(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を有するリコンビナントタンパク質であって、アクセプター性グリカンの末端Ｍａｎα３残基へのＮ−アセチルグルコサミンの転移を触媒し、かつ末端Ｍａｎα６残基へのＮ−アセチルグルコサミンの転移を触媒し、そして少なくとも２種の異なる酵素由来の触媒ドメインを含む、リコンビナントタンパク質。
【請求項２】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを含む融合タンパク質である、請求項１記載のリコンビナントタンパク質。
【請求項３】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインがヒト酵素に由来する、請求項２記載のリコンビナントタンパク質。
【請求項４】
ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインおよびヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン、ここで、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインのＮ末端側に位置する、触媒ドメインの間に位置するヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩステムドメイン由来の配列を含むスペーサー配列、ならびにＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインに対してＮ末端側に位置するターゲティングペプチド、ここで、ターゲティングペプチドは、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ由来の細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、およびステムドメインを含む、を含む請求項１または２記載のリコンビナントタンパク質。
【請求項５】
ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン、ここで、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインのＮ末端側に位置する；触媒ドメインの間に位置するスペーサー、ここで、スペーサーは、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、および配列番号１２４から成る群より選択される配列を含む；ならびにＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインに対してＮ末端側に位置するターゲティングペプチド、ここで、ターゲティングペプチドは、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ由来の細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、およびステムドメインを含む、を含む請求項１または２記載のリコンビナントタンパク質。
【請求項６】
スペーサーが、配列番号１１８、配列番号１２０、および配列番号１２４から成る群より選択される配列を含む、請求項５記載のリコンビナントタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項記載のリコンビナントタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
プロモーターに作動可能に連結された請求項７記載の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項８記載の発現ベクターを含むホスト細胞。
【請求項１０】
複合Ｎ−グリカンを製造する方法であって、
（１）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むホスト細胞を提供すること；そして
（２）アクセプター性グリカンの末端Ｍａｎα３残基へのＮ−アセチルグルコサミンの転移および末端Ｍａｎα６残基へのＮ−アセチルグルコサミンの転移を触媒して複合Ｎ−グリカンを製造する融合タンパク質が発現されるようにホスト細胞を培養すること
を含む、方法。
【請求項１１】
アクセプター性グリカンが、異種ポリペプチドに結合している、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
複合Ｎ−グリカンが、ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎβ３（ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎβ６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃである、請求項１０または請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ホスト細胞が、トリコデルマ属種（Trichoderma sp.）、アクレモニウム属（Acremonium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、アウレオバシジウム属（Aureobasidium）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、クリソスポリウムス属（Chrysosporium）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、フィリバシジウム属（Filibasidium）、フザリウム属（Fusarium）、ジベレラ属（Gibberella）、マグナポルテ属（Magnaporthe）、ムコール属（Mucor）、ミセリオフソラ属（Myceliophthora）、ミロセシウム属（Myrothecium）、ネオカリマスティクス属（Neocallimastix）、ニューロスポラ属（Neurospora）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、ペニシリウム属（Penicillium）、ピロミセス属（Piromyces）、シゾフィラム属（Schizophyllum）、タラロミセス属（Talaromyces）、サーモアスカス属（Thermoascus）、チエラビア属（Thielavia）、およびトリポクラジウム属（Tolypocladium）から成る群より選択される糸状菌細胞である、請求項１０〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
ホスト細胞が、さらに、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１０〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
ホスト細胞が、野生型ホスト細胞における活性レベルに比べて低下した活性レベルのドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ（５）ＧｌｃＮＡｃ（２）−ＰＰ−ドリキルマンノシルトランスフェラーゼを有するか又はａｌｇ３遺伝子が、ホスト細胞から欠失されている、請求項１０〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
ホスト細胞が、野生型ホスト細胞における活性又は発現レベルに比べて低下した活性レベルのα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ又は低下した発現レベルのｏｃｈ１遺伝子を有する、請求項１０〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
ホスト細胞が、さらに、
ｉ）α−１，２−マンノシダーゼをコードするポリヌクレオチド；
ｉｉ）β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド；および／または、
ｉｉｉ）シアリルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド
を含む、請求項１０〜１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
野生型糸状菌細胞における発現レベルに比べて低下した発現レベルのａｌｇ３遺伝子を有するか又はａｌｇ３遺伝子が欠失している、請求項２〜６のいずれか一項記載のリコンビナントタンパク質を含む糸状菌細胞。
【請求項１９】
さらに、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１８記載の糸状菌細胞。
【請求項２０】
野生型糸状菌細胞における活性レベルに比べて低下した活性レベルのα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼを有する、請求項１８〜１９のいずれか一項記載の糸状菌細胞。
【請求項２１】
野生型糸状菌細胞における発現レベルに比べて低下した発現レベルのｏｃｈ１遺伝子を有する、請求項１８〜２０記載の糸状菌細胞。
【請求項２２】
さらに、
ｉ）α−１，２−マンノシダーゼをコードするポリヌクレオチド；
ｉｉ）β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド；および／または、
ｉｉｉ）シアリルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド
を含む、請求項１８〜２１のいずれか一項記載の糸状菌細胞。
【請求項２３】
トリコデルマ属種（Trichoderma sp.）、アクレモニウム属（Acremonium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、アウレオバシジウム属（Aureobasidium）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、クリソスポリウムス属（Chrysosporium）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、フィリバシジウム属（Filibasidium）、フザリウム属（Fusarium）、ジベレラ属（Gibberella）、マグナポルテ属（Magnaporthe）、ムコール属（Mucor）、ミセリオフソラ属（Myceliophthora）、ミロセシウム属（Myrothecium）、ネオカリマスティクス属（Neocallimastix）、ニューロスポラ属（Neurospora）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、ペニシリウム属（Penicillium）、ピロミセス属（Piromyces）、シゾフィラム属（Schizophyllum）、タラロミセス属（Talaromyces）、サーモアスカス属（Thermoascus）、チエラビア属（Thielavia）、およびトリポクラジウム属（Tolypocladium）から成る群より選択される、請求項１８〜２２のいずれか一項記載の糸状菌細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年１１月２４日に出願された米国仮出願第６１／４１７，１４４号の利益を主張し、その仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列リストの提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる：コンピュータ可読形態（ＣＲＦ）の配列リスト（ファイル名：619672001040SEQLIST.txt、記録日：２０１１年１１月２２日、サイズ：３０５KB)。
【０００３】
発明の分野
本開示は、Ｎ−グリカンの製造に有用な組成物および方法に関する。
【０００４】
背景
タンパク質の翻訳後修飾は、多くの場合、適正なタンパク質のフォールディングおよび機能に必要である。通常のタンパク質改変は、小胞体で新生ポリペプチドにオリゴ糖（グリカン）が付加して糖タンパク質を形成することであり、これは、グリコシル化として知られる過程である。Ｎ−グリコシル化は、治療目的に使用されるリコンビナントタンパク質の製造に特に重要である。標準的な原核生物発現系は、そのような改変に必要な適切な機構を欠如しているので、これらの治療用タンパク質の製造には代替発現系を使用しなければならない。酵母および真菌は、単純な培地中で容易に大規模に成長できることが低い製造コストを可能にするので、タンパク質を発現させる魅力的な選択肢である。そのうえ、酵母細胞および真菌細胞の比較的単純な遺伝子構造を操作するための、ならびにより複雑な真核細胞、例えば哺乳動物細胞または昆虫細胞などを操作するためのツールが利用可能である（De Pourcq et al., Appl Microbiol Biotechnol, 87(5):1617-31）。
【０００５】
真菌細胞および哺乳動物細胞は、マンノース（８）Ｎ−アセチルグルコサミン（２）（Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２）の形成を生じるグリコシル化の初期段階で共通のステップを有する。しかし、その過程の後期段階には顕著な差が存在する。例えば酵母では、マンノシルトランスフェラーゼおよびマンナンポリメラーゼによってＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２に追加的なマンノースサブユニットが付加され、高マンノース型Ｎ−グリカンが産生する。対照的に、ヒトＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２からはマンノース糖が除去され、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が産生し、酵素Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）、マンノシダーゼＩＩ（ＭｎｓＩＩ）、およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴＩＩ）を必要とする３連続の反応が続いて、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２がＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に変換される。
【０００６】
高マンノース型Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質がヒトでの治療用途に適さないので、哺乳動物細胞と真菌細胞の間のグリコシル化過程の差は、真菌細胞を用いてグリコシル化哺乳動物タンパク質を発現させることに難題を突きつける（De Pourcq et al., 2010; Wildt and Gerngross, Nature Reviews Microbiology, 3: 119-128）。したがって、酵母種および真菌種でのグリコシル化経路を再操作して、それらがリコンビナントヒトタンパク質を発現できるようにするための研究が行われてきた。酵母細胞または真菌細胞の糖鎖工学での一般的なアプローチは、高マンノース型Ｎ−グリカンの形成に関与する内因性遺伝子を破壊することであった。これらの遺伝子破壊は、異なる種由来の内因性マンノシダーゼならびに／またはグリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼの過剰発現と組合せることができる（Chiba et al., 1998, J Biol Chem 273: 26298-304; Kainz et al., 2008, Appl Environ Microbiol 74: 1076-86; Maras et al., 1997, Euro J Biochem 249: 701-07; Maras et al., 1999, Febs Letters 452: 365-70; Hamilton et al., 2003, Science 301: 1244-6; De Pourcq et al., 2010）。しかし、非哺乳動物細胞でのグリコシル化哺乳動物タンパク質の製造は、複雑で時間のかかる遺伝子操作をまだ必要とし、所望の糖タンパク質の製造に非効率的なおそれがある。
【０００７】
したがって、非哺乳動物細胞中に複合Ｎ−グリカンを発現させるための、より単純でより効率的な系の必要性が当技術分野において相変わらず存在する。
【０００８】
概要
本明細書に記載されるのは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を有するリコンビナントタンパク質を含む組成物である。さらに、本明細書に記載されるのは、複合Ｎ−グリカンを製造する方法およびＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを製造する方法である。
【０００９】
したがって、一局面には、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を有するリコンビナントタンパク質であって、アクセプター性グリカンの末端Ｍａｎα３残基へのＮ−アセチルグルコサミンの転移を触媒し、かつ末端Ｍａｎα６残基へのＮ−アセチルグルコサミンの転移を触媒するリコンビナントタンパク質であって、少なくとも２種の異なる酵素由来の触媒ドメインを含有するリコンビナントタンパク質が含まれる。ある態様では、アクセプター性グリカンは、アミノ酸、ペプチド、またはポリペプチドより選択される分子に結合している。ある態様では、その分子は異種ポリペプチドである。前記態様と組合せることができる、ある態様では、アクセプター性グリカンはＭａｎ３である。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、リコンビナントタンパク質は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを含有する融合タンパク質である。ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、ヒト酵素に由来する。ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインは、配列番号１のアミノ酸残基１０５〜４４５と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、配列番号２１のアミノ酸残基３０〜４４７と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインに対してＮ末端側にある。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインに対してＮ末端側にある。
【００１０】
前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、リコンビナントタンパク質は、さらに、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインとＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインの間にスペーサーを含有する。ある態様では、スペーサーは、ステムドメイン由来配列を含有する。前記態様と組み合わせることができるある態様では、スペーサーは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０アミノ酸長である。前記態様と組み合わせることができるある態様では、スペーサーは、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、および配列番号１２４より選択される配列を含有する。ある態様では、スペーサーは、配列番号１１８、配列番号１２０、および配列番号１２４より選択される配列を含有する。ある態様では、スペーサーは、配列番号１２０または配列番号１２４の配列を含有する。ある態様では、スペーサーは、配列番号１２４の配列を含有する。
【００１１】
前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、リコンビナントタンパク質は、さらに、触媒ドメインのＮ末端に結合したターゲティングペプチドを含有する。ある態様では、ターゲティングペプチドは、ステムドメインを含有する。ある態様では、ステムドメインは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ酵素またはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ酵素に由来する。ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ酵素およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ酵素は、ヒト酵素である。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、ステムドメインは、マンノシダーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、２型ゴルジ体タンパク質、ＭＮＮ２、ＭＮＮ４、ＭＮＮ６、ＭＮＮ９、ＭＮＮ１０、ＭＮＳ１、ＫＲＥ２、ＶＡＮ１、またはＯＣＨ１より選択されるタンパク質に由来する。ある態様では、そのタンパク質は、アクレモニウム属（Acremonium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、アウレオバシジウム属（Aureobasidium）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、クリソスポリウムス属（Chrysosporium）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、フィリバシジウム属（Filibasidium）、フザリウム属（Fusarium）、ジベレラ属（Gibberella）、ヒュミコラ属（Humicola）、マグナポルテ属（Magnaporthe）、ムコール属（Mucor）、ミセリオフソラ属（Myceliophthora）、ミロセシウム属（Myrothecium）、ネオカリマスティクス属（Neocallimastix）、ニューロスポラ属（Neurospora）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、ペニシリウム属（Penicillium）、ピロミセス属（Piromyces）、シゾフィラム属（Schizophyllum）、タラロミセス属（Talaromyces）、サーモアスカス属（Thermoascus）、チエラビア属（Thielavia）、トリポクラジウム属（Tolypocladium）、またはトリコデルマ属（Trichoderma）より選択される生物に由来する。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、ターゲティングペプチドは、Ｋｒｅ２ターゲティングペプチドである。ある態様では、ターゲティングペプチドは、膜貫通ドメインを含有する。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、ターゲティングペプチドは、さらに、ステムドメインのＮ末端に結合した膜貫通ドメインを含有する。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、膜貫通ドメインは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ酵素またはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ酵素に由来する。ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ酵素およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ酵素は、ヒト酵素である。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、膜貫通ドメインは、マンノシダーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、２型ゴルジ体タンパク質、ＭＮＮ２、ＭＮＮ４、ＭＮＮ６、ＭＮＮ９、ＭＮＮ１０、ＭＮＳ１、ＫＲＥ２、ＶＡＮ１、またはＯＣＨ１より選択されるタンパク質に由来する。ある態様では、タンパク質は、アクレモニウム属（Acremonium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、アウレオバシジウム属（Aureobasidium）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、クリソスポリウムス属（Chrysosporium）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、フィリバシジウム属（Filibasidium）、フザリウム属（Fusarium）、ジベレラ属（Gibberella）、ヒュミコラ属（Humicola）、マグナポルテ属（Magnaporthe）、ムコール属（Mucor）、ミセリオフソラ属（Myceliophthora）、ミロセシウム属（Myrothecium）、ネオカリマスティクス属（Neocallimastix）、ニューロスポラ属（Neurospora）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、ペニシリウム属（Penicillium）、ピロミセス属（Piromyces）、シゾフィラム属（Schizophyllum）、タラロミセス属（Talaromyces）、サーモアスカス属（Thermoascus）、チエラビア属（Thielavia）、トリポクラジウム属（Tolypocladium）、またはトリコデルマ属（Trichoderma）より選択される生物に由来する。ある態様では、ターゲティングペプチドは、細胞質ドメインを含有する。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、ターゲティングペプチドは、さらに、ステムドメインのＮ末端に結合した細胞質ドメインを含有する。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、ターゲティングペプチドは、さらに、膜貫通ドメインのＮ末端に結合した細胞質ドメインを含有する。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、細胞質ドメインは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ酵素またはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ酵素に由来する。ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ酵素およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ酵素は、ヒト酵素である。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、細胞質ドメインは、マンノシダーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、２型ゴルジ体タンパク質、ＭＮＮ２、ＭＮＮ４、ＭＮＮ６、ＭＮＮ９、ＭＮＮ１０、ＭＮＳ１、ＫＲＥ２、ＶＡＮ１、またはＯＣＨ１より選択されるタンパク質に由来する。ある態様では、タンパク質は、アクレモニウム属（Acremonium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、アウレオバシジウム属（Aureobasidium）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、クリソスポリウムス属（Chrysosporium）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、フィリバシジウム属（Filibasidium）、フザリウム属（Fusarium）、ジベレラ属（Gibberella）、ヒュミコラ属（Humicola）、マグナポルテ属（Magnaporthe）、ムコール属（Mucor）、ミセリオフソラ属（Myceliophthora）、ミロセシウム属（Myrothecium）、ネオカリマスティクス属（Neocallimastix）、ニューロスポラ属（Neurospora）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、ペニシリウム属（Penicillium）、ピロミセス属（Piromyces）、シゾフィラム属（Schizophyllum）、タラロミセス属（Talaromyces）、サーモアスカス属（Thermoascus）、チエラビア属（Thielavia）、トリポクラジウム属（Tolypocladium）、またはトリコデルマ属（Trichoderma）より選択される生物に由来する。
【００１２】
別の局面には、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインおよびヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン、ここで、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインに対してＮ末端側に位置する、触媒ドメインの間に位置する、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩステムドメイン由来配列を含有するスペーサー配列、ならびにＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインに対してＮ末端側に位置するターゲティングペプチド、ここで、ターゲティングペプチドは、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ由来の細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、およびステムドメインを含有する、を含有するリコンビナントタンパク質が含まれる。別の局面には、配列番号９５と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含有するリコンビナントタンパク質が含まれる。
【００１３】
別の局面には、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン、ここで、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインに対してＮ末端側に位置する；触媒ドメインの間に位置するスペーサー、ここで、スペーサーは、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、および配列番号１２４より選択される配列を含有する；ならびにＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインに対してＮ末端側に位置するターゲティングペプチド、ここで、ターゲティングペプチドは、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ由来の細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、およびステムドメインを含有する、を含有するリコンビナントタンパク質が含まれる。ある態様では、スペーサーは、配列番号１１８、配列番号１２０、および配列番号１２４より選択される配列を含有する。ある態様では、スペーサーは、配列番号１２０または配列番号１２４の配列を含有する。ある態様では、スペーサーは、配列番号１２４の配列を含有する。
【００１４】
別の局面には、前記態様のいずれかのリコンビナントタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドが含まれる。別の局面には、プロモーターに作動可能に連結された、前記態様の単離されたポリヌクレオチドを含有する発現ベクターが含まれる。ある態様では、プロモーターは、構成的プロモーターである。ある態様では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。ある態様では、プロモーターは、ｇｐｄＡ、ｃｂｈ１、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、Aspergillus niger中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）ｇｌａＡ、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）アルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）トリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）アセトアミダーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）アセトアミダーゼ、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ、真菌エンドα−Ｌ−アラビナーゼ（ａｂｎＡ）、真菌α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＡ（ａｂｆＡ）、真菌α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ（ａｂｆＢ）、真菌キシラナーゼ（ｘｌｎＡ）、真菌フィターゼ、真菌ＡＴＰ−シンテターゼ、真菌サブユニット９（ｏｌｉＣ）、真菌トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｐｉ）、真菌アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＡ）、真菌α−アミラーゼ（ａｍｙ）、真菌アミログルコシダーゼ（ｇｌａＡ）、真菌アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）、真菌グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄ）、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、酵母アルコールオキシダーゼ、酵母ラクターゼ、酵母３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、酵母トリオースリン酸イソメラーゼ、細菌α−アミラーゼ、細菌Ｓｐｏ２、またはＳＳＯより選択される遺伝子に由来する。別の局面には、前記態様のいずれかの発現ベクターを含有するホスト細胞が含まれる。
【００１５】
別の局面には、任意の前記態様のリコンビナントタンパク質を製造する方法であって、リコンビナントタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドをホスト細胞に導入するステップ、そしてリコンビナントタンパク質が発現するようにホスト細胞を培養するステップを含む方法が含まれる。ある態様では、その方法は、さらに、ホスト細胞からリコンビナントタンパク質を精製するステップを含む。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、ホスト細胞は真菌細胞である。ある態様では、真菌細胞は、酵母または糸状菌より選択される。
【００１６】
別の局面には、複合Ｎ−グリカンを製造する方法であって、ホスト細胞を提供するステップ、ここで、ホスト細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを含有する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する、そして融合タンパク質が発現するようにホスト細胞を培養するステップを含む方法が含まれ、ここで、融合タンパク質は、アクセプター性グリカンの末端Ｍａｎα３残基へのＮ−アセチルグルコサミンおよび末端Ｍａｎα６残基へのＮ−アセチルグルコサミンの転移を触媒して複合Ｎ−グリカンを製造する。ある態様では、複合Ｎ−グリカンは、アミノ酸、ペプチド、またはポリペプチドより選択される分子に結合している。ある態様では、分子は異種ポリペプチドである。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、アクセプター性グリカンはＭａｎ３である。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、複合Ｎ−グリカンは、ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃである。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、ホスト細胞は真核細胞である。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、ホスト細胞は真菌細胞である。ある態様では、真菌細胞は、サッカロミセス・セルビジエ（S. cerevisiae）、クリベロミセス・ラクチス（K. lactis）、ピキア・パストリス（P. pastoris）、ハンセヌラ・ポリモルファ（H. polymorpha）、カンジダ・アルビカンス（C. albicans）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、またはヤロウイア属（Yarrowia）より選択される酵母細胞である。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、真菌細胞は、トリコデルマ属種（Trichoderma sp.）、アクレモニウム属（Acremonium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、アウレオバシジウム属（Aureobasidium）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、クリソスポリウムス属（Chrysosporium）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、フィリバシジウム属（Filibasidium）、フザリウム属（Fusarium）、ジベレラ属（Gibberella）、マグナポルテ属（Magnaporthe）、ムコール属（Mucor）、ミセリオフソラ属（Myceliophthora）、ミロセシウム属（Myrothecium）、ネオカリマスティクス属（Neocallimastix）、ニューロスポラ属（Neurospora）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、ペニシリウム属（Penicillium）、ピロミセス属（Piromyces）、シゾフィラム属（Schizophyllum）、タラロミセス属（Talaromyces）、サーモアスカス属（Thermoascus）、チエラビア属（Thielavia）、またはトリポクラジウム属（Tolypocladium）より選択される糸状菌細胞である。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、ホスト細胞は、さらに、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードするポリヌクレオチドを含有する。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、ホスト細胞は、野生型ホスト細胞における活性レベルに比べて低下した活性レベルのドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ（５）ＧｌｃＮＡｃ（２）−ＰＰ−ドリキルマンノシルトランスフェラーゼを有する。ある態様では、ホスト細胞は、野生型ホスト細胞における発現レベルに比べて低下した発現レベルのａｌｇ３���伝子を有する。ある態様では、ａｌｇ３遺伝子は、ホスト細胞から欠失されている。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、ホスト細胞は、野生型ホスト細胞における活性レベルに比べて低下した活性レベルのα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼを有する。ある態様では、ホスト細胞は、野生型ホスト細胞における発現レベルに比べて低下した発現レベルのｏｃｈ１遺伝子を有する。ある態様では、ｏｃｈ１遺伝子は、ホスト細胞から欠失している。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、ホスト細胞は、さらに、α−１，２−マンノシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含有する。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、ホスト細胞は、さらに、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含有する。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、ホスト細胞は、さらに、シアリルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含有する。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、ホスト細胞は、野生型トリコデルマ属（Trichoderma）細胞における活性レベルに比べて低下した活性レベルのドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ（５）ＧｌｃＮＡｃ（２）−ＰＰ−ドリキルマンノシルトランスフェラーゼを有するトリコデルマ属（Trichoderma）細胞である。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、ホスト細胞は、野生型酵母細胞における活性レベルに比べて低下した活性レベルのドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ（５）ＧｌｃＮＡｃ（２）−ＰＰ−ドリキルマンノシルトランスフェラーゼおよび低下した活性レベルのα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼを有する酵母または真菌細胞であって、さらに、α−１，２−マンノシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含有する酵母または真菌細胞である。
【００１７】
別の局面には、複合Ｎ−グリカンを製造する方法であって、トリコデルマ属（Trichoderma）ホスト細胞を提供するステップ、ここで、ホスト細胞は、野生型ホスト細胞における発現レベルに比べて低下した発現レベルのａｌｇ３遺伝子を有し、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインをコードする第１のポリヌクレオチドおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインをコードする第２のポリヌクレオチドを含有する、そしてホスト細胞を培養して複合Ｎ−グリカンを製造するステップを含む方法が含まれる。
【００１８】
