(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）転写モジュレータ応答エレメントに結合する転写モジュレータドメイン、
（ｉｉ）該転写モジュレータドメインに融合した発現調節ドメイン、および
（ｉｉｉ）分散型タンパク質形質導入ドメイン
を有する転写モジュレータであって、
Ｔｅｔ  Ｏｆｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄ転写モジュレータ（配列番号４）に対し、転写モジュレータドメインと発現調節ドメインとの間に６×ＨＮ精製タグが導入され、及び／又はＥ１２８Ｒの点突然変異が導入されていることを特徴とする転写モジュレータ。
【請求項２】
アラニンリンカーと、Ｑ３２Ｒ、Ｃ８８Ｒ、Ａ１１８Ｒ、及びＣ１９５Ｒからなる群より選択される一つ以上の点突然変異とが導入されていることを特徴とする請求項１に記載の転写モジュレータ。
【請求項３】
（ａ）（ｉ）転写モジュレータ応答エレメント、（ｉｉ）プロモータおよび（ｉｉｉ）コード配列を備える発現カセットを有する宿主細胞、ならびに
（ｂ）前記発現調節ドメインは前記転写モジュレータドメインに機能するように結合している、請求項１又は２に記載の転写モジュレータ
を備えることを特徴とする誘導性発現システム。
【請求項４】
形質導入エンハンサーをさらに備えることを特徴とする請求項３に記載の誘導性発現システム。
【請求項５】
（ａ）（ｉ）転写モジュレータ応答エレメント、（ｉｉ）プロモータおよび（ｉｉｉ）コード配列を備える発現カセットを有する宿主細胞、
（ｂ）（ｉ）前記転写モジュレータ応答エレメントに結合する転写モジュレータドメイン、（ｉｉ）該転写モジュレータドメインに機能するように結合した発現調節ドメインおよび（ｉｉｉ）分散型タンパク質形質導入ドメインを有し、Ｔｅｔ  Ｏｆｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄ転写モジュレータ（配列番号４）に対し、Ｅ１２８Ｒの点突然変異が導入されている転写モジュレータ、及び
（ｃ）核酸形質移入試薬
を備えることを特徴とする誘導性発現システム。
【請求項６】
発現メディエーターをさらに備えることを特徴とする請求項４又は５に記載の誘導性発現システム。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の転写モジュレータをコードすることを特徴とする核酸。
【請求項８】
ベクター内に存在することを特徴とする請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
細胞中に存在することを特徴とする請求項７に記載の核酸。
【請求項１０】
宿主細胞におけるコード配列の発現を誘導する方法であって、
（ａ）（ｉ）転写モジュレータ応答エレメント、プロモータおよび前記コード配列を備える発現カセットと、（ｉｉ）前記転写モジュレータドメインは発現メディエーターを介して前記転写モジュレータ応答エレメントに結合し、前記発現調節ドメインは前記転写モジュレータドメインに機能するように結合している、請求項１又は２に記載の転写モジュレータとを有する宿主細胞を提供する過程、ならびに
（ｂ）前記コード配列の発現誘導に充分な条件下に前記宿主細胞を維持する過程
を有することを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞を形質導入エンハンサーに接触させる過程をさらに有することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
宿主細胞におけるコード配列の発現を誘導する方法であって、
（ａ）（ｉ）転写モジュレータ応答エレメント、プロモータおよび前記コード配列を備える発現カセットと、（ｉｉ）発現メディエーターを介して前記転写モジュレータ応答エレメントに結合する転写モジュレータドメイン、該転写モジュレータドメインに機能するように結合した発現調節ドメインおよび分散型タンパク質形質導入ドメインを有し、Ｔｅｔ  Ｏｆｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄ転写モジュレータ（配列番号４）に対し、Ｅ１２８Ｒの点突然変異が導入されている転写モジュレータとを有する宿主細胞を提供する過程、
（ｂ）前記コード配列の発現誘導に充分な条件下に前記宿主細胞を維持する過程、ならびに
（ｃ）前記宿主細胞を核酸形質移入試薬に接触させる過程を有することを特徴とする方法。
【請求項１３】
（ａ）（ｉ）転写モジュレータ応答エレメント、（ｉｉ）プロモータおよび（ｉｉｉ）
クローニング部位を備える発現カセットを有するベクター、ならびに
（ｂ）（ｉ）前記転写モジュレータドメインは調節タンパク質応答エレメントに結合し、前記発現調節ドメインは該転写モジュレータドメインに機能するように結合している、請求項１又は２に記載の転写モジュレータ
を備えることを特徴とするキット。
【請求項１４】
形質導入エンハンサーをさらに備えることを特徴とする請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
（ａ）（ｉ）転写モジュレータ応答エレメント、（ｉｉ）プロモータおよび（ｉｉｉ）クローニング部位を備える発現カセットを有するベクター、
（ｂ）（ｉ）調節タンパク質応答エレメントに結合する転写モジュレータドメイン、（ｉｉ）該転写モジュレータドメインに機能するように結合した発現調節ドメインおよび（ｉｉｉ）分散型タンパク質形質導入ドメインを有し、Ｔｅｔ  Ｏｆｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄ転写モジュレータ（配列番号４）に対し、Ｅ１２８Ｒの点突然変異が導入されている転写モジュレータ、並びに
（ｃ）核酸形質移入試薬
を備えることを特徴とするキット。
【請求項１６】
発現メディエーターをさらに備えることを特徴とする請求項１４又は１５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
遺伝子を可逆的にオンおよびオフにする能力は、遺伝子の発現と機能の解析にとって、特にその産物が細胞にとって毒である遺伝子にとって大いに役に立つ。重金属、ステロイドホルモンおよびヒートショックタンパク質による調節に関与する、哺乳類細胞に内在する多数の誘導系が誘導性発現系に広く用いられている。しかしながら、誘導物質の多面的な効果がこれらの哺乳類誘導性プロモータを主に制限する。
【０００２】
２つの主な種類の原核生物由来の系を様々な異なる細胞での遺伝子発現の調節に利用することに成功しているが、これらの系の種類はＬａｃベースの系とＴｅｔベースの系である。両方の種類の系がリプレッサー／オペレータベースの系であり、それらの対応する原核生物のオペロン、ｌａｃについては大腸菌ラクトースオペロン、およびｔｅｔについてはトランスポゾンＴｎ１０テトラサイクリンオペロンから重要な配列を得ている。
【０００３】
ｔｅｔベースの系は、目的の遺伝子の誘導性発現を必要とする実験で一般的に好まれる方法として広く採用され、広く認められている。その最初に報告された形態では、前記系は２つのプラスミドを使用し、１つはトランス活性化因子、例えば、ｔＴＡドメインまたはｒｔＴＡドメインが融合したＶＰ１６ドメインを発現し、そして、他方はプロモータとトランス活性化因子応答配列に機能するように結合したコード配列を含む誘導性発現カセットを有する。この２プラスミド系を有する細胞株の構築には２段階の過程が関係する。第１の過程では、前記トランス活性化因子を安定的に発現する細胞株が構築され、トランス活性化因子応答性レポータコンストラクトを用いる一過性形質移入によるクローン選択と発現解析によって特定される。第２の過程では、目的のコード配列を含む誘導性発現カセットを前の過程で作製された細胞株に導入し、そして、２回目の選抜を実行して、前記コード配列の発現についてトランス活性化因子応答性誘導を示すクローンを特定する。
【０００４】
ｔｅｔベースの誘導性発現系は、高い基底発現レベル、低い反応性および誘導薬剤の毒性を示す初期の系に見られるいくつかの欠点を有効に克服している。そのような系は様々なレベルの発現メディエーターに反応して、段階的に数桁の範囲にわたってコード配列の発現の誘導を達成することができる。また、そのような系は極めて万能であり、いくつかの種類の改変を受け入れることができ、目的の多様な細胞において特定の遺伝子またはその組合せの役割の研究が可能になる。そのような系は、遺伝子治療法および薬理的小分子のスクリーニングを含む医療用途で使用可能である。そのような系の万能性によって、動物モデルまたは植物モデルにおける組織特異的または全体的な誘導性遺伝子発現を必要とする状況への適応が可能となり、インビボで遺伝子機能を研究する新しい道を開くことになる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第０５５８９３６２号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の態様は、分散型タンパク質形質導入ドメインを有する転写モジュレータを使用する誘導性発現系（誘導性発現システム）を含む。本発明の態様は、コード配列の発現を誘導するために前記系を使用する方法ならびに本発明の方法の実施に使用するキットをさらに含む。前記系、その構成要素、方法およびキットは様々な異なる用途に使用される。
【０００７】
本発明のいくつかの態様において、誘導性発現系であって、（ａ）転写モジュレータ応答エレメント、プロモータおよびコード配列を含む発現カセットを含む宿主細胞、ならびに（ｂ）前記転写モジュレータ応答エレメントに結合する転写モジュレータドメイン、前記転写モジュレータドメインに機能するように結合した発現調節ドメインおよび分散型タンパク質形質導入ドメインを含む転写モジュレータ、を含む系が提供される。いくつかの実施形態において、前記転写モジュレータ応答エレメントはＴｅｔ応答配列である。いくつかの実施形態において、前記転写モジュレータドメインはＴｅｔ転写モジュレータドメインである。特定の実施形態において、前Ｔｅｔ転写モジュレータは、発現メディエーターが無いときに前記転写モジュレータ応答エレメントに結合する。他の実施形態において、前記Ｔｅｔ転写モジュレータは、発現メディエーターが有るときに前記転写モジュレータ応答エレメントに結合する。いくつかの実施形態において、前記系は発現メディエーター、例えば、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記分散型タンパク質形質導入ドメインは、３個以上の非連続的な塩基性アミノ酸残基でできている塩基性パッチを含む。いくつかの実施形態において、前記塩基性パッチ中の塩基性アミノ酸残基のパーセントは３０パーセント以上である。いくつかの実施形態において、前記発現系は形質導入エンハンサー、例えば、ＤＮＡ形質移入試薬をさらに含む。
【０００８】
本発明のいくつかの態様において、転写モジュレータ応答エレメントに結合する転写モジュレータドメイン、前記転写モジュレータドメインに融合した発現調節ドメインおよび分散型タンパク質形質導入ドメインを含む転写モジュレータが提供される。いくつかの実施形態において、前記転写モジュレータドメインはＴｅｔ調節ドメインである。いくつかの実施形態において、前記転写モジュレータは、発現メディエーターが有るときに転写モジュレータ応答エレメントに結合する。他の実施形態において、前記転写モジュレータは、発現メディエーターが無いときに転写モジュレータ応答エレメントに結合する。いくつかの実施形態において、前記転写モジュレータは、Ｔｅｔ  Ｏｆｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄタンパク質（配列番号４）と比較して、１つ以上の点突然変異を含む。特定の実施形態において、前記の１つ以上の点突然変異は、Ｑ３２Ｒ、Ｃ８８Ｒ、Ａ１１８Ｒ、Ｅ１２８Ｒ、Ｃ１９５Ｒ、Ｑ３２Ｋ、Ｃ８８Ｋ、Ａ１１８Ｋ、Ｅ１２８ＫおよびＣ１９５Ｋからなる群より選択される。
【０００９】
本発明のいくつかの態様において、転写モジュレータ、例えば、上述の実施形態のうちの１つの転写モジュレータをコードする核酸が提供される。いくつかの実施形態において、ベクター内に前記核酸が存在する。いくつかの実施形態において、細胞中に前記核酸が存在する。
【００１０】
