(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の腫瘍部位に存在するプロトポルフィリン類の蛍光を分光検出する腫瘍部位の識別装置であって、前記プロトポルフィリン類がプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）とフォト−プロトポルフィリン（ＰＰｐ）であり、前記識別装置がＰｐＩＸの一部をＰＰｐに変換する光照射部と、ＰｐＩＸの蛍光とＰＰｐの蛍光を分光する分光部と、ＰｐＩＸの蛍光とＰＰｐの蛍光の相対蛍光強度を検出する分光検出部と、ＰｐＩＸとＰＰｐの相対蛍光強度に基づいて腫瘍部位と非腫瘍部位の判別を行う腫瘍判別部とを有する腫瘍部位の識別装置。
【請求項２】
前記光照射部が、光源と光源からの励起光を被験体に導光照射する光源用光ファイバーを備える、請求項１記載の識別装置。
【請求項３】
分光検出部が、ＰｐＩＸに由来する６３５ｎｍ付近の蛍光を検出する手段とＰＰｐに由来する６７５ｎｍ付近の蛍光を検出する手段を備える、請求項１又は２に記載の識別装置。
【請求項４】
ＰｐＩＸの蛍光とＰＰｐの蛍光を分光部に導く分光用光ファイバーを備える、請求項１〜３のいずれかに記載の識別装置。
【請求項５】
前記腫瘍判別部による腫瘍判別結果の情報を、その腫瘍判別された蛍光を発生する被験体の位置に対応した画像情報として表示する表示装置をさらに備える、請求項１〜４のいずれかに記載の識別装置。
【請求項６】
被験体の腫瘍部位の識別装置の作動方法であって、
被験体の腫瘍部位に蓄積されたプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）に光照射してＰｐＩＸの一部をフォト−プロトポルフィリン（ＰＰｐ）に変換する工程、
ＰｐＩＸとＰＰｐに対する励起光を照射する工程、
前記励起光によって励起されたＰｐＩＸとＰＰｐが発する蛍光を分光部で分光する工程、
ＰｐＩＸの蛍光とＰＰｐの蛍光の相対蛍光強度を検出する工程、
ＰｐＩＸとＰＰｐの相対蛍光強度に基づいて腫瘍部位と非腫瘍部位の判別を行う工程、
を含む、腫瘍部位の識別装置の作動方法。
【請求項７】
腫瘍が、センチネルリンパ節に転移した腫瘍である、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍部位の識別装置及び識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃癌や大腸癌などの消化器癌においてリンパ節転移は重要な予後因子の１つであり、患者の治療法を決定する上でリンパ節転移の有無を正確に診断することは非常に重要である。【０００３】
例えば、多くの消化器癌ではリンパ節転移の有無によって術後の補助療法の要否が決定され(非特許文献１，２)、また特に胃癌では、術中のセンチネルリンパ節生検で転移がないと診断できた場合は、郭清領域を縮小した手術が選択される場合もある(非特許文献３)。このような理由から、リンパ節転移を迅速かつ正確に診断できれば臨床的には非常に有用である。【０００４】
しかしながら現在のところ、従来の病理組織学的診断に取って代わる新たな診断技術は確立されていない。通常行われている病理組織学的診断法では、リンパ節転移の有無は単一の割面から得られた標本のみから診断を行っているため、小さな転移巣が見逃されることがあり、その診断精度は十分とは言えない(非特許文献４)。また術中迅速検査においては、診断までに少なくとも２０〜３０分を要していることから、より正確で迅速な新たな方法の確立が必要である。【０００５】
現在消化器領域を含めた幅広い領域で、癌の検出に５−アミノレブリン酸（5-ALA）を用いた光線力学的手法が応用されている(非特許文献５，６，７)。5-ALAは生体内にも存在するアミノ酸の一種であるが、体外から5-ALAを投与すると代謝酵素の活性の違いにより癌細胞内にその代謝産物であるプロトポルフィリンIX（PpIX）が蓄積する。PpIXは蛍光物質であり、これを検出して癌の診断を行うのがこの方法の原理である。本発明者らのグループは、マウスの直腸癌モデルを用いてそのリンパ節転移の診断に5-ALA由来のPpIXの蛍光を用いた方法を行い、非常に優れた成績を報告した(非特許文献４)。これは、消化器癌のリンパ節転移に対する5-ALAを用いた光線力学的診断法では初めての報告であった。【０００６】
