(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＫＣＣＭ  １１１８７Ｐ号で寄託された、セルラーゼを生産するヌメリスギタケ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ａｄｉｐｏｓａ）ＳＫＵ７１４。
【請求項２】
請求項１に記載のヌメリスギタケ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ａｄｉｐｏｓａ）ＳＫＵ７１４を培養して、セルラーゼを生産することを特徴とするセルラーゼの生産方法。
【請求項３】
前記培養は、コーン浸漬分５〜１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物１〜５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム３〜７ｇ／Ｌ、リン酸水素カリウム３〜７ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物１〜５ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩０．０１〜０．０３ｇ／Ｌ、及び炭素源１０〜３０ｇ／Ｌを含み、ｐＨ４．５〜５．５である培地で行うことを特徴とする請求項２に記載のセルラーゼの生産方法。
【請求項４】
前記炭素源は、セルロース、セロビオース、稲わら及びアビセルからなる群から選択されたことを特徴とする請求項３に記載のセルラーゼの生産方法。
【請求項５】
前記培養は、撹拌速度１００〜２００ｒｐｍ、通気量０．８〜１．２ｖｖｍ及び培養温度２５〜３０℃の条件にて行うことを特徴とする請求項２または３に記載のセルラーゼの生産方法。
【請求項６】
請求項１に記載のヌメリスギタケ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ａｄｉｐｏｓａ）ＳＫＵ７１４を培養して生産されたセルラーゼを用いて、セルロース基質を糖化することを特徴とするセルロースの糖化方法。
【請求項７】
前記セルロース基質は、ポプラ、稲わらまたはこれらの混合物であることを特徴とする請求項６に記載のセルロースの糖化方法。
【請求項８】
前記糖化は、基質の濃度５〜２５重量％、セルラーゼの濃度１〜４５ＦＰＵ／ｇ−基質、ｐＨ４〜７及び温度５０〜８０℃の条件にて行うことを特徴とする請求項６に記載のセルロースの糖化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新菌株ヌメリスギタケ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ａｄｉｐｏｓａ）ＳＫＵ７１４
、前記菌株からセルラーゼを生産する方法、及び生産されたセルラーゼを用いてセルロー
スを糖化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースは、地球上に存在する最も豊富な有機物質であって、石油や石炭のように枯渇される恐れがない再生可能な資源である。しかし、多くのセルロース資源は、農産廃棄物及び林産廃棄物として捨てられており、このような農産廃資源及び林産廃資源は、環境汚染の主な原因と見なされている。全世界の農産廃資源及び林産廃資源は、毎年３０億トン以上生産されており、アジアだけで８億トン以上が生産されている。
【０００３】
農産廃資源及び林産廃資源は、主にセルロースとヘミセルロースからなるので、これらを糖化させ、ブドウ糖を含む単糖類に転換できるならば、食糧問題、燃料問題及び環境問題の解決に大きな助けとなるであろう。
【０００４】
農産廃資源及び林産廃資源から単糖類を回収するための一般的な方法としては、硫酸を添加して、高温で加圧及び分解する方法が知られている。この場合、強酸及び高温に耐えることができる高価な生産装備が必要であり、各種の副反応により様々な分解産物が生成されるので、単糖類を分離回収する工程が困難であり、分解反応後の廃棄物処理などのコストにより生産単価が高く、全過程が環境に非親和的であるという問題点を有している。前述のように、一般的な糖化方法が商業的に利用するのに限界があるので、これを代替可能な、より環境親和的なセルロースの糖化方法について研究してきた。このような研究の一環として、様々な糖化酵素が開発され、その用途も多様であるので、産業的に色々な分野で商業化されており、また、新たな応用研究も活発に進められている。糖化酵素としてのセルラーゼは、繊維産業、製紙産業、洗剤産業、飼料産業などで多く利用されており、その他にも食品産業分野では、低カロリー食品の製造や生ごみ発酵など様々な用途に適用されている。
