(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱発生性脂肪細胞の増加を必要とする患者において熱発生性脂肪細胞を増加させるための組成物であって、有効量の、
ａ．配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド；および
ｂ．配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドを含む、組成物。
【請求項２】
前記ポリペプチドが二量体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記患者が代謝障害を有する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記患者が筋肉障害および代謝障害を有する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物を投与することにより、処置される患者の脂肪細胞におけるＵＣＰ−１の発現が促進される、請求項１から４までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＵＣＰ−１の発現が、白色脂肪組織において増加する、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、アクチビンに結合する、請求項１から６までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、アクチビンＡに結合する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、アクチビンＢに結合する、請求項７または８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、ＧＤＦ１１に結合する、請求項１から９までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、ミオスタチンに結合する、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、ＧＤＦ３に結合する、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、アクチビン、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３およびミオスタチンに結合する、請求項１から６までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、アクチビンＡに結合する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、アクチビンＢに結合する、請求項１３または１４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本出願は、２００９年６月８日に出願された米国仮出願第６１／２６８，１２８号および２００９年９月１０日に出願された米国仮出願第６１／２７６，４２２号、および２００９年１１月３日に出願された米国仮出願第６１／２８０，５４５号に対する優先権を主張する。上記出願の教示の全ては、本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の脂肪細胞（ｆａｔ  ｃｅｌｌ）は、伝統的に、エネルギーを蓄える白色脂肪細胞またはエネルギーを消費する褐色脂肪細胞のいずれかに分類される。褐色脂肪細胞は、ミトコンドリアのプロトン勾配からのＡＴＰ産生を脱共役することによって生化学的エネルギーを熱に変換する脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１）を発現する（非特許文献１）。そのような熱発生は、低温の環境条件において体温を維持する、または過剰なカロリー摂取に直面したときにエネルギー平衡を促進する働きをする。褐色脂肪の代謝的な重要性を強調すると、マウスにおいて褐色脂肪を遺伝的除去すると、インスリン抵抗性、高血糖、高脂血症、および高コレステロール血症を伴う重篤な肥満が生じる（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。ＵＣＰ−１の、重要な脱共役タンパク質としての役割を考慮すると、ＵＣＰ−１を発現する脂肪細胞は熱発生活性を有する。
【０００３】
ヒトにおいて、褐色脂肪組織は、乳児において重要な熱発生の役割を果たしているが、生後発達の間に縮小し、成人においては、まばらであり、臨床的に重要でないものとして歴史的に簡単に片づけられてきた。しかし、最近の発見により、この考えが覆され、成人期の間の褐色脂肪組織の役割（複数可）にかなりの関心が生まれた。特に、腫瘍転移をモニターするための陽電子放出断層撮影法とコンピュータ断層撮影法（ＰＥＴ−ＣＴ）の組合せの使用により、かなりの割合の成人における、高度に活性な推定上の褐色脂肪の貯蔵場所が思いがけなく検出された（非特許文献５）。その後の試験により、健康な成人では、これらの貯蔵所が実際にＵＣＰ１を発現している機能的な褐色脂肪であることが確認され（非特許文献６）、試験された若年の男性の９０％超において、褐色脂肪組織活性が低温曝露の間に観察されたが、熱中性条件では確認されなかった（非特許文献７）。さらに、種々の診断上の理由で実施されたほぼ２千のＰＥＴ−ＣＴスキャンの遡及的分析により、活性な褐色脂肪の量が、総合的な脂肪症の測定値として広く用いられる肥満度指数と逆相関することが示され、これにより、成人のヒトの代謝における褐色脂肪の重要な有益な役割の可能性が生じている（非特許文献８）。白色脂肪組織とともに散在する熱発生性脂肪細胞（例えば、褐色脂肪細胞または他のＵＣＰ−１を発現している脂肪細胞）の役割は明白ではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃａｎｎｏｎら、２００４年、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ８４巻：２７７〜３５９頁
【非特許文献２】Ｌｏｗｅｌｌら、１９９３年、Ｎａｔｕｒｅ  ３６６巻：７４０〜７４２頁
【非特許文献３】Ｈａｍａｎｎら、１９９５年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４４巻：１２６６〜１２７３頁
【非特許文献４】Ｈａｍａｎｎら、１９９６年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３７巻：２１〜２９頁
【非特許文献５】Ｎｅｄｅｒｇａａｒｄら、２００７年、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２９３巻：Ｅ４４４〜Ｅ４５２頁
【非特許文献６】Ｖｉｒｔａｎｅｎら、２００９年、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６０巻：１５１８〜１５２５頁
【非特許文献７】ｖａｎ  Ｍａｒｋｅｎ  Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｌｔら、２００９年、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６０巻：１５００〜１５０８頁
【非特許文献８】Ｃｙｐｅｓｓら、２００９年、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６０巻：１５０９〜１５１７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
熱発生性脂肪細胞の重要な代謝活性を考慮すると、ｉｎ  ｖｉｖｏで熱発生性脂肪細胞を増加させる（例えば、形成および／または活性の増加によって）作用剤が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達経路のアンタゴニストを使用することによって、患者における熱発生性脂肪細胞を増加させるための方法を提供する。そのようなアンタゴニストは、例えば、可溶性のＡｃｔＲＩＩＢタンパク質（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質）、ＡｃｔＲＩＩＢに結合する、またはＡｃｔＲＩＩＢの発現を阻害するアンタゴニスト、およびＡｃｔＲＩＩＢを通じてシグナルを送り、熱発生性脂肪細胞の制御に関与するリガンドに結合する、またはその発現を阻害するアンタゴニストであってよい。そのようなリガンドとしては、ミオスタチン（すなわち、ＧＤＦ８）、ＧＤＦ３、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、Ｂ、ＣまたはＥ）、ＧＤＦ１１、およびＮｏｄａｌが挙げられる。
【０００７】
ある特定の態様では、本開示は、それを必要とする患者に有効量のＡｃｔＲＩＩＢ関連ポリペプチドを投与することによって、熱発生性脂肪細胞を増加させるための方法を提供する。ＡｃｔＲＩＩＢ関連ポリペプチドは、ＧＤＦ３、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、アクチビンまたはＮｏｄａｌなどのＡｃｔＲＩＩＢリガンドに結合するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインまたはその部分）であってよい。場合によって、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１０マイクロモル未満のＫｄ、または１マイクロモル、１００ナノモル、１０ナノモルまたは１ナノモル未満のＫｄでＡｃｔＲＩＩＢリガンドに結合する。種々の適切なＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、その全てが参照により本明細書に組み込まれる、以下のＰＣＴ特許出願公開に記載されている：ＷＯ  ００／４３７８１、ＷＯ  ０４／０３９９４８、ＷＯ  ０６／０１２６２７、ＷＯ  ０７／０５３７７５、ＷＯ  ０８／０９７５４１およびＷＯ  ０８／１０９１６７。場合によって、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢリガンドによって誘発される細胞内のシグナル伝達事象などのＡｃｔＲＩＩＢシグナリングを阻害する。そのような調製物において使用するための可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１、２、５、６、１２、１４および１７から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号１、２、５、６、１２、１４および１７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどの、本明細書で開示されている可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのいずれでもあってよい。可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１、２、５、６、１２、１４および１７から選択される配列、または配列番号１の配列の少なくとも１０アミノ酸、２０アミノ酸または３０アミノ酸を含み、Ｃ末端の１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸または１０〜１５アミノ酸を欠き、Ｎ末端の１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸または５アミノ酸を欠くものなどの、天然のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの機能的な断片を含んでよい。場合によって、ポリペプチドは、配列番号１と比較して、Ｎ末端において２〜５アミノ酸、およびＣ末端においてわずか３アミノ酸の短縮を含む。別のポリペプチドは、配列番号１２として提示されるポリペプチドである。可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、アミノ酸配列に（例えば、リガンド結合ドメインに）、天然に存在するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと比較して１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の変化を含んでよい。アミノ酸配列における変化により、天然に存在するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと比較して、例えば、哺乳動物、昆虫または他の真核細胞において産生される際にポリペプチドのグリコシル化が変化する、またはポリペプチドのタンパク質分解性の切断が変化する可能性がある。可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１つのドメインとして、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢまたはその改変体のリガンド結合ドメイン）、および、例えば、改良された薬物動態、容易な精製、特定の組織に対するターゲティングなどの望ましい特性をもたらす１つまたは複数の追加的なドメインを有する融合タンパク質であってよい。例えば、融合タンパク質のドメインにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期、取り込み／投与、組織への局在化または分布、タンパク質複合体の形成、融合タンパク質の多量体化、および／または精製の１つまたは複数が増強され得る。可溶性のＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質は、Ｆｃドメイン（野生型または変異体）などの免疫グロブリン定常ドメインまたは血清アルブミンを含んでよい。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合物は、Ｆｃドメインと細胞外のＡｃｔＲＩＩＢドメインとの間に位置する比較的構造化されていないリンカーを含む。この構造化されていないリンカーは、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインのＣ末端（「尾部」）のおよそ１５アミノ酸の構造化されていない領域に対応してよい、または、二次的構造が比較的自由な５〜１５、２０、３０、５０またはそれ以上のアミノ酸の人工的な配列であってよい。リンカーは、グリシン残基およびプロリン残基に富んでよく、例えば、トレオニン／セリンおよびグリシンの繰り返し配列、例えば、ＴＧ４の繰り返し（配列番号１８）またはＳＧ４の繰り返し（配列番号１９）を含有する。融合タンパク質は、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列およびＧＳＴ融合物などの精製サブシーケンスを含んでよい。場合によって、可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、グリコシル化されたアミノ酸、ペグ化されたアミノ酸、ファルネシル化されたアミノ酸、アセチル化されたアミノ酸、ビオチン化されたアミノ酸、脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸、および有機誘導体化剤にコンジュゲートされたアミノ酸から選択される１つまたは複数の修飾されたアミノ酸残基を含む。一般に、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、患者における好ましくない免疫応答の可能性を減らすために、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の天然のグリコシル化を適切に媒介する哺乳動物の細胞系において発現されることが好ましい。ヒト細胞系およびＣＨＯ細胞系が首尾よく使用されており、他の一般的な哺乳動物の発現ベクターが有用であると予想される。
【０００８】
ある特定の態様では、本明細書に開示されている化合物は、医薬調製物として製剤化することができる。医薬調製物は、ＡｃｔＲＩＩＢに関連する障害を処置するために使用される化合物などの１種または複数種の追加的な化合物も含んでよい。医薬調製物は、実質的に発熱物質を含まないことが好ましい。
【０００９】
ある特定の態様では、本開示は、可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードし、完全なＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードしない核酸を提供する。単離されたポリヌクレオチドは、例えば上記の、可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのコード配列を含んでよい。例えば、単離された核酸は、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン（例えば、リガンド結合ドメイン）をコードする配列、および、ＡｃｔＲＩＩＢの膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインの一部または全部をコードするが、膜貫通ドメインもしくは細胞質ドメインの内部に位置する、または細胞外ドメインと膜貫通ドメインもしくは細胞質ドメインとの間に位置する終止コドンをコードする配列を含んでよい。例えば、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号４などの全長のＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチド配列または部分的に短縮された型を含んでよく、前記単離されたポリヌクレオチドは、３’末端の少なくとも６００ヌクレオチド前に転写終結コドンをさらに含む、またはそうでなければ、ポリヌクレオチドの翻訳により、場合によって全長のＡｃｔＲＩＩＢの短縮された部分と融合した細胞外ドメインが生じるように位置付けられている。本明細書に開示されている核酸は、発現させるためのプロモーターに作動可能に連結していてよく、本開示は、そのような組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を提供する。細胞は、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物の細胞であることが好ましい。
【００１０】
ある特定の態様では、本開示は、可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを作製するための方法を提供する。そのような方法は、本明細書に開示されている核酸（例えば、配列番号３）のいずれかを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの適切な細胞において発現させることを含んでよい。そのような方法は、ａ）可溶性のＡｃｔＲＩＩＢ発現構築物で形質転換される細胞を、可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを発現させるために適した条件下で培養すること、およびｂ）そのように発現された可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを回収することを含んでよい。可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、タンパク質を得るための周知の技法のいずれかを使用して、粗製物、部分的に精製された画分または高度に精製された画分として細胞培養物から回収することができる。
【００１１】
ある特定の態様では、本明細書に記載の化合物を使用して熱発生性脂肪細胞を増加させることは、代謝活性を管理することが有益である種々の疾患を管理することにおいて有用であり得る。例としては、肥満の管理、体脂肪含有量を減少させることまたは体脂肪含有量の増加速度を低下させること、および、肥満、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、ＩＩ型糖尿病、循環器疾患、癌、高血圧症、脳卒中、呼吸障害、脂質異常症、リポジストロフィー、コルチコステロイド投与の影響および胆嚢疾患などの障害を処置することが挙げられる。
【００１２】
ある特定の態様では、本明細書に開示されている可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、筋肉の減少または不十分な筋肉の成長に関連する障害であって、肥満、リポジストロフィー、糖尿病（例えば、ＩＩ型糖尿病）、悪液質または上記の他の障害などの代謝障害にも関連する障害を有する被験体を処置するための方法において使用することができる。そのような障害としては、筋ジストロフィー、筋肉減少症およびＨＩＶ（筋消耗およびリポジストロフィーの両方に関連し得る）が挙げられる。
【００１３】
ある特定の態様では、本開示は、細胞におけるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、アクチビン、ＧＤＦ３、およびＮｏｄａｌ）の活性に拮抗するための方法を提供する。方法は、細胞を可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと接触させることを含む。場合によって、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢリガンドの活性は、ＡｃｔＲＩＩＢ／ＡｃｔＲＩＩＢリガンド複合体によって媒介されるシグナル伝達によって、例えば、細胞増殖またはＵＣＰ−１の発現のレベルをモニターすることによってモニターする。この方法の細胞としては、骨芽細胞、軟骨細胞、ミオサイト、脂肪細胞および筋肉細胞が挙げられる。
【００１４】
ある特定の態様では、本開示は、本明細書に記載の障害または状態を処置するための医薬品を作出するための、可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの使用を提供する。
【００１５】
ある特定の態様では、本開示は、それを必要とする患者において熱発生性脂肪細胞を増加させるための方法を提供し、そのような方法は、有効量の、配列番号２のアミノ酸２９〜１０９の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号３の核酸とハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドからなる群から選択される化合物を投与することを含んでよい。ポリペプチドは、異種性の部分を含む融合タンパク質であってよい。ポリペプチドは、二量体であってよい。ポリペプチドは、免疫グロブリンの定常ドメインと融合していてよい。ポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４などの免疫グロブリンのＦｃ部分と融合していてよい。ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２９〜１０９、２９〜１２８、２９〜１３１、２９〜１３４、２５〜１０９、２５〜１２８、２５〜１３１、２５〜１３４または２０〜１３４の配列と少なくとも８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでよい。ポリペプチドは、配列番号５、６、１２、１４または１７のアミノ酸の配列と少なくとも８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでよい。そのような化合物で処置される患者は、例えば、代謝障害（例えば、肥満、糖尿病、メタボリックシンドローム、脂質異常症またはリポジストロフィー）または代謝障害に関連する筋肉障害（例えば、筋肉減少症の一部の場合）を含めた、本明細書に記載の障害を有する患者であってよい。化合物を投与することにより、処置される患者の脂肪細胞における、場合によって、白色脂肪組織におけるＵＣＰ−１の発現を促進することができる。
【００１６】
ある特定の態様では、本開示は、それを必要とする患者において熱発生性脂肪細胞を増加させるための方法であって、有効量の、ＡｃｔＲＩＩＢまたはＡｃｔＲＩＩＢを通じてシグナルを送るリガンドのいずれかをターゲティングすることによってＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達経路を阻害する化合物を投与することを含む方法を提供する。そのような化合物の例としては、ＡｃｔＲＩＩＢのアンタゴニスト；ミオスタチン（すなわち、ＧＤＦ−８）のアンタゴニスト；アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣまたはアクチビンＥ）のアンタゴニスト；ＧＤＦ−１１のアンタゴニスト；Ｎｏｄａｌのアンタゴニスト；およびＧＤＦ３のアンタゴニストが挙げられる。前述したそれぞれのアンタゴニストは、そのような標的に特異的に結合し、それを阻害する抗体または他のタンパク質（例えば、モノクローナル抗体などの抗体、またはミオスタチンおよびＧＤＦ３の場合ではプロペプチド）であってよい。前述のアンタゴニストは、ＡｃｔＲＩＩＢまたはリガンドの発現を阻害する核酸ベースの化合物（例えば、アンチセンス核酸またはＲＮＡｉ核酸）などの化合物であってもよい。そのような化合物で処置される患者は、例えば、代謝障害（例えば、肥満、糖尿病、メタボリックシンドローム、脂質異常症またはリポジストロフィー）または代謝障害に関連する筋肉障害（例えば、筋肉減少症の一部の場合）を含めた、本明細書に記載の障害を有する患者であってよい。化合物を投与することにより、処置される患者の脂肪細胞における、場合によって、白色脂肪組織におけるＵＣＰ−１の発現を促進することができる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
熱発生性脂肪細胞の増加を必要とする患者において熱発生性脂肪細胞を増加させるための方法であって、有効量の、
ａ．配列番号２のアミノ酸２９〜１０９の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｂ．ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号３の核酸とハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチド
からなる群から選択される化合物を投与することを含む、方法。
（項目２）
前記ポリペプチドが二量体である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ポリペプチドが、ＡｃｔＲＩＩＢに対して異種性の部分を含む融合タンパク質である、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記ポリペプチドが、免疫グロブリンの定常ドメインと融合している、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記ポリペプチドが、免疫グロブリンのＦｃ部分と融合している、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記免疫グロブリンがヒトＩｇＧ１である、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記ポリペプチドが、配列番号５または６の配列を含む、項目１から６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記患者が代謝障害を有する、項目１から７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記患者が筋肉障害および代謝障害を有する、項目１から７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２９〜１０９の配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１から９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２９〜１０９の配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２９〜１０９の配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２５〜１３１の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１から９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２５〜１３１の配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２５〜１３１の配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２５〜１３１の配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記化合物を投与することにより、処置される患者の脂肪細胞におけるＵＣＰ−１の発現が促進される、項目１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記ＵＣＰ−１の発現が、白色脂肪組織において増加する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
