(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合する、単離された、組換え型の、または精製された抗体であって、
（ｉ）（ａ）配列番号４２からなる第１の可変領域と、（ｂ）配列番号４４からなる第２の可変領域；または、
（ｉｉ）（ａ）配列番号４３からなる第１の可変領域と、（ｂ）配列番号４５からなる第２の可変領域；または、
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号４２からなる第１の可変領域と、（ｂ）配列番号４６からなる第２の可変領域
を含んでなる、抗体。
【請求項２】
前記ＣＳＦ−１Ｒが、ヒトＣＳＦ−１Ｒである、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
（ａ）配列番号３７からなる重鎖と、（ｂ）配列番号３９からなる軽鎖とを含んでなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
（ａ）配列番号３８からなる重鎖と、（ｂ）配列番号４０からなる軽鎖とを含んでなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
（ａ）配列番号３７からなる重鎖と、（ｂ）配列番号４１からなる軽鎖とを含んでなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、抗原結合フラグメントまたはダイアボディーである、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体をコードする、核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸を含んでなる、ベクター。
【請求項９】
プラスミドまたはウイルス起源である、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
ウイルス起源であり、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、泡沫状ウイルスまたはアデノウイルス随伴ウイルスに由来する、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
前記ポックスウイルスが、ワクシニアウイルスまたはカナリア痘ウイルスである、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
前記ワクシニアウイルスが、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）である、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項７に記載の核酸を含んでなる、細胞。
【請求項１４】
真核細胞である、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
前記真核細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
前記哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはベビーハムスター（ＢＨＫ）細胞である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体を製造する方法であって、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の細胞を、前記抗体の発現を可能とする条件下で培養すること、および、前記細胞または前記細胞の周囲の培地から前記抗体を精製することを含んでなる、方法。
【請求項１８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体と、薬学上許容される担体とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１９】
請求項７に記載の核酸と、薬学上許容される担体とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項２０】
請求項８〜１２のいずれか一項に記載のベクターと、薬学上許容される担体とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項２１】
薬剤として使用される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２２】
薬剤として使用される、請求項７に記載の核酸。
【請求項２３】
薬剤として使用される、請求項８〜１２のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２４】
薬剤として使用される、請求項１８〜２０に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
癌、破骨細胞活性の増強に関連する疾患、炎症性疾患および関節リウマチからなる群から選択される疾患の治療に用いられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２６】
癌、破骨細胞活性の増強に関連する疾患、炎症性疾患および関節リウマチからなる群から選択される疾患の治療に用いられる、請求項７に記載の核酸。
【請求項２７】
癌、破骨細胞活性の増強に関連する疾患、炎症性疾患および関節リウマチからなる群から選択される疾患の治療に用いられる、請求項８〜１２のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２８】
癌、破骨細胞活性の増強に関連する疾患、炎症性疾患および関節リウマチからなる群から選択される疾患の治療に用いられる、請求項１８〜２０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年３月１１日出願のＰＣＴ／ＥＰ２００９／００１７３３に基づく米国国内段階出願であり、また、２００８年３月１４日出願の欧州特許出願第０８３６０００５．６の優先権および２００８年４月１０日出願の米国仮出願第６１／０４３，８８４号の利益を主張する、２０１０年９月１３日出願の米国特許出願第１２／９２２，４４１号の一部継続出願である。
【０００２】
配列表
本出願はＥＦＳ−Ｗｅｂにより提出された配列表を含み、引用することによりその全内容を本明細書の一部とする。２０１１年３月３０日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーのファイル名は１３０２６９４４．ｔｘｔであり、５６，７６４バイトのサイズである。
【０００３】
説明
ＣＳＦ−１（コロニー刺激因子−１）は、様々な細胞種によって個々に発現されるサイトカインである。サイトカインは、ＣＳＦ−１の受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）を発現する単核食細胞系譜の細胞に対する分化、増殖および生存因子である(SHERR. Colony-stimulating factor-1 receptor. blood. 1990, vol.75, no.1, p.1-12)。ＣＳＦ−１Ｒは、細胞内キナーゼドメインと、５つの免疫グロブリン様サブドメインに組織化されたリガンド結合細胞外領域とを含有するｃ−ｆｍｓ癌原遺伝子によりコードされているチロシンキナーゼ受容体である。ＣＳＦ−１に対する応答は、生存、増殖、分化の増大、および機能の可逆的変化をもたらす。ｃ−ｆｍｓ遺伝子はそれ自体、マクロファージ分化マーカーである。ｃ−ｆｍｓの発現程度は、リゾチームおよびマクロファージ特異的タンパク質チロシンホスファターゼを含む、他のマクロファージ特異的遺伝子よりも強い(HUME, et al. Regulation of CSF-1 receptor expression. Molecular reproduction and development. 1997, vol.46, no.1, p.46-52)。
【０００４】
単核食細胞系譜の細胞の他、ＣＳＦ−１Ｒは、多くのヒト腫瘍種によっても発現される。乳癌では、ＣＳＦ−１Ｒの発現は、腫瘍サイズの増大および生存の低下に関連している(KLUGER, et al. Macrophage colony-stimulating factor-1 receptor expression is associated with poor outcome in breast cancer by large cohort tissue microarray analysis. Clinical cancer research. 2004, vol.10, no.1, p.173-7; SCHOLL, et al. Anti-colony-stimulating factor-1 antibody staining in primary breast adenocarcinomas correlates with marked inflammatory cell infiltrates and prognosis. Journal of the National Cancer Institute. 1994, vol.86, no.2, p.120-6）。上皮性卵巣癌では、大部分の原発腫瘍および転移がＣＳＦ−１Ｒを強く発現し、転移はＣＳＦ−１とＣＳＦ−１Ｒを共発現する場合が多い。ＣＳＦ−１Ｒはまた、腫瘍浸潤マクロファージによっても発現される(CHAMBERS, et al. Overexpression of epithelial macrophage colony-stimulating factor (CSF-1) and CSF-1 receptor: a poor prognostic factor in epithelial ovarian cancer, contrasted with a protective effect of stromal CSF-1. Clinical Cancer Research. 1997, vol.3, no.6, p.999-1007)。卵巣癌および子宮内膜癌では、ノーザンブロット分析によれば、腫瘍の大多数がＣＳＦ−１とＣＳＦ−１Ｒを共発現するが、ＣＳＦ−１Ｒ発現は正常子宮内膜組織サンプルでは弱く検出されるに過ぎないことが示される(BAIOCCHI, et al. Expression of the macrophage colony-stimulating factor and its receptor in gynecologic malignancies. Cancer. 1991, vol.67, no.4, p.990-6)。子宮頚癌では、ＣＳＦ−１Ｒ発現は、正常子宮内膜に比べて腫瘍間質および腫瘍上皮の双方でアップレギュレートされている(KIRMA, et al. Elevated expression of the oncogene c-fms and its ligand, the macrophage colony-stimulating factor-1, in cervical cancer and the role of transforming growth factor-beta1 in inducing c-fms expression. Cancer res.. 2007, vol.67, no.5, p.1918-26)。腎臓癌では、高レベルのＣＳＦ−１Ｒを発現する腫瘍関連マクロファージの浸潤が腫瘍の進行に関連している(HEMMERLEIN, et al. Expression of acute and late-stage inflammatory antigens, c-fms, CSF-1, and human monocytic serine esterase 1, in tumor-associated macrophages of renal cell carcinomas. Cancer immunology, immunotherapy. 2000, vol.49, no.9, p.485-92)。ＣＳＦ−１Ｒは、１００％に近い前立腺上皮内新生物または癌サンプルにより発現される(IDE, et al. Expression of colony-stimulating factor 1 receptor during prostate development and prostate cancer progression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002, vol.99, no.22,
p.14404-9)。ＣＳＦ−１Ｒ発現はまた、急性骨髄芽球性白血病およびＢ細胞慢性リンパ球性白血病においても検出されている(RAMBALDI, et al. Expression of the macrophage colony-stimulating factor and c-fms genes in human acute myeloblastic leukemia cells. Journal of Clinical Investigation. 1988, vol.81, no.4, p.1030-5)。
【０００５】
免疫組織化学およびin situハイブリダイゼーションによって行われた研究では、浸潤性乳癌細胞におけるＣＳＦ−１発現の特異性が示されたが、このような生産は乳管内のまたは非浸潤性の腫瘍細胞には見られない(SCHOLL, et al. Anti-colony-stimulating factor-1 antibody staining in primary breast adenocarcinomas correlates with marked inflammatory cell infiltrates and prognosis. Journal of the National Cancer Institute. 1994, vol.86, no.2, p.120-6; TANG, et al. M-CSF (monocyte colony stimulating factor) and M-CSF receptor expression by breast tumor cells: M-CSF mediated recruitment of tumor infiltrating monocytes?. Journal of cellular biochemistry. 1992, vol.50, no.4, p.350-6)。浸潤性腫瘍細胞によるＣＳＦ−１の生産は、患者の血漿中のその濃度の上昇と相関があり、正常被験体の３００ｐｇ／ｍｌ未満に比べて、１０００ｐｇ／ｍｌを超える場合がある。高い血清濃度は疾患の進行性病期および好ましくない短い予後と相関がある(SCHOLL, et al. Circulating levels of colony-stimulating factor 1 as a prognostic indicator in 82 patients with epithelial ovarian cancer. British journal of cancer. 1994, vol.69, no.2, p.342-6; SCHOLL. Circulating levels of the macrophage colony stimulating factor CSF-1 in primary and metastatic breast cancer patients. A pilot study. Breast cancer research and treatment. 1996, vol.39, no.3, p.275-83)。さらに、ＣＳＦ−１は腫瘍細胞の移動性および浸潤性を刺激することも示されている(DORSCH, et al. Macrophage colony-stimulating factor gene transfer into tumor cells induces macrophage infiltration but not tumor suppression. European journal of immunology. 1993, vol.23, no.1, p.186-90; WANG, et al. Induction of monocyte migration by recombinant macrophage colony-stimulating factor. Journal of immunology. 1988, vol.141, no.2, p.575-9; FILDERMAN, et al. Macrophage colony-stimulating factor (CSF-1) enhances invasiveness in CSF-1 receptor-positive carcinoma cell lines. Cancer res.. 1992, vol.52, no.13, p.3661-6)。
【０００６】
ＣＳＦ−１はまた、骨髄系の前駆体に走化作用を有し、腫瘍において単球の浸潤を促進する。しかしながら、これらの単球の存在は、免疫系による腫瘍の破壊を見るに十分なものではない(DORSCH, et al. Macrophage colony-stimulating factor gene transfer into tumor cells induces macrophage infiltration but not tumor suppression. European journal of immunology. 1993, vol.23, no.1, p.186-90)。乳房、卵巣または膵臓の腫瘍に苦しむ患者に共通して見られる高血清含量において、ＣＳＦ−１は、これらの単球の分化を、腫瘍抗原を提示することができ従って腫瘍細胞に対して有効な細胞傷害性免疫応答を誘導することができる樹状細胞ではなくマクロファージへ向けるものと思われる(SCHOLL. Circulating levels of the macrophage colony stimulating factor CSF-1 in primary and metastatic breast cancer patients. A pilot study. Breast cancer research and treatment. 1996, vol.39, no.3, p.275-83; BARON, et al. Modulation of MHC class II transport and lysosome distribution by macrophage-colony stimulating factor in human dendritic cells derived from monocytes. Journal of cell science. 2001, vol.114, no.pt5, p.999-1010)。
【０００７】
ＣＳＦ−１はまた、破骨細胞の増殖および分化にも不可欠である(CECCHINI, et al. Role of CSF-1 in bone and bone marrow development. Molecular reproduction and development. 1997, vol.46, no.1, p.75-83)。破骨細胞は、骨の発達、ホメオスタシスおよび修復の際に無機質化した骨の分解を主要に担う造血系前駆体に由来し、ＣＳＦ−１Ｒを発現する多核細胞である。骨粗鬆症、悪性の高カルシウム血症、関節リウマチ、腫瘍転移およびパジェット病などの種々の骨格疾患では、破骨細胞による骨吸収が骨芽細胞による骨形成を上回り、骨量の減少、骨格の脆弱性および骨折をもたらす(BRUZZANITI, et al. Molecular regulation of osteoclast activity. Reviews in endocrine. 2006, vol.7, no.1-2, p.123-39)。例えば、進行性乳癌患者は頻繁に骨への転移を起こす。骨転移は難治性疼痛、および破骨細胞活性の増大により引き起こされる腫瘍由来の骨欠損（骨溶解）による骨折の高いリスクをもたらす(CICEK, et al. Breast cancer bone metastasis and current small therapeutics. Cancer metastasis reviews. 2006, vol.25, no.4, p.635-44)。骨溶解は高レベルの循環ＣＳＦ−１と連関していることが示されている(KITAURA, et al. The journal of clinical investigation. M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis. 2005, vol.115, no.12, p.3418-27)。
【０００８】
また、ＣＳＦ−１経路は、炎症性腸疾患などの疾患における腸管炎症の媒介(MARSHALL, et al. Blockade of colony stimulating factor-1 (CSF-I) leads to inhibition of DSS-induced colitis. Inflammatory bowel diseases. 2007, vol.13, no.2, p.219-24)、急性同種移植片拒絶の際のマクロファージ増殖の媒介(JOSE, et al. Blockade of macrophage colony-stimulating factor reduces macrophage proliferation and accumulation in renal allograft rejection. American journal of transplantation. 2003, vol.3, no.3, p.294-300)、および感染マクロファージにおけるＨＩＶ−１複製(KUTZA, et al. Macrophage colony-stimulating factor antagonists inhibit replication of HIV-1 in human macrophages. Journal of immunology. 2000, no.164, p.4955-4960)にも関連している。
【０００９】
これらの理由から、癌および骨分解の治療のために種々の化合物によるＣＳＦ−１活性の阻害が提案された。
【背景技術】
【００１０】
ＷＯ０１／３０３８１は、腫瘍疾患の治療のための薬剤の製造におけるＣＳＦ−１活性の阻害剤の使用に関する。ＣＳＦ−１活性の阻害のために提案される２つのアプローチは、ＣＳＦ−１活性自体の抑制とＣＳＦ−１Ｒ活性の抑制である。ＣＳＦ−１またはその受容体に対する中和抗体は、ＣＳＦ−１活性の阻害剤として好ましい。
【００１１】
ＷＯ０３／０５９３９５には、ＣＳＦ−１活性を阻害することができる物質と癌治療のための細胞傷害活性を有する物質とを含んでなる組合せ製剤が記載されている。
【００１２】
ＷＯ２００５／０６８５０３には、被験体にＣＳＦ−１に対する抗体投与することにより、骨溶解、癌転移および癌転移に関連する骨欠損を予防および治療するための方法が開示されている。
【００１３】
ＥＰ１４８８７９２Ａは、ＣＳＦ−１Ｒチロシンキナーゼ活性を効果的に阻害することにより、分化、増殖またはメディエーターの放出の選択的阻害を示す単環式および／もしくは二環式アリールまたはヘテロアリールキナゾリン化合物の使用に関する。この出願はまた、異常な細胞増殖の阻害を目的とする薬剤の製造のためのこのような化合物の使用に関する。
【００１４】
ＵＳ２００５０５９１１３は、ａＣＳＦ−１と特異的に結合する抗体およびその抗原結合部分に関する。この発明はまた、ヒト抗ＣＳＦ−１抗体およびその抗原結合部分に関する。この出願の発明はまた、ヒト抗ＣＳＦ−１抗体を含んでなる重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子を用いる遺伝子療法を提供する。
【００１５】
Roussel and Sherr, 1989, PNAS, 86, 7924-7927およびAshmun et al., 1989, Blood, 73, 827-837は、ヒト受容体に対するＣＳＦ−１の結合を特異的に遮断し、それにより、リガンド依存性増殖を阻害する、ヒトＣＳＦ−１受容体に対するモノクローナル抗体（例えば、１２−３Ａ３および２−４Ａ５）を開示している。認識されるエピトープは、アミノ酸３４９番〜５１２番の間に位置していた。
【００１６】
ＷＯ２００９／０２６３０３は、ＣＳＦ−１と競合することができる、従って、ＣＳＦ−１がその受容体と結合するのを防ぐことができる、特定の実施形態では、ＩＬ−３４とＣＳＦ−１Ｒの間の結合を阻害することができる、抗原結合タンパク質を提供する。さらに、ＷＯ２００９／０２６３０３の実験の節は、この発明者らによって開発された抗体が、ＣＳＦ−１Ｒの主としてＮ末端、すなわち、配列番号２９のアミノ酸２０番〜２２３番の間に位置する結合エピトープ（ＷＯ２００９／０２６３０３ではＩｇ様ループ１およびＩｇ様ループ２に相当する）であり、Ｉｇ様ループ１領域とＩｇ様ループ２領域の双方の存在を必要とすることを示す。
【発明の概要】
【００１７】
発明の開示
本発明は、ＣＳＦ−１Ｒと、より具体的には、ヒトＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合する抗体に関する。
【００１８】
出願全体を通して使用される用語「ａ」および「ａｎ」は、文脈がそうではないことを明示しない限り、それらが「少なくとも１つの」、「少なくとも第１の」、「１以上の」または「複数の」示された成分または工程を意味する場合の意味において用いられる。例えば、用語「細胞」には、複数の細胞が含まれ、その混合物が含まれる。
【００１９】
用語「および／または」は、本明細書で用いられる場合にはいつも、「および」、「または」、および「前記用語により結ばれている要素の総てまたは任意の他の組合せ」を含む。
【００２０】
本明細書において用語「約」または「およそ」は、所与の値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。
【００２１】
本明細書において、用語「含んでなる」は、パーツのキット、製品、組成物および方法が、示されている成分または工程を含むが、他を排除するものではないことを意味するものとする。「から本質的になる」とは、製品、組成物および方法を定義するために用いられる場合、任意の本質的に重要な他の成分または工程を排除することを意味するものとする。よって、列挙された成分から本質的になる組成物は、微量の混入物および薬学上許容される担体を排除するものではない。「からなる」とは、微量要素とは言えない他の成分または工程を排除することを意味するものとする。
【００２２】
本明細書において、用語「特異的に結合する」とは、タンパク質およびその他の生物製品のヘテロな集団の存在下で標的タンパク質の存在の決定因となる結合反応を意味する。よって、示されたアッセイ条件下で、本発明による抗体は、ＣＳＦ−１Ｒの少なくとも一部と優先的に結合し、試験サンプル中に存在する他の成分とは有意な量では結合しない。本発明による抗体とＣＳＦ−１Ｒ標的との特異的結合は、結合親和性が少なくとも１０３Ｍ−１、好ましくは１０５Ｍ−１、１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１または１０１０Ｍ−１であることを意味する。特に有利な実施形態では、結合親和性は少なくとも１０９Ｍ−１または１０１０Ｍ−１である。
【００２３】
本明細書において、用語「ＣＳＦ−１Ｒ」は、ヒトＣＳＦ１受容体を意味する。ヒトＣＳＦ−１受容体は配列決定されており、そのアミノ酸配列は配列番号２９で示される。
【００２４】
本明細書において、「抗体」または「Ａｂ」は、最も広い意味で使用される。よって、「抗体」または「Ａｂ」は、天然に存在するものであってもよいし、または従来のハイブリドーマ技術、組換え技術により生産されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）および／もしくはその機能的フラグメントなどの人工のものであってもよい。本発明の抗体は、完全な免疫グロブリン分子、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、単一特異性抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、動物抗体（例えば、ラクダ抗体）、キメラ抗体、ならびにその一部、フラグメント、領域、ペプチドおよび誘導体（限定されるものではないが、酵素的切断、ペプチド合成または組換え技術などの公知の任意の技術によって提供される）（例えば、軽鎖を欠く免疫グロブリン（例えば、米国特許第６，００５，０７９号参照）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、抗体フラグメント、ダイアボディー、Ｆｄ、ＣＤＲ領域、または抗原もしくはエピトープと結合し得る抗体の任意の一部もしくはペプチド配列）の双方を含むものとする。抗体は、分子と特異的に相互作用し、それによりその分子を抗体に結合させることができる場合、その分子と「結合し得る」と言われる。抗体フラグメントまたは一部は完全抗体のＦｃフラグメントを欠いてもよく、完全抗体よりも、急速に循環から排除され、より低い非特異的組織結合を示し得る。抗体の例は、当技術分野で周知の方法を用い、例えば、パパイン（Ｆａｂフラグメントを作製するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを作製するため（例えば、Wahl et al., 24 J. Nucl. Med. 316-25 (1983)参照）などの酵素を用いたタンパク質分解切断により、完全抗体から作製することができる。抗体の一部は上記方法のいずれによって作製してもよく、または組換え分子の一部を発現させることによって作製してもよい。例えば、組換え抗体のＣＤＲ領域を単離し、適当な発現ベクターにサブクローニングすればよい。
【００２５】
