(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＶＩＩＩでジスルフィド結合を形成した２つのシステイン残基の硫黄原子を架橋するリンカー基によって１つ以上のポリエチレングリコール基が第ＶＩＩＩ因子に共役してなり、以下の構造を有する、第ＶＩＩＩ因子−ポリエチレングリコール共役体：
【化１】
0005870088.tif 000016
この際、Ｒ１は、直接結合、アルキレン基、または置換されてもよいアリールもしくはヘテロアリール基である置換基であり；前記アリール基としては、フェニル基、ベンゾイル基、およびナフチル基が挙げられ；前記ヘテロアリール基としては、ピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、ピリダジン、ピリミジンおよびプリンが挙げられ；ＰＥＧへの連結は、加水分解に不安定な結合による、または安定な結合(nonlabile bond)によるものである。
【請求項２】
前記アルキレン基がＣ１−１０アルキレン基である、請求項１に記載の第ＶＩＩＩ因子−ポリエチレングリコール共役体。
【請求項３】
前記ポリエチレングリコールが５〜１００ｋＤａの分子量を有する、請求項１または２に記載の第ＶＩＩＩ因子−ポリエチレングリコール共役体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の第ＶＩＩＩ因子−ポリエチレングリコール共役体を含む、薬剤組成物。
【請求項５】
製薬上許容できる希釈剤、アジュバント、または担体を含む、請求項４に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
他の薬剤活性のある物質(pharmaceutically active agent)をさらに含む、請求項４または５に記載の薬剤組成物。
【請求項７】
非経口投与に適する、請求項４〜６のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項８】
皮内、皮下、および筋肉内注射、並びに静脈内または骨内注入に適する、請求項４〜７のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項９】
溶液、懸濁液、またはエマルジョンの形態を有する、請求項４〜８のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１０】
前記共役体が、未修飾のＦＶＩＩＩと比べて長い半減期を有する、請求項４〜９のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１１】
前記共役体が、未修飾のＦＶＩＩＩと比べて高いＡＵＣを有する、請求項４〜１０のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１２】
前記共役体が、未修飾のＦＶＩＩＩと比べて高いバイオアベイラビリティを有する、請求項４〜１１のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１３】
前記共役体が、未修飾のＦＶＩＩＩと比べて低い免疫原性を有する、請求項４〜１２のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１４】
血液凝固疾患(blood clotting disease)または外傷(trauma)の治療に用いられる、請求項４〜１３のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１５】
前記血液凝固疾患が、血友病Ａまたは血友病Ｂである、請求項１４に記載の薬剤組成物。
【請求項１６】
血友病Ａ、血友病Ｂまたは外傷を有する哺乳動物の関節血症、出血、胃腸出血、および月経過多症の危険性を低減するのに用いられる、請求項４〜１３のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１７】
皮下に投与されて用いられる、請求項１６に記載の薬剤組成物。
【請求項１８】
静脈内に投与されて用いられる、請求項１６に記載の薬剤組成物。
【請求項１９】
１〜１４日に１度投与されて用いられる、請求項１６に記載の薬剤組成物。
【請求項２０】
ＦＶＩＩＩの機能の欠損の特徴を有する血液凝固疾患(blood clotting disease)の治療、または外傷の治療に使用される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の第ＶＩＩＩ因子−ポリエチレングリコール共役体。
【請求項２１】
以下の構造を有する、第ＶＩＩＩ因子−ポリエチレングリコール共役体：
【化２】
0005870088.tif 000017
この際、Ｒ１は、直接結合、アルキレン基、または置換されてもよいアリールもしくはヘテロアリール基である置換基であり；前記アリール基としては、フェニル基、ベンゾイル基、およびナフチル基が挙げられ；前記ヘテロアリール基としては、ピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、ピリダジン、ピリミジンおよびプリンが挙げられ；ＰＥＧへの連結は、加水分解に不安定な結合による、または安定な結合(nonlabile bond)によるものである、
の調製方法であって、
（ａ）ＦＶＩＩＩの２つのシステイン残基間のもとのジスルフィド結合を還元して、２つの遊離チオール基を生成し；
（ｂ）共役二重結合を有する共役試薬および脱離基の第１のチオレート付加反応(thiolate addition reaction)を行い；
（ｃ）前記脱離基の脱離によって、共役二重結合を生成し；さらに
（ｄ）第２のチオレート付加反応を行い、２つの硫黄原子間に３−炭素架橋を形成する
ことを含む、方法。
【請求項２２】
前記共役試薬は、下記式：
【化３】
0005870088.tif 000018
この際、Ｒ１は、直接結合、アルキレン基、または置換されてもよいアリールもしくはヘテロアリール基である置換基であり；前記アリール基としては、フェニル基、ベンゾイル基、およびナフチル基が挙げられ；前記ヘテロアリール基としては、ピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、ピリダジン、ピリミジンおよびプリンが挙げられ；ＰＥＧへの連結は、加水分解に不安定な結合による、または安定な結合(nonlabile bond)によるものであり、およびＬが、脱離基である、
を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アルキレン基がＣ１−１０アルキレン基である、請求項２１または２２に記載の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液凝固第ＶＩＩＩ因子の共役体に関する。
【背景技術】
【０００２】
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、重要な血液凝固因子であり、抗血友病因子（ＡＨＦ）としても知られている。ヒトでは、第ＶＩＩＩ因子はＦ８遺伝子にコードされている。この遺伝子が欠損すると、約５０００の男性のうち１人に発生する、劣性Ｘ染色体凝固障害としてよく知られる血友病Ａになる。
【０００３】
前記Ｘ染色体のＦ８遺伝子は、シグナルペプチドの開裂により２３３２アミノ酸の成熟ＦＶＩＩＩ分子を与えた後の２６のエクソンから２３５１のポリペプチドをコードする(Wang et al. Int. J. Pharmaceutics, 259: 1-15 (2003))。ＦＶＩＩＩは、ヒトにおける放出の原発部位がどこであるか不明な部分がかなりあるが、血管、糸球体、および管状の内皮細胞、並びに肝類洞細胞により合成され、血流に放出されることが見出されている。前記ＦＶＩＩＩ分子は、６つのタンパク質ドメイン；ＮＨ２−Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２−ＣＯＯＨで構成されている。前記成熟分子は、Ｎ−結合およびＯ−結合のグリコシル化、スルホン化、およびジスルフィド結合形成を含む、多くの翻訳後修飾を含む。ＦＶＩＩＩは、タンパク質のＡおよびＣドメインにおいて、合計２３のシステイン残基、８のジスルフィド結合を形成する１６のこれらの形態を含む(McMullen et al. Protein Science, 4:740-746(1995))。前記タンパク質の翻訳後修飾により、循環分子量は、グリコシル化のレベルおよび型により、最高３００ｋＤａでありうる。前記循環種が重鎖（Ａ１−Ａ２−Ｂ）および軽鎖（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）から構成されるヘテロダイマーとなるように、ＦＶＩＩＩはまた、タンパク質分解工程である。ＦＶＩＩＩが循環内に分泌されると、ＦＶＩＩＩは非共有な形態でヴォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）と結合する。前記２つの分子の結合は、ＦＶＩＩＩの軽鎖のＡ３およびＣ２ドメインで生じる(Lacroix-Desmazes et al. Blood, 112:240-249(2008))。ｖＷＦへの結合は、ＦＶＩＩＩの安定性および循環半減期を増加させる。ｖＷＦへの結合は、ＦＶＩＩＩの循環半減期させるが、ＦＶＩＩＩのもとの半減期は、１５〜１９時間である。
