(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母をγ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly、及びX-Glyからなる群から選ばれるペプチド（XはVal又はnValを表す）を含む培地で培養し、得られた菌体から酵母エキスを調製することを含む、γ-Glu-X及びγ-Glu-X-Glyからなる群から選ばれるペプチドを含む酵母エキスの製造方法であって、前記酵母はサッカロマイセス属に属する、方法。
【請求項２】
前記培地は前記ペプチドを0.1ppm以上含み、前記酵母エキスはγ-Glu-X及びγ-Glu-X-Glyからなる群から選ばれるペプチドを、合計量で乾燥重量当り0.005%以上含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵母が、前記ペプチドの細胞内への取込みが向上するように改変されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵母のHgt1pの活性が強化された、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記酵母のPtr2pの活性が強化された、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記酵母のグルタチオン合成酵素の活性が強化された、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
nValを含む培地で酵母を培養することを含む、γ-Glu-nValを含む酵母エキスの製造方法であって、前記酵母はサッカロマイセス属に属する、方法。
【請求項８】
前記酵母のγ-グルタミルシステイン合成酵素の活性が強化された、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
X及びX-Glyからなる群から選ばれるアミノ酸又はペプチド（XはVal又はnValを表す）を添加した酵母エキス原料に、γ-グルタミル基転移酵素を作用させることを含む、γ-Glu-
X及びγ-Glu-X-Glyからなる群から選ばれるペプチドを含む酵母エキスの製造方法であって、前記酵母はサッカロマイセス属に属する、方法。
【請求項１１】
前記アミノ酸又はペプチドの添加量は、合計量で酵母エキス原料の乾燥重量当り1％以上であり、前記酵母エキスはγ-Glu-X及びγ-Glu-X-Glyからなる群から選ばれるペプチドを、合計量で乾燥重量当り0.005%以上含有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエである、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜９の何れか一項に記載の方法によって製造される、酵母エキス。
【請求項１４】
前記γ-Glu-X及びγ-Glu-X-Glyからなる群から選ばれるペプチドを、合計量で乾燥重量当り0.02%以上含有する、請求項１３に記載の酵母エキス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ-Glu-X-Gly又はγ-Glu-Xを含有する酵母エキス及びその製造方法に関するものである。本発明の酵母エキスは、調味料や健康食品といった食品分野で有用である。
【背景技術】
【０００２】
酵母エキスは、食品にあつみ、うま味等を付与する機能を有し、調味料として幅広く食品分野で利用されてきた。中でも、グルタミン酸、システイン、グリシンからなるトリペプチドであるグルタチオン（以下、「GSH」と記載することがある）は、食品にコク味（kokumi）を付与することが知られており(Ueda et al., Agric. Biol. Chem., 54, 163-169
(1990); Ueda et al., Biosci. Biotechnolo. Biochem., 61, 1977-1980 (1997))、GSHを含有する調味料が開発されてきた。
【０００３】
ところで、クラスCに分類されるGタンパク質であるカルシウムセンシングレセプター（CaSR）は、GSHに応答することが報告されていたが(Wang et al., Journal of Biological
Chemistry, 281, 8864-8870 (2006))、その生理的な意味は明らかとなっていなかった。また、このCaSRは舌細胞にも存在しており、何らかの呈味応答を示すと考えられていたが(Gabriel et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 378, 414-418 (2009))、最近、このCaSRが人のコク味認識に関与していることが明らかとなった(Ohsu et al., Journal of Biological Chemistry, 285, 1016-1022 (2010))。同文献では、これまでコク味物質として認識されてきたGSHだけでなく、いくつかのγ−グルタミル化合物が同様にCaSRに応答することが報告されている。さらには、一般式γ-Glu-X又はγ-Glu-X-Gly（XはCysを除くアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）で表されるペプチド、例えばγ-Glu-Met、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Val-Glyなどがコク味付与効果を有していることが報告されている(WO2007/055393)。また、S-もしくはO-カルボキシアルキル化ガンマグルタミルまたはベータアスパラギルペプチドのエステルの群などもコク味物質として報告されている(WO2007/042288)。これらペプチドはGSHと同じく食品にコク味を付与するが、GSHと異なり還元型-SH基を有していない。一般に、GSHのように還元型-SH基を有する物質は不安定であり、ジスルフィド結合の形成とともにその力価が低下することが知られているが(WO2007/042288)、還元型-SH基を有していないコク味付与ペプチドは安定である点で、γ-Glu-X又はγ-Glu-X-Gly等は有用であると考えられる。
【０００４】
γ-Gluジペプチドを含有する食品については、44週間程も長期熟成したゴーダチーズから、各種γ-Gluジペプチドが検出されたとの報告がある(Toelstede, S and Hofmann, T, J. Agric. Food. Chem., 2009)。同文献では、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Glnなどの各種γ-Gluジペプチドが検出され、更に検出されたγ-Gluジペプチドの総量は、乾燥重量で、最大で3590μmol/kg含まれていたと報告されている。この値を固形分に基づいた重量パーセンテージに換算すると0.088%と算出される。
しかしながら、コク味を付与し得る量のγ-Glu-X及びγ-Glu-X-Glyを含む酵母エキスは知られていない。
【０００５】
さらに、γ-グルタミル化合物の一つであるグルタチオンの合成と分解は、γ-グルタミルサイクルと呼ばれる複数の酵素によって触媒されることが知られている。中でも、γ-グルタミルトランスペプチダーゼは、GSHのγ位のグルタミン酸を他のアミノ基を有する化合物に転移させることによりGSHをシステイニルグリシンへと分解することが知られている（蛋白質核酸酵素、1988-7 VOL.33 NO.9、ISSN 003909450、臨時増刊「グルタチオン研究のエポック」、ｐ１４３２−１４３３）。この転移反応に際し、アミノ基を有する化合物がアミノ酸である場合は、γ-Glu-Xというジペプチドが副生物として生成しうると考
えられる。しかし、副生物ということもありこれを有効に微生物に作らせるという研究はこれまで積極的に行われてこなかった。
【０００６】
γ-Glu-Xというジペプチドに関する知見として、ミクロコッカス・グルタミカス（Micrococcus glutamicus）の発酵ブロス解析の例を挙げることができる(Ronald et al., Journal of Biological Chemistry, 240, p2508-2511 (1965))。同文献では発酵ブロスを各種カラムにかけペプチド等を分離し、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Val、γ-Glu-Leuを単離したと報告されているが、各種カラム分離の結果見出されたものであり、どの程度の量ブロス中に含まれていたかは不明である。
【０００７】
一方、GSH生合成を担う酵素がストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）やクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）から新しく単離され、その基質特異性が解析された(Kino et al., JBB research communications, 352, pp.351-359 (2007))。通常、GSHは、GluとCysを結合させγ-Glu-Cysを生成するγ-グルタミルシステイン合成酵素と、生じたγ-Glu-CysとGlyを結合させGSHを生成するグルタチオン合成酵素という２種の酵素により生合成される。しかし、前記２種の微生物は、γ-グルタミルシステイン合成酵素とグルタチオン合成酵素が融合した特異な酵素を有している。in vitroの解析では、この酵素の基質認識は若干曖昧であり、Cys以外のアミノ酸も認識し、その結果γ-Glu-Xやγ-Glu-X-Glyを生成しうると報告している。しかし、あくまでin vitroの結果であり、γ-Glu-Xやγ-Glu-X-Glyといったペプチドを著量生成しているこれら微生物が、目的とするX以外にも多くのアミノ基を有する化合物を含むとの記載はない。
【０００８】
酵母エキスは幅広く食品分野で用いられてきた調味料であり、消費者の受容性も高い。その為、酵母エキスはγ-Glu-X-Glyやγ-Glu-Xのキャリアーとして使用されうる。この使用のためにミネラル含有酵母の研究がされている。酵母は、培地に金属を添加するとその金属を菌体中に取り込むことが知られている(B. Volesky, H.A., Appl. Microbiol. Biotechnol., 42;797-806 (1995))。特に、亜鉛、鉄、銅、マンガン、セレン、モリブデン、クロム等の微量元素を培地中に添加すれば、酵母は食品におけるこのような微量元素の強化を介した供給をするのに使用されうる（特開２００４−２９８０１４号公報）。その結果、ミネラル含有酵母の製造方法が開発された（特開昭５４−１５７８９０号公報、特開昭６０−７５２７９号公報、特公平６−１６７０２号公報）。
【０００９】
更に、ミネラル含有酵母は、呈味に関しても有益である。例えば、特開平８−３３２０８１号公報で開示されたマグネシウム高含有酵母の例を挙げることができる。無機のマグネシウム塩を添加したマグネシウム強化食品も市販されているが、無機塩であるために、苦味、渋味が強く、天然素材のマグネシウム配合食品に比べ、そのマグネシウム強化食品の日常の摂取は極めて困難であったと記載されている。酵母にマグネシウムを取り込ませることにより、天然素材を製造する技術が開示されている。栄養面のメリットとして、特開２００８−０９９５７８号公報に開示されている技術を例示することができる。同文献によると、亜鉛は味覚障害の改善や生殖機能の向上などに寄与するが、現在、十分な量が摂取されていないことについては見過ごされている。酵母の培養工程に亜鉛を添加すると、酵母が亜鉛を菌体内に取り込むが、水溶性亜鉛は、タンパク質やアミノ酸と結合して非結晶性の亜鉛として高濃度に蓄積される。このような非結晶性の亜鉛は結晶性の亜鉛と比較して、摂取したときに体内により効率よく吸収される。その結果、単純に亜鉛をそのまま摂取する場合に比べて、一旦酵母に取り込ませることにより、吸収性を良くすることができる。
【００１０】
上記のように、目的物質を単純に食品に添加する場合に比較して、一旦酵母に取り込ませてから、酵母或いは酵母エキスの形態で食品に添加することにより様々なメリットを享
受することができる。しかし、必須栄養素であるミネラルと異なり、酵母がアミノ酸やペプチドを取込む能力は複雑に制御されており、ミネラルを取り込ませるための上記技術をアミノ酸やペプチドの取り込みに単純に適用することは困難であると考えられた。
【００１１】
