(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト被検者の慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を評価するための in vitro 方法であって：
ａ）血清、血漿、又は全血試料中のタンパク質ＦＥＮ１の濃度を定量する工程、及び
ｂ）工程（ａ）で定量されたタンパク質ＦＥＮ１の濃度をタンパク質ＦＥＮ１の標準濃度と比較する工程を含んでなり、ここで標準濃度より高いタンパク質ＦＥＮ１の濃度は、ＣＯＰＤの指標となる、前記方法。
【請求項２】
タンパク質ＦＥＮ１をイムノアッセイ手順において測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
イムノアッセイ手順が酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＦＥＮ１をサンドイッチアッセイ形式で測定する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
ＦＥＮ１を競合アッセイ形式で測定する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６】
タンパク質ＦＥＮ１の標準濃度より高いタンパク質ＦＥＮ１の濃度がＣＯＰＤの指標となる、ヒトの血清、血漿、又は全血試料中でのＣＯＰＤの in vitro 評価における、タンパク質ＦＥＮ１の使用。
【請求項７】
ＣＯＰＤを喘息と区別するための、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法の使用。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項記載の方法を行うための in vitro 診断医療用具。
【請求項９】
タンパク質ＦＥＮ１の濃度を特異的に定量するのに必要とされる試薬を含んでなる、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法を実施するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性閉塞性肺疾患（＝ＣＯＰＤ）の評価に役立つ in vitro 方法に関する。それは、タンパク質ＦＥＮ１のＣＯＰＤのマーカーとしての使用を開示する。さらにそれは、具体的には、個体に由来する試料中のタンパク質ＦＥＮ１を in vitro で測定することによって、前記試料よりＣＯＰＤについて評価するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、慢性炎症と、正常より速い肺機能変数ＦＥＶ１の低下を伴う不可逆性の気流閉塞を特徴とする疾患である。これは、肺への空気と肺からの空気の流れの制限をもたらし、息切れを引き起こす。この疾患には、２つの主要な病理の側面、即ち、誘導気道からの粘液過剰分泌を特徴とする慢性気管支炎と、肺胞中の破壊的変化を特徴とする肺気腫がある。臨床現場では、肺機能検査時のその特徴的に低い気流によってＣＯＰＤが明確化される（Nathell, L., et al., Respiratory Research 8 (2007) 89）。喘息とは対照的に、この制限は、不十分に可逆的であって、通常は、経時的にますます悪化するものである。
【０００３】
全世界で、ＣＯＰＤは、１９９０年度の死因として第６位に順位付けられた。それは、多くの国々での喫煙率の増加と人口動態の変化により、２０３０年度までに全世界で第四位の死因になると予測されている（Mathers, C.D., et al., PLoS Med. 3 (2006) e442）。ＣＯＰＤは、米国では第四位の死因であって、２００７年度の米国におけるＣＯＰＤの経済負担は、医療費と生産性損失において４２６億ドルであった。
【０００４】
ＣＯＰＤは、ごく通常は喫煙に由来して、肺における異常な炎症応答の引き金になる、有害な粒子又はガスによって引き起こされる（Rabe, K.F., et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 176 (2007) 532-555 及び Hogg, J.C., et al., N. Engl. J. Med. 350 (2004) 2645-2653）。より大きな気道中での炎症応答は、慢性気管支炎として知られている（臨床的には、人々が定期的に痰を吐き出すときに診断される）。肺胞において、この炎症応答は、肺の組織の破壊（肺気腫として知られるプロセス）を引き起こす。ＣＯＰＤの自然経過は、そのほとんどが感染症や大気汚染によって引き起こされる、急性増悪と呼ばれる諸症状の時折の突然の悪化を特徴とする。
【０００５】
ＣＯＰＤの症状の多くは、喘息、気管支炎、肺線維症、及び結核のような他の呼吸器疾患に共通している。現行のＣＯＰＤ診断の判定標準には肺機能検査（スパイロメトリー）が必要とされるが、これは、肺の専門医だけが実施し得る、時間がかかって高額な手順である。例えば、スパイロメトリー検査は、患者の協力と努力にきわめて依存して、通常は、再現性を確保するために少なくとも３回繰り返される。
【０００６】
慢性気管支炎は、患者に「湿性咳」（即ち、痰を生じる咳）があるかどうかを問診することによって診断することができる。
喘息は、その病原性及び治療上の応答においてＣＯＰＤと異なるので、異なる臨床的概念とみなすべきである。しかしながら、不十分に可逆性の気流制限を発症して、現行ではＣＯＰＤ患者と見分けがつかないものの実践的な目的のために喘息として扱われている喘息患者もいる。一般集団における喘息及びＣＯＰＤの罹患率が高いために、多くの個体で両疾病単位の共存が生じている。喘息は、有意な気流制限と気管支拡張剤に対する強い応答を特徴とする。これらの患者では、１秒間努力呼気容量（ＦＥＶ１）が正常へ戻らないで、しばしば経時的に悪化する。
【０００７】
喘息患者では、正常対照と比較して、ＣＲＰ血清レベルが有意に高いことが知られている（Fujita, M., et al., Ann Allergy Asthma Immunol. 99 (2007) 48-53）。ＣＲＰは、数多くの感染性及び炎症性の状態に応答して増加するので、ＣＯＰＤに特異的ではない（Donaldson, G.C., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 175 (2007) 209-210）。故に、ＣＲＰは、ＣＯＰＤスクリーニングツールに求められる診断精度に関する判定標準を満たさない。
【０００８】
現行のＣＯＰＤ検出法であるスパイロメトリーは、一般的なスクリーニングツールとしての使用には適していないようである。スパイロメトリーは、多数の被検者のスクリーニングにおける一般的で広汎な使用としては、きわめて高額で、時間がかかって、医療システムが賄えるものではない。さらに、その結果は、患者のコンプライアンス（応諾性）に強く左右される。
【０００９】
当該技術分野では、ＣＯＰＤでは、肺の様々な部分での好中球、マクロファージ、及びＴ−リンパ球（具体的には、ＣＤ８＋）の増加も観測されていて、それが気流制限の度合いに関連すると記述されている（Saetta, M., et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 157 (1998) 822-826）。一部の患者では、特に増悪の間に、好酸球の増加もあるらしい（Saetta, M., et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 150 (1994) 1646-1652 及び Saetta, M., et al., Clin. Exp. Allergy  26 (1996) 766-774）。これらの炎症性細胞は、多様なサイトカイン及び炎症性メディエーター（最も注目すべきは、ロイコトリエン４、インターロイキン−８、及びＴＮＦ−α）を放出することが可能である。この炎症様式は、気管支喘息の患者で見られるものと顕著に異なっている。炎症性の変化は、禁煙の後でも存続する場合がある。起因事象の非存在下でもこの炎症応答が永続することを説明する機序については不明である。
【００１０】
従って、例えば、ＣＯＰＤを有することが疑われる個体を同定するために、簡単で費用効果の高いＣＯＰＤ評価の手順を提供することが本発明の目的である。この目的のためには、体液（例、血液、血清、又は血漿）において検出可能である、循環中に存在する一般的なＣＯＰＤマーカーを見出さなければならない。
【００１１】
臨床的に有用であるために、新たな診断マーカーは、単一マーカーとして、当該技術分野で知られている他のマーカーに匹敵するか又はより優れているべきである。あるいは、新しいマーカーは、単独で使用される場合でも、１以上の他のマーカーと組み合わせて使用される場合でも、それぞれ診断の感度又は特異度の向上をもたらすべきである。検査法の診断感度又は特異度は、下記に詳しく記載されるように、その受信者動作特性によって最もよく評価される。
【００１２】
全血、血清、又は血漿は、臨床ルーチンにおいて最も広く使用される試料源である。信頼し得るＣＯＰＤ検出に役立つか又は早期の予後情報を提供する早期ＣＯＰＤマーカーの同定は、この疾患の診断と管理に大いに役立つ方法をもたらすことができよう。故に、ＣＯＰＤの in vitro 評価を改善すべき喫緊の臨床ニーズが存在する。ＣＯＤＰの早期に診断された患者では、より進行した病期で診断される患者に比較して、肺傷害の可逆性の見込みがずっと高いので、ＣＯＰＤの早期診断を改善することは、特に重要である。
【００１３】
当該技術分野では、ＣＯＰＤの諸症状を上記に言及した他の呼吸器疾患のそれと信頼可能的に識別するために、そして疾患重症度、疾患進行、及び医薬品への応答における変化を予測するために、ＣＯＰＤ病態についての信頼可能で簡明な指標（例えば、代用マーカー）を同定すべきニーズがある。
【００１４】
ＣＯＰＤを in vitro で評価するのに使用し得る生化学マーカーを同定することができるかどうかを検討することが本発明の目的であった。特に、本発明の発明者は、体液試料中でのＣＯＰＤの評価のために生化学マーカーを同定することができるかどうかを検討した。
【発明の概要】
【００１５】
今回、タンパク質ＦＥＮ１の使用により、現在知られているＣＯＰＤの評価に利用可能な方法の諸問題のいくつかを少なくとも一部克服することができることが見出された。
驚くべきことに、本発明において、試料中のタンパク質ＦＥＮ１の濃度の in vitro 定量がＣＯＰＤの評価を可能にすることが見出された。この文脈において、個体より得られるそのような試料中の前記タンパク質ＦＥＮ１の、タンパク質ＦＥＮ１の標準濃度に比較した上昇濃度は、ＣＯＰＤの存在の指標となることが見出された。
【００１６】
本明細書に開示するのは、体液試料中のタンパク質ＦＥＮ１の濃度を免疫学的検出法によって定量して、その定量結果（特に、定量された濃度）をＣＯＰＤの評価に使用することを含んでなる、ＣＯＰＤについて評価するための in vitro 方法である。
【００１７】
本発明はまた、ａ）試料中のタンパク質ＦＥＮ１の濃度を定量する工程、及びｂ）工程（ａ）で定量されたタンパク質ＦＥＮ１の濃度をタンパク質ＦＥＮ１の標準濃度と比較する工程を含んでなる、被検者において慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を評価するための in vitro 方法に関し、ここで標準濃度より高いタンパク質ＦＥＮ１の濃度は、ＣＯＰＤの指標となる。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、試料中でのＣＯＰＤの in vitro 評価における、タンパク質ＦＥＮ１の使用に関し、ここでタンパク質ＦＥＮ１の標準濃度より高いタンパク質ＦＥＮ１の濃度は、ＣＯＰＤの指標となる。
【００１９】
さらに開示するのは、試料中でのＣＯＰＤの in vitro 評価における、タンパク質ＦＥＮ１と１以上の他のＣＯＰＤマーカーを含んでなるマーカーパネルの使用であり、ここでタンパク質ＦＥＮ１の標準濃度より高いタンパク質ＦＥＮ１の濃度は、ＣＯＰＤの指標となる。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、ＣＯＰＤを他の種類の肺疾患、好ましくは喘息と区別するための、本発明に従ってＣＯＰＤについて評価するための in vitro 方法の使用に関する。
【００２１】
さらなる態様において、本発明は、本発明に従ってＣＯＰＤについて評価するための in vitro 方法を行うための診断用具に関する。
また提供するのは、タンパク質ＦＥＮ１の濃度を特異的に定量するのに必要とされる試薬を含んでなる、本発明に従ってＣＯＰＤについて評価するための in vitro 方法を実施するためのキットである。
【００２２】
本発明の追加の側面及び利点は、以下に続く詳細な説明に照らして明らかになろう。しかしながら、この詳細な説明と具体的な実施例は、本発明の好ましい態様を示すものの、この詳細な説明より、当業者には、本発明の精神及び範囲内で様々な変更及び修飾が明らかになるので、例解のためにのみ示されると理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図面１は、ＣＯＰＤ患者より入手した１２３の試料について健常対照患者より入手した１８６の対照試料と比較して評価するための、ＡＵＣが０．８４である（ＲＯＣ  ８４％）ＣＯＰＤ試料におけるタンパク質ＦＥＮ１の受信者動作特性のプロット（ＲＯＣ−プロット）を示す。Ｘ軸：１−特異度（偽陽性）；Ｙ軸：感度（真陽性）。
【図２】図面２は、ＣＯＰＤ患者より入手した１２３の試料について健常対照患者より入手した１８６の対照試料と比較して評価するための、ＡＵＣが０．７４である（ＲＯＣ  ８８％）ＣＯＰＤ試料におけるＣＲＰの受信者動作特性のプロット（ＲＯＣ−プロット）を示す。Ｘ軸：１−特異度（偽陽性）；Ｙ軸：感度（真陽性）。
【図３】図面３は、定量したＦＥＮ１血清濃度値の、先の１２３のＣＯＰＤ試料のＣＯＰＤ病期０〜ＩＶ（ＣＯＰＤ病期判定は、表１に示す通りである）に従った箱ひげ図（box blot）の分布を示す。
【図４】図面４は、定量したＣＲＰ血清濃度の、先の１２３のＣＯＰＤ試料のＣＯＰＤ病期０〜ＩＶ（ＣＯＰＤ病期判定は、表１に示す通りである）に従った箱ひげ図の分布を示す。
【図５】図面５は、ＣＯＰＤ患者より入手した１２３の試料について喘息患者より入手した２６の対照試料と比較して評価するための、ＡＵＣが０．７９である（ＲＯＣ  ７９％）ＣＯＰＤ試料におけるタンパク質ＦＥＮ１の受信者動作特性のプロット（ＲＯＣ−プロット）を示す。Ｘ軸：１−特異度（偽陽性）；Ｙ軸：感度（真陽性）。
【図６】図面６は、ＣＯＰＤ患者より入手した１２３の試料について喘息患者より入手した２６の対照試料と比較して評価するための、ＡＵＣが０．７０である（ＲＯＣ  ７０％）ＣＯＰＤ試料におけるＣＲＰの受信者動作特性のプロット（ＲＯＣ−プロット）を示す。Ｘ軸：１−特異度（偽陽性）；Ｙ軸：感度（真陽性）。
【図７】図面７は、定量したＦＥＮ１血清濃度［Ｕ／ｍｌ］の、病期０〜ＩＶの１２３のＣＯＰＤ試料（４＿ＣＯＰＤ）、５０の健常試料（１＿健常）、１３５のスクリーニング対照試料（２＿スクリーニング対照）、及び２６の喘息患者試料（３＿喘息）に従った箱ひげ図の分布を示す。ｙ軸は、よりよい「可視化」のために調整した。
【図８】図面８は、ＣＯＰＤ患者より入手した１２３の試料について健常対照と喘息患者より入手した１６１の対照試料と比較して評価するための、ＦＥＮ１（実線）、ＦＥＮ１＋ＮＮＭＴ（破線）、及びＦＥＮ１＋ＮＮＭＴ＋セプラーゼ（点線）マーカー組合せについてのＣＯＰＤ試料におけるタンパク質ＦＥＮ１の受信者動作特性のプロット（ＲＯＣ−プロット）を示す。Ｘ軸：１−特異度（偽陽性）；Ｙ軸：感度（真陽性）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の発明者は、驚くべきことに、マーカータンパク質のＦＥＮ１がＣＯＰＤの評価に有用であることを証明することができた。肺傷害の、そして特にＣＯＰＤの様々な病期を最先端の方法によって分類することの不確実性の故に、タンパク質ＦＥＮ１は、今後、ＣＯＰＤ患者の評価において重要な判定標準の１つになり得るであろう。
【００２５】
本発明の方法は、ＣＯＰＤの評価に適している。正常対照と比較した、試料中のタンパク質ＦＥＮ１の増加した濃度は、ＣＯＰＤの指標となることが見出された。
１つの態様において、本発明は、ａ）試料中のタンパク質ＦＥＮ１の濃度を定量する工程、及びｂ）工程（ａ）で定量されたタンパク質ＦＥＮ１の濃度をタンパク質ＦＥＮ１の標準濃度と比較する工程を含んでなる、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を被検者において評価するための in vitro 方法に関し、ここで標準濃度より高いタンパク質ＦＥＮ１の濃度は、ＣＯＰＤの指標となる。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、ａ）体液試料中のタンパク質ＦＥＮ１の濃度を定量する工程、及びｂ）工程（ａ）で定量されたタンパク質ＦＥＮ１の濃度をタンパク質ＦＥＮ１の標準濃度と比較する工程を含んでなる、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を被検者において評価するための in vitro 方法に関し、ここで標準濃度より高いタンパク質ＦＥＮ１の濃度は、ＣＯＰＤの存在の指標となる。
