(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１−１５アミノ酸の鎖長を有するペプチドリンカーで接ぎ合わされたフィブロネクチン細胞結合性ドメインの少なくとも２つの領域を含む化合物であって、該化合物は１００未満のアミノ酸の長さであり、
少なくとも１つの領域は、アミノ酸配列ＧＲＧＤＳＰ（配列番号１）を含み、
別の領域は、Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12Ｘ13ＲＸ15ＰＸ17ＳＲＮＸ21Ｘ22ＴＬＴＸ26（配列番号２）を含み、式中、
Ｘ1はＫを表すかまたは存在せず、
Ｘ2はＫを表すかまたは存在せず、
Ｘ3はＫを表すかまたは存在せず、
Ｘ4はＫを表すかまたは存在せず、
Ｘ5はＫを表すかまたは存在せず、
Ｘ6はＫを表すかまたは存在せず、
Ｘ7はＳ、Ｖ、Ａ、Ｇを表すかまたは存在せず、
Ｘ8はＧ、Ａを表すかまたは存在せず、
Ｘ9はＲまたはＧを表し、
Ｘ10はＰ、Ａ、ＱまたはＧを表し、
Ｘ11はＲまたはＫを表し、
Ｘ12はＥ、Ｑ、Ｗ、ＡまたはＧを表し、
Ｘ13はＤまたはＥを表し、
Ｘ15はＶ、ＬまたはＩを表し、
Ｘ17はＨまたはＰを表し、
Ｘ21はＳ、ＴまたはＧを表し、
Ｘ22はＩまたはＬを表し、
Ｘ26はＮまたはＨを表す
ことを特徴とする化合物。
【請求項２】
Ｘ7は、Ｓを表すことを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｘ8は、Ｇを表すことを特徴とする請求項２記載の化合物。
【請求項４】
Ｘ9は、Ｒを表すことを特徴とする請求項３記載の化合物。
【請求項５】
Ｘ10は、ＧまたはＡを表すことを特徴とする請求項４記載の化合物。
【請求項６】
Ｘ11は、Ｒを表すことを特徴とする請求項５記載の化合物。
【請求項７】
Ｘ12は、Ｅ、ＡまたはＧを表すことを特徴とする請求項６記載の化合物。
【請求項８】
Ｘ13は、Ｄを表すことを特徴とする請求項７記載の化合物。
【請求項９】
Ｘ15は、Ｖを表すことを特徴とする請求項８記載の化合物。
【請求項１０】
Ｘ17は、Ｈを表すことを特徴とする請求項９記載の化合物。
【請求項１１】
Ｘ22は、Ｉを表すことを特徴とする請求項１０記載の化合物。
【請求項１２】
Ｘ26は、Ｎを表すことを特徴とする請求項１１記載の化合物。
【請求項１３】
Ｘ6は、Ｋを表すことを特徴とする請求項１２記載の化合物。
【請求項１４】
前記ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号３）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４）、ＳＧＴＧＳＧＴＧＳ（配列番号５）またはＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ（配列番号６）を含むことを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項１５】
前記ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号３）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４）、ＳＧＴＧＳＧＴＧＳ（配列番号５）またはＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ（配列番号６）を含むことを特徴とする請求項１２または１３記載の化合物。
【請求項１６】
前記配列番号２はＫＳＧＲＸ10ＲＸ12ＤＲＶＰＨＳＲＮＸ21ＩＴＬＴＮであり、式中、Ｘ10はＰ、ＡまたはＧであり、Ｘ12はＥ、ＡまたはＧであり、さらにＸ21はＳ、ＴまたはＧである、および
前記ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号３）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４）、ＳＧＴＧＳＧＴＧＳ（配列番号５）またはＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ（配列番号６）を含むことを特徴とする、請求項１記載の化合物。
【請求項１７】
少なくとも一部分は、請求項１から１６いずれか１項記載の化合物を含む被覆を表面上に含むことを特徴とする表面。
【請求項１８】
フィブロネクチンで被覆された表面の１または複数の機能的特徴を模倣することを特徴とする請求項１７記載の表面。
【請求項１９】
その上に請求項１８記載の表面を含むことを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィブロネクチンの１または複数の機能的特徴を模倣する化合物と、それらで修飾された表面とに関する。より具体的には、本発明は、ヒトのフィブロネクチンの被覆と同等の細胞接着を提供する、異種（xeno）不含、ヒトまたは動物の成分不含、合成で、化学的既知化合物と、それらで修飾された表面とに関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている、２０１０年１２月８日に出願した米国仮出願第６１／４２０，８１８号の利益を主張するものである。
【０００３】
細胞外基質（ＥＣＭ）蛋白質で被覆された表面は、細胞培養および移植機器（implanting devices）の被覆において広く用いられている。特に、フィブロネクチンは、細胞培養において用いられ、細胞接着、細胞増殖、細胞遊走および細胞分化を支援する、一般的に用いられるＥＣＭ蛋白質である。細胞培養のための表面を被覆するために用いられるＥＣＭ蛋白質は、通常、ヒトまたはその他の動物に由来し、しばしば、ほとんど既知ではない。このようなＥＣＭ蛋白質の使用は、例えばヒトの治療的用途において問題となり得る。単離されたヒトＥＣＭ蛋白質を、このような表面に被覆のために用いることができるが、それに用いるいくつかのＥＣＭに伴う費用は非常に高い。さらに、組換えのヒトＥＣＭ蛋白質を用いる場合と同様に、単離されたＥＣＭ蛋白質の異なるバッチ中に存在する混入物の変動により、単離されたＥＣＭ蛋白質の異なるバッチは、細胞培養の変動をもたらすことがある。さらに、細胞培養における変動が、単離されたフィブロネクチンと組換えのフィブロネクチンとの両方について通常利用される自己被覆プロセス自体から生じることがある。よって、フィブロネクチン被覆表面を模倣する、異物不含、ヒトまたは動物の成分不含の、合成化学的に既知表面の必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第５，１７１，３１８号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Freundら，FEBS 320：97-100（1993）
【非特許文献２】Gururajaら，J Pept Res，61：163-176（2003）
