３０〜６００ｍＣｉの範囲であり、より好ましくは約５０〜約５００ｍＣｉの範囲である。本発明に記載されるキメラ抗体では、ｖｉｓ-a-ｖｉｓマウス抗体の長い循環半減期のため、131ヨウ素標識キメラ抗体の非骨髄破壊的１回治療有効量は、約５〜約４０ｍＣｉであり、より好ましくは約３０ｍＣｉ未満である。造影の基準では、111インジウム標識はいパン的に約５ｍＣｉ未満である。
【０２３６】
本発明の放射性標識抗体に関して、それでの治療は、１回の治療処置を用いるか又は複数回の処置を用いることができる。放射性核種成分のため、治療前に、末梢血幹細胞(ＰＳＣ)又は骨髄(ＢＭ)が、放射線から生じる骨髄の致命的な毒性を潜在的に経験する患者では回収されることが好ましい。ＢＭ及び／又はＰＳＣは、標準的な技術を用いて回収され、そして次に予定された再輸液のためにパージされ、そして凍結された。さらに、治療前に、診断用に標識された抗体(例えば111インジウムを用いる)を用いた診断的線量測定研究が、患者について行われた。この目的は、治療用に標識された抗体(例えば90イットリウムを用いる)が、必ずしも、任意の通常の器官又は組織において無用に濃縮されないということを保証することである。
【０２３７】
１の実施態様では、本発明のキメラ糖鎖操作改変ＡＢＭは、リシンＡ鎖に会合される。最も有利なことに、リシンＡ鎖は脱グリコシル化されており、そして組換え手段を通して産生される。リシン免疫毒素を製造する有利な方法は、Vitettaら、Science 238, 1098 (1987)を参照のこと。当該文献は本明細書に援用される。
【０２３８】
診断目的でｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト癌細胞を殺傷するために使用される場合、コンジュゲートは、一般的に、少なくとも約１０ｎＭの濃度で細胞培地に加えられよう。ｉｎ ｖｉｔｒｏで用いるための投与様式及び製剤は、決定的ではない。培養又はかん流培地と適合性である水性製剤が通常使用されよう。細胞傷害性は、癌の存在又は程度を決定する慣用的な技術により読まれてもよい。
【０２３９】
上で記載される様に、癌治療用の細胞傷害性即効性医薬は、放射性同位体（例えば、Ｉ、Ｙ、Ｐｒ）を本発明のキメラ、糖鎖操作、及び／又は改変ＡＢＭに会合させることにより作成されうる。本明細書に使用される「細胞傷害性部分」という用語は、このような同位体を含むことを意図する。
【０２４０】
別の実施態様では、リポソームに細胞傷害性薬剤が充填され、そしてリポソームが本発明のＡＢＭで被膜される。本発明の改変ＡＢＭにの標的分子の多くが細胞表面上で発現されたので(例えば、悪性Ｂ細胞の表面上に多くのＣＤ２０分子が存在する)、本方法は、正確な細胞型について薬剤の多くの量をデリバリーすることを可能にする。
【０２４１】
このような治療薬を抗体へと会合させる技術は周知である(例えば、Arnonら、"Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeldら(共編), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstromら、 "Antibodies For Drug Delivery", Controlled Drug Delivery (第２版), Robinsonら(共編)、pp.623-53 (Marcel Defcker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pincheraら (共編)、 pp. 475-506 (1985);及びThorpeら、"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)を参照のこと。 (各文献は、その全てを本明細書に援用される))。
【０２４２】
本発明のＡＢＭについてのさらに別の治療適用としては、組換えＤＮＡ技術により、プロドラッグを変換できる酵素を細胞傷害性薬剤へと会合又は結合させること、並びにプロドラッグと一緒に抗体-酵素複合体用いて、腫瘍部位で当該プロドラッグを細胞傷害性薬剤へと変更することが挙げられる(例えば、Senterら、「Anti-Tumor Effects of Antibody-alkaline Phosphatase」, Proc. Natl. Acad. Sci USA 55:4842-46 (1988); "Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activites of Phosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates", Cancer Research 49:5789-5792 (1989); and Senter, "Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates: A New Approach to Cancer Therapy," FASEB J. 4:188-193 (1990))。
【０２４３】
本発明のＡＢＭについてのさらに別の治療的使用は、補体の存在下で未結合で、又は抗体薬剤又は抗体-毒素複合体の一部として、癌患者の骨髄から腫瘍細胞を取り除くことに関する。このアプローチによると、自己の骨髄は、抗体で処理することによりｅｘ ｖｉｖｏでパージされてもよく、そして当該骨髄は患者へと輸液で戻される(例えば、Ramsayら、"Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies", J. Clin. Immunol, 8(2):81-88 (1988)を参照のこと)。
【０２４４】
さらに、本発明が、親抗体と実質的に同じ結合特異性を可能にする抗原結合ドメイン(例えば、親抗体のＣＤＲを含むポリペプチド)を含み、そしてさらに、毒素ポリペプチドを含む一本鎖免疫毒素を含むことが意図される。本発明の一本鎖免疫毒素は、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト癌腫を治療するために使用されてもよい。
【０２４５】
同様に、本発明のＡＢＭの少なくとも抗原結合領域を含み、抗腫瘍活性、例えばリンフォカイン又はオンコスタチンを有する第二タンパク質の少なくとも機能的に活性な部分に結合された融合タンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト癌腫を治療するために使用することができる。
【０２４６】
本発明は、非限定的にＣＤ２０、Ｈｅｒ１(ＥＧＦＲ)、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ３、Ｈｅｒ４、ＴＲＡＩＬ受容体(例えば、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２)、ＴＮＦＲ、ＦＧＦ受容体(例えば、ＦＧＦＲ１)、ＩＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、及び他の細胞表面関連受容体を含む細胞表面受容体を発現する腫瘍細胞を選択的に殺傷する方法を提供する。本方法は、本発明の改変ＡＢＭ(例えば免疫毒素として会合されるか又は未会合である)を当該腫瘍細胞と反応させることを含む。これらの腫瘍細胞は、ヒト癌腫由来でありうる。
【０２４７】
さらに、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏで癌腫(例えば、ヒト癌腫)を治療する方法を提供する。本方法は、本発明の少なくとも１の改変ＡＢＭ(例えば免疫毒素として会合されるか、又は未会合である)を含む医薬として有効な量の組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０２４８】
さらなる態様では、本発明は、Ｂ細胞リンパ腫を含むＢ細胞増殖障害、並びにＢ細胞の減少に基き、病原性自己抗体により全身又は一部で産生される自己免疫疾患を治療する改善された方法であって、本発明のＡＢＭの治療有効量を治療を必要とする対象に投与することを含む、前記方法に関する。好ましい実施態様では、ＡＢＭは、マウスＢ-Ｌｙ１抗体の結合特異性と実質的に同じ結合特異性を有する糖鎖操作された抗ＣＤ-２０抗体である。別の好ましい実施態様では、抗体はヒト化されている。本発明のこの態様では、本発明のＡＢＭは、通常Ｂ細胞を有する血液を長期間減少させるために使用される。
【０２４９】
本発明の実施に従って、対象は、ヒト、ウマ、ブタ、ウシ、マウス、イヌ、ネコ、及び鳥の対象でありうる。他の温血動物も本発明に含められる。
【０２５０】
本発明の主題はさらに、ヒト腫瘍細胞の増殖を阻害し、対象の腫瘍を治療し、そして対象の増殖型疾患を治療する方法をさらに提供する。これらの方法は、本発明の組成物の有効量を対象に投与することを含む。
【０２５１】
