(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵プロセスにおいてメチオニン、その前駆体または誘導体を生産するための方法であって、工程：
炭素源と硫黄源と窒素源とを含んでなる適当な培養培地中で、Ｓ−アデノシルメチオニンおよび／またはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減されたホモセリンスクシニルトランスフェラーゼをコードするｍｅｔＡ対立遺伝子を過剰発現する改変微生物を培養する工程、および
該培養培地からメチオニンおよび／またはその誘導体を回収する工程
を含んでなり、
該微生物が、その核酸配列にＴ１５８Ｇヌクレオチド置換を有するｓｄａＡ遺伝子の発現の減弱により、メチオニン以外の化合物へのトレオニンの変換が低減され、かつ、該微生物のセリン利用能が増大されるように改変されている、方法。
【請求項２】
前記微生物のｓｄａＢ遺伝子の発現の減弱により、前記セリン利用能がさらに増大される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
遺伝子ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢおよび／またはｓｅｒＣのうち少なくとも１つの過剰発現により、前記セリン利用能がさらに増大される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
トレオニンからのグリシンの生産がさらに低減される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
トレオニンをグリシンに変換する酵素の活性が低減される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
下記遺伝子：ｌｔａＥ、ｋｂｌ、ｇｌｙＡ、ｔｄｈのうち少なくとも１つの発現が減弱される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
酵素ＧｌｙＡのセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を維持しつつトレオニンアルドラーゼ活性が減弱されている変異ＧｌｙＡ酵素が発現される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＧｌｙＡ酵素が、そのポリペプチド配列において下記のアミノ酸置換：Ｔ１２８Ｓ、Ｔ２２４Ｓ、Ｔ２２５Ｓ、Ｔ２２６Ｓ、Ｔ２２７Ｓ、Ｔ２３０Ｓ、Ｒ２３５Ｋのうち少なくとも１つを含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
内因性遺伝子ｇｌｙＡが、前記微生物から欠失されている、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物が、トレオニンからのイソロイシンの生産が低減されるようにさらに改変されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
トレオニンからα−ケト酪酸への脱アミノ化および／または脱水が低減される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
下記の酵素活性：トレオニンデアミナーゼ、トレオニンデヒドラターゼのうち少なくとも１つが減弱される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
下記遺伝子：ｉｌｖＡ、ｔｄｃＢ、ｔｄｃＧのうち少なくとも１つの発現が減弱される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
・ｍｅｔＪ遺伝子の欠失、
・Ｓ−アデノシルメチオニンおよび／またはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減された対立遺伝子ｍｅｔＡの発現、および
・その核酸配列にＴ１５８Ｇヌクレオチド置換を有するｓｄａＡ遺伝子の発現の減弱
を含んでなる改変微生物。
【請求項１５】
請求項２〜１３のいずれか一項に記載の改変をさらに含んでなる、請求項１４に記載の改変微生物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、トレオニンの変換が減弱された改変株を用いたメチオニンの生産方法に関する。これはトレオニンのグリシンへの分解を低減し、かつ／またはそのα−ケト酪酸への変換を低減することによって達成することができる。本発明はまた、トレオニンの変換が減弱された改変株に関する。
【０００２】
発明の背景
システイン、ホモシステイン、メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニンなどの硫黄含有化合物は、細胞代謝にとって重要であり、食品または飼料添加物および医薬品として使用すべく工業的に生産される。特に、動物が合成することのできない必須アミノ酸であるメチオニンは、多くの身体機能において重要な役割を果たす。タンパク質生合成におけるその役割とは別に、メチオニンは、メチル基転移ならびにセレニウムおよび亜鉛のバイオアベイラビリティに関与している。メチオニンはまた、アレルギーやリウマチ熱のような障害に対する治療薬として直接用いられる。しかしながら、生産されるメチオニンの大部分は動物飼料に添加されている。
【０００３】
ＢＳＥおよび鳥インフルエンザの結果として動物由来タンパク質の使用が減少するに伴い、純粋なメチオニンに対する需要が高まっている。化学的には、Ｄ，Ｌ−メチオニンは、通常、アクロレイン、メチルメルカプタンおよびシアン化水素から生産される。しかしながら、このラセミ混合物は、例えば鶏飼料用添加物において、純粋なＬ−メチオニンほどには良好に機能しない(Saunderson, C.L., (1985) British Journal of Nutrition 54, 621-633)。純粋なＬ−メチオニンは、ラセミ型メチオニンから、例えばＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−メチオニンのアシラーゼ処理によって生産することができるが、生産コストは大幅に増加する。環境問題に関連して純粋なＬ−メチオニンに対する需要が高まりつつあることから、メチオニンの微生物生産は魅力的である。
【０００４】
メチオニン生合成はホモセリン、システインおよびＣ１単位の生産に依存する。ホモセリンはアスパラギン酸(aspartarte)の誘導体であり、メチオニンに炭素骨格を与える。ホモセリンはまたトレオニンにも変換され、そしてこのトレオニンは（ｉ）イソロイシンの前駆体であり、またグリシン（ｉｉ）に変換され得る。これらの２つの反応はトレオニンを消費し、より多くのホモセリンをトレオニン経路に引き込むので、メチオニン経路へのフラックスを減少させる。
【０００５】
（ｉ）イソロイシンの生産に関しては、トレオニンは脱アミノ化されてα−ケト酪酸となるが、この反応はそれぞれ遺伝子ｉｌｖＡ（ＥＣ４．３．１．１９、Ramakrishnan et al, 1965, J Bacteriol, 89:661）およびｔｄｃＢ（ＥＣ４．３．１．１９、Goss et al, 1988, J Bacteriol, 170:5352）によりコードされるトレオニンデアミナーゼまたはトレオニンデヒドラターゼにより触媒される。ｓｄａＡ（ＥＣ４．３．１．１７；Su et al. 1989, J Bacteriol, 171 :5095）およびｓｄａＢ（ＥＣ４．３．１．１７，Su and Newman, 1991, 173:2473）によりコードされているセリンデアミナーゼはいくらかのトレオニンデアミナーゼ活性をコードしていることも知られている。
【０００６】
（ｉｉ）トレオニン・グリシン変換のための２つの経路は大腸菌に存在している。
（Ａ）トレオニンは、トレオニンデヒドロゲナーゼ（Ｔｄｈ；Ｅ．Ｃ．１．１．１．１０３）と２−アミノ３−ケト酪酸−ｃｏＡ−リアーゼ（Ｋｂｌ；Ｅ．Ｃ．２．３．１．２９）により触媒される２つの逐次反応によってグリシンに変換され得る(Boylan S.A. et al, 1981, Journal of Biological Chemistry, 256, 4, pp 1809-1815; Mukherjee J.J. et al, 1987, Journal of Biological Chemistry, 262, 30, pp 14441-14447)。これらの反応はそれぞれ１分子のアセチル−ｃｏＡおよびＮＡＤＨを生じる(Komatsubara S. et al, 1978, Journal of Bacteriology, 1981, 135, pp 318-323)。
【０００７】
（Ｂ）トレオニンはまたトレオニンアルドラーゼにより触媒される逆アルドール機構によって直接グリシンに変換され得る。この反応はアセトアルデヒドとグリシンを生じる(Plamann M.D. et al, 1983, Gene, 22, 1, pp 9-18)。大腸菌においてトレオニンアルドラーゼ活性を有する酵素は、下記遺伝子：ｌｔａＥ(Liu JL et al, 1998, European Journal of Biochemistry, 255, 1, pp 220-226)、ｋｂｌ(Markus J. P. et al, 1993, Biochemica et Biophysica Acta, 1164, pp 299-304)およびｇｌｙＡ(Schirch V. et al, 1968, Journal of Biological Chemistry, 243, pp 5561; Schirch V. et al, 1985, Journal of Bacteriology, 163, 1, pp 1-7)によりコードされている。
【０００８】
ＬｔａＥは、トレオニンの分解によるアセトアルデヒドとグリシンの生成に関与すると考えられている低特異性トレオニンアルドラーゼである(Liu JL et al., 1998, European Journal of Biochemistry, 255, 1, pp 220-226)。
【０００９】
Ｋｂｌの主要な活性は２−アミノ−３−ケト酪酸ＣｏＡリガーゼ（Ｅ．Ｃ２．３．１．２９）であり、２−アミノ３−ケト酪酸の脱アセチル化によるグリシンとアセチル補酵素Ａの生成からなる(Mukherjee J.J. et al, 1987, Journal of Biological Chemistry, 262, 30, pp 14441-14447)。それはＴＡＬ活性を有するためにトレオニン分解に使いやすい酵素となることが知られている(Markus J.P. et al., 1993, Biochemica et Biophysica Acta, 1164, pp 299-304)。
【００１０】
ＧｌｙＡの主要な活性はセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）（Ｅ．Ｃ．２．１．２．１）である。それはアミノ酸セリンおよびテトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）のグリシンおよび５，１０メチレン−ＴＨＦへの変換を触媒する（総説として、Schirch V. et al, 2005, Current opinion in Chemical biology, 9, pp 482-487）。ＧｌｙＡにより触媒される他の二次的活性のうち（総説として、Schirch L., 2006, Advances in enzymology and related areas of molecular biology, 53, pp 83-112）、トレオニンアルドラーゼ（ＴＡＬ）だけが生理学的関連があると思われる。ＧｌｙＡは結晶化され(Scarsdale et al, 2000, Journal of Molecular Biology, 296, pp 155-168)、基質特異性の起源を解明するための研究が行われた(Angelaccio S. et al, 1992, Biochemistry, 31, pp 155-162)。Angelaccio らは全てのトレオニンをアラニン活性部位の近傍で突然変異誘発したところ、突然変異Ｔ２２６ＡがトレオニンのＫｍを１．８倍高め、ＴＡＬ活性をそれらの定量限界より低いレベルに引き下げたが、ＴＨＦのＫｍもセリンのＫｍも変化させないことが分かった。しかしながら、ＳＨＭＴ反応のｋｃａｔは３２分の１に低下したことから、この突然変異は、ＳＨＭＴ活性には強い影響を持っている。