【非特許文献３】Prehodaら，Science，290:801-806（2000）
【非特許文献４】Wriggersら，Biopolymers，80（6）：736-746（2005）
【非特許文献５】Huら，J Biotechnol，107（1）：83-90（2004）
【非特許文献６】Mardilovichら，Langmuir，22：3259-3264（2006）
【非特許文献７】Margetaら，Proc Natl Acad Science，106：1632-37（2009）
【非特許文献８】van Dongenら，J Am Chem Soc，129：3494-3495（2007）
【非特許文献９】Katoら，Clinical Cancer Research，8：2455-2462（2002）
【非特許文献１０】Nie，Biotechnol. Prog.，25（1）：20-31（2009）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、異種不含、ヒトまたは動物の成分不含、合成化学的既知化合物と、それらで修飾された表面とを提供する。有利にも、このような化合物で修飾された表面は、ヒトのフィブロネクチンで被覆された表面を模倣する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
さらに、このような異種不含、ヒトまたは動物の成分不含、合成化学的既知被覆は、ほとんど規定されず、治療的用途において免疫応答を誘発することもある動物に由来する生成物に伴う問題を回避する。さらに、本発明は、本発明に従う化合物で修飾された表面を含む細胞培養容器を提供する。
【０００８】
ある態様において、本発明は、柔軟なリンカーで接ぎ合わされたフィブロネクチン細胞結合性ドメインの少なくとも２つの領域を含む化合物であって、少なくとも１つの領域は、アミノ酸配列ＧＲＧＤＳＰ（配列番号１）を含み、もう一つの領域は、Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12Ｘ13ＲＸ15ＰＸ17ＳＲＮＸ21Ｘ22ＴＬＴＸ26（配列番号２）を含み、式中、Ｘ1はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ2はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ3はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ4はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ5はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ6はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ7はＳ、Ｖ、Ａ、Ｇを表すかまたは存在せず、Ｘ8はＧ、Ａを表すかまたは存在せず、Ｘ9はＲまたはＧを表し、Ｘ10はＰ、Ａ、ＱまたはＧを表し、Ｘ11はＲまたはＫを表し、Ｘ12はＥ、Ｑ、Ｗ、ＡまたはＧを表し、Ｘ13はＤまたはＥを表し、Ｘ15はＶ、ＬまたはＩを表し、Ｘ17はＨまたはＰを表し、Ｘ21はＳ、ＴまたはＧを表し、Ｘ22はＩまたはＬを表し、Ｘ26はＮまたはＨを表す化合物を提供する。
【０００９】
ある実施形態において、Ｘ7はＳを表す。ある実施形態において、Ｘ8はＧを表す。ある実施形態において、Ｘ9はＲを表す。ある実施形態において、Ｘ10はＧまたはＡを表す。ある実施形態において、Ｘ11はＲを表す。ある実施形態において、Ｘ12はＥ、ＡまたはＧを表す。ある実施形態において、Ｘ13はＤを表す。ある実施形態において、Ｘ15はＶを表す。ある実施形態において、Ｘ17はＨを表す。ある実施形態において、Ｘ22はＩを表す。ある実施形態において、Ｘ26はＮを表す。
【００１０】
ある実施形態において、Ｘ7はＳを表し、Ｘ8はＧを表す。ある実施形態において、Ｘ7はＳを表し、Ｘ8はＧを表し、Ｘ9はＲを表す。ある実施形態において、Ｘ7はＳを表し、Ｘ8はＧを表し、Ｘ9はＲを表し、Ｘ10はＧまたはＡを表す。ある実施形態において、Ｘ7はＳを表し、Ｘ8はＧを表し、Ｘ9はＲを表し、Ｘ10はＧまたはＡを表し、Ｘ11はＲを表す。ある実施形態において、Ｘ7はＳを表し、Ｘ8はＧを表し、Ｘ9はＲを表し、Ｘ10はＧまたはＡを表し、Ｘ11はＲを表し、Ｘ12はＥ、ＡまたはＧを表す。ある実施形態において、Ｘ7はＳを表し、Ｘ8はＧを表し、Ｘ9はＲを表し、Ｘ10はＧまたはＡを表し、Ｘ11はＲを表し、Ｘ12はＥ、ＡまたはＧを表し、Ｘ13はＤを表す。ある実施形態において、Ｘ7はＳを表し、Ｘ8はＧを表し、Ｘ9はＲを表し、Ｘ10はＧまたはＡを表し、Ｘ11はＲを表し、Ｘ12はＥ、ＡまたはＧを表し、Ｘ13はＤを表し、Ｘ15はＶを表す。ある実施形態において、Ｘ7はＳを表し、Ｘ8はＧを表し、Ｘ9はＲを表し、Ｘ10はＧまたはＡを表し、Ｘ11はＲを表し、Ｘ12はＥ、ＡまたはＧを表し、Ｘ13はＤを表し、Ｘ15はＶを表し、Ｘ17はＨを表す。ある実施形態において、Ｘ7はＳを表し、Ｘ8はＧを表し、Ｘ9はＲを表し、Ｘ10はＧまたはＡを表し、Ｘ11はＲを表し、Ｘ12はＥ、ＡまたはＧを表し、Ｘ13はＤを表し、Ｘ15はＶを表し、Ｘ17はＨを表し、Ｘ22はＩを表す。ある実施形態において、Ｘ7はＳを表し、Ｘ8はＧを表し、Ｘ9はＲを表し、Ｘ10はＧまたはＡを表し、Ｘ11はＲを表し、Ｘ12はＥ、ＡまたはＧを表し、Ｘ13はＤを表し、Ｘ15はＶを表し、Ｘ17はＨを表し、Ｘ22はＩを表し、Ｘ26はＮを表す。
【００１１】
ある実施形態において、柔軟なリンカーは、アミノ酸配列ＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号３）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４）、ＳＧＴＧＳＧＴＧＳ（配列番号５）またはＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ（配列番号６）を含む。
【００１２】
ある実施形態において、Ｘ7はＳを表し、Ｘ8はＧを表し、Ｘ9はＲを表し、Ｘ10はＧまたはＡを表し、Ｘ11はＲを表し、Ｘ12はＥ、ＡまたはＧを表し、Ｘ13はＤを表し、Ｘ15はＶを表し、Ｘ17はＨを表し、Ｘ22はＩを表し、Ｘ26はＮを表し、柔軟なリンカーは、アミノ酸配列ＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号３）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４）、ＳＧＴＧＳＧＴＧＳ（配列番号５）またはＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ（配列番号６）を含む。
【００１３】