１の実施態様では、本発明は、癌、前癌症状又は前癌病変、又は自己免疫障害の治療又は予防において使用するための本発明に記載されるＡＢＭに関する。さらに別の実施態様では、本発明は、癌、前癌症状又は病変、又は自己免疫疾患の治療又は予防のための医薬としての使用するための、本発明に記載されるＡＧＭに関する。癌は、例えば、Ｂ細胞リンパ腫、肺癌、非小細胞肺(ＮＳＣＬ)癌、気管支肺胞細胞肺癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭部又は頸部癌、皮膚又は眼球内の黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、胃癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管の癌腫、子宮内膜癌、子宮頚癌、膣癌、外陰部癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎又は尿管の癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、慢性又は急性白血病、リンパ球性リンパ腫、中枢神経系(ＣＮＳ)の新生物、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫でありうるし、上記癌の任意の難治性のバージョン、又は上記癌の１以上の組合せを含む。前癌症状又は前癌病変として、例えば、口腔白板症、日光角化症 (ＨＮＰＣＣ)、結腸又は直腸の前癌性ポリープ、胃の上皮性異形成、腺腫性異形成、遺伝性非ポリポーシス大腸癌症候群(ＨＮＰＣＣ遺伝性非ポリポーシス大腸癌)、バレット食道、膀胱異形成、及び前癌性頚部状態が挙げられる。
【０２５２】
好ましくは、癌は、Ｂ細胞リンパ腫、乳癌、膀胱癌、頭頚部癌、皮膚癌、膵癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、腎癌、及び脳癌からなる群から選ばれる。自己免疫障害の例が上に挙げられる。
【０２５３】
さらに別の実施態様は、癌の治療又は予防用、又は前癌症状又は前癌病変の治療又は予防用の医薬の製造のための本発明に記載されるＡＢＭの使用である。癌及び前癌症状又は病変は上で定義される。
【０２５４】
その結果、本発明は、ヒト癌腫の治療のための医薬組成物、組合せ、使用、及び方法を包含することが明らかである。例えば、本発明は、ヒト癌腫の治療において使用するための医薬組成物であって、本発明の医薬として有効な量の抗体及び意薬として許容される担体を含む医薬組成物を含む。
【０２５５】
本発明のＡＢＭ組成物は、非限定的に静脈内、腹腔内、経口、リンパ管内、又は腫瘍への直接投与を含む慣用の投与様式を用いて投与され得る。静脈内投与が好ましい。
【０２５６】
本発明の１の態様では、本発明のＡＢＭを含む治療製剤は、所望の純度を有する抗体を、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、場合により医薬として許容される担体、賦形剤、又は安定剤と混合することにより、貯蔵用に調製される(Remingtonの「Pharmaceutical Sciences」第１６版、Osol, A.編 (1980)))。許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、使用される用量及び濃度でレシピエントに対して無毒性であり、そして緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；抗酸化薬、例えばアスコルビン酸及びメチオニン；保存剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウム・クロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロへキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満の)ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン；単糖、二糖類、及び他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース、又はデキストリン；キレート薬、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体(例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体)；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)が挙げられる。
【０２５７】
代表的な抗-ＣＤ２０ＡＢＭ製剤は、明らかに本明細書に援用されるWO98/56418において記載される。この公報は、２〜８℃で貯蔵された際に２年の最小の保管期間を有する、４０ｍｇ／ｍｌリツキシマブ、２５ｍＭ酢酸塩、１５０ｍＭトレハロース、０.９％ベンジルアルコール、０.０２％ポリソルベート２０を含む液体多用量製剤を記載する。目的の別の抗ＣＤ-２０製剤は、１０ｍｇ／ｍｌリツキシマブを、９.０ｍｇ／ｍｌ塩化ナトリウム、７.３５ｍｇ／ｍｌクエン酸ナトリウム二水和物、０.７ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、及び注射用滅菌水 、ｐＨ６.５中に含む。本発明では、リツキシマブは、本発明の改変ＡＢＭに代用されよう。
【０２５８】
皮下投与に適用される凍結乾燥製剤は、WO97／04801に記載される。このような凍結乾燥製剤は、適切な希釈液で再構成されて、高タンパク質濃度にされ、そして再構成された製剤は、本明細書で治療される哺乳動物に皮下投与されてもよい。
【０２５９】
本明細書の製剤は、１超の活性化合物を、治療される特定の適応症に必須なものとして含むことができ、好ましくは、互いに有害に影響することのない補完的活性を有する化合物を含んでもよい。例えば、細胞傷害性薬剤、化学療法薬剤、サイトカイン又は免疫抑制剤(例えば、Ｔ細胞に作用する薬剤、例えば、シクロスポリン又はＴ細胞に結合する抗体、例えばＬＦＡ-１に結合する抗体)をさらに提供することが望ましい。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するアンタゴニストの量、疾患又は障害のタイプ、又は治療、及び上記他の因子に左右される。これらは、一般的に、今まで使用されてきたのと同じ用量及び投与経路で使用されるか、又はこれまで使用された用量の約１〜９９％の用量で使用される。
【０２６０】
活性成分は、例えばコロイド様薬剤デリバリーシステム(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルジョンにおいて、液滴形成技術又は界面重合により調製された微小カプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセル中に取り込まれてもよい。このような技術は、RemingtonのPharmaceutical Sciences第１６版、Osol, A. 編(1980)に開示されている。
【０２６１】
徐放性製剤が製造されてもよい。徐放性製剤の適切な例として、アンタゴニストを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含む。当該マトリクスは、造形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第３, ７７３,９１９号)、L-グルタミン酸及びγエチル-L-グルタミン酸、非分解性エチレン-ビニルアセテート、分解性乳酸グリコール酸共重合体、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ(商標)(乳酸-グリコール酸共重合体と酢酸ロイプロリドからなる注射用マイクロスフィア)、及びポリＤ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０２６２】
ｉｎ ｖｉｖｏ投与に用いられる製剤は滅菌されてなければならない。これは、滅菌ろ過膜を通してろ過することにより容易に達成される。
【０２６３】
本発明の組成物は、非限定的に、液体溶液又は懸濁液、錠剤、ピル、粉末、座剤、重合体マイクロカプセル又はマイクロベシクル、リポソーム及び注射又は輸液溶液を含む様々な投与形態でありうる。好ましい形態は、投与様式及び治療適用に左右される。
【０２６４】
本発明の組成物はまた、好ましくは慣用される医薬として許容される担体及び当業者において知られているアジュバント、例えばヒト血清アルブミン、イオン交換物質、アルミナ、レシチン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、及び塩又は電解質、例えば硫酸プロタミンを含む。
【０２６５】
本発明の医薬組成物の最も効果的な投与様式及び投与計画は、重篤度及び疾患のコース、患者の健康及び治療への応答、及び医師の判断に左右される。従って、組成物の投与量は、個々の患者に合わせられるべきである。それにも関わらず、本発明の組成物の有効量は、一般的に約０.０１〜約２０００ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。
【０２６６】
本明細書に記載される分子は、非限定的に液体溶液又は懸濁液、錠剤、ピル、粉末、座剤、重合体マイクロカプセル又はマイクロベシクル、リポソーム及び注射又は輸液溶液を含む。好ましい形態は、投与様式及び治療適応に左右される。
【０２６７】
