(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物由来原料から得られるコハク酸を含む水溶液から、コハク酸を製造する方法であって、以下の工程（１）〜（４）を含むコハク酸の製造方法。
（１）生物由来原料から得られるコハク酸を含む水溶液と、該水溶液と相分離可能な溶剤とを、スタティックミキサーを用いて接触させる接触工程
（２）接触工程で前記水溶液と前記溶剤の接触により発生した固形分を、セトラーを用いて除去する固形分除去工程
（３）前記溶剤を相分離により分離する相分離工程
（４）前記溶剤を相分離により分離した後に残った液体と、該液体と相分離する溶剤とを、向流多段抽出塔で接触させ、後に該溶剤を相分離により分離する工程
【請求項２】
前記溶剤が無機性値／有機性値の比（Ｉ／Ｏ値）が０．２以上２．３以下であり、常圧（１気圧）で沸点が４０℃以上の有機溶媒である、請求項１に記載のコハク酸の製造方法。
【請求項３】
前記固形分除去工程において、前記固形分の除去を、前記水溶液および前記溶剤から選ばれる少なくとも１種の液体と共に抜き出すことにより行う請求項１又は２に記載のコハク酸の製造方法。
【請求項４】
抜き出した固形分を固液分離し、得られた液体を前記水溶液と前記溶剤との接触工程以前の工程および相分離工程以降の工程の少なくとも一方に戻す、請求項３に記載のコハク酸の製造方法。
【請求項５】
前記固液分離を遠心沈降法により行う、請求項４に記載のコハク酸の製造方法。
【請求項６】
前記固液分離をフィルターを用いて行う、請求項４に記載のコハク酸の製造方法。
【請求項７】
前記接触工程を３０〜６０℃で行う、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載のコハク酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を使用してコハク酸などの脂肪族ジカルボン酸を製造する方法に関する。
【０００２】
また、本発明は、特に、生物由来原料であるグルコース、スクロースおよびセルロースなどから微生物変換によって得られる脂肪族ジカルボン酸（塩）及び糖類、アミノ酸、タンパク質および無機塩類等を含む水溶液から脂肪族ジカルボン酸を製造する脂肪族ジカルボン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
脂肪族ジカルボン酸は、ポリエステルおよびポリアミドなどのポリマー、特に生分解性ポリエステルの原料として、また、食品、医薬品および化粧品などの原料として広く用いられている。特に脂肪族ジカルボン酸をポリマー原料として用いる場合、ポリマーの重合度維持や着色防止などのために、高純度の脂肪族ジカルボン酸が要求される。これらのうち、特にコハク酸は、近年、乳酸と共に生分解性ポリマーの原料として期待されている。
【０００４】
脂肪族ジカルボン酸は、従来、石油由来の原料より、工業的に製造されてきた。例えば、コハク酸は、石油由来の原料であるマレイン酸の水添反応により製造されてきた。一方、近年では、植物由来の原料から、広い生物由来原料から高い炭素収率で、種々の脂肪族ジカルボン酸を製造することができる。例えば、コハク酸、アジピン酸などは発酵により製造することができる。
【０００５】
脂肪族ジカルボン酸の発酵生産においては、例えば、発酵液を遠心分離およびろ過等で処理して菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂等で脱塩し、その溶液から結晶化あるいはカラムクロマトグラフィーにより脂肪族ジカルボン酸を精製する方法が用いられる。
【０００６】
イオン交換樹脂を用いる方法として、特許文献１では、菌体を遠心分離した後、脂肪族ジカルボン酸をＨ＋型強酸性陽イオン交換樹脂で精製する方法が開示されている。また、特許文献２では、微生物菌体を除去する方法として、微生物の懸濁液をｐＨ４以下に調整し、この微生物懸濁液にポリアクリル酸ナトリウムを溶解することにより、微生物菌体を凝集させ、菌体凝集塊を分離する方法が開示されている。
【０００７】
また、発酵による脂肪族ジカルボン酸の製造において、原料となるのは、一般に糖類であり、グルコース、スクロースおよびセルロースなどである。しかし、多糖類が不純物として含まれる場合や、原料の糖類が微生物に完全に資化されずに残り、脂肪族ジカルボン酸に糖類が混入することがある。
【０００８】
さらに、微生物を用いた発酵で、アンモニアを中和剤として用いる場合、アミノ酸を副生し、脂肪族ジカルボン酸にアミノ酸が混入する。さらに微生物由来のタンパク質、発酵で用いられる無機塩類も脂肪族ジカルボン酸に混入することがある。
【０００９】
しかしながら、これら不純物を、効率的且つ安価な方法で除去することは困難であった。
【００１０】
発酵により製造される脂肪族ジカルボン酸の精製方法としては、脂肪族ジカルボン酸のカルシウム塩を硫酸で分解する方法（例えば、特許文献３参照）、イオン交換樹脂を用いる方法（例えば、特許文献４参照）が知られている。しかし、これらの方法では充分な精製度が得られないばかりか大量の副生塩も発生し、その処理が問題となる。
【００１１】
さらに脂肪族ジカルボン酸のアンモニウム塩に硫酸水素アンモニウムおよび／または硫酸を加え、ジカルボン酸と硫酸アンモニウム塩を生成するとともに生成した硫酸アンモニウム塩を硫酸水素アンモニウムとアンモニアに熱分解し、リサイクルする方法が提案されている（例えば、特許文献５参照）。しかし、この方法では、副生塩を分解してそれぞれリサイクルするため塩の処理は問題ないが、副生塩の分解には高温を要し、困難であった。また精製度も不十分であった。
【００１２】
電気透析を用いる方法（例えば、特許文献６参照）も一般に知られている。しかし電気透析は装置がその生産規模に比例して多くなるため、工業スケールの生産であってもスケールメリットが小さくコスト高となる。
【００１３】
これらの問題を解決する方法として、有機酸を含む水溶液に溶剤を加えて有機酸を抽出する方法（例えば、特許文献７参照）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２００５／０３０９７３号
【特許文献２】日本国特開平５−３７８０号公報
【特許文献３】日本国特開平３−０３０６８５号公報
【特許文献４】日本国特表２００２−５０５３１０号公報
【特許文献５】日本国特表２００１−５１４９００号公報
【特許文献６】日本国特開２００５−３３３８８６号公報
【特許文献７】日本国特表平９−５００６４９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかしながら、特許文献１および２に記載の方法は、薬剤や樹脂を使用するため、手間がかかり、より簡便で効率よく脂肪族ジカルボン酸を精製できる方法が望まれていた。したがって、本発明の課題は、生物由来原料と微生物とを反応させて得られる脂肪族ジカルボン酸と微生物菌体を含む懸濁液から脂肪族ジカルボン酸の精製効率を向上させ、それにより脂肪族ジカルボン酸を効率よく製造できる方法を提供することにある。
【００１６】
また、脂肪族ジカルボン酸を精製するに際して、脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液に相分離可能な溶剤を加えて抽出する方法においては、その過程において水溶液相にも溶剤相にも溶解しない固形分が生成し、抽出を阻害するばかりか、その後続工程へ悪影響を及ぼしたり、脂肪族ジカルボン酸の純度悪化を招いたりするなどの問題が発生することがあった。
【００１７】
特に、生物由来原料である、グルコース、スクロースおよびセルロースなどから微生物変換によって得られた脂肪族ジカルボン酸（塩）、糖類、アミノ酸、タンパク質および無機塩類等からなる水溶液と溶剤とを接触させて脂肪族ジカルボン酸を抽出する際には、抽出操作や相分離操作を特に困難とする場合があった。
【００１８】
さらにまた、特許文献７に記載の抽出方法においては、対象となる有機酸を結晶として回収する方法を提供するものではない。
【００１９】
したがって、本発明は、上記の固形分の生成による相分離の阻害やそれに伴う製造操作の障害を解消し、生物由来原料から微生物変換によって得られる脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液から、効率的かつ安定的に脂肪族ジカルボン酸を製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、以下に記載する本発明の脂肪族ジカルボン酸の製造方法により、本発明の課題を解決できることを見出した。
【００２１】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
１．生物由来原料と微生物とを反応させて得られる脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液から、脂肪族ジカルボン酸を製造する方法であって、以下の工程（１）〜（４）を含む脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
（１）生物由来原料と微生物とを反応させることにより脂肪族ジカルボン酸を反応液中に蓄積させる脂肪族ジカルボン酸生成工程
（２）脂肪族ジカルボン酸生成工程で得られた脂肪族ジカルボン酸と微生物とを含む液と、酸とを混合することにより、ｐＨ１．０以上５．０以下の液を得るｐＨ調整工程
（３）ｐＨ調整工程で得られた液から微生物を分離する微生物分離工程
（４）微生物分離工程で微生物を分離して得られた水溶液と、溶剤とを接触させる接触工程
２．微生物がコリネ型細菌である、前項１に記載の方法。
３．脂肪族ジカルボン酸がコハク酸である、前項１又は２に記載の方法。
４．溶剤が無機性値／有機性値の比（Ｉ／Ｏ値）が０．２以上２．３以下であり、常圧（１気圧）で沸点が４０℃以上の有機溶媒である、前項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
５．生物由来原料から得られる脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液から、脂肪族ジカルボン酸を製造する方法であって、以下の工程（１）〜（３）を含む脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
（１）生物由来原料から得られる脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液と、該水溶液と相分離可能な溶剤とを接触させる接触工程
（２）接触工程で前記水溶液と前記溶剤の接触により発生した固形分を除去する固形分除去工程
（３）前記溶剤を相分離により分離する相分離工程
６．前記固形分除去工程において、前記固形分の除去を、セトラーを用いて行う前項５に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
７．前記接触工程において、前記水溶液と前記溶剤との接触を、スタティックミキサーを用いて行う前項５または前項６に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
８．前記固形分除去工程において、前記固形分の除去を、前記水溶液および前記溶剤から選ばれる少なくとも１種の液体と共に抜き出すことにより行う前項５から前項７のいずれか１項に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
９．抜き出した固形分を固液分離し、得られた液体を前記水溶液と前記溶剤との接触工程以前の工程および相分離工程以降の工程の少なくとも一方に戻す、前項８に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
１０．前記固液分離を遠心沈降法により行う、前項９に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
１１．前記固液分離をフィルターを用いて行う、前項９に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
１２．前記溶剤を相分離により分離した後に残った液体と、該液体と相分離する溶剤とを、向流多段抽出塔で接触させ、後に該溶剤を相分離により分離する工程を含む、前項５から前項１１のいずれか１項に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法
１３．前記接触工程を３０〜６０℃で行う、前項５から前項１２のいずれか１項に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
１４．生物由来原料から得られた脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液から、脂肪族ジカルボン酸を製造する方法であって、以下の工程（１）〜（５）を含む脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
（１）脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液と、該水溶液と相分離する溶剤とを接触させる接触工程
（２）接触工程で回収された脂肪族ジカルボン酸を濃縮する工程であって、該濃縮により抽出相中の水濃度が上昇する抽出相濃縮工程
（３）抽出相濃縮工程後の液から脂肪族ジカルボン酸を析出させる晶析工程
（４）晶析工程で析出した脂肪族ジカルボン酸を回収する固液分離工程
（５）固液分離工程で得られた脂肪族ジカルボン酸を回収した後の晶析母液の少なくとも一部を晶析工程より前のいずれかの工程に戻す晶析母液リサイクル工程
１５．接触工程より前に、前記生物由来原料から得られた脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液に酸を加えるプロトン化工程を含む、前項１４に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
１６．晶析工程に供給される、抽出相濃縮工程後の脂肪族ジカルボン酸を含む溶液中に含まれる溶剤の濃度が１０重量％以下である、前項１４または１５に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
１７．晶析工程に供給される、前記脂肪族ジカルボン酸を含む溶液中に含まれる溶剤の濃度が１重量％以下である、前項１６に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
１８．固液分離工程で脂肪族ジカルボン酸を回収した後の母液から、脂肪族ジカルボン酸以外の成分を除去した後、当該液の少なくとも一部を接触工程から晶析工程までの間の少なくともいずれか１の工程にリサイクルする、前項１４から前項１７のいずれか１項に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
１９．抽出相濃縮工程以前のいずれかの工程において、水を加えることを特徴とする前項１５から前項１８のいずれか１項に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
２０．プロトン化工程において加える酸としてｐＫａが４未満の酸を用い、且つ該プロトン化工程における前記生物由来原料から得られた脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液のｐＨを、１より大きく４未満の範囲に維持することを特徴とする、前項１５から前項１９のいずれか１項に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
２１．接触工程で用いる溶剤が、有機性値に対する無機性値の比率が０．２以上２．３以下であり、且つ沸点が４０℃以上であることを特徴とする、前項１４から前項２０のいずれか１項に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
２２．接触工程より前に、微生物を除去する工程を含むことを特徴とする、前項１４から前項２１のいずれか１項に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。  
２３．接触工程より前に、タンパク質を除去する工程を含むことを特徴とする、前項１４から前項２２のいずれか１項に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。  
２４．接触工程でミキサーセトラーを用い、該ミキサーセトラーのセトラー部から、抽出相、抽残相および固形分を含む相を回収することを特徴とする、前項１４から前項２３のいずれか１項に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
２５．前記セトラー部から回収した固形分を含む相を固液分離し、液相を回収することを特徴とする前項２４に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
２６．接触工程で更に向流多段抽出塔を用い、セトラー部で得られた抽残相から脂肪族ジカルボン酸を回収することを特徴とする、前項２４または前項２５に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
２７．晶析工程において冷却を行うことを特徴とする、前項１４から前項２６のいずれか１項に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
