(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養容器であって、
容器内底面の方向に沿って広がる機能性有機化合物層を備え、且つ、フィルム基材層、及び、該フィルム基材層の容器内側の表面上に積層された機能性有機化合物層を備える機能性フィルムである底部と、
前記底部の周縁に立設された、その下端面のうち少なくとも内周寄りの部分が、前記機能性有機化合物層の周縁部に載っている周側壁部と、
前記周側壁部の下端面に対向する上端面を備える枠状支持部と、
を備え、
周側壁部の下端面の内周寄りの部分が、機能性フィルムの、機能性有機化合物層側の面の周縁部に載っており、
機能性フィルムの、フィルム基材層側の面の周縁部が、枠状支持部の上端面の内周寄りの部分に載っており、
前記機能性フィルムの周縁部が、周側壁部の下端面の内周寄りの部分と、該部分に対向する、枠状支持部の上端面の内周寄りの部分とによって把持されるように、周側壁部の下端面の外周寄りの部分と、該部分に対向する、枠状支持部の上端面の外周寄りの部分とが接合されており、
周側壁部の下端面の内周寄りの、機能性フィルムの機能性有機化合物層側の面と接する部分が、弾性材料を含んでおり、
枠状支持部の上端面の内周寄りの、機能性フィルムのフィルム基材層側の面と接する部分が、弾性材料を含んでいる、
細胞培養容器。
【請求項２】
周側壁部の下端面の内周寄りの、機能性フィルムの機能性有機化合物層側の面と接する部分が、全周にわたり、弾性材料を含んでおり、
枠状支持部の上端面の内周寄りの、機能性フィルムのフィルム基材層側の面と接する部分が、全周にわたり、弾性材料を含んでいる、
請求項１に記載の細胞培養容器。
【請求項３】
細胞培養容器の製造方法であって、
フィルム基材層及び該フィルム基材層の上に積層された機能性有機化合物層を含む機能性フィルム、周側壁部、並びに、周側壁部の下端面と対向する上端面を備える枠状支持部を準備する工程と、
機能性フィルムの、機能性有機化合物層側の面の周縁部に、周側壁部の下端面の内周寄りの部分が接触し、フィルム基材層側の面の周縁部に、枠状支持部の上端面の内周寄りの部分が接触し、周側壁部の下端面の外周寄りの部分と枠状支持部の上端面の外周寄りの部分とが機能性フィルムの外周よりも外側位置において対向するように配置する工程と、
機能性フィルムの周縁部を、周側壁部の下端面の内周寄りの部分と枠状支持部の上端面の内周寄りの部分とにより把持しながら、周側壁部の下端面の外周寄りの部分と枠状支持部の上端面の外周寄りの部分とを接合する工程と
を含み、
周側壁部の下端面の内周寄りの、機能性フィルムの機能性有機化合物層側の面と接する部分が、弾性材料を含んでおり、
枠状支持部の上端面の内周寄りの、機能性フィルムのフィルム基材層側の面と接する部分が、弾性材料を含んでいる、
方法。
【請求項４】
周側壁部の下端面の内周寄りの、機能性フィルムの機能性有機化合物層側の面と接する部分が、全周にわたり、弾性材料を含んでおり、
枠状支持部の上端面の内周寄りの、機能性フィルムのフィルム基材層側の面と接する部分が、全周にわたり、弾性材料を含んでいる、
請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞培養容器の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
表面に細胞培養される機能性ポリマー（温度応答性ポリマー）の層を被覆した細胞培養支持体（シャーレなどの細胞培養容器）が特許文献１に記載されている。
この細胞培養支持体を用いることにより、温度を変化させるだけで培養・増殖後の細胞を破壊することなく細胞支持体から容易に剥離して回収することができる。
特許文献１では細胞培養容器を個別にバッチ処理して機能性有機化合物層を設ける方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平２−２１１８６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
機能性有機化合物層を備える細胞培養容器の効率的な製造方法として、基材層上に機能性有機化合物層を形成した、フィルム状、板状等の機能性基体を予め製造しておき、細胞培養容器の底面に固定する方法がある。図１には従来技術の一例として、底部１０１と周側壁部１０２とを有し、上面に開放された皿形状の細胞培養容器１００の容器底面に、基材層１１２と機能性有機化合物層１１１を備えた機能性基体１１０を固定する場合を示す。このとき、機能性基体１１０の外周は、周側壁部１０２の内周よりも若干小さくする必要がある。このため、底部１０１の容器内側の面上の全面に機能性有機化合物層１１１を形成することは困難であり、底部１０１の容器内側の面上の、周側壁部の下端と接する部分の少なくとも一部は、機能性有機化合物層が形成されていない部分となる。この結果、細胞接着性、細胞易剥離性等の所望の機能が十分に発揮されないという問題がある。例えば、温度応答性ポリマー層上で細胞培養を行って細胞シートを形成し、温度変化により細胞シートを剥離させ回収する場合において、温度応答性ポリマー層が存在しない容器底面上に細胞シートが接着してしまい、細胞シートの剥離回収が困難となる問題がある。