本発明の投与様式は、幾つかの場合、予測バイオマーカーの使用により決定され得る。予測バイオマーカーは、腫瘍関連遺伝子若しくはタンパク質、又は腫瘍関連シグナル経路の細胞成分の発現及び／又は活性化のパターンを決定するため(つまり観察及び／又は定量するため)に使用される分子マーカーである。腫瘍組織において標的化治療の生物学的効果を明らかにし、そしてこれらの効果を臨床応答へと相関することは、腫瘍において作動している突出した増殖及び生存経路を同定するのに役立ち、それにより、有望な応答者のプロファイルを確立し、そして逆に治療への抵抗性に打ち勝つ戦略を示す論理的根拠を提供する。例えば、改変ＡＢＭがＥＧＦＲに特異的な抗体である場合、抗ＥＧＦＲ治療のバイオマーカーが、細胞増殖障害を導くＥＧＦＲの下流シグナル経路において存在する１以上の分子、例えば非限定的にＡｋｔ、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＡＰＫ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＰＫＣ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５を含み得る(Mitchell、Nature Biotech. 22: 363-364 (2004); Becker, Nature Biotech 22: 15-18 (2004); Tsao and Herbst, Signal 4: 4-9 (2003))。抗ＥＧＦＲ治療についてのバイオマーカーはまた、増殖因子受容体、例えば、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ-２(ＨＥＲ２／ｎｅｕ)、及びＥｒｂＢ-３(ＨＥＲ３)を含むことがあり、そして抗ＥＧＦＲ治療に対する患者の応答の陽性又は陰性の予測因子でありうる。例えば、成長因子受容体ＥｒｂＢ-３(ＨＥＲ３)は、抗ＥＧＦＲ受容体ＡＢＸ-ＥＧＦについての負の予測バイオマーカーであると決定された(米国特許出願第2004/0132097 A1)。
【０２６８】
予測バイオマーカーは、非限定的に、免疫組織化学、フローサイトメトリー、免疫蛍光、捕捉及び検出アッセイ、並びに逆相アッセイ、及び／又は米国特許出願公開第2004/0132097A1号に記載されるアッセイを含む当業者に周知である細胞アッセイにより計測されてもよい。当該文献は、本明細書に援用される。抗ＥＧＦＲ治療の予測バイオマーカーは、それ自身、米国特許出願公開第2003/0190689Ａ1に記載される技術に従って同定され得る。当該文献の内容は本明細書に援用される。
【０２６９】
こうして、１の態様では、本発明は、標的抗原による細胞シグナル伝達の変化又は異常調節、及び/又は１以上の標的抗原の架橋及び/又は重合化を媒介する能力の変化に関する障害を治療する方法であって、
標的抗原による細胞シグナル伝達の変化又は異常制御、及び/又は１以上の標的抗原の架橋及び/又はオリゴマー形成を媒介する能力の変化に関連する障害(例えば癌)についての予測バイオマーカーの発現及び/又は活性化を検出する１又は複数の試薬で治療前にヒト対象由来のサンプルをアッセイすることによって、治療を必要とするヒト対象において改変ＡＢＭを用いた治療への応答性を予測し；
１以上の予測バイオマーカーの発現及び/又は活性化のパターン決定し、ここで当該パターンが改変ＡＢＭ治療へのヒト対象の応答性を予測し；そして
改変ＡＢＭでの治療に応答性であると予測されたヒト対象に、本発明の改変ＡＢＭを含む組成物の治療有効量を投与する
を含む、方法を提供する。本明細書に使用される場合、改変ＡＢＭ治療に応答すると予測されるヒト対象は、改変ＡＢＭが、標的抗原による細胞シグナル伝達の変化又は異常制御、及び/又は１以上の標的抗原の架橋及び/又はオリゴマー化を媒介する能力の変化に関連する疾患又は障害について計測可能な効果(例えば、腫瘍退行/収縮)を有するヒトであり、そして改変ＡＢＭ治療の治療効果が、有害な効果を下回ることがないヒトである。本明細書に使用される場合、サンプルは、１の生物、特にヒト由来の任意の生物学的サンプルについてのサンプルを意味し、１以上の細胞、例えば任意の器官、組織、又は生検サンプルであって、乳房、肺、消化管、皮膚、子宮頸部、卵巣、前立腺、腎臓、脳、頭部及び頸部などの器官から取りだされたサンプル、並びに非限定的にスメア、淡、分泌物、脳脊髄液、胆汁、血液、リンパ液、尿、及び糞便を含む他の生体サンプルを含む。
【０２７０】
本発明の改変ＡＢＭを含む組成物は、良好な医学慣習に合致する様式で剤形され、用量決定され、そして投与されよう。この関係で考慮される因子は、治療される特定の疾患又は障害、治療される特定の哺乳動物、本発明の臨床条件、疾患又は障害の原因、薬剤のデリバリー部位、投与方法、投与計画、及び医師に知られている他の因子を含む。投与される治療有効量のアンタゴニストは、このように考慮することによって決定されよう。
【０２７１】
一般的な提案として、１回投与あたりの非経口投与される抗体の治療有効量は、１日あたり、約０.１〜２０ｍｇ／ｋｇ（患者体重）の範囲であり、使用されるアンタゴニストの典型的な初期範囲は、約２〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【０２７２】
また、好ましくは、改変ＡＢＭは、約１.０ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇの治療有効量で使用される。
【０２７３】
また、より好ましくは、改変ＡＢＭは、約１.５ｍｇ／ｋｇ〜約１２ｍｇ／ｋｇの治療有効量で使用される。
【０２７４】
また、より好ましくは、改変ＡＢＭは、約１.５ｍｇ／ｋｇ〜約４.５ｍｇ／ｋｇの治療有効量で使用される。
【０２７５】
また、より好ましくは、改変ＡＢＭは、約４.５ｍｇ／ｋｇ〜約１２ｍｇ／ｋｇの治療有効量で使用される。
【０２７６】
最も好ましくは、改変ＡＢＭは、約１.５ｍｇ／ｋｇの治療有効量で用いられる。
【０２７７】
また、最も好ましくは、改変ＡＢＭは、約４.５ｍｇ／ｋｇの治療有効量で用いられる。
【０２７８】
また、最も好ましくは、改変ＡＢＭは、約１２ｍｇ／ｋｇの治療有効量で用いられる。
【０２７９】
好ましい実施態様では、改変ＡＢＭは抗体、好ましくはヒト化抗体である。このような未結合抗体についての適切な用量は、例えば、約２０ｍｇ／ｍ2〜約１０００ｍｇ／ｍ2の範囲である。１の実施態様では、抗体の用量は、リツキシマブについて現在推奨されている用量とは異なる。例えば、実質的に３７５ｍｇ／ｍ2未満の抗体の１以上の用量が患者に投与される。例えば、用量は、約２０ｍｇ／ｍ2〜約２５０ｍｇ／ｍ2、例えば約５０ｍｇ／ｍ2〜約２００ｍｇ／ｍ2の範囲である。
【０２８０】
さらに、一回以上の抗体の初回用量が投与され、それに続き１回以上の次回用量が投与される。ここで次回投与における抗体の用量ｍｇ／ｍ2は、初回投与の抗体の用量ｍｇ／ｍ2を超える。例えば、初回用量は、約２０ｍｇ／ｍ2〜約２５０ｍｇ／ｍ2の範囲であり(例えば、約５０ｍｇ／ｍ2〜約２００ｍｇ／ｍ2)、そして次回用量は、約２５０ｍｇ／ｍ2〜１０００ｍｇ／ｍ2の範囲でありうる。
【０２８１】
しかしながら上に記載される様に、改変ＡＢＭのこれらの提案された量は、かなりの治療分別にかけられる。適切な用量及びスケジュールの選択における主要な因子は、上で記載されたように得られた結果である。例えば、比較的高い用量は、進行中及び急性の疾患の治療に最初に必要とされ得る。最も効果的な結果を得るために、疾患又は障害に左右されて、アンタゴニストは、疾患又は障害の初発兆候、診断、出現、又は発症部位のできるだけ近くに投与されるか、又は疾患又は障害の沈静の間に投与される。
【０２８２】
本発明の改変ＡＢＭは、任意の適切な手段により投与され、例えば非経口、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻腔内、及び所望される場合、局所的免疫抑制治療、病巣内投与を含む。非経口輸液は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。さらに、アンタゴニストが、例えば低い用量のアンタゴニストをパルス輸液により適切に投与され得る。好ましくは、用量は注射により与えられ、最も好ましくは、投与が短い間又は長い間されるかに一部左右されて静脈内又は皮下注射により与えられる。
【０２８３】
他の化合物、例えば細胞傷害性薬剤、化学療法薬、免疫抑制剤及び／又はサイトカインが、本明細書のアンタゴニストと供に投与されてもよい。組合わされた投与は、分離された製剤又は１の医薬製剤を用い、そしていずれの順番で連続的投与を用いた共投与を含み、ここで好ましくは、両者(又は全ての)活性薬が同時にその生物学的活性を発揮する。
【０２８４】
治療を達成するために必要とされる本発明の組成物の用量が、さらにスケジュールを最適化することにより低減され得るということが明らかであろう。
【０２８５】
本発明の実施に従って、当該医薬担体は、脂質担体でありうる。脂質担体は、リン脂質でありうる。さらに、脂質担体は、脂肪酸であってもよい。また、脂質担体は、界面活性剤であってもよい。本明細書に使用される場合、界面活性剤は、液体の表面張力を変える(一般的には表面張力を低下させる)任意の物質である。
【０２８６】
本発明の一例では、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。非イオン界面活性剤の例として、非限定的に、ポリソルベート８０(Ｔｗｅｅｎ８０又は(ポリオキシエチレンソルビタン・モノオレエート)としても知られている)、Ｂｒｉｊ及びＴｒｉｔｏｎ(例えばＴｒｉｔｏｎＷＲ-１３３９及びＴｒｉｔｏｎＡ-２０)が挙げられる。
【０２８７】
或いは、界面活性剤は、イオン性界面活性剤でありうる。イオン性界面活性剤の例として、非限定的に、アルキルトリメチルアンモニウム・ブロミドが挙げられる。
