(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＩＳＨベースの癌抑制因子欠失アッセイのためのプローブセットを調製する方法であって、
（ａ）癌抑制遺伝子を含む染色体上の少なくとも１つの境界ゾーンを同定するステップであって、前記少なくとも１つの境界ゾーンが、前記癌抑制遺伝子に対してセントロメア側の第１の境界ゾーンを含むステップ、
（ｂ）前記第１の境界ゾーン内の核酸配列に、または前記第１の境界ゾーンに比べて前記癌抑制遺伝子から遠位にある核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの第１のフランキングプローブを提供するステップ、
（ｃ）前記癌抑制遺伝子に対してテロメア側の核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの第２のフランキングプローブを提供するステップ、および
（ｄ）前記境界ゾーンの間の前記癌抑制遺伝子における核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの標的プローブを提供するステップ
を含み、ここで、前記プローブセットは、ＦＩＳＨベースの癌抑制因子欠失アッセイにおいて使用するためのものであり、該アッセイは、（１）前記標的プローブのみに影響を及ぼす欠失、（２）前記標的プローブおよび前記標的プローブに最も近いセントロメア側フランキングプローブに影響を及ぼす欠失、（３）前記標的プローブおよび前記標的プローブに最も近いテロメア側フランキングプローブに影響を及ぼす欠失、または（４）前記標的プローブ、前記標的プローブに最も近いセントロメア側フランキングプローブおよび前記標的プローブに最も近いテロメア側フランキングプローブに影響を及ぼす欠失についての少なくとも１つのアーチファクト欠失頻度を提供するステップを含み、前記アーチファクト欠失頻度は、（ｉ）アーチファクトヘミ接合性欠失頻度および（ｉｉ）アーチファクトホモ接合性欠失頻度から選ばれる、方法。
【請求項２】
癌抑制遺伝子の欠失についてのＦＩＳＨベースのアッセイを行う方法であって、
（ａ）複数の細胞を含む細胞試料について、プローブセットを用いてＦＩＳＨを実行するステップであって、前記プローブセットは、前記癌抑制遺伝子に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第１のフランキングプローブ、前記癌抑制遺伝子に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第２のフランキングプローブ、および前記癌抑制遺伝子にハイブリダイズする少なくとも１つの標的プローブを含む、ステップ、
（ｂ）前記複数の細胞において、前記少なくとも第１のフランキングプローブおよび前記少なくとも第２のフランキングプローブならびに前記少なくとも１つの標的プローブからのＦＩＳＨシグナルを数えるステップ、
（ｃ）（１）前記標的プローブのみに影響を及ぼす欠失、（２）前記標的プローブおよび前記標的プローブに最も近いセントロメア側フランキングプローブに影響を及ぼす欠失、（３）前記標的プローブおよび前記標的プローブに最も近いテロメア側フランキングプローブに影響を及ぼす欠失、または（４）前記標的プローブ、前記標的プローブに最も近いセントロメア側フランキングプローブおよび前記標的プローブに最も近いテロメア側フランキングプローブに影響を及ぼす欠失について、（ｉ）アーチファクトヘミ接合性欠失頻度および（ｉｉ）アーチファクトホモ接合性欠失頻度から選ばれる少なくとも１つのアーチファクト欠失頻度を提供するステップ、
（ｄ）少なくとも１つのアーチファクト欠失頻度と同じタイプの欠失事象について、ステップ（ｂ）の数えられたＦＩＳＨシグナルから、（ｉ）見かけ上のヘミ接合性欠失頻度および（ｉｉ）見かけ上のホモ接合性欠失頻度から選ばれる少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度を決定するステップであって、ステップ（ｃ）においてアーチファクトホモ接合性欠失頻度が提供されなかった場合、前記少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度は、見かけ上のヘミ接合性欠失頻度を含み、ステップ（ｃ）においてアーチファクトヘミ接合性欠失頻度が提供されなかった場合、前記少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度は、見かけ上のホモ接合性欠失頻度を含む、ステップ、ならびに
（ｅ）前記見かけ上のヘミ接合性欠失頻度が前記アーチファクトヘミ接合性欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、前記試料が、前記癌抑制遺伝子のヘミ接合性欠失を有する細胞を含むかどうかを決定するか、または前記見かけ上のホモ接合性欠失頻度が前記アーチファクトホモ接合性欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、前記試料が、前記癌抑制遺伝子のホモ接合性の欠失を有する細胞を含むかどうかを決定するステップ
を含む、方法。
【請求項３】
癌抑制遺伝子の小さな欠失および大きな欠失を識別可能に検出するためのＦＩＳＨベースのアッセイを行う方法であって、
（ａ）プローブセットを用いて、複数の細胞を含む細胞試料についてＦＩＳＨを実行するか、またはプローブセットに含まれる第１のプローブサブセットを用いて、複数の細胞を含む第１の細胞試料についてＦＩＳＨを実行し、前記プローブセットに含まれる第２のプローブサブセットを用いて前記第１の細胞試料と同じ個体に由来する複数の細胞を含む第２の細胞試料についてＦＩＳＨを実行するステップであって、前記プローブセットは、前記癌抑制遺伝子にハイブリダイズする少なくとも１つの標的プローブ、前記癌抑制遺伝子に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第１のフランキングプローブ、前記癌抑制遺伝子に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第２のフランキングプローブ、ならびに前記第１のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第３のフランキングプローブおよび前記第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第４のフランキングプローブのうちの少なくとも１つを含む、ステップ、
（ｂ）前記複数の細胞または複数の前記複数の細胞において、前記少なくとも１つの標的プローブならびに前記少なくとも第１のフランキングプローブ、前記少なくとも第２のフランキングプローブ、ならびに前記少なくとも第３のフランキングプローブおよび前記少なくとも第４のフランキングプローブのうちの少なくとも１つからのＦＩＳＨシグナルを数えるステップ、
（ｃ）前記少なくとも第１のフランキングプローブと前記少なくとも第２のフランキングプローブとの間にエンドポイントを有する前記癌抑制遺伝子の欠失についての少なくとも１つの第１のアーチファクト欠失頻度を提供するステップ、
（ｄ）前記癌抑制遺伝子の欠失についての少なくとも１つの第２のアーチファクト欠失頻度を提供するステップであって、前記エンドポイントの少なくとも１つが、前記少なくとも第１のフランキングプローブと前記少なくとも第２のフランキングプローブとの間に存在しない、ステップ、
（ｅ）ステップ（ｂ）の数えられたＦＩＳＨシグナルから、前記少なくとも第１のフランキングプローブと前記少なくとも第２のフランキングプローブとの間にエンドポイントを有する前記癌抑制遺伝子の欠失についての少なくとも１つの第１の見かけ上の欠失頻度を決定するステップ、
（ｆ）ステップ（ｂ）の数えられたＦＩＳＨシグナルから、前記癌抑制遺伝子の欠失についての少なくとも１つの第２の見かけ上の欠失頻度を決定するステップであって、前記エンドポイントの少なくとも１つが、前記少なくとも第１のフランキングプローブと前記少なくとも第２のフランキングプローブとの間に存在しない、ステップ、ならびに
（ｇ）前記少なくとも１つの第１の見かけ上の欠失頻度が、前記少なくとも１つの第１のアーチファクト欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、前記試料が、前記癌抑制遺伝子の小さな欠失を有する細胞を含むかどうかを決定し、前記少なくとも１つの第２の見かけ上の欠失頻度が、少なくとも１つの第２のアーチファクトホモ接合性欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、前記試料が、前記癌抑制遺伝子の大きな欠失を有する細胞を含むかどうかを決定するステップ
を含む、方法。
【請求項４】
癌抑制遺伝子の欠失についてのＦＩＳＨベースのアッセイを最適化する方法であって、
（ａ）複数の候補プローブセットを提供するステップであって、それぞれの候補プローブセットは、前記癌抑制遺伝子に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第１のフランキングプローブ、前記癌抑制遺伝子に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第２のフランキングプローブ、および前記癌抑制遺伝子にハイブリダイズする少なくとも１つの標的プローブを含む、ステップ、
（ｂ）それぞれの候補プローブセットについて、
（ｉ）前記癌抑制遺伝子の完全なコピーの正倍数性の数を含む複数の細胞を含む少なくとも１つの細胞試料について前記候補プローブセットを用いてＦＩＳＨを実行し、
（ｉｉ）前記少なくとも１つの試料の前記複数の細胞において前記候補プローブセットの前記少なくとも第１のフランキングプローブおよび前記少なくとも第２のフランキングプローブならびに前記少なくとも１つの標的プローブからのＦＩＳＨシグナルを数え、そして
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の数えられたＦＩＳＨシグナルからアーチファクト欠失頻度を決定するステップ、ならびに
（ｃ）癌抑制遺伝子の欠失について最適化されたＦＩＳＨベースのアッセイに使用するための前記候補プローブセットからプローブセットを選択するステップであって、選択されたプローブセットは、ステップ（ｉｉｉ）において好ましいアーチファクト欠失頻度を有すると決定された、ステップ
を含む、方法。
【請求項５】
ｔ検定によるｐが０．０５以下である場合、前記見かけ上の頻度が前記アーチファクト頻度よりも有意に大きいか、または、前記見かけ上の頻度が３標準偏差だけ前記アーチファクト頻度を超えている場合、前記見かけ上の頻度が前記アーチファクト頻度よりも有意に大きい、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞試料が、固定され、保存されるか、または、３〜６μｍの範囲の厚さを有する、ホルマリン固定パラフィン包埋試料である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞試料が、細胞遠心と組み合わせられたエタノールまたはメタノール：酢酸での固定、薄層性出法、スミア、または、顕微鏡スライドガラス上へのピペッティングによって調製される、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
（ｉ）前記癌抑制因子が、ＰＴＥＮ、ｐ１６、ＲＢ１、ｐ５３、１０ｑ２３、１７ｐ１３、１３ｑ１４、９ｑ２４および９ｐ２１から選ばれる染色体バンドでヒト染色体上に位置する癌抑制遺伝子、または、１０ｑ、１７ｐ、１３ｑ、９ｐ、１ｐ、５ｑ、１９ｑ、２０ｑ、８ｐ、１２ｐ、および１６ｑから選ばれるヒト染色体腕上に位置する癌抑制因子であるか、あるいは、（ｉｉ）前記癌抑制因子がＰＴＥＮであり、少なくとも１つの第１のフランキングプローブが、ＴＳＰＡＮ１５、ＢＭＰＲ１ＡまたはＷＡＰＡＬにハイブリダイズするプローブを含み、かつ、少なくとも１つの第２のフランキングプローブが、ＦＡＳにハイブリダイズするプローブを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの第１のフランキングプローブが、前記癌抑制遺伝子に対してセントロメア側の境界ゾーン内、または、そのセントロメア側の位置にハイブリダイズするか、または、前記少なくとも１つの第２のフランキングプローブが、前記癌抑制遺伝子に対してテロメア側の境界ゾーン内またはそのテロメア側の位置にハイブリダイズする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの標的プローブ、および、前記少なくとも第１のフランキングプローブおよび前記少なくとも第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位が、５０ｋｂ〜２００ｋｂの範囲のサイズを有するか、または、前記少なくとも１つの標的プローブのハイブリダイゼーション部位が、前記少なくとも第１のフランキングプローブおよび前記少なくとも第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位から５００ｋｂ〜２０Ｍｂの範囲の距離だけ離れている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１０年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／３１３，９１６号および２０１０年３月１５日に出願されたカナダ国特許出願第２，６９６，５４５号（これらの両方の全体の内容は、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、癌抑制遺伝子の欠失を検出するためのアッセイにおける使用のための方法、プローブセット、およびキットならびにそのようなプローブセットを調製し、そのようなアッセイを最適化するための方法に関する。本発明の実施形態は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）薄切片、細針吸引（ＦＮＡ）生検材料、スミアなどにおけるように、血液または固形腫瘍などのような試料において、欠失、増幅、転座、および他の染色体事象などのような染色体事象を検出するための方法をさらに含む。いくつかの実施形態では、染色体事象は、癌抑制因子、関連する癌遺伝子、および／または癌原遺伝子などのような遺伝子を含む。
【背景技術】
【０００３】
癌性または前癌性細胞が癌抑制遺伝子について欠失しているかどうかについての認識は、診断上のおよび／もしくは予後の正確度を改善するのにまたは治療の選択に一般に有用である。腫瘍、新生物、過形成などを含む癌性または前癌性であることが疑われている増殖物由来のなどのように、癌性または前癌性であることが疑われている細胞の試料について、たとえば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料などのように、固定され、保存された試料として、検査室での分析が行われるのは、一般的である。特に、そのような試料の保存はまた、遡及研究が実行されることも可能にし、これは、将来の予測および治療選択を行うのに有用な情報を提供することができる。癌抑制遺伝子の欠失は、試料を対象の遺伝子に対するプローブ、一般に、少なくとも１つの対照プローブと接触させる蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および／または核の対比染色によってＦＦＰＥ試料においてアッセイすることができる。癌抑制遺伝子の例は、ＰＴＥＮ、ｐ５３、ｐ１６（ＣＤＫＮ２Ａとしても公知）、ＲＢ１、ＤＣＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、およびＡＰＣを含む。プローブは、蛍光で可視化することができ、結果として生じるＦＩＳＨシグナルは、欠失が存在するかどうかを決定するために分析される。
【０００４】
固形増殖物由来の試料が、固定され、保存された試料として提供される場合、それらは、厚さが数ミクロンの切片として一般に提供される。そのため、癌抑制遺伝子を含有する核の一部は、試料の切出しの間に切除され得る。この現象は、多くの場合、核の切断によるアーチファクトをもたらし、それにより、癌抑制遺伝子の欠失を実際に有していなかった細胞が、あたかも癌抑制遺伝子の少なくとも１つのコピーが欠けているかのように現れることになる。切断によるアーチファクトは、染色体が脱凝縮し、球状の形状の核の三次元体積内に分布する間期細胞において生じ得、間期細胞は、通常の病理組織切片を構成している。中期細胞では、約４６本の染色体は、平らで、ロッド状の直線状構造で存在し、一般に、切断を伴うことなく、顕微鏡スライドガラスの表面上に置くことができる。実際、固形腫瘍などのような癌性または前癌性であることが疑われている固形増殖物由来の試料を含む臨床試料において、大多数の細胞は、一般に、間期にある。中期細胞の代表試料は、遡及分析に使用される試料から、または患者から採取され、固定され、保存され、分析のために離れた検査室に送られた試料から得るのが困難または不可能であり得る。
【０００５】
核の切断によるアーチファクトは、したがって、ＦＩＳＨベースの癌抑制因子欠失アッセイの性能にマイナスに影響を与える。偽陽性（つまり癌抑制因子欠失が生じているという間違った結論）の可能性を防止するために、見かけ上の欠失頻度に対する最小閾値を設定することができ、見かけ上の欠失頻度が閾値を超えない場合、結果は、欠失について陰性であるか、またはせいぜい決定的でないと考えられる。閾値は、対照細胞を使用して行われたアーチファクト欠失頻度の推定値に基づくものとすることができ、欠失の観察レベルが有意であると考えられるには、アーチファクト欠失頻度を、アーチファクト欠失頻度の３標準偏差などのような量の差で、超える必要があり得る。しかしながら、たとえば、欠失を有する、試料における細胞の数が少ない場合にまたは試料における細胞が遺伝的に不均一である場合に、欠失と考えるのが困難となり得るまたは不可能となり得るという点で、そのような最小閾値の使用は、感度のトレードオフをもたらし得る。
【０００６】
ホスファターゼテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）は、ヒトにおいてＰＴＥＮ遺伝子によってコードされるタンパク質である。この癌抑制遺伝子の不活性化は、多くのタイプの癌において（非特許文献１）、およびカウデン病として公知の遺伝性の発生欠損において（非特許文献２）、観察されてきた。近年、ＰＴＥＮにハイブリダイズする３６８ｋｂのプローブの使用に基づいて、ＰＴＥＮ座のまわりの３６８ｋｂ以上のゲノムの欠失が前立腺癌において共通しており（非特許文献３）、それらの存在は、予後不良を伴う（非特許文献４；非特許文献５）ことが明らかになってきた。したがって、ＰＴＥＮなどのような癌抑制遺伝子の欠失についての正確なアッセイは、臨床的に重要である。
【０００７】
さらに、サイズによって欠失を区別する様式で欠失を検出する、より優れた性能が必要とされる。ホモ接合性のＰＴＥＮ欠失があり、欠失事象の少なくとも１つが、ＰＴＥＮそのものよりも大きな染色体のエリアおよびそのすぐまわりの環境を除去する前立腺の腫瘍は、転移腫瘍である可能性がより高いか、または転移の可能性が増加している。したがって、そのような欠失についてのプローブセットおよび方法は、予後においておよび治療に関して決定するためにならびに前立腺癌の進行および分類についてのさらなる調査において役立ち得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｏ  ＡＤら、ＰＴＥＮ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｕｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９８年；１９巻：３４８〜３５５頁
【非特許文献２】Ｍａｒｓｈ  ＤＪら、Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ＰＴＥＮ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃｏｗｄｅｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ−ｌｉｋｅ  ｆａｍｉｌｉｅｓ、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｇｅｎｅｔ．  １９９８年；３５巻：８８１〜８８５頁
【非特許文献３】Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００６年；１６９巻：１２８〜１３７頁
【非特許文献４】Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００７年；９７巻：６７８〜６８５頁
【非特許文献５】Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏら、Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２００８年；２１巻：１４５１〜１４６０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、核の切断によるアーチファクトの発生を低下させる、たとえばＰＴＥＮなどのような癌抑制遺伝子の欠失を検出するためのアッセイにおける使用のための方法、プローブセット、およびキットならびにそのようなプローブセットを調製し、そのようなアッセイを最適化するための方法が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の方法および組成物は、ＦＩＳＨベースの癌抑制因子欠失アッセイの性能（特異性、感度、および／または統計的有意性）が、切断によるアーチファクトなどのような誤差の原因を減少させることができるプローブセットを提供することによって最適化することができるという発見に部分的に基づく。プローブセットは、それぞれ、癌抑制遺伝子に対してセントロメア側（ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ）の位置、癌抑制遺伝子のまたは癌抑制遺伝子に隣接する位置、および癌抑制遺伝子に対してテロメア側（ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ）の位置でハイブリダイズする少なくとも第１のフランキングプローブ、標的プローブ、および第２のフランキングプローブを含む。癌抑制遺伝子は、あるタイプの癌性または前癌性細胞において欠失の傾向があり得、たとえば、ＰＴＥＮは、少なくとも、前立腺の新生物において欠失の傾向がある。第１または第２のフランキングプローブおよび標的プローブのハイブリダイゼーション部位の間の距離は、細胞遺伝学的な長さのスケールに基づいて短いものとすることができる、たとえば、５００ｋｂ〜１０または２０Ｍｂの範囲の距離とすることができる。
【００１１】
いくつかの実施形態では、第１のフランキングプローブおよび第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位は、それぞれ、第１の境界ゾーンおよび任意選択で第２の境界ゾーンによって、標的プローブのハイブリダイゼーション部位と分離されている（たとえば、セグメント重複およびコピー数多型などのような、これらの部位の近くのゲノム構造の特徴；下記にさらに説明される）。第１のフランキングプローブおよび第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位は、細胞遺伝学的な長さのスケールに基づいて、それぞれ、第１の境界ゾーン内および第２の境界ゾーン内（存在する場合）にあり得るまたはそれに隣接し得る。
【００１２】
プローブセットは、それらのハイブリダイゼーション部位の位置により、ゲノムの異常についてのＦＩＳＨベースのアッセイの性能を最適化することができる。標的プローブのハイブリダイゼーション部位の近くにおよび／または境界ゾーンに比べてアッセイ標的から遠位にあるが、境界ゾーンに隣接するようにフランキングプローブを位置づけることは、核切断に起因する偽陽性を含む決定的でない結果および／またはアーチファクトの観察を最小限にするのに役立ち得る。
【００１３】
したがって、本開示は、ＦＩＳＨベースのアッセイを行う方法、ＦＩＳＨベースの癌抑制因子欠失アッセイのためのプローブを調製する方法、および癌抑制因子欠失についてのＦＩＳＨベースのアッセイにおいて核切断の影響を測定するための方法を提供する。本開示はまた、ＦＩＳＨベースの癌抑制因子欠失アッセイに有用なプローブセットおよび組成物ならびにプローブを含むキットを提供する。
【００１４】
本発明のある実施形態は、ＦＩＳＨベースの癌抑制因子欠失アッセイのためのプローブセットを調製する方法であって、
（ａ）癌抑制遺伝子を含む染色体上の少なくとも１つの境界ゾーンを同定するステップであって、少なくとも１つの境界ゾーンが、癌抑制遺伝子に対してセントロメア側の第１の境界ゾーンを含むステップ、
（ｂ）第１の境界ゾーン内の核酸配列に、または第１の境界ゾーンに比べて癌抑制遺伝子から遠位にある核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの第１のフランキングプローブを提供するステップ、
（ｃ）癌抑制遺伝子に対してテロメア側の核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの第２のフランキングプローブを提供するステップ、および
（ｄ）境界ゾーンの間の癌抑制遺伝子における核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの標的プローブを提供するステップ
を含む方法である。
【００１５】
本発明の他の実施形態は、癌抑制遺伝子の欠失についてのＦＩＳＨベースのアッセイを行う方法であって、
（ａ）複数の細胞を含む細胞試料についてプローブセットを用いてＦＩＳＨを実行するステップであって、
プローブセットは、癌抑制遺伝子に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第１のフランキングプローブ、癌抑制遺伝子に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第２のフランキングプローブ、および癌抑制遺伝子にハイブリダイズする少なくとも１つの標的プローブを含むステップ、
（ｂ）複数の細胞において、少なくとも第１のフランキングプローブおよび少なくとも第２のフランキングプローブならびに少なくとも１つの標的プローブからのＦＩＳＨシグナルを数えるステップ、
（ｃ）（ｉ）アーチファクトヘミ接合性欠失頻度および（ｉｉ）アーチファクトホモ接合性欠失頻度から選ばれる少なくとも１つのアーチファクト欠失頻度を提供するステップ、
（ｄ）ステップ（ｂ）の数えられたＦＩＳＨシグナルから、（ｉ）見かけ上のヘミ接合性欠失頻度および（ｉｉ）見かけ上のホモ接合性欠失頻度から選ばれる少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度を決定するステップであって、ステップ（ｃ）においてアーチファクトホモ接合性欠失頻度が提供されなかった場合、少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度が、見かけ上のヘミ接合性欠失頻度を含み、ステップ（ｃ）においてアーチファクトヘミ接合性欠失頻度が提供されなかった場合、少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度が、見かけ上のホモ接合性欠失頻度を含むステップ、ならびに
（ｅ）見かけ上のヘミ接合性欠失頻度がアーチファクトヘミ接合性欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、試料が、癌抑制遺伝子のヘミ接合性の欠失を有する細胞を含むかどうかを決定するか、または見かけ上のホモ接合性欠失頻度がアーチファクトホモ接合性欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、試料が、癌抑制遺伝子のホモ接合性の欠失を有する細胞を含むかどうかを決定するステップ
を含む方法である。
【００１６】
本発明の他の実施形態は、癌抑制遺伝子の小さな欠失および大きな欠失を識別可能に検出するためのＦＩＳＨベースのアッセイを行う方法であって、
（ａ）プローブセットを用いて複数の細胞を含む細胞試料についてＦＩＳＨを実行するか、またはプローブセットに含まれる第１のプローブサブセットを用いて複数の細胞を含む第１の細胞試料についてＦＩＳＨを実行し、前記プローブセットに含まれる第２のプローブサブセットを用いて第１の細胞試料と同じ個体に由来する複数の細胞を含む第２の細胞試料についてＦＩＳＨを実行するステップであって、
プローブセットは、癌抑制遺伝子にハイブリダイズする少なくとも１つの標的プローブ、癌抑制遺伝子に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第１のフランキングプローブ、癌抑制遺伝子に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第２のフランキングプローブ、ならびに第１のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第３のフランキングプローブおよび第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第４のフランキングプローブのうちの少なくとも１つを含むステップ、
（ｂ）複数の細胞または複数の複数の細胞において、少なくとも１つの標的プローブならびに少なくとも第１のフランキングプローブ、少なくとも第２のフランキングプローブ、ならびに少なくとも第３のフランキングプローブおよび少なくとも第４のフランキングプローブのうちの少なくとも１つからのＦＩＳＨシグナルを数えるステップ、
（ｃ）少なくとも第１のフランキングプローブと少なくとも第２のフランキングプローブとの間にエンドポイントを有する癌抑制遺伝子の欠失についての少なくとも１つの第１のアーチファクト欠失頻度を提供するステップ、
（ｄ）癌抑制遺伝子の欠失についての少なくとも１つの第２のアーチファクト欠失頻度を提供するステップであって、エンドポイントの少なくとも１つが、少なくとも第１のフランキングプローブと少なくとも第２のフランキングプローブとの間に存在しない、ステップ、
（ｅ）ステップ（ｂ）の数えられたＦＩＳＨシグナルから、少なくとも第１のフランキングプローブと少なくとも第２のフランキングプローブとの間にエンドポイントを有する癌抑制遺伝子の欠失についての少なくとも１つの第１の見かけ上の欠失頻度を決定するステップ、
（ｆ）ステップ（ｂ）の数えられたＦＩＳＨシグナルから、癌抑制遺伝子の欠失についての少なくとも１つの第２の見かけ上の欠失頻度を決定するステップであって、エンドポイントの少なくとも１つが、少なくとも第１のフランキングプローブと少なくとも第２のフランキングプローブとの間に存在しない、ステップならびに
（ｇ）少なくとも１つの第１の見かけ上の欠失頻度が、少なくとも１つの第１のアーチファクト欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、試料が、癌抑制遺伝子の小さな欠失を有する細胞を含むかどうかを決定し、少なくとも１つの第２の見かけ上の欠失頻度が、少なくとも１つの第２のアーチファクトホモ接合性欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、試料が、癌抑制遺伝子の大きな欠失を有する細胞を含むかどうかを決定するステップ
を含む方法である。
【００１７】
本発明の他の実施形態は、癌抑制遺伝子の欠失についてのＦＩＳＨベースのアッセイを最適化するための方法であって、
（ａ）複数の候補プローブセットを提供するステップであって、それぞれの候補プローブセットは、癌抑制遺伝子に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第１のフランキングプローブ、癌抑制遺伝子に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第２のフランキングプローブ、および癌抑制遺伝子にハイブリダイズする少なくとも１つの標的プローブを含むステップ、
（ｂ）それぞれの候補プローブセットについて、
（ｉ）癌抑制遺伝子の完全なコピーの正倍数性の数を含む複数の細胞を含む少なくとも１つの細胞試料について、候補プローブセットを用いてＦＩＳＨを実行し、
（ｉｉ）少なくとも１つの試料の複数の細胞において候補プローブセットの少なくとも第１のフランキングプローブおよび少なくとも第２のフランキングプローブならびに少なくとも１つの標的プローブからのＦＩＳＨシグナルを数え、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の数えられたＦＩＳＨシグナルからアーチファクト欠失頻度を決定するステップ、ならびに
（ｃ）癌抑制遺伝子の欠失について最適化されたＦＩＳＨベースのアッセイにおける使用のための候補プローブセットからプローブセットを選択するステップであって、選択されたプローブセットは、ステップ（ｉｉｉ）において好ましいアーチファクト欠失頻度を有すると決定されたステップ
を含む方法である。
【００１８】
本発明の他の実施形態は、第２１染色体のバンド２１ｑ２２．１３−２１ｑ２２．３における欠失についてのＦＩＳＨベースのアッセイを行う方法であって、
（ａ）複数の細胞を含む細胞試料についてプローブセットを用いてＦＩＳＨを実行するステップであって、
プローブセットは、
ＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧとの間に位置する、またはその代わりに、ＴＭＰＲＳＳ２およびＥＲＧ遺伝子によって包含される領域内に位置する少なくとも１つの標的遺伝子にハイブリダイズする少なくとも１つの標的プローブ、
少なくとも１つの標的遺伝子に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第１のフランキングプローブ、および
少なくとも１つの標的遺伝子に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第２のフランキングプローブを含むステップ、
（ｂ）複数の細胞において、少なくとも第１のフランキングプローブおよび少なくとも第２のフランキングプローブならびに少なくとも１つの標的プローブからのＦＩＳＨシグナルを数えるステップ、
（ｃ）（ｉ）アーチファクトヘミ接合性欠失頻度および（ｉｉ）アーチファクトホモ接合性欠失頻度から選ばれる少なくとも１つのアーチファクト欠失頻度を提供するステップ、
（ｄ）ステップ（ｂ）の数えられたＦＩＳＨシグナルから、（ｉ）見かけ上のヘミ接合性欠失頻度および（ｉｉ）見かけ上のホモ接合性欠失頻度から選ばれる少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度を決定するステップであって、アーチファクトホモ接合性欠失頻度がステップ（ｃ）において提供されなかった場合、少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度は、見かけ上のヘミ接合性欠失頻度を含み、アーチファクトヘミ接合性欠失頻度がステップ（ｃ）において提供されなかった場合、少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度は、見かけ上のホモ接合性欠失頻度を含むステップ、ならびに
（ｅ）見かけ上のヘミ接合性欠失頻度がアーチファクトヘミ接合性欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、試料が、標的遺伝子の少なくとも１つのヘミ接合性欠失を有する細胞を含むかどうかを決定するか、または見かけ上のホモ接合性欠失頻度がアーチファクトホモ接合性欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、試料が、標的遺伝子の少なくとも１つのホモ接合性の欠失を有する細胞を含むかどうかを決定するステップ
を含む方法である。
【００１９】
本発明の他の実施形態は、第２１染色体のバンド２１ｑ２２．１３−２１ｑ２２．３における小さな欠失および大きな欠失を識別可能に検出するためのＦＩＳＨベースのアッセイを行う方法であって、
（ａ）プローブセットを用いて複数の細胞を含む細胞試料についてＦＩＳＨを実行するか、またはプローブセットに含まれる第１のプローブサブセットを用いて複数の細胞を含む第１の細胞試料についてＦＩＳＨを実行し、前記プローブセットに含まれる第２のプローブサブセットを用いて第１の細胞試料と同じ個体に由来する複数の細胞を含む第２の細胞試料についてＦＩＳＨを実行するステップであって、
プローブセットは、
ＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧとの間に位置する少なくとも２つの標的遺伝子にハイブリダイズする少なくとも２つの標的プローブ、
少なくとも２つの標的遺伝子に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第１のフランキングプローブ、
