(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１６で示されるペプチド以外の、下式（Ｉ）：
【化１６】
0006027094.tif 000021
［式中、
−  Ｎｔは、０〜１０アミノ酸長を有するペプチドから成り、
−  Ｃｔは、０〜１０アミノ酸長を有するペプチドから成り、
−  Ｘ１〜Ｘ４のそれぞれは、アミノ酸残基から成り、ここで：
−  （ｉ）Ｘ１は、特定のアミノ酸Ｗを意味するか、又は（ｉｉ）Ｘ１は、Ｗ以外の任意のアミノ酸残基を意味し、
−  （ｉ）Ｘ２は、特定のアミノ酸Ｓを意味するか、又は（ｉｉ）Ｘ２は、Ｓ以外の任意のアミノ酸残基を意味し、
−  （ｉ）Ｘ３は、特定のアミノ酸Ｎを意味するか、又は（ｉｉ）Ｘ３は、Ｎ以外の任意のアミノ酸残基を意味し、
−  （ｉ）Ｘ４は、特定のアミノ酸Ｓを意味するか、又は（ｉｉ）Ｘ４は、Ｓ以外の任意のアミノ酸残基を意味し、
但し、
−  ４個のアミノ酸残基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４のうち３個は、それらの個々の上記意味（ｉ）に定義される特定のアミノ酸を意味し、
−  Ｘ１〜Ｘ４の中の残りのアミノ酸残基は、その意味（ｉ）に定義される特定のアミノ酸残基以外の任意のアミノ酸残基を意味する］
で示される抗原性ペプチドを含む免疫原性組成物。
【請求項２】
式（Ｉ）で示されるペプチドが：
【化１７】
0006027094.tif 000022
［式中：
−  Ｎｔ及びＣｔは、上に定義される式（Ｉ）で示されるペプチドと同じ意味を有し、
−  Ｘは、（Ｉａ）についてＷ、（Ｉｂ）についてＳ、（Ｉｃ）についてＮ及び（Ｉｄ）についてＳ以外の任意のアミノ酸残基である］
から成る群より選択される、請求項１記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
式（Ｉ）で示されるペプチドが：
【化１８】
0006027094.tif 000023
から成る群より選択される、請求項１及び２のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
Ｎｔが、１〜１０アミノ酸残基長のアミノ酸配列を意味する、請求項１〜３のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
Ｎｔが、アミノ酸配列ＮＨ２−ＰＷＮＡ−ＣＯＯＨ［配列番号１０］を含むか、又はそれから成る、請求項１〜４のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
Ｃｔが、１〜１０アミノ酸残基長のアミノ酸配列を意味する、請求項１〜５のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
Ｃｔが、アミノ酸配列ＮＨ２−ＬＤＤＩＷ−ＣＯＯＨ［配列番号１１］を含むか、又はそれから成る、請求項１〜６のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
アミノ酸残基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４のそれぞれの意味（ｉｉ）が、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）から成る群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
抗原性ペプチドが：
【化１９】
0006027094.tif 000024
から成る群より選択される、請求項１〜８のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドが、担体分子と共有結合的に連結している、請求項１〜９のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドが、少なくとも１種の免疫アジュバントと組み合わされる、請求項１〜１０のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドが、少なくとも１種の免疫アジュバントと組み合わされる、ワクチン組成物から成る請求項１〜１０のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一項と同義の式（Ｉ）で示される抗原性ペプチド。
【請求項１４】
式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドが、担体分子と共有結合的に連結している、請求項１３記載の抗原性ペプチド。
【請求項１５】
試料中の式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体を検出及び／又は定量するための方法であって、以下：
ａ）被験試料を、請求項１〜１０のいずれか一項と同義の式（Ｉ）で示される１種又は複数のペプチドと接触させる工程、ならびに
ｂ）該式（Ｉ）で示されるペプチドと該試料中に存在する抗体との間の複合体の形成を検出及び／又は定量する工程
を含む、方法。
【請求項１６】
試料中の式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体を検出及び／又は定量するためのキットであって：
ａ）請求項１〜１０のいずれか一項と同義の式（Ｉ）で示される１種又は複数のペプチド、及び
ｂ）該ペプチドと、該試料中に存在する抗体との間に形成された複合体を検出するための１種又は複数の試薬
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、個体のＨＩＶ−１ウイルス感染の予防及び治療に関するものである。
【０００２】
発明の背景
ヒトＨＩＶ感染の約９０％は、ＨＩＶ−１ウイルスによって起こる。ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）は、ウイルス複製時に生じる突然変異の蓄積によって起こる、及び組換え事象によっても起こる、顕著な遺伝的変異性によって特徴づけられる。ＨＩＶ処置の化学療法の長期にわたる失敗は、特に、ＨＩＶ−１ウイルス株の高い変異原活性によって説明される。異なる経過の抗レトロウイルス療法後に、及び多剤療法（ＨＡＡＲＴ）後であっても、患者から耐性ウイルス変異体が速やかに生じることがこれまでに示された。これらの耐性ウイルスは、それらのタンパク質コンフォメーション及び構造に特異的変化を有する。通常、ＨＩＶ−１が現行処置を回避する原因となるそのような突然変異は、代々のウイルス世代にわたり維持され、処置条件下で選択を受ける結果として蓄積する。
【０００３】
抗ＨＩＶ−１薬を用いた処置は、ウイルスの複製を完全には遮断せず、そのことが、既存の耐性突然変異及び新興の突然変異の選択及び蓄積を可能にすることで、ウイルスが蔓延し続ける新たな機会をもたらす。既存の抗レトロウイルス薬（ＮＲＴＩ、ＮＮＲＴＩ、プロテアーゼ阻害剤、融合阻害剤及びＨＡＡＲＴのようなその混合物）は、耐性ウイルス株の出現及び増殖までに、ＨＩＶ−１の複製をある程度長期間減速することができるだけである。ＨＩＶ−１耐性変異体の広い蔓延は、重大な懸念を呼ぶので、さらなる抗ＨＩＶ−１治療ツールを利用できることが必要となる。
【０００４】
化学的抗レトロウイルス物質を利用するもの以外の様々な抗ＨＩＶ治療戦略が考えられており、それらには、（ｉ）抗ＨＩＶ抗体の使用、（ｉｉ）ＨＩＶ粒子の破壊に基づくワクチン、（ｉｉｉ）ＨＩＶペプチドに基づくワクチン及び（ｉｖ）ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターに基づくワクチンが含まれるが、それぞれがそれらに特異的な欠点を有する。
【０００５】
ＨＩＶの大流行により毎年数百万人が感染し続けているので、有効なワクチンの必要性が増大している。抗ＨＩＶ広域中和抗体を誘発する能力がある免疫原性生成物を開発する困難が原因で、抗ＨＩＶワクチンの開発は深刻に障害されている。
【０００６】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の初代単離株に対する広域中和性抗体（ｂＮＡｂ）の誘導は、依然として、ＡＩＤＳワクチン研究のための主要でまだ達成されていない目標である。エンベロープに基づくワクチンを用いた初期の試みは、実験室に順応した単離株に対してのみ有効な抗体を誘発した。これらの場合、防御は、ｇｐ１２０のＶ３超可変領域に対する高力価ｂＮＡｂと関連づけられた。しかし、発生した中和活性は、主として単離株に特異的であって、大部分のＨＩＶ−１初代単離株に対する有効性は最小限である。第ＩＩＩ相臨床試験でサブユニットｇｐ１２０ワクチンがＨＩＶ−１取込みから防御できないことは、課題の困難を明らかに示している。
【０００７】
それにもかかわらず、ｂＮＡｂは、ＨＩＶ感染個体からしばしば見出すことができる。感染初期に発生した応答は、通常は特異性の幅が狭く、同時代のウイルスではなく、ホストに伝染したウイルスを中和する。抗ウイルス処置の不在下で感染を防除できる数人の長期生存者では、そのような応答が感染の経過中に広幅化する。しかし、交差中和抗体応答の性質及びその発生に至るメカニズムは、理解されていない。
【０００８】
もちろんＥｎｖに対するＮＡｂは、感染後数週間以内に発生するが、この初期応答は特異的ウイルスサブタイプに対してのみ効果がある。しかし、ｂＮＡｂ（交差反応性中和Ａｂ）が、ＨＩＶの経過中に生じる場合がある。最近、いくつかの重要な研究から、ＨＩＶ感染対象（少なくとも１年間感染）の約２５％がｂＮＡｂ応答を有し、１％である「エリート中和者」が大部分のクレードに対して非常に強い活性を有することが示された。重要なことに、これらの結果は、感染者の免疫系が疾患の経過中にＨＩＶ−１に対するＮＡｂをin vivoで発生できることを実証している。これらの結果から、広域反応性Ｎａｂ活性が経時的に生じると思われ、慢性抗原曝露により促進されることが示唆されるが、防御性であろうｂＮＡｂ力価に関しては分からない。
【０００９】
低ノイズの持続性ウイルス複製は、ＮＡｂを回避するためのＥｎｖの継続進化に繋がる。そのような抗原進化は、より大きく保存されたＥｎｖタンパク質領域に新しいワクチン戦略を集中させる可能性があり、主な高度保存エピトープを模倣するようにワクチン免疫原を設計できることを示唆しうる。
【００１０】
効果のある抗ＨＩＶワクチンを設計するための主な障壁の一つは、ｂＮＡｂのターゲットが高度に多様なウイルスエンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）である一方で、保存されたエレメントが免疫原性に乏しいと思われることであった。これは、レセプター結合過程及び融合過程の際に、動態の制約及び特別な制約のために、ｂＮＡｂが潜在的に受攻性の部位にアクセスすることが妨害されることを意味する。実際に少量のＮＡｂしか記載されていない。例えば、同定された最初のｂＮＡｂは、ｇｐ１２０上のＣＤ４結合部位を塞いでＣＤ４の結合を阻止するｂ１２であった。ｇｐ４１サブユニットはｇｐ１２０よりもはるかに大きく保存されており、関与するコンフォメーション再編成は全ての株に共通である。遮蔽されているか、アクセスが困難であるか、又は一過性であるｇｐ４１の保存された構造エレメントに対して非常に低いｂＮＡｂ活性しか誘発されず；２Ｆ５及び４Ｅ１０を含めたそれらのｂＮＡｂは、ｇｐ４１の膜近位エクトドメイン領域（ＭＰＥＲ）をターゲティングする。しかし、これらの主要エピトープを免疫処置しても、ｂＮＡｂ活性の発生は生じなかった。抗原特徴と免疫学的特徴との間のこの分裂は、まだ理解されていない。
【００１１】
当技術分野において、ＨＩＶ−１ウイルスによって起こる感染を予防又は治療することを目標とした治療ツールの必要性が、まだある。
【００１２】
発明の概要
本発明は、下式（Ｉ）：
【化１】
0006027094.tif 000002
［式中、
−  Ｎｔは、０〜１００アミノ酸長を有するペプチドから成り、
−  Ｃｔは、０〜１００アミノ酸長を有するペプチドから成り、
−  Ｘ１〜Ｘ４のそれぞれは、アミノ酸残基から成り、ここで：
−  （ｉ）Ｘ１は、特定のアミノ酸Ｗを意味するか、又は（ｉｉ）Ｘ１は、Ｗ以外の任意のアミノ酸残基を意味し、
−  （ｉ）Ｘ２は、特定のアミノ酸Ｓを意味するか、又は（ｉｉ）Ｘ２は、Ｓ以外の任意のアミノ酸残基を意味し、
−  （ｉ）Ｘ３は、特定のアミノ酸Ｎを意味するか、又は（ｉｉ）Ｘ３は、Ｎ以外の任意のアミノ酸残基を意味し、
−  （ｉ）Ｘ４は、特定のアミノ酸Ｓを意味するか、又は（ｉｉ）Ｘ４は、Ｓ以外の任意のアミノ酸残基を意味し、
但し、
−  ４個のアミノ酸残基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４のうち３個は、それらの個々の上記意味（ｉ）に定義される特定のアミノ酸を意味し、
−  Ｘ１〜Ｘ４の中の残りのアミノ酸残基は、その意味（ｉ）に定義される特定のアミノ酸残基以外の任意のアミノ酸残基を意味する］
で示される抗原性ペプチドを含む免疫原性組成物に関するが、
但し、式（Ｉ）で示されるペプチドは、プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバードカレッジの名前で２０１０年６月２２日に番号PCT/US2010/001784で出願されたＰＣＴ出願に開示され、２０１１年１月１３日に国際公開公報第２０１１／００５２８９号として公開された配列番号１８で示されるペプチドを意味しない。
【００１３】
本発明は、また、医薬として使用するための、上記式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドを含む免疫原性組成物を扱う。
【００１４】
本発明は、また、個体のＨＩＶ−１ウイルス感染を予防及び／又は治療する方法に使用するための、上記式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドを含む免疫原性組成物に関する。
【００１５】
本発明は、また、個体のＨＩＶ−１ウイルス感染を予防及び／又は治療するための医薬を製造するための、上記式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドを含む免疫原性組成物の使用に関係する。
【００１６】
ある態様では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４の１個又は複数の意味（ｉｉ）は、相互に独立して、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）から成るアミノ酸残基の群より選択され、最も好ましくはアラニンである。
【００１７】
ある態様では、Ｘ１〜Ｘ４の１個だけは、それぞれＷ（Ｘ１について）、Ｓ（Ｘ２について）、Ｎ（Ｘ３について）及びＳ（Ｘ４について）以外のアミノ酸残基を意味する。
【００１８】
ある態様では、式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドは：
【化２】
0006027094.tif 000003
から成る群より選択される。
【００１９】
本発明は、また、式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドを含む免疫原性組成物に関係する。
【００２０】
ある態様では、式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドは、担体分子と共有結合的に連結している。
【００２１】
該免疫原性組成物のある態様では、場合により担体分子と連結している式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドは、１種又は複数の免疫アジュバント剤と組み合わされる。
【００２２】
本発明は、また、本明細書記載の式（Ｉ）で示されるペプチドに関する。
【００２３】
本発明は、また、ＨＩＶ−１ウイルスに感染した個体を予防及び／又は治療するための医薬を製造するための、式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体の使用を扱う。
【００２４】
本発明は、また、上記式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体に関する。
【００２５】
本発明は、また、式（Ｉ）で示されるペプチドを使用するＨＩＶ−１診断方法及びＨＩＶ−１診断キットに関係する。
【００２６】
本発明は、また、式（Ｉ）で示されるペプチドを使用するＨＩＶ−１予測法及びＨＩＶ−１予測キットに関する。
【００２７】
それは、また、特に抗ＨＩＶ−１の医学的処置を受けている患者における、式（Ｉ）で示されるペプチドを使用する、ＨＩＶ−１感染状態をモニタリングするための方法、及びそのようなモニタリング方法を行うためのキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】式（Ｉ）で示されるいくつかのペプチドのアミノ酸配列アライメントを示す図である。野生型：ＨＩＶ−１ ＨＸＢ２株のｇｐ４１タンパク質に含有されるアミノ酸配列、「３Ｓ」と呼ばれる場合もある。Ｓ６１３Ａ（Ｍ１）及びＫ６１７Ａ（Ｍ５）：上記「野生型」と強いアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列。Ｗ６１４Ａ、Ｓ６１５Ａ、Ｎ６１６Ａ及びＳ６１８Ａ：式（Ｉ）で示されるペプチドの特定の態様。
【図２Ａ】３Ｓ／ｇｐ４１モチーフ中にアラニン置換を含有するＨＩＶ−１ ＮＬ４．３ウイルスの感染性を示す図である。ＭＴ−２細胞に野生型（ＷＴ、白棒線）ＮＬ４．３ウイルス又はアラニン突然変異型３Ｓ／ｇｐ４１（黒棒線）ＮＬ４．３ウイルスからｐ２４当量１００ng/mLの抗原になるように感染させた。（Ａ）ｐ２４抗原を感染６日後に定量した。野生型に対する相対ユニットで表現した結果は、突然変異体に応じて３〜７種の独立したプラスミドクローン調製物からの平均±ＳＤを表す。
【図２Ｂ】３Ｓ／ｇｐ４１モチーフ中にアラニン置換を含有するＨＩＶ−１ ＮＬ４．３ウイルスの感染性を示す図である。ＭＴ−２細胞に野生型（ＷＴ、白棒線）ＮＬ４．３ウイルス又はアラニン突然変異型３Ｓ／ｇｐ４１（黒棒線）ＮＬ４．３ウイルスからｐ２４当量１００ng/mLの抗原になるように感染させた。（Ｂ）感染４日後に、標準的な位相差顕微鏡法によりシンシチウム形成を定量した。野生型に対する相対ユニットで表現した結果は、突然変異体に応じて２〜４種の別個のプラスミドクローン調製物からの平均±ＳＤを表す。