【００１１】
収量向上のために改変されるメチオニン生産に向けた株は当技術分野において現在、広く開示されている。現在、メチオニン生合成経路は多くの他の経路に関与する遺伝子と入り組んでいると理解されている。従って、一見してメチオニンの合成を促進するのに有益であると思われる遺伝子を増強または減弱しても反対の結果に終わることがある。トレオニン消費に関与する遺伝子はＣ１生産にも関与することが知られている。
【００１２】
トレオニン分解に関与するタンパク質の活性の阻害またはその発現の減弱はすでにいくつかの研究で開示されている。Simic ら (Simic et al, 2002, Applied and Environmental microbiology, 68(7), pp 3321-3327)は、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)のトレオニン生産を増大させるための、ＧｌｙＡタンパク質のトレオニン活性のアルドール切断の減弱を開示している。Martinez-Force ら (Martinez-Force et al, 1994, Biotechnology Progress, 10(4), pp 372-376)は、トレオニン生産を増大させるための、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のｉｌｖ１遺伝子の欠失を開示している。さらにこの研究で筆者らは、トレオニンおよびメチオニンの蓄積とトレオニンデアミナーゼ活性の低下の間に相関はないことを示している。Liu ら (Liu et al, 1998, European Journal of Biochemistry, 255(1), pp 220-226)は、大腸菌(Escherichia coli)のＬｔａＥ酵素の特徴と細胞増殖におけるその役割を詳細に示している。最後に、Lee ら (Lee et al, 2007, Molecular Systems Biology, 3(149), pp 1-8)は、トレオニン生産を増大させるためのｔｄｈ遺伝子の欠失とｉｌｖＡ遺伝子の突然変異を開示している。
【００１３】
これらの研究は全て、もっぱらトレオニン生産に向けられている。従来技術においてメチオニン生合成を向上させるための解決策としてトレオニン消費を回避することを意図したものはない。
【発明の開示】
【００１４】
本発明者らは、メチオニン代謝経路が複雑であるにもかかわらず、トレオニン変換に働きかけることによってメチオニン生産を増大させる方法を見出した。
【００１５】
発明の簡単な説明
本発明は、発酵プロセスにおいてメチオニン、その前駆体または誘導体を生産するための方法であって、下記工程：
炭素源と硫黄源と窒素源とを含んでなる適当な培養培地中で改変微生物を培養する工程、および
該培養培地からメチオニンおよび／またはその誘導体を回収する工程
を含んでなり、
該微生物がメチオニンよりも他の化合物におけるトレオニンの変換を低減するように改変される方法に関する。
【００１６】
特に、トレオニンのグリシンまたはイソロイシンへの変換が低減される。
【００１７】
本発明はまた、メチオニン生産の向上のための他の遺伝子改変と組み合わせて、メチオニンよりも他の化合物におけるトレオニンの変換が低減される、メチオニン生産の向上のために改変された微生物に関する。
【００１８】
トレオニンからのグリシンの生産は、特に、トレオニンをグリシンへ変換する酵素の活性を低下させることによって低減される。特定の一実施形態では、酵素ＧｌｙＡのセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を維持しつつトレオニンアルドラーゼ活性が減弱されている変異ＧｌｙＡ酵素が発現される。
【００１９】
トレオニンからのイソロイシンの生産は、特にトレオニンからα−ケト酪酸への脱アミノ化および／または脱水(dehydratation)を低下させることによって低減される。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、発酵プロセスにおいてメチオニン、その前駆体または誘導体を生産するための方法であって、下記工程：
炭素源と硫黄源と窒素源とを含んでなる適当な培養培地中で改変微生物を培養する工程、および
該培養培地からメチオニンおよび／またはその誘導体を回収する工程
を含んでなり、
該微生物がメチオニンよりも他の化合物へのトレオニンの変換を低減するように改変される方法に関する。
【００２１】
本発明によれば、メチオニンの前駆体は、メチオニン特異的代謝経路の一部であるか、またはこれらの代謝産物から誘導される代謝産物と定義される。メチオニンの誘導体は、Ｓ−アシルメチオニンおよびＮ−アシルメチオニンなど、メチオニン変換および／または分解経路に由来する。特に、これらの産物はＳ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）およびＮ−アセチルメチオニン（ＮＡＭ）である。特にＮＡＭは容易に回収できるメチオニン誘導体であり、単離して脱アシル化によりメチオニンに変換可能である。
【００２２】
「培養培地からメチオニンを回収する」とは、メチオニン、ならびに可能性としてはＳＡＭおよびＮＡＭおよび有用である可能性がある他のあらゆる誘導体を回収する行為を表す。
【００２３】
「発酵プロセス」、「培養」または「発酵」とは、単純炭素源、硫黄源および窒素源を含有する適当な増殖培地上での細菌の増殖を表して互換的に用いられる。
【００２４】
「適当な培養培地」は、微生物の培養および増殖に適当な培地である。このような培地は、微生物発酵の分野で培養される微生物に応じてよく知られている。
【００２５】
「微生物」とは、細菌、酵母または真菌を表す。好適には、微生物は、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、バチルス科(Bacillaceae)、ストレプトミセス科(Streptomycetaceae)およびコリネバクテリウム科(Corynebacteriaceae)の中から選択される。より好適には、微生物は、エシェリキア属(Escherichia)、クレブシェラ属(Klebsiella)、パンテア属(Pantoea)、サルモネラ菌属(Salmonella)またはコリネバクテリウム属(Corynebacterium)の種である。いっそうより好適には、微生物は、大腸菌(Escherichia coli)またはコリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)種のいずれかである。
【００２６】
「改変微生物」とは、メチオニン生産を向上させるために改変された微生物であり、メチオニンの生産収率を向上させる目的で遺伝的に改変された微生物を表す。本発明によれば、「向上された」または「向上させる」とは、微生物により生産されるメチオニンの量、特にメチオニン収率（炭素源グラム／モル当たりに生産されるメチオニンのグラム／モルの割合）が、対応する非改変微生物に比べて改変微生物で高いことを意味する。通常の改変としては、形質転換および組換えによる微生物への遺伝子欠失の導入、遺伝子置換、ならびに異種遺伝子の発現のためのベクターの導入を含む。
【００２７】
本発明によれば、この方法に使用される改変微生物は、一方でメチオニン生産の向上のための改変、他方で非改変微生物に比べてトレオニンからメチオニン以外の化合物の生産を低減するための改変を含んでなる。
【００２８】
「メチオニン以外の化合物」とは、特に、グリシンおよびイソロイシンを表す。
【００２９】
微生物におけるメチオニン生産に関与する遺伝子は当技術分野で公知であり、メチオニン特異的生合成経路に関与する遺伝子ならびに前駆体提供経路に関与する遺伝子およびメチオニン消費経路に関与する遺伝子を含んでなる。
【００３０】
メチオニンの効率的生産は、メチオニン特異的経路の至適化およびいくつかの前駆体供給経路を必要とする。メチオニン生産株は特許出願ＷＯ２００５／１１１２０２、ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されており、引用することにより本願の一部とされる。
【００３１】
その阻害剤ＳＡＭおよびメチオニンに対するフィードバック感受性が低減されたホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ対立遺伝子を過剰発現するメチオニン生産株は特許出願ＷＯ２００５／１１１２０２に記載されている。この出願はまた、これらの対立遺伝子と、特許出願ＪＰ２０００／１５７２６７に示唆されたようなメチオニンレギュロンのダウンレギュレーションを担うメチオニンレプレッサーＭｅｔＪ（ＧｅｎＢａｎｋ  １７９０３７３）の欠失の組合せも記載している。さらに、これらの２つの改変とアスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼの過剰発現の組合せが特許出願ＷＯ２００５／１１１２０２に記載されている。
【００３２】
遺伝子ｃｙｓＥ、ｍｅｔＨおよびｍｅｔＦの過剰発現はＷＯ２００７／０７７０４１に示唆されている。
【００３３】
メチオニンの生産を向上させるためには、微生物は以下のことを示し得る：
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されているような周辺質硫酸結合タンパク質をコードするｃｙｓＰ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されているような硫酸ＡＢＣ輸送体の成分をコードするｃｙｓＵ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されているような膜結合硫酸輸送タンパク質をコードするｃｙｓＷ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されているような硫酸パーミアーゼをコードするｃｙｓＡ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されているようなＯ−アセチルセリンスルフヒドララーゼをコードするｃｙｓＭ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されているような亜硫酸レダクターゼの、それぞれαおよびβサブユニットをコードするｃｙｓＩおよびｃｙｓＪ（ｃｙｓＩとｃｙｓＪはともに過剰発現することが好ましい）、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されているようにアデニリル硫酸レダクターゼをコードするｃｙｓＨ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１に記載されているようなセリンアシルトランスフェラーゼをコードするｃｙｓＥ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されているようなテトラヒドロ葉酸依存性アミノメチルトランスフェラーゼをコードするｇｃｖＴ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されているようなアミノエチル基の担体をコードすることによるグリシン切断に関与するｇｃｖＨ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されているようなグリシンデヒドロゲナーゼをコードするｇｃｖＰ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されているようなリポアミドデヒドロゲナーゼをコードするＩｐｄ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されているようなホスホグリセル酸デヒドロゲナーゼをコードするｓｅｒＡ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されているようなホスホセリンホスファターゼをコードするｓｅｒＢ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されているようなホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードするｓｅｒＣ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されているようなセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードするｇｌｙＡ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１に記載されているような５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをコードするｍｅｔＦ、
・ＷＯ２００５／１１１２０２に記載されているようなＳ−アデノシルメチオニンおよび／またはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減されたホモセリンスクシニルトランスフェラーゼをコードするｍｅｔＡ対立遺伝子、
・ＷＯ２００９／０４３８０３およびＷＯ２００５／１１１２０２に記載されているようなトレオニンに対するフィードバック阻害が低減されたアスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするｔｈｒＡまたはｔｈｒＡ対立遺伝子、
・ＷＯ２００７／０７７０４１に記載されているようなＢ１２依存性ホモシステイン−Ｎ５−メチルテトラヒドロ葉酸トランスメチラーゼをコードするｍｅｔＨ
からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現の増強、および／または
以下の遺伝子：
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されているようなピルビン酸キナーゼをコードするｐｙｋＡ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されているようなピルビン酸キナーゼをコードするｐｙｋＦ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されているようなホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼをコードするｐｕｒＵ
のうち少なくとも１つの発現の阻害。
【００３４】
本発明による微生物は、引用することにより本明細書の一部とされる特許出願ＷＯ２００４／０７６６５９に記載されているようにＯ−スクシニル−ホモセリンからホモシステインの生産のために優先的または排他的にＨ２Ｓを用いる変更されたｍｅｔＢ対立遺伝子を使用することによりメチオニンの生産を増大させるためにさらに改変してもよい。
【００３５】
当業者ならば、メチオニン生産を至適化するためには他の遺伝子も改変する必要があり得ることが分かるであろう。これらの遺伝子はＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００７／０２０２９５に開示されている。
【００３６】
上記に引用されるメチオニン生産に関する特許および特許出願の引用は全て、引用することにより本明細書の一部とされる。
【００３７】
本発明の第１の態様において、トレオニンからのグリシンの生産は、トレオニンをグリシンに変換する酵素の活性を減弱することにより低減される。
【００３８】
「低減される」、「減弱される」とは、本明細書において互換的に用いられ、同様の意味を有する。本明細書において、これらの用語は酵素活性または遺伝子発現の部分的または完全な抑制を表し、ひいてはそれは「低減される」または「減弱される」と言われる。
【００３９】
酵素活性は、酵素をそのアミノ酸配列において突然変異させること、対応するＲＮＡからの酵素の翻訳を低減すること、または対応する遺伝子の発現を低減することによって低減することができる。当業者ならば、翻訳を低減するための多くの方法を知っている。酵素発現は、対応するメッセンジャーＲＮＡ(Carrier and Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64)またはそのタンパク質（例えば、ＧＳＴタグ、Amersham Biosciences）を安定化または脱安定化する要素によって低減させてもよい。遺伝子発現は部分的にまたは完全に低減させることができる。この遺伝子発現の低減は、遺伝子発現の阻害か、その遺伝子発現に必要なプロモーター領域の全部もしくは一部の欠失か、その遺伝子のコード領域における欠失か、または野生型プロモーターの、より弱い天然もしくは合成プロモーターによる交換のいずれかであり得る。好適には、遺伝子の減弱は本質的にその遺伝子の完全な欠失であり、その遺伝子はそれらの株の同定、単離および精製を助ける選択マーカー遺伝子に置き換えることができる。
【００４０】
本発明の第１の態様において、改変微生物においてトレオニンからのグリシンの生産が低減される。
【００４１】
特定の態様では、トレオニンをグリシンに変換する酵素の活性が低減される。
【００４２】
本発明のさらに特定の実施形態では、改変微生物において下記遺伝子：ｌｔａＥ、ｋｂｌ、ｇｌｙＡ、ｔｄｈのうち少なくとも１つの発現が減弱される。
【００４３】
本発明の別の特定の実施形態では、改変微生物は、酵素ＧｌｙＡのセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を維持しつつトレオニンアルドラーゼ（ＴＡＬ）活性が減弱されている変異ＧｌｙＡ酵素を発現する。より詳しくは、本発明によれば、ＧｌｙＡ酵素はそのポリペプチド配列における下記のアミノ酸変化：Ｔ１２８Ｓ、Ｔ２２４Ｓ、Ｔ２２５Ｓ、Ｔ２２６Ｓ、Ｔ２２７Ｓ、Ｔ２３０Ｓ、Ｒ２３５Ｋのうち少なくとも１つを持つことができる。最も好ましいアミノ酸変化はＲ２３５Ｋである。
【００４４】
本発明の特定の実施形態では、該微生物から内因性遺伝子ｇｌｙＡが欠失されている。
【００４５】
本発明の第２の態様において、該微生物はトレオニンからのイソロイシンの生産が低減されるように改変される。
【００４６】
特に、トレオニンからのイソロイシンの変換は、トレオニンからα−ケト酪酸への脱アミノ化および／または脱水(dehydratation)によって低減される
【００４７】
本発明の特定の実施形態では、下記酵素活性：トレオニンデアミナーゼ、トレオニンデヒドラターゼのうち少なくとも１つが減弱される。本発明のさらに特定の実施形態では、該改変微生物において下記遺伝子：ｉｌｖＡ、ｔｄｃＢ、ｓｄａＡ、ｓｄａＢ、ｔｄｃＧのうち少なくとも１つが減弱される。
【００４８】
本発明によれば、改変微生物において、トレオニンからのグリシンおよび／またはイソロイシンの生産の低減に加えて、セリン利用能を増大させてもよい。
【００４９】
「セリン利用能が増大されている」とは、代謝経路に利用可能なセリンの内部プールが非改変微生物に比べて増大されていることを表す。この増大は、種々の手段、すなわち、内部生産の増大、分解の減少、外部への輸送の減少、および当業者に公知の他のあらゆる方法によって得られる。
【００５０】
特に、セリン生産は、この微生物において遺伝子ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢ、ｓｅｒＣのうち少なくとも１つの発現を増強することによって増大させてもよい。さらに、セリン分解は、セリンデアミナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子ｓｄａＡまたはｓｄａＢのうち少なくとも１つの活性を減弱することによって減少させてもよい。本発明の好ましい実施形態では、ｓｄａＡ遺伝子は１５８位においてグアニンの代わりにチミジンヌクレオチドを有する。
【００５１】
本発明のさらに特定の実施形態では、上記のように、トレオニンアルドラーゼ活性が低減されたｇｌｙＡ対立遺伝子の発現を増強することができる。
【００５２】
本発明の記載において、遺伝子およびタンパク質は大腸菌における対応する遺伝子の名称を用いて識別される。しかしながら、特に断りのない限り、これらの名称の使用は本発明に従うより一般的な意味を有し、他の生物、より詳しくは微生物における対応する遺伝子およびタンパク質の総てを包含する。
【００５３】
当業者ならば、ＧｅｎＢａｎｋに示されている既知の遺伝子に関する参照を用いて他の生物、細菌株、酵母、真菌、哺乳類、植物などにおける等価な遺伝子を決定することができる。この常法は、有利には、他の微生物由来の遺伝子との配列アラインメントを行い、縮重プローブを設計して、他の生物における対応する遺伝子をクローニングすることにより決定することができるコンセンサス配列を使用して行われる。これらの分子生物学の常法は当業者によく知られており、例えば、Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York)に記載されている。
【００５４】
ＰＦＡＭ(アラインメントのタンパク質ファミリーデータベースおよび隠れマルコフモデル(protein families database of alignments and hidden Markov models);
（http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/）は、タンパク質配列アラインメントを多数集めたものである。各ＰＦＡＭにより、多重アラインメントを視覚化し、タンパク質ドメインを調べ、生物間の分布を評価し、他のデータベースへのアクセスを確保し、既知のタンパク質構造を視覚化することができる。
【００５５】
主要な系統発生系を示す、完全に配列決定されたゲノムからのタンパク質配列を比較することにより、ＣＯＧ（タンパク質のオーソロガス群のクラスター(clusters of orthologous groups of proteins)；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）が得られる。各ＣＯＧは、少なくとも３つの系から定義されるので、前に保存されたドメインを同定することができる。
【００５６】
相同配列およびそれらの相同性％を同定する手段は当業者によく知られており、特にＢＬＡＳＴプログラムが挙げられ、このプログラムは、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/から、このウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに利用することができる。次に、得られた配列を、例えばプログラムＣＬＵＳＴＡＬＷ(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)またはＭＵＬＴＡＬＩＮ(http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html)を、これらのウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに用いて活用する（例えば、アラインする）ことができる。
【００５７】
発酵プロセスにおいてメチオニン、その前駆体または誘導体を生産するための方法は当業者によく知られている。プロセスを至適化するために、硫黄源、炭素源および窒素源の選択などの発酵プロセスの種々の因子を調整することができる。
【００５８】
本発明の好ましい態様では、培養培地に添加される、Ｌ−メチオニンの発酵生産に用いられる硫黄源は、硫酸塩、チオ硫酸塩、硫化水素、ジチオン酸塩、亜ジチオン酸塩、亜硫酸塩、メチルメルカプタン、二硫化ジメチルおよびその他のメチルキャップ亜硫酸塩または種々の供給源の組合せである。
