(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維症の患者から採取された生体液試料中に天然に存在するネオエピトープ含有タンパク質断片を免疫検定法により測定する方法であって、前記免疫検定法が、
前記試料中に天然に存在するタンパク質断片を、ペプチド配列：ＫＮＧＥＴＧＰＱからなるネオエピトープと反応性の免疫学的結合パートナと接触させること、および前記ネオエピトープを含むタンパク質断片を測定するために前記免疫学的結合パートナへのペプチド断片の結合の程度を測定することを含む方法によって実施される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性傷害の後に線維症を発症する危険性を示すバイオマーカを含む、線維性疾患の診断およびその発症の予測に有用なバイオマーカについてのアッセイに関する。
【０００２】
特に、本発明によれば、Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩ型コラーゲン、エラスチン、Ｃ反応性タンパク質、ならびにビグリカン、デコリン、バーシカンおよびパールカンを含むプロテオグリカンの分解断片に関するバイオマーカは有用であることが認められる。
【背景技術】
【０００３】
線維性疾患（表１に列挙するものを含む）は病的状態および死亡の主要原因であり、例えば肝硬変による死亡は世界中で年間８００，０００例に上る１。
【０００４】
【表１】
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【０００５】
「線維性疾患」は、主症状としてであるか二次症状としてであるかにかかわらず、線維症を生じさせるあらゆる疾患である。
【０００６】
線維症は、持続性感染、自己免疫反応、アレルギー応答、化学的傷害、放射線および組織損傷を含む様々な刺激によって誘発される慢性炎症反応の最終結果である。線維症は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の蓄積と再編成を特徴とする。明らかな病因および臨床上の違いを有するにもかかわらず、ほとんどの慢性的な線維性障害は、共通して、増殖因子、タンパク質分解酵素、血管新生因子および線維形成性サイトカインの産生を維持する持続性刺激原を有し、前記物質は共に、正常組織の構造を漸進的に再構築し、破壊する、結合組織要素、特に、コラーゲンおよびプロテオグリカンの沈着を刺激する３、４。ヒトの健康へのその多大の影響にもかかわらず、現在のところ、線維症の機序を直接標的とする承認された治療法はない５。
【０００７】
線維症の鍵となる細胞メディエイタは筋線維芽細胞であり、筋線維芽細胞は、活性化された場合、主要なコラーゲン産生細胞として働く。
【０００８】
＜細胞外マトリックス（ＥＣＭ）＞
線維形成は、通常は組織損傷から生じる複雑な細胞および分子機構を含む動的過程である６。線維形成は、漸進的な機能障害を伴う、組織の大きさと密度の増大をもたらす巨大分子の濃度を変化させる正常なＥＣＭ調節が不均衡である結果である。これらの巨大分子は、主として、コラーゲンおよびプロテオグリカンなどの構造および接着機能を有する線維性タンパク質である。
【０００９】
＜コラーゲン＞
コラーゲンは人体に広く分布する、すなわち人体のタンパク質質量の約３０％がコラーゲンから成る。コラーゲンは大部分の結合組織のＥＣＭの構造的完全性に関与する。ＥＣＭ含量は、遺伝子発現とタンパク質分泌の調節を介して、同時にまた内因性プロテアーゼ阻害ならびにメタロプロテイナーゼおよびシステインプロテアーゼによるタンパク質分解を介して、厳密に制御される合成と分解の微妙なバランスから生じる７〜９。表２は、主要なコラーゲン型をそれらの主要な組織分布と共に列挙する。
【００１０】
【表２】
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【００１１】
Ｉ型コラーゲンは最も豊富なコラーゲンであり、大部分の結合組織で認められる。Ｉ型コラーゲンは骨および皮膚の構造のために特に重要であり、そこでの主要なコラーゲン成分はＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンである１０。
【００１２】
Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンは、健常組織では１：１の割合で肝臓および肺の主要成分である。加えて、ＩＶ型およびＶＩ型コラーゲンは、大部分の組織の基底膜中で認められる。Ｖ型コラーゲンの最も一般的な局在は、Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンに関連して、特徴的なコラーゲン原線維内にある１０。
【００１３】
一部のコラーゲンは限られた組織分布を有する：例えば、ＩＩ型は、ほとんど排他的に軟骨で認められる１１。
【００１４】
線維形成の間、コラーゲンの正味量が増加する１２〜１４。表３は、例として肝線維症におけるコラーゲン増加を示す。
【００１５】
【表３】
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【００１６】
＜エラスチン＞
エラスチンは、多くの結合組織、主として弾性の結合組織中に存在するタンパク質である。アミノ酸のグリシン、バリン、アラニンおよびプロリンの非常に高い含量を有し、分子量は６４〜６６ｋＤａである。８３０個のアミノ酸から成る不規則なまたはランダムなコイル立体配座で構成されている。エラスチンは、リシルオキシダーゼによって触媒される反応において、多くの可溶性トロポエラスチンタンパク質分子を連結し、不溶性で耐久性のある巨大な架橋アレイを作製することによって作られる。
【００１７】
エラスチンは、血流を助ける圧力波伝搬のための媒体として動脈において重要な機能を果たし、大動脈のような大きな弾性血管において特に豊富である。エラスチンはまた、肺、弾性靭帯および皮膚においても非常に重要である。
【００１８】
エラスチンの合成および代謝回転の理解に多大の努力が費やされてきたにもかかわらず、このマトリックス分子のタンパク質分解切断から生じるネオエピトープは、現在まで線維症の疾患発症に関連付けられていなかった。
【００１９】
＜ビメンチン＞
ビメンチンは、中間径フィラメントファミリーのタンパク質の成員である。中間径フィラメントは真核細胞の重要な構造特徴である。それらは、微小管およびアクチンミクロフィラメントと共に、細胞骨格を構成する。大部分の中間径フィラメントは安定な構造であるが、線維芽細胞においては、ビメンチンは動的構造体として存在する。このフィラメントは中胚葉由来組織についてのマーカとして使用され、それ自体、肉腫の免疫組織化学的マーカとして使用されてきた。
【００２０】
Ｈｅｒｔｉｇと共同研究者たち（Ｈｅｒｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．２００８  Ａｕｇ；１９（８）：１５８４−９１）は、慢性移植腎症を有する被験者の尿細管上皮細胞における上皮間葉移行が移植片における線維症の進行を予測できるかどうかを検討し、これらの被験者からの８３例の生検においてビメンチン発現を測定した。Ｈｅｒｔｉｇらは、手術の１年後にビメンチン発現の上昇と腸線維症スコアの間に関連性を認めた。
【００２１】
肝線維症の別の試験において、Ｍｅｒｉｄｅｎと共同研究者たち（Ｍｅｒｉｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｇａｓｔｒｏ  ＆  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２０１０；８：２８９−２９６）は、ビメンチン発現（Ｆ０期で得た生検における）と線維症の進行の間に有意の関連性を認め、高レベルのビメンチン発現は肝線維症の速やかな進行を予測した。
【００２２】
従って、本発明者らは、ビメンチンの循環断片が感受性の高い特異的な線維症のバイオマーカとして働き得るどうかを検討したいと考えた。
【００２３】
＜プロテオグリカン＞
プロテオグリカンは、様々な数のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）側鎖をコアタンパク質に共有結合連結する、多様な巨大分子群である１６。これらのＧＡＧは二糖の繰り返し単位（例えばＮ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）の重合体であり、それらは二糖単位上のヒドロキシル、カルボキシルおよび硫酸側鎖のために酸性である（負に荷電している）。これによりＧＡＧは高度に親水性であり、従って水および陽イオン（例えば細胞外液からのナトリウム）の拡散を助ける１７。さらに、ＧＡＧは、例えばヒアルロン酸鎖と非共有結合連結を形成して、さらに一層大きな分子複合体を形成する能力を有する１６。表４は、結合組織に関連する、最も広く検討されているプロテオグリカンを列挙する。
【００２４】
【表４】
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【００２５】
＜Ｃ反応性タンパク質＞
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、炎症、感染または外傷などの種々の臨床状態に応答して肝臓によって産生される急性期血清タンパク質である２９。ＣＲＰの産生は、罹患組織または損傷組織から放出される、ＩＬ−６などのサイトカインによって誘導される。ＣＲＰの生理的役割はまだ不明であり、その前炎症作用または抗炎症作用に関する検討が進められている。
【００２６】
＜プロテアーゼ＞
線維形成の間のＥＣＭの合成と分解の不均衡は、低密度の内皮下マトリックスの、間質コラーゲンに富むマトリックスへの変換から生じる。コラーゲンおよびプロテオグリカンの増加は、（１）タンパク質産生の減少および（２）タンパク質分解の低下の一方または両方によると考えられる。タンパク質分解の低下は、最近ますます関心を集めている。このプロセスの調節において、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）およびそれらの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）は、システインプロテアーゼおよびシスタチンなどの他のプロテアーゼおよびそれらの阻害剤と同様に、重要な役割を果たす。
【００２７】
＜ＭＭＰ＞
ＭＭＰは、ＥＣＭの、すべてではないにせよ大部分の成分を分解することができる、エンドペプチダーゼの大きな群である。現在、２５を超えるＭＭＰが発見されている。ＭＭＰは、金属原子、典型的には亜鉛を含む活性部位を特徴とし、チモーゲンとして分泌される。種々のＭＭＰが種々の組織で発現される。表５では、肝臓中のＭＭＰを示す。
【００２８】
【表５】
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【００２９】
ＴＩＭＰは、３分子複合体中のＭＭＰおよび膜１型メタロプロテイナーゼに対して基質特異的および組織特異的に結合することによって、ＭＭＰのタンパク質分解活性をブロックする（表６）。線維症においてＴＩＭＰレベルは劇的に上昇し、ＭＭＰレベルはやや上昇するかまたは比較的不変のままであり（ＭＭＰ−２を除く）、全体としてコラーゲンの分解の低下を生じさせる。
【００３０】
【表６】
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【００３１】
＜線維芽細胞活性化タンパク質＞
線維芽細胞活性化タンパク質αサブユニット（ＦＡＰαまたはＦＡＰ、α）は、セリンプロテアーゼファミリーに属する内在性膜ゼラチナーゼである。ＦＡＰαは、１７０ｋＤａメラノーマ膜結合ゼラチナーゼ、内在性膜セリンプロテイナーゼ、およびセプラーゼとしても知られるヘテロ二量体膜結合プロテイナーゼ複合体のαサブユニットであり、ＤＰＰ４（ＣＤ２６）はβサブユニットである。一部の細胞はＦＡＰαホモ二量体だけを作製し、また別の細胞はＤＰＰ４ホモ二量体だけを作製する。単量体は不活性である。ＦＡＰαは、上皮癌の反応性間質線維芽細胞、治癒創傷の顆粒組織、ならびに骨および軟組織肉腫の悪性細胞において選択的に発現される３３。このタンパク質は、発生、組織修復および上皮癌発生の過程で線維芽細胞増殖の制御または上皮間葉相互作用に関与すると考えられる。ＦＡＰの発現は線維症の病期と共に上昇することが示されている３４、３５。
【００３２】
＜線維症バイオマーカ＞
多くの生化学的マーカが、疾患の特異的な生成物ではないが、線維性疾患に関して示唆されてきた。表７は、臨床試験で使用される肝線維症の生化学的マーカの例である。加えて、他の線維性疾患のバイオマーカの数多くの例が存在する１２、３６〜４２。
【００３３】
【表７Ａ】
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【表７Ｂ】
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【００３４】