少なくとも２つの標的遺伝子に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第２のフランキングプローブ、
ならびに、任意選択で、第１のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第３のフランキングプローブおよび第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第４のフランキングプローブのうちの少なくとも１つを含むステップ、
（ｂ）複数の細胞または複数の複数の細胞において、少なくとも２つの標的プローブならびに少なくとも第１のフランキングプローブ、少なくとも第２のフランキングプローブ、ならびに存在する場合、少なくとも第３のフランキングプローブおよび少なくとも第４のフランキングプローブのうちの少なくとも１つからのＦＩＳＨシグナルを数えるステップ、
（ｃ）少なくとも第１のフランキングプローブと少なくとも第２のフランキングプローブとの間にエンドポイントを有する標的遺伝子の少なくとも１つの欠失についての少なくとも１つの第１のアーチファクト欠失頻度を提供するステップであって、エンドポイントの１つは、２つの標的遺伝子の間にあるステップ、
（ｄ）標的遺伝子の少なくとも１つの欠失についての少なくとも１つの第２のアーチファクト欠失頻度を提供するステップであって、（ｉ）どのエンドポイントも２つの標的遺伝子の間に存在しないか、または（ｉｉ）少なくとも第３のフランキングプローブおよび少なくとも第４のフランキングプローブのうちの少なくとも１つが使用される場合、エンドポイントの少なくとも１つは、少なくとも第１のフランキングプローブと少なくとも第２のフランキングプローブとの間に存在しない、ステップ、
（ｅ）ステップ（ｂ）の数えられたＦＩＳＨシグナルから、少なくとも第１のフランキングプローブと少なくとも第２のフランキングプローブとの間にエンドポイントを有する標的遺伝子の少なくとも１つの欠失についての少なくとも１つの第１の見かけ上の欠失頻度を決定するステップであって、エンドポイントの１つは、２つの標的遺伝子の間にあるステップ、
（ｆ）ステップ（ｂ）の数えられたＦＩＳＨシグナルから、標的遺伝子の少なくとも１つの欠失についての少なくとも１つの第２の見かけ上の欠失頻度を決定するステップであって、（ｉ）どのエンドポイントも２つの標的遺伝子の間に存在しないか、または（ｉｉ）少なくとも第３のフランキングプローブおよび少なくとも第４のフランキングプローブのうちの少なくとも１つが使用される場合、エンドポイントの少なくとも１つは、少なくとも第１のフランキングプローブと少なくとも第２のフランキングプローブとの間に存在しない、ステップならびに
（ｇ）少なくとも１つの第１の見かけ上の欠失頻度が少なくとも１つの第１のアーチファクト欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、細胞試料または第１の細胞試料および第２の細胞試料が、標的遺伝子の少なくとも１つの小さな欠失を有する細胞を含むかどうかを決定し、少なくとも１つの第２の見かけ上の欠失頻度が少なくとも１つの第２のアーチファクトホモ接合性欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、細胞試料または第１の細胞試料および第２の細胞試料が、標的遺伝子の少なくとも１つの大きな欠失を有する細胞を含むかどうかを決定するステップ
を含む方法である。
【００２０】
本発明の他の実施形態は、ＰＴＥＮにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、ＦＡＳまたはＳＵＦＵにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、およびＴＳＰＡＮ１５にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含むプローブセットである。
【００２１】
本発明の他の実施形態は、ＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧとの間に位置する少なくとも１つの標的遺伝子にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、ＤＹＲＫ１ＡまたはＥＲＧにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、ならびにＴＭＰＲＳＳ２またはＵ２ＡＦ１にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含むプローブセットである。
【００２２】
本願は特定の実施形態において例えば以下の項目を提供する：
（項目１）
ＦＩＳＨベースの癌抑制因子欠失アッセイのためのプローブセットを調製する方法であって、
（ａ）癌抑制遺伝子を含む染色体上の少なくとも１つの境界ゾーンを同定するステップであって、前記少なくとも１つの境界ゾーンが、前記癌抑制遺伝子に対してセントロメア側の第１の境界ゾーンを含むステップ、
（ｂ）前記第１の境界ゾーン内の核酸配列に、または前記第１の境界ゾーンに比べて前記癌抑制遺伝子から遠位にある核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの第１のフランキングプローブを提供するステップ、
（ｃ）前記癌抑制遺伝子に対してテロメア側の核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの第２のフランキングプローブを提供するステップ、および
（ｄ）前記境界ゾーンの間の前記癌抑制遺伝子における核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの標的プローブを提供するステップ
を含む、方法。
（項目２）
癌抑制遺伝子の欠失についてのＦＩＳＨベースのアッセイを行う方法であって、
（ａ）複数の細胞を含む細胞試料について、プローブセットを用いてＦＩＳＨを実行するステップであって、前記プローブセットは、前記癌抑制遺伝子に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第１のフランキングプローブ、前記癌抑制遺伝子に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第２のフランキングプローブ、および前記癌抑制遺伝子にハイブリダイズする少なくとも１つの標的プローブを含む、ステップ、
（ｂ）前記複数の細胞において、前記少なくとも第１のフランキングプローブおよび前記少なくとも第２のフランキングプローブならびに前記少なくとも１つの標的プローブからのＦＩＳＨシグナルを数えるステップ、
（ｃ）（ｉ）アーチファクトヘミ接合性欠失頻度および（ｉｉ）アーチファクトホモ接合性欠失頻度から選ばれる少なくとも１つのアーチファクト欠失頻度を提供するステップ、
（ｄ）ステップ（ｂ）の数えられたＦＩＳＨシグナルから、（ｉ）見かけ上のヘミ接合性欠失頻度および（ｉｉ）見かけ上のホモ接合性欠失頻度から選ばれる少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度を決定するステップであって、ステップ（ｃ）においてアーチファクトホモ接合性欠失頻度が提供されなかった場合、前記少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度は、見かけ上のヘミ接合性欠失頻度を含み、ステップ（ｃ）においてアーチファクトヘミ接合性欠失頻度が提供されなかった場合、前記少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度は、見かけ上のホモ接合性欠失頻度を含む、ステップ、ならびに
（ｅ）前記見かけ上のヘミ接合性欠失頻度が前記アーチファクトヘミ接合性欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、前記試料が、前記癌抑制遺伝子のヘミ接合性欠失を有する細胞を含むかどうかを決定するか、または前記見かけ上のホモ接合性欠失頻度が前記アーチファクトホモ接合性欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、前記試料が、前記癌抑制遺伝子のホモ接合性の欠失を有する細胞を含むかどうかを決定するステップ
を含む、方法。
（項目３）
癌抑制遺伝子の小さな欠失および大きな欠失を識別可能に検出するためのＦＩＳＨベースのアッセイを行う方法であって、
（ａ）プローブセットを用いて、複数の細胞を含む細胞試料についてＦＩＳＨを実行するか、またはプローブセットに含まれる第１のプローブサブセットを用いて、複数の細胞を含む第１の細胞試料についてＦＩＳＨを実行し、前記プローブセットに含まれる第２のプローブサブセットを用いて前記第１の細胞試料と同じ個体に由来する複数の細胞を含む第２の細胞試料についてＦＩＳＨを実行するステップであって、前記プローブセットは、前記癌抑制遺伝子にハイブリダイズする少なくとも１つの標的プローブ、前記癌抑制遺伝子に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第１のフランキングプローブ、前記癌抑制遺伝子に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第２のフランキングプローブ、ならびに前記第１のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第３のフランキングプローブおよび前記第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第４のフランキングプローブのうちの少なくとも１つを含む、ステップ、
（ｂ）前記複数の細胞または複数の前記複数の細胞において、前記少なくとも１つの標的プローブならびに前記少なくとも第１のフランキングプローブ、前記少なくとも第２のフランキングプローブ、ならびに前記少なくとも第３のフランキングプローブおよび前記少なくとも第４のフランキングプローブのうちの少なくとも１つからのＦＩＳＨシグナルを数えるステップ、
（ｃ）前記少なくとも第１のフランキングプローブと前記少なくとも第２のフランキングプローブとの間にエンドポイントを有する前記癌抑制遺伝子の欠失についての少なくとも１つの第１のアーチファクト欠失頻度を提供するステップ、
（ｄ）前記癌抑制遺伝子の欠失についての少なくとも１つの第２のアーチファクト欠失頻度を提供するステップであって、前記エンドポイントの少なくとも１つが、前記少なくとも第１のフランキングプローブと前記少なくとも第２のフランキングプローブとの間に存在しない、ステップ、
（ｅ）ステップ（ｂ）の数えられたＦＩＳＨシグナルから、前記少なくとも第１のフランキングプローブと前記少なくとも第２のフランキングプローブとの間にエンドポイントを有する前記癌抑制遺伝子の欠失についての少なくとも１つの第１の見かけ上の欠失頻度を決定するステップ、
（ｆ）ステップ（ｂ）の数えられたＦＩＳＨシグナルから、前記癌抑制遺伝子の欠失についての少なくとも１つの第２の見かけ上の欠失頻度を決定するステップであって、前記エンドポイントの少なくとも１つが、前記少なくとも第１のフランキングプローブと前記少なくとも第２のフランキングプローブとの間に存在しない、ステップ、ならびに
（ｇ）前記少なくとも１つの第１の見かけ上の欠失頻度が、前記少なくとも１つの第１のアーチファクト欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、前記試料が、前記癌抑制遺伝子の小さな欠失を有する細胞を含むかどうかを決定し、前記少なくとも１つの第２の見かけ上の欠失頻度が、少なくとも１つの第２のアーチファクトホモ接合性欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、前記試料が、前記癌抑制遺伝子の大きな欠失を有する細胞を含むかどうかを決定するステップ
を含む、方法。
（項目４）
癌抑制遺伝子の欠失についてのＦＩＳＨベースのアッセイを最適化する方法であって、
（ａ）複数の候補プローブセットを提供するステップであって、それぞれの候補プローブセットは、前記癌抑制遺伝子に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第１のフランキングプローブ、前記癌抑制遺伝子に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第２のフランキングプローブ、および前記癌抑制遺伝子にハイブリダイズする少なくとも１つの標的プローブを含む、ステップ、
（ｂ）それぞれの候補プローブセットについて、
（ｉ）前記癌抑制遺伝子の完全なコピーの正倍数性の数を含む複数の細胞を含む少なくとも１つの細胞試料について前記候補プローブセットを用いてＦＩＳＨを実行し、
（ｉｉ）前記少なくとも１つの試料の前記複数の細胞において前記候補プローブセットの前記少なくとも第１のフランキングプローブおよび前記少なくとも第２のフランキングプローブならびに前記少なくとも１つの標的プローブからのＦＩＳＨシグナルを数え、そして
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の数えられたＦＩＳＨシグナルからアーチファクト欠失頻度を決定するステップ、ならびに
（ｃ）癌抑制遺伝子の欠失について最適化されたＦＩＳＨベースのアッセイに使用するための前記候補プローブセットからプローブセットを選択するステップであって、選択されたプローブセットは、ステップ（ｉｉｉ）において好ましいアーチファクト欠失頻度を有すると決定された、ステップ
を含む、方法。
（項目５）
第２１染色体のバンド２１ｑ２２．１３−２１ｑ２２．３における欠失についてのＦＩＳＨベースのアッセイを行う方法であって、
（ａ）複数の細胞を含む細胞試料について、プローブセットを用いてＦＩＳＨを実行するステップであって、
前記プローブセットは、
ＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧとの間に位置する少なくとも１つの標的遺伝子にハイブリダイズする少なくとも１つの標的プローブ、
前記少なくとも１つの標的遺伝子に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第１のフランキングプローブ、ならびに、
前記少なくとも１つの標的遺伝子に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第２のフランキングプローブ
を含む、ステップ、
（ｂ）前記複数の細胞において、前記少なくとも第１のフランキングプローブおよび前記少なくとも第２のフランキングプローブならびに前記少なくとも１つの標的プローブからのＦＩＳＨシグナルを数えるステップ、
（ｃ）（ｉ）アーチファクトヘミ接合性欠失頻度および（ｉｉ）アーチファクトホモ接合性欠失頻度から選ばれる少なくとも１つのアーチファクト欠失頻度を提供するステップ、
（ｄ）ステップ（ｂ）の数えられたＦＩＳＨシグナルから、（ｉ）見かけ上のヘミ接合性欠失頻度および（ｉｉ）見かけ上のホモ接合性欠失頻度から選ばれる少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度を決定するステップであって、ステップ（ｃ）においてアーチファクトホモ接合性欠失頻度が提供されなかった場合、前記少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度は、見かけ上のヘミ接合性欠失頻度を含み、ステップ（ｃ）においてアーチファクトヘミ接合性欠失頻度が提供されなかった場合、前記少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度は、見かけ上のホモ接合性欠失頻度を含む、ステップ、ならびに
（ｅ）前記見かけ上のヘミ接合性欠失頻度が前記アーチファクトヘミ接合性欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、前記試料が、前記標的遺伝子の少なくとも１つのヘミ接合性欠失を有する細胞を含むかどうかを決定するか、または前記見かけ上のホモ接合性欠失頻度が前記アーチファクトホモ接合性欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、前記試料が、前記標的遺伝子の少なくとも１つのホモ接合性の欠失を有する細胞を含むかどうかを決定するステップ
を含む、方法。
（項目６）
第２１染色体のバンド２１ｑ２２．１３−２１ｑ２２．３における小さな欠失および大きな欠失を識別可能に検出するためのＦＩＳＨベースのアッセイを行う方法であって、
（ａ）プローブセットを用いて、複数の細胞を含む細胞試料についてＦＩＳＨを実行するか、またはプローブセットに含まれる第１のプローブサブセットを用いて、複数の細胞を含む第１の細胞試料についてＦＩＳＨを実行し、前記プローブセットに含まれる第２のプローブサブセットを用いて前記第１の細胞試料と同じ個体に由来する複数の細胞を含む第２の細胞試料についてＦＩＳＨを実行するステップであって、
前記プローブセットは、
ＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧとの間に位置する少なくとも２つの標的遺伝子にハイブリダイズする少なくとも２つの標的プローブ、
前記少なくとも２つの標的遺伝子に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第１のフランキングプローブ、
前記少なくとも２つの標的遺伝子に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第２のフランキングプローブ、ならびに必要に応じて
前記第１のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第３のフランキングプローブおよび前記第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第４のフランキングプローブのうちの少なくとも１つ
を含む、ステップ、
（ｂ）前記複数の細胞または複数の前記複数の細胞において、前記少なくとも２つの標的プローブならびに前記少なくとも第１のフランキングプローブ、前記少なくとも第２のフランキングプローブ、ならびに存在する場合、前記少なくとも第３のフランキングプローブおよび前記少なくとも第４のフランキングプローブのうちの少なくとも１つからのＦＩＳＨシグナルを数えるステップ、
（ｃ）前記少なくとも第１のフランキングプローブと前記少なくとも第２のフランキングプローブとの間にエンドポイントを有する前記標的遺伝子の少なくとも１つの欠失についての少なくとも１つの第１のアーチファクト欠失頻度を提供するステップであって、前記エンドポイントの１つは、２つの標的遺伝子の間にある、ステップ、
（ｄ）前記標的遺伝子の少なくとも１つの欠失についての少なくとも１つの第２のアーチファクト欠失頻度を提供するステップであって、（ｉ）どのエンドポイントも２つの標的遺伝子の間に存在しないか、または（ｉｉ）前記少なくとも第３のフランキングプローブおよび前記少なくとも第４のフランキングプローブのうちの少なくとも１つを使用した場合、前記エンドポイントの少なくとも１つは、前記少なくとも第１のフランキングプローブと前記少なくとも第２のフランキングプローブとの間に存在しない、ステップ、
（ｅ）ステップ（ｂ）の数えられたＦＩＳＨシグナルから、前記少なくとも第１のフランキングプローブと前記少なくとも第２のフランキングプローブとの間にエンドポイントを有する、前記標的遺伝子の少なくとも１つの欠失についての少なくとも１つの第１の見かけ上の欠失頻度を決定するステップであって、前記エンドポイントの１つは、２つの標的遺伝子の間にある、ステップ、
（ｆ）ステップ（ｂ）の数えられたＦＩＳＨシグナルから、前記標的遺伝子の少なくとも１つの欠失についての少なくとも１つの第２の見かけ上の欠失頻度を決定するステップであって、（ｉ）どのエンドポイントも２つの標的遺伝子の間に存在しないか、または（ｉｉ）前記少なくとも第３のフランキングプローブおよび前記少なくとも第４のフランキングプローブのうちの少なくとも１つを使用した場合、前記エンドポイントの少なくとも１つは、前記少なくとも第１のフランキングプローブと前記少なくとも第２のフランキングプローブとの間に存在しない、ステップ、ならびに
（ｇ）前記少なくとも１つの第１の見かけ上の欠失頻度が前記少なくとも１つの第１のアーチファクト欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、前記細胞試料が、前記標的遺伝子の少なくとも１つの小さな欠失を有する細胞を含むかどうかを決定し、そして前記少なくとも１つの第２の見かけ上の欠失頻度が少なくとも１つの第２のアーチファクトホモ接合性欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、前記細胞試料が、前記標的遺伝子の少なくとも１つの大きな欠失を有する細胞を含むかどうかを決定するステップを含む、方法。
（項目７）
ＰＴＥＮにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、ＦＡＳまたはＳＵＦＵにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、およびＴＳＰＡＮ１５にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含むプローブセット。
（項目８）
ＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧとの間に位置する少なくとも１つの標的遺伝子にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、ＤＹＲＫ１ＡまたはＥＲＧにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、ならびにＴＭＰＲＳＳ２またはＵ２ＡＦ１にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含むプローブセット。
（項目９）
ＰＴＥＮにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、ＦＡＳまたはＳＵＦＵにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、およびＷＡＰＡＬにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含むプローブセット。
前述の全般的な説明および実施形態の以下の説明の両方は、単に、例示的かつ説明的なものであり、特許請求されるように、本発明を限定するものではないことが理解されたい。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
Ａ．概要
本発明の実施形態は、ＦＩＳＨベースのアッセイを行う方法、ＦＩＳＨベースの癌抑制因子欠失アッセイのためのプローブを調製する方法、癌抑制遺伝子の欠失についてのＦＩＳＨベースのアッセイを最適化するための方法、ならびにＦＩＳＨベースの癌抑制因子欠失アッセイに有用なプローブセット、組成物、およびプローブを含むキットを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、癌抑制因子は、ＰＴＥＮ、ｐ５３、ｐ１６（ＣＤＫＮ２Ａとしても公知）、ＲＢ１、ＤＣＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、およびＡＰＣから選ばれる。たとえば、これらの癌抑制因子は、たとえばＣｈａｎｇ  Ｈら、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ：  ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １７ｐ１３．１  （ｐ５３）  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２００４年；１２７巻：２８０〜２８４頁；Ｋｏｈｎｏ  ＴおよびＹｏｋｏｔａ  Ｊ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ９ｐ２１  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｃａｕｓｉｎｇ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐ１６  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ：  Ｄｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔｓ  ｆｏｒ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ、ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  ２００６年；５巻：１２７３〜１２８１頁；Ｆｒｉｅｎｄ  ＳＨら、Ａ  ｈｕｍａｎ  ＤＮＡ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｔｈａｔ  ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｅｓ  ｔｏ  ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  ａｎｄ  ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ、Ｎａｔｕｒｅ  １９８６年；３２３巻：６４３〜６頁；Ｐｏｐａｔ  ＳおよびＨｏｕｌｓｔｏｎ  ＲＳ、Ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １８ｑ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ，  ＤＣＣ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００５年；４１巻：２０６０〜２０７０頁；Ｂｅｃｋｅｒ  Ｋら、Ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＢＲＣＡ１／２  ａｎｄ  ｐ５３  Ｒ２４８Ｗ  ｇａｉｎ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｕｇｇｅｓｔ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｆｒａｇｉｌｅ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔｒｉａｄ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｂａｃｅｏｕｓ  ｇｌａｎｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  ２００８年；１５９巻：１２８２〜１２８９頁；ならびにＣａｓｔｅｌｌｓａｇｕｅ  Ｅら、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＰＣ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ２００８年；５４巻：１１３２〜４０頁において説明されている。
【００２５】
いくつかの実施形態では、癌抑制因子は、１０ｑ２３、１７ｐ１３、１３ｑ１４、９ｑ２４、および９ｐ２１から選ばれる染色体バンドのヒト染色体上に位置する癌抑制因子から選ばれる。いくつかの実施形態では、癌抑制因子は、１０ｑ、１７ｐ、１３ｑ、９ｐ、１ｐ、５ｑ、１９ｑ、２０ｑ、８ｐ、１２ｐ、および１６ｑから選ばれるヒト染色体腕上に位置する癌抑制因子から選ばれる。たとえば、前述のバンドおよび腕における癌抑制因子の存在は、たとえばＫｏｌｏｍｉｅｔｚ  Ｅら、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｄｅｌｅｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  １２０ｋｂ  ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ＡＢＬ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｗｉｔｈ  ｐｏｏｒ  ｏｕｔｃｏｍｅ、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２００３年；１７巻：１３１３〜１３２３頁、２００３年；Ｈａａｓｅ  Ｄ、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ、Ａｎｎ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ２００８年；８７巻：５１５〜５２６頁；Ｒｅｉｆｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｊら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉａｌ  ｔｕｍｏｒｓ  ｓｈｏｗｓ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｏｎ  １９ｑ  ａｎｄ  １ｐ、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １９９４年；１４５巻：１１７５〜１１９０頁；Ｃｈａｎｇ  Ｂら、Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  Ｌｉｎｋａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｍｉｌｉｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｔｗｏ  Ｓｍａｌｌ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｓ  ａｔ  ８ｐ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００７年；６７巻：４０９８〜４１０３頁；およびＲｅｉｎｅｒ  Ｍら、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｕｂｕｌａｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｓｈｏｗｓ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤＨ１３ｌｏｃｕｓ  ｏｎ  １６ｑ、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２００８年；３９巻：１６２１〜１６２９頁において説明されている。
【００２６】
ヒト染色体腕およびバンドは、ＩＳＣＮ  ２００９年．  Ａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ、編集者：Ｓｈａｆｆｅｒ  ＬＧ、Ｓｌｏｖａｋ  ＭＬ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＬＪ．、２００９年；第２章、Ｓ．  Ｋａｒｇｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．において定義されるとおりである。
【００２７】
下記の定義は、本発明の実施形態を理解するのに有用な用語および概念の定義であり、詳細な実施形態の説明およびそれらの実施形態の実施例が続く。実施形態の説明がセクションおよびサブセクションに構成されているが、１つのサブセクションにおいて説明される多くの態様は、他のセクションにおける実施形態に関連がある、たとえば、プローブのタイプの説明は、プローブを使用する方法に関連することが理解されたい。
【００２８】
Ｂ．定義
本明細書において使用されるように、「境界ゾーン」は、欠失のエンドポイントが高頻度で生じる染色体の領域である。染色体上の癌抑制遺伝子の近くの境界ゾーンの位置は、多くの試料について欠失のエンドポイントを測定し、多くのエンドポイントが密集する領域を同定することによって決定することができる。試料の集団における欠失エンドポイントは、ＦＩＳＨまたは比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）を使用するアレイなどのような技術によって測定することができ、これは、セクションＣ．１において下記にさらに説明される。いくつかの実施形態では、境界ゾーンのサイズは、５０ｋｂ、１００ｋｂ、２００ｋｂ、３００ｋｂ、４００ｋｂ、５００ｋｂ、もしくは１Ｍｂ以上および／または１．５Ｍｂ、２Ｍｂ、３Ｍｂ、４Ｍｂ、もしくは５Ｍｂ以下である。境界ゾーンは、ＣＧＨによって同定される壊れやすい領域を含む。
【００２９】
対象（たとえば前立腺癌）の所与の癌抑制遺伝子、ゾーンサイズ、および状態について、癌抑制遺伝子を含む染色体は、いくつかの実施形態では、「主要な境界ゾーン」を含んでいてもよい。主要な境界ゾーンは、最も大きな頻度で欠失エンドポイントを含む、癌抑制遺伝子に対してセントロメア側またはテロメア側の領域である。癌抑制遺伝子の各側に対して１つある、２つの主要な境界ゾーンがあり得る。
【００３０】
用語「欠失」は、染色体腕の一部が欠けている構造的染色体異常を説明するために細胞遺伝学的意味で、本明細書において使用される。したがって、欠失は、欠けているゲノムの特定の領域にマッピングされる染色体物質および遺伝子（複数可）の損失である。大まかに言えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ）由来のＤＮＡを標識することによって調製されるプローブなどのようなＦＩＳＨプローブは、細胞試料にハイブリダイズされ、ＦＩＳＨシグナルの存在または不在は、欠失が存在するかどうかを決定するために使用される。臨床的に遭遇する最も単純なタイプの欠失は、介在欠失である（図１を参照されたい）。いくつかの欠失は、約５Ｍｂ  ＤＮＡである、古典的な細胞遺伝学的分析の分解能未満である微小欠失であると考えられる。ＤＮＡのそのような超顕微鏡的な介在損失は、染色体の内部から生じ、１つのサイトバンド（ｃｙｔｏｂａｎｄ）内に生じる可能性がある。それらは、数百ｋｂのＤＮＡほどの小さいものとなり得、典型的に、ＦＩＳＨ法によって検出される。
【００３１】
本明細書において使用されるように、「プローブセット」は、異なって標識されたＤＮＡ配列のグループであるまたはマルチカラーＦＩＳＨアッセイにおいて使用するために異なって標識することができる。プローブセットのプローブは、蛍光顕微鏡法によって目に見えるシグナルを生成するために、限定を伴うことなく、宿主株からのＢＡＣもしくはコスミドＤＮＡの単離；ゲノムもしくはクローニングＤＮＡの増幅（たとえばポリメラーゼ連鎖反応もしくはローリングサークル増幅）；またはたとえば、標的ゲノムにおける十分に大きな領域（たとえば少なくとも５０ｋｂもしくは少なくとも１００ｋｂ）を網羅するオリゴヌクレオチドのセットの人工合成によるものを含む、当業者らに公知の様々な手順によって調製することができる。所与の領域に対するプローブは、複数の細菌人工染色体（ＢＡＣ）、コスミド、増幅産物、オリゴヌクレオチドなどに由来してもよいことに注目されたい。ある場合には、プローブはまた、ゲノムの他の領域にもハイブリダイズする反復配列を含有しないように設計されてもよい。特定のＢＡＣ「に由来する」プローブ「を含む」プローブセットは、明確に列挙されるプローブに寄与するまたはさらなるプローブを提供するもしくそれに寄与する、使用されているさらなるＢＡＣに関して排他的でない（ｏｐｅｎ）ことが理解されたい。対照的に、特定のＢＡＣ「に由来する」プローブ「から成る」プローブセットは、使用されているさらなるＢＡＣに関して排他的である（ｃｌｏｓｅｄ）。特定の遺伝子「にハイブリダイズする」プローブは、少なくとも部分的に、特定の遺伝子に重複する結合部位を有する。プローブはまた、近隣の遺伝子の一部にハイブリダイズしてもよいまたはしなくてもよい。用語「遺伝子」は、ＧｅｎｅＣａｒｄｓ（登録商標）データベース、ｖ３．０５、２０１１年２月１３日（たとえばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇを参照されたい）において所与の遺伝子について提供されるなどのように、染色体の座標によって境界を示されるゲノムＤＮＡのエリアを参照して、一般に使用される。
【００３２】
本明細書において使用されるように、「ＦＩＳＨシグナル」は、その標的へのプローブのハイブリダイゼーションから結果として生じる、ＦＩＳＨアッセイにおいて観察される蛍光のスポットである。ＦＩＳＨシグナルは、多くの場合、点状であるが、観察下の細胞におけるクロマチンの縮合状態に依存して、必ずしも、全体として密集して現れ得るとは限らない。
【００３３】
所与の特徴を有する複数の細胞を含む細胞試料について説明される場合、必ずしも、細胞試料における細胞がすべて、所与の特徴を有するというわけではないことに注目されたい。
