(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的流体アッセイを行うマイクロ流体装置であって、
捕捉剤が付されている少なくとも１つの別個の反応ベッセル要素が挿入されている少なくとも１つの流体チャネルを含む流体チャネルを有する流体／反応ベッセル層を備え、前記反応ベッセル要素は、アッセイを行うために流体の流れに暴露されるように前記チャネルに位置決めされており、
前記流体チャネルの開口を封止すると共に、隣接するエリアにおいて前記流体／反応ベッセル層に結合されるチャネル閉鎖層を備え、且つ、
前記装置は、前記別個の反応ベッセル要素において、反応の結果を観察する構成を有し、前記チャネル閉鎖層は、前記流体チャネルと前記要素をカバーする可撓性シートを有し、前記可撓性シートは、空気圧によって作動される流体弁として前記流体チャネルの選択された領域において可撓性ダイヤフラムを形成し、前記可撓性シートは、前記流体／反応ベッセル層の反対の面において、前記要素の流体暴露を制御する前記流体弁の前記可撓性ダイヤフラムの空気による作動を可能にする空気チャネルに面している、マイクロ流体装置において、
前記別個の反応ベッセル要素は、中空の流れ要素であって、流れを前記要素に通すことができるように、また前記要素の外側に沿って少なくとも等量のバイパスの流れを通すことができるように、前記流体チャネル内で位置付けられ、且つ、作られており、そして前記要素は、その長い表面の外側ではなく、その内側に捕捉剤が付されているマイクロ流体装置。
【請求項２】
複数の流体チャネルは、それぞれ別個の反応ベッセル要素を包含しており、また、複数の前記弁は、複数の前記各流体チャネルが、お互いに隔離されることが可能なように位置付けられている、請求項１に記載のマイクロ流体装置。
【請求項３】
前記流体／反応ベッセル層は、前記流体チャネルの底部を介して、反応の結果を観察できるように構成されている、請求項１又は請求項２のマイクロ流体装置。
【請求項４】
前記弁は、前記可撓性ダイヤフラムにより係合されたときに、前記流体チャネル内の流体の流れを止め、前記可撓性ダイヤフラムにより係合されないときに、流体が前記流体チャネル内において、弁座又は壁にわたって流れることを可能にする前記流体チャネル内に配置される弁座又は壁を有する請求項１又は請求項２のマイクロ流体装置。
【請求項５】
流体チャネルに沿う第２の選択された位置において、前記可撓性シートは、前記アッセイの流体を動かすための空気作動ピストンとしての可撓性ダイヤフラムを形成する請求項１又は２のマイクロ流体装置。
【請求項６】
前記装置は、前記流体／反応ベッセル層、前記チャネル閉鎖層及び空気／流体界面層を備え、これらの各層は共に積み重ねられ、且つ、結合されると共に、
前記空気／流体界面層は、前記空気チャネルと、前記流体／反応ベッセル層の前記流体チャネルに対し前記チャネル閉鎖層の貫通孔ピアに沿って流体を導く流体チャネルを有する請求項１又は請求項２のマイクロ流体装置。
【請求項７】
前記反応ベッセルは、中空の流れ要素であって、その長さは５００ミクロン未満であり、またその内径は７５±５０ミクロンである請求項１又は請求項２のマイクロ流体装置。
【請求項８】
前記可撓性シートと前記流体／反応ベッセル層は、結合可能な材料の活性化された表面の共有結合によって接合され、同じシートの連続的な部分が可撓性の弁ダイヤフラムを形成し、その弁ダイヤフラムは、表面が活性化された結合可能な材料から本来形成される弁座又は壁に係合し、結合中に、前記弁ダイヤフラムは、該弁ダイヤフラム部分とその対向する弁座又は壁との共有結合を中断する一連の開閉接点に晒されている、請求項１又は請求項２のマイクロ流体装置。
【請求項９】
前記可撓性シートはＰＤＭＳから構成される請求項１又は請求項２のマイクロ流体装置。
【請求項１０】
流体アッセイを行うマイクロ流体装置を製造する方法であって、
少なくとも１つの流体チャネルと比較的剛性の材料の裏材を有する流体／反応ベッセル層を形成し、その流体／反応ベッセル層の反対に向けられた面は、チャネル閉鎖層と結合するのに適したもので、前記チャネル閉鎖層は、可撓性シートを備え、
捕捉剤が付された、少なくとも１つの別個の反応ベッセル要素を流れチャネルに挿入し、その要素は、アッセイを行う装置内に、流体の流れに暴露させるために、前記流れチャネル内に位置付けられ、
前記流体／反応ベッセル層に前記可撓性シートの一面を係合させ、その可撓性シートは、前記要素と前記流体チャネルをカバーし、実質的なエリアの他所において、前記流体／反応ベッセル層の反対に向けられた面に前記可撓性シートを結合させ、流体チャネルに沿って選択された位置において、その可撓性シートは、空気圧によって作動される空気作動弁として可撓性弁ダイアフラムを形成する、
前記可撓性シートの反対の面において、空気チャネルを有する空気／流体界面層と結合させる、それは、挿入された別個の反応ベッセル要素の流体暴露を制御するように、前記弁の可撓性ダイアフラムの空気制御を可能にするためである、方法において、
前記要素は、中空の流れ要素であって、流れを前記要素に通すことができるように、また前記要素の外側に沿って少なくとも等量のバイパスの流れを通すことができるように、前記流体チャネル内で位置付けられ、且つ、作られ、また前記要素はその長い表面の外側ではなく、その内側に捕捉剤が付されている方法。
【請求項１１】
前記可撓性シートと前記流体／反応ベッセル層は、結合可能な材料の活性化された表面の共有結合されることによって接合され、その接合中に、同じシートの連続的な部分が前記可撓性の弁ダイヤフラムを形成するもので、その弁ダイヤフラムは活性化された結合可能な材料の表面から本来形成される弁座又は壁に係合し、該弁ダイヤフラム部分とその対向する弁座又は壁との共有結合を中断する一連の開閉接点に晒されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
複数の流体チャネルは、それぞれ別個の反応ベッセル要素を含有し、複数の前記弁は、複数の前記各流体チャネルが、お互いに隔離されることが可能なように位置付けられている、請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記流体／反応ベッセル層の流れチャネルに沿った第２の選択された位置において、前記可撓性シートは、前記別個の反応要素のそれぞれに対して、流体をポンピングする空気作動ピストンとしての可撓性ダイヤフラムを形成する請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記反応ベッセルは、中空の流れ要素であって、その長さは５００ミクロン未満であり、その内径は７５±５０ミクロンである請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
さらに捕捉剤によりバッチコーティングされた前記流れ要素を備え、
前記装置内に前記要素を配置する前に、前記要素の前記外側に撹乱せん断力を与えるように、前記捕捉剤を含む流体中の複数の前記要素の懸濁液が、強力に撹拌され、該せん断力は、前記要素の長い表面の外側への前記捕捉剤の結合を防止するように作用させて、前記要素の外側の長い表面上の活性捕捉剤の存在を排除し又は防止する請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記反応ベッセル要素は、中空の流れ要素であり、前記流れチャネルは、マイクロ流れチャネルであり、前記要素は、ピックアンドプレース動作によってその流れチャネル内に挿入され、前記流れ要素の位置を規定するとともに配置器具の容易な取り出しを可能にするように、前記流れ要素と前記流れチャネルの壁との間の近接場静電引力が用いられる請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記可撓性シートはＰＤＭＳから構成される請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流体アッセイ、例えば生物学的アッセイ、及びマルチプレックスアッセイを行うマイクロカセットすなわち「チップ」に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１１年３月２２日に出願された米国出願第６１／４６５，６８８号、及び２０１２年３月８日に出願された米国出願第６１／６０８，５７０号に対する優先権を主張するものであり、これらはそれぞれ、適用法によって許容される程度まで引用することにより全体が本明細書の一部をなす。
【背景技術】
【０００３】
例えば体液試料を用いたタンパク質アッセイ向けのマルチプレックスアッセイカセットを作る多くの独創的な試みがなされてきたにもかかわらず、製造コストは高いままであり、これらの装置は、一般的な血液試験に取って代わるためにこれらの装置を実用的な定量装置としてみなすには実質的に１０未満である所望の変動係数を欠いているが、費用対効果がより高く、長い間、研究活動及び個人医療の将来像と予見されている。コストが低く、実用的なマルチプレックスアッセイカセットであるという利点が大きな利点となる多くの他のアッセイが存在する。
【発明の概要】
【０００４】
流体を、複数のチャネル及び経路を通して、コンパクトで効率的かつ低コストな様式で移動させることが可能な、流体アッセイ、例えば生物学的アッセイを行うマイクロ流体装置が提供される。好ましくは７００ミクロン未満、好ましくは５００ミクロン未満の長さ、及び好ましくは約５０±２５ミクロンの内径を有する、別個の流れ検出要素、好ましくは極めて短い中空の流れ要素に捕捉剤が付され、該要素は、定位置においてピンセット又は真空ピックアンドプレース動作によってマイクロ流体チャネル内に挿入され、マイクロ流体チャネル内では、アッセイを行うように流体に効率的に暴露される。要素の位置を規定するとともに配置器具の容易な引き出しを可能にするように近接場静電引力が用いられる。マイクロ流体装置は、正確に作るのにコストが低く、流路に対して低侵襲性であり、目的のために実装されると、低い変動係数を有する単一の可搬のアッセイカートリッジ（チップ）上でのマルチプレックスアッセイをもたらすことができる、流れ要素、チャネル、弁、及びオンボードポンプを特徴とする。ＰＤＭＳとＰＤＭＳ、及びＰＤＭＳとガラス等の、表面が活性化可能である結合可能な材料の面の選択された領域の共有結合を含み、一方で、一方の可撓性シートの連続的な部分が、流れチャネルを完成させて封止し、挿入される検体検出要素、特に、試料及び試薬が通って流れる短い中空の流れ要素の位置をチャネル内に固定し、他の部分は可撓性の弁メンブレン及びポンプのダイヤフラムを形成する、これらの機能部の構成、組み付け及び使用の新規の方法が提示される。繰り返しの開閉接点作製プロトコルが、一体的な弁ダイヤフラム部分が、可撓性シート材料が係合する対向するシート部材によって画定されるそれらの弁座から移動することを妨げるような結合を防止する。それぞれが比較的剛性の材料の裏材を有する２つのサブアセンブリを準備し、その後でそれらのアセンブリの面同士を恒久的に結合させることが示されている。中空の検出流れ要素はチャネル内に固定されて示されており、中空の検出流れ要素は、要素を通る流れ容量の少なくとも５０％、好ましい実施態様では１００％以上にもなるバイパス流路を提供する。金属化ポリエステルフィルムが、多くの形態を有し、また非恒久的に結合される構成における利点を有するように示されている。
【０００５】
一態様において、流体アッセイ、例えば生物学的アッセイを行うマイクロ流体装置であって、捕捉剤が付される少なくとも１つの別個の流れ検出要素（好ましくは、定位置にある、約７００ミクロン未満、好ましくは約５００ミクロン未満の長さ、及び約７５±５０ミクロン、好ましくは多くの場合に５０±２５ミクロンの内径を有する極めて短い中空の流れ要素）が挿入される流れチャネルを有し、前記流れ要素は該アッセイを行う装置内で流体の流れに暴露されるように位置決めされる、マイクロ流体装置が特徴付けられる。この特徴の更なる態様は、特許請求の範囲によって示されるような以下の特徴のうちの１つ又は複数を含む。
【０００６】
前記検出要素は、ピックアンドプレース動作によってそのマイクロ流体チャネル内に挿入される、上記装置。
【０００７】
前記検出要素は、反対方向の向きの平面的な端面と、該端面間に延在する円筒形の外面とを有し、好ましくは前記流れチャネル内に、該要素を通る流れ、及び該固定される要素の外側に沿う少なくとも等しい量のバイパス流を可能にするように位置付けられる、７００ミクロン未満、好ましくはおよそ５００ミクロン未満の長さの短い中空の流れ要素を含む、上記装置。
【０００８】
前記ピックアンドプレース動作は、前記流れ要素の反対方向の向きの部分、好ましくは反対方向の向きの平行な平面的な表面に係合する自動化ピンセットフィンガーによって行われる、上記装置。
【０００９】
前記ピックアンドプレース動作は自動化真空ピックアップによって行われる、上記装置。
【００１０】
前記真空ピックアップ装置は、前記流れ要素の外側円筒面に係合する、上記装置。
【００１１】
流れチャネル閉鎖体、流体作動弁の可撓性ダイヤフラム又はオンボードポンプダイヤフラム、好ましくは３つ全部が、かなりのエリアの他の位置では対向する面に結合されることによって接合される可撓性シートのそれぞれの部分によって提供される、上記装置。
【００１２】
前記可撓性ダイヤフラムシートは、エラストマーではない空気不透過性の可撓性シート、好ましくはポリエステルフィルムから構成される、上記装置。
【００１３】
前記可撓性シートは、検出器の光学系に対して入射光又は蛍光を反射させるように好ましくはアルミニウムで金属化される、上記装置。
【００１４】
前記検出器は落射蛍光タイプのものであり、前記金属化されたフィルムは、所望の検体の存在に関連する入射励起光及び蛍光を反射するように位置決めされる、上記装置。
【００１５】
前記可撓性の空気不透過性シートは、前記流体試料に接触するように暴露されるエラストマーフィルムと面同士が結合される、上記装置。
【００１６】
前記可撓性シートはエラストマー、好ましくはＰＤＭＳからなる、上記装置。
