(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
反すう動物におけるメタン生成を減少させるための方法であって、ネオヘスペリジン、イソナリンギン、ポンシリン、及びヘスペリジンからなる群から選択されるフラバノングリコシド又はこれらの混合物を含有する飼料用組成物を該反すう動物に経口的に投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記飼料用組成物がネオヘスペリジン及びポンシリンを含む混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記混合物がナリンギンをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記混合物が天然の植物抽出物である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記植物抽出物がカンキツ類植物抽出物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物が担体をさらに含む、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物が、２５〜５５重量％のナリンギンと、１０〜２０重量％のネオヘスペリジンと、１〜５重量％のポンシリンと、１００重量％とするのに十分な量の担体とを含む混合物である、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が、４０〜５０重量％のナリンギンと、１１〜１５重量％のネオヘスペリジンと、３〜５重量％のポンシリンと、１００重量％とするのに十分な量の担体とを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記担体がセピオライトである、請求項６から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記反すう動物が、子牛、ウシ、バッファロー、ヒツジ、シカ、ラクダ又はヤギである、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記反すう動物が子牛である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が、５０〜１０００ｍｇ／Ｋｇの乾物濃度で、飼料に、固体形態で加えられる、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が、２００〜５００ｍｇ／Ｋｇの乾物濃度で、飼料に、固体形態で加えられる、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反すう動物のメタン生成を減少させるための新規組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタン、二酸化炭素及び亜酸化窒素は、温室効果を有する主な気体である。
【０００３】
メタン（ＣＨ４）は、その大気濃度が前世紀にわたり劇的に増加した温室効果ガスであり、二酸化炭素の次に、地球温暖化の最も大きな潜在的誘因となっている。対流圏のメタンレベルの増加は、地球規模の人口の増大と密接に相関している。その結果、メタン排出の約７０％は、人間の活動に関連すると考えられている。世界中の人々の数が増大するにつれて、廃棄物の埋立て及び農作業により生じ大気中に放出される、メタンの量が増加することになる。
【０００４】
ウシ、バッファロー、ヒツジ、及びヤギを含めた反すう動物は、メタン生成発酵が生じる大きな前胃を有する。反すう胃消化管は、４つの胃の区画、第一胃、第二胃、第四胃及び第三胃で構成されている。これらの中で最も大きく及び最も重要なのが第一胃である。第一胃は発酵区画として作用する。これは、植物性物質を分解するメタン生成古細菌を含む、大きな微生物の集団を有している。当該微生物は一般的にメタン生成菌と呼ばれる。古細菌の集団は、嫌気性微生物の発酵生成物である水素及び二酸化炭素を使用して、増殖のためのエネルギーを産出し、最終生成物としてメタンを生成する。最後に、メタンはおくびを介して第一胃から排出される。
【０００５】
ウシ及びヒツジによるメタンの生成は、炭素損失経路を表し、これは生産性を減少させるものである。メタン合成を介して失ったエネルギーを他の生化学的経路を介して、一般的にはプロピオナート合成へと再び導くことができれば、第一胃発酵はより効率的となり、動物の体重増加又はミルク生産の改善に反映されるであろう。それは、大気へのメタン排出を減少させるのに効果的ツールを提供するだけでなく、生産者にとっても費用対効果が大きいであろう。実際、大気中のメタンの寿命は１２年であるため（これに対して、二酸化炭素及び亜酸化窒素の寿命はそれぞれ１００年及び１２０年である）、メタン排出を減少させれば、環境に対してずっと迅速な効果があるだろう。
