(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結乾燥インフルエンザワクチン抗原を調製するためのプロセスであって、
（ｉ）抗原を含む液体組成物における該抗原の濃度を、遠心濾過を用いて増加させて、濃縮された抗原を提供するステップ、および
（ｉｉ）該濃縮された抗原を凍結乾燥させて、該凍結乾燥ワクチン抗原を提供するステップ
を含み、ここで、ステップ（ｉ）が抗原濃度を少なくとも１０倍増加させる、プロセス。
【請求項２】
再構成された液体インフルエンザワクチン抗原を調製するためのプロセスであって、
（ａ）抗原を請求項１に記載のプロセスによって凍結乾燥させるステップ、および
（ｂ）該凍結乾燥ワクチン抗原を水性液体中に再構成するステップ
を含む、プロセス。
【請求項３】
ステップ（ｂ）において用いられる前記水性液体の容積が、ステップ（ａ）の開始時点において用いられる前記液体組成物の容積より小さい、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
ステップ（ｂ）において用いられる前記水性液体の容積が、ステップ（ａ）の間に生じる前記濃縮された抗原の容積より小さい、請求項２に記載のプロセス。
【請求項５】
前記再構成された液体インフルエンザワクチン抗原が、インフルエンザワクチンを処方するために用いられる、請求項２、請求項３、または請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
前記インフルエンザワクチン抗原が、インフルエンザウイルスにより引き起こされる疾患から防御するためのものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
前記インフルエンザワクチンが不活性化インフルエンザワクチンである、請求項５に記載のプロセス。
【請求項８】
リオプロテクタントが、ステップ（ｉｉ）の開始時点において前記濃縮された抗原へ加えられる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項９】
前記凍結乾燥ワクチン抗原または前記再構成された液体ワクチン抗原が固形ワクチンを調製するために用いられる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記固形ワクチンが生分解性マイクロニードルを含む、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記マイクロニードルが、
（ａ）生体溶解性かつ生分解性マトリックス材料を、前記再構成された液体ワクチン抗原と混合するステップ；および
（ｂ）ステップ（ａ）からの該混合物を、マイクロニードルを形成するための空洞を含有する型に加えるステップ
によって製作される、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記固形ワクチンがコーティング型マイクロニードルを含む、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記マイクロニードルが金属またはプラスチックである、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記再構成された液体ワクチン抗原を、１つまたは複数の固形マイクロニードルの表面に適用して、前記ワクチンの注入のためのコーティング型マイクロニードルデバイスを提供するステップを含む、請求項１２または請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記マイクロニードルが、１００〜２５００μｍの長さである、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記固形ワクチンが薄型フィルムを含む、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記再構成された液体抗原を、１つまたは複数の口腔内溶解性ポリマーと混合するステップ、次に、
該混合物を用いてフィルムを形成して、前記ワクチンの頬側投与に適した薄型フィルムを提供するステップ
を含む、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記再構成された液体抗原を、１つまたは複数の局所溶解性ポリマーと混合するステップ、次に、
該混合物を用いてフィルムを形成して、前記ワクチンの経皮投与に適した薄型フィルムを提供するステップ
を含む、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記フィルムが、１０〜５００μｍの厚さである、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記フィルムが、７５〜１５０μｍの厚さである、請求項１９に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記抗原が、前記フィルム内の微粒子の内部にカプセル化されている、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２２】
（ｉ）請求項９〜２１のいずれか一項に記載のプロセスによって固形ワクチンを調製するステップ、次に、
（ｉｉ）固形ワクチンを個々の単位用量小袋の中へパッケージングするステップ
を含む、パッケージングされたワクチンを調製するためのプロセス。
【請求項２３】
インフルエンザワクチン抗原を調製するためのプロセスであって、
（ｉ）インフルエンザ抗原を含む液体組成物における該抗原の濃度を増加させて、濃縮された抗原を提供するステップ、
（ｉｉ）該濃縮された抗原を凍結乾燥させて、凍結乾燥ワクチン抗原を提供するステップ、および
（ｉｉｉ）該凍結乾燥ワクチン抗原を水性緩衝液中に再構成して、再構成された抗原を提供するステップ
を含む、プロセスであって、ここで、ステップ（ｉ）が遠心濾過を用いる、プロセス。
【請求項２４】
ステップ（ｉｉｉ）における再構成がリン酸緩衝液を用いる、請求項２３に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、米国仮出願第６１／３９６，７２０号（２０１０年６月１日出願）の利益を主張し、上記米国仮出願の全容は、全ての目的について参考として本明細書に援用される。
【０００２】
技術分野
本発明は、ワクチンに用いるための抗原溶液の処理の分野にある。
【背景技術】
【０００３】
ワクチン製造中、製造バルクにおける抗原の濃度が、最終の患者処方物における濃度を超える場合が多く、それゆえ、プロセスは、バルクが希釈されるステップを含む。しかしながら、状況によっては、水性バルクにおける抗原濃度を増加させることが必要であり、本発明は、抗原を濃縮するためのプロセスに関する。有用なプロセスは、抗原の濃度を、その免疫原性を破壊することなく増加させるべきである。
【０００４】
抗原濃縮が必要とされる一つの状況は、ほんの少量の材料が送達される新しい送達技術に関する状況である。例えば、ワクチンは、マイクロニードル（ｍｉｃｒｏｎｅｅｄｌｅ）［２、３（非特許文献２、３）］により、または薄型フィルムもしくはストリップ［１（非特許文献１）、１４〜１７（非特許文献４、５、特許文献１、２）］により送達することができる。これらの技術は、０．５ｍｌの典型的な筋肉内注射よりもはるかに小さい容積を送達するが、それらは、同量の抗原を必要とする場合があり、このことは、より濃縮されたバルク抗原を必要とすることが多い。
【０００５】
１２５〜５００μｇ／ｍｌから１４ｍｇ／ｍｌまで個々のインフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）の濃度を増加させることができる一つの現行の濃縮プロセスは、水性材料の出発容積の１０ｍｇ／ｍｌの濃度への接線流濾過（ＴＦＦ）、その後、凍結乾燥、その後、出発容積より小さい水性容積における凍結乾燥物の再構成を含む。このプロセスは、３つの異なる一価ＨＡバルクに実施することができ、単一の三価水性組成物としてのそれらの再構成により、４２ｍｇ／ｍｌの最終ＨＡ濃度がもたらされ得る。
【０００６】
ワクチン製造、特にインフルエンザワクチン製造（筋肉内注射によって送達されないインフルエンザワクチンなど）に用いるために、材料における抗原の濃度を増加させるためのさらなる改善されたプロセスを提供することが本発明の目的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０２／０５１３８２号
【特許文献２】国際公開第２０１０／００２４１８号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍａｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｅｏｎａｔｏｌｏｇｙ．  （２０１０）  Ｖｏｌ  １１，  ｎｕｍｂｅｒ  ２．
【非特許文献２】Ｋｏｕｔｓｏｎａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  （２００９）  ４（ｅ）：  ｅ４７７３．
【非特許文献３】Ｑｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  （２００９）  ４（９）：ｅ７１５２．
【非特許文献４】Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．  ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．  （２００９）  ３（１１）：３７１９−２９．
【非特許文献５】Ｃｕｉ  ＆  Ｍｕｍｐｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （２００２）  １９：９４７−５３．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
抗原がＴＦＦを用いて濃縮される現行のプロセスとは対照的に、本発明の抗原濃縮手順は、遠心濾過（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）および／または限外濾過を用いる。その後、現行のプロセスと同様に、濃縮された材料は、凍結乾燥することができ、凍結乾燥された材料は、さらなる使用のために再構成することができる。
【００１０】
したがって、本発明は、（ｉ）抗原を含む液体組成物における抗原の濃度を、遠心濾過および／または限外濾過を用いて増加させて、濃縮された抗原を提供するステップ、ならびに（ｉｉ）濃縮された抗原を凍結乾燥させて、凍結乾燥ワクチン抗原を提供するステップを含む、凍結乾燥ワクチン抗原を調製するためのプロセスを提供する。
【００１１】
本発明はまた、このプロセスにより調製された凍結乾燥ワクチン抗原を提供する。
【００１２】
凍結乾燥ワクチン抗原は、ワクチンを処方するために用いることができ、または、再構成して、その後、ワクチンを処方するために用いることができる。この再構成は、この場合もやはり、抗原濃度を増加させるように、理想的には、液体組成物の最初の容積、すなわち、ステップ（ｉ）の開始時点の容積より小さい容積で、かつ濃縮された抗原の凍結乾燥前の容積、すなわち、ステップ（ｉｉ）の開始時点の容積より小さい容積においてである。再構成された材料は、ワクチンを処方するために用いることができる。
【００１３】
本発明はまた、このプロセスにより処方されたワクチンを提供する。
【００１４】
プロセスは、凍結乾燥インフルエンザワクチン抗原を調製するために特に有用であり、この凍結乾燥インフルエンザワクチン抗原は、インフルエンザワクチンを処方するために有用である。
【００１５】
抗原
本発明は、様々な供給源由来の抗原を濃縮するのに有用である。抗原は、細菌、ウイルス、真菌、または寄生生物由来であってもよい。したがって、ワクチンは、細菌、ウイルス、真菌、および／または寄生生物によって引き起こされる疾患から防御し得る。
【００１６】
本発明に関して用いられる典型的な細菌には、以下が挙げられるが、それらに限定されない：
・Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓなどのＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ。
・Ｃ．ｔｅｔａｎｉおよびＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍなどのＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ。
・Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅなどのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ。
・Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅなどのＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ。
・Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｓｉ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、および弱毒Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  ＧｕｅｒｉｎなどのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ。
・Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅなどのＮｅｉｓｓｅｒｉａ。
・Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓなどのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ。
・Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、およびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓなどのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ。
【００１７】
本発明に関して用いられる典型的なウイルスには、以下が挙げられるが、それらに限定されない。
【００１８】
・インフルエンザＡ型、Ｂ型、またはＣ型ウイルスなどのオルトミクソウイルス。インフルエンザＡ型またはＢ型ウイルスは、パンデミック間期（例年／季節性）の株であってもよいし、またはパンデミック発生を引き起こす可能性をもつ株由来であってもよい（すなわち、現在広まっている株における血球凝集素と比較して新しい血球凝集素を有するインフルエンザ株、またはトリ被験体において病原性であり、かつヒト集団において水平方向に伝染する可能性を有するインフルエンザ株、またはヒトにとって病原性であるインフルエンザ株）。特定の季節および株の性質に依存して、インフルエンザＡ型ウイルスは、１つまたは複数の以下の血球凝集素亜型に由来し得る：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６。より詳細には下記に示されている。
【００１９】
・肺炎ウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶ）、およびモルビリウイルス（麻疹）などのパラミクソウイルス科ウイルス。
【００２０】
・肺炎ウイルスまたはメタ肺炎ウイルス（ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）、例えば、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ウシＲＳウイルス、マウス肺炎ウイルス、および七面鳥鼻気管炎ウイルス。好ましくは、肺炎ウイルスは、ＲＳＶまたはヒトメタ肺炎ウイルス（ＨＭＰＶ）である。
【００２１】
・パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）１型、２型、３型、または４型、ムンプス、センダイウイルス、サルウイルス５、ウシパラインフルエンザウイルス、およびニューカッスル病ウイルスなどのパラミクソウイルス属。好ましくは、パラミクソウイルス属はＰＩＶまたはムンプスである。
【００２２】
・エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス、カルジオウイルス、およびアフトウイルスなどのピコルナウイルス科。エンテロウイルスには、ポリオウイルス１型、２型、または３型、コクサッキーＡウイルス１型〜２２型、および２４型、コクサッキーＢウイルス１型〜６型、エコーウイルス（ＥＣＨＯウイルス）１型〜９型、１１型〜２７型、および２９〜３４型、ならびにエンテロウイルス６８型〜７１型が挙げられる。好ましくは、エンテロウイルスは、ポリオウイルス、例えば、ＭａｈｏｎｅｙもしくはＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓなどの１型株、ＭＥＦ−１などの２型株、またはＳａｕｋｅｔｔなどの３型株である。ヘパルナウイルス（ヘパトウイルスとも名付けられている）の例はＡ型肝炎ウイルスである。
【００２３】
・ルビウイルス、アルファウイルス、またはアルテリウイルスなどのトガウイルス科。風疹ウイルスなどのルビウイルスが好ましい。不活性化のための有用なアルファウイルスには、サケ膵臓病ウイルスおよび睡眠病ウイルスなどの水生のアルファウイルスが挙げられる。
【００２４】
・ダニ媒介性脳炎（ＴＢＥ）、デング（１型、２型、３型、または４型）、黄熱病、日本脳炎、ウエストナイル脳炎、セントルイス脳炎、ロシア春夏脳炎、ポワッサン脳炎などのフラビウイルス属。
【００２５】
・Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）。
【００２６】
・ウシウイルス性下痢症（ＢＶＤＶ）、ブタコレラ（ＣＳＦＶ）、またはボーダー病（ＢＤＶ）などのペスチウイルス。
【００２７】
・Ｂ型肝炎ウイルスなどのヘパドナウイルス。
【００２８】
・リッサウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）およびベシクロウイルス（ＶＳＶ）などのラブドウイルス。
【００２９】
・ノーウォークウイルス、ならびにハワイウイルスおよびスノーマウンテンウイルスなどのノーウォーク様ウイルス、ならびにブタ小水疱性発疹ウイルスなどのベシウイルスなどのカリシウイルス科。
【００３０】
・ＳＡＲＳ、ヒト呼吸器コロナウイルス、トリ伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）などのコロナウイルス。
【００３１】
・オンコウイルス、レンチウイルス、またはスプマウイルスなどのレトロウイルス。オンコウイルスは、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、またはＨＴＬＶ−３であってもよい。レンチウイルスは、ＳＩＶ、ＨＩＶ−１、またはＨＩＶ−２であってもよい。
【００３２】
・オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、またはコルチウイルスなどのレオウイルス属。
【００３３】
・パルボウイルスＢ１９またはボカウイルスなどのパルボウイルス属。
【００３４】
・単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、およびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）などのヒトヘルペスウイルス。
【００３５】
・パピローマウイルスおよびポリオーマウイルスなどのパポバウイルス。パピローマウイルスには、ＨＰＶ血清型１、２、４、５、６、８、１１、１３、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４１、４２、４７、５１、５７、５８、６３、および６５が挙げられる。
【００３６】
・ヒトアデノウイルスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、またはＧのいずれかを含むアデノウイルス科。
【００３７】
本発明は、ウイルス、特に、ワクチン抗原がウイルス表面糖タンパク質であるウイルスについてのワクチンを調製するのに理想的である。したがって、本発明は、下でより詳細に記載されているように、インフルエンザワクチンを調製するためにインフルエンザウイルス血球凝集素を濃縮するのに理想的である。ステップ（ｉ）および（ｉｉ）、続いて再構成により、＞５ｍｇ／ｍｌ、およびさらに＞１０ｍｇ／ｍｌのＨＡ含有量をもつインフルエンザワクチン抗原がもたらされ得る。
【００３８】
液体組成物
本発明のプロセスは、液体組成物における抗原の濃度を増加させ、それにより、処方物を目的とした濃縮された抗原を提供する。
【００３９】
好ましい液体組成物は、ステップ（ｉｉ）の前に凍結乾燥されたことがないものである。好ましい液体組成物は、ステップ（ｉ）の開始時点においてリオプロテクタント（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を実質的に含まない。したがって、組成物は、外因性糖アルコール（特に：ソルビトール、マンニトール、マルチトール、エリスリトール、キシリトール）および／または外因性二糖（特に：スクロース、トレハロース、マルトース、ラクツロース、ラクトース、セロビオース）を実質的に含まなくてもよい。したがって、液体組成物における（ソルビトール、マンニトール、マルチトール、エリスリトール、キシリトール、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクツロース、ラクトース、セロビオース）の合わせた濃度は、１０ｍｇ／ｍｌ未満（すなわち、１％未満）であってもよいが、理想的には、１ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、０．１ｍｇ／ｍｌ未満である。
【００４０】
典型的な液体組成物は、例えば、少なくとも５００回のワクチンの別個のヒト単位用量についての十分な抗原を含有する、バルクワクチンである。
【００４１】
液体組成物は、一価（すなわち、１つだけの病原体から防御するためのワクチン抗原を含有する）でも、多価（すなわち、１つより多い病原体から防御するためのワクチン抗原を含有し、１つより多い様々な非交差防御性病原体（例えば、複数の髄膜炎菌血清型または複数のインフルエンザＡ型ウイルス血球凝集素型）が存在する場合を含む）でもよい。
【００４２】
本発明は、様々なワクチン抗原濃度を有する液体試料に関して用いることができる。典型的には、液体試料は、ワクチン抗原を少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で含む。
【００４３】
濃縮ステップ
本発明のプロセスは、抗原の濃度を遠心濾過および／または限外濾過を用いて増加させるステップを含む。
【００４４】
遠心濾過は、液体のフィルターを通しての遠心分離を含む。フィルターは、抗原を保持して濃縮するが、溶媒または小さい溶質を保持しない。濾液の容積が増加するにつれて、保持分（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）における抗原の濃度もまた増加する。この技術は、典型的には、固定角ローターを用いる。種々の適切な遠心濾過デバイスが市販されており、例えば、商標Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（商標）、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（商標）、およびＳｐｉｎｔｅｋ（商標）として販売されている製品である。フィルターのカットオフは、目的の抗原が保持分中に保持されるように選択される。
【００４５】
限外濾過は、液体を半透膜に対して押す静水圧の使用を含む。フィルターは、抗原を保持して濃縮するが、溶媒または小さい溶質を保持しない。静水圧の連続的な適用によって、濾液の容積が増加し、それにしたがって、保持分における抗原の濃度もまた増加する。多くの限界濾過膜が市販されている。限外濾過膜の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）は、どの溶質が膜を通過することができるか（すなわち、濾液へ）、およびどれが保持されるか（すなわち、保持分中）を決定する。本発明に関して用いられるフィルターのＭＷＣＯは、目的の抗原の実質的に全部が保持分に留まるように選択される。
【００４６】
どの技術が選択されるとしても、それは、好ましくは、目的の抗原の濃度を少なくともｎ倍（ｎは５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、またはそれ以上である）増加させる。
【００４７】
凍結乾燥ステップ
抗原濃縮後、本発明のプロセスは、濃縮された抗原を凍結乾燥させて、凍結乾燥ワクチン抗原をもたらす。
【００４８】