別の態様において、少なくとも一部分が、柔軟なリンカーで接ぎ合わされたフィブロネクチン細胞結合性ドメインの少なくとも２つの領域を含む化合物であって、少なくとも１つの領域は、アミノ酸配列ＧＲＧＤＳＰ（配列番号１）を含み、別の領域は、Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12Ｘ13ＲＸ15ＰＸ17ＳＲＮＸ21Ｘ22ＴＬＴＸ26（配列番号２）を含み、式中、Ｘ1はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ2はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ3はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ4はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ5はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ6はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ7はＳ、Ｖ、Ａ、Ｇを表すかまたは存在せず、Ｘ8はＧ、Ａを表すかまたは存在せず、Ｘ9はＲまたはＧを表し、Ｘ10はＰ、Ａ、ＱまたはＧを表し、Ｘ11はＲまたはＫを表し、Ｘ12はＥ、Ｑ、Ｗ、ＡまたはＧを表し、Ｘ13はＤまたはＥを表し、Ｘ15はＶ、ＬまたはＩを表し、Ｘ17はＨまたはＰを表し、Ｘ21はＳ、ＴまたはＧを表し、Ｘ22はＩまたはＬを表し、Ｘ26はＮまたはＨを表す化合物の被覆を表面上に含む表面が提供される。ある実施形態において、表面は、フィブロネクチンで被覆された表面の１または複数の機能的特徴を模倣する。ある実施形態において、少なくとも一部分は、表面上に被覆を含み、Ｘ7はＳを表し、Ｘ8はＧを表し、Ｘ9はＲを表し、Ｘ10はＧまたはＡを表し、Ｘ11はＲを表し、Ｘ12はＥ、ＡまたはＧを表し、Ｘ13はＤを表し、Ｘ15はＶを表し、Ｘ17はＨを表し、Ｘ22はＩを表し、Ｘ26はＮを表し、柔軟なリンカーは、アミノ酸配列ＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号３）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４）、ＳＧＴＧＳＧＴＧＳ（配列番号５）またはＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ（配列番号６）を含む。
【００１４】
さらに別の態様において、表面を含む組成物であって、前記表面の少なくとも一部分は、柔軟なリンカーで接ぎ合わされたフィブロネクチン細胞結合性ドメインの少なくとも２つの領域を含む化合物であって、少なくとも１つの領域は、アミノ酸配列ＧＲＧＤＳＰ（配列番号１）を含み、別の領域は、Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12Ｘ13ＲＸ15ＰＸ17ＳＲＮＸ21Ｘ22ＴＬＴＸ26（配列番号２）を含み、式中、Ｘ1はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ2はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ3はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ4はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ5はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ6はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ7はＳ、Ｖ、Ａ、Ｇを表すかまたは存在せず、Ｘ8はＧ、Ａを表すかまたは存在せず、Ｘ9はＲまたはＧを表し、Ｘ10はＰ、Ａ、ＱまたはＧを表し、Ｘ11はＲまたはＫを表し、Ｘ12はＥ、Ｑ、Ｗ、ＡまたはＧを表し、Ｘ13はＤまたはＥを表し、Ｘ15はＶ、ＬまたはＩを表し、Ｘ17はＨまたはＰを表し、Ｘ21はＳ、ＴまたはＧを表し、Ｘ22はＩまたはＬを表し、Ｘ26はＮまたはＨを表す化合物の被覆を表面上に含み、前記表面は、フィブロネクチンで被覆された表面の１または複数の機能的特徴を模倣する組成物が提供される。
【００１５】
本発明のこれらおよびその他の特徴は、以下の詳細な説明を熟読することにより、よりよく理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａは、いずれの細胞外基質蛋白質の被覆も表面上に有さない組織培養表面の上に存在するＬＮＣａＰヒト前立腺がん細胞の画像である。図１Ｂは、本発明の化合物（すなわちＫＳＧＲＰＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＲＧＤＳＰ（配列番号７））で表面上が修飾された表面に接着したＬＮＣａＰヒト前立腺がん細胞の画像の図である。図１Ｃは、ヒトフィブロネクチンの被覆（すなわちＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔフィブロネクチン）を表面上に有する表面に接着したＬＮＣａＰヒト前立腺がん細胞の画像である。
【図２】ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔフィブロネクチンの表面（図中、「ＨＦＮ」とする）、本発明の化合物（すなわちＫＳＧＲＰＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＲＧＤＳＰ（配列番号７））を表面上に有する表面（図中、「模倣」とする）およびいずれの被覆も表面上に有さない対照の組織培養（図中、「ＴＣ」とする）表面へのＬＮＣａＰ細胞の接着の定量のためのＭＴＳアッセイの後の４９０ｎｍでの吸光度のレベルを示すグラフの図である。
【図３】ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔフィブロネクチンの表面（図中、「ＨＦＮ」とする）、本発明の化合物（すなわちＫＳＧＲＰＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＲＧＤＳＰ（配列番号７））を表面上に有する表面（図中、「模倣」とする）およびいずれの被覆も表面上に有さない対照の組織培養（図中、「ＴＣ」とする）表面へのＡ−１７２（ヒト神経膠芽腫株化細胞の）およびＲＫＯ（ヒト結腸癌株化細胞）細胞の接着のＩｎｃｕＣｙｔｅ（Ｅｓｓｅｎ）による集密度の定量を示すグラフの図である。