【図２Ｃ】３Ｓ／ｇｐ４１モチーフ中にアラニン置換を含有するＨＩＶ−１ ＮＬ４．３ウイルスの感染性を示す図である。ＭＴ−２細胞に野生型（ＷＴ、白棒線）ＮＬ４．３ウイルス又はアラニン突然変異型３Ｓ／ｇｐ４１（黒棒線）ＮＬ４．３ウイルスからｐ２４当量１００ng/mLの抗原になるように感染させた。（Ｃ）野生型（ＷＴ、×）ＮＬ４．３ウイルス又はＳ６１３Ａ（■）、Ｗ６１４Ａ（△）、Ｓ６１５Ａ（◇）、Ｎ６１６Ａ（○）、Ｋ６１７Ａ（●）、及びＳ６１８Ａ（□）を含むアラニン突然変異型３Ｓ／ｇｐ４１ ＮＬ４．３ウイルスに感染した初代ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞上清中のｐ２４抗原生成の動態研究。この実験は、２人の独立した健康なドナーから精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞に関して別個のプラスミドクローン調製物を用いて行った２回の独立した実験を代表するものである。
【図２Ｄ】３Ｓ／ｇｐ４１モチーフ中にアラニン置換を含有するＨＩＶ−１ ＮＬ４．３ウイルスの感染性を示す図である。ＭＴ−２細胞に野生型（ＷＴ、白棒線）ＮＬ４．３ウイルス又はアラニン突然変異型３Ｓ／ｇｐ４１（黒棒線）ＮＬ４．３ウイルスからｐ２４当量１００ng/mLの抗原になるように感染させた。（Ｄ）野生型（ＷＴ、白棒線）ＮＬ４．３ウイルス又はアラニン突然変異型３Ｓ／ｇｐ４１（黒棒線）ＮＬ４．３ウイルスによるＨｅｌａ Ｐ４Ｃ５細胞の感染性。細胞１５，０００個あたりｐ２４当量４ngの抗原となるように三つ組で４８時間、細胞に感染させ、細胞抽出物中のβ−ガラクトシダーゼ活性を決定した。野生型に対する相対ユニットで表現した結果は、３〜４種の独立したプラスミドクローン調製物からの平均±ＳＤを表す。アラニン突然変異型ＮＬ４．３ウイルスを、Ｓ６１３Ａ、Ｗ６１４Ａ、Ｓ６１５Ａ、Ｎ６１６Ａ、Ｋ６１７Ａ、及びＳ６１８Ａと呼ぶ。
【図３Ａ】３Ｓ／ｇｐ４１アラニン突然変異体により仲介されるＣＤ４＋Ｔ細胞上のＮＫｐ４４Ｌ発現及びＮＫ細胞脱顆粒を示す図である。（Ａ）精製ＣＤ４＋Ｔ細胞に野生型（ＷＴ）ＮＬ４．３ウイルス又は様々なアラニン突然変異型ＮＬ４．３ウイルスを感染させなかった（点線）か、又は一晩感染させた（実線）。細胞をＮＣＲに対するリガンド（ＮＫｐ３０−Ｉｇ、ＮＫｐ４４−Ｉｇ又はＮＫｐ４６−Ｉｇ融合タンパク質）で染色した。ヒストグラムはＣＤ４＋Ｔ細胞にゲート設定した。重ね合わせは、未感染細胞に比べたＨＩＶ感染細胞上でのＮＣＲリガンドの発現を示す。数字は、ＮＣＲリガンドを陽性発現しているＣＤ４＋Ｔ細胞の比率に対応する。
【図３Ｂ】３Ｓ／ｇｐ４１アラニン突然変異体により仲介されるＣＤ４＋Ｔ細胞上のＮＫｐ４４Ｌ発現及びＮＫ細胞脱顆粒を示す図である。（Ｂ）精製ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＮＫｐ４４Ｌの発現を、３Ｓ／ｇｐ４１モチーフの野生型（ＷＴ）又はアラニン突然変異型３Ｓ／ｇｐ４１合成ペプチドからのペプチドで処理しなかった（ＵＴ）か、又は処理した。細胞を抗ＮＫｐ４４Ｌ ｍＡｂ、又はＩｇＭアイソタイプ対照（点線）のいずれかで染色した。ヒストグラムはＣＤ４＋サブセットにゲート設定した。重ね合わせは、アイソタイプ対照に比べたＮＫｐ４４Ｌの発現を示す。数字は、ＮＫｐ４４Ｌを発現しているＣＤ４＋Ｔ細胞の比率に対応する。
【図３Ｃ】３Ｓ／ｇｐ４１アラニン突然変異体により仲介されるＣＤ４＋Ｔ細胞上のＮＫｐ４４Ｌ発現及びＮＫ細胞脱顆粒を示す図である。（Ｃ）抗ＣＤ１０７ａ ｍＡｂの存在下でＥ：Ｔ比が１：１のＩＬ２活性化ＮＫ細胞及び自己ＣＤ４＋Ｔ細胞で脱顆粒活性を判断した。精製ＣＤ４＋Ｔ細胞に野生型（ＷＴ）又はアラニン突然変異型３Ｓ／ｇｐ４１ ＮＬ４．３ウイルスを感染させなかった（ＮＩ）か、又は一晩感染させた。点プロットは、ＮＫｐ４４及びＣＤ１０７ａの発現の関数としてＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞にゲート設定する。各欄の数字は、陽性ＮＫ細胞の比率に対応する。
【図３Ｄ】３Ｓ／ｇｐ４１アラニン突然変異体により仲介されるＣＤ４＋Ｔ細胞上のＮＫｐ４４Ｌ発現及びＮＫ細胞脱顆粒を示す図である。（Ｄ）抗ＣＤ１０７ａ ｍＡｂ存在下におけるＥ：Ｔ比１：１での自己精製ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＮＫ細胞の脱顆粒効力。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、３Ｓ／ｇｐ４１モチーフからの野生型（ＷＴ）又はアラニン突然変異型合成ペプチドからのペプチドで処理しなかった（ＵＴ）か、又は処理した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を自己ＩＬ２活性化ＮＫ細胞と共にインキュベーションした。ヒストグラムは、ＮＫｐ４４を発現しているＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞にゲート設定した。重ね合わせは、未処理細胞に比べて、野生型（ＷＴ）、又はアラニン突然変異型３Ｓ／ｇｐ４１合成ペプチドのいずれかで処理した自己ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在下で試験した、ＮＫ細胞上でのＣＤ１０７ａ発現を示す。数字は、ＣＤ１０７ａを発現しているＮＫ細胞の比率に対応する。アラニン突然変異型ＮＬ４．３ウイルス又は３Ｓ／ｇｐ４１ペプチドをＳ６１３Ａ、Ｗ６１４Ａ、Ｓ６１５Ａ、Ｎ６１６Ａ、Ｋ６１７Ａ、及びＳ６１８Ａと呼ぶ。
【図４Ａ】特定の３Ｓ／ｇｐ４１アラニン突然変異体から発生したマウスＩｇによるウイルス感染の中和ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞上のＮＫｐ４４Ｌ及びＮＫ細胞脱顆粒の阻害を示す図である。アジュバント単独（Ｉｇ−Ａｄｊ、◆）、野生型（ＷＴ、×）又はＳ６１３Ａ（■）、Ｗ６１４Ａ（△）、Ｓ６１５Ａ（◇）、Ｎ６１６Ａ（○）、Ｋ６１７Ａ（●）、及びＳ６１８Ａ（□）を含めたアラニン突然変異型３Ｓ／ｇｐ４１ ＮＬ４．３ウイルスで免疫処置されたマウスから提供された精製Ｉｇと共に３０分間予備インキュベーションされたＮＬ４．３（左欄）又はＮＤＫ（右欄）コンピテントウイルスを精製ＣＤ４＋Ｔ細胞に感染させた。（Ａ）コンピテントウイルス（２００ＴＣＩＤ５０）を０〜２０μg/mlの範囲の様々な濃度の精製Ｉｇと共に３０分間インキュベーションし、続いてＰＨＡ活性化精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を添加した。感染６日後に、細胞上清中のｐ２４抗原を定量した。
【図４Ｂ】特定の３Ｓ／ｇｐ４１アラニン突然変異体から発生したマウスＩｇによるウイルス感染の中和ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞上のＮＫｐ４４Ｌ及びＮＫ細胞脱顆粒の阻害を示す図である。アジュバント単独（Ｉｇ−Ａｄｊ、◆）、野生型（ＷＴ、×）又はＳ６１３Ａ（■）、Ｗ６１４Ａ（△）、Ｓ６１５Ａ（◇）、Ｎ６１６Ａ（○）、Ｋ６１７Ａ（●）、及びＳ６１８Ａ（□）を含めたアラニン突然変異型３Ｓ／ｇｐ４１ ＮＬ４．３ウイルスで免疫処置されたマウスから提供された精製Ｉｇと共に３０分間予備インキュベーションされたＮＬ４．３（左欄）又はＮＤＫ（右欄）コンピテントウイルスを精製ＣＤ４＋Ｔ細胞に感染させた。（Ｂ）時間依存的効果。コンピテントウイルス（２００ＴＣＩＤ５０）を１０μg/mlのＩｇと共に３０分間インキュベーションし、続いてＰＨＡ活性化精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を添加した。感染から１０日間、２日毎に細胞上清中のｐ２４レベルを試験した。
【図４Ｃ】特定の３Ｓ／ｇｐ４１アラニン突然変異体から発生したマウスＩｇによるウイルス感染の中和ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞上のＮＫｐ４４Ｌ及びＮＫ細胞脱顆粒の阻害を示す図である。アジュバント単独（Ｉｇ−Ａｄｊ、◆）、野生型（ＷＴ、×）又はＳ６１３Ａ（■）、Ｗ６１４Ａ（△）、Ｓ６１５Ａ（◇）、Ｎ６１６Ａ（○）、Ｋ６１７Ａ（●）、及びＳ６１８Ａ（□）を含めたアラニン突然変異型３Ｓ／ｇｐ４１ ＮＬ４．３ウイルスで免疫処置されたマウスから提供された精製Ｉｇと共に３０分間予備インキュベーションされたＮＬ４．３（左欄）又はＮＤＫ（右欄）コンピテントウイルスを精製ＣＤ４＋Ｔ細胞に感染させた。（Ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＮＫｐ４４Ｌ発現を感染１７時間後に決定した。ヒストグラムをＣＤ４＋細胞サブセットにゲート設定した。重ね合わせは、ＩｇＭアイソタイプ対照に比べたＮＫｐ４４Ｌの発現を示す。番号は、陽性細胞の比率に対応する。
【図４Ｄ】特定の３Ｓ／ｇｐ４１アラニン突然変異体から発生したマウスＩｇによるウイルス感染の中和ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞上のＮＫｐ４４Ｌ及びＮＫ細胞脱顆粒の阻害を示す図である。アジュバント単独（Ｉｇ−Ａｄｊ、◆）、野生型（ＷＴ、×）又はＳ６１３Ａ（■）、Ｗ６１４Ａ（△）、Ｓ６１５Ａ（◇）、Ｎ６１６Ａ（○）、Ｋ６１７Ａ（●）、及びＳ６１８Ａ（□）を含めたアラニン突然変異型３Ｓ／ｇｐ４１ ＮＬ４．３ウイルスで免疫処置されたマウスから提供された精製Ｉｇと共に３０分間予備インキュベーションされたＮＬ４．３（左欄）又はＮＤＫ（右欄）コンピテントウイルスを精製ＣＤ４＋Ｔ細胞に感染させた。（Ｄ）自己ＮＫ細胞の脱顆粒。ＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ１０７ａ ｍＡｂの存在下で自己ＮＫ細胞と共にＥ：Ｔ比１：１でインキュベーションした。点プロットは、ＮＫｐ４４及びＣＤ１０７ａ発現の関数でＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞にゲート設定する。各欄の数字は、陽性細胞の比率に対応する。アラニン突然変異型ＮＬ４．３ウイルス又は３Ｓ／ｇｐ４１ペプチドを、Ｓ６１３Ａ、Ｗ６１４Ａ、Ｓ６１５Ａ、Ｎ６１６Ａ、Ｋ６１７Ａ、及びＳ６１８Ａと呼ぶ。
【図５Ａ】ＨＩＶ感染患者から精製された免疫沈降後の抗Ｗ６１４Ａ Ａｂによるウイルス感染の中和ならびにＣＤ４＋細胞上のＮＫｐ４４Ｌ及びＮＫ細胞脱顆粒の阻害を示す図である。抗３Ｓ−ＷＴ ｍＡｂ（抗３Ｓ、○）、１人のＨＩＶ感染患者から提供された抗３Ｓ−ＷＴ−免疫精製Ａｂ（＃１１７、□）、又は５人のＨＩＶ感染患者から提供された抗３Ｓ−Ｗ６１４Ａ−免疫精製Ａｂと共に３０分間予備インキュベーションされたＮＬ４．３（左欄）又はＮＤＫ（右欄）コンピテントウイルスをＰＨＡ活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞に感染させた：＃２４（●）、＃４４（■）、＃６５（▲）、＃７１（▼）、及び＃１０９（◆）。（Ａ）コンピテントウイルス（２００ＴＣＩＤ５０）を０〜２μg/ml範囲の様々な濃度の免疫精製Ａｂと共に３０分間インキュベーションし、続いてＣＤ４＋Ｔ細胞を添加した。感染６日後に、細胞上清中のｐ２４抗原を定量した。
【図５Ｂ】ＨＩＶ感染患者から精製された免疫沈降後の抗Ｗ６１４Ａ Ａｂによるウイルス感染の中和ならびにＣＤ４＋細胞上のＮＫｐ４４Ｌ及びＮＫ細胞脱顆粒の阻害を示す図である。抗３Ｓ−ＷＴ ｍＡｂ（抗３Ｓ、○）、１人のＨＩＶ感染患者から提供された抗３Ｓ−ＷＴ−免疫精製Ａｂ（＃１１７、□）、又は５人のＨＩＶ感染患者から提供された抗３Ｓ−Ｗ６１４Ａ−免疫精製Ａｂと共に３０分間予備インキュベーションされたＮＬ４．３（左欄）又はＮＤＫ（右欄）コンピテントウイルスをＰＨＡ活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞に感染させた：＃２４（●）、＃４４（■）、＃６５（▲）、＃７１（▼）、及び＃１０９（◆）。（Ｂ）時間依存性効果。コンピテントウイルス（２００ＴＣＩＤ５０）を１μg/mlの免疫精製Ａｂと共に３０分間インキュベーションし、続いてＰＨＡ活性化精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を添加した。感染後１０日間、２日毎に細胞上清中のｐ２４レベルを試験した。
【図５Ｃ】ＨＩＶ感染患者から精製された免疫沈降後の抗Ｗ６１４Ａ Ａｂによるウイルス感染の中和ならびにＣＤ４＋細胞上のＮＫｐ４４Ｌ及びＮＫ細胞脱顆粒の阻害を示す図である。抗３Ｓ−ＷＴ ｍＡｂ（抗３Ｓ、○）、１人のＨＩＶ感染患者から提供された抗３Ｓ−ＷＴ−免疫精製Ａｂ（＃１１７、□）、又は５人のＨＩＶ感染患者から提供された抗３Ｓ−Ｗ６１４Ａ−免疫精製Ａｂと共に３０分間予備インキュベーションされたＮＬ４．３（左欄）又はＮＤＫ（右欄）コンピテントウイルスをＰＨＡ活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞に感染させた：＃２４（●）、＃４４（■）、＃６５（▲）、＃７１（▼）、及び＃１０９（◆）。（Ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＮＫｐ４４Ｌの発現を感染１７時間後に決定した。ヒストグラムをＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットにゲート設定した。重ね合わせは、ＩｇＭアイソタイプ対照に比べたＮＫｐ４４Ｌの発現を示す。数字は、陽性細胞の比率に対応する。
【図５Ｄ】ＨＩＶ感染患者から精製された免疫沈降後の抗Ｗ６１４Ａ Ａｂによるウイルス感染の中和ならびにＣＤ４＋細胞上のＮＫｐ４４Ｌ及びＮＫ細胞脱顆粒の阻害を示す図である。抗３Ｓ−ＷＴ ｍＡｂ（抗３Ｓ、○）、１人のＨＩＶ感染患者から提供された抗３Ｓ−ＷＴ−免疫精製Ａｂ（＃１１７、□）、又は５人のＨＩＶ感染患者から提供された抗３Ｓ−Ｗ６１４Ａ−免疫精製Ａｂと共に３０分間予備インキュベーションされたＮＬ４．３（左欄）又はＮＤＫ（右欄）コンピテントウイルスをＰＨＡ活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞に感染させた：＃２４（●）、＃４４（■）、＃６５（▲）、＃７１（▼）、及び＃１０９（◆）。（Ｄ）自己ＮＫ細胞の脱顆粒。ＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ１０７ａ ｍＡｂの存在下で自己ＮＫ細胞と共にＥ：Ｔ比１：１でインキュベーションした。点プロットは、ＮＫｐ４４及びＣＤ１０７ａの発現の関数でＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞にゲート設定する。各欄の数字は、陽性ＮＫ細胞の比率に対応する。アラニン突然変異型ＮＬ４．３ウイルス又は３Ｓ／ｇｐ４１ペプチドをＳ６１３Ａ、Ｗ６１４Ａ、Ｓ６１５Ａ、Ｎ６１６Ａ、Ｋ６１７Ａ、及びＳ６１８Ａと呼ぶ。
【図６Ａ】３Ｓ／ｇｐ４１の熱不活性化アラニン突然変異体によって仲介されるＣＤ４＋Ｔ細胞上のＮＫｐ４４Ｌ発現及び自己ＮＫ細胞の脱顆粒を示す図である。熱不活性化ウイルス１mLあたりｐ２４当量１００ngの抗原となるように、野生型（ＷＴ）ＮＬ４．３ウイルス又は３Ｓ／ｇｐ４１の様々なアラニン突然変異体のウイルスで精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を一晩処理しなかったか、又は処理した。（Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＮＫｐ４４Ｌ発現を感染１７時間後に決定した。ヒストグラムをＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットにゲート設定した。重ね合わせは、ＩｇＭアイソタイプ対照に比べたＮＫｐ４４Ｌの発現を示す。数字は、陽性細胞の比率に対応する。
【図６Ｂ】３Ｓ／ｇｐ４１の熱不活性化アラニン突然変異体によって仲介されるＣＤ４＋Ｔ細胞上のＮＫｐ４４Ｌ発現及び自己ＮＫ細胞の脱顆粒を示す図である。熱不活性化ウイルス１mLあたりｐ２４当量１００ngの抗原となるように、野生型（ＷＴ）ＮＬ４．３ウイルス又は３Ｓ／ｇｐ４１の様々なアラニン突然変異体のウイルスで精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を一晩処理しなかったか、又は処理した。（Ｂ）自己ＮＫ細胞の脱顆粒。ＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ１０７ａ ｍＡｂ存在下で自己ＮＫ細胞と共にＥ：Ｔ比１：１でインキュベーションした。点プロットを、ＮＫｐ４４及びＣＤ１０７ａ発現の関数でＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞にゲート設定する。各欄の数字は、陽性ＮＫ細胞の比率に対応する。アラニン突然変異型ＮＬ４．３ウイルス又は３Ｓ／ｇｐ４１ペプチドをＳ６１３Ａ、Ｗ６１４Ａ、Ｓ６１５Ａ、Ｎ６１６Ａ、Ｋ６１７Ａ、及びＳ６１８Ａと呼ぶ。
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明は、主として、抗ＨＩＶ−１免疫原性組成物又はワクチン組成物であって、特に広域抗ＨＩＶ−１中和抗体の誘導を可能にする特異的抗原性ペプチドを含む抗ＨＩＶ−１免疫原性組成物又はワクチン組成物を提供する。
【００３０】
理想的には、効果のあるＨＩＶ−１ワクチンは、感染を完全に遮断する。実際には、感染を著しく軽減し、かつＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇を防止する、最適以下の、安全で効果のあるワクチンを開発することが、より現実的でありうる。この戦略の主たる目的は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇に作用する能力も有する広域中和抗体（ｂＮＡｂ）を発生する能力に結びついており、これは、先行技術では克服できないと思われた。
