(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機溶剤を取り扱うヒトの特殊健康診断で採取された生体試料中の馬尿酸およびメチル馬尿酸の総濃度を測定する方法であって、
（１）生体から採取された生体試料の一定量に、馬尿酸を安息香酸とグリシンとに加水分解し、かつメチル馬尿酸をメチル安息香酸とグリシンとに加水分解する酵素を作用させる工程、
（２）（１）の工程で得た反応液に、
（ａ）Ｄ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸オキシダーゼ、または
（ｂ）Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼおよびサルコシンオキシダーゼを
混合し、過酸化水素を発生させる工程、および
（３）（２）の工程で発生した過酸化水素の濃度を特定する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、馬尿酸およびメチル馬尿酸の総濃度を液状試薬にて測定する方法ならびにキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
馬尿酸はトルエンの尿中代謝物として、メチル馬尿酸はキシレンの尿中代謝物として、特殊健康診断での測定項目のひとつになっている。
【０００３】
しかしながら、これらの測定は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるものであり（例えば、特許文献１および２参照）、測定が煩雑である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭６２−２３０７６１号公報
【特許文献２】特開平０６−０４３１５０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、より簡便に馬尿酸およびメチル馬尿酸の総濃度を測定するための方法ならびにキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、生体試料中の馬尿酸およびメチル馬尿酸の総濃度を測定する方法を提供し、該方法は、（１）生体から採取された生体試料の一定量に、馬尿酸を安息香酸とグリシンとに加水分解し、かつメチル馬尿酸をメチル安息香酸とグリシンとに加水分解する酵素を作用させる工程、（２）（１）の工程で得た反応液に、（ａ）Ｄ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸オキシダーゼ、または（ｂ）Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼおよびサルコシンオキシダーゼを混合し、過酸化水素を発生させる工程、および（３）（２）の工程で発生した過酸化水素の濃度を特定する工程を含む。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、より簡便に馬尿酸とメチル馬尿酸の総濃度を測定することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、馬尿酸およびメチル馬尿酸の総濃度を液状試薬にて測定する方法ならびにキットに関する。
【０００９】
本発明における「馬尿酸」とは、何も修飾されていない馬尿酸そのものをいい、別名でＮ−ベンゾイルグリシンをいう。馬尿酸は、トルエンの代謝産物である。
【００１０】
本発明における「メチル馬尿酸」とは、馬尿酸のベンゼン環構造のｏ−位、ｍ−位、ｐ−位のいずれか１つがメチル基で修飾されたものをいい、別名でＮ−トルオイルグリシンをいう。メチル馬尿酸は、キシレンの代謝産物である。なお、「メチル馬尿酸」は、馬尿酸の不斉炭素がメチル基で修飾されたもの（Ｎ−ベンゾイルアラニン）の別名としても用いられることがあるが、本発明における「メチル馬尿酸」としては、Ｎ−ベンゾイルアラニンは除外される。
【００１１】
本発明における「安息香酸」とは、何も修飾されていない安息香酸そのものをいう。安息香酸は、馬尿酸の分解産物である。
【００１２】
本発明における「メチル安息香酸」とは、安息香酸のベンゼン環構造のｏ−位、ｍ−位、ｐ−位のいずれか１つがメチル基で修飾されたものをいい、別名でトルイル酸をいう。メチル安息香酸は、メチル馬尿酸の分解産物である。
【００１３】
本発明の生体試料中の馬尿酸およびメチル馬尿酸の総濃度を測定する方法は、（１）生体から採取された生体試料の一定量に、馬尿酸を安息香酸とグリシンとに加水分解し、かつメチル馬尿酸をメチル安息香酸とグリシンとに加水分解する酵素を作用させる工程、（２）（１）の工程で得た反応液に、（ａ）Ｄ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸オキシダーゼ、または（ｂ）Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼおよびサルコシンオキシダーゼを混合し、過酸化水素を発生させる工程、および（３）（２）の工程で発生した過酸化水素の濃度を特定する工程を含む。
【００１４】
（１）生体から採取された生体試料の一定量に、馬尿酸を安息香酸とグリシンとに加水分解し、かつメチル馬尿酸をメチル安息香酸とグリシンとに加水分解する酵素を作用させる工程
生体としては、特に限定されず、例えば、ヒト、動物（イヌ、ネコ、ブタ、ウシなど）が挙げられる。好ましくはヒト、より好ましくは有機溶媒を取り扱うヒトである。本発明の方法は、有機溶媒を取り扱うヒトの特殊健康診断に好適に用いられる。
【００１５】
生体試料としては、特に限定されず、例えば、尿、血液、唾液、骨髄液、細胞間質液が挙げられる。好ましくは尿、より好ましくは有機溶媒を取り扱うヒトの尿である。
【００１６】
「馬尿酸を安息香酸とグリシンとに加水分解し、かつメチル馬尿酸をメチル安息香酸とグリシンとに加水分解する酵素」としては、特に限定されず、例えば、アミノアシラーゼ（ＥＣ３．５．１．１４）、馬尿酸ヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．１．３２）、Ｎ―アシル−Ｄ−アミノ酸デアシラーゼが挙げられる。好ましくは、アミノアシラーゼである。
【００１７】
アミノアシラーゼとしては、特に限定されず、例えば、市販されているもの、微生物から調製されたものが挙げられる。市販されているものとしては、特に限定されず、例えば、Ｄ−アミノアシラーゼ「アマノ」（和光純薬工業株式会社）、アシラーゼ（シグマアルドリッチ社、ブタ腎臓由来）が挙げられる。生物としては、特に限定されず、例えば、アスペルギルス(Aspergillus)属、ブタ腎臓が挙げられる。
【００１８】
