(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の部分および第２の部分を含む透明板と、
前記第１の部分上に配設される不透明層と、
前記不透明層に形成される少なくとも１つの較正目標とを備え、各々の較正目標が、前記少なくとも１つの較正目標ならびに前記第２の部分とスライドとの間に配設される試料を画像化するために使用される顕微鏡対物レンズの回折限界未満の寸法を有するいくつかの特徴部を含む、較正装置。
【請求項２】
前記不透明層を前記第１の部分に付着させるために、前記透明板の前記第１の部分と前記不透明層との間に配設される接着剤をさらに備える、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記少なくとも１つの較正目標の前記特徴部が、前記第１の部分の表面の一部分を露出する前記不透明層内の穴をさらに備える、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記少なくとも１つの較正目標の前記特徴部が、前記不透明層内の蛍光ビーズをさらに備える、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記少なくとも１つの較正目標の前記特徴部が、前記不透明層内の反射ビーズをさらに備える、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記回折限界未満の寸法を有する前記特徴部の各々が、前記顕微鏡対物レンズの前記回折限界未満である直径を有する、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記特徴部が、前記少なくとも１つの較正目標を照射するために使用される光の波長未満である直径を有する、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
第１の部分および第２の部分を含む透明板と、
前記第１の部分上に配設される不透明層と、
前記不透明層に形成される少なくとも１つの較正目標とを備え、各々の較正目標が、前記少なくとも１つの較正目標ならびに前記第２の部分とスライドとの間に配設される試料を画像化するために使用される顕微鏡対物レンズの回折限界未満の寸法を有するいくつかの特徴部を含む、
顕微鏡カバーガラス。
【請求項９】
前記不透明層を前記第１の部分の表面に付着させるために、前記第１の部分の前記表面と前記不透明層との間に配設される接着剤をさらに備える、請求項８に記載のカバーガラス。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの較正目標の前記特徴部が、前記第１の部分の表面の一部分を露出する前記不透明層内の穴をさらに備える、請求項８に記載のカバーガラス。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの較正目標の前記特徴部が、前記不透明層内の蛍光ビーズをさらに備える、請求項８に記載のカバーガラス。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの較正目標の前記特徴部が、前記不透明層内の反射ビーズをさらに備える、請求項８に記載のカバーガラス。
【請求項１３】
前記回折限界未満の寸法を有する前記特徴部の各々が、前記顕微鏡対物レンズの前記回折限界未満である直径を有する、請求項８に記載のカバーガラス。
【請求項１４】
前記特徴部が、前記少なくとも１つの較正目標を照射するために使用される光の波長未満である直径を有する、請求項８に記載のカバーガラス。
【請求項１５】
顕微鏡カバーガラスを用いて回折限界の顕微鏡画像を較正するための方法であって、
前記顕微鏡カバーガラスは、
第１の部分および第２の部分を含む透明板と、
前記第１の部分上に配設される不透明層と、
前記不透明層に形成される少なくとも１つの較正目標とを備え、各々の較正目標が、前記少なくとも１つの較正目標ならびに前記第２の部分とスライドとの間に配設される試料を画像化するために使用される顕微鏡対物レンズの回折限界未満の寸法を有するいくつかの特徴部を含み、
前記方法は、
前記較正目標を照射するステップと、
前記顕微鏡対物レンズを使用して前記較正目標の部分領域から出力される光を収集するステップであって、前記顕微鏡対物レンズが、各々の特徴部から出力される前記光を色成分に分離する、ステップと、
ある色成分に対する別々の色画像を生成するステップであって、各々の色画像が前記較正目標の異なる色画像を表す、ステップと、
前記部分領域の原像を形成するために前記別々の色画像を組み合わせるステップと、
前記原像に基づいて較正された画像を生成するステップであって、前記較正された画像が、前記部分領域の集束された無歪みの特徴部を示す、ステップと
を含む、方法。
【請求項１６】
前記較正目標を照射するステップが、可視スペクトル内の異なる色に関連するいくつかの波長範囲にわたって光を放出する光源を用いて前記較正目標を照射するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記較正目標を照射するステップが、いくつかの光源を用いて前記較正目標を照射するステップであって、各々の光源が、可視スペクトル内の異なる色に関連する波長範囲にわたって光を放出する、ステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
特定の成分に対する別々の色画像を生成するステップが、他の色成分を通過させながら、各々の色成分を別々に検出器の画像平面に向けるステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