【０００４】
第ＶＩＩＩ因子は、内因系血液凝固経路に関わる重要な補因子である。前記凝固カスケードにおける役割は、活性化した血小板表面の正確な空間的配位におけるＦＸａｓｅ複合体の構成をするための「核形成鋳型」としての機能である(Shen et al. Blood, 111:1240-1247(2008))。ＦＶＩＩＩは、はじめにトロンビン（因子ＩＩａ）またはＦＸａにより活性化され、次いで、ＦＶＩＩＩａの形態でｖＷｆから解離する。ＦＶＩＩＩａは次いで、活性化血小板と血管損傷した部位で結合し、Ａ２およびＡ３の相互作用を介してＦＩＸａと結合する。血小板表面のＣａ２＋の存在下における前記ＦＩＸａのＦＶＩＩＩへの結合により、約２０００００倍ＦＩＸａのタンパク質分解活性が向上する。この複合体は、次いで、ＦｘをＦｘａに活性化する。第Ｘａ因子は、第Ｖａ因子の補因子を有し、トロンビンをより活性化する。トロンビンは、次にフィブリノーゲンをフィブリンに分解し、フィブリンの血液凝固における（第ＸＩＩＩ因子を使用した）重合および架橋を生じさせる。
【０００５】
もはやｖＷＦによって保護されてない活性化ＦＶＩＩＩは、前記工程におけるタンパク質分解が非活性化され（活性化タンパク質Ｃおよび第ＩＸａ因子によって特に顕著である）、血中から速やかに除去される。
【０００６】
タンパク質のＰＥＧ化のアプローチは、PolyTherics社によって開発され、ＰＥＧポリマーをタンパク質の１対のシステイン残基の還元ジスルフィド結合を介して所望のタンパク質に結合したTheraPEG（商標）として知られている（国際公開第2005/007197号）。この技術は、第ＦＩＸａ因子の混入のないＰＥＧ化形態の第ＩＸ因子の調製に用いられる（国際公開第2009/130602号）。
【０００７】
しかしながら、ＦＶＩＩＩのＰＥＧ化にこの同じ技術を使用することに関しては、自明または日常的なものである(trivial or routine)とは考えられなかった。
【０００８】
ＦＩＸに対するＦＶＩＩＩの活性の観点から、タンパク質と生体適合性ポリマーとの共役が容易な工程ではない特定のカギとなる相違が存在する。
【０００９】
例えば、ＦＩＸａはセリンタンパク質であり、ＦＶＩＩＩは酵素活性を有さない。一度活性化されたＦＩＸは、ＦＶＩＩＩに生じるその補因子との関連を形成し、凝固カスケードにおいて関与する際にのみ必要とする。
【００１０】
対照的に、ＦＶＩＩＩは、補因子であり、他の凝固因子（ＦＩＸａを含む）の構築における「鋳型」を形成することによって、これらの酵素活性が向上する。
【００１１】
これらの機能を発揮するために、ＦＶＩＩＩはＦＸ、ＦＸａ、ＦＩＸａ、およびリン脂質と結合できなければならない。また、循環においてＦＶＩＩＩを安定にするために、ヴォン・ヴィレブランド因子と結合できなければならない。したがって、システイン残基のジスルフィド結合におけるこのタンパク質のＰＥＧ化は、ジスルフィドが分子間相互作用を起こすＦＶＩＩＩのドメインのすべてに位置するため、これらの相互作用を立体的に妨げる。
【発明の概要】
【００１２】
よって、第ＦＶＩＩＩ因子のＰＥＧ化は、ＦＩＸのそれとは区別することができ、異なった、いくつかの独特および異なる課題が存在する。
【００１３】
TheraPEG（商標）の技術を利用したＦＩＸのＰＥＧ化が成功したという事実は、構造および機能が異なるタンパク質であるため、同じ方法を用いて調製されたＰＥＧ化ＦＶＩＩＩが成功するか失敗するかの指針となるものではない。
【００１４】
第ＶＩＩＩ因子（以下、ＦＶＩＩＩとも称する）の製造が、ＦＶＩＩＩを１以上の生体適合性ポリマーに共役することによって向上することを発見した。前記製造性能の向上としては、ＦＶＩＩＩの共役体の高純度の生産能を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の第一の態様によると、１以上のシステイン残基を介してＦＶＩＩＩに共役した生体適合性ポリマーが提供される。
【００１６】
前記生体適合性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ−ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、エチレングリコールおよびプロピレングリコールの共重合体、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオレフィンアルコール(polyolefinic alcohol)、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリサッカライド、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリビニルアルコール、ポリホスホスファスファゼン(polyphosphosphasphazene)、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルフォリン）、ポリアルキレンオキシドポリマー(polyalkyene oxide polymers)、ポリマレイン酸、ポリ（ＤＬ−アラニン）、カルボキシメチルセルロール、デキストラン、デンプンまたはデンプン誘導体、ヒアルロン酸、キチン、ポリメタクリレート、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ポリヒドロキシアルカノエート(polyhydroxy alkanoates)、ポリアミノ酸、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されうる。前記生体適合性ポリマーは、直鎖または分岐鎖の構造を有していてもよい。
【００１７】
さらなる実施形態においては、生体適合性ポリマーは、制限されないが、ＦＶＩＩ、アルブミン、トランスフェリン、モノクローナル抗体、抗体断片、例えば、単一ドメイン抗体、ＶＬ、ＶＨ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ３、ｓｃＦｖ、ｄｉ−ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、Ｆｃ及、およびこれらの組み合わせ等の免疫グロブリンからなる群から選択されるタンパク質でありうる。
【００１８】
１以上の生体適合性ポリマーが、必要であれば１以上のシステイン残基を介して各ＦＶＩＩＩ分子に共役してもよい。遊離システイン残基は、システインジスルフィド結合を還元した結果である。本発明に係る生体適合性ポリマーは、１以上の還元型システインジスルフィド結合を介してＦＶＩＩＩに共役してもよい。前記共役は、ＦＶＩＩＩでジスルフィド結合を形成した２つのシステイン残基の硫黄残基を架橋するリンカー基によるものであってもよい。前記ジスルフィド結合は、したがって、天然のジスルフィド結合であっても、組換により導入されたジスルフィド結合であってもよい。
【００１９】
前記ＰＥＧ分子は、任意の適当な分子量、例えば、５〜１００ｋＤａ、１０〜５００ｋＤａ、好ましくは５〜３０ｋＤａまたは１０〜３０ｋＤａを有していてもよい。適当な分子量としては、１０、２０、または３０ｋＤａを含む。
【００２０】
好ましくは、ＦＶＩＩＩ共役体の生体適合性ポリマー部分は、２つのシステイン残基に結合してもよく、これによりＦＶＩＩＩにジスルフィド結合を形成する。したがって、リンカーを含むＰＥＧはジスルフィド結合を架橋する。このような共役方法の例は、国際公開第2005/007197号、国際公開第2009/047500号、および国際公開第2010/010324号に記載される。
【００２１】