【００１７】
上記装置は、単一の可搬アッセイカートリッジ（チップ）上でマルチプレックスアッセイを行うように構成されている、上記装置。
【００１８】
上記装置の少なくとも幾つかのパーツは、結合可能な材料の活性化された表面の共有結合によって接合され、同じシートの連続的な部分が前記検出要素の位置をその流れチャネル内に固定する、上記装置。
【００１９】
上記装置の少なくとも幾つかのパーツは、結合可能な材料の活性化された表面の共有結合によって接合され、同じシートの連続的な部分が可撓性のポンプダイヤフラムを形成する、上記装置。
【００２０】
上記装置の少なくとも幾つかのパーツは、結合可能な材料の活性化された表面の共有結合によって接合され、同じシートの連続的な部分が可撓性の弁ダイヤフラムを形成する、上記装置。
【００２１】
前記可撓性の弁ダイヤフラム部分は、該弁ダイヤフラム部分とその対向する弁座との共有結合を中断する一連の開閉接点に晒されている、表面が活性化された結合可能な材料から本来形成される弁座に係合する、上記装置。
【００２２】
上記装置の少なくとも幾つかのパーツは、結合可能な材料の活性化された表面の共有結合によって接合され、同じシートのそれぞれの連続的な部分が、流れチャネルの開口側を封止し、前記検出要素の位置をその流れチャネル内に固定し、可撓性のポンプダイヤフラム又は可撓性の弁ダイヤフラムを形成し、好ましくは、前記シートのそれぞれの部分がこれらの機能の全てを行う、上記装置。
【００２３】
パーツは、表面が活性化された結合可能な材料の面の選択された領域の共有結合によって恒久的に固定される、上記装置。
【００２４】
活性化の形態は酸化である、上記装置。
【００２５】
前記パーツのうちの少なくとも１つは表面を活性化可能なエラストマーを含む、上記装置。
【００２６】
前記エラストマーはＰＤＭＳである、上記装置。
【００２７】
前記結合は、表面が活性化されたＰＤＭＳの対向する表面によって形成される、上記装置。
【００２８】
前記結合は、表面が活性化されたＰＤＭＳの一方の反対側の表面によって形成され、他方の表面は、ＰＤＭＳ以外の、表面が活性化されたガラス又はポリマーである、上記装置。
【００２９】
２つのサブアセンブリを準備することであって、各サブアセンブリは、比較的剛性の材料の裏材と、他方のサブアセンブリの合わせ面と結合するのに適した反対方向の向きの面とを有する、２つのサブアセンブリを準備することと、その後、該アセンブリの面同士を結合させることとによって形成される、上記装置。
【００３０】
前記結合は恒久的な結合を形成し、好ましくは、ＰＤＭＳのような表面の場合には、合わせ面の本来の構造が分子拡散によって実質的に排除される、表面が活性化された表面の結合を形成する、上記装置。
【００３１】
前記結合は、例えば上記装置の再使用を可能にするように分離可能である、上記装置。
【００３２】
前記結合は静電引力によって実質的に形成される、上記装置。
【００３３】
前記検出要素は、７００ミクロン以下、好ましくは約５００ミクロン未満、最も好ましくは約２００ミクロンの長さ、及びおよそ７０ミクロン±５０ミクロン、好ましくは多くの例において５０ミクロン±２５ミクロンの内径を有する円筒形の中空の流れ要素を含み、該要素は、その内面が、選択された流体アッセイ用の捕捉剤で実質的に均一にコーティングされる、上記装置。
【００３４】
前記捕捉剤はＥＬＩＳＡを行う抗体である、上記装置。
【００３５】
捕捉剤は、前記要素の全ての外面には実質的になく、前記検出要素は、該検出要素が挿入される前記チャネルに対して、該要素を通る実質的な流路、及び該要素の外面に沿う実質的なバイパス流路を規定するサイズである、上記装置。
【００３６】
前記検出要素は、該検出要素が挿入される開チャネルの深さよりも深い深さを有し、捕捉層が前記チャネルを閉鎖及び封止し、前記捕捉層は、前記流れ要素とのその接触によって弾性変形し、それによって、前記流れ要素に対して、該要素の位置を前記チャネル内に固定する力を加える、上記装置。
【００３７】
前記捕捉層は、前記開チャネルを規定する前記物質に共有結合する、上記装置。
【００３８】
前記捕捉層及び前記物質はともにＰＤＭＳを含む、上記装置。
【００３９】
前記捕捉層の一部が、対向する材料によって形成される弁座に係合するようになっている弁ダイヤフラムを形成し、前記一部は、合わせられる弁の表面同士の共有結合を妨げる、繰り返しの開閉弁座接点作製プロトコルに付されている、上記装置。
【００４０】
ＥＬＩＳ生物学的アッセイを行うように構成されている、上記装置。
【００４１】
７００ミクロン未満、好ましくは約５００ミクロン未満の長さの、一連の約３個〜１０個の離間した別個の流れ要素が所与のチャネル内に固定される、上記装置。
【００４２】
蛍光が捕捉された検体を標識し、前記流れ要素は、検出されるように外方へ進む蛍光放射を透過する窓に露出される、上記装置。
【００４３】
上記装置の窓は、蛍光落射検出を可能にするように、外部で生成された刺激光放射に対して透過性である。
【００４４】
別の態様において、流体アッセイ、例えば生物学的アッセイを行うマイクロ流体装置であって、捕捉剤が付される少なくとも１つの別個の流れ検出要素が挿入される流れチャネルを有し、前記流れ要素は該アッセイを行う装置内で流体の流れに暴露されるように位置決めされ、該装置は、２つのサブアセンブリを準備することであって、各サブアセンブリは、比較的剛性の材料の裏材と、他方のサブアセンブリの合わせ面と結合するのに適した反対方向の向きの面とを有する、２つのサブアセンブリを準備することと、その後、該アセンブリの面同士を結合させることとによって形成される、マイクロ流体装置が提供される。
【００４５】
好ましい実施態様は、特許請求の範囲によって示される更なる特徴を有する。
【００４６】
上記装置において前記結合は、前記２つのサブアセンブリの分離を可能にするように、静電結合等の破断可能なものである。
【００４７】
上記装置において前記結合は、２つの表面が活性化される表面をともに結合することによって形成される恒久的なものである。
【００４８】
上記装置において前記表面のうちの一方を画定する部材が、前記検出要素の位置をその流れチャネル内に固定し、可撓性のポンプダイヤフラム又は可撓性の弁ダイヤフラムを形成する部分を有し、好ましくは、前記シートのそれぞれの部分がこれらの機能の全てを行う。
【００４９】
上記装置において可撓性の弁ダイヤフラム部分が、該弁ダイヤフラム部分とその対向する弁座との共有結合を中断する一連の開閉接点に晒されている、表面が活性化された結合可能な材料から本来形成される弁座に係合する。
【００５０】
上記装置において前記合わせ面はともにＰＤＭＳの合わせ面である。
【００５１】
別の態様において、流体アッセイ、例えば生物学的アッセイを行うマイクロ流体装置であって、捕捉剤が付される、定位置にある、約７００ミクロン未満、好ましくは約５００ミクロン未満の長さ、及び約７５ミクロン±５０ミクロン、好ましくは多くの場合に５０±２５ミクロンの内径を有する極めて短い中空の流れ要素を含む少なくとも１つの別個の流れ検出要素が挿入される流れチャネルを有し、前記流れ要素は該アッセイを行う装置内で流体の流れに暴露されるように位置決めされ、前記流れ要素は、表面が活性化されるとともに、隣接する領域の対向する部材に分子結合によって結合される材料の重なる層によって定位置に固定される、マイクロ流体装置が提供される。
【００５２】
別の態様において、流体アッセイ、例えば生物学的アッセイを行うマイクロ流体装置であって、その内面のみに捕捉剤が付される、少なくとも１つの別個の流れ検出要素（好ましくは、定位置にある、約７００ミクロン未満、好ましくは約５００ミクロン未満の長さ、及び約７５±５０ミクロン、好ましくは多くの場合に５０±２５ミクロンの内径を有する極めて短い中空の流れ要素）が挿入される流れチャネルを有し、前記流れ要素は該アッセイを行う装置内で流体の流れに暴露されるように位置決めされ、前記流れチャネルは矩形の断面を有し、前記要素の外面は円筒形の断面を有し、該要素の該外面に沿ってバイパス流路が画定されている、マイクロ流体装置が提供される。
【００５３】
別の態様において、極めて短い中空の流れ要素の形態の別個の検出要素であって、約７００ミクロン未満、好ましくは約５００ミクロン未満の長さ、及び７５ミクロン±５０ミクロン、好ましくは多くの場合に約５０±２５ミクロンの内径を有し、該流れ要素には捕捉剤が付されており、該流れ要素は、アッセイを行う装置内で流体の流れに暴露されるように適所に固定されるように構成されている、別個の検出要素が提供される。幾つかの実施態様において、前記捕捉剤は前記要素の内面のみに存在する。
【００５４】
別の態様において、中空の流れ要素の形態の別個の検出要素であって、その内面にアッセイ用の捕捉剤を担持するがその外面には担持せず、該要素は、該要素を通る流れ容量に対して少なくとも約５０％のバイパス流れ容量を提供するように流体チャネル内の適所に固定されている、別個の検出要素が提供される。或る特定の実施態様において、前記バイパス流れ容量は、上記要素を通る前記流れ容量に対して約７５％以上であり、他の実施態様においては、前記バイパス流れ容量は、上記要素を通る前記流れ容量に対して約１００％以上である。
【００５５】
別の特徴は、上記のそれぞれの前記装置又は前記要素を製造する方法である。
【００５６】
別の特徴は、上記のいずれかの前記装置又は前記要素の使用方法である。
【００５７】
別の特徴は、アッセイの検出要素を準備する方法であって、前記検出要素、好ましくは中空の流れ要素を溶液内で混合することによってバッチコーティングすることと、乾燥させることと、その後、前記要素を取り上げてマイクロ流体装置の流れチャネル内に配置することと、好ましくは、前記流れチャネルを封止しながら前記流れ要素を捕捉する２つの対向する層を結合することによって前記要素を捕捉することとを含む、アッセイ用の検出要素を準備する方法である。
【００５８】
他の重要な特徴は、上述の装置のそれぞれを製造する開示の方法を含む。
【００５９】
他の重要な特徴は、上述の装置のそれぞれのうちの任意のものを使用する開示の方法を含む。
【００６０】
各発明の１つ又は複数の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の説明に記載される。本発明の他の特徴、目的及び利点は、説明及び図面から並びに添付の特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】空気／流体界面層（ａ）を示す図である。
【図２】チャネル閉鎖層（ｂ）を示す図である。
【図３】流体／反応ベッセル層（ｃ）を示す図である。
【図４】完全に組み付けられたマイクロ流体装置を示す図である。
【図５】反射コーティングを有するマイラーフィルムを示す図である。
【図６】マイクロ流体弁を示す図である。
【図７】マイクロ流体ピストンを示す図である。
【図８】マイクロ流体装置の動作を示す図である。
【図９】別のマイクロ流体アッセイ装置の組み付けステップの概略斜視図である。
【図９ａ】図９の装置の分解斜視図である。
【図１０ａ】図９及び図１０の流体チャネルの斜視図である。
【図１０ｂ】流れチャネル、中空の流れ要素、弁座及びポンプチャンバーを示す図１０ａの一部の拡大図である。
【図１０ｃ】図１０ａ及び図１０ｂのチャネル内に配置されている１つの極めて小さい中空の流れ要素を更により大きく拡大した図である。
【図１１】それぞれに４つの中空の流れ要素が配置されている２つのチャネルを示す、チャネル構造の一部を大きく拡大した平面図である。
【図１２】オンボードポンプ及び弁の概略図を有し、中空の流れ要素を通るとともに中空の流れ要素に沿う流路を示す、１つのチャネルの平面図である。
【図１２ａ】図１２の弁の図である。
【図１３】装置のチャネルの部分が切断されており、流れ要素内及び流れ要素の外側の流線を示す図式的な断面図である。
【図１３ａ】２つの層が、チャネルを閉鎖して中空の流れ要素を固定するために共有結合によって融着されている図１４３と同様の図である。
【図１４】図９の流体サブアセンブリの拡大平面図である。
【図１５】図９の空気サブアセンブリの部品を組み合わせるときの斜視図である。
【図１６】空気サブアセンブリの下面を、その透明なメンブレンを通して見上げた平面図である。
【図１７】同様に空気サブアセンブリの下面の、及び流体サブアセンブリの相手方の上面の平面図である。
【図１８】２つのサブアセンブリを一体にする動作を図式的に示す斜視図である。
【図１８ａ】僅かな圧力で押し合わせられる２つのサブアセンブリの一体となる表面を示す側面図である。
【図１８ｂ】図１８ａの一部の拡大図である。
【図１８ｃ】完成したアセンブリを上から見た斜視図である。
【図１８ｄ】完成したアセンブリを下から見た斜視図である。
【図１９】完成したアセンブリの上面図である。
【図２０】図９〜図１９の装置の組み付けプロセスにおけるステップの図である。
【図２０ａ】液密なチャネルを形成するとともに極めて小さい中空の流れ要素をチャネル内の所定位置に固定するために共有結合を用いるときのステップを示す図である。
【図２０ｂ】液密なチャネルを形成するとともに極めて小さい中空の流れ要素をチャネル内の所定位置に固定するために共有結合を用いるときのステップを示す図である。
【図２０ｃ】液密なチャネルを形成するとともに極めて小さい中空の流れ要素をチャネル内の所定位置に固定するために共有結合を用いるときのステップを示す図である。
【図２０ｄ】液密なチャネルを形成するとともに極めて小さい中空の流れ要素をチャネル内の所定位置に固定するために共有結合を用いるときのステップを示す図である。
【図２１】Ｘ、Ｙ並進テーブルの上に位置決めされているピックアンドプレース器具、別個の極めて小さい中空の流れ要素の送達プレート、及び先行する図のマルチプレックスマイクロ流体アッセイ装置の受け取りチャネルの図である。
【図２２】ピンセット型のピックアンドプレース装置及びその支持タワーの正面図である。
【図２３】ピンセット型のピックアンドプレース装置及びその支持タワーの側面図である。
