(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物におけるストレス応答を改善する方法であって、種子もしくは植物の一部またはそれらの部位を、０．０１グラム／ヘクタール〜１０．０グラム／ヘクタール乾重量の間の割合で、組成物と接触させるステップであって、前記組成物が、
ａ．縮合芳香族化合物、リグニンおよびタンニンおよび／または縮合型タンニンの混合物、
ｂ．０．５を超える前記組成物の酸素対炭素比、
ｃ．質量分析による測定で、０．５〜１．４の水素対炭素比および０．７未満の芳香族性指数を有する２００の数を超えるタンニン化合物、および
ｄ．質量分析による測定で、５５〜６０％のリグニン化合物、２７〜３５％のタンニン化合物および８〜１５％の縮合芳香族化合物である質量分布
を特徴とする溶存有機物の農業上許容可能な複合混合物を含むステップと、
環境ストレスに暴露された前記植物の前記環境ストレス応答を改善するステップとを含み、
前記環境ストレスが乾燥、塩分、弱光、湛水、病気、有害生物および温度から選ばれる少なくとも一である方法。
【請求項２】
前記組成物が、ＷＲＫＹエレメント、エチレン応答性エレメント、ＡＢＡレプレッサー、塩耐性ジンクフィンガーモチーフ、強光応答性エレメント、推定上の疾患耐性遺伝子、推定上のキチナーゼタンパク質、カルシウムイオン結合タンパク質、亜鉛イオン結合タンパク質、リン酸誘導性タンパク質、ＡＢＣ輸送体ファミリータンパク質、陽イオン／水素交換体、糖脂質輸送体遺伝子、カルモジュリン関連タンパク質、プロテインキナーゼ／糖結合、プロテアーゼ阻害剤遺伝子、ペクチンエステラーゼファミリータンパク質、オキシドレダクターゼ、膜貫通型受容体遺伝子、熱ショックタンパク質遺伝子または老化関連タンパク質から選択される少なくとも１種の植物遺伝子をダウンレギュレートする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物が、植物調節因子産生もしくは応答、オーキシン応答性ファミリータンパク質、ジベレリン２０オキシダーゼ遺伝子、アミノ酸トランスポーター、炭水化物トランスポーター、プリントランスポーターをコードする遺伝子、酵素をコードする遺伝子、防御関連遺伝子、転写因子もしくは転写調節因子をコードする遺伝子またはＡＴＰアーゼ／イオン移動をコードする遺伝子から選択される少なくとも１種の植物遺伝子をアップレギュレートする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が、転写因子をコードする遺伝子、酵素、プロテインキナーゼまたは加水分解酵素をコードする遺伝子から選択される少なくとも１種の植物遺伝子をアップレギュレートする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物が、植物調節因子産生もしくは応答、オーキシン応答性ファミリータンパク質、ジベレリン２０オキシダーゼ遺伝子、アミノ酸トランスポーター、炭水化物トランスポーター、プリントランスポーターをコードする遺伝子、酵素をコードする遺伝子、防御関連遺伝子、転写因子もしくは転写調節因子をコードする遺伝子またはＡＴＰアーゼ／イオン移動をコードする遺伝子から選択される少なくとも１種の植物遺伝子をアップレギュレートし、かつ、転写因子、転写調節因子、成長、防御、代謝またはイオン輸送から選択される少なくとも１種の植物遺伝子をダウンレギュレートする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
植物種の少なくとも１種の遺伝子を調節する方法であって、植物の一部またはその部位を、０．０１グラム／ヘクタール〜１０．０グラム／ヘクタール乾重量の間の割合で、組成物と接触させるステップを含み、前記組成物が、
ａ．縮合芳香族化合物、リグニンおよびタンニンおよび／または縮合型タンニンの混合物、
ｂ．０．５を超える前記組成物の酸素対炭素比、
ｃ．質量分析による測定で、０．５〜１．４の水素対炭素比および０．７未満の芳香族性指数を有する２００の数を超えるタンニン化合物、および
ｄ．質量分析による測定で、５５〜６０％のリグニン化合物、２７〜３５％のタンニン化合物および８〜１５％の縮合芳香族化合物である質量分布
を特徴とする溶存有機物の農業上許容可能な複合混合物を含み、
前記少なくとも１種の遺伝子が、成長、防御、代謝またはイオン輸送と関連する植物の機能を調節する方法。
【請求項７】
前記少なくとも１種の遺伝子が、転写因子をコードする遺伝子、酵素、プロテインキナーゼまたは加水分解酵素をコードする植物遺伝子から選択される少なくとも１種の植物遺伝子を調節する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が、縮合芳香族化合物、リグニンおよびタンニンおよび／または縮合型タンニンの混合物を含み、質量分析による測定で、前記組成物の化合物の全割合の少なくとも１０％が、タンニンおよび／または縮合型タンニンであることを特徴とする、請求項１、５および６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が、縮合芳香族化合物、リグニンおよびタンニンおよび／または縮合型タンニンの混合物を含み、質量分析による測定で、前記組成物の化合物の全割合の少なくとも２０％が、タンニンおよび／または縮合型タンニンであることを特徴とする、請求項１または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
環境ストレス低減の前記改善が、前記組成物を用いて処理されていない同様の植物種と比較した、前記環境ストレスが低減または中断された後の前記植物の農学的回復の改善を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記環境ストレスが乾燥である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記環境ストレスが塩である、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物においてストレス耐性を改善するための組成物に関する。具体的には、本方法は、植物の一部またはその部位を、部分的に腐植化されている天然有機物を特徴とする溶存有機物の農業上許容可能な複合混合物を含む組成物と接触させることを含む。
【背景技術】
【０００２】
肥料添加物として、有機化合物の様々な混合物が当技術分野で提案されている。具体的には、フミン酸組成物、Ｂｉｏ−Ｌｉｑｕｉｄ複合体（商標）が、土壌から植物への微量栄養素、より詳しくは、陽イオン栄養素の移動を補助すると、Ｂｉｏ  Ａｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（１９９９）ｗｗｗ．ｐｈｅｌｐｓｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｏｒｔｆｏｌｉｏ／ｈｕｍｉｃ＿ａｃｉｄ．ｐｄｆによって記載されている。
【０００３】
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｇｒｉｔｅｃｈ製のＴｒｉＦｌｅｘ（商標）Ｂｌｏｏｍ  Ｆｏｒｍｕｌａ栄養組成物は、「リン酸、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、ケイ酸カリウム（および）ケイ酸ナトリウム」を含有すると記載されている。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｇｒｉｔｅｃｈ製のＴｒｉＦｌｅｘ（商標）Ｇｒｏｗ  Ｆｏｒｍｕｌａ２−４−１栄養組成物は、「硝酸カリウム、硝酸マグネシウム、硝酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、ケイ酸カリウム、およびケイ酸ナトリウム」を含有すると記載されている。両組成物とも、「選択されたビタミン、植物組織培養成分、必須アミノ酸、海藻、フミン酸、フルボ酸および炭水化物で強化されている」といわれている。ｗｗｗ．ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ＿ｉｎｆｏ．ｐｈｐ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ＿ｉｄ／８２参照のこと。これらの製品は、主に、果実作物および花卉作物の「土壌を用いないハイドロガーデニング」（すなわち、水耕栽培）のために処方されているといわれているが、コンテナ土壌ガーデンにおける従来の化学肥料よりも優れるともいわれている。水耕成長培地または土壌成長培地への適用とは対照的に、葉面適用に対するその適合性または不適合性が記載されていない。ｗｗｗ．ａｍｅｒｉｃａｎａｇｒｉｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｐｒｏｄｕｃｔ＿ｄｅｔａｉｌ．ａｓｐ？ＩＤ＝  Ｉ  ＆ｐｒｏ  ＿ｉｄ＿ｐｋ＝４−０参照のこと。
【０００４】
Ａｃｔａｇｒｏ，ＬＬＣによって所有されている商標Ｍｏｎａｒｃｈ（商標）は、天然有機物由来の植物の栄養にならない有機組成物を３％含む２−２０−１５の主要植物栄養素を含有する肥料組成物である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
植物全般は、例えば、乾燥、塩分、弱光、湛水、病気、有害生物および温度を含む様々な環境ストレスに対して感受性である。従来の栄養的な植物の処理は、概して、環境ストレスに対して耐性を有する植物を提供できないか、提供する能力が無く、したがって、他の健康な植物またはよく育つ植物に利益を提供することに限定される。しかし、商業的な農学的プロセスは、植物のストレスを低減するための、または一般的な環境ストレスに抵抗する植物の能力および／もしくはこのようなストレスから迅速に回復する植物の能力を増強するためのさらなる植物の処理を必要とする。一般的な環境ストレスの代表的な例として、水のない連続期間（乾燥）、塩水に対する暴露、洪水、長い暗期および温度変動／霜が挙げられる。このようなストレスに対する暴露の結果、一般に、収量が不十分であったり、なくなったりするが、根の成長の低減ならびに／または葉の成長もしくは葉の数の低減ならびに／または茎の重量および／強度の低減ならびに／または果実の大きさおよび／もしくは重量および／もしくは栄養価の低減を示す場合もある。植物は、このようなストレスに対していくつかの自然防御を有し得るが、農学的生産を最大にすることを可能にするために、このようなストレスに応答し、および／または回復する増強された能力を植物に提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
