(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞をインターロイキン−２３（ＩＬ−２３）のアンタゴニストで処理する工程を包含する方法により、前記Ｔ細胞によるインターロイキン−１７（ＩＬ−１７）産生を阻害するための組成物であって、有効成分として前記アンタゴニストを含み、前記アンタゴニストが抗ＩＬ−２３抗体または抗ＩＬ−２３レセプター抗体である、組成物。
【請求項２】
前記Ｔ細胞が、活性化Ｔ細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Ｔ細胞が、記憶細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記処理が、インビボで実施される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記処理が、哺乳動物被験体中で実施される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記哺乳動物被験体が、ヒトである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗体が、抗体フラグメントである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗体フラグメントが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗体が、全長抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗体が、キメラ抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗体が、ヒト化抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗体が、ヒト抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
有効量のインターロイキン−２３（ＩＬ−２３）のアンタゴニストを哺乳動物被験体に投与する工程を包含する方法による、前記哺乳動物被験体中のインターロイキン１７（ＩＬ−１７）の上昇した発現によって特徴付けられる炎症疾患の処置のための組成物であって、前記炎症疾患が、慢性炎症、自己免疫性糖尿病、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、リウマチ様脊椎炎、痛風性関節炎および他の関節炎状態、多発性硬化症（ＭＳ）、喘息、全身性エリテマトーデス、成人呼吸窮迫症候群、ベーチェット病、乾癬、慢性肺炎症疾患、対宿主性移植片反応、クローン病、潰瘍性大腸炎、アルツハイマー病、及び発熱から選択され、有効成分として前記アンタゴニストを含み、前記アンタゴニストが抗ＩＬ−２３抗体または抗ＩＬ−２３レセプター抗体である、組成物。
【請求項１４】
前記哺乳動物被験体が、ヒトである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記炎症疾患が、慢性炎症疾患である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記慢性炎症疾患が、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、対宿主性移植片反応、多発性硬化症（ＭＳ）、および乾癬からなる群より選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記抗体が、抗体フラグメントである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１８】
前記抗体フラグメントが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記抗体が、全長抗体である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２０】
前記抗体が、キメラ抗体である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２１】
前記抗体が、ヒト化抗体である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２２】
前記抗体が、ヒト抗体である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２３】
前記アンタゴニストが、さらなる治療薬剤と組み合わせて投与される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２４】
前記さらなる治療薬剤が、抗炎症分子である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記抗炎症分子が、コルチコステロイドおよび非ステロイド性抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）からなる群より選択される、請求項２４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、インターロイキン２３（ＩＬ−２３）のアンタゴニストを用いた、炎症誘発性サイトカインであるインターロイキン１７（ＩＬ−１７）のＴ細胞による産生の抑制に関係する。さらに本発明は、ＩＬ−１７濃度の上昇がみられることを特徴とする炎症性疾患の治療において、ＩＬ−２３アンタゴニストを使用することに関係する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
ＩＬ−１７はＴ細胞由来の炎症誘発分子であり、上皮細胞及び内皮細胞、線維芽細胞性細胞を刺激して、ＩＬ−６、ＩＬ−８、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１等他の炎症性サイトカイン及びケモカインを産出させる（Ｓ．Ａｇｇａｒｗａｌ，Ａ．Ｌ．Ｇｕｒｎｅｙ，Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ ７１，１（２００２）；Ｚ．Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３，８１１（１９９５）；Ｊ．Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ １６，６１１（１９９６）；Ｆ．Ｆｏｓｓｉｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８３，２５９３（１９９６）；Ａ．Ｌｉｎｄｅｎ，Ｈ．Ｈｏｓｈｉｎｏ，Ｍ．Ｌａａｎ，Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ １５，９７３（２０００）；Ｘ．Ｙ．Ｃａｉ，Ｃ．Ｐ．Ｇｏｍｍｏｌｌ，Ｊｒ．，Ｌ．Ｊｕｓｔｉｃｅ，Ｓ．Ｋ．Ｎａｒｕｌａ，Ｊ．Ｓ．Ｆｉｎｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ６２，５１（１９９８）；Ｄ．Ｖ．Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０，３５１３（１９９８）；Ｍ．Ｌａａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６２，２３４７（１９９９））。
【０００３】
またＩＬ−１７は、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βを含む他のサイトカインと共同して作用し、さらにケモカインの発現を誘導する（上記Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍ．Ｃｈａｂａｕｄ，Ｆ．Ｆｏｓｓｉｅｚ，Ｊ．Ｌ．Ｔａｕｐｉｎ，Ｐ．Ｍｉｏｓｓｅｃ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１，４０９（１９９８））。慢性関節リウマチ−（ＲＡ）の滑膜（Ｓ．Ｋｏｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０３，１３４５（１９９９）及びＭ．Ｃｈａｂａｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４２，９６３（１９９９））並びに同種異系移植拒絶反応中（Ｍ．Ａ．Ａｎｔｏｎｙｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ ３１（１９９９）；Ｍ．Ａ．Ａｎｔｏｎｙｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６２，５７７（１９９９）；Ｃ．Ｃ．Ｌｏｏｎｇ，Ｃ．Ｙ．Ｌｉｎ，Ｗ．Ｙ．Ｌｕｉ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ ３２（２０００）；Ｈ．Ｇ．Ｈｓｉｅｈ，Ｃ．Ｃ．Ｌｏｏｎｇ，Ｗ．Ｙ．Ｌｕｉ，Ａ．Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｙ．Ｌｉｎ，Ｔｒａｎｓｐｌ Ｉｎｔ １４，２８７（２００１））、多発性硬化症を含む他の慢性炎症疾患（Ｋ．Ｋｕｒａｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４３，２４５５（２０００））、乾癬（Ｃ．Ａｌｂａｎｅｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １１５，８１（２０００）及びＢ．Ｈｏｍｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４，６６２１（２０００））で、ＩＬ−１７の濃度が著しく上昇することが認められている。活性化Ｔ細胞によって産出されることは明らかであるが、これまでの報告類ではＴｈ１並びにＴｈ２偏向サイトカインプロファイルの範例内におけるＩＬ−１７の明確な分類は提供されていない。
【０００４】
ＩＬ−２３はヘテロ二量体のサイトカインであり、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）と共通するｐ４０と名付けられているサブユニットがｐ１９という独自のサブユニットと結合している（Ｂ．Ｏｐｐｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３，７１５（２０００））。ＩＬ−２３はＴ細胞、特に記憶Ｔ細胞の増殖を促進することが報告されている（Ｄ．Ｍ．Ｆｒｕｃｈｔ，Ｓｃｉ ＳＴＫＥ ２００２ Ｊａｎ ８；２００２（１１４）：ＰＥ１）。最近ｐ１９形質転換マウスが深部全身性炎症及び好中球増加症を示すと報告されている（Ｍ．Ｔ．Ｗｉｅｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６，７５６３（２００１））。
ＩＬ−１７並びにＩＬ−２３サイトカインの発現と生物学的役割との関連性はこれまでのところ確立されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓ．Ａｇｇａｒｗａｌ，Ａ．Ｌ．Ｇｕｒｎｅｙ，Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ ７１，１（２００２）；Ｚ．Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３，８１１（１９９５）
【非特許文献２】Ｊ．Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ １６，６１１（１９９６）
【非特許文献３】Ｆ．Ｆｏｓｓｉｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８３，２５９３（１９９６）
【非特許文献４】Ａ．Ｌｉｎｄｅｎ，Ｈ．Ｈｏｓｈｉｎｏ，Ｍ．Ｌａａｎ，Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ １５，９７３（２０００）
【非特許文献５】Ｘ．Ｙ．Ｃａｉ，Ｃ．Ｐ．Ｇｏｍｍｏｌｌ，Ｊｒ．，Ｌ．Ｊｕｓｔｉｃｅ，Ｓ．Ｋ．Ｎａｒｕｌａ，Ｊ．Ｓ．Ｆｉｎｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ６２，５１（１９９８）
【非特許文献６】Ｄ．Ｖ．Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０，３５１３（１９９８）
【非特許文献７】Ｍ．Ｌａａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６２，２３４７（１９９９）
【非特許文献８】Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍ．Ｃｈａｂａｕｄ，Ｆ．Ｆｏｓｓｉｅｚ，Ｊ．Ｌ．Ｔａｕｐｉｎ，Ｐ．Ｍｉｏｓｓｅｃ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１，４０９（１９９８）
【非特許文献９】Ｓ．Ｋｏｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０３，１３４５（１９９９）
【非特許文献１０】Ｍ．Ｃｈａｂａｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４２，９６３（１９９９）
【非特許文献１１】Ｍ．Ａ．Ａｎｔｏｎｙｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ ３１（１９９９）
【非特許文献１２】Ｍ．Ａ．Ａｎｔｏｎｙｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６２，５７７（１９９９）
【非特許文献１３】Ｃ．Ｃ．Ｌｏｏｎｇ，Ｃ．Ｙ．Ｌｉｎ，Ｗ．Ｙ．Ｌｕｉ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ ３２（２０００）
【非特許文献１４】Ｈ．Ｇ．Ｈｓｉｅｈ，Ｃ．Ｃ．Ｌｏｏｎｇ，Ｗ．Ｙ．Ｌｕｉ，Ａ．Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｙ．Ｌｉｎ，Ｔｒａｎｓｐｌ Ｉｎｔ １４，２８７（２００１）
【非特許文献１５】Ｋｕｒａｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４３，２４５５（２０００）
【非特許文献１６】Ｃ．Ａｌｂａｎｅｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １１５，８１（２０００）
【非特許文献１７】Ｂ．Ｈｏｍｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４，６６２１（２０００）
【非特許文献１８】Ｂ．Ｏｐｐｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３，７１５（２０００）
【非特許文献１９】Ｄ．Ｍ．Ｆｒｕｃｈｔ，Ｓｃｉ ＳＴＫＥ ２００２ Ｊａｎ ８；２００２（１１４）：ＰＥ１
【非特許文献２０】Ｍ．Ｔ．Ｗｉｅｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６，７５６３（２００１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
（発明の概要）