【図２４】図２２及び図２３の装置によってピックアンドプレースするところを示す図である。
【図２５】図２２及び図２３の装置によってピックアンドプレースするところを示す図である。
【図２６】流れ要素の配置中の一連の位置のうちの１つを示し、ｎｓはチャネル壁と送達される要素との間の近接空間静電引力の使用を図式的に示す図である。
【図２７】流れ要素の配置中の一連の位置のうちの１つを示し、ｎｓはチャネル壁と送達される要素との間の近接空間静電引力を図式的に示す図である。
【図２８】流れ要素の配置中の一連の位置のうちの１つを示し、ｎｓはチャネル壁と送達される要素との間の近接空間静電引力を図式的に示す図である。
【図２９】真空ピックアップ装置によってピックアンドプレースするところを示す図である。
【図３０】真空ピックアップ装置によってピックアンドプレースするところを示す図である。
【図３１】真空装置による流れ要素の配置中の一連の位置のうちの１つを示し、ＮＳはチャネル壁と送達される要素との間の近接空間静電引力の使用を図式的に示す図である。
【図３２】真空装置による流れ要素の配置中の一連の位置のうちの１つを示し、ＮＳはチャネル壁と送達される要素との間の近接空間静電引力の使用を図式的に示す図である。
【図３３】真空装置による流れ要素の配置中の一連の位置のうちの１つを示し、ＮＳはチャネル壁と送達される要素との間の近接空間静電引力の使用を図式的に示す図である。
【図３４】図９の装置の組み付け中に行われる要素固定動作を示す図である（以下参照）。
【図３５】図９の装置の組み付け中に行われるチャネル封止動作を示す図である（以下参照）。
【図３６】各側で対向する構造に結合されるＰＤＭＳ層の覆う部分によって形成されているダイヤフラム弁の繰り返しサイクルを示す図であり、３ｐｓｉの陽圧及び８ｐｓｉの陰圧（真空）によって繰り返し開閉される弁は、ダイヤフラムと弁座との間に形成されている分子結合を克服することが分かっており、したがって、間に接触面−活性面を形成する恒久的な共有結合の傾向を経時的に中和し、したがって、このように形成された弁が適切に動作することを可能にする。
【図３７】液体の流れを左側からピストン内に引き込んで右側に放出し、所望の方向性のある拍動流を発生させることができる、圧送及び弁状態のシーケンスを図式的に示す図である。
【００６２】
図１−空気／流体界面層（ａ）
図１は図１ａ及び図１ｂを含み、貫通（ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｕｔ）チャネルが付随するおよそ１５０μｍ厚の可撓性ポリマーフィルム（ａ１）が載る顕微鏡スライド等のガラスシート（ａ２）から構成され、それによって一方の側がガラスシート（ａ２）によって閉じており、他方の側が開いている開チャネル又は溝（ａ３）を形成する、空気／流体層（ａ）を示している。
【００６３】
図２−チャネル閉鎖層（ｂ）
図２は図２ａ、図２ｂ及び図２ｃを含み、予め切り込まれた貫通孔ビア（ｂ６）及びアルミニウム等の反射コーティングを有するおよそ１２μｍ厚のマイラーシート（ｂ４）を、対応する予め切り込まれたビア（ｂ６）を有するおよそ１５０μｍ厚の可撓性ポリマーのシート（ｂ５）に取り付けることによって形成されるチャネル閉鎖層（ｂ）を示している。なお、例えば図２ｃに示されているような代替的な実施形態では、チャネル閉鎖層（ｂ）は、反射コーティングを有するか又は有しないマイラーシート（ｂ４）のみから可撓性ポリマーシートを伴わずに構成してもよいことが想定される。チャネル閉鎖層（ｂ）は、空気／流体層（ａ）に恒久的に結合され、空気／流体層（ａ）のチャネルの上部を閉じ、それによって閉鎖チャネルを形成する。チャネル閉鎖層（ｂ）は、空気／流体層（ａ）のチャネルの上部閉鎖体として働くことに加えて、以下の機能を提供する：
貫通孔ビア（ｂ６）は、空気／流体層（ａ）から流体／反応ベッセル層（ｃ）への流体及び空気の通過を可能にする。
チャネル閉鎖層（ｂ）は、弁及びポンプの作動の一環として撓む柔軟な材料から構成される。
マイラーフィルム（ｂ４）は、本明細書において後述するポンプ及びピストンの必要な構成要素であるガス不透過層を提供する。
マイラー層（ｂ４）の反射コーティングは、励起エネルギーを、マイラー層に達する前に反射し、それによって自家蛍光を防止する（図５を参照のこと）。
反射コーティングは、励起エネルギーを反応ベッセルに反射し戻し、この結果、入射蛍光が２倍に増加し、放出される蛍光が２倍増大し、それによって、放出される放射の捕捉をほぼ２倍高める。この結果、反射されるシグナルに対して反射されない蛍光シグナルが全体的にほぼ４倍増大し、それによって、検出シグナルがほぼ４倍増大する。
【００６４】
図３−流体／反応ベッセル層（ｃ）
図３は図３ａ及び図３ｂを含み、貫通チャネルが付随する約１５０μｍ厚の可撓性ポリマーフィルム（ｃ７）が載る２００μｍ厚のガラスカバースリップ等の薄ガラスシート（ｃ６）から構成され、それによって一方の側がガラスシート（ｃ６）によって閉じており、他方の側が開いている開チャネル又は溝（ｃ８）を形成する、流体／反応ベッセル層（ｃ）を示している。これらのチャネルは、流体の経路（ｃ９）、反応ベッセル（ｃ１０）を収容するチャネル（複数の場合もある）を提供し、オンボード弁及びピストン（ｃ１１）の特徴部を提供する。反応ベッセルは、流体／反応ベッセル層（ｃ）内に挿入され、次いで、チャネル閉鎖層（ｂ）（空気／流体層によって占められない側）に取り付けられ、それによって、流体／反応ベッセル層（ｃ）内のチャネルの上部を閉じて図４に示されているような閉鎖チャネルを形成する。
【００６５】
図４−完全に組み付けられたマイクロ流体装置
【００６６】
図５−反射コーティングを有するマイラーフィルム
このマイクロ流体装置は、流体流を駆動、制御及び操作するために、オンボードの空気圧によって作動されるピストン及び弁を含む。流体流の駆動、制御及び操作は、生体試料、試薬、希釈剤及び洗浄緩衝液の流れを導入するとともに計量することと、反応ベッセル内で行われるアッセイの流量及びインキュベーション時間を制御することとを含む。
【００６７】
図６−マイクロ流体弁
弁は、空気／流体層（ｃ）内に含まれている空気チャネル（１２）に陰圧を印加することによって作動され、それによって、柔軟なチャネル閉鎖層（ｂ）を撓ませてポリマー壁（１４）から持ち上げ、流体が流れることを可能にする（図ｂを参照のこと）。陰圧が解放されて柔軟な層が弛緩することを許されたときの密封を維持するためには、陽圧を印加する必要がある（図６ａを参照のこと）。柔軟なチャネル閉鎖層（ｂ）は、ガス不透過性であることによって流体チャネル（１５）内へのガスの侵入を防止するマイラーシート（ｂ４）を含む。
【００６８】
図７−マイクロ流体ピストン
ピストンは、空気／流体界面層（ａ）に含まれている空気チャネル（１２）に陰圧（図７ａ）及び陽圧（図７ｂ）を印加し、それによって、柔軟なチャネル閉鎖層（ｂ）を撓ませて流体チャネル（１５）内に陽圧及び陰圧を発生させることによって作動される。両側にマイクロ流体弁を有する１つのマイクロ流体ピストンからなる構成は、２つの方向に流体を駆動する順序で作動することができる。柔軟なチャネル閉鎖層は、ガス不透過性であることによって流体チャネル（１５）内へのガスの侵入を防止するマイラーシート（ｂ４）を含む。
【００６９】
図８−マイクロ流体装置の動作
例として、以下は、マイクロ流体装置の１つの可能な構成の動作の説明である。これは例として示されており、本発明は、以下に記載されるこの特定の構成に限定されることは意図せず、他の、現在既知である構成及び後に将来的に開発される構成の双方を含むことが意図される。複数の試料入口、試薬ウェル、緩衝液、及び反応ベッセルの複数の隔離チャネル（２８）を有する構成が想定され、例えば、図８ａは、４つの試薬ウェル及び反応ベッセルの４つの隔離チャネル（２８）を有するマイクロ流体装置を示している。
【００７０】
１．試料は試料入口（１６）に加えられ、試薬は試薬入口（１７）に加えられ、緩衝液は緩衝液入口（１８）に加えられる。
２．弁１（２３）は、試料（１６）を反応ベッセル（２０）内に引き込むように弁５（２７）及びピストン（２２）とともに開閉される。
３．試料（１６）を廃棄物出口内に押しやるように、弁１、２、３及び４は閉じられ、弁５（２７）及びピストン（２２）は開閉される。なお、このプロセスは、試薬（ステップ４）及び緩衝液（ステップ５）に関して繰り返される。
４．弁２（２４）は、試薬（１７）を反応ベッセル（２０）内に引き込むように弁５（２７）及びピストン（２２）とともに開閉される。
５．弁３（２５）は、緩衝液（１８）を反応ベッセル（２０）内に引き込むように弁５（２７）及びピストン（２２）とともに開閉される。
【００７１】
種々の図面の同様の参照符号は同様の要素を指す。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
本発明の目的は、流体を、複数のチャネル及び経路を通して、コンパクトで効率的かつ低コストで移動させることが可能な、生物学的アッセイを行うマイクロ流体装置を提供することである。
【００７３】
ほとんどの実施態様では、アッセイ装置は、３つの主要な層、すなわち、（ａ）空気／流体界面層、（ｂ）チャネル閉鎖層、及び（ｃ）流体／反応ベッセル層を形成するようにともに積み重ねられる複数の基板から構成される。さらに、装置は、流体の流れを駆動、制御及び操作するマイクロ流体弁及びピストンを含む。図１〜図８を参照する以下の説明は、流体／空気チャネルの構造、弁、ピストン及び入口ポートの配置に関してマイクロ流体装置の１つの特定の構成を対象とするが、本発明の範囲はこの特定の構成に限定されることは意図せず、他の、現在既知である、例えば以下で提示する実施形態の構成、及び後に将来的に開発される構成の双方を含むことが意図される。
【００７４】
図１−空気／流体界面層（ａ）
図１は図１ａ及び図１ｂを含み、貫通チャネルが付随するおよそ１５０μｍ厚の可撓性ポリマーフィルム（ａ１）が載る顕微鏡スライド（ａ２）等のガラスシートから構成され、それによって一方の側がガラスシート（ａ２）によって閉じており、他方の側が開いている開チャネル又は溝（ａ３）を形成する、空気／流体層（ａ）を示している。
【００７５】
図２−チャネル閉鎖層（ｂ）
図２は図２ａ、図２ｂ及び図２ｃを含み、予め切り込まれた貫通孔ビア（ｂ６）及びアルミニウム等の反射コーティングを有するおよそ１２μｍ厚のマイラーシート（ｂ４）を、対応する予め切り込まれたビア（ｂ６）を有するおよそ１５０μｍ厚の可撓性ポリマーのシート（ｂ５）に取り付けることによって形成されるチャネル閉鎖層（ｂ）を示している。なお、例えば図２ｃに示されているような代替的な実施形態では、チャネル閉鎖層（ｂ）は、反射コーティングを有するか又は有しないマイラーシート（ｂ４）のみから可撓性ポリマーシートを伴わずに構成してもよいことが想定される。チャネル閉鎖層（ｂ）は、空気／流体層（ａ）に恒久的に結合され、空気／流体層（ａ）のチャネルの上部を閉じ、それによって閉鎖チャネルを形成する。チャネル閉鎖層（ｂ）は、空気／流体層（ａ）のチャネルの上部閉鎖体として働くことに加えて、以下の機能を提供する：
貫通孔ビア（ｂ６）は、空気／流体層（ａ）から流体／反応ベッセル層（ｃ）への流体及び空気の通過を可能にする。
チャネル閉鎖層（ｂ）は、弁及びポンプの作動の一環として撓む柔軟な材料から構成される。
ポリエステルフィルム（ＤｕＰｏｎｔ社のマイラー（商標））（ｂ４）は、本明細書において後述するポンプ及びピストンの必要な構成要素であるガス不透過層を提供する。
マイラー層（ｂ４）の反射コーティングは、励起エネルギーを、マイラー層に達する前に反射し、それによって自家蛍光を防止する（図５を参照のこと）。
反射コーティングは、励起エネルギーを反応ベッセルに反射し戻し、この結果、入射蛍光が２倍に増加し、放出される蛍光が２倍増大し、それによって、放出される放射の捕捉をほぼ２倍高める。この結果、反射されるシグナルに対して反射されない蛍光シグナルが全体的にほぼ４倍増大し、それによって、検出シグナルがほぼ４倍増大する。
【００７６】
図３−流体／反応ベッセル層（ｃ）
図３は図３ａ及び図３ｂを含み、貫通チャネルが付随する約１５０μｍ厚の可撓性ポリマーフィルム（ｃ７）が載る２００μｍ厚のガラスカバースリップ等の薄ガラスシート（ｃ６）から構成され、それによって一方の側がガラスシート（ｃ６）によって閉じており、他方の側が開いている開チャネル又は溝（ｃ８）を形成する、流体／反応ベッセル層（ｃ）を示している。これらのチャネルは、流体の経路（ｃ９）、反応ベッセル（ｃ１０）を収容するチャネル（複数の場合もある）を提供し、オンボード弁及びピストン（ｃ１１）の特徴部を提供する。反応ベッセルは、流体／反応ベッセル層（ｃ）内に挿入され、次いで、チャネル閉鎖層（ｂ）（空気／流体層によって占められない側）に取り付けられ、それによって、流体／反応ベッセル層（ｃ）内のチャネルの上部を閉じて図４に示されているような閉鎖チャネルを形成する。
【００７７】
図４−完全に組み付けられたマイクロ流体装置
【００７８】
図５−反射コーティングを有するマイラーフィルム
このマイクロ流体装置は、流体流を駆動、制御及び操作するために、オンボードの空気圧によって作動されるピストン及び弁を含む。流体流の駆動、制御及び操作は、生体試料、試薬、希釈剤及び洗浄緩衝液の流れを導入するとともに計量することと、反応ベッセル内で行われるアッセイの流量及びインキュベーション時間を制御することとを含む。
【００７９】
図６−マイクロ流体弁
弁は、空気／流体層（ｃ）内に含まれている空気チャネル（１２）に陰圧を印加することによって作動され、それによって、柔軟なチャネル閉鎖層（ｂ）を撓ませてポリマー壁（１４）から持ち上げ、流体が流れることを可能にする（図ｂを参照のこと）。陰圧が解放されて柔軟な層が弛緩することを許されたときの密封を維持するためには、陽圧を印加する必要がある（図６ａを参照のこと）。柔軟なチャネル閉鎖層（ｂ）は、ガス不透過性であることによって流体チャネル（１５）内へのガスの侵入を防止するマイラーシート（ｂ４）を含む。
【００８０】
図７−マイクロ流体ピストン