そこで本発明は、底面の全面に機能性有機化合物層が設けられた細胞培養容器及びその製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、表面上に機能性有機化合物層が固定された底部を用意し、当該底部の周縁に、周側壁部を、その下端面の少なくとも内周寄りの部分が、機能性有機化合物層の周縁部に載るように設けることにより、底面の全面に機能性有機化合物層が設けられた細胞培養容器を得ることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
本発明は以下の発明を包含する。
（１）細胞培養容器であって、
容器内底面の方向に沿って広がる機能性有機化合物層を備える底部と、
前記底部の周縁に立設された、その下端面のうち少なくとも内周寄りの部分が、前記機能性有機化合物層の周縁部に載っている周側壁部と
を備える細胞培養容器。
【０００７】
（２）前記底部が、
底板部材と、
基材層、及び、該基材層の表面に積層された機能性有機化合物層を備える、前記底板部材の容器内側の表面に、機能性有機化合物層が容器内側に向くように配置された機能性基体と
の組み合わせである、
（１）の細胞培養容器。
【０００８】
（３）前記底部が、容器内側の表面上に積層された機能性有機化合物層を備える底板部材である、（１）の細胞培養容器。
【０００９】
（４）前記底部が、フィルム基材層、及び、該フィルム基材層の容器内側の表面上に積層された機能性有機化合物層を備える機能性フィルムである、（１）の細胞培養容器。
【００１０】
（５）周側壁部の下端面に対向する上端面を備える枠状支持部を更に備え、
周側壁部の下端面の内周寄りの部分が、機能性フィルムの、機能性有機化合物層側の面の周縁部に載っており、
機能性フィルムの、フィルム基材層側の面の周縁部が、枠状支持部の上端面の内周寄りの部分に載っており、
前記機能性フィルムの周縁部が、周側壁部の下端面の内周寄りの部分と、該部分に対向する、枠状支持部の上端面の内周寄りの部分とによって把持されるように、周側壁部の下端面の外周寄りの部分と、該部分に対向する、枠状支持部の上端面の外周寄りの部分とが接合されている、（４）の細胞培養容器。
【００１１】
（６）周側壁部の下端面の内周寄りの、機能性フィルムの機能性有機化合物層側の面と接する部分が、弾性材料を含んでおり、
枠状支持部の上端面の内周寄りの、機能性フィルムのフィルム基材層側の面と接する部分が、弾性材料を含んでいる、
（５）の細胞培養容器。
【００１２】
（７）細胞培養容器の製造方法であって、
底板部材の表面に、基材層、及び、該基材層の表面に積層された機能性有機化合物層を備える機能性基体を、機能性有機化合物層が容器内側に向くように配置する工程と、
周側壁部を、その下端面のうち少なくとも内周寄りの部分が、前記機能性有機化合物層の周縁部に載るように配置し、前記底板部材及び／又は前記機能性基体に接合する工程と、
を含む方法。
【００１３】
（８）細胞培養容器の製造方法であって、
容器内側の表面上に積層された機能性有機化合物層を備える底板部材の表面に、周側壁部を、その下端面のうち少なくとも内周寄りの部分が、前記機能性有機化合物層の周縁部に載るように配置し、前記周側壁部と前記底板部材とを接合する工程と、
を含む方法。
【００１４】
（９）細胞培養容器の製造方法であって、
フィルム基材層及び該フィルム基材層の上に積層された機能性有機化合物層を含む機能性フィルム、周側壁部、並びに、周側壁部の下端面と対向する上端面を備える枠状支持部を準備する工程と、
機能性フィルムの、機能性有機化合物層側の面の周縁部に、周側壁部の下端面の内周寄りの部分が接触し、フィルム基材層側の面の周縁部に、枠状支持部の上端面の内周寄りの部分が接触し、周側壁部の下端面の外周寄りの部分と枠状支持部の上端面の外周寄りの部分とが機能性フィルムの外周よりも外側位置において対向するように配置する工程と、
機能性フィルムの周縁部を、周側壁部の下端面の内周寄りの部分と枠状支持部の上端面の内周寄りの部分とにより把持しながら、周側壁部の下端面の外周寄りの部分と枠状支持部の上端面の外周寄りの部分とを接合する工程と
を含む方法。
【００１５】
（１０）周側壁部の下端面の内周寄りの、機能性フィルムの機能性有機化合物層側の面と接する部分が、弾性材料を含んでおり、
枠状支持部の上端面の内周寄りの、機能性フィルムのフィルム基材層側の面と接する部分が、弾性材料を含んでいる、
（９）の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、容器内底面の全面に機能性有機化合物層が設けられた細胞培養容器が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、上面に開放された皿形状の細胞培養容器（シャーレ）の容器底面に機能性基体を固定する従来技術の一例を示す断面模式図である。
【図２】本発明の細胞培養容器の全体形状の一例（皿形状）を示す図である。
【図３】本発明の細胞培養容器の全体形状の一例（フラスコ形状）を示す図である。
【図４】底板部材と、基材層及び機能性有機化合物層を備える機能性基体との組み合わせを底部とする、本発明の第１実施形態に係る細胞培養容器の製造方法の一例を示す。