【０２８８】
さらに、本発明に従い、脂質担体は、リポソームであってもよい。この適用において用いられるように、「リポソーム」は、本発明の任意の分子又はその組合せを含む任意の膜結合ベシクルである。
【０２８９】
以下の実施例は、本発明をさらに詳細に説明する。以下の製剤及び実施例は、当業者が本発明をより明確に理解し、そして本発明を実施可能にするために与えられる。しかしながら、本発明は、本発明の一態様の例として意図される具体的実施態様による範囲に制限されず、そして機能的に同等である方法は、本発明の範囲内である。さらに、本明細書に記載される発明に加えた本発明の様々な改変は、前述の記載及び添付の図面から当業者に明らかであろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内であると意図される。
【実施例】
【０２９０】
実施例
他に記載がない限り、以下の実施例において具体的なアミノ酸残基の位置の番号付けは、カバット番号付けシステムに従う。
【０２９１】
実施例１
材料と方法
組換え抗体Ｂ-Ｌｙｓ１のクローニング及び発現
Ｂ-Ｌｙ１発現ハイブリドーマセル(例えば、Poppema, S.ら、1987, Proceedings of the 9th Biotest Symposium, Institute of Education, London, (Sonneborn, H.H. and Tills, D.共編); Ling, N.R,ら、1987, In Leucocyte Typing Conference III: White cell differentiation antigens, 302-355, Oxford University Press, Oxford. (AJ. McMichael編.); Knapp, W. 1990. Leukocyte Typing Conference TV Proceedings, Oxford University Press, Oxfordを参照のこと)を１０％ＦＢＳ及び４ｍＭのＬ-グルタミンを含むＲＰＭＩ中で増殖させた。９０％を超える生存度の６×１０6細胞を回収し、そしてトータルＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙｍｉｄｉキットを用いて単離した。Ｂ-Ｌｙ１の可変軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡを、ＲＴ-ＰＣＲにより増幅した。ＲＴ-ＰＣＲ反応を以下の条件：初回のｃＤＮＡ鎖の合成について５０℃で３０分；初回変性について９５℃で１５分；９４℃で１分、４５℃で１分、７２℃で１分を３０サイクル；そして最終伸張ステップを７２℃で１０分行った。予期されるＰＣＲ産物のサイズを、ゲル電気泳動により確認した。ＰＣＲ産物を適切な大腸菌(E.coli)ベクター中にクローニングし、そしてＤＮＡシーケンスにより、様々な軽鎖及び重鎖コード遺伝子が単離されたということを確認した。
【０２９２】
キメラＢ-Ｌｙ１発現ベクターの構築のため、合成シグナル配列及び適切な制限部位を、さらなるＰＣＲ反応により様々な鎖に融合させた。様々な鎖の正確なＤＮＡ配列を最終的に確認した後に、対応するヒトＩｇＧ１定常領域と組み合わせた。遺伝子を構築すると、２個の別々のベクターを用い、１の遺伝子をそれぞれの鎖に用いてＭＰＳＶプロモーターの制御下及び合成ポリＡ部位の上流にクローニングし、プラスミドｐＥＴＲ１８０８(重鎖発現ベクター)及びｐＥＴＲ１８１３(軽鎖発現ベクター)を得た。各ベクターは、ＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を有した。
【０２９３】
リン酸カルシウム・トランスフェクション・アプローチを用いて、ＨＥＫ２９３-ＥＢＮＡ細胞をベクターｐＥＴＲ１８０８及びｐＥＴＲ１８１３で共トランスフェクションすることによりキメラＢ-Ｌｙ１を産生した。指数関数的に増殖しているＨＥＫ２９３-ＥＢＮＡ細胞をリン酸カルシウム法によってトランスフェクションした。１０％ＦＣＳを添加されたＤＭＥＭ培養培地を用いて、Ｔフラスコ中で接着単層培養として細胞を増殖させ、そしてそれらが５０〜８０％コンフルエントの間にトランスフェクションした。Ｔ７５フラスコでのトランスフェクションでは、ＦＣＳ(１０％Ｖ／Ｖ最終体積)、２５０μｇ／ｍｌネオマイシンを添加された１４ｍｌ中に、トランスフェクションの２４時間前に８００万個の細胞を蒔き、そして細胞を５％ＣＯ2雰囲気下のインキュベーター内に一晩３７℃で配置した。トランスフェクションされた各Ｔ７５フラスコについて、ＤＮＡ、ＣａＣｌ2及び水からなる溶液に、４７μｇの合計プラスミドベクターＤＮＡ(等量の軽鎖及び重鎖発現ベクターに分けられる)、２３５μｌの１Ｍ・ＣａＣｌ2を混合し、そして水を加えて終体積４６９μｌにすることにより調製した。この溶液に、４６９μｌの５０ｍＭ・ＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭ・ＮａＣｌ、１.５ｍＭ・Ｎａ2ＨＰＯ4溶液(ｐＨ７.０５)を加え、１０秒間すぐに攪拌し、室温で２０分間静置した。２％ＦＣＳを添加されたＤＭＥＭ１２ｍｌで懸濁液を希釈し、そして現在の培地の代わりにＴ７５に加えた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で約１７〜２０時間インキュベートし、次に培地を１２ｍｌのＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳで置換した。未改変抗体「ｃｈＢ-Ｌｙ１」の生産のために、抗体発現ベクターｐＥＴＲ１８０８及びｐＥＴＲ１８１３を１：１の比でトランスフェクションした。糖鎖操作抗体「ｃｈＢ-Ｌｙ１-ｇｅ」の生産のために、細胞を４個のプラスミド：２個については抗体発現用(ＰＥＴＲ１８０８及びｐＥＴＲ１８１３)、１個は融合のためのＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現用(ＰＥＴＲ１５１９)、そして１個のマンノシダーゼＩＩ発現用(ｐＣＬＦ９)を、それぞれ４：４：１：１の比で共トランスフェクションした。トランスフェクション後５日目に、上清を回収し、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、つづいて４０００ｒｐｍで１０分間遠心して、４℃に維持した。
【０２９４】
ｃｈＢ-Ｌｙ１及びｃｈＢ-Ｌｙ１-ｇｅを、スーパーデックス２００カラム(AMERSHAM Pharmacia)上で３回の連続したクロマトグラフィーステップ：タンパク質Ａクロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水に交換し、そして最終ステップからモノマー抗体ピークを回収することにより、培養上清から精製した。抗体濃度を、分光光度計を用いて２８０ｎｍでの吸光度から見積もった。
【０２９５】
オリゴ糖分析
ＰＮＧａｓｅＦ切断によりオリゴ糖を抗体から酵素的に放出させた。抗体は、ＰＶＤＦ膜に固定されているか又は溶液中に存在した。
【０２９６】
放出されたオリゴ糖を含む得られた切断溶液を、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ-ＭＳ分析用に直接調製するか、又はさらにＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ-ＭＳ分析のサンプル調製前にＥｎｄｏＨグリコシダーゼでさらに切断した。
【０２９７】
ＰＶＤＦ膜固定抗体についてのオリゴ糖放出方法
ＰＶＤＦ(Immobilon P, Millipore, Bedford, Massachusetts)膜で作成された９６ウェルプレートのウェルを、１００μlのメタノールで湿らせ、そしてマルチスクリーン吸引マニフォールド(Millipore, Bedford, Massachusetts)に適用された吸引を用いて液体を、ＰＶＤＦ膜を通して排出した。ＰＶＤＦ膜を３００μｌの水で３回洗浄した。次にウェルを５０μｌのＲＣＭ緩衝液(８Ｍ尿素、３６０ｍＭ・Ｔｒｉｓ、３.２ｍＭ・ＥＤＴＡ、ｐＨ８.６)で洗浄した。３０〜４０μｇの抗体を、１０μｌのＲＣＭ緩衝液を含むウェル中に充填した。ウェル中の液体を吸引を適用することにより膜を通して排出し、そして続いて膜を２回５０μｌのＲＣＭ緩衝液で洗浄した。ジスルフィド結合の還元を、５０μｌの０.１Ｍジチオスレイトールを含むＲＣＭを添加することにより３７℃で１時間行った。
【０２９８】
還元の次に、ウェルからジチオスレイトール溶液を取り除くために吸引を適用した。ウェルを３００μｌの水で３回洗浄し、次に０.１Ｍヨード酢酸を含む５０μｌのＲＣＭ緩衝液を加え、そして暗所で３０分間室温でインキュベートした。
【０２９９】
カルボキシメチル化の後に、ウェルに吸引を適用して排出し、そして次に３００μｌの水で３回洗浄した。エンドグリコシダーゼの吸着を防止するために、室温で１時間１％ポリビニルピロリドン３６０の水溶液１００μｌを１時間インキュベートすることによりＰＶＤＦ膜をブロッキングした。次にブロッキング試薬をゆっくり吸引することにより取り除き、次に３００μｌの水で３回洗浄した。
【０３００】
２.５ｍＵのペプチド-Ｎ-グリコシダーゼＦ(組換えＮ-グリカナーゼ、GLYKO、Novato, CA)及び０.１ｍＵシアリダーゼ(GLYKO, Novato, CA)を添加することにより(２０ｍＭ・ＮａＨＣＯ3を含有、pH７.０、終体積で２５μl)、Ｎ-結合オリゴ糖を放出させて、全ての潜在的に荷電された単糖残基を取り除いた。切断を３７℃で３時間行った。
