(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）ウィルス試料溶液にコンカナバリンＡを添加して反応させるステップと、
（Ｂ）前記反応液からウィルス−コンカナバリンＡ結合体を分離するステップと、
を含むことを特徴とするウィルスの濃縮方法であって、
前記コンカナバリンＡは、
（ａ）酸性条件下で、豆粉砕物を水で抽出するステップと、
（ｂ）前記水抽出物から飽和度０．４〜０．８の硫酸アンモニウムにより沈殿される沈殿物分画を得るステップと、
（ｃ）前記沈殿物分画から硫酸アンモニウムを除去するステップと、
を含む方法により得られる粗タンパク質であることを特徴とする、濃縮方法。
【請求項２】
前記ステップ（Ａ）の反応時間は、５分〜１時間であることを特徴とする請求項１に記載のウィルスの濃縮方法。
【請求項３】
前記ウィルスは、ノロウィルスまたはＡ型肝炎ウィルスであることを特徴とする請求項１に記載のウィルスの濃縮方法。
【請求項４】
前記ステップ（Ｂ）は、ステップ（Ａ）の反応液にアセトンを添加してウィルス−コンカナバリンＡ結合体を沈殿させて回収することにより行われることを特徴とする請求項１に記載のウィルスの濃縮方法。
【請求項５】
前記ステップ（Ａ）のコンカナバリンＡは、磁性ビードに連結された状態で投入されることを特徴とする請求項１に記載のウィルスの濃縮方法。
【請求項６】
前記ステップ（Ａ）のコンカナバリンＡは、レジンに連結された状態で投入されることを特徴とする請求項１に記載のウィルスの濃縮方法。
【請求項７】
ウィルスプローブの製造方法であって、
（ａ）酸性条件下で、豆粉砕物を水で抽出するステップと、
（ｂ）前記水抽出物から飽和度０．４〜０．８の硫酸アンモニウムにより沈殿される沈殿物分画を得るステップと、
（ｃ）前記沈殿物分画から硫酸アンモニウムを除去するステップと、
を含む方法によりコンカナバリンＡを得、
前記コンカナバリンＡを支持体に共有結合により結合することを特徴とするウィルスプローブの製造方法。
【請求項８】
前記支持体が磁性ビードであることを特徴とする請求項７に記載のウィルスプローブの製造方法。
【請求項９】
前記支持体がレジンであることを特徴とする請求項７に記載のウィルスプローブの製造方法。
【請求項１０】
（Ａ）試料溶液を用意するステップと、
（Ｂ）前記試料溶液から請求項１に記載の方法によりウィルスを濃縮するステップと、
（Ｂ）前記ウィルスの濃縮物からウィルスを検出するステップと、
を含むことを特徴とするウィルスの検出方法。
【請求項１１】
前記ステップ（Ａ）の試料が固体であり、ウィルスの脱離ステップを経て試料溶液を用意することを特徴とする請求項１０に記載のウィルスの検出方法。
【請求項１２】
前記ウィルスの脱離ステップと、（Ｂ）のウィルスの濃縮工程中のコンカナバリンＡとの反応ステップが同時に行われることを特徴とする請求項１１に記載のウィルスの検出方法。
【請求項１３】
前記ウィルスは、ノロウィルスまたはＡ型肝炎ウィルスであることを特徴とする請求項１０に記載のウィルスの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は濃度が低いウィルス溶液中のウィルスを短時間内に高い効率で濃縮することのできる経済的なウィルスの濃縮方法及び前記方法を応用したウィルスの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品衛生法第４条（危害食品などの販売など禁止）の規定に定めている「危害要素」とは、人体の健康を損なう虞のある生物学的、化学的または物理的な因子や条件のことをいう。外部から流入した異物や消費者の衛生に直接的な影響を及ぼさない変敗などは危害と見なさない。危害要素は、下記表１のように分けることができる。
【０００３】
【表１】
0006003958.tif 000002
【０００４】
本発明は、生物学的危害要素の検出と関連がある。生物学的危害要素は、カビ、細菌、ウィルスなどの微生物と寄生虫などの生物体を含む。生物学的危害要素は、原料の生産及び流通過程で作業場内に流入することがあり、作業場の環境、従業員、食品成分、製造・加工過程そのものにより汚染されることもある。
【０００５】
農水畜産物に由来する食品のうち危害要素により発生する事件事故は国民の健康に深刻な影響を及ぼし、危害要素の適切な早期検出方法及び制度の不在に起因して発生する食中毒事故による韓国の経済的な損失が１年につき１兆３０００億ウォンに至る。生物学的食中毒の発病要因のうちほとんどは微生物により誘発され、中でも、ウィルスによる食中毒が全体食中毒の３４〜４０％を占めてウィルス食中毒による損失が４、０００億ウォンに至る。
【０００６】
現代の都市環境の衛生状態が大幅に改善されているにも拘わらず、最近、食中毒原因ウィルスであるノロウィルス（ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）感染事例は増大傾向にあり、２０１２年の一年間に亘って日本人６名とヨーロッパ人１２名がこのウィルスに感染されて死亡した。米国疾病統制予防センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）は、ノロウィルス感染により１９９６年から２０００年まで合計３４８回の集団発病を引き起こしたと報告した。
【０００７】
また、青長年層ではＡ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）に対する抗体保有率が下がることに伴い、肝炎事例が増加すると報告されている。Ａ型肝炎ウィルスは伝染性の高い水因性疾病及び急性炎症性肝疾患であり、糞便及び経口により感染され、世界的に毎年１５０万件の感染事例が発生すると推定される。韓国では２０００年からＡ型肝炎が指定伝染病として登載されて以来、２００１年の約１００件から２０１０年の７、６５５件に発病件数が増加した。