【図５】底板部材と、基材層及び機能性有機化合物層を備える機能性基体との組み合わせを底部とする、本発明の第１実施形態に係る細胞培養容器の製造方法の他の一例を示す。
【図６】底板部材と、基材層及び機能性有機化合物層を備える機能性基体との組み合わせを底部とする、本発明の第１実施形態に係る細胞培養容器の製造方法の他の一例を示す。
【図７】容器内側の表面上に積層された機能性有機化合物層を備える底板部材を底部とする、本発明の第２実施形態に係る細胞培養容器の製造方法の一例を示す。
【図８】容器内側の表面上に積層された機能性有機化合物層を備える底板部材を底部とする、本発明の第２実施形態に係る細胞培養容器の製造方法の他の一例を示す。
【図９】フィルム基材層及び機能性有機化合物層を備える機能性フィルムを底部とする、本発明の第３実施形態に係る細胞培養容器の製造方法の一例を示す。
【図１０】フィルム基材層及び機能性有機化合物層を備える機能性フィルムを底部とする、本発明の第３実施形態に係る細胞培養容器の製造方法の他の一例を示す。
【図１１】フィルム基材層及び機能性有機化合物層を備える機能性フィルムを底部とする、本発明の第３実施形態に係る細胞培養容器の製造方法の、フラスコ型容器への適用例を示す。
【図１２】フィルム基材層及び機能性有機化合物層を備える機能性フィルムを底部とする、本発明の第３実施形態に係る細胞培養容器の製造方法の、フラスコ型容器への適用例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下の説明では必要に応じて図面を参照し本発明の特徴を説明するが、各図は模式的に示した図であり、各部の大きさ、形状は理解を容易にするために適宜誇張して示している。
【００１９】
＜細胞培養容器の形状＞
本発明の細胞培養容器の全体の形状について説明する。
本発明により製造される細胞培養容器は、底部と周側壁部とを備えるものである限り全体の形状は特に限定されない。
【００２０】
本発明の細胞培養容器の一例は、図２に示すように、底部２０１と周側壁部２０２とを備え、周側壁部２０２の上端方向に開放された皿形状の細胞培養容器２００である。底部２０１の容器内底面には機能性有機化合物層２１０が設けられる。
【００２１】
本発明の細胞培養容器の他の一例は、図３に示すように、底部３０１と、底部３０１の周縁に立設された周側壁部３０２と、周側壁部３０２の上端部に接合された、底部３０１に対向配置される天面部３０３と、周側壁部３０２の一部に通孔３０４が穿設されており、通孔３０４の周縁から容器部外側に延びる首部３０５を備える、「フラスコ型」と呼ばれる形状の容器部３００と、首部３０５に形成された係止部３０６を介して着脱可能に装着される蓋３１０とを備えるフラスコ型細胞培養容器３２０である。図３Ｂは容器部３００のＩ−Ｉ’断面図を示し、図３ＣはＩＩ−ＩＩ’断面図を示す。図示していないが、底部３０１の容器内底面に機能性有機化合物層３３０が設けられる。
【００２２】
本発明において「周側壁部」とは周側壁部のみからなるものであってもよいし、一部に通孔が穿設されており且つ首部を備えた周側壁部であってもよいし、その上端が天面部等により閉じられた形状の周側壁部であってもよい。
【００２３】
以下の説明では、最も簡易な構造の実施形態である、皿形状の細胞培養容器２００において容器内底面に機能性有機化合物層を形成する実施形態を中心に説明するが、本発明はこの形態には限定されない。
【００２４】
＜細胞培養容器の材料＞
底板部材、周側壁部、枠状支持部、蓋などの他の細胞培養容器の部材を形成する材料は特に限定されず、細胞培養において一般的に用いられる材料を用いることができる。例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂等の樹脂材料、表面親水化処理を施した上記の少なくとも１種を含む樹脂材料、及びガラスや石英等の無機材料であることができるが、好ましくは樹脂材料である。樹脂材料としては、ポリスチレン樹脂又はポリエチレンテレフタレート樹脂であることが好ましい。
【００２５】
＜機能性有機化合物層＞
本発明では、底板部材の容器内側の表面又は機能性基体の表面に、機能性有機化合物層が設けられる。
【００２６】
機能性有機化合物層を構成する有機化合物としては、所望の機能を有する層であれば特に限定されないが、より好ましくは、所定の刺激によって細胞接着性から細胞非接着性へと変化することが可能な表面を有する刺激応答性ポリマーや、１つ以上のエチレングリコール単位（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）からなるエチレングリコール鎖等の親水性化合物が挙げられる。
【００２７】
機能性有機化合物層の膜厚は、例えば、０．５ｎｍ〜３００ｎｍの範囲内とするよく、なかでも１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲内であることが好ましい。
【００２８】
以下「刺激応答性ポリマー層」及び「親水性化合物層」の好適な実施形態について説明する。
【００２９】
＜刺激応答性ポリマー層＞
