(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象糖鎖および非検出対象糖鎖を含む複数種の糖鎖と結合する標識用レクチンを用いて、検体中の前記検出対象糖鎖を有するアナライトを検出する方法であって、前記標識用レクチンと結合した前記アナライトを検出する検出工程の前に、
前記標識用レクチンを前記アナライトに接触させる標識処理と、
少なくとも１種の前記非検出対象糖鎖と結合するマスク用糖鎖認識分子を、前記非検出対象糖鎖を有する夾雑物に接触させるマスク処理とを含む検出前処理工程を行い（但し、前記標識処理を前記マスク処理の前に行う場合、前記標識用レクチンより前記非検出対象糖鎖に結合しやすい前記マスク用糖鎖認識分子を用いる）、
前記アナライトが前立腺特異抗原であり、前記標識用レクチンがノダフジレクチンであり、前記マスク用糖鎖認識分子がガレクチンであるか、または
前記アナライトがα−フェトプロテインであり、前記標識用レクチンがレンズマメレクチンであり、前記マスク用糖鎖認識分子がタチナタマメレクチンである
ことを特徴とする、検出対象糖鎖を有するアナライトの検出方法。
【請求項２】
前記検出前処理工程が、さらに、前記アナライトと結合するリガンドが固定化された支持体に前記アナライトおよび前記夾雑物を接触させる固相化処理を含む、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記固相化処理を、前記標識処理および前記マスク処理の前に行う、請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記標識処理および前記マスク処理を、前記固相化処理の前に行う、請求項２に記載の検出方法。
【請求項５】
前記標識処理と前記マスク処理を同時に行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項６】
前記標識処理を、前記マスク処理の前に行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項７】
前記マスク処理を、前記標識処理の前に行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項８】
前記固相化処理を、前記標識処理の後かつ前記マスク処理の前に行う、請求項２に記載の検出方法。
【請求項９】
前記固相化処理を、前記マスク処理の後かつ前記標識処理の前に行う、請求項２に記載の検出方法。
【請求項１０】
検出対象糖鎖および非検出対象糖鎖を含む複数種の糖鎖と結合する標識用レクチンを含む試薬と、
少なくとも１種の前記非検出対象糖鎖と結合するマスク用糖鎖認識分子を含む試薬と、
前記検出対象糖鎖を有するアナライトと結合するリガンドを含む試薬と
を含み、
前記アナライトが前立腺特異抗原であり、前記標識用レクチンがノダフジレクチンであり、前記マスク用糖鎖認識分子がガレクチンであるか、または
前記アナライトがα−フェトプロテインであり、前記標識用レクチンがレンズマメレクチンであり、前記マスク用糖鎖認識分子がタチナタマメレクチンである
ことを特徴とする、検出対象糖鎖を有するアナライトの検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レクチンを用いたアナライトの検出方法に関する。より詳しくは、アナライト（たとえば抗原）が有する糖鎖に対して所定の処理をする工程を含む、レクチンを用いた高感度・低ノイズであるアナライトの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体の生命機能を担う主役であるタンパク質が、細胞社会の中において秩序正しく機能を発揮するためには、糖鎖修飾をはじめとする翻訳後修飾が極めて重要な役割を担っている。生体内の殆どのタンパク質は糖鎖による修飾を受けており、タンパク質に付加した糖鎖がウイルスの感染、原虫の寄生、感染、毒素の結合、ホルモンの結合、受精、発生分化、タンパク質の安定性、がん細胞転移、アポトーシスなど、生命現象の様々な場で重要な役割を果たしていることが近年次々と明らかになってきた。
【０００３】
同じアミノ酸配列のタンパク質（同一名称のタンパク質）であっても、修飾されている糖鎖は多種多様であり、タンパク質を産生する細胞の状態によってその糖鎖構造は異なることが知られている。
【０００４】
このような糖鎖の変化と疾病との関係性についても明らかになってきており、例えば、特許文献１、非特許文献１に開示されるようなαフェトプロテイン（ＡＦＰ）糖鎖分画測定による肝癌の鑑別方法、特許文献２に開示されるような前立腺特異抗原（ＰＳＡ）糖鎖分画測定による前立腺癌の鑑別方法、非特許文献２、３に開示されるような癌胎児性抗原（ＣＥＡ）糖鎖分画測定による腺癌の鑑別方法などに応用されている。
【０００５】
糖タンパク質上の糖鎖の特異的検出にはレクチンと呼ばれる糖鎖を特異的に認識・結合・架橋する能力を持つタンパク質が広く利用されている。それは、糖鎖に対する抗体が非常に作製しにくく入手が困難であるためである。
【０００６】
レクチンは安価で大量に入手が可能であり、またタンパク質の安定性にも優れており長期間保存も可能である。しかし、レクチンは抗体よりも結合活性が低い、特異性が低いなどの問題がある。
【０００７】
例えば、ノダフジレクチン（ＷＦＡ）はＮ−アセチルガラクトサミンを主要な結合糖鎖とすることが知られているが、わずかにガラクトースとも結合するため、反応系内にガラクトース残基が存在すると非特異的に反応してしまうことになる。
【０００８】
このような特徴を持つレクチンを用いて、特定のタンパク質上の糖鎖を簡便に定量解析する方法として、タンパク質に対する抗体とレクチンを用いたサンドイッチアッセイがある。
【０００９】
しかし、この手法は対象タンパク質がある程度精製されている場合には有効であるが、通常の疾病診断において検体として用いられる血液や尿等の、測定対象以外の糖タンパク質や糖脂質といった夾雑物が大量に含まれる系では感度、定量性において著しく性能が落ち解析が非常に困難であった。そのため対象たんぱくの血清中の含有濃度が著しく高い（数μg/mL程度）限られた項目でしか、血清診断等に利用されていない。
【００１０】
夾雑物の影響を低減するための施策として、抗体を固定化した支持体表面への血清夾雑物の吸着を抑制するブロッキング剤の検討（特許文献３）、非特異物質をあらかじめ吸着させる吸収剤の添加（特許文献４、５）、支持体に吸着してしまった分子を効率よく除去できる洗浄液の検討（特許文献３）が行われている。
【００１１】
ここで、ブロッキング剤としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン等が知られており、そのほかには合成高分子材料を用いたものもある。非特異物質の吸収剤は、抗原抗体反応を阻害する分子やノイズの原因となる分子を結合させて反応系の中から取り除くことができる分子であり、グリコサミノグリカン、ヘパリン等、高分子、糖鎖複合体などが用いられることがある。洗浄液としては液の組成検討が行われており、塩強度、各種界面活性剤の効果を検討している例も報告されている（特許文献３）。
【００１２】
しかし、これらバックグラウンド低減施策では、検出レクチンを用いた定量解析では劇的な効果が認められる例は極めて少なく、また対象に適したブロッキング剤の探索のため、検討に非常に工数がかかることも問題である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開昭61-292062号公報
【特許文献２】国際公開WO2010/090264号公報
【特許文献３】特開2010-127827号公報
【特許文献４】特開2009-53195号公報
【特許文献５】特開2010-60293号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Sugar Chains of Human Cord Serum α-Fetoprotein: Characteristics of N-linked Sugar Chains of Glycoproteins Produced in Human Liver and Hepatocellular Carcinomas, K. Yamashita et al., Cancer Res., 53, 1 (1993)
【非特許文献２】Carbohydrate Structures of Nonspecific Cross-reacting Antigen-2, a Glycoprotein Purified from Meconium as an Antigen Cross-reacting with Anticarcinoembryonic Antigen Antibody, K. Yamashita et al., Biol. Chem., 264, 17873 (1989)