一側面では、本発明はＴ細胞によるインターロイキン１７（ＩＬ−１７）産生を抑制する方法に関するものであり、この方法にはインターロイキン２３（ＩＬ−２３）のアンタゴニストでＴ細胞を処理することが含まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
別の側面では本発明は、哺乳類被験体における、インターロイキン（ＩＬ−１７）の発現の上昇を特徴とする炎症性疾患の治療のための方法に関するものであり、この方法にはインターロイキン２３（ＩＬ−２３）のアンタゴニストを有効量哺乳類被験体に投与することが含まれる。
【０００８】
また別の側面では、本発明は以下の過程から成る抗炎症剤同定のための方法に関するものである：
（ａ）Ｔ細胞にＩＬ−２３を加え、候補薬の有る無しで培養する；
（ｂ）培養物中のＩＬ−１７濃度を追跡測定する；
（ｃ）当該候補薬分子が存在しない場合よりも存在する場合の方がＩＬ−１７の濃度が低ければ、候補薬分子が抗炎症剤であると確認される。
【０００９】
さらに別の側面で本発明は、哺乳類被験体内でＩＬ−１７産生を誘導するための方法に関するものであり、この方法には前記被験体にＩＬ−２３アンタゴニストを投与することが含まれる。すべての側面において、望ましいアンタゴニストあるいはアゴニストは抗ＩＬ−２３抗体もしくは抗ＩＬ−２３受容体抗体であり、これには抗体フラグメントが含まれる。望ましい炎症性疾患は、例えばリウマチ様関節炎（ＲＡ）、異系移植拒絶反応を引き起こす恐れのある移植片対宿主反応、多発性硬化症（ＭＳ）、乾癬等の慢性炎症状態である。ＩＬ−１７産生の誘導は一般的に、例えばＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの感染等、細菌感染を被った被験体に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】種々の細胞におけるＩＬ−１７の産生（Ａ）：Ｃ５７／ＢＬ−６マウスから脾臓の単個細胞懸濁液を調製し、密度勾配遠心によって懸濁脾細胞から単核細胞を分離した。２ｘ１０６細胞／ｍｌの細胞懸濁液を微生物由来リポペプチドＬＢＰ（１００ｎｇ／ｍｌ）もしくはＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＬＴＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）の有る無しで３日間培養した。その後細胞を回収し、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着法）を用いてＩＬ−１７の分析を行った。（Ｂ）：ＣＤ９０標識細胞をＦＡＣＳで陽性選別することで、マウス脾細胞から精製したＴ細胞を得た。この細胞をプレート結合抗ＣＤ３抗体もしくは活性化樹状細胞（ＬＰＳで処理）の上清の有る無しで３日間培養し（１ｘ１０６細胞／ｍｌ）、培養物上清を回収してＥＬＩＳＡキットを用いてＩＬ−１７濃度を測定した。マクロファージをｒｍＧＭ−ＣＳＦ（２ｎｇ／ｍｌ）とｒｍＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）で４日間処理し、洗浄してＬＰＳ（０．５μｇ／ｍｌ）で再活性化させることによって、樹状細胞をマクロファージ（脾細胞懸濁液から接着細胞集団として得た。）から得た。３回の独立した実験による代表的な結果を示す。
【図２Ａ】ＩＬ−２３がＩＬ−１７の産生を刺激する。Ａ．脾細胞から単離した単核細胞を１００Ｕ／ｍｌの組換えＩＬ−２と共に培養し（２ｘ１０６細胞／ｍｌ）、様々な濃度のＩＬ−２３（０．１〜１０００ｎｇ／ｍｌ）の有る無しで６日間培養した。培養物上清に集まったＩＬ−１７濃度をＥＬＩＳＡを用いて測定した。
【図２Ｂ】ＩＬ−２３がＩＬ−１７の産生を刺激する。Ｂ．ＩＬ−２３処理によるＩＬ−１７ｍＲＮＡ量の変化を定量ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。ＰＣＲ反応のＣｔ（サイクル閾値）の相対的変化をプロットした。各サンプルのデータを各サンプル中に存在するグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素ｍＲＮＡ量に対して標準化し、次に刺激前状態の時間ゼロに存在するＩＬ−１７ｍＲＮＡ量に対して再びサンプル間で標準化した。各Ｃｔ値は１回のＰＣＲサイクルに対応しているので、１ＣｔはｍＲＮＡ量２倍の変化にほぼ等しい。５Ｃｔ変化量および１０Ｃｔ変化量に対するｍＲＮＡ倍数のおよその差を括弧内に記している。実験は４個体のマウス由来の脾細胞を用いて行い、個々のデータポイントをｘで表し、平均Ｃｔ変化量を棒グラフで示した。
【図２Ｃ】ＩＬ−２３がＩＬ−１７の産生を刺激する。Ｃ．ＩＬ−２３処理に応答した、ＩＬ−１７群に属するＩＬ−１７ＦのｍＲＮＡ量の変化を図２Ｂの説明のように定量ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。
【図３】ＩＬ−２３は記憶Ｔ細胞に作用してＩＬ−１７産生を誘導する。マウス脾細胞の単個細胞懸濁液から単離した単核細胞を（ａ）ＣｙＣ−ＣＤ４ ＋ ＰＥ−ＣＤ４４もしくは（ｂ）ＣｙＣ−ＣＤ４ ＋ ＰＥ−ＣＤ６２Ｌで染色し、記憶表現型についてＣＤ４４高／ＣＤ６２Ｌ低、あるいは未刺激表現型についてＣＤ４４低／ＣＤ６２高であるＣＤ４＋細胞を選別した。選別した細胞は１００Ｕ／ｍｌの組換えＩＬ−２を加えて、ＩＬ−２３並びにプレート結合抗ＣＤ３（５μｇ／ｍｌ）、抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ）の有る無しで５日間培養して洗浄し、抗ＣＤ３抗体でさらに２４時間再刺激した。上清を集め、ＥＬＩＳＡを用いてＬ−１７濃度を測定した。
【図４Ａ】ＩＬ１２ｐ４０抗体はＩＬ−２３依存的ＩＬ−１７産生を阻害する：（Ａ）漸増する濃度のｐ４０抗体もしくはアイソタイプが一致するが無関係のコントロール抗体にＩＬ−２３（１００ｎｇ／ｍｌ）を加えて３７℃で１時間、プレインキュベートした。次にマウス脾細胞から単離した単核細胞（２ｘ１０６細胞／ｍｌ）を加え、組換えＩＬ−２の有る無しでさらに５〜６日間インキュベートした。上清を集め、ＥＬＩＳＡを用いてＬ−１７濃度を測定した（左側）。最適濃度のＩＬ−１２ｐ４０抗体もしくはアイソタイプが一致するが無関係のコントロール抗体は、ＬＰＳで刺激した樹状細胞（１０％ ｖ／ｖ）の馴化培地を加えて３７℃で１時間、プレインキュベートし、次にマウス脾臓から単離した単核細胞を加えてＩＬ−２存在下でさらに５日間インキュベートした。上清を集め、ＥＬＩＳＡを用いてＬ−１７濃度を測定した（右側）。
【図４Ｂ】ＩＬ１２ｐ４０抗体はＩＬ−２３依存的ＩＬ−１７産生を阻害する：（Ｂ）野生型マウス（Ｃ５７／ＢＬ６）もしくはＩＬ−１２の一構成成分を欠いたマウス［例えばＩＬ１２ａ−／−（ｐ３５ノックアウト）あるいはＩＬ１２ｂ−／−（ｐ４０ノックアウト）］の脾細胞から単離した単核細胞を、ＣｏｎＡ存在下で３日間培養し、上清のＩＬ−１７濃度をＥＬＩＳＡを用いて測定した。
【図５Ａ】ＩＬ−１７産生に対するＩＬ−１２の影響：（Ａ）脾細胞培養物から単離した単核細胞を、精製したＩＬ−２３（１ ｎＭ）並びに表示濃度のＩＬ−１２存在下で５日間培養し、次に洗浄してＣｏｎＡでさらに２４時間刺激した。細胞上清のＩＬ−１７濃度をＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。
【図５Ｂ】ＩＬ−１７産生に対するＩＬ−１２の影響：（Ｂ）野生型もしくはＩＬ−１２Ｒβ２欠乏マウス（ＩＬ−１２Ｒβ２−／−ｋｏ）由来の脾細胞培養物から単離した単核細胞を、精製したＩＬ−２３（１ ｎＭ）の有る無しで５日間培養し、次に洗浄してＣｏｎＡでさらに２４時間刺激した。細胞上清のＩＬ−１７濃度及びＩＦＮ−γ濃度をＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。
【図６】ＩＬ−２３ｐ１９遺伝子座のターゲティング。Ａ：天然ＩＬ−２３ｐ１９遺伝子座（上）、ターゲット構造（中）、正確にターゲットされた遺伝子座（下）を、二重斜線で示した部分を除き一定の比例で描いた。白四角部分はコーディングエキソン、あや目四角部分はそのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の５’及び３’非転写部位をコードしているエキソンを表している。ｐ１９遺伝子の４つのコーディングエキソンに番号を振った。矢じりのある四角部分はネオマイシン（ｎｅｏ）及びチミジンキナーゼ（ｔＫ）選択カセットのプロモーター部位を示している。ＥＧＦＰとある四角部分は強化緑色蛍光タンパク質レポーター遺伝子の部位を示している。クローニングとアームの分析に用いた制限部位は以下のように表示してある。Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｓ、ＳａｃＩＩ；Ｅ、Ｅｃｏ ＲＩ；Ｂｇ、Ｂｇｌ ＩＩ；Ｘ、Ｘｈｏ Ｉ。ショートアームを増幅するために使用したアンチセンスプライマーの位置は、文字Ｐと矢印で示している。Ｂａｍ ＨＩ及びＥｃｏ ＲＩで切断してできた制限フラグメントのサイズは、野生型（ＷＴ）及び変異型（ＭＵＴ）部位に表示しており、これらのフラグメントをサザンブロットで検出するために用いた２つのプローブの部位を太線で示している。Ｂ及びＣ：各々プローブ１で釣り上げられたＢａｍ ＨＩ切断物とプローブＩＩで釣り上げられたＥｃｏ ＲＩ切断物とのサザンブロット分析。ＤＮＡは野生型（ＷＴ）胚性幹（ＥＳ）細胞及びＥＳクローン１ｃ５、野生型マウス、ヘテロ接合性（ＨＥＴ）マウス、ノックアウト（ＫＯ）マウスから抽出した。バンドの同定をブロットの左側に示し、分子量は右側に示している。
【図７】ＩＬ−２３ｐ１９−／−マウスの全血清免疫グロブリン濃度。１６の野生型マウス（黒丸）及びＩＬ−２３ｐ１９−／−マウス（白丸）について、免疫グロブリンアイソタイプの血清濃度をアイソタイプ特異的ＥＬＩＳＡによって測定した。免疫グロブリンアイソタイプはグラフの下側に表示している。
【図８】Ｌ−２３ｐ１９−／−マウスにおける体液性免疫反応。Ａ−Ｇ：初回及び二度目の卵白アルブミン（ＯＶＡ）による免疫後の、ＩｇＧ１（Ａ）並びにＩｇＧ２ａ（Ｂ）、ＩｇＧ２ｂ（Ｃ）、ＩｇＧ３（Ｄ）、ＩｇＥ（Ｅ）、ＩｇＡ（Ｆ）のＯＶＡ特異的濃度。黒丸は野生型マウス、白丸はＬ−２３ｐ１９−／−マウス、灰色丸はＩＬ−１２ｐ４０−／−マウス。任意に使用する単位は方法と材料にて記載のとおりに計算したものである。各グループの平均は、黒横線で示しており、数値はグラフの下側に示している。星印はＰ値が０．０５未満で統計的に有意であることを示す。
【図９】Ｌ−２３ｐ１９−／−マウスにおいてＴ細胞非依存性Ｂ細胞の反応は正常である。ＴＮＰ−ＬＰＳ（タイプＩ、左側）あるいはＴＮＰ−Ｆｉｃｏｌｌ（タイプＩＩ、右側）で免疫したマウスについて、ＴＮＰ特異的ＩｇＭの血清濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。
【図１０】記憶Ｔ細胞の機能。野生型（黒丸）及びＬ−２３ｐ１９−／−マウス（白丸）を０日目に卵白アルブミンで免疫し、２１日目にＴＮＰ−ＯＶＡでチャレンジした。０日目、１４日目、２６日目に血清を採取してＴＮＰ特異的ＩｇＧ１（Ａ）及びＩｇＧ２ａ（Ｂ）の存在をＥＬＩＳＡによって調べた。ＩｇＧ１については市販されている標準品を使用した。ＩｇＧ２については、任意の単位を方法と材料にて記載のとおりに計算した。
【図１１】遅延型アレルギー（ＤＴＨ）反応。抗原特異的腫脹は、抗原チャレンジ直前に測定した値に対する足甲厚みの増加率として計算した。結果はグループごとに計６匹のマウスの平均を取り、誤差棒線は標準偏差を表している。抗原のみによって引き起こされる腫脹に対するコントロールとして、感作させなかった別の野生型グループを用いた。内側の星印は、対応するグループと野生型との差異が統計的に有意である（ｐ＜０．０５）ことを示している。ＷＴ、野生型；ｐ１９ｋｏ、ＩＬ−２３ｐ１９−／−マウス；ｐ４０ｋｏ、Ｌ−１２ｐ４０−／−マウス。
【図１２】一方正常Ｔ細胞の初回抗原刺激によって、ＩＬ−２３ｐ１９−／−抗原提示細胞によって産生されるＩＬ−１７濃度が減少した。Ａ：野生型（黒柱）あるいはＩＬ−２３ｐ１９−／−（白柱）樹状細胞との組み合わせにおける、ｂａｌｂ／ｃ Ｔ細胞のインビトロアロ刺激実験。未刺激ＣＤ４＋ Ｔ細胞とＣＤ８−／ＣＤ１１ｃ＋／ＭＨＣ−ＩＩ＋細胞をＦＡＣＳによって選別し、微生物性リポペプチド（ＢＬＰ）の有る無しで培養した。培養５日後に増殖と上清中のサイトカイン濃度を測定した。ＡＰＣ、抗原提示細胞。Ｂ：インビトロＴ細胞反応。ＫＬＨで免疫した野生型（黒柱）あるいはＩＬ−２３ｐ１９−／−（白柱）マウス由来のリンパ節細胞懸濁液を単離し、インビトロにて２５μｇ／ｍｌ ＫＬＨで再刺激した。培養５日後に増殖とＩＬ−１７濃度を測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（好ましい実施形態の詳細）
（Ａ．定義）
他に定義されていない限り、ここで使用されている科学技術用語は、本発明が属する分野の普通の技術者によって一般に理解されているものと同じ意味を持つ。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ １９９４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ １９８９）を参照する。本発明の目的のため以下の用語を下記に定義する。
【００１２】
「アンタゴニスト」はこの明細書では最も広い意味で使用されている。ＩＬ−２３「アンタゴニスト」は分子であり、作用の基となるメカニズムを問わず、部分的にあるいは完全にＩＬ−２３の生物学的活性を遮断あるいは抑制、中和、防御、干渉するものである。本発明の目的のため、生物学的活性とは望ましくは活性化Ｔ細胞においてＩＬ−１７産生を誘導する活性である。例えばＩＬ−２３アンタゴニストは、活性化Ｔ細胞（例えば記憶Ｔ細胞）集団において、ＩＬ−２３を介するＩＬ−１７産生を抑制あるいは遮断、転換する活性に基づいて同定される。例えば、培養活性化Ｔ細胞にＩＬ−２３を加えて試験化合物の有る無しで培養し、細胞培養物上清のＩＬ−１７濃度を、例えばＥＬＩＳＡによって、追跡測定することができる。試験化合物が無い場合よりも有る場合の方がＩＬ−１７濃度が低ければ、その試験化合物はＩＬ−２３アンタゴニストである。他の方法として、試験化合物による処理前後にリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて組織中のＩＬ−１７ｍＲＮＡの発現並びにＩＬ−２３ｍＲＮＡの発現を測定することもできる。試験化合物存在下でＩＬ−１７ｍＲＮＡが減少すれば、その化合物はＩＬ−２３アンタゴニストである。ＩＬ−２３アンタゴニストの例には天然シーケンスのＩＬ−２３ポリペプチドサブユニット（例えばｐ４０サブユニット）に対する中和抗体、免疫グロブリン定常部シーケンスと融合するＩＬ−２３サブユニットから成る免疫付着因子、小分子、天然シーケンスのＩＬ−２３ポリペプチドのサブユニットをコードする遺伝子の翻訳と転写の両方あるいは一方を抑制する作用のあるアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばＩＬ−２３遺伝子の遺伝的おとり等のおとり、その他が含まれるがこれらに限定されない。同様にＩＬ−２３アンタゴニストには例えばＩＬ−１２Ｒβ１あるいはＩＬ−２３Ｒ等の天然ＩＬ−２３受容体のサブユニットに対する中和抗体、免疫グロブリン定常部シーケンスと融合するＩＬ−２３受容体サブユニットから成る免疫付着因子、小分子、天然シーケンスのＩＬ−２３受容体ポリペプチドのサブユニットをコードする遺伝子の翻訳と転写の両方あるいは一方を抑制することのできるアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばＩＬ−２３受容体遺伝子の遺伝的おとり等のおとり、その他が含まれるがこれらに限定されない。
