(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物油を含む誘電性流体を生成する方法であって、前記誘電性流体が−５℃未満の流動点を有し、及び前記微生物油の脂肪酸組成が少なくとも５０％のＣ１８：１及び２％未満のＣ１８：２である方法において、
ａ．第１の微生物油を精製、漂白、脱臭又は脱ガムに供してＲＢＤ油を生成することであって、前記ＲＢＤ油が初期流動点及び第１の温度を有し、該第１の温度が１５℃〜５０℃であることと；
ｂ．前記ＲＢＤ油の温度を、前記第１の温度より低い第２の温度に下げることと；
ｃ．前記ＲＢＤ油を前記第２の温度に保持することと；
ｄ．前記ＲＢＤ油を前記第２の温度で濾過して、前記初期流動点より低い第２の流動点であって、−５℃未満である第２の流動点を有する第２の微生物油を提供することと
を含む方法。
【請求項２】
ａ．１つ以上の外来遺伝子を発現するように操作された遺伝子操作された細菌を、前記細菌が乾燥重量で少なくとも１０％の油を有するまで育てることと；
ｂ．前記細菌から前記油を分離して前記第１の微生物油を生成することと
により前記第１の微生物油を生成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物油が−１０℃〜−４０℃の流動点を有する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
抗酸化剤、金属イオン不活性化剤、腐食防止剤、解乳化剤、耐摩耗添加剤、流動点降下剤、又は抗加水分解性化合物を前記ＲＢＤ油又は第２の微生物油に添加することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子操作された細菌がＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ又はＣｈｌｏｒｅｌｌａである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子操作された細菌がＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上の外来遺伝子がショ糖インベルターゼ及び／又は１つ以上の脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする、請求項２、５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第２の温度が−１５℃〜１５℃である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願の相互参照
本出願は、２０１１年１０月１３日に出願した先行の米国仮特許出願第６１／５４６．９３２号；２０１１年８月１０日に出願した先行の米国仮特許出願第６１／５２２，２３１号；２０１１年２月２日に出願した先行の米国仮特許出願第６１／４３８，９６６号；２０１０年１１月３日に出願した先行の米国仮特許出願第６１／４０９，９０２号の利益を主張し、これらの出願は、全て、内容全体が本明細書によって参照により組み込まれる。
【０００２】
配列表の参照
本明細書は、添付した１〜４４ページに示されるように、配列表を含んでいる。
【０００３】
本発明は、微生物からの油の生成、及びそうした油を、その流動点が改善されるように処理する方法、並びに、食用油及びそのような油を含む食品並びに潤滑剤及び誘電性流体のような工業的生成物を含めた、それから得られる生成物に関する。従って本発明の実施形態は、化学、特に油脂化学、食用油並びにその生産及び使用、潤滑剤及びその生産、誘電性流体、原材料及びその生産、微生物学、及び分子生物学の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
化石燃料は、有機材料が地下に埋まった地質堆積物のうち、燃焼性のものを指す一般的な用語であり、腐敗した植物及び動物から作られ、地殻の熱及び圧力に何億年もさらされることによって、未精製油、石炭、天然ガス又は重油に変換されたものである。化石燃料は、限りある再生不可能な資源である。
【０００５】
プラスチック及び化学品の製造業者を含む多くの産業には、製造プロセスの原料としての炭化水素の供給力が大きく関与している。
【０００６】
特許文献１は、油を生成するために微細藻類を育てる方法及び材料、微生物油の抽出、並びに油産生微生物が生成する油から食品、食用油、燃料、及び他の油脂化学品を生産することを記載している。
一つの重要な油脂化学品用途は、工業用誘電性流体の生産であり、誘電性流体は、変圧器及び他の電気装置の電気絶縁及び冷却又は熱放散に使用される。このような電気装置には、電源及び配電変圧器、回路遮断器、コンデンサ、開閉装置、Ｘ線機器及び絶縁ケーブルが含まれる。
１９９０年代から、シールド変圧器の誘電性流体としてバイオベースの油、特に高オレイン酸大豆油が用いられている（非特許文献１を参照）。現在のバイオベースの誘電性流体は、添加剤が組み込まれた、精製された高オレイン酸トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）である（特許文献２並びに特許文献３及び特許文献４を参照）。例えば、ミネラル油ベースの誘電性流体と比べた高オレイン酸大豆油の誘電性流体の主な利点は、（ｉ）燃焼点の上昇（２倍）、（ｉｉ）変圧器寿命の増加（４〜８倍）、及び（ｉｉｉ）バイオベースの油の高い生分解性（＞３倍）及び低い毒性による流出対策コストの低下である（非特許文献２を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００８／１５１１４９号
【特許文献２】米国特許第６，２７４，０６７号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１００２４３９６９号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００８０２８３８０３号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  Ｅｎｇ，（２００９）ｖ．１（２）ｐｐ．２１２−２１６
【非特許文献２】Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｊ  Ｓｃｉ  Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ，（２００６）ｖ．８６  ｐｐ：１７６９−１７８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ミネラルベースの油に対するバイオベースの油の主な欠点は、バイオベースの油の酸化的な不安定性、バイオベースの油の高い生産コスト、及びミネラルベースの油からバイオベースの油への設備の移行である（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ（２００６）、前出を参照）。バイオベースの誘電性流体は誘電性流体市場の大きい割合を占めているが、現在のところ、市場ではミネラル油ベースの誘電性流体が優勢である。別の大きい欠点は、このような大豆ベースの油の生産コスト及び重要な食料供給源の非食料用途への転用である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
特定の実施形態では、本発明は、流動点が改善された微生物油、そのような油を製造する方法、及びそれから得られる生成物を提供する。流動点は、トリグリセリド油脂の飽和脂肪酸の不飽和脂肪酸に対する相対濃度及び脂肪酸の鎖長との関数である。本発明の方法の実施形態では、ステアリン画分として知られるパルミチン酸及びステアリン酸トリグリセリドを含む飽和画分の相対的な割合を低下させることにより、微生物油の初期流動点を低下させる。これらの方法では、油を画分化することにより、油の飽和トリグリセリド濃度を低下させる。これは、本発明の実施形態において、「脱ろう」の例示的な実施方法である乾式画分化によって達成することができる。この方法の一実施形態では、微生物（例えば、藻類）の油は、場合により最初に精製、漂白、脱臭又は脱ガムされ、初期流動点によって特徴づけられる「ＲＢＤ油」を生じる。次にＲＢＤ油の温度を制御された形で低下させると、やがて結晶核が形成され、その後その最初の結晶化温度に保って（すなわち数時間）、結晶を生じさせる。次に濾過により結晶を取り除き、２つの画分：ステアリン画分の一部又はほとんどを含有する固相、及び主としてオレイン画分を含有する液相を生じさせる。この液相は、初期流動点より低い第２の流動点によって特徴づけられ、例えば、第２の流動点は約−１０℃〜約−４０℃であってもよく、脂肪酸組成は少なくとも５０％のＣ１８：１及び１０％未満のＣ１８：２であってもよい。液相は、再び第２のより低い結晶化温度まで画分化に供され、ステアリンのさらなる除去が行われ得る。例示的な実施形態では、第１の結晶化温度は１５℃超〜約５０℃であり、第２の結晶化温度は約−１５℃〜約１５℃である。
【００１１】
いかなる場合にも、得られる精製された液体画分は、植物油業界で一般的に知られるようなスーパーオレイン油と同等又は実質的に同様であり、天然藻類の油と比べて良好な熱特性を有する。ある実施形態では、それらの特性が化学的な流動点降下剤を加えることでさらに改善され、流動点降下剤は、特定の用途に望ましい場合があるように、流動点をさらに低下させるものである。この方法により提供される微生物油は、食品用途のみならず、潤滑剤、油圧作動液、工業用油（ｉｎｄｕｓｔｒｉｃａｌ  ｏｉｌ）及び誘電性流体の生産のような工業用途にも使用することができる。工業用途（例えば誘電性流体）について、微生物油に（流動点降下剤に加えて、又はそれに代えて）加えることができる１つ以上の添加剤としては、抗酸化剤、金属イオン不活性化剤、腐食防止剤、解乳化剤、耐摩耗添加剤又は抗加水分解性化合物が挙げられる。
【００１２】
種々の実施形態では、微生物油は、１つ以上の脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのようなタンパク質をコードする外来遺伝子を発現する組み換え細胞を含め、別個の脂質プロフィール（すなわち、別個の脂肪酸プロフィール）を有する微細藻類細胞のような油産生微生物から得られる。例示的な実施形態では、微生物油は、１つ以上の外来遺伝子を発現するように操作された遺伝子操作された細菌から得られ、及びこの方法は、細菌が乾燥重量で少なくとも１０％の油を有するようになるまで細菌を育てることと、その細菌から油を分離することとをさらに含み、それにより微生物油が生成され、次にその微生物油が、上述のように、精製、漂白、脱臭され、場合により脱ガムされ得る。酵母、真菌、及びバクテリアを含めた、同様の又は別個の脂質プロフィールを有する他の油産生微生物もまた用いることができる。特定の実施形態では、このように、本発明は、酵母、真菌及びバクテリアを含むそのような微細藻類及び／又は油産生微生物から、脂質及び誘電性流体を含む油ベースの生成物を製造する方法を提供する。
【００１３】
特定の実施形態では、本発明は、微生物油を含む生成物を提供し、ここで微生物油は約１０℃〜−約４０℃の流動点を有し、及び微生物油の脂肪酸組成は、少なくとも約５０％のＣ１８：１及び約１０％未満のＣ１８：２である。このような実施形態の変形例では、生成物は−１０℃〜約−４０℃の流動点を有する。生成物中の微生物油は、例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％のＣ１８：１を含むことができる。ある場合では、微生物油は、約５％未満のＣ１８：２を含むことができる（例えば、少なくとも約８０％のＣ１８：１及び約５％未満のＣ１８：２である）。特定の実施形態では、生成物中の微生物油（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｏｉｌｄ）は、約２５〜約２００のヨウ素価を有する。微生物油は、特定の実施形態では、１つ以上の外来遺伝子を発現するように操作された遺伝子操作された細菌によって生成され得る。この目的での例示的な微生物としては、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属又はＣｈｌｏｒｅｌｌａ属の種（例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）が挙げられる。このような微生物は、例えば、ショ糖インベルターゼ及び／又は脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする１つ以上の外来遺伝子を発現するように操作することができる。例示的な実施形態では、細菌は、２つ以上の脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ又はショ糖インベルターゼ及び１つ以上の脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子を発現するように操作される。
【００１４】
種々の実施形態では、生成物は、抗酸化剤、金属イオン不活性化剤、腐食防止剤、解乳化剤、耐摩耗添加剤、流動点降下剤、又は抗加水分解性化合物のような１つ以上の添加剤を含む。例示的な生成物としては、潤滑剤、油圧作動液、工業用油、又は誘電性流体が挙げられる。誘電性流体（ｄｉｅｌｅｃｔｉｃ  ｆｌｕｉｄ）は、特に、上記に考察する添加剤の１つ以上を有し得る。
【００１５】
ある場合では、微生物油をベースとする生成物は誘電性流体である。ある実施形態では、誘電性流体に使用される微生物油は、以下の属性の１つ以上を有する：（ｉ）０．４μｇ／ｍｌ未満の総カロチノイド；（ｉｉ）０．００１μｇ／ｍｌ未満のリコピン；（ｉｉｉ）０．０２μｇ／ｍｌ未満のβ−カロチン；（ｉｖ）油１ｋｇあたり０．０２ｍｇ未満のクロロフィル；（ｖ）油１００ｇあたり０．４０〜０．６０ｍｇのγ−トコフェロール；（ｖｉ）油１００ｇあたり３〜９ｍｇのカンペステロール；又は（ｖｉｉ）油１ｇあたり０．５ｍｇ未満の総トコトリエノール。ある場合では、誘電性流体は、以下の特性の１つ以上を有する：約１１０ｃＳｔ未満、例えば、２０〜３０ｃＳｔの範囲の４０℃での粘度；（ｂ）約２〜約１５ｃＳｔ、例えば４〜８ｃＳｔの範囲の１００℃での粘度；（ｃ）少なくとも３５の４０℃での粘度指数（ＶＩ、無単位数）、限定されないが、３５〜８０のＶＩ、８０〜１１０のＶＩ、１１０〜１２５のＶＩＴ、１２５〜１６０のＶＩ、及びある実施形態では１６０より大きいＶＩを含む；（ｄ）−８〜１０℃以下の流動点（液体が流動し得る最も低い温度）、限定されないが、−２０〜−２５℃以下の流動点、及びある実施形態では−３０℃、又は−４０℃以下の流動点を含む；（ｅ）ＡＳＴＭ  Ｄ２８８２に等しい潤滑性；（ｆ）低揮発性；（ｇ）３００℃以上の引火点を含む、１５０℃以上の引火点を含めた、高引火点；（ｈ）１５０℃以上（例えば、３００℃超）の燃焼点、３００℃以上の引火点を含む；（ｉ）酸及び塩基の存在下での分解抵抗性、良好な熱安定性、酸素との反応に対する低感受性、及び低中和価（０．０６以下、例えば０．０３以下）を含めた、低反応性；（ｊ）高抗乳化度を含めた、良好な混和性；（ｋ）１％以下の２５℃での力率、限定されないが、０．５％以下、０．１５％以下、０．１％以下、及びある実施形態では０．０５％以下を含む、（ｌ）１．５％以下の１００℃での力率、限定されないが、１％以下、０．３％以下、及びある実施形態では０．１％以下を含む；（ｍ）高絶縁耐力；（ｎ）低損失係数；（ｏ）低電気伝導度；（ｐ）高比熱、限定されないが、少なくとも０．３９ｃａｌ／ｇｍ／℃の比熱、及びある実施形態では少なくとも０．４５ｃａｌ／ｇｍ／℃以上の比熱を含む；及び（ｑ）生分解性である、すなわち微生物の存在下で二酸化炭素及び水に分解し、それにより誘電性流体の少なくとも１５％又はそれ以上が標準的な試験条件下で分解して、２８日で生分解し、及びある実施形態では、このような条件下で３０％以上、又は７０％以上、又は１００％生分解する。
【００１６】
本発明はまた、上述の誘電性流体を含む電気部品も提供する。特定の実施形態では、電気部品は変圧器である。
【００１７】
本発明はさらに、微生物油を含む生成物を生成する方法を提供する。特定の実施形態では、この生成物は約−１０℃〜約−４０℃の流動点を有し、ここでこの微生物油の脂肪酸組成は少なくとも５０％のＣ１８：１及び１０％未満のＣ１８：２である。このような実施形態において、この方法は、１つ以上の外来遺伝子を発現するように操作された遺伝子操作された細菌を、その細菌が乾燥重量で少なくとも１０％の油を有するまで育てることと、次いで細菌から油を分離することとを含む。次いで微生物油が精製、漂白、脱臭、及び場合により脱ガムに供され、ＲＢＤ油が生成される。この方法は、場合により、抗酸化剤、金属イオン不活性化剤、腐食防止剤、解乳化剤、耐摩耗添加剤、流動点降下剤、又は抗加水分解性化合物をＲＢＤ油に添加することをさらに含む。例示的な操作された微生物としては、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属又はＣｈｌｏｒｅｌｌａ属の種（例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）を挙げることができる。このような微生物は、例えば、ショ糖インベルターゼ及び／又は脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする１つ以上の外来遺伝子を発現するように操作することができる。例示的な実施形態では、細菌は、２つ以上の脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ又はショ糖インベルターゼ及び１つ以上の脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子を発現するように操作される。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、誘電性流体を製造する方法を提供し、この方法は、（ａ）乾燥重量で少なくとも１０％の脂質である油産生細菌をもたらすように油産生細菌を育てる工程と、（ｂ）油産生細菌から脂質を分離する工程と、（ｃ）脂質を、精製、漂白、脱臭、脱ガム、及び結晶化又は乾式画分化による、又は脱ろうによる画分化からなる群から選択される少なくとも１つの処理工程に供する工程とを含む。
【００１９】
この方法の特定の実施形態のいくつかでは、油産生細菌は、微細藻類、油産生酵母、油産生真菌及び油産生バクテリアからなる群から選択される。ある場合では、油産生細菌は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓである油産生バクテリアである。ある場合では、油産生細菌は油産生真菌である。ある場合では、油産生真菌は、表３に列挙される種である。ある場合では、油産生細菌は油産生酵母である。ある場合では、油産生酵母は、表２に列挙される種である。ある場合では、油産生細菌は微細藻類である。ある場合では、微細藻類は、表１に列挙される種である。ある場合では、微細藻類はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の微細藻類である。
【００２０】
ある実施形態では、この方法により生成される誘電性流体は、以下の属性の１つ以上を有する：（ｉ）０．０５〜０．２４４ｍｃｇ／ｇの総カロチノイド；（ｉｉ）０．００３ｍｃｇ／ｇ未満のリコピン；（ｉｉｉ）０．００３ｍｃｇ／ｇ未満のβ−カロチン；（ｉｖ）０．０４５〜０．２６８ｍｃｇ／ｇのクロロフィルＡ；（ｖ）３８．３〜１６４ｍｃｇ／ｇのγ−トコフェロール；（ｖｉ）０．２５％未満のブラシカステロール、カンペステロール、スチグマステロール（ｓｔｉｇｎａｓｔｅｒｏｌ）、又はβ−シトステロール；（ｖｉｉ）２４９．６〜３２５．３ｍｃｇ／ｇの総トコトリエノール；（ｖｉｉｉ）０．００３〜０．０３９ｍｃｇ／ｇのルテイン；及び（ｉｘ）６０．８〜２６１．７ｍｃｇ／ｇのトコフェロール。ある実施形態では、この方法により生成される誘電性流体は、以下からなる群から選択される特性を有する：（ａ）約１１０ｃＳｔ未満、例えば２０〜３０ｃＳｔの範囲の４０℃での粘度；（ｂ）約２〜約１５ｃＳｔ、例えば４〜８ｃＳｔの範囲の１００℃での粘度；（ｃ）少なくとも３５の４０℃での粘度指数；（ｄ）−１５〜−２５℃以下を含め、−８〜−１０℃以下の流動点；（ｅ）ＡＳＴＭ  Ｄ２８８２に等しい潤滑性；（ｆ）１５０℃以上の引火点；（ｇ）０．０６以下の中和価；（ｈ）１％以下の２５℃での力率；（ｉ）少なくとも０．３９ｃａｌ／ｇｍ／℃の比熱；及び（ｊ）誘電性流体の少なくとも１５％又はそれ以上が、標準的な試験条件下において２８日で分解するような生分解性。
【００２１】
ある場合では、誘電性流体は、以下の添加剤の１つ以上と混合される：（ａ）抗酸化剤；（ｂ）金属イオンの不活性化剤；（ｃ）腐食防止剤；（ｄ）解乳化剤；（ｅ）耐摩耗添加剤；（ｆ）マランスチレン共重合体（ｍａｌａｎ  ｓｔｙｒｅｎｅ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）；（ｇ）流動点降下剤、限定されないが、ＶＩＳＣＯＰＬＥＸ（登録商標）１０−３１０又は１−１３３（Ｒｏｈｍａｘ−Ｅｖｏｎｉｋ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  ＧｍｂＨ）、又はその他の、ＩＮＦＩＮＥＵＭ（登録商標）Ｖ−３５１（Ｉｎｆｉｎｅｕｍ  ＵＫ  ｌｉｍｉｔｉｅｄ）、ＰＭＡ−Ｄ１１０及びＰＭＡ  Ｄのようなポリ（アルキル）アクリレート類及びポリ（メチル）アクリレート類を含む；又は（ｈ）カルボジイミド；又は（ｉ）合成エステル類又は（ｊ）ポリαオレフィン（ＰＡＯ）又は（ｋ）エストライドのエステル。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、油産生微生物油を含む誘電性流体を提供し、ここで前記誘電性流体は約１０％未満のＣ１８：２を含む。ある場合では、誘電性流体は約５％未満のＣ１８：２を含む。ある場合では、誘電性流体は約２％未満のＣ１８：２を含む。ある場合では、誘電性流体は少なくとも６５％のＣ１８：１をさらに含む。ある場合では、誘電性流体は３０％未満のＣ１６：０をさらに含む。
【００２３】
ある実施形態では、微生物油が別の油とブレンドされ、それにより本発明の実施形態における誘電性流体が生成される。ある場合では、この他の油は、微生物油ではない。ある場合では、この他の油は、大豆、菜種、キャノーラ、パーム、パーム核、ココナツ、トウモロコシ、野菜くず、ナンキンハゼ、オリーブ、ヒマワリ、綿実、鶏脂、牛脂、豚脂、微細藻類、大型藻類、微生物、クフェア、亜麻、ピーナッツ、上質のホワイトグリース、ラード、カメリナ・サティバ（Ｃａｍｅｌｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）、カラシの種子、カシューナッツ、オーツ麦、ハウチワマメ、ケナフ、キンセンカ、ヘルプ（ｈｅｌｐ）、コーヒー、亜麻仁（亜麻）、ヘーゼルナッツ、ユーホルビア、カボチャの種、コリアンダー、ツバキ、ゴマ、ベニバナ、イネ、アブラギリ、ココア、コプラ、ケシ、トウゴマの実、ピーカン、ホホバ、マカダミア、ブラジルナッツ、アボカド、油産生酵母、油産生バクテリア、石油、又は先述の油のいずれかの留出画分からなる群から選択される。
【００２４】
ある実施形態では、誘電性流体中における他の油の含有量は、３０％未満である。ある場合では、誘電性流体中における他の油の含有量は、２０％未満である。ある場合では、誘電性流体中における他の油の含有量は、１０％未満である。ある実施形態では、誘電性流体中における微生物油の含有量は、５０％未満である。ある場合では、誘電性流体中における微生物油の含有量は、２５％未満である。ある場合では、誘電性流体中における微生物油の含有量は、１０％未満である。
【００２５】
別の実施形態では、本発明は、以下の添加剤の１つ以上を含む誘電性流体を提供する：（ａ）抗酸化剤、限定されないがＢＨＴ及び他のフェノール類を含む；（ｂ）Ｃｕ、Ｚｎのような金属イオンの不活性化剤、限定されないがベンゾトリアゾールを含む；（ｃ）腐食防止剤、限定されないがエステル硫酸及びコハク酸エステルを含む；（ｄ）解乳化剤；（ｅ）耐摩耗添加剤、限定されないが、ジチオリン酸亜鉛を含む；（ｆ）流動点を低下させる添加剤、限定されないがマランスチレン共重合体（ｍａｌａｎ  ｓｔｙｒｅｎｅ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）、及び限定されないがポリメタクリレート類を含め、ポリ（アルキル）アクリレート類を含む；及び（ｇ）加水分解から保護する化合物、限定されないがカルボジイミド類を含む。
【００２６】
本発明のこれらの及び他の実施形態を、以下の本発明の詳細な説明において説明し、及び以下の例において例証する。上記で及び本出願全体にわたって考察される特徴のいずれも、本発明の種々の実施形態に組み合わせることができる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
微生物油を含む生成物であって、前記油が約−５℃未満の流動点を有し、及び前記微生物油の脂肪酸組成が、少なくとも５０％のＣ１８：１及び１０％未満のＣ１８：２である、生成物。
（項目２）
約−１０℃〜約−４０℃の流動点を有する、項目１に記載の生成物。
（項目３）
前記微生物油の脂肪酸組成が少なくとも６０％のＣ１８：１である、項目１又は２に記載の生成物。
（項目４）
前記微生物油の脂肪酸組成が少なくとも７０％のＣ１８：１である、項目１〜３のいずれか一項に記載の生成物。
（項目５）
前記微生物油の脂肪酸組成が５％未満のＣ１８：２である、項目１〜４のいずれか一項に記載の生成物。
（項目６）
前記微生物油の脂肪酸組成が、少なくとも８０％のＣ１８：１及び５％未満のＣ１８：２である、項目１〜５のいずれか一項に記載の生成物。
（項目７）
２５０℃〜３７５℃の引火点、又は３００℃〜４５０℃の燃焼点を有する、項目１〜６のいずれか一項に記載の生成物。
（項目８）
前記微生物油のヨウ素価が２５〜２００である、項目１〜７のいずれか一項に記載の生成物。
（項目９）
流動点降下剤をさらに含む、項目１〜８のいずれか一項に記載の生成物。
（項目１０）
潤滑剤、油圧作動液、工業用油、又は誘電性流体である、項目１〜９のいずれか一項に記載の生成物。
（項目１１）
誘電性流体である、項目１〜１０のいずれか一項に記載の生成物。
（項目１２）
前記誘電性流体が２０ｋＶ〜７５ｋＶの絶縁破壊電圧を有する、項目１１に記載の誘電性流体。
（項目１３）
２０ＭＶ／ｍ（ＲＭＳ）〜７５ＭＶ／ｍ（ＲＭＳ）の絶縁耐力を有する、項目１１又は１２に記載の誘電性流体。
（項目１４）
抗酸化剤、金属イオン不活性化剤、腐食防止剤、解乳化剤、耐摩耗添加剤、流動点降下剤、又は抗加水分解性化合物をさらに含む、項目１１〜１３のいずれか一項に記載の誘電性流体。
（項目１５）
前記微生物油が、１つ以上の外来遺伝子を発現するように操作された遺伝子操作された細菌により生成される、項目１〜１４のいずれか一項に記載の生成物。
（項目１６）
前記遺伝子操作された細菌がＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ又はＣｈｌｏｒｅｌｌａである、項目１５に記載の生成物。
（項目１７）
前記遺伝子操作された細菌がＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓである、請
求項１６に記載の生成物。
（項目１８）
前記１つ以上の外来遺伝子がショ糖インベルターゼ又は脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする、項目１５〜１７のいずれか一項に記載の生成物。
（項目１９）
前記１つ以上の外来遺伝子が２つ以上の脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする、項目１８に記載の生成物。
（項目２０）
前記１つ以上の外来遺伝子がショ糖インベルターゼ及び１つ以上の脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする、項目１８に記載の生成物。
（項目２１）
遺伝子操作された細菌により生成された微生物油を含む誘電性流体であって、約−１０℃〜約−４０℃の流動点を有する誘電性流体。
（項目２２）
前記微生物油の脂肪酸組成が少なくとも５０％のＣ１８：１及び１０％未満のＣ１８：２である、項目２１に記載の誘電性流体。
（項目２３）
前記微生物油の脂肪酸組成が少なくとも７０％のＣ１８：１である、項目２１又は２２に記載の誘電性流体。
（項目２４）
前記微生物油の脂肪酸組成が少なくとも７０％のＣ１８：１及び５％未満のＣ１８：２である、項目２１〜２３のいずれか一項に記載の誘電性流体。
（項目２５）
前記遺伝子操作された細菌がＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ又はＣｈｌｏｒｅｌｌａである、項目２１〜２４のいずれか一項に記載の誘電性流体。
（項目２６）
前記細菌がＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓである、項目２５に記載の誘電性流体。
（項目２７）
項目２１〜２６のいずれか一項に記載の誘電性流体を含む電気部品。
（項目２８）
変圧器である、項目２７に記載の電気部品。
（項目２９）
ＲＢＤ微生物油を生成する方法であって、前記微生物油が約−５℃未満の流動点を有し、及び前記微生物油の脂肪酸組成が少なくとも５０％のＣ１８：１及び１０％未満のＣ１８：２である方法において、
ａ．１つ以上の外来遺伝子を発現するように操作された遺伝子操作された細菌を、前記細菌が乾燥重量で少なくとも１０％の油を有するまで育てることと；
ｂ．前記細菌から前記油を分離することと；
ｃ．前記油を精製、漂白、脱臭又は脱ガムに供してＲＢＤ微生物油を生成することと
を含む方法。
（項目３０）
前記微生物油が約−１０℃〜約−４０℃の流動点を有する、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
抗酸化剤、金属イオン不活性化剤、腐食防止剤、解乳化剤、耐摩耗添加剤、流動点降下剤、又は抗加水分解性化合物を前記ＲＢＤ油に添加することをさらに含む、項目２９又は３０に記載の方法。
（項目３２）
前記遺伝子操作された細菌がＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ又はＣｈｌｏｒｅｌｌａである、項目２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記遺伝子操作された細菌がＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓである、項目３０に記載の方法。
（項目３４）
前記１つ以上の外来遺伝子がショ糖インベルターゼ又は脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする、項目２９〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記１つ以上の外来遺伝子が２つ以上の脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記１つ以上の外来遺伝子がショ糖インベルターゼ及び１つ以上の脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
微生物油を含む生成物を生成する方法であって、前記生成物が約−５℃未満の流動点を有し、及び前記微生物油の脂肪酸組成が少なくとも５０％のＣ１８：１及び１０％未満のＣ１８：２である方法において、
ａ．第１の微生物油を精製、漂白、脱臭又は脱ガムに供してＲＢＤ油を生成することであって、前記ＲＢＤ油が初期流動点及び第１の温度によって特徴づけられることと；
ｂ．前記ＲＢＤ油の温度を、前記第１の温度より低い第２の温度に下げることと；
ｃ．前記ＲＢＤ油を前記第２の温度に保持することと；
ｄ．前記ＲＢＤ油を前記第２の温度で濾過して、前記初期流動点より低い第２の流動点であって、約−５℃未満である第２の流動点によって特徴づけられる第２の微生物油を提供することと
を含む方法。
（項目３８）
前記微生物油が約−１０℃〜約−４０℃の流動点を有する、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
抗酸化剤、金属イオン不活性化剤、腐食防止剤、解乳化剤、耐摩耗添加剤、流動点降下剤、又は抗加水分解性化合物を前記第２の微生物油に添加することをさらに含む、項目３７又は３８に記載の方法。
（項目４０）
ａ．１つ以上の外来遺伝子を発現するように操作された遺伝子操作された細菌を、前記細菌が乾燥重量で少なくとも１０％の油を有するまで育てることと；
ｂ．前記細菌から前記油を分離して前記第１の微生物油を生成することと
により前記第１の微生物油を生成することをさらに含む、項目３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記第１の温度が１５℃超〜約５０℃であり、及び前記第２の温度が約−１５℃〜約１５℃である、項目３７〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記生成物が、潤滑剤、油圧作動液、工業用油、又は誘電性流体である、項目３７〜４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記生成物が誘電性流体である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記誘電性流体が、抗酸化剤、金属イオン不活性化剤、腐食防止剤、解乳化剤、耐摩耗添加剤、流動点降下剤、又は抗加水分解性化合物をさらに含む、項目４３に記載の方法。
【００２７】
本発明は、本発明の特定の具体的な実施形態を示す添付の図面と併せて考慮される以下の説明を参照することにより、理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＲＢＤ油画分化の典型的な冷却プロフィール（Ｔｆ＝濾過温度）。
【図２】藻類オレイン画分化の典型的な冷却プロフィール（Ｔｆ＝濾過温度）。
【図３】藻類の油及び画分化した油の流動点に対するＶＰＬ  １０−３１０の効果。「脱臭油」はＲＢＤ油である；「オレイン」はオレイン＃１である；「スーパーオレイン」はスーパーオレイン＃１である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、一部には、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ及び他の油産生微生物が、特定の実施形態では、生分解性潤滑剤、特にこれまでは主にミネラル油ベースであったエンジンオイル及び油圧作動液などの他の用途のなかでも、誘電性流体の生成に予想外に有利な特性を有するという発見からもたらされる。微生物油をベースとする潤滑剤は、チェーンソーバーにおける石油潤滑剤、掘削泥及び油、ストレート金属加工油剤、食品工業用潤滑剤、オープンギアオイル、生分解性グリース、油圧作動液、海洋用及び船外機関用潤滑剤、ウォータポンプ及び地下ポンプ用のオイル、レールフランジ用潤滑剤、ショックアブソーバ用潤滑剤、トラクター用オイル、農業機器潤滑剤、エレベータ用オイル、離型油、２サイクルエンジン用潤滑剤及び他の潤滑剤を代用することができる。
【００３０】
本発明はまた、一部には、流動点が低下するように微生物油を改変する方法の発見からからもたらされる。脂質のトランスエステル化により長鎖脂肪酸エステルが得られる。他の酵素的及び化学的方法を、脂肪酸、アルデヒド、アルコール、アルカン、及びアルケンが得られるように適合させてもよい。いくつかの用途では、誘電性流体に有用な炭化水素化合物が生成される。
【００３１】
読者が読みやすいように、この詳細な説明をいくつかの章に分けている。第Ｉ章は、本明細書で用いる用語の定義を提供している。第ＩＩ章は、本発明の方法の実施形態で有用な培養条件の説明を提供している。第ＩＩＩ章は、遺伝子操作の方法及び材料の説明を提供している。第ＩＶ章は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａにより例示されるような微細藻類を具体的に参照して、ショ糖利用を可能にするための微生物の遺伝子操作の説明を提供している。第Ｖ章は、脂質生合成を改変するための遺伝子操作の説明を提供している。第ＶＩ章は、本発明の実施形態の微生物油及びそれから得られる誘電性流体のような生成物を作る方法を説明している。第ＶＩＩ章は、本発明のさまざまな実施形態を示す例を開示している。
【００３２】
Ｉ．定義
他の意味であると定義されていない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び化学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解している意味を有する。以下の参考文献は、本発明で用いられる多くの用語に関する一般的な定義に関する知識を与えるものである。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版、１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ編集、１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第５版、Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（編集）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；Ｈａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ、Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用される場合、他の意味であると明記されていない限り、以下の用語は、それらに属する以下の意味を有する。
【００３３】
「微細藻類内で活性」は、微細藻類内で機能を発揮する核酸を指す。例えば、トランスジェニック微細藻類に抗生物質耐性を付与するために、抗生物質耐性遺伝子を動かすために用いられるプロモーターは、微細藻類内で活性である。
【００３４】
「アシルキャリアータンパク質」又は「ＡＣＰ」は、脂肪酸合成中に成長していくアシル鎖に、４’−ホスホパンテテイン部分の末端チオールにおいてチオールエステルとして結合するタンパク質であり、脂肪酸シンターゼ複合体の成分を含む。
【００３５】
「アシル−ＣｏＡ分子」又は「アシル−ＣｏＡ」は、補酵素Ａの４’−ホスホパンテテイン部分の末端チオールの位置で、チオールエステル結合によって補酵素Ａに共有結合したアシル部分を含む分子である。
【００３６】
「抗酸化剤」は、他の分子の酸化を阻害することが可能な分子である。抗酸化剤は工業製品に添加されることが多い。一般的な使用は、燃料中及び潤滑剤中で酸化を防止するための、並びにガソリン中でエンジン汚損残留物の形成を生じさせる重合を防止するための、安定剤としての使用である。抗酸化剤はまた、ゴム、プラスチック及び接着剤のようなポリマーにおいて、そのような材料の強度及び可撓性を失わせる酸化分解を防止するためにも、広く使用されている。
【００３７】
「抗加水分解性化合物」は、化学的化合物が水と反応して分解するのを阻害する分子である。例えば、カルボジイミドを抗加水分解性化合物として用いることができる。抗加水分解性化合物は、特に、例えばＳｐｅｃｉａｌＣｈｅｍから市販されている。
【００３８】
「耐摩耗添加剤」は、構成部品の耐摩耗性及び耐引掻性を高めて機械寿命を延ばすための、流体（例えば、潤滑油）に対する添加剤である。耐摩耗添加剤は、機械部品間で油膜が壊れたときに金属同士が直接接触することを防止する。典型的には、添加剤は部品表面上の金属と反応して膜を形成し、この膜が摩擦面に対して摺動し得る。耐摩耗添加剤は、典型的には亜鉛及びリン化合物を含有する。耐摩耗添加剤の例としては、ジチオリン酸亜鉛（ＺＤＰ）、亜鉛ジアルキルジチオリン酸（ＺＤＤＰ、腐食防止剤及び抗酸化剤としても働く）、リン酸トリクレシル（ＴＣＰ、高温での動作に使用される）、ハロカーボン（塩素化パラフィン、極圧での動作用）、グリセロールモノオレエート、ステアリン酸（１５０℃未満で可逆吸着過程によって表面に付着する、軽い接触条件に有用）が挙げられる。
【００３９】
「面積百分率」は、サンプル中の全ての脂肪酸を、検出前に脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）に変換し、ＦＡＭＥ  ＧＣ／ＦＩＤ検出法を用いて観察したピークの面積を指す。例えば、炭素原子１４個で、不飽和部のない脂肪酸（Ｃ１４：０）について、分離したピークが、任意の他の脂肪酸、例えば、Ｃ１４：１と比較すると観察される。それぞれの種類のＦＡＭＥに対するピーク面積は、混合物中のその組成物における割合と正比例しており、サンプル中に存在する全ピークの合計に基づいて算出される（すなわち、［特定のピークの面積／測定した全ピークの合計面積］×１００）。本明細書に記載の油及び細胞の脂質（脂肪酸）プロフィールについて述べる場合、「Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも４％」は、細胞中、又は抽出したグリセロ脂質組成物中の総脂肪酸のうち、少なくとも４％が、炭素原子が８個、１０個、１２個又は１４個の鎖長を有することを意味している。
【００４０】
「純培養」は、他の生物によって汚染されていない、微生物の培養物を指している。
【００４１】
「バイオディーゼル」は、ディーゼルエンジンの燃料として使用するのに適した、生物によって生成された脂肪酸アルキルエステルである。
【００４２】
「バイオマス」は、細胞の成長及び／又は増殖によって生成する物質である。バイオマスは、細胞及び／又は細胞内成分、並びに、限定されないが、細胞によって分泌された化合物のような細胞外物質を含有していてもよい。
【００４３】
「バイオリアクター」は、細胞を場合により懸濁物の状態で培養する、閉じられた筐体又は部分的に閉じられた筐体である。
【００４４】
誘電性流体の「絶縁破壊電圧」は、誘電性流体がその絶縁特性を失うときの電圧である。
【００４５】
「触媒」は、生成物の一部分とならずに、反応剤の化学反応を容易にするか、又は促進することができる、分子又は高分子複合体のような薬剤である。触媒は、反応速度を高め、その後で、同じ触媒が、生成物を得るための別の反応剤として作用してもよい。触媒は、一般的に、反応に必要な合計活性化エネルギーを小さくするため、反応がすばやく進行するか、又は低い温度で進行する。従って、反応の平衡状態にすばやく達し得る。触媒の例としては、生体触媒である酵素；生体触媒ではない熱；石油精製プロセスで用いる金属が挙げられる。
【００４６】
「セルロース系材料」は、セルロースを消化して得られる物質であり、グルコース及びキシロース、場合により、二糖類、オリゴ糖、リグニン、フルフラール類及び他の化合物のようなさらなる化合物を含む。セルロース系材料の供給源の非限定的な例としては、サトウキビの絞りかす、テンサイパルプ、トウモロコシ茎葉、木片、おがくず、スイッチグラスが挙げられる。
【００４７】
「共生培養」、及び「共生生育」及び「共生発酵」などのこの用語の変形は、同じバイオリアクター内に２種類以上の細胞が存在することを指す。２種類以上の細胞は、全てが微細藻類のような微生物であってもよく、異なる細胞種と共に培養された微細藻類細胞であってもよい。培養条件は、２種類以上の細胞の成長及び／又は増殖を進めるような条件であってもよく、又は、２種類以上の細胞のうち１種類、又は部分的な集合の成長及び／又は繁殖を容易にしつつ、残りの細胞の成長を維持する条件であってもよい。
【００４８】
「補因子」は、酵素がその酵素活性を発揮するのに必要な、基質以外の任意の分子である。
【００４９】
「相補的ＤＮＡ」又は「ｃＤＮＡ」は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の逆転写又は増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）を介する）によって通常得られるｍＲＮＡのＤＮＡ複写物である。
【００５０】
「腐食防止剤」は、流体に添加されると、その流体と接触している金属又は合金の腐食速度を低下させる分子である。
【００５１】
「育てられた」、及びこの語句の別の言い方である「培養された」、「発酵された」は、選択した条件及び／又は制御された条件を利用することによって、１つ以上の細胞の成長（細胞の大きさ、細胞成分が増え、及び／又は細胞活性が高まる）及び／又は増殖（有糸分裂によって細胞の数が増える）を意図的に進めることを指す。成長と増殖を組み合わせて、繁殖と呼ぶ場合もある。選択した条件及び／又は制御された条件の例としては、十分に定義されている培地（ｐＨ、イオン強度、炭素源のような既知の特徴を有する）、特定の温度、酸素圧、二酸化炭素濃度、バイオリアクター内の成長を用いることが挙げられる。育てることは、微生物の成長又は増殖が自然に起こること、又は人の介入なしに起こることを指さず、例えば、微生物が地中で最終的に化石化し、未精製油を生成するような天然の成長は、育てられたとは言わない。
【００５２】
「細胞溶解」は、低張な環境における細胞の溶解である。細胞溶解は、細胞内側への過剰な浸透作用、又は水の移動によって生じる（水分過剰）。細胞は、内部の水の浸透圧に耐えられず、爆発する。
【００５３】
「脱脂した食料」及び「脱脂した微生物バイオマス」は、機械的な力を使って（すなわち、連続圧搾機で圧縮して）、又は溶媒抽出を利用して、又は両者を使って油（脂質を含む）を抽出するか、又は単離した後の微生物バイオマスである。脱脂した食料は、微生物バイオマスから油／脂質を抽出又は単離する前と比較して、油／脂質の量が減っているが、油／脂質はいくらか残っている。
【００５４】
「解乳化剤」は、エマルション（通常は液液エマルション）を破壊するか、或いはその形成を防止する分子である。解乳化剤は、典型的には以下の化学物質をベースとする：酸触媒フェノールホルムアルデヒド樹脂、塩基触媒フェノールホルムアルデヒド樹脂、ポリアミン、ジエポキシド、ポリオール。これらの分子が通常エトキシ化（及び／又はプロポキシ化）され、望ましい水／油溶解度をもたらす。エチレンオキシドを添加すると水溶性が高くなり、一方、酸化プロピレンは水溶性を低下させる。市販の解乳化配合剤は、典型的には、キシレン、重質芳香族ナプサ（Ｈｅａｖｙ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｎａｐｔｈａ）（ＨＡＮ）、イソプロパノール、メタノール、２−エチルヘキサノール又はディーゼルのような１つ又は複数の担体溶媒中における２〜４種の異なる化学物質の混合物である。
【００５５】
「誘電体」又は「誘電性流体」は、通常の状況下で（又はその使用目的の状況下で）電流を伝導しない、又は電流の伝導度が極めて低い流体である。誘電性流体は、例えば変圧器及び他の電気装置において、電気絶縁、冷却及び潤滑に使用される。誘電性流体を利用する電気装置には、電源及び配電変圧器、回路遮断器、コンデンサ、開閉装置、Ｘ線機器、及び絶縁ケーブルが含まれる。
【００５６】
材料（例えば、絶縁体）の「絶縁耐力」は、絶縁破壊、すなわちその絶縁特性の不良が生じるのに必要な最大電圧であり、単位厚さあたりのボルトとして表される。材料の絶縁耐力は、標準方法、例えばＡＳＴＭ試験方法Ｄ１８１６、Ｄ８７７、Ｄ３３００、Ｄ１１７、Ｄ２４１３、Ｄ６１８０、Ｄ６１８１、又はＤ１３１０に従い決定することができる。
【００５７】
「発現ベクター」、「発現構築物」、「プラスミド」又は「組み換えＤＮＡ構築物」は、例えば、組み換え手段又は直接的な化学合成によって、人の介入によって発生した核酸を指し、一連の特定の核酸エレメントは、宿主細胞内で特定の核酸を転写及び／又は翻訳することができる。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス又は核酸フラグメントの一部分であってもよい。典型的には、発現ベクターは、プロモーターに動作可能に連結した、転写されるべき核酸を含む。