【０００５】
一方、植物体の細胞壁は、セルロース（不溶性のβ−１，４−グルカン繊維）、ヘミセルロース（非セルロース系多糖類）、リグニン（複雑なポリフェノール構造の多糖類）のような重合体で構成されている。構成成分のうちセルロースが最も多く存在し、その次にキシランが主成分であるヘミセルロースが多く存在し、これらの二つの成分が全体の植物のバイオマスの５０％以上を占めている。セルロースは、ブドウ糖単位がβ−１，４結合により連結された同種の重合体であって、これを単糖類に分解するためには、エンド−β−１，４−グルカナーゼ［ＥＣ  ３．２．１．４］、エキソ−β−１，４−グルカナーゼ［ＥＣ  ３．２．１．９１］、β−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）などの三つの酵素が必要である。エンド・グルカナーゼは、内側からβ−１，４ブドウ糖結合をランダムに切断し、エキソ・グルカナーゼは、非還元糖の末端からブドウ糖の二糖体であるセロビオースに切断していく。セロビオースは、β−グルコシダーゼによりブドウ糖に最終的に分解される。
【０００６】
セルラーゼ酵素の生産は、主にカビ（ｆｕｎｇｉ）を用いており、特に産業的な側面においてアスペルギルスとトリコデルマを用いた。セルラーゼの生産菌株として、トリコデルマレエセイＺＵ−０２（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＡＴＣＣ  ５６７６４）が代表的に集中して研究されてきたが、酵素の濃度及び活性が産業化を満たすのに十分でないという問題点がある。例えば、バイオマスからエタノールを生産する工程は、原料物質の再生、生産燃料の環境親和性などの多くの利点を有しているが、リグノセルロース系物質を原料にして生産されたエタノールは、ガソリンに比べて生産コストが著しく高く、実用化において障害となっている。このようなエタノールの生産工程にかかるコストのうち、糖化酵素の生産コストが全体コストの約６０％であって、最も大きな比重を占めている。
【０００７】
前述のように、セルロースの効率的な糖化工程の開発が切実に必要であり、そのうち環境親和的な新規を用いたセルロースの糖化工程の開発がより切実に要求されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、従来技術の問題点を解決するためになされたものであって、本発明が解決しようとする課題は、下記の通りである。
【０００９】
本発明の目的は、高活性のセルラーゼを生産する新菌株を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記菌株を用いてセルラーゼを生産する方法を提供することにある。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、前記セルラーゼを用いてセルロースを糖化する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、セルラーゼを生産するヌメリスギタケＳＫＵ７１４（受託番号ＫＣＣＭ  １１１８７Ｐ）菌株を特徴とする。
【００１３】
本発明は、セルラーゼの生産方法において、ヌメリスギタケＳＫＵ７１４（受託番号ＫＣＣＭ  １１１８７Ｐ）を培養することを特徴とする。
【００１４】