しかしながらヒト生体内ではリンパ節は結合組織に包まれて存在しており、これらの結合組織（脂肪やコラーゲンなど）は、青色の励起光のもとで青〜緑の波長域に強い自家蛍光を発し、これがPpIXの蛍光検出の妨げとなっている。【０００７】
PpIXは光照射によって退色することが知られており、この過程で光酸化反応を起こし、フォトプロトポルフィリン（PPp）と呼ばれる別の物質に変化することが知られている(非特許文献８)。PpIXが635nmに蛍光のピークを有するのに対し、PPpは675nm付近に別の蛍光ピークを有している(非特許文献９)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】「胃癌治療ガイドライン第３版」，日本胃癌学会編，金原出版
【非特許文献２】「大腸癌治療ガイドライン医師用2010年版」，大腸癌研究会編，金原出版
【非特許文献３】Ichikura T, et al.  Ann Surg. 2009 Jun;249(6):942-7
【非特許文献４】Murayama Y, et al.  Int J Cancer. 2009 Nov 15;125(10):2256-63
【非特許文献５】Stummer W, et al.  Neurosurgery. 1998 Mar;42(3):518-25
【非特許文献６】Kriegmair M, et al.  J Urol. 1996 Jan;155(1):105-9
【非特許文献７】Mayinger B, et al.  Gastrointest Endosc. 1999 Aug;50(2):242-6
【非特許文献８】Moan J, et al.  Int J Cancer. 1997 Jan 6;70(1):90-7
【非特許文献９】Bagdonas S, et al.  Photochem Photobiol. 2000 Aug; 72(2):186-92
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
腫瘍部位、特にリンパ節などの結合組織に覆われた腫瘍部位を臨床応用で識別するためには、内在性組織による自家蛍光を排除する方法が必要である。【００１０】
本発明の主な目的は、ポルフィリン類の蛍光を特異的に検出する方法を確立し、実際の臨床でリンパ節転移を含む腫瘍部位の診断の迅速性と正診率を向上することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
PpIXは励起光の光照射によってフォトプロトポルフィリン（PPp）と呼ばれる別の物質に変化する。PpIXが635nmに蛍光のピークを有するのに対し、PPpは675nm付近に別の蛍光ピークを有している。PpIXとPPpはそれぞれ別の蛍光ピークを有するため、この変化は経時的なスペクトル波形の変化として捉えることができる。【００１２】
またこの変化は、PpIXとPPpに対応する、635nmと675nmの２枚の分光画像を用いると、これらのratio imageから画像的に捉えることも可能である。【００１３】
本発明者らはこの変化に着目し、PpIXの光酸化（退色）反応に基づくratio imagingを行うことにより、PpIXの局在を特異的に捉えることができることを見出した。【００１４】
本発明は、以下の腫瘍部位の識別装置及び識別方法を提供するものである。
項１．  被験体の腫瘍部位に存在するプロトポルフィリン類の蛍光を分光検出する腫瘍部位の識別装置であって、前記プロトポルフィリン類がプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）とフォト−プロトポルフィリン（ＰＰｐ）であり、前記識別装置がＰｐＩＸの一部をＰＰｐに変換する光照射部と、ＰｐＩＸの蛍光とＰＰｐの蛍光を分光する分光部と、ＰｐＩＸの蛍光とＰＰｐの蛍光の相対蛍光強度を検出する分光検出部と、ＰｐＩＸとＰＰｐの相対蛍光強度に基づいて腫瘍部位と非腫瘍部位の判別を行う腫瘍判別部とを有する腫瘍部位の識別装置。
項２．  前記光照射部が、光源と光源からの励起光を被験体に導光照射する光源用光ファイバーを備える、項１記載の識別装置。