米国特許第５３８７５０４号は、アグリカン部位Ｎ３４１〜Ｆ３４２においてストロメライシンの作用によって放出されるネオエピトープ、ＶＤＩＰＥＮおよびこのネオエピトープに特異的なモノクローナル抗体を使用するＲＩＡアッセイを述べる。より一般的には、特異的なストロメライシン切断によって生成されるアグリカンの断片に特異的な単一特異性抗体の使用が記述されている。ストロメライシンの上昇は、変形性関節症、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化病変、痛風、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、特定のがん、関節損傷および数多くの炎症性疾患で起こる。ストロメライシンは特発性肺線維症において上昇することが報告され、アグリカンのストロメライシン切断産物を検出するためのアッセイが血液または他の生体液に関して実施できること、およびそのような断片の定量はＩＰＦや他の状態に関して診断的に使用できることが主張されている。しかし、これについての証拠は提供されておらず、本発明者らの知る限り、この予測を実証するその後の公表文献はない。そのようなＲＩＡアッセイは長年市販されているが、線維性疾患を診断するまたは観測する際にそれらが成功裏に使用されたという報告は現れていない。
【００３５】
米国特許第７，２２５，０８０号は、患者における炎症性、線維性または癌疾患の診断のための方法であって、前記患者における肝線維症および／または肝の壊死性炎症性病変の存在を調べるために、α２−マクログロブリン、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、ＧＧＴ（γグルタミルトランスペプチダーゼ）、γ−グロブリン、総ビリルビン、アルブミン、α１−グロブリン、α２−グロブリン、ハプトグロビン、β−グロブリン、アポＡ１、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β１、アポＡ２およびアポＢから成る群より選択される少なくとも４つの生化学的マーカの値を前記患者の血清または血漿中で測定し、その後前記の値を組み合わせることによる方法を開示する。この特許は、線維性疾患の間に生成されるネオエピトープを担持するペプチド断片の定量的測定を教示していない。
【００３６】
米国特許第６，０６０，２５５号は、肝線維症の程度を診断するための方法であって、ＩＶ型コラーゲンに特異的に結合する抗体を使用して試料中のＩＶ型コラーゲンの高分子形態の濃度を測定する段階、および該測定を肝線維症の程度に関連付ける段階を含む方法を述べる。やはり、体内で作用するタンパク質分解酵素によって生成されるネオエピトープは使用されていない。試料は、実際にはペプシンで消化され、このことは試料中のコラーゲン切断の天然パターンをあいまいにし得る。
【００３７】
米国特許第４，６２８，０２７号（Ｇａｙ）は、結合組織タンパク質に特異的な抗体の作製、より詳細には、ヒトコラーゲンおよびコラーゲン分解に関与する酵素に対する融合細胞ハイブリッドによるモノクローナル抗体の作製を開示する。組織学的、細胞学的および生物学的液体試料のコラーゲンプロフィールを確立するための、結合組織タンパク質に対するモノクローナル抗体の使用が述べられている。しかし、この特許は、結合組織タンパク質上のネオエピトープへの抗体の結合に基づく前記結合組織タンパク質の測定を記述していない。
【００３８】
Ｇｕａｎｅａｂｅｎｓ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ，１９９８９８は、悪化した肝線維症を伴う疾患である原発性胆汁性肝硬変を有する患者において、骨代謝回転マーカであるＩ型コラーゲンのＮ−テロペプチド（ＮＴＸ）、Ｉ型コラーゲンのＣ−テロペプチド（ＣＴＸ）およびＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド（ＰＩＮＰ）を評価した。ＮＴＸ、ＣＴＸおよびＰＩＮＰのレベルは対照と比較して患者において高く、疾患の組織学的病期と相関した。ＮＴＸで使用された抗体は、Ｉ型コラーゲンのＮ末端のカテプシンＫ切断部位に対して惹起されたものであり、ネオエピトープＪＹＤＧＫＧＶＧ↓に依存する。ＣＴＸにおいて使用された抗体は、Ｉ型コラーゲンのＣ末端のカテプシンＫ切断部位に対して惹起され、ネオエピトープＥＫＡＨＤＧＧＲ↓に依存する。これらのマーカは、Ｉ型コラーゲンのテロペプチド内に位置し、Ｉ型コラーゲンの内部（三重らせん部分）には位置しない。ＰＩＮＰアッセイのために使用されたモノクローナル抗体は、ネオエピトープではないＰＩＮＰ配列中の内部エピトープに対して惹起された。
【００３９】
Ｍｏｅｌｌｅｒ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｕｔ．，１９９９９９は、Ｉ型コラーゲンのＣ末端架橋テロペプチド（ＩＣＴＰ）が、アルコール性肝硬変患者では対照と比較して上昇していることを明らかにした。記述されている試験は、生化学的マーカが肝線維症を反映し得ることを示した。ＩＣＴＰポリクローナル抗体は、トリプシンおよびコラゲナーゼ切断Ｉ型コラーゲンに対して惹起された。しかし、抗体はネオエピトープに結合していない。
【００４０】
Ｒｏｓｅｎ  ＨＮ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ，２００４１００は、ホルモン補充治療（ＨＲＴ）を受けている女性において骨代謝回転マーカであるＩ型コラーゲンのＮ−テロペプチド（ＮＴＸ）およびＩ型コラーゲンのＣ−テロペプチド（ＣＴＸ）を評価した。試験では、骨代謝回転マーカが治療と共に低下することが認められた。ＮＴＸで使用された抗体は、Ｉ型コラーゲンのＮ末端のカテプシンＫ切断部位に対して惹起されたものであり、ネオエピトープＪＹＤＧＫＧＶＧ↓に依存する。ＣＴＸにおいて使用された抗体は、Ｉ型コラーゲンのＣ末端のカテプシンＫ切断部位に対して惹起され、ネオエピトープＥＫＡＨＤＧＧＲ↓に依存する。本発明と異なり、これらの抗体は骨代謝の評価のために使用され、線維症の評価のためではなかった。
【００４１】
Ｌｅｉｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ，２００７１０１は、ゾレドロン酸を摂取している前立腺癌患者においてネオエピトープ特異的な骨代謝回転マーカであるＩ型コラーゲンのＮ−テロペプチド（ＮＴＸ）およびＩ型コラーゲンのＣ−テロペプチド（ＣＴＸ）の使用を評価した。試験では、骨代謝回転マーカが治療と共に低下することが認められた。ＮＴＸで使用された抗体は、Ｉ型コラーゲンのＮ末端のカテプシンＫ切断部位に対して惹起され、ネオエピトープＪＹＤＧＫＧＶＧ↓に依存する。ＣＴＸにおいて使用された抗体は、Ｉ型コラーゲンのＣ末端のカテプシンＫ切断部位に対して惹起され、ネオエピトープＥＫＡＨＤＧＧＲ↓に依存する。本発明と異なり、これらの抗体は骨転移の浸潤における骨代謝の評価のために使用され、線維症の評価のためではなかった。
【００４２】
ＰＩＩＩＮＰは、線維性疾患の重症度を評価する多くの試験において１０２、重度の熱傷外傷後の皮膚線維症を有する患者において１０３、非硬変性原発性胆汁性肝硬変における疾患の進行に関して１０４、原発性胆汁性肝硬変および慢性ウイルス性Ｃ型肝炎において１０５使用されてきた。
【００４３】
ＰＩＩＩＮＰおよびＩＣＴＰは、心筋の線維症を有する患者において測定された１０６。
【００４４】
多くの報告は、生化学的指標の予測値を改善するために生化学的マーカのセットを組み合わせている。１１の異なる血清マーカがＦ０〜Ｆ４の線維症病期を有する２０５名の患者において測定され、最も有用なマーカは、α２−マクログロブリン、α２−グロブリン（またはハプトグロビン）、γ−グロブリン、アポリポタンパク質Ａ１、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、および総ビリルビンであった１０７。これらのマーカの指数は、０〜０．１０の範囲のスコア（全患者の１２％［４１名］）に関しては負の予測値（Ｆ２、Ｆ３またはＦ４の不在について１００％の確実性）、および０．６０〜１．００の範囲のスコア（全患者の３４％［１１５名］）に関しては高い正の予測値（Ｆ２、Ｆ３またはＦ４の存在について＞９０％の確実性）を有していた。
【発明の概要】
【００４５】
しかし、上記の報告のいずれにおいても、本明細書で特許請求するようなネオエピトープに結合する抗体に基づくペプチド断片の測定が線維性疾患を有する患者の評価のために有用であり得ることは示唆されていない。
【００４６】
本発明は、ここに、線維症の診断の方法であって、患者の生体液試料中に天然に存在するネオエピトープ含有タンパク質断片を測定する免疫検定法を実施するステップと、正常レベルを上回る、前記患者における前記測定の上昇を線維症の存在と関連付けるステップとを含み、ここで、前記免疫検定法は、前記試料中に天然に存在するタンパク質断片を、プロテイナーゼによるタンパク質の切断によって形成されるネオエピトープに対して反応性である免疫学的結合パートナと接触させるステップと、前記ネオエピトープを含むタンパク質断片を測定するために、前記免疫学的結合パートナへのペプチド断片の結合の程度を測定するステップとを含む方法によって実施し、かつ、ここで、前記タンパク質が、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲンもしくはＶＩ型コラーゲン、ビグリカン、デコリン、ルミカン、バーシカン、パールカン、ニューロカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、セルグリシン、シンデカン、βグリカン、ＣＲＰまたはビメンチンであり、但し、ネオエピトープがＩ型コラーゲンの切断によって形成される場合、切断は、Ｉ型コラーゲンがカテプシンＫによって切断される部位ではないことを条件とする方法を提供する。２００９年５月１４日（その優先日後）に公開された国際公開第ＷＯ２００９／０５９９７２号パンフレットは、ＩＩＩ型コラーゲンのネオエピトープについてのアッセイを開示するが、そのような測定の高いレベルが線維症の存在または程度に関連することは開示していない。場合により、本発明によるアッセイは、ＩＩＩ型コラーゲン以外の上記に挙げたタンパク質の１つに基づくか、またはＩＩＩ型コラーゲンに基づく場合、切断部位で形成されるネオエピトープ、ＰＧＩＰＧＲＮＧＤＰ＊  配列番号１、＊ＥＳＣＰＴＧＰＱＮＹ  配列番号２、またはＰＫＧＤＴＧＰＲＧＰ＊  配列番号３（＊は切断部位を示す）の１つに対する免疫学的結合パートナを利用する。
【００４７】
これらの目的に関して、心臓血管疾患は線維症とみなされなくてもよいし、本発明によって検出される線維症は、心臓血管疾患に付随する線維症以外であってもよい。場合により、本発明による免疫検定法における高レベル結果は、皮膚線維症、肺線維症または肝線維症に関連する。
【００４８】
本発明の方法は、患者の生体液試料を得る予備段階を含み得る。
【００４９】
本発明は、体液試料中に天然に存在するネオエピトープ含有タンパク質断片を測定する免疫検定の方法を含み、前記免疫検定法は、
前記試料中に天然に存在するタンパク質断片を、プロテイナーゼによるタンパク質の切断によって形成されるネオエピトープと反応性の免疫学的結合パートナと接触させるステップと、前記ネオエピトープを含むタンパク質断片を測定するために、ここで、前記免疫学的結合パートナへのペプチド断片の結合の程度を測定するステップとを含む方法によって実施され、前記タンパク質は、ニューロカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、セルグリシン、シンデカン、βグリカン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＣＲＰまたはビメンチンであり、但し、ネオエピトープがＩ型コラーゲンの切断によって形成される場合、切断は、Ｉ型コラーゲンがカテプシンＫによって切断される部位ではないことを条件とする。場合により、本発明によるアッセイは、ＩＩＩ型コラーゲン以外の上記に挙げたタンパク質の１つに基づくか、またはＩＩＩ型コラーゲンに基づく場合、切断部位で形成されるネオエピトープ、ＰＧＩＰＧＲＮＧＤＰ＊  配列番号１、＊ＥＳＣＰＴＧＰＱＮＹ  配列番号２、またはＰＫＧＤＴＧＰＲＧＰ＊  配列番号３（＊は切断部位を示す）の１つに対する免疫学的結合パートナを利用する。
【００５０】
前記免疫学的結合パートナは、Ｃ末端ネオエピトープまたはＮ末端ネオエピトープを含むペプチド断片に対して特異的結合親和性を有し得る。
【００５１】
ネオエピトープとの特異的反応性またはネオエピトープに対する免疫学的親和性は、関連する免疫学的結合パートナが、該ネオエピトープが由来する未切断タンパク質と反応性ではないことを意味する。好ましくは、前記免疫学的結合パートナは、配列がそれぞれの切断部位を越えて伸びる場合は、以下に列挙する配列のようなネオエピトープ配列と反応性ではない。
【００５２】
本明細書で使用される「免疫学的結合パートナ」という用語は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体ならびにＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２のような抗体の特異的結合断片も包含する。従って、前記免疫学的結合パートナは、モノクローナル抗体または特異的結合親和性を有するモノクローナル抗体の断片であり得る。
【００５３】