【００１３】
「アゴニスト」は、この明細書では最も広い意味で使用されている。ＩＬ−２３アゴニストは、作用の基となるメカニズムを問わず、あらゆる天然シーケンスのＩＬ−２３が仲介する生物学的活性と類似する作用を持つ分子である。本発明の目的のため、生物学的活性とは、望ましくは活性化Ｔ細胞においてＩＬ−１７産生を誘導する作用である。ＩＬ−２３アゴニストの例には、例えばＩＬ−１２Ｒβ１あるいはＩＬ−２３Ｒサブユニット等天然ＩＬ−２３受容体のサブユニットに対する作動性の抗体並びにペプチド、小有機分子その他が含まれるがこれらに限定されない。
【００１４】
「アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド」あるいは「アンチセンスオリゴヌクレオチド」（これらの用語は交換して使用することができる。）は、シーケンス特異的な方法でターゲット遺伝子の転写あるいは翻訳、もしくはその両方を抑制することができる核酸分子と定義される。「アンチセンス」という用語は、その核酸がターゲット遺伝子のコーディング（「センス」）遺伝子配列に対して相補的であることを指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ワトソン−クリック塩基結合によって逆平行方向に新生ｍＲＮＡとハイブリダイズする。ターゲットｍＲＮＡ鋳型と結合することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドはコードされているタンパク質の翻訳の達成を阻害する。この用語には特に「リボザイム」と呼ばれるアンチセンス薬剤が含まれ、これは自然自己スプライシング活性を持つシーケンスを加えることによってターゲットＲＮＡの触媒切断を誘導する（Ｗａｒｚｏｃｈａ ａｎｄ Ｗｏｔｏｗｉｅｃ，「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ：ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｕｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．」，Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ ２４：２６７−２８１ ［１９９７］）。
【００１５】
「抗体」とい用語は最も広い意味で使用されており、特にモノクローナル抗体（アンタゴニストを含む。例えば中和抗体並びに作動性抗体。）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び抗体フラグメントが含まれる。目的とする生物学的活性を示す限り、モノククローナル抗体には当該抗体のフラグメントに加えて特に「キメラ」抗体が含まれる。このキメラ抗体は、重鎖あるいは軽鎖もしくはその両方の部分が、特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応するシーケンスと同一であるもしくは類似しており、残りの鎖は別の種由来の抗体、あるいは別の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応するシーケンスと同一であるもしくは類似しているものである（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５ ［１９８４］）。さらにモノクローナル抗体には、非ヒト免疫グロブリン由来の最小シーケンスを含む、「ヒト化」抗体あるいはそのフラグメント（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、その他抗体の抗原結合シーケンス）が含まれる。大半の場合ヒト化抗体は、受容者のＣＤＲ由来の残基が、目的とする特異性、親和性、作用を持つ非ヒト種（供与体抗体）のＣＤＲ由来の残基に置き換わっているヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。非ヒト種の例には、マウスもしくはラット、ウサギ等がある。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖ ＦＲ残基は、非ヒトの対応する残基に置換されている。さらに、ヒト化抗体は受容者抗体にも導入されたＣＤＲもしくはフレームワークシーケンスにもみられない残基から成ることもできる。抗体の性能を向上させ最大にする目的でこれらの修飾が行われる。一般に、ヒト化抗体は実質的にあらゆる、１つ以上、典型的には２つの可変領域から成ることとなり、全てのもしくは実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に相当し、且つ全ての、もしくは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンシーケンスのＦＲ領域である。また最適なヒト化抗体は免疫グロブリン定常部（Ｆｃ）の１つ以上の部分から成ることとなり、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常部から成る。詳細についてはＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；及びＲｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９９８）を参照する。ヒト化抗体にはＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（Ｒ）抗体が含まれ、この抗体の抗原結合領域は、目的とする抗原でマカークザルを免疫して作られた抗体から得られたものである。
【００１６】
「抗体フラグメント」は完全抗体の一部分から成り、望ましくは完全抗体の抗原結合領域あるいは可変領域から成る。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント並びに直鎖抗体（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））、ダイアボディ、一本鎖抗体分子、抗体フラグメントから作られる多重特異性抗体が含まれる。
【００１７】
この明細書で使用されている「炎症性疾患」あるいは「炎症性疾病」という用語は、炎症を引き起こす病理学的状態を指し、この状態は典型的には好中球の化学走性によって引き起こされる。当該疾患の例には、乾癬並びに皮膚炎を含む炎症性皮膚疾患、汎発性強皮症及び全身性硬化症、炎症性腸炎（ＩＢＤ）に伴う反応（クローン病並びに潰瘍性大腸炎等）、外科的組織再潅流による損傷並びに心筋梗塞、心停止、心臓手術後の再潅流、経皮経管冠動脈形成手術後の狭窄等の心筋虚血状態、並びに卒中並びに腹部大動脈瘤を含む虚血性再潅流疾患、卒中に続発する脳水腫、頭蓋外傷、血液量減少ショック、仮死、成人呼吸窮迫症候群 急性肺損傷、ベーチェット病、皮膚筋炎、多発性筋炎、多発性硬化症（ＭＳ）、皮膚炎、髄膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、変形性関節炎、ループス腎炎、リウマチ様関節炎（ＲＡ）等の自己免疫疾患、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｒｇｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、血管炎、白血球の血管外漏出を伴う疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）炎症疾患、敗血症あるいは外傷に続発する多臓器損傷症候群、アルコール性肝炎、細菌性肺炎、腎炎を含む抗原抗体複合体媒介疾患、敗血症、サルコイドーシス、組織・臓器移植に対する免疫異常反応、並びに胸膜炎並びに肺胞炎、脈管炎、肺炎、慢性気管支炎、気管支拡張症、びまん性汎細気管支炎、過敏性肺炎、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、嚢胞性線維症を含む肺の炎症、その他が含まれる。望ましい適用には、慢性炎症、自己免疫性糖尿病、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、リウマチ性脊椎炎、痛風性関節炎等の関節炎症状態、多発性硬化症（ＭＳ）、喘息、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｈｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｒｅｎａｔｉｓｙｓ）、成人呼吸窮迫症候群、ベーチェット病、乾癬、慢性肺炎症性疾患、対宿主性移植片疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、アルツハイマー病、発熱が含まれ、さらに炎症が関係するあらゆる疾患・疾病および関連する異常状態が含まれるがこれらに限定されない。
【００１８】
「治療する」あるいは「治療」という用語は、治療処置と予防策の両方を指し、その目的は望ましくない生理学的変化あるいは異常を予防する、もしくは遅らせる（軽減する）ことである。本発明の目的のため、有益なあるいは望ましい臨床結果には、検出可能か否かに係わらず、症状の緩和並びに疾患の範囲の縮小、疾患状態の安定化（例えば悪化しない。）、疾患の進行の遅延あるいは減速、疾患状態の改善あるいは一時的緩和、緩解（部分的あるいは全体的）が含まれるがこれらに限定されない。「治療」は、治療を受けない場合に見込まれる生存期間と比較した生存期間の延長も意味することができる。治療を必要とするものには、当該状態あるいは疾患をすでに有するものに加えて、当該状態あるいは疾患を被りやすいもの、あるいは当該状態あるいは疾患を予防すべきものが含まれる。
【００１９】
「慢性」投与は、急性治療とは反対に継続して薬剤を投与することを指し、長期間に渡って望ましい効果を維持する目的で行う。
【００２０】
「間欠」投与は、中断しないが連続して行われない治療であり、即ち周期的な治療である。
【００２１】
一つ以上の別の治療薬剤「と併用する」投与には、あらゆる順序の同時（併用）投与及び連続投与が含まれる。
【００２２】
「被験体」は脊椎動物であり、望ましくは哺乳類、より望ましくはヒトである。
【００２３】
「哺乳類」はこの明細書では哺乳類に分類されるあらゆる動物を指すために使用され、ヒト、あるいはヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等の飼育動物・家畜動物並びに動物園あるいはスポーツあるいはペット動物が含まれるが、これらに限定されない。この明細書で望ましい哺乳類はヒトである。
【００２４】
「有効量」とは、有益なあるいは望ましい治療（予防を含む。）結果に効果のある十分な量である。
【００２５】
（Ｂ．発明を実施するための形態）
本発明を実施するには、他に指定のない限り、分子生物学（組換え技術を含む。）、微生物学及び細胞生物学、生化学、免疫学の通常の手法を使用することとなり、これらは当分野の技術の範囲内である。当該手法は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）；並びに「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ＆ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，１９８７）；「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）等の文献において詳細に説明されている。
【００２６】
前記で議論したとおり、本発明は活性化Ｔ細胞、特に記憶Ｔ細胞において、ＩＬ−２３がＩＬ−１７を産生し、ＩＬ−２３アンタゴニストがこの過程を抑制するこができるという認識に基づくものである。従って、ＩＬ−２３アンタゴニストはＩＬ−１７濃度の上昇を特徴とする炎症状態を治療するための有望な候補薬である。逆にＩＬ−２３アゴニストは、例えばＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染等のマイコバクテリア感染を含む多様な感染に対する防御免疫反応を誘導するのに有用である。
【００２７】
（１．ＩＬ−２３のアンタゴニストあるいはアゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイ）
本発明はＩＬ−２３のアンタゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイを含み、このアッセイではＩＬ−１７濃度の上昇がみられることを特徴とする炎症状態の治療における有効性を確認する。さらに本発明はＩＬ−２３アゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイを含み、このアッセイではＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ による感染等感染に対する防御免疫反応の促進における有効性を確認する。
【００２８】
候補アンタゴニストに対するスクリーニングアッセイは、ＩＬ−２３（これのサブユニットあるいはフラグメントを含む。）もしくはＩＬ−２３受容体（これのサブユニットあるいはフラグメントを含む。）と結合するもしくは化合する、さもなくはＩＬ−２３と他の細胞性タンパク質との相互作用を干渉し、これによってＩＬ−２３の産生あるいは機能を干渉する化合物同定を目的として立案することができる。この明細書で提供されるスクリーニングアッセイには、化学薬品ライブラリーのハイスループットスクリーニングに基づいたアッセイが含まれ、これによってアッセイが特に小分子候補薬の同定に適するようになる。一般には結合分析と活性分析とが提供される。
【００２９】
このアッセイは、当分野でよく特性を与えられている、タンパク質−タンパク質結合分析、生化学スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、細胞ベースアッセイを含む、多様な様式で行うことができるが、これらに限定されない。
【００３０】
アンタゴニスト並びにアゴニストに対するあらゆるアッセイは、候補薬にＩＬ−２３ポリペプチドあるいはＩＬ−２３受容体ポリペプチドあるいは当該ポリペプチド（特にＩＬ−２３及びＩＬ−２３受容体のサブユニットを含む。）のフラグメントに、二つの成分が相互作用することができる条件下で十分な時間接触することを必要とする点で共通している。例えばヒトＩＬ−２３ｐ１９サブユニットはアミノ酸１８９個のポリペプチドであり、そのアミノ酸配列はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ（受け入れ番号）ＡＦ３０１６２０（ＮＣＢＩ ６０５５８０；ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ３０１６２０；上記Ｏｐｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．，）でＥＭＢＬデータベースから知ることができる。ＩＬ−２３ポリペプチドであるｐ４０サブユニットのアミノ酸配列も判明している（ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットとしても知られる。）。ＩＬ−２３が結合するＩＬ−１２Ｒβ１のアミノ酸配列はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＮＣＢＩ ６０１６０４で知ることができる。抗体あるいは当該ポリペプチドに結合する小分子の作製は、当業者の通常技術の範囲に十分収まる。