【００３４】
本明細書において使用されるように、「アーチファクト欠失頻度」は、ＦＩＳＨシグナルの欠乏が、試料調製の間の核の切断または試料における細胞の遺伝子型と関連しない任意の他の原因などのような、誤差の原因により観察される、欠失アッセイにおける頻度を指す。アーチファクト欠失頻度は、ＦＩＳＨアッセイにおいて標的にされる遺伝子の欠失を含有していない陰性対照試料を使用して決定することができる。
【００３５】
本明細書において使用されるように、「見かけ上の欠失頻度」は、ＦＩＳＨシグナルの欠乏が観察される欠失アッセイにおける頻度を指し、それは、したがって、試料における実際の欠失頻度とのアーチファクト欠失頻度（試験試料について一般に未知であるが、上記に説明されるように対照試料から推定することができる）の組み合わせである。見かけ上の欠失頻度は、１つもしくは複数のＦＩＳＨシグナルの特定のセットの不在の頻度、標的プローブからの１つのＦＩＳＨシグナルが欠けている全体の頻度、標的プローブからの２つのＦＩＳＨシグナルが欠けている全体の頻度、または標的プローブからの少なくとも１つのＦＩＳＨシグナルが欠けている全体の頻度を指すことができる。
【００３６】
本明細書において使用されるように、「正倍数性の数」は、所与のタイプの細胞について正常な遺伝子のコピーの数を指す。正倍数性の数が４である場合の複製後および分裂前を除いて、正倍数性の数の典型的な値は、体細胞における体細胞染色体の座について２である。当業者らに公知である正倍数性の数が異なる他の状況があり、たとえば、正倍数性の数は、還元減数分裂を受けた生殖系列細胞においておよびＸ染色体座について雄性細胞において半分に低下する。Ｙ染色体座についての正倍数性の数は、雌性細胞において０、雄性細胞において１（または複製後および分裂前に２）である。
【００３７】
「染色体計数プローブ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅ）」は、核において特定の染色体の数を決定するために使用されるプローブを指し、一般的なタイプの染色体計数プローブは、セントロメア側またはセントロメア周囲の（ｐｅｒｉｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ）座でハイブリダイズするプローブを含む。
【００３８】
候補プローブセットによって与えられるアーチファクト欠失頻度および／または感度値に関して使用される場合の「好ましい」は、値が、試験される候補プローブセットの平均値よりも少なくとも、好適であることを意味する。アーチファクト欠失頻度および／または感度値が、少なくとも６０パーセンタイル、７０パーセンタイル、８０パーセンタイル、９０パーセンタイル、または９５パーセンタイルにあるといった、よりストリンジェントな基準を適用することによって、候補プローブセットを選択することもまた、もちろん可能であり、より高度なパーセンタイルは、より好適な性能を示すことが理解されたい（つまり高感度またはより低いアーチファクト欠失頻度）。
【００３９】
第１の座が第２の座よりもセントロメアに対して近い場合、第１の座は、第２の座に対して「セントロメア側に」ある。
【００４０】
第１の座が、第１の座が存在する腕のテロメアに対して第２の座よりも近い場合、第１の座は、第２の座に対して「テロメア側に」ある。
【００４１】
第１の座が、境界ゾーンに比べて癌抑制因子から遠位にあるハイブリダイゼーション部位などのような第３の座に比べて第２の座から「遠位にある」場合、第１の座が、第３の座からよりも、第２の座からさらに遠いことを意味し、したがって、ハイブリダイゼーション部位が、癌抑制因子に対してセントロメア側にある境界ゾーンに比べて、癌抑制因子から遠位にある場合、ハイブリダイゼーション部位は、癌抑制因子に対して必ずセントロメア側にある。同様に、ハイブリダイゼーション部位が、癌抑制因子に対してテロメア側にある境界ゾーンに比べて、癌抑制因子から遠位にある場合、ハイブリダイゼーション部位は、癌抑制因子に対して必ずテロメア側にある。
【００４２】
Ｃ．プローブを調製する方法
本発明は、欠失検出のための３色以上のＦＩＳＨアッセイのためのプローブの調製に部分的に関する。プローブは、たとえば、ヒト癌において頻繁に欠失しているＤＮＡの０．５〜１０メガベース（ｍｂ）の間のゲノム区間内におよびその末端にまたはその末端の近くにハイブリダイゼーション部位を有するように設計することができる。癌抑制遺伝子にハイブリダイズする標的プローブが、調製され、癌抑制遺伝子に対してテロメア側にあるおよびセントロメア側にあるハイブリダイゼーション部位を有するフランキングプローブが提供される（図２Ａ）。
【００４３】
本発明の方法によって調製されるフランキングプローブは、同定された境界ゾーン内のおよび／または境界ゾーンに比べて癌抑制遺伝子から遠位にあるハイブリダイゼーション部位を有することができる。いくつかの実施形態では、フランキングプローブは、境界ゾーンに比べて癌抑制遺伝子から遠位にあるハイブリダイゼーション部位を有し、ハイブリダイゼーション部位の中心は、境界ゾーンの近位端に近い、たとえば、境界ゾーンの近位端から２Ｍｂ、１．５Ｍｂ、１Ｍｂ、５００ｋｂ、２００ｋｂ、または１００ｋｂ以下である。
【００４４】
１．境界ゾーン同定
境界ゾーンは、Ｂｅｒｏｕｋｈｉｍ  Ｒら、Ｔｈｅ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｏｐｙ−ｎｕｍｂｅｒ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ａｃｒｏｓｓ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０年；４６３巻：８９９〜９０５頁において記載されている［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｔｕｍｏｒｓｃａｐｅ／ｐａｇｅｓ／ｐｏｒｔａｌＨｏｍｅ．ｊｓｆ］で入手可能なものなどのようなパブリックドメインデータセットに由来する比較ゲノムハイブリダイゼーションデータを使用して同定することができる；Ｌｉｕ  Ｗら、Ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎｄｉｃａｔｅｓ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｌｅｔｈａｌ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００９年；１５巻：５５９〜６５頁およびＦｅｒｒｅｉｒａ  ＢＩら、Ａｒｒａｙ  ＣＧＨ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  Ｅｗｉｎｇ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００８年；２７巻：２０８４〜２０９０頁もまた、参照されたい。典型的に、これらのデータセットは、欠失を含まない正常な細胞由来の識別可能に標識された参照ＤＮＡと共に、高解像度ゲノムマイクロアレイに対して、対象の癌抑制因子の欠失を含む可能性がある複数の癌性試料、たとえば腫瘍試料由来の標識ＤＮＡを用いて比較ハイブリダイゼーション実験を実行することによって得られた。一度、複数の試料由来のゲノムＤＮＡが、対象の癌抑制因子の頻繁な欠失を有するサブセットを含むように決定されたら、境界ゾーンは、個々の試料における別個のコピー数変化として同定される欠失ブレークポイントのクラスターがある領域として同定することができる。これは、対象の癌抑制因子に近づく位置と共に、コピー数における著しい減少として、癌性試料の集団における位置ごとの平均存在量から同定することができる。たとえば、参照に比べた平均コピー数は、５００ｋｂ、７５０ｋｂ、１Ｍｂ、１．５Ｍｂ、または２Ｍｂなどのような長さにわたり、１５％、２０％、または２５％などのような量、減少してもよい。
【００４５】
大きな一連のアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（たとえば５０、７５、１００、またはそれ以上）の分析が、複数の試料を個々にアッセイするために実行される場合、境界ゾーンもまた、コピー数変化が各試料において生じる場所を決定し、これらの位置をビニングし（ｂｉｎｎｉｎｇ）（たとえば、５０ｋｂ、１００ｋｂ  ２００ｋｂ  ３００ｋｂ、４００ｋｂ、５００ｋｂ、１Ｍｂ、１．５Ｍｂ、または２ＭｂなどのようなサイズのＤＮＡのストレッチに対応するビン（ｂｉｎ）において）、コピー数変化について有意に豊富であるビンを同定することによって、同定することができる。個々の試料におけるコピー数変化は、たとえばＦｅｒｒｅｉｒａ  ＢＩら、Ａｒｒａｙ  ＣＧＨ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  Ｅｗｉｎｇ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００８年；２７巻：２０８４〜２０９０頁において記載されるように同定することができる。ランクセグメンテーションは、獲得および損失のセグメントを同定するために使用することができ、このプロセスは、たとえば、ユーザーマニュアルにおいて記載されるように、市販で入手可能なソフトウェアＮｅｘｕｓ  Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４  ｏｒ  ５（２０１０年２月）（ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｅｌ  Ｓｅｇｕｎｄｏ、ＣＡ）において実行される。
【００４６】
「セグメント重複」と呼ばれる配列マイクロホモロジーの境界ゾーン決定クラスの上記のモードに加えて、「コピー数多型」（ＣＮＶ）と呼ばれる他のクラスは、上記に記載されるように同定されたコピー数変化の近くに存在し得る。いくつかの実施形態では、これらのクラスの少なくとも１つまたはそのような配列の両方のクラスが、コピー数変化に隣接してまたはその近くに（たとえば２５、５０、７５、または１００ｋｂ以内に）存在する場合、領域は、下記に記載されるようにＦＩＳＨプローブ分析のために選択されるであろう。セグメント重複位置は、Ｓｅｇｍｅｎｔａｌ  Ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅから得ることができる（Ｓｈｅ  Ｘら、Ｓｈｏｔｇｕｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｎｔ  ｓｅｇｍｅｎｔａｌ  ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ、Ｎａｔｕｒｅ  ２００４年；４３１巻：９２７〜９３０頁）。ＣＮＶデータは、Ｓａｎｇｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＣＮＶ  Ｐｒｏｊｅｃｔから得ることができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｈｕｍｇｅｎ／ｃｎｖ／）；たとえばＲｅｄｏｎ  Ｒら、Ｇｌｏｂａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２００６年；４４４巻：４４４〜４５４頁およびＫｏｍｕｒａ  Ｄら、Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ２００６年；１６巻：１５７５〜８４頁を参照されたい。ＣＮＶおよびセグメント重複はまた、Ｓｔａｎｋｉｅｗｉｃｚ  Ｐ、Ｌｕｐｓｋｉ  ＪＲ、Ｇｅｎｏｍｅ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  ２００２年；１８巻：７４〜８２頁、Ｂｅｒｏｕｋｈｉｍ  Ｒら、Ｔｈｅ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｏｐｙ−ｎｕｍｂｅｒ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ａｃｒｏｓｓ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０年；４６３巻：８９９〜９０５頁、およびＣａｓｃｉ  Ｔ、Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：  ＣＮＶ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００８年；９巻：８１４〜８１５頁においても記載されている。
【００４７】
いくつかの実施形態では、セグメント重複のクラスターが、コピー数変化の近くに存在するかどうかが決定される。クラスターは、５００ｋｂ、１Ｍｂ、または２Ｍｂ領域内に少なくとも３、４、５、６、またはそれ以上のセグメント重複を含むことができる。
【００４８】
その代わりにまたは境界ゾーン決定のための上記のモードに加えて、境界ゾーンは、染色体の正常な配列に沿って間を置いて配置されるハイブリダイゼーション部位を有する一連のプローブを用いて、対象の癌抑制因子の欠失を含む可能性がある大きな複数のもの（たとえば３００またはそれ以上の試料）をアッセイすることによって、ＦＩＳＨを使用して同定することができる。一連のプローブは、それらの間に結合するプローブがない場合、近いと考えられる。対象の癌抑制因子からより遠いプローブが、対象の癌抑制因子により近いプローブよりも有意に多く、欠失を含む試料においてＦＩＳＨシグナルを生成する場合、境界ゾーンは、２つの近くのプローブの間に存在することが決定される。有意性閾値は、下記に説明される。
【００４９】
２．ハイブリダイゼーション部位
プローブは、プローブが、５０％ホルムアミドを有する２×ＳＳＣにおける４５℃などのような低ストリンジェンシー条件下でＦＩＳＨによって検出に十分な程度まで塩基対を安定して形成する場合、部位にハイブリダイズすると考えられる。一般に、より低いストリンジェンシーは、低温および高塩濃度に関連する（Ｂａｙａｎｉ  Ｊ、Ｓｑｕｉｒｅ  ＪＡ，  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  （ＦＩＳＨ），  Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００４年；第２２章：Ｕｎｉｔ  ２２．４）。
【００５０】
本発明の方法によって調製されるプローブのハイブリダイゼーション部位は、以下の１つまたは複数を含む様々な方法で位置づけることができる。
【００５１】
（ａ）標的および他のハイブリダイゼーション部位に関する位置づけ
本発明によるプローブセットを調製する方法は、典型的に、癌抑制遺伝子における核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの標的プローブおよび少なくとも２つのフランキングプローブを提供するステップを含み、一方は、癌抑制遺伝子に対してセントロメア側にある部位にハイブリダイズし、一方は、癌抑制遺伝子に対してテロメア側にハイブリダイズする。
【００５２】
（ｂ）第１および第２の境界ゾーンに関する位置づけ
フランキングプローブは、境界ゾーンに関して位置づけることができる。あるフランキングプローブは、第１の境界ゾーン内の核酸配列に、または第１の境界ゾーンに比べて癌抑制遺伝子から遠位にある核酸配列にハイブリダイズすることができ、別のフランキングプローブは、第２の境界ゾーン内の核酸配列に、または第２の境界ゾーンに比べて癌抑制遺伝子から遠位にある核酸配列にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、これらの配列は、第１の境界ゾーンまたは第２の境界ゾーンに比べて癌抑制遺伝子に対して遠位にある。
【００５３】
（ｃ）さらなる境界ゾーンに関する位置づけ
方法は、さらなる境界ゾーン（第３の境界ゾーン、第４の境界ゾーン、または第５の境界ゾーンなど）を同定するステップおよびそれぞれのさらなる境界ゾーンに対して、さらなる境界ゾーン内の核酸配列に、またはさらなる境界ゾーンに比べて癌抑制遺伝子から遠位にある核酸配列にハイブリダイズするプローブを提供するステップをさらに含むことができ、ハイブリダイゼーション部位は、境界ゾーンに近くてもよい。３つ以上の境界ゾーンが同定される場合、欠失サイズは、試料の間で変動する傾向があることが予想される。プローブセットは、標的プローブにより近い、１つまたは複数のフランキングプローブからのＦＩＳＨシグナルが、標的プローブ自体からのＦＩＳＨシグナルと同様に欠けているかどうかに基づいて欠失のサイズに関する情報を得るために使用することができる。
【００５４】
３．プローブサイズおよび起源
境界ゾーンを同定することに加えて、プローブセットを調製する方法は、プローブを提供するステップを含む。プローブとして使用されるＤＮＡは、たとえば、蛍光顕微鏡法によって目に見えるシグナルを生成するために、１つもしくは複数の先在する宿主株もしくはＢＡＣ／コスミドライブラリーからＢＡＣもしくはコスミドＤＮＡを単離するまたは１つもしくは複数の新しいＢＡＣもしくはコスミドを構築すること；ゲノムまたはクローニングＤＮＡを増幅すること（たとえばポリメラーゼ連鎖反応またはローリングサークル増幅）；またはたとえば、標的ゲノムにおける十分に大きな領域（たとえば少なくとも５０ｋｂもしくは少なくとも１００ｋｂ）を網羅するオリゴヌクレオチドのセットなどＤＮＡを人工的に合成することによって得ることができる。プローブがハイブリダイズする領域のサイズは、５０ｋｂもしくは１００ｋｂ以上および／または１５０ｋｂ、２００ｋｂ、３００ｋｂ、４００ｋｂ、もしくは５００ｋｂ以下である。
【００５５】
４．プローブ機能性
いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って調製される少なくとも１つの標的プローブならびに少なくとも第１および第２のフランキングプローブは、ＦＩＳＨベースの癌抑制因子欠失アッセイにおいて使用することができ、アッセイは、５μｍの厚さを有し、５μｍ未満の平均核直径を有するホルマリン固定パラフィン包埋細胞性試料に対して、２０％、２５％、３０％、または３５％未満のアーチファクト欠失頻度プラス３標準偏差として決定される有意性閾値を有する。癌性前立腺試料などのような試料由来のＦＦＰＥ切片における完全な核は、完全な球体として存在しないが、切片調製の間に圧縮されてわずかに楕円形になる傾向があってもよい。
【００５６】
Ｄ．プローブセットおよびキット
本発明は、上記に記載される方法に従って調製されるプローブセットに関する。
【００５７】
本発明はまた、ＰＴＥＮにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、ＦＡＳまたはＳＵＦＵにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、およびＴＳＰＡＮ１５にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含むプローブセットにも関する。そのような実施形態では、ＰＴＥＮにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブは、標的プローブとして役立ち、ＦＡＳまたはＳＵＦＵにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブおよびＴＳＰＡＮ１５にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブは、フランキングプローブとして役立つ。いくつかの実施形態では、プローブセットは、ＢＭＰＲ１Ａにハイブリダイズする少なくとも１つのさらなるフランキングプローブを含む。ある実施形態では、プローブセットは、ＷＡＰＡＬにハイブリダイズする少なくとも１つのさらなるフランキングプローブを含む。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ＰＴＥＮにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブは、ＢＡＣ  ＲＰ１１−８４６Ｇ１７に由来するプローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、ＢＡＣ  ＲＰ１１−３９９Ｏ１９およびＲＰ１１−３６０Ｈ２０の少なくとも１つに由来するＦＡＳにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、ＢＡＣ  ＲＰ１１−４０４Ｃ６およびＲＰ１１−６Ｐ１６の少なくとも１つに由来するＴＳＰＡＮ１５にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、ＲＰ１１−１４１Ｄ８およびＲＰ１１−５２Ｇ１３の少なくとも１つに由来するＢＭＰＲ１Ａにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、ＲＰ１１−３５１Ｄ１３、ＲＰ１１−６６１Ｄ１０、ＲＰ１１−１４１Ｄ８、およびＲＰ１１−５２Ｇ１３の少なくとも１つに由来するＷＡＰＡＬおよび／またはＢＭＰＲ１Ａにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、ＲＰ１１−１４１Ｄ８およびＲＰ１１−６６１Ｄ１０の少なくとも１つに由来するＷＡＰＡＬにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、ＲＰ１１−１８Ｉ１４およびＲＰ１１−２Ｆ１３の少なくとも１つに由来するＳＵＦＵにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含む。本明細書において言及されるこれらのおよび他のすべてのＢＡＣは、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｂｕｆｆａｌｏ、Ｎｅｗ  ＹｏｒｋおよびＢＡＣＰＡＣ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｏａｋｌａｎｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能である。たとえば、配列情報は、ＮＣＢＩ  Ｃｌｏｎｅ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／  ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｇｅｎｏｍｅ／ｃｌｏｎｅ／）から入手可能である。
【００５９】
下記は、本開示によるプローブセットにおいて使用することができる、選択されるＢＡＣについての第１０染色体上のハイブリダイゼーション部位の位置に関する情報を提供する表である（座標は、ｖｅｒｓｉｏｎ  ＮＣＢＩ３６／ｈｇ１８、２００６年３月におけるものである）。
【００６０】
【化１】
0005976550.tif 000002
いくつかの実施形態では、プローブセットは、ＰＴＥＮ、ＦＡＳ、およびＴＳＰＡＮ１５にハイブリダイズするプローブを含み、ＰＴＥＮにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブは、ＢＡＣ  ＲＰ１１−８４６Ｇ１７に由来するプローブを含み、ＦＡＳにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブは、ＢＡＣ  ＲＰ１１−３９９Ｏ１９およびＲＰ１１−３６０Ｈ２０に由来するプローブを含み、ＴＳＰＡＮ１５にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブは、ＢＡＣ  ＲＰ１１−４０４Ｃ６およびＲＰ１１−６Ｐ１６に由来するプローブを含む。
【００６１】
いくつかの実施形態では、プローブセットは、少なくとも１つのセントロメア側のまたはセントロメア周囲のプローブを含む。これは、染色体計数に使用することができる。セントロメア周囲のプローブの例は、ＢＡＣ  ＲＰ１１−８９Ｊ２３、ＲＰ１１−１０４４Ｈ３、および／またはＲＰ１１−８０Ｃ１６に由来するプローブを含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、プローブセットは、ＲＰ１１−８４６Ｇ１７、ＲＰ１１−３９９Ｏ１９およびＲＰ１１−３６０Ｈ２０の少なくとも１つならびにＲＰ１１−４０４Ｃ６およびＲＰ１１−６Ｐ１６の少なくとも１つに由来するプローブから成る。
【００６３】
いくつかの実施形態では、プローブセットは、ＲＰ１１−８４６Ｇ１７、ＲＰ１１−３９９Ｏ１９およびＲＰ１１−３６０Ｈ２０の少なくとも１つならびにＲＰ１１−１４１Ｄ８およびＲＰ１１−５２Ｇ１３の少なくとも１つに由来するプローブから成る。
【００６４】
一般に、プローブは、プローブを生成するために、ニックトランスレーションなどのような標識反応を実行することによって、ＢＡＣに由来することができる。しかしながら、由来は、プローブが非標識形態で提供される場合、単に、ＢＡＣを成長させ、単離することであってもよい、言いかえれば、ＢＡＣの由来物は、ＢＡＣ自体を含む。
【００６５】
１．プローブ標識
本発明のプローブセットは標識することができる。非標識形態であるが、ハイブリダイゼーションに先立ってプローブの識別可能な標識を可能にする様式（たとえば別々の溶液または凍結乾燥体として）でプローブセットを提供することもまた、可能である。
【００６６】
標識は、直接の蛍光標識とすることができる。これは、直接標識されたヌクレオチドアナログの存在下においてニックトランスレーションまたはランダムプライミングなどのような周知の方法によって達成することができる。間接的な標識もまた、可能であり、それ自体蛍光団を有していないが、蛍光団の共有結合または非共有結合の付着を後で可能にする部分を有するヌクレオチドアナログが、ニックトランスレーションまたはランダムプライミング反応などのような標識反応において提供される。たとえばＢａｙａｎｉ  Ｊ、Ｓｑｕｉｒｅ  ＪＡ．  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  （ＦＩＳＨ）、Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００４年；第２２章：Ｕｎｉｔ  ２２．４を参照されたい。たとえば、アミノアリル部分を有するヌクレオチドアナログは、蛍光団と共有結合することができ、ビオチンまたはジゴキシゲニン部分を有するヌクレオチドアナログは、それぞれアビジンまたは抗ジゴキシゲニンなどのような結合パートナーと非共有結合することができ、結合パートナーは、蛍光でタグ付けされている。第１の結合パートナーを認識し、また標識される第２の結合パートナー（たとえば抗体）および場合により、次いで、第２を認識する第３の結合パートナーなどのような多数の層の結合パートナーを提供することによってシグナルを増幅することが可能である。
【００６７】
本明細書において記載されるプローブおよび方法と共に標識として使用することができる蛍光団の例は、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ、およびＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ（すべてＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒから、Ｉｎｔｅｒ  Ｍｅｄｉｃｏ、Ｍａｒｋｈａｍ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）；７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）；５−（および−６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン；リサミンローダミンＢ；５−（および−６）−カルボキシフルオレセイン；フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）；７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸；テトラメチルローダミン−５−（および−６）−イソチオシアネート；５−（および−６）−カルボキシテトラメチルローダミン；７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸；６−［フルオレセイン５−（および−６）−カルボキサミド］ヘキサン酸；Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａジアザ−３−インダセンプロピオン酸；エオシン−５−イソチオシアネート；エリトロシン−５−イソチオシアネート；５−（および−６）−カルボキシローダミン６Ｇ；ならびにＣａｓｃａｄｅ（商標）ブルーアセチルアジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）である。ＬＡＶｙｓｉｏｎプローブセットでは、異なる色の蛍光団は、セットにおける染色体のプローブがそれぞれ別個に可視化することができるように使用される。これらの蛍光団の多くは、たとえばｄＣＴＰおよび／またはｄＵＴＰへのヌクレオチドコンジュゲート形態で市販で入手可能である。
【００６８】
プローブセットにおいてそれぞれのプローブと共に使用されることとなる蛍光団は、一般に、それらが蛍光顕微鏡法によって区別されるのを可能にするように選ばれるべきである。たとえば、４つの相互に識別可能な蛍光団は、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ、およびＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａである。５色ＦＩＳＨは、混合性の第５のプローブ、たとえばＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａプラスＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅを使用することによって実行することができる。
【００６９】
２．染色体計数プローブ
いくつかの実施形態では、本発明のプローブセットは、上記に定義されるように、染色体計数プローブを含む。いくつかの実施形態では、染色体計数プローブ、たとえばＣＥＰ１０プローブ（Ｖｙｓｉｓ  Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ、ＩＬ、ＵＳＡ）は、第１０染色体上にハイブリダイゼーション部位を有する。
【００７０】
３．キット
本発明は、上記に記載されるプローブセットを含むキットに関する。キットはまた、プロテアーゼ（たとえばプロテイナーゼＫもしくはペプシン）、バッファー（たとえばクエン酸ナトリウム）、および／またはチオシアン酸ナトリウムなどのような試料前処理のための化学物質などのような、ＦＩＳＨアッセイを実行するのに有用な他の試薬を含んでいてもよい。
【００７１】
４．組成物
本発明は、上記に記載されるようなプローブセットを含む組成物を提供し、プローブセットのプローブは、識別可能に標識される。組成物は、水性組成物とすることができ、バッファー（たとえばＴｒｉｓ、重炭酸ナトリウム、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ）、塩、および／またはキレート化作用物質（たとえばＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ）などのようなさらなる物質を含むことができる。
【００７２】
Ｅ．アッセイ方法
本発明は、ＦＩＳＨによって癌抑制因子の欠失についてアッセイするための方法を提供する。そのような方法において使用することができるプローブセットは、上記セクションＣにおけるように調製されたプローブセットおよびセクションＤのプローブセットを含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、セクションＣ．２（ｂ）およびＣ．２（ｃ）において説明されるような境界ゾーンに関して位置づけられたハイブリダイゼーション部位を有する。
【００７３】
概して言えば、ＦＩＳＨによって癌抑制因子の欠失についてアッセイするための方法は、プローブセットを用いてＦＩＳＨを実行するステップを含む。プローブセットは、癌抑制遺伝子に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第１のフランキングプローブ、癌抑制遺伝子に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第２のフランキングプローブ、および癌抑制遺伝子にハイブリダイズする少なくとも１つの標的プローブを含む。フランキングプローブおよび標的プローブ（複数可）からのＦＩＳＨシグナルが数えられる。少なくとも１つのアーチファクト欠失頻度が、提供され、これは、陰性対照として役立つ。アーチファクト欠失頻度を、癌抑制遺伝子の欠失を有する細胞を含まない対照試料を用いて先に決定することおよびアーチファクト欠失頻度を多数のアッセイにおいて再度使用することが可能である。数えられたＦＩＳＨシグナルに基づいて、少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度が決定される。試料が癌抑制遺伝子の欠失を有する細胞を含むかどうかは、見かけ上の欠失頻度がアーチファクト欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて決定される。見かけ上の欠失頻度が比較されるアーチファクト欠失頻度は、欠失頻度がヘミ接合性またはホモ接合性かどうかおよびどのプローブハイブリダイゼーション部位が欠失によって影響を与えられるかの点から一致するはずである。
【００７４】
１．試料
ＦＩＳＨによって癌抑制因子の欠失についてアッセイするための方法において使用される試料は、細胞性の試料である。いくつかの実施形態では、試料は、ホルマリン、エタノール、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド−グルタルアルデヒド、またはカコジル酸ナトリウム、ホルマリン、およびグルタルアルデヒドの組み合わせなどのような保存剤を使用して、化学的に固定され、パラフィンまたは凍結組織マトリックス、たとえば最適切削温度（ＯＣＴ）化合物などのような不活性固形物質中に包埋される。いくつかの実施形態では、試料は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が非中期（たとえば間期）細胞である細胞を含む。たとえばＷｉｃｋ  ＭＲ、Ｍｉｌｌｓ  ＮＣ、Ｂｒｉｘ  ＷＫ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ，  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，  ａｎｄ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．  第１章  １〜１０頁  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｗｉｃｋ  ＭＲ．編  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００８年）を参照されたい。
【００７５】
一般に、試料は、固体支持体（たとえば、試料が包埋されているパラフィンマトリックスおよび／またはスライドガラスもしくはマイクロタイターウェルの壁）と共に提供される。
【００７６】
２．ＦＩＳＨの実行
本発明の欠失アッセイ方法は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を含む。用語「ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション」は、一般に、細胞学的または組織学的調製物の一部である核酸標的に対する核酸プローブのハイブリダイゼーションを指す。典型的に、ＦＩＳＨ方法は、以下のステップを含む：（ａ）上記に説明されるように固体支持体に固定された試料を提供するステップ；（ｂ）たとえば化学的な処理またはプロテアーゼ処理を用いる標的ＤＮＡへのプローブＤＮＡの到達性を増加させるための試料の処理（たとえば８％チオシアン酸ナトリウムを有する１０ｍＭクエン酸バッファー  ｐＨ６．０；０．２Ｎ  ＨＣｌ；または２５μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫもしくは７５０Ｕ／ｍｌのペプシン）、（ｃ）特異的なハイブリダイゼーション複合体を形成するためにプローブセットの標識プローブと標的ＤＮＡを含有する組織または物質を接触させるステップ、（ｄ）標的に特異的にハイブリダイズしていないプローブを選択的に除去するための、複合体のハイブリダイゼーション後の洗浄、および（ｅ）標的ＤＮＡ分子とハイブリダイゼーション複合体を形成したプローブからのＦＩＳＨシグナルを検出するステップ。そのような方法は、ＧａｌｌおよびＰａｒｄｕｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９８１年；２１巻：４７０〜４８０頁；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ、１９８２年；７６巻：１〜４６頁；Ａｎｇｅｒｅｒら、ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（ＳｅｔｌｏｗおよびＨｏｌｌａｅｎｄｅｒ編）１９８５年；７巻、４３〜６５頁、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ならびにＶａｒｅｌｌａ−Ｇａｒｃｉａ  Ｍら、ＥＧＦＲ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ：  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ２００９年；６２巻：９７０〜９７７頁を含む多くの資料において記載されている。