好ましくは、前記ペプチド断片は、Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型もしくはＶＩ型コラーゲン、エラスチン、Ｃ反応性タンパク質、またはプロテオグリカンであるビグリカン、デコリン、バーシカンおよびパールカンのうちの１つの断片である。結合組織タンパク質が好ましい。好ましくは、免疫学的結合パートナが結合するネオエピトープ配列は、いかなる他のタンパク質においても認められないか、または本発明の方法が関連する他のタンパク質のいずれにおいても認められない。
【００５４】
いくつかの候補プロテアーゼは、線維組織中のタンパク質の消化に関与し得る。おそらく、これは、疾患のレベルに依存して異なるネオエピトーププロフィールを生じさせる広範囲の複雑なプロセスの結果である。
【００５５】
＜コラーゲンアッセイ＞
Ｉ型コラーゲン
本発明者らは、以下の表に列挙する酵素が少なくとも以下の切断部位（「．」で示す）でＩ型コラーゲンを切断すると判定した。
【００５６】
【表８】
0005978128.tif 000010
【００５７】
Ｐはヒドロキシプロリンを示し、Ｍは酸化メチオニンを示し、Ｋはヒドロキシリシンを示す。
【００５８】
免疫学的結合パートナは、カテプシンＫのＩ型コラーゲン部位における切断を除き、Ｉ型コラーゲンの切断によって形成されるＣ末端またはＮ末端ネオエピトープと特異的に反応するものであり得る。
【００５９】
適切な免疫学的結合パートナは、従って、ペプチドのＮ末端の以下の配列のいずれかと特異的に反応性であり得る。
【００６０】
【表９】
0005978128.tif 000011
【００６１】
あるいは、適切な免疫学的結合パートナは、ペプチドのＣ末端の以下の配列のいずれかと特異的に反応性であり得る。
【００６２】
【表１０】
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【００６３】
ＩＩＩ型コラーゲン
本発明者らは、以下の表に列挙する酵素が少なくとも以下の切断部位（＊で示す）でＩＩＩ型コラーゲンを切断すると判定した。
【００６４】
【表１１Ａ】
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【表１１Ｂ】
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【表１１Ｃ】
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【表１１Ｄ】
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【００６５】
免疫学的結合パートナは、ＩＩＩ型コラーゲンの切断によって形成されるＣ末端またはＮ末端ネオエピトープと特異的に反応性のものであり得る。
【００６６】
適切な免疫学的結合パートナは、従って、ペプチドのＮ末端の以下の配列のいずれかと、またはペプチドのＣ末端の以下の配列のいずれかと特異的に反応性であり得る。
【００６７】
【表１２】
0005978128.tif 000017
【００６８】
【表１３】
0005978128.tif 000018
【００６９】
ＩＶ型コラーゲン
本発明者らは、以下の表に列挙する酵素が少なくとも以下の切断部位（「．」で示す）でＩＶ型コラーゲンを切断すると判定した。
【００７０】
【表１４Ａ】
0005978128.tif 000019
【表１４Ｂ】
0005978128.tif 000020
【００７１】
免疫学的結合パートナは、ＩＶ型コラーゲンの切断によって形成されるＣ末端またはＮ末端ネオエピトープと特異的に反応するものであり得る。
【００７２】
適切な免疫学的結合パートナは、従って、ペプチドのＮ末端の以下の配列のいずれかと、またはペプチドのＣ末端の以下の配列のいずれかと特異的に反応性であり得る。
【００７３】
【表１５】
0005978128.tif 000021
【００７４】
【表１６】
0005978128.tif 000022
【００７５】
Ｖ型コラーゲン
本発明者らは、以下の表に列挙する酵素が少なくとも以下の切断部位（「．」で示すか、または「．」が存在しない場合は配列の末端）でＶ型コラーゲンを切断すると判定した。
【００７６】
【表１７Ａ】
0005978128.tif 000023
【表１７Ｂ】
0005978128.tif 000024
【表１７Ｃ】
0005978128.tif 000025
【００７７】
Ｐはヒドロキシプロリンであり、Ｋはヒドロキシリシン、グリコシル化、リポキシ化または架橋を示す。
【００７８】
免疫学的結合パートナは、Ｖ型コラーゲンの切断によって形成されるＣ末端またはＮ末端ネオエピトープと特異的に反応するものであり得る。
【００７９】
適切な免疫学的結合パートナは、従って、ペプチドのＮ末端の以下の配列のいずれかと、またはペプチドのＣ末端の以下の配列のいずれかと特異的に反応性であり得る：
【００８０】
【表１８】
0005978128.tif 000026
【００８１】
Ｐはヒドロキシプロリンであり、Ｋはヒドロキシリシン、グリコシル化、リポキシ化または架橋を示す。
【００８２】
【表１９】
0005978128.tif 000027
【００８３】
Ｐはヒドロキシプロリンであり、Ｋはヒドロキシリシン、グリコシル化、リポキシ化または架橋を示す。
【００８４】
ＶＩ型コラーゲン
本発明者らは、以下の表に列挙する酵素が少なくとも以下の切断部位（「．」で示すか、または「．」が存在しない場合は配列の末端）でＶＩ型コラーゲンを切断すると判定した。
【００８５】
【表２０】
0005978128.tif 000028
【００８６】
免疫学的結合パートナは、Ｖ型コラーゲンの切断によって形成されるＣ末端またはＮ末端ネオエピトープと特異的に反応するものであり得る。
【００８７】
適切な免疫学的結合パートナは、従って、ペプチドのＮ末端の以下の配列のいずれかと、またはペプチドのＣ末端の以下の配列のいずれかと特異的に反応性であり得る。
【００８８】
【表２１】
0005978128.tif 000029
【００８９】
【表２２】
0005978128.tif 000030
【００９０】
プロテオグリカン
本発明のもう１つの態様では、前記ペプチド断片は、プロテオグリカンのバーシカン、ルミカン、パールカン、ビグリカンおよびデコリンの断片であり、それらはすべて線維性組織において同定される。
【００９１】
いくつかの候補プロテアーゼは、線維性病変中のプロテオグリカンの消化に関与し得る。本発明者らは、表１７に列挙する酵素が、少なくとも以下の切断産物を生じさせるルミカン、バーシカン、ビグリカン、パールカンおよびデコリンを生成すると判定した。
【００９２】
【表２３】
0005978128.tif 000031
【００９３】
免疫学的結合パートナは、バーシカン、ルミカン、デコリン、パールカンおよびビグリカンの切断によって形成されるＣ末端またはＮ末端ネオエピトープと特異的に反応するものであり得る。
【００９４】
適切な免疫学的結合パートナは、従って、ペプチドのＮ末端の以下の配列のいずれかと、またはペプチドのＣ末端の、表１９中の以下の配列のいずれかと特異的に反応性であり得る。
【００９５】
【表２４】
0005978128.tif 000032
【００９６】
【表２５】
0005978128.tif 000033
【００９７】
ＣＲＰ
いくつかの候補プロテアーゼは線維組織中のＣＲＰの消化に関与すると考えられ、文献は、線維性組織中の多くの異なるプロテアーゼを報告している。おそらく、これは、最終的に線維症へと至る広範囲の複雑なプロセスの結果である。しかし、本発明者らの評価では、初期は様々なＭＭＰで構成され得るが、後期はマトリックスのカテプシンＫ分解に大きく依存すると考えられ、疾患のレベルに依存して異なるネオエピトーププロフィールを生じさせる。本発明者らは、純粋な天然タンパク質の様々なインビトロ切断を通して、以下の表に列挙する酵素が少なくとも以下の切断部位（表２０では＊で示すが、表２１では各配列の末端）でＣＲＰを切断すると判定した。
【００９８】
【表２６】
0005978128.tif 000034
【００９９】
【表２７Ａ】
0005978128.tif 000035
【表２７Ｂ】
0005978128.tif 000036
【表２７Ｃ】
0005978128.tif 000037
【表２７Ｄ】
0005978128.tif 000038
【表２７Ｅ】
0005978128.tif 000039
【表２７Ｆ】
0005978128.tif 000040
【表２７Ｇ】
0005978128.tif 000041
【表２７Ｈ】
0005978128.tif 000042
【表２７Ｉ】
0005978128.tif 000043
【０１００】
従って、本発明の方法では、前記ペプチド断片は、好ましくは、表２０中のＣＲＰの上記部分配列のいずれか１つの＊記号で示される部位での、または表２１中のＣＲＰの任意の部分配列のいずれかの末端での、プロテアーゼによるＣＲＰの切断によって形成されるネオエピトープを含む。
【０１０１】
免疫学的結合パートナは、ＣＲＰの切断によって形成されるＣ末端またはＮ末端ネオエピトープと特異的に反応するものであり得る。
【０１０２】
適切な免疫学的結合パートナは、従って、ペプチドのＮ末端の以下の配列のいずれかと、またはペプチドのＣ末端の以下の配列のいずれかと特異的に反応性であり得る：
【０１０３】
【表２８】
0005978128.tif 000044
【０１０４】
【表２９】
0005978128.tif 000045
【０１０５】
エラスチン
いくつかの候補プロテアーゼは、線維性組織中のエラスチンの消化に関与し得る。本発明者らは、純粋な天然タンパク質の様々なインビトロ切断を通して、以下の表に列挙する酵素が、少なくとも以下の配列の各末端の切断部位で、または「．」で示す切断部位で、または「．」が示されていない場合は配列の末端でエラスチンを切断すると判定した。
【０１０６】
【表３０Ａ】
0005978128.tif 000046
【表３０Ｂ】
0005978128.tif 000047
【表３０Ｃ】
0005978128.tif 000048
【表３０Ｄ】
0005978128.tif 000049
【表３０Ｅ】
0005978128.tif 000050
【表３０Ｆ】
0005978128.tif 000051
【表３０Ｇ】
0005978128.tif 000052
【表３０Ｈ】
0005978128.tif 000053
【表３０Ｉ】
0005978128.tif 000054
【表３０Ｊ】
0005978128.tif 000055
【表３０Ｋ】
0005978128.tif 000056
【表３０Ｌ】
0005978128.tif 000057
【０１０７】
従って、本発明の方法では、前記ペプチド断片は、好ましくは、表２４中のエラスチンの部分配列のいずれか１つのＮ末端もしくはＣ末端部位での、または指示されている場合は「・」記号で示される部位での、プロテアーゼによるエラスチンの切断によって形成されるネオエピトープを含む。
【０１０８】
免疫学的結合パートナは、エラスチンの切断によって形成されるＣ末端またはＮ末端ネオエピトープと特異的に反応するものであり得る。
【０１０９】
適切な免疫学的結合パートナは、従って、ペプチドのＮ末端の以下の配列のいずれかと、またはペプチドのＣ末端の以下の配列のいずれかと特異的に反応性であり得る。
【０１１０】
【表３１Ａ】
0005978128.tif 000058
【表３１Ｂ】
0005978128.tif 000059
【０１１１】
【表３２Ａ】
0005978128.tif 000060
【表３２Ｂ】
0005978128.tif 000061
【０１１２】
ビメンチン
いくつかの候補プロテアーゼは、線維性組織中のビメンチンの消化に関与し得る。本発明者らは、純粋な天然タンパク質の様々なインビトロ切断を通して、以下の表に列挙する酵素が、少なくとも以下の配列の各末端の切断部位で、または「．」で示す切断部位で、または「．」が示されていない場合は配列の末端でビメンチンを切断すると判定した。
【０１１３】
【表３３】
0005978128.tif 000062
【０１１４】
従って、本発明の方法では、前記ペプチド断片は、好ましくは、表２４中のビメンチンの部分配列のいずれか１つのＮ末端もしくはＣ末端部位での、または指示されている場合は「・」記号で示される部位での、プロテアーゼによるビメンチンの切断によって形成されるネオエピトープを含む。
【０１１５】
免疫学的結合パートナは、ビメンチンの切断によって形成されるＣ末端またはＮ末端ネオエピトープと特異的に反応するものであり得る。
【０１１６】
適切な免疫学的結合パートナは、従って、ペプチドのＮ末端の以下の配列のいずれかと、またはペプチドのＣ末端の以下の配列のいずれかと特異的に反応性であり得る：
【０１１７】
【表３４】
0005978128.tif 000063
【０１１８】
【表３５】
0005978128.tif 000064
【０１１９】
同様の方法で検定し得るネオエピトープを規定するさらなる切断部位は、コラーゲン、エラスチン、ＣＲＰおよびプロテオグリカンまたは他の線維性組織タンパク質を本明細書で述べる酵素のいずれかに暴露し、それによって生成されたペプチドを単離して、配列決定することによって同定できる。さらに、アッセイは、例示した切断部位に隣接して生成される、すなわち上記で示したＮ末端エピトープに至るＣ末端配列および上述したＣ末端エピトープに結合するＮ末端配列中のネオエピトープに基づき得る。