【０００６】
反すう動物を用いた過去の研究では、メタンの生成は食餌によって影響を受けることが示されている。構造的／非構造的（セルロース系／デンプン質）炭水化物の比が増加することによって、メタン排出が増加する。さらに、食餌への脂質源の添加が腸内のメタン排出を減少させる。メタン減少と平行するが、高い脂肪補給の割合は、第一胃微生物の発酵、飼料の摂取及び繊維消化率を減少させる。いくつかの化学飼料添加物、例えば、抗生物質など（すなわちイオノフォア）又は寄生虫除去剤（ｄｅｆａｕｎａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を反すう動物の栄養分に導入することによって、成長を促進させ、飼料利用を向上させ、メタン生成を低減する。しかし、畜産物中の化学残留物の存在及び抗生剤に対する菌耐性の発生に対する懸念のため、有機畜産業において有用となるような、より安全な天然の代替形態の探索が推し進められてきた。
【０００７】
エッセンシャルオイル、タンニン、サポニン、フラボノイド及び多くの他の植物の２次的代謝物を含有する植物又は植物抽出物が、第一胃微生物集団の特定の群をターゲットとして第一胃代謝を改善させることが示されている。Ｐａｔｒａａ  Ａ．Ｋ．及びＳａｘｅｎａｂ  Ｊ（２０１０年）。「Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、７１巻（１１−１２号）：１１９８〜２２２頁は、植物の２次代謝物を使用して、第一胃でのメタン生成を阻害することについて記載している。文献ＷＯ２００５００００３５は、新鮮なアルファルファから得た可溶性アルファルファ抽出物の投与からなる、第一胃内の発酵を増強させ、特に、メタン生成を減少させるための手順について言及している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
よって、天然由来の化合物を含み、メタンの生成を減少させるのに効果的であり、畜産業におけるその使用に対して安全でもある、代替の反すう動物飼料用組成物に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者はこの度、天然の化合物を含む飼料用組成物を反すう動物に投与することによって、メタン排出が有意に減少することを見出した。
【００１０】
したがって、ある態様において、本発明は、反すう動物におけるメタン生成を減少させるための方法であって、ネオヘスペリジン、イソナリンギン、ポンシリン、及びヘスペリジンからなる群から選択されるフラバノングリコシド、又はこれらの混合物を含有する飼料用組成物を、反すう動物に経口的に投与するステップを含む方法に関する。
【００１１】
本発明の特定の実施形態では、当該組成物は、ネオヘスペリジン及びポンシリンを含む混合物である。より特定の実施形態では、当該混合物はナリンギンをさらに含む。好ましい実施形態では、当該混合物は天然の植物抽出物である。より好ましい実施形態では、植物はカンキツ類植物の抽出物である。
【００１２】
本発明の特定の実施形態では、当該組成物はさらに担体を含む。好ましい実施形態では、担体はセピオライトである。
【００１３】
特定の実施形態では、当該組成物は、２５〜５５重量％のナリンギンと、１０〜２０重量％のネオヘスペリジンと、１〜５重量％のポンシリンと、１００重量％となるのに十分な量の担体とを含む混合物である。好ましい実施形態では、当該組成物は、４０〜５０重量％のナリンギンと、１１〜１５重量％のネオヘスペリジンと、３〜５重量％のポンシリンと、１００重量％となるのに十分な量の担体とを含む。
【００１４】
本発明の特定の実施形態では、反すう動物は子牛、ウシ、バッファロー、ヒツジ、シカ又はヤギである。好ましい実施形態では、反すう動物は子牛である。
【００１５】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、５０〜１０００ｍｇ／Ｋｇ  ＤＭの濃度で、飼料に、固体形態で加えられる。好ましい実施形態では、当該組成物は２００〜５００ｍｇ／Ｋｇ  ＤＭの濃度で加えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、バイオガス及びメタン生成プロファイルを示す。フラボノイドを補充していない食料（対照）又は異なるタイプのフラボノイドを補充した食料で得た「インビトロ」シミュレーション試験系において使用された平均用量である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