【０００８】
このような傾向に鑑みて、２０１０年にはノロウィルス及びＡ型肝炎ウィルスを第１群感染病に変更して法定感染全数監視体系を運営している（疾病管理本部）。
【０００９】
一方、有害ウィルスが果菜類をはじめとする農産物検体から検出される事例が国内外で報告されている。ウィルスに感染した食品を加熱せずに摂取したり汚染された地下水を食水として飲んだりする場合にはウィルスに感染する虞がある。例えば、ノロウィルスとＡ型肝炎ウィルスは主として新鮮ではないカキを生で食べたときに感染し易い。ノロウィルスとＡ型肝炎ウィルスの代表的な感染原因及び症状予防法は、下記表２の通りである。
【００１０】
【表２】
0006003958.tif 000003
【００１１】
このため、農水畜産物の生産現地でウィルス性食中毒を予防し、消費者に安全な食物を提供するために活用可能なウィルスの高速検出方法は、このような社会的な損失を予防する方法である。
【００１２】
食中毒ウィルスは単クローンまたは多クローン抗体を用いた酵素免疫法、分子生物学的検査法により診断することができ、最近にはチップ技術を用いた検査法も開発されている。
【００１３】
食品からウィルスを検出するためには、食品からウィルスを脱離する過程、脱離液液中でウィルスを濃縮する過程、ウィルスを検出する過程を経ることになる。ウィルスの脱離は脱離液を用いて行い、脱離液は分析機関により非常に様々な種類が用いられている。脱離されたウィルスの濃縮方法としては、免疫磁力捕捉法（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ  ｃａｐｔｕｒｅ）、有機凝集法（ｏｒｇａｎｉｃ  ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ）、ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）沈殿法が用いられている。しかしながら、免疫磁力捕捉法はウィルスの濃縮時間は短縮することはできるが、高価の抗体を用いる高コストの濃縮方法であり、有機凝集法とＰＥＧ沈殿法はウィルスの濃縮に長時間がかかり、過程が複雑であるが故に濃縮過程中のウィルスの損失が多いため検出敏感度が低下するという欠点がある。
【００１４】
一方、食水や生活用水としては主として水道水や地下水が用いられているが、衛星処理施設及び方法の発達により腸チフス、コレラ、細菌性及びアメーバ赤痢などの細菌による水因性疾病は大幅に減少した。これに対し、原生動物は塩素消毒に対する耐性が大きいが故に浄水処理過程で除去しにくいためジアルジア及びクリプトスポリジウムなどによる発病は依然として問題視されている。また、水因性ウィルスは最小１ユニットで感染可能であるためウィルスによる汚染事故が地表微生物の検出なしにも発生したケースがある。ウィルスによる感染は汚染された原水を処理しなかった場合、または、私設、簡易浄水場での処理が十分ではない場合に発生する。地下水の場合には環境汚染（口蹄疫など）による水質汚染により各種の有害物質が検出されているが、特に、感染した患者の排泄物により伝染されるノロウィルスは小さいため土壌に浸透しやすく、低温が保たれる地下水でも長期に亘って生存可能であるため問題視されている。この理由から、ウィルスなどの生物学的危害要素から安全な食水の提供方法が依然として望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、上記の問題点を解消するために、安価な装備及び試薬を用いて短時間にウィルスを効率よく濃縮及び検出することのできる方法を提供することを目的としている。
【００１６】
また、本発明は、上記のウィルスの濃縮に際して、精製されたウィルス結合タンパク質の代わりに経済的に且つ効果的に用いることのできるウィルス結合粗タンパク質の製造方法を提供することを他の目的としている。
【００１７】
さらに、本発明は、ウィルスの濃縮及び検出に使用可能なウィルスプローブを製造することをさらに他の目的としている。
【００１８】
さらにまた、本発明は、ウィルスを効果的に除去可能な浄水方法を提供することをさらに他の目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記の目的を達成するために、本発明は、（Ａ）ウィルス試料溶液にコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を添加して反応させるステップと、（Ｂ）前記反応液からウィルス−ＣｏｎＡ結合体を分離するステップと、を含むことを特徴とするウィルスの濃縮方法を提供する。本発明者らは、ウィルスを速やかに濃縮及び検出するための新規な方法を開発するために鋭意努力した結果、ＣｏｎＡがウィルスと特異的に結合し、これを用いてウィルスを簡便且つ迅速に濃縮し、さらに、ウィルスの検出に活用することができるということを見出した。
【００２０】