【非特許文献３】Structural Studies of the Carbohydrate Moieties of Carcinoembryonic Antigens, K. Yamashita et al., Cancer Res., 47, 3451 (1987)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、レクチンを用いた糖鎖を有するアナライト（たとえば抗原）の検出系において、簡便な手法（簡易な構成）により、レクチンによる検出感度および定量性を向上させることができるアナライトの検出方法、ならびに検出キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、前記問題を解決するために鋭意検討した結果、レクチンを用いた測定系における高いバックグラウンド（ノイズ）の要因は、検出に用いるレクチンが、糖鎖認識性にある程度幅を持っているために、ブロッキング剤等による公知の処理方法を用いたとしても一定量発生する、支持体や抗原を捕捉するためのリガンド（抗体等）等に非特異的に結合した検出対象以外の糖タンパク質や糖脂質のような夾雑物にも結合してしまうことがあることを見出した。この新たな知見に基づき、本発明者らは、標識用レクチンが結合するおそれのある、検出の対象としない夾雑物が有する糖鎖を、当該糖鎖に強く結合する糖鎖認識分子（好ましくは標識用レクチンとは別の種類のレクチン）でマスキングすることにより、バックグラウンドの低減および感度の上昇が得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下の事項を包含する。
【００１７】
［１］検出対象糖鎖および非検出対象糖鎖を含む複数種の糖鎖と結合する標識用レクチンを用いて、検体中の前記検出対象糖鎖を有するアナライトを検出する方法であって、前記標識用レクチンと結合した前記アナライトを検出する検出工程の前に、
前記標識用レクチンを前記アナライトに接触させる標識処理と、
少なくとも１種の前記非検出対象糖鎖と結合するマスク用糖鎖認識分子を、前記非検出対象糖鎖を有する夾雑物に接触させるマスク処理とを含む検出前処理工程を行い（但し、前記標識処理を前記マスク処理の前に行う場合、前記標識用レクチンより前記非検出対象糖鎖に結合しやすい前記マスク用糖鎖認識分子を用いる）
前記アナライトが前立腺特異抗原であり、前記標識用レクチンがノダフジレクチンであり、前記マスク用糖鎖認識分子がガレクチンであるか、または
前記アナライトがα−フェトプロテインであり、前記標識用レクチンがレンズマメレクチンであり、前記マスク用糖鎖認識分子がタチナタマメレクチンである
ことを特徴とする、検出対象糖鎖を有するアナライトの検出方法。
【００１８】
［２］前記検出前処理工程が、さらに、前記アナライトと結合するリガンドが固定化された支持体に前記アナライトおよび前記夾雑物を接触させる固相化処理を含む、［１］に記載の検出方法。
【００１９】
［３］前記固相化処理を、前記標識処理および前記マスク処理の前に行う、［２］に記載の検出方法。
［４］前記標識処理および前記マスク処理を、前記固相化処理の前に行う、［２］に記載の検出方法。
【００２０】
［５］前記標識処理と前記マスク処理を同時に行う、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の検出方法。
［６］前記標識処理を、前記マスク処理の前に行う、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の検出方法。
【００２１】
［７］前記マスク処理を、前記標識処理の前に行う、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の検出方法。
［８］前記固相化処理を、前記標識処理の後かつ前記マスク処理の前に行う、［２］に記載の検出方法。
【００２２】
［９］前記固相化処理を、前記マスク処理の後かつ前記標識処理の前に行う、［２］に記載の検出方法。
【００２７】
［１０］検出対象糖鎖および非検出対象糖鎖を含む複数種の糖鎖と結合する標識用レクチンを含む試薬と、
少なくとも１種の前記非検出対象糖鎖と結合するマスク用糖鎖認識分子を含む試薬と、
前記検出対象糖鎖を有するアナライトと結合するリガンドを含む試薬と
を含み、
前記アナライトが前立腺特異抗原であり、前記標識用レクチンがノダフジレクチンであり、前記マスク用糖鎖認識分子がガレクチンであるか、または
前記アナライトがα−フェトプロテインであり、前記標識用レクチンがレンズマメレクチンであり、前記マスク用糖鎖認識分子がタチナタマメレクチンである
ことを特徴とする、検出対象糖鎖を有するアナライトの検出用キット。
【００２８】
本発明の課題を解決するための手段の概念図の一例を図１に示す。従来の実施形態を示す図１ａでは、標識体（６０ｂ）で標識化された標識用レクチン（６０ａ）は、検出対象糖鎖および非検出糖鎖を含む複数種の糖鎖を認識するため、アナライトである検出対象抗原（４６）が有する検出対象糖鎖（４６ｃ）のみならず、夾雑物である、非特異的に吸着する糖タンパク質（５０）や糖脂質（５２）が有する非検出対象糖鎖（４６ｄ）にも結合する。例えば、ＰＳＡ抗原を検出対象抗原（４６）とし、標識用レクチン（６０ａ）としてＷＦＡレクチンを用いる場合、Ｎ-アセチル-D-ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）が検出対象糖鎖（４６ｃ）に該当し、ガラクトース（Ｇａｌ）が非検出対象糖鎖（４６ｄ）に該当する。これに対して、本発明の実施形態を示す図１ｂでは、夾雑物が有する非検出対象糖鎖（４６ｄ）はマスク用糖鎖認識分子（７５）によってマスキングされているため、標識用レクチン（６０ａ）の夾雑物への結合を抑制することができる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、レクチンを用いた抗原の検出系において、簡便な手法（簡易な構成）により、測定系のバックグラウンドの上昇を抑え、レクチンによる対象抗原上の糖鎖の検出感度および定量性を向上させることができる抗原の検出方法、ならびに検出キットを提供することができる。
【００３０】
また、サンドイッチアッセイ系でマスク用糖鎖認識分子を試薬に含有させるだけ上記効果が得られるため、簡便な手法（簡易な構成）であり、診断シーンでの適用にも有効である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、リガンドが固定化された支持体に試料を接触させ、アナライトおよび夾雑物が支持体上に存在している状態（ａ）において、従来の実施形態に従った場合に、レクチンによるアナライトの検出においてバックグラウンドが発生するメカニズム（ｂ）、および本発明の実施形態に従った場合に、バックグラウンド低減および検出感度上昇の効果が奏される（ｃ）の様子を模式的に示した概念図である。
【図２】図２は、標識処理およびマスク処理を同時に行った後、固相化処理を行う、本発明の検出方法の一実施形態を示した概念図である。
【図３】図３は、マスク処理、固相化処理、標識処理の順序で行われる、本発明の検出方法の一実施形態を示した概念図である。
【図４】図４は、固相化処理に続いて、標識処理およびマスク処理が行われる、本発明の検出方法の一実施形態を示した概念図である。
【図５】図５は、本発明のアナライトの検出方法を実施する上で好適な、ＳＰＦＳ測定装置の構成を模式的に示す概略図である。
【図６】図６は、図５の測定装置のセンサチップ周辺の部分拡大図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明の検出方法、検出用キットについて説明する。
本明細書において「検出対象糖鎖」とは、アナライト（たとえば特定の疾患を発症した場合に血中に比較的高濃度で存在するようになるマーカーとなる抗原）が特異的に有する糖鎖であって、アナライトを検出するために、検出用レクチンを極力多く結合させることが意図される糖鎖を指す。一方、「非検出対象糖鎖」とは、アナライトとともに検体中に存在する夾雑物（アナライトとは異なる糖タンパク質、糖脂質等）が有する糖鎖であって、アナライトの検出の障害となるため、検出用レクチンを極力結合させないことが意図される糖鎖を指す。
【００３３】
本明細書における「検出方法」は、定性的にアナライトを検出する方法のみならず、定量的にアナライトを検出する方法（アナライトの定量方法）を当然に含む。
≪本発明に用いられる標識用レクチン・マスク用糖鎖認識分子等≫
本発明の方法には、標識用レクチン、標識体、マスク用糖鎖認識分子、リガンド、アナライトおよび夾雑物を含む検体、必要に応じてさらにリガンドを固定化するための支持体を用いる。以下、各要素について詳細に説明する。