本発明のいくつかの態様において、宿主細胞においてコード配列の発現を誘導するための方法であって、（ｉ）転写モジュレータ応答エレメント、プロモータおよび前記コード配列を含む発現カセット、および（ｉｉ）発現メディエーターを媒体として前記転写モジュレータ応答エレメントに結合する転写モジュレータドメイン、前記転写モジュレータドメインに機能するように結合した発現調節ドメインおよび分散型タンパク質形質導入ドメインを含む転写モジュレータ、を含む宿主細胞を提供すること、ならびに前記コード配列の発現誘導に充分な条件下で前記宿主細胞を維持することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、前記コード配列の発現に充分な様に、前記転写モジュレータの前記転写モジュレータ応答エレメントへの結合を仲介する発現メディエーターの濃度を前記宿主細胞にいて変化させることを前記方法は含む。いくつかの実施形態において、前記転写モジュレータ応答エレメントはＴｅｔ応答配列であり、前記転写モジュレータはＴｅｔ調節ドメインである。いくつかの実施形態において、前記転写モジュレータは、発現メディエーターが有るときに前記転写モジュレータ応答エレメントに結合し、そして、前記方法は前記コード配列の発現を誘導するために前記宿主細胞における前記発現メディエーターの濃度を上昇させることを含む。他の実施形態において、前記転写モジュレータは、発現メディエーターが無いときに前記転写モジュレータ応答エレメントに結合し、そして、前記方法は前記コード配列の発現を誘導するために前記宿主細胞における前記発現メディエーターの濃度を低下させることを含む。いくつかの実施形態において、前記発現メディエーターはテトラサイクリンおよびドキシサイクリンからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、前記分散型タンパク質形質導入ドメインは、３個以上の非連続的な塩基性アミノ酸残基でできている塩基性パッチを含む。いくつかの実施形態において、前記塩基性パッチ中の塩基性アミノ酸残基のパーセンテージは３０以上である。いくつかの実施形態において、前記方法は前記宿主細胞を形質導入エンハンサー、例えば、ＤＮＡ形質移入試薬と接触させることをさらに含む。
【００１１】
本発明のいくつかの態様において、（ａ）転写モジュレータ応答エレメント、プロモータおよびクローニング部位を含む発現カセットを含むベクター、ならびに（ｂ）前記調節タンパク質応答エレメントに結合する転写モジュレータドメイン、前記転写モジュレータドメインに機能するように結合した発現調節ドメインおよび分散型タンパク質形質導入ドメインを含む転写モジュレータ、を含むキットが提供される。いくつかの実施形態において、前記転写モジュレータ応答エレメントはＴｅｔ応答配列である。いくつかの実施形態において、前記転写モジュレータドメインはＴｅｔ転写モジュレータドメインである。いくつかの実施形態において、前記転写モジュレータは、発現メディエーターが無いときに前記転写モジュレータ応答エレメントに結合する。他の実施形態において、前記転写モジュレータは、発現メディエーターが有るときに転写モジュレータ応答エレメントに結合する。いくつかの実施形態において、前記分散型タンパク質形質導入ドメインは３個以上の非連続的な塩基性アミノ酸残基でできている塩基性パッチを含む。いくつかの実施形態において、前記塩基性パッチ中の塩基性アミノ酸残基のパーセンテージ数は３０以上である。いくつかの実施形態において、前記キットは形質導入エンハンサー、例えば、ＤＮＡ形質移入試薬をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記キットは対照細胞株をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記キットは発現メディエーター、例えば、テトラサイクリン、ｄｏｘ、エクダイソン、ＲＵ４８６、アプタマー、抗体およびタンパク質をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】ＴｅｔＲ  ＤＮＡ結合ドメイン（転写モジュレータドメイン）は灰色で、６×ＨＮ領域は黄色で、９×アラニンスペーサーは緑色で、そして３×ＶＰ１６ドメイン（発現調節ドメイン）は青色で示され、ｐｒＯＦ１４中の突然変異の位置は赤色で示されるｐｒＯＦ７（配列番号１）とｐｒＯＦ１４（配列番号２）（Ｔｅｔエクスプレス）のタンパク質配列を提供する図である。
【図１Ｂ】ＴｅｔＲ  ＤＮＡ結合ドメイン（転写モジュレータドメイン）は灰色で、６×ＨＮ領域は黄色で、９×アラニンスペーサーは緑色で、そして３×ＶＰ１６ドメイン（発現調節ドメイン）は青色で示され、ｐｒＯＦ１４中の突然変異の位置は赤色で示される、ｐｒＯＦ７（配列番号１）とｐｒＯＦ１４（配列番号２）（Ｔｅｔエクスプレス）のタンパク質配列を提供する図である。
【図２】レポータ細胞株は、二方向性ＴＲＥｔｉｇｈｔプロモータ（クロンテック社）の制御下でＺｓＧｒｅｅｎとホタルルシフェラーゼを共発現するＨｅＬａ細胞ベースの安定な細胞株（これ以降、「クローン１９」と称する）であり、ｐｒＯＦタンパク質に曝露してから１８時間後にルシフェラーゼの測定を行い、誘導倍率は、タンパク質を添加していない場合に対する倍率を意味する、様々なｐｒＯＦ突然変異体によって引き起こされる誘導を比較するルシフェラーゼアッセイの結果を示す図である。
【図３】ＴｅｔＲ（ＰＤＢ番号２ＮＳ７）の原型構造は、ピンクと青で色付けしたヘテロダイマーの２つのサブユニットを用いて示され、変異のおおよその位置は黄色で示される、３次元ＴｅｔＲ構造中のｐｒＯＦ１４突然変異体の位置を示す図である。
【図４】ＴｅｔＲ（ＰＤＢ番号２ＮＳ７）の原型構造は、ピンクと青で色付けしたヘテロダイマーの２つのサブユニットを用いて示され、アルギニン残基とリシン残基のおおよその位置は黄色で示される、ＴｅｔＲとＴｅｔエクスプレス中のアルギニン残基とリシン残基の位置を示す図である。
【図５】安定した二方向性ＴＲＥｔｉｇｈｔ  ＺｓＧｒｅｅｎ／ＦＬｕｃ組込みカセットを有するＨｅＬａレポータ細胞（クローン１９）を９６ウェルフォーマットでプレーティングし（ウェルあたり１５，０００細胞）、細胞が付着した後に、ウェルあたり０、５、１０または２０μＬの形質導入ミックスを添加し、形質導入ミックスは、次の添加物、２％  のＬＴＸ、０．６％のＸｆｅｃｔ、２％のリポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏ２０００）、０．２ｍＭのクロロキンまたは６μｇ／ｍＬのポリブレンのうちの１つを含むＯｐｔｉｍｅｍ培地中のＴｅｔエクスプレスタンパク質から成り、翌日にルシフェラーゼアッセイを実行する、Ｔｅｔエクスプレスの活性の向上を示すルシフェラーゼアッセイの結果を提供する図である。
【図６】クローン１９ＨｅＬａレポータ細胞を９６ウェルフォーマットでプレーティングし（ウェルあたり１５，０００細胞）、Ｔｅｔエクスプレスタンパク質（Ｏｐｔｉｍｅｍ培地中）を提示した量の試薬と混合して前記細胞に添加し、試薬にはミラス社のＴｒａｎｓｉｔ−ｓｉＱｕｅｓｔ、Ｔｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ、Ｔｒａｎｓｉｔ−ＬＴＩ、Ｔｒａｎｓｉｔ−Ｊｕｒｋａｔ、Ｔｒａｎｓｉｔ−２０２０またはクロンテック社のＸｆｅｃｔが含まれ、翌日にルシフェラーゼアッセイを実行する、Ｔｅｔエクスプレスの活性の向上を示すルシフェラーゼアッセイの結果を提供する図である。
【図７Ａ】クローン１９ＨｅＬａレポータ細胞を９６ウェルフォーマットでプレーティングし（ウェルあたり１５，０００細胞）、１０μｇのＴｅｔエクスプレス（ｐｒＯＦ１４）または熱不活化Ｔｅｔエクスプレス（７５℃で５分間）を０、１、２または４μＬのいずれかのＸｆｅｃｔと混合して前記細胞に添加し、翌日にルシフェラーゼアッセイを実行する、熱不活化したＴｅｔエクスプレスを使用するルシフェラーゼアッセイの結果を提供する図である。
【図７Ｂ】クローン１９ＨｅＬａレポータ細胞を９６ウェルフォーマットでプレーティングし（ウェルあたり１５，０００細胞）、デオキシリボヌクレアーゼＩで（１５０μＬのＴｅｔエクスプレスあたり１０ユニット、３７℃で３０分間）前処理していないまたは前処理したＴｅｔエクスプレスをＸｆｅｃｔと混合して細胞に添加し、翌日にルシフェラーゼアッセイを実行する、デオキシリボヌクレアーゼ処理ではＴｅｔエクスプレスの活性は変化しないことを示す図である。
【図７Ｃ】クローン１９ＨｅＬａレポータ細胞を１２ウェルフォーマットでプレーティングし（ウェルあたり５０，０００細胞）し、２μＬのリポフェクタミンＬＴＸを用いて０．５μｇのｐＵＣ１９プラスミド（対照）、ｐｒＯＦ７プラスミド、ｐＴｅｔ  Ｏｎ  ＡｄｖａｎｃｅｄプラスミドまたはｐＴｅｔ  Ｏｆｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄプラスミドを細胞に形質移入し、翌日にドキシサイクリンを１０００ｎｇ／ｍＬまで添加し、翌日にルシフェラーゼアッセイを実行したことを示す図である。
【図８】ウェルあたり５０，０００細胞のクローン１９ＨｅＬａレポータ細胞を１２ウェルフォーマットでプレーティングし、Ｘｆｅｃｔ試薬の存在下または非存在下で細胞を０、１、１０または１００μｇのＴｅｔエクスプレス（または派生物）で処理し、翌日にルシフェラーゼアッセイを実行する、Ｘｆｅｃｔのトランス活性化への効果を示す図である。
【図９】ウェルあたり５０，０００細胞のクローン１９ＨｅＬａレポータ細胞を１２ウェルフォーマットでプレーティングし、ミラス社のＴｒａｎｓｉｔ−ＳｉＱｕｅｓｔ試薬（ウェルあたり１μＬ）の存在下で細胞をウェルあたり０、５、１０、または２０μｇのＴｅｔエクスプレス（または派生物）で処理し、翌日にルシフェラーゼアッセイを実行する、Ｅ１２８Ｒ突然変異のＰＴＤ活性への効果を示す図である。
【図１０】各ｐｒＯＦタンパク質の分子量（Ｍｗ）、アミノ酸残基数（＃ａａ）および等電点（Ｉｓｏ  Ｐｔ）が表に示され、ｐｒＯＦ７タンパク質、ｐｒＯＦ１４タンパク質およびｐｒＯＦ１６タンパク質の一般的な構造を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の態様は、分散型タンパク質形質導入ドメインを有する転写モジュレータを使用する誘導性発現系を含む。本発明の態様は、コード配列の発現を誘導するために前記系を使用する方法ならびに本発明の方法の実施に使用するキットをさらに含む。前記系、その構成要素、方法およびキットは様々な異なる用途に使用される。
【００１４】
本発明が、記載される特定の実施形態に限定されることはなく、当然のことながら、変更され得るものであるということが、本発明をさらに詳細に説明する前に理解されるものとする。本発明の範囲は添付の請求項によってのみ限定されるので、本明細書において使用される用語は単に特定の実施形態を説明することを目的とするものであり、限定的であることを意図したものではないということもまた理解されるものとする。
【００１５】
数値の範囲が提供される場合、文脈によって別途明確に指示されない限り下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限と下限の間の各介在値およびその記載範囲内の他の任意の記載値または介在値が本発明に包含されると理解される。これらのより小範囲の上限と下限がそのより小範囲内に独立して含まれることが可能であり、また本発明に包含されるが、記載範囲内の任意の具体的に除外される限度に従属する。記載範囲が前記限度の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限度の一方または両方を排除する範囲もまた本発明に含まれる。
【００１６】
本明細書において、用語「約」を前置した数値を用いて一定の範囲が提示される。本明細書において用語「約」を使用して、それが先行する正確な数に逐語的サポートを提供し、ならびにその用語が先行する数に近い数、または近似する数を提供する。数が具体的に列挙した数に近い、または近似しているか判断する際、列挙されていないがそれに近い、または近似する数は、それが提示される文脈において、具体的に列挙された数と実質的に等価である数であり得る。
【００１７】
別途定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料もまた、本発明の実施または試験において使用可能であるが、代表的例証的方法および材料がこれから説明される。
【００１８】
本明細書で引用される全ての出版物および特許は、各々個々の出版物または特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、本明細書に参照により組み込まれ、そして、それと関連して刊行物が引用される方法および／または材料を開示および説明するために、本明細書に参照により組み込まれる。任意の刊行物の引用は出願日前のその開示についてのものであり、本発明が先行発明により、そのような出版物に先行する権限がないと認めることとして解釈すべきではない。さらに、提供された刊行の日付は実際の公開日と異なる可能性があり、それは個別に確認される必要があり得る。