別の局面には、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを含有する融合タンパク質、アクセプター性グリカン、ならびにＮ−アセチルグルコサミンドナーを緩衝液中で一緒にインキュベーションするステップを含む、複合Ｎ−グリカンを製造する方法が含まれ、ここで、融合タンパク質は、アクセプター性グリカンの末端Ｍａｎα３残基へのＮ−アセチルグルコサミンおよび末端Ｍａｎα６残基へのＮ−アセチルグルコサミンの転移を触媒して複合Ｎ−グリカンを製造する。ある態様では、アクセプター性グリカンは、アミノ酸、ペプチド、またはポリペプチドより選択される分子に結合している。ある態様では、その分子は、異種ポリペプチドである。ある態様では、アクセプター性グリカンはＭａｎ３である。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミンドナーはＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターである。
【００１９】
別の局面には、ａｌｇ３突然変異およびＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を含有する糸状菌細胞が含まれ、ここで、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２は、細胞によって分泌される中性Ｎ−グリカンの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％（mol％）を構成する）。中性Ｎ−グリカンは、アミノ酸、ペプチド、およびポリペプチドから成る群より選択される分子と結合している場合がある。ある態様では、ａｌｇ３突然変異は、ａｌｇ３の欠失である。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、細胞はトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）細胞である。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、糸状菌細胞は、さらに、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインをコードする第１のポリヌクレオチドおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインをコードする第２のポリヌクレオチドを含有する。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、糸状菌細胞は、さらに、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを含有する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する。
【００２０】
別の局面には、ホスト細胞においてＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを製造する方法であって、野生型ホスト細胞における活性レベルに比べて低下した活性レベルのマンノシルトランスフェラーゼを有するホスト細胞を提供するステップ、そしてホスト細胞を培養してＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを製造するステップを含む方法が含まれ、ここで、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンは、ホスト細胞により分泌された中性Ｎ−グリカンの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％（mol％）を構成する。中性Ｎ−グリカンは、アミノ酸、ペプチド、およびポリペプチドより選択される分子に結合している場合がある。ある態様では、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンは、異種ポリペプチドに結合している。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、マンノシルトランスフェラーゼはドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ（５）ＧｌｃＮＡｃ（２）−ＰＰ−ドリキルマンノシルトランスフェラーゼである。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、ホスト細胞は、野生型ホスト細胞での発現レベルに比べて低下した発現レベルのａｌｇ３遺伝子を有する。ある態様では、ａｌｇ３遺伝子は、ホスト細胞から欠失している。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、ホスト細胞はトリコデルマ属（Trichoderma）細胞である。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、ホスト細胞におけるα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼの活性レベルは、野生型ホスト細胞における活性レベルに比べて低下している。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、ホスト細胞は、α−１，２−マンノシダーゼをコードする内因性ポリヌクレオチドを含有する。
【００２１】
別の局面には、野生型糸状菌細胞における発現レベルに比べて低下した発現レベルのａｌｇ３遺伝子を有する糸状菌細胞であって、前記態様のいずれかのリコンビナントタンパク質を含有する糸状菌細胞が含まれる。ある態様では、ａｌｇ３遺伝子は突然変異を含有する。好ましくは、リコンビナントタンパク質は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を有し、ここで、リコンビナントタンパク質は、アクセプター性グリカンの末端Ｍａｎα３残基へのＮ−アセチルグルコサミンの転移を触媒し、かつ末端Ｍａｎα６残基へのＮ−アセチルグルコサミンの転移を触媒し、ここで、リコンビナントタンパク質は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを含有する融合タンパク質である。ある態様では、ａｌｇ３遺伝子の突然変異は、ａｌｇ３遺伝子の欠失である。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、融合タンパク質は、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドによりコードされる。ある態様では、プロモーターは誘導性プロモーターである。ある態様では、誘導性プロモーターはｃｂｈ１プロモーターである。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、糸状菌細胞は、さらに、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードするポリヌクレオチドを含有する。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、糸状菌は、野生型糸状菌細胞における活性レベルに比べて低下した活性レベルのα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼを有する。ある態様では、糸状菌は、野生型糸状菌細胞における発現レベルに比べて低下した発現レベルのｏｃｈ１遺伝子を有する。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、糸状菌細胞は、さらに、α−１，２−マンノシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含有する。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、糸状菌細胞は、さらに、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含有する。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、糸状菌細胞は、さらに、シアリルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含有する。前記態様と組み合わせることができる、ある態様では、糸状菌細胞は、トリコデルマ属種（Trichoderma sp.）、アクレモニウム属（Acremonium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、アウレオバシジウム属（Aureobasidium）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、クリソスポリウムス属（Chrysosporium）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、フィリバシジウム属（Filibasidium）、フザリウム属（Fusarium）、ジベレラ属（Gibberella）、マグナポルテ属（Magnaporthe）、ムコール属（Mucor）、ミセリオフソラ属（Myceliophthora）、ミロセシウム属（Myrothecium）、ネオカリマスティクス属（Neocallimastix）、ニューロスポラ属（Neurospora）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、ペニシリウム属（Penicillium）、ピロミセス属（Piromyces）、シゾフィラム属（Schizophyllum）、タラロミセス属（Talaromyces）、サーモアスカス属（Thermoascus）、チエラビア属（Thielavia）、およびトリポクラジウム属（Tolypocladium）より選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１−１】T. reesei Ｍ４４、Ｍ８１、Ｍ８４、Ｍ１０９、Ｍ１１０、Ｍ１３１、Ｍ１３２、Ｍ１３３、Ｍ１３４、およびＭ１２４株での平均グリコシル化の中性Ｎ−グリカン質量分析プロファイルを示す図である。
【図１−２】T. reesei Ｍ４４、Ｍ８１、Ｍ８４、Ｍ１０９、Ｍ１１０、Ｍ１３１、Ｍ１３２、Ｍ１３３、Ｍ１３４、およびＭ１２４株での平均グリコシル化の中性Ｎ−グリカン質量分析プロファイルを示す図である。
【図２】モノリン酸化Ｍａｎ７Ｇｎ２のフラグメンテーション分析を示す図である。モノリン酸化Ｍａｎ７Ｇｎ２の一構造例のみを示す。
【図３−１】T. reesei Ｍ４４、Ｍ８１、Ｍ８４、Ｍ１０９、Ｍ１１０、Ｍ１３１、Ｍ１３２、Ｍ１３３、Ｍ１３４、およびＭ１２４株の酸性グリカン質量分析プロファイルを示す図である。
【図３−２】T. reesei Ｍ４４、Ｍ８１、Ｍ８４、Ｍ１０９、Ｍ１１０、Ｍ１３１、Ｍ１３２、Ｍ１３３、Ｍ１３４、およびＭ１２４株の酸性グリカン質量分析プロファイルを示す図である。
【図４Ａ】発酵槽中で１３１．４時間培養（流加培養）したT. reesei Ｍ４４株の中性（ａ）および酸性（ｂ）Ｎ−グリカンプロファイルを示す図である。
【図４Ｂ】発酵槽中で１３１．４時間培養（流加培養）したT. reesei Ｍ４４株の中性（ａ）および酸性（ｂ）Ｎ−グリカンプロファイルを示す図である。
【図５Ａ】T. reesei培地の中性（ａ）および酸性（ｂ）Ｎ−グリカン質量分析プロファイルを示す図である。
【図５Ｂ】T. reesei培地の中性（ａ）および酸性（ｂ）Ｎ−グリカン質量分析プロファイルを示す図である。
【図６】T. reesei Ｍ４４の分泌タンパク質のメンブランブロットを示す図である。
【図７】発酵槽中で培養したT. reesei Ｍ４４のタンパク質バンドを分析した一例を示す図である。タンパク質のグリコシル化は、T. reeseiでの平均グリコシル化と有意差がなかった。スペクトルは、小さなベースラインシグナルに焦点を合わせたので、スペクトルの大きなシグナルは他のシグナルに比べて定量的でなかった。
【図８】ａｌｇ３プローブを用いた親株由来ＤＮＡおよびＡｌｇ３ノックアウト株由来ＤＮＡのサザンブロットを示す図である。
【図９Ａ】予測された制限生成物のサイズを有するｐＴＴｖ３８構築物断片の制限酵素マップを示す図である。
【図９Ｂ】ＥｃｏＲＩ＋ＰｖｕＩ（Ｅ＋Ｐ）またはＫｐｎＩ＋ＮｈｅＩ（Ｋ＋Ｎ）で消化した親株およびＡｌｇ３ノックアウト株由来ゲノムＤＮＡのサザンブロットを示す図である。対照ＤＮＡは、ＮｏｔＩで消化したｐＴＴｖ３８プラスミドＤＮＡであった。ＡｍｄＳプローブを用いてブロットをプローブした。
【図１０Ａ】中性Ｎ−グリカンのＭＡＬＤＩ分析を示す図である。図Ａに、親株Ｍ１２４を示す。図Ｂに、Ａｌｇ３ノックアウト４Ａを示す。四角印は、Ｎ−アセチルグルコサミンを表し、表示したグルコース１個以外、丸印はマンノースを表す。
【図１０Ｂ】中性Ｎ−グリカンのＭＡＬＤＩ分析を示す図である。図Ａに、親株Ｍ１２４を示す。図Ｂに、Ａｌｇ３ノックアウト４Ａを示す。四角印は、Ｎ−アセチルグルコサミンを表し、表示したグルコース１個以外、丸印はマンノースを表す。
【図１１】４Ａ Ａｌｇ３ノックアウト株由来Ｍａｎ３Ｇｎ２のフラグメンテーション分析を示す図である。
【図１２Ａ】Ａｌｇ３ノックアウト株４Ａ（図Ａ）および親株Ｍ１２４（図Ｂ）由来Ｈｅｘ５Ｇｎ２のフラグメンテーション分析を示す図である。枠で囲ったシグナルは、Ａｌｇ３ノックアウト株由来アイソマーとしてのみ存在する。
【図１２Ｂ】Ａｌｇ３ノックアウト株４Ａ（図Ａ）および親株Ｍ１２４（図Ｂ）由来Ｈｅｘ５Ｇｎ２のフラグメンテーション分析を示す図である。枠で囲ったシグナルは、Ａｌｇ３ノックアウト株由来アイソマーとしてのみ存在する。
【図１３】α−マンノシダーゼ消化後のＡｌｇ３ノックアウト株４Ａ由来中性Ｎ−グリカンを示す図である。
【図１４】液体クロマトグラフィーによるＡｌｇ３ノックアウト株由来の２種の主グリカン分離を示す図である。
【図１５Ａ】Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２画分（図Ａ）およびＨｅｘ６ＨｅｘＮＡｃ２画分（図Ｂ）のプロトンＮＭＲスペクトルを示す図である。クリオプローブを備えるVarian Unity INOVA ６００MHzスペクトロメーターを使用して、４０℃でスペクトルを収集した。
【図１５Ｂ】Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２画分（図Ａ）およびＨｅｘ６ＨｅｘＮＡｃ２画分（図Ｂ）のプロトンＮＭＲスペクトルを示す図である。クリオプローブを備えるVarian Unity INOVA ６００MHzスペクトロメーターを使用して、４０℃でスペクトルを収集した。
【図１６Ａ】親株Ｍ１２４（図Ａ）およびＡｌｇ３ノックアウト株４Ａ（Ｂ）の酸性画分を示す図である。２個のリン酸ユニットを有するＮ−グリカンに星印を付ける。
【図１６Ｂ】親株Ｍ１２４（図Ａ）およびＡｌｇ３ノックアウト株４Ａ（Ｂ）の酸性画分を示す図である。２個のリン酸ユニットを有するＮ−グリカンに星印を付ける。
【図１７】フラスコ中で５日間培養したT. reesei Ａｌｇ３ノックアウト株４Ａの上清由来中性Ｎ−グリカンを示す図である。
【図１８】発酵槽中で１０日間培養したT. reesei Ａｌｇ３ノックアウト株４Ａの上清由来中性Ｎ−グリカンを示す図である。
【図１９】ＧｎＴＩ反応混合物のＭＡＬＤＩスペクトルを示す図である。ＧｎＴＩは、５４％のアクセプターを、追加的なＨｅｘＮＡｃを有する生成物に変換した。
【図２０】ＧｎＴＩＩの発現のウエスタンブロット分析を示す図である。１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに試料を泳動させ、ニトロセルロースメンブラン上にブロッティングした。マウスα−ＨＩＳモノクローナル抗体を用いてメンブラン上からヒスチジンタグ付きＧｎＴＩＩを検出した。左側に示した数字は、分子量マーカータンパク質のサイズ（kDa）である。
【図２１】ＧｎＴＩＩ反応混合物のＭＡＬＤＩスペクトルを示す図である。８３％のアクセプター（ｍ／ｚ９１３．３４０）が生成物に変換された（ｍ／ｚ１１３６．４３３）。
【図２２】ＧｎＴＩ／ＧｎＴＩＩ融合タンパク質について観測されたＧｎＴＩ活性を示す図である。
【図２３】ａｌｇ３ローカスへのターゲティングにより得られたＧｎＴＩ／ＧｎＴＩＩ T. reeseiトランスフォーマント中に存在するＮ−グリカンを示す図である。
【図２４】ＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ融合タンパク質の酵素活性試験から精製された反応混合物のＭＡＬＤＩスペクトルを示す図である。
【図２５】β１−２，３，４，６−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ反応混合物のスペクトルを示す図である。
【図２６】β１−４ＧａｌＴ反応混合物のＭＡＬＤＩスペクトルを示す図である。
【図２７Ａ】３（Ａ）、５（Ｂ）および７（ＣおよびＤ）日目のT. reesei Ｍ１２７ ｐＴＴｖ１１０トランスフォーマント（ａｌｇ３ローカス中にｇｎｔＩＩ／Ｉ）の上清タンパク質から観測されたＮ−グリカンの図である。クローン１７Ａは７日目に最大のＧ０を製造した。（Ｅ）７日間振盪フラスコ中で培養したT. reesei Ｍ１２７株ＧｎＴＩＩ／Ｉトランスフォーマントクローン１７Ａ由来の上清タンパク質の中性Ｎ−グリカンの質量スペクトル。星印を付けたシグナルは、培地起源である。
【図２７Ｂ】３（Ａ）、５（Ｂ）および７（ＣおよびＤ）日目のT. reesei Ｍ１２７ ｐＴＴｖ１１０トランスフォーマント（ａｌｇ３ローカス中にｇｎｔＩＩ／Ｉ）の上清タンパク質から観測されたＮ−グリカンの図である。クローン１７Ａは７日目に最大のＧ０を製造した。（Ｅ）７日間振盪フラスコ中で培養したT. reesei Ｍ１２７株ＧｎＴＩＩ／Ｉトランスフォーマントクローン１７Ａ由来の上清タンパク質の中性Ｎ−グリカンの質量スペクトル。星印を付けたシグナルは、培地起源である。
【図２７Ｃ】３（Ａ）、５（Ｂ）および７（ＣおよびＤ）日目のT. reesei Ｍ１２７ ｐＴＴｖ１１０トランスフォーマント（ａｌｇ３ローカス中にｇｎｔＩＩ／Ｉ）の上清タンパク質から観測されたＮ−グリカンの図である。クローン１７Ａは７日目に最大のＧ０を製造した。（Ｅ）７日間振盪フラスコ中で培養したT. reesei Ｍ１２７株ＧｎＴＩＩ／Ｉトランスフォーマントクローン１７Ａ由来の上清タンパク質の中性Ｎ−グリカンの質量スペクトル。星印を付けたシグナルは、培地起源である。
【図２７Ｄ】３（Ａ）、５（Ｂ）および７（ＣおよびＤ）日目のT. reesei Ｍ１２７ ｐＴＴｖ１１０トランスフォーマント（ａｌｇ３ローカス中にｇｎｔＩＩ／Ｉ）の上清タンパク質から観測されたＮ−グリカンの図である。クローン１７Ａは７日目に最大のＧ０を製造した。（Ｅ）７日間振盪フラスコ中で培養したT. reesei Ｍ１２７株ＧｎＴＩＩ／Ｉトランスフォーマントクローン１７Ａ由来の上清タンパク質の中性Ｎ−グリカンの質量スペクトル。星印を付けたシグナルは、培地起源である。
【図２７Ｅ】３（Ａ）、５（Ｂ）および７（ＣおよびＤ）日目のT. reesei Ｍ１２７ ｐＴＴｖ１１０トランスフォーマント（ａｌｇ３ローカス中にｇｎｔＩＩ／Ｉ）の上清タンパク質から観測されたＮ−グリカンの図である。クローン１７Ａは７日目に最大のＧ０を製造した。（Ｅ）７日間振盪フラスコ中で培養したT. reesei Ｍ１２７株ＧｎＴＩＩ／Ｉトランスフォーマントクローン１７Ａ由来の上清タンパク質の中性Ｎ−グリカンの質量スペクトル。星印を付けたシグナルは、培地起源である。
【図２８Ａ】どちらもダイズトリプシン阻害剤存在下で培養したT. reesei Ｍ２０２ ＧｎＴＩＩ／Ｉトランスフォーマントクローン（Ａ）９Ａ−１および（Ｂ）３１Ａ−１に由来のリツキシマブの中性Ｎ−グリカン、および振盪フラスコ中でダイズトリプシン阻害剤存在下にて５日間培養した（Ｃ）T. reesei Ｍ２０２株ＧｎＴＩＩ／Ｉトランスフォーマントクローン９Ａ−１から精製したリツキシマブの中性Ｎ−グリカンの質量スペクトルを示す図である。
【図２８Ｂ】どちらもダイズトリプシン阻害剤存在下で培養したT. reesei Ｍ２０２ ＧｎＴＩＩ／Ｉトランスフォーマントクローン（Ａ）９Ａ−１および（Ｂ）３１Ａ−１に由来のリツキシマブの中性Ｎ−グリカン、および振盪フラスコ中でダイズトリプシン阻害剤存在下にて５日間培養した（Ｃ）T. reesei Ｍ２０２株ＧｎＴＩＩ／Ｉトランスフォーマントクローン９Ａ−１から精製したリツキシマブの中性Ｎ−グリカンの質量スペクトルを示す図である。
【図２８Ｃ】どちらもダイズトリプシン阻害剤存在下で培養したT. reesei Ｍ２０２ ＧｎＴＩＩ／Ｉトランスフォーマントクローン（Ａ）９Ａ−１および（Ｂ）３１Ａ−１に由来のリツキシマブの中性Ｎ−グリカン、および振盪フラスコ中でダイズトリプシン阻害剤存在下にて５日間培養した（Ｃ）T. reesei Ｍ２０２株ＧｎＴＩＩ／Ｉトランスフォーマントクローン９Ａ−１から精製したリツキシマブの中性Ｎ−グリカンの質量スペクトルを示す図である。
【図２９】スペーサーが改変されたＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ融合体の反応混合物のＭＡＬＤＩスペクトルを示す図である。図（Ａ）に、３×Ｇ４Ｓスペーサーで改変されたＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩの反応混合物を示す。アクセプターの３６％が、２個の追加的なＨｅｘＮＡｃを有する生成物に変換された。図（Ｂ）に、２×Ｇ４Ｓスペーサーで改変されたＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩの反応混合物を示す。アクセプターの３８％が２個の追加的なＨｅｘＮＡｃを有する生成物に変換された。ＧｎＴＩ生成物Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２の［Ｍ＋Ｎａ］＋シグナルについてのｍ／ｚの計算値（ｍ／ｚ計算値９３３．３１８）は、どちらのスペクトルからも検出されなかった。それは、全てのＧｎＴＩ生成物がＨｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ３に直接変換されたからであった（ｍ／ｚ計算値１１３６．３１８）。
【図３０Ａ】ＧｎＴＩＩ／Ｉスペーサー変異体細胞ペレット（Ａ）、および上清（Ｂ）のウエスタンブロットを示す図である。レーン１：ＧｎＴＩＩ陽性対照、２：ＧＹ３偽株、３：ＧＹ７−２野生型ＧｎＴＩＩ／Ｉ、４：ＧＹ３２−５  ３×Ｇ４Ｓスペーサー、５：ＧＹ３２−９  ３×Ｇ４Ｓスペーサー、６：ＧＹ３３−７  ２×Ｇ４Ｓスペーサー、７：ＧＹ３３−８  ２×Ｇ４Ｓスペーサー、８：ＧＹ４９−３  ＣＢＨＩスペーサーおよび９：ＧＹ５０−１０  ＥＧＩＶスペーサー。
【図３０Ｂ】ＧｎＴＩＩ／Ｉスペーサー変異体細胞ペレット（Ａ）、および上清（Ｂ）のウエスタンブロットを示す図である。レーン１：ＧｎＴＩＩ陽性対照、２：ＧＹ３偽株、３：ＧＹ７−２野生型ＧｎＴＩＩ／Ｉ、４：ＧＹ３２−５  ３×Ｇ４Ｓスペーサー、５：ＧＹ３２−９  ３×Ｇ４Ｓスペーサー、６：ＧＹ３３−７  ２×Ｇ４Ｓスペーサー、７：ＧＹ３３−８  ２×Ｇ４Ｓスペーサー、８：ＧＹ４９−３  ＣＢＨＩスペーサーおよび９：ＧＹ５０−１０  ＥＧＩＶスペーサー。
【図３１Ａ】プロテアーゼ阻害剤存在下で３日（Ａ）の発現期および４日（Ｂ）の発現期後に発現した、上清由来の野生型ＧｎＴＩＩ／Ｉおよびスペーサー変異体のＧｎＴ活性を示す図である。ｘ軸は、試料の正体を示し（ｗｔ＝野生型、＿１、＿２＝スペーサー変異体の該当クローン）、ｙ軸は、形成した生成物のパーセンテージを示す（ＧｎＴＩ反応生成物とＧｎＴＩＩ反応生成物を合計した）。
【図３１Ｂ】プロテアーゼ阻害剤存在下で３日（Ａ）の発現期および４日（Ｂ）の発現期後に発現した、上清由来の野生型ＧｎＴＩＩ／Ｉおよびスペーサー変異体のＧｎＴ活性を示す図である。ｘ軸は、試料の正体を示し（ｗｔ＝野生型、＿１、＿２＝スペーサー変異体の該当クローン）、ｙ軸は、形成した生成物のパーセンテージを示す（ＧｎＴＩ反応生成物とＧｎＴＩＩ反応生成物を合計した）。
【図３２】上清、細胞および溶解液中のＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質（野生型スペーサーを有する）のＧｎＴ活性を示す図である。ＧｎＴＩ生成物とＧｎＴＩＩ生成物を合計した。
【図３３Ａ】（Ａ）上清、（Ｂ）細胞、および（Ｃ）溶解液中のＧｎＴＩＩ／Ｉ野生型およびスペーサー変異体のＧｎＴ活性を示す図である。
【図３３Ｂ】（Ａ）上清、（Ｂ）細胞、および（Ｃ）溶解液中のＧｎＴＩＩ／Ｉ野生型およびスペーサー変異体のＧｎＴ活性を示す図である。
【図３３Ｃ】（Ａ）上清、（Ｂ）細胞、および（Ｃ）溶解液中のＧｎＴＩＩ／Ｉ野生型およびスペーサー変異体のＧｎＴ活性を示す図である。
【図３４】５日目の親株Ｍ１２４およびＧｎＴ１トランスフォーマントの中性Ｎ−グリカンのスペクトル例を示す図である。Ｇｎ付加を有するシグナル（ｍ／ｚ１４６０）に矢印を付ける。（ｐＴＴｖ１１はｃｂｈ１プロモーターを有し、ｐＴＴｖ１３はｇｐｄＡプロモーターを有する）。
【図３５】３日目および５日目の４個の陽性ＧＮＴ１トランスフォーマント中のＭａｎ５およびＧｎ１Ｍａｎ５の量を示す図である。内部較正物質（Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ４、２pmol）に対して定量を行った。
【図３６】親Ｍ１２４株およびＧｎＴ１トランスフォーマントのリン酸化Ｎ−グリカンのスペクトル例を内部較正物質（ＮｅｕＡｃＨｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ２、０．５pmol）と共に示す図である。ＧｎＴ１生成物に矢印を付ける。
【図３７Ａ】５日目の異なるＧｎＴＩＩ株／クローンの中性Ｎ−グリカンの図である。図（Ａ）にｐＴＴｖ１４０クローンを示す。図（Ｂ）にｐＴＴｖ１４２クローンを示す。図（Ｃ）にｐＴＴｖ１４３クローンを示す。図（Ｄ）にｐＴＴｖ１４１クローンを示す。
【図３７Ｂ】５日目の異なるＧｎＴＩＩ株／クローンの中性Ｎ−グリカンの図である。図（Ａ）にｐＴＴｖ１４０クローンを示す。図（Ｂ）にｐＴＴｖ１４２クローンを示す。図（Ｃ）にｐＴＴｖ１４３クローンを示す。図（Ｄ）にｐＴＴｖ１４１クローンを示す。
【図３７Ｃ】５日目の異なるＧｎＴＩＩ株／クローンの中性Ｎ−グリカンの図である。図（Ａ）にｐＴＴｖ１４０クローンを示す。図（Ｂ）にｐＴＴｖ１４２クローンを示す。図（Ｃ）にｐＴＴｖ１４３クローンを示す。図（Ｄ）にｐＴＴｖ１４１クローンを示す。
【図３７Ｄ】５日目の異なるＧｎＴＩＩ株／クローンの中性Ｎ−グリカンの図である。図（Ａ）にｐＴＴｖ１４０クローンを示す。図（Ｂ）にｐＴＴｖ１４２クローンを示す。図（Ｃ）にｐＴＴｖ１４３クローンを示す。図（Ｄ）にｐＴＴｖ１４１クローンを示す。
【図３８Ａ】３、５、および７日目の異なるＧｎＴＩＩ株／クローンおよび親株Ｍ１９８の中性Ｎ−グリカンの一例を示す図である。図（Ａ）にクローン１−１１７Ａを示す。図（Ｂ）にクローン３−１１Ａを示す。図（Ｃ）にクローン３０Ａを示す。図（Ｄ）に親株Ｍ１９８を示す。
【図３８Ｂ】３、５、および７日目の異なるＧｎＴＩＩ株／クローンおよび親株Ｍ１９８の中性Ｎ−グリカンの一例を示す図である。図（Ａ）にクローン１−１１７Ａを示す。図（Ｂ）にクローン３−１１Ａを示す。図（Ｃ）にクローン３０Ａを示す。図（Ｄ）に親株Ｍ１９８を示す。
【図３８Ｃ】３、５、および７日目の異なるＧｎＴＩＩ株／クローンおよび親株Ｍ１９８の中性Ｎ−グリカンの一例を示す図である。図（Ａ）にクローン１−１１７Ａを示す。図（Ｂ）にクローン３−１１Ａを示す。図（Ｃ）にクローン３０Ａを示す。図（Ｄ）に親株Ｍ１９８を示す。
【図３８Ｄ】３、５、および７日目の異なるＧｎＴＩＩ株／クローンおよび親株Ｍ１９８の中性Ｎ−グリカンの一例を示す図である。図（Ａ）にクローン１−１１７Ａを示す。図（Ｂ）にクローン３−１１Ａを示す。図（Ｃ）にクローン３０Ａを示す。図（Ｄ）に親株Ｍ１９８を示す。
【図３９】T. reeseiＭ１９８株およびＧｎＴＩＩクローン３−１７Ａのタンパク質が分離されたメンブランを示す図である。５０kDAタンパク質に矢印を付ける。
【図４０Ａ】親株Ｍ１９８（Ａ）およびＧｎＴＩＩクローン３−１７Ａ（Ｂ）の総分泌タンパク質と個別の分泌タンパク質（一つまたは複数）を対比した柱状図である。
【図４０Ｂ】親株Ｍ１９８（Ａ）およびＧｎＴＩＩクローン３−１７Ａ（Ｂ）の総分泌タンパク質と個別の分泌タンパク質（一つまたは複数）を対比した柱状図である。
【図４１】発酵槽培養した３〜７日目のＧｎＴＩＩ Ｍ３２９株、および５日目のＭ３２９株の振盪フラスコ培養物の柱状図である。
【図４２−１】T. reesei ＡＬＧ３およびＡＬＧ３ホモログの複数アミノ酸配列のアライメントを示す図である。
【図４２−２】T. reesei ＡＬＧ３およびＡＬＧ３ホモログの複数アミノ酸配列のアライメントを示す図である。
【図４２−３】T. reesei ＡＬＧ３およびＡＬＧ３ホモログの複数アミノ酸配列のアライメントを示す図である。
【００２３】
詳細な説明
本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を有するリコンビナントタンパク質であって、アクセプター性グリカンの末端Ｍａｎα３残基へのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の転移を触媒し、かつ末端Ｍａｎα６残基へのＮ−アセチルグルコサミンの転移を触媒するリコンビナントタンパク質であって、少なくとも２種の異なる酵素由来の触媒ドメインを含有するリコンビナントタンパク質に関する。
【００２４】
いくつかの態様では、本発明のリコンビナントタンパク質は、２個の触媒ドメインを含み、ここで、一方の触媒ドメインはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）活性を有し（例えば末端Ｍａｎα３残基と反応する）、他方の触媒ドメインは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴＩＩ）活性を有する（例えば末端Ｍａｎα６残基と反応する）。
【００２５】
いくつかの態様では、本発明のリコンビナントタンパク質は、本質的に連続的に起こる反応を触媒する。例えば、本発明のリコンビナントタンパク質は、最初にアクセプター性グリカンの末端Ｍａｎα３残基へのＧｌｃＮＡｃの転移を触媒し、次に末端Ｍａｎα６残基へのＧｌｃＮＡｃの転移を触媒する場合がある。一態様では、本質的に連続的な反応は、逆の順序の２反応の少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍効果的である。ある態様では、連続反応は、ＧｌｃＮＡｃが末端Ｍａｎα３残基にまだ転移されていないならば、本質的にまたは絶対的にＧｌｃＮＡｃが末端Ｍａｎα６残基に転移できないことを意味する。特定の一態様では、アクセプター性グリカンは、ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３枝を含有する。
【００２６】
いくつかの態様では、リコンビナントタンパク質は、場合により分枝アクセプター性グリカン中のＭａｎα３およびＭａｎα６残基の両方と特異的に反応するが、他のＭａｎα構造と、例えばＭａｎαベンジルおよび／またはＭａｎαＳｅｒ／Ｔｈｒ−ペプチドを有するＭａｎα単糖コンジュゲートと実質的または絶対的に反応しない。実質的でない反応性は、好ましくは、末端Ｍａｎα３およびＭａｎα６残基を有するアクセプター性グリカンの０．１mM反応濃度の場合のＶｍａｘの１０％未満、８％未満、６％未満、４％未満、２％未満、１％未満、または０．１％未満である。特定の一態様では、リコンビナントタンパク質は、アクセプター性グリカンの末端Ｍａｎα３（好ましくはＧｎＴＩ反応として）および末端Ｍａｎα６残基（好ましくはＧｎＴＩＩ反応として）と実質的に類似の反応性を有する。好ましくは、どちらの触媒活性も、同条件下で反応効率が他方の触媒活性の１０倍、５倍、３倍または２倍以下である。
【００２７】
特定の一態様では、末端Ｍａｎα３およびＭａｎα６へのＧｌｃＮＡｃの転移は、Ｍａｎ３グリカンの少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が、２個の末端ＧｌｃＮＡｃを有するグリカンに変換されることを引き起こす。反応有効性は、本明細書開示の実施例に記載のようにin vitroまたはin vivoアッセイにより測定することができる。ＧｌｃＮＡｃ転移反応の有効性は、本質的に実施例に記載されたように、アクセプターが０．１mM濃度およびドナーが飽和濃度での最大反応速度Ｖｍａｘとして測定することができる。特定の一態様では、反応の有効性は、アミノ酸、ペプチド、またはポリペプチドに結合したＭａｎ３アクセプター性グリカンを用いて測定される。
【００２８】
本開示は、さらに、複合Ｎ−グリカンを製造する方法であって、ホスト細胞を提供するステップ、ここで、ホスト細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを含有する融合タンパク質をコードする核酸を含有する、そして融合タンパク質が発現されるようにホスト細胞を培養するステップを含む、方法に関し、ここで、融合タンパク質は、アクセプター性グリカンの末端Ｍａｎα３残基へのＮ−アセチルグルコサミンの転移および末端Ｍａｎα６残基へのＮ−アセチルグルコサミンの転移を触媒して複合Ｎ−グリカンを製造する。
【００２９】
本発明は、また、野生型糸状菌細胞における発現レベルに比べて低下した発現レベルのａｌｇ３遺伝子を有する糸状菌細胞に関し、ここで、糸状菌細胞は、本発明のリコンビナントタンパク質を含有する。
【００３０】
定義
本明細書に使用するような「リコンビナントタンパク質」は、リコンビナント核酸から生成した任意のタンパク質を表す。本明細書に使用するような「リコンビナント核酸」は、少なくとも以下の一つが当てはまる核酸ポリマーを表す：（ａ）核酸配列は所与のホスト細胞と異質である（すなわちその細胞から自然に見出されない）；（ｂ）配列は、所与のホスト細胞から自然に見出されうるが、不自然な（例えば予想よりも多い）量で存在するか、または天然発現レベルよりも多いもしくは少ないレベルで発現され；あるいは（ｃ）核酸配列は、自然界で相互に同じ関係で見出されない２個以上の部分配列を含む。例えば、事例（ｃ）に関して、リコンビナント核酸配列は、新しい機能性核酸を作製するために配列された無関係な遺伝子由来の２個以上の配列を有する。別の例では、リコンビナント核酸配列は、自然には相互に隣接して見出されないプロモーター配列および遺伝子コード配列を含有する。
【００３１】
本明細書に使用するような「Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性」は、Ｎ−アセチルグルコサミニル残基（ＧｌｃＮＡｃ）をアクセプター性グリカンに転移する酵素の活性を表す。典型的には、この活性を有する酵素は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ）である。ある態様では、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼは真核生物性である。ある態様では、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼは、ＧｌｃＮＡｃ残基の１位から末端マンノース残基にβ−結合を形成する哺乳動物酵素である。ある態様では、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼは、β２−結合ＧｌｃＮＡｃ残基（一つまたは複数）をグリカンの、特にＮ結合型グリカンの、末端マンノース残基２位に転移するβ２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼである。ある態様では、β２−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼは、ＧｎＴＩ活性およびＧｎＴＩＩ活性を有する酵素である。ＧｎＴＩ活性は、Ｍａｎα３枝にＧｌｃＮＡｃ残基を転移する。Ｍａｎα３枝は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ３またはＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ５などの、Ｎ結合型グリカンコア構造のＭａｎα３（Ｒ−Ｍａｎα６）Ｍａｎβ枝でありうる。ＧｎＴＩ酵素は、哺乳動物酵素、植物酵素、または低級真核生物酵素でありうる。ＧｎＴＩＩ活性は、Ｎ結合型グリカンコア構造のＭａｎα６（ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３）Ｍａｎβ枝などのＭａｎα６枝にＧｌｃＮＡｃ残基を転移する。そのようなＭａｎα６枝の一例は、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である。
【００３２】
本明細書に使用するような「Ｎ−アセチルグルコサミン」は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）を表す。ＧｌｃＮＡｃは、グリカン構造の部分でありうる。アミン基は２位にあり、Ｄ−配置を有し、残基としてピラノース構造を有する。または、それは、２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノース（Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ）と称されることもある。ＧｌｃＮＡｃは、また、遊離還元単糖でありうる（すなわちグリカンの部分ではない）。
【００３３】
本明細書に使用するような「Ｍａｎ」は、マンノース残基を表す。「末端Ｍａｎα３」または「末端Ｍａｎα６」は、非還元末端の末端残基が別の一つまたは複数の単糖残基により置換されていないマンノースを表す。
【００３４】
本明細書に使用するような「グリカン」は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、脂質または還元末端コンジュゲートなどの担体に結合することができるオリゴ糖鎖を表す。ある態様では、本発明は、アスパラギン残基（Ａｓｎ）の側鎖アミド性窒素にＮ結合により−Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−（ここで、ＸｘｘはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸残基である）などのポリペプチド性Ｎグリコシル化部位にコンジュゲーションしたＮ結合型グリカンに関する。本発明は、さらに、真核細胞小胞体におけるＮ結合型グリカンの前駆体である、ドリコールホスホオリゴ糖（Ｄｏｌ−Ｐ−Ｐ−ＯＳ）前駆体脂質構造の部分としてのグリカンに関する場合がある。前駆体オリゴ糖は、それらの還元末端からドリコール脂質上の２個のリン酸残基に結合している。例えば、α３−マンノシルトランスフェラーゼＡｌｇ３は、Ｎ−グリカンのＤｏｌ−Ｐ−Ｐ−オリゴ糖前駆体を改変する。一般に、本明細書記載のグリカン構造は、非還元残基が一つまたは複数の他の単糖残基によって改変されていない末端グリカン構造である。
【００３５】
本明細書に使用するような「糖タンパク質」は、グリカンに結合したペプチドまたはポリペプチドを表す。グリカンは、共翻訳修飾または翻訳後修飾でペプチドまたはポリペプチドに結合されうる。
【００３６】
本明細書に使用するような「糖脂質」は、グリカンに結合している脂質を表し、糖脂質にはグリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、およびグリコシルホスファチジルイノシトールが含まれる。
【００３７】
本開示にわたり使用するような糖脂質および糖質という命名法は、本質的に、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会による勧告に従う（例えばCarbohydrate Res. 1998, 312, 167; Carbohydrate Res. 1997, 297, 1; Eur. J. Biochem. 1998, 257, 29）。Ｇａｌ（ガラクトース）、Ｇｌｃ（グルコース）、ＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）、ＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチルガラクトサミン）、Ｍａｎ（マンノース）、およびＮｅｕ５ＡｃはＤ−配置であり、ＦｕｃはＬ−配置であり、全ての単糖ユニットはピラノース形態であることが仮定される（Ｄ−Ｇａｌｐ、Ｄ−Ｇｌｃｐ、Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ、Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃ、Ｄ−Ｍａｎｐ、Ｌ−Ｆｕｃｐ、Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ）。アミン基は、天然ガラクトースおよびグルコサミンについて定義された通り、ＧａｌＮＡｃまたはＧｌｃＮＡｃの２位にある。グリコシド結合は、一部は短い方の命名で、一部は長い方の命名で示され、シアル酸ＳＡ／Ｎｅｕ５Ｘ残基の結合α３およびα６は、それぞれα２−３およびα２−６と同じことを意味し、ヘキソース単糖残基についてα１−３、α１−６、β１−２、β１−３、β１−４、およびβ１−６は、それぞれα３、α６、β２、β３、β４、およびβ６と短縮することができる。ラクトサミンは、ＩＩ型Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、および／またはＩ型Ｎ−アセチルラクトサミンを表す。Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃおよびシアル酸（ＳＡ）は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、またはＮｅｕ５Ｘの誘導体を含む任意の他の天然シアル酸を表す。シアル酸は、ＮｅｕＮＸまたはＮｅｕ５Ｘと呼ばれる（ここで、好ましくは、ＸはＡｃまたはＧｃである）。場合により、Ｎｅｕ５Ａｃ／Ｇｃ／ＸはＮｅｕＮＡｃ／ＮｅｕＮＧｃ／ＮｅｕＮＸと呼ばれうる。
【００３８】
本発明のリコンビナントタンパク質
本明細書における発明は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を有するリコンビナントタンパク質であって、アクセプター性グリカンの末端Ｍａｎα３残基へのＮ−アセチルグルコサミンの転移を触媒し、かつ末端Ｍａｎα６残基へのＮ−アセチルグルコサミンの転移を触媒するリコンビナントタンパク質に関する。本発明のリコンビナントタンパク質には、非限定的に、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を有する完全長タンパク質、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質フラグメント、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を有する触媒ドメイン、およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を有する融合タンパク質が含まれうる。本発明の単一のリコンビナントタンパク質は、Ｎ−アセチルグルコサミンの両方の転移を触媒する能力を有する。末端Ｍａｎα３残基へのＮ−アセチルグルコサミンの転移は、末端Ｍａｎα６残基へのＮ−アセチルグルコサミンの転移の前または後に起こりうる。または、転移は同時に起こりうる。
【００３９】