また、本発明は、セルラーゼの生産方法において、コーン浸漬分５〜１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物１〜５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム３〜７ｇ／Ｌ、リン酸水素カリウム３〜７ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物１〜５ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩０．０１〜０．０３ｇ／Ｌ、及び炭素源１０〜３０ｇ／Ｌ（最終的にｐＨ４．５〜５．５）を含む培地を用いることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明は、セルラーゼの生産方法において、培地に含まれる炭素源がセルロース、セロビオース、稲わら及びアビセルからなる群から選択されることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明は、セルラーゼの生産方法において、撹拌速度１００〜２００ｒｐｍ、通気量０．８〜１．２ｖｖｍ及び培養温度２５〜３０℃の条件にて培養することを特徴とする。
【００１７】
本発明は、セルロースの糖化方法において、前記菌株から生産されたセルラーゼを用いることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明は、セルロースの糖化方法において、基質の濃度５〜２５重量％、セルラーゼの濃度１〜４５ＦＰＵ／ｇ−基質、ｐＨ４〜７及び温度５０〜８０℃の条件にて糖化することを特徴とする。
【００１９】
また、本発明は、セルロースの糖化方法において、セルロース供給源、すなわち、基質には、稲わら、ポプラまたはこれらの混合物を利用することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のタケから分離した新菌株であるヌメリスギタケＳＫＵ７１４は、高活性のセルラーゼを生産する。
【００２１】
本発明の新菌株から生産されたセルラーゼは、従来の糖化酵素よりも優秀な糖化収率を表すので、バイオエネルギーの生産、繊維産業、製紙産業、洗剤産業、飼料産業、食品産業において低カロリー食品の製造や生ごみ発酵など様々な用途に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の菌株のＩＴＳ−５．８Ｓ  ｒＤＮＡ配列の類似種との類縁関係を分析した結果を示す図面である。
【図２Ａ】ヌメリスギタケＳＫＵ７１４菌株のβ−グルコシダーゼ活性（−●−）、セロビオハイドロラーゼ活性（−○−）、エンドグルカナーゼ活性（−▲−）及び単位量の酵素が濾紙を分解して生成するブドウ糖の生成率（−Δ−）を培養時間によって比較して示すグラフである。
【図２Ｂ】ヌメリスギタケＳＫＵ７１４菌株のキシラナーゼ活性（−●−）、ラッカーゼ活性（−○−）、マンナナーゼ活性（−▲−）及びリグニンペルオキシダーゼ活性（−Δ−）を培養時間によって比較して示すグラフである。
【図３Ａ】ヌメリスギタケＳＫＵ７１４菌株により生産されたβ−グルコシダーゼ酵素の最適活性ｐＨを示すグラフである。
【図３Ｂ】ヌメリスギタケＳＫＵ７１４菌株により生産されたβ−グルコシダーゼ酵素の最適活性温度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明を下記の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明が実施例に限定されるものではない。
【００２４】
実施例１：セルラーゼを生産する菌株の選別
セルラーゼを生産する菌株を分離するために、タケ菌の培養液１０ｕＬを生理食塩水１０ｍＬに懸濁し、懸濁液１０ｕＬ（１×１０４ｃｆｕ  ｍＬ−１）を取って、２％のカルボキシメチルセルロースが添加されたポテト・デキストロース寒天培地に塗抹した後、２７℃で３日間培養した。固体寒天培地でコロニーが形成された後、０．１％のコンゴレッド試薬で染色し、１Ｍの塩化ナトリウムで脱色して、このコロニーの周囲に繊維素分解環が生成された菌を選別する方法によって、様々なタケの胞子からセルラーゼを生産するタケ菌を多数探索した。
【００２５】
前記探索過程によって、一次菌株（Ｓ１からＳ６まで）を選別した。このように選別された菌株は、対照群（Ｃ）であって、従来のセルラーゼ生産菌株として利用されるトリコデルマレエセイＺＵ−０２を用いて、前記のようにカルボキシメチルセルロースを添加した固体寒天培地で繊維素分解能を確認した後、繊維素分解能に最も優れたＳ４菌株を選別した。