【００１９】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」という単数形は、文脈が明確に指定しない限り複数形の対象物を含むことに留意されたい。さらに、特許請求の範囲は、あらゆる任意的構成要素も除外するように作成してもよいことに留意されたい。したがって、この記述は請求要素の記載と関連した「だけ（ｓｏｌｅｌｙ）」、「のみ（ｏｎｌｙ）」などのような排他的用語、または「消極的」限定を用いるための先行記述としての役割を果たすことを目的とする。
【００２０】
本開示を読むことで当業者にとって明らかとなるように、本明細書で説明および例証される個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または精神から逸脱することなく他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴と容易に分離される、または組み合わされることが可能である個別の構成要素および特徴を有する。列挙される事象の順番で、または、論理的に可能である他の任意の順番で任意の列挙される方法を実施することが可能である。
【００２１】
誘導性発現系
先に要約したように、本発明の態様には誘導性発現系が含まれる。「誘導性発現系」は、恒常的発現プロトコル、すなわち、細胞内のコード配列の発現が、特定の発現メディエーター成分の有無に関係なく継続するプロトコルと比べて、誘導性発現プロトコル、すなわち、細胞のコード配列の発現が、与えられた刺激、例えば発現メディエーター化合物との接触に応答して生じるプロトコルを実行するのに必要な全ての構成要素を意味する。
【００２２】
本発明の誘導性発現系は、転写モジュレータおよび転写モジュレータ応答エレメントを含み、（いくつかの場合では発現メディエーターの存在下に）前記転写モジュレータが前記転写モジュレータ応答エレメントに結合して、所望する通りに、コード配列の発現を制御可能に誘導するものである。本発明の態様には、以下に詳述するような分散型タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含む転写モジュレータが含まれる。いくつかの場合では、前記誘導性発現系は、原核生物のオペロン、例えば、ｌａｃオペロン、トランスポゾンＴｎ１０、テトラサイクリンオペロンなどをベースとする。いくつかの場合では、前記誘導性発現系は、真核生物のシグナル伝達経路、例えば、ステロイド受容体をベースとする発現系、例えば、エストロゲン受容体またはプロゲステロンをベースとする発現系、メタロチオネインをベースとする発現系；エクジソンをベースとする発現系をベースとする。したがって、転写モジュレータおよび転写モジュレータ応答エレメントは、様々な異なる野生型の系に由来する場合がある。単に説明の便宜上、これから、主にＴｅｔをベースとする系、すなわち、転写モジュレータおよび転写モジュレータ応答エレメントが、トランスポゾンＴｎ１０テトラサイクリンオペロンに由来する系に関して本発明をさらに説明する。しかしながら、本発明は、ｌａｃ−応答配列、ｔｅｔ応答配列などの任意の原核生物系；ステロイド応答配列、血清応答配列、熱ショック応答配列、メタロチオネイン応答配列、転写因子結合ドメインなどの任意の真核生物系；ＨＩＶ  Ｒｅｖ応答配列などのウイルス系に由来する転写モジュレータおよび転写モジュレータ応答エレメントに容易に適用可能であるので、本発明は、これらに限定されない。
【００２３】
特定の実施形態において、本発明の誘導性発現系は：（ａ）転写モジュレータに応答する誘導性発現カセットを含む宿主細胞；（ｂ）分散型タンパク質形質導入ドメインを含む転写モジュレータ；および（ｃ）発現メディエーターを含む。使用の際に（例えば、以下に詳述するような方法において）、コード配列の誘導性発現（例えば、目的の遺伝子、インヒビターＲＮＡ、他の非タンパク質コードＲＮＡなど）が得られるように、異なる構成要素が作成される。これらの構成要素のそれぞれを、これから以下に詳細に説明する。
【００２４】
宿主細胞
本発明の様々な実施形態において使用される宿主細胞は、系の転写モジュレータに応答する誘導性発現カセットを含む細胞である（以下に詳細に説明する）。誘導性発現カセットは、細胞内で、所望する通りに、染色体に組み込まれ、またはエピソームにより保持されていてもよい。染色体に組み込まれている場合、発現カセットは、安定的に宿主細胞の染色体の一部である。エピソームに保持されている場合、発現カセットは、宿主細胞の染色体の一部ではない、プラスミドなどのベクター、ＢＡＣなどの人工染色体に存在する。誘導性発現カセットの長さは様々であり得るが、いくつかの場合では、誘導性発現カセットの長さは、０．１ｋｂ〜１５０ｋｂ、例えば５〜１０ｋｂを含む１〜１０ｋｂの範囲である。
【００２５】
目的の誘導性発現カセットは、コード配列に機能するように結合している転写モジュレータ応答性プロモータを含んでいる。目的の誘導性発現カセットの転写モジュレータ応答性プロモータは、お互いに機能するように結合した転写モジュレータ応答エレメントおよび最小プロモータ配列の両方を含んでおり、転写モジュレータ応答エレメントは、発現カセットの特有の構成に依存し、最小プロモータ配列の上流または下流のいずれでもあり得る。転写モジュレータ応答エレメントとして興味深いのは、原核生物のオペロンのオペレーター配列、例えば、ｔｅｔオペレーター配列である。いくつかの場合では、転写モジュレータ応答エレメントは、少なくとも１個のｔｅｔオペレーター配列を含んでいる。一実施形態において、転写モジュレータ応答エレメントは、２つ以上のｔｅｔオペレーター配列の複数コピー（例えば、多量体を形成し、またはコンカテマー化したコピー）を含んでいる。目的の１つの構成においては、ｔｅｔオペレーター配列は、適切な間隔で、最小プロモータ配列の上流（すなわち、５’）に、ホスホジエステル結合で機能するように結合し、ｔｅｔオペレーター配列に調節タンパク質（例えば、調節融合タンパク質）を結合させることにより目的のヌクレオチド配列の転写を可能にしている。転写モジュレータ応答エレメントの長さは様々であり得るが、いくつかの場合では、この配列の長さは、５〜１０００塩基対、例えば１５〜３５塩基対を含む１０〜１００塩基対の範囲である。目的とする特定のｔｅｔオペレーター配列には、以下のｔｅｔ転写モジュレータ応答性プロモータ中に見いだされるもの、すなわち、全てカリフォルニア州、マウンテンビューのクロンテックラボラトリーズ社から入手できる、ＰTRE プロモータ、ＰTRE-Tight プロモータ、およびＰTREG3 プロモータが含まれるが、これらに限定されない。
【００２６】
先に要約したように、転写モジュレータ応答性プロモータは、さらに転写モジュレータ応答エレメントと機能するように結合した最小プロモータ配列を含んでいる。目的の最小プロモータ配列は、それ自体は転写されないが、転写のための転写装置を位置につける役目を（少なくとも一部において）果たす配列である。「最小プロモータ」という用語には、結合している被転写コード配列のために転写の開始部位を規定するが、それ自体では、できたとしても、効率的に転写を開始することができない部分的プロモータ配列が含まれる。したがって、そのような最小プロモータの活性は、機能するように結合した転写モジュレータ応答エレメント（例えば、１つ以上のｔｅｔオペレーター配列）への転写モジュレータ（例えば、後述するような転写モジュレータタンパク質）の結合に依存する。目的の最小プロモータには、ヒトサイトメガロウイルスに由来する最小プロモータ（例えば、＋７５〜−５３位のヌクレオチド、＋７５〜−３１位のヌクレオチドなど）；ヒトＨＳＶチミジンキナーゼプロモータ；ヒトＵ６プロモータなどが含まれるが、これらに限定されない。目的のプロモータには、例えば、Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１に記載されているものが含まれる。最小プロモータ配列の長さは様々であり得るが、いくつかの場合では、この配列の長さは２５〜１０００、例えば５０〜１００塩基対の範囲である。
【００２７】
いくつかの場合では、ｔｅｔ応答配列および最小プロモータは、任意の都合のよい配列であり得るリンカー配列によって分離されていてもよい。そのような実施形態において、転写モジュレータ応答エレメント（例えばｔｅｔオペレーター配列）と最小プロモータの間の距離は様々であり得るが、いくつかの場合では、ｔｅｔオペレーター配列は、最小プロモータの上流５００塩基対以内、例えば、３００塩基対、例えば、２００塩基対を含む４００塩基対以内に位置する。
【００２８】
目的とする特定の転写モジュレータ応答エレメントの構成には、１０個のｔｅｔオペレーター配列と結合したサイトメガロウイルス最小プロモータ、１０個のｔｅｔオペレーター配列と結合した単純ヘルペスウイルス最小ｔｋプロモータなどが含まれるが、これらに限定されない。目的とする特定の転写モジュレータ応答性プロモータには、以下の市販の製品中に見いだされるもの、すなわち全てカリフォルニア州、マウンテンビューのクロンテックラボラトリーズ社から入手できる、ＰTRE プロモータ、ＰTRE-Tight プロモータ、およびＰTREG3 プロモータが含まれる。
【００２９】
先に要約したように、転写モジュレータが転写モジュレータ応答エレメントに結合して、コード配列が発現するように、転写モジュレータ応答性プロモータエレメントはコード配列に機能するように結合している。誘導性発現カセットのコード配列は、目的のタンパク質または目的の核酸（例えば、阻害性ＲＮＡ）をコード化することができる。したがって、発現カセットのコード配列の転写および得られたｍＲＮＡの翻訳を誘導して、特定の実施形態において、宿主細胞または動物中で目的のタンパク質が産生される。あるいは、被転写コード配列は、活性ＲＮＡ分子、例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、ｍｉＲＮＡなどをコードし得る。宿主細胞または動物中での活性ＲＮＡ分子の発現は、宿主内で機能を調節するために用いることができる（例えば、タンパク質をコードするｍＲＮＡの転写を阻害することによる目的のタンパク質の産生の防止）。コード配列の長さは様々であり得るが、いくつかの場合では、コード配列は、１０塩基対〜１５，０００塩基対、例えば１００塩基対〜１０００塩基対を含む５０塩基対〜５，０００塩基対の範囲の長さを有する。
【００３０】
誘導性発現カセットのコード配列は、外来性または内在性であり得る。「外来性」コード配列は、宿主細胞、例えば宿主のゲノムに導入されるヌクレオチド配列である。外来性コード配列は、宿主のゲノムのどこかに存在する可能性が無く（例えば、外来性ヌクレオチド配列）、または宿主のゲノム内に存在する配列であるが、ゲノムの異なる部位に組み込まれている追加コピーの配列であり得る。「内在性」コード配列は、宿主のゲノム内に存在するヌクレオチド配列である。野生型プロモータが調節タンパク質応答配列と置換され、内在性遺伝子が誘導性発現カセットの一部となるように、内在性遺伝子がオペレーター配列と機能するように結合し、オペレーター配列組換えベクターと内在性遺伝子配列との間の相同的組換えにより本発明の誘導性発現カセットを作成することが可能である。
【００３１】
誘導性発現カセットを含む宿主細胞は多種多様であり得る。宿主細胞は単細胞、細胞株、または多細胞生物の構成要素であり得る。いくつかの場合では、細胞は真核細胞である。目的とする特定の細胞型のいくつかの例には、細菌、酵母（例えば、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ））；真菌、植物細胞および動物細胞が含まれる。目的の宿主細胞には、動物細胞が含まれ、ここで、動物細胞の特定の種類には、昆虫、線形動物、または哺乳動物の細胞が含まれるが、これらに限定されない。例示の目的で、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、非ヒト霊長類およびヒトの細胞を含む様々な哺乳動物細胞を用いることができる。様々な種のうちで、造血性、神経、グリア、間充織、皮膚、粘膜、間質、筋肉（平滑筋細胞を含む）、脾臓、網膜内皮、上皮、内皮、肝臓、腎臓、胃腸、肺、繊維芽細胞、ならびに他の細胞型などの様々な細胞型を用いることができる。目的の造血細胞には、赤血球、リンパ球または骨髄単球性系列、ならびに筋芽細胞および線維芽細胞と関与する任意の有核細胞が含まれる。造血、神経、間質、筋肉、肝臓、肺、胃腸細胞などの幹細胞および前駆細胞、ならびにＥＳ細胞、ｅｐｉ−ＥＳ細胞、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの間充織幹細胞でもまた興味深い。
