(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３つの配列モチーフＮ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４（ここで、Ｎ１Ｎ２およびＮ３Ｎ４がＡ、Ｃ、Ｔ、およびＧの任意の組み合わせであり、Ｃがデオキシシチジンであり、Ｇがデオキシグアノシンであり、Ａがデオキシアデノシンであり、Ｔがデオキシチミジンである）を含む免疫調節のためのＤＮＡ構築物であって、該ＤＮＡ構築物の３’末端または５’および３’末端に位置する末端の５つのヌクレオチド内のみにＬ−立体配座にある少なくとも２つのヌクレオチドを含み、該ＤＮＡ構築物のその他のヌクレオチドはＤ−立体配座にある、構築物。
【請求項２】
Ｎ１Ｎ２がＧＴ、ＧＧ、ＧＡ、ＡＴまたはＡＡからなる群から選択されるエレメントであり、Ｎ３Ｎ４がＣＴまたはＴＴからなる群から選択されるエレメントである、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
少なくとも３つの連続するデオキシグアノシンから構成される少なくとも１つのＧストレッチを、５’および／または３’末端に直に備えてなる、請求項１または２に記載の構築物。
【請求項４】
３つの連続するデオキシグアノシンから構成されるＧストレッチが、２つの配列モチーフＮ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４のヌクレオチドＣＧの間に位置する、請求項１から３のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項５】
Ｃ、Ｔ及びＡからなる群より選ばれる少なくとも５つのヌクレオチドが、２つの配列モチーフＮ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４のヌクレオチドＣＧの間に位置する、請求項１から４のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項６】
ＤＮＡが、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡを含む線状開鎖ＤＮＡ構築物、または、一本鎖ループを有する少なくとも１つの末端を含む線状ＤＮＡ構築物である、請求項１から５のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項７】
前記配列モチーフＮ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４が、ＤＮＡ配列の一本鎖および／または二本鎖領域内に位置する、請求項１から６のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項８】
分子間および／または分子内塩基対ならびに少なくとも１つの不対合一本鎖領域を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項９】
互いにライゲーションされた少なくとも２つの請求項６に記載の構築物を含む、免疫調節のためのＤＮＡ構築物。
【請求項１０】
Ｌ−またはＤ−立体配座にある少なくとも１つのヌクレオチドが、カルボキシル、アミン、アミド、アルジミン、ケタール、アセタール、エステル、エーテル、ジスルフィド、チオールおよびアルデヒド基からなる群から選択される官能基で修飾されている、請求項１から９のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１１】
修飾されたヌクレオチドが、ペプチド、タンパク質、炭水化物、抗体、脂質、ミセル、ベシクル、合成分子、ポリマー、マイクロプロジェクタイル、金属粒子、ナノ粒子、または固相からなる群から選択される化合物に連結されている、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１２】
５’末端における１番目のＧストレッチと、３つの配列モチーフＮ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４（ここで、Ｎ１Ｎ２およびＮ３Ｎ４がＡ、Ｃ、Ｔ、およびＧの任意の組み合わせであり、Ｃがデオキシシチジンであり、Ｇがデオキシグアノシンであり、Ａがデオキシアデノシンであり、Ｔがデオキシチミジンである）とを含む免疫調節のためのＤＮＡ構築物であって、Ｃ、Ｔ及びＡからなる群より選ばれる少なくとも５つのヌクレオチドが、前記配列モチーフＮ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４のうちの１番目と２番目の配列モチーフのヌクレオチドＣＧの間に位置し、前記配列モチーフＮ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４のうちの２番目と３番目の配列モチーフのヌクレオチドＣＧの間に位置するＧストレッチを含み、３つの３’末端デオキシヌクレオチドのうち２つがＬ−立体配座にある、構築物。
【請求項１３】
少なくとも１つのさらなるＧストレッチを含む、請求項１２に記載の構築物。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物を含む医薬組成物。
【請求項１５】
さらに化学療法薬を含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１から１３のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物を含むワクチン。
【請求項１７】
ＤＮＡ構築物がアジュバントとして含まれる、請求項１６に記載のワクチン。
【請求項１８】
癌または自己免疫疾患の治療薬を製造するための、請求項１から１３のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物、請求項１４もしくは１５に記載の医薬組成物、または請求項１６もしくは１７に記載のワクチンの使用。
【請求項１９】
免疫系の調節のための治療薬を製造するための、請求項１から１３のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物、請求項１４もしくは１５に記載の医薬組成物、または請求項１６もしくは１７に記載のワクチンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫系の調節のための核酸分子およびこの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌、感染症、アレルギーおよび喘息などの複合疾患と戦うための新たな戦略は、患者の免疫系を利用することである。免疫系またはこの活性は、特定のＤＮＡ配列により調節できることが知られている。最も知られている免疫を改変する短いＤＮＡ配列は、Ｋｒｉｅｇら（Ｎａｔｕｒｅ  １９９５  ３７４：６５２２  ５４６〜５４９頁）により記載されている非メチル化シトシングアニンモチーフ（ＣＧモチーフ）を含有する。非メチル化ＣＧモチーフの発生は、原核生物またはウイルスと比べて、真核生物のゲノムにおいて実質的に抑制されている。したがって、このようなモチーフを含有するＤＮＡ分子は天然の「危険なシグナル」として進化し、原核生物病原体またはウイルス病原体に対する戦いでは免疫系を誘発する。これは、感染症および非感染症を治療または予防するのに治療的または予防的に利用することができる。