熱発生性脂肪細胞の増加を必要とする患者において熱発生性脂肪細胞を増加させるための方法であって、有効量の、
ａ．ＡｃｔＲＩＩＢのアンタゴニスト；
ｂ．ミオスタチンのアンタゴニスト；
ｃ．アクチビンのアンタゴニスト；
ｄ．ＧＤＦ１１のアンタゴニスト；
ｅ．Ｎｏｄａｌのアンタゴニスト；および
ｆ．ＧＤＦ３のアンタゴニスト
からなる群から選択される化合物を投与することを含む、方法。
（項目２０）
前記化合物がＡｃｔＲＩＩＢのアンタゴニストである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ＡｃｔＲＩＩＢのアンタゴニストが、
ＡｃｔＲＩＩＢに結合する抗体および
ＡｃｔＲＩＩＢをコードする核酸とハイブリダイズし、ＡｃｔＲＩＩＢの産生を阻害する核酸
からなる群から選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記化合物がミオスタチンのアンタゴニストである、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記ミオスタチンのアンタゴニストが、
ミオスタチンに結合する抗体、
ミオスタチンをコードする核酸とハイブリダイズし、ミオスタチンの産生を阻害する核酸、および
ミオスタチンのプロペプチドまたはその改変体を含むポリペプチド
からなる群から選択される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記化合物がアクチビンのアンタゴニストである、項目１９に記載の方法。
（項目２５）
前記化合物が、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、およびアクチビンＥから選択されるアクチビンタンパク質のアンタゴニストである、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記アクチビンのアンタゴニストが、
アクチビンに結合する抗体、および
アクチビンをコードする核酸とハイブリダイズし、アクチビンの産生を阻害する核酸
からなる群から選択される、項目２４または２５に記載の方法。
（項目２７）
前記化合物がＧＤＦ３のアンタゴニストである、項目１９に記載の方法。
（項目２８）
前記ＧＤＦ３のアンタゴニストが、
ＧＤＦ３に結合する抗体、
ＧＤＦ３をコードする核酸とハイブリダイズし、ＧＤＦ３の産生を阻害する核酸、およびＧＤＦ３のプロペプチドまたはその改変体を含むポリペプチド
からなる群から選択される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記化合物がＧＤＦ１１のアンタゴニストである、項目１９に記載の方法。
（項目３０）
前記ＧＤＦ１１のアンタゴニストが、
ＧＤＦ１１に結合する抗体、
ＧＤＦ１１をコードする核酸とハイブリダイズし、ＧＤＦ１１の産生を阻害する核酸、および
ＧＤＦ１１のプロペプチドまたはその改変体を含むポリペプチド
からなる群から選択される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記化合物がＮｏｄａｌのアンタゴニストである、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記Ｎｏｄａｌのアンタゴニストが、
Ｎｏｄａｌに結合する抗体、
Ｎｏｄａｌをコードする核酸とハイブリダイズし、Ｎｏｄａｌの産生を阻害する核酸、および
Ｎｏｄａｌのプロペプチドまたはその改変体を含むポリペプチド
からなる群から選択される、項目３１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、高脂肪食を与えた雄のマウスの精巣上体の脂肪パッドにおける、脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１）ｍＲＮＡのレベルに対する６０日間のＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｈＦｃ処置の影響を示す図である。ＲＴ−ＰＣＲデータ（相対的な単位、ＲＵで）は、平均±ＳＥＭであり；＊は、ビヒクルと比較してｐ＜０．０５である。ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｈＦｃにより、褐色脂肪に対するこの選択マーカーをコードするｍＲＮＡにおいてほぼ９倍の増加が引き起こされ、したがって、この白色脂肪の貯蔵所の内部に拡散的に分布した褐色脂肪細胞において熱発生能が上方制御されたことが示されている。
【図２】図２は、高脂肪食を与えたマウスにおいて、６０日間のＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃ処置によって精巣上体の白色脂肪組織内で誘導された熱発生の組織学的な変化を示す図である。全ての顕微鏡画像が同じ拡大率で示されている。ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色により、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃの、脂肪滴サイズを縮小し、褐色脂肪の特徴である多胞性の脂肪細胞のクラスター（矢印）を誘導する能力が示されている。隣接しない区画の免疫染色により、多胞性脂肪細胞および単房性脂肪細胞の両方において、ＵＣＰ１（緑色の蛍光）の広範な細胞質誘導が明らかになった。
【図３】図３は、高脂肪食を与えたマウスの精巣上体の白色脂肪におけるＵＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルに対する６０日間のＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃ処置の影響を示す図である。ＲＴ−ＰＣＲデータ（相対的な単位、ＲＵで）は、平均±ＳＥＭであり；ｎ＝群当たり６〜７であり；＊は、ｐ＜０．０５である。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃにより、褐色脂肪に対するこの選択マーカーをコードするｍＲＮＡにおいて６０倍の増加が引き起こされ、したがって、この白色脂肪の貯蔵所内の熱発生能が上方制御されたことが示されている。
【図４】図４は、食餌と６０日間のＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃ処置に応じた、マウスの精巣上体の白色脂肪における、サーチュインファミリーのメンバーであるＳＩＲＴ−１（サイレント情報制御因子２、ホモログ１）をコードするｍＲＮＡのレベルを示す図である。ＲＴ−ＰＣＲデータ（相対的な単位、ＲＵで）は、平均±ＳＥＭであり；ｎ＝群当たり７であり；＊は、ｐ＜０．０５であり；ＮＳ＝有意でない、である。高脂肪食を与えたマウスでは、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃによってＳＩＲＴ−１  ｍＲＮＡのレベルが７０％超上昇し、それらは標準食を与えたマウスと有意に異ならないレベルまで回復している。
【図５】図５は、食餌と６０日間のＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃ処置に応じた、マウスの精巣上体の白色脂肪におけるＰＧＣ−１α（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ活性化補助因子１α）をコードするｍＲＮＡのレベルを示す図である。ＲＴ−ＰＣＲデータ（相対的な単位、ＲＵで）は、平均±ＳＥＭであり；ｎ＝群当たり６〜７であり；＊＊＊は、ｐ＜０．００１である。高脂肪食を与えたマウスでは、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃによってＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡのレベルが２５０％超上昇し、それらは標準食を与えたマウスにおけるｍＲＮＡのレベルと有意に異ならないレベルまで回復している。
【図６】図６は、食餌と６０日間のＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃ処置に応じた、マウスの精巣上体の白色脂肪におけるＦｏｘｏ−１（フォークヘッドボックスを含有する、タンパク質Ｏのサブファミリー１）をコードするｍＲＮＡのレベルを示す図である。ＲＴ−ＰＣＲデータ（相対的な単位、ＲＵで）は、平均±ＳＥＭであり；ｎ＝群当たり７であり；＊＊は、ｐ＜０．０１である。高脂肪食を与えたマウスでは、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃによってＦｏｘｏ−１  ｍＲＮＡのレベルが９０％超上昇し、それらは標準食を与えたマウスにおけるｍＲＮＡのレベルと有意に異ならないレベルまで回復している。
【図７】図７は、食餌と６０日間のＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃ処置に応じた、マウスの精巣上体の白色脂肪におけるアディポネクチンｍＲＮＡのレベルを示す図である。ＲＴ−ＰＣＲデータ（相対的な単位、ＲＵで）は、平均±ＳＥＭであり；ｎ＝群当たり７であり；＊は、ｐ＜０．０５である。高脂肪食を与えたマウスでは、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃによってアディポネクチンｍＲＮＡのレベルが６０％超上昇し、したがって、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃはこれらのマウス内を循環しているアディポネクチンの濃度の上昇に寄与している。
【図８】図８は、食餌と６０日間のＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃ処置に応じたマウスのアディポネクチンの血清レベルを示す図である。主要なオリゴマーのアイソフォームの全て（全アディポネクチン）をＥＬＩＳＡ測定によって検出し、データは平均±ＳＥＭであり；ｎ＝群当たり７〜８であり；＊＊は、ｐ＜０．０１であり；＊＊＊は、ｐ＜０．００１である。高脂肪食を与えたマウスでは、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃによって、循環しているアディポネクチン濃度が７５％超増加し、標準食の対照におけるアディポネクチン濃度を有意に超えた。
【図９】図９は、マウスにおける、食餌と６０日間のＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃ処置に応じたインスリンの血清濃度を示す図である。データは平均±ＳＥＭであり；ｎ＝群当たり７〜８であり；＊＊は、ｐ＜０．０１である。高脂肪食を与えたマウスでは、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃにより、インスリン濃度が標準食の対照において観察されたレベルに対して正常化された。
【図１０】図１０は、食餌と６０日間のＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｍＦｃ処置に応じた、肩甲骨間の褐色脂肪の貯蔵所の両側性の対の写真である。高脂肪食により、サイズが増加し、貯蔵所の色が明るくなったが、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｍＦｃにより、これらの変化が大きく逆転した。
【図１１】図１１は、高脂肪食を与えたマウスにおける肩甲骨間の褐色脂肪の質量に対する６０日間のＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｍＦｃ処置の影響を示す図である。データは、左側の貯蔵所と右側の貯蔵所を合わせた平均±ＳＥＭであり；＊＊＊は、ｐ＜０．００１である。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｍＦｃにより、この褐色脂肪の貯蔵所の質量に対する高脂肪食の影響が逆転した。
【図１２】図１２は、マイクロコンピュータ断層撮影法（ｍｉｃｒｏＣＴ）によって決定された、高脂肪食を与えたマウスにおける肩甲骨間の褐色脂肪の密度に対する６０日間のＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｍＦｃ処置の影響を示す図である。データ（平均±ＳＥＭ）は、骨塩のヒドロキシアパタイト（ＨＡ）に対する正の値および水に対するゼロの値に基づいて標準化した単位で表されている；したがって、脂肪の値は負であり、白色脂肪に対する値は、一般には−１２０に近い。＊＊は、ｐ＜０．０１である。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｍＦｃにより、この褐色脂肪の貯蔵所の密度に対する高脂肪食の影響が完全に逆転した。
【図１３】図１３は、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃの完全なアミノ酸配列（配列番号１４）を示す図である。ＴＰＡリーダー（残基１〜２２）および短縮されたＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ネイティブな残基２５〜１３１）のそれぞれに下線が引かれている。配列決定によって成熟融合タンパク質のアミノ酸のＮ末端であることが明らかになったグルタミン酸が強調されている。
【図１４−１】図１４は、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示している（コード鎖である配列番号１５が上段に示され、相補鎖の配列番号１６が下段に示されている、３’−５’）。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）をコードする配列およびＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７３〜３９６）をコードする配列に下線が引かれている。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）に対応するアミノ酸配列も示されている。
【図１４−２】図１４は、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示している（コード鎖である配列番号１５が上段に示され、相補鎖の配列番号１６が下段に示されている、３’−５’）。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）をコードする配列およびＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７３〜３９６）をコードする配列に下線が引かれている。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）に対応するアミノ酸配列も示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
１．概要
哺乳動物の脂肪細胞（ｆａｔ  ｃｅｌｌ）は、エネルギーを蓄える白色脂肪細胞またはエネルギーを消費する褐色脂肪細胞のいずれかに分類することができる。脱共役タンパク質−１（ＵＣＰ１）は、ミトコンドリアのプロトン勾配からのＡＴＰ産生を脱共役することによって生化学的エネルギーを熱に変換し、褐色脂肪細胞に対する決定的な機能的マーカーであると広く考えられている。ＵＣＰ−１を発現している脂肪細胞は、本明細書では「熱発生性脂肪細胞」と称される。マウスにおいて、褐色脂肪組織を遺伝的除去すると、極度の肥満が生じ（Ｌｏｗｅｌｌら、１９９３年、Ｎａｔｕｒｅ  ３６６巻：７４０〜７４２頁）、ＵＣＰ１を選択的に除去すると、マウスにおけるβ３−アドレナリン作動性の刺激に対する発熱応答および抗肥満応答が妨げられ（Ｉｎｏｋｕｍａら、２００６年、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２９０巻：Ｅ１０１４〜Ｅ１０２１頁）、これにより、ＵＣＰ１がエネルギー消費および脂肪症の制御において重大な分子であることが確証されている（Ｋｏｚａｋら、２００８年、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｂｅｓ  ３２巻：Ｓ３２〜Ｓ３８頁）。
【００１９】
げっ歯類からヒトに及ぶ哺乳動物では、褐色脂肪細胞は、新生児期に最も顕著な散在性の褐色脂肪組織の貯蔵所において生じ、この年齢期に生存するための熱的な攻撃と一致している。最近の発見により、これらの褐色脂肪の貯蔵所は、ヒトにおいて、成人期の間に熱発生能を持続することが示されており（Ｎｅｄｅｒｇａａｒｄら、２００７年、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２９３巻：Ｅ４４４〜Ｅ４５２頁；ｖａｎ  Ｍａｒｋｅｎ  Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｌｔら、２００９年、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６０巻：１５００〜１５０８頁；Ｃｙｐｅｓｓら、２００９年、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６０巻：１５０９〜１５１７頁）、そのような組織を、治療的な利益のために外因的に活性化することができる可能性が生じている。興味深いことに、かなりの数の褐色脂肪細胞が、生後発達初期に一部の「白色」脂肪の貯蔵所内にも一過性に生じ（Ｘｕｅら、２００７年、Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ４８巻：４１〜５１頁）、成人期に、ある特定の条件下で白色脂肪の貯蔵所において再出現し得る（Ｃｏｕｓｉｎら、１９９２年、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １０３巻：９３１〜９４２頁）。ヒトにおいてさえ、限られた証拠により、褐色脂肪細胞を成人期の間に白色脂肪の貯蔵所において誘導することができることが示唆されている（Ｌｅａｎら、１９８６年、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｂｅｓ  １０巻：２１９〜２２７頁）。したがって、治療的な利益のために、「拡散した」熱発生性脂肪細胞を伝統的な白色脂肪の貯蔵所において誘導することができる可能性もある。白色脂肪組織の伝統的な貯蔵所は、実際、散在性の褐色脂肪の貯蔵所においては観察されないある程度の細胞のリモデリング、または表現型の可塑性を示す（Ｐｒｕｎｅｔ−Ｍａｒｃａｓｓｕｓら、２００６年、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ３１２巻：７２７〜７３６頁）。
【００２０】
実施例に記載の通り、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を使用して、高脂肪食を与えたマウスの脂肪の貯蔵所におけるＵＣＰ−１のシグナリングを増加させることができる。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢ由来の作用剤およびＡｃｔＲＩＩＢシグナリングを阻害する他の化合物を使用して、熱発生性脂肪細胞の数および／または活性を増加させることができる。熱発生性脂肪細胞の制御に関係づけられる、ＡｃｔＲＩＩＢに結合するリガンドとしては、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、およびアクチビンＥ）、ミオスタチン（すなわち、ＧＤＦ−８）、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−１１、およびＮｏｄａｌが挙げられる。ある特定の態様では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに関する。本明細書で使用される、「ＡｃｔＲＩＩＢ」という用語は、任意の種に由来する、アクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）タンパク質のファミリーおよびＡｃｔＲＩＩＢ関連タンパク質を指す。ＡｃｔＲＩＩＢファミリーのメンバーは、一般に全て、システインリッチ領域を有するリガンド結合性細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測セリン／トレオニンキナーゼ特異性を有する細胞質ドメインで構成される膜貫通タンパク質である。ヒトのＡｃｔＲＩＩＢ前駆体は以下のアミノ酸配列を有し、シグナルペプチドに下線が引かれており、細胞外ドメインが太字で示されており、潜在的なＮ結合グリコシル化部位が枠で囲まれている（配列番号２）（ＮＭ＿００１１０６、５１２アミノ酸）。
【００２１】
【化１】
0005912078.tif 000002
ネイティブなリーダーを含む上記の野生型配列を、本開示全体を通して、ＡｃｔＲＩＩＢの種々の短縮、成熟形態および改変体のいずれかのアミノ酸を番号付けするための基本配列として使用する。「ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド」という用語は、ＡｃｔＲＩＩＢファミリーのメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドならびに有用な活性を保持する任意のその改変体（変異体、断片、融合物、およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを指すために使用される。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとしては、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの配列と少なくとも約８０％同一である配列、および、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはそれを超える同一性を有する、任意の公知のＡｃｔＲＩＩＢの配列に由来するポリペプチドが挙げられる。
【００２２】
特定の実施形態では、本発明は、可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに関する。本明細書に記載のように、「可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド」という用語は、概して、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインを含むポリペプチドを指す。本明細書で使用される、「可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド」という用語は、任意の天然に存在するＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインならびに有用な活性を保持する任意のその改変体（変異体、断片およびペプチド模倣形態を含む）を含む。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインは、リガンドに結合し、また、一般に可溶性である。以下は、可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（配列番号１）（１１６アミノ酸）の例である。
【００２３】
【化２】
0005912078.tif 000003
可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの他の例は、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインに加えて、シグナル配列を含む（実施例１を参照されたい）。シグナル配列は、ＡｃｔＲＩＩＢのネイティブなシグナル配列、または組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）のシグナル配列またはミツバチメリチン（ＨＢＭ）のシグナル配列などの別のタンパク質由来のシグナル配列であってよい。
【００２４】
２つの関連するＩＩ型受容体、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢが、アクチビン（ＭａｔｈｅｗｓおよびＶａｌｅ、１９９１年、Ｃｅｌｌ  ６５巻：９７３〜９８２頁；Ａｔｔｉｓａｎｏら、１９９２年Ｃｅｌｌ  ６８巻：９７〜１０８頁）ならびに種々の他のＢＭＰおよびＧＤＦに対するＩＩ型受容体として同定されている。アクチビンに加え、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢは、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１を含めたいくつかの他のＴＧＦ−βファミリーのタンパク質と生化学的に相互作用し得る（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、１９９５年、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １３０巻：２１７〜２２６頁；ＬｅｅおよびＭｃＰｈｅｒｒｏｎ、２００１年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９８巻：９３０６〜９３１１頁；ＹｅｏおよびＷｈｉｔｍａｎ、２００１年、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ７巻：９４９〜９５７頁；Ｏｈら、２００２年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １６巻：２７４９〜５４頁）。ある特定の実施形態では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体のリガンド（ＡｃｔＲＩＩＢリガンドとも称される）を対象のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）と拮抗させることに関する。したがって、本発明の組成物および方法は、１種または複数種のＡｃｔＲＩＩＢ受容体のリガンドの異常な活性に関連する障害を処置するために有用である。典型的なＡｃｔＲＩＩＢ受容体のリガンドとしては、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、およびアクチビンＥ）、ＧＤＦ３、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１などのいくつかのＴＧＦ−βファミリーのメンバーが挙げられる。