【００３１】
結合性分析において相互作用とは結合することであり、形成される複合体は単離することができる、もしくは反応混合物中で検出することができる。ある実施例では、ＩＬ−２３ポリペプチドあるいはＩＬ−２３受容体ポリペプチドあるいは候補薬を、例えばマイクロタイタープレート等の固相上で、共有結合もしくは非共有結合によって固定化する。非共有結合は一般に、固体表面をＩＬ−２３あるいはＩＬ−２３受容体ポリペプチドの溶液で被覆し、乾燥することによって達成される。他の方法として、固定化しようとするＩＬ−２３あるいはＩＬ−２３受容体ポリペプチドに特異的な固定化した抗体（例えばモノクローナル抗体）を使用してそのＩＬ−２３ポリペプチドあるいはＩＬ−２３受容体ポリペプチドを固体表面に繋ぎとめることができる。このアッセイは、検出用標識によって標識することができる非固定化成分を固定化成分（例えば固着された成分を含む被覆された表面）に加えることによって行われる。反応完了後に、反応しなかった成分を除去し（例えば洗浄によって）、固体表面に固着している複合体を検出する。固定化されていない成分がもとより検出用標識を有している場合は、固体表面で固定されている標識を検出することで、複合体ができていることが示される。固定化されなかった細胞がもとより標識を有していない場合、複合体は、例えば固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体を用いる等して複合体を検出することができる。
【００３２】
候補化合物がＩＬ−２３あるいはＩＬ−２３受容体と相互作用するが結合しないポリペプチドである場合、それぞれのポリペプチドとの相互作用はタンパク質−タンパク質相互作用を検出するためのよく知られた方法によって検出することができる。当該アッセイには、例えば架橋形成並びに免疫共沈降、密度勾配カラムあるいはクロマトグラフカラムによる共精製等の伝統的な手法が含まれる。さらにタンパク質−タンパク質相互作用は、Ｃｈｅｖｒａｙ ａｎｄ Ｎａｔｈａｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５７８９−５７９３（１９９１）で公開されているように、Ｆｉｅｌｄｓらによって記載されている酵母ベースの遺伝システムを用いて測定することができる（Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），３４０：２４５−２４６（１９８９）；Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：９５７８−９５８２（１９９１）。酵母ＧＡＬ４等多数の転写活性化物質は、２つの物理的に別個の調節ドメインから構成され、１つはＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。先述の文献に記載されている酵母発現システム（一般に「ツーハイブリッドシステム」と呼ばれている。）はこの特性を利用して、二つのハイブリッドタンパク質が用いられており、その一つのタンパク質ではターゲットタンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと融合し、他方では候補活性化タンパク質が活性化ドメインと融合する。ＧＡＬ１−ｌａｃＺ１受容体遺伝子の発現は、ＧＡＬ４活性化プロモーターを制御した状態で、タンパク質−タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構築に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、βガラクトシダーゼに対する発色基質を用いて検出される。二つの特定のタンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を、ツーハイブリッド法を用いて同定するための完全キット（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲＴＭ）がＣｌｏｎｅｔｅｃｈから市販されている。またこのシステムを拡張し、特定のタンパク質相互作用に係わるタンパク質ドメインの位置を決定することが可能であり、さらにこれらの相互作用に必須の役割を持つアミノ酸残基を特定することができる。
【００３３】
ＩＬ−２３と他の細胞内並びに細胞外成分、特にＩＬ−１７との相互作用を干渉する化合物は、以下のように試験することができる。通常、ＩＬ−２３と細胞内もしくは細胞外成分（例えばＩＬ−１７）とを含む反応混合物を、これらの二つの物が相互作用できる条件下で十分な時間調製する。候補化合物がＩＬ−２３とＩＬ−１７との相互作用を抑制する作用を調べるために、試験候補化合物の存在が有る無しで、反応を進める。加えて、第三の混合物に儀薬を加えて陽性コントロールとすることもできる。ＩＬ−２３はＩＬ−１７産生を誘導することが示されており、試験化合物がＩＬ−２３とＩＬ−１７との相互作用を抑制する作用は、例えば、試験化合物の有る無しでＩＬ−１７量を測定することによって試験される。ＩＬ−１７の量が、候補化合物が無い場合の方が有る場合よりも少なければ、本発明の定義によりその候補化合物はＩＬ−２３のアンタゴニストである。
【００３４】
ＩＬ−２３によるＩＬ−１７産生誘導を抑制する作用に基づいて同定されたＩＬ−２３アンタゴニストは、ＩＬ−１７濃度の上昇がみられることを特徴とする炎症状態の治療のための候補薬である。
【００３５】
ＩＬ−２３によるＩｌ−１７産生誘導を促進する作用に基づいて同定されたＩＬ−２３アゴニストは、Ｍｙｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによる感染等感染に対する防御免疫反応を誘発するあるいは支援するための候補薬であり、結果として結核等の感染症の治療のための候補薬となる。
【００３６】
この明細書で特に議論されているスクリーニングアッセイは、説明のみを目的としていることを強調する。スクリーニングするアンタゴニスト（例えばポリペプチド、ペプチド、非ペプチド小有機分子、核酸、その他）の種類に応じて選択することが可能な多様な他のアッセイは、当分野の技術者によってよく知られたものであり、同等に本発明の目的に適する。
【００３７】
（２．抗ＩＬ−２３抗体と抗ＩＬ−２３受容体抗体）
特定の実施例において、ＩＬ−２３アンタゴニストあるいはアゴニストはＩＬ−２３（例えばＩＬ−２３のサブユニット）に対するモノクローナル抗体であり、これには抗体フラグメントが含まれる。別の特定の実施例では、ＩＬ−２３アンタゴニスト並びにアゴニストにはＩＬ−２３受容体（例えばＩＬ−２３受容体のサブユニット）に対するモノクローナル抗体が含まれる。そのサブユニットを含め、ＩＬ−２３についてはこの明細の前記に記述している。ＩＬ−２３受容体はＩＬ−１２Ｒβ１及び、最近発見されたＩＬ−２３Ｒと名付けられたサブユニット（Ｐａｒｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：５６９９−５７９８（２００２））の、２つのサブユニットから構成される。いずれのサブユニットに対する抗体も、本発明の範囲に明確に収まる。アンタゴニストの場合、ＩＬ−２３Ｒに特異的に結合する抗体はＩＬ−２３が介する生物学的活性を特異的に遮断するため、ＩＬ−２３Ｒに特異的に結合する抗体が特に望ましい。
【００３８】
モノクローナル抗体を作製する方法は、当分野でよく知られている。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されている方法等のハイブリドーマ法を用いてモニクローナル抗体を調製することができる。ハイブリドーマ法では、一般的にマウス、ハムスターその他の適当な宿主動物を免疫薬剤で免疫し、その免疫薬剤に特異的に結合することになる抗体を産生するあるいは抗体を産生することができるリンパ球を誘出させる。他の方法として、インビトロでリンパ球を免疫することもできる。
【００３９】
免疫薬剤は典型的にはＩＬ−２３もしくはＩＬ−２３受容体ポリペプチド、あるいはそれらの融合タンパク質を含むこととなる。一般に、ヒト由来の細胞を求める場合、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用され、非ヒト哺乳類源を求める場合には脾細胞あるいはリンパ節細胞が使用される。次にポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を固定された細胞系と融合し、ハイブリドーマ細胞を作る（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）ｐｐ．５９−１０３）。固定された細胞は普通、形質転換させた哺乳類細胞であり、特にげっ歯類、ウシ、ヒト由来の骨髄腫細胞である。通常はラットあるいはマウスの骨髄腫細胞が使用される。このハイブリドーマ細胞は、望ましくは融合していない固定された細胞の増殖あるいは生存を抑制する１つ以上の物質を含む適当な培地で培養することができる。例えば、宿主細胞がヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴあるいはＨＰＲＴ）という酵素を欠損している場合、典型的にはこのハイブリドーマのための培地にはヒポキサンチン及びアミノプロテイン、チミジンが含まれることとなり（「ＨＡＴ培地」）、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる。
【００４０】
不死化される細胞系で望ましいのは、効率よく融合するもので、且つ選択された抗体産生細胞が安定して高濃度に抗体を発現することを助け、ＨＡＴ培地等の培地に対する感受性があるものである。不死化される細胞系でさらに望ましいものは、マウス骨髄腫細胞系であり、例えばこれはＳｔａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ並びにＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから入手することができる。また、ヒトモノクローナル抗体作製に関しては、ヒト骨髄腫細胞系並びにマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系が記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８７） ｐｐ．５１−６３）。
【００４１】
次に、ＩＬ−２３もしくはＩＬ−２３受容体に対するモノクローナル抗体の存在に関して、ハイブリドーマ細胞を培養する培地を分析することができる。望ましくはハイブリドーマ細胞が産生したモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降もしくは、ラジオイムノアッセイあるいは酸素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロ結合分析によって判定する。当該技術並びに分析法は当分野で知られているものである。例えばモノクローナル抗体の結合親和性は、Ｍｕｎｓｏｎ ａｎｄ Ｐｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析によって判定される。
【００４２】
目的とするハイブリドーマ細胞を同定後、そのクローンを限界稀釈法によってサブクローン化し、標準法（上記Ｇｏｄｉｎｇ）によって培養する。この目的のために適した培地には、例えばＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地並びにＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。他の方法として、ハイブリドーマ細胞を哺乳類の腹水としてインビボで増殖させることもできる。
【００４３】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡセファロースあるいはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティークロマトグラフィー等、一般的な免疫グロブリン精製法によって、培地あるいは腹水から単離して精製することができる。
【００４４】
また、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されている方法等、組換えＤＮＡ法によってモノクローナル抗体を作製することもできる。一般的な手法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖並びに軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドのプローブを用いる方法によって）、本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを容易に単離してシーケンスを決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞は当該ＤＮＡの望ましい供給源として役立つ。単離後、ＤＮＡを発現ベクターに加えることができ、次にこのベクターを類人猿コス細胞あるいはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、他の免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞等の宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体を生成させる。例えばヒト重鎖並びに軽鎖の定常部をコードするシーケンスをマウスの同種シーケンスに置換することによって、あるいは免疫グロブリンをコードするシーケンスを、非免疫グロブリンポリペプチドをコードするシーケンスの全部もしくは一部に共有結合させることによって、ＤＮＡを改変することもできる（米国特許第４，８１６，５６７号；上記Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）。当該非免疫グロブリンポリペプチドを本発明の抗体の定常部と置換することができる、もしくは本発明の抗体の抗原結合部位である可変領域と置換してキメラ二価抗体を作製することもできる。
【００４５】
抗体は一価抗体であることができる。一価抗体を作製する方法は当分野でよく知られている。例えば、ある方法では免疫グロブリン軽鎖と改変重鎖の組換え発現を伴う。一般には重鎖をＦｃ領域の任意の部位で切断して、重鎖の架橋形成を防ぐ。他の方法として、関係するシステイン残基を他のアミノ酸残基と置換する、もしくはこれを除去して架橋形成を防ぐ。またインビトロの方法も一価抗体の作製に適する。
【００４６】