【００３１】
したがって、本発明は、ＨＩＶ−１ウイルスによる哺乳生物、好ましくはヒト生物の感染を予防及び／又は治療するための新規な物質及び組成物を提供する。
【００３２】
本発明にしたがって、「３Ｓ」という名の公知のｇｐ４１由来ペプチドと強い配列同一性を共有する特異的ペプチドのファミリーが抗ＨＩＶ−１ ｂＮＡｂのin vivo生成を誘導することが見出された。
【００３３】
上に引用された公知の「３Ｓ」ペプチドを含めた、ｇｐ４１ ＨＩＶ−１タンパク質由来の公知のペプチドとは対照的に、これらの特異的ペプチドが、様々なＨＩＶ−１ウイルス臨床単離株に対して強く広域な中和活性を生じることが、本明細書に示される。
【００３４】
非常に重要なことには、本発明によると、これらの特異的ペプチドがＮＫ細胞による溶解に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の感受性をトリガーしないが、脱顆粒を含めたＮＫ細胞の機能全体はインタクトなままであることも見出された。
【００３５】
追加的に、本発明者らは、これらの特異的ペプチドに対する抗体が、ＨＩＶ−１ウイルス感染の経過中に刺激される、ＮＫ細胞溶解に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の感受性を遮断することを示した。
【００３６】
本発明は、下式（Ｉ）：
【化３】
0006027094.tif 000004
［式中、
−  Ｎｔは、０〜１００アミノ酸長を有するペプチドから成り、
−  Ｃｔは、０〜１００アミノ酸長を有するペプチドから成り、
−  Ｘ１〜Ｘ４のそれぞれは、アミノ酸残基から成り、ここで：
−  （ｉ）Ｘ１は、特定のアミノ酸Ｗを意味するか、又は（ｉｉ）Ｘ１は、Ｗ以外の任意のアミノ酸残基を意味し、
−  （ｉ）Ｘ２は、特定のアミノ酸Ｓを意味するか、又は（ｉｉ）Ｘ２は、Ｓ以外の任意のアミノ酸残基を意味し、
−  （ｉ）Ｘ３は、特定のアミノ酸Ｎを意味するか、又は（ｉｉ）Ｘ３は、Ｎ以外の任意のアミノ酸残基を意味し、
−  （ｉ）Ｘ４は、特定のアミノ酸Ｓを意味するか、又は（ｉｉ）Ｘ４は、Ｓ以外の任意のアミノ酸残基を意味し、
但し、
−  ４個のアミノ酸残基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４のうちの３個は、それらの個々の上記意味（ｉ）に定義される特定のアミノ酸を意味し、
−  Ｘ１〜Ｘ４の中の残りのアミノ酸残基は、その意味（ｉ）に定義される特定のアミノ酸残基以外の任意のアミノ酸残基を意味する］
で示される抗原性ペプチドを含む免疫原性組成物に関するが、
但し、式（Ｉ）で示されるペプチドは、国際公開公報第２０１１／００５２８９号として公開されたＰＣＴ出願に開示された配列番号１８で示されるペプチドを意味しない。
【００３７】
国際公開公報第２０１１／００５２８９号として公開されたＰＣＴ出願に開示された配列番号１８で示されるペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：「Ａｃ−ＮＨＮＨＲＩＲＴＮＰＡＩＶＫ（Ａｃ）ＴＥＮＳＷＳＮＫＡＫＳＩＣＱＱＱ−ＮＨ２」（本特許出願の配列番号１６）。
【００３８】
０〜１００アミノ酸残基長を有するＮｔペプチドは、
【化４】
0006027094.tif 000005
アミノ酸残基長を有するペプチドを包含する／
０〜１００アミノ酸残基長を有するＣｔペプチドは、
【化５】
0006027094.tif 000006
アミノ酸残基長を有するペプチドを包含する／
【００３９】
ＨＩＶ−１ウイルス及び式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体の両方と接触させられたＣＤ４＋Ｔ細胞によるｐ２４生成が準検出不能であることによって示されるように、上に既述の式（Ｉ）で示されるペプチドは、好ましくは１種又は複数の免疫アジュバント剤と組み合わせて、免疫原性組成物に使用された場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＨＩＶ−１ウイルス感染を遮断する及び／又は未感染ＣＤ４＋Ｔ細胞へのＨＩＶ−１ウイルスの蔓延を遮断する抗体の生成を誘導する。
【００４０】
さらに、当技術分野においてＨＩＶ抗原として使用されてきた、「３Ｓ」ペプチド（図１に示す）を含めた他のＨＩＶ由来ペプチドとは対照的に、式（Ｉ）で示されるペプチドは、ＣＤ４＋Ｔ細胞表面でＮＫｐ４４Ｌの発現をトリガーせず、したがって、ＮＫ細胞によるＣＤ４＋Ｔ細胞破壊をトリガーしない。
【００４１】
なおさらに、式（Ｉ）で示されるペプチドを免疫処置された個体において生成された抗体は、脱顆粒を含むＮＫ細胞の他の機能を全く障害せずに、ＮＫ細胞によるＣＤ４＋Ｔ細胞のＮＫｐ４４Ｌ介在性溶解を遮断することができる。
【００４２】
したがって、本発明は、ＨＩＶ−１ウイルス感染の予防及び治療のために使用できる、高度に効果のある治療ツールを提供する。
【００４３】
本発明により使用される免疫原性組成物は、式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドを含み、そのペプチドは、本明細書の実施例に示されるように、該免疫原性組成物が個体に投与された場合に、該式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体の生成をもたらし、それらの抗体は、複数の臨床ＨＩＶ−１単離株に対して中和特性を与える。本明細書にさらに例示されるように、式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドは、担体分子とのコンジュゲーション及び／又は１種もしくは複数の免疫アジュバント剤との組み合わせによって免疫原性にすることができる。
【００４４】
式（Ｉ）で示されるポリペプチドを含む免疫原性組成物は、ＣＤ４細胞の該ＨＩＶ−１ウイルス感染を強力に軽減又は遮断さえする抗体を誘導することによって、ＨＩＶ−１ウイルスによる感染に対して予防的に使用することができる。
【００４５】
式（Ｉ）で示されるポリペプチドを含む免疫原性組成物は、感染した個体において既に複製したＨＩＶ−１ウイルスによるＣＤ４＋Ｔ細胞の感染を強力に軽減又は遮断さえする抗体を誘導することによって、ＨＩＶ−１感染個体において処置目的で使用することができる。
【００４６】
本明細書の実施例に示すように、式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドを含む免疫原性組成物で哺乳類を免疫処置後に得られる抗ＨＩＶ−１抗体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞−ｐ２４アッセイにおいて２０μg/ml未満のＩＣ５０を有しうる中和抗体から成る。
【００４７】
典型的には、ＣＤ４＋Ｔ細胞−ｐ２４アッセイは：
ａ）複製コンピテントＨＩＶ−１ウイルスを既知量の被験抗体と接触させることによって被験混合物を調製する工程、
ｂ）工程ａ）の終わりに得られた被験混合物と共にＰＨＡ活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞をＩＬ−２の存在下でインキュベーションする工程、及び
ｃ）工程ｂ）の終わりに得られたＣＤ４＋Ｔ細胞培養物中のｐ２４活性を決定する工程、及び
ｄ）工程ａ）で添加された既知量の抗体に関して工程ｃ）で決定されたｐ２４活性を、工程ａ）が抗ＨＩＶ抗体の不在下で行われた同じ試験で見出されたｐ２４活性と比較することによって、被験抗体のＩＣ５０値を決定する工程
を含む。
【００４８】
一般に、上記中和アッセイを行うために、工程ａ）で漸増する既知量の被験抗体が使用される一連の試験が行われる。中和アッセイの十分に詳細な説明を本明細書の実施例に示す。
【００４９】
本発明者らによって得られた結果は、式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドを含む免疫原性組成物が、それを必要とする個体に対する高度の安全性で使用されうることを示す。それは、該免疫原性組成物が、公知の抗ＨＩＶ抗原性ペプチド（例えば図１に示される「３Ｓ」ペプチド）とは対照的に、望ましくない副作用を引き起こさず、特にＣＤ４＋Ｔ細胞の機能性に影響しないからである。
【００５０】
さらに、式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドを含む免疫原性組成物は、（ｉ）いくつかのＨＩＶ−１臨床単離株に対する広域中和活性を与えられている抗体の発生、及び（ｉｉ）ＮＫ細胞によるＣＤ４＋Ｔ細胞溶解の遮断、を含めた、ＨＩＶ−１感染に対するその多面的活性のため、非常に強力な抗ＨＩＶ治療ツールである。
【００５１】
なおさらに、式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドを含む免疫原性組成物は、高い作用選択性を与えられる。それは、例示的に、その組成物が脱顆粒のようなＮＫ細胞の重要な抗菌免疫抵抗性機能に同時に影響せずに、ＮＫ細胞の抗ＣＤ４活性のみを障害するからである。
【００５２】
次に、式（Ｉ）で示される抗原性ポリペプチドを含む免疫原性組成物は、（ｉ）抗ＨＩＶ−１広域中和抗体を誘導することによって抗ＨＩＶ−１活性を有し、（ｉｉ）（ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞を破壊から防御すること、及び（ｂ）免疫系の非特異的抗菌機能が完全に機能性であり続けることを保証することによってＨＩＶ−１感染個体の免疫系の機能性を保護する。
【００５３】
式（Ｉ）で示されるペプチドの例示的な態様は、（ｉ）「Ｗ６１４Ａ」又は「Ｍ２」（本明細書の配列番号１２）、（ｉｉ）「Ｓ６１５Ａ」又は「Ｍ３」（本明細書の配列番号１３）、（ｉｉｉ）「Ｎ６１６Ａ」又は「Ｍ４」（本明細書の配列番号１４）及び（ｉｖ）「Ｓ６１８Ａ」又は「Ｍ６」（本明細書の配列番号１５）が含まれる図１に開示されている。
【００５４】
重要なことには、本明細書の実施例に示されるように、図１に示されるＳ６１３Ａ（又は「Ｍ１」）及びＫ６１７Ａ（又は「Ｍ５」）と名付けられたペプチドのような、式（Ｉ）で示されるペプチドと強いアミノ酸同一性を有する他の特異的ペプチドは、式（Ｉ）で示されるペプチドのどの抗ＨＩＶ特性も与えられていない。例示的に、ペプチドＳ６１３Ａ及びＫ６１７Ａは、（ｉ）抗ＨＩＶ中和抗体を誘導せず、（ｉｉ）ＣＤ４細胞によるＮＫｐ４４Ｌ発現をトリガーし、それ故にＮＫ細胞溶解に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の感受性もトリガーし、（ｉｉｉ）ＮＫ細胞による溶解に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の感受性を軽減又は遮断できる抗体の生成を誘導しない。
【００５５】
極めて驚いたことに、本発明者らは、上述のペプチドＳ６１３Ａ及びＫ６１７Ａが、ＨＩＶ−１ウイルスに対する中和抗体を誘導できないものの、これらのペプチドがＨＩＶ−１ウイルスによって発現された野生型配列を十分に認識する抗体を誘導することを示した。
【００５６】
同じく極めて驚いたことに、本明細書の実施例では、表４に示されるように、式（Ｉ）で示されるペプチドが、ＨＩＶ−１ウイルスによって発現される野生型配列と反応しない抗体を誘導することが示される。これらの驚くべき結果から、式（Ｉ）で示されるペプチドが、抗ＨＩＶ−１広域中和抗体を誘導するものの、対応する野生型ＨＩＶ−１配列と構造的に異なることが示唆される。これらの結果は、ＨＩＶ−１ウイルスによる感染に対して効果のある免疫応答を誘導するための抗原性化合物を探す場合に、当業者が予想したであろう結果とは明らかに対照的である。
【００５７】
他方で、上に引用されるＳ６１３Ａ及びＫ６１７Ａペプチドのような、式（Ｉ）で示されるペプチドに近い配列を有するペプチドは、野生型ＨＩＶ−１配列に構造的に密接に関係するように見え、それらの野生型配列を認識する抗体を誘導することができるが、これらの抗体は、抗ＨＩＶ−１特性を全く有さない。
【００５８】
本明細書に報告される結果は、（ｉ）式（Ｉ）で示されるペプチドの安全性も、（ｉｉ）式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体の様々な抗ＨＩＶ特性も、当業者によって予測できないであろうと示している。
【００５９】
さらに、式（Ｉ）で示されるペプチドは、線形空間構造を有すると予想される。
【００６０】
本発明者らは、また、式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体が、ＨＩＶ−１ウイルスに感染した少数の個体から見出されうることを示した。（ｉ）これらのＨＩＶ−１感染個体における式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体の存在、と（ｉｉ）低いＨＩＶ−１ウイルス量及び高いＣＤ４＋Ｔ細胞数、との間に強い相関が見出された。これらの結果から、ＨＩＶ−１ウイルスによる個体の感染を予防及び／又は治療するための、式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体の高いin vivo有効性がはっきりと示される。
【００６１】
本明細書の実施例は、また、式（Ｉ）で示されるペプチドの態様に存在する、突然変異Ｗ６１４Ａ及びＳ６１８Ａの一方を有する突然変異型ｇｐ４１タンパク質をコードする突然変異型ＨＩＶ−１ウイルスが、ヒトリンパ芽球様細胞系に感染する能力が非常に低下しており、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＮＫｐ４４Ｌ発現をトリガーしないことを例示する。これらの結果から、式（Ｉ）で示されるペプチドがＣＤ４＋Ｔ細胞によるＮＫｐ４４Ｌ発現を誘導できないことが、特異的変異型ｇｐ４１タンパク質を発現しているＨＩＶ−１ウイルス全体でも見出されることが示唆される。
【００６２】
本明細書に使用される、個体のＨＩＶ−１ウイルス感染を予防又は治療することは、（ｉ）ＡＩＤＳを含めた、該個体のＨＩＶ−１ウイルス感染に結びついた疾患を予防又は治療すること、及び（ｉｉ）ＨＩＶ−１疾患の進行を予防することを包含する。
【００６３】
本明細書に使用される用語「ＨＩＶ感染」は、一般に、１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）によるホスト動物、特にヒトホストの感染を包含する。「ＨＩＶ−１」は、本明細書において、ＨＩＶ−１ファミリーでの任意の株、形態、サブタイプ、クレード及び変種を表すために使用することができる。したがって、ＨＩＶ−１感染を処置することは、任意のＨＩＶ−１ファミリーのレトロウイルスのキャリアであるヒト又は活動性ＡＩＤＳと診断されたヒトの処置、及びそのようなヒトにおけるＡＩＤＳ関連状態の治療又は予防を包含する。ＨＩＶ−１のキャリアは、当技術分野において公知の任意の方法によって同定することができる。例えば、ヒトが抗ＨＩＶ−１抗体陽性であること、又はＨＩＶ−１陽性であること、又はＡＩＤＳの症状を有することに基づき、そのヒトをＨＩＶ−１キャリアとして同定することができる。すなわち、「ＨＩＶ−１感染を処置すること」は、例えば、急性原発性感染症候群（無症候性でありうるか、又は発熱、倦怠感、下痢、及び頭痛などの神経症状を有するインフルエンザ様疾患に関連しうる）、無症候感染（循環ＣＤ４＋Ｔ細胞数の漸減を伴う長い潜在期）、及びＡＩＤＳ（より重篤なＡＩＤＳ定義疾患及び／又は効果的な免疫機能と適合したレベル未満への循環ＣＤ４細胞数の減少によって定義される）が含まれるＨＩＶ−１感染のいくつかの進行段階の任意の一段階にある患者を処置することとして理解されたい。加えて、「ＨＩＶ−１感染を治療又は予防すること」は、また、例えばＨＩＶ−１汚染血との接触、輸血、体液交換、感染者との「危険な」性交、偶発的針穿刺、汚染された器具を用いた刺青もしくは鍼、又は妊娠、分娩もしくはその直後での母親から赤ちゃんへのウイルス伝染による、過去のＨＩＶ−１曝露の疑い後のＨＩＶ−１による感染疑いを処置することを包含する。
【００６４】
用語「ＨＩＶ−１感染を処置する」は、また、抗レトロウイルス療法に関連して、患者がウイルス量及び／又はＣＤ４ Ｔ細胞数に関してそのような療法に完全応答性又は部分応答性のいずれかであると理解されたい。
【００６５】
用語「ＨＩＶ−１感染を予防する」は、ＨＩＶ−１感染を有さないが、遅かれ早かれＨＩＶ−１による感染no危険があると考えられるヒトを処置することを包含しうる。
【００６６】
用語「ＡＩＤＳを処置する」は、より重篤なＡＩＤＳ定義疾患及び／又は有効な免疫機能と適合性のレベル未満への循環ＣＤ４細胞数の減少を示す患者を処置することを意味する。用語「ＡＩＤＳを処置する」は、また、ＡＩＤＳ関連状態を処置することを包含し、ＡＩＤＳ関連状態は、ＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）、進行性全身性リンパ節腫（ＰＧＬ）、抗ＨＩＶ抗体陽性状態、及びＨＩＶ陽性状態などのＡＩＤＳ又はＨＩＶ−１感染症、ＡＩＤＳ関連神経状態（認知症又は熱帯性不全対麻痺など）、カポジ肉腫、血小板減少性紫斑病、Pneumocystis carinii肺炎、Mycobacterial tuberculosis、食道カンジダ症、脳トキソプラズマ症、ＣＭＶ網膜炎、ＨＩＶ関連脳症、ＨＩＶ−１関連消耗症候群などの関連する日和見感染症に付随又は関連する障害及び疾患を意味する。
【００６７】
したがって、本明細書に使用される用語「ＡＩＤＳを予防する」は、ＨＩＶ−１感染を有する、又はＨＩＶ−１感染を有する疑いのある、又はＨＩＶ−１感染のリスクがある患者においてＡＩＤＳ（より重篤なＡＩＤＳ定義疾患及び／又は有効な免疫機能と適合性のレベル未満への循環ＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少によって特徴づけられる）及び／又はＡＩＤＳ関連状態の発症を予防することを意味する。
【００６８】