【００５８】
「外来遺伝子」は、細胞に導入された（「形質転換された」）ＲＮＡ及び／又はタンパク質を発現するようなコードを有する核酸であり、「導入遺伝子」とも呼ばれる。形質転換された細胞は、組み換え細胞と呼ばれることもあり、この細胞に、さらなる外来遺伝子が導入されてもよい。外来遺伝子は、形質転換される細胞と異なる種に由来していてもよく（つまり、異種）、同じ種に由来していてもよい（つまり、同種）。従って、外来遺伝子は、この細胞のゲノムでは異なる位置にあるような同種遺伝子を含んでいてもよく、内在する遺伝子複製物と比較して、異なる制御下にある同種遺伝子を含んでいてもよい。外来遺伝子は、この細胞の２種類以上の複製物中に存在していてもよい。外来遺伝子は、ゲノムへの挿入物として細胞（核又はプラスミド）中に維持されてもよく、又はエピソーム分子として細胞中に維持されてもよい。
【００５９】
「外部から与えられた」は、細胞培養物の培地に与えられた分子を指す。
【００６０】
「連続圧搾機で圧縮する」は、大豆や菜種のような原材料から油を抽出する機械的な方法である。連続圧搾機は、スクリュー型の機械であり、ケージで覆われた円筒形の空洞を通すことによって材料を圧縮する。原材料は、圧搾機の片側から入り、ケーキが他方から出ていく間に、ケージ内にあるバーの間から油がしみ出て、集められる。この機械は、スクリューからの摩擦及び連続的な圧力を利用し、原材料を動かし、圧縮する。油は、固形物が通過することができない小さな開口部からしみ出る。原材料が圧縮されていくと、典型的には、摩擦によって熱が発生する。
【００６１】
「脂肪酸」は、長い脂肪族末端（鎖）を有するカルボン酸である。脂肪酸の脂肪族部分は、完全飽和していても（二重結合なし）又は分子の１つ以上のさまざまな部分で不飽和であってもよい。ほとんどの天然に存在する脂肪酸は、４〜２８個の偶数の炭素原子の鎖を有する。脂肪酸は、トリグリセリド又は他の脂質、例えば、リン脂質、スフィンゴ脂質の構成要素であり得る。脂肪酸は「脂質価」によって特徴づけることができる。脂質価はＣ：Ｄの形式をとり、ここでＣは脂肪酸中の炭素原子の数であり、Ｄは脂肪酸中の二重結合の数である。従って「Ｃ１８：１」は、１８個の炭素及び１個の二重結合を有する脂肪酸を指し、一方「Ｃ１８：２」は、１８個の炭素及び２個の二重結合を有する脂肪酸を指す。
【００６２】
「脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ」は、脂質合成中に、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）から脂肪酸が開裂するのを触媒する酵素である。
【００６３】
「脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素」は、アシル−ＣｏＡ分子から一級アルコールへの還元を触媒する酵素である。
【００６４】
「脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素」は、アシル−ＣｏＡ分子からアルデヒドへの還元を触媒する。
【００６５】
「脂肪族アルデヒド脱炭酸酵素」は、脂肪族アルデヒドからアルカンへの変換を触媒する酵素である。
【００６６】
「脂肪族アルデヒド還元酵素」は、アルデヒドから一級アルコールへの還元を触媒する酵素である。
【００６７】
材料の燃焼点は、裸火で点火後少なくとも５秒間燃焼し続ける温度である。燃焼点は、標準方法、例えばＡＳＴＭ試験方法Ｄ９２又はＤ１３１０に従い決定することができる。
【００６８】
「引火点」は、材料が気化して空中で着火性混合物を形成する最低温度である。引火点では、材料は着火し得るが、点火時に生じる蒸気は、燃焼を持続させるのに十分な速度では生じないこともある。引火点は、標準方法、例えばＡＳＴＭ試験方法Ｄ３２７８、Ｄ３８２８、Ｄ５６、又はＤ９３に従い決定することができる。
【００６９】
「固定炭素源」は、培地中で、周囲温度及び周囲圧力で固体又は液体の形態として存在し、培地で培養されている微生物が利用することが可能な、炭素を含有する分子、典型的には有機分子である。
【００７０】
「従属栄養」は、それが培養条件に関連するとき、固定炭素源を利用又は代謝する間に実質的に光が存在しない状態で培養することである。
【００７１】
「ホモジネート」は、物理的に破壊されたバイオマスである。
【００７２】
「油圧作動液」は、油圧系の動力伝達媒体として機能する流体である。  
【００７３】
「炭化水素」は、水素原子と炭素元素のみを含む分子であり、炭素原子は、直鎖、分枝鎖、環状、又は部分的に環状の骨格になるように共有結合しており、この骨格に水素原子が接続している。炭化水素化合物の分子構造は、最も単純で天然ガスの構成成分であるメタン（ＣＨ４）から、未精製油、石油、ビチューメン中にみられるアスファルテンのようなある種の分子のように、非常に重く、非常に複雑なものまでさまざまである。炭化水素は、気体、液体又は固体の形態であってもよく、これらの形態を任意に組み合わせた形態であってもよく、骨格内の隣接する炭素原子間に１つ以上の二重結合又は三重結合を有していてもよい。従って、この用語には、直鎖、分枝鎖、環状、又は部分的に環状のアルカン、アルケン、脂質、パラフィンが含まれる。例としては、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、オクタン、スクアレンが挙げられる。
【００７４】
「水素：炭素比」は、原子単位であらわした、分子中の水素原子と炭素原子との比率である。この比率は、炭化水素分子中の炭素原子及び水素原子の数を述べるときに用いられ得る。例えば、最も大きな比率を有する炭化水素は、メタンＣＨ４である（４：１）。
【００７５】
「疎水性画分」は、水系相への溶解度よりも、疎水性相への溶解性が高いような、物質の一部分又は画分である。疎水性画分は、実質的に水には溶解せず、通常は非極性である。
【００７６】
「脂質収量の増加」は、例えば、培養物１リットルあたりの細胞乾燥重量が増加すること、脂質を構築する細胞の割合が増えること、又は、単位時間あたりの培養容積１リットルあたり、脂質の合計量が増えることのような、微生物培養物の脂質生産性の増加を指す。
【００７７】
「誘発性プロモーター」は、特定の刺激に応答し、動作可能に連結した遺伝子の転写に介在するプロモーターである。
【００７８】
「工業用油」は、工業上有用な油である。一般的な工業用油としては、チェーンソーバー潤滑剤、金属加工液、食品級潤滑剤、ギヤオイル、海洋用オイル、エンジン潤滑剤、トラクター用オイル、農業機器潤滑剤、エレベータ用オイル、離型油などが挙げられる。「チェーンソーバー潤滑剤」は、チェーンソーのバー及びチェーンの外部潤滑に使用される。「金属加工液」は、金属ピースを有用な物体に成形加工するプロセスを冷却及び／又は潤滑するために使用される流体である。「食品級潤滑剤」は、食用獣肉、家禽肉及び他の食品を加工する設備、用途及び工場での使用が許容される潤滑剤である。「ギヤオイル」は、例えば、自動車、トラック、及び他の機械類の、変速装置、トランスファーケース、及び差動装置における、ギヤを潤滑させるのに有用な油である。「海洋用オイル」は、海洋機器の可動部品を潤滑させるのに有用な油である。「エンジン潤滑剤」は、さまざまな内燃機関の潤滑に使用される。主要な機能は可動部品を潤滑させることであるが、エンジン潤滑剤はまた、清掃し、腐食を抑制し、封止性を向上させ、及び可動部品から熱を取り除くことによってエンジンを冷却することもできる。「トラクター用オイル」は、トラクターの可動部品を潤滑させるのに有用な油である。「農業機器潤滑剤」は、農業機器の可動部品を潤滑させるのに有用な潤滑剤である。「エレベータ用オイル」は、油圧式エレベータで油圧作動液として使用される油である。「離型油」は、金型を用いる成形品の作製に有用な油である。離型油は金型からの成形品の離型を促進し、望ましい表面仕上げを提供する表面調整特性を有し得る。
【００７９】
「動作可能に連結した状態で」は、制御配列（典型的には、プロモーター）、連結した配列（典型的には、タンパク質をコードする配列、コード配列とも呼ばれる）のような、２個の核酸配列間の機能的な連結である。プロモーターは、遺伝子の転写に介在することができる場合、外来遺伝子と動作可能に連結した状態である。
【００８０】
「系中」は、「その場で」又は「その元々の位置で」という意味である。「ヨウ素価」（又は「ヨウ素数」）は、油の不飽和度の尺度である。これは、油中の不飽和結合により消費されるヨウ素の質量である。例えば、ヨウ素価が５０の油は、１００ｇの油が５０グラムのヨウ素を消費し得る油である。ヨウ素価は、当該技術分野ではルーチン的に決定されている。ヨウ素価を決定する標準方法には、ＡＳＴＭ  Ｄ５７６８−０２（２００６）及びＤＩＮ  ５３２４１が含まれる。
【００８１】
「栄養物の制限濃度」は、培養している微生物の増殖を制限するような、培養物中の化合物の濃度である。「栄養物の非制限濃度」は、所与の培養期間中に、最大限の増殖を支援するような濃度である。従って、所与の培養期間中に生成する細胞の数は、栄養物が非制限濃度である場合よりも、制限濃度存在する場合には少なくなる。最大限の増殖を支援する濃度よりも多く栄養物が存在する場合には、培養物中に栄養物が「過剰で」あると言われる。
【００８２】
「リパーゼ」は、水に不溶性の脂質基質内のエステル結合を加水分解するのを触媒する水溶性酵素である。リパーゼは、脂質がグリセロール及び脂肪酸に加水分解されるのを触媒する。
【００８３】
「脂質改変酵素」は、脂質の共有構造を変化させる酵素を指す。脂質改変酵素の例としては、リパーゼ、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、ステアロイルアシルキャリアータンパク質デサチュラーゼ（ＳＡＤ）及び脂肪酸アシルデサチュラーゼ（ＦＡＤ）を含むデサチュラーゼ、並びに脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼが挙げられる。
【００８４】
「脂質経路に関連する酵素」は、脂質代謝、すなわち、脂質合成、改変又は変性においてなんらかの役割をはたす任意の酵素であり、脂質を化学的に改変するタンパク質、及びキャリアータンパク質である。
【００８５】
「脂質」は、非極性溶媒（例えば、エーテル及びクロロホルム）に可溶性であり、水には比較的溶けないか、完全に不溶性の分子種である。脂質分子は、主に、疎水性の性質を有する長い炭化水素鎖かららなるため、これらの性質を有している。脂質の例としては、脂肪酸（飽和及び不飽和）；グリセリド又はグリセロ脂質（例えば、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド又は天然の脂肪、ホスホグリセリド、グリセロリン脂質）；グリセリド以外のもの（スフィンゴ脂質、コレステロール及びステロイドホルモンを含むステロール脂質、テルペノイド、脂肪族アルコール、ワックス、ポリケツドを含むプレノール脂質）；複雑な脂質誘導体（糖に連結した脂質、又は糖脂質、タンパク質に連結した脂質）が挙げられる。「脂肪」は、「トリアシルグリセリド」と呼ばれる脂質の下位集団である。
【００８６】
「潤滑剤」は、固体表面間に膜として導入されたときに摩擦、熱、及び／又は摩耗を低減することが可能な物質である。
【００８７】
「溶解物」は、溶解した細胞内容物を含む溶液である。
【００８８】
「溶解すること」又は「溶解」は、細胞内成分を少なくともいくらか放出させるのに十分な程度まで、生物有機体又は細胞の原形質膜、場合により、細胞壁を分断することである。
【００８９】
「金属イオン不活性化剤」は、「金属不活性化剤」又は「金属不活性剤（ＭＤＡ）」としても知られ、金属イオンを不活性化する（通常は封鎖する）ことによって流体を安定化させるために用いられる燃料用及び／又は油用の添加剤である。金属イオンは、燃料中の天然に存在する酸及びシステムの金属部品による酸化プロセスによって潤滑剤中に生じた酸の作用により生じ得る。
【００９０】
「微細藻類」は、葉緑体又はプラスチドを含み、場合により、光合成を行うことができる真核性微生物であるか、又は、光合成を行うことができる原核性微生物である。微細藻類には、固定炭素源をエネルギーとして代謝することができない偏性光合成独立栄養生物と、単に固定炭素源がないと生存することができない従属栄養生物とが存在する。微細藻類には、細胞分裂の直後に、妹細胞から分離するＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのような単細胞有機体、２種類の別個の細胞型を有する単純な多細胞光合成細菌である、例えば、Ｖｏｌｖｏｘのような細菌が含まれる。微細藻類は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａのような細胞を含む。また、微細藻類には、Ａｇｍｅｎｅｌｌｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓのような、細胞−細胞接着性を示す他の細菌の有機体も含まれる。また、「微細藻類」は、特定のｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  ａｌｇａｅ種、及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の種のような、光合成を行う能力が失われている偏性従属栄養微生物も指す。
【００９１】
「微生物」及び「細菌」は、微細な単細胞有機体である。
【００９２】
「自然に共発現する」は、２種類のタンパク質あるいは遺伝子に関する際、例えば、２種類のタンパク質をコードする遺伝子が、共通の制御配列の制御下にあるため、又は、上述の２種類のタンパク質をコードする遺伝子が、同じ刺激に応答して発現するため、そのタンパク質又は遺伝子が、これらが誘導される組織又は有機体で自然に共発現することを意味する。
【００９３】
「油」は、油産生酵母、植物、及び／又は動物を含む有機体により生成される任意のトリアシルグリセリド油脂を指す。「脂肪」と区別されるときの「油」は、特に指示されない限り、必ずしもというわけではないが、一般的には平均的な室温及び圧力で液状である脂質を指す。例えば、「油」には、限定なしに、アボカド、ブラジルナッツ、キンセンカ、カメリナ、カメリナ・サティバ、キャノーラ、カシューナッツ、トウゴマの実、ココアバター（カカオとしても知られる、カカオ豆から得られるトリアシルグリセリド油脂で、典型的な室温及び圧力で固体である）、ココナツ、コーヒー、コプラ、コリアンダー、トウモロコシ、綿実、クフェア、ユーホルビア、ヘーゼルナッツ、麻、ジャトロファ、ホホバ、ケナフ、亜麻仁、ハウチワマメ、マカダミア、カラシの種子、オーツ麦、オリーブ、ケシ、パーム、パーム核、ピーナッツ、ピーカン、カボチャの種、菜種、イネ、ベニバナ、ゴマ、大豆、ヒマワリ、及びシナアブラギリ、並びにこれらの組み合わせから得られる油を含めた、植物から得られる植物油又は種子油が含まれる。「微生物油」は、細菌から得られる油を指す。
【００９４】
「油産生酵母」は、その乾燥細胞重量の２０％超を脂質として天然に蓄積することができる酵母を意味し、真菌類のＤｉｋａｒｙａ亜界の酵母である。油産生酵母としては、限定されないが、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ、及びＬｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉのような有機体が挙げられる。
【００９５】
「浸透圧衝撃」は、浸透圧が突然下がることによって、細胞が溶液中で破裂することである。浸透圧衝撃は、時に、誘発されてこのような細胞の細胞成分が溶液内に放出される。
【００９６】
「多糖分解酵素」は、任意の多糖の加水分解又は糖化を触媒することができる任意の酵素である。例えば、セルラーゼは、セルロースの加水分解を触媒する。
【００９７】
「多糖類」又は「グリカン」は、単糖類がグリコシド結合によって接続したもので構成される炭水化物である。セルロースは、特定の植物細胞壁を構成する多糖である。セルロースは、酵素によって解重合し、キシロース及びグルコースのような単糖類や、これより大きな二糖類及びオリゴ糖を生成し得る。
【００９８】
「流動点」は、特定の一組の条件下で液体が流れる、又は流動する最低温度である。例示的な流動点規格としては、ＡＳＴＭ  Ｄ９７−１１、Ｄ５８５３−１１、及びＤ５９４９−１０が挙げられるが、本明細書に記載される方法に関連して流動点の測定を行うにおいては、当業者に公知の、又は当業者が開発する他の規格も用いることができる。
【００９９】
「流動点降下剤」又は「ＰＰＤ」は、油又は潤滑剤におけるワックス状結晶の形成を制御するポリマーであり、その結果、流動点が降下し、低温での流動性能が向上する。
【０１００】
「プロモーター」は、核酸の転写に関連する核酸制御配列である。本明細書で使用される場合、プロモーターは、転写開始部位の近くに、必要な核酸配列を含み、例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合には、ＴＡＴＡエレメントを含む。また、プロモーターは、場合により、遠位エンハンサーエレメント又はリプレッサーエレメントを含み、これらは、転写開始部位から数千塩基対離れた位置にあってもよい。
【０１０１】
「組み換え体」は、外来の核酸を導入するか、又は天然の核酸を変えることによって改変された細胞、核酸、タンパク質又はベクターを指す。従って、例えば、組み換え細胞は、この細胞の天然の（組み換えされていない）形態にはみられない遺伝子を発現するか、又は、組み換えされていない細胞によって発現する遺伝子とは異なる天然遺伝子を発現する。「組み換え核酸」は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、一般的に核酸を操作することによって元々作られている核酸が、ポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼ、又はそれ以外のものを用いて、天然には通常みられない形態になっているような核酸である。組み換え核酸は、例えば、動作可能に連結した状態にある２種類以上の核酸を配置することによって生成させてもよい。従って、天然では通常は接続していないＤＮＡ分子を結合させることによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した核酸又は発現ベクターの単離物は、両方とも組み換えであると考える。組み換え核酸が作られ、宿主細胞又は有機体に導入されると、宿主細胞の細胞機構を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで複製し得るが、このような核酸は、いったん組み換え状態で産生すると、その後に細胞内で複製されたものであっても、組み換えと考える。同様に、「組み換えタンパク質」は、組み換え技術によって、すなわち、組み換え核酸の発現によって作られるタンパク質である。
【０１０２】
「ＲＢＤ油」は、精製、漂白、又は脱臭に供された油である。
【０１０３】
「再生可能なディーゼル」は、脂質の水素化及び脱酸素によって生成するアルカン混合物（例えば、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０）である。
【０１０４】
「糖化」は、バイオマス、通常はセルロース系バイオマス又はリグノセルロース系バイオマスを、グルコース及びキシロースのような単糖類に変換するプロセスである。「糖化された」又は「解重合された」セルロース系材料又はバイオマスは、糖化によって単糖類に変換されたセルロース系材料又はバイオマスを指す。
【０１０５】
「音波処理」は、音波エネルギーを用いることによって、細胞のような生体材料を破壊する過程である。
【０１０６】
「フルフラール種」は、２−フランカルボキサアルデヒド、又は同じ基本構造の特徴を保持した誘導体である。
【０１０７】
「茎葉」は、穀物を収穫した後に残る、作物の茎及び葉を乾燥させたものである。
【０１０８】
「ショ糖利用遺伝子」は、発現すると、ショ糖をエネルギー源として利用する能力を補助する遺伝子である。ショ糖利用遺伝子によってコードされるタンパク質は、本明細書では「ショ糖利用酵素」と呼ばれ、ショ糖トランスポーター、ショ糖インベルターゼ、グルコキナーゼやフルクトキナーゼのようなヘキソキナーゼを含む。
【０１０９】
「変圧器」は、誘導結合された導体、典型的には変圧器のコイルを介して、電気的エネルギーをある回路から別の回路に移す装置である。
【０１１０】
用語「脱ろう」油又は「油の脱ろう」は、油からより高い融点の成分を取り除くこと、及び／又は１つ以上の流動点降下剤を添加することを含むプロセスを指す。
【０１１１】
ＩＩ．育てること及び培養条件
特定の実施形態では、本発明は、一般的に、微生物油（脂質）を生成するための、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａの種及び株、並びに酵母、真菌、及びバクテリアの種及び株を含めた、野生型及び組み換え微細藻類のような油産生微生物を育てることに関する。読者が読みやすいように、この章をいくつかの節に分けている。第１節は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株と、新しいＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ種及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株並びに関連する微細藻類をゲノムＤＮＡ比較によって同定し、さらに本明細書に記載される方法に有用な他の微細藻類、酵母、真菌類、及びバクテリアを同定するやり方とについて記載している。第２節は、育てるのに有用なバイオリアクターについて記載している。第３節は、育てるための培地について記載している。第４節は、本明細書に記載される例示的な育てる方法に従う油（脂質）の生成について記載している。第５節は、本明細書に記載される方法での使用に適した油産生酵母のタイプ、酵母バイオマスを生じさせるための培養条件、並びに本明細書に記載される例示的な方法に従って調製されたバイオマスの脂質プロフィール及び化学組成について記載している。
【０１１２】
１．Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株並びに他の油産生微生物
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａは、高濃度の脂質を産生することができ、特に、誘電性流体及び他の潤滑剤の生成に適した脂質を産生することができるため、脂質の生成に使用するのに卓越した微生物である。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａによって産生される脂質は、他の微細藻類によって生成される脂質よりも飽和度が高い。さらに、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａの脂質は、一般的に、色素を含まず（クロロフィル及び特定のカロチノイドが低い乃至検出不能なレベル）、いかなる状況でも、他の微細藻類から得られる脂質よりもかなり色素の含有量が低い。さらに、本明細書に記載される方法で用いるために提供される組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞を用い、他の微生物から脂質を生成する場合と比較して、低コストで、高収率及び高効率で脂質を生成させることができる。本明細書に記載される方法で用いる具体的なＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ種及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株としては、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ（ＵＴＥＸ  ３２７を含む）、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｐｏｒｔｏｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ株１４４１、１４３５を含む）、及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉが挙げられる。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の種は、偏性従属栄養生物である。
【０１１３】
本明細書に記載の方法で使用するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａの種は、ゲノムの特定標的領域を増幅させることによって同定することができる。例えば、特定のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ種又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株の同定は、プライマーと、任意のゲノム領域を用いた方法とを用い、例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｏｔ．Ｂｕｌｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｎ．（２００１）４２：１１５−１２１  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓに記載されている方法を用いて、核及び／又は葉緑体のＤＮＡを増幅させ、塩基配列を決定することによって行うことができる。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａだけではなく、同様の脂質プロフィール及び産生能を有する他の炭化水素及び脂質を産生する有機体の種を同定するために、リポソームの内部に転写されたスペーサー（ＩＴＳ１及びＩＴＳ２  ｒＤＮＡ）、２３Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、及び他の保存されたゲノム領域を増幅させ、塩基配列を決定する、当業者によって十分に確率された系統発生解析の方法を用いてもよい。例えば、藻類を同定し、分類する方法は、例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年８月；１７０（４）：１６０１−１０及びＲＮＡ、２００５年４月；１１（４）：３６１−４を参照。
【０１１４】
従って、ゲノムＤＮＡ比較を用い、本明細書に記載の方法で使用すべき微細藻類の適切な種を同定することができる。保存されたゲノムＤＮＡ領域、例えば、限定されないが、２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡを、微細藻類の種から増幅させ、本明細書に記載の方法で使用する好ましい微細藻類に分類学的に関連する微細藻類の種をスクリーニングするために、コンセンサス配列を比較することができる。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属に含まれる種に対し、このようなＤＮＡ配列比較を行った例を以下に示す。ゲノムＤＮＡ比較は、株の収集中にうまく同定できなかった微細藻類の種を同定するのにも有用な場合がある。株の収集では、表現型及び形態学的特徴に基づいて、微細藻類の種を同定することが多いだろう。これらの特徴を使用すると、微細藻類の種又は属を間違ってカテゴリー分けしてしまうことがある。ゲノムＤＮＡ比較を用いることは、系統発生的関係に基づいて微細藻類種をカテゴリー分けする良好な方法であろう。
【０１１５】
本明細書に記載の方法で使用する例示的微細藻類は、典型的には、配列番号１１〜１９に列挙されている少なくとも１つの配列に対するヌクレオチド同一性が少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は少なくとも８５％の２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡ配列を有する。
【０１１６】
ヌクレオチド同一性又はアミノ酸同一性の割合を決定するために配列を比較する場合、典型的には、ある配列を参照配列として作用させ、これと試験配列とを比較する。配列比較アルゴリズムを用いた場合、試験配列及び参照配列をコンピューターに入力し、部分配列の座標を指定し、必要な場合、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムが、指定したプログラムパラメーターに基づいて、試験配列を参照配列と比較して配列同一性の割合を算出する。
【０１１７】
比較のために、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）による局地的ホモロジーアルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）によるホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）と同様の方法で検索することによって、これらのアルゴリズムをコンピューター制御によって実施することによって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩの、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ）、又は、視覚的な観察（一般的に、前出のＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．を参照）によって、配列の最適アラインメントを行うことができる。
【０１１８】
配列同一性の割合及び配列類似性を決定するのに適した他のアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ウェブアドレスはｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に公開されている。このアルゴリズムは、検索配列の中で、データベース配列中の同じ長さの文字列と整列させたときに、ある正の値である閾値Ｔとマッチするか、又は閾値Ｔを満足するような長さＷの短い文字列を特定することによって、スコアが最も大きくなる配列対（ＨＳＰ）をまず特定することを含む。Ｔは、近隣の文字列スコアの閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、前出）。これらの初期の近隣の文字列ヒットが、これらの配列に含まれるもっと長いＨＳＰを見つけるための初期検索の出発点として作用する。この文字列のヒットを、累積アラインメントスコアが増加していく限りは、それぞれの配列に沿って両方向に拡張していく。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメーターＭ（マッチングした残基対に対するリワードスコア；常に０より大きい）及びパラメーターＮ（マッチングしない残基に対するペナルティースコア；常に０より小さい）を用いて算出される。アミノ酸配列の場合、スコアの行列を用いて累積スコアを算出する。それぞれの方向への文字列ヒットの拡張は、累積アラインメントスコアが、到達した最大値からＸの大きさだけ下がった場合、１つ以上のマイナス値のスコアをもつ残基のアラインメントの累積のため、累積スコアが０又は０未満になった場合、又は、いずれかの配列が末端まできた場合に中止される。核酸又はポリペプチドが本発明の範囲内にあるかどうかを特定するためには、ＢＬＡＳＴプログラムのデフォルトパラメーターが適している。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、文字列長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４をデフォルトとして用い、両鎖を比較する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプロフラムを、文字列長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列をデフォルトとして用いる。ＴＢＬＡＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のタンパク質配列を用いる）は、文字列長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列をデフォルトとして用いる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）を参照）。
【０１１９】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、配列同一性の割合を算出することに加え、２つの配列間の類似性の統計分析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって与えられる類似性の測定値は、ひとつには最小合計確率（Ｐ（Ｎ））があり、この値は、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列が偶然マッチする確率の指標を与える。例えば、試験核酸と参照核酸とを比較したときの最小合計確率が、０．１未満、より好ましくは、約０．０１未満、最も好ましくは、約０．００１未満であるときに、この核酸は、参照配列と類似していると考える。
【０１２０】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａに加え、さまざまな油産生微生物を、本明細書に記載される方法で用いることができる。例えば、限定されないが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａのｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ種の株を含むＣｈｌｏｒｅｌｌａは、本明細書に記載される方法で用いるのに良好な微細藻類である。油、燃料、及び油脂化学品を生成するのに適した脂質又は炭化水素の生成に加え、本明細書に記載される方法で用いるための微生物の選択に影響を及ぼす考慮事項としては、以下の１つ以上を挙げることができる：（１）細胞重量を基準とした割合で脂質含有量が高いこと；（２）成長が容易であること；（３）遺伝子操作が容易であること；及び（４）バイオマスの処理が容易であること。特定の実施形態では、野生型の微生物又は遺伝子操作された微生物から、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、又は少なくとも７０％以上が微生物油（すなわち脂質及び脂肪酸）である細胞が得られる。好ましい有機体は、従属栄養で（実質的に光が存在しない状態の糖上で）生育する（且つ生育される）。微細藻類は、一般的に、本明細書に記載される方法で用いるのに良好な微生物である。方法の実施に用いることができる微細藻類の例としては、限定されないが、表１に列挙される以下の藻類が挙げられる。
【０１２１】
【表１】
0005970463.tif 000002
【０１２２】
【表２】
0005970463.tif 000003
【０１２３】
【表３】
0005970463.tif 000004
【０１２４】
微細藻類に加え、油産生酵母は、その乾燥細胞重量の２０％超を脂質として蓄積することができ、そのため本明細書に記載される方法において有用である。本発明の一実施形態では、脂質を産生する微生物又は油を抽出する、回収する、若しくは得ることのできる微生物は、油産生酵母である。本明細書に記載される方法で用いることができる油産生酵母の例としては、限定されないが、表２に列挙される油産生酵母が挙げられる。高油含有量を達成するための油産生酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ及びＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）を育てる例示的な方法を、以下の例に提供する。
【０１２５】
【表４】
0005970463.tif 000005
【０１２６】
本発明の一実施形態では、脂質を産生する微生物、又は脂質を抽出する、回収する、若しくは得ることのできる微生物は、真菌である。本明細書に記載される方法で用いることができる真菌の例としては、限定されないが、表３に列挙される真菌が挙げられる。
【０１２７】
【表５】
0005970463.tif 000006
【０１２８】
従って、本発明の一実施形態では、本明細書に記載される方法で用いられる微生物バイオマスの生成に使用される微生物は、真菌である。適した真菌の例（例えば、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎｅ、Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）には、文献に記載されるように、遺伝子操作に適していることが示されているものが含まれる（例えば、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｌ；１５３（Ｐｔ．７）：２０１３−２５（２００７）；Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｊｕｎ；２７１（５）：５９５−６０２（２００４）；Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ，Ｍａｒ；２１（３）：２１５−２３（１９９２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３０（２）：８３−８６（１９９５）；Ｓａｋｕｒａｄａｎｉ，ＮＩＳＲ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒａｎｔ，“Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｕｓｅｆｕｌ  Ｌｉｐｉｄ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ”（２００４）；及びＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１２０２１号を参照）。
【０１２９】
本発明の他の実施形態では、脂質を産生する微生物、又は油を抽出する、回収する、若しくは得ることのできる微生物は、油産生バクテリアである。油産生バクテリアは、その乾燥細胞重量の２０％超を脂質として蓄積することができるバクテリアである。本明細書に記載される方法で用いられる油産生バクテリアの種には、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ及びＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．のような、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属の種が含まれる。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓのような油産生バクテリアを育てる方法は、当該技術分野において公知である（Ｗａｌｔｅｒｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４６：１１４３−１１４９を参照）。高油含有量を達成するためのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓを育てる例示的な方法を、以下の例に提供する。
【０１３０】
２．バイオリアクター
微生物は、遺伝子操作を行うこと、及び微生物油（例えば、脂質、脂肪酸、アルデヒド、アルコール、及びアルカンのような炭化水素）を生成することを目的として培養される。前者の種類の培養は、小スケールで、最初は少なくとも原材料微生物が成長可能な条件下で実施される。炭化水素を生成させるための培養は、通常は、バイオリアクターで大規模に行われる（例えば、１０，０００Ｌ、４０，０００Ｌ、１００，０００Ｌ又はそれより大きなバイオリアクター）。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種を含む微細藻類、並びに本明細書に記載される他の油産生微生物は、典型的には、バイオリアクター内の液体培地にて、本明細書に記載される方法で培養する。典型的には、バイオリアクターには多量の光を入れず、又はいかなる量の光も入れない。ある実施形態では、微細藻類を含めた、油産生細菌の１つ又は複数の培養工程の全体が、実質的に光が存在しない状態で行われる。
【０１３１】
バイオリアクター又は発酵槽を用い、生理学的周期の種々の段階を経て、微細藻類細胞を培養する。バイオリアクターは、従属栄養を成長及び増殖させる方法で用いると、多くの利点を与える。本明細書に記載の微細藻類及び他の油産生細菌を、典型的には、液体中で、一例として懸濁培養物中で、大量に発酵させる。鋼鉄製発酵槽のようなバイオリアクターは、非常に大きな容積の培養物を収容する（種々の本発明の実施形態では、４０，０００リットル以上の容量を有するバイオリアクターを用いる）。また、バイオリアクターによって、典型的には、温度、ｐＨ、酸素圧、二酸化炭素濃度のような培養条件を制御することができる。例えば、バイオリアクターは、典型的には、例えば、酸素又は窒素のような気体成分を液体培養物にバブリングすることが可能な配管に接続したポートを用いて構築することができる。また、培地のｐＨ、微量元素が何であるか及びその濃度、他の培地構成要素のような他の培養パラメーターは、バイオリアクターを用いて簡単に操作することができる。
【０１３２】
バイオリアクターは、微細藻類が繁殖され、数が増える間、培地がバイオリアクターを流れるような構成であってもよい。ある実施形態では、例えば、播種した後であるが、細胞が所望の密度になる前に、培地をバイオリアクターに注入してもよい。別の状況では、培養開始時にバイオリアクターを培地で満たし、培養物を播種した後は、培地を注入しない。言い換えると、微細藻類の（又は他の細菌の）バイオマスを、微細藻類が繁殖され、数が増える間、水性媒体中で培養する。しかし、水性培地の量は、この期間全体でバイオリアクターを流れていない。従って、ある実施形態では、水性培地は、播種した後に、バイオリアクターを流れない。
【０１３３】
スピニングブレード、インペラー、揺動機構、撹拌棒、加圧気体を注入する手段のようなデバイスを備えるバイオリアクターを用い、微細藻類の培養物を混合することができる。混合は、連続的であってもよく、断続的であってもよい。例えば、ある実施形態では、微細藻類が望ましい数に増えるまで微細藻類を繁殖させるために、気体及び培地を入れるのに乱流を用いる形態は維持されない。
【０１３４】
気体、固体、半固体、液体を、微細藻類を含むバイオリアクターチャンバーに入れるため、又は抽出するために、バイオリアクターポートを用いてもよい。多くのバイオリアクターは、２個以上のポートを備えているが（例えば、１つは培地を入れるため、他方はサンプリングのため）、１種類の基質だけを１個のポートから入れたり、出したりする必要はない。例えば、バイオリアクターに培地を流し、その後で、サンプリングしたり、ガスを入れたり、ガスを出したり、又は他の目的のために１個のポートを使用してもよい。好ましくは、培養物の純培養性を損なうことなく、サンプリングポートを繰り返し用いることができる。サンプリングポートは、サンプルの流れを止めるか、開始させるか、又は連続的なサンプリング手段を与えるようなバルブ又は他のデバイスを備えるような構成であってもよい。バイオリアクターは、典型的には、培養物を播種することができるような少なくとも１個のポートを備えており、このようなポートを、培地又は気体を入れるような他の目的で用いることもできる。
【０１３５】
バイオリアクターポートによって、微細藻類の培養物の気体内容物を操作することができる。説明のために、バイオリアクターの容積の一部分は、液体ではなく気体であってもよく、バイオリアクターの気体注入口から、ポンプによって気体をバイオリアクターに入れることができる。ポンプによってバイオリアクターへと有益に入れることが可能な気体としては、空気、空気／ＣＯ２混合物、アルゴンのような希ガス、他の気体が挙げられる。バイオリアクターは、典型的には、バイオリアクターにガスを入れる速度をユーザーが制御することができるように取り付けられている。上述のように、バイオリアクターへの気体の流れを増やすことによって、培養物の混合性を高めることができる。
【０１３６】
気体の流れを増やすことは、培地の濁度にも影響を及ぼす。乱流は、バイオリアクターに入った気体が培地表面でバブリングするように、水性培地の液量より低いところに気体注入ポートを配置することによって起こすことができる。１種類以上の気体がポートを出て行き、気体が外に逃げ、それにより、バイオリアクター中に圧力が蓄積されるのを防ぐ。好ましくは、気体流出ポートは、バイオリアクターに微生物が入り込んで汚染されることを防ぐような「一方向」バルブにつながっている。
【０１３７】
３．培地
微細藻類及び他の細菌の培地は、典型的には、固定窒素源、固定炭素源、微量元素、場合により、ｐＨを維持するためのバッファー、ホスフェート（典型的には、リン酸塩として与えられる）のような成分を含有する。他の成分は、特に、海水微細藻類の場合には、塩化ナトリウムのような塩を含んでいてもよい。窒素源としては、有機窒素源及び無機窒素源が挙げられ、例えば、限定されないが、分子状窒素、硝酸エステル、硝酸塩、アンモニア（純水なもの、又は塩形態、例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４及びＮＨ４ＯＨ）、タンパク質、大豆ミール、コーンスティープリカー、酵母抽出物が挙げられる。微量元素の例としては、例えば、それぞれＺｎＣｌ２、Ｈ３ＢＯ３、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏのような形態の亜鉛、ホウ素、コバルト、銅、マンガン、モリブデンが挙げられる。
【０１３８】
本発明の方法で有用な微生物は、世界中の種々の場所及び環境で発見されている。他の種からの単離、及び得られる進化多様性の結果として、最適な成長、及び脂質及び／又は炭化水素構成要素の最適な発生のための特定の成長培地は、予測することが困難な場合がある。ある場合では、特定の微生物株は、ある種の阻害成分が存在するか、又は、特定の微生物株が必要とするある種の必須栄養分が必要量存在しないために、特定の成長培地上で成長することができない場合がある。
【０１３９】
固体及び液体の成長培地は、一般的に、さまざまな供給源から入手可能であり、さまざまな微生物株に適した特定の培地を調製する方法の説明は、例えば、オンラインでは、藻類の培養物を収集するためのＡｕｓｔｉｎ、１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ａ６７００、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ、７８７１２−０１８３のテキサス大学によって運営されているサイトｗｗｗ．ｕｔｅｘ．ｏｒｇ／で見つけることができる（ＵＴＥＸ）。例えば、種々の淡水培地及び塩水培地としては、ＰＣＴ公開番号第２００８／１５１１４９号に記載されているものが挙げられ、この文献は、参照により組み込まれる。
【０１４０】