さらに本発明の抗ＩＬ−２３抗体並びに抗ＩＬ−２３受容体抗体はヒト化抗体あるいはヒト抗体であることができる。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形態はキメラ免疫グロブリン、もしくはこれの免疫グロブリン鎖、あるいはそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）、その他の抗原結合サブシーケンス等）であり、これらは非ヒト免疫グロブリン由来の最小のシーケンスを含む。ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（受容者抗体）を含み、受容者抗体の相補性決定部（ＣＤＲ）由来の残基が、目的とする特異性及び親和性、活性を有する、マウスあるいはラット、ウサギ等非ヒト種（供与者抗体）のＣＤＲ由来の残基に置換されている。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は非ヒトの相当する残基によって置換されている。またヒト化抗体は、受容者抗体にも、移入されるＣＤＲもしくはフレームワークシーケンスにもない残基から成ることもできる。一般的に、ヒト化抗体は事実上全ての１つ以上、典型的には２つの可変領域から成ることになり、ここで全てのあるいは実質的に全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲに相当し、且つ全てのあるいは実質的に全てのＦＲ領域は非ヒト免疫グロブリンコンセンサスシーケンスのＦＲ領域である。最適なヒト化抗体は、免疫グロブリン定常部（Ｆｃ）の少なくとも一部分から成ることとなり、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常部である（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
【００４７】
非ヒト抗体をヒト化する方法は当分野においてよく知られている。一般的には、ヒト化抗体は非ヒト供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「導入」残基と呼ばれ、典型的には「導入」可変領域から得られる。ヒト化は基本的にＷｉｎｔｅｒらの方法（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って行われ、げっ歯類ＣＤＲシーケンスをヒト抗体の相当するシーケンスに置換する。従って、当該「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４，１８６，５６７号）、本質的に完全ヒト可変部が非ヒト種由来の相当するシーケンスで置換されたわけではない。実際には、典型的なヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の一部とおそらくはＦＲ残基の一部がげっ歯類抗体の相同する残基で置換されているヒト抗体である。
【００４８】
またヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリ（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））を含め、当分野で知られている多様な手法を用いて作製することができる。また、Ｃｏｌｅらの手法並びにＢｏｅｒｎｅｒらの手法もヒトモノクローナル抗体の調製に有用である（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）並びにＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１））。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内生免疫グロブリン遺伝子の一部または全部を不活性化した、マウス等の形質転換動物に導入することによって作ることができる。免疫チャレンジ後にヒト抗体の産生が観察され、遺伝子転位、集合体形成、抗体レパートリーを含め、全ての点でヒトにみられるものと非常に似ている。この手法は例えばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．５，５４５，８０７；５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，６６１，０１６ 及び以下の科学文献に記載されている：Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８１２−８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８２６（１９９６）；Ｌｏｎｇｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）。
【００４９】
Ｍｅｎｄｅｚら（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６（１９９７））はこの手法をさらに改良して「ゼノマウスＩＩ」と称する形質転換マウス系を作り出した。「ゼノマウスＩＩ」は抗原でチャレンジされると親和性の高い完全ヒト抗体を作る。これは上記のように、メガベースのヒト重鎖遺伝子座及び軽鎖遺伝子座を、内生ＪＨセグメントを欠損させたマウスに移入する生殖細胞系統合によって作製された。ゼノマウスＩＩは、約６６のＶＨ遺伝子と完全ＤＨ領域、ＪＨ領域、３種の定常部（μ、δ、χ）を含む１，０２０ ｋｂのヒト重鎖遺伝子座を有し、さらに３２のＶκ遺伝子とＪκセグメント、Ｃκ遺伝子を含む８００ ｋｂのヒトκ遺伝子座を有する。これらのマウスによって産生された抗体は、遺伝子転位並びに集合体形成、抗体レパートリーを含め、全ての点でヒトにみられるものと非常によく似ている。マウス遺伝子座の遺伝子転位を妨げる内生ＪＨセグメントを欠失しているため、このヒト抗体は内生抗体に優先して発現する。
【００５０】
他の方法として、ファージディスプレイ法（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｔｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３（１９９０））を用いて免疫されていない供与者由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）領域遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体並びに抗体フラグメントを作ることができる。この方法に従うと、抗体Ｖ領域遺伝子は、Ｍ１３あるいはｆｄ等の繊維状バクテリオファージのメジャーコートあるいはマイナーコートタンパク質遺伝子にインフレームクローニングされ、ファージ粒子表面上に機能性抗体フラグメントとしてディスプレイされる。この繊維状粒子にはファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーが含まれているため、抗体の機能特性に基づいて選択することで、これらの特性を呈する抗体をコードする遺伝子を選択することとなる。つまり、ファージはＢ細胞の一部の特性を模倣する。ファージディスプレイは様々な方法で行うことができ、それらの論評については、例えばＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ Ｓ．ａｎｄ Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３，５６４−５７１（１９９３）を参照する。いくつかのＶ遺伝子源をファージディスプレイに使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２，６２４−６２８（１９９１）は、免疫したマウスの脾臓由来のＶ遺伝子の、ランダムな組み合わせの少数ライブラリーから様々な系列の抗オキサゾロン抗体を単離した。免疫していないヒト供与者のＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、基本的にＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２，５８１−５９７（１９９１）あるいはＧｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１２，７２５−７３４（１９９３）で記載されている方法に従って、多様な系列の抗体（自己抗原を含む。）を単離することができる。自然状態での免疫反応では、抗体遺伝子は高率で突然変異を蓄積する（体細胞高頻度突然変異）。誘発された変化の一部によって高い親和性が得られ、高親和性表面免疫グロブリンをディスプレイするＢ細胞は優先して複製されてその後の抗原チャレンジの間に分化する。この自然状態での過程を、「チェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）」（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０，７７９−７８３（１９９２））として知られている手法を採用することによって模擬することができる。この方法では、重鎖及び軽鎖Ｖ領域遺伝子を、免疫していない供与者から得たＶ領域遺伝子の自然発生異体（レパートリー）のレパートリーに順次置換することによって、ファージディスプレイによって得られた「一次」ヒト抗体の親和性を向上させることができる。この手法によって、ｎＭ範囲内で親和性を持つ抗体及び抗体フラグメントの産生が可能となる。非常に大きなファージ抗体レパートリーを作製する方法は、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１，２２６５−２２６６（１９９３）に記載されている。
【００５１】
様々な抗体フラグメント作製の手法が開発されている。従来は完全抗体をタンパク質分解することを介して抗体フラグメントを得ていた（例えばＭｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７（１９９２）並びにＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）を参照する。）。しかし現在では、抗体フラグメントは組換え宿主細胞から直接作ることができる。例えばＦａｂ’−ＳＨフラグメントはＥ．ｃｏｌｉから直接回収することができ、化学結合してＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成する（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２））。別の実施例では、Ｆ（ａｂ’）２分子構築を促進するためにロイシンジッパー ＧＣＮ４を用いてＦ（ａｂ’）２を作る。別の方法によると、ＦｖあるいはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体フラグメントを作製するその他の手法は当分野の技術者がよく知るものである。
【００５２】
共有結合した２つの抗体から成るヘテロ結合抗体も、本発明の範囲に入る。当該抗体は、例えば、免疫システム細胞を不要細胞へ標的化させるために提唱されており（米国特許第４，６７６，９８０号）、またＨＩＶ感染に対する治療のために提唱されている（ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ ９１／００３６０及びＷＯ ９２／２００３７３）。ヘテロ結合抗体は、よく知られている市販されている架橋剤を使用し、あらゆる共有結合架橋法を用いて作ることもできる。
【００５３】
モノクローナル抗体の作製に関するより詳細な情報については、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９６；Ｌｉｄｄｅｌｌ ａｎｄ Ｗｅｅｋｓ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ，Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ：Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，１９９５；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９；Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，２００１を参照する。
【００５４】
（３．標的となる疾患）
ＩＬ−１７はリウマチ様関節炎（ＲＡ）を含む様々な炎症性疾患に関係している。ＲＡの基本的な特徴の一つは、関節周囲の骨の侵食である。骨吸収では破骨細胞が鍵となる役割を果たしているが、破骨細胞が前駆細胞から形成されるメカニズムは完全には理解されていない。最近Ｋｏｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：１３４５（１９９９））は、マウス造血細胞と１次骨芽細胞との共培養物において、インターロイキン１７（ＩＬ−１７）が破骨細胞様の細胞の形成を誘導する可能性がみられたことを報告している。このＩＬ−１７に誘導される破骨細胞形成は、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）の選択的阻害剤であるインドメタシンによって抑制されることが示されている。ＲＡ患者の滑液には、変形性関節症患者と比較して著しく高濃度のＩＬ−１７が含まれることが認められている。さらに免疫染色を用いて、ＲＡ患者の滑液膜組織にてＩＬ−１７陽性単核細胞が検出されたが、ＯＡ患者の組織からは検出されなかった。これらの結果は、ＲＡ患者ではＩＬ−１７が骨侵食と関節の損傷に寄与している可能性があり、抑制のための標的となり得ることを示唆すると解釈されている。
【００５５】
また、ベーチェット病患者でも健康な被験者と比較して、ＩＬ−１７の血清濃度の著しい上昇がみられる。Ｈａｍｚａｏｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．３１（４）：２０５−２１０（２００２）。
【００５６】
ＩＬ−１７濃度の上昇は喘息患者気道内でも見受けられ、これはＩＬ−１７がアルファ−ケモカイン等他の炎症誘発性化学伝達物質の放出を通じて炎症反応を増幅している可能性のあることを示唆している。Ｍｏｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｅｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０８（３）：４３０−４３８（２００１）；並びにＷｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５（２）：１７７−１８３（２００１）。
【００５７】
ＩＬ−１７濃度の上昇は、全身性エリテマトーデス患者で報告されている。Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｌｕｐｕｓ ９（８）：５８９−５９３（２０００）。
【００５８】
ＩＬ−１７は乾癬に関係していると記載されている。Ｈｏｍｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（１２）：６６２１−６６３２（２０００）。
【００５９】
多発性硬化症において血液及びＣＳＦ単核細胞で、ＩＬ−１７ｍＲＮＡが増加していることが報告されている。Ｍａｔｕｓｅｖｉｃｉｕｓ ｅｔ ｌａ．，Ｍｕｌｔ．Ｓｃｌｅｒ．５（２）：１０１−１０４（１９９９）。
【００６０】
これらの報告及び多数の同様の報告に基づくと、ＩＬ−２３がＩＬ−１７を産生する作用を抑制してその結果ＩＬ−１７濃度を減少させるＩＬ−２３アンタゴニストは、様々な（慢性）炎症状態並びに炎症疾患の治療の有益な候補である。当該状態並びに疾患には、慢性炎症、自己免疫糖尿病、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、リウマチ様脊椎炎、痛風性関節炎並びに他の関節炎状態、多発性硬化症（ＭＳ）、喘息、全身性紅斑性狼瘡（ｓｙｓｔｈｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｒｅｍａｔｏｓｕｓ）、成人呼吸窮迫症候群、ベーチェット病、乾癬、慢性肺炎症疾患、移植片対宿主反応、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、アルツハイマー病、発熱が含まれるがこれらに限定されない。