ピストンは、空気／流体界面層（ａ）に含まれている空気チャネル（１２）に陰圧（図７ａ）及び陽圧（図７ｂ）を印加し、それによって、柔軟なチャネル閉鎖層（ｂ）を撓ませて流体チャネル（１５）内に陽圧及び陰圧を発生させることによって作動される。両側にマイクロ流体弁を有する１つのマイクロ流体ピストンからなる構成は、２つの方向に流体を駆動する順序で作動することができる。柔軟なチャネル閉鎖層は、ガス不透過性であることによって流体チャネル（１５）内へのガスの侵入を防止するマイラーシート（ｂ４）を含む。
【００８１】
図８−マイクロ流体装置の動作
例として、以下は、マイクロ流体装置の１つの可能な構成の動作の説明である。これは例として示されており、本発明は、以下に記載されるこの特定の構成に限定されることは意図せず、他の、現在既知である構成及び後に将来的に開発される構成の双方を含むことが意図される。複数の試料入口、試薬ウェル、緩衝液、及び反応ベッセルの複数の隔離チャネル（２８）を有する構成が想定され、例えば、図８ａは、４つの試薬ウェル及び反応ベッセルの４つの隔離チャネル（２８）を有するマイクロ流体装置を示している。
【００８２】
１．試料は試料入口（１６）に加えられ、試薬は試薬入口（１７）に加えられ、緩衝液は緩衝液入口（１８）に加えられる。
２．弁１（２３）は、試料（１６）を反応ベッセル（２０）内に引き込むように弁５（２７）及びピストン（２２）とともに開閉される。
３．試料（１６）を廃棄物出口内に押しやるように、弁１、２、３及び４は閉じられ、弁５（２７）及びピストン（２２）は開閉される。なお、このプロセスは、試薬（ステップ４）及び緩衝液（ステップ５）に関して繰り返される。
４．弁２（２４）は、試薬（１７）を反応ベッセル（２０）内に引き込むように弁５（２７）及びピストン（２２）とともに開閉される。
５．弁３（２５）は、緩衝液（１８）を反応ベッセル（２０）内に引き込むように弁５（２７）及びピストン（２２）とともに開閉される。
【００８３】
図１ｂ、図２ｂ及び図５−対応して小さい反応ベッセルが挿入される浅いチャネル（溝）
流体／反応ベッセル層（ａ）は、剛性材料のベース、この例では顕微鏡スライドガラスと、取り付けられるポリマー層とによって規定されて示されており、ポリマー層に切り込まれるスロットとして形成される開チャネル（ａ３）がある。したがって、チャネル（ａ３）の深さは、ベースに取り付けられるポリマーフィルムの厚さによって規定される。図５に示されているように、その深さにわたって、短い中空の流れチューブの形態である反応ベッセルが挿入されている。この例では、ガラスのベースは２００μＭ厚であり、ポリマーフィルムはおよそ１５０μｍ厚であり、また図５に示されているように、ベッセルは、別個の、その外径の数倍の短い長さを有する。チャネルは、チャネル閉鎖層（ｂ）によって非恒久的な結合を用いて中空の流れ要素の周りで閉じられている。
【００８４】
図２ｂ及び図２ｃ、図４ｂ及び図５−チャネル閉鎖層（ｂ）としてのポリエステルフィルム（マイラー、ＤｕＰｏｎｔ社の商標）−利点
材料の３つの異なる組み合わせがそれぞれの利点を提供する。最も簡単な構成は、マイクロ流体装置において一般的であるような可撓性エラストマーメンブレンの代わりに、薄いポリエステル（マイラー（商標））フィルム自身を可撓性メンブレンとして用いることである。ポリエステルフィルムは、ガス透過性が低いという大きな利点を有する。エラストマーメンブレンに関連する１つの特定の問題は、弁及びピストンを作動するために、陽圧をメンブレンの空気側に印加して弁を閉じ、真空圧を印加して弁を開くことである。陽圧を用いて弁が閉じたまま保持されている場合、エラストマーメンブレンのガス透過性によって、メンブレンの圧力側にあるガスは何であれメンブレンを透過することが可能となり、このことは、流体チャネル内での有害な気泡の形成につながる可能性がある。流体チャネル内での気泡の形成は、気泡が形成されるときに、流体側に種気泡が既に存在する場合に特に問題である。しかしながら、弁領域の流体チャネルが完全に充填されて気泡がない場合は、ガスの透過が非常に低く、アッセイに対して問題とはならない。しかし、その弁座に既に気泡が存在している場合、ガス圧力側から流体側へのガスの透過が生じ、そこに既に存在する小さい気泡を、アッセイの正確性に影響を与えるサイズにする。気泡は、流体が捕捉剤に暴露されるときに捕捉の一様性の妨げとなる可能性がある。気泡は、流れの動態を変え、すなわち、流体を気泡の回りに流してそのエリアにおける結合動態等を変える可能性がある。概して、気泡は、アッセイプロセスにおいてばらつきを生じさせるとされるため、望ましくない。
【００８５】
特に高圧システムでは、エラストマーではないガス不透過メンブレンを用いることによって弁及びピストンの作動時に気泡を発生させないようにすることが利点であり、優れた選択はポリエステル（マイラー（商標））であると理解されている。ポリエステルフィルムをチャネル規定層、例えばＰＤＭＳに結合するために、化学的な前処理及び酸化プラズマへの暴露によって、層間に結合を形成してアッセイ中にチャネルを閉鎖することが可能となる。
【００８６】
ポリエステルフィルム（マイラー（商標））は、ＰＤＭＳ等のエラストマーよりも桁違いに堅いことが分かっているが、エラストマー等の非常に可撓性のメンブレンから得られるのと同じ作動の動きを得るために、断面積、すなわち弁及びピストンの設置面積を増加させることが可能であると理解されている。ネットワークの密度が高い必要がないためメンブレンの拡大した作動領域に対応することができる多くの状況が存在する。
【００８７】
当然ながら、ネットワーク内の要素の密度を高め、それによってより小さい設置面積でより多くの機能を達成することができることが極めて望ましい他の状況が存在する。以下で説明する実施態様は、より小さい設置面積においてより多くのアッセイを実行し、より様々なアッセイ、より多くの試料、より多くの検体、全てについてより多くを実行することが可能であることが達成される。それにもかかわらず、ポリエステル（マイラー（商標））フィルムの使用は、或る特定のアッセイに関して重要な前進であると考えられる。
【００８８】
多くの場合に、シリンジポンプ又は蠕動ポンプ等の外部のポンプを用いて、マイクロ流体装置において流体流を高い流体圧で駆動することが望ましい場合が多かった。このことは、高流量が必要とされる場合、及び、高い外圧を必要とする、非常に小さいチャネルを通して高流量を発生させる必要がある他の場合に必要とされてきた。当然ながら、そのような装置には弁が必要である。非常に高い背圧が伴うことになる、弁を通る流れを停滞させることが望ましいたいていの場合には、その弁座を閉じたままに保つために非常に高い空気による作動圧を有する必要がある。本発明者らは、このようにメンブレンに高圧が印加されることによってメンブレンを通る空気の有害な拡散が促されることを、エラストマーではないガス不透過メンブレン、例えばポリエステルフィルムを設けることによって回避し、アッセイのより低い変動係数をもたらすことができると理解している。
【００８９】
ポリエステルフィルムには、その使用の妨げになっていると考えられ得るが、特に緑色レーザー光の存在下で高い自家蛍光を有するという特性がある。しかし、自家蛍光が問題とはならない、免疫アッセイにしばしば用いられる他の検出技法、例えば化学発光法、電気化学発光法及びフォトクロミック法が存在する。
【００９０】
光が通過しなければならないメンブレンの自家蛍光が潜在的な問題である落射蛍光（検出モードとしての光刺激蛍光放出）を用いることが望ましい他の場合が存在するが、本明細書において提示される独自の解決策がその問題を解決する。
【００９１】
本明細書において提供されるものとして、その問題に対する１つの解決策は、メンブレンの、励起源に面する側に反射コーティング、例えばアルミニウム蒸着コーティングを有するポリエステルフィルム（マイラー（商標））を使用することである。落射蛍光検出システムにおける刺激レーザーはしたがって、メンブレンに対する入射光線が反射コーティングによって簡単に反射されて自家蛍光基板に達しないため、ポリエステルにおける自家蛍光が防止される。この場合、図５に示されているように、励起ビームが対象の蛍光物体を２回、すなわち行きに１回及び帰りに１回励起する機会を有するという観点から、増大したシグナル捕捉を得るという点で付加的な利点が生じる。蛍光の放出は２回捕捉され、すなわち、検出器が、直接的な蛍光の放出及び反射された蛍光の放出を検出する。そのため、反射コーティングを用いることにはシグナルに関する利点がある。
【００９２】
ポリエステルフィルム（マイラー（商標））を用いる第３の有利な構成は、上記の図４〜図７及び関連する文脈に示されているものであり、この場合、金属面とチャネル内の試料及び試料流体との接触が回避される。マイクロ流体チャネル内の任意の種類の金属化面は、化学物質と反応するおそれから、流体に接触することが常に望ましいわけではない。
【００９３】
金属化面を湿潤状態に晒すことも、ポリエステルフィルム（マイラー（商標））への金属の付着の安定性に悪影響を与える可能性がある。エラストマー層がポリエステルフィルムに結合されて、流体に暴露される表面を規定する、図４〜図７の図に示されているハイブリッドメンブレン構造がこの問題を解決する。
【００９４】
上記の実施態様の場合、チャネルがＰＤＭＳ等のエラストマー構造内に形成されるか、又は射出成形若しくはエンボス加工されたプラスチック部品又はガラスに形成されるか、又はセラミックにエッチングされるかは、この特徴に関しては重要ではない。弁の先端部は可撓性メンブレンである。可撓性メンブレンは、ポリエステル（マイラー（商標））等の、１層のエラストマーではない蒸気不透過フィルム、及び、ＰＤＭＳ等の１層のエラストマー、又はアルミニウムを有する１層のポリエステルフィルム、又は反射コーティングを有しない１層のポリエステルフィルムからなるものである。
【００９５】
この実施態様では、シリンジポンプ又は蠕動ポンプによって外部から駆動される流れはない。全ての流れは、メンブレンの領域によって形成されるオンボードピストン及びオンボード弁によって生成され、メンブレンの他の領域では流体チャネルを完成させて封止する。それらのピストン及び弁の状態の任意の組み合わせによって、装置の液体側に対する大気圧を実質的に排気しながら、必要ないずれの方向への流れも形成する。この構成の場合、エラストマーメンブレン、好ましくはＰＤＭＳが用いられる。
【００９６】
ピストンは弁と同様に作動されるように構成されている。メンブレンの空気側では、この可撓性メンブレンを撓ませるために圧力及び真空の双方が用いられる。メンブレンの空気側に印加される圧力によって、ピストンが下に押されて流体チャネルのキャビティ（ポンプチャンバー）に入り、流体を変位させるとともに流体をそのキャビティから押し出す作用が生じる。流体は最も低い圧力の方向へ流れる。そのため、流体チャネルがピストンの一方の側で弁によって塞がれる場合、排気領域に向かう他の方向への流れが生じる。
【００９７】
空気圧及び真空によって作動されるピストンを用いてマイクロ流体チャネル内で試薬及び流体を流す機構は、蠕動プロセスと呼ばれる。ピストンは、撓んで流体チャンバーに入るか又は流体チャンバーから出るが、これによってそれぞれ流体が流体側のピストンチャンバーから変位するか又は流体がチャンバー内に引き込まれる。ピストンが真空によって作動される場合、流体は、流体ピストンチャンバーエリアから、すなわち流体ピストンチャンバーエリアから出るように引き上げられ、これによってその場所で陰圧が形成され、流体がその場所に向かって駆動される。そのため、流体を望ましいリザーバー又は場所のいずれからでも引き込むことによって圧送が達成され、このことは、所望の流体源の場所につながる弁を除いて全ての弁を実質的に閉じることによって達成される。
【００９８】
好ましい実施態様では、一定の寸法を有するピストンは、所与の低圧から所与の真空に制御可能に切り換えることによって作動される。低圧及び真空は外部源からのものであり、そのピストン構造の変位時の幾何学的形状によって内部の流体の量の変位が決まる。したがって、１ストロークあたり別個の一定量の変位が提供される。ピストンの所与のストロークに関して、一定量が変位し、ポンプチャンバー内に引き込まれるか又はポンプチャンバーから押し出される。典型的な実施態様では、その量は、１ピストンにつき１ストロークあたりおよそ３００ナノリットル〜６００ナノリットルの範囲内にあるように選択され、選択された値の数パーセント以内で制御される。典型的な寸法は、およそ±１００ミクロンの撓み範囲を有する、楕円形状の、約１ミリメートル長×０．５ミリメートル幅である。
【００９９】
装置の動作には、排気される入口リザーバー源からの試薬及び流体の蠕動様圧送が伴う。全ての供給源及びシンクは大気圧まで排気される。例えば、緩衝液入口リザーバー、検出入口リザーバー及び試料入口リザーバーは全て、大気圧に対して開口しているリザーバーである。廃棄物も大気圧に排気される。流れは、弁及び１つのピストンを常に用いる弁及びピストンの状態の組み合わせによって、指向性の流れを形成するように形成される。例えば、廃棄物の方向への流れは、廃棄物に向かうピストンの下流の弁を開き、いかなる上流の流れも阻止し、かつピストンを用いて流体を廃棄物チャンバーの方向に押すことによって可能となる。記載した排気のため、背圧は存在しない。
【０１００】
下流のすなわち廃棄物側の弁を閉じ、入口側の弁を開き、かつピストンを用いて流体を押し戻すことによって、入口のいずれかに向かって戻る流れも形成することができる。
【０１０１】
流れプログラムの一例として、弁及びポンプは、緩衝液を緩衝液入力弁から廃棄物に向かって移動させ、また代替的には検出リザーバー内に戻し、緩衝液を用いてそれぞれのリザーバー内の乾燥した捕捉剤、例えば検出抗体を再水和するように操作することができる。このシステムは、背圧を決して有することなく、弁及びピストンの状態の組み合わせを用いて流れを任意の入口から任意の他の入口へ、又は任意の入口から出口へ移動させることを可能にする。
【０１０２】
ピストンは、流れがどの方向へ移動するのが望ましいかに関係なくそれらの弁が全て雰囲気に排気される入口又は出口のいずれにも開いているため、実質的に背圧のない流体ネットワーク上で動作する。