【００３４】
＜レクチン＞
本発明の検出方法では、検出対象糖鎖を有するアナライトを標識するための標識用レクチンとしてレクチンが用いられる。また、夾雑物が有する検出対象糖鎖をマスキングするためのマスク用糖鎖認識分子としてレクチンが用いられる場合がある。本発明において、マスキングに用いられる糖鎖認識分子はレクチンに限定されるものではなく、たとえば検出対象糖鎖をエピトープとして認識し、特異的に結合する抗体も包含されるが、標識用レクチンと同様、安価で大量に入手が可能であり、またタンパク質の安定性にも優れており長期間保存も可能であるという観点からは、レクチンが好適である。
【００３５】
レクチンは、その種類に応じた特定の糖鎖に高い結合能で結合するが、それとは別の糖鎖にも低い結合能ながら結合することがある。したがって、本発明の検出方法は、検出アナライトが有する検出対象糖鎖に高い結合能で結合する一方、夾雑物が有する非検出対象糖鎖にも弱い結合能で結合するレクチンを、標識用レクチンとして用いる場合に適用される。そして、標識用レクチンが弱い結合能で結合する非検出対象糖鎖に対して強い結合能で結合する糖鎖認識分子をマスク用糖鎖認識分子として用いる。このようなマスク用糖鎖認識分子は、標識用レクチンが強い結合能で結合する検出対象糖鎖に対しては、実質的に結合しないか、弱い結合能で結合する糖鎖認識分子（たとえば標識用レクチンとは異なる種類レクチン）である必要がある。
【００３６】
レクチンは、動植物，真菌，細菌，ウイルスなどから得られる様々な分子家系に属するレクチン、すなわち、細菌を含むすべての生物界で見出されるリシンＢ鎖関連の「Ｒ型レクチン」；真核生物全般に存在し糖タンパク質のフォールディングに関与する「カルネキシン・カルレティキュリン」，多細胞動物に広く存在し、「セレクチン」，「コレクチン」等代表的なレクチンを多く含むカルシウム要求性の「Ｃ型レクチン」；動物界に広く分布しガラクトースに特異性を示す「ガレクチン」；植物豆科で大きな家系を形成する「豆科レクチン」およびこれと構造類似性を有し動物細胞内輸送に関わる「Ｌ型レクチン」；リソソーム酵素の細胞内輸送に関わるマンノース６−リン酸結合性の「Ｐ型レクチン」；グリコサミノグリカンをはじめとする酸性糖鎖に結合する「アネキシン」；免疫グロブリン超家系に属し「シグレック」を含む「Ｉ型レクチン」などに分類することができる。
【００３７】
上記レクチンの具体例としては、ＡＣＡ（センニンコクレクチン），ＢＰＬ（ムラサキモクワンジュレクチン），ＣｏｎＡ（タチナタマメレクチン），ＤＢＡ（Ｈｏｒｓｅｇｒａｍレクチン），ＤＳＡ（ヨウシュチョウセンアサガオレクチン），ＥＣＡ（デイゴマメレクチン），ＥＥＬ（Ｓｐｉｎｄｌｅ Ｔｒｅｅレクチン），ＧＮＡ（ユキノハナレクチン），ＧＳＬ Ｉ（グリフォニアマメレクチン），ＧＳＬ ＩＩ（グリフォニアマメレクチン），ＨＨＬ（アマリリスレクチン），ジャカリン（ジャックフルーツレクチン），ＬＢＡ（リママメレクチン），ＬＣＡ（レンズマメレクチン），ＬＥＬ（トマトレクチン），ＬＴＬ（ロータスマメレクチン），ＭＰＡ（アメリカハリグワレクチン），ＮＰＡ（ラッパズイセンレクチン），ＰＨＡ−Ｅ（インゲンマメレクチン），ＰＨＡ−Ｌ（インゲンマメレクチン），ＰＮＡ（ピーナッツレクチン），ＰＳＡ（エンドウレクチン），ＰＴＬ−Ｉ（シカクマメレクチン），ＰＴＬ−ＩＩ（シカクマメレクチン），ＰＷＭ（ヨウシュヤマゴボウレクチン），ＲＣＡ１２０（ヒママメレクチン），ＳＢＡ（ダイズレクチン），ＳＪＡ（エンジュレクチン），ＳＮＡ（セイヨウニワトコレクチン），ＳＳＡ（ニホンニワトコレクチン），ＳＴＬ（ジャガイモレクチン），ＴＪＡ−Ｉ（キカラスウリレクチン），ＴＪＡ−ＩＩ（キカラスウリレクチン），ＵＤＡ（Ｃｏｍｍｏｎ Ｓｔｉｎｇｉｎｇ Ｎｅｔｔｌｅレクチン），ＵＥＡ Ｉ（ハリエニシダレクチン），ＶＦＡ（ソラマメレクチン），ＶＶＡ（ヘアリーベッチレクチン），ＷＦＡ（ノダフジレクチン），ＷＧＡ（パンコムギレクチン），ＡＡＬ（ヒイロチャワンダケレクチン），ＡＯＬ（アスペルギルス・オリゼレクチン）などを挙げることができる。
【００３８】
＜標識体＞
本発明の方法においては、検出対象抗原を検出するために、レクチンと複合体化させた標識体を用いる。そのために、標識体とレクチンと複合体化（結合）させた、標識化レクチンが作製される。
【００３９】
標識体としては、蛍光色素、酵素・補酵素、化学発光物質、放射性物質等の当業者に公知の標識体を用いることができる。
蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Integrated DNA Technologies社）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン(株)）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン(株)）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン(株)）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（GEヘルスケア  バイオサイエンス(株)）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、BODIPY（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン(株)）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Alexa Fluor（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン(株)）等の有機蛍光色素が挙げられる。
【００４０】
また、Eu、Tb等の希土類錯体系の蛍光色素（例えばATBTA-Eu3+）、青色蛍光タンパク質（BFP）、シアン蛍光タンパク質（CFP）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、赤色蛍光タンパク質（DsRed）またはAllophycocyanin（APC；LyoFlogen（登録商標））等に代表される蛍光タンパク質、ラテックスやシリカなどの蛍光微粒子等も、蛍光色素として挙げられる。
【００４１】
なお、血液検体に由来する試料を分析に供する場合は、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えるため、Cy5やAlexa Fluor 647など、近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。
【００４２】
放射性物質としては、ラジオアイソトープ(32P、14C、125I、3H、131Iなど）が挙げられる。
＜アナライト（検出対象物質）＞
本発明では、レクチンにより認識される特定の糖鎖を有し、かつ、適切なリガンドにより特異的に認識され結合し得る分子または分子断片をアナライト（検出対象物質）とすることができる。なお、本明細書において、当該アナライトが抗原である場合に「検出対象抗原」と呼ぶこともある。
【００４３】
このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ＰＮＡ（ペプチド核酸）等，またはヌクレオシド，ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）；タンパク質（ポリペプチド，オリゴペプチド等）；アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）；糖質（オリゴ糖，多糖類，糖鎖等）；脂質；またはこれらの修飾分子、複合体などを挙げることができる。これらの中でも、アナライトとしてタンパク質（糖タンパク質）および脂質（糖脂質）が好ましく、タンパク質（糖タンパク質）がより好ましい。
【００４４】
本発明のアナライトとしては、例えば、がん抗原／腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどのタンパク質が好適である。がん抗原／腫瘍マーカーの具体例としては、ＰＳＡ、ＡＦＰ、ＣＥＡなどが挙げられる。
【００４５】
＜アナライト（検出対象物質）を含む検体＞
本発明の検出方法では、アナライト（検出対象物質）を含む可能性のある検体を被検試料とすることができる。アナライトを含む可能性のある検体は、現実にアナライトを含む検体であってもよいし、現実にはアナライトを含まない検体であってもよい。このような検体としては、例えば、血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、細胞、組織、もしくは器官、またはそれらの調製物（例えば、生検標本）等の生体試料および生体由来試料を挙げることができる。特に、がん抗原／腫瘍マーカーを含む可能性のある、血液、血清または血漿が検体として好適である。
