(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の食中毒原因菌を検出する方法であって、
食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ａ）cadF遺伝子を増幅するための配列番号１及び配列番号２に記載の配列からなるプライマー対、
を用い、さらに、
（ｂ）cpe遺伝子を増幅するための配列番号３及び配列番号４に記載の配列からなるプライマー対、
（ｃ）ipaH遺伝子を増幅するための配列番号５及び配列番号６に記載の配列からなるプライマー対、
（ｅ）eae遺伝子を増幅するための配列番号９及び配列番号１０に記載の配列からなるプライマー対、
（ｆ）tdh遺伝子を増幅するための配列番号１１及び配列番号１２に記載の配列からなるプライマー対、
（ｇ）st1b遺伝子を増幅するための配列番号１３及び配列番号１４に記載の配列からなるプライマー対、
（ｈ）st1a遺伝子を増幅するための配列番号１５及び配列番号１６に記載の配列からなるプライマー対、
（ｊ）stx2遺伝子を増幅するための配列番号１９及び配列番号２０に記載の配列からなるプライマー、
（ｋ）stx1遺伝子を増幅するための配列番号２１及び配列番号２２に記載の配列からなるプライマー対、並びに
（ｌ）aggR遺伝子を増幅するための配列番号２３及び配列番号２４に記載の配列からなるプライマー対、
からなる群より選択されるプライマー対のうち、少なくとも５以上のプライマー対を用いて試料について核酸増幅反応を行う工程及び増幅産物を確認する工程を含む、試料中の食中毒原因菌を検出する方法。
【請求項２】
前記核酸増幅反応において、
（ａ）cadF遺伝子を増幅するための配列番号１及び配列番号２に記載の配列からなるプライマー対、
を用い、さらに、
（ｂ）cpe遺伝子を増幅するための配列番号３及び配列番号４に記載の配列からなるプライマー対、
（ｃ）ipaH遺伝子を増幅するための配列番号５及び配列番号６に記載の配列からなるプライマー対、
（ｅ）eae遺伝子を増幅するための配列番号９及び配列番号１０に記載の配列からなるプライマー対、
（ｆ）tdh遺伝子を増幅するための配列番号１１及び配列番号１２に記載の配列からなるプライマー対、
（ｇ）st1b遺伝子を増幅するための配列番号１３及び配列番号１４に記載の配列からなるプライマー対、
（ｈ）st1a遺伝子を増幅するための配列番号１５及び配列番号１６に記載の配列からなるプライマー対、
（ｊ）stx2遺伝子を増幅するための配列番号１９及び配列番号２０に記載の配列からなるプライマー、
（ｋ）stx1遺伝子を増幅するための配列番号２１及び配列番号２２に記載の配列からなるプライマー対、並びに
（ｌ）aggR遺伝子を増幅するための配列番号２３及び配列番号２４に記載の配列からなるプライマー対、
からなる群より選択されるプライマー対のうち、少なくとも６以上のプライマー対を用いる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸増幅反応において、
（ａ）cadF遺伝子を増幅するための配列番号１及び配列番号２に記載の配列からなるプライマー対、
を用い、さらに、
（ｂ）cpe遺伝子を増幅するための配列番号３及び配列番号４に記載の配列からなるプライマー対、
（ｃ）ipaH遺伝子を増幅するための配列番号５及び配列番号６に記載の配列からなるプライマー対、
（ｅ）eae遺伝子を増幅するための配列番号９及び配列番号１０に記載の配列からなるプライマー対、
（ｆ）tdh遺伝子を増幅するための配列番号１１及び配列番号１２に記載の配列からなるプライマー対、
（ｇ）st1b遺伝子を増幅するための配列番号１３及び配列番号１４に記載の配列からなるプライマー対、
（ｈ）st1a遺伝子を増幅するための配列番号１５及び配列番号１６に記載の配列からなるプライマー対、
（ｊ）stx2遺伝子を増幅するための配列番号１９及び配列番号２０に記載の配列からなるプライマー、
（ｋ）stx1遺伝子を増幅するための配列番号２１及び配列番号２２に記載の配列からなるプライマー対、並びに
（ｌ）aggR遺伝子を増幅するための配列番号２３及び配列番号２４に記載の配列からなるプライマー対、
からなる群より選択されるプライマー対のうち、少なくとも７以上のプライマー対を用いる請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸増幅反応において、
（ａ）cadF遺伝子を増幅するための配列番号１及び配列番号２に記載の配列からなるプライマー対、
を用い、さらに、
（ｂ）cpe遺伝子を増幅するための配列番号３及び配列番号４に記載の配列からなるプライマー対、
（ｃ）ipaH遺伝子を増幅するための配列番号５及び配列番号６に記載の配列からなるプライマー対、
（ｅ）eae遺伝子を増幅するための配列番号９及び配列番号１０に記載の配列からなるプライマー対、
（ｆ）tdh遺伝子を増幅するための配列番号１１及び配列番号１２に記載の配列からなるプライマー対、
（ｇ）st1b遺伝子を増幅するための配列番号１３及び配列番号１４に記載の配列からなるプライマー対、
（ｈ）st1a遺伝子を増幅するための配列番号１５及び配列番号１６に記載の配列からなるプライマー対、
（ｊ）stx2遺伝子を増幅するための配列番号１９及び配列番号２０に記載の配列からなるプライマー、
（ｋ）stx1遺伝子を増幅するための配列番号２１及び配列番号２２に記載の配列からなるプライマー対、並びに
（ｌ）aggR遺伝子を増幅するための配列番号２３及び配列番号２４に記載の配列からなるプライマー対、
からなる群より選択されるプライマー対のうち、少なくとも８以上のプライマー対を用いる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸増幅反応において、
（ａ）cadF遺伝子を増幅するための配列番号１及び配列番号２に記載の配列からなるプライマー対、
を用い、さらに、
（ｂ）cpe遺伝子を増幅するための配列番号３及び配列番号４に記載の配列からなるプライマー対、
（ｃ）ipaH遺伝子を増幅するための配列番号５及び配列番号６に記載の配列からなるプライマー対、
（ｅ）eae遺伝子を増幅するための配列番号９及び配列番号１０に記載の配列からなるプライマー対、
（ｆ）tdh遺伝子を増幅するための配列番号１１及び配列番号１２に記載の配列からなるプライマー対、
（ｇ）st1b遺伝子を増幅するための配列番号１３及び配列番号１４に記載の配列からなるプライマー対、
（ｈ）st1a遺伝子を増幅するための配列番号１５及び配列番号１６に記載の配列からなるプライマー対、
（ｊ）stx2遺伝子を増幅するための配列番号１９及び配列番号２０に記載の配列からなるプライマー、
（ｋ）stx1遺伝子を増幅するための配列番号２１及び配列番号２２に記載の配列からなるプライマー対、並びに
（ｌ）aggR遺伝子を増幅するための配列番号２３及び配列番号２４に記載の配列からなるプライマー対を用いる請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸増幅反応においてさらに、
（ｄ）invA遺伝子を増幅するための配列番号７及び配列番号８に記載の配列からなるプライマー対、及び／又は
（ｉ）lt遺伝子を増幅するための配列番号１７及び配列番号１８に記載の配列からなるプライマー、
を用いる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
核酸増幅反応がシャトルPCRであり、シャトルPCRにおいて試料溶液を(i)９４℃で１分間変性させ、その後、(ii)９４℃で５秒間変性させ(iii)６４℃で４５秒間アニーリング及び伸長させる(ii)及び(iii)からなるサイクルを繰り返す、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
食中毒原因菌を検出するためのキットであって、
食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ａ）cadF遺伝子を増幅するための配列番号１及び配列番号２に記載の配列からなるプライマー対、
を含み、さらに
（ｂ）cpe遺伝子を増幅するための配列番号３及び配列番号４に記載の配列からなるプライマー対、
（ｃ）ipaH遺伝子を増幅するための配列番号５及び配列番号６に記載の配列からなるプライマー対、
（ｅ）eae遺伝子を増幅するための配列番号９及び配列番号１０に記載の配列からなるプライマー対、
（ｆ）tdh遺伝子を増幅するための配列番号１１及び配列番号１２に記載の配列からなるプライマー対、
（ｇ）st1b遺伝子を増幅するための配列番号１３及び配列番号１４に記載の配列からなるプライマー対、
（ｈ）st1a遺伝子を増幅するための配列番号１５及び配列番号１６に記載の配列からなるプライマー対、
（ｊ）stx2遺伝子を増幅するための配列番号１９及び配列番号２０に記載の配列からなるプライマー、
（ｋ）stx1遺伝子を増幅するための配列番号２１及び配列番号２２に記載の配列からなるプライマー対、並びに
（ｌ）aggR遺伝子を増幅するための配列番号２３及び配列番号２４に記載の配列からなるプライマー対、
からなる群より選択されるプライマー対のうち、少なくとも５以上のプライマー対を含む、食中毒原因菌検出用キット。
【請求項９】
（ａ）cadF遺伝子を増幅するための配列番号１及び配列番号２に記載の配列からなるプライマー対、
を含み、さらに
（ｂ）cpe遺伝子を増幅するための配列番号３及び配列番号４に記載の配列からなるプライマー対、
（ｃ）ipaH遺伝子を増幅するための配列番号５及び配列番号６に記載の配列からなるプライマー対、
（ｅ）eae遺伝子を増幅するための配列番号９及び配列番号１０に記載の配列からなるプライマー対、