【００２５】
アクチビンは、二量体のポリペプチド増殖因子であり、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーに属する。２つの密接に関連するβサブユニットのホモ二量体／ヘテロ二量体である（βＡβＡ、βＢβＢおよびβＡβＢ）３つのアクチビン（Ａ、ＢおよびＡＢ）がある。ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーにおいて、アクチビンは独特であり、卵巣の細胞および胎盤の細胞におけるホルモンの産生を刺激することができ、神経細胞の生存を支持することができ、細胞周期の進行に、細胞型に応じて正または負の影響を及ぼすことができ、および少なくとも両生類の胚において中胚葉の分化を誘導することができる多機能性因子である（ＤｅＰａｏｌｏら、１９９１年、Ｐｒｏｃ  ＳｏｃＥｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．  １９８巻：５００〜５１２頁；Ｄｙｓｏｎら、１９９７年、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．  ７巻：８１〜８４頁；Ｗｏｏｄｒｕｆｆ、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ５５巻：９５３〜９６３頁）。さらに、刺激されたヒトの単球白血病細胞から単離された赤血球分化因子（ＥＤＦ）がアクチビンＡと同一であることが見いだされた（Ｍｕｒａｔａら、１９８８年、ＰＮＡＳ、８５巻：２４３４頁）。アクチビンＡが骨髄における赤血球生成の天然の制御因子として作用することが示唆された。いくつかの組織では、アクチビンのシグナリングは、その関連ヘテロ二量体であるインヒビンにより拮抗される。例えば、下垂体から卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）が放出されている間、アクチビンはＦＳＨの分泌および合成を促進するが、インヒビンはＦＳＨの分泌および合成を妨げる。アクチビンの生物活性を制御する、および／またはアクチビンに結合する他のタンパク質としては、フォリスタチン（ＦＳ）、フォリスタチン関連タンパク質（ＦＳＲＰ）、α２−マクログロブリン、ケルベロス、およびエンドグリンが挙げられ、それらについては下で説明する。
【００２６】
骨形成タンパク質７（ＢＭＰ７）は、骨原性タンパク質１（ＯＰ−１）とも称され、軟骨および骨の形成を誘導することが周知である。さらに、ＢＭＰ７は、幅広い生理的プロセスを制御する。特に、ＢＭＰ７は、褐色脂肪細胞の分化の重要なプロモーターであることが最近同定された（Ｔｓｅｎｇら、２００８年、Ｎａｔｕｒｅ  ４５４巻：１０００〜１００４頁）。本研究において、ＢＭＰ７を遺伝的除去することにより、マウスの胚において褐色脂肪が欠乏し、ＵＣＰ１がほぼ完全に存在しなくなった。さらに、マウスにおけるＢＭＰ７の発現を、アデノウイルスを投与することによって上方制御することにより、褐色脂肪の質量およびエネルギー消費が増加した。したがって、文献により、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体などのＢＭＰ７のアンタゴニストが、ＵＣＰ１の発現、褐色脂肪細胞の形成、および／または褐色脂肪細胞の活性を促進することが予想されないことが示唆されている。アクチビンと同様に、ＢＭＰ７も、ＩＩ型受容体であるＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢに結合する。しかし、ＢＭＰ７およびアクチビンは、ヘテロマーの受容体複合体に、別個のＩ型受容体を動員する。観察された主要なＢＭＰ７  Ｉ型受容体はＡＬＫ２であったが、アクチビンはＡＬＫ４（ＡｃｔＲＩＩＢ）に独占的に結合した。ＢＭＰ７とアクチビンは、別個の生物学的応答を引き出し、異なるＳｍａｄ経路を活性化した（Ｍａｃｉａｓ−Ｓｉｌｖａら、１９９８年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７３巻：２５６２８〜３６頁）。
【００２７】
増殖分化因子３（ＧＤＦ３）は、Ｖｇ１関連２としても公知であり、胚発生において重要な役割を果たし、成人期の間の脂肪生成にも関係づけられている。簡単に述べると、白色脂肪組織におけるＧＤＦ３の発現は、体重または肥満と相関し（Ｗｅｉｓｂｅｒｇら、２００３年、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１２巻：１７９６〜１８０８頁）、アデノウイルス媒介性のＧＤＦ３の過剰発現により、野生型マウスにおいて高脂肪食条件下で観察される脂肪症の増加が悪化する（Ｗａｎｇら、２００４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３２１巻：１０２４〜１０３１頁）。重要なことに、ＧＤＦ３を遺伝的除去したマウスは健康であり、標準食で維持すると基本的に正常であるが肥満から保護され、高脂肪食で維持すると基礎代謝率の上昇を示す（Ｓｈｅｎら、２００９年、Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２３巻：１１３〜１２３頁）。総合すると、これらの発見は、特に食餌誘導性の肥満において、より一般的には脂肪症の制御においてＧＤＦ３に関係づけられる。
【００２８】
Ｎｏｄａｌタンパク質は、中胚葉および内胚葉の誘導および形成、ならびにその後の、初期胚形成における心臓および胃などの軸構造の組織化において機能を有する。発生中の脊椎動物の胚における背側の組織が、脊索および脊索前板の軸構造に主に寄与し、同時に周囲の細胞を動員して非軸の胚構造を形成することが実証されている。Ｎｏｄａｌは、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体の両方、およびＳｍａｄタンパク質として公知の細胞内エフェクターを通じてシグナリングすると思われる。最近の試験により、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢがＮｏｄａｌに対するＩＩ型受容体として機能するという考えが支持される（Ｓａｋｕｍａら、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ．  ２００２年、７巻：４０１〜１２頁）。Ｎｏｄａｌリガンドがそれらの補因子（例えば、クリプト（ｃｒｉｐｔｏ））と相互作用して、Ｓｍａｄ２をリン酸化するアクチビンのＩ型受容体およびＩＩ型受容体を活性化することが示唆されている。Ｎｏｄａｌタンパク質は、中胚葉の形成、前側のパターニング、および左右軸の特定化を含めた、初期の脊椎動物の胚にとって重大な多くの事象に関係づけられる。実験的な証拠により、Ｎｏｄａｌのシグナリングにより、アクチビンおよびＴＧＦ−ベータに特異的に反応することが以前示されたルシフェラーゼレポーターであるｐＡＲ３−Ｌｕｘが活性化することが実証された。しかし、Ｎｏｄａｌは、骨形成タンパク質に対して特異的に応答性のレポーターであるｐＴｌｘ２−Ｌｕｘを誘導することができない。最近の結果により、アクチビン−ＴＧＦ−ベータ経路のＳｍａｄである、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３の両方によってＮｏｄａｌのシグナリングが媒介されることの直接的な生化学的証拠がもたらされた。さらなる証拠により、Ｎｏｄａｌのシグナリングに細胞外のクリプト（ｃｒｉｐｔｏ）タンパク質が必要であることが示され、このことによりアクチビンまたはＴＧＦ−ベータのシグナリングとは異なるものになっている。
【００２９】
増殖分化因子８（ＧＤＦ８）は、ミオスタチンとしても公知である。ＧＤＦ８は、骨格筋量の負の制御因子である。ＧＤＦ８は、発生中の骨格筋および成人の骨格筋において高度に発現される。トランスジェニックマウスにおけるＧＤＦ８のヌル突然変異は、骨格筋の顕著な肥大および過形成を特徴とする（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９７年、３８７巻：８３〜９０頁）。同様の骨格筋量の増加が、ウシにおけるＧＤＦ８の天然に存在する突然変異において明らかであり（Ａｓｈｍｏｒｅら、１９７４年、Ｇｒｏｗｔｈ、３８巻：５０１〜５０７頁；ＳｗａｔｌａｎｄおよびＫｉｅｆｆｅｒ、Ｊ．  Ａｎｉｍ．  Ｓｃｉ．、１９９４年、３８巻：７５２〜７５７頁；ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１９９７年、９４巻：１２４５７〜１２４６１頁；およびＫａｍｂａｄｕｒら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、１９９７年、７巻：９１０〜９１５頁）、ヒトにおいて著しい（Ｓｃｈｕｅｌｋｅら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００４年；３５０巻：２６８２〜８頁）。試験により、ヒトにおけるＨＩＶ感染に関連する筋消耗がＧＤＦ８タンパク質の発現の増加を伴うことも示されている（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら、ＰＮＡＳ、１９９８年、９５巻：１４９３８〜４３頁）。さらに、ＧＤＦ８は筋肉に特異的な酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の産生を調節すること、および筋芽細胞の細胞増殖を調節することができる（ＷＯ  ００／４３７８１）。ＧＤＦ８プロペプチドは、成熟ＧＤＦ８ドメイン二量体に非共有結合することができ、その生物活性を不活性化する（Ｍｉｙａｚｏｎｏら（１９８８年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６３巻：６４０７〜６４１５頁；Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら（１９８８年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６３巻；７６４６〜７６５４頁；およびＢｒｏｗｎら（１９９０年）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、３巻：３５〜４３頁）。ＧＤＦ８または構造的に関連するタンパク質に結合し、それらの生物活性を阻害する他のタンパク質としては、フォリスタチン、および潜在的に、フォリスタチン関連タンパク質が挙げられる（Ｇａｍｅｒら（１９９９年）Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．、２０８巻：２２２〜２３２頁）。
【００３０】
増殖分化因子１１（ＧＤＦ１１）は、ＢＭＰ１１としても公知であり、分泌タンパク質である（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、１９９９年、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２２巻：２６０〜２６４頁）。ＧＤＦ１１は、マウスの発生中に尾芽、肢芽、上顎弓および下顎弓および後根神経節において発現される（Ｎａｋａｓｈｉｍａら、１９９９年、Ｍｅｃｈ．  Ｄｅｖ．  ８０巻：１８５〜１８９頁）。ＧＤＦ１１は、中胚葉組織および神経組織の両方のパターニングにおいて独特の役割を果たす（Ｇａｍｅｒら、１９９９年、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．、２０８巻：２２２〜３２頁）。ＧＤＦ１１は、発生中のニワトリの肢における軟骨形成および筋形成の負の制御因子であることが示された（Ｇａｍｅｒら、２００１年、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．  ２２９巻：４０７〜２０頁）。筋肉におけるＧＤＦ１１の発現によっても、ＧＤＦ８と同様に筋肉の成長を制御することにおけるその役割が示唆されている。さらに、脳におけるＧＤＦ１１の発現により、ＧＤＦ１１が神経系の機能に関わる活性も有し得ることが示唆されている。興味深いことに、ＧＤＦ１１は、嗅上皮における神経の発達を阻害することが見いだされた（Ｗｕら、２００３年、Ｎｅｕｒｏｎ．  ３７巻：１９７〜２０７頁）。したがって、ＧＤＦ１１は、筋肉疾患および神経変性疾患（例えば、筋委縮性側索硬化症）などの疾患の処置において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける適用およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける適用を有し得る。
【００３１】
ある特定の態様では、本発明は、一般に、ＡｃｔＲＩＩＢ活性に関連する任意のプロセスにおけるＡｃｔＲＩＩＢリガンドのシグナリングに拮抗するための、ある特定のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）の使用に関する。場合によって、本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、およびアクチビンＥ）、ＧＤＦ３、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１などの１種または複数種のＡｃｔＲＩＩＢ受容体のリガンドと拮抗し得、したがって、追加的な障害の処置において有用であり得る。
【００３２】
したがって、本開示は、熱発生性脂肪細胞の活性に関連する疾患または状態を処置または予防することにおける、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢまたはＡｃｔＲＩＩＢリガンドのアンタゴニストの使用を意図している。ＡｃｔＲＩＩＢまたはＡｃｔＲＩＩＢリガンドは、多くの重大な生物学的プロセスの制御に関与する。そのような代謝的な障害または状態の例としては、これらに限定されないが、メタボリックシンドローム（シンドロームＸとしても公知である）、糖尿病、耐糖能障害、空腹時血糖異常、血漿インスリン濃度の上昇およびインスリン抵抗性、脂質異常症、高脂血症、過食および過食症、結腸癌、前立腺癌、乳癌、子宮内膜癌、腎臓癌、変形性関節症、閉塞性睡眠時無呼吸、胆石症、胆石、高血圧症、心疾患、心臓のリズムの異常および不整脈、心筋梗塞、うっ血性心不全、冠動脈心疾患、冠動脈疾患、狭心症、突然死、多嚢胞性卵巣疾患、頭蓋咽頭腫、プラダー−ウィリー症候群、フレーリッヒ症候群、ＧＨが欠損している被験体、正常変異低身長、ターナー症候群、ならびに全除脂肪体重の百分率として、代謝活性の低下または安静時エネルギー消費の減少を示している他の病態、例えば、急性リンパ性白血病の小児が挙げられる。さらなる例は、性機能障害および生殖機能障害（不妊症など）、男性における性腺機能低下症および女性における男性型多毛症、胃腸運動障害（肥満に関連する胃食道逆流など、呼吸器疾患（肥満低換気症候群またはピックウィック症候群など）、心血管障害、脳梗塞、脳血栓、一過性脳虚血発作、炎症（脈管構造の全身性炎症など）、動脈硬化症、高コレステロール血症、高尿酸血症、脂肪肝、痛風、胆嚢疾患、整形外科的障害、ならびに腰痛である。これらの障害および状態は、「典型的な治療的使用」の下で、以下に考察する。
【００３３】
本明細書で使用される用語は、概して、本発明に関しておよび各用語が使用される特定の文脈において、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。ある特定の用語を、本発明の組成物および方法ならびにそれらの作出および使用の仕方の記載において実践者に追加的な手引きを提供するために、以下または本明細書の他の箇所で考察する。用語の任意の使用の範囲または意味は用語が使用される特定の文脈から明らかになる。
【００３４】
「約」および「およそ」は一般に、測定の性質または精度を考慮して、測定量に関して許容できる誤差の程度を意味するものとする。一般には、典型的な誤差の程度は、所与の値または値の範囲の２０パーセント（％）以内であり、１０％以内であることが好ましく、５％以内であることがより好ましい。
【００３５】
あるいは、特に生物系では、「約」および「およそ」という用語は、所与の値の１桁以内の値、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。本明細書において示される数値的な量は、別段の指定のない限り概算であり、明示されていなければ「約」または「およそ」という用語を推定してよいことを意味している。
【００３６】
本発明の方法は、野生型配列と１種または複数種の変異体（配列改変体）を含めた、配列を互いに比較するステップを含んでよい。そのような比較は、一般には、例えば、当技術分野で周知の配列アラインメントのプログラムおよび／またはアルゴリズム（例えば、２、３挙げると、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＭＥＧＡＬＩＧＮ）を使用したポリマー配列のアラインメントを含む。当業者は、そのようなアラインメントでは、突然変異が残基の挿入または欠失を含有する場合、配列アラインメントにより、挿入された、または欠失した残基を含有しないポリマー配列に「ギャップ」（一般にはダッシュまたは「Ａ」で表される）が導入されることを容易に理解することができる。
【００３７】
本明細書で使用される「糖尿病」という用語は、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病としても公知である）を指す。Ｉ型糖尿病、またはインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、グルコースの利用を制御するホルモンであるインスリンが絶対的に欠乏した結果である。ＩＩ型糖尿病、またはインスリン依存性糖尿病（すなわち、インスリン非依存性糖尿病）は、インスリンのレベルが正常である、または上昇してさえいるにも関わらず度々起こり、組織がインスリンに適切に応答できないことの結果だと思われる。ほとんどのＩＩ型糖尿病患者は、肥満でもある。
【００３８】
「相同の」は、その文法形式および綴りの変形全てに関して、同一種の生物体のスーパーファミリーからのタンパク質、ならびに異なる種の生物体からの相同タンパク質を含めた、「共通の進化的起源」を有する２つのタンパク質間の関連性を指す。そのようなタンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、パーセント同一性の単位であろうとなかろうとそれらの配列類似性、または特定の残基またはモチーフおよび保存された位置の存在に反映されるように、配列相同性を有する。
【００３９】
「肥満」は、過剰な体脂肪がある状態である。肥満の操作上の定義は、メートルで２乗した身長当たりの体重（ｋｇ／ｍ２）として算出される肥満度指数（ＢＭＩ）に基づく。「肥満」は、医師によってそういうものとして診断された状態を指す。一般にヨーロッパ人、アフリカ人、先住アメリカ人またはインド人の血統の患者に対する１つの標準の等級付けシステムが以下に記載され、アジア人の患者に対しては多くの場合代替のシステムが使用される。このシステムに従って、肥満は、３０ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する、他の点では健康な被験体、または、少なくとも１つの併存症を有する被験体が２７ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する状態と定義される。
【００４０】
「配列類似性」という用語は、その文法形式の全てに関して、共通の進化的起源を共有してよい、または共有しなくてよい核酸配列間またはアミノ酸配列間の同一性または一致の程度を指す。
【００４１】
しかし、一般的な使用において、および本出願において、「相同の」という用語は、「高度に」などの副詞で修飾された場合、配列類似性を指してよく、共通の進化的起源に関係づけてよい、または関係づけなくてよい。
【００４２】
２．ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド
ある特定の態様では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢ改変体ポリペプチド（例えば、可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）に関する。場合によって、断片、機能的改変体、および修飾された形態が、それらの対応する野生型ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと同様または同一の生物活性を有する。例えば、本発明のＡｃｔＲＩＩＢ改変体は、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ３、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ８、またはＧＤＦ１１）に結合し、その機能を阻害することができる。場合によって、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、脂肪、筋肉、骨、または軟骨などの組織の成長を調節する。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの例としては、ヒトのＡｃｔＲＩＩＢ前駆体ポリペプチド（配列番号２）および可溶性のヒトＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、配列番号１、５、６、１２、１４、および１７）が挙げられる。
【００４３】
本開示では、ＡｃｔＲＩＩＢの機能的に活性な部分および改変体を同定する。出願人らは、配列番号２のアミノ酸６４に対応する位置にアラニンを有する（Ａ６４）、Ｈｉｌｄｅｎらによって開示された配列（Ｂｌｏｏｄ．  １９９４年、Ａｐｒ  １５；８３巻（８号）：２１６３〜７０頁）を有するＦｃ融合タンパク質が、アクチビンおよびＧＤＦ−１１に対して比較的低い親和性を有することを突きとめた。対照的に、６４位にアルギニンを持つ（Ｒ６４）同じＦｃ融合タンパク質は、アクチビンおよびＧＤＦ−１１に対して低ナノモルから高ピコモルまでの範囲の親和性を有する。したがって、本開示において、Ｒ６４を有する配列をヒトＡｃｔＲＩＩＢについての野生型参照配列として使用する。
【００４４】
Ａｔｔｉｓａｎｏら（Ｃｅｌｌ．  １９９２年、Ｊａｎ  １０；６８巻（１号）：９７〜１０８頁）は、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインのＣ末端におけるプロリンノットが欠失すると、アクチビンに対する受容体の親和性が低下することを示した。配列番号２のアミノ酸２０〜１１９を含有するＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質である「ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１１９）−Ｆｃ」は、プロリンノット領域および完全な膜近傍ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−Ｆｃと比較して、ＧＤＦ−１１およびアクチビンに対する結合性が低下している。しかし、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１２９）−Ｆｃタンパク質は、プロリンノット領域が破壊されているにもかかわらず、野生型と比較していくらか低下しているが同様の活性を保持する。したがって、アミノ酸１３４、１３３、１３２、１３１、１３０および１２９で停止するＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインは全て活性であると予測されるが、１３４または１３３で停止する構築物が最も活性であり得る。同様に、残基１２９〜１３４のいずれかにおける突然変異によっては、リガンドの結合親和性が大幅に変化しないことが予想される。これを支持すると、Ｐ１２９およびＰ１３０の突然変異によってリガンドの結合性は実質的に減少しない。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、早ければアミノ酸１０９（最後のシステイン）で終わってよいが、しかし、１０９〜１１９で終わる形態はリガンドの結合性が低下していると予想される。アミノ酸１１９は不十分に保存されていて、したがって容易に変化する、または短縮される。１２８以降で終わる形態は、リガンドの結合活性を保持する。１１９〜１２７で終わる形態は中間の結合能を有することになる。これらの形態のいずれも、臨床的または実験的な状況に応じて、使用するために望ましい可能性がある。
【００４５】
ＡｃｔＲＩＩＢのＮ末端において、アミノ酸２９以前で始まるタンパク質はリガンドの結合活性を保持することが予想される。アミノ酸２９は、最初のシステインを表す。２４位におけるアラニンからアスパラギンへの突然変異により、リガンドの結合性に実質的に影響を及ぼすことなく、Ｎ結合グリコシル化配列が導入される。これにより、アミノ酸２０〜２９に対応する、シグナル切断ペプチドとシステインが架橋した領域との間の領域における突然変異が良好に許容されることが確証された。詳細には、２０位、２１位、２２位、２３位および２４位で始まる構築物が活性を保持し、２５位、２６位、２７位、２８位および２９位で始まる構築物も活性を保持すると予測される。
【００４６】
総合すると、ＡｃｔＲＩＩＢの活性部分は、配列番号２のアミノ酸２９〜１０９を含み、構築物は、例えば、アミノ酸２０〜２９に対応する残基で始まり、アミノ酸１０９〜１３４に対応する位置で終わる。他の例としては、２０位〜２９位または２１位〜２９位で始まり、１１９位〜１３４位、１１９位〜１３３位または１２９位〜１３４位、１２９位〜１３３位で終わる構築物が挙げられる。他の例としては、２０位〜２４位（もしくは２１位〜２４位、または２２位〜２５位）で始まり、１０９位〜１３４位（もしくは１０９位〜１３３位）、１１９〜１３４（もしくは１１９位〜１３３位）または１２９位〜１３４位（もしくは１２９位〜１３３位）で終わる構築物が挙げられる。これらの範囲内の改変体、詳細には、配列番号２の対応する部分に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する改変体も意図されている。
【００４７】
本開示は、リガンド結合ポケットが、Ｙ３１、Ｎ３３、Ｎ３５、Ｌ３８〜Ｔ４１、Ｅ４７、Ｅ５０、Ｑ５３〜Ｋ５５、Ｌ５７、Ｈ５８、Ｙ６０、Ｓ６２、Ｋ７４、Ｗ７８〜Ｎ８３、Ｙ８５、Ｒ８７、Ａ９２、およびＥ９４〜Ｆ１０１の残基によって定義されることを実証している、複合性のＡｃｔＲＩＩＢの構造の解析結果を含む。これらの位置において、保存された突然変異が許容されるが、Ｋ７４Ａ突然変異が良好に許容され、Ｒ４０Ａ、Ｋ５５Ａ、Ｆ８２ＡおよびＬ７９位における突然変異も同じく良好に許容されることが予想される。Ｒ４０は、アフリカツメガエルではＫであり、これは、この位置における塩基性アミノ酸が許容されることを示している。Ｑ５３は、ウシのＡｃｔＲＩＩＢではＲであり、アフリカツメガエルのＡｃｔＲＩＩＢではＫであり、したがって、Ｒ、Ｋ、Ｑ、ＮおよびＨを含めたアミノ酸がこの位置において許容される。したがって、活性なＡｃｔＲＩＩＢ改変体タンパク質についての一般的な処方は、アミノ酸２９〜１０９を含むが、場合によって、２０位〜２４位または２２位〜２５位の範囲で始まり、１２９位〜１３４位の範囲で終わり、リガンド結合ポケットにおいてわずか１、２、５、１０または１５の保存されたアミノ酸の変化を含み、リガンド結合ポケットの４０位、５３位、５５位、７４位、７９位および／または８２位においてゼロ、１つまたは複数の保存されていない変化を含むものである。そのようなタンパク質は、配列番号２のアミノ酸２９〜１０９の配列に対して、８０％、９０％、９５％または９９％を超える配列同一性を保持し得る。変動が特に良好に許容され得る結合ポケットの外側の部位としては、細胞外ドメインのアミノ末端およびカルボキシ末端（上記の通り）、ならびに４２位〜４６位および６５位〜７３位が挙げられる。６５位におけるアスパラギンからアラニンへの変化（Ｎ６５Ａ）により、実際にＡ６４バックラウンドにおけるリガンドの結合性が改善され、したがって、Ｒ６４バックラウンドにおけるリガンドの結合性に対して有害な影響はないと予想される。この変化により、おそらくＡ６４バックラウンドのＮ６５におけるグリコシル化が排除され、したがって、この領域における有意な変化が許容される見込みがあることが実証されている。Ｒ６４Ａの変化は許容されにくいが、一方Ｒ６４Ｋは良好に許容され、したがって、Ｈなどの別の塩基性残基が６４位において許容され得る。
