(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のアミノ酸配列（ａ）又は（ｂ）を有し、マルトースに作用せず、グルコースからオリゴ糖を合成しないイソマルターゼを含有する、α−アミラーゼ、グルアミラーゼ、イソアミラーゼ及びプルラナーゼから選ばれる酵素との併用でデンプンからグルコース製造用の酵素製剤。
（ａ）配列番号３又は配列番号５
（ｂ）配列番号３又は配列番号５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、アミノ酸配列（ａ）と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【請求項２】
イソマルターゼが、糸状菌に由来するものである請求項１記載の酵素製剤。
【請求項３】
糸状菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ又はＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍである請求項２記載の酵素製剤。
【請求項４】
次のアミノ酸配列（ａ）又は（ｂ）を有し、マルトースに作用せず、グルコースからオリゴ糖を合成しないイソマルターゼと、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼ及びプルラナーゼから選ばれる酵素とを含有する、デンプンからグルコース製造用酵素組成物。
（ａ）配列番号３又は配列番号５
（ｂ）配列番号３又は配列番号５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、アミノ酸配列（ａ）と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【請求項５】
イソマルターゼが、糸状菌に由来するものである請求項４記載の酵素組成物。
【請求項６】
糸状菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ又はＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍである請求項５記載の酵素組成物。
【請求項７】
デンプンに、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼ及びプルラナーゼから選ばれる酵素と、次のアミノ酸配列（ａ）又は（ｂ）を有し、マルトースに作用せず、グルコースからオリゴ糖を合成しないイソマルターゼとを作用させることを特徴とするグルコースの製造法。
（ａ）配列番号３又は配列番号５
（ｂ）配列番号３又は配列番号５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、アミノ酸配列（ａ）と９０％以上の同一性を有する
【請求項８】
イソマルターゼが、糸状菌に由来するものである請求項７記載の製造法。
【請求項９】
糸状菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ又はＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍである請求項８記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デンプンからのグルコース生産に有用なイソマルターゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
デンプンからの工業的グルコース生産において、α−アミラーゼによる液化、グルコアミラーゼによる糖化、イソアミラーゼやプルラナーゼなどによる枝切り処理などに、様々な酵素が利用されている。このグルコース生産の一連の糖化工程において、糖化酵素であるグルコアミラーゼが有する糖転移、縮合反応等の副反応によって、副産物としてイソマルトースが生じ、デンプンをすべてグルコースに変換することができず、デンプンからのグルコース生産性が低下するという問題点がある。
【０００３】
イソマルトースは、グルコースがα−１，６グルコシド結合したものであるが、これをグルコースに分解することができれば、グルコースの収率上昇が期待できると考えられている。イソマルトースをグルコースに分解するために、α−１，６グルコシド結合を分解する酵素、イソマルターゼ（イソマルトシダーゼ、オリゴ−１，６−グルコシダーゼ）の働きが期待されている。
しかしながら、これまでに報告のあるイソマルターゼはイソマルトースを分解できるものの、糖転移反応により様々なオリゴ糖が生じ、効果的にグルコースを生産するために前述の目的のためには不向きであった。またこれらのイソマルターゼはマルトースにも作用し、グルコースを経て結果的にイソマルトースを合成してしまう。そこで、イソマルトースには作用するがマルトースには作用せず、また、グルコースからイソマルトースは合成しないという性質を有する新規なイソマルターゼが望まれていた。
【０００４】
デンプンの枝きり酵素といわれるイソアミラーゼやプルラナーゼは、α−１，６グルコシド結合を分解する酵素であるが、低分子のイソマルトースには作用しない。