【０３０１】
溶液中での抗体におけるオリゴ糖の放出方法
４０〜５０μｇの抗体を２.５ｍUのＰＮＧａｓｅＦ(Glyko, USA)を含む２ｍＭ・Ｔｒｉｓ、pH７.０、終体積２５μｌと混合し、そして混合液を３７℃で３時間インキュベートした。
【０３０２】
ハイブリッド二分岐型オリゴ糖の構造をＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ-ＭＳ中性オリゴ糖ピークに割り当てるための、ＰＮＧａｓｅＦ放出オリゴ糖のエンドグリコシダーゼＨ切断の使用
ＰＮＧａｓｅにより放出されたオリゴ糖を次にエンドグリコシダーゼＨ(ＥＣ３.２.１.９６)で切断した。エンドＨ切断では、１５ｍＵのエンドＨ(Roche, Switzerland)をＰＮＧａｓｅＦ切断産物(上記溶液方法の抗体)に加えて、最終体積３０μｌにし、そして混合物を３７℃で３時間インキュベートした。エンドＨは、Ｎ結合オリゴ糖のキトバイオースコアにおけるＮ-アセチルグルコサミン残基間で切断する。酵素は、オリゴマンノース及び多くのハイブリッド型グリカンのみを切断でき、一方複合型オリゴ糖は加水分解されない。
【０３０３】
ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ-ＭＳのサンプル調製法
酢酸を終濃度１５０ｍＭになるまで加えた後に、放出されたオリゴ糖を含む酵素切断産物を、さらに３時間室温でインキュベートし、そして次に０.６ｍｌのカチオン交換レジン(ＡＧ５０Ｗ-Ｘ８レジン、水素型、１００〜２００メッシュ、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｗｉｚｅｒｌａｎｄ)が充填されたマイクロ-バイオ-スピンクロマトグラフィーカラム(ＢｉｏＲａｄ, Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ)を通過させて、カチオン及びタンパク質を取り除いた。得られたサンプルの１μｌをステンレス鋼製の標的プレートに適用し、そして１μｌのｓＤＨＢマトリックスとプレート上で混合した。２ｍｇの２,５-ジヒドロキシ安息香酸＋０.１ｍｇの５-メトキシサリチル酸を含む１ｍｌのエタノール／１０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液(１：１(ｖ／ｖ))中に溶解することにより、ｓＤＨＢマトリックスを調製した。サンプルを風乾し、０.２μｌのエタノールを加え、そしてサンプルを最終的に空気の下で再結晶させた。
【０３０４】
ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ-ＭＳ
質量スペクトルを得るために使用されたＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分析計は、Voyager Elite(Perspective Biosystems)であった。当該装置を線形構成で操作し、２０ｋＶの加速及び８０ｎｓの遅延であった。オリゴ糖標準を用いた外部較正を、イオンの質量数決定に用いた。２００のレーザーショットから得たスペクトルを合計して最終的なスペクトルを得た。
【０３０５】
全血Ｂ細胞消失
健常ドナーからえた４９５μｌのヘパリン化血液を５ｍｌのポリスチレンチューブに一定量に分け、５μｌの１００倍濃縮抗体サンプル(１〜１０００ｎｇ／ｍｌ終濃度)又はＰＢＳのみを加え、そしてチューブを３７℃でインキュベートした。２４時間後、５０μｌの血液を新たなチューブに移し、そして抗ＣＤ３-ＦＩＴＣ、抗ＣＤ１９-ＰＥ、及び抗ＣＤ４５-ＣｙＣｈｒｏｍｅ(Becton-Dickinson)で１５分間室温で暗所において染色した。血液サンプルのＣＤ３-ＦＩＴＣ及びＣＤ１９-ＰＥ蛍光を、ＣＤ４５-ＣｙＣｈｒｏｍｅの閾値を設定することによりフローサイトメトリーにより分析した。ＣＤ１９+Ｂ細胞対ＣＤ３+Ｔ細胞の比をプロットすることにより、Ｂ細胞の消失を測定した。
【０３０６】
抗-ＣＤ２０抗体のＲａｊｉ細胞への結合
２０００００細胞を含む１８０μｌのＦＡＣＳ緩衝液(２％ＦＣＳ及び５ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳ)を５ｍｌのポリスチレンチューブに移した。次に、２０μｌの１０倍濃縮抗-ＣＤ２０抗体サンプル(１〜５０００ｎｇ/ｍｌ終濃度)又はＰＢＳのみを加え、そしてチューブを４℃で３０分間インキュベートした。次に、サンプルをＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、そして３００×ｇで３分間ペレット化した。上清を吸込みにより取り除き、そして細胞を１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に溶解させた。次に１μｌの抗Ｆｃ特異的Ｆ(ａｂ')２-ＦＩＴＣ断片(Jackson Immuno Research Laboratories, USA)を加え、そしてチューブを４℃で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液でサンプルを２回洗浄し、そしてフローサイトメトリーによる分析用に０.５μｇ/ｍｌのＰＩを含む５００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に溶解した。抗体濃度に対して幾何平均蛍光をプロットすることにより結合性を測定した。
【０３０７】
実施例２
高ホモロジー・アクセプター・アプローチ
マウスＢ-ｌｙ１タンパク質配列をヒト生殖細胞系列の集合に整列させ、そして最も高い配列同一性を示したヒト配列を拾い上げることにより、高ホモロジー抗体アクセプター・フレームワークのサーチを行った。ここで、ＶＢａｓｅデータベースから得たＶＨ１＿１０(位置１-ｅ、受託番号ＤＰ-８８)を重鎖フレームワークアクセプター配列として選択し、そしてＩＭＧＴデータベースから得たＩＧＫＶ２-４０(受託番号Ｘ５９３１４)配列を、軽鎖についてのフレームワークアクセプターとして選択した。これら２個のアクセプターフレームワーク上に、マウス重鎖及び軽鎖可変ドメインを移植した。フレームワーク４の領域が、生殖細胞系列Ｖ遺伝子の可変領域の一部ではないので、当該位置での配列比較を個別に行った。ＪＨ４領域を重鎖について選択し、そしてＪＫ４領域を軽鎖について選択した。設計された免疫グロブリンドメインの分子モデリングは、ＣＤＲの外側においてヒトのアミノ酸残基の代わりにマウスのアミノ酸残基を潜在的に必要とする１の点を明らかにした。ヒトフレームワーク中にマウスアミノ酸残基を再導入することは、いわゆる復帰突然変異を生成する。例えば、２７カバット位におけるヒトアクセプターアミノ酸残基を、チロシン残基へと復帰突然変異した。ヒト化抗体バリアントを、復帰突然変異を含むか又は除外するように設計された。ヒト化抗体軽鎖は、任意の復帰突然変異を必要としなかった。タンパク質配列を設計した後に、本タンパク質をコードするＤＮＡ配列を以下に詳述されるように合成した。
【０３０８】
混合フレームワークアプローチ  
ヒトアクセプターフレームワークの決定的なアミノ酸位(良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するために決定的である)で復帰突然変異の誘導を避けるために、全フレームワーク領域１(ＦＲ１)、又はフレームワーク領域１(ＦＲ１)及び２(ＦＲ２)のいずれかが、天然のヒト生殖細胞系列の配列における重要な位置において、ドナー残基又は機能的に同等な残基をすでに有するヒト抗体配列により置き換えられうるということが調査された。この目的のため、マウスＢ-ｌｙ１配列のＶＨフレームワーク１及び２を、個別にヒト生殖細胞系列配列に整列させた。ここで、最も高い配列同一性は、アクセプターフレームワークを選択するために重要でなく、そして用いられなかったが、その代わりに幾つかの決定的な残基が適合することが、より重要であると評価された。これらの決定的残基は、２４、７１、及び９４残基(カバット番号)を含み、そしてまた、２７、２８、及び３０位での残基(カバット番号)を含んだ。これらの残基は、カバット位よるＣＤＲ１定義から外れているが、しばしば抗原結合性に関与した。ＩＭＧＴ配列ＩＧＨＶ３-１５(受託番号Ｘ９２２１６)を適切な配列として選択した。タンパク質配列を設計した後で、これらのタンパク質をコードするＤＮＡ配列を以下に記載される様に合成した。このアプローチを用いて、復帰突然変異は、良好なレベルの抗原結合性を保持するために、軽鎖又は重鎖のいずれかに必要とされなかった。
【０３０９】
抗体遺伝子の合成