特定の例では、プロテオース培地は、純培養の培地に適しており、培地１リットル（ｐＨ約６．８）は、プロテオースペプトン１ｇを、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  １リットルに加えることによって調製することができる。Ｂｒｉｓｔｏｌ  ｍｅｄｉｕｍは、水溶液中に、２．９４ｍＭのＮａＮＯ３、０．１７ｍＭのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．３ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４３ｍＭ、１．２９ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．４３ｍＭのＮａＣｌを含む。１．５％寒天培地の場合、寒天１５ｇを上述の溶液１リットルに加えればよい。この溶液に蓋をし、オートクレーブにかけ、次いで、使用するまで冷蔵温度で保存する。別の例は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ単離培地（ＰＩＭ）であり、１０ｇ／Ｌのフタル酸水素カリウム（ＫＨＰ）、０．９ｇ／Ｌの水酸化ナトリウム、０．１ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、０．２ｇ／Ｌのリン酸水素カリウム、０．３ｇ／Ｌの塩化アンモニウム、１０ｇ／Ｌのグルコース、０．００１ｇ／Ｌの塩酸チアミン、２０ｇ／Ｌの寒天、０．２５ｇ／Ｌの５−フルオロシトシンを含み、ｐＨ範囲が５．０〜５．２である（Ｐｏｒｅ、１９７３、Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２６：６４８−６４９を参照）。本明細書に記載の方法と共に用いるのに適した他の培地は、上に特定したＵＲＬを閲覧することによって、又はＳＡＧ、ＣＣＡＰ又はＣＣＡＬＡのような、微生物の培地を保有している他の機関に助言を求めることによって、簡単に特定することができる。ＳＡＧは、ゲッティンゲン大学（ドイツ、ゲッティンゲン）のＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅを指し、ＣＣＡＰは、Ｓｃｏｔｔｉｓｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（英国、スコットランド）によって管理されている藻及び原生動物の培養株保存機関を指し、ＣＣＡＬＡは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ（トシェボニュ、チェコ共和国）の藻研究所の培養株保存機関を指す。さらに、米国特許第５，９００，３７０号は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種の従属栄養性発酵に適した培地の処方及び条件について記載している。
【０１４１】
費用効率的な生成について、固定炭素源の費用は、油生成を経済的なものにするには十分低くなければならないため、固定炭素源の選択が重要である。適切な炭素源は、例えば、アセテート、フロリドシド、フルクトース、ガラクトース、グルクロン酸、グルコース、グリセロール、ラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ラムノース、ラフィノース、スタキオース、ショ糖、及び／又はキシロースを含む。本明細書に記載される方法で有用な適切な原材料としては、例えば、黒液、コーンスターチ、解重合されたセルロース系材料、乳清、転化糖（グルコース／フルクトース）、糖液、ジャガイモ、モロコシ、ショ糖、テンサイ、サトウキビ、濃いサトウキビ汁、イネ、及び小麦が挙げられる。また、炭素源は、混合物として、例えば、ショ糖と解重合されたテンサイパルプの混合物として与えられてもよい。
【０１４２】
１つ以上の炭素源は、少なくとも約５０μＭ、少なくとも約１００μＭ、少なくとも約５００μＭ、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約５０ｍＭ、及び少なくとも約５００ｍＭの濃度の１つ以上の外部から与えられる固定炭素源で供給することができる。発酵原材料として高濃縮の炭素源が好ましく、及び種々の実施形態では、炭素源は、その最大溶解度に近い濃度（すなわち、９０％の溶解度を超える濃度、例えば９５％以上の、すなわち９９％溶解度の濃度）で原材料中に与えられる。
【０１４３】
例えば、ある実施形態では、細胞が成長して微生物油（脂質）を蓄積する間ずっと、高濃縮の固定炭素源が細胞に供給される流加回分式で育てる際、原材料中少なくとも３００ｇ／Ｌ、少なくとも４００ｇ／Ｌ、少なくとも５００ｇ／Ｌ、又は少なくとも６００ｇ／Ｌ又はそれ以上のグルコース濃度が用いられる。他の実施形態では、流加回分式で育てる際、原材料中少なくとも５００ｇ／Ｌ、少なくとも６００ｇ／Ｌ、少なくとも７００ｇ／Ｌ、少なくとも８００ｇ／Ｌ又はそれ以上のショ糖濃度が用いられる。高濃縮のショ糖炭素源の非限定的な例としては、濃いサトウキビ汁、サトウキビ汁、テンサイ汁及び糖液が挙げられる。本明細書に記載される方法の目的のための特に興味深い炭素源としては、セルロース（解重合形態）、グリセロール、ショ糖、及びモロコシが挙げられ、その各々を以下でより詳細に考察する。
【０１４４】
本明細書に記載の方法によれば、原材料として解重合されたセルロース系バイオマスを用い、微生物を培養してもよい。セルロース系バイオマス（例えば、トウモロコシ茎葉のような茎葉）は安価であり、入手が容易であるが、この物質を酵母のための原材料として使用する試みは長年失敗している。特定的には、このような原材料は、酵母の成長を阻害することがわかっており、酵母は、セルロース系材料から生成した五炭糖（例えば、ヘミセルロースから生成したキシロース）を用いることができない。対照的に、微細藻類は、処理したセルロース系材料を用いて成長することができる。セルロース系材料は、一般的に、約４０〜６０％のセルロースと；約２０〜４０％のヘミセルロースと；１０〜３０％のリグニンとを含む。
【０１４５】
適切なセルロース系材料としては、草及び木のエネルギー作物、及び農業用作物から得られた残渣、すなわち、主要な食品又は繊維製品の分野から除去されなかった植物の一部、主に茎及び葉が挙げられる。例としては、農業廃棄物、例えば、サトウキビの絞りかす、モミ殻、トウモロコシ繊維（茎、葉、皮及び穂軸を含む）、大豆ミール、麦わら、稲わら、テンサイパルプ、シトラスパルプ、柑橘類の皮；森林の廃棄物、例えば、硬材及び軟材の間伐、伐採作業から得られる硬材及び軟材の残渣；木材廃棄物、例えば、製材工場の廃棄物（木片、おがくず）、パルプ工場の廃棄物；都市廃棄物、例えば、都市固形廃棄物の紙片、都会の廃材、都市の伐採した草のような、都市の緑廃棄物；木材製造の廃棄物が挙げられる。さらなるセルロース含有材料としては、スイッチグラス、ハイブリッドポプラ材、ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ、テンサイ繊維、ソルガム繊維のような専用のセルロース含有作物が挙げられる。このような材料から生成する五炭糖としては、キシロースが挙げられる。
【０１４６】
細菌が上述の材料を含む糖類を利用することができる効率を高めるために、セルロース系材料を処理する。本明細書に記載される方法は、材料が微生物（例えば、微細藻類及び油産生酵母）の従属栄養性培養物で用いるのに適するように酸爆発させた後、セルロース系材料を処理するための新規方法を利用して実施することができる。上述のように、リグノセルロース系バイオマスは、セルロース、β１，４結合したグルコース（六炭糖）の結晶性ポリマー、ヘミセルロース、主にキシロース（五炭糖）で構成され、少量のマンノース、ガラクトース、アラビノース、リグニンで構成されている、ゆるく会合したポリマー、シナピルアルコール及びその誘導体で構成される複雑な芳香族ポリマー、α１，４結合したポリガラクツロン酸の直鎖であるペクチンのような、種々の画分で構成されている。セルロース及びヘミセルロースがポリマー構造であるため、これらの中に含まれる糖類（例えば、単糖類のグルコース及びキシロース）は、多くの細菌によって有効に使用する（代謝する）ことができるような形態ではない。このような細菌の場合、セルロース系バイオマスをさらに処理し、このポリマーを構成している単糖類を作成することは、セルロース系材料を原材料（炭素源）として有効に利用するのに非常に役立つ場合がある。
【０１４７】
セルロース又はセルロース系バイオマスに、「爆発」と呼ばれるプロセスを行い、このプロセスで、バイオマスは、高温高圧で、希硫酸（又は他の酸）で処理される。このプロセスは、セルロース系及びヘミセルロース系の画分をグルコースモノマー及びキシロースモノマーにする酵素加水分解を効率よく行うことができるようにバイオマスを調節する。得られた単糖類は、セルロース系糖と呼ばれる。その後に、セルロース系糖が微生物に利用され、種々の代謝物（例えば、脂質）を産生する。酸爆発工程によって、ヘミセルロース画分が、構成成分である単糖類へと部分的に加水分解する。これらの糖類を、さらなる処理によって、バイオマスから完全に遊離させることができる。ある実施形態では、さらなる処理は、爆発した材料を熱水で洗浄することを含む熱水処理であり、これによって、塩のような混入物質が除去される。この工程は、セルロース系エタノール発酵では、このようなプロセスで用いられる糖の濃度はもっと薄いため、必要ではない。他の実施形態では、さらなる処理は、さらなる酸処理である。さらに他の実施形態では、さらなる処理は、爆発した材料の酵素加水分解である。また、これらの処理を任意の組み合わせで用いてもよい。この種の処理は、遊離する糖の種類（例えば、五炭糖対六炭糖）、このプロセス中で糖類が遊離する段階に影響を及ぼす場合がある。その結果、五炭糖又は六炭糖のどちらかが主成分の異なる糖の流れを作成することができる。これらの五炭糖又は六炭糖を豊富に含む流れは、異なる炭素利用能を有する特定の微生物用に向けることができる。
【０１４８】
本明細書に記載の方法は、典型的には、エタノール発酵で達成されるよりも高い細胞密度になるまで発酵することを含む。従属栄養脂質油を生成するための培養物の密度が高いため、固定炭素源（例えば、セルロース系から誘導される糖の流れ）は、好ましくは、濃縮された形態である。解重合されたセルロース系材料のグルコース濃度は、好ましくは、育てる工程の前に、少なくとも３００ｇ／Ｌ、少なくとも４００ｇ／Ｌ、少なくとも５００ｇ／Ｌ、又は少なくとも６００ｇ／Ｌであり、場合により、細胞が成長し、脂質を蓄積する間ずっと、上述の物質を細胞に供給するような流加回分式で育てる。セルロース系糖の流れは、セルロース系エタノールの生成においては、この濃度範囲又はこの濃度範囲付近で用いられない。従って、リグノセルロース系の油を生成している間、非常に高密度の細胞を生成し、維持するために、炭素原材料を、非常に濃縮された形態で従属栄養培養物に運ばなければならない。しかし、油産生微生物の基質ではなく、油産生微生物によって代謝されないような供給物流中の任意の成分は、バイオリアクター中に蓄積し、その成分が、毒性であるか、又は望ましい最終産物を生成するのを阻害する場合には、問題となり得るであろう。リグニン及びリグニンから誘導される副産物、フルフラール類及びヒドロキシメチルフルフラール類のような炭水化物から誘導される副産物、セルロース系材料の生成から誘導される塩（爆発プロセス及びその次の中和プロセスの両方で）、さらに、代謝されていないペントース／ヘキソース糖ですら、エタノール発酵では問題となり得る場合があり、これらの影響は、初期原材料中のこれらの物質の濃度が高いプロセスでは、顕著に大きくなる。本発明の大量生成する用途に用いることが可能な六炭糖について、セルロース系材料から、３００ｇ／Ｌ、４００ｇ／Ｌ、５００ｇ／Ｌ、又はそれ以上の糖濃度を達成するために、これらの毒性のある物質の濃度を、典型的には、セルロース系バイオマスのエタノール発酵中に存在する濃度の２０倍高くすることができる。
【０１４９】
セルロース系材料の爆発プロセスによる処理は、かなりの量の硫酸、熱、圧力を利用するため、炭水化物の副産物、つまり、フルフラール類及びヒドロキシメチルフルフラール類が遊離する。フルフラール類及びヒドロキシメチルフルフラール類は、ヘミセルロースの加水分解中に、キシロースを水和してフルフラール及び水にすることによって生成する。本発明のある実施形態では、これらの副産物（例えば、フルフラール類及びヒドロキシメチルフルフラール類）は、バイオリアクターに入れる前に、糖化されたリグノセルロース系材料から除去される。本発明の特定の実施形態では、炭水化物の副産物を除去するプロセスは、爆発したセルロース系材料の熱水処理である。それに加え、特定の実施形態において、本発明は、リグノセルロース系の油を生成するのに、フルフラール類又はヒドロキシメチルフルフラール類のような化合物に耐え得る株を用いる方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、発酵培地中のフルフラール類に耐え得るだけでなく、発酵中に、実際には、これらの副産物を代謝することができる微生物の利用方法も提供する。
【０１５０】
また、この爆発プロセスは、顕著な量の塩も生じる。例えば、爆発の典型的な条件によって、爆発したセルロース系バイオマスを、水：固形分（乾燥重量）を１０：１の比率で再び懸濁させた場合、５ｍＳ／ｃｍを超える導電率が生じ得る。本発明の特定の実施形態では、爆発したバイオマスを希釈したものに対し、酵素による糖化を行い、得られた上澄みを、バイオリアクター中で使用するために最大２５倍まで濃縮する。濃縮した糖の流れ中の塩濃度（導電率で測定した場合）は、許容できないほど高い場合がある（最大１．５Ｍ  Ｎａ＋に相当）。同様に、その後の酵素による糖化プロセスのために、爆発した物質を中和すると、さらなる塩が生成する。本明細書に記載の方法により、上のようにして得られる濃縮したセルロース系糖の流れを、脂質を生成するための従属栄養プロセスで使用することができるように、これらの塩を除去することができる。ある実施形態では、これらの塩を除去する方法は、限定されないが、ＤＯＷＥＸ  Ｍａｒａｔｈｏｎ  ＭＲ３のような樹脂を用いた脱イオン化である。特定の実施形態では、樹脂を用いた脱イオン化工程は、糖の濃縮前に行うか、又は、糖化の前のバイオマスのｐＨ調節及び熱水処理の前に行うか、又はこれらの任意の組み合わせであってもよく、他の実施形態では、この工程は、これらの１つ以上のプロセスの後に行う。他の実施形態では、爆発プロセス自体を、塩が許容されない高濃度で生成するのを避けるように変更する。例えば、セルロース系バイオマスを硫酸（又は他の酸）で爆発させるのに代わる代替法は、セルロース系バイオマスが酵素加水分解（糖化）を受けやすくなるような機械的なパルプ化である。さらに他の実施形態では、高濃度の塩に耐性の天然微生物株、又は高濃度の塩に耐性を有するように遺伝子操作された株を用いる。
【０１５１】
油産生細菌を用いて従属栄養性の微生物油の生成で使用するための、爆発したセルロース系バイオマスを調製するプロセスに好ましい実施形態を以下のように行う。第１の工程では、爆発したセルロース系バイオマスを再懸濁させたもののｐＨを、５．０〜５．３の範囲に調節した後、セルロース系バイオマスを３回洗浄することを含む。この洗浄工程は、脱塩性及びイオン交換性の樹脂、逆浸透膜、熱水処理（上述のようなもの）の使用、又は、脱イオン水に再懸濁させ、遠心分離するのを単に繰り返す、といった種々の手段によって達成することができる。この洗浄工程によって、セルロース系の流れの導電率が１００〜３００μＳ／ｃｍになり、かなりの量のフルフラール類及びヒドロキシメチルフルフラール類が除去される。この洗浄工程からデカンテーションを行い、ヘミセルロース画分から遊離した五炭糖を濃縮するために残しておいてもよい。第２の工程では、洗浄したセルロース系バイオマスを酵素によって糖化することを含む。一実施形態では、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を用いる。第３の工程では、糖化されたバイオマスを遠心分離するか、又はデカンテーションし、次いですすぐことによる、糖の回収を含む。得られたバイオマス（固形分）は、エネルギー密度が高く、リグニンを豊富に含む成分であり、これを燃料として使用してもよく、廃棄するために送ってもよい。遠心分離／デカンテーション及びすすぎを行うプロセス中で回収された糖の流れを集める。第４の工程では、透過物を回収しつつ、混入している固形物を除去する精密濾過を含む。第５の工程では、濃縮工程を含み、この工程は、減圧エバポレーターを用いることによって達成されてもよい。この工程は、場合により、Ｐ’２０００（Ｓｉｇｍａ／Ｆｌｕｋａ）のような消泡剤の添加を含んでいてもよく、この作業は、得られる糖原料のタンパク質含有量によっては、時に必要である。
【０１５２】
本発明の方法の別の実施形態では、炭素源は、バイオディーゼルのトランスエステル化から得られる、酸性化されたグリセロール及び酸性化されていないグリセロールを含むグリセロールである。一実施形態では、炭素源は、グリセロールと、少なくとも１つの他の炭素源とを含んでいる。ある場合では、グリセロール及び少なくとも１つの他の固定炭素源の全てが、発酵開始時に微生物に与えられる。ある場合では、グリセロール及び少なくとも１つの他の固定炭素源が、微生物に対して所定の比率で同時に与えられる。ある場合では、グリセロール及び少なくとも１つの他の固定炭素源が、発酵している間、所定の速度で細菌に供給される。
【０１５３】
ある種の微細藻類は、グルコースが存在する状態よりも、グリセロールが存在する状態ですばやく細胞分裂を受ける（ＰＣＴ公開番号第２００８／１５１１４９号）。これらの状況では、細胞に対して、最初に細胞の密度をすばやく上げるためグリセロールを供給し、次いで微生物油（脂質）を蓄積させるためグルコースを供給するような二段階成長プロセスによって、油が産生する効率を高めることができる。トランスエステル化プロセスのグリセロール副産物を使用すると、微生物油の生成プロセスに戻す場合に経済的に顕著な利点がもたらされる。グリセロール及びグルコースの混合物を固定炭素源として用いる方法のような他の供給方法も同様に提供される。また、このような混合物を供給することによって、同じ経済的な利点が得られる。それに加え、特定の実施形態では、本発明は、ショ糖のような代わりとなる糖をグリセロールとの種々の組み合わせで微細藻類に供給する方法を提供する。
【０１５４】
本発明の方法の別の実施形態では、炭素源は転化糖である。転化糖は、ショ糖をその単糖成分フルクトースとグルコースとに分割することにより生成される。転化糖の生成は、当該技術分野において公知のいくつかの方法により達成することができる。そのような方法の一つは、ショ糖の水溶液を加熱することである。多くの場合に、ショ糖の転化糖への変換を加速させる触媒が用いられる。この触媒は生物学的な触媒であり；例えば、インベルターゼ及びスクラーゼのような酵素をショ糖に添加して、転化糖を生成する加水分解反応を加速させることができる。酸は非生物学的触媒の例であり、熱と組み合わせると加水分解反応を加速させ得る。転化糖は、作られた後、ショ糖と比べて結晶化しにくく、従って、保存上の利点、及び微細藻類を含む微生物を従属栄養培養する場合に濃縮炭素源が必要とされる流加回分発酵に対する利点を与える。一実施形態では、炭素源は、好ましくは濃縮された形態の（上述のように、用いられる条件下でその最大溶解度の少なくとも９０％）、すなわち、少なくとも８００ｇ／リットル、少なくとも９００ｇ／リットル、少なくとも１０００ｇ／リットル又は少なくとも１１００ｇ／リットルの、転化糖である。好ましくは濃縮された形態である転化糖は、細胞が成長して脂質を蓄積する間ずっと細胞に供給される。
【０１５５】
本発明の方法の別の実施形態では、炭素源は、ショ糖であり、ショ糖を含む複雑な原材料、例えば、サトウキビの処理から得られる濃いサトウキビ汁を含む。上述のように、従属栄養で油を生成するための培養物の密度は高いため、固定炭素源（例えば、ショ糖、グルコース等）は、濃縮された形態の、すなわち育てる工程の前に少なくとも５００ｇ／リットル、少なくとも６００ｇ／リットル、少なくとも７００ｇ／リットル又は少なくとも８００ｇ／リットルである固定炭素源であり、育てる工程は、場合により、細胞が成長して脂質を蓄積する間ずっと材料が細胞に供給される流加回分式で育てる。ある場合では、炭素源は、典型的には濃縮された形態の、すなわち、場合により流加回分培養である育てる工程の前に少なくとも固形分６０％又は約７７０ｇ／リットル糖、少なくとも固形分７０％又は約９２５ｇ／リットル糖、又は少なくとも固形分８０％又は約１１２５ｇ／リットル糖である、濃いサトウキビ汁の形態のショ糖である。濃縮された濃いサトウキビ汁は、細胞が成長して脂質を蓄積する間ずっと細胞に供給される。
【０１５６】
一実施形態では、培地は、少なくとも１つのショ糖利用酵素をさらに含む。ある場合では、培地は、ショ糖インベルターゼを含む。一実施形態では、ショ糖インベルターゼ酵素は、微生物の集合が発現する外来のショ糖インベルターゼ遺伝子によってコードされる分泌可能なショ糖インベルターゼ酵素である。従って、いくつかの状況では、以下の第ＩＶ章にさらに詳細に記載されるように、本明細書に記載の方法で用いられる細菌は、ショ糖トランスポーター、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、又はフルクトキナーゼのようなショ糖利用酵素を発現するように遺伝子操作されている。
【０１５７】
ショ糖を含有する複雑な原材料としては、サトウキビの処理から得られる廃棄糖液が挙げられ、サトウキビ処理の価値の低い上述の廃棄生成物によって、炭化水素及び他の油の生成において、顕著に費用を節約することができる。本明細書に記載の方法で有用な、ショ糖を含有する別の複雑な原材料は、ソルガムであり、ソルガムシロップ及び純粋なソルガムを含む。ソルガムシロップは、甘いソルガムの茎の汁から生成する。ソルガムシロップの糖プロフィールは、主に、グルコース（デキストロース）、フルクトース、ショ糖からなる。
【０１５８】
（４．油の生成）
本明細書に記載される方法に従って油（脂質）を生成するには、例えば、光が培養物にあたらないような、きわめて大きな（４０，０００リットル以上の）発酵槽を使用する場合のように、細胞を暗い場所で培養することが好ましい。例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種及び他の微細藻類種は、固定炭素源を含有する培地内で、光が存在しない状態で、油を生成するように成長し、増殖することができる；このような成長は、従属栄養性の成長として知られている。
【０１５９】
一例として、脂質を生成する微細藻類細胞の播種物質が培地に入れられ、細胞が増殖し始めるまでに遅延期間（遅延期）が存在する。遅延期間の後、増殖速度は徐々に上がっていき、対数期すなわち指数増殖期に入る。次いで、指数増殖期の後、窒素のような栄養物が少なくなったり、毒性基質が増えたり、菌体数感知機構のために増殖が遅くなる。このように増殖が遅くなった後、増殖が止まり、細胞は、細胞に与えられている特定の環境に依存して、静止期又は安定成長状態に入る。脂質を豊富に含むバイオマスを得るために、培養物は、典型的には、指数増殖期が終わった後に良好に収穫され、指数増殖期は、窒素又は別の鍵となる栄養物（炭素以外のもの）を枯渇させることによって初期に終わらせてもよく、細胞は、過剰に存在する炭素源を脂質に変換する。培養条件のパラメータは、油の総生成量、生成される油中の脂肪酸の組み合わせ、及び／又は特定の脂肪酸及び対応する１つ又は複数の脂質の生成を最適にするように操作することができる。
【０１６０】
好ましくは、本明細書に記載されている条件及び当該技術分野で既知の他の条件を用いて成長させた微生物は、脂質を少なくとも約２０重量％、好ましくは、少なくとも約４０重量％、より好ましくは、少なくとも約５０重量％、最も好ましくは、少なくとも約６０重量％含む。プロセスの条件は、特定の用途に適した脂質の収量を高めるように、及び／又は、生成費用を減らすように調節することができる。例えば、特定の実施形態では、微細藻類又は他の油産生細菌を、グルコースのような固定炭素エネルギーを過剰量与えつつ、制限濃度の１つ以上の栄養物、例えば、窒素、リン又は硫黄が存在する状態で培養する。窒素による制限は、窒素が過剰に与えられている培地における微生物脂質収量よりも、微生物脂質収量を増やす傾向がある。特定の実施形態では、脂質収量の増加は、少なくとも約１０％、約５０％、約１００％、約２００％、又は約５００％である。全培養期間の一部又は全期間にわたって、制限量の栄養物が存在する状態で細菌を培養してもよい。特定の実施形態では、栄養物の濃度は、全培養期間の間に、制限濃度及び非制限濃度を少なくとも２回繰り返す。過剰量の炭素を与えつつ、窒素量を制限するか、又はまったく窒素を含まない状態で、時間を延長させて培養を続けることによって、細胞の脂質含有量を増やすことができる。
【０１６１】
別の実施形態では、脂質経路に関連する酵素（例えば、脂肪酸合成酵素）のための１つ以上の補因子が存在する状態で、脂質を産生する細菌（例えば、微細藻類）を培養することによって、脂質収量を増やす。一般的に、補因子の濃度は、補因子が存在しない状態での微生物油収量よりも、微生物油（例えば、油脂又は脂肪酸）の量を増やすのに十分な濃度である。特定の実施形態では、補因子をコードする外来遺伝子を含む細菌（例えば、微細藻類）を培養物に含むことによって、培養物に補因子を与える。又は、補因子の合成に関与するタンパク質をコードする外来遺伝子を含有する細菌（例えば、微細藻類）を含むことによって、培養物に補因子を与えてもよい。特定の実施形態では、適切な補因子は、ビオチン及びパントテン酸化合物のような、脂質経路に関連する酵素に必要なビタミンを含む。本明細書に記載の方法で使用するのに適した補因子をコードする遺伝子、又はこのような補因子の合成に関与する遺伝子は、十分に知られており、上述のような構築物及び技術を用い、細菌（例えば、微細藻類又は本明細書に記載の他の油産生細菌）に導入することができる。
【０１６２】
本明細書に記載されているバイオリアクター、培養条件、従属栄養性成長及び増殖方法の特定の例を任意の適切な様式で組み合わせ、微生物の成長効率、及び脂質及び／又はタンパク質の生成効率を高めることができる。
【０１６３】
乾燥重量で、高い割合の油／脂質が蓄積した微細藻類のバイオマスが作成されている（ＰＣＴ公開番号第２００８／１５１１４９号）。本明細書に記載されている培養方法で作成され、本明細書に記載の有用な微細藻類のバイオマスは、乾燥重量で、少なくとも１０％の微細藻類の油を含む。ある実施形態では、微細藻類のバイオマスは、乾燥重量で、微細藻類の油を少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、又は少なくとも６０％含む。ある実施形態では、微細藻類のバイオマスは、乾燥重量で、微細藻類の油を１０〜９０％、２５〜７５％、４０〜７５％、又は５０〜７０％含む。
【０１６４】
本明細書に記載されているバイオマスの微細藻類の油、又は本明細書に記載の方法及び組成物で使用するために、バイオマスから抽出された微細藻類の油は、１つ以上の別個の脂肪酸エステル側鎖を有するグリセロ脂質を含む。グリセロ脂質は、１個、２個又は３個の脂肪酸分子でエステル化されたグリセロール分子から成り、脂肪酸分子は、長さはさまざまであってもよく、種々の飽和度を有していてもよい。脂肪酸分子（及びそれらを含む微細藻類の油）の長さ及び飽和度の特徴によって、以下の第Ｖ章にさらに詳細に記載されるように、培養条件又は脂質経路の操作によって、本明細書に記載の微細藻類の油中の脂肪酸分子の性質又は比率を改変するように操作することができる。従って、藻（又は他の微生物）の油の特定のブレンドは、２種類以上の微細藻類に由来するバイオマス又は藻の油を混合することによって、１種類の藻の中で調製されてもよく、又は、本明細書に記載の藻の油と、大豆、菜種、キャノーラ、パーム、パーム核、ココナツ、トウモロコシ、野菜くず、ナンキンハゼ、オリーブ、ヒマワリ、綿実、鶏脂、牛脂、豚脂、微細藻類、大型藻類、クフェア、亜麻、ピーナッツ、上質のホワイトグリース、ラード、カメリナ（Ｃａｍｅｌｌｉｎａ）・サティバ、カラシの種子、カシューナッツ、オーツ麦、ハウチワマメ、ケナフ、キンセンカ、麻、コーヒー、亜麻仁（亜麻）、ヘーゼルナッツ、ユーホルビア、カボチャの種、コリアンダー、ツバキ、ゴマ、ベニバナ、イネ、アブラギリ、ココア、コプラ、ケシ、トウゴマの実、ピーカン、ホホバ、ジャトロファ、マカダミア、ブラジルナッツ、アボカド、石油、又は上述のいずれかの油の留分のような他の供給源に由来する油とをブレンドすることによって調製されてもよい。
【０１６５】
上述のとおり、油の組成、すなわち、グリセロ脂質の脂肪酸構成要素の性質及び比率も、少なくとも２種類の別個の微細藻類に由来するバイオマス又は油を混ぜあわせることによって操作することができる。ある実施形態では、少なくとも２種類の別個の微細藻類は、異なるグリセロ脂質プロフィールを有している。この別個の種類の微細藻類を、好ましくは、それぞれの油を生成するような従属栄養条件下で、本明細書に記載されるように一緒に培養してもよく、又は別個に培養してもよい。異なる種類の微細藻類は、細胞のグリセロ脂質の構成成分である別個の脂肪酸を異なる割合で含有していてもよい。
【０１６６】
一般的に、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ株は、主要な種としてＣ１６及びＣ１８脂肪酸を有する脂質プロフィールを有する。このようなより長い鎖長の脂肪酸、特に一価飽和Ｃ１６及びＣ１８脂肪酸（すなわち、Ｃ１６：１及びＣ１８：１）は、一般的に、誘電性流体の生成に好ましい（例えば、米国特許第６，２７４，０６７号を参照）。例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ（ＵＴＥＸ  ３２７）、及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４４１）は、１２％〜３０％のＣ１６脂肪酸及び５０％〜５８％のＣ１８：１脂肪酸を含有する。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ（ＵＴＥＸ  ２５０）は、約７３％のＣ１８：１脂肪酸を含有し、及び他のＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ株は、限定されないが、ＵＴＥＸ  ２５、ＵＴＥＸ  ２４９、ＵＴＥＸ  ２５６、ＵＴＥＸ  ２６４、ＵＴＥＸ  ４１１、ＣＣＡＰ  ２１１／１７、ＣＣＡＰ  ２２１／８Ｄ及びＳＡＧ  ２２１  １０ｄを含め、７％〜１８％のＣ１６脂肪酸及び５５％〜７５％のＣ１８：１脂肪酸を含有し得る。種々の実施形態では、本明細書に記載される生成物（誘電性流体など）に有用な微生物油（脂質）は、少なくとも約５０％のＣ１８：１、例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、及び少なくとも約９０％のＣ１８：１である。これらの又は他の実施形態では、微生物油（脂質）は、約１０％未満のＣ１８：２、例えば、約７．５％未満、約５％未満、約２．５％未満、及び約１％未満のＣ１８：２である。微生物油は、合計１００％又はそれ未満になるＣ１８：１及びＣ１８：２の割合の任意の組み合わせを有し得る。例えば微生物油は、少なくとも５０％のＣ１８：１及び１０％未満のＣ１８：２又は少なくとも８０％のＣ１８：１及び５％未満のＣ１８：２を有し得る。
【０１６７】
また、微細藻類（又は他の微生物）の油（脂質）は、微細藻類によって産生されるか、又は培地から微細藻類の油に組み込まれた他の構成要素を含んでもよい。これらの他の構成要素は、培養条件、種、バイオマスから油を回収するのに用いられる抽出方法及び油組成に影響を与え得る他の因子に基づいて、さまざまな量で存在してもよい。このような構成要素の非限定的な例としては、以下が挙げられる：カロチノイド、０．４μｇ／ｍｌ未満の存在量；リコピン、０．００１μｇ／ｍｌ未満の存在量；β−カロチン、０．０２μｇ／ｍｌ未満の存在量；クロロフィル、油１ｋｇあたり０．０２ｍｇ未満の存在量；γ−トコフェロール、油１００ｇあたり０．４０〜０．６０ｍｇの存在量；カンペステロール、油１００ｇあたり３〜９ｍｇの存在量；及びトコトリエノール、油１ｇあたり０．５ｍｇ未満の存在量。
【０１６８】
他の構成要素としては、限定されないが、リン脂質、トコフェロール、トコトリエノール、カロチノイド（例えば、α−カロチン、β−カロチン、リコピンなど）、キサントフィル（例えば、ルテイン、ゼアキサンチン、α−クリプトキサンチン、β−クリプトキサンチン）、及び種々の有機化合物又は無機化合物が挙げられる。ある場合では、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種から抽出した油は、０．００３〜０．０３９μｇのルテイン／油ｇ、０．００３μｇ未満のリコピン／油ｇ；及び０．００３μｇ未満のβ−カロチン／油ｇを含む。
【０１６９】
５．油産生酵母株及び培養条件
本発明は、油産生酵母バイオマスから油／脂質を生成する方法を提供する。本発明は、一部には、酵母バイオマスを高油含有量で調製することができ、且つ抽出した油を、誘電性流体及び他の潤滑剤を含めた、さまざまな有用な生成物に変換することができるという発見からもたらされた。飽和脂肪酸と中鎖乃至それより長鎖の脂肪酸（例えば、Ｃ１６及びＣ１８脂肪酸）との混合物を含み得る酵母油は、誘電性流体を含む化学品の調製に良好な出発物質を提供する。
【０１７０】
適した油及び／又は脂質を産生するさまざまな酵母種を、本明細書に記載される方法に従い使用することができるが、高濃度の適した油又は脂質を天然に産生する酵母が好ましい。
【０１７１】
特定の実施形態では、油産生酵母は、乾燥重量で少なくとも２０％以上のトリグリセリド油脂である細胞を含む。他の実施形態では、油産生酵母は、乾燥重量で少なくとも２５〜３５％以上のトリグリセリド油脂を含有する。一般的に、これらの実施形態では、油産生酵母に含まれる油が多いほど、バイオマスから抽出することのできる油は多くなり、従って、乾燥重量で少なくとも４０％、少なくとも５０％、又は少なくとも６０％以上のトリグリセリド油脂を含有するように培養することができる油産生酵母が、典型的には好ましい。誘電性流体のような化学品には、望ましくない鎖長、飽和レベルがあったり、又は望ましくない混入物質が伴ったりし得るため、それらにおける使用にあらゆる種類の脂質が望ましいわけではない。また、これらの考慮事項は、本明細書に記載される方法で用いられる油産生酵母（又は任意の他の細菌）の選択にも影響を及ぼす。
【０１７２】
本明細書に記載される方法で用いるのに適した油産生酵母種としては、限定されないが、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｐｉｃｏｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｅｒｒｉｃｏｌｕｓ、Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｖｅｒｎａｌｉｓ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｒａｂｉｄａｒｕｍ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｕｃｕｊｏｉｄａｒｕｍ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｈｉｓｔｅｒｉｄａｒｕｍ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｉｌｖｉｃｏｌａ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ、Ｈｙｐｈｏｐｉｃｈｉａ  ｂｕｒｔｏｎｉｉ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｐｏｆｅｒ、Ｌｙｐｏｍｙｃｅｓ  ｏｒｅｎｔａｌｉｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｔｅｔｒａｓｐｏｒｏｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ、Ｒｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｈａｅｒｏｃａｒｐｕｍ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｄｉｆｆｌｕｅｎｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ  ｖａｒ．ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｔｅｒｐｅｎｏｉｄａｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｏｒｕｂｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｋｉｉ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｂｅｈｒｅｎｄ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｌａｉｂａｃｈｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｌｏｕｂｉｅｒｉ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｌｏｕｂｉｅｒｉ  ｖａｒ．ｌｏｕｂｉｅｒｉ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｅｎｓｅ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｓｐ．、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ  Ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、及びＺｙｇｏａｓｃｕｓ  ｍｅｙｅｒａｅが挙げられる。
【０１７３】
本明細書に記載される方法で用いる油産生酵母の種は、ゲノムの特定の標的領域を、本明細書で同定される種の同じ領域と比較することによって同定することができる；好ましい種は、本明細書で同定される種と同一性又は少なくとも極めて高度な相同性を示し、且つ本明細書に具体的に記載される株と同程度の量の、及びそれと同様の種類の脂質を生成する種である。例えば、特定の油産生酵母の種又は株の同定は、例えば、Ｋｕｒｔｚｍａｎ  ａｎｄ  Ｒｏｂｎｅｔｔ，Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ  ７３（４）：３３１−３７１（１９９８），Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  ｏｆ  ａｓｃｏｍｙｃｅｔｏｕｓ  ｙｅａｓｔｓ  ｆｒｏｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌａｒｇｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ（２６Ｓ）ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ｐａｒｔｉａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓに記載される方法を用いて、プライマー及び適切なゲノム領域を使用する方法を用いたゲノムＤＮＡの増幅及び配列決定により達成することができる。十分に確立された系統発生解析方法、例えば、核１８Ｓ及び２６Ｓ並びにリボソームＲＮＡ遺伝子の内部転写スペーサー（ＩＴＳ）領域及び他の保存領域の増幅及び配列決定を用いて、当業者は、本明細書に開示される方法で用いるのに適した油産生酵母の種を同定することができる。
【０１７４】
従って、ゲノムＤＮＡ比較を用いて、本明細書に記載される方法で使用すべき油産生酵母の適切な種を同定することができる。保存されたゲノムＤＮＡの領域、例えば、限定されないが、真菌１８Ｓの３’領域と真菌２６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の５’領域との間の保存されたゲノム配列を、例えば、本明細書に記載される方法で使用する好ましい油産生酵母に分類学的に関連し得る酵母種から増幅させて、好ましい種の対応する領域を比較することができる。次に、本明細書に記載される方法で用いるための高度な類似性を示す種を選択する。実施例６は、油産生酵母株の４８株についての保存された真菌１８Ｓの３’領域及び真菌２６Ｓ  ｒＲＮＡの５’領域のゲノム配列決定について記載している。パーセントヌクレオチド又はアミノ酸同一性を決定する配列比較は、微細藻類／微生物について上記に開示されるものと同じ方法を用いて実施することができる。
【０１７５】
油産生酵母は、本明細書に記載される方法においては液体培地で培養され、バイオマスを増殖する。本明細書に記載される方法では、油産生酵母種は、固定炭素源及び／又は固定窒素源を含有する培地で、光がない状態で成長させる（従属栄養成長）。油産生酵母の従属栄養成長は、通常は好気性環境で起こる。例えば、制限窒素条件下で長時間、例えば１０〜１５日間又はそれ以上にわたり従属栄養成長させると、細胞中の軽い脂質／油の含有分が蓄積し得る。
【０１７６】
油産生酵母培地は、典型的には、固定炭素源（以下で考察する）、固定窒素源（タンパク質、大豆ミール、酵母エキス、コーンスティープリカー、アンモニア（純粋の、又は塩形態の）、ナイトレート、又は硝酸塩など）、微量元素、場合によりｐＨ維持のためのバッファー、及びホスフェート（亜リン酸源；他のリン酸塩を使用することができる）のような成分を含有する。
【０１７７】
特定の例において、油産生酵母株の培養に適した培地は、ＹＰＤ培地である。この培地は一者培養に適しており、１０ｇのバクト酵母、２０ｇのバクトペプトン及び４０ｇのグルコースを蒸留水に添加することにより、１Ｌ容量の培地（ｐＨ約６．８）を調製することができる。１．５％寒天培地について、１Ｌの溶液に１５ｇの寒天を添加することができる。この溶液は蓋をしてオートクレーブ処理され、その後、使用時まで冷蔵温度に保存される。乾燥重量の割合として高脂質値を生じるように油産生酵母株を成長及び増殖させる他の方法については、記載がなされている（例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００７）４１：３１２−３１７を参照（流加回分発酵を用いてＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓを６７．５％ｗ／ｗの脂質に培養することを示す））。油産生酵母中の高脂質／油含有量は、典型的には、窒素制限下で過剰の炭素源を供給しながら発酵時間を増やすことにより生じ得る。
【０１７８】
固体及び液体成長培地は、一般的にさまざまな供給源から利用可能であり、油産生酵母のさまざまな株に適した特定の培地の調製についての手引きは、例えば、オンラインでｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ／ｍｅｄｉｕｍ／ｐｄｆ／ＤＳＭＺ＿Ｍｅｄｉｕｍ１８６．ｐｄｆに見ることができる。
【０１７９】
本明細書に記載される方法で用いるのに適した他の培地は、上記に特定されるＵＲＬを参考にすることにより、又はＦｕｎｇａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ａｕｓｔｒｉａｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃ．ｂｏｋｕ．ａｃ．ａｔ／ａｃｂｒ．ｈｔｍｌ）；Ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｆｕｎｇｉ  ａｎｄ  Ｙｅａｓｔｓ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ｂｃｃｍ．ｂｅｌｓｐｏ．ｂｅ／ａｂｏｕｔ／ｉｈｅｍ．ｐｈｐ）；Ｃｚｅｃｈ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ｓｃｉ．ｍｕｎｉ．ｃｚ／ｃｃｍ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）；Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ（ｗｗｗ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｉｐ／ｅａｓｙｓｉｔｅ／ｇｏ／０３ｂ−００００１１−０８ｈ／）；Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／）；Ｍｙｃｈｏｔｅｃａ  Ｕｎｉｖｅｓｉｔａｔｉｓ  Ｔａｕｒｉｎｅｎｅｓｉｓ（ｗｅｂ０８６．ｕｎｉｔｏ．ｉｔ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｂｉｏｖｅｇ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｉ．ｐｌ／Ｓｈｏｗ？＿ｉｄ＝ｂ５２２）；理研バイオリソースセンター（Ｒｉｋｅｎ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）Ｊａｐａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ｗｗｗ．ｊｃｍ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ＪＣＭ／ａｎｎｏｕｎｃｅ．ｓｈｔｍｌ）；Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ｗｗｗ．ｎｃｙｃ．ｃｏ．ｕｋ／）；ＡＴＣＣ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）；Ｐｈａｆｆ  Ｙｅａｓｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｐｈａｆｆｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ．ｏｒｇ／）のような、油産生酵母の培養物を管理している他の組織を参考にすることにより、容易に同定することができる。
【０１８０】
本明細書に記載される方法における有用な油産生酵母は、世界中のさまざまな場所及び環境に見出される。他の種からのその分離及び得られる進化的分岐の結果として、任意の特定の細菌種から油及び／又は脂質及び／又はタンパク質を最適に成長及び産生させるための特定の成長培地は、予測することが困難又は不可能であり得るが、当業者は、本明細書の開示をふまえて、ルーチン試験により適切な培地を容易に見つけることができる。ある場合では、特定の微生物株は、何らかの阻害成分が存在したり、又はその特定の微生物株が要求する何らかの必須栄養要件が存在しなかったりするために、特定の成長培地で成長させることができないこともある。以下の例は、乾燥細胞重量の割合として高濃度の脂質を蓄積するようにさまざまな油産生酵母種を培養する例示的な方法を提供する。
【０１８１】
固定炭素源は培地の主要成分である。本明細書に記載される方法の目的に適した固定炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、ショ糖、ラクトース、ガラクトース、キシロース、マンノース、ラムノース、アラビノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グリセロール、グルクロン酸、ラフィノース、スタキオース、及び／又はアセテートが挙げられる。上記の第３節（培地）には、適した炭素源に関するより詳細な考察が含まれる。
【０１８２】
プロセスの条件は、細胞のうち脂質（油）である重量の割合を増加させるように調整することができる。例えば、特定の実施形態では、油産生酵母は、グルコースのような固定炭素源の過剰量を与えながら、制限濃度の１つ以上の栄養物、例えば、窒素、リン酸塩、及び特定の金属イオンの存在下で培養される。窒素制限は、窒素が過剰に与えられる培養物での微生物脂質収率と比べて、微生物脂質収率を増加させる傾向がある。特定の実施形態では、脂質収率は少なくとも約１０％、５０％、１００％、２００％、又は５００％増加する。細菌は、全培養期間の一部分にわたり、又は期間全体にわたり、制限された量の栄養物の存在下で培養されてもよい。ある実施形態では、栄養物濃度は、全培養期間の間に制限濃度と非制限濃度とが少なくとも２回繰り返される。
【０１８３】