機能性有機化合物層は、刺激応答性ポリマー層であることが特に好ましい。刺激応答性ポリマー層とは、所定の刺激によって表面の細胞の接着度合いが変化するポリマーを含む層である。刺激応答性ポリマーとしては、温度応答性ポリマー、ｐＨ応答性ポリマー、イオン応答性ポリマー、光応答性ポリマーなどを挙げることができる。なかでも温度応答性ポリマーが、刺激の付与が容易であることから好ましい。
【００３０】
温度応答性ポリマーとして、例えば、細胞を培養する温度では細胞接着性を示し、作製した細胞シートを剥離する時の温度では細胞非接着性を示すものを用いるとよい。例えば、温度応答性ポリマーは、臨界溶解温度未満の温度では周囲の水に対する親和性が向上し、ポリマーが水を取り込んで膨潤して表面に細胞を接着しにくくする性質（細胞非接着性）を示し、同温度以上の温度ではポリマーから水が脱離することでポリマーが収縮して表面に細胞を接着しやすくする性質（細胞接着性）を示すものを用いるとよい。このような臨界溶解温度は、下限臨界溶解温度と呼ばれる。下限臨界溶解温度Ｔが０℃〜８０℃、さらに好ましくは０℃〜５０℃である温度応答性ポリマーを用いるとよい。Ｔが０℃〜８０℃であると、細胞を安定的に培養できるからである。
【００３１】
好適な温度応答性ポリマーとしてはアクリル系ポリマー又はメタクリル系ポリマーが挙げられる。具体的に好適な温度応答性ポリマーとしては、例えばポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド(Ｔ＝２１℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド(Ｔ＝約３５℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド(Ｔ＝約２８℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、及びポリ−Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)等が挙げられる。
【００３２】
これらのポリマーを形成するためのモノマーとしては、放射線照射によって重合し得るモノマーを用いることができる。モノマーとしては例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体、及びビニルエーテル誘導体等が挙げられ、これらの１種以上を使用してよい。モノマーが一種類単独で使用された場合、基材上に形成されるポリマーはホモポリマーとなり、モノマーが複数種一緒に使用された場合、基材上に形成されるポリマーはヘテロポリマーとなるが、どちらの形態も本発明に包含される。
【００３３】
また、増殖細胞の種類によってＴを調節する必要がある場合や、被覆物質と細胞培養支持体との相互作用を高める必要が生じた場合や、細胞支持体の親水・疎水性のバランスを調整する必要がある場合などには、上記以外の他のモノマー類を更に加えて共重合してよい。更に本発明に使用する上記ポリマーとその他のポリマーとのグラフト又はブロック共重合体、あるいは本発明のポリマーと他のポリマーとの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質が損なわれない範囲で架橋することも可能である。
【００３４】
ｐＨ応答性ポリマー及びイオン応答性ポリマーは作製しようとする細胞シートに適したものを適宜選択することができる。
【００３５】
刺激応答性ポリマー層は、重合して目的の刺激応答性ポリマーを形成するモノマーと、該モノマーを溶解しうる有機溶媒と含む塗布用組成物を調製し、これを慣用の塗布方法に従って、底板部材又は基材層の表面に塗布して塗膜を形成し、次に、該塗膜に放射線照射等の適当な手段により塗膜中のモノマーを重合してポリマーを形成するとともに、底板部材又は基材層の表面とポリマーとの間にグラフト化反応を生じさせることにより形成することができる。
【００３６】
＜親水性化合物層＞
機能性有機化合物層の他の実施形態として、１つ以上のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖（複数のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖は、「ポリエチレングリコール鎖」ということができる）等の親水性化合物の層が挙げられる。
【００３７】
エチレングリコール鎖の末端は水酸基により封鎖された形態であってもよいし、エチレングリコール鎖の末端に生体関連物質等の他の物質が共有結合により連結された形態であってもよい。
【００３８】
末端が水酸基により封鎖されたエチレングリコール鎖を含む層は、細胞が接着し難い親水性の表面を提供することができる。
【００３９】
エチレングリコール鎖の末端に共有結合されうる生体関連物質としては、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、ホルモン、酵素、サイトカイン、糖鎖、脂質、補酵素、酵素阻害剤、細胞、その他の機能を有するタンパク質が含まれる。更に、このような生体関連物質と親和性を有する低分子化合物、及び高分子化合物も生体関連物質の範囲に含まれる。
【００４０】