２８．晶析工程が減圧操作を含むことを特徴とする、前項１４から前項２７のいずれか１項に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
２９．生物由来原料と微生物とを反応させて得られる脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液から、脂肪族ジカルボン酸を製造する方法であって、以下の工程（１）〜（６）を含む脂肪族ジカルボン酸を製造する方法。
（１）生物由来原料と微生物とを反応させることにより脂肪族ジカルボン酸を反応液中に蓄積させる脂肪族ジカルボン酸生成工程
（２）脂肪族ジカルボン酸生成工程で得られた脂肪族ジカルボン酸と微生物菌体とを含む液と、酸とを混合することにより、ｐＨ１．０以上５．０以下の液を得るｐＨ調整工程
（３）ｐＨ調整工程で得られた液から微生物菌体を分離する菌体分離工程
（４）菌体分離工程で菌体を分離して得られた水溶液と、該水溶液と相分離可能な溶剤とを接触させる接触工程
（５）前記水溶液と前記溶剤の接触により発生した固形分を除去する固形分除去工程
（６）前記溶剤を相分離により分離する相分離工程
３０．生物由来原料と微生物とを反応させて得られる脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液から、脂肪族ジカルボン酸を製造する方法であって、以下の工程（１）〜（８）を含む脂肪族ジカルボン酸を製造する方法。
（１）生物由来原料と微生物とを反応させることにより脂肪族ジカルボン酸を反応液中に蓄積させる脂肪族ジカルボン酸生成工程
（２）脂肪族ジカルボン酸生成工程で得られた脂肪族ジカルボン酸と微生物菌体とを含む液と、酸とを混合することにより、ｐＨ１．０以上５．０以下の液を得るｐＨ調整工程
（３）ｐＨ調整工程で得られた液から微生物菌体を分離する菌体分離工程
（４）菌体分離工程で菌体を分離して得られた水溶液と、該水溶液と相分離可能な溶剤とを接触させる接触工程
（５）接触工程で回収された脂肪族ジカルボン酸を濃縮する工程であって、該濃縮により抽出相中の水濃度が上昇する抽出相濃縮工程
（６）抽出相濃縮工程後の液から脂肪族ジカルボン酸を析出させる晶析工程
（７）晶析工程で析出した脂肪族ジカルボン酸を回収する固液分離工程
（８）固液分離工程で得られた脂肪族ジカルボン酸を回収した後の晶析母液の少なくとも一部を、晶析工程より前のいずれかの工程に戻す晶析母液リサイクル工程
【発明の効果】
【００２２】
本発明の方法によれば、生物由来原料から得られた脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液から、効率的かつ安定的に脂肪族ジカルボン酸を製造することができる。
【００２３】
すなわち、低速の遠心分離でも微生物菌体を効率よく分離できるので、設備負荷を軽減することができ、また、溶剤抽出における分液時間の短縮や中間不溶分の減少が可能となるため、簡便で効率よく脂肪族ジカルボン酸が精製できる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液と溶剤の接触工程、相分離工程および固形分除去工程を有する脂肪族ジカルボン酸の製造方法の一形態を示す図面である。
【図２】プラスミドｐＭＪＰＣ１７．２の構築手順を示す図。下線の数字は当該配列番号の配列からなるプライマーを示す。
【図３】実施例２−１および実施例３−１における抽出液の希釈・蒸留操作における組成変化を示す図面である。
【図４】実施例２−４におけるコハク酸を含む水溶液と溶剤の接触工程、相分離工程および固形分除去工程を示す図面である。
【図５】実施例２−８におけるコハク酸を含む水溶液と溶剤の接触工程、相分離工程および固形分除去工程を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
Ｉ．第１の本発明
第１の本発明は、生物由来原料と微生物とを反応させて得られる脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液から、脂肪族ジカルボン酸を製造する方法であって、以下の工程（１）〜（４）を含む脂肪族ジカルボン酸の製造方法である。
（１）生物由来原料と微生物とを反応させることにより脂肪族ジカルボン酸を反応液中に蓄積させる脂肪族ジカルボン酸生成工程
（２）脂肪族ジカルボン酸生成工程で得られた脂肪族ジカルボン酸と微生物とを含む液と、酸とを混合することにより、ｐＨ１．０以上５．０以下の液を得るｐＨ調整工程
（３）ｐＨ調整工程で得られた液から微生物を分離する微生物分離工程
（４）微生物分離工程で微生物を分離して得られた水溶液と、溶剤とを接触させる接触工程
【００２６】
前記（１）〜（３）以外の工程については、従前知られた如何なる工程を含んでいてもよい。以下、各工程に分けて詳述する。
【００２７】
Ｉ−（１）生物由来原料と微生物とを反応させることにより脂肪族ジカルボン酸を反応液中に蓄積させる脂肪族ジカルボン酸生成工程
（生物由来原料）
生物由来原料としては、例えば、木材、稲わら、籾殻、米ぬか、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、おから、コーンコブ、タピオカカス、バガス、植物油カス、芋、そば、大豆、油脂、古紙、製紙残渣、水産物残渣、家畜排泄物、下水汚泥および食品廃棄物等が挙げられる。
【００２８】
この中でも、木材、稲わら、籾殻、米ぬか、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、おから、コーンコブ、タピオカカス、バガス、植物油カス、芋、そば、大豆、油脂、古紙および製紙残渣等の植物資源が好ましく、木材、稲わら、籾殻、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、芋、油脂、古紙および製紙残渣がより好ましく、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバおよびサゴヤシが最も好ましい。
【００２９】
前記生物由来原料は、一般に、窒素元素やＮａ、Ｋ、ＭｇおよびＣａ等の多くのアルカリ金属、アルカリ土類金属を含有する。
【００３０】
前記生物由来原料は、特に限定はされないが、例えば、酸およびアルカリ等の化学処理、微生物を用いた生物学的処理、物理的処理等の公知の前処理および糖化の工程を経て、炭素源へ誘導される。
【００３１】
その工程には、特に限定はされないが、例えば、生物由来原料をチップ化する、削るおよび擦り潰す等の前処理による微細化工程が含まれる。必要に応じて、更にグラインダーまたはミルによる粉砕工程が含まれる。
【００３２】
こうして微細化された生物由来原料は、更に前処理・糖化の工程を経て炭素源へ誘導される。その具体的な方法としては、例えば、硫酸、硝酸、塩酸および燐酸等の強酸による酸処理、アルカリ処理、アンモニア凍結蒸煮爆砕法、溶媒抽出、超臨界流体処理および酸化剤処理等の化学的方法、微粉砕、蒸煮爆砕法、マイクロ波処理および電子線照射等の物理的方法、並びに微生物または酵素処理による加水分解等の生物学的処理が挙げられる。
【００３３】
（微生物）
微生物の種類は特に制限されないが、エシェリヒア・コリ等の腸内細菌、バチルス属細菌、コリネ型細菌などが挙げられ、好気性微生物、通性嫌気性微生物または微好気性微生物を使用することが好ましい。
【００３４】
好気性微生物としては、具体的には、例えば、コリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ  Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、サクシノバチルス（Ｓｕｃｃｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、アナエロビオスピリラム（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属細菌、アクチノバチルス（Ａｃｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、糸状菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属細菌およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌などが挙げられる。これらの中でも、コリネ型細菌が好ましい。
【００３５】
エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリなどが挙げられる。ラクトバチルス属細菌としては、例えば、ラクトバチルス・ヘルヴェチカスなどが挙げられる（Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００１，９１，ｐ８４６−８５２）。
【００３６】
バチルス属細菌としては、例えば、バチルス・ズブチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・プミルス、バチルス・ステアロサーモフィルス等が挙げられる。リゾビウム属細菌としては、例えば、リゾビウム・エトリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ）などが挙げられる。
【００３７】
コリネ型細菌としては、これに分類されるものであれば特に制限されないが、例えば、コリネバクテリウム属に属する細菌、ブレビバクテリウム属に属する細菌、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する細菌、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌およびマイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌などが挙げられる。
【００３８】
これらの中でも、コリネバクテリウム属に属する細菌およびブレビバクテリウム属に属する細菌が好ましく、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）に分類される細菌、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）に分類される細菌、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）に分類される細菌、およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に分類される細菌がさらに好ましい。
【００３９】
炭素源を脂肪族ジカルボン酸に変換する微生物としては、上記したような微生物の野生株、ＵＶ照射およびＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株並びに細胞融合および遺伝子組み換え法等の遺伝学的手法により誘導される組み換え体等が挙げられる。
【００４０】
前記遺伝子組み換え体としては、各脂肪族ジカルボン酸について生合成酵素遺伝子の発現強化や分解酵素遺伝子の発現低下等、公知の方法によって得られたものを用いる。
【００４１】
具体的には、例えば、炭素源をコハク酸に変換する組み換え体微生物として、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が非改変型と比べて増強するように遺伝子改変された微生物、およびラクトデヒドロゲナーゼ活性が非改変型と比べて低減するように遺伝子改変された微生物等が挙げられる。
【００４２】
ここで、組み換え体作製に用いるコリネ型細菌の親株の特に好ましい具体例としては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ３１８３１およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９等が挙げられる。
【００４３】
なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もある（Ｌｉｅｌｂｌ，Ｗ．，Ｅｈｒｍａｎｎ，Ｍ．，Ｌｕｄｗｉｇ，Ｗ．ａｎｄ  Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ，Ｋ．Ｈ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９９１，ｖｏｌ．４１，ｐ２５５−２６０）。
【００４４】
したがって、本発明においては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株、及びその変異株ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１株はそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株及びＭＪ−２３３  ＡＢ−４１株と同一の株であるものとする。
【００４５】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３は、１９７５年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−３０６８として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７の受託番号で寄託されている。
【００４６】
ピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、「ＰＣ」、または「ｐｃ」とも呼ぶ）活性が非改変型と比べて増強するように遺伝子改変された細菌は、例えば、日本国特開平１１−１９６８８８号公報に記載の方法と同様にして、コリネ型細菌などの微生物においてｐｃ遺伝子をプラスミドにより宿主細菌中で高発現させることにより構築することができる。
【００４７】
また、相同組換えによって染色体上に組み込んでもよいし、プロモーター置換によってｐｃ遺伝子の発現を増強することもできる。形質転換は、例えば、電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１４４，ｐ．１８１−１８５，１９９３）等によって行うことができる。
【００４８】
ＰＣ活性の増強は、公知の方法、例えば、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５８，５５−６２，（１９８４）に記載の方法によりＰＣ活性を測定することによって確認することができる。
【００４９】
また、ラクトデヒドロゲナーゼ（以下、「ＬＤＨ」と称することがある）活性が非改変型と比べて低減するように遺伝子改変された微生物は、例えば、日本国特開平１１−２０６３８５号公報に記載されている相同組換えによる方法、あるいは、ｓａｃＢ遺伝子を用いる方法（Ｓｃｈａｆｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １４５（１９９４）６９−７３）等で染色体上のＬＤＨ遺伝子を破壊することによって構築することができる。
【００５０】
なお、ＬＤＨ活性は完全に消失していてもよい。ＬＤＨ活性が低下または消失したことは、公知の方法（Ｌ．Ｋａｎａｒｅｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３９，４２０２（１９６４）等）によりＬＤＨ活性を測定することによって確認することができる。
【００５１】
なお、コハク酸の製造方法に用いる微生物は、後述の実施例に記載のように、ＰＣ活性の増強とＬＤＨ活性の低下の両方の改変がなされたものが好ましい。このような微生物として、例えば、日本国特開２００８−２５９４５１号公報に記載されているブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株等が挙げられる。
【００５２】
なお、炭素源を脂肪族ジカルボン酸に変換する微生物は上記微生物に限定されず、公知のいずれの微生物も用いることができる。
【００５３】
上記のような炭素源をコハク酸に変換する微生物を、炭素源を含む培地などの反応液中で炭素源と反応させることにより、コハク酸を該反応液中に蓄積させることができる。
【００５４】
反応に用いる微生物は、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接反応に用いてもよいが、微生物を予め液体培地で培養（種培養）して増殖させたものを用いるのが好ましい。
【００５５】
種培養に用いる培地は、上記微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウムおよび硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキスおよびペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いることができる。
【００５６】
種培養は、通常、コリネ型細菌であれば、生育至適温度である２５℃〜３５℃の範囲で通気、攪拌し酸素を供給しながら行う。培養時間は一定量の菌体が得られる時間であればよいが、通常、６〜９６時間である。
【００５７】
（脂肪族ジカルボン酸）
脂肪族ジカルボン酸としては、例えば、乳酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、オキザロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、２−オキソグルタル酸、シス−アコニット酸、ピルビン酸および酢酸などが挙げられる。この中では、コハク酸、リンゴ酸およびフマル酸などのジカルボン酸が好ましく、コハク酸が特に好ましい。脂肪族ジカルボン酸は複数種類含まれてもよい。