（ｆ）tdh遺伝子を増幅するための配列番号１１及び配列番号１２に記載の配列からなるプライマー対、
（ｇ）st1b遺伝子を増幅するための配列番号１３及び配列番号１４に記載の配列からなるプライマー対、
（ｈ）st1a遺伝子を増幅するための配列番号１５及び配列番号１６に記載の配列からなるプライマー対、
（ｊ）stx2遺伝子を増幅するための配列番号１９及び配列番号２０に記載の配列からなるプライマー、
（ｋ）stx1遺伝子を増幅するための配列番号２１及び配列番号２２に記載の配列からなるプライマー対、並びに
（ｌ）aggR遺伝子を増幅するための配列番号２３及び配列番号２４に記載の配列からなるプライマー対、
からなる群より選択されるプライマー対のうち、少なくとも６以上のプライマー対を含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
（ａ）cadF遺伝子を増幅するための配列番号１及び配列番号２に記載の配列からなるプライマー対、
を含み、さらに
（ｂ）cpe遺伝子を増幅するための配列番号３及び配列番号４に記載の配列からなるプライマー対、
（ｃ）ipaH遺伝子を増幅するための配列番号５及び配列番号６に記載の配列からなるプライマー対、
（ｅ）eae遺伝子を増幅するための配列番号９及び配列番号１０に記載の配列からなるプライマー対、
（ｆ）tdh遺伝子を増幅するための配列番号１１及び配列番号１２に記載の配列からなるプライマー対、
（ｇ）st1b遺伝子を増幅するための配列番号１３及び配列番号１４に記載の配列からなるプライマー対、
（ｈ）st1a遺伝子を増幅するための配列番号１５及び配列番号１６に記載の配列からなるプライマー対、
（ｊ）stx2遺伝子を増幅するための配列番号１９及び配列番号２０に記載の配列からなるプライマー、
（ｋ）stx1遺伝子を増幅するための配列番号２１及び配列番号２２に記載の配列からなるプライマー対、並びに
（ｌ）aggR遺伝子を増幅するための配列番号２３及び配列番号２４に記載の配列からなるプライマー対、
からなる群より選択されるプライマー対のうち、少なくとも７以上のプライマー対を含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
（ａ）cadF遺伝子を増幅するための配列番号１及び配列番号２に記載の配列からなるプライマー対、
を含み、さらに
（ｂ）cpe遺伝子を増幅するための配列番号３及び配列番号４に記載の配列からなるプライマー対、
（ｃ）ipaH遺伝子を増幅するための配列番号５及び配列番号６に記載の配列からなるプライマー対、
（ｅ）eae遺伝子を増幅するための配列番号９及び配列番号１０に記載の配列からなるプライマー対、
（ｆ）tdh遺伝子を増幅するための配列番号１１及び配列番号１２に記載の配列からなるプライマー対、
（ｇ）st1b遺伝子を増幅するための配列番号１３及び配列番号１４に記載の配列からなるプライマー対、
（ｈ）st1a遺伝子を増幅するための配列番号１５及び配列番号１６に記載の配列からなるプライマー対、
（ｊ）stx2遺伝子を増幅するための配列番号１９及び配列番号２０に記載の配列からなるプライマー、
（ｋ）stx1遺伝子を増幅するための配列番号２１及び配列番号２２に記載の配列からなるプライマー対、並びに
（ｌ）aggR遺伝子を増幅するための配列番号２３及び配列番号２４に記載の配列からなるプライマー対、
からなる群より選択されるプライマー対のうち、少なくとも８以上のプライマー対を含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
（ａ）cadF遺伝子を増幅するための配列番号１及び配列番号２に記載の配列からなるプライマー対、
を含み、さらに
（ｂ）cpe遺伝子を増幅するための配列番号３及び配列番号４に記載の配列からなるプライマー対、
（ｃ）ipaH遺伝子を増幅するための配列番号５及び配列番号６に記載の配列からなるプライマー対、
（ｅ）eae遺伝子を増幅するための配列番号９及び配列番号１０に記載の配列からなるプライマー対、
（ｆ）tdh遺伝子を増幅するための配列番号１１及び配列番号１２に記載の配列からなるプライマー対、
（ｇ）st1b遺伝子を増幅するための配列番号１３及び配列番号１４に記載の配列からなるプライマー対、
（ｈ）st1a遺伝子を増幅するための配列番号１５及び配列番号１６に記載の配列からなるプライマー対、
（ｊ）stx2遺伝子を増幅するための配列番号１９及び配列番号２０に記載の配列からなるプライマー、
（ｋ）stx1遺伝子を増幅するための配列番号２１及び配列番号２２に記載の配列からなるプライマー対、並びに
（ｌ）aggR遺伝子を増幅するための配列番号２３及び配列番号２４に記載の配列からなるプライマー対を含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
さらに
（ｄ）invA遺伝子を増幅するための配列番号７及び配列番号８に記載の配列からなるプライマー対、及び／又は
（ｉ）lt遺伝子を増幅するための配列番号１７及び配列番号１８に記載の配列からなるプライマー、
を含む、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の食中毒原因菌検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食中毒原因菌の検出法、例えば核酸増幅反応を用いた食中毒原因菌の一括検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食中毒原因施設からの患者の発生を最小限に留めるためには、当該施設に対し適切かつ早急な行政対応を行う必要があり、そのために検査法に迅速性が求められている。食中毒事件が発生した際には、行政処分等の対応が行われることにより新たな患者の発生が防止されているが、病因物質や原因食品及び施設の特定には科学的な根拠が必要とされている。一般的に食中毒原因菌の検索には培養操作が必要となるため、通常３〜７日間を要する。また近年、生化学的性状が通常と異なる細菌による食中毒事件が報告されており（非特許文献１、非特許文献２）、原因菌を検出するためには豊富な知識や経験を要する。
【０００３】
2011年には欧州を中心に腸管出血性大腸菌O104による集団食中毒が発生したが、この当時、国内においてはO104の抗血清は入手困難であったため、発生があった場合には抗血清による同定は非常に困難であったと考えられる。このような状況を改善するために遺伝子検査が有効となることがある。生化学的、血清学的特徴が定型でなかった場合であっても、病原性が不変であれば関連遺伝子を検出することが可能と考えられる。
【０００４】
また、遺伝子検査は培養と比較し、結果までに数時間と迅速性が期待されることから、近年複数遺伝子を同時に検出することができるマルチプレックスPCRを用いた検査法の検討がなされている（非特許文献３〜６）。非特許文献５に記載の食中毒起因微生物検出方法では、１つの検体当たり３つの反応液を要する。
【０００５】
大規模で広域的な食中毒事件が発生した場合、原因食品の特定が急務であり、スクリーニング法としてマルチプレックスPCRは有効であるが、このような場合は食品を含む大量の検体に対応でき、広範囲の細菌を検出できる能力が要求される。また、検体搬入即日に結果の判定が可能で、その後の培養操作に反映できる迅速性が望まれる。さらに、日常搬入される全ての検体のスクリーニングで用いる場合については操作性や1検体当たりの経済性も求められる。
【０００６】
非特許文献７にはinvA遺伝子を増幅するためのプライマー対が記載されている。該プライマー対の塩基配列は本願明細書の配列番号７及び配列番号８に相当する。
【０００７】
非特許文献８にはlt遺伝子を増幅するためのプライマー対が記載されている（491頁、表１）。該プライマーLT-1の塩基配列は本願明細書の配列番号１７に相当する。該プライマーLT-2の塩基配列は本願明細書の配列番号１８の１〜２０位の塩基配列に相当する。
【０００８】
非特許文献９には種々の食中毒原因菌が記載されている。食中毒の原因菌として多いのはサルモネラ属菌、カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・コリであり、他にはブドウ球菌、ボツリヌス菌、腸炎ビブリオ、病原大腸菌、他にはウエルシュ菌、セレウス菌、エルシニア・エンテロコリチカ、ナグビブリオ、コレラ菌、赤痢菌、チフス菌、パラチフスＡ菌等が挙げられる（非特許文献９）。
【０００９】
非特許文献１０はcadF遺伝子を用いたカンピロバクター・ジェジュニ及びカンピロバクター・コリの同定法を記載している。同文献は専らカンピロバクター属細菌の同定が目的であり、カンピロバクター・ジェジュニとカンピロバクター・コリとを鑑別することには主眼が置かれていない。
【００１０】
非特許文献１１はリアルタイムPCR法による食中毒原因菌のスクリーニング法を記載している。
【００１１】
非特許文献１２は食中毒原因菌の24標的遺伝子を一斉検出するためのMultiplexリアルタイムSYBR Green PCR法を記載している。この方法では１検体の検査には８つの反応液が必要とされる。
【００１２】
非特許文献１３はリアルタイムPCR法における蛍光消光現象を利用した蛍光マルチプレックスPCR法による細菌性嘔吐毒関連遺伝子の同時検出および識別を記載している。開示されている方法は、一般的な食中毒原因菌の一部のみを同定するものである。検出時間は４〜５時間程度であり、反応液当たりの検出感度は107〜108cfu/反応である。
【００１３】
特許文献１はカンピロバクターのcdtB遺伝子を標的とする検出法を記載している。同文献の手法はリアルタイムPCR法であり、カンピロバクター属細菌のみに着目しており、他の属の食中毒原因菌の記載はない。