本明細書において、用語「可変領域」は、結合認識特異性の決定因子を含む軽鎖（ＶＬ）または重鎖（ＶＨ）の可変領域またはドメインを意味する。可変ドメインは抗原認識に関与し、抗原結合部位を形成する。本明細書において、用語「フレームワーク領域」とは、同じ種の異なる抗体間で少なくとも８５％相同な（すなわち、ＣＤＲ以外の）軽鎖および重鎖可変領域の一部を意味する。本明細書において、用語「相同な」とは、Smith-Watermanアルゴリズム(SMITH, et al. Identification of common molecular subsequences. Journal of Molecular Biology. 1981, no.147, p.195-7)を用いてアラインメントした際におよそ示されたパーセンテージの同一アミノ酸を有する２つのポリペプチドのアミノ酸の比較を意味する。例えば、「８５％相同」とは、最適なアラインメントを行った際に８５％のアミノ酸同一性を有する２つのポリペプチドのアミノ酸の比較を意味する。重鎖および軽鎖双方の可変領域は、Ｋａｂａｔのデータベース(Kabat et al., 前掲)に定義される、超可変配列の３つのストレッチ、すなわち相補性決定領域（ＣＤＲ）により隔てられた４つのフレームワークサブ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を含んでなるセグメントに分けられ、ＣＤＲ１はＦＲ１とＦＲ２の間に位置し、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３の間に位置し、ＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４の間に位置する。他者らが称するフレームワーク領域は、これらの特定の部分領域をＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４で示さずに、単一の天然免疫グロブリン鎖の可変領域内のＦＲを合わせたものを表す。本明細書においては、単数のＦＲは、４つの部分領域のうちの１つを表し、複数のＦＲはフレームワーク領域を構成する４つの部分領域のうちの２以上を表す。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域は、構成要素である軽鎖および重鎖のフレームワーク領域を合わせたものであり、これらのＣＤＲを配置し、整列させる働きをする。ＣＤＲは、抗原のエピトープに対する結合特異性および親和性を付与する、抗体の結合部位を形成するのに主要な役割を果たす。抗原結合領域を提供するＨ鎖またはＬ鎖の可変領域内には、特異性の異なる抗体の間で極めて変動性が高いために「超可変」と呼ばれる小さな配列がある。このような超可変領域はまた、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」領域とも呼ばれる。これらのＣＤＲ領域は、特定の抗原決定基構造の抗体の塩基の特異性を説明する。ＣＤＲは可変領域内の不連続のアミノ酸ストレッチを表すが、種によらず、可変重鎖領域および軽鎖領域内のこれらの重要なアミノ酸配列の位置は、可変鎖のアミノ酸配列内でも同様の位置を有することが判明した。総ての抗体の可変重鎖および軽鎖はそれぞれ３つのＣＤＲ領域を有し、それぞれは個々の軽（Ｌ）鎖および重（Ｈ）鎖に関して他のものとは不連続である（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３と呼ばれる）。受け入れられているＣＤＲ領域は、Kabat et al, 252 J. Biol. Chem. 6609-16 (1977)により記載されており、ＣＤＲループは、直鎖アミノ酸配列を調べている際にこれらのルールを適用することによって同定することができる。ＣＤＲ−Ｈ３ループを定義するためのルールは様々であり得るが（Chapter 4, Antibody Engineering: Methods & Protocols, (Lo, ed. Humana Press, Totowa, NJ, 2004)参照)、いくつかのＣＤＲ−Ｈ３ループの実際の境界は、円偏光二色性、核磁気共鳴、またはＸ線結晶学などの実験技術なしには同定し得ない。哺乳動物種では総て、抗体ペプチドは定常（すなわち、保存性の高い）領域と可変領域を含み、後者の中に、ＣＤＲと、重鎖または軽鎖の可変領域内でＣＤＲ外のアミノ酸配列からなるいわゆる「フレームワーク領域」とが存在する。ＣＤＲ領域は、Ｃｈｏｔｈｉａ命名法(CHOTHIA and LESK. Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins (1987) J Mol Biol. 1987 Aug 20;196(4):901-17)を用いて定義することもできる。よって、特定の実施形態では、ＣＤＲはＫａｂａｔにより定義されるＣＤＲであり、他の実施形態では、ＣＤＲはＣｈｏｔｈｉａにより定義されるＣＤＲである。抗体のＣＤＲ領域により認識される抗原決定基に関して、これは「エピトープ」とも呼ばれる。言い換えれば、エピトープは、抗体により認識されて、抗体が結合し得る分子の一部を意味する（対応する抗体結合領域はパラトープと呼ばれ得る）。一般に、エピトープは、分子の、化学的に活性な表面群、例えば、アミノ酸または糖側鎖からなり、特定の三次元構造的特徴ならびに特定の電荷特徴を有する。
【００２６】
本明細書において、用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」は、単一のクローンに由来する抗体を意味する。モノクローナル抗体は、HARLOW. Antibodies: A Laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor: Laboratory press, 1988およびHAMMERLING, et al. Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas. New York: Elsevier, 1981. p.563-681に開示されているものなどのハイブリドーマ法を用いて作製することができる。
【００２７】
本明細書において、用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来するか、またはその配列と密接に適合する可変領域および定常領域を有する抗体を意味する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によりコードされていないアミノ酸残基（例えば、in vitroではランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発により、またはin vivoでは体細胞突然変異により導入される突然変異）を含み得る。よって、本明細書において、用語「ヒト抗体」は、タンパク質の実質的に総ての部分がヒト生殖細胞系抗体と実質的に類似する抗体を意味する。「実質的に類似する」とは、ヒト生殖細胞系抗体の核酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、いっそうより好ましくは９５％相同な核酸配列を有する抗体を意味する。
【００２８】
本明細書において、用語「Ｆａｂ」とは、重鎖および軽鎖の可変領域を含み、かつ、結合活性を示す、抗体分子の領域を意味する。「Ｆａｂ」は、１本の重鎖と１本の軽鎖の凝集物（一般にＦａｂとして知られる）を含み、上記はいずれも、その凝集物が特定の抗原または抗原ファミリーと選択的に反応し得る限り、共有結合的凝集物であっても非共有結合的凝集物であってもよい。Ｆａｂフラグメントは、ＶＬと、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを含んでなる第２のポリペプチドとを含んでなるヘテロ二量体である。好ましい実施形態では、抗体はＦａｂ’フラグメントである。Ｆａｂ’フラグメントは、Ｆａｂ’フラグメントが、抗体「ヒンジ領域」由来の１以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数残基を含むことで、Ｆａｂフラグメントと異なる。
【００２９】
「Ｆ（ａｂ’）２」は、抗体のペプシン処理により得られる抗体フラグメント、または組換え技術などの他の技術により得られる同等のタンパク質を意味する。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、２つの抗原結合位を有しており抗原を架橋することができる。
【００３０】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、非共有結合的に強固に会合した１本の重鎖と１本の軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この構成において各可変ドメインの３つのＣＤＲは相互作用して、ＶＨ  ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定義する。これら６つのＣＤＲが一緒になって、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）であっても、完全結合部位より親和性は低いが、抗原を認識して、それと結合する能力を有する。
【００３１】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含んでなり、この場合、これらのドメインは単一のポリペプチドに存在する。好ましくは、ｓｃＦｖは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含んでなり、これにより、ｓｃＦｖに抗原結合に望ましい構造を形成させることができる(LENNARD. Standard protocols for the construction of scFv libraries. Methods in molecular biology. 2002, no.178, p.59-71)。
【００３２】
本明細書において、用語「抗体フラグメント」は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上のフラグメントを意味する。
【００３３】
「ダイアボディー」とは、２つの抗原結合部位を有する小抗体フラグメントを意味し、このフラグメントは同じポリペプチド鎖内に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ  ＶＬ）を含んでなる。同じ鎖のこれら２つのドメインの間で対合を可能とするには短いリンカーを使用することで、これらのドメインは別の鎖の相補的ドメインとの対合を余儀なくされ、２つの抗原結合部位が作出される。ダイアボディーは１つまたは２以上のエピトープと結合し得る。ダイアボディーは、POLJAK. Production and structure of diabodies. Structure. 1994, vol.2, no.12, p.1121-3、HUDSON, et al. High avidity scFv multimers; diabodies and triabodies. Journal of immunological methods. 1999, vol.231, no.1-2, p.177-89およびKIPRIYANOV. Generation of bispecific and tandem diabodies. Methods in molecular biology. 2002, no.178, p.317-31に十分に記載されている。
【００３４】
抗体フラグメントの生産のために種々の技術が開発されている。従来、これらのフラグメントは完全抗体のタンパク質分解性消化により誘導されていた。しかしながら、これらのフラグメントは、現在、組換え宿主細胞により直接生産することができる。Ｆａｂ、ＦｖおよびｓｃＦｖ抗体フラグメントは総て、大腸菌(E. coli)で発現させて大腸菌から分泌させることができ、従って、大量のこれらのフラグメントを生産することができる。抗体フラグメントの生産のための技術は、当業者には明らかである。他の実施形態では、選択される抗体は一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。
【００３５】
本明細書において「ドメイン抗体」（ｄＡｂ）は、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）または軽鎖（ＶＬ）可変領域のいずれかに相当する、抗体の最小の機能的結合単位からなる。ドメイン抗体は、およそ１３ｋＤａの分子量、すなわち、完全抗体の１０分の１未満の大きさを有する。
【００３６】
本明細書において、「Ｆｄ」は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる抗体フラグメントを意味する。
【００３７】
用語「抗体」または「Ａｂ」はまた、当業者に周知の他の抗体フラグメント、例えば、HOLLIGER, et al. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature biotechnology. 2005, vol.23, no.9, p.1126-36およびHOOGENBOOM, et al. Natural and designer binding sites made by phage display technology. Immunology today. 2000, vol.21, no.8, p.371-8に記載されているものも意味する。
【００３８】
一実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、
（ｉ）配列番号２の４５番で始まり５４番で終わる配列、配列番号２の６６番で始まり８７番で終わる配列、もしくは配列番号２の１１７番で始まり１２６番で終わる配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸を含んでなる、少なくとも１つのＣＤＲ、
または
（ｉｉ）配列番号４の４４番で始まり５６番で終わる配列、配列番号４の６６番で始まり７６番で終わる配列、または配列番号４の１０９番で始まり１１７番で終わる配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸を含んでなる、少なくとも１つのＣＤＲ
を含んでなる。
【００３９】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、少なくとも１つのＣＤＲを含んでなり、前記ＣＤＲは、
・配列番号２の４５番で始まり５４番で終わる配列、
・配列番号２の６６番で始まり８７番で終わる配列、
・配列番号２の１１７番で始まり１２６番で終わる配列、
・配列番号４の４４番で始まり５６番で終わる配列、
・配列番号４の６６番で始まり７６番で終わる配列、または
・配列番号４の１０９番で始まり１１７番で終わる配列
の少なくとも５個の連続するアミノ酸を含んでなるＣＤＲの群から互いに独立に選択される。
【００４０】
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、２、３、４または５つ、いっそうより好ましくは、６つのＣＤＲを含んでなり、前記ＣＤＲは、
・配列番号２の４５番で始まり５４番で終わる配列、
・配列番号２の６６番で始まり８７番で終わる配列、
・配列番号２の１１７番で始まり１２６番で終わる配列、
・配列番号４の４４番で始まり５６番で終わる配列、
・配列番号４の６６番で始まり７６番で終わる配列、または
・配列番号４の１０９番で始まり１１７番で終わる配列
の少なくとも５個の連続するアミノ酸を含んでなるＣＤＲの群から互いに独立に選択される。
【００４１】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、
（ｉ）
・配列番号２の４５番で始まり５４番で終わる配列、
・配列番号２の６６番で始まり８７番で終わる配列、もしくは
・配列番号２の１１７番で始まり１２６番で終わる配列
少なくとも５個の連続するアミノ酸を含んでなるＣＤＲの群から互いに独立に選択される２つ、いっそうより好ましくは、３つのＣＤＲ、または
（ｉｉ）
・配列番号４の４４番で始まり５６番で終わる配列、
・配列番号４の６６番で始まり７６番で終わる配列、もしくは
・配列番号４の１０９番で始まり１１７番で終わる配列
の少なくとも５個の連続するアミノ酸を含んでなるＣＤＲの群から互いに独立に選択される、２つ、いっそうより好ましくは、３つのＣＤＲ
を含んでなる。
【００４２】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、
（ｉ）
・配列番号の４５番で始まり５４番で終わる配列、
・配列番号２の６６番で始まり８７番で終わる配列、および
・配列番号２の１１７番で始まり１２６番で終わる配列
で示されるＣＤＲの群から互いに独立に選択される少なくとも１つのＣＤＲ、または
（ｉｉ）
・配列番号４の４４番で始まり５６番で終わる配列、
・配列番号４の６６番で始まり７６番で終わる配列、および
・配列番号４の１０９番で始まり１１７番で終わる配列
で示されるＣＤＲの群から互いに独立に選択される少なくとも１つのＣＤＲ
を含んでなる。
【００４３】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、
・配列番号２の４５番で始まり５４番で終わる配列、
・配列番号２の６６番で始まり８７番で終わる配列、
・配列番号２の１１７番で始まり１２６番で終わる配列、
・配列番号４の４４番で始まり５６番で終わる配列、
・配列番号４の６６番で始まり７６番で終わる配列、および
・配列番号４の１０９番で始まり１１７番で終わる配列
で示されるＣＤＲの群から互いに独立に選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる。
【００４４】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、
・配列番号２の４５番で始まり５４番で終わる配列、
・配列番号２の６６番で始まり８７番で終わる配列、
・配列番号２の１１７番で始まり１２６番で終わる配列、
・配列番号４の４４番で始まり５６番で終わる配列、
・配列番号４の６６番で始まり７６番で終わる配列、および
・配列番号４の１０９番で始まり１１７番で終わる配列
で示されるＣＤＲの群から互いに独立に選択される２、３、４または５つ、いっそうより好ましくは、６つのＣＤＲを含んでなる。
【００４５】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、
（ｉ）
・配列番号２の４５番で始まり５４番で終わる配列、
・配列番号２の６６番で始まり８７番で終わる配列、
・配列番号２の１１７番で始まり１２６番で終わる配列
で示されるＣＤＲの群から互いに独立に選択される２つ、いっそうより好ましくは、３つのＣＤＲ、または
（ｉｉ）
・配列番号４の４４番で始まり５６番で終わる配列、
・配列番号４の６６番で始まり７６番で終わる配列、
・配列番号４の１０９番で始まり１１７番で終わる配列
で示されるＣＤＲの群から互いに独立に選択される、２つ、いっそうより好ましくは、３つのＣＤＲ
を含んでなる。
【００４６】
一実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、（ｉ）配列番号１１、１２もしくは１３のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含んでなる少なくとも１つのＣＤＲ、または（ｉｉ）配列番号１４、１５もしくは１６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含んでなる少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる。
【００４７】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、配列番号１１、１２、１３、１４、１５または１６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含んでなる少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる。
【００４８】
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、配列番号１１、１２、１３、１４、１５または１６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含んでなる２、３、４、５つ、いっそうより好ましくは、６つのＣＤＲを含んでなる。
【００４９】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、（ｉ）配列番号１１、１２もしくは１３のいずれか１つで示される少なくとも１つのＣＤＲ、または（ｉｉ）配列番号１４、１５もしくは１６のいずれか１つで示される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる。
【００５０】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、配列番号１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６のいずれか１つで示される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる。
【００５１】
好ましい一実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、配列番号１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６のいずれか１つで示される２、３、４、５つ、いっそうより好ましくは、６つのＣＤＲを含んでなる。
【００５２】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、ｉ）配列番号１７、１８もしくは１９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含んでなる少なくとも１つのＣＤＲ、または（ｉｉ）配列番号２０、２１もしくは２２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含んでなる少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる。
【００５３】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、配列番号１７、１８、１９、２０、２１または２２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含んでなる少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる。
【００５４】
好ましい一実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、配列番号１７、１８、１９、２０、２１または２２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含んでなる２、３、４、５つ、いっそうより好ましくは、６つのＣＤＲを含んでなる。
【００５５】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、（ｉ）配列番号１７、１８もしくは１９のいずれか１つで示される少なくとも１つのＣＤＲ、または（ｉｉ）配列番号２０、２１もしくは２２のいずれか１つで示される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる。
【００５６】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、配列番号１７、１８、１９、２０、２１または２２のいずれか１つで示される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる。
【００５７】
好ましい一実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、配列番号１７、１８、１９、２０、２１または２２のいずれか１つで示される２、３、４、５つ、いっそうより好ましくは、６つのＣＤＲを含んでなる。
【００５８】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、（ｉ）配列番号２３、２４もしくは２５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含んでなる少なくとも１つのＣＤＲ、または（ｉｉ）配列番号２６、２７もしくは２８のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含んでなる少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる。
【００５９】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、配列番号２３、２４、２５、２６、２７または２８のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含んでなる少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる。
【００６０】
好ましい一実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、配列番号２３、２４、２５、２６、２７または２８のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含んでなる２、３、４、５つ、いっそうより好ましくは、６つのＣＤＲを含んでなる。
【００６１】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、（ｉ）配列番号２３、２４もしくは２５のいずれか１つで示される少なくとも１つのＣＤＲ、または（ｉｉ）配列番号２６、２７もしくは２８のいずれか１つで示される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる。
【００６２】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、配列番号２３、２４、２５、２６、２７または２８のいずれか１つで示される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる。
【００６３】
好ましい一実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、配列番号２３、２４、２５、２６、２７または２８のいずれか１つで示される２、３、４、５つ、いっそうより好ましくは、６つのＣＤＲを含んでなる。
【００６４】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、１つの可変領域を含んでなり、前記可変領域は、
・配列番号２の４５番で始まり５４番で終わる配列、
・配列番号２の６６番で始まり８７番で終わる配列、および
・配列番号２の１１７番で始まり１２６番で終わる配列
で示されるＣＤＲを含んでなる。
【００６５】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、１つの可変領域を含んでなり、前記可変領域は、
・配列番号４の４４番で始まり５６番で終わる配列、
・配列番号４の６６番で始まり７６番で終わる配列、および
・配列番号４の１０９番で始まり１１７番で終わる配列
で示されるＣＤＲを含んでなる。
【００６６】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、１つの可変領域を含んでなり、前記可変領域は、配列番号１１、１２および１３で示される３つのＣＤＲを含んでなる。
【００６７】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、１つの可変領域を含んでなり、前記可変領域は、配列番号１４、１５および１６で示される３つのＣＤＲを含んでなる。
【００６８】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、１つの可変領域を含んでなり、前記可変領域は、配列番号１７、１８および１９で示される３つのＣＤＲを含んでなる。
【００６９】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、１つの可変領域を含んでなり、前記可変領域は、配列番号２０、２１および２２で示される３つのＣＤＲを含んでなる。
【００７０】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、１つの可変領域を含んでなり、前記可変領域は、配列番号２３、２４および２５で示される３つのＣＤＲを含んでなる。
【００７１】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒとより特異的に結合し、かつ、１つの可変領域を含んでなり、前記可変領域は、配列番号２６、２７および２８で示される３つのＣＤＲを含んでなる。
【００７２】
好ましい実施形態では、前記可変領域は、１つ、より好ましくは２つ、いっそうより好ましくは３つ、明確に好ましくは、４つのフレームワーク領域、より好ましくは、ヒトＦＲをさらに含んでなる。本明細書において、「ヒトＦＲ」は、天然ヒト抗体のフレームワーク領域と少なくとも７５％相同なフレームワーク領域である。
【００７３】
好ましい一実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、かつ、１つの可変領域を含んでなり、前記可変領域は、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００７４】
より好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、かつ、１つの可変領域を含んでなり、前記可変領域は配列番号６で示される通りである。
【００７５】
別の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、１つの可変領域を含んでなり、前記可変領域は、配列番号９で示されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００７６】
別のより好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、かつ、１つの可変領域を含んでなり、前記可変領域は配列番号９で示される通りである。
【００７７】
別の実施形態では、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、かつ、２つの可変領域を含んでなり、前記可変領域は、
（ｉ）
・配列番号２の４５番で始まり５４番で終わる配列、
・配列番号２の６６番で始まり８７番で終わる配列、および
・配列番号２の１１７番で始まり１２６番で終わる配列
で示されるＣＤＲを含んでなる可変領域；
（ｉｉ）
・配列番号４の４４番で始まり５６番で終わる配列、
・配列番号４の６６番で始まり７６番で終わる配列、および
・配列番号４の１０９番で始まり１１７番で終わる配列
で示されるＣＤＲを含んでなる可変領域；
（ｉｉｉ）配列番号１１、１２および１３で示される３つのＣＤＲを含んでなる可変領域；
（ｉｖ）配列番号１４、１５および１６で示される３つのＣＤＲを含んでなる可変領域；
（ｖ）配列番号１７、１８および１９で示される３つのＣＤＲを含んでなる可変領域；
（ｖｉ）配列番号２０、２１および２２で示される３つのＣＤＲを含んでなる可変領域；
（ｖｉｉ）配列番号２３、２４および２５で示される３つのＣＤＲを含んでなる可変領域；
（ｖｉｉｉ）配列番号２６、２７および２８で示される３つのＣＤＲを含んでなる可変領域
からなる群から互いに独立に選択される。
【００７８】
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、かつ、