糸状菌の一種である麹菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅは清酒、味噌、醤油などの製造に古来より利用されている。これまでに全ゲノム配列が解析され（非特許文献１、２）、有用タンパク質や抗生物質の生産などの産業利用に向けて現在も研究が進められている（非特許文献３）。Ａ．ｏｒｙｚａｅは、アミラーゼなどのデンプン分解酵素を多く生産する微生物として知られ（非特許文献４）、ゲノム上にはいくつかのα−アミラーゼ様遺伝子の存在が推定されているが、それらのすべてがα−アミラーゼとして機能しているかは不明である。
一般的にα−アミラーゼやイソマルターゼは、糖質加水分解酵素ファミリー１３（ＧＨ  Ｆａｍｉｌｙ  １３）に属しており、ＧＨ  Ｆａｍｉｌｙ  １３は、ほとんどがα−１，４、α−１，６グルコシド結合に作用するとされている。すなわち、マルトースとイソマルトース両方に作用する。ＧＨ  Ｆａｍｉｌｙ  １３に属する酵素は、３つの触媒残基を含む４つの高度に保存されたアミノ酸領域を持つとされている（非特許文献５、６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍａｃｈｉｄａ，Ｍ．他「Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ．」Ｎａｔｕｒｅ，４３８，１１５７−６１（２００５）．
【非特許文献２】Ｇａｌａｇａｎ，ＪＥ．他「Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ  ａｎｄ  Ａ．ｏｒｙｚａｅ．」Ｎａｔｕｒｅ，４３８，１１０５−１５（２００５）．
【非特許文献３】Ａｂｅ，Ｋ．他「Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｏｎ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ．」Ｍｙｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉａ，１６２，１４３−５３（２００６）．
【非特許文献４】Ｍａｃｈｉｄａ，Ｍ．他「Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ：ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｋｏｊｉ  ｍｏｌｄ  ａｎｄ  ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｆｕｔｕｒｅ．」ＤＮＡ  Ｒｅｓ  １５，１７３−８３（２００８）．
【非特許文献５】ＭａｃＧｒｅｇｏｒ  ＥＡ他「Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｔｏ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅｓ．」Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １５４６  １−２０（２００１）．
【非特許文献６】Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｔ．他「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｅｌｅｖｅｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅｓ．」Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３  ３５５−３６０（１９８６）．
【非特許文献７】Ｋｅｉｚｏ  Ｙ他「Ｖａｌ２１６  ｄｅｃｉｄｅｓ  ｔｈｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  α−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１，３４１４−３４２０（２００４）．
【非特許文献８】Ｇａｒｃｉａ，Ｂｉａｎｃａ他「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  α−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｉｎｉｏｌｕｔｅｕｍ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２００１），２８１（１），１５１−１５８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、イソマルトースには作用するがマルトースには作用せず、また、グルコースからイソマルトースは合成しないという性質を有する新規なイソマルターゼ、及びデンプンからのグルコースの効率的な生産方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、前記糸状菌に着目し、イソマルトースには作用するがマルトースには作用しないイソマルターゼを見出すべく種々検討を行った。まず糸状菌とは全く相違する酵母に着目し、酵母の一つであるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のイソマルターゼについて検討し、保存領域中の２１６番目のバリンが基質特異性を決定することが報告されている（非特許文献７）ことから、このイソマルターゼと同じ位置にバリンを持つ配列を有する糸状菌を麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ゲノムデータベース（ＤＯＧＡＮ）で探索した。