安定成長状態では、細胞は油（脂質）を蓄積するが、細胞分裂は起こさない。本発明の一実施形態では、固定窒素源を除き、元の成長培地のあらゆる成分を細胞に与え続けることにより、成長状態が維持される。長期間細胞に供給することによるなど、固定窒素源を除く、細胞に本来与えられる全ての栄養物を供給することによって油産生酵母を育てると、乾燥細胞重量での脂質の割合が高くなる。
【０１８４】
他の実施形態では、固定窒素が少なくとも１週間又は２週間など長期間で全て消費された後に固定炭素源を細胞に供給することにより、高脂質バイオマスが生じる。ある実施形態では、細胞には、固定炭素源が存在し、且つ固定窒素源が存在しない状態で、１０日間、１５日間、又は２０日間、油を蓄積させる。本明細書に記載されるか、又は他の当該技術分野において公知の条件を用いた油産生酵母の成長は、乾燥重量で少なくとも約２０％の脂質を含むことができ、多くの場合に乾燥重量で３５％、４５％、５５％、６５％、及びさらには７５％以上の脂質を含むことができる。従って、細胞を成長状態に保つことにより、そこで細胞は炭素を消費して油を蓄積するが、細胞分裂は起こさず、微生物脂質生成における脂質としての乾燥細胞重量の割合が向上し得る。
【０１８５】
窒素が過剰な条件では、窒素が過剰には与えられない培養での微生物油収率と比べて、微生物のタンパク質収率が増加する傾向がある。油産生酵母に適した窒素供給源は、有機窒素供給源及び／又は無機窒素供給源に由来し得る。
【０１８６】
有機窒素供給源の非限定的な例は、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、及びコーンスティープ粉末である。好ましい無機窒素供給源の非限定的な例としては、例えば、及び限定なしに、（ＮＨ４）２ＳＯ４及びＮＨ４ＯＨが挙げられる。一実施形態では、本発明を実施するための培地は、無機窒素供給源のみを含有する。別の実施形態では、本発明を実施するための培地は、有機窒素供給源のみを含有する。さらに別の実施形態では、本発明を実施するための培地は、有機及び無機窒素供給源の混合物を含有する。
【０１８７】
油産生酵母の成長に用いられる培地配合の例には、以下が含まれる：７ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４；２ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４；１．５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１．５ｇ／Ｌ  酵母エキス；０．２ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；０．１ｇ／Ｌ  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ；０．００１ｇ／Ｌ  ビオチン及び０．００１ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＨＣＬでｐＨレベルを５．５に調整、及び１２ｇ／Ｌ  グルコース及び３０ｇ／Ｌ  ＮＨ４Ｃｌを窒素供給源として含む。油産生酵母の成長に用いられる別の培地には、以下が含まれる：２０ｇ／Ｌ  グルコース；０．５ｇ／Ｌ  酵母エキス；５ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４；及び１ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４；０．５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ。油産生酵母を発酵槽で成長させるための一つの培地配合は、以下からなる：３０ｇ／Ｌ  グルコース；２０ｇ／Ｌ  キシロース；２ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４；１ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４；及び０．５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ。
【０１８８】
本明細書に記載される方法では、バイオリアクター又は発酵槽を使用して、その生理学的周期のさまざまな期間を通じて油産生酵母細胞が培養される。例として、脂質を生成する油産生酵母細胞の播種物質が培地に導入される；細胞が増殖し始めるまでに遅延期間（遅延期）が存在する。遅延期間の後、増殖速度は徐々に上がっていき、対数期すなわち指数増殖期に入る。次いで、指数増殖期の後、窒素のような栄養物の減少、毒性基質の増加、及び菌体数感知機構のために増殖が遅くなる。このように増殖が遅くなった後、増殖が止まり、細胞は、細胞に与えられている特定の環境に依存して、静止期又は安定成長状態に入る。脂質を豊富に含むバイオマスを得るために、培養物は、典型的には指数増殖期が終わった後に良好に回収され、指数増殖期は、窒素又は別の鍵となる栄養物（炭素以外のもの）を枯渇させて、強制的に細胞が過剰に存在する炭素源を脂質に変換するようにすることで、初期に終わらせてもよい。培養条件のパラメータは、油の総生成量、生成する脂質種の組み合わせ、及び／又は特定の油の生成を最適にするように操作することができる。
【０１８９】
高脂質油産生酵母を生成するため、細胞を好ましくは液体中で、例として浮遊培養で、大量に発酵させる。鋼鉄製発酵槽のようなバイオリアクター（本発明の種々の実施形態では、５０００リットル、１０，０００リットル、８０，０００リットル、及びそれ以上の容積が用いられる）は、非常に大きい培養物容積を収容することができる。また、バイオリアクターによって、典型的には、温度、ｐＨ、酸素圧、及び二酸化炭素濃度のような培養条件を制御することができる。例えば、バイオリアクターは、典型的には、例えば、酸素又は窒素のような気体成分を液体培養物にバブリングすることが可能な配管に接続したポートを用いて構築することができる。
【０１９０】
バイオリアクターは、油産生酵母が繁殖し、数が増える全期間を通じて、培地がバイオリアクターを流れるような構成であってもよい。ある実施形態では、例えば、播種した後であるが、細胞が望ましい密度になる前に、培地をバイオリアクターに注入してもよい。別の状況では、培養開始時にバイオリアクターを培地で満たし、培養物を播種した後は、それ以上培地を注入しない。言い換えると、油産生酵母バイオマスを、酵母が繁殖し、数が増える全期間を通じて、水性媒体中で培養する；しかし、所定分量の水性培地が全期間を通じてバイオリアクターを流れているのではない。従ってある実施形態では、水性培地は、播種後にはバイオリアクターを流れない。
【０１９１】
スピニングブレード、インペラー、揺動機構、撹拌棒、加圧気体を注入する手段のようなデバイスを備えるバイオリアクターを用い、油産生酵母培養物を混合に供することができる。混合は、連続的であってもよく、断続的であってもよい。上記で簡潔に述べたように、バイオリアクターは、例えば、培養物の気体内容物の操作を可能にする、さまざまなポートを備えることが多い。説明のために、バイオリアクターの容積の一部分は、液体ではなく気体であってもよく、バイオリアクターの気体注入口から、ポンプによって気体をバイオリアクターに入れることができる。ポンプによってバイオリアクターへと有益に入れることが可能な気体としては、空気、空気／ＣＯ２混合物、アルゴンのような希ガス、他の気体が挙げられる。バイオリアクターは、典型的には、バイオリアクターにガスを入れる速度をユーザーが制御することができるように取り付けられている。上述のように、バイオリアクターへの気体の流れを増やすことによって、培養物の混合性を高めることができる。
【０１９２】
気体の流れを増やすと、培地の濁度にも影響が及ぶ。水性培地の液面より低いところに気体注入ポートを配置し、それによりバイオリアクターに入った気体を培地表面でバブリングさせるすることにより、乱流を起こすことができる。１つ以上の気体流出ポートにより気体が外に逃がされ、それによりバイオリアクター内の圧力の蓄積が防止される。好ましくは、気体流出ポートは、バイオリアクターに微生物が入り込んで汚染されることを防ぐ「一方向」バルブにつながっている。
【０１９３】
本明細書に記載されているバイオリアクター、培養条件、従属栄養性成長及び増殖方法の特定の例を任意の適切な様式で組み合わせ、微生物の成長効率、及び脂質及び／又はタンパク質の生成効率を高めることができる。
【０１９４】
上述の方法によって生じる油産生酵母培養物から、発酵培地中に油産生酵母バイオマスが得られる。油の抽出用にこのバイオマスを調製するため、並びに微細藻類又は他の微生物のバイオマスを調製するため、バイオマスは、典型的には発酵培地から濃縮され、又は回収される。発酵培地から油産生酵母バイオマスを回収する時点では、バイオマスは、主に、水性培地に懸濁されたインタクトな細胞を含む。このバイオマスを濃縮するため、脱水工程を行うことができる。脱水又は濃縮は、発酵ブロス又は他の液体培地からのバイオマスの分離を指し、従って固液分離である。従って、脱水中に、培地がバイオマスから（例えば、発酵ブロスを、バイオマスを保持するフィルターを介して排液することにより）取り除かれ、又はバイオマスは他の方法で培地から取り除かれる。一般的な脱水方法としては、遠心分離、濾過、及び機械的圧力の使用が挙げられる。これらの方法は、個別にも、又は任意に組み合わせても用いることができる。
【０１９５】
遠心分離には、遠心力を用いた混合物の分離が含まれる。遠心分離においては、混合物中のより大きい密度の成分が遠心軸から離れ、一方で混合物中の密度が小さい成分は軸に向かって移動する。有効重力を増加させることにより（すなわち、遠心分離速度を増加させることにより）、固体のように密度が大きい材料が、液体のように密度が小さい材料から分離するため、密度に従い分離される。バイオマス及びブロス又は他の水溶液の遠心分離により、油産生酵母細胞を含む濃縮ペーストが形成される。遠心分離では、多量の細胞内の水は除去されない。実際、遠心分離後にも、バイオマスには相当量の表面水分又は自由水分（例えば、７０％を上回る）がなお存在し得るため、遠心分離は乾燥工程とは見なされない。
【０１９６】
濾過もまた、脱水に用いることができる。本明細書に記載される方法に適した濾過の一例は、クロスフロー濾過としても知られるタンジェント流濾過（ＴＦＦ）である。タンジェント流濾過は、膜システム及びフロー力を用いて液体から固体を分離する分離技法である。例示的な適した濾過方法については、ＭａｘＣｅｌｌ  Ａ／Ｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ０．４５ｕＭ中空糸フィルターの使用について記載しているＧｅｒｅｓｈ，Ｃａｒｂ．Ｐｏｌｙｍ．５０；１８３−１８９（２００２）を参照。また、例えば、１００ｋＤ、３００ｋＤ、１０００ｋＤ膜（カタログ番号Ｐ２Ｃ０１ＭＣ０１）、０．１ｕＭ膜（カタログ番号Ｐ２ＶＶＰＰＶ０１）、０．２２ｕＭ膜（カタログ番号Ｐ２ＧＶＰＰＶ０１）、及び０．４５ｕＭ膜（カタログ番号Ｐ２ＨＶＭＰＶ０１）とともに使用する、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）装置も参照。好ましくは、保持液がフィルターを通過する程度は高くなく、保持液中の生成物は、好ましくはフィルター材料に付着しない。またＴＦＦは、中空糸濾過システムを用いて行うこともできる。孔径がなくとも約０．１マイクロメートル、例えば約０．１２、０．１４、０．１６、０．１８、０．２、０．２２、０．４５、又は少なくとも約０．６５μｍであるフィルターが適している。ＴＦＦの好ましい孔径は、溶質及び発酵ブロス中の発酵片を通過させるが、微生物細胞は通過させないものである。
【０１９７】
脱水はまた、バイオマスを脱水するのに十分な、しかし細胞の主な溶解は引き起こすことのない、液体の発酵ブロスを微生物バイオマスから分離させる機械的圧力を、バイオマスに直接加えて生じさせることもできる。微生物バイオマスを脱水させる機械的圧力は、例えばベルトフィルタープレスを使用して加えることができる。ベルトフィルタープレスは、縮径するロールのサーペンタインを介して、２つの張力がかかったベルトの間を通過するスラリー（例えば、発酵槽又はバイオリアクターから直接取られた微生物バイオマス）に機械的圧力を加える脱水装置である。ベルトフィルタープレスは、実際には３つの区間に分けられ得る：重力区間、ここでは自由に排出する水／液体が重力によって多孔質ベルトを介して排出される；ウェッジ区間、ここでは圧力を加えるための固体が調製される；及び圧力区間、ここでは重力で排出される固体に調整可能な圧力が加えられる。
【０１９８】
濃縮後、油産生酵母バイオマスは、本明細書において以下に記載されるように処理され、油の抽出用に調製される。
【０１９９】
乾燥重量で高い割合の油／脂質蓄積を有する油産生酵母バイオマスは、当該技術分野において公知の方法を含む種々の培養方法を用いて生成されている。蓄積された油／脂質の割合が高い油産生酵母は、本明細書に記載される方法で有用である。Ｃａｎｄｉｄａ  １０７は、窒素制限条件下で最大４０％脂質ｗｔ／ｗｔを蓄積可能であることが示された（Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９７７）ｐｐ．２３１−２３９）。Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．は、４８％ｗ／ｗの脂質含有量に至る流加回分培養でのＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｓ  ４４の生成を実証している（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００７）４１：３１２−３１７）。Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、動物性脂肪（ステアリン）を炭素源として使用するとき、バイオマス１ｇあたり０．４４〜０．５４ｇの脂質を生成可能であることが示されている（Ｐａｎｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００２）５８：３０８−３１２）。
【０２００】
本明細書に記載される培養方法により生成され、且つ本明細書に記載される方法において有用なバイオマスは、乾燥重量で少なくとも１０％の油を含む。ある実施形態では、バイオマスは、乾燥重量で少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、又は少なくとも６０％の油を含む。ある実施形態では、バイオマスは、乾燥重量で１０〜９０％の油、２５〜７５％の油、４０〜７５％の油、又は５０〜７０％の油を含有する。
【０２０１】
本明細書に記載されるバイオマスの油、又は本明細書に記載される方法及び組成物で用いられるバイオマスから抽出される油は、１つ以上の別個の脂肪酸エステル側鎖を有するグリセロ脂質を含み得る。グリセロ脂質は、１つ、２つ又は３つの脂肪酸分子にエステル化されたグリセロール分子から構成され、このグリセロール分子は長さがさまざまで、さまざまな飽和度を有し得る。油組成物、すなわちグリセロ脂質の脂肪酸構成要素の特性及び比率は、少なくとも２つ別個の油産生酵母種（又は油産生酵母株及び別の油産生細菌）に由来するバイオマス又は油を組み合わせることによって操作することができる。ある実施形態では、別個の細菌種のうちの少なくとも２つが、異なるグリセロ脂質プロフィールを有する。別個の細菌種は、好ましくは従属栄養条件下で、本明細書に記載されるように共に又は別々に培養することができ、それによりそれぞれの油が産生され得る。異なる細菌種は、細胞のグリセロ脂質中、異なる割合の別個の脂肪酸構成要素を含有し得る。
【０２０２】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは遺伝子操作されている。本発明の実施形態は、脂質改変酵素を含有するＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの操作された株を使用して、潤滑剤及び誘電性流体としての使用に適した油を作る。Ｙａｒｒｏｗｉａを操作する例は、米国特許第７，４６５，５６５号及び第７，２７３，７４６号及び米国特許出願第１０／８４０５７９号、第１１／６１３４２０号、第１１／７１４３７７号及び第１１／２６４７３７号に記載されている。
【０２０３】
ＩＩＩ．遺伝子操作方法及び材料
本明細書に記載される方法は、組み換え微細藻類又は他の組み換え油産生微生物を使用して実施することができる。この章は、限定されないが、組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｋｒｕｇａｎｉ、及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ宿主細胞を含めた、本明細書に記載される方法に有用な組み換え宿主細胞を作製するための、特にＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞により例示される、微細藻類のような油産生微生物を遺伝子改変する方法及び材料について記載する。これらの方法及び材料についての記載は、読者が読みやすいようにいくつかの節に分けている。第１節では、形質転換方法について記載している。第２節では、相同組み換えを用いる遺伝子操作方法について記載している。第３節では、発現ベクター及び構成要素について記載している。
【０２０４】
１．操作方法−形質転換
細胞を、例えば、微粒子銃、エレクトロポレーション（Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８：８２１−８２６）、ガラスビーズによる形質転換、及び炭化ケイ素ウィスカーによる形質転換のような任意の適切な技術によって形質転換することができる。使用可能な別の方法は、プロトプラストを作成し、ＣａＣｌ２及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用い、組み換えＤＮＡを微細藻類（又は他の微生物）細胞に導入することを含む（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）、Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：６３−７３、この論文は、Ｃｈｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａを形質転換するために、この方法を用いることを報告している）。微細藻類の共形質転換を利用し、２種類の別個のベクター分子を細胞に同時に導入することができる（例えば、Ｐｒｏｔｉｓｔ  ２００４  Ｄｅｃ；１５５（４）：３８１−９３）。
【０２０５】
微粒子銃による方法（例えば、Ｓａｎｆｏｒｄ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９８８）６：２９９  ３０２、米国特許第４，９４５，０５０号；エレクトロポレーション（Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９８５）８２：５８２４  ５８２８）；レーザービーム、マイクロインジェクション、又はＤＮＡを微細藻類に導入することが可能な任意の他の方法の使用を、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞などの油産生細菌を形質転換するために用いることができる。
【０２０６】
２．操作方法−相同組み換え
相同組み換えは、相同性領域を並べて交換する相補的ＤＮＡ配列の能力に関する。相同組み換えプロセスでは、標的とするゲノム配列（「テンプレート」）と相同な、トランスジェニックＤＮＡ（「ドナー」）を含む配列が生物に導入され、次いで、対応するゲノム相同配列の部位においてゲノムへの組み換えが行われる。このプロセスの機構的な工程には、ほとんどの場合に以下が含まれる：（１）相同ＤＮＡセグメントの対形成；（２）ドナーＤＮＡ分子への二本鎖切断の導入；（３）遊離ドナーＤＮＡ末端によるテンプレートＤＮＡ分子への侵入と、それに続くＤＮＡ合成；及び（４）組み換え産物をもたらす二本鎖切断修復イベントの回復（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）。
【０２０７】
宿主又は有機体で相同組み換えを行う能力は、分子の遺伝子レベルで行うことができ、用途に応じた油（油脂）を産生することができる油産生細菌の生成に有用であるといった多くの実用的意義がある。相同組み換えは、それ自体の本来の性質により、正確な遺伝子標的事象であり、従って、同じ標的配列を用いて作られたほとんどのトランスジェニック系は、表現型の観点では本質的に同一であり、それほど多くの形質転換事象をスクリーニングする必要はない。また、相同組み換えは、遺伝子が宿主の染色体に挿入される事象を標的としており、これにより、遺伝子の選択が存在しない状態であっても、優れた遺伝子安定性が得られる。染色体上の遺伝子座が異なることは、異種プロモーター／ＵＴＲに由来するものであっても、遺伝子発現に影響を与えるため、相同組み換えは、よく知られていないゲノム環境にある遺伝子座を検索し、特定のゲノム環境が遺伝子発現に与える影響を評価する方法になり得る。
【０２０８】
相同組み換えを用いる特に有用な遺伝子操作は、プロモーター／ＵＴＲのような選択特異的な宿主制御エレメントが、非常に特異的な様式で異種遺伝子を発現させることである。例えば、選択マーカーをコードする異種遺伝子によるデサチュラーゼ遺伝子／遺伝子ファミリーの除去又はノックアウトを用いて、宿主細胞で生成される飽和脂肪酸の全体的な割合を増加させることができる。実施例４は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓで生じさせるそのようなデサチュラーゼ遺伝子除去（ノックアウト）の相同組み換え標的構築物及び実施例について記載している。内因性遺伝子の発現を低下させる別のアプローチは、限定されないが、ＲＮＡｉ又はアンチセンスアプローチ、並びにｄｓＲＮＡアプローチを含め、遺伝子発現の下方調節又はサイレンシングをＲＮＡによって誘導する方法を用いることである。アンチセンス、ＲＮＡｉ、ｄｓＲＮＡ、及びヘアピンＲＮＡアプローチは、当該技術分野において周知であり、ｍＲＮＡとして発現するとヘアピンＲＮＡの形成をもたらす発現構築物又はアンチセンス方向に転写される標的遺伝子の一部分を含む発現構築物の導入を含む。これらのアプローチは全て、標的遺伝子の発現の低下をもたらす。また、実施例４は、ヘアピンＲＮＡアプローチによって内在するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓデルタ１２デサチュラーゼ遺伝子（ＦＡＤｃ）を下方調節する発現構築物及び実施例について記載している。
【０２０９】
相同組み換えは正確な遺伝子標的イベントであるため、十分なフランキング領域が同定されている限り、目的の遺伝子又は領域内の任意のヌクレオチドの正確な改変に用いることができる。従って、相同組み換えは、ＲＮＡ及び／又はタンパク質の遺伝子発現に影響を及ぼす制御配列を改変する手段として用いることができる。相同組み換えはまた、基質特異性、親和性、及びＫｍのような酵素活性が改変されるようタンパク質コード領域を改変し、そのようにして宿主細胞の代謝に望ましい変化を生じさせるためにも用いることができる。相同組み換えは、遺伝子ターゲッティング、遺伝子変換、遺伝子欠失、遺伝子重複、及び遺伝子反転を生じさせ、且つプロモーター、エンハンサー及び３’ＵＴＲのような遺伝子発現調節エレメントの交換を生じさせる強力な宿主ゲノム操作手段である。
【０２１０】
相同組み換えは、内在する宿主細胞ゲノム内にある目的の遺伝子又は領域を「標的とする」ために、内在する配列の一部を含む標的構築物を用いることによって行うことができる。このような標的配列は、目的の遺伝子又は領域の５’末端に位置していてもよく、目的の遺伝子／領域の３’末端に位置していてもよく、目的の遺伝子／領域に隣接していてもよい。このような標的構築物を、さらなるベクター骨格を有する超らせん構造のプラスミドＤＮＡとして、ベクター骨格を有さないＰＣＲ産物として、又は線状分子として宿主細胞内で形質転換してもよい。ある場合では、まず、制限酵素を用いて、トランスジェニックＤＮＡ（ドナーＤＮＡ）内にある同種配列にさらすことが有益な場合がある。この工程によって、組み換え効率が増し、望ましくない事象の発生を減らすことができる。組み換え効率を高める他の方法としては、処理されるゲノム配列に対して同種の線状末端を含有する形質転換されたトランスジェニックＤＮＡを作成するためにＰＣＲを用いることが挙げられる。
【０２１１】
非限定的な例示として、相同組み換えに有用なドナーＤＮＡ配列の領域としては、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおけるＤＮＡのＫＥ８５８領域が挙げられる。ＫＥ８５８は、タンパク質のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）ファミリーと相同性を共有するタンパク質のコード領域の一部を包含する１．３ｋｂのゲノムフラグメントである。サザンブロットから、ＫＥ８５８配列がＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）ゲノムの単一配列に存在することが示されている。この領域及び相同組み換えの標的化にこの領域を用いる例は、ＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／６６１４２号に記載されている。ドナーＤＮＡの別の有用な領域は６Ｓゲノム配列である。
【０２１２】
３．ベクター及びベクター成分
微生物の形質転換用ベクターは、本明細書の開示を考慮して、当業者には有名な既知の技術によって調製することができる。ベクターは、典型的には１つ以上の遺伝子を含有し、それぞれの遺伝子は、所望の産物（遺伝子産物）の発現をコードし、且つ、遺伝子発現を調整し、又は遺伝子産物を組み換え細胞の特定の位置に標的化する１つ以上の制御配列に動作可能に連結されている。読者の助けとなるように、この節をいくつかの節に分けている。第Ａ節は、ベクター上に含まれ得る制御配列について記載している。第Ｂ節は、ベクターに典型的に含まれる遺伝子並びにコドン最適化方法及びそれを用いて調製される遺伝子について記載している。
【０２１３】
Ａ．制御配列
制御配列は、コード配列の発現を制御するか、又は遺伝子産物を、細胞内又は細胞外の特定の位置に向かわせる核酸である。発現を制御する制御配列としては、例えば、コード配列の転写を制御するプロモーター、コード配列の転写を止めるターミネーターが挙げられる。別の制御配列は、コード配列の末端に位置する３’非翻訳配列であり、ポリアデニル化シグナルをコードする。遺伝子産物を特定の位置に向かわせる制御配列としては、シグナルペプチドをコードする配列が挙げられ、この配列は、細胞内又は細胞外の特定の位置に、この配列が結合したタンパク質を向かわせる。
【０２１４】
従って、微細藻類又は他の油産生細菌において外来遺伝子を発現するような例示的なベクターの設計は、望ましい遺伝子産物（例えば、選択可能なマーカー、脂質経路改変酵素、又はショ糖利用酵素）のためのコード配列を、微細藻類又は他の油産生細菌内で活性なプロモーターと動作可能に連結した状態で含む。又は、ベクターが、目的のコード配列と動作可能に連結した状態でプロモーターを含まない場合、コード配列を、ベクターの組み込み位置で内在するプロモーターに動作可能に連結するように、細胞内で形質転換してもよい。プロモーターを用いずに形質転換する方法は、微細藻類（例えば、Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １４：４、（１９９８）、ｐｐ．４４１−４４７）又は他の油産生細菌でうまく働くことがわかっている。
【０２１５】
多くのプロモーターは、微細藻類内で活性であり、形質転換される藻に内在するプロモーター、形質転換される藻に内在しないプロモーター（すなわち、他の藻に由来するプロモーター、高等植物に由来するプロモーター、植物ウイルス又は藻ウイルスに由来するプロモーター）を含む。微細藻類内で活性な、具体的な外来のプロモーター及び／又は内在するプロモーター（微細藻類中で機能する抗生物質耐性のある遺伝子）は、ＰＣＴ公開番号第２００８／１５１１４９号及びこの明細書に引用されている参考文献に記載されている）。
【０２１６】
外来遺伝子を発現させるために用いられるプロモーターは、その外来遺伝子に天然で連結しているプロモーターであってもよく、又は、異種遺伝子プロモーターであってもよい。ある種のプロモーターは、１つより多い微細藻類において活性である。他のプロモーターは、種に特異的である。具体的なプロモーターとしては、以下の実施例で用いられる、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉに由来するβ−チューブリンのようなプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣＭＶ）及びクロレラウイルスから由来するプロモーターのような、微細藻類の複数の種の中で活性であることが示されているウイルスプロモーターが挙げられる（例えば、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２００５  Ｍａｒ；２３（１０−１１）：７２７−３５；Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５  Ａｕｇ；４３（４）：３６１−５；Ｍａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（ＮＹ）．２００２  Ｊａｎ；４（１）：６３−７３）。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ内で外来遺伝子を発現させるのに適切な別のプロモーターは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａグルタミン酸脱水素酵素プロモーター／５’ＵＴＲである。通常、これらの配列のうち、プロモーターを含有し、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、又は６０ヌクレオチド、又はそれ以上が使用される。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ内で外来遺伝子を発現させるのに有用な代表的なプロモーターは、本明細書の配列表に列挙されており、例えば、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ＨＵＰ１遺伝子のプロモーター（配列番号１）、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ硝酸還元酵素プロモーター（配列番号２）がある。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａウイルスプロモーターを、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ内で遺伝子を発現させるために用いることもでき、例えば、米国特許第６，３９５，９６５号の配列番号１〜７が挙げられる。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ内で活性なさらなるプロモーターは、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９４  Ｏｃｔ  １４；２０４（１）：１８７−９４；Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９４  Ｏｃｔ；２６（１）：８５−９３；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００４  Ａｕｇ  １５；３２６（１）：１５０−９；及び、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００４  Ｊａｎ  ５；３１８（１）：２１４−２３に見いだすことができる。
【０２１７】
プロモーターは、一般的に、構成的であるか、又は誘発性であると特徴づけることができる。構成的プロモーターは、一般的に、いつでも（又は、細胞周期の特定の時期に）同じレベルで活性であるか、又は発現を起こすように機能する。誘発性プロモーターは、これとは異なり、刺激に応答したときのみ、活性である（又は不活性化する）か、又は顕著に上方調節されるか、又は下方調節される。どちらの種類のプロモーターも、本明細書に記載の方法での用途がある。本明細書に記載の方法で有用な誘発性プロモーターとしては、例えば、外から与えられる低分子（例えば、配列番号１の場合には、グルコース）、温度（熱いか、又は冷たい）、培地中の窒素不足などの刺激に応答して、動作可能に連結した遺伝子の転写に介在するプロモーターが挙げられる。適切なプロモーターは、本質的にサイレント遺伝子である遺伝子の転写を活性化させることができるか、又は、低濃度で転写されるような動作可能に連結した遺伝子の転写を上方調節し、好ましくは、かなり上方調節することができる。
【０２１８】
停止領域の制御配列の包含は任意であり、利用される場合には、停止領域は比較的置き換え可能であるため、その選択は、主に簡便なものである。停止領域は、転写開始領域（プロモーター）に由来するものであってもよく、目的のＤＮＡ配列に由来するものであってもよく、又は、別の供給源から得られるものであってもよい。例えば、Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｒｏｚｃｏ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８８）１６：８４１１。
【０２１９】
また、本発明は、制御配列及び組み換え遺伝子、及び目的の遺伝子を区画化して発現するための、これらを含むベクターを提供する。標的とするための細胞小器官は、葉緑体、プラスチド、ミトコンドリア、小胞体である。それに加え、本発明は、制御配列及び組み換え遺伝子、細胞の外側にタンパク質を分泌するための、これらを含むベクターを提供する。
【０２２０】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａの核ゲノム内で発現するタンパク質は、プラスチド標的シグナルを用い、プラスチドを標的としてもよい。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａに内在するプラスチド標的配列は知られており、例えば、プラスチドを標的とするタンパク質をコードする、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ核ゲノム内の遺伝子、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ６４６１９７及びＡＦ４９９６８４が挙げられ、一実施形態では、このような制御配列を含むベクターは、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａプラスチドでタンパク質を発現させることを標的とするために、本明細書に記載の方法で使用される。
【０２２１】
以下の実施例は、宿主細胞の正しい区画に異種タンパク質を向かわせるために、プラスチド標的配列を使用することを記載している。ｃＤＮＡライブラリーは、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｄｉｅｓ細胞を用いて作られ、ＰＣＴ出願米国特許出願公開第２００９／０６６１４２号明細書に記載されている。
【０２２２】
別の実施形態では、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ又は他の油産生細菌内でのポリペプチドの発現は、小胞体を標的としている。発現ベクター内の適切な保持シグナル又は選別シグナルによって、タンパク質が確実に小胞体（ＥＲ）に保持され、ゴルジ体の下流には行かない。例えば、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ  ＵＲ−Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのＩＭＰＡＣＴベクター１．３ベクターは、よく知られているＫＤＥＬ保持シグナル又は選別シグナルを含んでいる。このベクターを用い、ＥＲを保持することは、発現レベルが５倍以上に高まることが報告されているという点で、実益がある。この現象の主な理由は、ＥＲが、細胞質に存在するプロテアーゼより低い濃度のプロテアーゼを含んでいるか、及び／又は、細胞質に存在するプロテアーゼとは異なる、発現したタンパク質の翻訳後の分解に関与するプロテアーゼを含んでいるからだと思われる。緑色微細藻類内で機能するＥＲ保持シグナルが知られている。例えば、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００５  Ａｐｒ  ２６；１０２（１７）：６２２５−３０を参照。
【０２２３】
本発明の別の実施形態では、ポリペプチドは、細胞から出て、培地に分泌することを標的としている。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａなどの他の微細藻類内でも使用することが可能な、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ内で活性なシグナルの分泌については、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３８（１９９９）、ｐｐ．３３５−３４１を参照。
【０２２４】
Ｂ．遺伝子及びコドンの最適化
典型的には、遺伝子は、プロモーターと、コード配列と、停止制御配列とを含む。組み換えＤＮＡ技術によって組み立てられる場合、遺伝子は、発現カセットと呼ばれることもあり、組み換え遺伝子を宿主細胞に導入するために使用されるベクターに簡便に挿入するために、制限配列に隣接していてもよい。発現カセットは、ゲノム由来のＤＮＡ配列、又は相同組み換えにいよって発現カセットをゲノムに安定に組み込みやすくすることを標的とした他の核酸に隣接していてもよい。又は、ベクター及びその発現カセットは、組み込まれないままであってもよく、この場合には、ベクターは、典型的には、異種ベクターＤＮＡを複製するために与えることができるような、複製起源を含んでいてもよい。
【０２２５】
ベクター上に存在する共通の遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子であり、この発現によって、このタンパク質を含有する組み換え細胞が、このタンパク質を発現しない細胞と分化する。このような遺伝子、又はその対応する遺伝子産物は、選択可能なマーカーと呼ばれる。任意のさまざまな選択可能なマーカーを、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ又は本明細書に記載される方法で有用な任意の他の油産生細菌の形質転換に有用なトランス遺伝子構築物に用いることができる。適切な選択可能なマーカーの例としては、Ｇ４１８耐性遺伝子、硝酸還元酵素遺伝子（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３５：３５６−３６２を参照）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＰＴ；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）、Ｍａｒ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：６３−７３を参照）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、フレオマイシン対する耐性を付与するｂｌｅ遺伝子（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７２：１９７−２０５）が挙げられる。微細藻類及び他の油産生細菌の抗生物質に対する感度を決める方法はよく知られている。例えば、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１９９６  Ｏｃｔ  １６；２５２（５）：５７２−９を参照されたい。
【０２２６】
抗生物質ベースでない他の選択可能なマーカーもまた、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種を含め、一般に微細藻類の形質転換に有用なトランス遺伝子構築物に用いることができる。これまで微細藻類が利用できなかった特定の炭素源の利用能を付与する遺伝子もまた、選択可能なマーカーとして使用することができる。例示として、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株はショ糖上では、たとえ成長したとしても、典型的には生育が悪い。ショ糖インベルターゼ遺伝子を含む構築物を使用すると、陽性形質転換体が炭素基質としてショ糖上で成長する能力を付与することができる。
【０２２７】
本明細書に記載される方法の特定の実施形態のために、組み換え宿主細胞を調製するために用いられる発現ベクターは、遺伝子のうちの１つが選択可能なマーカーである場合に、少なくとも２つの遺伝子、及び多くの場合に３つの遺伝子を含み得る。例えば、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａは、選択可能なマーカーに加え、１つ以上の外来遺伝子、例えば、ショ糖インベルターゼ遺伝子又はアシルＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子を含むベクターで形質転換することにより作製することができる。１個又は全部の遺伝子が、誘発性プロモーターを用いて発現してもよく、これにより、これらの遺伝子が発現する相対的なタイミングを制御し、脂質収量及び脂肪酸エステルへの変換を高めることができる。２種以上の外来遺伝子の発現は、同じ誘発性プロモーターで制御されていてもよく、異なる誘発性（又は構成的）プロモーターで制御されていてもよい。後者の状況では、第１の外来遺伝子の発現は、第１の期間に誘発されてもよく（この間に、第２の外来遺伝子の発現が誘発されてもよく、誘発されなくてもよく）、第２の外来遺伝子の発現は、第２の期間に誘発されてもよい（この間に、第１の外来遺伝子の発現が誘発されてもよく、誘発されなくてもよい）。
【０２２８】
他の実施形態では、２種以上の外来遺伝子（任意の選択可能なマーカーに加えて）は、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及び脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素、アルコール産物を与えるこれらの組み合わせ作用である。さらに、限定されないが、アルデヒドを生成するための脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及び脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素のような他の外来遺伝子の組み合わせも提供される。一実施形態では、ベクターは、アルカンを生成するための、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素、脂肪族アルデヒド脱炭酸酵素の組み合わせを与える。これらのそれぞれの実施形態では、１つ以上の外来遺伝子が、誘発性プロモーターを用いて発現してもよい。
【０２２９】
２種以上の外来遺伝子を発現する、他の代表的なベクターとしては、ショ糖トランスポーター及びショ糖インベルターゼ酵素の両方をコードするベクター、選択可能なマーカーと、分泌されたショ糖インベルターゼとの両方をコードするベクターが挙げられる。いずれの種類のベクターで形質転換された組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ又は他の微細藻類若しくは微生物の細胞も、サトウキビ（及びサトウキビから誘導される糖）を炭素源として使用する能力が操作されているため、低い製造コストで脂質を生成する。上述の２種類の外来遺伝子の挿入は、定方向変異誘発法及び／又はランダム変異導入法によって多糖生合成を乱すことと組み合わせることができ、脂質産生へと進む炭素の流れが大きくなる方向に進む。個々に、及び組み合わせて、栄養転換、脂質の産生を変えるような操作、外来の酵素を用いた処理によって、微生物が産生する脂質の組成が変わる。この変化によって、産生する脂質の量、他の脂質種に対する的な１つ以上の脂質（油脂）種の相対量、及び／又は微生物が産生する脂質種の種類を変えることができる。例えば、微細藻類を、ＴＡＧの量及び／又は割合を増やすように操作することができる。
【０２３０】
組み換えタンパク質の最適な発現のために、形質転換されるべき宿主細胞で優先的に用いられるコドンを用いてｍＲＮＡを生成するコード配列を利用することが有益である。従って、トランス遺伝子の適切な発現は、トランス遺伝子のコドンの使用が、トランス遺伝子を発現する有機体の特定のコドンの偏りと適合していることが必要な場合がある。この影響の元になる正確な機構は多くあるが、利用可能なアミノアシル化されたｔＲＮＡプールと、細胞内で合成されるタンパク質との適切なバランス、この要求を満たす場合に、トランスジェニックメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をもっと効果的な翻訳との組み合わせを含む。トランス遺伝子内のコドンの使用が最適化されていない場合、利用可能なｔＲＮＡプールは、異種ｍＲＮＡの効率的な翻訳を可能にするのに十分ではなく、その結果、リボソームが失速し、停止し、トランスジェニックｍＲＮＡが不安定になる場合がある。
【０２３１】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａで組み換えタンパク質が首尾よく発現するのに有用な、コドンが最適化された核酸を本明細書に記載する。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種のコドン使用を、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓから単離したｃＤＮＡ配列を調べることにより分析した。この分析は２４，０００を超えるコドンの問い合わせに相当し、以下の表４に結果を示している。
【０２３２】
【表６】
0005970463.tif 000007
【０２３３】
他の実施形態では、組み換えベクター中の遺伝子は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ株以外の微細藻類株又は別の微生物株に対してコドンが最適化されている。例えば、微細藻類での発現用に遺伝子を記録する方法が、米国特許第７，１３５，２９０号に記載されている。コドン最適化のさらなる情報が、例えばＧｅｎＢａｎｋのコドン使用データベースで利用可能である。
【０２３４】
本明細書に記載される方法及び材料により、任意の外来遺伝子をＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ又は他の微細藻類又は他の油産生微生物に導入することが可能になるが、以下の章で考察するように、ショ糖利用及び脂質経路の改変に関係する遺伝子は、天然でそれを利用することができない微生物にとって、又はその利用が非効率的である微生物にとって、特に興味深い。
【０２３５】
ＩＶ．ショ糖利用