【０１２０】
上述したペプチドの２以上についてのアッセイは、別々に実施して、それらの結果を組み合わせてもよく、または上述したペプチドの２以上を一緒に測定してもよい。
【０１２１】
本発明によるアッセイの結果は、診断または予後値の総合指標を形成する１またはそれ以上の他の測定バイオマーカと組み合わせてもよい。
【０１２２】
一般に、不均一および均一形式、サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、酵素結合アッセイ、放射免疫検定法等を含む、これまでに公知のすべての免疫検定法の形式が本発明に従って使用できる。従って、場合により、前記方法は、前記免疫学的結合パートナと競合物質を前記試料の存在下でインキュベートし、競合物質が免疫学的結合パートナと結合するために試料中のペプチド断片と競合する競合免疫検定法として実施される。
【０１２３】
前記競合物質は、（１）Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型もしくはＶＩ型コラーゲンの配列、またはＣＲＰ、またはプロテオグリカンであるバーシカン、ルミカン、パールカン、デコリンおよびビグリカンペプチドのいずれかに由来する合成ペプチドであり得るか、または競合物質は、（２）プロテアーゼによって切断されて前記ネオエピトープとなる、精製された天然のＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型もしくはＶＩ型コラーゲン、またはＣＲＰ、またはプロテオグリカンであるニューロカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、セルグリシン、シンデカン、βグリカン、バーシカン、ルミカン、パールカン、デコリンおよびビグリカンのいずれかに由来し得る。
【０１２４】
１つの適切な方法は、Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型コラーゲン、ＣＲＰ、ビメンチンもしくはプロテオグリカンのニューロカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、セルグリシン、シンデカン、βグリカン、バーシカン、ルミカン、デコリン、パールカンおよびビグリカン断片のいずれかのネオエピトープ、または線維性組織に由来する他のタンパク質からのペプチド断片上のネオエピトープに結合するモノクローナル抗体または抗体結合断片を使用した競合免疫検定法であり得る。マイクロタイタープレートの固体表面上に被覆された、適切に選択された合成ペプチドは、モノクローナル抗体または結合断片への結合に関して試料と競合し得る。あるいは、モノクローナル抗体または結合断片によって認識されるネオエピトープを担持する精製天然Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型コラーゲン、ＣＲＰ、ニューロカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、セルグリシン、シンデカン、βグリカン、バーシカン、ルミカン、デコリン、パールカンおよびビグリカン断片を固体表面で使用し得る。さらにもう１つの代替例は、モノクローナル抗体または結合断片を固体表面に固定化し、次に、試料を、シグナル分子、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼまたはビオチンに適切に連結された合成ペプチドと共インキュベートすることである。
【０１２５】
試料は、血清、血液、血漿または他の、例えば線維性組織生検の試料であり得る。
【０１２６】
アッセイは、前記ネオエピトープと特異的に反応する第一免疫学的結合パートナと、ネオエピトープが属する関連タンパク質に対して反応性の第二免疫学的結合パートナとを用いたサンドイッチアッセイとして実施し得る。場合により、前記第二免疫学的結合パートナは、同じタンパク質の第二のエピトープに対する結合パートナである。
【０１２７】
特定の好ましい方法では、本発明の方法は、前記ペプチド断片の前記結合の測定レベルを、（ａ）匹敵する健常個体および／または（ｂ）病的線維性状態の特徴を示す数値と比較し、場合により測定されたペプチドの高レベル（通常は高い結合レベルによって示される）をより重度の前記状態と関連付けることをさらに含む。
【０１２８】
本発明の１つの態様は、前述したネオエピトープ、特にＩ型およびＩＶ型コラーゲンについてのネオエピトープを認識するモノクローナル抗体の開発に関する。これは、Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型コラーゲン、ＣＲＰ、ビメンチン、ニューロカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、セルグリシン、シンデカン、βグリカン、バーシカン、ルミカン、デコリン、パールカンおよびビグリカン分子のアミノ酸配列（上記に列挙した配列またはその中で終了する配列を含む）に由来する合成ペプチドでマウスを免疫し、選択したマウスからの脾細胞を骨髄腫細胞に融合して、関連合成ペプチド上のネオエピトープに対する結合に関してモノクローナル抗体を試験することによって達成できる。ネオエピトープに対する特異性は、合成ペプチドとの反応性、および免疫ペプチドのＣ末端延長形態（Ｃ末端ネオエピトープに関して）または免疫ペプチドのＮ末端延長形態（Ｎ末端ネオエピトープに関して）との反応性の欠如を求めることによって確実にし得る。天然のＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型コラーゲン、ＣＲＰ、ビメンチン、ニューロカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、セルグリシン、シンデカン、βグリカン、バーシカン、ルミカン、デコリン、パールカンおよびビグリカンへの結合能力の欠如を確認するために、ネオエピトープに対する抗体も評価し得る。あるいは、ネオエピトープに対する特異性は、抗体の反応性が、末端アミノ酸の１つに共有結合連結されたビオチンまたは他の官能基の存在に負の依存性を有することを求めることによって確実にし得る。
【０１２９】
本発明は、上記に提示したＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型コラーゲン、ＣＲＰ、ビメンチン、ニューロカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、セルグリシン、シンデカン、βグリカン、バーシカン、ルミカン、デコリン、パールカンおよびビグリカンの部分配列のいずれか１つの末端部位における、プロテアーゼによるＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型コラーゲン、ＣＲＰ、ビメンチン、ニューロカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、セルグリシン、シンデカン、βグリカン、バーシカン、ルミカン、デコリン、パールカンおよびビグリカンの切断によって形成されるネオエピトープと特異的に免疫反応性である免疫学的結合パートナを含み、例えばモノクローナル抗体またはその結合断片であり得る。
【０１３０】
本発明は、上記に提示したＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型コラーゲン、ＣＲＰ、ビメンチン、ニューロカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、セルグリシン、シンデカン、βグリカン、バーシカン、ルミカン、デコリン、パールカンおよびビグリカンの部分配列のいずれか１つにおける配列の末端部位でのＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型コラーゲン、ＣＲＰ、ビメンチン、ニューロカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、セルグリシン、シンデカン、βグリカン、バーシカン、ルミカン、デコリン、パールカンおよびビグリカンの切断によって形成されるＣ末端またはＮ末端ネオエピトープに対するモノクローナル抗体を産生する細胞株を含む。
【０１３１】
本発明は、上記に提示したこれらのタンパク質の部分配列のいずれか１つにおけるＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型コラーゲン、ＣＲＰ、ビメンチン、ニューロカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、セルグリシン、シンデカン、βグリカン、バーシカン、ルミカン、デコリン、パールカンおよびビグリカンの切断によって形成されるＣ末端またはＮ末端ネオエピトープを含むペプチドをさらに提供する。そのようなペプチドは、前記ペプチドに対する免疫応答を生じさせるためにハプテンとして担体に結合し得るか、または免疫検定法における使用のために固体表面に固定化し得るもしくは検出可能なマーカに結合し得る。
【０１３２】
本発明は、上記に提示したＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型コラーゲン、ＣＲＰ、ビメンチン、ニューロカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、セルグリシン、シンデカン、βグリカン、バーシカン、ルミカン、デコリン、パールカンおよびビグリカンの部分配列のいずれか１つにおける、Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型コラーゲン、ＣＲＰ、ビメンチン、ニューロカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、セルグリシン、シンデカン、βグリカン、バーシカン、ルミカン、デコリン、パールカンおよびビグリカンの切断によって形成されるＣ末端またはＮ末端ネオエピトープを含むペプチドをコードする単離核酸分子をさらに含む。
【０１３３】
本発明は、上記に提示したＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型コラーゲン、ＣＲＰ、ビメンチン、ニューロカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、セルグリシン、シンデカン、βグリカン、バーシカン、ルミカン、デコリン、パールカンおよびビグリカンの部分配列のいずれか１つにおける、Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型コラーゲン、ＣＲＰ、ビメンチン、ニューロカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、セルグリシン、シンデカン、βグリカン、バーシカン、ルミカン、デコリン、パールカンおよびビグリカンの切断によって形成されるＣ末端またはＮ末端ネオエピトープを含むペプチドの発現のための発現シグナルおよび該ペプチドの発現をコードするコード配列を含有する核酸配列を含むベクターをさらに含み、そのようなベクターで形質転換された、前記ペプチドを発現する宿主細胞をさらに含む。
【０１３４】
本発明のさらにもう１つの態様は、上述した方法を実施するために好都合に使用できるキットに関する。そのようなキットは、（１）合成ペプチドで被覆されたマイクロタイタープレートと、（２）前記合成ペプチドと反応性の本発明のモノクローナル抗体または抗体結合断片と、（３）標識抗マウスＩｇＧ免疫グロブリンとを含み得る。あるいは、そのようなキットは、（１）精製天然Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型コラーゲン、ＣＲＰ、ビメンチン、バーシカン、ルミカン、デコリン、パールカンおよびビグリカン断片で被覆されたマイクロタイタープレートと、（２）Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型コラーゲン、ＣＲＰ、ビメンチン、ニューロカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、セルグリシン、シンデカン、βグリカン、バーシカン、ルミカン、デコリン、パールカンおよびビグリカン断片上のネオエピトープを認識し、前記精製Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型コラーゲン、ＣＲＰ、ビメンチン、ニューロカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、セルグリシン、シンデカン、βグリカン、バーシカン、ルミカン、デコリン、パールカンおよびビグリカン断片と反応性であるモノクローナル抗体と、（３）標識抗マウスＩｇＧ免疫グロブリンとを含み得る。あるいは、そのようなキットは、（１）ストレプトアビジンで被覆されたマイクロタイタープレートと、（２）ビオチンに連結された合成ペプチドと、（３）Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型コラーゲン、ＣＲＰ、ビメンチン、ニューロカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、セルグリシン、シンデカン、βグリカン、バーシカン、ルミカン、デコリン、パールカンおよびビグリカン断片上のネオエピトープを認識し、前記合成ペプチドと反応性であるモノクローナル抗体と、（４）標識抗マウスＩｇＧ免疫グロブリンとを含み得る。さらにもう１つの代替例は、（１）ストレプトアビジンで被覆されたマイクロタイタープレートと、（２）ビオチンに連結された合成ペプチドと、（３）Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型コラーゲン、ＣＲＰ、ビメンチン、ニューロカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、セルグリシン、シンデカン、βグリカン、バーシカン、ルミカン、デコリン、パールカンおよびビグリカン断片上のネオエピトープを認識する（および前記合成ペプチドと反応性である）、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合されたモノクローナル抗体とを含むキットであり得る。