ヒト化抗体Ｖ領域のアミノ酸配列を設計した後に、ＤＮＡ配列を作成しなければならなかった。個々のフレームワーク領域のＤＮＡ配列データを、ヒト生殖細胞系列配列のデータベースから発見した。ＣＤＲ領域のＤＮＡ配列を、対応するマウスｃＤＮＡデータから取得した。これらの配列では、全ＤＮＡ配列が事実上集められた。このＤＮＡ配列データを有するので、サイレントミューテーションを導入し、制限エンドヌクレアーゼについての認識部位を作成することにより、診断制限部位を実際の配列に導入した。天然のＤＮＡ鎖を得るために、遺伝子合成を行った(例えば、Wheelerら、1995)。この方法では、オリゴヌクレオチドは、目的の遺伝子から設計され、その結果一連のオリゴヌクレオチドは、コード鎖に由来し、そして他の一連のオリゴヌクレオチドは非コード鎖に由来する。各オリゴヌクレオチドの３'及び５'末端は(列における１番目と最後を除く)は、常に、反対の鎖に由来する２個のプライマーに対する相補鎖を示す。任意の熱安定性ポリメラーゼに適した反応緩衝液中にオリゴヌクレオチドを入れ、そしてＭｇ2+、ｄＮＴＰ、及びＤＮＡポリメラーゼを加えた場合、各オリゴヌクレオチドは、その３'末端から伸張される。新たに形成された、１のプライマーの３'末端は、反対側の鎖の次のプライマーにアニールし、そして、鋳型依存性ＤＮＡ伸張に適した条件下で、その配列をさらに伸張させる。大腸菌中に増殖させるために最終生成物を慣用されるベクターへとクローニングした。
【０３１０】
抗体産生
ヒト重鎖及び軽鎖リーダー配列(分泌用)を上記可変領域配列の上流に加え、そしてこれらは次に、標準的な分子生物学的技術を用いて、それぞれヒトＩｇＧ１κ定常重鎖及び軽鎖配列の上流に結合させた。ＭＰＳＶプロモーターの制御下及び合成ポリＡ部位の上流で、得られた全長抗体の重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列を哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした(１を軽鎖及び１を重鎖)。実施例１に記載される様に各ベクターはＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を有する。上記実施例１に記載されるように、つまり、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡを哺乳動物抗体重鎖及び軽鎖発現ベクターで共トランスフェクションし、トランスフェクション後５〜７日に馴化培養培地を回収し、そしてタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーを行い、続いてカチオン交換クロマトグラフィーを行い、そして最終的なサイズ排除クロマトグラフィーステップにより分泌された抗体を精製して純粋なモノマーＩｇＧ１抗体を単離した。抗体を２５ｍＭリン酸カリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン溶液(ｐＨ６.７)中に剤形した。上記実施例１のキメラ抗体について記載される様にヒト化抗体バリアントの糖鎖操作バリアントを、ＧｎＴ-ＩＩＩグリコトランスフェラーゼ発現ベクターと一緒に、又はＧｎＴ-ＩＩＩ発現ベクター+ゴルジマンノシダーゼＩＩ発現ベクターと一緒に、抗体発現ベクターをコトランスフェクションすることにより産生される。糖鎖操作されていない抗体について上に記載されるのと同様に糖鎖操作抗体を精製し、そして剤形した。抗体のＦｃ領域に結合されるオリゴ糖を、以下に記載される様にＭＡＬＤＩ/ＴＯＦ-ＭＳにより分析した。
【０３１１】
オリゴ糖分析
抗体のオリゴ糖を放出する方法では、４０〜５０μｇの抗体を含む溶液を２.５ｍＵのＰＮＧａｓｅＦ(Glyko、U.S.A.)を含む２ｍＭ・Ｔｒｉｓ、ｐＨ７.０、終体積２５μｌ中に混合し、そして混合液を３７℃で３時間インキュベートした。
【０３１２】
ＭＡＬＤＩ/ＴＯＦ-ＭＳ用のサンプル調製
放出されたオリゴ糖を含む酵素切断産物を、酢酸を最終濃度１５０ｍＭまで添加した後に、放出されたオリゴ糖を含む酵素切断産物をさらに室温で３時間インキュベートし、そして次に、マイクロ-バイオ-スピンクロマトグラフィーカラム(BioRad, Switzerland)中に充填された０.６ｍｌのカチオン交換レジン(ＡＧ５０Ｗ-Ｘ８レジン、水素型、１００〜２００メッシュ、BioRad, Switzerland)に通過させて、カチオン及びタンパク質を取り除く。得られたサンプル１μｌをステンレス鋼標的プレートに適用し、そして１μｌのｓＤＨＢマトリクスとプレート上で混合した。ｓＤＨＢマトリクスを２ｍｇの２,５-ジヒドロキシ安息香酸＋０.１ｍｇの５-メトキシサリチル酸を含む１ｍｌのエタノール／１０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液(１：１、ｖ／ｖ)に溶解することにより調製した。サンプルを風乾し、０.２μｌのエタノールを加え、そしてサンプルを最終的に空気の下で再結晶化させた。
【０３１３】
ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ-ＭＳ
質量スペクトルを得るために使用されたＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分析計は、Voyager Elite(Perspective Biosystems)であった。当該装置を線形構成で操作し、２０ｋＶの加速及び８０ｎｓの遅延させた。オリゴ糖標準を用いた外部較正を、イオンの質量数決定に用いた。２００のレーザーショットから得たスペクトルを合計して最終的なスペクトルを得た。
【０３１４】
抗原結合アッセイ
上記実施例１のキメラＢ-ｌｙ１抗体に記載される様に、フローサイトメトリーに基くアッセイを用いて、精製モノマーヒト化抗体バリアントを、Ｒａｊｉ Ｂ細胞リンパ腫標的細胞上のヒトＣＤ２０への結合性について試験した。
【０３１５】
モノマーＩｇＧ１グリコバリアントの、ＮＫ細胞及びＦｃγＲＩＩＩＡ発現ＣＨＯ細胞株への結合
ヒトＮＫ細胞を新たに単離された末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)から単離し、ＣＤ１６及びＣＤ-５６陽性細胞を濃縮する陰性選別(ＭＡＣＳシステム、Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach/Germany)を適用した。ＣＤ５６発現により決定される純度は、８８〜９５％であった。新たに単離されたＮＫ細胞を、カルシウム及びマグネシウムイオンを伴わないＰＢＳ中で３７℃で２０分間インキュベートして(３×１０5細胞／ｍｌ)、ＮＫ細胞に付随したＩｇＧを取り除いた。１０6細胞／ｍｌの細胞を、様々な濃度の抗-ＣＤ２０抗体(０、０.１、０.３、１、３、１０μｇ／ｍｌ)を含むＰＢＳ、０.１％ＢＳＡとインキュベートした。数回洗浄した後に、抗体の結合を、１：２００ＦＩＴＣ結合Ｆ(ａｂ')２ヤギ抗ヒト、Ｆ(ａｂ')２特異的ＩｇＧ(Jackson Immuno Research, West Grove, PA/USA)及び抗ヒトＣＤ５６-ＰＥ(ＢＤ Biosciences, Allschwil/Switzerland)とインキュベートすることにより検出した。抗ＦｃγＲＩＩＩＡ ３Ｇ８Ｆ(ａｂ')２断片(Ancell、Bayport, MN/USA)を１０μｇ／ｍｌの濃度で加えて、抗体グリコバリアントの結合と競合させた(３μｇ／ｍｌ)。結合抗体バリアントを指す蛍光強度を、ＣＤ５６陽性細胞について、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ(BD Biosciences, Allschwil/Switzerland)で測定した。ＣＨＯ細胞をＦｃγＲＩＩＩ Ａ-Ｖａｌ１５８α鎖及びγ鎖をコードする発現ベクターで電気穿孔(２８０Ｖ、９５０μＦ、０.４ｃｍ)によりトランスフェクションした。形質転換体を、６μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加することにより選別し、そして安定なクローンを、１０μｌのＦＩＴＣ結合抗ＦｃγＲＩＩＩ ３Ｇ８モノクローナル抗体(BD Biosciences, Allschwill/Switzerland)を１０6細胞に用いてＦＡＣＳにより分析した。ＩｇＧ１のＦｃγＲＩＩＩ Ａ-Ｖａｌ１５８発現ＣＨＯ細胞への結合は、上に記載されるＮＫ細胞結合と同様に行われた。
【０３１６】
ＡＤＣＣアッセイ
ヒト末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を効果細胞として用い、そしてHistopaque-１０７７(Sigma Diagnostics Inc., St.Louis, MO63178 USA)を用い、そして製品説明書に実質的に従って製造した。簡潔に記載すると、静脈血をボランティアからヘパリン化シリンジで取った。当該血液を１：０.７５〜１.３でＰＢＳ(Ｃａ2+又はＭｇ2+を含まない)で希釈し、Histopaque-1077に積層した。時間を空けずに勾配を４００×ｇで３０分間室温で遠心した。ＰＢＭＣを含有する境界面を回収し、そしてＰＢＳ(２個の勾配から得た細胞あたり５０ｍｌ)で洗浄し、そして室温で３００×ｇで１０分間遠心することにより回収した。ペレットをＰＢＳで懸濁後、ＰＢＭＣを計数し、そして２００×ｇで１０分間室温で遠心することにより二回目の洗浄を行った。次に細胞を、次なる方法に用いるのに適切な培地中に懸濁した。
【０３１７】