環境ストレスに応答し、および／または回復して、農学的生産を最大にすることを可能にするように、植物に増強されたストレス抵抗能を提供する組成物（以下、「ＣＰ」ともいう。ＣＡＳ登録番号１１７５００６−５６−０）。開示される組成物は、一般的な環境ストレスに対する植物の応答を改善および／または増強する植物における遺伝子調節を提供する。この遺伝子調節は、その他の機序の中でも、転写因子の調節を含む。ストレス条件に先立つ、ストレス条件の間の、またはストレス条件のすぐ後の植物へのＣＰの適用は、ストレスに抵抗し、および／またはストレスから農学的に回復する植物の能力を、ＣＰを用いて処理されていない類似の状態にある植物と比較して改善する。
【０００７】
温室および野外の実験によって、ＣＰが植物の成長および発達を促進して、作物収量を増大し得ることが実証されている。生理学的研究によって、本明細書に開示される組成物は、栄養素の利用能および植物内での移動性の改善を提供することが示される。さらに、ＣＰは、植物ホルモンの合成もしくは利用能を増強し、および／またはＣＰは、これらの植物ホルモンのうちの一部との相乗作用を有する。分子レベルでは、植物成長活性および発達活性は、遺伝子および遺伝子発現によって制御され、かつ／または影響を受ける。ＣＰは、植物の成長、発達、ストレス抵抗性および／または病気耐性に関与する重要な遺伝子の発現を誘発または変更することによって作用すると思われる。
【発明の効果】
【０００８】
植物遺伝子発現に対する上記の組成物の強力な効果は、農業、園芸および造園におけるこれらの製品の広範な適用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の根形成に対するＣＰ組成物適用の効果を、対照と対比して表す写真である。
【図２】アラビドプシスの成長に対するＣＰ組成物適用の効果を、通常条件下の対照と対比して表す写真である。
【図３】アラビドプシスの成長および発達に対する塩分ストレス後のＣＰ組成物適用の効果を、対照と対比して表す写真である。
【図４】アラビドプシスの成長に対する塩分ストレス前のＣＰ組成物適用の効果を、対照と対比して表す写真である。
【図５】アラビドプシス乾燥抵抗性に対するＣＰ組成物適用の効果を、対照と対比して表す写真である。
【図６】ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒによって決定されるＲＮＡ調製物の品質を示す図である。
【図７】対照と対比した、ＣＰ適用後のアラビドプシスのゲノム規模での発現プロフィールを示す図である。
【図８】対照と対比して、ＣＰ適用後、ｐ値≦０．０１で、発現レベルが１．５倍以上変化したアラビドプシス遺伝子の遺伝子発現プロフィールを示す図である。
【図９】対照と対比して、ＣＰ適用後、ｐ値≦０．０１で、発現レベルが１．５倍以上変化したアラビドプシス遺伝子のボルケーノプロットを示す図である。
【図１０】対照と比較した、ＣＰ調節されたアラビドプシス遺伝子のヒートマップを示す図である。
【図１１】対照と対比して、ＣＰ１０００適用後、ｐ値≦０．０１で、発現レベルが１．５倍以上変化したアラビドプシス遺伝子の遺伝子発現プロフィールを示す図である。
【図１２】対照と対比して、ＣＰ１０００適用後、ｐ値≦０．０１で、発現レベルが１．５倍以上変化したアラビドプシス遺伝子のボルケーノプロットを示す図である。
【図１３】対照と比較した、ＣＰ１０００で調節されたアラビドプシス遺伝子のヒートマップを示す図である。
【図１４】対照と対比した、アラビドプシスの乾燥耐性に対するＣＰ組成物適用の効果のグラフである。
【図１５】対照と対比した、アラビドプシスの塩分耐性に対するＣＰ組成物適用の効果のグラフである。
【図１６】対照と対比した、アラビドプシスの萎れ乾燥耐性(wilting drought tolerance)に対するＣＰ組成物適用の効果のグラフおよび写真である。
【図１７】対照と対比した、ＣＰ組成物処理後のアラビドプシス遺伝子分析の概略図である。
【図１８】ＣＰ組成物によりアップレギュレートされた共通のアラビドプシス遺伝子の概略図である。
【図１９】ＣＰ組成物によりダウンレギュレートされた共通のアラビドプシス遺伝子の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［物質および方法］
本明細書に開示される組成物は、天然有機物が豊富な供給源から水溶液中に単離および抽出された有機分子の混合物を含む。天然有機物は、主として、土壌環境において経時的に様々な程度に改変されている植物物質に由来する。植物物質の中には、最近、環境中に堆積されたものもある。天然有機物の少なくとも一部は、腐植化の部分的プロセスを通過して、部分的に腐植化されている天然有機物となっている。腐植化は、微生物、真菌、および／もしくは環境（熱、圧力、日光、電光、炎など）による天然有機物の分解ならびに／または酸化を含む。最も好ましくは、ＣＰは、大きく腐植化を受けなかった天然有機物（部分的に腐植化されている天然有機物）を含有する。一態様では、天然有機物は、通常、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、１５ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、２５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、３５ｐｐｍ、４０ｐｐｍ、４５ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、５５ｐｐｍ、６０ｐｐｍ、６５ｐｐｍ、７０ｐｐｍ、７５ｐｐｍ、８０ｐｐｍ、８５ｐｐｍ、９０ｐｐｍ、９５ｐｐｍ、１００ｐｐｍまたは５００ｐｐｍまでの溶存有機物（ＤＯＭ）を含有または提供する環境から得られる。その他の態様では、天然有機物は、通常、約５００ｐｐｍ、１０００ｐｐｍ、１５００ｐｐｍ、２０００ｐｐｍ、２５００ｐｐｍ、３０００ｐｐｍ以上のＤＯＭを含有または提供する環境から得られる。
【００１１】
天然有機物は、極めて複雑であり、一般に、供給源および供給源について多く見られる環境条件に応じて、数千の化合物が存在する。フルボ酸（ＣＡＳ番号４７９−６６−３）およびフミン酸（ＣＡＳ番号１４１５−９３−６）などの腐植物質が、天然有機物に由来する有機複合体の例であるが、以下に詳述するように、ＣＰは、フルボ酸およびフミン酸とは化学的および生物学的に異なる独特なものである。
【００１２】
ＣＰは、溶存有機物を含有し、有機物は、上記のように、腐植化のプロセス、例えば、微生物、殺真菌、および／または環境（熱、圧力、日光、電光、炎など）による分解プロセスの際に形成される。その他の天然または合成の天然有機物分解プロセスが関与し得るか、または使用され得る。一態様では、ＣＰは、大きく腐植化を受けなかった天然有機物（例えば、部分的に腐植化されている天然有機物）を主に含有する。腐植化の量は、既知の方法を使用して、例えば、１３Ｃ  ＮＭＲによって決定し、特性決定してよい。
【００１３】
一態様では、ＣＰは、その元の供給源に対して約１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、１５００倍、２０００倍、２５００倍、３０００倍、３５００倍、４０００倍、４５００倍または約５０００倍の溶存有機物（ＤＯＭ）濃度レベルを有するＣＰ組成物を提供するように、その供給源から天然有機物を取り出すこと、場合により、加工することおよび／または濃縮することによって得られる。別の態様では、溶存有機物（ＤＯＭ）濃度レベルのＣＰ濃度は、約７５００倍、１０，０００倍、１５，０００倍、２０，０００倍、２５，０００倍および最大約５０，０００倍であり得る。ＣＰ組成物を、ＤＯＭの濃度が約１０ｐｐｍ〜約７００，０００ｐｐｍの間であるよう調整してもよい。好ましくは、ＣＰ組成物を、ＤＯＭの濃度が約１０００ｐｐｍ〜約５００，０００ｐｐｍの間であるよう調整してもよい。ＣＰ組成物を、水溶液中、５００ｐｐｍずつ増加した任意のｐｐｍ値（例えば、１０，５００ｐｐｍ、１１，０００ｐｐｍ、１１，５００ｐｐｍ、１２，０００ｐｐｍなど）を含む、１０００ｐｐｍと５０，０００ｐｐｍの間の任意のｐｐｍ値によって表されるＤＯＭ値に調整してもよい。その他のＤＯＭ濃度を使用してもよく、例えば、約７５，０００ｐｐｍと約７５０，０００ｐｐｍの間の極めて濃縮された組成物を調製してもよい。例えば、元の供給源の約３０，０００倍の濃縮物は、約５５０，０００ｐｐｍのＤＯＭを含有し得る。特定の態様では、ＣＰ組成物は、およそ約９１％〜約９９％の間の水であり、残りの有機物は、主に、微量のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩および遷移金属塩を含むＤＯＭである。さらにその他の態様では、ＣＰ組成物のＤＯＭは、水溶液を用いる再構成に適した形態に、乾燥または凍結乾燥されている。
【００１４】
ＣＰ組成物は、物質の複合混合物、典型的には、単一の構造式では事足りない、化合物の不均一な混合物を含有する。詳細な化学的および生化学的検査によって、ＣＰは、フミン酸およびフルボ酸と比較して、植物に対するその生物学的効果およびその化学組成の両方で独特な組成物であることが示されている。以下にさらに論じられるように、ＣＰ物質の元素的特性決定および分光学的特性決定によって、フミン酸およびフルボ酸などの、ほとんどのその他の腐植質をベースとする有機複合体とは区別される。物質の一貫性を提供し、天然由来物質の正常変動を補うために、ＣＰ組成物のブレンドを実施してもよい。
【００１５】
ＣＰ組成物は、種子、葉に、または植物の任意のその他の部分もしくはその部位に適用してもよい。ＣＰの適用割合は、土壌に適用され、または植物の葉もしくは部位への葉面適用として、約０．０１グラム／ヘクタール〜約１０．０グラム／ヘクタール乾重量の間、約０．２グラム／ヘクタール〜約２．０グラム／ヘクタール乾重量の間、０．３グラム／ヘクタール〜約１．５グラム／ヘクタール乾重量の間または約０．４グラム／ヘクタール〜約１．０グラム／ヘクタール乾重量の間であり得る。
【００１６】
［特性決定方法］
ＣＰを構成する有機化合物は、様々な方法で（例えば、分子量、種々の官能基間の炭素の分布、相対元素組成、アミノ酸含量、炭水化物含量などによって）特性決定できる。一態様では、ＣＰを、腐植質をベースとする物質の既知標準に対して特性決定した。
【００１７】