その結果、全く意外にも、イソマルターゼを産生することが知られていない糸状菌である麹菌のゲノム上に、バリンを持つ配列が存在することを見出した。そして当該配列を有する遺伝子を大腸菌で発現させたところ、イソマルトースを分解する作用を有し、かつマルトースには作用しないイソマルターゼが得られることを見出し、本発明を完成した。なお、イソマルトースを分解できる酵素（オリゴ−１，６−グリコシダーゼ、デキストラングルコシダーゼ、ネオプルラナーゼ、ＤｅｘＣタンパク等）は、細菌、酵母、糸状菌等から既に多数報告されている（非特許文献８）が、前述の構造を有していないものは、イソマルトースとマルトース両方に作用すると考えられる。
【０００８】
すなわち、本発明は、活性中心にＧＦＲＭＤＶＩＮＦ（配列番号１）のアミノ酸配列を有し、糸状菌に由来する、マルトースに作用しないイソマルターゼを提供するものである。
【０００９】
また、本発明は、次のアミノ酸配列（ａ）又は（ｂ）を有し、マルトースに作用しないイソマルターゼを提供するものである。
（ａ）配列番号３又は配列番号５
（ｂ）配列番号３又は配列番号５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【００１０】
また、本発明は、上記のイソマルターゼをコードする遺伝子を提供するものである。
【００１１】
さらに本発明は、デンプンに、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼ及びプルラナーゼから選ばれる酵素と、上記のイソマルターゼを作用させることを特徴とするグルコースの製造法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のイソマルターゼは、イソマルトースには作用するがマルトースには作用せず、また、グルコースからイソマルトースは合成しないという性質を有する。従って、このイソマルターゼを用いれば、デンプンから高収率でグルコースを生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】市販グルコアミラーゼ１／１００水溶液の基質特異性を示す。
【図２】市販グルコアミラーゼ１／１０００水溶液の基質特異性を示す。
【図３】形質転換体（＋ａｇｌ１）とネガティブコントロール株（−ａｇｌ１）の細胞抽出液（可溶性画分）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。（ゲル濃度：１２％、ＡはＣＢＢ染色、Ｂでは一次抗体にＨｉｓ−Ｔａｇ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、二次抗体にＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓe ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅを使用）
【図４】形質転換体（＋ａｇｌ１）とネガティブコントロール株（−ａｇｌ１）の細胞抽出液（可溶性画分）のウエスタンブロッティング結果を示す。（ゲル濃度：１２％、ＡはＣＢＢ染色、Ｂでは一次抗体にＨｉｓ−Ｔａｇ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、二次抗体にＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓe ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅを使用）
【図５】本発明Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅイソマルターゼ（ＡＧＬ１）の反応温度範囲を示す。
【図６】本発明Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅイソマルターゼ（ＡＧＬ１）の反応ｐＨ範囲を示す。
【図７】本発明Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅイソマルターゼ（ＡＧＬ１）の基質特異性を示す。
【図８】本発明Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍイソマルターゼ（ＦＯＡＧＬ１）の反応温度範囲を示す。
【図９】本発明Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍイソマルターゼ（ＦＯＡＧＬ１）の反応ｐＨ範囲を示す。
【図１０】本発明Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍイソマルターゼ（ＦＯＡＧＬ１）の基質特異性を示す。
【図１１】本発明Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅイソマルターゼ（ＡＧＬ１）と市販糖化酵素を併用した場合の糖化結果を示す。