【図４Ａ】図中で「ＤＡ２」とするＫＳＧＲＰＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮＳＧＴＧＳＧＴＧＳＧＲＧＤＳＰ（配列番号８）、図中で「ＤＡ４」とするＫＳＧＲＰＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＲＧＤＳＰ（配列番号９）、図中で「ＤＡ１」とするＫＳＧＲＡＲＡＤＲＶＰＨＳＲＮＴＩＴＬＴＮＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＲＧＤＳＰ（配列番号１０）、図中で「ＤＡ３」とするＫＳＧＲＡＲＡＤＲＶＰＨＳＲＮＴＩＴＬＴＮＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＲＧＤＳＰ（配列番号１１）、図中で「ＤＡ５」とするＫＳＧＲＧＲＧＤＲＶＰＨＳＲＮＧＩＴＬＴＮＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＲＧＤＳＰ（配列番号１２）、図中で「模倣ペプチド」とするＫＳＧＲＰＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＲＧＤＳＰ（配列番号７）の被覆を表面上に有する表面、図中で「フィブロネクチン」とするＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔフィブロネクチンの表面、または図中で「ペプチドなし」とするペプチド被覆を有さない表面に接着したＡ−１７２ヒト膠芽腫がん細胞の画像の図である。特に、柔軟なリンカーに下線を付す。
【図４Ｂ】図中で「ＤＡ２」とするＫＳＧＲＰＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮＳＧＴＧＳＧＴＧＳＧＲＧＤＳＰ（配列番号８）、図中で「ＤＡ４」とするＫＳＧＲＰＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＲＧＤＳＰ（配列番号９）、図中で「ＤＡ１」とするＫＳＧＲＡＲＡＤＲＶＰＨＳＲＮＴＩＴＬＴＮＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＲＧＤＳＰ（配列番号１０）、図中で「ＤＡ３」とするＫＳＧＲＡＲＡＤＲＶＰＨＳＲＮＴＩＴＬＴＮＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＲＧＤＳＰ（配列番号１１）、図中で「ＤＡ５」とするＫＳＧＲＧＲＧＤＲＶＰＨＳＲＮＧＩＴＬＴＮＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＲＧＤＳＰ（配列番号１２）、図中で「模倣ペプチド」とするＫＳＧＲＰＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＲＧＤＳＰ（配列番号７）の被覆を表面上に有する表面、図中で「フィブロネクチン」とするＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔフィブロネクチンの表面、または図中で「ペプチドなし」とするペプチド被覆を有さない表面へのＡ−１７２ヒト膠芽腫がん細胞の接着のＭＴＳアッセイによる定量分析に基づくグラフの図である。特に、柔軟なリンカーに下線を付す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書で用いる場合、以下の用語は、以下に記載する定義を有するものとする。
【００１８】
本明細書で用いる場合、「フィブロネクチン細胞結合性ドメイン」との用語は、ヒトまたはその他の動物に由来するフィブロネクチン蛋白質の領域であって、その領域への細胞結合を特徴とする領域のことをいう。フィブロネクチン細胞結合性ドメインの例示的な領域は、それらに限定されないが、ＳＧＲＰＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮ（配列番号１３）およびＧＲＧＤＳＰ（配列番号１）を含む。
【００１９】
本明細書で用いる場合、「フィブロネクチンで被覆された表面の１または複数の機能的特徴」との語句は、それらに限定されないが、フィブロネクチンに依存性の細胞型の細胞接着、細胞成長、細胞遊走および細胞分化を含む。例示的なフィブロネクチンに依存性の細胞型は、それらに限定されないが、ＬＮＣＡＰ細胞、ＭＩＡ−Ｐａｃａ−２細胞、Ａ−１７２細胞およびＲＫＯ細胞を含む。ある実施形態において、フィブロネクチンで被覆された表面の１または複数の機能的特徴は、ＬＮＣａＰ細胞を用いて特徴づけられる。別の実施形態において、フィブロネクチンで被覆された表面の１または複数の機能的特徴は、ＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞を用いて特徴づけられる。さらに別の実施形態において、フィブロネクチンで被覆された表面の１または複数の機能的特徴は、Ａ−１７２細胞を用いて特徴づけられる。まださらに別の実施形態において、フィブロネクチンで被覆された表面の１または複数の機能的特徴は、ＲＫＯ細胞を用いて特徴づけられる。望ましくは、表面は、フィブロネクチンで被覆された表面の細胞接着を模倣する。
【００２０】
本明細書で用いる場合、本発明の化合物で被覆された細胞培養表面とフィブロネクチンで被覆された細胞培養表面との比較に関する「模倣する（ｍｉｍｉｃ）」および「模倣する（ｍｉｍｉｃｓ）」との用語は、評価される１または複数の機能的特徴における相対的類似性のことをいう。望ましくは、相対的類似性の定量は、少なくとも１つの機能的特徴における少なくとも９０％の類似性を示す。
【００２１】
本明細書で用いる場合、「柔軟なリンカー」との用語は、アミノ酸配列の２つの領域を、接ぎ合わされた領域の相対的柔軟性を提供し、そのことによりこれらの領域の動きを可能にする様式で一緒に接続するように機能する化学的化合物のことをいう。例えば、柔軟なリンカーにおけるねじれ角の変化は、柔軟なリンカーと結合した領域が旋回することを可能にする）。本発明において、柔軟なリンカーは、フィブロネクチン細胞結合性ドメインの２つの領域を一緒に接ぎ合わせるために用いられる。リンカーは、一緒に連結されるアミノ酸配列の立体構造に影響を与え、その結果、化合物全体の結果として得られる活性に影響を与えることがあるが、リンカーは、リンカー内およびリンカーの生物活性を有するとはみなされない。むしろ、リンカーは、接ぎ合わされたアミノ酸配列の機能を支持するように設計される。リンカーは、組換え技術または合成技術（例えば固相合成）のいずれかにより生成され、天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸および／またはペプチド模倣物を含んでよい。典型的に、リンカーは、１〜１５アミノ酸の鎖長である。あるいくつかの実施形態において、リンカーは、５〜１０アミノ酸の鎖長である。リンカーは、当該技術において公知であり、それらに限定されないが、非特許文献１、非特許文献２（リンカーＧＳＧＳ（配列番号１４）およびＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１５））、非特許文献３、非特許文献４および非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７（リンカーＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ）、非特許文献８（２〜９のＧＧＳＧＧＳ（配列番号１６）リピートを含有するリンカー）を含む多数の出版物に記載されている。
