(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ドメインＶのステム（ａ）又は（ｂ）内に塩基対ミスマッチを有さないように改変された、Ｓａｂｉｎ３の５’非コード領域からなる５’非コード領域であって、ステム（ａ）及び（ｂ）内の塩基対のうちの７個又は８個がＵ−Ａ塩基対又はＡ−Ｕ塩基対であり、前記Ｕ−Ａ塩基対がステム（ａ）内の４７１〜５３８位及び４７２〜５３７位並びにステム（ｂ）内の４７８〜５３３位、４８０〜５３１位及び４８１〜５３０位に存在し、Ａ−Ｕ塩基対がステム（ｂ）内の４７９〜５３２位及び４８２〜５２９位に存在し、又は前記Ｕ−Ａ塩基対がステム（ａ）内の４７１〜５３８位及び４７２〜５３７位並びにステム（ｂ）内の４７８〜５３３位、４８０〜５３１位及び４８１〜５３０位に存在し、Ａ−Ｕ塩基対がステム（ｂ）内の４７７〜５３４位、４７９〜５３２位及び４８２〜５２９位に存在する、５’非コード領域と、
（ii）Ｓａｂｉｎ１、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ又はＳａｕｋｅｔｔ株からのカプシドコード領域Ｐ１と
（iii）Ｓａｂｉｎ３からの、プロテアーゼ２Ａコード領域を含む非構造コード領域と
を有する生存可能な弱毒化組換えポリオウイルス。
【請求項２】
Ｓａｂｉｎ３に由来する３’非コード領域を有する、請求項１に記載のポリオウイルス。
【請求項３】
プロテアーゼ２Ａ遺伝子内に変異をさらに含み、前記変異が、サル起源の細胞における免疫原性粒子の収量の増加と関連している、請求項１又は２に記載のポリオウイルス。
【請求項４】
プロテアーゼ２Ａ遺伝子内の変異が、請求項１又は２に記載のポリオウイルスをＶｅｒｏ細胞内で継代することによって得ることができる、請求項３に記載のポリオウイルス。
【請求項５】
変異が、残基Ｈ２０、Ｄ３８又はＣ１０９を変化させない、請求項３又は４に記載のポリオウイルス。
【請求項６】
変異が、Ａ８Ｖ、Ｙ１０Ｃ、Ｃ１７Ｙ、Ｎ１８Ｓ、Ｙ１９Ｃ、Ｙ１９Ｈ、Ｔ２３Ｉ、Ｅ２５Ｇ、Ａ３０Ｐ、Ｉ３３Ｖ、Ｗ３５Ｒ、Ｋ４５Ｅ、Ｇ４８Ｄ、Ｅ６５Ｋ、Ｅ６５Ｖ、Ｙ７０Ｃ、Ｔ７９Ａ、Ｆ８０Ｌ、Ｙ８２Ｈ、Ｙ９３Ｈ、Ｈ９６Ｙ、Ｓ１０５Ｔ、Ｐ１０６Ｓ、Ｉ１２２Ｖ、Ｖ１２３Ａ、Ｇ１２７Ｒ、Ｖ１３１Ａ及びＳ１３４Ｔのうちのいずれか１又は２以上のアミノ酸の変化である、請求項３〜５のいずれかに記載のポリオウイルス。
【請求項７】
不活化されている、請求項１〜６のいずれかに記載のポリオウイルス。
【請求項８】
ワクチンにおいて使用するための、請求項７に記載のポリオウイルス。
【請求項９】
請求項７に記載のポリオウイルスと、薬学的に許容される担体又は希釈剤とを含むワクチン。
【請求項１０】
不活化ポリオワクチン（ＩＰＶ）の種としての、請求項１〜６のいずれかに記載のポリオウイルスのインビトロでの使用。
【請求項１１】
不活化ポリオワクチンを調製する方法であって、
（ｉ）請求項１〜６のいずれかに記載のポリオウイルスを生体外の細胞培養で増殖させるステップと、
（ii）前記ポリオウイルスを不活化するステップと、
（iii）前記不活化ポリオウイルスを、薬学的に許容される担体又は希釈剤と共に製剤化
するステップと
を含む方法。
【請求項１２】
ポリオウイルスを非ヒト細胞内で増殖させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ポリオウイルスに対してワクチン接種する方法において使用するための医薬品の製造における、請求項７に記載のポリオウイルスの使用。
【請求項１４】
請求項７に記載のポリオウイルスを含む、ポリオウイルスに対するワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不活化ポリオワクチンに関する。特に、本発明は、不活化ポリオワクチン、不活化ポリオワクチンの生成において使用される弱毒化ポリオウイルス及びこうした不活化ポリオワクチンの調製に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界保健機関（ＷＨＯ，World Health Organisation）の世界ポリオ根絶計画は、大きな進歩を遂げてきた。このプログラムで使用される主な手段は、弱毒化経口生ポリオワクチンとなっている。この弱毒化生ワクチンは、低い割合の受容者又はその接触者においてワクチンに関連した灰白髄炎を引き起こすことが長年にわたって知られており、より最近では、感染性の表現型に復帰し得ることが知られており、これは、ポリオが消滅しているためにワクチンプログラムが活発でなくなっている世界のいくつかの地域で大流行を引き起こす。一部の免疫不全患者によるワクチン由来のポリオウイルスの長期の排出も詳しく報告されている。したがって、経口ポリオワクチンの使用及びその表現型を変えるその能力は、世界的にポリオの根絶における問題である。
【０００３】
一部の地域では監視不足のために野生型ウイルスが検出されずに循環していることもあるので、最後の野生型ウイルスが隔離されたと考えられるときに直ちにワクチン接種をやめることは全く賢明ではないだろう。また、免疫不全の個体は、ワクチン接種後にきわめて長期にわたってウイルスの排出を継続することもあり、再発生の源となり得る。さらに、経口ワクチンによってその使用の最終回から引き起こされる大流行が依然としてあり得る。
【０００４】
したがって、ワクチン接種及び監視は、野生型ウイルスの根絶が宣言された後にいくらかの間、継続しなければならない。これは、監視及びワクチン生成に従事する研究所におけるポリオウイルスの使用を必要とする。ワクチン生成は、Salkによって開発された種類の不活化ポリオワクチン（ＩＰＶ，inactivated poliovaccine）の製造に主に関することになる。
【０００５】
このSalkワクチンは、生体外のVero細胞内で増殖させる、ポリオウイルスの３種の野生の有毒な野生型株、すなわち、Ｍａｈｏｎｅｙ（１型ポリオウイルス）、ＭＥＦ−１（２型ポリオウイルス）、及びＳａｕｋｅｔｔ（３型ポリオウイルス）株に基づいている（Wood et al, Biologicals 25:59-64, 1997）。これらの野生型ポリオウイルスは、次いで、ＩＰＶを生成するためにホルマリンで不活化される。ＩＰＶの生成において現在使用されている野生型株は、ヒトにおいて麻痺性であることが知られており、ＩＰＶの生成において大量に使用されている。これは、重大な封じ込めの問題を提示し、これは、ＩＰＶに必要とされる生成規模と調和させるのが容易ではないこともある。経口ワクチンで使用されるのと同一の株を不活化ワクチンの製造で使用することには、それらが弱毒化されており、したがって、それらが流出したとしてもあまり危険を呈さないという根拠でいくらかの関心が示されている。しかし、ヒトで複製する際にそれらが不安定であることは、それらが危険なままであり、それらの免疫原性特性が現在使用されている野生型株のものと異なることを意味し、したがって、これらの株に基づくＩＰＶを開発する主要な臨床開発プログラムが必要となる。