特定の成分に対する別々の色画像を生成するステップが、前記別々の色画像を計算機可読媒体に記憶するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記原像に基づいて前記較正された画像を生成するステップが、前記較正された画像を取得するために、前記別々の色画像に関して、画像並進、画像回転、拡大および非線形の幾何学的歪みを遂行するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記別々の色画像に関連する、画像並進、画像回転、拡大および非線形の幾何学的歪みに関連するパラメータデータを計算機可読媒体に記憶するステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記回折限界未満の寸法を有する前記特徴部の各々が、前記顕微鏡対物レンズの前記回折限界未満である直径を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記特徴部が、前記較正目標を照射するために使用される光の波長未満である直径を有する、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年９月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／２４６，６４４号の優先権を主張するものであり、その仮特許出願の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本開示は、顕微鏡法の画像化技術に関し、詳細には、顕微鏡の倍率を向上させるためのシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
多くの異なる型の画像化システムが、現代の科学研究において、小型または遠距離の対象の画像を獲得するために採用されており、それらの画像化システムには、超高分解能電子顕微鏡、超高分解能の走査型トンネル（「ＳＴＭ」）および原子間力（「ＡＦＭ」）の画像化機器、ならびに、多くの異なる型の光学顕微鏡、望遠鏡、および画像生成検知器がある。大多数の型の画像化装置、機器、および技法と同様に、異なる型の顕微鏡法に関連する多くの異なる相反関係および平衡が存在する。例えば、透過型電子顕微鏡法は、固定の薄く切り分けられた試料に関して実施され、したがって、本質的に２次元の非生存の試料に関する使用に制約される。走査型トンネルおよび原子間力の顕微鏡法は、材料の表面の高分解能画像を取得するための非光学的技法であるが、表面より下の試料の体積のナノスケールまたはマイクロスケールの内容物に関する情報を取得するためには使用され得ない。すべての型の顕微鏡法は、分解能制限によりいろいろな点で制約されるが、光学顕微鏡法は、「回折限界」と呼ぶ、おそらくは最もよく知られた分解能制限に関連しており、その回折限界は、従来の可視光の光学顕微鏡法を約２００ｎｍの分解能限界に制限する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
過去２０年の間、多くは生物学的試料である、蛍光体で標識された試料を、光学蛍光顕微鏡法機器によって、従来の光学顕微鏡法に対する回折限界の分解能より著しく小さな分解能で画像化することを可能にする様々な超分解能技法が開発されてきた。これらの技法は、経時的に蛍光体で標識された試料から放出される蛍光を収集することに基づく。放出する蛍光体が約２００ｎｍより大きな距離だけ相互に離隔されているならば、または換言すれば、試料内の蛍光体の位置が従来の光学顕微鏡法により分解可能となるならば、試料内の蛍光体の位置は、ある場合では１０ｎｍ未満の分解能に対して決定され得る。しかしながら、蛍光放出信号は、放出する蛍光体が試料内部で低密度に配置されるときにのみ解釈され得るので、一般的に多数の中間画像が、蛍光体で標識された対象の超分解能の最終的な画像を構築するために、低密度に配置された蛍光体の異なる組から発生される必要がある。したがって、超分解能画像は、多数の中間画像を発生させるために、比較的弱い信号を蓄積するために必要な時間を犠牲にして取得される。超分解能画像化のために必要な時間は、超分解能画像が構築される元になる比較的弱い信号を収集するために必要な時間の期間にわたって移動し形状を変化する傾向にある生きた細胞の画像化には好都合でない。比較的弱い信号を収集するために必要な時間期間が長いことによって、有害または致命的なレベルの紫外光を含む電磁放射に生存細胞がさらされる結果になる場合もある。超分解能画像化のための十分なデータを獲得するのに必要な時間が、画像化される試料の型に関係のない、重大な実験的制約を表す場合もある。これらすべての理由で、光学顕微鏡の設計および開発、製作を行う者は、回折限界未満で画像を捕捉するためのシステムおよび方法を探索し続けている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、試料の画像が回折限界未満で取得され得るように、顕微鏡画像化パラメータを調整するために、光学顕微鏡とともに使用され得る光学顕微鏡較正装置を対象とする。顕微鏡較正装置は、少なくとも１つの較正目標を含む。各々の較正目標は、顕微鏡対物レンズの回折限界未満の寸法を有するいくつかの特徴部を含む。較正目標のうちの１つの別々の色成分の回折限界の画像が、特定の倍率に対して取得される。画像処理が、色成分画像を組み合わせ、較正目標の集束された歪みのない画像を取得するために使用され得る。較正目標の集束された歪みのない画像を取得するために使用されるパラメータは、同じパラメータを用いて同じ倍率に対して、試料の集束された歪みのない画像を取得するために使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ】光学顕微鏡較正装置の図である。
【図１Ｂ】光学顕微鏡較正装置の別の図である。
【図１Ｃ】光学顕微鏡較正装置のさらに別の図である。
【図２】対象平面内の点源から出力される光を受け、対応する画像平面に斑点を発生させるように広げる光学システムを示す図である。
【図３】図３Ａは、理論的な点広がり関数の例の表現を示す図である。図３Ｂは、理論的な点広がり関数の例の表現を示す図である。
【図４】光学システムに関連する回折限界を示す図である。
【図５】顕微鏡スライドの表面に固着されることになる較正装置を示す図である。
【図６】スライドの表面に付着された較正装置の断面図である。
【図７】付着された較正装置を伴うスライドの断面図である。
【図８Ａ】可視スペクトル内の広範囲の波長にわたって光を放出する光源を用いる顕微鏡の内部の光路を示す図である。
【図８Ｂ】較正目標の部分領域内の穴から出力される光のビームの例を示す図である。
【図８Ｃ】較正目標の部分領域内の穴から出力される光に関連する３つの別々の色成分画像の例を示す図である。