前記ＣｏｎＡとしては、商用化された精製試料を用いてもよい。しかしながら、試薬としてのＣｏｎＡは１ｇ当たりに数十万ウォンと高価であるため、実験室での研究を目的としたウィルスの濃縮ではなく、食品素材でのウィルス検出のように試料の数が多く、しかも、多くの繰り返し実験回数が必要な場合にはさらに経済的に使用可能な試料が求められる。本発明のウィルス濃縮では、精製されたＣｏｎＡ試料ではなく、粗タンパク質試料を用いてもよい。前記粗タンパク質試料は、ＣｏｎＡの含有量が多いことがウィルスの効果的な濃縮に有利である。この理由から、本発明者らは、ＣｏｎＡの含有量が高い粗タンパク質試料の製造方法を開発した。すなわち、ＣｏｎＡは、（Ａ）豆粉砕物を水で抽出するステップと、（Ｂ）前記水抽出物から飽和度０．４〜０．８の硫酸アンモニウムにより沈殿される沈殿物分画を得るステップと、（Ｃ）前記沈殿物分画から硫酸アンモニウムを除去するステップと、を含む方法により得られる粗タンパク質として用いられてもよい。前記飽和度は、飽和溶液での濃度に対する濃度の割合を意味する。
【００２１】
本発明において、前記ステップ（Ａ）の反応時間は５分〜１時間であることが好ましい。反応時間が５分以下である場合にはＣｏｎＡとウィルスの結合が十分ではないため濃縮効率が低下する。本発明は、安価な試料と装備を用いることから経済的であり、ウィルスとの反応時間が短く、しかも、濃縮効率が良いことからウィルス濃縮にかかる時間が大幅に短縮されることを特徴とする。このため、反応時間が長引くと濃縮効率はやや向上するとはいえ、通常の場合に１０分〜３０分反応させるだけで十分であり、反応時間が１時間以上になる場合に他の問題が発生するわけではないが、実質的に得られる効果が大幅に増大されるわけではないため反応時間は１時間以下であることが好ましい。
【００２２】
前記ウィルスとして、下記の実施例ではノロウィルスとＡ型肝炎ウィルスのみを挙げたが、これに限定されることはない。
【００２３】
前記ステップ（Ｂ）のウィルス−ＣｏｎＡ結合体の分離は種々の方法により行われてもよく、用途に応じて適切に選択して用いてもよい。例えば、反応液にアセトンのように水と混合される有機溶媒を加えてウィルス−ＣｏｎＡ結合体を沈殿させて回収してもよい。または、ＣｏｎＡを磁性ビードまたはレジンに連結したウィルスプローブを製造した後、ステップ（Ａ）においてＣｏｎＡをウィルスプローブの形で投入した後に反応させ、プローブを回収してウィルス−ＣｏｎＡ結合体を分離してもよい。磁性ビードやレジンに連結されるＣｏｎＡとしても精製された試料を用いてもよいが、粗タンパク質の形に製造しても同じ結果が得られる。
【００２４】
このため、本発明は、ＣｏｎＡが支持体に共有結合により結合されているウィルスプローブを提供する。前記支持体はＣｏｎＡの固定のために用いられる固体物質であり、ＣｏｎＡと結合可能な官能基を有するものであればいかなるものであっても構わない。下記の実施例では、支持体として磁性ビードとレジンを例示しているが、紙や多孔質の担体を用いてもよい。ウィルスプローブが磁性ビードよりなる場合には磁石やろ過により、ウィルスプローブがレジンや紙などの場合にはろ過により簡単に回収可能である。本発明は、Ｃｏｎ−Ａとウィルスの結合体を形成してウィルスを濃縮することを核心としており、当業者であれば、ＣｏｎＡが連結されたウィルスプローブは従来の技術（例えば，  Ｓｈａｎ  Ｓ．  Ｗｏｎｇ，  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｍ．  Ｊａｍｅｓｏｎ  ”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ”  ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ，  ２０１１）を応用して容易に製造可能であるためウィルスプローブの製造についての詳細な説明は省略する。
【００２５】
また、本発明は、（Ａ）試料溶液を用意するステップと、（Ｂ）前記試料溶液から前記本発明によるウィルスの濃縮方法によりウィルスを濃縮するステップと、（Ｂ）前記ウィルスの濃縮物からウィルスを検出するステップと、を含むことを特徴とするウィルスの検出方法を提供する。
【００２６】
試料が野菜などの固体試料であれば、試料溶液の製造は、ウィルスの脱離ステップを経て行われる。本発明によれば、ＣｏｎＡ溶液をウィルス脱離液として用いてウィルスの脱離と同時にＣｏｎＡと反応させてもよい。前記本発明のウィルスの検出方法において、ＣｏｎＡとして粗タンパク質を用いてもよいことはいうまでもない。
【００２７】
ＣｏｎＡ試料として上述したウィルスプローブを用いた場合には、必要に応じて、ウィルスプローブからウィルスを脱離した後にウィルスを検出してもよく、プローブに結合された状態でウィルスを検出してもよい。プローブからのウィルスの脱離も公知の技術であるためここではこれについての詳細な説明を省略する（例えば，  Ｓｏｕｓａ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ  ｎｏｉｓｅ  ｒａｔｉｏ  ｉｎ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ２Ｄ−ＰＡＧＥ  ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１１，  ９（４５））。
【００２８】
前記濃縮物からのウィルスの検出は、当業者であれば、電子顕微鏡による直接的な計数方法、ウィルスの抗原に特異的な抗体を用いた免疫酵素学的方法、重合酵素連鎖反応による遺伝子検出方法など用途及びウィルスの特性に応じて適切な方法を用いてもよい。
【００２９】
また、本発明は、ＣｏｎＡが連結されたレジンを通過させることを特徴とする浄水方法を提供する。下記の実施例からも確認できるように、コンカナバリンＡが連結されたレジンの通過により水に含有されている極少量のウィルスも効果的に除去することができる。
【発明の効果】
【００３０】