したがって、本明細書に使用される用語「ＨＩＶ−１の進行を予防する」は、ＨＩＶ−１感染を有する患者においてそのＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少を予防すること、及び／又はそのウイルス量の増加を予防することを意味し、それらは、疾患の合併症及び疾患の重症度増加に結びつく二つの主なマーカーである。
【００６９】
本明細書に使用されるアミノ酸残基は、アラニン（「Ａ」又は「Ａｌａ」とも呼ばれる）、アルギニン（（「Ｒ」又は「Ａｒｇ」とも呼ばれる）、アスパラギン（「Ｎ」又は「Ａｓｎ」とも呼ばれる）、アスパラギン酸（「Ｄ」又は「Ａｓｐ」とも呼ばれる）、システイン（「Ｃ」又は「Ｃｙｓ」とも呼ばれる）、グルタミン（「Ｑ」又はＧｌｎ」とも呼ばれる）、グルタミン酸（（「Ｅ」又は「Ｇｌｕとも呼ばれる）、グリシン（「Ｇ」又は「Ｇｌｙ」とも呼ばれる）、ヒスチジン（「Ｈ」又は「Ｈｉｓ」とも呼ばれる）、イソロイシン（「Ｉ」又は「Ｉｌｅ」とも呼ばれる）、ロイシン（「Ｌ」又は「Ｌｅｕ」とも呼ばれる）、リシン（「Ｋ」又は「Ｌｙｓ」とも呼ばれる）、メチオニン（「Ｍ」又は「Ｍｅｔ」とも呼ばれる）、フェニルアラニン（（「Ｆ」又は「Ｐｈｅ」とも呼ばれる）、プロリン（「Ｐ」又は「Ｐｒｏ」とも呼ばれる）、セリン（「Ｓ」又は「Ｓｅｒ」とも呼ばれる）、トレオニン（「Ｔ」又は「Ｔｈｒ」とも呼ばれる）、トリプトファン（「Ｗ」又は「Ｔｒｐ」とも呼ばれる）、チロシン（「Ｙ」又は「Ｔｙｒ」とも呼ばれる）及びバリン（「Ｖ」又は「Ｖａｌ」とも呼ばれる）を包含する。
【００７０】
本発明のペプチド中の全てのアミノ酸は、Ｄ型又はＬ型の両方でありうるが、天然Ｌ型が好ましい。
【００７１】
したがって、上記式（Ｉ）で示されるペプチドにおいて、アミノ酸残基Ｘ１が、（ｉｉ）Ｗ以外の任意のアミノ酸残基を意味する場合、アミノ酸残基Ｘ１は、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｔ、Ｓ、Ｙ又はＶのいずれか一つを意味しうる。同じ論法が、式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドのＸ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４アミノ酸残基のいずれかの意味のために使用される。
【００７２】
任意の特別な理論に縛られたいわけではないが、本発明者らは、式（Ｉ）で示されるペプチドが、生理学的に適合性の食塩溶液（例えば０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液）中に懸濁される場合、空間的に線形であると考える。
【００７３】
したがって、式（Ｉ）で示されるペプチドのいくつかの態様では、アミノ酸残基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４のそれぞれの意味（ｉｉ）が、それぞれＸ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４の意味（ｉ）のアミノ酸残基に比べて、空間コンフォメーション変化を発生しないアミノ酸残基から成る。
【００７４】
式（Ｉ）で示されるペプチドのいくつかの態様では、アミノ酸残基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４のそれぞれの意味（ｉｉ）は、小サイズの無荷電アミノ酸残基から成る。
【００７５】
式（Ｉ）で示されるペプチドのいくつかの態様では、アミノ酸残基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４のそれぞれの意味（ｉｉ）は、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）から成る群より選択される。
【００７６】
式（Ｉ）で示されるペプチドのいくつかの態様では、アミノ酸残基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４のそれぞれの意味（ｉｉ）は、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）及びプロリン（Ｐｒｏ又はＰ）から成る群より選択される。
【００７７】
式（Ｉ）で示されるペプチドのいくつかの好ましい態様では、アミノ酸残基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４のそれぞれの意味（ｉｉ）は、無極性側鎖を有する小サイズの無荷電アミノ酸残基から成る。いくつかの好ましい小サイズの無荷電アミノ酸残基は、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）から成る群より選択される。より好ましくは、無極性側鎖を有する小サイズの無荷電アミノ酸残基は、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）及びメチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）から成る群より選択される。他の好ましい態様では、無極性側鎖を有する小サイズの無荷電アミノ酸残基は、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）及びメチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）から成る群より選択される。
【００７８】
これらの好ましい態様のいくつかでは、アミノ酸残基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４のそれぞれの意味（ｉｉ）は、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）から成る群より選択される。
【００７９】
式（Ｉ）で示されるペプチドのいくつかの好ましい態様では、アミノ酸残基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４のそれぞれの意味（ｉｉ）は、アラニン残基（Ａｌａ又はＡ）から成る。
【００８０】
式（Ｉ）で示されるペプチドのいくつかの態様では、４個のアミノ酸残基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４のそれぞれは、その意味（ｉｉ）を示す。
【００８１】
式（Ｉ）で示されるペプチドのいくつかの態様では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４のうち３個のアミノ酸残基は、１個が残り２個とは独立してその意味（ｉｉ）を示し、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４の中の４番目のアミノ酸残基は、その意味（ｉ）を示す。
【００８２】
式（Ｉ）で示されるペプチドのいくつかの態様では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４の中の２個のアミノ酸残基は、一方が他方とは独立して、その意味（ｉｉ）を示し、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４の中の残りの２個のアミノ酸残基は、一方が他方とは独立して、それらの意味（ｉ）を示す。
【００８３】
式（Ｉ）で示されるペプチドのいくつかの好ましい態様では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４の中の１個だけのアミノ酸残基が、意味（ｉｉ）を示し、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４の中の残りのアミノ酸残基のそれぞれは、その意味（ｉ）を示す。
【００８４】
したがって、上式（Ｉ）で示されるペプチドのいくつかの好ましい態様では、
−  Ｘ１は、上記意味（ｉｉ）を示し、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４のそれぞれは、それらの個々の上記意味（ｉ）を示すか、又は
−  Ｘ２は、上記意味（ｉｉ）を示し、Ｘ１、Ｘ３及びＸ４のそれぞれは、それらの個々の上記意味（ｉ）を示すか、又は
−  Ｘ３は、上記意味（ｉｉ）を示し、Ｘ１、Ｘ２及びＸ４のそれぞれは、それらの個々の上記意味（ｉ）を示すか、又は
−  Ｘ４は、上記意味（ｉｉ）を示し、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３のそれぞれは、それらの個々の上記意味（ｉ）を示す。
【００８５】
上記態様は、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４残基の全てがそれら個々の意味（ｉ）を示すペプチドに比べて、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４の中の単一アミノ酸変化（すなわち意味（ｉｉ）を示す単一アミノ酸残基）が、空間コンフォメーション変化のリスクを最小限にし、したがって良好な抗ＨＩＶ特性を誘導する、すなわち抗ＨＩＶ中和抗体の生成を誘導する機会を増大させるであろうと考えられるので、最も好ましい。
【００８６】
式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドのなおさらなる態様では、該抗原性ペプチドは、２００アミノ酸残基以下のアミノ酸長を有する。これらの態様は、
【化６】
0006027094.tif 000007
アミノ酸残基長を有する式（Ｉ）で示されるペプチドを包含する。これらの好ましい態様のいくつかでは、式（Ｉ）で示されるペプチドは、１５〜２０アミノ酸残基長を含めた１０〜２６アミノ酸残基長を有する。
【００８７】
本明細書記載の式（Ｉ）で示されるペプチドは、公知のクローニング技法又は化学合成によって生成させることができる。
【００８８】
例えば、式（Ｉ）で示されるペプチドをコードするＤＮＡがクローニング技法の使用によって調製され、自己複製可能なベクターに挿入され、リコンビナントＤＮＡが調製される。リコンビナントＤＮＡがEscherichia coli、Bacillus subtilis、Actinomyces、酵母、糸状菌、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞などの適切なホストに導入され、トランスフォーマントが得られる。トランスフォーマントの培養生成物から、式（Ｉ）で示されるペプチドを含有するペプチドを得ることができる。又は、式（Ｉ）で示されるペプチドをコードするＤＮＡが調製され、コムギ胚芽及びEscherichia coli培養抽出物を使用する無細胞タンパク質合成系に供されて本発明のペプチドが合成される。次に、式（Ｉ）で示されるペプチドが担体タンパク質と連結されるいくつかの態様では、式（Ｉ）で示されるペプチドと所望の担体タンパク質との両方を含有する融合タンパク質から成る免疫原性生成物は、リコンビナントＤＮＡ技法によって合成することができる。
【００８９】
さらに、「固相法」又は「液相法」などの式（Ｉ）で示されるペプチドのための慣例の化学合成法を用いて、アミノ酸が連続的に結合され、脱水／縮合によって伸長される。
【００９０】
そのうえ、式（Ｉ）で示されるペプチドが、所望のペプチド又はポリペプチド、例えばタンパク質担体分子と連結されると、式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドを含む免疫原性生成物を合成することができる。
【００９１】
式（Ｉ）で示されるペプチドは、以下の抗原性ペプチドを包含する：
【化７】
0006027094.tif 000008
［式中：
−  Ｎｔ及びＣｔは、上に定義される式（Ｉ）で示されるペプチドと同じ意味を有し、
−  Ｘは、（Ｉａ）についてＷ、（Ｉｂ）についてＳ、（Ｉｃ）についてＮ及び（Ｉｄ）についてＳ以外の任意のアミノ酸残基である］。
【００９２】
式（Ｉ）で示されるペプチドのある態様では、該「任意のアミノ酸残基」は、アラニン残基（「Ａ」とも呼ばれる）である。それらの態様では、式（Ｉａ）〜（Ｉｄ）で示される各ペプチドのアミノ酸残基「Ｘ」は、「Ａ」を意味する。
【００９３】
好ましい態様では、式（Ｉ）で示されるペプチドは：
【化８】
0006027094.tif 000009
から成る群より選択される。
【００９４】
式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドのある態様では、Ｎｔ（「Ｎ末端」領域について）は、１〜５アミノ酸残基長を含めた１〜１０アミノ酸残基長を有するペプチドから成る。したがって、これらの態様によると、Ｎｔは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸残基長を有するペプチドである。いくつかの態様では、Ｎｔは、５又は６アミノ酸残基長を有する。
【００９５】
式（Ｉ）で示されるペプチドのある態様では、Ｎｔは、アミノ酸配列ＮＨ２−ＰＷＮＡ−ＣＯＯＨ［配列番号１０］を含むか、又はそれから成る。
【００９６】
式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドのある態様では、Ｃｔ（「Ｃ末端」領域について）は、１〜５アミノ酸残基長を含めた１〜１０アミノ酸残基長を有するペプチドから成る。したがって、これらの態様によると、Ｃｔは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸残基長を有するペプチドである。いくつかの態様では、Ｃｔは、５又は６アミノ酸残基長を有する。
【００９７】
式（Ｉ）で示されるペプチドのある態様では、Ｃｔは、アミノ酸配列ＮＨ２−ＬＤＤＩＷ−ＣＯＯＨ［配列番号１１］を含むか、又はそれから成る。
【００９８】
Ｎｔ及びＣｔペプチドのそれぞれは、共有結合によって、好ましくは通常のペプチド結合によって、ペプチドＳ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｋ−Ｘ４の対応する末端に直接連結される。
【００９９】
本発明による免疫原性組成物において、ＮｔもしくはＣｔペプチドの一方、又はそれらの両方は、単一アミノ酸モノマーのポリマーを含むか、又はそれから成る。例示的に、該アミノ酸ポリマーは、ポリアラニン、ポリグルタミン又はポリリシンポリマーから成りうる。
【０１００】
式（Ｉ）で示されるペプチドのＣ末端及び／又はＮ末端は、末端ＮＨ２基及び／もしくはＣＯＯＨ基の修飾によって、ならびに／又はその中に含有されるアミノ酸残基の側鎖のＮＨ２基及び／もしくはＣＯＯＨ基の修飾によって、本明細書において明示された天然配列から逸脱するおそれがある。例えば、担体分子のための結合部位を提供するために、これらの基は、アシル化、アセチル化、アミド化又は修飾される場合がある。
【０１０１】
ある態様では、抗原性ペプチドは：
【化９】
0006027094.tif 000010
から成る群より選択される。
【０１０２】
本発明による免疫原性組成物のある態様では、式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドは、担体分子と共有結合的に連結している。
【０１０３】
担体分子と連結された式（Ｉ）で示されるポリペプチドを含む免疫原性生成物を発生させるために使用される担体分子の種類は、当業者に全般的に周知である。担体分子の機能は、ＨＩＶ−１に対する免疫応答を高めるために、サイトカインの助け（Ｔ細胞ヘルプ）を提供することである。
【０１０４】
ペプチドが場合により結合される担体分子は、多様な公知の担体より選択することができる。ワクチン目的の担体分子の例は、ヒト又はウシ血清アルブミン及びキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などのタンパク質ならびに脂肪酸を包含する。式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドが共有結合的に連結されうる担体分子の他の態様には、ジフテリアトキソイド、コレラトキソイド、E. coli易熱性トキソイド又は破傷風トキソイドなどの細菌毒素又はトキソイド、N. meninigitidis外膜タンパク質（欧州特許出願EP0372501）、合成ペプチド（欧州特許出願EP0378881及びEP0427347）、熱ショックタンパク質（ＰＣＴ出願である国際公開公報第９３／１７７１２号）、百日咳タンパク質（ＰＣＴ出願である国際公開公報第９８／５８６６８号）、H. influenzae由来プロテインＤ（ＰＣＴ出願である国際公開公報第００／５６３６０号）及びC. difficile由来毒素Ａ又はＢ（国際特許出願である国際公開公報第００／６１７６１号）が挙げられる。
【０１０５】
必要に応じて任意の適切なリンカーとの任意の適切なコンジュゲーション反応を用いることができる。本明細書の実施例は、式（Ｉ）で示されるペプチドがＫＬＨ担体分子と共有結合的に連結している免疫原性組成物の態様を例示している。
【０１０６】
本発明は、また、医薬の免疫原性活性成分として使用するためを含めた、医薬として使用するための、場合により担体分子と共有結合している、本明細書記載の式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドに関する。
【０１０７】
本発明は、また、個体のＨＩＶ−１ウイルス感染を予防及び／又は治療するための方法に使用するための、場合により担体分子と共有結合している、本明細書記載の式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドを扱う。
【０１０８】
本発明は、また、ＨＩＶ−１に感染した個体を予防及び／又は治療するための、すなわち個体のＨＩＶ−１ウイルス感染を予防及び／又は治療するための薬物を製造するための、場合により担体分子と共有結合している、式（Ｉ）で示される抗原性ポリペプチドの使用に関係する。
【０１０９】
本発明は、また、ＨＩＶ−１感染個体を予防及び／又は治療するための、すなわち個体のＨＩＶ−１ウイルス感染を予防及び／又は治療するための方法であって、好ましくは担体分子と連結された式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドを含む免疫原性組成物を該個体に投与する工程を含む方法を扱う。
【０１１０】