【００２２】
本発明において用いるために適切な柔軟なリンカーは、それらに限定されないが、ＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号３）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４）、ＳＧＴＧＳＧＴＧＳ（配列番号５）およびＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ（配列番号６）を含む。
【００２３】
フィブロネクチンは、高分子量（約４４０ｋＤａ）のＥＣＭ糖蛋白質であり、これは、インテグリンとよばれる膜貫通受容体蛋白質、ならびにＥＣＭの成分であるコラーゲン、フィブリンおよびヘパラン硫酸プロテオグリカン（例えばシンデカン類）と結合する。フィブロネクチンは、細胞接着、細胞成長、細胞遊走および細胞分化を支持し、創傷治癒、胚発生、およびある型の発癌において重要な役割を演じることが示されている。
【００２４】
構造として、フィブロネクチンは、Ｃ末端ジスルフィド結合の対で連結された２つのほぼ同一のポリペプチド鎖からなる二量体として存在する。それぞれのフィブロネクチン単量体は、２３０〜２５０ｋＤａの分子量を有し、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型の３つの型のモジュールを含有する。モジュールは、フィブロネクチン単量体の長さ方向に沿っていくつかの機能的な蛋白質結合性ドメインに配置される。４つのフィブロネクチン結合性ドメインが存在し、フィブロネクチンが他のフィブロネクチン分子と会合することを可能にする。これらのフィブロネクチン結合性ドメインの１つであるＩ1~5は、「集合ドメイン」とよばれ、これは、フィブロネクチンマトリクスの集合の開始のために必要である。モジュールＩＩＩ9~10は、フィブロネクチンの「細胞結合性ドメイン」に相当する。ＲＧＤ配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）は、ＩＩＩ10にあり、細胞表面上のα５β１インテグリンおよびαＶβ３インテグリンを介する細胞接着の部位である。「相乗作用部位」（synergy site）は、ＩＩＩ9にあり、α５β１インテグリンとのフィブロネクチンの会合の調節において役割を有する。フィブロネクチンは、フィブリン結合（Ｉ1~5、Ｉ10~12）、コラーゲン結合（Ｉ6~9）、フィビュリン−１結合（ＩＩＩ13~14）、ヘパリン結合およびシンデカン結合（ＩＩＩ12~14）のためのドメインも含有する。
【００２５】
主題の発明がいずれの理論によっても制限されることを意味しないが、本発明の化合物は、柔軟なリンカーで接ぎ合わされたフィブロネクチン細胞結合性ドメインの少なくとも２つの領域を含む。領域は、フィブロネクチンの１または複数の機能的特徴を模倣する様式で互いに相互作用すると考えられる。特に、このような化合物で被覆された表面は、フィブロネクチンで被覆された表面の細胞接着を模倣する。
【００２６】
本発明の化合物は、従来の組換え技術または合成技術（例えば固相合成）を用いて生成できる。同様に、このような化合物は、従来の技術を用いて、所定の用途のために適切な程度まで精製できる。有利には、本発明の化合物の合成による合成は、少なくとも７０％以上のレベルの純度を提供できる。ある実施形態において、化合物は、少なくとも９０％のレベルの純度を有する。望ましくは、本発明の化合物は、９０％以上のレベルの純度を有する。治療薬のようなあるいくつかの用途において、化合物は合成されることが特に好ましい。
【００２７】
本発明の化合物は、柔軟なリンカーで接ぎ合わされたフィブロネクチン細胞結合性ドメインの少なくとも２つの領域を含む。望ましくは、本発明の化合物は、１００未満のアミノ酸の長さである。あるいくつかの実施形態において、本発明の化合物は、約２５アミノ酸と約５０アミノ酸との間の鎖長である。本発明の化合物は、天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸および／またはペプチド模倣物を含んでよい。
【００２８】
当業者は、フィブロネクチン細胞結合性ドメインの領域および／またはリンカーについての本明細書に記載されるアミノ酸配列のうちの１または複数のアミノ酸を、細胞培養用の表面の上を被覆する場合に、結果として得られる化合物の、フィブロネクチンで被覆された表面の１または複数の機能的特性を模倣する能力を損なうことなく置換できると理解される。
【００２９】
特に、本発明の化合物は、天然に存在するフィブロネクチン細胞結合性ドメインと比較して、１または複数のアミノ酸の保守的置換（同類置換）を有してよい。保守的置換（同類置換）は、それぞれのアミノ酸の側鎖が、類似の化学構造および極性の、遺伝子によりコードされるかもしくは遺伝子によりコードされないアミノ酸に由来する側鎖で置き換えられることと定義される。類似の側鎖を有するこの種類のアミノ酸のファミリーが、当該技術において知られている。これらは、例えば、塩基性側鎖（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
【００３０】
本発明は、柔軟なリンカーで接ぎ合わされたフィブロネクチン細胞結合性ドメインの少なくとも２つの領域を含む化合物であって、少なくとも１つの領域は、アミノ酸配列ＧＲＧＤＳＰ（配列番号１）を含み、別の領域は、Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12Ｘ13ＲＸ15ＰＸ17ＳＲＮＸ21Ｘ22ＴＬＴＸ26（配列番号２）を含み、式中、Ｘ1はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ2はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ3はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ4はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ5はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ6はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ7はＳ、Ｖ、Ａ、Ｇを表すかまたは存在せず、Ｘ8はＧ、Ａを表すかまたは存在せず、Ｘ9はＲまたはＧを表し、Ｘ10はＰ、Ａ、ＱまたはＧを表し、Ｘ11はＲまたはＫを表し、Ｘ12はＥ、Ｑ、Ｗ、ＡまたはＧを表し、Ｘ13はＤまたはＥを表し、Ｘ15はＶ、ＬまたはＩを表し、Ｘ17はＨまたはＰを表し、Ｘ21はＳ、ＴまたはＧを表し、Ｘ22はＩまたはＬを表し、Ｘ26はＮまたはＨを表す化合物を提供する。