【０１０３】
ピストン及びそのチャンバーの楕円形状によって横寸法がコンパクトになり、楕円は、楕円の長軸が、図示のマイクロカセットの長軸に対応する直線的なチャネルに一致するように配置される。楕円形状の別の利点は、基本的には、通常の流体チャネルから漸進的に拡張してこの楕円形状に拡張し、次に、後続の層流の流れラインに整合する通常のチャネル寸法に再び制限されて戻るチャネルの領域を提供することである。例えば、典型的なチャネル寸法は、ピストンチャンバーが位置付けられる地点までは１５０ミクロン〜２５０ミクロンの幅であるものとすることができ、次に、この楕円形状において、１ミリメートルの長さ寸法にわたっておよそ５００ミクロンの幅に拡張し、次に同様に２００ミクロンのチャネル幅まで狭まる。楕円は幅狭になるが、アッセイに必要な、例えば３００ナノリットル又は６００ナノリットルの体積変位を達成するほど依然として十分大きい。したがって、楕円を幅狭に保つことは、内部の全体積が増加するためピストンを通る速度が低下することに起因して流体が捕捉されるか又は非常に遅い速度に達する可能性があるポケットを低減するのに役立つ。混合が必要であるか又は１つの試薬を別の試薬によって変位させる必要がある場合、そのチャネルを流れる流体を保つことが望ましく、また、そのチャネルの幅を制限するのが実現可能な程度まで、ポンプを通る速度を、流体の変位を完了させるのに大量の流体を必要とはしないが、チャネルを洗い流し、何も残さないほど十分に高く維持することができる。この実施態様では、約４００ミクロン〜８００ミクロンの幅、及び約６００ミクロン〜１２００ミクロンの長さを用いることが望ましく、より小さい寸法は記載したより小さいポンプ容積に対応する。
【０１０４】
この特定の実施態様におけるポンプ及び弁の機能は、アッセイ、すなわち固定化捕捉剤、例えば抗体を有する中空の流れ要素を収容するチャネルに多くの異なる水性試薬液を充填することを伴う免疫アッセイを行うことである。この目的は、表面上に検体、例えば特定のタイプの抗原を捕捉することである。
【０１０５】
有用な捕捉剤としては、アッセイ用の抗体、抗原、オリゴマー、ＤＮＡ、天然ＤＮＡ又は更に小さい分子が挙げられる。
【０１０６】
以下の説明は、記載される特徴に従った装置において行われる特定の免疫アッセイの説明である。捕捉剤は、ヒトの血漿、ヒトの血清、尿又は脳脊髄液等の水性試料中を流れる特定の検体に対して高い親和性を有するように選択される。対象の検体が、記載したようにピストンによって作動されるチャネルを通って流れると、或る割合の検体が、中空の流れ要素、すなわち少数の一連の要素、例えば３個〜１０個の要素、好ましくは４個〜６個の要素の内面に結合する。その結合が生じると、中空の要素内及び中空の要素の周りの流体体積中のその特定の検体の濃度が低下するため、少量のスラグ（ｓｌｕｇ）を新たな溶液と入れ替えることが望ましい。このために、流体を、ピストン及び弁の周期的な作動によってシステム内に圧送する。入口に近い弁を開き、次にピストンに真空圧を印加することによって、試料をリザーバーから引き込むことが可能である。前述したように、７５ナノリットル〜６００ナノリットルが引き込まれ、目下好ましい実施態様では２００ナノリットルが引き込まれる。この実施態様では、１ピストンストロークあたり２００ナノリットルが選択され、システム内には４つのピストンがあり、それぞれが２００ナノリットルを変位させるため、４つ全てのピストンのフルストロークによって１サイクルあたり８００ナノリットルが提供される。
【０１０７】
各チャネルには１つのピストンがあり、記載した特定の装置において、図示されているような装置は４つの独立したチャネルとともに動作するため、１ピストンあたり２００ナノリットルの４倍となる。用いられるいずれかのリザーバーから同時に８００ナノリットルが引き込まれる。試料が、装置を通って流れる場合、１サイクルにつき血清であるか血漿であるか別の選択された試料であるかに関係なく、サイクルごとに８００ナノリットルの試料が消費される。緩衝液又は検出抗体が流される場合も同じことが当てはまる。常に、ピストン設計の選択される幾何学的形状によって決まる、１サイクルあたり８００ナノリットルのこれらの別個の体積変位がある。一方向流が所望される場合、ピストンが８００ナノリットルを引き込み、次に８００ナノリットルを押し出し、また次に８００ナノリットルを引き込み、次に８００ナノリットルを押し出すといった具合に続くため、流れは拍動するように生じる。典型的なＥＬＩＳＡプロトコル中には、１つのチャネルあたり２００ナノリットルのスラグ量で、８００ナノリットルの流体を、正味の流れにおいてそのスラグを新たなスラグによって実際に変位させることなくチャネル内にある間に往復して振動させることが望ましい。これは単に、１つ以外の全ての弁を閉じたままにし、次にピストンを往復させて振動させることによって行われる。正味の流れはチャネルを通過することが可能ではない。流れはチャネルに入り、次に上流へ変位して戻り、また次に引き戻され、このように循環して上流へ押し戻される。特定のアッセイでは、これは、スラグが排出されて新たなスラグが導入される前におよそ６０回行われる。これは、免疫アッセイにおいて検体及び中空の流れ要素へのその結合を実質的に利用するために６０回行われる。
【０１０８】
マイクロ流体装置の構成に関して、図４Ａは、２つの固有のサブアセンブリが、装置を支持する剛性構造を有する独立したスタンドアロン装置として形成される、複数サブアセンブリ構成を示している。サブアセンブリは、形成後、組み合わせられて完全なアセンブリを形成する。図４Ｂの左側に記載されているのは、２つの構成要素、すなわちこの場合ではガラス基板と、空気チャネル及び外界への流体界面チャネルを形成する、ガラス基板に結合されるポリマーフィルムとからなる空気流体界面層Ａである。空気流体界面層Ａは、射出成形プラスチック部材又はエンボス加工プラスチック部材として全体的に構成することもできる。この概念は、一方の側にチャネルが形成される中実の剛性基板を用いる。空気流体界面層Ａには、メンブレン又は弁及びピストン作動メンブレンとも称されるチャネル閉鎖層Ｂが結合される。チャネル閉鎖層Ｂは、上述したプロセス、すなわちプラズマ結合、ＰＤＭＳ対ＰＤＭＳ、又はより複雑であるが本質的に同様の、マイラーとＰＤＭＳとの結合を用いた恒久的な結合機構で結合される。これによって、空気流体層と呼ばれる完全なサブアセンブリが構成される。第２のサブアセンブリが、同様にガラスの中実基板と、ＰＤＭＳシートであって、ＰＭＤＳシートがガラス基板に結合されるところに切り込まれるチャネルを有するＰＤＭＳシートとからなり、図４Ｂにおいて流体反応層Ｃと呼ばれるものを形成する。ここでの着想は、これらの２つのサブアセンブリが形成され、これらのサブアセンブリが機械的な意味ではスタンドアロンであることである。このことによって、流体サブアセンブリを空気サブアセンブリに接触させる前に中空の流れ要素を開口した流体チャネル内に配置する機会が得られる。これは、流体装置のＰＤＭＳチャネル層が、非恒久的な結合で空気装置に結合されているＰＤＭＳメンブレン層に接触するように、それらの２つの層を互いに接触させることによって予め行われる（図１〜図８）。その結合は、２つの装置を一緒に保持するようにそれらの表面間を静電付着させるという性質を有する。そのように、付着は、チャネルからの漏れを防止するほど十分に強力であることが予想されるが、弁においてその力を克服することが背圧の使用によって可能であるほど強力ではない。弁はしたがって、弁座の真空作動によって作動することが可能であり、メンブレンと弁座との間の付着は、真空が非恒久的な静電付着を克服するようなものである。したがって、この構成プロセスは、互いに密接に接触するＰＤＭＳとＰＤＭＳとの間の自己接着に依存する２つのサブアセンブリの非恒久的な付着を伴う。装置は良好に動作し、２つのサブアセンブリを組み付けて互いに接触させることによってチャネルを完成させる前に、ユーザーが、中空の流れ要素、又は円形若しくは球状の要素である任意の他の要素、又は流体チャネル内に配置されるのに適した任意の他のタイプの装置を埋め込むことを可能にする。装置は良好に働く。装置の利点のうちの１つは、装置が再使用可能な構成のプロセスであり、それによって、特定のアッセイを実行した後で、装置を分解し、前回の実行で用いられたか又は消費された要素を取り出して新たな要素と入れ替え、したがって流体装置を保存しながら使用するが、消費可能な中空の要素は入れ替えることが可能であることである。これによって、最小限の装置を用いてアッセイ実施試験を非常に迅速に実行し、費用対効果があるという利点が与えられる。研究所にとっては、例えば、研究所が試薬又は物体をチャネル内に分注又は配置又はスポッティングしてからアッセイを実行し、マイクロ流体装置を再使用することによってそのプロセスを繰り返すことに関心がある研究環境における研究に有用である。
【０１０９】
図１〜図８のマイクロ流体装置の構成は、弁及びピストン、並びに直前で説明したサブアセンブリの接合という概念を表す。
【０１１０】
図９（以下参照）を参照すると、２つの予め構成されたサブアセンブリ間で組み付けを完成させる、大きな利点を有する別の有用な技法は、非恒久的な結合プロセスを用いることとは対照的に、恒久的な結合を形成することである。
【０１１１】
直前で説明した全体的な構成及び設計によって可能となる低圧動作は、空気に対するメンブレンを透過させるようにする駆動圧を下げることができるため、気泡の問題が、ＰＤＭＳ等のエラストマーメンブレンを従来技術の設計よりも大幅に低下した空気透過及び気泡のリスクで用いることが可能である程度まで軽減されることが分かった。このことは、製造が低コストかつ簡単であるという利点を有し、極めて一定の感度の高いアッセイを達成することを可能にする。
【０１１２】
次に説明する実施態様における違いは、真空又は圧力によって作動されて弁及びピストンを動作させるメンブレン又は可撓性の層がエラストマー材料から作られ、装置を作るのに異なる有利な技法が用いられることである。
【０１１３】
バッチプロセスによって製造される特別な中空の流れ要素の説明
対処する問題のうちの１つは、上記で図示及び説明したような中空の流れ要素、すなわち、流れチャネル内に固定されて液体試料の流れに暴露される、７００ミクロン未満、好ましくは５００ミクロン未満、また多くの場合に約２００ミクロンの長さ、及び約７５±５０ミクロンのボア直径を有する要素に関連する表面積に関するものである。（そのような中空の流れ要素及びこれらに基づくアッセイ装置は、ＣｙＶｅｋ社（Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ，  ＣＴ）から、「Ｍｉｃｒｏ−Ｔｕｂｅ」（商標）、ｕ−Ｔｕｂｅ（商標）及びＭｕ−Ｔｕｂｅ（商標）の商標名で入手可能である。）そのような装置は、キャピラリーチューブを形成するのに用いられるような無端延伸（ｅｎｄｌｅｓｓｌｙ  ｄｒａｗｎ）マイクロボアフィラメントから効率的に作られるが、この場合、フィラメントは、長さが細かく切られ、キャピラリーチューブではなく別個の極めて短い中空の流れ要素を形成する。浸漬技法によって塗布される、そのような装置の表面上に固定化される捕捉剤は、重大な枯渇の問題を引き起こす可能性があると理解されている。これは例えば、１ミリリットルあたり数ピコグラムといった低レベルの濃度の検体を特性化しようとすることが望まれる場合に生じる。「枯渇」と称される現象は、測定される試料中の検体の濃度が、流れ要素の大きな活性エリアに結合する結果として体積的に不都合に枯渇する可能性がある場合に生じる。この結果、アッセイの感度、したがってアッセイの有効性が低下する。更に説明すると、抗原に対するＥＬＩＳＡ又はサンドイッチ型のアミノアッセイにおける任意の検体は、慣性反力、動的プロセスによって支配されるように捕捉抗体に結合する。抗原等の検体が抗体等の捕捉剤に結合する一方で、その逆も生じ、結合している検体分子が捕捉剤から分離する。その動態は、検体が捕捉される「オン」速度及び検体が解放される「オフ」速度に関する。捕捉反応は、周囲の体積内の検体を枯渇させ、その正味の捕捉速度を低下させながら、系が、結合速度と分離速度とが等しい平衡に達するまで続く。実質的に指数曲線に従って漸次の作用が生じる。
【０１１４】
平衡状態の絶対値は、アッセイ対象の試料の体積中の検体の元の濃度に依存する。濃度の上昇はより高いシグナルにつながり、濃度の低下はより低いシグナルにつながる。アッセイの枯渇が生じる場合、試料中の検体の濃度は悪影響が出るように経時にわたって低下する。流れチャネル内に固定される中空の流れ要素によって、要素が暴露される液体試料の体積中の捕捉剤が余分になる可能性があり、検体の有効濃度を低下させると理解されている。濃度は、測定しようとする最初の開始点濃度に対して過度の速度で低下する。これを較正しようとする努力は役立つが、シグナルは、低下すると、雑音レベルに近づき、結果としてより低い信号対雑音比、すなわちアッセイの有効性の特有の低下につながるため、そのような枯渇は最終的にはアッセイの感度を下げる。（ノイズ、すなわちバックグラウンド、捕捉抗体の非特異的結合、蛍光ノイズ、電子ノイズ等の大きな一因となるものが既に存在する。）したがって、特に低い濃度を検出するために、アッセイ測定にプラスに寄与しないような検体の最初の量の枯渇を生じさせないことが望ましい。そのようにする効率的な方法は、暴露される表面の量を何らかの形で限定するため、明らかになっていない。これは、浸漬等によってコーティングされるとともに、免疫アッセイ若しくはサンドイッチアッセイ、又は更には分子診断型のアッセイにおいて用いられる、種々の記載の小さい検出要素の使用に関連する固有の問題とみなすことができる。典型的には、要素の全ての表面を均一にコーティングするために、要素を、捕捉剤、例えば抗体、又は感知若しくは検出される検体の捕捉分子である何らかのタイプの部分に浸漬することが望まれる。本発明の１つの目的は、内面及び外面によって特徴付けられ、又は多くの場合に２つの端面も有する中空の流れ要素に関してこの問題を克服することである。或る密度の捕捉分子がコーティングされる全ての表面積を合計することにより、およそ１０００００平方ミクロンにわたる表面積になることができる。これは、小径ボアフィラメントから形成される好ましい形態の中空の流れ要素にあてはまり、この要素は、およそ７００ミクロン未満、好ましくは約５００ミクロン以下、目下好ましい実施態様では２００ミクロンである長さを有する。同様に、内側ボアは、浸漬及び撹拌によって均一なコーティングを達成するように、５０ミクロン±２５ミクロンの範囲内であることが望ましいことが分かっている。１つの好ましい場合では、要素は１２５ミクロンの外径又は幅、及び７０ミクロンの内径又は幅を有する。本明細書において対処する特定の問題は、概して浸漬によってコーティングされる流れアッセイ要素、特に中空の流れ要素、また特に言及した寸法の要素の活性表面積を正確に低減する実用的な手法を見つけることである。