凍結乾燥は、典型的には、チャンバー内における以下の３つの段階を含む：（ａ）凍結段階；（ｂ）一次乾燥段階；および（ｃ）二次乾燥段階。ステップ（ａ）は、コンジュゲートのモバイル水を凍結する。ステップ（ｂ）において、チャンバー圧力を低下させ（例えば、≦０．１トールまで）、生成物に熱を加えて、凍結水を昇華させる。ステップ（ｃ）において、温度を増加させて、結晶の水などの任意の結合水も、残留水含有量が所望のレベルに下がるまで、取り除く。
【００４９】
凍結が生じる前の、典型的な凍結乾燥における最初のステップは、リオプロテクタントの添加である。いくつかの実施形態において、リオプロテクタントが、ステップ（ｉ）における濃縮の前に加えられていてもよいが、それよりも、濃縮が生じた後に、すなわち、ステップ（ｉ）の終了時点に、またはステップ（ｉｉ）の開始時点に、それを加えることが好ましい。このことにより、凍結乾燥の凍結の開始時点に存在するリオプロテクタントの量を調節することがより容易になる。
【００５０】
したがって、本発明のプロセスは、１つまたは複数のリオプロテクタントを、濃縮された抗原へ加えるステップを含んでもよい。適切なリオプロテクタントには、糖アルコール（ソルビトール、マンニトール、マルチトール、エリスリトール、キシリトールなど）および二糖（スクロース、トレハロース、マルトース、ラクツロース、ラクトース、セロビオースなど）が挙げられるが、それらに限定されない。スクロースおよびマンニトール（またはそれらの混合物）は、本発明に関して用いられる好ましいリオプロテクタントである。
【００５１】
凍結乾燥後、凍結乾燥ワクチン抗原は再構成することができる。この再構成は、水（例えば、注射用蒸留水、ｗｆｉ）または緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、またはクエン酸緩衝液）を用いることができる。緩衝液は、典型的には、５〜２０ｍＭの範囲で含まれる。リン酸緩衝液が好ましい。
【００５２】
ステップ（ｉ）は、第１の液体容積のワクチン抗原を濃縮し、第２の（低下した）液体容積中に同量の抗原を含む組成物がもたらされた。ステップ（ｉｉ）は、この濃縮材料を乾燥させた。この乾燥材料は、第３の液体容積において再構成することができる。第３の容積が第１の容積より大きい場合には、プロセス全体にわたって、抗原を濃縮し損ねている。同様に、第３の容積が第２の容積より大きい場合には、再構成ステップが、濃縮に関して逆行している。したがって、第３の容積は、第２の容積と等しいか、または好ましくは、それより小さいかのいずれかである。したがって、凍結乾燥／再構成ステップは、さらなる抗原濃縮を達成することができる。第３の容積が第２の容積と等しい（またはより大きい）実施形態は、例えば、緩衝液交換などに、なお有用であるが、それらは好ましくない。
【００５３】
処方物
凍結乾燥ワクチン抗原は、ワクチンを処方するために用いることができるが、典型的には、それを行う前に再構成される。
【００５４】
本発明は、様々なワクチン処方物を調製するために用いることができる。増加した抗原濃度は、本発明が、少量の材料の患者への送達に関わる技術にとって理想的であることを意味する。例えば、本発明は、（例えば、皮内注射用の）０．１ｍｌ以下の単位用量容積を有する液体ワクチン処方物を調製するために有用である。本発明はまた、（固形非凍結乾燥ワクチン処方物を含む）固形ワクチン処方物を調製するために有用であり、なぜならば、それは、高い抗原濃度を必要とし得るからである。下でより詳細に記載されているように、適切な固形処方物には、固形生分解性マイクロニードル、コーティング型マイクロニードル（ｃｏａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｎｅｅｄｌｅ）、および薄型経口フィルムが挙げられるが、それらに限定されない。したがって、本発明のプロセスにおける処方ステップは、凍結乾燥ワクチン抗原から固形ワクチン形態を調製することを含んでもよい。
【００５５】
本発明の処方ワクチンは、凍結乾燥ステップからのリオプロテクタント（複数可）を保持する。したがって、ワクチンは、例えば、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、エリスリトール、キシリトール、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクツロース、ラクトース、および／またはセロビオースの１つまたは複数を含んでもよい。
【００５６】
本発明のワクチンは理想的には、イヌリンを含まない。
【００５７】
固形生分解性マイクロニードル
本発明を用いて調製することができる一つの有用な固形処方物は、固形生分解性マイクロニードルである。これらは、典型的には、単独で投与されず、むしろ、複数のニードルが同時に、例えば、複数のマイクロニードルを含む皮膚パッチとして、投与される。
【００５８】
マイクロニードルは、固形であって、保存中、構造的完全性を保持し、かつパッチが適用される場合、被験体の皮膚に貫入することができるような、固形である。皮膚貫入に必要とされる力学特性は、問題になっている生物体に依存するが、それらは、通常、ヒト皮膚に貫入するのに十分な強度を有する。適切な固形ニードルを形成するための材料は、容易に入手可能であり、これらを、任意の特定のニーズのために、試験して、適当な濃度などを決定することができる。マイクロニードルは生体溶解性（ｂｉｏｓｏｌｕｂｌｅ）かつ生分解性である。したがって、固形材料は、参考文献２および３（下記参照）に用いられたコーティング型マイクロニードルとは対照的に、パッチが適用された後、皮膚において溶解する。溶解して、その後、材料は、代謝されて、無害な最終生成物が生成される。パッチを適用した後の溶解のタイムスケールは様々であり得るが、溶解は、典型的には、パッチを適用した後すぐに（例えば、１０秒以内に）、開始し、例えば、最高１分間、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、１時間、５時間、１０時間、または２４時間、マイクロニードルが完全に溶解するまで、続き得る。適切なインビボ溶解動態をもつ材料は、容易に入手可能であり、これらは様々であり得、任意の所望の溶解プロフィールのために試験して、適当な濃度などを決定することができる。
【００５９】
マイクロニードルを形成するための適切なマトリックス材料は、典型的には、生体溶解性かつ生分解性ポリマーであり、これらは、１つまたは複数の炭水化物を含んでもよい。例えば、材料は、セルロース、デキストリン、デキストラン、二糖、キトサン、キチンなど、またはそれらの混合物を含んでもよい。他のＧＲＡＳ材料もまた用いてもよい。これらの材料は、便利には、凍結乾燥ワクチン抗原を再構成するために用いられる液体中にそれらを含めることによって、ワクチン抗原と組み合わせることができる。
【００６０】
適切なセルロースには、セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースが挙げられるが、それらに限定されない。適切なデキストリンには、マルトデキストリン、シクロデキストリン、アミロデキストリン、イコデキストリン、黄色デキストリン、および白色デキストリンが挙げられるが、それらに限定されない。適切な二糖には、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、およびセロビオースが挙げられるが、それらに限定されない。生体溶解性かつ生分解性マイクロニードルを形成するための一つの適切な材料は、デキストリン／トレハロース混合物である。
【００６１】
マイクロニードルは、皮膚に貫入することができる。それらは、表皮に貫入して、真皮へ材料を送達する（すなわち、皮内送達）のに十分な長さであるべきであるが、理想的には、それらが皮下組織の中へ、またはそれを越えて、貫入することができるほど長くはない。それらは、典型的には、長さが１００〜２５００μｍ、例えば、長さが１２５０〜１７５０μｍ、または約１５００μｍである。送達時点において、先端は、真皮に貫入していてもよいが、ニードルの基部は、表皮に留まったままであってもよい。
【００６２】
マイクロニードルは、様々な形および幾何学的配置をもち得る。それらは、典型的には、皮膚接触（ｓｋｉｎ−ｆａｃｉｎｇ）点で先細になっており、例えば、角錐または円錐としての形をとる。＜５００μｍの最大直径をもつ先細のマイクロニードルが典型的である。
【００６３】
単一のパッチは、典型的には、複数のマイクロニードル、例えば、パッチあたり≧１０個、≧２０個、≧３０個、≧４０個、≧５０個、≧６０個、≧７０個、≧８０個、≧９０個、≧１００個、≧２００個、≧３００個、≧４００個、≧５０個、≧７５０個、≧１０００個、またはそれより多い個数を含む。パッチが複数のマイクロニードルを含む場合、それは、マイクロニードルの全部が付着しているバッキング層を含んでもよい。≧２０個の突出したマイクロニードルを有する単一のバッキング層が典型的である。パッチが複数のマイクロニードルを含む場合、これらを、規則的な反復パターンもしくはアレイで配置することができ、または不規則に配置されてもよい。
【００６４】
パッチは、典型的には、３ｃｍ２以下、例えば、＜２ｃｍ２または＜１ｃｍ２の面積を有する。０．５ｃｍ〜１．５ｃｍの直径を有する円形パッチが有用である。
【００６５】
パッチ上のマイクロニードルの密度は、様々であり得るが、≧１０個ｃｍ−２、≧２０個ｃｍ−２、≧３０個ｃｍ−２、≧４０個ｃｍ−２、≧５０個ｃｍ−２、≧６０個ｃｍ−２、≧７０個ｃｍ−２、≧８０個ｃｍ−２、またはそれより大きい密度であってもよい。
【００６６】
本発明のパッチは、皮膚接触内面および環境接触外面を有する。内面は、被験体の皮膚への接着性を促進するために接着剤を含んでもよい。存在する場合、それは、好ましくは、マイクロニードル自体に存在せず、すなわち、マイクロニードルは接着剤を含まない。内面上に接着剤を有するのではなく、パッチは、例えば、絆創膏またはニコチンパッチに見られるような、パッチを皮膚に接着させるための接着性外側縁を提供する追加のバッキングを有してもよい。
【００６７】
上記のようなパッチは、参考文献４〜８における技術およびガイダンスに従うことによって作製することができる。例えば、１．５ｍｍの長さのマイクロニードルの空洞を有する型を調製することができる。デキストリンおよびトレハロースのマトリックス材料を、インフルエンザワクチンと混合することができ、この水性材料を、遠心力で型に入れ、固形マイクロニードルのアレイを形成することができる。その後、セルロースゲルを、マトリックス／ワクチン混合物（例えば、その混合物はフィルムを形成している）の上に入れ、パッチ上のバッキング層を形成することができる。このバッキング層が乾燥したならば、それを取り出し、固形マイクロニードルが突出するパッチが、生み出され得る。したがって、本発明のプロセスにおける処方ステップは以下のステップを含んでもよい：（ａ）生体溶解性かつ生分解性マトリックス材料を、通常には凍結乾燥ワクチン抗原を再構成することによって、ワクチン抗原と混合するステップ；および（ｂ）ステップ（ａ）からの混合物を、マイクロニードルを形成するための空洞を含有する型に加えるステップ。それはさらに以下のステップを含んでもよい：（ｃ）混合物を型において固化させて（ｓｅｔ）、固形マイクロニードルを形成するステップ；（ｄ）任意で、固化マイクロニードルに材料を適用して、バッキング層がもたらされるステップ；および（ｅ）マイクロニードル（および任意のバッキング層）を型から取り出すステップ。
【００６８】
パッチを、個々の小袋の中へパッケージングし、例えば、窒素下で密閉し、その後、熱密閉してもよい。それらは、マイクロニードルへの損傷を避けるために注意深く保存されるべきである。
【００６９】
コーティング型マイクロニードル
本発明を用いて調製することができる別の有用な固形処方物は、コーティング型マイクロニードルである。これらは、典型的には、単独で投与されず、むしろ、複数のニードルが同時に、例えば、複数のマイクロニードルにより、投与される。一つの適切な製造物は、Ｍａｃｒｏｆｌｕｘ（商標）（Ｚｏｓａｎｏ）の商標として販売されている。
【００７０】
マイクロニードルは、保存中、構造的完全性を保持し、かつ被験体の皮膚に貫入することができるような、固形である。皮膚貫入に必要とされる力学特性は、問題になっている生物体に依存するが、それらは、通常、ヒト皮膚に貫入するのに十分な強度を有する。マイクロニードルは固形であり、患者の皮膚への挿入後、（上記で論じられた生分解性マイクロニードルとは対照的に）無傷のままである。適切な固形ニードルを形成するための材料は、容易に入手可能であり、これらを、任意の特定のニーズのために、試験し、選択することができ、例えば、金属（ステンレススチールなど）またはポリマー（ポリカーボネートなど、理想的には医療グレード）である。金属ニードルは、レーザーカッティングおよび電解研磨を用いて製作することができる［９］。ポリマーニードルは、マイクロ複製（ｍｉｃｒｏｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）および／またはマイクロ成形（ｍｉｃｒｏｍｏｌｄｉｎｇ）（射出成形を含む）によって製作することができる。適切なマイクロニードルは、参考文献２、３、および９〜１３に開示されている。