【００５９】
より好適には、培養培地中の硫黄源は硫酸塩もしくはチオ硫酸塩、またはその混合物である。
【００６０】
本発明による「炭素源」とは、微生物の正常な増殖を助けるために当業者が使用可能ないずれの炭素源も表し、六炭糖（グルコース、ガラクトースまたはラクトースなど）、五炭糖、単糖類、二糖類（スクロース、セロビオースまたはマルトースなど）、オリゴ糖、糖蜜、デンプンまたはその誘導体、ヘミセルロース、グリセロールおよびそれらの組合せであり得る。特に好ましい炭素源はグルコースである。別の好ましい炭素源はスクロースである。
【００６１】
本発明の特定の実施形態では、炭素源は再生可能な供給原料に由来する。再生可能な供給原料は、短期のうちに、その目的生成物への変換を可能とするに十分な量で再生され得る、特定の工業プロセスに必要とされる原料と定義される。
【００６２】
窒素源とは、アンモニウム塩またはアンモニアガスのいずれかに相当する。
【００６３】
窒素源は、アンモニウムまたはアンモニアの形で供給される。
【００６４】
発酵は一般に、少なくとも１つの単純炭素源、および必要であれば代謝産物の生産のための補助基質を含有する、使用する微生物に適合された適当な培養培地の入った発酵槽で行われる。
【００６５】
当業者ならば、本発明による微生物に対する培養条件を定義することができる。特に、細菌は２０℃〜５５℃の間、好適には２５℃〜４０℃の間、より具体的には、Ｃ．グルタミクムでは約３０℃、大腸菌では約３７℃の温度で発酵される。
【００６６】
大腸菌に対する既知の培養培地の例として、その培養培地はＭ９培地(Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128)、Ｍ６３培地(Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)またはSchaefer ら (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96)により定義されているものなどの培地と同一または類似の組成であり得る。
【００６７】
Ｃ．グルタミクムに対する既知の培養培地の例として、その培養培地はＢＭＣＧ培地(Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210)またはRiedel ら (2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583)により記載されているものなどの培地と同一または類似の組成であり得る。
【００６８】
本発明の特定の態様では、培養は、微生物を無機基質、特に、リン酸塩および／またはカリウムに関して制限するまたは飢餓状態とするような条件で行われる。
【００６９】
生物が無機基質の制限を受けるとは、微生物の増殖が、なお弱い増殖を許容しつつ、供給された無機化学物質の量によって支配される条件を定義する。
【００７０】
無機基質に関して微生物を飢餓状態にするとは、その無機基質が存在しないために微生物の増殖が完全に停止する条件を定義する。
【００７１】
本発明はまた、所望により最終産物の一部または全量（０〜１００％）に留まっている発酵液および／またはバイオマスのメチオニン、その前駆体または誘導体を単離する工程を含んでなる、メチオニンの生産方法に関する。
【００７２】
発酵後、必要であればＬ−メチオニン、その前駆体またはそれに由来する化合物を回収および精製する。培養培地中のメチオニンおよびＮ−アセチル−メチオニンなどの生成化合物の回収および精製のための方法は当業者によく知られている。
【００７３】
場合により０〜１００％、好適には少なくとも９０％、より好適には９５％、いっそうより好適には少なくとも９９％のバイオマスが発酵産物の精製中に得られる。
【００７４】
場合により、メチオニン誘導体Ｎ−アセチル−メチオニンを、メチオニンが回収される前に、脱アシル化によってメチオニンに変換させる。
【００７５】
本発明はまた、
・Ｍｅｔｊ遺伝子の欠失、
・メチオニンに対するフィードバック感受性が低減された対立遺伝子ＭｅｔＡの発現、および
・上記のような改変の少なくとも１つ
を含んでなる改変微生物に関する。
【００７６】
本発明はまた、以下の実施例に記載されているものなどの改変微生物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】ピルビン酸、トレオニン、イソロイシンおよびメチオニンを含む代謝経路を示す。
【実施例】
【００７８】
実施例Ｉ：ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ（ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１）株の構築
メチオニン生産株は特許出願ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３３７２（引用することにより本願の一部とされる）に記載されている。
【００７９】
１．ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ（ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１）株の構築
特許出願ＷＯ２００７／０７７０４１およびＰＣＴ／ＦＲ２００９／０５２５２０に記載されているプラスミドｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１を、エレクトロポレーションによって組換え株ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＵＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡに導入し、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＲＵ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＵＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ（ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１）を得た。
【００８０】
実施例ＩＩ：ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｌｔａＥ  Δｔｄｈ（ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１）株の構築
メチオニン生産株は特許出願ＷＯ２００７０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３３７２（引用することにより本願の一部とされる）に記載されている。
【００８１】
１．ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｌｔａＥ：：Ｋｍ株の構築
ｌｔａＥ遺伝子を不活化するために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略は、考慮する遺伝子の大部分を欠失させるとともに、カナマイシン耐性カセットを挿入することを可能とする。この目的で、ＤｌｔａＥＦとＤｌｔａＥＲの２つのオリゴヌクレオチドを用いた（ウェブサイトhttp://ecogen.org/に参照配列）。
【００８２】
ＤｌｔａＥＦ（配列番号１）
0005922036.tif 000002
この配列は以下の領域を有する。
・ｌｔａＥ領域の９０８４４６〜９０８５２６の配列と相同な領域（小文字）
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域（大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
【００８３】
ＤｌｔａＥＲ（配列番号２）
0005922036.tif 000003
この配列は以下の領域を有する。
・ｌｔａＥ領域の９０７４４６〜９０７５２５の配列と相同な領域（小文字）
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域（大文字）
【００８４】
オリゴヌクレオチドＤｌｔａＥＦおよびＤｌｔａＥＲを用いて、プラスミドｐＫＤ４からカナマイシン耐性カセットをＰＣＲ増幅した。次に、得られたＰＣＲ産物をエレクトロポレーションによって、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＵＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ（ｐＫＤ４６）株に導入した（ここで、発現されるＲｅｄリコンビナーゼ酵素が相同組換えを可能とする）。次に、このカナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、以下に定義されるオリゴヌクレオチドｌｔａＥＦおよびｌｔａＥＲを用いたＰＣＲ分析により確認する。保持した株をＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｌｔａＥ：：Ｋｍと呼称した。
【００８５】
ｌｔａＥＦ（配列番号３）
0005922036.tif 000004
（ｌｔａＥ領域の９０７２３４〜９０７２５４の配列と相同）
ｌｔａＥＲ（配列番号４）
0005922036.tif 000005
（ｌｔａＥ領域の９０８６０３〜９０８６２３の配列と相同）
【００８６】
２．ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｌｔａＥ：：Ｋｍ  Δｔｄｈ：：Ｃｍ株の構築
ｔｄｈ遺伝子を不活化するために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略は、考慮する遺伝子の大部分を欠失させるとともに、クロラムフェニコール耐性カセットを挿入することを可能とする。この目的で、ＤｔｄｈＦとＤｔｄｈＲの２つのオリゴヌクレオチドを用いた（ウェブサイトhttp://ecogen.org/に参照配列）。
【００８７】
ＤｔｄｈＦ（配列番号５）
0005922036.tif 000006
この配列は以下の領域を有する。
・ｔｄｈ領域の３７８９２８７〜３７８９３６６の配列と相同な領域（小文字）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅に関する領域（大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
【００８８】
ＤｔｄｈＲ（配列番号６）
0005922036.tif 000007
この配列は以下の領域を有する。
・ｔｄｈ領域の３７８８３４８〜３７８８４３１の配列と相同な領域（小文字）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅に関する領域（大文字）
【００８９】
オリゴヌクレオチドＤｔｄｈＦおよびＤｔｄｈＲを用いて、プラスミドｐＫＤ３からクロラムフェニコール耐性カセットをＰＣＲ増幅した。次に、得られたＰＣＲ産物をエレクトロポレーションによって、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＯＷ  ＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＵＦ  Ｆｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｌｔａＥ：：Ｋｍ（ｐＫＤ４６）株に導入した（ここで、発現されるＲｅｄリコンビナーゼ酵素が相同組換えを可能とする）。次に、クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、以下に定義されるオリゴヌクレオチドｔｄｈＦおよびｔｄｈＲを用いたＰＣＲ分析により確認した。保持した株をＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｌｔａＥ：：Ｋｍ  Δｔｄｈ：：Ｃｍと呼称した。