【００２７】
ＡＳＣは、「カスパーゼ関連動員（recruitment）ドメイン含有アポトーシス関連スペック様タンパク質」であり、「メチル化誘導サイレンシングの標的１」（ＴＭＳ１）（Ｓｗｉｓｓ−ＰＲＯＴ：Ｑ９ＵＬＺ３）としても知られている。配列番号１で示される配列を特徴とする、本発明の意味でのＡＳＣタンパク質は、２２ｋＤａのタンパク質である。カスパーゼ関連動員ドメイン（ＣＡＲＤ）は、ＡＰＡＦ１（アポトーシスプロテアーゼ活性化因子１）のようなアダプタータンパク質とアポトーシスに参画するカスパーゼのプロ酵素（pro-form）（例、ＣＡＳＰ９）の間の相互作用に媒介する。ＡＳＣは、ＣＡＲＤ含有アダプタータンパク質ファミリーの一員ある。ＷＯ２００６／１０５２５２には、ＡＳＣ（＝ＣＡＲＤ−９）の遺伝子発現レベルがＣＯＰＤの診断の指標となることが示された。
【００２８】
ＡＲＭＥＴ（変異型初期腫瘍内アルギニンリッチ、ＡＲＰ、Ｓｗｉｓｓ−ＰＲＯＴ  ＩＤ：Ｐ５５１４５）タンパク質の生物学的な役割及び機能は、依然としてほとんどわかっていない。配列番号２で示される配列を特徴とする、本発明の意味でのＡＲＭＥＴタンパク質は、２０．３ｋＤａのタンパク質である。ＡＲＭＥＴタンパク質は、１７９個のアミノ酸からなり、予測されるシグナル配列（ａａ１〜２１）を担う。対応する遺伝子は、染色体縞３ｐ２１．１に位置して、Shridhar, V., et al．，（Oncogene 12 (1996) 1931-1939）によって初めて特性決定された。この遺伝子は、高度に保存されていて、ラット、マウス、ウシ、及びハムスターといった多くの哺乳動物種に見出すことができる。ＡＲＭＥＴがそのように命名されたのは、初期の研究により、ＡＲＭＥＴがアルギニンリッチ領域を担うＮ末端で５０個のアミノ酸だけより長いことが示唆されたからである（Shridhar, V., et al., Oncogene 12 (1996) 1931-1939; Shridhar, R., et al., Cancer Res. 56 (1996) 5576-5578; Shridhar, V., et al., Oncogene 14 (1997) 2213-2216）。しかしながら、より最近の研究では、このアルギニン域をコードしない、より小さなオープンリーディングフレームの転写証拠が示されている（Tanaka, H., et al., Oncol. Rep. 7 (2000) 591-593; Mizobuchi, N., et al., Cell Struct. Funct. 32 (2007) 41-50）。対応するタンパク質のサイズ補正により、当初記載された変異型コドン（ＡＴＧ５０）は、今日では、開始コドンであると同定されている。Petrova, P., et al.,（J. Mol. Neurosci. 20 (2003) 173-188）は、ラット中脳１型星状細胞系の条件培地よりＡＲＭＥＴ遺伝子産物を精製して、それをＭＡＮＦ（中脳星状細胞由来神経栄養因子）と命名した。ごく最近の研究では、ＡＲＭＥＴが「非折り畳みタンパク質応答」（ＵＰＲ）（誤って折り畳まれたタンパク質が小胞体（ＥＲ）に蓄積すると活性化されるプロセス）によって上方調節されていることが証明された（Tanaka, H., et al., Oncol. Rep. 7 (2000) 591-593; Apostolou, A., et al., Exp. Cell Res. 314 (2008) 2454-2467）。この研究に基づいて、ＡＲＭＥＴは、ＵＰＲの適応経路の新規分泌メディエーターとして特性決定されている。
【００２９】
配列番号３で示される配列を特徴とする、本発明の意味でのＮＮＭＴ（ニコチンアミドＮ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓｗｉｓｓ−ＰＲＯＴ：Ｐ４０２６１）タンパク質は、２９．６ｋＤａのタンパク質であって、５．５６の等電点を有する。ＮＮＭＴは、ニコチンアミドと他のピリジン類のＮ−メチル化を触媒する。この活性は、多くの薬物及び外因性化合物の生体内変化にとって重要である。このタンパク質は、専ら肝臓中で発現されて、細胞質に位置すると報告されてきた。ＮＮＭＴは、ヒト肝臓に由来して、計算分子量が２９．６ｋＤａである２６４個のアミノ酸タンパク質をコードする７９２ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含有するｃＤＮＡよりクローン化された（Aksoy, S., et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 14835-14840）。この文献では、この酵素のヒトＣＯＰＤにおける潜在的な役割についてほとんど知られていない。Am. J. Respir. Crit. Care Med. 181, pp. 798-805 では、ＣＯＰＤ患者の骨格筋細胞におけるＮＮＭＴのより高いｍＲＮＡ発現が観測された。ある研究では、ＮＮＭＴが肺癌（ＬＣ）に有用なバイオマーカーであることが示された（J. Cancer Res. Clin. Onc., Vol. 136 (No.9)(2009) 1223-1229）。前記の研究では、ＮＮＭＴの血清レベルが、ＬＣ患者において、ＣＯＰＤ患者や健常ドナーにおけるより有意に高いことが見出された。
【００３０】
本発明の意味でのＦｌａｐエンドヌクレアーゼ−１タンパク質（＝ＦＥＮ１，ＦＥＮ−１）、Ｓｗｉｓｓ−ＰＲＯＴ  ＩＤ：Ｐ３９７４８は、配列番号４に示す配列を特徴とする、分子量が４２．６ｋＤａである３８０個のアミノ酸の核内タンパク質である。ヒトＦＥＮ１のコーディング配列は、１９９４年に Murray によって新たにクローン化された配列より予測された（Murray, J.M., et al., Mol. Cell. Biol. 14 (1994) 4878-4888）。酵母相同体、ｒａｄ２の機能に基づいて、高い忠実度の染色体分離とＵＶ誘発性ＤＮＡ傷害の修復における役割が示唆された。これらが染色体の完全性における基本的なプロセスであるので、著者らは、このタンパク質の癌回避における関与も提起した。後に、ヒトの第１１染色体上の遺伝子座が Hiraoka ら（Hiraoka, L.R., et al., Genomics 25 (1995) 220-225）と Taylor ら（Taylor, T.D., et al., Nature 440 (2006) 497-500）によって同定された。ＦＥＮ１の機能とＤＮＡとのその相互作用は、数多くの研究の焦点になってきた（Robins, P., et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 28535-28538, Shen, B., et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 9173-9176, Hasan, S., et al., Mol. Cell 7 (2001) 1221-1231, Qiu, J., et al., J. Biol. Chem. 277 (2002) 24659-24666 及び Sakurai, S., et al, EMBO J. 24 (2005) 683-693）。ＤＮＡポリメラーゼが下流の Okazaki（岡崎）断片の５’端に遭遇するときの置換合成によって産生される５’−張出し（overhanging）フラップ構造を切断するエンドヌクレアーゼ活性を含めて、ＤＮＡ代謝におけるいくつかの酵素的機能が証明されている。追加的に、ＦＥＮ１は、ニック又はギャップのある二本鎖ＤＮＡに対する５’→３’エクソヌクレアーゼ活性も保有して、ＲＮアーゼＨ活性を明示する。上記については、Shen ら（Shen, B., et al., BioEssays 27 (2005) 717-729）又は Liu ら（Liu, Y., et al., Annu. Rev. Biochem. 73 (2004) 589-615）によって概説されている。
【００３１】
本発明の意味でのＡＰエンドヌクレアーゼ（ＡＰＥＸ１，ＡＰＥＸ−１）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ．Ｐ２７６９５）は、配列番号５に示す配列を特徴とする。そのプロセシング前の前駆体分子は、３１８個のアミノ酸からなって、３５．６ｋＤａの分子量を有する。ＡＰＥＸ１は、ＤＮＡ修復に関与して、ＤＮＡ鎖の無プリン又は無ピリミジン部位を切除する。このような無塩基部位は、自発的に、又は化学薬剤により、又は特定の異常塩基を除去するＤＮＡグリコシラーゼによって、割と頻繁に産生される。
【００３２】
ＡＰ部位は、正常なＤＮＡ複製を妨げる可能性がある変異前損傷（pre-mutagenic lesions）であるので、細胞は、そのような部位を同定して修復するためのシステムを含有する（Barzilay, G., and Hickson, I.D., Bioessays 17 (1995) 713-719）。その３次元構造が解明されて、エンドヌクレアーゼ活性に関与するアミノ酸が同定された（Barizilay, G., et al., Nature Structural Biology 2 (1995) 561-567；Gorman, M.A., et al., EMBO Journal 16 (1997) 6548-6558；Beernink, P., et al., J. Mol. Biol. 307 (2001) 1023-1034）。ＡＰＥＸ１は、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ＮＦ−ＫＢ、及びＨＩＦ−１のような様々な転写因子のレドックス制御因子でもある。この活性は、エンドヌクレアーゼ活性とは無関係であるらしい。両機能は、このタンパク質の異なるドメインに定位されている（Barzilay, G., and Hickson, I.D., Bioessays 17 (1995) 713-719）。プロテインキナーゼＣによるＡＰＥＸ１のリン酸化がレドックス活性を高めるのに対し、非リン酸化型は、ＤＮＡ修復に関与している（Yacoub, A., et al., Cancer Res. 57 (1997) 5457-5459）。１つのリン酸化部位、Ｙ２６１（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ配列による）が Rush, J., et al., Nature Biotech 23 (2005) 94-101 によって同定された。
【００３３】
線維芽細胞活性化タンパク質（＝ＦＡＰ）としても知られる、本発明の意味でのセプラーゼは、２つの同一の単量体セプラーゼ単位からなる、ゼラチナーゼ活性とジペプチジルペプチダーゼ活性を有する１７０ｋＤａの糖タンパク質である（Pineiro-Sanchez, M.L., et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 7595-7601; Park, J.E., et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 36505-36512）。ヒト膜結合型セプラーゼタンパク質の単量体は、７６０個のアミノ酸を含んで、配列番号６に示される。ヒトのセプラーゼは、その最初のＮ末端の４残基を線維芽細胞の細胞質の内部に有して、２１残基の膜貫通ドメインと、次いで７３４残基の細胞外Ｃ末端触媒ドメインがこれに続くと予測されている（Goldstein, L.A., et al., Biochim. Biophys. Acta. 1361 (1997) 11-19; Scanlan, M.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 5657-5661）。ヒトのセプラーゼタンパク質のより短い形態は、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースのアクセッション番号：Ｑ１２８８４由来の２６〜７６０位のアミノ酸を含んでなる、可溶型セプラーゼ又は循環抗プラスミン切断酵素（＝ＡＰＣＥ）として当業者に知られている（Lee, K.N., et al., Blood 103 (2004) 3783-3788; Lee, K.N., et al., Blood 107 (2006) 1397-1404）。可溶型セプラーゼの二量体は、２つの同一の単量体可溶型セプラーゼタンパク質単位からなる１６０ｋＤａの糖タンパク質である。Pineiro-Sanchez et al.（上掲）は、セプラーゼの増加した発現がヒトのメラノーマ細胞及び癌腫細胞の浸潤性表現型と相関することを見出した。Henry, L.R., et al., Clin. Cancer Res. 13 (2007) 1736-1741 は、高レベルの間質性セプラーゼを有するヒトの結腸腫瘍患者は、攻撃的な疾患進行と転移又は再発の潜在的な発現を有する可能性がより高いと記載している。
【００３４】
ＣＤ２６としても知られる、ヒトのジペプチジルペプチダーゼＩＶ（＝ＤＰＰＩＶ）は、本発明の意味において、１１０ｋＤａの細胞表面分子である。ヒトＤＰＰＩＶタンパク質のアミノ酸配列は、７６６個のアミノ酸を含んで、配列番号７（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースアクセッション番号：Ｐ２７４８７）に示される。それは、第三位のアミノ酸の位置にプロリン又はアラニンがあるペプチドよりＮ末端ジペプチドを選択的に除去する、内因性のジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性を含有する。それは、様々な細胞外分子と相互作用して、細胞内シグナル伝達カスケードにも関与する。このヒトＤＰＰＩＶの多機能活性は、細胞種と、タンパク分解酵素としてのその役割に影響を及ぼす細胞内又は細胞外の諸条件（細胞表面受容体、同時刺激性の相互作用タンパク質、及びシグナル伝達メディエーター）に依存する。ヒトＤＰＰＩＶは、１〜６位アミノ酸の短い細胞質ドメイン、７〜２８位アミノ酸の膜貫通ドメイン、及び内因性ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）活性がある２９〜７６６位アミノ酸の細胞外ドメインを有する。ヒトの可溶型ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（＝可溶型ＤＰＰＩＶ）のアミノ酸配列は、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースのアクセッション番号：Ｐ２７４８７由来の２９〜７６６位アミノ酸を含む。可溶型ＤＰＰＩＶの二量体は、２つの同一の単量体可溶型ＤＰＰＩＶ単位からなる１７０ｋＤａの糖タンパク質である。
【００３５】
本発明の意味での「可溶型ＤＰＰＩＶ／セプラーゼタンパク質複合体」（＝ＤＰＰＩＶ／セプラーゼ）は、可溶型ＤＰＰＩＶホモ二量体（１７０ｋＤａ）と可溶型セプラーゼホモ二量体（１６０ｋＤａ）より形成された、分子量３３０ｋＤａの可溶型複合体である。ある条件の下で、この複合体は、６６０ｋＤａの分子量を有する、二重複合体を形成する場合がある。
【００３６】
当業者に明らかであるように、本発明が配列番号４の全長タンパク質ＦＥＮ１に限定されると解釈してはならない。タンパク質ＦＥＮ１の生理学的又は人工的な断片、タンパク質ＦＥＮ１の二次修飾体、並びにタンパク質ＦＥＮ１の対立遺伝子変異体も本発明に含まれる。ポリペプチドの変異体は、同じ遺伝子によってコードされても、例えば、選択的ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡプロセシングの結果として、その等電点（＝ＰＩ）又は分子量（＝ＭＷ）、又はその両方が異なる場合がある。変異体のアミノ酸配列は、その対応するマーカー配列に対して９５％以上同一である。人工的な断片には、好ましくは、合成的に、又は組換え技術によって産生されるペプチドが含まれて、これは、配列番号４に開示される配列より誘導されるような少なくとも６、７、８、９、又は１０個の連続したアミノ酸からなる、診断上興味深い少なくとも１つのエピトープを含む。このような断片は、有利にも、抗体の産生のために、又はイムノアッセイにおける標準品として使用することができる。
【００３７】
先行技術において、タンパク質ＦＥＮ１の体液中の存在又はレベルに、ＣＯＰＤの評価における診断上の有用性があることは知られていないようである。今回、本発明の発明者は、個体に由来する体液試料より定量されるようなタンパク質ＦＥＮ１の増加濃度がＣＯＰＤの指標となることを見出して、確定することができた。
【００３８】