【００７１】
本発明の抗原を、マイクロニードル上へコーティングすることができる。このコーティングは、例えば、浸漬ステップ、その後の、（例えば、蒸発による）乾燥ステップ（必要に応じてそれらのステップを繰り返す）を含む、浸漬コーティング（ｄｉｐ−ｃｏａｔｉｎｇ）などの簡単なプロセスによって達成することができる。他の有用なコーティング技術は、参考文献１１に開示されている。したがって、本発明のプロセスにおける処方ステップは、以下のことを含んでもよい：凍結乾燥ワクチン抗原、またはその再構成された形態を１つまたは複数の固形マイクロニードルの表面へ適用して、ワクチンの注入用のコーティング型マイクロニードルデバイスがもたらされること。
【００７２】
ニードルに適用するためのコーティング溶液は、１つまたは複数の生体溶解性かつ生分解性マトリックス材料を含むことができ、これらは、１つまたは複数の炭水化物を含んでもよい。例えば、材料は、セルロース、デキストリン、デキストラン、二糖、キトサン、キチンなど、またはそれらの混合物を含んでもよい。他のＧＲＡＳ材料もまた用いてもよい。適切なセルロース、デキストリン、および二糖は上記に列挙されている。これらの材料は、便利には、凍結乾燥ワクチン抗原を再構成するために用いられる液体中にそれらを含めることによって、ワクチン抗原と組み合わせることができる。
【００７３】
したがって、本発明のプロセスにおける処方ステップは以下のステップを含んでもよい：（ａ）生体溶解性かつ生分解性マトリックス材料を、通常には凍結乾燥ワクチン抗原を再構成することによって、ワクチン抗原と混合するステップ；および（ｂ）ステップ（ａ）からの混合物を、１つまたは複数の固形マイクロニードルの表面に適用し、ワクチンの注入用のコーティング型マイクロニードルデバイスがもたらされるステップ。コーティングは、参考文献１１に記載されているように、１つまたは複数の「沈着増強成分」を用いることによって増強させてもよい。
【００７４】
上記で論じられた適用ステップは、適用サブステップ、続く乾燥サブステップを含んでもよく、この対のサブステップは、１回、または１回より多く、例えば、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはより多い回数、実施することができる。
【００７５】
デバイスにおけるマイクロニードルは、適用された場合、皮膚に貫入することができる。それらは、表皮に貫入して、真皮へ材料を送達する（すなわち、皮内送達）のに十分な長さであるべきであるが、理想的には、皮下組織の中へ、またはそれを越えて、貫入することができるほど長くはない。それらは、典型的には、長さが１００〜２５００μｍ、例えば、長さが２５０〜７５０μｍ、または約１５００μｍである。送達時点において、先端は、真皮に貫入していてもよいが、ニードルの基部は、表皮に留まったままであってもよい。ニードルを、患者の皮膚に、３０秒間〜３０分間、適用し、その後、取り除くことができる。
【００７６】
マイクロニードルは、様々な形および幾何学的配置をもち得る。それらは、典型的には、皮膚接触点で先細になっており、例えば、角錐または円錐としての形をとる。＜５００μｍの最大直径をもつ先細のマイクロニードルが典型的である。
【００７７】
マイクロニードルデバイスは、典型的には、複数のマイクロニードル、例えば、デバイスあたり≧１０個、≧２０個、≧３０個、≧４０個、≧５０個、≧６０個、≧７０個、≧８０個、≧９０個、≧１００個、≧２００個、≧３００個、≧４００個、≧５０個、≧７５０個、≧１０００個、≧１５００個、≧２０００個、またはそれより多い個数を含む（例えば、デバイスあたり３００〜１５００個）。デバイスが複数のマイクロニードルを含む場合、これらは全て、典型的には、単一のバッキング層に付着している。デバイスが複数のマイクロニードルを含む場合、これらを、規則的な反復パターンもしくはアレイで配置することができ、または不規則に配置されてもよい。
【００７８】
マイクロニードルデバイスは、典型的には、３ｃｍ２以下、例えば、＜２ｃｍ２または＜１ｃｍ２の面積を有する。０．５ｃｍ〜１．５ｃｍの直径を有する円形デバイスが有用である。
【００７９】
マイクロニードルの密度は、様々であり得るが、≧１０個ｃｍ−２、≧２０個ｃｍ−２、≧３０個ｃｍ−２、≧４０個ｃｍ−２、≧５０個ｃｍ−２、≧６０個ｃｍ−２、≧７０個ｃｍ−２、≧８０個ｃｍ−２、またはそれより大きい密度であってもよい。各マイクロニードル間が２ｍｍで、１４個のマイクロニードル／ｃｍ２の密度をもつデバイスが有用である。
【００８０】
マイクロニードルデバイスは、皮膚接触内面および環境接触外面を有する。内面は、被験体の皮膚への接着性を促進するために接着剤を含んでもよい。存在する場合、それは、好ましくは、マイクロニードル自体に存在せず、すなわち、マイクロニードルは接着剤を含まない。内面上に接着剤を有するのではなく、デバイスは、デバイスを皮膚に接着させるための接着性外側縁を提供する追加のバッキングを有してもよい。
【００８１】
マイクロニードルデバイスを、個々の小袋の中へパッケージングし、例えば、窒素下で密閉し、その後、熱密閉してもよい。それらは、マイクロニードルへの損傷を避けるために注意深く保存されるべきである。
【００８２】
薄型フィルム
本発明を用いて調製することができる別の有用な固形処方物は、薄型経口フィルムなどの薄型フィルムである。これらのフィルムは、唾液および頬組織との接触で、湿り、迅速に溶解し、それゆえに、口の中でワクチン抗原を放出する。これらの薄型フィルムの主要な成分は、典型的には、１つまたは複数の親水性ポリマー（複数可）であり、そのポリマーは、良好な粘膜接着特性を有し得、完全に溶解するまで頬組織への強い接着を与える。同じようなフィルムは、非経口送達、例えば、参考文献１４に開示されているような経皮投与に用いることができる。
【００８３】
適切な薄型フィルムは、典型的には、最初に適用される場合、厚さが１０〜５００μｍ、例えば、厚さ７５〜１５０μｍである。患者の口に、例えば、ヒト成人の口に、またはヒト幼児の口に適合するそれらの他の寸法が適し得る。
【００８４】
一つの適切な型のフィルムは、参考文献１５に開示されている。このフィルムは、（ｉ）粘膜接着性層としてＮｏｖｅｏｎおよびＥｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ−１００、および（ｉｉ）不透過性バッキング層として医薬品ワックスを有する粘膜接着性二層フィルムを含む。これらのフィルムのさらなる詳細は参考文献１６にある。
【００８５】
別の適切な型のフィルムは参考文献１７に開示されている。このフィルムは以下を含む：（ａ）１つまたは複数の水溶性ポリマー；（ｂ）１つまたは複数の粘膜接着性ポリマー；（ｃ）微粒子内にカプセル化されたワクチン抗原。適切な水溶性ポリマーには、プルラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、アルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、キサンタンガム、トラガカントゴム、グアーガム、アカシアゴム、アラビアゴム、ポリアクリル酸、メタクリル酸メチルコポリマー、カルボキシビニルポリマー、アミラーゼ（ａｍｙｌａｓｅ）、高アミラーゼスターチ、ヒドロキシプロピル化高アミラーゼスターチ、デキストリン、ペクチン、キチン、レバン、エルシナン、コラーゲン、ゼラチン、ゼイン、グルテン、大豆タンパク質分離物、乳漿タンパク質分離物、およびカゼインが挙げられるが、それらに限定されない。適切な粘膜接着性ポリマーには、キトサン、ヒアルロン酸塩、アルギン酸塩、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（Ｌ−リシン）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、およびそれらの誘導体またはコポリマーが挙げられるが、それらに限定されない。有用な微粒子は、口の中でなお存在しているが、カプセル化された粒子の内容物（すなわち、ワクチン抗原）を放出する材料でできている。
【００８６】
参考文献１４におけるフィルムは、経皮送達のために、陽イオン性ポリ（β−アミノエステル）を含む。
【００８７】
本発明に関して有用な経口フィルムは、ワクチンを、投与中、より美味にさせる矯味矯臭薬を含んでもよい。
【００８８】
薄型フィルムは、様々なプロセスによって作製することができ、そのプロセスには、溶媒キャスティング（ｓｏｌｖｅｎｔ  ｃａｓｔｉｎｇ）；ホットメルト押し出し成形；固形分散押し出し成形；および圧延が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８９】
したがって、本発明のプロセスにおける処方ステップは、以下のステップを含んでもよい：（ａ）通常には凍結乾燥ワクチン抗原を再構成することによる、ワクチン抗原を、１つまたは複数の口腔内溶解性（ｏｒａｌｌｙ−ｓｏｌｕｂｌｅ）ポリマーと混合するステップ；および（ｂ）ステップ（ａ）からの混合物を用いてフィルムを形成して、ワクチンの頬側投与に適した薄型フィルムをもたらすステップ。
【００９０】
本発明のプロセスにおける処方ステップは、以下のステップを含んでもよい：（ａ）通常には凍結乾燥ワクチン抗原を再構成することによる、ワクチン抗原を、ポリ（β−アミノエステル）などの１つまたは複数の局所溶解性ポリマーと混合するステップ；および（ｂ）ステップ（ａ）からの混合物を用いてフィルムを形成して、ワクチンの経皮投与に適した薄型フィルムをもたらすステップ。
【００９１】
これらのフィルムを、個々の単位用量の小袋の中へパッケージングし、例えば、窒素下で密閉し、その後、熱密閉してもよい。小袋は、保存中、フィルムを乾燥状態に保つために防水であるべきである。
【００９２】
処置およびワクチンの投与の方法
本発明の処方ワクチンを、被験体に、例えば、皮膚を通して、頬組織を通して、送達することができる。したがって、本発明は、本発明の処方ワクチンを被験体に投与するステップを含む、被験体において免疫応答を起こす方法を提供する。これは、例えば、マイクロニードルが被験体の真皮に貫入するように、マイクロニードルパッチまたはデバイスを被験体の皮膚に適用すること、または薄型フィルムを被験体の頬組織もしくは舌に適用することを含んでもよい。
【００９３】
本発明はまた、被験体にワクチン接種する方法に用いるための凍結乾燥抗原を提供する。本発明はまた、被験体において免疫応答を起こすための薬物の製造における凍結乾燥抗原の使用を提供する。
【００９４】
本発明はまた、被験体にワクチン接種する方法に用いられる、再構成された凍結乾燥抗原を提供する。本発明はまた、被験体において免疫応答を起こすための薬物の製造における再構成された凍結乾燥抗原の使用を提供する。
【００９５】
ワクチン製造物は、ヒトまたは非ヒト動物の被験体にワクチンを投与するのに適している。
【００９６】
これらの方法および使用によって起こされた免疫応答は、一般的に、抗体応答、好ましくは、防御抗体応答を含む。
【００９７】
マイクロニードルパッチまたはデバイスは、（例えば、絆創膏または公知の皮膚パッチについてのように）簡単な手による適用により皮膚に適用されてもよいし、バネ駆動式注入器を用いて適用されてもよい。
【００９８】
本発明により調製されるワクチンは、小児と成人のどちらも処置するのに用いることができる。
【００９９】
処置は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールによることができる。複数回投与は、一次免疫スケジュールおよび／または追加免疫スケジュールにおいて用いられてもよい。複数回投与は、典型的には、少なくとも１週間（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）離して、投与される。
【０１００】
インフルエンザワクチン接種
本発明のプロセスは、インフルエンザワクチンを調製するのに理想的である。様々な形態のインフルエンザウイルスワクチンが現在利用可能であり（例えば、参考文献１８の１７章および１８章を参照）、現在のワクチンは、不活性化ウイルスかまたは弱毒化生ウイルスかのいずれかに基づいている。不活性化ワクチン（全ウイルス、スプリットビリオン、または表面抗原）は、筋肉内または皮内注射によって投与されるが、生ワクチンは鼻腔内に投与される。本発明は、これらのワクチン形態の全部に関して用いることができる。
【０１０１】