エチレングリコール鎖等の親水性化合物の層を、樹脂製の底板部材又は基材層の表面に固定化するためには、予め、底板部材又は基材層の表面に、該表面に物理的に吸着可能であって、エチレングリコール鎖の末端の水酸基と反応して共有結合を形成可能な官能基を側鎖に含むポリシロキサンを含むプライマー層を設ける。ポリシロキサンの側鎖上の官能基としては、グリシジル基又はエポキシ基が好ましい。プライマー層は、基材層の表面に、所望の側鎖を有するシラノール化合物を適用し、該表面上で縮合重合してポリシロキサンに変換することにより形成することができる。
【００４１】
次いで、プライマー層の官能基と、エチレングリコール又はエチレングリコール単位が２以上繰り返されたポリエチレングリコールの水酸基とを反応させて共有結合を形成し、エチレングリコール鎖を固定化する。このとき、触媒量の濃硫酸を含むエチレングリコール又はポリエチレングリコールをプライマー層に接触させる。
末端が水酸基により封鎖されたエチレングリコール鎖を含む層はこのようにして形成される。
【００４２】
更に、必要に応じて、エチレングリコール鎖の一端に、他の物質との共有結合を形成することが可能な、少なくとも１つの官能基を直接的又は間接的に連結させる。官能基の導入方法は特に限定されない。
【００４３】
＜機能性基体＞
本発明の第１実施形態では、基材層及び機能性有機化合物層を備える機能性基体を用いる。
本発明において「基体」とは、所定の構造を有している限り、フィルムであってもよいし、板状体であってもよい。
【００４４】
フィルム状の機能性基体（以下「機能性フィルム」と呼ぶことがある）は、好ましくはロール状に巻き取り可能な可撓性を有するものである。可撓性の機能性フィルムは、ロール・ツー・ロール法による大量生産が容易であるため好ましい。機能性フィルムは本発明の第３実施形態において好適に用いられる。
【００４５】
機能性基体は、樹脂製の基材層に機能性有機化合物層を適当な方法により形成することにより製造することができる。樹脂製の基材層と機能性有機化合物層との間には必要に応じて１つ以上の他の層（例えば親水性化合物層を樹脂製基材層に固定するための上記プライマー層）が存在していてもよい。
【００４６】
機能性基体の平面形状は、固定される領域の形状に応じた任意の形状であることができる。例えば、三角形、四角形（長方形、正方形、平行四辺形、菱形等）、五角形、六角形、七角形、八角形等の多角形や、円形、楕円形等の形状であることができる。
【００４７】
基材層は、最終的な機能性基体に応じて適宜選択される。機能性基体が板状であれば板状の樹脂製基材層が用いられ、機能性基体がフィルム状であればフィルム状の樹脂製基材層（以下「フィルム基材層」という）が用いられる。
【００４８】
基材層は、一方の表面に上述の機能性有機化合物層を形成することが可能な樹脂材料を含むものであればよく、材料の種類は特に限定されない。典型的には、基材層の材料として、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ＴＡＣ（トリアセチルセルロース）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、アクリル等が挙げられる。
【００４９】
基材層の、機能性有機化合物層が形成される側の表面は、易接着処理された表面であることができる。「易接着処理」とは、例えば、ポリエステル、アクリル酸エステル、ポリウレタン、ポリエチレンイミン、シランカップリング剤、ペルフルオロオクタンスルホン酸（ＰＦＯＳ）等の易接着剤による処理を指す。
【００５０】
基材層の厚さは適宜選択することができる。基材層がフィルム基材層である場合、その厚さ（フィルム基材層が基材の層に加えて易接着層を備える場合は、易接着層を含むフィルム基材層の全体の厚さを指す）は、特に制限は無いが可撓性を付与する厚さであることが好ましく、例えば５〜５００μｍ、より好ましくは２０〜５００μｍ、特に好ましくは５０〜２５０μｍである。
【００５１】
機能性基体が備える機能性有機化合物層の機能及び構造は既に述べたとおりである。
基材層の表面での機能性有機化合物層の形成は、刺激応答性ポリマー層及び親水性化合物層に関して詳述した方法等の適当な方法により行うことができる。基材層と機能性有機化合物層との間にはプライマー層等の、機能性有機化合物層の積層に必要な層が介在していてもよい。
【００５２】
＜機能性有機化合物層が積層された底板部材＞
本発明の第２実施形態では、容器内側の表面に機能性有機化合物層が形成された底板部材を用いる。
【００５３】
この場合、底板部材は一方の表面に上述の機能性有機化合物層を形成することが可能な樹脂材料を含むものであればよく、細胞培養容器の材料に関して説明した材料のうち樹脂材料により形成されていることが特に好ましい。
【００５４】
底板部材上の機能性有機化合物層の機能及び構造は既に述べたとおりである。
底板部材の表面での機能性有機化合物層の形成は、刺激応答性ポリマー層及び親水性化合物層に関して詳述した方法等の適当な方法により行うことができる。底板部材表面と機能性有機化合物層との間にはプライマー層等の、機能性有機化合物層の積層に必要な層が介在していてもよい。
【００５５】
＜本発明の細胞培養容器の特徴＞
本発明の細胞培養容器は、
容器内底面の方向に沿って広がる機能性有機化合物層を備える底部と、