酵母を用いたGSHやγ-Glu-Cysの生成に関する研究が数多く報告されている。例えば、サッカロミセス属酵母を変異処理し、亜鉛耐性度が向上した菌株を選択する方法によりGSH含量を向上させたとの報告（特開平０２−２９５４８０号公報）や、変異型MET30遺伝子を保持させることによりMET25遺伝子の発現を脱抑制させ細胞内のγ-Glu-Cys含有量を上昇させたとの報告（特願２００２−２８２７４３号）などを例示することができる。また、最近の学術的な知見としては、Hgt1pによるGSHの取込みの例を挙げることができる。Hgt1pによりGSHやその２量体であるGSSGは菌体内に取り込まれるが、過剰量のアミノ酸や様々なジペプチド、トリペプチドの存在下でもHgt1pによるGSHの取り込みは影響されなかったことから、Hgt1pは当初考えられていた非特異的なトランスポーターではなく、GSHに特異的なトランスポーターであると考えられている(Bourbouloux et al., Journal of Biological Chemistry, 275, pp.13259-13265 (2000))。更に、Hgt1pの活性部位の探索も行われている(Kaur et al., FEMS Yeast Res., 9, 849-866 (2009))。
【００１２】
上記のようにGSHやその前駆体であるγ-Glu-Cysに関する知見は数多く報告されているものの、γ-Glu-Xやγ-Glu-X-Glyといった物質を含む酵母菌体、及び同菌体から調製されるエキスを製造する方法に関する知見はほとんどない。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の実施態様は、γ-Glu-X、又はγ-Glu-X-Glyを含む酵母エキス、及びそれを製造する方法を提供することを含む。
【００１４】
本発明者らは、酵母がγ-Glu-X及びγ-Glu-X-Gly（XはCysを除くアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す。以下の記載においても同様である。）を細胞内に取込むこと、及び、γ-Glu-X又はγ-Glu-X-Glyを含む培地で培養した酵母から酵母エキスを調製することによって、γ-Glu-X、又はγ-Glu-X-Glyを含む酵母エキスを製造することができることを見出し、これにより上記課題は達成された。また、酵母をγ-Glu-X又はX-Glyを含む培地で培養すると、これらの化合物を細胞内に取込み、細胞内の酵素反応によってγ-Glu-X-Glyを生成し得ることを見出した。さらに、X及びX-Glyから選ばれるアミノ酸又はペプチドを添加した酵母エキス原料に、γ-グルタミル基転移酵素を作用させることにより、γ-Glu-X又はγ-Glu-X-Glyを含む酵母エキスを製造することができることを見出した。
【００１５】
従って本発明の一実施態様は、γ-Glu-X及びγ-Glu-X-Glyからなる群から選ばれるペプチドを、合計量で乾燥重量当り0.005%以上含有する酵母エキス（XはCys及びその誘導体を除くアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）を提供する。
本発明のさらなる実施態様は、前記ペプチドを、合計量で0.02%以上含有する、前記酵母エキスを提供する。
本発明のさらなる実施態様は、前記XがValである、前記酵母エキスを提供する。
本発明のさらなる実施態様は、前記XがnValである、前記酵母エキスを提供する。
本発明のさらなる実施態様は、前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である、前記酵母エキスを提供する。
本発明のさらなる実施態様は、酵母をγ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly、及びX-Glyからなる群から選ばれるペプチド（XはCys及びその誘導体を除くアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）を含む培地で培養し、得られた菌体から酵母エキスを調製することを含む、γ-Glu-X及びγ-Glu-X-Glyからなる群から選ばれるペプチドを含む酵母エキスの製造方法を提供する。
本発明のさらなる実施態様は、前記培地は前記ペプチドを0.1ppm以上含み、前記酵母エ
キスはγ-Glu-X及びγ-Glu-X-Glyからなる群から選ばれるペプチドを、合計量で乾燥重量当り0.005%以上含有する、前記方法を提供する。
【００１６】
本発明のさらなる実施態様は、前記XがValである、前記方法を提供する。
本発明のさらなる実施態様は、前記酵母が、前記ペプチドの細胞内への取込みが向上するように改変されている、前記方法を提供する。
本発明のさらなる実施態様は、前記酵母のHgt1pの活性が強化された、前記方法を提供する。
本発明のさらなる実施態様は、前記酵母のPtr2pの活性が強化された、前記方法を提供する。
本発明のさらなる実施態様は、前記酵母のグルタチオン合成酵素の活性が強化された、前記方法を提供する。
本発明のさらなる実施態様は、nValを含む培地で酵母を培養することを含む、γ-Glu-nValを含む酵母エキスの製造方法を提供する。
本発明のさらなる実施態様は、前記酵母のγ-グルタミルシステイン合成酵素の活性が強化された、前記方法を提供する。
本発明のさらなる実施態様は、前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエである、前記方法を提供する。
【００１７】
本発明のさらなる実施態様は、X及びX-Glyからなる群から選ばれるアミノ酸又はペプチド（XはCys及びその誘導体を除くアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）を添加した酵母エキス原料に、γ-グルタミル基転移酵素を作用させることを含む、γ-Glu-X及びγ-Glu-X-Glyからなる群から選ばれるペプチドを含む酵母エキスの製造方法を提供する。
本発明のさらなる実施態様は、前記アミノ酸又はペプチドの添加量は、合計量で酵母エキス原料の乾燥重量当り1％以上であり、前記酵母エキスはγ-Glu-X及びγ-Glu-X-Glyからなる群から選ばれるペプチドを、合計量で乾燥重量当り0.005%以上含有する、前記方法を提供する。
本発明のさらなる実施態様は、前記XがValである、前記方法を提供する。
本発明のさらなる実施態様は、前記XがnValである、前記方法を提供する。
本発明のさらなる実施態様は、前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエである、前記方法を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、γ-Glu-X、もしくはγ-Glu-X-Gly、又はこれらの両方を含む酵母エキスを製造することができる。これらのペプチドを含む酵母エキスは、コク味の点で優れている。
また、γ-Glu-Xを含む酵母エキスは、γ-Glu-X-Glyを含む酵母エキスを製造する原料としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、γ-Glu-Val-Gly、γ-Glu-Val、及びVal-Gly標品のHPLC-MSクロマトグラムを示す。
【図２】図２は、γ-Glu-Val-Gly、γ-Glu-Val、Val-Gly、γ-Glu-nVal-Gly、及びγ-Glu-nVal標品のHPLC-MSクロマトグラムを示す。
【図３】図３は、プラスミドpUC19AOX-G418-BRIの構造を示す。
【図４】図４は、プラスミドpKS-URA3-13の構造を示す。
【図５】図５は、プラスミドpKS-URA3-13-kanMXの構築を示す。
【図６】図６は、プラスミドpLoxP-PADH1-kanR5の構築を示す。
【図７】図７は、プラスミドpKS-URA3-PADH1-LRの構築を示す。
【図８】図８は、プラスミドpKS-URA3-P-ADH1の構築を示す。
【図９】図９は、プロモーター置換に用いるＤＮＡ断片の調製を示す。CDS=目的遺伝子のコード配列、up-CDS=目的遺伝子の上流領域。横縞を入れた四角形は40塩基対のオーバーラップ領域を示し、黒の四角形は目的遺伝子の5’領域での相同組換えのための40塩基対の断片を示す。
【図１０】図１０は、pUG6-PTDH3のマップを示す。
【図１１】図１１は、PTDH3-GSH2カセットの多コピー酵母ベクターへのクローニングを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の酵母エキスは、γ-Glu-X及びγ-Glu-X-Glyから選ばれるペプチド（XはCys及びその誘導体を除くアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）を、合計量で酵母エキスの乾燥重量当り0.005%以上含有する酵母エキスである。本発明の酵母エキスは、前記ペプチドを、合計量で乾燥重量当り0.005%以上、0.02%以上、0.1%以上、又は0.5%以上含有する。
【００２１】
本発明の酵母エキスの原料となる酵母は、後述する本発明の方法に用いられる酵母と同様である。
【００２２】
前記ペプチド中のGlu、及びGlyは、各々グルタミン酸、及びグリシンを示す。また、符号“‐”はペプチド結合を表す。γ-Gluの“γ”とは、グルタミン酸のγ位のカルボキシル基を介して他のアミノ酸が結合していることを意味する。
【００２３】
「X」は、天然アミノ酸の中でCys及びその誘導体を除く19種類のアミノ酸又はその誘導体を示す。Cysはシステインを示し、その誘導体としては、α−アミノ酪酸、β−アミノ酪酸等が挙げられる。前記Cys及びその誘導体を除くアミノ酸には、グリシン（Gly）、アラニン（Ala）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、セリン（Ser）、スレオニン（Thr）、メチオニン（Met）、アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、プロリン（Pro）などの中性アミノ酸、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）などの酸性アミノ酸、リジン（Lys）、アルギニン（Arg）、ヒスチジン（His）などの塩基性アミノ酸、及びフェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）、トリプトファン（Trp）などの芳香族アミノ酸が含まれる。特に、Xが疎水性アミノ酸の場合、前記ペプチドのコク味効果が高く、このようなペプチドは特異な例である。このようなアミノ酸の例として、Val、Ala、Leu、Pheなどを例示することができる。
【００２４】
また、アミノ酸の誘導体として、例えばノルバリン（nVal）、ノルロイシン（nLeu）、tert−ロイシン（tLeu）、及びヒドロキシプロリン（Hyp）などを例示することができる。
【００２５】
上記ペプチドのうち、特定の例としては、γ-Glu-Val-Gly、γ-Glu-Val、γ-Glu-nVal-Gly、γ-Glu-nVal、及びVal-Glyである。
【００２６】
尚、上記アミノ酸及びアミノ酸誘導体は、すべてＬ−体である。
【００２７】
本発明の酵母エキスは、形状は特に制限されず、粉体状でもよく、溶液であってもよい。また、本発明の酵母エキスは、従来の酵母エキスと同様の用途、例えば、調味料、食品添加物、又は健康食品等として利用することができる。本発明の酵母エキスは、コク味付与効果に優れている。コク味とは、五基本味により表現できない味を意味し、基本味のみならず、厚み、ひろがり、持続性、まとまりなど基本味の周辺の味をも増強する味をいう。コク味付与効果は、うま味や塩味の共存下でより発揮されるため、酵母エキスにＬ−グルタミン酸ナトリウムや呈味性ヌクレオチド等のうま味物質、及び／又は食塩等の塩味物質を添加してもよい。また、調味料、食品添加物又は健康食品に、本発明の酵母エキスと
共に、うま味物質及び／又は塩味物質を加えてもよい。
【００２８】
実施例に示すように、γ-Glu-Val-Glyを含む酵母エキス、特に下記に示す本発明の方法により製造された酵母エキスを含む溶液は、同溶液中に含まれるγ-Glu-Val-Glyと同濃度のγ-Glu-Val-Gly溶液よりもコク味増強効果が高かった。このことは、本発明の酵母エキスの有用性を示している。
【００２９】
本発明の酵母エキスは、例えば、下記に示す本発明の方法により製造することができる。
【００３０】
本発明の第一の方法は、酵母をγ-Glu-X-Gly、γ-Glu-X、及びX-Glyから選ばれるペプチド（XはCys及びその誘導体を除くアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）を含む培地で培養し、得られた菌体から酵母エキスを調製することにより、γ-Glu-X-Gly及びγ-Glu-Xから選ばれるペプチドを含有する酵母エキスを製造する方法である。
【００３１】