【０１３５】
従って、本発明は、本明細書で述べる、特にＩ型およびＩＶ型コラーゲンに関する免疫学的結合パートナ、ならびに前記免疫学的結合パートナに結合する競合物質、ならびに、場合により洗浄試薬、緩衝液、停止試薬、酵素標識、標識酵素の基質、較正基準、抗マウス抗体および指示書の１またはそれ以上を含む免疫検定キットを包含する。
【０１３６】
本明細書で述べるアッセイは患者における線維症の診断に有用である。加えて、試験は、疾患の進行の評価および治療に対する応答を監視するために有用である。本発明の免疫学的結合パートナは、Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型コラーゲン、ＣＲＰ、ビメンチン、ニューロカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、セルグリシン、シンデカン、βグリカン、バーシカン、ルミカン、デコリン、パールカンおよびビグリカン切断産物の存在または位置を示すために免疫染色においても使用し得る。
【０１３７】
以下の実施例および添付の図面を参照して本発明をさらに説明し、例示する。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】図１は、種々の生物学的試料：プールされたヒト血清試料（血清）；ヒト羊水（ＡＦ）；ヒト線維芽細胞培地（Ｆｉｂｒ．Ｃｌｔｒ．）のＣＯ３  ＥＬＩＳＡ結果を表示するグラフを示す。
【図２】図２ａは、偽手術したラット（ｓ）ならびに基線時（ｂ）および終了時（ｔ）の胆管結紮ラットにおけるＣＯ３血清レベルを表示するグラフを示す。  図２ｂは、ラット血清中のＣＯ３の対応するΔ値：終了時レベル−基線レベルを示す。
【図３】図３は、種々のヒト血清試料中のＣＯ３レベルを表示するグラフを示す。正常血清：健常個体より。ＣＯＰＤ：慢性閉塞性肺疾患（肺線維症を導く）。強皮症（皮膚および肺線維症を導く）。ＨＣＶ：Ｃ型ウイルス性肝炎（肝線維症を導く）。
【図４】図４は、実施例５で測定した肝重量と肝スコアを示す。
【図５】図５は、実施例５で本発明に従って測定したＩＩＩ型コラーゲンのＭＭＰ−９切断断片のレベルを示す。
【図６】図６は、実施例５で測定したＢＤＬラットまたは偽手術ラットにおけるＩＩＩ型コラーゲン遺伝子発現のレベルを示す。
【図７】図７は、ウエスタンブロット法によって測定した、実施例５で使用された抗体と反応性のＩＩＩ型コラーゲンのＭＭＰ−９切断断片の発現レベルの変化を示す。
【図８】図８は、実施例５で得た肝切片の組織染色の結果を示す。
【図９】図９は、実施例５で測定した、本発明によるＩＩＩ型コラーゲンの断片の測定と他の肝バイオマーカの相関を示す。
【図１０】図１０は、実施例６においてヒト血清試料に関して得た結果を示す。
【図１１】図１１は、ＣＲＰからのＮ末端ネオエピトープを認識するモノクローナル抗体の反応性を試験して得た結果を示す。
【図１２】図１２は、実施例８で測定したラット肝におけるコラーゲン蓄積を示す。
【図１３】図１３は、実施例８で得た免疫検定法の結果を示す。
【図１４】図１４は、肝コラーゲン含量と図１３の免疫検定法結果の相関を示す。
【図１５】図１５は、本発明による免疫検定法の結果と、実施例８におけるヒアルロン酸およびシリウスレッド染色の測定との比較を示す。
【図１６】図１６は、最初のパネルではシリウスレッド染色と本発明による免疫検定法からの結果の相関、および２番目のパネルではヒアルロン酸レベルとシリウスレッド染色との相関を示す。
【図１７】図１７は、本発明の免疫検定法の結果とヒアルロン酸レベルとの間に相関がないことを示す。
【図１８】図１８は、実施例９で述べる皮膚切片と皮膚の厚さの測定を示す。
【図１９】図１９は、実施例９における本発明に従った免疫検定法からの結果を示す。
【図２０】図２０は、パネルＡでは実施例９で得たウエスタンブロット像およびパネルＢでは本発明による対応する免疫検定法結果を示す。
【図２１】図２１は、免疫検定法の結果と皮膚厚さ測定との相関を示す。
【図２２】図２２は、実施例９で述べる尿の免疫検定法結果とウエスタンブロット測定との相関を示す。
【実施例】
【０１３９】
＜実施例１：ＭＭＰ−９で分解したＩＩＩ型コラーゲン＞
方法
切断：ヒト胎盤から単離したＩＩＩ型コラーゲンを１０ｍＭ酢酸に溶解した（１ｍｇ／ｍｌ）。次に混入断片を除去するためにタンパク質溶液をフィルター（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ＹＭ−１０）に通した。ＭＭＰ−９を酢酸４−アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ）で３７℃にて３時間予備活性化した。活性化後、ＩＩＩ型コラーゲンとＭＭＰ−９を１００：１で混合し、３７℃で３日間、振とうしながらインキュベートした。
【０１４０】
溶液を液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）によって分析し、Ｍａｓｃｏｔ検索を実施することによって断片を同定した。ペプチド配列を相同性検索によって選択し、他のタンパク質もしくは関連タンパク質に対する交差反応性、または種間交差反応性がないことを確実にした。
【０１４１】
抗体設計：ペプチド配列を合成し、オボアルブミン（ＯＶＡ）に結合した。マウスを２〜３週間ごとに５回まで免疫した。抗体価を、選択および非選択の両方のスクリーニングペプチドによって検査した。十分な抗体価が達成された場合、陽性マウスを融合のために選択し、安楽死させて、脾臓を分解し、Ｂ細胞を骨髄腫細胞との融合のために取り出した。抗体産生細胞の選択は、単細胞クローン中の生存キメラ細胞を培養し、再接種することによって実施した。ネオエピトープは小さな合成ペプチド配列によって生成され、これは天然タンパク質を反映しないことがあり得るので、クローンを選択および非選択ペプチドによって、次いで天然反応性試験によって選択する（図１）。ＩｇＧサブタイプクローンを抗体産生のために選択する。プロテインＧカラムによって抗体の精製を行う。
【０１４２】
アッセイの開発：最適抗体濃度を、抗体被覆およびスクリーニングペプチドの希釈液を用いて、競合ＥＬＩＳＡにおいてチェッカーボード解析によって決定する。ＭＭＰ−９（ＣＯ３）アッセイによる分解されたコラーゲンについての種々の測定を表２４に示す。
【０１４３】
【表３６】
0005978128.tif 000065
【０１４４】
＜実施例２：生物学的関連試料中のＣＯ３：偽手術ラットと比較した胆管結紮ラットにおけるＣＯ３レベル＞
方法：４０匹の雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（６ヶ月齢）をＮｏｒｄｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅの動物実験施設に収容した。実験は、デンマーク法務省の実験動物委員会（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄａｎｉｓｈ  Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｊｕｓｔｉｃｅ）によって承認され、臨床試験実施基準のヨーロッパ規格（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｆｏｒ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）（２００８／５６１−１４５０）に従って実施された。ラットを、敷き料および巣材（Ａｌｔｒｏｍｉｎ  １３２４；Ａｌｔｒｏｍｉｎ，Ｌａｇｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に標準的なＩＩＩ−Ｈ型ケージに１８〜２２℃で収容し、精製水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  ｓｙｓｔｅｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を自由に摂取させた。ラットを１２時間の明／暗周期の条件下で飼育した。
【０１４５】
肝線維症を総胆管結紮（ｃｏｍｍｏｎ  ＢＤＬ）によって誘発した。簡単に述べると、ラットを麻酔し、胆管を見つけ出して、胆管の周囲で２つの結紮を実施し、次いで結紮の間を切断して、腹部を閉じた。偽手術したラットでは、胆管結紮を行わずに腹部を閉じた。ラットを２つの群に分けた。第１群（ＢＤＬラット１０匹と偽手術ラット１０匹）は２週間後に犠死させ、第２群（ＢＤＬラット９匹と偽手術ラット１０匹）は４週間後に犠死させた。試験期間（２または４週間）の終了時に、少なくとも１４時間の絶食後、すべての生存動物をＣＯ２によって窒息させ、瀉血によって犠死させた。
【０１４６】
基線時および終了時に軽いＣＯ２／Ｏ２麻酔下で、少なくとも１４時間絶食させたラットの後眼窩洞から血液試料を採取した。血液を収集し、室温で３０分間放置して凝固させ、次いで１５００ｇで１０分間遠心分離した。血餅を取り除いた液体全部を新しい管に移し、再び１５００ｇで１０分間遠心分離した。次に血清を清浄な管に移し、−８０℃で保存した。ＣＯ３をラットからの５倍希釈血清試料中で測定した。偽手術とＢＤＬのレベルを、正規分布を仮定した統計的有意性のマン−ホイットニー両側ノンパラメトリック検定（α＝０．０５）によって比較した。ＣＯ３レベルは、偽手術動物と比較してＢＤＬ群において有意に高かった。結果を図２ａおよびｂに示す。
【０１４７】
＜実施例３：種々の線維性疾患におけるＣＯ３（ヒト血清）＞
ＣＯ３レベルを、３つの異なる線維性疾患（慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、強皮症およびＣ型ウイルス性肝炎（ＨＣＶ））を有するヒトからの血清中で測定した。血清試料はＳｅｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ（ＳＬＩ  Ｌｔｄ），ＵＫから入手した。ＣＯ３レベルは、３つの異なる線維性疾患において上昇していた（図３）。
【０１４８】
＜実施例４：抗体の開発−マーカＣＯ３−６１０Ｃの検出＞
ＩＩＩ型コラーゲン（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を活性化ＭＭＰ−９（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によってインビトロで２日間分解した。分解断片をＬＳ−ＭＳ／ＭＳによって配列決定し、ＭＡＳＣＯＴ検索によって同定した。特定ペプチド配列、６１０ＫＮＧＥＴＧＰＱを抗体作製のために選択した。この配列のＮ末端はヒトＩＩＩ型コラーゲンの残基６１０である。合成ペプチドをオボアルブミンに結合した後、４〜６週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスを乳化抗原約２００μＬおよびＣＯ３−６１０Ｃ（ＫＮＧＥＴＧＰＱＧＰＧＧＣ−ＯＶＡ）５０μｇにより皮下免疫した。安定な血清力価レベルに達するまで、フロイント不完全アジュバント中、２週間の間隔で連続免疫を実施した。２回目の免疫時からマウスを採血した。各採血時に、血清力価を測定し、最も高い抗血清力価を有するマウスを融合のために選択した。４回目の免疫後、このマウスを１ヶ月間休息させ、次に０．９％塩化ナトリウム溶液１００μＬ中のＣＯ３−６１０Ｃ  ５０μｇで３日間静脈内追加免疫した後、細胞融合のために脾臓を単離した。
【０１４９】
モノクローナル抗体産生クローンを、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａより購入した、ａ）免疫原性ペプチド：ＫＮＧＥＴＧＰＱＧＰ−ＧＧＣ−オボアルブミン（ＯＶＡ）（８０７６７８）、ｂ）スクリーニングペプチド：ＫＮＧＥＴＧＰＱＧＰ−ＰＧ−Ｋ−ビオチン（８０７９７１）、ｃ）非選択ペプチド：ＩＩ型コラーゲンα１鎖であるＫＤＧＥＴＧＡＡＧＰＰＧＫ−ビオチン（１１８３１８）、Ｉ型コラーゲンα１鎖の分解産物であるＫＤＧＥＡＧＡＱＧＰＰＧＫ−ビオチンを用いて選択した。ＥＬＩＳＡ被覆プレートはＮＵＮＣ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）より入手した。ペプチド結合試薬および緩衝液はＰｉｅｒｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）によって生産された。