【図８Ｄ】可視スペクトルの異なる波長範囲内の光を各々が放出する別々の光源を用いる顕微鏡の例を示す図である。
【図９】図９Ａは、較正目標の部分領域に関連する一連の原像の例の表現を示す図である。図９Ｂは、較正目標の部分領域に関連する一連の原像の例の表現を示す図である。
【図１０】対物レンズの色収差および回折限界に関して補正するために使用される画像較正の仮想的な例を示す図である。
【図１１】図１１Ａは、較正された画像を発生させるために原像を較正するときに決定されることになる較正パラメータの図式表現である。図１１Ｂは、較正された画像を発生させるために原像を較正するときに決定されることになる較正パラメータの図式表現である。図１１Ｃは、較正された画像を発生させるために原像を較正するときに決定されることになる較正パラメータの図式表現である。図１１Ｄは、較正された画像を発生させるために原像を較正するときに決定されることになる較正パラメータの図式表現である。
【図１２】較正目標の部分領域に関連する３次元画像空間内の領域の仮想的な斜視図である。
【図１３】６つの別々の較正目標を用いる光学顕微鏡較正装置を示す図である。
【図１４】図１４Ａは、較正装置を伴うカバーガラスの等角図である。図１４Ｂは、較正装置を伴うカバーガラスの上平面図である。
【図１５】図１５Ａは、顕微鏡スライドに固着される較正物を伴うカバーガラスを示す図である。図１５Ｂは、顕微鏡スライドに固着される較正物を伴うカバーガラスを示す図である。
【図１６】回折限界未満で試料の画像を取得する方法の流れ図である。
【図１７】画像処理ステップを実行する典型的な電子計算機システムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
図１Ａ〜１Ｃは、光学顕微鏡較正装置１００の異なる図を示す。図１Ａでは、較正装置１００は、透明板１０４上に配設される不透明層１０２を含む。不透明層１０２は、装置１００のおおよその中心に位置する較正目標１０６を含む。装置１００は、目標１０６が顕微鏡対物レンズの視野の範囲内に位置するように装置１００を布置する助けとなるように、不透明層１０２の外側表面上に配設されるいくつかの方向矢印１０８をさらに含み得る。図１Ｂは、特徴部１１０の２次元正方格子で構成される較正目標１０６の拡大された図を示す。他の実施形態では、特徴部１０８は、特徴部の菱形の、六角形の、長方形の、平行四辺形の、さらには無作為の分布などの他の２次元格子配置を有し得る。特徴部１１０は、不透明層１０２に形成される穴であり得る。図１Ｃは、図１Ｂに示す線Ｉ−Ｉに沿った、較正装置１００の較正目標１０６の一部分の断面図を示す。断面図により、透明板１０４の表面上に配設される不透明層１０２が明らかになり、特徴部１１０は、層１０２内部に位置する穴である。図１Ｃは、層１０２および透明板１０４の一部分の拡大された図１１２を含む。拡大された図１１２により、透明板１０４の表面に層１０２を接着するための薄い接着剤層１１４が明らかになり、拡大された図１１２は、穴１１０が、不透明層１０２および接着剤層１１４の高さにおよび、表面に対して実質的に垂直な側部壁を有することを示す。換言すれば、各々の穴１１０は、接着剤層１１４が上に配設される透明層１０４の表面の一部分を露出する。
【０００８】
図１Ｃに示すように、透明板１０２の厚さＴは、約０．１ｍｍから約１．０ｍｍにわたる場合があり、ガラスまたは透明高分子などの任意の適した透明材料で構成され得る。不透明層１０２の厚さｔは、約２０ｎｍから約１００ｎｍ以上にわたる場合があり、金（「Ａｕ」）および銀（「Ａｇ」）などの任意の適した不透明材料で構成され得る。接着剤層１１４は、不透明層１０２を透明層１０４の表面に付着させる任意の適した材料で構成され得る。例えば、不透明層１０２がＡｕで構成され、透明板１０４がガラスで構成されるならば、クロム（「Ｃｒ」）が、不透明層１０２をガラス表面に付着させるために使用され得る。
【０００９】
図１Ｂの例に示すように、穴１１０の格子は、実装密度のより高くない穴の正方格子１１８により包囲される内側の実装密度の高い穴の正方格子１１６を含む。図１Ｃに戻ると、近接する内側の格子穴１１０間の距離Ｄは、約２μｍから約８μｍにわたる場合があり、近接する外側の格子穴間の距離は、約５μｍから約１５μｍにわたる場合がある。穴１１０の直径ｄは、約５０ｎｍから約１９０ｎｍにわたる場合がある。穴の直径は、顕微鏡の回折限界未満であるように選択され得ることに留意されたい、ただし、回折限界は約〜λ／２であり、ここでλは光の波長である。例えば、較正装置１００の一実施形態では、穴１１０は、直径が約１００ｎｍであり、内側の格子距離が５μｍであり、外側の格子距離が約１０μｍである場合がある。約１００ｎｍの直径は、約２００ｎｍの分解能限界を有する可視光の光学顕微鏡法の回折限界より十分に小さい。
【００１０】
較正装置１００は、透明板の表面上に接着剤の層を最初に堆積することにより作製され得る。接着剤は、表面上に接着剤を噴霧または刷毛塗りすることにより堆積され得る。接着剤層が堆積された後、不透明層が堆積される。不透明層が金属または半導体であるならば、不透明層は、プラズマ蒸着もしくは化学蒸着またはウェハ接合を使用して堆積され得る。穴は、実質的に直立した円筒形の壁部を伴う穴を発生させるために、集束イオンビーム加工を使用して不透明層および接着剤層に形成され得る。
【００１１】
代替実施形態では、特徴部１０８は、不透明層１０２上に配設されるビーズであり得る。ビーズは、直径がｄであり、特定の波長の光にさらされるときに蛍光を発する反射ビーズまたは蛍光ビーズであり得る。
【００１２】
以下で説明する画像処理と組み合わせた較正装置１００は、回折限界未満の状態にある試料の微視的要素の画像を発生させることができる。例えば、画像平面で画像に再編成されることになる入射波面の一部分を収集可能なだけである、顕微鏡などの典型的な回折限界の光学システムを考えてみる。光学システムを通過する光は、直線伝搬から逸脱し、画像平面である程度に広がる。円形の開口部を伴う光学システムが、対象平面内の点源から出力される平面波を受けるとき、対応する画像点が画像平面に存在するのではなく、光は実際には、微弱な環により包囲されるエアリーディスクと呼ぶ、ごく小さな円形の斑点に広がる。エアリーディスクの半径が、近隣の画像の重複、したがって分解能を決定する。図２は、対象平面２０６内の点源（ｘ，ｙ）２０４から出力される光を受け、対応する画像平面２１０に斑点２０８を発生させるように光を広げる光学システム２０２を示す。点源２０４から出力される光は、放射照度Ｉ（ｘ，ｙ）を有し、光学システム２０２により点（ｘ’，ｙ’）２１２を中心とする斑点２０８に変換され、対応する放射照度は、斑点２０８に対する対称的な点広がり関数２１４により表される。例えば、斑点２０８などの斑点に対する放射照度分布を表すために使用される、適した点広がり関数は、エアリー関数であり得る。