酵母は、γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly、又はX-Glyを細胞内に取込むことができる限り特に制限されず、サッカロミセス・セレビシエ等のサッカロミセス属、キャンディダ・ユティリス(Candida utilis)等のキャンディダ属、ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)等のピヒア属、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等のシゾサッカロミセス属等に属する酵母を例示することができる。中でも、サッカロミセス・セレビシエやキャンディダ・ユティリスが特定の例であり、これらは酵母エキスの生産によく用いられている。本発明の酵母は、１倍体でもよいし、２倍性またはそれ以上の倍数性を有するものであってもよい。
【００３２】
酵母は、γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly、又はX-Glyを細胞内に取込み、γ-Glu-X及び／又はγ-Glu-X-Glyを細胞内に蓄積し得る限り、野生株であっても、各種変異株のいずれであってもよい。変異株としては、γ−グルタミルシステイン合成酵素（GSH1）及び／又はグルタチオン合成酵素（GSH2）の活性を増強させた株が挙げられる。また、酵母は、γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly、又はX-Glyの細胞内への取込みが向上するように改変されていてもよい。γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly、又はX-Glyの取込みは、これらのペプチドの取込みに関与するタンパク質の活性を増強することにより、向上させることができる。Hgt1pはGSHに特異的なトランスポーターであることが報告されていたが、Hgt1pの活性を増強することによってγ-Glu-Val-Glyまたはγ-Glu-nVal-Glyの取込みが向上することが示された(実施例参照)。したがって、Hgt1p活性の増強により、γ-Glu-Val-Glyだけでなく、他のγ-Glu-X-Glyペプチドの細胞中への取込みも向上され得る。また、Ptr2pはオリゴペプチド輸送体であることが報告されている。Ptr2pの活性を増強することによって、Val-Glyの取込みが増強されるようであることが示された(実施例参照)。したがって、Ptr2p活性の増強により、Val-Glyだけでなく他のX-Glyペプチドの細胞中への取込みが向上され得る。サッカロマイセス・セレビシエのPtr2pをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号５８に示す。このヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号５９に示す。前記酵素又はタンパク質の活性を増強する方法としては、これらをコードする染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なものに変更することによって発現を強化させる方法、染色体上に目的の遺伝子を挿入することにより多コピー化を促し、発現を強化させる方法、目的遺伝子を含むプラスミドを酵母に導入することにより発現を強化させる方法等が挙げられる。
【００３３】
プロモーターは、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよいし、或いは公知の高発現プロモーター、例えば、PGK1、PDC1、TDH3、TEF1、HXT7などを用いてもよい。或いは、CEN4の複製開始点を持つプラスミドや2μm DNAの複製開始点を持つ多コピー型プラスミドを用いてもよい。或いは、染色体上
の任意の領域に目的遺伝子を導入する為に、トランスポゾンを用いてもよいし、150コピーあるrDNA配列を標的に目的遺伝子を導入してもよい。
【００３４】
γ−グルタミルシステイン合成酵素の活性の増強は、例えば米国特許第7,553,638号、Otake Y. et al., Bioscience and Industry, volume 50, No.10, pp.989-994, 1992等に開示されている。また、米国特許第7,553,638号にはグルタチオン合成酵素遺伝子の破壊について開示されているが、γ−グルタミルシステイン合成酵素の活性増強と同様にして、グルタチオン合成酵素活性も増強させることができる。Hgt1pの活性も、同様にして増強することができる。
【００３５】
サッカロマイセス・セレビシエのGsh1p及びGsh2pをコードする遺伝子の塩基配列は、それぞれSaccharomyces Genome Database（http://www.yeastgenome.org/）に開示されている。また、キャンディダ・ユティリスのGsh1p及びGsh2pをコードする遺伝子の塩基配列は、米国特許第7553638号に開示されている。サッカロマイセス・セレビシエのGsh1pをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号６０に示す。同塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号６１に示す。サッカロマイセス・セレビシエのGsh2pをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１９に示す。同塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号２０に示す。
Hgt1pをコードする遺伝子は、Saccharomyces Genome Database（http://www.yeastgenome.org/）より取得することができる。同塩基配列は、Hgt1pの別名として、Gsh11p、Opt1p等が挙げられる。サッカロマイセス・セレビシエのGSH11として開示されている配列を、配列番号２１に示す。また、同塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号２２に示す。
【００３６】
酵母エキスを製造する方法を説明する。
まず、酵母を前記ペプチドを含む培地で培養する。培地は、酵母が増殖し得るものであれば特に制限されないが、実施例に記載したSD培地に限定されることなく通常工業的に用いられる培地を利用することができる。
【００３７】
酵母の培養に際して、上記培地にγ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly、又はX-Glyを添加する。これらのペプチドは、１種単独であってもよく、任意の複数種の混合物であってもよい。また、これらのペプチドは、培養開始時から培地に含まれていてもよく、培養途中の任意の時点で培地に添加されてもよい。培養途中での前記ペプチドの培地への添加は、培養終了時の0〜50時間前(なお、ここでは0時間前とは添加直後を意味する)、0.1〜24時間前、又は0.5〜6時間前である。また、培養途中での添加は、連続的に添加される形式でもよい。
【００３８】
前記ペプチドを含む培地での培養に先立って、前培養を行ってもよい。前培養に用いる培地は、前記ペプチドを含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。
【００３９】
培地に添加するペプチドの量は、添加時の培養液中の最終濃度で通常0.1ppm以上、0.5ppm以上、1ppm以上、10ppm以上、又は50ppm以上である。ペプチドの量の上限は特に制限されないが、例えば費用の観点から100,000ppm以下、又は50,000ppm以下と設定することもでき、通常10,000ppm以下、1,000ppm以下、又は500ppm以下である。
培地に添加するペプチドの量は、添加時の培養液中の最終濃度で通常0.1ppm以上、0.5ppm以上、1ppm以上、10ppm以上、又は50ppm以上である。ペプチドの量の上限は、特に制限されない。しかし、例えば、費用の観点から100,000ppm以下、又は50,000ppm以下と設定することもでき、通常10,000ppm以下、1,000ppm以下、又は500ppm以下である。
【００４０】
培養条件は、通常の酵母エキスの製造と同様の条件を採用することができ、用いる酵母に応じて適宜変更することができる。バッチ培養、フェドバッチ培養、連続培養など任意
の方法を使用することができる。サッカロマイセス・セレビシエの場合は、25〜35℃で、27〜33℃で、又は28〜32℃で振とう培養等により好気的に培養することが好ましい。
【００４１】
上記のようにして酵母を培養すると、酵母の細胞中に、γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly、又はこれらの両方が蓄積する。培地にγ-Glu-X、又はX-Glyを添加した場合、細胞内にこれらのペプチドが蓄積することに加え、γ-Glu-X-Glyも蓄積する。これは、細胞内に取込まれたγ-Glu-X、及びX-Glyから、細胞内のγ−グルタミル基転移酵素の働きによってγ-Glu-X-Glyが生成することによると推定される。尚、実施例に示すように、酵母中のγ-Glu-Val、及びγ-Glu-Val-Glyの含有量と、細胞中のGSHの含有量とは相関しないことから、従来の方法で製造された酵母エキスは、GSHを高濃度で含有する酵母から製造されたものであっても、γ-Glu-X又はγ-Glu-X-Glyを高濃度に含有しないと考えられる。
【００４２】
得られた酵母からの酵母エキスの調製は、通常の酵母エキスの調製と同様にして行えばよい。酵母エキスは、酵母菌体を熱水抽出したものを処理したものでもよいし、酵母菌体を消化したものを処理したものでもよい。また、必要に応じて得られた酵母エキスを濃縮してもよいし、乾燥し粉末の形態にしてもよい。
【００４３】
上記のようにして、γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly、又はこれらの両方の含有量が高められた酵母エキスが得られる。好適な形態では、酵母エキスは、γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly、又はこれらの両方を、合計量で乾燥重量当り0.005%以上、0.02%以上、0.1%以上、又は0.5%以上含有する。
【００４４】
上記のようにして得られるγ-Glu-Xを含む酵母エキスに、下記に示す方法と同様にして、γ−グルタミル基転移酵素を作用させることによって、γ-Glu-X-Glyを含む酵母エキスを製造することができる。
【００４５】
本発明の第二の方法は、X及びX-Glyからなる群から選ばれるアミノ酸又はペプチド（XはCys及びその誘導体を除くアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）を添加した酵母エキス原料に、γ-グルタミル基転移酵素を作用させることにより、γ-Glu-X及びγ-Glu-X-Glyから選ばれるペプチドを含む酵母エキスを製造する方法である。
X又はX-Glyに、γ−グルタミル基転移酵素を作用させると、γ-Glu-X又はγ-Glu-X-Glyが生成する。したがって、X又はX-Glyを含む酵母エキスに、γ-グルタミル基転移酵素を作用させることによっても、γ-Glu-X又はγ-Glu-X-Glyを含む酵母エキスが得られる。X及び／又はX-Glyを含む酵母エキスは、X及び／又はX-Glyを含む培地で培養した酵母から調製したものであってもよく、酵母エキス原料にX及び／又はX-Glyを加えたものであってもよい。
【００４６】
酵母エキス原料としては、通常の方法で得られる酵母エキスを使用することができる。
【００４７】
酵母エキス原料に添加するX又はX-Glyは、１種単独であってもよく、任意の複数種の混合物であってもよい。X及び／又はX-Glyの添加量は、合計量で酵母エキス原料の乾燥重量当り1％以上、5%以上、又は10%以上である。
【００４８】
γ−グルタミル基転移酵素による反応は、水又は緩衝液等の水性溶媒中で行う。具体的には、例えば、酵母エキス原料を水性溶媒に溶解し、γ−グルタミル基転移酵素を添加する。反応条件は、用いるγ−グルタミル基転移酵素に応じて適宜設定することができる。通常、pH 3〜9、15〜70℃で、1〜300分間、又はpH 5〜8、30〜70℃で、5〜150分間反応させる。
【００４９】
酵母エキス原料の水性溶媒中の濃度は、操作性の見地から定めればよい。通常、酵母エ
キス原料の乾燥重量として、0.1%〜50%、又は0.5%〜20%である。
【００５０】