【００５８】
（反応液）
前記生物由来原料から誘導される炭素源を含む反応液中で、該炭素源を脂肪族ジカルボン酸に変換する微生物と、該炭素源とを反応させることにより、脂肪族ジカルボン酸を反応液中に蓄積させることができる。
【００５９】
上記生物由来原料から誘導される炭素源としては、通常、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボースおよびタガトース等のヘキソース、アラビノース、キシロース、リボース、キシルロースおよびリブロース等のペントース、マルトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、澱粉およびセルロース等の２糖または多糖類、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノクチン酸、アラキジン酸、エイコセン酸、アラキドン酸、ベヘニン酸、エルカ酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リグノセリン酸およびセラコレン酸等の脂肪酸、並びにグリセリン、マンニトール、キシリトールおよびリビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質を用いることが好ましい。このうち、グルコース、マルトース、フルクトース、スクロース、ラクトース、トレハロースおよびセルロースがより好ましい。
【００６０】
脂肪族ジカルボン酸としてコハク酸を生成する場合、反応液における炭素源の使用濃度は特に限定されないが、コハク酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、５〜３０％（Ｗ／Ｖ）とすることが好ましく、１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）とすることがより好ましい。
【００６１】
上記炭素源を含む反応液としては特に限定されず、例えば、微生物を培養するための培地であってもよいし、リン酸緩衝液等の緩衝液であってもよい。反応液は、窒素源および無機塩などをさらに含む水溶液であることが好ましい。
【００６２】
ここで、窒素源としては、微生物が資化してコハク酸を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキスおよびコーンスティープリカーなどの各種の有機または無機の窒素化合物が挙げられる。
【００６３】
無機塩としては、例えば、各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄および亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、パントテン酸、イノシトールおよびニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド並びにアミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加することが好ましい。また、反応時の発泡を抑えるために、培養液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが好ましい。
【００６４】
反応液には、例えば上記した炭素源、窒素源および無機塩などのほかに、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガス（炭酸ガス）を含有させることが好ましい。
【００６５】
炭酸イオンまたは重炭酸イオンは、中和剤としても用いることのできる、炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウムおよび重炭酸カリウムなどから供給されるが、必要に応じて、炭酸若しくは重炭酸またはこれらの塩あるいは二酸化炭素ガスから供給することもできる。
【００６６】
炭酸または重炭酸の塩の具体例としては、例えば、炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウムおよび重炭酸カリウム等が挙げられる。
【００６７】
炭酸イオンまたは重炭酸イオン反応液への添加量は、１〜５００ｍＭが好ましく、２〜３００ｍＭがより好ましく、３〜２００ｍＭがさらに好ましい。二酸化炭素ガスを反応液に含有させる場合は、溶液１Ｌ当たりの二酸化炭素ガスの含有量は５０ｍｇ〜２５ｇが好ましく、１００ｍｇ〜１５ｇがより好ましく、１５０ｍｇ〜１０ｇがさらに好ましい。
【００６８】
生物由来原料と微生物とを反応させて脂肪族ジカルボン酸を得る微生物変換においては、ｐＨが低くなると微生物の代謝活性が低くなったり、或いは微生物が活動を停止するようになり、製造歩留まりが悪化したり、微生物が死滅するため、通常には中和剤を使用する。
【００６９】
通常はｐＨセンサーによって反応系内のｐＨを計測し、所定のｐＨ範囲となるように中和剤の添加によりｐＨを調節する。ｐＨ値は、用いる細菌、カビ等の微生物の種類に応じて、その活性が最も有効に発揮される範囲に調整される。中和剤の添加方法については特に制限はなく、連続添加であっても間欠添加であってもよい。
【００７０】
中和剤としては、例えば、アンモニア、炭酸アンモニウム、尿素、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属の水酸化物、アルカリ金属の炭酸塩およびアルカリ土類金属の炭酸塩が挙げられる。これらの中でも、アンモニア、炭酸アンモニウムおよび尿素が好ましい。
【００７１】
前記アルカリ（土類）金属の水酸化物としては、例えば、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２およびＭｇ（ＯＨ）２等並びにこれらの混合物などが挙げられる。また、アルカリ（土類）金属の炭酸塩としては、例えば、Ｎａ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＣａＣＯ３、ＭｇＣＯ３およびＮａＫＣＯ３等並びにこれらの混合物などが挙げられる。
【００７２】
脂肪族ジカルボン酸としてコハク酸を生成する場合、生成反応におけるｐＨは、通常ｐＨ５〜１０であることが好ましく、ｐＨ６〜９．５であることがより好ましい。反応中も、必要に応じて反応液のｐＨをアルカリ性物質、炭酸塩および尿素などによって当該範囲内に調節することが好ましい。
【００７３】
脂肪族ジカルボン酸としてコハク酸を生成する場合、生成反応の温度は、３７〜４５℃が好ましく、３９℃〜４５℃がより好ましく、３９℃〜４３℃がさらに好ましく、３９〜４１℃が特に好ましい。
【００７４】
脂肪族ジカルボン酸としてコハク酸を生成する場合、反応時間は、１時間〜１６８時間が好ましく、３時間〜７２時間がより好ましい。
【００７５】
脂肪族ジカルボン酸としてコハク酸を生成する場合、反応に用いる微生物の量は、特に規定されないが、１〜７００ｇ／Ｌが好ましく、１０〜５００ｇ／Ｌがより好ましく、２０〜４００ｇ／Ｌがさらに好ましい。
【００７６】
脂肪族ジカルボン酸としてコハク酸を生成する場合、生成反応は、通気、攪拌して行ってもよいが、通気せず、酸素を供給しない嫌気的雰囲気下で行ってもよい。ここで言う嫌気的雰囲気下は、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを供給して反応させる、二酸化炭素ガス含有の不活性ガスを通気する等の方法によって得ることができる。
【００７７】
以上のような反応により、脂肪族ジカルボン酸が反応液中に生成、蓄積し、「脂肪族ジカルボン酸と微生物を含む液」が得られる。
【００７８】
以上、炭素源をコハク酸に変換する微生物およびそれを用いてコハク酸と微生物を含む液を得る方法を例に挙げて説明したが、炭素源をコハク酸以外の脂肪族ジカルボン酸に変換する微生物、およびそれらを用いた脂肪族ジカルボン酸の生産方法も数多く知られている。
【００７９】
したがって、微生物による脂肪族ジカルボン酸生成における反応温度および圧力等の反応条件は、選択される菌体およびカビなど微生物の活性に依存することになるが、脂肪族ジカルボン酸を得るための好適な条件を各々の場合に応じて選択すればよい。
【００８０】
本発明においては、微生物変換後の発酵液は、その後の精製工程での操作性および効率性を考慮して適宜濃縮してもよい。濃縮方法としては、特に限定されないが、例えば、不活性ガスを流通させる方法、加熱により水を留去させる方法および減圧で水を留去させる方法並びにこれらを組み合わせる方法などが挙げられる。また濃縮操作は、バッチ操作で行っても、連続操作で行ってもよい。
【００８１】
上記のようにして得られた「脂肪族ジカルボン酸と微生物を含む液」に下記（２）〜（４）の精製工程を適用することにより、脂肪族ジカルボン酸を製造することができる。
【００８２】
Ｉ−（２）脂肪族ジカルボン酸生成工程で得られた脂肪族ジカルボン酸と微生物とを含む液と、酸とを混合することにより、ｐＨ１．０以上５．０以下の液を得るｐＨ調整工程
脂肪族ジカルボン酸と微生物とを含む液（発酵懸濁液）から菌体を分離する際の発酵懸濁液のｐＨは、通常１．０以上５．０以下が好ましく、１．５以上４．０以下がより好ましく、２．０以上３．５以下がさらに好ましい。
【００８３】
発酵懸濁液のｐＨの調整が必要な場合、酸であれば特に限定されないが、塩酸、硫酸、燐酸および硝酸などの酸を用いてｐＨの調整を行うことができる。
【００８４】
後述する接触工程で脂肪族ジカルボン酸を溶剤中に回収する際に、該脂肪族ジカルボン酸を含有する水溶液において、脂肪族ジカルボン酸が塩の水溶液として存在する場合、脂肪族ジカルボン酸および／または脂肪族ジカルボン酸の塩が、脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液と相分離する溶剤中に抽出される量が少ない場合がある。したがって、当該水溶液に酸を加えてｐＨを調整することで、プロトン化することが好ましい。
【００８５】
例えば、生物由来原料から脂肪族ジカルボン酸を得る際に、微生物による発酵を利用して得る場合には、発酵を効率的に進めるために発酵液の水素イオン濃度（ｐＨ）を調整する場合がある。
【００８６】
アルカリ中和を行った場合、脂肪族ジカルボン酸が塩の水溶液として存在することになるため、プロトン化を行うことが特に好ましい。例えば、発酵操作で中和剤としてアンモニアを用いた場合、脂肪族ジカルボン酸はアンモニウム塩として存在することになるため、酸によるプロトン化を行うことが好ましい。
【００８７】
プロトン化は、後述する接触工程の前であれば、如何なる段階において実施してもよい。
【００８８】
プロトン化で用いる酸は、脂肪族ジカルボン酸塩と塩交換する必要があるので、通常は脂肪族ジカルボン酸より強い酸、すなわち酸解離定数ｐＫａが脂肪族ジカルボン酸より小さい酸、通常はｐＫａが４未満の酸を用いることが好ましい。
【００８９】
プロトン化に用いる酸としては、有機酸であっても、無機酸であっても構わず、１価の酸であっても多価の酸であっても構わないが、無機酸の方が好ましい。
【００９０】
プロトン化で硫酸を用いた場合は、硫酸アンモニウムが副生塩として発生する。本発明の製造方法で、無機塩が副生塩である場合には、接触工程で副生塩による塩析効果による液々分離性状の改善が期待できるため好ましい。
【００９１】
酸を加える量は用いる酸の強度にもよるが、通常は脂肪族ジカルボン酸塩を構成するカチオン量に対し、０．１〜５倍等量の酸を添加することが好ましい。通常、酸の添加はｐＨで調整する。
【００９２】
プロトン化に用いる酸のｐＨは、脂肪族ジカルボン酸の酸強度ｐＫａにもよるが、少なくともｐＫａ以下とすることが好ましい。また、ｐＨは、１より大きく、４未満の範囲とすることが好ましい。
【００９３】
一方、酸を過剰に加えてもｐＨの下がり方は徐々に鈍化し、過剰の酸は脂肪族ジカルボン酸塩とは塩交換せず酸として系内に存在することとなる。余剰の酸は最終的には後続の接触工程で抽残相として回収させ、その処理には再び中和処理等が必要になり非効率である。従ってｐＨは１以上で制御することが好ましい。
【００９４】
なお、ｐＨ調整工程と後述するプロトン化工程は、１つの工程で併用しても構わない。すなわち、ｐＨ調整工程にプロトン化工程が含まれていてもよく、ｐＨ調整工程でプロトン化まで行ってもよい。
【００９５】
Ｉ−（３）ｐＨ調整工程で得られた液から微生物を分離する微生物分離工程
微生物を発酵懸濁液より分離除去する方法としては、沈降分離、遠心分離およびろ過分離並びにそれらを組み合わせた方法などが用いられる。工業的には、遠心分離および膜ろ過分離などの方法で行われる。遠心分離においては、遠心沈降および遠心ろ過などを用いることができる。
【００９６】
遠心分離法は、微生物を通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上を除去することができれば、分離機の種類および運転条件に限定されるものではないが、通常１００Ｇ〜１００，０００Ｇの遠心力で分離することが好ましい。
【００９７】
また、分離操作はバッチ式でも連続式でも行うことができる。
【００９８】
膜濾過に用いられる膜は、脂肪族ジカルボン酸が通過し、微生物およびその凝集体が通過できないポアサイズの膜であれば特に制限されないが、精密濾過膜および限外濾過膜が好ましく、精密濾過膜がより好ましい。
【００９９】
膜の材質は特に限定は無く、例えば、ポリオレフィン、ポリスルフィン、ポリアクリロニトリルおよびポリフッ化ビニリデン等の有機膜でも、セラミック等の無機材質の膜でも使用できる。
【０１００】
また操作方法として、デッドエンド型およびクロスフロー型のいずれでも用いることができる。膜ろ過分離では、微生物が膜に目詰まりすることが多いので、遠心分離などで微生物の粗取りしてから膜ろ過を行うなどの方法も用いられる。
【０１０１】
Ｉ−（４）微生物分離工程で微生物を分離して得られた水溶液と、溶剤とを接触させる接触工程
微生物分離工程で微生物を分離した後の脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液と、溶剤とを接触させて、脂肪族ジカルボン酸を抽出する。当該水溶液を濃縮した後に溶剤と接触させてもよい。接触工程により、脂肪族ジカルボン酸を選択的に溶剤中に抽出することができ、水溶性の高い糖類、アミノ酸類および無機塩類は主に水溶液相に分配される。
【０１０２】
脂肪族ジカルボン酸塩のプロトン化で発生した副生塩は水溶液相に分配され、脂肪族ジカルボン酸と容易に分離できる。例えば副生塩が硫酸アンモニウムの場合は、ほぼ全てが水溶液相に回収される。同時に硫酸アンモニウムは、水溶液相に回収されたアミノ酸、糖類とともに濃縮、晶析、乾燥等の処理によりアミノ酸、糖類を有機分含んだ硫酸アンモニウムとして回収することができる。この硫酸アンモニウムは有機物を適度に含むことから肥料として有用である。
【０１０３】
（溶剤）
接触工程において使用する溶剤としては、脂肪族ジカルボン酸を含有する水溶液と相分離する有機溶媒であれば特に制限は無いが、無機性値／有機性値の比（以下、Ｉ／Ｏ値と略記することがある）が０．２以上２．３以下であることが好ましく、０．３以上２．０以下であることがより好ましい。
【０１０４】
前記溶剤を用いることにより、脂肪族ジカルボン酸を選択的に抽出して、効率よく夾雑不純物と分離できる。
【０１０５】
また、接触工程において使用する溶剤は、常圧（１気圧）で沸点が４０℃以上であることが好ましく、６０℃以上であることがより好ましい。また、常圧での沸点が１２０℃以下であることが好ましく、１００℃以下であることがより好ましく、９０℃以下であることが好ましい。
【０１０６】
前記溶剤を用いることにより、溶剤が気化して引火する危険性や、溶剤が気化して脂肪族ジカルボン酸の抽出効率が低下するという問題や溶媒のリサイクルがしにくいといった問題を回避することができる。また、使用後の溶剤を蒸留などの方法により分離したり、精製して再利用したりする際の必要熱量が少なくてすむという利点がある。
【０１０７】
無機性値及び有機性値は、有機概念図論（「系統的有機定性分析」藤田穆、風間書房（１９７４））により提案されており、有機化合物を構成する官能基に対して予め設定された数値を基に有機性値及び無機性値を算出し、その比を求めて得られる。
【０１０８】
Ｉ／Ｏ値が０．２以上２．３以下であり、常圧で沸点が４０℃以上の有機溶媒としては、例えば、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトンおよびアセトン等のケトン系溶媒、テトラヒドロフランおよびジオキサン等のエーテル系溶媒、酢酸エチル等のエステル系溶媒、アセトニトリル等のニトリル系溶媒、並びにプロパノール、ブタノールおよびオクタノール等の炭素鎖３以上のアルコールが例示される。
【０１０９】
各有機溶媒のＩ／Ｏ値および沸点を表１に示す。
【０１１０】
【表１】
0005991400.tif 000002
【０１１１】
前記のような溶剤を、微生物分離工程で微生物を分離して得られた水溶液に接触させて、脂肪族ジカルボン酸を抽出する。ここで、溶剤は、該「微生物分離工程で微生物を分離して得られた水溶液」の容量１に対し０．５〜５の容量で加えることが好ましく、１〜３の容量で加えることがより好ましい。
【０１１２】
（接触操作）
接触工程の温度は、脂肪族ジカルボン酸が抽出される温度であれば特に限定されないが、１０〜５０℃が好ましく、２０〜４０℃がより好ましい。
【０１１３】