以上述べたように、本発明によれば、ウィルスの濃縮のための反応時間が約５分〜約１時間に過ぎず、早い時間内にウィルスを高い効率で濃縮することができる。また、本発明のウィルスの濃縮方法においては、粗タンパク状態のＣｏｎＡを用いることができるため、高価な試料や高価な装備または熟練した技術を必要としない。この理由から、簡便且つ経済的にウィルスを濃縮することができる。
【００３１】
前記ウィルスの濃縮方法を用いた本発明のウィルスの検出方法においては、さらに脱離過程においてウィルスとの結合反応が起こるため別途の反応時間が不要になり、特に早い検出を必要とする食品素材でのウィルス検出に用いて好適である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１ａ】本発明の一実施形態によるＣｏｎＡ粗タンパク質の製造過程を示すフローチャートである。
【図１ｂ】本発明の一実施形態によるＣｏｎＡ粗タンパク質の製造過程を示すフローチャートである。
【図２ａ】ｃｏｎＡとウィルスの結合親和度を示すグラフである。
【図２ｂ】ｃｏｎＡとウィルスの結合親和度を示すグラフである。
【図２ｃ】ｃｏｎＡとウィルスの結合親和度を示すグラフである。
【図３ａ】Ａ型肝炎ウィルスの濃縮効率を示す写真である。
【図３ｂ】Ａ型肝炎ウィルスの濃縮効率を示す写真である。
【図４ａ】ノロウィルスの濃縮効率を示す写真である。
【図４ｂ】ノロウィルスの濃縮効率を示す写真である。
【図５】本発明の一実施形態によるウィルスの検出方法を示す模式図である。
【図６ａ】図５の方法によるＡ型肝炎ウィルスの濃縮効率を示す写真である。
【図６ｂ】図５の方法によるノロウィルスの濃縮効率を示す写真である。
【図７ａ】本発明の他の実施形態によるノロウィルスの定量曲線を示す図である。
【図７ｂ】本発明の他の実施形態によるノロウィルスの定量結果を示す図である。
【図８】食品素材でのＡ型肝炎ウィルスの検出効率を示す比較図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、実施例を挙げて本発明についてより詳細に説明する。しかしながら、このような図面及び実施例は本発明の技術的思想の内容と範囲を容易に説明するための単なる例示に過ぎず、これにより本発明の技術的範囲が限定または変更されることはない。なお、このような例示に基づいて本発明の技術的思想の範囲内で種々の変形と変更が可能であるということは当業者にとって自明である。
【００３４】
実施例１：ウィルス結合粗タンパク質の分離
２００ｇのタチナタマメ（Ｊａｃｋ−ｂｅａｎ）をミキサーで粉砕した後、２，４００ｍＬの蒸留水で１時間攪拌した。次いで、ＨＣｌを用いてｐＨを４．６に調整し、室温で２時間攪拌した後、４℃で攪拌なしに一晩中浸漬した。浸漬された反応液の上澄液はワットマン紙フィルター（Ｎｏ．４）でろ過し、沈殿物は遠心分離（６，０００ｒｐｍ、１０分）した後、ろ過したろ液と上澄液を合わせて約２Ｌの抽出液を得た。
【００３５】
抽出液を４℃で攪拌しながら飽和度が０．４になるように５６０ｇの硫酸アンモニウムを添加して４℃で４時間攪拌し、次いで、攪拌なしに一晩中浸漬した。次いで、浸漬液を遠心分離（６，０００ｒｐｍ、１０分）して上澄液約２，５６０ｍＬを回収した。４℃で回収した上澄液を攪拌しながらさらに７１７ｇの硫酸アンモニウムを添加して飽和度が０．８になるようにした後に２時間攪拌し、次いで、一晩中浸漬した。翌日に遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１５分）により得られた上澄液は廃棄し、沈殿物は蒸留水６０ｍＬを用いて回収した。
【００３６】
前記方法により約０．４〜０．８の硫酸アンモニウム飽和度により得られた沈殿物の溶液（豆タンパク質分画物）を蒸留水を用いて透析（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ６、スペクトラム・ラボラトリーズ社、米国）して硫酸アンモニウムを除去した。さらなる精製のために、透析液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１５分）して約１３２ｍＬの上澄液を得た。
【００３７】
この上澄液に７４ｇの硫酸アンモニウムを入れて飽和度０．８の硫酸アンモニウムが溶解された豆抽出物を４℃で１時間攪拌した後に遠心分離（６，０００ｒｐｍ、１０分）した。遠心分離により得られた沈殿物は２０ｍＬの０．０５Ｍのリン酸塩溶液（ｐＨ６．１）に溶解して、６０％エタノールに−８℃で４８時間透析した。次いで、６０％エタノールを除去し、３次蒸留水で２４時間透析した。透析し終わった透析液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分）し、得られた上澄液を凍結乾燥して豆からコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）入り粗タンパク質０．４３ｇを分離した。
【００３８】
図１は、ＣｏｎＡ入り粗タンパク質の分離過程を示すフローチャートである。
【００３９】
実施例２：ＣｏｎＡとウィルスとの間の結合の確認
ＥＬＩＳＡと表面プラズモン共鳴（Ｓｕｌｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＳＰＲ）分析法によりｃｏｎＡとウィルスとの間に結合力があることを確認した。ウィルスとしては、現在韓国内に頻繁に出現するタイプであるＧＩ．４、ＧＩＩ．３またはＧＩＩ．４型ノロウィルスを光州保健環境研究院から受け取って用いた。
【００４０】