本発明の一実施形態において、生体適合性ポリマーは、図２に示されるスキームに従ってＦＶＩＩＩに共役できる。図２では、基Ｒ１が生体適合性ポリマーおよびＦＶＩＩＩ分子のジスルフィド結合の硫黄原子を結ぶリンカー基の間に示される。
【００２２】
Ｒ１は、直接結合、アルキレン基（好ましくはＣ１−１０アルキレン基）、または置換されてもよいアリールもしくはヘテロアリール基でありうる置換基を示し；この際、アリール基は、フェニル、ベンゾイル、およびナフチル基を含み；適当なヘテロアリール基は、ピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、ピリダジン、ピリミジン、およびプリンを含み；ポリマーへの連結は、加水分解に不安定な結合(hydrolytically labile bond)、または安定な結合(nonlabile bond)によるものである。
【００２３】
アリールまたはヘテロアリール基に存在しうる特定の置換基は、例えば、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＲ、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＯＣＯ２Ｒ、−ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＨＣＯ２Ｒ、−ＮＲ’ＣＯ２Ｒ、−ＮＯ、−ＮＨＯＨ、−ＮＲ’ＯＨ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣＯＲ、−Ｃ＝Ｎ−−ＮＲ’ＣＯＲ、−Ｎ＋Ｒ３、−Ｎ＋Ｈ３、−Ｎ＋ＨＲ２、−Ｎ＋Ｈ２Ｒ、ハロゲン、例えば、フッ素または塩素、−Ｃ≡ＣＲ、−Ｃ＝ＣＲ２、および１３Ｃ＝ＣＨＲ（この際、ＲまたはＲ’は、それぞれ独立して、水素原子またはアルキル基（好ましくはＣ１−６）またはアリール（好ましくはフェニル）基を表す）から選択される１以上の同一または異なる置換基を含む。電子求引性置換基の存在が特に好ましい。一実施形態において、Ｒ１の置換されてもよいアリールまたはヘテロアリール基は、Ｒ１ユニットを生体適合性ポリマーに連結するアミド（ＮＨＣＯ）基で置換されたアリールまたはヘテロアリール基を含む。
【００２４】
ＦＶＩＩＩのシステイン残基間の元のジスルフィド結合の２つの硫黄原子間のリンカー基は、３−炭素架橋を有していてもよい。一実施形態において、ＦＶＩＩＩのシステイン残基間の元のジスルフィド結合の２つの硫黄原子間のリンカー基は、（ＣＨ２）２ＣＨＣ（Ｏ）−である。
【００２５】
本発明の一実施形態において、前記生体適合性ポリマーは、上記のようにして共役してもよく、この際、生体適合性ポリマーに共役したＦＶＩＩＩを含む組成物は下記構造を有する：
【００２６】
【化１】
0005870088.tif 000002
【００２７】
本発明の最も広義な意味では、前記試薬は下記のように表されうる：
【００２８】
【化２】
0005870088.tif 000003
【００２９】
この際、Ｒ１は上記と同様の定義であり、およびＬは脱離基である。
【００３０】
Ｌは、−ＳＲ、−ＳＯ２Ｒ、−ＯＳＯ２Ｒ、−Ｎ＋Ｒ３、−Ｎ＋ＨＲ２、−Ｎ＋Ｈ２Ｒ、ハロゲン（例えば、フッ素または塩素）、または−ＯＷを表してもよく、この際、Ｒは、それぞれ独立して、水素原子またはアルキル基（例えば、Ｃ１−６アルキル）またはアリール基（例えば、フェニル）を表し、Ｗは、少なくとも１個の電子求引性置換基を含む置換されたアリール基（例えば、フェニル）を表す。
【００３１】
一実施形態において、前記脱離基ＬがＳＯ２Ｒ２（この際、Ｒ２は、それぞれ独立して、水素原子またはアルキル基（例えば、Ｃ１−６アルキル）またはアリール基（例えば、フェニル）を表す）であり、Ｒ１は上記と同様の定義であり、前記共役試薬は、下記式を有する：
【００３２】
【化３】
0005870088.tif 000004
【００３３】
一実施形態において、前記生体適合性ポリマーはＰＥＧであってもよく、前記脱離基は−ＳＯ２Ｒ２であってもよく、この際、Ｒ２は上記と同様の定義であり、前記試薬は下記のとおりである：
【００３４】
【化４】
0005870088.tif 000005
【００３５】
本発明の他の実施形態において、前記共役試薬は、生体適合性ポリマーがアミド部分（ＣＯＮＨ）を介して連結する特定の配列から形成されてもよく、この際、Ｌは上記と同様の定義の脱離基である。換言すると、Ｒ１はＲ３−ＣＯＮＨであり、前記試薬は下記式を有する：
【００３６】
【化５】
0005870088.tif 000006
【００３７】
Ｒ３は、直接結合、アルキレン基（好ましくはＣ１−１０アルキレン基)、または置換されてもよいアリールもしくはヘテロアリール基でありうる置換基を示し；この際、アリール基は、フェニル、ベンゾイル、およびナフチル基を含み；適当なヘテロアリール基は、ピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、ピリダジン、ピリミジン、およびプリンを含み；ポリマーへの連結は、加水分解に不安定な結合(hydrolytically labile bond)、または安定な結合(nonlabile bond)によるものである。
【００３８】
アリールまたはヘテロアリール基に存在しうる特定の置換基は、例えば、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＲ、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＯＣＯ２Ｒ、−ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＨＣＯ２Ｒ、−ＮＲ’ＣＯ２Ｒ、−ＮＯ、−ＮＨＯＨ、−ＮＲ’ＯＨ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣＯＲ、−Ｃ＝Ｎ−−ＮＲ’ＣＯＲ、−Ｎ＋Ｒ３、−Ｎ＋Ｈ３、−Ｎ＋ＨＲ２、−Ｎ＋Ｈ２Ｒ、ハロゲン、例えば、フッ素または塩素、−Ｃ≡ＣＲ、−Ｃ＝ＣＲ２、および１３Ｃ＝ＣＨＲ（この際、ＲまたはＲ’は、それぞれ独立して、水素原子またはアルキル基（好ましくはＣ１−６）またはアリール（好ましくはフェニル）基を表す）から選択される１以上の同一または異なる置換基を含む。電子求引性置換基の存在が特に好ましい。
【００３９】
部分ＣＯＮＨが存在し、前記脱離基が−ＳＯ２Ｒ２であり、Ｒ２およびＲ３が上記と同様の定義である一実施形態において、前記試薬は下記のとおりである：
【００４０】
【化６】
0005870088.tif 000007
【００４１】
前記共役試薬の上記と同様の定義のＲ１における置換されてもよいアリールまたはヘテロアリール基がアミド（ＮＨＣＯ）基によって置換されたアリールまたはヘテロアリール基であり、Ｒ３が上記と同様の定義であるこのような実施形態において、前記共役タンパク質の構造は下記のとおりでありうる：
【００４２】
【化７】
0005870088.tif 000008
【００４３】
生体適合性ポリマーがＰＥＧである場合、ＰＥＧがポリエチレン部分であり、Ｌが上記した定義と同様の脱離基である、本発明の本実施形態における共役試薬は、下記のとおりである：
【００４４】
【化８】
0005870088.tif 000009
【００４５】
反応条件が中性または若干塩基性である場合には、下記試薬が使用されうる：
【００４６】
【化９】
0005870088.tif 000010
【００４７】
より酸性の条件では、上記試薬は以下に示される下記分子、ＰＥＧモノ−スルホンを形成してもよく、これはまた本明細書に記載される共役反応への使用に適する。
【００４８】
【化１０】
0005870088.tif 000011
【００４９】
前記第ＶＩＩＩ因子は、任意の好適な原料由来のものでありうる。第ＶＩＩＩ因子は組換ＤＮＡ技術を使用して生産されてもよく、または血漿から精製されてもよい。第ＶＩＩＩ因子は、その活性断片または突然変異タンパク質を含む。
【００５０】
本明細書中で使用される「突然変異タンパク質」との語は、元のＦＶＩＩＩと比較して得られた産物の活性を顕著に変化させることなく、ＦＶＩＩＩの天然成分の１以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基に置換されるもしくは欠失する、または１以上のアミノ酸残基がＦＶＩＩＩの元の配列に付加する、ＦＶＩＩＩタンパク質のアナログを意味する。これらの突然変異タンパク質は、既知の合成法および／もしくは部位特異的突然変異誘発技術、または上記に適切な他の既知の技術によって調製される。
【００５１】