種々の官能基間の炭素分布の特性決定を目的として、適した技術として、１３Ｃ−ＮＭＲ、元素分析、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＦＴＩＣＲ−ＭＳ）およびフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＰおよび腐植物質標準の化学特性決定を、Ｈｕｆｆｍａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．およびワシントン大学（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）によって実施された、エレクトロスプレーイオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＥＳＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）およびＩＣＰ−ＡＥＳを使用する金属の元素分析を使用して実施した。
【００１８】
ＣＰの元素的、分子量的および分光学的な特性決定は、主に、リグニン化合物およびタンニン化合物（ならびに縮合型タンニンおよび非縮合型タンニンの混合物）、縮合芳香族化合物ならびに微量の脂質および無機物からなる有機複合体と一致する。数千の化合物が存在し、２２５〜７００ダルトンの範囲の分子量を有し、化合物の大部分は、分子あたり約１０〜約３９個の間の炭素原子を有する。ＣＰ組成物は、一般に、炭素、酸素および水素ならびに少量の窒素および硫黄から構成される。ＣＰ組成物はまた、カリウムおよび鉄も５％を上回るレベルで含有する。
【００１９】
通常、ＣＰ組成物中に存在する溶解固体の元素組成を、表Ａに示す。有機化合物が、無機元素から分離されている場合には、元素の内訳は、Ｃが５５％、Ｈが４％、Ｏが３８％、Ｎが１．８％およびＳが２．２％である。
【００２０】
【表１】
0005976543.tif 000002
【００２１】
分析によって、ＣＰ中に存在する有機化合物のクラスの中でも、概して、リグニンおよびタンニン（縮合型および非縮合型の混合物）、縮合芳香族化合物、未同定物質ならびに一部の脂質が存在することが明らかにされている。一態様では、ＣＰ組成物は、ＣＰ組成物中に存在する化合物の全割合の少なくとも１０％がタンニンおよび／または縮合型タンニンであることを特徴とする。別の態様では、ＣＰ組成物は、ＣＰ組成物中に存在する化合物の全割合の少なくとも１５％がタンニンおよび／または縮合型タンニンであることを特徴とする。別の態様では、ＣＰ組成物は、ＣＰ組成物中に存在する化合物の全割合の少なくとも２０％がタンニンおよび／または縮合型タンニンであることを特徴とする。これらのクラスの化合物の各々は、かなり狭いＭｗ範囲および炭素数／分子によって、さらに特性決定される。ＣＰの代表的なサンプリングについて、様々な化合物クラスの各々の数およびパーセンテージの内訳、そのＭＷおよび炭素原子／分子（炭素範囲）を、表Ｂ１に示す。
【００２２】
【表２】
0005976543.tif 000003
【００２３】
組成物の３種の異なる製造バッチの平均に基づく、第２の代表的なサンプリングの様々な化合物クラスの各々の数およびパーセンテージの内訳、そのＭＷおよび炭素原子／分子（炭素範囲）を、表Ｂ２に示す。
【００２４】
【表３】
0005976543.tif 000004
【００２５】
表Ｃは上記のクラスの定義において使用される酸素対炭素（Ｏ／Ｃ）および水素対炭素（Ｈ／Ｃ）比を要約する。一態様では、ＣＰ組成物は、質量分析による測定で、溶存有機物のＯ／Ｃ比が、約０．４を超えることを特徴とする。一態様では、ＣＰ組成物は、質量分析による測定で溶存有機物のＨ／Ｃ比が、約０．８を超えることを特徴とする。別の態様では、ＣＰ組成物は、質量分析による測定で、溶存有機物のＨ／Ｃ比が、約０．８５を超えることを特徴とする。
【００２６】
【表４】
0005976543.tif 000005
【００２７】
［ＣＰと腐植物質標準との比較］
腐植物質対ＣＰの、元素的および構造的な比較特性決定を実施した。国際腐植物質学会から得た３種の腐植物質標準、すなわちレオナルダイトフミン酸（ＬＨＡ）、パホキーピート(Pahokee Peat)フミン酸（ＰＰＨＡ）およびスワニーリバー(Suwannee River)フルボ酸ＩＩ（ＳＲＦＡ）を使用した。各腐植物質標準および各ＣＰサンプルを、ＦＴＩＲおよびＥＳＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳによって分析した。ＥＳＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ分析のためには、各腐植物質標準の一部をＮＨ４ＯＨ／水に溶解した。陽イオン交換樹脂（ＡＧ  ＭＰ−５０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いる分析のために、ＣＰの３種のサンプル（ＣＰ６０番、ＣＰ７５番およびＣＰ９９番）を調製した。陽イオン交換樹脂（ＡＧ  ＭＰ−５０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いる分析のために、組成物の３種のサンプル（ＣＰ１番、ＣＰ２番およびＣＰ３番）を調製した。腐植物質標準および組成物の各サンプルの比較を表Ｄに示す。
【００２８】
【表５】
0005976543.tif 000006
【００２９】
表Ｄは、腐植物質標準とＣＰサンプルの間には大きな相違があることを示す。例えば、Ｏ／Ｃ比は、腐植物質のすべてにおいて０．４未満であるが、ＣＰサンプルについては０．５を上回る。サンプルのＤＢＥはまた、フミン酸標準のものよりも大幅に低く、平均ＭＷはより大きい。
【００３０】
質量スペクトル分析に基づくと、ＣＰサンプル中に、腐植物質標準においては実質的に存在しないか、大幅に低減しているいくつかの化合物が存在する。特に、ＣＰの少なくとも１種の構成要素は、１種または複数のタンニン化合物と対応し得る。比較によって、腐植物質標準中には、％のタンニン化合物が少量で存在する。例えば、表Ｅに示されるように、フルボ酸標準およびフミン酸標準では、両標準は、ＣＰサンプルにおいて見られるタンニン％よりも少なくとも３倍〜４倍少ない。
【００３１】
【表６】
0005976543.tif 000007
【００３２】
ＩＨＳＳ標準およびＣＰサンプルのフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）スペクトルを比較すると、主に、１６００〜１８００ｃｍ−１の領域において類似性がある。両サンプルセットにおいて、本発明者らは、カルボキシル官能基に由来する１７００ｃｍ−１辺りでのＣ＝Ｏストレッチによる極めて強いピークおよびアルケンまたは芳香族化合物に由来するＣ＝Ｃ結合と一致する、１５９０〜１６３０領域におけるピークを見出す。しかし、７００〜１４５０ｃｍ−１の領域における大幅な相違が観察される。すべてのスペクトルにおいて１１６０〜１２１０でのピークは存在し、これは、アルコール、エーテル、エステルおよび酸のＣ−Ｏ結合に起因する。最大の相違は、ＣＰサンプル中の８７０ｃｍ−１でのピークであり、これは、ＩＨＳＳ標準中には存在しない。このピークは、アルケンおよび芳香族化合物のＣ−Ｈ結合によるものであり得る。
【００３３】
上記の化学的、元素的および構造的な特性決定に基づくと、ＣＰは、フミン酸およびフルボ酸またはそれらの組合せとは化学的および生化学的に異なる独特なものである。さらに、植物の健康、乾燥および塩ストレス耐性の改善に関する、ＣＰの遺伝子調節の性質および程度ならびに全体的な効果の結果として、ＣＰは、このようなストレス抵抗性活性および遺伝子調節特性が、質および量において一般的に欠けている既知のフミン酸組成物および／またはフルボ酸組成物およびその処理のものに対して独特である。ＣＰのその他の有益な植物機能特質は、存在し得るか、処理方法および／もしくはＣＰから得られる遺伝子調節に起因し得る。
【００３４】
特性決定データに基づいて、ＣＰは、比較的小さい分子または約３００〜約１８，０００ダルトンの分子量分布を有する超分子凝集物を含有し得る。有機分子の混合物から分画される有機物中に含まれるものとして、様々な腐植物質、有機酸および微生物の浸出物がある。この混合物は、脂肪族および芳香族の特徴の両方を有することが示されている。例示的に、炭素分布は、カルボニル基およびカルボキシル基に約３５％、芳香族基に約３０％、脂肪族基に約１８％、アセタール基に約７％、また、その他のヘテロ脂肪族基に約１２％を示す。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ＣＰ中の化合物の混合物は、約３００〜約３０，０００ダルトン、例えば、約３００〜約２５，０００ダルトン、約３００〜約２０，０００ダルトンまたは約３００〜約１８，０００ダルトンの分子量分布を有する有機分子または超分子凝集物を含む。
【００３６】
種々の官能基間の炭素分布を特性決定する際に、使用可能な適した技術として、１３Ｃ−ＮＭＲ、元素分析、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＦＴＩＣＲ−ＭＳ）およびフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
一態様では、カルボキシ基およびカルボニル基は、ＣＰの有機化合物の混合物中の炭素原子の約２５％〜約４０％、例えば、約３０％〜約３７％を、例示的には、約３５％を合計して占める。
【００３８】
別の態様では、芳香族基は、ＣＰの有機化合物の混合物中の炭素原子の約２０％〜約４５％、例えば、約２５％〜約４０％または約２７％〜約３５％、例示的には、約３０％を占める。
【００３９】
別の態様では、脂肪族基は、ＣＰの有機化合物の混合物中の炭素原子の約１０％〜約３０％、例えば、約１３％〜約２６％または約１５％〜約２２％、例示的には、約１８％を占める。
【００４０】
別の態様では、アセタールおよびその他のヘテロ脂肪族基は、ＣＰの有機化合物の混合物中の炭素原子の約１０％〜約３０％、例えば、約１３％〜約２６％または約１５％〜約２２％、例示的には、約１９％を占める。
【００４１】
別の態様では、芳香族対脂肪族炭素の比は、ＣＰでは、約２：３〜約４：１、例えば、約１：１〜約３：１または約３：２〜約２：１である。
【００４２】
特定の例示的態様では、ＣＰの有機化合物の混合物中の炭素分布は、以下のとおりである。カルボキシ基およびカルボニル基が約３５％、芳香族基が約３０％、脂肪族基が約１８％、アセタール基が約７％、およびその他のヘテロ脂肪族基が約１２％である。
【００４３】
ＣＰの有機化合物の元素組成は、一連の実施形態においては、独立に以下のとおりである。重量で、Ｃが約２８％〜約５５％、例示的に約３８％；Ｈが約３％〜約５％、例示的に約４％；Ｏが約３０％〜約５０％、例示的に約４０％；Ｎが約０．２％〜約３％、例示的に約１．５％；Ｓが約０．２％〜約４％、例示的に約２％である。ＣＰの有機化合物の元素組成は、別の一連の実施形態では、独立に以下のとおりである。重量で、Ｃが約４５％〜約５５％、例示的に約５０％；Ｈが約３％〜約５％、例示的に約４％、Ｏが約４０％〜約５０％、例示的に約４５％；Ｎが約０．２％〜約１％、例示的に約０．５％；Ｓが約０．２％〜約０．７％、例示的に約０．４％である。