【００３１】
あるいくつかの実施形態において、Ｘ1は存在せず、Ｘ2は存在せず、Ｘ3は存在せず、Ｘ4は存在せず、Ｘ5は存在せず、Ｘ6はＫを表す。さらに別の実施形態において、Ｘ1は存在せず、Ｘ2は存在せず、Ｘ3は存在せず、Ｘ4は存在せず、Ｘ5は存在せず、Ｘ6は存在しない。
【００３２】
ある実施形態において、Ｘ1はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ2はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ3はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ4はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ5はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ6はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ7はＳを表し、Ｘ8はＧを表し、Ｘ9はＲを表し、Ｘ10はＰを表し、Ｘ11はＲを表し、Ｘ12はＥを表し、Ｘ13はＤを表し、Ｘ15はＶを表し、Ｘ17はＨを表し、Ｘ21はＳを表し、Ｘ22はＩを表し、Ｘ26はＮを表す。よって、Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6ＳＧＲＰＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮ（配列番号１７）。ある実施形態において、Ｘ1は存在せず、Ｘ2は存在せず、Ｘ3は存在せず、Ｘ4は存在せず、Ｘ5は存在せず、Ｘ6はＫを表し、Ｘ7はＳを表し、Ｘ8はＧを表し、Ｘ9はＲを表し、Ｘ10はＰを表し、Ｘ11はＲを表し、Ｘ12はＥを表し、Ｘ13はＤを表し、Ｘ15はＶを表し、Ｘ17はＨを表し、Ｘ21はＳを表し、Ｘ22はＩを表し、Ｘ26はＮを表す。よって、ＫＳＧＲＰＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮ（配列番号１８）。
【００３３】
ある実施形態において、Ｘ1はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ2はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ3はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ4はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ5はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ6はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ7はＳを表し、Ｘ8はＧを表し、Ｘ9はＲを表し、Ｘ10はＡを表し、Ｘ11はＲを表し、Ｘ12はＥを表し、Ｘ13はＤを表し、Ｘ15はＶを表し、Ｘ17はＨを表し、Ｘ21はＳを表し、Ｘ22はＩを表し、Ｘ26はＮを表す。よって、Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6ＳＧＲＡＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮ（配列番号１９）。ある実施形態において、Ｘ1は存在せず、Ｘ2は存在せず、Ｘ3は存在せず、Ｘ4は存在せず、Ｘ5は存在せず、Ｘ6はＫを表し、Ｘ7はＳを表し、Ｘ8はＧを表し、Ｘ9はＲを表し、Ｘ10はＡを表し、Ｘ11はＲを表し、Ｘ12はＥを表し、Ｘ13はＤを表し、Ｘ15はＶを表し、Ｘ17はＨを表し、Ｘ21はＳを表し、Ｘ22はＩを表し、Ｘ26はＮを表す。よって、ＫＳＧＲＡＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮ（配列番号２０）。
【００３４】
ある実施形態において、Ｘ1はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ2はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ3はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ4はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ5はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ6はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ7はＳを表し、Ｘ8はＧを表し、Ｘ9はＲを表し、Ｘ10はＡを表し、Ｘ11はＲを表し、Ｘ12はＡを表し、Ｘ13はＤを表し、Ｘ15はＶを表し、Ｘ17はＨを表し、Ｘ21はＳを表し、Ｘ22はＩを表し、Ｘ26はＮを表す。よって、Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6ＳＧＲＡＲＡＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮ（配列番号２１）。ある実施形態において、Ｘ1は存在せず、Ｘ2は存在せず、Ｘ3は存在せず、Ｘ4は存在せず、Ｘ5は存在せず、Ｘ6はＫを表し、Ｘ7はＳを表し、Ｘ8はＧを表し、Ｘ9はＲを表し、Ｘ10はＡを表し、Ｘ11はＲを表し、Ｘ12はＡを表し、Ｘ13はＤを表し、Ｘ15はＶを表し、Ｘ17はＨを表し、Ｘ21はＳを表し、Ｘ22はＩを表し、Ｘ26はＮを表す。よって、ＫＳＧＲＡＲＡＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮ（配列番号２２）。
【００３５】
ある実施形態において、Ｘ1はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ2はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ3はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ4はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ5はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ6はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ7はＳを表し、Ｘ8はＧを表し、Ｘ9はＲを表し、Ｘ10はＡを表し、Ｘ11はＲを表し、Ｘ12はＡを表し、Ｘ13はＤを表し、Ｘ15はＶを表し、Ｘ17はＨを表し、Ｘ21はＴを表し、Ｘ22はＩを表し、Ｘ26はＮを表す。よって、Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6ＳＧＲＡＲＡＤＲＶＰＨＳＲＮＴＩＴＬＴＮ（配列番号２３）。ある実施形態において、Ｘ1は存在せず、Ｘ2は存在せず、Ｘ3は存在せず、Ｘ4は存在せず、Ｘ5は存在せず、Ｘ6はＫを表し、Ｘ7はＳを表し、Ｘ8はＧを表し、Ｘ9はＲを表し、Ｘ10はＡを表し、Ｘ11はＲを表し、Ｘ12はＡを表し、Ｘ13はＤを表し、Ｘ15はＶを表し、Ｘ17はＨを表し、Ｘ21はＴを表し、Ｘ22はＩを表し、Ｘ26はＮを表す。よって、ＫＳＧＲＡＲＡＤＲＶＰＨＳＲＮＴＩＴＬＴＮ（配列番号２４）。