【００２６】
実施例２：菌株の同定
前記実施例１で分離したＳ４菌株の同定のために、韓国微生物保存センターでＩＴＳ−５．８Ｓ  ｒＤＮＡ配列を分析した。Ｓ４菌株のＩＴＳ−５．８Ｓ  ｒＤＮＡ配列は、配列番号１に表した。
【００２７】
前記Ｓ４菌株のＩＴＳ−５．８Ｓ  ｒＤＮＡ配列の類似種との類縁関係を分析した結果、ヌメリスギタケに同定された（図１）。
【００２８】
前記Ｓ４菌株は、「ヌメリスギタケ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ａｄｉｐｏｓａ）ＳＫＵ７１４」と命名し、韓国微生物保存センターに２０１１年４月２０日に受託番号ＫＣＣＭ  １１１８７Ｐ号でブダペスト条約に基づいて国際寄託した。
【００２９】
実施例３：セルラーゼの生産のための培地の最適化実験
（１）炭素源の種類によるセルラーゼ活性試験
７Ｌの発酵槽で炭素源の種類によるヌメリスギタケＳＫＵ７１４菌株のセルラーゼ生産活性を確認する実験を行った。この時、炭素源には、セルロース、グルコース、ラクトース、マルトース、セロビオース、カルボキシメチルセルロース、スクロース、キシラン、稲わら及びアビセルを使用した。
【００３０】
前培養培地（Ｐｏｔａｔｏ  ｓｔａｒｃｈ  ４ｇ／Ｌ、Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ２０ｇ／Ｌ）５０ｍＬが含まれている５０ｍＬのフラスコにヌメリスギタケＳＫＵ７１４菌株を接種し、振とう培養器で１５０ｒｐｍ、２５℃で５日間種培養を行った。生産培地（コーン浸漬分８ｇ／Ｌ、酵母抽出物２ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム５ｇ／Ｌ、リン酸水素カリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物３ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩０．０２ｇ／Ｌ及び炭素源２０ｇ／Ｌ、最終的にｐＨ５）が含まれた５０ｍＬのフラスコに前記種培養液５０ｍＬを接種し、撹拌速度１５０ｒｐｍ、培養温度２５℃、ｐＨ５で７日間本培養を行った。
【００３１】
各炭素源に対するヌメリスギタケＳＫＵ７１４菌株のβ−グルコシダーゼ活性及びブドウ糖の生成率を測定した結果を下記の表１に示した。
【００３２】
【表１】
0006022606.tif 000002
【００３３】
前記表１によれば、炭素源としてセルロース、セロビオース、稲わら及びアビセルを使用した時、比較的優秀なセルラーゼ活性を表し、セルロースを炭素源として使用した時、最大のセルラーゼ活性を表した。
【００３４】
（２）窒素源の種類によるセルラーゼ活性試験
７Ｌの発酵槽で窒素源の種類によるヌメリスギタケＳＫＵ７１４菌株のセルラーゼ生産活性を確認する実験を行った。この時、窒素源には、酵母抽出物、ペプトン、コーン浸漬分、尿素、硫酸アンモニア、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム及びトリプトンを使用した。
【００３５】
窒素源の濃度が５ｇ／Ｌである時、各窒素源の種類によるヌメリスギタケＳＫＵ７１４菌株のβ−グルコシダーゼ活性及びブドウ糖の生成率を測定した結果を下記の表２に示した。
【００３６】
【表２】
0006022606.tif 000003
【００３７】
前記表２によれば、窒素源として酵母抽出物、コーン浸漬分及びトリプトンを使用した時、比較的優秀なセルラーゼ活性を表し、酵母抽出物を窒素源として使用した時、最大のセルラーゼ活性を表した。
【００３８】
実施例４：高活性酵素の生産のための最適な培養条件実験
（１）ポプラを基質として使用した場合、セルラーゼの最適な培養条件実験