【０００６】
本質的に経験的な手順を使用して１９５０年代にSabinによって開発された弱毒化生ポリオウイルスワクチンは、経口生ポリオワクチンとして世界中で使用されてきた。過去数年にわたり、科学者達は、これらのワクチン株の神経毒性が低減される機序を明らかにする試みにおいていくつかの分子生物学的技術を用いてきた。その研究の大部分は、血清型１及び３に集中している。これらの双方について、ワクチン株の完全なヌクレオチド配列が、神経毒性のあるそれらの原種のものと比較されている。ポリオウイルス１型の場合には、ワクチン株は、７４４１塩基のゲノム内の４７位でその原種と異なっている（Nomoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5793-5797, 1982）。ポリオウイルス３型についての類似した試験により、ワクチン株とその原種株との間で７４３２塩基のゲノム内にちょうど１０個のヌクレオチド配列の相違が明らかにされている（Stanway et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1539-1543, 1984）。
【０００７】
２型株は天然に弱毒化した親から開発されたが、ワクチンに関連した灰白髄炎の症例から単離された、神経毒性復帰株の解析により、Ｓａｂｉｎ２から１７個の相違が特定された（Pollard et al., J. Virol. 63: 4949-4951, 1989）。
【０００８】
ポリオウイルス３型株のゲノムの５’非コード領域の二次構造についてのモデルは、以前に提唱されている（Skinner et al., J. Mol. Biol. 207: 379-392, 1989）。ドメインＶ（ヌクレオチド４７１〜５３８）に関して、４７１〜４７３位及び４７７〜４８３位の塩基は、それぞれ以下のように、５３８〜５３６位及び５３４〜５２８位の塩基と対にされる：
0005955860.tif 000002
【０００９】
便宜上、これらの対にされる領域は、ステム（ａ）（４７１〜４７３／５３８〜５３６）及びステム（ｂ）（４７７〜４８３／５３４〜５２８）と呼ばれる。ドメインＶのステム（ａ）又はステム（ｂ）の塩基対が逆向きにされた弱毒化ポリオウイルスは、欧州特許出願公開第０３８３４３３号明細書に開示されている。ポリオウイルスゲノムの５’非コード領域のドメインＶのステム（ａ）又は（ｂ）内にＵ−Ｇ塩基対又は他の塩基対ミスマッチ（Watson−Crick型塩基対からの逸脱）を有さない弱毒化ポリオウイルスは、国際公開第９８／４１６１９号パンフレット及び国際公開第２００８／０１７８７０号パンフレットに記載されている。これらの弱毒化ポリオウイルスは、親であるＳａｂｉｎワクチン株と実質的に同一の弱毒化、又はそれよりも高度の弱毒化を有する（したがってこれらは使用するのに安全である）が、遺伝的にはるかにより安定である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】欧州特許出願公開第０３８３４３３号明細書
【特許文献２】国際公開第９８／４１６１９号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００８／０１７８７０号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Wood et al, Biologicals 25:59-64, 1997
【非特許文献２】Nomoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5793-5797, 1982
【非特許文献３】Stanway et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1539-1543, 1984
【非特許文献４】Pollard et al., J. Virol. 63: 4949-4951, 1989
【非特許文献５】Skinner et al., J. Mol. Biol. 207: 379-392, 1989
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ＩＰＶの種として使用するための内部型組換えポリオウイルス株を開発した。本発明のポリオウイルス株は、免疫原性特性が改良され、組織培養細胞内での増殖能力が高められている。本発明のポリオウイルス株はさらに、弱毒化され遺伝的に安定であり、ＩＰＶ生成に使用するのに安全であるようにされている。特に、本発明者らは、驚くべきことに、遺伝的に改変されたＳａｂｉｎ３の５’非コード領域と、Ｓａｂｉｎ１、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ又はＳａｕｋｅｔｔからのカプシドタンパク質（capsid protein）と、Ｓａｂｉｎ３からの非構造コード領域及び３’非コード領域とを含む内部型組換えポリオウイルスが、５’非コード領域に同一の遺伝的改変を有するＳａｂｉｎ３株と比較して改良された免疫原性特性を有することを見出した。本発明のポリオウイルス株は、組織培養で増殖させることができ、ＩＰＶの種として機能するのに必要な免疫原性を有するが、ヒトではそれらが大量に曝露された場合でさえ全く複製しないことになる。
【００１３】
したがって、本発明は、
（ｉ）ドメインＶのステム（ａ）又は（ｂ）内に塩基対ミスマッチを有さないように改変された、Ｓａｂｉｎ３の５’非コード領域からなる５’非コード領域であって、ステム（ａ）及び（ｂ）内の塩基対のうちの７個又は８個がＵ−Ａ塩基対又はＡ−Ｕ塩基対である５’非コード領域、
（ii）Ｓａｂｉｎ１、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ又はＳａｕｋｅｔｔ株からのカプシドタンパク質と
を有する弱毒化組換えポリオウイルスを提供する。
【００１４】
本発明は、