【０１１５】
本明細書において対処する更なる問題は、試料の流れに暴露するようにチャネル内の定位置に置かれる、処理される中空の流れ要素に関するものである。捕捉剤すなわち抗体を要素の表面に塗布し、次に各要素を例えばマルチプレックスマイクロ流体「チップ」（又は「カセット」）のチャネル内のその定位置に機械的に移送するように、要素を自由な状態においてバッチで固定化プロセスに暴露することが望ましい。迅速で正確な配置プロセス、例えば正確なＸＹステージに取り付けられるピックアンドプレース装置を用いることが望ましい。そのような目的のために、小さい要素を、表面からピックアップし、マイクロ流体通路を形成するように後で閉じられる開チャネル内に配置するように物理的に接触させることが望ましい。グリッパ、例えばピンセット器具、又は装置の外面に接触する真空ピックアップを用いることが望ましい。ピックアンドプレース動作は、中空の流れ要素を収納するように開チャネルを予めアライメントすることによって可能となり、自由な要素は自動化ピックアンドプレース器具によってその表面上に供給される。これによって、グリッパが、中空の流れ要素を供給ポケットから正確にピックアップし、中空の流れ要素が固定される所望の流れチャネルの位置に配置することが可能となる。真空ピックアップを用いる場合、中空の要素を供給溝内に端と端とが当接した関係で入れておき、外側円筒面と真空ピックアップとを係合させることが可能である。本発明者らは、活性捕捉剤、例えば抗体が要素の外面に固定化されていることに関連する問題が生じると認識している。そのようなコーティングは、操作プロセスの結果として機械的な損傷を受けやすい。マイクロ流れ要素の外面は、（ａ）供給面、例えばアライメントポケット又は溝、（ｂ）移送グリッパ又は真空ピックアップ装置、及び（ｃ）マイクロ流れ要素が配置されるチャネルの表面に接触する。これらの全ての接触する機会によって、通常は流れ要素の表面に吸着される抗体等の非常に薄い層である、脆弱なコーティングされた捕捉剤に損傷を与える可能性が生じる。このコーティングは多くの場合、およそ数ナノメートル又は数十ナノメートルの厚さである数分子分の厚さでしかなく、極めて脆弱である。配置された中空の流れ要素の捕捉面に損傷を与えることの最終結果は、アッセイの読み出し中に見られる。表面が引っ掻かれているか又は何らかの形で乱されている場合、捕捉された検体の一様でない濃度又は提示を生じる可能性があり、シグナルは一様ではなくなる可能性があり、アッセイの非再現性又は不十分な実行の一因となる。
【０１１６】
したがって、本発明者らは、中空の検出要素、特にマイクロボアフィラメントから形成される微細ボア要素の外面には固定化された活性捕捉剤がないことが望ましく、外面に捕捉剤がある場合、損傷を受けやすく、枯渇の一因となる捕捉剤すなわち抗体の全表面積の増加の一因となると理解している。
【０１１７】
特許請求の範囲及び以下で記載される特徴はこれらの問題及び他の重大な問題に対処する。
【０１１８】
別個の中空の流れ要素は、抗体又は抗原等の捕捉剤を含有する液体内に浸漬され、液体によってコーティングされた後で、フロースルーアッセイのために取り上げられてチャネル内に配置される。中空の流れ要素は、約７００ミクロン未満の長さ、及び７０±５０ミクロン、好ましくは５０±２５ミクロンのボア直径を有する別個の要素という好ましい形態である。流れ要素は、活性捕捉剤、例えば捕捉抗体が外側にはなく、又は限られた外側エリアにあるように表面処理される。この効果のために、中空の流れ要素は活性剤の槽内に配置されて激しく撹拌され、その結果、保護された内面のコーティングが生じるが、極度のせん断力に起因して、外面、例えば円形の断面の別個の要素の外側円筒面全体には付着しないエリアが生じる。このせん断手順の代わりに又はこのせん断手順に加えて、所定の捕捉剤による流れ要素の外面のコーティングを防止することになる特別なフィラメントの製造プロセスが考えられる。選択されたコーティングエリアの捕捉剤は、多数の要素の同時の処理のマスクによって作り出すことができるような、正確に位置決めされるレーザービームによって除去されるか又は不活性化され、中空の流れ要素の内面に画定されたエリアの残りの活性剤が残される。要素の内側の残りの捕捉剤自体が、所望のアッセイに関連する読み取り可能なコードを有用に規定する。流れチャネルの形状は、チャネル内に固定される流れ要素に対して、（ａ）第１の要素が詰まった場合に、中空の流れ要素の露出している外側に沿うバイパスチャネルの流れが、チャネル内の後の要素に達して後の要素内を流れることを可能にし、（ｂ）中空の流れ要素を通る試料及びアッセイ液体の流れに加えて、その表面を捕捉剤及び他のアッセイ液体に暴露するようなサイズである。外側を封止しようとする必要がないため、要素は、要素に押圧されるエラストマーシート等によって簡単に把持することができる。要素を適所に固定し、要素の送達後に配置器具を引き離すときの配置器具のいかなる撹乱力も克服するのに、流れ要素とチャネル壁との間の静電引力が用いられる。アッセイ後、落射蛍光検出を用いる場合、蛍光が励起されて中空の流れ要素の幾何学的形状に限定される特別な走査によって読み取られる。ロケーターが記録データに埋め込まれ、例えば要素から検出された蛍光データ内の対象の領域を見つけるのに用いられる。中空の要素内の捕捉剤物質によって書き込まれたコードは、要素の透明な壁を通じて読み取られる。多くの特徴が、他の中空の要素、例えばより長い要素の場合に有用であると分かっているか、又は有用であると分かることになる。
【０１１９】
走査に関して、本発明の目的は、マイクロ流体チップ内に含まれる複数の固定化要素の蛍光測定を行う方法を提供することである。この方法は、走査、並びに適切な焦点合わせ及びカメラ露光中に辿るべき道筋を求めることを提供する。この方法は、既知の一般的なチップレイアウトに基づいている。提供されるこの方法によって、測定されるチップをスキャナー内に配置し、次にいかなる付加的な手動の設定も必要とすることなく走査を開始することができる。この方法は、残りのことを行い、結果として所望の蛍光測定値を生成する。
【０１２０】
本発明の或る特定の態様は、内面に、撹乱されない、すなわち所望のエリア又はパターンを有する活性捕捉剤を残しながらも、中空の流れ要素の外面、例えば延長した外側円筒面及び／又は端面上に活性捕捉剤が生じることを排除又は防止することを含む。この態様に対処する特徴は、内面の捕捉剤を選択的に限定する技法、並びに外面及び内面と組み合わせて作用し所望の結果を達成するステップを含む。
【０１２１】
捕捉表面積全体を低減するという特定の利点に関して、本発明の２つの態様及びそれらの組み合わせの効果を説明する。第１の技法は、捕捉剤、例えば抗体が中空の流れ要素の外面に固定化することを排除又は防止するように用いられる。これはバッチコーティングプロセス中に行われ、要素の外面に撹乱せん断力を与えるために、対象の捕捉剤を含むエッペンドルフチューブ又は他の実験用チューブ内に別個の中空の要素を懸濁させることと、流体を強力に撹拌することとを含む。好ましくは、これは、例えば容器を、オービターのおよそ２０００ｒｐｍで、オービターの回転中心を横切って測定した約０．５ｃｍの支持テーブルの横方向への全偏位を伴う周回経路の周りで周回させる器具を用いて、流体を高速でボルテックス処理することによって達成される。中空の流れ要素は、或る量、例えば１ミリリットルの捕捉剤、例えば抗体とともに配置される。適切なボルテックス速度は、例えば懸濁液の性質、例えば選択される液体の粘度に依存し、実験によって容易に求めることができる。適切なボルテックス速度は、捕捉剤が中空の流れ要素の外側の長い表面、例えば本体が円形の断面を有する場合に外側円筒面に事実上存在しないか否かを観察することによって設定される。関連する物理的原理は、吸着プロセス中に捕捉剤が表面に結合することを防止するように働く、要素の外面に対する剪断力に関係する。激しい撹拌が、任意の捕捉剤、例えばその表面に既に結合している抗体をそぎ取るのに十分であるか否かを観察することができる。同時に、内面は、管状である幾何学的形状及びチューブのマイクロボアによってこのせん断から環境的に保護される。このことは、ボルテックス処理によって何らかの乱流が要素内で生じることを防止する。層流状態のみが存在する。マイクロボアの要素の場合、レイノルズ数は、その層流状態が内面に存在することを確実にするほど常に十分に低い。これらの状態下では、中空の要素の内壁の界面において横切る流体の速度は、当然ながらゼロである。そのため、内壁の界面ではせん断力は生じず、一方で、外側はかなりの乱流の高せん断力環境にある。要素の長さが短いことによって、内面の実質的に均一なコーティングが可能となり、一方で、浸漬によってコーティングされるより長い要素は、悪影響が出るように不均一にコーティングされやすい。強力な撹拌、例えばボルテックス処理の観察結果によると、サンドイッチアッセイを行うことによって観察される蛍光は、外側円筒面、又は他の形状の中空の要素には全く存在せず、一方で内面には観察可能に存在することが観察される。正方形の端の中空の流れ要素の場合、蛍光は要素の端面にも存在する。
【０１２２】
ボルテックス処理は、せん断力を発生させる目下好ましい技法である。本明細書において示されている場合では、コーティングされた要素を、１分あたりおよそ２０００回転のレートで、及び約２５ｍｍの偏位で、小さい円内で非常に高速に往復させるように周回回転させることを用いる。
【０１２３】
しかし、かなりの乱流を生じるいずれのタイプの高速振動も用いることができるため、往復運動、円形回転、流体を非常に迅速に混合して高せん断力を生じるものであれば何でも十分である。
【０１２４】
要するに、強力な撹拌の存在下での中空の流れ要素によって、要素の外面からの捕捉剤、例えば抗体の除去、及び捕捉剤による外面のコーティングの防止につながるが、要素の内面は、その後の試料の検体と相互作用するように捕捉剤、例えば捕捉抗体を固定化する状態に置かれる。
【０１２５】
高せん断技法の代替としては、小径ボアチューブの最初の引き抜き中に、かつ通常の除去可能な保護ポリマーコーティングがフィラメントに塗布される、引き抜き経路に沿う地点の前に、付着防止コーティング、例えばスパッタリングされる金、銀又は黒鉛を、例えばスパッタリングチャンバーに通すことによってフィラメントに塗布する代替的なプロセスが考えられる。捕捉剤、例えば抗体が付着する前に、シラン又は同様のコーティングを受け面に塗布しなければならない。しかし、スパッタコーティング等の特性に起因して、その面はシラン又は同様のものを受け取らず、その場合、同様に活性捕捉剤を受け取らない。
【０１２６】
本発明の別の特徴は、コーティングされた捕捉剤を、流れ要素の選択された端面、及び内面の縁部分又は他の部分から除去するという望ましさ及び技法を実現することに関する。好ましくは、強力な撹拌プロセスに続いて、要素は、捕捉剤、例えば抗体を、捕捉剤が高せん断プロセスによって除去されなかった表面から除去するか又は不活性化するレーザー除去プロセスを用いて更に処理される。それらの表面は、横断端面、及び内面の選択された部分を含み、アッセイを処理するのに十分であるが、試料からの検体の枯渇を低減するほど十分に小さいサイズの、内面の環状のストライプのみが残る。
【０１２７】
好ましい形態では、除去レーザーを中空の要素の延長軸に対して横断方向に配置し、これには、端面に対して平行に到達するエネルギーが、実質的に平行な放射の入射だけでなく、それらの端面を画定する透明な物質による放射の内部反射散乱の結果としてそれらの端面にある捕捉剤に対して中和効果又は除去効果を有するという効果がある。
【０１２８】
説明した２つの新規のプロセスの正味の効果は、新規の組み合わせで用いられる場合、中空の要素の内面に固定化される捕捉剤の、小さいものであり得る選択された寸法のバンドのみを残すことである。これは、捕捉剤がないスペースによって分離される１つ又は複数のバンドを残すように行うことができる。したがって、中央の単一のバンド、又は一方の端により近い単一のバンド、又は要素の長さに沿って分散される複数のバンドを生成することができる。これらのバンドは、異なる幅を有するものとすることができ、異なる間隔を有することができ、特定の流れ要素を符号化するのに有用なコード、例えばバーコードの形態を有することができる。
【０１２９】
さらに、重要な新規の特徴を有する製造技法を説明する。
【０１３０】
短い中空の要素を、予め供給された連続的な小径ボアのフィラメントから短い別個の要素に最初に形成する、すなわち切る。短い中空の要素を次にバッチ式に処理する。
【０１３１】
次に、中空の要素の大部分を、エッペンドルフチューブ内で洗浄緩衝液に暴露する。洗浄プロセスを行った後で、緩衝液を除去し、シランと入れ替える。この簡単な低コストの浸漬ステップを用いることによって、シランが要素の表面全体に結合することが可能となる。或る時間後に、余分なシランを、バッファ内の水で洗い流す。次に、捕捉剤、例えば抗体の溶液を、中空の要素の大部分とともにエッペンドルフチューブに添加し、一晩インキュベートさせる。インキュベーションは、周回ボルテックサーにおいて、１分あたり２０００回転でおよそ１６時間行い、周回運動による直径変位はおよそ０．５センチメートルである。多くのエッペンドルフチューブを収容する周回プレートは、およそ６インチの直径であるが、周回運動は、反時計回り方向及び次に時計回り方向の運動である円形のパターンであり、周回によって、例えば左右におよそ０．５センチメートルの変位が生じる。