【００９０】
ｔｄｈＦ（配列番号７）
0005922036.tif 000008
（ｔｄｈ領域の３７８８２１０〜３７８８２３３の配列と相同）
ｔｄｈＲ（配列番号８）
0005922036.tif 000009
（ｔｄｈ領域の３７９０７１９〜３７９０７３８の配列と相同）
【００９１】
３．ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｌｔａＥ  Δｔｄｈ株の構築
次に、カナマイシン耐性カセットおよびクロラムフェニコール耐性カセットを除去した。カナマイシンまたはクロラムフェニコール耐性カセットのＦＲＴ部位に作用するリコンビナーゼＦＬＰを担持するｐＣＰ２０プラスミドを、エレクトロポレーションによって組換え株ＭＧ１６５５  ｍｅｔ  Ａ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＦＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  Δｌｔａ：：Ｋｍ  Δｔｄｈ：：Ｃｍに導入した。４２℃での一連の培養の後、カナマイシン耐性カセットおよびクロラムフェニコール耐性カセットが存在しないことを、従前に用いたものと同じオリゴヌクレオチドｌｔａＥＦ／ｌｔａＥＲおよびｔｄｈＦ／ｔｄｈＲを用いたＰＣＲ分析により確認した。保持した株をＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｌｔａＥ  Δｔｄｈと呼称した。
【００９２】
４．ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｌｔａＥ  Δｔｄｈ（ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１）株の構築
特許出願ＷＯ２００７／０７７０４１およびＰＣＴ／ＦＲ２００９／０５２５２０に記載されているプラスミドｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１を、エレクトロポレーションによって組換え株ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｌｔａＥ  Δｔｄｈに導入し、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＵＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｌｔａＥ  Δｔｄｈ（ｐＭＥ１０１−ｔＡｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１）株を得た。
【００９３】
実施例ＩＩＩ：生産株の評価
生産株を小エルレンマイヤーフラスコで評価した。５．５ｍＬの前培養物を混合培地（２．５ｇ／Ｌグルコースおよび９０％最小培地ＰＣ１を含む１０％ＬＢ培地（Ｓｉｇｍａ２５％））中、３７℃で１６時間増殖させた。これを用いて、培地ＰＣ１においてＯＤ６００が０．２となるよう５０ｍＬ培養物に植菌を行った。スペクチノマイシンは終濃度５０ｍｇ／Ｌで加えた。培養温度は３７℃とした。培養物のＯＤ６００が５〜７に達した際に、細胞外アミノ酸を、ＯＰＡ／Ｆｍｏｃ誘導体化後にＨＰＬＣにより定量し、他の関連の代謝産物は、屈折率測定検出を用いたＨＰＬＣ（有機酸およびグルコース）およびシリル化後のＧＣ−ＭＳを用いて分析した。各株につき３反復を行った。
【００９４】
株１  ＭＧ１６５５  ｍｅｔ  Ａ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ（ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１）
株２  ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｌｔａＥ  Δｔｄｈ（ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１）
【００９５】
表１：最小培地の組成（ＰＣ１）
【表１】
0005922036.tif 000010
【００９６】
表２：種々の株により回分培養で生産されたメチオニン収率（Ｙｍｅｔ）（メチオニンｇ／グルコースｇの％）。メチオニン／グルコース収率の正確な定義については下記を参照。ＳＤは、３回の反復に基づいて計算された収率の標準偏差を示す。
【表２】
0005922036.tif 000011
細胞外メチオニン濃度は、ＯＰＡ／ＦＭＯＣ誘導体化後にＨＰＬＣにより定量した。残留グルコース濃度は屈折率測定検出を用いたＨＰＬＣを用いて分析した。メチオニン収率は次のように表した。
【数１】
0005922036.tif 000012
表１から分かるように、遺伝子ｔｄｈおよびｌｔａＥの欠失の際には、メチオニン／グルコース収率（Ｙｍｅｔ）が増大する。
【００９７】
実施例ＩＶ：下記実施例ＶおよびＶＩで試験されるメチオニン生産株３〜１２の構築
１．プロトコール
いくつかのプロトコールを用いてメチオニン生産株を構築したが、それらを下記実施例に記載する。
【００９８】
プロトコール１：相同組換えおよび組換え体の選択による染色体改変(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000))。
特定の染色体座における対立遺伝子置換または遺伝子破壊を、Datsenko. & Wanner (2000)により記載されているような相同組換えによって行った。Ｆｌｐ認識部位が隣接するクロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性ｃａｔ遺伝子、カナマイシン（Ｋｍ）耐性ｋａｎ遺伝子、またはゲンタマイシン（Ｇｔ）耐性ｇｍ遺伝子を、それぞれ鋳型としてｐＫＤ３またはｐＫＤ４またはｐ３４Ｓ−Ｇｍ(Dennis et Zyltra, AEM july 1998, p 2710-2715)プラスミドを用いたＰＣＲにより増幅した。得られたＰＣＲ産物を用いて、λ  Ｒｅｄ（γ、β、ｅｘｏ）リコンビナーゼを発現するプラスミドｐＫＤ４６を担持するレシピエント大腸菌株を形質転換した。抗生物質耐性変換体を選択し、突然変異を有する遺伝子座の染色体構造を表４に挙げられている適当なプライマーを用いたＰＣＲ分析によって確認した。
【００９９】
ｐＣＰ２０プラスミドを担持するクローンを３７℃にてＬＢ上で培養した後、３０℃で抗生物質耐性の欠損を調べたこと以外は、Datsenko. & Wanner (2000)により記載されている通りにプラスミドｐＣＰ２０を用いてｋａｎ耐性遺伝子を除去した。次に、抗生物質感受性クローンを表４に挙げられているプライマーを用いたＰＣＲによって確認した。
【０１００】
プロトコール２：Ｐ１ファージ形質導入
染色体改変をＰ１形質導入により、所与の大腸菌レシピエント株に移入した。このプロトコールは、（ｉ）耐性遺伝子関連の染色体改変を含むドナー株に対するファージ溶解液の調製と、（ｉｉ）得られたファージ溶解液によるレシピエント株の感染、の２工程から構成される。
【０１０１】
ファージ溶解液の調製
・１０ｍｌのＬＢ＋Ｋｍ５０μｇ／ｍｌまたは＋グルコース０．２％＋ＣａＣｌ２  ５ｍＭ中、目的の染色体改変を有するＭＧ１６５５株の一晩培養物１００μｌを植菌する。
・振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートする。
・ドナーＭＧ１６５５株で調製されたＰ１ファージ溶解液１００μｌ（約１×１０９ファージ／ｍＬ）を添加する。
・３７℃で３時間、細胞が完全に溶解するまで振盪する。
・２００μｌのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける。
・４５００ｇで１０分間遠心分離して細胞残渣を除去する。
・上清を滅菌試験管に移す。
・溶解液を４℃で保存する。
【０１０２】
形質導入
・ＬＢ培地中で培養した大腸菌レシピエント株の一晩培養物５ｍｌを１５００ｇで１０分間遠心分離する。
・２．５ｍｌのＭｇＳＯ４  １０ｍＭ、ＣａＣｌ２  ５ｍＭに細胞ペレットを懸濁させる。
・１００μｌの細胞に、染色体改変株ＭＧ１６５５のＰ１ファージ１００μｌ（試験管）および対照試験管としてＰ１ファージを含まない１００μｌ細胞および細胞を含まない１００μｌのＰ１ファージを感染させる。
・振盪せずに３０℃で３０分間インキュベートする。
・各試験管に１００μｌの１Ｍクエン酸ナトリウムを加え、ボルテックスにかける。
・１ｍｌのＬＢを加える。
・振盪しながら３７℃で１時間インキュベートする。
・７０００ｒｐｍで３分間遠心分離する。
・ＬＢ＋Ｋｍ  ５０μｇ／ｍｌに播種する。
・３７℃で一晩インキュベートする。
【０１０３】
その後、抗生物質耐性形質導入体を選択し、突然変異遺伝子座の染色体構造を、表４に挙げられている適当なプライマーを用いたＰＣＲ分析によって確認した。
【０１０４】
以下実施例で、表３に挙げられている全ての株の構築について説明する。
【０１０５】
表３：以下の実施例に見られる中間株および生産株の遺伝子型および対応番号の一覧
【表３】
0005922036.tif 000013
0005922036.tif 000014
【０１０６】
２．株３の説明
メチオニン生産株３の遺伝子改変（表３）は特許出願ＥＰ１０３０６１６４．４およびＵＳ６１／４０６２４９（引用することにより本願の一部とされる）に記載されている。株３のＤＮＡ配列決定を行った後、予期しないことにｓｄａＡ遺伝子にミスセンス突然変異が特定された。この突然変異は構造遺伝子の１５８番に存在し（Ｔ１５８Ｇ）、対応するタンパク質にロイシン５３からアルギニンへのアミノ酸変化を生じる。この対立遺伝子をｓｄａＡ＊１と呼称した。
【０１０７】
３．改変型ｓｄａＡ遺伝子を有する株の構築−セリン分解経路の改変
３．１．ｓｄａＡ＊（Ｔ１５８Ｇ）を含む株５の構築
株３においてｙｏｂＤ遺伝子を欠失させるために、プライマーＯｍｅ１９８３−ＤｙｏｂＤ−ａｍｐｌｉｆ−Ｆ（配列番号０９）およびＯｍｅ１９８６−ＤｙｏｂＤ−ａｍｐｌｉｆ−Ｒ（配列番号１０）（表４）を用いて、ＢＷ２５１１３  ΔｙｏｂＤ：：Ｋｍ株(Keio collection Baba. et al., Mol Syst Biol, 2, 2006-0)からΔｙｏｂＤ：：Ｋｍ欠失を増幅したこと以外はプロトコール１を用いた。
【０１０８】
カナマイシン耐性組換え体を選択した。耐性カセットの挿入は、プライマーＯｍｅ１９８７−ＤｙｏｂＤ−ｖｅｒｉｆ−Ｆ（配列番号１１）およびＯｍｅ１９８８−ＤｙｏｂＤ−ｖｅｒｉｆ−Ｒ（配列番号１２）（表４）を用いたＰＣＲにより、また、ＤＮＡ配列決定により確認した。ｓｄａＡ遺伝子のｓｄａＡ＊１対立遺伝子もＤＮＡ配列決定により確認した。プラスミドｐＫＤ４６を除去した後、得られた株ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ｓｄａＡ＊１  ΔｙｏｂＤ：：Ｋｍを株４と呼称した（表３）。
【０１０９】
次に、特許出願ＥＰ１０３０６１６４．４およびＵＳ６１／４０６２４９に記載されているｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７を、エレクトロポレーションによって株４（表３）に導入した。プラスミドｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７の存在を確認し、得られた株ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔ  Ａ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ｓｄａＡ＊１  ＡｙｏｂＤ：：Ｋｍ  ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７を株５と呼称した（表３）。
【０１１０】
３．２．再構成ｓｄａＡｗｔ対立遺伝子（ｓｄａＡｒｃ）を含む株７の構築