項３．  分光検出部が、ＰｐＩＸに由来する６３５ｎｍ付近の蛍光を検出する手段とＰＰｐに由来する６７５ｎｍ付近の蛍光を検出する手段を備える、項１又は２に記載の識別装置。
項４．  ＰｐＩＸの蛍光とＰＰｐの蛍光を分光部に導く分光用光ファイバーを備える、項１〜３のいずれかに記載の識別装置。
項５．  前記腫瘍判別部による腫瘍判別結果の情報を、その腫瘍判別された蛍光を発生する被験体の位置に対応した画像情報として表示する表示装置をさらに備える、項１〜４のいずれかに記載の識別装置。
項６．  被験体の腫瘍部位の識別方法であって、
被験体の腫瘍部位に蓄積されたプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）に光照射してＰｐＩＸの一部をフォト−プロトポルフィリン（ＰＰｐ）に変換する工程、
ＰｐＩＸとＰＰｐに対する励起光を照射する工程、
前記励起光によって励起されたＰｐＩＸとＰＰｐが発する蛍光を分光部で分光する工程、
ＰｐＩＸの蛍光とＰＰｐの蛍光の相対蛍光強度を検出する工程、
ＰｐＩＸとＰＰｐの相対蛍光強度に基づいて腫瘍部位と非腫瘍部位の判別を行う工程、
を含む、腫瘍部位の識別方法。
項７．  腫瘍が、センチネルリンパ節に転移した腫瘍である、項６に記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、青〜緑の波長域に強い自家蛍光を発する脂肪やコラーゲンなどの結合組織が混在した部位であっても、腫瘍部位を正確かつ迅速に診断することができる。例えば腫瘍部位を切除した後、その周辺に腫瘍の遺残があるか否か、あるいは切除したリンパ節に転移があるか否かなどは本発明の装置もしくは方法により容易に診断することができ、手術成績の向上につながる。【００１６】
本発明は新たに複雑な機器を必要とせず、迅速かつ簡便に腫瘍部位を特異的に検出できる装置であり、手術室内やベッドサイドでの使用も可能である。【００１７】
本発明の装置を臨床応用することで、以下の点が期待できる。
・術中迅速診断の一助となり、より正確で迅速な診断につながる。
・正確な術中診断により、縮小手術や遺残のない手術につながる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】PpIXの光酸化反応(photobleaching)。Cox GS, Krieg M, Whitten DG. J. Am. Chem. Soc. 1982, 104, 6930-6937
【図２】PpIXの励起スペクトル。Ericson MB, Grapengiesser S, Gudmundson F, et al. Laser. Med. Sci. 2003, 18, 56-62
【図３】PpIXの蛍光スペクトル。
【図４】PPpの励起スペクトル。Ericson MB, Grapengiesser S, Gudmundson F, et al. Laser. Med. Sci. 2003, 18, 56-62
【図５】PPpの蛍光スペクトル。
【図６】癌細胞におけるヘムの代謝経路。
【図７】PpIXに光照射してPPpが徐々に生成したときのスペクトル変化。光照射によりPpIXに由来する635nm付近の蛍光強度のピークが減少し、PPpに由来する675nm付近の蛍光強度が増加することが分かる。Ericson MB, Grapengiesser S, Gudmundson F, et al. Laser. Med. Sci. 2003, 18, 56-62
【図８】本発明の装置の概略。(A)  (1) 2枚の画像を連続的に取得する方法。回転式(下図)あるいはスライド式のフィルターを切り替えて画像を取得し、コンピューター上で画像演算を行う。(B)  (2) 2枚の画像を同時に取得する方法。2つのCCDカメラを用いて、2枚の分光画像を同時に取得し、コンピューター上で画像演算を行う。＊これより先端をグラスファイバーとすることにより、内視鏡として利用でき、体内での診断にも用いることが可能。
【図９】画像処理の概略
【図１０】5-ALAを投与した癌細胞での光照射によるスペクトル変化の結果。
【図１１】5-ALAを投与した癌細胞での光照射によるレシオ（I675/I635）変化の結果。