【００１４】
このように、現状では1検体当たり複数の反応液が必要となる方法や、高価な試薬・機器を用いる方法、発生する食中毒原因菌のうち一部にしか対応できない方法、判定に1日以上かかってしまう方法等しか提供されていない。迅速性、操作性、経済性、合理性を同時に持ち、上記のような事例に対応できる検出方法はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開２０１０−１３０９０１
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】木村薫ら:下痢症より分離された乳糖分解性サルモネラ菌について, 感染症学雑誌, 62, 123-128(1988)
【非特許文献２】仲西寿男、丸山務監修:食品由来感染症と食品微生物, 中央法規出版, 380-397(2009)
【非特許文献３】Hiroshi Fukushima et al.: Simultaneous screening of 24 target genes of foodborne pathogens in 35 food borne outbreaks using multiplex real-time SYBR green PCR analysis, Int J Microbiol., 18 pages (2010)
【非特許文献４】田栗利紹、野口英太郎、平山文俊:マルチプレックスＰＣＲを用いた食中毒起因細菌一括検出方法, 長崎県衛生公害研究所報, 43-56（2002）
【非特許文献５】重本直樹ら:蛍光RT-multiplex PCR法を用いた食中毒起因微生物の包括的検出, Jpn. J. Food Mi-crobiol., 29(1), 11-17(2012)
【非特許文献６】Jie Liu et al.: Simultaneous Detection of Six Diarr-hea-Causing Bacterial Pathogens with an In-House PCR-Luminex Assay, J. Clin. Microbiol., 50, 98-103(2012)
【非特許文献７】Christine C. Ginocchio et al.: Naturally Occurring Deletions in the Centisome 63 Pathogenicity Island of Environmental Isolates of Salmonella spp., Infect. Immun., 65, 1267-1272(1997)
【非特許文献８】小西典子ら:6種類の毒素原性大腸菌が検出された仕出し弁当を原因とする集団食中毒事例とColony-sweep PCR法を応用した検査法について, 感染症学雑誌, 83, 490-495(2009)
【非特許文献９】厚生労働省:食中毒統計資料 過去の食中毒発生状況http://www.mhlw.go.jp/topics/syokuchu/04.html
【非特許文献１０】Konkel et al. : Identification of the Enteropathogens Campylobacter jejuni and Campylobacter coli basedon the cadF virulence gene andits product, J. Clin.Microbiol., 37, 510-517(1999)
【非特許文献１１】福島博ら:リアルタイムPCR 法による食中毒菌の迅速スクリーニングの検討, 感染症学雑誌, 79, 644-655(2005)
【非特許文献１２】島根保環研所報第50号（2008）食中毒菌の24標的遺伝子を一斉検出するためのMultiplexリアルタイムSYBR Green PCR法
【非特許文献１３】広島県立総合技術研究所保健環境センター研究報告，No. 19， p15-20，2011蛍光消光現象を利用した蛍光マルチプレックスPCR 法による細菌性嘔吐毒関連遺伝子の同時検出および識別。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、上記の問題点に対処可能な食中毒原因菌同定法を提供することを目的とする。例えば本発明は迅速性、操作性、経済性、合理性を同時に備えた食中毒原因菌同定法を提供することを課題とする。
【００１８】
本発明は、1検体当たり1反応液で検査可能であり、発生する食中毒原因菌の大部分に対応でき、かつ短時間で結果判定が可能であるマルチプレックスPCR法を提供することを目的とする。
【００１９】
例えばある実施形態において本発明は(i)大量の検体数（１００検体前後）に対応でき、(ii)細菌性感染型食中毒の原因菌のほとんどを検出でき、(iii)試料搬入当日に結果が判定でき（所要時間２時間程度）、(iv)操作が簡便であり（１検体を１反応液で処理可能）、かつ(v)市販プライマーを用いたPCRと比較して検体当たりのランニングコストが安い、という５つの要件を満たす食中毒原因菌の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者は上記の問題を解決するために鋭意検討した結果、食中毒原因菌の遺伝子を特異的に増幅できるマルチプレックスPCR用プライマーを作製し、多くの臨床分離株を含む食中毒原因菌についてマルチプレックスPCRの評価を行い、複数の食中毒原因菌を同時に検出できることを見出し本発明を完成させた。本発明のプライマーを用いたマルチプレックスPCRは、高い特異性を有し、複数の食中毒原因菌を同時に検出できる。また、本発明の方法は、多数の検体について、一回の操作によって菌種レベルで食中毒原因菌を同定できる。すなわち本発明は、以下の実施形態を提供する。
【００２１】
第１の実施形態において、本発明は、試料中の食中毒原因菌を検出する方法であって、
食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ａ）cadF遺伝子を増幅するための配列番号１及び配列番号２に記載の配列からなるプライマー対、
を用いて試料について核酸増幅反応を行う工程及び増幅産物を確認する工程を含む、試料中の食中毒原因菌を検出する方法を提供する。配列番号１及び配列番号２に記載の配列からなるプライマー対を用いると、カンピロバクターのcadF遺伝子が増幅される。例えば配列番号２５に示すCampylobacter coli JV20 contig00034のcadF遺伝子（391-936位）が増幅され507bpの増幅産物が得られるか、または配列番号２６に示すCampylobacter jejuni subsp. jejuni CG8421 CPSのcadF遺伝子（391-897位）が増幅され546bpの増幅産物が得られる。こうした増幅産物は電気泳動等により確認することができ、これによりカンピロバクター・ジェジュニ及び／又はカンピロバクター・コリを検出できる。本願明細書において増幅産物とは、核酸増幅反応により標的遺伝子が複製される結果生じる核酸をいう。
【００２２】
さらなる実施形態において本発明は、試料中の食中毒原因菌を検出する方法であって、食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ｂ）cpe遺伝子を増幅するための配列番号３及び配列番号４に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、食中毒原因菌を検出する方法を提供する。（b）のプライマー対を使用すると配列番号２７のcpe遺伝子が増幅され378bpの増幅産物が得られる。該増幅産物からウエルシュ菌を検出することができる。
【００２３】
さらなる実施形態において本発明は、試料中の食中毒原因菌を検出する方法であって、食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ｃ）ipaH遺伝子を増幅するための配列番号５及び配列番号６に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、食中毒原因菌を検出する方法を提供する。（c）のプライマー対を使用すると配列番号２８のipaH遺伝子が増幅され332bpの増幅産物が得られる。該増幅産物から赤痢菌及び／又は腸管侵入性大腸菌を検出することができる。
【００２４】
さらなる実施形態において本発明は、試料中の食中毒原因菌を検出する方法であって、食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ｄ）invA遺伝子を増幅するための配列番号７及び配列番号８に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、食中毒原因菌を検出する方法を提供する。（d）のプライマー対を使用すると配列番号２９のinvA遺伝子が増幅され284bpの増幅産物が得られる。該増幅産物からサルモネラ属菌を検出することができる。
【００２５】
さらなる実施形態において本発明は、試料中の食中毒原因菌を検出する方法であって、食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ｅ）eae遺伝子を増幅するための配列番号９及び配列番号１０に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、食中毒原因菌を検出する方法を提供する。（e）のプライマー対を使用すると配列番号３０のeae遺伝子が増幅され252bpの増幅産物が得られる。該増幅産物から腸管病原性大腸菌を検出することができる。
【００２６】