実施形態では、組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ又は他の微細藻類細胞又は他の微生物の細胞は、１つ以上の外来性のショ糖利用遺伝子を含む。種々の実施形態では、１つ以上の遺伝子は、フルクトキナーゼ、グルコキナーゼ、ヘキソキナーゼ、ショ糖インベルターゼ、ショ糖トランスポーターからなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードする。例えば、ショ糖トランスポーター及びショ糖インベルターゼが発現することにより、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ又は任意の他の微細藻類細胞又は他の微生物の細胞が培地からショ糖を細胞に運び込み、ショ糖を加水分解してグルコース及びフルクトースを産生することが可能になる。場合により、フルクトースのリン酸化を最大にするのに内在するヘキソキナーゼ活性では不十分な場合、フルクトキナーゼもまた発現させてよい。適したショ糖トランスポーターの例は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＣＡＤ９１３３４、ＣＡＢ９２３０７、及びＣＡＡ５３３９０である。適したフルクトキナーゼの例は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｐ２６９８４、Ｐ２６４２０及びＣＡＡ４３３２２である。
【０２３６】
一実施形態では、本明細書に記載される方法は、ショ糖インベルターゼを分泌するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ宿主細胞で実施される。ショ糖インベルターゼの分泌により、ショ糖を細胞に運び込むことができるトランスポーターの発現が不要になる。これは、分泌したインベルターゼがショ糖分子からグルコース分子及びフルクトース分子への変換を触媒し、いずれの分子も、本明細書に記載される方法で有用な微生物によって輸送及び利用され得るためである。例えば、分泌シグナル（例えば、配列番号４（酵母に由来する）、配列番号５（高等植物に由来する）、配列番号６（真核性のコンセンサス分泌シグナルなど）、配列番号７（高等植物及び真核性のコンセンサスに由来するシグナル配列の組み合わせ）を用いたショ糖インベルターゼ（例えば、配列番号３）の発現によって、インベルターゼ活性が細胞外で発生する。このようなタンパク質の発現は、本明細書に開示されている遺伝子操作方法によって可能となるが、それによって細胞外グルコースをエネルギー源としてすでに利用可能な細胞が、ショ糖を細胞外エネルギー源として利用することができる。
【０２３７】
ショ糖を含有する培地に分泌されるインベルターゼを発現するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ種は、誘電性流体又は他の潤滑剤（食用油の生産用、消費者によっては、非組み換え微生物を使用して生産された油を好み得る）として使用される微生物油の生成に好ましい微細藻類の種である。この完全に活性なタンパク質の発現及び細胞外標的化によって、得られた宿主細胞がショ糖で成長することが可能となる一方、対応する非形質転換細胞は成長できない。従って、本明細書に記載される方法の実施では、インベルターゼ活性及びショ糖の加水分解によって評価される場合にインベルターゼ遺伝子が発現するようにゲノムに組み込まれた、限定されないが酵母インベルターゼ遺伝子を含む、コドンが最適化されたインベルターゼ遺伝子を有するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ組み換え細胞が利用されてもよい。インベルターゼ遺伝子は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ及び他の微細藻類組み換え細胞において選択可能なマーカーとして有用であり、なぜならそのような細胞はショ糖上で成長することができるが、それに対応する非形質転換細胞は成長できないためである；インベルターゼを使用して組み換え宿主細胞を選択する方法は、藻類の分子遺伝学についての強力な選択可能マーカーである。
【０２３８】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａでショ糖インベルターゼが首尾よく発現することも、異種（組み換え）タンパク質が藻類細胞で発現し、且つ細胞の外に出て、完全に活性で機能的な形態で培地に首尾よく移ることができることを示している。従って、微細藻類において広範で多様な一連の異種タンパク質を発現させ、且つそれらを宿主細胞外に分泌させる方法及び試薬が利用可能である。そのようなタンパク質としては、例えば、工業用酵素、例えば、リパーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、エステラーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ラクターゼ、イソメラーゼ、及びインベルターゼが挙げられる。
【０２３９】
適切なショ糖インベルターゼの例としては、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＣＡＢ９５０１０、ＮＰ＿０１２１０４、ＣＡＡ０６８３９で特定されるものが挙げられる。適切なインベルターゼの非限定的な例を以下の表５に列挙している。それぞれの列挙したインベルターゼのアミノ酸配列は、以下の配列表に含まれている。ある場合では、本明細書に記載の方法及びベクターで使用するのに適した外来のショ糖利用遺伝子は、表５から選択されるショ糖インベルターゼとのアミノ酸同一性が少なくとも４０％、５０％、６０％、７５％、又は９０％、又はそれ以上であるショ糖インベルターゼをコードする。
【０２４０】
【表７】
0005970463.tif 000008
【０２４１】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａによってインベルターゼを培地に分泌させると、細胞は、純粋な試薬グレードのグルコースで成長させるときと同様に、サトウキビ加工から得た廃棄糖液でも成長することができる；サトウキビ加工のこの価値の低い廃棄産物を用いることによって、脂質及び他の油の生成において費用を大幅に節約することができる。従って、本明細書に記載される方法は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ又は他の微細藻類微生物の集合と、（ｉ）ショ糖及び（ｉｉ）ショ糖インベルターゼ酵素を含む培地とを含む微生物培養物の使用を含み得る。種々の実施形態では、培養物中のショ糖は、モロコシ、テンサイ、サトウキビ、糖液、又は解重合されたセルロース系材料（場合によりリグニンを含有し得る）に由来する。ここで例示される微生物は、ショ糖を利用できるように変えられるが、セルラーゼ、ペクチナーゼ、イソメラーゼなどを分泌する能力を有する操作された宿主細菌がセルロース系のような原材料を利用することができるように、本明細書に記載される方法及び試薬を適用してもよく、その結果、宿主は酵素反応の分解産物に単に耐えるだけでなく、それを炭素源として利用するようになる。
【０２４２】
Ｖ．脂質経路の操作
ショ糖を含有する原材料のような原材料をＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ（又は他の微細藻類細胞又は他の微生物細胞）が利用する能力を変えることに加え、生成される脂質の特性及び／又は割合を変えるように改変された組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ（又は他の微細藻類細胞又は他微生物の細胞）が、本明細書に記載される方法において有用である。それに加えて、又は代えて、脂肪酸経路における脂質及び中間物の酵素処理によって生成されるさまざまな脂質分子の特性及び／又は割合を変えるため、この経路を改変することができる。種々の実施形態では、この組み換え細胞は、形質転換されていない対応する細胞と比較して、単位容積あたり及び／又は単位時間当たりの脂質収量、炭素鎖長（例えば工業用化学物質、限定されないが誘電性流体用に、及び脂質原材料を必要とする他の用途のため）が増加又は最適化され、二重結合又は三重結合の数が場合によりゼロまで減らされ、及び特定の脂質種（脂肪酸）の、又は別個の脂質の集合の水素：炭素比が大きくなっている。
【０２４３】
特定の実施形態では、脂肪酸の合成に対し、代謝における分岐点を制御するような１つ以上の鍵となる酵素を上方調節するか、又は下方調節し、脂質の産生を高める。上方調節は、例えば、転写を増やす強力なプロモーターエレメント及び／又はエンハンサーエレメントを用い、例えば、目的の酵素をコードする遺伝子が発現するような発現構築物を用いて細胞を形質転換することによって達成することができる。このような構築物は、形質転換体を選択することができるような選択可能なマーカーを含んでいてもよく、これは、構築物の増幅及び付随するコードされた酵素の発現量の増加のために用いることができる。本明細書に記載野の方法に従って上方調節するのに適した酵素の例としては、ピルビン酸をアセチル−ＣｏＡに変換する役割を担うピルビン酸脱水素酵素（例えば、微細藻類由来のもの、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＰ＿４１５３９２；ＡＡＡ５３０４７；Ｑ１ＸＤＭ１；ＣＡＦ０５５８７を含む）が挙げられる。ピルビン酸脱水素酵素を上方調節すると、アセチル−ＣｏＡの産生量が増え、それによって脂肪酸の合成量が増える。アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼは、脂肪酸合成の最初の工程を触媒する。従って、この酵素を上方調節すると、脂肪酸の産生量を増やすことができる（例えば、微細藻類由来のもの、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＢＡＡ９４７５２；ＡＡＡ７５５２８；ＡＡＡ８１４７１；ＹＰ＿５３７０５２；ＹＰ＿５３６８７９；ＮＰ＿０４５８３３；ＢＡＡ５７９０８を含む）。また、脂肪酸合成中に、アシル鎖を成長させるアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）を上方調節することによって、脂肪酸産生量を増やすこともできる（例えば、微細藻類由来のもの、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ａ０Ｔ０Ｆ８；Ｐ５１２８０；ＮＰ＿８４９０４１；ＹＰ＿８７４４３３を含む）。グリセロール−３−ホスフェートアシルトランスフェラーゼは、脂肪酸合成の律速工程を触媒する。この酵素を上方調節すると、脂肪酸の産生量を増やすことができる（例えば、微細藻類由来のもの、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＡＡ７４３１９；ＡＡＡ３３１２２；ＡＡＡ３７６４７；Ｐ４４８５７；ＡＢＯ９４４４２を含む）。
【０２４４】
遺伝子の上方調節及び／又は下方調節は、脂肪酸の生合成経路に関する遺伝子の発現を制御する包括的な制御因子に適用することができる。従って、脂肪酸合成の１つ以上の包括的な制御因子を、適切な場合に上方調節するか、又は下方調節し、それぞれ、複数の脂肪酸合成遺伝子の発現を阻害するか、又は高め、最終的に、脂質の産生量を増やすことができる。例としては、ステロール制御エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）、例えば、ＳＲＥＢＰ−１ａ及びＳＲＥＢＰ−１ｃ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＰ＿０３５６１０及びＱ９ＷＴＮ３を参照）。
【０２４５】
本明細書に記載される方法はまた、例えば、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（表６を参照）、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素（表８を参照）、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素、脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼ、脂肪族アルデヒド還元酵素、デサチュラーゼ（ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ及び脂肪酸アシルデサチュラーゼなど）及びスクアレンシンターゼ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ２０５７９１を参照）のような脂質改変酵素をコードする１つ以上の外来遺伝子を含むように改変された組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ（又は他の微細藻類又は他の微生物の）細胞で実施することもできる。ある実施形態では、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及び自然に共発現するアシルキャリアータンパク質をコードする遺伝子が、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ（又は他の微細藻類又は他の微生物の）細胞に、場合により他の脂質改変酵素をコードする１つ以上の遺伝子とともに形質転換される。他の実施形態では、ＡＣＰと脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼとは、それらが特定の組織又は有機体で自然に共発現するか否かにかかわらず、２つが本明細書に記載される微生物及び方法で共に使用されるときに利点を付与するような互いに対する親和性を有してもよい。従って、特定の実施形態では、本発明は、これらの酵素の自然に共発現する対、並びに、ＡＣＰから特定の長さの炭素鎖が切断されやすくなるように互いに作用し合うための親和性を共有する対の双方を包含する。
【０２４６】
さらに他の実施形態では、デサチュラーゼをコードする外来遺伝子を、脂質飽和に関する改変をもたらすように他の脂質改変酵素をコードする１つ以上の遺伝子とともにＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ（又は他の微細藻類又は他の微生物の）細胞に形質転換する。別の実施形態では、内在するデサチュラーゼ遺伝子を、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ（又は他の微細藻類又は他の微生物の）細胞内で（例えば、遺伝子のさらなる複製物の導入によって）過剰発現させる。ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＦ１５３０８；ＡＢＭ４５９１１；及びＡＡＹ８６０８６を参照）は、例えば、ステアロイル−ＡＣＰからオレオイル−ＡＣＰへの変換を触媒する。この遺伝子を上方調節すると、細胞が生成する一価不飽和脂肪酸の比率を増やすことができ、一方、下方調節すると、一価不飽和物の比率を減らすことができる。例示として、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）は、Ｃ１８：０前駆体からのＣ１８：１脂肪酸の合成に関与する。デサチュラーゼの別のファミリーは、デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼを含む脂肪酸アシルデサチュラーゼ（ＦＡＤ）である。これらのデサチュラーゼは、脂質飽和に関する改変ももたらす。例示として、デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼは、Ｃ１８：１前駆体からのＣ１８：２脂肪酸の合成に関与する。同様に、ω−６脂肪酸デサチュラーゼ、ω−３脂肪酸デサチュラーゼ、又はω−６−オレイン酸デサチュラーゼのような１つ以上のグリセロ脂質デサチュラーゼの発現を制御することにより、不飽和脂肪酸の飽和脂肪酸に対する比を変えることができる。ある実施形態では、デサチュラーゼが特定の炭素長の基質又は特定の範囲内の炭素長を有する基質中で位置特異的な改変を設けることができるように、デサチュラーゼは、望ましい炭素鎖長に関して選択され得る。別の実施形態では、望ましい脂肪酸プロフィールが一価不飽和物（Ｃ１６：１及び／又はＣ１８：１など）の増加である場合、ＳＡＤの過剰発現又は異種ＳＡＤの発現を、脂肪酸アシルデサチュラーゼ（ＦＡＤ）のサイレンシング又は不活性化（例えば、内在するデサチュラーゼ遺伝子の突然変異、ＲＮＡｉ、ヘアピンＲＮＡ、ノックアウト等による）と結び付けることができる。以下の実施例４は、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ及びデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼの標的化した除去又はノックアウトについて記載し、また、内在するデサチュラーゼ遺伝子の発現を低下させるヘアピンＲＮＡアンチセンス構築物の使用についても記載している。
【０２４７】
従って、特定の実施形態では、本発明の微生物は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素、脂肪族アルデヒド還元酵素、デサチュラーゼ、脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼ、又は自然に共発現するアシルキャリアータンパク質から選択される１つ以上の外来遺伝子を発現するように遺伝子操作される。適した発現方法は、リパーゼ遺伝子の発現に関して上記に記載されており、他の方法の中でも特に、誘発的発現及び区画化された発現が挙げられる。脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、脂質合成中に、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）から脂肪酸を切断する。次に、さらなる酵素処理によって、切断された脂肪酸が補酵素と組み合わさり、アシル−ＣｏＡ分子を生じる。このアシル−ＣｏＡは、アルデヒドを生じる脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素の、並びにアルコールを生じる脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素についての酵素活性の基質である。上述のように特定した、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素の作用によって生成されるアルデヒドは、アルコーを生じる脂肪族アルデヒド還元酵素、又はアルカン若しくはアルケンを生じる脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼのいずれかによるさらなる酵素活性の基質である。
【０２４８】
ある実施形態では、本明細書に記載される方法によって生成する脂肪酸、グリセロ脂質、又は対応する一級アルコール、アルデヒド、アルカン、又はアルケンは、１６個又は１８個の炭素原子を含む。誘電性流体又は対応するアルコール、アルデヒド、アルカン及びアルケンの生成に好ましい脂肪酸は、１６〜１８個の炭素原子を含む。特定の実施形態では、上述の脂肪酸は飽和であり（炭素−炭素二重結合又は三重結合を含まない）；一価不飽和であり（二重結合が１個）；多価不飽和であり（２個以上の二重結合）；及び直鎖である（環状でない）か又は分枝鎖であるか又はこの２つのタイプの混合であり得る。誘電性流体には、一価不飽和脂肪酸、特にオレイン酸（Ｃ１８：１）が好ましい。望ましい鎖長及び／又は飽和度を有する脂質の生成を増加させるため、望ましい鎖長特異性を有するチオエステラーゼが過剰発現するように、より短い鎖長特異性を有するチオエステラーゼの生成がノックアウトされるように、又はそのような遺伝子の発現が低下するように、及び／又は望ましい脂質の飽和度に関与するデサチュラーゼ遺伝子がノックアウトされるように、微細藻類細胞を操作することができる。
【０２４９】
上述のさまざまな酵素は、典型的には、特定の数の炭素原子を含む基質の加水分解に対し、優先的な特異性を有する。例えば、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、炭素原子を１２個含む脂肪酸をＡＣＰから優先的に切断し得る。ある実施形態では、ＡＣＰと長さ特異的なチオエステラーゼとは互いに親和性を有し得るため、これらは組み合わせとして特に有用であり得る（例えば、外来性ＡＣＰとチオエステラーゼ遺伝子とは、それらが由来する特定の組織又は有機体で自然に共発現し得る）。従って、種々の実施形態では、本発明の組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ（又は他の微細藻類又は他の微生物の）細胞は、基質に含まれる炭素原子の数に関して酵素活性（例えば、ＡＣＰからの脂肪酸の切断、アシル−ＣｏＡのアルデヒド若しくはアルコールへの還元、又はアルデヒドからアルカンへの変換）の触媒に特異性を有してタンパク質をコードする外来遺伝子を含むことができる。酵素特異性は、種々の実施形態では、８〜３４個の炭素原子及び好ましくは１６〜１８個の炭素原子を有する基質に対するものであり得る。
【０２５０】
本明細書に記載の細菌及び方法とともに用いるのに適した他の脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼとしては、限定されないが、表６に列挙されたものが挙げられる。
【０２５１】
【表８】
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【０２５２】
誘電性流体のようなバイオ油をベースとする化学品は、ヒマワリ油及びキャノーラ油のような天然エステル（すなわち、種子油）に由来する高オレイン酸（Ｃ１８：１）の脂肪酸組成を有する。表７は、一般的な市販の種子油の脂肪酸プロフィールを示す。以下の市販の種子油のデータは全て、ＵＳ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏｄｅｓ，７ｔｈ  Ｅｄ．２０１０−２０１１から編集した。
【０２５３】
【表９】
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【０２５４】
本明細書に記載の細菌及び方法とともに用いるのに適した脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素としては、限定されないが、表８に列挙したものが挙げられる。
【０２５５】
【表１０】
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【０２５６】
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは高等植物（及びいくつかの微細藻類の種）の脂肪酸生合成の終結因子であり、ほとんどの植物種でこれはＦａｔＡ遺伝子ファミリーのメンバーにより行われ、このメンバーの役割は、Ｃ１６：０からＣ１８：０への段階で伸長を終結させることである。より短鎖の脂肪酸を合成する種（Ｃｕｐｈｅａ、Ｅｌａｅｉｓ、Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ、又はＵｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａなど）では、ＦａｔＢ遺伝子によりコードされる異なるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ群がこの終結工程を行う。
【０２５７】
本明細書に記載される方法での使用に適した他の酵素には、表６及び表８に列挙されるタンパク質のうちの一つと少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有するもの、及び対応する望ましい酵素活性（例えば、アシルキャリアータンパク質からの脂肪酸の切断、アシル−ＣｏＡのアルデヒド若しくはアルコールへの還元、又はアルデヒドからアルカンへの変換）を示すものが含まれる。さらなる実施形態において、酵素活性は、上述の配列のうちの一つと少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の同一性を有する配列に存在し、これらは全て本明細書によって参照により組み込まれる。
【０２５８】
発現させる外来遺伝子（又は不活性化する内因性遺伝子又はその両方）の望ましい組み合わせを選択することにより、細菌により産生される油を用途に応じて調節することができ、次いで、この油を水系バイオマスから抽出してもよい。例えば、細菌は以下を含み得る：（ｉ）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子；（ｉｉ）場合により、自然に共発現するアシルキャリアータンパク質又は脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼに対して親和性を有するアシルキャリアータンパク質；（ｉｉｉ）変異型の内在するデサチュラーゼ遺伝子、ここでは、デサチュラーゼノックアウトなど、突然変異によりデサチュラーゼ遺伝子又はデサチュラーゼタンパク質が不活性化されている；（ｉｖ）内在するステアロイルアシルキャリアータンパク質デサチュラーゼの過剰発現又は異種ＳＡＤの発現；及び（ｖ）前述の任意の組み合わせ。
【０２５９】
脂肪酸アシルＡＣＰチオエステラーゼなど、このような酵素をコードする遺伝子は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓのように、多量の脂質生成を示すことが既に知られている細胞から得ることができる。脂質生成で役割を担うことが既に知られている遺伝子、例えば、二重結合を飽和させる酵素をコードする遺伝子を、個々にレシピエント細胞に形質転換することができる。微細藻類中での脂質生成を変化させる（向上させる）ことのできる遺伝子を同定する方法については、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００８／１５１１４９号に記載されている。
【０２６０】
従って、特定の実施形態では、本発明の実施において、同じ種の野生型細胞と比較して変化したレベルで脂質経路酵素を発現するように遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞又は他の微細藻類又は他の微生物の細胞が利用され得る。ある場合では、上述の細胞は、野生型細胞よりも高いレベルで脂質経路に関連する酵素を発現するように遺伝子操作されているか、及び／又は、野生型細胞よりも高いレベルで脂質経路に関連する酵素を発現するように選択される。ある場合では、脂質経路に関連する酵素は、ピルビン酸脱水素酵素、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、アシルキャリアータンパク質、グリセロール−３  ホスフェートアシルトランスフェラーゼからなる群から選択される。ある場合では、上述の細胞は、野生型細胞よりも低いレベルで脂質経路に関連する酵素を発現するように遺伝子操作されているか、及び／又は、野生型細胞よりも低いレベルで脂質経路に関連する酵素を発現するように選択される。細胞が、脂質経路に関連する酵素を低いレベルで発現する一実施形態では、脂質経路に関連する酵素は、クエン酸シンターゼを含む。
【０２６１】
ある実施形態では、上述の細胞は、野生型細胞と比べ、異なるレベルで脂肪酸合成の包括的な制御因子を発現するように遺伝子操作されているか、及び／又は、異なるレベルで脂肪酸合成の包括的な制御因子を発現するように選択され、それにより、複数の脂肪酸合成遺伝子の発現レベルは、野生型細胞と比べて変化している。ある場合では、脂質経路に関連する酵素は、脂肪酸を改変する酵素を含む。ある場合では、脂質経路に関連する酵素は、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ、グリセロ脂質デサチュラーゼから選択される。ある場合では、細胞は、より低レベルの脂質経路酵素を発現するように、又は特定の脂質経路酵素を全く発現しないように（すなわち、ここで脂質経路酵素は外来遺伝子によりノックアウト又は置換されている）、遺伝子操作され、及び／又は選択されている。
【０２６２】
他の実施形態では、本発明の実施において、１つ以上の外来遺伝子及び／又は１つ以上の不活性化された内因性遺伝子を含む油産生細菌が利用され、ここで外来遺伝子又は内因性遺伝子は、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素、脂肪族アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素、脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼ、デサチュラーゼ、及びアシルキャリアータンパク質からなる群から選択される１つ又は複数のタンパク質をコードする。別の実施形態では、内在するデサチュラーゼ遺伝子は、上記の外来遺伝子の１つ以上を含む細菌で過剰発現する。一実施形態では、外来遺伝子は、プロモーターと動作可能に連結された状態にあり、プロモーターは刺激に応じた誘導性又は抑制性を有する。ある場合では、刺激は、外部から与えられた小分子、熱、冷温、及び培地中の制限窒素又は無窒素からなる群から選択される。ある場合では、外来遺伝子は細胞内区画で発現し、又は他の方法でそこに標的化される。ある実施形態では、細胞内区画は、葉緑体、プラスチド及びミトコンドリアからなる群から選択される。ある実施形態では、細菌は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｋｒｕｇａｎｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉである。
【０２６３】
一実施形態では、外来遺伝子又は不活性化された内在する遺伝子は、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする。ある場合では、外来性遺伝子又は不活性化された内在する遺伝子によりコードされるチオエステラーゼは、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）からの８〜１８炭素脂肪酸の切断を触媒する。ある場合では、外来遺伝子又は不活性化された内在する遺伝子によりコードされるチオエステラーゼは、ＡＣＰからの１０〜１４炭素脂肪酸の切断を触媒する。一実施形態では、外来遺伝子又は不活性化された内在する遺伝子によりコードされるチオエステラーゼは、ＡＣＰからの１２炭素脂肪酸の切断を触媒する。ある実施形態では、外来遺伝子によりコードされるチオエステラーゼは、ＡＣＰからの１６〜１８炭素脂肪酸の切断を触媒する。
【０２６４】
一実施形態では、外来遺伝子は脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素をコードする。ある場合では、外来遺伝子によりコードされる還元酵素は、８〜１８炭素脂肪酸アシル−ＣｏＡの対応する一級アルコールへの還元を触媒する。ある場合では、外来遺伝子又は不活性化された内在する遺伝子によりコードされる還元酵素は、１０〜１４炭素脂肪酸アシル−ＣｏＡの対応する一級アルコールへの還元を触媒する。一実施形態では、外来遺伝子又は不活性化された内在する遺伝子によりコードされる還元酵素は、１２炭素脂肪酸アシル−ＣｏＡのドデカノールへの還元を触媒する。
【０２６５】
本明細書に記載される方法の実施においては、２つの外来遺伝子（又は２つの不活性化された内在する遺伝子）を含む組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ（又は他の微細藻類又は微生物の）細胞が利用されてもよく、ここで第１の外来遺伝子又は不活性化された内在する遺伝子は脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードし、第２の外来遺伝子又は不活性化された内在する遺伝子は、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素、及びアシルキャリアータンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする。ある場合では、２つの外来遺伝子は、それぞれプロモーターと動作可能に連結した状態にあり、プロモーターは刺激に応じた誘導性を有する。ある場合では、各プロモーターは、培地中の制限窒素又は無窒素など、同じ刺激に応じた誘導性を有する。培地中の窒素の制限又は完全な不含は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ及び他の微細藻類及び他の微生物種のような一部の微生物における油の生成を刺激し、油（脂質）の生成を高レベルに誘導するための誘因として使用することができる。本明細書に開示される遺伝子操作方法と組み合わせて用いられるとき、乾燥細胞重量の割合としての脂質は、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％及び少なくとも７５％などの高レベルまで押し上げることができる。
【０２６６】
本明細書に開示される新規油（脂質）及びそれから得られる誘電性流体は、ヒマワリ油及びキャノーラ油のようなＣ１６及びＣ１８脂肪酸が高い他の天然に存在する油とは別のものである。
【０２６７】
一実施形態では、第１の外来遺伝子によりコードされるチオエステラーゼは、ＡＣＰからの８〜１８炭素脂肪酸の切断を触媒する。さらに、より長い鎖長の油が望ましい実施形態では、１つ以上のより短い鎖長（すなわちＣ１４未満、例えば、Ｃ１２、Ｃ１０、及び／又はＣ８）のＴＥ及び／又は対応するＡＣＰ遺伝子の発現を低下させ（その発現を変化させることにより）又は消失させる（例えば、ノックアウトにより）。
【０２６８】
上述の種々の実施形態では、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ（又は他の微細藻類又は他の微生物の）細胞は、脂質経路酵素をコードする少なくとも１つの外来遺伝子又は少なくとも１つの不活性化された（又は発現が低下するように操作された）内在する遺伝子を含み得る。ある場合では、脂質経路酵素は、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、グリセロ脂質デサチュラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、アシルキャリアータンパク質、及びグリセロール−３リン酸アシルトランスフェラーゼからなる群から選択される。他の場合では、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ又は他の細胞は、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素、脂肪族アルデヒド還元酵素、脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼ、及び／又はアシルキャリアータンパク質からなる群から選択される脂質改変酵素を含む。
【０２６９】
ＶＩ．微生物油の生成及びそれから得られる生成物
１．微生物油の生成
本明細書に記載される方法に従い微生物油を生成するため、微生物細胞により生成された未処理の原料油（脂質）を任意の好都合な方法で回収し、又は他の方法で集める。油は、例えば全細胞の抽出によって単離することができる。この方法では、まず細胞を破壊し、次いで、上述のような遠心分離を用いるなどして、細胞内の及び細胞膜／細胞壁に関連する脂質及び脂肪酸、並びに細胞外の炭化水素を、細胞塊から分けることができる。微生物で生成される細胞内脂質は、多くの実施形態において、微生物細胞を溶解するプロセスの後又はその最中に抽出される。
【０２７０】
より具体的には、培養の完了後、微生物は典型的には発酵ブロスから分離される。多くの場合に、この分離は遠心分離によって行われ、これにより微生物バイオマスの濃縮ペーストが生じる。次いで、場合によりバイオマスを洗浄溶液（例えば、脱イオン水）で洗浄し、発酵ブロス及び発酵片を取り除く。場合により、洗浄した微生物バイオマスを乾燥させて（オーブン乾燥、凍結乾燥など）、その後細胞を破壊してもよい。あるいは、発酵が完了している場合には、細胞を発酵ブロスの一部又は全部と分離することなく溶解させてもよい。例えば、細胞は、細胞を溶解させるときに、細胞と細胞外の液体とのｖ：ｖ比が１：１未満であってもよい。
【０２７１】
脂質を含有する微生物を溶解し、溶解物を作成してもよい。本明細書で詳細に記載するように、微生物を溶解する工程（細胞溶解とも呼ばれる）は、熱による溶解、塩基を加えること、酸を加えること、プロテアーゼのような酵素、アミラーゼのような多糖分解酵素を用いること、超音波を用いること、機械的な溶解、浸透圧衝撃を用いること、溶解性ウイルスに感染させること、及び／又は１つ以上の溶解遺伝子の発現を含む、任意の簡便な手段によって行うことができる。溶解を行い、微生物によって産生された細胞内分子を放出させる。微生物を溶解させるための、これらのそれぞれの方法を単独の方法として用いてもよく、同時又は連続して、組み合わせとして用いてもよい。細胞の破壊度は、顕微鏡分析によって観察することができる。本明細書に記載した１つ以上の方法を用い、典型的には、７０％を超える細胞の破壊が観察される。好ましくは、細胞の破壊は、８０％を超えており、より好ましくは、９０％を超えており、最も好ましくは、約１００％である。
【０２７２】
特定の実施形態では、成長した後に微生物を溶解させ、例えば抽出又はさらなる処理のために、微生物油の露出を増加させる。外来性リパーゼ遺伝子を利用している場合、リパーゼ発現（例えば、誘導性プロモーターによる）又は細胞溶解のタイミングは、脂質及び／又は炭化水素の収量を最適化するように調節することができる。以下に、いくつかの溶解技術を記載している。これらの技術を個々に用いてもよく、又は組み合わせて用いてもよい。
【０２７３】
本発明の一実施形態では、微生物を溶解する工程は、微生物を含有する細胞懸濁物を加熱することを含む。この実施形態では、微生物を含む発酵ブロス（又は、発酵ブロスから単離した微生物の懸濁物）を、微生物、すなわち、微生物の細胞壁及び細胞膜が分解するか、又は破壊するまで加熱する。典型的には、かけられる温度は、少なくとも５０℃である。もっと効率よく細胞を溶解させるために、もっと高い温度、例えば、少なくとも３０℃、少なくとも６０℃、少なくとも７０℃、少なくとも８０℃、少なくとも９０℃、少なくとも１００℃、少なくとも１１０℃、少なくとも１２０℃、少なくとも１３０℃、又はそれ以上の温度を使用する。熱処理によって細胞を溶解することは、微生物を沸騰させることによって行ってもよい。又は、熱処理（沸騰させない）をオートクレーブ中で行ってもよい。熱処理された溶解物を、さらなる処理のために冷却してもよい。また、細胞の破壊は、蒸気による処理によって、すなわち、加圧した蒸気を加えることによって行ってもよい。細胞を破壊するための微細藻類の蒸気処理は、例えば、米国特許第６，７５０，０４８号に記載されている。ある実施形態では、蒸気処理は、蒸気を発酵槽に吹き込み、ブロスを所望の温度に約９０分未満、好ましくは約６０分未満、より好ましくは約３０分未満維持することによって行ってもよい。
【０２７４】
本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、微生物を含有する細胞懸濁物に塩基を加えることを含む。塩基は、少なくとも、使用した微生物の水系タンパク質化合物の一部分を加水分解するのに十分なほど強いことが必要である。タンパク質を溶解するのに有用な塩基は、化学分野で知られている。本発明の方法の実施形態で有用な、例示的な塩基としては、限定されないが、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムの水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、及びこれらの混合物が挙げられる。好ましい塩基はＫＯＨである。細胞を破壊するための微細藻類の塩基処理は、例えば、米国特許第６，７５０，０４８号に記載されている。
【０２７５】
本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、微生物を含有する細胞懸濁物に酸を加えることを含む。酸による溶解は、１０〜５００ｍＮの濃度、又は好ましくは、４０〜１６０ｎＭの濃度の酸を用いて行うことができる。酸による溶解は、好ましくは、室温より高い温度（例えば、４０〜１６０℃、すなわち５０〜１３０℃の温度）で行われる。中程度の温度（例えば、室温〜１００℃、特に、室温〜６５℃）の場合、酸による処理は、有益には、音波処理又は他の細胞破壊方法と組み合わせてもよい。
【０２７６】
本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、酵素を用いることによって微生物を溶解することを含む。微生物を溶解するのに好ましい酵素は、プロテアーゼ、及びヘミセルラーゼのような多糖分解酵素（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒに由来するヘミセルラーゼ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、モントリオール；＃Ｈ２１２５）、ペクチナーゼ（例えば、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．に由来するペクチナーゼ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、モントリオール；＃Ｐ２４０１）、Ｍａｎｎａｗａｙ  ４．０Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、セルラーゼ（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅに由来するセルロース；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、モントリオール；＃Ｃ９４２２）、ドリセラーゼ（例えば、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｓｐ．に由来するドリセラーゼ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、モントリオール；＃Ｄ９５１５）である。
【０２７７】
本発明の他の実施形態では、溶解は、例えば、多糖分解酵素のようなセルラーゼ、場合により、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ又はＣｈｌｏｒｅｌｌａウイルスに由来するもの、及び／又は、プロテアーゼ、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓプロテアーゼ、キモトリプシン、プロテイナーゼＫ、Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ  ｂｙ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ、Ｏｄａ  Ｙｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、第８巻、Ｎｕｍｂｅｒ  １、２０００年１月、ｐｐ．２９−３２（４）、Ａｌｃａｌａｓｅ  ２．４  ＦＧ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、に列挙されているプロテアーゼ、Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ  １００Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）のような酵素によって行われる。先に示したプロテアーゼ及び多糖分解酵素の任意の組み合わせを含む、プロテアーゼと多糖分解酵素の任意の組み合わせを用いてもよい。
【０２７８】
別の実施形態では、溶解は、連続圧搾機を用いて行うことができる。このプロセスでは、バイオマスに、高圧状態で、スクリュー型デバイスを用いて力を加え、細胞を溶解させ、細胞内脂質を放出させ、細胞内のタンパク質及び繊維（及び他の成分）と分離させる。
【０２７９】
本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、超音波を用いて、すなわち、音波処理によって行われる。従って、高周波数の音を用いて細胞を溶解させることができる。音は、電子的に発生させ、適切に濃縮した細胞懸濁物に対し、金属片を介して伝搬させてもよい。この音波処理（又は超音波処理）は、細胞懸濁物中に空洞を作り出すことに基づいて、細胞の一体性を破壊する。
【０２８０】
本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、機械的な溶解によって行われる。細胞は、機械的に溶解されてもよく、場合により、炭化水素（例えば、脂質）を集めやすいように均質化してもよい。例えば、加圧による破壊を利用し、細胞を含有するスラリーを制水型オリフィス弁にポンプで圧送してもよい。高圧（１５００ｂａｒまで）をかけ、その後、出口ノズルを通して瞬間的に拡散させてもよい。細胞の破壊は、弁での衝撃、オリフィス内での大きな液体剪断力、放出による急な圧力低下といった３種類の異なる機構によって行われ、これにより、細胞が爆発する。この方法によって、細胞内の分子が放出される。又は、ボールミルを用いてもよい。ボールミルの場合、ビーズのような小さな研磨粒子を含む懸濁物中で細胞を撹拌する。細胞は、剪断力、ビーズ間で研磨されること、ビーズと衝突することによって破壊される。ビーズは、細胞を破壊して、細胞内容物を放出させる。また、細胞は、細胞を破壊するためのブレンド（例えば、例として高速ブレンダー又はＷａｒｉｎｇブレンダー）を用いるか、フレンチプレスを用いるか、又は細胞壁が弱い場合には、遠心分離を用い、剪断力によって破壊されてもよい。
【０２８１】
本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、浸透圧衝撃を与える（すなわち、低張液中に微生物細胞を懸濁する）ことによって行われる。
【０２８２】
本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、微生物を溶解性ウイルスに感染させることを含む。本明細書に記載の方法で用いるのに微生物を溶解するのに適したさまざまなウイルスが知られており、特定の微生物に特定の溶解性ウイルスを選択し、使用することは、当業者の知識の範囲内である。例えば、ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ  ｂｕｒｓａｒｉａ  ｃｈｌｏｒｅｌｌａウイルス（ＰＢＣＶ−１）は、特定の単細胞性の、真核性のクロレラに似た緑色の藻の中で複製し、溶解させる、大きな２０面体のプラークを形成する二本鎖ＤＮＡウイルスのグループ（Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科、クロロウイルス属）の原型である。従って、培養物を任意の適切なクロレラウイルスに感染させることによって、任意の感染しやすい微細藻類を溶解させることができる。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種を、クロレラウイルスを用いて感染させる方法は知られている。例えば、Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．２００６；６６：２９３−３３６；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９９年４月２５日；２５７（１）：１５−２３；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００４年１月５日；３１８（１）：２１４−２３；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２０００；（４４）：１６１−２；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００６年３月；８０（５）：２４３７−４４；Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９；５３：４４７−９４を参照。