−ワクチンにおいて使用するための本発明の不活化ポリオウイルス;
−不活化ポリオワクチン（ＩＰＶ）の種としての本発明のポリオウイルスの使用と、
−不活化ポリオウイルス及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含み、アジュバントを含んでもよいワクチン;並びに
−不活化ポリオワクチンを調製する方法であって、
（ｉ）請求項１〜７のいずれかに記載のポリオウイルスを生体外の細胞培養で増殖させるステップと、
（ii）前記ポリオウイルスを不活化するステップと、
（iii）前記不活化ポリオウイルスを、薬学的に許容される担体又は希釈剤と共に製剤化するステップと
を含む方法
も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】３型ワクチン株Ｓａｂｉｎ３並びに株Ｓ１５、Ｓ１７、Ｓ１８及びＳ１９のドメインＶ（ヌクレオチド４７１〜５３８）の、予測されるＲＮＡ二次構造を示す図である。改変株に導入した変異を太字で示している。
【図２】Ｓ１８に基づいた改変株のゲノム構造を示す図である。株Ｓ１８に存在する又は導入した、固有の制限部位を使用して、ドメインＶ及び／又はカプシドタンパク質（Ｐ１）コード領域を相互に交換する。ウイルス命名法は形式に従い、そこでは、「Ｓ１９／ＭａｈＰ１」は、Ｓ１９のドメインＶ配列、Ｍａｈｏｎｅｙのカプシド配列及びＳａｂｉｎ３の非構造コード領域を有するウイルスを意味する。
【図３】種々の細胞における３型株の温度感受性を例示する図である。Ｌ２０Ｂ細胞、Ｖｅｒｏ、ＭＲＣ５及びＨｅｐ２Ｃ細胞における異なる温度でのプラーク形成によってウイルスをアッセイして、結果を、３１℃でのＰＦＵと比較した各温度でのＰＦＵにおける減少を示すグラフ上にプロットした。
【図４】ＭＲＣ５細胞における３３℃での一段増殖を示す図である。複製細胞シートを同調的に３型ウイルスに感染させて、３３℃でインキューベートし、次いで、異なる時間に回収してウイルス力価を決定した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
ポリオウイルスゲノムは、１本の長いポリペプチドとして宿主細胞によって翻訳される単一線状ＲＮＡ分子である。ポリオウイルスＲＮＡは、高度に構造化された長い５’末端を含み、これは、ポリペプチド産物をコードしておらず、Ｉ〜VIの６つのドメインを含有している。これらのドメインのうちのいくつか（ドメインＶを含む）は、翻訳の開始を決定する内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ，Internal Ribosome Entry Site）を共に含む。ポリオウイルスＲＮＡのコード領域は、２つの領域に分けられ、１つは、ウイルスのカプシドを構成する構造タンパク質をコードし、もう１つは、ウイルスのプロテアーゼ及びウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ等の非構造タンパク質をコードしている。３’非翻訳領域は、５’非コード領域よりも複雑でない。
【００１７】
本発明者らは、５’非コード領域のドメインＶに変異を有し、そのため、野生型ポリオウイルス株と比較して弱毒化されていると共に遺伝的に安定である、ポリオウイルスの内部型組換え株を開発した。本発明の内部型組換えポリオウイルス株は、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２、Ｓａｂｉｎ３、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ又はＳａｕｋｅｔｔポリオウイルス株からの１種又は２種以上のカプシドタンパク質も有する。ポリオウイルスのカプシドタンパク質は、ポリオウイルス粒子を囲むタンパク質外殻を形成する。したがって、これらのカプシドタンパク質は、宿主の免疫系に曝露され、ポリオウイルスに対する宿主の免疫応答を導く。内部型組換えポリオウイルスのカプシドタンパク質を変化させることにより、ポリオウイルスの免疫原性特性の操作が可能になる。
【００１８】
したがって、本発明の弱毒化ポリオウイルスは、Ｓａｂｉｎ３の５’非コード領域を含み、それは、ドメインＶのステム（ａ）及び（ｂ）が塩基対ミスマッチを含まず、且つステム（ａ）及び（ｂ）内の塩基対のうちの７個又は８個がＡ−Ｕ又はＵ−Ａ塩基対であるように改変されている。本発明の弱毒化ポリオウイルスは、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２、Ｓａｂｉｎ３、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ又はＳａｕｋｅｔｔ株からの、好ましくは、Ｓａｂｉｎ１、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ及び／又はＳａｕｋｅｔｔからの、より好ましくは、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ及び／又はＳａｕｋｅｔｔからの、カプシドタンパク質、こうした１種のカプシドタンパク質、２種以上のカプシドタンパク質、又は全構造タンパク質も含む。
【００１９】
ドメインＶの改変
本発明の弱毒化ポリオウイルスは、遺伝的に安定であり、ＩＰＶの種として使用するのに安全である。これは、野生型を再生するのに２つの同時の変異が必要とされるようにＧＣ塩基対をＡＵ塩基対で置き換えることにより、並びに単一変異によるＧＣへの復帰及び構造を強化する結果を防ぐためにＧＵ塩基対をＡＵ塩基対で置き換えることにより、５’非コード領域内のドメインＶの構造を弱めることによって達成される。ドメインＶの熱力学的安定性がＳａｂｉｎ３型ワクチン株のものと同じになるように調整されたウイルスは、同一の生物学的特性を有するが、継代において安定であることが示されている（Macadam et al (2006) J Virol. 80(17):8653-63）。本発明の弱毒化ポリオウイルスは、ドメインＶのステム（ａ）又は（ｂ）内に塩基対ミスマッチを有さないように改変された、Ｓａｂｉｎ３の５’非コード領域からなる５’非コード領域であって、ステム（ａ）及び（ｂ）内の塩基対のうちの７個又は８個がＵ−Ａ又はＡ−Ｕ塩基対である５’非コード領域を含む。
【００２０】