本発明を実施するには、他に示さなければ、当該分野の技術範囲内にある、分子生物学（組換え技術が含まれる）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の慣用技術を利用する。そのような技術については、Sambrook, et al.「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular クローニング: A Laboratory Manual）」第２版（1989）；Gait, M.J.（監修)「オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide Synthesis）」(1984); Freshney, R.I.（監修）「動物細胞の培養（Animal Cell Culture）」(1987);「酵素学の方法（Methods in Enzymology）」アカデミック・プレス社；Ausubel, F.M., et al.（監修)「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」(1987)（及び、定期更新版)；Mullis, et al.（監修）「ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（PCR: The Polymerase Chain Reaction）」（1994）のような文献において十分説明されている。
【００３９】
他に定義されなければ、本明細書に使用する技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が普通に理解するのと同じ意味を有する。Singleton, et al.「微生物学及び分子生物学辞典（Dictionary of Microbiology and Molecular Biology）」第２版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク州ニューヨーク（1994）；March「最新有機化学反応、機序、及び構造（Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure）」第４版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク州ニューヨーク（1992）；Lewin, B.「遺伝子Ｖ（Genes V）」出版元：オックスフォード大学出版局（1994），ISBN 0-19-854287 9)；Kendrew, J., et al.（監修）「分子生物学事典（The Encyclopedia of Molecular Biology）」出版元：ブラックウェル・サイエンス社（1994），ISBN 0-632-02182-9)；及び、Meyers, R.A.（監修）「分子生物学とバイオテクノロジー：総合手引書（Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference）」出版元：ＶＣＨパブリッシャーズ社（1995), ISBN 1-56081-569 8) は、本出願において使用される用語の多くに対する一般的なガイドを当業者に提供する。
【００４０】
本明細書に使用するように、以下の用語のそれぞれは、本セクションにおいて、それと関連した意味を有する。
冠詞の「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書において、その冠詞の文法上の対象の１又は１より多く（即ち、少なくとも１）を意味するために使用される。例を挙げると、「マーカー（a marker）」は、１つのマーカー又は１より多いマーカーを意味する。「少なくとも」という用語は、１つの対象が存在しても、１つより多いさらなる対象が存在してもよいことを示すために使用される。
【００４１】
「１以上」という表現は、１〜５０、好ましくは１〜２０、また好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、又は１５を示す。
本明細書に使用する「マーカー」又は「生化学マーカー」という用語は、個体の検査試料を分析するための標的として使用される分子を意味する。１つの態様において、そのような分子標的の例は、タンパク質又はポリペプチドである。本発明におけるマーカーとして使用されるタンパク質又はポリペプチドには、前記タンパク質の天然に存在する変異体、並びに前記タンパク質又は前記変異体の断片、特に、免疫学的に検出可能な断片が含まれると考慮される。免疫学的に検出可能な断片は、好ましくは、前記マーカーポリペプチドの少なくとも６、７、８、１０、１２、１５、又は２０個の連続アミノ酸を含む。当業者は、細胞によって放出されるか又は細胞外マトリックスに存在するタンパク質が、例えば、炎症の間に損傷され得て、そのような断片へ分解又は切断される可能性があることを理解されよう。ある種のマーカーは、不活性型で合成されて、引き続き、タンパク分解によって活性化される場合がある。当業者が理解されるように、タンパク質又はその断片は、複合体の一部として存在する場合もある。そのような複合体も、本発明の意味でのマーカーとして使用してよい。加えて、又は代替的に、マーカーポリペプチド又はその変異体は、翻訳後修飾を担う場合がある。好ましい翻訳後修飾は、グリコシル化、アシル化、又はリン酸化である。
【００４２】
本明細書に使用する「標識」という用語は、直接的又は間接的な検出によりシグナルを産生することが可能である、あらゆる物質を意味する。
直接的な検出では、本発明における使用に適した標識基又は標識は、限定されないが、色素原、蛍光、化学発光基（例、アクリジニウムエステル類又はジオキセタン類）、電気化学発光化合物、触媒、酵素、酵素基質、色素、蛍光色素（例、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニン、及びこれらの誘導体）、コロイド状金属及び非金属粒子、並びに有機高分子ラテックス粒子が含まれる、あらゆる既知の検出可能なマーカー基より選択することができる。他の標識基の例は、ルテニウム又はユーロピウム錯体のような蛍光金属錯体、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡに使用されるような）及び、放射性同位体である。
【００４３】
間接的な検出系は、例えば、検出試薬（例、検出抗体）が生体親和性結合対の第一の相手で標識されることを含む。好適な結合対の例は、ハプテン又は抗原／抗体、ビオチン又はビオチン類似体（アミノビオチン、イミノビオチン、又はデスチオビオチンのような）／アビジン又はストレプトアビジン、糖／レクチン、核酸又は核酸類似体／相補性核酸、及び受容体／リガンド（例、ステロイドホルモン受容体／ステロイドホルモン）である。好ましい第一結合対の成員は、ハプテン、抗原、及びホルモンを含む。特に好ましいのは、ジゴキシン及びビオチンのようなハプテンとその類似体である。そのような結合対の第二の相手（例、抗体、ストレプトアビジン、等）は、通常、例えば、上記に言及したような標識による直接的な検出を可能にするように標識される。
【００４４】
「慢性閉塞性肺疾患について評価する」又は「ＣＯＰＤについて評価する」という用語は、本発明による方法が、単独で、又は他のマーカー又は変数と一緒になって、例えば、ＣＯＰＤの非存在又は存在について医師が確定又は確認するのに役立つことを示すために使用される。この方法は、例えば、ＣＯＰＤの非存在又は存在を確定又は確認するのに有用であろう。
【００４５】
本発明の意味での「ＣＯＰＤのマーカー」とは、単一のマーカーとして、又はマーカーのＦＥＮ１と組み合わせた場合に、検討下の問診（diagnostic question）に対してＣＯＰＤの評価における関連情報を加えるマーカーである。この情報は、マーカーのＦＥＮ１をすでに含んでなるマーカーパネル（マーカーの組合せ）へ前記マーカーを含めることによって、ＣＯＰＤの評価の（所与の特異度での）感度又は（所与の感度での）特異度がそれぞれ改善され得るならば、適切であるか又は付加価値があるとみなされる。好ましくは、感度又は特異度のそれぞれの改善は、ｐ＝０．０５、０．０２、０．０１又はそれ未満の有意水準で統計学的に有意である。
【００４６】
本明細書に使用する「試料」又は「検査試料」という用語は、in vitro での評価の目的で個体より入手される生体試料を意味する。本発明の方法において、試料又は患者試料は、本発明のある態様では、どの体液も含んでよい。好ましい試料は、血清、血漿、又は全血のような体液であって、血清又は血漿が最も好ましい。
【００４７】
タンパク質ＦＥＮ１、特にタンパク質ＦＥＮ１の可溶型は、適正な試料において in vitro で定量する。好ましくは、試料は、ヒト被検者、例えば、ＣＯＰＤ患者、又はＣＯＰＤのリスク状態の人、又はＣＯＰＤを有することが疑われる人に由来する。また、タンパク質ＦＥＮ１は、血清又は血漿試料において定量されることが好ましい。
【００４８】
本明細書に使用する「標準試料」という用語は、in vitro での評価の目的で、見かけ上健常な個体の標準群より提供される生体試料を意味する。本明細書に使用する「標準濃度」という用語は、見かけ上健常な個体の標準群において確定された数値を意味する。
【００４９】
当業者には、本発明の方法（複数）による工程（ａ）の測定結果を標準濃度へ比較することが知られている。このような標準濃度は、陰性標準試料、陽性標準試料、又は上記種の対照の１つ又は１より多くを含んでなる混合標準試料を使用して定量することができる。陰性標準試料は、好ましくは、非喫煙者、ＣＯＰＤ、喘息、又はその様々な組合せの診断がない対照喫煙者由来の試料を含む。陽性標準試料は、好ましくは、ＣＯＰＤの診断がある被検者由来の試料を含む。
【００５０】
「定量した濃度を標準濃度と比較する」という表現は、当業者にとにかく明白であることをさらに例解するために単に使用する。対照試料において標準濃度を確定する。対照試料は、内部又は外部の対照試料であり得る。１つの態様では、内部対照試料を使用する。即ち、前記マーカー（複数）のレベル（複数）に変化があるかどうかを決定するために、検査試料においてだけでなく、同じ被検者より採取した１以上の他の試料（複数）においてもマーカーレベル（複数）について評価する。別の態様では、外部対照試料を使用する。外部対照試料では、個体に由来する試料中のマーカーの存在又は量を、所与の状態に罹患していることが知られているか又はそのリスク状態にあることが知られている個体；又は所与の状態がないことが知られている個体、即ち「正常個体」中の存在又は量と比較する。例えば、患者試料中のマーカーレベルを、ＣＯＰＤの特定経過と関連することが知られているレベルへ比較することができる。通常、試料のマーカーレベルは、診断と直接的又は間接的に相関して、マーカーレベルは、例えば、個体がＣＯＰＤのリスク状態にあるかどうかを判定するために使用される。あるいは、試料のマーカーレベルは、例えば、ＣＯＰＤ患者における療法への応答、ＣＯＰＤの診断、疾患進行のリスクの判断、又はＣＯＰＤ患者のフォローアップにおいて、ＣＯＰＤに対する適正な薬物を選択するための手引きに関連することが知られているマーカーレベルへ比較することができる。企図される診断使用に依拠して、適正な対照試料を選択して、そのマーカーのそこでの対照値又は標準値を確定する。当業者には、１つの態様におけるそのような対照試料が、同年齢であって併存疾患がない標準集団より入手されることが理解されよう。また当業者に明らかであるように、対照試料において確定される絶対的なマーカー値は、使用するアッセイに依存するものである。好ましくは、対照（標準）値を確定するには、適正な標準集団からの１００名の十分に特性決定された個体由来の試料を使用する。また、標準集団は、２０、３０、５０、２００、５００、又は１０００名の個体からなるように選択され得ることが好ましい。健常個体は、対照値を確定するのに好ましい標準集団を代表する。
【００５１】
「測定」、「測定すること」又は「定量すること」という用語は、好ましくは、定性的、半定量的、又は定量的な測定を含む。本発明では、タンパク質ＦＥＮ１を体液試料において測定する。好ましい態様において、測定は、半定量的な測定である。即ち、タンパク質ＦＥＮ１の濃度がカットオフ値の上にあるか又は下にあるかが判定される。当業者が理解するように、有り（Yes）（存在）又は無し（No）（非存在）のアッセイにおいて、アッセイ感度は、通常、カットオフ値に適合する（match）ように設定される。
【００５２】
対照群又は対照集団において定量されるようなタンパク質ＦＥＮ１の数値は、例えば、カットオフ値又は標準範囲を確定するために使用される。そのようなカットオフ値より高いか又は標準範囲のより高値の外側にある数値は、ＣＯＰＤの存在のために上昇しているか又はその指標になるとみなされる。
【００５３】
ある態様では、一定のカットオフ値を確定する。そのようなカットフ値は、対象となる問診に適合するように選択される。
ある態様では、９０％の特異度をもたらすようにカットオフを設定し、また好ましくは、９５％の特異度をもたらすようにカットオフを設定し、また好ましくは、９８％の特異度をもたらすようにカットオフを設定する。
【００５４】
ある態様では、９０％の感度をもたらすようにカットオフを設定し、また好ましくは、９５％の感度をもたらすようにカットオフを設定し、また好ましくは、９８％の感度をもたらすようにカットオフを設定する。
【００５５】
１つの態様では、対照群又は対照集団において定量されるようなタンパク質ＦＥＮ１の数値を使用して、標準範囲を確定する。好ましい態様では、タンパク質ＦＥＮ１の濃度が標準範囲の９０％パーセンタイルより上にあれば、その定量値は、上昇しているとみなされる。さらに好ましい態様では、タンパク質ＦＥＮ１の濃度が標準範囲の９５％パーセンタイル、９６％パーセンタイル、９７％パーセンタイル、又は９７．５％パーセンタイルより上にあれば、その定量値は、上昇しているとみなされる。
【００５６】
カットオフ値の上の数値は、例えば、ＣＯＰＤの存在の指標になり得る。カットオフ値の下の数値は、例えば、ＣＯＰＤの非存在の指標になり得る。
さらに好ましい態様において、タンパク質ＦＥＮ１の測定は、定量的な測定である。さらなる態様において、タンパク質ＦＥＮ１の濃度は、根本的な問診に相関している。
【００５７】
ある設定においてすでにＣＯＰＤが確認された患者より提供される試料は、陽性対照試料として使用し得て、好ましくは、検討される試料と並行してアッセイされ得る。このような設定において、陽性対照試料中のマーカータンパク質ＦＥＮ１の陽性結果は、この検査手順がその技術レベルで行われたことを示す。
【００５８】
当業者が理解するように、どのそのような評価も、in vitro でなされる。試料（検査試料）は、その後、処分される。試料は、本発明の in vitro 診断方法のためにのみ使用されて、試料の成分は、患者の体内へ戻されない。典型的には、試料は、体液試料、例えば、血清、血漿、又は全血である。
【００５９】
本発明による方法は、個体より得られる液体又は体液試料と、そのような試料中のタンパク質ＦＥＮ１の in vitro 定量に基づく。本明細書に使用する「個体」は、単一のヒト又は非ヒト生物を意味する。従って、本明細書に記載の方法及び組成物は、ヒト疾患と獣医学的疾患の両方に適用可能である。好ましくは、個体、被検者、又は患者は、ヒトである。
【００６０】
好ましくは、マーカータンパク質ＦＥＮ１は、液体試料より、特異結合剤の使用によって、in vitro で特異的に定量される。
本発明による好ましい態様では、タンパク質ＦＥＮ１の濃度が定量される。ある態様では、マーカータンパク質ＦＥＮ１の濃度が、試料より、特異結合剤の使用によって、in vitro で特異的に定量される。
【００６１】
特異結合剤は、例えば、タンパク質ＦＥＮ１の受容体、タンパク質ＦＥＮ１へ結合するレクチン、タンパク質ＦＥＮ１に対する抗体、タンパク質ＦＥＮ１に対するペプチドボディ、二重特異性デュアル結合剤又は二重特異性抗体フォーマットである。特異結合剤は、その対応する標的分子に対して少なくとも１０７ｌ／モルの親和性を有する。特異結合剤は、その標的分子に対して、好ましくは１０８ｌ／モル、また好ましくは１０９ｌ／モルの親和性を有する。
【００６２】
当業者が理解するように、「特異的」という用語は、試料中に存在する他の生体分子が、配列番号４のタンパク質ＦＥＮ１配列に特異的な結合剤へ有意には結合しないことを示すために使用される。好ましくは、標的分子以外の生体分子へ結合するレベルは、標的分子に対する親和性の最大でもほんの１０％以下、ほんの５％以下、ほんの２％以下、又はほんの１％以下である結合親和性をもたらす。好ましい特異結合剤は、親和性並びに特異性についての上記の最低基準を共に満たすものである。
【００６３】
特異結合剤の例は、ペプチド、ペプチド模倣体、アプタマー、シュピーゲルマー（spiegelmers）、ダルピン（darpins）、アンキリン反復タンパク質、クニッツ（Kunitz）型ドメイン、抗体、単一ドメイン抗体（Hey, T., et al., Trends Biotechnol 23 (2005) 514-522 を参照のこと）、及び抗体の一価断片である。
【００６４】
ある好ましい態様において、特異結合剤は、ポリペプチドである。
ある好ましい態様において、特異結合剤は、抗体又は一価抗体断片、好ましくは、モノクローナル抗体に由来する一価断片である。
【００６５】
一価抗体断片には、限定されないが、下記に提供されるような、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、単一ドメイン抗体、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片が含まれる。