接触工程により、脂肪族ジカルボン酸が溶剤中に回収される。また、上記水溶液にアミノ酸または糖類が含まれる場合は、アミノ酸および糖類はともに水溶液相に分配されるので、脂肪族ジカルボン酸を糖類およびアミノ酸と分離できる。
【０１１４】
接触工程における、脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液と、該水溶液と溶剤とを接触させる操作は、一段で行っても、多段で行ってもよいが多段で行うことが好ましい。また溶剤は脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液に対して並流で流しても、向流で流しても構わない。
【０１１５】
また、溶剤中に得られた脂肪族ジカルボン酸については、カラム処理および晶析処理等のさらなる精製操作を行ってもよい。また、複数の脂肪族ジカルボン酸が含まれる場合は目的の脂肪族ジカルボン酸のみを分離する操作をさらに行ってもよい。
【０１１６】
接触する際の時間は、脂肪族ジカルボン酸が充分に抽出される時間であれば特に限定されず、接触装置、接触条件にもよるが、通常１秒〜５時間が好ましい。
【０１１７】
接触時間を１秒以上とすることにより、脂肪族ジカルボン酸の溶剤相への抽出が十分となる。一方、接触時間を５時間以下とすることにより、接触装置が無用に大きくなるのを防ぎ効率的であるとともに、脂肪族ジカルボン酸に共存するタンパク質類の溶剤による変性を抑え、後述する固形分を減少することができる。
【０１１８】
接触する際の圧力は、脂肪族ジカルボン酸が充分に抽出される圧力であれば特に限定されないが、連続的に行う場合には、通常大気圧で操作される。
【０１１９】
脂肪族ジカルボン酸がコハク酸である場合、上記本発明の方法によりコハク酸を製造した後に、得られたコハク酸を用いてコハク酸誘導体を製造することができる。
【０１２０】
ここで、コハク酸誘導体としては、例えば、コハク酸塩、無水コハク酸、無水マレイン酸、コハク酸エステル、コハク酸イミド、１，４−ジアミノブタン、コハク酸ニトリル、２−ピロリドン、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ−エチルピロリドン（ＮＥＰ）、１，４−ブタンジオール（１，４−ＢＧ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、γ−ブチロラクトン（ＧＢＬ）およびポリテトラメチンエーテルグリコール（ＰＴＭＧ）などが挙げられる。
【０１２１】
また、本発明の製造方法により製造されたコハク酸を原料として重合反応を行うことにより、コハク酸含有ポリマーを製造することができる。
【０１２２】
近年、環境に配慮した工業製品が数を増す中、植物由来の原料を用いたポリマーに注目が集まってきており、特に、本発明において製造されるコハク酸は、ポリエステルおよびポリアミド等のポリマーに加工して用いることが出来る。
【０１２３】
コハク酸含有ポリマーとしては、具体的には、例えば、ブタンジオールおよびエチレングリコールなどのジオールとコハク酸とを重合させて得られるコハク酸ポリエステル、並びにヘキサメチレンジアミンなどのジアミンとコハク酸とを重合させて得られるコハク酸ポリアミドなどが挙げられる。
【０１２４】
ＩＩ．第２の発明
第２の発明は、生物由来原料から得られる脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液から、脂肪族ジカルボン酸を製造する方法であって、以下の工程（１）〜（３）を含む脂肪族ジカルボン酸の製造方法である。
（１）生物由来原料から得られる脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液と、該水溶液と相分離可能な溶剤とを接触させる接触工程
（２）接触工程で前記水溶液と前記溶剤の接触により発生した固形分を除去する固形分除去工程
（３）前記溶剤を相分離により分離する相分離工程
【０１２５】
前記（１）〜（３）以外の工程については、従前知られた如何なる工程を含んでいてもよい。以下、各工程に分けて詳述する。
【０１２６】
ＩＩ−（１）生物由来原料から得られる脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液と、該水溶液と相分離可能な溶剤とを接触させる接触工程
接触工程により、脂肪族ジカルボン酸を選択的に溶剤中に抽出することができ、水溶性の高い糖類、アミノ酸類、無機塩類は主に水溶液相に分配される。
【０１２７】
溶剤としては、脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液と相分離するものであれば特に制限されず、Ｉ−（４）で上述した溶剤を用いることができる。
【０１２８】
脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液と溶剤との接触操作としては、Ｉ−（４）で上述したように行う。なお、接触する際の温度は、脂肪族ジカルボン酸が抽出される温度であれば特に限定されないが、３０〜６０℃が好ましい。
【０１２９】
接触温度を３０℃以上とすることにより、溶剤の粘度が上昇するのを抑え、後述する固形分の沈降に要する時間を短縮し、固形分が溶剤相に浮遊するのを防ぐことができ、溶剤相に固形分が混入するのを防ぐことができる。また、接触温度を６０℃以下とすることにより、脂肪族ジカルボン酸の抽出率を向上することができ、効率が良い。
【０１３０】
後述する相分離工程では、水溶液と溶剤とを相分離させるが、場合により相界面に固形分を含む相（以下、中間相と記載することがある）が形成されることがある。該中間相が溶剤相（以下、抽出相と記載することがある）と、水溶液相（以下、抽残相という記載することがある）とを分離することを困難にしたり、抽出相への不純物の混入量を増加させたりする虞がある。したがって、中間相を除去することが好ましい。
【０１３１】
接触工程の特に好ましい形態は、図１に示すように、脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液と溶剤とをミキサーセトラーで混合した後に液々分離し、抽出相液、中間相、抽残相をそれぞれ分離回収し、中間相は固液分離し、分離回収した液を必要に応じて相分離した後に接触工程以前の工程および相分離工程以降の工程の少なくとも一方に戻すことである。
【０１３２】
（接触装置）
接触装置は、脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液と溶剤との接触および溶剤相、水溶液相の回収、および後述する固形分除去工程において固形分の除去ができればどのような装置であってもよいが、装置が簡単で操作も容易な、上記のミキサーセトラー型抽出装置が好ましい。
【０１３３】
ミキサーは脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液と、該水溶液と相分離可能な溶剤とが充分混合すれば如何なる方式でもよく、例えば、攪拌装置を有する容器およびスタティックミキサーなどが挙げられる。
【０１３４】
ただし、攪拌装置を有する容器を用いるケースにおいては、攪拌により容器内に巻き込まれた空気などの気泡が発生した固形分に付着し、後続のセトラー部における固形分の相分離を著しく阻害するので、空気などを巻き込まない条件で攪拌することが好ましい。操作許容範囲の広さおよび設備費用の観点から、ミキサーはスタティックミキサーとするのが好ましい。
【０１３５】
（接触工程と相分離工程）
第２の本発明の脂肪族ジカルボン酸の製造方法は、脂肪族ジカルボン酸を含有する水溶液と、該水溶液と相分離可能な溶剤とを接触させる接触工程と、接触工程後に液を相分離させる、後述する相分離工程を含む。
【０１３６】
接触工程をバッチ操作により行う場合には、脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液に該水溶液と相分離可能な溶剤を加え、充分混合した後に、相分離工程において、抽出相、中間相および抽残相を、それぞれの相付近から排出口により取り出す方法、並びに接触を行った容器の底部から順次取り出す方法等により、それぞれ分離回収することができる。固形分を多く含む中間相は抽出相とともに取り出すことも可能であるし、抽残相とともに取り出すことも可能である。
【０１３７】
また、例えば、接触工程を連続操作により行う場合には、脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液と、該水溶液と相分離可能な溶剤とを接触混合するミキサーを有するミキサー部と、接触混合することにより得られた混合液を静置することで相分離させる工程（以下、相分離工程と記載することがある）に適用するセトラーを有するセトラー部とからなる、接触装置（以下、ミキサーセトラー型抽出機と記載することがある）を用いた相分離工程において、セトラー部で抽出相、中間相および抽残相をそれぞれ回収することもできる。
【０１３８】
ＩＩ−（２）接触工程で前記水溶液と前記溶剤の接触により発生した固形分を除去する固形分除去工程
固形分除去工程では、生物由来原料から得られた脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液と、該水溶液と相分離可能な溶剤との接触により発生した固形分を除去する。
【０１３９】
通常、生物由来原料から得る際に微生物による発酵法を用いた場合、脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液には、生物由来のタンパク質など高次構造を有した高分子類が存在することが多い。タンパク質などは通常水溶性が高く、抽出操作においてはその殆どが水溶液相へ分配されるが、接触工程で溶剤と接触することにより、その高次構造が破壊、変性し、水にも溶剤にも溶解せず固形分になるものが一部存在する。
【０１４０】
したがって、本発明に係る固形分除去工程では、接触工程により生成した水にも溶剤にも溶解しない固形分を除去する。
【０１４１】
接触工程で生成した固形分は、主に液々界面近傍に集まる傾向にあり、相分離を困難にさせる課題がある。液々界面近傍に固形分が生成した場合でも、バッチ法で接触させている場合には、生成した固形分を都度除去して抽出相、抽残相を回収すれば操作上大きな問題とはならない場合がある。
【０１４２】
一方、連続抽出、特に向流多段抽出塔では、固形分が連続的に発生するため、液々分散や液々分離に支障が生じ、安定運転を妨げるばかりか、抽出ができなくなることさえある。
【０１４３】
また、固形分を含んだ液が後の工程に移行すると、後続工程で悪影響を及ぼすことがある。例えば、接触工程で回収された脂肪族ジカルボン酸を含む抽出液は、脂肪族ジカルボン酸濃度が低いので濃縮する場合があるが、固形分が存在すると、リボイラーなど加熱面に固形分が付着、焦げ付き、伝熱効率を悪化させる。
【０１４４】
さらに後続工程にもよるが、品質上問題になるケースもある。例えば、脂肪族ジカルボン酸をポリエステル原料として用いる場合においては、窒素分がポリマーの色調に大きく関与していることが判明している。固形分はタンパク質変性物を多く含み、窒素分を多く含むため、固形分が最終製品に混在するとポリエステル色調に影響を及ぼす虞がある。
【０１４５】
上記の理由から、接触工程で生成した固形分を固形分除去工程で除去することにより、これらの課題が解決される。
【０１４６】
固形分の除去方法としては特に限定されず、例えば、固形分を濾過する方法や、相溶しない液体同士を接触させた後各相を相分離させる機能を有する装置で分離する方法により行うことができる。
【０１４７】
例えば、バッチ抽出においては、脂肪族ジカルボン酸を含む発酵液に溶剤を加え、充分混合した後、抽出相、固形物を多く含む中間相および抽残相をそれぞれ分離回収することができる。
【０１４８】
また、連続抽出においては、発酵液と溶剤を混合するミキサー部と混合液を液々分離するセトラー部からなるミキサーセトラー型抽出器において、セトラーで抽出相、固形分を多く含む中間相および抽残相をそれぞれ回収することができる。
【０１４９】
ミキサーは発酵液と溶剤が充分混合すればどんな方式でもよく、例えば、攪拌槽およびスタティックミキサーなどが挙げられる。ただし、攪拌槽を用いるケースにおいては、発生した固形分に攪拌により攪拌槽内に巻き込まれた気泡が固形分に付着し、後続のセトラーにおける固形分の沈降を著しく阻害するので、攪拌条件の設定には注意を要する。
【０１５０】
操作許容範囲の広さおよび設備費用の観点からは、ミキサーはスタティックミキサーとするのが好ましい。
【０１５１】
一方、セトラーのタイプは特に限定されない。例えば、一槽式で抽出相、中間相および抽残相をそれぞれ回収するタイプ、並びに多槽式で抽出相、中間相および抽残相をそれぞれ回収するタイプなどが挙げられる。
【０１５２】
固形物を多く含む中間相は、抽出相および抽残相も含むため、固液分離し、固形分と抽出相および／または抽残相を分離し、抽出相および／または抽残相を回収することができる。
【０１５３】
固液分離方法についても特に限定されるものではないが、沈降分離およびろ過分離のいずれの方法も用いることができる。沈降分離においては、重力場で固形分を沈降分離しても、また遠心力場において固形分を沈降分離してもよい。
【０１５４】
中でも、その沈降速度から遠心沈降分離が好ましい。また、その方式は、バッチ操作でも連続操作でもよい。連続式の遠心沈降機としては、例えば、スクリューデカンターおよび分離板式遠心沈降機が挙げられる。
【０１５５】
ろ過分離において、その方法は、ろ材、ろ過圧力、連続操作・バッチ操作などで分類されるが、いずれも固形分を抽出相および／または抽残相と分離できれば特に限定するもののではない。
【０１５６】
ただし、ろ材の目開きは０．１μｍ以上１０μｍ以下が好ましい。０．１μｍ以上とすることにより、透過流束が十分となり、ろ過の時間を短縮することができる。また、１０μｍ以下とすることにより、固形分の分離が十分となる。
【０１５７】
また、ろ材の材質は溶剤に不溶である必要があることから、テフロン（登録商標）などを用いることが好ましい。ろ過は、真空式、加圧式および遠心式のいずれも用いることができる。さらに、その方式は、連続式でも、バッチ式でも構わない。
【０１５８】
固形分は、固形分を選択的に分離する方法で除去しても構わないし、接触工程で用いる液とともに除去しても構わないが、脂肪族ジカルボン酸の回収効率を高めるために固形分のみを選択的に除くことが好ましい。接触工程で用いる液とともに除去した場合には、後の工程で固液分離して固形分のみを選択的に除去することが好ましい。
【０１５９】
より具体的には、接触工程で用いる液とともに固形分を取り出して除去し、取り出した液と固形物の混合物から固形分を更に分離した上で、液のみを再度接触工程以前の工程および相分離工程以降の工程の少なくとも一方に戻すことが好ましい。
【０１６０】
ＩＩ−（３）前記溶剤を相分離により分離する相分離工程
（相分離操作）
相分離工程における相分離操作は、槽で一定時間静置することでも可能であるし、遠心分離装置により行うこともできる。上記のようなミキサーセトラー型抽出機では、接触混合することにより得られた混合液を静置することで相分離させるセトラー部を有しており、セトラー部において液を一定時間静置することにより、相分離することができる。
【０１６１】
相分離工程は、連続的に行ってもよいし、回分的に行っても構わない。
【０１６２】
相分離する際の温度は、各相が分離可能な温度であれば特に限定されないが、３０〜６０℃が好ましく、かつ接触操作と同程度の温度で処理することが好ましい。
【０１６３】
相分離温度を３０℃以上とすることにより、液粘性が高くなるのを防ぎ、固形分の分離が容易となり、溶剤相への固形分の混入および固形分に混入する溶剤量の増加を抑えることができる。また、相分離温度を６０℃以下とすることにより、相分離の過程でコハク酸が水溶液中に逆抽出されるのを防ぐことができる。
【０１６４】
相分離する際の時間は、各相が相分離される時間であれば特に限定されず、接触装置、接触条件および相分離方法にもよるが、通常１分〜５時間が好ましい。
【０１６５】
相分離時間を１分以上とすることにより、相分離が十分となり、溶剤相への水溶液および固形分の混入並びに水溶液相への溶剤および固形分の混入を防ぐことができる。また、相分離時間を５時間以下とすることにより、相分離装置が無用に大きくなるのを防ぎ、効率的である。
【０１６６】
また相分離する際の圧力は、脂肪族ジカルボン酸が充分に抽出される圧力であれば特に限定されないが、連続的に行う場合には、通常大気圧で操作することが好ましい。
【０１６７】
（相分離装置）
相分離工程に用いるセトラーは、脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液と、該水溶液と相分離可能な溶剤とを接触させた後の液を相分離することが可能なものであれば、如何なる方式であってもよい。
【０１６８】
具体的には、例えば、一槽で抽出相、中間相および抽残相をそれぞれ回収するもの、多槽式で抽出相、中間相および抽残相をそれぞれ回収するもの、並びに回転装置による遠心分離により各相を回収するものなどが挙げられる。
【０１６９】
固形物を多く含む中間相は、通常、抽出相の液および抽残相の液から選ばれる少なくとも１種の液を含むため、ＩＩ−（２）で上記した方法と同様の方法で、中間相を固液分離し、抽出相の液および抽残相の液から選ばれる少なくとも１種の液を分離し、回収することができる。
【０１７０】
＜脂肪族ジカルボン酸＞
第２の本発明の脂肪族ジカルボン酸としては、生物由来原料から得られた脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液から製造されるものであれば特に限定されず、カルボキシ基を２つ有する脂肪族炭化水素であれば如何なるものも採用することができる。