上記で説明したように、本発明者は、フラボノイド、特に、フラバノングリコシドを含む飼料用組成物を反すう動物に投与することによって、メタン排出が有意に減少することを見出した。
【００１８】
したがって、ある態様において、本発明は、反すう動物におけるメタン生成を減少させるための方法であって、ネオヘスペリジン、イソナリンギン、ポンシリン、及びヘスペリジンからなる群から選択されるフラバノングリコシド、又はこれらの混合物を含有する飼料用組成物を反すう動物に経口的に投与するステップを含む方法に関する。
【００１９】
本明細書で使用される「反すう動物」という用語は、亜目反芻類（Ｒｕｍｉｎａｎｔｉａ）の任意の偶蹄目哺乳動物を指す。この哺乳動物は、食い戻しを咀嚼し、４つの区画の胃を有し、そのうちの１つが第一胃である。このグループには、中でも、シカ、アンテロープ、バッファロー、ウシ、ヒツジ、ラクダ、及びヤギが含まれる。
【００２０】
本明細書で使用される「フラボノイド」という用語は、花弁の中に黄色又は赤色／青色の色素沈着をもたらす水溶性植物顔料の１つのクラスを指す。「フラバノン」という用語は、フラボノイドの１つのタイプを指す。フラバノンは一般に、７位においてジサッカライドでグリコシル化されて、「フラバノングリコシド」となる。
【００２１】
後述する実施例に示すように、発明者らは、驚くことに、本発明による飼料用組成物を反すう動物に投与することによって、メタン排出が有意に減少することを見出した。
【００２２】
反すう動物によるメタン生成は、当技術分野で周知の方法を使用して測定することができる。例えば、六フッ化硫黄（ＳＦ６）トレーサー法は、呼気を持続的に採取するウシ頸部の周りの真空容器（evacuated canisters）を使用して、野外で個々のウシからのメタンを測定することを可能にする技法である。他の方法として、開放呼吸回路室が挙げられ、これは、それぞれ１頭のウシを飼育している、密封され、気候制御された部屋であり、動物により生成されるすべての気体の分析を可能にする。
【００２３】
放出されたメタンはまた、赤外線分光法、ガスクロマトグラフィー、質量分析、及び調整可能なレーザーダイオード技術、囲い込み技術(enclosure techniques)（例えば呼吸熱量測定法）、飼料特性の発酵バランスに基づく予測方程式、同位体トレーサー技術などにより測定することができる。
【００２４】
また、メタン生成は「インビトロ」で測定することができる。この場合、第一胃液を動物から収集し、嫌気性条件下でインキュベーション培地を用いてインキュベートすることができる。
【００２５】
本発明の特定の実施形態では、組成物はネオヘスペリジン及びポンシリンを含む混合物である。より特定の実施形態では、当該混合物はネオヘスペリジン、ポンシリン及びナリンギンを含む。本発明の別の特定の実施形態では、混合物は天然の植物抽出物の形態である。好ましい実施形態では、当該植物抽出物はカンキツ類植物抽出物であり、より好ましくはダイダイ植物抽出物であり、このような抽出物は、異なるフラボノイド（ｆｌａｖａｎｏｉｄ）、特に、フラバノングリコシドを含有する。好ましい実施形態では、当該植物抽出物は、ネオヘスペリジン、ポンシリン及びナリンギンの混合物を含有する。後述の実施例で示すように、当該植物抽出物は、約２０重量％のナリンギン及び４０重量％のダイダイ抽出物（２５〜２７％のナリンギン；１１〜１３％のネオヘスペリジン及び３〜５％のポンシリン）を含む天然の植物抽出物である。ある特定のケースでは、このような天然の植物抽出物は市販されている（Ｂｉｏｆｌａｖｅｘ（登録商標））。
【００２６】
したがって、本発明によると、本発明の組成物のフラバノンは、植物、より具体的には、カンキツ類植物から得ることができる。
【００２７】
本発明による組成物中のすべての成分は、天然由来の生成物であり、容易に入手可能である。また、組成物が混合物の形態である場合、当該混合物は取り扱いが容易であり、当業者に公知の工業的配合手順に従い調製することができる。
【００２８】