【００４８】
ＡｃｔＲＩＩＢは、ほぼ全ての脊椎動物にわたって良く保存されており、長く伸びた完全に保存された細胞外ドメインを伴う。ＡｃｔＲＩＩＢに結合するリガンドの多くも、高度に保存されている。したがって、種々の脊椎動物生物体由来のＡｃｔＲＩＩＢ配列を比較することにより、変化させることができる残基への洞察がもたらされる。したがって、活性な、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ改変体は、別の脊椎動物のＡｃｔＲＩＩＢの配列からの対応する位置に１つまたは複数のアミノ酸を含んでよい、または、ヒトまたは他の脊椎動物の配列中の残基と類似した残基を含んでよい。以下の実施例は、活性なＡｃｔＲＩＩＢ改変体を定義するためにこのアプローチを例示している。Ｌ４６は、アフリカツメガエルのＡｃｔＲＩＩＢではバリンであり、したがって、この位置は変化させることができ、場合によって、Ｖ、ＩまたはＦなどの別の疎水性の残基、または、Ａなどの非極性残基に変化させることができる。Ｅ５２は、アフリカツメガエルではＫであり、これは、この部位では、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、ＹおよびおそらくＡなどの極性残基を含めた多種多様な変化が許容され得ることを示している。Ｔ９３はアフリカツメガエルではＫであり、これは、この位置において、広範な構造的な変動が許容され、Ｓ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、ＧおよびＹなどの極性残基が好ましいことを示している。Ｆ１０８は、アフリカツメガエルではＹであり、したがって、Ｙ、またはＩ、ＶもしくはＬなどの他の疎水性の群が許容されるはずである。Ｅ１１１は、アフリカツメガエルではＫであり、これは、この位置において、Ｄ、Ｒ、ＫおよびＨ、ならびにＱおよびＮを含めた荷電残基が許容されることを示している。Ｒ１１２はアフリカツメガエルではＫであり、これは、この位置においてＲおよびＨを含めた塩基性残基が許容されることを示している。１１９位のＡは比較的不十分に保存されており、げっ歯類ではＰとして現れ、アフリカツメガエルではＶとして現れ、したがって、この位置では基本的にどんなアミノ酸も許容されるはずである。
【００４９】
本開示は、さらにＮ結合グリコシル化部位（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）を付加することにより、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質の血清中の半減期が、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４）−Ｆｃ形態と比較して増加することを実証している。２４位にアスパラギンを導入することにより（Ａ２４Ｎ構築物）、長い半減期を付与するＮＸＴ配列が創出される。他のＮＸ（Ｔ／Ｓ）配列は、４２〜４４（ＮＱＳ）および６５〜６７（ＮＳＳ）において見いだされるが、後者は６４位のＲで効率的にグリコシル化されない可能性がある。Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列は、一般に、リガンド結合ポケットの外側の位置に導入することができる。非内在性のＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を導入するために特に適した部位としては、アミノ酸２０〜２９、２０〜２４、２２〜２５、１０９〜１３４、１２０〜１３４または１２９〜１３４が挙げられる。Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列は、ＡｃｔＲＩＩＢ配列とＦｃまたは他の融合物の構成要素との間のリンカーに導入することもできる。そのような部位は、既存のＳまたはＴに対して正しい位置にＮを導入することによって、または、既存のＮに対応する位置にＳまたはＴを導入することによって、最小の労力で導入することができる。したがって、Ｎ結合グリコシル化部位を創出する望ましい変化は：Ａ２４Ｎ、Ｒ６４Ｎ、Ｓ６７Ｎ（事によるとＮ６５Ａ変化と組み合わせる）、Ｅ１０６Ｎ、Ｒ１１２Ｎ、Ｇ１２０Ｎ、Ｅ１２３Ｎ、Ｐ１２９Ｎ、Ａ１３２Ｎ、Ｒ１１２ＳおよびＲ１１２Ｔである。グリコシル化されると予測されるＳはいずれも、グリコシル化によって保護がもたらされるので、免疫原性部位を創出することなくＴに変化させることができる。同様に、グリコシル化されると予測されるＴはいずれもＳに変化させることができる。したがってＳ６７ＴおよびＳ４４Ｔの変化が意図されている。同様に、Ａ２４Ｎ改変体では、Ｓ２６Ｔの変化を使用することができる。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢ改変体は、１つまたは複数の追加的な、非内在性のＮ結合グリコシル化コンセンサス配列を含んでよい。
【００５０】
Ｌ７９位は、アクチビン−ミオスタチン（ＧＤＦ−１１）結合特性の変化を付与するために変化させることができる。Ｌ７９ＡまたはＬ７９Ｐにより、ＧＤＦ−１１結合性が、アクチビン結合性よりも大きな程度に低下する。Ｌ７９ＥまたはＬ７９Ｄにより、ＧＤＦ−１１結合性が保持される。驚くべきことに、Ｌ７９Ｅ改変体およびＬ７９Ｄ改変体では、アクチビン結合性が大いに低下している。ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験により、これらの非アクチビン受容体は、筋肉量を増加させる有意な能力を保持することが示されているが、他の組織に対する影響は減少することが示されている。これらのデータにより、アクチビンへの影響が低下したポリペプチドを得ることの望ましさおよび実現性が実証されている。
【００５１】
記載の変種は、種々のやり方で組み合わせることができる。さらに、本明細書に記載の突然変異誘発プログラムの結果により、ＡｃｔＲＩＩｂに、多くの場合保存することが有益であるアミノ酸位があることが示されている。これらとしては、６４位（塩基性アミノ酸）、８０位（酸性アミノ酸または疎水性アミノ酸）、７８位（疎水性、特にトリプトファン）、３７位（酸性、特にアスパラギン酸またはグルタミン酸）、５６位（塩基性アミノ酸）、６０位（疎水性アミノ酸、特にフェニルアラニンまたはチロシン）が挙げられる。したがって、本明細書に開示されている改変体のそれぞれにおいて、本開示は、保存することができるアミノ酸の枠組みを提供する。保存することが望ましい可能性がある他の位置は、以下の通りである：５２位（酸性アミノ酸）、５５位（塩基性アミノ酸）、８１位（酸性の）、９８（極性または荷電した、特にＥ、Ｄ、ＲまたはＫ）。
【００５２】
ある特定の実施形態では、単離されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの断片は、対応するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸の断片（例えば、配列番号３および４）から組換えによって作製したポリペプチドをスクリーニングすることによって得ることができる。さらに、断片は、従来のメリフィールドの固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃの化学などの当技術分野で公知の技法を使用して化学的に合成することができる。断片を作製し（組換えによってまたは化学合成によって）、試験して例えば、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質またはＡｃｔＲＩＩＢリガンドのアンタゴニスト（阻害物質）またはアゴニスト（活性化因子）として機能することができるペプチジル断片を同定することができる。
【００５３】
ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの機能的な改変体は、配列番号１、２、５、６、１２、１４、および１７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の場合では、機能的な改変体は、配列番号１、２、５、６、１２、１４、および１７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００５４】
ある特定の実施形態では、本発明は、治療効果、または安定性（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける有効期間およびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるタンパク質分解に対する耐性）を増強するような目的のために、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの構造を修飾することによって機能的改変体を作出すること意図している。修飾されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、例えば、アミノ酸の置換、欠失、または付加によっても作製することできる。例えば、ロイシンをイソロイシンもしくはバリンと、アスパラギン酸をグルタミン酸と、トレオニンをセリンと、孤立して交換すること、または同様にアミノ酸を構造的に関連するアミノ酸と交換すること（例えば、保存された突然変異）は、生じた分子の生物活性に対して主要な影響を及ぼさないと予想することが合理的である。保存された交換は、それらの側鎖が関連するアミノ酸のファミリー内で行われる交換である。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸配列における変化により、機能的なホモログが生じるかどうかを、改変体ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの、野生型ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと同様に細胞における応答をもたらすための、または、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、およびアクチビンＥ）、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＧＤＦ−１１またはミオスタチンなどの１種または複数種のリガンドに、野生型と同様に結合するための能力を評価することによって容易に決定することができる。
【００５５】
ある特定の実施形態では、本発明は、ポリペプチドのグリコシル化を変化させるためのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの特定の突然変異を意図している。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドにおける典型的なグリコシル化部位は、配列番号２に例示されている。そのような突然変異は、Ｏ結合グリコシル化部位またはＮ結合グリコシル化部位などの１つまたは複数のグリコシル化部位が導入または排除されるように選択することができる。アスパラギン結合グリコシル化認識部位は、一般に、適切な細胞のグリコシル化酵素によって特異的に認識されるトリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで「Ｘ」は任意のアミノ酸である）を含む。変化は、野生型ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの配列に１つまたは複数のセリン残基またはトレオニン残基を付加すること、または野生型ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの配列を１つまたは複数のセリン残基またはトレオニン残基で置換することによっても行うことができる（Ｏ結合グリコシル化部位について）。グリコシル化認識部位のアミノ酸の１位または３位の一方、または両方における種々のアミノ酸の置換または欠失（および／または２位におけるアミノ酸の欠失）により、修飾されたトリペプチド配列における非グリコシル化がもたらされる。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、配糖体をＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに化学的または酵素的に結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）させることによる。使用する結合方式に応じて、糖（複数可）を（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離のカルボキシル基；（ｃ）遊離のスルフヒドリル基、例えばシステインの遊離のスルフヒドリル基；（ｄ）遊離のヒドロキシル基、例えばセリン、トレオニン、またはヒドロキシプロリンの遊離のヒドロキシル基；（ｅ）芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンの芳香族残基；または（ｆ）グルタミンのアミド基に付けることができる。これらの方法は、参照により本明細書に組み込まれている、１９８７年９月１１日公開のＷＯ  ８７／０５３３０およびＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ（１９８１年）ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５９〜３０６頁に記載されている。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに存在する１つまたは複数の炭水化物部分の除去は、化学的に、および／または酵素的に実現することができる。化学的な脱グリコシルは、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、化合物のトリフルオロメタンスルホン酸、または相当する化合物に曝露することを含んでよい。この処理により、連結している糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外の大部分または全ての糖が切断されるが、アミノ酸配列は損なわれない。化学的な脱グリコシルは、さらにＨａｋｉｍｕｄｄｉｎら（１９８７年）Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ２５９巻：５２頁、およびＥｄｇｅら（１９８１年）Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １１８巻：１３１頁に記載されている。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの炭水化物部分の酵素的な切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら（１９８７年）Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １３８巻：３５０頁に記載の通り、種々のエンドグリコシダ��ゼおよびエキソグリコシダーゼを使用することによって実現することができる。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの配列は、哺乳動物の細胞、酵母細胞、昆虫細胞および植物細胞は全て、ペプチドのアミノ酸配列に影響され得る異なるグリコシル化パターンを導入し得るので、必要に応じて、使用する発現系の種類に応じて調整することができる。一般に、ヒトにおいて使用するためのＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞系またはＣＨＯ細胞系などの妥当なグリコシル化をもたらす哺乳動物の細胞系において発現させるが、他の哺乳動物の発現細胞系も同様に有用であると予想される。
【００５６】
本開示は、さらに、場合によって短縮型改変体を含む、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの改変体、特に、コンビナトリアル改変体のセットを生成する方法を意図している；コンビナトリアル変異体のプールは、機能的な改変体配列を同定するために特に有用である。そのようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、薬物動態の変化またはリガンド結合性の変化などの特性の変化を有するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド改変体を生成することであってよい。種々のスクリーニングアッセイが以下に提供され、そのようなアッセイは、改変体を評価するために使用することができる。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢリガンドがＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに結合するのを妨げるために、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド改変体を、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに結合する能力についてスクリーニングすることができる。
【００５７】
ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはその改変体の活性は、細胞に基づくアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいても試験することができる。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド改変体の、脂肪細胞の分化または機能に関与する遺伝子（例えば、ＵＣＰ−１）の発現に対する影響を評価することができる。これは、必要に応じて、１つまたは複数の組換えＡｃｔＲＩＩＢリガンドタンパク質（例えば、ＧＤＦ８）の存在下で実施され、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／またはその改変体、ならびに場合によって、ＡｃｔＲＩＩＢリガンドを作製するために、細胞をトランスフェクトすることができる。同様に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをマウスまたは他の動物に投与することができ、褐色脂肪細胞の熱発生などの１つまたは複数の脂肪細胞の特性を評価することができる。同様に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはその改変体の活性を、脂肪細胞（ｆａｔ  ｃｅｌｌ）、筋肉細胞、骨細胞、および神経細胞において、これらの細胞の成長に対する任意の影響について、例えば下記のアッセイによって試験することができる。そのようなアッセイは当技術分野で周知であり、ルーチン的である。ＳＭＡＤ応答性のレポーター遺伝子をそのような細胞系において使用して下流のシグナリングに対する影響をモニターすることができる。
【００５８】
天然に存在するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに対して選択的な効力を有するコンビナトリアルケミストリーで導いた改変体を生成することができる。そのような改変体タンパク質は、組換えＤＮＡ構築物から発現されたら、遺伝子療法のプロトコールにおいて使用することができる。同様に、突然変異誘発により、対応する野生型ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと劇的に異なる細胞内の半減期を有する改変体を生じることができる。例えば、変化したタンパク質に、ネイティブなＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの破壊、またはそうでなければ不活性化をもたらすタンパク質分解または他のプロセスに対する高い安定性または低い安定性のいずれかを与えることができる。そのような改変体およびそれらをコードする遺伝子を利用して、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの半減期を調節することによってＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのレベルを変化させることができる。例えば、短い半減期により、一過性の生物学的影響を生じることができ、誘導性の発現系の一部の場合、細胞内の組換えＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのレベルを厳重に調節することが可能になり得る。
【００５９】
ある特定の実施形態では、本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドにおいて天然に存在するいずれかに加えて、翻訳後修飾をさらに含んでよい。そのような修飾としては、これらに限定されないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質付加およびアシル化が挙げられる。結果として、修飾されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ポリエチレングリコール、脂質、多糖または単糖、およびリン酸などの非アミノ酸要素を含有してよい。そのような非アミノ酸要素の、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの機能性に対する影響を、他のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド改変体に関して本明細書に記載されているように試験することができる。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、細胞においてＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発生期の形態を切断することによって作製される場合、翻訳後プロセシングは、タンパク質の正しい折りたたみおよび／または機能に対しても重要であり得る。種々の細胞（ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３またはＨＥＫ２９３など）は、そのような翻訳後活性に対して特異的な細胞機構および特徴的なメカニズムを有し、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの正しい修飾およびプロセシングを確実にするために選出することができる。
【００６０】
ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの機能的改変体または修飾された形態は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの少なくとも一部分および１つまたは複数の融合ドメインを有する融合タンパク質を含む。周知のそのような融合ドメインの例としては、これらに限定されないが、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（例えば、Ｆｃ）、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）、またはヒト血清アルブミンが挙げられる。融合ドメインは、所望の特性を付与するように選択することができる。例えば、いくつかの融合ドメインが、アフィニティークロマトグラフィーによって融合タンパク質を単離するために特に有用である。親和性精製の目的のために、グルタチオンとコンジュゲートした樹脂、アミラーゼとコンジュゲートした樹脂、およびニッケルとコンジュゲートした樹脂またはコバルトとコンジュゲートした樹脂などの、アフィニティークロマトグラフィーのための関連性のあるマトリックスを使用する。そのようなマトリックスの多くは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＧＳＴ精製システムおよび（ＨＩＳ６）融合パートナーを用いると有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）などの「キット」形態で入手可能である。別の例として、融合ドメインは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの検出を容易にするように選択することができる。そのような検出ドメインの例としては、さまざまな蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）ならびに通常、特異的な抗体が入手可能な短いペプチド配列である「エピトープタグ」が挙げられる。特異的なモノクローナル抗体が容易に入手可能である周知のエピトープタグとしては、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）、およびｃ−ｍｙｃタグが挙げられる。ある場合には、融合ドメインは、関連性のあるプロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それによって、そこから組換えタンパク質が遊離することを可能にする、因子Ｘａまたはトロンビンに対するものなどのプロテアーゼ切断部位を有する。次いで、遊離したタンパク質を、その後のクロマトグラフィーによる分離によって融合ドメインから単離することができる。ある特定の好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏで安定化するドメイン（「安定化」ドメイン）と融合している。「安定化すること」は、破壊の減少、腎臓によるクリアランスの減少、または他の薬物動態的な影響によるものであるかどうかは関係なく、血清中の半減期を増加させることのいずれをも意味する。免疫グロブリンのＦｃ部分と融合することにより、広範囲のタンパク質に対して望ましい薬物動態特性が付与されることが公知である。同様に、ヒト血清アルブミンに融合することによって、望ましい特性を付与することができる。選択することができる他の種の融合ドメインとしては、多量体化（例えば、二量体化、四量体化）しているドメインおよび機能的ドメイン（筋肉の成長をさらに刺激することなどの追加的な生物学的機能を付与する）が挙げられる。
【００６１】
特定の例として、本発明は、Ｆｃドメイン（例えば、配列番号１３）と融合した細胞外（例えば、ＧＤＦ８結合性）ドメインを含むＧＤＦ８アンタゴニストとしての融合タンパク質を提供する。
【００６２】
【化３】
0005912078.tif 000004
場合によって、Ｆｃドメインは、Ａｓｐ−２６５、リジン３２２、およびＡｓｎ−４３４などの残基において１つまたは複数の突然変異を有する。ある場合では、これらの突然変異の１つまたは複数（例えば、Ａｓｐ−２６５突然変異）を有する変異体Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃγ受容体に対する結合能が低下している。他の場合では、これらの突然変異の１つまたは複数（例えば、Ａｓｎ−４３４突然変異）を有する変異体Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して、ＭＨＣクラスＩ関連Ｆｃ受容体（ＦｃＲＮ）に対する結合能が上昇している。
【００６３】