【０１７１】
脂肪族ジカルボン酸の炭素数は、２以上４０以下であることが好ましく、３以上２０以下であることがより好ましく、３以上１０以下であることが特に好ましい。炭化水素基の有する炭素数を４０以下とすることにより、安定した水溶液として存在することが容易となる。また、炭素数を２以上とすることにより、水溶液と相分離可能な溶剤中に安定して存在することが容易となる。また、脂肪族ジカルボン酸の脂肪族炭化水素基部分は、直鎖状であっても環状であっても構わない。
【０１７２】
より具体的には、例えば、シュウ酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、セバシン酸、リンゴ酸、フマル酸、オキザロ酢酸、２−オキソグルタル酸、シス−アコニット酸、ドデカン二酸およびダイマー酸等が挙げられる。これらの中では、アジピン酸、コハク酸およびダイマー酸が好ましく、コハク酸およびアジピン酸が特に好ましい。
【０１７３】
第２の本発明においては、生物由来原料から誘導される炭素源から脂肪族ジカルボン酸が誘導される。具体的には、例えば、これらの炭素源を用いて、微生物変換による発酵法、および加水分解・脱水反応・水和反応・酸化反応・還元反応等の反応工程を含む化学変換法並びにこれらの組み合わせによりジカルボン酸が合成されることが好ましい。
【０１７４】
これらの中でも、脂肪族ジカルボン酸生産能を有する微生物を利用した微生物変換による発酵法が好ましい。脂肪族ジカルボン酸生産能を有する微生物を利用した微生物変換による発酵法は、Ｉ−（１）で上述したように行う。
【０１７５】
尚、本発明の方法において発酵液を用いる場合、微生物を除去した後の発酵液を用いることが好ましい。微生物の除去方法は、Ｉ−（３）で上述したように行う。
【０１７６】
上記のように生物由来原料から誘導される炭素源から微生物変換により得られた脂肪族ジカルボン酸は、水溶液中に通常溶解した状態で存在することになるが、後の接触工程の前にジカルボン酸の一部が、例えば析出などして固体として存在していても構わない。
【０１７７】
また、通常、微生物変換により得られた脂肪族ジカルボン酸を含有する水溶液は、微生物変換の際に用いた糖類やアミノ酸などを含有しており、このような水溶液と溶剤とを、後の接触工程で接触させた場合には特に固形物が生成しやすく、本発明の課題が顕著となり、本発明による解決の効果も大きくなる。
【０１７８】
＜後続工程＞
抽出相中に選択的に回収された脂肪族ジカルボン酸を最終的に脂肪族ジカルボン酸結晶として回収するには、通常、濃縮工程および晶析工程が必要となる。ここで抽出相から脂肪族ジカルボン酸結晶を回収する一般的な方法を説明するが、本発明に採用可能な後続工程はこれらに制限されない。
【０１７９】
（抽出相濃縮工程）
抽出相濃縮工程は、ＩＩＩ−（２）において後述するように行う。
【０１８０】
（晶析工程）
晶析工程は、ＩＩＩ−（３）において後述するように行う。
【０１８１】
（固液分離工程）
晶析工程で得られた脂肪族ジカルボン酸スラリーは、ＩＩＩ−（４）において後述するように、固液分離操作により脂肪族ジカルボン酸結晶および母液を分離する。
【０１８２】
ＩＩＩ．第３の本発明
第３の本発明は、生物由来原料から得られた脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液から、脂肪族ジカルボン酸を製造する方法であって、以下の工程（１）〜（５）を含む脂肪族ジカルボン酸の製造方法である。
（１）脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液と、該水溶液と相分離する溶剤とを接触させる接触工程
（２）接触工程で回収された脂肪族ジカルボン酸を濃縮する工程であって、該濃縮により抽出相中の水濃度が上昇する抽出相濃縮工程
（３）抽出相濃縮工程後の液から脂肪族ジカルボン酸を析出させる晶析工程
（４）晶析工程で析出した脂肪族ジカルボン酸を回収する固液分離工程
（５）固液分離工程で得られた脂肪族ジカルボン酸を回収した後の晶析母液の少なくとも一部を晶析工程より前のいずれかの工程に戻す晶析母液リサイクル工程
【０１８３】
前記（１）〜（５）以外の工程については、従前知られた如何なる工程を含んでいてもよい。以下、各工程に分けて詳述する。
【０１８４】
ＩＩＩ−（１）脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液と、該水溶液と相分離する溶剤とを接触させる接触工程
接触工程は、ＩＩ−（１）で上述したように行う。また、接触工程より前に、上記した方法により、微生物またはタンパク質を除去する工程を含むことが好ましい。
【０１８５】
接触工程においては、上記したように、ミキサーセトラーを用い、該ミキサーセトラーのセトラー部から、抽出相、抽残相および固形分を含む相を回収することが好ましく、該セトラー部から回収した固形分を含む相を固液分離し、液相を回収することがより好ましい。
【０１８６】
また、向流多段抽出塔を用い、セトラー部で得られた抽残相から脂肪族ジカルボン酸を回収することがさらに好ましい。
【０１８７】
ＩＩＩ−（２）接触工程で回収された脂肪族ジカルボン酸を濃縮する工程であって、該濃縮により抽出相中の水濃度が上昇する抽出相濃縮工程
一般に、抽出相における脂肪族ジカルボン酸濃度は希薄であるため濃縮操作が必要となる。濃縮度は特に限定されるものではないが、最終濃縮液中の脂肪族ジカルボン酸の溶解度が飽和溶解度以下であり、かつ極力飽和溶解度に近いほうが好ましい。
【０１８８】
また脂肪族ジカルボン酸の抽出に用いる溶剤は、水と最低共沸組成を形成することが多く、また共沸組成は溶剤リッチな組成であることが多い。従って、濃縮操作に伴い、溶剤が多く留去することとなり、濃縮液中の溶剤濃度は濃縮前に比べて低下する。
【０１８９】
生物由来原料から得られた脂肪族ジカルボン酸は、一般に水溶性の高い不純物を多く含むため、後続の晶析工程において、溶剤が共存する系よりも水が存在する系の方が高い精製効果が期待できる。
【０１９０】
また溶剤が後続工程まで残留するとその回収がより困難となるため、抽出相濃縮工程後の脂肪族ジカルボン酸を含む溶液中に含まれる溶剤の濃度は、１０重量％以下とすることが好ましく、１重量％以下とすることがより好ましい。
【０１９１】
最終濃縮液の溶剤濃度を１０質量％以下とし、また、脂肪族ジカルボン酸濃度を飽和溶解度近傍とするためには、抽出相の濃縮前および濃縮操作の過程のうち少なくとも一方の工程で水を加えることが好ましい。
【０１９２】
ＩＩＩ−（３）抽出相濃縮工程後の液から脂肪族ジカルボン酸を析出させる晶析工程
晶析工程は、通常、抽出相を含有する溶液中の脂肪族ジカルボン酸を、ジカルボン酸の溶解度差などを利用して固体の脂肪族ジカルボン酸を析出させる工程である。
【０１９３】
晶析方法は、抽出相を含有する溶液から脂肪族ジカルボン酸を固体として析出させる工程であれば、どのような方法によるものであっても構わない。
【０１９４】
より具体的には、例えば、溶液温度を変化させて溶解度の温度依存性を利用して晶析する冷却晶析法、並びに加熱および減圧などの操作により溶液から溶媒を揮発させて溶液中の脂肪族ジカルボン酸濃度を高めて晶析する方法、さらにはそれらの組み合わせによる方法などが挙げられる。
【０１９５】
また、冷却晶析では、その冷却方法として、例えば、抽出相を含有する溶液を外部の熱交換器などに循環させ冷却する方法、および冷媒の流通する管を抽出相を含有する溶液中に投入する方法などがある。
【０１９６】
中でも、装置内を減圧することにより溶液中の溶媒を揮発させて、溶媒の気化熱により冷却する方法では、熱交換界面に脂肪族ジカルボン酸が析出することによる熱移動の阻害を防止することができるとともに、溶液中の脂肪族ジカルボン酸の濃縮も伴い、晶析収率の点からも好ましい。
【０１９７】
また、晶析操作はバッチ操作であっても連続操作であってもよい。得られる固体の脂肪族ジカルボン酸の粒子径のばらつきを小さくでき、大量生産時に効率的に且つ晶析のために要するエネルギーを小さくできるなどの理由により、連続操作が好ましい。
【０１９８】
晶析装置は特殊な晶析槽である必要は無く、公知の攪拌槽を用いることができる。
【０１９９】
ＩＩＩ−（４）晶析工程で析出した脂肪族ジカルボン酸を回収する固液分離工程
晶析で得られた脂肪族ジカルボン酸スラリーは固液分離操作により脂肪族ジカルボン酸結晶および母液を分離する。分離方法は、特に限定されるものではなく、例えば、ろ過分離および沈降分離などが挙げられる。
【０２００】
固液分離操作は、バッチでも連続でもよい。効率の良い固液分離機としては、例えば、連続式の遠心ろ過機およびデカンター等の遠心沈降機などが挙げられる。
【０２０１】
また、所望する脂肪族ジカルボン酸の純度により、固液分離操作で回収したウェットケーキは冷水等でリンスすることができる。
【０２０２】
ＩＩＩ−（５）固液分離工程で得られた脂肪族ジカルボン酸を回収した後の晶析母液の少なくとも一部を晶析工程より前のいずれかの工程に戻す晶析母液リサイクル工程
固液分離工程で得られた母液および／または洗浄液の少なくとも一部は、晶析工程より前の工程にリサイクルすることができる。
【０２０３】
晶析母液をリサイクルする工程は特に限定はないが、接触工程、濃縮工程へリサイクルできる。接触工程へリサイクルすると抽出塔は大きくなるが、水相へ分配されやすい（分配係数が小さい）不純物はリサイクル系内から選択的に除去することができる。
【０２０４】
一方、濃縮工程にリサイクルすると抽出塔は小さくて済むが、不揮発性の不純物は全てリサイクル系内に蓄積することとなる。
【０２０５】
母液およびリンス液の全てをリサイクルすることも可能であるが、長期間の運転を続けることで不純物がリサイクル系内に蓄積することから、少なくとも一部は系外にパージすることが好ましい。
【０２０６】
パージ水は通常活性汚泥等有機物を処理した後廃水されるが、パージ水は脂肪族ジカルボン酸を含んでいるとともにｐＨが低いことから、発酵操作で回収された使用済菌体の失活処理剤として有効である。
【０２０７】
晶析母液リサイクルにおいては、所望する脂肪族ジカルボン酸の純度、収量および収率等の条件により、リサイクル量およびリサイクル場所を決めることができる。
【０２０８】
第３の本発明の製造方法により製造される脂肪族ジカルボン酸としては、第２の本発明の脂肪族ジカルボン酸と同様である。また、第３の本発明においては、第２の本発明において上述したように、生物由来原料から誘導される炭素源から脂肪族ジカルボン酸が誘導される。
【０２０９】
＜プロトン化工程＞
また、接触工程で脂肪族ジカルボン酸を溶剤中に回収する際に、該脂肪族ジカルボン酸を含有する水溶液において、脂肪族ジカルボン酸が塩の水溶液として存在する場合、Ｉ−（２）において上述したプロトン化と同様の方法により塩をプロトン化することが好ましい。
【０２１０】
脂肪族ジカルボン酸を含有する水溶液に酸を加えるプロトン化工程は、接触工程より前の工程であれば、如何なる段階において実施される工程であっても構わない。
【０２１１】
＜その他の工程＞
さらに本発明の方法により得られた脂肪族ジカルボン酸に、その用途に応じて、乾燥処理および精製処理に代表されるような、他の工程を適用することもできる。例えば、活性炭等の吸着剤による脱色工程、イオン交換樹脂により共存イオン類を除去するイオン交換工程、共存する不飽和ジカルボン酸を水添処理する工程およびさらに高度精製するための晶析工程などの処理が考えられる。
【実施例】
【０２１２】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
【０２１３】
参考例１：コハク酸発酵菌株の作製
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノムＤＮＡの抽出
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３は、１９７５年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−３０６８として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７の受託番号で寄託されている。
【０２１４】
Ａ培地［尿素  ２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ６ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４−５Ｈ２Ｏ  ６ｍｇ、ビオチン  ２００μｇ、チアミン  ２００μｇ、イーストエキストラクト  １ｇ、カザミノ酸  １ｇ、グルコース  ２０ｇ、蒸留水  １Ｌに溶解］１０ｍＬに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株を対数増殖期後期まで培養し、遠心分離（１００００ｇ、５分）により菌体を集めた。
【０２１５】
得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ  ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍＬに懸濁した。次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。
【０２１６】
前記溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
【０２１７】
（Ｂ）ＰＣプロモーター置換用プラスミドの構築
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子のＮ末端領域のＤＮＡ断片の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６のＣｇｌ０６８９）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。尚、配列番号１のＤＮＡは５’末端がリン酸化されたものを用いた。
【０２１８】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２５μＭ  ｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【０２１９】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で１分らなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は４分とした。
【０２２０】
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧ  ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．９ｋｂの断片を検出した。
【０２２１】
ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行い、これをＰＣ遺伝子Ｎ末端断片とした。
【０２２２】
一方、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来で構成的に高発現するＴＺ４プロモーター断片はプラスミドｐＭＪＰＣ１（日本国特開２００５−９５１６９号公報）を鋳型とし、配列番号３および配列番号４に記載の合成ＤＮＡを用いたＰＣＲにより調製した。尚、配列番号４のＤＮＡは５’末端がリン酸化されたものを用いた。
【０２２３】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）  ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２５μＭ  ｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【０２２４】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒分らなるサイクルを２５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は３分とした。
【０２２５】
増幅産物の確認は、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧ  ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．５ｋｂの断片を検出した。
【０２２６】
ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行い、これをＴＺ４プロモーター断片とした。
【０２２７】
上記にて調製したＰＣ遺伝子Ｎ末端断片とＴＺ４プロモーター断片を混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、制限酵素ＰｓｔＩで切断し、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧ  ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離し、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて回収し、これをＴＺ４プロモーター：ＰＣ遺伝子Ｎ末端断片とした。
【０２２８】
さらに、前記ＤＮＡ断片と、大腸菌プラスミドｐＨＳＧ２９９（宝酒造製）をＰｓｔＩで切断して調製したＤＮＡとを混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結した。