【００７７】
いくつかの実施形態では、プロテイナーゼＫまたはトリプシンなどのようなタンパク質分解酵素を用いる核の処理は、完全な固定された核におけるタンパク質への標識ＤＮＡの非特異的な結合を軽減してもよい。さらに、ＣＣＤ（電荷結合素子）などのような装置を使用する画像取り込み。さらに、ＣＣＤ（電荷結合素子）カメラなどのような装置を使用する画像取り込みは、非特異的なハイブリダイゼーションから生じるバックグラウンド蛍光を低下させるために画像処理ソフトウェアを使用して画像の処理と連結することができる。さらに、ゲノムにおける反復配列とのプローブにおける反復配列のクロスハイブリダイゼーションは、複雑な蛍光シグナルに至り得る。Ｃｏｔ−１  ＤＮＡ抑制ステップは、この問題を改善するためにハイブリダイゼーションプロトコールに含むことができる。Ｃｏｔ−１画分における核酸が、高頻度反復配列（たとえばＡｌｕ配列、α−サテライト、およびβ−サテライト配列）を含有することによって特徴付けられるので、これらの核酸は、ゲノムにおける反復配列に結合し、それによって、そのような配列へのプローブの結合を遮断する（たとえばＢｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  Ｖ、１９９４年、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。さらに、反復配列が除去されたプローブは、物理的な除去または直接的な合成によって調製されてもよい；たとえばＲｏｇａｎら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｏｐｙ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ２００１年；１１巻：１０８６〜１０９４頁、Ｎａｖｉｎら、ＰＲＯＢＥＲ：  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＦＩＳＨ  ｐｒｏｂｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００６年；２２巻：２４３７〜２４３８頁、および米国特許出願公開第２００３／００２２１６６号（Ｃｏｌｌｉｎｓら）を参照されたい。
【００７８】
以下は、試料を調製し、ＦＩＳＨを実行するための手順の例である。組織は、ホルマリンなどのような固定剤を用いて固定し、次いで、パラフィン中に包埋することができる。次いで、切片は、ミクロトームを使用してカットされ、顕微鏡スライドガラスに適用される。試料は、分析されることとなる癌性または前癌性細胞のタイプに依存して、生検材料または他の供給源から調製することができる、たとえば、供給源は、前立腺腫瘍、乳房腫瘍、黒色腫、および他の固形腫瘍：針生検試料、細針吸引生検材料、根治的前立腺全摘除術、転移性試料（たとえば骨またはリンパ節由来の）、細胞診調製物（尿または腹水などのような体液由来の）、ならびに末梢血から単離された循環腫瘍細胞から選ぶことができる。いくつかの実施形態では、検体は、細胞遠心と組み合わせられたエタノールもしくはメタノール：酢酸における細胞の固定、薄層析出法（たとえばＴｈｉｎＰｒｅｐ、Ｃｙｔｙｃ  Ｃｏｒｐ．）、スミア、または顕微鏡スライドガラス上へのピペッティングによって調製することができる。
【００７９】
任意の適したｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション方法を使用することができる。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション前に、細胞内に含有される染色体ＤＮＡは、それぞれ、変性させる。変性は、高ｐＨ、熱（たとえば、７０℃〜９５℃の温度、たとえば８３℃）、ホルムアミドおよびテトラアルキルアンモニウムハロゲン化物またはその組み合わせなどのような有機溶媒の存在下においてインキュベートすることによって典型的に実行される。たとえば、染色体ＤＮＡは、７０℃を超える温度（たとえば７３℃または８３℃、約５分間のインキュベート）ならびに７０％ホルムアミドおよび２×ＳＳＣ（０．３Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム）を含有する変性バッファーの組み合わせによって変性させることができる。変性条件は、典型的に、細胞形態が保存されるように確立される。たとえば、染色体プローブは、たとえば、約５分間、約７３℃または８３℃までプローブを加熱することによって、熱によって変性させることができる。
【００８０】
スライドにマウントされたＦＦＰＥ試料についての処理手順の例は、以下の表において示される。
【００８１】
【化２】
0005976550.tif 000003
プローブセットのプローブが二本鎖形態で提供されるなどのようないくつかの実施形態では、プローブセットのプローブはまた、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション前に変性させてもよい。上記に記載されるものなどのような変性条件を使用することができる。
【００８２】
変性化学薬品または条件の除去の後に、プローブは、ハイブリダイズ条件下で染色体ＤＮＡにアニールされる。「ハイブリダイズ条件」は、プローブおよび標的染色体ＤＮＡの間のアニーリングを促進する条件である。ハイブリダイゼーション条件は、プローブの濃度、塩基組成、複雑さ、および長さならびにインキュベーションの塩濃度、温度、および長さに依存して変動する。たとえば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、１×〜２×ＳＳＣ、５０〜５５％ホルムアミド、ハイブリダイゼーション促進剤（たとえば１０％デキストラン硫酸）、および非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するための非標識遮断ＤＮＡを含有するハイブリダイゼーションバッファーにおいて実行することができる。一般に、ハイブリダイゼーション条件は、上記に記載されるように、２５℃〜５５℃の温度、および０．５時間〜９６時間のインキュベーションの長さを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションは、２〜１６時間、３２℃〜約４５℃の温度で実行することができる。
【００８３】
標的領域の外部のＤＮＡへの染色体のプローブの非特異的な結合は、食塩水を用いる一連の洗浄によって除去することができる。それぞれの洗浄における塩の温度および濃度は、所望のストリンジェンシーに依存する。たとえば、高度なストリンジェンシー条件については、洗浄は、０．２×〜２×ＳＳＣおよびＮＰ−４０などのような０．１％〜１％の非イオン性界面活性剤を使用して、約６５℃〜約８０℃で実行することができる。ストリンジェンシーは、洗浄の温度を減少させることによってまたは洗浄における塩の濃度を増加させることによって低下させることができる。組織試料へのプローブのハイブリダイゼーションは、手動でまたはＴｈｅｒｍｏＢｒｉｔｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｖｅｎ、ＶＰ  ２０００  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、もしくはＸＭａｔｒｉｘ（商標）ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（すべてＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．から市販で入手可能）などのような機器の補助により実行することができる。
【００８４】
ハイブリダイズさせ、洗浄された試料からのＦＩＳＨシグナルの検出は、顕微鏡で直接、蛍光を観察するオペレーターによってなどのようにリアルタイムでの後の分析を可能にするためにまたは画像を記録することによる後の分析を可能にするために行うことができる。検出は、一般に、アッセイにおける使用においてそれぞれの蛍光団に対する励起光の適切な供給源の使用を伴い（たとえば、適切なフィルターを通過する光または適切な波長のレーザーからの光）、蛍光で放射された光は、次いで、適切なフィルターを通過し、それは、オペレーターによって直接、観察するおよび／またはコンピューターに接続されてもよいフィルムベースのもしくはデジタルカメラなどのようなカメラを用いて撮影することができる。
【００８５】
３．計数
試料における複数の核のＦＩＳＨシグナルが、数えられる。いくつかの実施形態では、複数の核は、少なくとも５０、７５、または１００の核を含む。計数は、たとえば、それぞれの検査される核についてのエントリーおよびそれがそれぞれのＦＩＳＨシグナルをいくつ含有したかを含有するリストを作製することによってならびに／またはそれぞれ、ＦＩＳＨシグナル量の観察された組み合わせを有した核の数を数えることによって達成することができる。いくつかの実施形態では、そのようなリストは、同様に、ＦＩＳＨシグナル量の可能であるが観察されなかった組み合わせを含有することができる。リストは、それらの頻度を加えて、ＦＩＳＨシグナル量のそれぞれの観察された組み合わせについてのエントリーを作製することによって再編成することができる（たとえば下記の表２を参照されたい）。ＦＩＳＨシグナルを数えることによって得られた情報は、下記に説明される、少なくとも１つのアーチファクト欠失頻度を考慮して解釈されたい。
【００８６】
４．アーチファクト欠失頻度
欠失アッセイ方法は、少なくとも１つのアーチファクト欠失頻度を提供するステップを含む。核は、欠失以外の理由で、標的プローブからのＦＩＳＨシグナルを欠き得、たとえば、ホルマリン固定パラフィン包埋試料を含む切片化試料の場合には、試料におけるいくつかの核は、切断され得る。また、核の画分における標的ハイブリダイゼーション部位が、ＦＩＳＨ手順のハイブリダイゼーションステップの間に十分に到達できないかもしれないこともあり得る。さらに、ＦＩＳＨシグナルが観察される頻度は、研究されている組織調製物の品質およびそれに対する経年変化の影響によって影響を及ぼされ得る。したがって、標的プローブからのＦＩＳＨシグナルを欠くすべての核が、実際の遺伝的な欠失を示すとは限らない。
【００８７】
そのため、偽陽性（誤って欠失と考えられる）についての可能性を軽減するために、少なくとも１つのアーチファクト欠失頻度は、アッセイの標的の欠失を有する細胞を示す試料からの結果および標的プローブシグナルの不在の原因が、上記に説明された誤差の技術的根拠などのように、根底にある遺伝子型以外にある可能性がある試料からの結果を区別するために提供される。
【００８８】
アーチファクト欠失頻度は、標的遺伝子の欠失を有していないことが公知の細胞の試料を使用する対照アッセイに基づいて決定することができる。対照試料から決定されたアーチファクト欠失頻度の正確度は、試料調製方法に関して細胞の試験試料に厳密に一致した細胞の対照試料を使用することによって、試験試料に関連して最適化されてもよい。たとえば、癌抑制遺伝子の損失について試験されることとなる前癌性／癌性／可能性として癌性の試料と同じ組織タイプの良性の過形成などのような非新生物の組織試料は、対照として役立ち得る。前立腺癌に対するアッセイの場合には、非新生物の組織試料は、単に、管理目的のために良性の前立腺肥大（ＢＰＨ）のための手術を受けている、癌を有していない患者から得ることができる。アーチファクト欠失頻度はまた、ＦＩＳＨシグナルおよび腫瘍切片における相対的な核体積の両方に影響を与える他の生物学的変数によっても影響を及ぼされる。ＤＮＡの縮合、核のサイズおよび形状、試料切片の厚さ、アッセイ設計（３または４色ＦＩＳＨアッセイにおけるシグナル距離は、部分的に、プローブのゲノムの距離に依存する）、ならびに増殖速度および倍数性ステータス（より高度なレベルの倍数性の可能性が高いほど、より大きな体積の核を示唆する）。これらの核の変数に加えて、実際のＦＩＳＨシグナル自体（「スポットサイズ」）、ゲノムの凝縮した領域（たとえば、抑制された遺伝子のＤＮＡ）と比較して、脱凝縮した核染色質（発現される遺伝子の典型的な開いたＤＮＡ詰め込み）においてより大きな三次元空間を占め得る。さらに、個々のＦＩＳＨシグナルは、Ｇ２の核が、細胞のＤＮＡの倍加により、「ダブレット」のまたは対になったスポットカウントを示すので、ＤＮＡ複製が既に起こっている場合、解釈するのがより困難となり得る。これらのダブレットは、物理的に連結された、対になったスポットとなる、つまり、接しているもしくは糸によって連結されているまたは隣接している（最大のシグナルまたはスポットの直径よりも小さな隙間で）。いくつかの実施形態では、スコアリング基準は、この影響がアッセイの結果を歪めないことを保証するために調節されてもよい（Ｖａｒｅｌｌａ−Ｇａｒｃｉａ  Ｍら、ＥＧＦＲ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ：  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．  ２００９年；６２巻：９７０〜９７７頁を参照されたい）。これは、物理的に連結した、対になったスポットおよび／または隣接するスポットを１つのシグナルのみとして数えることを含むことができる。隣接するが、少なくとも、最大のシグナルの直径によって分離されるスポットは、別々のシグナルとして数えることができる。他方では、ＤＮＡ複製前に、シグナルはそれぞれ、単一のドット様のハイブリダイゼーションシグナル（「シングレット」）を示し、これらもまた、１つのシグナルのみとして数えられる。倍数性、核サイズ、および染色質凝縮などのようなこれらの変数のいくつかのものは、正常な対照試料および腫瘍検体の間で変動し得る。したがって、これらの���子は、間期ＦＩＳＨアッセイについてのアーチファクト欠失頻度を確立するために使用される陰性対照において完全に説明するのが困難になり得、これは、低い腫瘍細胞の含有量またはさらなるサブクローンのゲノム変化を有する試料において特に重要になり得る。したがって、欠失を考えるために比較的ストリンジェントな統計閾値を使用することは望ましいこととなり得、さらに下記に説明される。
【００８９】
いくつかの実施形態では、少なくとも２つまたはそれ以上のアーチファクト欠失頻度が提供される。たとえば、ヘミ接合性およびホモ接合性の欠失についてのアーチファクト欠失頻度を提供することができる。さらに、別々のアーチファクト欠失頻度が、プローブの異なる組み合わせからのＦＩＳＨシグナルの不在に至る欠失、たとえば、標的プローブのみに影響を与える欠失、標的プローブおよび標的プローブに最も近いセントロメア側のフランキングプローブに影響を与える欠失、標的プローブおよび標的プローブに最も近いテロメア側のフランキングプローブに影響を与える欠失、ならびに標的プローブ、標的プローブに最も近いセントロメア側のフランキングプローブ、および標的プローブに最も近いテロメア側のフランキングプローブに影響を与える欠失について提供される。３つ以上のフランキングプローブを含むプローブセットが使用される実施形態では、アーチファクト欠失頻度は、標的プローブからより遠く離れているフランキングプローブに影響を与える欠失を同様に考慮することができるように、所与のセット内のそれぞれのプローブについて提供することができる。
【００９０】
別々のアーチファクト欠失頻度を提供するという利点は、切断事象などのような誤差の原因により欠けているＦＩＳＨシグナルが、クローン集団の遺伝子型よりも、核によって変化しやすくなり得ることであり、任意の所定のタイプの欠失（たとえば、標的プローブおよび標的プローブに最も近いテロメア側のフランキングプローブに影響を与えるヘミ接合性の欠失）についてのアーチファクト欠失頻度は、切断事象などのような誤差の原因のうちのいくつかが、同様に、少なくとも１つのセントロメア側のフランキングプローブに影響を与え得るので、少なくとも１つのセントロメア側のフランキングプローブもまたアッセイにおいて使用されない場合よりも低い。
【００９１】
アーチファクト欠失頻度の低下は、いくつかの細胞型がとりわけ切断によるアーチファクトの傾向があるという点で、分析中の細胞型に依存して非常に役立ち得る。たとえば、５ミクロン組織学的切片における間期ＦＩＳＨによるシグナルの切断による損失に関する最近の研究において、正常な骨髄核の約２０％が切断によるシグナル損失を示したことが分かった。対照的に、正常な肝臓切片における核の約６０％が、切断による損失を示した（Ｗｉｌｋｅｎｓ  Ｌら  ２００５年  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｓｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．  Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ  ２００５年；４４７巻：５８６〜５９２頁）。損失を検出するための偽陽性率におけるこの変化は、非常に大きく不規則な形状の肝細胞核が５ミクロンの切片の調製の間に、より頻繁に切断される場合に、ますます影響を有する切断による切削アーチファクトによるものと考えられる。
【００９２】
５．少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度の決定
ＦＩＳＨシグナルを数えることによって得られた情報は、少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度を決定するために分析される。見かけ上の頻度は、どれくらい多くの標的プローブが試料において欠けているかについての観察値である。このステップは、少なくとも１つのアーチファクト欠失頻度を提供するステップに関連して任意のタイミングで行われてもよいことに注目されたい。アーチファクト欠失頻度と同じくらい多く、いくつかの実施形態では、少なくとも２またはそれ以上の見かけ上の欠失頻度が、決定される。効率のために、見かけ上の欠失頻度を決定することは、一般に望ましく、比較に適用可能な対においてアーチファクト欠失頻度を提供する（たとえば、標的プローブおよび標的プローブに最も近いテロメア側のフランキングプローブに影響を与えるヘミ接合性の欠失についてのアーチファクトおよび見かけ上の欠失頻度）。いかなる場合も、次のステップを実行するために、少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度は、少なくとも１つのアーチファクト欠失頻度と同じタイプの欠失事象についてのものでなければならない。
【００９３】
６．癌抑制遺伝子欠失の検出
試料が欠失を有する細胞を含むかどうかは、少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度が少なくとも１つのアーチファクト欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて決定される。有意性についての閾値は、特異度対感度の所望のレベルに従って選ぶことができる；一般的な値は、ｔ検定（片側もしくは両側）などのような統計的検定に従って０．０５以下のｐ値またはアーチファクト欠失頻度からの少なくとも３標準偏差の差異を含む。いくつかの実施形態では、アーチファクト欠失頻度プラス少なくとも２．５、３、または３．５標準偏差などのような有意性閾値は少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度が、少なくとも１つのアーチファクト欠失頻度よりも有意に大きいかどうかを決定するために使用される。
【００９４】
上記に説明されるように、多数のアーチファクト欠失頻度を提供することができ、多数の見かけ上の欠失頻度を決定することができる。したがって、このステップは、多数のタイプの欠失が存在するかどうかを決定することを含むことができる。たとえば、フランキングおよび標的プローブからの２セットのＦＩＳＨシグナルの存在は、核が標的癌抑制因子の欠失を有していないことを示す（図２Ｂ、左の略図において図式化）。標的プローブＦＩＳＨシグナルの一方または両方の不在は、見かけ上のヘミ接合性（図２Ｂ、中央）またはホモ接合性（図２Ｂ、右）の欠失をそれぞれ示す。見かけ上の欠失のサイズに関する情報もまた、１つまたは複数のフランキングプローブが不在であるかどうかから得ることができる。図２Ｂ右および中央の例は、標的プローブのみが影響を与えられている比較的小さな欠失を示す。
【００９５】
したがって、いくつかの実施形態では、方法は、試料が、標的プローブのみに影響を与える欠失、標的プローブおよび標的プローブに最も近いセントロメア側のフランキングプローブに影響を与える欠失、標的プローブおよび標的プローブに最も近いテロメア側のフランキングプローブに影響を与える欠失、ならびに標的プローブ、標的プローブに最も近いセントロメア側のフランキングプローブ、および標的プローブに最も近いテロメア側のフランキングプローブに影響を与える欠失から選ばれる欠失を有する細胞を含むかどうかを決定するステップを含む。
【００９６】
図２Ｂにおいて示される単純な欠失配置に加えて、フランキング対照プローブを含有する領域の近くのさらなる再構成のために、シグナルの獲得または損失を含むより複雑なパターンが見られてもよい。たとえば、進行型の前立腺癌において観察されるＰＴＥＮ遺伝子損失のうちのいくつかは、欠失事象と関連する、ＰＴＥＮに密接に連結される遺伝子を含む複雑な損失を有するように思われる（下記に説明される）。さらに、さらなるスポットを有する複雑なシグナル配置はまた、不平衡転座、多染色体性、または倍数性による複雑な染色体の獲得からも生じ得る。正常な核において観察される単純なパターンと異なる任意のパターンもまた、それが細胞の有意な割合において現れる場合、異常であると通常考えられる。異常なパターンにおけるシグナルの数および位置の注意深い評価は、根底にある染色体の変化の有益な情報を提供することができる。
【００９７】
７．境界ゾーン
アッセイにおいて使用される１つまたは複数のフランキングプローブは、境界ゾーンにおけるまたは境界ゾーンに比べて癌抑制遺伝子に対して遠位のハイブリダイゼーション部位を有することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第１のフランキングプローブは、癌抑制遺伝子に対してセントロメア側の第１の境界ゾーン内のまたはそれに対してセントロメア側の位置にハイブリダイズし、少なくとも１つの第２のフランキングプローブは、癌抑制遺伝子に対してテロメア側の第２の境界ゾーン内のまたはそれに対してテロメア側の位置にハイブリダイズする。このように位置づけられたフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位が、それが境界ゾーンに比べて癌抑制遺伝子に対して近位にある場合よりも、欠失する可能性が低いので、そのように位置づけられたハイブリダイゼーション部位を有するフランキングプローブの使用は、役立ち得る。そのようなプローブセットの使用は、図２Ｂの中央および右におけるようなパターンを与える欠失頻度を高めることができる。これらのパターンは、（推定上、部分的にまたは完全に欠失した）癌抑制遺伝子に対してセントロメア側およびテロメア側にハイブリダイズするフランキングプローブからのシグナルを有し、フランキングプローブハイブリダイゼーション部位ではなく癌抑制遺伝子を含有するクロマチンのループのみが、切除される核体積に及ぶように染色体が配置されることが必要であるので、これらのパターンは、核の体積の切断面が切除される切断によるアーチファクトを通して繰り返し生じる可能性が低い。境界ゾーンおよびそれへのハイブリダイゼーション部位の位置は、上記セクションＣ．２においてより詳細に説明され、その議論は、同様にここに関連する。
【００９８】
Ｆ．小さなおよび大きな欠失を識別可能に検出するためのアッセイ
癌抑制遺伝子の両方のコピーが欠失している細胞が、異なるサイズの２つの別々の欠失事象を受けている可能性がある。本発明は、異なるサイズの欠失事象を識別可能に検出するための方法に関する。
【００９９】
１．プローブセット
これらの方法では、少なくとも４つのプローブのプローブセットが、使用される。プローブセットは、癌抑制遺伝子に対してハイブリダイズする少なくとも１つの標的プローブ、癌抑制遺伝子に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第１のフランキングプローブ、癌抑制遺伝子に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第２のフランキングプローブ、および第１のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする、少なくとも第３のフランキングプローブ、または第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第４のフランキングプローブ少なくとも１つを含む。プローブセットは、セントロメア側のまたはセントロメア周囲のプローブをさらに含むことができる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、プローブセットは、部分的に重複するプローブを含む２つのサブセットを含む。２つのサブセットは、少なくとも１つの異なって位置づけられたフランキングプローブがアッセイの第２のまたは反射的な（ｒｅｆｌｅｘ）部分において使用される、２部のアッセイにおいて使用することができる。たとえば、図１７は、セントロメア側のプローブ、ＴＳＰＡＮ１５プローブ、ＰＴＥＮプローブ、およびＦＡＳプローブが、第１の部において使用され、セントロメア側のプローブ、ＢＭＰＲ１Ａプローブ、ＰＴＥＮプローブ、およびＳＵＦＵプローブが、第２の部において使用される、小さなおよび大きなＰＴＥＮ欠失のための２部のアッセイのためのプローブの１つの可能な配置の例を提供する。欠失が、図１７における垂直方向の点線によって境界を示される領域を超える場合、１つまたは複数のフランキングプローブが影響を与えられるはずであり、ＴＳＰＡＮ１５またはＳＵＦＵのプローブが影響を与えられる場合、非常に大きな欠失が示されるであろう。たとえば、欠失が、ＰＴＥＮからテロメアまでの全領域の損失をもたらす可能性があり、これは、ＰＴＥＮ、ＦＡＳ、およびＳＵＦＵプローブに影響を与えるであろう。より一般に、プローブセットは、部分的に重複するプローブを含む、少なくとも２つのサブセットを含むことができ、第１のサブセットは、少なくとも１つの標的プローブ、少なくとも１つのセントロメア側のフランキングプローブ、少なくとも１つのテロメア側のフランキングプローブ、および任意選択で、セントロメア側のまたはセントロメア周囲のハイブリダイゼーション部位を有する少なくとも１つのプローブを含み、第２のサブセットは、少なくとも１つの標的プローブ、少なくとも１つのセントロメア側のフランキングプローブ、少なくとも１つのテロメア側のフランキングプローブ、および任意選択で、セントロメア側のまたはセントロメア周囲のハイブリダイゼーション部位を有する少なくとも１つのプローブを含み、第２のサブセットの少なくとも１つのセントロメア側のフランキングプローブおよび少なくとも１つのテロメア側のフランキングプローブのうちの少なくとも１つは、第１のサブセットにおけるその対応物とは異なっている。
【０１０１】
２．計数；アーチファクトのおよび見かけ上の欠失頻度
ＦＩＳＨシグナルを数えるステップ、アーチファクト欠失頻度を提供するステップ、および見かけ上の欠失頻度を決定するステップは、数えるためのより多くのプローブがあり、より多くのタイプの欠失についてのアーチファクトおよび見かけ上の頻度がそれぞれ提供され、決定され得るという点を除いて、上記のセクションＥ．３〜Ｅ．５において説明されるものに類似する。たとえば、少なくとも１つの第１のアーチファクト欠失頻度は、少なくとも第１および少なくとも第２のフランキングプローブ（つまり、セントロメア側およびテロメア側の、標的プローブに最も近いフランキングプローブ）の間にエンドポイントを有する癌抑制遺伝子の欠失のために提供することができ、少なくとも１つの第２のアーチファクト欠失頻度は、２つの最も遠位のフランキングプローブの間にエンドポイントを有する癌抑制遺伝子の欠失のために提供することができ、エンドポイントの少なくとも１つは、少なくとも第１のフランキングプローブと少なくとも第２のフランキングプローブとの間にない。上記の議論は、少なくとも３つのフランキングプローブがともにまたは２部のアッセイにおいて試料（複数可）に対してハイブリダイズするかどうかにかかわらず適用可能である。
【０１０２】
同様に、少なくとも１つの第１の見かけ上の欠失頻度は、少なくとも第１のフランキングプローブと少なくとも第２のフランキングプローブとの間にエンドポイントを有する癌抑制遺伝子の欠失のために決定することができ、少なくとも１つの第２の見かけ上の欠失頻度は、２つの最も遠位のフランキングプローブの間にエンドポイントを有する癌抑制遺伝子の欠失のために決定することができ、エンドポイントの少なくとも１つは、少なくとも第１のフランキングプローブと少なくとも第２のフランキングプローブとの間にない。
【０１０３】
３．試料が小さなまたは大きな欠失を有する細胞を含むかどうかの決定
試料が、使用されるフランキングプローブのいずれかのハイブリダイゼーション部位に影響を与える癌抑制遺伝子の欠失を有する細胞を含むかどうかは、セクションＥ．６において上記に記載されるように、関連する見かけ上の欠失頻度が、関連するアーチファクト欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて決定される。
【０１０４】
標的プローブが、適切なアーチファクト欠失頻度よりも有意に大きな見かけ上のヘミ接合性またはホモ接合性欠失頻度を有する試料は、フランキングプローブのいずれも、適切なアーチファクト欠失頻度よりも有意に大きな見かけ上の欠失頻度を有しない場合、小さな欠失（複数可）のみ（いかなるフランキングプローブにも影響を与えない）を含むことが決定される。
【０１０５】
標的プローブおよび少なくとも１つのフランキングプローブが、適切なアーチファクト欠失頻度よりも有意に大きな見かけ上の欠失頻度を有する場合、大きな欠失が存在する可能性が高い。
【０１０６】
フランキングプローブのハイブリダイゼーションのみが第１０染色体の一方のコピー上で欠失しており、標的プローブのハイブリダイゼーション部位のみが第１０染色体の他方のコピー上で欠失している、まれな対の小さな欠失の可能性は、同じ染色体からのＦＩＳＨシグナルが互いに近くにある傾向に基づいて一般に除外することができ、したがって、ヘミ接合性の大きな欠失の場合には、影響を与えられない染色体からのＦＩＳＨシグナルは、互いに近くにあるはずであることに注目されたい。
【０１０７】
小さなおよび大きな欠失が存在し得、これらの場合には、標的プローブは、対応するアーチファクトのホモ接合性欠失頻度よりも有意に大きな見かけ上のホモ接合性欠失頻度を有し、少なくとも１つのフランキングプローブは、対応するアーチファクトのヘミ接合性欠失頻度よりも有意に大きな見かけ上のヘミ接合性欠失頻度を有する。大きな欠失が２つのフランキングプローブハイブリダイゼーション部位の損失をもたらしている場合には、（たとえば、癌抑制因子に対してテロメア側のハイブリダイゼーション部位を有する２つのフランキングプローブに影響を与える、癌抑制因子からテロメアまでの全領域の損失）、２つのフランキングプローブは、対応するアーチファクトのヘミ接合性欠失頻度よりも有意に大きな見かけ上のヘミ接合性欠失頻度を有するであろう。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの大きな欠失がある癌抑制遺伝子のホモ接合性の欠失は、転移または転移性腫瘍を示し、転移腫瘍は、身体における他の位置に少なくとも１つの第２の腫瘍を生じさせ得、第２の腫瘍は、転移性腫瘍である。いくつかのそのような実施形態では、癌抑制遺伝子の１つのコピーは、小さな欠失により欠けており、１つのコピーは、大きな欠失により欠けている。いくつかの実施形態では、癌抑制遺伝子の両方のコピーは、大きな欠失により欠けている。いくつかの実施形態では、癌抑制因子に対してテロメア側に位置する少なくとも２つのフランキングプローブハイブリダイゼーション部位に影響を与える、少なくとも１つの大きな欠失がある。いくつかの実施形態では、より遠位（癌抑制遺伝子に関して）の当該少なくとも２つのフランキングプローブハイブリダイゼーション部位は、癌抑制遺伝子から少なくとも５、７．５、１０、または１２．５Ｍｂにある。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、小さなおよび大きな欠失を検出するための方法は、プローブセットによって含まれる第１のプローブサブセットを用いて複数の細胞を含む第１の細胞性の試料についてＦＩＳＨを実行するステップおよびプローブセットによって含まれる第２のプローブサブセットを用いて複数の細胞を含む第１の細胞性の試料と同じ個体由来の第２の細胞性の試料についてＦＩＳＨを実行するステップを含み、癌抑制遺伝子は、ＰＴＥＮであり、第１のプローブサブセットは、ＴＳＰＡＮ１５にハイブリダイズするフランキングプローブおよびＦＡＳにハイブリダイズするフランキングプローブを含み、第２のプローブサブセットは、ＢＭＰＲ１ＡまたはＷＡＰＡＬにハイブリダイズするフランキングプローブ（ＢＭＰＲ１ＡまたはＷＡＰＡＬのうちの１つにハイブリダイズするプローブはまた、それらが近くの遺伝子であるので、他方にハイブリダイズしてもよいことが理解されたい）およびＳＵＦＵにハイブリダイズするフランキングプローブを含む。ＰＴＥＮ欠失がこの方法において検出される場合、フランキングプローブのハイブリダイゼーション部位の少なくとも１つが、ＰＴＥＮと共に欠失しているかどうかの分析は、欠失が大きな欠失であるかどうかを決定するために使用することができる。
【０１１０】
４．境界ゾーン
セクションＥの方法におけるように、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第１のフランキングプローブは、癌抑制遺伝子に対してセントロメア側の第１の境界ゾーン内のまたはそれに対してセントロメア側の位置にハイブリダイズし、および／または少なくとも１つの第２のフランキングプローブは、癌抑制遺伝子に対してテロメア側の第２の境界ゾーン内のまたはそれに対してテロメア側の位置にハイブリダイズする。
【０１１１】
第３のおよび／または第４のフランキングプローブが、境界ゾーン内にまたは境界ゾーンに比べて癌抑制遺伝子に対して遠位に位置することもまた、可能である。すなわち、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第３のフランキングプローブは、少なくとも１つの第１のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してセントロメア側の第１の遠位の境界ゾーンに対してセントロメア側の位置にハイブリダイズするおよび／または少なくとも１つの第４のフランキングプローブは、少なくとも１つの第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してテロメア側の第２の遠位の境界ゾーンに対してテロメア側の位置にハイブリダイズする。
【０１１２】
境界ゾーンおよびそれへのハイブリダイゼーション部位の位置は、上記セクションＣ．２においてより詳細に説明され、その議論は、同様にここに関連する。
【０１１３】
Ｇ．アッセイ最適化のための方法
本発明は、癌抑制遺伝子の欠失のためのＦＩＳＨベースのアッセイを最適化するための方法に関する。これらの方法では、複数の候補プローブセットが、提供され、プローブセットはそれぞれ、癌抑制遺伝子の完全なコピーの正倍数性の数を含む複数の細胞を含む少なくとも１つの試料についてＦＩＳＨを実行するために使用される。ＦＩＳＨシグナルは数えられ、アーチファクト欠失頻度が決定される。好ましいアーチファクトの欠失率を有すると決定されたプローブセットは、癌抑制遺伝子の欠失のための最適化されたＦＩＳＨベースのアッセイにおける使用のために候補プローブセットから選択される。
【０１１４】
１．候補プローブセット
いくつかの実施形態では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５以上の候補プローブセットが提供される。候補プローブセットは、いくつかのプローブを共通して有することができ、たとえば、少なくとも２つの候補プローブセットは、少なくとも１つの同一の標的プローブおよび／または少なくとも１つの同一のフランキングプローブを含むことができる。もちろん、少なくとも１つのプローブは、それぞれの候補セットの間で異なるべきである。いくつかの実施形態では、フランキングプローブの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４つは、境界ゾーン内に位置するまたは境界ゾーンに比べて癌抑制遺伝子に対して遠位にあり、プローブは、それに対して近くてもよい。