ＥＬＩＳＡ実験は、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に０、０．０１、０．０５、０．１、１、５０、１００μｇ／ｍｌのＣｏｎＡを５０μｌずつ分注して４℃で１２時間コーティングし、次いで、０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０（シグマ社、米国）入りリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で各ウェルを３回洗浄した後、５％脱脂乳（ＳＫＩ４００、ビオショップ）入りリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液で室温で１時間反応させて遮断することにより行われた。次いで、ノロウィルスを２時間室温で反応させた後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０入りリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで、５％脱脂乳に１０００倍希釈された１次抗体（Ａｎｔｉ−Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  Ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＰ１  ａｎｔｉｂｏｄｙ、ａｂ９２９７６、アブカム社）で１時間培養した後に洗浄し、５％脱脂乳で２０００倍希釈された２次抗体（Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ／ＨＲＰ、Ｐ０４４８、ダコ）でさらに１時間培養して洗浄した。ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）基剤（Ｐ８２８７、シグマ社）を添加して室温で２０分間培養し、０．５ＭＨ２ＳＯ４を用いて停止した後、４９５ｎｍで吸光度を測定した。図２Ａ〜図２Ｃの左図はそれぞれＧＩ．４、ＧＩＩ．３またはＧＩＩ．４型ノロウィルスに対するＥＬＩＳＡ結果である。ＣｏｎＡの濃度が増大することに伴い、検出されるノロウィルスが増大することを確認することができ、少なくとも５０μｇ／ｍｌの濃度であるときに有意的な値を確認することができた。
【００４１】
プラズモン共鳴分析は、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００  ＳＰＲバイオセンサー（ＧＥ社、米国）を用いて行った。先ず、供給者の説明書に従いＣＭ５チップ（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｄｅｘｔｒａｎ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｈｉｐ、ビアコア社）をＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化させた。次いで、ＧＩ．４、ＧＩＩ．３またはＧＩＩ．４型ノロウィルスを注入して約３５０反応単位（ＲＵ）が固定されるように注入し、１Ｍエタノールアミンを注射して未反応基を遮断した。０．２５〜１００ｎｍの様々な濃度に希釈されたＣｏｎＡ（シグマ−アルドリッチ社、米国）を２０μｌ／分の速度で２分間チップに注入した。図２Ａ〜図２Ｃの右図は、それぞれＧＩ．４、ＧＩＩ．３またはＧＩＩ．４型ノロウィルスに対するプラズモン共鳴スペクトルである。ＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｖｅｒ．３．２ソフトウェアを用いて結合速度（Ｋｏｎ）及び解離速度（Ｋｏｆｆ）を計算し、これから平衡解離定数（Ｋｄ）Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎを求めた。ＧＩ．４、ＧＩＩ．３またはＧＩＩ．４型ノロウィルス平衡解離定数はそれぞれ４．４７×１０−９、４．６２×１０−９、２．１９×１０−９であり、３タイプのノロウィルスはいずれもＣｏｎＡとの結合親和度が高いことを確認することができた。
【００４２】
実施例３：ＣｏｎＡまたはＣｏｎＡ入り粗タンパク質を用いたノロウィルス及びＡ型肝炎ウィルスの濃縮
ＣｏｎＡまたは実施例１で製造したＣｏｎＡ入り粗タンパク質を用いて３種類の方法によりノロウィルス（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）とＡ型肝炎ウィルスを濃縮した。下記の実験において、ノロウィルスとしてはＧＩＩ．４型を用いた。
【００４３】
１）沈殿によるウィルスの濃縮
（１）ウィルスの濃縮
ＣｏｎＡ（シグマ−アルドリッチ社、米国）または実施例１で製造した粗タンパク質を１０４ＴＣＩＤ５０／ｍＬのＡ型肝炎ウィルス試料（ＶＲ−１４０２、ＡＴＣＣ、米国）に０、０．５、１または５ｍｇ／ｍＬの濃度で入れて１０分間反応させた。次いで、−２０℃アセトンを試料量の６倍入れて攪拌した後、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄液は廃棄し、濃縮されたタンパク質を回収した。回収されたタンパク質を冷たい９０％アセトンで洗浄し、同じ条件下で遠心分離した後に上澄液を除去し、５分間乾燥して濃縮されたＡ型肝炎ウィルス沈殿物を得た。対照区としてＣｏｎＡの代わりにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ビオショップ社、カナダ）を５ｍｇ／ｍＬの濃度で添加して１０分間反応させた以外は、上記の方法と同様にして濃縮されたＡ型肝炎ウィルス沈殿物を得た。
【００４４】