（ｉ）
・配列番号２の４５番で始まり５４番で終わる配列で示されるＣＤＲ、
・配列番号２の６６番で始まり８７番で終わる配列で示されるＣＤＲ、および
・配列番号２の１１７番で始まり１２６番で終わる配列で示されるＣＤＲ
を含んでなる第１の可変領域と、
（ｉｉ）
・配列番号４の４４番で始まり５６番で終わる配列で示されるＣＤＲ、
・配列番号４の６６番で始まり７６番で終わる配列で示されるＣＤＲ、および
・配列番号４の１０９番で始まり１１７番で終わる配列で示されるＣＤＲ
を含んでなる第２の可変領域と
を含んでなる。
【００７９】
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、かつ、
・配列番号１１、１２および１３で示される３つのＣＤＲを含んでなる可変領域、および
・配列番号１４、１５および１６で示される３つのＣＤＲを含んでなる可変領域
を含んでなる。
【００８０】
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、
・配列番号１７、１８および１９で示される３つのＣＤＲを含んでなる可変領域、および
・配列番号２０、２１および２２で示される３つのＣＤＲを含んでなる可変領域
を含んでなる。
【００８１】
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、かつ、
・配列番号２３、２４および２５で示される３つのＣＤＲを含んでなる可変領域、および
・配列番号２６、２７および２８で示される３つのＣＤＲを含んでなる可変領域
を含んでなる。
【００８２】
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、かつ、
・配列番号６で示される可変領域、および
・配列番号９で示される可変領域
を含んでなる。
【００８３】
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、
（ｉ）
・配列番号２の４５番で始まり５４番で終わる配列で示されるＣＤＲ、
・配列番号２の６６番で始まり８７番で終わる配列で示されるＣＤＲ、および
・配列番号２の１１７番で始まり１２６番で終わる配列で示されるＣＤＲ
を含んでなる重鎖可変領域と、
（ｉｉ）
・配列番号４の４４番で始まり５６番で終わる配列で示されるＣＤＲ、
・配列番号４の６６番で始まり７６番で終わる配列で示されるＣＤＲ、および
・配列番号４の１０９番で始まり１１７番で終わる配列で示されるＣＤＲ
を含んでなる軽鎖可変領域と
を含んでなる。
【００８４】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、かつ、（ｉ）配列番号１１、１２および１３で示される３つのＣＤＲを含んでなる重鎖可変領域と、（ｉｉ）配列番号１４、１５および１６で示される３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖可変領域とを含んでなる。
【００８５】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、（ｉ）配列番号１７、１８および１９で示される３つのＣＤＲを含んでなる重鎖可変領域と、（ｉｉ）配列番号２０、２１および２２で示される３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖可変領域とを含んでなる。
【００８６】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、かつ、（ｉ）配列番号２３、２４および２５で示される３つのＣＤＲを含んでなる重鎖可変領域と、（ｉｉ）配列番号２６、２７および２８で示される３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖可変領域とを含んでなる。
【００８７】
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、かつ、（ｉ）配列番号６で示される重鎖可変領域と、（ｉｉ）配列番号９で示される軽鎖可変領域とを含んでなる。
【００８８】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、かつ、ｓｃＦｖであり、前記ｓｃＦｖは、
（ｉ）
・配列番号２の４５番で始まり５４番で終わる配列で示されるＣＤＲ、
・配列番号２の６６番で始まり８７番で終わる配列で示されるＣＤＲ、および
・配列番号２の１１７番で始まり１２６番で終わる配列で示されるＣＤＲ
を含んでなる可変領域と、
（ｉｉ）
・配列番号４の４４番で始まり５６番で終わる配列で示されるＣＤＲ、
・配列番号４の６６番で始まり７６番で終わる配列で示されるＣＤＲ、および
・配列番号４の１０９番で始まり１１７番で終わる配列で示されるＣＤＲ
を含んでなる可変領域と
を含んでなる。
【００８９】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、かつ、ｓｃＦｖであり、前記ｓｃＦｖは、
・配列番号１１、１２および１３で示される３つのＣＤＲを含んでなる可変領域と、
・配列番号１４、１５および１６で示される３つのＣＤＲを含んでなる可変領域と
を含んでなる。
【００９０】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、かつ、ｓｃＦｖであり、前記ｓｃＦｖは、
・配列番号１７、１８および１９で示される３つのＣＤＲを含んでなる可変領域と、
・配列番号２０、２１および２２で示される３つのＣＤＲを含んでなる可変領域と
を含んでなる。
【００９１】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、かつ、ｓｃＦｖであり、前記ｓｃＦｖは、
・配列番号２３、２４および２５で示される３つのＣＤＲを含んでなる可変領域と、
・配列番号２６、２７および２８で示される３つのＣＤＲを含んでなる可変領域と
を含んでなる。
【００９２】
より好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、かつ、ｓｃＦｖであり、前記ｓｃＦｖは、
・配列番号６で示される可変領域と、
・配列番号９で示される可変領域と
を含んでなる。
【００９３】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、かつ、ｓｃＦｖであり、前記ｓｃＦｖは、
（ｉ）
・配列番号２の４５番で始まり５４番で終わる配列で示されるＣＤＲ、
・配列番号２の６６番で始まり８７番で終わる配列で示されるＣＤＲ、および
・配列番号２の１１７番で始まり１２６番で終わる配列で示されるＣＤＲ
を含んでなる重鎖可変領域と、
（ｉｉ）
・配列番号４の４４番で始まり５６番で終わる配列で示されるＣＤＲ、
・配列番号４の６６番で始まり７６番で終わる配列で示されるＣＤＲ、および
・配列番号４の１０９番で始まり１１７番で終わる配列で示されるＣＤＲ
を含んでなる軽鎖可変領域と
を含んでなる。
【００９４】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、かつ、ｓｃＦｖであり、前記ｓｃＦｖは、
・配列番号１１、１２および１３で示される３つのＣＤＲを含んでなる重鎖可変領域と、
・配列番号１４、１５および１６で示される３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖可変領域と
を含んでなる。
【００９５】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、かつ、ｓｃＦｖであり、前記ｓｃＦｖは、
・配列番号１７、１８および１９で示される３つのＣＤＲを含んでなる重鎖可変領域と、
・配列番号２０、２１および２２で示される３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖可変領域と
を含んでなる。
【００９６】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、かつ、ｓｃＦｖであり、前記ｓｃＦｖは、
・配列番号２３、２４および２５で示される３つのＣＤＲを含んでなる重鎖可変領域と、
・配列番号２６、２７および２８で示される３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖可変領域と
を含んでなる。
【００９７】
より好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、かつ、ｓｃＦｖであり、前記ｓｃＦｖは、
・配列番号６で示される重鎖可変領域と、
・配列番号９で示される軽鎖可変領域と
を含んでなる。
【００９８】
いっそうより好ましい実施形態では、配列番号６および９で示されるアミノ酸配列内で少なくとも１つのアミノ酸が置換されている（表１および表２に従う）ｓｃＦｖが提供される。明確に好ましい実施形態では、配列番号６および９で示されるアミノ酸配列内で表１および表２に示されるアミノ酸の総てが置換されている（表１および表２に従う）ヒト抗体が提供される。
【００９９】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、かつ、配列番号２で示される重鎖を含んでなる。
【０１００】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、かつ、配列番号４で示される軽鎖を含んでなる。
【０１０１】
より好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、かつ、配列番号２で示される重鎖と配列番号４で示される軽鎖とを含んでなる。
【０１０２】
いっそうより好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、配列番号２で示される２本の重鎖と配列番号４で示される２本の軽鎖とを含んでなる。この特定の抗体は、本願を通してＣＸＩＩＧ６と呼ぶ。
【０１０３】
別の好ましい実施形態によれば、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、
（ｉ）
・配列番号２の４５番で始まり５４番で終わる配列で示されるＣＤＲ、
・配列番号２の６６番で始まり８７番で終わる配列で示されるＣＤＲ、および
・配列番号２の１１７番で始まり１２６番で終わる配列で示されるＣＤＲ
を含んでなる重鎖可変領域と、
（ｉｉ）
・配列番号４の４４番で始まり５６番で終わる配列で示されるＣＤＲ、
・配列番号４の６６番で始まり７６番で終わる配列で示されるＣＤＲ、および
・配列番号４の１０９番で始まり１１７番で終わる配列で示されるＣＤＲ
を含んでなる軽鎖可変領域と
を含んでなる、ヒト抗体に関する。
【０１０４】
別の実施形態によれば、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、
・配列番号１１、１２および１３で示される３つのＣＤＲを含んでなる重鎖可変領域と、
・配列番号１４、１５および１６で示される３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖可変領域と
を含んでなる、ヒト抗体に関する。
【０１０５】
別の実施形態によれば、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、
・配列番号１７、１８および１９で示される３つのＣＤＲを含んでなる重鎖可変領域と、
・配列番号２０、２１および２２で示される３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖可変領域と
を含んでなる、ヒト抗体に関する。
【０１０６】
別の実施形態によれば、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、
・配列番号２３、２４および２５で示される３つのＣＤＲを含んでなる重鎖可変領域と、
・配列番号２６、２７および２８で示される３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖可変領域と
を含んでなる、ヒト抗体に関する。
【０１０７】
好ましい実施形態によれば、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、
・配列番号６で示される重鎖可変領域と、
・配列番号９で示される軽鎖可変領域と
を含んでなる、ヒト抗体に関する。
【０１０８】
より好ましい実施形態では、配列番号６および９で示されるアミノ酸配列内で少なくとも１つのアミノ酸が置換されている（表１および表２に従う）ヒト抗体が提供される。いっそうより好ましい実施形態では、配列番号６および９で示されるアミノ酸配列内で表１および表２に示されるアミノ酸の総てが置換されている（表１および表２に従う）ヒト抗体が提供される。
【０１０９】
【表１】
0005996558.tif 000002
【０１１０】
【表２】
0005996558.tif 000003
【０１１１】
別の実施形態によれば、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒ、より好ましくは、ヒトＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合する、単離された、組換え型の、または精製された抗体であって、
（ａ）下式：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（式中、
ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域であり；
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域であり；
ここで、
ＣＤＲ１は、配列番号２の４５番で始まり５４番で終わる配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸を有し；
ＣＤＲ２は、配列番号２の６６番で始まり８７番で終わる配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸を有し；かつ
ＣＤＲ３は、配列番号２の１１７番で始まり１２６番で終わる配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸を有する）
で定義される第１の可変領域と；
（ｂ）下式：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（式中、
ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域であり；
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域であり；
ここで、
ＣＤＲ１は、配列番号４の４４番で始まり５６番で終わる配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸を有し；
ＣＤＲ２は、配列番号４の６６番で始まり７６番で終わる配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸を有し；かつ
ＣＤＲ３は、配列番号４の１０９番で始まり１１７番で終わる配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸を有する）
で定義される第２の可変領域と
を含んでなる抗体に関する。
【０１１２】
別の実施形態によれば、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合する、単離された、組換え型の、または精製された抗体であって、
（ａ）下式：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（式中、
ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域であり；
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域であり；
ここで、
ＣＤＲ１は、配列番号１１、１７および２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し；
ＣＤＲ２は、配列番号１２、１８および２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し；かつ
ＣＤＲ３は、配列番号１３、１９および２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する）
で定義される第１の可変領域と；
（ｂ）下式：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（式中、
ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域であり；
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域であり；
ここで、
ＣＤＲ１は、配列番号１４、２０および２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し；
ＣＤＲ２は、配列番号１５、２１および２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し；かつ
ＣＤＲ３は、配列番号１６、２２および２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する）
で定義される第２の可変領域と
を含んでなる抗体に関する。
【０１１３】
別の実施形態によれば、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒ、より好ましくは、ヒトＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合する、単離された、組換え型の、または精製された抗体であって、
下記の（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）：
（ｉ）
（ａ）下式：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（式中、
ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域であり；
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域であり；
ここで、
ＣＤＲ１は、配列番号１１で示される通りであり；
ＣＤＲ２は、配列番号１２で示される通りであり；かつ
ＣＤＲ３は、配列番号１３で示される通りである）
で定義される第１の可変領域と；
（ｂ）下式：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（式中、
ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域であり；
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域であり；
ここで、
ＣＤＲ１は、配列番号１４で示される通りであり；
ＣＤＲ２は、配列番号１５で示される通りであり；かつ
ＣＤＲ３は、配列番号１６で示される通りである）
で定義される第２の可変領域；または
（ｉｉ）
（ａ）下式：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（式中、
ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域であり；
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域であり；
ここで、
ＣＤＲ１は、配列番号１７で示される通りであり；
ＣＤＲ２は、配列番号１８で示される通りであり；かつ
ＣＤＲ３は、配列番号１９で示される通りである）
で定義される第１の可変領域と；
（ｂ）下式：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（式中、
ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域であり；
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域であり；
ここで、
ＣＤＲ１は、配列番号２０で示される通りであり；
ＣＤＲ２は、配列番号２１で示される通りであり；かつ
ＣＤＲ３は、配列番号２２で示される通りである）
で定義される第２の可変領域；または
（ｉｉｉ）
（ａ）下式：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（式中、
ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域であり；
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域であり；
ここで、
ＣＤＲ１は、配列番号２３で示される通りであり；
ＣＤＲ２は、配列番号２４で示される通りであり；かつ
ＣＤＲ３は、配列番号２５で示される通りである）
で定義される第１の可変領域と；
（ｂ）下式：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（式中、
ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域であり；
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域であり；
ここで、
ＣＤＲ１は、配列番号２６で示される通りであり；
ＣＤＲ２は、配列番号２７で示される通りであり；かつ
ＣＤＲ３は、配列番号２８で示される通りである）
で定義される第２の可変領域
のうちいずれか１つを含んでなる抗体に関する。
【０１１４】
別の実施形態によれば、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒ、より好ましくは、ヒトＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合する、単離された、組換え型の、または精製された抗体であって、
・配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる第１の可変領域と、
・配列番号９のアミノ酸配列を含んでなる第２の可変領域と
を含んでなる抗体に関する。
【０１１５】
別の実施形態によれば、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒ、より好ましくは、ヒトＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合する、単離された、組換え型の、または精製された抗体であって、
・配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる第１の可変領域と、
・配列番号４のアミノ酸配列を含んでなる第２の可変領域と
を含んでなる抗体に関する。
【０１１６】
別の実施形態によれば、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒ、より好ましくは、ヒトＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合する、単離された、組換え型の、または精製された抗体であって、
・配列番号３７（図３２参照）および配列番号３８からなる群から選択される重鎖と、
・配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１からなる群から選択される軽鎖と
を含んでなる抗体に関する。
【０１１７】
別の実施形態によれば、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒ、より好ましくは、ヒトＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合する、単離された、組換え型の、または精製された抗体であって、
・配列番号４２および配列番号４３からなる群から選択される第１の可変領域と、
・配列番号４４、配列番号４５および配列番号４６からなる群から選択される第２の可変領域と
を含んでなる抗体に関する。
【０１１８】
好ましい一実施形態によれば、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒ、より好ましくは、ヒトＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、（ａ）配列番号３７からなる重鎖と、（ｂ）配列番号３９からなる軽鎖とを含んでなる、単離された、組換え型の、または精製された抗体に関する。
【０１１９】
別の好ましい実施形態によれば、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒ、より好ましくは、ヒトＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、（ａ）配列番号３８からなる重鎖と、（ｂ）配列番号４０からなる軽鎖とを含んでなる、単離された、組換え型の、または精製された抗体に関する。
【０１２０】
有利な一実施形態によれば、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒ、より好ましくは、ヒトＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、（ａ）配列番号３７からなる重鎖と、（ｂ）配列番号４１からなる軽鎖とを含んでなる、単離された、組換え型の、または精製された抗体に関する。
【０１２１】
好ましい一実施形態によれば、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒ、より好ましくは、ヒトＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、（ａ）配列番号４２からなる第１の可変領域と、（ｂ）配列番号４４からなる第２の可変領域とを含んでなる、単離された、組換え型の、または精製された抗体に関する。
【０１２２】
別の好ましい実施形態によれば、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒ、より好ましくは、ヒトＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、（ａ）配列番号４３からなる第１の可変領域と、（ｂ）配列番号４５からなる第２の可変領域とを含んでなる、単離された、組換え型の、または精製された抗体に関する。
【０１２３】
有利な一実施形態によれば、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒ、より好ましくは、ヒトＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合し、（ａ）配列番号４２からなる第１の可変領域と、（ｂ）配列番号４６からなる第２の可変領域を含んでなる、単離された、組換え型の、または精製された抗体に関する。
【０１２４】
本発明によれば、抗体、より具体的には、ヒト抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇＥなどの異なるアイソタイプのものであってもよい。好ましい実施形態では、本発明によれば、抗体、より具体的には、ヒト抗体はＩｇＧである。
【０１２５】
関連の実施形態では、ヒト抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の改変型または非改変型の定常領域を含んでなる。好ましい実施形態では、定常領域はヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４であり、場合により、ある特性を増強または低減するために改変されてよい。
【０１２６】
ＩｇＧ１の場合、定常領域、特に、ヒンジ領域またはＣＨ２領域に対する改変は、ＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性を含むエフェクター機能を増強または低減し得る。他の実施形態では、ＩｇＧ２定常領域は、抗体−抗原凝集物の形成を低減するために改変される。ＩｇＧ４の場合、定常領域、特に、ヒンジ領域に対する改変は、半抗体の形成を低減し得る。
【０１２７】
抗体の１以上のアミノ酸が変異を受けても、所望の結合親和性が保持される場合がある。これらの変異体は、抗体の少なくとも１つのアミノ酸が違う残基で置換される。別の実施形態によれば、本発明は、ＣＤＲに含まれるアミノ酸の少なくとも１つが保存的に置換されている、上記のようなＣＳＦ１と特異的に結合する抗体を提供する。保存的置換を表３に示す。
【０１２８】
【表３】
0005996558.tif 000004
【０１２９】
本発明はまた、親和性成熟により本発明の抗体を改変するプロセスに関する。
【０１３０】
本明細書において、「親和性成熟」は、１以上のＣＤＲに含まれる１以上のアミノ酸の置換であって、そのような置換を持っていない親抗体に比べてＣＳＦ−１Ｒに対する抗体の親和性に改善をもたらす置換を意味する。親和性成熟プロセスは、当技術分野で公知である。例えば、MARKS, et al. By-passing immunization: building high affinity human antibodies by chain shuffling. Biotechnology. 1992, vol.10, no.7, p.779-83; BARBAS, et al. In vitro evolution of a neutralizing human antibody to human immunodeficiency virus type 1 to enhance affinity and broaden strain cross-reactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1994, vol.91, no.9, p.3809-13; SCHIER. Identification of functional and structural amino-acid residues by parsimonious mutagenesis. Gene. 1996, vol.169, no.2, p.147-55; YELTON. Affinity maturation of the BR96 anti-carcinoma antibody by codon-based mutagenesis. J. immunol.. 1995, vol.155, no.4, p.1994-2004; JACKSON, et al. In vitro antibody maturation. Improvement of a high affinity, neutralizing antibody against IL-1 beta. J. immunol.. 1995, vol.154, no.7, p.3310-9およびHAWKINS, et a