【図１２】本発明Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍイソマルターゼ（ＦＯＡＧＬ１）と市販糖化酵素を併用した場合の糖化結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のイソマルターゼは、活性中心にＧＦＲＭＤＶＩＮＦ（配列番号１）のアミノ酸配列を有する。このアミノ酸配列は、本発明のイソマルターゼが、イソマルトースに作用してグルコースに分解するが、マルトースには作用しないという特徴を有する活性中心であると考えられる。また、本発明のイソマルターゼは、グルコースからイソマルトース等のオリゴ糖を合成しない。従って、本発明のイソマルターゼは、イソマルトースからグルコースを生成するという基質特異性の極めて高い酵素であるという特徴を有する。
【００１５】
本発明のイソマルターゼは、２５〜４０℃で５０％以上の相対活性を示し、最適温度は約３０℃である。また、本発明イソマルターゼは、ｐＨ５〜８で５０％以上の相対活性を示し、最適ｐＨは約７．０である。本発明のイソマルターゼの基質特異性は明確であり、イソマルトースに作用するが、マルトース、ニゲロース、トレハロース、デキストラン及びスターチに作用しない。なお、コウジビオースはイソマルトースの２０％程度作用する。またグルコースにも作用しないし、オリゴ糖を生成しない。
【００１６】
本発明のイソマルターゼは、活性中心に前記のようなアミノ酸配列を有することを特徴とするが、その具体例としては、次のアミノ酸配列（ａ）又は（ｂ）を有し、マルトースに作用しないものが挙げられる。
（ａ）配列番号３又は配列番号５
（ｂ）配列番号３又は配列番号５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【００１７】
ここで配列番号３のアミノ酸配列を有するイソマルターゼは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のイソマルターゼであり、配列番号５のアミノ酸配列を有するイソマルターゼはＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ由来のイソマルターゼである。アミノ酸配列（ｂ）とアミノ酸配列（ａ）との相同性（同一性）は、配列番号３及び５とそれらの欠失、置換又は付加体との間で、それぞれ、７０％以上であればよいが、８０％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましい。
【００１８】
本発明の遺伝子は、前記のイソマルターゼをコードする遺伝子である。当該遺伝子は、前記活性中心のアミノ酸配列をコードするものであればよいが、前記アミノ酸配列（ａ）又は（ｂ）をコードするものが好ましい。さらに好ましい遺伝子は、次の塩基配列（ｃ）又は（ｄ）を有するものである。
（ｃ）配列番号２又は配列番号４
（ｄ）配列番号２又は配列番号４からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列。
【００１９】
ここでストリンジェントな条件とは、５０％ホルムアミドの存在下で７００ｍＭのＮａＣｌ中４２℃、又はこれと同等の条件をいう。また、塩基配列（ｃ）と塩基配列（ｄ）との相同性（同一性）は、配列番号２又は４の塩基配列と、それぞれ、７０％以上であればよいが、８０％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましい。
【００２０】
本発明のイソマルターゼは、例えば糸状菌由来の本発明イソマルターゼ遺伝子をクローニングし、当該遺伝子を発現ベクターに組み込んで組み換えプラスミドを調製し、得られた組み換えプラスミドを大腸菌その他の宿主に形質転換し、該形質転換体を培養することにより製造できる。
【００２１】
本発明イソマルターゼ遺伝子は、例えば糸状菌由来のｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法、または糸状菌ゲノムよりＰＣＲ後、イントロンを除去する方法等によってクローニングすることができる。その一例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のイソマルターゼのアミノ酸配列に基づき、保存領域中の２１６番目のバリン残基を有する領域と同様な領域を、糸状菌のデータベースから探索した。その結果、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのゲノムデータベースからＧＦＲＭＤＶＩＮＦ（配列番号１）の配列を見出した。この配列がイソマルターゼの活性中心と推定した。そして、この活性中心を有する遺伝子が増幅されるようにプライマーを設計し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法により目的遺伝子を得た。
【００２２】
イソマルターゼ遺伝子を組み込むための発現ベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられ、例えば大腸菌用としてはｐＥＴ−１４ｂ、ｐＢＲ３２２等が挙げられる。枯草菌用としては、ｐＵＢ１１０等が挙げられる。糸状菌用としては、ｐＰＴＲＩ等が挙げられる。また、酵母用としては、ｐＲＳ４０３等が挙げられる。
【００２３】
得られた組み換えプラスミドは、大腸菌、枯草菌、糸状菌、酵母等に形質転換し、当該形質転換体を培養すれば、本発明イソマルターゼが得られる。
【００２４】