本明細書で使用される「カンキツ類」という用語は、ミカン属（ｇｅｎｕｓ  Ｃｉｔｒｕｓ）の植物を指す。カンキツ類植物の例としては、ブンタン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｍａｘｉｍａ）（Ｐｏｍｅｌｏ）、丸仏手柑（Ｃｉｔｒｕｓ  ｍｅｄｉｃａ）（Ｃｉｔｒｏｎ）、マンダリン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ）（Ｍａｎｄａｒｉｎ  ｏｒａｎｇｅ）、ダイダイ（Ｃｉｔｒｕｓ  ａｕｒａｎｔｉｕｍ）（Ｂｉｔｔｅｒ  ｏｒａｎｇｅ）、タヒチライム（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌａｔｉｆｏｌｉａ）（Ｐｅｒｓｉａｎ  ｌｉｍｅ）、レモン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ）（Ｌｅｍｏｎ）、グレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｐａｒａｄｉｓｉ）（Ｇｒａｐｅｆｒｕｉｔ）、オレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）（Ｓｗｅｅｔ  Ｏｒａｎｇｅ）、カラタチ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｔｒｉｆｏｌｉａｔａ）（Ｔｒｉｆｏｌｉａｔｅ  Ｏｒａｎｇｅ）などが挙げられる。
【００２９】
植物からのフラボノイド（ｆｌａｖａｎｏｉｄ）の単離のための方法は現在の技術水準において周知である。ある特定のケースでは、ダイダイ抽出物は、例えば、抽出、濾過、濃縮、沈殿、清澄化及び最終乾燥などの当業者に周知の通常の方法により粉砕したカンキツ果実（特にダイダイ（Ｃｉｔｒｕｓ  ａｕｒａｎｔｉｕｍ））から得ることができる。抽出プロセスは、アルカノール／水二成分系で実施することができ、アルカノールは、メタノール、エタノール、プロパノールなどから選択される。好ましくはメタノールが使用される。非限定的な実例では、５０ｇの乾燥ダイダイを３００ｍｌのメタノールで抽出する。懸濁液を遠心分離することによって、残渣を分離し、母液を最終体積５０ｍｌになるまで真空濃縮する。生成した液体は、５日間室温で静置し、濾過して不溶性物質を分離し、濃縮し、珪藻土床を介して再び濾過し、スプレー乾燥する。
【００３０】
特定の実施形態では、前記フラバノンは、カンキツ類植物の果実から得ることができる。例えば、ナリンギンは、一部のカンキツ類果実、例えば、グレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｐａｒａｄｉｓｉ）及びダイダイ（Ｃｉｔｒｕｓ  ａｕｒａｎｔｉｕｍ）などの皮から得たグリコシル化フラバノンである。ナリンギンはまた、果実のパルプ並びに植物の葉、花及び種子の中にも発見されている。本発明によるフラボノイドの単離方法の例示的な実例としては、例えば、文献ＵＳ２４２１０６３Ａ及びＵＳ２４２１０６２Ａにおいて記載されている方法が挙げられ、これらの文献中には、植物性材料からナリンギンを回収する方法が記載されている。また、ヘスペリジンは、文献ＵＳ２４４２１１０Ａ、ＵＳ２３４８２１５Ａ及びＵＳ２４００６９３Ａに記載されている方法に従い得ることができる。同様に、ネオヘスペリジンは、文献ＵＳ３３７５２４２Ａに記載されている方法に従い得ることができる。ＵＳ３３７５２４２Ａは、ネオヘスペリジンを生成するための方法を記載しており、ナリンギンをイソバニリンと反応させてネオヘスペリジンカルコンを生成する。次いでこのカルコンを環化することによって、ネオヘスペリジンを生成する。
【００３１】
さらに、本発明の組成物のフラバノン（ｆｌａｖｏｎｏｎｅｓ）は市販されており、容易に得ることができる。例えば、本発明に従う実施例に示すように、イソナリンギン、ネオエリオシトリン（ｎｅｏｅｒｉｔｒｏｃｉｎ）及びポンシリンは、ＩＮＤＯＦＩＮＥ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｃ（ＵＳＡ）から購入する。また、上述の通り、本発明による前記天然の植物抽出物は市販されている（Ｂｉｏｆｌａｖｅｘ（登録商標））。
【００３２】
本発明の特定の実施形態では、組成物は、２５〜５５重量％のナリンギン、１０〜２０重量％のネオヘスペリジン、１〜５重量％のポンシリン及び１００重量％となるまでに十分な量の担体を含む混合物である。より特定の実施形態では、組成物は、４０〜５０重量％のナリンギン、１１〜１５重量％のネオヘスペリジン、３〜５重量％のポンシリン及び１００重量％となるまでに十分な量の担体を含む。
【００３３】
本発明の別の好ましい実施形態によると、組成物は担体を含む。特定の実施形態では、担体はセピオライトである。セピオライトは堆積物由来の自然に発生する粘土鉱物である。セピオライトは、大きな比表面積を有する非膨潤性で、軽量の多孔質粘土である。化学的には、セピオライトは、その個々の粒子が針状形態を有する、水和したケイ酸マグネシウムである。この粘土の高い表面積及び多孔度が、液体に対するその優れた吸収能力の原因となっている。これらの特性により、セピオライトは、例えば、ペット用トイレ砂、動物飼料添加剤、担体、吸収剤、懸濁化添加剤、チキソトロピック添加剤及び増粘剤などの広範囲な用途に貴重な材料となっている。