本発明に係る突然変異タンパク質は、ストリンジェントな条件下で、本発明に係る、ＦＶＩＩＩをコード化する、ＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズする、ＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸によってコード化されるタンパク質を含む。「ストリンジェントな条件」との語は、ハイブリッド形成および次の洗浄条件を意味し、当業者はこれを従来「ストリンジェント」と称する(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Interscience, N.Y., sections 63 and 6.4 (1987, 1992); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y (1989))。
【００５２】
下記に制限されるものではないが、ストリンジェントな条件の例としては、例えば５分間、２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ、１５分間、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ；３７℃で３０〜６０分間、０．１倍ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ、並びにその後６８℃で３０〜６０分間、０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中で、研究されるハイブリッドの計算上のＴｍ未満の１２〜２０℃の洗浄条件を含む。当業者は、ストリンジェントな条件は、ＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチドプローブ（１０〜４０塩基等）、またはオリゴヌクレオチドプローブ混合物の長さによっても異なることは理解している。プローブ混合物を使用する場合には、ＳＳＣの代わりにテトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）を使用することが好ましい。
【００５３】
このような突然変異タンパク質は、実質的に同様の、またはより高いＦＶＩＩＩへの活性を有するように、ＦＶＩＩＩの配列と十分重複したアミノ酸配列を有することが好ましい。
【００５４】
ＦＶＩＩＩの特徴的な活性の一つとしては、血液凝固カスケードへの参加能があり、ＦＶＩＩＩ活性を検出するためのアッセイは本明細書に記載される。突然変異タンパク質がかなりのＦＶＩＩＩ活性を有する限り、これはＦＶＩＩＩと実質的に同様の活性を有すると考えられうる。ゆえに、このような突然変異タンパク質を本明細書に記載されるアッセイにかけることを含む定常的な実験によって、所定の突然変異タンパク質が少なくとも実質的にＦＶＩＩＩと同じ活性を有するかどうかを決定できる。
【００５５】
好ましい実施形態において、このような突然変異タンパク質は、ＦＶＩＩＩのアミノ酸配列と少なくとも４０％の同一性(identity)または相同性(homology)を有する。より好ましくは、ＦＶＩＩＩのアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または最も好ましくは少なくとも９０％、９５％もしくは９９％の同一性(identity)または相同性(homology)を有する。
【００５６】
同一性(identity)は、配列を比較することによって決定される、２以上のポリペプチド配列または２以上のポリヌクレオチド配列間の関係を反映する。通常、同一性は、比較する配列の長さにわたって、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の精密なヌクレオチド−ヌクレオチドまたはアミノ酸−アミノ酸の対応(exact nucleotide to nucleotide or amino acid to amino acid correspondence)を意味する。
【００５７】
精密な対応が存在しない配列では、「同一性（％）」が測定される。通常、比較される２つの配列を、配列間の最大の相関性があるように並べる。これは、アライメントの度合いを上げるために、１または２つの配列中に「ギャップ」を挿入することを含みうる。同一性（％）は、比較されるそれぞれの配列の全長にわたって測定されてもよく（いわゆる、グローバルアライメント）、これは同じまたは極めて類似の長さの配列に特に適切であり、またはより短い所定の長さにわたって測定されてもよく（いわゆる、ローカルアライメント）、これは長さが異なる配列により適切である。
【００５８】
２以上の配列の同一性または相同性を比較する方法は当該分野において既知である。ゆえに、例えば、Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1 (Devereux, et al., Nucleic acids Research, 12: 387 (1984))で利用できるプログラム、例えば、プログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰを用いて、２つのポリヌクレオチド間の同一性（％）や２つのポリペプチド配列間の同一性（％）や相同性（％）を測定してもよい。ＢＥＳＴＦＩＴは、Smith and Waterman (Advances in Applied Mathematics, 2: 482-489 (1981))の「ローカルホモロジー(local homology)」アルゴリズムを使用し、２つの配列間で類似する最適な単一の領域を見出す。配列間の同一性および／または類似性(similarity)を測定する他のプログラムもまた当該分野において既知であり、例えば、プログラム(Atschul et al., J. Molec. Biol., 215: 403 (1990), www.ncbi.nlm.nih.govのNCBIのホームページでアクセス可能)のＢＬＡＳＴファミリーやＦＡＳＴＡ(Pearson W R, Methods in Enzymology, 183: 63-98 (1990))がある。
【００５９】
本発明に従って使用できるＦＶＩＩＩの突然変異タンパク質は、本明細書に提示される教示やガイダンスに基づいて、過度の実験を必要とすることなく、当業者によって定常的に得られる置換ペプチドとして実質的に相当する配列の有限なセットを含む。
【００６０】
本発明に係る突然変異タンパク質の好ましい変更は、「同類」置換("conservative" substitution)として知られているものがある。ＦＶＩＩＩの同類アミノ酸置換は、グループのメンバー間の置換が分子の生物学的機能を保存するような十分に同様の生化学的特性を有するグループ内の同義的アミノ酸を含む。アミノ酸の挿入および欠失はまた、特に挿入または欠失が数個のアミノ酸、例えば、３０個以下、好ましくは１０個以下を含み、機能的な立体配置(functional conformation)に重要なアミノ酸、例えば、システイン残基を除去または置換(displace)しない場合には、その機能を変えることなく上記配列中でなされてもよいことは明らかである。このような欠失および／または挿入によって生産されたタンパク質および突然変異タンパク質は本発明の技術的範囲に含まれる。
【００６１】
ゆえに、アミノ酸であるグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンは、しばしば他のアミノ酸（脂肪族側鎖を有するアミノ酸）に置換されてもよい。これらの可能性のある置換のうち、（比較的短い側鎖を有することから）グリシンおよびアラニンを他のアミノ酸の置換に使用すること、並びに（疎水性のより大きな脂肪族側鎖を有することから）バリン、ロイシン、およびイソロイシンを他のアミノ酸の置換に使用することが好ましい。他のアミノ酸に置換されることの多い他のアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；リジン、アルギニン、およびヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩（酸性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギンおよびグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；並びにシステインおよびメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）を含む。このような置換は、しばしば「同類」または「半同類」アミノ酸置換と称する。