【０２２９】
得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬ  カナマシンおよび５０μｇ／ｍＬ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【０２３０】
前記培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで切断することにより、約１．０ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＭＪＰＣ１７．１と命名した。
【０２３１】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の５’上流領域のＤＮＡ断片の取得は、参考例１（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号５および配列番号６）を用いたＰＣＲによって行った。
【０２３２】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ  １μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）  ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２５μＭ  ｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【０２３３】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
【０２３４】
増幅産物の確認は、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧ  ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．７ｋｂの断片を検出した。
【０２３５】
ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４  ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５’末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１１９（宝酒造製）のＳｍａＩ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。
【０２３６】
この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬ  アンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを、配列番号７および配列番号６で示した合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ反応に供した。
【０２３７】
反応液組成：上記プラスミド１ｎｇ、Ｅｘ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）  ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．２μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【０２３８】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で５０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
【０２３９】
このようにして挿入ＤＮＡ断片の有無を確認した結果、約０．７ｋｂの増幅産物を認めるプラスミドを選抜し、これをｐＭＪＰＣ５．１と命名した。
【０２４０】
次に、上記ｐＭＪＰＣ１７．１およびｐＭＪＰＣ５．１をそれぞれ制限酵素ＸｂａＩで切断後混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結した。これを制限酵素ＳａｃＩおよび制限酵素ＳｐｈＩで切断したＤＮＡ断片を０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧ  ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離し、約１．７５ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて回収した。
【０２４１】
前記ＰＣ遺伝子の５’上流領域とＮ末端領域の間にＴＺ４プロモーターが挿入されたＤＮＡ断片を、ｓａｃＢ遺伝子を含むプラスミドｐＫＭＢ１（特開２００５−９５１６９）をＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結した。
【０２４２】
得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマシンおよび５０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。
【０２４３】
得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約１．７５ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＭＪＰＣ１７．２と命名した（図２）。
【０２４４】
（Ｃ）ＰＣ増強株の作製  
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ（ＬＤＨ活性が低下した株：特開２００５−９５１６９）の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＭＪＰＣ１７．２のプラスミドＤＮＡ用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から再調製した。
【０２４５】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換は電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１４４，ｐ．１８１−１８５，１９９３）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン  ２５μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ、グルコース  ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【０２４６】
前記培地上に生育した株は、ｐＭＪＰＣ１７．２がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのＰＣ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。
【０２４７】
次に、上記相同組み換え株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。その結果、２回目の相同組み換えによりｓａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を数十個得た。
【０２４８】
この様にして得られた株の中には、そのＰＣ遺伝子の上流にｐＭＪＰＣ１７．２に由来するＴＺ４プロモーターが挿入されたものと野生型に戻ったものが含まれる。ＰＣ遺伝子がプロモーター置換型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて液体培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ＰＣ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。
【０２４９】
ＴＺ４プロモーターおよびＰＣ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号８および配列番号９）を用いて分析すると、プロモーター置換型では６７８ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、ＴＺ４プロモーターが挿入された株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−５／ΔＬＤＨと命名した。
【０２５０】
参考例２：ジャーファーメンターによるコハク酸発酵液の調製
（Ａ）種培養
尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇを蒸留水に溶解、１０００ｍＬに調整した培地１００ｍＬを５００ｍＬの三角フラスコに入れ、１２１℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液４ｍＬを添加し、上記で構築したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−５／ΔＬＤＨ株を接種して１６時間３０℃にて振とう（１６０ｒｐｍ）培養した。
【０２５１】
（Ｂ）本培養
硫酸アンモニウム：３．０ｇ、８５％リン酸：６．７ｇ、塩化カリウム：４．９ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：１．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：１２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：１２０ｍｇ、コーンスティープリカー（王子コーンスターチ社製）３０．０ｇ、１０Ｎ水酸化カリウム水溶液：１１．０ｇ、消泡剤（ＣＥ４５７：日本油脂製）：２．５ｇを蒸留水に溶解して調整した培地２．０Ｌを５Ｌの発酵糟に入れ、１２１℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やしてから２８％  アンモニア水を加えてｐＨを７．０に調整した後、予めフィルター滅菌したＤ−ビオチン、塩酸チアミン各０．２ｇ／Ｌ水溶液：１５ｍＬ、及びあらかじめ滅菌した７２０ｇ／Ｌショ糖水溶液：１１０ｍＬを添加し、これに前述の種培養液を１００ｍＬ加えて、３０℃に保温した。
【０２５２】
ｐＨは２８％アンモニア水を用いて７．２以下にならないように保ち、通気は毎分３．０Ｌ、背圧は０．０５ＭＰａ、攪拌は毎分７５０回転で本培養を開始した。溶存酸素濃度がほぼ０まで低下した後、再び上昇を開始して１ｐｐｍに達したところであらかじめ滅菌した７２％ショ糖水溶液を約５．３ｇ添加したところ、再び０まで低下した。溶存酸素濃度が再び上昇するごとに上記の方法にてショ糖水溶液添加を繰り返して、培養開始後１９時間まで継続した。
【０２５３】
（Ｃ）コハク酸生成反応
８５％  リン酸：１．６ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：１．１ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：４３ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：４３ｍｇ、１０Ｎ水酸化カリウム水溶液：２．８６ｇを蒸留水に溶解、４２ｍＬに調整後、１２１℃、２０分加熱滅菌処理し、反応濃縮培地を作製した。
【０２５４】
室温まで冷やした上記反応濃縮培地：４２ｍＬ、及び予め滅菌した７２０ｇ／Ｌショ糖水溶液：５３０ｍＬ、滅菌水：１．２Ｌ、予めフィルター滅菌したＤ−ビオチン、塩酸チアミン各０．２ｇ／Ｌ水溶液：２０ｍＬ、上記本培養により得られた培養液６７５ｍＬを５Ｌのジャーファーメンターに加え反応を開始した。
【０２５５】
反応温度は４０℃、攪拌回転数は毎分１５０、ｐＨは中和剤（炭酸水素アンモニウム：１７１ｇ、２８％アンモニア水：３５４ｇ、蒸留水：５２９ｇ）の逐次添加によって７．３５に調整しながら反応を継続し、反応液中の残存ショ糖が０．１ｇ／Ｌ以下になったところで終了した。
【０２５６】
このようにして調製したコハク酸発酵液（菌体を含んだ状態）を下記の実施例及び比較例で用いた。
【０２５７】
なお、コハク酸発酵液を遠心分離（１５，０００Ｇ、５分）処理し、得られた上澄液について組成分析を行ったところ、表２に示す組成であった。
【０２５８】
【表２】
0005991400.tif 000003
【０２５９】
〔実施例１〕
［実施例１−１］
＜菌体分離＞
（実施例１−１−１）
上記参考例２（Ｃ）で得られたコハク酸発酵液２２ｍＬを、９５％硫酸でｐＨを２．５に調整したのち１０ｍＬを遠心チューブに入れ、５００Ｇで８分遠心分離を行い、遠心分離後の上澄液の濁度（ＯＤ６６０）を測定した。尚、菌体分離前の濁度（ＯＤ６６０）は２４であった。
【０２６０】
（実施例１−１−２）
ｐＨを３．０に調整した以外は実施例１−１−１と同様にして菌体分離を行い、遠心分離後の上澄液の濁度（ＯＤ６６０）を測定した。
【０２６１】
（実施例１−１−３）
ｐＨを４．０に調整した以外は実施例１−１−１と同様にして菌体分離を行い、遠心分離後の上澄液の濁度（ＯＤ６６０）を測定した。
【０２６２】
（実施例１−１−４）
ｐＨを５．０に調整した以外は実施例１−１−１と同様にして菌体分離を行い、遠心分離後の上澄液の濁度（ＯＤ６６０）を測定した。
【０２６３】
（比較例１−１−１）
コハク酸発酵液（ｐＨ７．６）を実施例１−１−１と同様にして菌体分離を行い、遠心分離後の上澄液の濁度（ＯＤ６６０）を測定した。
【０２６４】
また、遠心分離を４２００Ｇで８分を行い、実施例１−１−１〜１−１−４および比較例１−１−１と同様の実験を行った。
【０２６５】
その結果、表３に示すように、いずれの遠心分離条件においてもｐＨ２．５〜５．０に調整した場合に、ｐＨ７．６での遠心分離と比較して、菌体分離効率の向上、遠心分離上澄液の濁度の低下が認められた。
【０２６６】
特に、ｐＨ２．５および３．０に調整して遠心分離を行った場合は、低速遠心分離条件（５００Ｇ）においてもｐＨ７．６での高速遠心条件（４２００Ｇ）よりも優れた菌体分離効率を示した。
【０２６７】
【表３】
0005991400.tif 000004
【０２６８】
［実施例１−２］
＜菌体分離＋ＭＥＫ抽出＞
（実施例１−２−１）
上記参考例２（Ｃ）で得られたコハク酸発酵液５０ｍＬを遠心チューブに入れ、９５％硫酸でｐＨを２．５に調整したのち、９５００Ｇで１０分遠心分離を行った。得られた上澄液について、一部を用いて濁度（ＯＤ６６０）の測定を行い、残りを用いて以下の手順でＭＥＫ抽出を行った。
【０２６９】
上澄液２０ｇにＭＥＫ１０ｇ加え、５分懸濁した後、静置して分相時間（水相と有機相が分離するまでの時間）を測定した。また、水相と有機相の間に存在する中間不溶分の存在量を確認し、有機相における浮遊物の存在しない領域（有機相クリア率）を目視にて確認した。
【０２７０】
有機相における浮遊物の存在しない領域（有機相クリア率）がコハク酸等の有機酸を抽出する際に回収できる実質的な有機相の割合とみなすことができる。また、上澄液の一部を用いて光散乱測定を行った。
【０２７１】
光散乱測定は大塚電子株式会社製ＥＬＳ−８００型装置、ＥＬＳ−８０００ｖｅｒ．４．０ソフトウェアを用いて実施した。入射スリットはΦ０．２、Φ０．１に設定した。光源はＨｅ−Ｎｅレーザー１０ｍＷ、検出器はフォトカウント用光電子増倍管を使用した。測定は室温下、１ｃｍの角セルを使用し、各処理液原液を用いて行った。測定アングルは９０℃、溶媒は水を選択した。
【０２７２】
その他の測定パラメータは全てオートで設定し散乱強度及び粒径を測定した。散乱強度は粒径モニターテーブルに記載の、ｎ＝１〜１００各スキャンの平均値を用いた。なお、濃厚サンプルはアッテネータフィルターで自動に入射光量が調整されるため、フィルター値で除し、補正した数値を評価に用いた。
【０２７３】
（実施例１−２−２）
上記参考例２（Ｃ）で得られたコハク酸発酵液のｐＨを３．０に調整した以外は実施例１−２−１と同様にして菌体分離を行い、得られた上澄液を９５％硫酸でｐＨを２．５に調整したのち、実施例１−２−１と同様にしてＯＤ６６０の測定、ＭＥＫ抽出を行い、分相時間、中間不溶分の量、有機相クリア率、平均粒径、光散乱強度を測定した。
【０２７４】
（実施例１−２−３）
菌体分離前のｐＨを４．０に調整した以外は実施例１−２−２と同様にして菌体分離・ＭＥＫ抽出を行い、ＯＤ６６０、分相時間、中間不溶分の量、有機相クリア率、平均粒径、光散乱強度を測定した。
【０２７５】
（実施例１−２−４）
菌体分離前のｐＨを５．０に調整した以外は実施例１−２−２と同様にして菌体分離・ＭＥＫ抽出を行い、ＯＤ６６０、分相時間、中間不溶分の量、有機相クリア率、平均粒径、光散乱強度を測定した。
【０２７６】
（比較例１−２−１）
菌体分離前のｐＨを７．６に調整した以外は実施例１−２−２と同様にして菌体分離・ＭＥＫ抽出を行い、ＯＤ６６０、分相時間、中間不溶分の量、有機相クリア率、平均粒径、光散乱強度を測定した。
【０２７７】
その結果、表４に示すように、ｐＨ２．５および３．０に調整した場合は、分相時間が短く、中間不溶分の量も少なく、有機相クリア率が格段に向上したので、ＭＥＫ抽出の効率がよいことがわかった。
【０２７８】
また、ｐＨ４．０に調整した場合は、分相時間は長くなるものの、中間不溶分の量がやや減少し、有機相クリア率が向上する効果が認められた。ｐＨ５．０に調整した場合は、分相時間は長くなるものの、中間不溶分の量がやや多くなるも、有機相クリア率が改善する効果が認められた。一方、ｐＨ７．６に調整した場合は分相時間が長く、中間不溶分の量も多く、有機相クリア率が悪いために、ＭＥＫ抽出の効率が悪かった。