７Ｌの発酵槽でコーン浸漬分８ｇ／Ｌ、酵母抽出物２ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム５ｇ／Ｌ、リン酸水素カリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物３ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩０．０２ｇ／Ｌ及びポプラ２０ｇ／Ｌを含む培地の最適化実験を行った。ｐＨ３〜７の範囲及び培養温度２０〜３５℃の範囲で変化させつつセルラーゼ活性を比較した。その結果、ｐＨ５、培養温度２５〜３０℃で最大のセルラーゼ活性を表した。
【００３９】
また、前述のポプラ基質が含まれた培地で最適な培養条件（ｐＨ５、２５℃）にて、各セルラーゼに対する培養時間別に活性を測定して、図２Ａ及び図２Ｂにそれぞれ示した。図２Ａには、β−グルコシダーゼ、セロビオハイドロラーゼ及びエンドグルカナーゼの活性と、単位量の酵素が濾紙を分解して生成するブドウ糖の生成率を培養時間別に測定した結果をグラフで示した。そして、図２Ｂには、キシラナーゼ、ラッカーゼ、マンナナーゼ及びリグニンペルオキシダーゼの活性変化を培養時間別に測定した結果をグラフで示した。
【００４０】
（２）稲わらを基質として使用した場合、セルラーゼの生産及び活性の最適化実験
７Ｌの発酵槽でコーン浸漬分８ｇ／Ｌ、酵母抽出物２ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム５ｇ／Ｌ、リン酸水素カリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物３ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩０．０２ｇ／Ｌ及び稲わら２０ｇ／Ｌを含む培地の最適化実験を行った。ｐＨ３〜７の範囲及び培養温度２０〜３５℃の範囲で変化させつつセルラーゼの生産を比較した。その結果、ｐＨ５、培養温度２５〜３０℃で最大のセルラーゼ生産を表した。
【００４１】
また、生産されたセルラーゼ活性の最適条件を次のように探索した。ｐＨ３〜７．５の範囲及び温度４０〜８５℃の範囲で変化させつつβ−１，４−グルコシダーゼ活性を比較し、その結果を図３Ａ及び図３Ｂに示した。図３Ａ及び図３Ｂの結果によれば、ｐＨ５、温度６５℃で最大のセルラーゼ活性を表した。
【００４２】
実施例５：菌株の糖化収率の分析
一般に、植物体が含有しているリグノセルロースは、酵素の加水分解だけで高い糖化収率が得られない。したがって、酵素の加水分解の前にリグニンとヘミセルロースとを断片化する前処理過程を遂行して、セルラーゼ酵素の繊維素加水分解効率を向上させる。本実験では、前処理のために２重量％の水酸化ナトリウム溶液４０ｍＬが含まれたフラスコに稲わら１０ｇを入れ、８５℃で１時間反応させた後、０．４５ｕＭのフィルタで濾過して得られた稲わらを６５℃で乾燥させて使用した。
【００４３】
菌株の最適糖化条件を探索するために、酵素の濃度、基質の濃度、反応温度、反応ｐＨを変化させつつ実験を行った。
【００４４】
まず、前処理された稲わらを濃度別に２０ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に様々な濃度のセルラーゼと共に添加した。セルラーゼが添加された緩衝液は、１５〜５５℃で１５０ｒｐｍで７２時間反応させた後、変性された酵素を除去するために、反応液を１００℃で３分間煮って室温で冷やした後、４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して沈殿させた。酵素活性の測定は、還元糖の測定法により上澄液を用いた。
【００４５】
6糖化率は、反応が終了した稲わらを１０５℃で２４時間乾燥させた後、減少した１ｇの稲わらの重さを基準にして下記の数式１によって測定された。
【００４６】
【数１】
0006022606.tif 000004
【００４７】
（１）酵素の濃度による糖化収率実験
温度６５℃、ｐＨ６の条件にて、酵素の濃度によるヌメリスギタケＳＫＵ７１４菌株の糖化実験を行った結果を下記の表３に示した。
【００４８】
【表３】
0006022606.tif 000005
【００４９】
前記表３によれば、酵素の濃度が１５〜４５ＦＰＵ／ｇ−基質である時、最適な糖化収率を表した。
【００５０】
（２）基質の濃度による糖化収率実験
本実験では、ヌメリスギタケＳＫＵ７１４菌株が生産した糖化酵素によるポプラの糖化に及ぼす基質濃度の影響を確認した。ポプラ基質の初期濃度を１〜２７重量％に変化させつつ糖化収率を測定した結果を下記の表４に示した。