【００１３】
図３Ａは、画像平面内部の１次元での理論的な点広がり関数の例の表現を示す。水平軸３０２は、図２に示す点２１２などの画像平面内の点（ｘ’，ｙ’）を通過する画像平面内の線である。理論的な点広がり関数は、高く比較的狭い中心ピーク３０４を有し、高さが減少する２次ピーク３０５〜３１４が、中心ピークから離れて両方向に延在する。曲線の高さは強度に対応し、水平軸３０２は、出力画像平面での原点からの直線距離に対応する。図３Ｂは、３次元空間での点広がり関数の表現を与え、２つの水平軸３１６および３１８が、画像平面の平面内にあり、点（ｘ’，ｙ’）で交わり、点広がり関数の表面上の任意の点での高さは、画像平面上の対応する位置で観測される強度に対応する。光学システムにより発生されるインパルス応答関数の画像は、点広がり関数の中心ピークに対応する中心の明るい平円形であり、中心ピークを包囲する環または隆起に対応する、半径が増大する同心環を伴うように見える。
【００１４】
図４は、光学システムに関連する回折限界を示す。距離ｓ１  ４０６だけ離隔された対象平面内の２つの点（ｘ１，ｙ１）４０２および（ｘ２，ｙ２）４０４を考えてみる。光学システムから出力されるこれらの２つの点の画像が、画像点（ｘ’１，ｙ’１）および（ｘ’２，ｙ’２）を中心とする、２つの点広がり関数４０８および４１０である。点源４０２および４０４からの、放射照度分布が画像平面での点広がり関数４０８および４１０により表される斑点への光の広がりは、回折に関係する現象である。ｓ１が十分に大きく、そのため、画像平面での点広がり関数４０８および４１０の中心間の対応する距離ｓ’１  ４１２が、曲線４１４により図４に表される２つの点広がり関数の和が明確に二峰性のままであるように点広がり関数を離隔する場合、画像平面内の点４０２および４０４の画像は相互に区別され得る。これに対して、対象平面内の２つの点４１６および４１８が、十分に小さな距離ｓ２  ４２０により離隔され、そのため、画像平面内の２つの点４２２および４２４の対応する画像が重複し、曲線４２６により表される２つの点広がり関数の和が単一のピークに合体する場合、２つの点４１６および４１８は画像平面で相互に区別され得ない。従来の光学顕微鏡法に関する最小間隔または最大分解能は、一般に次式のように考えられる。
【００１５】
【数１】
0005976654.tif 000002
【００１６】
ただし、
θは、光学システムに入射する、または光学システムから出射する光の最大の円錐体の半角であり、
λは、光の波長であり、
ηは、光学システムが動作している媒体の屈折率であり、
ＮＡは、顕微鏡対物レンズの開口数である。
【００１７】
入力画像での最小間隔または最大分解能は、右方の点広がり関数の最初の左方の零点が左方の点広がり関数の最初の右方の零点に一致する、点広がり関数間の間隔に対応する。画像化され得る特徴部の最小離隔距離または最大分解能は、光学顕微鏡法システムに関しては約２００ｎｍに対応する。最小間隔または最大分解能は「回折限界」と呼ばれるが、その理由は、画像平面内の点源の点広がり関数画像が回折の結果として生起するからである。
【００１８】
図４を参照して考察される回折限界は、光学顕微鏡法を使用して取得される試料の画像に対する絶対的な分解能限界ではない。回折限界未満で取得される較正目標１００の拡大された画像が、画像処理較正パラメータを取得するために様々な画像化技法を使用して処理され得るものであり、その画像処理較正パラメータは、やはり回折限界未満での倍率分解能を用いて試料の画像を調整するために使用され得る。回折限界未満での倍率分解能を用いて試料の画像を調整するために使用され得る１組の較正パラメータを決定するために、較正目標１００がどのように使用され得るかの、図５〜１１を参照する説明が次に与えられる。
【００１９】
図５は、顕微鏡スライド５０２の表面に固着されることになる較正装置１００を示す。図５では、較正装置１００は、不透明表面１０２がスライド５０２の表面５０４に面するように布置される。スライド５０２および透明板１０４の屈折率と実質的に整合する屈折率を有する光学ゲル５０６が、不透明表面１０２とスライド５０２の表面５０４との間に配設される。例えば、透明板１０４およびスライド５０２は、屈折率が１．５２のガラスで構成される場合があり、光学ゲル５０６は、やはり屈折率が１．５２の材料で構成される場合がある。図６は、較正装置１００の縁部に沿って位置する接着剤６０２を使用してスライド５０２の表面に付着された較正装置１００の断面図を示す。接着剤６０２は、スライド５０２の研磨された表面などの研磨された表面に接着可能である、トシルアミド−ホルムアルデヒド樹脂などの高分子接着剤であり得る。
【００２０】
次いでスライド５０２および較正装置１００は、較正装置１００が顕微鏡対物レンズに面し、スライド５０２が顕微鏡光源に面する状態で顕微鏡載物台上に置かれる。図７は、光学顕微鏡の顕微鏡対物レンズ７０２を用いる観察のために布置された、付着された較正装置１００を伴うスライド５０２の断面図を示す。図７では、液浸油７０４が、透明板１０４と対物レンズ７０２との間に配設される。液浸油７０４は、透明板１０４およびスライド５０２の屈折率と実質的に整合する屈折率を有する。光７０６が、対物レンズ７０２に対向して位置する照射源から出力される。光７０６は、スライド５０２および較正目標１０６を通過する。図７に示すように、対物レンズ７０２は、較正目標１０６の少なくとも一部分を通過する光が、破線７０８および７１０により規定される対物レンズの視野の範囲内に入るように布置される。図７は、液浸油対物レンズとともに較正装置１００を使用することを限定することは意図されない。較正装置１００は、空気媒体中で作動する対物レンズおよび水媒体中で作動する対物レンズなどの、他の型の顕微鏡対物レンズとともに使用され得る。