本明細書の「抗体」という用語は、最も広義で使用されて、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクト抗体より生成される多重特異性抗体（例、二重特異性抗体）、及び抗体断片（それらが所望される生物活性を明示する限りにおいて）が含まれる。ある好ましい態様において、特異結合剤は、抗体又は一価抗体断片、好ましくは、モノクローナル抗体に由来する一価断片である。
【００６６】
「単離」抗体は、その本来の環境の成分より同定及び分離された、及び／又は回収された抗体である。その本来の環境の混在成分は、該抗体の研究、診断、又は療法上の使用に干渉するはずの物質であって、酵素、ホルモン、及び他のタンパク性又は非タンパク性の溶質を含めてよい。いくつかの態様では、抗体を（１）例えば、ローリー法によって定量されるような抗体の９５重量％より高くまで、そしていくつかの態様では、９９重量％より高くまで；（２）例えば、スピニングカップ配列決定装置の使用により、少なくとも１５残基のＮ末端又は内部アミノ酸配列を得るのに十分な度合いまで、又は（３）例えば、クマシーブルー染色又は銀染色を使用する還元又は非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質性まで精製する。単離抗体には、その抗体の本来環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、組換え細胞内の in situ 抗体が含まれる。しかしながら、通常、単離抗体は、少なくとも１回の精製工程によって製造される。
【００６７】
「ネイティブ抗体」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。それぞれの軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖へ連結しているが、ジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変動する。それぞれの重鎖と軽鎖にも、一定間隔の鎖内ジスルフィド架橋がある。それぞれの重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有して、いくつかの定常ドメインがそれに続く。それぞれの軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有して、その他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一定常ドメインと並置して、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並置している。特別なアミノ酸残基が軽鎖及び重鎖の可変ドメインの間のインターフェイスを形成すると考えられている。
【００６８】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインに関連する。重鎖の可変ドメインは、「ＶＨ」と呼ばれる場合がある。軽鎖の可変ドメインは、「ＶＬ」と呼ばれる場合がある。一般に、これらのドメインは、抗体の最も変化する部分であって、抗原結合部位を含有する。
【００６９】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が配列において抗体間で広汎に異なって、それぞれの特別な抗体のその特別な抗原への結合と特異性において使用されるという事実に関連する。しかしながら、この可変性は、抗体の可変ドメイン全体で均等に分布しているわけではない。それは、軽鎖と重鎖の両方の可変ドメインにおいて超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブな重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ４つのＦＲ領域（主にβシート配置を採って、３つのＨＶＲによって連結している）を含み、このβシート構造を連結して、ある場合はその構造の一部となるループを形成する。各鎖中のＨＶＲは、ＦＲ領域によってごく近接して一緒になって、他の鎖由来のＨＶＲと一緒に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al．「免疫学的に興味深いタンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」第５版、米国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ（1991）を参照のこと）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接的には関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の参画のような、様々なエフェクター機能を明示する。
【００７０】
抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、どの脊椎動物種に由来しても、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる、２つの明瞭に別々の種類のうち１つへ帰属させることができる。
【００７１】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依拠して、抗体（免疫グロブリン）を異なるグラスへ帰属させることができる。免疫グロブリンには５種の主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあって、このいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２へさらに分類することができる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元配置についてはよく知られていて、例えば、Abbas et al．「細胞及び分子免疫学（Celluular and Mol. Immunology）」第４版、W. B. Saunders 社（2000）に一般的に記載されている。抗体は、１以上の他のタンパク質又はペプチドと該抗体の共有結合的又は非共有結合的な会合によって形成される、より大きな融合分子の一部であってよい。
【００７２】
「全長抗体」、「インタクト抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書において可換的に使用されて、下記に定義されるような抗体断片ではなくて、その実質的にインタクトな形態での抗体を意味する。この用語は、特に、Ｆｃ領域を含有する重鎖がある抗体に言及する。
【００７３】
「抗体断片」は、インタクト抗体の一部を含み、好ましくは、その抗原結合領域を含んでなる。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；二重特異性抗体；線状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片より形成される多重特異性抗体が含まれる。
【００７４】
抗体のパパイン消化は、それぞれに単一の抗原結合部位がある、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、残余の「Ｆｃ」断片（この名称は、容易に結晶するその能力を反映する）を産生する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有して、依然として抗原と交差結合することが可能であるＦ（ａｂ’）２断片を生じる。
【００７５】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含有する最小の抗体断片である。１つの態様では、２本鎖Ｆｖ種が、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインが緊密に非共有結合的に会合した二量体からなる。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインが、この軽鎖と重鎖が２本鎖Ｆｖ種におけるそれに類似した「二量体」構造で会合し得るように、柔軟なペプチドリンカーによって共有結合的に連結され得る。それぞれの可変ドメインの３つのＨＶＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を規定するのは、この配置においてである。集合的に、この６つのＨＶＲは、抗体へ抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つだけのＨＶＲを含んでなる、Ｆｖの半分）でも、完全な結合部位より低い親和性であっても、抗原を認識して結合する能力を有する。
【００７６】
Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインを含有して、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１以上のシステインが含まれる重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端の数個の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基（複数）がフリーチオール基を担うＦａｂ’の表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的カップリングについても知られている。
【００７７】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメインとＶＬドメインを含み、ここでこれらのドメインは、単一のポリペプチド鎖で存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それによりｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成することが可能になる。ｓｃＦｖの概説については、例えば、「モノクローナル抗体の薬理学（The Pharmacology of Monoclonal Antibodies）」第113巻、Rosenburg and Moore (監修)、Springer-Verlag, ニューヨーク (1994)中の Plueckthun の概説（269-315頁）を参照のこと。
【００７８】
「二重特異性抗体」という用語は、２つの抗原結合部位がある抗体断片を意味し、この断片は、同一のポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）へ連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同一の鎖上の２つのドメインの間での対合を可能にするにはあまりに短いリンカーを使用することによって、このドメインは、無理やり別の鎖の相補性ドメインと対合して、２つの抗原結合部位を創出する。二重特異性抗体は、二価又は二重特異性であり得る。二重特異性抗体については、例えば、ＥＰ０４０４０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; 及び Holliger, P. et al., PNAS USA 90 (1993) 6444-6448 により詳しく記載されている。Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134 には、三重特異性抗体（triabodies）と四重特異性抗体（tetrabodies）についても記載されている。
【００７９】
本明細書に使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団より入手される抗体を意味する。即ち、この集団を含んでなる個別の抗体は、微量で存在し得る、可能な突然変異体（例、天然に存在する突然変異体）を除けば、同一である。このように、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体の混合物ではないという、抗体の特徴を示す。ある態様において、そのようなモノクローナル抗体には、典型的には、標的へ結合するポリペプチド配列を含んでなる抗体が含まれて、ここで標的結合性のポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合性ポリペプチド配列の選択が含まれる方法によって入手された。例えば、この選択方法は、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、又は組換えＤＮＡクローンのプールのような、複数のクローンからのユニーククローンの選択であり得る。選択された標的結合配列を、例えば、標的への親和性を高める、標的結合配列をヒト化する、細胞培養におけるその産生を向上させる、その in vivo 免疫原性を低下させる、多重特異性抗体を創出する、等のようにさらに改変することができること、そしてこの改変された標的結合配列を含んでなる抗体も本発明のモノクローナル抗体であることが理解されるべきである。異なる決定基（エピトープ）に対して向けられる異なる抗体が典型的には含まれるポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には他の免疫グロブリンがそれらに非混在である点で有利である。
【００８０】
特異結合剤は、好ましくは、配列番号４と反応性の抗体である。
本発明に開示されるような達成のために、様々な供給源からの抗体を使用してよい。抗体を入手するための標準プロトコールは、最新の代替法としても使用してよい。抗体の産生の代替法は、中でも、免疫化のために臨床上重要なＦＥＮ１のエピトープを代表する、合成又は組換えペプチドの使用を含む。あるいは、ＤＮＡワクチン接種としても知られるＤＮＡ免疫化を使用してよい。明らかに、異なる種、例えば、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ラット、又はモルモット由来のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を使用することができる。モノクローナル抗体は、一定の特性を伴って求められる任意の量で産生することができるので、それらは、臨床ルーチン用のアッセイの開発において理想的なツールとなる。
【００８１】
今や当業者が理解するように、タンパク質ＦＥＮ１は、ＣＯＰＤの評価に有用であるマーカーとして同定された。様々な免疫診断手順を使用して、本発明の達成事項に匹敵するデータに到達することができる。
【００８２】
タンパク質ＦＥＮ１の定量には、個体より入手される試料を、結合剤−ＦＥＮ１複合体の形成に適した条件の下で、ＦＥＮ１の特異結合剤とともに in vitro でインキュベートする。そのような条件については、当業者ならば創意に富む努力をせずにそのような適正なインキュベーション条件を容易に同定することができるので、特定する必要はない。結合剤−ＦＥＮ１複合体の量を定量して、ＣＯＰＤの評価に使用する。当業者が理解するように、特異結合剤−ＦＥＮ１複合体の量を定量するための数多くの方法があって、いずれも関連教科書に詳しく記載されている（例えば、Tijssen, P., 上掲、又は Diamandis, E.P., and Christopoulos, T.K.（監修）「イムノアッセイ（Immunoassay）」アカデミック・プレス、ボストン（1996）を参照のこと）。
【００８３】
イムノアッセイについては、当業者によく知られている。このようなアッセイを行うための方法、並びに実地の応用及び手順については、関連教科書に要約されている。関連教科書の例は、Burdon, R.H., and v. Knippenberg, P.H.（監修）、「酵素イムノアッセイの実践及び理論（Practice and theory of enzyme immunoassays）」、エルセヴィエ、アムステルダム（1990）中221-278頁、Tijssen, P.「酵素−抗体又は他の酵素−巨大分子コンジュゲートの調製（Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates）」と、免疫学的な検出法を扱っている、Colowick, S.P., and Caplan, N.O.（監修）「酵素学の方法（Methods in Enzymology）」アカデミック・プレスの様々な巻、特に、７０、７３、７４、８４、９２、及び１２１巻である。
【００８４】
本発明はまた、ある態様において、タンパク質ＦＥＮ１へ特異的に結合する抗体の、本発明による方法における使用に関する。
１つの態様では、本発明による方法において、タンパク質ＦＥＮ１をイムノアッセイ手順で測定する。
【００８５】
さらなる態様では、タンパク質ＦＥＮ１を酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）において検出する。