前記底部の周縁に立設された、その下端面のうち少なくとも内周寄りの部分が、前記機能性有機化合物層の周縁部に載っている周側壁部と
を備えることを特徴とする。
【００５６】
この特徴を備える細胞培養容器は、容器内底面の全面、すなわち、容器内底面の中央部だけでなく、周側壁部の下端と接する部分にまで、隙間なく機能性有機化合物層を有する。容器内底面の周側壁部の下端と接する部分にまで機能性有機化合物層を設けることが困難であった図１に示すような従来技術とは異なり、細胞接着性、細胞易剥離性等の所望の機能が十分に発揮させることが可能である。
【００５７】
本発明の細胞培養容器は底部の形態に応じて３つの実施形態に大別される。
本発明の細胞培養容器の第１実施形態では、底部が、底板部材と機能性基体との組み合わせである。
本発明の細胞培養容器の第２実施形態では、底部が、容器内側の表面上に積層された機能性有機化合物層を備える底板部材である。
本発明の細胞培養容器の第３実施形態では、底部が、機能性フィルムである。
以下、各実施形態について、その構造及び製造方法を具体的に説明する。
【００５８】
＜第１実施形態＞
本発明の第１の実施形態を図４〜６を参照して説明する。
図４〜６に断面図を示す例において製造される細胞培養容器４２０、５２０、６２０は図２に示すような皿形状の細胞培養容器２００である。
【００５９】
図４の実施形態では、底板部材４０１と機能性基体４０２とを組み合わせて細胞培養容器の底部を構成する。
機能性基体４０２は、基材層４１２及び機能性有機化合物層４１１を少なくとも備える。
【００６０】
細胞培養容器４２０は、底板部材４０１の容器内側の表面に、機能性基体４０２を配置して固定する工程（図４Ａ及びＢ）と、周側壁部４０３を、その下端面４３０が、好ましくはその全周にわたり、機能性有機化合物層４１１の周縁部に載るように配置し、機能性有機化合物層４１１を介して機能性基体４０２に接合する。
【００６１】
図４に示す形態では、底板部材４０１と機能性基体４０２とが固定され、機能性基体４０２の機能性有機化合物層４１１の周縁部と周側壁部４０３の下端面４３０とが固定される。
【００６２】
底板部材４０１と機能性基体４０２とを固定する方法は特に限定されない。例えば、両者を接着剤、粘着剤、ヒートシール性樹脂等を介して固定する方法や、樹脂製の底板部材４０１と樹脂製の基材層４１２とを、超音波溶着や、レーザー溶着等の樹脂接合技術を用いて接合する方法等が挙げられる。図示していないが、接着剤、粘着剤、ヒートシール性樹脂等を介して部材同士を固定する場合には、固定される部材間に接着剤層、粘着剤層、ヒートシール性樹脂層等が適宜存在する。
【００６３】
機能性基体４０２の機能性有機化合物層４１１の周縁部と周側壁部４０３の下端面４３０とを接合する方法もまた特に限定されない。例えば、両者を接着剤、粘着剤、ヒートシール性樹脂等を介して固定する方法や、機能性有機化合物層４１１を介して、樹脂製の基材層４１２と樹脂製の周側壁部４０３とを、超音波溶着や、レーザー溶着等の樹脂接合技術を用いて接合する方法等が挙げられる。
【００６４】
図４の例では、周側壁部４０３の下端面４３０の全体が機能性有機化合物層４１１の周縁部に接しているが、これには限定されず、周側壁部４０３の下端面４３０の少なくとも内周寄りの部分が、機能性有機化合物層４１１の周縁部に接していればよい。
【００６５】
図５及び図６には、周側壁部の下端面の内周寄りの部分だけが機能性有機化合物層の周縁部に載り、周側壁部の下端面の外周寄りの部分が底板部材と接合される例を示す。
【００６６】
図５に示す例では、底板部材４０１と、機能性基体５０２と、周側壁部４０３とを図５Ｄの順に重ねた場合の平面視において、底板部材４０１の外周と、周側壁部４０３の下端面４３０の外周が、それぞれ、機能性有機化合物層５１１と基材層５１２を備える機能性基体５０２の外周よりも外側に位置し、且つ、周側壁部４０３の下端面４３０の内周は、機能性基体５０２の外周よりも内側に位置する。
【００６７】
図５に示す例では、はじめに底板部材４０１と機能性基体５０２とを、底板部材４０１の周縁が機能性基体５０２の周縁よりも外側に位置するように配置する（図５Ｂ）。続いて周側壁部４０３を、その下端面４３０の内周寄りの部分が機能性基体５０２の機能性有機化合物層５１１の周縁部に載り、下端面４３０の外周寄りの部分が、機能性基体５０２の周縁よりも外側に位置するように配置する（図５Ｄ）。このとき、周側壁部４０３の下端面４３０の外周寄りの部分は、底板部材４０１の容器内側表面の周縁部分と対向する（図５Ｄ）。周側壁部４０３の下端面４３０の外周寄りの部分と、底板部材４０１の容器内側表面の周縁部分とを、接着剤、粘着剤、ヒートシール性樹脂等により接合するか、周側壁部４０３と底板部材４０１が共に樹脂製である場合は超音波溶着、レーザー溶着等の手段により接合することにより、細胞培養容器５２０を完成させる（図５Ｅ）。
【００６８】
底板部材と周側壁部下端面の外周寄りの部分とを接合する図５の例の変形例を図６に示す。図６の例では、周側壁部６０３において下端面の内周寄りの部分６３１と、外周寄りの部分６３２との高さ位置が異なり、後者６３２が前者６３１よりも底部方向に突出しており、前者６３１が機能性基体５０２の機能性有機化合物層５１１の周縁部に載った状態で、後者６３２が底板部材４０１の容器内側表面の周縁部分と当接するように形成されている。