【００２１】
較正装置１００は、多くの異なる種類の光源とともに使用され得る。例えば、適した光源には、白熱光、ハロゲン灯、または可視スペクトル内の広範囲の波長にわたって光を放出する任意の発生源がある。他の適した光源には、可視スペクトルの青色、緑色または赤色帯域などの可視スペクトル内の狭い波長帯域にわたって光を放出する、発光ダイオード（「ＬＥＤ」）およびレーザがある。
【００２２】
図８Ａは、ハロゲン灯などの、可視スペクトル内の広範囲の波長にわたって光を放出する光源を用いる顕微鏡の内部の光路を示す。多くの異なる型の顕微鏡および対応する光路が存在する。図８Ａは、顕微鏡のすべての異なるよく知られた変形の範囲内で光路を表すことは意図されず、また図８Ａは、顕微鏡のすべての様々な構成要素を表すものでもない。図８Ａは、回折限界未満で得られる試料の画像を処理するために使用され得る画像処理パラメータを取得するために較正装置１００を使用する顕微鏡画像化に適用されるような、顕微鏡法の一般的な原理を示すことが意図される。図８Ａでは、スライド５０２および較正装置１００は、透明板１０４が顕微鏡対物レンズ８０４に面し、光源８０６がスライド５０２に対向して布置される状態で載物台８０２上に配設される。点線の方向矢印８０８は、光源８０６から放出される光を表す。光源８０６は、白熱光、ハロゲン灯、または可視スペクトル内の広範囲の波長にわたって光を放出する任意の光源であり得る。光源８０２から放出される光は、スライド５０２および較正装置１００を通過する。より低い倍率の対物レンズが、顕微鏡対物レンズの光軸の途中に較正目標１０６の少なくとも一部分を置くために、（図１に示す）板１００の方向矢印１０８の位置を突き止めるために使用され得る。より高い倍率の対物レンズ８０４が選択され、対物レンズ８０４および／または載物台８０２が、較正目標１０６の部分領域の拡大された画像を取得するためにｚ方向８１０に布置される。
【００２３】
図１を参照して上記で説明したように、較正目標１０６を構成する穴の直径（例えば、〜約１００ｎｍ）は、光源８０６から放出される可視光の波長未満であり（すなわち、可視光は約３８０ｎｍから約７５０ｎｍにわたる）、回折限界（すなわち、〜約２００ｎｍ）未満である。較正目標１０６内の各々の穴を通過する光は、ビームが対物レンズ８０４に入射する際に広がる光の狭いビームとして出力される。較正目標１０６内の穴から出力される光の各々のビームは、対物レンズ８０４により収集され、対物レンズ８０４の色収差および回折限界が原因で歪みを受ける。その結果、較正目標１０６内の穴から出力される光の各々のビームは、穴から出力されるビームのスペクトルを含む発散性の異なって色付いたビームに分離される。色収差は光学的歪みの典型であり、レンズが、レンズを通過するすべての波長の光を同じ収束点に集束させることができないというものである。色収差は、レンズが、光の異なる波長に対して異なる屈折率を有することに起因する。典型的な対物レンズは、色収差に対してある程度の補正をもたらす被膜またはレンズコーティングを含む。図８Ｂは、較正目標１０６の部分領域８１１内の穴から出力される白色光のビームの例を示す。部分領域８１１は、破線の囲み１２０により図１Ｂで特定され、対物レンズ８０４の視野の範囲内に入る較正目標１０６の例の一部分を表す。図８Ｂの例では、（図８Ａに示す）対物レンズ８０４はブロックにより表され、方向矢印８１２は、部分領域８１１内の穴８１４から出力される光のビームの方向を表す。光のビーム８１２が対物レンズ８０４を通過する際、対物レンズ８０４を構成するレンズが、ビーム８１２を異なる色付いたビームに分離する色収差を生出し、各々のビームは、ビーム８１２の本来の経路から発散し、各々のビームは、ビーム８１２を構成する光の色スペクトル内の異なる色成分である。例えば、異なって模様付けされた方向矢印８１６〜８１８は、ビーム８１２の青色、緑色および赤色だけの色成分ビームを表す。異なる色付いたビーム８１６〜８１８は、対物レンズ８０４の色収差および回折限界が原因でビーム８１２の経路から発散する。
【００２４】
図８Ａに戻ると、顕微鏡は３つの二色鏡８２０〜８２２を含み、それらの二色鏡は、可視スペクトル内の青色、緑色および赤色の波長範囲を対応する検出器８２４〜８２６に反射するように構成され、それらの検出器は、画像処理のために、図１７を参照して以下で説明する計算機システムなどの計算機システム８２７に接続される。方向矢印８２８〜８３０は、特定の倍率に対する部分領域８１１の画像の青色、緑色および赤色の色成分を表す。二色鏡８２０は、赤色および緑色の波長範囲内の光を通過させ、青色の波長範囲内の光を検出器８２４の画像平面に反射し、二色鏡８２１は、赤色の波長範囲内の光を通過させ、緑色の波長範囲内の光を検出器８２５の画像平面に反射し、二色鏡８２２は、赤色の波長範囲内の光を検出器８２６の画像平面に反射する。その結果、検出器８２４は部分領域８１１の画像の青色成分を捕捉し、検出器８２５は部分領域８１１の画像の緑色成分を捕捉し、検出器８２６は部分領域８１１の画像の赤色成分を捕捉する。これらの３つの別々の画像は、穴から出力される光の青色、緑色および赤色の色成分の、青色、緑色および赤色の画像であり、同じ倍率に対して捕捉され、画像処理のために計算機システム８２７に送出される。３つの別々の青色、緑色および赤色の画像は、同じ倍率に対して同時または異なる時間に捕捉され得る。例えば、画像が同じ倍率に対して異なる時間に捕捉されることになるならば、二色鏡および対応する検出器のうちのただ１つが、対応する色画像を捕捉する時間に使用される。
【００２５】