アクセプター性グリカンは、アミノ酸、ペプチド、またはポリペプチドなどの分子に結合している場合がある。ある態様では、アミノ酸はアスパラギン残基である。アスパラギン残基は、側鎖アミドからのアミノグリコシド結合（生物学的哺乳動物ポリペプチドＮ−グリカン結合構造）の場合があり、ジペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドなどのペプチド鎖の部分の場合がある。グリカンは、還元末端誘導体、例えば還元性ＧｌｃＮＡｃまたはＭａｎのＮ、Ｏ、またはＣ結合型誘導体、好ましくはグリコシド誘導体、例えばアミノ酸、アルキル、ヘテロアルキル、アシル、アルキルオキシ、アリール、アリールアルキル、およびヘテロアリールアルキルの群より選択される、あるグリカン結合型構造を有するスペーサーまたは末端有機残基などでありうる。スペーサーは、さらに、多価担体または固相に結合している場合がある。ある態様では、アルキル含有構造には、メチル、エチル、プロピル、およびＣ４−Ｃ２６アルキル、グリセロ脂質、リン脂質、ドリコール−リン脂質およびセラミドなどの脂質、ならびに誘導体が含まれる。還元末端は、また、第二級アミン結合または誘導体構造への還元アミノ化により誘導体化することができる。ある担体には、（ポリ）ペプチド、多糖、例えばデキストラン、セルロース、アミロースもしくはグリコサミノグリカンなどの生体高分子またはオリゴマー、ならびにポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド（例えばナイロンもしくはポリスチレン）、ポリアクリルアミド、およびポリ乳酸を含めたプラスチック、ＰＡＭＡＭ、StarburstもしくはStarfishデンドリマーなどのデンドリマー、またはポリリシンおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリアルキルグリコールなどの他の有機ポリマーまたはオリゴマーが含まれる。固相には、マイクロタイターウェル、シリカ粒子、ガラス、金属（鋼、金、および銀が含まれる）、ポリスチレンまたは樹脂ビーズ、ポリ乳酸ビーズ、多糖ビーズまたは有機スペーサー含有磁気ビーズなどのポリマービーズが含まれうる。
【００４０】
ある態様では、アクセプター性グリカンは、異種ポリペプチドに結合している。本明細書に使用するような「ペプチド」および「ポリペプチド」は、複数の連続重合アミノ酸残基を含むアミノ酸配列である。本発明のために典型的には、ペプチドは、最大５０個のアミノ酸残基を含む分子であり、ポリペプチドは、５０個よりも多いアミノ酸残基を含む。ペプチドまたはポリペプチドは、改変アミノ酸残基、コドンによってコードされない天然アミノ酸残基、および非天然アミノ酸残基を含みうる。本明細書に使用するような「タンパク質」は、任意のサイズのペプチドまたはポリペプチドを表しうる。「異種ポリペプチド」という用語は、所与のホスト細胞中に自然には見出されず、所与のホスト細胞に内因性でないポリペプチドを表す。ある態様では、異種ポリペプチドは、治療用タンパク質である。治療用タンパク質には、例えば、モノクローナル抗体、エリスロポイエチン、インターフェロン、成長ホルモン、酵素、または凝固因子が含まれうる。例えば、アクセプター性グリカンは、リツキシマブなどの治療用タンパク質に結合している場合がある。
【００４１】
アクセプター性グリカン
ある態様では、アクセプター性グリカンの構造は、以下の構造［Ｒ１］ｙＭａｎα３（［Ｒ２］ｚＭａｎα６）Ｍａｎ｛β４ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃαｘ）ｎ［β４ＧｌｃＮＡｃ］ｍ｝ｑ（式中、ｑ、ｙ、ｚ、ｎおよびｍは、０または１であり；ｘは、随意のフコース残基の結合位置３または６であり；Ｒ１はＧｌｃＮＡｃ、好ましくはＧｌｃＮＡｃβ２であり；Ｒ２は分枝構造Ｍａｎα３（Ｍａｎα６）である）を有し、但し、ｚが１の場合、ｙは０であり、ｚが０の場合、ｙは０または１である。（）は、存在または不在のいずれかである規則的Ｎ−グリカンコア構造中の枝を定義する。［］および｛｝は、直鎖配列中に存在または不在のいずれかであるグリカン構造の一部を定義する。ｚが０でｙが０の場合、その構造はＭａｎ３グリカンであり、ｚが０でありｙが１である場合、その構造はＧｌｃＮＡｃＭａｎ３グリカンである。ｙが０でありｚが１である場合、グリカンはＭａｎ５グリカンである。アクセプター性グリカンは、好ましくは還元末端ＧｌｃＮＡｃからＡｓｎ残基にβ−グリコシド結合している場合がある。一態様では、アクセプター性グリカンは、ポリペプチド結合型Ｎ−グリカン（式中、ｍおよびｑは１である）であり、アクセプター構造は、［Ｒ１］ｙＭａｎα３（［Ｒ２］ｚＭａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃαｘ）ｎβ４ＧｌｃＮＡｃの誘導体を含有する。場合による誘導体には、ＧｌｃＮＡｃまたはキシロースなどの単糖残基による置換が含まれる。
【００４２】
アクセプター性グリカンは、Ｍａｎ３、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３、またはＭａｎ５でありうる。ある態様では、アクセプター性グリカンは、Ｍａｎ３またはＧｌｃＮＡｃＭａｎ３である。Ｍａｎ３は、Ｍａｎα３またはＭａｎα６残基の少なくとも一方を含むトリマンノシルグリカンであり、好ましくはＭａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎなどの分枝オリゴ糖である。他の特定のＭａｎ３オリゴ糖は、Ｍａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎβ、Ｍａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃ、およびポリペプチド結合型Ｍａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃである。加えて、ホスト細胞に応じて、グリカンは、Ｍａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃαｘ）ｎＧｌｃＮＡｃ［式中、ｘは３または６であり、ｎは０または１であり、これは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（ｎ＝０）およびＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｆｕｃ（ｎ＝１）のように末端マンノース構造および還元末端組成を示す単糖組成式によっても表現される］のように、Ｍａｎβおよび／またはＧｌｃＮＡｃ残基にＦｕｃ、ＸｙｌまたはＧｌｃＮＡｃを含有しうる。ある態様、特にポリペプチド結合構造を有する態様では、Ｍａｎ３構造はＭａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ｎＧｌｃＮＡｃである。ある態様では、ポリペプチド結合型ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３構造は、ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ｎＧｌｃＮＡｃ［単糖組成式ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（ｎ＝０）およびＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｆｕｃ（ｎ＝１）によっても表現される］である。ある態様では、ポリペプチド結合型Ｍａｎ５構造は、Ｍａｎα３｛Ｍａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎα６｝Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ｎＧｌｃＮＡｃである［式中、｛｝および（）は枝を示し、ｎは０または１であり、これは、単糖組成式Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ｎ＝０）およびＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｆｕｃ（ｎ＝１）によっても表現される］。
【００４３】
したがって、あるＭａｎ３グリカンは、次式：Ｍａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃαｘ）ｎβ４ＧｌｃＮＡｃ［式中、ｎは０または１であって、分子の部分の存在または不在を示し、ｘは３または６であり、（）は構造中の枝を定義する］による構造を有する。アクセプター性グリカンがＭａｎ３である本発明の態様では、リコンビナントタンパク質は、Ｍａｎ３の末端Ｍａｎα３およびＭａｎα６へのＮ−アセチルグルコサミンの転移を触媒する結果、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３、ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃαｘ）ｎＧｌｃＮＡｃ［式中、ｎは０または１であり、これは、単糖組成式ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（ｎ＝０）およびＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｆｕｃ（ｎ＝１）によっても表現される］が生じる。
【００４４】
アクセプター性グリカンがＭａｎ５である本発明の態様では、リコンビナントタンパク質は、Ｍａｎ５の末端Ｍａｎα３へのＮ−アセチルグルコサミンの転移を触媒する。２個のマンノースが（例えばマンノシダーゼＩＩにより）ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５から除去されてＧｌｃＮＡｃＭａｎ３が形成した後に、リコンビナントタンパク質が末端Ｍａｎα６へのＮ−アセチルグルコサミンの転移を触媒する結果、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３［構造ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃαｘ）ｎＧｌｃＮＡｃ（式中、ｎは０または１である）を有し、抗体に結合している場合はＧ０とも呼ばれる］が生じる。
【００４５】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含有する融合タンパク質
ある態様では、本発明のリコンビナントタンパク質は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを含有する融合タンパク質である。「融合タンパク質」という用語は、異種アミノ酸に結合したタンパク質またはポリペプチドを含有する任意のタンパク質またはポリペプチドを表す。
【００４６】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｌｃＮＡｃ−ＴＩ；ＧｎＴＩ；ＥＣ２．４．１．１０１）は、反応ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン＋３−（α−Ｄ−マンノシル）−β−Ｄ−マンノシル−Ｒ⇔ＵＤＰ＋３−（２−（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニル）−α−Ｄ−マンノシル）−β−Ｄ−マンノシル−Ｒ（式中、Ｒは、グリカン性アクセプターにおけるＮ結合型オリゴ糖の残りを表す）を触媒する。Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインは、この反応を触媒することができる、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ酵素の任意の部分である。様々な生物由来のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ酵素についてのアミノ酸配列は、配列番号１〜１９に列挙されている。追加的なＧｎＴＩ酵素は、ＣＡＺｙデータベース中のグリコシルトランスフェラーゼファミリー１３に列挙されている（cazy.org/GT13_all）。酵素的に特徴づけられた種には、A. thaliana ＡＡＲ７８７５７．１（米国特許第６，６５３，４５９号）、C. elegans ＡＡＤ０３０２３．１（Chen S. et al J. Biol.Chem 1999;274(1):288-97）、D. melanogaster ＡＡＦ５７４５４．１（Sarkar & Schachter Biol Chem. 2001 Feb;382(2):209-17）；C. griseus ＡＡＣ５２８７２．１（Puthalakath H. et al J. Biol.Chem 1996 271(44):27818-22）；H. sapiens ＡＡＡ５２５６３．１（Kumar R. et al  Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Dec;87(24):9948-52）；M. auratus ＡＡＤ０４１３０．１（Opat As et al  Biochem J. 1998 Dec 15;336 (Pt 3):593-8）、（非活性化突然変異体の一例を含む）、ウサギ、O. cuniculus ＡＡＡ３１４９３．１（Sarkar M et al.  Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Jan 1;88(1):234-8）が含まれる。特徴づけられた活性酵素の追加的な例は、cazy.org/GT13_characterizedに見出すことができる。ウサギＧｎＴＩ触媒ドメインの３Ｄ構造は、Unligil UM et al. EMBO J. 2000 Oct 16;19(20):5269-80にＸ線結晶学により規定された。ＧｎＴＩについてのProtein Data Bank（ＰＤＢ）構造は、１ＦＯ８、１ＦＯ９、１ＦＯＡ、２ＡＭ３、２ＡＭ４、２ＡＭ５、および２ＡＰＣである。ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインは、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ酵素（配列番号１）、またはその変異体に由来する。ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインは、配列番号１のアミノ酸残基８４〜４４５と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含有する。いくつかの態様では、より短い配列を触媒ドメインとして使用することができる（例えば、ヒト酵素のアミノ酸残基１０５〜４４５またはウサギ酵素のアミノ酸残基１０７〜４４７；Sarkar et al. (1998) Glycoconjugate J 15:193-197）。ＧｎＴＩ触媒ドメインとして使用することができる追加的な配列には、ヒト酵素の約３０〜４４５番アミノ酸のアミノ酸残基またはヒト酵素のアミノ酸残基３０〜１０５から開始し約４４５番アミノ酸まで連続する任意のＣ末端ステムドメイン、あるいは別のＧｎＴＩまたはその触媒活性変異体もしくは突然変異体の対応する相同配列が含まれる。触媒ドメインは、ステム��メイン、膜貫通ドメイン、または細胞質ドメインの全てまたは部分などの、酵素のＮ末端部分を含みうる。
【００４７】
本明細書に使用するような「細胞質」は、細胞の細胞質と相互作用するタンパク質の部分を表すために使用される。
【００４８】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＧｌｃＮＡｃ−ＴＩＩ；ＧｎＴＩＩ；ＥＣ２．４．１．１４３）は、反応ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン＋６−（α−Ｄ−マンノシル）−β−Ｄ−マンノシル−Ｒ⇔ＵＤＰ＋６−（２−（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニル）−α−Ｄ−マンノシル）−β−Ｄ−マンノシル−Ｒ（式中、Ｒは、グリカン性アクセプターにおけるＮ結合型オリゴ糖の残りを表す）を触媒する。Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、この反応を触媒することができる、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ酵素の任意の部分である。様々な生物由来のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ酵素についてのアミノ酸配列を、配列番号２０〜３３に列挙する。ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ酵素（配列番号２０）に由来する。追加的なＧｎＴＩＩ種は、ＣＡＺｙデータベース中のグリコシルトランスフェラーゼファミリー１６に列挙されている（cazy.org/GT16_all）。酵素的に特徴づけられた種には、カエノラブディティス・エレガンス（C. elegans）、ドロソフィラ・メラノガスター（D. melanogaster）、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）、ラツス・ノルベギグス（Rattus norvegigus）、スス・スクロファ（Sus scrofa）のＧｎＴＩＩが含まれる（cazy.org/GT16_characterized）。ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、配列番号２１のアミノ酸残基約３０〜約４４７と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含有する。触媒ドメインは、ステムドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞質ドメインの全てまたは部分などの、酵素のＮ末端部分を含みうる。
【００４９】
ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインに対してＮ末端側である。他の態様では、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインのＮ末端側である。「Ｎ末端側」という用語は、参照アミノ酸残基セットに比べて、遊離アミン基（−ＮＨ２）を有するアミノ酸で終結したポリペプチド末端付近のアミノ酸残基セットの位置づけを表す。
【００５０】
スペーサー
本発明のある態様では、リコンビナントタンパク質は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインとＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインの間にスペーサーを含有する。「スペーサー」という用語は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインとＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを分離している連続アミノ酸であって、それによりスペーサーが触媒ドメインの酵素機能に影響を及ぼさない、任意の配列の任意のいくつかの連続アミノ酸を表す。典型的には、スペーサーは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０アミノ酸長である。ある態様では、スペーサーは、ステムドメイン由来の配列を含有する。「ステムドメイン」は、グリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシルヒドロラーゼなどのネイティブな酵素の膜貫通ドメインに隣接して位置するタンパク質ドメインまたはそのフラグメントであって、場合によりその酵素をＥＲ／ゴルジ体にターゲティングするかまたはＥＲ／ゴルジ体でのその酵素の貯留を支援するタンパク質ドメインまたはそのフラグメントを表す。ステムドメインは、一般に、第１のアミノ酸で開始し、疎水性膜貫通ドメインが続き、触媒ドメインで終止する。例示的なステムドメインには、非限定的に、ヒトＧｎＴＩのステムドメイン、ヒトＧｎＴＩＩについてのアミノ酸残基約３０〜約８３もしくは約３０〜約１０５、またはT. reesei ＫＲＥ２についてのアミノ酸残基約２６〜約１０６もしくは約２６〜約８３が含まれる。スペーサーがステムドメイン由来の配列を含有するある態様では、スペーサーは、ヒトＧｎＴＩ配列のアミノ酸３０〜８３番（配列番号３４）を含む。他の態様では、スペーサーは、配列番号３５〜３８に列挙する任意の配列を含みうる。
【００５１】
適切なスペーサーのさらなる例には、非限定的に、フレキシブルスペーサー３×Ｇ４Ｓ（配列番号１１８）、フレキシブルスペーサー２×Ｇ４Ｓ（配列番号１２０）、T. reesei ＣＢＨＩについてのスペーサー（配列番号１２２）；およびT. reesei ＥＧＩＶセルラーゼについてのスペーサー（配列番号１２４）が含まれる。
【００５２】
ある態様では、スペーサーの長さは、ＧｎＴ１のステムドメインの長さとほぼ同じである。ある態様では、長さは、アミノ酸残基約７４個±アミノ酸約３７個である。例えば、スペーサーの長さは、アミノ酸約３０個〜アミノ酸約１１０個、またはアミノ酸約３５個〜アミノ酸約１００個、または本明細書記載の実施例に例示するように、アミノ酸±２、３、４、または５個である。一態様では、スペーサー長は、ＧｎＴ１の切断型ステムドメインに対応し、例えば、アミノ酸２５〜アミノ酸１０４番から、またはアミノ酸３０番からアミノ酸１０１番の間から開始し、ＧｎＴ１ステムドメイン終止部までである。ある態様では、スペーサーは、ヒトＧｎＴ１のステムドメインの一部を含む場合があり、それは、アミノ酸７０番からアミノ酸８７番の間（配列番号３４での番号付けによる）、またはアミノ酸７６番からアミノ酸１０４番の間に位置するアミノ酸から開始し、またはアミノ酸３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、７３、７４、７５、７６、８０、８３、８４、８５、８６、８７、１００、１０１、１０２、１０３、または１０４番から開始し、ヒトＧｎＴ１ステムドメインの終末部まででありうる。他の態様では、スペーサーは、異種スペーサーペプチドを含む場合があり、それには、真菌スペーサーペプチドおよび／または反復オリゴマースペーサーペプチドが含まれうる。
【００５３】
典型的には、スペーサーは、特異的コンフォメーションを有さない伸長ペプチドであり、高い柔軟性（例えば、ＧｌｙおよびＡｌａ）、親水性（例えば、ＳｅｒおよびＴｈｒ）を可能にするアミノ酸残基、および場合によりコンフォメーションを阻止するためのＰｒｏを含有する。スペーサーは、グリコシル化されている場合がある。ある態様では、スペーサーは、真菌Ｏ−マンノシル化を含めて、Ｏ−グリコシル化されている。ある態様では、スペーサーは、タンパク質ドメインを自然に分離するスペーサーなどの、内因性真菌、糸状菌、またはトリコデルマ属（Trichoderma）のスペーサーペプチドである。スペーサーは、糸状菌（例えばT. reesei）などの真菌の分泌酵素もしくはセルロース分解性酵素、そのフラグメント、またはそのスペーサーの多量体、および／またはそのフラグメントもしくはその突然変異アナログもしくは等価物から得ることができる。天然真菌スペーサーは、二量体性またはオリゴマー性のプロリンおよび／もしくはグリシンおよび／もしくはセリンおよび／もしくはトレオニン、ならびに／またはＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、ＰｒｏもしくはＡｌａまたはその任意の組み合わせより選択される複数のアミノ酸残基を含有しうる。ある態様では、スペーサーは、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、ＰｒｏまたはＡｌａより選択される１〜１０または１〜５個のアミノ酸残基、および場合によりマイナス荷電残基ＧｌｕもしくはＡｓｐまたはプラス荷電残基ＬｙｓもしくはＡｒｇより選択される荷電アミノ酸残基を有するモノマーを含有する反復オリゴマーである。ある態様では、荷電残基はマイナス荷電している。ある態様では、モノマーは、二量体もしくはオリゴマー性アミノ酸残基、ならびに／またはＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、ＰｒｏおよびＡｌａより選択される複数の単一アミノ酸残基を含有する。ある態様では、オリゴマーは、グリシンの二量体またはオリゴマーと、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、ＰｒｏおよびＡｌａより選択される単一残基とのモノマーを含有する。ある態様では、単一の残基はＳｅｒまたはＴｈｒである。ある態様では、残基はＳｅｒである。ある態様では、反復スペーサーの配列は、｛（Ｙｙｙ）ｎＸｘｘ｝ｍである［式中、ｎは２〜１０であり、ｍは２〜１０であり、ＸｘｘおよびＹｙｙは、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、ＰｒｏおよびＡｌａより選択され、但し、ＸｘｘおよびＹｙｙは、同じアミノ酸残基ではない］。ある態様では、反復スペーサーは｛（Ｇｌｙ）ｎＸｘｘ｝ｍである［式中、ｎは２〜１０であり、ｍは２〜１０であり、Ｘｘｘは、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、ＰｒｏおよびＡｌａより選択される］。ある態様では、ＸｘｘはＳｅｒまたはＴｈｒである。ある態様では、ＸｘｘはＳｅｒである。
【００５４】
ターゲティングペプチド
ある態様では、本発明のリコンビナントタンパク質は、触媒ドメインに結合したターゲティングペプチドを含む。本明細書に使用するような「結合した」という用語は、ポリペプチドの場合は２個のアミノ酸残基ポリマー、またはポリヌクレオチドの場合は２個のヌクレオチドポリマーが、相互に直接隣り合うようにカップリングされているか、または同じポリペプチドもしくはポリヌクレオチド内であるが介在性のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドにより分離されているかのいずれかであることを意味する。本明細書に使用するような「ターゲティングペプチド」は、ホスト細胞内の小胞体（ＥＲ）またはゴルジ装置（Golgi）にリコンビナントタンパク質を局在化することができるリコンビナントタンパク質の任意の数の連続アミノ酸残基を表す。ターゲティングペプチドは、触媒ドメインに対してＮ末端側またはＣ末端側でありうる。ある態様では、ターゲティングペプチドは、触媒ドメインに対してＮ末端側である。ある態様では、ターゲティングペプチドは、ＥＲまたはゴルジ成分（Golgi component）への、例えばマンノシダーゼＩＩ酵素への結合を提供する。他の態様では、ターゲティングペプチドは、ＥＲまたはゴルジ膜への直接結合を提供する。
【００５５】
ターゲティングペプチドの成分は、普通はＥＲまたはゴルジ装置にある任意の酵素に由来しうる。そのような酵素には、マンノシダーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、２型ゴルジタンパク質、ならびにＭＮＮ２、ＭＮＮ４、ＭＮＮ６、ＭＮＮ９、ＭＮＮ１０、ＭＮＳ１、ＫＲＥ２、ＶＡＮ１、およびＯＣＨ１酵素が含まれる。そのような酵素は、アクレモニウム属（Acremonium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、アウレオバシジウム属（Aureobasidium）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、クリソスポリウムス属（Chrysosporium）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、フィロバシジウム属（Filobasidium）、フザリウム属（Fusarium）、ジベレラ属（Gibberella）、ヒュミコラ属（Humicola）、マグナポルテ属（Magnaporthe）、ムコール属（Mucor）、ミセリオフソラ属（Myceliophthora）、ミロセシウム属（Myrothecium）、ネオカリマスティクス属（Neocallimastix）、ニューロスポラ属（Neurospora）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、ペニシリウム属（Penicillium）、ピロミセス属（Piromyces）、シゾフィラム属（Schizophyllum）、タラロミセス属（Talaromyces）、サーモアスカス属（Thermoascus）、チエラビア属（Thielavia）、トリポクラジウム属（Tolypocladium）、およびトリコデルマ属（Trichoderma）種などの酵母または真菌種に由来しうる。そのような酵素についての配列は、GenBank配列データベースから見出すことができる。
【００５６】
ある態様では、ターゲティングペプチドは、リコンビナントタンパク質の触媒ドメインの一つと同じ酵素および生物に由来する。例えば、リコンビナントタンパク質がヒトＧｎＴＩＩ触媒ドメインを含む場合、リコンビナントタンパク質のターゲティングペプチドはヒトＧｎＴＩＩ酵素に由来する。他の態様では、ターゲティングペプチドは、リコンビナントタンパク質触媒ドメインとは異なる酵素および／または生物に由来しうる。
【００５７】
本発明のターゲティングリコンビナントタンパク質に使用することができる、ＥＲまたはゴルジへのタンパク質のターゲティングに使用するための様々なターゲティングペプチドの例には：ガラクトシルトランスフェラーゼに融合したＫｒｅ２／Ｍｎｔ１ Ｎ末端ペプチド（Schwientek, JBC 1996, 3398）、酵母細胞のＥＲにマンノシダーゼを局在化してＭａｎ５を製造するためのＨＤＥＬ（Chiba, JBC 1998, 26298-304; Callewaert, FEBS Lett 2001, 173-178）、ＧｎＴＩ触媒ドメインに融合したＯＣＨ１ターゲティングペプチド（Yoshida et al, Glycobiology 1999, 53-8）、α２−マンノシダーゼに融合した酵母Ｍｎｓ１ Ｎ末端ペプチド（Martinet et al, Biotech Lett 1998, 1171）、ＧｎＴＩまたはβ４ＧａｌＴの触媒ドメインに結合したＫｒｅ２のＮ末端部分（Vervecken, Appl. Environ Microb 2004, 2639-46）、WildtおよびGerngross（Nature Rev Biotech 2005, 119）に総説された様々なアプローチ、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）での完全長ＧｎＴＩ（Kalsner et al, Glycocon. J  1995, 360-370）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）での完全長ＧｎＴＩ（Kasajima et al, Biosci Biotech Biochem 2006, 2662-8）、アスペルギルス属（Aspergillus）においてC. elegans ＧｎＴＩに融合した酵母Ｓｅｃ１２局在化構造の部分（Kainz et al 2008）、アスペルギルス属（Aspergillus）においてヒトＧｎＴＩに融合した酵母Ｍｎｎ９のＮ末端部分（Kainz et al 2008）、ヒトＧｎＴＩに融合したアスペルギルス属（Aspergillus） Ｍｎｎ１０のＮ末端部分（Kainz et al, Appl. Environ Microb 2008, 1076-86）、およびT. reeseiでの完全長ヒトＧｎＴＩ（Maras et al, FEBS Lett 1999, 365-70）が含まれる。
【００５８】
ある態様では、ターゲティングペプチドは、配列番号１１５または配列番号１１６のアミノ酸配列を有するＫｒｅ２／Ｍｎｔ１（すなわちＫｒｅ２）ターゲティングペプチドである。
【００５９】
ターゲティングペプチドのために使用することができる配列のさらなる例には、下表１に列挙する配列が含まれる。
【００６０】
【表１】
0006017439.tif 000002
0006017439.tif 000003
0006017439.tif 000004
0006017439.tif 000005
0006017439.tif 000006
【００６１】
ホスト細胞におけるグリコシル化経路内のタンパク質を発現させること（ここで、タンパク質の一つが、特徴づけられていない配列を唯一のターゲティングペプチドとして含有する）およびグリカン生合成の細胞質局在化を考慮して、生成したグリカンを測定すること（例えばSchwientek JBC 1996 3398のように）によって、またはターゲティングペプチドと融合した蛍光レポータータンパク質を発現させること、および免疫蛍光によりゴルジでのタンパク質局在化を分析することによって、またはゴルジの細胞質膜を分画することおよびタンパク質の局在化を測定することによって、特徴づけられていない配列をターゲティングペプチドとしての使用について試験することができる。
【００６２】
ターゲティングペプチドは、ステムドメインを含みうる。ある態様では、ステムドメインは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ酵素またはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ酵素に由来する。とりわけある態様では、ステムドメインは、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ酵素またはヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ酵素に由来する。ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ酵素由来のステムドメインに対応する配列は、配列番号３４である。ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ酵素由来のステムドメインに対応する配列は、配列番号２０の残基３０〜８５である。
【００６３】
ターゲティングペプチドは、膜貫通ドメインを含みうる。「膜貫通ドメイン」は、膜内で三次元構造として熱力学的に安定な任意のアミノ酸残基配列を表す。ターゲティングペプチドがステムドメインも含む態様では、膜貫通ドメインはステムドメインに対してＮ末端側である。ある態様では、膜貫通ドメインは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ酵素またはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ酵素に由来する。特にある態様では、膜貫通ドメインは、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ酵素またはヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ酵素に由来する。ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ酵素由来の膜貫通ドメインに対応する配列は、配列番号１の残基７〜２９である。ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ酵素由来の膜貫通ドメインに対応する配列は、配列番号２０の残基１０〜２９である。
【００６４】
ターゲティングペプチドは、細胞質ドメインを含みうる。「細胞質ドメイン」という用語は、細胞質環境内で三次元構造として熱力学的に安定なアミノ酸配列を表す。ターゲティングペプチドがステムドメインも含む態様では、細胞質ドメインはステムドメインに対してＮ末端側である。ターゲティングペプチドが膜貫通ドメインも含む態様では、細胞質ドメインは、膜貫通ドメインに対してＮ末端側である。ある態様では、細胞質ドメインは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ酵素またはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ酵素に由来する。特にある態様では、細胞質ドメインは、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ酵素またはヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ酵素に由来する。ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ酵素由来の細胞質ドメインに対応する配列は、配列番号１の残基１〜６である。ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ酵素由来の細胞質ドメインに対応する配列は、配列番号２０の残基１〜９である。
【００６５】
ある態様では、リコンビナントタンパク質は、触媒ドメインの間にヒトＧｎＴＩステムドメイン配列を含有するスペーサー配列と共に、ヒトＧｎＴＩ触媒ドメインに対してＮ末端側にヒトＧｎＴＩＩ触媒ドメインを含有する。この態様では、リコンビナントタンパク質は、また、ヒトＧｎＴＩＩ由来の細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、およびステムドメインと共に、ＧｎＴＩＩ触媒ドメインに対してＮ末端側にターゲティングペプチドを含む。この態様におけるリコンビナントタンパク質の配列は、配列番号９５と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であり、この態様のリコンビナントタンパク質をコードする、ありうるｃＤＮＡの配列は、配列番号９６である。
【００６６】
他の態様では、リコンビナントタンパク質は、スペーサー配列と共に、ヒトＧｎＴＩ触媒ドメインに対してＮ末端側にヒトＧｎＴＩＩ触媒ドメインを含有する。スペーサー配列には、非限定的に、配列番号１１８、１２０、１２２、または１２４に少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列が含まれうる。この態様では、リコンビナントタンパク質は、また、ヒトＧｎＴＩＩ由来の細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、およびステムドメインと共に、ＧｎＴＩＩ触媒ドメインに対してＮ末端側にターゲティングペプチドを含む。したがって、ある態様では、リコンビナントタンパク質の配列は、配列番号１１９、１２１、１２３、および１２５より選択される配列に、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。ある態様では、配列番号１１９のリコンビナントタンパク質をコードする、ありうるｃＤＮＡの配列は、配列番号１４１である。他の態様では、配列番号１２１のリコンビナントタンパク質をコードする、ありうるｃＤＮＡの配列は、配列番号１３９である。なお他の態様では、配列番号１２３のリコンビナントタンパク質をコードする、ありうるｃＤＮＡの配列は、配列番号１４３である。さらなる態様では、配列番号１２５のリコンビナントタンパク質をコードする、ありうるｃＤＮＡの配列は、配列番号１４５である。
【００６７】
本発明のリコンビナントタンパク質の製造
本発明の別の局面には、本発明のリコンビナントタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドが含まれる。本明細書に使用するような用語「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「核酸の配列」およびその変形は、ＤＮＡおよびＲＮＡで見られるように塩基対形成および塩基スタッキングを可能にする配置で核酸塩基を含有することを条件として、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチド、および非ヌクレオチド骨格を含有する他のポリマーの一般名である。したがって、これらの用語には、既知のタイプの核酸配列改変、例えば、アナログによる一つまたは複数の天然ヌクレオチドの置換；ヌクレオチド間改変、例えば、非荷電結合を用いた改変（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）、マイナス荷電結合を用いた改変（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、およびプラス荷電結合を用いた改変（例えば、アミノアルキルホスホロアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル）；例えばタンパク質などのペンダント部分を含有する改変（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなどを含む）；インターカレーターを用いた改変（例えば、アクリジン、ソラレンなど）；およびキレート剤を含有する改変（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）が含まれる。本明細書に使用するような、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドについての記号は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Biochem. 9:4022, 1970）によって推奨される記号である。
【００６８】
単離されたポリヌクレオチドの配列は、例えば直接化学合成またはクローニングなどの、当業者に公知の任意の適切な方法によって調製される。直接化学合成のために、核酸ポリマーの形成は、典型的には、伸長途中のヌクレオチド鎖の末端５’−ヒドロキシル基への、３’−ブロックおよび５’−ブロックされたヌクレオチドモノマーの連続付加を伴い、ここで、各付加は、添加されたモノマー（典型的には、ホスホトリエステル、ホスホラミダイトなどのリン誘導体である）の３’位に対する伸長途中の鎖の末端５’−ヒドロキシル基の求核攻撃によって果たされる。そのような方法は、当業者に公知であり、関連する文書および文献に記載されている［例えば、Matteucci et al., (1980) Tetrahedron Lett 21:719-722；米国特許第４，５００，７０７号；同第５，４３６，３２７号；および同第５，７００，６３７号］。加えて、所望の配列は、適切な制限酵素を使用してＤＮＡを開裂させること、ゲル電気泳動法を用いてフラグメントを分離すること、およびその後に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；例えば米国特許第４，６８３，１９５号）の利用などの、当業者に公知の技法によりゲルから所望の核酸配列を回収することによって、天然供給源から単離することができる。
【００６９】
本発明の各ポリヌクレオチドは、発現ベクターに組み込むことができる。「発現ベクター」または「ベクター」は、ホスト細胞にトランスダクション、トランスフォーメーション、または感染することによって、その細胞にネイティブなもの以外の、またはその細胞にネイティブではない方法で、核酸および／またはタンパク質をその細胞に発現させる、化合物および／または組成物を表す。「発現ベクター」は、ホスト細胞により発現されるべき核酸配列（通常ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含有する。場合により、発現ベクターは、また、ウイルス、リポソーム、タンパク質コーティングなどの、ホスト細胞への核酸の移行を達成することを助ける物質を含む。本発明での使用に考えられている発現ベクターには、核酸配列を任意のある種のまたは必要な作動エレメントと一緒に挿入できる発現ベクターが含まれる。さらに、発現ベクターは、ホスト細胞に導入されてその中で複製できる発現ベクターでなければならない。ある種の発現ベクターは、プラスミドであって、特に、文書により十分に立証された制限部位を有し、特にある種のまたは核酸配列の転写に必要な作動エレメントを含有するプラスミドである。そのようなプラスミドおよび他の発現ベクターは、当業者に周知である。
【００７０】