【００３６】
ある実施形態において、Ｘ1はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ2はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ3はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ4はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ5はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ6はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ7はＳを表し、Ｘ8はＧを表し、Ｘ9はＲを表し、Ｘ10はＧを表し、Ｘ11はＲを表し、Ｘ12はＧを表し、Ｘ13はＤを表し、Ｘ15はＶを表し、Ｘ17はＨを表し、Ｘ21はＧを表し、Ｘ22はＩを表し、Ｘ26はＮを表す。よって、Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6ＳＧＲＧＲＧＤＲＶＰＨＳＲＮＧＩＴＬＴＮ（配列番号２５）。ある実施形態において、Ｘ1は存在せず、Ｘ2は存在せず、Ｘ3は存在せず、Ｘ4は存在せず、Ｘ5は存在せず、Ｘ6はＫを表し、Ｘ7はＳを表し、Ｘ8はＧを表し、Ｘ9はＲを表し、Ｘ10はＧを表し、Ｘ11はＲを表し、Ｘ12はＧを表し、Ｘ13はＤを表し、Ｘ15はＶを表し、Ｘ17はＨを表し、Ｘ21はＧを表し、Ｘ22はＩを表し、Ｘ26はＮを表す。よって、ＫＳＧＲＧＲＧＤＲＶＰＨＳＲＮＧＩＴＬＴＮ（配列番号２６）。
【００３７】
ある実施形態において、Ｘ1はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ2はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ3はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ4はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ5はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ6はＫを表すかまたは存在せず、Ｘ7はＳを表し、Ｘ8はＧを表し、Ｘ9はＲを表し、Ｘ10はＡを表し、Ｘ11はＲを表し、Ｘ12はＡを表し、Ｘ13はＤを表し、Ｘ15はＶを表し、Ｘ17はＨを表し、Ｘ21はＧを表し、Ｘ22はＩを表し、Ｘ26はＮを表す。よって、Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6ＳＧＲＡＲＡＤＲＶＰＨＳＲＮＧＩＴＬＴＮ（配列番号２７）。ある実施形態において、Ｘ1は存在せず、Ｘ2は存在せず、Ｘ3は存在せず、Ｘ4は存在せず、Ｘ5は存在せず、Ｘ6はＫを表し、Ｘ7はＳを表し、Ｘ8はＧを表し、Ｘ9はＲを表し、Ｘ10はＡを表し、Ｘ11はＲを表し、Ｘ12はＡを表し、Ｘ13はＤを表し、Ｘ15はＶを表し、Ｘ17はＨを表し、Ｘ21はＧを表し、Ｘ22はＩを表し、Ｘ26はＮを表す。よって、ＫＳＧＲＡＲＡＤＲＶＰＨＳＲＮＧＩＴＬＴＮ（配列番号２８）。
【００３８】
本発明の化合物は、フィブロネクチンの１もしくは複数の機能的特性が望まれるか、またはフィブロネクチンと関連する１もしくは複数のシグナル伝達特性の改変が望まれる用途のために有用である。例えば、本発明の化合物は、細胞シグナル伝達を阻害するための治療薬として利用してよい。フィブロネクチンに由来するペプチドの転移抑制性の効果は、例えば、非特許文献９に記載される。
【００３９】
同様に、本発明の化合物を用いて修飾された表面は、フィブロネクチンの１もしくは複数の機能的特性が望まれるか、またはフィブロネクチンと関連する１もしくは複数のシグナル伝達特性の改変が望まれる用途のために有用である。このような用途は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞培養およびｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞増殖の助長を含む。例えば、フィブロネクチンで被覆された人工装具デバイスは、新しい上皮組織の成長および遊走を助長することが望まれる。フィブロネクチンで被覆された人工装具デバイスの調製は、当業者に公知である（例えば、特許文献１を参照されたい）。
【００４０】
本発明の化合物で修飾された表面は、受動（すなわち非共有結合）被覆、化合物の共有結合による固定化または化合物の沈着（deposition）の任意のその他の方法のいずれかを利用してよい。
【００４１】
細胞培養で用いるための本発明の化合物で修飾された表面は、細胞培養容器、細胞培養デバイスおよびマイクロキャリアを含む。本発明で用いるために適切な細胞培養容器は、当業者に公知である。適切な容器の例は、それらに限定されないが、ディッシュ、フラスコ、マルチウェルプレートおよび顕微鏡スライド、細胞培養インサートを含む。細胞培養のために適切なマイクロキャリアも、当業者に公知である。例えば、非特許文献１０を参照されたい。
【００４２】
有利には、本発明の表面を用いて培養された細胞は、治療的用途（例えば創傷治癒において）のために適切であり、そうでなければ免疫原性応答を誘発し、移植された細胞の拒絶さえ導くことがある、異なる供給源からの単離されたフィブロネクチンの使用に固有の問題を回避する。
【実施例】
【００４３】
アミノ酸配列ＫＳＧＲＰＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＲＧＤＳＰ（配列番号７）を有する本発明の化合物を、商業的に利用可能なカスタムペプチド合成サービスを用いて合成した。この化合物を、次いで、表面の上に付加して表面を修飾した。
【００４４】