【００４４】
特定の例示的態様では、元素分布は、重量で、Ｃが約３８％；Ｈが約４％；Ｏが約４０％；Ｎが約１．５％およびＳが約２％である。残余は、主に、ＣＰ中の無機イオン、主として、カリウムおよび鉄からなる。別の特定の例示的態様では、元素分布は、重量で、ＣＰ中、Ｃが約５０％；Ｈが約４％；Ｏが約４５％；Ｎが約０．５％およびＳが約０．４％である。
【００４５】
様々な態様において、ＣＰ中に存在し得る有機化合物のクラスの中には、アミノ酸、炭水化物（単糖類、二糖類および多糖類）、糖アルコール、カルボニル化合物、ポリアミン、脂質およびそれらの混合物がある。これらの特定の化合物は、通常、微量、例えば、化合物の全割合の５％未満で存在する。存在し得るアミノ酸の例として、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、セリン、トレオニン、チロシンおよびバリンが挙げられる。存在し得る単糖および二糖の例として、限定するものではないが、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、アラビノース、リボースおよびキシロースが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
上記の化学的、元素的および構造的な特性決定に基づくと、ＣＰは、フミン酸およびフルボ酸またはそれらの組合せとは化学的および生物学的に異なる独特なものである。さらに、植物の健康、乾燥および塩分ストレス耐性の改善に関するＣＰの遺伝子調節の性質および程度ならびに全体的な効果の結果として、概して、ＣＰは、このような活性および特性が質および量において一般に欠けている既知のフミン酸組成物および／またはフルボ酸組成物および処理に対して独特であると考えられる。ＣＰのその他の有益な植物機能特質は、存在し得るか、処理方法および／もしくはＣＰから得られる遺伝子調節に起因し得る。
【００４７】
有機化合物の適した混合物は、例えば、多くの構成要素の１種として、Ｆｌｏｒａｔｉｎｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（ＦＢＳ）のＣａｒｂｏｎ  Ｂｏｏｓｔ−Ｓ土壌溶液およびＫＡＦＥ（商標）−Ｆ葉面溶液として市販されている製品中に見ることができる。これらの製品に関する情報は、ｗｗｗ．ｆｂｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍで入手できる。したがって、本明細書に開示され、記載される態様の例示的組成物は、適した容積の水に、ＣＰとしてＣａｒｂｏｎ  Ｂｏｏｓｔ（商標）−Ｓ葉面溶液またはＫＡＦＥ（商標）−Ｆ葉面溶液、第２の構成要素として少なくとも１種の駆除剤を加えることによって調製できる。一態様では、有効成分は、ＣＡＳ登録番号１１７５００６−５６−０であり、例として、ＣＰに対応する。
【００４８】
ストレス耐性および／または遺伝子調節を提供する組成物中に存在するべきであるＣＰの量は、使用される特定の有機混合物に応じて変わる。量は、例えば、組成物における混合物の溶解度の限界を超えることによって、またはその他の必須構成要素を溶液から出してしまうことによって、物理的に不安定な組成物をもたらすほど多くするべきではない。他方、量は、標的植物種に適用される場合に、ストレス耐性の増強または遺伝子調節を提供できないほど少なくするべきではない。任意の特定の有機混合物には、当業者ならば、ルーチンの製剤安定性および生物学的効率の試験によって、任意の特定の使用のために組成物中の有機混合物の量を最適化できる。
【００４９】
特に、例えば、Ｃａｒｂｏｎ  Ｂｏｏｓｔ（商標）−ＳおよびＫＡＦＥ（商標）−Ｆの商標名のもとで販売される市販の製剤において見られるように、有機化合物の混合物が使用される場合、栄養組成物において必要とされるＣＰの量は、著しく少ないと分かることが多い。例えば、いくつかの状況では、そのような混合物のわずか１重量部（水を除く）が、約１０００重量部まで、またはそれを超える第２の構成要素の、植物の沈着部位への葉面送達を補助し得る。その他の状況では、ルーチンの試験に基づいて、より多量の有機混合物を加えることが有益であると分かる場合もある。通常、ＣＰ対第２の構成要素の適した比は、約１：２０００〜約１：５、例えば、約１：１０００〜約１：１０または約１：５００〜約１：２０、例示的には、約１：１００である。有機化合物の供給源としてＣａｒｂｏｎ  Ｂｏｏｓｔ（商標）−Ｓ溶液またはＫＡＦＥ（商標）−Ｆ溶液を使用する場合には、このような溶液の、本明細書において第２の構成要素の濃縮組成物中に含まれるのに適した量は、濃縮組成物の約５〜約２５、例えば、約８〜約１８、例示的には、約１２重量部中、約１重量部のＣａｒｂｏｎ  Ｂｏｏｓｔ（商標）−Ｓ溶液またはＫＡＦＥ（商標）−Ｆ溶液である。
【００５０】
場合により、本発明の組成物中にさらなる構成要素が存在してもよい。例えば、組成物は、第２の構成要素をさらに含んでもよい。第２の構成要素は、ＣＰ以外の植物栄養素の少なくとも１種の農業上許容可能な供給源のものであり得る。第２の構成要素はまた、駆除剤であってもよく、本明細書において、用語「駆除剤」は、少なくとも１種の除草剤、殺虫剤、殺真菌薬、殺菌剤、抗ウイルス剤、抗線虫薬またはそれらの組合せを指す。
【００５１】
植物の環境ストレスに対する感受性を低減させるための植物および／または種子の処理のための、本明細書に記載される組成物の使用方法がさらに開示される。組成物を、単一の植物（例えば、室内用鉢植え植物または庭園用観賞植物）に、または一定区域を占める植物の集まりに適用してもよい。いくつかの実施形態では、組成物を、農作物または園芸作物に、特に食用作物に適用する。本明細書において「食用作物」とは、主に、人間の食用のために成長させた作物を意味する。本発明の方法は、野外使用に対して、および保護された栽培、例えば、温室使用においての両方に適している。
【００５２】
本方法は、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、エンバクおよびコメを含む穀類などのイネ科（イネ科に属する）作物にとって有益であり得るが、それらはまた、野菜作物、果実作物、大豆などの広葉の農作物、種子作物、または種子を生産するために特別に生育される任意の種の作物を含む非イネ科作物にも非常に適している。本明細書において、用語「果実」および「野菜」は、農業的意味または料理的意味で使用され、厳密な植物学的意味では使用されない。例えば、トマト、キュウリおよびズッキーニは、本目的上野菜と考えられるが、植物学的にいえば、消費されるのはこれらの作物の果実である。
【００５３】
本方法が有用であると見出され得る野菜作物として、限定されるものではないが、
葉物野菜およびサラダ用野菜、例えば、アマランス、ビート葉、ビターリーフ、チンゲンサイ、芽キャベツ、キャベツ、ブタナ、セルタス、チョクウィー(choukwee)、ツルムラサキ、チコリー、フユアオイ、キクの葉、ノヂシャ、クレス、タンポポ、エンダイブ、アリタソウ、シロザ、ゼンマイ、フルーテッド・パンプキン(fluted pumpkin)、ゴールデン・サンファイア、グッド・キング・ヘンリー、オオベンケイソウ、ジャンブー、カイラン、ケール、小松菜、クカ(kuka)、ラゴス・ボロギ(Lagos bologi)、ランドクレス、レタス、アメリカハンゲショウ、モロヘイヤ、ミズナ、カラシナ、白菜、ツルナ、オラーチェ、エンドウ葉、ポルク(polk)、赤チコリー、ロケット（アルガラ）、サムファイア、ハマフダンソウ、ハマナ、シエラ・レオネ・ボロギ(Sierra Leone bologi)、ソコ(soko)、スイパ、ホウレンソウ、スベリヒユ、フダンソウ、タアサイ、カブの葉、オランダガラシ、ヨウサイ、冬スベリヒユおよび油菜など、
花の咲く野菜および果実のなる野菜、例えば、エイコーン・スクワッシュ、アルメニアン・キューカンバー(Armenian cucumber)、アボカド、ピーマン、ニガウリ、バターナッツ・スクワッシュ、カイグア、ケープ・グーズベリー、カイエンペッパー、ハヤトウリ、チリペッパー、キュウリ、ナス（オーベルジーヌ）、アーティチョーク、ヘチマ、マラバル・ゴード(Malabar gourd)、パルワル、ペポカボチャ、多年生キュウリ、カボチャ、カラスウリ、スクワッシュ（マロー）、スイートコーン、スイートペッパー、ティンダ、トマト、トマティロ、冬瓜、ウエスト・インディアン・ガーキン(West Indian gherkin)およびズッキーニ（コルゲット）など、
マメ科の野菜（マメ科植物）、例えば、アメリカホドイモ、小豆、黒豆、ササゲ、ヒヨコマメ（ガルバンゾ・ビーン）、ドラムスティック、フジマメ、ソラマメ（ブロード・ビーン）、サヤインゲン、グアー、インゲンマメ(haricot bean)、ホースグラム、インディアン・ピー(Indian pea)、インゲンマメ（kidney bean）、レンズマメ、ライマメ、モスビーン、緑豆、白インゲンマメ、オクラ、エンドウマメ、ピーナッツ（落花生）、キマメ、インゲンマメ(pinto bean)、ツルアズキ、ベニバナインゲン(runner bean)、大豆、タルウィ、テパリービーン、ウラドマメ、ハッショウマメ、シカクマメおよびジュウロクササゲなど、
鱗茎菜および茎菜、例えば、アスパラガス、カルドン、セルリアック、セロリ、エレファントガーリック、ウイキョウ、ニンニク、コールラビ、クラト、リーキ、レンコン、ノパル、タマネギ、プロイセンアスパラガス、エシャロット、ネギおよび行者ニンニクなど、
塊根野菜および塊茎野菜、例えば、アヒパ、アラカチャ、タケノコ、ビートルート、ブラッククミン、ゴボウ、ブロードリーフ・アローヘッド(broadleaf arrowhead)、カマス、カンナ、ニンジン、キャッサバ、チョロギ、大根、落花生エンドウ、ゾウコンニャク、エンセーテ、生姜、ゴボウ(gobo)、ハンブルグパセリ、セイヨウワサビ、キクイモ、ヒカマ、パースニップ、ヒッコリー、プレクトランサス、ジャガイモ、プレイリー・ターナップ、ラディッシュ、ルタバガ（スイード）、サルシフィ、スコルツォネラ、ムカゴニンジン、サツマイモ、タロイモ、ティー(ti)、タイガーナッツ、ターナップ、ウルコ(ulluco)、ワサビ、ウォーターチェスナット、ヤーコンおよびヤムなど、ならびに
ハーブ、例えば、アンジェリカ、アニス、バジル、ベルガモット、キャラウェー、カルダモン、カモミール、チャイブ、シラントロ、コリアンダー、ディル、フェンネル、チョウセンニンジン、ジャスミン、ラベンダー、レモンバーム、レモンバジル、レモングラス、マジョラム、ミント、オレガノ、パセリ、ポピー、サフラン、セージ、スターアニス、タラゴン、タイム、ターメリックおよびバニラなどが挙げられる。