【００４６】
前記血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液などの液性の試料は、適当な緩衝液により希釈して使用することができる。また、細胞、組織、または器官などの固形の試料は、固形の試料の体積の２〜１０倍程度の適当な緩衝液でホモジェナイズして、懸濁液またはその上清を、そのまま、またはさらに希釈して使用することができる。
【００４７】
＜アナライト、標識用レクチン、マスク用糖鎖認識分子の組合せ＞
本発明の検出方法における、アナライト（検出対象抗原）、標識用レクチン、およびマスク用糖鎖認識分子（レクチン）の組合せの具体例を表１に示す。
【００４８】
表１に示す以外にも、がん抗原／腫瘍マーカーなどの検出対象抗原、検体中にそれとともに含まれやすい夾雑物（検出対象抗原以外の糖タンパク質や糖脂質）、それぞれが有する糖鎖の種類を考慮しながら、前者が有する検出対象糖鎖に結合しやすい標識用レクチンと、そのレクチンが同時に結合するおそれのある後者が有する非検出対象糖鎖に結合しやすいマスク用糖鎖認識分子（レクチン）を適宜選択し、組み合わせて用いることが可能である。
【００４９】
【表１】
0005991032.tif 000002
＜リガンド（抗原捕捉物質）＞
本発明では、アナライト（検出対象物質）を特異的に認識して結合し、かつ、レクチンによる糖鎖認識を妨げない分子をリガンド（抗原捕捉物質）として用いることができる。アナライトに対応する適切な物質であればリガンドは特に限定されないが、例えば、抗体、アプタマー、合成ペプチド等を用いることができる。特に、検出対象抗原に対するモノクローナル抗体が好適である。
【００５０】
たとえば、がん抗原／腫瘍マーカーなどを検出対象抗原とする場合は、その抗原に特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体など）をリガンドとして用いることが適切である。例えば、ヒトＰＳＡを抗原とする場合には、抗ヒトＰＳＡ抗体を用いればよい。
【００５１】
なお、上記「抗体」は、完全抗体のみならず任意の抗体断片または誘導体を含む意味で用いられ、完全抗体に加え、Ｆａｂ、Ｆａｂ'2、ＣＤＲ、ヒト化抗体、多機能抗体、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）等の各種抗体も包含される。
【００５２】
＜支持体＞
本発明の検出方法においては、測定系に応じて、リガンドを固定化する（そこにアナライトを捕捉する）ための支持体を用いることができる。支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラスなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、ビーズ（主として球状）、プレート（主として平面状）などの形状で用いられる。ビーズとしては磁気ビーズ、樹脂ビーズ等が充填されたカラムなどが使用できる。プレートの場合、マルチウェルプレート（96穴マルチウェルプレート等）、バイオセンサーチップなどが使用できる。なお、プレート等の平面状の支持体を基板と呼ぶこともある。
【００５３】
リガンドと支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により行うことができる。これらの支持体はすべて市販のものが好適に使用できる。
なお、支持体に固定化されており、送液される検体中のアナライトを捕捉して当該支持体上に固相化することができる状態のリガンドを固相化リガンドと呼ぶこともある。
【００５４】
≪本発明の検出方法≫
＜検出方法に含まれる工程＞
本発明の検出方法は、検出対象糖鎖および非検出対象糖鎖を含む複数種の糖鎖と結合する標識用レクチンを用いて、検体中の前記検出対象糖鎖を有するアナライトを検出する方法であって、前記標識用レクチンと結合した前記アナライトを検出する検出工程の前に、以下の処理を含む検出前処理工程を含む：
（１）前記標識用レクチンを前記アナライトに接触させる標識処理；
（２）少なくとも１種の前記非検出対象糖鎖と結合するマスク用糖鎖認識分子を、前記非検出対象糖鎖を有する夾雑物に接触させるマスク処理；および、必要に応じて、
（３）前記アナライトと結合するリガンドが固定化された支持体に前記アナライトを接触させる固相化処理。
【００５５】
＜工程・処理が実施される順序＞
本発明の検出方法では、検出前処理工程、検出工程の順序で行われる。検出前処理工程に含まれる最後の処理の後に、検出工程を行うようにすればよい。
【００５６】
また、検出前処理工程の内部における、標識処理、マスク処理、および必要に応じて行われる固相化処理の順序には様々な実施形態が含まれる。たとえば、標識処理およびマスク処理は、同時に行うこともできる。具体的には、以下のような処理の実施形態を挙げることができる。なお、「標識処理＋マスク処理」は標識処理とマスク処理を同時に行うことを表し、「→」はその左側の処理を実施後、右側の処理を実施することを意味する。例えば、「（標識処理＋マスク処理）→固相化処理」は、標識処理とマスク処理を同時に行った後に、固相化処理を行うことを表す。
【００５７】
（検出前処理工程における処理の順序）
（１）標識処理＋マスク処理
（２）標識処理→マスク処理
（３）マスク処理→標識処理
（４）（標識処理＋マスク処理）→固相化処理
（５）標識処理→マスク処理→固相化処理
（６）マスク処理→標識処理→固相化処理
（７）標識処理→固相化処理→マスク処理
（８）マスク処理→固相化処理→標識処理
（９）固相化処理→（標識処理＋マスク処理）
（１０）固相化処理→標識処理→マスク処理
（１１）固相化処理→マスク処理→標識処理
図２〜図４にこれらの実施形態の一部について概念図を示した。図２は上記（４）、図３は上記（８）、図４は上記（１１）の実施形態に相当する概念図である。いずれの実施形態においても最終的に、標識体（６０ｂ）で標識化されたレクチン（６０ａ）は、非検出対象糖鎖（４６ｄ）を有する糖タンパク質（５０）や糖脂質（５２）などの夾雑物への結合が抑制され、検出対象糖鎖（４６ｃ）を有するアナライト（４６）に結合できるようになっている。
【００５８】
固相化処理を含まない本発明の実施形態としては、例えば、リガンドとして、ＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）試薬のドナー蛍光体を標識した抗体を、標識用レクチンを標識する標識体としてＦＲＥＴ試薬のアクセプター蛍光体を用いる方法があげられる。この場合、リガンド（抗体）にアナライト以外の糖タンパク質や糖脂質（夾雑物）が非特異的に結合し、バックグラウンド上昇の原因となる。したがって、固相化処理を含まない場合であっても、前述したような標識処理、およびマスク処理を含む検出前処理工程の後、検工程を行うことにより、上昇したバックグラウンドを低減させることが可能であり、本発明の効果を得ることができる。
【００５９】
本発明の検出方法としては、検出前処理工程に固相化処理が含む実施形態が、検出感度上昇の観点から好ましい。
検出前処理工程におけるマスク処理の実施順序は、（Ａ）固相化処理を実施後に、支持体上でマスク処理を行う場合と、（Ｂ）それ以外の場合（固相化処理の前にマスク処理を行う、または、固相化処理を実施しない場合）に大きく分けることができる。
【００６０】
実施形態（Ａ）では、検体中に含まれるアナライト（抗原等）を、同じく検体中に含まれる糖タンパク質や糖脂質などの夾雑物とともに、リガンド（抗体等）が固定化されている支持体と先に接触させる。すると、支持体上では、固相化リガンドによってアナライトが捕捉されるとともに、夾雑物が非特異的にリガンドまたは支持体に吸着する。このような状態の支持体に、マスク用糖鎖認識分子を添加することで、支持体およびリガンドに非特異的に結合した夾雑物が有する非検出対象糖鎖をマスキングことができる。これにより、レクチンを添加した際の高いバックグラウンドは抑制される。
【００６１】
実施形態（Ｂ）では、希釈しないままの検体に、または適当な緩衝液等で希釈して調製した試料に、マスク用糖鎖認識分子を添加する。これにより、検体中に含まれる夾雑物が有する非検出対象糖鎖をマスキングすることができ、特異性および感度が向上する。
【００６２】
多量の夾雑物中でマスク処理を行う実施形態（Ｂ）に比べ、支持体およびリガンドに吸着した夾雑物のみをマスク処理する実施形態（Ａ）のほうが、ノイズ除去の効果が高いため、より好ましい。
【００６３】
また、標識用レクチンが非検出対象糖鎖（夾雑物）に結合することをいち早く防止するため、マスク処理は標識処理の前に行う方が好ましい。