γ−グルタミル基転移酵素としては、グルタミナーゼ、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ（γ-GTP）等が挙げられる。酵素量は、γ-GTPについては、pH8.5、25℃の溶液中で1分間あたりにγ-グルタミル-p-ニトロアニリドより1.0μmoleのp-ニトロアニリンを遊離する活性を1ユニットと定義した場合（シグマ総合カタログ2008-2009年版の917ページに記載の定義）、通常0.001〜1000 units/ml、0.005〜100units/ml、0.01〜25units/ml、又は0.05〜10 units/mlである。グルタミナーゼについても、γ-GTPに準じて酵素量を適宜設定することができる。
【００５１】
酵素反応後、γ−グルタミル基転移酵素を失活させるための処理、例えば80〜100℃での熱処理を行ってもよく、そのような処理を行わなくてもよい。
【００５２】
γ−グルタミル基転移酵素の基質として、γ−グルタミル化合物、例えばGSHを反応液に加えてもよい。また、酵母エキスに含まれるGSHを基質としてもよい。この場合、GSHの含有量を高めた酵母、例えばGsh1p及び／又はGsh2pの活性を増強した酵母から調製した酵母エキスを用いることができる。酵母エキス中のGSHの含有量は、多ければ多いほうがよいが、通常乾燥重量あたり1〜50%、１％〜30%、又は5%〜20%である。
【００５３】
上記のようにして、γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly、又はこれらの両方の含有量が高められた酵母エキスが得られる。酵母エキスは、γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly、又はこれらの両方を、合計量で乾燥重量当り0.005%以上、0.02%以上、0.1%以上、又は0.5%以上含有する。
【００５４】
得られた酵母エキスは、必要に応じて濃縮してもよいし、乾燥し粉末の形態にしてもよい。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明を実施例に基づいて更に具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例になんら限定されるものではない。
【００５６】
実施例１：各種酵母エキス中のγ-Glu-Val-Gly及びγ-Glu-Valの検出
各種市販酵母エキス中のγ-Glu-Val-Gly、γ-Glu-Val及びVal-Gly含量を測定した。測定は、下記方法に従って、ペプチドを６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（AQC）を用いて蛍光誘導体化し、LC-MS/MSにより検出することより行った。まず、適当な濃度に希釈した各種酵母エキス溶液2.5μL、又はγ-Glu-Val-Gly、γ-Glu-Val、及びVal-Glyを含む標準液2.5μLに、MillQ水2.5μL、5μM内部標準物質溶液（L-アラニン-3,3,3-d3、シグマ社（Ala-D3）、DL-バリン-2,3,4,4,4,5,5,5-d8、シグマ社（Val-d8）。いずれも安定同位体で標識されている。）5μL、硼酸緩衝液（日本ウォーターズ社製ＡccQ-Fluor（登録商標）試薬キット付属品）30μLを添加した。この混合物に、AQC試薬溶液（上記試薬キットの試薬粉末をアセトニトリル1mL中に溶解することにより調製）10μLを添加した。得られた混合物を10分間、55℃で加熱後、0.1%のギ酸水溶液100μLを加え、分析サンプルとした。
【００５７】
次に、上記のように調製した分析サンプルを下記逆相液体クロマトグラフィーで分離した後、質量分析装置に導入した。分離条件は下記の通りである。
【００５８】
（１）HPLC：Agilent 1200シリーズ
（２）分離カラム：Unison UK-Phenyl  内径2.0mm、長さ100mm、粒子径3μm（Imtakt社製）
（３）カラム温度：40℃
（４）移動相Ａ：25mMギ酸アンモニウム(アンモニア水でpH6.0に調製)
（５）移動相Ｂ：メタノール
（６）流速：0.25mL／min
（７）溶出条件：溶出は、移動相Ａ及び移動相Ｂの混合液を用いて行った。混合液に対する移動相Ｂの比率は以下の通り。0分（5%）、0分〜17分（5%〜40%）、17分〜17.1分（40%〜80%）、17.1分〜19分（80%）、19分〜19.1分（80%〜5%）、19.1分〜27分（5%）。
【００５９】
その後、前述の分離条件によって溶出されたγ-Glu-Val-Gly、γ-Glu-Val、及びVal-Glyの誘導体化合物を質量分析計に導入してHPLC-MSクロマトグラフィーにより定量を行った。分析条件は下記の通り。
【００６０】
（１）質量分析装置：AB Sciex API3200 QTRAP
（２）検出モード：Selected Ion Monitoring（ポジティブイオンモード）
（３）選択イオン：表１
【００６１】
【表１】
0005857973.tif 000002
【００６２】
γ-Glu-Val-Gly、γ-Glu-Val、及びVal-Glyの誘導体化合物の定量は、解析ソフトAnalyst ver 1.4.2(AB Sciex)を用いて行った。定量を行うための内部標準物質として、γ-Glu-Val-Glyとγ-Glu-Valの誘導体化合物の場合はAla-d3の誘導体化合物を、Val-Glyの誘導体化合物の場合はVal-d8の誘導体化合物を、各々用いた。結果を表２に示す。表中、「ND」は定量限界以下を表す（以下、同様）。誘導体化された内部標準アミノ酸、γ-Glu-Val-Gly、γ-Glu-Val、及びVal-Gly標品の分析結果（HPLC-MSクロマトグラム）を図１に示す。
【００６３】
【表２】
0005857973.tif 000003
【００６４】
表１に示すように各種酵母エキス中のγ-Glu-Val-Glyは多くとも数ppmであり、γ-Glu-Val、Val-Glyは、多くとも数十ppmオーダーであった。
【００６５】
実施例２：各種酵母細胞中のγ-Glu-Val-Gly及びγ-Glu-Valの検出
次に、各種酵母細胞中に含まれているγ-Glu-Val-Gly及びγ-Glu-Val含量を測定した。菌株は、標準菌株としてサッカロマイセス・セレビシエS288C株、及びGSH含量が高い菌株としてサッカロマイセス・セレビシエAJ14819株（FERM BP-08502株として国際寄託されている）を用いた。S288C株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門（NRBC：NITE Biological Resource Center、〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）にNBRC1136の番号で保存されており、分譲を受けることができる。また、同株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America）にもATCC26108の番号で保存されており、分譲を受けることができる。また、AJ14819株は、市販のサッカロマイセス・セレビシエ菌株から取得した１倍体酵母をEMSにて変異処理し、MET25遺伝子の発現がメチオニンによって抑制されない変異株として選択された菌株であり、2002年9月11日付けで独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号FERM P-19007として寄託され、平成2003年10月1日にブダペスト条約に基く国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-08502が付与されている（特許第4352877号）。
【００６６】
上記の各々の菌株をSD培地(500ml容坂口フラスコ中50ml）に１エーゼ分植菌し、30℃で120rpmの速度で24時間振とう培養した。
【００６７】
〔SD培地組成〕
グルコース     ２％
Nitrogen Base  １倍濃度
（10倍濃度Nitrogen Baseは、1.7gのBacto Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and
Ammonium Sulfate (Difco社)と5gの硫酸アンモニウムを混合したものを100mlの滅菌水に溶解し、pHを5.2程度に調製し、フィルター濾過滅菌したもの）
【００６８】
得られた培養液の吸光度を測定し、初発OD660が0.01になるように（なお、吸光度は、BECKMAN COULTER社のDU640 SPECTROPHTOMETERを用いて測定した。）SD培地（2L容バッフルフィン付き三角フラスコ中400ml。複数本）に植菌し、30℃で120rpmの速度にて回転方式で19時間振とう培養した。得られた培養液から、400 ODユニット（OD660が1である培養液1mlに含まれる菌体を1 ODユニットと定義する。）分の菌体を遠心分離により採取した。上清は可能な限り取り除き、残った菌体を45mlのmilliQ水に懸濁した。再度遠心分離により菌体を集菌し、45mlのmilliQ水に再懸濁した。この操作を累計3回繰り返すことにより、菌体から培地分を完全に除去した。得られた洗浄菌体は、約1.5mlのmilliQ水に懸濁し、70℃で10分間加熱した。この工程にて菌体内に含まれるエキス分を抽出した。次に、遠心操作によりエキスと菌体残渣を分離した。
【００６９】
エキスから10kDaの遠心濾過膜（MILLIPORE社：Amicon Ultra - 0.5mL 10K（カタログ番号UFC501096））を用いて細胞デブリを除去し、得られた画分を実施例１と同様にしてAQC試薬にて誘導体化し、LC-MS/MSによりγ-Glu-Val-Gly及びγ-Glu-Valを測定した。一方、常法（チオール基に結合する蛍光試薬ABD-Fを用いて、エキス中のGSHを誘導体化し、HPLCにて分離、定量した。）により、菌体内のGSH量を測定した。また、乾燥菌体重量は、洗浄菌体を4時間104℃で乾燥させることにより測定した。このようにして測定した一定量の培養液に含まれる酵母細胞から調製したエキス中のγ-Glu-Val-Gly、γ-Glu-Valの量、及び乾燥菌体重量から、乾燥菌体あたりに含まれるこれらペプチドの含量を算出した。結果
を表３に示す。
【００７０】
【表３】
0005857973.tif 000004
【００７１】
その結果、γ-Glu-Val-Glyまたはγ-Glu-Val含量とGSH含量の相関は特に見られなかった。
【００７２】
実施例３：S288C株へのγ-Glu-Val-Glyの添加（１）
S288C株をSD培地（500ml容坂口フラスコ中50ml）に１エーゼ分植菌し、30℃で120rpmの速度で24時間振とう培養した。得られた培養液の吸光度を測定し、初発OD660が0.01になるようにSD培地（2L容バッフルフィン付き三角フラスコ中400ml。複数本）に植菌し、30℃で120rpmの速度にて回転方式で16時間振とう培養した。前記SD培地には、あらかじめ最終濃度で100ppmとなるようにγ-Glu-Val-Gly（国産化学（株）より購入）を添加した。
【００７３】
上記培養液を用いて、実施例２と同様に乾燥菌体あたりに含まれるγ-Glu-Val-Glyを算出した。その結果、γ-Glu-Val-Gly含量は、約20,000ppm（=2%）であった。
また、各種洗浄工程で、洗浄液に含まれるγ-Glu-Val-Glyの含量を測定したが、遠心３回目の操作で0.01ppm、すなわち定量限界以下となった。菌体洗浄操作は、更にもう１回行っているため、４段分離により、洗浄工程で培地中のγ-Glu-Val-Glyは十分に除去されており、菌体抽出液に持ち越されていないことが確認された。
【００７４】
実施例４：S288C株へのγ-Glu-Val-Glyの添加（２）
S288C株をSD培地（500ml容坂口フラスコ中50ml）に１エーゼ分植菌し、30℃で120rpmの速度で24時間振とう培養した。得られた培養液の吸光度を測定し、初発OD660が0.01になるようにSD培地（2L容バッフルフィン付き三角フラスコ中400ml、複数本）に植菌し、30℃で120rpmの速度にて回転方式で19時間振とう培養した。19時間後に、所定濃度になるように各種濃度のγ-Glu-Val-Gly水溶液を添加し、１時間培養を継続した。これらの培養液を用いて、実施例２と同様に乾燥菌体あたりに含まれるγ-Glu-Val-Glyの含量を算出した。また、抽出されたエキス中の固形分を計算することにより、エキス固形分中のγ-Glu-Val-Glyの量も計算した。結果を表４に示す。
【００７５】
【表４】
0005857973.tif 000005
【００７６】
その結果、γ-Glu-Val-Glyの添加量に応じて、乾燥菌体及びエキス固形分当りのγ-Glu-Val-Glyの含量が増加した。
【００７７】
実施例５：γ-Glu-Val-Gly含有酵母エキスの製造