【００６１】
ＩＬ−１７は、結核等ある種の感染疾患に対する防御反応が生じる際に重要な役割を果たしていることが知られており、ＩＦＮ−γ生成を促して細胞性免疫反応を誘導することがわかっている。従って作動性抗体を含めＩＬ−２３アゴニストは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによって引き起こされる結核等様々な感染症に対する細胞性免疫反応の誘導において有用性が認められており、毎年世界中で３００万人以上の人々が死亡する原因となっているこうした感染性疾患を治療するための有望な候補薬である。
【００６２】
（４．薬学的組成物）
ＩＬ−２３あるいはＩＬ−２３受容体に特異的に結合する抗体は、この明細の前記で記載されているスクリーニングアッセイによって同定された他のＩＬ−２３アンタゴニスト分子あるいはアゴニスト分子も同様に、特に炎症性疾患あるいは細胞性免疫反応の誘導による疾患等様々な疾患の治療のために薬学的組成物の形態で投与することができる。
【００６３】
抗体フラグメントを使用する場合は、標的タンパク質の結合部位に特異的に結合する最小の大きさの阻害性フラグメントが望ましい。例えば、抗体の可変領域シーケンスに基づいて、標的タンパク質のシーケンスに結合する性質を有するペプチド分子を立案することができる。当該ペプチドは化学的に合成するか、もしくは組換えＤＮＡ法によって合成することができ、もしくは両方の方法で合成することができる。Ｍａｒａｓｃｏ ｓｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３（１９９３）を参照する。
【００６４】
活性成分は、コロイド剤輸送系（例えばリポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、ナノカプセル）もしくはマイクロエマルジョン中で、例えばコアセルベーション法あるいは界面重合によって調製したマイクロカプセルに取り入れることもできる。例えば各々ヒドロキシメチルセルロース、あるいはゼラチンマイクロカプセル並びにポリ（メチルメタシレート）マイクロカプセルがある。当該手法はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（上記）に記載されている。
【００６５】
インビボ投与に使用する製剤は滅菌されていなければならない。これは滅菌濾過メンブレンを用いた濾過によって容易に行われる。
【００６６】
持続放出性製剤を調整することもできる。持続放出性製剤の適当な例には、抗体を内包する、疎水性固形ポリマーの半透過性基質が含まれ、この基質は、例えばフィルム、マイクロカプセル等成形物の形態をとる。持続放出性製剤の例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（メタクリ酸２ヒドロキシエチル）あるいはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．３，７７３，９１９）、Ｌ−グルタミン酸とγＬ−グルタミン酸エステルとの共重合物、非分解性酢酸エチレンビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸とグリコール酸との共重合体と酢酸ロイプロライドから構成される注入用小球形）等の分解性酪酸グリコール酸共重合体、ポリＤ（−）３ヒドロキシ酪酸が含まれる。酢酸エチレンビニル並びに乳酸−グリコール酸等のポリマーは１００日間に渡って分子を放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短い期間しかタンパク質を放出することができない。カプセルに入れた抗体が長期間体内に留まる場合、水分と３７℃という温度にさらされる結果変成したり、凝集したりすることもある。この結果生物学的活性が失われ、免疫原性が変性する可能性がある。関係するメカニズムに基づいた、安定化のための合理的な方法を考案することができる。例えばその凝集メカニズムがチオ二硫化物の置換による分子間Ｓ−Ｓ結合の形成によるものであると判明したならば、ＳＨ基の修飾、並びに酸性溶液の凍結乾燥、水分量の制御、適切な添加剤の使用、特別なポリマー基質組成の開発によって安定化を達成することができる。
【００６７】
またこの処方物には、治療の対象となる特定の適用のために必要な活性化合物を一つ以上含むことができ、望ましくは互いに有害作用を与えない相補的活性を持つ化合物である。当該分子は意図する目的に対して効果が得られる量で組み合わされた形で適切に存在するか、もしくは独立して処方されて、同時にあるいはあらゆる順序で順次投与される。
【００６８】
例えば、本発明のＩＬ−２３アンタゴニストを抗炎症剤並びに、標的とする疾患並びに状態の治療のため目下使用されている他の活性化合物と併用して投与することができる。当該化合物にはコルチコステロイド、アスピリンやイブプロフェン並びに例えばＣｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標）及びＶｉｏｘｘ（登録商標）等のＣＯＸ−２、等の抑制剤等の非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、メトトレキセートやレフルノミド、スルファサラジン、アザチオプリン、シクロスポリン、ヒドロキシクロロキン、Ｄペニシラミン等の疾患変性性抗リウマチ薬剤（ＤＭＡＲＤ）、ＴＮＦ並びにＩＬ−１抑制剤等の生体応答調節剤（ＢＲＭ）が含まれる。
【００６９】
以下の例は説明の目的のためにのみ提供するものであって、あらゆる面で、本発明の範囲を制限することを意図しない。
【００７０】
この明細書で記載されている全ての特許並びに参考文献は、参考のためこの明細にその全体を添付する。
【実施例】
【００７１】
（実施例１）
インターロイキン２３（ＩＬ−２３）は、インターロイキン１７（ＩＬ−１７）の産生を特徴とする、第三のＣＤ４ Ｔ細胞活性化状態を促進する。
【００７２】
活性化Ｔ細胞によって産生することは明らかであるが、従来の報告ではＴｈ１並びにＴｈ２偏向サイトカインプロファイルの例証内でＩＬ−１７の明確な分類は提供されていない。この実施例にて記載される最初の実験の目的は、ＩＬ−１７がＴｈ１あるいはＴｈ２応答に伴うシグナルとは異なるシグナルに応答して発現している可能性を調べることであった。
【００７３】
（実験方法）
細胞培養 − 脾臓単個細胞懸濁液はＣ５７／ＢＬ−６マウスから調製し、密度勾配遠心によって懸濁脾細胞から単核細胞を単離した。２ｘ１０６細胞／ｍｌにＩＬ−２を添加し、様々な刺激の有る無しで培養した（図の説明で示している。）。その後に細胞を回収してＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いてＩＬ−１７について分析した。マクロファージ（脾細胞懸濁液から接着性集団として得た）をｒＧＭ−ＣＳＦ（２ｎｇ／ｍｌ）とｒＩＬ−４（１０００ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）で４日間処理し、洗浄してＬＰＳ（０．５μｇ／ｍｌ）で再活性化することによってマクロファージから樹状細胞を得た。マウス脾細胞の単個細胞懸濁液から単離した単核細胞をＣｙＣ−ＣＤ４ ＋ ＰＥ−ＣＤ４４あるいはＣｙＣ−ＣＤ４ ＋ ＰＥ−ＣＤ６２Ｌで染色し、記憶表現型についてはＣＤ４４高／ＣＤ６２Ｌ低、未刺激表現型についてはＣＤ４４低／ＣＤ６２Ｌ高であるＣＤ４＋細胞を選別することによって、記憶Ｔ細胞及び未刺激Ｔ細胞を分離した。
【００７４】
インビトロＴ細胞分化誘導 − ＣＤ４＋細胞は、抗ＣＤ４磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、野生型Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓から精製した。精製したＴ細胞（２ ｘ １０６細胞／ｍｌ）を５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体及び１ ｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体をコートしたプレート上に置き、３日間活性化した。培養物にＩＬ−２を添加してＩＬ−１２（２０ ｍＭ）＋ 抗ＩＬ−４（０．５μｇ／ｍｌ）（Ｔｈ１分化用）もしくはＩＬ−２３（１０ ｎＭ）（ＩＬ−１７産生用）で処理した。初回活性化後に細胞培養物を十分に洗浄し、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）でさらに２４時間刺激した。その後、ＥＬＩＳＡを使用して分泌された様々なサイトカインについて細胞上清を分析した。
【００７５】
ＩＬ−１２ｐ４０抗体によるＩＬ−１７産生抑制 − 抗ＩＬ−１２抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｃａｔ．ｎｏ．ＡＦ−４１９−ＮＡ）もしくは無関係のコントロール抗体（抗ＦＧＦ−８Ｇ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｃａｔ．ｎｏ．ＡＦ−４２３−ＮＡ））にＩＬ−２３（１００ｎｇ／ｍｌ）、あるいはＬＰＳ刺激済み樹状細胞（１０％ ｖ／ｖ）の馴化培地を加えて３７℃で１時間プレインキュベートした。次にマウス脾臓から単離した単核細胞（２ ｘ １０６細胞／ｍｌ）を加えてさらに５〜６日間培養した。上清を集めＩＬ−１７濃度をＥＬＩＳＡを用いて測定した。
【００７６】
ＩＬ−２３の精製−マウスＩＬ−２３ − ＩＬ−２３構成成分を、ヒト胚性腎細胞（細胞数２９３）内でＣ末端Ｈｉｓ標識ｐ１９とＦＬＡＧ０標識ｐ４０とを共発現させることによって作製し、分泌されたタンパク質をニッケルアフィニティ樹脂によって精製した。内毒素濃度は１μｇ当たり０．２エンドトキシンユニットを下回っており、検出できる濃度ではなかった。
【００７７】
（結果）
最初に、様々な微生物産生物のＩＬ−１７産生促進作用を調べた。スピロヘータＢ．Ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉが引き起こすライム病患者由来の微生物性リポペプチドに応答してＩＬ−１７が上昇することが、Ｉｎｆａｎｔｅ−Ｄｕａｒｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏ １６５，６１０７（２０００）によって認められている。ＬＰＳ（グラム陰性細菌）あるいはＬＴＡ（グラム陽性細菌）、ＬＢＰ（細菌性リポペプチド）を含む様々な微生物性ペプチドを加えた脾細胞培養物で、ＩＬ−１７が産生された（図１）。精製Ｔ細胞単独、あるいは精製マクロファージ自体はＩＬ−１７を産生しなかった。プレート結合抗ＣＤ３を用いて受容体架橋形成をした精製Ｔ細胞、及び活性化マクロファージあるいは活性化樹状細胞の上清で処理した精製Ｔ細胞ではＩＬ−１７の産生が上昇した。このことは、Ｔ細胞に作用してＩＬ−１７の産生を促進する未同定の因子を、これらの細胞が放出していることを示唆している。
【００７８】
このＩＬ−１７促進作用に関係していると考えられる候補分子の発現をプロファイルしたところ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて、Ｌ−２３の構成成分であるｐ１９及びｐ４０のｍＲＮＡ発現量（Ｂ．Ｏｐｐｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３，７１５（２０００））が１００〜１０００倍増加することが活性化樹状細胞で観察された（データは示していない）。つまり、ＩＬ−２３の効果が確認された。
【００７９】
マウスＩＬ−２３構成成分は、ヒト胚性腎細胞（細胞数２９３）中でＣ末端Ｈｉｓ標識ｐ１９とＦｌａｇ標識ｐ４０と共発現させて作製し、分泌されたタンパク質をニッケルアフィニティ樹脂を使用して精製した。内毒素は０．２ ＥＵ／μｇ以下であり、検出されなかった。培養脾細胞にＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）とＣｏｎＡ（２．５μｇ／ｍｌ）を加え、Ｔｈ１誘導条件（ＩＬ−１２ ＋ 抗ＩＬ−４）下、あるいはＴｈ２誘導条件（ＩＬ−４ ＋ 抗ＩＦＮ−γ）下、あるいは精製ＩＬ−２３（１００ｎｇ／ｍｌ）存在下で３〜４日間培養した。その後培養物を洗浄し、ＣｏｎＡでさらに２４時間再刺激した。様々なサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡを使用して測定した。ＥＬＩＳＡの標準曲線範囲の最低稀釈に満たない濃度は、「検出不能（Ｎ．Ｄ．）」と記録した。以下は、別々に実施した３回の実験結果の典型例である。
【００８０】
ＩＬ−１２刺激Ｔｈ１誘導条件下で培養した脾細胞によるＩＬ−１７産生は明確なものではなかった。一方Ｔｈ２誘導条件下では、コントロールと比較してＩＬ−１７の増加はなかった。結果は以下にある表１に示す。
【００８１】
【表１】
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ＩＬ−２３を加えた培養物では、投与量に応じて高濃度のＩＬ−１７産生がみられた（図２）。またＩＬ−２３では、Ｔｈ１誘導条件下で観察されたものよりも高い濃度のＧＭ−ＣＳＦがみられた。対照的に、ＩＦＮ−γ濃度は、Ｔｈ１誘導条件下で観察されたものよりも著しく低かった。ＴＮＦ−α濃度はＴｈ１条件と同程度であった。ＩＬ−１２ｐ４０単独ではＩＬ−１７産生がみられなかった（データは示していない。）。ＩＬ−２３はＩＬ−１７ｍＲＮＡ濃度の上昇を促進した（図２Ｂ）。ＩＬ−１７ｍＲＮＡ濃度はＩＬ−２３を暴露した６時間のあいだに数百倍増加し、ＩＬ−２３が存在し続けると高い濃度が維持された。この効果は抗ＩＬ−１７抗体の存在によって抑制されなかった。これは、ＩＬ−１７自体はこのプロセスに関与していないことを示唆している（データは示していない。）。さらに、最近ＩＬ−１７群の一員と同定されたＩＬ−１７ＦのｍＲＮＡも、ＩＬ−２３に応答して上方制御されたことが認められた（図２Ｃ）。
【００８２】
ＩＬ−２３は、記憶Ｔ細胞の増殖を促進するが未刺激Ｔ細胞の増殖は促進しないことが報告されている（上記Ｄ．Ｍ．Ｆｒｕｃｈｔ）。よって、未刺激Ｔ細胞と記憶Ｔ細胞とを比較して、ＩＬ−２３のＩＬ−１７産生に対する影響を調べた。蛍光発色セルソーター（ＦＡＣＳ）を使用して脾細胞から精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。記憶細胞集団をＣＤ４＋ＣＤ４４高もしくはＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ低で選別し、未刺激細胞集団をＣＤ４＋ＣＤ４４低もしくはＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ高で選別した。図３にみられるように、ＩＬ−２３は記憶細胞集団（ＣＤ４４高とＣＤ６２Ｌ低）でのみＩＬ−１７産生を刺激し、未刺激細胞（ＣＤ４４低とＣＤ６２Ｌ高）では刺激しなかった。
【００８３】
ＩＬ−２３が介在するＩＬ−１７産生は、ＩＬ−２３と共通するｐ４０と相互作用する、ＩＬ−１２の中和抗体の存在によって完全に遮断された（図４Ａ左側）。無関係の抗体存在下でＩＬ−１７産生が変化しなかったことから、この効果は抗体提示細胞上のＦｃ受容体が連結したことが原因ではない。また、この抗体は、ＬＰＳ活性化樹状細胞の馴化培地に応答して観察されるＩＬ−１７の産生を５０％以上抑制した（図４Ａ右側）。ＩＬ−１２ｐ４０欠損マウス（系：Ｂ６．１２９Ｓ１−ＩＬ１２ｂｔｍｌＪｍ）の培養脾細胞で、野生型マウスあるいはＩＬ−１２ｐ３５欠損マウス（系：Ｂ６．１２９Ｓ１−ＩＬ１２ａｔｍｌＪｍ）と比較して、ＣｏｎＡ刺激に応答するＩＬ−１７産生の著しい減少が見られた（図４Ｂ）。但し、全くなくなったわけではない。