（２）（１）の工程で得た反応液に、（ａ）Ｄ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸オキシダーゼ、または（ｂ）Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼおよびサルコシンオキシダーゼを混合し、過酸化水素を発生させる工程
この工程では、（ａ）（１）の工程で得た反応液に存在する安息香酸またはメチル安息香酸の量を評価するために、Ｄ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸オキシダーゼを混合し、過酸化水素を発生させるか、または（ｂ）（１）の工程で得た反応液に存在するグリシンの量を評価するために、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）、グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼおよびサルコシンオキシダーゼを混合し、過酸化水素を発生させる。
【００１９】
（ａ）Ｄ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸オキシダーゼを混合し、過酸化水素を発生させる工程
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．３）は、補因子としてフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を含むペルオキシソーム酵素の一つであり、Ｄ−アミノ酸をイミノ酸に変換し、同時にアンモニアと過酸化水素を合成する。Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとしては、特に限定されず、例えば、市販されているもの、動物臓器から調製されたものが挙げられる。市販されているものとしては、特に限定されず、例えば、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＭＰバイオメディカル社）、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（シグマアルドリッチ社）が挙げられる。
【００２０】
Ｄ−アミノ酸としては、特に限定されず、例えば、α−アミノ酸（アラニン、ロイシン、イソロイシン、リジン、バリン、グルタミン酸、プロリン、チロシンなど）、β−アミノ酸、γ−アミノ酸が挙げられる。純粋なＤ−アミノ酸のみならず、Ｄ−アミノ酸を含むラセミ体であってもよい。好ましくは、安価に入手できる観点から、アラニン（ラセミ体）である。
【００２１】
この工程では、例えば、Ｄ−アミノ酸としてアラニン（ラセミ体）を用いた場合、ピルビン酸、アンモニアおよび過酸化水素が発生する。（１）の工程で得た反応液に安息香酸またはメチル安息香酸が存在する場合、これらの化合物はＤ−アミノ酸オキシダーゼによる反応を阻害する。したがって、発生する過酸化水素の濃度を特定することによって反応液中の安息香酸またはメチル安息香酸の量を知ることができる。
【００２２】
（ｂ）Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼおよびサルコシンオキシダーゼを混合し、過酸化水素を発生させる工程
グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．１．１．２０）は、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）のメチル基をグリシンに転移してサルコシンとアデノシルホモシテインを合成する。グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼとしては、特に限定されず、例えば、市販されているもの、動物臓器（ウサギ肝、ラット肝など）由来のものが挙げられる。市販されているものとしては、特に限定されず、例えば、Recombinant human GNMT Glycine N-methyltransferase (aa 1-295), His-tagged（Acris Antibodies GmbH社）が挙げられる。
【００２３】
サルコシンオキシダーゼ（ＥＣ１．５．３．１）は、サルコシン、水および酸素からグリシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を生成する。サルコシンオキシダーゼとしては、特に限定されず、例えば、市販されているもの、微生物から調製されたものが挙げられる。市販されているものとしては、特に限定されず、例えば、サルコシンオキシダーゼ（東洋紡株式会社、SAO−331、微生物由来）、サルコシンオキシダーゼ（ＭＰバイオメディカル社、152047）が挙げられる。微生物としては、特に限定されず、例えば、アリスロバクター（Arthrobactor）属が挙げられる。
【００２４】
この工程では、（１）の工程で得た反応液中のグリシンの量を、発生する過酸化水素の濃度を特定することによって知ることができる。
【００２５】
（３）（２）の工程で発生した過酸化水素の濃度を特定する工程
過酸化水素の濃度を特定する方法としては、特に限定されず、公知の液状試薬を用いた方法を採用することができる。例えば、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）および／またはＮ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン（ＡＤＰＳ）を基質とするペルオキシダーゼを用いた酵素発色法、過酸化水素による鉄イオンの酸化に伴う色素の呈色反応を利用する方法が挙げられる。
【００２６】
本発明はまた、上記方法を実施するためのキットを含む。キットは、上記種々の酵素と酵素反応に必要な試薬とを含む。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００２８】
（実施例１）
表１に記載の処方により試薬Ｒ１およびＲ２を準備する。ヒトから採取した尿の一定量に、試薬Ｒ１を表１に記載のＳ／Ｒ比に従って添加し、十分反応させた後、試薬Ｒ２を表１に記載のＳ／Ｒ比に従って添加する。
【００２９】
【表１】
0005978658.tif 000002
【００３０】
上記で求まる上記尿中の過酸化水素の濃度から上記尿中の馬尿酸およびメチル馬尿酸の総濃度を算出する。
【００３１】
（実施例２）
表２に記載の処方により試薬Ｒ１およびＲ２を準備する。ヒトから採取した尿の一定量に、試薬Ｒ１を表２に記載のＳ／Ｒ比に従って添加し、十分反応させた後、試薬Ｒ２を表２に記載のＳ／Ｒ比に従って添加する。
【００３２】
【表２】
0005978658.tif 000003
【００３３】
上記で求まる上記尿中の過酸化水素の濃度から上記尿中の馬尿酸およびメチル馬尿酸の総濃度を算出する。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明は、特殊健康診断の分野において利用され得る。