γ-Glu-Val-Glyを添加して培養した酵母菌体より酵母エキスを製造した。S288C株をSD培地（500ml容坂口フラスコ中50ml）に１エーゼ分植菌し、30℃で120rpmの速度で24時間振とう培養した。得られた培養液の吸光度を測定し、初発OD660が0.01になるようにSD培地（2L容バッフルフィン付き三角フラスコ中400ml、12本）に植菌し、30℃で120rpmの速度にて回転方式で19時間振とう培養した。19時間後に、最終濃度で50ppmになるようにγ-Glu-Val-Gly水溶液を添加し、１時間培養を継続した。
【００７８】
得られた全ての培養液から集菌し、実施例２と同様の手順で菌体洗浄を行った。400 ODユニット分の洗浄菌体を1.5mlのmilliQ水に懸濁した。同懸濁液を70℃で10分間保持することにより、酵母菌体からエキスを抽出した。更に遠心分離を行い、菌体残渣を取り除き、エキスのみを回収した。このエキス（添加区エキス）に含まれるγ-Glu-Val-Gly濃度を測定したところ約300ppmであり、固形分は約1%であった。なお、γ-Glu-Val-Glyを培養液に添加せずに同様の操作により調製したエキス（無添加区エキス）に含まれるγ-Glu-Val-Gly濃度は定量限界以下であり、固形分は約1%であった。
【００７９】
このようにして調製したエキスについて、MSG（グルタミン酸ナトリウム）存在下でのコク味を、次のようにして評価した。まず、コントロールとして、0.2% MSG及び0.5% NaClを含有する水溶液を用い、これを官能評点0.0と定義した。次に、0.2% MSG、0.5% NaCl、及び10ppmのγ-Glu-Val-Glyを含む水溶液をコク味の標準溶液とし、官能評点3.0と定義した。これら2つをコク味強度の基準として、エキスのコク味強度を、エキスと0.2% MSG、及び0.5% NaClを含む水溶液を被検サンプルとして評価した。なお、被検サンプル中の添加区エキスの量は、γ-Glu-Val-Gly濃度が10ppmになるように調製した。無添加区エキスは、被検サンプル中の固形分が添加区エキスと同じになるように調製した。即ち、コク味の標準溶液と添加区エキスの被検サンプル中のγ-Glu-Val-Gly濃度は同等であり、添加区エキスの被検サンプルと無添加区エキスの被検サンプルの固形分は同等である。
【００８０】
このようにして準備した被検サンプルを専門のパネラー4名で、コク味を評価した。その結果、4名のパネラー全員が、添加区エキスの方が、同じ濃度のγ-Glu-Val-Glyよりもコク味が強いと評価した。更に、コク味について、異なる段階での味の評価、すなわち先味および中味のコク味と、後味のコク味についての評価を行った。各々のコク味について４名のパネルの点数の平均点を評点とした。結果を表５に示す。尚、先味および中味とは喫食後０から４秒までに感じる呈味であり、後味とは喫食後５秒以降に感じる呈味のことを示す。この結果から分かるように、γ-Glu-Val-Glyを培養工程で添加して調製したエキスは、γ-Glu-Val-Glyが何らかの代謝を受けたか、又は、γ-Glu-Val-Glyと酵母エキス中の成分との相乗作用により、先および中味、ならびに後味のコク味が増強されたと推定される。
【００８１】
【表５】
0005857973.tif 000006
【００８２】
実施例６：S288C株へのγ-Glu-Valの添加（１）
S288C株をSD培地（500ml容坂口フラスコ中50ml）に１エーゼ分植菌し、30℃で120rpmの速度で24時間振とう培養した。得られた培養液の吸光度を測定し、初発OD660が0.01になるようにSD培地（2L容バッフルフィン付き三角フラスコ中400ml、複数本）に植菌し、30℃で120rpmの速度にて回転方式で24時間振とう培養した。前記SD培地には、あらかじめ最終濃度で100ppmとなるようにγ-Glu-Val（Bachem（株）より購入）を添加した。この培養液を用いて、実施例２と同様に乾燥菌体あたりに含まれるγ-Glu-Val及びγ-Glu-Val-Glyの量を算出した。結果を表６に示す。
【００８３】
【表６】
0005857973.tif 000007
【００８４】
その結果、酵母細胞内に取込まれたγ-Glu-Valの一部は、γ-Glu-Val-Glyに変換されていた。
【００８５】
実施例７：S288C株へのγ-Glu-Valの添加（２）
S288C株をSD培地（500ml容坂口フラスコ中50ml）に１エーゼ分植菌し、30℃で120rpmの速度で24時間振とう培養した。得られた培養液の吸光度を測定し、初発OD660が0.01になるようにSD培地（2L容バッフルフィン付き三角フラスコ中400ml、複数本）に植菌し、30℃で120rpmの速度にて回転方式で19時間振とう培養した。19時間後に、所定濃度になるように各種濃度のγ-Glu-Val水溶液を添加し、１時間培養を継続した。これらの培養液を用いて、実施例２と同様に乾燥菌体あたりに含まれるγ-Glu-Valの含量を算出した。また、抽出されたエキス中の固形分を計算することにより、エキス固形分中のγ-Glu-Valも計算した。結果を表７に示す。
【００８６】
【表７】
0005857973.tif 000008
【００８７】
その結果、γ-Glu-Valの添加量に応じて、乾燥菌体及びエキス固形分当りのγ-Glu-Valの含量が増加した。
【００８８】
実施例８：S288C株へのVal-Glyの添加
S288C株をSDP培地（SD培地作製に用いる硫酸アンモニウムをプロリンで代替。プロリン最終濃度は0.1g/L）（500ml容坂口フラスコ中50ml）に１エーゼ分植菌し、30℃で120rpmの速度で24時間振とう培養した。得られた培養液の吸光度を測定し、初発OD660が0.01になるようにSDP培地（2L容バッフルフィン付き三角フラスコ中400ml、複数本）に植菌し、30℃で120rpmの速度にて回転方式で24時間振とう培養した。このSDP培地には、あらかじめ最終濃度で100ppmとなるようにVal-Gly（Bachem（株）より購入）を添加した。この培養液を用いて、実施例２と同様に乾燥菌体あたりに含まれるγ-Glu-Val-Glyの含量を算出した。結果を表８に示す。
【００８９】
【表８】
0005857973.tif 000009
【００９０】
Val-Glyを培地に添加した場合は、酵母細胞内にγ-Glu-Val-Glyが蓄積した。
【００９１】
実施例９：γ−グルタミル基転移酵素を作用させた、Val-Glyを添加した酵母エキス
固形分あたりにGSHを約8％含有する酵母エキス（市販の酵母エキスに試薬のGSHを添加したサンプル）の1％水溶液を調製し、NaOHを用いてそのpHを7.0に調製した。この溶液に、粉末のVal-Glyを水溶液中の最終濃度で400ppm、800ppm、又は4000ppmになるように添加し、被検サンプルを作製した。また、Val-Glyを添加しない酵母エキス水溶液をコントロールとした。これらの被検サンプルにグルタミナーゼ（大和化成株式会社  グルタミナーゼダイワ SD-C100S）を1mg/mlになるように添加し、37℃で120分間酵素反応を行った。また、グルタミナーゼの代わりに、γ-GTP（シグマ社 ウマ腎臓由来γ-グルタミルトランスペプチダーゼ、コードG9270-100UN）を0.05mg/mlになるように添加し、同様に37℃で120分間酵素反応を行った。反応液は、速やかに氷冷し、γ-Glu-Val-Gly、GSH、及びCys-Gly含量を測定した。
【００９２】
その結果、下記表に示す通り、Val-Gly無添加区では、γ-Glu-Val-Glyはほとんど生成しなかったが、Val-Glyの添加量を増やすにつれ、より多くのγ-Glu-Val-Glyの生成が見られた。特に、γ-GTPを用いた場合に、γ-Glu-Val-Glyの生成が顕著であった。
【００９３】
【表９】
0005857973.tif 000010
【００９４】
【表１０】
0005857973.tif 000011
【００９５】
Val-Glyの代わりに、ValやnValを添加し、同様の酵素反応を行うことにより、γ-Glu-Valやγ-Glu-nValも生成する。
【００９６】
実際、Val-Glyの代わりに、Valを最終濃度で4000ppm、又はnValを最終濃度で800ppm、4000ppm添加し、γ-GTPを用いて同様の実験を行った。本実験においても、キャンディダ・ユティリスから調製した酵母エキスを市販の酵母エキスとして使用した。更に、反応液の乾燥固形物を測定し、乾燥固形物中のγ-Glu-Val含量、又はγ-Glu-nVal含量を算出した。その結果、Valを最終濃度で4000ppm添加したときは、酵母エキスの乾燥固形物あたり0.239%のγ-Glu-Valが生成し、nValを最終濃度で800ppm添加したときは、酵母エキスの乾燥固形物あたり0.709%のγ-Glu-nValが生成し、nValを最終濃度で4000ppm添加したときは、酵母エキスの乾燥固形物あたり1.029%のγ-Glu-nValが生成した。γ-Glu-nValの測定は、実施例１と同様にして標準溶液として1μMのγ-Glu-nValを用いることによって、行った。誘導体化されたγ-Glu-nVal標品の分析結果（HPLC-MSクロマトグラム）を図２に示す。
【００９７】
実施例１０：GSH2強化株へのγ-Glu-Val添加
GSH2発現強化株を下記手順にて育種することができる。
【００９８】
１）S288C株のウラシル要求株（ura3変異株）の取得
ウラシル要求株は、常法に従い変異剤処理したサッカロマイセス・セレビシエ株を5-FOAを含む寒天培地にスプレッドし、生育してくる菌株の中からura3変異株を選択することにより取得することができる（例えば、METHODS IN YEAST GENETICS 2000 EDITIONの179ページを参照）。また、ウラシル要求株は、以下に示すように、URA3遺伝子を除いたURA3近傍DNAをS288C株に導入し、URA3遺伝子を破壊することによっても、取得することができる。
【００９９】
まず、配列番号１及び２に示すプライマーを用い、S288C株の染色体DNAを鋳型とするPCRにより、URA3の上流500 bpを増幅した。また、配列番号３及び４に示すプライマーを用い、URA3の下流500bpを増幅した。PCRの条件は、熱変性 94℃、10秒、アニーリング 55℃、10秒、伸張 72℃、1分、25サイクルであった。次に、エタノール沈殿によって精製したこれら2つのDNA断片を鋳型に、配列番号５及び６に示すプライマーを用いてオーバーラップPCRを行い、URA3遺伝子の上流500 bp及び、下流 500 bpを結合した1kbのDNA断片を得た。このDNA断片でS288C株を形質転換した後、ウラシルを添加したSD培地で一晩培養し、5-FOA平板培地に菌体を塗布した。得られた形質転換体からura3Δ0株を取得した。
【０１００】
２）プロモーター置換の為の鋳型プラスミドの作製
まず、配列番号７及び８のプライマーを用い、サッカロマイセス・セレビシエ野生株の染色体DNAを鋳型とするPCRによりURA3ローカスを増幅した（熱変性 94℃、10秒、アニーリング 50℃、10秒、伸張 72℃、1分、25サイクル）。得られたDNA断片をエタノール沈殿により精製後、SphI及びEcoRIで消化し、プラスミドpUC19のSphI-EcoRI部位に挿入し、pUC19-URA3を得た。次に、配列番号９及び１０に示すプライマーを用いてサッカロマイセス・セレビシエ野生株の染色体DNAよりPGK1プロモーター領域を増幅した。このDNA断片をPstIで消化し、PstIで消化及び、CIAP処理を行ったpUC19-URA3のPstI部位に挿入し、pUC19-PGK1p-URA3を得た。同様に、配列番号１１及び１２に示すプライマーを用いて増幅したPGK1プロモーターをAatIIで消化し、AatIIで消化及び、CIAP処理を行ったpUC19-PGK1p-URAのAatII部位に挿入し、pUC19-PGK1p-URA3-PGK1pを得た。なお、作成した鋳型プラスミドの塩基配列を配列決定して確認したところ、S288C株の染色体DNAを鋳型とした場合に想定される塩基配列と同等であった。よって、野生株の染色体DNAの代わりにS288C株の染色体DNAを鋳型に用いても同様のプラスミドを作造できる。
【０１０１】
３）染色体上のGSH2遺伝子へのPGK1プロモーターの導入
5’端にGSH2の上流配列をもつ配列番号１３のプライマー、及びGSH2遺伝子の開始コドンから始まる一部のORF内配列を持つ配列番号１４のプライマーを用い、pUC19-PGK1p-URA3-PGK1pを鋳型にPCRを行い（熱変性 94℃、10秒、アニーリング 60℃、10秒、伸張 72℃、4分、25サイクル）、PGK1プロモーターに挟まれたURA3を持つDNA断片を調製する。このDNA断片でura3Δ0株を形質転換し、SD平板培地に塗布し得られる形質転換体から、GSH2プロモーターがPGK1プロモーター−URA3−PGK1プロモーターに置換された株を取得することができる。