図８Ｂを参照して上記で説明したように、対物レンズ８０４によって、較正目標１０６内の穴から出力される光のビームが、発散性の色成分に離隔するので、別々の青色、緑色および赤色の画像で表される穴は位置合わせされていない。図８Ｃは、図８Ｂに示す部分領域８１１の３つの別々の青色、緑色および赤色の画像の例の表現を示す。図８Ｂを参照して上記で説明したように、対物レンズ８０４によって、各々の穴から出力される光ビームが、色付いた光の別々の発散性のビームに分離する。図８Ｃの例の表現では、青色、緑色および赤色の画像８３１〜８３３は、較正目標１０６の特定の倍率に対する、図８Ａを参照して上記で説明したような検出器８２４〜８２６により捕捉される画像を表す。別々の画像８３１〜８３３内の斑点は、対応する色付いたビームが発散するので位置合わせされていない。例えば、図８Ｃに示すように、方向矢印８３４は、穴８１４から出力される光ビーム８１２の経路を表し、破線円８３５〜８３７は、光ビーム８１２の画像が画像８３１〜８３２の各々で位置することになる場所を表す。しかしながら、対物レンズ８０４の色収差および回折限界が原因で、３つの別々の青色、緑色および赤色の成分画像内の斑点が発生される。穴８１４から出力される光の青色成分は、青色画像８３１内の青色斑点８４０により表され、穴８１４から出力される光の緑色成分は、緑色斑点８４１により表され、穴８１４から出力される光の赤色成分は、赤色画像８３３内の赤色斑点８４２により表される。３つの画像８３１〜８３３は、組み合わされた原像８４４を発生させるために処理器８２８により和がとられる。原像８４４は、特定の倍率に対する、部分領域８１１の穴から出力される光の各々のビームの青色、緑色および赤色だけの成分の単一の画像である。例えば、破線円８４６は、穴８１４から出力される光が画像８４４内に現れることになる斑点を表すが、対物レンズ８０４の色収差および回折限界が原因で、穴８１４から出力される光は、青色、緑色および赤色の斑点８４０〜８４２としての画像８４４での３つだけの成分色表現を伴う成分色に分離される。青色、緑色および赤色の斑点は、別々の画像８３１〜８３３では位置合わせされていないが、各々の斑点は、特定の倍率に対する、対応する穴から出力される光の色成分の集束された無歪みの画像である。例えば、画像８３１〜８３３内の青色、緑色および赤色の斑点８４０〜８４２は、各々、ビーム８１２の青色、緑色および赤色だけの色成分の集束された無歪みの別々の画像である。
【００２６】
上記で説明したように、較正装置は顕微鏡とともに使用され得るものであり、顕微鏡は、ＬＥＤおよび／またはレーザの組み合わせで構成される光源を使用し、各々のＬＥＤまたはレーザは、可視スペクトルの異なる狭い波長範囲内の光を放出する。図８Ｄは、別々の青色、緑色および赤色の光源で構成される光源８５０を用いる顕微鏡の例を示す。図８Ｄに示す顕微鏡は、図８Ａを参照して上記で説明した顕微鏡と同様であり、ただし、３つの二色鏡８２０〜８２２は、部分鍍銀鏡８５１、半鍍銀鏡８５２、鏡８５３、ならびに対応する青色、緑色および赤色の色フィルタ８５５〜８５７により置換される。発生源８５０は、図８Ａおよび８Ｂを参照して説明したように、可視スペクトルの狭い青色、緑色および赤色の波長帯域内の光を出力し、その光は、較正板１００の較正目標内の各々の穴を通過し、対物レンズ８０４により収集かつ集束される。部分鍍銀鏡８５１は、対物レンズ８０４から出力される光のほぼ１／３を、狭い青色波長帯域内の光だけを通過させるフィルタ８５５に向けて反射し、一方で光のほぼ２／３は、半鍍銀鏡８５２の方に鏡８５１を通過する。鏡８５２は、鏡８５１を透過された光のほぼ半分を、狭い緑色帯域だけを通過させるフィルタ８５６に向けて反射する。鏡８５２を透過された光は、鏡８５３により、狭い赤色帯域内の光を通過させるだけであるフィルタ８５７に向けて反射される。検出器８２４〜８２６は、図８Ａおよび８Ｃを参照して上記で説明したように、部分領域８１１の青色、緑色および赤色の画像を捕捉する。
【００２７】
図８Ａ〜８Ｄの例では、対物レンズ８０４から出力される光の青色、緑色および赤色の成分が使用されているが、その理由は、青色、緑色および赤色の成分が、種々の異なる色付いた画像を生成するように異なる放射照度と組み合わされ得る原色であるからである。あるいは、青色、緑色および赤色以外の色を生成し、反射し、透過させる、他の型の光源、二色鏡およびフィルタが、対物レンズから出力される光の異なる色成分画像を捕捉するために使用され得る。
【００２８】
顕微鏡は、試料と顕微鏡対物レンズとの間の一連の対象平面を画像化するために使用されることが多い。この動作は、対物レンズにより形成される画像の３次元画像空間を一体で表す１組の画像平面を発生させるために使用され得る。図９Ａは、較正目標１０６の部分領域８１１に関連する一連の原像９０１〜９０８の例の表現を示す。原像９０１〜９０８の各々は、部分領域８１１の異なる集束を使用して取得され、原像９０１〜９０８は、部分領域８１１内の穴の各々から出力される成分光ビームの３次元画像空間を形成する。ｘ軸およびｙ軸として図示される方向矢印９１０および９１１は部分領域８１１の平面を表し、方向矢印９１４は部分領域８１１の上方の原像９０１〜９０８の上昇を表し、各々の原像は部分領域８１１の異なる対象平面と関連する。画像空間によって、部分領域８１１内の各々の穴から出力される光の青色、緑色および赤色の光成分を対物レンズ８０４が集束させる場所が明らかになる。図９Ｂは、対物レンズ８０４を使用して生出される画像空間内の、図９Ａに示す領域９１６の仮想的な斜視図を示す。斑点９１８〜９２０は、部分領域８１１内の穴から出力される光の単一のビームの別々の青色、緑色および赤色の成分の、別々の青色、緑色および赤色の焦点を表す。斑点９１８〜９２０は、対物レンズ８０４に関連する３次元画像空間内の異なる点を中心とする別々の焦点に、対物レンズ８０４が青色、緑色および赤色の成分をどのように集束させるかを表す。
【００２９】
次いで、較正目標１０６の原像が、較正された画像および関連する画像較正パラメータを取得するために様々な画像化技法を使用して処理され得るものであり、その画像較正パラメータは、回折限界未満での倍率分解能を用いて試料の画像を処理するために使用され得る。較正パラメータを取得するために使用され得る、適した顕微鏡画像化技法の例は、米国特許出願第１２／７５１，８１６号で説明されている高密度確率的サンプリング画像化（ｄｅｎｓｅ  ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ−ｓａｍｐｌｉｎｇ  ｉｍａｇｉｎｇ）（「ＤＳＳＩ」）であり、その米国特許出願は、２０１０年３月３１日に出願され、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｃｏｍｐａｎｙにより所有され、参照により本明細書に組み込まれている。ＤＳＳＩの詳細は、第１２／７５１，８１６号の特許出願で説明されているので、較正目標１００の原像に適用されるようなＤＳＳＩを使用して取得される画像較正パラメータの概観を次に提供する。