【０００３】
非メチル化ＣＧモチーフを含むＤＮＡ構築物は、樹状細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）およびＮＫＴ細胞を含む先天性免疫系のエフェクター細胞を強く刺激して、かなりの生理学的効果を誘発することができる。非メチル化ＣＧモチーフは、先天性免疫パターン認識受容体Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）９により検出される。正確な認識機構はまだ十分に理解されていないが、根本的な経路の解明において大幅な進歩がなされた（Ａ．Ｋｒｉｅｇ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．、５：４７１〜４８４頁、２００６）。非メチル化ＣＧを含有するＤＮＡ構築物が受容体に結合すると、複数のシグナルカスケードが応答細胞で活性化されると考えられている。特徴的な表面分子の上方制御およびサイトカインの分泌により、Ｔｈ１パターンが優勢な適応免疫が誘導される。このような構築物は、例えば、抗体、化学療法または放射線療法、ワクチンまたはサイトカインとの併用で使用することができる。アレルギー性疾患および喘息は、ほとんどがＴｈ２媒介性である。Ｔｈｌ／Ｔｈ２の比を増加することにより、Ｔｈ２媒介応答が減弱され、これによりこれらのタイプの疾患を治療または予防することができる。
【０００４】
表面分子には、分析される特定の細胞タイプにより、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ６９、ＣＤ８０またはＣＤ８６が含まれる。サイトカインの分泌も、樹状細胞タイプによって特徴があり、サイトカインには、例えば、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、インターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−８、インターフェロン（ＩＦＮ）−アルファ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−１または１０ｋＤａのＩＦＮ−ガンマ誘導タンパク質（ＩＰ−１０）が含まれる。
【０００５】
疾患を予防または治療するのに、ワクチン接種は極めて有効なアプローチであることが証明されている。強力および持続的な免疫応答を確保するために、樹状細胞などの抗原提示細胞を刺激することができるアジュバントが該抗原と一緒に通常は投与され、この目的のためＴＬＲ９アゴニストは強力な免疫刺激剤となることが示されている。
【０００６】
非メチル化ＣＧモチーフが免疫応答に影響を及ぼすまたは免疫応答を調節する根本的機構のいずれの説明とも無関係に、多くのアプローチが、このようなモチーフを用いて免疫系を調節するために開発された。ＷＯ  １９９８／０１８８１０は、非メチル化ＣＧモチーフを含有する免疫刺激性配列は、一本鎖の一部であるときさらにより効果があることを開示している。しかし、開鎖一本鎖ＤＮＡ分子の投与は、一本鎖核酸の迅速な分解のため実用的でない。その結果、非メチル化ＣＧモチーフを含む一本鎖または二本鎖ＤＮＡ構築物を保護するための種々の方法が開発された。
【０００７】
ＤＮＡヌクレアーゼによる分解に対する抵抗性を得るために、多くの場合、核酸ポリマーの骨格におけるホスホジエステル結合がホスホロチオエートに修飾される。このようなホスホロチオエート保護（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ-ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）核酸の幾分低い刺激活性に加えて、ここ数年内の臨床試験は、ホスホロチオエート保護の毒性が、医薬組成物または医薬品におけるこのような核酸のいかなる使用も除外または大幅に制限することを示した。
【０００８】
ＣＧモチーフを含むＤＮＡ配列を保護するための別のアプローチは、例えばＥＰ  １  １９６  １７８に開示されている。この文献は、ＣＧモチーフを含むヌクレオチド残基の、部分的に一本鎖のダンベル型共有結合閉鎖配列（ｄｕｍｂｂｅｌｌ−ｓｈａｐｅｄ，ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｃｌｏｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（「ｄＳＬＩＭ」）を含む、短いデオキシリボ核酸分子を開示している。ＥＰ  １  １９６  １７８の開示によれば、ＣＧモチーフは、開示された分子の二本鎖ステムの両末端における一本鎖ループ内または二本鎖ステム内に位置する。一本鎖ヘアピンループは、細胞内または細胞の外側でのＤＮＡヌクレアーゼによる分解から二本鎖ステムを保護する。
【０００９】
文献ＷＯ  ２０１０／０３９１３７は、免疫刺激性モチーフに隣接する配列において、および／または修飾がなければ免疫刺激性となるオリゴヌクレオチドモチーフにおいて１つまたは複数の化学修飾を有する、ＴＬＲ媒介疾患に対するアンタゴニストとしての免疫制御性オリゴヌクレオチドを開示している。故に、ＷＯ  ２０１０／０３９１３７の開示されたオリゴヌクレオチドの意図は、ＴＬＲに起因する免疫応答を抑制することである。
【００１０】
ＷＯ  ２００５／０４２０１８は、ｃクラスオリゴヌクレオチドが、該分子の５’末端もしくは３’末端またはこの近くに概ね位置するＣｐＧ配列、および該分子の他方の末端またはこの近くに概ね位置するＧＣに富むパリンドロームモチーフを特徴とする、新たないわゆるＣクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドを記載している。該文献は、ｃクラスＤＮＡのパリンドローム配列のバリエーションを開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
技術水準に関して、真核生物細胞への移入後に安定であり、有害な副作用を回避する代替の免疫調節ＤＮＡ構築物を提供することが本開示の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本開示は、少なくとも１つの配列モチーフＮ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４（ここで、Ｎ１Ｎ２およびＮ３Ｎ４がＣ、Ｇ、Ａ、およびＴの任意の組み合わせであり、Ｃがデオキシシチジンであり、Ｇがデオキシグアノシンであり、Ａがデオキシアデノシンであり、Ｔがデオキシチミジンである）を含む免疫刺激のためのＤＮＡ構築物であって、Ｌ−立体配座にある少なくとも１つのヌクレオチドを含む線状一本鎖または二本鎖ＤＮＡ配列である、構築物を教示する。Ｎ１Ｎ２は、ＧＴ、ＧＧ、ＧＡ、ＡＴまたはＡＡからなる群から選択されるエレメントであってもよく、Ｎ３Ｎ４はＣＴまたはＴＴからなる群から選択されるエレメントである。
【００１３】