【０１０２】
４）URA3選択マーカーの除去とGSH2遺伝子のプロモーター置換
GSH2プロモーターがPGK1プロモーター−URA3−PGK1プロモーターに置換された株を、ウラシル添加SD培地で一晩培養し、適量を5-FOA平板培地に塗布する。出現したコロニーから、導入されたPGK1プロモーター間の相同組換えにより、URA3が除去され、GSH2プロモーターがPGK1プロモーターに置換した株を取得することができる。さらに、野生型ゲノムを鋳型に、配列番号１５及び１６のプライマーを用いて増幅したDNAを前記株に導入することにより、URA3が野生型に復元し、GSH2プロモーターがPGK1プロモーターに置換していること以外、ura3Δ0株と遺伝子型が全く同一な株を取得できる。
【０１０３】
このようにして得られる菌株から酵母エキスを製造し、実施例３、４、６〜８と同様に
評価する。
【０１０４】
実施例１１：HGT1強化株へのγ-Glu-Val-Gly添加
HGT1発現強化株は実施例10と同様の手法により取得することができる。具体的にはpUC19-PGK1p-URA3-PGK1pを鋳型に、5’端にGSH11の上流配列を持つ配列番号１７のプライマー、及び GSH11遺伝子の開始コドンから始まる一部のORF内配列を持つ配列番号１８のプライマーを用いてPCRを行い、得られたDNA断片を出芽酵母に導入することにより、GSH11のプロモーターをPGK1プロモーターに置換した細胞を取得する。
【０１０５】
このようにして得られる菌株から酵母エキスを製造し、実施例３、４、６〜８と同様に評価する。
【０１０６】
実施例１２：HGT1またはPRT2改変株のγ-Glu-Val-Gly取込み活性の評価
GSH特異的輸送体と考えられていたHgt1p及びペプチド輸送体Ptr2pのγ-Glu-Val-Gly蓄積に対する影響を以下のように評価した。
【０１０７】
1) S288Cからのウラシル要求性変異株(ura3変異株)の取得
ジェネティシン(G418)抵抗性カセット(PADH1-kanR)を、pUC19AOX-G418-BRI(図３、配列番号２３、Olga A. et al., Mol Biotechnol., Pubslished online December 19, 2010)を鋳型として使用し、プライマーURA3Km-L1(配列番号２４)及びURA3Km-R2(配列番号２５)を使用して、PCRにより増幅した。プラスミドpUC19AOX-G418-BRIは、pUC19ベクターにクローニングしたサッカロマイセス・セレビシエADH1(ADC1)プロモーターの制御下のE. coliトランスポゾンTn5由来のカナマイシン耐性遺伝子(neo)からなる。BR1は、このプラスミドでは、親のpUC19AOX-G418のPADH1とkaznRの間にあるBamHI及びEcoRI部位が削除されていることを意味する。PADH1-kanRカセットあるいはその同等物も、鋳型としてpUC19AOX-G418-BRIの代わりにプラスミドpKat7 (Lang-Hinrichs, C. et al., 1989. Applied Microbiology and Biotechnology, 30:388-394)またはpUM2 (Merckelbach A, et al., 1993, Appl Microbiol Biotechnol., Nov;40:361-364)を使用し、上記のプライマーURA3Km-L1及びURA3Km-R2を使用して、PCRにより得ることができる。
プライマーURA3Km-L1の5'末端の40ヌクレオチドはURA3上流領域に相同的であり、プライマーURA3Km-R2の5'末端の40ヌクレオチドはURA3下流領域に相補的である。
得られたDNA断片を使用してサッカロマイセス・セレビシエ S288Cを形質転換した。形質転換体を200 μg/mlのG418を含むYPDプレート上で選択した。URA3遺伝子の欠失は、プライマーura3up2(配列番号２６)及びura3dn2(配列番号２７)を使用してPCRにより確認した。
【０１０８】
得られた株はS288C ura3Δ0::PADH1-kanRであった。本株はS288C ura3Δ0とも称する。本株を使用してHGT1またはPTR2過剰発現株を構築した。
他方、HGT1またはPTR2欠失株を構築するために使用する別のウラシル要求性変異株を以下のようして得た。URA3をプロモーター及びターミネーター領域とともに含む断片を、S288Cの染色体DNAを鋳型として使用し、前述のプライマーura3up2及びura3dn2を使用するPCRにより増幅した。この断片をpBluescript II KS(+)のSmaI部位にクローニングし、その構造を配列決定分析により確認した。得られたプラスミドをpKS-URA3-13と称した(図４、配列番号２８)。
【０１０９】
プラスミドpKS-URA3-13をStuI及びNcoIで消化し、クレノーフラグメントで処理してNcoI部位を平滑末端化した。得られた4.38kbの断片を、loxP-kanMX-loxPモジュールを含む、pUG6から得た1.64kbのHincII-HincII断片とライゲーションした(Guldener, U., Heck, S., Fiedler, T., Beinhauer, J., Hegemann, J.H. 1996, A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Research 24, 2519-2
524)。得られたプラスミドはpKS-URA3-13-kanMXと称した。本プラスミドのマップ及び構築スキームを図５、配列番号２９に示す。
【０１１０】
その後、URA3断片に隣接するkanMX遺伝子を、前述のプライマーura3up2及びura3dn2、並びにpKS-URA3-13-kanMXを鋳型として使用するPCRによって増幅した。得られた断片を使用してサッカロマイセス・セレビシエ S288C株を形質転換し、形質転換体を200μg/mlのG418を含むYPD培地上で選択した。その結果、URA3のコード領域の227ヌクレオチドを欠失したS288Cの誘導株を得た。この欠失はura3Δ227::loxP-kanMX-loxPと称した。kanMXマーカーを欠失するために、得られた株を、GAL1プロモーターの制御下のCreリコンビナーゼをコードする遺伝子及びURA3を選択マーカーとして含むプラスミドpSH47(Guldener, U., Heck, S., Fiedler, T., Beinhauer, J., and Hegemann, J.H. 1996. A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Research 24, 2519-2524)で形質転換した。細胞をYPD培地からYPG(ガラクトースを含む)に移すことにより誘導されるCre-リコンビナーゼ合成の後、マーカーが欠失された。プラスミドpSH47が欠失した得られた株をS288C ura3Δ227::loxPと称した。
【０１１１】
2) HGT1欠失変異株の取得
Agleu2-CaURA3-Agleu2カセットを含むDNA断片を、プラスミドpAG61(Goldstein, A.L., Pan, X., and McCusker, J.H. 1999. Heterologous URA3MX cassettes for gene replacement in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 15, 507-511)を鋳型として使用し、プライマーhgt1-pUG6u(配列番号３０)及びhgt1-pUG6d(配列番号３１)を使用するPCRによって増幅した。Agleu2-CaURA3-Agleu2カセットは、アシュビア・ゴシピ(Ashbya gossypii)LEU2遺伝子の2個の同一の断片に囲まれた、アシュビア・ゴシピTEFプロモーター及びターミネーターの制御下のカンジダ・アルビカンスURA3遺伝子を含む。LEU2遺伝子断片のそれぞれは、C末端領域から該遺伝子の3'UTRにわたる470bpの配列である。Agleu2-CaURA3-Agleu2カセットはプラスミドpAG61から切り出すことができる。
【０１１２】
プライマーhgt1-pUG6uの5'末端の47ヌクレオチドはHGT1 5'領域に相同的であり、プライマーhgt1-pUG6dの5'末端の44ヌクレオチドはHGT1 3'領域に相補的である。
得られた断片を使用してS288C ura3Δ227::loxP株を形質転換した。形質転換体をSD培地を含むプレート上で選択した。HGT1遺伝子のコード領域の1981〜2400位のヌクレオチドを欠失した、得られた株S288C ura3Δ227::loxP hgt1Δ1981::Agleu2CaURA3-Agleu2をS288C hgt1Δと称した。
HGT1遺伝子の欠失は、プライマーhgt1-51(配列番号３２)及びhgt1-32(配列番号３３)を使用して、PCRにより確認した。
【０１１３】
3) PTR2欠失変異株の取得
プラスミドpUC19AOX-G418-BRIからPADH1-kanRモジュールをXbaIとSacIで切り出し、プラスミドpUG6の同じ部位へサブクローン化した。得られたプラスミドをpLoxP-PADH1-kanR5(図６)と称した。
loxP-PADH1-kanR-loxPモジュールを含むDNA断片を、pLoxP-PADH1-kanR5プラスミドを鋳型として使用し、プライマーptr2-pUG6u(配列番号３４)及びptr2-pUG6d(配列番号３５)を使用するPCRにより増幅した。
【０１１４】
プライマーhgt1-pUG6uの5'末端の47ヌクレオチドはPTR2 5'領域に相同的であり、プライマーhgt1-pUG6dの5'末端の44ヌクレオチドはPTR2 3'領域に相補的である。
得られた断片を使用してS288C ura3Δ227::loxP株を形質転換した。形質転換体を、200μg/mlのG418を含むYPD培地を含むプレート上で選択した。PTR2遺伝子のコード領域の422〜1388位のヌクレオチドを欠失する、得られた株S288C ura3Δ227::loxP ptr2Δ967::loxP-PADH1-kanR-loxPは、S288C ptr2Δと指称する。
【０１１５】
PTR2遺伝子の欠失は、プライマーptr2-51(配列番号３６)及びptr2-31(配列番号３７)を使用して、PCRによって確認した。
【０１１６】
4) S288C株からのHGT1及びPTR2欠失変異株の取得
株S288C hgt1Δptr2ΔはS288C ptr2Δ株と同様にして構築した。ただし、S288C hgt1Δ株は形質転換に使用した。
【０１１７】
5) Hgt1p過剰生産株の取得
ADH1のプロモーターを含むDNA断片を、サッカロマイセス・セレビシエ株S288Cの染色体DNAを鋳型として使用し、プライマーadh1L1(配列番号３８)及びadh1R1(配列番号３９)を使用するPCRによって増幅した。得られた断片をプラスミドpUC19のSmaI部位へクローン化し、その構造を配列決定分析によって確認した。得られたプラスミドをpUC19-PADH1-r(図７)と称した。
【０１１８】
プラスミドpKS-URA3-13からのHindIII-HindIII断片(1.16kb)を、pKS-URA3H-d産生プラスミドpBluescript II KS(+)のHindIII部位へサブクローン化した。プラスミドpUC19-PADH1-rからのKpnI-SalI断片をpKS-URA3H-dのSalI-KpnI部位へクローン化した。得られたプラスミドをpKS-URA3-P-ADH1(図８)と称した。
【０１１９】
その後、プラスミドpKS-URA3-PADH1をClaIとBsrGIで消化した。消化したプラスミドをクレノーフラグメントで平滑末端化し、セルフライゲーションさせた。pKS-URA3-PADH1-5'dと称する、得られたプラスミドをEcoRIで消化し、クレノーフラグメントで処理した後、XbaIで消化した。得られた断片をPADH1の断片と結合し、XbaI及びBstZ17IによりプラスミドpUC19-PADH1-rから切り出した。得られたプラスミドをpKS-URA3-PADH1-LR(図７)と称した。
【０１２０】
PADH1-URA3-PADH1カセットを含むDNA断片を、プラスミドpKS-URA3-PADH1-LRを鋳型として使用し、プライマーPADH1-HGT1(配列番号４０)及びHGT1-PADH1(配列番号４１)を使用するPCRにより増幅した。
プライマーPADH1-HGT1の5'末端の40ヌクレオチドはHGT1コード領域の最初の40ヌクレオチドに相補的であり、プライマーHGT1-PADH1の5'末端の40ヌクレオチドはHGT1上流領域に相同的である。
【０１２１】