【００３４】
本発明の方法によれば、天然由来のフラボノイドを含む本発明による組成物を動物に与えると、反すう動物におけるメタン排出／生成が減少する。飼料効率は、農業において経済性と関連する。反すう動物におけるメタン生成を阻害する化合物は、より望ましい脂肪酸プロファイルを生成すること、アセタートの代わりにプロピオナートの比率を増加させること、よって第一胃エネルギー発酵がより効率的になる方向へと第一胃発酵をシフトさせる結果になることが知られている（米国特許第３，７４５，２２１号；第３，６１５，６４９号；及び第３，８６２，３３３号を参照されたい）。したがって、本発明のさらなる目的は、反すう動物におけるメタン生成を阻害して、飼料の利用効率を増加させる第一胃微生物発酵に対する有利な効果を生じる方法を提供することである。以下の実施例に示すように、本発明による組成物は、生成されるメタンのレベルを低減させ、揮発性脂肪酸の生成の傾向を、プロピオン酸の生成の方へとシフトさせた。
【００３５】
揮発性脂肪酸を検出する方法は当技術分野で周知である。通常、クロマトグラフィー法、例えば、ＨＰＬＣ又は炎イオン化検出を有するガスクロマトグラフィーなどが使用される。
【００３６】
餌を与える方式は、特に何れの方式にも限定されず、本発明の飼料用組成物は、配合飼料の上にトップドレッシングして与えてもよいし、本発明の飼料用組成物を配合飼料と混合した後で給与してもよい。また、栄養バランスに悪影響を及ぼさずに、メタン生成が効率的に減少される限り、給与量は制限されない。
【００３７】
よって本発明の好ましい実施形態では、組成物は、飼料に固体形態で加える。特定の実施形態では、組成物は、５０〜１０００ｍｇ／Ｋｇ  ＤＭ（乾物換算）の濃度で加える。より特定の実施形態では、組成物は、２００〜５００ｍｇ／Ｋｇ  ＤＭの濃度で、固体形態で飼料に加える。
【００３８】
本発明による組成物は、他の飼料成分、例えば、ビタミン、酵素、鉱物塩、製粉した穀物、タンパク質含有成分、炭水化物含有成分、粗小麦粉(wheat middlings)及び／又はふすまなどを含有することができる。
【００３９】
本発明による飼料用組成物の形状は、特に何れかの形状に限定されず、例えば、粉末及びペレットなどの従来の飼料用組成物における任意の形態であってよい。また、飼料用組成物は、配合飼料及び飼料補助添加物を生成するために一般に利用される方法に従い生成することができる。
【００４０】
本発明の特定の実施形態では、前記反すう動物は、子牛、ウシ、バッファロー、ヒツジ、シカ、ラクダ又はヤギである。好ましい実施形態では、前記反すう動物は子牛である。
【００４１】
本発明は以下の実施例を参照してより詳細に記載されるが、これらの実施例は、決して本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００４２】
材料及び方法
同一の実験プロトコルに従う２つの試験を、Ｔｈｅｏｄｏｒｏｕ  Ｍ  Ｋら、（１９９４）「Ａｎｉｍａｌ  Ｆｅｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、４８巻（３号）、１８５〜１９７頁；Ｍａｕｒｉｃｉｏ、Ｒ．Ｍ．ら、（１９９９）、「Ａｎｉｍａｌ  Ｆｅｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」  ７９巻、３２１〜３３０頁により記載されている実験プロトコルに基づき、「インビトロ」の模擬試験系を使用して、異なる純粋なフラボノイドの第一胃発酵に対する効果を検討するために設計した。
【００４３】
半自動の圧力計により気体生成を検出し、圧力レベルと生成された気体体積との間の関係を事前に計算した。
【００４４】