本開示のさらなる実施形態として、Ｌ−立体配座にある少なくとも１つのヌクレオチドが、ＤＮＡ一本鎖の５’および／もしくは３’末端またはこの近くに位置する末端の５つのヌクレオチド内に含まれる構築物が提供される。
【００１４】
本発明は、少なくとも３つの連続するデオキシグアノシンの少なくとも１つのＧストレッチが、５’および／または３’末端の近くに位置し、Ｇストレッチが、請求項１または２に記載の２つの配列モチーフの間に位置することができるＤＮＡ構築物をさらに提供する。
【００１５】
請求項１または２に記載の２つの配列モチーフの間の間隔は、特にデオキシグアノシンが配列のエレメントにない場合、少なくとも５つの塩基であってもよい。
【００１６】
ＤＮＡ配列は、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡを含む線状開鎖ＤＮＡ構築物である、または一本鎖ループを有する少なくとも１つの末端を含む線状ＤＮＡ構築物であることがさらに意図される。
【００１７】
上に定義された配列モチーフＮ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４は、ＤＮＡ配列の一本鎖および／または二本鎖領域内に位置するものとする。
【００１８】
さらなる実施形態として、構築物は、分子間および／または分子内塩基対ならびに少なくとも１つの不対合一本鎖領域を含む。
【００１９】
さらに、分子間および／または分子内塩基対ならびに少なくとも１つの不対合一本鎖領域を含む少なくとも２つの構築物が、互いにライゲーションする多量体構築物が提供される。
【００２０】
さらに、構築物は、カルボキシル、アミン、アミド、アルジミン、ケタール、アセタール、エステル、エーテル、ジスルフィド、チオールおよびアルデヒド基からなる群から選択される官能基で修飾される、Ｌ−またはＤ−立体配座にある少なくとも１つのヌクレオチドを含んでもよい。
【００２１】
修飾されたヌクレオチドは、ペプチド、タンパク質、炭水化物、抗体、合成分子、ポリマー、マイクロプロジェクタイル（ｍｉｃｒｏ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）、金属粒子、ナノ粒子、ミセル、脂質担体、または固相からなる群から選択される化合物に連結されてもよい。
【００２２】
本開示は、５’末端における１番目のＧストレッチと、デオキシグアノシンを除いて少なくとも５つの塩基が１番目と２番目のモチーフの間に位置する請求項１または２に記載の３つの配列モチーフと、２番目と３番目の配列モチーフの間に位置するＧストレッチとを有し、３つの３’末端デオキシヌクレオチドのうち２つがＬ−立体配座にあるＤＮＡ構築物を提供する。
【００２３】
本開示による構築物は、癌もしくは自己免疫疾患の治療、または免疫系の調節のために使用することができる。
【００２４】
本開示のさらなる実施形態として、上記のＤＮＡ構築物を含む医薬組成物が提供される。医薬組成物はまた、化学療法薬を含んでもよい。
【００２５】
さらに、上記のＤＮＡ構築物を含むワクチンが提供される。その際、ＤＮＡ構築物はアジュバントとして含まれてもよい。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本開示の意味において、線状開鎖ＤＮＡ配列がＤＮＡ構築物として指定される。前記ＤＮＡ配列は、一本鎖または部分的にもしくは完全に二本鎖であってもよい。用語ＤＮＡ構築物は、対応するＤＮＡ配列の長さの限定を示すものではない。ＤＮＡ構築物の単量体単位はヌクレオチドである。
【００２７】
ＤＮＡ構築物は、合成的に作製されてもよく、または部分的にもしくは完全に生物学的起源であってもよく、生物学的起源には、ＤＮＡ配列の作製の遺伝子ベースの方法が含まれる。
【００２８】
Ｌ−ＤＮＡまたはＬ−立体配座にあるヌクレオチドは、自然発生のＤ−デオキシリボースの代わりに、糖残基としてＬ−デオキシリボースを含むヌクレオチドを指す。Ｌ−デオキシリボースは、Ｄ−デオキシリボースの光学異性体（鏡像）である。Ｌ−立体配座にあるヌクレオチドから部分的にまたは完全に成るＤＮＡ構築物は、部分的にまたは完全に一本鎖または二本鎖であってもよいが、Ｌ−立体配座にあるヌクレオチドは、Ｄ−立体配座にあるヌクレオチドにハイブリダイズすることができない（Ｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２００６  ３４：５１０１〜１１頁）。Ｌ−ＤＮＡは、Ｄ−ＤＮＡと同様に可溶性であり選択的である。しかし、Ｌ−ＤＮＡは、自然発生の酵素、特にエキソヌクレアーゼによる分解に対して抵抗性であり、そのためＬ−ＤＮＡは生物分解に対して保護される（Ｕｒａｔａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９２  ２０：３３２５〜３２頁）。したがって、Ｌ−ＤＮＡは極めて広く適用可能である。
【００２９】
本開示による「ステム」は、同一ＤＮＡ分子（この後、部分的に自己相補的となる）または異なるＤＮＡ分子（部分的にまたは完全に相補的である）内のどちらかの塩基対合により形成されるＤＮＡ二本鎖と理解されるものとする。分子内（ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ）塩基対合は、同一分子内の塩基対合を指定し、異なるＤＮＡ分子間の塩基対合は、分子間（ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ）塩基対合と呼ばれる。
【００３０】
本開示の意味において「ループ」は、ステム構造内またはステム構造の末端のどちらかの、不対合一本鎖領域と理解されるものとする。「ヘアピン」は、ステムおよびループの特徴的な組み合わせであり、同一ＤＮＡ分子の２つの自己相補的領域がハイブリダイズして不対合ループを有するステムを形成する場合に生じる。ダンベル型は、ステム領域に隣接する両方の末端にヘアピンを有する線状ＤＮＡ構築物を示す。故に、本開示の関連において「線状ＤＮＡ構築物」は、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡを含む線状開鎖ＤＮＡ構築物、または二本鎖ＤＮＡステムの両方の末端の一本鎖ループを含む線状ダンベル型ＤＮＡ構築物のどちらかを示す。
【００３１】
ＤＮＡ一本鎖の５’末端または３’末端を意味するかにかかわらず、用語「ＤＮＡ末端」は、末端ヌクレオチドを指すだけでなく、末端の５つのヌクレオチド、またはさらには、それぞれのＤＮＡ末端に関して最後の３つのヌクレオチドも含む。ＤＮＡ末端の修飾は、それぞれのヌクレオチドの少なくとも１つに関する。
【００３２】
「Ｇストレッチ」は、本開示の意味において少なくとも３つの連続するデオキシグアノシンの配列と理解されるものとする。
【００３３】
ヌクレオチドが、共有結合または非共有結合される「固相」は、カラム、マトリックス、ビーズ、修飾ガラスまたは官能化ガラスを含むガラス、シリコンおよび修飾シリコンを含むシリカまたはシリカベースの材料、プラスチック（ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレンならびにスチレンおよび他の材料のコポリマー、アクリル、ポリブチレン、ポリウレタン等を含む）、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、多糖類、炭素ならびに無機ガラス、金属、ナノ粒子、およびプラスチックを指すが、これらに限定されない。故に、マイクロタイタープレートも、本開示による固相の範囲内である。