【図１２】5-ALAを投与した癌細胞のレシオイメージング(ratio imaging)
【図１３】PpIXを特異的に検出するイメージング法。
【図１４】臨床検体での実験結果（１）
【図１５】臨床検体での実験結果（２）偽陰性の克服
【図１６】臨床検体での実験結果（３）疑陽性の克服
【図１７】5-ALA-処理された癌細胞の光退色(photobleaching)、照射光405nm - 励起光405nm。405nm の光はPpIXの励起効率およびPpIXを光退色(photobleaching)させる効果は大きいが、PPpの励起の効果は小さいことが明らかになった。
【図１８】5-ALA-処理された癌細胞の光退色(photobleaching)、照射光436nm - 励起光436nm。436nm の光はPPpの励起効率はよいが、PpIXの励起およびPpIXを光退色(photobleaching)させる効果が小さいことが明らかになった。
【図１９】5-ALA-処理された癌細胞の光退色(photobleaching)、照射光405nm - 励起光436nm。405nmの照射光はPpIXをphotobleachingさせる効果が強く、なおかつ436nmの励起光はPPpの励起に適するため、これが最適な組み合わせである。
【図２０】5-ALA-処理された癌細胞の光退色(photobleaching)。光照射に伴うRatioの変化。405nmを照射し、436nmで励起する組み合わせが最適な組み合わせである。
【図２１】コラーゲンの光退色(photobleaching)、照射光405nm - 励起光436nm。コラーゲンの光退色はほとんど認められない。
【図２２】FADの光退色(photobleaching) 、照射光405nm - 励起光436nm。FADの光退色はほとんど認められない。
【図２３】コラーゲン及びFADの光退色(photobleaching)、光照射に伴うRatioの変化。コラーゲンやFADは光を照射してもRatioの変化は見られない。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明では、プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）に光照射してフォト−プロトポルフィリン（ＰＰｐ）に変換すると(図１)、蛍光波長が約40nm長波長にシフトし、ＰｐＩＸとＰＰｐの蛍光波長の相違に基づき、自家蛍光の影響を受けずに腫瘍部位を識別することができる。
【００２０】
ＰｐＩＸは励起光が４０５ｎｍ前後で最もよく励起され(図２)、蛍光の極大吸収波長は約６３５ｎｍである(図３)。
【００２１】
ＰＰｐは励起光が４３６ｎｍ前後で最もよく励起され(図４)、蛍光の極大吸収波長は約６７５ｎｍである(図５)。
【００２２】
本発明では、被験体すなわち癌患者に5-アミノレブリン酸（5-ALA）を投与する。5-ALAは細胞に吸収され、細胞内でポルフォビリノーゲンに変換され、その後ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）の作用によりその4量体であるテトラピロール誘導体になり、これが環化してウロポルフィルノーゲンIIIになる。その後、コプロポルフィルノーゲン、プロトポルフィリノーゲンIIIを経てプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）になる(図６)。
【００２３】
癌細胞はPBGDの活性が高く、かつ、ＰｐＩＸをヘムに変換するための鉄付加酵素(ferrochelatase; FC)の活性が低いため、ＰｐＩＸが癌細胞に蓄積される。この蓄積したＰｐＩＸは、光照射によりＰＰｐに一部変換される。ＰＰｐへの変換のために照射する光の波長は３８０〜４５０ｎｍ程度の範囲であればよく、好ましくは４３６ｎｍ前後の波長の光を照射することで、ＰｐＩＸが徐々にＰＰｐに変換される(図７)。４３６ｎｍ前後の光を照射することで、ＰｐＩＸの一部のＰＰｐへの変換と、ＰｐＩＸ及びＰＰｐの励起の両方を同時に行うことができる。ＰｐＩＸとＰＰｐを同時に励起する励起光は405nm付近の光でも励起はできるが、ＰｐＩＸの量に対して生成するＰＰｐの量が少ないため、ＰＰｐを効率的に励起して蛍光を得るために、ＰＰｐの励起に適した４３６ｎｍ前後の光を照射するのが好ましい。最も好ましい組み合わせは、照射光に405nmを、励起光に436nmを選択する場合である。この組み合わせで、I675/I635比が最も大きくなる。照射時間は、２〜５分間程度であり、照射強度は２〜５J/cm2程度である。励起光を多く照射すると、ＰｐＩＸからＰＰｐへの変換の程度が大きくなり、腫瘍の識別が容易になるが、手術中に腫瘍部位を検出するためには短時間、かつ、組織／細胞に損傷を与えない程度のエネルギーの励起光を照射するのが好ましい。