l. Selection of phage antibodies by binding affinity. Mimicking affinity maturation. Journal of molecular biology. 1992, vol.226, no.3, p.889-96参照。
【０１３１】
本発明はまた、前記のような親和性成熟により得られた、ＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合する抗体に関する。
【０１３２】
別の実施形態では、本発明は、前記のような抗体のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、いっそうより好ましくは、少なくとも９８％相同なアミノ酸配列を有する、前記のような抗体の変異体を提供する。
【０１３３】
別の実施形態では、本発明による抗体は、２以上のエピトープと特異的に結合する。例えば、本発明による抗体は、ＣＳＦ−１Ｒの２つの異なるエピトープと結合し得る。あるいは、本発明による抗体は、ＣＳＦ−１Ｒおよび別の分子に結合することができる。本明細書において、２以上のエピトープと特異的に結合する抗体は、架橋抗体であってもよい。例えば、一方の抗体はアビジンに結合させ、他方をビオチンに結合させることができる。架橋抗体は、当技術分野で周知の便宜な架橋法のいずれを用いて作製してもよい。抗体フラグメントから二重特異性抗体を作出するための技術はまた、例えば、BRENNAN, et al. Preparation of bispecific antibodies by chemical recombination of monoclonal immunoglobulin G1 fragments. Science. 1985, vol.229, no.4708, p.81-3およびSHALABY, et al. Development of humanized bispecific antibodies reactive with cytotoxic lymphocytes and tumor cells overexpressing the HER2 protooncogene. The Journal of experimental medicine. 1992, vol.175, no.1, p.217-25; KOSTELNY, et al. Formation of a bispecific antibody by the use of leucine zippers. J. immunol.. 1992, vol.148, no.5, p.1547-33にも記載されている。
【０１３４】
好ましい実施形態によれば、本発明に従い、２以上のエピトープと特異的に結合する抗体は、ダイアボディーである。
【０１３５】
別の好ましい実施形態によれば、本発明に従い、２以上のエピトープと特異的に結合する抗体は、ZAPATA, et al. Engineering linear F(ab')2 fragments for efficient production in Escherichia coli and enhanced antiproliferative activity. Protein engineering. 1995, vol.8, no.10, p.1057-62に記載されているような直鎖抗体である。
【０１３６】
好ましい実施形態では、本発明による抗体は、配列番号２９のアミノ酸２０番〜４１番の間（すなわち、ヒトドメインＤ１のＮ末端部分）に位置する少なくとも１つのエピトープと特異的に結合する。好ましい実施形態では、本発明による抗体は、配列番号２９のアミノ酸２０番〜４１番の間（すなわち、ヒトドメインＤ１のＮ末端部分）に位置する１つのエピトープと結合し、配列番号２９のアミノ酸４２番〜９０番の間、および／またはアミノ酸９１番〜１０４番の間、および／またはアミノ酸１０５番〜１９９番の間、および／またはアミノ酸２００番〜２９８番の間に位置するエピトープとは結合しない。好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、配列番号２９のアミノ酸２０番〜４１番の間（すなわち、ヒトドメインＤ１のＮ末端部分）に位置する最小エピトープを認識することができる。有利な実施形態によれば、本発明の抗体は、構築物ｐＴＧ１８０１６を認識して、それと結合することができる（図１９および関連の実施例を参照）。
【０１３７】
好ましい実施形態では、本発明による抗体は、ＣＳＦ−１Ｒ受容体との結合に関してＩＬ−３４リガンドと競合しない。本明細書において、用語「ＩＬ−３４リガンドと競合しない」とは、ＩＬ３４リガンドの、その受容体ＣＳＦ−１Ｒへの結合に阻害がないことを意味する。
【０１３８】
好ましい実施形態では、本発明による抗体は、ＣＳＦ−１Ｒ受容体との結合に関してＣＳＦ−１リガンドと部分的に競合する。本明細書において、用語「ＣＳＦ−１リガンドと部分的に競合する」とは、ＣＳＦ−１リガンドの、その受容体ＣＳＦ−１Ｒへの結合の、１００％未満、好ましくは５０％未満、いっそうより好ましくは２０％未満、有利には１０％未満の阻害を意味する。この部分的阻害剤はリガンド結合を低下させるだけで、全面的に排除するのではなく、この阻害は部分的阻害と呼ばれる。
【０１３９】
好ましい実施形態では、本発明による抗体は、ＣＳＦ１の、その受容体ＣＳＦ−１Ｒへの結合を部分的に妨げることができ、前記結合を全面的に阻害できるわけではない。より詳しくは、本発明による抗体は、ＣＳＦ−１の、ＣＳＦ−１Ｒへの結合をおよそ５〜１０％低下させることができる。特定の実施形態によれば、前記結合の低下は、ＣＳＦ−１（配列番号４７の１〜４４４番にわたるアミノ酸配列を有する−図２１参照）の、配列番号２９のＩｌｅ  ２０〜Ｇｌｕ  ５１２にわたるアミノ酸配列を有する受容体ＣＳＦ−１Ｒへの結合を測定することにより、本明細書の実験の節に記載の通りに測定される。
【０１４０】
好ましい実施形態では、本発明による抗体は、ＣＳＦ１−Ｒに対する高親和性結合を特徴とする。より詳しくは、本発明による抗体は、１ｎＭ未満、好ましくは０．８ｎＭ未満、より好ましくは０．６ｎＭ未満のＫｉを有する。このような予期しない高親和性の結果として、本発明の抗体は少量で投与することができ、従って、潜在的副作用を排除することができる。
【０１４１】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、それが特異的または優先的に結合するポリペプチドまたは細胞、すなわち、ＣＳＦ１−Ｒ発現細胞、より好ましくはＣＳＦ１−Ｒ発現ヒト細胞、有利にはＣＳＦ１−Ｒ発現ヒト癌細胞の生物活性を部分的または完全に遮断または阻害するアンタゴニスト抗体である。
【０１４２】
本発明の特定の実施形態によれば、本発明の抗体は、下記の有利な特性のうちの少なくとも１つを有する：
・In Vitro試験：本発明による抗体は、ＣＳＦ−１Ｒ受容体との結合に関してＩＬ−３４リガンドと競合しない；
・In Vitro試験：本発明による抗体は、ＣＳＦ−１Ｒ受容体との結合に関してＣＳＦ−１リガンドと部分的に競合する；
・ＡＤＣＣ試験：正常ヒト末梢血単核細胞の存在下で、本発明の抗体は、ＣＳＦ１−Ｒ発現ヒト細胞、特に、ＣＳＦ１−Ｒ発現ヒト癌細胞に対して抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を示す；
・In Vivo試験：本発明の抗体は、ＣＳＦ１−Ｒ発現ヒト癌細胞を持つ非ヒト動物に対して抗腫瘍作用を示す；
・In Vivo試験：本発明の抗体は、ＣＳＦ１−Ｒ発現ヒト癌細胞を持つ、ヒトを含む動物に対して抗腫瘍作用を示す；
・In Vivo試験：本発明の抗体は、ＡＭＬ５細胞のＣＳＦ−１依存的増殖を阻害する；
・In Vivo試験：本発明の抗体は、ＣＳＦ−１ＲのＣＳＦ−１依存的リン酸化を部分的に阻害する；
・In Vivo試験：本発明の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒに対して直接的な拮抗活性を持たない。
【０１４３】
本発明による抗体は、グリコシル化されていてもされていなくてもよい。
【０１４４】
本明細書において、用語「グリコシル化」とは、抗体と共有結合している糖鎖単位の存在を意味する。
【０１４５】
別の実施形態では、本発明による抗体は、放射線増感剤、受容体および／または細胞傷害性薬剤とコンジュゲートされる。
【０１４６】
本明細書において、用語「放射線増感剤」とは、放射線療法に対する細胞の感受性を高める分子を意味する。放射線増感剤としては、限定されるものではないが、メトロニダゾール、ミソニダゾール、デスメチルミソニダゾール、ピモニダゾール、エタニダゾール、ニモラゾール、マイトマイシンＣ、ＲＳＵ１０６９、ＳＲ４２３３、Ｅ０９、ＲＢ６１４５、ニコチンアミド、５−ブロモデオキシウリジン（ＢＵｄＲ）、５−ヨードデオキシウリジン（ＩＵｄＲ）、ブロモデオキシシチジン、フルオロデオキシウリジン（ＦＵｄＲ）、ヒドロキシ尿素およびシスプラチンが挙げられる。
【０１４７】
本明細書において、用語「受容体」とは、リガンドと特異的に結合することができる化合物を意味する。本発明の好ましい実施形態によれば、受容体はビオチンである。
【０１４８】
本明細書において、用語、細胞傷害性薬剤とは、細胞に対して直接毒性があり、それらの再生または成長を妨げる化合物を意味する。好ましい実施形態によれば、本発明の文脈で用いられる細胞傷害性薬剤は、癌治療薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素またはそのフラグメント）、または放射性同位元素からなる群から選択される。
【０１４９】
別の実施形態では、本発明による抗体は、標識薬剤とコンジュゲートされる。
【０１５０】
本明細書において、「標識薬剤」とは、検出可能な化合物を意味する。標識薬剤は、それ自体検出可能であってもよく（例えば、放射性同位元素標識もしくは蛍光標識）、または酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物の化学修飾を触媒してもよい。
【０１５１】
本明細書において、用語「コンジュゲートされる」とは、本発明による抗体と標識薬剤が共有結合的または非共有結合的に結合されることを意味する。
【０１５２】
「共有結合する」とは、反応性官能基を介したカップリングを意味し、場合により、架橋剤または他の活性化剤の媒介的使用を伴ってもよい（例えば、HERMANSON. Bioconjugate techniques. Academic press, 1996参照）。本発明による抗体および／またはコンジュゲートされる薬剤は、それらのカップリングを可能とするために、例えば、活性化されたカルボニル基上（in situで活性化されたものを含む）またはイミドエステル上での置換によるか、不飽和カルボニル基への付加によるか、飽和炭素原子もしくはヘテロ原子上での還元的アミノ化、求核置換によるか、芳香環上での反応により、修飾してもよい。特に、カップリングは、ホモ二官能性またはヘテロ二官能性架橋試薬を用いて行ってよい。グルタルアルデヒド、コハク酸、およびＤＭＳ（スベリイミド酸ジメチル）のようなビス−イミドエステルを含むホモ二官能性架橋剤が、種々の部分に存在し得るアミン基をカップリングするために使用可能である。多くの例がHERMANSON. Bioconjugate techniques. Academic press, 1996. p.118-228に示されており、これらは当業者に周知である。ヘテロ二官能性架橋剤としては、アミン反応性基とスルフヒドリル反応性基、カルボニル反応性基とスルフヒドリル反応性基、およびスルフヒドリル反応性基と光反応性リンカーの双方を有するものが挙げられる。好適なヘテロ二官能性架橋剤は、例えば、HERMANSON. Bioconjugate techniques. Academic press, 1996. p.229-285に記載されている。例としては、例えば、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＭＢＰ（スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート）、ＳＭＰＴ（スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン）、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル（４ヨードアセチル）アミノベンゾエート）、ＧＭＢＳ（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル）、ＳＩＡＸ（スクシンイミジル−６−ヨードアセチルアミノヘキソネート、ＳＩＡＣ（スクシンイミジル−４−ヨードアセチルアミノメチル）、ＮＰＩＡ（ｐ−ニトロフェニルヨードアセテート）がある。他の例も、糖鎖含有分子（例えば、ｅｎｖ糖タンパク質、抗体）とスルフヒドリル反応性基をカップリングするために有用である。例としては、ＭＰＢＨ（４−（４−Ｎマレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド）およびＰＤＰＨ（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシル−ヒドラジド（Ｍ２Ｃ２Ｈおよび３−２（２−ピリジルジチオ）プロプリオニルヒドラジド）が挙げられる。
【０１５３】
別の実施形態によれば、本発明は、本発明の抗体をコードする核酸配列に関する。
【０１５４】
用語「核酸配列」とは、ヌクレオチドの直鎖配列を意味する。これらのヌクレオチドはポリリボヌクレオチドもしくはポリデオキシリボヌクレオチドの直鎖配列のいずれか、または両者の混合物である。本発明においてポリヌクレオチドの例としては、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡの両混合物を有するハイブリッド分子が挙げられる。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、１以上の改変ヌクレオチドを有してよい。
【０１５５】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明による核酸配列はベクター内に含まれる。
【０１５６】
ベクターはプラスミドまたはウイルス起源であってよく、適当であれば、トランスフェクション効率および／またはベクターの安定性を高める１以上の物質と組み合わせてもよい。これらの物質は、当業者に入手可能な文献に広く記載されている（例えば、FELGNER, et al. Cationic liposome mediated transfection. Proceedings of the Western Pharmacology Society. 1989, vol.32, p.115-21; HODGSON, et al. Virosomes: cationic liposomes enhance retroviral transduction. Nature biotechnology. 1996, vol.14, no.3, p.339-42; REMY, et al. Gene transfer with a series of lipophilic DNA-binding molecules. Bioconjugate chemistry. 1994, vol.5, no.6, p.647-54参照）。非限定例として、これらの物質はポリマー、脂質、特に、陽イオン脂質、リポソーム、核タンパク質または中性脂質であり得る。これらの物質は、単独でまたは組み合わせて使用可能である。考えられ得る組合せは、組換えプラスミドベクターと陽イオン脂質（ＤＯＧＳ、ＤＣ−ＣＨＯＬ、スペルミン−ｃｈｏｌ、スペルミジン−ｃｈｏｌなど）、リゾリン脂質（例えば、ヘキサデシルホスホコリン）および中性脂質（ＤＯＰＥ）との組合せである。
【０１５７】
好ましい実施形態によれば、本発明において使用可能な陽イオン脂質は、ＥＰ９０１４６３に記載の陽イオン脂質、より好ましくは、ｐｃＴＧ９０である。
【０１５８】
本発明の文脈で使用可能なプラスミドの選択肢は極めて広い。それらはクローニングベクターおよび／または発現ベクターであり得る。一般には、それらは当業者に公知であり、それらのうちのいくつかは市販されているが、遺伝子操作技術を用いてそれらを構築または改変することもできる。挙げられる例としては、ｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐ  Ｐｏｌｙ (LATHE, et al. Plasmid and bacteriophage vectors for excision of intact inserts. Gene. 1987, vol.57, no.2-3, p.193-201)に由来するプラスミドがある。好ましくは、本発明の文脈で使用されるプラスミドは、生産細胞および／または宿主細胞において複製が開始されるようにする複製起点（例えば、ＣｏｌＥ１起点は、大腸菌で生産しようとするプラスミドに関して選択されｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１系は、プラスミドを哺乳動物宿主細胞で自己複製させることが望まれる場合に選択される、LUPTON, et al. Mapping genetic elements of Epstein-Barr virus that facilitate extrachromosomal persistence of Epstein-Barr virus-derived plasmids in human cells. Molecular and cellular biology. 1985, vol.5, no.10, p.2533-42; YATES, et al. Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells. Nature. 1985, vol.313, no.6005, p.812-5）を含む。プラスミドは、トランスフェクト細胞の選択または同定を可能とする選択遺伝子（栄養要求性突然変異の補足、抗生物質耐性をコードする遺伝子など）をさらに含んでなり得る。本来、プラスミドは、所与の細胞においてその維持および／またはその安定性を改善する付加的要素（プラスミドの、単量体型での維持を促進するｃｅｒ配列）を含み得る（SUMMERS, et al. Multimerization of high copy number plasmids causes instability: CoIE1 encodes a determinant essential for plasmid monomerization and stability. Cell. 1984, vol.36, no.4, p.1097-103,細胞ゲノムへ組み込むための配列）。
【０１５９】
ウイルスベクターについては、ポックスウイルス（ワクシニアウイルス、特に、ＭＶＡ、カナリア痘ウイルスなど）由来、アデノウイルス由来、レトロウイルス由来、ヘルペスウイルス由来、アルファウイルス由来、泡沫状ウイルス由来またはアデノウイルス随伴ウイルス由来のベクターを企図することができる。複製可能または複製欠陥ウイルスベクターを使用することができる。組み込みを起こさないベクターを使用することが有利である。これに関して、アデノウイルスベクター、ならびにポックスウイルス、より好ましくは、ワクシニアウイルスおよびＭＶＡ由来のベクターが本発明の実施に特に極めて好適である。
【０１６０】
好ましい実施形態によれば、本発明によるウイルスベクターは、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）に由来する。ＭＶＡベクターおよびそのようなベクターの作製方法は、欧州特許ＥＰ８３２８６およびＥＰ２０６９２０、ならびにSUTTER, et al. Nonreplicating vaccinia vector efficiently expresses recombinant genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 1992, vol.89, no.22, p.10847-51に十分に記載されている。より好ましい実施形態によれば、本発明による核酸配列は、ＭＶＡベクターの欠失Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩ、いっそうより好ましくは、欠失ＩＩＩに挿入され得る(MEYER, et al. Mapping of deletions in the genome of the highly attenuated vaccinia virus MVA and their influence on virulence. The Journal of general virology. 1991, vol.72, no.Pt5, p.1031-8; SUTTER, et al. A recombinant vector derived from the host range-restricted and highly attenuated MVA strain of vaccinia virus stimulates protective immunity in mice to influenza virus. Vaccine. 1994, vol.12, no.11, p.1032-40.)。
【０１６１】
レトロウイルスは、分裂細胞に感染し、ほとんどの場合にはそれに組み込まれる特性を有し、この点で、癌に関する使用に特に適切である。本発明による組換えレトロウイルスは、一般に、レトロウイルスＬＴＲまたは下記のものなどの内部プロモーターの制御下に置かれたＬＴＲ配列、キャプシド形成領域および本発明によるヌクレオチド配列を含む。組換えレトロウイルスは、任意の起源（マウス、霊長類、ネコ、ヒトなど）のレトロウイルスに、特に、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）、ＭＶＳ（マウス肉腫ウイルス）またはフレンドマウスレトロウイルス（Ｆｂ２９）に由来してもよい。それは、ウイルス粒子を構築するために必要とされるウイルスポリペプチドｇａｇ、ｐｏｌおよび／またはｅｎｖをトランスで供給し得るキャプシド形成細胞株で増殖される。このような細胞株は文献に記載されている（ＰＡ３１７、Ｐｓｉ  ＣＲＩＰ  ＧＰ＋Ａｍ−１２など）。本発明によるレトロウイルスベクターは、特にＬＴＲ（プロモーター領域を真核生物プロモーターで置換）またはキャプシド形成領域（異種キャプシド形成領域、例えばＶＬ３Ｏタイプで置換）に、修飾を含み得る（米国特許第５７４７３２３号参照）。
【０１６２】
ベクターが宿主生物または環境内で増殖することを避けるために、複製に必須であり、かつ、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４およびＬ１−Ｌ５領域から選択される、少なくとも１つの領域の全部または一部を欠いたアデノウイルスベクターを用いることも好ましい。Ｅ１領域の欠損が好ましい。しかしながら、それは、欠陥のある必須機能が相補細胞株および／またはヘルパーウイルスによりトランスで補足される程度に、特にＥ２、Ｅ４および／またはＬ１−Ｌ５領域の全部または一部に影響を及ぼす他の修飾／欠損と組み合わせてもよい。この点において、最新の第２世代ベクターを用いることが可能である（例えば、国際出願ＷＯ９４／２８１５２およびＷＯ９７／０４１１９参照）。例として、Ｅ１領域およびＥ４転写単位の主要部分の欠損が極めて特に有利である。クローニング能力を高める目的で、アデノウイルスベクターは非必須Ｅ３領域の全部または一部をさらに欠くことができる。別法によれば、キャプシド形成に必須な配列、すなわち５’および３’ＩＴＲ（逆方向末端反復配列）とキャプシド形成領域を保有する最小アデノウイルスベクターを用いることも可能である。様々なアデノウイルスベクターおよびそれらを作製する技術が知られている（例えば、GRAHAM, et al. Methods in molecular biology. Edited by MURREY. The human press inc, 1991. p.109-128参照）。
【０１６３】
さらに、本発明によるアデノウイルスベクターの起源は、種および血清型の双方の観点から様々であり得る。該ベクターはヒトもしくは動物（イヌ、トリ、ウシ、マウス、ヒツジ、ブタ、サルなど）源のアデノウイルスのゲノムに由来するか、または少なくとも２種の異なる起源のアデノウイルスゲノムフラグメントを含んでなるハイブリッドに由来する。イヌ起源のＣＡＶ−１またはＣＡＶ−２アデノウイルス、トリ起源のＤＡＶアデノウイルスまたはウシ起源のＢａｄ３型アデノウイルスが特に挙げられる(ZAKHARCHUK, et al. Physical mapping and homology studies of egg drop syndrome (EDS-76) adenovirus DNA. Archives of virology. 1993, vol.128, no.1-2, p.171-6; SPIBEY, et al. Molecular cloning and restriction endonuclease mapping of two strains of canine adenovirus type 2. The Journal of general virology. 1989, vol.70, no.Pt 1, p.165-72; JOUVENNE, et al. Cloning, physical mapping and cross-hybridization of the canine adenovirus types 1 and 2 genomes. Gene. 1987, vol.60, no.1, p.21-8; MITTAL, et al. Development of a bovine adenovirus type 3-based expression vector. The Journal of general virology. 1995, vol.76, no.Pt 1 , p.93-102)。しかしながら、血清型Ｃアデノウイルス、特に２または５型血清型Ｃアデノウイルスに由来するヒト起源のアデノウイルスベクターが好ましい。
【０１６４】
本明細書において、用語「複製可能」は、トランス補足の不在下でも宿主細胞で複製し得るウイルスベクターを意味する。
【０１６５】
本発明の好ましい態様によれば、複製適格ベクターは複製適格アデノウイルスベクターである。これらの複製適格アデノウイルスベクターは当業者に周知である。これらの中では、ＯＮＹＸ−０１５ウイルスの場合のように(BISCHOFF, et al. An adenovirus mutant that replicates selectively in p53-deficient human tumor cells. Science. 1996, vol.274, no.5286, p.373-6; He HEISE, et al. An adenovirus E1A mutant that demonstrates potent and selective systemic anti-tumoral efficacy. Nature Medicine. 2000, vol.6, no.10, p.1134-9; WO 94/18992)、５５ｋＤ  Ｐ５３阻害剤をコードするＥ１ｂ領域に欠損があるアデノウイルスベクターが特に好ましい。従って、このウイルスは、ｐ５３欠陥新生物細胞に選択的に感染してそれを死滅させるために使用可能である。当業者ならば、確立された技術に従い、アデノウイルス５または他のウイルスでｐ５３阻害剤遺伝子を変異させ、破壊することもできる。Ｅ１Ａ  Ｒｂ結合領域に欠損があるアデノウイルスベクターも本発明で使用可能である。例えば、Ｅ１Ａ領域に２４塩基対の欠損を有する変異型アデノウイルスであるデルタ２４ウイルス(FUEYO, et al. A mutant oncolytic adenovirus targeting the Rb pathway produces anti-glioma effect in vivo. Oncogene. 2000, vol.19, no.1, p.2-12)。デルタ２４はＲｂ結合領域に欠損を有し、Ｒｂと結合しない。従って、この変異型ウイルスの複製は、正常細胞においてはＲｂにより阻害される。しかしながら、Ｒｂが不活化されて、細胞が新生物化すると、デルタ２４はもはや阻害されない。その代わりに、変異型ウイルスは効率的に複製し、Ｒｂ欠陥細胞を溶解させる。
【０１６６】
本発明によるアデノウイルスベクターは、in vitroにおいて大腸菌(Escherichia coli)で、ライゲーションもしくは相同組換え（例えば、国際出願ＷＯ９６／１７０７０参照）あるいはまた補足細胞株における組換えにより作製することができる。
【０１６７】
本発明の好ましい実施形態によれば、ベクターは、本発明による抗体の発現に必須なエレメントをさらに含んでなる。
【０１６８】