【００３４】
本開示による免疫調節は、免疫刺激および免疫抑制を指す。免疫刺激は、免疫系のエフェクター細胞が増殖、移動、分化するまたはいずれか他の形態で活性になるように刺激されることを優先的に意味する。例えば、通常はヘルパーＴ細胞からの共刺激シグナルを必要とするＢ細胞増殖は、免疫刺激性ＤＮＡ分子により共刺激シグナルなしで誘導され得る。
【００３５】
一方、免疫抑制は、免疫系の活性化または有効性の減少と理解されるものとする。免疫抑制は一般に、例えば移植された臓器の拒絶を予防するため、骨髄移植後の移植片対宿主病を治療するため、または例えば、関節リウマチもしくはクローン病などの自己免疫疾患の治療のために意図的に誘導される。
【００３６】
この関連において、免疫調節はまた、まだ発達中または成熟中の免疫反応に影響を与えること、または確立された免疫反応の特徴を調節することによる、免疫反応の性質または特徴の影響も指す。
【００３７】
本開示において使用される用語「ワクチン接種」は、疾患に対する免疫を生じさせるための抗原物質（ワクチン）の投与を指す。ワクチンは、ウイルス、真菌、寄生原虫、細菌などの多くの病原体による感染の影響を予防または改善することができるが、アレルギー性疾患および喘息、ならびに腫瘍の影響も予防または改善することができる。ワクチンは、典型的には、免疫応答をブーストするのに使用される１つまたは複数のアジュバント、例えば免疫刺激性核酸を含有する。ワクチン接種は、感染症および他の疾患を予防する最も有効なおよび最も費用効果の高い方法であると一般に考えられている。
【００３８】
投与される物質、例えば、病原体（細菌またはウイルス）の生きているが弱毒化された形態、これらの病原体の死滅または不活化形態、精製物質（抗原をコードするタンパク質、核酸など）、または腫瘍細胞もしくは樹状細胞などの細胞であってもよい。特に、ＤＮＡワクチン接種は最近開発された。ＤＮＡワクチン接種は、抗原をコードするＤＮＡの、ヒトまたは動物細胞への挿入（および発現、免疫系認識の誘発）により効き目がある。発現されたタンパク質を認識する免疫系の幾つかの細胞は、これらのタンパク質および該タンパク質を発現する細胞に対する攻撃を開始する。ＤＮＡワクチンの１つの利点は、これらが極めて製造および貯蔵しやすいことである。さらに、ＤＮＡワクチンは、より広範囲の免疫応答型を誘導する能力を含む、従来のワクチンに対する幾つかの利点を有する。
【００３９】
ワクチン接種は、抗原に曝露した際、ワクチン接種された健康な個体において抗原に対する免疫をもたらす、予防的アプローチとして使用することができる。あるいは、治療的ワクチン接種は、個体の免疫系を抗原に導くことにより、ワクチン接種された罹患個体の免疫系の応答の改善をもたらすことができる。予防的および治療的ワクチン接種は両方とも、ヒトおよび動物に適用することができる。
【００４０】
本開示において使用される用語「遺伝子治療」は、腫瘍または自己免疫疾患などの疾患を治療するための、個体の細胞および／または生物組織の一過的または永続的な遺伝的修飾（例えば遺伝子の挿入、変更、または除去）を指す。遺伝子治療の最も一般的な形態は、変異遺伝子を置換するための不特定な遺伝子位置への機能遺伝子の挿入を伴うが、他の形態は、変異の直接的修正、またはウイルス感染を可能にする正常遺伝子の修飾、またはさらには遺伝子もしくは遺伝子断片の、転写のための細胞への移入を伴う。
【００４１】
「自家遺伝子治療（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）」は、同一個体の組織または細胞の使用を指す。単離された細胞または組織は、遺伝子治療により修飾され、ドナーに再導入される。対照的に、「同種異系遺伝子治療（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）」は、受け入れ側（ａｃｃｅｐｔｏｒ）個体以外の個体由来の遺伝子治療用細胞の使用を指す。遺伝的修飾後、同種異系細胞は受け入れ側に導入される。
【００４２】
用語「生体外遺伝子治療」は、個体由来の細胞、例えば造血幹細胞または造血前駆細胞が、生体外で遺伝子修飾され、この後、治療される個体に導入される治療アプローチを指す。用語「生体内遺伝子治療」は、個体由来の細胞、例えば造血幹細胞または造血前駆細胞が、例えばウイルスベクターまたは他の発現構築物を用いて、生体内で遺伝子修飾される治療アプローチを指す。
【００４３】
遺伝子治療はまた、「生殖細胞系遺伝子治療」および「体細胞系遺伝子治療」に分類することもできる。「生殖細胞系遺伝子治療」の場合、生殖細胞、すなわち、精子または卵子が遺伝子修飾される。遺伝子変化は通常、それらのゲノムに組み込まれる。したがって、治療による変化は遺伝性となり、後の世代に受け継がれることになる。このアプローチは、遺伝的障害および遺伝性疾患の治療に有用である。「体細胞系遺伝子治療」の場合、治療的遺伝子は個体の体細胞系細胞に移入される。いずれの修飾および影響も個体のみに限定され、個体の子孫または後の世代に受け継がれない。
【００４４】
用語「癌」は、癌性疾患、または乳癌、黒色腫、皮膚新生物、リンパ腫、白血病、胃腸腫瘍（結腸癌（ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胃癌、膵臓癌、結腸癌（ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ）、小腸癌を含む）、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌、腎細胞癌および／もしくは肝転移を含むがこれらに限定されない群から選択される治療または予防される腫瘍を含む。
【００４５】
本開示による自己免疫疾患は、関節リウマチ、クローン病、全身性ループス（ＳＬＥ）、自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺炎、多発性硬化、バセドウ病、重症筋無力症、セリアック病およびアジソン病を含む。
【００４６】
本開示は、Ｌ−立体配座にある少なくとも１つのＣＧモチーフおよび少なくとも１つのヌクレオチドを含む線状開鎖ＤＮＡ配列を提供する。部分的／完全Ｌ−立体配座により、ＤＮＡは、自然発生のＤ−立体配座特異的ＤＮＡ分解酵素に対する基質として作用することができない。これにより、本発明のＤＮＡ構築物は、毒性であることが示されているホスホロチオエート骨格を使用する必要なく酵素分解に対して保護される。さらに、ＤＮＡ構築物は、最小数のヌクレオチドからのみ成り、これが該構築物を小さくし、これにより患者の細胞によるそれらの取り込みを著しく改善する。
【００４７】
ＣＧ含有ＤＮＡ構築物の効果はＴＬＲ９とのそれらの相互作用に依存し、ＤＮＡ−タンパク質相互作用は、ＤＮＡおよびタンパク質の両方の立体配座に依存する。単一分子のキラリティーは、得られたポリマーの立体配座に対し決定的であることから、部分的または完全なＬ−立体配座にあるＤＮＡ分子が、ＴＬＲ９に結合しＴＬＲ９を活性化することができるかどうかは知られていなかった。実験データは、このような保護されたＤＮＡ分子が、驚くべきことに免疫応答の誘導に適していることを示す。例および図に示されているように、単一ヌクレオチドのキラリティーにおける少なくとも部分的な変化は、ＴＬＲ９への結合およびＴＬＲ９の活性化を明らかに依然として可能にする。したがって、ＣＧモチーフを有するＤＮＡ分子およびＬ−立体配座にあるヌクレオチドは、免疫調節に使用することができる。