ＡＤＣＣアッセイに用いられるエフェクター対標的の割合は、それぞれＰＢＭＣについて２５：１及びＮＫ細胞について１０：１であった。丸底９６ウェルプレートのウェルあたり５０μｌを加えるために、効果細胞をＡＩＭ-Ｖ培地中に適切な濃度で調製した。標的細胞は、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で増殖するヒトＢリンパ腫細胞(例えば、Ｒａｊｉ細胞)であった。標的細胞をＰＢＳで洗浄し、計数し、そしてマイクロウェルあたり１００μｌで３００００個の細胞を加えるために、１ｍｌあたり３０万個の濃度になるように再懸濁した。抗体をＡＩＭ-Ｖ中に希釈し、５０μｌをあらかじプレートされた標的細胞に加え、室温で１０分間標的に結合させた。次に効果細胞を加え、そしてプレートを５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下３７℃で４時間インキュベートした。標的細胞の殺傷を、細胞傷害性検出キット(Roche Diagnostics, Rotkreuz, Switzerland)を用いて損傷された細胞から放出された乳酸デヒドロゲナーゼ(ＬＤＨ)を計測することにより評価した。４時間のインキュベートの後に、プレートを８００×ｇで遠心した。各ウェルから得た１００μｌの上清を新たな透明平底９６ウェルプレートに移した。当該キットの１００μｌ着色基質緩衝液をウェル毎に加えた。呈色反応のＶｍａｘ値をＥＬＩＳＡリーダーで測定し、ＳＯＦＴｍａｘＰｒｏソフトウェア(Molecular Devices, Sunnyvale, CA94089, USA)を用いて少なくとも１０分間４９０ｎｍで測定した。標的及び効果細胞のみを含むが抗体を含まないウェルから、自然に生じるＬＤＨ放出を計測した。最大放出を、標的細胞及び１％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００のみを含むウェルから測定した。具体的な抗体媒介性殺傷の割合を、以下のように計算した：
((ｘ-ＳＲ)/(ＭＲ-ＳＲ)＊１００
[式中、
ｘは、具体的な抗体濃度でＶｍａｘの平均値であり、
ＳＲは、自然に生じる放出のＶｍａｘの平均値であり、そして
ＭＲは、最大放出のＶｍａｘの平均値である]
【０３１８】
補体依存性細胞傷害性アッセイ
標的細胞を計数し、ＰＢＳで洗浄し、１ｍｌあたり１００万個の細胞を含むようにＡＩＭ-Ｖ(Invitrogen)中に懸濁した。５０μｌの細胞を、平底９６ウェルプレートのウェル毎にプレートした。抗体希釈液をＡＩＭ-Ｖ中に調製し、そして当該細胞に５０μｌを加えた。室温で１０分間抗体を細胞に結合させた。ヒト血清補体(Quidel)を新たに融解し、AIM-Vで３倍に希釈し、そして５０μｌをウェルに加えた。ラビット補体(Cedarlane Laboratories)を製造者により記載されるとおりに調製し、ＡＩＭ-Ｖで３倍に希釈し、そして５０μｌをウェルに加えた。対照として、補体ソースを３０分間５６℃で加熱してアッセイに加えた。アッセイプレートを３７℃で２時間インキュベートした。細胞の殺傷を、ＬＤＨ放出を計測することにより測定した。簡潔に記載すると、プレートを３００×ｇで３分間遠心した。１ウェルあたり５０μｌを新たな９６ウェルプレートに移し、そして細胞傷害性キット(Roche)から得た５０μｌのアッセイ試薬を加えた。ＥＬＩＳＡリーダーでの反応速度測定が、上清中のＬＤＨ濃度に対応するＶｍａｘを測定した。当該細胞を１％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００の存在下でインキュベートすることにより最大放出を測定した。
【０３１９】
全血Ｂ細胞消失アッセイ
抗ＣＤ２０抗体による全血中の通常のＢ細胞の消失を上記実施例１に記載される様に行った。
【０３２０】
アポトーシスアッセイ
抗体のアポトーシス効力を、一晩(１６〜２４時間)当該細胞(５×１０5細胞/ｍｌの標的細胞濃度)を１０μｇ/ｍｌ(抗原結合について飽和状態)の抗体とインキュベートすることによりアッセイした。サンプルをＡｎｎＶ-ＦＩＴＣで染色し、そしてＦＡＣＳにより分析した。アッセイを３回行った。
【０３２１】
アネキシンＶ及びホスファチジルセリンなどのアポトーシスマーカーの存在に従うことにより検出をフローサイトメトリーによって行った。陰性対照(アポトーシスが未誘導)は、抗体を含まず、リン酸緩衝生理食塩水のみを含んだ。陽性対照(最大アポトーシス)は、５μＭの強力なアポトーシス誘導性カンプトテシン(ＣＰＴ)を含んだ。
【０３２２】
結果及び考察
ヒト化Ｂ-ｌｙ１軽鎖(ＢＫＶ１)と複合体形成した抗体バリアントＢ-ＨＨ１、ＢＨＨ２、Ｂ-ＨＨ４のヒトＣＤ２０抗原への結合性と、親、キメラ抗体ｃｈＢ-ｌｙ１(上記実施例１に記載されている)のヒトＣＤ２０抗原への結合性の比較により、全ての抗体が似通ったＥＣ５０値を有するが、Ｂ-ＨＨ１コンストラクトが、Ｂ-ＨＨ２及びＢ-ＨＨ３バリアントに比べて低い強度/化学両論で結合することが示された(図１１)。Ｂ-ＨＨ１は、その部分的なヒトＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域(カバット定義)、並びに２８位(カバット番号付け)でＡｌａ/Ｔｈｒを有する点でＢ-ＨＨ２及びＢ-ＨＨ３とは区別される。このことにより、２８位、完全ＣＤＲ１及び/又は完全ＣＤＲ２のいずれかが抗体/抗原相互作用に重要であることが示唆される。
【０３２３】
Ｂ-ＨＬ１、Ｂ-ＨＨ１、及びキメラｃｈＢ-ｌｙ１親抗体の比較により、Ｂ-ＨＬ１コンストラクトには結合活性がないこと、及びＢ-ｌｙ１に比べてＢ-ＨＨ１の結合強度/化学両論が約半分であることが示された（図１２）。Ｂ-ＨＬ１並びにＢ-ＨＨ１の両者が、ヒトＶＨ１クラスに由来するアクセプターフレームワークに基いて設計される。他の違いのなかで、Ｂ-ＨＬ１コンストラクトの７１位(カバット番号付け)は、かなり異なっており、抗原結合性について推定の重要性が示唆される。７１位でのアミノ酸は、重鎖の標準ループ構造を決定する残基のうちの一つである。ここで、アラニン又は機能的同等物(例えば、ロイシン、バリン、又はスレオニン(例えば、Moreaら、Methods 20: 267-279 (2000))は、抗原結合性に重要であると思われる一方、アルギニンは、抗原結合性に決定的であると思われる。
【０３２４】
図２、及び９〜１３の抗原結合データを比較した場合、ＢＨＨ２-ＢＫＶ１、ＢＨＬ８-ＢＫＶ１、及びＢＨＬ１１-ＢＫＶ１バリアントは、試験された様々なヒト化抗体バリアントの中で、ヒト細胞の表面上のヒトＣＤ２０に対する良好な結合親和性を示す。抗原結合性についての類似するＥＣ５０値にも関わらず、これらのバリアントは、ＣＤ２０陽性標的細胞においてアポトーシスを誘導するその挙動の点でかなり異なっている(図４-６、１４、１５を参照のこと)。オリジナルのＢ-Ｌｙ１抗体がアポトーシスの低い誘導を示したので、本発明者は、親Ｂ-ｌｙ１抗体コンストラクトと、Ｂ-ＨＬ８及びＢ-ＨＨ２コンストラクトとの間の差異を決定した。Ｂ-ＨＬ８又は親Ｂ-ｌｙ１重鎖に存在しない７つの残基がＢ-ＨＨ２において同定された：Ｇｌｎ１、Ａｌａ９、Ｖａｌ１１、Ｌｙｓ１２、Ｓｅｒ１６、Ｖａｌ２０、及びＭｅｔ４８である。これらの７つの残基全ては、ＶＨドメインのフレームワーク領域に位置する。直接の抗原接触の可能性は、Ｇｌｎ１を除いて起こりそうもなかった。これらの残基のうちの１つが、新たに生成されたアポトーシス誘導性に関与するかを決定するために、Ｂ-ＨＨ２コンストラクトのアポトーシスの様態を潜在的に回復できる７個のＢ-ＨＬ８重鎖のバリアントを作成した：Ｂ-ＨＬ１１(Ｅ１Ｑ変異を有する)、Ｂ-ＨＬ１２(Ｇ９Ａ、Ｖ４８Ｍ)、Ｂ-ＨＬ１３(Ｌ１１Ｖ、Ｖ４８Ｍ)、Ｂ-ＨＬ１４(Ｖ１２Ｋ、Ｖ４８Ｍ)、Ｂ-ＨＬ１５(Ｇ１６Ｓ、Ｖ４８Ｍ)、Ｂ-ＨＬ１６(Ｌ２０Ｖ、Ｖ４８Ｍ)、及びＢ-ＨＬ１７(Ｖ４８Ｍ)。配列番号３２、３４、３６、３８、４０、４２、及び４４を参照のこと(これらは、配列表に記載される場合、カバットに従った番号付けされていないが、当該カバットの番号付けは、当業者により容易に決定できる)。これらのバリアントの抗原結合性性質は、ＥＣ５０値及び化学両論に関して劇的に異なることはない(図２を参照のこと)。しかしながら、アポトーシスを誘導する能力において、目立った差異が見ることができる(図４〜６、１４、１５、及び２４)。Ｌ１１Ｖ、Ｖ４８Ｍ改変を有するコンストラクト、Ｂ-ＨＬ１３は、アポトーシスを誘導する能力を有意に増加させた。しかしながら、Ｖ４８Ｍの改変は、単独で目に見える効果を有さなかった(図５を参照のこと)。こうして、１１及び１２カバット位の残基が、最もアポトーシスの挙動に影響を与えた。これらの残基は、直接抗原結合性に影響を与えないが、むしろＶＨとＣＨ１ドメインとの間の境界に影響し、そうして肘角度の調節を介して作用する。
【０３２５】
Ｂ-ＨＬ４コンストラクトは、ＢＨＨ２のＦＲ１を、ヒト生殖細胞系列配列ＩＧＨＶ１-４５(受託番号Ｘ９２２０９)のＦＲ１で置換することにより、ＢＨＨ２抗体から生成される。このコンストラクトは、ＦＲ１内の４個の位置でしか異なるアミノ酸を有していないにも関わらず、抗原結合能力のかなりの低下を示す。これらの残基は、２、１４、２８、及び３０位(カバット番号付け)に位置する。これらのなかで、２８位及び３０位は、影響力の強い位置でありうる。なぜなら、これらは、ＣＤＲ１のコチア定義（Chothia definition）の一部であるからである。Ｂ-ＨＨ８及び９のバリアント(両方ともＢＫＶ１軽鎖を有する）では、２８位及び３０位が親Ｂ−ｌｙ１に比べて改変されている。図２２に見られるように、スレオニン２８又はスレオニン３０が存在する場合、結合性質は有意に影響を受けない(図２２)。復帰突然変異は、移植された全長カバットＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有したヒト化軽鎖において導入された。アポトーシスの誘導の際(図１４、１５、及び２１を参照のこと)、最も強力なバリアントは、ヒト化Ｂ-ｌｙ１バリアントＢＨＨ２-ＢＫＶ１であった(オリジナルのｃｈＢ-ｌｙ１よりもさらに強力であり、そしてリツキシマブと同じ配列を有する抗体（Ｃ２Ｂ８）よりもずっと強力であった)。アポトーシスの増加を回復しうる他のヒト化バリアントは：Ｂ-ＨＬ１３及びＢ-ＨＬ１４(ＢＨＬ８の誘導体)、ＢＨＨ(混合フレームワーク)、ＢＨＨ９(Ｓ３０Ｔの効果を調べるために１の復帰突然変異を有する混合フレームワーク)、及びＢ-ＨＨ６(Ｂ-ＨＨ２のＭ３４Ｉ誘導体)である。バリアントＢＨＨ４は、さらなる非ヒト配列を誘導しない別のヒト化Ｂ-ｌｙ１バリアントである。バリアントＢ-ＨＨ５、Ｂ-ＨＨ６及びＢ-ＨＨ７は、部分的にヒト化カバットＣＤＲ１領域を有するＢ-ＨＨ２コンストラクトの誘導体である。