【００５４】
本方法が有用であると見出され得る果実作物として、リンゴ、アプリコット、バナナ、ブラックベリー、クロフサスグリ、ブルーベリー、ボイセンベリー、カンタロープ、サクラ、シトロン、クレメンタイン、クランベリー、ダムスン、ドラゴンフルーツ、イチジク、ブドウ、グレープフルーツ、セイヨウスモモ、セイヨウスグリ、グアバ、ハニーデュー、ジャックフルーツ、キーライム、キウィフルーツ、キンカン、レモン、ライム、ローガンベリー、リュウガン、ビワ、マンダリン、マンゴー、マンゴスチン、メロン、マスクメロン、オレンジ、パパイヤ、モモ、セイヨウナシ、カキ、パイナップル、オオバコ、プラム、ザボン、ウチワサボテン、マルメロ、ラズベリー、アカフサスグリ、スターフルーツ、ストロベリー、タンジェロ、タンジェリン、タイベリー、アグリフルーツおよびスイカが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
本方法が有用であると見出され得る種子作物として、任意の植物種の種子を生産するために使用される特殊な作物が挙げられ、それについて本方法が有用であると見出され得るものとして、穀類（例えば、オオムギ、トウモロコシ（メイズ）、キビ、エンバク、コメ、ライムギ、ソルガム（ミロ）およびコムギ）に加えて、ソバ、綿、亜麻仁（リンシード）、カラシ、ケシ、菜種（キャノーラを含む）、サフラワー、ゴマおよびヒマワリなどの非イネ科種子作物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
本方法が有用であると見出され得る、上記のカテゴリーのいずれにも適合しないその他の作物として、サトウダイコン、サトウキビ、ホップおよびタバコが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
上記で列挙される作物の各々は、その独自の特定のストレス保護の必要性を有する。特定の作物のための本明細書に記載される組成物のさらなる最適化は、過度の実験を行うことなく、本開示内容に基づいて当業者によって容易に行うことができる。
【００５８】
本明細書に開示され、記載される組成物を使用する方法は、種子に、植物の葉表面に、もしくは植物または種子の部位に、本明細書に記載されるような組成物を適用することを含む。
【００５９】
本明細書において物質または組成物に適用される用語「農業上許容可能な」とは、植物またはその環境にとって、許容されないほど有害ではないか、毒性でないこと、かつ、本明細書に記載されるように使用される場合に物質に暴露され得る使用者または他者にとって安全でないものではないことを意味する。
【００６０】
本明細書において「葉表面」は、通常、葉の表面であるが、葉柄、托葉、茎、苞葉、花芽などを含めた植物のその他の緑色部分は、活性成分の吸収を可能にし得る表面を有し、本発明では、「葉表面」は、このような緑色部分の表面を含むと理解される。
【００６１】
本明細書において使用される「部位」とは、葉表面を含み、また、植物に近接した区域または複数の種子が植え付けられているか、植え付けることができる区域も含む。
【００６２】
本明細書において使用される「種子処理」とは、概して、種子を、少なくとも１種の有効成分（ａ．ｉ．またはＡＩ）を含有するかまたは含む化合物または組成物と接触させることを指す。化合物または組成物は、種子に適した任意の形態、例えば、液体、ゲル、エマルジョン、懸濁液、ディスパージョン、噴霧液または粉末であり得る。種子処理は、種子コーティングおよび種子ドレッシングを含む。好ましい実施形態では、Ａ．Ｉ．はＣＰである。
【００６３】
本明細書において使用される「種子コーティング」または「種子ドレッシング」とは、概して、種子の少なくとも一部上に形成されたコーティングまたはマトリックスを指し、コーティングまたはマトリックスは、少なくとも１種のＡＩを含有するかまたは含む。種子コーティングプロセスもしくはコーティングからの少なくとも１種のＡＩの分解／放出を容易にするために、または過剰のダストオフ（dust-off）を防ぐために、または処理された種子に色を加えるために、種子コーティング中に任意選択の化合物または薬剤を含めてもよい。
【００６４】
本明細書において使用される用語「種子」とは、任意の特定の種類の種子に限定されず、単一の植物種に由来する種子、複数の植物種に由来する種子の混合物または植物種内の様々な系統に由来する種子のブレンドを指し得る。開示され、記載される組成物を利用して、裸子植物種子、双子葉被子植物種子および単子葉被子植物種子を処理できる。
【００６５】
本明細書において使用される用語「農学的回復」とは、ストレスが低減または中断した後の植物の生物学的応答の相対的再開に関連する。農学的回復は、任意の特定の種類の生物学的に関連する植物回復に限定されるのではなく、例えば、重量、果実生産、収量、生存、色、外観、芳香などの一部またはすべての回復を含むことができる。一例では、農学的回復は、本明細書に開示される組成物を用いて処理されていない同様の植物と比較した、乾燥の中断後の植物重量、葉数および茎の重量の改善のうち１つまたは複数を含む。
【００６６】
本明細書に開示され、記載される組成物は、種子または葉の表面または部位に液体または固体を適用するための任意の従来の系を使用して適用できる。通常、散布による適用が最も好都合であると見出されるが、必要に応じてタンブリング、ブラシまたはロープウィックによる適用を含むその他の技術を使用してもよい。散布では、任意の従来の噴霧法を使用して、流体ノズルおよび回転円盤噴霧装置を含む散布液滴を生成することができる。組成物の散水システムへの導入も使用できる。
【００６７】
葉表面または部位適用のためには、組成物の適用速度は、約０．０１グラム／ヘクタール〜約１０．０グラム／ヘクタール乾重量の間、約０．２グラム／ヘクタール〜約２．０グラム／ヘクタール乾重量の間、０．３グラム／ヘクタール〜約１．５グラム／ヘクタール乾重量の間または約０．４グラム／ヘクタール〜約１．０グラム／ヘクタール乾重量の間とすることができ、土壌中または植物の葉もしくは部位への葉面適用として適用される。
【００６８】
本明細書に開示され、記載される組成物は、種子、植物または部位への適用の前の水でのさらなる希釈および／または混合に適した、濃縮形態（例えば、液体、ゲルまたは再構成可能な粉末形態）で提供されてもよい。あるいは、それらは、直接適用のために、そのまますぐに使える溶液として提供されてもよい。本明細書に開示され、記載される組成物は、その他の肥料溶液および／または駆除剤溶液と組み合わされる場合があるので、このようなその他の溶液と混合することによって、希釈および／または再構成され得る。
【００６９】
上記の濃縮組成物は、さらなる希釈に適している。植物の葉への適用には、濃縮組成物を、水で約６００倍、または約６００倍超、より通常は約１００倍、または約４０倍まで希釈してもよい。例示的には、濃縮製品は、約６０〜約６００ｌ／ｈａ、例えば、約８０〜約４００ｌ／ｈａまたは約１００〜約２００ｌ／ｈａの希釈後の総適用容量において、約０．１〜約３０ｌ／ｈａ、例えば、約５〜約２５ｌ／ｈａで適用してもよい。
【００７０】
種子処理適用には、濃縮組成物を、水で約６００倍、または約６００倍超、より通常は約１００倍、または約４０倍まで希釈してもよい。例示的には、濃縮製品は、約０．１ｍｇ／Ｋｇ種子〜約１００ｍｇ／Ｋｇ種子、例えば、約０．１ｍｇ／Ｋｇ種子、０．５ｍｇ／Ｋｇ種子、０．７５ｍｇ／Ｋｇ種子、１．０ｍｇ／Ｋｇ種子、１．２５ｍｇ／Ｋｇ種子、１．５ｍｇ／Ｋｇ種子、１．７５ｍｇ／Ｋｇ種子、２．０ｍｇ／Ｋｇ種子、２．５ｍｇ／Ｋｇ種子、３．０ｍｇ／Ｋｇ種子、３．５ｍｇ／Ｋｇ種子、４．０ｍｇ／Ｋｇ種子、４．５ｍｇ／Ｋｇ種子、５．０ｍｇ／Ｋｇ種子、５．５ｍｇ／Ｋｇ種子、６．０ｍｇ／Ｋｇ種子、６．５ｍｇ／Ｋｇ種子、７．０ｍｇ／Ｋｇ種子、７．５ｍｇ／Ｋｇ種子、８．０ｍｇ／Ｋｇ種子、８．５ｍｇ／Ｋｇ種子、９．０ｍｇ／Ｋｇ種子、９．５ｍｇ／Ｋｇ種子および１０．０ｍｇ／Ｋｇ種子で適用してもよい。濃縮製品はまた、約１５ｍｇ／Ｋｇ、２０ｍｇ／Ｋｇ、２５ｍｇ／Ｋｇおよび３０ｍｇ／Ｋｇで適用してもよい。
【００７１】
上記のように濃縮組成物を希釈することによって調製された適用溶液は、本明細書に開示され、記載される組成物および方法のさらなる態様を表す。
【実施例】
【００７２】
［実験に関して］
ＣＰは、植物の遺伝子発現に影響を及ぼすことができ、アップレギュレートまたはダウンレギュレートされる遺伝子を、遺伝子マイクロアレイ技術およびモデル植物であるアラビドプシスを使用して同定した。出願人によって実施されたアラビドプシスでの予備実験では、ＣＰの適用は、処理した植物を塩分ストレス（ＮａＣｌ）に暴露した場合に、アラビドプシスの葉数の２４．９％の増大、葉面積の４７．０％の増大、葉新鮮重の４６．９％の増大および葉乾重量の２５％の増大を示した。ＣＰの同様の適用は、乾燥ストレス下のアラビドプシス植物体で萎れ症状の出現を遅らせた。ＣＰに暴露されたシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｉｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＤＮＡ分析を実施して、乾燥ストレス、酸化ストレスなどの様々な種々の環境ストレスの態様との相関を有する遺伝子発現および遺伝子調節、ならびにイオン輸送およびその他の作用機序の態様との遺伝子発現および遺伝子調節の相関を同定した。
【００７３】
植物物質および生育条件。シロイヌナズナ、アクセッションＣｏｌｏｍｂｉａ（Ｃｏｌ−０）を使用した。このアクセッションは、フロリダ大学の細胞科学および微生物学科（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｌｏｒｉｄａ’ｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ、ＦＬ  ３２６１１）のＤｒ．Ｚ．Ｍｏｕから提供された。種子を、オートクレーブにかけたＭｅｔｒｏ−Ｍｉｘ  ２００鉢植え用ミックス（ＳｕｎＧｒｏ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ）中に植え付け、滅菌蒸留水で水やりをし、低温室中で３日間春化処理した（約７℃で暗所）。種子を発芽させ、室温を２４℃に、相対湿度を４５％〜７０％の範囲に設定した生育室中で、実生を生育させた。最初に、生育室中の光周期は１６時間明および８時間暗とし、後に、１０時間明および１４時間暗に変更した。
【００７４】
ＣＰ対対照実験。葉面適用のために、ＣＰおよび比較例ＣＥを脱イオン水で希釈し、アラビドプシスのロゼット葉上に、流れ落ちるまで噴霧した。ＣＰを組織培養培地に加えるために、ＣＰ保存溶液を無菌フード下で濾過滅菌し、オートクレーブにかけて約４５℃に冷却した培地に添加した。