【０２７９】
なお、平均粒径が小さい不溶成分は分液速度を悪化させること、光散乱強度が大きい条件では中間不溶分の生成が多くなることが考えられた。なお、アラニン、バリンおよびグルタミン酸などのアミノ酸はＭＥＫ中には回収されなかった。
【０２８０】
【表４】
0005991400.tif 000005
【０２８１】
［実施例１−３］
遠心分離を１０００Ｇで８分間行った以外は実施例１−２−１と同様にして菌体分離・ＭＥＫ抽出を行い、ＯＤ６６０、分相時間、中間不溶分の量を測定した。その結果、ＯＤ６６０は０．１９１であり、分相時間は２６秒で、中間不溶分の量は少なかった。このことから、低速遠心でも効率よくＭＥＫ抽出が行えることがわかった。
【０２８２】
［実施例１−４］
（Ａ）ジャーファーメンターによるコハク酸発酵液の調整
参考例１で作製した菌株を用いて、参考例２に従ってコハク酸発酵液を作製した。ただし、コハク酸生成反応時の温度は３９℃、ｐＨは７．６で行った。なお、得られたコハク酸発酵液を遠心分離（１５，０００Ｇ，５分）処理し、得られた上澄液について組成分析を行った。結果を表５に示す。
【０２８３】
【表５】
0005991400.tif 000006
【０２８４】
（Ｂ）ｐＨ調整および遠心分離
作製したコハク酸発酵液を９５％硫酸で各々ｐＨを７．６、７．０、６．５、６．０、５．５、５．０、４．５、４．０、３．５、３．０、２．５、２．０、１．５、１．０および０．５に調整した後、３５ｍＬずつ遠心チューブに分注し、４０℃で１０〜３０分間保温した。
【０２８５】
ただし、ｐＨ１．０および０．５に調整した試料は、結晶が析出するため５０℃で保温した。なお、ｐＨ１．５については、保温温度の違いによる影響を確認するため４０℃保温または５０℃保温の２通りで行った。
【０２８６】
保温後、各ｐＨの試料を５００Ｇで８分間遠心分離を行った。得られた遠心上澄液のうちｐＨ２．０〜０．５の試料については、２８％アンモニア水を用いて各々ｐＨ２．５に再調整し、ｐＨ７．６〜３．０の試料については、９５％硫酸を用いて各々ｐＨ２．５に再調整した。
【０２８７】
ｐＨ２．５に調整した上澄液の一部を用いて濁度（ＯＤ６６０）を測定した。測定結果を表６（遠心条件：５００Ｇ、８分）に示す。なお、菌体分離前のコハク酸発酵液の濁度（ＯＤ６６０）は２５であった。
【０２８８】
（Ｃ）ＭＥＫ抽出
ｐＨ２．５に調整済みの発酵液上澄液の一部を用いてＭＥＫ抽出を行った。発酵液上澄液２０ｇにＭＥＫ１０ｇを加え４０℃で５分間懸濁した後、静置し、分相時間（水相と有機相が分離するまでの時間）を測定し、水相と有機相の間に存在する中間不溶分の存在量を確認し、有機相における浮遊物の存在しない領域（有機相クリア率）を目視にて確認した。
【０２８９】
さらに、上澄液の一部を用いて光散乱測定を行い、平均粒径、光散乱強度を測定した。ＭＥＫ抽出結果および光散乱測定結果を表６（遠心条件：５００Ｇ、８分）に示す。なお、光散乱測定は、実施例１−２−１記載の測定方法に従って行った。
【０２９０】
その結果、表６に示すようにいずれの遠心条件の場合においても、ｐＨを７．０〜０．５で遠心した場合、ｐＨ７．６で遠心した場合に比較して、上澄液の濁度低下が確認された。特にｐＨ５．５以下で遠心した場合、ｐＨ７．６で遠心した場合と比較して、ＭＥＫ抽出に於いて、中間不溶分の減少が認められ、抽出性が改善されていることが確認された。
【０２９１】
また、ｐＨ３．５以下で遠心した場合、ｐＨ７．６で遠心分離した場合と比較して、ＭＥＫ抽出時の分相時間が短くなり、さらに抽出性が改善されていることが確認された。
【０２９２】
一方、ｐＨ１．０以下の試料について、結晶が析出するため遠心前の温度を４０℃から５０℃に上げた。これについては、ｐＨ１．５の試料を用いて、４０℃と５０℃の２通りの方法で実施した結果（表６、実施例１−４−３および１−４−４）、上澄液濁度、ＭＥＫ抽出性（分相時間、中間不溶分、有機相クリア率）とも、ほぼ変わらなかった。
【０２９３】
【表６】
0005991400.tif 000007
【０２９４】
［実施例１−５］
（Ａ）ジャーファーメンターによるコハク酸発酵液の調整
（Ａ−１）種培養および本培養
参考例１で作製した菌株を用いて、参考例２（Ａ）および（Ｂ）記載の方法に従って、種培養、本培養を行った。
【０２９５】
（Ａ−２）コハク酸生成反応
８５％リン酸：０．３ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．２ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：９ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：９ｍｇ、１０Ｎ水酸化カリウム水溶液：０．５７ｇを蒸留水に溶解、８．４ｍＬに調整後、１２１℃、２０分加熱滅菌処理し、反応濃縮培地を作製した。
【０２９６】
室温まで冷やした上記反応濃縮培地：８．４ｍＬ、及び予め滅菌した７２０ｇ／Ｌショ糖水溶液：１０６ｍＬ、滅菌水：１７８ｍＬ、予めフィルター滅菌したＤ−ビオチン、塩酸チアミン各０．２ｇ／Ｌ水溶液：０．４ｍＬ、上記本培養により得られた培養液０．２Ｌを１Ｌのジャーファーメンターに加え反応を開始した。
【０２９７】
反応温度は４０℃、攪拌回転数は毎分２００回転、ｐＨは中和剤（炭酸水素アンモニウム：１７１ｇ、２８％アンモニア水：３５４ｇ、蒸留水：５２９ｇ）の逐次添加によって７．３５に調整しながら反応を継続し、反応液中の残存ショ糖が０．１ｇ／Ｌ以下になったところで終了した。
【０２９８】
なお、コハク酸発酵液を遠心分離（１５，０００Ｇ、５分）処理し、得られた上澄液について組成分析を行ったところ、表７に示す組成であった。また、コハク酸発酵液の濁度（ＯＤ６６０）を測定した結果は、３０であった。
【０２９９】
【表７】
0005991400.tif 000008
【０３００】
（Ｂ）膜濾過およびｐＨ調整
得られたコハク酸発酵液を９５％硫酸でｐＨ２．５に調整した後、４０ｍＬずつを膜濾過（膜孔径０．２２μｍ、５μｍ）にて菌体分離した。一方、比較例として得られたコハク酸発酵液を、４０ｍＬずつを各々膜濾過（膜孔径０．２２μｍ、５μｍ）した後、濾液は９５％硫酸を用いてｐＨを２．５に調整した。得られたｐＨを２．５に調整済みの膜濾過液の一部を用いて濁度（ＯＤ６６０）測定を行った。測定結果を表８に示す。
【０３０１】
（Ｃ）ＭＥＫ抽出
上記膜濾過液の一部を用いてＭＥＫ抽出を行った。膜濾過液２ｇにＭＥＫ１ｇを加え、室温で５分間懸濁した後、静置し、分相時間（水相と有機相が分離するまでの時間）を測定し、水相と有機相の間に存在する中間不溶分の存在量を確認し、有機相における浮遊物の存在しない領域（有機相クリア率）を目視にて確認した。ＭＥＫ抽出結果を表８に示す。
【０３０２】
その結果、表８に示すように、いずれの孔径の膜を用いて膜分離を行った場合においても、ｐＨを２．５での膜分離を行った場合、ｐＨ７．４での膜分離と比較して、濾過液の濁度の低下が認められた。また、ＭＥＫ抽出性についても、ｐＨ２．５で膜分離を行った場合、ｐＨ７．４に比較して、いずれの条件においても中間不溶分が著しく削減されると共に分相時間も短くなり、抽出性が大幅に改善された。
【０３０３】
【表８】
0005991400.tif 000009
【０３０４】
［実施例１−６］
（Ａ）ｐＨ調整および遠心分離、膜分離
実施例１−５（Ａ−２）で得られたコハク酸発酵液を９５％硫酸でｐＨを２．５に調整した。これを３５ｍＬずつ遠心チューブに分注し、４２００Ｇで８分間遠心し、得られた上澄液を各々膜濾過（膜孔径０．２２、５μｍまたは、膜濾過なし）した。
【０３０５】
一方、比較例として、実施例１−５（Ａ−２）で得られたコハク酸発酵液を３５ｍＬずつ遠心チューブに分注し、４２００Ｇで８分間遠心し、得られた上澄液を各々膜濾過（膜孔径０．２２、５μｍまたは、膜濾過なし）した。その後、濾液を９５％硫酸でｐＨ２．５に調整した。また、得られたｐＨを２．５に調整済みの膜濾過液の一部で濁度（ＯＤ６６０）測定を行った。測定結果を表９に示す。
【０３０６】
（Ｂ）ＭＥＫ抽出
上記、膜濾過液を用いてＭＥＫ抽出を行った。上記濾過液２０ｇにＭＥＫ１０ｇを加え４０℃で５分間懸濁した後、静置し、分相時間（水相と有機相が分離するまでの時間）を測定し、水相と有機相の間に存在する中間不溶分の存在量を確認し、有機相における浮遊物の存在しない領域（有機相クリア率）を目視にて確認した。また、濾過液の一部を用いて光散乱測定を行い、平均粒径、光散乱強度を測定した。ＭＥＫ抽出および光散乱測定結果を表９に示す。なお、光散乱測定は、実施例１−２−１記載の測定方法に従って行った。
【０３０７】
その結果、表９に示すように、遠心分離と膜分離を組み合わせた場合においてもｐＨを２．５で遠心および膜分離を行った場合、ｐＨ７．４で遠心および膜分離を行った場合と比較して、濾過液の濁度の低下が認められた。また、ＭＥＫ抽出性についても中間不溶分が著しく削減されると共に、分相時間が短くなり、抽出性が大幅に改善された。
【０３０８】
【表９】
0005991400.tif 000010
【０３０９】
〔実施例２〕
本実施例における酸類、糖類の定量分析は、高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を用い、アミノ酸の定量分析はアミノ酸分析計を用い以下の条件で測定を行った。またタンパク質の定量は試料を塩酸により加水分解処理し、加水分解前後の総アミノ酸量の増分をタンパク質量と見なした。
【０３１０】
＜酸類、糖類の分析＞
カラム；信和化工（株）製  ＵＬＴＲＯＮ  ＰＳ−８０Ｈ  ８．０ｍｍＩ．Ｄ．×  ３０ｃｍ
溶離液：水（過塩素酸）（過塩素酸６０％水溶液１．８ｍｌ／１Ｌ−Ｈ２Ｏ）
温度：６０℃
【０３１１】
＜アミノ酸の分析＞
装置：日立アミノ酸分析計  Ｌ−８９００
分析条件：生体アミノ酸分離条件−ニンヒドリン発色法（５７０ｎｍ，４４０ｎｍ）
標準品：ＰＦ（和光アミノ酸混合液ＡＮＩＩ型０．８ｍｌ＋Ｂ型０．８ｍｌ→１０ｍｌ）
注入量：１０μｌ
【０３１２】
＜タンパク質定量のための加水分解処理＞
試料１０ｍｇまたは１００ｍｇを精秤し、純水で１ｍＬ定容としたものを、２００μＬ分注、乾固し、塩酸雰囲気下１５０℃、１時間加熱し、タンパク質を加水分解処理した。これを乾固させた後純水２００μＬを加えて再溶解させ、０．４５μｍフィルターでろ過後、ろ液をアミノ酸の分析に供した。
【０３１３】
［実施例２−１］
＜プロトン化＞
表２に示す組成のコハク酸発酵液１５００ｇに９８％硫酸を加え、ｐＨを２．５に調整した（以下、コハク酸水溶液と記載することがある）。ここで９８％硫酸の添加量は、１５０ｇであった。
【０３１４】
＜接触工程（バッチ操作）＞
硫酸添加後のコハク酸水溶液を、ボトム弁付の容量５Ｌのジャケット付攪拌槽に入れ、さらにメチルエチルケトン（以下、ＭＥＫと記載することがある）に予め水を添加した１０％含水メチルエチルケトン溶液２４７５ｇを加え（ＭＥＫ溶液／コハク酸水溶液＝１．５（ｗ／ｗ））、ジャケットに温水を通液することで内温を３０℃に制御しながら３０分間攪拌した。その後攪拌を止め、内温を３０℃に制御しながら約１時間静置した。静置後液々界面近傍のＭＥＫ相には中間相が存在していた。
【０３１５】
攪拌槽ボトム弁から抽残相、中間相、抽出相を順に回収したところ、それぞれの重量は抽出相２５０３ｇ、抽残相１４９０ｇ、中間相１３２ｇであった。抽出相の組成を以下の表１０に示す。
【０３１６】
【表１０】
0005991400.tif 000011
【０３１７】
＜蒸留＞
回収した抽出液は連続蒸留によりＭＥＫを実質的に除去する。ここで蒸留留出液はＭＥＫと水の共沸組成物、すなわち１１ｗｔ％含水ＭＥＫとして回収されるが、釜残液の濃縮度合い次第ではコハク酸が析出する懸念がある。そこで蒸留留出液が１１ｗｔ％含水ＭＥＫ、釜残液が３０ｗｔ％コハク酸溶液となるよう抽出液２５０３ｇに対し１０３ｇの水を添加した。ここで水の添加量は下記計算に従い算出した。
【０３１８】
（抽出液の希釈）
抽出液のＭＥＫおよびコハク酸濃度をそれぞれＣＭＥＫ，０、ＣＳＡ，０、希釈後のＭＥＫおよびコハク酸濃度をそれぞれＣＭＥＫ，１、ＣＳＡ，１とした際の相図を図３に示す。図３では、抽出液の水による希釈、その後の蒸留におけるＭＥＫおよびコハク酸の組成変化が示されている。
【０３１９】
図３において、希釈操作線は抽出液組成（ＣＭＥＫ，０，ＣＳＡ，０）および原点（０，０）を結ぶ線、
ＣＳＡ＝（ＣＳＡ，０／ＣＭＥＫ，０）ＣＭＥＫ 
また蒸留操作線は釜残液（０，０．３）と留出液（０．８９，０）結ぶ線、
ＣＳＡ＝０．３−（０．３／０．８９）ＣＭＥＫ    
で表現され、希釈後の液はそれぞれの線の交点にあることから、
ＣＳＡ，１＝（ＣＳＡ，０／ＣＭＥＫ，０）ＣＭＥＫ，１  ・・・ｅｑ．（１）
ＣＳＡ，１＝０．３−（０．３／０．８９）ＣＭＥＫ，１  ・・・ｅｑ．（２）
【０３２０】
これらを解くことで希釈液組成（ＣＭＥＫ，１，ＣＳＡ，１）が得られる。さらに希釈水の添加量は抽出液に対して、（ＣＭＥＫ，０−ＣＭＥＫ，１）／ＣＭＥＫ，１で計算することができる。
【０３２１】
ここでは、抽出液組成が（０．８２２０、０．０３５３）であったので、希釈後の組成は（０．７８９５，０．０３３９）、希釈水の添加量は抽出液に対して４．１２ｗｔ％、すなわち２５０３ｇ×４．１２ｗｔ％＝１０３ｇとした。
【０３２２】
蒸留は径５ｍｍのコイルパックを高さ３０ｃｍ充填した内径４０ｍｍの充填カラムを備えた５００ｍｌの丸底フラスコ、さらには還留器を備えた常圧連続蒸留装置を用いた。希釈液は丸底フラスコへ約３００ｍｌ添加後、フラスコをオイルバスで加熱しながら炊上げ、全還留をかけながら系内を安定させた。
【０３２３】
ここでオイルバスの温度は１２０℃とした。ここで塔頂温度は７４℃（共沸温度）、塔底温度は１０１℃であった。塔内が安定したのを確認後、還留比を１に設定し、留出液を連続的に抜出すとともに供給液を充填塔中段へ連続的に供給し、釜残液も連続的に抜出しを開始した。供給液は予熱器であらかじめ６０℃まで加熱した後、充填塔へ供給した。
【０３２４】
供給液は塔頂温度、塔底温度が乱れないように１００ｍｌ／時で供給を始め、約１時間かけて４００ｍｌ／時まで増やした。供給液の増加にあわせオイルバスの温度は徐々に上げていき最終的には１４０℃とした。希釈液２６０６ｇを全量蒸留するのに７時間を要した。蒸留後のボトムフラスコは比較的きれいであった。
【０３２５】
蒸留後の釜残液は２９０ｇであった。またその組成を分析した結果を、下記表１１に示す。
【０３２６】
【表１１】
0005991400.tif 000012
【０３２７】
＜晶析＞
ＭＥＫを留去した液はジャケット付５００ｍｌセパラブルフラスコへ移し、攪拌下ジャケットに温水を通水することで８０℃に保温した。その後プログラム付循環恒温槽を用い、ジャケットへ通水する温水を１時間かけて２０℃まで冷却し、コハク酸を冷却晶析し、２０℃到達後さらに２０℃で１時間熟成した。
【０３２８】
得られたスラリーは真空ろ過し、さらに冷水１５０ｇで水洗し、ウェットケーキを回収した。さらに得られたウェットケーキは、真空燥機を用いて最大限圧条件下で８０℃で乾燥し、最終的に７８ｇのコハク酸を回収した。得られたコハク酸の組成分析結果を、下記表１２に示す。
【０３２９】
【表１２】
0005991400.tif 000013
【０３３０】
［実施例２−２］
実施例２−１において、抽出温度を２０℃にする以外同じ方法で処理を行った。抽出後の中間相は実施例２−１に比べて明らかに多く、回収された抽出相、中間相、抽残相はそれぞれ２３２２ｇ、３１６ｇ、１４８５ｇであった。抽出相を組成分析した結果を下記表１３に示す。
【０３３１】
【表１３】
0005991400.tif 000014
【０３３２】
蒸留処理において抽出液を全て処理するのに約７時間を要した。また蒸留後のボトムフラスコは比較的きれいであった。最終的に得られたコハク酸の収率は５５％、タンパク質含量は２９ｐｐｍであった。
【０３３３】
［実施例２−３］
実施例２−１において、抽出温度を６０℃にする以外同じ方法で処理を行った。
【０３３４】
抽出後の中間相は実施例２−２に比べて明らかに少なく、回収された抽出相、中間相、抽残相はそれぞれ２４９８ｇ、１３１ｇ、１４９５ｇであった。抽出相を組成分析した結果を下記表１４に示す。
【０３３５】
【表１４】
0005991400.tif 000015
【０３３６】
蒸留処理において抽出液を全て処理するのに約７時間を要した。また蒸留後のボトムフラスコは比較的きれいであった。最終的に得られたコハク酸の収率は５５％、タンパク質含量は３５ｐｐｍであった。
【０３３７】
［実施例２−４］
＜プロトン化＞
上述のコハク酸発酵液１５００ｇに９８％硫酸を加えｐＨを２．５に調整した。ここで９８％硫酸添加量は約１５０ｇであった。
【０３３８】
＜抽出（ミキサー（攪拌槽）／セトラー）＞
硫酸添加後のコハク酸水溶液を、図４に示すような、５００ｍｌジャケット付攪拌槽および各槽が６００ｍｌ、４００ｍｌ、３００ｍｌのジャケット付３槽式のセトラーを用い、ＭＥＫ溶液と混合、液々分離することでコハク酸を連続抽出した。すなわちコハク酸水溶液１６５０ｇおよび予め水を添加した１０％含水メチルエチルケトン（ＭＥＫ）溶液２４７５ｇ（ＭＥＫ溶液／コハク酸水溶液＝１．５（ｗ／ｗ））を、ジャケットに３０℃の温水を流し温度制御された５００ｍｌジャケット付攪拌槽にそれぞれ２０ｇ／分、３０ｇ／分の速度で供給するとともに、槽内が均一となるよう激しく攪拌しながら、懸濁液を５０ｇ／分の速度で連続的に抜き出した。
【０３３９】