【００６２】
本発明の融合タンパク質の配列に対するアミノ酸変更は、適当な技術を用いることによって、例えば、部位特異的突然変異誘発を用いることによってなされる。
【００６３】
本発明の技術的範囲に含まれるアミノ酸置換または挿入が、天然または非天然のアミノ酸を用いて作製できることは理解されるべきである。天然または合成アミノ酸を使用するか否かにかかわらず、Ｌ−アミノ酸のみが存在することが好ましい。
【００６４】
加えて、ＦＶＩＩＩおよび他のペプチドまたはタンパク質断片を含む融合タンパク質はまた、融合タンパク質がＦＶＩＩＩの活性を保持する場合に使用されうる。本明細書における「融合タンパク質」との語は、一般的な意味では、水素結合または塩架橋(salt bridge)等の化学的な手段によって、またはタンパク質合成を介したペプチド結合によって、または双方によって、１以上のタンパク質が一緒に結合することを意味する。
【００６５】
本明細書中で使用される「機能的誘導体(Functional derivative)」との語は、ＦＶＩＩＩの誘導体、およびこれらの突然変異タンパク質を包含し、これらは、残基の側鎖として生じる官能基から調製されてもよく、または当該分野において既知の手段によってＮ−もしくはＣ−末端基への付加であり、製薬上許容できる限り、即ち、ＦＶＩＩＩの活性と実質的に同等であるタンパク質の活性を破壊せず、それを含む組成物に毒性を付与しない限り、本発明に包含される。
【００６６】
これらの誘導体は、例えば、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは第１級もしくは第２級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分（例えば、アルカノイルまたはカルボキシルアロイル(carboxylic aroyl)基）を用いて形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、または、例えば、使用できるヒドロキシル基のグリコシル化等を含む、アシル部分を用いて形成される遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体（例えば、セリルまたはトレオニル残基の誘導体）を含む。
【００６７】
本発明に係る「ＦＶＩＩＩの活性断片」は、本明細書に記載されるようなＦＶＩＩＩの断片または突然変異タンパク質であってもよい。「断片」との語は、分子のサブセット、すなわち、所望の生物学的活性を保持するより短いペプチドを意味する。断片は、ＦＶＩＩＩのいずれかの末端からアミノ酸を除去し、得られた断片について本明細書に記載されるようにその性質を試験することによって容易に調製されうる。ポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端のいずれかから一度に１個のアミノ酸を除去するためのプロテアーゼは既知であり、所望の生物学的活性を保持する断片を決定することは、定常的な実験を含むのみである。
【００６８】
ＦＶＩＩＩの活性画分、その突然変異タンパク質および活性断片として、本発明は、当該画分がＦＶＩＩＩと実質的に同等の活性を有する場合には、タンパク質分子のポリペプチド鎖の断片もしくは前駆体単独、または、これらと結合する関連分子もしくは残基、たとえば、糖もしくはホスフェート残基、または前記タンパク質もしくはこれらの糖の残基の凝集体をともに包含する。
【００６９】
本明細書における「塩」との語は、ＦＶＩＩＩ分子またはその類似体のカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の双方を意味する。カルボキシル基の塩は、当該分野において既知の手段によって形成され、無機塩、例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄、または亜鉛塩等、および例えば、トリエタノールアミン等のアミン、アルギニンまたはリジン、ピペリジン、プロカイン等により形成される塩等の有機塩基との塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば、鉱酸、例えば、塩酸または硫酸との塩、および有機酸、例えば、酢酸またはシュウ酸との塩が挙げられる。いうまでもなく、このような塩は、本明細書に記載されるＦＶＩＩＩの生物学的活性を保持している必要がある。
【００７０】
本明細書において使用される「第ＶＩＩＩ因子共役体」または「ＦＶＩＩＩ共役体」との語は、生体適合性ポリマー部分を含むように修飾された第ＶＩＩＩ因子を意味し、これは、未修飾の第ＶＩＩＩ因子と比べて改善された薬物動態学的特性を有する。前記薬物動態学的プロファイルにおける改善は、後述のパラメータ：効力、安定性、濃度曲線下面積、循環半減期、および免疫原性または交差反応性の１以上における改善として見られる。
【００７１】
未修飾ＦＶＩＩＩに比べて、本発明のＦＶＩＩＩ共役体は、未修飾ＦＶＩＩＩに比べた場合の、濃度曲線下面積（ＡＵＣ）、Ｃｍａｘ、クリアランス（ＣＬ）、半減期、血漿滞留時間(plasma residence time)、およびバイオアベイラビリティを含む、薬物動態学的特性の１以上の改善を示す。
【００７２】
患者にペプチド薬剤を投与する際の、本明細書で使用される「濃度曲線下面積(area under the curve)」または「ＡＵＣ」は、０から無限大の時間の関数としての患者の体循環での薬剤濃度を記載する濃度曲線下の全面積として規定される。本明細書中で使用される、「クリアランス」または「腎クリアランス」との語は、１分あたりに排出される一定薬剤量を含む血漿の容積として規定される。
【００７３】
患者にペプチド薬剤を投与する際の、本明細書中で使用される「半減期」または「ｔ１／２」との語は、患者の薬剤の血漿濃度が半分に減少するのに必要な時間として規定される。複数のクリアランスメカニズム、再分配、および当該分野において既知の他のメカニズムによってペプチド薬剤と関連する半減期がより長くなる場合がある。一般的に、アルファ相(alpha half-life)およびベータ相半減期(beta half-life)は、アルファ相が再分配に関連し、ベータ相がクリアランスに関連するように規定される。しかしながら、ほとんどで、血流に限定されるタンパク質薬剤では、少なくとも２種のクリアランス半減期が存在しうる。アルファ相およびベータ相半減期へのＰＥＧ化の正確な影響は、当該分野において既知であるように、大きさおよび他のパラメータによって変化するであろう。「半減期」のさらなる説明は、Pharmaceutical Biotechnology (1997, DFA Crommelin and RD Sindelar, eds., Harwood Publishers, Amsterdam, pp 101-120)に見出される。
【００７４】
患者にペプチド薬剤を投与する際の、本明細書中で使用される「滞留時間(residence time)」との語は、投薬後に患者の体内に薬剤がとどまる平均時間として規定される。
【００７５】
患者にペプチド薬剤を投与する際の、本明細書中で使用される「免疫原性」との語は、投薬後、または繰り返し投薬後の、薬剤の患者の免疫応答の誘発(illicit)しやすさ(propensity)として規定される。
【００７６】
患者にペプチド薬剤を投与する際の、本明細書中で使用される「交差反応性」との語は、非共役薬剤の、投薬後、または繰り返し投薬後の、薬剤が患者に生じている抗体に結合する傾向として規定される。
【００７７】
ＦＶＩＩＩ共役体は、例えば、非共役のＦＶＩＩＩと比較して、治療的有用性を提供する。このような治療的有用性としては、特に制限されないが、循環半減期の増加、免疫原性の減少、交差反応性の低減、活性の上昇、必要投与量の低減、および別の投与経路の可能性（例えば、皮下）を含む。
【００７８】
本発明によると、生体適合性ポリマーとのＦＶＩＩＩの共役体は、薬剤組成物におけるＦＶＩＩＩの利用可能性を促進する。さらに、生体適合性部分は、ＦＶＩＩＩを分解および抗体反応から保護しうる。ＦＶＩＩＩ共役体は、循環半減期を延ばし、これにより、投与量の節約効果が得られ、投与回数を減少できる。
【００７９】