【００４８】
驚くべきことに、誘導される刺激パターンは、同一のヌクレオチド配列を使用する場合ですら、図に見ることができるように、ＥＰ  １  １９６  １７８に開示された分子により誘導される刺激パターンとは異なる。ＥＰ  １  １９６  １７８は、分子の両方の末端における一本鎖ループまたは二本鎖ステム（「ｄＳＬＩＭ」）にＣＧモチーフを含むダンベル型分子を開示している。
【００４９】
ＤＮＡ構築物は、一本鎖または部分的にもしくは完全に二本鎖であってもよい。これは、同一分子内（分子内）もしくは異なる分子内（分子間）の、またはこの任意の組み合わせの塩基対合を含む。構築物が少なくとも１つの不対合一本鎖領域を含むことも可能である。さらなる実施形態として、ヘアピン構造が含まれる。Ｌ−立体配座にあるヌクレオチドは分解の対象にならないため、部分的または完全なＬ−立体配座により、構築物のより長い半減期が確保される。
【００５０】
一本鎖または部分的にもしくは完全に二本鎖である少なくとも２つの分子が、多量体構築物を形成するように互いにライゲーションできることも意図される。これらの多量体構築物は故に、１つの分子内に隙間なく詰め込まれた、ライゲーションパターンと少なくとも同数のＣＧモチーフを組み込み、したがって、かなりの免疫応答を誘発することが予測される。得られた一本鎖または部分的にもしくは完全に二本鎖多量体構築物は、酵素分解に対する保護のための、分子内にＬ−立体配座でのヌクレオチドを含む共有結合閉鎖多量体構築物、あるいは５’および／もしくは３’末端またはこの近くにＬ−立体配座でのヌクレオチドを含む開鎖多量体構築物のどちらかであってもよい。
【００５１】
本開示により、ＣＧモチーフ（複数可）は、構築物の一本鎖および／または二本鎖領域内に位置する。ＥＰ  １  １９６  １７８に開示されているように、ＣＧモチーフは、これが分子の一本鎖領域内または二本鎖領域内に含まれるかにかかわらず、免疫応答を誘発することができる。
【００５２】
本開示は、カルボキシル、アミン、アミド、アルジミン、ケタール、アセタール、エステル、エーテル、ジスルフィド、チオールおよびアルデヒド基からなる群から選択される官能基を有する、Ｌ−またはＤ−立体配座にある少なくとも１つのヌクレオチドの化学修飾をさらに含む。これは、例えば吸着、共有結合またはイオン結合による、ペプチド、タンパク質、脂質、ベシクル、ミセル、炭水化物、抗体、合成分子、ポリマー、マイクロプロジェクタイル、金属粒子、ナノ粒子または固相からなる群から選択される化合物へのＤＮＡ構築物の結合を可能にする。修飾は、それぞれの目的に特異的に選択することができる。構築物は、これにより、組み込まれたＣＧモチーフ（複数可）に応答する特定の細胞へ他の分子を往復させるのに例えば使用されてもよい。さらに、このような修飾により、マイクロプロジェクタイル（構築物を細胞に移入するのに使用することができる）に構築物を結合させることが可能である。構築物は、固相、例えばマイクロタイタープレートに結合させることもできる。
【００５３】
Ｔｈ１偏向活性化は、ＮＫ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を伴い、これらの免疫応答は、癌治療に利用することができる。非メチル化ＣＧモチーフを含有するＤＮＡ構築物は、好ましくはＴｈ１活性化をもたらすことから、本開示の構築物は、癌を治療するのに使用することができる。癌の治療のためのＴＬＲ９アゴニストにかかわる多くの臨床試験が進行中である。このような分子は、単独で、または例えば、放射線療法、外科手術、化学療法および凍結療法と併用して、効果的に投与されている（Ｋｒｉｅｇ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００７  １１７：１１８４〜９４頁）。それらの強力な免疫調節、小さいサイズ、および安定性により、本開示の構築物は、この点で非常に有利になると予測される。さらに、該構築物の特徴的な免疫学的プロフィールは、該構築物と他のあまり有利でないＴＬＲ９リガンドを区別し、このプロフィールは癌特異的治療に利用することができる。
【００５４】
一方、ＴＬＲ９アゴニストは、制御性Ｔ細胞の生成にも関与し、故に自己免疫疾患の治療に使用することができる。投与の経路は、ＣＧモチーフを含有するＤＮＡ構築物の生体内での影響を判定する１つの変数になると思われる（Ｋｒｉｅｇ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００７  １１７：１１８４〜９４頁）。
【００５５】
ＣＧモチーフを含有するこのようなＤＮＡ分子の免疫刺激効果は、癌治療において化学療法などの標準的治療アプローチの有効性を改善することが示されている。したがって、本開示の構築物を含む医薬組成物も提供される。この場合もやはり、最先端のＴＬＲ９アゴニストと比較して本開示の構築物の有利な特徴は、本開示の構築物を癌、感染症、アレルギーおよび喘息などの疾患の治療に有望なツールにする。これによりアレルギーおよび喘息（ほとんどがＴｈ２媒介）の治療は、Ｔｈ１活性化の優先から効果を得る。
【００５６】
ＴＬＲ９アゴニストは、ワクチンにおける強力なアジュバントであることが示されていることから、本開示のＤＮＡ構築物を含むワクチンも提供される。本開示の構築物はＴＬＲ９刺激に関連する配列のみを含み、およびＬ−ヌクレオチド修飾により安定である。したがって、関連しない配列による副作用は避けることができる。該分子のより長い半減期は、効果的な刺激を確保するため強力な免疫応答が予測される。
【００５７】
本開示のＤＮＡ分子は、合成カラムおよびそれぞれのヌクレオチド（べータ−Ｌ−デオキシ「ＮＴ」（ｎ−ｂｚ）ＣＥＤホスホラミダイト；「ＮＴ」はアデノシン、シチジン、グアノシンまたはチミジンを表す）を用いて作製された。ＤＮＡ分子は、この後ＨＰＬＣにより精製された。
【００５８】
Ｄ−リボースの代わりにＬ−リボースを有するＤＮＡの使用の影響を明らかにするため、以下のＤＮＡ分子が本明細書に記載された最初の実験に使用された（表１）。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
表１の配列を用いた実験は、ＣＧモチーフを含有するＬ−リボース保護線状配列は、免疫系を刺激することができること、および誘導された免疫応答は、ＥＰ  １  １９６  １７８に開示されているようなｄＳＬＩＭにより誘導された免疫応答とは明らかに異なることを示した。故に、ＯＤＮ２２１６（ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ；配列番号６）と呼ばれる修飾配列およびこの修飾がＧストレッチの影響（それらの存在、長さおよび位置に関する）、ＣＧモチーフ間の間隔、ならびにＬ−リボースヌクレオチドとＣＧモチーフ各々のＧストレッチの間の距離のような構造差の影響を調べるのに使用された。
【００６１】