融合タンパク質の種々の要素は、所望の機能性に一致するように任意に配置することができることが理解される。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、異種ドメインに対してＣ末端に位置付けることができる、または、その代わりに、異種ドメインを、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに対してＣ末端に位置付けることができる。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインと異種ドメインは、融合タンパク質において隣接する必要はなく、また、追加的なドメインまたはアミノ酸配列を、いずれかのドメインのＣ末端もしくはＮ末端またはドメイン間に含めることができる。
【００６４】
ある特定の実施形態では、本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを安定化することができる１つまたは複数の修飾を含有する。例えば、そのような修飾により、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける半減期が増強される、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの循環半減期が増強される、またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのタンパク質分解が低下する。そのような安定化修飾としては、これらに限定されないが、融合タンパク質（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび安定剤ドメインを含む融合タンパク質を含む）、グリコシル化部位の修飾（例えば、グリコシル化部位をＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに付加することを含む）、および炭水化物部分の修飾（例えば、炭水化物部分をＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドから除去することを含む）が挙げられる。融合タンパク質の場合では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＩｇＧ分子などの安定剤ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）と融合している。本明細書で使用される、「安定剤ドメイン」という用語は、融合タンパク質の場合のような融合ドメイン（例えば、Ｆｃ）を指すだけでなく、炭水化物部分などの非タンパク質性の修飾、またはポリエチレングリコールなどの非タンパク質性ポリマーを含む。
【００６５】
ある特定の実施形態では、本発明により、他のタンパク質から単離された、またはそうでなければ他のタンパク質を実質的に含まない、利用可能なＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの単離および／または精製された形態が作出される。
【００６６】
ある特定の実施形態では、本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（修飾されていない、または修飾された）は、種々の当技術分野で公知の技法によって作製することができる。例えば、そのようなＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、Ｂｏｄａｎｓｋｙ，  Ｍ．  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３年）およびＧｒａｎｔ  Ｇ．  Ａ．（編）、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ、Ｗ．  Ｈ．  ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２年）に記載の技法などの標準のタンパク質化学の技法を使用して合成することができる。さらに、自動ペプチド合成機が市販されている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  Ｍｏｄｅｌ  ３９６；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  ９６００）。あるいは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、それらの断片または改変体は、当技術分野で周知のさまざまな発現系（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＣＯＳ細胞、バキュロウイルス）を使用して、組換えによって作製することができる（以下も参照されたい）。別の実施形態では、修飾されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは修飾されていないＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、天然に存在する、または組換えによって作製した全長のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、例えば、プロテアーゼ、例えば、トリプシン、サーモリシン、キモトリプシン、ペプシン、または対塩基性アミノ酸変換酵素（ＰＡＣＥ）を使用して消化することによって作製することができる。コンピュータ解析（市販のソフトウェア、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、Ｏｍｅｇａ、ＰＣＧｅｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．を使用する）を使用してタンパク質分解の切断部位を同定することができる。あるいは、そのようなＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、天然に存在する、または組換えによって作製した全長のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドから、当技術分野で公知の標準の技法など、例えば化学的切断（例えば、臭化シアン、ヒドロキシルアミン）によって作製することができる。
【００６７】
３．ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸
ある特定の態様では、本発明は、本明細書に開示されている任意の改変体を含めた、任意のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）をコードする、単離された核酸および／または組換え型の核酸を提供する。例えば、以下の配列は、天然に存在するヒトのＡｃｔＲＩＩＢ前駆体ポリペプチドをコードする（配列番号４）（ＮＭ＿００１１０６のヌクレオチド５〜１５４３、１５３９ｂｐ）：
【００６８】
【化４】
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以下の配列は、ヒトの可溶性の（細胞外）ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドコードする（配列番号３）（３４８ｂｐ）。
【００６９】
【化５】
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対象の核酸は、一本鎖または二本鎖であってよい。そのような核酸は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であってよい。これらの核酸は、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを作出するための方法において、または直接的な治療剤として（例えば、遺伝子療法による手法）使用することができる。
【００７０】
ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする対象の核酸は、さらに、配列番号３の改変体である核酸を含むと理解されている。改変体ヌクレオチド配列は、対立遺伝子改変体などの、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加または欠失によって異なる配列を含み、したがって、配列番号４に示されているコード配列のヌクレオチド配列と異なるコード配列を含む。
【００７１】
ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、単離された、または組換え型の核酸配列を提供する。当業者は、配列番号３と相補的な核酸配列、および配列番号３の改変体も本発明の範囲内であることを理解するであろう。別の実施形態では、本発明の核酸配列は、単離されていてよい、組換え型であってよい、および／または異種ヌクレオチド配列と融合していてよい、またはＤＮＡライブラリー内のものであってよい。例えば、本発明は、配列番号１０または１５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、単離された、または組換え型の核酸配列を提供する。
【００７２】
他の実施形態では、本発明の核酸は、高度にストリンジェントな条件下で、配列番号３に示されているヌクレオチド配列、配列番号３の相補配列、またはその断片とハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。上記の通り、当業者は、ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件は変動し得ることを容易に理解するであろう。当業者は、ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件は変動し得ることを容易に理解するであろう。例えば、約４５℃、６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でハイブリダイゼーション、その後、５０℃、２．０×ＳＳＣで洗浄を実施することができた。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度は、低ストリンジェンシーの５０℃、約２．０×ＳＳＣ〜高ストリンジェンシーの５０℃で約０．２×ＳＳＣから選択することができる。さらに、洗浄ステップにおける温度は、低ストリンジェンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで上昇させることができる。温度と塩の両方が変動してよい、または、他の変量が変化する一方で、温度または塩濃度は一定に保たれてよい。一実施形態では、本発明は、室温で６×ＳＳＣの低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、その後室温で２×ＳＳＣで洗浄される核酸を提供する。
【００７３】
遺伝暗号における縮重に起因して配列番号３に記載の核酸と異なる単離された核酸も、本発明の範囲内である。例えば、いくつものアミノ酸が２つ以上のトリプレットによって指定される。同じアミノ酸、またはシノニム（例えば、ＣＡＵとＣＡＣは、ヒスチジンに対するシノニムである）を特定するコドンにより、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」突然変異がもたらされる。しかし、哺乳動物の細胞の間に、対象のタンパク質のアミノ酸配列における変化を導くＤＮＡ配列の多型が存在すると予想される。当業者は、天然の対立遺伝子変種に起因して、所与の種の個体の間に、特定のタンパク質をコードする核酸の１つまたは複数のヌクレオチド（ヌクレオチドの最大約３〜５％）においてこれらの変種が存在することを理解するであろう。任意の全てのそのようなヌクレオチドの変種および生じたアミノ酸の多型は、本発明の範囲内である。
【００７４】
ある特定の実施形態では、本発明の組換え型の核酸は、発現構築物中の１つまたは複数の制御ヌクレオチド配列に作動可能に連結していてよい。制御ヌクレオチド配列は、一般に、発現のために使用する宿主細胞に適している。多数の種類の適切な発現ベクターおよび適切な制御配列は、さまざまな宿主細胞に対して当技術分野で公知である。一般には、前記１つまたは複数の制御ヌクレオチド配列としては、これらに限定されないが、プロモーター配列、リーダー配列またはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびにエンハンサー配列またはアクチベーター配列を挙げることができる。当技術分野で公知の構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターは、本発明で意図されている。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または２つ以上のプロモーターのエレメントを併せ持つハイブリッドプロモーターのいずれかであってよい。発現構築物は、プラスミドなどのエピソーム上で細胞内に存在してよい、または、発現構築物は、染色体内に挿入することができる。好ましい実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含有する。選択マーカー遺伝子は、当技術分野で周知であり、使用する宿主細胞によって変動する。
【００７５】
本発明のある特定の態様では、対象の核酸は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、少なくとも１つの制御配列に作動可能に連結した発現ベクター中にもたらされる。制御配列は、当技術分野で認められており、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが直接発現されるように選択される。したがって、制御配列という用語は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節エレメントを含む。典型的な制御配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０年）に記載されている。例えば、ＤＮＡ配列に作動可能に連結しているときに、その発現を調節する多種多様な発現調節配列のいずれも、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させるために、これらのベクターに使用することができる。そのような有用な発現調節配列としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターおよび後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルスの最初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系またはＴＲＣ系、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによってその発現が導かれるＴ７プロモーター、ファージラムダの主要なオペレーター領域およびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素に対するプロモーター、Ｐｈｏ５などの酸性ホスファターゼのプロモーター、酵母α接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系のポリヘドロン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）プロモーターならびに原核細胞もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を調節することが公知である他の配列、ならびに、それらのさまざまな組合せが挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択肢および／または発現されることが望ましいタンパク質の種類などの因子に左右され得ることが理解されるべきでる。さらに、ベクターのコピー数、ベクターにコードされる任意の他のタンパク質、例えば抗生物質マーカーなどのコピー数および発現を調節する能力も考慮するべきである。
【００７６】
本発明の組換え型の核酸は、クローニングされた遺伝子、またはその部分を、原核細胞、真核細胞（酵母細胞、トリの細胞、昆虫細胞または哺乳動物の細胞）のいずれか、またはその両方における発現に適したベクターにライゲーションすることによって作製することができる。組換えＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを作製するための発現ビヒクルは、プラスミドおよび他のベクターを含む。例えば、適切なベクターとしては、以下の種類のプラスミドが挙げられる：Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞において発現させるための、ｐＢＲ３２２由来のプラスミド、ｐＥＭＢＬ由来のプラスミド、ｐＥＸ由来のプラスミド、ｐＢＴａｃ由来のプラスミドおよびｐＵＣ由来のプラスミド。
【００７７】
いくつかの哺乳動物の発現ベクターは、細菌におけるベクターの繁殖を容易にするための原核生物の配列と、真核細胞において発現される１つまたは複数の真核生物の転写ユニットとの両方を含有する。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来のベクターは、真核細胞をトランスフェクトするために適した哺乳動物の発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかは、原核細胞および真核細胞の両方において複製および薬物耐性選択を容易にするために、ｐＢＲ３２２などの細菌のプラスミドからの配列で修飾される。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）、またはエプスタイン−バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来の、およびｐ２０５）などのウイルスの派生体を、真核細胞においてタンパク質を一過性に発現させるために使用することができる。他のウイルス（レトロウイルスを含む）の発現系の例は、以下の遺伝子療法の送達系の説明において見ることができる。プラスミドの調製において、および宿主生物体の形質転換において利用されるさまざまな方法は、当技術分野で周知である。原核細胞および真核細胞の両方に適した他の発現系、ならびに一般的な組換え手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）１６章および１７章を参照されたい。ある場合には、バキュロウイルスの発現系を使用することによって組換え型のポリペプチドを発現させることが望ましいことがある。そのようなバキュロウイルスの発現系の例としては、ｐＶＬ由来のベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１など）、ｐＡｃＵＷ由来のベクター（ｐＡｃＵＷ１など）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来のベクター（ｐＢｌｕｅＢａｃ  ＩＩＩを含有するβ−ｇａｌなど）が挙げられる。
【００７８】
好ましい実施形態では、Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）およびｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃ．）などのベクターを、対象のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをＣＨＯ細胞において産生させるために設計する。明らかになるように、対象の遺伝子構築物は、精製のために、例えば、融合タンパク質または改変体タンパク質を含めたタンパク質を産生させるために、培養物中で繁殖させた細胞において対象のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを発現させるために使用することができる。
【００７９】
本発明は、１つまたは複数の対象のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする配列（例えば、配列番号３、４、１０、または１５）を含む組換え型の遺伝子でトランスフェクトした宿主細胞にも関する。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であってよい。例えば、本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌の細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルスの発現系を使用して）、酵母または哺乳動物の細胞において発現させることができる。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【００８０】
したがって、本発明は、さらに、対象のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを作製する方法に関する。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトした宿主細胞は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現を起こすのに適した条件下で培養することができる。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、細胞とＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含有する培地の混合物から分泌させ、単離することができる。あるいは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、細胞質によって、または膜画分中に保持し、細胞を回収し、溶解させ、タンパク質を単離することができる。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞を培養するために適した培地は、当技術分野で周知である。対象のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、細胞培養培地、宿主細胞、またはその両方から、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体を用いた免疫親和性精製を含めたタンパク質を精製するための当技術分野で公知の技法を使用して単離することができる。好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、その精製を容易にするドメインを含有する融合タンパク質である。
【００８１】
別の実施形態では、組換えＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの所望の部分のＮ末端においてポリ（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位の配列などの精製リーダー配列をコードする融合遺伝子により、Ｎｉ２＋金属樹脂を使用したアフィニティークロマトグラフィーによって発現された融合タンパク質を精製することが可能になり得る。次いで、その後に精製リーダー配列をエンテロキナーゼで処理することによって除去して、精製されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをもたらすことができる（例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉら、（１９８７年）Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４１１巻：１７７頁；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８巻：８９７２頁）を参照されたい）。
【００８２】
融合遺伝子を作出するための技法は、周知である。基本的に、異なるポリペプチド配列をコードするさまざまなＤＮＡ断片の連結は、従来の技法に従って、ライゲーションのための平滑末端になった末端または付着末端になった末端、適切な末端をもたらすための制限酵素消化、必要に応じて突出末端を埋めること、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素によるライゲーションを用いて実施する。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含めた従来の技法によって合成することができる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を、その後にアニーリングしてキメラ遺伝子配列を生成することができる２つの連続した遺伝子断片間の相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを使用して行うことができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｅｄｓ．  Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２年を参照されたい）。
【００８３】
４．抗体および他のアンタゴニスト
本発明の別の態様は、本明細書に開示されている標的に結合するタンパク質および本明細書に開示されている標的の発現を阻害する核酸を含めた、抗体および他のアンタゴニストに関する。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）に特異的に応答する抗体、およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと競合的に結合する抗体を、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの活性のアンタゴニストとして使用することができる。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに由来する免疫原を使用することにより、抗タンパク質／抗ペプチドの抗血清またはモノクローナル抗体を、標準のプロトコールによって作出することができる（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ：１９８８年）を参照されたい）。マウス、ハムスターまたはウサギなどの哺乳動物を、免疫原性の形態のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドもしくはＡｃｔＲＩＩＢリガンド、抗体応答を引き出すことができる抗原断片、または融合タンパク質で免疫化することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与するための技法としては、担体へのコンジュゲーションまたは当技術分野で周知の他の技法が挙げられる。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢリガンドの免疫原性部分を、アジュバントの存在下で投与することができる。免疫化の進行を、血漿中または血清中の抗体価を検出することによってモニターすることができる。標準のＥＬＩＳＡまたは他の免疫測定法を、抗原として免疫原を用いて使用して、抗体のレベルを評価することができる。
【００８４】
ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢリガンドの抗原性調製物を用いて動物を免疫化した後、抗血清を得ることができ、望ましい場合には、ポリクローナル抗体を血清から単離することができる。モノクローナル抗体を作製するために、抗体産生細胞（リンパ球）を免疫化した動物から回収し、標準の体細胞融合手順によって骨髄腫細胞などの不死化細胞と融合してハイブリドーマ細胞を生じることができる。そのような技法は当技術分野で周知であり、例えば、ハイブリドーマ法（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって最初に開発された、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５〜４９７頁）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂａｒら、１９８３年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４巻：７２頁）、およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅら、１９８５年、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓおよびＣａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．  ７７〜９６頁）が挙げられる。ハイブリドーマ細胞を、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに特異的に応答する抗体およびそのようなハイブリドーマ細胞を含む培養物から単離されたモノクローナル抗体の産生について、免疫化学的にスクリーニングすることができる。
【００８５】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、対象のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢリガンドにも特異的に応答するその断片を含むものとする。抗体は、従来の技法を使用して断片化することができ、その断片を、有用性について、上記の全抗体についてと同様にスクリーニングすることができる。例えば、抗体をペプシンで処理することによってＦ（ａｂ）２断片を生成することができる。生じたＦ（ａｂ）２断片を処理してジスルフィド架橋を減少させてＦａｂ断片を作製することができる。本発明の抗体は、さらに、抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域によって付与されるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに対する親和性を有する二重特異性分子、単鎖分子、およびキメラ分子ならびにヒト化分子を含むものとする。好ましい実施形態では、抗体は、抗体に付き、検出することができる標識をさらに含む（例えば、標識は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素の補因子であってよい）。
【００８６】
ある特定の好ましい実施形態では、本発明の抗体はモノクローナル抗体であり、ある特定の実施形態では、本発明は、新規の抗体を生成するための利用可能な方法を作出する。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢリガンドに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するための方法は、マウスに、ある量の、検出可能な免疫応答を刺激するために有効なＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢリガンドを含む免疫原性組成物を投与すること、マウスから抗体産生細胞（例えば、脾臓からの細胞）を得ること、抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合して抗体産生ハイブリドーマを得ること、および、抗体産生ハイブリドーマを試験して、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢリガンドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定することを含んでよい。ハイブリドーマが得られたら、それを細胞培養物中で、場合によって、ハイブリドーマ由来の細胞が、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢリガンドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する培養条件において、繁殖させることができる。モノクローナル抗体を細胞培養物から精製することができる。
【００８７】
抗体に関して使用される形容詞「に特異的に応答する」は、当技術分野で一般に理解されているように、対象の抗原（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）と対象でない他の抗原との間で抗体が十分に選択的であり、抗体が、最低でも、特定の種類の生物試料中の対象の抗原の存在を検出するために有用であることを意味するものとする。治療的適用などの、抗体を使用するある特定の方法では、高い程度の結合の特異性が望ましい場合がある。モノクローナル抗体は、一般に、（ポリクローナル抗体と比較して）所望の抗原と交差反応性のポリペプチドとを有効に識別する傾向が強い。抗体：抗原相互作用の特異性に影響を及ぼす１つの特徴は、抗体の抗原に対する親和性である。所望の特異性はさまざまな異なる親和性で達し得るが、一般に好ましい抗体は、約１０−６、１０−７、１０−８、１０−９またはそれ未満の親和性（解離定数）を有する。
【００８８】
さらに、望ましい抗体を同定する目的で、抗体をスクリーニングするために使用する技法は、得られる抗体の特性に影響を及ぼす可能性がある。例えば、抗体を、溶液中の抗原と結合させるために使用する場合、溶液の結合性を試験することが望ましいことがある。さまざまな異なる技法が、特に望ましい抗体を同定するために、抗体と抗原の相互作用を試験するために利用可能である。そのような技法としては、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイ、Ｂｉａ−ｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、サンドイッチアッセイ（例えば、ＩＧＥＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄの常磁性ビーズ系）、ウェスタンブロット、免疫沈降アッセイ、および免疫組織学的検査が挙げられる。
【００８９】
ある特定の態様では、本開示は、可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは可溶性のＡｃｔＲＩＩＢリガンドに結合する抗体を提供する。そのような抗体は、上記したが、可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは可溶性のＡｃｔＲＩＩＢリガンドまたはその断片を抗原として使用して生成することができる。この種類の抗体は、例えば、生物試料中のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを検出するために、および／または、個体における可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのレベルをモニターするために使用することができる。ある場合では、可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは可溶性のＡｃｔＲＩＩＢリガンドに特異的に結合する抗体を使用して、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢリガンドの活性を調節し、それによって熱発生性脂肪細胞を増加させることができる。
【００９０】
ミオスタチンおよびＧＤＦ３などのある特定のリガンドは、それぞれのプロペプチドの結合部分、またはその改変体を含むポリペプチドを使用することによって阻害することができる。そのようなプロペプチドは、Ｆｃ融合タンパク質を含めた、融合タンパク質として調製することができる。適切なプロペプチドの例は、公開特許出願ＷＯ  ０２／０８５３０６およびＷＯ  ０６／００２３８７に開示されている。
【００９１】
さらに、いわゆる「トラップ」（例えば、フォリスタチン、ＦＬＲＧ、ＦＳＴＬ、ケルベロスおよびＣｏｃｏ）、可溶性のＩ型受容体、例えば、ＡＬＫ−７などの他の結合性タンパク質を使用することができる。そのようなポリペプチドの例は、公開特許出願ＷＯ  ０５／１１５４３９、ＷＯ  ０８／１０９７７９、ＷＯ  ０８／０６７４８０、ＷＯ  ０７／１０９６８６、ＷＯ  ０５／１００５６３、およびＷＯ  ０５／０２５６０１において見ることができる。
【００９２】
アンチセンスプローブまたはＲＮＡｉプローブなどの核酸（天然に存在するヌクレオチドおよび天然に存在しないヌクレオチドの両方を含んでよい）を使用して、ＡｃｔＲＩＩＢまたは本明細書で考察したリガンドのいずれかの発現を阻害することができる。
【００９３】
５．スクリーニングアッセイ
ある特定の態様では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである化合物（作用剤）を同定するための、対象のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）の使用に関する。このスクリーニングによって同定された化合物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで組織の成長を調節するその能力を評価するために、脂肪、筋肉、骨、軟骨、および／またはニューロンなどの組織において試験することができる。場合によって、これらの化合物を、動物モデルにおいてさらに試験して、ｉｎ  ｖｉｖｏで組織の成長を調節するその能力を評価することができる。
【００９４】
ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをターゲティングすることによって組織の成長を調節するための治療剤についてスクリーニングするための多数の手法がある。ある特定の実施形態では、化合物のハイスループットなスクリーニングを行って、脂肪、筋肉、骨、軟骨、および／またはニューロンの成長に対するＡｃｔＲＩＩＢ媒介性の影響をかき乱す作用剤を同定することができる。ある特定の実施形態では、アッセイを行って、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの、その結合パートナー、例えばＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、アクチビン、ＧＤＦ３、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ８、またはＧＤＦ１１）などへの結合を特異的に阻害する、または低下させる化合物をスクリーニングし、同定することができる。あるいは、アッセイを使用して、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの、その結合性タンパク質、例えばＡｃｔＲＩＩＢリガンドなどへの結合を増強する化合物を同定することができる。別の実施形態では、化合物を、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと相互作用するそれらの能力によって同定することができる。
【００９５】
さまざまなアッセイ形式が十分であり、本開示に照らして、本明細書に明白に記載されていないアッセイ形式は、それでも、当業者に理解されよう。本明細書に記載のように、本発明の試験化合物（作用剤）は、任意のコンビナトリアルケミストリー法によって創出することができる。あるいは、対象化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成された天然に存在する生体分子であってよい。組織の成長のモジュレーターとして作用するそれらの能力について試験される化合物（作用剤）は、例えば、細菌、酵母、植物または他の生物体（例えば、天然物）によって産生することができる、化学的に作製することができる（例えば、ペプチド模倣薬を含めた小分子）、または、組換えによって作製することができる。本発明で意図される試験化合物としては、非ペプチジル有機分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣薬、糖、ホルモン、および核酸分子が挙げられる。特定の実施形態では、試験作用剤は、約２，０００ダルトン未満の分子量を有する小有機分子である。
【００９６】
本発明の試験化合物は、単一の、別個の実体として提供することができる、または例えば、コンビナトリアルケミストリーで作出された、複雑さが大きいライブラリー内に提供することができる。これらのライブラリーは、例えば、アルコール、ハロゲン化アルキル、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテルおよび他のクラスの有機化合物を含んでよい。試験系への試験化合物の提示は、特に最初のスクリーニングステップにおいて、単離された形態または化合物の混合物のいずれかであってよい。場合によって、化合物は、他の化合物で誘導体化されてもよく、化合物の単離を容易にする誘導体化基を有する。非限定的な誘導体化基の例としては、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、緑色蛍光タンパク質、同位元素、ポリヒスチジン、磁気ビーズ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光活性化可能な架橋剤またはそれらの任意の組合せが挙げられる。
【００９７】
化合物のライブラリーおよび天然の抽出物を試験する多くの薬物スクリーニングプログラムでは、所与の期間中に調査される化合物の数を最大にするために、ハイスループットなアッセイが望ましい。精製または半精製されたタンパク質を用いて導くことができるような無細胞系において実施されるアッセイが、試験化合物によって媒介される分子標的における変化の急速な発生および比較的容易な検出が可能になるように生成することができるという点で、多くの場合「一次」スクリーニングとして好ましい。さらに、試験化合物の細胞の毒性または生物学的利用能の影響は、一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系では無視することができ、その代わりに、アッセイは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとその結合性タンパク質（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド）との間の結合親和性の変化において明白であり得る分子標的に対する薬物の影響に主に焦点が置かれている。
【００９８】
単に例示するために、本発明の典型的なスクリーニングアッセイでは、アッセイの目的に応じて、対象化合物を、普通はＡｃｔＲＩＩＢリガンドに結合することができる単離され、精製されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと接触させる。次いで、化合物の混合物およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに、ＡｃｔＲＩＩＢリガンドを含有する組成物を加える。ＡｃｔＲＩＩＢ／ＡｃｔＲＩＩＢリガンド複合体の検出および数量化により、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとその結合性タンパク質の複合体の形成を阻害すること（または強化すること）における化合物の有効性を決定するための手段がもたらされる。化合物の有効性は、さまざまな濃度の試験化合物を使用して得られたデータから用量応答曲線を生成することによって評価することができる。さらに、対照アッセイも実施して、比較のための基線をもたらすことができる。例えば、対照アッセイでは、単離され、精製されたＡｃｔＲＩＩＢリガンドを、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含有する組成物に加え、ＡｃｔＲＩＩＢ／ＡｃｔＲＩＩＢリガンド複合体の形成を、試験化合物の非存在下で定量化する。一般に、反応物が混和され得る順番は変動してよく、同時に混和することができることが理解されよう。さらに、精製されたタンパク質の代わりに、細胞抽出物および溶解物を使用して適切な無細胞アッセイ系を提供することができる。
【００９９】
ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとその結合性タンパク質の複合体の形成は、さまざまな技法によって検出することができる。例えば、複合体の形成の調節を、例えば、検出可能な標識タンパク質、例えば、放射標識された（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈ）、蛍光標識された（例えば、ＦＩＴＣ）、または酵素的に標識されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはその結合性タンパク質などを使用して、免疫測定法によって、またはクロマトグラフィーによる検出によって定量化することができる。
【０１００】
ある特定の実施形態では、本発明は、直接的、または間接的のいずれかで、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとその結合性タンパク質の相互作用の程度を測定することにおいて、蛍光偏光アッセイおよび蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイの使用を意図している。さらに、光導波路（ＰＣＴ公開ＷＯ  ９６／２６４３２および米国特許第５，６７７，１９６号）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、表面電荷センサー、および表面力センサーに基づく検出方式などの他の検出方式が、本発明の多くの実施形態に適合する。
【０１０１】
さらに、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとその結合性タンパク質の相互作用を攪乱または強化する作用剤を同定するために、「二重ハイブリッドアッセイ」としても公知である相互作用トラップアッセイの使用を意図している。例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら、１９９３年Ｃｅｌｌ  ７２巻：２２３〜２３２頁；Ｍａｄｕｒａら、１９９３年Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８巻：１２０４６〜１２０５４頁；Ｂａｒｔｅｌら、１９９３年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４巻：９２０〜９２４頁；およびＩｗａｂｕｃｈｉら、１９９３年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８巻：１６９３〜１６９６頁）を参照されたい。特定の実施形態では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとその結合性タンパク質の相互作用を分離する化合物（例えば、小分子またはペプチド）を同定するために、逆二重ハイブリッド系の使用を意図している。例えば、ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ、１９９９年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２７巻：９１９〜２９頁；ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ、１９９９年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７巻：３７４〜８１頁；および米国特許第５，５２５，４９０号；同第５，９５５，２８０号；および同第５，９６５，３６８号を参照されたい。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、対象化合物を、本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと相互作用するそれらの能力によって同定する。化合物とＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの相互作用は、共有結合性または非共有結合性であってよい。例えば、そのような相互作用は、光架橋、放射標識したリガンドを結合させること、およびアフィニティークロマトグラフィー（Ｊａｋｏｂｙ  ＷＢら、１９７４年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４６巻：１頁）を含めたｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける生化学的方法を使用して、タンパク質レベルで同定することができる。ある場合では、化合物を、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに結合する化合物を検出するためのアッセイなどのメカニズムに基づくアッセイにおいてスクリーニングすることができる。これは、固相または液相の結合事象を含んでよい。あるいは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする遺伝子を、レポーター系（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質）を用いて細胞にトランスフェクトし、ライブラリーと対照してスクリーニングすることができ、ハイスループットなスクリーニングによって、またはライブラリーの個々のメンバーと対照してスクリーニングすることが好ましい。他のメカニズムに基づく結合アッセイ、例えば、自由エネルギーの変化を検出する結合アッセイを使用することができる。結合アッセイは、ウェル、ビーズまたはチップに固定した標的、または固定化抗体に捕捉された標的を用いて、またはキャピラリー電気泳動で分離することによって実施することができる。結合した化合物は、通常、比色定量または蛍光または表面プラズモン共鳴を使用して検出することができる。
【０１０３】
ある特定の態様では、本発明は、体重増加および肥満を調節するための方法および作用剤を提供する。細胞レベルでは、追加的な脂肪細胞（ｆａｔ  ｃｅｌｌ）（脂肪細胞）の生成につながる脂肪細胞の増殖および分化が肥満の発生において重大である。したがって、同定された任意の化合物を、細胞全体または組織全体、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて試験して、脂肪細胞の増殖または分化を測定することによって脂肪生成を調節するそれらの能力を確証することができる。この目的のために、当技術分野で公知のさまざまな方法を利用することができる。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）または試験化合物の、脂肪生成に対する影響を、細胞に基づくアッセイにおいて、例えば、オイルレッドＯ染色ベシクル内のトリアシルグリセロールの蓄積を観察することによって、およびＦＡＢＰ（ａＰ２／４２２）およびＰＰＡＲγ２などのある特定の脂肪細胞マーカーの出現によって、３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞の成熟脂肪細胞への分化を測定することによって決定することができる。例えば、Ｒｅｕｓｃｈら、２０００年、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０巻：１００８〜２０頁；Ｄｅｎｇら、２０００年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．  １４１巻：２３７０〜６頁；Ｂｅｌｌら、２０００年、Ｏｂｅｓ  Ｒｅｓ．  ８巻：２４９〜５４頁を参照されたい。細胞に基づくアッセイの別の例としては、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび試験化合物の、脂肪細胞または脂肪細胞の前駆体細胞（例えば、３Ｔ３−Ｌ１細胞）の増殖における役割を、例えば、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）陽性細胞をモニターすることによって分析することが挙げられる。例えば、Ｐｉｃｏら、１９９８年、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ＢｉｏＣｈｅｍ．  １８９巻：１〜７頁；Ｍａｓｕｎｏら、２００３年、Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ．  ７５巻：３１４〜２０頁を参照されたい。
【０１０４】
本発明のスクリーニングアッセイは、対象のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの改変体だけでなく、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢシグナリングのアゴニストおよびアンタゴニストを含めた任意の試験化合物にも適用されることが理解される。さらに、これらのスクリーニングアッセイは、薬物の標的の検証および品質管理の目的のために有用である。
【０１０５】
６．典型的な治療的使用
ある特定の実施形態では、本発明の組成物（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、アクチビンまたはＧＤＦ８）の異常な活性に関連する疾患または状態を処置または予防するために使用することができる。ある特定の実施形態では、本発明は、処置または予防を必要とする個体を、個体に治療有効量の上記のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを投与することによって処置または予防する方法を提供する。これらの方法は、特に、動物、より詳細にはヒトの治療的処置および予防的処置を目的とする。
【０１０６】
本明細書で使用される、障害または状態を「予防する」治療剤は、統計サンプルにおいては、処置されていない対照試料と比較して、処置した試料における障害または状態の発生率を低下させる、または、処置されていない対照試料と比較して、障害または状態の１つまたは複数の症状の発症を遅延させる、もしくはその重症度を低下させる化合物を指す。本明細書で使用される「処置すること」という用語は、言及した状態の予防法、またはいったん確立された状態の寛解または排除を含む。
【０１０７】
本明細書において実証されている通り、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃにより、ミトコンドリアにおける脱共役を媒介するタンパク質であるＵＣＰ１の発現が促進され、代謝的に活性な脂肪組織または熱発生脂肪組織が導かれる。したがって、本明細書に開示されている組成物は、褐色脂肪組織または褐色脂肪細胞の欠乏、メタボリックシンドローム（シンドロームＸとしても公知である）、糖尿病、高脂血症、高コレステロール血症、過食および過食症、高血圧症、動脈硬化症（冠動脈疾患または冠動脈心疾患）、心筋梗塞、うっ血性心不全、脳梗塞、脳血栓、呼吸器疾患（ピックウィック症候群など）、結腸癌、前立腺癌、乳癌、子宮内膜癌、腎臓癌、成長ホルモンが欠乏している被験体、正常変異低身長、ターナー症候群、ならびに全除脂肪体重の百分率として代謝活性の低下または安静時エネルギー消費の減少を示す他の病態、例えば、急性リンパ性白血病の小児、などのさまざまな障害を処置するために使用することができる。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物（例えば、可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）を熱発生性脂肪細胞の形成および／または活性を促進するために使用する。上記の通り、白色脂肪組織内部の熱発生性、散在性の褐色脂肪組織および褐色脂肪細胞は、多数の、ミトコンドリアで発現されている脱共役タンパク質１（ＵＣＰ）を含有する。高カロリーを摂取した、褐色脂肪細胞を欠く個体は、過剰なカロリー摂取を熱に変換することができず、したがって、やむを得ず、使用されない生化学的エネルギーを、一般には広がった白色脂肪組織として貯蔵する。１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、ＧＤＦ８）の機能に対するｉｎ  ｖｉｖｏにおける遮断または拮抗により、散在性の貯蔵所内の褐色脂肪細胞または白色脂肪組織内部に分布した褐色脂肪細胞の熱発生活性を有効に増加させることができる。この手法は、本明細書で示されるデータによって確証され、支持され、それによって、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質により、白色脂肪におけるＵＣＰ１の発現が誘導され、体組成全体が増強され、高脂肪食のマウスにおける代謝的な状態が改善されることが示された。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物（例えば、可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）を、循環器疾患およびＩＩ型糖尿病が発生する危険性を増加させる障害および危険因子の組合せであるメタボリックシンドローム（シンドロームＸおよびインスリン抵抗性シンドロームとしても公知である）の処置の一部として使用する。大部分の患者は高齢であり、肥満であり、座りがちであり、ある程度のインスリン抵抗性を有する。中心の（腹部または内臓の）脂肪症が、このシンドロームの重要な特徴である。