第ＶＩＩＩ因子は、ジスルフィド結合でＰＥＧと共役するためのPolyTherics社のTheraPEG（商標）技術を用いてＰＥＧ化されうる。多くのモノＰＥＧ化第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、例えば、１０、２０、および３０ｋＤａのＰＥＧ試薬を用いて調製される。
【００８０】
前記ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの凝集活性は、凝固アッセイを用いてin vitroで試験されうる。
【００８１】
第ＶＩＩＩ因子は、数十年間市販されており、また、血液製剤としての血漿ドナーから精製され、または組換ＤＮＡ技術により製造されうる。
【００８２】
ＦＶＩＩＩとの共役体を形成するであろうポリエチレングリコールポリマーはいくつかの異なるタイプがある。単一ポリエチレングリコール鎖を有する直鎖のＰＥＧポリマーがあり、分岐鎖のまたは分岐した(multi-arm)ＰＥＧポリマーがある。分岐鎖のポリエチレングリコールは、統一基(unifying group)を介して一緒に結合する２以上の別の直鎖のＰＥＧ鎖を含む。例えば、２個のＰＥＧポリマーがリジン残基によって一緒に結合してもよい。一方の直鎖のＰＥＧ鎖がα−アミノ基に結合し、他方のＰＥＧ鎖がε−アミノ基に結合する。リジンコアの残りのカルボキシル基は、タンパク質に共有結合するために利用可能な状態で残っている。直鎖および分岐鎖のポリエチレングリコールポリマーの両方はある範囲の分子量で市販されている。
【００８３】
本発明の一態様では、ＦＶＩＩＩ−ＰＥＧ共役体は、ＦＶＩＩＩに結合した１以上の直鎖のポリエチレングリコールポリマーを含み、この際、各ＰＥＧは、約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有する。本発明の他の態様では、ＦＶＩＩＩ−ＰＥＧ共役体は、ＦＶＩＩＩに結合した１以上の直鎖のポリエチレングリコールポリマーを含み、この際、各直鎖のＰＥＧは、約５ｋＤａ〜約４０ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態においては、各直鎖のＰＥＧは、約１０ｋＤａ〜約３０ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態においては、各直鎖のＰＥＧは、約２０ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態においては、各直鎖のＰＥＧは、約１０ｋＤａ未満の分子量を有する。特定の実施形態において、ＦＶＩＩＩ−ＰＥＧ共役体がＦＶＩＩＩに結合した１超の直鎖のＰＥＧポリマーを含む場合には、例えば、２、３、または８個までの直鎖のＰＥＧポリマーがＦＶＩＩＩに結合する。実施形態によっては、ＦＶＩＩＩ−ＰＥＧ共役体は複数の直鎖のＰＥＧポリマーを含み、この際、各直鎖のＰＥＧは約１０〜３０ｋＤａの分子量を有する。
【００８４】
本発明のＦＶＩＩＩ−ＰＥＧ共役体は、ＦＶＩＩＩに結合した１以上の分岐鎖のＰＥＧポリマーを含み、この際、各分岐鎖のＰＥＧは約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有する。本発明の他の態様では、ＦＶＩＩＩ−ＰＥＧ共役体は、ＦＶＩＩＩに結合した１以上の分岐鎖のＰＥＧポリマーを含み、この際、各分岐鎖のＰＥＧは約５ｋＤａ〜約４０ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態においては、各分岐鎖のＰＥＧは、約５ｋＤａ〜約３０ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態においては、各分岐鎖のＰＥＧは、約２０ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態においては、各分岐鎖のＰＥＧは、約１０ｋＤａ未満の分子量を有する。特定の実施形態において、ＦＶＩＩＩ−ＰＥＧ共役体がＦＶＩＩＩに結合した１超の分岐鎖のＰＥＧポリマーを含む場合には、例えば、２、３、または８個までの分岐鎖のＰＥＧポリマーがＦＶＩＩＩに結合する。実施形態によっては、ＦＶＩＩＩ−ＰＥＧ共役体は８個以下の直鎖のＰＥＧポリマーを含み、この際、各分岐鎖のＰＥＧは約１０〜３０ｋＤａの分子量を有する。
【００８５】
ＦＶＩＩＩ−ＰＥＧ共役体は、以下に制限されないが、イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー等の当該分野において既知のクロマトグラフ法、アフィニティクロマトグラフィー、沈殿および膜を用いた分離(membrane-based separation)によって精製されうる。
【００８６】
上述したように、PolyThericsは、部位特異的ＰＥＧ化を目的としてタンパク質中の天然の硫黄原子の選択的化学を利用できるTheraPEG（商標）として知られる技術を開発した。この技術はまた、新規な硫黄含有基が組換または他の手段によって導入されたタンパク質およびペプチドに適用できる。PolyThericは、ジスルフィド結合がＰＥＧ連結炭素架橋の付加によってより安定にできること、および３次元構造を保持し、かつ、タンパク質の機能を維持しつつタンパク質中のジスルフィド結合にこのような修飾を行うことが可能であることを示す。これにより、初めて、ジスルフィド結合を形成して、天然のまたは選択的に操作されたタンパク質において部位特異的に目的とするタンパク質に生体適合性ポリマーを共役する２個の硫黄原子の共役チオール選択性を利用できるようになった。本アプローチの一例としては、ＰＥＧ部分をＦＶＩＩＩタンパク質に付加する（またはＦＶＩＩＩを「ＰＥＧ化する」）技術を使用することがある。
【００８７】
ジスルフィド架橋共役試薬は、相互マイケルおよびレトロマイケル反応(interactive Michael and retro-Michael reaction)されることが可能である潜在的に交差共役する系(latently cross-conjugated system)である。これにより、天然のジスルフィド基の還元によって生成した２個の遊離チオールが、もとのジスルフィド結合の２個の硫黄基を連結する３−炭素架橋を介して再アニールすることができる（例えば、ＰＥＧ部分を付加する共役反応の概略図に関する図２を参照）。共役試薬は、ＦＶＩＩＩタンパク質をＰＥＧ化するのに使用される生体適合性ポリマーとしてＰＥＧを含む場合には、「ＰＥＧ化」試薬として記載されうる。
【００８８】
機構的に、共役試薬の共役二重結合は、連続の付加反応を開始する必要がある。チオレート付加(thiolate addition)が起こると、残っているスルフィン酸部分が除去できる。これにより、第２のチオレートアニオンの付加および２つの硫黄原子間の３−炭素架橋の形成のための別の共役二重結合が生成する。最終産物は、炭素架橋のいずれかの側に２つの非常に安定なチオール−エーテル結合である。
【００８９】
本発明の第２の態様によると、本発明の第一の態様に関連して規定された１以上のシステイン残基を介してＦＶＩＩＩに共役した生体適合性ポリマーを含む薬剤組成物が提供される。
【００９０】
本発明に係る薬剤組成物は、さらに製薬上許容できる希釈剤、アジュバント、または担体を含んでもよい。
【００９１】
経口投与に適用される薬剤組成物は、カプセル等の不連続単位として、溶液、シロップ、または懸濁液として（水性もしくは非水性液体における；または食用発泡体もしくはホイップとして；またはエマルジョンとして）提示されてもよい。錠剤または硬質ゼラチンカプセルに適する賦形剤としては、ラクトース、トウモロコシデンプンまたはその誘導体、ステアリン酸またはその塩などが挙げられる。軟質ゼラチンカプセルと一緒に使用するのに適する賦形剤としては、例えば、植物油、ワックス、脂肪、半固体、または液状ポリオールなどが挙げられる。溶液およびシロップの調製に使用されうる賦形剤としては、例えば、水、ポリオール、および糖が挙げられる。懸濁液の調製では、油（例えば、植物油）を使用して、水中油型または油中水型懸濁液が形成されうる。
【００９２】
担体が固体である鼻腔内投与に使用される薬剤組成物は、鼻から吸い込むように、すなわち、鼻のそばに近づけた粉末の容器から鼻腔を介して急速吸入することによって、投与される、例えば、２０〜５００ミクロンの粒径を有する粗粉末を含む。鼻腔用スプレーとして、または点鼻薬として投与されるための、担体が液体である適当な組成物は、活性成分の水性または油性溶液を含む。吸入用によって投与されるのに使用される薬剤組成物は、様々なタイプの定量加圧型のエアロゾル(metered dose pressurised aerosol)、ネブライザー、または吸入器によって生成する微粒子ダストまたはミストを含む。