【００８４】
ＩＬ−１７産生におけるＩＬ−１２の役割を調べるために、漸増する濃度（０．００１〜１ ｍＭ）のマウスＩＬ−１２をＩＬ−２３（１ ｎＭ）を含む培養物に加えた。図５Ａで示したように、ＩＬ−１２は投与量に応じてＩＬ−１７濃度を減少させた。
【００８５】
さらに、ＩＬ−１２受容体特異性成分である（Ａ．Ｏ．Ｃｈｕａ，Ｖ．Ｌ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｈ．Ｐｒｅｓｋｙ，Ｕ．Ｇｕｂｌｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５５．４２８６（１９９５））ＩＬ−１２受容体ベータ鎖２（ＩＬ−１２Ｒβ２）（Ｗｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６５，６２２１（２０００））を欠損するマウスの脾細胞を、精製したＩＬ−２３で処理した。ＩＬ−１２Ｒβ２−／−マウスの脾細胞はＩＬ−２３刺激に応答し、ＩＦＮ−γ濃度に影響を与えることなく、刺激を与えていないコントロールに比べてＩＬ−１７産生を増加させた。驚くべきことに、これらのマウスのバックグラウンドＬ−１７濃度は野生型マウスの１０倍を超えており、これはＩＬ−２３が誘導するＩＬ−１７産生が、ＩＬ−１２によって負方向に制御されている可能性のあることを示唆している。しかしながら、ＩＬ−１２Ｒβ２ノックアウトマウスとは対照的に、ＩＬ−２３ｐ３５ノックアウトマウス由来の培養脾細胞では、ＩＬ−１７の上昇は確認されなかった。この違いが生じた理由は不明であるが、ｐ３５欠損状態でＩＬ−１２ｐ４０の機能が変性していることが関係している、もしくは遺伝的バックグラウンドあるいは病原体暴露の違いによるとも考えられる。
【００８６】
（考察）
まとめると、これらのデータはエフェクターサイトカインとしてＩＬ−１７を発現する、第三のＴ細胞活性化状態の促進におけるＩＬ−２３の役割を示唆している。Ｔｈ１及びＴｈ２系は体液性免疫反応に対して細胞性免疫を促進するものとして記載されている。これらの反応によって、それぞれ細胞内外の病原体に対する重要な防御が提供され、これらの反応のうちの一方でも欠損すると特定の病原体に対する感染性が上昇する。対照的にＩＬ−２３は、本質的に先天性免疫反応の媒介体として機能すると考えられている細胞に大きく依存することを特徴とする病原体に対する適応免疫反応を促進する。ＩＬ−１７はこの反応の主要なエフェクターサイトカインとして、ケモカイン産生を誘導して単球及び好中球のより迅速な動員を促進することができる。さらに、ＩＬ−２３に応答して高濃度のＧＭ−ＣＳＦが観察されたことは、骨髄細胞が増産されたことを支持する。これはさらにＩＬ−１７刺激間質細胞からＧ−ＣＳＦが産生することによって増強される。しかしながら、ＩＬ−１７がＩＬ−１７によるＩＣＡＭ誘導を促進し、その結果続いて起こるＴ細胞応答の重要な共同誘導を提供することがわかっていることから、この適応反応の特性は骨髄系反応の食細胞に排他的に依存するものではない。
【００８７】
近年いくつかの研究によって、ｐ３５欠損マウスとｐ４０欠損マウスとの間の著しい差異が指摘されている（Ｄｅｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．６６：４９９４−５０００（２００２）；Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：１３２２−１３２７（２００２）；Ｅｌｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ＆ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７０：１９３６−１９４８；Ｈｏｌｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：６９５７−６９６６（２００１））。これらの研究は、様々なモデル生物体内で免疫が介在する異物排除において、一般的にｐ４０の欠損がｐ３５欠損よりも有害であることがみられた点で共通している。
【００８８】
多数の重篤な炎症性疾患にＩＬ−１７の発現が伴うことは、当該疾患の治療においてＩＬ−２３アンタゴニストが有望な候補薬と成りうることを示唆している。
【００８９】
（実施例２）
（インターロイキン２３（ＩＬ−２３）欠損マウス）
インビボでＩＬ−２３とＩＬ−１７の関係をさらに調べるため、ＩＬ−２３欠損マウス表現型をＩＬ−１７欠損マウスの表現型と比較した。
【００９０】
（実験方法）
マウス：全てのマウスは病原体の存在しない状態で特別に飼育した。ＩＬ−１２ｐ４０−／−マウスはＪａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＡ）から、Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。
【００９１】
試薬：他に記載のない限り、試薬は以下の業者から購入した：抗体及びＥＬＩＳＡ試薬はＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、サイトカインはＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、ＴＮＰ結合抗原はＢｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）、組織培養試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、から入手した。
【００９２】
ＩＬ２３ｐ１９欠損マウスの作製：マウスＩＬ２３ｐ１９遺伝子座を取り囲むゲノムＤＮＡを、Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｏｔｏ，ＣＡ）のゲノムＢＡＣライブラリーのクローン１９８ａ３から単離した。ＩＬ２３ｐ１９コーディング領域全体をＥＧＦＰレポーター遺伝子で置換するために立案されたターゲティングベクターを、標準的な分子クローニング技術を使用して以下のＤＮＡ断片から構築した：チミジンキナーゼ選択カセット；各々が遠心端並びに近位端上にある内生ＳａｃＩＩ及びＢｇｌＩＩ部位によって限定される、５４０３ベースペアから成る５’相同アーム；ＢａｍＨＩ（５’末端）及びＡｆｌＩＩＩ（３’末端）を用いてｐＥＧＦＰ−１（ＢＤ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から切除したＥＧＦＰ発現カセット；ＰＧＫ−ｎｅｏ耐性カセット；近位端の内生ＸｈｏＩ部位と遠心端の５’−ＧＣＴＴＧＧＴＧＧＣＣＣＡＣＣＴＡＴＧＡＴ−３’（配列番号１）プライマーとによって限定される１２０３ ｂｐショートアーム（図６Ａ）。この構築物を電気穿孔法によって１２９／ＳｖＥｖ胚性幹（ＥＳ）細胞に導入すると、６００のクローンのうち９つで相同組換えが発生し、Ｇ４１８及びガンシクロビル（Ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）で選抜した。遺伝子座ターゲティングの正確さを検証するために、ＥＳ細胞とマウスのゲノムＤＮＡをサザンブロットによって分析した。ＢａｍＨＩで切断し、次いでプローブ１（オリゴヌクレオチド、５’−ＡＧＡＣＣＣＴＣＡＡＡＧＴＴＣＡＴＧＡＣ−３’（センス）（配列番号２）と５’−ＣＴＧＡＣＧＧＣＧＴＴＴＣＴＣＴＡＣＣ−３’（アンチセンス）（配列番号３）を用いたＰＣＲによって得られた８３１ ｂｐゲノムＤＮＡフラグメント）でメンブレンをハイブリダイゼーションし、野生型対立遺伝子に対する７０２７ ｂｐのフラグメント及び正確にターゲッティングされた変異型対立遺伝子に対する１１７８８ ｂｐのフラグメントを得た。同様に、ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、次いでプローブ２（オリゴヌクレオチド、５’−ＴＴＴＴＧＣＣＡＧＴＧＧＧＡＴＡＣＡＣＣ−３’（センス）（配列番号４）と５’−ＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＴＴＡＣＡＣ−３’（アンチセンス）（配列番号５）を用いたＰＣＲによって得られた３９０ ｂｐゲノムＤＮＡフラグメント）でメンブレンをハイブリダイゼーションし、野生型対立遺伝子に対する９１９７ ｂｐのフラグメント及び正確にターゲッティングされた変異型対立遺伝子に対する６２１１ ｂｐのフラグメントを得た。２種のＥＳ細胞クローン（１ｃ５並びに３ｈ６）を未分化胚芽細胞に注入し、生殖細胞系に変異型対立遺伝子を移入させたキメラ動物を得た。日常的に行われる遺伝子型判定のため、我々は一般的なアンチセンスプライマー（５’−ＧＣＣＴＧＧＧＣＴＣＡＣＴＴＴＴＴＣＴＧ−３’）（配列番号６）及び野生型特異的センスプライマー（５’−ＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣ−３’）（配列番号７）、ノックアウト特異的センスプライマー（５’−ＡＧＧＧＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣ−３’）（配列番号８）を使用するＰＣＲを基本とする方法を用いた。この３つ組のプライマーは野生型対立遺伝子の２１０ ｂｐフラグメントと変異型対立遺伝子の２８９ ｂｐフラグメントとを増幅する。ＰＣＲはＲｏｂｏｃｙｃｌｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で実行し、以下の条件を用いた：９４℃６０秒で１サイクル、９４℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃６０秒で３５サイクル、７２℃７秒で１サイクル。
【００９３】
血液細胞サブ集団のＦＡＣＳ分析：脾臓及び胸腺、リンパ節を６〜８週のマウスから分離し、標準方法によって単個細胞懸濁液を調製した。末梢血液を心臓穿刺によって得、ＥＤＴＡで処理して凝固を防いだ。赤血球はＡＣＫ溶解緩衝液（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を用いて溶解した。全細胞を、３０分間氷上にて、２％不活性化仔ウシ心臓血清−ハンクス溶液（ＨＢＳＳ）でインキュベートした。次に、フィコエリスリンあるいはビオチン、Ｃｙｃｈｒｏｍｅ（ＴＭ）と結合させた様々な抗体を、１００万細胞当たり１μｇ加えた同じ緩衝液で細胞を染色した。ビオチン化抗体を使用したものには、検出のためストレプトアビジン結合ＰＥ−ＴＲ複合体（Ｃａｌｔａｇ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を使用した。同じ緩衝液で２回の洗浄後、Ｅｐｉｘ−ＸＬ フローサイトメトリーシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を使用して蛍光を測定した。
【００９４】
アロタイプＴ細胞の刺激：ＣＤ４とＣＤ６２Ｌの二重陽性Ｔ細胞を、ツーステップ単離法によって６〜８週のｂａｌｂ／ｃマウス脾臓から単離した。最初に、陰性磁気細胞分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）によって他の細胞種からＴ細胞を分離した。次にこれらの細胞をＣＤ４とＣＤ６２Ｌの抗体で標識し、ＭｏＦｏソーター（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）でＦＡＣＳ選別した。共にＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドにある、野生型あるいはＩＬ−２３ｐ１９−／−マウスの樹状細胞も、ツーステップ単離法によって単離した。磁気細胞分離（Ｍｉｌｉｔｅｒｎｙｉ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）によってＣＤ１１ｃ陽性脾細胞を陽性選別し、次いでＣＤ１１ｃ並びにＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８に対する抗体で標識した。次に、ＣＤ１１ｃ＋／ＭＨＣ−ＩＩ＋／ＣＤ８−細胞をＭｏＦｏソーターを使用して再びＦＡＣＳで選別した。実験に使用した細胞集団は全て９８％以上の精製度であった。アロ刺激反応を除去するため、１０４の樹状細胞と１０５のＴ細胞を、それぞれペニシリン−ストレプトマイシン及び１０％不活性化仔ウシ心臓血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａ，ＵＴ）を添加した計２００μｌのＩＭＤＭで培養した。一部の実験では、１００ｎｇ／ｍｌの細菌性リポペプチドを加えて、樹上細胞によるサイトカイン産生を誘導した。培養５日後に、ＥＬＩＳＡによるサイトカイン測定のために１２０μｌの上清を取り除き、代わりに各ウェル当たり１μＣｉの３Ｈ−チミジンを含む新たな培地を加えた。１６時間後にトップカウントシンチレーションカウンターを製造者による使用説明書に従って使用し（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）、チミジンの取り込みを測定した。
【００９５】
インビボＴ細胞分化：１グループにつき４個体のオスと４個体のめすマウスを免疫した。３０μｌのＣＦＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｅｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）乳剤とＰＢＳとの１：１溶液に加えた、７５μｇのキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をマウス左後方足に注入した。５日後に流入領域鼠径リンパ節及び膝窩リンパ節を摘出し、ペニシリン−ストレプトマイシン及び１０％不活性化仔ウシ心臓血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）と２５μｇ／ｍｌのＫＬＨを加えたＩＭＤＭで再刺激した。増殖分析のため、９６ウェルプレートに、５ｘ１０５の細胞を２００μｌずつ３通りに播種し、培養期間の最後の１８時間には各ウェル当たり１μＣｉの３Ｈ−チミジンを加えて１１２時間増殖させた。トップカウントシンチレーションカウンターを製造者による使用説明書に従って使用し（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）、チミジンの取り込みを測定した。サイトカイン分泌については、２．５ｘ１０６個の細胞を含む１ｍｌを４８ウェルプレートで培養し、７２時間後に上清を集めた。サイトカイン分泌はＥＬＩＳＡによって判定した。提示しているデータは全部で３回行った実験のうちの一代表例である。
【００９６】
遅延型アレルギー反応：２００μｇのメチル化ウシ血清アルブミン（ｍＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をＣＦＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）乳剤とＰＢＳとの１：１溶液に加えて計２００μｌとし、これを一グループ当たり６個体のマウス腹部の３箇所に皮下注射した。免疫後８日目に、２０μｌの５ ｍｇ／ｍｌ ｍＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を後ろ足の一つに注射することよってこのマウスをチャレンジし、他方の後ろ足には２０μｌのＰＢＳを注射した。７つバネ式キャリパーセット（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ，Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，ＣＡ）を使用して、チャレンジから１８、４２、６６時間後に足甲の腫張を計測した。ＤＴＨ反応の程度は、抗原を注射した足とＰＢＳを注射した足の足甲厚みの差異から測定した。