個別のポリヌクレオチドの組み込みは、例えば、発現ベクター、例えばプラスミド中の特定部位を切断するための制限酵素（ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｈａＩ、ＸｈｏＩ、ＸｍａＩなど）の使用を含む公知の方法により達成することができる。制限酵素は、１本鎖末端を生成し、その１本鎖末端は、切断された発現ベクターの末端に対して配列が相補的な終端を有するまたは有するように合成されたポリヌクレオチドにアニーリングすることができる。アニーリングは、適切な酵素、例えばＤＮＡリガーゼを使用して行われる。当業者に理解されているように、多くの場合、発現ベクターおよび所望のポリヌクレオチドの両方を同じ制限酵素で切断することによって、発現ベクターの末端とポリヌクレオチドの末端が相互に相補的であることが保証される。加えて、ＤＮＡリンカーを使用して、発現ベクターへの核酸配列の結合を容易にすることができる。
【００７１】
当業者に公知の方法（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号）を利用することによって、一連の個別のポリヌクレオチドを組み合わせることもできる。
【００７２】
例えば、所望のポリヌクレオチドのそれぞれを最初に別々のＰＣＲで産生することができる。その後、ＰＣＲ生成物の末端が相補的配列を含有するような特異的プライマーを設計する。ＰＣＲ生成物を混合し、変性させ、再アニーリングすると、その３’末端でマッチする配列を有する鎖が重複し、相互に対するプライマーとして作用することができる。ＤＮＡポリメラーゼによるこの重複の伸長により、最初の配列が一緒に「スプライシング」された分子が生成する。このように、一連の個別のポリヌクレオチドを一緒に「スプライシング」し、続いて、ホスト細胞に同時にトランスダクションすることができる。したがって、複数のポリヌクレオチドのそれぞれの発現が果たされる。
【００７３】
個別のポリヌクレオチド、または「スプライシングされた」ポリヌクレオチドは、次に発現ベクターに組み込まれる。本発明は、ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込む過程に関して限定されない。当業者は、発現ベクターにポリヌクレオチドを組み込むために必要なステップを熟知している。典型的な発現ベクターは、一つまたは複数の調節領域が先行する所望のポリヌクレオチドをリボソーム結合部位と共に含有し、リボソーム結合部位は、例えば、３〜９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、エシェリキア・コリ（E. coli）において開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置する。Shine and Dalgarno (1975) Nature 254(5495):34-38およびSteitz (1979) Biological Regulation and Development (ed. Goldberger, R. F.), 1:349-399 (Plenum, New York)を参照されたい。
【００７４】
本明細書に使用するような「作動可能に連結された」という用語は、制御配列がポリペプチドの発現を指令するように、その制御配列がＤＮＡ配列のコード配列またはポリヌクレオチドのコード配列に対して適切な位置に位置付けられる配置を表す。
【００７５】
調節領域には、例えばプロモーターおよびオペレーターを含有する領域が含まれる。プロモーターは、ポリペプチドをコードする所望のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド部分に作動可能に連結されることにより、ＲＮＡポリメラーゼ酵素を介して、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド部分の転写を開始する。オペレーターは、プロモーターに隣接する核酸配列であって、リプレッサータンパク質が結合できるタンパク質結合ドメインを含有する。リプレッサータンパク質の不在下で、転写はプロモーターを介して開始する。存在下では、オペレーターのタンパク質結合ドメインに特異的なリプレッサータンパク質は、オペレーターに結合することによって転写を阻害する。このように、使用される特定の調節領域および対応するリプレッサータンパク質の有無に基づいて、転写制御が達成される。例には、ラクトースプロモーター（Ｌａｄリプレッサータンパク質は、ラクトースと接触するとコンフォメーションを変化することで、Ｌａｄリプレッサータンパク質がオペレーターに結合することを阻止する）およびトリプトファンプロモーター（トリプトファンと複合体を形成しているとき、ＴｒｐＲリプレッサータンパク質はオペレーターと結合するコンフォメーションを有し；トリプトファン不在下ではＴｒｐＲリプレッサータンパク質はオペレーターに結合しないコンフォメーションを有する）が含まれる。別の例は、ｔａｃプロモーターである（de Boer et al., (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80(1):21-25参照）。当業者に理解されているように、これらの調節領域および他の調節領域を本発明に使用することができ、本発明はこの点に限定されない。
【００７６】
本発明のリコンビナントタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドに連結するための特定のプロモーターの例には、以下の遺伝子由来のプロモーターが含まれる：ｇｐｄＡ、ｃｂｈ１、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）ｇｌａＡ、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）アルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）トリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）アセトアミダーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）アセトアミダーゼ、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ、真菌エンドα−Ｌ−アラビナーゼ（ａｂｎＡ）、真菌α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＡ（ａｂｆＡ）、真菌α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ（ａｂｆＢ）、真菌キシラナーゼ（ｘｌｎＡ）、真菌フィターゼ、真菌ＡＴＰ−シンテターゼ、真菌サブユニット９（ｏｌｉＣ）、真菌トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｐｉ）、真菌アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＡ）、真菌α−アミラーゼ（ａｍｙ）、真菌アミログルコシダーゼ（ｇｌａＡ）、真菌アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）、真菌グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄ）、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、酵母ラクターゼ、酵母３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、酵母トリオースリン酸イソメラーゼ、細菌α−アミラーゼ、細菌Ｓｐｏ２、およびＳＳＯ。ある態様では、本発明のリコンビナントタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドは、構成的プロモーターに作動可能に連結されている。他の態様では、本発明のリコンビナントタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドは、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。特定の好ましい態様では、誘導性プロモーターはｃｂｈ１遺伝子に由来する。
【００７７】
所望の配列を組み込むために任意の適切な発現ベクターを使用することができるものの、容易に利用可能な発現ベクターには、非限定的に：ｐＳＣｌＯｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＢＲｌＭＣＳ−３、ｐＵＲ、ｐＥＸ、ｐＭＲｌＯＯ、ｐＣＲ４、ｐＢＡＤ２４、ｐＵＣ１９などのプラスミド；Ｍｌ３ファージおよびλファージなどのバクテリオファージが含まれる。もちろん、そのような発現ベクターは、特定のホスト細胞だけに適切でありうる。しかし、当業者は、任意の特定の発現ベクターが任意の所与のホスト細胞に適するかどうかを日常的な実験作業により容易に判定することができる。例えば、発現ベクターをホスト細胞に導入し、次に生存率およびそのベクターに含有される配列の発現についてそのホスト細胞をモニターすることができる。加えて、発現ベクターおよび任意の特定のホスト細胞に対するその適合性について記載している関連文書および文献を参照することができる。
【００７８】
本発明の別の局面には、本発明のリコンビナントタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを含有するホスト細胞が含まれる。本明細書に使用するような「ホスト細胞」は、リコンビナントＤＮＡまたはＲＮＡの挿入によりトランスフォーメーションできる、生きた生物学的細胞を表す。そのようなリコンビナントＤＮＡまたはＲＮＡは、発現ベクター中にありうる。したがって、本明細書記載のホスト細胞は、原核生物（例えば、真正細菌界の生物）または真核細胞でありうる。当業者によって理解されているように、原核細胞は膜結合型の核を欠如しており、一方で真核細胞は膜結合型の核を有する。ある態様では、本発明のリコンビナントタンパク質の製造のために使用されるホスト細胞は、酵母または糸状菌などの真菌細胞である。他の態様では、ホスト細胞は哺乳動物細胞である。そのような細胞は、ヒト性または非ヒト性でありうる。
【００７９】
本発明の別の局面には、本発明のリコンビナントタンパク質を製造する方法が含まれる。その方法は、リコンビナントタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドをホスト細胞に導入するステップ、およびリコンビナントタンパク質が発現されるようにホスト細胞を培養するステップを含む。その方法は、ホスト細胞からリコンビナントタンパク質を精製するステップも含みうる。
【００８０】
本発明のリコンビナントタンパク質を製造する方法は、ホスト細胞中への本発明のリコンビナントポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの導入または移行を含みうる。ホスト細胞中に発現ベクターを移行させるためのそのような方法は、当業者に周知である。例えば、エシェリキア・コリ（E. coli）に発現ベクターをトランスフォーメーションするための一方法は、発現ベクターがカルシウム沈殿を経て導入される塩化カルシウム処理を伴う。他の塩、例えばリン酸カルシウムも、類似の手順により使用されうる。加えて、エレクトロポレーション（すなわち、核酸配列への細胞透過性を増加させる電流の適用）を使用してホスト細胞にトランスフェクションすることができる。同様に、核酸配列のマイクロインジェクションは、ホスト細胞にトランスフェクションする能力を提供する。複合脂質、リポソーム、およびデンドリマーなどの他の手段も採用してもよい。当業者は、これらの方法または他の方法を使用して、ホスト細胞に所望の配列をトランスフェクションすることができる。
【００８１】
ベクターは、自律的複製ベクター、すなわち染色体外実体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しないベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体でありうる。ベクターは、自己複製を保証するための任意の手段を含有しうる。または、ベクターは、ホストに導入されたときにゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体（一つまたは複数）と一緒に複製されるベクターでありうる。さらに、単一のベクターもしくはプラスミド、またはホストのゲノムに導入されるべき総ＤＮＡを一緒になって含有する２種以上のベクターまたはプラスミド、またはトランスポゾンを使用することができる。
【００８２】
ベクターは、トランスフォーメーションされたホストの容易な選択を許す一つまたは複数の選択マーカーを含有しうる。選択マーカーは、その生成物が、例えば生命破壊またはウイルス耐性、重金属耐性、原栄養性から栄養要求株までなどを提供する遺伝子である。細菌細胞の選択は、ａｍｐ、ｇｐｔ、ｎｅｏ、およびｈｙｇ遺伝子などの遺伝子により付与された微生物耐性に基づきうる。
【００８３】
酵母ホストのために適切なマーカーは、例えば、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３である。糸状菌ホストに使用するための選択マーカーには、非限定的に、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにその等価物が含まれる。アスペルギルス属（Aspergillus）に使用するためのいくつかは、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）またはアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）のａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子ならびにストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）のｂａｒ遺伝子である。トリコデルマ属（Trichoderma）に使用するためのいくつかは、ｂａｒ、ｐｙｒ４、およびａｍｄＳである。
【００８４】
ベクターは、ホストのゲノムへのベクター組み込み、またはそのゲノムと無関係な細胞中でのベクターの自律的複製を許すエレメント（一つまたは複数）を含有しうる。
【００８５】
ベクターは、ホストのゲノムへの組み込みのために、遺伝子配列に依存する場合があり、または相同もしくは非相同組み換えによるゲノムへのベクターの組み込みのために、ベクターの任意の他のエレメントに依存する場合がある。または、ベクターは、相同組み換えによるホストゲノムへの組み込みを指令するために、追加的なヌクレオチド配列を含有しうる。追加的なヌクレオチド配列は、ベクターが染色体（一つまたは複数）中の正確な位置（一つまたは複数）でホストゲノムに組み込みできるようにする。組み込みエレメントは、正確な位置での組み込みの見込みを増加させるために、１００〜１０，０００塩基対、好ましくは４００〜１０，０００塩基対、最も好ましくは８００〜１０，０００塩基対などの十分な数の核酸を含有する場合があり、それらは、相同組み換えの確率を高めるために、対応するターゲット配列と高度に相同である。組み込みエレメントは、ホストのゲノム中のターゲティング配列と相同な任意の配列でありうる。さらに、組み込みエレメントは、非コードまたはコードヌクレオチド配列でありうる。他方で、ベクターを、非相同組み換えによりホストのゲノムに組み込んでもよい。
【００８６】
自律的複製のために、ベクターは、さらに、そのベクターが問題となるホスト中で自律的複製できるようにする複製起点を含みうる。複製起点は、細胞内で機能する、自律的複製を仲介する任意のプラスミドレプリケーターでありうる。「複製起点」または「プラスミドレプリケーター」という用語は、本明細書において、プラスミドまたはベクターがin vivo複製できるようにする配列として定義される。酵母ホストに使用するための複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３の組み合わせ、およびＡＲＳ４とＣＥＮ６の組み合わせである。糸状菌細胞において有用な複製起点の例は、ＡＭＡ１およびＡＮＳ１（Gems et al., 1991; Cullen et al., 1987；国際公開公報第００／２４８８３号）である。ＡＭＡ１遺伝子の単離およびその遺伝子を含むプラスミドまたはベクターの構築は、国際公開公報第００／２４８８３号に開示された方法に従って達成することができる。
【００８７】
他のホストについて、トランスフォーメーション手順は、例えばクリベロマイセス属（Kluyveromyces）についてJeremiah D. Read, et al., Applied and Environmental Microbiology, Aug. 2007, p. 5088-5096に、ザイモモナス属（Zymomonas）についてOsvaldo Delgado, et al., FEMS Microbiology Letters 132, 1995, 23-26に、ピキア・スチピチス（Pichia stipitis）について米国特許第７，５０１，２７５号に、クロストリジウム属（Clostridium）について国際公開公報第２００８／０４０３８７号に見出すことができる。
【００８８】
１コピーよりも多い遺伝子をホストに挿入して遺伝子生成物の生成を増加させることができる。遺伝子のコピー数の増加は、遺伝子の少なくとも１個の追加的なコピーをホストゲノムに組み込むことにより、または増幅可能な選択マーカー遺伝子をヌクレオチド配列と一緒に入れることにより得ることができ、その際、選択マーカー遺伝子の増幅コピーを含有する細胞、すなわち遺伝子の追加的なコピーを含有する細胞を、適切な選択剤の存在下で培養することにより選択することができる。
【００８９】
上記エレメントをライゲーションして本発明のリコンビナント発現ベクターを構築するために使用される手順は、当業者に周知である（例えば、Sambrook et al., 1989、上記参照）。
【００９０】
ホスト細胞に少なくとも一つの発現ベクターがトランスフォーメーションされる。発現ベクターを一つだけ使用する場合（中間体の添加なし）、ベクターは、必要な核酸配列の全てを含有する。
【００９１】
ホスト細胞に発現ベクターをトランスフォーメーションしたら、ホスト細胞を成長させる。本発明の方法は、細胞中でリコンビナント核酸が発現されるようにホスト細胞を培養することを含みうる。微生物ホストについて、このプロセスは、細胞を適切な培地中で培養することを必要とする。典型的には、細胞は適切な培地中で３５℃にて成長される。本発明におけるある種の成長培地には、例えば、Luria-Bertani（ＬＢ）ブロス、Sabouraudデキストロース（ＳＤ）ブロスまたは酵母培地（ＹＭ）ブロスなどの一般的な市販の調製済み培地が含まれる。他の限定成長培地または合成成長培地も使用することができ、特定のホスト細胞の成長に適切な培地は、微生物学または発酵科学の技術者に公知であろう。成長に適切な温度範囲および他の条件は、当技術分野において公知である（例えば、Bailey and Ollis 1986参照）。
【００９２】
ホスト細胞から本発明のリコンビナントタンパク質を精製するための方法は、当技術分野において周知である（E. L. V. Harris and S. Angel, Eds. (1989) Protein Purification Methods: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, England参照）。そのような方法には、非限定的に、分取用ディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、イオン交換および分配クロマトグラフィー、ならびに向流分配、ならびにその組み合わせが含まれる。ある態様では、リコンビナントタンパク質は、精製を容易にするために追加的な配列タグを有する。そのようなマーカーには、エピトープタグおよびタンパク質タグが含まれる。エピトープタグの非限定的な例には、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ポリヒスチジン（６×−ＨＩＳ）、ＧＬＵ−ＧＬＵ、およびＤＹＫＤＤＤＤＫ（ＦＬＡＧ）（配列番号１１７）エピトープタグが含まれる。エピトープタグは、いくつかの確立された方法によりペプチドに付加することができる。エピトープタグのＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチドとして、またはＰＣＲ増幅に使用されるプライマーにより、リコンビナントタンパク質コード配列に挿入することができる。代替として、ペプチドコード配列は、エピトープタグとの融合体を生み出す特異的ベクター；例えばｐＲＳＥＴベクター（Invitrogen Corp., San Diego, Calif.）にクローニングすることができる。タンパク質タグの非限定的な例には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、およびマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が含まれる。タンパク質タグは、いくつかの周知の方法によりペプチドまたはポリペプチドに結合される。一アプローチでは、ポリペプチドまたはペプチドのコード配列は、ポリペプチドまたはペプチドと、関心がもたれるタンパク質タグとの間の融合体を生み出すベクターにクローニングすることができる。適切なベクターには、非限定的に、例示的なプラスミドｐＧＥＸ（Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway、N.J.）、ｐＥＧＦＰ（CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, Calif.）、およびｐＭＡＬ（商標）（New England BioLabs, Inc., Beverly, Mass.）が含まれる。発現に続いて、適切な固相マトリックスを用いたクロマトグラフィーにより、ホスト細胞の粗溶解液からエピトープタグまたはタンパク質タグの付いたポリペプチドまたはペプチドを精製することができる。いくつかの場合では、精製に続いてエピトープタグまたはタンパク質タグを除去する（すなわちプロテアーゼ切断による）ことが好ましい場合がある。
【００９３】
複合グリカンを製造する方法
本発明の別の局面には、ホスト細胞を提供するステップ（ここで、ホスト細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する）および融合タンパク質が発現されるようにホスト細胞を培養するステップ（ここで、融合タンパク質は、アクセプター性グリカンの末端Ｍａｎα３残基へのＮ−アセチルグルコサミンおよび末端Ｍａｎα６残基へのＮ−アセチルグルコサミンの転移を触媒して複合Ｎ−グリカンを製造する）を含む、複合Ｎ−グリカンを製造する方法が含まれる。ある態様では、この局面には、トリコデルマ属（Trichoderma）細胞においてヒト様Ｎ−グリカンを製造する方法が含まれる。
【００９４】
本明細書に使用するような、「複合Ｎ−グリカン」という用語は、末端ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３構造を含むＮ−グリカンを表す。
【００９５】
複合Ｎ−グリカンには、式［ＧｌｃＮＡｃβ２］ｚＭａｎα３（［ＧｌｃＮＡｃβ２］ｗＭａｎα６）Ｍａｎ｛β４ＧｌｃＮＡｃβ（Ｆｕｃαｘ）ｎ［４ＧｌｃＮＡｃ］ｍ｝ｐ（式中、ｎ、ｍ、およびｐは、０または１であり、分子の部分の存在または不在を示すが、但し、ｍが０の場合、ｎは０であり（フコースは、ＧｌｃＮＡｃに結合した枝である）、ｘは３または６であり、（）は構造中の枝を定義し、［］は直鎖配列中に存在するかまたは不在のグリカン構造の一部を定義し、ｚおよびｗは０または１である）を有する任意のグリカンが含まれる。好ましくは、ｗおよびｚは１である。ある態様では、複合Ｎ−グリカンには、
ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ、
ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ、
ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃ、
ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃ、および
Ｍａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ
が含まれる。ある態様では、複合Ｎ−グリカンは、真菌非フコシル化ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３、および／またはＭａｎ３である。
【００９６】
ある態様では、複合Ｎ−グリカンを製造する方法は、異なるグリカンの混合物を産生する。複合Ｎ−グリカンは、そのようなグリカン混合物の少なくとも１％、少なくとも３％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、または少なくとも７５％以上を構成しうる。
【００９７】
アクセプター性グリカン、したがって複合Ｎ−グリカンは、アミノ酸、ペプチド、またはポリペプチドなどの分子に結合している場合がある。ある態様では、アミノ酸誘導体は、アスパラギン残基である。アスパラギン残基は、側鎖アミドからのアミノグリコシド結合（生物学的哺乳動物ポリペプチドＮ−グリカン結合構造）の場合があり、ジペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドなどのペプチド鎖の部分の場合がある。グリカンは、還元末端誘導体、例えば還元性ＧｌｃＮＡｃまたはＭａｎのＮ、Ｏ、またはＣ結合型誘導体、好ましくはグリコシド誘導体、アミノ酸、アルキル、ヘテロアルキル、アシル、アルキルオキシ、アリール、アリールアルキル、およびヘテロアリールアルキルの群より選択される、あるグリカン結合型構造を有するスペーサーまたは末端有機残基などでありうる。スペーサーは、さらに、多価担体または固相に結合している場合がある。ある態様では、アルキル含有構造には、メチル、エチル、プロピル、およびＣ４−Ｃ２６アルキル、グリセロ脂質、リン脂質、ドリコール−リン脂質およびセラミドなどの脂質、ならびに誘導体が含まれる。還元末端は、また、第二級アミン結合または誘導体構造への還元アミノ化により誘導体化することができる。ある担体には、例えば（ポリ）ペプチド、多糖、例えばデキストラン、セルロース、アミロース、またはグリコサミノグリカンなどの生体高分子またはオリゴマー、ならびにポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド（例えばナイロンまたはポリスチレン）、ポリアクリルアミド、およびポリ乳酸を含めたプラスチック、ＰＡＭＡＭ、StarburstまたはStarfishデンドリマーなどのデンドリマー、またはポリリシンおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリアルキルグリコールなどの他の有機ポリマーまたはオリゴマーが含まれる。固相には、マイクロタイターウェル、シリカ粒子、ガラス、金属（鋼、金および銀が含まれる）、ポリスチレンまたは樹脂ビーズ、ポリ乳酸ビーズ、多糖ビーズまたは有機スペーサー含有磁気ビーズなどのポリマービーズが含まれうる。
【００９８】
ある態様では、アクセプター性グリカンは、異種ポリペプチドに結合している。ある態様では、異種ポリペプチドは、治療用タンパク質である。治療用タンパク質には、モノクローナル抗体、エリスロポエチン、インターフェロン、成長ホルモン、酵素、または凝固因子が含まれる場合があり、治療用タンパク質は、ヒトまたは動物の処置に有用でありうる。例えば、アクセプター性グリカンは、リツキシマブなどの治療用タンパク質に結合している場合がある。
【００９９】
アクセプター性グリカンは、「本発明のリコンビナントタンパク質」という標題の節に記載された任意のアクセプター性グリカンでありうる。
【０１００】
ある態様では、アクセプター性グリカンは、Ｍａｎ５でありうる。そのような態様では、ランダム組み込みを用いて、またはＭａｎ５グリコシル化に影響しないことが知られている公知の部位へのターゲット組み込みによって、Ｍａｎ５発現性T. reesei株にＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ融合酵素をトランスフォーメーションする。ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５を生成する株を選択する。選択された株に、さらに、Ｍａｎ５構造を切断することができるマンノシダーゼＩＩ型マンノシダーゼの触媒ドメインをトランスフォーメーションする。ある態様では、マンノシダーゼＩＩ型酵素はグリコシドヒドロラーゼファミリー３８（cazy.org/GH38_all.html）に属する。特徴づけられた酵素には、cazy.org/GH38_characterized.htmlに列挙された酵素が含まれる。特に有用な酵素は、サブファミリーα−マンノシダーゼＩＩ（Ｍａｎ２Ａ１；ＭａｎＡ２）の酵素のような、糖タンパク質を切断するゴルジ型酵素である。そのような酵素の例には、ヒト酵素ＡＡＣ５０３０２、ドロソフィラ・メラノガスター（D. melanogaster）酵素（Van den Elsen J.M. et al (2001) EMBO J. 20: 3008-3017）、ＰＤＢ参照名１ＨＴＹに従う３Ｄ構造を有する酵素、およびＰＤＢにおいて触媒ドメインで参照された他の酵素が含まれる。細胞質での発現のために、マンノシダーゼの触媒ドメインは、典型的にはＮ末端ターゲティングペプチドと融合されるか、または動物もしくは植物マンノシダーゼＩＩ酵素の内因性動物もしくは植物ゴルジ体ターゲティング構造と共に発現される。マンノシダーゼＩＩ型マンノシダーゼの触媒ドメインをトランスフォーメーション後に、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３を効率的に製造している株を選択する。
【０１０１】
ホスト細胞
複合Ｎ−グリカンを製造する方法は、ホスト細胞を提供する第１のステップを含む。核酸配列をトランスフォーメーション後に生存性を維持する限り、任意の原核または真核ホスト細胞を本発明に使用することができる。好ましくは、ホスト細胞は、必要な核酸配列のトランスダクション、その後のリコンビナントタンパク質の発現、または生じた中間体によって不利に影響されない。適切な真核細胞には、非限定的に、真菌、植物、昆虫または哺乳動物細胞が含まれる。
【０１０２】
ある態様では、ホストは真菌株である。本明細書に使用するような「真菌」には、門嚢菌門（Ascomycota）、担子菌門（Basidiomycota）、ツボカビ門（Chytridiomycota）、および接合菌門（Zygomycota）（Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UKにより定義されている）ならびに卵菌（Oomycota）（Hawksworth et al., 1995、上記、１７１ページに引用されている）ならびに全ての栄養胞子形成菌（Hawksworth et al., 1995、上記）が含まれる。
【０１０３】
特定の態様では、真菌ホストは酵母株である。本明細書に使用するような「酵母」には、子嚢菌酵母（Endomycetales）、担子菌酵母、および不完全菌に属する酵母（Blastomycetes）が含まれる。酵母の分類が将来変わるおそれがあるので、本発明のために、酵母をBiology and Activities of Yeast（Skinner, F. A., Passmore, S. M., and Davenport, R. R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980）に記載されているように定義するものとする。
【０１０４】
ある態様では、酵母ホストは、カンジダ属（Candida）、ハンセヌラ属（Hansenula）、クリヴェロマイセス属（Kluyveromyces）、ピキア属（Pichia）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、またはヤロウイア属（Yarrowia）株である。
【０１０５】
ある態様では、酵母ホストは、サッカロミセス・セルビジエ（Saccharomyces cerevisiae）、クリベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、またはヤロウイア属（Yarrowia）である。
【０１０６】
別の特定の態様では、真菌ホスト細胞は糸状菌株である。「糸状菌」には、全ての糸状形態の亜門EumycotaおよびOomycota（Hawksworth et al., 1995、上記によって定義されている）が含まれる。糸状菌は、一般に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複合多糖から構成される菌糸体壁によって特徴づけられる。栄養成長は菌糸の伸長によるものであり、炭素異化は偏性好気性である。対照的に、サッカロミセス・セルビジエ（Saccharomyces cerevisiae）などの酵母による栄養成長は、単細胞性葉状体の出芽によるものであり、炭素異化は発酵によるものでありうる。
【０１０７】
糸状菌ホスト細胞は、例えば、アクレモニウム属（Acremonium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、フザリウム属（Fusarium）、ヒュミコラ属（Humicola）、ムコール属（Mucor）、ミセリオフソラ属（Myceliophthora）、ニューロスポラ属（Neurospora）、ペニシリウム属（Penicillium）、スキタリジウム属（Scytalidium）、チエラビア属（Thielavia）、トリポクラジウム属（Tolypocladium）、またはトリコデルマ属（Trichoderma）株でありうる。
【０１０８】
ある態様では、糸状菌ホスト細胞は、トリコデルマ属種（Trichoderma sp.）、アクレモニウム属（Acremonium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、アウレオバシジウム属（Aureobasidium）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、クリソスポリウムス属（Chrysosporium）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、フィリバシジウム属（Filibasidium）、フザリウム属（Fusarium）、ジベレラ属（Gibberella）、マグナポルテ属（Magnaporthe）、ムコール属（Mucor）、ミセリオフソラ属（Myceliophthora）、ミロセシウム属（Myrothecium）、ネオカリマスティクス属（Neocallimastix）、ニューロスポラ属（Neurospora）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、ペニシリウム属（Penicillium）、ピロミセス属（Piromyces）、シゾフィラム属（Schizophyllum）、タラロミセス属（Talaromyces）、サーモアスカス属（Thermoascus）、チエラビア属（Thielavia）、またはトリポクラジウム属（Tolypocladium）株である。
【０１０９】
ある態様では、ホスト細胞は哺乳動物細胞である。そのような細胞は、ヒトまたは非ヒト細胞でありうる。
【０１１０】
他のある態様では、ホスト細胞は、原核性であり、ある態様では、その原核生物は、エシェリキア・コリ（E. coli）、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）、クロストリジウム種（Clostridium sp.）、クロストリジウム・フィトフェルメンタス（Clostridium phytofermentans）、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）、クロストリジウム・ベイジェリンキイ（Clostridium beijerinckii）、クロストリジウム・アセトブチリカム（モーレラ・サーモアセティカ）（Clostridium acetobutylicum（Moorella thermoacetica)）、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Thermoanaerobacterium saccharolyticum）、またはクレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）である。他の態様では、原核ホスト細胞は、カルボキシドセラカルボキシドセラ種（Carboxydocella sp.）、コルネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、エンテロバクテリアセエ科（Enterobacteriaceae）、エルウィニア・クリサンテミ（Erwinia chrysanthemi）、ラクトバチルス種（Lactobacillus sp.）、ペディオコッカス・アシヂラクティシ（Pediococcus acidilactici）、ロドシュードモナス・カプスラタ（Rhodopseudomonas capsulata）、ストレプトコッカス・ラクティス（Streptococcus lactis）、ビブリオ・ファーニシイ（Vibrio furnissii）、ビブリオ・ファーニシイＭ１（Vibrio furnissii M1）、カルディセルロシルブター・サッカロリティカス（Caldicellulosiruptor saccharolyticus）、またはザントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）である。他の態様では、ホスト細胞はシアノバクテリアである。細菌ホスト細胞の追加的な例には、非限定的に、エシェリキア属（Escherichia）、エンテロバクター属（Enterobacter）、アゾトバクター属（Azotobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、バチルス属（Bacillus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、クレブシエラ属（Klebsiella）、プロテウス属（Proteus）、サルモネラ属（Salmonella）、セラチア属（Serratia）、シゲラ属（Shigella）、リゾビア属（Rhizobia）、ビトレシラ属（Vitreoscilla）、シネココックス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、およびパラコッカス属（Paracoccus）分類網に割当てられる種が含まれる。
【０１１１】
複合Ｎ−グリカンを製造するための本発明の方法において、その方法は、融合タンパク質が発現されるようにホスト細胞を培養するステップを含む。微生物ホストについて、このプロセスは、細胞を適切な培地中で培養することを必要とする。典型的には、細胞は適切な培地中で３５℃で成長される。本発明におけるある成長培地には、例えば、Luria-Bertani（ＬＢ）ブロス、Sabouraudデキストロース（ＳＤ）ブロスまたは酵母培地（ＹＭ）ブロスなどの一般的な市販の調製済み培地が含まれる。他の限定成長培地または合成成長培地も使用することができ、特定のホスト細胞の成長に適切な培地は、微生物学または発酵科学の技術者に公知である。成長に適切な温度範囲および他の条件は、当技術分野において公知である（例えば、Bailey and Ollis 1986参照）。ある態様では、細胞培養物のｐＨは３．５から７．５の間、４．０から７．０の間、４．５から６．５の間、５から５．５の間、または５．５である。
【０１１２】
複合Ｎ−グリカンを製造する方法に使用されるホスト細胞は、「発明のリコンビナントタンパク質」という標題の節に記載された任意の本発明のリコンビナントタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する。ある態様では、ホスト細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有し、ここで、融合タンパク質は、アクセプター性グリカンの末端Ｍａｎα３残基へのＮ−アセチルグルコサミンおよび末端Ｍａｎα６残基へのＮ−アセチルグルコサミンの転移を触媒して複合Ｎ−グリカンを製造する。
【０１１３】
ある態様では、ホスト細胞は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードするポリヌクレオチドを含有する。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードするポリヌクレオチドは、ホスト細胞に内因性（すなわち、自然に存在する）であってもよく、またはそのポリヌクレオチドは、ホスト細胞に異種であってもよい。
【０１１４】
ある態様では、ホスト細胞は、α−１，２−マンノシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含有する。α−１，２−マンノシダーゼをコードするポリヌクレオチドは、ホスト細胞に内因性であってもよく、またはそのポリヌクレオチドは、ホスト細胞に異種であってもよい。これらのポリヌクレオチドは、効率的なエキソ−α−２−マンノシダーゼ切断をされずにゴルジ体からＥＲに移行した高マンノースグリカンを発現しているホスト細胞に特に有用である。α−１，２−マンノシダーゼは、グリコシドヒドロラーゼファミリー４７（cazy.org/GH47_all.html）に属するマンノシダーゼＩ型酵素でありうる。ある態様では、α−１，２−マンノシダーゼは、cazy.org/GH47_characterized.htmlに列挙された酵素である。特に、α−１，２−マンノシダーゼは、ＥＲ性α−マンノシダーゼＩ ＥＣ３．２．１．１１３酵素サブファミリー中の酵素などの、糖タンパク質を切断するＥＲ型酵素でありうる。そのような酵素の例には、ヒトα−２−マンノシダーゼ１Ｂ（ＡＡＣ２６１６９）、哺乳動物ＥＲマンノシダーゼの組み合わせ、またはα−１，２−マンノシダーゼ（ＭＤＳ１）などの糸状菌酵素が含まれる（T. reesei ＡＡＦ３４５７９；Maras M et al J Biotech. 77, 2000, 255）。細胞質発現のために、マンノシダーゼの触媒ドメインは、典型的には、ＨＤＥＬ、ＫＤＥＬ、またはＥＲタンパク質もしくは初期ゴルジ体タンパク質の部分などのターゲティングペプチドと融合されるか、あるいは動物または植物マンノシダーゼＩ酵素の内因性ＥＲターゲティング構造と共に発現される。
【０１１５】