【０２８３】
本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、自己消化を含む。この実施形態では、微生物を、微生物を溶解する溶解性タンパク質を生成するように遺伝子操作する。この溶解遺伝子を、誘発性プロモーターを用いて発現させ、まず、細胞は、発酵槽内で望ましい密度まで成長し、その後、プロモーターの誘発によって、細胞を溶解させる溶解遺伝子が発現する。一実施形態では、溶解遺伝子は、多糖分解酵素をコードしている。特定の他の実施形態では、溶解遺伝子は、溶解性ウイルスに由来する遺伝子である。従って、例えば、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａウイルスに由来する溶解遺伝子を、藻の細胞中で発現させてもよい。Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６０、３０８−３１５（１９９９）；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １８０（１９９９）４５−５３；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６３、３７６−３８７（１９９９）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３０、３６１−３６８（１９９７）を参照。溶解遺伝子の発現は、好ましくは、誘発性プロモーター、例えば、低分子、光、熱及び他の刺激の存在のような刺激によって誘発される、微細藻類内で活性なプロモーターを用いてなされる。
【０２８４】
上述の方法によって生成した細胞溶解物から脂質を分離するための種々の方法が利用可能である。例えば、脂質及び脂質誘導体、例えば、脂肪族アルデヒド、脂肪族アルコール、アルカンのような炭化水素を、疎水性溶媒、例えば、ヘキサンで抽出してもよい（Ｆｒｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．１９８９、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１１：７１７を参照）。また、脂質及び脂質誘導体を、液化によって抽出してもよく（例えば、Ｓａｗａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．１９９９、Ｂｉｏｍａｓｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ  １７：３３−３９、及びＩｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９３、Ｂｉｏｍａｓｓ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ  ６（４）：２６９−２７４を参照）；油の液化によって抽出してもよく（例えば  Ｍｉｎｏｗａ  ｅｔ  ａｌ．１９９５、Ｆｕｅｌ  ７４（１２）：１７３５−１７３８を参照）；超臨界ＣＯ２抽出によって抽出してもよい（例えば、Ｍｅｎｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００３、Ｉｎｏｒｇａｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３５６：３２８−３３４を参照）。Ｍｉａｏ及びＷｕは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｏｃｏｉｄｅｓの培養物から、微細藻類の脂質を回収するプロトコルを記載しており、このプロトコルでは、細胞を遠心分離処理によって集め、蒸留水で洗浄し、凍結乾燥によって乾燥させた。得られた細胞粉末を乳鉢で細かく粉砕し、次いで、ｎ−ヘキサンで抽出した。Ｍｉａｏ及びＷｕ、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６）９７：８４１−８４６。
【０２８５】
従って、本明細書に記載の微生物によって生成した脂質、脂質誘導体、炭化水素を、有機溶媒を用いた抽出によって回収することができる。ある場合では、好ましい有機溶媒は、ヘキサンである。典型的には、事前に溶解物成分を分離させることなく、溶解物に有機溶媒を直接加える。一実施形態では、上述の１つ以上の方法によって生成した溶解物を、脂質及び／又は炭化水素成分が有機溶媒と溶液を形成するのに十分な時間、有機溶媒と接触させる。ある場合では、溶液をその後にさらに精製し、特定の望ましい脂質成分又は炭化水素成分を回収する。ヘキサンによる抽出方法は、当該技術分野でよく知られている。
【０２８６】
微生物から脂質を抽出する他の方法は、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願米国特許第１０／０３１１０８号に記載される。
【０２８７】
本明細書に記載されるように、細胞によって産生される脂質及び脂質誘導体、例えば、脂肪族アルデヒド、脂肪族アルコール、アルカンのような炭化水素を、上述のように、リパーゼのような１つ以上の酵素を用いて改変してもよい。炭化水素が、細胞の外の環境に存在する場合、１つ以上の酵素を、この酵素が炭化水素を改変しするか、又は炭化水素前駆体からの合成を完結させるような条件下で、この環境に加えてもよい。又は、炭化水素を、細胞材料から部分的又は完全に単離してから、酵素のような１つ以上の触媒を加えてもよい。このような触媒は、外から加えられ、触媒の活性は、細胞の外で生じるか、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じる。
【０２８８】
２．微生物油のさらなる処理
従って、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞によって産生されるか、又は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで酵素によって改変される脂質及び炭化水素は、本明細書に記載されるように、従来の手段によってさらに処理されてもよい。処理は、「クラッキング」して、炭化水素分子を小さくし、水素：炭素比を大きくすることを含んでいてもよい。触媒によるクラッキング方法及び熱によるクラッキング方法は、炭化水素及びトリグリセリド油脂の処理において通常用いられる。触媒による方法は、固体酸触媒のような触媒の使用を含む。触媒は、シリカ−アルミナ又はゼオライトであってもよく、この触媒により、炭素−炭素結合が不均衡又は非対称に破壊され、カルボカチオンとヒドリドアニオンが生じる。これらの反応性中間体は、次いで、転移するか、又は別の炭化水素にヒドリドが移動する。このように、この反応によって、中間体が再生し、自己連鎖的な機構を生じ得る。また、炭化水素を処理し、炭化水素中の炭素−炭素二重結合又は三重結合を減らしてもよく、場合によりゼロにしてもよい。また、炭化水素を処理し、炭化水素中の環又は環状構造を除去するか、又は取り除いてもよい。また、水素：炭素比が大きくなるように、炭化水素を処理してもよい。この処理は、水素添加（「水素化」）及び／又は炭化水素を小さな炭化水素にする「クラッキング」を含んでいてもよい。
【０２８９】
脂質の抽出後、本明細書に記載される方法によれば、脂質を１つ以上の処理工程にかけることができる。これらの処理工程は、燃料の生成時に未精製油（例えば、石油及び他の供給源）に対して行われる精製工程とは別個のものである。これらの処理工程は、いくつかの態様では、人の食用に生成する間に種子油に対して行われるものと同等である。ある実施形態では、抽出した脂質は脱ガムされ、レシチン及び他のリン脂質が抽出される。他の実施形態では、抽出した脂質は、塩基又はアルカリ金属を使用して精製される。さらに他の実施形態では、抽出した脂質は漂白クレイ、通常は酸性クレイに通される。他の実施形態では、抽出した脂質は脱臭され、アルデヒド及びケトンのような揮発性の不純物が除去又は低減される。さらに他の実施形態では、抽出した脂質は脱ろうされ、ワックス又は飽和脂肪が除去又は低減される。前述の処理工程は、所望の生成物の特徴に応じて、抽出した脂質に関するいかなる組み合わせで行われてもよい。精製され（例えば、塩基又はアルカリ金属による）、漂白され（例えば、漂白クレイによる）及び／又は脱臭された抽出脂質は、通常ＲＢＤ油と呼ばれる。本明細書に記載される微細藻類及び／又は油産生酵母に由来する抽出脂質から生成されたＲＢＤ油は、誘電性流体の生成を含め、さまざまな工業用途に有用である。
【０２９０】
ある実施形態では、脱ガムが実施され、リン脂質のような混入物質が油から除去される。本発明のある実施形態では、抽出した油の脱ガムは、精製、漂白及び脱臭（すなわちＲＢＤ）の一部である。ＲＢＤプロセスにより、抽出した油の臭い、色、及び／又は味が除去又は低減される。ある実施形態では、精製プロセスは、通常、脱ガム及び中和工程の２工程からなり、中和工程では、油中の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）が水酸化ナトリウムによる苛性アルカリストリッピングによって取り除かれる。漂白工程には、油をさまざまな漂白クレイと混合して色、微量金属及び硫黄化合物を吸着させることが含まれ得る。脱臭工程は、低圧及び高温で行われる蒸留プロセスであってもよい。例示的な蒸留プロセスでは、油が真空下に置かれ、蒸気で加熱することにより、任意の残留する味及び臭い並びにＦＦＡが取り除かれる。また、脱臭は、活性炭による処理によっても達成することができる。
【０２９１】
上記に列挙される工程は、流動点を低下させる働きをし得る。種々の実施形態では、微生物油（脂質）の流動点は、約−１０℃、約−１５℃、約−２０℃、約−２５℃、約３０℃、約−３５℃、又は約−４０℃まで低下され得る。さらに、微生物油の流動点は、これらの値のいずれかを境界とする任意の範囲内、例えば、約−１０℃〜−４０℃又は約−１５℃〜約−３５℃等にあってもよい。流動点の低下は、ステアリン画分として知られる主としてパルミチン酸及びステアリン酸トリグリセリドからなる飽和画分の相対的な割合が、これらの工程によって低下するために起こり得る。油を画分化すると、油の飽和トリグリセリド濃度が低下する。画分化は、植物油業界で公知の脱ろうプロセスのような、乾式画分化により達成されてもよい。このプロセスでは、まず、微生物（例えば、藻類）の油が、植物油業界で用いられるものと同様の方法によって精製、漂白及び脱臭される。それにより、−５〜−１０℃の範囲、例えば−８℃の流動点を有する油が得られる。
【０２９２】
次いで、結晶核が形成されるまで、ＲＢＤ油の温度を制御された方法で下げることができる。次いで、油をその結晶化温度に数時間維持して、結晶の成長を促進し得る。次いで、結晶を濾過により取り出すと、２つの画分が得られる：ステアリン画分の一部又はほとんどを含有する固相、及び主としてオレイン画分を含有する液相。これにより、−８〜−１５℃の範囲、例えば−１１℃の流動点を有する油が得られる。液相は、より低い結晶化温度まで再び画分化に供することで、ステアリンのさらなる除去を生じさせることができる。得られる精製された液体画分は、植物油業界で一般的に知られるとおりのスーパーオレインに相当するもので、天然の微生物油と比べてより良好な熱的特性を有する。例えば、２回目の画分化により、−１５℃〜−２５℃の範囲、例えば−２０℃の流動点を有する油を得ることができる。得られた油は、重要なことに食品用途を含めた、さまざまな用途に極めて有用であり、食品用途では微生物油を、割安で、且つ多くの場合により健康的な、動物油及び植物油の代替品として、全面的に又は部分的に用いることができる。
【０２９３】
３．微生物油から得られる生成物
また、本明細書に記載される微生物油を使用して、潤滑剤、油圧作動液、工業用油、又は誘電性流体のような生成物を生成することもできる。一般的な工業用油としては、チェーンソーバー潤滑剤、金属加工液、食品級潤滑剤、ギヤオイル、海洋用オイル、エンジン潤滑剤、トラクター用オイル、農業機器潤滑剤、エレベータ用オイル、離型油などが挙げられる。誘電性流体（ｄｉｅｌｅｃｔｉｃ  ｆｌｕｉｄ）は、典型的には、電気部品（特に高電圧の電気出力分布機器のもの）、例えば、オートリクローザ、コンデンサ、回路遮断器、高電圧流体で満たされたトランスミッションケーブル、配電部品、スイッチングギヤ（例えば、高電圧負荷開閉器、例えば米国特許第６，７９７，９０９号に記載されるもの）、変圧器、変速装置部品、及び電圧調整器の冷却及び／又は電気的絶縁に使用される。
【０２９４】
従来の誘電性流体はミネラル油ベースの潤滑剤を含む。それらには、グループ１、グループＩＩ、及びグループＩＩ＋ベースオイルが含まれ、従来どおり精製され又は軽く水素化処理されていて、且つ１２０未満の粘度指数（ＶＩ）を有する石油ベースの油である。これにはまた、高度に精製された従来の油生成物であるグループＩＩＩベースオイル（米国での「合成モータオイル」を含む）も含まれる。グループＩＩＩベースオイルは、グループ１又はグループＩＩ／ＩＩ＋ベースオイルを水素化処理（ハイドロクラッキング及び／又は水素異性化）することによって作ることができ、グループＩ、ＩＩ、又はＩＩ＋ベースオイルと比べて含有する飽和物、硫黄、及び窒素が少なく、１２０より大きいＶＩを有する。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（ＡＳＴＭ）は、誘電性流体及び他の炭化水素組成物（ディーゼル燃料（ＡＳＴＭ  Ｄ９７５）、ジェット燃料（ＡＳＴＭ  Ｄ１６５５）、及びバイオディーゼル（ＡＳＴＭ  Ｄ６７５１）など）について、沸点、セタン価、曇り点、引火点、粘度、アニリン点、硫黄含有量、含水量、灰分、銅板腐食、及び炭素残渣のようないくつかの要素のうちのいずれかに従う仕様を確立している。
【０２９５】
バイオベースの誘電性流体は、さまざまなプロセスにより調製することができる。例えば、一つのプロセスは、未精製の植物油から出発して、脱ガム、アルカリ精製、漂白、脱臭、水素化、脱ろう（ＲＢＤ植物油を生じさせるため）、クレイ処理による微量の極性化合物及び酸性物質の除去（米国特許第６，２７４，０６７号を参照）、及び添加剤との混合を含み、それによりバイオベースの誘電性流体が生成される。
【０２９６】
誘電性流体の主要な特性には、粘度、可燃性、反応性、混和性、電気絶縁能力、生分解性、及び製造費用が含まれる。これらの及び他の特性を以下で考察するが、読者は、本発明の特定の実施形態の利点のいくつかについて、ミネラル油ベースの誘電性流体に対する従来のバイオベースの誘電性流体の利点及び欠点のいくつかを理解することにより、より良く理解することができる。粘度については、バイオベースの誘電性流体は一般的により高い粘度及び流動点を有し、従ってミネラル油ベースの誘電性流体と比べて劣った低温特性を有する。しかしながら、ミネラル油はさまざまな供給源間で一貫性がなく、且つ供給源の化合物が複雑であるため、ミネラル油ベースの誘電性流体の粘度はロット毎に異なり得る。バイオベースの誘電性流体は、一般的にミネラル油ベースの誘電性流体と比べて引火点及び燃焼点が高い（少なくとも２倍高い）。バイオベースの誘電性流体は、一般的にミネラル油ベースの誘電性流体と比べて加水分解、熱、及び酸化に関する安定性が劣り、酸価が（約２倍）高い。バイオベースの誘電性流体は、一般的にミネラル油ベースの誘電性流体と比べて高い生分解性を有し、毒性が低く、再生不能なものと対比される再生可能な資源から生産される。バイオベースの誘電性流体は、一般的にミネラル油ベースの誘電性流体と比べて生成にかかる費用が高く、より多くの添加剤が必要である。
【０２９７】
本発明の方法は新規の誘電性流体を提供し、これは、特定の実施形態では、従来のバイオベースの誘電性流体の利点を全て有し、欠点が少なく、ある実施形態では欠点がない。本方法のこれらの及び他の利点は、誘電性流体の一般的特性についての以下の考察を考慮すると、より良く理解することができる。
【０２９８】
理想的には、誘電性流体の粘度は、温度に伴う変化が可能な限り小さくなければならない。粘度は、流れ又は剪断に対する流体の抵抗性の尺度（「濃さ」）であり、動粘性（ｋｖ）及び絶対値（動的）で測られる（４０℃及び１００℃におけるｃＳｔ又はｍｍ２／ｓ）（ＡＳＴＭ  Ｄ２２７０−０４；ＡＳＴＭ  Ｄ４４５；ＡＳＴＭ  Ｄ８８）。一般的に、２つの動く表面を適切に離れさせる最小粘性の潤滑剤が望ましい。粘度は、ときに油圧作動液の最も重要な特性と考えられる。粘度が高過ぎる場合、摩擦、圧力降下、パワー消費、及び発熱が増加する。粘度が低過ぎる場合、高い動作温度で内部漏れの増加が起こり得る。可動部品の過剰な摩耗又は起こり得る焼付きを防ぐには、油膜は不十分であり得る。さまざまな供給源から得られる誘電性流体の例示的な粘度（ｃＳｔ単位）は以下である：ミネラル油由来：４０℃で２０及び１００℃で４；大豆油由来：４０℃で３０及び１００℃で７．６；ヒマワリ油由来：４０℃で４０及び１００℃で８．７；及び菜種（キャノーラ）油由来：４０℃で３３（Ｓｉｎｉａｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｌｕｂｒｉｃａｔｉｏｎ；２４，１０１−１１０（２００７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ；Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．，８６，１７６９−１７８０（２００６））。本発明の方法は、特定の実施形態では、前述の供給源から得られる誘電性流体の粘度と同様の粘度を有する誘電性流体を提供し得る。例示的な実施形態では、誘電性流体は、４０℃で約１１０ｃＳｔ未満、例えば２０〜３０ｃＳｔの範囲の粘度、及び／又は１００℃で約２〜約１５ｃＳｔ、例えば４〜８ｃＳｔの範囲の粘度を有する。
【０２９９】
粘度指数（ＶＩ、無単位数）は、温度の変動に伴う粘度の変動の計測値である。ＶＩについては、４０℃での油のｋｖが２つの（ＶＩが０及び１００の）基準油と比較され、ここで全ての油は１００℃で同じｋｖを有する（ＡＳＴＭ  Ｄ２２７０）。ＶＩ値は、一般的に可能な限り高くなければならない。高いＶＩ値は、温度に伴う油の粘度の変化が小さいことを示す。一般に：低いＶＩは３５未満であり；中程度のＶＩは３５〜８０であり；高いＶＩは８０〜１１０であり；極めて高いＶＩは１１０〜１２５であり；極度のＶＩは１２５〜１６０であり；及び極度に高いＶＩは１６０以上である。さまざまな出発物質から得られる誘電性流体のＶＩには、以下が含まれる：ミネラル油由来：１０３；大豆油由来：２４６；及びヒマワリ油由来：２０６（Ｓｉｎｉａｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｌｕｂｒｉｃａｔｉｏｎ；２４，１０１−１１０（２００７））。本発明の方法は、特定の実施形態では、前述の供給源から得られる誘電性流体のＶＩと同様のＶＩを有する誘電性流体を提供し得る。
【０３００】
流動点は、液体が流れ、又は流動する最低温度（℃）である（ＡＳＴＭ  Ｄ９７）。流動点は、誘電性流体が使用されるときの予想される最低周囲温度より少なくとも１０℃低くなければならない。さまざまな出発物質から得られる誘電性流体の流動点には、以下が含まれる：ミネラル油由来：−５０℃；大豆油由来：−９℃；ヒマワリ油由来：−１２℃；及び菜種（キャノーラ）油由来：−２１℃（Ｓｉｎｉａｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｌｕｂｒｉｃａｔｉｏｎ；２４，１０１−１１０（２００７））。本発明の方法は、特定の実施形態では、前述の供給源から得られる誘電性流体の流動点と同様の流動点を有する誘電性流体を提供し得る。種々の実施形態では、微生物油ベースの誘電性流体の流動点は、約−１０℃、約−１５℃、約−２０℃、約−２５℃、約３０℃、約−３５℃、又は約−４０℃であり得る。さらに、微生物油ベースの誘電性流体の流動点は、これらの値のいずれかを境界とする任意の範囲内、例えば、約−１０℃〜−４０℃又は約−１５℃〜約−３５℃等にあってもよい。
【０３０１】
例えば、及び上述のように、本明細書に記載される方法に従い生成されるＲＢＤ油は、約−８℃以下の流動点で容易に生成することができる。この流動点は、ＲＢＤ油を流動点降下剤と混合することによりさらに下げることができ、油に添加される流動点降下剤の量に基づき−１５〜−２０℃以下の範囲の流動点を有する油が実現される。一回の画分化からのオレイン画分が、約−１１℃の流動点を有する油を容易に生成し、この流動点は、オレイン画分を流動点降下剤と混合することによりさらに下げることができ、油に添加される流動点降下剤の量に基づき−１６〜−２０℃以下の範囲の流動点を有する油が実現される。２回目の画分化からのオレイン画分（「スーパーオレイン」）は、約−２０℃の流動点を有する油を容易に生成し、この流動点は、スーパーオレイン画分を流動点降下剤と混合することによりさらに下げることができ、油に添加される流動点降下剤の量に基づき−２０℃未満、すなわち−２６℃以下の流動点を有する油が実現される。さまざまな流動点降下剤が、Ｃｈｅｖｒｏｎ、Ｏｒｏｎｉｔｅ、Ｉｎｆｉｎｅｕｍ、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ、ＲｏｈｍＭａｘ  Ｅｖｏｎｉｋなどから市販されている。本明細書に記載される微生物油（脂質）で用いられる例示的な流動点降下剤としては、ＶＩＳＣＯＰＬＥＸ（登録商標）１０−３１０又は１−１３３（Ｒｏｈｍａｘ−Ｅｖｏｎｉｋ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  ＧｍｂＨ）、又は他のポリ（アルキル）アクリレート及びポリ（メチル）アクリレート、例えばＩＮＦＩＮＥＵＭ（登録商標）Ｖ−３５１（Ｉｎｆｉｎｅｕｍ  ＵＫ  ｌｉｍｉｔｉｅｄ）、ＰＭＡ−Ｄ１１０及びＰＭＡ−Ｄが挙げられる。
【０３０２】
流体粘度が不十分で流体膜が表面接触を防止しない場合には（ＡＳＴＭ  Ｄ２８８２）、早期に摩耗が起こるため、誘電性流体の潤滑性（耐摩耗特性）は重要である。ある実施形態では、本発明の方法は、良好な（ＡＳＴＭ  Ｄ２８８２と同等か、又はそれより良好な）潤滑性を有する誘電性流体を提供する。
【０３０３】
誘電性流体にとって、揮発性、すなわち油の気化しやすさ（蒸気ａｔｍ対℃）もまた重要である。一般的に、揮発性は低いほど好ましい。ある実施形態では、本発明の方法は、ミネラル油ベースの誘電性流体及び従来のバイオベースの誘電性流体と同程度に低く、さらにはそれより低い揮発性を有する誘電性流体を提供し得る。
【０３０４】
誘電性流体の可燃性は重要である。一般的に、可燃性は低いほど好ましい（“Ｂｉｏ−Ｂａｓｅｄ  Ｌｕｂｒｉｃａｎｔｓ：Ａ  Ｍａｒｋｅｔ  Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ  Ｓｔｕｄｙ  Ｕｐｄａｔｅ”  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｏｙｂｅａｎ  Ｂｏａｒｄ，Ｎｏｖ．２００８，Ｏｍｎｉ  Ｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｌｔｄ．，ｗｗｗ．ｓｏｙｎｅｗｕｓｅｓ．ｏｒｇ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｒｅｐｏｒｔｓ／ＢｉｏＢａｓｅｄＬｕｂｒｉｃａｎｔｓＭａｒｋｅｔＳｔｕｄｙ．ｐｄｆを参照）。本発明の方法は、特定の実施形態では、ミネラル油ベースの誘電性流体及び従来のバイオベースの誘電性流体と同程度に低く、さらにはそれより低い可燃性を有する誘電性流体を提供し得る。
【０３０５】
引火点は、油が気化して着火性混合気を形成する最低温度（℃）である。ＡＳＴＭ  Ｄ３２７８、Ｄ３８２８、Ｄ５６、及びＤ９３に、誘電性流体に適した引火点仕様が記載されている。油の発火を防ぐため、引火点は一般的に可能な限り高くなければならない。さまざまな供給源から得られる誘電性流体の引火点には、以下が含まれる：ミネラル油由来：１４７℃；及びＴＡＧ由来（典型的）：３２４℃（Ｎｅｗ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｏｌａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｗｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒｓ，ｗｗｗ．ｃｏｏｐｅｒｐｏｗｅｒ．ｃｏｍ／Ｌｉｂｒａｒｙ／ｐｄｆ／０００４８．ｐｄｆ）。ある実施形態では、本発明の方法は、前述の供給源から得られる誘電性流体の引火点と同様の、及びＡＳＴＭ  Ｄ１３１０及びＡＳＴＭ  Ｄ９２仕様以上の引火点を有する誘電性流体を提供し得る。
【０３０６】
燃焼点は、裸火で着火後、油が少なくとも５秒燃焼し続け得る最低温度（℃）である。ＡＳＴＭ  Ｄ１３１０及びＡＳＴＭ  Ｄ９２に、誘電性流体に適した燃焼点仕様が記載されている。油の発火を防ぐため、燃焼点は可能な限り高くなければならない。さまざまな供給源から得られる誘電性流体の燃焼点には、以下が含まれる：ミネラル油由来：１６５℃；及びＴＡＧ由来（典型的）：３６０℃（Ｎｅｗ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｏｌａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｗｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒｓ，ｗｗｗ．ｃｏｏｐｅｒｐｏｗｅｒ．ｃｏｍ／Ｌｉｂｒａｒｙ／ｐｄｆ／０００４８．ｐｄｆ）。ある実施形態では、本発明の方法は、前述の供給源から得られる誘電性流体の燃焼点と同様の、及びＡＳＴＭ  Ｄ１３１０及びＡＳＴＭ  Ｄ９２仕様以上の燃焼点を有する誘電性流体を提供し得る。ある実施形態では、燃焼点は３００℃を上回り、例えば３００℃〜４５０℃である。
【０３０７】
誘電性流体の反応性は重要である；誘電性流体は、酸／塩基、熱、及び空気と反応してはならない（又は低反応性を呈しなければならない）。
【０３０８】
加水分解反応性は、酸又は塩基の存在下における流体の分解に対する感受性を指す。ＡＳＴＭ  Ｄ２６１９及びＡＳＴＭ  Ｄ９４３に、誘電性流体に適した加水分解反応性が記載されている。ＴＡＧでは、感受性を有する官能基はエステル及び酸／塩基感受性官能基である。本発明の方法は、特定の実施形態では、低い加水分解反応性を有する（ＡＳＴＭ  Ｄ２６１９及び／又はＡＳＴＭ  Ｄ９４３と同等か、又はそれより良好な）誘電性流体を提供し得る。
【０３０９】
熱安定性は、誘電性流体の熱分解に対する感受性を指す。バイオ油由来の誘電性流体では、熱的不安定性は、典型的には、最終的に脱離生成物をもたらすグリセロール上のβ−水素に起因する。本発明の方法は、特定の実施形態では、高い熱安定性を有する（従来のバイオ油由来の誘電性流体の熱安定性と等しいか、又はそれより高い）誘電性流体を提供し得る。
【０３１０】
酸化感受性は、酸化生成物を形成する酸素との反応に対する誘電性流体の感受性を指す。ＡＳＴＭ  Ｄ９４３及びＡＳＴＭ  Ｄ２２７２に、誘電性流体に適した酸化安定性が記載されている。酸化に対しては低感受性が望ましい；値が高いほど、より酸化しやすい潤滑剤を指す。特定の実施形態では、本発明の方法は、特定の実施形態において、低酸化感受性を有する（例えば、ＡＳＴＭ  Ｄ９４３又はＡＳＴＭ  Ｄ２２７２）誘電性流体を提供し得る。
【０３１１】
中和価（酸価／酸化指数）は、油又は誘電性流体中の酸の量の尺度である。酸は、油（又は誘電性流体）が経年及び修理点検に伴い酸化すると形成される。酸は、バイオベースの潤滑剤では、酸化、エステル熱分解、又は酸／塩基加水分解によって生じる。ＡＳＴＭ  Ｄ９４７、ＡＳＴＭ  Ｄ３４８７、及びＡＳＴＭ  Ｄ６８７１に、誘電性流体に適した中和価が記載されている。一般的に、酸価は可能な限り低くなければならない。酸価は、標準的なミネラル油について０．０３であり、バイオベースの油について０．０６である（Ｅｓｔｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｆｌｕｉｄｓ，ＩＥＥＥ／ＰＥＳ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ７，２００３，ｗｗｗ．ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒｓｃｏｍｍｉｔｔｅｅ．ｏｒｇ／ｉｎｆｏ／Ｆ０３／Ｆ０３−ＥｓｔｅｒＦｌｕｉｄｓ．ｐｄｆ）。本発明の方法は、特定の実施形態では、低い酸価を有する（例えば、ＡＳＴＭ  Ｄ９４７、ＡＳＴＭ  Ｄ３４８７、又はＡＳＴＭ  Ｄ６８７１）誘電性流体を提供し得る。
【０３１２】
混和性は、流体が他の流体と混合する能力を指す。理想的には、誘電性流体は他の潤滑剤、流体、及び添加剤と良好に混合しなければならないが、水とは良好に混合してはならない。抗乳化度は、油圧作動液が水との混合にどの程度抵抗するかを指す。抗乳化度は、誘電性流体において最適である。望ましい潤滑剤及び添加剤との混和性は、誘電性流体において最適である。特定の実施形態では、本発明の方法は、特定の実施形態において、良好な混和性及び抗乳化度を有する誘電性流体を提供し得る。
【０３１３】
誘電性流体は、良好な電気絶縁特性を有しなければならず、すなわち電流の散逸を防止しなければならない。変圧器に関して絶縁力率試験が行われ、誘電損失が計測される（％で計測）。この値は変圧器の状態−湿潤度、乾燥度、絶縁性の低下、巻線の、バリアの、タップ切換器の、ブッシングの及び油の状態−を報告する。誘電性流体に関連する力率の値は、可能な限り低くなければならず、典型的には０．５％以下でなければならない。例えば、精油所から出荷された新しい油の力率は、２５℃で０．０５％以下及び１００℃で０．３％以下でなければならない（ｗｗｗ．ｎｔｔｗｏｒｌｄｗｉｄｅ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈ２２０９．ｈｔｍに引用されるとおりのＩＥＥＥ指針Ｃ５７、１０６−１９９１）。６９ｋＶ以下で動作する新しい機器の新しい油については、力率は２５℃で０．１５％以下及び１００℃で１．５％以下でなければならない；６９ｋＶから２８８ｋＶ以下で動作するものについては、力率は２５℃で０．１０％以下及び１００℃で１．０％以下でなければならない；３４５ｋＶ以上で動作するものについては、力率は２５℃で０．０５％以下及び１００℃で０．３％以下でなければならない。回路遮断器用の新しい油は、２５℃で０．０５％以下及び１００℃で０．３％以下の力率を有しなければならない。回路遮断器で用いられる油は、２５℃で１．０％を上回る力率を有してはならない。本発明の方法の特定の実施形態は、望ましい力率要件を備える誘電性流体を提供する。
【０３１４】
絶縁耐力は、誘電性流体（電気絶縁体）が壊れずに抵抗することのできる最大電界強度を指す。絶縁耐力はＭＶ／ｍの単位で計測され（相対誘電率）、ＡＳＴＭ  Ｄ８７７が誘電性流体に適した仕様を提供している。電気絶縁体としての使用には、潤滑剤の絶縁耐力は可能な限り高くなければならない。本発明の方法は、特定の実施形態では、ＡＳＴＭ  Ｄ８７７によって規定される絶縁耐力と同等の、又はそれより優れた絶縁耐力を有する誘電性流体を提供し得る。
【０３１５】
損失係数は、電気絶縁体として使用するときの誘電性流体に起因する電気損失の尺度であり、２５℃における％単位で計測される。ＡＳＴＭ  Ｄ９２４に、誘電性流体に適した仕様が提供されている。電気絶縁体としては、損失係数の値は可能な限り低くなければならない。特定の実施形態では、本発明の方法は、ＡＳＴＭ  Ｄ９２４によって規定される損失係数と同等の、又はそれより優れた損失係数を有する誘電性流体を提供する。
【０３１６】
電気伝導度は、電気絶縁体として使用するときの、誘電性流体の電流を伝導する能力の尺度であり、Ｓ・ｍ−１の単位で計測される。ＡＳＴＭ  Ｄ２６２４に、誘電性流体に適した仕様が提供されている。絶縁体としては、誘電性流体の電気伝導度の値は可能な限り低くなければならない。本発明の方法の実施形態は、ＡＳＴＭ  Ｄ２６２４によって規定される電気伝導度と比較して望ましい電気伝導度を有する誘電性流体を提供する。
【０３１７】
電気変圧器での使用及び他の用途には、誘電性流体の熱的特性は、熱が効率的に伝達されるものでなければならない。比熱は物質の熱容量を指し、ｃａｌ／ｇｍ／℃の単位で計測される。ＡＳＴＭ  Ｄ−２７６６に、誘電性流体に適した仕様が提供されている。比熱の値が高いほど、より効率的な熱伝達及び冷却が可能になる。比熱の値は、ミネラル油由来の誘電性流体について一般的に約０．３９であり、ＴＡＧ由来の誘電性流体について約０．４５である（Ｓａｆｅｔｙ  Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｏｌａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｗｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒｓ，ｗｗｗ．ｃｏｏｐｅｒｐｏｗｅｒ．ｃｏｍ／Ｌｉｂｒａｒｙ／ｐｄｆ／０００４８．ｐｄｆ）。本発明の実施形態における方法は、０．３９以上の、及び／又はＡＳＴＭ  Ｄ２６２４仕様を満たす比熱値を有する誘電性流体を提供し得る。
【０３１８】
誘電性流体の環境特性は重要である。一般的に、流出又は他の事故の環境影響を軽減するように選択された誘電性流体が用いられなければならない。生分解性は、環境中で二酸化炭素と水に分解する誘電性流体の特性を指し、一般的に２８日あたりの％の単位で計測される。ＯＥＣＤ  ３０１Ｂ及びＡＳＴＭ  Ｄ−６０４６に、誘電性流体に適した生分解性仕様が提供されている。易生分解性の生分解性値は、一般的に約１００％であり；本質的に生分解性の生分解性値は、一般的に２０〜７０％であり；及び非生分解性の生分解性値は、一般的に無視し得るほど僅か乃至０％である。ミネラル油由来の誘電性流体は、一般的に１５〜３５％の範囲の生分解性値を有し、バイオ油由来の誘電性流体は、一般的に７０〜１００％の範囲の生分解性値を有する。本発明の方法の特定の実施形態は、７０〜１００％の範囲の生分解性値を有する誘電性流体を提供し得る（Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｌｕｂｒｉｃａｎｔｓ  Ｍａｎｕａｌ：Ｂｉｏｂａｓｅｄ  Ｏｉｌｓ，Ｆｌｕｉｄｓ，＆  Ｇｒｅａｓｅｓ  ｗｗｗ．ｒｅｎｅｗａｂｌｅｌｕｂｒｉｃａｎｔｓ．ｃｏｍ／  ＲｅｎｅｗａｂｌｅＬｕｂｒｉｃａｎｔｓＭａｎｕａｌ＿  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ．ｈｔｍｌ＃Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎを参照）。
【０３１９】
ヨウ素価（又はヨウ素数）は、油に関する不飽和度の尺度である。より具体的には、ヨウ素価は、油中の不飽和結合により消費されるヨウ素の質量である。乾性油は約１７５以上の比較的高いヨウ素価を有する。大豆油は約１３０であり、オリーブ油は約８０のヨウ素価を有する。ヨウ素価は、当該技術分野ではルーチン的に決定されている。ヨウ素価を決定する標準方法には、ＡＳＴＭ  Ｄ５７６８−０２（２００６）及びＤＩＮ  ５３２４１が含まれる。種々の実施形態では、微生物油をベースとする生成物、例えば誘電性流体中の微生物油は、約２５〜約２００、例えば、約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、又は約１７５のヨウ素価を有し得る。さらに、ヨウ素価は、これらの値のいずれかを境界とする任意の範囲内、例えば、約２５〜約１７５、約５０〜約２００、約５０〜約１７５等にあってもよい。
【０３２０】
脂肪酸不飽和もまた変化させることができる。不飽和を増加させると、凝固点／流動点が低下する。高オレイン酸バイオ潤滑剤に見られるような一価不飽和が現在最適であり、流動点と酸化反応性との均衡に相当する。一価不飽和油は空気と反応するが、多価不飽和ＦＡ又はＰＵＦＡと比べるとはるかに緩徐である。ＰＵＦＡの例としては、アラキドン酸（ＡＲＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）が挙げられる。二価及び多価不飽和ＦＡは酸化に対する感受性が高く、電気的な用途には不適である。植物油から得られる誘電性流体の一つの問題は、多価不飽和ＦＡ（例えば、リノール酸及びリノレン酸）の存在である。本発明の一部の実施形態の誘電性流体の一つの利点は、それが含む（又はそれが由来する）微生物油が二価及び多価不飽和ＦＡを、他のバイオ油から得られる誘電性流体が含有するものと比べて、ほとんど、及びある実施形態では全く含有しないことである。
【０３２１】
誘電性流体の脂質プロフィールは、通常は原材料油の脂質プロフィールと極めて類似している。より長い鎖（Ｃ１６〜Ｃ１８）の一価不飽和脂肪酸の量が多いことは、誘電性流体としての使用に好ましい。多価不飽和脂肪酸（Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、ＡＲＡ、ＥＰＡ及びＤＨＡなど）は、酸化及び酸化生成物の生成から、好ましくない。飽和脂肪酸は、高い凝固点を有する固体又は液体である傾向を有し、従って飽和脂肪酸が誘電性流体中に多量にあるのは望ましくない。種々の実施形態では、誘電性流体に有用な微生物油（脂質）は、少なくとも約５０％のＣ１８：１、例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、及び少なくとも約９０％のＣ１８：１である。これらの又は他の実施形態では、微生物油（脂質）は約１０％未満のＣ１８：２、例えば、約７．５％未満、約５％未満、約２．５％未満、及び約１％未満のＣ１８：２である。微生物油は、合計１００％以下になるＣ１８：１及びＣ１８：２の割合の任意の組み合わせを有することができる。例えば微生物油は、少なくとも５０％のＣ１８：１及び１０％未満のＣ１８：２又は少なくとも８０％のＣ１８：１及び５％未満のＣ１８：２を有することができる。
【０３２２】
例示を目的として、本明細書には、ヒマワリ油の２０〜７５％及び大豆油の４８〜６５％と比較して２％未満のＣ１８：２を含有する油産生微生物由来のＴＡＧ油が提供される（実施例４を参照）。また、大豆油の５〜１０％と比較して０．５％未満のＣ１８：３を有するＴＡＧ油も提供される。
【０３２３】
誘電性流体のこれらの及び他の特性は、任意の用途に適した、潤滑剤、油圧作動液、工業用油、又は誘電性流体のような生成物が提供されるように、本明細書に記載される方法に従い実現し、操作し、及び／又は変化させることができる。例えば、油産生微生物の遺伝子操作は、上述のように、脂質中のさまざまな脂肪酸の鎖長、飽和、及び／又は組成を変えるように行うことができる。特定の実施形態では、本明細書に記載されるような有用な微生物油は、１つ以上の外来遺伝子を発現するように操作された遺伝子操作された細菌によって生成される。例えば、遺伝子操作された細菌は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ（例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）又はＣｈｌｏｒｅｌｌａであってもよい。例示的な外来遺伝子には、ショ糖インベルターゼ及び／又は脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするものが含まれる。
【０３２４】
さらに、微細藻類又は油産生酵母から抽出された脂質は、誘電性流体に望ましい特性を実現するため、さまざまな化学的な改変に供することができる。典型的な改変には、脂肪酸（ＦＡ）鎖長を変化させることが含まれる。鎖が短いＦＡほど低い流動点を有する。化学的な改変はまた、本発明の方法の実施形態において、不飽和を低減するためにも用いることができ、アルキル化、ラジカル付加、アシル化、エン反応、ヒドロホルミル化、選択的水素化、オリゴマー形成、ヒドロアミノメチル化、アシルオキシ化、及びエポキシ化が挙げられる。それに加えて、又は代えて、望ましい特性、例えば流動点を実現するため、流動点降下剤のような添加剤を処理済みの微生物油と混合することができる。例示的な添加剤については、以下でさらに詳細に考察する。
【０３２５】
上記に考察したとおり、特定の実施形態では、油産生細菌から抽出した原料微生物油は、典型的には本発明の生成物に取り込まれる前に「濃縮される」。例えば、微生物脂質には、堆積物として溶液から結晶化し、及び／又は沈殿し、析出し得る混入物質が存在し得る。堆積物の形成は、誘電性流体が低温で使用される場合に特に問題である。堆積物又は沈殿物は、流動の低下、詰まりなどの問題引き起こし得る。当該技術分野では、より高い品質の生成物を生成するための、このような混入物質及び堆積物の除去に特別に対処する方法がよく知られている。そのような方法の例としては、限定されないが、リン脂質及び遊離脂肪酸のような混入物質を除去する油の前処理（例えば、ガム状物質の除去、苛性ソーダによる精製、シリカ吸着剤による濾過）が挙げられる。
【０３２６】
脱ろうは、本発明の方法の実施形態において、微生物油を濃縮するために用いることができる。本発明の実施形態に従い誘電性流体を脱ろうするアプローチは、いくつかある。一つのアプローチは、流体を他の誘電性流体とブレンドすることである。別のアプローチは、凝固点を下げることのできる添加剤を使用することである。乾式画分化もまた、飽和画分（ステアリン画分）の相対的な割合を減らすために用いることができる。油を冷却することにより、飽和物を結晶化させ、次いで結晶を濾別することができる。画分化は、流体を個々の成分又は画分に選択的に分離し、特定の画分を除去するか、又は含むようにすることができる。他の画分化方法は、尿素による画分化、溶媒による画分化、及び熱による蒸留が挙げられる。
【０３２７】
次いで、珪藻土又は漂白クレイのような他の濾過材料を冷却した液体に加えてスラリーを形成し、次いで、これを葉状圧力フィルター又は他の種類のフィルターで濾過し、粒状物を除去し得る。次いで、濾過した液体を研磨フィルターに通し、残った任意の堆積物及び珪藻土を除去して、最終生成物を生成し得る。それに代えて、又は加えて、この生成物、又は前述のプロセス工程のいずれかの終わりに生成される微生物油を、流動点降下剤と混合して、本発明の生成物、例えば誘電性流体を生成することができる。
【０３２８】
本発明の一実施形態では、潤滑油又は誘電性流体を生成する方法が提供され、この方法は、（ａ）本明細書に開示される方法を用いて脂質を含有する微生物を育てることと、（ｂ）脂質を含有する微生物を溶解して溶解物を生成することと、（ｃ）溶解した微生物から脂質組成物を単離することと、（ｄ）単離した脂質組成物を濃縮することとを含み、これにより潤滑油又は誘電性流体が生成される。典型的には、工程（ｄ）は、１つ以上の精製、漂白、及び／又は脱臭工程及び１つ以上の画分化工程を含み、それによりパルミチン酸及び／又はステアリン酸トリグリセリドを除去して飽和画分の相対的な割合が低減され得る。さらなる実施形態において、工程（ｄ）から得られる潤滑油又は誘電性流体は、流動点降下剤と混合される。
【０３２９】
場合により、単離された脂質の酸化安定性を増加させる他の添加剤を、これらの方法により生成される微生物油、潤滑剤、又は誘電性流体と混合することができる。そのような添加剤の例としては、抗酸化剤、例えばトコフェロール（ビタミンＥ、例えば、α−、β−及び／又はδ−トコフェロール）、アスコルビン酸（ビタミンＣ）が挙げられる。適した抗酸化剤は市販されている。ＢＡＳＦ社は、ＩＲＧＡＮＯＸ（登録商標）の商標で、一連の適したフェノールベース及びアミンベースの抗酸化剤を販売している。ＩＲＧＡＮＯＸ  Ｌ１０９、ＩＲＧＡＮＯＸ  Ｌ６４、ＩＲＧＡＮＯＸ  Ｌ５７、他のＩＲＧＡＮＯＸ抗酸化剤、並びに他のフェノールベース及びアミンベースの化合物が、油及び誘電性流体を含む生成物に対する抗酸化添加剤として適している。抗酸化剤の他の非限定的な例としては、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、モノ第三ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）、ブチル化ヒドロアニソール、テトラヒドロブチロフェノン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｂｕｔｒｏｐｈｅｎｏｎｅ）、パルミチン酸アスコルビル、及び没食子酸プロピルが挙げられる。特定の実施形態では、微生物油をベースとする生成物、例えば誘電性流体は、重量で０．１％〜５％、好ましくは０．５％〜２％の抗酸化剤をさらに含む。
【０３３０】
誘電性流体のような生成物として使用するために場合により単離された脂質に添加され得る他の添加剤は、金属イオンの不活性化剤、腐食防止剤、耐摩耗添加剤、及び／又は加水分解防止剤である。誘電性流体に広く用いられている添加剤のいくつかが、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，２００６，Ｊ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ；８６：１７６９−１７８０に記載されている。金属イオン不活性化剤は、２つの主要な機能を有する。これは金属の表面に対する化学的攻撃を抑制し、また、金属表面を不動態化して、ラジカル（不対電子）形成の触媒として作用し得るあらゆる残基を抑制する。金属不活性化剤は市販されている。例えば、ＢＡＳＦ社は、ＩＲＧＡＭＥＴ（登録商標）ラインの金属不活性化剤を含む一連の金属不活性化剤を提供している。ＲＴＶＡＮＤＥＲＢＩＬＴ社は、ＣＵＶＡＮ（登録商標）ラインの金属不活性化剤を販売している。金属不活性化剤の他の例としては、１−（ジイソオクチルアミノメチル）−１，２，４−トリアゾール、１−（２−メトキシプロプ−２−イル）トリルトリアゾール、１−（１−シクロヘキシルオキシプロピル）トリルトリアゾール、１−（１−シクロヘキシルオキシヘプチル）トリルトリアゾール、１−（１−シクロヘキシルオキシブチル）トリルトリアゾール、１−［ｂｉｓ（２−エチルヘキシル）アミノメチル−４−メチルベンゾトリアゾールを含む誘導体化トリアゾール、ホウ酸トリエチル、ホウ酸トリプロピル、ホウ酸トリイソプロピル、ホウ酸トリブチル、ホウ酸トリペンチル、ホウ酸トリヘキシル、ホウ酸トリシクロヘキシル、ホウ酸トリオクチル、ホウ酸トリイソオクチルを含む誘導体化ホウ素、及び他の誘導体化ヒドラジン金属不活性化剤、例えば、２’，３−ｂｉｓ［［３−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル］プロピオニル］］プロポニオヒドラジン（ｐｒｏｐｏｎｉｏｈｙｄｒａｚｉｎｅ）などが挙げられる。特定の実施形態では、微生物油をベースとする生成物、例えば誘電性流体は、重量で０．１％〜５％、好ましくは０．５％〜２％の１つ以上の金属不活性化剤をさらに含む。
【０３３１】
従って、本明細書に記載される方法に従い調製された誘電性流体は、複数の添加剤を含有することができ、限定されないが、以下の添加剤の１つ以上が含まれる：（ａ）抗酸化剤、限定されないがＢＨＴ及び他のフェノール類を含む；（ｂ）Ｃｕ、Ｚｎなどの金属イオンの不活性化剤、限定されないがベンゾトリアゾールを含む；（ｃ）腐食防止剤、限定されないがエステル硫酸及びコハク酸エステルを含む；（ｄ）解乳化剤；（ｅ）耐摩耗添加剤、限定されないがジチオリン酸亜鉛を含む；（ｆ）流動点を降下させる添加剤、限定されないがマランスチレン共重合体（ｍａｌａｎ  ｓｔｙｒｅｎｅ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）、限定されないがポリメタクリレートを含むポリ（アルキル）アクリレートを含む；及び（ｇ）加水分解を防ぐ化合物、限定されないがカルボジイミドを含む。
【０３３２】