本発明のイソマルターゼは、前記のようにイソマルトースをグルコースに分解し、マルトースに作用せず、グルコースからオリゴ糖を合成しない。従って、デンプンに、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼ及びプルラナーゼから選ばれる酵素と、本発明のイソマルターゼを作用させれば、グルコースが選択的に製造できる。ここで、α−アミラーゼとしては、例えばクライスターゼＴ１０（大和化成株式会社）を用いることができる。グルコアミラーゼとしては、例えばＧＯＤＯ−ＡＮＧＨ（合同酒精株式会社）を用いることができる。イソアミラーゼとしては、例えばＧＯＤＯ−ＦＩＡ（合同酒精株式会社）を用いることができる。プルラナーゼとしては、例えばプルラナーゼ「アマノ」３（天野エンザイム株式会社）を用いることができる。
【００２５】
反応は、例えばデンプンおよびアミラーゼ等のデンプン糖化酵素に前記酵素を添加し、当該酵素が作用するｐＨ、温度条件にて混合撹拌することにより行なわれる。本発明方法によれば、イソマルトースが副生しないため、高収率でグルコースを製造することができる。あるいは、一般的な糖化反応後に、イソマルトースとグルコースを分離し、これに前記酵素を添加し、当該酵素が作用するｐＨ、温度条件にて混合攪拌する。本発明方法によれば、副生したイソマルトースをグルコースに変換することが可能になり、高収率でグルコースを製造することができる。
【実施例】
【００２６】
次に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００２７】
実施例１（グルコアミラーゼによる分解）
市販グルコアミラーゼ（合同酒精株式会社：ＧＯＤＯ−ＡＮＧＨ）の１／１００あるいは１／１０００水溶液を１５μＬ及び、０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ６の５μＬを、２％マルトースもしくは２％イソマルトース水溶液に混合し、３０℃で１８時間作用させた。５分間沸騰水中で反応を止め、反応液を真空濃縮後、シリカゲルＴＬＣに供した。展開溶媒はイソプロパノール／ｎ−ブタノール／水（１０／５／４）で、展開後、風乾し、アンスロン硫酸液を噴霧し、１０５℃で加熱して発色させた。
【００２８】
図１（市販グルコアミラーゼ１／１００水溶液の結果）及び図２（市販グルコアミラーゼ１／１０００水溶液の結果）に示したように、市販グルコアミラーゼは、マルトースによく作用したが、イソマルトースも分解することができた。また、マルトースやイソマルトースを分解するとともに、マルトースからは、イソマルトースが、イソマルトースからはマルトースが、転移あるいはグルコースの再結合により生じることがわかった。
【００２９】
実施例２（データベースからのａｇｌ１遺伝子発見）
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのイソマルターゼと相同位置にバリンを持ち、他種のイソマルターゼと高い相同性を示した推定α−アミラーゼ様遺伝子を麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ゲノムデータベース（ＤＯＧＡＮ）上で見出し、ａｇｌ１と名づけた（ＤＯＧＡＮ  ＩＤ：Ａｏ０９００２００００１７６）。ａｇｌ１はα−アミラーゼではなく、イソマルターゼをコードしていると推測した。今日まで糸状菌からのイソマルターゼの報告は知られていない。
また、同様の検索によりＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍのａｇｌ１遺伝子（foａｇｌ１）を見出した。
【００３０】
【表１】
0005928089.tif 000002
【００３１】
実施例３（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅイソマルターゼ遺伝子による大腸菌の形質転換）
大腸菌発現用ベクターとして、ｐＥＴ−１４ｂ  （Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いた。
ａｇｌ１遺伝子増幅のためのＰＣＲに使用したプライマーの配列は以下の通りである。
【００３２】
ｇｌｕｐｈａ１．６Ｆ
５’−ａｃｇｇｇａｔｃｃｃａｔｇｇｃｃａｃａｃｃ−３’（配列番号１０）
ｇｌｕｐｈａ１．６Ｒ
５’−ｃｔｇｇｇｇａｔｃｃｔａａｔｃａｇｇｃｃｔｃ−３’（配列番号１１）
【００３３】
麹菌より調製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてプライマーｇｌｕｐｈａ１．６Ｆ及びプライマーｇｌｕｐｈａ１．６Ｒを用いてＰＣＲを行い、ａｇｌ１遺伝子を含む断片を得た。取得したＤＮＡ断片はエタノール沈殿等を行い、回収した。ａｇｌ１遺伝子を含むＤＮＡ断片をＢａｍＨ  Ｉ処理し、エタノール沈殿等にてＤＮＡを回収した。ＢａｍＨ  Ｉ処理及び脱リン酸化処理を行ったｐＥＴ−１４ｂ  とライゲーション反応させ、大腸菌の形質転換を行った。得られたコロニーからプラスミドを調製し、ａｇｌ１遺伝子を含むプラスミドｐＥＴ−１４ｂ−ａｇｌ１を得た。ａｇｌ１遺伝子の塩基配列を配列番号２に、また該遺伝子がコードするイソマルターゼのアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【００３４】