ある態様では、ホスト細胞は、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含有する。ガラクトシルトランスフェラーゼは、末端Ｎ−アセチルグルコサミニル残基にβ−結合型ガラクトシル残基を転移する。ある態様では、ガラクトシルトランスフェラーゼはβ−４−ガラクトシルトランスフェラーゼである。一般に、β−４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、ＣＡＺｙグリコシルトランスフェラーゼファミリー７に属し（cazy.org/GT7_all.html）、これには、Ｎ−アセチルラクトサミンシンターゼ（ＥＣ２．４．１．９０）としても知られている、β−Ｎ−アセチルグルコサミニル−グリコペプチドβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．３８）が含まれる。有用なサブファミリーには、β４−ＧａｌＴ１、β４−ＧａｌＴ−ＩＩ、−ＩＩＩ、−ＩＶ、−Ｖ、および−ＶＩ、例えば哺乳動物もしくはヒトβ４−ＧａｌＴＩもしくはβ４ＧａｌＴ−ＩＩ、−ＩＩＩ、−ＩＶ、−Ｖ、および−ＶＩ、またはその任意の組み合わせが含まれる。β４−ＧａｌＴ１、β４−ＧａｌＴＩＩ、またはβ４−ＧａｌＴＩＩＩは、特に、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３、またはＧｌｃＮＡｃＭａｎ５などのＮ−グリカン上の末端ＧｌｃＮＡｃβ２構造のガラクトシル化にとって有用である（Guo S. et al. Glycobiology  2001, 11:813-20）。触媒領域の三次元構造が公知であり（例えば(2006) J.Mol.Biol. 357: 1619-1633）、その構造は、ＰＤＢデータベース中にコード２ＦＹＤで描写されている。ＣＡＺｙデータベースは、ある種の酵素の例を含んでいる。特徴づけられた酵素もまた、cazy.org/GT7_characterized.htmlのＣＡＺｙデータベース中に列挙されている。有用なβ４ＧａｌＴ酵素の例には、β４ＧａｌＴ１、例えばウシBos taurus酵素ＡＡＡ３０５３４．１（Shaper N.L. et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83 (6), 1573-1577 (1986)）、ヒト酵素（Guo S. et al. Glycobiology  2001, 11:813-20）、およびMus musculus酵素ＡＡＡ３７２９７（Shaper, N.L. et al. 1998 J. Biol. Chem. 263 (21), 10420-10428）；β４ＧａｌＴＩＩ酵素、例えばヒトβ４ＧａｌＴＩＩ ＢＡＡ７５８１９．１、チャイニーズハムスターCricetulus griseus ＡＡＭ７７１９５、Mus musculus酵素ＢＡＡ３４３８５、およびニホンメダカOryzias latipes ＢＡＨ３６７５４；ならびにβ４ＧａｌＴＩＩＩ酵素、例えばヒトβ４ＧａｌＴＩＩＩ ＢＡＡ７５８２０．１、チャイニーズハムスターCricetulus griseus ＡＡＭ７７１９６およびMus musculus酵素ＡＡＦ２２２２１が含まれる。
【０１１６】
ガラクトシルトランスフェラーゼは、ホスト細胞の細胞質中に発現されうる。Schwientek J.Biol. Chem 1996 3398に記載されたＫｒｅ２ペプチドなどの異種ターゲティングペプチドを使用することができる。ガラクトシルトランスフェラーゼの発現のために使用することができるプロモーターには、ｇｐｄなどの構成的プロモーター、ゴルジ体またはＥＲでＮ−グリカンを合成する内因性グリコシル化酵素およびマンノシルトランスフェラーゼなどのグリコシルトランスフェラーゼのプロモーター、ならびにｃｂｈ１プロモーターなどの高収量内因性タンパク質の誘導性プロモーターが含まれる。
【０１１７】
ホスト細胞がガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含有する本発明のある態様では、ホスト細胞は、ＵＤＰ−Ｇａｌおよび／またはＵＤＰ−Ｇａｌトランスポーターをコードするポリヌクレオチドも含有する。ホスト細胞がガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含有する本発明のある態様では、ホスト細胞を培養する場合にグルコースの代わりにラクトースを炭素源として使用してもよい。培地は、ｐＨ４．５から７．０の間または５．０から６．５の間でありうる。ホスト細胞が、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドおよびＵＤＰ−Ｇａｌおよび／またはＵＤＰ−Ｇａｌトランスポーターをコードするポリヌクレオチドを含有する本発明のある態様では、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋またはＭｇ２＋などの二価陽イオンが細胞培養培地に添加される場合がある。
【０１１８】
ある態様では、ホスト細胞は、シアリルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含有する。シアリルトランスフェラーゼは、Ｎｅｕ５Ａｃなどのα３−またはα６−結合型シアル酸をガラクトシル化複合グリカンの末端Ｇａｌに転移する。適切なシアリルトランスフェラーゼの例は、グリコシル化タンパク質ファミリー２９（cazy.org/GT29.html）から見出すことができる。有用なα３−またはα６−シアリルトランスフェラーゼには、特定のサブファミリーＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを有するβ−ガラクトシドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．１）、およびβ−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．４）との交差反応性がありうるＮ−アセチルラクトサミニドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）が含まれる。有用なサブタイプのα３−シアリルトランスフェラーゼには、ＳＴ３Ｇａｌ−ＩＩＩおよびＳＴ３Ｇａｌ−ＩＶが含まれる。これらのうち、ある酵素学的に特徴づけられた種は、グリコシル化酵素のＣＡＺｙデータベースに特徴づけられたように列挙されている（cazy.org/GT29_characterized.html）。α３−またはα６−結合型シアリルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドは、ホスト細胞に内因性であってもよく、またはホスト細胞に異種であってもよい。ホスト細胞でのシアリル化は、特に真菌、植物、線虫／寄生虫、または昆虫細胞における、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃなどのドナーＣＭＰ−シアル酸を合成する酵素の発現を必要としうる。
【０１１９】
ホスト細胞は、増加または低下した活性レベルの様々な内因性酵素を有しうる。低下した活性レベルは、阻害剤、抗体などを用いて内因性酵素の活性を阻害することにより提供されうる。ある態様では、ホスト細胞は、様々な内因性酵素の活性を増加または低下するやり方で遺伝的に改変される。「遺伝的に改変」は、ポリペプチドを増加したレベルで、低下したレベルで、または突然変異した形態で発現する原核または真核ホスト細胞を生み出すために使用される任意のリコンビナントＤＮＡまたはＲＮＡ法を表す。言い換えると、リコンビナントポリヌクレオチド分子がホスト細胞にトランスフェクション、トランスフォーメーション、またはトランスダクションされ、その結果、所望のタンパク質の発現を変更するように、その細胞は変更されている。
【０１２０】
遺伝子発現、遺伝子の機能、または遺伝子生成物（すなわち、遺伝子によってコードされるタンパク質）の機能低下を生じる遺伝的改変は、遺伝子発現の不活性化（完全または部分的）、欠失、中断、遮断、サイレンシング、またはダウンレギュレーション、または減弱と呼ぶことができる。例えば、遺伝子によりコードされるタンパク質の機能低下を生じる、そのような遺伝子における遺伝的改変は、遺伝子の完全欠失（すなわち、その遺伝子が存在しないことにより、タンパク質が存在しない）、タンパク質の不完全な翻訳もしくは無翻訳を生じる（例えば、タンパク質が発現されない）遺伝子突然変異、またはタンパク質の自然機能を低下させるもしくは打ち消す遺伝子突然変異（例えば、酵素活性もしくは作用が減少もしくは消失したタンパク質が発現される）の結果でありうる。より具体的には、本明細書に論じされたタンパク質の作用を減少させることへの参照は、一般に、タンパク質の発現および／または機能性（生物学的活性）の低下を生じる、問題となるホスト細胞における任意の遺伝的改変を表し、それには、タンパク質の活性低下（触媒作用減少）、タンパク質の阻害または分解の増加、およびタンパク質の発現の低下または消失が含まれる。例えば、本発明のタンパク質の作用または活性は、タンパク質の生成を遮断もしくは低下させること、タンパク質の作用を低下させること、またはタンパク質の作用を阻害することによって減少させることができる。これらの改変のいくつかの組み合わせも可能である。タンパク質の生成を遮断または低下させることは、そのタンパク質をコードする遺伝子を、成長培地中に誘導化合物の存在を必要とするプロモーターのコントロール下に置くことを含みうる。誘導因子が培地から枯渇するように条件を確立することによって、タンパク質をコードする遺伝子の発現（したがって、タンパク質合成）を止めることができよう。タンパク質の作用を遮断または低下させることは、また、米国特許第４，７４３，５４６号に記載の技法に類似した切り出し技法のアプローチを使用することを含む場合がある。このアプローチを使用するために、関心がもたれるタンパク質をコードする遺伝子が特異的遺伝子配列の間にクローニングされ、ゲノムからの遺伝子の特異的でコントロールされた切り出しが可能になる。切り出しは、例えば、米国特許第４，７４３，５４６号のように培養物の培養温度の変化によって、または何か他の物理学的もしくは栄養学的シグナルによって促進することができよう。
【０１２１】
一般に、本発明によると、突然変異タンパク質または改変タンパク質の所与の特徴（例えば酵素活性）における増加または減少は、同じ生物から（同じ起源または親配列から）得られた野生型（すなわち正常な未改変）タンパク質の同じ特徴に関して起こり、その特徴は、同じまたは等価の条件下で測定または達成される。同様に、遺伝的に改変されたホスト細胞の特徴（例えば、タンパク質の発現および／もしくは生物学的活性、または生成物の生成）における増加または減少は、同種の、好ましくは同株の、野生型ホスト細胞の同じ特徴に関して、同じまたは等価の条件下で起こる。そのような条件には、タンパク質の活性（例えば、発現もしくは生物学的活性）またはホスト細胞の他の特徴が測定されるアッセイ条件または培養条件（例えば培地組成、温度、ｐＨなど）、および使用されるアッセイの種類、評価されるホスト細胞などが含まれる。上述のように、等価の条件は、類似であるが、必ずしも同一ではなく（例えば、条件における幾分の保守的変化を許容することができる）、同条件下で行われた比較に比べて、細胞成長または酵素発現または生物学的活性に及ぼす作用を実質的には変化しない条件（例えば培養条件）である。
【０１２２】
好ましくは、所与のタンパク質（例えば酵素）の活性を増加または減少させる遺伝的改変を有する、遺伝的に改変されたホスト細胞は、それぞれ、野生型ホスト細胞における野生型タンパク質の活性に比べて、タンパク質の活性または作用（例えば、発現、生成および／または生物学的機能）の少なくとも約５％、より好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約３５％、より好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約４５％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約５５％、より好ましくは  少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、または５％から１００％の間の全整数での任意のパーセンテージ（例えば、６％、７％、８％など）の増加または減少を有する。単離された改変核酸分子またはタンパク質を単離された野生型核酸分子またはタンパク質と直接比較する場合（例えば、in vitroとin vivoの比較を行う場合）、同じ差異が確実である。
【０１２３】
本発明の別の局面では、所与のタンパク質（例えば酵素）の活性を増加または減少させる遺伝的改変を有する、遺伝的に改変されたホスト細胞は、それぞれ、野生型ホスト細胞における野生型タンパク質の活性に比べて、タンパク質の活性または作用（例えば、発現、生成および／または生物学的活性）の少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍、より好ましくは約２０倍、より好ましくは少なくとも約３０倍、より好ましくは少なくとも約４０倍、より好ましくは少なくとも約５０倍、より好ましくは少なくとも約７５倍、より好ましくは少なくとも約１００倍、より好ましくは少なくとも約１２５倍、より好ましくは少なくとも約１５０倍、または少なくとも約２倍から始まる任意の全整数変化分（例えば、３倍、４倍、５倍、６倍など）の増加または減少を有する。
【０１２４】
ある態様では、ホスト細胞は、野生型ホスト細胞における活性レベルに比べて、低下した活性レベルのドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ（５）ＧｌｃＮＡｃ（２）−ＰＰ−ドリキルマンノシルトランスフェラーゼを有する。ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ（５）ＧｌｃＮＡｃ（２）−ＰＰ−ドリキルマンノシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１３０）は、α−Ｄ−マンノシル残基をドリキル−リン酸Ｄ−マンノースから膜脂質結合型オリゴ糖に転移する。典型的には、ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ（５）ＧｌｃＮＡｃ（２）−ＰＰ−ドリキルマンノシルトランスフェラーゼ酵素は、ａｌｇ３遺伝子によってコードされる。ある態様では、ホスト細胞は、野生型ホスト細胞における発現レベルに比べて低下した発現レベルのａｌｇ３遺伝子を有する。ある態様では、ａｌｇ３遺伝子は、ホスト細胞から欠失されている。
【０１２５】
ある態様では、ホスト細胞は、野生型ホスト細胞における活性レベルに比べて低下した活性レベルのα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼを有する。α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．２３２）は、α−Ｄ−マンノシル残基をＧＤＰ−マンノースからタンパク質結合型オリゴ糖に転移し、ゴルジ装置でα−（１→６）−Ｄ−マンノシル−Ｄ−マンノース結合を引き起こす伸長を形成する。典型的には、α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ酵素は、ｏｃｈ１遺伝子によってコードされる。ある態様では、ホスト細胞は、野生型ホスト細胞における発現レベルに比べて低下した発現レベルのｏｃｈ１遺伝子を有する。ある態様では、ｏｃｈ１遺伝子はホスト細胞から欠失されている。
【０１２６】
ある態様では、ホスト細胞は、低下したレベルのプロテアーゼ活性を有する。ある態様では、様々なプロテアーゼをコードする遺伝子が、ホスト細胞から欠失されている。これらの遺伝子には、例えば、ｐｅｐ１（アスペルギルス属（Aspergillus）でのｐｅｐＡ）などのプロテアーゼおよびセロビオヒドロラーゼ１（ｃｂｈ１）などのセルロース分解酵素をコードする遺伝子が含まれる。
【０１２７】
ある態様では、ホスト細胞は、相同組み換えの効率を高めるために、低下した活性レベルの非相同末端結合（ＮＨＥＪ）関連タンパク質を有しうる。ある態様では、これらのタンパク質をコードする遺伝子は、ホスト細胞から欠失されている。遺伝子およびそれらのホモログには、非限定的に、例えばNinomiyaら（2004）、Ishibashiら（2006）、Villalbaら（2008）、およびMizutaniら（2008）に記載されているようなＫｕ７０、Ｋｕ８０、Ｌｉｇ４、Ｒａｄ５０、Ｘｒｓ２、Ｓｉｒ４、Ｌｉｆｌ、またはＮｅｉｌが含まれる。
【０１２８】
複合Ｎ−グリカンを製造する方法のある態様では、ホスト細胞は、野生型トリコデルマ属（Trichoderma）細胞における活性レベルに比べて低下した活性レベルのドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ（５）ＧｌｃＮＡｃ（２）−ＰＰ−ドリキルマンノシルトランスフェラーゼを有するトリコデルマ属（Trichoderma）細胞である。
【０１２９】
複合Ｎ−グリカンを製造する方法の他のある態様では、ホスト細胞は、野生型酵母細胞における活性レベルに比べて低下した活性レベルのドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ（５）ＧｌｃＮＡｃ（２）−ＰＰ−ドリキルマンノシルトランスフェラーゼおよび低下した活性レベルのα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼを有する酵母細胞であって、さらに、α−１，２−マンノシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含む酵母細胞である。
【０１３０】
複合Ｎ−グリカンをin vitro製造する方法
別の局面では、本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを含む融合タンパク質、アクセプター性グリカン、ならびにＮ−アセチルグルコサミンドナーを一緒に緩衝液中でインキュベーションするステップを含む、複合Ｎ−グリカンを製造する方法を提供し、ここで、融合タンパク質は、アクセプター性グリカンの末端Ｍａｎα３残基へのＮ−アセチルグルコサミンの転移および末端Ｍａｎα６残基へのＮ−アセチルグルコサミンの転移を触媒して複合Ｎ−グリカンを製造する。ある態様では、アクセプター性グリカンは、アミノ酸、ペプチド、またはポリペプチドに結合している。ある態様では、アクセプター性グリカンは、異種ポリペプチドに結合している。ある態様では、アクセプター性グリカンはＭａｎ３である。ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミンドナーは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターである。典型的には、緩衝液は、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、またはＭｇ２＋などの二価陽イオンを濃度１μM〜１００mM、１００μM〜５０mM、または０．１mM〜２５mMの濃度で含有する。Ｎ−アセチルグルコサミン性ドナーは、典型的には、アクセプター性グリカン上の反応性アクセプター部位に関して１．１〜１００倍過剰などのモル過剰で使用される。アクセプター性グリカンの濃度は、典型的には、１μMから１００mM、１００μMから５０mM、または１から２５mMの間である。アクセプター性グリカンがポリペプチドに結合している場合、分子量がより高くなることから、その濃度範囲は典型的には下限にある。反応成分の濃度は、緩衝液中のそれらの溶解度に基づき調整することができる。酵素活性の量（ユニット）は、妥当な反応時間内に効率的な反応が可能になるように調整することができる。妥当な反応時間は、典型的には数分〜数日である。ある態様では、反応時間は、約０．５時間〜１日または１〜６時間であろう。
【０１３１】
有用な緩衝液には、約５〜８．５、５．５．〜８．０、または６．０および７．５のｐＨ範囲のＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳなどの、融合タンパク質に適切な緩衝液が含まれる。典型的には、ＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳ、またはＭＯＰＳ緩衝液の濃度は、ｐＨを維持するために調整された、５から１５０mMの間、１０から１００mMの間、または１０から６０mMの間であろう。反応は、１０〜２００mMのＮａＣｌなどの塩および／または酵素を安定化するがグリコシル化できないタンパク質（例えば、純粋な非グリコシル化アルブミンまたはアクセプター性グリカン不含アルブミン）を添加することによって最適化することができる。特定の一態様では、in vitro反応は、細胞培養培地中で行われるように調整される。反応速度を低下させるために、リン酸緩衝液を使用してもよい。
【０１３２】
Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを製造するための細胞および方法
別の局面では、本発明は、ａｌｇ３突然変異およびＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を含有する糸状菌細胞を提供し、ここで、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２には、細胞によって分泌される中性Ｎ−グリカンの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％（mol％）が含まれる。中性Ｎ−グリカンは、アミノ酸、ペプチド、またはポリペプチドに結合している場合がある。ａｌｇ３遺伝子は、点突然変異またはａｌｇ３遺伝子全体の欠失などの、当技術分野で公知の任意の手段により突然変異誘発することができる。好ましくは、ａｌｇ３タンパク質の機能は、ａｌｇ３突然変異により低下または消失している。糸状菌細胞は、アクレモニウム属（Acremonium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、アウレオバシジウム属（Aureobasidium）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、クリソスポリウムス属（Chrysosporium）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、フィリバシジウム属（Filibasidium）、 フザリウム属（Fusarium）、ジベレラ属（Gibberella）、ヒュミコラ属（Humicola）、マグナポルテ属（Magnaporthe）、ムコール属（Mucor）、ミセリオフソラ属（Myceliophthora）、ミロセシウム属（Myrothecium）、ネオカリマスティクス属（Neocallimastix）、ニューロスポラ属（Neurospora）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、ペニシリウム属（Penicillium）、ピロミセス属（Piromyces）、シゾフィラム属（Schizophyllum）、スキタリジウム属（Scytalidium）、タラロミセス属（Talaromyces）、サーモアスカス属（Thermoascus）、チエラビア属（Thielavia）、トリポクラジウム属（Tolypocladium）、またはトリコデルマ属（Trichoderma）細胞でありうる。ある態様では、糸状菌細胞はT. reesei細胞である。ある態様では、糸状菌細胞は、さらに、任意の本発明のリコンビナントタンパク質をコードする一つまたは複数のポリヌクレオチドを含有する。例えば、糸状菌細胞は、さらに、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインをコードする第１のポリヌクレオチドおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインをコードする第２のポリヌクレオチドを含有しうる。または、糸状菌細胞は、さらに、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有しうる。
【０１３３】
なお別の局面では、本発明は、ホスト細胞においてＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを製造する方法であって、野生型ホスト細胞における活性レベルに比べて低下した活性レベルのマンノシルトランスフェラーゼを有するホスト細胞を提供するステップ、およびホスト細胞を培養してＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを製造するステップを含む方法を提供し、ここで、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンは、ホスト細胞により分泌される中性Ｎ−グリカンの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％（mol％）を構成する。
【０１３４】
Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンは、アミノ酸、ペプチド、またはポリペプチドなどの分子に結合している場合がある。ある態様では、アミノ酸はアスパラギン残基である。アスパラギン残基は、側鎖アミドからアミノグリコシド結合している場合があり（生物学的哺乳動物タンパク質Ｎ−グリカン結合構造）、ジペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドなどのペプチド鎖の部分でありうる。グリカンは、還元末端誘導体、例えば還元性ＧｌｃＮＡｃまたはＭａｎのＮ、Ｏ、またはＣ結合型誘導体、好ましくはグリコシド誘導体、アミノ酸、アルキル、ヘテロアルキル、アシル、アルキルオキシ、アリール、アリールアルキル、およびヘテロアリールアルキルの群より選択される、あるグリカン結合型構造を有するスペーサーまたは末端有機残基などでありうる。スペーサーは、さらに、多価担体または固相に結合している場合がある。ある態様では、アルキル含有構造には、メチル、エチル、プロピル、およびＣ４−Ｃ２６アルキル、グリセロ脂質、リン脂質、ドリコール−リン脂質およびセラミドなどの脂質ならびに誘導体が含まれる。還元末端は、また、第二級アミン結合または誘導体構造への還元的アミノ化により誘導体化することができる。特定の担体には、（ポリ）ペプチド、多糖、例えばデキストラン、セルロース、アミロース、またはグリコサミノグリカンなどの生体高分子またはオリゴマー、ならびにポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド（例えば、ナイロンもしくはポリスチレン）、ポリアクリルアミド、およびポリ乳酸を含めたプラスチック、ＰＡＭＡＭ、StarburstもしくはStarfishデンドリマーなどのデンドリマー、またはポリリシン、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリアルキルグリコールなどの他の有機ポリマーまたはオリゴマーが含まれる。固相には、マイクロタイターウェル、シリカ粒子、ガラス、金属（鋼、金および銀が含まれる）、ポリマービーズ、例えばポリスチレンまたは樹脂ビーズ、ポリ乳酸ビーズ、多糖ビーズまたは有機スペーサー含有磁気ビーズが含まれうる。
【０１３５】
ある態様では、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンは、異種ポリペプチドに結合している。ある態様では、異種ポリペプチドは、治療用タンパク質である。治療用タンパク質には、モノクローナル抗体、エリスロポイエチン、インターフェロン、成長ホルモン、酵素、または凝固因子が含まれる場合があり、治療用タンパク質は、ヒトまたは動物の処置に有用でありうる。例えば、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンは、リツキシマブなどの治療用タンパク質に結合している場合がある。典型的には、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンは、さらに改変されて複合グリカンになる。そのような改変は、ホスト細胞においてin vivoで、またはin vitro法により行われうる。
【０１３６】
ある態様では、マンノシルトランスフェラーゼは、ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ（５）ＧｌｃＮＡｃ（２）−ＰＰ−ドリキルマンノシルトランスフェラーゼである。典型的には、ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ（５）ＧｌｃＮＡｃ（２）−ＰＰ−ドリキルマンノシルトランスフェラーゼ酵素は、ａｌｇ３遺伝子によりコードされる。ある態様では、ホスト細胞は、野生型ホスト細胞における発現レベルに比べて低下した発現レベルのａｌｇ３遺伝子を有する。ある態様では、ａｌｇ３遺伝子は、ホスト細胞から欠失されている。配列番号９７および９８は、それぞれ、T. reeseiにおけるａｌｇ３遺伝子の核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。
【０１３７】
ある態様では、ホスト細胞におけるα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼの活性レベルは、野生型ホスト細胞における活性レベルに比べて低下していない。典型的には、α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ酵素は、ｏｃｈ１遺伝子によりコードされる。ある態様では、ホスト細胞は、α−１，２−マンノシダーゼをコードする内因性ポリヌクレオチドを含有する。
【０１３８】
ある態様では、ホスト細胞はトリコデルマ属（Trichoderma）細胞であり、ある態様では、ホスト細胞はトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）細胞である。
【０１３９】
発明の糸状菌細胞
さらなる一局面では、本発明は、野生型糸状菌細胞におけるａｌｇ３遺伝子の発現レベルに比べて低下した発現レベルの本発明のａｌｇ３遺伝子を有する糸状菌細胞を提供し、ここで、その糸状菌細胞は、「発明のリコンビナントタンパク質」という標題の節に記載されたような任意の本発明のリコンビナントタンパク質も含有する。例えばある態様では、糸状菌細胞は、さらに、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する。融合タンパク質の発現は、ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターによってコントロールされうる。プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターでありうる。ある好ましい態様では、プロモーターは、ｃｂｈ１誘導性プロモーターなどの誘導性プロモーターである。
【０１４０】
別の局面では、本発明は、野生型糸状菌細胞におけるａｌｇ３遺伝子の発現レベルに比べて低下した発現レベルの本発明のａｌｇ３遺伝子を有する糸状菌細胞を提供し、ここで、糸状菌細胞は、また、リコンビナントＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインをコードする第１のポリヌクレオチドおよびリコンビナントＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインをコードする第２のポリヌクレオチドを含有する。そのような態様では、リコンビナントＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインの発現は、第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターによりコントロールされ、リコンビナントＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインの発現は、第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターによりコントロールされる。プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターでありうる。特定の好ましい態様では、プロモーターは、ｃｂｈ１誘導性プロモーターなどの誘導性プロモーターである。
【０１４１】
他の態様では、リコンビナントＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインおよびリコンビナントＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインが別々のポリペプチドとして発現されるように、単一のポリヌクレオチドが、それらのドメインの両方をコードしうる。そのような態様では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドからの各触媒ドメインの別々の翻訳を可能にする配列内リボソーム進入部位を含有しうる。そのような態様では、リコンビナントＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインの発現は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドの部分に作動可能に連結されたプロモーターによってコントロールされ、リコンビナントＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインの発現は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドの部分に作動可能に連結されたプロモーターによってコントロールされる。プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターでありうる。ある好ましい態様では、プロモーターは、ｃｂｈ１誘導性プロモーターなどの誘導性プロモーターである。
【０１４２】
本明細書に開示するようなＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｌｃＮＡｃ−ＴＩ；ＧｎＴＩ；ＥＣ２．４．１．１０１）は、反応ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン＋３−（α−Ｄ−マンノシル）−β−Ｄ−マンノシル−Ｒ⇔ＵＤＰ＋３−（２−（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニル）−α−Ｄ−マンノシル）−β−Ｄ−マンノシル−Ｒを触媒する（式中、Ｒは、グリカンアクセプター中のＮ−結合型オリゴ糖の残りを表す）。Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインは、この反応を触媒することができるＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ酵素の任意の部分である。様々な生物由来のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ酵素についてのアミノ酸配列を、配列番号１〜１９に列挙する。追加的なＧｎＴＩ酵素は、ＣＡＺｙデータベースのグリコシルトランスフェラーゼファミリー１３（cazy.org/GT13_all）に列挙されている。酵素的に特徴づけられた種には、アラビドプシス・タリアナ（A. thaliana）ＡＡＲ７８７５７．１（米国特許第６，６５３，４５９号）、カエノラブディティス・エレガンス（C. elegans）ＡＡＤ０３０２３．１（Chen S. et al J. Biol.Chem 1999;274(1):288-97）、ドロソフィラ・メラノガスター（D. melanogaster）ＡＡＦ５７４５４．１（Sarkar & Schachter Biol Chem. 2001 Feb;382(2):209-17）；クリセツルス・グリセウス（C. griseus）ＡＡＣ５２８７２．１（Puthalakath H. et al J. Biol.Chem 1996 271(44):27818-22）；ホモ・サピエンス（H. sapiens）ＡＡＡ５２５６３．１（Kumar R. et al  Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Dec;87(24):9948-52）；メラノクロミス・アウラツス（M. auratus）ＡＡＤ０４１３０．１（Opat As et al  Biochem J. 1998 Dec 15;336 (Pt 3):593-8）（非活性化突然変異体の一例を含む）、ウサギ、オリクトラグス・クニクルス（O. cuniculus）ＡＡＡ３１４９３．１（Sarkar M et al.  Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Jan 1;88(1):234-8）が含まれる。特徴づけられた活性酵素の追加的な例は、cazy.org/GT13_characterizedに見出すことができる。ウサギＧｎＴＩ触媒ドメインの３Ｄ構造は、Unligil UM et al. EMBO J. 2000 Oct 16;19(20):5269-80にＸ線結晶学によって規定された。ＧｎＴＩについてのProtein Data Bank（ＰＤＢ）構造は、１ＦＯ８、１ＦＯ９、１ＦＯＡ、２ＡＭ３、２ＡＭ４、２ＡＭ５、および２ＡＰＣである。ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインは、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ酵素（配列番号１）、またはその変異体に由来する。ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインは、配列番号１のアミノ酸残基８４〜４４５と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含有する。いくつかの態様では、より短い配列を触媒ドメインとして使用することができる（例えば、ヒト酵素のアミノ酸残基１０５〜４４５またはウサギ酵素のアミノ酸残基１０７〜４４７；Sarkar et al. (1998) Glycoconjugate J 15:193-197）。ＧｎＴＩ触媒ドメインとして使用することができる追加的な配列には、ヒト酵素のアミノ酸約３０〜４４５番のアミノ酸残基またはヒト酵素のアミノ酸残基３０〜１０５から開始しアミノ酸約４４５番まで連続する任意のＣ末端ステムドメイン、あるいは別のＧｎＴＩまたはその触媒活性変異体もしくは突然変異体の対応する相同配列が含まれる。触媒ドメインは、ステムドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞質ドメインの全てまたは部分などの、酵素のＮ末端部分を含みうる。
【０１４３】
本明細書に開示するようなＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＧｌｃＮＡｃ−ＴＩＩ；ＧｎＴＩＩ；ＥＣ２．４．１．１４３）は、反応ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン＋６−（α−Ｄ−マンノシル）−β−Ｄ−マンノシル−Ｒ⇔ＵＤＰ＋６−（２−（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニル）−α−Ｄ−マンノシル）−β−Ｄ−マンノシル−Ｒを触媒する（式中、Ｒは、グリカンアクセプター中のＮ−結合型オリゴ糖の残りを表す）。Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、この反応を触媒することができるＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ酵素の任意の部分である。様々な生物由来のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ酵素についてのアミノ酸配列を、配列番号２０〜３３に列挙する。ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ酵素（配列番号２０）、またはその変異体に由来する。追加的なＧｎＴＩＩ種は、ＣＡＺｙデータベースのグリコシルトランスフェラーゼファミリー１６に列挙されている（cazy.org/GT16_all）。酵素的に特徴づけられた種には、カエノラブディティス・エレガンス（C. elegans）、ドロソフィラ・メラノガスター（D. melanogaster）、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）、ラツス・ノルベギグス（Rattus norvegigus）、スス・スクロファ（Sus scrofa）（cazy.org/GT16_characterized）のＧｎＴＩＩが含まれる。ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、配列番号２１の約３０〜約４４７番アミノ酸残基と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含有する。触媒ドメインは、ステムドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞質ドメインの全てまたは部分などの酵素のＮ末端部分を含みうる。
【０１４４】
糸状菌細胞が本発明の融合タンパク質を含有する態様では、融合タンパク質は、さらに、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインとＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインの間にスペーサーを含有しうる。「スペーサー」という標題の節に記載されたような本発明の任意のスペーサーを使用することができる。ある好ましい態様では、スペーサーは、ＥＧＩＶスペーサー、２×Ｇ４Ｓスペーサー、３×Ｇ４Ｓスペーサー、またはＣＢＨＩスペーサーである。他の態様では、スペーサーは、ステムドメイン由来の配列を含有する。
【０１４５】
ＥＲ／ゴルジ体に発現させるために、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩおよび／またはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、典型的にはターゲティングペプチドと、またはＥＲタンパク質もしくは初期ゴルジタンパク質の一部と融合されるか、あるいは動物または植物Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ酵素の内因性ＥＲターゲティング構造と共に発現される。ある好ましい態様では、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩおよび／またはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、「ターゲティングペプチド」という標題の節に記載されたような本発明の任意のターゲティングペプチドを含有する。好ましくは、ターゲティングペプチドは、触媒ドメインのＮ末端に結合している。いくつかの態様では、ターゲティングペプチドは、「ターゲティングペプチド」という標題の節に記載されたような本発明の任意のステムドメインを含有する。ある好ましい態様では、ターゲティングペプチドはＫｒｅ２ターゲティングペプチドである。他の態様では、ターゲティングペプチドは、さらに、ステムドメインのＮ末端に結合した膜貫通ドメインまたはステムドメインのＮ末端に結合した細胞質ドメインを含有する。ターゲティングペプチドがさらに膜貫通ドメインを含有する態様では、ターゲティングペプチドは、さらに、膜貫通ドメインのＮ末端に結合した細胞質ドメインを含有しうる。
【０１４６】
本発明のａｌｇ３遺伝子の発現レベルは、非限定的にａｌｇ３遺伝子を突然変異誘発することを含めた、当技術分野で公知の任意の適切な方法により低下させることができる。ａｌｇ３は、例えば、点突然変異またはａｌｇ３遺伝子全体の欠失によって突然変異誘発することができる。好ましくは、ａｌｇ３タンパク質の機能は、ａｌｇ３の突然変異により低下または消失している。ａｌｇ３遺伝子は、ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ（５）ＧｌｃＮＡｃ（２）−ＰＰ−ドリキルα−１，３−マンノシルトランスフェラーゼをコードする。本明細書に開示されたように、本発明のドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ（５）ＧｌｃＮＡｃ（２）−ＰＰ−ドリキルマンノシルトランスフェラーゼは、α−Ｄ−マンノシル残基をドリキルリン酸Ｄ−マンノースから膜脂質結合型オリゴ糖に転移する。
【０１４７】
ある態様では、糸状菌細胞は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードするポリヌクレオチドを含有しうる。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードするポリヌクレオチドは、糸状菌細胞に内因性の（すなわち自然に存在する）場合があり、または糸状菌細胞に異種の場合がある。
【０１４８】