HGT1上流領域を含むDNA断片を、サッカロマイセス・セレビシエS288C株の染色体DNAを鋳型として使用し、プライマーhgt53(配列番号４２)及びhgt33(配列番号４３)を使用するPCRにより増幅した。
【０１２２】
その後、上記のようにして得た断片を、Shevchuk, N.A., Bryksin, A.V., Nusinovich,
Y.A., Cabello, F.C., Sutherland M., Ladisch S. 2004, Construction of long DNA molecules using long PCR-based fusion of several fragments simultaneously. Nucleic Acids Res., 32(2):e19に記載されたようにして、プライマーhgt53及びPADH1-HGT1を使用するPCRにより融合した。得られた断片を使用してS288C ura3Δ0::PADH1-kanR株を形質転換した。形質転換体をSD培地を含むプレート上で選択した。その結果、S288C ura3Δ0::PADH1-kanR PADH1-URA3-PADH1-HGT1株を得た。この株をS288C PADH1-HGT1と称した。
【０１２３】
プロモーター置換実験のスキームを図９に示す。プライマーhgt53はプライマー1に相当し、プライマーhgt33はプライマー2に相当し、プライマーHGT1-PADH1はプライマー3に相当し、プライマーPADH1-HGT1はプライマー4に相当する。
【０１２４】
6) Ptr2p過剰生産株の取得
PTR2の在来プロモーターの置換は、HGT1のプロモーターの置換(図９)と同様に行った。
以下のプライマーを使用した。
ptr52(配列番号４４)、プライマー1に相当
ptr32(配列番号４５)、プライマー2に相当
PTR2-PADH1(配列番号４６)、プライマー4に相当
PADH1-PTR2(配列番号４７)、プライマー3に相当
【０１２５】
プライマーPADH1-PTR2の5'末端の40ヌクレオチドはPTR2コード領域の最初の40ヌクレオチドに相補的であり、プライマーPTR2-PADH1の5'末端の30ヌクレオチドはPTR2上流領域に相同的である。
【０１２６】
7) 変異株の評価
各株を、最終濃度100 ppmのγ-Glu-Val-Glyを含む5 mlのSD培地を含む50 mlチューブ中で培養した。それぞれの株を初発OD600=0.5で一晩培養することによりチューブ中に接種し、チューブを240rpm、30℃の回転振盪機上に置いた。培養時間は7時間とした。その後、2 mlの液体培養物から遠心分離により細胞を回収し、1 mlのmilliQ水で3回洗浄した。その後、洗浄した細胞を1 mlのmilliQ中に懸濁し、水浴上70℃で10分間インキュベートして細胞内物質を抽出した。細胞デブリとエキスを遠心分離によって分離した後、水相を清浄なバイアルに移し、減圧乾燥した。このようにして乾燥エキスを調製した。その後、乾燥エキス中のγ-Glu-Val-Glyの量をLC-MS/MS分析により測定した。以下に詳細な手順を示す。
【０１２７】
器具
質量分析計: Triple Quadrupole Agilent 6410
HPLC: Agilent 1200
カラム: Thermo Hypersil-Keystone C18 100 mm*2.1 mm*5 μm
1. サンプルを100μlの水に溶解した後、100μlのアセトニトリル(MeCN)を加え、遠心分離した。
2. 190μlの上清を新しいチューブに移し、乾燥させた。
3. ペレットを40μlの水に溶解した。
4. 誘導体化のために、得られた溶液20μlを60μlのバッファー及び80μlの誘導体化試薬と混合し、55℃で10分間インキュベートした。
5. インキュベーションの後、200 μlの0.1% HCOOH水溶液を加えてAQC誘導体化反応を停止した。
【０１２８】
得られた溶液40μlをHPLCのために採取し、溶出液中のγ-Glu-Val-GlyをMS/MS検出器により分析した。
HPLC条件
移動相A−H2O中の0.1% HCOOH
移動相B−MeCN中の0.1% HCOOH
流速−0.250 ml/min
【０１２９】
【表１１】
0005857973.tif 000012
【０１３０】
【表１２】
0005857973.tif 000013
【０１３１】
これらのデータから、細胞内のγ-Glu-Val-Gly量を算出した。結果を表１３及び１４に示す。HGT1遺伝子はγ-Glu-Val-Glyの培地からの輸送に必須であるが、PTR2はそうではないことが示された。
【０１３２】
【表１３】
0005857973.tif 000014
【０１３３】
【表１４】
0005857973.tif 000015
【０１３４】
実施例１３：Hgt1p過剰生産株へのγ-Glu-Val-Gly添加の効果
実施例１２で得られたHgt1p過剰生産株S288C PADH1-HGT1、及びその親株S288Cのγ-Glu-Val-Gly取り込み能を、実施例４に記載したのと同様の方法で評価した。γ-Glu-Val-Glyの培地への添加量は最終濃度で100 ppmとした。その結果、S288Cにおける乾燥細胞重量に対するγ-Glu-Val-Glyの細胞内含量は約0.9%であったが、S288C PADH1-HGT1における乾燥重量細胞に対するγ-Glu-Val-Glyの細胞内含量は約4.9%であった。この結果によりHgt1p生産過剰の効果が確認される。
【０１３５】
実施例１４：S288C株へのγ-Glu-nVal-Gly添加の効果
実施例４に記載の方法と同様にして、S288C株のγ-Glu-nVal-Gly取り込み能を評価した。γ-Glu-nVal-Glyを最終濃度が10ppm又は100ppmとなるように予め培地に添加した。また、γ-Glu-nVal-Glyの定量は、実施例１に記載の方法と同様にして行い、標準液としてγ-Glu-Val-Glyの代わりに1μMのγ-Glu-nVal-Glyを用いて行った。その結果、乾燥菌体あたりに含まれるγ-Glu-nVal-Glyの含有量は、培地にγ-Glu-nVal-Glyを添加しなかった場合は定量限界以下であったが、培地に最終濃度で10ppm添加した場合は約0.07%であり、培地に最終濃度で100ppm添加した場合は約0.09%であった。誘導体化したγ-Glu-nVal-Gly標品の分析結果（HPLC-MSクロマトグラム）を図２に示す。
【０１３６】
実施例１５：S288C株へのγ-Glu-nVal添加の効果
実施例７に記載の方法と同様にして、S288C株のγ-Glu-nVal取り込み能を評価した。γ-Glu-nValを最終濃度が10ppm又は100ppmとなるように予め培地に添加した。また、γ-Glu-nValの定量は実施例１と同様にして行い、標準液としてγ-Glu-Valのかわりに1μMのγ-Glu-nValを用いて行った。その結果、培地にγ-Glu-nValを添加しなかった場合の乾燥菌体あたりに含まれるγ-Glu-nValは定量限界以下であったが、培地に最終濃度で10ppm添加した場合は約0.03%、最終濃度で100ppm添加した場合は約0.13%であった。
【０１３７】
実施例１６：γ-Glu-nVal-Gly含有酵母エキスの製造
実施例５に記載の方法と同様にしてγ-Glu-nVal-Glyを添加して培養した酵母菌体より酵母エキスを製造した。S288C株をSD培地（500ml容坂口フラスコ中50ml）に１エーゼ分植菌し、30℃で120rpmの速度で24時間振とう培養した。得られた培養液の吸光度を測定し、初発OD660が0.01になるようにSD培地（2L容バッフルフィン付き三角フラスコ中400ml、12本）に植菌し、30℃で120rpmの速度にて回転方式で19時間振とう培養した。19時間後に、最終濃度で50ppmになるようにγ-Glu-nVal-Gly水溶液を添加し、１時間培養を継続した。
【０１３８】
得られた全ての培養液から集菌し、実施例２の記載と同様の手順で菌体洗浄を行った。400 ODユニット分の洗浄菌体を1.5mlのmilliQ水に懸濁した。同懸濁液を70℃で10分間保持することにより、酵母菌体からエキスを抽出した。更に遠心分離を行い、菌体残渣を取り除き、エキスのみを回収した。このエキス（添加区エキス）に含まれるγ-Glu-nVal-Gl
y濃度を測定したところ約100ppmであり、固形分は約1%であった。なお、γ-Glu-nVal-Glyを培養液に添加せずに同様の操作により調製したエキス（無添加区エキス）に含まれるγ-Glu-nVal-Gly濃度は定量限界以下であり、固形分は約1%であった。
【０１３９】
このようにして調製したエキスについて、MSG（グルタミン酸ナトリウム）存在下でのコク味を、次のようにして評価した。まず、コントロールとして、0.2% MSG及び0.5% NaClを含有する水溶液を用い、これを官能評点0.0と定義した。次に、0.2% MSG、0.5% NaCl、及び1ppmのγ-Glu-nVal-Glyを含む水溶液をコク味の標準溶液とし、官能評点3.0と定義した。これら2つをコク味強度の基準として、エキスのコク味強度を評価した。エキスのコク味強度は、エキスと0.2% MSG、及び0.5% NaClを含む水溶液を被検サンプルとして評価した。被検サンプル中の添加区エキスの量は、γ-Glu-nVal-Gly濃度が1ppmになるように調製した。無添加区エキスは、被検サンプル中の固形分が添加区エキスの被検サンプルと同じになるように調製した。即ち、コク味の標準溶液と添加区エキスの被検サンプル中のγ-Glu-nVal-Gly濃度は同等であり、添加区エキスの被検サンプルと無添加区エキスの被検サンプルの固形分は同等である。更に、添加区エキス中のγ-Glu-nVal-Glyと同じ濃度になるように無添加区エキスにγ-Glu-nVal-Glyを添加したモデルサンプルも評価した。即ち、モデルサンプル中のγ-Glu-nVal-Gly濃度は約100ppmであり、固形分は約1％であった。
【０１４０】
このようにして準備した被検サンプルについて、専門のパネラー4名で、コク味を評価した。その結果、4名のパネラー全員が、添加区エキスの方が、同じ濃度のγ-Glu-Val-Glyよりもコク味が強いと評価した。更に、コク味を先味および中味のコク味と、後味のコク味についての評価を行う為に、各々のコク味について４名のパネルの点数の平均点を評点とした。結果を表１５に示す。尚、先味および中味とは喫食後０から４秒までに感じる呈味であり、後味とは喫食後５秒以降に感じる呈味のことを示す。この結果から分かるように、γ-Glu-nVal-Glyを培養工程で添加して調製したエキスは、γ-Glu-nVal-Glyが何らかの代謝を受けたか、又は、γ-Glu-nVal-Glyと酵母エキス中の成分との相乗作用により、先味および中味、ならびに後味のコク味が増強したと推定される。
【０１４１】
【表１５】
0005857973.tif 000016
【０１４２】
実施例１７：Hgt1p過剰生産株へのγ-Glu-nVal-Gly添加の効果
実施例１２で得られたHgt1p過剰生産株S288C PADH1-HGT1、及びその親株S288Cのγ-Glu-nVal-Gly取り込み能を実施例４及び実施例１３に記載したのと同様の方法で評価した。γ-Glu-nVal-Glyの培地への添加量は最終濃度で100 ppmとした。その結果、S288Cにおける乾燥菌体重量でのγ―Glu-nVal-Glyの細胞内含量は約0.09%であったが、S288C PADH1-HGT1における乾燥菌体重量でのγ―Glu-nVal-Glyの細胞内含量は約2.84%であった。
【０１４３】
実施例１８：Ptr2p過剰生産株へのVal-Gly添加の効果
実施例１２で得られたHgt1p過剰生産株であるS288C PADH1-HGT1、実施例１２で得られたPtr2p過剰生産株であるS288C PADH1-PTR2P、及びそれらの親株S288Cの、Val-Glyからのγ-Glu-Val-Gly生産能を評価した。各株を、最終濃度100 ppmのVal-Glyを含む10mlのSD培地を含む50 mlチューブ中で培養した。それぞれの株を初発OD600=0.01で一晩培養することによりチューブ中に接種し、チューブを240rpm、30℃の回転振盪機上に置いた。培養時間は20時間とした。その後、2 mlの液体培養物から遠心分離により細胞を回収し、1 mlのmilliQ水で3回洗浄した。その後、洗浄した細胞を1 mlのmilliQ中に懸濁し、水浴上70℃で10分間インキュベートして細胞内物質を抽出した。細胞デブリとエキスを遠心分離によって分離した後、水相を清浄なバイアルに移し、減圧乾燥した。このようにして乾燥エキスを調製した。その後、乾燥エキス中のγ-Glu-Val-Glyの量を、実施例１２に記載したように、LC-MS/MS分析により測定した。結果から判る通り、PTR2は培地からのVal-Glyのトランスポーターであるようであり、Val-Glyから細胞内のγ-Glu-Val-Gly含量を増加させるのに有効であった。