好ましい一実施形態において、本発明の弱毒化ポリオウイルスは、Ｕ−Ａ塩基対がステム（ａ）内の４７１〜５３８位及び４７２〜５３７位並びにステム（ｂ）内の４７８〜５３３位、４８０〜５３１位及び４８１〜５３０位に存在し、Ａ−Ｕ塩基対がステム（ｂ）内の４７９〜５３２位及び４８２〜５２９位に存在する、改変された、Ｓａｂｉｎ３の５’非コード領域のドメインＶを含む。改変されたＶドメインの配列は、以下の通りであってもよい：
AUUCUAACUAUUAAGCAGGCAGCUGCAACCCAGCAGCCAGCCUGUCGUAACGCGCAAGUUAAUAGCGAAA（配列番号１）。
【００２１】
他の好ましい一実施形態において、本発明の弱毒化ポリオウイルスは、Ｕ−Ａ塩基対がステム（ａ）内の４７１〜５３８位及び４７２〜５３７位並びにステム（ｂ）内の４７８〜５３３位、４８０〜５３１位及び４８１〜５３０位に存在し、Ａ−Ｕ塩基対がステム（ｂ）内の４７７〜５３４位、４７９〜５３２位及び４８２〜５２９位に存在する、改変された、Ｓａｂｉｎ３の５’非コード領域のドメインＶを含む。改変されたドメインＶの配列は、以下の通りであってもよい：
AUUCUAAAUAUUAAGCAGGCAGCUGCAACCCAGCAGCCAGCCUGUCGUAACGCGCAAGUUAAUAUCGAAA（配列番号２）。
【００２２】
本発明のポリオウイルスは、対応して、Ｓａｂｉｎ１又はＳａｂｉｎ２ポリオウイルスのステム（ａ）及び（ｂ）の配列に由来していてもよい。
【００２３】
本発明のポリオウイルスの５’非コード領域内の変異は、ウイルスの毒性を弱毒化させてウイルスを遺伝的に安定化し、それによって、それらが毒性に復帰する可能性を少なくする。したがって、これらの変異は、ウイルスを不活化ポリオワクチンの生成に現在使用されている野生型ウイルスに必要とされる封じ込めレベルよりも低い封じ込めレベルで生成しても安全であるようにする。
【００２４】
ドメインＶ内の変異は、当技術分野において知られている変異誘発の標準的な方法うちのいずれによって導入されてもよい。例えば、変異は、ポリオウイルスのゲノムＲＮＡに対応するコピーＤＮＡの部位特異的変異誘発により、ポリオウイルスの株、通常はＳａｂｉｎ株に導入され得る。これは、ポリオウイルスゲノムの感染性のＤＮＡコピーからの適切な領域を、Ｍ１３等のバクテリオファージの１本鎖ＤＮＡ内にサブクローニングすることによって達成されてもよい。代替的に、変異配列は、完全にインビトロで合成することもできる。
【００２５】
当該変異又は各変異の導入後、改変されサブクローニングされたコピーＤＮＡは、それらが由来する完全なコピーＤＮＡ内に再導入される。生ウイルスは、インビトロで転写を導くためにＴ７プロモーターを典型的には使用してポジティブセンスＲＮＡを生成することにより、変異した全長コピーＤＮＡから回収される（Van der Werf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2330-2334, 1986）。
【００２６】
回収されたＲＮＡは、標準的な技術を使用して組織培養に適用され得る（Koch, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 61:89-138, 1973）。インキュベーションの２〜３日後に、ウイルスは、組織培養の上清から回収され得る。次いで、ヒトのポリオウイルス受容体のトランスジェニックマウスにおいて標準的なＬＤ５０試験を使用して、又はサルにおいてＷＨＯに承認されているワクチン安全性試験を使用して、神経毒性のレベル及びしたがって改変されたウイルスの弱毒化のレベルを未改変のウイルスのものと比較することもできる（WHO Tech. Rep. Ser. 687:107-175）。
【００２７】
ドメインＶを弱めることによる弱毒化は、ＢＧＭ細胞において（Macadam et al., Virology 181:451-458, 1991）又は（Macadam et al., Virology 189:415-422, 1992においてＣＭ−１細胞について記載されているように）Ｌ２０Ｂ細胞において温度感受性とほぼ相関することも示されている。したがって、予想される弱毒化のレベルを決定するための予備的なスクリーニングとして、改変ウイルスの温度感受性を決定することができる。これは、同一の細胞において例えば３３℃又は３５℃で得られる数からの１０の累乗（１．０ｌｏｇ１０）によって、プラーク形成単位（ｐｆｕ，plaque forming using）の数が減少する温度（Ｔ）として表され得る。Ｔの値が小さいほど弱毒化の程度が大きくなる。
【００２８】
構造コード領域
ポリオウイルスゲノムの構造コード領域は、カスピドタンパク質をコード化しており、これは、ポリオウイルス粒子の保護性のタンパク質外殻を形成する。本発明の弱毒化ポリオウイルスは、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２、Ｓａｂｉｎ３、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ又はＳａｕｋｅｔｔ株からの、好ましくは、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ及び／又はＳａｕｋｅｔｔ株からの１種又は２種以上のカプシドタンパク質を含んでいてもよい。好ましい一実施形態において、本発明の弱毒化ポリオウイルスは、Ｓａｂｉｎ１、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ又はＳａｕｋｅｔｔ株の全てのカプシドタンパク質を含む。本発明のポリオウイルスは、異なる株の任意の組合せからの、例えば、Ｍａｈｏｎｅｙ及びＭＥＦからの、Ｍａｈｏｎｅｙ及びＳａｕｋｅｔｔからの、ＭＥＦ及びＳａｕｋｅｔｔからの、又はＭａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ及びＳａｕｋｅｔｔからのカプシドタンパク質を含んでいてもよい。
【００２９】
内部型組換え株は、当技術分野において知られている標準的な技術によって生成され得る。
【００３０】
非構造コード領域及び３’非コード領域
本発明のポリオウイルスは、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２、Ｓａｂｉｎ３、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ及びＳａｕｋｅｔｔ株のうちのいずれかからの非構造コード領域及び３’非コード領域を有していてもよい。
【００３１】