【００３２】
任意の都合のよいプロトコルを用いて宿主細胞を調製することができ、プロトコルは、標的細胞の性質、標的細胞の位置、例えば、インビボかインビトか、などに依存して変更し得る。所望であれば、ウイルスベクターなどのベクターを、所望の通りに誘導性発現カセットを含むように細胞を操作するために使用することができる（例えば、カリフォルニア州、マウンテンビューのクロンテックラボラトリーズ社から市販されているようなレトロウイルスおよびアデノウイルスベクターを参照されたい）。宿主細胞および／または発現コンストラクトの性質に応じて、目的のプロトコルには、エレクトロポレーション、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿法、形質移入剤介在性導入、直接マイクロインジェクション、ウイルス感染などが含まれ得る。方法の選択は、通常は、形質転換される細胞のタイプ、形質転換が実施される環境（すなわち、インビトロ、エクスビボまたはインビボ）に依存する。これらの方法の全般的な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌら、分子生物学のショートプロトコル（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），第３版、ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，１９９５に見出すことができる。目的の誘導性発現カセットを含むベクター核酸を細胞に導入した後、約１〜２４時間、時々、選択しながら、３７℃で、通常にインキュベートする。宿主細胞内で発現カセットを長時間維持することが望ましい場合、安定的組み込みプロトコルを用いてもよい。
【００３３】
所望であれば、宿主細胞はインビトロまたはインビボで操作してもよい。インビトロで操作される宿主細胞については、そのような細胞は、最終的に宿主生物に導入されることができる。細胞の性質に応じて、細胞を、多種多様の方法により、宿主生物、例えば哺乳動物細胞に導入することができる。注入により造血細胞を脈管系に投与することができ、ここで、１０4 個以上の細胞、いくつかの場合では１０10個以下の細胞、例えば１０8 個以下の細胞が投与される。使用される細胞の数は、様々な環境、導入の目的、細胞の寿命、用いられるプロトコル、例えば、投与の回数、細胞の増殖能力、治療薬の安定性、治療薬の生理的要求等に依存するであろう。あるいは、移植片として用い得る皮膚細胞については、細胞の数は、火傷または他の外傷に塗布される層のサイズに依存するであろう。筋芽細胞または線維芽細胞については、細胞の数は１０4 個以上であってもよく、いくつかの場合では１０8 個以下であり、ここで、細胞は分散体として適用され、通常は目的の部位、またはその近くに注射される。細胞は生理的に許容される媒体中にあり得る。
【００３４】
転写モジュレータ
先に要約したように、本発明の系の他の構成要素は転写モジュレータ（調節タンパク質とも呼ばれる）である。目的の転写モジュレータは、宿主細胞内で、例えば、上述したように、誘導性発現カセットの応答配列に結合することにより、例えば、上述したように、誘導性発現カセットの発現を調節、例えば、誘導または抑制するように構成される。目的の転写モジュレータの配列は様々であり得るが、いくつかの場合では、その配列は５〜５０００個、例えば１００〜７００個のアミノ酸残基を含む。本発明の実施形態の転写モジュレータは、転写モジュレータ（すなわち、調節性）ドメイン、発現調節ドメインおよび分散型タンパク質形質導入ドメインを含む融合タンパク質である。転写モジュレータのこれらの構成要素のそれぞれについて、以下に詳細に説明する。
【００３５】
転写モジュレータ（すなわち、調節性）ドメインは、誘導性発現カセットの転写モジュレータ応答エレメントと結合するドメインである。転写モジュレータドメインは、発現メディエーターの存在下、または非存在下のいずれにおいても、応答配列と結合するように構成されている。発現メディエーターは、例えば、転写モジュレータのメディエーター結合ドメインで転写モジュレータと結合し、そうすることにより、転写モジュレータが転写モジュレータ応答エレメントと結合するか否かを媒介する化合物である。いくつかの場合では、転写モジュレータドメインは、発現メディエーターが有るときに応答配列と結合するが、発現メディエーターが無いときには結合しないものである。あるいは、いくつかの場合では、転写モジュレータドメインは、発現メディエーターが無いときに応答配列と結合するが、発現メディエーターが有るときには結合しないものである。転写モジュレータドメインの長さは様々であり得るが、いくつかの場合では、転写モジュレータドメインは、５〜１，０００個のアミノ酸、例えば、５〜１５個のアミノ酸残基を含む、５〜５００個のアミノ酸の範囲である。
【００３６】
転写モジュレータドメインとして興味深いのは、ｔｅｔをベースとする転写モジュレータドメインであり、このモジュレータドメインは１つ以上のＴｅｔＲドメイン、すなわち、野生型ＴｅｔＲタンパク質中に見いだされるドメイン、または野生型ＴｅｔＲタンパク質中に見いだされるドメインに由来するドメインを含む。
【００３７】
例えば、転写モジュレータが発現メディエーターの非存在下で応答配列と結合する特定の実施形態において、転写モジュレータドメインは、野生型Ｔｅｔリプレッサー内に見られるドメイン（テトラサイクリンなどの発現メディエーターの非存在下にｔｅｔオペレーター配列と結合するが、存在下には結合しない）であり得る。様々なクラスの様々な異なる野生型Ｔｅｔリプレッサーを転写モジュレータドメインの供給源として使用することができ、目的の野生型Ｔｅｔリプレッサーのクラスには、ＴｅｔＲ（Ａ）クラス、例えば、Ｔｎ１７２１トランスポゾンに担持されるＴｅｔリプレッサー（Ａｌｌｍｅｉｒら、（１９９２）Ｇｅｎｅ１１１（１）：１１−２０；ＮＣＢＩ（米国国立医学図書館、国立生物工学情報センタ）アクセッション番号Ｘ６１３６７およびコードされるタンパク質配列のデータベース相互参照番号（ＧＩ：）ＧＩ：４８１９８）；ＴｅｔＲ（Ｂ）クラス、例えば、Ｔｎ１０テトラサイクリン耐性決定因子によってコードされるＴｅｔリプレッサー（Ｐｏｓｔｌｅら、（１９８４）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１２）：４８４９−６３，アクセッション番号Ｘ００６９４，ＧＩ：４３０５２）；ＴｅｔＲ（Ｃ）クラス、例えば、プラスミドｐＳＣ１０１のテトラサイクリンリプレッサー（Ｂｒｏｗら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２（１）：１−１２，アクセッション番号Ｍ３６２７２，ＧＩ：１５０４９６）；ＴｅｔＲ（Ｄ）クラス、例えば、サルモネラ・オルドネズ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｏｒｄｏｎｅｚ）において特定されたＴｅｔリプレッサー（Ａｌｌａｒｄら、（１９９３）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３７（１−２）：３０１−５，アクセッション番号Ｘ６５８７６，ＧＩ：４９０７５）；ＴｅｔＲ（Ｅ）クラス、例えば、エンテロバクター科のメンバーから単離されたＴｅｔリプレッサー（Ｔｏｖａｒら、（１９８８）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１５（１）：７６−８０，アクセッション番号Ｍ３４９３３，ＧＩ：１５５０２０）；ＴｅｔＲ（Ｇ）クラス、例えば、ビブリオ・アングイラルム（Ｖｉｂｒｉｏ  ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）において特定されたＴｅｔリプレッサー（Ｚｈａｏら、（１９９２）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３６（１０）：１０５１−６０，アクセッション番号Ｓ５２４３８，ＧＩ：２６２９２９）；ＴｅｔＲ（Ｈ）クラス、例えば、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）から単離されたプラスミドｐＭＶ１１によってコードされるＴｅｔリプレッサー（Ｈａｎｓｅｎら、（１９９３）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３７（１２）：２６９９−７０５，アクセッション番号Ｕ００７９２，ＧＩ：３９２８７２）；ＴｅｔＲ（Ｊ）クラス、例えば、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）からクローニングされたＴｅｔリプレッサー（Ｍａｇａｌｈａｅｓら、（１９９８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４４３（１−２）：２６２−６６，アクセッション番号ＡＦ０３８９９３，ＧＩ：４１０−４７０６）；ＴｅｔＲ（Ｚ）クラス、例えば、グラム陽性微生物、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）から単離されたｐＡＧ１プラスミドによってコードされるＴｅｔリプレッサー（Ｔａｕｃｈら、（２０００）Ｐｌａｓｍｉｄ  ４４（３）：２８５−９１，アクセッション番号ＡＡＤ２５０６４，ＧＩ：４５８３４００）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、転写モジュレータドメインは、クラスＢのｔｅｔリプレッサー、例えば、Ｔｎ１０由来Ｔｅｔリプレッサーである。発現メディエーターの非存在下に応答配列と結合する、特定の転写モジュレータドメインの例には、以下の転写モジュレータ、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ転写モジュレータおよびＴｅｔ−Ｏｆｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄ転写モジュレータ内に見出される転写モジュレータが含まれるが、これらに限定されない。両者とも、カリフォルニア州、マウンテンビューのクロンテックラボラトリーズ社から入手できる。
【００３８】
他の例として、発現メディエーターの存在下で転写モジュレータが応答配列と結合する特定の実施形態において、転写モジュレータドメインは、発現メディエーターの存在下で調節性応答配列と結合するのみである、変異型Ｔｅｔリプレッサードメイン内に見出されるドメインであり得る。変異型Ｔｅｔリプレッサーと野生型Ｔｅｔリプレッサーとのアミノ酸の相違は、１個以上のアミノ酸の置換、１個以上のアミノ酸の欠失、または１個以上のアミノ酸の付加であり得る。いくつかの場合では、本発明の変異型Ｔｅｔリプレッサーは以下の機能特性を有する：１）ポリペプチドがＴｅｔオペレーター配列と結合することができる、すなわち、野生型ＴｅｔリプレッサーのＤＮＡ結合特異性を維持している；２）野生型Ｔｅｔリプレッサーと比較して、反対の様式で発現メディエーターによって調節される、すなわち、変異型Ｔｅｔリプレッサーは、発現メディエーターの非存在下よりもむしろ発現メディエーターの存在下で調節性応答配列と結合するのみである。
【００３９】