【００２４】
本発明の装置の１例の概略を図８に示す。図8は、本発明の装置の単なる例であって、これらに限定されないことはいうまでもない。
【００２５】
図８の装置では、光源(この図では水銀ランプ)からの光を励起フィルターにより436nm前後の励起光とし、これをサンプルに照射する。図８では436nm前後の励起光を用いた場合を例示しているが、405nm前後の照射光と436nm前後の励起光を組み合わせるのがさらに好ましい。
【００２６】
励起光の波長は、ＰｐＩＸからＰＰｐへの変換が可能であり、かつ、ＰｐＩＸの蛍光ＰＰｐの蛍光が得られる波長であればよく、その波長は適宜選択される。サンプルとしては、癌の外科切除の場合には癌患者のリンパ節、腹膜転移などの転移が予測される部位、或いは癌の存在が疑われる部位、切除した癌組織の周辺、切除断端や剥離面が挙げられ、切除後の癌組織などをサンプルとして用いることもできる。
【００２７】
ＰｐＩＸのＰＰｐへの変換と、ＰｐＩＸ及びＰＰｐの励起に使用する光源は、異なっていてもよいが同一であるのが好ましい。このような光源としては、低圧水銀ランプ、高圧水銀ランプ、超高圧水銀ランプなどの水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプなどが挙げられ、水銀ランプが好ましい。
【００２８】
上記の光源からの励起光は、励起フィルター、対物レンズなどを経て直接被験体の腫瘍を有する可能性のある部位に照射してもよく、励起フィルターを通過した励起光は光ファイバーを通して照射し、その反射光を光ファイバーで分光部に導くことも好ましい実施形態の1つである。光ファイバーを使用すると本発明の装置を内視鏡として利用することができ、体内での癌の診断に使用することもできる。或いは対物レンズを備えた蛍光顕微鏡を利用することもできる。
【００２９】
励起フィルターを通過した励起光及び反射光はダイクロイックミラー(図8Aでは＞455nm)を通過させるのが好ましい。
【００３０】
ダイクロイックミラーを通過した反射光は、分光部によりＰｐＩＸの蛍光とＰＰｐの蛍光に分光される。分光部は、バンドパスフィルター（図８A、左側） 又はダイクロイックミラー（図８B、右側）を用いることができる。バンドパスフィルターは回転式、スライド式のいずれであってもよい(図8Aでは回転式)。ダイクロイックミラーを用いる場合、例えば＞６１５ｎｍ、＞６５５ｎｍの２つのダイクロミックミラーを組み合わせることで、６３５±２０ｎｍ、６７５±２０ｎｍの２つの分光データを同時に取得することができる。
【００３１】
分光部により取得された６３５ｎｍ付近、６７５ｎｍ付近の２つのデータは分光検出部に送られ、光照射の前と後で画像データを取得する。分光検出部は、CCDカメラなどの撮像手段を備える。CCDカメラなどの撮像手段は、図8Aのようにバンドパスフィルターを用いて2枚の画像を連続的に取得する場合には1つでよく、図8Bのようにダイクロイックミラーを用いて2枚の画像を同時に取得する場合には、分光検出部は2つの撮像手段を備えることになる。
【００３２】
分光検出部で得られた画像データは、腫瘍判別部に送られ、腫瘍の有無を判定する。腫瘍判別部は、分光検出部からの光学像を有する画像信号を演算する中央制御部(例えばコンピュータ)を備える。
【００３３】