本発明の方法は、従来のバックグラウンド抑制方法と組み合わせて行うこともでき、組合せることでより高いバックグラウンド抑制効果が期待できる。
【００６４】
＜各工程・処理の詳細＞
以下に各工程・処理の詳細について説明する。
〔１．標識処理〕
標識処理は、アナライト−標識用レクチン複合体を形成するために、標識用レクチンをアナライトに接触させる処理である。この処理に用いられる標識用レクチンは、あらかじめ標識体と複合体化されている。標識用レクチンを含む溶液を、アナライトを含む溶液（検体または調製された試料等）または固相化処理によりアナライトが捕捉されている支持体と接触させれば、通常自ずと標識用レクチンとアナライトとの接触が起こり、当該アナライトが有する検出対象糖鎖を介して両者は結合する。この処理で用いる標識用レクチンの量、反応液中の濃度、反応時間などの反応条件は、用いる標識用レクチンやアナライトの性状に応じて適宜調整すればよい。
【００６５】
〔２．マスク処理〕
マスク処理は、夾雑物が有する非検出対象糖鎖への標識用レクチンの結合を抑制するために、マスク用糖鎖認識分子を夾雑物に接触させる処理である。この処理に用いられるマスク用糖鎖認識分子（たとえばレクチン）は、標識用レクチンと異なり、標識体とは複合体化されない。マスク用糖鎖認識分子を含む溶液を、（アナライトとともに）夾雑物を含む溶液または固相化処理により（アナライトが捕捉されているとともに）夾雑物が非特異的に吸着したリガンドおよび支持体と接触させれば、通常自ずとマスク用糖鎖認識分子と夾雑物との接触が起こり、当該夾雑物が有する非検出対象糖鎖を介して両者は結合する。この処理で用いるマスク用糖鎖認識分子の量、反応液中の濃度、反応時間などの反応条件は、用いるマスク用糖鎖認識分子や夾雑物の性状に応じて適宜調整すればよい。
【００６６】
〔３．固相化処理〕
固相化処理は、基板状の測定用部材（支持体に相当する）を用いる検出系などにおいて行われる処理であって、アナライトおよび夾雑物を、リガンドが固定化された支持体に接触させる処理である。アナライトおよび夾雑物（標識処理およびマスク処理がすでに行われている場合は、それぞれ標識用レクチンおよびマスク用糖鎖認識分子と複合体化している）を含む溶液を、リガンドが固定化された支持体と接触させれば、通常自ずと、アナライトはリガンドと接触して捕捉され、夾雑物はリガンドまたは支持体と接触して非特異的に吸着する。この処理の反応時間、反応温度等の反応条件は、用いるアナライトおよびリガンドに応じて、適宜調整すればよい。
【００６７】
〔４．検出工程〕
検出工程は、標識用レクチンと複合体化した標識体が発するシグナルを測定することによって、標識用レクチンと結合したアナライトを検出する工程である。この工程における測定結果に基づき、検体中のアナライトの存否や、アナライトの含有量などに関するデータを取得することができる。
【００６８】
（測定方法）
本発明の検出工程において用いられる測定方法は、上記標識体が発するシグナルを測定できるものであれば特に限定されず、それぞれの標識体に適した当業者に公知の方法に従って行うことができる。例えば、放射性物質により標識されたレクチンを検出する場合には、液体シンチレーションやＲＩＡ法により検出することができる。蛍光色素により標識されたレクチンを検出する場合には、ルミノメーター、ＳＰＦＳ測定器等により検出することができる。酵素で標識されたレクチンを検出する場合は、標識された酵素に対応した基質を加えた後に、酵素による基質の化学的変化、例えば、発色、蛍光、化学発光等を測定することにより検出することができる。
【００６９】
〔表面プラズモン励起増強蛍光分光（Surface Plasmon-field enhanced fluorescence spectroscopy:SPFS）法〕
本発明の検出方法に用いる測定法として、ＳＰＦＳが好適に用いられる。ＳＰＦＳは、誘電体部材上に形成された金属薄膜に全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる角度で励起光を照射したときに、金属薄膜を透過したエバネッセント波が表面プラズモンとの共鳴により数十倍〜数百倍に増強されることを利用して、金属薄膜近傍に捕捉されたアナライト（分析対象物）を標識する蛍光体を効率的に励起させ、その蛍光シグナルを測定する方法である。このようなＳＰＦＳは、一般的な蛍光標識法などに比べて極めて感度が高いため、サンプル中にアナライトがごく微量しか存在しない場合であってもそれを定量することができる。
【００７０】
<ＳＰＦＳ用測定部材>
ＳＰＦＳ用測定部材は、一般的に、サンドイッチ型免疫複合体を形成してＳＰＦＳによる蛍光測定を行うための場（測定領域）が形成されているセンサチップと、サンドイッチ型免疫複合体の形成などに用いられる各種の溶液（アナライトを含む試料、標識リガンド溶液、その他の反応試薬等）を測定領域上に保持することのできる、流路またはウェルを構築するための部材とを積層化した構成をとる。
【００７１】
センサチップは、基本的に、金属薄膜の裏面に励起光を導入するための透明支持体と、当該透明支持体上に形成された、表面プラズモン共鳴を発生させるための金属薄膜と、当該金属薄膜上に形成された、アナライトをセンサ表面に捕捉するための反応層とを含み、さらに必要に応じて、金属薄膜と反応層の間に形成された、蛍光体が金属薄膜に近接しすぎることにより起こる蛍光の金属消光を防止するためのスペーサ層を含んでいてもよい。
【００７２】
反応層が形成されている部位が測定領域に相当する。流路またはウェルの底面全域に反応層を形成して測定領域としてもよいし、底面の一部のみに（必要であれば所望のパターニングで）反応層を形成して測定領域としてもよい。測定領域の面積は、一般的にレーザー光として照射される励起光の照射面積を考慮しながら調整することができる。たとえば、励起光のスポット径が１ｍｍφ程度であれば、上記アッセイエリアは通常、少なくとも数ｍｍ四方の面積を有するものとなるよう設計される。
【００７３】
ＳＰＦＳのシステムを、密閉流路を通じて各種の溶液を送液する「流路型」とする場合、センサチップの上に、流路を形成するための穴のあいた「フローセル」を積載し、必要に応じてさらにその上に、上記フローセルの穴に対応する位置に送液導入口および送液排出口のあいた「天板」を積載し、これらを密着させて固定するようにして、測定部材を構築する。上記フローセルの穴に対応する位置のセンサチップ表面が、流路の底面をなし、そこに測定領域が形成される。流路型の場合、たとえばポンプやチューブを含む送液手段を用いて、各種の液体を送液導入口から流路内に送液して送液排出口から排出することができ、必要に応じて往復型、循環型の送液を行うこともできる。送液速度や送液（循環）時間などの条件は、試料の量や試料中のアナライトの濃度、流路ないしウェルのサイズや反応層の態様（固相化リガンドの密度等）、ポンプの性能等を考慮しながら、適宜調整することができる。
【００７４】
一方、ＳＰＦＳのシステムを、上記流路よりも広い空間に各種の溶液を貯留させる「ウェル型」とする場合、センサチップの上に、ウェルを形成するための貫通孔を有する「ウェル部材」を積載して固定することにより測定部材を構築する。ウェル型の場合、たとえばピペット状の部材を用いて、各種の液体をウェルに添加し、除去することができる。
【００７５】
上記フローセルは、たとえばシート状のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製とすることができる。上記天板は、測定領域から発せられる蛍光を測定できるよう透明性を有する材料で作製され、たとえばプレート状のポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）製とすることができる。あるいは、フローセルおよび天板を、成形加工やフォトリソグラフィにより所望の形状にしたプラスチック製とすることも可能である。
【００７６】
センサチップ上にフローセルまたはウェル部材を密着させて固定する手段は特に限定されるものではなく、一般的には物理的に上下から圧力をかけるようにすればよく、必要であれば、透明支持体と同じ光屈折率を有する接着剤、マッチングオイル、透明粘着シートなどを用いてもよい。
【００７７】
<ＳＰＦＳ用測定装置>
本発明に係る測定法は、一般的なＳＰＦＳ用測定装置を使用して実施することができる。ＳＰＦＳ用測定装置は、基本的に、ＳＰＦＳ用測定部材が着脱可能となっており、使用する蛍光体に応じた適切な波長の励起光（好適にはレーザー光）を照射するための光源、励起光をセンサチップの金属薄膜の裏面に所定の角度で入射させるためのプリズム（透明支持体が平面基板状のセンサチップを使用する場合）、金属薄膜で反射した光を受光しその強度を測定する受光器、蛍光体から発せられる蛍光を集光するためのレンズおよびその蛍光の強度を測定するための検出器、励起光および蛍光から所定の波長を有する光のみを透過させそれ以外の光をカットするための各種のフィルタなどを備える。