発現に必要なエレメントは、核酸配列のＲＮＡへの転写およびｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を可能とする総てのエレメントからなる。これらのエレメントは、調節可能または構成的であり得るプロモーターを特に含んでなる。本来、このプロモーターは選択されたベクターおよび宿主細胞に適している。挙げられる例は、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＭＴ（メタロチオネイン；ＭＣＩＶＯＲ  Human purine nucleoside phosphorylase and adenosine deaminase: gene transfer into cultured cells and murine hematopoietic stem cells by using recombinant amphotropic retroviruses. Molecular and cellular biology. 1987, vol.7, no.2, p.838-46）、α−１抗トリプシン、ＣＦＴＲ、界面活性剤、免疫グロブリン、アクチン(TABIN, et al. Adaptation of a retrovirus as a eukaryotic vector transmitting the herpes simplex virus thymidine kinase gene. Molecular and cellular biology. 1982, vol.2, no.4, p.426-36)およびＳＲα(TAKEBE, et al. SR alpha promoter: an efficient and versatile mammalian cDNA expression system composed of the simian virus 40 early promoter and the R-U5 segment of human T-cell leukemia virus type 1 long terminal repeat. Molecular and cellular biology. 1988, vol.8, no.1, p.466-72)遺伝子の真核生物のプロモーター、ＳＶ４０ウイルス（シミアンウイルス）の初期プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）のＬＴＲ、ＨＳＶ−ｌ  ＴＫプロモーター、ＣＭＶウイルス（サイトメガロウイルス）の初期プロモーター、ワクシニアウイルスのｐ７．５Ｋ  ｐＨ５Ｒ、ｐＫ１Ｌ、ｐ２８およびｐ１１プロモーター、ｐ１１Ｋ７．５などのキメラプロモーター、ならびにＥ１ＡおよびＭＬＰアデノウイルスプロモーターである。このプロモーターはまた、腫瘍または癌細胞における発現を刺激するプロモーターでもあり得る。特に、乳癌および前立腺癌において過剰発現されるＭＵＣ−1遺伝子のプロモーター(CHEN, et al. Breast cancer selective gene expression and therapy mediated by recombinant adenoviruses containing the DF3/MUC1 promoter. The Journal of clinical investigation. 1995, vol.96, no.6, p.2775-82)、結腸癌において過剰発現されるＣＥＡ（癌胎児性抗原を表す）遺伝子のプロモーター(SCHREWE, et al. Cloning of the complete gene for carcinoembryonic antigen: analysis of its promoter indicates a region conveying cell type-specific expression. Molecular and cellular biology. 1990, vol.10, no.6, p.2738-48)、黒色腫において過剰発現されるチロシナーゼ遺伝子のプロモーター(VILE, et al. Use of tissue-specific expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene to inhibit growth of established murine melanomas following direct intratumoral injection of DNA. Cancer res.. 1993, vol.53, no.17, p.3860-4)、乳癌および膵臓癌において過剰発現されるＥＲＢＢ−２遺伝子のプロモーター(HARRIS, et al. Gene therapy for cancer using tumor-specific prodrug activation. Gene therapy. 1994, vol.1, no.3, p.170-5)、肝臓癌において過剰発現されるα−フェトタンパク質遺伝子のプロモーター(KANAI, et al. In vivo gene therapy for alpha-fetoprotein-producing hepatocellular carcinoma by adenovirus-mediated transfer of cytosine deaminase gene. Cancer res.. 1997, vol.57, no.3, p.461-5)が挙げられる。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーターが、極めて特に好ましい。
【０１６９】
しかしながら、ワクシニアウイルス由来の（例えば、ＭＶＡベクター）を用いる場合には、チミジンキナーゼ７．５Ｋ遺伝子のプロモーターおよびｐＨ５Ｒプロモーターが特に好ましい。
【０１７０】
必要なエレメントとにはさらに、本発明による核酸配列の発現または宿主細胞におけるその維持を改善する付加的エレメントが含まれる。イントロン配列、分泌シグナル配列、核局在配列、ＩＲＥＳ型の翻訳の再開始のための内部部位、転写終結ポリＡ配列、三分節リーダーおよび複製起点が特に挙げられる。これらのエレメントは当業者に公知である。分泌シグナル配列の中でも、配列番号５および／または８で示されるポリペプチドをコードする配列が特に好ましい。
【０１７１】
本発明による組換えベクターはまた、１以上の付加的な対象遺伝子を含んでなってよく、これらの遺伝子は同じ調節エレメントの制御下の置くこともできるし（ポリシストロニックカセット）、または独立したエレメントとすることもできる。特に挙げられる遺伝子は、インターロイキンＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ケモカイン（ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ−１４など）、インターフェロン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、並びに自然免疫および血管新生に作用する因子（例えば、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤を表すＰＡｌ−１）をコードする遺伝子である。特定の一実施形態では、本発明による組換えベクターは、ＩＬ−２をコードする対象遺伝子を含んでなる。
【０１７２】
本発明はまた、本発明の核酸配列を含んでなる細胞に関する。好ましい実施形態では、本発明の細胞は、真核細胞、より好ましくは哺乳動物細胞である。発現用宿主として利用可能な哺乳動物細胞は、当技術分野で周知であり、限定されるものではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞および他の多くのものなどの不死化細胞株が挙げられる。さらなる好適な真核細胞としては、酵母および他の真菌がある。
【０１７３】
本発明はまた、本発明の細胞を、その抗体の発現を可能とする条件下で培養すること、およびその細胞またはその細胞の周囲の培地から抗体を精製することを含んでなる、本発明の抗体を生産する方法に関する。
【０１７４】
別の実施形態では、本発明は、本発明の抗体、核酸配列またはベクターと薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物に関する。好ましい実施形態では、該医薬組成物は対象化合物をさらに含んでなる。
【０１７５】
薬学上許容される担体は好ましくは、等張性、低張または弱低張であり、例えばスクロース溶液など、比較低いイオン強度を有する。さらに、このような担体は、任意の溶媒、または非発熱原性無菌水などの水性もしくは部分的に水性の液体を含んでもよい。さらに、該医薬組成物のｐＨは、in vivo使用の要件を満たすために調製および緩衝される。該医薬組成物はまた、薬学上許容される希釈剤、アジュバントまたは賦形剤、ならびに可溶化剤、安定剤および保存剤を含んでもよい。注射投与には、水性または非水性等張性溶液中の処方物が好ましい。それは単回用量で、または液体もしくは使用時に適当な希釈剤で再構成することができる乾燥形態（粉末および凍結乾燥品など）で多回用量として提供してもよい。
【０１７６】
本発明はまた、（ｉ）本発明による医薬組成物、抗体、核酸配列またはベクターと、（ｉｉ）対象化合物とを含んでなるパーツキットに関する。
【０１７７】
本明細書において、用語「対象化合物」とは、治療化合物、好ましくは、癌治療薬または骨量減少の治療に有用な化合物に関する。
【０１７８】
好ましい実施形態によれば、癌治療薬は、アブラキサン(Abraxane)（パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子処方物(Paclitaxel Albumin-stabilized Nanoparticle Formulation)）、アドリアマイシン(Adriamycin)（塩酸ドキソルビシン）、アドルシル(Adrucil)（フルオロウラシル）、アルダラ(Aldara)（イミキモド(Imiquimod)）、アレムツズマブ(Alemtuzumab)、アリムタ(Alimta)（ペメトレキセド二ナトリウム(Pemetrexed Disodium)）、アミノレブリン酸、アナストロゾール(Anastrozole)、アプレピタント(Aprepitant)、アリミデックス(Arimidex)（アナストロゾール(Anastrozole)）、アロマシン(Aromasin)（エキセメスタン(Exemestane)）、アラノン(Arranon)（ネララビン(Nelarabine)）、三酸化ヒ素、アバスチン(Avastin)（ベバシズマブ(Bevacizumab)）、アザシチジン(Azacitidine)、ベバシズマブ(Bevacizumab)、ベキサロテン(Bexarotene)、ボルテゾミブ(Bortezomib)、キャンパス(Campath)（アレムツズマブ(Alemtuzumab)）、カンプトサール(Camptosar)（塩酸イリノテカン）、カペシタビン(Capecitabine)、カルボプラチン(Carboplatin)、セツキシマブ(Cetuximab)、シスプラチン(Cisplatin)、クラフェン(Clafen)（シクロホスファミド）、クロファラビン(Clofarabine)、クロファレックス(Clofarex)（クロファラビン(Clofarabine)）、クロラール(Clolar)（クロファラビン）、シクロホスファミド(Cyclophosphamide)、シタラビン(Cytarabine)、シトサール(Cytosar)−Ｕ（シタラビン）、サイトキサン(Cytoxan)（シクロホスファミド）、ダコゲン(Dacogen)（デシタビン(Decitabine)）、ダサチニブ(Dasatinib)、デシタビン(Decitabine)、デポシト(DepoCyt)（リポソーム化シタラビン）、デポフォーム(DepoFoam)（リポソーム化シタラビン）、塩酸デクスラゾキサン(Dexrazoxane Hydrochloride)、ドセタキセル(Docetaxel)、ドキシル(Doxil)（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、塩酸ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシンリポソーム、Ｄｏｘ−ＳＬ（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、エフデックス(Efudex)（フルオロウラシル）、エレンス(Ellence)（塩酸エピルビシン(Epirubicin Hydrochloride)）、エロキサチン(Eloxatin)（オキサリプラチン(Oxaliplatin)、エメンド(Emend)（アプレピタント(Aprepitant)）、塩酸エピルビシン(Epirubicin Hydrochloride)、エルビタックス(Erbitux)（セツキシマブ）、塩酸エルロチニブ(Erlotinib Hydrochloride)、エバセット(Evacet)（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、エビスタ(Evista)（塩酸ラロキシフェン(Raloxifene Hydrochloride)）、エキセメスタン(Exemestane)、ファスロデックス(Faslodex)（フルベストラント(Fulvestrant)）、フェマーラ(Femara)（レトロゾール(Letrozole)）、フルオロプレックス(Fluoroplex)（フルオロウラシル）、フルオロウラシル、フルベストラント(Fulvestrant)、ゲフィチニブ(Gefitinib)、塩酸ゲムシタビン(Gemcitabine Hydrochloride)、ゲムツズマブ・オゾガマイシン(Gemtuzumab Ozogamicin)、ジェムザール(Gemzar)（塩酸ゲムシタビン）、グリベック(Gleevec)（メシル酸イマチニブ(Imatinib Mesylate)）、ハーセプチン(Herceptin)（トラスツズマブ(Trastuzumab)）、ハイカムチン(Hycamtin)（塩酸トポテカン(Topotecan Hydrochloride)）、メシル酸イマチニブ、イミキモド、イレッサ(Iiressa)（ゲフィチニブ(Gefitinib)）、塩酸イリノテカン(Irinotecan Hydrochloride)、イキサベピロン(Ixabepilone)、イクセンプラ(Ixempra)(イキサベピロン(Ixabepilone)）、ケオキシフェン(Keoxifene)（塩酸ラロキシフェン(Raloxifene Hydrochloride)）、ケピバンス(Kepivance)（パリフェルミン(Palifermin)）、二トシル酸ラパチ��ブ(Lapatinib Ditosylate)、レナリドマイド(Lenalidomide)、レトロゾール(Letrozole)、レブラン(Levulan)（アミノレブリン酸(Aminolevulinic Acid)）、リポドックス(LipoDox)（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、リポソーム化シタラビン、メタゾラストン(Methazolastone)（テモゾロミド(Temozolomide)）、メトトレキサート(Methotrexate)、ミロサール(Mylosar)（アザシチジン(Azacitidine)）、マイロターグ(Mylotarg)（ゲムツズマブ・オゾガマイシン(Gemtuzumab Ozogamicin)）、ナノ粒子パクリタキセル(Nanoparticle Paclitaxel)（パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子処方物）、ネララビン(Nelarabine)、ネオサール(Neosar)（シクロホスファミド(Cyclophosphamide)）、ネクサバール(Nexavar)（トシル酸ソラフェニブ(Sorafenib Tosylate)）、ニロチニブ(Nilotinib)、ノルバデックス(Nolvadex)（クエン酸タモキシフェン(Tamoxifen Citrate)）、オンキャスパー(Oncaspar)（ペガスパルガーゼ(Pegaspargase)）、オキサリプラチン(Oxaliplatin)、パクリタキセル、パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子処方物、パリフェルミン(Palifermin)、パニツムマブ(Panitumumab)、パラプラット(Paraplat)（カルボプラチン(Carboplatin)）、パラプラチン(Paraplatin)（カルボプラチン(Carboplatin)）、ペガスパルガーゼ(Pegaspargase)、ペメトレキセド二ナトリウム(Pemetrexed Disodium)、プラチノール(Platinol)−ＡＱ（シスプラチン）、プラチノール(Platinol)(シスプラチン）、塩酸ラロキシフェン(Raloxifene Hydrochloride)、レブリミド(Revlimid)（レナリドマイド(Lenalidomide)）、リツキサン(Rituxan)（リツキシマブ(Rituximab)）、リツキシマブ、スクレロゾール胸腔内エアゾール(Sclerosol Intrapleural Aerosol)（タルク）、トシル酸ソラフェニブ(Sorafenib Tosylate)、スプリセル(Sprycel)（ダサチニブ）、無菌タルク粉末（タルク）、ステリタルク(Steritalc)（タルク）、リンゴ酸スニチニブ(Sunitinib Malate)、スーテント(Sutent)（リンゴ酸スニチニブ）、サイノビル(Synovir)（サリドマイド(Thalidomide)）、タルク、クエン酸タモキシフェン(Tamoxifen Citrate)、タラビン(Tarabine)ＰＦＳ（シタラビン(Cytarabine)）、タルセバ(Tarceva)（酸塩エルロチニブ(Erlotinib Hydrochloride)）、ターグレチン(Targretin)（ベキサロテン(Bexarotene)）、タシグナ(Tasigna)（ニロチニブ(Nilotinib)）、タキソール(Taxol)（パクリタキセル(Paclitaxel)）、タキソテール(Taxotere)（ドセタキセル(Docetaxel)）、テモダール(Temodar)（テモゾロミド(Temozolomide)）、テモゾロミド)、テムシロリムス(Temozolomide)、サロミド(Thalomid)（サリドマイド(Thalidomide)）、サリドマイド、トテクト(Totect)（塩酸デクスラゾキサン(Dexrazoxane Hydrochloride)）、塩酸トポテカン(Topotecan Hydrochloride)、トリセル(Torisel)（テムシロリムス(Temsirolimus)）、トラスツズマブ(Trastuzumab)、トリセノックス(Trisenox)（三酸化ヒ素）、タイケルブ(Tykerb)（二トシル酸ラパチニブ(Lapatinib)）、ベクチビックス(Vectibix)（パニツムマブ(Panitumumab)）、ベルケード(Velcade)（ボルテゾミブ(Bortezomib)）、ビダザ(Vidaza)（アザシチジン(Azacitidine)）、ボリノスタット(Vorinostat)、ゼローダ(Xeloda)（カペシタビン(Capecitabine)）、ザインカード(Zinecard)（塩酸デクスラゾキサン(Dexrazoxane Hydrochloride)）、ゾレンドロン酸(Zoledronic Acid)、ゾリンザ(Zolinza)（ボリノスタット(Vorinostat)）およびゾメタ(Zometa)（ゾレンドロン酸(Zoledronic Acid)）からなる群から選択される。
【０１７９】
本発明の好ましい実施形態によれば、骨量の減少の治療に有用な化合物は、ビホスホネート、選択性エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）（例えば、テリパラチド（フォルテオ(Forteo））、ラネル酸ストロンチウム、デノスマブもしくはカルシトニン、またはそれらの組合せである。より好ましい実施形態によれば、ビホスホネートは、アレンドロネート（フォサマックス(Fosamax)、フォサマックスプラスＤ）、エチドロネート（ダイドロネル(Didronel)）、イバンドロネート（ボニバ(Boniva)）、パミドロネート（アレジア(Aredia)）、リセドロネート（アクトネル(Actonel)、アクトネルＷ／カルシウム）、チルドロネート（スケリド(Skelid)）、およびゾレンドロン酸（リクラスト(Reclast)、ゾメタ(Zometa)）からなる群から選択される。より好ましい実施形態によれば、ＳＥＲＭは、ラロキシフェン（エビスタ(Evista)）、バゼドキシフェン／プレマリン（アプレラル(Aprelal)）およびタモキシフェンからなる群から選択される。
【０１８０】
別の実施形態によれば、本発明は、破骨細胞活性の増強に関連する疾患の治療のための本発明の抗体、核酸配列、ベクター、医薬組成物またはパーツキットの使用に関する。このような疾患には、限定されるものではないが、内分泌障害（高コルチゾール症、性腺機能低下症、原発性もしくは続発性副甲状腺機能亢進症、甲状腺機能亢進症）、高カルシウム血症、欠乏状態（くる病／骨軟化症、壊血病、栄養失調）、慢性疾患（吸収不良症候群、慢性腎不全（腎性骨異栄養症）、慢性肝疾患（肝性骨異栄養症）、薬物（グルココルチコイド（グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症）、アンドロゲン欠乏治療、アロマターゼ阻害療法、ヘパリン、アルコール）、および遺伝病（骨形成不全症、ホモシスチン尿症）、骨粗鬆症、大理石骨病、関節炎および関節リウマチに関連する骨の炎症、歯周病、線維性形成異常および／またはパジェット病が含まれる。
【０１８１】
別の実施形態によれば、本発明は、炎症および／または自己免疫に関連する疾患の治療のための、本発明の抗体、核酸配列、ベクター、医薬組成物またはパーツキットの使用に関する。このよう疾患は、限定されるものではないが、血清反応陰性脊椎関節症（乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、ライター症候群、炎症性腸疾患に関連する脊椎関節症）、人工関節弛緩、結合組織疾患（若年性関節リウマチ、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）および狼瘡腎炎、硬皮症、シェーグレン症候群、混合性結合組織病、多発性筋炎、皮膚筋炎）、炎症性腸疾患（例えば、クローン病；潰瘍性大腸炎）、ウィップル病、肉芽腫性回結腸炎に関連する関節炎、炎症性皮膚症状（自己免疫性水疱性類天疱瘡、自己免疫性尋常性天疱瘡、湿疹、皮膚炎）、炎症性肺疾患（肺胞炎、肺線維症、類肉腫症(sarcoidoisis)、喘息、気管支炎、閉塞性細気管支炎）、炎症性腎疾患（糸球体腎炎、腎臓同種移植片拒絶、腎尿細管炎症）、アテローム性動脈硬化症、全身性血管炎（側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、高安動脈炎、結節性多発性動脈炎、川崎病、ウェゲナー肉芽腫、チャーグ・ストラウス症候群、顕微鏡的多発性血管炎、壊死性糸球体腎炎、ヘノッホ・シェンライン紫斑病、本態性クリオグロブリン血症性血管炎およびその他の小血管血管炎、ベーチェット病）、マクロファージ活性化疾患（マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）、成人発症型スティル病、血球貪食症候群）、リウマチ性多発性筋痛、原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、１型糖尿病、橋本甲状腺炎、グレーブス病、多発性硬化症（ＭＳ）、ギラン−バレー症候群、アジソン病および／またはレイノー現象、グッドパスチャー症候群を含んでなる。
【０１８２】
別の実施形態によれば、本発明は、癌の治療のための、本発明の抗体、核酸配列、ベクター、医薬組成物またはパーツキットの使用に関する。
【０１８３】
本明細書において、用語「癌」は、限定されるものではないが、腺癌、腺傍細胞腺癌、副腎皮質細胞癌、肺胞細胞癌、未分化癌、類基底細胞癌、基底細胞癌、細気管支癌、肺癌（bronchogenic carcinoma）、腎腺癌(renaladinol carcinoma)、胎児性癌、アノメトロイド癌（anometroid carcinoma）、線維層板肝細胞癌、濾胞性癌、巨細胞癌、肝細胞癌、表皮内癌、上皮内癌、軟膜癌(leptomaningio carcinoma)、髄様癌、黒色性癌、髄膜癌、子宮間膜癌(mesometonephric carcinoma)、燕麦細胞癌、扁平上皮細胞癌腫、汗腺癌、移行上皮癌、管状細胞癌、エナメル芽細胞肉腫、砂上石灰化を伴う髄膜腫、ブドウ状肉腫、子宮内膜間質肉腫、ユーイング肉腫、線維束状肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球肉腫、免疫芽球肉腫、傍骨性骨肉腫、カピセス肉腫(coppices sarcoma)、白血球性肉腫（白血病）、リンパ性肉腫（リンパ肉腫）、髄様肉腫、骨髄性肉腫（顆粒球性肉腫）、オースチオゲンシ肉腫(austiogenci sarcoma)、骨膜肉腫、細網細胞肉腫（組織球性リンパ腫）、円形細胞肉腫、紡錘細胞肉腫、滑膜肉腫、毛細管拡張性聴原性肉腫、バーキットリンパ腫、ＮＰＤＬ、ＮＭＬ、ＮＨ、および、びまん性リンパ腫を意味する。好ましい実施形態によれば、本発明の方法は骨に対する転移癌の治療を対象とし、その転移癌は乳癌、肺癌、腎臓癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血液細胞悪性腫瘍（白血病およびリンパ腫を含む）、頭頚部癌、胃腸管癌（食道癌、胃癌、結腸癌、腸管癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管または胆嚢の癌を含む）、女性生殖管の悪性腫瘍（卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌および子宮頚癌を含む）、膀胱癌、脳癌（神経芽腫を含む）、肉腫、骨肉腫ならびに皮膚癌（悪性黒色腫または扁平上皮細胞癌を含む）である。
【０１８４】
本発明はさらに、癌治療薬による化学療法治療を受けている癌患者の治療を改善する方法であって、該患者を上記で開示されたような方法で同時処置することを含んでなる方法に関する。
【０１８５】
本発明はさらに、細胞傷害剤または放射線療法の細胞傷害有効性を改善する方法であって、そのような治療を必要とする患者を上記で開示されたような方法で同時処置することを含んでなる方法に関する。
【０１８６】
本発明はさらに、ビホスホネート、選択性エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）（例えば、テリパラチド（フォルテオ(Forteo））、ラネル酸ストロンチウム、デノスマブもしくはカルシトニン、またはそれらの組合せによる治療を受けている、破骨細胞活性の増強に関連する疾患を有する患者の治療を改善するための方法であって、該患者を上記で開示されたような方法で同時処置することを含んでなる方法に関する。
【０１８７】
別の実施形態では、本発明の抗体の使用は、転移癌に罹患している患者において骨に対する転移癌を予防または治療するための薬剤の製造において意図される。関連の実施形態では、転移癌は乳癌、肺癌、腎臓癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血液細胞悪性腫瘍（白血病およびリンパ腫を含む）、頭頚部癌、胃腸管癌（食道癌、胃癌、結腸癌、腸管癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管または胆嚢の癌を含む）、女性生殖管の悪性腫瘍（卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌および子宮頚癌を含む）、膀胱癌、脳癌（神経芽腫を含む）、肉腫、骨肉腫、または皮膚癌（悪性黒色腫もしくは扁平上皮細胞癌を含む）である。
【０１８８】
別の実施形態によれば、本発明は、薬剤の製造における、本発明の抗体、核酸配列、ベクター、医薬組成物またはパーツキットの使用に関する。
【０１８９】
別の実施形態によれば、本発明は、癌を有する患者を治療するための薬剤の製造における、本発明の抗体、核酸配列、ベクター、医薬組成物またはパーツキットの使用に関する。
【０１９０】
別の実施形態によれば、本発明は、破骨細胞活性の増強に関連する疾患を有する患者を治療するための薬剤の製造における、本発明の抗体、核酸配列、ベクター、医薬組成物またはパーツキットの使用に関する。
【０１９１】
別の実施形態によれば、本発明は、炎症性疾患、より具体的には、炎症性腸疾患を有する患者を治療するための薬剤の製造における、本発明の抗体、核酸配列、ベクター、医薬組成物またはパーツキットの使用に関する。
【０１９２】
別の実施形態によれば、本発明は、関節リウマチに罹患している患者を治療するための薬剤の製造における、本発明の抗体、核酸配列、ベクター、医薬組成物またはパーツキットの使用に関する。
【０１９３】
本発明の抗体、核酸配列、ベクター、医薬組成物またはパーツキットの投与は、当業者に公知の任意の手段によって達成し得る。好ましい投与経路としては、限定されるものではないが、皮内、皮下、経口、非経口、筋肉内、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、眼、膣および直腸がある。好ましい実施形態によれば、本発明の抗体、核酸配列、ベクター、医薬組成物またはパーツキットは全身送達される。
【０１９４】
投与は単回用量または一定時間をおいた後に１回または数回繰り返される用量で行うことができる。望ましくは、本発明の抗体、核酸配列、ベクター、医薬組成物またはパーツキットは、１週間間隔で１〜１０回投与される。
【０１９５】
一般的な指針として、該抗体の好適な用量は約２ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇまたは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。本発明のベクターの好適な用量は、ＭＶＡベクターでは、約１０４〜１０１０ｐｆｕ（プラーク形成単位）、望ましくは約１０５〜１０８ｐｆｕで様々であり、アデノウイルス系ベクターでは、約１０５〜１０１３ｉｕ（感染単位）、望ましくは約１０７〜１０１２ｉｕで様々である。ベクタープラスミドに基づく組成物は１０μｇ〜２０ｍｇの間、有利には１００μｇ〜２ｍｇの間の用量で投与し得る。
【０１９６】
本発明の使用または方法が癌の治療のためである場合、本発明の方法または使用は１以上の慣例の治療法（例えば、放射線照射、化学療法および／または外科術）と組み合わせて行うことができる。複数の治療アプローチの使用は患者により広い介入基盤を提供する。一実施形態では、本発明の方法は外科的介入の前または後に行うことができる。別の実施形態では、それは放射線療法（例えば、γ線照射）の前または後に行うことができる。当業者ならば、使用可能な適当な放射線療法プロトコールおよびパラメーターを容易に処方することができる（例えば、PEREZ. Principles and practice of radiation oncology. 2nd edition. LIPPINCOTT, 1992参照）。
【図面の簡単な説明】
【０１９７】
【図１】ＣＳＦ−１ＲでトランスフェクションしたＮＩＨ／３Ｔ３細胞の、ｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６による特異的染色を示す。
【図２】ｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６の存在下での、細胞表面ＣＳＦ−１Ｒに対するＣＳＦ−１の結合の阻害を示す。
【図３】ｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６による可溶性ヒトＣＳＦ−１Ｒの特異的遮断を示す（「ｃｔｒｌ」は対照を意味し、「ｎｅｇ  ＳＮ」は陰性対照ハイブリドーマ上清を意味する）。
【図４】ｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６の存在下での、ヒト破骨細胞分化およびマトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）分泌の阻害を示す（「対照」は対照を意味し、「ＣＸＩＩＧ６  ＳＮ」はＣＸＩＩＧ６ハイブリドーマ上清を意味し、「ｎｅｇ  ＳＮ」は陰性対照ハイブリドーマ上清を意味する）。
【図５】ｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６は、ＣＳＦ−１Ｒと相同性を有する他のチロシンキナーゼ受容体と交差反応性がないことを示す（「ＳＮ」はハイブリドーマ上清を示す）。