【０１１５】
２．アーチファクト欠失頻度決定
アーチファクト欠失頻度は、癌抑制遺伝子の完全なコピーの正倍数性の数を含む複数の細胞を含む少なくとも１つの試料についてＦＩＳＨを実行することによってそれぞれの候補プローブセットについて決定される。アーチファクト欠失頻度は、上記に記載されるようにＦＩＳＨシグナルを数えることによって決定される。いくつかの実施形態では、ＦＩＳＨは、測定されるアーチファクト欠失頻度のより統計的に正確な比較を可能にするために、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５つなどのような複数の試料についてそれぞれのプローブセットを用いて実行される。
【０１１６】
３．好ましいアーチファクト欠失頻度を有するプローブセットの選択
好ましいアーチファクト欠失頻度を示すことが分かったプローブセットは、最適化されたアッセイにおける使用のために選択される。いくつかの実施形態では、選択されるプローブセットのアーチファクト欠失頻度は、少なくとも６０パーセンタイル、７０パーセンタイル、８０パーセンタイル、９０パーセンタイル、または９５パーセンタイルにあり、より高度なパーセンタイルは、より好適な性能を示すことが理解されたい（つまり、より低いアーチファクト欠失頻度）。
【０１１７】
４．欠失を有する試料の使用
いくつかの実施形態では、ＦＩＳＨはまた、癌抑制遺伝子のホモ接合性またはヘミ接合性の欠失を含む複数の細胞を含む複数の細胞性の試料について、それぞれの候補プローブセットを用いてまたは好ましいアーチファクト欠失頻度を示すことが分かった候補プローブセットのサブセットを用いて実行される。ＦＩＳＨシグナルは、数えられ、見かけ上の欠失頻度は、上記に記載されるように決定される。
【０１１８】
（ａ）感度
試料が、癌抑制遺伝子のホモ接合性またはヘミ接合性の欠失を含む細胞を含むことが公知である場合、感度値は、複数の試料のうちのいくつが、候補プローブセットについて決定されたアーチファクト欠失頻度よりも有意に大きな見かけ上の欠失頻度を有すると決定されたかに基づいて決定される。候補プローブセットのアーチファクト欠失頻度についての標準偏差は、上記に記載されるように通常の方法で決定されてもよい、ただし、アーチファクト欠失頻度が、癌抑制遺伝子の完全なコピーの正倍数性の数を含む複数の細胞を含む少なくとも３つの試料について決定されることを条件とする。あるいは、アーチファクト欠失頻度の標準偏差は、感度を評価するために、有意性を決定する際に使用するために推定されてもよい（たとえば、候補プローブセットの全体のアーチファクト欠失頻度に基づいてまたは他のプローブセットについて公知の標準偏差に基づいて）。有意性を決定するための閾値に対する選択肢は、上記に説明されるとおりである。
【０１１９】
（ｂ）感度値およびアーチファクト欠失頻度を考慮するプローブセットの選択
感度が、少なくとも候補プローブセットのうちのいくつかについて決定される場合、好ましい感度値および好ましいアーチファクト欠失頻度の両方を有した候補プローブセットは、最適化されたアッセイにおける使用のために選択することができる。いくつかの実施形態では、アーチファクト欠失頻度および／または感度値は、少なくとも６０パーセンタイル、７０パーセンタイル、８０パーセンタイル、９０パーセンタイル、または９５パーセンタイルにあり、より高度なパーセンタイルは、より好適な性能を示すことが理解されたい（つまり高感度またはより低いアーチファクト欠失頻度）。
【０１２０】
Ｈ．癌原遺伝子および癌遺伝子座の特徴付けのためのアッセイ方法
ＰＴＥＮなどのような癌抑制遺伝子は、様々な方法で細胞増殖を阻害するタンパク質をコードするものである。これらの「細胞性のブレーキ」の１つまたは複数の損失は、細胞周期の解放を通して多くの癌の進行の一因となり、損失事象を「腫瘍形成性」にする。多くのタンパク質は、ｐ１６サイクリンキナーゼ阻害剤；分泌ホルモン（たとえば腫瘍由来の増殖因子β）に対する受容体；ＤＮＡが損傷を受けているまたは染色体が異常な場合、細胞周期を阻止するチェックポイント制御タンパク質；アポトーシスを促進するタンパク質；およびさらに、ＤＮＡ修復に参加する酵素などのような細胞内タンパク質を含めて、癌抑制遺伝子によってコードされるとして一般に認識される（ＤＮＡにおけるエラー、ギャップ、または破壊された末端を修復するための能力を失った細胞は、細胞の成長および増殖の制御において決定的なものを含む、多くの遺伝子における突然変異を蓄積する）。
【０１２１】
癌抑制遺伝子の１つのコピーが細胞増殖を制御するのに十分となり得るので、通常、癌抑制遺伝子の両方の対立遺伝子は、腫瘍発生を促進するために失われるまたは不活性化されるはずである。したがって、癌抑制遺伝子における腫瘍形成性の機能喪失型の突然変異は、劣性に作用する傾向がある。多くの癌において、欠失または点突然変異は、任意のタンパク質の生産を予防する１つもしくは複数の癌抑制遺伝子において生じているまたは突然変異した癌抑制遺伝子からの非機能性のタンパク質の生産に至る。しかしながら、癌抑制因子の１つのコピーの損失さえ、第２の腫瘍形成性の事象を細胞に起こしやすくさせ得る。たとえば、そのような関係は、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧおよびＰＴＥＮ損失ならびにＡＫＴとのさらなる関連の間で存在するように思われる。Ｓｑｕｉｒｅ，  ＪＡ、ＴＭＰＲＳＳ−ＥＲＧ  ａｎｄ  ＰＴＥＮ  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００９年）４１巻、５０９〜５１０頁を参照されたい。異常なＥＲＧ発現は、ＰＴＥＮ損失と関連するマウスにおいて腫瘍形成性の事象として特徴付けられた。Ｃａｒｖｅｒ，  ＢＳ、Ｔｒａｎ  Ｊ、Ｇｏｐａｌａｎ  Ａ、Ｃｈｅｎ  Ｚら、Ａｂｅｒｒａｎｔ  ＥＲＧ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｏｐｅｒａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ＰＴＥＮ  ｔｏ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００９年）４１巻、６１９〜６２４頁を参照されたい。Ｃａｒｖｅｒらは、ＰＴＥＮの１つのコピーの損失が細胞増殖を促進し得るが、ＥＲＧが過剰発現されない限り、細胞は、侵襲性の疾患に進行しなかったことを示唆した。同書を参照されたい。同様に、ヒトＥＲＧ過剰発現構築物のみを有するマウスは前立腺腫瘍を発症しないように思われるが、ＰＴＥＮ欠失を有するマウスとの交雑からの子孫は、腫瘍を発症した。Ｋｉｎｇ  ＪＣら  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００９年）４１巻、５２４〜５２６頁。
【０１２２】
前立腺癌は最も一般的な新生物であり、北アメリカの男性における癌死亡の第２の主要原因であるが、最近の発見でさえ、前立腺の発癌現象におけるそのような腫瘍形成性の事象について実際にほとんど知られていない。Ｃａｒｖｅｒ，  ＢＳ、Ｔｒａｎ  Ｊ、Ｇｏｐａｌａｎ  Ａ、Ｃｈｅｎ  Ｚら、Ａｂｅｒｒａｎｔ  ＥＲＧ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｏｐｅｒａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ＰＴＥＮ  ｔｏ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００９年）４１巻、６１９〜６２４頁を参照されたい。ＰＴＥＮ関連性の腫瘍形成性の事象に関して、ＥＲＧ１は、悪性の前立腺組織において過剰発現される癌原遺伝子としての役割と一致して、前立腺癌（ＣａＰ）トランスクリプトームにおいて観察された。Ｊｅｍａｌ  Ａら、Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、２００５年  ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ．  ２００５年；５５巻：１０〜３０頁を参照されたい。また、Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ＴＭＰＲＳＳ２  ａｎｄ  ＥＴＳ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００５年；３１０巻：６４４〜６４８頁は、ＴＭＰＲＳＳ２のプロモーター領域へのＥＲＧの転座をもたらす、前立腺癌における第１の再発性遺伝子再構成について記載している。さらに、現在、ＥＲＧ１過剰発現のメカニズムの根底にあると考えられているように、他の遺伝子もまた、アンドロゲン応答性または他の強力なプロモーターに転座することが示された。同書を参照されたい。現在まで記載されている遺伝子融合物は、アンドロゲン感受性ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子ならびに転写因子のＥＴＳファミリーの３つの前述のメンバー（ＥＲＧ、ＥＴＶ１、およびＥＴＶ４）を含む。上記の研究は、発現の検出から始まり、続いて、欠失または他の再構成を介しての過剰発現をもたらす再構成を発見する。
【０１２３】
そのため、前立腺癌において同定される癌抑制因子の欠失または癌原遺伝子（たとえばＥＲＧ）の続く過剰発現に至る染色体の再構成の同定は、一般に、非特異的な染色体異常のみによって先に特徴付けられた上皮性腫瘍を理解するための新たな機会を示す。
【０１２４】
最近の研究では、染色体２１ｑ２２．２−３のおよそ２Ｍｂの共通の欠失の存在は上記に説明されるようにＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再構成を引き起こすとしておよび疾患進行と関連するとして記載された。Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ  Ｍ，ら、Ｔｈｒｅｅ−Ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＴＭＰＲＳＳ２／ＥＲＧ  Ｆｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｄｉｃａｔｅｓ  Ｔｈａｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｍｉｃｒｏｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ２１  Ｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ．  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ（２００６年）８巻、４６５〜４６９頁を参照されたい。さらに、ｂｒｅａｋ−ａｐａｒｔ三色ＦＩＳＨは、第２１染色体上のＴＭＰＲＳＳ２およびＥＲＧの間の欠失が遺伝子融合事象と関連することを確認するために使用された。
【０１２５】
したがって、およそ２Ｍｂの領域は、欠失させると、ＥＲＧの過剰発現がもたらされる。この共通の欠失は、有効なインフレーム融合遺伝子形成をもたらす。しかしながら、前立腺癌の進行に対する、１３遺伝子介在性のＴＭＰＲＳＳ２およびＥＲＧを失う結果について利用可能な情報は、あるとしてもほとんどない。
【０１２６】
実際に、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合物および結果として生ずる過剰発現をもたらす第２１染色体の再構成に至る事象または融合もしくは過剰発現が、ゲノムの欠失によるＰＴＥＮ発現の低下と関連するかどうかについてほとんどまたは全く知られていない。ほとんどすべての重点は、ＥＲＧの融合および結果として生ずる過剰発現にある。したがって、本発明はまた、ＰＴＥＮステータスに関連する続く事象の性質を特徴付けるために使用されてもよい。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＦＩＳＨによって、対象の癌抑制因子（複数可）、癌遺伝子（複数可）、癌原遺伝子（複数可）、または他の遺伝子の欠失または他の再構成についてアッセイするための方法を提供する。これらは、１３の遺伝子（たとえばＥＲＧ、ＥＴＳ２、ＦＳＭＧ１、Ｂ３ＧＡＬＴ５、ＨＭＧＮ１、ＤＳＣＡＭ、ＢＡＣＥ２、およびＴＭＰＲＳＳ２を含有する２１ｑ２２．２領域）を含有するＤＮＡの約２Ｍｂの損失をもたらすＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合遺伝子が形成される場合に共通して欠失する染色体領域において、対象の特異的な標的遺伝子をアッセイするための方法を含む。そのような方法において使用することができるプローブセットは、上記セクションＣまたはＥにおけるように調製されたプローブセットおよびセクションＤのプローブセットを含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、セクションＣ．２（ｂ）およびＣ．２（ｃ）において説明される境界ゾーンに関して位置づけられたハイブリダイゼーション部位を有する。
【０１２８】
概して言えば、ＦＩＳＨによって対象の少なくとも１つの遺伝子の欠失についてアッセイするための方法は、プローブセットを用いてＦＩＳＨを実行するステップを含む。プローブセットは、対象の遺伝子（複数可）に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも１つの第１のフランキングプローブ、対象の遺伝子（複数可）に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも１つの第２のフランキングプローブ、および対象の遺伝子（複数可）に対してハイブリダイズする少なくとも１つの標的プローブ（複数可）を含む。フランキングプローブおよび標的プローブ（複数可）からのＦＩＳＨシグナルが数えられる。核切断によって引き起こされる少なくとも１つのアーチファクト欠失頻度が、提供され、これは、陰性対照として役立つ。アーチファクト欠失頻度を、対象の遺伝子（複数可）の欠失または再構成を有する細胞を含まない対照試料を用いて先に決定することおよびアーチファクト欠失頻度を多数のアッセイにおいて再度使用することが可能である。数えられたＦＩＳＨシグナルに基づいて、少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度が決定される。試料が対象の遺伝子（複数可）の欠失を有する細胞を含むかどうかは、見かけ上の欠失頻度がアーチファクト欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて決定される。見かけ上の欠失頻度が比較されるアーチファクト欠失頻度は、欠失頻度がヘミ接合性またはホモ接合性かどうかおよびどのプローブハイブリダイゼーション部位が欠失によって影響を与えられるかの点から一致するはずである。
【０１２９】
１．試料
ＦＩＳＨによって対象の少なくとも１つの遺伝子の欠失についてアッセイするための方法において使用される試料は、細胞性の試料である。いくつかの実施形態では、試料は、ホルマリン、エタノール、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド−グルタルアルデヒド、またはカコジル酸ナトリウム、ホルマリン、およびグルタルアルデヒドの組み合わせなどのような保存剤を使用して、化学的に固定され、パラフィンまたは凍結組織マトリックス、たとえば最適切削温度（ＯＣＴ）化合物などのような不活性固形物質中に包埋される。いくつかの実施形態では、試料は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が非中期（たとえば間期）細胞である細胞を含む。たとえばＷｉｃｋ  ＭＲ、Ｍｉｌｌｓ  ＮＣ、Ｂｒｉｘ  ＷＫ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ，  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，  ａｎｄ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．  第１章  １〜１０頁  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｗｉｃｋ  ＭＲ．編  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００８年を参照されたい。
【０１３０】
一般に、試料は、固体支持体（たとえば、試料が包埋されているパラフィンマトリックスおよび／またはスライドガラスもしくはマイクロタイターウェルの壁）と共に提供される。
【０１３１】
２．ＦＩＳＨの実行
本発明の欠失アッセイ方法は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を含む。用語「ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション」は、一般に、細胞学的または組織学的調製物の一部である核酸標的に対する核酸プローブのハイブリダイゼーションを指す。典型的なＦＩＳＨ方法は、上記セクションＦ．２において説明される。
【０１３２】
試料を調製し、ＦＩＳＨを実行するための手順の例は、当技術分野において周知であり、セクションＦにおいて説明される。説明されるように、試料は、分析されることとなる癌性または前癌性細胞のタイプに依存して、多くの供給源から調製することができ、たとえば、供給源は、前立腺腫瘍、乳房腫瘍、黒色腫、および他の固形腫瘍から選ぶことができる。試料は、細胞遠心と組み合わせられたエタノールもしくはメタノール：酢酸における細胞の固定、薄層析出法（たとえばＴｈｉｎＰｒｅｐ、Ｃｙｔｙｃ  Ｃｏｒｐ．）、スミア、または顕微鏡スライドガラス上へのピペッティングのための標準的な調製物を使用して、針生検材料、細針吸引生検材料、根治的前立腺全摘除術、転移性試料（たとえば骨またはリンパ節由来の）、細胞診調製物（尿または腹水などのような体液由来の）、および末梢血から単離された循環腫瘍細胞から得ることができる。
【０１３３】
適したｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション方法は、使用することができ、セクションＥ２において説明される。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション前に、細胞内に含有される染色体ＤＮＡは、典型的に、高ｐＨ、熱（たとえば、７０℃〜９５℃の温度）、ホルムアミドおよびテトラアルキルアンモニウムハロゲン化物またはその組み合わせなどのような有機溶媒の存在下においてインキュベートすることによって変性させる。変性条件は、典型的に、細胞形態が保存されるように確立される。たとえば、染色体ＤＮＡは、７０℃を超える温度（たとえば７３℃）ならびに７０％ホルムアミドおよび２×ＳＳＣ（０．３Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム）を含有する変性バッファーの組み合わせによって変性させることができる。その代わりに、たとえば、細針生検試料から得られた染色体ＤＮＡは、５分間、８３℃で変性させてもよい。
【０１３４】
プローブセットのプローブが二本鎖形態で提供されるなどのようないくつかの実施形態では、プローブセットのプローブはまた、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション前に変性させてもよい。上記に記載されるものなどのような変性条件を使用することができる。
【０１３５】
変性化学薬品または条件の除去の後に、プローブは、ハイブリダイズ条件下で染色体ＤＮＡにアニールされる。「ハイブリダイズ条件」は、プローブおよび標的染色体ＤＮＡの間のアニーリングを促進する条件である。ハイブリダイゼーション条件は、プローブの濃度、塩基組成、複雑さ、および長さならびにインキュベーションの塩濃度、温度、および長さに依存して変動する。たとえば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、１×〜２×ＳＳＣ、５０〜５５％ホルムアミド、ハイブリダイゼーション促進剤（たとえば１０％デキストラン硫酸）、および非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するための非標識遮断ＤＮＡを含有するハイブリダイゼーションバッファーにおいて実行することができる。一般に、ハイブリダイゼーション条件は、上記に記載されるように、２５℃〜５５℃の温度、および０．５時間〜９６時間のインキュベーションの長さを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションは、２〜１６時間、３２℃〜約４５℃の温度で実行することができる。
【０１３６】
標的領域の外部のＤＮＡへの染色体のプローブの非特異的な結合は、食塩水を用いる一連の洗浄によって除去することができる。それぞれの洗浄における塩の温度および濃度は、所望のストリンジェンシーに依存する。たとえば、高度なストリンジェンシー条件については、洗浄は、０．２×〜２×ＳＳＣおよびＮＰ−４０などのような０．１％〜１％の非イオン性界面活性剤を使用して、約６５℃〜約８０℃で実行することができる。ストリンジェンシーは、洗浄の温度を減少させることによってまたは洗浄における塩の濃度を増加させることによって低下させることができる。組織試料へのプローブのハイブリダイゼーションは、手動でまたはＴｈｅｒｍｏＢｒｉｔｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｖｅｎ、ＶＰ  ２０００  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、もしくはＸＭａｔｒｉｘ（商標）ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（すべてＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．から市販で入手可能）などのような機器の補助により実行することができる。
【０１３７】
ハイブリダイズさせ、洗浄された試料からのＦＩＳＨシグナルの検出は、顕微鏡で直接、蛍光を観察するオペレーターによってなどのようにリアルタイムでの後の分析を可能にするためにまたは画像を記録することによる後の分析を可能にするために行うことができる。検出は、一般に、アッセイにおける使用においてそれぞれの蛍光団に対する励起光の適切な供給源の使用を伴い（たとえば、適切なフィルターを通過する光または適切な波長のレーザーからの光）、蛍光で放射された光は、次いで、適切なフィルターを通過し、それは、オペレーターによって直接、観察するおよび／またはコンピューターに接続されてもよいフィルムベースのもしくはデジタルカメラなどのようなカメラを用いて撮影することができる。
【０１３８】
３．計数
試料における複数の核のＦＩＳＨシグナルが、数えられる。いくつかの実施形態では、複数の核は、少なくとも５０、７５、または１００の核を含む。計数は、たとえば、それぞれの検査される核についてのエントリーおよびそれがそれぞれのＦＩＳＨシグナルをいくつ含有したかを含有するリストを作製することによってならびに／またはそれぞれ、ＦＩＳＨシグナル量の観察された組み合わせを有した核の数を数えることによって達成することができる。いくつかの実施形態では、そのようなリストは、同様に、ＦＩＳＨシグナル量の可能であるが観察されなかった組み合わせを含有することができる。リストは、それらの頻度を加えて、ＦＩＳＨシグナル量のそれぞれの観察された組み合わせについてのエントリーを作製することによって再編成することができる（たとえば下記の表２を参照されたい）。ＦＩＳＨシグナルを数えることによって得られた情報は、下記に説明される、少なくとも１つのアーチファクト欠失頻度を考慮して解釈されたい。
【０１３９】
４．アーチファクト欠失頻度
欠失アッセイ方法は、少なくとも１つのアーチファクト欠失頻度を提供することを含む。上記セクションＦ．４において説明されるように、あらゆる試料についての核は、欠失または再構成以外の理由で、１つまたはいくつかの標的プローブからのＦＩＳＨシグナルを欠き得、たとえば、ホルマリン固定パラフィン包埋試料を含む細針吸引生検材料試料の場合には、試料におけるいくつかの核は、切断され得る。また、核の画分における標的ハイブリダイゼーション部位が、細針生検技術から生じる細胞圧縮または他のアーチファクトのためにＦＩＳＨ手順のハイブリダイゼーションステップの間に十分に到達できないかもしれないこともあり得る。さらに、ＦＩＳＨシグナルが観察される頻度は、研究されている組織調製物の品質およびそれに対する経年変化の影響によって影響を及ぼされ得る。したがって、標的プローブからのＦＩＳＨシグナルを欠くすべての核が、実際の遺伝的な欠失を示すとは限らない。
【０１４０】
そのため、偽陽性（誤って欠失と考えられる）についての可能性を軽減するために、少なくとも１つのアーチファクト欠失頻度は、アッセイの標的の欠失を有する細胞を示す試料からの結果および標的プローブシグナルの不在の原因と、上記に説明された誤差の技術的根拠などのように、根底にある遺伝子型以外にある可能性がある試料からの結果とを区別するために提供される。
【０１４１】
アーチファクト欠失頻度は、標的遺伝子（複数可）の欠失を有していないことが公知の細胞の試料を使用する対照アッセイに基づいて決定することができる。対照試料から決定されたアーチファクト欠失頻度の正確度は、試料調製方法に関して細胞の試験試料に厳密に一致した細胞の対照試料を使用することによって、試験試料に関連して最適化されてもよい。
【０１４２】
たとえば、対象の遺伝子（複数可）の損失について試験されることとなる、前癌性／癌性／可能性として癌性の試料と同じ組織タイプの非新生物の組織試料は、対照として役立ち得る。前立腺癌に対するアッセイの場合には、非新生物の組織試料は、単に、管理目的のために良性の前立腺肥大（ＢＰＨ）のための手術を受けている、癌を有していない患者から得ることができる。乳癌の場合には、試料は、予防的なまたは縮小の目的のために単独で手術を受けている患者から得ることができる。
【０１４３】
とりわけセクションＢおよびＥ．４において上記に説明されるように、アーチファクト欠失頻度はまた、ＤＮＡの縮合、核のサイズおよび形状、試料切片の厚さ、アッセイ設計（３または４色ＦＩＳＨアッセイにおけるシグナル距離は、部分的に、プローブのゲノムの距離に依存する）、ならびに増殖速度および倍数性ステータス（より高度なレベルの倍数性の可能性が高いほど、より大きな体積の核を示唆する）などのような、ＦＩＳＨシグナルおよび腫瘍切片における相対的な核体積の両方に影響を与える他の生物学的変数によっても影響を及ぼされる。これらの核の変数に加えて、実際のＦＩＳＨシグナルは、それ自体（「スポットサイズ」）、ゲノムの凝縮した領域（たとえば、抑制された遺伝子のＤＮＡ）と比較して、脱凝縮した核染色質（発現される遺伝子の典型的な開いたＤＮＡ詰め込み）においてより大きな三次元空間を占め得る。さらに、個々のＦＩＳＨシグナルは、Ｇ２の核が、細胞のＤＮＡの倍加により、「ダブレット」のまたは対になったスポットカウントを示すので、ＤＮＡ複製が既に起こっている場合、解釈するのがより困難となり得る。これらのダブレットは物理的に連結される、スポットである、つまり、接しているもしくは糸によって連結されているまたは隣接している（最大のシグナルまたはスポットの直径よりも小さな隙間により）。いくつかの実施形態では、スコアリング基準は、この影響がアッセイの結果を歪めないことを保証するために調節されてもよい（Ｖａｒｅｌｌａ−Ｇａｒｃｉａ  Ｍら、ＥＧＦＲ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ：  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．  ２００９年；６２巻：９７０〜９７７頁を参照されたい）。これは、物理的に連結した、対になったスポットおよび／または隣接するスポットを１つのシグナルのみとして数えることを含むことができる。隣接するが、少なくとも、最大のシグナルの直径によって分離されるスポットは、別々のシグナルとして数えることができる。他方では、ＤＮＡ複製前に、シグナルはそれぞれ、単一のドット様のハイブリダイゼーションシグナル（「シングレット」）を示し、これらもまた、１つのシグナルのみとして数えられる。倍数性、核サイズおよび染色質凝縮などのようなこれらの変数のいくつかのものは、正常な対照試料および腫瘍検体の間で変動し得る。したがって、これらの因子は、間期ＦＩＳＨアッセイについてのアーチファクト欠失頻度を確立するために使用される陰性対照において完全に説明するのが困難になり得、これは、低い腫瘍細胞の含有量またはさらなるサブクローンのゲノム変化を有する試料において特に重要になり得る。したがって、欠失を考えるために比較的ストリンジェントな統計閾値を使用することは望ましいこととなり得、さらに下記に説明される。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、少なくとも２つまたはそれ以上のアーチファクト欠失頻度が提供される。たとえば、ヘミ接合性およびホモ接合性の欠失についてのアーチファクト欠失頻度を提供することができる。さらに、別々のアーチファクト欠失頻度が、プローブの異なる組み合わせからのＦＩＳＨシグナルの不在に至る欠失、たとえば、標的プローブのみに影響を与える欠失、標的プローブおよび標的プローブに最も近いセントロメア側のフランキングプローブに影響を与える欠失、標的プローブおよび標的プローブに最も近いテロメア側のフランキングプローブに影響を与える欠失、ならびに標的プローブ、標的プローブに最も近いセントロメア側のフランキングプローブ、および標的プローブに最も近いテロメア側のフランキングプローブに影響を与える欠失について提供される。２つを超えるフランキングプローブを含むプローブセットが使用される実施形態では、アーチファクト欠失頻度は、標的プローブからより遠く離れているフランキングプローブに影響を与える欠失を同様に考慮することができるように、所与のセット内のそれぞれのプローブについて提供することができる。
【０１４５】
別々のアーチファクト欠失頻度を提供するという利点は、切断事象などのような誤差の原因により欠けているＦＩＳＨシグナルが、クローン集団の遺伝子型よりも、核によって調整可能になり得ることであり、任意の所定のタイプの欠失（たとえば、標的プローブおよび標的プローブに最も近いテロメア側のフランキングプローブに影響を与えるヘミ接合性の欠失）についてのアーチファクト欠失頻度は、切断事象などのような誤差の原因のうちのいくつかが、同様に、少なくとも１つのセントロメア側のフランキングプローブに影響を与え得るので、少なくとも１つのセントロメア側のフランキングプローブもまたアッセイにおいて使用されない場合よりも低い。
【０１４６】
アーチファクト欠失頻度の低下は、いくつかの細胞型がとりわけ切断によるアーチファクトの傾向があるという点で、分析中の細胞型に依存して非常に役立ち得る。たとえば、５ミクロン組織学的切片における間期ＦＩＳＨによるシグナルの切断による損失に関する最近の研究において、正常な骨髄核の約２０％が切断によるシグナル損失を示したことが分かった。対照的に、正常な肝臓切片における核の約６０％が、切断による損失を示した（Ｗｉｌｋｅｎｓ  Ｌら  ２００５年  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｓｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．  Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ  ２００５年；４４７巻：５８６〜５９２頁）。損失を検出するための偽陽性率におけるこの差は、非常に大きく、不規則な形状の肝細胞核が５ミクロンの切片の調製の間により頻繁に切断される場合、ますます影響を有する切断の切削アーチファクトによると考えられる。
【０１４７】
５．少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度の決定
ＦＩＳＨシグナルを数えることによって得られた情報は、少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度を決定するために分析される。見かけ上の頻度は、どれくらい多くの標的プローブが試料において欠けているかについての観察である。このステップは、少なくとも１つのアーチファクト欠失頻度を提供するステップに比べて任意のタイミングで行われてもよいことに注目されたい。逆位などのような他の再構成が欠失をもたらすということもまた、事実である。アーチファクト欠失頻度と同じくらい多く、いくつかの実施形態では、少なくとも２またはそれ以上の見かけ上の欠失頻度が、決定される。効率のために、見かけ上の欠失頻度を決定することは、一般に望ましく、比較に適用可能な対においてアーチファクト欠失頻度を提供する（たとえば、標的プローブおよび標的プローブに最も近いテロメア側のフランキングプローブに影響を与えるヘミ接合性の欠失についてのアーチファクトおよび見かけ上の欠失頻度）。いかなる場合も、次のステップを実行するために、少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度は、少なくとも１つのアーチファクト欠失頻度と同じタイプの欠失事象についてのものでなければならない。
【０１４８】
６．対象の遺伝子（複数可）の欠失または再構成の検出
試料が欠失または再構成（欠失をもたらす）を有する細胞を含むかどうかは、少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度が少なくとも１つのアーチファクト欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて決定される。上記に説明されるように、有意性についての閾値は、多くの統計アプローチを使用して、特異度対感度の所望のレベルに従って選ぶことができる。したがって、多数のアーチファクト欠失頻度を提供することができ、多数の見かけ上の欠失頻度を決定することができる。このステップは、多数のタイプの欠失が存在するかどうかを決定することをさらに含むことができる。たとえば、フランキングおよび標的プローブからの２つの完全なセット（単一の標的遺伝子の場合には３つのうちの２セット）のＦＩＳＨシグナルの存在は、核が標的癌抑制因子の欠失を有していないことを示す（図２Ｂ、左の略図において図式化）。単一の標的についての標的プローブＦＩＳＨシグナルの一方または両方の不在は、見かけ上のヘミ接合性（図２Ｂ、中央）またはホモ接合性（図２Ｂ、右）の欠失をそれぞれ示す。見かけ上の欠失のサイズに関する情報もまた、１つまたは複数のフランキングプローブが不在であるかどうかから得ることができる。図２Ｂ右および中央の例は、標的プローブのみが影響を与えられている比較的小さな欠失を示す。
【０１４９】
他の例では、フランキングおよび標的プローブからの２セット（第１および第２の標的遺伝子の場合には４つのうちの２セット）のＦＩＳＨシグナルの存在は、核が標的癌抑制因子、癌遺伝子、または他の標的遺伝子の欠失を有していないことを示す。この例では、標的プローブＦＩＳＨシグナルのうちの１つまたは２の不在は、見かけ上のヘミ接合性またはホモ接合性の欠失をそれぞれ示す。見かけ上の欠失のサイズに関する情報もまた、どのフランキングプローブまたは遺伝子標的が不在であるかどうかから得ることができる。
【０１５０】
したがって、いくつかの実施形態では、方法は、試料が、標的プローブ（複数可）のみに影響を与える欠失、１つまたは２つの標的プローブおよび第１の標的プローブに最も近いセントロメア側のフランキングプローブに影響を与える欠失、１つまたは２つの標的プローブおよび第２の標的プローブに最も近いテロメア側のフランキングプローブに影響を与える欠失、ならびに標的プローブの両方、第１の標的プローブに最も近いセントロメア側のフランキングプローブ、および第２の標的プローブに最も近いテロメア側のフランキングプローブに影響を与える欠失から選ばれる欠失を有する細胞を含むかどうかを決定するステップを含む。
【０１５１】
図２Ｂにおいて示される単純な欠失の配置に加えて、フランキング対照プローブを含有する領域の近くのさらなる再構成のために、シグナルの獲得または損失を含むより複雑なパターンが観察されてもよい。たとえば、さらなるスポットを有する他の複雑なシグナル配置はまた、不平衡転座、多染色体性、またはトリソミー２１におけるように、倍数性による複雑な染色体の獲得からも生じ得る。正常な核において観察される単純なパターンと異なる任意のパターンもまた、それが細胞の有意な割合において現れる場合、異常であると通常考えられる。ＰＴＥＮおよび他の遺伝子のように、異常なパターンにおけるシグナルの数および位置の注意深い評価は、根底にある染色体の変化の有益な情報を提供することができる。