【００７５】
塩分（塩）ストレス。これは、生育培地または培養培地に塩化ナトリウム溶液（５０ｍＭ〜２００ｍＭ）を適用することによって誘導した。
【００７６】
乾燥ストレス。生育培地を、生育室中で水やりをせずに徐々に乾燥させた。
【００７７】
植物成長アッセイ。これは、ロゼット葉を計数することによって行った。実験の最後に、葉を採取し、大型フラットベッドスキャナー（Ｅｐｓｏｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  １００００ＸＬ）およびＷｉｎｆｏｌｉａソフトウェア（Ｒｅｇｅｎｅｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｉｎｃ．）を使用してその葉面積を求めた。採取直後に葉の新鮮重をとり、乾重量は、１７５℃で２４〜４８時間乾燥した後に量った。
【００７８】
［遺伝子調節研究］
マイクロアレイ分析によって、ＣＰ組成物は、アラビドプシス遺伝子の大きく多様な群の発現の調節において極めて強力であることが示された。ＣＰ（本明細書において以下、「Ｔ１」とも呼ばれる）およびＣＰ１０００（本明細書において以下、「Ｔ２」と呼ばれる）と表される第２のＣＰ製剤の葉面適用の６時間後、４５６種の遺伝子の発現レベルが５０％（１．５倍）を超えて変化した。それらの中でも、６０種の遺伝子が、発現を１．５〜３．２倍増大させ、３９６種の遺伝子が発現レベルを１．５〜３８．４倍減少させた。比較例ＣＥの葉面適用の６時間後、４２３種の遺伝子の発現レベルが５０％（１．５倍）を超えて変化し、その中でも、１６０種の遺伝子がその発現を１．５〜４．０倍増大させ、２６３種の遺伝子が発現を１．５〜２０．３倍減少させた。ＣＰおよびＣＰ１０００（Ｔ１およびＴ２）の化学組成は、本明細書に記載される部分的に腐植化された物質の特徴を共有する。
【００７９】
ＣＰによって調節される遺伝子の一部は、オーキシン、ジベレリン酸、アブシジン酸などの植物ホルモンおよび潜在的にはその他の化学的刺激に対する応答またはその代謝に関与している可能性がある。いくつかの他の遺伝子は、イオン結合またはイオン移動性、植物防御などに関与している可能性が高い。最も注目すべきことに、ＣＰによって調節される遺伝子の多くが転写因子である。
【００８０】
上記の結果は、ＣＰが、成長、発達およびストレス抵抗性にとって重要な多数の植物の生化学的および生理学的プロセスに対して重要な効果を発揮できることを示す。ある意味では、ＣＰは、非伝統的な植物成長調節因子のように作用する。
【００８１】
本研究は、植物の遺伝子発現を調節するＣＰの役割を理解するための最初の試みであったが、結果は、ＣＰの作用様式に関するいくつかの極めて興味深い現象を示す。それでもやはり、この研究から得た知見を確認するため、また、決定的に重要な植物生理学的プロセスまたは生化学的プロセスに関与している遺伝子発現全体に対する、特に、主要な遺伝子に対するＣＰの効果をより理解するためのさらなる調査が進行中である。
【００８２】
［マイクロアレイ調製］
全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉキット試薬（Ｑｉａｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＭＡ）を使用して、ロゼット葉から単離し、ＲＮアーゼ不含水（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に溶解した。マイクロアレイ調製およびスキャニングサービスは、フロリダ大学のＩｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＵＦ−ＩＣＢＲ、Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ、ＦＬ）によって提供された。ＲＮＡ濃度は、最初、Ｎａｎｄｒｏｐ  ８０００を使用して求め、次いで、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによって調べた。蛍光標識されたｃＲＮＡは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｑｕｉｃｋ  Ａｍｐ標識キット／Ｔｗｏ  Ｃｏｌｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｐ／ｎ  ５１９０−０４４４）を使用して各反応において１７５ｎｇの全ＲＮＡから作製した。ダイスワップにおいて、特定の処理から得られたＣｙ５標識されたｃＲＮＡを、対照由来の同量のＣｙ３標識されたｃＲＮＡと、またはその逆を混合した。ハイブリダイゼーションは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのハイブリダイゼーションユーザーマニュアルおよびGene Expresstionハイブリダイゼーションキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｐ／ｎ  ５  １８８−５２４２）に従って実施した。合計１００μｌの反応混合物を各Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ４４Ｋ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ４マイクロアレイ（４３８０３フィーチャー）にアプライし、６５℃のハイブリダイゼーション回転オーブン中で１７時間ハイブリダイズした。スライドを、最初に、室温でＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｗａｓｈバッファー１（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｐ／ｎ  ５  １８８−５３２５）／０．００５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１０２で１分間洗浄し、次いで、室温でＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｗａｓｈバッファー２（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｐ／ｎ  ５１８８−５３２６）／０．００５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１０２で１分間洗浄し、スライドをＡｇｉｌｅｎｔ  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｒｙｉｎｇ溶液（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｐ／ｎ  ５１８５−５９７９）に３０秒間浸漬することによって乾燥させた。アレイをデュアルレーザーＤＮＡマイクロアレイスキャナー（モデルＧ２５０５Ｃ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用することによってスキャンした。Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  １０．１．１．１ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、画像からデータを抽出し、アレイ内で正規化した。アレイ内正規化は、Ｌｏｗｅｓｓ法に基づいていた。
【００８３】
［マイクロアレイデータ分析］
ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ  １０．０．２パッケージ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、マイクロアレイデータを分析した。スプリット−チャンネルを使用して、２色のデータ（赤および緑）を単色データ（赤または緑）としてＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇにインポートした。このプロセスの際に、すべてのサンプルのパーセンタイルシフトおよび中央値へのシフトを使用してアレイ間正規化を実施した
【００８４】
最初に、ｔ検定ｐ値（≦０．０１）、次いで、変化倍数（≧１．５）に従って、差次的に発現された遺伝子のリストを同定した。さらに、Ｒ２．３ソフトウェアおよびＬＩＭＭＡパッケージを使用してマイクロアレイデータを正規化し、差次的に発現された遺伝子のリストを作製した。
【００８５】
［結果］
１．正常生育条件下でのアラビドプシスの成長に対するＣＰの効果：試験を実施して、アラビドプシス植物体の正常生育条件に対するＣＰの効果を決定した。これらの試験は、処理されたアラビドプシス植物体は、非処理植物体よりも密度の高い根を根鉢上に有すると思われることを示した（図１）が、葉数、葉面積および新鮮または乾燥葉重量においては処理および非処理植物体間で有意な相違は観察されなかった（表１）。
【００８６】
この試験を、異なる光周期（１０／１４時間  昼／夜）下で反復した。葉数（処理の７、１４および２１日後）、葉面積および新鮮または乾燥葉重量においては、対照ＣＰ、（および比較例ＣＥ）処理された植物体間で有意な相違は観察されなかった。（表２、図２、図１４）。
【００８７】
【表７】
0005976543.tif 000008
【００８８】
【表８】
0005976543.tif 000009
【００８９】
２．塩ストレス抵抗性に対するＣＰの効果：アラビドプシス植物体で２種の試験を実施して、塩ストレスを低減することに対するＣＰの有効性を決定した。最初の１つでは、ＣＰ適用前に１００ｍＭ  ＮａＣｌを用いて４日間灌水することによって植物体にストレスを加えた。１つの植物体を含む各ポット（セル）に、２００９年２月３日および５日に１００ｍＭ  ＮａＣｌ  ２５ｍＬを与えた。１日後、ＣＰまたは水（対照）を用いて植物体を処理した。処理された植物体の７４パーセントが、複数のシュートを発達させた（図３）が、非処理植物体の２９％しか、複数のシュートを発達させなかった（表３）。
【００９０】
【表９】
0005976543.tif 000010
【００９１】
第２の試験では、アラビドプシス植物体をＣＰを用いて処理し、その後、それらを塩ストレスに付した。異なる結果が得られた。植物体に、２００９年２月１６日にＣＰまたは水で葉面噴霧し、ＣＰ適用後、５０ｍＭ  ＮａＣｌを用いて４日間、次いで、１００ｍＭ  ＮａＣｌを用いて７日間灌水した。この試験では、ＣＰ処理は、葉数（２４．９％）、面積（４７．０％）および新鮮重（４６．９％）および乾重量（２５．０％）を大幅に増大させた。（表４、図４、図１５）。