【０１３２】
ボルテックスプロセスが完了した後の最終結果は、捕捉剤が中空の要素の内面に、及び端面にも固定化されているが、中空の要素の外側円筒面には存在しないというものである。捕捉剤溶液をエッペンドルフチューブから取り出して、洗浄緩衝液、洗浄緩衝溶液と入れ替え、洗浄緩衝液溶液を次に、ブロッキング緩衝液と呼ばれる安定化緩衝液と更に入れ替える。好ましい実施形態では、ＳＴＡＢＬＥ  ＣＯＡＴ溶液と呼ばれる市販の材料を用いる。
【０１３３】
ＳＴＡＢＬＥ  ＣＯＡＴブロッキング溶液を、中空の流れ要素とともにエッペンドルフチューブに導入し、次に、これらの要素の一部を、ＳＴＡＢＬＥ  ＣＯＡＴの幾らかとともにピペット内に吸引し、アライメントプレート上に分注する。ピンセットによるピックアップの場合、アライメントプレートは一連の矩形のポケットを含み、ポケットは、単一の要素を小さいスペース内に、好ましくは数ミクロンのサイズの隙間公差で、要素とポケットの壁との間に１０ミクロン〜５０ミクロンのスペースがあるように収容するとともに位置決めするようにそれぞれ設計されている。要素は、プレート上を浮遊した後で、依然として緩衝溶液の存在下でこれらのポケット内に落下する。余分な緩衝溶液を、要素を有するアライメントプレートを遠心分離機又は遠心分離機ホルダー内に配置するとともに、およそ２０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離させることによって要素を含むそれらのプレートから除去し、それによって、あらゆる余分なＳＴＡＢＬＥ  ＣＯＡＴ溶液をプレート及び要素から除去する。このプロセスは、排水チャネルがポケットから径方向に延在する新規のプレートの設計によって容易になる。（真空ピックアップの場合は、ピックアップがピンセットの場合のように端面にではなく円筒面に係合する理由から、要素同士の端と端とが近づくことができるため、ポケットによって可能となるよりも高い密度の被処理要素を収納するように連続的な溝が用いられる）。
【０１３４】
中空の要素は、依然としてプレートにある間に、レーザー、好ましくはエキシマレーザー、フッ化物レーザー又はフッ化クリプトンレーザーであり得る紫外レーザーを用いて、捕捉剤、例えば抗体を要素の端部及び要素の内面のセクションから除去するか又は変性させるように、要素の端部及び末端部分又はセクションがレーザービームによって要素の軸に対して垂直に暴露されるよう離間している２つのビームによって更に処理される。レーザー構成の特徴として、２つのレーザービームは、捕捉抗体の表面の残りのバンドの望ましい幅を規定する一定の距離だけ分離される。アライメントプレートのそれらのポケット内の中空の要素は、依然としてレーザーが要素の端部を実質的に処理するとともに、要素の中央付近で合理的な公差窓を上下する一定の幅パターンを残しながらも、或る程度の自由度で往復移動することが可能であるものとすることができる。
【０１３５】
その代わりに、ギャップを有する一連の３つ以上のレーザービームを規定することが可能であり、それによって、レーザービーム間の種々のギャップにおいてレーザービームの種々の幅によって生成されるパターンが、バーコードのように見えるとともにバーコードとして有用である中空の要素の暴露パターンを規定する。
【０１３６】
さらに、チャネル内で、中空の要素の外側及び要素内のかなりのバイパス流を有することが有用であると理解されている。１つの利点は製造が簡単であることであり、これは、要素を、封止することなく、また要素をチャネル壁に接着するために扱いにくい接着剤を用いようとすることなく保持することができるためである。別の利点は、液体流路に直列に配置される場合に可能性のある粒子が中空の流れ要素のうちの１つの内部の流れを妨げるためにアッセイを全く台無しにするというリスクを回避することである。外側にかなりのバイパス流を有することによって、少なくとも５０％、多くの場合に７５％以上、及び或る特定の好ましい場合には１００％以上が非常に有用となる。これによって、少なくとも或る程度、要素を「短絡」させることが可能となり、１つの要素が塞がれるか又は詰まって流れが止まっているにもかかわらず、他の要素が流れを受け入れて、アッセイは部分的にしか詰まっている粒子による影響を受けないことが確実となる。本明細書において提示される概念の場合、外面、すなわち円筒要素の場合は中空の要素の円筒形の外面又はその端面に活性捕捉剤を有することを回避することを可能にすることによって、結果として枯渇の問題につながらないと更に理解されている。活性捕捉剤が中空の要素の外側円筒面に付着することを回避するとともに、端部をレーザー処理するという上述した技法はしたがって、説明したバイパス流の利用の実用性に寄与する。
【０１３７】
中空の流れ要素のサイズ決め
長い間受け入れられてきた知識では、捕捉剤、例えば抗体の表面積が小さいほど、アッセイの感度が理論的観点からはより高くなる。したがって、中空の要素の内径を可能な限り小さく保ち、その表面積を最小限に抑えることが常に望まれてきた。しかし、現在では、限度内で、アッセイの性能は、その直径が或る程度まで増加するにつれて改善されると実験的に確定されている。これは、用いるのが望ましいバッチプロセスによる非均一なコーティング、またおそらくは、チューブ要素の直径が７５ミクロンの内径の要素と比較して小さい場合に、中空の要素を通って実際に流れる体積、全体積の量が乱されることが可能であるという点でアッセイ中に生じる何らかの効果の直接的な結果であると考えられる。本発明者らは、内径は約７５±５０、好ましい場合は５０±２５であるべきであることを見出した。
【０１３８】
外径は、内径又は内側の幅の１．２倍〜４倍の範囲内の直径又は幅を有することが好ましい。
【０１３９】
中空の流れ要素の長さに関しては、約７００ミクロン未満、多くの場合に５００ミクロン未満の長さによって最良の結果が得られる。目下好ましい形態では、長さは２５０μｍである。
【０１４０】
１００．我々が話している間にこのことを確認してみる。先願では、２０対１のＩＤ長対ＩＤに設定される２０対１の比が好ましいとされていた。
【０１４１】
より短い中空の要素によって、本明細書において説明されるバッチプロセスによりコーティングされる場合に捕捉剤のより高い均一性のコーティングにつながることが発見されており、また、より短い中空の要素は、ピックアンドプレース動作中の軸方向のピンセットの力により耐えやすいことが分かっている。
【０１４２】
上述したように、許容範囲で可撓性であるが寸法的に安定している、それらのそれぞれの中実基板又はキャリア上にそれぞれ作られる２つのサブアセンブリを提供することに大きな利点がある。極めて小さい中空の流れ要素（又はカセット内の適所に固定される他の検出要素）は、アライメントの前にサブアセンブリの一方の合わせ面の開位置に配置される。サブアセンブリ同士がアライメントされると、２つのサブアセンブリは、結合状態下で組み合わせられて１つの完全なアセンブリを形成し、要素の埋め込まれた位置を固定する。次に、２つのサブアセンブリは、組み合わせられて流体チャネルを完成する。２つのサブアセンブリを組み合わせることによって、弁及びピストン装置、並びに検出要素の埋め込みが完成する。これらの特徴は、図１〜図８を参照して上述した非恒久的に結合される実施形態とともに生じる。
【０１４３】
恒久的な結合の特徴を用いる広範な組み付けの概念の別の実施態様を次に説明する。ここで、図９から始めて幾つかの図面を参照する。以下は、図９（以下参照）に記される構成要素のリストである。
【０１４４】
２０．完成したカートリッジ
２２．試料入口ウェル
２４．緩衝液入口ウェル
２６．廃棄物ウェルリザーバー
２８．リザーバーウェル−抗体試薬を検出
−好ましい実施形態では−乾燥された
３０．マイクロ流体チャネル
３２．極めて小さい中空の流れ要素（「要素」）
３４．マイクロ流体弁座
３５．マイクロ流体弁空気チャンバー
３６．ピストン流体チャンバー
３７．ピストン空気チャンバー
３８．エラストマーメンブレン
３９．プラズマ結合されたインターフェイス
４０．流れを示す矢印
４１．バイパス流路
４２．ガラス基板
４３．バルク材料
４４．マイクロ流体チャネル壁
４６．制御／リザーバー層
４８．流体層サブアセンブリ−要素のない
５０．流体層サブアセンブリ−要素のある
５２．１回分の試料の４つの検体マイクロ流体ネットワーク
５４．マイクロ流体弁−フルアセンブリ
５５．ピストン−フルアセンブリ
５６．リザーバー／制御プラスチック部材
５８．空気界面ポート
６０．ピストン制御ライン
６２．弁制御ライン
６４．アーム器具の端部（ピンセット又は真空プローブ）
６６．ピックアンドプレースアーム（上下に動く）
６８．供給源／対象のＸ、Ｙテーブル（Ｘ座標及びＹ座標に動く）
７０．中空の流れ要素の供給源（溝及びウェルプレート）
７２．対象のマイクロ流体装置
７４．アーム器具の端部−真空
７６．アーム器具の端部−ピンセット
７８．活性化表面
【０１４５】
図９では、上側から始めて、サブアセンブリ４６、すなわち制御／リザーバー層４６が２つの要素から構成され、上側の射出成形又は機械加工されたプラスチック構成要素５６の下面にＰＤＭＳメンブレンシート３８が結合されている。
【０１４６】
底部の流体層又はサブアセンブリ５０が、検出要素、例えば中空の短い円筒形の流れ要素３２を有する。流体サブアセンブリは、ＰＤＭＳガスケット又はシート３８が一面にわたってその上面に恒久的に結合される薄いガラスシート４２からなり、シート３８は、チャネル壁４４間に流体チャネルを画定する切欠き部を有し、チャネルの底部はガラスシート４２である（図１０Ｃ）。それらの２つのサブアセンブリを組み合わせる前に、検出要素を、図示の実施形態ではピックアンドプレース動作によって流体層４８のチャネル内の定位置に分配する。２つのサブアセンブリ４６及び５０は、組み合わせられ、流体密で漏れのない動作を提供するがメンブレン３８の一部による弁及びピストンの作動も可能にするように結合される。この構成の１つの新規の特徴は、ＰＤＭＳガスケットを用いる記載の２つのサブアセンブリが、検出要素、この場合は極めて短い中空の流れ要素（Ｍｉｃｒｏ−ｔｕｂｅ（商標）要素）を捕捉するか又はチャネル内に埋め込むことを可能にすることである。それらの２つのサブアセンブリを組み合わせて単一のアセンブリにすることによって、中空の流れ要素を収容するマイクロ流体チャネルを有するという機能、並びに弁及びピストンが機能するという機能が提供される。流体的にロバストで漏れのないマイクロ流体構造では、それ自体既知であるプラズマ結合プロセスを用いることで記載した多くの機能を果たし、検出要素を所定位置に固定するとともに、ＰＤＭＳメンブレンが接触する露出している弁座においてプラズマ結合を破る、これから説明するプロセスと併せてチャネルを完全に封止するように弁及びポンプのダイヤフラムを形成する。
【０１４７】
流体サブアセンブリは、ＰＤＭＳをガラスに、次に上側アセンブリに共有結合させることによって組み付けられ、リザーバーアセンブリは、ＰＤＭＳをプラスチックに共有結合させることによって形成される。主要な利点は、別個の小さい検出要素、すなわち中空の流れ要素を、組み付け前に開チャネル内に配置することである。
【０１４８】
この技法の重要性は、捕捉剤、例えば抗体を効率的なバッチプロセスにおいて中実基板上に固定化することを可能にし、それによって、数千ものこれらの要素を、費用効果的で高度に再現可能である１回の非常に簡単なバッチプロセスで作ることを可能にすることにも関する。プロセス自体に、生物学的な内容物に損傷を与えるプロセスパラメーターがなく、室温のプロセスであるものとすることができる。
【０１４９】
したがって、この概念の特徴は、サブアセンブリを、定位置において捕捉要素と組み合わせることを含み、捕捉（又は検出）要素はバッチプロセスで予め準備されており、結合プロセス、特に恒久的なプラズマ結合プロセスを用いる最終的な組み付けによってサブアセンブリ同士を接合し、その接合は、弁座において、繰り返し局所的に撓んで弁の表面に接触することにより選択的に行われる。これについてはこれから説明する。
【０１５０】
弁調整（Ｂｒｅａｋ−Ｉｎ）プロセス
空気制御入力ポートを外部で制御される空気圧ラインに接続する。
メンブレンを空気弁チャンバー内に引き込むように真空（５ｐｓｉ〜１４ｐｓｉ）を用いて全ての弁を作動する。
表面が活性化された（例えばプラズマにより活性化された）リザーバー／制御層を、流体層と共形接触させる。
ＰＤＭＳメンブレンを流体層のＰＤＭＳ表面と密に接触させるように圧力（１ｐｓｉ〜１０ｐｓｉ）を弁制御ラインに一時的に印加する。制御ラインにおいて真空圧に切り替えて戻す前におよそ１秒〜３秒間接触させる。
１分〜２分の時間にわたって、およそ２０サイクルの真空と圧力との間の一連の作動を迅速に行うことによって弁の初期調整を行う。
ＰＤＭＳ面の表面の活性化及び熱履歴に応じて、５分〜２０分の時間にわたって真空及び圧力による弁のサイクルを継続する。最初の調整サイクルが行われると、よりゆっくりとしたより持続的な作動シーケンスを好ましくは用いて、全ての結合する傾向が防止されるまで、ＰＤＭＳ表面のゆっくりとした避けられない結合を防止し、これは、圧力によって最高１分間弁を作動し、その後、新たに形成された結合をいずれも破断するように真空によって間欠的に作動することにより達成することができる。このプロセスを最高２０分間継続することは、弁のメンブレンと弁座との間の将来的な恒久的な結合を完全に防止すると示されている。
同様の表面が合わせられたときに分子結合能力を有する他の材料も用いることができ、分子の結合は、弁座において同様に破壊される。
【０１５１】
弁調整プロセスの説明