【０３２６】
ヒト化Ｂ-ｌｙ１抗体の重要な性質は、Cragg、M.S.及びGlennie, M.J., Blood 103(7):2738-2743(2004年4月)に定義されるＩＩ型抗ＣＤ２０抗体であるということである。その結果、ＣＤ２０に結合した際に、Polyak, M.J.及びDeans, J.P., Blood 99(９):3256-3262(2002)の目的のために記載されたアッセイを用いてＣＤ２０+ヒト細胞の表面からＣＤ２０を非イオン性界面活性剤で抽出することに対する抵抗性を誘導しなかった。Ｃ２Ｂ８抗体(リツキシマブと同一の配列を有する他の抗ＣＤ２０抗体(Ｒｅｆｆに対する米国特許公開2003 0003097号))に比べて、ＣＤ２０の非イオン性界面活性剤抽出に対する有意に低い抵抗性を誘導した。ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体について予期される様に、ヒト化Ｂ-ｌｙ１は、有意な補体媒介性溶解活性を有さず、そしてＣＤ２０抗体Ｃ２Ｂ８(リツキシマブと同一の配列を有するキメラＩｇＧ１)よりずっと低い補体媒介性溶解活性を示した。ヒト化Ｂ-ｌｙ１抗体(バリアント、Ｂ-ＨＨ２、Ｂ-ＫＶ１)の別の重要な性質は、同型凝集アッセイにおいてかなり強力であったということである。このアッセイでは、ＣＤ２０陽性ヒト細胞であるＤａｕｄｉ細胞を、Deansらにより記載される様に、最大２４時間３７℃で５％ＣＯ２雰囲気の哺乳動物細胞インキュベーター内で細胞培地中で、１μｇ/ｍｌの濃度の抗体とインキュベートし、そして並行して５μｇ/ｍｌの濃度の抗体とインキュベートした。比較として、細胞の並行対照インキュベートを抗ＣＤ２０抗体であるＣ２Ｂ８を用いて同一の条件下で行った。異なる時点、例えば８時間及び２４時間のインキュベートで、細胞を顕微鏡を用いて視覚的に調べた。ヒト化Ｂ-ｌｙ１抗体が強力な同型凝集を引き起こすことが発見され、凝集体は、Ｃ２Ｂ８対照抗体の添加により誘導された凝集体よりも有意に大きかった。さらにそして抗-ＣＤ２０ＩＩ型である抗体と一致して、ＣＤ２０陽性細胞がヒト化Ｂ-ｌｙ１抗体とインキュベートされた場合に、同一の条件下でリツキシマブと同一の配列を有するＣ２Ｂ８キメラＩｇＧ１抗体を用いた対照に比べて、高レベルのアポトーシスを誘導した。
【０３２７】
哺乳動物細胞中でＧｎＴＩＩＩグリコシルトランスフェラーゼを抗体遺伝子と共発現させることにより、ヒト化抗体の糖鎖操作バリアントを産生した。WO2004/065540に記載されたように、これは二分岐型非フコシル化オリゴ糖を含む抗体のＦｃ領域に結合された非フコシル化オリゴ糖の分画を増大させる(図１７〜１９)。糖鎖操作された抗体は、糖鎖操作されていない抗体及び対照Ｃ２Ｂ８抗体に比べて、ヒトＦｃγＲＩＩＩ受容体への有意に高いレベルの結合性を有し(図２０)、そして同様に高いＡＤＣＣ活性を有した(図１６)。ヒト化Ｂ-ｌｙ１抗体は、対照Ｃ２Ｂ８抗体に比べて、全血アッセイにおいてヒトＢ細胞の欠乏を誘導する点においてより強力である(図１６)。これは、非糖鎖操作Ｂ-ｌｙ１抗体及びその糖鎖操作バージョンの両方について真実である。糖鎖操作された抗体は、全血アッセイにおいてＢ細胞を消失させる点において、Ｃ２Ｂ８対照抗-ＣＤ２０に比べて約１０００倍強力であった。この比較は、非糖鎖操作及び糖鎖操作されたＢ-ｌｙ１抗体のヒト化形態の両方にとって重要である。なぜなら、混合されたＦｃ受容体依存性活性、例えばＡＤＣＣ＋補体媒介性の溶解＋アポトーシスの誘導において、Ｂ-ｌｙ１の両方の形態がＣ２Ｂ８より有意に強力であったが、Ｂ-ｌｙ１の両方の形態が劇的に低い補体媒介性溶解活性を有したということが示されたからである。ＡＤＣＣ、Ｆｃ受容体依存性細胞障害活性及びアポトーシス誘導は、ヒト化Ｂ-ｌｙ１抗体バリアントの優れた活性で存在した。さらに、アポトーシスアッセイでは、当該ＩＩ型ＣＤ２０抗体の糖鎖操作及び非糖鎖操作形態の両方が強力であり、Ｆｃγ受容体への高い結合親和性を有するＦｃ操作バリアントが、非Ｆｃ操作されたバリアントに比べてアポトーシス誘導の点でさらに強力であり、そして全てのバリアントは、対照抗体Ｃ２Ｂ８よりも有意により強力であった。ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体による高い造血凝集及びアポトーシスの誘導の正確なメカニズムは知られておらず、そしてＣＤ２０陽性細胞の表面上のほかの分子、例えばＦｃγ受容体などへの付随的結合は、この重要な性質に影響できる。その結果、Ｆｃγ受容体、例えばＦｃγＲＩＩＩに対する高い結合親和性、及び付随性のＡＤＣＣ活性の増加についてＦｃ領域を操作されたＩＩ型の抗ＣＤ２０抗体が、非Ｆｃ操作および同型凝集に比べてさらに強力なアポトーシスを誘導できたということを示すことが重要である。標的ＣＤ２０陽性細胞が見られ得るが、ＦｃγＩＩＩ陽性細胞への到達が血液中よりもさらに難しい場所が体内に存在する(例えばリンパ節)。これらの場所では、抗ＣＤ２０抗体自身によるアポトーシスの誘導は、ヒトにおける抗ＣＤ２０抗体による良好な治療に決定的でありうるし、非ホジキンリンパ腫及びＢ細胞慢性リンパ白血病などの血液系腫瘍の治療、並びに、Ｂ細胞欠乏アプローチを介したリューマチ用関節炎及びループスなどの自己免疫疾患の治療の両方に決定的である。ヒト化Ｆｃ操作ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体のＦｃγＲＩＩＩに対する高い結合親和性及び高いＡＤＣＣは、このような治療についてかなり重要な寄与でありうる。最終的に、低減されるか無視できる当該ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、例えばヒト化及びＦｃ操作されたバリアント、の補体媒介性溶解���性は重要でありうる。なぜなら、抗ＣＤ２０抗体による高い補体活性は、不所望の副作用の増加と相関するからである。
【０３２８】
実施例３
アポトーシス活性に影響する更なる試験残基として、ＢＨＨ２重鎖の６個のバリアントＢＨＨ２-Ａ(Ｖ１１Ｌ)(配列番号１２４)、ＢＨＨ２-Ｂ(Ｋ１２Ｖ)(配列番号１２５)、ＢＨＨ２-Ｃ(Ａ９Ｇ)(配列番号１２６)、ＢＨＨ２-Ｄ(Ｅ１０Ｇ)(配列番号１２７)、ＢＨＨ２-Ｅ(Ｔ１１０Ｉ)(配列番号１２８)、及びＢＨＨ２-Ｆ(Ｓ１１２Ｉ)(配列番号１２９)を作成した。これらのバリアント・コンストラクトを、本明細書の上において記載された方法により標的抗原(ＣＤ２０)への結合性について試験した。６個全てのバリアント・コンストラクトは、結合活性を保持した。
【０３２９】
本明細書の上に記載される方法により、これらの重鎖バリアントコンストラクトは、アポトーシス効果について試験された。コンストラクトのうちの５個：ＢＨＨ２-Ｂ、ＢＨＨ２-Ｃ、ＢＨＨ２-Ｄ、ＢＨＨ-２Ｅ、及びＢＨＨ-２Ｆは、ＢＨＨ２親コンストラクトと同じアポトーシス潜在性を有した。しかしながら、アポトーシスを誘導するＢＨＨ２-Ａ(Ｖ１１Ｌ)の能力は、ＢＨＨ２に比べて有意に低下された(図２３を参照のこと)。
【０３３０】
ヒト化Ｂ-ｌｙ１軽鎖(ＢＫＶ１)における１のアミノ酸置換基のアポトーシスの効果は、５個のバリアント：ＢＫＶ-１０(Ｐ４０Ａ)(配列番号１３０)、ＢＫＶ-Ｉｌ(Ａ８０Ｐ)(配列番号１３１)、ＢＫＶ-１２(Ｖ８３Ｆ)(配列番号１３２)、ＢＫＶ-１３(Ｅ１０５Ａ)(配列番号１３３)、及びＢＫＶ-１４(Ｉ１０６Ａ)(配列番号１３４)の生成を通して試験した。ＢＫＶ-１１、ＢＫＶ-１２、ＢＫＶ-１３、及びＢＫＶ-１４のコンストラクトを、本明細書の上に記載された方法により、標的抗原(ＣＤ２０)への結合性について試験した。これらの４個の軽鎖バリアントコンストラクトは、本明細書の上に記載される方法によりアポトーシス効果について試験された。ＢＫＶ-１１、ＢＫＶ１２、及びＢＫＶ-１３のアポトーシス能力は、それぞれの置換によって変化しなかった。しかしながら、ＢＫＶ-１４は、ＢＫＶ１に比べてアポトーシスを誘導する能力を低減した(例えば、図２５を参照のこと)。
【０３３１】
本明細書において言及された全ての教科書、論文記事、ＧｅｎＢａｎｋ、及び出願公開、及び特許出願は、各々個別の公開又は特許出願が具体的かつ個別に言及されるのと同程度に本明細書に援用される。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図１】
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【図２６】
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【配列表】
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