ある態様では、本発明により使用される免疫原性組成物は、予防目的又は治療目的のための、それを必要とする個体への式（Ｉ）で示されるペプチド１０ng〜１mgの投与に適合された量の、式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドを含む。
【０１１１】
式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドの量１０ng〜１０mgは、式（Ｉ）で示されるペプチドの量約
【化１０】
0006027094.tif 000011
を包含する。
【０１１２】
配列番号１２、１３、１４又は１５で示されるペプチドの群より選択される式（Ｉ）で示されるペプチドの量は、特に約２００μg、５００μg又は１mgでありうる。
【０１１３】
当業者は、式（Ｉ）で示されるペプチドの量を、日常的なアッセイを行うこと、ならびにin vivoで投与された場合にＣＤ４＋Ｔ細胞のＨＩＶ−１ウイルス感染を遮断する、及び／又は未感染ＣＤ４＋Ｔ細胞へのＨＩＶ−１ウイルスの蔓延を遮断する抗体応答を誘導するペプチド量の範囲を、本明細書の実施例に開示された１種又は複数のアッセイを含めた公知のアッセイを用いて決定することによって容易に適合させることができる。
【０１１４】
特に、式（Ｉ）で示されるペプチドの量は、そのアミノ酸長に応じて、したがってその分子量に応じて変動する場合があり、式（Ｉ）で示されるペプチドの重量あたりの配列「Ｓ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｋ−Ｘ４」の数の比率は、該式（Ｉ）で示されるペプチド中に含有されるＣｔ及びＮｔペプチドの長さと共に変動し、したがって、該ペプチドの分子量と共に変動することが考慮される。
【０１１５】
また、式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドが担体分子と結合している、及び該担体分子と結合している該式（Ｉ）で示されるペプチドを含むか、又はそれから成る免疫原性化合物を患者が投与される、好ましい態様では、投与されるべき免疫原性ペプチドの量は、（ｉ）式（Ｉ）で示されるペプチドの分子量と、（ｉｉ）使用される担体分子の分子量との両方に応じて変動しうる。
【０１１６】
個体に投与されるべき免疫原性化合物の量は、当業者によって容易に決定又は適合され、その当業者は、主として、配列番号１２〜１５）から成る群より選択される式（Ｉ）で示されるペプチドの有効量範囲が含まれる、式（Ｉ）で示されるペプチドの有効量範囲によって、及び次にその当業者が投与するつもりである免疫原性化合物の分子量によって導かれる。
【０１１７】
いくつかの態様では、投与されるべき免疫原性ペプチドの量は、該免疫原性化合物約０．１μg、０．５μg、１μg、５μg、１０μg又は２０μgでありうる。
【０１１８】
式（Ｉ）で示されるペプチドの量は、最大で、式（Ｉ）で示されるペプチド１０，０００mgでありうる。
【０１１９】
上に詳記された式（Ｉ）で示されるペプチドの量は、該式（Ｉ）で示されるペプチドが本発明による免疫原性組成物中で担体分子とコンジュゲーションされた場合にも適用される。
【０１２０】
例示的に、ヒト個体に使用される場合、ＫＬＨ担体分子とコンジュゲーションされた式（Ｉ）で示されるペプチドを含む免疫原性組成物は、免疫原性生成物であるＫＬＨと式（Ｉ）で示されるペプチドとのコンジュゲート０．１μg〜５０μgを含有しうる。
【０１２１】
ある態様では、免疫原性組成物は、それを必要とする個体に少なくとも２回投与される。これらの態様では、本発明による免疫原性組成物の第２の投与工程は、第１の投与工程の２週間〜６ヶ月後の期間に行われる。
【０１２２】
ある態様では、免疫原性組成物は、それを必要とする個体に少なくとも３回投与される。これらの態様では、本発明による該免疫原性組成物の第２の投与工程は、第１の投与工程の２週間〜６ヶ月後の期間に行われる。これらの態様では、該免疫原性組成物の第３の投与工程は、第１の投与工程の６ヶ月超〜約１年後の期間に行われる。
【０１２３】
いくつかの態様では、該免疫原性組成物は、次に再び免疫処置された個体に、例えば５年毎又は１０年毎に投与される。
【０１２４】
本発明は、また、本明細書記載の式（Ｉ）で示される抗原性ポリペプチドを含む免疫原性組成物に関する。
【０１２５】
ある態様では、式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドは、担体分子と共有結合的に連結している。
【０１２６】
ある態様では、本発明による免疫原性組成物は、さらに、１種又は複数の免疫アジュバント剤を含む。
【０１２７】
式（Ｉ）で示されるペプチドを含む免疫原性生成物、好ましくは該式（Ｉ）で示されるペプチドと担体分子との間のコンジュゲートから成る免疫原性生成物を含み、さらに、１種又は複数の免疫アジュバント化合物を含む、本明細書において同義の免疫原性組成物は、本明細書において「ワクチン組成物」とも呼ばれる場合がある。
【０１２８】
いくつかの態様では、本発明による免疫原性組成物と、本発明によるワクチン組成物との間に、そのような組成物を称するために採用された用語以上に特定の区別は行われない。
【０１２９】
より正確には、免疫原性組成物は、発生した抗体が免疫処置された哺乳生物に予防効果又は治療効果を発揮すると予想されない状況において、哺乳生物、例えばマウス、ウサギ、ヒツジ、ウマ又はヤギ生物に投与されたときに式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体を発生させることを狙いとする。本発明による免疫原性組成物は、これらの抗体のさらなる非治療的使用のために、例えばＨＩＶ−１ウイルス検出試薬又はＨＩＶ由来ペプチド検出試薬として、式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体を生成させるために使用することができる。
【０１３０】
他方で、本発明によるワクチン組成物は、発生した抗体が、免疫処置された哺乳生物において予防効果又は治療効果を発揮すると予想されない状況で、該ワクチン組成物が投与される哺乳生物において式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体を発生させることを狙いとする。
【０１３１】
免疫アジュバント剤は、非限定的に、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）、ＱＳ−２１（Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, Mass.）；ＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ；Corixa, Hamilton, Mont.）、５２９（アミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物, Corixa, Hamilton, Mont.）、ＩＬ−１２（Genetics Institute, Cambridge, Mass.）；ＧＭ−ＣＳＦ（Immunex Corp., Seattle, Wash.）；Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−テロニル（theronyl）−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）；Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと呼ばれる）；Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ−エチルアミン）（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）；及びコレラ毒素を包含する。使用されうる他の免疫アジュバント剤又は化合物は、コレラ毒素の無毒性誘導体、例えばそのＡサブユニットなど、及び／又はN. meningitidisポリペプチドとコレラ毒素もしくはそのＢサブユニット（「ＣＴＢ」）とのコンジュゲートもしくは遺伝子工学融合体、プロコレラゲノイド（procholeragenoid）、菌類多糖、例えばシゾフィラン、ムラミルジペプチド、ムラミルジペプチド（「ＭＤＰ」）誘導体など、ホルボールエステル、E. coli易熱性毒素、ブロックポリマー又はサポニンを包含する。
【０１３２】
例示的に、本明細書の実施例は、（ｉ）免疫原性生成物としてＫＬＨと式（Ｉ）で示されるペプチドとのコンジュゲート及び（ｉｉ）免疫アジュバント剤としてフロイント不完全アジュバントを含むワクチン組成物を例示する。
【０１３３】
そのような免疫原性組成物の製剤は、当業者に周知である。本発明の免疫原性組成物は、好ましくは、薬学的に許容されうる担体を含む。適切な薬学的に許容されうる担体及び／又は希釈剤には、任意及び全ての通常の溶媒、分散媒、フィラー、固体担体、水溶液、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などが挙げられる。適切な薬学的に許容されうる担体には、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなどの１種又は複数、さらにはその組み合わせが挙げられる。薬学的に許容されうる担体は、さらに、湿潤剤又は乳化剤、抗体の有効期限又は有効性を高める保存料又は緩衝剤などの少量の補助物質を含みうる。薬学的に許容されうる担体の調製及び使用は、当技術分野において周知である。任意の通常の媒体又は薬剤が活性成分と不適合性である場合を除いて、本発明の免疫原性組成物中へのその使用が考えられている。
【０１３４】
そのような免疫原性組成物は、非経口的に、例えば皮下又は筋肉内のいずれかの注射により、さらには経口又は経鼻的に投与することができる。他の投与様式は、非限定的に、例えば経口製剤、肺製剤、坐剤及び経皮適用を採用する。例えば経口製剤には、非限定的に、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような普通に採用される賦形剤が挙げられる。
【０１３５】
本発明は、また、本明細書記載の式（Ｉ）で示される抗原性ポリペプチドを１種又は複数の免疫アジュバント化合物と組み合わせて含むワクチン組成物に関係する。
【０１３６】
本発明は、また、（ｉ）式（Ｉ）で示されるペプチドを含む免疫原性生成物が、（ｉｉ）１種又は複数の免疫アジュバント化合物と組み合わされたものを含むワクチン組成物に関する。
【０１３７】
一般に、本発明による免疫原性組成物又はワクチン組成物は、１、２、３、４又は最大で５種の異なる免疫アジュバント化合物を含む。
【０１３８】
好ましい態様では、本発明による免疫原性組成物又はワクチン組成物は、１又は２種の異なる免疫アジュバント化合物を含む。
【０１３９】
免疫原性組成物又はワクチン組成物のいくつかの好ましい態様では、式（Ｉ）で示されるペプチドは：
【化１１】
0006027094.tif 000012
から成る群より選択される。
【０１４０】
免疫原性組成物又はワクチン組成物のいくつかの好ましい態様では、式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドは：
【化１２】
0006027094.tif 000013
から成る群より選択される。
【０１４１】
いくつかの好ましい態様では、式（Ｉ）で示される抗原性ポリペプチドは、担体分子と共有結合的に連結している。
【０１４２】
本発明は、また、ＨＩＶ−１感染個体を予防及び／又は治療することを狙いとするワクチン組成物の活性薬剤としての、本明細書に広く記載されるような式（Ｉ）で示される抗原性ペプチドに関する。
【０１４３】
より全般的に、本発明は、また、本明細書に広く記載されるような式（Ｉ）で示されるペプチド自体に関する。
【０１４４】
式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体
本明細書において広く論じられ、実験的に例示されたように、式（Ｉ）で示されるペプチドを含む免疫原性組成物を個体に免疫処置することで、抗ＨＩＶ−１広域中和抗体の生成が誘導される。これらの抗ＨＩＶ−１広域中和抗体自体は、活性抗ＨＩＶ−１剤として使用することができる。
【０１４５】
式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体は、ＨＩＶ−１の予防又はＨＩＶ−１の治療目的のために、さらにはＨＩＶ−１の診断目的のために使用することができる。
【０１４６】
いくつかの態様では、式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体は、ヒトを含めた哺乳類に本明細書記載の式（Ｉ）で示されるペプチドを含む免疫原性組成物を免疫処置後に生成される抗体から成る。
【０１４７】
いくつかの態様では、式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体は、ＨＩＶ−１に対する免疫応答を生じたＨＩＶ感染個体から得られる。
【０１４８】
上記の両態様では、該抗体は、該ヒトを含めた該哺乳類から採取された試料、特に血液試料からの精製によって得ることができる。
【０１４９】
上記両態様では、該抗体は、また、例えば該ヒトを含めた該哺乳類から得られたＢ細胞から出発して、それらをコードする関連ＤＮＡ材料をクローニングすることによって得ることができる。
【０１５０】
上記両態様では、該抗体は、また、該ヒトを含めた該哺乳類から採取された該抗体のアミノ酸配列を配列決定し、次に、式（Ｉ）で示されるペプチドに対する関連リコンビナント抗体を生成させるために、該抗体又はそのＣＤＲを含むその一部をコードするＤＮＡ分子を合成することによって得ることができる。
【０１５１】
本発明は、また、本明細書記載の式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体を扱う。
【０１５２】
いくつかの好ましい態様では、該抗体は：
【化１３】
0006027094.tif 000014
から成る群より選択される式（Ｉ）で示されるペプチドに対するものである。
【０１５３】
いくつかの他の好ましい態様は、該抗体は：
【化１４】
0006027094.tif 000015
から成る群より選択される式（Ｉ）で示されるペプチドに対するものである。
【０１５４】
式（Ｉ）で示されるペプチドを含む免疫原性組成物を免疫処置することによって式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体を調製することは、特に本明細書の実施例に開示されている。又は、式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体は、そのような抗体をすでに自然に有するＨＩＶ−１感染患者から採取することができ；それらは、また、それらを生成しているヒトＢリンパ球の不死化後に得ることができ；また、それらのｃＤＮＡをクローニングし、さらに、それら又はそれらの誘導体をリコンビナントＤＮＡ技法により生成させるために使用することができる。
【０１５５】
本発明は、また、ＨＩＶ−１感染個体を予防及び／又は治療するための医薬を製造するための、本明細書記載の免疫原性組成物を免疫処置された個体から得られた抗ＨＩＶ−１抗体の使用を扱う。
【０１５６】
本明細書における用語「抗体」は、有用な抗原結合特異性を有する分子を表すために使用される。当業者であれば、この用語が、抗体のフラグメント又は誘導体であるポリペプチドであって、それでも同じ又は極めて類似した機能性を示すことができるポリペプチドにも及びうることを容易に認識するであろう。そのような抗体フラグメント又は誘導体を、本明細書において使用されるような抗体という用語に包含させるつもりである。本明細書では、受動免疫療法用の「抗体」又は「抗体分子」によって、免疫グロブリン分子全体だけでなく、ＨＩＶ−１ウイルスに対して中和活性を保持するＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及び他のそのフラグメントなどの、そのフラグメントも意味される。同様に、抗体という用語には、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）及びドメイン抗体（ｄＡｂ）などの抗体の遺伝子工学誘導体が含まれる。
【０１５７】
式（Ｉ）で示されるペプチドに対する精製抗体を含む組成物の製造は、本明細書の実施例に開示されている。
【０１５８】
いくつかの態様では、式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体は、ポリクローナル抗体から成る。式（Ｉ）で示されるペプチドに対する精製ポリクローナル抗体を含む組成物の生成は、本明細書の実施例に開示されている。
【０１５９】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書において、通常のモノクローナル抗体ハイブリドーマなどの任意の単離されたＡｂを包含し、さらにまた、例えば哺乳類細胞系で発現された同一のヒト免疫グロブリンの試料などの、任意の細胞によって生成された、単離された単一特異性抗体を包含するために使用される。
【０１６０】
抗体の可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメインは、抗原認識に関与するが、これは、初期のプロテアーゼ消化実験によって最初に認識された事実である。げっ歯類抗体の「ヒト化」によってさらなる確証が見出された。生じた抗体がげっ歯類親抗体の抗原特異性を保持するように、げっ歯類起源の可変ドメインをヒト起源の定常ドメインに融合させることができる（Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855）。抗原特異性が可変ドメインによって付与され、定常ドメインとは無関係であることは、全てが１種又は複数の可変ドメインを含有する抗体フラグメントの細菌発現を伴う実験から公知である。これらの分子には、Ｆａｂ様分子（Better et al (1988) Science 240, 1041）；Ｆｖ分子（Skerra et al (1988) Science 240, 1038）；ＶＨ及びＶＬパートナードメインが柔軟なオリゴペプチドを介して連結している単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子（Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879）及び単離されたＶドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄａｂ）（Ward et al (1989) Nature 341, 544）が挙げられる。それらの特異的結合部位を保持する抗体フラグメントの合成に関与する技法全般の総説は、Winter及びMilstein（1991, Nature 349, 293-299）に見出すことができる。