さらなる実施形態において本発明は、試料中の食中毒原因菌を検出する方法であって、食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ｆ）tdh遺伝子を増幅するための配列番号１１及び配列番号１２に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、食中毒原因菌を検出する方法を提供する。（f）のプライマー対を使用すると配列番号３１のtdh遺伝子が増幅され195bpの増幅産物が得られる。該増幅産物から腸炎ビブリオを検出することができる。
【００２７】
さらなる実施形態において本発明は、試料中の食中毒原因菌を検出する方法であって、食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ｇ）st1b遺伝子を増幅するための配列番号１３及び配列番号１４に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、食中毒原因菌を検出する方法を提供する。（g）のプライマー対を使用すると配列番号３２のst1b遺伝子が増幅され169bpの増幅産物が得られる。該増幅産物から腸管毒素原性大腸菌を検出することができる。
【００２８】
さらなる実施形態において本発明は、試料中の食中毒原因菌を検出する方法であって、食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ｈ）st1a遺伝子を増幅するための配列番号１５及び配列番号１６に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、食中毒原因菌を検出する方法を提供する。（h）のプライマー対を使用すると配列番号３３のst1a遺伝子が増幅され150bpの増幅産物が得られる。該増幅産物から腸管毒素原性大腸菌を検出することができる。
【００２９】
さらなる実施形態において本発明は、試料中の食中毒原因菌を検出する方法であって、食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ｉ）lt遺伝子を増幅するための配列番号１７及び配列番号１８に記載の配列からなるプライマー、
を用いる、食中毒原因菌を検出する方法を提供する。（i）のプライマー対を使用すると配列番号３４のlt遺伝子が増幅され132bpの増幅産物が得られる。該増幅産物から毒素原性大腸菌を検出することができる。
【００３０】
さらなる実施形態において本発明は、試料中の食中毒原因菌を検出する方法であって、食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ｊ）stx2遺伝子を増幅するための配列番号１９及び配列番号２０に記載の配列からなるプライマー、
を用いる、食中毒原因菌を検出する方法を提供する。（j）のプライマー対を使用すると配列番号３５のstx2遺伝子が増幅され117bpの増幅産物が得られる。該増幅産物から腸管出血性大腸菌を検出することができる。
【００３１】
さらなる実施形態において本発明は、試料中の食中毒原因菌を検出する方法であって、食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ｋ）stx1遺伝子を増幅するための配列番号２１及び配列番号２２に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、食中毒原因菌を検出する方法を提供する。（k）のプライマー対を使用すると配列番号３６のstx1遺伝子が増幅され100bpの増幅産物が得られる。該増幅産物から腸管出血性大腸菌を検出することができる。
【００３２】
さらなる実施形態において本発明は、試料中の食中毒原因菌を検出する方法であって、食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ｌ）aggR遺伝子を増幅するための配列番号２３及び配列番号２４に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、食中毒原因菌を検出する方法を提供する。（l）のプライマー対を使用すると配列番号３７のaggR遺伝子が増幅され76bpの増幅産物が得られる。該増幅産物から腸管凝集付着性大腸菌を検出することができる。
【００３３】
これらの(a)〜(l)のプライマー対は、単一の対で、又は複数の対を任意に組み合わせて、又は(a)〜(l)の全ての対を組み合わせて同時に、又は逐次的に核酸増幅反応に用いることができる。複数のプライマー対を使用し、同一溶液中でPCRを行う場合、これをマルチプレックスPCRという。増幅産物の有無は電気泳動等により確認することができ、これにより試料から増幅された遺伝子を有する食中毒原因菌を検出することができる。
【００３４】
さらなる実施形態において核酸増幅反応はシャトルPCRとすることができる。またシャトルPCRにおいて試料溶液を(i)９４℃で１分間変性させ、その後、(ii)９４℃で５秒間変性させ(iii)６１℃以上の温度、例えば６１℃、６２℃、６３℃又は６４℃で４５秒間アニーリング及び伸長させる(ii)及び(iii)からなるサイクルを所定の回数、例えば３０回以上、３１回、３２回、３３回、３４回、又は３５回以上繰り返すことができる。これをさらに、その後７２℃にて５分保持することができる。
【００３５】
さらなる実施形態において本発明は、食中毒原因菌を検出する方法に用いるためのキットを提供する。該キットは上記（ａ）〜（ｌ）のプライマー対のいずれか、それらの任意の組合せ、又は全部を含み得る。また場合によりキットは他の試薬や使用説明書を含みうる。
【発明の効果】
【００３６】
本発明のマルチプレックスシャトルPCR法により食中毒原因菌を一括検出することができる。具体的には、食中毒原因菌として頻繁に検出されるカンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni)及びカンピロバクター・コリ(C. coli)、ウエルシュ菌(Clostridium perfringens)、シゲラ属菌(Shigella spp.)、サルモネラ属菌(Salmonella spp.)、ビブリオ・パラヘモリティカス(Vibrio parahaemolyticus)、腸管出血性大腸菌（EHEC）、腸管毒素原性大腸菌（ETEC）、腸管侵入性大腸菌（EIEC）、腸管病原性大腸菌（EPEC）、腸管凝集付着性大腸菌（EAggEC）を一括検出することができる。
【００３７】
ある実施形態において、本発明の方法はシャトルPCRを用いるため検出所要時間は、温度変化が遅い機器を使用し電気泳動を含めても2時間以内に検出が可能であった。
【００３８】
本発明の方法は、特殊で高価な試薬を必要とせず、ある実施形態では1検体当たりの検出にかかる費用は試薬や電気泳動を全て含めて約130円であり、従来法と比較して低価格で効率的に食中毒原因菌を検出同定できる。また、リアルタイムPCRやLAMP法などと比べ高価な機器を導入する必要もない。さらに本発明の方法は多種の食中毒原因菌を一括検出するが、その際の特異度と感度も高く、菌株を用いたある実施形態では感度は99.1%、特異度は100%であった。検出感度は全ての遺伝子が102 CFU/反応以下となった。ある実施形態では、消化器症状事例において糞便からテンプレートDNAを抽出し、本発明の方法と培養結果を比較したところ、感度は83.3%、特異度は96.4%であった。
【００３９】
このように本発明の方法は大規模な食中毒などが発生した際の大量の検体などに用いることができる迅速・安価・簡便な有用なスクリーニング法である。1検体当たりに1反応液を使用するため、複雑な操作も必要としない。本発明の検出方法は臨床検体の検査や、食中毒事例における食品中からの細菌検出に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】PCRプロトコルを示す。左が従来の一般的なPCR法であり、右が本発明のPCR法である。
【図２】PCR増幅産物を示す。図２Ａはアニーリング温度６４℃にて本発明のマルチプレックスシャトルPCR法を行った結果である（本発明）。図２Ｂはアニーリング温度６０℃にてマルチプレックスシャトルPCR法を行った結果である（比較例）。
【図３】cadF遺伝子増幅によるC. jejuni及びC. coliの鑑別を示す。レーン１がC. jejuniでありレーン2がC. coliである。Mはマーカーを表す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
ある実施形態において本発明は試料中の食中毒原因菌の存在の有無を検出する方法を提供する。食中毒原因菌の検出は、食中毒原因菌に汚染された食品の迅速診断、食品加工工程の安全性確認、食中毒発生時における原因菌の同定などに有用である。
【００４２】
ある実施形態において本発明の食中毒原因菌検出方法は、食中毒原因菌のゲノムDNA又はmRNAに特異的に結合可能なプライマー対を使用し、核酸増幅反応を行うことにより試料中の食中毒原因菌を検出するものである。
【００４３】
本願明細書において試料は、生物学的材料を含むあらゆる試料を包含する。試料としては、食品や食品由来試料、動物飼料や飼料由来の試料、糞便、尿、直腸のスワブ、唾液、血液、体液等が挙げられる。試料は、適宜材料を希釈して検査に用いることができる。一例として試料が糞便である場合、これに適当量の試薬を添加してDNAを抽出し、抽出DNAについてPCRを行うことができる。
【００４４】
本発明の検出法を用いることにより、食品中の食中毒原因菌、例えばC.コリ、C.ジェジュニ、ウエルシュ菌、シゲラ属菌、サルモネラ属菌、ビブリオ・パラヘモリティカス、腸管出血性大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、腸管侵入性大腸菌、腸管病原性大腸菌、腸管凝集付着性大腸菌等の存在について、簡便かつ迅速に、菌種毎に知ることができる。