実施例４（大腸菌でのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅイソマルターゼの発現）
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＤ４９４（ＤＥ３）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ及びＥ．ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ（ＤＥ３）をプラスミドｐＥＴ−１４ｂ−ａｇｌ１により形質転換し、形質転換株を取得した。また、ネガティブコントロールとしてａｇｌ１を持たないｐＥＴ−１４ｂベクターを用いて形質転換株を取得した。各形質転換株のコロニーをＬＢ培地に植菌し、前培養を行った。４０ｍＬのＬＢ培地に前培養液を接種し、２０℃で９時間培養した。その後、最終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、２０℃で１２時間誘導培養を行った。発現誘導後、菌体を７，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離で回収し、１ｍＬの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に縣濁した。菌体は、超音波破砕機にて破砕した。破砕した菌体溶液を１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を粗酵素溶液として回収した。各菌株由来の粗酵素について、アクリルアミドゲル濃度１２％にてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングを行い、発現したＡＧＬ１の評価を行った。検出はＨｉｓ−Ｔａｇ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ及びＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅにより行った。各形質転換株で発現されたＡＧＬ１の活性についてＴＬＣを用いて評価したところ、イソマルトース分解活性はＥ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ及びＥ．ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ（ＤＥ３）を宿主とした形質転換体で強く見られたが、マルトース分解活性がすべての形質転換株で見られた。このことから、観察されたマルトース分解活性は宿主である大腸菌由来のものである、もしくはＡＧＬ１のマルトース分解活性に大腸菌由来のマルトース分解活性が加算されたものではないかと推測した。大腸菌由来のマルターゼについては報告されている。よって、最適宿主であるＥ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを宿主とした形質転換株（＋ａｇｌ１）とＥ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（−ａｇｌ１，ネガティブコントロール）との比較実験を行った。ＡＧＬ１タンパク質の発現状況について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇにて形質転換株とネガティブコントロール株とを比較した（図３、図４）。形質転換株ではＡＧＬ１と推定できるバンドを確認できたが、ネガティブコントロールでは確認できなかった。即ち宿主大腸菌はＡＧＬ１を産生せず、形質転換によってＡＧＬ１を産生するようになった事を確認した。
【００３５】
実施例５（大腸菌で発現したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅイソマルターゼの性質：ＡＧＬ１の精製）
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ｃｈｅｌａｔｅ−６５０Ｍカラム（φ１０×４５ｍｍ）に４ｍＬの２００ｍＭ  ＮｉＳＯ4を注入した後、４０ｍＬの蒸留水及び４０ｍＬの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化を行った。４ｍＬのＡＧＬ１粗酵素溶液をニッケルキレートＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ｃｈｅｌａｔｅ−６５０Ｍカラム（φ１０×４５ｍｍ）にアプライし、０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で非吸着画分を溶出し、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  イミダゾールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で吸着画分を溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて単一バンドを確認できた画分を回収し、１０  ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析を行った。
タンパク質の定量にはブラッドフォード法を用いた。
【００３６】