表２は、ホスホロチオエートで修飾された最初の２つおよび最後の６つのヌクレオチドを有するＯＤＮ２２１６と比較した、使用された配列ならびにＩＦＮ−アルファおよびＩＰ−１０分泌に対するこの影響をまとめたものである。太字はｌ−リボースを含むヌクレオチドを表し、イタリック体はＧストレッチを指し、および下線が引かれた文字はＣＧモチーフを指す。ダッシュは、ＣＫｍ５０８との比較のため、それぞれの配列を所定の位置に置くものとするが、配列の構造修飾または機能修飾のいずれも示すものではない。
【００６２】
【表２】
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【００６３】
良好な結果は、少なくとも１つのＧストレッチを、特に３’末端またはこの近くに有する配列で得られた。刺激はさらに、ＣＧモチーフの存在に依存性であり（ＣＫｍ４７７）、この場合もやはり、刺激がｌ−リボースではなくＣＧモチーフの影響であることを示している。
【００６４】
正の構造成分を同定するＯＤＮ２２１６の修飾配列で得られた結果は、ＣＫｍ３７４のＤＮＡ配列に移行された。表３は、ＥＰ  １  １９６  １７８に開示されているようなダンベル型ｄＳＬＩＭと比較した、修飾配列を使用する結果を示す。この場合もやはり、太字はｌ−リボースを含むヌクレオチドを表し、イタリック体はＧストレッチを指し、二重下線が引かれた文字はホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを表し、および下線が引かれた文字はＧＣモチーフを指す。
【００６５】
表３の結果からわかるように、５’末端に直に位置するＧストレッチが有利であると考えられる（ＣＫｍ５３２およびＣＫｍ４９９を比較せよ）。さらに、５’末端に３つの代わりに４つのデオキシグアノシンを使用することは、ＩＦＮ−アルファおよびＩＰ−１０の刺激をさらに増加させる（ＣＫｍ５０１およびＣＫｍ５３２を比較せよ）。
【００６６】
ＣＧモチーフ間に追加のＧストレッチを付加することは、同様に有益であると考えられる（ＣＫｍ５３２およびＣＫｍ５２０を比較せよ）。１番目と２番目のＧストレッチの間の距離は、ＤＮＡ分子の有効性にさらに影響を及ぼす。さらに、３’またはこの近くのみにおけるｌ−リボースを含むデオキシヌクレオチドの使用は、ＤＮＡ分子の十分な程度の安定化をもたらすと考えられる。ＩＦＮ−アルファおよびＩＰ−１０の所望される良好な刺激を観察することができる（以下参照）。ＩＬ−８は、血管新生の誘導に関与することが示されているため、ＩＬ−８分泌は少量でのみ誘導されることが有益であると考えられる。
【００６７】
明らかに、ｌ−リボースを含有するデオキシヌクレオチドの安定効果と組み合わせた、Ｇストレッチの存在および注意深く選択された位置は、ｄＳＬＩＭ分子の刺激効率を上回るＤＮＡ分子の作製を可能にする。
【００６８】
【表３】
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本開示は、開示された実施形態に限定されることなく例および図により以下にさらに例証される。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】酵素消化後のＤＮＡ構築物のアガロースゲル電気泳動を示す図である。
【図２】マウスマクロファージ細胞系の刺激後のＧＦＰ強度を示す図である。
【図３】形質細胞様樹状細胞（ＰＤＣ）を刺激後のＭＩＰ−１アルファ濃度を示す図である。
【図４】ＰＤＣを刺激後のＭＩＰ−１ベータ濃度を示す図である。
【図５】ＰＤＣを刺激後のＩＬ−８濃度を示す図である。
【図６】ＰＤＣを刺激後のＩＬ−６濃度を示す図である。
【図７】ＰＤＣを刺激後のＩＦＮ−アルファ濃度を示す図である。
【図８】ＰＤＣを刺激後のＴＮＦ−アルファ濃度を示す図である。
【図９】抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）を刺激後のＭＣＰ−１およびＩＬ−８濃度を示す図である。
【図１０】ＰＢＭＣを刺激後の活性化Ｔ細胞の頻度を示す図である。
【図１１】ＰＢＭＣのＩＦＮ−アルファ、ＩＰ−１０およびＩＬ−８分泌を示す図である。
【図１２】ＰＢＭＣのＩＦＮ−アルファ、ＩＰ−１０およびＩＬ−８分泌を示す図である。
【図１３】ＥＬＡＭ９細胞の刺激に対するｌ−リボース修飾末端デオキシヌクレオチドの影響を示す図である。
【図１４】非刺激状態と比較した、ＣＫｍ５３２およびｄＳＬＩＭによるＢ細胞およびＰＤＣの免疫刺激を示す図である。
【００７０】
図面の詳細な説明
図１は、Ｔ７バクテリオファージ由来のＴ７ポリメラーゼによる消化に供される全てのＤＮＡ構築物のゲルを示す。６μｇの各ＤＮＡ構築物を、１０単位のＴ７ポリメラーゼと共にインキュベートした（合計反応容量：２０μｌ）。０、１、２、５、３０、および１５００分後、インキュベーション混合物の３μｌのアリコートを試料から除去し、および５μｌのホルムアミド含有サンガー色素で希釈した。全てのアリコートを３％アガロースゲルに添加し、４０分間１００ボルトで流した。
【００７１】
非修飾ＤＮＡ分子ｌｉｎ−３０Ｌ２（レーン２）は、Ｔ７ポリメラーゼとの５分のインキュベーション後、完全に消化されることが見出されたのに対し、本発明による構築物（ＣＫｍ３３７；レーン３）、ならびにｄＳＬＩＭ（レーン１）およびホスホロチオエート修飾構築物ＣＫｍ３３８（レーン４）およびＣＫｍ３３９（レーン５）は、１５００分のインキュベーション後でさえ著しい存在を保持した。事実、ＣＫｍ３３７は、テストされた全て分子のうち最も高い安定性を示した。この不十分な安定性により、Ｌｉｎ  ３０Ｌ２をさらなる試験から除外した。
【００７２】
図２は、種々の刺激性ＤＮＡ構築物によるＥＬＡＭ９細胞の刺激を示す。ＥＬＡＭ９細胞は、幾つかのＮＦκＢ応答エレメントを含有するヒトエラスチンプロモーター（ｈＥＬＡＭ）の制御下でｄｌ−ｅＧＦＰを安定にトランスフェクトされたＴＬＲ９陽性マウスマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４）である。細胞を播種した翌日、細胞を、示されたＤＮＡ構築物（３μΜ）で７時間刺激した。ＧＦＰ強度の幾何平均をフローサイトメトリーにより測定した。
【００７３】
最後のＴを除いて全てのヌクレオチドをＬ−立体配座で有するＤＮＡ構築物（ＣＫｍ３３６）は、刺激能力を有さなかった。しかし、両方の末端にＬ−立体配座でのヌクレオチドを有するＤＮＡ構築物（ＣＫｍ３３７）は、ＧＦＰ発現を刺激した。これはむしろ予想外であった。その理由は、Ｌ−立体配座でのヌクレオチドを有する、ＣＧモチーフを含有するＤＮＡ構築物が、ＴＬＲ９に結合しＴＬＲ９を活性化することができるかどうかは知られていなかったためである。さらに、ＣＫｍ３３７は、ｄＳＬＩＭ（ＥＰ  １  １９６  １７８に開示されている分子）より容易に細胞により取り込まれること、およびホスホロチオエート修飾構築物（ＣＫｍ３３８およびＣＫｍ３３９）より毒性が少ないことが予期される。
【００７４】