【００７８】
より具体的な態様は、例えば、特開２０１０―１４５２７２号公報、特開２０１１−８０９３５号公報、特開２００８−１０２１１７号公報、特許第３５６２９１２号公報など、各種の文献を参照することができる。
【００７９】
以下、より詳細なＳＰＦＳ用測定装置の構成例について説明する。
図５は、本発明のアナライトの定量測定方法を説明する定量測定装置の概略を模式的に示す概略図、図６は、図５の定量測定装置の部分拡大図である。
【００８０】
図５、６に示すように、本発明の定量測定装置１０は、鉛直断面形状が略台形であるプリズム形状の誘電体部材１２と、この誘電体部材１２の水平な上面１２ａに形成された金属膜１４とを有するセンサチップ１６を備えており、このセンサチップ１６は、定量測定装置１０のセンサチップ装填部１８に装填されている。
【００８１】
また、誘電体部材１２の下方の一方の側面１２ｂの側には、図に示すように、光源２０が配置されており、この光源２０からの入射光２２が、誘電体部材１２の外側下方から、誘電体部材１２の側面１２ｂに入射して、誘電体部材１２を介して、誘電体部材１２の上面１２ａに形成された金属膜１４に向かって照射されるようになっている。
【００８２】
また、光源２０と誘電体部材１２との間には、光源２０から照射されるレーザー光を、金属膜１４上で表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするための偏光フィルタを設けることもできる。
【００８３】
また、誘電体部材１２の下方の他方の側面１２ｃの側には、図５に示すように、入射光２２が金属膜１４によって反射された金属膜反射光２４を受光する受光手段２６が備えられている。
【００８４】
なお、光源２０には、光源２０から照射される入射光２２の、金属膜１４に対する入射角α１を適宜変更可能とする入射角調整手段（図示せず）が備えられている。一方で、受光手段２６にも、図示しない可動手段が備えられており、金属膜反射光２４の反射角が変わった場合にも、光源２０と同期して、確実に金属膜反射光２４を受光するように構成されている。
【００８５】
なお、センサチップ１６、光源２０、受光手段２６によって、本発明の定量測定装置１０のＳＰＲ測定を行うＳＰＲ測定部２８が構成されている。
また、センサチップ１６の上方には、後述するような蛍光物質が励起されて発光した蛍光３０を受光するための光検出手段３２が備えられている。
【００８６】
なお、センサチップ１６と、光検出手段３２との間には、例えば、カットフィルタや集光レンズなどを設けることもできる。
なお、センサチップ１６、光源２０、光検出手段３２によって、本発明の定量測定装置１０のＳＰＦＳ測定を行うＳＰＦＳ測定部３４が構成されている。
【００８７】
また、受光手段２６および光検出手段３２は、それぞれ、定量演算手段４０に接続されており、受光手段２６によって受光した金属膜反射光２４の光量と、光検出手段３２によって受光した蛍光３０の光量とが、定量演算手段４０に送信されるように構成されている。
【００８８】
また、本実施例のセンサチップ１６では、金属膜１４の上面１４ａに流路３６が形成されている。この流路３６の一部には、検出対象抗原（アナライト）と特異的に結合する分子（リガンド）が固相化されたセンサ部３８が設けられている。
【００８９】
≪検出用キット≫
本発明の検出用キットは、上記本発明の検出方法に使用されるものである。本発明の検出用キットは、
（１）検出対象糖鎖および非検出対象糖鎖を含む複数種の糖鎖と結合する標識用レクチンを含む試薬、
（２）少なくとも１種の前記非検出対象糖鎖と結合するマスク用糖鎖認識分子を含む試薬、および
（３）前記検出対象糖鎖を有するアナライトと結合するリガンドを含む試薬、
を含む。
【００９０】
また、本発明の検出用キットは、さらに、
（４）本発明に係る検出方法が指示として記載された使用説明書、および／または
（５）レクチン標識化試薬
を含んでいてもよい。
【００９１】
キットに含まれる使用説明書（４）は、本発明の方法を実施するために、本発明に係る検出方法のいずれかが、指示として記載された使用説明書である。使用説明書の具体的態様は上記情報を適切に伝達できるものであればよい。例えば、紙片、キットの包装、キットの構成物のラベル等に印刷されているものでよく、ディスケット、ＣＤ等コンピューターで読み取り可能な媒体中に記録されているものでもよい。
【００９２】
キットに含まれるレクチン標識化試薬（５）は、レクチンを標識化する際に用いる試薬であり、標識体と、レクチンと標識体を結合させる試薬を通常含むものである。
≪応用例≫
本発明の方法は、疾病の診断に用いることができる。例えば、検出対象抗原（アナライト）がＰＳＡの場合、本発明の検出方法により定量された、患者由来の生体試料中のＰＳＡ量から、前立腺癌の診断をすることが可能である。他にも、アナライトがＡＦＰの場合は肝細胞癌を、ＣＥＡの場合は消化管を中心とした癌の診断をすることが可能である。
【実施例】
【００９３】
以下に実施例を示し本発明の詳細な説明を行うが、本発明はこれにより限定されるものではない。
（定量測定装置の構成）
以下の実施例においては、測定装置として、上記ＳＰＦＳ測定装置を自作して使用した。当該ＳＰＦＳ測定装置は、上記定量測定装置１０と同様の構成である。
【００９４】
なお、上記構成のうち、光源２０として、波長６３５ｎｍの光を照射することができるレーザーダイオード（ＬＤ）を用いており、光源２０と誘電体部材１２との間には、光学フィルタとして減光フィルタ（中性濃度フィルタ）を設けてフォトン量を調整できるようにした。
【００９５】
また、誘電体部材１２としては、シグマ光機（株）製の６０度プリズムを用い、この誘電体部材１２の上部に、後述する、プラズモン励起センサを固定することによって、センサチップ１６を構成する。
【００９６】
また、センサチップ１６の上部には、集光レンズとして対物レンズを備え、光検出手段３２としては、光電子増倍管（ＰＭＴ）を用いた。
（プラズモン励起センサの作製）
屈折率１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板（（株）オハラ製のＳ−ＬＡＬ  １０）をプラズマ洗浄し、この基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法によって形成した。その後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法によって形成した。クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４〜５２ｎｍであった。
【００９７】
このようにして金薄膜が形成された基板を、１０−カルボキシ−１−デカンチオールを１ｍＭ含むエタノール溶液に２４時間以上浸漬し、金薄膜の表面にＳＡＭ膜を形成した。基板をこの溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。
【００９８】
高さ０．５ｍｍの流路となる溝を有し、溝の両端に貫通穴を有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを、ＳＡＭ膜の表面が流路の内側となるように溝をＳＡＭ膜に対向させて基板上に配置し、流路の外側のＰＤＭＳ製シート上部から圧着して、ビスでＰＤＭＳ製シート（流路３６）とプラズモン励起センサとを固定した。
【００９９】
（抗体の固相化）
［調製例１］
〔抗ＰＳＡ抗体固相化ＳＡＭ膜（基板）〕
上記のとおりプラズモン励起センサを接続した外部流路に、超純水を１０分間、その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を２０分間、ペリスタポンプによって、室温（２５℃）、流速５００μＬ／分の条件で循環送液させ、プラズモン励起センサの表面を平衡化した。
【０１００】
続いて、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を５０ｍＭと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を１００ｍＭとを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を５ｍＬ送液し、２０分間循環させた後、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（Ｎｏ.７９、２．５ｍｇ／ｍＬ、ミクリ免疫研究所製）溶液２．５ｍＬを３０分間循環送液することで、ＳＡＭ膜上に当該抗体を固相化し、抗ＰＳＡ抗体固相化ＳＡＭ膜を調製した。
【０１０１】