【００４５】
本発明の方法を実施する際は、食中毒原因菌による汚染が疑われる食品等の生物学的試料から周知のポリヌクレオチド調製方法、例えばアルカリ-SDS法やボイル法等によってポリヌクレオチドを調製し、得られたポリヌクレオチドを本発明の被験試料とすることができる。例えば菌株を加熱後、遠心分離した上清をテンプレートDNAとしうる。
【００４６】
本明細書においてポリヌクレオチドとは、複数の塩基または塩基対からなるリボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチド重合体をいう。ポリヌクレオチドは、RNA、一本鎖および二本鎖のDNAを含む。ポリヌクレオチドは、未修飾の天然の状態のもの、及び修飾塩基の両方を包含する。
【００４７】
本願明細書において塩基配列について特異的に結合とは、一方の塩基配列が他方の塩基配列と相補的に塩基対を形成し結合することを言い、ランダムな配列同士の非特異的な結合は除かれる。この場合、一方の塩基配列と他方の塩基配列とは、完全に対形成するよう相補性が一致していると高温でも特異的に結合するが、適当な温度等の条件下で一方の塩基配列と他方の塩基配列とが対形成できるならば配列中に不一致の塩基が一部存在してもよい。例えば配列番号１及び２のプライマーは、それぞれカンピロバクター・コリのcadF遺伝子（配列番号２５）の配列と不一致の塩基を１又は２つ有するが、Tm値は59.8℃及び61℃であり、これと特異的に結合しうる。また配列番号２のプライマーはカンピロバクター・ジェジュニのcadF遺伝子（配列番号２６）と不一致の塩基を１つ有するが、Tm値が61℃であり、これと特異的に結合しうる。
【００４８】
本願明細書において遺伝子とは、生物またはウイルスのゲノムの遺伝情報をコードする塩基配列からなる核酸をいう。遺伝子は狭義には構造遺伝子をさすが、本願明細書中では一部の実施形態においては非コード領域や、認識配列をも包含することがある。本発明のマルチプレックスシャトルPCR法は、Campylobacter coliのcadF遺伝子（配列番号２５）、Campylobacter jejuni subsp. jejuniのcadF遺伝子（配列番号２６）、Clostridium perfringensのcpe遺伝子（配列番号２７）、Shigella flexneriのipaH遺伝子（配列番号２８）、Salmonella entericaのinvA遺伝子（配列番号２９）、大腸菌のeae遺伝子（配列番号３０）、Vibrio parahaemolyticusのtdh遺伝子（配列番号３１）、大腸菌のSt1b遺伝子（配列番号３２）、大腸菌のST1a遺伝子（配列番号３３）、大腸菌のLT遺伝子（配列番号３４）、大腸菌のstr2遺伝子（配列番号３５）、大腸菌のstx1遺伝子（配列番号３６）、及び大腸菌のaggR遺伝子（配列番号３７）等の遺伝子を増幅しうる。また、これらの他に、さらなる遺伝子を増幅してもよい。本発明では、目的遺伝子を検出するために、当該遺伝子を標的とするプライマーを使用できるほか、当該遺伝子に対応するmRNAを標的とするプライマーを使用してもよい。ある遺伝子に対応するmRNAとは、ゲノムにコードされる遺伝子が転写されたmRNA産物をいう。ゲノム中の遺伝子の塩基配列が特定されていれば、当業者は適宜、これに対応するmRNAを標的とするプライマーを設計することができる。
【００４９】
本発明の検出方法では、目的遺伝子を増幅するために、当該遺伝子に特異的なプライマーを用いる。プライマーとしては特に断らない限り、目的遺伝子のある領域を挟んで5'側及び3'側から伸長するよう設計されたプライマー対を用いる。増幅されるのは全長遺伝子であっても、その一部の領域であってもよい。プライマーとしては、上記のcadFやcpe遺伝子等を増幅するものが挙げられる。設計したプライマーはBasic Local Alignment Search Tool（BLAST）といった支援ツールを用いて融点や特異性を確認することができる。本発明のプライマーとしては、例えば配列番号１〜２４の塩基配列を有するプライマーが挙げられる。本発明の検出方法に用いるプライマーはこれらに限定されず、同じ遺伝子の一部又は全部を増幅し、類似の長さの増幅産物を生じ、類似のTm温度を有するものであれば、塩基配列が前後したり、一部にミスマッチ、置換、付加塩基を有するものであってもよい。またプライマーは検出のため、適宜標識化することができる。標識としては蛍光物質、放射性同位元素、酵素活性物質等が挙げられる。
【００５０】
本発明の方法は、（a）〜（l）のプライマー対を別々に用いてもよいが、単一の核酸増幅反応において（a）〜（l）のプライマー対の一部又は全部を適当に組み合わせて同時に使用することもできる。複数のプライマーを単一反応に使用する手法を、マルチプレックスPCR法という。また変性ステップ、アニーリングステップ、伸長ステップを通常３段階で行うところを、変性ステップ及びアニーリングと伸長を兼ねたステップからなる２段階でPCRを行う手法をシャトルPCR法という。これらを組み合わせた方法をマルチプレックスシャトルPCR法という。本発明の食中毒原因菌の検出同定方法は、核酸増幅反応工程を含み、好ましくはマルチプレックスPCR法、さらに好ましくはマルチプレックスシャトルPCR法を用いる。本発明の方法ではPCRによる増幅産物を電気泳動し、増幅産物のバンドのサイズを観察することで複数の菌種を同時に鑑別することができる。本発明における核酸増幅方法は、目的産物が得られる限りどのような手法を用いてもよい。例えば本発明の核酸増幅方法はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いることができる。
【００５１】
ある実施形態において本発明の核酸増幅反応はシャトルPCR法により行う。シャトルPCR法の条件は、増幅産物が特異的に得られるよう適当に設定することができる。一例として本発明のPCR法の条件は、試料溶液を９４℃で１分、次いで９４℃で５秒、次いで６４℃で４５秒にて伸長させるサイクルを所定の回数繰り返し、その後７２℃にて５分保持する、というものであり得る。ここでアニーリングと伸長を兼ねたステップ（以下、本願明細書においてアニーリング・伸長ステップということがある）は、温度に敏感であり、６４℃以上であれば非特異的バンドの出現を防止できるが、６０℃で行うと非特異的増幅産物が生じる場合がある。したがって本発明のシャトルPCR法は６４℃以上、６３℃以上、６２℃以上、又は６１℃以上で行うことが望ましい。ある実施形態において本発明のシャトルPCR法のアニーリング・伸長ステップは温度が６０℃以下ではない。サイクル数は増幅産物が確認できればよく、例えば２０回以上、２５回以上、３０回以上、例えば３１回、３２回、３３回、３４回、３５回、３６回、３７回、３８回、３９回、４０回等とすることができる。サイクル数は試薬中の標的遺伝子または標的微生物の存在量に応じて適宜変更することができる。逆にサイクル数を一定とし、試薬を順次希釈した系列を用意することもできる。
【００５２】
本願明細書において検出とは、遺伝子について用いる場合、ある試料中に目的の遺伝子が存在するか否かを決定することをいう。また検出とは、微生物について用いる場合、ある試料中に当該微生物が存在するか否かを決定することをいい、定性的又は定量的な検出があり得る。本願明細書において同定とは、ある試料中に存在する遺伝子又は微生物の種類を特定することをいう。
【００５３】
本発明の方法は、１検体を１反応液で検査できるため、１回の検査で大量の検体を処理できる。これは大規模な食中毒事件を処理する場合や、原因特定のために汚染の疑われる食品試料が一度に多く持ち込まれる場合などに特に有利である。本発明の方法では、例えば96ウェルプレートを用いる場合、コントロール（陽性対照）とブランク（陰性対照）を除き94検体が１プレートで検査可能である。
【００５４】
本発明の方法は病原遺伝子を標的遺伝子とし、１菌種に複数存在する場合は保有率が高く、病原性に深く関わっている遺伝子を標的とする。カンピロバクター属については増幅産物のサイズからC. jejuniとC. coliの鑑別ができるような遺伝子を標的とする。これにより本発明の方法は複数の食中毒原因菌、例えば１１種又は１２種の食中毒原因菌の検出について、高い感度と特異度を実現した。食中毒原因菌の検出について感度が高い、とは試料中に存在する標的微生物が少なくても検出できることをいい、100〜106 cfu/反応、例えば100〜105 cfu/反応、100〜104 cfu/反応、100〜103cfu/反応又は100〜102 cfu/反応の検出感度が挙げられる。例えばある実施形態においてアニーリング・伸長反応を64℃にて行うと、全ての遺伝子は102 CFU/反応以下となる。試料当たりのテンプレートDNA添加量が1.25μLあれば、最も検出感度が低い遺伝子であっても8×104 CFU/mL以上のテンプレートDNAは検出可能である。一般に急性期の食中毒患者の糞便中には106 CFU/g以上の食中毒原因菌が排出されることが多いため（非特許文献１１）、最も検出感度が低い遺伝子であっても検出可能となる。また、本願明細書において食中毒原因菌の検出について特異度が高い、とは、ある検査について陰性の検体を正しく陰性と判定する確率が高いことをいう。
【００５５】
ある実施形態において本発明は、上記の食中毒原因菌の検出に用いるためのキットを提供する。該キットを用い、試料について核酸増幅反応、例えばマルチプレックスシャトルPCR法を行うことにより、試料中の食中毒の原因菌を高感度にて特異的に検出することができる。本発明のキットは、