一実施形態において、上述の機能特性を有する変異型Ｔｅｔリプレッサー転写モジュレータは、野生型Ｔｅｔリプレッサーの配列中のアミノ酸残基を置換することによって作製される。例えば米国特許第５，７８９，１５６号に記載されたように、７１、９５、１０１および１０２位のアミノ酸においてアミノ酸置換を有するＴｎ１０由来Ｔｅｔリプレッサーは、発現メディエーターの存在下に調節性応答配列と結合する。変異型Ｔｅｔリプレッサーの所望の機能特性を維持する、これらのアミノ酸部位、または他のアミノ酸部位でのその他のアミノ酸の置換、欠失または付加は、本発明の方法の範囲内である。上記の変異の他に、さらなる適切な変異型Ｔｅｔリプレッサー（例えば、上述した所望の機能特性を有する）を、米国特許第５，７８９，１５６号に記載された通りに、野生型Ｔｅｔリプレッサーの突然変異生成および選択により作製することができる（実施例１）。変異型Ｔｅｔリプレッサーは、例えば、以下のようにして作製および選択することができる。野生型Ｔｅｔリプレッサーをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）をランダム変異導入に供し、得られた変異核酸を発現ベクターに導入し、スクリーニングのために宿主細胞に導入する。置換型テトラサイクリン化合物が存在する場合にのみＴｅｔオペレーター配列に結合するＴｅｔリプレッサーの選択を可能にするようなスクリーニングアッセイを用いることができる。例えば、その中でＴｅｔオペレーター配列がＬａｃリプレッサーをコードする遺伝子の発現を制御し、Ｌａｃリプレッサーが選択マーカー（例えば、薬剤耐性）をコードする遺伝子の発現を制御する大腸菌株中に、発現ベクター中の変異した核酸のライブラリーを導入することができる。細菌中でＴｅｔオペレーター配列にＴｅｔリプレッサーが結合することにより、Ｌａｃリプレッサーの発現が阻害され、その結果、選択可能なマーカー遺伝子の発現が誘導されるであろう。マーカー遺伝子を発現する細胞は、選択可能な表現型（例えば、薬剤耐性）に基づいて選択される。野生型Ｔｅｔリプレッサーついては、テトラサイクリンの非存在下に、選択可能なマーカー遺伝子の発現が起こるであろう。変異型Ｔｅｔリプレッサーをコードする核酸は、置換されたテトラサイクリン化合物の存在下でのみ、細菌中で選択マーカー遺伝子の発現を誘導することのできる核酸の能力に基づいて、この系を用いて選択することができる。
【００４０】
標準的な分子生物学的方法、例えば、ヌクレオチド変異を組み込んだオリゴヌクレオチドプライマーを用いる部位特異的突然変異導入法またはＰＣＲ−突然変異導入法により、例えば、（例えば、上述したような、７１、９５、１０１および／または１０２位に）特定の変異を有する変異型Ｔｅｔリプレッサーを、野生型リプレッサーをコードする核酸にヌクレオチドの変異を導入することによって作製することができる。また、変異型Ｔｅｔリプレッサーをライブラリーからの選択により特定する場合は、その変異した核酸をライブラリーベクターから回収することができる。
【００４１】
発現メディエーターの存在下に発現を誘導する転写モジュレータの具体例には、以下の転写モジュレータ内に見いだされる転写モジュレータドメインが含まれるが、これらに限定されない。以下のモジュレータとは、Ｔｅｔ−Ｏｎ転写モジュレータ；Ｔｅｔ−Ｏｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ転写モジュレータおよびＴｅｔ−Ｏｎ  ３Ｇ転写モジュレータである（いずれも、カリフォルニア州、マウンテンビューのクロンテックラボラトリーズ社から入手できる）。
【００４２】
前記転写モジュレータドメインに加え、転写モジュレータは、転写モジュレータドメインに機能するように結合している、例えば、融合している発現調節ドメインをさらに含んでいる。発現調節ドメインは、誘導性発現カセットの転写を調節するドメインであり、調節活性は、転写の活性化または抑制（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）（すなわち、抑制（ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ））である。
【００４３】
したがって、いくつかの場合では、発現調節ドメインは、真核生物細胞中で、転写を直接的または間接的に活性化する。これらの実施形態において、発現調節ドメインは、活性化ドメイン、すなわち、発現活性化ドメインと呼ばれる場合がある。これらの実施形態において、活性化ドメイン、それ自体が転写を活性化する活性を有している（すなわち、ドメインが転写を直接活性化する）場合がある。発現活性化ドメインは、例えば、調節タンパク質と相互作用する転写活性化タンパク質のリクルートメントを通して、間接的なメカニズムにより転写を活性化することもできる。転写モジュレータ中に、任意の好都合な発現活性化ドメインが存在していてもよい。発現活性化ドメインの長さは様々であり得るが、いくつかの場合では、５〜１０００、例えば５〜１５個のアミノ酸を含む５〜５００の範囲である。目的の発現活性化ドメインには、単純ヘルペスウイルス粒子タンパク質１６（本明細書においてはＶＰ１６と呼び、そのアミノ酸配列はＴｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｊ．ら、（１９８８）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２：７１８−７２９に開示されている）、酸性転写活性化ドメイン、プロリンに富む転写活性化ドメイン、セリン／スレオニンに富む転写活性化ドメイン、およびグルタミンに富む転写活性化ドメインが含まれるが、これらに限定されない。酸性転写活性化ドメインの例には、既に説明したＶＰ１６領域、およびＧＡＬ４のアミノ酸残基７５３−８８１、ＮＦ−KＢ  ＲｅｌＡのアミノ酸残基４１６−５５０、またはＲｅｌＡのアミノ酸残基５３５−５４５の多量体、およびＣＲＥＢのアミノ酸残基１６５−２５２（ＣＡＤドメイン）が含まれる。プロリンに富む転写活性化ドメインの例には、ＣＴＦ／ＮＦ１のアミノ酸残基３９９−４９９、およびＡＰ２のアミノ酸残基３１−７６が含まれる。セリン／スレオニンに富む転写活性化ドメインの例には、ＩＴＦ１のアミノ酸残基１−４２７、およびＩＴＦ２のアミノ酸残基２−４５１が含まれる。グルタミンに富む転写活性化ドメインの例には、Ｏｃｔ１のアミノ酸残基１７５−２６９、およびＳｐ１のアミノ酸残基１３２−２４３が含まれる。上述の領域およびその他の有用な転写活性化ドメインのそれぞれのアミノ酸配列は、Ｓｅｉｐｅｌ，Ｋ．ら．（ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９２）１３：４９６１−４９６８）に開示されている。
【００４４】
上述したように、いくつかの場合では、発現活性化ドメインは、調節タンパク質と相互作用する転写活性化因子をリクルートすることにより、間接的に転写を活性化することができる。例えば、発現活性化ドメインは、宿主細胞内に存在する内在性活性化因子などの転写活性化タンパク質とのタンパク質−タンパク質相互作用を調節することができる。そのようなドメインの例には、ロイシンジッパー、ヘリックス・ループ・ヘリックスドメインおよびジンクフィンガードメインが含まれる。
【００４５】
発現メディエーターの存在下に発現を誘導する発現活性化ドメインの具体例には、以下の転写モジュレータ内に見いだされる発現活性化ドメインが含まれるが、これらに限定されない。以下のモジュレータとは、Ｔｅｔ−Ｏｎ転写モジュレータ、Ｔｅｔ−Ｏｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ転写モジュレータおよびＴｅｔ−Ｏｎ  ３Ｇ転写モジュレータである（いずれも、カリフォルニア州、マウンテンビューのクロンテックラボラトリーズ社から入手できる）。
【００４６】
先に概説したように、発現調節ドメインは、真核生物細胞内で転写を直接的または間接的に抑制するドメインであり得る。これらの実施形態において、発現調節ドメインは、抑制ドメイン、すなわち、発現抑制ドメインと呼ばれる場合がある。これらの実施形態において、抑制ドメイン自体が転写抑制活性を有している場合がある（すなわち、ドメインは、転写を直接抑制する）。「転写を抑制する」とは、発現抑制ドメインが存在しない対照の状態と比較して、少なくとも検出可能なほど転写活性が低下することを意味し、転写が検出可能でないレベルまで転写が阻害される実施形態を含む。発現抑制ドメインは、例えば、調節タンパク質と相互作用する転写抑制タンパク質のリクルートメントを通して、間接的なメカニズムにより転写を抑制することもできる。転写モジュレータ中に、任意の好都合な発現抑制ドメインが存在していてもよい。発現抑制ドメインの長さは様々であり得るが、いくつかの場合では、５〜１０００、例えば５〜１００個のアミノ酸を含む５〜５００の範囲である。目的の発現抑制ドメインには、以下の転写サプレッサー内に見いだされる抑制ドメインが含まれるが、つまり、Ｋｒｕｐｐｅｌタンパク質、エングレイルドタンパク質、ｋｎｉｒｐｓタンパク質、ｐａｉｒｅｄタンパク質およびｅｖｅｎ−ｓｋｉｐｐｅｄタンパク質（全てショウジョウバエ由来）；ＳＩＮ３、ＧＡＬ８０およびＴＵＰ１タンパク質（全て出芽酵母（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅ）由来）；ｔｅｔリプレッサー；Ｅｇｒ−１、ＷＴ１、ＲＡＲａ、ＫＲＡＢ、ｖｅｒＡ、ＹＹ１、ＡＤＥ１Ｂ、Ｅ４Ｂ４、ＳＣＩＰ、ｋｉｄ−１、Ｚｎｆ２およびｋｏｘ−１タンパク質等であるがこれらに限定されない。いくつかの場合では、ドメインは、Ｋｉｄ１などの様々なジンクフィンガータンパク質内に見いだされるＫＲＡＢドメインである。特定の実施形態のうち興味深いものは、クロンテックラボラトリーズ社（マウンテンビュー、カリフォルニア州）から入手できるｔＴＳ転写モジュレータ内に見いだされる抑制ドメインである。
【００４７】
調節性（すなわち、転写モジュレータ）ドメインおよび発現調節ドメインに加え、例えば、上述したように、本発明の転写モジュレータは、分散型タンパク質形質導入ドメイン、すなわち分散型ＰＴＤをさらに含んでいる。タンパク質形質導入は、細胞の細胞膜を通過するタンパク質の転位を意味する。タンパク質形質導入ドメインは、タンパク質にタンパク質形質導入能力を与える、タンパク質のドメインまたは領域を意味する。したがって、タンパク質形質導入ドメインは、細胞外部、例えば、細胞が存在する培地から細胞質に通過する能力を転写モジュレータに与える。したがって、転写モジュレータは細胞外部から細胞膜を通過して細胞の細胞質に流通することができる。
【００４８】
本発明の転写モジュレータ中のタンパク質形質導入ドメインは分散型タンパク質導入ドメインである。分散型とは、タンパク質形質導入ドメインのアミノ酸が、ポリペプチド中に連続したアミノ酸の別個のドメインとして分けられているのではなく、ポリペプチドの全体にわたって分布していることを意味する。したがって、タンパク質形質導入ドメインは、タンパク質を三次元構造に折りたたまれると、タンパク質にタンパク質形質導入活性を与えるタンパク質表面上の「塩基性パッチ」を構成する複数の非連続的なアミノ酸残基からなる。言い換えると、タンパク質が立体構造をとるとすると、塩基性パッチの一部である、連続しない複数の残基の相互作用から、分散型タンパク質形質導入ドメインが生じる。「塩基性パッチ」は、３％以上、例えば、１０％以上を含む５％以上の塩基性アミノ酸残基、すなわち、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）を含む、折りたたまれたタンパク質の表面領域である。所与の塩基性パッチの塩基性残基の総数は様々であり得るが、いくつかの場合では、２〜５０個、例えば、５〜２０個を含む３〜３０個、例えば２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、いくつかの場合では、６個以上、８個以上、または１０個以上、例えば２０個以上の残基の範囲である。塩基性パッチの表面積は様々であり得るが、いくつかの場合では、５〜１０，０００Å2 、例えば２５〜１００Å2 の範囲である。分散型タンパク質形質導入ドメインの塩基性パッチは連続しないアミノ酸残基から生じるので、塩基性パッチに関与する（すなわち、そのメンバーである）いくつかの残基は、タンパク質の一次配列において非連続的である。したがって、分散型タンパク質形質導入ドメインの塩基性パッチに存在する２個以上の残基は、１以上の残基長、例えば３以上の残基長を含む２以上の残基長、例えば、４以上、５以上、１０以上の残基長である領域またはドメインによって一次配列内でお互いに分離されている可能性がある。塩基性パッチに関与し、１個以上の介在性残基によって一次配列内で分離されている残基対の数は様々であり得るが、この数は２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上などである。したがって、分散型タンパク質形質導入ドメインは、それが見いだされるタンパク質の一次配列内で連続した残基から構成される「標準的な」タンパク質形質導入ドメインとは区別される。したがって、分散型タンパク質形質導入ドメインは、非標準的タンパク質形質導入ドメインとしてみなされ得る。
【００４９】