【０１６１】
「ＳｃＦｖ分子」によって、本発明者らは、ＶＨ及びＶＬパートナードメインが柔軟なオリゴペプチドを介して連結している分子を意味する。ＳｃＦｖ抗体などの操作抗体（engineered  antibody）は、参照により本明細書に組み入れられるJ. Huston et al, (1988) "Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single chain Fv analogue produced in E. coli", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 5879-5883及びA. Pluckthun, (1991) "Antibody engineering; Advances from use of E. coli expression systems", Bio/technology 9 (6): 545-51に記載された技法及びアプローチを用いて作製することができる。
【０１６２】
本明細書記載のように反応性の、適切なモノクローナル抗体は、公知の技法、例えば"Monoclonal Antibodies; A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988)及び"Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Application", S G R Hurrell (CRC Press, 1982)に開示された技法によって調製することができる。
【０１６３】
さらなる態様は、抗原と接触するマウス抗体領域である相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒト抗体フレームワークに転移されたヒト化抗体を包含する。そのような抗体は、ほぼ完全にヒト抗体であり、患者に投与された場合に有害抗体応答を滅多に起こさない。いくつかのキメラ抗体又はヒト化抗体が治療薬として登録されており、今や様々な適応に広く使用されている（Borrebaeck & Carlsson, 2001, Curr. Opin. Pharmacol. 1: 404-408）。
【０１６４】
抗体がヒト化抗体であることが好ましい。適切に調製された非ヒト抗体は、公知の方法で、例えばマウス抗体のＣＤＲ領域をヒト抗体のフレームワーク中に挿入することによって「ヒト化」することができる。ヒト化抗体は、Verhoeyen et al (1988) Science, 239, 1534-1536及びKettleborough et al, (1991) Protein Engineering, 14 (7), 773-783に記載された技法及びアプローチを用いて作製することができる。
【０１６５】
他の抗体の態様は、リコンビナント技法を用いて生成させることができる完全ヒト抗体を包含する。典型的には、数十億種の異なる抗体を含む大規模ライブラリーが使用される。例えばマウス抗体のキメラ化又はヒト化を採用する以前の技法とは対照的に、この技法は、特異的抗体を発生させるために動物の免疫処置に頼らない。その代わりに、リコンビナントライブラリーは、莫大な数の予め製造された抗体変異体を含み、ここで、そのライブラリーは、任意の抗原に特異的な抗体を少なくとも一つ有する見込みがある。
【０１６６】
本明細書に提供されるようなＨＩＶ−１感染の受動的処置では、本発明の抗体がそれを必要とする患者に投与され、好ましくは静脈投与される。投与頻度は、患者の血清中の抗体力価の経時的減少をたどることによって臨床的に決定することができるが、いずれにせよ、１年に１〜５２回、最も好ましくは１年に１〜１２回の間の頻度でありうる。抗体量は、疾患の重症度又は血清中の抗体の半減期に応じて変動しうるが、好ましくは患者１kgあたり１〜１０mgの範囲であり、好ましくは患者１kgあたり１〜５mgの範囲であり、最も好ましくは患者１kgあたり１〜２mgである。
【０１６７】
ＨＩＶ−１の診断、予測、モニタリングの方法及びキット
本明細書の実施例に開示されるように、式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体は、ＨＩＶ−１感染患者から見出すことができる。
【０１６８】
結果的に、式（Ｉ）で示されるペプチドは、被験個体中の該ペプチドに対する抗体の存在及び場合により量を決定するための検出試薬として使用することができる。
【０１６９】
本発明は、試料中の式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体を検出及び／又は定量するための方法であって、以下：
ａ）被験試料を式（Ｉ）で示される１種又は複数のペプチドと接触させる工程、ならびに
ｂ）該式（Ｉ）で示されるペプチドと該試料中に存在する抗体との間の複合体の形成を検出及び／又は定量する工程
を含む方法に関する。
【０１７０】
本発明は、また、試料中から式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体を検出及び／又は定量するためのキットであって：
ａ）その上の式（Ｉ）で示される１種又は複数のペプチド、及び
ｂ）該試料中に存在する該ペプチドと抗体との間に形成した複合体を検出するための１種又は複数の試薬
を含むキットに関する。
【０１７１】
いくつかの態様では、被験試料は、個体から以前に採取された試料から成り、その個体には、（ｉ）ＨＩＶ−１ウイルスに感染されたと疑われる個体及び（ｉｉ）ＨＩＶ−１ウイルスに感染している個体が含まれる。
【０１７２】
いくつかの態様では、該試料は、（ｉ）式（Ｉ）で示されるペプチドを含む免疫原性組成物を免疫処置された哺乳類から採取された試料から精製された抗体の調製物及び（ｉｉ）式（Ｉ）で示されるペプチドに対するモノクローナル抗体又はリコンビナント抗体の調製物などの、式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体を含有すると予想される調製物から成る。
【０１７３】
上記検出方法のいくつかの態様では、式（Ｉ）で示されるペプチド（１種又は複数）は、基材上に固定化される。
【０１７４】
いくつかの態様では、式（Ｉ）で示されるペプチドは、個体のＨＩＶ−１ウイルス感染を診断するための試薬として使用することができる。
【０１７５】
したがって、本発明は、また、個体におけるＨＩＶ−１ウイルス感染の診断のための方法であって、以下：
ａ）該個体からの試料を式（Ｉ）で示される１種又は複数のペプチドと接触させる工程、及び
ｂ）該式（Ｉ）で示されるペプチドと該試料中に存在する抗体との間の複合体の形成を検出する工程
を含む方法に関する。
【０１７６】
方法の工程ｂ）のいくつかの態様では、該式（Ｉ）で示されるペプチドと抗体との間の複合体が、存在する場合、定量される。
【０１７７】
本発明は、また、個体におけるＨＩＶ−１ウイルス感染の診断のためのキットであって：
ａ）式（Ｉ）で示される１種又は複数のペプチド、及び
ｂ）該式（Ｉ）で示されるペプチドと、該個体から採取された試料中に存在する抗体との間に形成された複合体を検出するための１種又は複数の試薬
を含むキットに関する。
【０１７８】
上記診断方法又は診断キットのいくつかの態様では、該式（Ｉ）で示されるペプチド（１種又は複数）は、本明細書にさらに開示されるように、基材上に固定化される。
【０１７９】
上記方法によると、式（Ｉ）で示されるペプチド（１種又は複数）と、被験個体から以前に採取された試料中に含有される抗体との間の複合体の形成が検出される場合、ＨＩＶ−１感染が確定される。
【０１８０】
上記診断方法によると、ＨＩＶ−１ウイルスに対するＨＩＶ−１感染個体の免疫応答のレベルは、式（Ｉ）で示されるペプチド（１種又は複数）と、被験個体から以前に採取された試料中に含有される抗体との間に形成された複合体を定量することによって決定される。
【０１８１】
いくつかの態様では、式（Ｉ）で示されるペプチドは、個体のＨＩＶ−１ウイルス感染の進行を予測するための試薬として使用することができる。
【０１８２】
したがって、本発明は、また、個体におけるＨＩＶ−１ウイルス感染の進行を予測するための方法であって、以下：
ａ）該個体からの試料を、式（Ｉ）で示される１種又は複数のペプチドと接触させる工程、ならびに
ｂ）該式（Ｉ）で示されるペプチドと該試料中に存在する抗体との間の複合体の形成を検出及び定量する工程
を含む方法に関する。
【０１８３】
本発明は、また、個体におけるＨＩＶ−１ウイルス感染の進行を予測するためのキットであって：
ａ）式（Ｉ）で示される１種又は複数のペプチド、及び
ｂ）該式（Ｉ）で示されるペプチドと、該個体から採取された試料中に存在する抗体との間に形成された複合体を検出するための１種又は複数の試薬
を含むキットに関する。
【０１８４】
上記方法によると、式（Ｉ）で示されるペプチド（１種又は複数）と、被験個体から以前に採取された試料中に含有される抗体との間の複合体の形成が検出される場合、ＨＩＶ−１感染が確定される。
【０１８５】
上記予測方法によると、ＨＩＶ−１ウイルスに対するＨＩＶ−１感染個体の免疫応答のレベルが工程ｂ）で決定される。
【０１８６】
上記予測方法を行う場合、工程ｂ）で、式（Ｉ）で示されるポリペプチドに対する高レベルの抗体が測定される場合、好都合な転帰が予想される。逆に、工程ｂ）で、式（Ｉ）で示されるポリペプチドに対する低レベルの抗体が測定される場合、転帰不良が予想される。
【０１８７】
本明細書に使用されるような、式（Ｉ）で示されるペプチドに対する「高」レベルの抗体は、一つ又は複数の参照値に比べて決定される。
【０１８８】
上記予測法のいくつかの態様では、式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体の存在が、該ＨＩＶ−１感染個体から以前に採取された試料中から検出されるならば、好都合な転帰が確定されうる。それは、本明細書の実施例に示されるように、式（Ｉ）で示されるペプチドに対する血清抗体を有する個体が、低いウイルス量及び高いＣＤ４＋Ｔ細胞数などの良好な臨床パラメーターを有することが分かっているからである。
【０１８９】
上記診断方法、上記予測方法、及び該方法を行うためのキットは、ＨＩＶ−１感染個体における抗ＨＩＶ−１医学的処置の効率をモニタリングするために使用することができる。
【０１９０】
本発明は、また、ＨＩＶ−１感染個体における抗ＨＩＶ−１の医学的処置をモニタリングするための方法であって：
ａ）該ＨＩＶ−１感染個体に抗ＨＩＶ−１を施す工程、及び
ｂ）該患者から採取された試料中の、式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体のレベルを決定する工程
を含む方法に関する。
【０１９１】
モニタリング方法のいくつかの態様では、式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体のレベルは、該個体に抗ＨＩＶ−１処置を施す前に、したがってその方法の工程ａ）の前に決定される。
【０１９２】
モニタリング方法のいくつかの態様では、特に抗ＨＩＶ−１処置が該個体に抗ＨＩＶ−１薬学的組成物を投与する複数の工程を含む場合、上記モニタリング方法は、各投与工程で、又は一つもしくは複数の投与工程だけで、又は最終投与工程後に行われる。
【０１９３】
上記方法にしたがってモニタリングできる抗ＨＩＶ−１医学的処置の態様は、本明細書記載の式（Ｉ）で示されるペプチドを含むワクチン組成物をＨＩＶ−１感染個体に免疫処置することを包含することが、本明細書に詳記される。
【０１９４】
「抗体を含有する試料」又は「試料中の抗体を検出する」などの語句は、抗体が含有又は検出されない試料又は決定（検出の試み）を除外するつもりはない。一般的な意味で、本発明は、ＨＩＶ−１ウイルス感染に応答して、及びＨＩＶ−１ウイルス疾患の経過中に生成された抗体が試料中に存在するかどうかを、抗体が検出されるかどうかにかかわらず決定するためのアッセイを伴う。
【０１９５】
ペプチドと抗体とが特異的に反応するようにそれらを反応させるための条件は、当業者に周知である。例えば、Current Protocols in Immunology (Coligan et al., editors, John Wiley & Sons, Inc)又は本明細書の実施例を参照されたい。
【０１９６】
診断方法は、抗体を含有する見込みのある体液又は組織の試料を取り出すことを含む。抗体は、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、又はＩｇＡ型でありうる。一般に、ＩｇＭ及び／又はＩｇＡ抗体は、例えば初期感染の検出のために検出される。上述の追加的なペプチド（例えば、鞭毛タンパク質の検出用のペプチド）のいくつかをその方法に使用すると、ＩｇＧ抗体を検出することができる。試料は、好ましくは入手が容易なものであって、静脈血試料又はさらに指穿刺から得られた血清又は血漿であってもよい。他の身体部分からの組織又は脳脊髄液（ＣＳＦ）、唾液、胃液分泌、粘液などの他の体液は、抗体を含有することが知られており、試料の起源として使用することができる。
【０１９７】
ペプチド抗原と試料抗体とを適切な媒体中で反応させてしまえば、アッセイが行われて抗体−ペプチド反応の存在又は不在が判定される。熟練者に明らかな多種類の適切なアッセイの中に、免疫沈降及び凝集アッセイがある。
【０１９８】
本発明の態様では、アッセイは、（１）試料中の抗体（１種もしくは複数）を固定化すること、本発明のペプチドを添加すること、及び次にペプチドに結合した抗体の程度を、例えばペプチドをラベルすること、もしくはペプチドを特異的に認識するラベル抗体などのラベル物質（コンジュゲート、結合パートナー）を添加することによって検出すること；（２）本発明のペプチドを固定化すること、抗体（１種もしくは複数）を含有する飼料を添加すること、及び次にペプチドに結合した抗体の量を、例えば、抗体を特異的に認識する、ラベル抗体などのラベル物質（コンジュゲート、結合パートナー）を添加することによって検出すること；又は（３）反応物を全く固定化せずにペプチドと抗体（１種又は複数）含有試料を反応させること、及び次に例えばペプチドをラベルすること、もしくはペプチドを特異的に認識するラベル抗体などのラベル物質（コンジュゲート、結合パートナー）を添加することによって、抗体とペプチドとの複合体の量を検出することを含みうる。
【０１９９】
本発明のペプチドを固定化することは、共有又は非共有結合性のいずれかの場合があり、非共有結合性固定化は、非特異的（例えばマイクロタイターウェル内の例えばポリスチレン表面への非特異的結合）でありうる。固体又は半固体の担体、支持体又は表面への特異的又は半特異的結合は、固体又は半固体の担体、支持体又は表面へのそれの共有結合性又は非共有結合性結合を可能にする部分を関連して有するペプチドによって果たすことができる。例えば、その部分は、担体、支持体又は表面に結合した成分に親和性を有しうる。この場合、その部分は、例えば、６−アミノヘキサン酸などの、ペプチドのアミノ基に結合したビオチンもしくはビオチニル基又はそのアナログの場合があり、そのときその成分は、アビジン、ストレプトアビジン又はそのアナログである。一選択肢は、その部分がアミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号：１７）を有し、担体が、Ｎｉ＋＋イオンをチャージされたニトリロ三酢酸誘導体（ＮＴＡ）を含む状況である。例えば、磁気ビーズあるいはスチレンジビニルベンゼン、ヒドロキシル化スチレンジビニルベンゼンなどのコポリマーのラテックス、ポリスチレン、カルボキシル化ポリスチレン、カーボンブラックビーズ、非活性化又はポリスチレンもしくはポリ塩化ビニル活性化ガラス、エポキシ活性化多孔質磁気ガラス、ゼラチンもしくは多糖のパーティクル又は他のタンパク質パーティクル、赤血球、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体又はそのような抗体のＦａｂフラグメントは、適切な担体、支持体又は表面の中に含まれる。
【０２００】
特異的抗体の検出のために抗原を使用するイムノアッセイのプロトコールは、当技術分野において周知である。例えば、通常のサンドイッチアッセイを使用することができ、又は通常の競合アッセイ形式を使用することができる。いくつかの適切な種類のアッセイの考察については、Current Protocols in Immunology（上記）を参照されたい。好ましい一アッセイでは、抗体を含有する試料の添加前又は添加後のいずれかで、本発明のペプチドが、固体又は半固体の表面又は担体に共有結合又は非共有結合によって固定化される。
【０２０１】
特異的結合アッセイ、特にイムノアッセイを行うための装置は、公知であり、本方法に使用するために容易に適応することができる。一般に、沈殿、遠心分離、濾過、クロマトグラフィー、又は磁気などの分離工程を要する異種アッセイ法よりも固相アッセイの方が、試薬の分離が迅速及び簡単なことから、実施が容易である。固相アッセイ装置には、マイクロタイタープレート、フロースルーアッセイ装置、ディップスティック、及びイムノキャピラリー又はイムノクロマトグラフィー性イムノアッセイ装置が挙げられる。
【０２０２】