従来の技術との比較のために、ＰＥＧ沈殿法によりウィルス濃縮物を製造した。より具体的に、Ａ型肝炎ウィルス試料に２倍のＰＥＧ溶液［１６％ＰＥＧ  ６０００（シグマ・ケミカル・カンパニー、米国）、０．５２５Ｍ  ＮａＣｌ（ビオショップ社、カナダ）］を入れて４℃で１０分間反応させた。反応液を２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離して上澄液を除去し、沈殿物の形でＡ型肝炎ウィルス濃縮物を得た。ＰＥＧ沈殿法では４〜６時間反応させることが通常であるが、短時間内にウィルスが濃縮可能な本発明における方法との比較のために反応時間を同様に限定した。
【００４５】
ノロウィルス試料（光州保健環境研究院、１００ＲＴ−ＰＣＲｕｎｉｔｓ／ｍＬ）に対しても、ＣｏｎＡやＢＳＡまたはＰＥＧと３０分間反応させた以外は、Ａ型肝炎ウィルスと同じ方法により濃縮されたノロウィルス沈殿物を得た。
【００４６】
（２）濃縮サンプルにおけるウィルスの確認
（１）で製造  した沈殿物をそれぞれ２００μｌのＴＥ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）から浮遊させた後、１０倍ずつ希釈してＲＴ−ＰＣＲを行い、電気泳動してＡ型肝炎ウィルスまたはノロウィルスを検出し、その結果を図３及び図４に示す。図３ＡはＣｏｎＡを、図３Ｂは実施例１で製造した粗タンパク質を用いたＡ型肝炎ウィルスの検出結果であり、図４ＡはＣｏｎＡを、図４Ｂは実施例１で製造した粗タンパク質を用いたノロウィルスの検出結果である。
【００４７】
Ａ型肝炎ウィルスの検出のためのプライマーとしてはＨＡＶ＿ＶＰ１＿Ｆ（配列番号１  ：  ５’−ＴＧＧ  ＴＴＴ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＡＡＣ  ＡＣＴ  ＧＡＧ  Ｇ−３’）とＨＡＶ＿ＶＰ１＿Ｒ（配列番号２  ：  ５’−ＡＣＣ  ＣＡＡ  ＧＧＡ  ＧＴＡ  ＴＣＡ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＡＧ−３’）を用い、ノロウィルスの検出のためのプライマー（Ｂｉｏｎｅｅｒ社、韓国）としてはＮｏｒｏ＿Ｍｏｎ４３１＿Ｆ（配列番号３  ：  ５’−ＴＧＧ  ＡＣＩ  ＡＧＲ  ＧＧＩ  ＣＣＹ  ＡＡＹ  ＣＡ−３’）とＮｏｒｏ＿Ｍｏｎ４３３＿Ｒ（配列番号４  ：  ５’−ＧＧＡ  ＹＣＴ  ＣＡＴ  ＣＣＡ  ＹＣＴ  ＧＡＡ  ＣＡＴ−３’）用いた。
【００４８】
各ウィルスの検出のためのＰＣＲ条件は、下記の通りである。
Ａ型肝炎ウィルスのＰＣＲ条件：変性９４℃で３０秒間、アニーリング５７℃で３０秒間、伸長７２℃で３０秒間３０サイクルを行い、最終伸長は７２℃で１０分間行う。
【００４９】
ノロウィルスのＰＣＲ条件：変性９４℃で３０秒間、アニーリング６０℃で３０秒間、伸長７２℃で３０秒間４０サイクルを行い、最終伸長は７２℃で１０分間行う。
【００５０】
図３Ａから確認できるように、ＣｏｎＡを添加しなかったときよりも、ＣｏｎＡを０．５ｍｇ／ｍＬ添加した場合にＡ型肝炎ウィルスの濃縮効率は約１０倍増大し、ＣｏｎＡの添加量が増大するほど濃縮効率に優れていた。また、濃度計で比較した結果、ＣｏｎＡの陰性対照区タンパク質であるＢＳＡを５ｍｇ／ｍＬの量で入れたときには、ＣｏｎＡを０．５ｍｇ／ｍＬ入れたときよりも濃縮効率が０．４倍低かった。従来の濃縮方法であるＰＥＧ濃縮法もまた、ＣｏｎＡを０．５ｍｇ／ｍＬ入れたときよりも濃縮効率が０．５倍低いため、ＣｏｎＡを０．５ｍｇ／ｍＬの低い濃度で用いても濃縮効率に優れていることを確認した。
【００５１】
精製されたＣｏｎＡではなく、実施例１で製造した粗タンパク質に対する濃縮効率を示す図３Ｂもまた、精製されたＣｏｎＡよりも濃縮効率がやや低かったが、粗タンパク質を５ｍｇ／ｍＬ用いた場合には精製されたＣｏｎＡと濃縮効率がほとんど同様であり、従来のＰＥＧ沈殿に比べて濃縮効率が顕著に高いことを示す。
【００５２】
ノロウィルスに対する濃縮効率を示す図４Ａもまた、従来の技術によるＰＥＧよりもＣｏｎＡによりノロウィルスが効果的に濃縮されることを示す。陰性対照区タンパク質であるＢＳＡは、むしろタンパク質を追加せずにアセトンのみを用いて濃縮したときよりも濃縮効率がさらに低かった。実施例１で製造した粗タンパク質に対する濃縮効率を示す図４Ｂもまた、Ａ型肝炎ウィルスの結果と同様に、精製されたＣｏｎＡよりは相対的に濃縮効率が低かったが、従来の技術によるＰＥＧ沈殿法とほとんど同じ濃縮効率を示す。
【００５３】
２）磁性ビードによるウィルスの濃縮
（１）ＣｏｎＡが連結された磁性ビードの製造
ストレプトアビジンが連結された磁性ビードとビオチン化されたＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ、ｃｏｎＡ）の反応によりＣｏｎＡが連結された磁性ビードを製造した（図５）。
【００５４】
より具体的に、先ず、ビオチン−ＸＸマイクロスケールタンパク質標識キット（Ｂｉｏｔｉｎ−ＸＸ  ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ、Ｂ３００１０；モレキュラープローブス社）の製作方法に従いＣｏｎＡ（シグマ−アルドリッチ社、米国）をビオチン化させた。簡略には、反応チューブ（コンポーネントＣ）に１ｍｇ／ｍｌのＣｏｎＡ溶液１００μｌと１Ｍ重炭酸ナトリウム１００μｌを入れて混合した。次いで、ｂｉｏｔｉｎ−ＸＸ、ＳＳＥ（コンポーネントＡ）に１０μｌのイオン水を入れて製造した溶液１μｌを添加して常温下で１５分間反応させた。次いで、キットに組み込まれているスピンフィルター（コンポーネントＤ）と精製用レジン（コンポーネントＥ）を用いてビオチン化されたＣｏｎＡを精製した。
【００５５】