さらなる態様では、タンパク質ＦＥＮ１をサンドイッチアッセイ（サンドイッチ型のアッセイ形式）で検出する。そのようなアッセイでは、第一の特異結合剤を使用してタンパク質ＦＥＮ１を一方で捕捉して、直接的又は間接的に検出可能であるように標識された第二の特異結合剤を他方で使用する。サンドイッチ型アッセイ形式において使用される特異結合剤は、タンパク質ＦＥＮ１に対して特異的に指向された抗体であり得る。一方では、検出は、異なる捕捉抗体及び標識抗体（即ち、ＦＥＮ１ポリペプチド上の異なるエピトープを認識する抗体）を使用することによって行うことができる。他方では、サンドイッチ型アッセイは、タンパク質ＦＥＮ１の同一エピトープに対して指向される捕捉及び標識抗体でも行ってよい。この態様では、タンパク質ＦＥＮ１の二量体又は多量体の形態だけが検出され得る。ある態様では、タンパク質ＦＥＮ１への抗体を定性的（ＦＥＮ１が存在又は非存在であるか）又は定量的（ＦＥＮ１の量を定量する）イムノアッセイに使用する。
【００８６】
さらなる態様において、本発明による方法は、ＦＥＮ１の測定に基づき、ここでＦＥＮ１の前記測定は、少なくとも２種の非重複エピトープと反応性の少なくとも２種の抗体を利用するサンドイッチイムノアッセイで実施する。
【００８７】
さらなる態様では、タンパク質ＦＥＮ１を競合アッセイにおいて検出する。そのようなアッセイ形式では、配列番号４のＦＥＮ１へ特異的に結合する結合剤を使用する。混合物中で、該混合物へ加えた標識ＦＥＮ１と、試料に含まれるＦＥＮ１が、特異結合剤への結合について競合する。標準手順に従って、そのような競合の程度を測定することができる。
【００８８】
検査試料中のタンパク質ＦＥＮ１の濃度は、上記にすでに記載したような、特異的ＥＬＩＳＡを使用して、in vitro で定量することができる。このアッセイ形式を使用して、本発明者は、典型的な方法（例、スパイロメトリー）によってＣＯＰＤを有するとすでに診断された患者由来の試料を見かけ上健常な個体由来の試料から識別することが可能であることを示した。本出願の実施例のセクションにおいて結果を示す。
【００８９】
本発明の発明者は、驚くべきことに、タンパク質ＦＥＮ１を体液試料中で検出することができる。なおより驚くべきことに、彼らは、個体より入手されるそのような液体試料中のタンパク質ＦＥＮ１の存在がＣＯＰＤに相関する可能性があることを証明することができる。ＣＯＰＤの評価においてマーカーＦＥＮ１を利用するのに、組織試料も生検試料も必要とされない。簡便な体液試料（例えば、その少量のアリコート）中のタンパク質ＦＥＮ１のレベルを測定することは、ＣＯＰＤの分野においてきわめて有利であるとみなされる。
【００９０】
好ましい態様において、本発明による方法は、血清を試料材料として実施される。さらに好ましい態様において、本発明による方法は、血漿を試料材料として実施される。さらに好ましい態様において、本発明による方法は、全血を試料材料として実施される。
【００９１】
さらに好ましい態様において、本発明は、個体より入手される液体試料からのＣＯＰＤの in vitro 評価におけるマーカー分子としてのタンパク質ＦＥＮ１の使用に関する。
理想的な診断のシナリオは、例えば、感染症におけるように、単一の事象又はプロセスがそれぞれの疾患を引き起こすという状況であろう。他のすべての症例において、正確な診断は、特に、疾患の病因が（ＣＯＰＤの症例のように）完全には理解されていない場合、きわめて困難になり得る。当業者が理解するように、例えば、ＣＯＰＤの場合のような所与の多因子疾患について１００％の特異度と同時に１００％の感度で診断し得る生化学マーカーは、１つもない。むしろ、生化学マーカーが使用されるのは、根本的な問診（例、疾患の存在、非存在、又は重症度）について、ある種の尤度又は予測値で評価するためである。故に、ルーチンの臨床診断では、一般に、基礎疾患の評価において、様々な臨床症状と生体マーカーが一緒に考慮される。当業者は、評価すべき問診についての相対リスク又は尤度を計算するために定型的に使用される数学／統計学の手法に知悉している。ルーチンの臨床業務では、一般に、基礎疾患の診断、治療、及び管理において、様々な臨床症状と生体マーカーが医師によって一緒に考慮されるものである。
【００９２】
ＣＯＰＤ患者は、慣例上、気管支拡張剤又はステロイド類で治療されて、気流閉塞の可逆性をスパイロメトリーによって検査される。可逆性が１５％未満であれば、そして特に、彼らが長い喫煙歴を有していれば、彼らは、ＣＯＰＤ患者として分類されるはずである。
【００９３】
ＡＴＳ（米国胸部疾患学会）のＣＯＰＤ診断の判定基準は、以下の通りである：
・ＦＥＶ１／ＦＶＣ比＜０．７
・ＦＥＶ１＜７０％予測値、吸入型Ｂ２アゴニストに対する可逆性＜１５％
・２週間の経口プレドニゾロン試験投与でも１５％未満のＦＥＶ１可逆性
・喫煙歴。
【００９４】
ＦＥＶ１は、最大吸入の位置から始めて、被検者が最大の努力をして１秒間で肺より呼出される空気の量である。ＦＥＶ１％は、努力肺活量（ＦＶＣ）の百分率として表されるＦＥＶ１である。ＦＶＣは、最大吸入の位置から被検者が最大の努力をして肺より呼出される空気の全量である。ＦＥＶ１は、最初の１秒の呼気において呼出される空気の量を測定するスパイロメーターを使用して測定し得る。
【００９５】
ＡＴＳ（米国胸部疾患学会）／欧州呼吸器学会（2004）によるＣＯＰＤのスパイロメーター分類を表１に示す。ＡＴＳ  ＣＯＰＤ病期０は、現在では、もはやＡＴＳ分類体系に使用されていない。
【００９６】
表１：
【００９７】
【表１】
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【００９８】
ＣＯＰＤの評価において、マーカータンパク質ＦＥＮ１は、以下の側面の１以上において有利であろう：評価；スクリーニング；疾患の病期判定（staging）；疾患進行のモニタリング；予後判定；療法のガイダンスと療法への応答のモニタリング。
【００９９】
ＣＯＰＤを有することが疑われるか又は知られている個体について評価する場合に好ましい診断関連の分野は、スクリーニング、疾患の病期判定、疾患進行のモニタリング、及び療法への応答のモニタリングである。
【０１００】
スクリーニング（個体がＣＯＰＤを発症するリスク状態にあるか又はＣＯＰＤを有するかどうかの評価）：
スクリーニングは、疾患の指標（例えば、ＣＯＰＤの存在）に関して個体（例えば、リスク状態の個体）を同定するために検査を体系的に適用することと定義される。好ましくは、スクリーニング集団は、ＣＯＰＤの平均リスクより高い状態にあることが知られている個体からなる。例えば、ＣＯＰＤのスクリーニング集団は、喫煙者又は元喫煙者のような、ＣＯＰＤの平均リスクより高い状態にあることが知られている個体からなる。
【０１０１】
本発明の意味でのスクリーニングは、ＣＯＰＤを発症するリスクについての、個体の不偏評価に関する。ある態様では、本発明による方法をスクリーニング目的に使用する。即ち、それを使用して、ａ）試料中のタンパク質ＦＥＮ１の濃度を in vitro で定量する工程、及びｂ）工程（ａ）で定量されたタンパク質ＦＥＮ１の濃度をタンパク質ＦＥＮ１の標準濃度と比較する工程によって、ＣＯＰＤの事前診断がない被検者について評価する。ここで標準濃度より高いタンパク質ＦＥＮ１の濃度は、ＣＯＰＤの存在の指標となる。ある態様では、血液、血清、又は血漿のような体液試料をＣＯＰＤのスクリーニングにおける試料として使用する。
【０１０２】
タンパク質ＦＥＮ１の測定は、ＣＯＰＤを有することが疑われる個体におけるＣＯＰＤの存在又は非存在について医師が評価するのに役立つだろう。
ある態様において、本発明は、ａ）試料中のタンパク質ＦＥＮ１の濃度を定量する工程、及びｂ）工程（ａ）で定量されたタンパク質ＦＥＮ１の濃度をタンパク質ＦＥＮ１の標準濃度と比較する工程を含んでなる、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の被検者における存在又は非存在について評価するための in vitro 方法に関し、ここで標準濃度より高いタンパク質ＦＥＮ１の濃度は、ＣＯＰＤの存在の指標となる。好ましい態様において、試料は、体液試料である。さらに好ましい態様において、試料は、血清、血漿、及び全血からなる群より選択される。
【０１０３】
ある態様において、本発明は、ａ）試料中のタンパク質ＦＥＮ１の濃度を定量する工程、ｂ）工程（ａ）で定量されたタンパク質ＦＥＮ１の濃度をタンパク質ＦＥＮ１の標準濃度と比較する工程、及びｃ）工程（ｂ）の比較に基づいて、ＣＯＰＤの存在又は非存在について評価する工程を含んでなる、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の被検者における存在又は非存在について評価するための in vitro 方法に関し、ここで標準濃度より高いタンパク質ＦＥＮ１の濃度は、ＣＯＰＤの存在の指標となる。好ましい態様において、試料は、体液試料である。さらに好ましい態様において、試料は、血清、血漿、及び全血からなる群より選択される。
【０１０４】
ある態様において、本発明は、ＣＯＰＤの存在又は非存在について被検者を評価する in vitro 方法に関し、該方法は、ａ）試料中のタンパク質ＦＥＮ１の濃度を定量する工程、及びｂ）工程（ａ）で定量されたタンパク質ＦＥＮ１の濃度を標準集団において確定されたタンパク質ＦＥＮ１のカットオフ値と比較する工程を含んでなり、ここでカットオフ値より高いタンパク質ＦＥＮ１の濃度は、ＣＯＰＤの存在の指標となる。ある態様において、本発明は、ＣＯＰＤの存在又は非存在について被検者を評価する in vitro 方法に関し、該方法は、ａ）試料中のタンパク質ＦＥＮ１の濃度を定量する工程、及びｂ）工程（ａ）で定量されたタンパク質ＦＥＮ１の濃度を標準集団において確定されたタンパク質ＦＥＮ１のカットオフ値と比較する工程を含んでなり、ここでカットオフ値より低いタンパク質ＦＥＮ１の濃度は、ＣＯＰＤの非存在の指標となる。
【０１０５】
ある態様において、本発明は、ＣＯＰＤの評価におけるタンパク質ＦＥＮ１の使用に関する。好ましくは、ＣＯＰＤの存在又は非存在の評価においてタンパク質ＦＥＮ１を使用する。
【０１０６】
さらなる態様において、本発明は、試料中でのＣＯＰＤの in vitro 評価におけるタンパク質ＦＥＮ１の使用に関し、ここでタンパク質ＦＥＮ１の標準濃度より高いタンパク質ＦＥＮ１の濃度は、ＣＯＰＤの指標となる。
【０１０７】
好ましい態様において、この使用による試料は、体液試料である。さらに好ましい態様において、この使用による前記体液試料は、血清、血漿、及び全血からなる群より選択される。
【０１０８】
さらなる態様において、本発明は、体液試料中でのＣＯＰＤのin vitro 評価におけるタンパク質ＦＥＮ１の使用に関し、ここでタンパク質ＦＥＮ１についての体液試料中の標準濃度より高いタンパク質ＦＥＮ１の濃度は、ＣＯＰＤの存在の指標となる。
【０１０９】
さらなる態様において、本発明は、血清、血漿、又は全血試料中でのＣＯＰＤの in vitro 評価におけるタンパク質ＦＥＮ１の使用に関し、ここでタンパク質ＦＥＮ１についての血清、血漿、及び全血試料中の標準濃度より高いタンパク質ＦＥＮ１の濃度は、ＣＯＰＤの存在の指標となる。
【０１１０】
本発明の１つの態様は、おそらくはＣＯＰＤがない個体とおそらくはＣＯＰＤを有する個体を識別するための集団のスクリーニングに関連する。次いで、後者の個体群は、さらなる診断手順（例えば、肺機能検査、スパイロメトリー、又は他の好適な手段）へ処される場合がある。
【０１１１】
ある態様において、本発明による in vitro 方法は、タンパク質ＦＥＮ１の評価を行うのが、臨床方針の決定（特にＣＯＰＤの治療又は療法用医薬品によるさらなる治療）と気道及び肺の感染／炎症性疾患の治療又は療法、並びに抗生物質治療又は治療用抗体治療の療法制御のために、ＣＯＰＤを有するリスク状態に従って患者を分類するためであることを特徴とする。
【０１１２】
ある態様において、本発明は、ａ）試料中のタンパク質ＦＥＮ１の濃度を定量する工程、及びｂ）工程（ａ）で定量されたタンパク質ＦＥＮ１の濃度をタンパク質ＦＥＮ１の標準濃度と比較することによって、個体がＣＯＰＤを発症するリスクについて評価する工程を含んでなる、前記個体がＣＯＰＤを発症するリスク状態にあるかどうかについて評価するための in vitro 方法に関し、ここで標準濃度より高いタンパク質ＦＥＮ１の濃度は、個体がＣＯＰＤを発症するリスク状態にあることの指標となる。
【０１１３】
ある態様において、本発明は、ａ）体液試料中のタンパク質ＦＥＮ１の濃度を定量する工程、及びｂ）工程（ａ）で定量されたタンパク質ＦＥＮ１の濃度をタンパク質ＦＥＮ１の標準濃度と比較することによって、個体がＣＯＰＤを発症するリスクについて評価する工程を含んでなる、前記個体がＣＯＰＤを発症するリスク状態にあるかどうかについて評価するための in vitro 方法に関し、ここで標準濃度より高いタンパク質ＦＥＮ１の濃度は、個体がＣＯＰＤを発症するリスク状態にあることの指標となる。好ましい態様において、体液試料は、血清、血漿、及び全血からなる群より選択される。
【０１１４】
予後判定
ある尤度で疾患アウトカムを予測する予後指標をＣＯＰＤ患者の臨床、病理学、又は生化学上の特徴として明確化することができる。その主たる使用は、患者管理を合理的に計画すること、即ち、攻撃的な疾患への不十分な治療と無痛性の疾患への過剰治療をそれぞれ回避することの助けになることである。
【０１１５】
タンパク質ＦＥＮ１のレベルは、単独で、ＣＯＰＤ患者を健常対照又は他の肺疾患（例、喘息、気管支炎、肺線維症、及び結核）と区別すること、好ましくはＣＯＰＤを喘息と区別することに有意に貢献するので、それは、ＣＯＰＤに罹患している患者の予後について評価することに役立つと予測されるはずである。タンパク質ＦＥＮ１の濃度は、九分通り、肺機能検査又はスパイロメトリーの結果と組み合わされる。
【０１１６】
ＣＯＰＤの喘息との区別
さらなる態様では、本発明による方法を使用して、ＣＯＰＤを他の種類の肺疾患、好ましくは喘息と区別する。
【０１１７】
タンパク質ＦＥＮ１を使用して、ＣＯＰＤを他の種類の肺疾患、例えば、喘息、気管支炎、肺線維症、及び結核と区別する（好ましくは、ＣＯＰＤを喘息と区別する）ことも好ましい。驚くべきことに、本発明者は、ＣＯＰＤ特異マーカー、好ましくはＦＥＮ１と、ＣＲＰ、インターロイキン−６、血清アミロイドＡ、Ｓ１００、及びＥ−セレクチンからなる群より選択される炎症マーカーのマーカー組合せの使用により、ＣＯＰＤと他の炎症性肺疾患（例、喘息、肺の急性又は慢性炎症）のそれぞれとの間の区別をもたらすことが可能であることを見出した。タンパク質ＦＥＮ１とタンパク質ＣＲＰについての実験結果を実施例のセクションに示す。
【０１１８】
疾患進行のモニタリング
現行では、ＣＯＰＤと診断された患者が多かれ少なかれ安定した状態を保つのかどうか、又はその疾患が進行するのかどうかを妥当な尤度で予測することは、きわめて困難である。
【０１１９】
疾患の（即ち、ＣＯＰＤの）進行については、検査試料中のタンパク質ＦＥＮ１の濃度の in vitro モニタリングによって、特に、１以上の連続した試料を採取することによって評価することができる。ある態様において、本発明は、ＣＯＰＤを罹患している患者において疾患進行をモニターするための in vitro 方法に関し、該方法は、ａ）試料中のタンパク質ＦＥＮ１の濃度を定量する工程、ｂ）工程（ａ）で定量されたタンパク質ＦＥＮ１の濃度をタンパク質ＦＥＮ１の標準濃度と比較して、工程（ａ）で定量された濃度を同じ患者より以前の時点で採取した試料中で定量したこのマーカーの濃度に比較することによって疾患進行をモニターする工程を含んでなる。理解されるように、Ｃ末端ｐｒｏＳＰ−Ｂのレベルの経時的な増加は、疾患進行の指標になる。
【０１２０】
療法への患者の応答をモニターする
本発明による方法は、患者モニタリングにおいて使用される場合、患者のフォローアップに使用して、例えば、ＣＯＰＤの治療薬の効力について評価するのに役立ててよい。
【０１２１】
ある態様において、本発明は、ａ）体液試料中のタンパク質ＦＥＮ１の濃度を定量する工程、ｂ）工程（ａ）で定量されたタンパク質ＦＥＮ１の濃度をタンパク質ＦＥＮ１の標準濃度と比較して、工程（ａ）で定量された濃度をこのマーカーのその基準値に対するこのマーカーの濃度に比較することによって、ＣＯＰＤ療法に対する患者の応答をモニターする工程を含んでなる、ＣＯＰＤを抑えることを目標とした治療に対する患者の応答をモニターするための in vitro 方法に関する。好ましい態様において、体液試料は、血清、血漿、及び全血からなる群より選択される。
【０１２２】
療法に対する患者の応答をモニターすることは、例えば、療法前及び療法後のタンパク質ＦＥＮ１のマーカーレベルを確定することによって、そしてその療法前及び療法後のマーカーレベルを比較することによって実施することができる。
【０１２３】
ＣＯＰＤ治療に対する患者の応答については、検査試料中のタンパク質ＦＥＮ１の濃度を経時的にモニターすることによって in vitro で評価し得る。ある態様において、本発明は、ａ）試料中のタンパク質ＦＥＮ１の濃度を定量する工程、ｂ）工程（ａ）で定量されたタンパク質ＦＥＮ１の濃度を以前の試料で確定されたタンパク質ＦＥＮ１の濃度と比較する工程を含んでなる、ＣＯＰＤ治療に対する患者の応答をモニターするための in vitro 方法に関し、ここでタンパク質ＦＥＮ１の減少は、前記治療に対する陽性応答の指標となる。
【０１２４】
タンパク質ＦＥＮ１のレベルは、療法に対する患者の応答をモニターするのに適しているようである。従って、本発明はまた、療法に対する患者の応答をモニターすることにおけるタンパク質ＦＥＮ１の使用に関し、ここでタンパク質ＦＥＮ１の減少したレベルは、ＣＯＰＤの有効な治療の陽性指標となる。