本発明のいくつかの実施形態は、表面抗原インフルエンザワクチン（不活性化型）を用いる。そのようなワクチンは、スプリットビリオンワクチンまたは全ビリオンワクチンより少ないウイルス成分を含有する。それらは、表面抗原血球凝集素、および典型的には、ノイラミニダーゼも含む。これらのタンパク質をインフルエンザウイルスから精製された形態で調製するためのプロセスは、当技術分野においてよく知られている。ＦＬＵＶＩＲＩＮ（商標）、ＡＧＲＩＰＰＡＬ（商標）、およびＩＮＦＬＵＶＡＣ（商標）製品は、表面抗原インフルエンザワクチンの例である。
【０１０２】
本発明が表面抗原インフルエンザワクチンを用いる場合、このウイルスは、卵内で成長していてもよいし、または細胞培養で成長していてもよい（下記参照）。ワクチン用のインフルエンザウイルス成長のための現在の標準方法は、孵化ＳＰＦ鶏卵を用い、ウイルスは、卵内容物（尿膜腔液）から精製される。卵に基づいたウイルス成長が用いられる場合には、１つまたは複数のアミノ酸が卵の尿膜腔液へウイルスと共に導入されてもよい［２４］。ウイルスはまず、卵内で成長する。その後、それは感染した卵から採取される。ビリオンは、尿膜腔液から様々な方法によって採取することができる。例えば、精製プロセスは、ビリオンを破壊する界面活性剤を含む線形スクロース勾配溶液を用いるゾーン遠心分離を含んでもよい。その後、抗原は、任意の希釈後、ダイアフィルトレーションによって精製されてもよい。ウイルスを不活性化するための化学的手段には、有効量の１つまたは複数の以下の作用物質での処理を含む：界面活性剤、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、バイナリーエチルアミン、アセチルエチレンイミン、またはそれらの組み合わせ。ウイルス不活性化の非化学的方法は、例えば、ＵＶ光またはγ線照射など、当技術分野において知られている。
【０１０３】
本発明のいくつかの実施形態は、全ウイルス、スプリットウイルス、ビロソーム、弱毒化生ウイルス、または組換え血球凝集素を用いることができる。これらのワクチンは、それらの抗原を、例えば、余分のインフルエンザウイルスタンパク質の存在について、試験することによって、表面抗原ワクチンと容易に区別することができる。
【０１０４】
不活性化全ウイルスは、（例えば、卵または培地から得られた）ウイルス含有液からビリオンを採取し、その後、上記のようにそれらを処理することによって、得ることができる。
【０１０５】
スプリットビリオンは、精製されたビリオンを界面活性剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコレート、トリ−Ｎ−ブチルリン酸、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１、臭化セチルトリメチルアンモニウム、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ９など）で処理し、サブビリオン調製物を生じることによって得られる（例えば、「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」スプリッティングプロセス）。例えばインフルエンザウイルスを、スプリットする方法は、当技術分野においてよく知られており、例えば、参考文献１９〜２４などを参照されたい。ウイルスのスプリッティングは、典型的には、感染性か非感染性かにかかわらず、全ウイルスを破壊濃度のスプリッティング剤で破壊または断片化することによって行われる。破壊は、ウイルスタンパク質の完全または部分的可溶化を生じ、ウイルスの完全性を変化させる。好ましいスプリッティング剤は、非イオン性およびイオン性（例えば、陽イオン性）表面活性物質、例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレン−アルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、ＮＰ９、四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、トリ−Ｎ−ブチルリン酸、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびＤＯＴ−ＭＡ、オクチルフェノキシポリオキシエタノールまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１などのＴｒｉｔｏｎ表面活性物質）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ表面活性物質）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルなどである。一つの有用なスプリッティング手順は、デオキシコール酸ナトリウムとホルムアルデヒドの連続効果を用い、スプリッティングは、最初のビリオン精製中に（例えば、スクロース密度勾配溶液中で）起こり得る。したがって、スプリッティングプロセスは、（非ビリオン材料を除去するための）ビリオン含有材料の清澄、（例えば、ＣａＨＰＯ４吸着などの吸着方法を用いる）採取されたビリオンの濃縮、全ビリオンの非ビリオン材料からの分離、（例えば、デオキシコール酸ナトリウムなどのスプリッティング剤を含有するスクロース勾配を用いる）密度勾配遠心分離ステップにおけるスプリッティング剤を用いるビリオンのスプリッティング、およびその後の、望ましくない材料を除去するための濾過（例えば、限外濾過）を含み得る。スプリットビリオンは、有用には、リン酸ナトリウム緩衝等張塩化ナトリウム溶液中に再懸濁することができる。スプリットワクチンの例は、ＢＥＧＲＩＶＡＣ（商標）、ＩΝΤΑΝΖΑ（商標）、ＦＬＵＡＲＩＸ（商標）、ＦＬＵＺＯＮＥ（商標）、およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤ（商標）製品である。
【０１０６】
ビロソームは、核酸を含まないウイルス様リポソーム粒子である［２５］。それらは、ウイルスの界面活性剤での可溶化、続いて、ヌクレオカプシドの除去、およびウイルス糖タンパク質を含有する膜の再構成によって調製することができる。ビロソームを調製するための代替方法は、ウイルス膜糖タンパク質を過剰量のリン脂質に加えて、膜内にウイルスタンパク質を有するリポソームを生じさせることを含む。
【０１０７】
弱毒化生ウイルスは、（卵内または細胞培養で成長した）ウイルスから得られるが、ウイルスは不活性化されていない。そうではなく、ウイルスは、例えば、ヒトインフルエンザ感染のフェレットモデルにおいてインフルエンザ様病気を生じさせないように、弱毒化（「ａｔｔ」）されている。それはまた低温に適応した（「ｃａ」）株であってもよく、すなわち、それは、２５℃（多数の野生型インフルエンザウイルスの複製について制限的である温度）で効率的に複製することができる。それはまた、温度感受性（「ｔｓ」）であってもよく、すなわち、それの複製は、多くの野生型インフルエンザウイルスが効率的に成長する温度（３７〜３９℃）において制限される。ｃａ、ｔｓ、およびａｔｔ表現型の累積的効果は、以下である：弱毒化ワクチンにおけるウイルスは、鼻咽頭で複製して、典型的なヒト患者において防御免疫を誘導することができるが、それは疾患を引き起こさない。すなわち、それは標的ヒト集団への一般的な投与について安全であるということである。これらのウイルスは、ビリオン含有液からビリオンを精製すること、例えば、その液体の遠心分離による清澄後、（例えば、スクロース、リン酸カリウム、およびグルタミン酸一ナトリウムを含有する）緩衝液での安定化によって調製することができる。生ワクチンは、ＦＬＵＭＩＳＴ（商標）製品を含む。生ワクチンは本発明に関して用いることができるが、非生ワクチンを用いることが好ましい。
【０１０８】
ビリオンから得られた抗原を用いることの代替として、血球凝集素を組換え宿主（例えば、バキュロウイルスベクターを用いる、Ｓｆ９などの昆虫細胞系）において発現させ、精製された形態で［２６〜２８］、またはウイルス様粒子（ＶＬＰ；例えば、参考文献２９および３０を参照）の形態で用いることができる。
【０１０９】
本発明のいくつかの実施形態は、卵内ではなく、細胞培養で成長したウイルスから調製されたインフルエンザワクチンを用いる。細胞培養が用いられる場合、ウイルス成長培養基は、典型的には、哺乳動物起源の細胞系である。適切な起源の哺乳動物細胞には、ハムスター細胞、ウシ細胞、（ヒトおよびサルを含む）霊長類細胞、およびイヌ細胞が挙げられるが、それらに限定されない。腎細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞などの様々な細胞型を用いてもよい。適切なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣという名前を有する細胞系である。適切なサル細胞は、例えば、Ｖｅｒｏ細胞系のように、腎細胞などのアフリカミドリザル細胞である。適切なイヌ細胞は、例えば、ＭＤＣＫ細胞系のように腎細胞である。したがって、適切な細胞系には、ＭＤＣＫ；ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；Ｖｅｒｏ；ＭＲＣ−５；ＰＥＲ．Ｃ６；ＷＩ−３８などが挙げられるが、それらに限定されない。インフルエンザウイルスを成長させるための好ましい哺乳動物細胞系には、メイディン・ダービー・イヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞［３１〜３４］；アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ）腎臓由来のＶｅｒｏ細胞［３５〜３７］；ヒト胚性網膜芽細胞由来のＰＥＲ．Ｃ６細胞［３８］が挙げられる。これらの細胞系は、広く入手可能であり、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクションから、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓから、またはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６、およびＣＲＬ−１５８７により様々な異なるＶｅｒｏ細胞を供給し、カタログ番号ＣＣＬ−３４によりＭＤＣＫ細胞を供給する。ＰＥＲ．Ｃ６は、ＥＣＡＣＣから寄託番号９６０２２９４０により入手可能である。哺乳動物細胞系のあまり好ましくない代替物として、ウイルスは、トリ細胞系で成長することができ［例えば、参考文献３９〜４１］、それには、アヒル（例えば、アヒル網膜）またはニワトリ由来の細胞系が挙げられる。トリ細胞系の例には、トリ胚性幹細胞［３９、４２］およびアヒル網膜細胞［４０］が挙げられる。適切なトリ胚性幹細胞には、ニワトリ胚性幹細胞由来のＥＢｘ細胞系、ＥＢ４５、ＥＢ１４、およびＥＢ１４−０７４が挙げられる［４３］。ニワトリ胚性線維芽細胞（ＣＥＦ）もまた用いてもよい。
【０１１０】
インフルエンザウイルスを成長させるための最も好ましい細胞系はＭＤＣＫ細胞系である。もともとのＭＤＣＫ細胞系は、ＡＴＣＣからＣＣＬ−３４として入手可能であるが、この細胞系の誘導体もまた用いてもよい。例えば、参考文献３１は、懸濁培養での成長に適応したＭＤＣＫ細胞系を開示する（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９として寄託された「ＭＤＣＫ  ３３０１６」）。同様に、参考文献４４は、無血清培養において懸濁状態で成長するＭＤＣＫ由来細胞系を開示する（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４４９として寄託された「Ｂ−７０２」）。参考文献４５は、非腫瘍原性ＭＤＣＫ細胞を開示し、それらには、「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０２）、および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）が挙げられる。参考文献４６は、感染に対する高い感受性を有するＭＤＣＫ細胞系を開示し、それらには、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２０４２）が挙げられる。これらのＭＤＣＫ細胞系のいずれもを用いることができる。
【０１１１】
ウイルスが哺乳動物細胞系で成長している場合、本発明の製造物は、有利なことには、卵タンパク質（例えば、オボアルブミンおよびオボムコイド）およびニワトリＤＮＡを含まず、それにより、潜在的なアレルゲン性を低下させる。
【０１１２】
本発明の細胞由来製造物における血球凝集素は、卵由来ウイルスに見られるパターンとは異なるグリコシル化パターンを有し得る。したがって、そのＨＡ（および他の糖タンパク質）は、ニワトリ卵に見られないグリコフォームを含む可能性がある。有用なＨＡには、イヌグリコフォームが挙げられる。