（a）配列番号１及び配列番号２に記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるcadF遺伝子、または前記遺伝子に対応するmRNAを増幅しうるプライマー対、
（b）配列番号３及び配列番号４に記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるcpe遺伝子、又は前記遺伝子に対応するmRNAを増幅しうるプライマー対、
（c）配列番号５及び配列番号６に記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるipaH遺伝子、又は前記遺伝子に対応するmRNAを増幅しうるプライマー対、
（d）配列番号７及び配列番号８に記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるinvA遺伝子、又は前記遺伝子に対応するmRNAを増幅しうるプライマー対、
（e）配列番号９及び配列番号１０に記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるeae遺伝子、又は前記遺伝子に対応するmRNAを増幅しうるプライマー対、
（f）配列番号１１及び配列番号１２に記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるtdh遺伝子、又は前記遺伝子に対応するmRNAを増幅しうるプライマー対、
（g）配列番号１３及び配列番号１４に記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるst1b遺伝子、又は前記遺伝子に対応するmRNAを増幅しうるプライマー対、
（h）配列番号１５及び配列番号１６に記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるst1a遺伝子、又は前記遺伝子に対応するmRNAを増幅しうるプライマー対、
（i）配列番号１７及び配列番号１８に記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるlt遺伝子、又は前記遺伝子に対応するmRNAを増幅しうるプライマー対、
（j）配列番号１９及び配列番号２０に記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるstx2遺伝子、又は前記遺伝子に対応するmRNAを増幅しうるプライマー対、
（k）配列番号２１及び配列番号２２に記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるstx1遺伝子、又は前記遺伝子に対応するmRNAを増幅しうるプライマー対、及び
（l）配列番号２３及び配列番号２４に記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるaggR遺伝子、又は前記遺伝子に対応するmRNAを増幅しうるプライマー対のいずれか、それらの任意の組合せ、又は全てを含みうる。キットは、本発明のプライマー対の他、使用説明書を含み得る。本発明のキットはさらに、蛍光プローブ、インターカレーター、ポリヌクレオチド調製用試薬、陽性又は陰性プライマー対等を含み得る。陽性プライマーは、公知のデータベースから取得した塩基配列情報などから適宜設計することができる。陰性プライマーは、標的遺伝子のいずれとも無関係のランダムな配列とすることができる。本発明の方法及びキットは、さらに黄色ブドウ球菌及びセレウス菌を検出するための手段（プライマー対等）をさらに含みうる。
本明細書に引用した全ての文献は、参照により本明細書に組み入れるものとする。
【実施例】
【００５６】
以下の実施例は、例示のみを意図したものであり、何ら本発明の技術的範囲を限定することを意図するものではない。特に断らない限り、試薬は、市販されているか、又は当技術分野で慣用の手法、公知文献の手順に従って入手又は調製する。
【００５７】
材料及び方法
１  使用菌株とテンプレート調整
本実施例で検出の対象とした細菌はCampylobacter jejuni及びC. coli、Clostridium perfringens、Shigella spp.、Salmonella spp.、Vibrio parahaemolyticus、腸管出血性大腸菌（EHEC）、腸管毒素原性大腸菌（ETEC）、腸管侵入性大腸菌（EIEC）、腸管病原性大腸菌（EPEC）、腸管凝集付着性大腸菌（EAEC）である。使用菌株は臨床分離株である場合については、同一事例由来で1菌株、または血清型や遺伝子型が異なる株とした（表１）。菌株の一部は山梨県食肉衛生検査所から分与されたものである。使用した培地はC. jejuni及びC. coliはCCDA（Oxoid）培地、Clostridium perfringensはCW寒天培地（ニッスイ）、Shigella spp.及びSalmonella spp. はSS寒天培地（栄研化学）、Vibrio parahaemolyticusはTCBS寒天培地（ニッスイ）、EHEC、ETEC、EIEC、EPEC、EAECはマッコンキー寒天培地（ニッスイ）であった。培養した菌株を滅菌精製水100μLに浮遊させ、100℃、10分間加熱し、10,000rpm、5分間遠心した上清をテンプレートDNAとした。
【００５８】
【表１−１】
0005884108.tif 000002
【００５９】
【表１−２】
0005884108.tif 000003
【００６０】
【表１−３】
0005884108.tif 000004
【００６１】
２  プライマーの設計
使用したプライマー及び標的遺伝子を表２に示す。プライマーは、上から順に配列番号１〜２４である。配列番号１〜６、９〜１６、１９〜２４の配列を有するプライマーは本発明において新規に設計したものである。配列番号７及び８のプライマーは非特許文献７に記載されているものを使用した。配列番号１７のプライマーは非特許文献８に記載のものを使用した。配列番号１８のプライマーは非特許文献８に記載の配列を延長したものである。設計したプライマーはBasic Local Alignment Search Tool（BLAST）を用いて特異性を確認した。Tm値（℃）は試薬メーカーの添付文書を参照した。プライマーはHQ-PCRグレード（TaKaRa）を用いた。TEバッファー（Wako）で100μMとなるよう調整し、−30℃で保存した。
【００６２】
【表２】
0005884108.tif 000005
【００６３】
３  設計プライマーの感度・特異度の検討
全ての使用プライマーを混合し、1反応液中で表1の菌株を用いたマルチプレックスPCRを行った。反応試薬はMultiplex PCR Assay Kit（TaKaRa）を用いた。1反応当たりMultiplex PCR Mix 1を6.25 μL 、Multiplex PCR Mix 2を0.0625 μL、プライマーを表２の濃度となるよう添加し、テンプレートDNAを1.25 μL 加え、滅菌精製水で全量を12.5μLとした。PCR装置はPerkin Elmer cetus DNA Thermal Cycler 480を用いた。反応条件は検討の結果2ステップのシャトルPCRとした（図1）。増幅産物を3%アガロースゲル（TaKaRa）で100V、30分間電気泳動し、増幅産物の大きさにより判定を行った。C. jejuni及びC. coli、Shigella spp.、Salmonella spp.については全ての菌株が遺伝子を保有しているものとし、それ以外については市販プライマーまたは既に反応性が確立されているプライマー（既存プライマー）を用いて結果を比較することにより感度・特異度を算出した。
【００６４】
４  検出感度の測定
使用菌株のうち各々の遺伝子保有株の任意の菌株をBrain Heart Infusion（BHI:Oxoid）ブロスで3〜5時間培養し、希釈した菌液をTryptone Soya Agar（TSA:Oxoid）で一夜培養し、菌数を算出した。カンピロバクターについては7％馬血液含有BHIで一夜培養後、CCDA選択サプリメント不含CCDA培地で菌数を算出した。この菌液を用いて100、101、102、103 CFU/反応におけるmultiplex PCRを行い、検出感度を測定した。
【００６５】
５  消化器症状事例におけるマルチプレックスPCRのスクリーニング法としての感度・特異度の検討
山梨県内において2012年3月〜2013年6月までに消化器症状を呈した患者及び、調理従事者等の健常者の糞便72検体（9事例）を対象とし、培養結果と本発明の方法の比較を行った。糞便の培養は前述の培地で行った。糞便からのDNA抽出はアルカリ熱溶菌法により行った。即ち、約10倍乳剤の糞便を100μL採取し、10,000 rpmで5分間遠心後、上清を取り除き、50 mMのNaOH （Wako）85μLで懸濁した。100℃で10分間加熱し、1M Tris-HCl（pH 7.5 : Wako）15μLで中和後、10,000 rpmで5分間遠心し、上清をテンプレートDNAとした。
【００６６】
結果
１  設計プライマーの感度・特異度
各菌株を用いたマルチプレックスPCRの結果、各遺伝子の増幅産物は明瞭に区別することができた（図２Ａ）。図２ＡおよびＢにおいて、各レーンは次のとおりである。1:cadF (jejuni)、2:cpe、3:ipaH、4:invA、5:eae、6:tdh、7:st1b、8:st1a、9:lt、10:stx2、11:stx1及び12:aggR。図２Ａはアニーリング・伸長ステップの温度を６４℃として本発明のマルチプレックスシャトルPCR法を行った結果であり、非特異的バンドが出現することなく、各菌株が特異的に識別できた。図２Ｂはアニーリング・伸長ステップの温度を６０℃としてシャトルPCRを行った比較例であり、レーン５、７、９、１２に非特異的バンドが見られた。他の条件は図２Ａの場合と同様であった。