【００３０】
図１０は、対物レンズの色収差および回折限界に関して補正するために、画像較正がどのように使用され得るかの仮想的な例を示す。図１０では、画像１００２は、図８を参照して上記で説明したように取得されている部分領域８１１の特定の倍率に対する原像を表す。異なって陰影付けされた斑点の各々の３つ組は、特定の倍率に対する対物レンズ８０４の青色、緑色および赤色の斑点を表す。例えば、図１０は、青色、緑色および赤色の斑点１００６〜１００８の拡大図１００４を含む。青色、緑色および赤色の斑点１００６〜１００８は、部分領域８１１内の穴から出力される光の単一のビームの青色、緑色および赤色の成分色の画像を表す。対物レンズ８０４の色収差および回折限界によって、較正目標内の穴から出力される光の各々のビームが色成分ビームに離隔するが、色成分に関連する各々の斑点は、穴から出力される光のその色成分の拡大された、集束された無歪みの画像である。例えば、青色、緑色および赤色の斑点１００６〜１００８は、各々、特定の倍率に対する、部分領域８１１内の対応する穴から出力される光の青色、緑色および赤色の成分の拡大された、集束された無歪みの画像である。これらの３つの別々の成分は、対物レンズ８０４の色収差および回折限界が原因で、画像１００２により表される画像平面内の異なる空間的場所に置かれる。画像較正では、部分領域８１１の較正された画像１０１０を発生させるために、各々の穴から出力される光に関連する色成分斑点を組み合わせるために、画像１００２の空間的パラメータを調整する。較正された画像１０１０は、部分領域８１１の拡大された画像を表し、斑点１０１２などの各々の斑点が、部分領域８１１内の各々の穴から出力される光の拡大された、集束された無歪みの画像を表す。画像１０１０内の各々の斑点は、原像１００２内の対応する色成分斑点を組み合わせるためにＤＳＳＩを使用して生成され得る。例えば、図１０は、斑点１０１２の拡大図１０１４を含み、斑点１０１２は、較正された画像１０１０内の無歪みの白色斑点として現れ、青色、緑色および赤色の斑点１００６〜１００８を組み合わせることにより発生される。換言すれば、原像１００２内の色成分斑点の各々の組は、較正された画像１０１０内の単一の斑点を発生させるために組み合わされ、較正された画像１０１０内の斑点が、直径が対物レンズ８０４の回折限界未満である穴から出力される光の拡大された図であるとしても、較正された画像１０１０内の各々の斑点は、集束している（すなわち、対物レンズ８０４の色収差および回折限界が原因の歪みがない）ように見える。
【００３１】
図１１Ａ〜１１Ｄは、原像１００２から較正された画像１０１０を発生させるために調整される較正パラメータの図式表現を示す。較正は、画像並進、画像回転、拡大、および非線形の幾何学的歪みの組み合わせを含み、それらは、部分領域８１１内の各々の穴に関連する色成分斑点を組み合わせるために使用される。図１１Ａは、較正装置１００内の穴を透過される光の画像を表す単一の集束された無歪みの斑点１１０４を形成するために、３つの別々の青色、緑色および赤色の画像に関連する、青色、緑色および赤色の斑点１１０１〜１１０３を較正でどのように組み合わせるかの例の表現を示す。図１１Ａに示すように、斑点１１０１〜１１０３は、それぞれガウス分布１１０５〜１１０７により表される強度プロファイルを有する。較正は、強度ピークの座標および大きさを調整するために、並進、回転、拡大、および幾何学的歪みを使用する処理であり、その結果、強度ピークは、関連する強度プロファイル１１０８を伴う斑点１１０４を発生させるように位置合わせされる。図１１Ｂ〜１１Ｃは、Ｘ、Ｙ、およびＺ座標により特徴付けられる３次元デカルト座標基準枠に関する、画像並進および回転の例を示す。図１１Ｂは、較正目標内の同じ穴に関連する色成分斑点を位置合わせするために、別々の原像の青色、緑色および赤色の色成分画像１１１０〜１１１２の各々を基準枠の範囲内で並進させる例を表す。方向矢印１１１４〜１１１６などの方向矢印は、色成分画像の各々が基準枠内で並進され得る３つの異なる方向を表す。図１１Ｃは、同じ穴に関連する色成分斑点をさらに位置合わせするために、別々の原像の青色、緑色および赤色の色成分画像１１１０〜１１１２の各々を基準枠座標に関して回転する例を表す。方向矢印１１１８〜１１２０は、同じ穴に関連する色成分斑点をさらに位置合わせするために、基準枠に対して回転されている、画像平面１１１０に関連する直交のｘ、ｙ、およびｚの局所座標を表す。非線形の幾何学的歪みはデジタル画像処理技法であり、色成分画像の一部分が、同じ穴に関連する色成分斑点をさらに位置合わせするためにデジタル的に操作される。図１１Ｄの例では、画像１１１０〜１１１２の３つの重複する部分領域１１２２〜１１２４の非線形の歪みは、それぞれ、同じ穴に関連する斑点を位置合わせするために歪まされ、焦点深度依存であり得る。例えば、部分領域１１２２〜１１２４の並進、回転、拡大での調整、および歪みが、同じ穴に関連する斑点１１２５〜１１２７を位置合わせする。
【００３２】
３次元画像空間を形成する原像は、色成分の焦点を共通の焦点に偏移させるために、並進され、回転され、局所的に曲げられ得る。図１２は、図９Ｂに示す領域９１６の仮想的な斜視図を示す。較正は、青色、緑色および赤色の焦点９１８〜９２０を単一の焦点１２０２に偏移させるために使用され得るものであり、単一の焦点１２０２は、対物レンズ８０４の色収差および回折限界が原因の歪みがない場合の、部分領域８１１内の穴から出力される光のビームの焦点に対応する。
【００３３】
代替実施形態では、較正装置を１つだけの較正に限定するのではなく、較正装置は任意の数の較正目標を含むことができ、特徴部は、各々の較正目標に対して変動される、または同じである。図１３は、６つの別々の較正目標１３０１〜１３０６を用いる光学顕微鏡較正装置１３００を示す。各々の近接する対の較正目標は、装置１３００の不透明層１３１０に塗布または食刻される間隔部１３０８などの間隔部により離隔される。較正目標１３０１〜１３０６は、特徴部の複数の大きさを有し得る、または較正目標１３０１〜１３０６は、特徴部の複数の大きさの任意の組み合わせを有し得る。例えば、較正目標１３０１〜１３０３が、直径が約９０ｎｍの不透明層１３１０内の穴で構成され得る一方で、較正目標１３０４〜１３０６は、直径が約１１０ｎｍの穴で構成され得る。