【００９３】
非経口投与に使用される薬剤組成物としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および対象となるレシピエントの血液と製剤を実質的に等張にする溶質を含みうる、水性および非水性滅菌注射溶液；並びに懸濁化剤および増粘剤を含みうる、水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられる。注射溶液に使用されうる賦形剤としては、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、および植物油が挙げられる。本組成物は、単回投与用(unit-dose)または頻回投与用(multi-dose)容器、例えば、密閉アンプルおよびバイアル瓶に入れられてもよく、また、使用する直前に、滅菌液、例えば、注射用水の添加のみが必要なフリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵されてもよい。即時調製の注射溶液および懸濁液を滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製してもよい。
【００９４】
通常、薬剤組成物は、保存剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、着臭剤、塩（本発明の物質はそれ自体が製薬上許容できる塩の形態で提供されてもよい）、緩衝液、被覆剤、または抗酸化剤を含んでもよい。本組成物はまた、本発明の物質に加えて治療上活性のある薬剤を含んでもよい。本発明の薬剤組成物は、製薬上許容できる希釈剤、アジュバント、または担体と組み合わせて使用されてもよい。このような賦形剤としては、以下に制限されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水（リン酸緩衝生理食塩水）、デキストロース、リポソーム、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００９５】
本薬剤組成物は、例えば、経口、静脈内、皮下、筋肉内、骨内、鼻腔内、または他の経路などによって、患者の病気を治療するのに有効な効果的な公知の方法で投与されてもよい。治療でまたは予防として、活性剤を、注射可能な組成物として、例えば、滅菌水性分散液、好ましくは等張液として患者に投与してもよい。
【００９６】
哺乳動物、特にヒトに投与する場合には、活性剤の１日あたりの投与量は０．０１ｍｇ／ｋｇ体重以上であり、具体的には約１ｍｇ／ｋｇ程度であると予想される。ともかく、主治医が患者に最も適切であろう実際の投与量を決定するであろうし、これは患者の年齢、体重、性別、および応答性等の因子によって異なるであろう。上記投与量は、平均的な症例の具体例である。いうまでもなく、より高いまたはより低い投与量が好ましい場合もあり、このような場合も本発明の範囲に含まれる。
【００９７】
本発明の物質の投与量は、処置すべき病気または疾患、処置すべき患者の年齢や状態などに応じて、広範な上限下限で変化し、最終的には、主治医が使用するのに適切な量を決定するであろう。
【００９８】
この投与量は、必要に応じて頻繁に繰り返されてもよい。副作用が発症する場合には、一般的な臨床でのプラクティスに従って、投与の量および／または頻度を減らしてもよい。一実施形態においては、薬剤組成物を１〜１４日毎に１回投与してもよい。
【００９９】
本発明の第三の態様によると、第二の態様の薬剤組成物および他の薬剤活性のある物質が提供される。上記他の薬剤活性のある物質は、ＦＶＩＩＩの活性を促進するまたは向上させるものであってもよく、例えば、他の血液凝固因子がある。
【０１００】
本発明の薬剤組成物は、単独で、または治療用化合物もしくは分子、例えば、抗炎症剤、鎮痛剤、または抗生剤等の、他の化合物と組み合わせて使用されてもよい。このような他の化合物との投与は、同時であっても、別個であってもまたは順次であってもよい。化合物は、必要であれば指示書を含んでもよいキットの形態で調製されてもよい。
【０１０１】
好ましくは、本発明の薬剤組成物および他の治療用化合物は、必要とする患者に直接投与される。
【０１０２】
本発明はまた、本発明の薬剤組成物、および以下に制限されないが、経口投与用のカプセル、肺への投与用の吸入器及び静脈内投与用の注射溶液等の投与ビヒクルを含む部分のキットを提供する。
【０１０３】
本発明の第４の態様によると、本発明の薬剤組成物を血液凝固疾患(blood clotting disease)を治療する必要のある患者に投与することを有する血液凝固疾患の治療方法が提供される。したがって、本発明の上記態様はまた、当該方法におけるこのような組成物の使用を包含する。
【０１０４】
血液凝固疾患は、血液凝固因子の機能の欠損または自己抗体の生成によって生じる可能性がある。血液凝固疾患の例としては、血友病Ａ、後天的血友病Ａがある。
【０１０５】
本明細書中で使用される、「治療(treatment)」との語は、ヒトまたは非ヒト動物に有益でありうるいずれのレジメをも包含する。「非ヒト動物」の治療は、ウマおよびコンパニオンアニマル（例えば、ネコやイヌ）ならびにヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシおよびウマ科の動物等の農場／農業動物(agricultural animal)などの、家畜の治療にまで拡張される。治療は、現存の症状または疾患について行われても、または予防（予防的治療）を目的としてもよい。治療は、遺伝病または後天的な疾患に対してであってよい。治療は、急性または慢性の症状に対してであってよい。
【０１０６】
本発明の第５の態様によると、生体適合性ポリマーおよびＦＶＩＩＩの下記共役体の調製方法が提供される。
【０１０７】
【化１１】
0005870088.tif 000012
【０１０８】
この際、前記方法は、
（ａ）ＦＶＩＩＩの２つのシステイン残基間のもとのジスルフィド結合を還元して、２つの遊離チオール基を生成し；
（ｂ）共役二重結合を有する共役試薬および脱離基の第１のチオレート付加反応(thiolate addition reaction)を行い；
（ｃ）前記脱離基の脱離によって、共役二重結合を生成し；さらに
（ｄ）第２のチオレート付加反応を行い、２つの硫黄原子間に３−炭素架橋を形成する
ことを含む。
【０１０９】
このような方法において、前記共役試薬は、下記式を有していてもよい。
【０１１０】
前記共役試薬は、下記式：
【０１１１】
【化１２】
0005870088.tif 000013
【０１１２】
この際、Ｒ１は上記と同様の定義であり、Ｌは上記と同様の定義の脱離基である。
【０１１３】
本発明の上記実施形態のさらなる態様は、共役試薬の様々な構造に関して、上記したのと同様である。
【０１１４】
上記と同様の定義である置換基（この際、Ｒ１およびＲ２は上記と同様の定義である）を有する、使用できる共役試薬の一例としては、下記のとおりである。
【０１１５】
【化１３】
0005870088.tif 000014
【０１１６】
この際、脱離基は、ＳＯ２Ｒ２として表されるスルフィニル基である。
【０１１７】
生体適合性ポリマーがＰＥＧである場合には、共役試薬（この際、Ｒ２およびＲ１は上記と同様の定義である）は下記のとおりでありうる。
【０１１８】
【化１４】
0005870088.tif 000015
【０１１９】
本発明の第２以降の好ましい態様は、必要であれば適宜修飾して、第１の態様と同様である。
【０１２０】
ここで、本発明を、下記実施例を参照しながらさらに説明するが、下記実施例は参考を目的とし、本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
本明細書および実施例において、下記多くの図面を参照する。この際、
【図１】図１は、血液凝固カスケードを示す。略称：ＨＭＷＫ−高分子量キニノゲン(High Molecular Weight Kininogen)；ＰＫ−プレカリクレイン；ＰＬ−リン脂質。
【図２】図２は、ジスルフィド特異的ＰＥＧ化化学に係る工程を示す（Shaunak et al. in Nat Chem Biol. 2006; 2(6):312-313から）。
【図３】図３は、ＰＴＴ凝固アッセイに係る工程の概略図を示す。略称：ＨＭＷＫ−高分子量キニノゲン(High Molecular Weight Kininogen)；ＰＫ−プレカリクレイン；ＰＬ−リン脂質。