本発明の態様では、固体又は半抗体の表面又は担体は、マイクロタイターウェルの底面もしくは側面；フィルター表面もしくはメンブラン（例えばニトロセルロースメンブランもしくはＰＶＤＦ（フッ化ポリビニリデン）メンブラン、例えばImmobilonメンブランなど）；中空糸；ビーズ状クロマトグラフィー媒体（例えばアガロースもしくはポリアクリルアミドゲル）；磁気ビーズ；繊維状セルロースマトリックス；ＨＰＬＣマトリックス；ＦＰＬＣマトリックス；ペプチドが結合した分子が液相中に溶解もしくは分散されたときに、フィルターによって保持できるような分子量を有する物質；ミセルに混入することなしに液相を変化もしくは交換させる、ミセルを形成するもしくはミセルの形成に関与する能力のある物質；水溶性ポリマー；又は任意の他の適切な担体、支持体もしくは表面である。
【０２０３】
本発明のいくつかの態様では、ペプチドは、検出を可能にする適切なラベルを備える。単独で、又は他の組成物もしくは化合物と協力して検出可能なシグナルを提供する能力がある通常のラベルを使用することができる。適切な検出方法には、例えば、免疫蛍光顕微鏡法、例えば共焦点顕微鏡法など、又はフローサイトメトリー（ＦＡＣｓｃａｎ）による、蛍光ラベルで直接又は間接的にタグ付けされた薬剤の検出；オートラジオグラフィーによる放射性ラベルされた薬剤の検出；電子顕微鏡法；免疫染色；細胞成分分画などが挙げられる。一態様では、放射性エレメント（例えば放射性アミノ酸）が、ペプチド鎖に直接組み入れられ；別の態様では、放射性ラベルが、ビオチン／アビジン相互作用、フルオレセインとコンジュゲーションした抗体との結合などを介してペプチドと結合される。一態様では、抗体用の検出可能な特異的結合パートナーが混合物に添加される。例えば、結合パートナーは、第１抗体に結合する検出可能な第２抗体でありうる。この第２抗体は、例えばアビジン／ビオチン系などの、放射性ラベル、酵素ラベル、蛍光ラベル、発光ラベル、又は他の検出可能なラベルでラベルすることができる。
【０２０４】
本発明の態様では、検出手順は、抗体−ペプチド複合体の変色を目視検査すること、又は抗体−ペプチド複合体の物理化学的変化を試験することを含む。物理化学的変化は、酸化反応又は他の化学反応と共に起こるおそれがある。それらは、目視によって、分光光度計を用いてなどで検出することができる。
【０２０５】
その方法の一態様では、ペプチド又はペプチドの混合物は、ニトロセルロース紙上に電気ブロッティング又はドットブロッティングされる。続いて、生体液（例えば血清又は血漿）が、ブロッティングされた抗原と共にインキュベーションされ、生体液中の抗体が抗原（１種又は複数）と結合させられる。次に、結合した抗体は、例えば標準的な免疫酵素法によって検出することができる。
【０２０６】
方法の別の態様では、ラテックスビーズが本発明の抗原（１種又は複数）にコンジュゲーションされる。続いて、生体液をビーズ／ペプチドコンジュゲートと共にインキュベーションすることによって、反応混合物が形成される。次に、反応混合物を分析して、抗体の存在が判定される。
【０２０７】
血液生成物又は他の生理学的液体もしくは生体液をスクリーニングするための好ましい一アッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ、すなわちＥＬＩＳＡである。典型的にはＥＬＩＳＡでは、本発明の単離された抗原（１種又は複数）が、マイクロタイターウェルの表面に直接又は捕捉マトリックス（すなわち抗体）を介して吸着される。次に、表面上に残った非特異的タンパク質結合部位を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、熱不活性化正常ヤギ血清（ＮＧＳ）、又はＢＬＯＴＴＯ（保存料、塩類及び消泡剤も含有する無脂肪粉乳の緩衝溶液）などの適切な薬剤でブロッキングする。次に、抗ＨＩＶ−１抗体を含有する疑いのある生物学的試料と共にウェルをインキュベーションする。試料は、ニートで適用することができ、又は往々の場合、通常は少量（０．１〜５．０重量％）のタンパク質を含有するＢＳＡ、ＮＧＳ、又はＢＬＯＴＴＯなどの緩衝溶液中に希釈することができる。十分な時間インキュベーションして特異的結合を起こした後で、ウェルを洗浄して未結合のタンパク質を除去し、次に、標準手順により酵素又は他のラベルとコンジュゲーションされてブロッキング緩衝液中に溶解された至適濃度の適切な抗免疫グロブリン抗体（例えば、ヒト対象に対する、イヌ、マウス、ウシなどの別の動物由来の抗ヒト免疫グロブリン）と共にそれをインキュベーションする。ラベルは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどを含めた多様な酵素から選択することができる。特異的結合が再度起こるために十分な時間を与え、次にウェルを再度洗浄して未結合のコンジュゲートを除去し、適切な酵素基質を添加する。発色させ、ウェルの内容物の吸光度を視覚的に又は機器によって決定する（適切な波長で測定）。カットオフＯＤ値は、ＨＩＶ−１ウイルスに感染していない個体から採取された少なくとも５０個の血清試料の平均ＯＤの標準偏差（ＳＤ）として、又は他のそのような従来定義により定義することができる。非常に特異的なアッセイの場合、ＯＤ＋２ＳＤをカットオフ値として使用することができる。
【０２０８】
ＥＬＩＳＡの一態様では、アルカリ性コーティング緩衝液中に至適濃度のストレプトアビジン又は同等のビオチン結合性化合物でコーティングされ、４℃で一晩インキュベーションされた９６ウェルＥＬＩＳＡプレート又は同等の固相などの表面上に、本発明のペプチドは、固定化される。標準洗浄緩衝液で適切な回数洗浄後に、通常のブロッキング緩衝液に溶解された至適濃度のビオチン化型の本発明の組成物／抗原を各ウェルに適用し；試料を添加し、；アッセイを上記のように進める。
【０２０９】
別の有用なアッセイ形式は、ラテラルフロー形式である。ヒトもしくは動物抗体又はｓｔａｐｈプロテインＡもしくはＧ抗体に対する抗体をシグナル発生体又はレポーター（すなわちコロイド金）でラベルし、それを乾燥させ、グラスファイバーパッド（試料適用パッド）上に配置する。診断ペプチドをＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）メンブラン（例えばImmobilonメンブラン（Millipore））又はニトロセルロースメンブランなどのメンブラン上に固定化する。試料（血液、血清など）の溶液を試料適用パッドに適用すると、それは、コロイド金ラベルされたレポーターを溶解し、これは、試料中の全ての抗体に結合する。この混合物は、毛管現象により次のメンブラン（診断ペプチドを含有するＰＶＤＦ又はニトロセルロース）に移送される。診断ペプチドに対する抗体が存在するならば、それらは、シグナルを発生するメンブラン上に縞状に塗った診断ペプチドに結合する。コロイド金ラベルされた抗体に特異的な、追加的な抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧなど）を用いて対照シグナルを生成させる。
【０２１０】
対象でのＨＩＶ−１感染の検出用に、本発明の単離されたペプチドを利用するために、任意の数の通常のタンパク質アッセイ形式、特にイムノアッセイ形式を設計できることは、当業者によって理解されているはずである。したがって本発明は、特定のアッセイ形式の選択に限定されず、当業者に公知のアッセイ形式を包含すると考えられる。
【０２１１】
本発明によるＥＬＩＳＡ又は他のアッセイ用の試薬は、キットの形態で提供することができる。そのようなキットは、対象（例えばヒト又は他の動物）からの試料を使用してＨＩＶ−１ウイルス感染を診断するために有用である。そのような診断キットは、本発明のペプチド（及び所望により上述の追加的なペプチド）、ならびに場合により式（Ｉ）で示されるペプチドに対する抗体に結合した本発明のペプチドの検出（を可能にする手段）のためのシステム、及び／又はペプチドが結合できる表面を含有しうる。一態様では、キットは、適切なペプチドの混合物もしくはそのような混合物を調製するための手段、及び／又はペプチド−抗体複合体を検出するための試薬を含有する。
【０２１２】
キットは、本発明のペプチド（１種又は複数）が予備吸着されたマイクロタイタープレート、別の適切なアッセイ装置、様々な希釈剤及び緩衝剤、特異的に結合した抗原又は抗体の検出用の、ラベルされたコンジュゲート又は他の薬剤、ならびに酵素基質、補因子及び色素原などの他のシグナル発生試薬を含みうる。キットの他の構成要素は、当業者が容易に決定することができる。そのような構成要素には、コーティング試薬、本発明のペプチドに特異的なポリクローナルもしくはモノクローナル捕捉抗体、又は２種以上の抗体のカクテル、標準としてのこれらの抗原の精製もしくは半精製抽出物、ＭＡｂ検出抗体、指示薬分子がコンジュゲーションした抗マウスもしくは抗ヒト抗体、吸収用に調製されたＥＬＩＳＡプレート、比色用指示薬チャート、ディスポーザブル手袋、除染説明書、アプリケータースティックもしくは容器、試料調製コップなどが挙げられうる。一態様では、キットは、ペプチド−抗体複合体の形成を可能にする反応媒体を構成するために適切な緩衝液又は他の試薬を含む。そのようなキットは、ＨＩＶ−１ウイルスによる感染を診断するために臨床検査室にとって好都合な、効果のある方法を提供する。
【０２１３】
いくつかの態様では、本明細書記載の診断方法及びキットは、一般に、個体から以前に採取された試料中の抗ＨＩＶ抗体の存在を検出するために使用することができる。いくつかの他の態様では、本明細書記載の診断方法及びキットは、現在試験されている個体に感染したＨＩＶ−１ウイルスサブファミリーの同一性を決定するために使用することができる。
【０２１４】
いくつかの態様では、本明細書記載の診断方法及びキットは、式（Ｉ）で示されるペプチドのファミリーに属するペプチドより選択される１種だけのペプチドを使用する。
【０２１５】
他の態様では、本明細書記載の診断方法及びキットは、式（Ｉ）で示されるペプチドのファミリーに属するペプチドより選択される複数のペプチドを使用する。
【０２１６】
例示的に、本明細書記載の診断方法及びキットの態様は：
【化１５】
0006027094.tif 000016
から成る群より選択される、式（Ｉ）で示される複数のペプチドを使用する。
【０２１７】
本発明は、さらに、以下の実施例により例示されるが、それに限定されることはない。
【０２１８】
実施例
実施例の材料及び方法
１．  ウイルスの調製
突然変異体を、QuickChange II XL部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene）を用いてプラスミドｐＮＬ４．３から調製し、その後にＤＮＡ配列決定により検証した。野生型及びアラニン突然変異型３Ｓ／ｇｐ４１ ｐＮＬ４．３プラスミドをリポフェクタミン（Invitrogen）によってOptima培地中で２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後に、無細胞上清を回収し、ＨＩＶ主要コアタンパク質ｐ２４の濃度はVidas Ag p24 IIキット（Biomerieux）を用いた。ウイルス上清を−８０℃で保存する。
【０２１９】
２．  ペプチド及び抗体
コンジュゲーションされていない、及びＫＬＨ−コンジュゲーションされた、野生型及びアラニン突然変異型の精製３Ｓ／ｇｐ４１合成ペプチド（図１）をCovalabs（Villeurbanne, France）から購入した。フロイント不完全アジュバントの存在下でＫＬＨ連結ペプチド２０mgをマウスに２回ＩＶ注射し、各注射の間隔は約２週間であった。記載のように（Vieillard et al AIDS 2006）、野生型又はアラニン突然変異型３Ｓ／ｇｐ４１ペプチド１００ngを４℃で一晩コーティングしたMaxisorpプレート（Nunc）を用いることによって、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって血清を力価測定した。
【０２２０】
３．  初代健康ＣＤ４＋Ｔ細胞の精製
健康ドナーからの全血試料由来の白血球は、「Etablissement Francais du sang」(Hopital Pitie-Salpetriere, Paris, France）からのバフィーコート遠心分離によって得た。ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＤ４磁気マイクロビーズ（Miltenyi）で精製した。フローサイトメトリー分析から、純度９５％を超えるＣＤ４細胞であることが実証された。１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したRPMI-1640 Glutamax培地（Invitrogen）中で細胞を１μg/ml ＰＨＡ−Ｌ（Murex）で３日間活性化し、次に３日毎に添加した１００IU/mlプロロイキン（Proleukin）−２（Chiron）と共に培養した。
【０２２１】
４．  感染アッセイ
精製された活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＭＴ２細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞（１０７個）をｐ２４抗原等価物１００ngと共に３７℃でそれぞれ１７時間及び２時間インキュベーションした。次に、細胞をＰＢＳ／ＥＤＴＡ中で２回洗浄し、１０６個/mLに再懸濁した。ウイルスの生成を感染後２日毎にＥＬＩＳＡによってモニタリングし、Vidas Ag p24 IIキット（Biomerieux）でｐ２４濃度を測定した。感染ＭＴ２細胞上のシンシチウム形成を９６時間後に標準位相差顕微鏡法によって判断した。
【０２２２】
５．  単一ラウンドＨＩＶ−１感染性アッセイ
A. Morris及びO. Schwartz（Pasteur Institute Paris, France）から親切に贈与してもらったＨｅｌａ Ｐ４Ｃ５にＣＤ４＋及びＣＣＲ５＋を共トランスフェクションしたが、その細胞は、ルシフェラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子に連結したＨＩＶ−１末端反復配列（ＬＴＲ）の組み込み型コピーを含有した（Amara et al J. Exp. Med. 1997）。細胞を１日前に播種し、ｐ２４が４ng/mlの野生型又はアラニン突然変異型３Ｓ／ｇｐ４１ ＮＬ４．３ウイルスを感染させた。感染４８時間後に、Ｈｅｌａ−Ｐ４Ｃ５細胞溶解液中のβ−ガラクトシダーゼ活性を、ＣＰＲＧ β−ガラクトシダーゼキット（OZ biosciences）を用いて測定した。
【０２２３】
６．  中和アッセイ
製造業者の説明書にしたがって、マウス抗血清由来のポリクローナルＩｇＧ画分をＮａｂプロテインＡ／Ｇ Ｓｐｉｎキットを用いて単離し、次にZebaスピン脱塩カラムで脱塩した（どちらもThermo Scientific製）。免疫グロブリン画分をCentricon遠心フィルターユニット（Millipore）で濃縮し、次にＢＣＡタンパク質アッセイキットを用いて定量した（Thermo Scientific）。精製Ａｂを初濃度２０μg/mlに続く５回の２倍希釈で試験した。
【０２２４】
ヒト抗ＷＴ又は抗Ｗ６１４Ａ ３Ｓ／ｇｐ４１ Ａｂを、Pierce Direct IPキットを用いてアミン反応性アガロース支持体上に合成ペプチドを直接固定化することにより、ＨＩＶ感染患者の熱不活化血漿からの免疫沈降によって精製した。次に、精製ＡｂをＰＢＳで透析し（Silde-A-Lyser Dialysis cassette, Pierce）、定量した。精製Ａｂを初濃度２μg/mlに続く５回の２倍希釈で試験した。
【０２２５】
精製Ａｂの中和を試験するために、感染性ウイルスを用いた２種のアッセイを行った（Fenyo et la PLoS one 2009）：
（１）Ａｂの効力（５０％［ＩＣ５０］及び９０％［ＩＣ９０］の阻害を達成するために必要な濃度）を比較するために、本発明者らは、最初にＣＤ４＋Ｔ細胞−ｐ２４アッセイを用いた。感染性複製コンピテントウイルス（２００ＴＣＩＤ５０）を様々な濃度のＩｇと共に３０分間インキュベーションし、続いてＩＬ２の存在下でＰＨＡ活性化精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を添加した。ｐ２４測定（Vidas Ag p24 II kit, Biomerieux）のために、感染開始から７日後に二つ組の試料を回収した。
（２）様々な精製Ａｂのディファレンシャルな中和活性の可能性を評価するために、本発明者らは、それらが異なるＸ４株（ＮＬ４．３、ＢＲＵ、ＮＤＫ）及びＲ５株（ＪＲ−ＣＳＦ、ＹＵ−２）からのＨＩＶ−１侵入、又はＲＯＤ ＨＩＶ−２を阻害する能力を、Clarisse Berlioz-Torrent（Institut Cochin, Paris, France）から親切に提供されたＨｅｌａ−Ｐ４Ｃ５細胞及び／又はＴＺＭ−ｂｌ細胞を用いて測定した（NIH AIDS Research and Reference Reagent Program）。感染性複製コンピテントウイルス（２００ＴＣＩＤ５０）を様々な濃度のＩｇと共に３０分間インキュベーションし、続いてＨｅｌａ Ｐ４Ｃ５細胞を添加した。感染４８時間後に、Ｈｅｌａ−Ｐ４Ｃ５溶解液中のβ−ガラクトシダーゼ活性を、ＣＰＲＧ β−ガラクトシダーゼキット（OZ biosciences）を用いて測定し、ＴＺＭ−ｂｌ溶解液中のルシフェラーゼ活性を、Britelite Plus試薬（Perkin Elmer）を用いて測定する。ＴＣＩＤアッセイにおけるプラスの値を決定するために、バックグラウンドの２．５倍のカットオフ値を適用した。データをＴＣＩＤ５０及びＴＣＩＤ９５で表現した。
【０２２６】
７．  フローサイトメトリー
生存ウイルス又は熱不活性化ウイルスが１７時間存在した、又は３７℃で４時間３Ｓ／ｇｐ４１ペプチドで処置された、精製ＣＤ４＋Ｔ細胞にＦＡＣＳ分析を行った。試料を各抗ＮＫｐ４４Ｌ抗体１μgと共に、又は融合タンパク質（ＮＫｐ３０−Ｉｇ、ＮＫｐ４４−Ｉｇ、又はＮＫｐ４６−Ｉｇ）と共に、ＰＢＳ／ＢＳＡ１％の存在下で４℃で２時間インキュベーションした。次に、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡ１％中で洗浄し、特異的二次抗体（ＰＢＳ／ＢＳＡ１％で１：１００希釈）と共に４℃で３０分間インキュベーションし、最終的に抗ＣＤ４ ｍＡｂで直接染色し、既述（Vieillard et al PNAS 2005）のようにBD CellFix溶液（BD Bioscience）を用いて固定した。ＣＤ４＋細胞の少なくとも１０，０００回の事象をFACSCanto（BD Biosciences）又はNavios（Coulter）で検出した。