前記方法により製造された１０μｇのビオチン化されたｃｏｎＡに１ｍｇのストレプトアビジンが結合された磁性ビード（１０ｍｇ／ｍＬ、Ｍ−２８０ストレプトアビジン、１１２０６Ｄ；インビトロジェン）を入れて常温下で１時間反応させた後、磁性を用いてビードを回収し、これを０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０（シグマ社、米国）入りリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄してＣｏｎＡが連結された磁性ビードを製造した。
【００５６】
（２）ウィルスの濃縮
（１）で製造した、ＣｏｎＡが連結された磁性ビードを有する試料チューブに１０４ＴＣＩＤ５０／ｍＬのＡ型肝炎ウィルス試料（ＶＲ−１４０２、ＡＴＣＣ、米国）またはノロウィルス試料（光州保健環境研究院、１００ＲＴ−ＰＣＲｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を１０−１〜１０−４の濃度に希釈した溶液２００μｌを入れて、室温下で１０分間反応させた。反応後に、磁石を用いて磁性ビードを収集し、２００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ、バイオセサン社、韓国）で３回に亘って洗浄した。洗浄した磁性ビードと１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を１．５ｍｌチューブに入れて懸濁して上澄液を除去した。
【００５７】
磁性ビードに結合されたウィルス結合体を分離するために、溶離液（５０ｍＭグリシン、ｐＨ２．８）５０μｌを磁性ビード入りチューブに入れて１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ溶液を用いてｐＨ７．５に中和した。
【００５８】
（３）ウィルスの検出
（２）で磁性ビードを用いて濃縮した後に溶離した溶液とウィルス希釈原液のそれぞれに対して目的ウィルスを１）の（２）に記載の方法によりＲＴ−ＰＣＲした後に電気泳動して検出した。図６Ａ及び図６Ｂは、ノロウィルス及びＡ型肝炎ウィルスの検出結果を示す電気泳動写真である。
【００５９】
図６Ａ及び図６Ｂから確認できるように、Ａ型肝炎ウィルス及びノロウィルスは濃縮前に原液から１０００倍の希釈範囲まで検出が確認され、ＣｏｎＡが連結された磁性ビードを用いた場合にも検出限界レベル範囲である１０００倍希釈検体までＲＴ−ＰＣＲで確認可能であった。
【００６０】
３）レジンによるウィルスの濃縮
（１）ＣｏｎＡが連結されたレジンの製造
レジン中のカルボキシル基を活性化させるために０．５ｇのイオン交換レジン（ＷＫ６０Ｌ、イリュン化学株式会社）を１０ｍｇのＥＤＣ（Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ′−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を溶かした３０％ＥｔＯＨ溶液に投入した後に１０分間反応させた。上澄液を除去した後、１０ｍｇのｃｏｎＡを溶かした３０％ＥｔＯＨ溶液を入れて１２時間さらに反応させた。反応液からレジンを回収し、３０％ＥｔＯＨを用いて洗浄した。
【００６１】
（２）ウィルスの濃縮
（１）で製造した、ｃｏｎＡが連結されたレジンを用いてノロウィルスを濃縮した。先ず、カラム（８０ｍｍ×２００ｍｍ）にレジン０．３４ｇを充填した後、ノロウィルス希釈液（ＧＩＩ．４、４．０７×１０２／ｍＬ）０．５ｍｌを流し、０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０（シグマ社、米国）入りリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ、バイオセサン社、韓国）溶液０．５ｍｌで洗浄した。ろ過液とレジンはそれぞれ収集して含有されたウィルスを下記で定性及び定量分析した。
【００６２】
（３）ウィルスの検出
レジンを通過したウィルス希釈液とレジンに含有されているウィルスを定性及び定量分析した。比較のために、ＣｏｎＡが連結されていないレジンを用いて（２）と同じ方法によりウィルス希釈液を通過させた後、レジンを通過したろ過液とレジンに含有されているウィルスの量を一緒に分析した。
【００６３】
先ず、ウィルス希釈液原液、ＣｏｎＡが連結されたレジンを通過したろ過液、ろ過液の洗浄後に収集したレジンを回収して１）の（２）に記載の方法に従いそれぞれＲＴ−ＰＣＲを行った後にアラロースゲルで電気泳動してＥｔＢｒ染色後の反応結果を確認し、その結果を図８Ｂに示す。レジンは、トリゾール（インビトロジェン社、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）０．５ｍｌでウィルスを抽出して分析した。図８Ｂから確認できるように、ｃｏｎＡを連結したレジンカラムを通過したウィルス希釈液からはノロウィルスが検出されず、回収したレジンからはウィルスが検出された。これに対し、ｃｏｎＡを連結しなかったレジンカラムを通過したウィルス希釈液からはノロウィルスが検出され、回収したレジンからはウィルスが検出されなかった。
【００６４】
より詳細な分析のために、定量分析を行った。
【００６５】
定量のための標準曲線を得るためにノロウィルスのＲＮＡを抽出してｃＤＮＡで合成し、これを鋳型としてＮｏｒｏ＿Ｍｏｎ４３１＿ＦとＮｏｒｏ＿Ｍｏｎ４３３＿Ｒをプライマーとして用いてノロウィルスのＲＮＡをクローニングした。クローニングしたＲＮＡをｐＴＯＰＴＡ  Ｖ２（エンジノミックス社、ＥＺ００１Ｓ）に挿入してプラスミドを製造し、１０倍希釈法を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの標準試料として用いた。