【０１５２】
７．境界ゾーン
２つ以上の標的遺伝子のアッセイにおいて使用される１つまたは複数のフランキングプローブは、境界ゾーンにおけるまたは境界ゾーンに比べて対象の遺伝子（複数可）に対して遠位のハイブリダイゼーション部位を有することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第１のフランキングプローブは、対象の遺伝子（複数可）のうちの１つに対してセントロメア側の第１の境界ゾーン内のまたはそれに対してセントロメア側の位置にハイブリダイズし、および／または少なくとも１つの第２のフランキングプローブは、対象の同じまたは異なる遺伝子に対してテロメア側の第２の境界ゾーン内のまたはそれに対してテロメア側の位置にハイブリダイズする。２つの標的遺伝子の場合には、一方の標的遺伝子は、第１の標的遺伝子と呼ばれ、他方は、第２の標的遺伝子と呼ばれる。ＰＴＥＮの例に関しては、このように位置づけられたフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位が、それが境界ゾーンに比べて対象の遺伝子（複数可）に対して近位にある場合よりも、欠失する可能性が低いので、そのように配置されたハイブリダイゼーション部位を有するフランキングプローブの使用は、役立ち得る。そのようなプローブセットの使用は、図２Ｂの中央および右におけるようなパターンを与える欠失頻度を高めることができる。これらのパターンは、（推定上、部分的にまたは完全に欠失した）対象の遺伝子（複数可）に対してセントロメア側およびテロメア側にハイブリダイズするフランキングプローブからのシグナルを有し、フランキングプローブハイブリダイゼーション部位ではなく対象の遺伝子（複数可）を含有するクロマチンのループが、切除される核体積に及ぶ様式で、染色体が配置されることが必要であるので、これらのパターンは、核の体積の切断面が切除される切断によるアーチファクトを通して繰り返し生じる可能性が低い。境界ゾーンおよびそれへのハイブリダイゼーション部位の位置は、上記により詳細に説明され、その議論は、同様にここに関連する。
【０１５３】
Ｉ．小さなおよび大きな欠失を識別可能に検出するためのアッセイ
対象の少なくとも２つの遺伝子の両方のコピーが欠失している細胞が、異なるサイズの１つまたは複数の別々の欠失事象を受けている可能性がある。本発明は、異なるサイズの欠失事象を識別可能に検出するための方法に関する。
【０１５４】
１．プローブセット
ヒトゲノム配列の現在の設計図に従って１３もの遺伝子を含有する２１ｑ２２−２３染色体の約２Ｍｂ領域について存在するより複雑な配置に関する方法では、少なくとも４つのプローブのプローブセットが使用され、より細かいレベルの欠失検出を行うことができる。プローブセットは、対象の遺伝子（たとえばＨＭＧＮ１遺伝子およびＤＳＣＡＭ遺伝子）にハイブリダイズする少なくとも２つの標的プローブ、対象の遺伝子（複数可）（たとえばＥＲＧ）に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第１のフランキングプローブ、対象の遺伝子（複数可）（たとえばＴＭＰＲＳＳ２）に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第２のフランキングプローブ、ならびに任意選択で、第１のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第３のフランキングプローブ（たとえばＤＹＲＫ１Ａ）または第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第４のフランキングプローブ（たとえばＵ２ＡＦ１）の少なくとも１つを含む。Ａｍｏｎｏ，  Ｋら「Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  Ｄｏｗｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  （ＤＳＣＡＭ）  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｂｉｐｏｌａｒ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ」（２００８年）Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８巻（１号）１〜１０頁；Ｃｕｄｄａｐａｈ，Ｓら「Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ＨＭＧＮ１  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａｎｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ａｔ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｒｅｇｉｏｎｓ」（２０１１年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３１巻、７００〜７０９頁を参照されたい。プローブセットは、いくつかの実施形態では、セントロメア側のまたはセントロメア周囲のプローブをさらに含んでいてもよい。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、プローブセットは、部分的に重複するプローブを含む２つのサブセットを含む。２つのサブセットは、少なくとも１つの異なって位置づけられたフランキングプローブが、アッセイの第２のまたは反射的な部分において使用される、２部のアッセイにおいて使用することができる。たとえば、図２２は、セントロメア側のプローブ、ＴＭＰＲＳＳ２プローブ、ＤＳＣＡＭプローブ、およびＥＲＧプローブが、第１の部において使用され、セントロメア側のプローブ、ＤＹＲＫ１Ａプローブ、ＤＳＣＡＭプローブ、およびＵ２ＡＦ１プローブが、第２の部において使用される、小さなおよび大きなＤＳＣＡＭ欠失のための２部のアッセイのための上記に記載されるプローブの１つの可能な配置の例を提供する。欠失が、図２２において垂直方向の点線によって境界を示される領域を超える場合、１つまたは複数のフランキングプローブが影響を与えられるはずであり、ＴＭＰＲＳＳ２またはＥＲＧのプローブが影響を与えられる場合、非常に大きな欠失が示されるであろう。たとえば、欠失が、ＤＳＣＡＭからテロメアまでの全領域の損失をもたらす可能性があり、これは、ＤＳＣＡＭ、ＴＭＰＲＳＳ２、およびＵ２ＡＦ１プローブに影響を与えるであろう。
【０１５６】
２．計数；アーチファクトのおよび見かけ上の欠失頻度
ＦＩＳＨシグナルを数えるステップ、アーチファクト欠失頻度を提供するステップ、および上記の例について見かけ上の欠失頻度を決定するステップは、数えるための多数のプローブがあり、多数のタイプの欠失についてのアーチファクトおよび見かけ上の頻度がそれぞれ提供され、決定され得るので、比較的、複雑である。
【０１５７】
たとえば、少なくとも１つの第１のアーチファクト欠失頻度は、少なくとも第１および少なくとも第２のフランキングプローブ（つまり、セントロメア側およびテロメア側の、標的プローブに最も近いフランキングプローブ）の間にエンドポイントを有するＤＳＣＡＭまたはＨＭＧＮ１の欠失のために提供することができ、少なくとも１つの第２のアーチファクト欠失頻度は、２つの最も遠位のフランキングプローブの間にエンドポイントを有する対象の遺伝子（複数可）の欠失のために提供することができ、エンドポイントの少なくとも１つは、少なくとも第１のフランキングプローブと少なくとも第２のフランキングプローブとの間にない。すなわち、第１のアーチファクト欠失頻度は、第１および第２のフランキングプローブの結合部位ではなく、ＤＳＣＡＭまたはＨＭＧＮ１の一方または両方を包含する欠失に対応し、第２のアーチファクト欠失頻度は、フランキングプローブ結合部位を包含する、より大きな欠失に対応する。
【０１５８】
その代わりにまたはさらに、少なくとも１つの第１のアーチファクト欠失頻度は、エンドポイントのうちの１つがＤＳＣＡＭおよびＨＭＧＮ１の間にある、少なくとも第１のフランキングプローブと少なくとも第２のフランキングプローブとの間にエンドポイントを有するＤＳＣＡＭまたはＨＭＧＮ１の欠失のために提供することができ、少なくとも１つの第２のアーチファクト欠失頻度は、エンドポイントがＤＳＣＡＭおよびＨＭＧＮ１の間にない対象の遺伝子（複数可）の欠失のために提供することができる。すなわち、第１のアーチファクト欠失頻度は、他方のではなく、ＤＳＣＡＭまたはＨＭＧＮ１のうちの一方を包含する欠失に対応し、第２のアーチファクト欠失頻度は、両方を包含する欠失に対応する（どちらのエンドポイントも遺伝子の間にないので）。
【０１５９】
上記の議論は、フランキングプローブが、ともにまたは２部のアッセイにおいて試料（複数可）に対してハイブリダイズするかどうかにかかわらず適用可能である。
【０１６０】
３．試料が小さなまたは大きな欠失を有する細胞を含むかどうかの決定
試料が、使用されるフランキングプローブのいずれかのハイブリダイゼーション部位に影響を与える対象の遺伝子（複数可）の欠失を有する細胞を含むかどうかの決定は、上記に記載されるように、関連する見かけ上の欠失頻度が、関連するアーチファクト欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づく。
【０１６１】
標的プローブが、適切なアーチファクト欠失頻度よりも有意に大きな見かけ上のヘミ接合性またはホモ接合性欠失頻度を有する試料は、フランキングプローブのいずれも、適切なアーチファクト欠失頻度よりも有意に大きな見かけ上の欠失頻度を有しない場合、小さな欠失（複数可）のみ（いかなるフランキングプローブにも影響を与えない）を含むことが決定される。
【０１６２】
標的プローブおよび少なくとも１つのフランキングプローブが、適切なアーチファクト欠失頻度よりも有意に大きな見かけ上の欠失頻度を有する場合、大きな欠失が存在する可能性が高い。
【０１６３】
たとえば、フランキングプローブのハイブリダイゼーションのみが第２１染色体の一方のコピー上で欠失しており、標的プローブのハイブリダイゼーション部位のみが第２１染色体の他方のコピー上で欠失している、まれな対の小さな欠失の可能性は、同じ染色体からのＦＩＳＨシグナルが互いに近くにある傾向に基づいて一般に除外することができ、したがって、ヘミ接合性の大きな欠失の場合には、影響を与えられない染色体からのＦＩＳＨシグナルは、互いに近くあるはずであることに注目されたい。
【０１６４】
小さなおよび大きな欠失が存在し得、これらの場合には、標的プローブは、対応するアーチファクトのホモ接合性欠失頻度よりも有意に大きな見かけ上のホモ接合性欠失頻度を有し、少なくとも１つのフランキングプローブは、対応するアーチファクトのヘミ接合性欠失頻度よりも有意に大きな見かけ上のヘミ接合性欠失頻度を有する。大きな欠失が２つのフランキングプローブハイブリダイゼーション部位の損失をもたらしている場合には（たとえば、対象の遺伝子（複数可）に対してテロメア側のハイブリダイゼーション部位を有する２つのフランキングプローブに影響を与える、対象の遺伝子（複数可）からテロメアまでの全領域の損失）、２つのフランキングプローブは、対応するアーチファクトのヘミ接合性欠失頻度よりも有意に大きな見かけ上のヘミ接合性欠失頻度を有するであろう。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの大きな欠失がある対象の遺伝子（複数可）のホモ接合性の欠失は、転移または転移性腫瘍を示し、転移腫瘍は、身体における他の位置に少なくとも１つの第２の腫瘍を生じさせ得、第２の腫瘍は、転移性腫瘍である。いくつかのそのような実施形態では、対象の遺伝子（複数可）の１つのコピーは、小さな欠失により欠けており、１つのコピーは、大きな欠失により欠けている。いくつかの実施形態では、対象の遺伝子（複数可）の両方のコピーは、大きな欠失により欠けている。いくつかの実施形態では、対象の遺伝子（複数可）に対してテロメア側に位置する少なくとも２つのフランキングプローブハイブリダイゼーション部位に影響を与える、少なくとも１つの大きな欠失がある。いくつかの実施形態では、より遠位（対象の遺伝子（複数可）に関して）の当該少なくとも２つのフランキングプローブハイブリダイゼーション部位は、対象の遺伝子（複数可）から少なくとも５、７．５、１０、または１２．５Ｍｂにある。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、小さなおよび大きな欠失を検出するための方法は、プローブセットによって含まれる第１のプローブサブセットを用いて複数の細胞を含む第１の細胞性の試料についてＦＩＳＨを実行するステップおよびプローブセットによって含まれる第２のプローブサブセットを用いて複数の細胞を含む第１の細胞性の試料と同じ個体由来の第２の細胞性の試料についてＦＩＳＨを実行するステップを含み、対象の遺伝子は、ＤＳＣＡＭおよびＨＭＧＮ１であり、第１のプローブサブセットは、ＴＭＰＲＳＳ２にハイブリダイズするフランキングプローブおよびＥＲＧにハイブリダイズするフランキングプローブを含み、第２のプローブサブセットは、ＤＹＲＫ１ＡにハイブリダイズするフランキングプローブおよびＵ２ＡＦ１にハイブリダイズするフランキングプローブを含む。ＤＳＣＡＭおよび／またはＨＭＧＮ１欠失がこの方法において検出される場合、フランキングプローブのハイブリダイゼーション部位の少なくとも１つが、ＤＳＣＡＭおよび／またはＨＭＧＮ１と共に欠失しているかどうかの分析は、欠失が大きな欠失であるかどうかを決定するために使用することができる。
【０１６７】
４．境界ゾーン
セクションＨの方法におけるように、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第１のフランキングプローブは、対象の遺伝子（複数可）に対してセントロメア側の第１の境界ゾーン内のまたはそれに対してセントロメア側の位置にハイブリダイズし、および／または少なくとも１つの第２のフランキングプローブは、対象の遺伝子（複数可）に対してテロメア側の第２の境界ゾーン内のまたはそれに対してテロメア側の位置にハイブリダイズする。
【０１６８】
第３のおよび／または第４のフランキングプローブが、境界ゾーン内にまたは境界ゾーンに比べて対象の遺伝子（複数可）に対して遠位に位置することもまた、可能である。すなわち、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第３のフランキングプローブは、少なくとも１つの第１のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してセントロメア側の第１の遠位の境界ゾーンに対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする、および／または少なくとも１つの第４のフランキングプローブは、少なくとも１つの第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してテロメア側の第２の遠位の境界ゾーンに対してテロメア側の位置にハイブリダイズする。
【０１６９】
境界ゾーンおよびそれへのハイブリダイゼーション部位の位置は、上記のセクションにおいてより詳細に説明され、その議論は、同様にここに関連する。
【０１７０】
Ｊ．プローブセットおよびキット
本発明は、上記に記載される方法に従って調製されるプローブセットに関する。
【０１７１】
本発明はまた、ＤＳＣＡＭまたはＨＭＧＮ１にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、ＴＭＰＲＳＳ２またはＵ２ＡＦ１にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、およびＥＲＧにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含むプローブセットに関する。そのような実施形態では、ＤＳＣＡＭまたはＨＭＧＮ１にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブは、標的プローブとして役立ち、ＴＭＰＲＳＳ２またはＵ２ＡＦ１にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブおよびＥＲＧにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブは、フランキングプローブとして役立つ。いくつかの実施形態では、プローブセットは、ＤＹＲＫ１Ａにハイブリダイズする少なくとも１つのさらなるフランキングプローブを含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、プローブセットは、ＢＡＣ  ＲＰ１１−１３９Ｄ１２、ＲＰ１１−９０７Ｐ２４、ＲＰ１１−２８０Ｏ１７、ＲＰ１１−１８３Ｉ１２、ＲＰ１１−２８１Ｆ３、ＲＰ１１−１１１３Ｍ１３、およびＲＰ１１−１２３Ａ７の少なくとも１つに由来するＤＳＣＡＭにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、ＢＡＣ  ＲＰ１１−１３７Ｊ１３およびＲＰ１１−３４８Ｃ１５の少なくとも１つに由来するＨＭＧＮ１にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、ＢＡＣ  ＲＰ１１−３５Ｃ４、ＣＴＤ−３０９５Ｄ１１、およびＲＰ１１−６７１Ｌ１０の少なくとも１つに由来するＴＭＰＲＳＳ２にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、ＢＡＣ  ＲＰ１１−４７６Ｄ１７およびＲＰ１１−９５１Ｉ２１の少なくとも１つに由来するＥＲＧにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、ＲＰ１１−１０５Ｏ２４、ＲＰ１１−７７７Ｊ１９、およびＣＴＤ−３１４０Ｌ２の少なくとも１つに由来するＤＹＲＫ１Ａにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、ＲＰ１１−４４６Ｌ１９およびＣＴＤ−２６０１Ａ２２の少なくとも１つに由来するＵ２ＡＦ１にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含む。本明細書において言及されるこれらのおよび他のすべてのＢＡＣは、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｂｕｆｆａｌｏ、Ｎｅｗ  ＹｏｒｋおよびＢＡＣＰＡＣ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｏａｋｌａｎｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能である。たとえば、配列情報は、ＮＣＢＩ  Ｃｌｏｎｅ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｇｅｎｏｍｅ／ｃｌｏｎｅ／）から入手可能である。
【０１７３】
下記は、本開示によるプローブセットにおいて使用することができる、選択されるＢＡＣについての第２１染色体上のハイブリダイゼーション部位の位置に関する情報を提供する表である（座標は、ｖｅｒｓｉｏｎ  ＧＲＣｈ３７／ｈ１９、２００９年２月におけるものである）。
【０１７４】
【化３】
0005976550.tif 000004
いくつかの実施形態では、プローブセットは、ＤＳＣＡＭ、ＨＭＧＮ１、ＴＭＰＲＳＳ２、およびＥＲＧにハイブリダイズするプローブを含み、ＤＳＣＡＭにハイブリダイズさせるプローブ（複数可）は、ＢＡＣ  ＲＰ１１−８４６Ｇ１７、ＲＰ１１−９０７Ｐ２４、ＲＰ１１−２８０Ｏ１７、またはその組み合わせに由来し、ＨＭＧＮ１にハイブリダイズするプローブ（複数可）は、ＢＡＣ  ＲＰ１１−８１３７Ｊ１３、ＲＰ１１−３４８Ｃ１５、またはその両方に由来し、ＴＭＰＲＳＳ２にハイブリダイズするプローブ（複数可）は、ＢＡＣ  ＲＰ１１−３５Ｃ４、ＣＴＤ−３０９５Ｄ１１、またはその両方に由来し、ＥＲＧにハイブリダイズするプローブ（複数可）は、ＢＡＣ  ＲＰ１１−４７６Ｄ１７、ＲＰ１１−９５１Ｉ２１、またはその両方に由来する。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、プローブセットは、少なくとも１つのセントロメア側のまたはセントロメア周囲のプローブを含む。これは、染色体計数に使用することができる。セントロメア周囲のプローブの例は、ＢＡＣ  ＣＴＤ−２２５１Ｋ１２、ＲＰ１１−４７Ｂ１３、ＣＴＤ−２３１４Ｊ１０、またはその組み合わせに由来するプローブを含む。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、プローブセットは、ＲＰ１１−１３９Ｄ１２、ＲＰ１１−４７６Ｄ１７およびＲＰ１１−９５１Ｉ２１の少なくとも１つ、ならびにＲＰ１１−３５Ｃ４およびＣＴＤ−３０９５Ｄ１１の少なくとも１つに由来するプローブから成る。
【０１７７】
本明細書において組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明のいくつかの実施形態を例証し、説明と共に、本発明の原理について説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】図１は、染色体腕の一部の大きな介在欠失を示す図である。この例において、欠失が起こった後に、いくつかのサイトバンドが失われる。
【図２】図２は、プローブセットの配置（パネルＡ）および核の３色間期ＦＩＳＨ分析を使用する典型的な観察（パネルＢ）を示す図である。パネルＡは、図式的な染色体上のプローブのハイブリダイゼーション部位の配置を示す。プローブＡは、ハッチングとして示される、第１の色を用いて標識され（たとえば蛍光顕微鏡法では、この色は赤色とすることができる）、標的プローブ（「Ｔｕｍ  Ｓｕｐ」）は、白色として示される、第２の色を用いて標識され（たとえば蛍光顕微鏡法では、この色は緑色とすることができる）、プローブＢは、黒色として示される、第３の色を用いて標識される（たとえば蛍光顕微鏡法では、この色は青色とすることができる）。パネルＢでは、正常な核（左）は、３対のそれぞれの色のシグナルを有するであろう。Ｔｕｍ  Ｓｕｐ遺伝子の単純なヘミ接合性の損失（中央の核）について、「白色の」ＦＩＳＨシグナルは、欠けており（つまり、１つのシグナルのみが存在する）が、癌抑制遺伝子の側面に位置するプローブＡおよびＢは、二つ組みで存在したままである。ホモ接合性の損失（右の核）については、フランキングプローブは保持されているが、両方の「白色の」ＦＩＳＨシグナルは、欠失している。
【図３】図３は、複雑な再構成を受けた細胞からの可能性のあるＦＩＳＨシグナルを示す図である。この図におけるＦＩＳＨシグナルは、図２と同じプローブセットによって生成される。左のパターンは、フランキングプローブＡのハイブリダイゼーション部位を含む領域の２つの倍加およびフランキングプローブＢのハイブリダイゼーション部位を含む領域の１つの倍加が生じた細胞によって生成され得る。右のパターンは、癌抑制因子が、ヘミ接合性に欠失し、プローブＢのハイブリダイゼーション部位を含む領域の３つの余分なコピーが倍加事象から結果として生じた細胞によって生成され得る。
【図４】図４は、対照正常前立腺細胞を使用して欠失をスコアリングするための閾値および一方のプローブがＰＴＥＮにハイブリダイズし、他方のプローブがセントロメア側のハイブリダイゼーション部位を有する第１０染色体についての染色体計数プローブである２色プローブセット（Ｖｙｓｉｓ  Ｉｎｃ．）を使用するＰＴＥＮ欠失検出を示す図である。
【図５】図５は、ＴＳＰＡＮ１５、ＰＴＥＮ、およびＦＡＳにハイブリダイズするプローブを使用するＦＩＳＨアッセイ設計を示す図である。パネルＡは、ＰＴＥＮ欠失事象を検出するために使用することができるプローブのハイブリダイゼーション部位の図である。３つのプローブセットは、セントロメア側の紫色のＴＳＰＡＮ１５およびテロメア側の緑色のＦＡＳ遺伝子が側面に位置する赤色のＰＴＥＮプローブを含む。パネルＢは、核当たり２つの赤色（ＰＴＥＮ；白色として示される）、緑色（ＦＡＳ；斜めのハッチングとして示される）、青色（第１０染色体計数プローブ；交差ハッチング）、および紫色（ＴＳＰＡＮ１５；黒色として示される）のスポットを有することが予想されるであろう正常な細胞を使用する、４色間期ＦＩＳＨの三次元の図である。青色のセントロメアプローブは、モノソミー１０が存在し得るかどうかを決定するために使用される。標的プローブのハイブリダイゼーション部位にフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位が接近しているために、切断は、フランキングプローブおよび標的プローブにともに影響を与える傾向があり、欠失についてのスコアリングアルゴリズムは、フランキングプローブおよび標的プローブに影響を与えない実際の欠失事象ならびに切出しによって引き起こされる切断の間での識別の改善を伴って設計することができる。ここに示される図のセクションにおいてなどのように正常な核のアッセイ分析では、切出しの間の切断による排除によるそれぞれのプローブについてのアーチファクト欠失頻度の閾値レベルを提供するために使用することができる。
【図６】図６は、核当たり１つの赤色（ＰＴＥＮ；白色として示される）、２つの緑色（ＦＡＳ；斜めのハッチングとして示される）、２つの青色（第１０染色体計数プローブ；交差ハッチング）、および２つの紫色（ＴＳＰＡＮ１５；黒色として示される）のスポットを有することが予想されるであろう、ＰＴＥＮについてヘミ接合性に欠失した細胞を使用する４色間期ＦＩＳＨの三次元の図を示す図である。
【図７】図７は、核当たり１つの赤色（ＰＴＥＮ；白色として示される）、１つの緑色（ＦＡＳ；斜めのハッチングとして示される）、２つの青色（第１０染色体計数プローブ；交差ハッチング）、および２つの紫色（ＴＳＰＡＮ１５；黒色として示される）のスポットを有することが予想されるであろう、ＰＴＥＮおよびＦＡＳを含む領域についてヘミ接合性に欠失した細胞を使用する４色間期ＦＩＳＨの三次元の図を示す図である。
【図８】図８は、小さなホモ接合性のＰＴＥＮ欠失を有する細胞からの染色体上の３つのプローブを用いる中期ＦＩＳＨを示す図である。図８Ａは、１０ｑ２３．２にハイブリダイゼーション部位を有するＲＰ１１−４２０Ｋ１０に由来するセントロメア側のフランキングプローブからのＦＩＳＨシグナルを示す図である。２つのダブレットＦＩＳＨシグナルがこのプローブについて観察された。図８Ｂは、１０ｑ２５．１にハイブリダイゼーション部位を有するＲＰ１１−２４６Ｂ１３に由来するテロメア側のフランキングプローブからのＦＩＳＨシグナルを示す図である。２つのダブレットＦＩＳＨシグナルが、このプローブについて同様に観察された。図８Ｃは、存在する場合、ＰＴＥＮにハイブリダイズするであろうＲＰ１１−８４６Ｇ１７からのＦＩＳＨシグナルの不在を示す図である。ＤＡＰＩチャネルからの非特異的なＤＮＡ染色のいくらかの表面滲みのみが目に見えた。図８Ｄは、パネルＡ〜Ｃにおいて示される３つのチャネルおよびＤＡＰＩチャネルのオーバーレイを示す図である。
【図９】図９は、ＢＭＰＲ１Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＡＳ、および第１０染色体のセントロメア側のプローブからの多数のＦＩＳＨシグナルを含む２つの核を示す図である。上位の核は、２つのセントロメア側のシグナル（Ｃ）およびＢＭＰＲ１Ａ／ＰＴＥＮ／ＦＡＳ（Ｂ／Ｐ／Ｆ）シグナルの２つのクラスターを示す。下位の核は、ＢＭＰＲ１Ａ／ＰＴＥＮ／ＦＡＳおよびセントロメア側のシグナル（Ｂ／Ｐ／Ｆ／Ｃ）の２つのクラスターならびに一方がセントロメア側のシグナルに近い、２つのＢ／Ｐ／Ｆクラスターがある、複製後の核であるように思われる。２つのセントロメア側のシグナルが分解されていないまたは１つが切断事象により失われた可能性がある。
【図１０】図１０は、ＣＧＨデータからの前立腺癌試料対正常参照ＤＮＡについてのコピー数プロファイルを示す図である。左側のプロファイルは、癌試料における損失の程度を示し、右側のプロファイルは、獲得の程度を示す。矢じりは、ＰＴＥＮの位置に対応する損失プロファイルにおけるピークを示す。さらなる説明については、実施例１を参照されたい。
【図１１】図１１は、ヘミ接合性のＰＴＥＮ欠失を有する８２の前立腺癌試料についてのＦＩＳＨ結果を示す図である。１つの欠けているＦＩＳＨシグナルを有するプローブは陰影によって示し、したがって、たった１つのＰＴＥＮシグナルを失った試料は、ＰＴＥＮ列においてのみ陰影を有し、両方のフランキングプローブが同様に失われた試料は、３つの列すべてにおいて陰影を有する。さらなる説明については、実施例３を参照されたい。
【図１２】図１２は、ホモ接合性のＰＴＥＮ欠失を有する５０の前立腺癌試料についてのＦＩＳＨ結果を示す図である。陰影がホモ接合性の損失を示し、斜めのハッチングがヘミ接合性の損失を示すという点を除いて、プロットは、図１１におけるとおりである。さらなる説明については、実施例３を参照されたい。
【図１３】図１３は、様々なＰＴＥＮ欠失ステータスについての代表的なＦＩＳＨ顕微鏡検査法の画像を示す図である。白色の矢じりは、ＰＴＥＮ  ＦＩＳＨシグナルを示す。ＰＴＥＮに加えて、使用されるプローブは、図９におけるとおりである。パネルＡにおける細胞は、２つのそれぞれのＦＩＳＨシグナルを有した（正常）。パネルＢにおける細胞は、１つのＰＴＥＮ  ＦＩＳＨシグナルを頻繁に欠いた（小さなヘミ接合性のＰＴＥＮ欠失）。パネルＣにおける細胞は、１つのＰＴＥＮ  ＦＩＳＨシグナルおよび１つのプローブＡ  ＦＩＳＨシグナルを頻繁に欠いた（大きなヘミ接合性のＰＴＥＮ欠失）。パネルＤにおける細胞は、ＰＴＥＮおよびプローブＢについてのＦＩＳＨシグナルの両方を頻繁に欠いた（大きなホモ接合性の欠失）。パネルＥにおける細胞は、２つのＰＴＥＮ  ＦＩＳＨシグナルを頻繁に欠いた（小さなホモ接合性の欠失）。
【図１４】図１４は、セグメント重複が円の内部で曲線によって結び付けられる染色体１０ｑの環状記号を示す図である。円の外側の３つの矢じりは、下から上に、プローブＡ、ＰＴＥＮプローブ、およびプローブＢのハイブリダイゼーション部位をそれぞれ示す。
【図１５】図１５は、第１０染色体を、円で囲まれたＰＴＥＮの位置と共に示す図である。実施例１のＣＧＨコピー数データから生成された損失および獲得のプロットを染色体の図の下に示す。下の２列は、ＣＮＶおよびセグメント重複の部位である。
【図１６】図１６は、ＰＴＥＮの付近にある図１５からのデータの拡大を示す図である。図１３その他からのプローブＡおよびプローブＢの位置を示す。ＣＮＶおよびセグメント重複は、ＣＧＨデータの下の３および５列目に示す。その下に、個々の前立腺癌試料における欠失エリアを示す（太い線は欠失を示す）。
【図１７】図１７は、小さなおよび大きなＰＴＥＮ欠失を区別する２部の方法のためのプローブサブセットを示す図である。方法の第１の部では、ＦＩＳＨは、ＴＳＰＡＮ１５にハイブリダイズするフランキングプローブ、ＰＴＥＮにハイブリダイズする標的プローブ、およびＦＡＳにハイブリダイズするフランキングプローブを用いて実行することができる。セントロメア側のプローブもまた、使用することができる。小さな欠失のブレークポイントが最も頻繁に生じるように思われる境界ゾーンは、点線によって示す。セグメント重複クラスター（ＳＤ）の位置もまた、示す。第２の部（「反射的なアッセイ」）では、フランキングプローブは、ＢＭＰＲ１ＡおよびＳＵＦＵにハイブリダイズする。アッセイのそれぞれの部は、一方の側のＰＴＥＮに比較的近い領域が、大きな欠失によって影響を与えられるかどうかを調べ、さらに大きな欠失において影響を与えられるであろう他方の側の、より遠く離れているプローブを提供し、ＳＵＦＵの場合には、損失は、ＰＴＥＮからテロメアまでずっと及ぶ欠失によって引き起こされ得る。
【図１８】図１８は、小さなおよび大きなＰＴＥＮ欠失を区別するための２部のアッセイのための、完全な染色体に結合した図１７におけるプローブからのＦＩＳＨシグナルを示す図である。
【図１９】図１９は、第１０染色体に沿った図１７における２部のアッセイのプローブについてのプローブハイブリダイゼーション部位およびプローブが由来し得るＢＡＣを示す図である。パネルＡは、第１のサブセットのプローブを示し、パネルＢは、第２のサブセットのプローブを示す（反射的なアッセイについて）。
【図２０】図２０は、ＰＴＥＮ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＳＵＦＵ、ＴＳＰＡＮ１５、およびＦＡＳの近くのＣＮＶおよびセグメント重複の座の相対的地位を示す図である。
【図２１】図２１は、９５％の同一性および長さ＞１００００ｂｐによるｂｌａｓｔファイルからのヒットの抽出のためのパイソンスクリプト言語ソースコードを示す図である。
【図２２】図２２は、より小さなおよびより大きな欠失を検出するための４色ｆｉｓｈを使用するプローブセット配置を示す図である。これは、領域２１ｑ２２．２の引き伸ばしたセクション上のプローブのハイブリダイゼーション部位を示す。垂直線を用いて示された標的プローブＡ（ＤＳＣＡＭ）は、第１の色（たとえば水色）で標識する。水平方向の線を用いて示された標的プローブＢ（ＨＭＧＮ１）は、第２の色（たとえば金色）で標識する。格子縞模様で示すフランキングプローブＣ（ＥＲＧ）は、第３の色（たとえばオレンジ色）で標識する。むくで示すフランキングプローブＤ（５’ＴＭＰＲＳＳ２）は、第４の色（たとえば緑色）で標識する。図はまた、第１の４つのプローブのうちの３つのシグナルが失われ、より大きな欠失境界が有効となる場合において使用されるドットのセントロメア側のフランキングプローブＥ（たとえば緑色の蛍光で標識されたＤＹＲＫ１Ａ）および斜交平行線模様のテロメア側のフランキングプローブＦ（たとえば金色の蛍光で標識されたＵ２ＡＦ１）をも示す。４色試験では、プローブＡおよびＢが失われる場合、プローブＣおよびＤ（オレンジ色および緑色の蛍光）は残るであろう。プローブＡ、Ｂ、およびＣが失われる場合、プローブＤ（緑色の蛍光）は残り、さらなるフランキングプローブのいずれかを用いる追跡３色の試験は、欠失境界を決定するために使用することができる。
【図２３】図２３は、遺伝子および例示的なプローブ位置を示す２１ｑ２２．１３−２１ｑ２２．３領域のマップならびに欠失が生じ得るゾーンの指標を示す図である。
【実施例】
【０１７９】
ここで、本発明の実施形態について詳細に言及することとし、これらの態様および結果は、添付の図面において例証される。
【０１８０】
（実施例１）
第１０染色体についてのコピー数多型、セグメント重複、および比較ゲノムハイブリダイゼーションデータの分析；プローブ部位選択
Ｌｉｕら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ２００９年；１５巻：５５９〜６５頁からのＣＧＨデータをｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで分析した。１４人の患者からの５８の転移性ＣａＰ試料における染色体１０ｑ領域のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏコピー数分析を（Ｌｉｕ  Ｗら  Ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎｄｉｃａｔｅｓ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｌｅｔｈａｌ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ２００９年；１５巻：５５９〜６５頁）、１．０×１０−６の有意性閾値およびセグメント当たり最低５つのプローブを用い、ランクセグメンテーション（ｒａｎｋ  ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を適用して実行した（Ｎｅｘｕｓ  Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  ｖ．４；ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｅｌ  Ｓｅｇｕｎｄｏ、ＣＡ）。ゲノム不均衡は、獲得［ｌｏｇ（３／２）もしくは０．２の閾値］または損失［ｌｏｇ（１／２）もしくは−０．３の閾値、］として決めた、それぞれ、Ｆｅｒｒｅｉｒａ  ＢＩら、Ａｒｒａｙ  ＣＧＨ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  Ｅｗｉｎｇ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００８年；２７巻：２０８４〜２０９０頁によって定義されるように、２つのコピー数変化（ＣＮＴ）によって決定した。
【０１８１】
ＰＴＥＮの近くの損失のエリアを示すデータを図１６において示す。基準と比べた転移性ＣａＰ試料の集団における座の平均存在量もまた、決定し、プロットした（図１５および１６；図１０もまた参照されたい）。存在量が、８１．５Ｍｂ〜８９．６７Ｍｂの（つまり、ＰＴＥＮに対して約８Ｍｂセントロメア側の）領域において２０％を超えて減少し、集団においてコピー数変化を示すことが決定された。
【０１８２】