【０２２７】
８．脱顆粒アッセイ
野生型又はアラニン突然変異型３Ｓ／ｇｐ４１ ＮＬ４．３ウイルスに感染していないか、又は感染したＣＤ４＋Ｔ細胞を、自己ＩＬ２活性化自己ＰＢＭＣ及び抗ＣＤ１０７ａ ｍＡｂ（H4A3; Becton Dickinson）の存在下で１：１の比で再懸濁した。１時間キュベーション後に、既述（Beziat et al PLoS One 2010）のように、３mMモネンシンを添加して追加的な３時間のインキュベーションに供した。ＮＫ細胞を抗ＣＤ３、抗ＣＤ５６、及び抗ＮＫｐ４４ ｍＡｂで染色し、FACSCanto（BD Biosciences）又はNavios（Coulter）で分析した。少なくとも５，０００回のＣＤ３−ＣＤ５６＋事象を分析した。
【０２２８】
実施例１：ＣＤ４＋Ｔ細胞感染に関するＣＤ４の３Ｓ／ｇｐ４１の完全性
ウイルス生活環に果たす３Ｓ／ｇｐ４１モチーフの役割を描写するために、ＮＬ４．３  ＨＩＶ−１株由来のｇｐ４１タンパク質の３Ｓモチーフ内の位置Ｓ６１３からＳ６１８の間の残基に、単一の点置換を個別に導入した。これらの単一置換がウイルスの感染性に効果を発揮するかどうかを検討するために、各ウイルス調製物からｐ２４当量１００ngの抗原となるようにＭＴ−２細胞を誘発した。図２Ａに、３Ｓ／ｇｐ４１モチーフの置換効果は、ウイルス生成の完全に近い消失から、野生型モチーフを発現しているウイルスについての無効までの範囲であることを示す。実際に、Ｓ６１３Ａ突然変異型ウイルスは、ＭＴ−２に感染するその完全な能力を保ったが、Ｋ６１７Ａは、野生型に観察されたレベルのまだ６６±１０％であり、残りの突然変異体は２２％未満であった。Ｗ６１４Ａ及びＳ６１８Ａ突然変異体は、ＭＴ−２細胞において感染を樹立する能力がないと思われる（図２Ａ）。これらのデータは、これらの突然変異体がシンシチウム形成する能力で確認され、Ｗ６１４Ａ及びＳ６１８Ａ突然変異型ウイルスのいずれかに感染したＭＴ−２細胞では、野生型に比べてこれらの巨細胞構造が完全に不在であった（図２Ｂ）。これらのデータから、３Ｓ／ｇｐ４１モチーフのＷ６１４及びＳ６１８の両方の位置がウイルス感染時に重大な役割を果たしうることが示唆される。
【０２２９】
精製ＣＤ４＋Ｔ細胞での感染の動態研究によって、野生型ならびにＳ６１３Ａ及びＫ６１７Ａ突然変異体が非常に生産的なウイルス複製（ｐ２４が最大１８７pg/ml）を示し、感染の８日後にｐ２４の生成がピークになったことが明らかとなった（図２Ｃ）。対照的に、どのような期間でも、Ｓ６１５Ａ及びＮ６１６Ａ突然変異型ウイルスの感染レベルは非常に低いままであり、それぞれウイルス量のピークは１３．５及び１７．３pg/mlであり、Ｗ６１４Ａ及びＳ６１８Ａでは検出不能のままである（図２Ｃ）。感染したＪｕｒｋａｔ細胞の存在下で類似の結果が観察された（データは示さず）。
【０２３０】
本発明者らは、次に、３Ｓ／ｇｐ４１モチーフへの突然変異によってウイルスサイクルのどの工程が影響を受けたかを決定しようとした。３Ｓ／ｇｐ４１突然変異体の感染性を評価するために、トランスフェクション後の２９３Ｔ細胞からのウイルス上清を、ＨＩＶ−１に感染するとＴａｔによって活性化されるＨＩＶ−ＬＴＲ Ｌａｃ−Ｚカセットを有するＨｅｌａ派生細胞系であるＨｅｌａ Ｐ４Ｃ５指標細胞で試験した（Amara et al J Exp Med 1997）。図２Ｄに示すように、野生型に類似して、Ｓ６１３Ａ及びＫ６１７Ａ突然変異体の両方が細胞に感染する能力を保っている。対照的に、Ｓ６１５Ａ、Ｎ６１６Ａ，及びＳ６１８Ａ突然変異体の存在下で、感染性レベルは野生型の１０分の１未満であり、Ｗ６１４Ａ突然変異体では完全に検出不能である。このことから、３Ｓ／ｇｐ４１モチーフの特異的位置での独特な置換がＣＤ４＋Ｔ細胞におけるウイルス侵入を阻害することが示唆される。
【０２３１】
実施例２：３Ｓ／ｇｐ４１モチーフでの点突然変異はＮＫｐ４４Ｌの発現を消滅させる
本発明者他によって以前に示されたように、ＨＩＶ−１感染は、ＮＫｐ４４Ｌを含めたある種のＮＫＲリガンドの発現を誘導する（Vieillard et al 2005; Ward et al 2007）。本発明者らは、３Ｓ／ｇｐ４１置換を含有するウイルスも、精製ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＮＫｐ４４Ｌ発現を誘導する能力があるかどうか判定したかった。野生型ウイルスに感染後、高い頻度の細胞がＮＫｐ４４Ｌを発現した（５６．２％）。Ｓ６１３Ａ又はＫ６１７Ａ突然変異体に感染したＣＤ４＋Ｔ細胞でも類似の結果が得られ、それぞれ６１．０及び６７．６％の細胞がＮＫｐ４４Ｌを発現していた。より興味深いことに、他の突然変異体；Ｗ６１４Ａ、Ｓ６１５Ａ、Ｎ６１６Ａ、及びＳ６１８Ａで発現は検出されなかった。以前のデータに一致して（Vieillard et al 2005; Ward et al 2007）、ＮＫｐ３０リガンド及びＮＫｐ４６リガンドの発現は、置換の位置がどこであれ、野生型及びアラニン突然変異型３Ｓ／ｇｐ４１ウイルスのどちらに感染した細胞でも誘導されなかった（図３Ａ）。
【０２３２】
本発明者らは、次に、ＮＫｐ４４Ｌの発現が感染粒子の不在下でディファレンシャルにレギュレーションされる可能性を検討した。そのように、熱不活性化ウイルスの存在下で（図６Ａ）、又は３Ｓ／ｇｐ４１モチーフに様々なアラニン置換を含む合成３Ｓペプチドで刺激後に（図３Ｂ）、コンピテントウイルスを用いてそれらの特異的残基置換に関して得られた結果に類似する結果が得られた。実際に、ＮＫｐ４４Ｌの発現は、Ｓ６１３Ａ及びＫ６１７Ａ突然変異型エレメントの存在下でのみ誘導され、そのレベルは野生型で観察されたこのレベルに近いのに対して、残りの非感染性粒子又はペプチド突然変異体はＮＫｐ４４Ｌを誘導できない。
【０２３３】
実施例３：３Ｓ／ｇｐ４１ウイルス突然変異体に感染した自己ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在下でのＮＫ細胞脱顆粒のモデュレーション
本発明者らは、ある３Ｓ／ｇｐ４１突然変異を含有するＮＬ４．３ウイルスに感染したＣＤ４＋Ｔ細胞上にＮＫｐ４４Ｌを見出したので（図２Ａ）、本発明者らは、このリガンドを発現しているターゲット細胞の方が、ＮＫ細胞傷害性に対して感受性が高い可能性を検討した。野生型又は様々な突然変異型ウイルスのいずれかに感染した精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を自己ＩＬ２活性化ＮＫ細胞と共にインキュベーションして、それらの脱顆粒能を決定した。図３Ｃに、未感染細胞（４．２％）に比べて、野生型ウイルス（２８．８％）、又はＳ６１３Ａ（２９．５％）及びＫ６１７Ａ（２９．９％）突然変異体の存在下でＮＫｐ４４＋ＮＫ細胞上でのＣＤ１０７ａの高発現が検出されたことを示すが、これは、ＣＤ４＋ターゲットＴ細胞上でのＮＫｐ４４Ｌの高発現を示しているデータと整合が取れている（図３Ａ）。対照的に、ＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＮＫｐ４４Ｌの誘導が観察されない残りの突然変異体では、脱顆粒のレベルは、未感染細胞で得られたこのレベルにほぼ近いままである（図３Ｃ）。熱不活性化ウイルス粒子（図６Ｂ）及び合成ペプチド（図４Ｄ）の存在下で類似の結果が得られた。
【０２３４】
全体的に見て、これらの結果から、高度に保存されている３Ｓ／ｇｐ４１モチーフ内の独特な残基の置換が、ＣＤ４＋ターゲット細胞のＮＫ細胞感受性のモデュレーションに関して重大な結果を導くことが強く示唆される。
【０２３５】
実施例４：マウスにおける３Ｓ様広域中和抗体の誘発
したがって、本発明者らは、野生型及び各アラニン突然変異型３Ｓ／ｇｐ４１ペプチドをマウスに免疫処置して、特異的抗体を発生させた。それらの全てについて、遊離ペプチド捕捉後のＥＬＩＳＡでそれらの特異的３Ｓ／ｇｐ４１配列に対して強い免疫応答が見られた（データは示さず）。興味深いことに、血清交差反応性の大きさはペプチド成分に依存し；抗血清は、それらがＮＫｐ４４Ｌの発現を誘導する能力に直接比例して、各合成ペプチドと相互作用する。したがって、野生型と、Ｓ６１３Ａ及びＫ６１７Ａ突然変異体との間に強い血清交差反応性が観察されたが、他方でこの効果は、他の突然変異体では、独特な置換によって誘導される推定上のコンフォメーション改変に一致して顕著に減少する。
【０２３６】
より重要には、免疫グロブリン（Ｉｇ）全体を各血清から溶離させて、Ｒ５とＸ４とのＨＩＶ−１株の交雑クレードでそれらの中和力価及び中和幅を判断した。既述のように（Vieillard AIDS 2006）、ＴＺＭ−ｂｌ及びＨｅｌａ−Ｐ４Ｃ５細胞を用いた異なる古典的中和アッセイを用いて、本発明者らは、ＨＩＶ−１に対する抗３Ｓ野生型抗体に著しい中和活性が不在であることを確認した（表２及び３）。免疫処置されたＳ６１３Ａ及びＫ６１７Ａ突然変異マウスから精製されたＩｇの存在下で類似の結果が観察された。驚くことに、Ｗ６１４Ａ、Ｓ６１５Ａ、Ｎ６１６Ａ及びＳ６１８Ａ突然変異体について強い広域中和活性が検出された。実際に、様々なＸ４（ＮＬ４．３、ＢＲＵ、及びＮＤＫ）ＨＩＶ−１株、ならびにＲ５（ＪＲ−ＣＳＦ及びＹＵ−２）ＨＩＶ−１株に対して、これらの各突然変異体によって有意な応答が誘発され、ＩＣ５０値はＩｇが３．３〜１７．７μg/mlの範囲であった（表２）。より重要なことには、Ｗ６１４Ａ由来Ｉｇは、試験された全てのＸ４及びＲ５ ＨＩＶ−１株を中和することができ、ＩＣ９５は、Ｈｅｌａ−Ｐ４Ｃ５細胞ではウイルスに応じて６．７から１９．５μg/mLの間であり（表２）、ＴＺＭ−ｂｌ細胞では３．９から１０．３μg/mLの間であった（表３）。予想通り、ＨＩＶ−２株の存在下で（ＲＯＤ）、条件が何であれ中和活性は検出されなかったが（表３）、これは、ＨＩＶ−２株配列中の３Ｓ／ｇｐ４１モチーフの特異的欠失と整合が取れている（Vieillard PNAS 2005）。
【０２３７】
これらのデータを最終的に確認するために、本発明者らは、次に、ＮＬ４．３又はＮＤＫ ＨＩＶ−１株に感染した精製ＣＤ４＋Ｔ細胞のｐ２４生成を検出することによってウイルス中和の有効性を決定した。図４Ａから、ＷＴ、又はＳ６１３Ａ及びＫ６１７Ａ突然変異体からのＩｇの濃度が何であれ、それらのＩｇによるＮＬ４．３への中和活性が不在であることが確認される。対照的に、Ｗ６１４Ａ、Ｓ６１５Ａ、Ｎ６１６Ａ及びＳ６１８Ａ突然変異体からのＩｇの存在下でｐ２４生成の有意な減少が観察された。興味深いことに、１０μg/mlを超える濃度の、Ｗ６１４ＡからのＩｇで、ｐ２４抗原は検出不能のままである。ＮＤＫ感染後にも類似の結果が観察された（図４Ａ）。そのうえ、動態研究から、野生型ならびにＳ６１３Ａ及びＫ６１７Ａ突然変異体に比べて、１０μg/mlのＷ６１４Ａ突然変異体からのＩｇで、どのような感染後時間であれ、ｐ２４の生成が完全に消失し、Ｓ６１５Ａ、Ｎ６１６Ａ及びＳ６１８Ａ突然変異体からのＩｇで有意に遅延することが明らかとなった（図４Ｂ）。全体的に見て、これらのデータは、高度に保存された３Ｓ／ｇｐ４１モチーフへの特定位置での置換が、マウスにおいて広域中和活性の生成を誘発したことを強く裏付けている。
【０２３８】
アラニン−３Ｓ／ｇｐ４１突然変異体から精製されたＩｇによるＮＫｐ４４Ｌ阻害の有効性をさらに判断するために、健康なドナー由来の精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を、免疫処置マウスから精製されたＩｇで前処理した３Ｓ／ｇｐ４１野生型ペプチドと共にインキュベーションした。図４Ｃに、３Ｓに誘導されるＮＫｐ４４Ｌ発現が、対照細胞（３５．５％）に比べて３Ｓ−ＷＴからのＩｇの存在下では有意に減少する（９．４％）ことを示すが、これは、抗３Ｓ野生型ｍＡｂを用いた以前のデータと一致する（Vieillard et al PNAS 2005）。より重要なことには、アラニン−３Ｓ／ｇｐ４１突然変異体の存在下でＮＫｐ４４Ｌ発現の強い阻害も観察されたが、これは、Ｗ６１４Ａ、Ｓ６１５Ａ、Ｎ６１６Ａ及びＳ６１８Ａ突然変異体よりもＳ６１３Ａ及びＫ６１７Ａ由来Ｉｇの方がやや顕著であった（図４Ｃ）。これらの結果は、ＷＴ又はアラニン−３Ｓ／ｇｐ４１突然変異体からのＡｂの存在下にて３Ｓ−ペプチドで処理された自己ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＩＬ−２活性化ＮＫ細胞の脱顆粒データと一致する。このように、脱顆粒は、ＷＴでは９１．４％、アラニン３Ｓ／ｇｐ４１突然変異体では置換の位置がどこであろうと７８．３±４．８％阻害された（図４Ｄ）。このことから、特異的置換を有する３Ｓ／ｇｐ４１ペプチドから発生したＩｇは、広域中和能を獲得し、防御すると同時にＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＮＫｐ４４Ｌ発現阻害を可能にすることが示された。
【０２３９】
実施例５：ＨＩＶ−１患者由来血漿中の広域ＮＡｂの抗Ｗ６１４Ａ ３Ｓ突然変異体
近年、ＨＩＶ感染患者において広域反応性Ｎａｂ活性が経時的に生じると思われることが実証された。置換された３Ｓ／ｇｐ４１モチーフに対するｂＮＡｂがＨＩＶ感染で誘発される頻度に関する情報を得るために、本発明者らは、多様な臨床特徴を有するＨＩＶ−１感染患者から得られた血漿１０６試料の中和活性を分析した。評価した１０６試料のうち、５５／１０６（５２％）は、検出可能なレベルの抗３Ｓ−ＷＴ Ａｂを有し、その値は１５〜３２５AU/mlの間の範囲であった。既述のように（Vieillard et al AIDS 2006）、Spearman検定から、抗３Ｓ Ａｂの量とＣＤ４カウントとの間に高度に有意な関係が明らかである（ｐ＜０．０００１）（データは示さず）。予想外なことには、特異的にＷ６１４Ａ突然変異型３Ｓ／ｇｐ４１モチーフに対する抗体がＥＬＩＳＡにより血漿１０６試料中５試料で検出された（４．７％）。それらのそれぞれについて、高レベルのＡｂが検出可能であった（１２０〜２５０AU/mlの範囲）。これらの特異的抗体は、ＩｇＧアイソタイプであり（データは示さず）、高ＣＤ４カウント（８２２±８９CD4/mm3）及び検出不能のウイルス量（２０コピー/ml未満）を有する患者だけから検出された（表３）。注目すべきは、特異的にＷ６１４Ａ突然変異型３Ｓ／ｇｐ４１モチーフに対するこれらのＡｂは、野生型モチーフに対する抗体と同様に、健康なドナーの血漿からは検出不能である（データは示さず）、（Vieillard et al AIDS 2006）。
【０２４０】
これら独特な患者５人の血漿試料を検討したところ、血漿の希釈倍率として表現した中和レベルから、これらの血漿の全てについてＸ４ ＮＬ４．３及びＲ５ ＹＵ−２ウイルスの存在下で交差クレード抗ＨＩＶ中和活性が明らかとなり、その全てについてＩＣ５０＞１００であった。興味深いことに、これらの患者の１人（＃１０９）からの血漿はＨＩＶ粒子の少なくとも９５％を中和した（表３）。中和活性が、特異的にＷ６１４Ａ ３Ｓ／ｇｐ４１突然変異型モチーフに対するＡｂに関連することを確認するために、ＨＩＶ感染患者５人の血清由来のＡｂを、対応する合成ペプチドで免疫精製した。これらの溶離したＡｂは、少なくとも二つの異なるＨＩＶ−１株についてそれぞれＨｅｌａ−Ｐ４Ｃ５細胞及びＴＺＭ−ｂｌ細胞において＜０．２から１．９μg/mlの間、又は＜０．２から１．９μg/mlの間のＩＣ５０値で有意な中和活性を示す（表３）。顕著には、これら患者５人のうち１人（＃１０９）から精製された抗体は、中和アッセイが何であれ、全てのＸ４及びＲ５ ＨＩＶ−１株に対して類似の幅の中和活性を０．６から１．９μg/mlの間のＩＣ９５で示す（表３）。これらのデータは、精製ＣＤ４＋Ｔ細胞でのｐ２４生成によって確認され、ｐ２４生成は、それぞれＮＬ４．３及びＮＤＫに感染後に、０．２から１．０μg/mlの間及び０．１１から１．８μg/mlの間の強い中和活性を示した（図５Ａ）。そのうえ、動態研究から、感染後のどの時間であれ、無細胞上清中のｐ２４生成が、ＨＩＶ−１感染患者由来の１μg/ml免疫精製Ａｂで、対照に比べて非常に有意に減少していることが示される（図５Ｂ）。
【０２４１】
次に、本発明者らは、Ｗ６１４Ａ ３Ｓ／ｇｐ４１突然変異型モチーフを特異的に認識する、ＨＩＶ−１感染患者から精製されたこれらの中和ｂＮＡｂによるＮＫｐ４４Ｌ阻害の効果を決定したかった。図５Ｃに、全ての抗Ｗ６１４Ａ ＮＡｂが３Ｓ感作対照細胞に比べてＮＫｐ４４Ｌを阻害する能力を保ったことを示すが；しかし、マウス由来の、又はＨＩＶ−１患者（＃１１７）から精製された、抗３Ｓ／ｇｐ４１野生型Ａｂに比べて、有効性はややダウンモデュレーションされている。実際に、精製抗３Ｓ−ＷＴ Ａｂの存在下で２１．９％の細胞がＮＫｐ４４Ｌを発現し、一方で、２１．９〜３４．６％の細胞は、ＨＩＶ−１患者由来の抗Ｗ６１４Ａ突然変異型３Ｓ／ｇｐ４１ ｂＮＡｂで処理後にＮＫｐ４４Ｌ＋のままである。重要なことには、野生型又は抗Ｗ６１４Ａ ３Ｓ／ｇｐ４１精製Ａｂで処理された自己ＣＤ４＋Ｔ細胞と、自己ＩＬ２活性化ＮＫ細胞との共培養から、ＣＤ１０７ａの発現が非常に有意に減少又は消失したことが明らかになり、Ａｂの不在下で３Ｓ感作ＣＤ４＋ターゲットＴ細胞と共に共培養されたＮＫ細胞での２８．６％に比べて、１．８から７．８％の間のＣＤ１０７ａ＋ＮＫｐ４４＋ＮＫ細胞という値であった（図５Ｄ）。まとめると、これらのデータから、特異的突然変異型の３Ｓ／ｇｐ４１モチーフに対する天然ｂＮＡｂの誘発が、一部のＨＩＶ−１感染者に存在し、二分した効果を有し、ウイルス中和とＣＤ４枯渇阻害の両方を結合することが明らかになる。
【０２４２】
【表１】
0006027094.tif 000017
【０２４３】
【表２】
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【０２４４】
【表３】
0006027094.tif 000019
【０２４５】
【表４】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ａ−３】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【配列表】
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