他の態様では、糸状菌細胞は、また、「ホスト細胞」という標題の節に記載されたような、本発明のα−１，２−マンノシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含有しうる。α−１，２−マンノシダーゼをコードするポリヌクレオチドは、糸状菌細胞に内因性の場合があり、または糸状菌細胞に異種の場合がある。これらのポリヌクレオチドは、特に、効率的なエキソ−α−２−マンノシダーゼ切断をされずにゴルジ体からＥＲに移行した高マンノース性グリカンを発現している糸状菌細胞に有用である。細胞質発現のために、マンノシダーゼの触媒ドメインは、典型的には、ＨＤＥＬ、ＫＤＥＬ、またはＥＲタンパク質もしくは初期ゴルジタンパク質の部分などのターゲティングペプチドと融合されるか、あるいは動物または植物マンノシダーゼＩ酵素の内因性ＥＲターゲティング構造と共に発現される。
【０１４９】
さらなる態様では、糸状菌細胞は、また、「ホスト細胞」という標題の節に記載されたような、本発明のガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含有しうる。ガラクトシルトランスフェラーゼは、β−結合型ガラクトシル残基を末端Ｎ−アセチルグルコサミニル残基に転移する。ある態様では、ガラクトシルトランスフェラーゼはβ−４−ガラクトシルトランスフェラーゼである。ガラクトシルトランスフェラーゼは、糸状菌の細胞質中に発現されうる。Schwientek J.Biol. Chem 1996 3398に記載されたＫｒｅ２ペプチドのような異種ターゲティングペプチドを使用してもよい。ガラクトシルトランスフェラーゼの発現のために使用することができるプロモーターには、ｇｐｄなどの構成的プロモーター、ゴルジ体またはＥＲでＮ−グリカンを合成する内因性グリコシル化酵素およびマンノシルトランスフェラーゼなどのグリコシルトランスフェラーゼのプロモーター、ならびにｃｂｈ１プロモーターなどの高収量内因性タンパク質の誘導性プロモーターが含まれる。ホスト細胞がガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含有する本発明の態様では、ホスト細胞は、また、ＵＤＰ−Ｇａｌおよび／またはＵＤＰ−Ｇａｌトランスポーターをコードするポリヌクレオチドを含有する。糸状菌細胞がガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含有する本発明のある態様では、糸状菌細胞を培養する場合にグルコースの代わりにラクトースを炭素源として使用してもよい。培地は、ｐＨ４．５から７．０の間または５．０から６．５の間でありうる。糸状菌細胞が、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドおよびＵＤＰ−Ｇａｌおよび／またはＵＤＰ−Ｇａｌトランスポーターをコードするポリヌクレオチドを含有する本発明のある態様では、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋またはＭｇ２＋などの二価陽イオンが細胞培養培地に添加される場合がある。
【０１５０】
他の態様では、糸状菌細胞は、また、「ホスト細胞」という標題の節に記載されたような、本発明のシアリルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含有しうる。シアリルトランスフェラーゼは、Ｎｅｕ５Ａｃなどのα３−またはα６−結合型シアル酸をガラクトシル化複合グリカンの末端Ｇａｌに転移する。α３−またはα６−結合型シアリルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドは、糸状菌細胞に内因性の場合があり、または糸状菌細胞に異種の場合がある。糸状菌細胞でのシアリル化は、特に真菌、植物、線虫／寄生虫、または昆虫細胞での、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃなどのドナーＣＭＰ−シアル酸を合成する酵素の発現を必要としうる。
【０１５１】
追加的に、糸状菌細胞は、増加または低下した活性レベルの様々な追加的な内因性酵素を有しうる。低下した活性レベルは、阻害剤、抗体などを用いて内因性酵素の活性を阻害することにより提供されうる。ある態様では、糸状菌細胞は、一つまたは複数の内因性酵素の活性を増加または低下するやり方で遺伝的に改変される。糸状菌細胞を遺伝的に改変して一つまたは複数の内因性酵素の活性を増加または低下させる方法は、当技術分野において周知であり、それには、非限定的に、「ホスト細胞」という標題の節に記載の方法が含まれる。ある態様では、糸状菌細胞は、野生型糸状菌細胞における活性レベルに比べて低下した活性レベルのα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼを有する。ゴルジ装置でのα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．２３２）は、伸長を開始するα−Ｄ−マンノシル残基をＧＤＰ−マンノースからタンパク質結合型Ｎ−グリカンオリゴ糖に転移して、α−（１→６）−Ｄ−マンノシル−Ｄ−マンノース結合を形成する。典型的には、α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ酵素は、ｏｃｈ１遺伝子によってコードされる。ある態様では、糸状菌細胞は、野生型糸状菌細胞における発現レベルに比べて低下した発現レベルのｏｃｈ１遺伝子を有する。ある態様では、ｏｃｈ１遺伝子は、糸状菌細胞から欠失されている。
【０１５２】
糸状菌細胞は、例えば、アクレモニウム属（Acremonium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、アウレオバシジウム属（Aureobasidium）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、クリソスポリウムス属（Chrysosporium）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、フィリバシジウム属（Filibasidium）、フザリウム属（Fusarium）、ジベレラ属（Gibberella）、ヒュミコラ属（Humicola）、マグナポルテ属（Magnaporthe）、ムコール属（Mucor）、ミセリオフソラ属（Myceliophthora）、ミロセシウム属（Myrothecium）、ネオカリマスティクス属（Neocallimastix）、ニューロスポラ属（Neurospora）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、ペニシリウム属（Penicillium）、ピロミセス属（Piromyces）、シゾフィラム属（Schizophyllum）、スキタリジウム属（Scytalidium）、タラロミセス属（Talaromyces）、サーモアスカス属（Thermoascus）、チエラビア属（Thielavia）、トリポクラジウム属（Tolypocladium）、またはトリコデルマ属（Trichoderma）細胞でありうる。ある態様では、糸状菌細胞はT. reesei細胞である。
【０１５３】
発明の方法により製造された複合Ｎ−グリカンを含有する薬学的組成物
別の局面では、本発明は、薬学的に許容されうる担体と一緒に製剤化された、本発明の方法により製造された異種分子に結合した一つまたは複数の複合Ｎ−グリカンを含有する組成物、例えば薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、また、併用療法で、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、併用療法は、本発明による異種分子に結合した複合Ｎ−グリカンを、少なくとも一つの他の治療剤と共に含みうる。
【０１５４】
本明細書に使用するような、「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合性の、任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌および抗真菌剤、等張化および吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適する。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち本発明による異種分子に結合した複合Ｎ−グリカンは、その化合物を不活性化するおそれのある酸の作用および他の自然条件からその化合物を保護するための材料でコーティングされる場合がある。
【０１５５】
本発明の薬学的組成物は、一つまたは複数の薬学的に許容されうる塩を含みうる。「薬学的に許容されうる塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持する塩であって、望まれない毒性学的作用を全く与えない塩を表す（例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19参照）。そのような塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの無毒の無機酸から、ならびに脂肪族モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族スルホン酸および芳香族スルホン酸などの無毒の有機酸から得られるものが含まれる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属から、ならびにＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの無毒の有機アミンから得られるものが含まれる。
【０１５６】
本発明の薬学的組成物には、また、薬学的に許容されうる抗酸化剤が含まれうる。薬学的に許容される抗酸化剤の例には：（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤が含まれる。
【０１５７】
本発明の薬学的組成物に採用されうる、適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが含まれる。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング物質の使用により、分散物の場合は必要な粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。
【０１５８】
これらの組成物は、また、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの佐剤を含有しうる。微生物の存在の防止は、滅菌手順により、および様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを入れることにより保証することができる。糖、塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物に入れることも望ましい場合がある。加えて、注射用薬学的剤形の持続吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延剤を入れることによって引き起すことができる。
【０１５９】
薬学的に許容される担体には、無菌水溶液または無菌分散物、および無菌注射液または無菌注射用分散物の即時調製用の無菌粉末が含まれる。薬学的活性物質のためのそのような媒質および薬剤の使用は、当技術分野において公知である。任意の従来の媒質または薬剤が活性化合物と不適合性である場合を除き、本発明の薬学的組成物にそれを使用することが考えられている。補充的な活性化合物も組成物に混ぜ込むことができる。
【０１６０】
治療用組成物は、典型的には製造および保存の条件で無菌および安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬物濃度に適した他の秩序化構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体プロピレングリコールなど）、およびその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒でありうる。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散物の場合は必要な粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合、等張化剤を、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを、組成物に入れることが望ましい。注射用組成物の持続吸収は、組成物にモノステアリン酸塩およびゼラチンなどの吸収遅延剤を入れることにより引き起こされうる。
【０１６１】
無菌注射液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上に列挙した成分の一つまたは組み合わせと共に適切な溶媒中で混ぜ合わせ、続いてマイクロ濾過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散物は、基本分散媒および上に列挙した成分からの必要な他の成分を含有する無菌ビヒクル中に活性化合物を混ぜ合わせることにより調製される。無菌注射液調製用の無菌粉末の場合、ある調製方法は、活性成分に加えて任意の追加的な所望の成分の粉末を、予め濾過滅菌されたその溶液から回収する、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【０１６２】
１回投与剤形を製造するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される対象および特定の投与様式に応じて変動する。１回投与剤形を製造するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じる組成物の量である。一般に、この量は、薬学的に許容される担体と活性成分を合計した１００％のうち、約０．０１％〜約９９％、好ましくは約０．１％〜約７０％、最も好ましくは約１％〜約３０％に及ぶ。
【０１６３】
投薬計画は、最適な所望の応答（例えば治療応答）を提供するように調整される。例えば、単回ボーラス投与を行ってもよく、経時的に数回の分割投与を行ってもよく、または治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例的に減少または増加させてもよい。投与の容易さおよび薬用量の均一性のために、非経口組成物をユニット投薬剤形で製剤化することが特に好都合である。本明細書に使用するようなユニット投薬剤形は、処置される対象のためのユニット投薬量として適切な、物理的に別個のユニットを表し、各ユニットは、必要な薬学的担体と共同して所望の治療効果を生じるように計算された、所定量の活性化合物を含有する。本発明のユニット投薬形態についての規格は、（ａ）活性化合物の独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体での感受性を取り扱うための、そのような活性化合物を配合する技術に固有の制限によって決定され、それらに直接依存する。
【０１６４】
異種分子に結合した複合Ｎ−グリカンの投与のために、特に、異種分子が抗体である場合、薬用量は、ホストの体重に対して約０．０００１〜１００mg/kg、より通常には０．０１〜５mg/kgに及ぶ。例えば、薬用量は、０．３mg/kg体重、１mg/kg体重、３mg/kg体重、５mg/kg体重もしくは１０mg/kg体重、または１〜１０mg/kgの範囲内でありうる。例示的な処置方式は、１週間１回、隔週１回、３週間に１回、４週間に１回、１ヶ月１回、３ヶ月に１回または３〜６ヶ月に１回の投与を必要とする。異種抗体に結合した複合Ｎ−グリカンのための特定の投薬方式には、１mg/kg体重または３mg/kg体重の静脈内投与が含まれ、抗体は、以下の投薬スケジュールの一つを用いて与えられる：（ｉ）４週間毎の投薬を６回、次に３ヶ月毎；（ｉｉ）３週間毎；（ｉｉｉ）３mg/kg体重を１回、続いて３週間毎に１mg/kg体重。
【０１６５】
または、本発明による異種分子に結合した複合Ｎ−グリカンは、徐放製剤として投与することができ、その場合、より回数の少ない投与が必要とされる。薬用量および回数は、患者での投与された物質の半減期に応じて変動する。一般に、ヒト抗体が最長の半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体がそれに続く。投与の投薬量および回数は、その処置が予防的であるか治療的であるかに応じて変動しうる。予防的適用では、比較的低い薬用量が比較的数少ない合間で長期間投与される。一部の患者は、余命の間、処置を受け続ける。治療応用では、疾患の進行が減速または終了するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量が必要な場合がある。その後、患者に予防的方式を投与することができる。
【０１６６】
本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の薬用量レベルは、患者に毒性を有さずに、特定の患者、組成物、および投与様式に関して所望の治療応答を達成するために有効な活性成分の量を得るために変動させることができる。選択された薬用量レベルは、採用された本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、採用される特定の化合物の排泄速度、処置期間、採用された特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態および病歴などの、医学分野で周知の要因を含めた多様な薬物動態要因に依存する。
【０１６７】
本発明の免疫グロブリンの「治療有効薬用量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の減少、無症状期の回数および期間の増加、または病苦による障害もしくは不能の予防を生じる。例えば、腫瘍の処置について「治療有効薬用量」は、好ましくは、未処置の対象に比べて、細胞の成長または腫瘍の成長を少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、なおより好ましくは少なくとも約６０％、いっそうより好ましくは少なくとも約８０％阻害する。化合物が腫瘍の成長を阻害する能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系で評価することができる。または、組成物のこの性質は、化合物が、当業者に公知のアッセイによりそのような阻害をin vitro阻害する能力を検討することによって評価することができる。治療用化合物の治療有効量は、腫瘍径を減少させるか、またはさもないと対象における症状を改善しうる。当業者は、対象のサイズ、対象の症状の重症度、および選択された特定の組成物または投与経路のような要因に基づき、そのような量を決定することができよう。
【０１６８】
本発明の組成物は、当技術分野において公知の多様な一つまたは複数の方法を用いて、一つまたは複数の投与経路を介して投与することができる。当業者に理解されるように、投与経路および／または投与様式は、所望の結果に応じて変動する。本発明の結合部分のためのある種の投与経路には、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路、例えば注射または注入によるものが含まれる。本明細書に使用するような「非経口投与」という語句は、経腸投与および局所投与以外の投与様式、通常は注射によるものを意味し、それには、非限定的に、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節包内、眼窩内、心腔内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入が含まれる。
【０１６９】
または、本発明による異種分子に結合した複合Ｎ−グリカンは、局所、上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下または局所などの非腸管外（nonparenteral）経路を介して投与することができる。
【０１７０】
活性化合物は、植込剤、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化デリバリーシステムを含めた徐放製剤などの、化合物を迅速放出から保護する担体を用いて調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製するための多数の方法が特許を得ているか、または一般に当業者に公知である。例えば、Sustained and Controlled Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。
【０１７１】
治療用組成物は、当技術分野において公知の医療用具を用いて投与することができる。例えば、ある態様では、本発明の治療用組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３１２，３３５号；同第５，０６４，４１３号；同第４，９４１，８８０号；同第４，７９０，８２４号；または同第４，５９６，５５６号に開示された用具などの、無針皮下注射用具を用いて投与することができる。本発明に有用な周知の植込剤およびモジュールの例には：米国特許第４，４８７，６０３号（この特許は、コントロールされた速度で薬物（medication）を分配するための植込み可能なマイクロ注入ポンプを開示している）；米国特許第４，４８６，１９４号（これは、皮膚を経由して医薬を投与するための治療用具を開示している）；米国特許第４，４４７，２３３号（これは、正確な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを開示している）；米国特許第４，４４７，２２４号（これは、連続薬物デリバリーのための変流量の植込み可能な注入装置を開示している）；米国特許第４，４３９，１９６号（これは、多チャンバー区画を有する浸透圧薬物デリバリーシステムを開示している）；および米国特許第４，４７５，１９６号（これは、浸透圧薬物デリバリーシステムを開示している）が含まれる。
【０１７２】
ある態様では、本発明による異種分子に結合した複合Ｎ−グリカンの使用は、治療用抗体で処置されうる任意の疾患の処置のためである。
【０１７３】
本発明をそのいくつかの具体的な態様と一緒に説明したが、前述の説明は、本発明の範囲を例示するつもりであって、限定するつもりではないことを理解されたい。本発明の範囲内の他の局面、利点、および改変は、本発明が属する技術分野の専門家に明らかであろう。
【０１７４】
本発明を説明したが、主題発明を限定としてではなく、例証として例示するために以下の実施例を提供する。
【０１７５】
実施例
実施例１  −  糖鎖工学のためのホスト株の選択
本実施例の目的は、糖鎖工学のために最適なT. reesei株を同定することであった。最適な株は、多量のＭａｎ５Ｎ−グリカンおよび少量の酸性グリカンを製造する。
【０１７６】
試料
Ｍ４４（ＶＴＴ−Ｄ−００７７５；Selinheimo et al., FEBS J. 2006, 273(18): 4322-35）、Ｍ８１、Ｍ８４、Ｍ１０９、Ｍ１１０、Ｍ１３１、Ｍ１３２、Ｍ１３３、Ｍ１３４およびＭ１２４（Ｍ４４のｍｕｓ５３欠失株）を含めた様々なT. reesei株を分析した。１０株のそれぞれを振盪フラスコ培養で成長させた。試料を３日、５日、および７日の異なる３時点で採取した。上清（分泌タンパク質）および細胞ペレットの両方を収集し、グリカン分析を行うまで−２０℃で凍結保存した。
【０１７７】
表示された時点からの分泌タンパク質からＮ−グリカンを単離し、続いてマトリックス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）グリカンプロファイリングを行った。５日の時点からの細胞ペレットをＮ−グリカンプロファイリングに供した。合計８０個の試料（中性および酸性上清画分各３０個、および中性および酸性ペレット画分各１０個）を分析に供した。
【０１７８】
振盪フラスコ培養と発酵槽培養の間のグリカンプロファイルの差を判断するために、Ｍ４４株も回分培養および流加発酵槽培養に供した。グリカン分析のために、異なる３時点からの試料を、合計１２個の試料について分析した（６個の中性画分および６個の酸性画分）。対照として培地を分析した。
【０１７９】
質量分析法
Bruker Ultraflex ＴＯＦ／ＴＯＦ装置（Bruker Daltonics, Germany）でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を行った。中性Ｎ−グリカンは、陽イオンリフレクターモードで［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンとして検出し、酸性Ｎ−グリカンは、陰イオンリニアモードで［Ｍ−Ｈ］  −イオンとして検出した。中性Ｎ−グリカン成分の相対的モル存在量は、スペクトルの相対シグナル強度に基づき割当てた。提示されたグリカンプロファイル中の発生したグリカンシグナルを１００％に基準化し、試料間の比較を可能にした。
【０１８０】
タンパク質特異的グリコシル化法
発酵槽培養した試料からのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦメンブランにブロッティングした。関心がもたれるタンパク質バンドを切出し、ＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いた酵素的放出によりＮ−グリカンを遊離させた。
【０１８１】
T. reesei株の中性Ｎ−グリカンプロファイル
所望のＭａｎ５構造は、図１に示した質量スペクトルのｍ／ｚ値１２５７．４に［Ｍ＋Ｎａ］＋シグナルとして観測することができる。分析されたT. reesei株の中性グリコームは、主要な中性グリカン種としてＭａｎ５またはＭａｎ８のいずれかを有することが見出された（表２のＨ５Ｎ２およびＨ８Ｎ２）。
【０１８２】
【表２】
0006017439.tif 000007
【０１８３】
中性Ｎ−グリカン画分中にいくつかの酸性Ｎ−グリカンが観測された。これは、リン酸化グリカンの特異的性質、例えばホスホジエステル構造の存在、またはこの研究に使用された実験条件下の中性画分への酸性種の漏出につながりうるホスホグリカンの他の性質が原因であるおそれがあった。対応する構造をチェックするために、関心がもたれるシグナルをＭＳ／ＭＳ分析に供した。グリカンの質量分析フラグメンテーションは、Bruker Ultraflex ＴＯＦ／ＴＯＦをＭＳ／ＭＳ分析モードで使用して行った（図２）。グリカンが完全メチル化（permethylate）されなかったので、ＭＳ／ＭＳデータに基づく最終的な構造決定を得ることはできなかった。
【０１８４】
T. reesei株の酸性Ｎ−グリカンプロファイル
糖鎖工学目的には、最少量の酸性Ｎ−グリカンを有する株を有することが有用であった。したがって、スクリーニングのために使用された株から酸性Ｎ−グリカンプロファイルを分析した。分析された株の酸性Ｎ−グリカンスペクトルを図３および下表３に示す。
【０１８５】
【表３】
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【０１８６】
発酵槽培養したＭ４４株からのＮ−グリカンプロファイル
異なる培養条件がＭ４４株のグリカンプロファイルに変化を引き起こしうるかどうかを見出すために、Ｍ４４株を発酵槽中で培養した。発酵槽中で培養した試料（回分培養；４１時間１０分、８８時間４５分および１１２時間５０分、および流加培養；４５時間５０分、１３１時間４０分および２１７時間２０分）についてＮ−グリカン分析を行い、振盪フラスコ培養のＮ−グリカンと比較した。発酵槽中で培養したT. reesei Ｍ４４株の分泌タンパク質の中性および酸性Ｎ−グリカンを図４に示す。フラスコ培養と発酵槽培養の間のＮ−グリカンのパーセンテージの比較を下表４に示す。
【０１８７】
【表４】
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【０１８８】
振盪フラスコ培養の培地のＮ−グリカン分析
対照実験として、T. reeseiの培地（真菌との接触なし）を分析した。図５ａに、中性Ｎ−グリカンの分析を示すが、その分析でＮ−グリカンは観測されなかった。ヘキソースオリゴマーの小さなシグナル（最もありそうなことには、培地に使用された植物材料に由来する）が、ベースラインの上に認識できた。図５ｂ（酸性グリカン）では、Ｎ−グリカンに対応するシグナルは観測されなかった。
【０１８９】
分泌タンパク質のＮ−グリコシル化
個別の分泌タンパク質の間のグリコシル化に変動があるかどうかをチェックするために、発酵培養上清からの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦメンブランにブロッティングした。次に、選択されたバンドのＮ−グリカンを、メンブラン上の酵素放出を用いて取り外した。結果を図６および７に示す。
【０１９０】
結論：中性グリカン
本研究の目的は、最高量のＭａｎ５ Ｎ−グリカンおよび最低量の酸性グリカンを有する、糖鎖工学用のT. reesei株を同定することであった。質量分析での主ピークとしてＭａｎ５を有する株は、より高い内因性α−１，２−マンノシダーゼ活性を有しうる。T. reeseiのＮ−グリコシル化に関する背景情報に基づき、Ｍａｎ５に関して有望な構造は、Ｍａｎα３［Ｍａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎα６］Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃである（Salovuori et al. 1987; Stals et al. Glycobiology 14, 2004, page 725）。
【０１９１】
いくつかの株は、主な中性グリコフォームとしてＨ８Ｎ２を含有した。文献に基づくと、このグリコフォームは、Ｇｌｃα３Ｍａｎα２Ｍａｎα２Ｍａｎ５構造である可能性が最も高かった（Stals et al. Glycobiology 14, 2004, page 725）。これらの株でのグルコシダーゼ欠乏が、より小さなグリコフォームへのグリカンのトリミングを阻止している可能性がある。
【０１９２】
いくつかの株では、中性スペクトル中に酸性Ｎ−グリカンが観測された。この状況は、酸性Ｎ−グリカンの比率がより高いこと、または酸性グリカンから中性グリカンを分離する際に中性画分中に特異的構造が漏出したことが原因であるおそれがあった。
【０１９３】
株のグリカンプロファイルは、振盪フラスコよりも発酵槽中で培養したときの方が糖鎖工学にとって少しだけ好都合であった。発酵槽培養された試料からの個別のタンパク質のグリコシル化は、平均的グリコシル化と有意差がなかった。分析された全タンパク質は、主グリコフォームとしてＭａｎ５を含有した。この観測は、全ての分泌タンパク質が類似のグリカンプロセッシングを受けることを示唆した。したがって、大部分の分泌タンパク質がT. reeseiホスト細胞によって同様にグリコシル化されたように見えた。哺乳動物細胞の場合、このことは必ずしも当てはまらない。
【０１９４】
酸性グリカン
末端リン酸残基は抗体などの標準的な治療用タンパク質に存在しないことから、一般に、Ｎ−グリカンのリン酸化は、糖鎖工学のために望ましくない。この決まりのいくつかの例外は、リソソームグリコシル化貯蔵障害のために使用される少数の専門タンパク質である。Ｎ−グリカンのリン酸化は、真菌においてタンパク質特異的でありうる。動物では、マンノースリン酸化が、保存されたリソソームターゲティングシグナルである。
【０１９５】
今日まで、T. reesei Ｎ−グリカンの硫酸化の報告はなかった。したがって、本報告において言及される酸性構造は、リン酸化グリカンが有望であった。
【０１９６】
リン酸化は、フラスコ培養の場合のようにT. reeseiを低ｐＨ値で培養したときの方がよく見られるが、これは、低ｐＨストレスおよび菌糸体破損と関係する可能性がある（Stals et al., 2004, Glycobiology 14:713-724）。この研究では、フラスコ培養試料と発酵槽培養試料の間に明らかな差が観測された。酸性Ｎ−グリカンが振盪フラスコ培養試料から観測され、その全てがリン酸化Ｎ−グリカンであった。発酵槽試料中の酸性Ｎ−グリカンの量は、検出限界未満であったおそれがあるか、またはより高いｐＨのせいでグリカンの有意なリン酸化がなかったおそれがある。中性グリカン種と酸性グリカン種の間でイオン化効率が異なることから、この研究に使用した方法でＮ−グリカン全量に対する酸性Ｎ−グリカンの比率を検証できなかった。
【０１９７】
リン酸化レベルを決定するために、回分培養および流加発酵槽中で培養されたT. reeseiの分泌タンパク質１０μgから、Ｎ−グリカナーゼによりＮ−グリカンを放出させた。Bradfordに基づく方法を使用して、標準としてＢＳＡを用いてタンパク質濃度を測定した。１pmolの標準分子ＮｅｕＡｃＨｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ２を酸性Ｎ−グリカンに添加してからＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を行った。培養物のｐＨを低下させた場合、主グリコフォームの量（発酵槽についてＨｅｘ７ＨｅｘＮＡｃ２Ｐおよびフラスコ培養についてＨｅｘ６−８ＨｅｘＮＡｃ２Ｐ）は、回分培養の分泌タンパク質に対して０．９pmol/１０μg, 、流加培養の分泌タンパク質に対して０．６pmol/１０μg、およびフラスコ培養の分泌タンパク質に対して１６０pmol/１０μgであった。中性Ｎ−グリカン試料に添加した標準グリカンＨｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ４ １０pmolを使用して、中性Ｎ−グリカンの量を測定し、その後ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を行った。主グリコフォームＨｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ２の量は、回分培養および流加培養の分泌タンパク質に対して８７pmol/１０μgであり、フラスコ培養の分泌タンパク質に対して１４５pmol/１０μgであった。したがって、Ｎ−グリカン全量に対する酸性Ｎ−グリカンの比率は、回分培養で１％、流加培養で０．７％、およびフラスコ培養で５２％であった。定量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのデータを用いたシグナル強度の比較のみに基づいた。
【０１９８】
Ｎ−グリカンは、また、酸性画分の方が大型であった。これは、１個のヘキソースユニットを伴うリンがグリカン骨格に結合されるホスホマンノシル化反応が原因であったおそれがある。いくつかの二リン酸化構造が酸性スペクトルに認められた。この説明は、以前に公表された、T. reeseiに見出されたリン酸化グリカンに関するデータと一致する（Stals et al. 2004, Glycobiology 14:725-737）。発酵槽中で培養したとき、酸性Ｎ−グリカンの比率は、非常に低く、検出限界未満であった。
【０１９９】
T. reesei培地のＮ−グリカンスペクトルからは、T. reeseiのN-グリコームに植物材料含有培地由来のグリカンが混入していることが明らかにならなかった。
【０２００】
結論として、異なるT. reesei株のＮ−グリカン分析は、Ｍ４４、Ｍ１０９、Ｍ１３１、Ｍ１３２およびＭ１２４株における主グリコフォームがＭａｎ５またはＭａｎα３［Ｍａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎα６］Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃであることを明らかにした。Ｍａｎ５生成株における副成分としてのＨ８Ｎ２を含めて、グルコースが存在する可能性が考えられた。２株（Ｍ１０９およびＭ１３１）は、Ｈ７Ｎ２よりも大量のＨ８Ｎ２を含有した。豊富なＨ８Ｎ２は、グルコシダーゼの部分的欠乏を示した可能性がある。
【０２０１】
Ｍ４４株は、リン酸化グリカンをほとんど含有しなかった。中性グリカン画分からｍ／ｚ１５２１およびｍ／ｚ１６８３でのシグナルとして観測された漏出性酸性グリカンは、Ｍ１３１、Ｍ１０９、Ｍ１３２およびＭ１２４株からの試料で観測され、それは、より高いリン酸化レベルおよび潜在的ホスホジエステル構造の存在を示した。
【０２０２】
本研究の目的は、Ｍａｎ５Ｇｎ２構造の最大生成および酸性（リン酸化）Ｎ−グリカンの低レベル生成を有する株を見出すことであった。最良の株は、ｐＨコントロールした振盪フラスコ培養条件下で８０％を超えるＭａｎ５を有した。最良の株は、また、二リン酸化グリカン生成および／またはより大型のリン酸化構造の生成が低下していた（表３参照）。
【０２０３】
実施例２  −  Ａｌｇ３欠損Trichoderma株の産生
ベクターの構築および株の産生
ＡＬＧ３マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をTrichoderma reeseiゲノム配列から同定した。ａｌｇ３遺伝子の１０００bpの５’および３’フランキング領域フラグメントの間にアセトアミダーゼ選択マーカーを挿入するために破壊構築物を設計した。フランキング領域フラグメントをＰＣＲにより増幅し、Saccharomyces cerevisiaeでの相同組み換えクローニングにより構築物を作製した。消化により破壊カセットをその骨格ベクターから放出させ、T. reesei Ｍ１２４株にトランスフォーメーションした。トランスフォーマントをアセトアミダーゼ培地で選択し、その構築物の５’フランキング領域フラグメント外側のフォワードプライマーおよびＡｍｄＳ選択マーカー内部のリバースプライマーを用いたＰＣＲによりスクリーニングした。
【０２０４】
トランスフォーマントのスクリーニング
６２個のスクリーニング済みトランスフォーマントのうち５８個から、ａｌｇ３ローカスへの構築物の組み込みに予想されたサイズのＰＣＲ生成物が得られた。９個のＰＣＲ陽性トランスフォーマントを単一胞子培養により精製して単核クローンにし、それらから胞子懸濁液を調製した。これらの９個のクローンを、破壊カセットが正しく組み込まれたかについて、サザンハイブリダイゼーションにより分析した。親株および９個のクローンからのＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡを、標準ハイブリダイゼーション条件下でａｌｇ３プローブとハイブリダイゼーションした。プローブは、任意のクローン由来のＤＮＡとではなく、親株由来のＤＮＡとハイブリダイゼーションし、ａｌｇ３欠失が成功したことを示した（図８）。
【０２０５】
ＡｍｄＳプローブを用いたサザンハイブリダイゼーションによりさらなる分析を行った。ＡｍｄＳ遺伝子を欠失カセット中に入れ、その遺伝子は、親株由来のＤＮＡからでなく、トランスフォーマント由来のＤＮＡから検出可能であると予測された。親株Ｍ１２４および９個のトランスフォーマントのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ＋ＰｖｕＩ（Ｅ＋Ｐ）およびＫｐｎＩ＋ＮｈｅＩ（Ｋ＋Ｎ）で消化した。ａｌｇ３−ＡｍｄＳ欠失カセットを有するＮｏｔＩ消化プラスミドを陽性対照として使用した。プローブは、陽性対照由来の予想される約２．７kbフラグメント（ＡｍｄＳ）を認識したが、親株とハイブリダイゼーションしなかった。全てのトランスフォーマントから、予想されたシグナルが得られ（Ｅ＋Ｐについて１．６＋２．８kbおよびＫ＋Ｎについて１．７＋３．４kb、図９Ｂに矢印で示す）、欠失カセットの正しい組み込みを示した。クローン１１Ａおよび１５Ａは、いくつかの追加的なフラグメントのハイブリダイゼーションも示したが、これは、ゲノムへの欠失カセットの非特異的組み込みを示唆している（図９Ｂ）。
【０２０６】
Ｎ−グリカンの分析論
５個の異なるＡｌｇ３ノックアウト株（４Ａ、５Ａ、６Ａ、１０Ａおよび１６Ａ）ならびに親株Ｍ１２４の振盪フラスコ培養物をＮ−グリカンについて分析した。３、５、７、および９日の時点から試料を収集した。全ての培養物を二つ組で成長させた。
【０２０７】
ランダムに選択したノックアウト株（４Ａ）からの分泌タンパク質のタンパク質濃度を、全ての時点から、ブラッドフォードに基づくアッセイを用いてＢＳＡ標準曲線と対比させて測定した。最高タンパク質濃度は５日目に検出された。したがって、全部で５個のノックアウト株について５日目の試料をＮ−グリカン分析のために使用した。二つ組の培養物を含む全試料を三つ組みで分析した。Ｎ−グリカン分析のために１０μgを使用した。中性および酸性Ｎ−グリカンの両方をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより分析した。
【０２０８】
親株Ｍ１２４での主グリコフォームはＭａｎ５Ｇｎ２であった。全てのＡｌｇ３ノックアウト株において、主グリコフォームはＭａｎ３であった（図１０）。親株Ｍ１２４からＭａｎ３は見出されなかった。異なるＡｌｇ３ノックアウト株で、Ｍａｎ３の量は、ｐＨ低下させた振盪フラスコ培養物中に４９．７％から５５．２％の間となった。Ｈｅｘ６Ｇｎ２は親株で増加した。観測された中性Ｎ−グリカンシグナルのパーセンテージとしてのシグナル強度を下表５に示す。
【０２０９】
【表５】
0006017439.tif 000010
【０２１０】
各グリコフォームの種々のアイソマーが存在することは、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析では観測できないので、さらなるタンデム質量分析研究を行った。最初に、Ｍａｎ３およびＨｅｘ５Ｇｎ２構造を検討した。Ｍａｎ３について、Ｍａｎ３構造が分枝であるか直鎖であるかが問われた。この分析のために、これらの両構造を含有する試料を完全メチル化し、Bruker Ultraflex III ＴＯＦ／ＴＯＦ装置を製造業者の説明書に従って使用して質量分析フラグメンテーションにより分析した（図１１および１２）。
【０２１１】
次に、Ｈｅｘ６Ｇｎ２構造の非還元末端上のヘキソースユニットがマンノースであるかグルコースであるかを判定した。全てのノックアウト株および親株にα−マンノシダーゼ消化を行った（図１３）。骨格からα−マンノースを切断し、β−マンノースを無影響のまま残すナタマメ−マンノシダーゼを使用した。生じた構造はＭａｎ１Ｇｎ２と予想された。
【０２１２】
ＭＡＬＤＩでの低分子量領域効果のせいで、Ｍａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２グリカンの相対強度は幾分低下していたおそれがあり、このことは、Ｈｅｘ６の相対量のわずかな増加を説明した。α−マンノシダーゼ消化後に、Ｍａｎ３およびＭａｎ４グリコフォームは消失した。Ｍａｎ２構造は観測されなかった。しかし、Ｈｅｘ６（ｍ／ｚ１４１９）は消化されず（表６）、構造の非還元末端にグルコースユニットがあったことを示した。いくらかの難消化性Ｈｅｘ５も存在したが、これは、おそらくＨｅｘ６の立体障害されたＭａｎ６枝が除去される弱い反応により生成したものと思われる。
【０２１３】
【表６】
0006017439.tif 000011
【０２１４】
Ａｌｇ３ノックアウト株から見出された種々の構造の最終分析のために、Ａｌｇ３ノックアウト株４Ａに大規模ＰＮＧａｓｅ Ｆ消化を行った。２種の主グリカンをＨＰＬＣで精製し（図１４）、ＮＭＲにより分析した（図１５）。
【０２１５】
図１５Ａに示したデータに基づき、Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２種は、Ｍａｎα１−３（Ｍａｎα１−６）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃとして明確に同定された。Ｍａｎα３およびＭａｎα６のＨ−１ユニットは、それぞれ５．１０５および４．９１４ppmで共鳴した。Ｍａｎβ４のＨ−２ユニットは４．２４５ppmで観測された。このシグナルは、隣接するＭａｎα３−ＯＨ置換が原因で非常に特徴的であった。コアＧｌｃＮＡｃユニットのＮ−アセチル基のＣＨ３シグナルは、２．０３８および２．０７５で観測された。これらの値は、Sugabaseデータベース（www.boc.chem.uu.nl/sugabase/sugabase.html）におけるこの五糖について報告された値とよく一致した。さらに、商業的に製造されたＭａｎα１−３（Ｍａｎα１−６）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（Glycoseparations, Inc.）について同一実験条件でプロトン−ＮＭＲスペクトルを測定し、ほぼ同一の化学シフトが得られた。