遺伝子ｓｄａＡおよびｙｏｂＤは、大腸菌染色体上で近接しており（それぞれ４０．８４ｍｉｎと４１．０１ｍｉｎ）、ファージＰ１は２ｍｉｎの大腸菌染色体をパッケージングできるので、これらの遺伝子ｓｄａＡとｙｏｂＤは同時に形質導入可能である。これにより、ｓｄａＡ野生型対立遺伝子とＡｙｏｂＤ：：Ｋｍ欠失は、プロトコール２に従い、ＢＷ２５１１３  ｓｄａＡ  ＡｙｏｂＤ：：Ｋｍ株(Keio collection Baba. et al., Mol Syst Biol, 2, 2006-0)から、Ｐ１ファージ溶解液を用いて株３（表３）へ同時に形質導入した。
【０１１１】
カナマイシン耐性形質導入体を選択した。ΔｙｏｂＤ：：Ｋｍ欠失の存在は、プライマーＯｍｅ１９８７−ＤｙｏｂＤ−ｖｅｒｉｆ−Ｆ（配列番号１１）およびＯｍｅ１９８８−ＤｙｏｂＤ−ｖｅｒｉｆ−Ｒ（配列番号１２）（表４）を用いたＰＣＲとその後のＤＮＡ配列決定により確認した。ｓｄａＡ野生型対立遺伝子とｄａＡ＊１対立遺伝子の交換はＤＮＡ配列決定により確認し、ｓｄａＡｒｃ（ｒｃは再構成を表す）と呼称した。得られた株ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ｓｄａＡｒｃ  ΔｙｏｂＤ：：Ｋｍを株６と呼称した（表３）。
【０１１２】
次に、特許出願ＥＰ１０３０６１６４．４およびＵＳ６１／４０６２４９に記載されているプラスミドｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７を、エレクトロポレーションによって株６（表３）に導入した。プラスミドｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７の存在を確認し、得られた株ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ｓｄａＡｒｃ  ΔｙｏｂＤ：：Ｋｍ  ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７を株７と呼称した（表３）。
【０１１３】
４．タンパク質ＧｌｙＡまたはＧｌｙＡ＊（Ｒ２３５Ｋ）過剰生産株の構築−トレオニン／グリシン経路の改変
４．１．ｇｌｙＡ遺伝子の欠失による株８の構築
株３においてｇｌｙＡ遺伝子を欠失させるために、プライマーＯｍｅ０６４１−ＤｇｌｙＡ  Ｒ（配列番号１３）とＯｍｅ０６４２−ＤｇｌｙＡ  Ｆ（配列番号１４）（下記参照）を用いてプラスミドｐＫＤ４からカナマイシン耐性カセットを増幅したこと以外はプロトコール１を用いた。カナマイシン耐性組換え体を選択した。この耐性カセットの挿入は、プライマーＯｍｅ０６４３−ｇｌｙＡ  Ｒ（配列番号１５）とＯｍｅ０６４４−ｇｌｙＡ  Ｆ（配列番号１６）（表４）を用いたＰＣＲ、またＤＮＡ配列決定により確認した。得られた株をＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ΔｇｌｙＡ：：Ｋｍ  ｐＫＤ４６と呼称した。
【０１１４】
Ｏｍｅ０６４１−ＤｇｌｙＡ  Ｒ（配列番号１３）
0005922036.tif 000015
この配列は以下の領域を有する。
・ｇｌｙＡ遺伝子の上流配列（２６８３４５１〜２６８３５２９、ウェブサイトhttp://ecogene.org/に参照配列)と相同な大文字の配列
・プラスミドｐＫＤ４(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)のプライマー部位２に相当する下線大文字の配列
【０１１５】
Ｏｍｅ０６４２−ＤｇｌｙＡ  Ｆ（配列番号１４）
0005922036.tif 000016
この配列は以下の領域を有する。
・ｇｌｙＡ遺伝子の上流配列（２６８２２９８〜２６８２３７６、ウェブサイトhttp://ecogene.org/に参照配列)と相同な大文字の配列
・プラスミドｐＫＤ４(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)のプライマー部位１に相当する下線大文字の配列
【０１１６】
次に、プロトコール２に従い、上記のＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ΔｇｌｙＡ：：Ｋｍ  ｐＫＤ４６株からＰ１ファージ溶解液を用いて、ΔｇｌｙＡ：：Ｋｍ欠失を株３（表３）に形質導入した。
【０１１７】
カナマイシン耐性形質導入体を選択した。ΔｇｌｙＡ：：Ｋｍ欠失の存在は、プライマーＯｍｅ０６４３−ｇｌｙＡ  Ｒ（配列番号１５）とＯｍｅ０６４４−ｇｌｙＡ  Ｆ（配列番号１６）（表４）を用いたＰＣＲにより確認した。得られた株ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ＤｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ｓｄａＡ＊１  ΔｇｌｙＡ：：Ｋｍを株８と呼称した（表３）。
【０１１８】
４．２．ｇｌｙＡを発現する株９の構築
大腸菌のセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子を過剰発現させるために、プラスミドｐＣＣ１Ｂ  ＡＣ(EpiCentre)およびｐＳＣＢ(Stratagene)に由来するプラスミドｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ−ＴＴｇｌｙＡを構築した。
【０１１９】
プラスミドｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ−ＴＴｇｌｙＡを構築するために、ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ−ＴＴｇｌｙＡ挿入配列を、鋳型としてＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡを用い、プライマーＯｍｅ１１６２−ｇｌｙＡＲ−ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号１７）とＯｍｅ１１６５−ＰｇｌｙＡＦ−ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号１８）を用いたＰＣＲにより増幅し、プラスミドｐＳＣＢ(Stratagene)にクローニングした。得られたベクターを配列決定により確認し、ｐＳＣＢ−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ−ＴＴｇｌｙＡと呼称した。
【０１２０】
次に、プラスミドｐＳＣＢ−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ−ＴＴｇｌｙＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、得られた断片ＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ−ＴＴｇｌｙＡ−ＨｉｎｄＩＩＩを、プラスミドｐＣＣ１ＢＡＣのＨｉｎｄＩＩＩ部位間にクローニングした。選択されたプラスミドは、プラスミドｐＣＣ１ＢＡＣｌａｃＺプロモーターとは逆配向にＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ−ＴＴｇｌｙＡ挿入配列を持っており、これをＤＮＡ配列決定により確認し、ｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ−ＴＴｇｌｙＡと呼称した。
【０１２１】
Ｏｍｅ１１６２−ｇｌｙＡＲ−ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号１７）
0005922036.tif 000017
この配列は以下の領域を有する。
・ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位およびＥｃｏＲＩ制限部位ならびに余分な塩基に関する下線大文字の配列
・ｇｌｙＡプロモーター配列（２６８２０６３〜２６８２０８５、ウェブサイトhttp://ecogene.org/に参照配列）と相同な太字大文字の配列
【０１２２】
Ｏｍｅ１１６５−ＰｇｌｙＡＦ−ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号１８）
0005922036.tif 000018
この配列は以下の領域を有する。
・ＢａｍＨＩ制限部位およびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位ならびに余分な塩基に関する下線大文字の配列
・ｇｌｙＡ遺伝子の転写ターミネーター（２６８３７４４〜２６８３７６２、ウェブサイトhttp://ecogene.org/に参照配列）と相同な太字大文字の配列
【０１２３】
次に、上記のｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ−ＴＴｇｌｙＡを、エレクトロポレーションによって株８（表３）の導入した。プラスミドｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ−ＴＴｇｌｙＡの存在を確認し、得られた株ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ＤｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ｓｄａＡ＊１  ΔｇｌｙＡ：：Ｋｍ  ｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ−ＴＴｇｌｙＡを株９と呼称した（表３）。
【０１２４】
４．３．ｇｌｙＡ＊を発現する株１０の構築
ｐＳＣＢ−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ＊（Ｒ２３５Ｋ）−ＴＴｇｌｙＡの構築
プラスミドｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ＊（Ｒ２３５Ｋ）−ＴＴｇｌｙＡを構築するために、プライマーＯｍｅ１４８３−ｇｌｙＡ＊  Ｒ  Ｒ２３５Ｋ（配列番号１９）とＯｍｅ１４８２−ｇｌｙＡ＊  Ｆ  Ｒ２３５Ｋ（配列番号２０）を用いてプラスミドｐＳＣＢ−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ−ＴＴｇｌｙＡを構築した。親ＤＮＡ鋳型を除去するためにこのＰＣＲ産物をＤｐｎＩで消化した。得られた接着性のオーバーハングをリン酸化し、大腸菌株に導入し、プラスミドｐＳＣＢ−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ＊（Ｒ２３５Ｋ）−ＴＴｇｌｙＡを形成した。このＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ＊（Ｒ２３５Ｋ）−ＴＴｇｌｙＡ挿入配列、特に、ｇｌｙＡ遺伝子におけるＲ２３５Ｋ（７０３−ＡＡＡ−７０５）突然変異の存在をＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１２５】
Ｏｍｅ１４８３  ｇｌｙＡ＊  Ｒ  Ｒ２３５Ｋ（配列番号１９）
0005922036.tif 000019
この配列は以下の領域を有する。
・ｇｌｙＡ遺伝子（２６８２８０２〜２６８２８５０、ウェブサイトhttp://ecogene.org/に参照配列）と相同な大文字の配列
・挿入されたコドン突然変異ＣＧＣ−７０８−ＴＴＴ（Ｒ２３５Ｋ）に相当する太字大文字
・ＳｔｕＩ制限部位を出現させるサイレント点突然変異（Ｇ７０４Ｔ）に相当する下線大文字
【０１２６】
Ｏｍｅ１４８２  ｇｌｙＡ＊  Ｆ  Ｒ２３５Ｋ（配列番号２０）
0005922036.tif 000020
この配列は以下の領域を有する。
・ｇｌｙＡ遺伝子（２６８２８０２〜２６８２８５０、ウェブサイトhttp://ecogene.org/に参照配列）と相同な大文字の配列
・挿入されたコドン突然変異ＣＧＣ−７０８−ＴＴＴ（Ｒ２３５Ｋ）に相当する太字大文字
・ＳｔｕＩ制限部位を出現させるサイレント点突然変異（Ｇ７０４Ｔ）に相当する下線大文字
【０１２７】
ｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ＊（Ｒ２３５Ｋ）−ＴＴｇｌｙＡの構築
ｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ＊（Ｒ２３５Ｋ）−ＴＴｇｌｙＡを構築するために、下記のｐＳＣＢ−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ＊（Ｒ２３５Ｋ）−ＴＴｇｌｙＡからＨｉｎｄＩＩＩ断片ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ＊（Ｒ２３５Ｋ）−ＴＴｇｌｙＡを精製し、プラスミドｐＣＣ１ＢＡＣのＨｉｎｄＩＩＩ部位間にクローニングした。選択されたプラスミドは、プラスミドｐＣＣ１ＢＡＣのｌａｃＺプロモーター配向とは逆配向にＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ＊（Ｒ２３５Ｋ）−ＴＴｇｌｙＡ挿入配列を持っており、これをＤＮＡ配列決定により確認し、ｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ＊（Ｒ２３５Ｋ）−ＴＴｇｌｙＡと呼称した。
【０１２８】
次に、上記のｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ＊（Ｒ２３５Ｋ）−ＴＴｇｌｙＡを、エレクトロポレーションによって株８（表３）に導入した。プラスミドｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ＊（Ｒ２３５Ｋ）−ＴＴｇｌｙＡの存在を確認し、得られた株ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ＤｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ｓｄａＡ＊１  ΔｇｌｙＡ：：Ｋｍ  ｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ＊（Ｒ２３５Ｋ）−ＴＴｇｌｙＡを株１０と呼称した（表３）。
【０１２９】
４．４．ｇｌｙＡを過剰発現する株１１の構築
ｐＣＬ１９２０−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ−ＴＴｇｌｙＡの構築
プラスミドｐＣＬ１９２０−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ−ＴＴｇｌｙＡは、プラスミドｐＣＬ１９２０(Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631)および上記のｐＣＣ１ＢＡＣ−Ｐ  ｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ−ＴＴｇｌｙＡに由来するものである。
【０１３０】
ｐＣＬ１９２０−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ−ＴＴｇｌｙＡを構築するために、ｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ−ＴＴｇｌｙＡから精製したＨｉｎｄＩＩＩ断片ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ−ＴＴｇｌｙＡを、プラスミドｐＣＬ１９２０のＨｉｎｄＩＩＩ部位間にクローニングした。選択されたプラスミドは、プラスミドｐＣＬ１９２０のｌａｃＺプロモーター配向とは逆配向にＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ−ＴＴｇｌｙＡ挿入配列を持っており、これをＤＮＡ配列決定により確認し、ｐＣＬ１９２０−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ−ＴＴｇｌｙＡと呼称した。
【０１３１】
次に、上記のｐＣＬ１９２０−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ−ＴＴｇｌｙＡを、エレクトロポレーションによって株８（表３）に導入した。プラスミドｐＣＬ１９２０−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ−ＴＴｇｌｙＡの存在を確認し、得られた株ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ＤｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ｓｄａＡ＊１  ΔｇｌｙＡ：：Ｋｍ  ｐＣＬ１９２０−Ｐ  ｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ−ＴＴｇｌｙＡを株１１と呼称した（表３）。
【０１３２】
４．５．  ｇｌｙＡ＊を過剰発現する株１２の構築
ｐＣＬ１９２０−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ＊（Ｒ２３５Ｋ）−ＴＴｇｌｙＡの構築
プラスミドｐＣＬ１９２０−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ＊（Ｒ２３５Ｋ）−ＴＴｇｌｙＡは、プラスミドｐＣＬ１９２０(Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631)および上記のｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ＊（Ｒ２３５Ｋ）−ＴＴｇｌｙＡに由来するものである。
【０１３３】
ｐＣＬ１９２０−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ＊（Ｒ２３５Ｋ）−ＴＴｇｌｙＡを構築するために、ｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ＊（Ｒ２３５Ｋ）−ＴＴｇｌｙＡから精製したＨｉｎｄＩＩＩ断片ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ＊（Ｒ２３５Ｋ）−ＴＴｇｌｙＡを、プラスミドｐＣＬ１９２０のＨｉｎｄＩＩＩ部位間にクローニングした。選択されたプラスミドは、ｐＣＬ１９２０プラスミドのｌａｃＺプロモーター配向とは逆配向にＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ＊（Ｒ２３５Ｋ）−ＴＴｇｌｙＡ挿入配列を持っており、これをＤＮＡ配列決定により確認し、ｐＣＬ１９２０−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ＊（Ｒ２３５Ｋ）−ＴＴｇｌｙＡと呼称した。
【０１３４】
次に、このｐＣＬｌ９２０−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ＊（Ｒ２３５Ｋ）−ＴＴｇｌｙＡを、エレクトロポレーションによって株８（表３）に導入した。プラスミドｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ＊（Ｒ２３５Ｋ）−ＴＴｇｌｙＡの存在を確認し、得られた株ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ＤｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ｓｄａＡ＊１  ΔｇｌｙＡ：：Ｋｍ  ｐＣＬｌ９２０−ＰｇｌｙＡ−ｇｌｙＡ＊（Ｒ２３５Ｋ）−ＴＴｇｌｙＡを株１２と呼称した（表３）。
【０１３５】
表４：上記の染色体改変のＰＣＲ確認に用いたプライマー
【表４】
0005922036.tif 000021
【０１３６】
実施例Ｖ：メチオニン生産に対するＧＬＹＡ＊突然変異タンパク質のトレオニンアルドラーゼ活性の減弱の効果
１．ｇｌｙＡまたはｇｌｙＡ＊対立遺伝子のいずれかを有する生産株の評価
生産株を小エルレンマイヤーフラスコで評価した。５．５ｍＬの前培養物を混合培地（２．５ｇ／Ｌグルコースおよび９０％最小培地ＰＣ１を含む１０％ＬＢ培地（Ｓｉｇｍａ２５％））中、３０℃で２１時間増殖させた。これを用いて、培地ＰＣ１（表５の組成）においてＯＤ６００が０．２となるよう５０ｍＬ培養物に植菌を行った。必要であれば、カナマイシンおよびスペクチノマイシンを５０ｍｇ／Ｌ濃度で加え、クロラムフェニコールを３０ｍｇ／Ｌ濃度で加えた。培養温度は３７℃とした。培養物のＯＤ６００が５〜７に達した際に、細胞外アミノ酸を、ＯＰＡ／Ｆｍｏｃ誘導体化後にＨＰＬＣにより定量し、他の関連の代謝産物は、屈折率測定検出を用いたＨＰＬＣ（有機酸およびグルコース）およびシリル化後のＧＣ−ＭＳを用いて分析した。
【０１３７】
表５：最小培地組成（ＰＣ１）
【表５】
0005922036.tif 000022
【０１３８】
表６：上記の条件で増殖させた種々の株により回分培養で生産されたメチオニン収率（Ｙｍｅｔ）（メチオニンｇ／グルコースｇの％）。メチオニン／グルコース収率の正確な定義については下記を参照。ＳＤは、数回の反復に基づいて計算された収率の標準偏差を示す（Ｎ＝反復回数）。
【表６】
0005922036.tif 000023
【０１３９】
セリンからグリシンへの変換を触媒することに加え、ＧｌｙＡ酵素はまたＬ−トレオニンを切断することもできる。このことは本発明者らによりｇｌｙＡ欠失を有する株を用いて証明された。この株は検出可能なセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）およびトレオニンアルドラーゼ（ＴＡＬ）活性を、もはや持っていなかった（データは示されていない）。
【０１４０】
表６から分かるように、メチオニン／グルコース収率（Ｙｍｅｔ）は、ｇｌｙＡｗｔに比べてｇｌｙＡ＊対立遺伝子の発現（株１０）または過剰発現（株１２）時に増大する（ｇｌｙＡｗｔの発現および過剰発現はそれぞれ株９および１１）。
【０１４１】
ＧｌｙＡのセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）に影響を与えずにトレオニンアルドラーゼ活性を減弱することがメチオニンの生産に有益である（下記表７の活性を参照）。
【０１４２】
細胞外メチオニン濃度を、ＯＰＡ／ＦＭＯＣ誘導体化後、ＨＰＬＣにより定量した。残留グルコース濃度は、屈折率測定検出によるＨＰＬＣを用いて分析した。メチオニン収率は次のように表した。
【数２】
0005922036.tif 000024
【０１４３】
２．ｇｌｙＡ  ｗｔまたはｇｌｙＡ＊対立遺伝子のいずれかを過剰発現する株のＳＨＭＴおよびＴＡＬ活性の測定
セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）、トレオニンアルドラーゼ（ＴＡＬ）およびアロトレオニンアルドラーゼ（ａＴＡＬ）活性のin vitro測定については、大腸菌株を上記のような最小培地で培養し、対数増殖期の終了時に遠心分離によりバイオマスを回収した。ペレットをＥＤＴＡとともにプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する冷２０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７．２に再懸濁させた。その後、細胞をＰｒｅＣｅｌｌｙｓ（Bertin Technologies；２×１０秒６５００ｒｐｍ）でビーズビーティングを行うことで溶解させた後、４℃にて３０分１２０００ｇで遠心分離を行った。上清を脱塩し、酵素分析に用いた。タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ試薬(Bradford, 1976)を用いて測定した。
【０１４４】
ＳＨＭＴ活性は、式（１）および（２）に記載されているようにメチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＭＴＨＦＤ）結合酵素アッセイを用いて３７℃にて分光光度測定によりモニタリングした。このアッセイでは、ＳＨＭＴ酵素反応により生産された５，１０−メチレン−ＴＨＦの酸化によって生じた５，１０−メテニル−ＴＨＦの形成を３５０ｎｍでモニタリングした。