図３〜図８は、分泌されるケモカインおよびサイトカインに関するｐＤＣに対するＤＮＡ構築物の影響を示す。ｐＤＣは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社、ダイアモンドＰＤＣキットからの複合分類手順を用いてフィコール精製ＰＢＭＣから濃縮した。最初に、ＰＢＭＣを、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社のキットからのｐＤＣビオチン抗体カクテルを用いてｐＤＣ以外から枯渇し、次いで細胞を、ＰＤＣダイアモンドキットからのＣＤ３０４（ＢＤＣＡ−４）ダイアモンドマイクロビーズを用いて、ｐＤＣについて陽性分類した。ＰＤＣを、培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ウシ胎仔血清、１００単位／ｍｌペニシリン、１００単位／ｍｌストレプトマイシン２ｍＭグルタミン、３７℃、５％Ｃ０２）に１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３と共に２．５×１０５／ｍｌで播種し、３μΜで適用された個々の構築物により２日間刺激した。
【００７５】
細胞を刺激した際に分泌される化合物の量の判定には、刺激された細胞の清澄な上清を回収し、マルチプレックスシステム（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘ／Ｂｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ）またはＥＬＩＳＡを用いて分析した。
【００７６】
驚くべきことに、ＣＫｍ３３７で刺激されたｐＤＣは、ｄＳＬＩＭによる刺激と比べてＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータおよびＩＬ−８分泌に対する同様の影響を示した。ｌｉｎ  ＣＫｍ３３８およびＣＫｍ３３９で刺激した際のＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータおよびＩＬ−８分泌は、若干高かった（図３、４および５）。しかし、全てのホスホロチオエート修飾構築物は、上述されたような幾つかの欠点を受け継ぐ。
【００７７】
ＩＬ−６分泌に関して、ｄＳＬＩＭ、ＣＫｍ３３７およびＣＫｍ３３８はｐＤＣに対し同様の影響を与えた。ＣＫｍ３３９は若干より有効であった（図６）。
【００７８】
重要なのは、ＣＫｍ３３７は驚くべきことに、全ての他の線状構築物と比較してｐＤＣのＩＦＮ−アルファ分泌に対しより強い影響を与えた。（図７）。
【００７９】
ｄＳＬＩＭ、ＣＫｍ３３７、ＣＫｍ３３８およびＣＫｍ３３９は全て、ｐＤＣのＴＮＦ−アルファ分泌に対し同様の影響を与えた（図８）。
【００８０】
ＰＢＭＣは、フィコール密度勾配によりヒトバフィーコートから単離された。機能分析には、培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ウシ胎仔血清、１００単位／ｍｌペニシリン、１００単位／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、３７℃、５％Ｃ０２）中１０６細胞／ｍｌが、示された濃度（２〜３μΜ）で適用された個々の化合物により２日間刺激された。
【００８１】
図９（ＡおよびＢ）は、ＭＣＰ−１およびＩＬ−８の分泌に関するＰＢＭＣに対する示されたＤＮＡ構築物（各３μΜ）の影響を示す。ｐＤＣでの実験から予期される通り、全てのヌクレオチドをＬ−立体配座で有するＤＮＡ構築物（ＣＫｍ３３６）は、ＰＢＭＣに適用された場合、刺激能力を有さなかった。しかし、ＣＫｍ３３７は、ＭＣＰ−１およびＩＬ−８分泌の両方の誘発に有効であった。驚くべきことに、ＩＬ−８分泌に関するこの影響は、ｄＳＬＩＭと比較してより強く、ＭＣＰ−１分泌に関しては強さが低かった。
【００８２】
細胞亜集団およびこの活性化状態の判定には、特徴的な表面マーカーが選択的フルオロフォア結合抗体で標識された。抗体染色は、１０６細胞／染色セットで実施された。各セットは、フルオロフォア基に結合された最大４つの異なる抗体と共にインキュベートされ、最後に４００μｌ  ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁され、少なくとも１００，０００生細胞についてフローサイトメトリーにより分析された。Ｔ細胞およびこの活性化細胞を判定するためのゲート戦略は、活性化マーカーＣＤ６９によるＣＤ３＋／ＣＤ５６−であった。
【００８３】
図１０は、ＰＢＭＣの集団内の活性化Ｔ細胞の頻度に対する、示されたＤＮＡ構築物（各２μΜ）の影響を示す。全ての５つの構築物は同等の刺激能力を有した。Ｔ細胞はＴＬＲ９を発現しない。したがって、ＤＮＡ構築物で刺激するとＰＢＭＣ集団内の細胞が活性化され、今度はＴ細胞を活性化することができる。
【００８４】
配列の最適化は、Ｇストレッチの導入がトランスフェクション後のオリゴヌクレオチドの有効性を増加させることを明らかにした。有効性は、さらに、ＣＧモチーフ間の距離に依存する。線状ＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチドの３’末端でのＬ−リボースを含むデオキシヌクレオチドの使用により、分解に対し十分に保護され得る（表２および３を比較せよ）。オリゴＣＫｍ５０１（配列番号３３）、ＣＫｍ５２７（配列番号３２）、ＣＫ５３２（配列番号３１）およびＣＫｍ５３４（配列番号３４）は、表３からわかるように予想外の良好な結果を示した。図１１および１２は、ＰＢＭＣにおけるサイトカインＩＦＮ−アルファ（上）、ＩＰ−１０（中）およびＩＬ−８（下）の分泌に対する、示されたＤＮＡ構築物の影響を示す。実験は、既に上述されたように行われた。
【００８５】
図１１は、ダンベル型ｄＳＬＩＭと比較して、ＣＫｍ５０１およびＣＫｍ５２７がＩＦＮ−アルファ分泌のレベルの上昇をもたらすこと、ならびにＣＫｍ５２７はＩＰ−１０分泌も増加させることを示す。ＩＬ−８の分泌は、ｄＳＬＩＭに関しては同等に低いが、ホスホロチオエート修飾デオキシヌクレオチドにより両方の末端で保護されたダンベル型ｄＳＬＩＭの一本鎖ループの配列であるＣＫｍ３３９との比較ではより低い。
【００８６】
図１２からわかるように、ＣＫｍ５３２は、ＩＦＮ−アルファおよびＩＰ−１０分泌の著しい、および予想外に高い誘導を示すが、ＩＬ−８分泌の同等に低い誘導を示す。故に、ＣＫｍ５３２は、５’末端に直に位置するＧストレッチ、および２つのＣＧモチーフ（２番目と３番目のＧＣモチーフ）の間に位置するさらなるＧストレッチの構造エレメントが有利であると考えられることを確認するものである。表３におけるＣＫｍ５２０およびＣＫｍ５３２の比較は、ＣＫｍ５３２における２番目と３番目のＧＣモチーフの間のＧストレッチの位置が、ＩＦＮ−アルファおよびＩＰ−１０分泌の所望される増加に関与するのに対し、ＣＫｍ５２０はＩＬ−８分泌を主に増加させることを示している。さらに、３’末端における２つのＬ−リボースを含むデオキシヌクレオチドでのみオリゴを保護することは十分であると考えられる。
【００８７】
５’末端でのＧストレッチの短縮は、図１２におけるＣＫｍ５３２およびＣＫｍ５３４の比較からわかるように有効性の低下をもたらす。この場合もやはり、ＣＫｍ５３２は、増加したＩＦＮ−アルファおよびＩＰ−１０分泌ならびに低いＩＬ−８分泌に関して、同定された構造成分の利点を示している。
【００８８】