【０２１６】
Ｈｅｘ６ＨｅｘＮＡｃ２成分のＮＭＲスペクトルを図１５Ｂに示す。このデータは、この成分が八糖Ｇｌｃα１−３Ｍａｎα１−２Ｍａｎα１−２Ｍａｎα１−３（Ｍａｎα１−６）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃを表すことを意味する。グルコースユニットの存在は、典型的なαＧｌｃの２．４Hzカップリングを示す５．２５５シグナルから明らかであった。全てのＭａｎシグナルは、典型的にはエカトリアルＨ−２配置が原因の＜１Hzカップリングを示している。Sugabaseデータに比べて小さな差が観測されたが（表７）、これは、このＮＭＲ測定に使用された温度が異なることに起因する可能性がある（４０℃に対して２６℃）。
【０２１７】
【表７】
0006017439.tif 000012
【０２１８】
最終的に、ランダムに選択されたノックアウト株４ＡのＮ−グリカンプロファイルを種々の時点で分析した（３、５、７および９日目）。振盪フラスコ培養のｐＨは開始時点で４．８であり、終了時点で２．６であった。二つ組の培養物の各時点から三つ組みの試料を分析した。二つ組の両方で、ｐＨ低下のせいでＭａｎ３Ｇｎ２シグナルの相対量が成長時間の関数として減少したことが観測された。しかし、Ｈｅｘ６Ｇｎ２シグナルの量は、成長時間の関数として増加した（表８）。
【０２１９】
【表８】
0006017439.tif 000013
【０２２０】
クローン４Ａ（５日目）でのＭａｎ３のパーセンテージに関するこれら二つの分析（表４および７）の間の差異に注目した。この差異は、分析手順の差異によるおそれがあった。凍結解凍サイクル（１回または複数）後に、異種培地タンパク質調製物のいくぶんの不安定性が観測されたが、これは、グリカンおよび／またはタンパク質の分解が、比較的大型のグリカンの量の低下を招いたことが原因の可能性があった。表５でのデータ取得は、追加的な凍結解凍サイクルを含んだ。
【０２２１】
ＭＡＬＤＩによって酸性Ｎ−グリカン画分も分析した（図１６）。親株Ｍ１２４での種々の酸性化合物の存在度は、全Ａｌｇ３ノックアウト株と異なり、ノックアウト株の間では酸性画分は非常に類似しているように見えた。
【０２２２】
親株における３種の主グリカンはＨ６Ｎ２Ｐ１、Ｈ７Ｎ２Ｐ１およびＨ８Ｎ２Ｐ１であった。Ａｌｇ３ノックアウトでは、サイズがより小さなグリカンに移行してＨ５Ｎ２Ｐ１、Ｈ６Ｎ２Ｐ１およびＨ４Ｎ２Ｐ１であった。追加的に、二リン酸化グリカンは親株の方が豊富であった。これは、リン酸化マンノースをグリカンに結合させる特定の酵素にふさわしい基質が欠如していることが原因であった可能性がある。リン酸化マンノースは、他のマンノース残基によりさらに伸長することができる。リン酸化は、発酵条件下で生成した親Ｍ１２４株のグリカン中に実質的には存在しなかった。
【０２２３】
発酵槽成長試料と振盪フラスコ成長試料との比較
一つのＡｌｇ３ノックアウト株（トランスフォーマント４Ａ）を、ラクトース−穀粒粕（spent grain）エキス培地を用いた回分発酵で成長させた。培地は、２０g/l穀粒粕エキスを有する６０g/lラクトースであって、植菌後体積は７リットル（発酵槽の運転bio01616）であった。他の培地成分は、ＫＨ２ＰＯ４および（ＮＨ４）２ＳＯ４であった。培養ｐＨは５．５から５．８の間にコントロールした。運転の経過中にバイオマスおよび培養上清を採取し、−２０℃で保存した。起こりうるＲＮＡ分析のために菌糸体試料も収集し、直ちに液体窒素中で凍結させ、−７０℃に移した。これらの発酵の全経過から収集した試料をＮ−グリカン組成について分析した。トランスフォーマント４Ａの発酵槽の運転bio01616）について、および振盪フラスコ培養からの５日目の試料について、Ｎ−グリカンの分析を実施した（図１７および１８）。振盪フラスコ培養での主シグナルはＭａｎ３（５９％）であった。発酵槽培養では、主シグナルはＭａｎ３（８５％）であり、Ｈｅｘ６の比率は８％に減少した。
【０２２４】
結論
Ａｌｇ３ノックアウトは、予想されるＭａｎ３グリコフォームを５０％以上製造することに成功した。Ｍａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎβ−の所望の分枝構造を、フラグメンテーション質量分析およびＮＭＲ法により検証した。
【０２２５】
Ａｌｇ３ノックアウトの他の生成物には、Ｍａｎ４（マンノース含有副生成物）、Ｈｅｘ５（図１３に示すＨｅｘ６の分解生成物）および２番目に大きな成分であったＨｅｘ６が含まれた。Ｈｅｘ６成分は、マンノシダーゼ耐性およびＧｌｃα３Ｍａｎ末端を含むという特異的ＮＭＲシグナルにより、末端Ｇｌｃを含有することが特徴づけられた。グリカン構造は、末端Ｇｌｃの量を低下するための方法によりさらに最適化することができると考えられたが、そのことは、末端Ｇｌｃは、分子のＭａｎα６アーム上にマンノースを欠如するグリカンへのグルコシダーゼＩＩの効力を最適以下にする見込みがあった。発酵条件のさらなる最適化で、末端Ｇｌｃの量が低下する可能性がある。
【０２２６】
このデータから、Aspergillus（Kainz et al., Appl Environ Microb. 2008 1076-86）およびP. pastoris（Davidson et al., Glycobiology 2004, 399-407）でのＡｌｇ３ノックアウトについての初期のデータよりも、T. reeseiのＡｌｇ３ノックアウトの方が、良好なグリコシル化の結果が示された。KainzらおよびDavidsonらの研究では、類似またはより高いＨｅｘ６対応生成物レベルが報告された。それらの研究は、α２−マンノース、ＯＣＨ１生成物およびびより大きなサイズに伴う追加的な問題、ならびにP. pastoris生成された細胞型特異的グリカンも報告した。結論として、T. reesei Ａｌｇ３ノックアウトのＮ−グリカン分析は、ノックアウト株での主グリコフォームが、哺乳動物型Ｎ−グリカンの効率的な産生のために望まれる出発点である、Ｍａｎ３Ｇｎ２であることを明らかにした。
【０２２７】
実施例３  −  個別のＧｎＴＩおよびＧｎＴＩＩ酵素の精製および活性
ヒトＧｎＴＩおよびＧｎＴＩＩ（Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ）のアクセプター特異性および活性を研究するために、それらの酵素をPichia pastorisにおいて可溶性分泌タンパク質として発現させた。
【０２２８】
P. Pastorisでの製造のためのＧｎＴＩ構築物の産生
ヒトＧｎＴＩ（Ｐ２６５７２）配列を完全長配列として得て、Trichoderma reesei overs過剰発現ベクターにサブクローニングした。酵素学的研究用にPichia pastorisで分泌型タンパク質を生成させるために、ヒトＧｎＴＩの可溶性部分をコードするタンパク質コード配列（ＣＤＳ）をｐＢＬＡＲＧ−ＳＸ発現ベクターにクローニングした。クローニング手順の際に、Ｈｉｓタグをコードする配列をフレームの５’末端に付加して切断型タンパク質のＮ末端にタグを得た。配列を配列解析により検証した。生じたベクターｐＴＴｇ５を線状化し、エレクトロポレーションによりP. pastoris ＧＹ１９０細胞にトランスフォーメーションし、ＧＹ４株を回収した。Ａｒｇ＋トランスフォーマントを釣り上げ、ＰＣＲによりスクリーニングした。組み込まれたプラスミドを含有するＧＹ４クローンをタンパク質発現について試験した。
【０２２９】
可溶性ＧｎＴＩの発現および精製
最初に、可溶性ＧｎＴＩを発現しているP. pastoris ＧＹ４株をＢＭＧＹ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、１００mMリン酸カリウム（ｐＨ６．０）、１．３４％酵母ニトロゲンベース、４×１０〜５％ビオチン、１％グリセロール）中で＋３０℃にて振盪しながらＯＤ６００が２〜６になるまで一晩成長させた。次に、遠心分離により細胞を採集し、ＯＤ６００が１になるようにＢＭＭＹ培地（ＢＭＧＹと同様であるが、１％グリセロールの代わりに０．５％メタノールを有する）中に再懸濁した。培養物をバッフル付きフラスコ中に入れ、＋１６℃の振盪恒温槽に戻した。１００％メタノールを終濃度０．５％になるように２４時間毎に添加し、誘導を維持した。発現培養試料１mlを誘導の０、２４、４８、および７２時間後に採取し、細胞ペレットおよび上清の両方を分析のために保存した。誘導の３日後に、培養物全体からの細胞を遠心分離により採集し、上清を収集し、ＧｎＴＩのさらなる精製に供した。
【０２３０】
活性アッセイのための粗ＧｎＴＩ試料の調製
可溶性Ｈｉｓ−タグ付きＧｎＴＩを含有するPichia pastoris細胞培養物を、濃縮および緩衝液交換により活性アッセイ用に処理した。簡潔には、ＭｅＯＨを用いた誘導の３日後に、５０ml Falconチューブ（Eppendorf 5810R、３２２０rcf、＋４℃で５分間）中で細胞をペレットにし、上清を収集することによって、振盪フラスコ培養からP. pastoris上清４０mlを採集した。次に、Millipore Amicon Ultracel 30Kコンセントレーターを用いた連続遠心分離（Eppendorf 5810Rまたは同等物、３２２０rcf、＋４℃で１０分間）により上清を＜２．５mlに濃縮した。濃縮物の体積を１００mM ＭＥＳ（ｐＨ６．１）で２．５mlに調整した。ＰＤ−１０ゲル濾過カラム（GE Healthcare 17-0851-01）を用いて濃縮物を緩衝液交換に供した。最初にカラムを１００mM ＭＥＳ（ｐＨ６．１）で平衡化し、次に試料（２．５ml）を添加し、流出液を捨て、ＭＥＳ緩衝液２．２５mlで溶離液を収集した。最後に、溶離液５００μlをMillipore Biomax 30Kコンセントレーター（Eppendorf 5417、１２，０００rcf、＋４℃で５分間）で１００μlに濃縮し、活性アッセイに直接使用した。
【０２３１】
ＧｎＴＩ酵素の活性アッセイ
Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（Ｍａｎ３Ｇｎ）を、ＧｎＴＩ活性アッセイでのＧｎＴＩに対するアクセプターとして使用した。ＧｎＴＩ反応は、０．１mMアクセプター性Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、２０mM ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、５０mM ＧｌｃＮＡｃ、１００mM ＭｎＣｌ２、０．５％ＢＳＡおよび８μl ＧｎＴＩを１００mM ＭＥＳ（ｐＨ６．１）中に含有する反応混合物を総体積１０μlで室温にて一晩インキュベーションすることにより実施した。反応物を１００℃で５分間インキュベーションすることにより反応を停止した。
【０２３２】
ＧｎＴＩ活性アッセイに平行して、粗酵素調製物中にありうるＨｅｘＮＡｃ’ａｓｅ活性を確認した。ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ（＝Ｇｎ２Ｍａｎ３Ｇｎ２−Ａｓｎ）をＨｅｘＮＡｃ’ａｓｅに対する基質として使用した。Ｍａｎ３ＧｎおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの代わりに１００pmolのＧｎ２Ｍａｎ３Ｇｎ２−Ａｓｎを添加した以外は、ＧｎＴＩと同様に反応を実施した。ＨｅｘＮＡｃ’ａｓｅ活性は検出されなかった。
【０２３３】
HyperSep ９６ウェル真空マニフォールド（Thermo Scientific）を用いたHypersep Ｃ１８（１００mg、Thermo Scientific、カタログ番号:60300-428）およびHypercarb（１０mg/９６ウェルプレート/１パッケージ、カタログ番号60302-606）連続クロマトグラフィーにより、反応混合物をＭＡＬＤＩ分析用に精製した。Hypersep Ｃ１８は、ＥｔＯＨ ３００μlおよびＭＱ水 ３００μlを用いて調製し、次に収集プレートを下に入れ、試料をロードし、ＭＱ水 ５０μlで溶離した。HypercarbをＭｅＯＨ ３００μlおよびＭＱ水 ３００μlを用いて調製した。Hypersep Ｃ１８からの溶離液をロードし、０．５Ｍ ＮＨ４Ａｃ １５０μlで塩類を除去し、ＭＱ水２×３００μlでウェルを洗浄した。ＧｎＴＩ反応生成物を２５％ＡＣＮ １５０μlで溶離し、ＨｅｘＮＡｃ’ａｓｅ反応生成物を２５％ＡＣＮおよび０．０５％ＴＦＡで溶離した。試料をSpeedvac中で乾燥させた。
【０２３４】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化時間飛行型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析（ＭＳ）をBruker Ultraflex ＴＯＦ／ＴＯＦ装置（Bruker Daltonics, Germany）で行った。アクセプター糖および生成物をポジティブイオンリフレクターモードで［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンとして検出した。Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ１およびＨｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２の［Ｍ＋Ｎａ］＋シグナルについての計算されたｍ／ｚ値は、それぞれ７３３．２３８および９３３．３１８であった。アクセプターと生成物のパーセント比は、Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ１およびＨｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２に対応するシグナルから計算した（図１９）。
【０２３５】
P. pastorisでの製造用のＧｎＴＩＩ構築物の産生
それぞれＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含有するプライマーＧＰ３およびＧＰ１３を用いて、ヒトＧｎＴＩＩをコードするヌクレオチド配列をＰＣＲ増幅した。ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩ消化したＰＣＲフラグメントを、同様に消化したｐＢＬＡＲＧ−ＳＸクローニングベクターにライゲーションした。配列を検証後に、最終構築物をP. pastoris ＧＳ１９０株にトランスフォーメーションしてＧＹ２２株を得た。陽性酵母トランスフォーマントをＰＣＲによりスクリーニングした。２種のクローン（その一方だけを図２０に示す）を、＋１６℃および＋３０℃におけるメタノール誘導性ＡＯＸ１プロモーターのコントロール下でのＧｎＴＩＩ発現について検討した。
【０２３６】
可溶性ＧｎＴＩＩの発現
ウエスタンブロット分析によると（図２０）、P. pastoris ＧＹ２２株は可溶性リコンビナントＧｎＴＩＩ酵素を生成した。ＧｎＴＩＩは、計算分子量４９０４９．０Daおよび２個の推定上のＮ−グリコシル化部位を有する。リコンビナントＧｎＴＩＩは＋１６℃で培地中に分泌された（レーン９）。＋３０℃で成長させると、リコンビナントＧｎＴＩＩは細胞内に拘束された（レーン４）。
【０２３７】
可溶性ＧｎＴＩＩの活性アッセイ
ＧｎＴＩについて上記のように、可溶性Ｈｉｓタグ付きＧｎＴＩＩを含有するP. pastoris細胞培養物を活性アッセイ用に処理した。細胞培養物を遠心分離し、上清を採集および濃縮し、１００mM ＭＥＳ（ｐＨ６．１）に緩衝液交換を行い、生じた試料をさらに濃縮してから活性試験を行った。
【０２３８】
活性アッセイは、ＧｎＴＩと同様に実施した。ＧｎＭａｎ３ＧｎをＧｎＴＩＩアクセプターとして使用した。
【０２３９】
１００mM ＭＥＳ（ｐＨ６．１）中に０．１mMアクセプター性ＧｎＭａｎ３Ｇｎ、２０mM ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、５０mM ＧｌｃＮＡｃ、１００mM ＭｎＣｌ２、０．５％ＢＳＡ、およびＧｎＴＩＩの存在下でＧｎＴＩＩの反応を実施した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析のための反応混合物の精製は、ＧｎＴＩについて上記のように、真空マニフォールド上の９６ウェルプレートでのHypersep C18およびHypercarb連続クロマトグラフィーにより行った。
【０２４０】
Bruker Ultraflex ＴＯＦ／ＴＯＦ装置（Bruker Daltonics、Germany）でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを行った。アクセプター性糖および生成物をポジティブイオンリフレクターモードで［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンとして検出した。反応終了時の生成物とアクセプターの比をそれらのシグナル強度から計算した（ＧｎＭａｎ３Ｇｎアクセプターおよび１個のＧｌｃＮＡｃが付加された生成物の［Ｍ＋Ｎａ］＋シグナルについての計算ｍ／ｚ値は、それぞれ９３３．３１８および１１３６．３９７である）。
【０２４１】
ＧｎＴＩＩを生成しているP. pastorisの培養を繰り返し、上清からのＧｎＴＩＩ濃縮物（６０×）を調製し、その活性を上記方法により測定した。２．５時間、５時間、および一晩経過時点の試料のＭＡＬＤＩスペクトルは、アクセプターの８０％、８３％、および８２％がそれぞれ生成物に変換されたことを示した。２．５時間で最大に近い反応に到達した。
【０２４２】
加えて、粗ＧｎＴＩＩ試料を調製し、粗ＧｎＴＩ試料について上記のように、活性アッセイを実施した。反応混合物を一晩インキュベーションし、精製し、ＭＡＬＤＩ分析に供した。ＭＡＬＤＩスペクトルは、ＧｎＴＩＩ活性を明らかにした（図２１）。ＨｅｘＮＡｃ’ａｓｅ活性は粗ＧｎＴＩＩ試料から検出されなかった。
【０２４３】
上記ＧｎＴＩＩ活性アッセイに使用するためのＧｎＴＩＩアクセプターを合成するために使用した方法は以下の通りであった。上記のようにP. pastoris培養液からＧｎＴＩ試料を調製した。このＧｎＴＩ試料は、高いＧｎＴＩ活性を示したので、それを約４０nmolのＭａｎ３ＧｎからＧｎＭａｎ３Ｇｎへの変換に使用することができた。０．５mM Ｍａｎ３Ｇｎ、２０mM ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、５０mM ＧｌｃＮＡｃ、１００mM ＭｎＣｌ２、０．５％ＢＳＡ、およびＧｎＴＩ試料の存在下で反応を実施した。反応混合物を室温で３日間インキュベーションした。約１％の試料をHypercarbクロマトグラフィーによる精製およびＭＡＬＤＩ分析に供した。ＭＡＬＤＩスペクトルによると、ＧｎＴＩの反応は、ほぼ全てのＭａｎ３ＧｎアクセプターをＧｎＭａｎ３Ｇｎ生成物に変換した。２．８％のアクセプターだけが変換されなかった。
【０２４４】
実施例４  −  ＧｎＴＩ／ＧｎＴＩＩ融合タンパク質
ＧｎＴＩ／ＧｎＴＩＩ発現構築物の産生
フレーム内融合部位（天然ＡｌｅＩ制限部位を含有し、終止コドンが除去され、ＧｎＴＩＩ配列と重複したＧｎＴＩ由来短鎖配列）を含有する５’末端６５塩基長融合プライマーと、ＳｐｅＩまたはＮｄｅＩ制限部位のいずれかを含有する、ＧｎｔＩＩに相同な３’末端プライマーとを用いて、１３１３bpのＧｎＴＩＩフラグメントを増幅することにより、リコンビナントＧｎＴＩ／ＩＩ融合タンパク質を構築した。この融合部位は、ｃｂｈ１プロモーターのコントロール下の野生型ＧｎＴＩを有する（ＡｌｅＩ／ＮｄｅＩを用いてクローニング）、またはｇｐｄプロモーターのコントロール下の野生型ＧｎＴＩを有する（ＡｌｅＩ／ＳｐｅＩを用いてクローニング）T. reesei過剰発現ベクターに融合フラグメントを直接クローニングすることを可能にした。高忠実度Phusionポリメラーゼ（Finnzymes）ならびに標準的な増幅およびクローニング手順を使用した。発現ベクターから直接配列決定することにより配列を検証した。生じたベクターを使用して、T. reeseiでの膜貫通タンパク質として融合体を発現させた。
【０２４５】
融合タンパク質の機能性に関してより多くの情報を得るために、融合ＧｎＴＩ／ＩＩタンパク質を、P. pastorisでの可溶性タンパク質としても発現させた。酵素研究用のタンパク質を生成するために、タンパク質の可溶性部分をコードするＧｎＴＩ／ＩＩ融合体のＣＤＳをｐＢＬＡＲＧ−ＳＸ発現ベクターにクローニングした。クローニング手順の際に、Ｈｉｓタグをコードする配列をフレームの５’末端に付加して、切断型タンパク質のＮ末端にタグを得た。配列解析により配列を検証した。生じたベクターを線状にし、エレクトロポレーションによりP. pastoris ＧＳ１９０株にトランスフォーメーションしてＧＹ６株を回収した。Ａｒｇ＋トランスフォーマントを釣上げ、ＰＣＲによりスクリーニングした。組み込みされたプラスミドを含有するP. pastorisクローンをタンパク質発現について試験した。
【０２４６】
P. pastorisにおいて生成した可溶性ＧｎＴＩ／ＩＩの精製
P. pastorisでの発現および精製手順は、リコンビナントＧｎＴＩタンパク質を用いて上記のように実施した。
【０２４７】
ＧｎＴＩ／ＩＩ融合タンパク質の酵素活性試験
活性アッセイは、アクセプターとしてＭａｎ３Ｇｎオリゴ糖およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃドナーを用いて、ＧｎＴＩアッセイについて上記のように実施した。反応生成物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析した。ＧｎＴＩ／ＧｎＴＩＩ融合タンパク質についてＧｎＴＩ活性だけが観測された（図２２）。
【０２４８】
ランダム組み込みによるＧｎＴＩ／ＧｎＴＩＩ構築物を用いたT. reeseiのトランスフォーメーション
ｇｐｄＡプロモーターを有するキメラヒトＧｎＴＩ／ＧｎＴＩＩプラスミドをランダム組み込みでT. reesei Ｍ１２４株に共トランスフォーメーションした。アセトアミダーゼマーカー遺伝子を含有するプラスミドの共トランスフォーメーションにより選択を行った。ＰＣＲ陽性トランスフォーマント２０個を精製して単核クローンにし、振盪フラスコ培養で成長させ、グリカン分析に供した。全てのトランスフォーマントおよび親株Ｍ１２４を、４％ラクトースおよび２％穀粒粕エキスを補充したTrichoderma最少培地（ＴｒＭＭ）（ｐＨ４．８）中で培養した。上清および菌糸体試料を３、５、および７日目に収集し、分析まで凍結保存した。加えて、対照として、T. reeseiにＧｎＴＩ構築物をランダム組み込みによりトランスフォーメーションした。
【０２４９】
ランダム組み込みにより得られたT. reesei ＧｎＴＩ／ＧｎＴＩＩ株のグリカン分析
T. reesei Ｍ１２４株ＧｎＴＩ／ＧｎＴＩＩトランスフォーマントからの異なる３時点（３、５および７日目）の異なる２０個のクローンからの試料を分析した。対照について、二つの親Ｍ１２４株からの試料を分析した。ＳＤＳ変性なしのＮ−グリカナーゼ反応を、上清タンパク質５μｇに関して三つ組みにして９６ウェルプレートで行った。上清のタンパク質濃度は、標準としてＢＳＡを使用してブラッドフォードに基づくアッセイ（Bio-Rad Quick Start Bradford Protein Assay）により測定した。中性および酸性Ｎ−グリカンの両方をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。任意の時点の任意のクローンでのＧｎＴＩ／ＧｎＴＩＩ構築物を用いて、およびｇｐｄＡプロモーターを有するＧｎＴＩトランスフォーマントのクローンにおいて、Ｇｏ生成物は検出されなかった。
【０２５０】
ターゲット組み込みによるＧｎＴＩ／ＧｎＴＩＩ構築物を用いたT. reeseiのトランスフォーメーション
キメラＧｎＴＩ／ＧｎＴＩＩ配列を、アセトアミダーゼマーカー遺伝子ならびにａｌｇ３ローカス組み込み用の５’−および３’−フランキング配列部位を含有するベクターであるｐＴＴｖ３８骨格にサブクローニングした。そのベクターを消化されたフラグメントとしてT. reesei Ｍ１２４株にトランスフォーメーションした。このトランスフォーメーションから、ａｌｇ３ローカスへの正しい組み込みを示すＰＣＲフラグメントをもたらす１８個のＰＣＲ陽性トランスフォーマントが検出された。１回の胞子精製後に、これらのトランスフォーマントを振盪フラスコ中で培養し、下記のように分析した。
【０２５１】
ａｌｇ３ローカスへのターゲティングにより得られたT. reesei ＧｎＴＩ／ＧｎＴＩＩ株のグリカン分析
Δａｌｇ３T. reesei ＧｎＴＩ／ＧｎＴＩＩトランスフォーマントの異なる３時点（３、５および７日目）での１０個の異なるクローンの上清試料を得た。２種類の異なる培地組成でクローンを振盪フラスコ中で培養しておいた。２％穀粒粕エキス、４％ラクトース、およびフタル酸Ｋ緩衝剤を有するＴｒＭＭ（ｐＨ５．５）を全てのクローンについて使用し、平行して２％穀粒粕エキス、４％ラクトース、１％カザミノ酸、およびフタル酸Ｋ緩衝剤を有するＴｒＭＭ（ｐＨ５．５）を５個のクローンについて使用した。培養を７日間、５日間は＋２８℃で、ならびに６および７日目は＋２４℃で継続した。
【０２５２】
Ｎ−グリカン分析は、上清タンパク質５μgについて三つ組みにして、９６ウェルプレート中で行った。３、５、および７日目から試料を分析した。上清のタンパク質濃度は、標準としてＢＳＡを使用してブラッドフォードに基づくアッセイ（Bio-Rad Quick Start Bradford Protein Assay）により測定した。中性および酸性Ｎ−グリカンの両方をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。
【０２５３】
検出可能な量のグリコフォームＧ０が各クローンから見出された。クローン２０１Ａが最大量を含有し、Ｇｎ２Ｍａｎ３が１．２％であった（図２３および表９）。加えて、この特定のクローンではＨｅｘ６の量が最低であった。１％カザミノ酸を有する第２の培地は、Ｇ０／ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃβの余分な生成をまったく示さなかった。３および７日目の試料の結果は、５日目の試料についての結果と本質的に同じであった。
【０２５４】
【表９】
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【０２５５】
実施例５  −  ＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ融合タンパク質
ＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ発現構築物の作製
ＰＣＲ重複技法を適用することによりＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ融合発現構築物を産生した。融合部位に５０bpのフレーム内重複を含有するプライマーを用いて、融合フラグメントをＧｎＴＩＩおよびＧｎＴＩテンプレートから別々に増幅した。フラグメントをアガロースゲルから精製し、標準的な手順により融合構築物の増幅用のＰＣＲテンプレートとして使用した。融合構築物を、ＡｐａＩ／ＳｐｅＩ制限部位を有するベクターにクローニングした。生じた構築物を配列分析により検証した。P. pastorisにおいてターゲットタンパク質のＮ末端にＨｉｓタグを有する可溶型ＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩを発現させるためにベクターを産生した。このベクターは、ＧｎＴＩ／ＩＩ融合構築物について上記したものと類似の方法で産生した。
【０２５６】
P. pastorisにおいて生成した可溶性ＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩの精製
P. pastorisにおける発現および精製手順を、リコンビナントＧｎＴＩタンパク質について上記したように実施した。
【０２５７】
ＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ融合タンパク質の酵素活性試験
ＧｎＴＩについて上記したように、Ｍａｎ３Ｇｎオリゴ糖をアクセプターとして使用して、活性アッセイを実施した。ＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ反応からの精製反応混合物のＭＡＬＤＩスペクトルは、２個のＧｌｃＮＡｃβ残基がアクセプターに転移したことを示した（図２４）。
【０２５８】
【表１０】
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【０２５９】
β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによる特徴づけ
ＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ活性反応において形成した混合物をStreptococcus pneumoniae由来β１−２，３，４，６−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼで処理した。転移したβ−結合型ＧｌｃＮＡｃ残基の両方が切断されたことを判定するためにＭＡＬＤＩ ＭＳ分析を用いた（図２５）。
【０２６０】
β１−４ＧａｌＴによるガラクトシル化
ＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ活性反応で形成した混合物を牛乳由来β１−４ＧａｌＴで処理した。β１−４ＧａｌＴは、生成混合物中の末端ＧｌｃＮＡｃ残基をガラクトシル化すると予想される。β１−４ＧａｌＴ反応混合物のＭＡＬＤＩスペクトルによると、両方の生成物はガラクトシル化されていた。２個のガラクトースがＧｎ２Ｍａｎ３Ｇｎ生成物に転移しており、これは、ＧｌｃＮＡｃ残基が別々のマンノース枝に結合していることを示した（図２６）。
【０２６１】
ランダム組み込みによるＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ構築物を用いたT. reeseiのトランスフォーメーション
キメラＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ配列を設計し、ｇｐｄＡプロモーターを含有するベクターにクローニングした。プラスミド配列の検証後、それをヒグロマイシンマーカー遺伝子と共にT. reesei Ｍ１２４株に共トランスフォーメーションした。１３個のＰＣＲ陽性トランスフォーマントを同定した。全ての陽性トランスフォーマントおよび親株Ｍ１２４を、４％ラクトースおよび２％穀粒粕エキスを補充したＴｒＭＭ（ｐＨ４．８）中で培養した。加えて、４％ラクトース、２％穀粒粕エキス、および１％カザミノ酸を補充し、１００mM ＰＩＰＰＳ（ピペラジン１，４ビス２プロパンスルホン酸）で緩衝化したＴｒＭＭ（ｐＨ５．５）中で７個のトランスフォーマントおよび親株を培養した。株の成長速度をモニターするためにｐＨ測定を用いた。上清および菌糸体試料を３、５、および７日目に収集し、凍結保存し、グリカン構造について分析した。ｃｂｈ１プロモーターを含有するプラスミドにＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ配列もクローニングした。加えて、対照としてランダム組み込みによりT. reeseiにＧｎＴＩ構築物をトランスフォーメーションした。
【０２６２】
ランダム組み込みにより得られたT. reesei ＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ株のグリカン分析
２種の異なる培地中で培養したT. reesei Ｍ１２４株ＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩトランスフォーマントおよび親Ｍ１２４株の１５６個の上清試料を分析した。第１の培地は、２％穀粒粕エキスおよび４％ラクトースを補充したＴｒＭＭ（ｐＨ４．８）であり、第２の培地は、２％穀粒粕エキス、４％ラクトース、１００mM ＰＩＰＰＳ、および１％カザミノ酸を補充したＴｒＭＭ（ｐＨ５．５）であった。両方の種類の培地中で細胞を３、５および７日間成長させた。
【０２６３】
ＳＤＳ変性なしのＮ−グリカナーゼ反応は、３および５日の時点の試料の上清タンパク質５μｇについて三つ組みにして９６ウェルプレートで実施した。上清のタンパク質濃度は、標準としてＢＳＡを使用してブラッドフォードに基づくアッセイ（Bio Rad Quick Start Bradford Protein Assay）により測定した。中性および酸性Ｎ−グリカンの両方をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。
【０２６４】
３および５日の時点のいずれのクローンにも、予想されるＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ生成物の徴候を見ることができなかった。加えて、ランダム組み込みにより産生した、ｇｐｄＡプロモーターを有するＧｎＴＩおよびＧｎＴＩ／ＩＩトランスフォーマントから生成物は観測されなかった。
【０２６５】
ターゲット組み込みによるＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ構築物を用いたT. reeseiのトランスフォーメーション
ｃｂｈ１プロモーターのコントロール下のキメラＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ配列をｐｙｒ４遺伝子ループアウトマーカーと一緒に有するベクターを構築し、ターゲット組み込みのためにバックボーンベクターのａｌｇ３フランキング領域フラグメントの間にサブクローニングした。ＰｍｅＩ消化した発現カセットをT. reesei Ｍ１２７株（Ｍ１２４のｐｙｒ４−株）にトランスフォーメーションした。プレート選択後に、クローンをＰＣＲでスクリーニングし、単一胞子を介して精製した。グリカン分析用の材料を得るために、既述のように振盪フラスコ培養を行った。Ｍ１２７トランスフォーメーションでのａｌｇ３ローカスへの正しい組み込みを示す５個のＰＣＲ陽性トランスフォーマントを、４０g/lラクトース、２０g/l穀粒粕エキス、および１００mM ＰＩＰＰＳを補充したＴｒＭＭ（ｐＨ５．５）を含有する体積３００mlの培地中で＋２８℃にて７日間培養した。細菌の混入を避けるために、植菌時に１００mg/lアンピシリンをフラスコに添加した。グリカン分析用の試料を３、５および７日目に収集した。
【０２６６】
ａｌｇ３ローカスへのターゲティングにより得られたT. reesei ＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ株のグリカン分析
T. reesei Ｍ１２４株（対照）、Ｍ１２７ ＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩトランスフォーマントの５個の異なるクローンの上清試料、および対照培地試料を、上清タンパク質５μgについて三つ組みにして９６ウェルプレートで調製した。上清のタンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用してブラッドフォードに基づくアッセイ（Bio-Rad Quick Start Bradford Protein Assay）により測定した。ＰＮＧａｓｅ Ｆの反応を既述のように行ったが、ＳＤＳ変性は行わなかった。放出されたＮ−グリカンを、最初にHypersep Ｃ−１８を用いて、次にHypersep Hypercarb（どちらもThermo Scientific製）を用いて精製し、その際、中性および酸性グリカンを分離した。両方の精製を９６ウェル形式で行った。中性Ｎ−グリカンをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。
【０２６７】
T. reesei Ｍ１２７ ＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩトランスフォーマント由来の中性Ｎ−グリカンの比率を、ｐｙｒ４陽性である以外はＭ１２７株と同じであるＭ１２４株からの比率と比較した。５個のＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩトランスフォーマントのうち４個は、全ての時点（３、５および７日目）で主グリコフォームとしてＧ０を生成した。クローン４６ＡだけがＧ０陰性であった（図２７）。各クローンでのＭａｎ３Ｇｎの比率は全ての時点で小さかったが、Ｈｅｘ６の比率はまだ極めて大きかった。７日目に、クローン１７Ａは他のクローンに比べて最も多いＧ０および最も少ないＨｅｘ６を生成した（図２７）。振盪フラスコ条件で５日目にＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩトランスフォーマントの４個のクローンが約４０％のグリコフォームＧ０を生成した（図２７）。ｐＨコントロールした発酵条件は、ａｌｇ３ノックアウトでのＧ０生成物の量を増加させ、Ｈｅｘ６の量を減少させる可能性がある。
【０２６８】
培地試料中で、一連の植物型Ｎ−グリカンが観測されたが、Ｇ０に対応するシグナルは観測されなかった。
【０２６９】
ターゲット組み込みによるＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ構築物を用いたリツキシマブ生成T. reeseiのトランスフォーメーション
「ターゲット組み込みによるＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ構築物を用いたT. reeseiのトランスフォーメーション」という標題の節に記載の発現カセットを、T. reesei Ｍ２７９株（Ｍ２０２のｐｙｒ４−株）にトランスフォーメーションした。Ｍ１２４からｐｅｐ１プロテアーゼを欠失させること、およびリツキシマブ重鎖および軽鎖を導入すること（Ｋｅｘ２切断部位を有する）によりＭ２０２を得た。プレート選択後に、クローンをＰＣＲでスクリーニングし、単一胞子を介して精製した。グリカン分析用の材料を得るために、「ターゲット組み込みによるＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ構築物を用いたT. reeseiのトランスフォーメーション」という標題の節に記載の振盪フラスコ培養を行い、加えて、一部の培地に０．３mg/mlダイズトリプシン阻害剤（ＳＢＴＩ）および１％カザミノ酸を補充した。ＳＢＴＩを最初は植菌時に、次に３〜６日目に毎日添加した。ＰＭＳＦおよびペプスタチンＡを凍結前に全ての試料に添加した。
【０２７０】
ａｌｇ３ローカスへのターゲティングにより得られたリツキシマブ生成T. reesei ＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ株のグリカン分析
ＳＢＴＩ存在下の５日目の上清試料ならびにＳＢＴＩ不在下の５および７日目の試料から、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーでリツキシマブを精製した。変性タンパク質約１０μgについてＰＮＧａｓｅ Ｆ反応を行った。放出されたＮ−グリカンを最初にHypersep C-18で、次にHypersep Hypercarb（どちらもThermo Scientific製）で精製し、そこで中性および酸性グリカンを分離した。精製ステップは９６ウェル形式で行った。中性および酸性Ｎ−グリカンをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。２個のＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩトランスフォーマントクローン、９Ａ−１および３１Ａ−１は、Ｇ０グリコフォームをそれぞれ約３０％および約２４％生成した。しかし、適度な量のＨｅｘ６およびＧｎＭａｎ３もなお観測された（図２８）。他のクローンからのリツキシマブは、ほとんどまたは全くＧ０を含有しなかった。
【０２７１】
スペーサーの最適化
ＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ融合タンパク質について一連のスペーサー改変を構築した。これらの変異体をPichiaで生成させ、酵素の安定性および活性についてin vitroで検討した。
【０２７２】
ＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ融合タンパク質をクローニングするための材料および方法をここに記載する。Ｔ４５配列をＰＣＲ重複戦略を用いて二つの部分に分けて増幅した。最初にＧＰ１３ ５’プライマーおよびＧＰ９３ ３’プライマーを用いてフラグメントを増幅し、ＧＰ９２ ５’プライマーおよびＧＰ２ ３’プライマーを用いて第２のフラグメントを増幅した。Phusion高忠実度ＰＣＲポリメラーゼ（Finnzymes）を用いて、供給業者により提供された標準条件下で増幅を実施した。サイクリング条件は以下の通りであった：最初に９８℃で３０秒間変性、９８℃で５秒間変性、６５℃で３０秒間アニーリング、７２℃で４５秒間伸長を２０回繰り返し、最後に７２℃で２０分間伸長。生じたＰＣＲ生成物をFermentas GeneJETゲル抽出キットでアガロースゲルから精製した。重複する改変配列を有するこれらのフラグメントを、プライマーなしの標準条件で同じ反応混合物中に混ぜ合わせた。１０回のアニーリング／伸長サイクルを以下のように実施した：最初に９８℃で３０秒間変性、９８℃で５秒間変性、６５℃で３０秒間アニーリング、７２℃で４５秒間伸長を１０回繰返し、最後に７２℃で２０分間伸長。プライマーＧＰ１３（５’）およびＧＰ２（３’）を添加し、サイクリングを上記のように２０増幅サイクル継続した。増幅されたＴ４５フラグメントをFermentas GeneJET ＰＣＲ精製キットで精製し、ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩ（New England Biolabs）で標準プロトコールにより消化し、ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩ消化した酵母発現ベクターｐＢＬＡＲＧ−ＳＸにクローニングした。生じたベクターを、プライマー３’ＡＯＸ、５’ＡＯＸ、ＧＰ９、ＧＰ３７、ＧＰ３８およびＧＰ１２２を用いて配列決定した。配列は正しいことが分かった。
【０２７３】
この、生じたプラスミドを、３×Ｇ４Ｓスペーサー改変用のテンプレートとして使用した。Ｔ４６配列のクローニングを、Ｔ４５に関して上記のように行った。ＧＰ１３ ５’プライマーおよびＧＰ９５ ３’プライマーを最初のフラグメント合成のために使用し、ＧＰ９４ ５’プライマーおよびＧＰ２ ３’プライマーを第２のフラグメント合成のために使用した。フラグメントを混ぜ合わせ、プライマーＧＰ１３（５’）およびＧＰ２（３’）を増幅のために添加した。増幅されたフラグメントＴ４６を次にＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩで消化し、酵母発現ベクターｐＢＬＡＲＧ−ＳＸにクローニングした。生じたベクターを、上記プライマーを用いて配列決定し、配列は正しいことが分かった。
【０２７４】
セルラーゼ関連天然スペーサーを類似のＰＣＲ重複法で構築した。ＣＢＨＩ関連スペーサーに関して、第１のフラグメントを、ＧＰ１３ ５’プライマーおよびＧＰ１０７ ３’プライマーを用いて増幅した。第２のフラグメントをＧＰ１０８ ５’プライマーおよびＧＰ２ ３’プライマーを用いて増幅した（表１１）。ＥＧＩＶ関連スペーサーに関して、第１のフラグメントをＧＰ１３ ５’プライマーおよびＧＰ１０９ ３’プライマーを用いて増幅した。第２のフラグメントを、ＧＰ１１０ ５’プライマーおよびＧＰ２ ３’プライマーを用いて増幅した（表１１）。どちらの場合も、ＰＣＲ生成物をアガロースゲルから精製し、混ぜ合わせ、次のＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用して配列Ｔ５０およびＴ５１を増幅した。次に、Ｔ５０およびＴ５１ ＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩで消化し、酵母発現ベクターｐＢＬＡＲＧ−ＳＸにクローニングした。