いくつかの実施形態において、例えば、タンパク質が立体構造をとるとすると、タンパク質表面上に位置する中性残基および酸性残基を塩基性残基で置換してタンパク質表面上の塩基性残基パッチを作製することにより、非形質導入ポリペプチド内に分散型タンパク質形質導入ドメインを作製することができる。その結果、これらの変異により作製された分散型タンパク質形質導入ドメインは、変異型転写モジュレータが細胞膜を通過して形質導入することを促進するであろう。いくつかの実施形態において、細胞膜を通過する、いくらかの能力を示すタンパク質の形質導入は、タンパク質中の既存の分散型タンパク質形質導入ドメインを修飾することによって、例えば、タンパク質表面上の塩基性パッチのサイズまたは位置を修飾することによって改良することができる。言い換えると、転写モジュレータを、改良した分散型タンパク質形質導入ドメインを含むように変異させる。そのような修飾は、既存の分散型タンパク質形質導入ドメインよりも２倍以上、例えば、３倍以上、または４倍以上、いくつかの場合では５倍以上、６倍以上、７倍以上、または８倍以上、例えば、１０倍以上、１５倍以上、または２０倍以上、タンパク質形質導入の効率を向上させることができる。分散型ＰＴＤを含む形質導入タンパク質は、任意の都合のよいプロトコルを用いて製造することができる。所望の分散型ＰＴＤを提供するためのコードタンパク質の配列中の標的とする変異を生成するための任意の都合のよいプロトコルを用いて、元の形質導入タンパク質をコードする核酸を変異させることができる。ＤＮＡ配列またはそのような変異のタンパク質産物は、通常、本明細書に提供される配列と実質的に類似しているであろうが、例えば、それぞれ少なくとも１個のヌクレオチドまたはアミノ酸が異なり、少なくとも２個異なっていてもよいが、多くとも約１０個のヌクレオチドまたはアミノ酸が異なっている。配列の変化は、置換、挿入、欠失またはその組み合わせであり得る。欠失は、さらに大きな変化、例えば、ドメインまたはエクソンの欠失、例えば連続した１０、２０、５０、７５、１００、１５０またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失を含んでいてもよい。クローニングした遺伝子のインビトロにおける突然変異生成法は公知である。部位特異的突然変異生成のためのプロトコルの例は、Ｇｕｓｔｉｎら、（１９９３），バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）  １４：２２；Ｂａｒａｎｙ（１９８５），Ｇｅｎｅ  ３７：１１１−２３；Ｃｏｌｉｃｅｌｌｉら、（１９８５），Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：５３７−９；およびＰｒｅｎｔｋｉら、（１９８４），Ｇｅｎｅ  ２９：３０３−１３に見出すことができる。部位特異的突然変異生成法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験室指針（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９，ｐｐ．１５．３−１５．１０８；Ｗｅｉｎｅｒら、（１９９３），Ｇｅｎｅ  １２６：３５−４１；Ｓａｙｅｒｓら、（１９９２），バイオテクニクス  １３：５９２−６；ＪｏｎｅｓおよびＷｉｎｉｓｔｏｒｆｅｒ（１９９２），バイオテクニクス  １２：５２８−３０；Ｂａｒ��ｏｎら、（１９９０），核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ）  １８：７３４９−５５；ＭａｒｏｔｔｉおよびＴｏｍｉｃｈ（１９８９），Ｇｅｎｅ  Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．６：６７  ７０；ならびにＺｈｕ（１９８９），Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７７：１２０−４に見出すことができる。分散型タンパク質形質導入ドメインを作製するために、または、例えば、改良されたタンパク質形質導入ドメインを作製するために既存のタンパク質形質導入ドメインを改変するために変異し得る中性残基または酸性残基は、任意の都合のよい方法、例えば、ＲａｐｔｏｒＸ、ＥＳｙＰｒｅｄ３Ｄ、ＨＨｐｒｅｄ、Ｐｈｙｒｅ、Ｐｈｙｒｅ２などの公表されている３Ｄタンパク質モデリングソフトウェアを用いて決定することができる。同様に、これらの残基における変異が、タンパク質の形質導入を促進または向上することを確認するために用いることのできる任意の都合のよい方法は、免疫組織化学アッセイ、発現アッセイなどの任意の都合のよい方法により容易に確認することができる。
【００５０】
いくつかの場合では、転写モジュレータは、転写モジュレータドメイン、発現活性化ドメインおよび分散型ＰＴＤに加え、１つ以上の追加のドメインを含んでいてもよい。転写モジュレータは、タンパク質タグドメイン、例えば、転写モジュレータのための精製タグとしての機能をはたすタグ配列を含んでいてもよい。任意の都合のよいタグ配列が使用され、米国特許第７，１７６，２９８号、米国特許出願公開第２００９００２３８９８号（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載された配列が含まれるが、これらに限定されない。特定の目的のタグ配列には、６×Ｈｉｓタグ、６×Ｈｉｓタグなどが含まれるが、これらに限定されない。存在する場合、そのようなタグは長さが様々であり得るが、いくつかの場合では、５〜５００個のアミノ酸、例えば６〜１２個のアミノ酸を含む５〜１００個のアミノ酸の範囲である。タグは、転写モジュレータ内の任意の都合のよい部位に位置していてよく、いくつかの場合では、タグドメインは、転写モジュレータドメインと発現活性化ドメインとの間に位置する。目的とする他の任意のドメインはスペーサードメインである。存在する場合には、スペーサードメインは長さが様々であり得るが、いくつかの場合では、２〜５０個、例えば５〜１５個のアミノ酸の範囲である。スペーサードメインの配列は任意の都合のよい配列であり得るが、いくつかの場合では、その配列は、ポリ−アラニン配列、ポリグリシン配列、または混合アミノ酸配列である。タグドメインと同様に、スペーサードメインは、転写モジュレータの任意の都合のよい部位に位置していてもよく、いくつかの場合では、タグドメインは転写モジュレータと発現活性化ドメインとの間に位置する。目的とする１つの構成は、例えば、以下に詳細に説明するｐｒＯＦ７およびｐｒＯＦ１４タンパク質に見られるような、転写モジュレータドメイン−タグドメイン−スペーサードメイン−発現活性化ドメインである。
【００５１】
先に概説したように、いくつかの実施形態において、転写モジュレータは、ｔｅｔ転写モジュレータ、例えば、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄ、Ｔｅｔ−Ｏｎ、Ｔｅｔ−Ｏｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ、Ｔｅｔ  Ｏｎ−３ＧまたはｒＴＳ転写モジュレータである（これらは全てカリフォルニア州、マウンテンビューのクロンテックラボラトリーズ社から入手できる）。これらの特定の転写モジュレータのアミノ酸配列を以下に示す。
【００５２】
【表１】
0006022470.tif 000002
【００５３】
【表２】
0006022470.tif 000003
【００５４】
【表３】
0006022470.tif 000004
【００５５】
【表４】
0006022470.tif 000005
【００５６】
【表５】
0006022470.tif 000006
【００５７】
【表６】
0006022470.tif 000007
【００５８】
ある実施形態において、転写モジュレータは、これらの特定の転写モジュレータの突然変異体、例えば、改良型ＰＴＤを誘導するように変異された転写モジュレータであり得る。そのような例においては、転写モジュレータドメインは、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄ、Ｔｅｔ−Ｏｎ、Ｔｅｔ−Ｏｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ、Ｔｅｔ  Ｏｎ−３ＧまたはｔＴＳ転写モジュレータと比較し、１つ以上の点突然変異を含んでいる場合がある。目的の点突然変異には、Ｑ３２Ｒ、Ｃ８８Ｒ、Ａ１１８Ｒ、Ｅ１２８Ｒ、Ｃ１９５Ｒ、Ｑ３２Ｋ、Ｃ８８Ｋ、Ａ１１８Ｋ、Ｅ１２８Ｋ、Ｃ１９５Ｋが含まれるが、これらに限定されない。本発明の所定のｔｅｔ転写モジュレータは、前記特定の点突然変異のうち、記載された点突然変異の１つ以上、例えば、３つ以上、４つ以上、５つ以上を含む２つ以上を含んでいてもよい。この用途の目的のため、本発明のｔｅｔ調節タンパク質のアミノ酸配列は、野生型ＴｅｔＲと７５％以上、例えば、９０％以上を含み、８５％以上を含む８０％以上のアミノ酸配列と、アミノ酸配列同一性を有している。
【００５９】
発現メディエーター
宿主細胞および調節タンパク質に加え、（特定の実施形態に依存する）本発明の系は、さらに発現メディエーターを含んでいてもよい。目的の発現メディエーターは、例えば、転写モジュレータのメディエーター結合ドメインで転写モジュレータと結合し、そうすることにより、上述したように、転写モジュレータが転写モジュレータ応答エレメントと結合するか否かを調節する化合物である。ある実施形態において、目的の発現メディエーターは低分子量化合物、例えば、１０００ダルトン以下、例えば７５０ダルトン以下の分子量を有する化合物である。目的の発現メディエーターには、テトラサイクリン系抗生物質およびその類似体が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの場合では、発現メディエーターは、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンである。また、興味深いものは、これらの化合物の類似体、例えば、米国特許出願公開第２００９０２５７９８５号に記載された、置換型テトラサイクリン化合物である。目的とする、他のメディエーターには、メディエーター機能を有するエクジソン、ＲＵ４８６、アプタマー、抗生物質およびタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
方法
本発明の態様には、さらに宿主細胞内で発現を誘導する方法が含まれ、宿主細胞はインビトロでもインビボでもあり得る。本発明の特定の実施形態の方法の実施において、発現メディエーターの濃度（例えば、上述したもの）は、分散型ＰＴＤ転写モジュレータと、発現カセットのコード配列の発現が起こるのに十分な様式で、誘導発現カセットに対する応答を含む宿主細胞内で変化する。言い換えると、発現メディエーターの濃度は、転写モジュレータおよび誘導性発現カセットの両者を含む宿主細胞内で上昇または減少し、上昇または減少は、所望のコード配列発現を起こすのに十分である。いくつかの場合では、例えば、転写モジュレータが発現メディエーターの存在下に応答配列に結合する、これらの実施形態において、発現メディエーターの濃度は実質的に０からコード配列の発現を引き起こすのに十分な量まで上昇する。他の実施形態、例えば、転写モジュレータが発現メディエーターの非存在下に応答配列に結合するこれらの実施形態において、宿主細胞内部の発現メディエーターの濃度は、転写モジュレータがコード配列の発現を引き起こす濃度まで減少する。いくつかの場合では、例えば、転写モジュレータが、発現メディエーターの非存在下に応答配列に結合する方法においては、発現メディエーターが使用されないことに留意されたい。これらの実施形態において、例えば、発現が望ましい場合に宿主細胞を転写モジュレータと接触させることにより、発現メディエーターなしで転写モジュレータを使用することができる。
【００６１】
本発明の方法の実施形態において使用される宿主細胞は、誘導性発現カセットと、分酸型ＰＴＤを含む、十分量の転写モジュレータの両者を含むものである。宿主細胞は、任意の都合のよい方法で提供することができる。いくつかの場合では、宿主細胞は、転写モジュレータ発現カセットと誘導性発現カセットとを含むベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、次いで、宿主細胞中で、転写モジュレータの必要量を提供するのに十分な様式で転写モジュレータのコード配列を発現させることによって提供される。任意の都合のよい形質移入および発現プロトコルを用いることができ、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ（登録商標）およびＴｅｔ−Ｏｎ（登録商標）遺伝子発現システム使用者マニュアル、クロンテックラボラトリーズ社、バージョン番号ＰＲ５８９６９（２００６）に記載されたものが含まれる。