【００９２】
【表１０】
0005976543.tif 000011
【００９３】
さらなる塩ストレス実験を実施したが、その目的は、温室中で生育させたトマト植物体（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓ．）に対する誘導された塩ストレスの影響の軽減におけるＣＰの効果を決定することであった。トマトを種子から生産し、この実験のために３インチ×３インチのポットに移植した。無作為完備型ブロック計画で配置した処理あたり８の反復実験を含む、合計５種の処理を行った。すべてのポットに、それらが移植された当日および１４日後の第２の適用での２５ｍｌの土壌灌注としてＣＰの適用を施した。未処理チェックは水のみを用いて処理し、ＣＰを用いて処理したポットは０．３ｐｐｍ  ＣＰ〜２．４ｐｐｍ  ＣＰの範囲の割合を有していた。第２の適用の７日後、各処理においてポットの半分に、２００ｍＭ  ＮａＣｌ塩溶液の２５ｍｌの土壌灌注を施した。１１日後、植物体を、活力、植物体の高さ、葉数ならびに植物体、根、およびシュート重量について測定した。データを表４Ａおよび４Ｂに示す。
【００９４】
【表１１】
0005976543.tif 000012
【００９５】
【表１２】
0005976543.tif 000013
【００９６】
この実験は、少なくとも一部は、ストレスを軽減するためのＣＰの最適な割合を評価するために設計した。上に明確に示されるように、塩灌注は、活力、高さ、葉数およびシュート重量によって示されるように、植物体のシュートに対してはごくわずかな効果しかなかった。しかし、塩は、ＵＴＣにおいて植物体の根重量および植物体全重量に対して、塩ストレスのないＵＴＣにおける植物体と比較して統計的に有意な負の影響を有していた。高い割合のＣＰ（１．２ｐｐｍおよび２．４ｐｐｍのＣＰ）を添加することは、塩ストレスを受けた植物体およびストレスを受けていない植物体の両方について大幅な断根を引き起こしたが、低い割合は、ストレスを受けた植物体および受けていない植物体の両方について根および植物体全体の大きさを大幅に改善した。最低の割合のＣＰを用いて処理された植物については、ストレスを受けていない植物体およびストレスを受けた植物体間で根重量において統計的差異はなかった。表４Ａおよび４Ｂに示される結果は、予測されないものであった。
【００９７】
さらなる実験を実施したが、その目的は、温室中で生育させたトマト植物体（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓ．）に対する誘導された塩ストレスの影響の軽減におけるＣＰの効果を決定することであった。トマトを種子から生産し、この実験のために３インチ×３インチのポットに移植した。無作為完備型ブロック計画で配置した処理あたり８の反復実験を含む、合計５種の処理を行った。すべてのポットに、それらが移植された当日および１４日後の第２の適用での２５ｍｌの土壌灌注としてＣＰの適用を施した。未処理チェックは水のみを用いて処理し、ＣＰを用いて処理したポットは０．０７５および０．０３７５ｐｐｍ  ＣＰの割合を有していた。第２の適用の７日後、各処理においてポットの半分に、２００ｍＭ  ＮａＣｌ塩溶液の２５ｍｌの土壌灌注を施した。１３日後、植物体を、葉数およびシュート重量について測定した。データを表４Ｃおよび４Ｄに示す。
【００９８】
【表１３】
0005976543.tif 000014
【００９９】
【表１４】
0005976543.tif 000015
【０１００】
この実験は、少なくとも一部は、植物の発達に対する、またストレスを軽減するためのＣＰの２種の異なる適用割合を評価するために設計した。上に示されるように、両割合でＣＰを用いて処理された植物体は、塩誘導性ストレスに暴露されたかどうかにかかわらず、シュート重量および葉数の両方において統計的に有意な差異を示した。さらに、ＣＰおよび塩の適用を施されている植物体は、塩ストレスのない、ＣＰを用いて処理されたものと同等またはそれよりも大きく、これらの植物体はまた、より多くの葉を有していたことが示される。普通、このレベルで適用される塩は、植物に関して大きさおよび葉数の両方を低減すると予想される。したがって、表４Ｃおよび４Ｄに示される結果は予測されないものであった。
【０１０１】
３．乾燥抵抗性に対するＣＰの効果：アラビドプシス植物体を、２００９年２月２３日にＣＰを用いて、または用いずに処理し、次いで、２００９年３月９日から水やりを中断することによって乾燥条件に付した。これらの植物体を３月９日から３月３０日まで、萎れ症状または植物体の死滅について観察した。このＣＰ処理は、萎れ症状を１〜２日遅延すると思われた（図５；図１６）。図５および１６は、乾燥に対するアラビドプシス耐性に対するＣＰ適用の効果を示す。図５に見られるように、左の列：ＣＰ処理；右の列：対照。水やりを停止した１７日後にとった写真。
【０１０２】
さらなる実験を実施したが、その目的は、温室中で生育させたトマト植物体（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓ．）に対する誘導された乾燥ストレスの影響の軽減におけるＣＰの効果を決定することであった。トマトを種子から生産し、この実験のために３インチ×３インチのポットに移植した。無作為完備型ブロック計画で配置した処理あたり８の反復実験を含む、合計３種の処理を行った。処理２におけるすべてのポットに、それらが移植された当日および２１日後の第２の適用での２５ｍｌの土壌灌注としてＣＰの適用を施した。未処理チェックおよび処理３は、水のみを用いて処理した。第２の適用の７日後、処理２および３におけるすべての植物体について毎日の水やりを中断して、極度の乾燥条件を摸倣した。水やりを停止した１６日後に、各処理において植物体の半分を採取して、根重量、シュート重量および総重量を測定した。次いで、水やりを再開し、９日後に乾燥ストレスからの回復を決定した。結果を表４Ｅに示す。示されるように、一時期、水やりが行われなかったすべての植物体は、ＣＰを用いて処理されたか否かにかかわらず、最終的には影響を受けた。ＣＰは、水がないという影響を最小にすることにおいて、わずかな効果を有すると思われるが、データは統計的に有意ではない場合もある。しかし、水やりを再開した後、ＣＰを用いて処理された植物体は、表４Ｄに示されるように、根およびシュート重量に関してかなり改善された応答／回復を有していた。この応答データは、統計的に有意であると決定された。したがって、本明細書に開示される組成物は、ストレス低減において改善を提供し、また、組成物を用いて処理されていない同様の植物体と比較した、ストレスが低減および／または中断された後の「農学的回復」の改善も含む。表４Ｅに示される自己回復結果は、予測されないものであった。
【０１０３】
【表１５】
0005976543.tif 000016
【０１０４】
４．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの種子発芽に対するＣＰの効果  ２種の試験を実施して、ＣＰと接触させたアラビドプシス種子の種子発芽の効果を決定した。第１の試験は、以下の処理からなるものであった：
Ｙ２  ＭＳ（Ｓｉｇｍａムラシゲおよびスクーグ基礎塩混合物）
Ｙ２  ＭＳ＋ＣＰ５０００Ｘ
Ｙ２  ＭＳ＋１２５ｍＭ  ＮａＣｌ
Ｙ２  ＭＳ＋１２５ｍＭ  ＮａＣｌ＋ＣＰ５０００Ｘ
【０１０５】
各プレート中に２００〜３００個の種子を含む、各処理について１つのペトリ皿。第２の試験は、同様の処理からなるものとした：
Ｙ２  ＭＳ
Ｙ２  ＭＳ＋ＣＰ１０００Ｘ
Ｙ２  ＭＳ＋１２５ｍＭ  ＮａＣｌ
Ｙ２  ＭＳ＋１２５ｍＭ  ＮａＣｌ＋ＣＰ１０００Ｘ
【０１０６】
各処理４プレートについて４プレート、各プレート中に４９個の種子を植え付けた。処理間で有意差は観察されなかった。
【０１０７】
５．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの根の成長に対するＣＰの効果：３種の試験を実施して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアラビドプシスの根の成長に対するＣＰの効果を決定した。第１の試験では、種子をＶ２  ＭＳ＋１２５ｍＭ  ＮａＣｌ培地で発芽させ、次いで、４日齢の実生を以下の条件に付した：
Ｖ２  ＭＳ＋１２５ｍＭ  ＮａＣｌ
Ｖ２  ＭＳ＋１２５ｍＭ  ＮａＣｌ＋ＣＰ１０００Ｘ
Ｖ２  ＭＳ＋１２５ｍＭ  ＮａＣｌ＋ＣＰ５０００Ｘ
【０１０８】
第２の試験では、Ｖ２  ＭＳ培地で発芽させた４日齢の実生を、以下を含有するペトリ皿に移した：
Ｖ２  ＭＳ
Ｖ２  ＭＳ＋ＣＰ１０００Ｘ  Ｖ２  ＭＳ＋ＣＰ５０００Ｘ
【０１０９】
処理４プレート各々、各プレート中に４〜６個の実生。
【０１１０】
第３の試験では、実生をＶ２  ＭＳ中で生育させ、次いで、さらに高濃度のＮａＣｌに付した：
Ｖ２  ＭＳ
Ｖ２  ＭＳ＋２２５ｍＭ  ＮａＣｌ
Ｖ２  ＭＳ＋２２５ｍＭ  ＮａＣｌ＋ＣＰ１０００Ｘ
Ｖ２  ＭＳ＋２２５ｍＭ  ＮａＣｌ＋ＣＰ５０００Ｘ
【０１１１】
各処理は４プレートからなり、各プレート中に４〜６個の実生を入れた。これらの３試験で有意差は観察されなかった。
【０１１２】
６．ＣＰによって開始された遺伝子発現：図６に示されるように、アラビドプシスロゼット葉から高品質ＲＮＡを単離した。発現技術は図１７に図式的に表されている。Ａｇｉｌｅｎｔ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのアラビドプシスオリゴマイクロアレイＶ４は、植物の全ゲノムに及ぶ４３６０３種の遺伝子または転写物を含有する。表５に要約されるように、ハイブリダイズされた４３，６０３種の遺伝子または転写物（以下、簡潔さのために遺伝子と呼ばれる）のうち１，３８２種の遺伝子または１，１１５種の遺伝子が、それぞれＴ１（ＣＰ）または比較例ＣＥについてｐ値≦０．０１で有意な変化倍数を示した。図７は、Ｔ１処理対対照における、アラビドプシス遺伝子のゲノム規模での発現プロフィール（４３６０３フィーチャー）を表す（Ｙ軸：遺伝子発現レベル変化倍数；Ｘ軸：左側にＴ１および右側に対照）。
【０１１３】