抜き出した懸濁液はジャケットに３０℃の温水を流すことで温度制御された３槽式のセトラーの第１槽へ供給し、液々分離され第１槽ボトムから抽残相を連続的に抜き出した。抽出液は第１槽と第２槽間の堰をオーバーフローし、第２槽へ供給された。第２槽へ供給された抽出液にはかなりの不溶成分が懸濁していた。
【０３４０】
第２槽では第１槽で分離できなかった不溶成分をボトムに沈降させ、清澄な抽出液のみを第２槽と第３槽間の堰をオーバーフローさせ第３槽へ供給させた。さらに第３槽では液界面近傍から清澄な抽出液をオーバーフローさせて抽出液を回収した。
【０３４１】
連続抽出終了後、それぞれの槽に残った抽出液および抽残相さらには第１槽中間相、第２槽ボトムに残った不溶成分を回収した。回収した抽出相、抽残相、中間相はそれぞれ２３７０ｇ、抽残相１４９０ｇ、中間相２６０ｇであった。抽出相を組成分析した結果を下記表１５に示す。
【０３４２】
【表１５】
0005991400.tif 000016
【０３４３】
＜蒸留＞
回収した抽出液は２３７０ｇに対し９７ｇの水を添加し、実施例２−１と同様の方法で連続蒸留を行い、釜残液２７５ｇを回収した。蒸留には７時間を要したが、蒸留後のボトムフラスコは比較的きれいであった。得られた釜残液を組成分析した結果を下記表１６に示す。
【０３４４】
【表１６】
0005991400.tif 000017
【０３４５】
＜晶析＞
回収した釜残液は実施例２−１と同様の方法により晶析し、最終的に７４ｇのコハク酸を回収した。得られたコハク酸を組成分析した結果を下記表１７に示す。
【０３４６】
【表１７】
0005991400.tif 000018
【０３４７】
［実施例２−５］
【０３４８】
＜プロトン化＞
上述のコハク酸発酵液１５００ｇに９８％硫酸を加えｐＨを２．５に調整した。ここで９８％硫酸添加量は約１５０ｇであった。
【０３４９】
＜抽出（ミキサー（スタティックミキサー）／セトラー）＞
硫酸添加後のコハク酸水溶液は、ジャケット付スタティックミキサー（ノリタケ１／４（１）−Ｎ４０−１７４−０（内径５ｍｍ、エレメント数２４））および各槽が６００ｍｌ、４００ｍｌ、３００ｍｌのジャケット付３槽式のセトラーを用い、ＭＥＫ溶液と混合、液々分離することでコハク酸を連続抽出した。
【０３５０】
すなわちコハク酸水溶液１６５０ｇおよび予め水を添加した１０％含水メチルエチルケトン（ＭＥＫ）溶液２４７５ｇ（ＭＥＫ溶液／コハク酸水溶液＝１．５（ｗ／ｗ））を、それぞれ２０ｇ／分、３０ｇ／分の速度でジャケットに３０℃の温水を流すことで温度制御されたスタティックミキサーへ供給し、抜き出した懸濁液はジャケットに３０℃の温水を流すことで温度制御された３槽式のセトラーの第１槽に供給し、液々分離され第１槽ボトムから抽残相を連続的に抜き出した。
【０３５１】
抽出液は第１槽と第２槽間の堰をオーバーフローし、第２槽へ供給された。第２槽では第１槽で分離できなかった不溶成分をボトムに沈降させ、清澄な抽出液のみを第２槽と第３槽間の堰をオーバーフローさせ第３槽へ供給させた。さらに第３槽では液界面近傍から清澄な抽出液をオーバーフローさせて抽出液を回収した。
【０３５２】
連続抽出終了後、それぞれの槽に残った抽出液および抽残相さらには第１槽中間相、第２槽ボトムに残った不溶成分を回収した。回収した抽出相、抽残相、中間相はそれぞれ２４３５ｇ、抽残相１４９０ｇ、中間相１９７ｇであった。抽出相を組成分析した結果を下記表１８に示す。
【０３５３】
【表１８】
0005991400.tif 000019
【０３５４】
＜蒸留＞
回収した抽出液は２４３５ｇに対し１００ｇの水を添加し、実施例２−１と同様の方法で連続蒸留を行い、釜残液２８６ｇを回収した。蒸留には７時間を要したが、蒸留後のボトムフラスコは比較的きれいであった。
【０３５５】
＜晶析＞
回収した釜残液は実施例２−１と同様の方法により晶析し、最終的に７６ｇのコハク酸を回収した。得られたコハク酸を組成分析した結果を下記表１９に示す。
【０３５６】
【表１９】
0005991400.tif 000020
【０３５７】
［実施例２−６］
実施例２−１の方法に従い、プロトン化、抽出操作を行い、抽出相２５０３ｇ、抽残相１４９０ｇ、中間相１３２ｇを回収した。中間相は遠心沈降機にて２０００Ｇで１０分間振切り清澄液１３０ｇを回収した。清澄液と抽出液とを混合して得られた液の組成分析結果を、下記表２０に示す。
【０３５８】
【表２０】
0005991400.tif 000021
【０３５９】
＜蒸留＞
回収した抽出液は２６３３ｇに対し１０８ｇの水を添加し、実施例２−１と同様の方法で連続蒸留を行い、釜残液３１０ｇを回収した。蒸留には７時間を要したが、蒸留後のボトムフラスコは比較的きれいであった。
【０３６０】
＜晶析＞
回収した釜残液は実施例２−１と同様の方法により晶析し、最終的に８２ｇのコハク酸を回収した。得られたコハク酸を組成分析した結果を、下記表２１に示す。
【０３６１】
【表２１】
0005991400.tif 000022
【０３６２】
［実施例２−７］
実施例２−１の方法に従い、プロトン化、抽出操作を行い、抽出相２５０３ｇ、抽残相１４９０ｇ、中間相１３２ｇを回収した。中間相は目開き０．５μｍのＰＴＦＥ製メンブランフィルターで加圧ろ過することで清澄液１３０ｇを回収した。清澄液と抽出液とを混合して得られた液の組成分析結果を、下記表２２に示す。
【０３６３】
【表２２】
0005991400.tif 000023
【０３６４】
＜蒸留＞
回収した抽出液は２５０３ｇに対し１０８ｇの水を添加し、実施例２−１と同様の方法で連続蒸留を行い、釜残液３１０ｇを回収した。蒸留には７時間を要したが、蒸留後のボトムフラスコは比較的きれいであった。
【０３６５】
＜晶析＞
回収した釜残液は実施例２−１と同様の方法により晶析し、最終的に８２ｇのコハク酸を回収した。得られたコハク酸を組成分析した結果を、下記表２３に示す。
【０３６６】
【表２３】
0005991400.tif 000024
【０３６７】
［実施例２−８］
実施例５のプロトン化、抽出操作において、コハク酸水溶液１６５０ｇに対して含水ＭＥＫ供給量を８２５ｇ（（ＭＥＫ溶液／コハク酸水溶液＝０．５（ｗ／ｗ））をそれぞれ２０ｇ／分、含水ＭＥＫ供給量を１０ｇ／分でスタティックミキサーにする供給する以外は同じ方法に従い、抽出相６８８ｇ、抽残相１６１３ｇ、中間相１７３ｇを回収した。中間相は目開き０．５μｍのＰＴＦＥ製メンブランフィルターで加圧ろ過することで清澄液１７２ｇを回収した。
【０３６８】
＜連続抽出＞
図５に示すようなプロセスフローにて、連続抽出操作により溶剤相にコハク酸を回収した。抽残相１６１３ｇは、内径φ２０ｍｍ、高さ２ｍのジャケット付攪拌型連続抽出塔（理論段１０段）を用い連続抽出しコハク酸を回収した。ここで抽残相は２００ｇ／時で塔頂部から供給し、ボトムから予め１０ｗｔ％含水に調整したＭＥＫ溶液２００ｇ／時で連続抽出した。連続相は抽残相、分散相はＭＥＫ相とした（軽液分散）。また抽出塔の温度はジャケットに温水を通液することで３０℃に制御した。最終的に抽出液を１７７７ｇ回収した。
【０３６９】
回収した抽出液は、ミキサーセトラーで回収した抽出液、および中間相を加圧ろ過することで固形分を除去した清澄液とあわせ、合計２６３７ｇであった。回収した抽出液、ミキサーセトラーで回収した抽出液、および加圧ろ過することで固形分を除去した清澄液の混合液の組成を分析した結果を、下記表２４に示す。
【０３７０】
【表２４】
0005991400.tif 000025
【０３７１】
＜蒸留＞
回収した抽出液は２６３７ｇに対し１９０ｇの水を添加し、実施例２−１と同様の方法で連続蒸留を行い、釜残液４３２ｇを回収した。蒸留には７時間を要したが、蒸留後のボトムフラスコは比較的きれいであった。
【０３７２】
＜晶析＞
回収した釜残液は実施例２−１と同様の方法により晶析し、最終的に１１４ｇのコハク酸を回収した。得られたコハク酸を組成分析した結果を、下記表２５に示す。
【０３７３】
【表２５】
0005991400.tif 000026
【０３７４】
［比較例２−１］
実施例２−１の方法に従い、中間相を抽出相として回収する以外同じ方法では抽出相２６３３ｇ、抽残相１４９０ｇを回収した。
【０３７５】
＜蒸留＞
回収した抽出液は２６３３ｇに対し１０９ｇの水を添加し、実施例２−１と同様の方法で連続蒸留を行い、釜残液３００ｇを回収した。連続蒸留ではオイルバス温度を１４０℃としたが、連続蒸留開始後数時間後にはボトム温度が低下したので（ＭＥＫ検出）、供給量を下げ、オイルバス温度１４０℃でボトム温度＞１００℃が維持できる条件で運転を継続した。結果蒸留には９時間を要した。また蒸留後のボトムフラスコ内面には粘着物が多量に付着していた。
【０３７６】
＜晶析＞
ＭＥＫを留去した液はジャケット付５００ｍｌセパラブルフラスコへ移し、攪拌下ジャケットに温水を通水することで８０℃に保温した。その後プログラム付循環恒温槽を用い、ジャケットへ通水する温水を１時間かけて２０℃まで冷却し、コハク酸を冷却晶析し、２０℃到達後さらに２０℃で１時間熟成した。
【０３７７】
得られたスラリーは真空ろ過し、さらに冷水１５０ｇで水洗し、ウェットケーキを回収した。さらに得られたウェットケーキは真空燥機で８０℃、最大減圧で乾燥し、最終的に８３ｇのコハク酸を回収した。得られたコハク酸を組成分析した結果を、下記表２６に示す。
【０３７８】
【表２６】
0005991400.tif 000027
【０３７９】
［比較例２−２］
実施例２−１の方法に従い、プロトン化したコハク酸水溶液を実施例２−９で用いた連続抽出塔塔頂部から２００ｇ／時で供給するとともに、ボトムから１０％含水ＭＥＫを３００ｇ／時で供給したところ、塔内で多量の不溶成分が発生し、液々分離を阻害し、連続運転はできなかった。
【０３８０】
以上の実施例および比較例の結果を纏めたものを、下記表２７に示す。
【０３８１】
【表２７】
0005991400.tif 000028
【０３８２】
［実施例３］
本実施例における酸類、糖類の定量分析、アミノ酸の定量分析、タンパク質の定量は実施例２と同様に行った。
【０３８３】
［実施例３−１］
＜プロトン化工程＞
表２に示す組成のコハク酸発酵液１５００ｇに、９８％硫酸を加えｐＨを２．５に調整した。ここで９８％硫酸添加量は１５０ｇであった。
【０３８４】
＜接触工程＞
硫酸添加後のコハク酸水溶液は、ジャケット付スタティックミキサー（ノリタケ１／４（１）−Ｎ４０−１７４−０（内径Φ５ｍｍ、エレメント数２４））および各槽が６００ｍｌ、４００ｍｌ、３００ｍｌのジャケット付３槽式のセトラーを用い、ＭＥＫ溶液と混合、液々分離することでコハク酸を連続抽出した。
【０３８５】
すなわちコハク酸水溶液１６５０ｇおよび予め水を添加した１０％含水メチルエチルケトン（以下、ＭＥＫと略記することがある）溶液８２５ｇ（ＭＥＫ溶液（重量）／コハク酸水溶液（重量）＝０．５（重量／重量））をそれぞれ２０ｇ／分、１０ｇ／分の速度でジャケットに３０℃の温水を流すことで温度制御されたスタティックミキサーへ供給し、抜き出した懸濁液はジャケットに３０℃の温水を流すことで温度制御された３槽式のセトラーの第１槽へ供給し、液々分離され第１槽のボトムから抽残相を連続的に抜き出した。
【０３８６】
抽出相は第１槽と第２槽間の堰をオーバーフローし、第２槽へ供給した。第２槽では第１槽で分離できなかった不溶成分をボトムに沈降させ、清澄な抽出相のみを第２槽と第３槽間の堰をオーバーフローさせ第３槽へ供給させた。さらに第３槽では液界面近傍から清澄な抽出相をオーバーフローさせて抽出相を回収し、最終的に抽出相６８８ｇ、抽残相１６１３ｇ、中間相１７３ｇを回収した。中間相は目開き０．５μｍのＰＴＦＥ製メンブランフィルターで加圧ろ過することで、清澄液１７２ｇを回収した。
【０３８７】
＜連続抽出＞
回収した抽残相１６１３ｇは、内径Φ２０ｍｍ，高さ２ｍのジャケット付攪拌型連続抽出塔（理論段１０段）を用い、１０％含水ＭＥＫ１６１３ｇ（ＭＥＫ溶液（重量）／コハク酸水溶液（重量）＝１．０（重量／重量））で連続抽出した。ここで抽残相は２００ｇ／時間の速度で塔頂部から供給し、塔底から予め含水量１０重量％に調整したＭＥＫ溶液を２００ｇ／時間の速度で流した。連続相は抽残相、分散相はＭＥＫ相とした（軽液分散）。
【０３８８】
また抽出塔の温度はジャケットに温水を通液することで３０℃に制御した。最終的に抽出相は１７７７ｇ回収された。回収した抽出相はミキサーセトラーで回収した清澄液とあわせ、得られた脂肪族ジカルボン酸を含有する液は、合計２６３７ｇであった。その組成を分析したところ下記表２８に示すような結果であった。
【０３８９】
【表２８】
0005991400.tif 000029
【０３９０】
＜蒸留＞
回収した抽出相は連続蒸留によりＭＥＫを実質的に除去する。ここで蒸留留出液への水の添加量は、実施例２−１と同様に算出した。蒸留後の釜残液は４３２ｇであった。またその組成を分析した結果を、下記表２９に示す。
【０３９１】
【表２９】
0005991400.tif 000030
【０３９２】
＜晶析＞
ＭＥＫを留去した液はジャケット付５００ｍｌセパラブルフラスコへ移し、攪拌下ジャケットに温水を通水することで８０℃に保温した。その後プログラム付循環恒温槽を用い、ジャケットへ通水する温水を１時間かけて２０℃まで冷却し、コハク酸を冷却晶析し、２０℃到達後さらに２０℃で１時間熟成した。
【０３９３】
得られたスラリーは真空ろ過して晶析母液を分離した。さらに得られた晶析物のウエットケーキを冷水２５０ｇで水洗し洗浄液を回収し、コハク酸を主成分とするウェットケーキを得た。さらに得られたウェットケーキを真空乾燥機で８０℃最大限圧条件で乾燥し、最終的に１１４ｇのコハク酸を回収した。得られたコハク酸を組成分析した結果を、下記表３０に示す。
【０３９４】
【表３０】
0005991400.tif 000031
【０３９５】
晶析母液および洗浄液は、混合して５６２ｇの回収液とし、その組成は下記表３１の通りであった。
【０３９６】
【表３１】
0005991400.tif 000032
【０３９７】
［実施例３−２］
＜プロトン化＞
前記コハク酸発酵液１３８４ｇに、９８％硫酸を加えｐＨ２．５とした。ここで９８％硫酸添加量は１３８ｇであった。このプロトン化した液に、実施例３−１で回収された回収液の半分に当たる２８１ｇを加え、コハク酸水溶液１８０３ｇを調整した。
【０３９８】
＜抽出＞
実施例３−１と同様の方法で、コハク酸水溶液を１０％含水ＭＥＫで抽出した。ミキサーセトラーではコハク酸水溶液に対し０．５重量倍の１０％含水ＭＥＫをそれぞれ２０ｇ／分、１０ｇ／分で供給し、回収した中間相は加圧ろ過、抽残相はさらに抽残相に対し１．０重量倍の１０％含水ＭＥＫで向流多段連続抽出を行った。結果、抽出相２８８２ｇ、抽残相１５９３ｇを回収した。その組成は以下の通りであった。
【０３９９】
＜蒸留＞
実施例３−１と同様の方法で蒸留を行い、コハク酸濃縮液４３８ｇを回収した。その組成は下記表３２の通りであった。
【０４００】
【表３２】
0005991400.tif 000033
【０４０１】
＜晶析＞
実施例３−１と同様の方法で晶析を行い、コハク酸１１３ｇと晶析母液および洗浄液の混合液である回収液５６８ｇを回収した。下記表３３に得られたコハク酸の組成を、下記表３４に得られた回収液の組成を示す。
【０４０２】
【表３３】
0005991400.tif 000034
【０４０３】
回収したコハク酸／新たに供給したコハク酸：１１３×０．９５９／（１３８４×０．０８６５）＝９１％
【０４０４】
【表３４】
0005991400.tif 000035
【０４０５】
［実施例３−３］
実施例３−２と同じ手順でプロトン化から晶析までの工程を実施して、コハク酸１１４ｇと晶析母液および洗浄液の混合物である回収液５７３ｇを得た。下記表３５に得られたコハク酸の組成を、下記表３６に得られた回収液の組成を示す。
【０４０６】
【表３５】
0005991400.tif 000036
【０４０７】
【表３６】
0005991400.tif 000037
【０４０８】
［実施例３−４］
実施例２と同じ手順でプロトン化から晶析までの工程を実施して、コハク酸１１４ｇと、晶析母液および洗浄液の混合物である回収液５６４ｇを得た。下記表３７に得られたコハク酸の組成を示す。下記表３８に得られた回収液の組成を示す。
【０４０９】
【表３７】
0005991400.tif 000038
【０４１０】
【表３８】
0005991400.tif 000039
【０４１１】
晶析母液と回収液の混合物である回収液をリサイクルしても、得られるコハク酸の純度が大きく低減することもなく、単位操作上の不具合も起きなかった。
【０４１２】
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお本出願は、２００９年１０月７日付で出願された日本特許出願（特願２００９−２３３８２０）、２００９年１１月１７日付で出願された日本特許出願（特願２００９−２６２００７）および２００９年１２月２２日付で出願された日本特許出願（特願２００９−２９１４７４）に基づいており、その全体が引用により援用される。
【産業上の利用可能性】
【０４１３】
また、本発明によりコハク酸、フマル酸およびリンゴ酸などの非アミノ有機酸が得られる。コハク酸または該コハク酸を含有する組成物は、食品添加物、医薬品および化粧品などに用いることができる。またフマル酸または該フマル酸を含有する組成物は、食品添加物、不飽和ポリエステル樹脂および紙用サイズ剤等に用いることができる。さらに、リンゴ酸または該リンゴ酸を含有する組成物は、食品添加物、化粧品、消臭剤、洗剤および染色剤等に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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