【００３４】
１つまたは複数の較正装置は、較正パラメータの決定に続いて、顕微鏡対物レンズの視野に試料を簡単に滑り込ませ、試料の画像を処理するために較正パラメータを使用することにより、回折限界未満で試料を画像化することを可能にするように、カバーガラスに形成される場合もある。図１４Ａ〜１４Ｂは、カバーガラスの一部分に形成される較正装置１４０２を伴うカバーガラス１４００の等角図および上平面図を示す。較正装置１４０２は、上記で説明した較正装置１００と同じ様式で構成される較正目標１４０６および方向矢印１４０８を含むが、透明板１０４を含む較正装置１００とは異なり、較正装置１４０２は比較的大きな透明板１４０４を含む。板１４０４の第１の領域は較正装置１４０２専用であり、板１４０４の第２の領域１４１０は試料を受けるために無被覆である。較正装置１４０２は較正装置１００と同じ様式で使用されるが、カバーガラス１４００の残りの無被覆領域１４１０は、顕微鏡を使用して観察されることになる試料を覆って置かれ得る。
【００３５】
図１５Ａは、顕微鏡スライド１５０２の表面に固着されることになる較正装置１４０２およびカバーガラス１４０４を示す。図１５Ａでは、較正装置１４０２は、較正装置１４０２の不透明表面がスライド１５０２の表面１５０４に面するように布置される。スライド１５０２およびカバーガラス１４０４の屈折率と実質的に整合する屈折率を有する光学ゲル１５０６が、不透明表面と表面１５０４との間に配設され、試料１５０８が、カバーガラス１４０４の無被覆領域１４１０上に置かれる。図１５Ｂは、図１５Ａに示す線ＩＩ−ＩＩに沿う、スライド１５０２の表面１５０４に付着されたカバーガラスの断面図を示す。カバーガラス１４００の縁部に沿って位置する接着剤１５１０が、カバーガラス１４００をスライド１５０２に固着させるために使用され得る。接着剤１５１０は、研磨された表面１５０４などの研磨された表面に接着可能である、トシルアミド−ホルムアルデヒド樹脂などの高分子接着剤であり得る。
【００３６】
図１６は、回折限界未満で試料の画像を取得する方法の流れ図を示す。ブロック１６０１では、図８Ａおよび８Ｄを参照して上記で説明したように、較正目標が光源を使用して照射される。ブロック１６０２では、図８Ａおよび８Ｄを参照して上記で説明したように、較正目標の部分領域から出力される光が、顕微鏡対物レンズを使用して収集される。ブロック１６０３では、図８Ａおよび８Ｃを参照して上記で説明したように、対物レンズから出力される光のある色成分に対する目標の別々の色画像が生成される。ブロック１６０４では、図８Ｃを参照して上記で説明したように、別々の色画像が、原像を形成するために組み合わされる。ブロック１６０５では、ＤＳＳＩなどの映像処理を使用して原像に基づいて較正された画像が生成される。較正された画像１０１０などの較正目標の較正された画像を発生させるために、原像１００２などの較正目標の原像を調整するために使用される倍率および画像較正パラメータが記憶される。較正目標の画像倍率および関連する較正パラメータが保存され、それによって、実際の試料が特定の倍率を使用して画像化されるときに、関連する較正パラメータが試料の回折限界の画像を調整するために使用され得る。
【００３７】
図１７は、ＤＳＳＩまたは別の適した画像処理方法の画像処理ステップを実行する典型的な電子計算機システムを示す。計算機システムは、１つまたは複数の中央処理装置（「ＣＰＵ」）１７０２〜１７０５と、ＣＰＵ／メモリ−部分システム母線１７１０または複数の母線によりＣＰＵに相互接続される、１つまたは複数の電子メモリ１７０８と、ＣＰＵ／メモリ−部分システム母線１７１０を、追加的な母線１７１４および１７１６、または複数の高速シリアル相互接続を含む他の型の高速相互接続媒体に相互接続する第１のブリッジ１７１２とを包含する。これらの母線またはシリアル相互接続は同様に、ＣＰＵおよびメモリを、グラフィック処理器１７１８などの専用処理器に、および１つまたは複数の追加的なブリッジ１７２０に接続し、ブリッジ１７２０は、高速シリアルリンクに、または制御器１７２７などの複数の制御器１７２２〜１７２７に相互接続され、それらの制御器は、計算機可読媒体１７２８などの様々な異なる型の計算機可読媒体、電子表示装置、入力装置、ならびに他のそのような構成要素、下位構成要素、および計算資源へのアクセスをもたらす。計算機可読媒体１７２８は、実行用のＣＰＵに対する命令を提供することに関与する任意の適した媒体であり得る。例えば、計算機可読媒体１７２８は、ファームウェア、光ディスク、フラッシュメモリ、磁気ディスク、または磁気ディスク装置などの不揮発性媒体であり得る。画像処理は、分散型計算機システム上で実装される場合もあり、部分的にハードウェア論理回路網で実装される場合もある。
【００３８】
前述の説明では、解説目的で、本開示の徹底した理解をもたらすために具体的な専門語を使用した。しかしながら、本明細書で説明したシステムおよび方法を実践するために具体的な詳細は必要とされないことは、当業者には明らかであろう。具体的な例の前述の説明は、例示および説明の目的で提示される。それらの説明は、本開示に関して網羅的であること、または説明した正確な形態に本開示を限定することは意図されない。明らかに、多くの修正および変形が上記の教示に鑑みて可能である。それらの例が示され、説明されるのは、本開示の原理および実践的な用途を最良に解説するためであり、そのことによって他の当業者が、企図される特定の使用に適するような様々な修正によって本開示および様々な例を最良に利用することを可能にするためである。本開示の範囲は、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物により定義されることが意図される。
【図１Ｃ】
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【図１３】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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