【００６２】
また、本発明の方法において使用される宿主細胞は転写モジュレータタンパク質が宿主細胞を形質導入する、すなわち、転写モジュレータタンパク質が宿主細胞により取り込まれるのに十分な条件下に、宿主細胞を、適当量の転写モジュレータタンパク質と接触させることにより提供することができる。これらの実施形態において、形質導入条件下に、宿主細胞を転写モジュレータタンパク質と接触させる。特定の例においては、細胞培養条件下に、ある量の転写モジュレータを、ある量の宿主細胞と接触させ、形質導入が起こるのに十分な時間、インキュベートする。ある例においては、細胞あたり１個の分子〜細胞あたり１×１０Ｅ12個の分子、例えば、細胞あたり７×１０Ｅ7 個の分子〜細胞あたり７×１０Ｅ8 個の分子の範囲の量の転写モジュレータタンパク質を、１〜５０００万、例えば１０，０００〜１００，０００個の範囲の量の宿主細胞と接触させる。任意の都合のよい培地を使用することができ、ここで、目的の培地には、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、ＯｐｔｉＭＥＭ等が含まれるが、これらに限定されない。細胞および転写モジュレータを、様々な時間、例えば、５分〜５日、例えば１〜４時間、様々な温度、例えば、４〜４２、例えば、３０〜３７℃の範囲の温度でインキュベートする。したがって、特定の実施形態によれば、本発明の方法は、宿主細胞を、例えば、上述したような分散型タンパク質形質導入ドメインを含む転写モジュレータを用いて形質導入するステップを含む。
【００６３】
これらのうちの特定の実施形態において、形質導入エンハンサーの存在下に、宿主細胞を転写モジュレータと接触させることができる。形質導入エンハンサーは、例えば、２倍、例えば、５または１０倍以上を含む３倍以上、形質導入を増強させる化学物質である。形質導入エンハンサーとして興味深いものは核酸形質移入試薬であり、目的の核酸形質移入試薬には：クロンテックラボラトリーズ社由来のＸｆｅｃｔ（商標）形質移入試薬、ライフテクノロジーズ社由来のリポフェクタミンＬＴＸ形質移入試薬、ライフテクノロジーズ社由来のリポフェクタミン２０００、ミラス社由来のＳｉＱｕｅｓｔ形質移入試薬、Ｔｒａｎｓｉｔ−ｓｉＱｕｅｓｔ形質移入試薬、Ｔｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ形質移入試薬、Ｔｒａｎｓｉｔ−ＬＴＩ形質移入試薬、Ｔｒａｎｓｉｔ−Ｊｕｒｋａｔ形質移入試薬、Ｔｒａｎｓｉｔ−２０２０形質移入試薬、クロロキン、ＰＥＧ等が含まれるが、これらに限定されない。使用される場合、形質導入エンハンサーは、培地中に任意の都合のよい濃度で含ませることができ、ここで、ある例においては、濃度は、０．００１ｍｇ／ｍＬ〜０．１ｍｇ／ｍＬ、例えば、０．００１〜０．０１ｍｇ／ｍＬを含む、０．００２５〜０．０３６ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【００６４】
発現メディエーターが使用される実施形態において、転写モジュレータおよび誘導性発現カセットの両方を含む宿主細胞の準備に続き、宿主細胞中に発現メディエーターの濃度は、発現カセット中のコード配列の転写を起こすのに十分な量で上昇させたり、低下させたりする。したがって、宿主細胞中の発現メディエーターの量は、所望の通りに、コード配列の発現を起こすように上昇させたり、低下させたりする。
【００６５】
発現メディエーターの濃度が宿主細胞中で上昇する例においては、宿主細胞を適当量の発現メディエーターと接触させてもよい。宿主細胞中で遺伝子発現をインビトロで誘導するために、発現メディエーターを含む培地中で細胞を培養することによって、宿主細胞を発現メディエーターと接触させる。発現メディエーターの存在下、インビトロで細胞を培養した場合、発現メディエーターの濃度を変化させてもよく、いくつかの場合では、１０〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲である。発現メディエーターは、既に細胞が培養されている培地に直接加えてもよく、または発現メディエーターを含まない培地から細胞を収集し、所望の発現メディエーターを含む新鮮な培地で培養してもよい。インビボで遺伝子発現を誘導するために、対象に発現メディエーターを投与することによって、対象内の宿主細胞を発現メディエーターと接触させる。一実施形態において、発現メディエーターをヒト対象または動物対象に投与する場合、投与量は、０．０００５〜１．０μｇ／ｍＬの範囲の血清濃度を達成するように調整する。発現メディエーターは、遺伝子導入にとって十分なインビボ濃度を達成するのに効果的なあらゆる手段によって対象に投与することができる。投与の適切なモデルの例には、経口投与（例えば、飲料水中に発現メディエーターを溶解する）、徐放型ペレットおよび拡散ポンプの移植が含まれる。本発明の発現メディエーターをトランスジェニック植物に投与するために、植物に投与する水中に誘導剤を溶解することができる。
【００６６】
発現メディエーターの濃度を低下させることによって発現メディエーターの濃度が変化する実施形態において、前述したものと反対のプロトコルを使用することができる。例えば、宿主細胞は、コード配列の発現を阻害するのに十分な量の発現メディエーターを含む培地中で維持されるものであり得る。そのような例においては、宿主細胞を収集し、発現メディエーターを含まない新鮮培地中で培養することによって、コード配列の発現が誘導される。インビトロの実施形態については、動物または植物は、例えば、上述したように、発現メディエーターが投与されており、そして、所望により、コード配列の発現を誘導するために発現メディエーターの投与が中止されるものであり得る。
【００６７】
いくつかの場合では、コード配列の発現が所望の量になった後、発現メディエーターの濃度を、発現誘導前のレベルまで戻して変えることによって発現を停止させることができる。
【００６８】
所望であれば、前記ステップのいずれかのステップを、例えば、所望の発現量が達成されるまで繰り返してもよい。
【００６９】
有用性
本発明の方法および組成物は、多面発現効果または細胞毒性を引き起こさずに、迅速に、効率的かつ制御された様式で遺伝子発現のスイッチの切り替え、または遺伝子発現のレベルの調節が可能であることが望ましい、様々な異なる用途において使用される。本発明の方法および組成物は、インビトロ用途およびインビボ用途の両方において使用される。方法および組成物が使用される用途には、真核細胞、植物および動物中での細胞発生および分化の研究；インビトロタンパク質生産；インビボタンパク質生産；インビボでの調節された遺伝子発現の画像化；ヒトの疾患の動物モデル；安定な細胞株の作製；インヒビターＲＮＡの発現；薬剤スクリーニング、遺伝子治療等が含まれるが、これらに限定されない。目的の用途には、Ｆｒｅｕｎｄｌｉｅｂ，“Ｔｅｔシステム：強力な遺伝子誘導発現−初年度から１５年間の進行中の成功談（Ｔｈｅ  Ｔｅｔ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ｐｏｗｅｒｆｕｌ，Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−Ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｆｉｆｔｅｅｎ  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ａｎ  ｏｎｇｏｉｎｇ  ｓｕｃｃｅｓｓ  ｓｔｏｒｙ），”クローン技術（Ｃｌｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）（Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００７）に記載されたものが含まれるが、これらに限定されない。
【００７０】
本発明の方法および組成物が使用される用途は、米国特許第５，８８８，９８１号、第５，８６６，７５５号、第５，７８９，１５６号、第５，６５４，１６８号、第５，６５０，２９８号、第６，００４，９４１号、第６，２７１，３４８号、第６，２７１，３４１号、第６，７８３，７５６号、第５，４６４，７５８号、第６，２５２，１３６号、第５，９２２，９２７号、第５，９１２，４１１号および第５，８５９，３１０、ならびに米国特許出願公開第２００９０２５７９８５号にさらに記載されており、それらの文献に開示されている特定の用途の開示は、参照により本明細書により具体的に組み込まれる。
【００７１】
キット
本発明のさらなる態様には、例えば誘導性遺伝子発現プロトコルに用いられるキットが含まれる。いくつかの例においては、本発明のキットは、ある量の上述したような分散型タンパク質形質導入ドメイン転写モジュレータ（または同じものをコードするベクター配列）とプロ誘導性（ｐｒｏ−ｉｎｕｃｉｂｌｅ）発現カセットを含むベクターとを少なくとも含み、プロ誘導性発現カセットは、クローニング部位（例えば、制限酵素認識部位の形態で）、例えば多重クローニング部位（ＭＣＳ）と機能するように結合した転写修飾因子応答性プロモータ（例えば、上述したもの）を含む。キット中に存在する追加成分には、形質導入増強剤、例えば、ＤＮＡ形質移入試薬；発現メディエーター、例えば、テトラサイクリンまたはｄｏｘ；宿主細胞系；対照細胞株などが含まれるが、これらに限定されない。キットの様々な試薬成分は、別個の容器中に存在していてもよく、またはそれらのいくつか、もしくは全部が、所望により、単一の容器中で試薬混合物とあらかじめ混合されてもよい。
【００７２】
前記成分に加え、本発明のキット（特定の実施形態において）には、本発明の方法を実施するための使用説明書がさらに含まれていてもよい。これらの使用説明書は、本発明のキット中に様々な形態で存在していてもよく、そのうちの１つ以上がキット中に存在していてもよい。そのような使用説明書が存在し得る１つの形態は、キットの梱包中、挿入された梱包中の、適切な媒体または基板に印刷された情報として、情報が印刷された一枚または複数の紙等である。そのような使用説明書のさらに他の形態は、コンピュータ読み取り可能な媒体、例えば、情報が記録されたディスケット、コンパクトディスク（ＣＤ）である。存在し得る、そのような使用説明書のさらに他の形態は、離れた場所で情報にアクセスするためにインターネットを通して使用し得るウェブサイトアドレスである。
【００７３】
実験
次の実施例は、本発明の実施法および使用法を当業者に完全に開示し、説明するために述べられるものであり、本発明者らが自分たちの発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではなく、以下の実験が実施された全ての、または唯一の実験であると意味することを意図するものでもない。使用した数（例えば、量、温度など）については正確性を確実にするように努力しているが、ある程度の実験誤差とばらつきを考慮するべきである。他に指示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセルシウス度であり、圧力は大気圧または大気圧近くである。標準的な略記を用いることができる。例えば、ｂｐは塩基対、ｋｂはキロベース、ｐｌはピコリッター、ｓまたはｓｅｃは秒、ｍｉｎは分、ｈまたはｈｒは時間、ａａはアミノ酸、ｋｂはキロベース、ｎｔはヌクレオチドなどである。
【００７４】
実施例１：ｐｒＯＦ１４（すなわち、「Ｔｅｔエクスプレス」）の作成
Ｔｅｔエクスプレスを開発するために、クロンテック社のＴｅｔ−Ｏｆｆ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ転写モジュレータのコード配列について、まず大腸菌での発現用にコドンを最適化し、その後にそれを細菌用発現ベクターにクローンした。次に、図１Ａに示すように、６×ＨＮ精製タグ（クロンテックラボラトリーズ社、マウンテンビュー、カリフォルニア州）とその後に９残基のアラニンリンカーをＤＮＡ結合ドメインとＶＰ１６活性化ドメインの間に導入してｐｒＯＦ７を作成した。その結果生じたｐｒＯＦ７を、ｔｅｔ応答性誘導性発現カセットを保持する宿主細胞の培地に添加すると、標準的タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）（すなわち、別の明確なＰＴＤ）を必要とすることなくｐｒＯＦ７タンパク質がそれだけで哺乳類レポータ細胞をトランス活性化することができることが観察された。
【００７５】