その後、１重量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を３０分間循環送液することによって、流路内の非特異吸着防止処理を行った。
［調製例２］
〔抗ＡＦＰ抗体固相化ＳＡＭ膜（基板）〕
抗ＰＳＡ抗体の代わりに、抗ＡＦＰモノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）を用いた他は、調製例１と同様にして、抗ＡＦＰ抗体固相化ＳＡＭ膜を調製した。
【０１０２】
（標識レクチンの作製）
［作製例１］
〔蛍光標識ＷＦＡレクチン〕
蛍光標識ＷＦＡレクチンを、蛍光物質ラベリングキット「Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標名）６４７タンパク質ラベリングキット」（インビトロジェン社製）を利用して作製した。ＷＦＡレクチン（Ｌ-１３５０、Ｖｅｃｔｏｒ社）１００μｇ相当と、０．１Ｍ重炭酸ナトリウムと、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｄｙｅとを混合し、室温で１時間反応させた後、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび限外濾過を行い、標識に利用されなかったＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｄｙｅを取り除いて、蛍光標識ＷＦＡレクチンを得た。その後、吸光度を測定し標識レクチン濃度を定量した。
【０１０３】
［作製例２］
〔蛍光標識ＬＣＡレクチン〕
蛍光標識ＬＣＡレクチンを、蛍光物質ラベリングキットを利用して作製した。レクチンとして、ＬＣＡレクチン（Ｌ-１０４０、Ｖｅｃｔｏｒ社）を用いた他は、作製例１と同様にして蛍光標識ＬＣＡレクチンを得た。
【０１０４】
＜血清検体中のＰＳＡの測定＞
陰性対照検体として５種のＰＳＡフリープールヒト血清を用意した。また、陽性対照検体として、これら５種のＰＳＡフリープール血清それぞれに、ＬＮＣａＰ（ヒト前立腺癌細胞培養株）培養上清をＰＳＡ濃度５０ｐｇ/ｍＬとなるように添加した血清サンプルを調製した。これら合計１０個のサンプルをそれぞれＰＢＳにて２倍希釈して、実施例１〜３における測定サンプルとした。なお、前記ＰＳＡフリープールヒト血清としては、コージンバイオ社から正常ヒトプール血清を購入し、ＥＬＩＳＡにてＰＳＡ濃度が０．０１ｎｇ/ｍＬ以下であることを確認した血清を用いた。
【０１０５】
［実施例１］
（血清検体中のＰＳＡの測定（１））
各測定サンプルをガレクチンでマスク処理した後、蛍光標識ＷＦＡレクチン（作製例１）と接触させ、その後、抗ＰＳＡ抗体を固相化した基板（調製例１）と反応させた。詳しくは以下の通りである。
【０１０６】
測定サンプル０．１ｍＬにガレクチンを終濃度１０μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間反応させた。次に、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７で標識したＷＦＡレクチンの溶液（１μｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解したもの）を０．１ｍＬ添加し、室温で１時間反応させた。ガレクチンによるマスク処理、蛍光標識ＷＦＡレクチンによる標識処理を行った測定サンプルを流路に０．1ｍＬ添加し、流速２００μＬ／分にて２０分間循環送液させた。続いて、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）を送液して、５分間洗浄した。その後、定量測定装置によって、ＳＰＦＳ測定を行った。ガレクチンによるマスク処理を除いた工程で測定サンプルの調製も実施し、同様にＳＰＦＳ測定を実施した。
【０１０７】
ＳＰＦＳの測定結果を表２に示す。表中のシグナル値は実測値であり、ＰＳＡ添加血清のシグナル値はＰＳＡ由来のシグナル値＋バックグラウンドのシグナル値として示されている。
【０１０８】
【表２】
0005991032.tif 000003
ガレクチンによるマスク処理を行った測定サンプルは、未処理の測定サンプルと比較して、PSAフリープール血清の値（バックグラウンド）が１/４程度に低下していることを確認した。
【０１０９】
また、５検体のＳ/Ｎ比（ＰＳＡ添加血清のシグナル値／対応するＰＳＡフリー血清のシグナル値）の平均値は、未処理サンプルが２．０２であったのに対し、ガレクチンによるマスク処理サンプルでは３．６２に上昇し、検出感度が上昇することが明らかとなった。
【０１１０】
［実施例２］
（血清検体中のＰＳＡの測定（２））
各測定サンプルをガレクチンでマスク処理した後、抗ＰＳＡ抗体を固相化した基板（調製例１）と反応させ、その後、蛍光標識ＷＦＡレクチン（作製例１）と接触させた。詳しくは以下の通りである。
【０１１１】
測定サンプルにガレクチンを終濃度１０μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間反応させた。ガレクチンによるマスク処理を行った測定サンプルを流路に０．1ｍＬ添加し、流速２００μＬ／分にて２０分間循環送液させた。続いて、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）を送液して、５分間洗浄した。反応後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７を標識したＷＦＡレクチン溶液（１μｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解したもの）を０．１ｍＬ添加し、流速２００μＬ／分にて５分間送液した。再びＴｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）を送液して、５分間洗浄した。その後、定量測定装置によって、ＳＰＦＳ測定を行った。ガレクチンによるマスク処理を除いた工程で測定サンプルの調製も実施し、ＳＰＦＳ測定を実施した。
【０１１２】
ＳＰＦＳの測定結果を表３に示す。表中のシグナル値は実測値であり、ＰＳＡ添加血清のシグナル値はＰＳＡ由来のシグナル値＋バックグラウンドのシグナル値として示されている。
【０１１３】
【表３】
0005991032.tif 000004
ガレクチンによるマスク処理を行った測定サンプルは、未処理の測定サンプルと比較して、ＰＳＡフリープール血清のシグナル値（バックグラウンド）が１/３程度に低下していることを確認した。
【０１１４】
また、５検体のＳ/Ｎ比（ＰＳＡ添加血清のシグナル値／対応するＰＳＡフリー血清のシグナル値）の平均値は、未処理サンプルが２．６４であったのに対し、ガラクトシダーゼ処理サンプルでは４．２０に上昇し、検出感度が上昇することが明らかとなった。
［実施例３］
（血清検体中のＰＳＡの測定（３））
各測定サンプルを抗ＰＳＡ抗体を固相化した基板（調製例１）と反応させた後、ガレクチンでマスク処理し、その後、蛍光標識ＷＦＡレクチン（作製例１）と接触させた。詳しくは以下の通りである。
【０１１５】
測定サンプルを流路に０．1ｍＬ添加し、流速２００μＬ／分にて２０分間循環送液させた。続いて、ガレクチンを１０μｇ／ｍＬを含有するＰＢＳ溶液（ガレクチン（＋）対応）、またはガレクチンを含有しないＰＢＳ（ガレクチン（−）対応）を０．１ｍＬ添加し、２０分間循環送液させた。その後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）を送液して流速２００μＬ／分にて、５分間洗浄した。洗浄後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７を標識したＷＦＡレクチン溶液（１μｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解したもの）を０．１ｍＬ添加し、流速２００μＬ／分にて５分間送液した。その後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）を送液して流速２００μＬ／分にて、５分間洗浄した。その後、定量測定装置によって、ＳＰＦＳ測定を行った。ガレクチンによるマスク処理を除いた工程でもＳＰＦＳ測定を実施した。
【０１１６】
ＳＰＦＳの測定結果を表４に示す。表中のシグナル値は実測値であり、ＰＳＡ添加血清のシグナル値はＰＳＡ由来のシグナル値＋バックグラウンドのシグナル値として示されている。
【０１１７】
【表４】
0005991032.tif 000005
基板上にてガレクチンによるマスク処理を行った測定サンプルは、未処理の測定サンプルと比較して、PSAフリープール血清の値（バックグラウンド）が１/５程度に低下していることを確認した。
【０１１８】