【００９７】
Ｔ細胞依存体液性反応と免疫グロブリン分析：全免疫グロブリン合計濃度を測定するために、各遺伝子型の免疫していないマウスで６〜９週目のオス８個体とメス８個体から血清を得た。全免疫グロブリンアイソタイプの合計濃度をルミネックスビーズ分析（上記Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）によって測定した。ＯＶＡ得意的体液性免疫反応の分析のため、各遺伝子型につき７匹のマウス（オス４とメス３）をＣＦＡに加えたＯＶＡで０日目に免疫し、２１日目と４２日目に不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に加えた同じ抗原でブースター免疫した。血清分析のため、免疫する前と免疫後１４日目、２８日目、４９日目に眼窩後方の出液から血液を得た。ＯＶＡ特異的免疫グロブリンアイソタイプは、ＯＶＡを捕捉剤として、また検出用にアイソタイプ特異的２次抗体を使用して、ＥＬＩＳＡによって検出した。ＥＬＩＳＡの直線範囲に入るよう、血清サンプルは以下のように稀釈した：ＩｇＧは１：３１２５０００、ＩｇＧ２ａは１：２５０００、ＩｇＧ２ｂは１：６２５０００、ＩｇＧ３及びＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥは１：１０００。純粋なＯＶＡ特異的アイソタイプは市販されていないため、以前の実験でＯＶＡ免疫マウスから得た血清の稀釈シリーズを標準として使用した。結果は任意の単位として表し、最後に採取した血液で野生型グループの平均値を１００とした。記憶Ｔ細胞の体液性免疫反応への寄与を調べるため、遺伝子型ごとに５〜６個体のマウスからなるグループを、０日目にＣＦＡに加えたＯＶＡで免疫し、２１日目にＩＦＡに加えたＴＮＰ１１−ＯＶＡでブースター免疫した。血清分析のため、免疫前と免疫後１４日目及び２８日目に眼窩後方の出液から血液を得た。捕捉剤としてＴＮＰ２８−ＢＳＡを、また検出用にアイソタイプ特異的２次抗体を使用して、ＥＬＩＳＡによってＴＮＰ特異的免疫グロブリンアイソタイプを検出した。ＴＮＰ特異的ＩｇＧ１については、市販されている標準を使用した。ＴＮＰ特異的ＩｇＧ２ａについては、以前の実験でＴＮＰ免疫マウスから得た血清の稀釈シリーズを使用し、結果は上記に記載したとおりに算出した。試料の稀釈率は、ＩｇＧ１用では１：３１２５０、ＩｇＧ２ａ用では１：１２５０であった。
【００９８】
Ｔ細胞非依存体液性反応：各遺伝子型につき６個体から成るグループを、ＰＢＳに加えた５０μｇのＴＮＰ１−ＬＰＳあるいは１００μｇのＴＮＰ２０−ＡＥＣＭ−Ｆｉｃｏｌｌで腹膜内に免疫した。１０日後に血清を採取し、捕捉剤としてＴＮＰ２８−ＢＳＡを、また検出用にＩｇＭ特異的２次抗体を使用して、ＴＮＰ特異的ＩｇＭをＥＬＩＳＡによって分析した。ＴＮＰ特異的ＩｇＭ抗体はＥＬＩＳＡの標準物として使用した。試料の稀釈率は、Ｆｉｃｏｌｌ用では１：１２８０、ＬＰＳ用では１：５１２０であった。
【００９９】
（結果）
ＩＬ−２３ｐ１９遺伝子欠損：ＩＬ−２３のインビボ非重複的影響を調べるため、ＩＬ−２３を欠損するがＩＬ−１２を産生する成分を残したマウスを作製した。４つのエキソンから構成される、ｐ１９の全コーディング領域を、強化ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）レポーター遺伝子とネオマイシン耐性カセットで置換したターゲティングベクターを構築した（図６）。１ｃ５と３ｈ６の二つの正確にターゲットされたＥＳ細胞クローンによって生殖細胞系伝播を行い、変異は、１染色体当たり３つのマーカーを用いたスピードコンジェニック法によってＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドへ戻し交雑した。この分析に基づき、実験のため、１２９バックグラウンドからの遺伝的混入が５％未満のマウスを選別した。ｅＧＦＰの発現パターンは内生ｐ１９ｍＲＮＡの発現パターンに相当した（データは示していない。）。
【０１００】
ＩＬ−２３ｐ１９−／−マウスは顕性表現型を持たない。ＩＬ−２３／ＩＬ−１２二重欠損となるＩＬ−１２ｐ４０−／−の表現型から予測されたとおり、ＩＬ−２３ｐ１９−／−動物は顕性表現型を示さず、メンデルの法則に従った頻度で生まれる。組織病理学的な試験上、臓器・器官に異常は見られず、さらに臨床化学的数値並びに血液学的数値の試験でも、野生型とノックアツト型の間に差異は見られなかった。さらに、ＩＬ−２３ｐ１９−／−マウスの体の大きさ並びに体重は標準であり、オスメス共に完全に成熟した。様々な細胞表面のマーカーを用いて胸腺細胞及び脾細胞、末梢血液白血球をフローサイトメトリー分析したところ、野生型マウスとＩＬ−２３ｐ１９−／−マウスの間に主だった差異は見られなかった（表２）。ＩＬ−２３は記憶Ｔ細胞に作用することが知られているため、各サブグループについて記憶細胞（ＣＤ４４高／ＣＤ６２Ｌ−）と未刺激細胞（ＣＤ６２Ｌ＋）の比を調べたが、野生型マウスとＩＬ−２３ｐ１９−／−マウスの間に差異は見られなかった。分析全体でこの二つの遺伝子型間で見られた唯一の注目すべき差異は、樹状細胞集団がわずかにＣＤ８＋表現型へ傾いている点にある。この影響は小さなものであるが、データが厳しいものであるために統計的に有意となり、ＩＬ−２３が抗原提示細胞に影響を与えているという最近の観察結果に矛盾しないと考えられる。まとめると、ＩＬ−２３は通常の発生に必要とされるものではないもようであり、ｅＧＦＰカセットの導入によって実験に用いたどの細胞も影響を受けない。
【０１０１】
【表２】
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ＩＬ−２３ｐ１９−／−マウスの体液性免疫反応。体液性免疫反応の発生におけるＩＬ−２３の役割を調べるため、最初に、各遺伝子型１６個体のマウスの血清で、免疫グロブリンの全アイソタイプの合計濃度を測定した。野生型マウスとＩＬ−２３ｐ１９−／−マウスの間に統計的に有意な差異は見られず（図７）、このことはＩＬ−２３が通常の免疫グロブリン濃度の維持に決定的に必要なものではないことを示している。次に我々は、佐剤に加えて導入されるタンパク質抗原に対するＴ細胞依存性体液性免疫反応の発生に、ＩＬ−２３が関係しているか否かを調べた。この目的のため、１グループ７個体のマウスを其々卵白アルブミン（ＯＶＡ）で免疫した。免疫前血清のＯＶＡ特異的免疫グロブリンアイソタイプを分析し（全て陰性、データは示していない。）、２回の免疫後にその都度分析を行った（図８）。初回免疫後、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＥについては有意な差はどのグループ間にもなかった。しかし、ＩＬ−２３ｐ１９−／−及びＩＬ−１２ｐ４０−／−マウスで、初回免疫後ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａ及びＩｇＡの有意な減少が観察された。予測のとおり、２度目の免疫後には全アイソタイプの濃度が劇的に増加した。この時点でＩＬ−２３ｐ１９−／−及びＩＬ−１２ｐ４０−／−の両マウスとも試験したアイソタイプ量は有意に少なかった。これら二つの遺伝子型の差異は通常有意なものではなく、内生ＩＬ−１２はＩＬ−２３欠損状態で体液性免疫反応に主要な役割を果たしてはいないことを示している。
【０１０２】
体液性免疫反応はＢ細胞及びＴ細胞の両方が正しく機能することに依存しているため、我々は次に、どのようなメカニズムによってＩＬ−２３がその誘発効果を発揮するのかを試験しようと努めた。ＩＬ−２３の欠損が直接Ｂ細胞の機能に影響を与えているか否かを試験するために、ＩＬ−２３欠損マウスでＴ細胞非依存性（ＴＩ）抗原に対するＢ細胞応答を上昇させる能力を調べた。ＴＩ−１抗原、トリニトロフェル（ＴＮＰ）ＬＰＳはＣＤ１４及びＴＬＲ４を介してＢ細胞の活性化を導き、ＴＩ−２抗原、ＴＮＰ−フィコールはＢ細胞表面受容体のクラスター形成を介してＢ細胞を活性化する。ＩＬ−２３ｐ１９−／−マウスは、双方のタイプの抗原に対する通常のＢ細胞応答を上昇させた（図９）。これはＩＬ−２３がＴ細胞非依存性Ｂ細胞応答に関与していないことを示している。さらに、ＩＬ−２３ｐ１９−／−マウス由来のＢ細胞は、インビトロでＬＰＳ並びに抗ＩｇＭ、抗ＣＤ４０に反応して普通に増殖し、ＩＬ−４に応答する正常なアイソタイプスイッチがみられた（データは示していない。）。Ｂ細胞のＩＬ−２３刺激は、増殖の増加あるいはアイソタイプスイッチを導くものではなく（データは示していない。）、即ちＩＬ−２３は直接Ｂ細胞の機能に影響しないと、我々は結論付けた。
【０１０３】
体液性免疫反応は主に２次免疫の段階で損なわれ、またＩＬ−２３ｐ１９−／−マウスのＢ細胞の機能は正常であるもようであるため、抗原特異的ヘルパーＴ細胞を無意味に再活性化するとこうした表現型が現れるという仮説を立てた。この問題により直接的に対応するため、我々は５〜６個体のマウスのグループを０日目にＯＶＡで免疫し、次いで１４日目にＴＮＰ接合ＯＶＡで２次免疫した。この免疫方法を用いるとＯＶＡに特異的な記憶Ｔ細胞が２次免疫によって再活性化されるが、ＴＮＰに対して特異性を持つ新規のＢ細胞群は二度目の免疫時にのみ活性化される。つまり、ＯＶＡ特異的記憶Ｂ細胞小群はＴＮＰ特異的な免疫グロブリンの形成に関与しない。再活性化後７日目に、我々は血清中のＴＮＰ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａについて試験し、ＩＬ−２３ｐ１９−／−マウスではどちらのアイソタイプも著しく減少していることがわかった（図１０Ａ，Ｂ）。さらにこの結果は、Ｔ細胞依存的Ｂ細胞応答におけるＩＬ−２３の重要性を強調するものである。
【０１０４】
ＩＬ−２３ｐ１９−／−マウスにおける遅延型アレルギー反応（ＤＴＨ） ＩＬ−２３ｐ１９−／−マウスにおける記憶ＣＤ４＋細胞の機能の詳細を調べるため、このマウスのＤＴＨ反応を上昇させる性質について評価した。ＤＴＨ反応はＴ細胞に強く依存しており、ＩＬ−１２ｐ４０−／−マウスでこの反応は欠損し、ＩＬ−１２ｐ３５欠損マウスでは正常のようである。このことはＤＴＨ反応がＩＬ−２３によって仲介されている可能性のあることを示唆している。この問題に対応するため、野生型及びＩＬ−２３ｐ１９−／−、ＩＬ−１２ｐ４０−／−マウス６個体のグループを、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）に加えたメチル化ＢＳＡ（ｍＢＳＡ）で感作し、７日後にｍＢＳＡを足に注射してＤＴＨ反応を誘発した。非特異的な腫張のためのコントロールとして、感作していない野生型マウスのグループにも免疫チャレンジした。チャレンジから１８、４２、６６時間後に特異的な足甲腫張を測定したところ、ＩＬ−１２ｐ４０−／−とＬ−２３ｐ１９−／−の双方とも同程度に、野生型マウスに比べて抑制されていた（図１１）。反応曲線もＩＬ−１２ｐ４０−／−とＩＬ−２３ｐ１９−／−で類似しており、４２時間目と６６時間目で腫張は非常に抑制されていたが、１８時間目では抑制されていなかった。つまり、ＩＬ−２３はＤＴＨ反応の本質的な仲介物であり、ＩＬ−２３が欠損していると記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞による反応効果が無効となる。
【０１０５】
ＩＬ−２３ｐ１９−／−樹状細胞がＴ細胞を刺激する能力。ＩＬ−２３ｐ１９−／−マウスにみられる異常がＩＬ−２３欠損抗原提示細胞による有効性のないＴ細胞初回抗原刺激によるものである可能性を除外するため、我々は次にＩＬ−２３ｐ１９−／−ＤＣがｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓から単離したアロタイプ未刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激する能力を調べた。ＤＣがない状態で、これらのＴ細胞は増殖せず、検出できる量のサイトカインの分泌もなかった（図１２Ａ）。それぞれの遺伝子型にＤＣを加えると、両遺伝子型とも強健に増殖し、ＩＬ−１７を産生した。これまでにＩＬ−２３がＩＬ−１７の強力な誘導物質であることを示したので、我々は次に、強力なトール様受容体２アゴニストでありＩＬ−２３産生誘導物質である細菌性リポペプチドを用いてＤＣによるＩＬ−２３産生を誘導した。これらの条件下でｗｔＤＣはＴ細胞によるＩＬ−１７産生を強力に誘導し（図１２Ａ下）、ＩＬ−２３ｐ１９−／−ＤＣで刺激されたＴ細胞によるＩＬ−１７産生量は著しく少なかった。これらの実験結果をより生理学的な条件下で確認するために、我々は次に８個体のマウスからなるグループを完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）に加えたキーホール リンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）で免疫し、インビボでＴ細胞反応を誘発させた。５日後に流入領域リンパ節（ＬＮＣ）を採取してインビトロにてＫＬＨで再刺激した。これもまた、ＩＬ−２３ｐ１９−／−マウスから採取したＬＮＣによるＩＬ−１７産生量は著しく少ないことが認められた（図１２Ｂ下）。ＬＮＣ増殖は双方の遺伝子型で同程度であり（図１２Ｂ下）、これはｗｔマウスとＩＬ−２３ｐ１９−／−マウスの双方とも抗原に対する強健なＴ細胞応答を上昇させていることを示している。要するに、ＩＬ−２３欠損によって樹状細胞の誘発的能力が著しく損なわれているのではなく、Ｔ細胞によるＩＬ−１７産生が減衰している。
【０１０６】
（考察）
ＩＬ−２３ｐ１９欠損マウスを用いて、ＩＬ−２３のインビボでの非重複性機能を分析し、ＩＬ−２３の欠損が、体液性免疫反応やＤＴＨ反応等のＴ細胞依存的免疫反応を減衰することを見出した。
【０１０７】
体液性免疫反応の著しい減衰がＩＬ−２３ｐ１９−／−マウスでみられ、全ての免疫グロブリンアイソタイプに影響を与えていた。同時にＩＬ−１２ｐ４０−／−マウスの反応も、同程度かあるいはやや高い程度に抑制された。これらの結果はＩＬ−２３が有効な体液性免疫反応に絶対的に必要であるという結論を支持するものであるが、一方、ＩＬ−１２ｐ３５−／−マウスを使用してＩＬ−１２が存在しない状態での正常な体液反応にＩＬ−２３が必要十分なものであるか否かは、今後判定すべきで点である。
【０１０８】
まとめると、ＩＬ−２３ｐ１９−／−マウスでは、ＤＨＴの抑制及び体液性免疫反応で生じる、インビボＴ細胞応答が減衰しており、表現型的にはＩＬ−１７欠損マウスと類似する。我々の結果は、ＩＬ−２３もしくはそのアゴニストの臨床的投与が、免疫処方において、並びに免疫無防備状態にある患者において、Ｔ細胞機能を支えるのに有益である可能性を示している。
【０１０９】
本発明は具体的な実施例と考える参考文献と共に記載されているが、本発明は当該実施例に限定されないことを理解すべきである。反対に本発明は、附属する請求事項の本質と範囲の内に含まれる多様な変法と類似法を包含することを意図している。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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