【０１２５】
マーカー組合せ
故に、本発明は、ある態様において、ＣＯＰＤの評価用のマーカーパネルの１つのマーカーとしてのタンパク質ＦＥＮ１の使用に関する。そのようなマーカーパネルは、タンパク質ＦＥＮ１と、ＣＯＰＤについての１以上の追加マーカーを含む。あるマーカーの組合せは、例えば、ＣＯＰＤのスクリーニングにおいて有利であろう。
【０１２６】
当業者が理解するように、検討下の問診を改善するために２以上のマーカーの測定値を使用する多くのやり方がある。
生化学マーカーは、個別に定量してよく、本発明のある態様において、それらは、同時に（例えば、チップ又はビーズベースのアレイ技術を使用して）定量してもよい。従って、バイオマーカーの濃度は、例えば、各マーカーについて個別のカットオフを使用することによって、独立的に解釈されるか又は、それらは、解釈のために組み合わされる。
【０１２７】
当業者が理解するように、マーカーレベルをある尤度又はリスクへ相関させる工程は、様々なやり方で実施及び達成することができる。好ましくは、タンパク質ＦＥＮ１と１以上の他のマーカー（複数）の定量された濃度を数学的に組み合わせて、その複合値を基礎問診へ相関させる。マーカー値は、どの適正な最先端の数学的方法によっても、ＦＥＮ１の定量値と組み合わせてよい。
【０１２８】
好ましくは、マーカーの組合せに適用される数学的アルゴリズムは、ロジスティック関数である。そのような数学的アルゴリズム又はそのようなロジスティック関数を適用することの結果は、好ましくは、単一値である。基礎問診に依存して、そのような数値は、例えば、個体のＣＯＰＤについてのリスクへ、又はＣＯＰＤ患者の評価に役立つ他の企図される診断上の使用へ容易に相関させることができる。好ましいやり方では、ａ）個体を諸群へ（例えば、正常群、ＣＯＰＤのリスク状態の個体群、肺の急性又は慢性炎症の患者群、等へ）分類すること、ｂ）これらの群の間で有意に異なるマーカーを単変量解析によって同定すること、ｃ）これらの異なる群について評価するのに有用なマーカーの独立した特異値について評価するためのロジスティック回帰分析、及びｄ）独立した特異値を組み合わせるためのロジスティック関数の構築によって、そのようなロジスティック関数を得る。この種の分析において、マーカーは、もはや独立性ではなく、マーカーの組合せの代表となる。
【０１２９】
ある態様において、ＦＥＮ１の数値と少なくとも１つのさらなるマーカーの数値を組み合わせることに使用するロジスティック関数は、ａ）個体を、正常群とＣＯＰＤを有する可能性がある個体群のそれぞれへ分類すること、ｂ）ＦＥＮ１の数値と少なくとも１つのさらなるマーカーの数値を確定すること、ｃ）ロジスティック回帰分析を実施すること、及びｄ）ＦＥＮ１のマーカー値と少なくとも１つのさらなるマーカーの数値を組み合わせるためのロジスティック関数の構築によって入手される。
【０１３０】
マーカーの組合せを疾患へ相関させるためのロジスティック関数は、好ましくは、統計手法を適用することによって開発されて入手されるアルゴリズムを利用する。適正な統計手法は、例えば、判別分析（ＤＡ）（即ち、線形、二次、正則化−ＤＡ）、カーネル法（即ち、ＳＶＭ）、ノンパラメトリック法（即ち、ｋ−最近傍分類器）、ＰＬＳ（部分的最小二乗法）、ツリーベース法（即ち、論理回帰、ＣＡＲＴ、ランダムフォレスト法、ブースティング／バギング法）、一般化線形モデル（即ち、ロジスティック回帰）、主成分ベース法（即ち、ＳＩＭＣＡ）、一般化加法モデル、ファジィ論理ベース法、ニューラルネットワーク及び遺伝的アルゴリズムベース法である。当業者には、本発明のマーカー組合せについて評価して、それにより適正な数学的アルゴリズムを入手するのに適正な統計手法を選択するのに何の問題もないであろう。ある態様において、ＣＯＰＤの評価に使用される数学的アルゴリズムを入手するのに利用する統計手法は、ＤＡ（即ち、線形、二次、正則化判別分析）、カーネル法（即ち、ＳＶＭ）、ノンパラメトリック法（即ち、ｋ−最近傍分類器）、ＰＬＳ（部分的最小二乗法）、ツリーベース法（即ち、論理回帰、ＣＡＲＴ、ランダムフォレスト法、ブースティング／バギング法）、又は一般化線形モデル（即ち、ロジスティック回帰）より選択される。これらの統計手法に関する詳細は、以下の参考文献に見出される：Ruczinski, I., et al., J. of Computational and Graphical Statistics 12 (2003) 475-511; Friedman, J.H., J. of the AmericanStatistical Association 84 (1989) 165-175; Hastie, T., et al.「統計学習の初歩（The Elements of Statistical Learning）」Springer Verlag (2001); Breiman, L., et al.「分類と回帰ツリー（Classification and regression trees）」ワズワース国際グループ（Wadsworth International Group）、カリフォルニア州（1984）；Breiman, L., Machine Learning 45 (2001) 5-32; Pepe, M.S.「分類と予測のための医学的検査の統計学的評価（The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction）」オックスフォード統計科学シリーズ（Oxford Statistical Science Series）28, オックスフォード大学出版局（2003）；及び Duda, R.O., et al.「パターン分類（Pattern Classification）」ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社、第２版（2001）。
【０１３１】
生体マーカーの基本的な組合せのために最適化した多変量カットオフを使用して、状態Ａと状態Ｂ（例えば、正常群とＣＯＰＤのリスクがある個体群、療法へ応答性のＣＯＰＤ患者と療法が失敗するＣＯＰＤ患者、肺の急性炎症を有する患者とＣＯＰＤ患者、疾患進行を示すＣＯＰＤ患者と疾患進行を示さないＣＯＰＤ患者）をそれぞれ識別することは、本発明の態様である。
【０１３２】
受信者動作曲線下面積（＝ＡＵＣ）は、診断手順の性能又は精度の指標である。診断方法の精度は、その受信者動作特性（ＲＯＣ）によって最良に記載される（特に、Zweig, M.H., and Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577 を参照のこと）。ＲＯＣグラフは、観測データの全範囲にわたって決定閾値を連続的に変化させることより生じる、すべての感度／特異度対のプロットである。
【０１３３】
臨床検査の臨床性能は、その診断精度、又は被検者を臨床的に関連した亜群へ正確に分類する能力に依存する。診断精度は、検討される被検者の２つの異なる状態を正確に識別する検査の能力を測定する。そのような状態は、例えば、健康と疾患、又は「疾患進行」対「疾患進行無し」である。
【０１３４】
各々の場合において、ＲＯＣプロットでは、決定閾値の全範囲に対して「感度」対「１−特異度」をプロットすることによって、２つの分布の間の重なりが図示される。ｙ軸には、感度、又は真陽性率［（真陽性検査結果の数）／（真陽性検査結果の数＋偽陰性検査結果の数）として定義される］がある。これは、疾患又は状態の存在下での正値性とも呼ばれている。それは、罹患状態の亜群からのみ計算される。ｘ軸には、偽陽性率、又は１−特異度［（偽陽性結果の数）／（真陰性結果の数＋偽陽性結果の数）として定義される］がある。それは、特異性の指標であって、非罹患状態の亜群だけから計算される。真陽性率と偽陽性率は、２つの異なる亜群からの検査結果を使用することによって全く別々に計算されるので、ＲＯＣプロットは、試料中の疾患の罹患率とは無関係である。ＲＯＣプロット上の各点は、特別な決定閾値に対応する感度／１−特異度の対を表す。完全な識別の検査（２つの分布結果に重なりがない）では、左上隅［ここでは、真陽性率が１．０又は１００％（完全感度）であって、偽陽性率が０（完全特異度）である］を通過するＲＯＣプロットが得られる。識別の無い検査（２つの群で同一の分布結果）についての理論上のプロットは、左下隅から右上隅までの４５°対角線である。ほとんどのプロットは、上記２つの極端の間に落ちる（ＲＯＣプロットが４５°対角線より完全に下に落ちるならば、これは、「正値性」の判定基準を「〜より大きい」から「〜未満」へ（又はその逆へ）逆転させることによって容易に解消される。定性的には、プロットが左上隅に近づくにつれて、検査の全体精度が高くなる。
【０１３５】
臨床検査の診断精度を定量するための１つの簡便な目標は、その性能を１つの数字によって表現することである。最も一般的な全体尺度は、ＲＯＣプロット下面積（ＡＵＣ）である。変換により、この面積は、いつでも０．５以上である（そうでなければ、そうなるように、決定ルールを逆転させることができる）。数値は、１．０（２群の検査値の完全な分離）と０．５（２群の検査値の間に見かけの分布差が無い）の間に及ぶ。この面積は、この対角線に最も近い点や９０％特異度での感度といった、プロットの特別な部分だけでなく、プロット全体にも左右される。これは、ＲＯＣプロットが完全なもの（面積＝１．０）にどのくらい近いかの定量的な記述表現である。
【０１３６】
全体のアッセイ感度は、本明細書に開示される方法を実施するのに必要とされる特異度に依存するものである。ある好ましい設定では、７５％の特異度で十分であり得て、統計手法と生じるアルゴリズムは、この特異性の要件に基づく可能性がある。１つの好ましい態様において、ＣＯＰＤのリスク状態にある個体について評価するのに使用する方法は、８０％、８５％の特異度、又は好ましくは９０％又は９５％の特異度に基づく。
【０１３７】
ＣＯＰＤのスクリーニングには、ある種のマーカーの組合せが有利であろう。
１つの態様において、本発明は、試料中のタンパク質ＦＥＮ１と１以上の他のマーカー（複数）の濃度を定量する工程、定量されたタンパク質ＦＥＮ１の濃度と１以上の他のマーカーの濃度をそれぞれ数学的に組み合わせる工程を含んでなる、ＣＯＰＤを生化学マーカーによって評価するための in vitro 方法へ向けられ、ここで組み合わされた数値の増加は、ＣＯＰＤの存在の指標となる。
【０１３８】
ある態様において、本発明は、試料中のタンパク質ＦＥＮ１と１以上の他のマーカー（複数）の濃度を定量する工程と、定量されたタンパク質ＦＥＮ１の濃度をタンパク質ＦＥＮ１の標準濃度と比較する工程を含んでなる、ＣＯＰＤを生化学マーカーによって評価するための in vitro 方法へ向けられ、ここで標準濃度より高いタンパク質ＦＥＮ１の濃度は、ＣＯＰＤの存在の指標となる。前記方法の１以上の他のマーカーは、ＡＳＣ、ＡＲＭＥＴ、ＮＮＭＴ、ＡＰＥＸ１、及びセプラーゼからなる群より選択されることが好ましい。さらに好ましい態様において、前記マーカーパネルは、少なくともタンパク質ＦＥＮ１とタンパク質ＡＳＣを含む。さらに好ましい態様において、前記マーカーパネルは、少なくともタンパク質ＦＥＮ１とタンパク質ＡＲＭＥＴを含む。さらに好ましい態様において、前記マーカーパネルは、少なくともタンパク質ＦＥＮ１とタンパク質ＮＮＭＴを含む。さらに好ましい態様において、前記マーカーパネルは、少なくともタンパク質ＦＥＮ１とタンパク質ＡＰＥＸ１を含む。さらに好ましい態様において、前記マーカーパネルは、少なくともタンパク質ＦＥＮ１とタンパク質セプラーゼを含む。
【０１３９】
ある態様において、本発明は、ＣＯＰＤの指標となる１以上のマーカー分子（複数）との組合せにおける、ＣＯＰＤの in vitro 評価用のマーカー分子としてのマーカーＦＥＮ１の使用に関する。故に、本発明は、ある態様において、ＣＯＰＤマーカーパネル（即ち、タンパク質ＦＥＮ１とＣＯＰＤスクリーニング目的のための１以上の追加マーカーを含んでなるマーカーパネル）の１つのマーカーとしてのタンパク質ＦＥＮ１の使用に関する。
【０１４０】
例えば、本発明はまた、タンパク質ＦＥＮ１とＡＳＣを含んでなるマーカーパネルの、タンパク質ＦＥＮ１とＡＲＭＥＴを含んでなるマーカーパネルの、又はタンパク質ＦＥＮ１とＮＮＭＴを含んでなるマーカーパネルの、又はタンパク質ＦＥＮ１とＡＰＥＸ１を含んでなるマーカーパネルの、又はタンパク質ＦＥＮ１とセプラーゼを含んでなるマーカーパネルの、又はタンパク質ＦＥＮ１とＡＳＣ、ＡＲＭＥＴ、ＮＮＭＴ、ＡＰＥＸ１、及びセプラーゼからなる群より選択される２以上のマーカーを含んでなるマーカーパネルの使用に関する。
【０１４１】
ある態様では、本発明による方法でのタンパク質ＦＥＮ１との組合せにおける使用に好ましいマーカーは、ＡＳＣ、ＡＲＭＥＴ、ＮＮＭＴ、ＡＰＥＸ１、及びセプラーゼからなる群より選択される。これらのマーカーは、ＣＯＰＤについて評価するために、それぞれ個別に使用しても、ＦＥＮ１と一緒のあらゆる組合せで使用してもよい。
【０１４２】
ある態様において、ＣＯＰＤを生化学マーカーによって評価するための in vitro 方法に使用されるマーカーパネルは、試料中のタンパク質ＦＥＮ１とタンパク質ＮＮＭＴの濃度を定量する工程を含み、ここでタンパク質ＦＥＮ１の標準濃度より高いタンパク質ＦＥＮ１の濃度は、ＣＯＰＤの存在の指標となる。さらなる態様において、in vitro 方法に使用されるマーカーパネルは、マーカータンパク質のＦＥＮ１、ＮＮＭＴ、及びセプラーゼを含む。さらなる態様において、in vitro 方法に使用されるマーカーパネルは、マーカータンパク質のＦＥＮ１、ＮＮＭＴ、セプラーゼ、及びＡＳＣを含む。
【０１４３】
さらなる態様において、タンパク質ＦＥＮ１との組合せにおける使用のためのマーカーは、炎症（即ち、基礎疾患の全身炎症）の評価に有用であるマーカーである。
炎症のマーカー
現在、炎症の診断用に多くの血清マーカーが知られている。当業者は、「炎症のマーカー」という用語に馴染みがある。前記炎症のマーカーは、例えば、インターロイキン−６、Ｃ−反応性タンパク質、血清アミロイドＡ、ｓＥ−セレクチン、及びＳ１００タンパク質より選択される。
【０１４４】
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、２１ｋＤａの分泌型タンパク質であって、造血作用に関与する活性と自然免疫応答の活性化に関与する活性へ分けることができる数多くの生体活性を有する。ＩＬ−６は、急性期の反応体であって、接着分子が含まれる様々なタンパク質の合成を刺激する。その主要な機能は、肝臓タンパク質の急性期産生に媒介することであって、その合成は、サイトカインのＩＬ−１及びＴＮＦ−αによって誘導される。ＩＬ−６は、通常、マクロファージとＴリンパ球によって産生される。ＩＬ−６の正常血清濃度は、５ｐｇ／ｍｌ未満である。
【０１４５】
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、宿主防御に関与する、２１ｋＤａのサブユニットがある、急性期のホモ五量体Ｃａ２＋結合タンパク質である。ＣＲＰの合成は、ＩＬ−６によって、そしてＩＬ−１が肝類洞中のクッパー細胞によるＩＬ−６の合成の引き金になり得るので、間接的にはＩＬ−１によって誘導される。ＣＲＰの正常血漿濃度は、健常集団の９０％において３μｇ／ｍｌ（３０ｎＭ）未満であって、健常個体の９９％において１０μｇ／ｍｌ（１００ｎＭ）未満である。血漿ＣＲＰ濃度は、例えば、イムノアッセイによって測定することができる。血漿ＣＲＰ濃度は、例えば、均質アッセイ形式又はＥＬＩＳＡによって測定することができる。
【０１４６】
血清アミロイドＡ（＝ＳＡＡ）は、１１．７ｋＤａの低分子量の急性期タンパク質である。それは、専ら、ＩＬ−１、ＩＬ−６、又はＴＮＦ−αの刺激に応答して肝臓によって合成されて、Ｔ細胞依存型免疫応答の調節に関与する。急性事象時に、ＳＡＡの濃度は、１０００倍まで増加して、１ミリグラム／ミリリットルに到達する。これは、嚢胞性線維症、腎移植片拒絶、外傷、又は感染症のような多様な疾患において炎症をモニターするのに使用される。慢性関節リウマチでは、ある種の症例において、ＣＲＰの代用物として使用されてきたが、ＳＡＡは、まだ広く受け入れられていない。
【０１４７】
Ｓ１００タンパク質は、今日では２０種より多い成員が含まれる、増加し続けるＣａ２＋結合タンパク質のファミリーを形成する。Ｓ１００タンパク質の生理学的に重要な構造は、ホモ二量体であるが、それぞれ他のもの（例、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９）とヘテロ二量体を形成し得るものもある。細胞内の機能は、タンパク質リン酸化、酵素活性、又は細胞骨格の動態の調節から細胞の増殖及び分化への関与へと多岐に及ぶ。細胞から放出されるＳ１００タンパク質もあるので、例えば、神経細胞生存、星状細胞増殖、アポトーシスの誘導、及び炎症プロセスの調節といった、細胞外の機能についても記載されてきた。Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ヘテロ二量体のＳ１００Ａ８／Ａ９及びＳ１００Ａ１２は、炎症時に見出されて、Ｓ１００Ａ８が慢性炎症に応答する一方で、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ８／Ａ９、及びＳ１００Ａ１２は、急性炎症時に増加する。Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ８／Ａ９、及びＳ１００Ａ１２は、一部の癌、腎自家移植片拒絶、大腸炎、及び（最も重要には）ＲＡが含まれる、炎症要素を伴う異なる疾患へ関連付けられてきた（Burmeister, G., and Gallacchi, G., Inflammopharmacology 3 (1995) 221-230；Foell, D., et al., Rheumathology 42 (2003) 1383-1389）。