好ましい一実施形態において、本発明の弱毒化ポリオウイルスは、Ｓａｂｉｎ３に由来する非構造コード領域及び３’非コード領域を有する。Ｓａｂｉｎ３を骨格とする株においてカプシドタンパク質をカセットとして交換することによって本発明のポリオウイルスを生成することは、インビトロ又はインビボにおける、カプシド領域外での株間の組換えの、可能性のある既知又は未知のあらゆる影響を排除する。これはまた、構築をより容易にし、ウイルスの特性をより予測可能にする。
【００３２】
一実施形態において、本発明の弱毒化ポリオウイルスは、特に、５’非コード領域がＳａｂｉｎ１又はＳａｂｉｎ２に由来している場合に、Ｓａｂｉｎ１又はＳａｂｉｎ２に由来する非構造コード領域及び３’非コード領域を有する。
【００３３】
プロテアーゼ２Ａ遺伝子内の変異
本発明の弱毒化ポリオウイルスは、プロテアーゼ２Ａ遺伝子内に変異を含んでいてもよく、前記変異は、Ｖｅｒｏ細胞のような、サル起源の細胞株における免疫原性粒子の収量の増加と関連している。こうした変異は、本発明のポリオウイルスをＶｅｒｏ細胞内で継代することによって又は任意の標準の変異誘発技術によって得られ得る。
【００３４】
プロテアーゼ２Ａ遺伝子内の変異は、典型的には、本発明のポリオウイルスをＶｅｒｏ細胞内で継代することによって得られるものである。サル細胞株内でポリオウイルスの収量を増加させる、プロテアーゼ２Ａ遺伝子内の他の変異も導入され得る。プロテアーゼ２Ａ遺伝子内の変異は、感染性のポリオウイルスのクローンを直接に変異させることによって導入されてもよい。
【００３５】
一実施形態において、本発明の弱毒化ポリオウイルスは、プロテアーゼ２Ａ遺伝子内に、残基Ｈ２０、Ｄ３８又はＣ１０９を変化させない変異を含む。好ましい一実施形態において、ポリオウイルスのプロテアーゼ２Ａ遺伝子の変異は、Ａ８Ｖ、Ｙ１０Ｃ、１７ＣＹ、Ｎ１８Ｓ、Ｔ１９Ｃ、Ｙ１９Ｈ、Ｌ２１Ｒ、Ｔ２３Ｉ、Ｅ２５Ｇ、Ａ３０Ｐ、Ｉ３３Ｖ、Ｗ３５Ｒ、Ｋ４５Ｅ、Ｇ４８Ｄ、Ｅ６５Ｋ、Ｅ６５Ｖ、Ｙ７０Ｃ、Ｔ７９Ａ、Ｆ８０Ｌ、Ｙ８２Ｈ、Ｙ９３Ｈ、Ｈ９６Ｙ、Ｓ１０５Ｔ、Ｐ１０６Ｓ、Ｉ１２２Ｖ、Ｖ１２３Ａ、Ｇ１２７Ｒ、Ｖ１３１Ａ及びＳ１３４Ｔのうちの１個のアミノ酸の変化を含む。
【００３６】
プロテアーゼ２Ａ遺伝子内のこれらの変異は、Ｖｅｒｏ細胞のような、サル起源の細胞株における温度感受性の低下及び／又は適応度の増大と関連すると同時に、プロテアーゼ２Ａの変異を欠いた対応するポリオウイルスにおいて認められる弱毒化の程度を保持している。
【００３７】
したがって、本発明は、本発明のポリオウイルスをＶｅｒｏ細胞内で継代することと、免疫原性粒子の収量の増加に関連する変異をプロテアーゼ２Ａ遺伝子内に有するポリオウイルスを選択することとを含む、プロテアーゼ２Ａ遺伝子内に変異を含む弱毒化ポリオウイルスを生成する方法も提供し、前記選択は、
（ｉ）プロテアーゼ２Ａ遺伝子を配列決定して、適切な変異を特定すること、又は
（ii）ポリオウイルスをスクリーニングして、Ｖｅｒｏ細胞内で継代されていない本発明のポリオウイルスと比較して、不変の、若しくは実質的に不変の弱毒化の程度及び温度感受性の低下を有するウイルス粒子を特定すること
を伴う。
【００３８】
温度感受性アッセイは、例えば、Macadam et al., Virology 189:415-22, 1992に記載のようにＶｅｒｏ細胞を使用して行われ得る。
【００３９】
プロテアーゼ２Ａ遺伝子内の変異は、上記のようにＤＮＡ内に変異を導入する既知のいかなる方法によっても導入され得る。
【００４０】
ＩＰＶの生成方法において、Ｖｅｒｏ細胞のように、ヒト以外の細胞内で増殖させる本発明のポリオウイルスは、好ましくは、本明細書中に記載のプロテアーゼ２Ａ遺伝子内に少なくとも１個の変異を含む。
【００４１】
ワクチン
本発明のポリオウイルスは、血清有病率試験等の調査活動において小規模で使用されてもよく、ＩＰＶ生成において大規模で使用されてもよい。本発明のポリオウイルスは、ポリオウイルスの根絶の前に最低限の封じ込めを必要とし、ヒトに感染性の生存可能な株についての現行のＷＨＯの指針によって必要とされているようなカテゴリーＢＳＬ３−ポリオでの根絶後の封じ込めは必要とされないことになる。
【００４２】
したがって、弱毒化ポリオウイルスは、（ＩＰＶの）種として使用されてもよい。したがって、本発明は、本発明の不活化された弱毒化ポリオウイルスを提供する。本発明は、ＩＰＶの種としての本発明によるポリオウイルスの使用も提供する。
【００４３】
本発明によってさらに提供されるのは、不活化ポリオワクチンを調製する方法であって、
（ｉ）本発明による弱毒化ポリオウイルスを生体外の細胞培養で増殖させるステップと、
（ii）前記ポリオウイルスを不活化するステップと、
（iii）前記不活化ポリオウイルスを、薬学的に許容される担体又は希釈剤と共に製剤化するステップと
を含む方法である。
【００４４】
当該弱毒化ポリオウイルスは、非ヒト培養細胞、例えばＬ２０Ｂ細胞及びＶｅｒｏ細胞内で増殖させてもよい。当該弱毒化ポリオウイルスは、ヒトの培養細胞、例えばＭＲＣ５及びＨｅｐ２Ｃ細胞内で増殖させてもよい。
【００４５】
当該ポリオウイルスは、いかなる好適な方法によって不活化されていてもよい。典型的には、現在使用されているＩＰＶにおいて野生型ポリオウイルスを不活化するのに使用される方法が用いられる。例えば、当該ポリオウイルスは、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン又はバイナリーエチレンイミン処理によって、好ましくはホルムアルデヒド処理によって、不活化されていてもよい。
【００４６】
本発明による弱毒化ポリオウイルスは、不活化されていてもよい。本発明の不活化された弱毒化ポリオウイルス株は、薬学的に許容される担体又は希釈剤と組み合わされていてもよい。ＩＰＶ製剤のような、不活化ウイルス製剤に入れて従来通りに使用されるいかなる担体又は希釈剤が用いられてもよい。ＩＰＶ製剤は、１型、２型及び／又は３型のカプシドタンパク質を含む不活化ポリオウイルスを含んでいてもよい。
【００４７】
したがって、本発明の弱毒化不活化ポリオウイルスは、ヒト患者において灰白髄炎に対してワクチン接種するために使用され得る。したがって、本発明は、ポリオウイルスに対して対象にワクチン接種をする方法であって、それを必要としている対象に本発明の不活化ポリオウイルスの有効量を投与するステップを含む方法を提供する。有効量は、ポリオウイルスに対する防御免疫応答を誘発するのに十分な量である。この目的のために、これらは、非経口等の、任意の好適な経路によって投与され得る。非経口投与は、皮下、皮内又は筋肉内の注射によるものであってもよい。本発明の不活化ポリオウイルスは、アジュバントと共に投与されてもよい。