主に濃縮物（９０：１０）で構成される混合飼料を与えた、第一胃をカニューレ処置した子牛を第一胃液ドナーとして使用した；飼料組成は表１に示す。種菌を収集し、２層の手術用ガーゼで濾過し、魔法瓶の中に保持した。基質として、フラボノイド（表２）及び６００ｍｇの濃縮物（表１）並びに６０ｍｇの大麦わらを予熱したボトル（３９℃）内に３重に投与し、嫌気性条件下で維持した。フラボノイドであるイソナリンギン、ネオエリオシトリン（neoeritrocin）、ポンシリンは、ＩＮＤＯＦＩＮＥ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｃ（ＵＳＡ）から購入した。１０ｍｌの第一胃液及び４０ｍｌの培養培地をボトルに加えた（ＭｃＤｏｕｇａｌｌ、ＥＩ（１９４８年）、Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｒｕｍｉｎａｎｔ  ｓａｌｉｖａ．１．Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｕｔｐｕｔ  ｏｆ  ｓｈｅｅｐ’ｓ  ｓａｌｉｖａ、「Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．」、４３巻（１号）９９〜１０９頁）。ボトルを満たし、嫌気性条件を適用したら、ボトルを密封し、インキュベーションプロセスを温水槽内で開始した。圧力を２、４、６、８、１２、２４、３６及び４８時間の時点で記録した。各試料を２つのセット又はバッチで３重でインキュベートした。
【００４５】
【表１】
0005970603.tif 000002
【００４６】
【表２】
0005970603.tif 000003
【００４７】
１２時間のインキュベーション後、各処理からの１本のボトル（繰り返し試験）を開封し、ｐＨを記録し、ボトルを揮発性脂肪酸（Ｊｏｕａｎｙ，Ｊ．Ｐ．、１９８２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｄｅｓ  Ａｌｉｍｅｎｔｓ  ２巻、１３１〜１４４頁）、ラクタート（Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ａ．Ｃ．Ｃ．、１９９６年、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｅｎｚｙｍ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５６巻、４９〜５８頁）及びアンモニア（Ｃｈａｎｅｙ，Ａ．Ｌ．、Ｍａｒｂａｃｈ，Ｅ．Ｐ．、１９６２年．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．８巻、１３０〜１３２頁）分析のためにサンプリングした。
【００４８】
Ｙｕ及びＭｏｒｒｉｓｏｎ（２００４年）により提案された技法を使用して環境ＤＮＡを抽出した。特定プライマーを使用してｑＰＣＲにより、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）、メガスフェラ・エルスデニ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ）及びセレノモナス・ルミナンチウム（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）のＤＮＡを定量した（Ｔａｊｉｍａ，Ｋ．ら、２００１年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．６７巻、２７６６〜２７７４頁；Ｏｕｗｅｒｋｅｒｋ，Ｄ．ら、２００２年、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９２巻、７５３〜７５８頁）。ＳＡＳ統計的パッケージのＰＲＯＣ  ＭＩＸＥＤ手順を使用して、結果を統計的に分析した（ＳＡＳ、２０００年、Ｕｓｅｒ’ｓ  ｇｕｉｄｅ：Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、第８版、ｉｎｓｔ．、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ）。最小有意差を使用して平均値を比較した。平均値の間の差がＰ＜０．０５であるものが、有意であると受け入れた。
【００４９】
結果：
１．気体の生成：
図１は、第一胃液の「インビトロ」の培養物を異なるタイプ及び用量のフラボノイドで補充した場合の気体及びメタン生成の動態を示している。プロファイルは、両方の用量に対する平均値を表している。各処理に対する平均値、用量及びサンプリング時間を、結果の統計的分析と一緒に表３に示す。
【００５０】
気体生成レベルがインキュベーション時間と共に急激に増加した。フラボノイドの添加がバイオガス生成を有意に変化させた（Ｐ＜０．０５）。ただし、この変化は、異なるフラボノイド物質の間で均一に生じたわけではない。ネオエリオシトリンは、対照と比較して気体生成レベルを増加させ（２６６．７ｖｓ．２５３．７２  Ｐ＞０．０５）、ナリンギンは変化させなかったが（Ｐ＞０．０５）、その一方でポリフェノールの残りは平均生成レベルを減少させた（Ｐ＜０．０５）。最も低い値は、ネオヘスペリジン及びＢｉｏｆｌａｖｅｘ（登録商標）混合物である（それぞれ２３０．７及び２３３．３）。イソナリンギン、ポンシリン及びヘスペリジン（それぞれ２３６．６、２３８及び２３９．６）もまた気体生成を減少させた。含有レベル（２００及び５００ｍｇ／ｋｇ）は、気体生成に対して有意な効果（Ｐ＜０．００１）があったが、この効果は、フラボノイドのタイプにより異なった。より顕著な用量効果はネオヘスペリジンで達成された。