【図６】ＣＸＩＩＧ６重鎖の核酸配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。ヌクレオチド配列に付加されているクローニングのための制限部位を含むプライマー配列を下線で示す。制限部位は下線の斜体で示す。Ｖドメインのアミノ酸配列は太字で強調されている。
【図７】ＣＸＩＩＧ６軽鎖の核酸配列（配列番号３）および推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。ヌクレオチド配列に付加されているクローニングのための制限部位を含むプライマー配列を下線で示す。制限部位は下線の斜体で示す。Ｖドメインのアミノ酸配列は太字で強調されている。
【図８】プラスミド構築物ｐＴＧ１７７５３を示す。
【図９】プラスミド構築物ｐＴＧ１７７２７を示す。
【図１０】プラスミド構築物ｐＯｐｔｉＶＥＣ（商標）を示す。
【図１１】プラスミド構築物ｐＴＧ１７８９５を示す。
【図１２】プラスミド構築物ｐＴＧ１７８１２を示す。
【図１３】プラスミド構築物ｐＴＧ１７８６８を示す。
【図１４】プラスミド構築物ｐＴＧ１７８６９を示す。
【図１５】ヒト化ＣＸＩＩＧ６軽鎖変異体を示す。
【図１６】ヒト化ＣＸＩＩＧ６  ＩｇＧ１重鎖変異体を示す。
【図１７】組換えマウスＣＸＩＩＧ６およびキメラＣＸＩＩＧ６  ＩｇＧ１による可溶性ヒトＣＳＦ−１Ｒの特異的遮断を示す。
【図１８】組換えマウスＣＸＩＩＧ６およびキメラＣＸＩＩＧ６  ＩｇＧ１の存在下での、ヒト破骨細胞分化およびマトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）分泌の阻害。
【図１９】市販の抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体のエピトープに対して本発明のモノクローナル抗体のエピトープをマッピングするために用いたＣＳＦ−１Ｒの種々の構築物を示す。ヒト配列を白いバーで表し、マウス配列を網掛けバーで表す。名称に×の入った抗体は、構築物と結合しないことを示す。
【図２０】エピトープのマッピングに用いたＣＳＦ−１Ｒの種々の構築物のＩｇ様ドメインの限界を示す。
【図２１】ＥＬ４−ＣＳＦ−１Ｒに対する１２５Ｉ−Ｈ２７Ｋ１５抗体と非標識Ｈ２７Ｋ１５抗体の競合曲線。
【図２２】ＥＬ４−ＣＳＦ−１Ｒに対する１２５Ｉ−Ｈ２７Ｋ１５抗体と種々の抗体の競合曲線。
【図２３】ポストインキュベーション競合曲線：ＣＳＦ−１／ｍＡｂ。
【図２４】プレインキュベーション競合曲線：ｍＡｂ／ＣＳＦ−１。
【図２５】同時インキュベーション競合曲線：ｍＡＢ＋ＣＳＦ−１。
【図２６】同時インキュベーション競合曲線：ｍＡＢ＋ＣＳＦ−１Ｒ。
【図２７】ｍＡＢ変異体の交差反応性の欠如。
【図２８】可溶性ＣＳＦ−１Ｒの遮断。３つのｈＣＸＩＩＧ６変異体とｃｈＣＸＩＩＧ６は、可溶性ヒトＣＤ１１５を遮断し、Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞のＣＳＦ−１依存性増殖を回復させる。結果は４反復ウェルの平均＋／−ＳＥＭで表す。ＮＤ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ  ５パラメーターロジスティック方程式を用いて計算した。
【図２９】図２９Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ：ＡＭＬ３細胞のＣＳＦ−１依存性増殖の阻害。図２９Ａでは、ＡＭＬ５細胞を抗ヒトＣＤ１１５  ｍＡＮ  ３２９１（左のパネル）かｃｈＣＸＩＩＧ６（右のパネル）のいずれかで染色した。各パネルで、左のヒストグラムは、同位元素対照（それぞれマウスＩｇＧ１およびリツキシマブ）で染色したＡＭＬ５細胞に相当する。図２９Ｂは、ＡＭＬ５細胞の増殖がＣＳＦ−１により用量依存的に刺激されることを示す。図２９Ｃは、ｈＣＸＩＩＧ６変異体およびｃｈＣＸＩＩＧ６がＡＭＬ５細胞のＣＳＦ−１依存的増殖を阻害することを示し、３回の独立した実験からの結果を示す。図２９Ｄは、図２９Ｃに示される結果からＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにより計算したＥＣ５０およびＲ二乗値を含む。
【図３０】図３０Ａ／Ｂ：ＥＬ４−ＣＳＦ−Ｒ標的細胞に対するＡＤＣＣ活性。３０Ａでは、エフェクター細胞として血液ドナー番号１からのＰＢＭＣを使用して、Ｅ：Ｔ比２５でのＥＬ４−ＣＤ１１５標的細胞に対するＨ２７Ｋ５、Ｈ２７Ｋ１５およびＨ１９Ｋ１２の細胞傷害活性を評価した。３０Ｂでは、ドナー番号２からのＰＢＭＣを、図３０Ａと同様のアッセイにて、示されたＥ：Ｔ比で試験した。アスタリスク（＊）はリツキシマブと比較した場合のｐ＜０．０５を示し、シータの記号（Φ）はｃｈＣＸＩＩＧ６と比較した場合のｐ＜０．０５を示す。
【図３１】図３１Ａ／Ｂ：ＢｅＷｏ絨毛癌腫瘍モデルにおける治療効果。
【図３２】配列番号３７〜配列番号４７の配列表。
【実施例】
【０１９８】
ＣＳＦ−１ＲでトランスフェクトしたＮＩＨ／３Ｔ３細胞の、ｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６による特異的染色
Ｂ４−８００−５細胞株は、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、全長ヒトＣＳＦ−１Ｒをコードする発現プラスミドで安定的にトランスフェクトすることにより作出した。Ｂ４−８００−５細胞上での細胞表面ＣＳＦ−１Ｒ発現を、アイソタイプ対照と比較し、抗ヒトＣＳＦ−１Ｒ  ｍＡｂ  ６１７０１（マウスＩｇＧ１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）または２−４Ａ５−４（ラットＩｇＧ１，ｋ、ＧｅｎｅＴｅｘ）を用いた間接免疫染色により確認した（図１、上のパネルおよび中央のパネル）。ハイブリドーマＣＸＩＩＧ６または陰性対照ハイブリドーマからの培養上清をＢ４−８００−５細胞または親ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の免疫染色に用いた（図１、下のパネル）。
【０１９９】
フローサイトメトリー分析によれば、ハイブリドーマＣＸＩＩＧ６からの培養上清は選択的にＢ４−８００−５細胞を染色することが示され、細胞表面ＣＳＦ−１Ｒに対するｍＡｂの特異性が証明された。
【０２００】
細胞表面ＣＳＦ−１Ｒに対するＣＳＦ−１の結合の部分的阻害
３×１０５のＴＨＰ−１細胞（ヒトＣＳＦ−１Ｒ陽性単球性白血病細胞株）を、ハイブリドーマ培養上清、ナイーブまたは抗ＣＳＦ−１Ｒ免疫マウスからの血清（１：１０００希釈）、ｍＡｂ抗ＣＳＦ−１Ｒ  ２−４Ａ５−４（ＧｅｎｅＴｅｘ）もしくは対照ラットＩｇＧ１（１０μｇ／ｍｌ）のいずれかの存在下、または試薬無しで、４℃にて３０分間インキュベートした。冷ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を１μｇ／ｍｌのビオチン化組換えヒトＣＳＦ−１とともに３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、さらに４℃にて３０分間、１０μｇ／ｍｌストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにインキュベートした。ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定した後、細胞染色をフローサイトメトリーにより分析した。
【０２０１】
対照サンプルと比較した場合の蛍光強度の低下は、細胞表面ＣＳＦ−１Ｒに対するＣＳＦ−１の結合の阻害を反映する。ＣＳＦ−１Ｒ免疫マウスからの血清はＴＨＰ−１細胞に対するＣＳＦ−１の結合を遮断する（図２）。陰性対照ハイブリドーマ上清または無関連のｍＡｂは効果を示さず、ハイブリドーマＣＸＩＩＧ６からの培養上清は、ＴＨＰ−１細胞に対するＣＳＦ−１の結合を少なくとも部分的に阻害すると思われる（図２の右下のパネル）。
【０２０２】
ｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６結合部位の最初の位置決定
ＣＳＦ−１Ｒ上の、ｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６の結合部位を特定するため、ＣＳＦ−１Ｒの細胞外領域の、５つの細胞外免疫グロブリン様ドメイン（Ｍｅｔ１〜Ｇｌｕ５１２、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）か、３つのみのＮ末端免疫グロブリン様ドメイン（Ｍｅｔ１〜Ｓｅｒ２９０）のいずれか（双方ともＣ末端でヒトＩｇＧ１のＦｃ領域と融合）を含んでなる可溶型のヒトＣＳＦ−１Ｒを用いてウエスタンブロットを行った。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃと融合された可溶型のＥＧＦＲ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を陰性対照として用いた。
【０２０３】
各可溶性受容体１００ｎｇを未変性状態で電気泳動に付した後、ニトロセルロースシートに転写し、ハイブリドーマ上清、ウサギｐＡｂ  ｃ−ｆｍｓ／ＣＳＦ−１Ｒ  Ｈ３００（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、マウスｍＡｂ  ６１７０１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはナイーブマウスもしくはＣＳＦ−１Ｒ免疫マウスからの血清のいずれかでプロービングした。
【０２０４】
可溶型のＣＳＦ−１Ｒは双方とも、ｐＡｂ  ｃ−ｆｍｓ／ＣＳＦ−１Ｒ  Ｈ３００、ｍＡｂ  ６１７０１または免疫マウスからの血清でブロービングした際にブロードバンドとして検出された。ナイーブマウス血清または陰性対照ハイブリドーマ上清では検出可能なシグナルは見られなかった。ＣＸＩＩＧ６ハイブリドーマ上清はＣＳＦ−１Ｒ１−２９０：ＦｃならびにＣＳＦ−１Ｒ１−５１２：Ｆｃを認識したが、ＥＧＦＲ：Ｆｃは認識せず、このことはＣＸＩＩＧ６がヒトＣＳＦ−１Ｒの３つのＮ末端免疫グロブリン様ドメイン内（残基１〜２９０の間）にあるエピトープと特異的に結合することを示唆する。
【０２０５】
ｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６による可溶性ヒトＣＳＦ−１Ｒの特異的遮断
ＣＳＦ−１依存性マウス骨髄性白血病Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞株（番号ＣＲＬ−１８３８、ＡＴＣＣ）を用いて、ヒトおよびマウスＣＳＦ−１Ｒに対するＣＸＩＩＧ６ハイブリドーマ上清の遮断活性を評価した。５ｎｇの可溶性ヒトＣＳＦ−１Ｒ（ＣＳＦ−１Ｒ１−５１２：Ｆｃ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を、白色９６ウェルマイクロプレートにて、ハイブリドーマ上清、ｍＡｂ  ６１７０１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはマウスアイソタイプ対照ｍＡｂのいずれかの希釈系とともにプレインキュベートした。次に、これらの培養ウェルに、ＣＳＦ−１の不在下で一晩培養した１０Ｅ４  Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞を、０．１ｎｇのヒトＣＳＦ−１とともに最終アッセイ容量１００μｌとして加えた。培養物を３７℃で４８時間インキュベートし、細胞増殖ＥＬＩＳＡ（Ｒｏｃｈｅ）を用い、ＢｒｄＵの組み込みにより増殖を定量した。
【０２０６】
可溶性ヒトＣＳＦ−１Ｒは、陰性対照ＩｇＧ１を含む、または含まない陰性ハイブリドーマ上清の存在下で示される場合と同様に、ヒトＣＳＦ−１により媒介されるＭ−ＮＦＳ−６０細胞の増殖を完全に阻害した（図３；３ウェルの平均＋／−ＳＥＭ）。これに対し、ＣＸＩＩＧ６ハイブリドーマ上清および陽性対照ｍＡｂ  ６１７０１は双方とも、用量依存的に細胞増殖を回復させることができ、それらが可溶性ヒトＣＳＦ−１Ｒを中和することができたことを示す。
【０２０７】
このアッセイにおいて、低希釈率のＣＸＩＩＧ６ハイブリドーマ上清の存在下でのＭ−ＮＦＳ−６０細胞の活発な増殖は、ｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６がＭ−ＮＦＳ−６０細胞によって発現されたマウスＣＳＦ−１Ｒを遮断することができなかったことを示した。さらに、可溶性ＣＳＦ−１Ｒの不在下で行ったマウスＣＳＦ−１で補助したＭ−ＮＦＳ−６０増殖アッセイでは、ｍＡｂ  ＡＦＳ９８抗マウスＣＳＦ−１Ｒ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で処理すると、細胞増殖に劇的な濃度依存的低下が起こった（データは示されていない）。ＣＸＩＩＧ６ハイブリドーマ上清は、陰性対照抗体および陰性ハイブリドーマ上清と同様に、細胞増殖の低下を引き起こさなかった。これらの結果は、ｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６が特異的にヒトＣＳＦ−１Ｒを標的とすることを証明する。
【０２０８】
ヒト破骨細胞分化およびマトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）分泌の阻害
破骨細胞は、健常な血液ドナーからのＰＢＭＣのエルトリエーションによって得られたヒト単球から作製した。簡単にいえば、単球を９６ウェルプレートに２×１０Ｅ４細胞／ウェルで播種し、ハイブリドーマ培養上清、ｍＡｂｓ抗ヒトＣＳＦ−１Ｒ  ６１７０１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）または２−４Ａ５−４（ＧｅｎｅＴｅｘ）、ｍＡｂ抗ヒトＣＳＦ−１  ２６７３０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、マウスもしくはラットアイソタイプ対照、またはナイーブおよびＣＳＦ−１Ｒ免疫マウスからの血清のいずれかをハイブリドーマ培養培地で希釈したもので４５分間処理した。これらの培養ウェルに完全ａ−ＭＥＭ培地をヒトＣＳＦ−１およびＲＡＮＫＬ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、それぞれ２５および４０ｎｇ／ｍｌ）とともに、または伴わずに加えた。ハイブリドーマ上清、ｍＡｂまたは／およびサイトカインを含む、もしくは含まない培地を９日間、３日ごとに補充した。９日目に馴化培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、全ヒトＭＭＰ−９をアッセイした。破骨細胞の形成は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからの白血球酸性ホスファターゼキットを用い、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）の染色により評価した。
【０２０９】
ＣＳＦ−１＋ＲＡＮＫＬは、単球の破骨細胞（大きな多核ＴＲＡＰ陽性細胞として定義される）への分化を誘導したが、サイトカインの不在下ではＴＲＡＰ陽性破骨細胞は見られなかった。０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＳＦ−１  ｍＡｂ  ２６７３０を加えると、ＭＭＰ−９分泌の欠如により示されるように、破骨細胞分化が完全に排除された。同濃度の抗ＣＳＦ−１Ｒ  ｍＡｂ ６１７０１または２−４Ａ５−４および免疫マウス血清（１：１０００希釈）は、破骨細胞の形成を部分的に阻害したに過ぎなかった（図４；サイトカイン有り（＋）または無し（−）；３ウェルの平均＋／−ＳＥＭ；＊：２ウェルの平均）。１：２０または１：１００希釈のＣＸＩＩＧ６ハイブリドーマ培養上清で処理すると、２つの陰性対照ハイブリドーマ上清（Ａ、Ｂ）に比べ、ＭＭＰ−９生産のレベルが有意に減少した。これらの結果は、ｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６が、細胞表面ＣＳＦ−１Ｒの機能を遮断することにより、ヒト単球から破骨細胞への分化を阻害することを証明する。
【０２１０】
ＣＳＦ−１ＲのＣＳＦ−１依存性リン酸化の阻害
ヒトＣＳＦ−１Ｒを発現するプラスミドでＮＩＨ／３Ｔ３細胞を安定的にトランスフェクトすることにより得られたＢ４−８００−５細胞株を用いて、ＣＳＦ−１依存性ＣＳＦ−１Ｒリン酸化に対するＣＸＩＩＧ６ハイブリドーマ上清の効果を検討した。細胞を２×１０Ｅ５細胞／６０ｍｍペトリ皿で播種し、４８〜７２時間培養した。３７℃で１時間血清飢餓状態にした後、細胞を３７℃で１時間、ＣＸＩＩＧ６ハイブリドーマ上清、ｍＡｂ  ２−４Ａ５−４（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ）またはアイソタイプ対照ｍＡｂ（陰性ハイブリドーマ上清で希釈）のいずれかを含有する培養培地で処理し、次に、３７℃で５分間、１００ｎｇ／ｍｌのｈＣＳＦ−１で刺激するか、または刺激せずにおいた。次に、細胞層を溶解させ、全タンパク質を抽出した。１０μｇのタンパク質を、ウエスタンブロットを、ウサギｐＡｂ  ｃ−ｆｍｓ／ＣＳＦ−１Ｒ  Ｈ３００またはウサギｐＡｂ  ｐ−ｃ−ｆｍｓ／ＣＳＦ−１Ｒ（Ｔｙｒ７０８）−Ｒ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のいずれかで、その後、ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＨＲＰでプロービングすることにより分析した。
【０２１１】
ＣＳＦ−１の不在下では、ＣＸＩＩＧ６ハイブリドーマ上清でもｍＡｂ  ２−４Ａ５−４でも、７０８番でリン酸化されたＣＳＦ−１Ｒに特異的な抗体で見られたような受容体のリン酸化は誘導されず、ｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６単独では促進作用を示さないことが示された。ＣＳＦ−１で刺激すると、ＣＳＦ−１ＲはＴｙｒ７０８でリン酸化され、アイソタイプ対照処理細胞では非刺激細胞に比べてＣＳＦ−１Ｒの量が減少したが、これは受容体の分解を反映する（データは示されていない）。ＣＸＩＩＧ６ハイブリドーマ上清またはｍＡｂ  ２−４Ａ５−４で前処理しても、ＣＳＦ−１Ｒの消失は高まらなかった。ＣＳＦ−１Ｒのリン酸化は、ＣＸＩＩＧ６ハイブリドーマ上清またはｍＡｂ  ２−４Ａ５−４で処理した後に低下した。これらの結果は、ｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６がＣＳＦ−１ＲのＣＳＦ−１依存性リン酸化を遮断することができることを示す。
【０２１２】
ｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６の交差反応性
チロシンキナーゼ受容体のＩＩＩ型サブファミリーに属し、細胞外Ｉｇ様ドメインにおいてＣＳＦ−１Ｒと相同性を示す一連の精製可溶性受容体：可溶性ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、Ｆｌｔ−３およびＰＤＧＦＲβ（４つは総てＦｃ融合タンパク質として発現される）に対してＥＬＩＳＡによりｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６の交差反応性を試験するとともに、ＰＤＧＦＲαおよびＳＣＦＲ（ｃ−ｋｉｔ）をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手し、ＥＬＩＳＡプレートを被覆するのに用いた。チロシンキナーゼ受容体のＥＧＦＲサブファミリーからの可溶性ＥＧＦＲ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を陰性対照として用いた。
【０２１３】
ハイブリドーマＣＸＩＩＧ６（ＣＸＩＩＧ６  ＳＮ）または陰性対照ハイブリドーマ、または抗ＣＳＦ−１ＲマウスＩｇＧ１  ６１７０１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）から培養上清を、抗体濃度５００ｎｇ／ｍｌで被覆したＥＬＩＳＡプレート上でインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄した後、結合した抗体を、ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇ（Ｓｉｇｍａ）を用いて明らかにし、ＯＤ（４５０−５４０ｎｍ）を測定した。図５に示されている結果は、ｍＡｂ  ６１７０１同様、ＣＸＩＩＧ６はＣＳＦ−１Ｒと強く結合したが、他のいずれのチロシンキナーゼ受容体にも特異的シグナルは検出されなかった。このことは、試験した種々のＩＩＩ型チロシンキナーゼ受容体のうち、ＣＸＩＩＧ６がＣＳＦ−１Ｒに特異的であることを示す。
【０２１４】
ｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６用の発現ベクターの構築
ＤＧ４４哺乳動物細胞株においてｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６を生産するために、ＣＸＩＩＧ６重鎖および軽鎖をコードする遺伝子のクローニングにＯｐｔｉＣＨＯ（商標）抗体発現キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２７６２−０１９）を用いた。ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）抗体発現キットは、（１）ＣＭＶプロモーターの下流に目的遺伝子のクローニングを可能とする二シストロン性プラスミドｐＯｐｔｉＶＥＣ（商標）ベクター（目的遺伝子の転写は、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）によりジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）要求性選択マーカーから隔てられ、同じｍＲＮＡで目的遺伝子と選択マーカーの転写が可能となる）；（２）ＣＭＶプロモーターの下流に目的遺伝子のクローニングを可能とするｐｃＤＮＡ（商標）３．３ベクター（このｐｃＤＮＡ（商標）３．３はジェネティシン（登録商標）を用いて選択が可能なネオマイシン耐性遺伝子を含む）を含む。このｐＯｐｔｉＶＥＣ（商標）およびｐｃＤＮＡ（商標）３．３ベクターは、目的遺伝子のｍＲＮＡの３’末端の適切なプロセシングを命令するＴＫポリＡ配列を含む。
【０２１５】
特異的プライマー（表４参照）を合成し、全ＣＸＩＩＧ６重鎖および軽鎖遺伝子のＰＣＲ増幅およびクローニングに用いた（それぞれ配列番号１および配列番号３；それぞれ図６および図７参照）。逆方向プライマーは効率的な真核生物の翻訳のためのＫｏｚａｋコンセンサス配列を含んだ(KOZAK M. An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Res. 1987, 15(20):8125-8148)。
【０２１６】
【表４】
0005996558.tif 000005
ＣＸＩＩＧ６重鎖を、プラスミドｐＴＧ１７７５３（図８）を鋳型とし、ＯＴＧ１８９２９およびＯＴＧ１８９３０を用いてＰＣＲ増幅し、ベクターｐＯｐｔｉＶＥＣ（商標）−ＴＯＰＯ（登録商標）（ｐＯｐｔｉＶＥＣ（商標）−ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡクローニング（登録商標）キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２７４４−０１７−０１）およびｐｃＤＮＡ（商標）３．３−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（ｐｃＤＮＡ（商標）３．３−ＴＯＰＯ（商標）ＴＡクローニング（登録商標）キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｋ８３００−０１）にクローニングし、それぞれｐＴＧ１７７８６およびｐＴＧ１７７８９を得た。
【０２１７】
ＣＸＩＩＧ６軽鎖を、プラスミドｐＴＧ１７７２７（図９）を鋳型とし、ＯＴＧ１８９３１およびＯＴＧ１８９３２を用いてＰＣＲ増幅し、ベクターｐＯｐｔｉＶＥＣ（商標）−ＴＯＰＯ（登録商標）（ｐＯｐｔｉＶＥＣ（商標）−ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡクローニング（登録商標）キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２７４４−０１７−０１）およびｐｃＤＮＡ（商標）３．３−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（ｐｃＤＮＡ（商標）３．３−ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡクローニング（登録商標）キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｋ８３００−０１）にクローニングし、それぞれｐＴＧ１７７８８およびｐＴＧ１７７８７を得た。
【０２１８】
ＣＭＶプロモーターならびにｐＴＧ１７７８６、ｐＴＧ１７７８７、ｐＴＧ１７７８８およびｐＴＧ１７７８９のＴＫポリＡシグナルを含む全発現カセットのヌクレオチド配列を決定したところ、それらの理論的配列との一致が見られた。
【０２１９】
ｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６からのキメラ抗体の作製
ｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６の可変ドメインをヒト定常領域と組み合わせた。
【０２２０】
キメラ軽鎖（キメラＣＸＩＩＧ６  Ｉｇκ鎖と呼ぶ）を作製するため、ＣＸＩＩＧ６  ＶＫドメイン（配列番号３から）をコードする配列とヒトＩＧＫＣ領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｊ００２４１）をコードする配列を連結することにより理論的配列を設計した。このＸｂａｌ  ＮｏｔＩ  ＤＮＡフラグメントは、５’末端にマウス型（上記のｐＴＧ１７７８７およびｐＴＧ１７７８８の場合）において用いたものと同じ非翻訳配列（Ｋｏｚａｋ配列を含む）を保持していた。このキメラＣＸＩＩＧ６軽鎖配列に、ＣＨＯでの発現のためにコドンの最適化を行い、合成オリゴヌクレオチドから構築し、ＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧを介してｐＯｐｔｉＶＥＣ（商標）（図１０）にサブクローニングした。得られたキメラＣＸＩＩＧ６軽鎖（可変領域および定常領域）の、コドンを最適化した核酸配列は配列番号３４に示す通りである。得られたプラスミドをｐＴＧ１７８９５と呼んだ（図１１）。
【０２２１】
キメラ重鎖ＩｇＧ１およびＩｇＧ４（それぞれキメラＣＸＩＩＧ６  ＩｇＧ１鎖およびキメラＣＸＩＩＧ６  ＩｇＧ４鎖と呼ぶ）を作製するため、ＣＸＩＩＧ６  ＶＨドメイン（配列番号１から）をコードする配列とヒトＩＧＨＧ１Ｃ領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｊ００２２８）またはヒトＩＧＨＧ４Ｃ領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｋ０１３１６）のいずれかをコードする配列を連結することにより理論的配列を設計した。これらのＸｂａＩ  ＮｏｔＩ  ＤＮＡフラグメントは、５’末端にマウス型（上記のｐＴＧ１７７８７およびｐＴＧ１７７８８の場合）において用いたものと同じ非翻訳配列（Ｋｏｚａｋ配列を含む）を保持していた。次に、キメラＣＸＩＩＧ６重鎖に、ＣＨＯでの発現のためにコドンの最適化を行い、合成し、ＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧによりＸｂａＩ  ＮｏｔＩを介してｐＴＧ１７８１２（図１２）にクローニングした。得られたキメラＣＸＩＩＧ６  ＩｇＧ１重鎖（可変領域および定常領域）の、コドンを最適化した核酸配列は配列番号３５に示す通りであり、得られたプラスミドをｐＴＧ１７８６８と呼んだ（図１３）。得られたキメラＣＸＩＩＧ６  ＩｇＧ４重鎖（可変領域および定常領域）の、コドンを最適化した核酸配列は配列番号３６に示す通りであり、得られたプラスミドをｐＴＧ１７８６９と呼んだ（図１４）。
【０２２２】
ｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６からのヒト化抗体の作製
ヒト化軽鎖変異体を作製するため、配列番号９で示されるような軽鎖可変領域内で表２に従うアミノ酸置換を行った。
【０２２３】
ＤＮＡ配列は、ＣＸＩＩＧ６  ＶＫドメイン（配列番号３から）の置換を有する改変配列とヒトＩＧＫＣ領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｊ００２４１）をコードする配列を連結することにより設計した。このＸｂａＩ  ＮｏｔＩ  ＤＮＡフラグメントは、５’末端にマウス型（上記のｐＴＧ１７７８７およびｐＴＧ１７７８８の場合）において用いたものと同じ非翻訳配列（Ｋｏｚａｋ配列を含む）を保持していた。次に、このヒト化ＣＸＩＩＧ６軽鎖配列を、ＣＨＯでの発現のためにコドンを最適化し、合成オリゴヌクレオチドから構築し、ＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧによりＸｂａＩ  ＮｏｔＩを介してｐＯｐｔｉＶＥＣ（商標）（図１０）にクローニングした。得られたヒト化ＣＸＩＩＧ６軽鎖変異体およびプラスミドを図１５に一覧化する。
【０２２４】
ヒト化重鎖変異体を作製するため、配列番号６で示されるような重鎖可変領域内で表１に従うアミノ酸置換を行った。
【０２２５】
ＤＮＡ配列は、ＣＸＩＩＧ６  ＶＨドメイン（配列番号１から）の置換を有する改変配列とヒトＩＧＨＧ１Ｃ領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｊ００２２８）をコードする配列を連結することにより設計した。このＸｂａＩ  ＡｐａＩ  ＤＮＡフラグメントは、５’末端にマウス型（上記のｐＴＧ１７７８６およびｐＴＧ１７７８９の場合）において用いたものと同じ非翻訳配列（Ｋｏｚａｋ配列を含む）を保持していた。次に、このＤＮＡ配列を、ＣＨＯでの発現のためにコドンを最適化し、合成し、ＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧによりＸｂａＩ  ＡｐａＩを介してｐＴＧ１７８１２（図１２）にクローニングした。得られたヒト化ＣＸＩＩＧ６  ＩｇＧ１重鎖変異体およびプラスミドを図１６に一覧化する。
【０２２６】
組換えマウスＣＸＩＩＧ６およびキメラＣＸＩＩＧ６  ＩｇＧ１のin vitro阻害活性