【００４８】
８〜４０ユニットのＤ抗原のように、従来のＩＰＶについて投与される量に相当する用量が投与されてもよい。
【００４９】
本発明の不活化された内部型組換えポリオウイルスの用量は、必要とされる程度の免疫原性を達成するために調整され得る。例えば、カプシドタンパク質がＳａｂｉｎ２又はＳａｂｉｎ３に由来しているときに、カプシドタンパク質がＳａｂｉｎ１、ＭＥＦ、Ｍａｈｏｎｅｙ又はＳａｕｋｅｔｔに由来しているときよりも高い用量を使用することもできる。例えば、約１６〜約８０ユニットのＤ抗原の用量、例えば約３０ユニットのＤ抗原（例えば、３２ユニットのＤ抗原）又は約６０ユニットのＤ抗原（例えば、６４ユニットのＤ抗原）などを使用することもできる。ワクチンが適切なアジュバントと共に投与される場合には、より低い用量を使用することもできる。
【００５０】
本発明は、本発明の不活化ポリオウイルスと、薬学的に許容される担体又は希釈剤とを含むワクチンを提供する。当該ワクチンは、アジュバントをさらに含んでいてもよい。当該ワクチンは、１種又は２種以上の異なる本発明の内部型組換えポリオウイルス株を含んでいてもよい。例えば、当該ワクチンは、１型及び２型、１型及び３型、２型及び３型、又は１型、２型及び３型のポリオウイルス株からの構造タンパク質を含むウイルスの混合物を含んでいてもよい。典型的には、１型カプシドタンパク質は、Ｓａｂｉｎ１又はＭａｈｏｎｅｙ、好ましくはＭａｈｏｎｅｙから、２型カプシドタンパク質は、Ｓａｂｉｎ２又はＭＥＦ、好ましくはＭＥＦから、３型カプシドタンパク質は、Ｓａｂｉｎ３又はＳａｕｋｅｔｔ、好ましくはＳａｕｋｅｔｔからであることになる。
【００５１】
本発明の１型、２型及び３型のポリオウイルスの異なる相対免疫原性からみて、当該ワクチンは、１型、２型及び／又は３型のカプシドタンパク質を含有する異なる量のポリオウイルスを含んでいてもよい。例えば、１型：２型：３型の比率のｘ：ｙ：ｚは、ｘ＜ｙ＜ｚで使用され得る。特定の一例において、当該比率は、Ｄ抗原の３０：３２：４５ユニットであってもよい。
【００５２】
本発明の不活化ポリオウイルスは、独立のポリオワクチンとして投与されてもよく、又は、例えばＤＴＰ（ジフテリア、百日咳、破傷風）、Ｈｉｂ（ヘモフィルス（Haemophilus）インフルエンザＢ型）若しくはＢ型肝炎等の他の構成要素を含有する組合せワクチンにおいて投与されてもよい。
【００５３】
本発明は、ポリオウイルスに対してワクチン接種する方法において使用するための医薬品の製造における、本発明による不活化ポリオウイルスの使用、及びポリオウイルスに対してワクチン接種する方法において使用するための、本発明による不活化ポリオウイルスも提供する。
【００５４】
以下の例は、本発明を例示するものである。
［実施例］
【実施例１】
【００５５】
新しい株の構築
Ｓ１５、Ｓ１７、Ｓ１８及びＳ１９（表１、図１）は、３型経口ポリオワクチン株Ｓａｂｉｎ３の派生株である。標準的な方法によってウイルスを構築して回収した。変異したヌクレオチドは図１に太字で示しており、それ以外の場合、配列はＳａｂｉｎ３と同一である。ＵＡ又はＡＵ塩基対によるＣＧ塩基対の置換は、ドメインＶの熱力学的安定性を次第に低下させる；次いで、何らかの単一の変異が関連した塩基対を弱めることになるので、全てのＵＧ塩基対の除去は、構造を遺伝的に安定にする。構造を強化するためには、それが、ＵＡ塩基対をＣＧ（又はＧＣ）塩基対に変えることによってのみ達成され得るので、２個の同時の変異が必要とされることになる。
【００５６】
標準的な方法によってウイルスを構築して回収した。より詳細には、ＰＣＲ変異誘発によってＳ１７、Ｓ１８及びＳ１９を構築した。各プラスミドについて、ヌクレオチド（ａ）３１〜５０及び４７１〜４８９、（ｂ）４７１〜４８９及び５２２〜５４０並びに（ｃ）５２２〜５４０及び７５５〜７７８に位置する、Ｓａｂｉｎ３の５’非コード領域の３種の断片を、（図１に示しているように）必要な配列の変更が組み込まれているプライマーを使用してＰＣＲによって増幅した。部分的に重複したこの３種の断片（ａ）〜（ｃ）をゲル精製して、外側のプライマーと混合してそれで再増幅し、次いで、変異した５’非コード領域を含む７４７ｂｐの断片をpCR2.1（Invitrogen社製）内にクローニングしてその配列を決定した。正しい配列を有するMｌuI−SacI（２７９〜７５１）断片を、SacI−SacI（７５１〜１９００）断片を欠いているＳａｂｉｎ３クローン内に連結させた。部分的なSacI／SmaI（２７６８）断片の添加によって全長の感染性のクローンを作製した。
【００５７】
Ｓ１８及びＳ１９の双方のカプシドタンパク質コード領域（Ｐ１）を、血清型１及び血清型２の弱毒化生ワクチン株（Ｓａｂｉｎ１及びＳａｂｉｎ２）のＰ１領域と、又は現在の野生型のＩＰＶの種株であるＭａｈｏｎｅｙ（１型）、ＭＥＦ（２型）及びＳａｕｋｅｔｔ（３型）のＰ１領域と正確に置き換えた。コード配列を変更することなく、５’及び３’末端にSacI及びSacIIの制限部位を組み込んだ（図２）、関連したポリオウイルス株からのＲＮＡを鋳型及びプライマーとして使用してＰＣＲによってカプシド配列を増幅した。
【００５８】
以下のプライマーを使用してＳａｂｉｎ１及びＭａｈｏｎｅｙのＰ１領域を増幅した：
- SACI[5’-ATCATAATGGGAGCTCAGGTTTCA-3’]（配列番号３）及び
- 2ASAC1(-)[5’TTGTAACCCGCGGTGTACACAGCTTTATTCTGATGCCCAAAGCCATATGTGGTCAGAT-3’]（配列番号４）。
【００５９】
以下を用いてＳａｂｉｎ２のＰ１領域を増幅した：
- SAC2a[5’-ACAATGGGCGCTCAA-3’]（配列番号５）及び
- 2ASAC2(-)[5’-TTGTAACCCGCGGTGTACACAGCTTTATTCTGATGCCCAAAGCCATAAGTCGTTAATC-3’]（配列番号６）。
【００６０】
以下を用いてＭＥＦのＰ１領域を増幅した：
- SAC2b[5’-ACAATGGGAGCTCAA-3’]（配列番号７）及び
- 2ASACMEF(-)[5’-TTGTAACCCGCGGTGTACACAGCTTTATTCTGATGCCCAAAGCCATAGGTTGTCAAGC-3’]（配列番号８）。