本発明の化合物により修飾された表面が、フィブロネクチンで被覆された表面の１または複数の機能的特徴を模倣する能力を探索するために、細胞を播種し、このような両方の表面で同じ培養条件下で監視した。簡単に述べると、ＡＴＣＣからのＬＮＣａＰ細胞、ＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞、Ａ−１７２細胞またはＲＫＯ細胞を、供給元の使用説明に従って培養した。ＬＮＣａＰは、１０％ウシ胎児血清を補ったＲＰＭＩ−１６４０培地（ＡＴＣＣカタログ番号３０−２００１）で培養した。ＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞およびＡ−１７２細胞は、１０％ウシ胎児血清を補ったＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ＃１１８８５−０８４）で成長させた。ＲＫＯ細胞は、１０％ウシ胎児血清を補ったＥＭＥＭ（ＡＴＣＣカタログ＃３０−２００３）で培養した。細胞は、加湿インキュベータ中で５％ＣＯ2を用いて３７℃で培養した。播種のために培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、３ｍｌの０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡをＴ−７５フラスコ中の細胞に加えた。フラスコを顕微鏡下で調べ、細胞が表面から一旦脱着したら、１０ｍｌの培養培地を加えてトリプシンを中和した。細胞を１５ｍｌのＢＤ  Ｆａｌｃｏｎチューブに移し、２００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを、２００マイクログラム／ｍｌのＢＳＡを有するＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ＃１１８８５−０８４）で１回洗浄した。細胞を、２００マイクログラム／ｍｌのＢＳＡを有するＤＭＥＭに再懸濁し、５０，０００細胞／ｃｍ2にて２４ウェルプレートのウェルあたり１．０ｍｌの培地に播種した。培養表面は、化合物ＫＳＧＲＰＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＲＧＤＳＰ（配列番号７）、または陽性対照として貢献するＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔフィブロネクチンにより修飾されたいずれかの表面であった。さらに、ＢＤの組織培養用の処理済み表面は、陽性対照としての役割を果たした。細胞を、加湿インキュベータ中で５％ＣＯ2を用いて３７℃で２４時間インキュベートした。
【００４５】
播種の後の２４時間のインキュベーションの後に、ＬＮＣａＰ細胞を顕微鏡で視覚化し、画像を取得した。特に、細胞接着および伸展は、本発明の化合物ＫＳＧＲＰＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＲＧＤＳＰ（配列番号７）により修飾した表面（図１Ｂを参照されたい）と、ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔフィブロネクチン（図１Ｃを参照されたい）により修飾した表面との間で同等であった。これとは対照的に、細胞接着および伸展は、陰性対照として役割を果たす表面上に被覆を有さない組織培養用の処理済み表面において著しく低減した（図１Ａを参照されたい）。
【００４６】
上記の視覚的な分析に加えて、ＭＴＳ分析を行って、細胞接着の程度の定量を行った。簡単に述べると、プレートを逆さまにすることにより培地を除去し、ＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ＃Ｇ３５８２）を含有する３００μｌの完全培地を、２４ウェルプレートの各ウェルに加えた。細胞を加湿インキュベータ中で５％ＣＯ2にて３７℃でインキュベート１時間した。インキュベーションの後に、０．１ｍｌの培地をＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ（商標）９６ウェルプレートに移し、吸光度を４９０ｎｍにて測定した。
【００４７】
図２に示すように、化合物ＫＳＧＲＰＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＲＧＤＳＰ（配列番号７）で処理した表面およびＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔフィブロネクチンで処理した表面は、同等のＬＮＣａＰ細胞の接着を支持したが、未処理の組織培養表面へのＬＮＣａＰの接着は、著しく低減した。
【００４８】
同様に、化合物ＫＳＧＲＰＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＲＧＤＳＰ（配列番号７）で処理した表面およびＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔフィブロネクチンで処理した表面上へのＡ−１７２細胞およびＲＫＯ細胞のＩｎｃｕＣｙｔｅ（Ｅｓｓｅｎ）による集密度の定量は、同等であった（図３を参照されたい）。これとは対照的に、未処理の組織培養表面への集密度の定量は、著しく低減した。
【００４９】
さらに、ＫＳＧＲＰＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＲＧＤＳＰ（配列番号７）、ＫＳＧＲＰＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮＳＧＴＧＳＧＴＧＳＧＲＧＤＳＰ（配列番号８）、ＫＳＧＲＰＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＲＧＤＳＰ（配列番号９）、ＫＳＧＲＡＲＡＤＲＶＰＨＳＲＮＴＩＴＬＴＮＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＲＧＤＳＰ（配列番号１０）、ＫＳＧＲＡＲＡＤＲＶＰＨＳＲＮＴＩＴＬＴＮＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＲＧＤＳＰ（配列番号１１）、またはＫＳＧＲＧＲＧＤＲＶＰＨＳＲＮＧＩＴＬＴＮＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＲＧＤＳＰ（配列番号１２）の被覆を表面上に有する表面は、ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔフィブロネクチン表面と同様に細胞接着および伸展を支持した（図４Ａおよび図４Ｂを参照されたい）。
【００５０】
当業者は、上記の実施形態に、本発明の広い発明の概念を逸脱することなく変更を行うことができることを認識しよう。よって、この発明は、開示される特定の実施形態に限定されないが、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神および範囲内の改変をカバーすることを意図することが理解される。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【配列表】
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