【０１１０】
関連する実施形態では、本発明の可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび他の組成物を、インスリン抵抗性および相対的にインスリンが欠乏していることに関連した血糖の上昇を特徴とするＩＩ型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病または成人発症型糖尿病としても公知である）の処置の一部として使用することができる。糖尿病における複雑な、多因子性の代謝的な変化は、多くの場合、多くの器官、最も重要なことに心臓血管系の傷害および機能損傷につながる。ＩＩ型糖尿病は、多くの場合、肥満（腹部または内臓の脂肪症）、高血圧症、コレステロールの上昇、およびメタボリックシンドロームと関連する。ＩＩ型糖尿病に対する重要な危険因子としては、加齢、高脂肪食、および座りがちな生活習慣が挙げられる。
【０１１１】
他の関連する実施形態では、本発明の可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび他の組成物を、多くの場合プラークと称される脂肪性の沈着物が蓄積することによって動脈壁が肥厚する慢性的な炎症性の状態である、アテローム性動脈硬化症の処置の一部として使用することができる。アテローム性動脈硬化症に対する危険因子としては、加齢、糖尿病、異常リポ蛋白血症、肥満（腹部または内臓の脂肪症）、および座りがちな生活習慣が挙げられる。
【０１１２】
可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、メタボリックシンドロームを伴いやすい、リポジストロフィー障害に対しても使用することができる。重篤なインスリン抵抗性は、リポジストロフィーの遺伝的な形態および先天性の形態の両方に起因し得、後者の場合、抗レトロウイルス療法で処置された患者におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）関連リポジストロフィーを含む。
【０１１３】
対象のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、さらに、肥満の発生を遅らせる、または予防するための治療剤としても使用することができる。この手法は、本明細書で示されるデータによって確証され、支持され、それによって、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質により、高脂肪食のマウスにおける代謝的な状態が改善されることが示された。
【０１１４】
他の実施形態では、本発明は、動物において体脂肪含有量を制御するため、および、それに関連する状態、特に、それに関連する健康を損なう状態を処置または予防するための組成物および方法を提供する。本発明によれば、体重を制御する（調節する）ことは、体重を低下または増加させること、体重増加率を低下または上昇させること、または体重減少率を上昇または低下させることを指してよく、また、体重を積極的に維持すること、または有意に変化させないこと（例えば、別なふうに体重を増加または減少させる外的影響または内的影響に対して）も含む。本発明の一実施形態は、体重を制御することを必要とする動物（例えば、ヒト）に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを投与することによって体重を制御することに関する。
【０１１５】
特定の一実施形態では、本発明は、動物において体重を低下させる、および／または体重増加を低下させるため、より詳細には、肥満の危険性がある、または肥満に罹患している患者において肥満を処置する、または寛解させるための方法および化合物に関する。別の特定の実施形態では、本発明は、体重を増加させる、または保持することができない動物（例えば、消耗症候群の動物）を処置するための方法および化合物に関する。そのような方法は、体重量および／または体質量を増加させるため、または重量および／または質量の減少を低下させるため、または望ましくなく低い（例えば、不健康な）体重量および／または体質量に関連する、またはそれによって引き起こされる状態を改善するために有効である。
【０１１６】
ＷＯ  ２００６／０１２６２７およびＷＯ  ２００８／０９７５４１において実証されている通り、本明細書に開示されている化合物により、筋肉の成長が刺激される。したがって、これらの化合物は、筋肉機能障害および代謝機能障害が重複している疾患または状態において特に有用であり得る。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物（例えば、可溶性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）を、筋ジストロフィーに対する処置の一部として使用する。「筋ジストロフィー」という用語は、徐々に衰弱すること、ならびに骨格筋、および時には心筋および呼吸器筋が衰退することを特徴とする変性筋肉疾患の群を指す。筋ジストロフィーは、筋肉における微小な変化から始まる進行性の筋消耗および脱力を特徴とする遺伝的障害である。時間とともに筋肉が変性するにつれて、その人の筋肉の強度が減退する。さらに、筋肉量が減退すること、および身体活動が減ることが、カロリー摂取とエネルギー消費との間の不均衡に寄与し、過剰なエネルギーが白色脂肪組織として不健康に貯蔵されることにつながる。対象のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むレジメンで処置することができる典型的な筋ジストロフィーとしては、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エメリ−ドレフュス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨまたはＦＳＨＤ）（ランドジー−デジェリーヌとしても公知である）、筋緊張性ジストロフィー（ＭＭＤ）（シュタイネルト病としても公知である）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー（ＤＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）が挙げられる。
【０１１８】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、フランスの神経科医であるＧｕｉｌｌａｕｍｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ａｍａｎｄ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅにより、１８６０年代に最初に記載された。ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、１９５０年代に、ＤＭＤのこの変形について最初に記載したドイツの医師であるＰｅｔｅｒ  Ｅｍｉｌ  Ｂｅｃｋｅｒにちなんで名づけられた。ＤＭＤは、男性における最も頻度の高い遺伝性疾患の１つであり、３，５００人の少年に影響を及ぼしている。ＤＭＤは、Ｘ染色体の短腕に位置するジストロフィン遺伝子が破損すると起こる。男性はＸ染色体を１コピーしか有さないので、ジストロフィン遺伝子を１コピーしか有さない。ジストロフィンタンパク質を有さないと、筋肉は収縮と弛緩のサイクルの間に容易に傷害を受ける。この疾患の初期では筋肉は再生によって補償されるが、その後、筋肉前駆細胞は進行中の傷害についていけず、健康な筋肉が、非機能的な線維脂肪性組織に置き換えられる。
【０１１９】
ＢＭＤは、ジストロフィン遺伝子における異なる突然変異に起因する。ＢＭＤ患者はいくらかのジストロフィンを有するが、数量が不十分であるか、または質が悪いかのいずれかである。いくらかのジスロフィンを有することにより、ＢＭＤの人の筋肉は、ＤＭＤの人の筋肉と同じくらいひどく、または同じくらい急速に変性することから保護される。
【０１２０】
例えば、最近の研究により、ｉｎ  ｖｉｖｏでＧＤＦ８（ＡｃｔＲＩＩＢリガンド）の機能を遮断または排除することにより、ＤＭＤ患者およびＢＭＤ患者における少なくともある特定の症状を有効に処置することができることが実証されている。したがって、対象のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＧＤＦ８阻害物質（アンタゴニスト）として作用し、ＤＭＤ患者およびＢＭＤ患者において、ｉｎ  ｖｉｖｏでＧＤＦ８および／またはＡｃｔＲＩＩＢの機能を遮断する代替の手段を成すことができる。この手法は、本明細書で示されるデータによって確証され、支持され、それによって、筋ジストロフィーのマウスモデルにおいて、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質によって筋肉量が増加することが示された。
【０１２１】
同様に、対象のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドにより、筋肉の成長を必要とする他の疾患状態において筋肉量を増加させるための有効な手段がもたらされる。例えば、ルー−ゲーリック病（運動ニューロン疾患）とも称されるＡＬＳは、脳と骨格筋をつなぐＣＮＳの構成要素である運動ニューロンを攻撃する、慢性であり、不治であり、かつ止められないＣＮＳ障害である。ＡＬＳでは、運動ニューロンが変質し、最終的に死に、人の脳は正常に完全に機能性かつ機敏なままであるにもかかわらず、運動の命令が筋肉に到達しない。ＡＬＳを生じる大部分の人は４０〜７０歳である。脱力する最初の運動ニューロンは、腕または脚につながる運動ニューロンである。ＡＬＳの人は、歩行困難を有する可能性があり、物を落とす可能性があり、転倒する可能性がある、ろれつが回らない可能性があり、ならびに笑うことおよび泣くことを制御できない可能性がある。最終的に、肢の筋肉は、使われないことから委縮し始める。この筋肉の脱力が、衰弱性になり、人は、車いすが必要になる、またはベッドの外で機能できなくなる。大部分のＡＬＳ患者は、疾患の発症から３〜５年で、呼吸不全または肺炎のような人工呼吸補助の合併症で死ぬ。この手法は、本明細書で示されるデータによって確証され、支持され、それによって、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質により、ＡＬＳのマウスモデルの外見、筋肉量および寿命が改善されることが示された。
【０１２２】
ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドによって誘導される筋肉量の増加も、筋消耗疾患に罹患している人のためになり得る。Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら（上記）は、ヒトにおいて、ＧＤＦ８の発現が除脂肪体重と逆相関すること、および、ＡＩＤＳ消耗症候群の男性においてＧＤＦ８遺伝子の発現の増加が体重減少と関連することを報告した。ＡＩＤＳ患者においてＧＤＦ８の機能を阻害することにより、ＡＩＤＳの少なくともある特定の症状を、完全に排除するとまではいかなくとも、軽減することができ、したがって、ＡＩＤＳ患者の生活の質が著しく改善される。
【０１２３】
加齢に伴う筋肉の損失である筋肉減少症は、多くの場合、メタボリックシンドローム、糖尿病、動脈硬化症、脂質異常症、および他の加齢性の代謝的な状態とも関連する。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドによって誘導される筋肉量も、筋肉減少症に罹患している人のためになり得る。
【０１２４】
７．医薬組成物
ある特定の実施形態では、本発明の化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）を、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化する。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、単独で、または医薬製剤（治療組成物）の成分として投与することができる。対象化合物は、ヒト医学または獣医学において使用するための任意の都合のよいやり方で投与するために製剤化することができる。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、本発明の治療方法は、組成物を、移植片またはデバイスとして、局所的に、全身的に、または局部的に投与することを含む。投与する際、本発明において使用するための治療用組成物は、当然、発熱物質を含まない、生理的に許容される形態である。さらに、組成物は、例えば、組織傷害を有する部位である標的組織部位（例えば、骨、軟骨、筋肉、脂肪またはニューロン）に送達するために、被包されていること、または粘性の形態で注射されることが望ましい場合がある。局所投与は、創傷治癒および組織修復に適する場合がある。場合によって上記の組成物に同様に含めることができる、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド以外の治療的に有用な作用剤は、本発明の方法では、その代わりにまたはそれに加えて、対象化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）と、同時にまたは逐次的に投与することができる。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、１種または複数種の治療用化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）を標的組織部位に送達することができ、発生中の組織のための構造をもたらし、最適に体内に再吸収され得るマトリックスを含んでよい。例えば、マトリックスにより、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの緩慢な放出をもたらすことができる。そのようなマトリックスは、現在他の移植される医学的アプリケーションのために使用されている材料で形成されてよい。
【０１２７】
マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容的な外見および界面特性に基づく。対象組成物の特定の適用により、適切な製剤が規定される。組成物のための潜在的なマトリックスは、生分解性のおよび化学的に定義された硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ酸無水物であってよい。他の潜在的な材料は、生分解性であり、かつ生物学的に明確に定義された、例えば骨または皮膚のコラーゲンなどである。別のマトリックスは、純粋なタンパク質または細胞外基質の構成成分で構成されている。他の潜在的なマトリックスは、非生分解性であり、化学的に定義された、例えば、焼結したヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸塩、または他のセラミックスなどである。マトリックスは、上記の種類の材料のいずれかの組合せ、例えば、ポリ乳酸とヒドロキシアパタイト、またはコラーゲンとリン酸三カルシウムで構成されてよい。バイオセラミックスは、例えばカルシウム−アルミン酸塩−リン酸塩など、組成を変更することができ、加工して孔サイズ、粒子サイズ、粒子の形状、および生分解性を変更することができる。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、経口的に、例えば、それぞれが活性成分として所定量の作用剤を含有する、カプセル、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ（風味を付けた基剤、通常はショ糖およびアラビアゴムまたはトラガントを使用する）、粉末、顆粒の形態で、または、水性液もしくは非水性液中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油エマルション液もしくは油中水エマルション液として、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、またはパステル剤（ゼラチンおよびグリセリン、またはショ糖およびアラビアゴムなどの不活性な基剤を使用する）および／または口内洗浄剤などとして、投与することができる。作用剤は、巨丸剤、舐剤またはペースト剤としても投与することができる。
【０１２９】
経口投与するための固体剤形（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉末、顆粒など）では、本発明の１種または複数種の治療用化合物は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの１種または複数種の薬学的に許容される担体、および／または以下のいずれかと混合することができる：（１）充填剤または増量剤、例えば、デンプン、乳糖、ショ糖、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸など；（２）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖、および／またはアラビアゴムなど；（３）保湿剤、例えば、グリセロールなど；（４）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンまたはタピオカデンプン、アルギン酸塩、ある特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなど；（５）溶解遅延剤、例えばパラフィンなど；（６）吸収促進剤、例えば、四級アンモニウム化合物など；（７）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートなど；（８）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイト粘土など；（９）潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物など；および（１０）着色料。カプセル、錠剤および丸剤の場合では、医薬組成物は、緩衝剤も含んでよい。同種の固体組成物は、乳糖（ｌａｃｔｏｓｅ）または乳糖（ｍｉｌｋ  ｓｕｇａｒ）などの賦形剤、ならびに高分子量のポリエチレングリコールなどを使用するソフト充填ゼラチンカプセルおよびハード充填ゼラチンカプセル内の充填剤としても利用することができる。
【０１３０】
経口投与するための液体剤形としては、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ剤、およびエリキシル剤が挙げられる。活性成分に加えて、液体剤形は、当技術分野で一般に使用される不活性な希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物を含有してよい。不活性な希釈剤に加えて、経口用組成物は、アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）および懸濁剤、甘味料、調味料、着色料、香料、および保存料なども含んでよい。
【０１３１】
懸濁液は、活性化合物に加えて、懸濁剤、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、およびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガント、ならびにそれらの混合物を含有してよい。
【０１３２】
本明細書に開示されているある特定の組成物は、皮膚または粘膜のいずれかに局所的に投与することができる。局所用製剤は、皮膚または角質層への浸透賦活剤として有効であることが公知の多種多様の作用剤の１つまたは複数をさらに含んでよい。これらの例は、２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、プロピレングリコール、メチルアルコールまたはイソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、およびアゾンである。化粧品として許容される製剤を製造するために、追加的な作用剤をさらに含めることができる。これらの例は、脂肪、ワックス、油、色素、芳香剤、保存料、安定剤、および表面活性剤である。当技術分野で公知のものなどの角質溶解薬も含めることができる。その例はサリチル酸および硫黄である。
【０１３３】
局所投与または経皮投与するための剤形としては、粉末、スプレー剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、液剤、パッチ剤、および吸入剤が挙げられる。活性化合物は、滅菌条件下で、薬学的に許容される担体と、および必要であり得る任意の保存料、緩衝液、または噴霧剤と混合することができる。軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤およびゲル剤は、本発明の対象化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）に加えて、賦形剤、例えば、動物および植物の脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはそれらの混合物などを含有してよい。
【０１３４】
粉末およびスプレー剤は、対象化合物に加えて、賦形剤、例えば、乳糖（ｌａｃｔｏｓｅ）、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、およびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物などを含有してよい。スプレー剤は、通例の噴霧剤、例えばクロロフルオロハイドロカーボンなど、および揮発性の非置換型炭化水素、例えば、ブタンおよびプロパンなどをさらに含有してよい。
【０１３５】
ある特定の実施形態では、非経口投与に適した医薬組成物は、１種または複数種のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、意図されたレシピエントの血液との等張性を製剤に与える溶質または懸濁剤もしくは増粘剤を含有し得る、１種または複数種の薬学的に許容される滅菌の等張性の水溶液もしくは非水性溶液、分散液、懸濁液もしくはエマルション、または使用する直前に滅菌の注射可能な溶液または分散液に再構成することができる滅菌粉末と組み合わせて含んでよい。本発明の医薬組成物に利用することができる適切な水性担体および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、および適切なそれらの混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。妥当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料を使用することによって、分散液の場合では必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。
【０１３６】
本発明の組成物は、アジュバント、例えば、保存料、湿潤剤、乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）および分散剤なども含有してよい。さまざまな抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることによって、微生物の作用を確実に予防することができる。例えば、糖、塩化ナトリウムなどの等張化剤も組成物に含めることが望ましい場合がある。さらに、注射可能な医薬形態の持続的な吸収を、吸収を遅延させる作用剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどを含めることによってもたらすことができる。
【０１３７】
投薬レジメンは、主治医が本発明の対象化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）の作用を修飾するさまざまな因子を考慮することよって決定されることが理解される。さまざまな因子は、処置される疾患に左右される。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に開示されているＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは他の化合物をｉｎ  ｖｉｖｏで産生させるための遺伝子療法も提供する。そのような療法は、ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチド配列を、上で列挙した障害を有する細胞または組織に導入することによってその治療効果が実現される。ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチド配列の送達は、キメラウイルスなどの組換え型の発現ベクターまたはコロイド分散系を使用して実現することができる。ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチド配列を治療的に送達するためには、標的リポソームを使用することが好ましい。
【０１３９】
本明細書で教示した遺伝子療法のために利用することができるさまざまなウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または好ましくはＲＮＡウイルス、例えばレトロウイルスなどが挙げられる。レトロウイルスベクターは、マウスまたはトリのレトロウイルスの派生体であることが好ましい。単一の外来遺伝子を挿入することができるレトロウイルスベクターの例としては、これらに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられる。いくつもの追加的なレトロウイルスベクターは、多数の遺伝子を組み入れることができる。これらのベクターは全て、形質導入された細胞を同定し、生成することができるように、選択マーカーの遺伝子を移入すること、または組み入れることができる。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質またはタンパク質を付着させることによって、標的に特異的に作出することができる。好ましいターゲティングは、抗体を使用することによって実現される。当業者は、特異的なポリヌクレオチド配列を、レトロウイルスのゲノムに挿入して、またはウイルス外被に付着させて、ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドを含有するレトロウイルスベクターの標的特異的な送達を可能にすることができることを理解するであろう。好ましい一実施形態では、ベクターを、骨、軟骨、筋肉またはニューロンの細胞／組織にターゲティングする。