【０１１３】
卵由来材料およびニワトリグリコフォームが存在しないことにより、細胞培養で成長したウイルスから調製されたワクチンを卵由来製造物と区別することができる方法が提供される。
【０１１４】
ウイルスが細胞系で成長している場合、成長のための培養物、およびまた、培養を開始するために用いられるウイルス接種物は、好ましくは、単純ヘルペスウイルス、ＲＳウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、および／またはパルボウイルスを含まない（すなわち、それらによる汚染について試験し、陰性の結果が示されている）［４７］。単純ヘルペスウイルスの非存在は特に好ましい。
【０１１５】
ＭＤＣＫ細胞などの細胞系での成長について、ウイルスは、懸濁状態の細胞において成長してもよいし［３１、４８、４９］、接着培養の細胞で成長してもよい。懸濁培養のための一つの適切なＭＤＣＫ細胞系は、（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９として寄託された）ＭＤＣＫ  ３３０１６である。代替として、マイクロキャリア培養を用いることができる。
【０１１６】
インフルエンザウイルス複製を支援する細胞系は、好ましくは、無血清培養培地および／または無タンパク質培地中で成長する。ヒトまたは動物起源の血清由来の添加物が存在しない培地は、本発明との関連において、無血清培地と呼ばれる。無タンパク質とは、タンパク質、成長因子、他のタンパク質添加物および非血清タンパク質を排除しているが、任意で、トリプシンまたはウイルス成長に必要とされる場合がある他のプロテアーゼなどのタンパク質を含むことができる、細胞の増倍が起こる培地を意味すると理解される。そのような培地で成長した細胞は、当然ながら、それ自体のタンパク質を含有する。
【０１１７】
インフルエンザウイルス複製を支援する細胞系は、好ましくは、ウイルス複製中３７℃未満［５０］、例えば、３０〜３６℃、３１〜３５℃、または３３±１℃で成長する。
【０１１８】
培養細胞においてウイルスを増殖させるための方法は一般的に、培養細胞に、培養される株を接種するステップ、例えば、ウイルス力価または抗原発現により決定されるようなウイルス増殖にとって望ましい時間の間（接種後２４〜１６８時間）、感染した細胞を培養するステップ、および増殖したウイルスを収集するステップを含む。培養細胞は、１：５００〜１：１、好ましくは、１：１００〜１：５、より好ましくは１：５０〜１：１０の（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ５０により測定される）ウイルス対細胞比で接種される。ウイルスは細胞の懸濁液に加えられるか、または細胞の単層に適用され、ウイルスは、細胞に、２５℃〜４０℃、好ましくは２８℃〜３７℃で、少なくとも６０分間、ただし通常には、３００分間未満、好ましくは９０〜２４０分間、吸着させられる。感染した細胞培養物（例えば、単層）は、採取される培養上清のウイルス含有率を増加させるために凍結融解によるかまたは酵素作用によるかのいずれかで除去されてもよい。その後、採取された液体は不活性化されるか凍結保存されるかのいずれかである。培養細胞を、約０．０００１〜１０、好ましくは０．００２〜５、より好ましくは０．００１〜２の感染多重度（「ｍ．ｏ．ｉ．」）で感染させてもよい。さらにより好ましくは、細胞を約０．０１のｍ．ｏ．ｉ．で感染させる。感染した細胞は、感染から３０〜６０時間後、採取することができる。好ましくは、細胞は、感染から３４〜４８時間後、採取される。さらにより好ましくは、細胞は、感染から３８〜４０時間後、採取される。プロテアーゼ（典型的にはトリプシン）は、一般的に、ウイルス放出を可能にするために細胞培養中に加えられ、プロテアーゼは培養中の任意の適切な段階で加えることができる。
【０１１９】
細胞培養から調製されたワクチンを含むワクチン製造物は、好ましくは、用量あたり１０ｎｇ未満（好ましくは１ｎｇ未満、より好ましくは１００ｐｇ未満）の残留宿主細胞ＤＮＡを含有し、痕跡量の宿主細胞ＤＮＡが存在してもよい。
【０１２０】
任意の残留宿主細胞ＤＮＡの平均の長さは、５００ｂｐ未満、例えば、４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満などであることが好ましい。
【０１２１】
汚染ＤＮＡは、標準精製手順、例えば、クロマトグラフィーなどを用いてワクチン調製中に除去することができる。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、ヌクレアーゼ処理、例えば、ＤＮアーゼを用いることにより、増強させることができる。宿主細胞ＤＮＡ汚染を低下させるための便利な方法は、参考文献５１および５２に開示されており、それは、最初にＤＮアーゼ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（ウイルス成長中に用いることができる）を用いること、およびその後、陽イオン性界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）（ビリオン破壊中に用いることができる）を用いることの２ステップ処理を含む。β−プロピオラクトンなどのアルキル化剤での処理も宿主細胞ＤＮＡを除去するために用いることができ、有利なことには、ビリオンを不活性化するためにも用いてもよい［５３］。
【０１２２】
本発明のいくつかの実施形態は、一価インフルエンザワクチン（すなわち、それは単一のインフルエンザウイルス株由来の血球凝集素抗原を含む）を用いるが、いくつかの実施形態において、それは、二価ワクチン、三価ワクチン、四価ワクチン、または＞４価ワクチン（すなわち、４つより多い異なるインフルエンザウイルス株由来の血球凝集素を含む）などの多価ワクチンであってもよい。一価ワクチンと多価ワクチンとは、複数のＨＡ型についてアミノ酸シーケンシングなどにより試験することによって容易に区別される。
【０１２３】
一価ワクチンは、パンデミック状況中かまたはパンデミック前の状況のいずれかにおいて、パンデミック株またはパンデミックの可能性がある株に対して免疫化するのに特に有用である。これらの株の特性は以下である：（ａ）それらは、現在広まっているヒト株における血球凝集素と比較して新しい血球凝集素を含有する。すなわち、１０年超の間、ヒト集団において明らかではなかった株（例えば、Ｈ２）、またはこれまでに、ヒト集団において全く見られることがなかった株（例えば、一般的に鳥集団においてのみ見出されているＨ５、Ｈ６、またはＨ９）であり、それゆえに、ヒト集団はその株の血球凝集素に対して免疫学的にナイーブである；（ｂ）それらは、ヒト集団において水平に伝染する能力がある；および（ｃ）それらはヒトに対して病原性である。これらの株は、インフルエンザＡ型  ＨＡ亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６のいずれかを有してもよい。Ｈ５血球凝集素型を有するウイルスは、パンデミックインフルエンザに対して免疫化するために好ましく、またはＨ２、Ｈ７、もしくはＨ９亜型も好ましい。本発明は、１つまたは複数のインフルエンザＡ型ウイルスＮＡ亜型Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、またはＮ９から防御し得る。したがって、可能な株には、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１、およびＨ７Ｎ７、ならびに任意の他の新たなパンデミックの可能性のある株が挙げられる。
【０１２４】
多価ワクチンは、季節的設定においてより典型的であり、例えば、三価ワクチンが典型的であり、Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、およびインフルエンザＢ型ウイルス株由来などの２つのインフルエンザＡ型ウイルスおよび１つのインフルエンザＢ型ウイルス株由来の血球凝集素を含む。四価ワクチンもまた有用であり［５４］、例えば、２つのインフルエンザＡ型ウイルス株と２つのインフルエンザＢ型ウイルス株、または３つのインフルエンザＡ型ウイルス株と１つのインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む。したがって、ワクチンは、二価、三価、四価などであってもよい。一価ワクチンを除いて、インフルエンザＡ型ウイルス株とインフルエンザＢ型ウイルス株の両方由来の血球凝集素を含むことが通例である。２つのインフルエンザＡ型ウイルス株だけを含むワクチンにおいて、これらは、通常、１つのＨ１株（例えば、Ｈ１Ｎ１株）と１つのＨ３株（例えば、Ｈ３Ｎ２株）である。しかしながら、いくつかの実施形態において、１つのパンデミックインフルエンザＡ型ウイルス株と１つのＨ１株、または１つのパンデミックインフルエンザＡ型ウイルス株と１つのＨ３株であってもよい。
【０１２５】
ワクチンが１つより多いインフルエンザ株を含む場合、その異なる株は、典型的には、別々に成長し、ウイルスが採取されかつ抗原が調製された後で混合される。したがって、本発明のプロセスは、１つより多いインフルエンザ株由来の抗原を混合するステップを含んでもよい。
【０１２６】
参考文献５４に記載されているように、例示的な四価ワクチンは、２つのインフルエンザＡ型ウイルス株と２つのインフルエンザＢ型ウイルス株由来（「Ａ−Ａ−Ｂ−Ｂ」）、または３つのインフルエンザＡ型ウイルス株と１つのインフルエンザＢ型ウイルス株由来（「Ａ−Ａ−Ａ−Ｂ」）の血球凝集素を含むことができる。
【０１２７】
インフルエンザＢ型ウイルスは現在、異なるＨＡ亜型を提示していないが、インフルエンザＢ型ウイルス株は、２つの別個の系列に分類される。これらの系列は１９８０年代後半に出現し、お互いに抗原的におよび／または遺伝的に区別することができるＨＡを有する［５５］。現在のインフルエンザＢ型ウイルス株は、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様かまたはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様のいずれかである。本発明のワクチンが２つのインフルエンザＢ型株を含む場合、これは通常、１つのＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株と１つのＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株である。これらの株は、通常、抗原的に区別されるが、アミノ酸配列の違いもまた、その２つの系列を区別するために記載されており、例えば、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株は、アミノ酸残基１６４（「Ｌｅｅ４０」ＨＡ配列に対して番号付けられた）において欠失をもつＨＡタンパク質を有する場合が（常にではないが）多い［５６］。
【０１２８】
好ましいＡ−Ａ−Ｂ−Ｂワクチンは、（ｉ）Ｈ１Ｎ１株；（ｉｉ）Ｈ３Ｎ２株；（ｉｉｉ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株；および（ｉｖ）Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株由来の血球凝集素を含む。
【０１２９】
３つのインフルエンザＡ型ウイルス株を含むワクチンにおいて、これらは通常、１つのＨ１株（例えば、Ｈ１Ｎ１株）と２つのＨ３株（例えば、２つのＨ３Ｎ２株）である。２つのＨ３株は、抗原的に別個のＨＡタンパク質、例えば、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９と交差反応する１つのＨ３Ｎ２株と、Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２と交差反応する１つのＨ３Ｎ２株を有する。２つのＨ３株は、異なるクレイド由来であってもよい（Ｈ３Ｎ２株のクレイドＡ、ＢおよびＣは参考文献５７に開示されている）。しかしながら、いくつかの実施形態において、これらの株の１つ（すなわち、Ｈ１株、または２つのＨ３株のうちの１つ）は、パンデミック株に置き換えられてもよい。
【０１３０】
したがって、一つの好ましいＡ−Ａ−Ａ−Ｂワクチンは、（ｉ）Ｈ１Ｎ１株；（ｉｉ）Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９様Ｈ３Ｎ２株；（ｉｉｉ）Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２様Ｈ３Ｎ２株；および（ｉｖ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様またはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様であり得るインフルエンザＢ型ウイルス株由来の血球凝集素を含む。