特定の実施形態では、本発明の方法は、約−１０℃〜約−４０℃の流動点を有する微生物油を含む生成物を生成し、ここで微生物油の脂肪酸組成は、少なくとも５０％のＣ１８：１及び１０％未満のＣ１８：２である。この方法は、１つ以上の外来遺伝子を発現するように操作された遺伝子操作された細菌を、その細菌が乾燥重量で少なくとも１０％の油を有するようになるまで育てることを含む。例示的な遺伝子操作された微生物としては、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ（例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）又はＣｈｌｏｒｅｌｌａが挙げられる。例示的な外来遺伝子としては、ショ糖インベルターゼ及び／又は脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするものが挙げられる。ある実施形態では、遺伝子操作された細菌は、例えば、ショ糖インベルターゼ及び脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするか、２つの異なる脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするか、又はショ糖インベルターゼ及び２つの異なる脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする、少なくとも２つの外来遺伝子を発現する。細菌が乾燥重量で少なくとも１０％の油を有するようになると、油が細菌から分離され、精製、漂白、脱臭又は脱ガムに供されて、ＲＢＤ油が生成される。場合により、抗酸化剤、金属イオン不活性化剤、腐食防止剤、解乳化剤、耐摩耗添加剤、流動点降下剤、及び／又は抗加水分解性化合物をＲＢＤ油に添加して、望ましい生成物を生成することができる。
【０３３３】
特定の実施形態では、本発明の画分化方法は、約−１０℃〜約−４０℃の流動点を有する生成物（例えば、誘電性流体（ｄｉｅｌｅｃｔｉｃ  ｆｌｕｉｄ））への組み込みに適した微生物油を生成し、ここで微生物油の脂肪酸組成は、少なくとも５０％のＣ１８：１及び１０％未満のＣ１８：２である。この方法は、出発（すなわち「第１の」）微生物油を精製、漂白、脱臭又は脱ガムに供して、初期流動点及び第１の温度によって特徴づけられるＲＢＤ油を生成することと、ＲＢＤ油の温度を第２の温度に下げることと、ＲＢＤ油を第２の温度で濾過して、初期流動点より低い第２の流動点であって、約−１０℃〜約−４０℃である第２の流動点によって特徴づけられる第２の微生物油を提供することとを含み、ここで第２の微生物油の脂肪酸組成は、少なくとも５０％のＣ１８：１及び１０％未満のＣ１８：２である。例示的な第１の温度は１５℃〜約５０℃であり、例示的な第２の温度は約−１５℃〜約１５℃である。場合により、抗酸化剤、金属イオン不活性化剤、腐食防止剤、解乳化剤、耐摩耗添加剤、流動点降下剤、及び／又は抗加水分解性化合物を第２の微生物油に添加して、望ましい生成物を生成することができる。これらの実施形態の変形例において、第１の微生物油は、１つ以上の外来遺伝子を発現するように操作された遺伝子操作された細菌を、その細菌が乾燥重量で少なくとも１０％の油を有するようになるまで育てることと、次いで、細菌から油を分離して第１の微生物油を生成することとにより生成される。この方法を用いて、例えば、潤滑剤、油圧作動液、工業用油、又は誘電性流体を生成することができる。特定の実施形態では、生成物が誘電性流体（ｄｉｅｌｅｃｔｉｃ  ｆｌｕｉｄ）である場合、流体は、抗酸化剤、金属イオン不活性化剤、腐食防止剤、解乳化剤、耐摩耗添加剤、流動点降下剤、又は抗加水分解性化合物のうちの１つ以上を含む。
【０３３４】
本発明の一実施形態では、誘電性流体は、油産生微生物から得られる油及び／又は誘電性流体を既存の油又は誘電性流体とブレンドすることにより生成される。既存の油及び誘電性流体は、植物又は動物（又はその双方、すなわち石油）を起源とするのものであってよい。
【０３３５】
従って、本発明は、油産生微生物からの脂質が誘電性流体並びにさまざまな工業的及び他の用途に有用な他の生成物を生じるように企図されるさまざまな方法を含む。本明細書に開示される方法により生成される油の改変方法の例としては、限定されないが、油の加水分解、油の水素化、及び油のエステル化が挙げられる。微細藻類脂質の他の化学的な改変としては、限定なしに、エポキシ化、酸化、加水分解、硫酸化、スルホン化、エトキシ化、プロポキシル化、アミド化、及び鹸化が挙げられる。微細藻類の油の改変により基本的な油脂化学品が生成され、これは、望ましい機能のため、選択された誘導体油脂化学品にさらに改変することができる。燃料生成方法に関する上記の記載と同様にして、これらの化学的な改変を、本明細書に記載される微生物培養物から産生された油に対して行うこともできる。
【０３３６】
特定の実施形態では、本明細書に記載される誘電性流体は、変圧器コア／コイル組立体を収容するタンク（ここでは誘電性流体がコア／コイル組立体を取り囲む）を含めた、変圧器のような電気システムで用いられる。このような実施形態の変形例において、タンクは酸素吸収材料も含み、この材料はタンク内のガスと接触しているが、誘電性絶縁流体からは接触しないよう隔離されている。適した酸素吸収材料は、タンク内部で誘電性流体を取り囲む大気中の遊離酸素濃度を低減することが可能で、ひいては流体それ自体にある溶存酸素の存在量を低減するものである。そのような化合物は、酸素除去化合物と呼ばれ得る。有用な酸素除去化合物には、食品包装業界で一般的に用いられているものが含まれる。本発明の実施において有用な酸素除去化合物の代表的なものには、以下が含まれる：亜硫酸ナトリウム；硫酸銅五水和物；炭素と活性鉄粉との組み合わせ；ハイドロサルファイト、水酸化カルシウム、重炭酸ナトリウム及び活性炭の混合物；金属粉末の表面にコーティングされた金属ハロゲン化物粉末；及び水酸化カルシウムのようなアルカリ化合物と炭酸ナトリウム又は重炭酸ナトリウムとの組み合わせ。上記の組成物の１つ以上の混合物及び組み合わせもまた有用と考えられる。また、酸素除去化合物としては、亜硫酸塩と、水和硫酸銅、塩化第一スズ、又は酸化コバルトのような促進剤との混合物を含む、酸素を取り除く組成物を含めた、参照により組み込まれる米国特許第２，８２５，６５１号により提供される組成物も有用である。別の有用な酸素除去化合物クラスには、同様に参照によって組み込まれる米国特許第４，３８４，９７２号に開示されるような、マンガン、鉄、コバルト又はニッケルの塩、アルカリ化合物、及び亜硫酸塩又は潮解性化合物を含む組成物が含まれる。好ましい酸素除去化合物は、酸化鉄（ＩＩ）のような少なくとも１つの基本酸化鉄を含み（又はその基本成分として含み）、又は酸化鉄材料の混合物から構成される。有用な酸化鉄含有組成物は、例えば、「Ａｇｅｌｅｓｓ」の商標名でＤｕｎｃａｎ，Ｓｏｕｔｈ  ＣａｒｏｌｉｎａのＭｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｇａｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから、及び「Ｆｒｅｓｈｍａｘ」の商標名でＢｕｆｆａｌｏ，Ｎ．Ｙ．のＭｕｌｔｉｓｏｒｂ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から市販されている。また、第一鉄塩及び酸化改質剤及び／又は金属亜硫酸塩又は硫酸塩化合物の混合物を含む酸素吸収剤も有用である。
【０３３７】
本発明について上に詳細に説明し、以下の実施例で例示するが、これらは説明のために与えられたものであり、特許請求の範囲に書かれた発明を限定するために与えられているのではない。
【実施例】
【０３３８】
ＶＩＩ．実施例
実施例１：Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａを培養する方法
細胞乾燥重量で高い割合の油を得るようにＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株を育てた。凍結保存した細胞を室温で解凍し、細胞５００μｌを、２％グルコースを含む培地４．５ｍｌ（４．２ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、３．１ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．２４ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２５ｇ／Ｌ  クエン酸一水和物、０．０２５ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２  ２Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌ  酵母抽出物）に入れ、６ウェルプレートで撹拌しつつ（２００ｒｐｍ）、２８℃で７日間成長させた。細胞乾燥重量は、あらかじめ秤量しておいたエッペンドルフ管中、培養物１ｍｌを１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって決定した。培養物の上澄みを棄て、得られた細胞ペレットを脱イオン水１ｍｌで洗浄した。培養物を再び遠心分離処理し、上澄みを棄て、細胞ペレットを凍結するまで−８０℃に置いた。次いで、サンプルを２４時間凍結乾燥し、細胞乾燥重量を算出した。培養物中の総脂質を決定するために、培養物３ｍｌを取り出し、Ａｎｋｏｍシステム（Ａｎｋｏｍ  Ｉｎｃ．、Ｍａｃｅｄｏｎ、ＮＹ）を用い、製造業者のプロトコルに従って分析した。サンプルを、Ａｍｋｏｍ  ＸＴ１０抽出機を用い、製造業者のプロトコルに従って、溶媒抽出した。酸によって加水分解して乾燥させたサンプルと、溶媒抽出して乾燥させたサンプルとの質量差として、総脂質を決定した。細胞乾燥重量での油の割合を測定した値を表９に示す。
【０３３９】
【表１１】
0005970463.tif 000012
【０３４０】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の複数の株に由来する微細藻類サンプルの遺伝子型を解析した。藻類のバイオマスからゲノムＤＮＡを以下のように単離した。液体培養物から、細胞（約２００ｍｇ）を１４，０００×ｇで５分間遠心分離処理した。次いで、細胞を滅菌蒸留水に再び懸濁させ、１４，０００×ｇで５分間遠心分離処理し、上澄みを棄てた。このバイオマスに、直径約２ｍｍの１個のガラスビーズを加え、この管を−８０℃で少なくとも１５分間置いた。サンプルを取り出し、研磨バッファー（１％  Ｓａｒｋｏｓｙｌ、０．２５Ｍ  ショ糖、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、ＲＮａｓｅ  Ａ  ０．５ｕｇ／μｌ）１５０μｌを加えた。ペレットを短時間ボルテックスすることによって再び懸濁させた後、５Ｍ  ＮａＣｌ  ４０μｌを加えた。サンプルを簡単にボルテックスした後、５％  ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）６６μｌを加え、最後に短時間ボルテックスした。次いで、サンプルを６５℃で１０分間インキュベートした後、１４，０００×ｇで１０分間遠心分離処理した。新しい管に上澄みを移し、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール  １２：１２：１  ３００μｌで１回抽出し、次いで、１４，０００×ｇで５分間遠心分離処理した。０．７体積部のイソプロパノール（約１９０μｌ）を含む新たな管に、得られた水相を移し、ひっくり返すことによって混合し、室温で３０分間インキュベートするか、又は４℃で一晩インキュベートした。１４，０００×ｇで１０分間遠心分離処理することによってＤＮＡを回収した。次いで、得られたペレットを７０％エタノールで２回洗浄した後、１００％エタノールで最後に洗浄した。ペレットを室温で２０〜３０分風乾した後、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）５０μｌで再び懸濁させた。
【０３４１】
上述のように調製した藻の全ＤＮＡ５μｌを、これを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で１：５０に希釈した。最終容積が２０μｌのＰＣＲ反応を以下のように設定した。２×ｉＰｒｏｏｆ  ＨＦマスターミックス（ＢＩＯ−ＲＡＤ）１０μｌを、０．４μｌのプライマーＳＺ０２６１３（１０ｍＭストック濃度の５’−ＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＴＧＡＧＣＣＧＧＣＧＡＣ−３’（配列番号９））に加えた。このプライマー配列は、Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ寄託番号Ｌ４３３５７の位置５６７〜５８８であり、高等植物及び藻のプラスチドゲノムにおいて高度に保存されている。次いで、これに０．４μｌのプライマーＳＺ０２６１５（１０ｍＭストック濃度の５’−ＣＡＧＴＧＡＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣＡＣＴＣ−３’（配列番号１０））を加えた。このプライマー配列は、Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ寄託番号Ｌ４３３５７の位置１１１２〜１０９３と相補性であり、高等植物及び藻のプラスチドゲノムにおいて高度に保存されている。次いで、希釈した全ＤＮＡ５μｌ及びｄＨ２Ｏ  ３．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応を以下のように行った。９８℃、４５秒；９８℃、８秒；５３℃、１２秒；７２℃、２０秒を３５サイクル繰り返した後、７２℃で１分、２５℃で保持。ＰＣＲ産物を精製するために、核反応物に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０  ２０μｌを加えた後、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール  １２：１２：１  ４０μｌで抽出し、ボルテックスし、１４，０００×ｇで５分間遠心分離処理した。ＰＣＲ反応物をＳ−４００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に入れ、３，０００×ｇで２分間遠心分離処理した。次いで、精製したＰＣＲ産物を、ＰＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯへとＴＯＰＯクローン化し、ＬＢ／Ｓｐｅｃプレートで陽性クローンを選択した。精製したプラスミドＤＮＡについて、Ｍ１３の順プライマー及び逆プライマーを用い、両方向で配列を決定した。２３Ｓ  ｒＲＮＡ  ＤＮＡの配列が決定された全部で１２種類のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株を選択し、これらの配列を、配列表に列挙している。株及び配列表の番号のまとめは、以下にある。ＵＴＥＸ  １４３５（配列番号１５）配列との全体的な違いについて、配列を分析した。最も違う配列として、２対があらわれた（ＵＴＥＸ  ３２９／ＵＴＥＸ  １５３３及びＵＴＥＸ  ３２９／ＵＴＥＸ  １４４０）。これら両者の場合で、ペアワイズアラインメントから、一対の配列同一性が７５．０％であった。ＵＴＥＸ  １４３５の配列同一性の割合も、以下に示している。
【０３４２】
【表１２】
0005970463.tif 000013
【０３４３】
上に列挙した株の部分集合から得られた脂質サンプルについて、ＨＰＬＣを用いて脂質プロフィールを分析した。結果を以下の表１０に示す。
【０３４４】
【表１３】
0005970463.tif 000014
【０３４５】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５から抽出した油（溶媒抽出によるか、又は連続圧搾機を用いる、について、カロチノイド、クロロフィル、トコフェロール、他のステロール及びトコトリエノールを分析した。結果を以下の表１１にまとめる。
【０３４６】
【表１４】
0005970463.tif 000015
【０３４７】
４つの別個のロットからの、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓから抽出した油を、標準的な植物油の処理方法を用いて精製し、漂白した。簡潔に言えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓから抽出した未精製油を水平デカンターで透明にし、そこで油から固形分を分離した。次いで透明にした油をクエン酸及び水とともにタンクに移し、約２４時間静置しておいた。２４時間後、タンク内の混合物が２つの別個の層を形成した。下層は水及びガムから構成され、次いでガムをデカンテーションにより除去してから、その脱ガム油を漂白タンクに移した。次いで油を別の一添加量のクエン酸とともに加熱した。次いで漂白クレイを漂白タンクに加え、混合物を真空下でさらに加熱することで、存在した水を全て蒸発させた。次いで混合物を葉状濾過器でポンピングして、漂白クレイを除去した。次いで濾過した油を最終的な５μｍ仕上げフィルターに通し、次いで、回収して、使用時まで保存した。次いで精製及び漂白した（ＲＢ）油について、カロチノイド、クロロフィル、ステロール、トコトリエノール及びトコフェロールを分析した。これらの分析の結果を以下の表１２にまとめる。「ｎｄ」は、検出されなかったことを示し、検出感度は以下に掲載する：
検出感度
カロチノイド（ｍｃｇ／ｇ）ｎｄ＝＜０．００３ｍｃｇ／ｇ
クロロフィルＩＩ（ｍｃｇ／ｇ）ｎｄ＝＜０．０３ｍｃｇ／ｇ
ステロール（％）ｎｄ＝０．２５％
トコフェロール（ｍｃｇ／ｇ）；ｎｄ＝３ｍｃｇ／ｇ
【０３４８】
【表１５】
0005970463.tif 000016
【０３４９】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ油の同じ４つのロットを、微量元素についても分析した。結果を以下の表１３にまとめる。
【０３５０】
【表１６】
0005970463.tif 000017
【０３５１】
実施例２：微粒子銃によってＰｒｏｔｏｔｈｅｃａを形質転換する一般的な方法
Ｓｅａｓｈｅｌｌ製の金マイクロキャリア５５０ナノメートルを製造業者のプロトコルに従って調製した。プラスミド（２０μｇ）を、結合バッファー５０μｌ及びＳ５５０ｄ金担体６０μｌ（３０ｍｇ）と混合し、氷中、１分間インキュベートした。沈殿バッファー（１００μｌ）を加え、この混合物を氷中でさらに１分間インキュベートした。ボルテックスした後、ＤＮＡでコーティングされた粒子を、エッペンドルフ５４１５Ｃ微量遠心器で１０，０００ｒｐｍで１０秒間回転させることによって、ペレット状にした。この金ペレットを冷たい１００％エタノール５００μｌで１回洗浄し、微量遠心器で軽く回転させることによってペレット状にし、氷冷したエタノール５０μｌで再び懸濁させた。軽く（１〜２秒）音波処理した後、１０μｌのＤＮＡコーティングされた粒子を、すぐにキャリア膜に移した。
【０３５２】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ株を、２％グルコースを含むプロテオース培地（２ｇ／Ｌ  酵母エキス、２．９４ｍＭ  ＮａＮＯ３、０．１７ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．３ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１．２８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．４３ｍＭ  ＮａＣｌ）中、旋回シェーカー上で、細胞密度が２×１０６細胞／ｍｌになるまで成長させた。この細胞を収穫し、滅菌蒸留水で１回洗浄し、培地５０μｌに再び懸濁させた。非選択的なプロテオース培地プレートの中央の１／３に１×１０７細胞を広げた。この細胞を、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で撃った。破裂ディスク（１３５０ｐｓｉ）を用い、プレートはスクリーン／マクロキャリアの集合体から６ｃｍ下に置いた。細胞を２５℃で１２〜２４時間回復させた。回復したら、ゴム製スパチュラで細胞をプレートから掻き取り、培地１００μｌと混合し、適切に選別した抗生物質を含むプレートに広げた。２５℃でインキュベーションして７〜１０日経過後、プレート上に形質転換された細胞を示すコロニーが目視で確認された。コロニーを取り出し、２回目の選択ラウンドのために選択的な（抗生物質あるいは炭素源のいずれか）寒天プレートにスポットとして乗せた。
【０３５３】
実施例３：微細藻類細胞での異種脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の発現
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種を含む微細藻類細胞で異種チオエステラーゼ遺伝子を発現させる方法及びその結果が、以前に、本明細書によって参照により組み込まれるＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／６６４１２号に記載されている。本実施例では、高等植物種に由来する他のチオエステラーゼ遺伝子／遺伝子産物を使用した結果について記載する。
【０３５４】
Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓに由来する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５の遺伝的背景に導入した。コドンが最適化されたｃＤＮＡ配列（配列番号８７）及びアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＢＳ３０４２２．１に由来）（配列番号８８）は配列表に列挙している。発現構築物は、核ゲノムに組み込むための、６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号１００）及び３’（配列番号１０１）相同組み換え標的配列（構築物に隣接する）と、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域とを含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号７８として列挙され、選択マーカーとして機能した。Ｒ．ｃｏｍｍｕｎｉｓコード領域は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８４）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号８５）の制御下にあった。また、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ天然トランジットペプチドは、Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイルデサチュラーゼ（配列番号８６）に由来するトランジットペプチドによって置き換えた。置き換えられたトランジットペプチドを有するチオエステラーゼのｃＤＮＡ配列は、配列番号８７として列挙される。Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ発現カセットの全体をｐＳＺ１３７５と命名し、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの遺伝的背景に形質転換した。ショ糖を唯一の炭素源とするプレートで陽性クローンをスクリーニングした。陽性クローンの一部を選択し、脂質生成条件下で成長させ、上述のような直接的なトランスエステル化法を用いて脂質（脂肪酸）プロフィールを決定した。選択されたクローンの脂肪酸プロフィールを、以下の表１４にまとめている。
【０３５５】
【表１７】
0005970463.tif 000018
【０３５６】
結果は、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓチオエステラーゼトランス遺伝子を有する形質転換体は、野生型株と比べてＣ１６：０脂肪酸のレベルが変化し、及びそれより程度は少ないがＣ１８：０脂肪酸のレベルも変化したことを示している。また、野生型レベルと比較したとき、Ｃ１８：１脂肪酸濃度の増加も同時に起こった。
【０３５７】
実施例４：微細藻類Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおける飽和脂肪酸濃度の改変
Ａ．遺伝子ノックアウトアプローチによるステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ（ｄｅｓａｔｕｒｅａｓｅ）及びデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ発現の低減
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）に由来するゲノムＤＮＡのｃＤＮＡ、Ｉｌｌｕｍｉａトランスクリプトーム及びＲｏｃｈｅ  ４５４シーケンシングに基づくバイオインフォマティクスベースのアプローチを用いたゲノムスクリーンの一部として、脂肪酸不飽和化に関わる２つの特定の遺伝子群を同定した：ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）及びデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ（Δ１２  ＦＡＤ）。ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ酵素は脂質合成経路の一部であり、脂肪酸アシル鎖に二重結合を導入する働きをし、例えば、Ｃ１８：０脂肪酸からＣ１８：１脂肪酸を合成する。デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼもまた脂質合成経路の一部であり、既に不飽和の脂肪酸に二重結合を導入する働きをし、例えば、Ｃ１８：１脂肪酸からＣ１８：２脂肪酸を合成する。バイオインフォマティクスを試みる間に同定されたこれらの２つの脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子クラスに基づくプローブを使用したサザンブロット分析から、デサチュラーゼ遺伝子の各クラスが複数のファミリーメンバーから構成されている可能性が高いことが示された。さらに、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼをコードする遺伝子は、２つの別個のファミリーに分類された。これらの結果に基づき、デサチュラーゼ酵素の各ファミリー内でより高度に保存されたコード領域を標的とすることにより複数の遺伝子ファミリーメンバーを破壊する３つの遺伝子破壊構築物を設計した。
【０３５８】
３つの相同組み換え標的構築物は、以下を用いて設計した：（１）デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ（ｄ１２ＦＡＤ）ファミリーメンバーのコード配列の高度に保存された部分及び（２）２つの別個のＳＡＤファミリーの各々を標的化する２つの構築物、各々が各ファミリーからのコード配列の保存領域を有する。この戦略は、相同組み換えにより標的遺伝子のフランキング領域を標的とし得る古典的な遺伝子置換戦略ではなく、選択可能なマーカー遺伝子（ショ糖を加水分解する能力を付与するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するｓｕｃ２ショ糖インベルターゼカセット）をこれらの高度に保存されたコード領域（複数のファミリーメンバーを標的とする）に埋め込むように設計される。
【０３５９】
全ての構築物は、上述の方法を用いた微粒子銃形質転換により細胞に導入し、構築物は線状化してから細胞に撃ち込んだ。形質転換体はショ糖含有プレート／培地で選択し、脂肪酸プロフィールの変化は上述の方法を用いて分析した。３つの標的構築物の各々からの関連する配列を以下に列挙する。
【０３６０】
【表１８】
0005970463.tif 000019
【０３６１】
構築物の各々による形質転換からの代表的な陽性クローンを取り出し、それらのクローンの脂肪酸プロフィールを決定して（面積％で表されている）、以下の表１５にまとめた。
【０３６２】
【表１９】
0005970463.tif 000020
【０３６３】
構築物の各々は、望ましい脂肪酸クラスに対して計測可能な影響を有し、３つのケース全てにおいて、特に２つのＳＡＤノックアウトで、Ｃ１８：０濃度が著しく上昇した。ＳＡＤノックアウトからの複数のクローンをさらに比較すると、ＳＡＤ２Ｂノックアウト系統が、ＳＡＤ２Ａノックアウト系統で観察されるＣ１８：１脂肪酸濃度と比べて、Ｃ１８：１脂肪酸の著しく大きい低下を有したことが示された。
【０３６４】
上述の方法を用いてＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）の背景にさらなるΔ１２脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ）ノックアウトを生じさせた。Δ１２ＦＡＤの潜在的な相同性を同定するため、以下のプライマーを使用して、推定ＦＡＤをコードするゲノム領域を増幅した：
プライマー１  ５’−ＴＣＡＣＴＴＣＡＴＧＣＣＧＧＣＧＧＴＣＣ−３’  配列番号７４
プライマー２  ５’−ＧＣＧＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＧＣＴＣＧＡＡ−３’  配列番号７５
【０３６５】
上記プライマーを用いたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓゲノムＤＮＡのゲノム増幅から得られた配列は、高度な類似性を示したが、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにΔ１２ＦＡＤの複数の遺伝子又は対立遺伝子が存在することが示された。
【０３６６】
この結果に基づき、１つ以上のΔ１２ＦＡＤ遺伝子を除去する２つの遺伝子破壊構築物を設計した。この戦略は、古典的な遺伝子置換戦略を用いるのではなく、ショ糖インベルターゼ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するｓｕｃ２）カセットを高度に保存されたコード領域に埋め込み、ひいては選択可能なマーカーとしてショ糖を加水分解する能力を付与することであった。ｐＳＺ１１２４と命名された第１の構築物は、５’及び３’ゲノム標的配列を含み、それに、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２遺伝子の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターと、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲとが隣接した（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２カセット）。ｐＳＺ１１２５と命名された第２の構築物は、５’及び３’ゲノム標的配列を含み、それに、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２遺伝子の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターと、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲとが隣接した。構築物の関連する配列は、配列表に列挙する：
【０３６７】
【表２０】
0005970463.tif 000021
【０３６８】
ｐＳＺ１１２４及びｐＳＺ１１２５を、それぞれＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの背景に導入し、ショ糖を加水分解する能力に基づき陽性クローンを選択した。表１６は、ｐＳＺ１１２４及びｐＳＺ１１２５を標的とするベクターを利用した２つのトランスジェニック系で得られた脂肪酸プロフィール（面積％、上述の方法を用いて作成）をまとめている。
【０３６９】
【表２１】
0005970463.tif 000022
【０３７０】
ＦＡＤ２Ｂ（ｐＳＺ１１２４）構築物を含むトランスジェニックから、脂質プロフィールに極めて興味深い、且つ予想外の結果がもたらされ、すなわち低下することを予想し得たＣ１８：２濃度が、約１面積％しか低下しなかった。しかしながら、Ｃ１８：１脂肪酸濃度は著しく増加し、ほぼ例外なくＣ１６：０濃度がその代償となり、Ｃ１６：０濃度は著しく低下した。ＦＡＤ２Ｃ（ｐＳＺ１１２５）構築物を含むトランスジェニックからも、脂肪酸プロフィールの変化がもたらされた：Ｃ１８：２の濃度が著しく低下し、これには対応するＣ１８：１濃度の増加が伴う。
【０３７１】
Ｂ．Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞においてデルタ１２デサチュラーゼ（ＦＡＤｃ）を下方調節するＲＮＡヘアピンアプローチ
ヘアピンＲＮＡによりＦＡＤｃ（デルタ１２デサチュラーゼ遺伝子）の遺伝子発現を下方調節するベクターを、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５の遺伝的背景に導入した。唯一の炭素源としてショ糖で成長する能力を陽性クローンに付与するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼ遺伝子を選択可能なマーカーとして利用し、２つのタイプの構築物を使用した。第１のタイプの構築物は、ＦＡＤｃコード領域の第１エクソンがシスでその第１のイントロンに連結し、その後に逆方向の第１エクソンの反復単位が続く部分を利用した。このタイプの構築物は、ｍＲＮＡとして発現したときにヘアピンを形成するように設計された。この第１のタイプの構築物を２つ作製し、１つはＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター（配列番号８４）により駆動されるもので、ｐＳＺ１４６８と命名され、２つ目は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｍａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター（配列番号８９）により駆動されるもので、ｐＳＺ１４６９と命名された。第２のタイプの構築物は、アンチセンス方向の大きいＦＡＤｃエクソン２を利用し、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター（配列番号８４）により駆動されるか（ｐＳＺ１４７０と命名された）、又はＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｍａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター（ｐｒｏｍｔｅｒ）（配列番号８９）により駆動された（ｐＳＺ１４７１と命名された）。４つの構築物はいずれも、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼカセット（配列番号７８）と、核ゲノムに組み込むための、６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号１００）及び３’（配列番号１０１）相同組み換え標的配列（構築物に隣接する）とを有した。各ヘアピンＲＮＡ構築物のＦＡＤｃ部分の配列を、各構築物の関連する部分とともに、以下のとおり配列表に列挙する：
【０３７２】
【表２２】
0005970463.tif 000023
【０３７３】
４つの構築物のそれぞれを、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの背景に形質転換し、ショ糖を唯一の炭素源として含むプレートを使用して陽性クローンをスクリーニングした。各形質転換から陽性クローンを取り出し、一部を選択して、脂肪酸プロフィールに対するｐＳＺ１４６８、ｐＳＺ１４６９、ｐＳＺ１４７０及びｐＳＺ１４７１に含まれたヘアピン及びアンチセンスカセットの影響を決定した。各形質転換から選択されたクローンを脂質生成条件下で成長させ、上述のような直接的なトランスエステル化法を用いて脂肪酸プロフィールを決定した。形質転換のそれぞれからの代表的な脂肪酸プロフィールを、以下の表１７にまとめている。野生型１及び２細胞は、陰性対照として形質転換体のそれぞれと共に実行した非形質転換Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞であった。
【０３７４】
【表２３】
0005970463.tif 000024
【０３７５】
上記の結果は、ヘアピン構築物ｐＳＺ１４６８及びｐＳＺ１４６９が予想された表現型：それぞれ野生型１及び野生型２と比較したときのＣ１８：２脂肪酸濃度の低下及びＣ１８：１脂肪酸濃度の増加を示したことを示している。アンチセンス構築物ｐＳＺ１４７０及びｐＳＺ１４７１は、Ｃ１８：２脂肪酸濃度の低下はもたらさず、それぞれ野生型１及び野生型２と比較したときには僅かな増加を示し、及びＣ１６：０脂肪酸濃度の僅かな低下を示した。
【０３７６】
Ｃ．外来性ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼの発現
Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＢ６７８４０．１）を、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ１４３５の遺伝的背景に導入した。この発現構築物は、核ゲノムに組み込むための、６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号１００）及び３’（配列番号１０１）相同組み換え標的配列（構築物に隣接する）と、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域とを含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号７８として列挙され、選択マーカーとして機能した。Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼコード領域は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８４）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあり、天然トランジットペプチドがＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチド（配列番号８６）に置き換えられた。コドンが最適化されたｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列（置き換えられたトランジットペプチドを含む）を、配列表にそれぞれ配列番号９８及び配列番号９９として列挙する。Ｏ．ｅｕｒｏｐａｅａ  ＳＡＤ発現カセットの全体をｐＳＺ１３７７と命名し、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの遺伝的背景に形質転換した。ショ糖を唯一の炭素源とするプレートで陽性クローンをスクリーニングした。陽性クローンの一部を選択し、脂質生成条件下で成長させ、上述のような直接的なトランスエステル化法を用いて脂肪酸プロフィールを決定した。選択されたクローンの脂肪酸プロフィールを、以下の表１８にまとめている。
【０３７７】
【表２４】
0005970463.tif 000025
【０３７８】
上記の結果は、異種デサチュラーゼ、この場合、Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａに由来するステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼを導入することにより、より高濃度のＣ１８：１脂肪酸及びそれに伴うＣ１８：０及びＣ１６：０脂肪酸濃度の低下がもたらされ得ることを示している。
【０３７９】
実施例５：油産生酵母を育てること
この実施例及び続く実施例で使用した油産生酵母株は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、所在地Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｂｅ  ７Ｂ、３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ、又はＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｓｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、所在地Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  ８５１６７，３５０８  Ｕｔｒｅｃｈｔ、オランダのいずれかから入手した。１８５個の油産生酵母株を、成長率及び脂質生成についてスクリーニングした。
【０３８０】
ＹＰＤ寒天（以下に記載するようなＹＰＤ培地、２％寒天添加）プレートに単一コロニーを線状に塗ることにより、全ての株を純培養にした。各株のＹＰＤプレートからの単一コロニーを取り出し、ＹＰＤ培地（１０ｇバクト酵母エキス、２０ｇバクトペプトン及び２０ｇグルコース／蒸留水中１Ｌの最終容積）中、ロータリーシェーカーにおいて２００ｒｐｍ、３０℃で後期対数期まで成長させた。
【０３８１】
脂質生産性を評価するため、５０ｍＬの風袋重量を測ったバイオリアクターチューブ（ＭｉｄＳｃｉ，Ｉｎｃ．）に２ｍＬのＹＰＤ培地を添加し、各株の凍結ストックから播種した。次いで、チューブを３０℃のインキュベーターに置き、２００ｒｐｍで振とうしながら２４時間成長させて、種培養物を生じさせた。２４時間後、０．１Ｍフタル酸バッファー、ｐＨ５．０を含有する８ｍＬのＹ１培地（アミノ酸不含酵母窒素原基礎、Ｄｉｆｃｏ）を添加し、穏やかにピペッティングすることにより十分に混合した。得られた培養物を、第２の風袋重量を測ったバイオリアクターチューブに等分した。次いで、得られた２回分の各５ｍＬの培養物を、２００ｒｐｍでの撹拌を伴う３０℃のインキュベーターに５日間置いた。次いで、脂質生産性及び脂質プロフィール用に細胞を収穫した。３ｍＬの培養物を使用して乾燥細胞重量及び総脂質含有量（脂質生産性）を決定し、１ｍＬを使用して脂肪酸プロフィールを決定した。いずれの場合にも、培養物はチューブに入れ、３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離処理することにより細胞をペレット状にした。上澄みをデカンテーションした後、各チューブに２ｍＬの脱イオン水を加え、それを用いて得られた細胞ペレットを洗浄した。チューブを再び３５００ｒｐｍで１０分間回転させ、洗浄した細胞をペレット状にし、次いで、上澄みをデカンテーションし、細胞ペレットを−７０℃のフリーザーに３０分間置いた。次いで、チューブを凍結乾燥器に一晩移して乾燥させた。翌日、円錐形チューブ＋３ｍＬ培養物から得られた乾燥バイオマスの重量を記録し、得られた細胞ペレットを、Ａｎｋｏｍ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓシステムを使用して（製造者の指示に従い）全脂質抽出に供し、総脂質含有量を決定した。
【０３８２】
スクリーニングした１８５株のなかから、成長率及び脂質生産性に基づき３０株を選択した。これらの３０株の脂質生産性（乾燥細胞重量のパーセント脂質として表される）を以下で表１９にまとめている。
【０３８３】
【表２５】
0005970463.tif 000026
【０３８４】
１ｍＬ培養物から得られた細胞ペレットを直接的なトランスエステル化に供し、ＧＣにより分析して脂肪酸プロフィールを決定した。上記の酵母株のうち１７個の脂肪酸プロフィールの要約を、以下の表２０にまとめている。
【０３８５】
【表２６】
0005970463.tif 000027
【０３８６】
さらなる油産生酵母株に対して脂肪酸プロフィール分析を行い、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｋｉｉ  ＣＢＳ  ２９２４を含むいくつかの株は、高い割合のＣ１６：１脂肪酸を生成することが分かった。この油産生酵母株は、ＤＣＷの割合として約４０％脂質の脂質生産性、及びＣ１２：０（０．３６％）；Ｃ１４：０（１．３６％）；Ｃ１５：０（０．１６％）；Ｃ１６：０（１０．８２％）；Ｃ１６：１（４２．９％）；Ｃ１７：０（０．１１％）；Ｃ１８：０（２．１％）；Ｃ１８：１（３５．８１％）；Ｃ１８：２（４．６２％）の脂肪酸プロフィールを有した。この株は、脂肪酸プロフィールの一部として特に高い割合のＣ１６：１（パルミトオレイン酸）を有することが分かった。高い割合の１６：１を生成するものとして、４つのさらなる株を同定した：Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＣＢＳ  ６０１２（１０．１０％）；Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＣＢＳ  ６３３１（１４．８０％）、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＣＢＳ  １０１４４（１２．９０％）及びＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＣＢＳ  ５５８９（１４．２０％）。
【０３８７】
実施例６：油産生酵母株の遺伝子型決定
４８個の異なる油産生酵母株の遺伝子型決定を行った。以下のような油産生酵母バイオマスの４８個の異なる株の各々から、ゲノムＤＮＡを単離した。液体培養物から、細胞（約２００ｍｇ）を１４，０００×ｇで５分間遠心分離処理した。次いで、細胞を滅菌蒸留水に再び懸濁させ、１４，０００×ｇで５分間遠心分離処理し、上澄みを棄てた。このバイオマスに、直径約２ｍｍの１個のガラスビーズを加え、この管を−８０℃で少なくとも１５分間置いた。サンプルを取り出し、研磨バッファー（１％  Ｓａｒｋｏｓｙｌ、０．２５Ｍ  ショ糖、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、ＲＮａｓｅ  Ａ  ０．５ｕｇ／ｕｌ）１５０μｌを加えた。ペレットを短時間ボルテックスすることによって再び懸濁させた後、５Ｍ  ＮａＣｌ  ４０μｌを加えた。サンプルを短時間ボルテックスした後、５％  ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）６６μｌを加え、最後に短時間ボルテックスした。次いで、サンプルを６５℃で１０分間インキュベートした後、１４，０００×ｇで１０分間遠心分離処理した。新しい管に上澄みを移し、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール  １２：１２：１  ３００μｌで１回抽出し、次いで、１４，０００×ｇで５分間遠心分離処理した。０．７体積部のイソプロパノール（約１９０μｌ）を含む新たな管に、得られた水相を移し、ひっくり返すことによって混合し、室温で３０分間インキュベートするか、又は４℃で一晩インキュベートした。１４，０００×ｇで１０分間遠心分離処理することによってＤＮＡを回収した。次いで、得られたペレットを７０％エタノールで２回洗浄した後、１００％エタノールで最後に洗浄した。ペレットを室温で２０〜３０分風乾した後、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）５０μｌで再び懸濁させた。
【０３８８】