中央制御部(コンピュータ)による635nmと675nmの2つの画像データの演算の1例が図9に示されている。PpIXからPPpに変換するための光の照射前と照射後において、635nmの画像（１、３；I635nm）と675nmの画像（２、４；I675nm）を取得し、照射前と照射後の各々について画像演算（画像間の除算I675nm/I635nm）を行ってレシオイメージを作成して画像Ａ，Ｂを得、画像Ｂ÷画像Ａにより増分を検出し、この増分がカットオフ値以上であれば、腫瘍部位と判定し、カットオフ値以下であれば非腫瘍部位であると判定する。具体的には６３５ｎｍ付近の画像の蛍光強度（I635nm）と、６７５ｎｍ付近の画像の蛍光強度（I635nm）のデータを取得し、これらの比（I675nm/I635nm）についてレシオイメージを励起光照射前（ＩＲ  ｐｒｅ＝Ｉ６７５ｎｍ  ｐｒｅ／Ｉ６３５ｎｍ  ｐｒｅ）と励起光照射後（ＩＲ  ｐｏｓｔ＝Ｉ６７５ｎｍ  ｐｏｓｔ／Ｉ６３５ｎｍ  ｐｏｓｔ）を行い、各レシオイメージ（ＩＲ  ｐｒｅ及びＩＲ  ｐｏｓｔ）の比（ＩＲ  ｐｏｓｔ／ＩＲ  ｐｒｅ）を作成すると、腫瘍部位は該比（ＩＲ  ｐｏｓｔ／ＩＲ  ｐｒｅ）の高い部位として画像化され、コラーゲン、結合組織などは該比の低い部位として画像化され、これにより腫瘍部位を識別することができる。
【００３４】
上記腫瘍判別部の判別結果は、コンピュータに接続されたディスプレイに送られ、腫瘍部位ないし非腫瘍部位を表示することができる。
【００３５】
本発明において検出可能な癌としては、特に限定されず、例えば悪性黒色腫、皮膚癌、肺癌、気管支癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、肝臓癌及び胆管癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、脳腫瘍等の上皮細胞などが悪性化した癌や腫瘍、骨肉腫、筋肉腫等の支持組織構成細胞が悪性化した癌や腫瘍などを挙げることができ、消化器癌（胃癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、膵臓癌、肝臓及び胆管癌など）が特に好ましく、消化器癌のリンパ節転移(特にセンチネルリンパ節転移)、腹膜転移などが挙げられる。
【００３６】
被験体としては、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ及びネコなどの哺乳類が挙げられ、特にヒトが挙げられる。
【００３７】
５−ＡＬＡは、塩を使用することもできる。このような塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の酸付加塩、及びナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等のアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属塩等を挙げることができる。
【００３８】
５−ＡＬＡの投与量は、ヒト体重１ｋｇあたり、１ｍｇ〜４００ｍｇ程度、好ましくは１０ｍｇ〜４０ｍｇ程度であればよい。
【００３９】
５−ＡＬＡ投与からＰｐＩＸを励起させるために励起光を照射するまでの時間としては、腫瘍組織に十分なＰｐＩＸが蓄積している時間帯が望ましく、具体的には４時間から８時間が挙げられる。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。【００４１】
本実施例では以下の材料を用いた。
PpIX溶液：0.1mMの濃度となるようにジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解した。
使用した細胞株：MKN-45（ヒト低分化型胃癌から樹立）
(1)5-ALAの投与
培養ディッシュに1mMの5-ALAを加え、30分間培養した。その後培地を交換し、さらに３時間インキュベーションした。トリプシン処理を行い、1×107個/mlの濃度の細胞浮遊液を回収し、実験に使用した。
(2)スペクトル分析
以下の装置を用いてスペクトル分析を行った。【００４２】
蛍光実体顕微鏡 (SZX12, Olympus)
intensified multichannel spectrophotometer
(MCPD-7000, Otsuka Electronics, Osaka)
水銀ランプ(U-LH100HG, Olympus)
励起・蛍光フィルター (D436 20x - E455LPV2)
(Ex. 436±20nm, Em. >455nm, Chroma Technology Corp.)