【００５１】
メタン生成に理論的に関与している特定の古細菌集団の発酵作用に対するフラボノイド物質の効果を分析した。図１（ｂ）は、メタン生成評価値を示し、表４は平均値及び統計分析を示す。
【００５２】
平均メタン収量は生成された全バイオガスより少なかった。対照では、メタン収量はガス総生産量の約１５％であった。実験的処理は平均メタン生産量及び累積的メタン生産量を改変したが、これらの変化は処理により異なった：ネオエリオシトリンは対照と比較して、メタン生成レベルを増加させた（Ｐ＜０．０５）。メタン生成活性は、培地へヘスペリジン又はナリンギンを含有させることにより改変されなかった（Ｐ＜０．０１）。しかし、ネオヘスペリジン、イソナリンギン、ポンシリン及びＢｉｏｆｌａｖｅｘ混合物はメタン生成を低減させた（Ｐ＜０．０５）。ネオヘスペリジンは最も顕著な低減を示し、これもまたヘスペリジンとは異なるものであった（Ｐ＜０．０５）。一般に、用量を増加させることによってメタン生成がより多く減少したネオヘスペリジンのケースを除いて、用量「それ自体」は有意な差を示さなかった。
【００５３】
実験は、メタン減少に対するフラボノイドの効果が、微生物の活性及びバイオガス生成の全般的減少から生じたものか、或いはこれに反してフラボノイドが特異的にメタン生成（古細菌）集団に影響を及ぼしたのかの判定を可能にするために設計された。この目的を達成するために、総ガス生産量におけるメタン寄与率の統計分析が表５に示されている。培地中のフラボノイドの存在が、バイオガス総生産量におけるメタン寄与率を減少させた（Ｐ＜０．０５）、ただし、やはり、上述の影響は物質によって不均一であった。
【００５４】
ネオエリオシトリンを含有させると（表５）、メタンの比率が有意に増加したが、Ｂｉｏｆｌａｖｅｘ及びネオヘスペリジンの存在は明らかにこれを低減させた（ネオヘスペリジン、Ｂｉｏｆｌａｖｅｘ及び対照、それぞれ１３．７０、１３．６６及び１４．５８）。ポリフェノールの残りはメタン生成活性を数値的に低減させたが、報告された差は統計学的に有意ではなかった。ネオエリオシトリン及びＢｉｏｆｌａｖｅｘ混合物の用量（５００、２００ｍｇ／ｋｇ  ＤＭ）は、メタン生成を抑制する傾向にあったが、ＦＬ−物質の残りはいずれの効果も示さなかった。これは、ＦＬ−物質の用量×タイプの有意な相互作用を反映している（Ｐ＜０．０５）。
【００５５】
第２の試験において、負レファレンス（フラボノイドなし、対照）及び２種の正レファレンス（ネオヘスペリジン及びＢｉｏｆｌａｖｅｘのフラボノイド源）に対して、セピオライト（充填剤として）及びＣＢＣ（カンキツ類ビオフラボノイド複合体）を試験した。賦形剤（セピオライト）の効果はガス及びメタン生産量の点からは何もなかった（表６及び７）。その一方でＣＢＣはガス生産量を適度に減少させが、メタン生産量に対する変化は検出されなかった。
【００５６】
【表３】
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【００５７】
【表４】
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【００５８】
【表５】
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【００５９】
【表６】
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【００６０】
【表７】
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【００６１】
２．第一胃内の発酵の特徴付け
２．１  ＶＦＡ及びアンモニアの濃度。
（各タイプ及び用量で）フラボノイドを含有する、又は含有しない「インビトロ」の培地中での平均揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）及びアンモニア（Ｎ−ＮＨ３）濃度を表８に示す。両方（ＶＦＡ及びＮ−ＮＨ３）の平均（μ）濃度について、インキュベーション時間全体を通して、各フラボノイドタイプ及び用量に対するこれらの発生を追跡したものがそれぞれ最初の欄に示されている。数値的には、Ｂｉｏｆｌａｖｅｘがより高いＶＦＡ平均値及び蓄積された濃度を示した；しかしこの差は統計的有意性には到達しなかった（Ｐ＞０．０５）。アンモニアレベルは閾値レベルを超えて、適切な微生物発酵を確実にした（５０ｍｇ／Ｌ）。明らかに、ネオエリオシトリン（２２７．８４ｍｇ／Ｌ）及びＢｉｏｆｌａｖｅｘ混合物（２０９．９２ｍｇ／Ｌ）はそれぞれ最も高い平均値及び最も低い平均値を示した。