コピー数多型（ＣＮＶ）データは、ＡＳＣＩＩテキスト形式でＳａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ  ＣＮＶ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｈｕｍｇｅｎ／ｃｎｖ／）から得た。入手可能なデータは、国際コンソーシアムＨａｐＭａｐ（ｈｔｔｐ：／／ｈａｐｍａｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって収集された、２６９の別個の試料に相当した。次いで、ダウンロードしたファイルをフィルターにかけ、第１０染色体に関する領域のみをスプレッドシートに転送した。重複領域は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ上で手動で選択した。セグメント重複データは、参照データベースとして構築した第１０染色体を使用し、Ｂｌａｓｔ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９９０年；２１５巻：４０３〜４１０頁）アライメントを用いることによって得た。
【０１８３】
Ｓｅｇｍｅｎｔａｌ  Ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅから得た個々のセグメント重複（Ｓｈｅ  Ｘら、Ｓｈｏｔｇｕｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｎｔ  ｓｅｇｍｅｎｔａｌ  ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ、Ｎａｔｕｒｅ  ２００４年；４３１巻：９２７〜９３０頁、ｈｔｔｐ：／／ｈｕｍａｎｐａｒａｌｏｇｙ．ｇｓ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／）は、次いで、自動的な方法で染色体に対してアライメントし、結果として生じるヒットを、データベースにおけるそれぞれのセグメントについて表に示した。Ｓｅｇｍｅｎｔａｌ  Ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅにおける９０００を超える配列についての表をフィルターにかけ、９５％を超える相同性を有し、１０キロベースよりも長いヒット（アライメント）のみを、コンピュータースクリプトによって自動的に選択した（図２１）。次いで、近接する領域は、ＣＮＶセグメントと同じ方法で手動で選択した。近接するアライメント（ヒット）を分類するために考えたカットオフ値は、５０キロベースの距離とした。１００キロベースの距離の別のカットオフ値は、結果として生じるクラスターを分類するために用いた。
【０１８４】
第１０染色体は、表１において列挙される領域においてセグメント重複（ＳＤ）およびＣＮＶのクラスターを含有したことが決定された。
表１．  第１０染色体のセグメント重複およびＣＮＶ
【０１８５】
【表１−１】
0005976550.tif 000005
表１における座標は、ヒトゲノムのＵＣＳＣ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ＮＣＢＩ３６／ｈｇ１８（２００６年３月）の第１０染色体における位置を指す。
【０１８６】
セグメント重複、ＣＮＶ、および集団コピー数変化の位置に基づいて、ＴＳＰＡＮ１５およびＢＭＰＲ１Ａ座を、セントロメア側のフランキングプローブに対するハイブリダイゼーション部位として選択した。ＦＡＳおよびＳＵＦＵ座を、テロメア側のフランキングプローブに対するハイブリダイゼーション部位として選択した。
【０１８７】
（実施例２）
ホモ接合性のＰＴＥＮ欠失を有する試料を用いる３色ＦＩＳＨ。
【０１８８】
ＰＣ３細胞系の細胞からの中期染色体を（Ｂｅｈｅｓｈｔｉ  Ｂら、Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ  （ＳＫＹ）  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ  ｆｉｓｈ  ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ２００１年；３巻：６２〜９頁）、固定し、１０ｑ２３．２にハイブリダイゼーション部位を有するＲＰ１１−４２０Ｋ１０  ＢＡＣ（緑色に標識）；１０ｑ２５．１にハイブリダイゼーション部位を有するＲＰ１１−２４６Ｂ１３  ＢＡＣ（赤色に標識）；およびＰＴＥＮにハイブリダイゼーション部位を有するＲＰ１１−８４６Ｇ１７（水色に標識）を使用して調製した、３つの識別可能に標識したプローブをハイブリダイズさせた。染色体はまた、ＤＡＰＩ（青色）を用いて対比染色した。赤色、緑色、水色、および青色のチャネルにおける画像を、蛍光顕微鏡法によって得た。染色体の代表的なセットからの画像を、４つのＦＩＳＨシグナルが緑色および赤色のチャネル（パネルＡおよびＢ）で目に見えた図８に示す。二倍性のゲノムが複製されたが、中期でまだ分離していなかったので、４つのＦＩＳＨシグナルがあった。わずかなＤＡＰＩ蛍光がこのチャネルで目に見えたが、水色ＦＩＳＨシグナルは、ＰＴＥＮプローブについて観察されなかった（パネルＣ）。パネルＤは、パネルＡ〜Ｃの３つの画像および青色のチャネルからのＤＡＰＩ蛍光のオーバーレイを示す。
【０１８９】
（実施例３）
４色間期ＦＩＳＨによる欠失マッピング
４色間期ＦＩＳＨを、ＰＴＥＮの少なくとも１つのコピーについて欠失した癌性前立腺組織の１３２の試料について実行した。１３２の試料は、ＭｃＧｉｌｌ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｒｏｎｔｏで採取された３３０の癌性前立腺臨床組織試料のサブセットであった。これらの試料に関する詳細は、下記表に掲載する。
合計３３０人の患者の内訳
【０１９０】
【表１−２】
0005976550.tif 000006
ヘミまたはホモ接合性のＰＴＥＮ欠失を有する１３２の試料の内訳
【０１９１】
【表１−３】
0005976550.tif 000007
使用したプローブは、ＢＡＣ  ＲＰ１１−１４１Ｄ８およびＲＰ１１−５２Ｇ１３に由来するプローブ（「プローブＡ」；ＰＴＥＮに対してセントロメア側のハイブリダイゼーション部位）；ＢＡＣ  ＲＰ１１−８４６Ｇ１７に由来するＰＴＥＮプローブ；ならびにＢＡＣ  ＲＰ１１−３９９Ｏ１９およびＲＰ１１−３６０Ｈ２０に由来するプローブ（「プローブＢ」；ＰＴＥＮに対してテロメア側のハイブリダイゼーション部位）とした。プローブは、ニックトランスレーションによって識別可能な蛍光団を用いて標識した。ＢＡＣクローンについての位置情報は、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  １のＨｕｍａｎ（２００６年３月）アセンブリから得ることができる。第１０染色体セントロメア側のプローブＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ標識ＣＥＰ１０、Ｖｙｓｉｓ  Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ、ＩＬ、ＵＳＡもまた、使用した。
【０１９２】
１３２の試料の分析は、細胞の少なくとも３０％における１つまたは０のＰＴＥＮプローブＦＩＳＨシグナルの存在に基づいて、それらのうちの８２がヘミ接合性のＰＴＥＮ欠失を有し、５０がホモ接合性のＰＴＥＮ欠失を有したことを示した。さらに、プローブＡおよびＢの存在または不在は、欠失（複数可）が、これらのプローブのハイブリダイゼーション部位を同様に包含したかどうかを決定するために数えた。結果は、下記表２において列挙し、図１１〜１３に示す。
表２．  欠失の程度
【０１９３】
【表２】
0005976550.tif 000008
ホモ接合性のＰＴＥＮ欠失についてのカラムでは、括弧内の数は、所与のプローブからのＦＩＳＨシグナルがいくつ存在したかを示し、したがって、たとえば、「プローブＡ（１）、ＰＴＥＮ（０）、プローブＢ（１）」は、一方の染色体が、ＰＴＥＮのみについて欠失しており、他方の染色体が、プローブＡ〜プローブＢの全領域について欠失しているまたは一方の染色体が、ＰＴＥＮおよびプローブＢについて欠失しており、他方の染色体が、プローブＡおよびＰＴＥＮについて欠失していることを示す。
【０１９４】
ＰＴＥＮのみに影響を与える欠失の最小のサイズは、１７６ｋｂと推定された。プローブＡ、ＰＴＥＮ、およびプローブＢに影響を与える最大の欠失のサイズ範囲は、少なくとも２．５Ｍｂと推定された。
【０１９５】
（実施例４）
２色ＦＩＳＨによって解釈することが困難な試料におけるＰＴＥＮステータスの分解能
研究時に未知の臨床の結果を有する根治的前立腺全摘除術由来の９１のホルマリン固定パラフィン包埋試料のセットを、Ａｂｂｏｔｔ  Ｉｎｃ．からの市販で入手可能なＰＴＥＮおよびセントロメア側のプローブを用いる２色間期ＦＩＳＨならびにプローブＡはＢＡＣ  ＲＰ１１−１４１Ｄ８およびＲＰ１１−５２Ｇ１３から調製し、ＰＴＥＮプローブおよびプローブＢは実施例３におけるとおりとしたプローブセットを使用する４色ＦＩＳＨの両方を使用して分析した。結果が２つのアッセイの間で異なった６つの試料が同定された。これらの結果は、下記表３において列挙する。
【０１９６】
２色アッセイについての分析基準は、２つのＰＴＥＮシグナルおよび２つの第１０染色体セントロメア側のプローブを有する少なくとも７０％の核：コピー変化なし。同時に、１つのＰＴＥＮシグナル欠けて、損失しているが、２つのセントロメア側のプローブが存在する、２５％〜３０％の核：決定的でない。１つのＰＴＥＮシグナルが欠けており、両方のセントロメア側のプローブが保持されている３０％を超える核：ヘミ接合性の欠失。２つのＰＴＥＮシグナルが欠けており、セントロメア側のプローブが保持されている３０％〜１００％の核：ホモ接合性の欠失とした。
【０１９７】
切断によるアーチファクトを所与のセットにおいてそれぞれのプローブについて確立した後、４色アッセイについての分析基準を確立した。それらは、２つのＰＴＥＮシグナルを有し、フランキングプローブを保持する少なくとも８０％の核：コピー変化なし。両方のフランキングプローブを保持しながら、１つのＰＴＥＮシグナルが欠けている１８％〜２０％の核：決定的でない。１つのＰＴＥＮシグナルが欠けているが、両方のフランキングプローブを同時に保持する２０％以上：ヘミ接合性の欠失。一方、両方のフランキングプローブが同時に損失していてもよい、またはどちらも損失していなくてもよい、２つのＰＴＥＮシグナルが欠けている２０％〜１００％の核：ホモ接合性の欠失とした。
【０１９８】
これらの基準は、欠失と考えるために、見かけ上の頻度は、アーチファクト欠失頻度プラス３標準偏差よりも大きくなければならないという条件に基づくものとし、これらの値は２色アッセイについては３０％、４色アッセイについては２０％とした。２色および４色プローブセットについての対照結果を示す下記表を参照されたい。アーチファクト欠失頻度は、生検材料および／または良性前立腺肥大を有する患者に対して実行された根治的前立腺全摘除術からの非癌性前立腺試料由来の対照試料を使用して測定した。ＦＩＳＨアッセイにおける有意性閾値を設定するための３標準偏差の使用は、Ｖｅｎｔｕｒａら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｄｉａｇｎ．  ２００６年；８巻：１４１〜１５１頁において説明されている。
表３．  対照結果−４色プローブセットを用いるアーチファクト欠失の頻度
【０１９９】
【表３】
0005976550.tif 000009
表４．  対照結果−２色プローブセットを用いるアーチファクト欠失の頻度
【０２００】
【表４】
0005976550.tif 000010
表５．  ２色および４色ＰＴＥＮプローブセットを使用するＰＴＥＮ欠失の検出
【０２０１】
【表５】
0005976550.tif 000011
「ヘミおよびホモ接合性の欠失」は、ＰＴＥＮの１つのコピーの最初の欠失、その後に続くクローン増殖、ホモ接合性欠失亜集団をもたらす第２の欠失事象と一致して、両方のタイプの欠失を有する有意な数の細胞が存在したことを示す。
【０２０２】
したがって、４色アッセイは、２色アッセイによって決定的でなかった試料９〜１７および１９を分析することができた。さらに、いくつかの試料は、２色アッセイにおいて偽陽性結果を示したように思われ（推定上、平均以上の数の切断の影響による）、試料１、３、および４は偽陰性結果を示したように思われる。最後に、試料９では、２色アッセイは、細胞のヘミ接合性欠失集団を明らかに検出しなかった。
【０２０３】
４つのプローブアッセイの改善された特異度および感度は、フランキングプローブＡおよびＢを、アッセイの標的（ＰＴＥＮ）の近くであるがなお、多くの欠失が、フランキングプローブからのＦＩＳＨシグナルに影響を与えないはずである位置に位置づけることから結果として生じる、より低いアーチファクト欠失頻度から結果として生じると考えられる。
【０２０４】
（実施例５）
ｐ１６についての境界ゾーン同定およびＦＩＳＨプローブ調製物
参照細胞に対する黒色腫細胞試料からの平均のゲノムのコピー数を比較するＣＧＨデータは、［Ｂｅｒｏｕｋｈｉｍ  Ｒら、Ｔｈｅ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｏｐｙ−ｎｕｍｂｅｒ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ａｃｒｏｓｓ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０年；４６３巻：８９９〜９０５頁］において記載される［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｔｕｍｏｒｓｃａｐｅ／ｐａｇｅｓ／ｐｏｒｔａｌＨｏｍｅ．ｊｓｆ］から得る。１１１の黒色腫試料の集団における座の平均相対的コピー数が多くても１５Ｍｂの区間にわたり少なくとも２０％減少する最も近いコピー数変化ゾーンは、９ｐ２１で、ｐ１６遺伝子（ＣＤＫＮ２Ａとしても公知）のセントロメア側で同定される。
【０２０５】
コピー数変化ゾーンおよび周囲の近辺のエリアにおけるコピー数多型の多型の座（ＣＮＶ）［Ｃａｓｃｉ  Ｔ．  Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：  ＣＮＶ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００８年；９巻：８１４〜８１５頁］についてのＷｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｈｕｍｇｅｎ／ｃｎｖ／］およびセグメント重複［Ｒｕｄｄ  ＭＫら、Ｓｅｇｍｅｎｔａｌ  ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｎｏｖｅｌ，  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ、Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２００９年；１８巻：２９５７〜６２頁］についてのＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ［ｈｔｔｐ：／／ｈｕｍａｎｐａｒａｌｏｇｙ．ｇｓ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／］からのゲノムアノテーションを得た。
【０２０６】
コピー数変化ゾーンにおけるまたはそれに対して５Ｍｂ以内のセントロメア側の少なくとも１つのＣＮＶを同定する。ｐ１６に対する少なくとも１つのＣＮＶの最も近いもののアノテートされたエンドポイントは、下記で、遠位および近位のＣＮＶエンドポイントと呼ばれる（ｐ１６に対する接近に関して）。
【０２０７】
コピー数変化ゾーンにおけるアノテートされたセグメント重複の１Ｍｂの範囲内のまたはそれに対して５Ｍｂ以内のセントロメア側の少なくとも４つのアノテートされたセグメント重複を含有する少なくとも１つのクラスターを同定した。ｐ１６に最も近いセグメント重複クラスターのエンドポイントは、Ｓｅｇｍｅｎｔａｌ  Ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅにおける高密度セグメント重複領域のアノテートされたエンドポイントによって（Ｓｈｅ  Ｘら、Ｓｈｏｔｇｕｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｎｔ  ｓｅｇｍｅｎｔａｌ  ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ、Ｎａｔｕｒｅ  ２００４年；４３１巻：９２７〜９３０頁、ｈｔｔｐ：／／ｈｕｍａｎｐａｒａｌｏｇｙ．ｇｓ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／）またはｐ１６に最も近位のおよび最も遠位の１Ｍｂの範囲内の２つのセグメント重複座の位置によって定義される。
【０２０８】
（１）ＣＮＶおよびセグメント重複クラスターのｐ１６に対してより遠位の、遠位エンドポイントおよび（２）ＣＮＶおよびセグメント重複クラスターのｐ１６に対してより近位の、近位エンドポイントによって境界を示される領域は、境界ゾーンとして同定される。
【０２０９】
中央がｐ１６に対して遠位にある境界ゾーンの端から１Ｍｂ以内にあり、セントロメア側に及ぶハイブリダイゼーション部位を有するセントロメア側のフランキングプローブを調製する。
【０２１０】
ｐ１６のテロメア側の側で、少なくとも１つのＣＮＶおよび／または少なくとも１つのセグメント重複クラスターは、ｐ１６座のテロメア側の末端の２Ｍｂ以内で同定される。中央がＣＮＶまたはセグメント重複クラスターのテロメア側の末端から１Ｍｂ以内にあり、テロメア側に及ぶハイブリダイゼーション部位を有するテロメア側のフランキングプローブを調製する。
【０２１１】
中央がｐ１６座内またはｐ１６座の一方の末端から１００ｋｂ以内にあるハイブリダイゼーション部位を有する標的プローブを調製する。
【０２１２】
セントロメア側のフランキングプローブ、テロメア側のフランキングプローブ、および標的プローブを含むＦＩＳＨプローブセットは、間期ＦＩＳＨを介してｐ１６の欠失のためにアッセイするために使用することができる。アッセイは、セントロメア側のフランキングプローブ、テロメア側のフランキングプローブ、および標的プローブのＦＩＳＨシグナルに影響を与える切断によるアーチファクトが、テロメア側およびセントロメア側のフランキングプローブの間に少なくとも１つのエンドポイントを有する遺伝的な欠失によって影響を与えられる細胞と容易に区別されるので、ホルマリン固定パラフィン包埋試料により高精度を有する。
【０２１３】
（実施例６）
４色間期ＦＩＳＨによる２１ｑ２２．１３−２１ｑ２２．３領域の欠失マッピング
４色間期ＦＩＳＨを、上記に記載される方法を使用して、前立腺組織の（ＦＦＰＥ−ＦＮＡ）試料：
１．正常な細胞
２．ヘミ接合性のＰＴＥＮ欠失、および
３．ホモ接合性のＰＴＥＮ欠失
に対して実行する。
【０２１４】
２１ｑ２２．１３−２１ｑ２２．３（特に２１ｑ２２．２）領域は、ＴＭＰＲＳＳ２、ＨＭＧＮ１、ＤＳＣＡＭ、およびＥＲＧ１を含むいくつかの遺伝子を含む。使用されることとなるプローブは、ＢＡＣ  ＲＰ１１−４７６Ｄ１７に由来し（プローブＡ：ＨＭＧＮ１に対してセントロメア側）、ＢＡＣ  ＲＰ１１−１３７Ｊ１３およびＲＰ１１−３４８Ｃ１５に由来するＨＭＧＮ１プローブ、ＢＡＣ  ＲＰ１１−１３９Ｄ１２、ＲＰ１１−９０７Ｐ２４、ＲＰ１１−２８０Ｏ１７、ＲＰ１１−１８３Ｉ１２、ＲＰ１１−２８１Ｆ３、ＲＰ１１−１１１３Ｍ１３、およびＲＰ１１−１２３Ａ７に由来するＤＳＣＡＭプローブ、ならびにＲＰ１１−３５Ｃ４に由来するプローブ（プローブＢ；ＤＳＣＡＭに対してテロメア側）とする。プローブは、ニックトランスレーションによって識別可能に標識される（たとえば赤色、緑色、水色、および金色の蛍光団を用いて）。ＢＡＣについての位置情報は、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＢｒｏｗｓｅｒのＨｕｍａｎ（２００９年２月）アセンブリから得ることができる。第２１染色体セントロメア側のまたは中心周囲のプローブもまた、使用されてもよい。
【０２１５】
試料の分析は、ヘミ接合性のＰＴＥＮ欠失を有する細胞のサブセットはまた、ＨＭＧＮ１およびＤＳＣＡＭのプローブの一方または両方ではなく、プローブＡおよびプローブＢからのハイブリダイゼーションシグナルの存在によって示されるように、ＨＭＧＮ１欠失もしくはＤＳＣＡＭ欠失またはその両方を有することを示す。ホモ接合性のＰＴＥＮ欠失を示す細胞の他のサブセットは、さらなるまたは単一の欠失を示す。正常な細胞は、すべての遺伝子の存在を示す。
【０２１６】
本明細書内の実施形態は、本発明の実施形態の例証を提供し、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。当業者は、他の多くの実施形態が本発明によって包含されることを容易に認識する。本開示において引用される刊行物および特許はすべて、参照によってそれらの全体が組み込まれる。参照によって組み込まれる物質は、本明細書と矛盾するまたは一致しない程度まで、本明細書は、任意のそのような物質に取って代わるであろう。あらゆる参考文献の引用は、本明細書においてそのような参考文献が本発明に対する先行技術となることを許可するものではない。
【０２１７】
それと反対に他に示されない限り、請求項を含む本明細書において使用される、成分の量、反応条件などを表現するすべての数は、近似値であり、本発明によって得られることが求められる所望の特性に依存して変動してもよい。少なくとも、また、請求項の範囲への等価物の見解の適用を限定する試みとしてではなく、数のパラメーターは、それぞれ、有効数字の数および通常の丸めのアプローチを考慮して解釈されるべきである。
【０２１８】
他に示されない限り、一連のエレメントに先行する用語「少なくとも」は、一連のすべてのエレメントを指すように理解されたい。当業者らは、通常の実験作業のみを使用して、本明細書において記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するまたは確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の請求項によって包含されるように意図される。
【０２１９】
（ａ）または（ｉ）などのような標識を有するものを含めて、方法ステップが列挙される場合、たとえば、後に列挙されるステップが前に列挙されたステップの産物または結果を必要としない場合、請求項におけるステップの順序は必ずしも唯一の可能な順序ではないことが理解されたい。
例示的な実施形態：
１．ＦＩＳＨベースの癌抑制因子欠失アッセイのためのプローブセットを調製する方法であって、
（ａ）癌抑制遺伝子を含む染色体上の少なくとも１つの境界ゾーンを同定するステップであって、少なくとも１つの境界ゾーンは、癌抑制遺伝子に対してセントロメア側の第１の境界ゾーンを含むステップ、
（ｂ）第１の境界ゾーン内の核酸配列に、または第１の境界ゾーンに比べて癌抑制遺伝子から遠位にある核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの第１のフランキングプローブを提供するステップ、
（ｃ）癌抑制遺伝子に対してテロメア側の核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの第２のフランキングプローブを提供するステップ、および
（ｄ）境界ゾーンの間の癌抑制遺伝子における核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの標的プローブを提供するステップ
を含む方法。
２．少なくとも１つの標的プローブ、少なくとも第１のフランキングプローブおよび第２のフランキングプローブは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、コスミド、もしくは増幅産物に由来するまたは合成オリゴヌクレオチドのセットとして提供される、実施形態１に記載の方法。
３．第１の境界ゾーンは、主要な境界ゾーンである、実施形態１〜２のいずれか１つに記載の方法。
４．癌抑制遺伝子は、ＰＴＥＮである、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
５．癌抑制遺伝子は、ｐ１６、ＲＢ１、およびｐ５３から選ばれる、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
６．少なくとも１つの境界ゾーンを同定するステップは、（１）コピー数変化が、癌抑制遺伝子の欠失を含むことが公知の試料の集団において生じるならびに（２）コピー数多型（ＣＮＶ）およびセグメント重複のクラスターの少なくとも１つが生じる領域を同定するステップを含む、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の方法。
７．少なくとも第２の境界ゾーンを同定するステップをさらに含み、第２の境界ゾーンは、癌抑制遺伝子に対してテロメア側にあり、第２のフランキングプローブは、第２の境界ゾーン内の核酸配列に、または第２の境界ゾーンに比べて癌抑制遺伝子から遠位にある核酸配列にハイブリダイズする、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の方法。
８．少なくとも第３の境界ゾーンを同定するステップおよび第３の境界ゾーン内の核酸配列に、または第３の境界ゾーンに比べて癌抑制遺伝子から遠位にある核酸配列にハイブリダイズするプローブを提供するステップをさらに含む、実施形態７に記載の方法。
９．少なくとも１つの染色体計数プローブを提供するステップをさらに含む、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の方法。
１０．少なくとも１つの標的プローブならびに少なくとも第１のフランキングプローブおよび第２のフランキングプローブは、ＦＩＳＨベースの癌抑制因子欠失アッセイにおいて使用することができ、アッセイは、５μｍの厚さを有し、５μｍ未満の平均核直径を有するホルマリン固定パラフィン包埋細胞性試料について、３０％以下のアーチファクト欠失頻度プラス３標準偏差として計算される有意性閾値を有する、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の方法。
１１．少なくとも１つの標的プローブならびに少なくとも第１のフランキングプローブおよび第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位は、５０〜２００ｋｂの範囲のサイズを有する、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．少なくとも１つの標的プローブのハイブリダイゼーション部位は、５００ｋｂ〜２０Ｍｂの範囲の距離により、少なくとも第１のフランキングプローブおよび第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位から分離している、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．少なくとも第１のフランキングプローブおよび第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位は、それぞれ、少なくとも第１の境界ゾーンおよび第２の境界ゾーン内にある、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．少なくとも第１の境界ゾーンおよび第２の境界ゾーンは、３００ｋｂ〜２Ｍｂの範囲のサイズを有する、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．少なくとも第１の境界ゾーンおよび第２の境界ゾーンの少なくとも１つは、癌性または前癌性細胞由来の比較ゲノムハイブリダイゼーションデータにおけるコピー数変化に基づいて同定される、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．少なくとも第１の境界ゾーンおよび第２の境界ゾーンの少なくとも１つは、癌抑制遺伝子の欠失を含有していることが公知の複数の細胞試料のＦＩＳＨ分析に基づいて同定される、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の方法によって調製されるプローブセットを含む、癌抑制遺伝子における欠失を検出するためのキット。
１８．癌抑制遺伝子の欠失についてのＦＩＳＨベースのアッセイを行う方法であって、
（ａ）複数の細胞を含む細胞試料についてプローブセットを用いてＦＩＳＨを実行するステップであって、
プローブセットは、癌抑制遺伝子に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第１のフランキングプローブ、癌抑制遺伝子に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第２のフランキングプローブ、および癌抑制遺伝子にハイブリダイズする少なくとも１つの標的プローブを含むステップ、
（ｂ）複数の細胞において、少なくとも第１のフランキングプローブおよび少なくとも第２のフランキングプローブならびに少なくとも１つの標的プローブからのＦＩＳＨシグナルを数えるステップ、
（ｃ）（ｉ）アーチファクトヘミ接合性欠失頻度および（ｉｉ）アーチファクトホモ接合性欠失頻度から選ばれる少なくとも１つのアーチファクト欠失頻度を提供するステップ、
（ｄ）ステップ（ｂ）の数えられたＦＩＳＨシグナルから、（ｉ）見かけ上のヘミ接合性欠失頻度および（ｉｉ）見かけ上のホモ接合性欠失頻度から選ばれる少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度を決定するステップであって、ステップ（ｃ）においてアーチファクトホモ接合性欠失頻度が提供されなかった場合、少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度は、見かけ上のヘミ接合性欠失頻度を含み、ステップ（ｃ）においてアーチファクトヘミ接合性欠失頻度が提供されなかった場合、少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度は、見かけ上のホモ接合性欠失頻度を含むステップ、ならびに
（ｅ）見かけ上のヘミ接合性欠失頻度がアーチファクトヘミ接合性欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、試料が、癌抑制遺伝子のヘミ接合性の欠失を有する細胞を含むかどうかを決定するか、または見かけ上のホモ接合性欠失頻度がアーチファクトホモ接合性欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、試料が、癌抑制遺伝子のホモ接合性の欠失を有する細胞を含むかどうかを決定するステップ
を含む方法。
１９．ｐが、ｔ検定に従って０．０５以下である場合に、見かけ上の頻度は、アーチファクトの頻度よりも有意に大きい、実施形態１８に記載の方法。
２０．見かけ上の頻度が、３標準偏差分、アーチファクトの頻度を超える場合に、見かけ上の頻度は、アーチファクトの頻度よりも有意に大きい、実施形態１８に記載の方法。
２１．少なくとも１つの第１のフランキングプローブは、癌抑制遺伝子に対してセントロメア側の境界ゾーン内の位置またはそれに対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする、実施形態１８〜２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．少なくとも１つの第２のフランキングプローブは、癌抑制遺伝子に対してテロメア側の境界ゾーン内の位置またはそれに対してテロメア側の位置にハイブリダイズする、実施形態１８〜２１のいずれか１つに記載の方法。
２３．ステップ（ｃ）においてアーチファクトヘミ接合性欠失頻度およびアーチファクトホモ接合性欠失頻度を提供するステップ、ステップ（ｄ）において見かけ上のヘミ接合性欠失頻度および見かけ上のホモ接合性欠失頻度を決定するステップ、ならびにステップ（ｅ）において、試料が癌抑制遺伝子のヘミ接合性欠失を有する細胞を含むかどうかおよび試料が癌抑制遺伝子のホモ接合性の欠失を有する細胞を含むかどうかの両方を決定するステップを含む、実施形態１８〜２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．プローブセットは、癌抑制遺伝子を含む染色体に対して特異的な少なくとも１つの染色体計数プローブをさらに含み、少なくとも１つの染色体計数プローブからのＦＩＳＨシグナルを数えるステップ、見かけ上の異数体の頻度を決定するステップ、および見かけ上の異数体の頻度が、アーチファクトの異数体の頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、試料における細胞が、当該染色体について異数体かどうかを決定するステップをさらに含む、実施形態１８〜２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．細胞試料は、固定され、保存される、実施形態１８〜２４のいずれか１つに記載の方法。
２６．細胞試料は、３〜６μｍの範囲の厚さを有する、ホルマリン固定パラフィン包埋試料である、実施形態２５に記載の方法。
２７．癌抑制遺伝子は、ＰＴＥＮである、実施形態１８〜２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．少なくとも１つの第１のフランキングプローブは、ＴＳＰＡＮ１５にハイブリダイズするプローブを含み、少なくとも１つの第２のフランキングプローブは、ＦＡＳにハイブリダイズするプローブを含む、実施形態２７に記載の方法。
２９．少なくとも１つの第１のフランキングプローブは、ＢＭＰＲ１ＡまたはＷＡＰＡＬにハイブリダイズするプローブを含み、少なくとも１つの第２のフランキングプローブは、ＦＡＳにハイブリダイズするプローブを含む、実施形態２７または２８に記載の方法。
３０．癌抑制遺伝子は、ｐ１６、ＲＢ１、およびｐ５３から選ばれる、実施形態１８〜２６のいずれか１つに記載の方法。
３１．少なくとも１つの標的プローブならびに少なくとも第１のフランキングプローブおよび第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位は、５０〜２００ｋｂの範囲のサイズを有する、実施形態１８〜３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．少なくとも１つの標的プローブのハイブリダイゼーション部位は、５００ｋｂ〜２０Ｍｂの範囲の距離、少なくとも第１のフランキングプローブおよび第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位から分離している、実施形態１８〜３１のいずれか１つに記載の方法。
３３．癌抑制遺伝子の小さな欠失および大きな欠失を識別可能に検出するためのＦＩＳＨベースのアッセイを行う方法であって、
（ａ）プローブセットを用いて複数の細胞を含む細胞試料についてＦＩＳＨを実行するか、またはプローブセットに含まれる第１のプローブサブセットを用いて複数の細胞を含む第１の細胞試料についてＦＩＳＨを実行し、前記プローブセットに含まれる第２のプローブサブセットを用いて第１の細胞試料と同じ個体に由来する複数の細胞を含む第２の細胞試料についてＦＩＳＨを実行するステップであって、
プローブセットは、癌抑制遺伝子にハイブリダイズする少なくとも１つの標的プローブ、癌抑制遺伝子に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第１のフランキングプローブ、癌抑制遺伝子に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第２のフランキングプローブ、ならびに第１のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第３のフランキングプローブおよび第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくともの第４のフランキングプローブのうちの少なくとも１つを含むステップ、
（ｂ）複数の細胞または複数の複数の細胞において、少なくとも１つの標的プローブならびに少なくとも第１のフランキングプローブ、少なくとも第２のフランキングプローブ、ならびに少なくとも第３のフランキングプローブおよび少なくとも第４のフランキングプローブ少なくとも１つからのＦＩＳＨシグナルを数えるステップ、
（ｃ）少なくとも第１のフランキングプローブと少なくとも第２のフランキングプローブとの間にエンドポイントを有する癌抑制遺伝子の欠失についての少なくとも１つの第１のアーチファクト欠失頻度を提供するステップ、
（ｄ）癌抑制遺伝子の欠失についての少なくとも１つの第２のアーチファクト欠失頻度を提供するステップであって、エンドポイントの少なくとも１つは、少なくとも第１のフランキングプローブと少なくとも第２のフランキングプローブとの間に存在しない、ステップ、