【００６６】
標準反応液は、１回の反応当たりにクローニングされたプラスミド２μｌ、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  ＥｘＴａｑ（タカラ社、ＲＲ４２０Ａ）１０μｌ、順方向及び逆方向のプライマー（１０ｐｍｏｌ）０．５μｌずつ用い、ＰＣＲグレードウォーターで最終体積を２０μｌに調節した後、ＲＴ−ＰＣＲマシン（タカラ社、ＴＰ８５０）を用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０秒間、５５℃で２０秒間、７２℃で３０秒間４５回繰り返し行った。増幅された蛍光値は、各種の重合酵素連鎖反応サイクルが進むことに伴い、７２℃で１０秒間反応させた後に１回ずつ持続的に測定した。
【００６７】
図７Ａは、前記方法により得られた標準曲線であり、ｙ＝−３．７２９ｘ＋４２．５５であり、Ｒ２＝０．９９１であった。ｙ切片値４２．５５から、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの４２周期内に増幅される全ての値を信頼することができることが分かり、Ｒ値から、増幅が効率的に行われることがわかる。
【００６８】
標準試料により得られる式から、実験に用いた試料原液にはノロウィルスが３．３９ｃｏｐｉｅｓ／μＬ含有されていることを確認した。ＣｏｎＡが連結されたレジンカラムにより濃縮されたウィルスを定量化させたときに２．１６ｃｏｐｉｅｓ／μＬであった。これに対し、ＣｏｎＡを連結しなかったレジンからはｃｔ値が確認されず、カラムを通過したろか液からは２．１５ｃｏｐｉｅｓ／μＬが検出された。
【００６９】
実施例４：新鮮な野菜からのＡ型肝炎ウィルスの検出効率の比較
本発明と従来の技術により実際の新鮮な野菜試料からのＡ型肝炎ウィルスの濃縮効率を比較した。
【００７０】
従来の技術としては、牛肉エキスを含む脱離溶液によりウィルスを脱離させた後、ＰＥＧにより濃縮する方法を用いた。ＣｏｎＡを用いた濃縮のためには、実施例３の１）による沈殿法を用いた。より具体的な実験方法は、下記の通りである。
【００７１】
１０ｇのレタスに１０３ＴＣＩＤ５０の濃度に希釈されたＡ型肝炎ウィルスを２０μｌずつ１０回接種し、クリーンベンチで３０分間乾燥して試料を用意した。
【００７２】
先ず、前記試料にＴｒｉｓ溶液４０ｍＬと５ｍｇの実施例１で製造した粗タンパク質が溶解された４０ｍＬの水溶液を入れ、ストマッカー（ＳＩＢＡＴＡサイエンステクノロジー）を用いて５分間物理的衝撃を加えた後、１０分間攪拌した。１０分後に溶液を１５，０００×ｇ及び４℃の条件下で遠心分離してウィルス上澄液を取った。上澄液に−２０℃のアセトンを試料量の６倍入れて攪拌した後、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離して濃縮されたタンパク質を回収した。次いで、実施例３の１）の（２）に記載の方法と同じ方法によりＡ型肝炎ウィルスを検出した。
【００７３】
比較のために同様に製造されたＡ型ウィルス感染レタス試料に牛肉エキス脱離溶液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭグリシン、１％牛肉エキス、ｐＨ９．５）８０ｍＬを入れ、ストマッカー（ＳＩＢＡＴＡサイエンステクノロジー）を用いて５分間物理的な衝撃を加えた後に１０分間攪拌した。１０分後に溶液を１５，０００×ｇ及び４℃の条件下で遠心分離してウィルス上澄液を取った。上澄液に２倍のＰＥＧ溶液［１６％ＰＥＧ  ６０００（シグマ・ケミカル・コンパニー、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）、０．５２５Ｍ  ＮａＣｌ］を入れて１０分間反応させた。次いで、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離して濃縮されたタンパク質を回収し、実施例３の１）の（２）と同じ方法によりＡ型肝炎ウィルスを検出した。
【００７４】
図８は、ＣｏｎＡ沈殿法及びＰＥＧ沈殿法の主な特徴及び結果を示す図である。図８から、本発明によるウィルスの濃縮方法は粗タンパク質を用いた方法であるにも拘わらず、ＰＥＧ溶液を用いた濃縮方法に比べて約２倍ほど効果的に検出されることを確認した。
【図１ａ】
0006003958.tif 000004
【図１ｂ】
0006003958.tif 000005
【図２ａ】
0006003958.tif 000006
【図２ｂ】
0006003958.tif 000007
【図２ｃ】
0006003958.tif 000008
【図３ａ】
0006003958.tif 000009
【図３ｂ】
0006003958.tif 000010
【図４ａ】
0006003958.tif 000011
【図４ｂ】
0006003958.tif 000012
【図５】
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【図６ａ】
0006003958.tif 000014
【図６ｂ】
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【図７ａ】
0006003958.tif 000016
【図７ｂ】
0006003958.tif 000017
【図８】
0006003958.tif 000018
【配列表】
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