（１）Ｌ−セリン＋ＴＨＦ＋２Ｈ＋←→グリシン＋５，１０−メチレン−ＴＨＦ（ＳＨＭＴ反応）
（２）５，１０−メチレン−ＴＨＦ＋ＮＡＤＰ＋←→５，１０−メテニル−ＴＨＦ＋ＮＡＤＰＨ（ＭＴＨＦＤ反応）
【０１４５】
ＳＨＭＴ活性の測定については、２μｇの粗細胞抽出物を５０ｍＭ  Ｂｉｃｉｎｅ−ＫＯＨバッファーｐＨ８．６、１０ｍＭ  Ｌ−セリン、０．４ｍＭ  ＴＨＦ、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノールおよび１．５ｍＭ  ＮＡＤＰ＋中でアッセイした。３７℃で１０分間インキュベートした後、粗細胞抽出物を添加することによって反応を開始し、大腸菌からＭＴＨＦＤ酵素を精製した。その後、この反応混合物を３７℃で１０分間インキュベートし、２％（ｖ／ｖ）過塩素酸を加えることにより反応を停止させた。過塩素酸を添加すると、反応（２）で生じる還元型ピリジンヌクレオチドが破壊される。室温で１０分後、３５０ｎｍにて吸光度を読み取った。実験ごとにＬ−セリンを含まない対照を実施し、分光光度測定のブランクとして用いた。
【０１４６】
グリシンとアセトアルデヒドを生じるＴＡＬ活性は、４−ヒドラジノ−７−ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤＨ）検出系を用いて３７℃で蛍光測定によりアッセイした。アセトアルデヒドの形成率は、生成したアセトアルデヒドをＮＢＤＨで誘導体化して５３０ｎｍでの蛍光ヒドラゾン誘導体を生じさせることによって測定した。２００〜２５０μｇの粗細胞抽出物を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＨＣｌバッファーｐＨ８．０、０．０１ｍＭリン酸ピリドキサールおよび１０ｍＭ  Ｌ−トレオニン中でアッセイした。粗細胞抽出物を添加することによって反応を開始させた。３７℃で１０分および４０分のインキュベーションの後、２．５％（ｖ／ｖ）ＴＣＡを添加することによって反応を停止させた。室温にて１００００ｇで５分遠心分離を行った後、０．３３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２中０．００１％（ｗ／ｖ）のＮＢＤＨを上清に加え、生成した蛍光ヒドラゾンを、室温で１０分インキュベートした後にＦＬｘ８００蛍光マイクロプレートリーダー（λ励起＝４８５ｎｍ；λ発光＝５３０ｎｍ，Biotek）を用いて定量した。実験ごとにＬ−トレオニンを含まない対照を実施し、蛍光測定のブランクとして用いた。
【０１４７】
表７：種々の株に関してセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）活性およびトレオニンアルドラーゼ（ＴＡＬ）活性を測定し、ｍＵＩ／タンパク質ｍｇで示す。標準偏差は数回の独立した培養に基づいて算出した（Ｎ＝反復回数）。
【表７】
0005922036.tif 000025
【０１４８】
表７から分かるように、株１０および１２のＴＡＬ活性（ｇｌｙＡ＊を含む）はそれぞれ、対照株３、９および株１１（ｇｌｙＡｗｔを含む）の約２分の１および６分の１であった。さらに、ＧｌｙＡ酵素に導入されたＲ２３５Ｋ突然変異（ＧｌｙＡ＊となる）は、野生型酵素に比べてそのＳＨＭＴ活性に劇的に影響を及ぼさずにＴＡＬ活性を低下させた。ＧｌｙＡの主要なセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）活性に影響を与えずにトレオニンアルドラーゼ活性を減弱することがメチオニンの生産に有益である（前記表６のメチオニン収率を参照）。
【０１４９】
これは株１０および１２において、株３および１１よりもセリンからグリシンへの炭素フラックスを高めることができ、メチオニン生産結果と良好な一致が見られる（表６）．
【０１５０】
実施例ＶＩ：メチオニン生産に対するセリンデアミナーゼ活性（ＳＤＡ）の減弱の効果
１．ｓｄａＡｒｃ（株７）またはｓｄａＡ＊（株５）のいずれかを有する生産株の評価
流加法を用いた２．５Ｌ発酵槽(Pierre Guerin)での生産条件下で株を試験した。カナマイシンおよびスペクチノマイシン(spectinopycin)を各培地に５０ｍｇ／Ｌの濃度で加えた。簡単に述べれば、２．５ｇ／Ｌグルコースを含む１０ｍＬのＬＢ培地で増殖させた２４時間培養物を用いて、最小培地（Ｂ１ａ）中２４時間前培養物に植菌した。これらのインキュベーションは、ロータリーシェーカー（２００ＲＰＭ）にて、５０ｍＬの最小培地（Ｂ１ａ）の入った５００ｍＬバッフル付きフラスコ中で行った。初回の前培養物を３０℃で増殖させ、２回目の前培養物を３４℃で増殖させた。
【０１５１】
第三の前培養工程は、バイオマス濃度１．２ｇ／Ｌとなるように５ｍＬの濃縮前培養物を植菌した２００ｍＬの最小培地（Ｂ１ｂ）を充填したバイオリアクター(Sixfors)にて行った。前培養温度は３４℃で一定に維持し、ｐＨは１０％ＮＨ４ＯＨ溶液を用いて６．８の値に自動調整した。溶存酸素濃度は、空気供給および／または攪拌を用いて空気分圧飽和度が３０％の値になるように絶えず調整した。回分培養培地からグルコースが消費された後、初期流速０．７ｍＬ／時で流加を開始し、最終細胞濃度を約１８ｇ／Ｌとするために、２４時間、０．１３／時の増加率で指数関数的に上昇させた。
【０１５２】
表８：回分前培養用無機培地組成（Ｂ１ａおよびＢ１ｂ）
【表８】
0005922036.tif 000026
【０１５３】
表９：流加前培養用無機培地組成（Ｆ１）
【表９】
0005922036.tif 000027
【０１５４】
表１０：回分培養用無機培地組成（Ｂ２）
【表１０】
0005922036.tif 000028
【０１５５】
表１１：流加培養用培地組成（Ｆ２）
【表１１】
0005922036.tif 000029
【０１５６】
次に、２．５Ｌの発酵槽(Pierre Guerin)に６００ｍＬの最小培地（Ｂ２）を充填し、バイオマス濃度２．１ｇ／Ｌとなるように５５〜７０ｍＬの範囲の容量の前培養物を植菌した。
【０１５７】
培養温度を３７℃に維持し、ｐＨはＮＨ４ＯＨ溶液（９時間１０％、培養収量まで２８％のＮＨ４ＯＨ）を自動的に添加することで実施値（６．８）に維持した。回分段階では初期攪拌速度を２００ＲＰＭに設定し、流加段階で１０００ＲＰＭに引き上げた。回分段階では初期空気流量を４０ＮＬ／時に設定し、流加段階の最初に１００ＮＬ／時に引き上げた。溶存酸素濃度は攪拌を高めることによって、２０〜４０％の間、好適には３０％飽和の値に維持した。
【０１５８】
細胞塊が５ｇ／Ｌの濃度付近に達したところで、初期流量５ｍＬ／時で流加を開始した。供給溶液はＳ字型で流量を増しつつ注入し、２６時間後に２４ｍＬ／時に達した。厳密な供給条件は式：
【数３】
0005922036.tif 000030
（式中、Ｑ（ｔ）は、回分容量６００ｍＬの場合の供給流量（ｍＬ／時）であり、ｐ１＝１．８０、ｐ２＝２２．４０、ｐ３＝０．２７０、ｐ４＝６．５）
により算出した。
【０１５９】
２６時間の流加後、供給溶液ポンプを停止し、グルコースが消費された後に培養を停止した。
【０１６０】
細胞外アミノ酸を、ＯＰＡ／Ｆｍｏｃ誘導体化後にＨＰＬＣにより定量し、他の関連の代謝産物は、屈折率測定検出を用いたＨＰＬＣ（有機酸およびグルコース）およびシリル化後のＧＣ−ＭＳを用いて分析した。
【０１６１】
表１２：株により流加培養で生産された最大メチオニン収率（Ｙｍｅｔ ｍａｘ）（メチオニンｇ／グルコースｇの％）。メチオニン／グルコース収率の定義については下記を参照。ＳＤは、数回の反復に基づいて計算された収率の標準偏差を示す（Ｎ＝反復回数）。
【表１２】
0005922036.tif 000031
表１２から分かるように、メチオニン／グルコース収率（Ｙｍｅｔ）は、ｓｄａＡｗｔ発現の場合に比べてｓｄａＡ＊対立遺伝子の発現の際に増大する。ＳｄａＡ酵素のセリンデアミナーゼ活性の減弱は、メチオニン生産のためのセリン利用能を高める。
【０１６２】
発酵槽容量は、最初の容量にｐＨを調節するため、また、培養物に供給するために添加した溶液を加え、サンプリングに用いた容量および蒸発による損失を差し引くことで算出した。
【０１６３】
硫加容量は供給原料を秤量することにより絶えず追跡した。次に、注入されたグルコースの量は注入重量、溶液の濃度およびＢｒｉｘの方法によって測定されたグルコース濃度（［グルコース］）に基づいて算出した。
【０１６４】
メチオニン収率は次のように表した。
【数４】
0005922036.tif 000032
【０１６５】
ここで、培養中に得られた最大収率を各株について示した。
【０１６６】
メチオニン０およびメチオニンｔはそれぞれ最初と最後のメチオニン濃度であり、Ｖ０およびＶｔは最初とｔ時の容量である。
【０１６７】
消費グルコースは次のように算出した。
【数５】
0005922036.tif 000033
【０１６８】
注入グルコースｔ＝供給容量ｔ＊［グルコース］
消費グルコースｔ＝［グルコース］０＊Ｖ０＋注入グルコース−［グルコース］残留＊Ｖｔ
［グルコース］０、［グルコース］、［グルコース］残留はそれぞれ最初のグルコース濃度、供給グルコース濃度および残留グルコース濃度である。
【０１６９】
２．株５および７におけるセリンデアミナーゼ活性（ＳＤＡ）の測定
ＳＤＡ活性のin vitro測定については、大腸菌株を上記のような最小培地で培養し、遠心分離により回収した。ペレットを、３ｍＭ  ＦｅＳＯ４、３０ｍＭ  ＤＴＴおよびＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む冷５０ｍＭグリシルグリシンバッファー（ｐＨ８）に懸濁させた。その後、細胞をＰｒｅＣｅｌｌｙｓ（Bertin Technologies；２×１０秒６５００ｒｐｍ）でビーズビーティングを行うことで溶解させた後、１２０００ｇ（４℃）にて３０分遠心分離を行った。上清を脱塩し、酵素分析に用いた。タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ試薬(Bradford, 1976)を用いて測定した。上清を脱塩せずに、酵素分析に用いた。タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ試薬(Bradford, 1976)を用いて測定した。
【０１７０】
ＳＤＡ活性の測定については、１００μｇの粗細胞抽出物を、３ｍＭ  ＦｅＳＯ４、３０ｍＭ  ＤＴＴおよび５０ｍＭ  Ｌ−セリンを含む５０ｍＭグリシルグリシンバッファー（ｐＨ）中でアッセイした。粗細胞抽出物を添加することによって反応を開始させた。３７℃で５分および２０分のインキュベーションの後、０．４ｍＬのトルエンを加え、ＨＣｌ中２−４−ジニトロフェニルヒドラジンで反応を停止させた。ホモジネーションの後、この調製混合物を室温にて３５００ｒｐｍで５分遠心分離を行い、上相を１０％（ｗ／ｖ）炭酸ナトリウムで処理した。ホモジネーションの後、この調製混合物を室温にて３５００ｒｐｍで１分遠心分離を行い、下相を１．５Ｍ  ＮａＯＨで処理した。１０分のインキュベーション後、ピルビン酸の生成量を、アルカリ性溶液中でケト酸ヒドラゾンの発色を測定することにより５４０ｎｍでの分光光度測定により測定した。発色強度は１５分内では変化しなかった。実験ごとにＬ−セリンを含まない対照を実施し、分光光度測定のブランクとして用いた。
【０１７１】
表１３：上記の培養物でセリンデアミナーゼ（ＳＤＡ）活性を測定し、ｍＵＩ／タンパク質ｍｇで示す。標準偏差は数回の独立した培養に基づいて算出した（Ｎ＝反復回数）。
【表１３】
0005922036.tif 000034
表１３から分かるように、株５のＳＤＡ活性は野生型７の活性の１００分の１より低い。このＳＤＡ活性の著しい低下はメチオニン生産の向上と相関していた（表１２参照）。
【０１７２】
ＳｄａＡ＊に伴って残留セリンデアミナーゼ活性が存在するが、これは細胞生理に重要である可能性があることに着目することが重要である。
【０１７３】
参照文献
0005922036.tif 000035
0005922036.tif 000036
【図１】
0005922036.tif 000037
【配列表】
0005922036000001.app