【００６９】
図６に示す例では、先ず底板部材４０１と機能性基体５０２とを、底板部材４０１の周縁が機能性基体５０２の周縁よりも外側に位置するように配置する（図６Ｂ）。続いて周側壁部６０３を、その下端面の内周寄りの部分６３１が機能性基体５０２の機能性有機化合物層５１１の周縁部に載り、下端面の外周寄りの部分６３２が、底板部材４０１の容器内側表面の周縁部分と当接するように配置する（図６Ｄ）。次に周側壁部６０３の下端面の外周寄りの部分６３２と底板部材４０１の容器内側表面の周縁部分とを、接着剤、粘着剤、ヒートシール性樹脂等により接合するか、周側壁部６０３と底板部材４０１が共に樹脂製である場合は超音波溶着、レーザー溶着等の手段により接合することにより、細胞培養容器６２０を完成させる（図６Ｅ）。
【００７０】
図５及び６に示す例では、機能性基体５０２の周縁が、周側壁部の下端面の内周寄りの部分と、底板部材４０１の表面とにより把持されており、この把持状態は周側壁部と底板部材との接合により保持されるため、底板部材４０１と機能性基体５０２とが相互に接合されていることは必須ではない。
【００７１】
＜第２実施形態＞
本発明の第２の実施形態を図７〜８を参照して説明する。
図７〜８に横断面を示す例において製造される細胞培養容器７２０、８２０は図２に示すような皿形状の細胞培養容器２００である。
【００７２】
図７の実施形態では、容器内側の表面上の積層された機能性有機化合物層７１１を備える底板部材７０１を用意する（図７Ｂ）。機能性有機化合物層７１１は底板部材７０１の容器内側の表面の全体に形成されている。周側壁部４０３を、その下端面４３０が機能性有機化合物層７１１の周縁部に載るように配置し、機能性有機化合物層７１１を介して周側壁部４０３と底板部材７０１とを、第１実施形態について説明したのと同様の手段により接合して、細胞培養容器７２０を完成させる（図７Ｄ）。
機能性有機化合物層７１１の機能及び構造は既に述べたとおりである。
【００７３】
図７の例では、周側壁部４０３の下端面４３０の全体が機能性有機化合物層７１１の周縁部に接した状態で接合されているが、これには限定されず、周側壁部４０３の下端面４３０の少なくとも内周寄りの部分が、機能性有機化合物層７１１の周縁部に接していればよい。
【００７４】
図８には、周側壁部の下端面の内周寄りの部分が機能性有機化合物層の周縁部に載り、周側壁部の下端面の外周寄りの部分が底板部材と接合される例を示す。図８に示す例では、底板部材７０１と周側壁部４０３とが図８Ｄに示すように重ねられた場合の平面視において、底板部材７０１の外周と、周側壁部４０３の下端面４３０の外周は、それぞれ、機能性有機化合物層８１１の外周よりも外側に位置する。そして、周側壁部４０３の下端面４３０の内周は、機能性有機化合物層８１１の外周よりも内側に位置する。この実施形態では、まず底板部材７０１の容器内側の表面に、機能性有機化合物層８１１を、底板部材７０１の周縁が機能性有機化合物層８１１の周縁よりも外側に位置するように形成する（図８Ｂ）。続いて周側壁部４０３を、その下端面４３０の内周寄りの部分が機能性有機化合物層８１１の周縁部に載り、下端面４３０の外周寄りの部分が、機能性有機化合物層８１１の周縁よりも外側に位置するように配置する（図８Ｄ）。このとき、周側壁部４０３の下端面４３０の外周寄りの部分は、底板部材７０１の容器内側表面の周縁部分と対向する（図８Ｄ）。周側壁部４０３の下端面４３０の外周寄りの部分と、底板部材７０１の容器内側表面の周縁部分とを第１実施形態について説明したのと同様の手段により接合することにより、細胞培養容器８２０を完成させる（図８Ｅ）。
【００７５】
＜第３実施形態＞
本発明の第３の実施形態を図９〜１０を参照して説明する。
図９〜１０に横断面を示す例において製造される細胞培養容器９２０、１０２０は図２に示すような皿形状の細胞培養容器２００である。
【００７６】
第３実施形態では、細胞培養容器の底部として、フィルム基材層、及び、該フィルム基材層の容器内側の表面上に積層された機能性有機化合物層を備える機能性フィルムを用いることを特徴とする。機能性フィルムの特徴については上述したとおりである。
【００７７】
機能性フィルムを細胞培養容器の底部とする場合には、機能性フィルムが脱落しないよう、図９に示す方式で機能性フィルムを固定することが好ましい。まず、フィルム基材層９１２及び該フィルム基材層の上に積層された機能性有機化合物層９１１を含む機能性フィルム９０１と、周側壁部４０３と、周側壁部４０３の下端面４３０と対向する上端面９３０を備える枠状支持部９４０を準備する（図９Ａ）。ここで、図９Ｂのように重ね合わせたときに平面視において、機能性フィルム９０１の外周は、周側壁部４０３の下端面４３０及び枠状支持部９４０の上端面９３０の内周よりも外側にあり、外周よりも内側にあるように構成されている。本発明において「枠状支持部」とは、周側壁部の下端面と対向する上端面を備えた枠状の形状を有したものである。
【００７８】