【００６１】
以下のプライマーを使用してＳａｕｋｅｔｔのＰ１領域を増幅した：
- S3P1[5’-AACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGGAGCTCAAGTATCATCCCAA-3’]（配列番号９）及び
- 2ASACSkt(-)[5’-TTGTAACCCGCGGTGTACACAGCTTTATTCTGATGCCCAAAGCCGTAGGTGGTCAAAC-3’]（配列番号１０）。
【００６２】
以下のプライマーを使用してＰＣＲ変異誘発によってSacII制限部位をＳ１８内に導入した：
- 2ASAC3(+)[5’-GTGTACACCGCGGGTTACAA-3’]（配列番号１１）及び
- 2ASAC3(-)[5’-TTGTAACCCGCGGTGTACAC-3’]（配列番号１２）。
【００６３】
SacI及びSacIIの制限部位を使用して全長ゲノムプラスミド内に組み込む前に、全てのＰ１領域のコピーを含むＤＮＡ断片の配列を確認した。こうして、ドメインＶの配列内（Ｓ１８様又はＳ１９様）及びカプシドタンパク質コード配列内（Ｓａｂｉｎ又は野生；血清型１、２又は３）で異なった最終的な１２株が生成された（表２、図２）。ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲ後に、全変異体の５’非コード領域の配列を確認した。
【００６４】
２μｇ以上のＴ７転写産物を用いた、ＨＥｐ２Ｃ単層のトランスフェクション（Van der Werf et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2330-2334, 1986）によってウイルスを回収し、その後、完全な細胞変性効果が明らかになるまでの時間である、２４〜４８時間、３３℃でのインキュベーションを行った。
【実施例２】
【００６５】
弱毒化の表現型及び感染力
過去１５年間にわたり、ポリオウイルスの毒性を評価するための、ヒトのポリオウイルス受容体を発現しているトランスジェニックマウスの使用が確立され、その有効性が認められてきている。
【００６６】
ポリオウイルス受容体を発現しているトランスジェニックマウス（ＴｇＰＶＲマウス）の脊髄内接種は、ウイルスの複製によりニューロンの欠失と麻痺の明らかな臨床徴候とがもたらされるので、インビボでの感染力を測定する感度が高い方法である。１０ＰＦＵより少ない野生型ウイルスは、通常、この接種経路を使用して５０％のマウスを麻痺させるのに十分である（Chumakov et al, Dev. Biol. (Basel) 105:171-177, 2001）。
【００６７】
変異したＳａｂｉｎ３株及び内部型組換え株の弱毒化表現型を、この標準的な方法によって決定した。これらの結果を表１及び２に示している。
【００６８】
【表１】
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【００６９】
【表２】
0005955860.tif 000004
【００７０】
感度が高い脊髄内経路を使用して、１０細胞培養感染単位未満の野生型株Ｍａｈｏｎｅｙ及びＬｅｏｎは、半分のマウスを麻痺させるのに十分であった（表１）。サルの試験で認められているように（Macadam et al, 2006）、株Ｓ１５はＳａｂｉｎ３と区別できず、Ｓ１８由来の全てのウイルスは１０８ＣＣＩＤ５０を超えるＰＤ５０を有していた（表１及び２）。これらは、５μｌである、接種された用量において実行可能な最高の力価を表しているので、過小評価であろう。Ｓ１９由来のウイルスにおける３個のＣＧ−ＵＡ塩基対の交換の効果は、外挿法によって、このモデルにおける感染力が１０億分の１よりも減少しそうである。これらの結果により、Ｓ１８及びＳ１９に基づいたウイルスは、ドメインＶにおいて復帰しない限り（これらの株がそうなることはあり得ない）低い感染力を有する、Ｓａｂｉｎ３よりもヒトへの感染性が実質的に低くなることが示唆される。
【実施例３】
【００７１】
継代における安定性
安定性を評価するために、ヒト腸管内における選択を模した、Ｓａｂｉｎ３のドメインＶにおける復帰を急速に選択する条件下で、Ｌ２０Ｂ細胞において３７℃でウイルスを継代した。これらの条件下でＳ１５及び（表現型的にＳ１５と同様の）Ｓ１６のドメインＶ配列は、完全に安定であった（Macadam et al, 2006）。Ｓ１８及びＳ１９由来のウイルスも継代において安定であって、復帰不能なさらなる対の変異を有するという利点を有する。Ｖｅｒｏ細胞においても同様であったが、Ｓａｂｉｎ３のドメインＶにおける復帰の選択がより遅い速度で生じた。
【００７２】
Ｖｅｒｏで選択された全てのウイルスがプロテアーゼ２Ａ遺伝子内に変異を有しており、限られた程度まで、それらの親よりも高温で増殖した。この現象はサル細胞に対する適応を表しており、ヒト又はマウス起源の細胞では認められない。これらの変異は、インビボでの表現型に対して影響しないようである（表３）。Ｖｅｒｏ細胞における３７℃での１０回継代後のウイルスのうちの１つのＰＤ５０、及び３７℃で選択された３個のプラークは、これらの親であるＳ１８のものと区別できなかった。同様に、２ＡにおけるＮ１８Ｓ変異の存在は、野生型カプシドを有するＳ１９−ＩＰＶ株の表現型の弱毒化に対して影響しなかった（表４）。脊髄内に投与した最高用量において、いずれのマウスにも臨床疾患はなかった。灰白髄炎のサルモデルにおいて同様の結果が以前に得られた。ドメインＶ内の４８１における弱毒化変異によって引き起こされる、Ｓａｂｉｎ２の温度感受性表現型を抑制する異なる２個の２Ａ変異は、弱毒化に影響を及ぼさなかった（Rowe et al.; Virology 269:284-293, 2000）。
【００７３】
【表３】
0005955860.tif 000005
【００７４】
【表４】
0005955860.tif 000006
【実施例４】
【００７５】
細胞培養における増殖特性
細胞培養において、ドメインＶのＲＮＡ二次構造が次第に弱まることにより、ウイルスが複製できる温度の上限が次第に低下した（図３）。実際の限度は、使用した細胞の基質に依存しており、Ｈｅｐ２Ｃ細胞が最も許容性であり、Ｌ２０Ｂ細胞が最低でＶｅｒｏ細胞は中程度であった。ＭＲＣ５細胞も中程度であるが、Ｖｅｒｏ細胞よりも許容性である。
【００７６】