調製したＥ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを宿主とした形質転換体由来の粗酵素４ｍＬをニッケルキレート  ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ｃｈａｌａｔｅ−６５０Ｍカラム（φ１０×４５ｍｍ）に供し、２０ｍＭイミダゾールで吸着タンパク質の溶出を行った。非吸着画分と吸着画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｎｏ．１１にＡＧＬ１と思われるタンパク質が確認された。２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して、最終濃度が０．０４１％ＧＯＤ、０．０１％ＰＯＤ、０．５％Ｏ−ジアニシジンとなるように添加・混合し、ＧＯＤ試薬とした。２０ｍｇ／ｍＬイソマルトース１０μｌ、２００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５μｌの混合液に、精製酵素溶液５μｌを加え反応液とした（全量２０μｌ）。また、精製酵素溶液を蒸留水にした溶液をコントロールとした。酵素反応液を３０℃で３時間インキュベートした。酵素反応液を１００℃で３分間処理した後、ＧＯＤ試薬２００μｌ加えて３０℃で１０分インキュベートした。４Ｎ  ＨＣｌを４μｌ加えた後、４００ｎｍにおける吸光度を測定した。ＧＯＤ法の原理については以下の通りである。
【００３７】
【化１】
0005928089.tif 000003
【００３８】
α−グルコシダーゼ活性の１Ｕは、本条件において、１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成させる活性と定義し、以下の式より酵素活性を算出した。
【００３９】
【数１】
0005928089.tif 000004
【００４０】
ＡＧＬ１はＮｉキレートカラムクロマトグラフィーにより２７．６倍に精製され、収率は７６．６％となった。精製酵素はＳＤＳ−ＰＡＧＥにて単一なバンドを示した。
【００４１】
実施例６（大腸菌で発現したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅイソマルターゼの性質：最適温度）
２０ｍｇ／ｍＬイソマルトース１０μｌ、２００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５μｌの混合液に、精製酵素溶液５μｌを加え反応液とした（全量２０μｌ）。反応液を２０〜６０℃の温度で３時間インキュベートし、ＧＯＤ法によって活性を測定した。
精製酵素を用いて、ＧＯＤ法により最適温度について評価した（図５）。最適温度は３０℃であった。
【００４２】
実施例７（大腸菌で発現したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅイソマルターゼの性質：至適ｐＨ）
２０ｍｇ／ｍＬのイソマルトース１０μｌ、２００ｍＭの各種緩衝液の混合液に、精製酵素溶液５μｌを加え反応液とした（全量２０μｌ）。反応液を３０℃で３時間インキュベートし、ＧＯＤ法によって活性を測定した。
精製酵素を用いて、ＧＯＤ法により最適ｐＨについて評価した（図６）。最適ｐＨは７．０であった。
【００４３】
実施例８（大腸菌で発現したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅイソマルターゼの性質：特異性）
５ｍｇ／ｍＬの各基質１０μｌ、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５μｌの混合液に、精製酵素溶液５μｌを加え反応液とした（全量２０μｌ）。酵素反応液を３０℃で３時間インキュベートし、ＧＯＤ法によって活性を測定した。
精製酵素を用いて、ＧＯＤ法により基質特異性について評価した（表２）。ＡＧＬ１はイソマルトースに特異的に作用したが、コウジビオースに対してもわずかに活性を示した。
【００４４】
【表２】
0005928089.tif 000005
【００４５】
実施例９（糸状菌イソマルターゼによる分解）
実施例５で得られた糸状菌由来イソマルターゼ粗酵素１６μＬに、１０ｍｇ／ｍＬとなるように、グルコース、マルトース、イソマルトースの０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ６溶液を４μＬをそれぞれ加えた。３０℃にて、８、２４時間反応し、反応液を実施例１と同様にＴＬＣ分析に供した。図７に示したように、グルコースやマルトースを基質とした場合に、分解や転移物は検出されなかった。一方、イソマルトースは分解し、グルコースのスポットが増加した。また、イソマルトースから他の転移物は生じなかった。
【００４６】
実施例１０（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍイソマルターゼ遺伝子のクローニング）
実施例３と同様にしてＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ由来のイソマルターゼ遺伝子をクローニングした。その遺伝子の塩基配列を配列番号４に、また該遺伝子がコードするイソマルターゼのアミノ酸配列を配列番号５に示す。
Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍより調製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行い、ｆｏａｇｌ１配列を含むＤＮＡ断片を得た。得られた断片を大腸菌の発現用プラスミドｐＥＴ-１４ｂへ組み込み、発現プラスミドｐＥＴ−１４ｂ−ｆｏａｇｌ１を調製した。
【００４７】
実施例１１（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍイソマルターゼ遺伝子から取得した酵素の性質：最適温度、至適ｐＨ、基質特異性）
実施例４と同様にして、発現プラスミドｐＥＴ−１４ｂ−ｆｏａｇｌ１により形質転換された大腸菌を培養後、菌体を回収して、超音波破砕を行った結果、イソマルトース分解活性を確認した。この菌体破砕抽出物を実施例５の精製方法により精製して得られた、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍイソマルターゼ酵素（ＦＯＡＧＬ１）を以下の試験に供した。
得られたＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍイソマルターゼについて、実施例６と同様の方法で最適温度、実施例７と同様の方法で至適ｐＨを調べた結果、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍイソマルターゼの最適温度は３０℃（図８）、最適ｐＨはｐＨ６.５（図９）であった。
また、実施例８と同様の方法であるＧＯＤ法により、基質特異性について評価した（表３）。ＦＯＡＧＬ１はイソマルトースに特異的に作用した。マルトースやトレハロースには作用せず、コウジビオースやパノースに対してわずかに活性を示した。
【００４８】
【表３】
0005928089.tif 000006
【００４９】
実施例１２  （Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍイソマルターゼの分解特性）
実施例１１で得られたＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍイソマルターゼ酵素（ＦＯＡＧＬ１）のグルコース、マルトース、イソマルトースの分解について調べた。
Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ由来イソマルターゼ（ＦＯＡＧＬ１）粗酵素１６μＬに、１０ｍｇ／ｍＬとなるように、グルコース、マルトース、イソマルトースの０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ６溶液を４μＬをそれぞれ加えた。３０℃にて、８、２４時間反応し、反応液を実施例１と同様にＴＬＣ分析に供した。図１０に示したように、グルコースやマルトースを基質とした場合に、分解や転移物は検出されなかった。一方、イソマルトースは分解し、グルコースのスポットが増加した。また、イソマルトースから他の転移物は生じなかった。
【００５０】
実施例１３（本発明酵素と市販糖化用酵素との併用）
溶性デンプンを濃度30％(w/w)となるように、０．１Ｍ 酢酸緩衝液(ｐＨ４．２)に加熱溶解した。溶性デンプン液５０ｍＬに対して、市販糖化用酵素ＯＰＴＩＭＡＸ  ４０６０(グルコアミラーゼ・プルラナーゼ混合酵素)を４０μＬ加え、６０℃にて１６時間酵素反応を行った。反応後、試料を１００℃加熱し、酵素反応を停止させた(デンプン分解物)。
デンプン分解物を０．１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ６．８)にて１０倍希釈した後、実施例４または実施例５により得られたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅイソマルターゼイソマルターゼ（ＡＧＬ１）、あるいは実施例１０によりＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ由来イソマルターゼ（ＦＯＡＧＬ１）を加え、３０℃で５時間反応させた。反応後、５分間沸騰水中で反応を止め、シリカゲルＴＬＣに供した。展開溶媒はイソプロパノール／ｎ−ブタノール／水（１０／５／４）で、展開後、風乾し、アンスロン硫酸液を噴霧し、１０５℃で加熱して発色させた。
【００５１】
ＯＰＴＩＭＡＸ４０６０のみを作用させた図１１と図１２の各第２レーンでは、イソマルトースのスポットが確認された。それに対して、イソマルターゼを作用させた図１１と図１２の各第３レーンでは、そのスポットが薄くなり、イソマルトースが分解されていることがわかった。
この結果から、本酵素を使用することにより糖化工程におけるグルコースの収率を向上させることができることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明のイソマルターゼにより、デンプンからの工業的グルコース生産工程で、グルコースの収率を飛躍的に向上させることが可能になる。
【図１】
0005928089.tif 000007
【図２】
0005928089.tif 000008
【図３】
0005928089.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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