【０１５０】
被覆ペプチドを溶解するために使用した緩衝液は以下のもので構成された：４０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１２Ｈ２Ｏ、７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１％ＢＳＡ、１０％ソルビトール、ｐＨ７。血清アッセイについては、以下の化学物質を含有する緩衝液を使用した：８ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１２Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３．７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１％ＢＳＡ、０．００３％フェノールレッド、ｐＨ７．４。尿のアッセイに使用した異なる緩衝液は、４００ｍＭのＴＲＩＺＭＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ＢＳＡ、０．３６％Ｂｒｏｎｉｄｏｘ  Ｌ５、ｐＨ８．０を含んだ。血清及び尿アッセイの両方について、２５ｍＭのＴＲＩＺＭＡ、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０３６％Ｂｒｏｎｉｄｏｘ  Ｌ５、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０から成る洗浄緩衝液、および０．１％Ｈ２ＳＯ４から成る反応停止緩衝液を使用した。アッセイ開発のために使用したＥＬＩＳＡプレートは、Ｒｏｃｈｅ（Ｈｖｉｄｏｖｒｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）からのストレプトアビジン被覆プレート、カタログ番号：１１９４０２７９であった。すべてのＥＬＩＳＡプレートをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ（ＣＡ．ＵＳＡ）からのＥＬＩＳＡリーダーで分析した。
【０１５１】
予備実験において、いくつかのチェッカーボード解析を実施することによって試薬、それらの濃度およびインキュベーション期間を最適化した。ストレプトアビジンで被覆した９６穴ＥＬＩＳＡプレートを、３００ｒｐｍで絶えず振とうすることによって２０℃で３０分間ＰＢＳ−ＴＢＥ緩衝液に溶解した５ｎｇ／ｍｌの合成ペプチド、ビオチニル化ＫＮＧＥＴＧＰＱＧＰでさらに被覆した。洗浄緩衝液で洗った後、試料２０μｌを添加し、次いでペルオキシダーゼ結合抗ヒトｍＡｂ−ＮＢ５１−３２  ＣＯ３−６１０Ｃ溶液（インキュベーション緩衝液中２３ｐｇ／ｍｌ）１００μｌを添加した。プレートを２０℃で１時間インキュベートし、その期間中３００ｒｐｍで振とうした。この後洗浄し、最後に、テトラメチルベンジリジン（ＴＭＢ）１００μｌ（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ、カタログ番号４３８ＯＨ）を加えて、プレートを暗所にて３００ｒｐｍで振とうしながら１５分間インキュベートした。反応を停止するため、停止溶液１００μｌを添加し、プレートを、６５０ｎｍを参照として用いて４５０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーにおいて分析した。
【０１５２】
血清アッセイについてはビオチニル化ＮＢ５１−３２  ＣＯ３−６１０Ｃおよび尿アッセイについてはビオチニル化ＮＢ５１−１３４  ＣＯ３−６１０Ｃの連続希釈によって標準曲線を作成した。標準濃度は、０、０．３３、１、３、９、２７、８１および１６２ｎｇ／ｍｌであった。
【０１５３】
配列ＫＮＧＥＴＧＰＱＧＰのＮ末端のアミノ酸Ｋは、ヒトＩＩＩ型コラーゲン配列のアミノ酸６１０であるので、このようにして得られた免疫検定法を用いて検出された断片をＣＯ３−６１０Ｃと称する。
【０１５４】
＜実施例５：ラットで誘発した肝線維症におけるＣＯ３−６１０Ｃと他のバイオマーカとの比較＞
試験動物
４０匹の６ヶ月齢の雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットをＮｏｒｄｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｏｐｅｎｈａｒｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋの動物実験施設に収容した。実験は、デンマーク法務省の実験動物委員会によって承認され、臨床試験実施基準のヨーロッパ規格（２００８／５６１−１４５０）に従って実施された。ラットを、敷き料および巣材（Ａｌｔｒｏｍｉｎ  １３２４；Ａｌｔｒｏｍｉｎ，Ｌａｇｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に標準的なＩＩＩ−Ｈ型ケージに１８〜２２℃で収容し、水を自由に摂取させた。ラットを１２時間の明／暗周期の条件下で飼育した。
【０１５５】
試験計画
２０匹のラットにおいて、肝線維症を総ＢＤＬによって誘発した。手術手順は無菌条件下で実施した。ラットを麻酔し、胆管の位置を特定して、２か所で結紮し、次いで結紮の間を切断して、腹部を閉じた。その他の２０匹のラットは偽手術に供し、胆管結紮を行わずに腹部を閉じた。次にラットを２つの群に分けた。第１群（ＢＤＬラット１０匹と偽手術ラット１０匹）は２週間後に犠死させ、第２群（ＢＤＬラット１０匹と偽手術ラット１０匹）は４週間後に犠死させた。試験期間（２または４週間）の終了時に、少なくとも１４時間の絶食後、すべての生存動物をＣＯ２によって窒息させ、瀉血によって犠死させた。
【０１５６】
採血
基線時および終了時に軽いＣＯ２／Ｏ２麻酔下で、少なくとも１４時間の絶食後にラットの後眼窩洞から血液試料を採取した。血液を室温で３０分間放置して凝固させ、次いで１５００ｇで１０分間遠心分離した。血餅を取り除いた液体全部を新鮮な管に移し、再び１５００ｇで１０分間遠心分離した。次に血清を清浄な管に移し、−８０℃で保存した。
【０１５７】
組織の取扱い
ラットを安楽死させた後、肝臓を慎重に切開し、計量して、４％ホルムアルデヒド中に少なくとも２４時間固定し、適切な切片に切断して、パラフィンに包埋した。５μｍの厚さの切片を切断し、スライドガラスに載せて、シリウスレッドで染色した。肝切片を、構造、炎症の存在、胆管の増殖および線維症の評価によって組織学的に評価した。実質中の新たな胆管形成を、以下の採点法を用いて半定量的に評価した：正常＝０、軽度の変化（１／３以下の罹患小葉）＝１、中等度の変化（１／３〜２／３の罹患小葉）＝２、および重度の変化（２／３以上の罹患小葉）＝３。４０倍および１００倍の倍率のＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ６０顕微鏡とＯｌｙｍｐｕｓ  ５０５０ズームデジタルカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用してデジタル写真を撮影した。
【０１５８】
総コラーゲンおよび血清ＣＴＸ−ＩＩの測定
市販のＱｕｉｃｋＺｙｍｅ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ａｓｓａｙ（ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して総コラーゲン濃度を検定した。市販のＲａｔ  ＣＴＸ−ＩＩキット（ＩＤＳ  Ｎｏｒｄｉｃ，Ｈｅｒｌｅｖ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用してＣＴＸ−ＩＩの濃度を検定した。すべての試料を２回重複して検定した。
【０１５９】
ＩＩＩ型コラーゲンのｍＲＮＡの定量化
肝組織試料中のＩＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ３ａ１）の転写産物の数を、蛍光レポータープローブを用いて定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって測定した。試料中のＣｏｌ３ａ１コピー数を、Ｃｏｌ３ａ１プラスミドｃＤＮＡ  Ｉｍａｇｅ  Ｃｌｏｎｅ  ７０９７０８１（Ｇｅｎｅｓｅｒｖｉｃｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を希釈標準品として使用して得た標準曲線から推定した。Ｃｏｌ３ａ１の量を、ハウスキーピング遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（Ｈｐｒｔ１）の量で基準化した。Ｃｏｌ３ａ１およびＨｐｒｔ１  ｍＲＮＡについてのプライマーおよびプローブは、それぞれＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０３２０８５．１およびＮＭ＿０１２５８３．２（ＴＩＢ  Ｍｏｌｂｉｏｌ  ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｍａｎｙ）を鋳型として用いて設計した。Ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従って使用して全ＲＮＡを凍結肝試料から抽出し、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてその品質をＲＮＡナノチップ中で評価した。ＲＮＡの単離後すぐに、１μｇのＲＮＡを鋳型として用いて、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。試験した各々の試料について、反応混合物から逆転写酵素を除いた、ｃＤＮＡ合成陰性対照を含めた。Ｃｏｌ３ａ１およびＨｐｒｔ１について別々のＰＣＲ反応を、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  Ｆａｓｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｐｌｕｓ  Ｈｙｂｐｒｏｂｅキット（Ｒｏｃｈｅ）を製造者の指示に従って使用して２０μＬ形式で実施した。リアルタイム蛍光データをＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ２．０装置（Ｒｏｃｈｅ）で収集した。
【０１６０】
抽出
組織をスチール製粉砕機中の過剰の液体窒素中で粉砕した。次に試料を１．５ｍｌエッペンドルフ管に移し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有する０．５Ｍ酢酸溶液中、４℃で一晩振とうした。次に試料を、６０％振幅の５パルスを用いて超音波で破砕し（Ｕ５０  ｃｏｎｔｒｏｌ、ＩＫＡ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ）、４℃でさらに２時間放置した後、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を慎重に取り出し、新しいエッペンドルフ管に移して、−８０℃で保存した。
【０１６１】
デンシトメトリー
Ｓｉｌｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ｇｉｖｅ  ｃｉｔｙ，ｃｏｕｎｔｒｙ）からのＵＮ−ＳＣＡＮ−ＩＴバージョン６．１を用いてデンシトメトリー測定を実施した。
【０１６２】
組織像分析
シリウスレッドで染色した組織学的切片を、Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍソフトウエアバージョン３．２．８．０（ｇｉｖｅ  ｃｉｔｙ，ｃｏｕｎｔｒｙ）を用いて分析した。Ｐｉｘｅｌｉｎｋ  ＰＬ−Ａ６２３Ｃ顕微鏡デジタルカメラを用いて画像を取得した。
【０１６３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法
組織抽出物２０μｇを、還元剤（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＮｕＰＡＧＥ、ＮＰ０００４）を含有する充填緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＬＤＳ  ４ｘ、ＮＰ０００７）と混合した。次に試料を４〜１２％ビス−トリス勾配ゲル（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＮＰ０３３２ＢＯＸ）に充填し、２００Ｖで５２分間泳動させた。その後ｉ−Ｂｌｏｔトランスファーシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてタンパク質をニトロセルロース膜に転写し、（？  Ｎｅｅｄ  ｔｏ  ｓｐｅｌｌ  ｏｕｔ？）ＴＴＢＳ中５％乳を用いて４℃で一晩ブロックした。βアクチン抗体（ＡｂＣａｍ  ａｂ８２２９，ｇｉｖｅ  ｃｏｍｐａｎｙ，ｃｉｔｙ  ｃｏｕｎｔｒｙ？）を充填対照として使用した。