主に−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）２−の反復単位から構成される本来のＰＤＭＳは、本質的に疎水性であり、また特別に処理することなく、ＰＤＭＳ、ガラス及びシリコン等の他の同様の表面に恒久的な結合ではないが付着する傾向がある。しかし、酸素プラズマ等による処理時に、メチル基（ＣＨ３）がシラノール基（ＳｉＯＨ）と入れ替えられ、したがって、高密度のシラノール基を含有する、他の同様の表面と不可逆的に結合することが可能な高い表面エネルギーの親水性表面を形成する。この不可逆的な結合プロセスは、各表面のＯＨ基間の凝縮反応によって生じ、結果として、水（Ｈ２Ｏ）の同時の遊離によって共有Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ結合が生じる。
【０１５２】
酸素プラズマ及び同様の技法は、圧力、出力及び時間等の制御パラメーターを有し、それらの全てによって表面のＯＨ基の濃度が決まる。より高濃度のＯＨ基であれば、２つの表面間でより多くの共有結合が生じ、したがってより強力な機械的結合が生じる。酸素プラズマ又は同様の処理後に雰囲気に暴露されたままであれば、親水性の表面が、バルクから表面への短い移動可能なポリマー鎖の移動によってその本来の疎水性状態に「回復」する。完全な「回復」は、室温で数時間かけて生じ、温度を上昇させることによって加速させ、真空及び／又は低温で保存することによって遅らせることができる。これは、結合前に親水性表面処理に固定するように、活性化された基板を、数日間真空バッグ内において−５０℃で保存することにより対処される。
【０１５３】
結合機構は、利用可能なＯＨ部位を完全に消費する前に数分から数時間の時間にわたる水の遊離を伴うかなりゆっくりとした縮合反応に従うため、このプロセスを完了前に中断することが可能である。完了すると、界面間の結合強度はバルク引き裂き強度に相当し、２つの材料の不可逆的な付着につながる。これらの層をこの段階で分離しようとすると、層の一方又は双方へのバルク損傷につながる。しかし、結合サイクルの初期段階においてこれらの表面を機械的に分離することによって結合プロセスを中断することは、２つの表面間に形成された少数の結合にしか修復不可能な損傷を与えないことが分かっている。バルクの引き裂き強度は、界面の結合よりもかなり高く、したがって、分離によるバルクへの損傷は修復不可能なものではない。また、結合プロセスが十分に早く（通常は最初の数秒以内に）中断される場合、層を分離するのに必要とされる力は、未処理の層を分離するのに必要とされる付着力と大差ない。層を短い時間（通常は更に数秒）再び接触させることによって、結合が再び始まって中断する。このサイクルを繰り返すたびに、可能性のある結合が、全てのそのような結合部位が消費されて材料が未処理材料の特性を有するものに戻るまで、徐々に排除される。
【０１５４】
好ましい新規の技法では、表面を活性化し、例えばＰＤＭＳ又は同様の表面をプラズマにより活性化し、それらの表面を接触させてから、可撓性メンブレンと弁座との間の結合を恒久的に妨害するが、装置を一緒に保持するために広範な表面にわたるいずれかの場所で完全でロバストな結合が生じるように弁を作動して開閉させることによって、ＰＤＭＳの層間にマイクロ弁が形成される。
【０１５５】
装置の製造
図９を参照すると、記載の概念を用いる製品は、ヒトの血漿試料中の抗体濃度を定量化する消耗マイクロ流体カートリッジである。図９に示されているようなカートリッジは、試料入口のオンボード投入部（ｐｒｏｖｉｓｉｏｎｓ）、換言すると、分析対象の試料、例えば血漿試料又は血清試料を受け取るリザーバーを含む。
【０１５６】
完成したカートリッジ２０は、患者の血漿試料若しくは血清試料、又は、脳脊髄液若しくは尿を含む他のタイプの体液を受け取る試料入口ウェル２２を含む。完成したカートリッジ２０はまた、アッセイの処理中に用いられる試薬である緩衝液の緩衝液入口ウェル２４と、マイクロ流体チャネルを通って流れるとともにマイクロ流体カートリッジに全て内蔵されている必要がもはやない試薬及び試料の全てを収容するように設計されている廃棄物リザーバーウェル２６とを含み、蛍光標識とともに検出抗体を含むリザーバーウェル２８も含む。好ましい実施形態では、検出抗体はチャネル又はリザーバー内で乾燥され、動作中に、緩衝液ウェル２４内に収容される緩衝液を用いて再水和される。
【０１５７】
ここで図１０、図１１及び図１２を参照する。図１０は、以下では要素と称される極めて小さい中空の流体流れ要素を含む４つの独立したマイクロ流体チャネル群を含むマイクロ流体チャネルを示している。図１０は、それぞれが６つのチャネル３０を含むそれらの４つのチャネル群を示している。極めて小さい中空の流れ要素３２、マイクロ流体弁座３４及びピストン３６が存在する。極めて小さい中空の流れ要素は、バッチプロセスで、捕捉抗体が要素の内面に付された状態で形成され、それらの要素はチャネル３２内に入れられる。
【０１５８】
中空の要素の寸法の例：好ましい実施形態の長さはおよそ２５０ミクロンであり、内径はおよそ７５ミクロンであり、外径はおよそ１２５ミクロンである。図１１は、平行な例示的なチャネルである２つの例示的なチャネル内に示されている中空の要素の拡大概略図である。
【０１５９】
目下好ましい実行では、チャネルは要素よりも幅広であり、要素は、近傍の静電力によって引き付けられて一方のチャネル壁に付着し、他方の側にバイパス流路を画定する。
【０１６０】
図１３は、中空の要素の外側にその要素を囲むスペースを有するチャネル３０内の中空の流れ要素の断面図を示している。図１３は、流れ矢印４０とともに示されているマイクロ流体チャネル３０内の中空の要素３２を示しており、中空の要素は、上面がエラストマーメンブレン３８によって、かつ底面がガラス基板要素４２によって捕捉されている。
【０１６１】
ガラス基板層４２の典型的な寸法は、ホウケイ酸ガラスの２００ミクロンの厚さであり、エラストマーメンブレン層要素３８は１００ミクロン〜２００ミクロンの典型的な厚さを有する。同様にチャネルを提供するのは、典型的な１００ミクロン〜１５０ミクロンの高さのエラストマーＰＤＭＳ材料であり、このようにマイクロ流体チャネルを形成する。同様に図１３に示されているように、エラストマーメンブレン層は左側及び右側の双方に続き、また、ガラス基板は左側及び右側に続き、両側に、中空のガラス要素を同様に含む１つ又は複数の平行なマイクロ流体チャネルが含まれ、ガラス層要素４２は、ＰＤＭＳ表面のプラズマによる活性化及びその後の接触、したがってガラス層への結合を伴う共有結合技法を用いるサブアセンブリプロセスにおいて予め形成されたエラストマー壁、すなわちマイクロ流体チャネル壁４４に結合され、中空の要素はそのチャネルに挿入される。
【０１６２】
平行な付加的なチャネル３０がある。平行なチャネルの目的は、交差反応を防止するために異なる抗体を互いから隔離することである。
【０１６３】
チャネルの深さは、中空の要素とチャネル壁との間の静電力によってプレース装置、例えばピンセット又は真空ピックアップが要素から解放されるように、取り上げられてチャネル壁のうちの一方に当接して配置される要素の直径よりも小さい。このプロセスにおいて、端部において「Ｌ字」形の動作で横方向に移動させることによって、静電引力が高まり、ピンセットを要素との係合から解放するとともにピンセットを取り外すことが可能となる。チャネル３０は、制御／リザーバー４６の弾性メンブレン３８の両端に接触させることによって包囲される。要素は、チャネル３０内でエラストマー３８とガラス４２との間に保持される。
【０１６４】
図１１は、一連の４つの離間した要素３２及びバイパス流れスペース４１を含む２つの例示的なチャネルを概略的に示している。
【０１６５】
図１４は、要素３２がチャネル３０内に入っている、流体層サブアセンブリ４８の上面図である。アセンブリ５０は要素を含む。
【０１６６】
図１４では、４組のマイクロ流体の１回分の試料、すなわち４つの検体ネットワーク５２が示されており、各ネットワークはそれ自身のそれぞれの試料によってアッセイを行うように設計されている。
【０１６７】
図１２は、４つの要素３２と、マイクロ流体ピストンチャンバー３６と、弁座３４（図１０）を有する弁５４とを含む単一のチャネル３０の拡大図である。
【０１６８】
図１２は、矢印によって、中空の要素３２の回りのバイパス流路４１及び要素を流れる流れを示している。
【０１６９】
図９及び図１４を参照すると、チャネル３０は、ガラス基板４２と、１１０ミクロンの厚さのＰＤＭＳのシートをナイフで切り込むことによって形成されるマイクロ流体チャネル壁３２とから形成される。
【０１７０】
図９は、既知の技法を用いて、ガラスシート４２と、特有の切り込みパターンのＰＤＭＳシート４２とを合わせることによって流体エリア４８を形成することを示している。
【０１７１】
リザーバー／制御プラスチック部材５６（試料の流体リザーバー２２、アッセイ緩衝液の流体リザーバー２４、及び試薬廃棄物の流体リザーバー２６を含む）は、ＰＤＭＳメンブレン３８に結合され、制御／リザーバー層４６を形成する。
【０１７２】
図１５の斜視図を参照すると、層４６及びメンブレン３８は、プラズマ活性化分子結合によって組み付けられる準備が整っている。図１６は最終的なアセンブリ４６を示す上面図である。空気界面ポート５８が、圧力及び真空による作動を、弁５４（メンブレン３８とマイクロ流体弁座３４とによって形成される）及びピストン５５（ピストンは、ピストン流体チャンバー３６及びピストン空気チャンバーに載るエラストマーメンブレン３８によって形成される）のピストン制御ライン６０及び弁制御ライン６２に提供する、コンピューター制御される空気制御ラインと合致するようになっている。３７と３６との間に挟まれるメンブレン３８によって形成されるピストンポンプは、一方向への真空及び他方向への圧力によって作動される。
【０１７３】
本発明の多くの実施形態を記載した。それにもかかわらず、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく多くの変更をなすことができることが理解されるであろう。したがって、他の実施形態が添付の特許請求の範囲の範囲内にある。
【図１Ａ】
0005978287.tif 000002
【図１Ｂ】
0005978287.tif 000003
【図２Ａ】
0005978287.tif 000004
【図２Ｂ】
0005978287.tif 000005
【図２Ｃ】
0005978287.tif 000006
【図３Ａ】
0005978287.tif 000007
【図３Ｂ】
0005978287.tif 000008
【図４Ａ】
0005978287.tif 000009
【図４Ｂ】
0005978287.tif 000010
【図５】
0005978287.tif 000011
【図６Ａ】
0005978287.tif 000012
【図６Ｂ】
0005978287.tif 000013
【図７Ａ】
0005978287.tif 000014
【図７Ｂ】
0005978287.tif 000015
【図７Ｃ】
0005978287.tif 000016
【図８】
0005978287.tif 000017
【図８Ａ】
0005978287.tif 000018
【図９】
0005978287.tif 000019
【図９Ａ】
0005978287.tif 000020
【図１０Ａ】
0005978287.tif 000021
【図１０Ｂ】
0005978287.tif 000022
【図１０Ｃ】
0005978287.tif 000023
【図１１】
0005978287.tif 000024
【図１２】
0005978287.tif 000025
【図１２Ａ】
0005978287.tif 000026
【図１２Ｂ】
0005978287.tif 000027
【図１２Ｃ】
0005978287.tif 000028
【図１２Ｄ】
0005978287.tif 000029
【図１２Ｅ】
0005978287.tif 000030
【図１２Ｆ】
0005978287.tif 000031
【図１３】
0005978287.tif 000032
【図１３ａ】
0005978287.tif 000033
【図１４】
0005978287.tif 000034
【図１５】
0005978287.tif 000035
【図１６】
0005978287.tif 000036
【図１７】
0005978287.tif 000037
【図１８】
0005978287.tif 000038
【図１８Ａ】
0005978287.tif 000039
【図１８Ｂ】
0005978287.tif 000040
【図１８Ｃ】
0005978287.tif 000041
【図１８Ｄ】
0005978287.tif 000042
【図１９】
0005978287.tif 000043
【図２０】
0005978287.tif 000044
【図２０Ａ】
0005978287.tif 000045
【図２０Ｂ】
0005978287.tif 000046
【図２０Ｃ】
0005978287.tif 000047
【図２０Ｄ】
0005978287.tif 000048
【図２１】
0005978287.tif 000049
【図２２】
0005978287.tif 000050
【図２３】
0005978287.tif 000051
【図２４】
0005978287.tif 000052
【図２５】
0005978287.tif 000053
【図２６】
0005978287.tif 000054
【図２７】
0005978287.tif 000055
【図２８】
0005978287.tif 000056
【図２９】
0005978287.tif 000057
【図３０】
0005978287.tif 000058
【図３１】
0005978287.tif 000059
【図３２】
0005978287.tif 000060
【図３３】
0005978287.tif 000061
【図３４】
0005978287.tif 000062
【図３５】
0005978287.tif 000063
【図３６】
0005978287.tif 000064
【図３７】
0005978287.tif 000065