(3)分光画像の取得
以下の装置を用いて分光画像の取得を行った。【００４３】
マクロズーム顕微鏡 (MVX10, Olympus)
12ビットモノクロCCDカメラ (ORCA-ER, Hamamatsu Photonics)
液晶チューナブルフィルタ(Varispec VIS-20-HC-20, CRi Inc.)
蛍光ミラーユニット(U-MNBV2, Olympus)
まず画像取得前にバックグラウンドノイズを撮影 (IN 635nm ,IN 675nm)。【００４４】
PpIXとPPpに対応する分光画像 (IS 635nm, IS 675nm)を一定時間ごとに撮影。
(4)Ratio imageの作成
画像処理は、image-Jを用いて行った。【００４５】
下の式により、照射前と後でのratio imageを作成 (IR 0, IR n)。【００４６】
【数１】
0005991975.tif 000002
【００４７】
(5)PpIXに特異的な画像の作成
得られたratio imageを下の式によって除算を行った。【００４８】
【数２】
0005991975.tif 000003
【００４９】
この結果、得られた値があるcut-off値より大きいところがPpIXの存在している部位となる。【００５０】
実施例１
胃癌細胞株(MKN-45)に5-ALAを投与して3時間培養した後、436nmの励起光を照射し続け、一定時間ごとにスペクトルを測定した。PpIX溶液と変化率は異なるが、同様の傾向(635nmのピークの低下と675nmのピークの上昇)が、培養細胞においても観察された（図10）。また、レシオ（I675/I635）は照射量依存的に上昇することが確認された（図11）。但し、その変化率はPpIX溶液を用いた場合よりも低かった。【００５１】
実施例２
スペクトル変化を画像的に捉えるため、レシオイメージングを行った。すなわち、436nmの励起光の元、一定の光照射ごとに635nm及び675nmの分光画像を取得し、それらのレシオイメージを作成し、照射前後でのレシオイメージの変化を観察した。結果を図12に示す。スペクトル測定の結果と同様に、光照射に伴って、レシオイメージの輝度が徐々に上昇することが示された。【００５２】
実施例３
実施例2と同様にして5-ALAを投与した癌細胞の細胞浮遊液とコラーゲンファイバーとを同時に観察し、レシオイメージングを行った。【００５３】
各々の分光画像では、癌細胞とコラーゲンを区別することはできないが、それぞれのレシオイメージ(IR pre及びIR post)を作成し、さらにそのレシオ（IR post/ IR pre）を作成すると、PpIXの存在部位のみが周囲よりも高い値として画像化されることが明らかになった(図13)。【００５４】
実施例４：臨床試験
対象患者は術前にリンパ節転移が疑われる胃癌および大腸癌の患者のうち、あらかじめ書面により臨床試験への参加の同意を得られた患者である。ただし、ポルフィリン症、アレルギー歴のある者、肝・腎機能障害を有する者、消化管通過障害のある者は除外した。
手術の２時間前に15mg/kgの5-ALAを50%ブドウ糖溶液に溶かして内服させる。
転移が疑われる領域のリンパ節を１つずつ半割し、その割面の蛍光観察と分光画像の取得を上述の方法に従い行った。【００５５】
観察後、リンパ節はホルマリン固定し、病院病理部に提出して病理診断に供した。【００５６】
本発明の腫瘍部位の識別方法を使用して、実際に診断を行った結果を図14に示す。【００５７】
本発明の方法を用いると、PpIXが存在している部位のみを画像として捉えることができ、元画像と合成すると、真のPpIXの局在部位、即ち癌の局在を簡便に明らかにできる。【００５８】
次に、周囲にコラーゲンや脂肪組織などの結合組織が付着した癌組織を本発明の方法で処理した結果を図15に示す。この検体は一部に蛍光画像で青色の自家蛍光を強く認めており、その影響を受けてPpIX赤色の蛍光(635nm、675nm)を確認し難い。red channel imageや635nmの分光画像を用いてもPpIXの局在が不明瞭であるが、本発明の方法及び装置を用いることで、PpIXの局在が明らかにされた。【００５９】
さらに、別の臨床験体の結果を図16に示す。この例では、結合組織や血管壁に由来する自家蛍光を強く認め、red channel imageや分光画像では強い自家蛍光の影響でPpIXが存在していないとことにも強いシグナルを認めるが、本発明の方法及び装置では自家蛍光の影響を排除できることを示している。【００６０】
実施例５：効率のよい照射光の選択についての検討
本実施例では以下の材料を用いた。
(1)使用した細胞株
MKN-45（ヒト低分化型胃癌から樹立）
(2)5-ALAの投与
MKN-45細胞を培養したディッシュに1mMの5-ALAを加え、30分間培養した。その後培地を交換し、さらに３時間インキュベーションした。トリプシン処理を行い、1×107個/mlの濃度の細胞浮遊液を回収し、実験に使用した。
(3)スペクトル分析
以下の装置を用いてスペクトル分析を行った。【００６１】
蛍光実体顕微鏡 (SZX12, Olympus)
intensified multichannel spectrophotometer
(MCPD-7000, Otsuka Electronics, Osaka)
水銀ランプ(U-LH100HG, Olympus)
励起・蛍光フィルター 
[1] 405nm励起  D405/20x - HQ430LP (Chroma Technology Corp.)