【０１６４】
統計分析
平均値および平均の標準誤差（ＳＥＭ）を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて計算し、正規分布を仮定した統計的有意性のスチューデント両側ペアードｔ検定によって（α＝０．０５）、またはマン−ホイットニー両側ノンパラメトリック検定によって（α＝０．０５）比較した。相関係数（Ｒ２）および対応するｐ値を線形回帰によって決定した。
【０１６５】
結果
肝臓の外観：犠死の時点で、対照動物の肝臓は正常な全体形態を示したが、ＢＤＬ動物の肝臓は腫脹していた。肝重量は、偽手術対照と比較してＢＤＬラットでは有意に増大していた（犠死時の平均重量：手術後２週間目、偽手術では８．１ｇ；ＢＤＬでは１４．１ｇ；手術後４週間目、偽手術では９．０ｇ；ＢＤＬでは１９．４ｇ）（図４、パネルＡ）。０〜３等級を用いた肝切片の半定量的採点は、２週間目と比較して４週間目では肝臓の有意に大きな構造変化を示した（図４、パネルＢ）。図４、パネルＡは、胆管結紮（ＢＤＬ）ラットまたは偽手術ラットにおける肝重量を示す。データは平均＋ＳＥＭで示している。＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。パネルＢは、各群の肝臓における構造変化の採点を示す。データは平均＋ＳＥＭで示している。＊＊、Ｐ＝０．００９４。パネルＣは、手術後２週間目と４週間目の偽手術ラットおよびＢＤＬラットにおける肝構造を示すシリウスレッド顕微鏡写真を示す。門脈路の周囲の肝構造は、偽手術ラットと比較してＢＤＬラットでは明らかに破壊されている。コラーゲンを赤色で強調している。もとの倍率は４０倍であった。
【０１６６】
組織学的検査下で、偽手術動物の肝臓は線維症の徴候を示さず、顕微鏡的に正常であった（図４Ｃ）。ＢＤＬラットの肝臓では、著明な胆管増殖が観察された。手術後２週間目の群では、増殖は門脈路の周囲に位置したが、４週間目の群では増殖が広がっていた（図４Ｃ）。コラーゲン沈着が胆管構造の周囲で認められた。炎症はわずかであり、門脈路に限定された。細胞内胆汁うっ滞、胆管塞栓、胆汁梗塞または肝細胞ロゼット形成のいずれに関しても、胆汁うっ滞の徴候は見られなかった。
【０１６７】
ＣＯ３−６１０Ｃレベルの変化：図５は、パネルＡでは胆管結紮（ＢＤＬ）ラットまたは偽手術ラットにおけるＭＭＰ−９媒介性ＣＯ３分解の血清レベルを示す。データは平均＋平均の標準誤差として示している。手術後２週間目、＊＊＊Ｐ＜０．０００１および手術後４週間目、＊＊Ｐ＝０．００１４。パネルＢでは、ＣＯ３−６１０ＣのΔ値（終了時−基線時、ペアード）を示す。手術後２週間目、Ｐ＜０．０００１および手術後４週間目、Ｐ＝０．００１６。パネルＣでは、ＢＤＬラットおよび偽手術ラットにおけるＣＴＸ−ＩＩレベルを示す。データは平均＋平均の標準誤差として示している。
【０１６８】
ＢＤＬ群では、偽手術群と比較してＣＯ３−６１０Ｃレベルが有意に上昇していた（平均値：手術後２週間目の偽手術群３９．７ｎｇ／ｍｌ、ＢＤＬ群１００．３ｎｇ／ｍｌ；群間の平均上昇率は１５３％であった；手術後４週間目の偽手術群３９．７、ＢＤＬ群９２．６ｎｇ／ｍｌ；群間の平均上昇率は１３３％であった）（図５、パネルＡおよびＢ）。偽手術群では変化がなかった。ＩＩ型コラーゲン分解を示すＣＴＸ−ＩＩレベルは、偽手術群またはＢＤＬ群において変化しなかった（図５、パネルＣ）。
【０１６９】
ＩＩＩ型コラーゲン遺伝子発現：図６は、ＢＤＬまたは偽手術ラットにおけるＩＩＩ型コラーゲン遺伝子発現を示す。データは平均＋平均の標準誤差として示している；手術後２週間目、Ｐ＜０．０００１および手術後４週間目、Ｐ＝０．０００６。
【０１７０】
ＩＩＩ型コラーゲンａ１鎖のｍＲＮＡは、偽手術ラットと比較して両方のＢＤＬ群で有意に上昇していた。
【０１７１】
ウエスタンブロット法およびデンシトメトリー：図７は、Ａ）手術後２週間目と４週間目のウエスタンブロット法、およびＢ）デンシトメトリーによって定量化したウエスタンブロット法からのバンドによって評価したＢＤＬ群および偽手術群のラットの肝臓におけるＣＯ３−６１０Ｃの発現の変化を示す。
【０１７２】
ウエスタンブロット分析は、偽手術ラットにおいて非常に低いレベルのＣＯ３−６１０Ｃを示した（図７、パネルＡ）。手術後２週間目およびそれ以後はＣＯ３−６１０Ｃレベルが著しく上昇した（図７、パネルＡ）。結果をデンシトメトリー分析によって定量化した（図７、パネルＢ）。
【０１７３】
組織像分析：図８のパネルＡは、上の列ではシリウスレッドで染色したＢＤＬラットまたは偽手術ラットからの組織学的切片を示す。下の列は、肝臓における総コラーゲン含量（赤色）を定量するためにマスクされた組織学的切片を示す。パネルＢは、Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍソフトウエアによって定量化した総コラーゲンを示す−手術後２週間目、Ｐ＝０．００８１；手術後４週間目、Ｐ＝０．００４７。
【０１７４】
シリウスレッドで染色し、Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍソフトウエアを用いて増強した組織学的切片は、ＢＤＬ処置ラットにおいて経時的なコラーゲン含量の増加を示した（図８、パネルＡ）。コラーゲンを示すマスク中の赤色は、同じソフトウエアを用いて定量化されたものであり（図８、パネルＢ）、偽手術ラットと比較してＢＤＬ処置ラットにおける総コラーゲン含量の有意の増加を確認した（手術後２週間目、Ｐ＝０．００８１；手術後４週間目、Ｐ＝０．００４７）。
【０１７５】
相関：図９のパネルＡは、ＣＯ３−６１０Ｃに対するＣｏｌ３ａ１の相関がＲ２＝０．６９９３、Ｐ＜０．０００１で認められたことを示す。パネルＢでは、コラーゲン％に対するＣＯ３−６１０Ｃの相関がＲ２＝０．２２７８およびＰ＝０．００５０で認められた。パネルＣでは、コラーゲン％に対するＣｏ１３ａ１の相関がＲ２＝０．５４０９、Ｐ＜０．０００１で認められた。
【０１７６】
以下について相関が認められた：ＣＯ３−６１０Ｃに対するＣｏｌ３ａ１  ｍＲＮＡ  がＲ２＝０．６９９３およびＰ＜０．０００１で（図９Ａ）、ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍによって定量化されたコラーゲン％に対するＣＯ３−６１０ＣがＲ２＝０．２２７８およびＰ＝０．００５０で（図９Ｂ）、ならびにｖｉｓｉｏｐｈａｒｍによって定量化されたコラーゲン％に対するＣｏｌ３ａ１  ｍＲＮＡがＲ２＝０．５４０９およびＰ＜０．０００１で（図９Ｃ）。
【０１７７】
ＥＣＭリモデリングは組織の発生、維持および病因の総合プロセスである。正しく且つ最適な組織の方向づけと質のために、タンパク質分解活性は、細胞移動、損傷組織の除去および新しいタンパク質の分離のためのプロセスにおいて不可欠である（１０８：１０９）。特異的なマトリックス分解産物であるネオエピトープは、肝線維症のマトリックス代謝回転の新しい生化学的マーカの同定のためおよび線維症の病因を理解するために重要であると考えられる。現在のところ、線維症の病因におけるＥＣＭリモデリングの評価を可能にする使用可能な測定技術または生化学的マーカは存在しない。
【０１７８】
この実施例では、インビボ状況下でＣＯ３−６１０Ｃマーカを検討するため、６ヶ月齢のＢＤＬラットを選択した。前記ラットは、より若齢のラットに比べて低いコラーゲンリモデリングを有することが以前に示されていたからである。ラットは骨格的に成熟し、骨端軟骨板はほとんど休止していて、そのため全体的なコラーゲン代謝回転に寄与する度合がはるかに低い。これは、バイオマーカに対する感受性と特異性に影響を及ぼす。これらのラットは、定量的な組織学的分析および重量増加を伴う腫脹の両方によって評価されたように、明らかに肝線維症を示し、従ってこのモデルはＥＣＭリモデリングの証拠、特に血清中のＩＩＩ型コラーゲンの証拠を探索するために適切であった。
【０１７９】
本発明のデータは、ＭＭＰ−９媒介性ＩＩＩ型コラーゲン分解からのネオエピトープＣＯ３−６１０Ｃが肝線維症についての生化学的診断マーカであり、ＢＤＬ処置ラットでは偽手術ラットから１５３％までの血清中の平均上昇を有することを明らかに示す。
【０１８０】
ＣＯ３−６１０Ｃマーカの上昇についての生物学的な理論的根拠をさらに検討するため、健常肝臓と疾患肝臓からタンパク質抽出を行った。ウエスタンブロット法によって主要バンドを同定し、これが、疾患肝臓では豊富であるが、健常肝臓では豊富でないタンパク質断片であることを示唆した。これは、この新規マーカの病理学的正確さの証拠を提供する。
【０１８１】
肝臓の病的代謝回転像をさらに検討するため、ＩＩＩ型コラーゲンのｍＲＮＡを測定した。偽手術を受けたラットと比較してＢＤＬラットではｍＲＮＡの上昇を認め、これはこれまでの所見と一致する。これらのデータは、肝線維症が単なるＥＣＭタンパク質の蓄積だけではなく、組織形成と組織分解の両方が高度に上方調節される、加速された代謝回転状況でもあることを強く示唆する。組織形成は組織分解を上回り、経時的に瘢痕組織の蓄積を導く。これまでの研究者たちは、肝線維症を評価するために他のマトリックス代謝回転タンパク質を使用し、その１つはＩＩＩ型ラーゲン形成マーカであるＮ末端ＩＩＩ型プロコラーゲンであった。このマーカはＩＩＩ型コラーゲンの形成を示し、これまでの試験で肝線維症において上昇することが示されている。
【０１８２】
生化学的マーカＣＯ３−６１０Ｃの動力学をさらに理解するため、様々な相関関係を検討した。最も重要な点として、定量的組織学検査によって肝臓で測定された線維症の程度に対するＣＯ３−６１０Ｃの有意の相関が存在した。肝線維症のレベルはＩＩＩ型コラーゲンのｍＲＮＡの発現レベルに相関した。最後に、ＣＯ３−６１０Ｃは肝臓におけるＩＩＩ型コラーゲンのｍＲＮＡに相関した。合わせて考慮すると、肝臓における病的プロセスと全身性生化学的マーカＣＯ３−６１０Ｃのレベルには有意の相関が存在した。加えて、組織抽出は、循環レベルが局所的に生成されることの証拠を提供した。
【０１８３】
＜実施例６：ヒト血清試料に関するＥＬＩＳＡ＞
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）（ｎ＝５）、強皮症（ｎ＝５）、慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染症（ｎ＝５）を有する患者、および健常対照（ｎ＝５）からヒト血清試料を得た。ＣＯ３−６１０断片の濃度を測定するために血清試料をＣＯ３−６１０ＥＬＩＳＡにおいて試験した（上記実施例４参照）。結果を図１０に示す。健常被験者からの血清試料は３０ｎｇ／ｍｌ未満のＣＯ３−６１０Ｃ断片の濃度を有していたが、疾患被験者は循環中で高いレベルを有することが認められ、罹患線維症組織における大量の組織リモデリングを示唆した。
【０１８４】
＜実施例７：クローンｎｂ９４の反応性＞
マウスを、オボアルブミンに結合した合成ペプチドＫＡＦＶＦＰ（配列番号１１６７）（ＫＡＦＶＦＰＫＥＳＤ−ＧＧＣ−ＯＶＡ（配列番号１０４９））で免疫し、脾細胞を融合のために使用して、モノクローナル抗体を、ストレプトアビジンで前被覆したマイクロタイタープレートのウエル中に固定化したビオチニル化ＫＡＦＶＦＰ（配列番号１１６７）、すなわち（ＫＡＦＶＦＰＫＥＳＤ−ビオチン（配列番号１０４９））に対する反応性に関して試験した。ビオチニル化ＫＡＦＶＦＰＫＥＳＤ（配列番号１０４９）に結合する抗体をさらなる特徴づけのために選択し、前記抗体は、ＫＡＦＶＦＰＫＥＳＤ（配列番号１０４９）との共インキュベーションによって阻害され得るが、伸長ペプチドＲＫＡＦＶＦＰＫＥＳＤ（配列番号１１６６）によっては阻害されない。好ましいモノクローナル抗体をＮＢ９４−３７−１Ａ７と称した。
【０１８５】
競合ＥＬＩＳＡを使用して、基本的にストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートのウエル中に固定化したビオチニル化ＫＡＦＶＦＰＫＥＳＤ（配列番号１０４９）（０．１５ｎｇ／ｍｌで使用した）に関して上述したように、試料とモノクローナル抗体ＮＢ９４−３７−１Ａ７をインキュベートし（２０℃で９０分間）、次いで洗浄して、次にペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫グロブリンを添加した。競合のために以下の物質を２倍希釈で使用した：（１）合成ＫＡＦＶＦＰ（配列番号１１６７）ペプチド；（２）ＣＲＰに無関係なナンセンスペプチド（ＫＮＥＧＴＧ）；（３）ヒト血清試料のプール；（４）ＭＭＰ３で７日間タンパク質分解切断し、その後プロテアーゼ活性をブロックするためにＥＤＴＡを添加して停止させ、試験時まで−８０℃で保存したＣＲＰ；（５）（４）と同じであるがＭＭＰ３の代わりにＭＭＰ８を使用したＣＲＰ；（６）ＭＭＰ３の代わりにカテプシンＫ（およびカテプシンＫ活性をブロックするための阻害剤としてＥ６４）を使用した（２日間）ことを除いて（４）と同じＣＲＰ。
【０１８６】