【０１４８】
ｓＥ−セレクチン（可溶型内皮白血球接着分子−１、ＥＬＡＭ−１）は、内皮細胞上でのみ、そして炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α）又はエンドトキシンによる活性化の後でのみ発現される、１１５ｋＤａのＩ型膜貫通糖タンパク質である。細胞表面のＥ−セレクチンは、白血球が炎症部位に血管外遊出するのに必須の工程である、白血球の内皮へのローリング付着のメディエーターであって、それにより局在化免疫応答において重要な役割を担う。可溶型Ｅ−セレクチンは、おそらくはその表面発現分子のタンパク分解的な切断より生じて、健常個体の血液に見出される。様々な病理学的状態において、ｓＥ−セレクチンの血清レベルの上昇が報告されてきた（Gearing, A.J., and Hemingway, I., Ann. N.Y. Acad. Sci. 667 (1992) 324-331）。
【０１４９】
ある態様において、本発明による方法でのタンパク質ＦＥＮ１との組合せにおける使用に好ましいマーカーは、ＣＲＰ、インターロイキン−６、血清アミロイドＡ、及びＳ１００からなる群より選択される。本発明の in vitro 方法によるさらなる態様では、ＦＥＮ１について定量した数値を、ＣＲＰ、インターロイキン−６、血清アミロイドＡ、Ｓ１００、及びＥ−セレクチンからなる群より選択される少なくとも１つのさらなるマーカーの定量値と組み合わせる。ある態様において、本発明は、ＣＯＰＤの評価におけるＦＥＮ１及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のマーカー組合せの使用に関する。ある態様において、本発明は、ＣＯＰＤの評価におけるＦＥＮ１及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）のマーカー組合せの使用に関する。ある態様において、本発明は、ＣＯＰＤの評価におけるＦＥＮ１及び血清アミロイドＡのマーカー組合せの使用に関する。ある態様において、本発明は、ＣＯＰＤの評価におけるＦＥＮ１及びＳ１００のマーカー組合せの使用に関する。
【０１５０】
さらなる態様において、本発明は、ＣＯＰＤの存在又は非存在についての血清又は血漿試料中の in vitro 評価における、タンパク質ＦＥＮ１とＣＲＰを含んでなるマーカーパネルの使用に関し、ここでタンパク質ＦＥＮ１の標準濃度より高いタンパク質ＦＥＮ１の濃度と、タンパク質ＣＲＰの標準濃度より高いタンパク質ＣＲＰの濃度は、ＣＯＰＤの存在の指標となる。
【０１５１】
さらなる態様において、本発明は、ＣＯＰＤの存在又は非存在についての血清又は血漿試料中の in vitro 評価における、タンパク質ＦＥＮ１とＣＲＰを含んでなるマーカーパネルの使用に関し、ここでタンパク質ＦＥＮ１の標準濃度以下のタンパク質ＦＥＮ１の濃度と、タンパク質ＣＲＰの標準濃度より高いタンパク質ＣＲＰの濃度は、ＣＯＰＤの非存在の指標となる。
【０１５２】
１つの態様では、マーカーパネルを単一の検査デバイス内で、例えば、チップ上に、又はアレイ形式において組み合わせる。本発明によるマーカーパネルは、ある態様において、バイオチップアレイ（タンパク質アレイ）技術を使用して決定される。アレイとは、アドレス指定可能な個々のマーカーの収集物である。そのようなマーカーは、マイクロタイタープレート内に含まれるか又は平面上に印字されるアレイ（ここでは、各マーカーが別々のＸ座標及びＹ座標に存在する）のように、空間的にアドレス指定可能であり得る。あるいは、マーカーは、タグ、ビーズ、ナノ粒子、又は物理特性に基づいてアドレス指定可能であり得る。当業者に知られた方法に従って、バイオチップアレイを製造することができる（例えば、ＵＳ５，８０７，５２２；Robinson, W. H., et al., Nat. Med. 8 (2002) 295-301; Robinson, W. H., et al., Arthritis Rheum. 46 (2002) 885-893 を参照のこと）。本発明に使用するアレイは、多数のアドレス指定可能マーカーを用いるどの免疫学的アッセイにも関連する。当業者にはマイクロアレイとしても知られているバイオチップアレイは、小型化形態のアレイである。
【０１５３】
「チップ」、「バイオチップ」、「ポリマーチップ」、又は「タンパク質チップ」という用語は、可換的に使用されて、シリコンウェハ、ナイロンストリップ、プラスチックストリップ、又はガラススライドの一部になり得る共通の基質上に配置された、多数のプローブ、マーカー、又は生化学マーカーの収集物を意味する。
【０１５４】
「アレイ」、「マクロアレイ」、又は「マイクロアレイ」とは、ガラス、プラスチック、シリコンチップ、又はアレイを形成する他の材料といった基質又は固体表面へ付着されるか又はその上で作製される、分子、マーカー、開口部（openings）、マイクロコイル、検出体、及び／又はセンサーといった物質の意図的に創出された収集物である。アレイは、多数（例、数十、数千、又は数百万）の反応又は組合せのレベルを同時に測定するために使用することができる。アレイは、少数（例、１つ、２〜３、又は１ダース）の物質を含有する場合もある。アレイ中の物質は、同一であっても、互いに異なっていてもよい。アレイは、多様な形式（例、可溶性分子のライブラリー、固定化分子のライブラリー、固定化抗体のライブラリー、樹脂ビーズ、シリカチップ、又は他の固体支持体へ繋留した化合物のライブラリー）をとることが可能である。アレイは、アレイ上のパッドの大きさに依存して、マクロアレイであっても、マイクロアレイであってもよい。マクロアレイは一般に、約３００ミクロン以上のパッドサイズを含有して、ゲル及びブロットスキャナによって容易に造影することができる。マイクロアレイは、一般に、３００ミクロン未満のパッドサイズを含有する。
【０１５５】
「固体支持体」は、不溶性で官能化されたポリマー材料であり、それへライブラリーメンバー又は試薬を、固定化されるか又はそれらが過剰の試薬、可溶性の反応副産物、又は溶媒より（濾過、遠心分離、洗浄、等によって）容易に分離されることを可能にするように、付着又は共有結合（しばしばリンカーを介して）させることができる。
【０１５６】
ある態様において、本発明は、マーカータンパク質ＦＥＮ１と任意選択的に１以上の他のＣＯＰＤマーカータンパク質を含んでなるバイオチップアレイに関する。
本発明はまた、ある態様において、本発明による方法を実施してタンパク質ＦＥＮ１の濃度とタンパク質のＡＳＣ、ＡＲＭＥＴ、ＮＮＭＴ、ＡＰＥＸ１、及びセプラーゼからなる群より選択される１以上の他のマーカーの濃度を特異的に定量するためのバイオチップアレイと、任意選択的に、その測定を実施するための補助試薬を提供する。
【０１５７】
本発明はまた、ある態様において、本発明による方法を実施してタンパク質ＦＥＮ１の濃度とタンパク質のＡＳＣ、ＡＲＭＥＴ、ＮＮＭＴ、ＡＰＥＸ１、及びセプラーゼからなる群より選択される１以上の他のマーカーの濃度を特異的に定量するためのバイオチップアレイと、任意選択的に、ＣＯＰＤの存在又は非存在についての評価時の補助試薬を提供する。
【０１５８】
キット
本発明はまた、タンパク質ＦＥＮ１の濃度を特異的に定量するのに必要とされる試薬を含んでなる、本発明による in vitro 方法を実施するためのキットを提供する。
【０１５９】
本発明はまた、タンパク質ＦＥＮ１の濃度と、任意選択的に、上記に記載のようなＣＯＰＤの１以上のマーカータンパク質の濃度を特異的に定量するのに必要とされる試薬を含んでなる、本発明による方法を実施するためのキットを提供し、ここで他のマーカーは、それぞれ個別に使用しても、そのあらゆる組合せで使用してもよい。
【０１６０】
本発明はまた、タンパク質ＦＥＮ１の濃度とタンパク質のＡＳＣ、ＡＲＭＥＴ、ＮＮＭＴ、ＡＰＥＸ１、及びセプラーゼからなる群より選択される１以上の他のマーカータンパク質の濃度を特異的に定量するのに必要とされる試薬と、任意選択的に、その測定を実施するための補助試薬を含んでなる、本発明による方法を実施するためのキットを提供する。
【０１６１】
なおさらなる態様において、本発明は、タンパク質ＦＥＮ１の濃度を特異的に定量するのに必要とされる試薬と、ＣＯＰＤマーカー組合せにおいて一緒に使用されるＣＯＰＤの１以上の他のマーカーを測定するのに必要とされる試薬を含んでなるキットに関する。前記キットは、ある態様において、タンパク質ＦＥＮ１へ特異的に結合する抗体又はその断片を含む。さらなる態様では、前記キット中の前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖからなる群より選択される。１つの態様において、本発明は、配列番号４のＦＥＮ１配列に含まれる少なくとも２つの非重複エピトープへ特異的に結合する少なくとも２つの抗体又はその断片を含んでなるキットに関する。好ましくは、本発明によるキットに含まれる少なくとも２つの抗体又はその断片は、モノクローナル抗体である。前記キットは、ある態様において、抗体又はその断片がその上に固定化されるバイオチップをさらに含む。
【０１６２】
さらなる態様において、本発明は、本発明に従ってＣＯＰＤについて評価するための in vitro 方法を行うための in vitro 診断医療用具（ＩＶＤ）に関する。本明細書に使用する「診断用具」は、それが試薬、目盛り測定器（calibrator）、対照材料、キット、標本容器、ソフトウェア、機器、装置、装具、又はシステムであっても、単独で使用されても、in vitro 使用のための他の診断製品と組み合わせて使用されても、in vitro 診断医療用具（ＩＶＤ）を意味する。製造業者には、単に、又は主に、マーカーの濃度、生理学的又は病理学的な状態、先天異常に関する情報を得る目的で、又は潜在的なレシピエントとの安全性又は適合性を判定するために、又は治療手段についてモニターするために、ヒトの身体に由来する試料又は標本を検査するのに in vitro で使用されることが企図されなければならない。
【０１６３】
以下の実施例、配列表、及び図面は、本発明の理解を助けるために提供するのであって、本発明の真の範囲は、付帯の特許請求項に示される。ここで説明する手順には、本発明の精神から逸脱することなく種々の変更を施すことができると理解される。
【０１６４】
配列の記載
配列番号１  ヒトタンパク質ＡＳＣのアミノ酸配列（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースアクセッション番号：Ｑ９ＵＬＺ３）を示す。
【０１６５】
配列番号２  ヒトタンパク質ＡＲＭＥＴのアミノ酸配列（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースアクセッション番号：Ｐ５５１４５）を示す。
配列番号３  ヒトタンパク質ＮＮＭＴのアミノ酸配列（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースアクセッション番号：Ｐ４０２６１）を示す。
【０１６６】
配列番号４  ヒトタンパク質ＦＥＮ１のアミノ酸配列（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースアクセッション番号：Ｐ３９７４８）を示す。
配列番号５  ヒトタンパク質ＡＰＥＸ１のアミノ酸配列（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースアクセッション番号：Ｐ２７６９５）を示す。
【０１６７】
配列番号６  ヒトタンパク質セプラーゼのアミノ酸配列（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースアクセッション番号：Ｑ１２８８４）を示す。
配列番号７  ヒトタンパク質ＤＰＰＩＶのアミノ酸配列（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースアクセッション番号：Ｐ２７４８７）を示す。
【０１６８】
配列番号８  フォワードプライマー
配列番号９  リバースプライマー
配列番号１０  Ｎ末端ペプチド伸張部分
【実施例】
【０１６９】
実施例１
ＣＯＰＤ試験集団
血清試料の供給源：
ＣＯＰＤ特異的タンパク質をＣＯＰＤの潜在的な診断マーカーとして同定するために、全国多施設研究において、十分に特性決定されたＣＯＰＤ（表１によるＡＴＳ分類体系）患者より血清試料を導いた。それぞれの試料ドナーについてスパイロメトリーを実施した。肺機能、他の診断検査結果、並びに、転院理由、診断、及び合併症についても、特定の症例報告書（ＣＲＦ）に記録した。ＣＯＰＤ試料について、表２に示す対照群１〜４より入手した対照試料と比較して評価した。
【０１７０】
血清試料の調製：
血清試料を血清管へ吸引して、そのまま室温で少なくとも６０分〜１２０分まで凝固させた。遠心分離（１０分、２０００ｇ）の後で、上清を１ｍｌのアリコートに分けて、−７０℃で凍結させた。測定の前に試料を融かして、プロトタイプアッセイ及びリファレンスアッセイに適したより少ない量へ再分割して、再び凍結させた。試料を融かしてからすぐに分析した。故に、パネル中の各試料は、測定前に、凍結融解サイクルを２回だけ受けた。
【０１７１】
実施例２．１
マーカータンパク質ＦＥＮ１に対する抗体の産生
マーカータンパク質ＦＥＮ１に対するポリクローナル抗体を、ＦＥＮ１の血清及び血漿レベル又は他の体液中の濃度のイムノ検出アッセイ（例、ウェスタンブロット及びＥＬＩＳＡ）による測定における、この抗体のさらなる使用のために産生する。
【０１７２】
大腸菌における組換えタンパク質発現
ＦＥＮ１に対する抗体を産生するために、この組換え抗原を大腸菌において産生する。故に、ドイツゲノム研究資源センター（ＲＺＰＤ，ドイツ、ベルリン）より入手した全長ｃＤＮＡクローンより、以下のプライマーを使用して、ＦＥＮ１コーディング領域をＰＣＲ増幅する：
フォワードプライマー（配列番号８）：
5’-cacacacaattgattaaagaggagaaattaactATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACATTGAAGGCCGTGGAATTCAAGGCCTGGCC-3’（ＭｕｎＩ部位に下線を施し、コーディングヌクレオチドは、大文字）、
リバースプライマー（配列番号９）：
5’-acgtacgtaagcttTCATTATTTTCCCCTTTTAAACTTC-3’（ＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線を施し、コーディングヌクレオチドは、大文字）。
【０１７３】
フォワードプライマーは、（ＭｕｎＩクローニング部位とリボソーム結合部位以外に）ＦＥＮ１遺伝子に対して５’端で正しいフレームで融合されるＮ末端ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲペプチド伸張部分（配列番号１０）をコードする。ＭｕｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したＰＣＲ断片をｐＱＥ８０Ｌベクター（Qiagen, ヒルデン、ドイツ）中へ連結させる。引き続き、この産生したプラスミドで大腸菌株のＸＬ１ブルーコンピテント細胞を形質転換する。配列解析の後で、ｐＱＥベクター系列のＴ５−プロモーターの制御下でのＩＰＴＧ−誘導可能な発現のために、製造業者の説明書に従って、この産生プラスミドで大腸菌Ｃ６００コンピテント細胞を形質転換する。
【０１７４】
ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲ−ＦＥＮ１融合タンパク質の精製のために、一晩誘導した１Ｌの細菌培養液を遠心分離によってペレット化して、この細胞ペレットを溶解緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ））に再懸濁させる。この細胞をフレンチプレスにおいて１５００バールの圧力で破壊する。不溶性の材料を遠心分離（２５０００ｇ，１５分、４℃）によってペレット化して、上清をＮｉ−ニトリロトリ酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）金属親和性クロマトグラフィーへ適用する。このカラムを数ベッド容量の洗浄緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）で洗浄する。最後に、洗浄緩衝液を２０〜ｍＭ〜５００ｍＭのイミダゾールの線形勾配とともに使用して、結合した抗原を溶出させて、抗原含有画分（各７ｍＬ）をＵＶ検出器のＯＤ２８０で同定する。抗原含有画分をプールし、保存緩衝液（７５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．５％（ｗ／ｖ）サッカロース）に対して透析して、４℃又は−８０℃でそれぞれ保存する。