【００６７】
カンピロバクター属のcadF遺伝子についてはさらに１５分の電気泳動を行ったところ、カンピロバクター・ジェジュニ(C. jejuni)とカンピロバクター・コリ(C. coli)を鑑別することができた（図３）。レーン1がC. jejuniでありレーン2がC. coliである。
【００６８】
健常者由来のC. coli 1株と、2株のEHEC O111:HNMのeae遺伝子以外は全て検出または、既プライマーと同一の結果であり、感度は99.1 %であった。また、非特異反応は確認されなかったため、特異度は100%であった。1検体当たりの試薬にかかる費用は電気泳動まで含めて約130円であり、PCRは約75分で完了した。
【００６９】
２  検出感度の測定
12種の遺伝子の検出感度はipaHが1 CFU/反応と最も検出感度が高く、invA、eae、tdh、lt、st1a、st1b、stx1、stx2は10 CFU/反応であり、cadF、cpe、aggRは102 CFU/反応であった。
本発明の方法の既存プライマーと比較した感度及び特異度を表３に示す。
【００７０】
【表３】
0005884108.tif 000006
【００７１】
３  消化器症状事例におけるマルチプレックスPCRのスクリーニング法としての感度・特異度の検討
消化器症状事例において糞便からテンプレートDNAを抽出し、マルチプレックスPCRを行い、培養結果との比較を行ったところ、感度は83.3%、特異度は96.4%であった（表４）。検出された遺伝子はcadF、cpe、eae、stx1、aggRの5種であった。カンピロバクターが培養陽性となった2検体でcadFが陰性となり、cadFが陽性となった2検体でカンピロバクターが培養陰性となった。また、EHEC O103が培養陽性となった検体でeaeを検出することができなかった（表５）。下記表４に消化器症状事例由来糞便を用いた培養と比較した本発明の方法の感度・特異度を示す。また表５に消化器症状事例由来糞便の培養及び本発明の方法の結果を示す。
【００７２】
【表４】
0005884108.tif 000007
【００７３】
【表５】
0005884108.tif 000008
【００７４】
本発明の方法で検出対象とした11種の細菌は厚生労働省の統計によると、国内で過去10年間に発生した細菌性食中毒の原因の約90%を占めている。標的遺伝子は病原遺伝子とし、1菌種に複数存在する場合は保有率が高く、病原性に深く関わっているものを選択した。また、カンピロバクターについては増幅産物のサイズからC. jejuniとC. coliの鑑別ができるような遺伝子とした。
【００７５】
使用プライマーは特異性の確保とシャトルPCRの導入を考え、3つの条件（1. Tm値が概ね60℃以上、2. 鎖長が25から30塩基程度、3. 増幅産物が区別可能な大きさ）を満たすものとした。プライマー対(d)と(i)を除き、全てのプライマー対は本発明において独自に設計したものである。12対のプライマーは少なくとも66℃まではアニーリング可能であったことから、反応時間の短縮と特異性の向上を目的にシャトルPCRとした（図1）。
表1の菌株を用いたマルチプレックスPCRの結果、感度・特異度ともに良好であった（表４）。
【００７６】
本発明の方法の検出感度はアニーリング・伸長反応を64℃に下げて行うことにより、全ての遺伝子が102 CFU/反応以下となった。1反応チューブ当たりのテンプレートDNA添加量は1.25μLであるため、最も検出感度が低い遺伝子であっても8×104 CFU/mL以上のテンプレートDNAであれば検出が可能である。一般に急性期の患者糞便中には106 CFU/g以上の原因菌が排出されることが多いため（非特許文献１１）、最も検出感度が低い遺伝子であっても検出が可能であると考えられる。
【００７７】
消化器症状事例における本発明の方法の有用性を糞便からDNAを抽出し確認したところ、菌株を用いた結果と比較し、若干の感度・特異度の低下が見られたものの、概ね同様の結果が得られた（表４）。感度低下の原因としては検体の不適切な保存が考えられる。培養からカンピロバクターが3検体陽性になった事例において、先に搬入のあった1検体はcadF陽性が確認されたが、その後搬入があり3日間、20℃程度の室温で保存していた2検体は陰性となった。この際、陽性となっていた1検体についても同条件下で保存していたが、再度確認したところ陰性となった。このことから、検体の保存温度は本発明の方法の結果に影響を与えることが考えられる。また、特異度が低下した原因として死菌由来遺伝子の検出が考えられる。カンピロバクターが原因となった食中毒事例の患者糞便1検体からcadFが検出されたが、培養結果は非病原菌を含む全ての細菌が陰性であった。この検体は抗菌薬を投与後採取されたものであったこと、既存プライマーにおいてもカンピロバクター由来の増幅産物が確認されていることから、死菌由来の遺伝子を検出したことが考えられた。同様の検体は他にも1検体確認されている（表５）。これらの結果は過去に感染があり、抗菌薬の投与により通常培養で分離できない検体であっても、PCRにより検出することができる一例である。多くの患者が抗菌薬服用後であり、患者検体が限られる事例などにおいては、このような結果は補助的な情報として有用であると考えられる。
【００７８】
本発明の方法は迅速・安価・簡便なスクリーニング法として開発された。シャトルPCRを用いたため、検出所要時間は温度変化が遅い初期の機器を使用した場合で、電気泳動を含めても2時間以内に検出が可能であった。最新の機器を使用すればさらなる迅速性が期待される。1検体当たりの費用についても特殊で高価な試薬を必要としないため、前述のとおり試薬費が約130円/検体と安価である。また、リアルタイムPCRやLAMP法などと比べ高価な機器を導入する必要もない。1検体当たりに1反応液を使用するため、複雑な操作も必要としない。これらのことから本発明の方法は日常搬入される全ての検体から大規模な食中毒などが発生した際の大量の検体まで用いることができる迅速・安価・簡便な有用なスクリーニング法であると考えられる。本発明の検出方法は臨床検体の検査や、食中毒事例における食品中からの細菌検出に用いることができる。
【００７９】
本発明の食中毒原因菌の検出方法は、(I)大量の検体数に対応できる、(II)細菌性感染型食中毒の原因菌のほとんどを検出できる、(III)試料搬入当日に結果が判定できる、(IV)操作が簡便である、(V)１検体当たりのランニングコストが安いという５つの要件を同時に満たすために開発された。
【００８０】
本発明の方法は従来法と比較して迅速・安価・簡便で大量の検体を同時に処理可能である。ここでは従来法の例として非特許文献１２、非特許文献４、非特許文献１３及び非特許文献５に記載の方法に言及し、本発明をこれらと比較して説明する。例えば(I)機器１台当たりの処理検体数（９６ウェルプレートの場合）に着目すると非特許文献１３に記載の方法は本発明と同様９４検体を処理可能であるが、非特許文献１３に記載の方法では検出遺伝子数は６と少なく、(II)発生する食中毒原因菌の約10%程度に対応するのみである。非特許文献１２、非特許文献４及び非特許文献５に記載の方法は機器１台当たりの処理検体数が、それぞれ７、１１及び３０である。(III)検出時間に着目すると非特許文献１２に記載の方法及び非特許文献４に記載の方法は２時間程度で結果がでるが、非特許文献１２に記載の方法も非特許文献４に記載の方法も(I)処理できる検体数が少なく、試薬費を市販試薬の価格や使用量から推定すると(V)１検体当たりのコストも本発明のそれより高い。非特許文献１３及び非特許文献５に記載の方法の検出時間はPCRのみでも、それぞれ4〜5時間及び3.5〜4.5時間を要する。これに対して本発明の方法はPCR反応に1〜1.25時間を要するのみである。(IV)１検体に必要な反応液については、本発明の方法は１反応液で１検体を検査できる。非特許文献１３に記載の方法も同様であるが、非特許文献１３に記載の方法は検出感度が107〜108cfu/反応と低い。一般に急性期の患者糞便中には106 CFU/g以上の原因菌が排出されるが、DNA抽出のための希釈等により、検査チューブには102〜103cfu程度の原因菌に相当するDNAが存在することとなる。そのため、非特許文献１３に記載の方法は感度が糞便からのDNA抽出サンプルの検査には不向きである。非特許文献１２、非特許文献４及び非特許文献５に記載の方法は、１検体に必要な反応液が、それぞれ、８、７、及び３反応液である。(IV)操作の簡便性については、本発明の方法はリアルタイムPCRを必要とせず、１検体に必要な反応液も少ない。非特許文献１２に記載の方法はリアルタイムPCRを必要とする。また非特許文献４及び非特許文献５に記載の方法は１検体に必要な反応液が、それぞれ７及び３である。(V)検体当たりのコストに着目すると、試薬費を市販試薬の価格や使用量から推定すると本発明の方法は従来法（例えば非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献４、非特許文献１３及び非特許文献５に記載の方法）より有意に低コストで検査が可能である。このように本発明の検出方法はこうした(I)〜(V)の望ましい性質を全て備えている。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明のプライマーによるマルチプレックスシャトルPCR法を用いることにより、食中毒原因菌を一括検出することができる。本発明の方法は迅速かつ簡便に、そして安価に、かつ高い特異性で多種の食中毒原因菌を一括検出できる。
[１]  試料中の食中毒原因菌を検出する方法であって、