【００５１】
【表４】
0006022606.tif 000006
【００５２】
前記表４の結果によれば、ポプラ基質の初期濃度が１０〜２５重量％である時、糖化収率が優秀であり、２０重量％である時、最適な糖化収率を表した。
【００５３】
（３）温度による糖化収率実験
本実験では、ヌメリスギタケＳＫＵ７１４菌株が生産した糖化酵素によるポプラの糖化に及ぼす温度の影響を確認した。反応温度を２０℃、３５℃、５０℃、６５℃、８０℃にそれぞれ変化させつつ糖化収率を測定した結果を下記の表５に示した。
【００５４】
【表５】
0006022606.tif 000007
【００５５】
前記表５の結果によれば、糖化温度５０〜８０℃で糖化収率が優秀であり、６５℃で最適な糖化収率を表した。
【００５６】
（４）ｐＨによる糖化収率実験
本実験では、ヌメリスギタケＳＫＵ７１４菌株が生産した糖化酵素によるポプラの糖化に及ぼすｐＨの影響を確認した。反応ｐＨを１、３、５、７、９にそれぞれ変化させつつ糖化収率を測定した結果を下記の表６に示した。
【００５７】
【表６】
0006022606.tif 000008
【００５８】
前記表６の結果によれば、ｐＨ４〜７で糖化収率が優秀であり、ｐＨ７で最適な糖化収率を表した。
【００５９】
実施例６：最適条件での糖化実験
（１）ヌメリスギタケセルラーゼを用いたポプラの糖化実験
最適化された条件にてヌメリスギタケＳＫＵ７１４菌株が生産したセルラーゼを用いて、ポプラの糖化実験を行った。すなわち、基質の濃度１０重量％、酵素の濃度２５ＦＰＵ／ｇ−基質、ｐＨ６、温度６５℃で糖化実験を行った。下記の表７には、ヌメリスギタケＳＫＵ７１４菌株から生産されたセルラーゼと、ノボザイムズ社製のトリコデルマレエセイ由来のセルラーゼ（商品名：Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ  １．５Ｌ）との糖化収率を比較して示した。
【００６０】
【表７】
0006022606.tif 000009
【００６１】
（２）ヌメリスギタケセルラーゼを用いた稲わらの糖化実験
最適化された条件にてヌメリスギタケＳＫＵ７１４菌株が生産したセルラーゼを用いて、稲わらの糖化実験を行った。すなわち、基質の濃度１０重量％、酵素の濃度１６ＦＰＵ／ｇ−基質、ｐＨ６、温度６５℃で２４時間糖化実験を行った。下記の表８には、ヌメリスギタケＳＫＵ７１４菌株から生産されたセルラーゼ、ノボザイムズ社製のトリコデルマレエセイ由来のセルラーゼ（商品名：Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ  １．５Ｌ）及びナメコ菌株（Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ｎａｍｅｋｏ、ＫＴＣＣ２６１６３）から生産されたセルラーゼの糖化収率を比較して示した。
【００６２】
【表８】
0006022606.tif 000010
【００６３】
ナメコ菌株とヌメリスギタケ菌株は、同一なウロコタケ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ｓｐ．）菌株であるが、セルロースの糖化効率において顕著な差を表している。特に、ナメコ菌株は、タンパク質の低生産性及び低い酵素活性のため、糖化酵素として適用するのに限界があったが、本発明のヌメリスギタケ菌株は、セルラーゼを含む様々なバイオマス分解酵素の生産、タンパク質の高生産性、高い酵素活性及び熱安定性により、商業的に利用するのに適している。
【受託番号】
【００６４】
寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１１８７Ｐ
受託日付：２０１１０４２０
【図１】
0006022606.tif 000011
【図２Ａ】
0006022606.tif 000012
【図２Ｂ】
0006022606.tif 000013
【図３Ａ】
0006022606.tif 000014
【図３Ｂ】
0006022606.tif 000015
【配列表】
0006022606000001.app