【０１７５】
免疫化のためのペプチド免疫原の産生：
ＦＥＮ１に特異的であるポリクローナル抗体を創出するために、他の既知のヒトタンパク質に対して有意な相同性を示さないペプチド配列を同定する。スイスバイオインフォーマティクス研究所でアクセス可能なヒトタンパク質のデータバンクに対して、Ｂｌａｓｔソフトウェアを使用して、ＦＥＮ１のアミノ酸配列を実行する。アミノ酸配列２６０〜２７３は、他のヒトタンパク質に対して有意な相同性を示さないので、ＦＥＮ１特異抗体を産生するために選択する。それぞれの配列を合成してＫＬＨ（＝アオガイヘモシアニン）へ化学的にコンジュゲートして、免疫化のための免疫原を入手する。
【０１７６】
ポリクローナル抗体の産生：
ａ）免疫化
免疫化には、タンパク質溶液（１００μｇ／ｍｌ  タンパク質ＦＥＮ１）及び完全フロイントアジュバントの１：１比での新鮮なエマルジョンを調製する。各ウサギを、このエマルジョンの１ｍｌで、１、７、及び１４日目と３０、６０、及び９０日目に免疫化する。血液を吸引して、生じる抗ＦＥＮ１血清を実施例３及び４に記載のようなさらなる実験に使用する。
【０１７７】
ｂ）ウサギ血清からのカプリル酸及び硫酸アンモニウムでの連続沈殿によるＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）の精製
１容量のウサギ血清を４容量の酢酸緩衝液（６０ｍＭ，ｐＨ４．０）で希釈する。ｐＨは、２Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基で４．５へ調整する。激しく撹拌しながら、カプリル酸（２５μｌ／ｍｌの希釈試料）を滴下する。３０分後、試料を遠心分離（１３０００ｘｇ，３０分、４℃）させ、ペレットを捨てて、上清を採取する。上清のｐＨを２Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基の添加によって７．５へ調整して、濾過（０．２μｍ）する。
【０１７８】
４Ｍ硫酸アンモニウム溶液の最終２Ｍ濃度への滴下によって、激しい撹拌下に、上清中の免疫グロブリンを沈殿させる。沈殿した免疫グロブリンを遠心分離（８０００ｘｇ，１５分、４℃）によって採取する。
【０１７９】
上清を捨てる。ペレットを１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、３０ｍＭ  ＮａＣｌに溶かして、徹底的に透析する。この透析液を遠心分離（１３０００ｘｇ，１５分、４℃）させて、濾過（０．２μｍ）する。
【０１８０】
ポリクローナルウサギＩｇＧのビオチニル化
ポリクローナルウサギＩｇＧを１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５），３０ｍＭ  ＮａＣｌ中１０ｍｇ／ｍｌとする。１ｍｌのＩｇＧ溶液につき５０μｌのビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＤＭＳＯ中３．６ｍｇ／ｍｌ）を加える。室温で３０分後、この試料をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／ＮａＯＨ，ｐＨ７．５，３０ｍＭ  ＮａＣｌ）でクロマトグラフ処理する。ビオチニル化ＩｇＧを含有する画分を採取する。同じ手順に従って、モノクローナル抗体をビオチニル化した。
【０１８１】
ポリクローナルウサギＩｇＧのジゴキシゲニン化（digoxygenylation）
ポリクローナルウサギＩｇＧを１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／ＮａＯＨ，３０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）中１０ｍｇ／ｍｌとする。１ｍｌのＩｇＧ溶液につき５０μｌのジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−e−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Roche Diagnostics，マンハイム、ドイツ、カタログ番号：１３３３０５４）（ＤＭＳＯ中３．８ｍｇ／ｍｌ）を加える。室温で３０分後、この試料をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／ＮａＯＨ，ｐＨ７．５，３０ｍＭ  ＮａＣｌ）でクロマトグラフ処理する。ジゴキシゲニン化ＩｇＧを含有する画分を採取する。同じ手順に従って、モノクローナル抗体をジゴキシゲニンで標識した。
【０１８２】
実施例２．２
ＣＲＰ
マーカータンパク質のＣＲＰは、Roche Diagnostics，マンハイム（ＦＲＧ）によって流通されている均質アッセイ（Hitachi）を使用して測定する。
【０１８３】
実施例３
ヒト血清又は血漿試料中のＦＥＮ１の測定用のＥＬＩＳＡ
ヒト血清又は血漿試料中のＦＥＮ１の検出のために、サンドイッチＥＬＩＳＡを開発した。この抗原の捕捉及び検出のために、ＦＥＮ１に対する抗体のアリコートをビオチンとジゴキシゲニンとそれぞれコンジュゲートさせた。
【０１８４】
ストレプトアビジンコート化マイクロタイタープレートの別々のウェルにおいて、インキュベーション緩衝液（４０ｍＭリン酸塩、２００ｍＭ酒石酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％フェノール、０．１％ポリエチレングリコール４００００、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．２％  ＢＳＡ、０．１％ウシＩｇＧ、０．０２％  ５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン、ｐＨ７．４へ調整、ヒト抗ラット抗体応答（ＨＡＲＡ）の消失ために２００μｇ／ｍｌのポリマー性モノクローナルマウスＩｇＧ  Ｆａｂ断片を補充；Roche Diagnostics GmbH，マンハイム、ドイツ、カタログ番号：１１０９６４７８−００１）中にビオチン標識化抗体とジゴキシゲニン標識化抗体のそれぞれの０．１２μｇ／ｍｌを含有する１００μｌの抗体試薬と試料（２０μｌ）を混合した。
【０１８５】
１時間のインキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。
次の工程では、普遍コンジュゲート（Universal Conjugate）緩衝液（Roche Diagnostics GmbH，マンハイム、ドイツ、カタログ番号：１１６８４８２５）中３０ｍＵ／ｍｌの抗ジゴキシゲニン−ＨＲＰコンジュゲート（Roche Diagnostics GmbH，マンハイム、ドイツ、カタログ番号：１６３３７１６）とともにウェルを６０分間インキュベートして、先と同様に洗浄した。
【０１８６】
次いで、１００μｌのＴＭＢ基質溶液（Roche Diagnostics GmbH，マンハイム、ドイツ、カタログ番号：１２０３４４２５）とともにウェルを３０分間インキュベートした。２Ｎ硫酸（５０μｌ）の添加により発色を止めて、青色を黄色へ変換した。ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍでＯＤを測定した。
【０１８７】
すべてのインキュベーションは、室温であった。ヒト血清又は血漿の試料をインキュベーション緩衝液で５％へプレ希釈した。較正のために、ヒト血清を標準品として使用した。これをインキュベーション緩衝液で２／４／８／１６／３２％へ希釈して、それぞれ２／４／８／１６／３２ユニット／ｍｌの恣意的な任意値の較正液（calibrators）を作製した。
【０１８８】
非線形最小二乗法の曲線適合（Wiemer-Rodbard）によって較正曲線の式を計算して、ウェルの吸光度読取値を対応する濃度値へ変換するのに使用した。この結果にプレ希釈率を掛けて、それぞれの試料それ自体の濃度を得た。
【０１８９】
実施例４
ＣＯＰＤの血清マーカーとしてのＦＥＮ１
表１に示すＡＴＳ  ＣＯＰＤ病期０〜ＩＶ分類の１２３名の十分特性決定されたＣＯＰＤ患者に由来する血清試料を使用する。この試験集団を表２に示す。
【０１９０】
表２：試験集団
【０１９１】
【表２】
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【０１９２】
ＣＯＰＤ試料中のタンパク質ＦＥＮ１の血清濃度について、明らかに健常な個体（＝対照コホート）と喘息患者（対照４）より入手した対照試料（対照１、２、及び３）に比較して評価して、０．８４のＡＵＣを得る（表３）。表３に表す、マーカーＦＥＮ１の結果の受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）を図面１に示す。炎症マーカーＣＲＰについて定量したデータを図面２に示す。ＦＥＮ１のＡＵＣは、ＣＲＰのＡＵＣより高い。
【０１９３】
表３：ＣＲＰと比較したマーカータンパク質のＲＯＣ分析
【０１９４】
【表３】
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【０１９５】
９５％の特異度をもたらす９５％分位数の計算によって、対照集合におけるカットオフ値を決定した。受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）（表３）又は９５％のプリセット特異度での臨床感度（表４）を計算することによって、このバイオマーカーの診断ポテンシャルについて評価した。ＣＯＰＤについての「カットオフ」対「健常個体（対照１）」のマーカーＦＥＮ１の感度は、７４％である。それぞれの対照コホート（対照１、２、及び３：即ち、健常非喫煙者、喫煙者、元喫煙者、及びＣＯＰＤを発症する職業上のリスクがある個体）に対して９５％の特異度を生じるカットオフ値で、ＣＯＰＤについての一般スクリーニングでのカットオフのためのマーカーＦＥＮ１の感度は、５３％である。
【０１９６】
表４：ＣＲＰと比較したマーカータンパク質の感度及び特異度
【０１９７】
【表４】
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【０１９８】
対照１（表２による健常対照）に基づくか又は対照１、２、及び３（表２によるスクリーニング対照）に基づいてカットオフ（９５％特異度）を適用する場合、マーカーＦＥＮ１の感度は、ＣＲＰの感度より高い（表４）。このことは、マーカーＦＥＮ１がマーカーＣＲＰより大きいＡＵＣを明示するＲＯＣ分析によっても反映されている（表３）。
【０１９９】
ＡＴＳ  ＣＯＰＤ病期０〜ＩＶによるＣＯＰＤ試料中のタンパク質ＦＥＮ１について定量したデータを使用して、タンパク質ＦＥＮ１の血清濃度のＡＴＳ  ＣＯＰＤ病期０〜ＩＶとの相関を表す、図面３に示す箱ひげ図を計算した。ＡＴＳ  ＣＯＰＤ病期０〜ＩＶに従って分類した各試料内の炎症マーカーＣＲＰについて定量したデータを使用して、ＣＲＰの血清濃度のＣＯＰＤ病期判定との相関を表す、図面４に示す箱ひげ図を計算した。
【０２００】
ＦＥＮ１血清濃度は、ＡＴＳ病期０〜ＩＶと有意には相関しないので、マーカーＦＥＮ１は、ＣＯＰＤの診断に有用であるが、ＣＯＰＤ病期判定には有用でない。
実施例５
ヒトのＣＯＰＤを喘息と区別するための血清マーカーとしてのＦＥＮ１
表１に示すＡＴＳ  ＣＯＰＤ病期０〜ＩＶ分類に従って十分に特性決定された１２３名のＣＯＰＤ患者に由来する試料、並びに２６名の喘息患者（表２に示す対照４）に由来する試料について、マーカーＦＥＮ１を使用して分析した。喘息対照コホートに対して９５％の特異度を生じるカットオフ値で、ＣＯＰＤの感度は、７９％である（表５）。
【０２０１】
ＣＯＰＤを喘息と区別するためのマーカーＦＥＮ１の感度は、炎症マーカーＣＲＰの感度より高い。
表５：マーカータンパク質の使用による「ＣＯＰＤ」対「喘息」の区別
【０２０２】
【表５】
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【０２０３】
マーカーＦＥＮ１の結果のグラフ表示を受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）として図面５に示す。炎症マーカーＣＲＰの結果は、受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）として図面６に示す。
【０２０４】
ＣＯＰＤ試料中のタンパク質ＦＥＮ１について定量したデータを使用して、表６に示すデータに基づいて、健常被検者（ｎ＝５０）からの試料、スクリーニング対照（ｎ＝１３５）と喘息患者（ｎ＝２６）からの試料に対する、タンパク質ＦＥＮ１の血清濃度のＡＴＳ  ＣＯＰＤ病期０〜ＩＶ（表２に示すように、ｎ＝１２３）との相関を表す、図面７に示す箱ひげ図を計算した。対照（健常、スクリーニング対照、及び喘息）の平均値が５．９Ｕ／ｍｌと８．２Ｕ／ｍｌの間の範囲に及ぶのに対し、ＣＯＰＤ患者のＦＥＮ１濃度は、有意により高くて、２７．１Ｕ／ｍｌの平均値である。結果を表６に表す。
【０２０５】
表６：ＦＥＮ１の変動性
【０２０６】
【表６】
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【０２０７】
実施例６
マーカー組合せ／統計的分析及び結果
Ｒ−ツールボックス「glmnet」（http://cran.r-project.org/）において実施するように、マーカー組合せの数学的モデルとしてペナルティ付きロジスティック回帰（ＰＬＲ）を使用した。追加マーカーについて検索するために、最初のマーカーは、このモデルに非ペナルティ付きのやり方で入れる一方で、すべての他のマーカーをペナルティ化へ処した。
【０２０８】
内部反復の１０分割交差検証によってアルゴリズムの最適化（即ち、ペナルティ化の種類とそのペナルティ化変数の選択）を行う一方で、性能変数（感度と特異度）の導出は、外部反復の１０分割交差検証に基づいた。
【０２０９】
元のデータセットを１０部分に分けて、その後この部分のうち９つで訓練セットを形成して、１０番目の部分を検定セットとした。次いで、この訓練セットも１０部分へ分けて、この部分の９つでサブ訓練セットを形成して、１０番目の部分をサブ検定セットとした。これらのサブデータセットを用いて、追加マーカーの数に基づいて、ペナルティ化変数を最適化した。この最適化された値を用いて、ＰＬＲを訓練セット全体に適用して、診断ルールを作成した。推定罹患事後確率に対する閾値を対照と訓練セットの症例に対して決定して、この多変量診断ルールについて９０％の見かけの特異度及び感度を達成した。次いで、このルールを検定セットへ適用して、所与の閾値での感度と特異度を推定した。外部１０分割交差検証を５０回繰り返して、内部交差検証を２５回繰り返した。
【０２１０】
交差検証からの個別の試行の綿密な分析は、ＦＥＮ１にとって最良の追加マーカーがＮＮＭＴであることを明らかにした。すべての試行においてそれが最良の追加マーカーとして選択されたからである。２つの追加マーカーがある最良のモデルは、ＦＥＮ１＋ＮＮＭＴ及びセプラーゼである。３つの追加マーカーがある最良のモデルは、ＦＥＮ１＋ＮＮＭＴ、セプラーゼ、及びＡＳＣである。
【０２１１】
表２に示すようなＡＴＳ  ＣＯＰＤ病期０〜ＩＶ分類による１２３名の十分に特性決定されたＣＯＰＤ患者に由来する試料、並びに健常（ｎ＝１３６）及び喘息患者（ｎ＝２５）に由来する１６１の試料からなる対照コホートについて分析した。
【０２１２】
表７に、上記組合せの訓練セット及び検定セットに対する分類性能を９０％の特異度に基づいて示す。
表７の結果は、１つの追加マーカーを組み合わせることによって、単一マーカーとしてのＦＥＮ１に比べて、特異度の損失を伴うことなく、感度を有意に改善することが可能であることを明らかに示す。
【０２１３】
表７：９０％の特異度でのマーカー組合せ
【０２１４】
【表７】
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【０２１５】
表８に、上記組合せの訓練セット及び検定セットに対する分類性能を９０％の感度に基づいて示す。表８の結果は、１つの追加マーカーを組み合わせることによって、単一マーカーとしてのＦＥＮ１に比べて、感度の損失を伴うことなく、特異度を有意に改善することが可能であることを明らかに示す。
【０２１６】
表８：９０％の感度でのマーカー組合せ
【０２１７】
【表８】
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【０２１８】
対照コホートに対して９０％の特異度を生じるカットオフ値を用いると、ＦＥＮ１での一般スクリーニングのカットオフの感度は、８２．３％であり、ＦＥＮ１＋ＮＮＭＴでは９０．０％であり、ＦＥＮ１＋ＮＮＭＴ＋セプラーゼでは９２．６％であって、ＦＥＮ１＋ＮＮＭＴ＋セプラーゼ＋ＡＳＣ（図面８に示されない４マーカー組合せ）では、９３．１％である。マーカーＦＥＮ１と３マーカーまでのマーカーマーカー組合せの結果のグラフ表示を、受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）として図面８に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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