それらの中で、Ｔ１については４５６種および４２３種の遺伝子の発現レベルが、少なくとも１．５倍または５０％変化した。したがって、図８は、ｐ値≦０．０１で、その発現レベルが１．５倍以上変化したアラビドプシス遺伝子の発現プロフィールプロットを表す（Ｙ軸：遺伝子発現レベル変化倍数、Ｘ軸：左側にＴ１および右側に対照）。図９は、ｐ値≦０．０１で、その発現レベルが１．５倍以上変化したアラビドプシス遺伝子のボルケーノプロットである（Ｙ軸：ｐ値の−ｌｏｇ１０（２＝ｐ値０．０１）、Ｘ軸：遺伝子発現レベル変化倍数）。図１０は、右側の対照と比較した、ＣＰ調節された遺伝子のヒートマップであり、ここで、各線は別個の遺伝子を表す。幅が広く、より黒い線は、アップ／ダウンレギュレートされた遺伝子を表す。図１１は、ｐ値≦０．０１で、その発現レベルが１．５倍以上変化したアラビドプシス遺伝子の発現プロフィールプロットを表す（Ｙ軸：遺伝子発現レベル変化倍数；Ｘ軸：左側にＴ２および右側に対照）。図１２は、Ｔ２対対照では、ｐ値≦０．０１で、その発現レベルが１．５倍以上変化したアラビドプシス遺伝子のボルケーノプロットである（Ｙ軸：ｐ値の−ｌｏｇ１０（２＝ｐ値０．０１）、Ｘ軸：遺伝子発現レベル変化倍数）。図１３は、右側の対照と比較した、ＣＥ調節された遺伝子のヒートマップであり、ここで、各線は、別個の遺伝子を表す。ＣＥについて、アップレギュレートされた遺伝子の数は、Ｔ１およびＴ２についてそれぞれ６０および１６０であった。その発現レベル変化は、１．５（カットオフ）〜４．０倍の範囲であり、１．８〜１．９の平均変化倍数であった。
【０１１４】
図１８および１９に示されるように、ＣＰ（Ｔ１）またはＣＰ１０００（Ｔ２）適用の６時間後、かなり多数の遺伝子がダウンレギュレートされた。例えば、３９４種の遺伝子の発現がＴ１によって抑制され、その発現レベルが３８．４倍ほども低下した。同様に、Ｔ２については２６３種の遺伝子が抑制され、その発現レベルは、２０．３倍ほども低下した。
【０１１５】
【表１６】
0005976543.tif 000017
【０１１６】
表６および７は、それぞれ、Ｔ１に応じて、また、Ｔ２に応じて、その発現レベルが１．５倍以上まで変化し、ｐ≦０．０１を有していた遺伝子の遺伝子名、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号および説明（および潜在的機能）を含めた詳細を提供する。表６は、Ｔ１（ＣＰが接触した）処理に応答すると分かった４５６種の遺伝子を列挙する。表７は、Ｔ２処理に応答する４２３種の遺伝子を列挙する。以下は、これらの有意に差次的に発現された遺伝子の一部の短い概説を提供する。ＣＰとの接触によって調節される多数の遺伝子が予測されないものであった。
【０１１７】
Ｔ１によってアップレギュレートされる６０種の遺伝子の中に以下がある。
植物調節因子産生または応答をコードする５種の遺伝子：変化倍数１．５〜１．８  オーキシン応答性ファミリータンパク質の３種、
ジベレリン２０オキシダーゼ遺伝子の２種、
トランスポーター（アミノ酸、炭水化物およびプリン）をコードする３種の遺伝子：変化倍数１．５〜１．８、
酵素をコードする８種の遺伝子：変化倍数１．５〜３．２、
３種の防御関連遺伝子：変化倍数１．６〜２．６、および
転写因子または転写調節因子をコードする２種の遺伝子：変化倍数１．８〜２．２  ＡＴＰアーゼ／イオン移動をコードする１種の遺伝子：変化倍数１．５。
【０１１８】
Ｔ１によってダウンレギュレートされる３９６種の遺伝子の中に、転写因子、転写調節因子、イニシエーターをコードする３４種の遺伝子がある。
【０１１９】
Ｔ２によってアップレギュレートされる１６０種の遺伝子の中に以下がある。
転写因子をコードする１０種の遺伝子：変化倍数１．５〜３．５、
様々なプロテインキナーゼの１２種および加水分解酵素の６種などの様々な種類の酵素をコードする３９種の遺伝子ならびに多様なその他のもの。
【０１２０】
Ｔ１およびＴ２によって調節される９９種の遺伝子の中に以下がある。
１種の遺伝子（ＡＴ５Ｇ２０６３受容体）：Ｔ１およびＴ２によってアップレギュレートされる、
ｉ）ＷＲＫＹエレメントを含有する３種、
ｉｉ）エチレン応答性エレメントを含有する１種、
ｉｉｉ）ＡＢＡレプレッサーを含有する１種、
ｉｖ）塩耐性ジンクフィンガーモチーフを含有する１種、
ｖ）強光応答性のエレメントを含有する１種
を含めた、転写因子をコードする１１種の遺伝子、１．５〜６．２倍ダウン、
４種の推定上の疾患耐性遺伝子、１．５〜２．４ダウン、
推定上のキチナーゼタンパク質をコードする１種の遺伝子、１．６〜２．１ダウン、
カルシウムイオン結合タンパク質をコードする２種の遺伝子、４．７〜５．５ダウン、
亜鉛イオン結合タンパク質をコードする３種の遺伝子、２．２〜３．５ダウン、
リン酸誘導性タンパク質をコードする１種、３．２〜５．０ダウンされる、
ＡＢＣ輸送体ファミリータンパク質をコードする１種の遺伝子、３．２〜３．５、
陽イオン／水素交換体（プロトン交換輸送体）をコードする１種の遺伝子、
１種の糖脂質輸送体遺伝子、３．３〜３．７ダウン、
１種のカルモジュリン関連タンパク質、３．２〜３．６ダウン；１種のプロテインキナーゼ／糖結合、
２種のプロテアーゼ阻害剤遺伝子、１．８〜３．４、
１種のペクチンエステラーゼファミリータンパク質、２．９〜８．１ダウン、
１種のオキシドレダクターゼ、２．６〜４．０ダウン、
２種の膜貫通型受容体遺伝子、１．９〜３．４ダウン、
１種の熱ショックタンパク質遺伝子、２．７〜２．８ダウン、および
１種の老化関連タンパク質、２．１〜２．６ダウン。
【０１２１】
表８および表９に、Ｔ１およびＴ２（ＣＰ誘導性）対対照に応答性の遺伝子ならびにＴ１によってアップレギュレートされる転写因子遺伝子ならびにＴ１およびＴ２の両方によってアップレギュレートされる遺伝子のリストがそれぞれ要約されている。ＣＰは、アラビドプシスゲノム研究によって表されるような、多数の多様な群の植物遺伝子の発現の調節における効力を示している。ＣＰによって調節される遺伝子の一部は、オーキシン、ジベレリン酸、アブシジン酸などの植物ホルモンおよび潜在的にはその他の化学的刺激に対する応答またはその代謝に関与している。ＣＰによって調節される遺伝子の一部は、イオン結合または移動性、植物防御などに関与している。最も注目すべきことに、ＣＰによって調節される遺伝子の多数が転写因子である。これは、ＣＰが、多数の植物生化学的および生理学的プロセスに対して効果を発揮することを示す。これらの利点は、その他の植物に当てはまる。ある意味では、ＣＰは、非伝統的植物成長調節因子のように作用する。上記の実験のさらなる結果は、ＣＰが植物において遺伝子発現を調節し得ることを示す。この調節は、例えば、乾燥および塩分ストレスなどのストレス下で、植物の成長を改善し得る。さらに、ＣＰは、植物の乾燥回復の改善を提供し得、乾燥ストレス下で植物での萎れ症状の出現を遅延し得る。
【０１２２】
【表１７−１】
0005976543.tif 000018
【表１７−２】
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【表１７−３】
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【表１７−４】
0005976543.tif 000021
【表１７−５】
0005976543.tif 000022
【表１７−６】
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【表１７−７】
0005976543.tif 000024
【表１７−８】
0005976543.tif 000025
【表１７−９】
0005976543.tif 000026
【表１７−１０】
0005976543.tif 000027
【表１７−１１】
0005976543.tif 000028
【表１７−１２】
0005976543.tif 000029
【表１７−１３】
0005976543.tif 000030
【表１７−１４】
0005976543.tif 000031
【表１７−１５】
0005976543.tif 000032
【表１７−１６】
0005976543.tif 000033
【表１７−１７】
0005976543.tif 000034
【表１７−１８】
0005976543.tif 000035
【表１７−１９】
0005976543.tif 000036
【表１７−２０】
0005976543.tif 000037
【表１７−２１】
0005976543.tif 000038
【表１７−２２】
0005976543.tif 000039
【表１７−２３】
0005976543.tif 000040
【表１７−２４】
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【表１７−２５】
0005976543.tif 000042
【表１７−２６】
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【表１７−２７】
0005976543.tif 000044
【表１７−２８】
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【表１７−２９】
0005976543.tif 000046
【表１７−３０】
0005976543.tif 000047
【表１７−３１】
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【表１７−３２】
0005976543.tif 000049
【表１７−３３】
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【表１７−３４】
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【表１７−３５】
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【表１７−３６】
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【表１７−３７】
0005976543.tif 000054
【表１７−３８】
0005976543.tif 000055
【０１２３】
【表１８−１】
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【表１８−２】
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【０１２４】
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【表１９−２０】
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【０１２５】
【表２０−１】
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【表２０−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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