全ての株の増殖及び収量の動態は３３℃でのＭＲＣ５細胞におけるのと同様であり、２４時間以内に野生型ウイルス（１０８〜１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）と同じくらい多い収量を生成した（図４）。ＭＲＣ５細胞は、ＩＰＶ生成に有効であることが認められており認可されているが、これを使用する製造業者は多くなく、マイクロキャリア上での無血清Ｖｅｒｏ細胞培養が好まれている。Ｖｅｒｏ細胞における初期収量は、細胞の供給源及び継代レベルに依存して、変動したが、常にＭＲＣ５細胞におけるよりも少なかった。これまでのところ、Ｓ１８ウイルスについては２×１０８／ｍｌの力価が、Ｓ１９ウイルスについては５×１０７／ｍｌの力価が２４時間で得られている。それでもやはり、本発明者らの予備的な証拠（下記）により、現在の野生型の種で得られるものと等しい、Ｖｅｒｏ細胞におけるＤ−抗原の収量を得ることができることが示唆される。
【実施例５】
【００７７】
免疫原性
ＩＰＶ産物についての２つの標準的なバッチリリースアッセイは、Ｄ−抗原ＥＬＩＳＡ試験及びラット免疫原性試験である（European Pharmacopoeia-supplement 2001 2000:0214 1289-1293）。ＥＬＩＳＡアッセイは、天然のポリオビリオンに特異的な抗体を使用して抗原性を測定し、次いで、標準製剤と比較して効力が表される。インビボアッセイの場合は、複数の群のラットに４種の希釈のワクチンで免疫し、抗体を中和する存在についてそれらの血清を試験する。被験製剤についてのセロコンバージョン率を標準製剤で得られたものと統計的に比較することによってワクチン効力を算出する。本明細書に記載の新しい株の免疫原性を評価するために、これらの双方のアッセイを用いている。
【００７８】
表５に挙げている全てのウイルスについて、製造業者のプロトコル（Martin et al., J. Gen. Vir. 84:1781-1788, 2003）を規模を縮小して使用して、ウイルスの高い力価のストックを調製し、ホルムアルデヒドで不活化した。不活化の前及び後の材料についてＤ−抗原ＥＬＩＳＡを行った。これらのデータを使用して、ワクチンバッチリリース標準操作手順を使用して行われるインビボアッセイに適切な用量を算出した。ワクチンは、効力の９５％信頼限界が値１．０を含む場合にこのラットの試験を通過する；したがって、野生型カプシド（及びＳ１８／Ｓ１Ｐ１）を有する全ての構築物は、ＩＰＶとして発売されるのに十分に免疫原性であった。
【００７９】
ポリオウイルスＭＥＦ−１は、１９４２年に単離され、少なくとも２つの密接に関連した構成要素を含有していた；ＩＰＶ製造業者によって現在使用されているＭＥＦ−１株は、いくつかのヌクレオチド位置においても異なっている（Odoom, JK; PhD Thesis, London School of Hygiene and Tropical Medicine, 2008）。ウイルスＳ１８／ＭＥＦＰ１のカプシドタンパク質のアミノ酸配列は、１位置においてＩＰＶ効力の参照株のものと異なることが見出され、そのため、参照と同一のカプシドアミノ酸配列を有する、もう１つのバージョンであるＳ１８／ＭＥＦ２Ｐ１を構築した。ラット免疫原性アッセイにおいて、Ｓ１８／ＭＥＦ２Ｐ１は、１．０の相対効力を有する参照株（表４）と区別できなかったが、ウイルスＳ１８／ＭＥＦＰ１は、わずかにより低い効力を有していた。いずれの株もワクチンバッチリリース試験（ＣＩが１．０の値を含まなければならない）を通過するのに十分に効力があったが、ワクチン生成にはＭＥＦ２Ｐ１カプシドタンパク質配列を有する株が好ましくなりそうである。
【００８０】
【表５】
0005955860.tif 000007
【００８１】
統計解析後、これらの結果により、以下のことが示された：
（ｉ）ドメインＶ内に導入された変更は、不活化、抗原性又は免疫原性に対する影響を有さなかった。
（ii）ＤＡｇＵ／初期感染力価の観点からの免疫原の収量は、製造業者のデータと一致していた。
（iii)野生型カプシドタンパク質を有する株は、同等のＩＰＶ株とほぼ同じくらいに免疫原性があった。
（iv)関連した野生型参照株と比較して、Ｓａｂｉｎカプシドタンパク質を有する株は、免疫原性が、（１型では）わずかに高く、（２型では）はるかに低く、（３型では）わずかに低かった。
【実施例６】
【００８２】
Ｖｅｒｏ細胞における増殖及び安定性
ポリオウイルスのＳ１８及びＳ１９株をＶｅｒｏ細胞内で増殖させるとき、それらの初期の複製はかなり遅い。プロテアーゼ２Ａ遺伝子内に特定の変異を有するポリオウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞内でより効率良く増殖する。多数のポリオウイルスをＶｅｒｏ細胞内で増殖させるときには、それらはこの細胞型における増殖のために適応し、増殖効率を上昇させる役割を果たしているのはプロテアーゼ２Ａ遺伝子内の変異である。２Ａ遺伝子内に導入された好適な改変（例えば、変異Ｎ１８Ｓ）を有するＳ１８及びＳ１９株のバージョンは、この適応のステップを必要とせず、Ｖｅｒｏ細胞内で最初から効率良く複製する。
【００８３】
Ｖｅｒｏ細胞を１．０の感染多重度で感染させて、それらの細胞を３３℃で４８時間インキューベートすることにより、Ｖｅｒｏ細胞における増殖に対する、Ｓａｂｉｎ３、Ｓ１８及びＳ１９のプロテアーゼ２Ａ遺伝子内のＶ１２３Ａ変異の効果を実証した。３３℃でのＨｅｐ２Ｃ細胞におけるＣＣＩＤ５０アッセイによって収量を測定した。これらの結果を以下の表６に示している。
【００８４】
【表６】
0005955860.tif 000008
【００８５】
Ｓ１８／ＭａｈＰ１ウイルスと、２Ａ遺伝子内に導入された変異を有する同等のウイルスであるＳ１８／ＭａｈＰ１／２Ａ  Ｎ１８Ｓとの双方をＶｅｒｏ細胞内で３種の異なる温度で１０回の継代にわたって増殖させて、プロテアーゼ２Ａ遺伝子配列及びドメインＶ配列の安定性を決定した。下記の表７に示しているように、ドメインＶ配列、及びＮ１８Ｓが変異したプロテアーゼ２Ａ遺伝子配列は完全に安定であった。未変異のプロテアーゼ２Ａ遺伝子配列は、予想した通りに、Ｖｅｒｏ細胞内での増殖を促進する変異を獲得した。
【００８６】
【表７】
0005955860.tif 000009
【図１】
0005955860.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
0005955860.tif 000013
【配列表】
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