【０１４４】
【表１６】
0005857973.tif 000017
【０１４５】
実施例１９：GSH1過剰発現株へのnValの添加の効果
S288C株を、実施例８に記載のVal-Gly無添加区と同様にしてSDP培地で培養した。その後、細胞内γ-Glu-nVal-Gly及びγ-Glu-nValを測定したが、検出限界未満であった。そこで、GSH1過剰発現株へのnValの添加の影響を評価した。
先ず、GSH1 過剰発現株を下記のようにして構築した。
【０１４６】
1) サッカロマイセス・セレビシエ野生株のウラシル要求性株(ura3変異株)の取得
ウラシル要求性株(ura3変異株)を実施例１０に記載したのと同様の方法で得た。ただし、S288C株の代わりに、サッカロマイセス・セレビシエ野生株(MATα型半数体株)を使用した。得られた株はプライベートナンバーAJ14956が付与され、工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人産業技術総合研究所）特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１つくば中央第６）に2010年8月18日に寄託され、受託番号FERM P-22000が付与された。該寄託は2010年11月17日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-11299が付与された。
【０１４７】
2) GSH1過剰発現株の取得
鋳型プラスミドpAUA(Olga, A.S. et al, 2010, Mol Biotechnol, published on line; 19 December 2010, DOI 10.1007/s12033-010-9362-6)を使用して、GSH1の在来プロモーターをADH1のプロモーターと置換した。その後、本発明者らが以前に報告した方法(Olga, A.S. et al, 2010)により、AJ14956のGSH1の在来プロモーターをADH1のプロモーターと置換した。その後、削除したURA3遺伝子を、実施例１０に記載したのと同様の方法で野生型株に戻した。このようにしてGSH1過剰発現株AG1を得、該株はいうまでもなくウラシル非要求性であった。
その後、このAG1株をnValを添加したSD培地で培養した。具体的には、１エーゼ分のAG1
株をSD培地(500ml容坂口フラスコ中50ml)に植菌し、30℃で120rpmの速度で24時間振とう培養した。得られた培養液の吸光度を測定し、初発OD660が0.01になるようにSDP培地（2L容バッフルフィン付き三角フラスコ中400ml。複数本）に植菌し、30℃で120rpmの速度にて回転方式で23時間振とう培養した。23時間後、nVal溶液を10ppmあるいは100ppmの最終濃度で加え、培養を1時間継続した。その後、γ-Glu-nValの量を実施例１５に記載の方法と同様にして測定した。10ppmのnValを培地に添加した場合はγ-Glu-nVal含量は0.07%であり、100ppmのnValを添加した場合はγ-Glu-nVal含量は0.37%であった。その後、100ppmのnValを使用して培養した培地からγ-Glu-nValを含む酵母エキスを基本的に実施例１６に記載の方法と同様にして調製した。この酵母エキスは乾燥物として1.44%のγ-Glu-nValを含んでいた。この酵母エキスはその特徴から、先味および中味について強いコク味を与えると考えられる。
【０１４８】
実施例２０：GSH2過剰発現株へのγ-Glu-Valの添加の効果(1)
S288Cからのura3Δ0の代わりに実施例１９に記載したAJ14956を使用したことを除いて、GSH2過剰発現株PG2を、基本的に実施例１０に記載の方法と同様にして構築した。対照として、実施例１０及び実施例１９に記載の方法と同様にして、削除したURA3遺伝子を野生型遺伝子に戻すことによりAJ14956からWT株を得た。
【０１４９】
１エーゼ分のWT株またはPG2株をSD培地(500ml容坂口フラスコ中50ml)に植菌し、30℃で120rpmの速度で24時間振とう培養した。得られた培養液の吸光度を測定し、培養液を初発OD660が0.01になるように、γ-Glu-Valを種々の濃度で添加したSD培地（2L容バッフルフィン付き三角フラスコ中400ml。複数本）に植菌し、OD660が所定の値になるまで30℃で120rpmの速度にて回転方式で振とう培養した。その後、乾燥菌体及び抽出されたエキスの固形物分中のγ-Glu-Val-Glyの量を前記の方法で計算した。結果に示されるように、GSH2 過剰発現株のPG2はγ-Glu-Valを培地から取り込み、細胞中でγ-Glu-Val-Glyに変換した。
【０１５０】
【表１７】
0005857973.tif 000018
【０１５１】
実施例２１：GSH2過剰発現株へのγ-Glu-Valの添加の効果(2)
1) 切出し可能なkanMXマーカー及びTDH3プロモーターを含む鋳型プラスミドの調製
グリセルアルデヒド3-ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードするTDH3遺伝子のプロモーターを含むDNA断片を、鋳型としてS288C株の染色体DNAを使用し、tdh3-EcoR1(配列番号
４８)及びtdh3-Pci1(配列番号４９)プライマーを使用して、PCR(熱変性94℃、20秒、アニーリング50℃、20秒、伸長72℃、30秒、30サイクル)により増幅した。得られた断片をpUC57ベクターのSmaI部位へクローン化した。TDH3遺伝子のプロモーターがHindIII部位か
らEcoRI部位の方向に向いているプラスミドを選択し、pUC57-PTDH3と称した。クローン化したDNA断片の構造は配列決定分析により確認した。
【０１５２】
pUC57-PTDH3のNdeI-SalI DNA断片を、pUG6(Guldener, U., Heck, S., Fiedler, T., Beinhauer, J., and Hegemann, J.H. 1996. A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Research 24, 2519-2524)のNdeI-SalI部位へクローン化した。得られたプラスミドをpUG6-PTDH3(図１０)と称した。
【０１５３】
2) GSH1及びGSH2在来プロモーターのTDH3のプロモーターによる置換
loxP-kanMX-loxP-PTDH3カセットを、鋳型としてpUG6-PTDH3を使用し、GSH1-pUG(配列番号 ５０)及びPTDH3-GSH1(配列番号５１)プライマーを使用するPCR(熱変性：94℃、20秒、アニーリング：48℃、60秒、伸長：72℃、120秒、2サイクル；94℃、20秒、アニーリング：65℃、20秒、伸長：72℃、120秒、20サイクル)により増幅した。得られたDNA断片を使用してS288C株を形質転換した。形質転換体を200μg/mlのG418を含むYPD培地上で選択した。その結果、GSH1遺伝子のプロモーターがTDH3のプロモーターで置換されたS288C誘導株が得られた(S288C loxP-kanMX-loxP-PTDH3-GSH1株)。そして常法による5-FOAを含む培地上での選択により（例えば、METHODS IN YEAST GENETICS, 2000 EDITION, p.179を参照）、この株のura3誘導株(S288C ura3 loxP-kanMX-loxP-PTDH3-GSH1株)を得た。実施例１２に記載したように、pSH47プラスミドでの形質転換により、得られた株からkanMXマーカーを削除した。その結果、S288C ura3 loxP-PTDH3-GSH1株を得た。
【０１５４】
次いでGSH2遺伝子の在来プロモーターをTDH3のプロモーターで置換した。この目的のために、loxP-kanMX-loxP-PTDH3カセットを、pUG6-PTDH3を鋳型として使用し、PTDH3-GSH2(配列番号５２)及びGSH2-pUG(配列番号５３)プライマーを使用するPCR(熱変性：94℃、20秒、アニーリング：48℃、60秒、伸長：72℃、120秒、2サイクル；94℃、20秒、アニーリング：65℃、20秒、伸長：72℃、120秒、20サイクル)により増幅した。GSH2上流領域は、鋳型としてS288C株の染色体DNAを使用し、GSH2up2(配列番号５４)及びGSH2d_tail(配列番号５５)プライマーを使用するPCR(熱変性94℃20秒、アニーリング48℃20秒、伸長72℃30秒を30サイクル)により増幅した。得られた断片を、GSH2up2(配列番号５４)及びPTDH3-GSH2(配列番号５２)プライマーを使用して、オーバーラップ・エクステンションPCR(Shevchuk, N.A. at al. 2004. Construction of long DNA molecules using long PCR-based fusion of several fragments simultaneously. Nucleic Acids Res.32(2):e19) (熱変性：94℃、20秒、アニーリング：55℃、20秒、伸長：72℃、120秒、30サイクル)により融合した。得られたDNA断片を使用してS288C ura3 loxP-PTDH3-GSH1株を形質転換した。形質転換体を200μg/mlのG418を含むYPD培地上で選択した。その結果、S288C ura3 loxP-PTDH3-GSH1 loxP-kanMX-loxP-PTDH3-GSH2株を得た。その後、この株から上記のようにしてkanMXマーカーを削除し、S288C ura3 loxP-PTDH3-GSH1 loxP-PTDH3-GSH2株を得た。本株をY3560と称した。
【０１５５】
3) GSH2過剰発現プラスミドの構築
PTDH3-GSH2構築物を、鋳型としてY3560染色体DNAを使用し、yepgsh2-F(配列番号５６)及びyepgsh2-R(配列番号５７)プライマーを使用して増幅した。これらのプライマーの5'配列の45ヌクレオチドは、YEp24プラスミドのSmaI-BamHI断片に隣接する領域に相補的であった(図１１)。次いでYEp24プラスミドをSmaI及びBamHIで消化し、得られた断片のより大きいものをアガロースゲル電気泳動により分離した。得られたPTDH3-GSH2及びYEp24断片を混合したものを使用してS288C ura3Δ227::loxP及びY3560株を形質転換した。形質転換体をSD培地上で選択した。得られたプラスミドをYEp24-PTDH3-GSH2と指称し、得られた株をS288C ura3Δ227/YEp24-PTDH3-GSH2及びY3560/YEp24-PTDH3-GSH2とそれぞれ指称した。
【０１５６】
4) 変異株の評価
S288C ura3Δ227/YEp24-PTDH3-GSH2、Y3560/YEp24-PTDH3-GSH2、S288C及びY3560株をそれぞれ、50mlチューブ中の、最終濃度100ppmのγ-Glu-Valを含む10mlのSD培地で培養した。Y3560株については、ウラシル(20mg/L)も培地に添加した。それぞれの株を初発OD600=0.01で一晩培養することによりチューブ中に接種し、チューブを240rpm、30℃の回転振盪機上に18時間置いた。その後、2 mlの液体培養物から遠心分離により細胞を回収し、1 mlのmilliQ水で3回洗浄した。その後、洗浄した細胞を1 mlのmilliQ中に懸濁し、水浴上70℃で10分間インキュベートして細胞内物質を抽出した。細胞デブリとエキスを遠心分離によって分離した後、水相を清浄なバイアルに移し、減圧乾燥した。このようにして乾燥エキスを調製した。その後、乾燥エキス中のγ-Glu-Val-Glyの量を、実施例１２に記載したようにしてLC-MS/MS分析により測定した。結果を表１８に示す。
【０１５７】
結果に示されるように、GSH2過剰発現株は細胞中のγ-Glu-Valをγ-Glu-Val-Glyに変換した。
【０１５８】
【表１８】
0005857973.tif 000019
【図１】
0005857973.tif 000020
【図２】
0005857973.tif 000021
【図３】
0005857973.tif 000022
【図４】
0005857973.tif 000023
【図５】
0005857973.tif 000024
【図６】
0005857973.tif 000025
【図７】
0005857973.tif 000026
【図８】
0005857973.tif 000027
【図９】
0005857973.tif 000028
【図１０】
0005857973.tif 000029
【図１１】
0005857973.tif 000030