機能性フィルム９０１、周側壁部４０３、及び、枠状支持部９４０を、機能性フィルム９０１の、機能性有機化合物層９１１側の面の周縁部に、周側壁部４０３の下端面４３０の内周寄りの部分が接触し、フィルム基材層９１２側の面の周縁部に、枠状支持部９４０の上端面９３０の内周寄りの部分が接触し、周側壁部４０３の下端面４３０の外周寄りの部分と枠状支持部９４０の上端面９３０の外周寄りの部分とが機能性フィルム９０１の外周よりも外側位置において対向するように配置する（図９Ｂ）。
【００７９】
続いて、機能性フィルム９０１の周縁部を、周側壁部４０３の下端面４３０の内周寄りの部分と枠状支持部９４０の上端面９３０の内周寄りの部分とにより把持しながら、周側壁部４０３の下端面４３０の外周寄りの部分と、枠状支持部９４０の上端面９３０の外周寄りの部分とを第１実施形態と同様の手段により接合することにより、細胞培養容器９２０を完成させる（図９Ｃ）。周側壁部４０３の下端面４３０の内周寄りの部分と枠状支持部９４０の上端面９３０の内周寄りの部分とにより、好ましくは全周縁が、把持されていることにより、機能性フィルム９０１の脱落が防止される。
【００８０】
図示していないが、周側壁部４０３の下端面４３０の外周寄りの部分と、枠状支持部９４０の上端面９３０の外周寄りの部分との接合を容易にするために、図６のように、周側壁部４０３の下端面４３０の外周寄りの部分がその内周寄りの部分よりも底部方向に突出している構成、及び／又は、枠状支持部９４０の上端面９３０の外周寄りの部分がその内周寄りの部分よりも周側壁部方向に突出している構成とすることにより、周側壁部４０３の下端面４３０の外周寄りの部分と、枠状支持部９４０の上端面９３０の外周寄りの部分とが当接するようにしてもよい。
【００８１】
更に、周側壁部の下端面と枠状支持部の上端面とによる機能性フィルム周縁部の把持をより強固にするための変形例を図１０に示す。この変形例では、周側壁部１００３の下端面１０３０の内周寄りの部分が、好ましくは全周にわたり、機能性フィルム９０１の機能性有機化合物層９１１側の面と密着する弾性材料１０３１を含んでおり、枠状支持部１００４の上端面１０４０の内周寄りの部分が、好ましくは全周にわたり、フィルム基材層９１２側の面と密着する弾性材料１０４１を含んでいる。弾性材料１０３１、１０４１としては、ポリジメチルシロキサン等のシリコーン系ゴム材料が挙げられる。弾性材料１０３１、１０４１による密着により、機能性フィルム周縁部の把持がより強固になるとともに、機能性フィルム周縁部からの液漏れを防ぐことができる。
【００８２】
＜フラスコ型細胞培養容器＞
図４〜１０では、皿形状の細胞培養容器を製造する例を示すが、これには限定されない。フラスコ型細胞培養容器などの他の細胞培養容器についても同様に製造できることは当業者にとり自明である。例えば、図４〜１０に示す方法で、容器内底面の方向に沿って広がる機能性有機化合物層を備える底部３０１と、通孔１０４が穿設されており且つ首部１０５を備えた、上方に開放された周側壁部３０２とを組み合わせ、続いて、周側壁部３０２の上方の開放端に、天面部３０３を接合して該開放端を閉じることによりフラスコ型容器部３００を完成させることができる。
【００８３】
或いは、図４〜１０に示す方法で、容器内底面の方向に沿って広がる機能性有機化合物層を備える底部３０１と、通孔１０４が穿設されており且つ首部１０５を備えた、上方が天面部３０３により閉塞された周側壁部３０２とを組み合わせることによりフラスコ型容器部３００を完成させることができる。例えば枠状支持部を用いて機能性フィルムを周側壁部の下端面に固定する本発明の第３実施形態では、図１１及び図１２に示すように、通孔及び首部を備えた天面部により閉塞された周側壁部１１０１と、機能性フィルム１１０２と、周側壁部１１０１の下端面に対向する上端面を有する枠状支持部１１０３とを配置し、機能性フィルム１１０２の周縁部を、周側壁部１１０１の下端面１２３０の内周寄りの部分と枠状支持部１１０３の上端面１２４０の内周寄りの部分とにより把持しながら、周側壁部１１０１の下端面１２３０の外周寄りの部分と枠状支持部１１０３の上端面１２４０の外周寄りの部分とを上述の手段により接合して、フラスコ型容器部１２２０を製造することができる。
【符号の説明】
【００８４】
２００，３２０・・・細胞培養容器
２０１，３０１・・・底部
２０２，３０２，４０３，６０３，１００３，１１０１・・・周側壁部
４０１，７０１・・・底板部材
４０２，５０２・・・機能性基体
９０１、１１０２・・・機能性フィルム
９４０，１００４，１１０３・・・枠状支持部
２１０，３３０，４１１，５１１，７１１，８１１，９１１・・・機能性有機化合物層
【図１】
0005857642.tif 000002
【図２】
0005857642.tif 000003
【図３】
0005857642.tif 000004
【図４】
0005857642.tif 000005
【図５】
0005857642.tif 000006
【図６】
0005857642.tif 000007
【図７】
0005857642.tif 000008
【図８】
0005857642.tif 000009
【図９】
0005857642.tif 000010
【図１０】
0005857642.tif 000011
【図１１】
0005857642.tif 000012
【図１２】
0005857642.tif 000013