【０１４０】
あるいは、組織培養細胞を、従来のリン酸カルシウムトランスフェクションによって、レトロウイルスの構造遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖをコードするプラスミドで直接トランスフェクトすることができる。次いで、これらの細胞を、対象遺伝子を含有するベクタープラスミドでトランスフェクトする。生じた細胞は、レトロウイルスベクターを培地中に放出する。
【０１４１】
ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドのための別の標的送達系は、コロイド分散系である。コロイド分散系としては、巨大分子の複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含めた脂質に基づく系が挙げられる。本発明の好ましいコロイド系はリポソームである。リポソームは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて送達ビヒクルとして有用な人工的な膜小胞である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびインタクトなビリオンは、水性の内部に被包することができ、生物学的に活性な形態で細胞に送達することができる（例えば、Ｆｒａｌｅｙ、ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．、６巻：７７頁、１９８１年を参照されたい）。リポソームビヒクルを使用して効率的に遺伝子移入するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｍａｎｎｉｎｏ、ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：６８２頁、１９８８年を参照されたい。リポソームの組成物は、通常、一般に、ステロイド、特にコレステロールと組み合わせたリン脂質の組合せである。他のリン脂質または他の脂質も使用することができる。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在に左右される。
【０１４２】
リポソームの作製において有用な脂質の例としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシドなどのホスファチジル化合物が挙げられる。例示的なリン脂質としては、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。リポソームのターゲティングも、例えば、器官特異性、細胞特異性、および細胞小器官特異性に基づいて可能であり、当技術分野で公知である。
【実施例】
【０１４３】
本発明は、ここに概して説明され、単に本発明のある特定の実施形態および実施形態を例証する目的で含めた、本発明を限定することを意図しない以下の実施例を参照することによってより容易に理解されよう。
【０１４４】
（実施例１）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質の生成
出願人らは、中間に最小のリンカー（３つのグリシンアミノ酸）を伴ってヒトまたはマウスのＦｃドメインと融合したヒトＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインを有する可溶性のＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質を構築した。この構築物を、それぞれＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃと称する。
【０１４５】
ＣＨＯ細胞系から精製したＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃを以下に示す（配列番号５）
【０１４６】
【化６】
0005912078.tif 000007
ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｈＦｃタンパク質およびＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃタンパク質を、ＣＨＯ細胞系において発現させた。３つの異なるリーダー配列を検討した：
（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号７）
（ｉｉ）組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号８）
（ｉｉｉ）ネイティブ：ＭＧＡＡＡＫＬＡＦＡＶＦＬＩＳＣＳＳＧＡ（配列番号９）。
【０１４７】
選択された形態は、ＴＰＡリーダーを使用し、以下のプロセシングされていないアミノ酸配列を有する：
【０１４８】
【化７】
0005912078.tif 000008
このポリペプチドは、以下の核酸配列によってコードされる（配列番号１０）：
【０１４９】
【化８】
0005912078.tif 000009
ＣＨＯ細胞が産生した物質のＮ末端を配列決定することにより、主要な配列である−ＧＲＧＥＡＥが明らかになった（配列番号１１）。特に、文献において報告された他の構築物は、−ＳＧＲ．．．配列から始まる。
【０１５０】
精製は、例えば、任意の順番の以下の３つ以上を含めた、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって実現することができた：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および陽イオン交換クロマトグラフィー。精製は、ウイルス濾過および緩衝液の交換で完了することができた。
【０１５１】
ＨＥＫ２９３細胞およびＣＯＳ細胞においても、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を発現させた。全ての細胞系からの材料および合理的な培養条件により、ｉｎ  ｖｉｖｏで筋肉を築く活性を有するタンパク質がもたらされたが、おそらく細胞系の選択および／または培養条件に関連して効力の変動性が観察された。
【０１５２】
（実施例２）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ変異体の生成
出願人らは、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインにおいて一連の突然変異を起こさせ、これらの変異体タンパク質を細胞外ＡｃｔＲＩＩＢとＦｃドメインとの可溶性の融合タンパク質として作製した。バックグラウンドのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合物は以下の配列を有する（Ｆｃ部分に下線が引かれている）（配列番号１２）：
【０１５３】
【化９】
0005912078.tif 000010
Ｎ末端の短縮およびＣ末端の短縮を含めた、さまざまな突然変異を、バックグラウンドのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質に導入した。実施例１において提示されたデータに基づいて、これらの構築物は、ＴＰＡリーダーを用いて発現させる場合、Ｎ末端のセリンを欠くことが予想される。ＰＣＲ突然変異誘発によってＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインにおいて突然変異を起こさせた。ＰＣＲの後、断片を、Ｑｉａｇｅｎカラムによって精製し、ＳｆｏＩおよびＡｇｅＩを用いて消化し、ゲル精製した。これらの断片を、ライゲーションするとヒトＩｇＧ１との融合キメラが創出されるように、発現ベクターのｐＡＩＤ４（ＷＯ２００６／０１２６２７）にライゲーションした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５  アルファを形質転換したら、コロニーを採集し、ＤＮＡを単離した。マウスの構築物（ｍＦｃ）については、マウスＩｇＧ２ａでヒトＩｇＧ１を代替した。全ての変異体について配列を検証した。
【０１５４】
変異体は全て、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において一過性のトランスフェクションによって作製した。要約すると、５００ｍｌのスピナ中、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、容積２５０ｍｌのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地中、細胞６×１０５個／ｍｌで準備し、一晩成長させた。次の日に、これらの細胞を、ＤＮＡ：ＰＥＩ（１：１）複合体を用いて、０．５ｕｇ／ｍｌの最終的なＤＮＡ濃度で処理した。４時間後、２５０ｍｌの培地を加え、細胞を７日間成長させた。細胞を遠心沈澱することによって条件培地を回収し、濃縮した。
【０１５５】
変異体を、例えば、プロテインＡカラムを含めたさまざまな技法を使用して精製し、低ｐＨ（３．０）のグリシン緩衝液を用いて溶出した。中和した後、これらをＰＢＳに対して透析した。
【０１５６】
ＣＨＯ細胞においても、同様の方法体系によって変異体を作製した。
【０１５７】
変異体を、結合アッセイおよび／またはバイオアッセイで試験した。ある場合には、精製されたタンパク質ではなく条件培地を用いてアッセイを実施した。改変体は、例えば、公開特許出願ＷＯ  ０６／０１２６２７およびＷＯ  ０８／０９７５４１に記載されている。そのような改変体は、本明細書に記載の方法において使用することができる。
【０１５８】
（実施例３）
高脂肪食を与えたマウスにおける、白色脂肪組織の熱発生特性に対するＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｈＦｃの影響
出願人らは、高脂肪食を与えた雄のマウスにおいて、褐色脂肪細胞および他の代謝的な評価項目に対するＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの影響を調査した。１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを、体重を釣り合わせ、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｈＦｃ（ｎ＝１０）またはトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）ビヒクル（ｎ＝７）を用いて、１０ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．で、週２回、６０日間処置した。この間中、マウスは、４．５％の脂肪を含有する標準の固形飼料の代わりに、５８％の脂肪を含有する食餌を無制限に食べることができた。試験終了時に、精巣上体の脂肪パッドを採取し、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）を使用して、白色脂肪の貯蔵所内に拡散的に分布している褐色脂肪細胞における熱発生の能力の、文書により十分に立証されたマーカーである脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１）をコードするｍＲＮＡのレベルを測定した（Ｃｏｕｓｉｎら、１９９２年、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １０３巻：９３１〜９４２頁）。
【０１５９】
ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｈＦｃで処置することにより、一群の注目すべき代謝的な影響が引き起こされた。高脂肪食マウスでは、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｈＦｃにより、精巣上体の脂肪におけるＵＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルが、ビヒクルと比較してほぼ９倍に増加し（図１；Ｐ＜０．０５）、これはＣ５７ＢＬ／６マウスが、他のマウス系統と比較してひどく鈍い、重要な白色脂肪の貯蔵所内へのＵＣＰ１および褐色脂肪細胞の誘導を見せることを考慮すると、特に印象的な影響である（Ｇｕｅｒｒａら、１９９８年、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０２巻：４１２〜４２０頁；  Ｘｕｅら、２００７年、Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ４８巻：４１〜５１頁）。ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｈＦｃにより、有益な、血清を含まない脂肪酸濃度の３０％の低下（ｐ＜０．００１）ももたらされた。重要なことに、ＵＣＰ１の上方制御には、ベースラインおよび４８日目に核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって決定された通り、体組成に対するＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｈＦｃの有益な影響が付随した。高脂肪食条件下で、ビヒクルで処置した対照における総脂肪量は、この４８日の間で３倍になり、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｈＦｃで処置することにより、この増加が４０％削減された。４８日目までに、総脂肪量はＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｈＦｃで処置したマウスにおいて体重の２６％であったのに対して、対照マウスでは３９％であり、一方、除脂肪組織質量は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃで処置したマウスにおいて体重の６４％であったのに対して、対照マウスでは５５％であった。したがって、最終結果は、高脂肪食の条件下での健康な体組成であった。
【０１６０】
（実施例４）
高脂肪食を与えたマウスにおける、白色脂肪組織の熱発生特性に対する短縮型改変体ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃの影響
上記の試験において（実施例３）、出願人らは、高脂肪食条件下での、白色脂肪組織の熱発生特性および他の代謝的な評価項目に対する短縮型改変体ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃの影響も調査した。
【０１６１】
出願人らは、短縮型融合タンパク質ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃ（図１３〜１４）を、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｈＦｃに関して上記したものと同じリーダーおよび方法体系を使用して生成した。ＣＨＯ細胞において発現させた後に精製した成熟タンパク質は、以下に示す配列を有する（配列番号６）：
【０１６２】
【化１０】
0005912078.tif 000011
１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃを１０ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．で用いて、または、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）ビヒクルを用いて、週２回、６０日間、処置した。この間中、マウスは、４．５％の脂肪を含有する標準の固形飼料の代わりに、５８％の脂肪を含有する食餌を無制限に食べることができた。標準の固形飼料の食餌で維持した追加的なマウス群も、ＴＢＳビヒクルで処置し、食餌性の対照として追跡した。
【０１６３】
高脂肪食条件下で、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃで処置することにより、組織学的な変化、および熱発生の能力と一致した、白色脂肪組織における遺伝子発現プロファイルが誘発された。図２に示されている通り、精巣上体の白色脂肪の組織学的検査により、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃによって脂肪滴サイズが縮小し、褐色脂肪の特徴である多胞性の脂肪細胞のクラスターの形成が引き起こされたことが示された。さらに、この組織の免疫組織化学的な分析により、多胞性脂肪細胞および単房性脂肪細胞の両方において、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃによる処置の結果としてＵＣＰ１が広範に細胞質誘導されることが明らかになった（図２）。
【０１６４】
定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定された通り、付随的なこれらの組織学的な変化は、精巣上体の白色脂肪における重要な熱発生制御遺伝子および代謝制御遺伝子の発現における有意な変化であった。高脂肪食マウスでは、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃで処置することにより、ＵＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルが、ビヒクルと比較して６０倍超に上昇し（図３）、これは、上記の通り、この系統のマウスが、他のマウス系統と比較して、ひどく鈍い、重要な白色脂肪の貯蔵所内へのＵＣＰ１および褐色脂肪細胞の誘導を見せるので、特に印象的な変化である。さらに、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃで処置することにより、高脂肪食によって誘導される代謝的な傷害を防ぎ（Ｐｆｌｕｇｅｒら、２００８年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５巻：９７９３〜９７９８頁）、脂肪酸の動員の重要な調節に関係があるとされている（Ｒｏｄｇｅｒｓら、２００８年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５８２巻：４６〜５３頁）、エネルギー感受性マスター制御因子（脱アセチル化酵素）であるサーチュインＳＩＲＴ−１（サイレント情報制御因子２、ホモログ１）をコードするｍＲＮＡのレベルが上昇した（図４）。著しいことに、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃで処置することにより、文書により十分に立証されたＳＩＲＴ−１の標的であり、今度は、ミトコンドリアの生合成および褐色脂肪組織における熱発生の能力に必要な多くの遺伝子の発現を調節する（Ｕｌｄｒｙら、２００６年、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ、３巻：３３３〜３４１頁）、ＰＧＣ−１α（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ活性化補助因子１α）をコードするｍＲＮＡのレベルも上昇した（図５）。特に、白色脂肪細胞においてＰＧＣ−１αを強制的に発現させることにより、褐色脂肪細胞におけるものと酷似している、ＵＣＰ１を含めた、遺伝子発現の熱発生プログラムが誘導されることが示されている（Ｈａｎｓｅｎら、２００６年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３９８巻：１５３〜１６８頁）。本試験では、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃにより、高脂肪食条件下での白色脂肪組織におけるＰＧＣ−１α遺伝子の発現が、標準食を与えたマウスからの発現と区別できないレベルにまで回復した（図５）。
【０１６５】
処置に関連づけられる追加的な変化は、白色脂肪組織における発現プロファイルの変化と、有益なホルモンの影響および代謝的な影響との間の顕著な関連を構成する。したがって、精巣上体の白色脂肪において、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃにより、ＳＩＲＴ−１の標的およびアディポネクチンの発現の重要な誘導因子のどちらでもある転写因子（Ｑｉａｏら、２００６年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１巻：３９９１５〜３９９２４頁）であるＦｏｘｏ−１（フォークヘッドボックスを含有する、タンパク質Ｏサブファミリー１）をコードするｍＲＮＡのレベルが上昇した（図６）。アディポネクチンは、脂肪量／肥満と逆に濃度が変動する脂肪由来のホルモンであり、標的組織において重要なインスリン感作作用を発揮する（Ｙａｍａｕｃｈｉら、２００１年、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７巻：９４１〜９４６頁；  Ｍａｅｄａら、２００２年、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ８巻：７３１〜７３７頁；  Ｋａｄｏｗａｋｉら、２００５年、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  ２６巻：４３９〜４５１頁）。Ｆｏｘｏ−１  ｍＲＮＡの誘導と一致して、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃで処置することにより、精巣上体の白色脂肪におけるアディポネクチンｍＲＮＡのレベル（図７）ならびにアディポネクチンの循環濃度（図８）が上昇した。重要なことに、これらの変化は、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃで処置したマウスにおいて、循環インスリン（図９）、トリグリセリド、遊離の脂肪酸、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、および低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の強い減少を伴い、これらのパラメータのほぼ全ての正常化を導いている。最終的に、上述の影響は、ベースラインおよび４８日目に核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって決定された通り、体組成における有益な変化を伴った。詳細には、ビヒクルで処置した対照における総脂肪量は、高脂肪食条件下で、この４８日の間で３倍になり、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃで処置することにより、この増加がほぼ４０％削減された。要約すると、高脂肪食条件下で、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃで処置することにより、１）熱発生の能力と一致した、白色脂肪組織における組織学的な変化および遺伝子発現プロファイル、２）広範囲のホルモンパラメータおよび代謝的なパラメータにおける有益な変化、および３）体組成の改良がもたらされた。
【０１６６】
（実施例５）
高脂肪食を与えたマウスにおける、褐色脂肪の貯蔵所に対するＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｍＦｃの影響
別の試験において、出願人らは、高脂肪食条件下での、肩甲骨内の褐色脂肪の貯蔵所の性質に対する、短縮型改変体ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｍＦｃの影響を調査した。９週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｍＦｃ（ｎ＝２０）を１０ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．で用いて、またはトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）ビヒクル（ｎ＝１０）を用いて、週２回、６０日間、処置した。投薬を開始する前の最初の７日間、マウスは、４．５％の脂肪を含有する標準の固形飼料の代わりに、５８％の脂肪を含有する食餌を無制限に食べることができた。標準の固形飼料の食餌で維持した追加的なマウス群（ｎ＝１０）も、ＴＢＳビヒクルで処置し、食餌性の対照として追跡した。
【０１６７】
標準食と比較して、高脂肪食により、肩甲骨間の褐色脂肪組織の貯蔵所においていくつかの注目すべき変化がもたらされ、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｍＦｃで処置することにより、これらの変化のそれぞれが、完全に、または広く逆転した。詳細には、高脂肪食により、その色が赤色から淡紅色に明るくなっただけでなく、肩甲骨間の貯蔵所の明白な拡大が引き起こされた（図１０）。この食餌誘導性の拡大は、褐色脂肪の貯蔵所の質量が倍増したこと（図１１）および密度が低下したこと（図１２）を反映した。貯蔵所の密度は、マウスのサブセット（ｎ＝群当たり４）に対するｉｎ  ｓｉｔｕでのマイクロコンピュータ断層撮影法（ｍｉｃｒｏＣＴ）によって決定し、核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって決定された全体脂肪の百分率は、群の平均に近かった（全てのマウスをＮＭＲによって走査した。どんな場合でも、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｍＦｃ処置により、褐色脂肪量（図１１）および褐色脂肪密度（図１２）における食餌誘導性の変化が完全に逆転したが、貯蔵所のサイズおよび色（図１０）における食餌誘導性の変化は大きく逆転した。これらの結果により、高脂肪食条件下で、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｍＦｃにより、健康な褐色脂肪機能と相関する可能性がある性質が大きく、または完全に回復し、したがって、褐色脂肪の貯蔵所の全体のサイズが縮小するにつれて褐色脂肪の質が改善されることが示されている。
【０１６８】
総合すると、これらのデータにより、可溶性のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を、ＴＧＦファミリーのリガンドによるシグナリングのアンタゴニストとして使用して、熱発生褐色脂肪細胞の形成および／または活性を増加させ、およびそれによって、高カロリー摂取、および、その上潜在的に、他の条件によって悪化する代謝的な状態を処置することができることが示されている。
参照による組み込み
本明細書で言及した全ての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許が、具体的にかつ個別に、参照により組み込まれることが示されたかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６９】
主題の特定の実施形態が考察されているが、上記の明細書は例示的であり、限定的ではない。本明細書および以下の特許請求の範囲を概観すれば、多くの変形が当業者に明らかになるであろう。本発明の全範囲は、特許請求の範囲を、均等物の全範囲と一緒に、および、明細書を、そのような変形と一緒に参照することによって決定されるべきである。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図２】
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【図１０】
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【配列表】
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