（excitation 405±20nm, emission >430nm）
[2] 436nm励起  D436/20x - E455LPV2 (Chroma Technology Corp.)
（excitation 436±20nm, emission >455nm）
(4)照射およびスペクトル取得条件
405nmまたは436nmの光を照射し、0.25J/cm2ずつ蛍光スペクトルを取得した。
＜Case１＞照射光、励起光ともに405nmを選択した場合
光照射に伴い、635nmのピーク（PpIX）の減弱を認める一方、675nmに新たなピーク（PPp）の出現を認めた（図１７（ａ）、（ｂ））。【００６２】
図１７（ａ）：蛍光強度を示したグラフ
図１７（ｂ）：（ａ）を635nmのピークで標準化したグラフ
＜Case２＞照射光、励起光ともに436nmを選択した場合
光照射に伴い、635nmのピーク（PpIX）の緩やかな減弱を認め、675nmに新たなピーク（PPp）の出現を認めた（図１８（ａ）、（ｂ））。【００６３】
図１８（ａ）：蛍光強度を示したグラフ
図１８（ｂ）：（ａ）を635nmのピークで標準化したグラフ
＜Case３＞照射光に405nm、励起光に436nmを選択した場合
405nmの光照射に伴い、635nmのピーク（PpIX）の減弱を認め、675nmに新たなピーク（PPp）の出現を認めた（図１９（ａ）、（ｂ））。【００６４】
図１９（ａ）：蛍光強度を示したグラフ
図１９（ｂ）：（ａ）を635nmのピークで標準化したグラフ
＜Case４＞上記３つの組み合わせの比較（図20）
いずれの組み合わせでも、照射前と1J/cm2照射した後ではI675/I635の比(ratio)が上昇していることが確認できるが、照射光に405nmを、励起光に436nmを選択した組み合わせ（Case３）が最も大きな変化を示している。これは、405nmの波長がPpIXをより効率よくPPpに変化させるとともに、436nmの励起光がPPpの励起に最も適しているためである。
実施例６：コラーゲンとFADのスペクトル変化についての検討
本実施例では、代表的な生体内在性蛍光物質のスペクトル変化について検討するため、以下の材料を用いた。【００６５】
コラーゲン：ウシのアキレス腱から抽出したI型コラーゲン
FAD：90μMに希釈したFAD溶液
スペクトル分析は上述の装置で行った。照射光は405nm、励起光は436nmを選択した。
＜Case１＞コラーゲンのスペクトル変化
光照射に従って全体に蛍光ピークの減弱を認めるが、スペクトル変化は認めない（図２１）。
＜Case２＞FADのスペクトル変化
光照射に従って全体に蛍光ピークの減弱を認めるが、スペクトル変化は認めない（図２２）。
＜Case３＞光照射に伴うI675/I635 比(Ratio)の変化
コラーゲン、FAD共に、光照射を行ってもRatioの値はほぼ一定を示し（図２３）、PpIXの変化とは異なることからPpIXと区別が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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