精製組換えマウスＣＸＩＩＧ６（従前に記載の通り）およびそのキメラＩｇＧ１変異体（従前に記載されているようなキメラＣＸＩＩＧ６  ＩｇＧ１）が可溶性ヒトＣＳＦ−１Ｒを遮断することができたかどうかを判定するため、Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞増殖および破骨細胞分化モデル（従前に記載の通り）で用量応答試験を行った。Ｒｏｃｋｌａｎｄ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，０１０−０１４１）からの精製ポリクローナルマウスＩｇＧ２ａおよび本出願者が作製したキメラＩｇＧ１を対照抗体として並行して試験した。細胞を、ＳＰＲバイオセンサーアッセイにおいて抗原結合により測定される、ある濃度範囲の活性抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体に曝すことにより遮断効果を評価した。ｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６とそれらの個々の対照ｍＡｂとの比較は、同量の全抗体をロードすることによって行った（Ｆｃ結合によるＳＰＲバイオセンサーアッセイ）。
【０２２７】
Ｍ−ＮＦＳ−６０バイオアッセイ：Ｍ−ＮＦＳ−６０バイオアッセイでは、細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのヒト可溶性ＣＳＦ−１Ｒおよび１ｎｇ／ｍｌのヒトＣＳＦ−１の存在下、０．２３ｎｇ／ｍｌ〜０．５μｇ／ｍｌの活性ｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６（組換えマウスＣＸＩＩＧ６；キメラＣＸＩＩＧ６  ＩｇＧ１）または相当濃度の対照ｍＡｂで４８時間処理した。図１７に示される結果は、Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞の増殖が、両ｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６（組換えマウスＣＸＩＩＧ６；キメラＣＸＩＩＧ６  ＩｇＧ１）の濃度の上昇に応答して増大したことを示し、それらが可溶性ＣＳＦ−１ＲとＣＳＦ−１の結合（３ウェルの平均＋／−ＳＥＭ）に拮抗作用を示すことを証明する。キメラＣＸＩＩＧ６  ＩｇＧ１は、細胞増殖の回復において組換えマウスＣＸＩＩＧ６と同等の効果があった。対照マウスＩｇＧ２ａおよびキメラＩｇＧ１は、それらそれぞれの濃度範囲で、可溶性ＣＳＦ−１ＲによるＣＳＦ−１の中和に効果が無かった。これらの結果は、精製組換えマウスＣＸＩＩＧ６およびキメラＣＸＩＩＧ６  ＩｇＧ１が可溶性ヒトＣＳＦ−１Ｒを阻害することを示す。
【０２２８】
破骨細胞バイオアッセイ：破骨細胞バイオアッセイでは、エルトリエーションしたヒト単球を、２５ｎｇ／ｍｌのＣＳＦ−１（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ）および４０ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬの存在下、０．８５ｎｇ／ｍｌ〜０．６２μｇ／ｍｌの活性ｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６（組換えマウスＣＸＩＩＧ６；キメラＣＸＩＩＧ６  ＩｇＧ１）とともに８日間インキュベートした。培地および総ての添加薬剤を４日目と６日目に補充し、６〜８日間馴化した培養培地にて全ＭＭＰ−９を測定した。図１８に示されている結果は、対照抗体と比較して、組換えマウスＣＸＩＩＧ６およびそのキメラ変異体（キメラＣＸＩＩＧ６  ＩｇＧ１）がそれぞれ、破骨細胞分化と並行するＭＭＰ−９生産を有意に低下させたことを示し、増殖の遅延が起こったことを示唆している（図１８；３ウェルの平均＋／−ＳＥＭ）。
【０２２９】
これらの結果はさらに、精製組換えマウスＣＸＩＩＧ６およびキメラＣＸＩＩＧ６  ＩｇＧ１が細胞表面ＣＳＦ−１Ｒの機能を阻害することを示す。
【０２３０】
本発明の抗体と市販の抗体とのエピトープマッピング
これらの実験は、本発明の抗体のエピトープの位置を決定するため、より詳しくは、本発明の抗体が市販のいくつかの抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体と同じエピトープと結合するか異なるエピトープと結合するかを判定するために設計されたものである。
【０２３１】
本発明のキメラＣＸＩＩＧ６（ｃｈＣＸＩＩＧ６）、ｍＡｂ  ３２９１（マウスＩｇＧ１、クローン６１７０１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＭＡＢ３２９１）およびｍＡｂ  ＪＦ１４（マウスＩｇＧ１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−８０１７４）はヒトＣＳＦ−１Ｒに結合するが、マウスＣＳＦ−１Ｒには結合しない。モノクローナル抗体３２９１およびＪＦ１４は、ヒトＣＳＦ−１ＲのＮ末端部分に対して作製されたものであったことから選択された。ＣＳＦ−１Ｒ上にｍＡｂ結合部位をマッピングするために、ヒトＣＳＦ−１Ｒの末端切断型突然変異体およびヒトとマウスＤ１−Ｄ３  ＣＳＦ−１Ｒ間のキメラをヒスチジンタグと融合させたものを構築物した（詳細は図１９および２０参照）。これらの構築物を、ＣＨＯ細胞を用い、分泌タンパク質として発現させた。構築物の発現は、検出に抗Ｈｉｓタグ抗体を用いる免疫ブロット分析により確認した。抗Ｈｉｓタグ抗体をコーティングしたウェル中でＣＨＯ培養上清をインキュベートすることにより、総ての構築物をＥＬＩＳＡプレートに補足した。抗体を、ビオチン−ＮＨＳ（Ｓｉｇｍａ  ｒｅｆ  Ｂ３２９５−１０ＭＧ）を用いてビオチン化した。ビオチン化抗体を各ウェルに加え、ストレプトアビジン−ＨＲＰで結合を検出した。ビオチン化リツキシマブ(Du et al., 2007, J. Biol. Chem. 282 (20), 15073-15080, NCBI Access Numbers 2OSL_H & 2OSL_L)を陰性アイソタイプ対照として用いた（ＣＳＦ−１Ｒと結合しない）。結果を表１９にまとめる。
【０２３２】
結果：予測されたように、リツキシマブは供試したいずれの構築物にも結合しない。キメラＣＸＩＩＧ６、ｍＡｂ  ３２９１およびｍＡｂ  ＪＦ１４は、ヒトＣＳＦ−１Ｒの単離されたドメイン１（Ｄ１）に結合することができる（構築物ｐＴＧ１８０３８；図１９）。さらに、ヒトＤ１をマウスＤ１で置換すると、これら３つのｍＡｂの結合が完全に無効となる（構築物ｐＴＧ１８００３参照；図１９）。構築物ｐＴＧ１８０１５およびｐＴＧ１８０００をヒトおよびマウスＤ１サブドメインと組み合わせて用いて得られた結果は、ｍＡｂ  ３２９１およびＪＦ１４の結合はヒトＣＳＦ−１Ｒ  Ｄ１ドメインのＮ末端と中央部分の双方を必要とし、本発明のモノクローナル抗体の結合はヒトドメインＤ１のＮ末端部分のみを必要とすることを示す（構築物ｐＴＧ１８０１６参照；図１９）。
【０２３３】
これらのデータは、本発明のモノクローナル抗体のエピトープが、モノクローナル抗体３２９１およびＪＦ１４とは異なるエピトープ上でヒトＣＳＦ−１Ｒと結合することを示す。興味深いことに、ヒトおよびマウスＣＳＦ−１ＲのＮ末端はＩ２０Ａ、Ｖ２７Ｇ、Ｋ３３ＥおよびＡ３６Ｅ（最初のメチオニンが残基１である）の４残基だけが異なる。
【０２３４】
モノクローナル抗体Ｈ１９Ｋ１２、Ｈ２７Ｋ５およびＨ２７Ｋ１
ヒトＣＳＦ−１Ｒ機能に対して遮断活性を有するマウスＩｇＧ２ａを産生するハイブリドーマＣＸＩＩＧ６の作製は上記に記載されている。ＣＸＩＩＧ６  ＩｇＧ２ａの重鎖および軽鎖をクローニングし、配列を決定した（図６および７参照）。ｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６の可変ドメインＶＨおよびＶＬとヒトＩｇＧ１定常領域を組み合わせてモノクローナル抗体のキメラ型（ｃｈＣＸＩＩＧ６）を構築した（上記参照）。ヒト抗体配列との相同性を高め、モノクローナル抗体の潜在的免疫原性を減じるために、ＶＨおよびＶＬドメイン中に突然変異を導入することにより、ヒト化変異体を作製した（図１５および１６参照）。
【０２３５】
２６２型の本発明のヒト化モノクローナル抗体をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で一時的に発現させ、それらのＣＳＦ−１Ｒ結合能を試験した。この第１のスクリーニングのうち、３１のヒト化ＣＸＩＩＧ６変異体（ｈＣＸＩＩＧ６）を、（ｉ）ヒトＣＳＦ−１Ｒに対する親和性、（ｉｉ）ヒト生殖細胞系配列とのより高い相同性（好ましくは、前記相同性は少なくとも７６％、より好ましくは少なくとも８５％である）および（ｉｉｉ）最小のin silico免疫原性に基づいて選択した。水晶発振子マイクロバランス（Ａｔｔａｎａ）技術を用いた親和性試験は、選択された総てのｈＣＸＩＩＧ６変異体が組換えヒトＣＳＦ−１Ｒに対して親ｍＡｂ  ｃｈＣＸＩＩＧ６と同等の、１０−９〜１０−１０Ｍの範囲の親和性を有することを示した。３０のヒト化変異体のうちＣＳＦ−１Ｒに対する高い親和性、最大のヒト相同性および最小のin silico免疫原性を特徴とする３つがさらなる検討のために選択された：Ｈ１９Ｋ１２、Ｈ２７Ｋ５およびＨ２７Ｋ１５。
【０２３６】
本発明のモノクローナル抗体Ｈ２７Ｋ１５の生化学的特徴
Ａ - Ｈ２７Ｋ１５抗体のヨウ素−１２５による放射性標識
材料
本発明のモノクローナル抗体Ｈ２７Ｋ１５は、２．１ｍｇ／ｍＬ濃度の水溶液（ＰＢＳ  ｐＨ７．５）として提供した。
【０２３７】
ヨウ素−１２５放射性核種をＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒから１０−５Ｎ水酸化ナトリウム中のヨウ化ナトリウムとして購入した（比活性：６４３．８ＧＢｑ／ｍｇ−放射性核種純度：９９．９５％）。
【０２３８】
クロラミン−Ｔ（Ｎ−クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミド、ＰＭ：２２７．６ｇ．ｍｏｌ−１）、メタ重亜硫酸ナトリウム（ＰＭ＝１９０．１ｇ．ｍｏｌ−１）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびトリクロロ酢酸はＳｉｇｍａから購入した。
【０２３９】
リン酸緩衝生理食塩水０．１Ｍ、ｐＨ７．２は、本発明者らの研究室で調製した。
【０２４０】
方法
１００μｇの抗体に、１．２ｍＣｉのＮａ１２５Ｉ溶液（４４．４ＭＢｑ）および７．６μＬの新しく調製したクロラミン−Ｔ溶液（リン酸バッファー中１ｍｇ／ｍＬ）を加えた。室温で２分後に、１２．７μＬのメタ重亜硫酸ナトリウム（リン酸バッファー中１ｍｇ／ｍＬ）を加えることにより反応を停止させた。
【０２４１】
組み込まれなかったヨウ素−１２５を、溶出バッファー（リン酸バッファー０．１Ｍ  ｐＨ７．２／０．５％ＢＳＡ）で予め飽和させたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（ＰＤ−１０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でのゲル濾過により除去した。このカラムを０．５ｍＬの４０のアリコートとして溶出させた。各画分の放射活性をヨウ素−１２５放射性核種に関して較正された自動ガンマカウンター（ヨウ素−１２５放射性核種較正済みのＷａｌｌａｃｅ  Ｗｉｚａｒｄ  ２４７０自動ガンマカウンター−Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で測定し、目的の放射性ヨウ化産物を含有する画分をプールした。
【０２４２】
放射性標識化合物の放射化学的純度は、Ｇｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓプレコートシリカゲルプレートにて、１０％ＴＣＡを溶離剤として用いて行うＩＴＬＣ分析により評価した。
【０２４３】
結果および放射性標識抗体溶液の特徴
精製前に、ＩＴＬＣで決定された放射化学的収量は９７．８％であった。
【０２４４】
放射性標識抗体溶液の特徴を以下にまとめる。
【０２４５】
【表５】
0005996558.tif 000006
【０２４６】
放射性標識抗体の純度および完全性を還元条件および非還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により評価した。１０〜２５０ｋＤａの１０の分子量マーカーからなる広域分子量標準（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてゲルを較正した。ゲルをクーマシーブルーで染色した。第２段階で、ゲルを乾燥させ、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ  ４４５  ＳＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、オートラジオグラフィー用スクリーンに露光した。データ解析にはＩｍａｇｅＪソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いた。
【０２４７】
クーマシーブルー染色後とオートラジオグラフィーの後に得られた電気泳動プロフィールは同じである。非還元条件下では、１５０ｋＤａに完全なＩｇＧ分子に相当する１つの主要バンドが見られた。還元条件下では、それぞれ抗体の重鎖および軽鎖に相当する５０ｋＤａおよび２５ｋＤａのバンドが検出された。これらの電気泳動結果から、クロラミン−Ｔ法は抗体の完全性に影響を及ぼさないことが確認される。
【０２４８】
Ｂ - ＥＬ４−ＣＳＦ−１Ｒ細胞に対する放射性標識Ｈ２７Ｋ１５抗体の結合アッセイ
ｂ１  １２５Ｉ−Ｈ２７Ｋ１５の親和性結合の測定
結合親和性の尺度として平衡解離定数（ＫＤ）を用いた。１２５Ｉ−Ｈ２７Ｋ１５抗体のＫＤは、一定数の細胞に漸増濃度の放射性標識抗体を加える飽和アッセイにより測定した。
【０２４９】
材料
０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中の放射性標識抗体の溶液
【表６】
0005996558.tif 000007
【０２５０】
１００倍モル過剰の非標識抗体を含む放射性標識抗体の溶液（非特異的結合）：４５μｇ／ｍＬの非標識抗体および０．４５μｇ／ｍＬの放射性標識抗体を含有する溶液を調製した後、ＰＢＳ／ＢＳＡ０．５％で４倍希釈系を作製した。
【０２５１】
細胞：０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中、４０×１０６細胞／ｍＬのＥＬ４−ＣＳＦ−１Ｒ細胞懸濁液を調製した。
【０２５２】
方法
ＥＬ４−ＣＳＦ−１Ｒ細胞を、最終容量１５０μＬ中、漸増濃度の放射性標識抗体とともに、振盪しながら氷上で１時間インキュベートした（５０μＬ  ＰＢＳ／ＢＳＡ０．５％中２×１０６細胞）。
【０２５３】
非特異的結合は、過剰量の非標識抗体（１００倍モーラー過剰）を同時にインキュベートすることにより測定した。
【０２５４】
インキュベーション後、反応混合物を、２００μＬのジブチルフタレートオイルクッション上にのせ、マイクロ遠心管内にて１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。遠心管を液体窒素中で凍結させ、ヨウ素−１２５放射性核種較正済みのＷａｌｌａｃｅ  Ｗｉｚａｒｄ  ２４７０自動ガンマカウンター（効率：６３％）を用いた放射活性の測定のために、細胞ペレットを含有する遠心管の先端を切り取った。
【０２５５】
非特異的結合は、１００倍モーラー過剰の非標識抗体を含有する、４点濃度の放射性標識抗体の結合放射活性を測定することにより決定した。結合画分と遊離画分をプロットしたグラフを作成し、直線の傾きを求めるために線形回帰を用いた。特異的結合は、過剰量の非標識抗体の不在下で見られた結合（総結合）から過剰量の非標識抗体の存在下で見られた結合（非特異的結合）を差し引いたものと定義される。
【０２５６】
結果
ＥＬ４−ＣＳＦ−１Ｒ細胞に対するヒト化１２５Ｉ−Ｈ２７Ｋ１５抗体の親和性定数および細胞当たりの最大結合部位はＰｒｉｓｍソフトウエアにより求めた。
【０２５７】
ＥＬ４−ＣＳＦ−１Ｒ細胞に対する１２５Ｉ−Ｈ２７Ｋ１５抗体の結合特性を以下にまとめる。
【０２５８】
【表７】
0005996558.tif 000008
【０２５９】
ｂ２  非標識Ｈ２７Ｋ１５の阻害定数の測定
この試験の目的は、免疫反応性のある放射性標識抗体の親和性が非標識抗体と同じかどうかを調べることであった。一定の濃度の放射性標識抗体と非標識抗体の連続希釈系を用いて放射性標識解離結合アッセイを行った。
【０２６０】
材料
【表８】
0005996558.tif 000009
【０２６１】
非標識抗体の溶液：４５０ｎＭ（６７．５μｇ／ｍＬ）の溶液を調製した後、ＰＢＳ／ＢＳＡ０．５％で２．５倍希釈系を作製した。濃度範囲：４５０ｎＭ〜７．５６ｐＭ。
【０２６２】
細胞：０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中、４０×１０６細胞／ｍＬのＥＬ４−ＣＳＦ−１Ｒ細胞懸濁液を調製した。
【０２６３】
方法：細胞を、非標識抗体の不在下（総結合：対照ウェル）および５０μＬ中、様々な濃度（上述）の非標識抗体の存在下で、１．５ｎＭ放射性標識抗体５０μＬとともに、振盪しながら氷上で１時間インキュベートした（５０μＬ  ＰＢＳ／ＢＳＡ０．５％中、２×１０６細胞）。
【０２６４】
インキュベーション後、反応混合物を、２００μＬのジブチルフタレートオイルクッション上にのせ、マイクロ遠心管内にて１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。遠心管を液体窒素中で凍結させ、ガンマカウンターを用いた放射活性の測定のために、細胞ペレットを含有する遠心管の先端を切り取った。
【０２６５】
放射性標識抗体の相対的結合のパーセンテージは下記のように計算した。
【数１】
0005996558.tif 000010
（対照ウェルは、非標識抗体が存在しないウェルである）
【０２６６】
結果
これらの結合データを図２１に示す。
【０２６７】
競合曲線から得られるＩＣ５０値はＰｒｉｓｍソフトウエアにより決定し、チェン・プルソフ(Cheng-Prusoff)式(Biochem. Pharmacol., 22, 3099-3108, 1973)：
【数２】
0005996558.tif 000011
（［Ｌ］は、アッセイに用いた放射性標識抗体の濃度であり、
ＩＣ５０は、放射性標識抗体の５０％阻害を達成するのに必要な非標識抗体の濃度である）
を用いて絶対阻害定数Ｋｉに変換した。
ＩＣ５０値および阻害定数を以下にまとめる。
【０２６８】
【表９】
0005996558.tif 000012
ｂ３  １２５Ｉ−Ｈ２７Ｋ１５と種々の抗体の間の競合試験
【０２６９】
材料
０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中、放射性標識Ｈ２７Ｋ１５抗体の溶液：上記の通り
非標識抗体の溶液
種々の抗体を次のように表で示す。
【０２７０】
【表１０】
0005996558.tif 000013
【０２７１】
各抗体について、４５０ｎＭの溶液（６７．５μｇ／ｍＬ）を調製した後、ＰＢＳ／ＢＳＡ０．５％で２．５倍希釈系を作製した。濃度範囲：４５０ｎＭ〜７．５６ｐＭ。
【０２７２】
細胞：０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中、４０×１０６細胞／ｍＬのＥＬ４−ＣＳＦ−１Ｒ細胞懸濁液を調製した。
【０２７３】
方法
細胞を、非標識競合物の不在下（総結合：対照ウェル）および５０μＬ中、様々な濃度（上述）の非標識競合物の存在下で、１．５ｎＭ  １２５Ｉ−Ｈ２７Ｋ１５抗体５０μＬとともに、振盪しながら氷上で１時間インキュベートした（５０μＬ  ＰＢＳ／ＢＳＡ０．５％中、２×１０６細胞）。
【０２７４】
インキュベーション後、反応混合物を、２００μＬのジブチルフタレートオイルクッション上にのせ、マイクロ遠心管内にて１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。遠心管を液体窒素中で凍結させ、ガンマカウンターを用いた放射活性の測定のために、細胞ペレットを含有する遠心管の先端を切り取った。
【０２７５】
放射性標識抗体の相対的結合のパーセンテージは下記のように計算した。
【数３】
0005996558.tif 000014
（対照ウェルは、競合物の存在しないウェルである）
【０２７６】
結果
これらの結合データを図２２に示す。
【０２７７】
競合曲線から得られるＩＣ５０値はＰｒｉｓｍソフトウエアにより決定し、チェン・プルソフ式：
【数４】
0005996558.tif 000015
（［Ｌ］は、アッセイに用いた１２５Ｉ−Ｈ２７Ｋ１５抗体の濃度であり、
ＩＣ５０は、１２５Ｉ−Ｈ２７Ｋ１５抗体の５０％阻害を達成するのに必要な競合物の濃度であり、
ＫＤは、１２５Ｉ−Ｈ２７Ｋ１５抗体の親和性定数である）
を用いて絶対阻害定数Ｋｉに変換した。
【０２７８】
各競合物について、ＩＣ５０値およびＫｉ定数を以下にまとめる。
【０２７９】
【表１１】
0005996558.tif 000016
【０２８０】
本発明のモノクローナル抗体（Ｈ２７Ｋ１５、ｃｈＣＸＩＩＧ６、Ｈ１９Ｋ１２およびＨ２７Ｋ５）の親和性は、０．５〜０．８ｎＭで全く同等のＫｉ値である。
【０２８１】
市販のモノクローナル抗体３２９１およびＪＦ１４のＫｉ値は１ｎＭより高い。結論として、これらの抗体は、ＣＳＦ−１Ｒ抗原に対して、本発明のモノクローナル抗体よりも低い親和性を有する。
【０２８２】
Ｃ - Ｄ１−Ｄ５  ヒトＣＳＦ−１Ｒに対するヒトＣＳＦ−１の競合的結合アッセイ
ＣＳＦ−１（１−４４４）を、ビオチン−ＮＨＳ（Ｓｉｇｍａ  ｒｅｆ．  Ｂ３２９５−１０ＭＧ）を用いてビオチン化した。ビオチン化ＣＳＦ−１（０．０１２μｇ／ｍｌを１００μｌ／ウェル）を、ＦＣ−Ｄ１−Ｄ５  ヒトＣＳＦ−１Ｒ（１μｇ／ｍＬを１００μＬ／ウェル）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｒｅｆ．  ３２９−ＭＲ−１００）をコーティングしたウェルに加え、結合した分子を、ストレプトアビジン−ＨＲＰを用いて検出した。競合実験のために、漸増量のモノクローナル抗体（０．０３０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌを１００μｌ／ウェル）をビオチン化ＣＳＦ−１とプレインキュベート、同時インキュベートまたはポストインキュベートした。
【０２８３】
本発明者らは、その受容体との結合に関してＣＳＦ−１と競合することが知られていてことから、陽性対照として市販のモノクローナル抗体３２９１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｒｅｆ．  ＭＡＢ３２９１）、本発明の１つのモノクローナル抗体Ｈ２７Ｋ１５、モノクローナル抗体Ｘ（ＷＯ２００９／０２６３０３）、および陰性対照としてリツキシマブを試験した。
【０２８４】
プレインキュベーションの場合には、モノクローナル抗体を、ビオチン化ＣＳＦ−１を加える１時間前に、コーティングされたヒトＣＳＦ−１Ｒとともにインキュベートした。
【０２８５】
ポストインキュベーションの場合には、ビオチン化ＣＳＦ−１を、モノクローナル抗体を加える１時間前に、コーティングされたヒトＣＳＦ−１Ｒとともにインキュベートした。
【０２８６】
同時インキュベーションの場合には、ビオチン化ＣＳＦ−１とモノクローナル抗体を、コーティングされたヒトＣＳＦ−１Ｒとともにインキュベートした。
【０２８７】
結果：３２９１抗体とＨ２７Ｋ１５抗体は双方とも、ＣＳＦ−１と同じ結合部位に結合することが知られる陽性対照抗体Ｘにより認識されるもの（すなわち、Ｉｇ様ドメイン２〜３）とは異なるエピトープ（すなわち、Ｉｇ様ドメイン１）を認識することがこれまでに示された（上記参照）。ここで、本発明者らは、陽性対照とは対照的に、３２９１抗体およびＨ２７Ｋ１５抗体の双方が、抗体用量が高くても（すなわち、ＩＣ５０の約１００倍）、ＣＳＦ−１結合の部分的競合物であることを示す。総ての状況で（プレインキュベーション、同時インキュベーションまたはポストインキュベーション）、飽和用量において、Ｈ２７Ｋ１５は、ＣＳＦ−１Ｒに対するＣＳＦ−１の結合をおよそ１０〜２０％低下させることができる（図２３、２４および２５参照）が、抗体３２９１は、同じ結合を実験状況に応じておよそ３０〜４０％低下させることができる。
【０２８８】
従って、本発明のモノクローナルは、その受容体ＣＳＦ−１Ｒに対するＣＳＦ１の結合を部分的に妨げることができる。
【０２８９】
このことを以下の実験で確認した。
【０２９０】
ＥＬＩＳＡマイクロプレートを、０．１μｇ（すなわち、１μｇ／ｍｌを１００μＬ）のヒトＣＳＦ１  １−４４４（Ｇｅｎｅａｒｔ−配列番号４７、図３２参照）でコーティングした。０．１２５μｇ／ｍＬのＦｃ−Ｄ１−Ｄ５  ヒトＣＳＦ−１（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｒｅｆ  ３２９−ＭＲ−１００）１００μＬを、漸増濃度の抗体下で同時インキュベートした。ＣＳＦ１に結合したＦｃ−Ｄ１−Ｄ５  ヒトＣＳＦ−１Ｒを、抗ＩｇＧ−Ｆｃ−ヒト−ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ａ８０−２０４Ｐ）を用いて検出した。検出に用いた抗体はヒトＦｃに結合することから、抗体Ｈ２７Ｋ１５の代わりにマウス抗体ＣＸＩＩＧ６を競合に用いた。競合物ｍＡｂ  Ｘ（ＷＯ２００９／０２６３０３）は、ヒトＣＳＦ−１と同じ部位でヒトＣＳＦ−１Ｒと結合することが知られていることから、陽性対照として用いた。ラットＩｇＧ２ａを陰性対照として用いた（ｈＣＤ１１５と結合しない無関係のアイソタイプ抗体）。
【０２９１】
結果：ＷＯ２００９／０２６３０３に示されているｍＡｂ  Ｘは、競合抗体に関して予測されるようにＦｃ−Ｄ１−Ｄ５  ヒトＣＳＦ−１Ｒに対するＣＳＦ１（１−４４４）の結合を全面的に阻害する。３２９１およびｍＣＸＩＩＧ６の双方は、抗体用量が高くても（すなわち、１００μｇ／ｍＬ）、ＣＳＦ１に対するＦｃ−Ｄ１−Ｄ５  ヒトＣＳＦ−１Ｒの結合を部分的に低下させるに過ぎない。ｍＣＸＩＩＧ６および３２９１はＦｃ−ｈＣＤ１１５に対するＣＳＦ１の結合をそれぞれおよそ５〜１０％および１０〜２０％低下させる（図２６参照）。これらの結果は、Ｆｃ−Ｄ１−Ｄ５  ヒトＣＳＦ−１Ｒに対するＣＳＦ１の結合の、Ｈ２７Ｋ１５またはｍＡｂ  ３２９１による部分的阻害を示す上記の結果と一致している。
【０２９２】
図２６は、ヒトＣＳＦ１に対する組換えヒトＦｃ−ヒトＤ１−Ｄ５  ＣＤ１１５の結合の、種々のｍＡｂによる部分的低下を示す（同時インキュベーション実験）。ヒトＣＳＦ１  （０．１μｇ／ｍＬ）を９６ウェルプレートにコーティングし、組換えＦｃ−Ｄ１−Ｄ５  ヒトＣＳＦ−１Ｒ（０．１２５μｇ／ｍＬ）と漸増濃度のｍＡｂの混合物（同時インキュベーション実験）で１時間４５分インキュベートした。ｈＣＳＦ−１に結合するＣＤ１１５は、ＨＲＰとコンジュゲートした抗ヒトＦｃ−ＩｇＧを用いて検出した。
【０２９３】
Ｄ - １２５Ｉ−Ｈ２７Ｋ１５と、ＣＳＦ−１Ｒ受容体の１つの天然リガンドとして知られるＩＬ−３４との間の競合試験
材料
０．５％ＢＳＡ  １２５Ｉ−Ｈ２７Ｋ１５を含有するＰＢＳ中、放射性標識抗体の溶液（上記の通り）。
【０２９４】
リガンドの溶液：組換えヒトＩＬ−３４（２６．１ｋＤａ）は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから０．４２２ｍｇ／ｍＬの濃度で購入した。４５０ｎＭ溶液を調製した後、ＰＢＳ／ＢＳＡ０．５％で２．５倍希釈系を作製した。濃度範囲：４５０ｎＭ〜７．５６ｐＭ。
【０２９５】
細胞：０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中、４０×１０６細胞／ｍＬのＥＬ４−ＣＳＦ−１Ｒ細胞懸濁液を調製した。
【０２９６】
方法
天然リガンドを用いたこの競合試験では２つの異なるプロトコールを実施した。
【０２９７】
第１のプロトコールでは、細胞を、非標識競合物の不在下（総結合：対照ウェル）および５０μＬ中、様々な濃度（上述）の非標識競合物の存在下で、１．５ｎＭ  １２５Ｉ−Ｈ２７Ｋ１５抗体５０μＬとともに、振盪しながら氷上で１時間インキュベートした（５０μＬ  ＰＢＳ／ＢＳＡ０．５％中、２×１０６）。
【０２９８】
第２のプロトコールは、放射性標識Ｈ２７Ｋ１５抗体の添加前に氷上で３０分間、漸増濃度のリガンドとともにＥＬ４−ＣＳＦ−１Ｒ細胞をインキュベートするというものであった。その後、振盪しながら氷上で１時間、２回目のインキュベーションも行った。
【０２９９】
これら２種類の実験では、反応混合物を、２００μＬのジブチルフタレートオイルクッション上にのせ、マイクロ遠心管内にて１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。遠心管を液体窒素中で凍結させ、ガンマカウンターを用いた放射活性の測定のために、細胞ペレットを含有する遠心管の先端を切り取った。
【０３００】
放射性標識抗体の相対的結合のパーセンテージは下記のように計算した。
【数５】
0005996558.tif 000017
（対照ウェルは、競合物の存在しないウェルである）
【０３０１】
結果：１２５Ｉ−Ｈ２７Ｋ１５抗体結合の解離は見られなかった。結論として、Ｈ２７Ｋ１５抗体およびＩＬ−３４リガンドは、ＣＳＦ−１Ｒ抗原の異なるエピトープを認識する。
【０３０２】
さらに、１２５Ｉ−ＩＬ−３４とヒト化Ｈ２７Ｋ１５抗体との間の競合結合試験を行ったところ、１２５Ｉ−ＩＬ−３４結合は、Ｈ２７Ｋ１５抗体の濃度を上昇させても解離せず、本明細書において、本発明の抗体はＣＳＦ−１Ｒ受容体との結合に関してＩＬ−３４と競合しないことを示す。
【０３０３】
ｈＣＸＩＩＧ６変異体Ｈ２７Ｋ５、Ｈ２７Ｋ１５およびＨ１９Ｋ１２の生物学的特徴
Ａ．モノクローナル抗体の発現および精製
キメラＣＸＩＩＧ６、ｈＣＸＩＩＧ６変異体Ｈ１９Ｋ１２、Ｈ２７Ｋ５、Ｈ２７Ｋ１５およびリツキシマブを、接着性ＣＨＯ−Ｋ１もしくはＣＨＯ−ＤＧ４４細胞の一時的トランスフェクションか、または安定なＣＨＯ−ＤＧ４４トランスフェクタントのポリクローナルプールのいずれかにより発現させた。
【０３０４】
Ｂ．他のチロシンキナーゼ受容体の中でもＣＳＦ−１Ｒに対するＨ２７Ｋ５、Ｈ２７Ｋ１５およびＨ１９Ｋ１２の特異性
方法
マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）を、各ウェル当たり３００ｎｇの、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓか購入した下記可溶性受容体：ＣＳＦ−１Ｒ２０−５１２−Ｆ（カタログ番号３２９−ＭＲ／ＣＦ）、（ＥＧＦＲ）２−Ｆｃ−６ｘｈｉｓ（カタログ番号１１２９−ＥＲ）、Ｆｌｔ−３−Ｆｃ−６ｘｈｉｓ（カタログ番号３６８−ＳＴ／ＣＦ）、ＰＤＧＦＲβ−Ｆｃ−６ｘｈｉｓ（カタログ番号３８５−ＰＲ／ＣＦ）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）２−Ｆｃ−６ｘｈｉｓ（カタログ番号３５７−ＫＤ／ＣＦ）、ＶＥＧＦＲ１−Ｆｃ−６ｘｈｉｓ（カタログ番号３２１−ＦＬ−０５０）、ヒトＳＣＦＲ（カタログ番号３３２−ＳＲ／ＣＦ）およびＰＤＧＦＲαＥＣＤ（カタログ番号３２２−ＰＲ／ＣＦ）でコーティングした。５０μｌのＨ２７Ｋ５、Ｈ２７Ｋ１５、Ｈ１９Ｋ１２  ｍＡｂまたはリツキシマブ（ＰＢＳ中５００ｎｇ／ｍｌ）のいずれかをウェルに加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ウェルの効率的なコーティングを制御するため、受容体−ヒトＦｃ融合タンパク質Ｆｌｔ−３−Ｆｃ−、ＰＤＧＦＲβ−Ｆｃ、ＶＥＧＦＲ２−Ｆｃ、ＶＥＧＦＲ１−Ｆｃをコーティングしたウェルとともに抗ヒトＩｇＧ（ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｉ３３８２）もインキュベートし、ＰＤＧＦＲα−およびＳＣＦＲコーティングウェルは、それぞれ抗ＰＤＧＦ−Ｒα（マウスＩｇＧ１、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＭＡＢ３２２）および抗ＳＣＦ−ＲヤギＩｇＧ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＡＦ３３２）とともにインキュベートした。抗体結合は、ヒトＩｇκ軽鎖（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号Ａ８０−１１５Ｐ）、ヤギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚカタログ番号ｓｃ２０３３）またはマウスＩｇ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ０４１２）のいずれかに対するセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートＡｂで検出した。テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ８６６５）（０．０５Ｍ酢酸ナトリウム、０．０５Ｍクエン酸、Ｈ２Ｏ２  １／７０００中、０．１ｍｇ／ｍｌ）で可視化した後、分光光度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、Ｔｒｉｓｔａｒ  ＬＢ９４１）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定し、５４０ｎｍでの吸光度を差し引くことにより補正した。
【０３０５】
結果
ｃｈＣＸＩＩＧ６と同様に、これらのヒト化変異体の中に他の受容体ＥＣＤのいずれかと免疫反応性を示したものはなかったが、それらは不死化ＣＳＦ−１Ｒ  ＥＣＤとは強く結合した（図２７）。この結果は、ヒト化が他のチロシンキナーゼ受容体の中でもＣＳＦ−１Ｒに対するｍＡｂ  Ｈ１９Ｋ１２、Ｈ２７Ｋ５およびＨ２７Ｋ１５の特異性を変化させなかったことを示す。
【０３０６】
Ｃ．ｈＣＸＩＩＧ６変異体のＣＳＦ−１Ｒ遮断活性
Ｃ．１  Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイで試験した可溶性ＣＳＦ−１Ｒ−Ｆｃの遮断
方法
Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞を、ＣＳＦ−１を含まない完全ＲＰＭＩ−１６４０培地で２回洗浄し、ＣＳＦ−１欠乏とするために同じ培地中で一晩インキュベートした。可溶性ヒトＣＳＦ−１Ｒの中和に関してアッセイするために、５ｎｇのヒトＣＳＦ−１Ｒ２０−５１２−Ｆｃを、完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中、抗体（Ｈ２７Ｋ５、Ｈ２７Ｋ１５、Ｈ１９Ｋ１２  ｍＡｂ、ｃｈＣＸＩＩＧ６またはリツキシマブ）の連続希釈液の入った白色９６ウェルマイクロプレート（ＶｉｅｗＰｌａｔｅＴＭ−９６、Ｐａｃｋａｒｄ）中で３０分間インキュベートした。次に、これらの培養ウェルに、１０４個のＣＳＦ−１欠乏細胞を、０．１ｎｇのヒトＣＳＦ−１とともに最終アッセイ容量１００μｌで加えた。細胞を３７℃で４８時間インキュベートし、Ｒｏｃｈｅからの細胞増殖ＥＬＩＳＡ（カタログ番号１１６４７２２３００１）を製造者のプロトコールに従って用いて、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の組み込みを２時間行った後に増殖を定量した。ＯＤを分光光度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｒｉｓｔａｒ  ＬＢ９４１）で測定した。
【０３０７】
結果
マウス骨髄性白血病細胞株Ｍ−ＮＦＳ−６０はその増殖がＣＳＦ−１に依存し、マウスｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６ＣＳＦ−１Ｒ遮断活性を証明するためにこれまでに使用されてきた。このアッセイでは、Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞をヒトＣＳＦ−１およびヒト可溶性ホモ二量体ジスルフィド結合ＣＳＦ−１Ｒ２０−５１２−Ｆｃとともに培養する。可溶性ＣＳＦ−１ＲによるＣＳＦ−１の捕捉が細胞増殖の阻害をもたらす。ヒトＣＳＦ−１Ｒを中和する抗体を加えると、可溶性ＣＳＦ−１ＲによるＣＳＦ−１の捕捉が妨げられ、細胞増殖が回復する。陰性対照リツキシマブの存在下では、可溶性ＣＳＦ−１Ｒは、ＣＳＦ−１により媒介されるＭ−ＮＦＳ−６０細胞の増殖を完全に阻害した（図２８）。Ｈ１９Ｋ１２、Ｈ２７Ｋ５およびＨ２７Ｋ１５は、ｃｈＣＸＩＩＧ６と同様に、可溶性ＣＳＦ−１Ｒ２０−５１２−Ｆｃの用量依存的中和をもたらし、細胞増殖を回復させた。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエアで５パラメーターロジスティック方程式を用いて計算したＮＤ５０（最大ＣＳＦ−１Ｒ遮断効果の５０％を与える中和用量）は、供試した３つのｈＣＸＩＩＧ６変異体で同等であり（それぞれＨ１９Ｋ１２、Ｈ２７Ｋ５およびＨ２７Ｋ１５に関して２９．８、３０．７および２９．１ｎｇ／ｍｌ）、親ｍＡｂ  ｃｈＣＸＩＩＧ６（１８．１ｎｇ／ｍｌ）のＮＤ５０と有意に異なるとは思われなかった。
【０３０８】
Ｃ．２  ＡＭＬ５細胞アッセイで試験した細胞表面ＣＳＦ−１Ｒの遮断
方法
ＡＭＬ５細胞の免疫細胞化学およびフローサイトメトリー分析
ＡＭＬ５細胞（ＯＣＩ−ＡＭＬ５、ＤＳＭＺカタログ番号ＡＣＣ−２４７）を免疫細胞化学およびフローサイトメトリーにより分析した。５×１０５細胞を１００μｌのＰＢＳ中、抗ヒトＣＳＦ−１Ｒ  ｍＡｂ  ３２９１（マウスＩｇＧ１、クローン６１７０１、１０μｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＭＡＢ３２９１）、マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＭＡＢ００２、１０μｇ／ｍｌ）、ｃｈＣＸＩＩＧ６（１０μｇ／ｍｌ）またはリツキシマブのいずれかとともに氷上で３０分間インキュベートした。次に、細胞を氷上で３０〜４５分間、フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５５０５８９）またはフルオレセインイソチオシアネートコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＡＱ１１２Ｆ）のいずれかで標識した。
【０３０９】
ＡＭＬ５細胞増殖に対するＣＳＦ−１の効果
ＡＭＬ５細胞を、平底（実験１および２、ＴＰＰカタログ番号９２０９６）または丸底（実験３、Ｆａｌｃｏｎカタログ番号３０７７）いずれかの９６ウェルプレートにて、２．５  Ｅ４細胞／１００μｌ／ウェルで播種した。各ウェルに、ヒトＣＳＦ−１を含有する１００μｌの培地を加えた。細胞を４８時間培養し、Ｒｏｃｈｅからの細胞増殖ＥＬＩＳＡ（カタログ番号１１６４７２２３００１）を製造者のプロトコールに従って用いて、ＢｒｄＵの組み込みを４時間行った後にそれらの増殖を測定した。ＯＤは分光光度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、Ｔｒｉｓｔａｒ  ＬＢ９４１）で測定した。４反復ウェルから平均ＯＤ＋／−ｓｅｍを計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いてｌｏｇ［ＣＳＦ−１］（ｎｇ／ｍｌ）に対してプロットし、３パラメーター方程式を用いて非線形回帰曲の当てはめを行った。
【０３１０】
ＡＭＬ５細胞増殖に対するｈＣＸＩＩＧ６変異体の効果
細胞を培養し、上記のように９６ウェルプレートに播種した。段階的量のｃｈＣＸＩＩＧ６、Ｈ２７Ｋ１５、Ｈ２７Ｋ５、Ｈ１９Ｋ１２または陰性対照リツキシマブを５０μｌ培地中に加えた。３７℃で３０分のインキュベーションの後、４０ｎｇ／ｍｌ  ｈＣＳＦ−１を含有する５０μｌの培地を各ウェルに加えた。各実験は、それぞれ各２反復のｍＡｂ濃度を含んでなる４つの同じ９６ウェルプレートで行った。細胞を４８時間培養し、上記のようにＢｒｄＵの組み込みを４時間行った後に、それらの増殖を測定した。各プレートからの結果をまずＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて分析し、５パラメーター方程式を用いて非線形回帰曲線の当てはめを行った。４つの供試ｍＡｂのうち少なくとも３つに関してＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍに当てはまる結果を示すプレートを平均＋／−ｓｅｍの計算のために選択した。このようにして、実験１および２は４つのプレートのうち２つからの結果に基づいて分析し（平均は４反復のＯＤ値から計算）、実験３は４つのプレートのうち３つからの結果に基づいて分析した（平均は６つのＯＤ値から計算）。ＥＣ５０およびＲ二乗は、各供試ｍＡｂについてＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにより計算した。
【０３１１】
結果
コロニー刺激因子−１は、ヒト急性骨髄性白血病細胞株ＯＣＩ−ＡＭＬ５（ＡＭＬ５）の増殖を刺激することが報告されている(Drexler HG, Zaborski M, Quentmeier H., 2007. Cytokine response profile of human myeloid factor-dependent leukaemia cell lines. Leukemia 11:701-8)。ＡＭＬ５細胞を免疫細胞化学およびフローサイトメトリーにより分析した。市販の抗ｈＣＳＦ−１Ｒ  マウスＩｇＧ１  ３２９１での染色（マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較）およびｃｈＣＸＩＩＧ６での染色（リツキシマブと比較）は陽性であり、ＡＭＬ５細胞が表面ＣＳＦ−１Ｒを発現したことを示す（図２９Ａ）。
【０３１２】
ＣＳＦ−１Ｒ遮断の効果を研究するためのモデルを設定するために、まず、ＡＭＬ５細胞増殖に用量依存的増加を誘導したことを確認することが必要であった。図２８Ｂは、  ＡＭＬ５は外因性ＣＳＦ−１の不在下で増殖可能であるが、培養培地に増殖因子を添加すると細胞増殖が用量依存的に高まることを示す。従って、ＡＭＬ５細胞は、それらの増殖のためにＣＳＦ−１に厳格に依存するわけではないが、ＣＳＦ−１反応性である。
【０３１３】
次に、最大に近い増殖を誘導する濃度である１０ｎｇ／ｍｌのＣＳＦ−１で培養したＡＭＬ５細胞に対するｈＣＸＩＩＧ６変異体およびｃｈＣＸＩＩＧ６の効果を試験した（図２９Ｂ）。図２９Ｃは、３回の独立した実験からの結果を示す。ヒト化変異体Ｈ２７Ｋ５、Ｈ２７Ｋ１５およびＨ１９Ｋ１２ならびにｃｈＣＸＩＩＧ６は、ＡＭＬ５細胞増殖に用量依存的低下を誘導した。実験間で変動が見られ、変動は、特に実験１では（図２９Ｄ）、各ｍＡｂのＥＣ５０の違いとＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて計算されたどちらかといえば低いＲ二乗により反映される。従って、このアッセイでは、ｈＣＸＩＩＧ６変異体に、それらのＥＣ５０に従って信頼のできるランク付けを行うことはできなった。３つのｈＣＸＩＩＧ６変異体は総て、ＡＭＬ５細胞のＣＳＦ−１依存的増殖の阻害において等しく有効であると思われた。
【０３１４】
Ｃ．３  ＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達に対する非促進効果およびＣＳＦ−１依存的リン酸化に対する阻害効果
方法
Ｂ４−８００−５は、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、ヒトＣＳＦ−１Ｒをコードする発現プラスミドｐＴＧ１７３６６で安定的にトランスフェクトすることにより得られた組換え細胞株である。Ｂ４−８００−５細胞は、６０ｍｍペトリ皿当たり２×１０５細胞で播種し、７２時間培養した。細胞は、１％ＦＣＳを含有する１ｍｌのＤＭＥＭ培地にて、実験１時間前に３７℃で培養することにより血清飢餓状態とした。
【０３１５】
架橋の不在下でＣＳＦ−１Ｒ遮断または抗体の効果を試験するために、細胞を、ｍＡｂ  ｃｈＣＸＩＩＧ６、Ｈ１９Ｋ１２、Ｈ２７Ｋ５、Ｈ２７Ｋ１５またはヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照リツキシマブを含有する１ｍｌのＤＭＥＭ−１％ＦＣＳで、３７℃にて１時間処理した。この細胞培養物に１００ｎｇ／ｍｌのｈＣＳＦ−１（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓカタログ番号１１３４３１１５）を３７℃で５分間加えるか、または細胞を刺激せずにおいた。
【０３１６】
抗体架橋実験では、細胞を、ｍＡｂ  ｃｈＣＸＩＩＧ６、Ｈ１９Ｋ１２、Ｈ２７Ｋ５、Ｈ２７Ｋ１５、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照リツキシマブ、組換えマウスＩｇＧ２ａ  ＣＸＩＩＧ６またはマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＭＡＢ００３）を含有する１ｍｌのＤＭＥＭ−１％ＦＣＳで、氷上で１時間処理した。細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄した。２０μｇ／ｍｌのポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＡＦ００７）、２０μｇ／ｍｌのポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ  ＦｃＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎカタログ番号１０９−０３５−０９８）または１００ｎｇ／ｍｌのｈＣＳＦ−１をこれらの細胞に３７℃で１０分間加えるか、または細胞を処理せずにおいた。培地を除去し、ペトリ皿に抽出バッファー（６２ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、１００ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ６．８）を加えることにより細胞層を溶解させた。細胞抽出液を、それぞれチロシン７０８リン酸化ＣＳＦ−１Ｒ、総ＣＳＦ−１Ｒおよびβ−アクチンの検出のために以下の抗体：ポリクローナルウサギ抗ホスホ−ＣＳＦ−１ＲＴｙｒ７０８（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙカタログ番号ｓｃ−３３３５８−Ｒ）、ポリクローナルウサギ抗ＣＳＦ−１Ｒ（Ｈ３００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙカタログ番号ｓｃ−１３９４９、１／２００希釈）およびモノクローナルマウス抗β−アクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ａ２２２８、１／２０００希釈）でプロービングしたウエスタンブロットで分析した。ウサギおよびマウス一次抗体はそれぞれポリクローナルヤギ抗ウサギまたはウサギ抗マウスＩｇＨＲＰ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎカタログ番号Ｐ０４４８、Ｐ０２６０）で検出した。
【０３１７】
結果
本発明者らは、チロシン７０８のＣＳＦ−１依存的リン酸化に対するｈＣＸＩＩＧ６変異体Ｈ１９Ｋ１２、Ｈ２７Ｋ５およびＨ２７Ｋ１５、ならびにｃｈＣＸＩＩＧ６の効果と、それらの促進効果の欠如を検討した。ＣＳＦ−１の不在下で、どのｍＡｂも、０．１、１または１０μｇ／ｍｌのいずれかで試験した場合、チロシン７０８でリン酸化されたＣＳＦ−１Ｒに特異的な抗体を用いた場合に見られるような受容体のリン酸化を誘導しなかった。このことは、キメラ型またはヒト化型のいずれのＣＸＩＩＧ６−ｍＡｂ誘導体も総て、Ｂ４−８００−５細胞に単独で適用された場合に促進効果を示さないことを示した。
【０３１８】
ＣＳＦ−１刺激の際、全長ＣＳＦ−１Ｒに相当する約１５０ｋＤａのバンドはリン酸化され、リツキシマブアイソタイプ対照とともに、または抗体を伴わずに培養した細胞において全細胞ＣＳＦ−１Ｒは低下した。より低分子量の他の３つのバンドは抗ホスホ−ＣＳＦ−１ＲＴｙｒ７０８抗体で検出された。Ｂ４−８００−５細胞をＣＳＦ−１による刺激の前に３７℃にてｃｈＣＸＩＩＧ６またはｈＣＸＩＩＧ６変異体とともにインキュベートした場合、抗ホスホ−ＣＳＦ−１ＲＴｙｒ７０８  ｍＡｂにより認識された４バンドの強度は、リツキシマブ処理細胞で見られたものに比べて低かった。１５０ｋＤａバンドの強度の低下は、同様の条件でハイブリドーマ由来ＣＸＩＩＧ６でこれまでに得られたものに匹敵した。２つのより下方のバンドの強度の低下は、より劇的であると思われた。ＣＳＦ−１Ｒ  Ｔｙｒ７０８リン酸化に対するｃｈＣＸＩＩＧ６およびｈＣＸＩＩＧ６変異体の阻害効果は、０．１、１および１０μｇ／ｍｌで見られた。
【０３１９】
処置患者ｍＡｂにおけるｈＣＸＩＩＧ６に対する体液性応答（ヒト抗ヒト抗体応答）の潜在的発生を予想するために、本発明者らは次に、ＣＳＦ−１Ｒ受容体リン酸化に対する二次抗ＩｇＧ  ＡｂによるｍＡｂ架橋の効果を検討した。マウスＣＸＩＩＧ６の架橋は、これまでにハイブリドーマ由来ＣＸＩＩＧ６で見られたような、抗ホスホ−ＣＳＦ−１ＲＴｙｒ７０８抗体で検出される１５０ｋＤａの微弱なバンドだけを生成し、総ＣＳＦ−１Ｒの若干のダウンレギュレーションが検出可能であったが、これはおそらくＣＳＦ−１Ｒの弱い活性化を反映している。架橋時に、ｈＣＸＩＩＧ６変異体およびｃｈＣＸＩＩＧ６もまた、低強度で１５０ｋＤａバンドを生成した。１５０ｋＤａリン酸化ＣＳＦ−１Ｒバンドの強度は、１００ｎｇ／ｍｌのＣＳＦ−１で刺激した後に見られたものに比べて極めて弱かった。抗ＣＳＦ−１Ｒ  ｍＡｂ誘導体、ｃｈＣＸＩＩＧ６またはｈＣＸＩＩＧ６変異体のいずれでも、架橋後に抗ＣＳＦ−１ＲＴｙｒ７０８抗体により、ＣＳＦ−１により誘導されたより低ＭＷのバンドは検出されなかった。
【０３２０】
これらの実験は、ｃｈＣＸＩＩＧ６同様に、ｈＣＸＩＩＧ６変異体Ｈ１９Ｋ１２、Ｈ２７Ｋ５およびＨ２７Ｋ１５がＣＳＦ−１ＲのＣＳＦ−１依存的リン酸化を部分的に阻害し得ること、およびＣＳＦ−１Ｒに対して直接的な促進活性を持たないことを示す。細胞表面上のｍＡｂの架橋は、ＣＳＦ−１Ｒリン酸化に対して最小限の効果を持っているに過ぎない。
【０３２１】
Ｄ−ＥＬ４−ＣＳＦ−１Ｒ標的細胞に対する細胞傷害性
方法
マウスリンパ腫由来Ｔ細胞株ＥＬ４（ＡＴＣＣカタログ番号ＴＩＢ−３９）を、ヒト全長ＣＳＦ−１Ｒをコードするレンチウイルスベクターで安定的にトランスフェクトすることにより、ＥＬ４−ＣＳＦ−１Ｒ組換え細胞株を作出した。表面ＣＳＦ−１Ｒ発現は、ｍＡｂ  ＣＸＩＩＧ６（マウスＩｇＧ２ａ）または３２９１での免疫染色およびフローサイトメトリー分析により確認した（データは示されていない）。
【０３２２】
ＥＬ４−ＣＳＦ−１Ｒ細胞をＤＭＥＭ完全培地で洗浄し、同じ培地に再懸濁させ、９６ウェルプレートに５０μｌ中、２×１０４細胞／ウェルで播種した。細胞を氷上で４５〜６０分間、培養培地で希釈した５０μｌの抗体でオプソニン化した。次に、５０μｌのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を種々のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で加えた。ヒト化ＣＸＩＩＧ６変異体、ｃｈＣＸＩＩＧ６および陰性対照リツキシマブを１０ｎｇ／ｍｌ、０．３および１０μｇ／ｍｌで試験した。１５０μｌの培養培地、標的細胞またはＰＢＭＣ単独を含有する対照ウェルを平衡して実施し、（ｉ）培養培地（ＣＭ）バックグラウンド、（ｉｉ）培養培地＋溶解溶液バックグラウンド、（ｉｉｉ）標的細胞自然放出（ＳＲ）、（ｉｖ）各ＰＢＭＣ濃度でのエフェクター細胞自然放出、および（ｖ）溶解溶液の存在下での標的細胞最大放出（ＭＲ）を測定した。プレートを２５０ｘｇで４分間遠心分離し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、１５μｌの１０倍溶解溶液（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ１８２Ａ）を、培養培地または標的細胞単独を含有する対照ウェルに加え、プレートを３７℃で４５分間さらにインキュベートした。ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ１７８０）を製造者の説明書に従って用い、培養上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を定量した。Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＴｒｉＳｔａｒ  ＬＢ  ９４１リーダーおよびＭｉｋｒｏＷｉｎ  ２０００ソフトウエアを用い、４９０ｎｍで吸光度を記録した。
【０３２３】
平均ＣＭバックグラウンドを、実験値、標的ＳＲ値およびエフェクターＳＲ値から差し引いた。平均ＣＭ＋溶解溶液バックグラウンドを、標的ＭＲ値から差し引いた。統計学的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエアにてノンパラメトリック・マン・ホイットニー片側ｔ検定（ｃｈＣＸＩＩＧ６または各ｈＣＸＩＩＧ６変異体をリツキシマブと比較する場合）または両側ｔ検定（各ｈＣＸＩＩＧ６変異体をｃｈＣＸＩＩＧ６と比較する場合）を用い、平均ＣＭおよびＳＲ対照を差し引いた後のＯＤ値を用いて行った。溶解％は下式を用いて計算した。
【数６】
0005996558.tif 000018
【０３２４】
結果
ｃｈＣＸＩＩＧ６およびｈＣＸＩＩＧ６変異体（ヒトＩｇＧ１）のＡＤＣＣ活性を、種々の血液ドナーからのＰＢＭＣを用い、標的ＥＬ４−ＣＳＦ−１Ｒ細胞で試験した。
【０３２５】
ドナー番号１からのエフェクター細胞を、Ｅ：Ｔ比  ２５：１で用いた（図３０Ａ）。この実験では、ｍＡｂの不在下で１０％を超える直接溶解が見られたが、これはＰＢＭＣ中に含まれるＮＫ細胞の活性を反映したものであり得る。陰性対照のリツキシマブで得られた値も同等の範囲であった。ＥＬ４−ＣＳＦ−１Ｒ細胞はリツキシマブと結合しなかったことがフローサイトメトリー分析により確認された（データは示されていない）。１０ｎｇ／ｍｌのｍＡｂで、特異的溶解（リツキシマブの存在下で見られる非特異的溶解を超える溶解）は抗ＣＳＦ−１Ｒ  ｍＡｂでは見られなかった。０．３μｇ／ｍｌのｍＡｂでは、ｃｈＣＸＩＩＧ６は２０％を超える細胞傷害性を誘導した。３つのｈＣＸＩＩＧ６変異体による溶解は同じ桁であった。高いｍＡｂ濃度（１０μｇ／ｍｌ）では、３つのｈＣＸＩＩＧ６変異体は総て、３５％近い細胞傷害性をもたらしたが、ｃｈＣＸＩＩＧ６による溶解は依然として２０％を下回った。
【０３２６】
別の実験を、ドナー番号２からのエフェクター細胞をＥ：Ｔ比  ２５：１、５０：１または１００：１で用いて行った（図３０Ｂ）。第１の実験とは対照的に、直接溶解は検出されなかった。バックグラウンド細胞傷害性は、試験した総てのＥ：Ｔ比でリツキシマブを用いた場合の１０％より低かった。結果は、これまでの実験からの結果とよく相関しており、低いｍＡｂ濃度（１０ｎｇ／ｍｌ）では特異的溶解は見られなかったが、０．３および１０μｇ／ｍｌのｃｈＣＸＩＩＧ６および３つのｈＣＸＩＩＧ６変異体は、ＥＬ４−ＣＳＦ−１Ｒ細胞の有意な特異的溶解を誘導した。これらのｍＡｂ濃度および総ての試験Ｅ：Ｔ比のいずれでも、標的細胞の溶解はこの場合にも、ｃｈＣＸＩＩＧ６の場合よりもＨ２７Ｋ５、Ｈ２７Ｋ１５およびＨ１９Ｋ１２の場合に高かった（ｐ＝０．０２）。
【０３２７】
これらの結果は、ｃｈＣＸＩＩＧ６およびｈＣＸＩＩＧ６変異体が、表面ＣＳＦ−１Ｒを発現する標的細胞を死滅させる能力を有することを証明する。
【０３２８】
ＢｅＷｏ腫瘍モデルにおけるキメラおよびヒト化抗ＣＳＦ−１Ｒ  ｍＡｂの治療効果
ｃｈＣＸＩＩＧ６およびｈＣＸＩＩＧ６変異体はヒトＣＳＦ−１Ｒに特異的であり、かつ、そのマウス同族体を認識せず、それらのin vivo効果は、ヒトＣＳＦ−１Ｒ陽性腫瘍を用いたマウスモデルでしか検討できない。しかしながら、ヒトＣＳＦ−１の不在下では、ヒトＣＳＦ−１Ｒは不活性のままであり、その機能の遮断を調べることができない。さらに、治療利益をもたらすと予想されるＣＳＦ−１Ｒ陽性宿主細胞（腫瘍関連マクロファージ、破骨細胞）の遮断は、このモデル系では実現不可能である。ヒトＣＳＦ−１Ｒ陽性ＢｅＷｏ腫瘍を用いた下記の実験では、腫瘍細胞に対するｍＡｂの細胞傷害効果だけが治療効力をもたらし得る。
【０３２９】
ＢｅＷｏヒト絨毛癌細胞は表面ＣＳＦ−１Ｒを発現する
in vitroで培養したＢｅＷｏ細胞をｍＡｂ  Ｈ２７Ｋ１５（リードヒト化抗ＣＳＦ−１Ｒ）で免疫染色し、共焦顕微鏡で蛍光を分析した。陰性対照のリツキシマブと比較した場合の、Ｈ２７Ｋ１５で見られた特異的染色は、ＢｅＷｏ細胞がそれらの表面にヒトＣＳＦ−１Ｒを発現することを示す。ＢｅＷｏ細胞は、培養上清のＥＬＩＳＡ滴定により判定した場合、ＣＳＦ−１を分泌しない（結果は示されていない）。
【０３３０】
ＮＭＲ１ヌードマウスに皮下移植したＢｅＷｏ細胞に由来する固形腫瘍を、免疫組織化学による分析のためのＯＣＴに含めた。凍結組織切片をマウス型のＣＸＩＩＧ６またはアイソタイプ対照で染色した。腫瘍の全域に強い特異的染色が見られたが、これはin vivoにおいてＢｅＷｏ腫瘍細胞でｈＣＳＦ−１Ｒの細胞表面および細胞質双方の発現を表している。
【０３３１】
実験１：ＢｅＷｏ絨毛癌腫瘍モデルにおけるキメラＣＸＩＩＧ６の治療効果
４００万個のＢｅＷｏ細胞をＮＭＲ１ヌードマウスの側腹部に皮下移植した。マウス１１匹の群をキメラＣＸＩＩＧ６の３回の注射（ｃｈＣＸＩＩＧ６、ＰＢＳ中５０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、１、３および７日目に投与）で処置し、別の１１匹の群は、同じ方法に基づきリツキシマブアイソタイプ対照で処置した。腫瘍成長の阻害（図３１Ａ）およびマウス生存期間の延長（図３１Ｂ）がｃｈＣＸＩＩＧ６処置マウスで見られたが、このことはヒトＣＳＦ−１Ｒ陽性ＢｅＷｏ腫瘍をこのｍＡｂで標的化することが治療効果を有することを示す。
【０３３２】
実験２：ＢｅＷｏ絨毛癌腫瘍モデルにおけるキメラＣＸＩＩＧ６およびヒト化Ｈ２７Ｋ１５の治療効果
下記の２つの改変を加えて上記のプロトコールを繰り返した。
【０３３３】
・ｃｈＣＸＩＩＧ６またはヒト化Ｈ２７Ｋ１５  ｍＡｂを試験し（マウス１０匹／群）、アイソタイプ対照リツキシマブと比較した。
【０３３４】
・ｍＡｂを、１週間ではなく３週間、週に３回注射した。
【０３３５】
ｃｈＣＸＩＩＧ６またはＨ２７Ｋ１５処置を延長しても、第１の実験に比べて腫瘍成長阻害またはマウス生存に関する改善は見られなかった。しかしながら、両ｍＡｂともリツキシマブアイソタイプ対照群に比べて腫瘍成長を阻害した。Ｈ２７Ｋ１５の場合、腫瘍体積の減少は、マン・ホイットニー検定を用いたところ、１４日目に統計学的に有意であり、その後の時点（１７日目および２１日目）でも有意に近かった。ｃｈＣＸＩＩＧ６では、腫瘍体積の減少は統計学的に有意に近かった。
【０３３６】
参照文献
0005996558.tif 000019
0005996558.tif 000020
0005996558.tif 000021
0005996558.tif 000022
0005996558.tif 000023
0005996558.tif 000024
0005996558.tif 000025
0005996558.tif 000026
【図２】
0005996558.tif 000027
【図３】
0005996558.tif 000028
【図４】
0005996558.tif 000029
【図６】
0005996558.tif 000030
【図７】
0005996558.tif 000031
【図８】
0005996558.tif 000032
【図９】
0005996558.tif 000033
【図１０】
0005996558.tif 000034
【図１１】
0005996558.tif 000035
【図１２】
0005996558.tif 000036
【図１３】
0005996558.tif 000037
【図１４】
0005996558.tif 000038
【図１５】
0005996558.tif 000039
【図１６】
0005996558.tif 000040
【図１７】
0005996558.tif 000041
【図１８】
0005996558.tif 000042
【図２０】
0005996558.tif 000043
【図２１】
0005996558.tif 000044
【図２２】
0005996558.tif 000045
【図２３】
0005996558.tif 000046
【図２４】
0005996558.tif 000047
【図２５】
0005996558.tif 000048
【図２９−１】
0005996558.tif 000049
【図２９−２】
0005996558.tif 000050
【図２９−３】
0005996558.tif 000051
【図３２−１】
0005996558.tif 000052
【図３２−２】
0005996558.tif 000053
【図３２−３】
0005996558.tif 000054
【図３２−４】
0005996558.tif 000055
【図３２−５】
0005996558.tif 000056
【図３２−６】
0005996558.tif 000057
【図３２−７】
0005996558.tif 000058
【図３２−８】
0005996558.tif 000059
【図１】
0005996558.tif 000060
【図５】
0005996558.tif 000061
【図１９】
0005996558.tif 000062
【図２６】
0005996558.tif 000063
【図２７】
0005996558.tif 000064
【図２８】
0005996558.tif 000065
【図３０−１】
0005996558.tif 000066
【図３０−２】
0005996558.tif 000067
【図３１】
0005996558.tif 000068
【配列表】
0005996558000001.app