図１３は、Ｌ−リボース修飾の程度が異なるデオキシヌクレオチドを含む示されたＤＮＡ構築物によるＥＬＡＭ９細胞刺激の結果を上部に示す。Ｌ−リボースを含むヌクレオチドは、太字で図１３の下部の配列に表されている。実験は２連で行われた（Ｌ−ｄＳＬＩＭ０３２およびＬ−ｄＳＬＩＭ０３０）。
【００８９】
Ｌ−リボースを含むデオキシヌクレオチドの程度および位置は、ＥＬＡＭ９細胞の刺激に影響を及ぼす。Ｌ−立体配座での完全な配列（ＣＫｍ３３６；配列番号２）は刺激効果を全く有さず、これはＷＯ  ２０１０／０３９１３７の開示と一致している。良好な効果が、３’および５’末端のＬ−リボースを含むデオキシヌクレオチドにより保護されたＣＧモチーフを含むオリゴを用いて得られるのに対し、５’末端でのＬ−リボースを含むデオキシヌクレオチドの長い伸長は逆効果である（ＣＫｍ４８９およびＣＫｍ４９０を比較せよ）。さらに、Ｌ−リボースを含むデオキシヌクレオチドによるＣＧモチーフの修飾は、効果の喪失をもたらす。故に、良好な刺激効果を達成するために、ＣＧモチーフはＬ−リオボース（Ｌ−ｒｉｏｂｏｓｅ）を含むべきではなく、両方の末端でのＬ−リボース修飾デオキシヌクレオチドの伸長は制限（すなわち、５’末端の末端デオキシヌクレオチドが８つを超えず、最後のＣＧモチーフの後の３’末端デオキシヌクレオチドが最大に）されるべきである。
【００９０】
図１４は、非刺激状態と比較したＣＫｍ５３２およびｄＳＬＩＭによる免疫刺激を示す。ＦＡＣＳ実験は、図１０に記載された実験に使用され、ならびにＢ細胞（ゲート戦略：ＣＤ１９陽性、活性化マーカーとしてのＣＤ８６）およびＰＤＣ（ゲート戦略：系統陰性、ＨＬＡ−ＤＲ陽性、ＣＤ１２３陽性細胞、ＣＤ４０および活性化マーカーとしてのＨＬＡ−ＤＲ）にそれぞれ適合されたプロトコルに従って実施された。示されたデータは、３つの異なるバフィーコート調製物の測定に基づく。
【００９１】
図１４の上部は、マーカーＣＤ８６により証明されたＢ細胞の刺激を示す。ｄＳＬＩＭおよび非刺激状態と比較した場合、明らかに、ＣＫｍ５３２はＢ細胞の刺激の増加をもたらす。これは、抗体産生細胞などのＢ細胞の成熟の増加を示すものであり、免疫刺激の重要な特徴である。
【００９２】
図１４の下部は、マーカーＨＬＡ−ＤＲを用いて検出されたＰＤＣの刺激を示す。ＨＬＡ−ＤＲは、ＭＨＣ分子の一部であり、故に免疫系の抗原提示プロセスの一部である。この場合もやはり、ＣＫｍ５３２は、この免疫刺激特性の、ｄＳＬＩＭまたは非刺激細胞より強い増加を示す。
【００９３】
結論として、ＣＫｍ３３７（両方の末端にＬ−立体配座でのヌクレオチドを有するＤ−ＤＮＡ構築物）は驚くべきことに、ＰＢＭＣおよび単離されたｐＤＣの両方に対する刺激効果を有したのに対し、全てのヌクレオチドをＬ−立体配座で有するＤＮＡ構築物（ＣＫｍ３３６）は効果がなかった。明らかに、ＣＫｍ３３７の立体配座は、ＴＬＲ９への結合を依然として可能にし、ＣＫｍ３３６は、ＴＬＲ９に結合することまたはＴＬＲ９を刺激することが立体的にできない。
【００９４】
予想外なことに、ダンベル型ｄＳＬＩＭおよびホスホロチオエート修飾オリゴと比較した、ＣＫｍ３３７により誘導された刺激パターンは、全ての他の構築物と比べて独特であった。ＣＫｍ３３７は、ｐＤＣによる最高量の分泌ＩＦＮ−アルファを誘導した。ＰＢＭＣによるＩＬ−８分泌は、ホスホロチオエート修飾分子と比べてより弱かったが、ｄＳＬＩＭと比べてより強かった。対照的に、ｄＳＬＩＭは、ＰＢＭＣによるより多い量の分泌ＭＣＰ−１を誘導したが、Ｃｋｍ３３７はホスホロチオエート修飾分子と同等であった。
【００９５】
いわゆるＧストレッチを線状ＤＮＡ分子の５’末端に直に導入することにより、ＣＫｍ３３７で観察された効果を増加させることが可能であった。さらに、３’末端のＬ−リボースを含むデオキシヌクレオチドによる、分解に対する単なる保護が、オリゴの安定化には十分であることが判明した。Ｇストレッチ、ＣＧモチーフ、ＣＧモチーフの間隔の同定された構造的特徴、ならびにＬ−リボース修飾デオキシヌクレオチドの種々の程度および位置を用いた保護は、Ｌ−リボースを含むオリゴヌクレオチドの免疫刺激効果の調節を可能にする。本開示が、細胞または免疫系を標的刺激するための免疫刺激性ＤＮＡ構築物を構築する新たなツールを明らかにすることは、極めて明白であると考えられる。
【００９６】
ＩＦＮ−アルファは、長年にわたり抗ウイルスサイトカインとして知られてきた。ＩＦＮ−アルファはＴｈ１細胞発生を刺激し、したがってＣＧ含有ＤＮＡ分子の影響を促進する。ＩＦＮ−アルファはまた、マウスおよびヒト悪性腫瘍において抗腫瘍活性も示し、一部には細胞傷害性Ｔ細胞の活性化およびこれによる腫瘍細胞溶解の可能性の増加により、移植された腫瘍細胞の腫瘍原性を減少させることができる。ＮＫ細胞およびマクロファージ活性の両方も抗腫瘍細胞傷害性に重要であり、同様にＩＦＮ−アルファにより増加される（Ｂｒａｓｓａｒｄら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．２００２  ７１：５６５〜８１頁）。したがって、本開示のＤＮＡ構築物で刺激した際のＩＦＮ−アルファの量の増加は、癌の治療に有益であることが予期される。
【００９７】
ＩＰ−１０は、生体内での強力な血管新生抑制タンパク質であることが最近示された。故に、特に腫瘍疾患の治療におけるＩＰ−１０の誘導もまた有利であると考えられる。
【００９８】
ＩＬ−８は、好中球の活性化および抹消血から組織への遊走を媒介することが知られている炎症誘発性サイトカインである。結果として生じる好中球浸潤は、卵巣癌について示されているように（Ｌｅｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  １６４：２７６９〜７５頁）、腫瘍増殖の阻害に部分的に関与し得る。さらに、ＩＬ−８はまた、Ｔ細胞および好塩基球に対して走化性でもある。したがって、少なくとも幾つかの腫瘍タイプの治療または予防には、ＣＧ含有ＤＮＡ構築物に応じてＩＬ−８を選択的に上方制御することが有利である。一方、ＩＬ−８は血管新生を誘発するため、ＩＬ−８分泌の誘導が逆効果になる可能性があることが確立されている。故に、本発明の種々のＤＮＡ分子による種々の程度のＩＬ−８誘導は、該分子を所望の治療効果に適合できるようにする可能性がある。
【００９９】
ＭＣＰ−１は、損傷および感染の部位への単球／マクロファージの動員に役割を果たすことが知られており、これにより宿主抗腫瘍応答の刺激に関与する可能性がある。ＭＣＰ−１は、インビトロでヒト腫瘍細胞の幾つかのタイプに対してより細胞増殖抑制性に単球を活性化できることが示されている（Ｚａｃｈａｒｉａｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９０  １７１：２１７７〜８２頁）。したがって、ＩＬ−８と同様に、特定の腫瘍背景に応じてＭＣＰ−１発現を調節することが有益である。
【０１００】
故に、誘導される特異的サイトカインパターンは、特徴的な腫瘍タイプの治療および予防に有益である。明らかに、非メチル化ＣＧモチーフがＴＬＲ９に提示される特異的背景は、応答細胞において誘導される個々のそれぞれの刺激パターンを決定するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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