ｐｒＯＦ７のタンパク質配列を調査して、明確なＰＴＤは同定されなかった。ｐｒＯＦ７は、そのタンパク質の折り畳みにより形成されるような新規の分散型ＰＴＤを含む可能性があると仮説を立てた。３次元空間でのアルギニン残基とリシン残基のクラスター形成の結果、ＰＴＤとして機能することができる塩基性パッチがタンパク質表面上に生じる可能性があった。リシン残基とアルギニン残基の位置をｔｅｔＲの構造上に示すと、実際に塩基性パッチが観察された（図４を参照）。
【００７６】
ｐｒＯＦ７の形質導入活性を向上させることが可能であるか判定するために、点突然変異によりさらなるアルギニン残基を導入して前記塩基性パッチを拡大した。次のような１４アルギニン残基を特定した：
１．タンパク質の表面に局在する。
２．アルギニン／リシンに富むパッチ近傍に位置する。
３．５つの異なるクラスのＴｅｔＲの間で異なる。我々は、その他のクラスのうちの１つ以上においてアルギニンである位置を好んだ。
前記の１４アルギニン残基を無作為に組み合わせて導入して、その結果、２７種の異なる突然変異体コンストラクトが生じた。以下に報告するように、変異型タンパク質が作成された。下線は前記転写モジュレータドメイン（ｔｅｔＲ）を意味し、斜体は前記発現調節ドメイン（ＶＰ１６）を意味し、一続きのアラニンは前記リンカーを意味し、そして太字は形質導入活性を向上させるためになされたアルギニン置換を意味する。
【００７７】
【表７】
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【００７８】
【表８】
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【００７９】
【表９】
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【００８０】
【表１０】
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【００８１】
【表１１】
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【００８２】
【表１２】
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【００８３】
【表１３】
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【００８４】
【表１４】
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【００８５】
【表１５】
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【００８６】
【表１６】
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【００８７】
【表１７】
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【００８８】
【表１８】
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【００８９】
変異型タンパク質を精製し、そして、以前のとおりトランス活性化活性について選抜した。この選抜による最良の候補は０９０８２７＃１１と呼ばれるコンストラクトであり、それは５つの突然変異（Ｑ３２Ｒ、Ｃ８８Ｒ、Ａ１１８Ｒ、Ｅ１２８Ｒ、Ｃ１９５Ｒ）を含有した。図２、３および４にこのデータが要約されている。その結果生じたタンパク質はｐｒＯＦ１４と名付けられ、その後にＴｅｔエクスプレスと改名されている。
【００９０】
実施例２：ＤＮＡ形質移入試薬の使用による形質導入の向上
Ｔｅｔエクスプレスタンパク質の開発中に、いくつかの異なるＤＮＡ形質移入試薬の共添加がＴｅｔレポータ細胞株でのルシフェラーゼ活性を大いに増大させることに我々は気が付いた。Ｔｅｔエクスプレスの開発の最中に、我々は、レポータプラスミドの一過性形質移入から安定的なレポータ細胞株の使用に切り替えた。これらの細胞は、ＺｓＧｒｅｅｎ１とホタルルシフェラーゼをＴＲＥ−ｔｉｇｈｔプロモータ（クロンテックラボラトリーズ社、マウンテンビュー、カリフォルニア州）の制御下で発現する安定的に組み込まれたレポータを有するＨｅＬａ細胞ベースの細胞株である。これは、我々がＴｅｔエクスプレスの活性を測定するためにＤＮＡ形質移入する必要はもはや無いことを意味した。我々は、観察されるＴｅｔエクスプレスの活性がこの切り替えにより低下することに気が付き、そして、あるＤＮＡ形質移入試薬の存在下で形質導入を実行することにより活性が元の状態に復帰することが可能であることを判定した。形質導入を最も向上させた試薬にはクロンテック社のＸｆｅｃｔ、ライフテクノロジーズ社のリポフェクタミンＬＴＸおよび２０００ならびにミラス社のＳｉＱｕｅｓｔ試薬が含まれる（図５および６）。
【００９１】
図５は、Ｔｅｔエクスプレスの活性の向上を示すルシフェラーゼアッセイの結果を提供する。安定した二方向性ＴＲＥｔｉｇｈｔ  ＺｓＧｒｅｅｎ／ＦＬｕｃ組込みカセットを有するＨｅＬａレポータ細胞（クローン１９）を９６ウェルフォーマットでプレーティングした（ウェルあたり１５，０００細胞）。細胞が付着した後に、ウェルあたり０、５、１０または２０μＬの形質導入ミックスを添加した。形質導入ミックスは、次の添加物、２％  のＬＴＸ、０．６％のＸｆｅｃｔ、２％のリポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏ２０００）、０．２ｍＭのクロロキンまたは６μｇ／ｍＬのポリブレンのうちの１つを含むＯｐｔｉｍｅｍ培地中のＴｅｔエクスプレスタンパク質から成った。翌日にルシフェラーゼアッセイを実行した。
【００９２】
図６は、Ｔｅｔエクスプレスの活性の向上を示すルシフェラーゼアッセイの結果を提供する。クローン１９ＨｅＬａレポータ細胞を９６ウェルフォーマットでプレーティングした（ウェルあたり１５，０００細胞）。Ｔｅｔエクスプレスタンパク質（Ｏｐｔｉｍｅｍ培地中）を提示した量の試薬と混合し、前記細胞に添加した。試薬にはミラス社のＴｒａｎｓｉｔ−ｓｉＱｕｅｓｔ、Ｔｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ、Ｔｒａｎｓｉｔ−ＬＴＩ、Ｔｒａｎｓｉｔ−Ｊｕｒｋａｔ、Ｔｒａｎｓｉｔ−２０２０またはクロンテック社のＸｆｅｃｔが含まれた。翌日にルシフェラーゼアッセイを実行した。
【００９３】
向上効果を示したが、程度はそれほどではない他の試薬にはミラス社のＴＫＯ試薬、ＬＴＩ試薬、Ｊｕｒｋａｔ試薬および２０２０試薬、クロロキン、ＰＥＧが含まれる。向上効果があったとしても貧弱であった他の試薬にはポリブレンおよびＤＭＳＯが含まれる。
【００９４】
図７Ａは、熱不活化したＴｅｔエクスプレスを使用するルシフェラーゼアッセイの結果を提供する。クローン１９ＨｅＬａレポータ細胞を９６ウェルフォーマットでプレーティングした（ウェルあたり１５，０００細胞）。１０μｇのＴｅｔエクスプレスまたは熱不活化Ｔｅｔエクスプレス（７５℃で５分間）を０、１、２または４μＬのいずれかのＸｆｅｃｔと混合し、前記細胞に添加した。翌日にルシフェラーゼアッセイを実行した。図７Ｂに示されるように、デオキシリボヌクレアーゼ処理ではＴｅｔエクスプレスの活性は変化しない。クローン１９ＨｅＬａレポータ細胞を９６ウェルフォーマットでプレーティングした（ウェルあたり１５，０００細胞）。デオキシリボヌクレアーゼＩで（１５０μＬのＴｅｔエクスプレスあたり１０ユニット、３７℃で３０分間）前処理していない、または前処理したＴｅｔエクスプレスをＸｆｅｃｔと混合し、細胞に添加した。翌日にルシフェラーゼアッセイを実行した。図７Ｃでは、クローン１９ＨｅＬａレポータ細胞を１２ウェルフォーマットでプレーティングした（ウェルあたり５０，０００細胞）。２μＬのリポフェクタミンＬＴＸを用いて０．５μｇのｐＵＣ１９プラスミド（対照）、ｐｒＯＦ７プラスミド、ｐＴｅｔ  Ｏｎ  ＡｄｖａｎｃｅｄプラスミドまたはｐＴｅｔ  Ｏｆｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄプラスミドを細胞に形質移入した。翌日に、ドキシサイクリンを１０００ｎｇ／ｍＬまで添加した。翌日にルシフェラーゼアッセイを実行した。
【００９５】
図７Ａ〜７Ｃに示されるような、観察されたルシフェラーゼ活性の増大は、タンパク質形質導入の向上というよりもむしろプラスミドＤＮＡ（すなわち、Ｔｅｔエクスプレスの細菌性発現ベクター）の混入に起因する可能性があるという懸念を表明した。実行した実験には、
１．デオキシリボヌクレアーゼでＴｅｔエクスプレスタンパク質精製物を処理すること（効果なし）、
２．前記タンパク質精製物を７０〜７５℃で５分間熱不活化すること（活性の喪失に至った）、
３．Ｔｅｔエクスプレスをコードする細菌性発現ベクターの前記宿主レポータ細胞への直接的形質移入（効果なし）
が含まれた。これらの実験の結果により、ルシフェラーゼ活性の増大の原因としてのプラスミドＤＮＡの混入が除外された。
【００９６】
図８はＸｆｅｃｔ（クロンテックラボラトリーズ社、マウンテンビュー、カリフォルニア州）のトランス活性化への効果を示す。ウェルあたり５０，０００細胞のクローン１９ＨｅＬａレポータ細胞を１２ウェルフォーマットでプレーティングした。Ｘｆｅｃｔ試薬の存在下、または非存在下で細胞を０、１、１０または１００μｇのＴｅｔエクスプレス（または派生物）で処理した。翌日にルシフェラーゼアッセイを実行した。
【００９７】
図９は、Ｅ１２８Ｒ突然変異の効果を示す。ウェルあたり５０，０００細胞のクローン１９ＨｅＬａレポータ細胞を１２ウェルフォーマットでプレーティングした。ミラス社のＴｒａｎｓｉｔ−ＳｉＱｕｅｓｔ試薬（ウェルあたり１μＬ）の存在下で細胞をウェルあたり０、５、１０、または２０μｇのＴｅｔエクスプレス（または派生物）で処理した。翌日にルシフェラーゼアッセイを実行した。
【００９８】
図１０は、ｐｒＯＦ７タンパク質、ｐｒＯＦ１４タンパク質およびｐｒＯＦ１６タンパク質の一般的な構造を示す模式図を提供する（線図は一定の縮尺ではない）。各ｐｒＯＦタンパク質の分子量（Ｍｗ）、アミノ酸残基数（＃ａａ）および等電点（ＩｓｏＰｔ）が表に示されている。
【００９９】
明確な理解を目的として、例証と実例により前記発明の詳細を記述してきたが、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく本発明に一定の変更および改変を行うことが可能であることが、本発明の教示に照らして当業者にとって容易に明らかとなる。
【０１００】
したがって、前述のものは本発明の原理を例証するにすぎない。本明細書では明確に説明または示されていないが、本発明の原理を具現化し、そして、本発明の精神及び範囲内に含まれる様々な構成を当業者は考案可能であることが認識される。また、本明細書に列挙される実施例と条件的用語は全て、本発明者らが本技術分野をさらに発展させることになった本発明の原理および概念を読者が理解する助けとなることを主として意図したものであり、そのような特定的に列挙した実施例および条件に限定されることが無いと解釈されるものとする。さらに、本発明の原理、態様および実施形態ならびにその特定の実施例を列挙している本明細書における記述は全て、その構造および機能の両方の同等物を包含するものと意図される。加えて、そのような同等物には現在公知の同等物および将来に開発される同等物、すなわち、構造に関わらず、同じ機能を果たす開発される任意の要素の両方が含まれると意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書において示され、説明される例示的な実施形態に限定されると意図されない。むしろ、本発明の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲によって具現化される。
【０１０１】
米国特許法第１１９条（ｅ）の定めにより、本願は２０１０年１１月２４日に提出された米国特許仮出願番号第６１／４１７，０６２号の提出日時に対する優先権を主張するものである。その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図３】
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【図９】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図１０】
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【配列表】
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