上述のように調製した藻類の全ＤＮＡ５μｌを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で１：５０に希釈した。最終容積が２０μｌのＰＣＲ反応を以下のように設定した。２×ｉＰｒｏｏｆ  ＨＦマスターミックス（ＢＩＯ−ＲＡＤ）１０μｌを、０．４μｌのプライマーＳＺ５４３４順プライマー（１０ｍＭストック濃度の５’−ＧＴＣＣＣＴＧＣＣＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣ−３’（配列番号３９））及び０．４μｌのプライマーＳＺ５４３５逆プライマー（１０ｍＭストック濃度の５’−ＴＴＧＡＴＡＴＧＣＴＴＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＧＧ−３’（配列番号４０））に加えた。これらのプライマーは、１８Ｓの３つのプライム領域と真菌２６Ｓ  ｒＲＮＡ  遺伝子の５つのプライム領域との間の配列保存に基づき選択した。順プライマーはＧｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＹ５５０２４３のヌクレオチド１６３２〜１６５２と同じであり、逆プライマーはＧｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＣ＿００１１４４のヌクレオチド４６４２７１〜４６４２９３と同じである。次に、５μｌの希釈した全ＤＮＡ及び３．２μｌのｄＨ２Ｏを加えた。ＰＣＲ反応を以下のように行った：９８℃、４５秒；９８℃、８秒；５３℃、１２秒；７２℃、２０秒を３５サイクル繰り返した後、７２℃で１分、２５℃で保持。ＰＣＲ産物を精製するために、各反応物に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０  ２０μｌを加えた後、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール  １２：１２：１  ４０μｌで抽出し、ボルテックスし、１４，０００×ｇで５分間遠心分離処理した。ＰＣＲ反応物をＳ−４００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に入れ、３，０００×ｇで２分間遠心分離処理した。得られた精製後のＰＣＲ産物をクローン化し、ＺｅｒｏＢｌｕｎｔ  ＰＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に従い使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換した。配列決定反応は、アンピシリン耐性コロニーで直接実行した。精製したプラスミドＤＮＡについて、Ｍ１３の順プライマー及び逆プライマーを用い、両方向で配列を決定した。次いで、精製したＰＣＲ産物を、ＰＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯへとＴＯＰＯクローン化し、ＬＢ／Ｓｐｅｃプレートで陽性クローンを選択した。精製したプラスミドＤＮＡについて、Ｍ１３順プライマー及び逆プライマーを用い、両方向で配列を決定した。
【０３８９】
遺伝子型を解析した４８株の油産生酵母のリストは、対応する配列番号と共に、表２１にある。
【０３９０】
【表２７】
0005970463.tif 000028
【０３９１】
実施例７：高油含有量を達成するＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓを育てること
２５０ｍｌバッフルフラスコ内において、４％ショ糖を含有する５０ｍｌのＭＳＭ培地（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，（１９６１）Ａｒｃｈ  Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ  ３８，２０９−２２を参照）に播種した２ｍｌの凍結保存ストックを使用して、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０（ＤＳＭ  ４４１９３、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｔｔｗｅｎ  ＧｍｂＨ）の種培養物を産生した。この種培養物を、それが６００ｎｍで１．１６の光学密度に達するまで、３０℃で、２００ｒｐｍで撹拌しながら成長させた。２つの異なる窒素条件下：１０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ及び１８．７ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ（それぞれ２回ずつ）で脂質を生成させるため、１０ｍｌの種フラスコ培養物を使用して培養物を播種した。成長培養物を、３０℃、２００ｒｐｍで撹拌しながら６日間成長させた。１０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ条件での細胞成長は、６日間の培養後、ＤＣＷで最高５７．２％の（平均）脂質に達した。１８．７ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ条件での細胞成長は、５日間の培養後、ＤＣＷで最高５１．８％の（平均）脂質に達した。
【０３９２】
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓバイオマスのサンプルを直接的なトランスエステル化に供し、脂肪酸プロフィールについてＧＣ／ＦＩＤにより分析した。結果は以下であった：Ｃ１４：０（２．３３）；Ｃ１５：０（９．０８）；Ｃ１６：０（２４．５６）；Ｃ１６：１（１１．０７）；Ｃ１７：０（１０．５０）；２二重結合当量（２ＤＢＥ）Ｃ１７種（１９．９０）；Ｃ１８：０（２．４９）；Ｃ１８：１（１７．４１）；Ｃ１８：２（０．０５）；Ｃ１９：０（０．７５）及び２ＤＢＥ  Ｃ１９種（１．８７）。
【０３９３】
実施例８：微生物からの油の抽出
Ａ．連続圧搾機及び圧縮助剤を用いた微細藻類からの油の抽出
ドラム乾燥機を用い、ＤＣＷで３８％の油を含む微細藻類バイオマスを乾燥させ、得られた含水量は５〜５．５％であった。バイオマスをＦｒｅｎｃｈ  Ｌ２５０プレスに供給した。バイオマス３０．４ｋｇ（６７ｌｂｓ）をプレスに供給したが、油は回収されなかった。同じ乾燥させた微生物バイオマスに、種々の割合のスイッチグラスを圧縮助剤として組み合わせ、プレスに供給した。乾燥微生物バイオマス及び２０％ｗ／ｗ  スイッチグラスを組み合わせると、最も良好な油の総回収率が得られた。次いで、圧縮したケーキをヘキサンで抽出し、スイッチグラスが２０％の条件で、最終収率は、６１．６％の利用可能な油（重量によって算出）の総量であった。細胞乾燥重量の５０％を超える油を有するバイオマスは、油を抽出するために、スイッチグラスのような圧縮助剤を使う必要はなかった。連続圧搾機を用いた微細藻類からの油の他の抽出方法は、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／３１１０８号に記載されている。
【０３９４】
Ｂ．連続圧搾機を用いた油産生酵母からの油の抽出
酵母株Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ（ＤＳＭＺ−ＤＳＭ  ７０３９８）を、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ  ７Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）から入手した。凍結保存した細胞を解凍し、１×ＤＡＳビタミン溶液（１０００×：９ｇ／Ｌ  トリシン；０．６７ｇ／Ｌ  チアミンＨＣｌ；０．０１ｇ／Ｌ  ｄ−ビオチン；０．００８シアノコバラミン；０．０２  パントテン酸カルシウム；及び０．０４ｇ／Ｌ  ｐ−アミノ安息香酸）を含有する５０ｍＬ  ＹＰＤ培地（上記）に加え、３０℃で、２００ｒｐｍで撹拌しながら１８〜２４時間、ＯＤの読みが５ＯＤ（Ａ６００）を超えるまで成長させた。次いで、培養物を７Ｌ発酵槽に移し、１×ＤＡＳビタミン溶液を含有するＹＰ１培地（アミノ酸及び硫酸アンモニウム不含の８．５ｇ／Ｌ  Ｄｉｆｃｏ酵母窒素原基礎、３ｇ／Ｌ  硫酸アンモニウム、４ｇ／Ｌ  酵母エキス）に切り換えた。培養物のサンプルを１日２回採取し、ＯＤ（Ａ６００）、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）及び脂質濃度についてアッセイした。培養物が５０ｇ／Ｌ  ＤＣＷ超に達したとき、培養物を収穫した。乾燥細胞重量を基準として、酵母バイオマスは約５０％の油を含んだ。２つの酵母バイオマスサンプルを直接的なトランスエステル化に供し、脂肪酸プロフィールについてＧＣ／ＦＩＤにより分析した。結果は面積パーセントで表し、以下の表２２に示す。
【０３９５】
【表２８】
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【０３９６】
収穫した酵母ブロスを、比較のため３つの異なる方法を用いて乾燥させた：（１）強制空気オーブン内において７５℃で一晩トレイ乾燥した；（２）濃縮なしにドラム乾燥機で乾燥させた；及び（３）酵母ブロスを固形分２２％まで濃縮し、次いでスラリーをドラム乾燥機で乾燥させた。３つの異なる乾燥条件のそれぞれからの材料を加熱調湿し、スクリュープレスに送り込んで油を抽出した。プレス温度は１５０°Ｆであり、調湿した乾燥酵母バイオマスは、プレスに送る準備ができるまで約１９０°Ｆに保持した。
【０３９７】
トレイ乾燥した酵母の含水量は１．４５％であり、次いで、この乾燥した酵母を９０℃のオーブン内で１０分間調湿した。調湿後の含水量は０．９％であった。次いで、調湿したトレイ乾燥材料を卓上Ｔａｂｙスクリュープレス（２．２Ｈｐモータ及び７０ｍｍスクリュー直径を備えるＴａｂｙ  Ｐｒｅｓｓｅｎ  Ｔｙｐｅ  ７０オイルプレス）に送り込み、油を抽出した。この材料からは多量の油は得られず、プレスで重厚な堆積物（ｆｏｏｔｉｎｇ）が観察された。
【０３９８】
濃縮なしにドラム乾燥した酵母ブロスの含水量は５．４％であり、次いで、このドラム乾燥した酵母を９０℃のオーブン内で２０分間調湿した。調湿後の含水量は１．４％であった。次いで、調湿したドラム乾燥酵母を卓上Ｔａｂｙスクリュープレスに送り込み、油を抽出した。この材料からは良好に油が得られ、堆積物は最小限であった。
【０３９９】
ドラム乾燥して濃縮した酵母ブロスの含水量は２．１％であり、次いで、このドラム乾燥して濃縮した酵母を９０℃のオーブン内で２０分間調湿した。調湿後の含水量は１．０％であった。次いで、調湿したドラム乾燥濃縮酵母を卓上Ｔａｂｙスクリュープレスに送り込み、油を抽出した。この材料からは良好に油が得られ、堆積物は最小限であった。
【０４００】
Ｃ．乾燥及び油産生バクテリアからの油の抽出
油産生菌種Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０（ＤＳＭＺ−ＤＳＭ  ４４１９３）を本明細書に提供される方法に従い培養し、ＤＣＷで約３２％の脂質を含む油産生バクテリアバイオマスを生成した。
【０４０１】
収穫したＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓブロスを遠心分離を用いて濃縮し、次いで、脱イオン水で洗浄し、１．８Ｌの脱イオン水中に懸濁させた。５０グラムの精製セルロース（ＰＢ２０−Ｐｒｅ−ｃｏ−Ｆｌｏｃ，ＥＰ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ，Ｎｅｖａｄａ）を懸濁させたバイオマスに加え、脱イオン水で合計固形分を２０％に調整した。次いで、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓバイオマスをドラム乾燥機で乾燥させ、ドラム乾燥後のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓの含水量は約３％であった。
【０４０２】
次いで、ドラム乾燥した材料を、１３０℃のオーブンで３０分間加熱調湿すると、含水量が約１．２％になった。次いで、加熱調湿したバイオマスを卓上Ｔａｂｙプレス（スクリュープレス）に送り込み、油を抽出した。プレス温度は２０９°Ｆであり、調湿した乾燥酵母バイオマスは、プレスに送る準備ができるまで約２４０°Ｆに保持した。油の回収には、重い堆積物が伴った。
【０４０３】
実施例９：抽出した油の処理；流動点を降下させる
まとめ
前述の例に従い調製される微生物油は、食品及び潤滑剤での使用向けにその特性を向上させるため、本明細書に記載される方法に従い処理することができる。上記の例に記載される微生物に加え、微細藻類Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓが、微生物油の優れた生成体である。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａの種及び株を培養して高油量を得て、そこから油を抽出する方法については、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号第２００８／１５１１４９号、第２０１０／１２０９３９号、及び第２０１０／１３８，６２０号を参照のこと。
【０４０４】
飽和画分の相対的な割合を低下させることにより、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓから得られる油の流動点を低下させた。飽和画分は、商業的にはステアリン画分として知られるパルミチン酸及びステアリン酸トリグリセリドから主になっている。これは、油を画分化して油の飽和トリグリセリド濃度を低下させることにより達成した。これは、植物油業界で公知の脱ろうプロセスと同様の、結晶化又は乾式画分化により行った。まず、藻類油を、上述の方法により（植物油業界で用いられるものと同様の方法もまた用いることができた）精製、漂白及び脱臭し、「ＲＢＤ油」を生成した。
【０４０５】
結晶核が形成されるまで、ＲＢＤ油の温度を制御された方法で降下させた。次いで、油をその結晶化温度に数時間保持し、結晶の成長を促進した。次いで、結晶を濾過によって取り除くと、２つの画分が得られた：ステアリン画分の一部又はほとんどを含有する固相、及び主としてオレイン画分を含有する液相。液相を再び画分化に供して結晶化温度を下げ、ステアリンのさらなる除去を生じさせた。得られる精製された液体画分は、植物油業界で一般的に知られるようなスーパーオレインと同等のものであり、天然藻類の油と比べて良好な熱特性を有する。
【０４０６】
材料及び方法
材料
藻類油（精製、漂白、及び脱臭されたもの）が、Ｓｏｌａｚｙｍｅ，Ｉｎｃ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）によって生成された。表２３は、本研究に使用した油の特性をまとめている。
【０４０７】
【表２９】
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【０４０８】
約５０％（ｗ／ｗ）の菜種油担体を含有するポリアルキルメタクリレート共重合体ベースの流動点降下剤（ＰＰＤ）ＶＩＳＣＯＰＬＥＸ（登録商標）１０−３１０及び精製ミネラル油担体を含有するＶＩＳＣＯＰＬＥＸ（登録商標）１−１３３は、ＲｏｈｍＭａｘ  Ｅｖｏｎｉｋ（Ｈｏｒｓｈａｍ、ＰＡ）により供給された。
【０４０９】
方法
Ａ．乾式画分化：結晶化
約２．５ｋｇの藻類油を、生成物を加熱及び冷却するように働く温度制御式循環水浴に接続された、３Ｌジャケット付き容器に入れた（Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ＆  Ｄｅｇｕｍｍｉｎｇ、Ｃｈａｒｌｅｒｏｉ、ベルギー）。リアクターには変速撹拌機を装着した。冷却は、油の温度及びリアクターの二重壁の間を循環する水の温度をモニタリングすることにより制御した。冷却終了時に、リアクターから結晶懸濁液の液滴サンプルを棒で取り、カバーグラスに載せて結晶形成を観察した。サンプルは、結晶が期せずして溶解する前に、直ちに顕微鏡下に分析した。
【０４１０】
全体的な冷却パターンは図１に示される。撹拌機速度は、第１段階の間３０ｒｐｍ、及び冷却プログラムの終わりまで１５ｒｐｍであった。
【０４１１】
Ｂ．乾式画分化：濾過
結晶化が終わると、１Ｌ膜加圧フィルター（Ｃｈｏｑｕｅｎｅｔ  ＳＡ、Ｃｈａｕｎｙ、フランス）を使用して結晶懸濁液を濾過した。濾過は、最終冷却温度に保たれたチャンバ内で実行した。濾過時間は２０分間であり、濾過供給圧力は４ｂａｒｇであった。
【０４１２】
分離工程が終わると、ステアリン画分及びオレイン画分を秤量し、画分収率を計算し、各画分のサンプルをさらなる分析のために取っておいた。藻類スーパーオレイン＃１は、第１の画分化からのオレインを処理し、図２に示される冷却プログラムの後、上述の結晶化及び濾過プロセスを繰り返すことにより生成した。藻類スーパーオレイン＃２及び＃３は、脱臭油の第１の画分化、及び図２に示されるものと同様の冷却プログラムを用いて結晶化及び濾過プロセスを繰り返すことにより生成した。
【０４１３】
Ｃ．流動点（ＰＰ）
流動点降下剤（０．５及び１．０グラム）をフラスコに秤量した。各フラスコに、藻類油、オレイン及びスーパーオレイン画分（１００ｇ）を加えた。混合物を十分に混合した。Ｄ  ９７  ＡＳＴＭ（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）の標準方法に従い、各サンプルを試験した。サンプルを試験管に流し込み、温度を４８．０℃に設定した水浴中、撹拌なしに加熱し、サンプルは、それが４６．０℃に達するまで加熱した。加熱後、サンプルを２５．０℃に冷却（水浴中）した。次いで、サンプルをメタノール浴中の金属製シリンダーに入れた。メタノール浴の温度は、サンプルの温度が１０．０℃に達するまで、−１．０℃〜−２．０℃に設定した。次いで、サンプルの温度が−７．０℃に達するまで、メタノール浴の温度を−１７．０℃に下げた。サンプルの温度が予想流動点を約１１．０℃上回るとき、３．０℃下がる毎にメタノール浴からサンプルを取り出し、流動能力を確認した。サンプルの流動点は、メタノール浴から取り出したときに試験管内のサンプルが流動しなくなったときの温度として決定した。記録する温度には３．０℃を加え、サンプルの実際の流動点の値を提供した。
【０４１４】
各工程で生成される油の特性は、本明細書に記載される方法において、流動点をさらに低下させる化学的な流動点降下剤を添加することにより、さらに改善することができた。この例に用いた流動点降下剤は、いずれもＥｖｏｎｉｋにより生産されるＶＩＳＣＯＰＬＥＸ（登録商標）１０−３１０及び１−１３３であったが、任意の標準的な流動点降下剤を使用しても同様の結果を得ることができた。結果を、以下の表２４、及び図３に示す。
【０４１５】
【表３０】
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【０４１６】
実施例１０：操作された微細藻類から生成される油の流動点
Ｐｒｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）を、実施例２の方法を用いて、以下の表２５のプラスミド構築物のうちの１つで形質転換した。
【０４１７】
【表３１】
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【０４１８】
構築物の各々は、核ゲノムに組み込むための領域と、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域とを含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号７８として列挙され、選択マーカーとして機能した。核ゲノムの組み込みに使用した標的領域の関連する配列を以下に示す。
【０４１９】
【表３２】
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【０４２０】
ショ糖を選択可能なマーカーに加え、４つの構築物のうちの３つはまた、タンパク質又はＲＮＡのいずれかを発現させるための別のさらなる配列を含んだ。表２６は、示される構築物のＤＮＡ配列によりコードされる重要な酵素又はヘアピンＲＮＡカセットを列挙している。全てのタンパク質コード領域は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５（表２を参照）の核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するようにコドンを最適化した。使用した構築物についてのアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列の両方を、配列表に列挙する。
【０４２１】
【表３３】
0005970463.tif 000034
【０４２２】
Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ  ＡＣＰチオエステラーゼ（構築物３のＣｔＯＴＥ）及びＣｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ  ＦａｔＢ２チオエステラーゼ（構築物４のＣｗＴＥ２）の双方のコード領域とも、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８４）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号８５）の制御下にあった。Ｃ．ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ  ＡＣＰチオエステラーゼの天然トランジットペプチドは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチド（配列番号８６）に置き換えた。Ｃ．ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ  ＡＣＰチオエステラーゼのコドンが最適化されたｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列（置き換えたトランジットペプチドを含む）を、配列表にそれぞれ配列番号１０６及び配列番号１０４として列挙する。Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ  ＦａｔＢ２チオエステラーゼのコドンが最適化されたｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を、配列表にそれぞれ配列番号１０７及び配列番号１０５として列挙する。ＦＡＤｃヘアピンＲＮＡを含む構築物１については、実施例４に記載される。
【０４２３】
各構築物をＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの遺伝的背景に形質転換した。ショ糖を唯一の炭素源とするプレートで陽性クローンをスクリーニングした。陽性クローンの一部を選択し、脂質生成条件下で成長させた。野生型ＵＴＥＸ  １４３５はグルコースを使用して成長させ、一方、他のトランスジェニック系は全て、ショ糖で育てた。各構築物について、形質転換体を成長させ、油を単離した。単離した油を脂肪酸プロフィールについて分析し、本明細書に記載されるように流動点を決定した。流動点は、流動点評価に関するＡＳＴＭ  Ｄ９７標準試験方法を用いて決定した。トランスジェニック株についての油の脂肪酸プロフィール及び流動点を、以下の表２７に示す。表２７は、遺伝子操作された微細藻類によって生成された油の流動点の首尾よく行われた操作についてのデータを開示する。構築物３で形質転換した油の流動点は、−１０．５℃から−１９．５℃に低下した。
【０４２４】
【表３４】
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【０４２５】
実施例１１：改変された脂肪酸プロフィールを有する操作された微細藻類
上述のように、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種の特定の内在する脂質経路酵素をノックアウト又はノックダウンする異種遺伝子の組み込みにより、脂肪酸プロフィールを変えることができる。内在する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、脂質合成中におけるアシルキャリアータンパク質からの脂肪酸の切断を触媒するため、宿主生物の脂質プロフィールを構築する際に重要な脂質経路酵素である。内在する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子ＦＡＴＡ１をノックアウト又はノックダウンする結果として、宿主細胞の脂質プロフィールが影響を受け得るかどうかを評価するため、プラスミド構築物を作製した。
【０４２６】
Ａ．内在するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓチオエステラーゼ遺伝子をノックアウトすることによる脂肪酸プロフィールの改変
Ｐｒｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５、Ｓ１９２０の古典的に変異を誘発した誘導体を、実施例２の方法を用いて、以下の表２８のプラスミド構築物のうちの１つで形質転換した。各構築物は、内在するＦＡＴＡ１遺伝子を分断するように核ゲノムに組み込むための領域と、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域とを含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号７８として列挙され、選択マーカーとして機能した。全てのタンパク質コード領域は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５（表２を参照）の核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するようにコドンを最適化した。核ゲノムの組み込みに使用したＦＡＴＡ１遺伝子の標的領域の関連する配列を、以下に示す。
【０４２７】
【表３５】
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【０４２８】
【表３６】
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【０４２９】
構築物ＦＡＴＡ１−ＣｒｂＴｕｂ＿ｙＩｎｖ＿ｎｒ−ＦＡＴＡ１における関連する制限部位は、以下の配列中、小文字、太字及び下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ  １、Ｋｐｎ  Ｉ、Ａｓｃ  Ｉ、Ｍｆｅ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、ＢｓｐＱ  Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端を区切る。太字で小文字の配列は、ＦＡＴＡ１遺伝子座での相同組み換えによる標的化した組み込みを可能にするＳ１９２０に由来するゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子（ショ糖を代謝するＳ１９２０の能力を付与する）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターを、囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示されるＳ１９０  ＦＡＴＡ１ゲノム領域が続く。
【化１】
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【化２】
0005970463.tif 000039
【０４３０】
Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ  ＡＣＰ−チオエステラーゼ２（ＣｗＦａｔＢ２）遺伝子（寄託番号Ｕ５６１０４）をＳ１９２０のＦＡＴＡ１遺伝子座に導入するため、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８４）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号８５）の制御下でＣｗＦａｔＢ２遺伝子のタンパク質コード領域を発現する構築物を作成した。Ｓ１９２０で発現させた構築物は、ＦＡＴＡ１−ＣｒｂＴｕｂ＿ｙＩｎｖ＿ｎｒ：：ａｍｔ０３＿ＣｗＴＥ２＿ｎｒ−ＦＡＴＡ１と書くことができる。
【０４３１】
構築物ＦＡＴＡ１−ＣｒｂＴｕｂ＿ｙＩｎｖ＿ｎｒ：：ａｍｔ０３＿ＣｗＴＥ２＿ｎｒ−ＦＡＴＡ１における関連する制限部位は、以下の配列中、小文字、太字且つ下線で示され、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ  １、Ｋｐｎ  Ｉ、Ａｓｃ  Ｉ、Ｍｆｅ  Ｉ、ＢａｍＨ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉ、Ｓｐｅ  Ｉ、Ａｓｃ  Ｉ、Ｐａｃ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、ＢｓｐＱ  Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端を区切る。太字で小文字の配列は、ＦＡＴＡ１遺伝子座での相同組み換えによる標的化した組み込みを可能にするＳ１９２０に由来するゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子（ショ糖を代謝するＳ１９２０の能力を付与する）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターを、囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの内在するａｍｔ０３プロモーターが続く。Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ  ＡＣＰ−チオエステラーゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りのＡＣＰ−チオエステラーゼコード領域を太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示されるＳ１９２０  ＦＡＴＡ１ゲノム領域が続く。Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ  ＦａｔＢ２チオエステラーゼのコドンが最適化されたｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を、配列表にそれぞれ配列番号１０７及び配列番号１０５として列挙する。
【化３】
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【化４】
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【化５】
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【０４３２】
ＦＡＴＡ１−ＣｒｂＴｕｂ＿ｙＩｎｖ＿ｎｒ−ＦＡＴＡ１をＳ１９２０に形質転換した後、一次形質転換体をクローン精製し、実施例１に開示される条件と同様のｐＨ５．０の標準的な脂質生成条件下で成長させた。標準的な脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー炎イオン化（ＦＡＭＥ  ＧＣ／ＦＩＤ）検出方法を用いて、脂肪酸プロフィールを分析した。以下の表２９は、いくつかの形質転換体の脂肪酸プロフィールを提供する。
【０４３３】
【表３７】
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【０４３４】
これらの結果は、宿主の内在するＦＡＴＡ１対立遺伝子を除去することにより、操作された微細藻類の脂質プロフィールが変わることを示している。選択可能なマーカーを内在するＦＡＴＡ１対立遺伝子に標的化させる影響は、Ｃ１６：０脂肪酸産生の明らかな減少と、それに伴うＣ１８：１脂肪酸産生の増加である。
【０４３５】
ＦＡＴＡ１−ＣｒｂＴｕｂ＿ｙＩｎｖ＿ｎｒ：：ａｍｔ０３＿ＣｗＴＥ２＿ｎｒ−ＦＡＴＡ１をＳ１９２０に形質転換した後、一次形質転換体をクローン精製し、４０ｇ／Ｌの総濃度となるように提供される種々の炭素源で、標準的な脂質生成条件下にｐＨ７．０で成長させた。ショ糖濃度は４０ｇ／Ｌであった。グルコースのみを炭素源として使用した場合、グルコースは４０ｇ／Ｌで提供した。グルコース及びフルクトースを炭素源として使用した場合、グルコースは２０ｇ／Ｌで提供し、及びフルクトースは２０ｇ／Ｌで提供した。脂肪酸プロフィールをＧＣ−ＦＩＤにより評価した。得られた脂肪酸プロフィールを表３０に列挙する。
【０４３６】
【表３８】
0005970463.tif 000044
【０４３７】
選択可能なマーカーが単独で宿主のＦＡＴＡ１対立遺伝子を標的化することと一致して、選択可能なマーカーを外来性チオエステラーゼと共に組み込むと、操作された微細藻類の脂質プロフィールが変化する。上記のように、外来遺伝子をＦＡＴＡ１対立遺伝子に標的化させると、Ｃ１６：０脂肪酸産生の明らかな減少が生じる。ＦＡＴＡ１遺伝子座におけるＣｗＴＥ２チオエステラーゼのさらなる発現はまた、中鎖脂肪酸及びＣ１８：１脂肪酸産生にも影響を与え、影響の程度は、分析される形質転換体に存在する外来性チオエステラーゼ活性のレベルに依存する。ＦＡＴＡ１−ＣｒｂＴｕｂ＿ｙＩｎｖ＿ｎｒ：：ａｍｔ０３＿ＣｗＴＥ２＿ｎｒ−ＦＡＴＡ１のような構築物中でＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲのように反復単位が隣接する遺伝子は、宿主ゲノムに組み込むと、増幅することができる。標的組み込み部位で増幅されるトランス遺伝子の複製物の数とチオエステラーゼ濃度との間には、脂肪酸プロフィール又はウエスタンブロッティングにより評価されるときの組み換えタンパク質蓄積のいずれに対する影響によっても明らかなように、良好な一致がある。
【０４３８】
ＣｗＴＥ２遺伝子が増幅を起こしたトランスジェニック系は、中鎖（Ｃ１０：０〜Ｃ１４：０）脂肪酸の著しい増加及び同時に起こるＣ１８：１脂肪酸の減少を示す。対照的に、ＣｗＴＥ２が増幅をほとんど又は全く起こさなかった形質転換体（おそらく１〜２個の複製物）は、外来性チオエステラーゼのより低い発現と一致し、中鎖脂肪酸の僅かな増加及びＣ１８：１脂肪酸の増加に対するはるかに大きい影響をもたらす。
【０４３９】
まとめて、これらのデータは、宿主の内在するＦＡＴＡ１対立遺伝子を除去すると、操作された微細藻類の脂質プロフィールが変化することを示している。
【０４４０】
Ｂ．内在するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓチオエステラーゼ遺伝子をノックダウンすることによる脂質プロフィールの改変
ヘアピンＲＮＡによりＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＦＡＴＡ１遺伝子の発現を下方調節する構築物ｐＳＺ１７７３を、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５  Ｓ１９２０の遺伝的背景に導入した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼ遺伝子を選択可能なマーカーとして利用し、唯一の炭素源としてショ糖で成長する能力を付与した。ヘアピンＲＮＡをコードする構築物部分には、ＦａｔＡ１コード領域の第１エクソンと、それに続く内在するイントロン、及び逆方向の第１エクソンの反復単位を利用した。ヘアピン構築物を核ゲノムに組み込むため、それぞれ配列番号１００及び１０１として列挙される６Ｓゲノム領域に対する５’及び３’相同組み換え標的配列（構築物に隣接する）が含まれた。この構築物は、６Ｓ：：β−Ｔｕｂ：ｓｕｃ２：ｎｒ：：β−ｔｕｂ：ヘアピンＦａｔＡ：ｎｒ：：６Ｓと命名される。
【０４４１】
６Ｓ：：β−Ｔｕｂ：ｓｕｃ２：ｎｒ：：β−ｔｕｂ：ヘアピンＦａｔＡ：ｎｒ：：６Ｓにおける関連する制限部位は、以下の配列中、小文字、太字且つ下線で示され、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ  １、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｍｆｅ  Ｉ、ＢａｍＨ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉ、Ｓｐｅ  Ｉ、Ｘｈｏ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、ＢｓｐＱ  Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端を区切る。太字で小文字の配列は、６Ｓ遺伝子座での相同組み換えによる標的化した組み込みを可能にするＳ１９２０由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子（ショ糖を代謝するＳ１９２０の能力を付与する）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターを、囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるヘアピンＦａｔＡ１の発現を駆動する第２のＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターが続く。ＦａｔＡ１のイニシエーターＡＴＧコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、ＦａｔＡ１コード領域の残りの第１エクソンは大文字により示す。ＦａｔＡ遺伝子のイントロンは下線の大文字として示し、及び下線の大文字、太字のイタリックで示されるリンカー領域をＦａｔＡ１イントロン／逆向きの第１エクソンジャンクションに作製して、これらのベクターにおけるＲＮＡスプライシングを促進した。ＦａｔＡ１の逆の第１エクソンは大文字により示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示されるＳ１９２０  ６Ｓゲノム領域が続く。このＲＮＡｉ構築物のＦＡＴＡ部分の配列は、配列番号１１０として列挙される。
【化６】
0005970463.tif 000045
【化７】
0005970463.tif 000046
【化８】
0005970463.tif 000047
【０４４２】
６Ｓ：：β−Ｔｕｂ：ｓｕｃ２：ｎｒ：：β−ｔｕｂ：ヘアピンＦａｔＡ：ｎｒ：：６Ｓの発現は、標的ＦａｔＡ遺伝子をサイレンシングするヘアピンＲＮＡの形成をもたらす。Ｓ１９２０へのその形質転換後、一次形質転換体をクローン精製し、ｐＨ５．０の標準的な脂質生成条件下で成長させた。代表的な形質転換体クローンから得られたプロフィールを、表３１に列挙する。
【０４４３】
【表３９】
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【０４４４】
上記の結果は、ＦＡＴＡヘアピン構築物から、予想された表現型：野生型の非形質転換対照と比較したときのＣ１６脂肪酸濃度の低下及びＣ１８：１脂肪酸濃度の増加が得られたことを示している。
【０４４５】
本発明を、特定の実施形態と関連させて記載してきたが、さらなる改変ができることは理解されるであろう。本明細書は、本発明の原理に一般的に従い、本発明のいかなる変更、応用又は適応をも包含することを意図しており、それらは、本発明が属する技術分野の範囲内にある知られているあるいは慣例の実践範囲内で行われ、また本明細書に記載する本質的な特徴に適用できるような、本開示からの逸脱を含む。
【０４４６】
本明細書に引用されている全ての参考文献は、特許、特許明細書、刊行物を含め、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号も含め、その内容がすでに具体的に組み込まれているか否かにかかわらず、その全体が本明細書によって参照により組み込まれる。本明細書で述べられている刊行物は、本発明と組み合わせて使用することが可能な試薬、方法及び概念を記載し、開示する目的で引用されている。本明細書におけるいかなる記載も、これらの引用文献が本明細書に記載した本発明との関連で従来技術であることを認めたものと解釈されるべきではない。特に、以下の特許明細書は、あらゆる目的のために、その内容全体が本明細書によって参照により組み込まれる：ＰＣＴ出願番号第２００９年１１月３０日に出願したＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号、名称「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｉｌｏｒｅｄ  Ｏｉｌｓ  ｉｎ  Ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ」；２００９年１１月３０日に出願したＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号、名称「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｉｌｏｒｅｄ  Ｏｉｌｓ  ｉｎ  Ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ」；及び２０１０年４月１４日に出願したＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／３１１０８号、名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｏｉｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ」。
配列表
【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
0005970463.tif 000059
【化２０】
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【化２１】
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【化２２】
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【化２３】
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【化２４】
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【化２５】
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【化２６】
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【化２７】
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【化２８】
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【化２９】
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【化３０】
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【化３１】
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【化３２】
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【化３３】
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【化３４】
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【化３５】
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【化３６】
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【化３７】
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【化３８】
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【化３９】
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【化４０】
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【化４１】
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【化４２】
0005970463.tif 000082
【化４３】
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【化４４】
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【化４５】
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【化４６】
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【化４７】
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【化４８】
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【化４９】
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【化５０】
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【化５１】
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【化５２】
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【化５３】
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【化５４】
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【化５５】
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【化５６】
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【化５７】
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【化５８】
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【化５９】
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【化６０】
0005970463.tif 000100
【化６１】
0005970463.tif 000101
【化６２】
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【化６３】
0005970463.tif 000103
【化６４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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