【図４】図４は、発色凝固アッセイに係る工程の概略図を示す。
【図５】図５は、本発明の共役体の２つの別の概略構造を示し、この際、ＦＶＩＩＩは黒色の曲線で表され、（Ｃ）はＦＶＩＩＩのシステイン残基を表し、ＦＶＩＩＩは本明細書に記載されるようなリンカーによって生体適合性ポリマーに共役して示される。
【実施例】
【０１２２】
ここで、本発明を、下記実施例を参照しながらさらに説明するが、下記実施例は詳細に説明するのみのために存在する。
【０１２３】
実施例１：ＦＶＩＩＩのジスルフィドＰＥＧ化
ヒトＦＶＩＩＩのジスルフィドＰＥＧ化を、Shaunak et al. in Nat Chem Biol. 2006; 2(6):312-31に記載される方法を改変した方法に従って行う。
【０１２４】
実施例２：ジスルフィド結合の還元
TheraPEG（商標）ＰＥＧ化方法は、ジスルフィド結合の還元が必要である。還元は、セレノシスタミン（ＳｅＣｙｓ）の存在または不存在下のいずれかにおいて、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）等の好適な還元剤を用いて行われる。用いられる還元剤の濃度は、例えば、０．５〜５ｍｍのＤＴＴまたは低い過剰モルのＴＣＥＰである。
【０１２５】
実施例３：ＦＶＩＩＩのＰＥＧ化
ＦＶＩＩＩのＰＥＧ化のためにTheraPEG（商標）を使用する最初の評価が小スケール反応（例えば、５〜２０μｇ  ＦＶＩＩＩ）で行われる。これにより、ＰＥＧ試薬を用いてＰＥＧ化ＦＶＩＩＩを再現性良く調製するのに使用される条件を同定できる。タンパク質分解を防止、またはタンパク質の安定性を支援するために、ベンズアミジンまたは他の添加剤が添加されうる。
【０１２６】
反応をスケールアップ（例えば、０．２〜０．３ｍｇ  ＦＶＩＩＩ）して、初期のインビトロ評価用のＰＥＧ化ＦＶＩＩＩを作製する。異なるＰＥＧ分子量（例えば、１０、２０、および３０ｋＤａ）および所定数の共役ＰＥＧ部分（例えば、１〜８）を有するＰＥＧ−ＦＶＩＩＩサンプルの範囲をインビトロ分析用に作製する。
【０１２７】
ＰＥＧ化反応の温度の効果は、ＦＶＩＩＩのＰＥＧ−ＦＶＩＩＩへの変換率に効果があるかどうかを測定することによって評価されうる。ただし、初期のインビトロ評価が、高温（例えば、１０〜３０℃）でＰＥＧ化産物の活性にマイナス効果があることを示す場合、以降の反応は低温（例えば、２〜１０℃）で行われる。
【０１２８】
本技術分野において既知の様々な精製技術が、ＰＥＧ化材料の単離および精製に用いられうる。このような技術としては、特に制限されないが、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、沈殿および膜を用いた分離(membrane-based separation)を含む。
【０１２９】
さらにインビトロ評価用の材料のより大量に作製するために、反応を、例えば、１ｍｇ  ＦＶＩＩＩにスケールアップさせる。小スケールの反応で決定した条件下で、ＦＶＩＩＩのＰＥＧ化体(PEGylated variant)が調製される。
【０１３０】
精製後、ＰＥＧ化産物を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＳＥ−ＨＰＬＣで分析して純度を求め、好適なタンパク質アッセイ、例えば、ＢＣＡアッセイで定量される。これらの方法のすべては、当該技術分野の当業者において周知である。
【０１３１】
実施例４：ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩのインビトロ活性の評価
ＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの活性は、クロマトグラフィーアッセイおよび修飾活性化部分トロンボプラスチン時間凝固アッセイを用いて測定される。
【０１３２】
クロマトグラフィーアッセイ
前記クロマトグラフィーアッセイ(Hypen Biomed catalogue number The chromogenic assay (Hyphen Biomed, catalogue no. 221402)は、着色基質の形成によってＦＶＩＩＩの活性を測定するものであり、凝固形成を伴わない。発色アッセイに係る工程の概略図である図３を参照。
【０１３３】
トロンビンによって活性化されると、第ＶＩＩＩ：Ｃ因子は第ＩＸａ因子、リン脂質、およびカルシウムとともに酵素複合体を形成し、第Ｘ因子および第Ｘａ因子を活性化する。第ＶＩＩＩ：Ｃ因子は、第ＶＩＩＩ：Ｃ因子の補因子活性を評価するための発色アッセイである。第ＩＸａ因子、リン脂質（ＰＬＰｓ）、およびカルシウムの一定量存在下、トロンビン活性化第ＶＩＩＩ：Ｃ因子は、過剰となる一定濃度でアッセイに供給される第Ｘ因子を、第Ｘａ因子に活性化する酵素複合体を形成する。この活性は、一定量および過剰量の第ＩＸａ因子の存在下において阻害要因となる第ＶＩＩＩ：Ｃ因子の量に直接的に相関がある。次いで、生成された第Ｘａ因子が、特異的第Ｘａ因子着色基質（Ｓｘａ−１１）における活性によって、正確に測定される。第Ｘａ因子は、基質を開裂してｐＮＡを放出する。生じたｐＮＡの量は、第Ｘａ因子活性に直接比例する。最終的に、アッセイしたサンプルにおける第ＶＩＩＩ：Ｃ因子の量と、放出されたｐＮＡの量によって、４０５ｎｍのカラー現像で測定された、生じた第Ｘａ因子活性との間には直接相関がある。
【０１３４】
第ＶＩＩＩ因子の活性に基づく、５つの薬理学的な第ＶＩＩＩ因子産物を用いたアッセイの比較研究は、Butenasらによって行われた(Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) 2004 104: Abstract 4012)。
【０１３５】
凝固アッセイ
凝固ＦＶＩＩＩの試験方法は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）に基づく一段階アッセイである。ＦＶＩＩＩは、第ＩＸａ因子、カルシウム、およびリン脂質の存在下、第Ｘ因子の第Ｘａ因子への酵素的変換において、補酵素として作用する。凝固物の形成にかかる時間（秒）と、ＦＶＩＩＩ濃度の対数との間には、反比例の関係がある。
【０１３６】
組成物
１．第ＶＩＩＩ因子欠損血漿、Helena Biosciences、カタログ番号5193
２．ａＰＴＴ−ＥＳ試薬、Helena Biosciences、カタログ番号5397
３．塩化カルシウム溶液、０．０２５ｍｏｌ／Ｌ
希釈した試験サンプル２５μｌをインキュベートし、ＦＶＩＩＩ欠損血漿２５μｌを、予め加温したａＰＴＴ−ＥＳ試薬５０μｌとともにインキュベートさせる。活性化剤により接触システムが開始する。次いで、リン脂質の存在下、内因性経路の残りが行われる。３７℃で正確に３分インキュベーションを行った後、０．０２５ｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム５０μｌを添加し、凝固を開始させる。前記凝固時間は、Sysmex CA50凝固分析器(Sysmex CA50 coagulation analyser)で測定した。
【０１３７】
ＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ化ＦＶＩＩＩは、ＷＨＯ国際ＦＶＩＩＩ基準（ＮＩＢＳＣ）に対して測定される。未知のサンプルの活性レベルは、既知活性のＦＶＩＩＩ標準物質の一連の希釈物から作成された検量線に対する、試験物質の様々な希釈物の凝固時間を比較することによって内挿され、また、１ｍＬ当たりの国際単位（ＩＵ／ｍＬ）で報告される。ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの特異的凝固活性の保持率もまた算出される。
【０１３８】
ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩが未修飾のＦＶＩＩＩと同じ速度で凝固するかどうかを評価するために、散乱光検出における２〜８０％に変化する間の凝固時間を測定し、凝固時間を散乱光の変化率（％）に対してプロットする。曲線の傾きは、凝固反応の速度とされる。これは、ＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの同じ４つの濃度を用いることによって行われる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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