（ｅ）ステップ（ｂ）の数えられたＦＩＳＨシグナルから、少なくとも第１のフランキングプローブと少なくとも第２のフランキングプローブとの間にエンドポイントを有する癌抑制遺伝子の欠失についての少なくとも１つの第１の見かけ上の欠失頻度を決定するステップ、
（ｆ）ステップ（ｂ）の数えられたＦＩＳＨシグナルから、癌抑制遺伝子の欠失についての少なくとも１つの第２の見かけ上の欠失頻度を決定するステップであって、エンドポイントの少なくとも１つは、少なくとも第１のフランキングプローブと少なくとも第２のフランキングプローブとの間に存在しない、ステップ、ならびに
（ｇ）少なくとも１つの第１の見かけ上の欠失頻度が、少なくとも１つの第１のアーチファクト欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、細胞試料が、癌抑制遺伝子の小さな欠失を有する細胞を含むかどうかを決定し、少なくとも１つの第２の見かけ上の欠失頻度が、少なくとも１つの第２のアーチファクトホモ接合性欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、細胞試料が、癌抑制遺伝子の大きな欠失を有する細胞を含むかどうかを決定するステップ
を含む方法。
３４．プローブセットに含まれる第１のプローブサブセットを用いて複数の細胞を含む第１の細胞試料についてＦＩＳＨを実行するステップおよびプローブセットに含まれる第２のプローブサブセットを用いて第１の細胞試料と同じ個体に由来する複数の細胞を含む第２の細胞試料についてＦＩＳＨを実行するステップを含み、癌抑制遺伝子は、ＰＴＥＮであり、第１のプローブサブセットは、ＴＳＰＡＮ１５にハイブリダイズするフランキングプローブおよびＦＡＳにハイブリダイズするフランキングプローブを含み、第２のプローブサブセットは、ＢＭＰＲ１ＡまたはＷＡＰＡＬにハイブリダイズするフランキングプローブおよびＳＵＦＵにハイブリダイズするフランキングプローブを含む、実施形態３３に記載の方法。
３５．少なくとも１つの第１のフランキングプローブは、癌抑制遺伝子に対してセントロメア側の第１の境界ゾーンに対してセントロメア側の位置にハイブリダイズし、少なくとも１つの第２のフランキングプローブは、癌抑制遺伝子に対してテロメア側の第２の境界ゾーンに対してテロメア側の位置にハイブリダイズする、実施形態３３〜３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．少なくとも１つの第３のフランキングプローブは、少なくとも１つの第１のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してセントロメア側の第１の遠位の境界ゾーンに対してセントロメア側の位置にハイブリダイズするまたは少なくとも１つの第４のフランキングプローブは、少なくとも１つの第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してテロメア側の第２の遠位の境界ゾーンに対してテロメア側の位置にハイブリダイズする、実施形態３３〜３５のいずれか１つに記載の方法。
３７．少なくとも１つの第１のフランキングプローブは、癌抑制遺伝子に対してセントロメア側の第１の境界ゾーンに対してセントロメア側の位置にハイブリダイズし、少なくとも１つの第２のフランキングプローブは、癌抑制遺伝子に対してテロメア側の第２の境界ゾーンに対してテロメア側の位置にハイブリダイズする、実施形態３６に記載の方法。
３８．細胞が癌抑制遺伝子の２つの欠失を含むことを決定するステップを含み、大きな欠失である欠失の少なくとも１つは、転移または転移性腫瘍を示す、実施形態３３〜３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．細胞試料は、固定され、保存される、実施形態３３〜３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．細胞試料は、３〜６μｍの範囲の厚さを有する、ホルマリン固定パラフィン包埋試料である、実施形態３９に記載の方法。
４１．癌抑制遺伝子は、ＰＴＥＮである、実施形態３３および３５〜４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．少なくとも１つの第１のフランキングプローブは、ＢＭＰＲ１ＡまたはＷＡＰＡＬにハイブリダイズするプローブを含み、少なくとも１つの第２のフランキングプローブは、ＦＡＳにハイブリダイズするプローブを含む、実施形態４１に記載の方法。
４３．ＴＳＰＡＮ１５にハイブリダイズする少なくとも１つの第３のフランキングプローブを提供するステップを含む、実施形態４１〜４２のいずれか１つに記載の方法。
４４．ＳＵＦＵにハイブリダイズする少なくとも１つの第４のフランキングプローブを提供するステップを含む、実施形態４１〜４３のいずれか１つに記載の方法。
４５．癌抑制遺伝子は、ｐ１６、ＲＢ１、およびｐ５３から選ばれる、実施形態３３および３５〜４０のいずれか１つに記載の方法。
４６．少なくとも１つの標的プローブならびに少なくとも第１のフランキングプローブおよび第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位は、５０〜２００ｋｂの範囲のサイズを有する、実施形態３３〜４５のいずれか１つに記載の方法。
４７．少なくとも１つの標的プローブのハイブリダイゼーション部位は、５００ｋｂ〜２０Ｍｂの範囲の距離により、少なくとも第１のフランキングプローブおよび第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位から分離している、実施形態３３〜４６のいずれか１つに記載の方法。
４８．癌抑制遺伝子の欠失についてのＦＩＳＨベースのアッセイを最適化するための方法であって、
（ａ）複数の候補プローブセットを提供するステップであって、それぞれの候補プローブセットは、癌抑制遺伝子に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第１のフランキングプローブ、癌抑制遺伝子に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第２のフランキングプローブ、および癌抑制遺伝子にハイブリダイズする少なくとも１つの標的プローブを含むステップ、
（ｂ）それぞれの候補プローブセットについて、
（ｉ）癌抑制遺伝子の完全なコピーの正倍数性の数を含む複数の細胞を含む少なくとも１つの細胞試料について候補プローブセットを用いてＦＩＳＨを実行し、
（ｉｉ）少なくとも１つの試料の複数の細胞において候補プローブセットの少なくとも第１のフランキングプローブおよび少なくとも第２のフランキングプローブならびに少なくとも１つの標的プローブからのＦＩＳＨシグナルを数え、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の数えられたＦＩＳＨシグナルからアーチファクト欠失頻度を決定するステップならびに
（ｃ）癌抑制遺伝子の欠失について最適化されたＦＩＳＨベースのアッセイにおける使用のための候補プローブセットからプローブセットを選択するステップであって、選択されたプローブセットは、ステップ（ｉｉｉ）において好ましいアーチファクト欠失頻度を有すると決定されたステップを含む方法。
４９．ステップ（ｂ）前に、その後に、またはそれと並行して、それぞれの候補プローブセットについて、
（ｉｖ）癌抑制遺伝子のホモ接合性またはヘミ接合性欠失を含む複数の細胞を含む複数の細胞試料について候補プローブセットを用いてＦＩＳＨを実行するステップ、
（ｖ）複数の細胞において候補プローブセットの少なくとも第１のフランキングプローブおよび第２のフランキングプローブならびに少なくとも１つの標的プローブからのＦＩＳＨシグナルを数えるステップ、
（ｖｉ）複数の試料のそれぞれについて、ステップ（ｖ）の数えられたＦＩＳＨシグナルから見かけ上の欠失頻度を決定するステップならびに
（ｖｉｉ）ステップ（ｖｉ）およびステップ（ｉｉｉ）の後に、複数の試料のうちのいくつが、ステップ（ｉｉｉ）のアーチファクト欠失頻度よりも有意に大きな見かけ上の欠失頻度を有すると決定されたかに基づいて候補プローブセットの感度値を決定するステップをさらに含み、
ステップ（ｃ）の選択されたプローブセットは、ステップ（ｖｉｉ）において好ましい感度値を有することが決定されている、実施形態４８に記載の方法。
５０．細胞試料は、固定され、保存される、実施形態４８〜４９のいずれか１つに記載の方法。
５１．細胞試料は、３〜６μｍの範囲の厚さを有する、ホルマリン固定パラフィン包埋試料である、実施形態５０に記載の方法。
５２．ＰＴＥＮにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、ＦＡＳまたはＳＵＦＵにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、およびＴＳＰＡＮ１５にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含むプローブセット。
５３．実施形態５２のプローブセットを含む、ＰＴＥＮ遺伝子における欠失を検出するためのキット。
５４．ＰＴＥＮにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、ＦＡＳまたはＳＵＦＵにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、およびＴＳＰＡＮ１５にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブが、識別可能に標識される、実施形態５２に記載のプローブセット。
５５．ＢＭＰＲ１ＡまたはＷＡＰＡＬに結合する少なくとも１つのプローブをさらに含む、実施形態５２および５４のいずれか１つに記載のプローブセット。
５６．プローブセットは、ＦＡＳに結合するプローブを含む、実施形態５２および５４〜５５のいずれか１つに記載のプローブセット。
５７．ＳＵＦＵに結合するプローブをさらに含む、実施形態５２および５４〜５６のいずれか１つに記載のプローブセット。
５８．少なくとも１つの染色体計数プローブをさらに含む、実施形態５２および５４〜５７のいずれか１つに記載のプローブセット。
５９．プローブセットは、細菌人工染色体に由来する、ＰＴＥＮにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、ＦＡＳまたはＳＵＦＵにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、およびＴＳＰＡＮ１５にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含む、実施形態５２および５４〜５８のいずれか１つに記載のプローブセット。
６０．ＰＴＥＮにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブは、ＲＰ１１−８４６Ｇ１７に由来するプローブを含み、ＦＡＳにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブは、ＲＰ１１−３９９０１９およびＲＰ１１−３６０Ｈ２０の少なくとも１つに由来するプローブを含み、ＴＳＰＡＮ１５にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブは、ＲＰ１１−１６８Ｂ４およびＲＰ１１−１２４Ｌ５の少なくとも１つに由来するプローブを含む、実施形態５９に記載のプローブセット。
６１．プローブセットは、ＲＰ１１−８４６６１７、ＲＰ１１−３９９０１９およびＲＰ１１−３６０Ｈ２０の少なくとも１つ、ならびにＲＰ１１−１６８Ｂ４およびＲＰ１１−１２４Ｌ５の少なくとも１つに由来するプローブから成る、実施形態６０に記載のプローブセット。
６２．ＰＴＥＮにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、ＦＡＳまたはＳＵＦＵにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、およびＴＳＰＡＮ１５にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブが、識別可能に標識される、実施形態５２および５４〜６１のいずれか１つに記載のプローブセットを含む組成物。
６３．第２１染色体のバンド２１ｑ２２．１３−２１ｑ２２．３における欠失についてのＦＩＳＨベースのアッセイを行う方法であって、
（ａ）複数の細胞を含む細胞試料についてプローブセットを用いてＦＩＳＨを実行するステップであって、
プローブセットは、
ＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧとの間に位置する少なくとも１つの標的遺伝子にハイブリダイズする少なくとも１つの標的プローブ、
少なくとも１つの標的遺伝子に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第１のフランキングプローブ、
ならびに少なくとも１つの標的遺伝子に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第２のフランキングプローブを含むステップ、
（ｂ）複数の細胞において、少なくとも第１のフランキングプローブおよび少なくとも第２のフランキングプローブならびに少なくとも１つの標的プローブからのＦＩＳＨシグナルを数えるステップ、
（ｃ）（ｉ）アーチファクトヘミ接合性欠失頻度および（ｉｉ）アーチファクトホモ接合性欠失頻度から選ばれる少なくとも１つのアーチファクト欠失頻度を提供するステップ、
（ｄ）ステップ（ｂ）の数えられたＦＩＳＨシグナルから、（ｉ）見かけ上のヘミ接合性欠失頻度および（ｉｉ）見かけ上のホモ接合性欠失頻度から選ばれる少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度を決定するステップであって、ステップ（ｃ）においてアーチファクトホモ接合性欠失頻度が提供されなかった場合、少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度は、見かけ上のヘミ接合性欠失頻度を含み、ステップ（ｃ）においてアーチファクトヘミ接合性欠失頻度が提供されなかった場合、少なくとも１つの見かけ上の欠失頻度は、見かけ上のホモ接合性欠失頻度を含むステップ、ならびに
（ｅ）見かけ上のヘミ接合性欠失頻度がアーチファクトヘミ接合性欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、試料が、標的遺伝子の少なくとも１つのヘミ接合性の欠失を有する細胞を含むかどうかを決定するか、または見かけ上のホモ接合性欠失頻度がアーチファクトホモ接合性欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、試料が、標的遺伝子の少なくとも１つのホモ接合性の欠失を有する細胞を含むかどうかを決定するステップを含む方法。
６４．少なくとも１つの標的遺伝子は、ＥＴＳ２、ＦＳＭＧ１、Ｂ３ＧＡＬＴ５、ＨＭＧＮ１、ＤＳＣＡＭ、およびＢＡＣＥ２から選ばれる、実施形態６３に記載の方法。
６５．ｐが、ｔ検定に従って０．０５以下である場合に、見かけ上の頻度は、アーチファクトの頻度よりも有意に大きい、実施形態６３〜６４のいずれか１つに記載の方法。
６６．見かけ上の頻度が、３標準偏差分、アーチファクトの頻度を超える場合に、見かけ上の頻度は、アーチファクトの頻度よりも有意に大きい、実施形態６３〜６４のいずれか１つに記載の方法。
６７．少なくとも１つの第１のフランキングプローブは、少なくとも１つの標的遺伝子に対してセントロメア側の境界ゾーン内のまたはそれに対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする、実施形態６３〜６６のいずれか１つに記載の方法。
６８．少なくとも１つの第２のフランキングプローブは、少なくとも１つの標的遺伝子に対してテロメア側の境界ゾーン内のまたはそれに対してテロメア側の位置にハイブリダイズする、実施形態６３〜６７のいずれか１つに記載の方法。
６９．ステップ（ｃ）においてアーチファクトヘミ接合性欠失頻度およびアーチファクトホモ接合性欠失頻度を提供するステップ、ステップ（ｄ）において見かけ上のヘミ接合性欠失頻度および見かけ上のホモ接合性欠失頻度を決定するステップ、ならびにステップ（ｅ）において、試料が少なくとも１つの標的遺伝子のヘミ接合性の欠失を有する細胞を含むかどうかおよび試料が少なくとも１つの標的遺伝子のホモ接合性の欠失を有する細胞を含むかどうかの両方を決定するステップを含む、実施形態６３〜６８のいずれか１つに記載の方法。
７０．プローブセットは、染色体２１に対して特異的な少なくとも１つの染色体計数プローブをさらに含み、少なくとも１つの染色体計数プローブからのＦＩＳＨシグナルを数えるステップ、見かけ上の異数体の頻度を決定するステップ、および見かけ上の異数体の頻度が、アーチファクトの異数体の頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、試料における細胞が、当該染色体について異数体かどうかを決定するステップをさらに含む、実施形態６３〜６９のいずれか１つに記載の方法。
７１．細胞試料は、固定され、保存される、実施形態６３〜７０のいずれか１つに記載の方法。
７２．細胞試料は、３〜６μｍの範囲の厚さを有する、ホルマリン固定パラフィン包埋試料である、実施形態７１に記載の方法。
７３．少なくとも１つの標的遺伝子は、ＨＭＧＮ１を含む、実施形態６３〜７２のいずれか１つに記載の方法。
７４．少なくとも１つの標的遺伝子は、ＤＳＣＡＭを含む、実施形態６３〜７３のいずれか１つに記載の方法。
７５．プローブセットは、少なくとも２つの標的遺伝子にハイブリダイズする少なくとも２つの標的プローブを含む、実施形態６３〜７４のいずれか１つに記載の方法。
７６．少なくとも２つの標的遺伝子は、ＨＭＧＮ１およびＤＳＣＡＭを含む、実施形態７５に記載の方法。
７７．少なくとも１つの第１のフランキングプローブは、ＥＲＧにハイブリダイズするプローブを含む、実施形態６３〜７６のいずれか１つに記載の方法。
７８．少なくとも１つの第２のフランキングプローブは、ＴＭＰＲＳＳ２にハイブリダイズするプローブを含む、実施形態６３〜７７のいずれか１つに記載の方法。
７９．少なくとも１つの標的プローブならびに少なくとも第１のフランキングプローブおよび第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位は、５０〜２００ｋｂの範囲のサイズを有する、実施形態６３〜７８のいずれか１つに記載の方法。
８０．少なくとも１つの標的プローブのハイブリダイゼーション部位は、５００ｋｂ〜２０Ｍｂの範囲の距離により、少なくとも第１のフランキングプローブおよび第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位から分離している、実施形態６３〜７９のいずれか１つに記載の方法。
８１．第２１染色体のバンド２１ｑ２２．１３−２１ｑ２２．３における小さな欠失および大きな欠失を識別可能に検出するためのＦＩＳＨベースのアッセイを行う方法であって、
（ａ）プローブセットを用いて複数の細胞を含む細胞試料についてＦＩＳＨを実行するか、またはプローブセットに含まれる第１のプローブサブセットを用いて複数の細胞を含む第１の細胞試料についてＦＩＳＨを実行し、前記プローブセットに含まれる第２のプローブサブセットを用いて第１の細胞試料と同じ個体に由来する複数の細胞を含む第２の細胞試料についてＦＩＳＨを実行するステップであって、
プローブセットは、
ＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧとの間に位置する少なくとも２つの標的遺伝子にハイブリダイズする少なくとも２つの標的プローブ、
少なくとも２つの標的遺伝子に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第１のフランキングプローブ、
少なくとも２つの標的遺伝子に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第２のフランキングプローブ、
ならびに任意選択で、第１のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第３のフランキングプローブおよび第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第４のフランキングプローブのうちの少なくとも１つを含むステップ、
（ｂ）複数の細胞または複数の複数の細胞において、少なくとも２つの標的プローブならびに少なくとも第１のフランキングプローブ、少なくとも第２のフランキングプローブ、ならびに存在する場合、少なくとも第３のフランキングプローブおよび少なくとも第４のフランキングプローブのうちの少なくとも１つからのＦＩＳＨシグナルを数えるステップ、
（ｃ）少なくとも第１のフランキングプローブおよび少なくとも第２のフランキングプローブの間にエンドポイントを有する標的遺伝子の少なくとも１つの欠失についての少なくとも１つの第１のアーチファクト欠失頻度を提供するステップであって、エンドポイントの１つは、２つの標的遺伝子の間にあるステップ、
（ｄ）標的遺伝子の少なくとも１つの欠失についての少なくとも１つの第２のアーチファクト欠失頻度を提供するステップであって、（ｉ）どのエンドポイントも２つの標的遺伝子の間に存在しないか、または（ｉｉ）少なくとも第３のフランキングプローブおよび少なくとも第４のフランキングプローブのうちの少なくとも１つが使用される場合、エンドポイントの少なくとも１つは、少なくとも第１のフランキングプローブおよび少なくとも第２のフランキングプローブの間にないステップ、
（ｅ）ステップ（ｂ）の数えられたＦＩＳＨシグナルから、少なくとも第１のフランキングプローブおよび少なくとも第２のフランキングプローブの間にエンドポイントを有する標的遺伝子の少なくとも１つの欠失についての少なくとも１つの第１の見かけ上の欠失頻度を決定するステップであって、エンドポイントの１つは、２つの標的遺伝子の間にあるステップ、
（ｆ）ステップ（ｂ）の数えられたＦＩＳＨシグナルから、標的遺伝子の少なくとも１つの欠失についての少なくとも１つの第２の見かけ上の欠失頻度を決定するステップであって、（ｉ）どのエンドポイントも２つの標的遺伝子の間にないまたは（ｉｉ）少なくとも第３のフランキングプローブおよび少なくとも第４のフランキングプローブのうちの少なくとも１つが使用される場合、エンドポイントの少なくとも１つは、少なくとも第１のフランキングプローブと少なくとも第２のフランキングプローブとの間に存在しない、ステップならびに
（ｇ）少なくとも１つの第１の見かけ上の欠失頻度が少なくとも１つの第１のアーチファクト欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、試料が、標的遺伝子の少なくとも１つの小さな欠失を有する細胞を含むかどうかを決定し、少なくとも１つの第２の見かけ上の欠失頻度が少なくとも１つの第２のアーチファクトホモ接合性欠失頻度よりも有意に大きいかどうかに基づいて、試料が、標的遺伝子の少なくとも１つの大きな欠失を有する細胞を含むかどうかを決定するステップ
を含む方法。
８２．少なくとも２つの標的遺伝子は、ＥＴＳ２、ＦＳＭＧ１、Ｂ３ＧＡＬＴ５、ＨＭＧＮ１、ＤＳＣＡＭ、およびＢＡＣＥ２から選ばれる、実施形態８１に記載の方法。
８３．プローブセットは、第１のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第３のフランキングプローブおよび第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してテロメア側の位置にハイブリダイズする少なくとも第４のフランキングプローブのうちの少なくとも１つを含む、実施形態８１〜８２のいずれか１つに記載の方法。
８４．プローブセットに含まれる第１のプローブサブセットを用いて複数の細胞を含む第１の細胞試料についてＦＩＳＨを実行するステップおよびプローブセットに含まれる第２のプローブサブセットを用いて第１の細胞試料と同じ個体に由来する複数の細胞を含む第２の細胞試料についてＦＩＳＨを実行するステップを含み、少なくとも２つの標的遺伝子は、ＨＭＧＮ１およびＤＳＣＡＭを含み、第１のプローブサブセットは、ＤＹＲＫ１ＡにハイブリダイズするフランキングプローブおよびＴＭＰＲＳＳ２にハイブリダイズするフランキングプローブを含み、第２のプローブサブセットは、ＥＲＧにハイブリダイズするフランキングプローブおよびＵ２ＡＦ１にハイブリダイズするフランキングプローブを含む、実施形態８１〜８３のいずれか１つに記載の方法。
８５．少なくとも１つの第１のフランキングプローブは、少なくとも２つの標的遺伝子に対してセントロメア側の第１の境界ゾーンに対してセントロメア側の位置にハイブリダイズし、少なくとも１つの第２のフランキングプローブは、少なくとも２つの標的遺伝子に対してテロメア側の第２の境界ゾーンに対してテロメア側の位置にハイブリダイズする、実施形態８１〜８４のいずれか１つに記載の方法。
８６．（ｉ）少なくとも１つの第３のフランキングプローブは、存在し、少なくとも１つの第１のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してセントロメア側の第１の遠位の境界ゾーンに対してセントロメア側の位置にハイブリダイズする、または（ｉｉ）少なくとも１つの第４のフランキングプローブは、存在し、少なくとも１つの第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位に対してテロメア側の第２の遠位の境界ゾーンに対してテロメア側の位置にハイブリダイズする、実施形態８１〜８５のいずれか１つに記載の方法。
８７．少なくとも１つの第１のフランキングプローブは、少なくとも２つの標的遺伝子に対してセントロメア側の第１の境界ゾーンに対してセントロメア側の位置にハイブリダイズし、少なくとも１つの第２のフランキングプローブは、少なくとも２つの標的遺伝子に対してテロメア側の第２の境界ゾーンに対してテロメア側の位置にハイブリダイズする、実施形態８６に記載の方法。
８８．細胞試料は、固定され、保存される、実施形態８１〜８７のいずれか１つに記載の方法。
８９．細胞試料は、３〜６μｍの範囲の厚さを有する、ホルマリン固定パラフィン包埋試料である、実施形態８８に記載の方法。
９０．少なくとも２つの標的遺伝子は、ＨＭＧＮ１およびＤＳＣＡＭを含む、実施形態８１〜８３および８５〜８９のいずれか１つに記載の方法。
９１．少なくとも１つの第１のフランキングプローブは、ＥＲＧにハイブリダイズするプローブを含み、少なくとも１つの第２のフランキングプローブは、ＴＭＰＲＳＳ２にハイブリダイズするプローブを含む、実施形態９０に記載の方法。
９２．ＤＹＲＫ１Ａにハイブリダイズする少なくとも１つの第３のフランキングプローブを提供するステップを含む、実施形態８１〜８３および８５〜９１のいずれか１つに記載の方法。
９３．Ｕ２ＡＦ１にハイブリダイズする少なくとも１つの第４のフランキングプローブを提供するステップを含む、実施形態８１〜８３および８５〜９２のいずれか１つに記載の方法。
９４．少なくとも２つの標的プローブならびに少なくとも第１のフランキングプローブおよび第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位は、５０〜２００ｋｂの範囲のサイズを有する、実施形態８１〜９３のいずれか１つに記載の方法。
９５．少なくとも２つの標的プローブのハイブリダイゼーション部位は、５００ｋｂ〜２０Ｍｂの範囲の距離により、少なくとも第１のフランキングプローブおよび第２のフランキングプローブのハイブリダイゼーション部位から分離している、実施形態８１〜９４のいずれか１つに記載の方法。
９６．ＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧとの間に位置する少なくとも１つの標的遺伝子にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、ＤＹＲＫ１ＡまたはＥＲＧにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、ならびにＴＭＰＲＳＳ２またはＵ２ＡＦ１にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含むプローブセット。
９７．少なくとも１つの標的遺伝子にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、ＤＹＲＫ１ＡまたはＥＲＧにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、およびＴＭＰＲＳＳ２またはＵ２ＡＦ１にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブは、識別可能に標識される、実施形態９６に記載のプローブセット。
９８．少なくとも１つの標的遺伝子は、ＥＴＳ２、ＦＳＭＧ１、Ｂ３ＧＡＬＴ５、ＨＭＧＮ１、ＤＳＣＡＭ、およびＢＡＣＥ２から選ばれる、実施形態９６〜９７のいずれか１つに記載のプローブセット。
９９．プローブセットは、ＨＭＧＮ１に結合するプローブを含む、実施形態９６〜９８のいずれか１つに記載のプローブセット。
１００．プローブセットは、ＤＳＣＡＭに結合するプローブを含む、実施形態９６〜９９のいずれか１つに記載のプローブセット。
１０１．プローブセットは、ＤＹＲＫ１Ａに結合するプローブを含む、実施形態９６〜１００のいずれか１つに記載のプローブセット。
１０２．プローブセットは、Ｕ２ＡＦ１に結合するプローブを含む、実施形態９６〜１０１のいずれか１つに記載のプローブセット。
１０３．プローブセットは、ＴＭＰＲＳＳ２に結合するプローブを含む、実施形態９６〜１０２のいずれか１つに記載のプローブセット。
１０４．プローブセットは、ＥＲＧに結合するプローブを含む、実施形態９６〜１０３のいずれか１つに記載のプローブセット。
１０５．少なくとも１つの染色体計数プローブをさらに含む、実施形態９６〜１０４のいずれか１つに記載のプローブセット。
１０６．プローブセットにおけるプローブの少なくとも３つは、細菌人工染色体に由来する、実施形態９６〜１０５のいずれか１つに記載のプローブセット。
１０７．プローブセットは、ＲＰ１１−１３７Ｊ１３およびＲＰ１１−３４８Ｃ１５の少なくとも１つに由来するＨＭＧＮ１にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、ＲＰ１１−４７６Ｄ１７およびＲＰ１１−９５１Ｉ２１の少なくとも１つに由来するＥＲＧにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、ならびにＲＰ１１−３５Ｃ４、ＣＴＤ−３０９５Ｄ１１、およびＲＰ１１−６７１Ｌ１０の少なくとも１つに由来するＴＭＰＲＳＳ２にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含む、実施形態１０６に記載のプローブセット。
１０８．プローブセットは、ＲＰ１１−１３９Ｄ１２、ＲＰ１１−９０７Ｐ２４、ＲＰ１１−２８０Ｏ１７、ＲＰ１１−１８３Ｉ１２、ＲＰ１１−２８１Ｆ３、ＲＰ１１−１１１３Ｍ１３およびＲＰ１１−１２３Ａ７の少なくとも１つに由来するＤＳＣＡＭにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、ＲＰ１１−４７６Ｄ１７およびＲＰ１１−９５１Ｉ２１の少なくとも１つに由来するＥＲＧにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、ならびにＲＰ１１−３５Ｃ４、ＣＴＤ−３０９５Ｄ１１、およびＲＰ１１−６７１Ｌ１０の少なくとも１つに由来するＴＭＰＲＳＳ２にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含む、実施形態１０６に記載のプローブセット。
１０９．プローブセットは、ＲＰ１１−１３７Ｊ１３およびＲＰ１１−３４８Ｃ１５の少なくとも１つに由来するＨＭＧＮ１にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、ＲＰ１１−１３９Ｄ１２、ＲＰ１１−９０７Ｐ２４、ＲＰ１１−２８０Ｏ１７、ＲＰ１１−１８３Ｉ１２、ＲＰ１１−２８１Ｆ３、ＲＰ１１−１１１３Ｍ１３、およびＲＰ１１−１２３Ａ７の少なくとも１つに由来するＤＳＣＡＭにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、ＲＰ１１−４７６Ｄ１７およびＲＰ１１−９５１Ｉ２１の少なくとも１つに由来するＥＲＧにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、ならびにＲＰ１１−３５Ｃ４、ＣＴＤ−３０９５Ｄ１１、およびＲＰ１１−６７１Ｌ１０の少なくとも１つに由来するＴＭＰＲＳＳ２にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含む、実施形態１０６に記載のプローブセット。
１１０．（ｉ）ＲＰ１１−４４６Ｌ１９およびＣＴＤ−２６０１Ａ２２の少なくとも１つに由来するＵ２ＡＦ１にハイブリダイズするプローブまたは（ｉｉ）ＲＰ１１−１０５Ｏ２４、ＲＰ１１−７７７Ｊ１９、およびＣＴＤ−３１４０Ｌ２の少なくとも１つに由来するＤＹＲＫ１Ａにハイブリダイズするプローブのうちの少なくとも１つをさらに含む、実施形態１０６に記載のプローブセット。
１１１．プローブセットは、
（ｉ）ＲＰ１１−１３７Ｊ１３、ＲＰ１１−３４８Ｃ１５、ＲＰ１１−１３９Ｄ１２、ＲＰ１１−９０７Ｐ２４、ＲＰ１１−２８０Ｏ１７、ＲＰ１１−１８３Ｉ１２、ＲＰ１１−２８１Ｆ３、ＲＰ１１−１１１３Ｍ１３、およびＲＰ１１−１２３Ａ７の少なくとも１つに由来するＨＭＧＮ１またはＤＳＣＡＭにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、
（ｉｉ）ＲＰ１１−４７６Ｄ１７およびＲＰ１１−９５１Ｉ２１の少なくとも１つに由来するＥＲＧにハイブリダイズするプローブ、
（ｉｉｉ）ＲＰ１１−３５Ｃ４、ＣＴＤ−３０９５Ｄ１１、およびＲＰ１１−６７１Ｌ１０の少なくとも１つに由来するＴＭＰＲＳＳ２にハイブリダイズするプローブ、ならびに
（ｉｖ）任意選択で、（ａ）ＲＰ１１−４４６Ｌ１９およびＣＴＤ−２６０１Ａ２２の少なくとも１つに由来するＵ２ＡＦ１にハイブリダイズするプローブまたは（ｂ）ＲＰ１１−１０５Ｏ２４、ＲＰ１１−７７７Ｊ１９、およびＣＴＤ−３１４０Ｌ２の少なくとも１つに由来するＤＹＲＫ１Ａにハイブリダイズするプローブのうちの少なくとも１つに由来するプローブから成る、実施形態９６に記載のプローブセット。
１１２．（ｉ）ＲＰ１１−１３７Ｊ１３およびＲＰ１１−３４８Ｃ１５の少なくとも１つに由来するＨＭＧＮ１にハイブリダイズするプローブ、
（ｉｉ）ＲＰ１１−１３９Ｄ１２、ＲＰ１１−９０７Ｐ２４、ＲＰ１１−２８０Ｏ１７、ＲＰ１１−１８３Ｉ１２、ＲＰ１１−２８１Ｆ３、ＲＰ１１−１１１３Ｍ１３、およびＲＰ１１−１２３Ａ７の少なくとも１つに由来するＤＳＣＡＭにハイブリダイズするプローブ、
（ｉｉｉ）ＲＰ１１−４７６Ｄ１７およびＲＰ１１−９５１Ｉ２１の少なくとも１つに由来するＥＲＧにハイブリダイズするプローブ、
（ｉｖ）ＲＰ１１−３５Ｃ４、ＣＴＤ−３０９５Ｄ１１、およびＲＰ１１−６７１Ｌ１０の少なくとも１つに由来するＴＭＰＲＳＳ２にハイブリダイズするプローブ、
（ｖ）ＲＰ１１−４４６Ｌ１９およびＣＴＤ−２６０１Ａ２２の少なくとも１つに由来するＵ２ＡＦ１にハイブリダイズするプローブならびに
（ｖｉ）ＲＰ１１−１０５Ｏ２４、ＲＰ１１−７７７Ｊ１９、およびＣＴＤ−３１４０Ｌ２の少なくとも１つに由来するＤＹＲＫ１Ａにハイブリダイズするプローブ
から成る、実施形態９６に記載のプローブセット。
１１３．プローブセットは、ＲＰ１１−１３９Ｄ１２、ＲＰ１１−４７６Ｄ１７およびＲＰ１１−９５１Ｉ２１の少なくとも１つ、ならびにＲＰ１１−３５Ｃ４およびＣＴＤ−３０９５Ｄ１１の少なくとも１つに由来するプローブから成る、実施形態９６に記載のプローブセット。
１１４．ＰＴＥＮにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、ＦＡＳまたはＳＵＦＵにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、およびＷＡＰＡＬにハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含むプローブセット。
１１５．実施形態９６〜１１４のいずれか１つに記載のプローブセットを含む、第２１染色体のバンド２１ｑ２２．１３−２１ｑ２２．３における欠失を検出するためのキット。
【図３】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１５】
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【図１８】
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【図２１】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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