【０２７５】
全てのＰＣＲ増幅は、高忠実度Phusionポリメラーゼ（Finnzymes）を用いて行った。プライマー（表１１）は、MWG Operonから取り寄せた。配列決定は、ヘルシンキ大学バイオテクノロジー研究所ＤＮＡ配列決定研究室（DNA Sequencing Laboratory of the Institute of Biotechnology, University of Helsinki）が商業サービスとして行った。
【０２７６】
【表１１】
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【０２７７】
スペーサー改変された（３×Ｇ４Ｓおよび２×Ｇ４Ｓ）ＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ融合酵素を、実施例３でのＧｎＴＩについて記載したものと類似の方法で濃縮および緩衝液交換により活性アッセイ用に処理した。活性アッセイを、Ｍａｎ３Ｇｎアクセプターを用いて実施し、反応混合物をＧｎＴＩ活性アッセイに記載したように精製した。ＭＡＬＤＩ分析もＧｎＴＩ反応混合物に関して記載したように行ったが、加えてＧｎＴＩＩ生成物Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ３の形成を追跡した。Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ３の［Ｍ＋Ｎａ］＋シグナルについての計算ｍ／ｚ値は１１３６．３１８であった（図２９）。
【０２７８】
スペーサー変異体
ＧｎＴＩＩ／Ｉスペーサー変異体をＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質の野生型スペーサー配列から改変した。改変されたスペーサーを表１２に列挙する。全部で４個のスペーサー変異体株（ＧＹ３２、ＧＹ３３、ＧＹ４９、およびＧＹ５０）、野生型ＧｎＴＩＩ／Ｉ融合株（ＧＹ７−２）、および偽（mock）株（ＧＹ３）を、プロテアーゼ阻害剤存在下で＋１６℃で発現させた。株をＢＭＧＹ培地６０mlに＋３０℃、２２０rpmで一晩（ｏ／ｎ）植菌した。一晩培養物をペレットにし、細胞をＢＭＭＹ培地６０ml中に再懸濁した。ＭｅＯＨ誘導の開始と同時に、およびその後は１日１回、プロテアーゼ阻害剤である１mM ＥＤＴＡ、１．５μMペプスタチンＡ（Sigma）および完全ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤１個（Roche）を培養液に添加した。３日目および４日目に試料２５mlを培養液から採取し、濃縮チューブ（Millipore）を使用して上清試料を濃縮し、ＰＤ−１０カラムで緩衝液を１００mM ＭＥＳ（ｐＨ６．１）に交換し、最終的に５０倍濃縮した。野生型の細胞ペレット（３番目）以外、細胞ペレットを１×ＰＢＳ ５００μl中に再懸濁し、野生型の細胞ペレットは、１００mM ＭＥＳ（ｐＨ６．１）および完全（ＥＤＴＡ不含）阻害剤カクテル５００μl中に再懸濁した。
【０２７９】
３×Ｇ４Ｓスペーサーを含有するＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１１９に示す。３×Ｇ４Ｓスペーサーを含有するＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ融合タンパク質のヌクレオチド配列を配列番号１４１に示す。２×Ｇ４Ｓスペーサーを含有するＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１２１に示す。２×Ｇ４Ｓスペーサーを含有するＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ融合タンパク質のヌクレオチド配列を配列番号１３９に示す。ＣＢＨＩスペーサーを含有するＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１２３に示す。ＣＢＨＩスペーサーを含有するＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ融合タンパク質のヌクレオチド配列を配列番号１４３に示す。ＥＧＩＶスペーサーを含有するＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１２５に示す。ＥＧＩＶスペーサーを含有するＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ融合タンパク質のヌクレオチド配列を配列番号１４５に示す。
【０２８０】
遠心分離を繰返すことおよび完全（ＥＤＴＡ不含）阻害剤カクテルを有する１００mM ＭＥＳ（ｐＨ６．１）中に細胞を再懸濁することにより、細胞懸濁物試料２００μlを洗浄した。洗浄した細胞試料２００μlを採取すること、ガラスビーズ５０μlおよびトリトンＸ−１００ ２μlを添加すること、ならびにビーズ攪拌器中に６分間入れることによって細胞溶解液を調製した。５０倍濃縮したP. pastoris培養上清、細胞試料および細胞溶解液のＧｎＴＩ活性アッセイを上記のように行った。
【０２８１】
【表１２】
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【０２８２】
３日目からの細胞ペレットおよび５０倍濃縮培養上清のウエスタンブロット分析を図３０に示す。ＣＢＨＩスペーサー変異体（ＧＹ４９）は、上清からではなく、細胞ペレット試料から強いシグナルを発した。ＥＧＩＶスペーサー変異体（ＧＹ５０）を上清から検出し、かすかなシグナルだけが得られた。上清試料からのかすかなシグナルは、野生型ＧｎＴＩＩ／Ｉ融合株（ＧＹ７−２）ならびに２×Ｇ４Ｓスペーサー変異株ＧＹ３３−７およびＧＹ３３−８でも得られた（図３０）。
【０２８３】
次に、スペーサー変異体を含有するＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質の活性を、野生型スペーサーを含有するＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質の活性と比較した。
【０２８４】
上清中の融合ＧｎＴＩＩ／Ｉの活性。ＧｎＴＩ基質Ｍａｎ３Ｇｎを提供すると、反応生成物ＧｎＭａｎ３Ｇｎは、融合タンパク質のＧｎＴＩＩ活性についてのアクセプターとして作用した。３日および４日の発現期の後に、活性アッセイ用の試料を採取した。図３１に、野生型スペーサーまたはスペーサー変異体のいずれかを含有するＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質の培養物の活性アッセイの結果を示す。試料の培養は、阻害剤（１．５μMペプスタチンＡ、１mM ＥＤＴＡ、１錠/５０mlの完全ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤）の存在下で行った。分かり易くするために、ＧｎＴＩおよびＧｎＴＩＩの反応生成物を一緒に添加した。全ての活性アッセイ試料は、ＧｎＴＩ生成物ＧｎＭａｎ３Ｇｎを少量（＜５％）だけ含有し、ＧｎＴＩＩがＧｎＭａｎ３ＧｎをＧｎ２Ｍａｎ３Ｇｎに活発に変換したことを示した。
【０２８５】
全部で４個のスペーサー変異体がＧｎＴ活性を示したものの、クローン間および培養日数間で幾分変動があった。２×Ｇ４Ｓ（クローン＿１）、３×Ｇ４Ｓ（クローン＿１およびクローン＿２）、またはＥＧＩＶスペーサー変異体を含有するＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質は、野生型スペーサーを有する酵素よりも高い活性を示した（図３１）。ＣＢＨＩスペーサー変異体を含有するＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質は、野生型スペーサーを有する酵素に匹敵する活性を示した（図３１）。２×Ｇ４Ｓ変異体を含有するＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質（クローン＿２）は、野生型スペーサーを有する酵素よりも低い活性を有した（図３１）。４日目の試料は、３日目の試料よりも高い活性を有したが、例外として、３×Ｇ４Ｓスペーサー変異体を含有するＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質（クローン＿１およびクローン＿２）は３日目の方が高い活性を示した（図３１）。ＥＧＩＶスペーサー変異体を含有するＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質は、４日目に最高の活性を有した（図３１）。
【０２８６】
細胞および細胞溶解物中の融合ＧｎＴＩＩ／Ｉ活性。野生型スペーサーを有するＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質を含有する細胞からの細胞試料、細胞溶解物試料、および上清試料の活性アッセイは、細胞溶解物試料が最高の活性を含有したことを示した（図３２）。２番目に高い活性は、細胞表面上にあり、最低の活性は、上清試料に見られた（図３２）。したがって、大部分のＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質が細胞中または細胞表面上に局在し、少量だけが分泌されたと思われる。
【０２８７】
野生型スペーサーまたはスペーサー変異体のいずれかを有するＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質を含有する細胞のＧｎＴ活性を図３３に示す。完全ＥＤＴＡ不含阻害剤カクテルを有する１００mM ＭＥＳ（ｐＨ６．１）５００μl中に細胞を、およびＰＢＳ ５００μｌ中にスペーサー変異体を再懸濁し、活性試験用の細胞および溶解物を、上記のように調製した。
【０２８８】
図３３に示すように、スペーサー変異体を含有するＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質は、上清よりも細胞中の方がずっと高いＧｎＴＩＩ／Ｉ活性を有した。溶解物中で、酵素は、不活性に見えた。この活性の欠如は、放出されたプロテアーゼの作用が原因と考えられる。ＣＢＨＩスペーサー変異体を含有するＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質は、細胞および溶解物の方が高い活性を示したが（図３３）、これは、細胞ペレット試料の方が高いシグナルを示したウエスタンブロット分析に関係する（図３０）。
【０２８９】
考察。上清において、２×Ｇ４Ｓおよび３×Ｇ４Ｓスペーサー変異体を含有するＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質は、野生型スペーサーを含有するＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質よりも高い活性を有し、一方でＣＢＨＩスペーサー変異体は、野生型スペーサーを含有するＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質に匹敵する活性を有した。その上、ＥＧＩＶスペーサー変異体を含有するＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質は、最高のＧｎＴ活性を示した。３日目の試料のウエスタンブロット分析は、４日目の活性の結果と幾分相関を有した。ウエスタンブロット分析は、野生型、２×Ｇ４ＳおよびＥＧＩＶの両クローンの上清試料でかすかなバンドを示した。活性は以下の順序で検出された：ＥＧＩＶ＞２×Ｇ４Ｓ（クローン＿１）＞３×Ｇ４Ｓ（クローン＿２）＞３×Ｇ４Ｓ（クローン＿１）≧ＣＢＨＩ＝野生型＝２×Ｇ４Ｓ（クローン＿２）。
【０２９０】
野生型スペーサーを含有するＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質の上清、細胞、および細胞溶解物試料中のＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質活性の決定は、大部分の活性が細胞内に関連し、より少ない量が分泌されることを示した。このことは、ウエスタンブロット分析において、なぜ上清画分よりも細胞画分の方にずっと良好なＨｉｓタグ付きＧｎＴＩＩ／Ｉシグナルが認められたかを説明すると考えられる。
【０２９１】
完全ＥＤＴＡ不含阻害剤錠剤によるセリンおよびシステインプロテアーゼの、ＥＤＴＡによるメタロプロテイナーゼの、ならびにペプスタチンＡによるアスパラギン酸プロテアーゼの阻害は、ＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質の収率を改善した。セリンプロテアーゼ阻害剤の使用に関するこの観測は、P. pastorisの培地中のセリン型プロテアーゼ活性がＰＭＳＦで完全に阻害されたことを示したSalaminら（Appl. Environ. Microbiol., 76 (2010) 4269-4276）の研究に一致する。加えて、Vadら（J. Biotechnol. 116 (2005) 251-260）は、P. pastorisにおいて１０mM ＥＤＴＡの存在下で、Saccharomyces cerevisiaeタンパク質であるジスルフィドイソメラーゼの共発現と組み合わせて、インタクトなヒト副甲状腺ホルモンが３００mg/lを超える高い生成を示したことを報告した。
【０２９２】
４個のスペーサー変異体のそれぞれを含有する全てのＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質がＧｎＴＩＩ／Ｉ活性を有し、２×Ｇ４ＳおよびＥＧＩＶスペーサー変異体を有する酵素の活性が、野生型スペーサーを含有するＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質よりも高い活性を有した。
【０２９３】
実施例６  −  アクセプター性グリカンとしてのＭａｎ５への融合タンパク質の使用
Ｍａｎ５型Ｎ−グリコシル化を有するリツキシマブ発現T. reesei株の構築
ネイティブなリツキシマブ配列はコドンが調和している。合成されたリツキシマブ軽鎖および重鎖を含有する原型プラスミドを産生した。抗体鎖およびＣＢＨＩ融合タンパク質は、４０ヌクレオチド重複配列を有するように設計し、酵母相同組み換えを用いたクローニングを可能にするために、重鎖についての発現ベクターｐＨＨＯ１（アセトアミダーゼ選択マーカーｃｂｈ１がｃｂｈ１ローカスへの組み込み用に隣接する）または軽鎖についてのｐＨＨＯ２（ヒグロマイシン選択マーカーｅｇｌ１がｅｇｌ１ローカスへの組み込み用に隣接する）も同じく設計する。
【０２９４】
得られた遺伝子プラスミドをE. coliにトランスフォーメーションする。ＤＮＡを調製し、合成遺伝子を消化し、プラスミド骨格から単離する。発現ベクターを、ＣＢＨＩ融合タンパク質および重鎖または軽鎖のいずれかを有するT. reesei発現ベクターを用いた酵母相同組み換えにより、発現ベクターを構築する。組み換えされたプラスミドを酵母からレスキューし、E. coliにトランスフォーメーションする。ＰＣＲスクリーニング後に、正しいクローンを単離し、配列決定する。発現カセットフラグメントを消化し、プラスミド骨格から単離し、重鎖構築物について約１０．２kbのフラグメントおよび軽鎖構築物について１０．８kbフラグメントが生じる。重鎖および軽鎖フラグメントをT. reesei Ｍ１２４株に共トランスフォーメーションする。ヒグロマイシン耐性および単独窒素源としてアセトアミドで成長する能力についてトランスフォーマントを選択する。連続する２回のラウンドで二重選択培地上にトランスフォーマントを画線し、ゲノムへの発現構築物の組み込みについてＰＣＲにより試験する。
【０２９５】
リツキシマブ抗体を発現しているT. reesei株へのＧｎＴＩＩ／Ｉタンデム酵素およびマンノシダーゼＩＩの導入
リコンビナントＧｎＴＩＩ／ＩをＭ１２４などのＭａｎ５産生株に導入することに加え、ＧｎＴＩＩ／Ｉがアクセプター分子としてＧｌｃＮＡｃＭａｎ３を利用することができるようにＧｌｃＮＡｃＭａｎ５グリカン構造から２個のマンノースを除去するために、マンノシダーゼＩＩ活性がさらに必要である。
【０２９６】
上記の方法を本質的に用いて、上述の実施例に記載されたＧｎＴＩＩ／Ｉ発現カセットを、例えばT. reeseiのｃｂｈ２ローカスにターゲティングすることができる。次に、ＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質用のＧｌｃＮＡｃＭａｎ３アクセプター分子を産生するために、上記トランスフォーメーション法を用いて、マンノシダーゼＩＩ活性をその株に導入する。
【０２９７】
マンノシダーゼ発現を推進するためのプロモーターを有する所望のマンノシダーゼ含有発現カセットを設計することにより、マンノシダーゼＩＩ活性をリツキシマブ抗体発現Ｍ１２４株に導入する。有用なプロモーターは、ｇｐｄＡまたはｃｂｈ１由来である。マンノシダーゼＩＩ活性は、ランダム組み込みに続く、最も適切な発現レベルを有する株のスクリーニングによりトランスフォーメーションすることができる。発現カセットを、専売の選択マーカー遺伝子と連結するか、または選択マーカーを、別々の発現カセットとして共トランスフォーメーションする。トランスフォーメーションは、上記方法にしたがって行う。
【０２９８】
マンノシダーゼＩＩ融合構築物を、T. reeseiの細胞質ドメイン、膜貫通ドメインおよびステムドメイン、またはＫＲＥ２ターゲティングペプチドから得て、ヒトマンノシダーゼＩＩのＮ末端アミノ酸欠失にフレーム内結合することができる。コードされた融合タンパク質は、そのマンノシダーゼ触媒ドメイン活性を保持しながら、ＫＲＥ２ターゲティングペプチド配列によりＥＲ／ゴルジ体に局在し、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２をＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に加水分解することができる。ある態様では、完全長ヒトマンノシダーゼＩＩは、Ｍ１２４で発現させることができる。
【０２９９】
ＫＲＥ２ターゲティングペプチドは、ＫＲＥ２のアミノ酸約１〜約１０６番または約１〜約８３番を含む。
Ｋｒｅ２  ａａ１〜１０６
ＭＡＳＴＮＡＲＹＶＲＹＬＬＩＡＦＦＴＩＬＶＦＹＦＶＳＮＳＫＹＥＧＶＤＬＮＫＧＴＦＴＡＰＤＳＴＫＴＴＰＫＰＰＡＴＧＤＡＫＤＦＰＬＡＬＴＰＮＤＰＧＦＮＤＬＶＧＩＡＰＧＰＲＭＮＡＴＦＶＴＬＡＲＮＳＤＶＷＤＩＡＲＳＩＲＱ（配列番号１１５）
Ｋｒｅ２  ａａ１〜８３
ＭＡＳＴＮＡＲＹＶＲＹＬＬＩＡＦＦＴＩＬＶＦＹＦＶＳＮＳＫＹＥＧＶＤＬＮＫＧＴＦＴＡＰＤＳＴＫＴＴＰＫＰＰＡＴＧＤＡＫＤＦＰＬＡＬＴＰＮＤＰＧＦＮＤＬＶＧＩＡＰＧＰＲ（配列番号１１６）
【０３００】
Trichodermaに上記マンノシダーゼＩＩ構築物をトランスフォーメーション後、Trichoderma株を選択し、２回の連続するラウンドで選択培地上に画線し、ゲノムへの発現構築物の組み込みについてＰＣＲにより試験する。次に、Ｍａｎ５生成性で、ＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質、マンノシダーゼＩＩ、およびリツキシマブ抗体を発現する、選択されたTrichoderma株トランスフォーマントを振盪フラスコ中または培養槽条件で培養し、上記のようにグリカン含量について分析した。
【０３０１】
実施例７  −  T. reeseiにおけるＧｎＴＩおよびＧｎＴＩＩの発現
ランダム組み込みによるＧｎＴＩ構築物を用いたT. reesei Ｍ１２４のトランスフォーメーション
コドン最適化されたヒトＧｎｔＩをT. reesei Ｍ１２４株にトランスフォーメーションした。ＧｎｔＩ遺伝子を二つの異なるプロモーターのコントロール下のベクターにクローニングした：（１）ｃｂｈ１遺伝子の誘導性プロモーター；および（２）ｇｐｄＡ遺伝子の構成的発現されたプロモーター。二つのプロモーターのいずれかの下でＧｎｔＩを含有するベクターを、それぞれアセトアミダーゼ遺伝子またはヒグロマイシン耐性マーカー遺伝子のいずれかを含有するプラスミドと共にT. reesei Ｍ１２４株に共トランスフォーメーションした。
【０３０２】
ｇｐｄＡプロモーター下およびアセトアミド選択下のＧｎｔＩを有する３４個のトランスフォーマントをＰＣＲによりスクリーニングし、全てがＧｎｔＩ陽性であった。ｃｂｈ１プロモーター下およびアセトアミド選択下のＧｎｔＩを有するトランスフォーマントについて、２６個中１９個がＧｎｔＩ構築物についてＰＣＲ陽性であった。加えて、初回のＤＮＡ抽出は、ｃｂｈ１プロモーター下およびヒグロマイシン選択下のＧｎｔＩを有する５株について行った。これらの株の全てがＰＣＲ陽性であった。２５個のｇｐｄＡプロモータートランスフォーマントおよび全てのｃｂｈ１プロモータートランスフォーマント（１４＋５）を単核クローンに精製し、胞子懸濁物を調製した。
【０３０３】
初回分析目的のために、２３個のｇｐｄＡプロモータートランスフォーマントおよび１９個のｃｂｈ１プロモータートランスフォーマント（１４個はアセトアミドから、５個はヒグロマイシン選択から成長した）、ならびに親株Ｍ１２４を、２％穀粒粕エキスおよび４％ラクトースを補充したTrichoderma最少培地５０mlを有する２５０ml振盪フラスコ中で培養した。株の成長をｐＨ測定によりモニターした。試料（上清および菌糸体）を３、５、および７日目に収集し、グリカン構造分析のために使用するまで凍結保存した。
【０３０４】
ランダム組み込みにより得られたT. reesei ＧｎＴＩ株のグリカン分析
全ての上清試料のタンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用してブラッドフォードに基づくアッセイ（BioRad Quickstart Bradford Protein Assay）により測定した。Ｎ−グリカン分析に供された試料の分泌タンパク質含量を５μｇまたは１０μｇに調整した。上清タンパク質５μｇについて９６ウェルプレート、または上清タンパク質１０μgについて１．５mlチューブのいずれかで、Ｎ−グリカン分析を行った。全てのＮ−グリカン分析を三つ組みで行った。中性および酸性Ｎ−グリカンの両方をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで分析した。
【０３０５】
４個のＧｎＴ１トランスフォーマント（３および５日目）において生成されたＧｎＴ１生成物Ｇｎ１Ｈｅｘ５の量および同じく生成した酸性Ｎ−グリカンの量のより正確な測定を行うために、ＭＡＬＤＩスペクトルに公知のグリカンを添加した。中性および酸性Ｎ−グリカンについて、１１７７Daの質量値の２pmol/スペクトルの内部較正剤Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ４および１３６２Daの質量値の０．５pmolのモノシアリル化Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ２をそれぞれ使用した。分析を三つ組みで行った。
【０３０６】
いずれのｇｐｄＡプロモータートランスフォーマントからもＧｎＴ１生成物は観測されなかった。しかし、８個のｃｂｈＩプロモータートランスフォーマント（５個はヒグロマイシン選択され、３個はアセトアミド選択されたもの）がＧｎＴ１生成物Ｇｎ１Ｍａｎ５を生成した（図３４および３５、ならびに表１３）。
【０３０７】
【表１３】
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【０３０８】
ＧｎＴ１生成物Ｇｎ１Ｍａｎ６Ｐ１、Ｇｎ１Ｍａｎ７Ｐ１、およびＧｎ１Ｍａｎ８Ｐ１も、全ての陽性トランスフォーマントのリン酸化Ｎ−グリカン中に見出された。リン酸化Ｎ−グリカンの量は、ＧｎＴ１トランスフォーマントで増加し、プロファイルはより大きなＮ−グリカンに偏り、Ｍａｎ７Ｐ１またはＭａｎ８Ｐ１が最も強いシグナルを有した（親Ｍ１２４ではＭａｎ６Ｐ１）（図３６）。
【０３０９】
８個のＧｎＴＩトランスフォーマントがＧｎ１Ｍａｎ５構造を生成した。Ｇｎ１Ｍａｎ５はクローン３９で最も存在度が高かった。しかし、２番目に高いレベルのＧｎ１Ｍａｎ５を生成したが、高い比率のＭａｎ５およびＧｎ１Ｍａｎ５を有したクローン８が最良のクローンであると思われた（図３５）。ｃｂｈＩプロモーターのコントロール下でＧｎＴＩを含有するクローン８をＭ１９８株と名付け、分析継続のために選択した。
【０３１０】
ターゲット組み込みによるＧｎＴＩＩ構築物を用いたT. reesei Ｍ１９８株のトランスフォーメーション
５個のＧｎＴＩＩ保有ベクターを生み出した（表１４）。２個のベクターがＧＮＴＩＩ中にネイティブな哺乳動物ゴルジ体ターゲティングペプチドを含有した。残りの３個のベクターでは、哺乳動物ターゲティングペプチドがT. reesei ＭＮＴ１（α−１，２−マンノシルトランスフェラーゼ）ターゲティングペプチドに置き換えられていた。全部で５個のベクターがｃｂｈ１プロモーターまたはｇｐｄＡプロモーターのいずれかおよびｐｙｒ４ループアウトマーカーを含有した。追加的に、全部で５個のベクターが、ａｌｇ３ローカスに組み込むようにターゲティングされ、したがってａｌｇ３遺伝子を欠失していた。ｃｂｈ１プロモーター下のＭＮＴ１／ＧｎＴＩＩ構築物のうち、２個の異なる大きさのＧｎＴＩＩ配列欠失を試験した。
【０３１１】
【表１４】
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【０３１２】
ｐＴＴｖ１４４ベクターを除くこれらのベクターを、最良のｐｙ４陰性ＧｎＴＩ生成株Ｍ１９８（Ｍ３１９）にＰｍｅＩフラグメントとしてトランスフォーメーションした。トランスフォーマントを精製して単核クローンにし、ＰＣＲをスクリーニングした。次に、両端に正しい組み込みを示しているクローンを分析継続のために選択した。
【０３１３】
産生したＧＮＴＩＩ発現株の成長特性を研究するために、大量の振盪フラスコ培養物を調製した。振盪フラスコ培養物を２回の別々の回分培養で調製した。最初の回分培養物はｐＴＴｖ１４０、ｐＴＴｖ１４２、およびｐＴＴｖ１４３を含有した。２回目の回分培養物はｐＴＴｖ１４１を含有した。親株Ｍ１９８を対照株として使用した。４０g/lラクトース、２０g/l穀粒粕エキス、および１００mM ＰＩＰＰＳを補充したＴｒＭＭ培地（ｐＨ５．５）中で細胞を成長させた。構築物１個あたり５個のトランスフォーマントを培養した。ｐＴＴｖ１４０、ｐＴＴｖ１４２、およびｐＴＴｖ１４３培養物を３、５、７、および９日目にサンプリングした。ｐＴＴｖ１４１培養物を３、５、７、および１０日目にサンプリングした。各試料のｐＨおよび細胞乾燥重量を測定し、培養上清試料をグリカン構造分析のために使用した。
【０３１４】
T. reesei Ｍ１９８株のａｌｇ３ローカスにＧｎＴＩＩをターゲティングすることにより得られたT. reesei株のグリカン分析
ｐＴＴｖ１４０ベクター（ネイティブなターゲティングペプチドおよびｃｂｈＩプロモーターを含有）、ｐＴＴｖ１４２ベクター（ＭＮＴ１ターゲティングペプチド、ＧＮＴＩＩの７４aa Ｎ末端欠失、およびｃｂｈＩプロモーターを含有）、ｐＴＴｖ１４３ベクター（ＭＮＴ１ターゲティングペプチド、ＧＮＴＩＩの１１０aa Ｎ末端欠失、およびｃｂｈＩプロモーターを含有）、およびｐＴＴｖ１４１ベクター（ターゲティングペプチドおよびｇｐｄＡプロモーターを含有）を含有する５個の異なるクローンを分析した。
【０３１５】
５日目の試料については三つ組みで、３および７日目の試料については二つ組で、上清タンパク質５μgについて９６ウェルプレートを用いてＮ−グリカン分析を準備した。上清のタンパク質濃度を、ＢＳＡを標準として使用してブラッドフォードに基づくアッセイ（BioRad Quickstart Bradford Protein Assay）により測定した。ＰＮＧａｓｅ Ｆ反応は既述のように行った。放出されたＮ−グリカンを最初にHypersep Ｃ−１８ １００mgで、次にHypersep Hypercarb １０mg（どちらもThermo Scientific製）で精製し、そこで中性および酸性グリカンを分離した。両方の精製を９６ウェル形式で行った。中性Ｎ−グリカンをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより分析した。
【０３１６】
ＧｎＴＩＩをトランスフォーメーションされた４個の異なる株のＮ−グリカンを分析した。
クローン
１−１１７Ａ、ｐＴＴｖ１４０ベクターをトランスフォーメーションされたことにより、ネイティブなターゲティングペプチドおよびｃｂｈＩプロモーターを含有し、約４０％のＧ０および約１３％のＨｅｘ６を生成した（図３７Ａ）。ｐＴＴｖ１４３ベクターをトランスフォーメーションされたことにより、ＭＮＴ１ターゲティングペプチド、ＧｎＴＩＩの１１０ａａ Ｎ末端末端欠失、およびｃｂｈＩプロモーターを含有するクローンは、約１０％のＧ０を生成した（図３７Ｃ）。ｇｂｄＡプロモーターを含有したクローン３Ｂは、約２８％のＧ０および約１９％のＨｅｘ６を生成した（図３７Ｄ）。
【０３１７】
ｐＴＴｖ１４０、ｐＴＴｖ１４１、およびｐＴＴｖ１４２ベクターを含有する代表的なクローンのグリコシル化パターンも、時間の関数として安定であることが示された（図３８）。
【０３１８】
タンパク質の特異的グリコシル化
グリコシル化におけるタンパク質特異的変化を分析するために、ｐＴＴｖ１４２ベクター含有クローン３−１７Ａおよび親株Ｍ１９８由来の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦメンブランにブロッティングした。関心がもたれるタンパク質バンド（Ｍ１９８のバンド４本および３−１７Ａクローンの４本）を切り出し、ＰＮＧａｓｅ Ｆを用いたメンブラン上酵素放出でＮ−グリカンを遊離させた（図３９）。
【０３１９】
剥離および精製した中性Ｎ−グリカンを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いて分析した。総分泌タンパク質のグリコシル化パターンは、Ｍ１９８親株の分離された５０kDaタンパク質に類似していた（図４０）。最小サイズのタンパク質バンドはグリコシル化されていなかった。
【０３２０】
ＧｎＴＩＩクローン３−１７Ａでは、典型的でないシグナルの大部分が消失し、それらのシグナルが培地起源であることが確認された。追加的に、クローン３−１７Ａのグリコシル化パターンは、総分泌タンパク質のグリカンパターンと異なった（図４０Ｂ）。クローン３−１７ＡからのＧ０の量は、約３５〜３６％であった（図４０Ｂ）。
【０３２１】
ＧｎＴＩＩ株の発酵槽培養
ＧｎＴＩＩ １−１１７Ａ Ｍ３２９株（ｐＴＴｖ１４０ベクターを含有する）の発酵培養は、ＴｒＭＭ（ｐＨ５．５）＋２％穀粒粕エキス＋６％ラクトース＋０．５％ＫＨ２ＰＯ４＋０．５％（ＮＨ４）２ＳＯ４中で＋２８℃（ｐＨ５．５）にて行った。３日目に採取した試料に関して、上記「タンパク質特異的グリコシル化」の節に記載の分泌タンパク質５μgについて三組みでＮ−グリカン分析を行った。３日目にＧ０の量は約４８％であり、Ｈｅｘ６の量は約１９％であった（図４１）。
【０３２２】
実施例８  −  T. reesei ＡＬＧ３ホモログ
ランダム組み込みによるＧｎＴＩ構築物を用いたT. reesei Ｍ１２４のトランスフォーメーション
他の生物からT. reesei ＡＬＧ３ホモログを同定した。これらのホモログは、T. reesei以外の糸状菌細胞用のＡＬＧ３欠失構築物を設計するために使用することができる。ＡＬＧ３ホモログを表１５に列挙する。T. reesei ＡＬＧ３およびＡＬＧ３ホモログの複数のアミノ酸配列アライメントを図４２に示す。
【０３２３】
【表１５】
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【０３２４】
実施例９  −  ＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ融合タンパク質変異体
ＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ発現構築物の産生
誘導性プロモーターｃｂｈ１のコントロール下であり、４個のスペーサー変異体のうち１個を含有するリコンビナントＧｎＴＩ／ＩＩ融合タンパク質を、実施例４および５に記載するように構築した。４個のスペーサー変異体は、２×Ｇ４Ｓスペーサー、３×Ｇ４Ｓスペーサー、ＣＢＨＩスペーサー、およびＥＧＩＶスペーサーである。
【０３２５】
簡潔には、融合部位で５０bpフレーム内重複を含有するプライマーを用いて、ＧｎＴＩＩおよびＧｎＴＩテンプレートから融合フラグメントを別々に増幅する。フラグメントをアガロースゲルから精製し、標準的な手順により融合構築物の増幅用のＰＣＲテンプレートとして使用する。融合構築物を、誘導性プロモーターｃｂｈ１のコントロール下でＡｐａＩ／ＳｐｅＩ制限部位を有するベクターにクローニングする。追加的に、ＧＮＴＩＩドメイン中のネイティブな哺乳動物ＧｏｌｇｉターゲティングペプチドをT. reesei ＭＮＴ１（α−１，２−マンノシルトランスフェラーゼ）ターゲティングペプチドによって置き換えた。
【０３２６】
融合タンパク質に２×Ｇ４Ｓスペーサー変異体を導入するために、ＰＣＲ重複戦略を用いてＴ４５配列を二つの部分に分けて増幅する。最初に、ＡＫＴ１−６−１ ５’プライマー（ＧＧＴＡＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＴＧＣＧＣＡＴＣＡＴＧＣＧＣＴＴＣＣＧＡＡＴＣＴＡＣＡＡＧＣＧ（配列番号１４６））およびＧＰ９３ ３’プライマーを用いてフラグメントを増幅し、ＧＰ９２ ５’プライマーおよびＡＫＴ１−６−４ ３’プライマー（ＧＧＣＧＣＧＣＣＡＣＴＡＧＴＣＴＡＡＴＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＡＴＣＡＴＡＧＣＣ（配列番号１４７））を用いて第２のフラグメントを増幅する。Phusion高忠実度ＰＣＲポリメラーゼ（Finnzymes）を用いて、供給業者によって提供される標準条件下で増幅を実施する。サイクリング条件は実施例５に記載する通りである。生じたＰＣＲ生成物をアガロースゲルから精製し、重複する改変配列を有するフラグメントを、プライマーを有さない標準条件と同じ反応混合物中に混ぜ合わす。１０回のアニーリング／伸長サイクルは実施例５に記載するように実施する。プライマーＡＫＴ１−６−１（５’）およびＡＫＴ１−６−４（３’）を添加し、実施例５に記載するようにサイクルを２０増幅サイクルにわたり継続する。次に、増幅したＴ４５フラグメントを精製し、ＡｐａＩ／ＳｐｅＩ（New England Biolabs）で標準プロトコールにしたがって消化し、Trichoderma reesei発現ベクターにクローニングする。次に、クローニングされたフラグメントを、適切なプライマーセットを用いた配列決定により検証し、産生した配列を、２×Ｇ４Ｓプロモーターおよびａｌｇ３ターゲティングを有するT. reesei発現ベクターの構築のために使用する。
【０３２７】
生じたプラスミドを、３×Ｇ４Ｓスペーサー改変用のテンプレートとして使用する。Ｔ４６配列のクローニングは、Ｔ４５に関して上記したように行う。ＡＫＴ１−６−１ ５’プライマーおよびＧＰ９５ ３’プライマーを第１のフラグメント合成のために使用し、ＧＰ９４ ５’プライマーおよびＡＫＴ１−６−４ ３’プライマーを第２のフラグメント合成のために使用する。フラグメントを混ぜ合わせ、プライマーＡＫＴ１−６−１（５’）およびＡＫＴ１−６−４（３’）を増幅のために添加する。次に、増幅したフラグメントＴ４６をＡｐａＩ／ＳｐｅＩで消化し、Trichoderma reesei発現ベクターにクローニングする。次に、クローニングされたフラグメントを、適切なプライマーセットを用いた配列決定により検証し、産生した配列を、３×Ｇ４Ｓプロモーターおよびａｌｇ３ターゲティングを有するT. reesei発現ベクターの構築のために使用する。
【０３２８】
ＣＢＨＩおよびＥＧＩＶスペーサーを、類似のＰＣＲ重複法で構築する。ＣＢＨＩスペーサーについて、第１のフラグメントは、ＡＫＴ１−６−１ ５’プライマーおよびＧＰ１０７ ３’プライマーを用いて増幅する。第２のフラグメントは、ＧＰ１０８ ５’プライマーおよびＡＫＴ１−６−４ ３’プライマーを用いて増幅する（表１１）。ＥＧＩＶスペーサーについて、第１のフラグメントは、ＡＫＴ１−６−１ ５’プライマーおよびＧＰ１０９ ３’プライマーを用いて増幅する。第２のフラグメントは、ＧＰ１１０ ５’プライマーおよびＡＫＴ１−６−４ ３’プライマーを用いて増幅する（表１１）。両方の場合、ＰＣＲ生成物をアガロースゲルから精製し、混ぜ合わせ、次のＰＣＲ反応用のテンプレートとして使用して、配列Ｔ５０およびＴ５１を増幅する。次に、Ｔ５０およびＴ５１のＰＣＲ生成物をＡｐａＩ／ＳｐｅＩで消化し、Trichoderma reesei発現ベクターにクローニングする。次に、クローニングされたフラグメントを、適切なプライマーセットを用いた配列決定により検証し、産生した配列を、ＣＢＨＩまたはＥＧＩＶプロモーターのいずれかおよびａｌｇ３ターゲティングを有するT. reesei発現ベクターの構築のために使用する。
【０３２９】
全てのＰＣＲ増幅は、高忠実度Phusionポリメラーゼ（Finnzymes）を用いて行う。プライマー（表１１）はMWG Operonから取寄せる。配列決定は、ヘルシンキ大学バイオテクノロジー研究所ＤＮＡ配列決定研究室が商業サービスとして行う。
【０３３０】
スペーサー変異（２×Ｇ４Ｓ、３×Ｇ４Ｓ、ＣＢＨＩ、およびＥＧＩＶ）を有する既述のキメラＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ配列を有するTrichoderma reesei発現ベクターを、ｃｂｈ１プロモーターのコントロール下でｐｙｒ４遺伝子ループアウトマーカーと共にサブクローニングし、次に、骨格へのターゲット組み込みのためのａｌｇ３フランキング領域フラグメントを構築する。発現カセットをT. reesei Ｍ２７９株（Ｍ２０２のｐｙｒ４−株）にトランスフォーメーションする。プレート選択後に、クローンをＰＣＲでスクリーニングし、単一胞子を介して精製する。グリカン分析用の材料を得るために、既述の振盪フラスコ培養を行う。
【０３３１】
リツキシマブ抗体発現性T. reesei株へのＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質変異体の導入
リコンビナントＧｎＴＩＩ／Ｉ融合タンパク質変異体を、実施例５に記載のリツキシマブ発現性T. reesei Ｍ２７９株に導入する。
【０３３２】
簡潔には、ｃｂｈ１プロモーターのコントロール下でのＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ融合タンパク質、ＭＮＴＩターゲティングペプチド、ｐｙｒ４ループアウトマーカー、および４個のスペーサー変異体のうち１個を有するベクターを、それぞれターゲット組み込みのために骨格ベクター中のａｌｇ３フランキング領域フラグメントの間にサブクローニングすることで、ａｌｇ３遺伝子を欠失させる。ＰｍｅＩ消化された発現カセットをT. reesei Ｍ２７９株（ｐｙｒ４−株）にトランスフォーメーションする。プレート選択後、クローンをＰＣＲでスクリーニングし、単一胞子を介して精製する。
【０３３３】
ａｌｇ３ローカスへのターゲティングにより得られたリツキシマブ産生T. reesei ＧｎＴＩＩ／ＧｎＴＩ変異体株のグリカン分析
グリカン分析用の材料を得るために、実施例５に記載の振盪フラスコ培養を行い、加えて一部の培地に０．３mg/mlダイズトリプシン阻害剤（ＳＢＴＩ）および１％カザミノ酸を補充する。ＳＢＴＩを最初に植菌時に、次に３〜６日目に毎日添加する。ＰＭＳＦおよびペプスタチンＡを全ての試料に添加してから凍結する。
【０３３４】
リツキシマブは、ＳＢＴＩを有する５日目の上清試料ならびにＳＢＴＩを有さない５および７日目の試料からプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーで精製する。ＰＮＧａｓｅ Ｆの反応を変性タンパク質約１０μgについて行う。放出されたＮ−グリカンを最初にHypersep Ｃ−１８で、次にHypersep Hypercarb（両方ともThermo Scientific製）で精製し、その際、中性および酸性グリカンを分離する。精製ステップを９６ウェル形式で行う。中性および酸性Ｎ−グリカンをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析して、リツキシマブ抗体上のＧ０グリコフォームの存在について試験する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
0006017439.tif 000042
【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
0006017439.tif 000044
【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
0006017439.tif 000048
【図２０】
0006017439.tif 000049
【図２１】
0006017439.tif 000050
【図２２】
0006017439.tif 000051
【図２３】
0006017439.tif 000052
【図２４】
0006017439.tif 000053
【図２５】
0006017439.tif 000054
【図２６】
0006017439.tif 000055
【図２７Ａ】
0006017439.tif 000056
【図２７Ｂ】
0006017439.tif 000057
【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
0006017439.tif 000059
【図２７Ｅ】
0006017439.tif 000060
【図２８Ａ】
0006017439.tif 000061
【図２８Ｂ】
0006017439.tif 000062
【図２８Ｃ】
0006017439.tif 000063
【図２９】
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【図３０Ａ】
0006017439.tif 000065
【図３０Ｂ】
0006017439.tif 000066
【図３１Ａ】
0006017439.tif 000067
【図３１Ｂ】
0006017439.tif 000068
【図３２】
0006017439.tif 000069
【図３３Ａ】
0006017439.tif 000070
【図３３Ｂ】
0006017439.tif 000071
【図３３Ｃ】
0006017439.tif 000072
【図３４】
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【図３５】
0006017439.tif 000074
【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３７Ｄ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
0006017439.tif 000081
【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
0006017439.tif 000083
【図３９】
0006017439.tif 000084
【図４０Ａ】
0006017439.tif 000085
【図４０Ｂ】
0006017439.tif 000086
【図４１】
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【図４２−１】
0006017439.tif 000088
【図４２−２】
0006017439.tif 000089
【図４２−３】
0006017439.tif 000090
【配列表】
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