また、５検体のＳ/Ｎ比（ＰＳＡ添加血清のシグナル値／対応するＰＳＡフリー血清のシグナル値）の平均値は、未処理サンプルが３．５０であったのに対し、ガラクトシダーゼ処理サンプルでは１３．５に上昇し、検出感度が上昇することが明らかとなった。
【０１１９】
以上、実施例１〜３において示されたように、上記測定系に生じていた、ガラクトースを含む糖鎖を有する血清成分中の夾雑物（糖タンパク質等）の非特異結合に由来するシグナル（バックグラウンドのノイズ）は、ガレクチンによりそのガラクトースをマスキングすることで抑制することが可能であり、ＰＳＡ上のＧａｌＮＡｃ糖鎖構造を特異的に検出する感度が向上することが確認できた。
【０１２０】
また、実施例２（表３）と実施例３（表４）を比較した結果、マスク処理は、血清タンパク質が大量に含まれている溶液中で行うよりも、ある程度対象が絞られる抗体固定化基板上で行う方が効果が高いことが確認できた。
【０１２１】
＜血清検体中のＡＦＰの測定＞
前記実施例１〜３ではＰＳＡを検出対象抗原（アナライト）として試験を実施したが、同様の試験をＡＦＰを検出対象抗原として実施した。以下に実施例４〜６として示す。
【０１２２】
陰性対照検体として５種のＡＦＰフリープール血清を用意した。また、陽性対照検体として、これら５種のＡＦＰフリープール血清それぞれに、ミュータスワコーＡＦＰ−Ｌ３用コントロールＬ（商品名、和光純薬株式会社製、Ｌ３＝２０％、ＡＦＰ濃度２００ｎｇ／ｍＬ）をＡＦＰ濃度１．０ｎｇ/ｍＬとなるように添加した血清サンプルを調製した。これら合計１０個のサンプルを実施例４〜６における測定サンプルとした。なお、前記ＡＦＰフリープールヒト血清としては、コージンバイオ社から正常ヒトプール血清を購入し、ＥＬＩＳＡにてＡＦＰ濃度が０．０１ｎｇ/ｍＬ以下であることを確認した血清を用いた。
【０１２３】
［実施例４］
（血清検体中のＡＦＰの測定（１））
各測定サンプルをコンカナバリンＡレクチンでマスク処理した後、蛍光標識ＬＣＡレクチン（作製例２）と接触させ、その後、抗ＡＦＰ抗体を固相化した基板（調製例２）と反応させた。
【０１２４】
すなわち、実施例１において、ガレクチンに代えてコンカナバリンＡレクチンを、蛍光標識ＷＦＡレクチン（作製例１）に代えて蛍光標識ＬＣＡレクチン（作製例２）を、抗ＰＳＡ抗体を固相化した基板（調製例１）に代えて抗ＡＦＰ抗体を固相化した基板（調製例２）を用いた他は、実施例１と同様に行った。
【０１２５】
ＳＰＦＳの測定結果を表５に示す。表中のシグナル値は実測値であり、ＡＦＰ添加血清のシグナル値はＡＦＰ由来のシグナル値＋バックグラウンドのシグナル値として示されている。
【０１２６】
【表５】
0005991032.tif 000006
コンカナバリンＡレクチンによるマスク処理を行った測定サンプルは、未処理の測定サンプルと比較して、ＡＦＰフリープール血清の値（バックグラウンド）が３/４程度に低下していることを確認した。その時のＡＦＰ-Ｌ３添加血清を測定した場合の値はほとんど差がないことも確認できた。
【０１２７】
また、５検体のＳ/Ｎ比（ＡＦＰ−Ｌ３添加血清のシグナル値／対応するＡＦＰフリー血清のシグナル値）の平均値は、未処理サンプルが４．１８であったのに対し、ガラクトシダーゼ処理サンプルでは４．８０に上昇し、検出感度が上昇することが明らかとなった。
【０１２８】
［実施例５］
（血清検体中のＡＦＰの測定（２））
各測定サンプルをコンカナバリンＡレクチンでマスク処理した後、抗ＡＦＰ抗体を固相化した基板（調製例２）と反応させ、その後、蛍光標識ＬＣＡレクチン（作製例２）と接触させた。
【０１２９】
すなわち、実施例２において、ガレクチンに代えてコンカナバリンＡレクチンを、蛍光標識ＷＦＡレクチン（作製例１）に代えて蛍光標識ＬＣＡレクチン（作製例２）を、抗ＰＳＡ抗体を固相化した基板（調製例１）に代えて抗ＡＦＰ抗体を固相化した基板（調製例２）を用いた他は、実施例２と同様に行った。
【０１３０】
ＳＰＦＳの測定結果を表６に示す。表中のシグナル値は実測値であり、ＡＦＰ添加血清のシグナル値はＡＦＰ由来のシグナル値＋バックグラウンドのシグナル値として示されている。
【０１３１】
【表６】
0005991032.tif 000007
コンカナバリンＡレクチンによるマスク処理を行った測定サンプルは、未処理の測定サンプルと比較して、ＡＦＰフリープール血清の値（バックグラウンド）が３/２程度に低下していることを確認した。その時のＡＦＰ-Ｌ３添加血清を測定した場合の値はほとんど差がないことも確認できた。
【０１３２】
また、５検体のＳ/Ｎ比（ＡＦＰ−Ｌ３添加血清のシグナル値／対応するＡＦＰフリー血清のシグナル値）の平均値は、未処理サンプルが６．４３であったのに対し、ガラクトシダーゼ処理サンプルでは８．２５に上昇し、検出感度が上昇することが明らかとなった。
【０１３３】
［実施例６］
（血清検体中のＡＦＰの測定（３））
各測定サンプルを抗ＡＦＰ抗体を固相化した基板（調製例２）と反応させた後、マンノシダーゼで酵素処理し、その後、蛍光標識ＬＣＡレクチン（作製例２）と接触させた。
【０１３４】
すなわち、実施例３において、ガレクチンに代えてコンカナバリンＡレクチンを、蛍光標識ＷＦＡレクチン（作製例１）に代えて蛍光標識ＬＣＡレクチン（作製例２）を、抗ＰＳＡ抗体を固相化した基板（調製例１）に代えて抗ＡＦＰ抗体を固相化した基板（調製例２）を用いた他は、実施例３と同様に行った。
【０１３５】
ＳＰＦＳの測定結果を表７に示す。表中のシグナル値は実測値であり、ＡＦＰ添加血清のシグナル値はＡＦＰ由来のシグナル値＋バックグラウンドのシグナル値として示されている。
【０１３６】
【表７】
0005991032.tif 000008
基板上にてコンカナバリンＡレクチンによるマスク処理を行った測定サンプルは、未処理の測定サンプルと比較して、ＡＦＰフリープール血清の値（バックグラウンド）が１２程度に低下していることを確認した。
【０１３７】
また、５検体のＳ/Ｎ比（ＡＦＰ−Ｌ３添加血清のシグナル値／対応するＡＦＰフリー血清のシグナル値）の平均値は、未処理サンプルが８．１１であったのに対し、ガラクトシダーゼ処理サンプルでは１５．３に上昇し、検出感度が上昇することが明らかとなった。
【０１３８】
以上、実施例４〜６において示されたように、マンノースを含む糖鎖を有する血清成分中の夾雑物（糖タンパク質等）の非特異結合に由来する、上記測定系に生じていたシグナル（ノイズ）は、コンカナバリンＡレクチンによりそのマンノースをマスキングすることで抑制することが可能であり、ＡＦＰ上のフコース糖鎖構造を特異的に検出する感度が向上することが確認できた。
【０１３９】
また、実施例５（表６）と実施例６（表７）を比較した結果、マスク処理は、血清タンパク質が大量に含まれている溶液中で行うよりも、ある程度対象が絞られる抗体固定化基板上で行う方が、効果が高いことが確認できた。
【０１４０】
上記実施例では、ＳＰＦＳ測定装置において、各種溶液を循環送液する態様を例として説明したが、必ずしも循環させる必要はなく、一方向に送液し続ける態様や、両方向に往復送液する態様、あるいは、所定量の溶液を送液した後、所定時間滞留させる態様など、本発明の目的を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【０１４１】
１０      定量測定装置
１２      誘電体部材
１２ａ    上面
１２ｂ    側面
１２ｃ    側面
１４      金属膜
１４ａ    上面
１６      センサチップ
１８      センサチップ装填部
２０      光源
２２      入射光
２４      金属膜反射光
２６      受光手段
２８      ＳＰＲ測定部
３０      蛍光
３２      光検出手段
３４      ＳＰＦＳ測定部
３６      微細流路
３８      センサ部
４０      定量演算手段
４４      抗原補足抗体（リガンド）
４６      検出対象抗原（アナライト）
４６ａ    タンパク質（抗原）
４６ｂ    検出対象糖鎖でも非検出対象糖鎖でもない糖鎖
４６ｃ    検出対象糖鎖
４６ｄ    非検出対象糖鎖
５０      非特異的に吸着する糖タンパク質（夾雑物）
５０ａ    タンパク質
５２      非特異的に吸着する糖脂質（夾雑物）
５２ａ    脂質
６０      蛍光標識レクチン（プローブ）
６０ａ      標識用レクチン
６０ｂ      標識体
７５      マスク用糖鎖認識分子
８０      支持体
【図１】
0005991032.tif 000009
【図２】
0005991032.tif 000010
【図３】
0005991032.tif 000011
【図４】
0005991032.tif 000012
【図５】
0005991032.tif 000013
【図６】
0005991032.tif 000014