【００６２】
初期のＶＦＡ濃度［ｔ＝０において一定値を記録］は増加した。この増加は０〜１２時間の間が、１２〜７２時間の間に記録された値よりも大きく、これはインキュベーション時間中の段階的な基質発酵を反映している［すなわち、平均ＶＦＡ濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）の増加は、第１の（０〜１２時間）期間中には２．１ｍｍｏｌ／時間であったのに対して、この期間の後、これらの増加は平均０．２ｍｍｏｌ／時間に減少した］。鉱物混合物の緩衝作用により、ＶＦＡ濃度の増加は、培地の酸性度の増加を反映しなかった。平均ｐＨ値は、０、１２、及び７２時間において、それぞれ６．８１、６．７７±０．００３４及び６．７３±０．００３３であった。培地安定性は、平均値の狭い標準誤差により証明済みである。
【００６３】
２．２  ＶＦＡのモル比率
炭水化物源（デンプンで主に構成；すなわち濃縮物）の培地への補充は、ＶＦＡプロファイルに有意な変化を引き起こし、これによって、プロピオナート（２０．０３、２８．２０及び２６．４５）及びブチラート（０、１２及び７２時間でそれぞれ、９．０７、９．８８及び１０．４５）の比率が増加し、その一方でアセタートの比率の低減（モル／１００モル；６２．５、５５．８６及び５５．８６）が観察された。しかし、増加は異なるフラボノイドタイプの間で均一ではなかった。培地内のプロピオン酸の比率は、対照と比較して、ナリンギン、イソナリンギン、ポンシリン、Ｂｉｏｆｌａｖｅｘ混合物及びネオヘスペリジンにより向上したが、残りは向上しなかった。ネオヘスペリジン、ナリンギン及びＢｉｏｆｌａｖｅｘにおいて、インキュベーション時間に対する応答が用量によっても有意に改変された（Ｄ×Ｈ：Ｐ＜０．００９）ことに注目されたい。一般に、メタン生産量（表５）とプロピオナートの比率の間に負の相関関係が観察され（表９）、ネオエリオシトリンを含有させるとメタン比率が増加したのに対して、ネオヘスペリジン及びＢｉｏｆｌａｖｅｘの場合では反対の結果になり、これは明らかにメタン排出を抑制し（ネオヘスペリジン、Ｂｉｏｆｌａｖｅｘ及び対照、それぞれ１３．７０、１３．６６、１４．５８）、プロピオナートの比率を向上させた（ネオヘスペリジン、Ｂｉｏｆｌａｖｅｘ、及び対照、並びにネオエリオシトリン(neoeritrocin)のプロピオナートの比率、それぞれ２５．７、２５．８及び２４．４（Ｐ＜０．１）並びに２３．７（Ｐ＜０．０５））。
【００６４】
【表８】
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【００６５】
【表９】
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【００６６】
３．１．ラクタート濃度及び微生物プロファイル。
反すう胃内のラクタート濃度と、アシドーシス機能障害との間の関係を実験的に実証した。１２時間インキュベートしたボトルから得た、ラクタート濃度及びラクタート産生（Ｓ．ボビス）又は消費（Ｓ．ルミナンチウム及びＭ．エルスデニ）細菌力価の値が表１０に示されている。
【００６７】
異なるフラボノイドの補充の、乳酸濃度に対する効果は穏やかであり、ネオヘスペリジン、ヘスペリジン及びＢｉｏｆｌａｖｅｘの存在だけが、インキュベーション期間に記録された増加を穏やかにする傾向にあった（［ｃ］ｔ＝０：２２．１６ｍｇ／ｌ）。上述した発酵条件（表８及び９）の変化が、微生物のＤＮＡ濃度における増加をもたらしたが、対照、ネオエリオシトリン、ポンシリン及びヘスペリジンについて力価を比較した場合、増加が統計的有意性に実際到達したのはネオヘスペリジンのケースだけであった。この実験的処理は、Ｓ．ボビス及びＳ．ルミナンチウムの力価を変化させなかった。しかし、以前の実験から得た結果によると、記録された対照の値と比較して、ネオヘスペリジン及びＢｉｏｆｌａｖｅｘ混合物の両方が記録されたＭ．エルスデニの力価を向上させた。
【００６８】
【表１０】
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【図１】
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