データは、モノクローナル抗体ＮＢ９４−３７−１Ａ７が合成ペプチドＫＡＦＶＦＰＫＥＳＤ（配列番号１０４９）、ならびにＭＭＰ３およびＭＭＰ８で切断したＣＰＲと強く結合することを明らかにする。カテプシンＫによるＣＲＰの切断は、モノクローナル抗体ＮＢ９４−３７−１Ａ７によって認識される分析物の放出がより少ない。最後に、データは、抗体がヒト血清中のペプチド断片に結合することを示し、循環ペプチド断片中にこの配列が存在することを確認する。
【０１８７】
＜実施例８：生物学的関連試料中のＣＯ３：ラットの四塩化炭素（ＣＣｌ４）誘発性肝硬変におけるＣＯ３レベル＞
試験動物および肝硬変の誘発：
この試験は、線維症または肝硬変を有する５２匹の雄性Ｗｉｓｔａｒラットと３５匹の雄性Ｗｉｓｔａｒ対照ラットを含んだ。ラットに線維症または肝硬変を発症させるために、四塩化炭素（ＣＣｌ４）およびフェノバルビタール処置による誘発プログラムに３ヶ月齢の動物を含めた。ＣＣｌ４を吸入によって週に２回投与し、フェノバルビタール（０．３ｇ／ｌ）を飲料水に添加した。試験期間を通じて動物には水と飼料を自由に摂取させた。
【０１８８】
線維症の定量化：
肝切片（４μｍ）を飽和ピクリン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中の０．１％シリウスレッドＦ３Ｂ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。各動物につきシリウスレッド染色肝切片の３６視野を分析することによって相対的線維症面積（総肝面積のパーセンテージとして表す）を評価した。各々の視野を１０倍の倍率で取得した［Ｅ６００顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）およびＲＴ−Ｓｌｉｄｅｒ  ＳＰＯＴデジタルカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＭＩ）。結果をコンピュータ化Ｂｉｏｑｕａｎｔ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ形態計測システムを用いて分析した。相対的線維症面積を評価するため、測定されたコラーゲン面積を正味の視野面積で除して、次に１００を乗じた。総視野面積から血管内腔面積を差し引いて正味線維症面積の最終算定を得た。分析した各動物から、パーセンテージとしての線維症の量を測定し、平均値を提示した。
【０１８９】
線維症／肝硬変病期による群の分類：
動物を線維症および肝硬変の４つの異なる病期に分類し（Ａ群：中等度の線維症、Ｂ群：進行した線維症、Ｃ群：中等度の肝硬変、およびＤ群：進行した肝硬変）、この分類は、シリウスレッド陽性肝面積のパーセンテージによって決定した（Ａ群：＜５％、Ｂ群：５〜１０％、Ｃ群：１０〜１５％およびＤ群：＞１５％）。このために、対照ラットと線維症／肝硬変ラットを、ＣＣｌ４処置の間の４つの異なる時点：肝硬変誘発プログラムの開始後８、１２、１６および２０週間目を考慮して検討した。
【０１９０】
ヒアルロン酸測定：
サンドイッチＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）を用いて血清ヒアルロナンを測定した。
【０１９１】
統計：
結果の統計分析は、適切な場合は不対スチューデントｔ検定によって実施した。データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表し、０．０５以下のｐ値を有意とみなした。
【０１９２】
試験計画：
このプロトコールに含めた動物を以下の群の１つに無作為に割り当てた。Ａ／８週間のＣＣｌ４処置、Ｂ／１２週間のＣＣｌ４処置、Ｃ／１６週間のＣＣｌ４処置およびＤ／２０週間のＣＣｌ４処置。並行して、４つの対照群を同じ時点で検討した。１３匹の線維症ラットと７匹に対照ラットを各々の群に含めた。試験終了時に、３日間の適応地期間中ラットを標準的な代謝ケージ（Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ，Ｈｏｈｅｎｐｅｉｓｓｅｎｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に入れ、その後２４時間の尿収集を実施した。尿量を重量測定で決定した。適応期間中、ラットに水道水と飼料を自由に摂取させた。次に、２４時間の尿試料を２，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１０のポリプロピレンチューブに分取した（各々４００μＬ）。尿試料をその後の分析のために−８０℃で保存した。
【０１９３】
予定されていた剖検時に、ラットを計量し、ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｌ）で麻酔して、断頭した。血液を採取し、室温で２０分間放置して凝固させ、その後２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。血清をポリプロピレンチューブにアリコートとして収集し（各々４００μＬ）、ドライアイスを介して−８０℃の冷凍庫に移した。ＣＣｌ４処置の開始時の基線血液試料の収集は、感染の危険性を上昇させ得るおよび／または誘発される病態生理学的プロセスの進行に支障をきたす可能性がある実験モデルの変化を導入し得る、付加的な介入処置を回避するため、考慮しなかった。組織学的検査およびシリウスレッド染色のために、肝臓の左葉の半分を１０％中性緩衝ホルマリン中に１６時間入れ、パラフィンに包埋して、４μｍ厚さの切片に切断した。肝線維症の定量化後、使用しなかったパラフィンブロック材料をバイオマーカ定量化のために保存した。左葉の他の半分は液体窒素中で急速冷凍し、ウエスタンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲまたは免疫組織化学分析のために保存した。肝線維症面積、血清および尿重量オスモル濃度、Ｎａ＋およびＫ＋、アルブミン、クレアチニン、アラニンアミノトランスフェラーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼの測定を試験材料および方法の章に従って実施した。
【０１９４】
結果：
モデルの組織学的有効性確認：
肝コラーゲンを、肝切片のシリウスレッド染色によってすべての試験動物において定量した。各動物についての最終データを、３６の連続する顕微鏡視野で観察されたレッド染色の平均として収集した（図１２）。
【０１９５】
図１２は、四塩化炭素でそれぞれ８週間および２０週間処置したラットＮｏ．１（左側）およびラットＮｏ．４３（右側）の肝臓におけるコラーゲン蓄積を定量するために使用した３６の画像の２セットからの代表的写真を示す。
【０１９６】
血清ＣＯ３マーカは、対照ラットと比較して線維症および肝硬変ラットの両方において統計的に有意の上昇を示す。動物を、線維症を定量するために使用した肝臓の完全自動化シリウスレッド染色手順に従って分類した（図１３および１４）。
【０１９７】
図１３は、Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｃｌｉｎｉｃ（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ）において実施されたＣＣｌ４吸入ラットおよび対照ラットにおける血清ＣＯ３レベルを示す。各々の点は１匹の動物を表す。ラットを、線維症を定量するために使用した肝臓のシリウスレッド染色のコンピュータ画像解析に従って分類した。
【０１９８】
血清ＣＯ３および肝臓のシリウスレッド染色の定量値を各々の動物において検討した場合、２つの変数の間で統計的に有意の相関を認めた（Ｒ２＝０．４０８７；ｎ＝２１）（図１４）。
【０１９９】
ＣＯ３−６１０Ｃのレベルを肝線維症の血清学的指標であるヒアルロン酸（ＨＡ）と比較した。ＨＡレベルを市販のＥＬＩＳＡキットで定量し、結果は、肝硬変ラットと線維症動物におけるこのＥＣＭ成分の有意の上昇を示す（図１５および１６）。
【０２００】
シリウスレッドに対するＣＯ３の相関はＨＡの相関を上回った。肝線維症の組織学的定量化における変動の７０％以上がＣＯ３の血清学的測定によって説明できる。残りの３０％は未知の変数または固有の変動性によるものである。これに対し、ヒアルロン酸の測定によっては肝線維症の２５％しか説明できない（図１５）。
【０２０１】
これまでの結果から予想されたように、ＣＯ３とヒアルロン酸の間で相関は認められず、それらが肝線維症の発症における２つの独立した病態生理学的プロセスの結果であることを示唆した（図１７）。
【０２０２】
実施例９：マウスにおけるブレオマイシン誘発性皮膚線維症
マウスをＰＢＳまたはブレオマイシンの皮膚への適用によって処置した。ＭＭＰ−９媒介性ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＯ３）分解断片ＣＯ３−６１０Ｃの尿中レベルの上昇は、マウスにおける皮膚線維症の進行と関連した。
【０２０３】
図１８は、処置の８週間目のＰＢＳ処置ラットからの皮膚切片（パネルＡ）および処置の８週間目のブレオマイシン処置ラットからの皮膚切片（パネルＢ）を示す。２週間（Ｐ＝０．００２９）、４週間（Ｐ＝０．０００４）、６週間（Ｐ＜０．０００１）および８週間（Ｐ＜０．０００１）にわたってＰＢＳ（ｎ＝７／時点）およびブレオマイシン（ｎ＝１３／時点）で処置したマウスの間での皮膚厚さの増大をパネルＣおよびＤにプロットしている。全体的な皮膚厚さは、試験期間中、ＰＢＳ（ｎ＝２８）およびブレオマイシン（ｎ＝５２）処置マウスの間で増大する（Ｐ＜０．０００１）。皮膚幅は、写真をサンプリングする代わりに皮膚切片当たりの全体的な数としてＶｉｓｉｏｐｈａｒｍソフトウエアによって計算した。
【０２０４】
図１９は、試験の時点全体を通して有意の上昇を明らかにする、ＣＯ３−６１０Ｃ尿アッセイの結果を示す。この図は、各時点についての結果（終了時点についてＰＢＳ処置ｎ＝７、ブレオマイシン処置ｎ＝１３）およびすべての時点についての集合的なＣＯ３−６１０Ｃレベル（ＰＢＳ処置マウスｎ＝２８およびブレオマイシン処置マウスｎ＝５２）を示す。２週間、Ｐ＝０．０００８、４週間、Ｐ＜０．０００１、６週間、Ｐ＜０．０００１、８週間、Ｐ＜０．０００１および全体、Ｐ＜０．０００１。
【０２０５】
図２０は、２週間および８週間の処置後の対照ＣとブレオマイシンＢに関するＣＯ３−６１０Ｃウエスタンブロット像を示す（パネルＡ）。すべての時点についてのＣＯ３−６１０デンシトメトリー測定（終了時点についてＰＢＳ処置ｎ＝７、ブレオマイシン処置ｎ＝１３）および集合的ＣＯ３−６１０レベル（ＰＢＳ処置マウスｎ＝２８およびブレオマイシン処置マウスｎ＝５２）をパネルＢに示し、ＣＯ３−６１０レベルの統計的に有意の上昇（Ｐ＜０．０００１）を明らかにする。
【０２０６】
図２１に認められるように、尿アッセイにおけるＣＯ３−６１０レベルは皮膚厚さの進行、従って総コラーゲン沈着と相関することが認められた。ｒ＝０．４８８３、Ｒ２＝０．２３８４。
【０２０７】
図２２に認められるように、統計的に有意の相関がＣＯ３−６１０  ＥＬＩＳＡ尿アッセイとウエスタンブロットデンシトメトリー測定の間で認められた（ｒ＝０．６５２８、Ｐ＜０．０００１）。
【０２０８】
本明細書において、明白に指示されない限り、「または」の語は、記述される状態のいずれかまたは両方を満たす場合、真値を返す演算子（ｏｐｅｒａｔｏｒ）の意味で使用され、これに対し演算子「排他的にまたは」は状態の１つだけを満たすことが求められる。「含む」という語は、「から成る」を意味するのではなく「包含する」の意味で使用される。上記で認識したすべての先行教示は参照により本明細書に組み込まれる。本明細書におけるいかなる先行公表文献の認識も、その教示がその日現在、オーストラリアまたは別の場所での共通の一般的知識であったことの承認または表明であると解釈されるべきではない。
【０２０９】
［文献リスト］
【表３７Ａ】
0005978128.tif 000066
【表３７Ｂ】
0005978128.tif 000067
【表３７Ｃ】
0005978128.tif 000068
【表３７Ｄ】
0005978128.tif 000069
【表３７Ｅ】
0005978128.tif 000070
【表３７Ｆ】
0005978128.tif 000071
【表３７Ｇ】
0005978128.tif 000072
【表３７Ｈ】
0005978128.tif 000073
【表３７Ｉ】
0005978128.tif 000074
【表３７Ｊ】
0005978128.tif 000075
【表３７Ｋ】
0005978128.tif 000076
【図１】
0005978128.tif 000077
【図２ａ】
0005978128.tif 000078
【図２ｂ】
0005978128.tif 000079
【図３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１２】
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【図１８】
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【図２０】
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【配列表】
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