食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ａ）cadF遺伝子を増幅するための配列番号１及び配列番号２に記載の配列からなるプライマー対、
を用いて試料について核酸増幅反応を行う工程及び増幅産物を確認する工程を含む、試料中の食中毒原因菌を検出する方法。   
[２]  前記核酸増幅反応においてさらに、
（ｂ）cpe遺伝子を増幅するための配列番号３及び配列番号４に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる１に記載の方法。   
[３]  前記核酸増幅反応においてさらに、
（ｃ）ipaH遺伝子を増幅するための配列番号５及び配列番号６に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、１または２に記載の方法。   
[４]  前記核酸増幅反応においてさらに、
（ｅ）eae遺伝子を増幅するための配列番号９及び配列番号１０に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、１〜３のいずれか１項に記載の方法。   
[５]  前記核酸増幅反応においてさらに、
（ｆ）tdh遺伝子を増幅するための配列番号１１及び配列番号１２に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、１〜４のいずれか１項に記載の方法。   
[６]  前記核酸増幅反応においてさらに、
（ｇ）st1b遺伝子を増幅するための配列番号１３及び配列番号１４に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、１〜５のいずれか１項に記載の方法。   
[７]  前記核酸増幅反応においてさらに、
（ｈ）st1a遺伝子を増幅するための配列番号１５及び配列番号１６に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、１〜６のいずれか１項に記載の方法。   
[８]  前記核酸増幅反応においてさらに、
（ｊ）stx2遺伝子を増幅するための配列番号１９及び配列番号２０に記載の配列からなるプライマー、
を用いる、１〜７のいずれか１項に記載の方法。   
[９]  前記核酸増幅反応においてさらに、
（ｋ）stx1遺伝子を増幅するための配列番号２１及び配列番号２２に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、１〜８のいずれか１項に記載の方法。   
[１０]  前記核酸増幅反応においてさらに、
（ｌ）aggR遺伝子を増幅するための配列番号２３及び配列番号２４に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、１〜９のいずれか１項に記載の方法。   
[１１]  前記核酸増幅反応においてさらに、
（ｄ）invA遺伝子を増幅するための配列番号７及び配列番号８に記載の配列からなるプライマー対、及び／又は
（ｉ）lt遺伝子を増幅するための配列番号１７及び配列番号１８に記載の配列からなるプライマー、
を用いる、１〜１０のいずれか１項に記載の方法。   
[１２]  核酸増幅反応がシャトルPCRであり、シャトルPCRにおいて試料溶液を(i)９４℃で１分間変性させ、その後、(ii)９４℃で５秒間変性させ(iii)６４℃で４５秒間アニーリング及び伸長させる(ii)及び(iii)からなるサイクルを繰り返す、１〜１１のいずれか１項に記載の方法。   
[１３]  食中毒原因菌を検出するためのキットであって、
食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ａ）cadF遺伝子を増幅するための配列番号１及び配列番号２に記載の配列からなるプライマー対、
を含む、食中毒原因菌検出用キット。   
[１４]  さらに、
（ｂ）cpe遺伝子を増幅するための配列番号３及び配列番号４に記載の配列からなるプライマー対、
を含む、１３に記載のキット。   
[１５]  さらに、
（ｃ）ipaH遺伝子を増幅するための配列番号５及び配列番号６に記載の配列からなるプライマー対、
を含む、１３または１４に記載のキット。   
[１６]  さらに、
（ｅ）eae遺伝子を増幅するための配列番号９及び配列番号１０に記載の配列からなるプライマー対、
を含む、１３〜１５のいずれか１項に記載のキット。   
[１７]  さらに、
（ｆ）tdh遺伝子を増幅するための配列番号１１及び配列番号１２に記載の配列からなるプライマー対、
を含む、１３〜１６のいずれか１項に記載のキット。   
[１８]  さらに、
（ｇ）st1b遺伝子を増幅するための配列番号１３及び配列番号１４に記載の配列からなるプライマー対、
を含む、１３〜１７のいずれか１項に記載のキット。   
[１９]  さらに、
（ｈ）st1a遺伝子を増幅するための配列番号１５及び配列番号１６に記載の配列からなるプライマー対、
を含む、１３〜１８のいずれか１項に記載のキット。   
[２０]  さらに、
（ｊ）stx2遺伝子を増幅するための配列番号１９及び配列番号２０に記載の配列からなるプライマー、
を含む、１３〜１９のいずれか１項に記載のキット。   
[２１]  さらに、
（ｋ）stx1遺伝子を増幅するための配列番号２１及び配列番号２２に記載の配列からなるプライマー対、
を含む、１３〜２０のいずれか１項に記載のキット。   
[２２]  さらに、
（ｌ）aggR遺伝子を増幅するための配列番号２３及び配列番号２４に記載の配列からなるプライマー対、
を含む、１３〜２１のいずれか１項に記載のキット。   
[２３]  さらに
（ｄ）invA遺伝子を増幅するための配列番号７及び配列番号８に記載の配列からなるプライマー対、及び／又は
（ｉ）lt遺伝子を増幅するための配列番号１７及び配列番号１８に記載の配列からなるプライマー、
を含む、１３〜２２のいずれか１項に記載の食中毒原因菌検出用キット。
【配列表フリーテキスト】
【００８２】
配列番号１  cadF遺伝子用フォワードプライマーcadF-F
配列番号２  cadF遺伝子用リバースプライマーcadF-R
配列番号３  cpe遺伝子用フォワードプライマーcpe-F
配列番号４  cpe遺伝子用リバースプライマーcpe-R
配列番号５  ipaH遺伝子用フォワードプライマーipaH-F
配列番号６  ipaH遺伝子用リバースプライマーipaH-R 
配列番号７  invA遺伝子用フォワードプライマーinvA-F
配列番号８  invA遺伝子用リバースプライマーinvA-R
配列番号９  eae遺伝子用フォワードプライマーeaeA-F
配列番号１０  eae遺伝子用リバースプライマーeaeA-R
配列番号１１  tdh遺伝子用フォワードプライマーtdh-F
配列番号１２  tdh遺伝子用リバースプライマーtdh-R
配列番号１３  st1b遺伝子用フォワードプライマーST1b-F
配列番号１４  st1b遺伝子用リバースプライマーST1b-R
配列番号１５  st1a遺伝子用フォワードプライマーST1a-F
配列番号１６  st1a遺伝子用リバースプライマーST1a-R
配列番号１７  lt遺伝子用フォワードプライマーLT-F
配列番号１８  lt遺伝子用リバースプライマーLT-R
配列番号１９  stx2(VT2)遺伝子用フォワードプライマーVT2-F
配列番号２０  stx2(VT2)遺伝子用リバースプライマーVT2-R
配列番号２１  stx1(VT1)遺伝子用フォワードプライマーVT1-F
配列番号２２  stx1(VT1)遺伝子用リバースプライマーVT1-R
配列番号２３  aggR遺伝子用フォワードプライマーaggR-F
配列番号２４  aggR遺伝子用リバースプライマーaggR-R
配列番号２５  Campylobacter coli JV20 contig00034 cadF
配列番号２６  Campylobacter jejuni subsp. jejuni CG8421 CPS cadF
配列番号２７  Clostridium perfringens SM101, complete genome cpe
配列番号２８  Shigella flexneri invasion plasmid antigen H (ipaH)
配列番号２９  Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium DT104 main chromosome, complete genome invA
配列番号３０  Escherichia coli O55:H7 eae
配列番号３１  Vibrio parahaemolyticus thermostable direct hemolysin(tdh)
配列番号３２  Escherichia coli ETEC heat-stable enterotoxin (St1b)
配列番号３３  ETEC H10407 plasmid pEntH10407 (ST1a)
配列番号３４  heat-labile enterotoxin (LT) 
配列番号３５  Escherichia coli O157:H7 str. Sakai VT2 subunit B
配列番号３６  Escherichia coli O157:H7 sakai VT1 subunitA precursor
配列番号３７  Escherichia coli 55989 aggR
【図１】
0005884108.tif 000009
【図２】
0005884108.tif 000010
【図３】
0005884108.tif 000011
【配列表】
0005884108000001.app