【０１３１】
別の好ましいＡ−Ａ−Ａ−Ｂワクチンは、（ｉ）Ｈ１Ｎ１株、（ｉｉ）Ｈ３Ｎ２株、（ｉｉｉ）Ｈ５株（例えば、Ｈ５Ｎ１株）、および（ｉｖ）インフルエンザＢ型株由来の血球凝集素を含む。
【０１３２】
別の好ましいＡ−Ａ−Ａ−Ｂワクチンは、（ｉ）２つの異なるＨ１株、（ｉｉ）Ｈ３Ｎ２株、および（ｉｉｉ）インフルエンザＢ型株由来の血球凝集素を含む。
【０１３３】
２つ以上のインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原が存在する場合、インフルエンザＢ型ウイルス株の少なくとも２つは、別個の血球凝集素を有し得るが、関連したノイラミニダーゼを有してもよい。例えば、それらは、両方ともＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様ノイラミニダーゼを有してもよく［５８］、または両方ともＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様ノイラミニダーゼを有してもよい。例えば、２つのＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様ノイラミニダーゼは両方とも、１つまたは複数の以下の配列特性を有してもよい：（１）残基２７においてはセリンではなく、好ましくはロイシンである；（２）残基４４においてはグルタミン酸ではなく、好ましくはリシンである；（３）残基４６においてはスレオニンではなく、好ましくはイソロイシンである；（４）残基５１においてはプロリンではなく、好ましくはセリンである；（５）残基６５においてはアルギニンではなく、好ましくはヒスチジンである；（６）残基７０においてはグリシンではなく、好ましくはグルタミン酸である；（７）残基７３においてはロイシンではなく、好ましくはフェニルアラニンである；および／または（８）残基８８においてはプロリンではなく、好ましくはグルタミンである。同様に、いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼは、残基４３に欠失を有してもよく、またはそれはスレオニンを有してもよい；ＮＡ遺伝子におけるトリヌクレオチド欠失に起因する残基４３における欠失は、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株の特性として報告されているが、最近の株はＴｈｒ−４３を取り戻している［５８］。逆に、当然ながら、その反対の特性は、２つのＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様ノイラミニダーゼによって共有される可能性がある（例えば、Ｓ２７、Ｅ４４、Ｔ４６、Ｐ５１、Ｒ６５、Ｇ７０、Ｌ７３、および／またはＰ８８）。これらのアミノ酸は、「Ｌｅｅ４０」ノイラミニダーゼ配列に対して番号付けられている［５９］。したがって、本発明のＡ−Ａ−Ｂ−Ｂワクチンは、ＨＡについて抗原的に別個であるが（１つのＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様、１つのＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様）、ＮＡについては関連している（両方ともＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様、または両方ともＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様）２つのＢ株を用いてもよい。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、本発明は、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／０３／２００３（Ｈ３Ｎ２）株、およびＢ／Ｊｉａｎｇｓｕ／１０／２００３株のそれぞれ由来の血球凝集素を含有する三価スプリットワクチンを包含しない。
【０１３５】
抗原を組成物に有用に含めることができる株には、抵抗性パンデミック株［６１］を含む、抗ウイルス治療に抵抗性（例えば、オセルタミビル［６０］および／またはザナミビルに対して抵抗性）である株が挙げられる。
【０１３６】
本発明のいくつかの実施形態において、ワクチンは、少量のチオメルサールまたはメルチオレートなどの水銀に基づいた保存剤を含んでもよい。存在する場合、そのような保存剤は、典型的には、５μｇ／ｍｌ未満の水銀を供給し、より低いレベル、例えば、＜１μｇ／ｍｌ、＜０．５μｇ／ｍｌが可能である。好ましいワクチンは、チオメルサールを含まず、より好ましくは、水銀を含まない［２３、６２］。そのようなワクチンは、非水銀性保存剤を含むことができる。チオメルサールの非水銀性代替物には、２−フェノキシエタノールまたはコハク酸α−トコフェロールが挙げられる［２３］。最も好ましくは、ワクチンは保存剤を含まない。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、ワクチンは、安定化量のゼラチンを、例えば、０．１％未満で含んでもよい。しかしながら、他の実施形態において、ワクチンはゼラチンを含まない。ゼラチンの非存在により、ワクチンは、ゼラチン感受性である少ない割合の患者において安全であることが保証され得る［６３、６４］。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、ワクチンは、１つまたは複数の抗生物質、例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢを含んでもよい。しかし、好ましい実施形態においては、ワクチンは抗生物質を含まない。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、ワクチンはホルムアルデヒドを含んでもよい。しかし、好ましい実施形態においては、ワクチンはホルムアルデヒドを含まない。
【０１４０】
上記で言及されているように、いくつかの実施形態において、ワクチンは卵成分（例えば、オボアルブミンおよびオボムコイド）を含んでもよいが、好ましい実施形態は卵成分を含まない。
【０１４１】
特定の成分および添加物を使用せずにワクチンを調製することは、参考文献６５に開示されており、それにより、これらの材料が残留量でさえも存在しないことを保証する。
【０１４２】
血球凝集素（ＨＡ）は、現在の不活性化インフルエンザワクチンにおいて主要な免疫原であり、ワクチン用量は、典型的にはＳＲＩＤによって測定される、ＨＡレベルへの参照により標準化される。現行のワクチンは、典型的には、１株あたり約１５μｇのＨＡを含有するが、より低い用量が、例えば、小児用に、またはパンデミック状況において、またはアジュバントを用いる場合、用いることができる。より高い用量（例えば、３×または９×用量［６６、６７］）と同様に、１／２（すなわち、１株あたり７．５μｇのＨＡ）、１／４、および１／８などの分割量も用いられている。これらのワクチンは、０．５ｍｌの用量容積、すなわち、３０μｇ／ｍｌ／株の典型的なＨＡ濃度を有する。三価ＩＮＴＡＮＺＡ（商標）製品は、０．１ｍｌの容積中、１株あたり９μｇのＨＡ、すなわち、９０μｇ／ｍｌ／株のＨＡ濃度を含有し、２７０μｇ／ｍｌの総ＨＡ濃度を示す。
【０１４３】
本発明の製造物は、用量あたりインフルエンザ１株あたり０．１〜５０μｇ、好ましくは０．１〜５０μｇ、例えば、１〜２０μｇのＨＡを含むことができる。理想的には、製造物は、１株あたり≦１６μｇの血球凝集素、例えば、１〜１５μｇ、１〜１０μｇ、１〜７．５μｇ、１〜５μｇなどを有する。１株あたりの特定のＨＡ用量は、例えば、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９、約１．５などを含む。
【０１４４】
生ワクチンについて、投薬量は、ＨＡ含有量ではなく、５０％組織培養感染量（ｍｅｄｉａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｏｓｅ（ＴＣＩＤ５０））によって測定され、例えば、用量あたり１株あたり１０６〜１０８（好ましくは１０６．５〜１０７．５）のＴＣＩＤ５０である。
【０１４５】
本発明に関して用いられるインフルエンザ株は、野生型ウイルスに見出されるような天然ＨＡ、または改変型ＨＡを有してもよい。例えば、ウイルスをトリ種において高病原性にさせる決定因子（例えば、ＨＡ１／ＨＡ２切断部位の周りの超塩基性領域）を除去するようにＨＡを改変することが知られている。逆遺伝学の使用は、そのような改変を促進する。
【０１４６】
本発明のワクチン製造物は、インフルエンザワクチン抗原に加えて構成要素を含むことができる。上記で論じられているように、例えば、それらは、生体溶解性かつ生分解性マトリックス材料、または経口フィルムポリマーを含むことができる。
【０１４７】
ワクチン製造物は、界面活性剤を含んでもよい。界面活性剤のレベルは、幅広く様々であり得、例えば、１μｇのＨＡあたり０．０５〜５０μｇの界面活性剤（「μｇ／μｇ」）である。低レベルの、例えば、０．１〜１μｇ／μｇの界面活性剤を用いることができ、または高レベル、例えば、５〜３０μｇ／μｇを用いることもできる。界面活性剤は単一の界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０またはＣＴＡＢ）でもよいし、混合物（例えば、ポリソルベート８０とＣＴＡＢの両方）でもよい。好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０（「Ｔｗｅｅｎ  ８０」）またはオクチルフェノールエトキシレート（「Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００」）などの非イオン性である。ポリソルベート８０は、１μｇのＨＡあたり０．０５〜５０μｇのポリソルベート８０、例えば、０．１〜１μｇ／μｇ、０．１〜０．８μｇ／μｇ、０．１〜０．５μｇ／μｇ、５〜４０μｇ／μｇ、５〜３０μｇ／μｇ、または８〜２５μｇ／μｇで存在してもよい。
【０１４８】
上記で言及されているように、いくつかのワクチン製造物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含んでもよいが、好ましいワクチンは水銀も保存剤も含まない。
【０１４９】
ワクチン製造物は、ナトリウム塩などの生理的塩を含んでもよい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、それは、１〜２０ｍｇ／ｍｌで存在してもよい。存在してもよい他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【０１５０】
ワクチン製造物は、１つまたは複数の緩衝液を含んでもよい。典型的な緩衝液には、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液（特に、水酸化アルミニウムアジュバントと共に）、またはクエン酸緩衝液が挙げられる。緩衝液は、典型的には、５〜２０ｍＭの範囲で含まれる。
【０１５１】
ワクチン製造物は、好ましくは、無菌である。ワクチン製造物は、好ましくは、非発熱性であり、例えば、用量あたり＜１ＥＵ（内毒素単位、標準的尺度）、および好ましくは用量あたり＜０．１ＥＵを含有する。ワクチン製造物は好ましくは、グルテンを含まない。
【０１５２】
ワクチン製造物は、免疫賦活分子を含むことができる。これらは、パッチを調製する前に抗原と混合することができる。免疫賦活分子の適切なクラスには、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ５アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、およびＣＤ１ｄアゴニストが挙げられるが、それらに限定されない。適切な免疫賦活分子には、イミキモド（「Ｒ−８３７」）［６８、６９］およびレシキモド（「Ｒ−８４８」）［７０］などのイミダゾキノリン、またはそれらの塩（例えば、塩酸塩）；ＲＣ−５２９［７１、７２］などのアミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体；α−ガラクトシルセラミドなどのα−グリコシルセラミド；参考文献７３からの「ＥＲ  ８０４０５７」；Ｅ５５６４［７４、７５］などが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１５３】
インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能、および防御を評価するための方法は当技術分野においてよく知られている。ヒトインフルエンザウイルスの血球凝集素に対する抗体力価は、防御と相関していることが、ヒト研究から示されている（約３０〜４０の血清試料血球凝集阻害力価は、同種ウイルスによる感染から約５０％の防御を示す）［７６］。抗体応答は、典型的には、血球凝集阻害により、マイクロ中和試験により、一元放射状免疫拡散法（ＳＲＩＤ）により、および／または一元放射状溶血反応（ＳＲＨ）により測定される。これらのアッセイ技術は、当技術分野においてよく知られている。好ましいワクチンは、効力についてのＣＰＭＰ評価基準の１、２、または３を満たす。成人（１８〜６０歳）において、これらの評価基準は以下である：（１）≧７０％のセロプロテクション；（２）≧４０％のセロコンバージョン；および／または（３）≧２．５倍のＧＭＴ増加。高齢者（＞６０歳）において、これらの評価基準は以下である：（１）≧６０％のセロプロテクション；（２）≧３０％のセロコンバージョン；および／または（３）≧２倍のＧＭＴ増加。これらの評価基準は、少なくとも５０人の患者についての非盲検研究に基づいている。
【０１５４】
インフルエンザワクチンは、現在、生後６ヶ月から小児および成人の免疫化に用いることが推奨されている。したがって、ヒト被験体は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であってもよい。そのワクチンを受けるのに好ましい被験体は、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、好ましくは≧６５歳）、幼若者（例えば、≦５歳）、入院中の被験体、医療従事者、軍部関係者および軍人、妊婦、慢性病の免疫不全の被験体、ワクチンを受ける前の７日以内に抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルまたはザナミビル化合物；下記参照）を服用した被験体、卵アレルギーをもつ人々、および海外旅行をする人々である。しかしながら、ワクチンは、これらの群にのみ適しているわけではなく、集団においてより一般的に用いられてもよい。パンデミック株について、全年齢群への投与が好ましい。
【０１５５】
１用量より多い投与（典型的には２用量）は、免疫学的にナイーブな患者において、例えば、以前にインフルエンザワクチンを受けたことがない人々にとって、または新しいＨＡ亜型に対するワクチン接種をするために（パンデミック発生においてのように）、特に有用である。
【０１５６】
緩衝液を用いる再構成
さらなる実施態様において、本発明は、（ｉ）抗原を含む液体組成物における抗原の濃度を増加させて、濃縮された抗原を提供するステップ、（ｉｉ）濃縮された抗原を凍結乾燥させて、凍結乾燥ワクチン抗原を提供するステップ、および（ｉｉｉ）凍結乾燥ワクチン抗原を水性緩衝液中に再構成して、再構成された抗原を提供するステップを含む、ワクチン抗原を調製するためのプロセスを提供する。
【０１５７】
ステップ（ｉ）における濃縮に用いることができる技術、およびステップ（ｉｉｉ）における再構成に用いられる材料は別として、このさらなる実施態様についての詳細は本明細書ですでに記載されていることと同じである。
【０１５８】
本発明の前述の実施態様とは対照的に、ステップ（ｉ）は、ステップ（ｉ）において遠心濾過および／または限外濾過を用いることに制限されない。濃縮ステップ（ｉ）に様々な技術を用いることができ、それらには、遠心濾過、限外濾過、または接線流濾過（交差流濾過としても知られている）が挙げられるが、それらに限定されない。これらの３つの濃縮技術は相互排他的ではなく、例えば、本発明は、接線流限外濾過を用いることができる。
【０１５９】
接線流濾過（ＴＦＦ）は、液体をフィルター膜にわたって接線方向に通すことを含む。試料側は、典型的には、濾液側に対して陽圧で保たれる。液体がフィルターの上を流れるとき、その中の成分は、膜を通って濾液へと通過することができる。連続流は、濾液の容積を増加させ、それにしたがって、保持分における抗原の濃度は増加する。ＴＦＦは、デッドエンド濾過と対照をなし、そのデッドエンド濾過において、試料は、膜に対して接線方向ではなく、膜を貫いて通る。多くのＴＦＦシステムが市販されている。ＴＦＦ膜のＭＷＣＯは、どの溶質が膜を通って通過することができるか（すなわち、濾液中）、およびどれが保持されるか（すなわち、保持分中）を決定する。本発明に関して用いられるＴＦＦフィルターのＭＷＣＯは、目的の抗原の実質的に全部が保持分に留まるように選択される。
【０１６０】
どの技術が選択されようと、それは、好ましくは、目的の抗原の濃度を少なくともｎ倍（ｎは５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、またはそれより大きい数である）増加させる。
【０１６１】
この実施態様において、ステップ（ｉｉｉ）における再構成は緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、またはクエン酸緩衝液）を用いる。緩衝液は、典型的には、５〜２０ｍＭの範囲で含まれる。リン酸緩衝液が好ましい。水を用いるか、または非水性溶媒を用いる再構成は、本発明のこの実施態様の一部をなすものではない。
【０１６２】
ステップ（ｉ）は、ワクチン抗原の第１の液体容積を濃縮し、第２の（低下した）液体容積における同量の抗原を含む組成物が提供された。ステップ（ｉｉ）はこの濃縮材料を乾燥させた。この乾燥材料は、第３の容積の緩衝液中に再構成される。第２の容積は第１の容積より小さい。第３の容積は、第２の容積と等しいか、または好ましくはそれより小さい（したがって、当然、第１の容積より小さい。すなわち、全プロセスは、最初の液体組成物における抗原の、より濃縮された水性の形態を提供している）かのいずれかである。
【０１６３】
この実施態様の再構成された抗原は、本明細書ですでに記載されているようなワクチンを処方するために用いることができる。
【０１６４】
この実施態様は、一価ワクチンまたは多価ワクチン；卵由来ワクチンまたは細胞培養由来ワクチン；不活性化ワクチンまたは生ワクチン；表面抗原ウイルスワクチンまたはスプリットウイルスワクチン；液体ワクチンまたは固形ワクチンなどを含むインフルエンザワクチンを調製するために特に有用である。
【０１６５】
一実施形態において、緩衝液により再構成された抗原は、上記のようなマイクロニードルをコーティングするために用いられる。
【０１６６】
一般
用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「包含すること（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を網羅し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、排他的にＸからなってもよいし、または追加の何かを包含してもよく、例えば、Ｘ＋Ｙであってもよい。
【０１６７】
語「実質的に」とは、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを全く含まなくてもよい。必要に応じて、語「実質的に」は、本発明の定義から省略される場合がある。
【０１６８】
数値ｘに関する用語「約」は、任意であり、例えば、ｘ±５％を意味する。
【０１６９】
特に記述がない限り、２つ以上の成分を混合するステップを含むプロセスは、混合のいかなる特定の順序も必要としない。したがって、成分は任意の順序で混合することができる。３つの成分がある場合には、２つの成分をお互いに組み合わせ、その後、その組み合わせに第３の成分を組み合わせてもよいなど。
【０１７０】
動物性（特に、ウシの）材料が細胞の培養に用いられる場合、それらは、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない、特に、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から獲得されるべきである。概して、動物由来材料の完全な非存在下で、細胞を培養することが好ましい。
【０１７１】
化合物が組成物の一部として身体に投与される場合、その化合物は、代替として、適切なプロドラッグに置き換えられてもよい。
したがって本発明は以下の項目を提供する：
（項目１）  凍結乾燥ワクチン抗原を調製するためのプロセスであって、
（ｉ）抗原を含む液体組成物における該抗原の濃度を、遠心濾過または限外濾過を用いて増加させて、濃縮された抗原を提供するステップ、および
（ｉｉ）該濃縮された抗原を凍結乾燥させて、該凍結乾燥ワクチン抗原を提供するステップ
を含む、プロセス。
（項目２）  再構成された液体ワクチン抗原を調製するためのプロセスであって、
（ａ）抗原を項目１に記載のプロセスによって凍結乾燥させるステップ、および
（ｂ）該凍結乾燥ワクチン抗原を水性液体中に再構成するステップ
を含む、プロセス。
（項目３）  ステップ（ｂ）において用いられる上記水性液体の容積が、ステップ（ａ）の開始時点において用いられる上記液体組成物の容積より小さい、項目２に記載のプロセス。
（項目４）  ステップ（ｂ）において用いられる上記水性液体の容積が、ステップ（ａ）の間に生じる上記濃縮された抗原の容積より小さい、項目２に記載のプロセス。
（項目５）  上記再構成された液体ワクチン抗原が、ワクチンを処方するために用いられる、項目２、項目３、または項目４に記載のプロセス。
（項目６）  上記ワクチン抗原が、細菌、ウイルス、真菌、および／または寄生生物により引き起こされる疾患から防御するためのものである、前述の項目のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目７）  上記ワクチンがインフルエンザワクチンである、項目５に記載のプロセス。
（項目８）  ステップ（ｉ）が抗原濃度を少なくとも１０倍増加させる、前述の項目のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目９）  リオプロテクタントが、ステップ（ｉｉ）の開始時点において上記濃縮された抗原へ加えられる、前述の項目のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１０）  上記凍結乾燥ワクチン抗原または上記再構成された液体ワクチン抗原が固形ワクチンを調製するために用いられる、前述の項目のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１１）  上記固形ワクチンが生分解性マイクロニードルを含む、項目１０に記載のプロセス。
（項目１２）  上記マイクロニードルが、
（ａ）生体溶解性かつ生分解性マトリックス材料を、上記再構成された液体ワクチン抗原と混合するステップ；および
（ｂ）ステップ（ａ）からの該混合物を、マイクロニードルを形成するための空洞を含有する型に加えるステップ
によって製作される、項目１１に記載のプロセス。
（項目１３）  上記固形ワクチンがコーティング型マイクロニードルを含む、項目１０に記載のプロセス。
（項目１４）  上記マイクロニードルが金属またはプラスチックである、項目１３に記載のプロセス。
（項目１５）  上記再構成された液体ワクチン抗原を、１つまたは複数の固形マイクロニードルの表面に適用して、上記ワクチンの注入のためのコーティング型マイクロニードルデバイスを提供するステップを含む、項目１３または項目１４に記載のプロセス。
（項目１６）  上記マイクロニードルが、１００〜２５００μｍの長さである、項目１１〜１５のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１７）  上記固形ワクチンが薄型フィルムを含む、項目１０に記載のプロセス。
（項目１８）
上記再構成された液体抗原を、１つまたは複数の口腔内溶解性ポリマーと混合するステップ、次に、
該混合物を用いてフィルムを形成して、上記ワクチンの頬側投与に適した薄型フィルムを提供するステップ
を含む、項目１７に記載のプロセス。
（項目１９）
上記再構成された液体抗原を、１つまたは複数の局所溶解性ポリマーと混合するステップ、次に、
該混合物を用いてフィルムを形成して、上記ワクチンの経皮投与に適した薄型フィルムを提供するステップ
を含む、項目１７に記載のプロセス。
（項目２０）  上記フィルムが、１０〜５００μｍ（例えば、７５〜１５０μｍ）の厚さである、項目１７〜１９のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２１）  上記抗原が、上記フィルム内の微粒子の内部にカプセル化されている、項目１７〜２０のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２２）
（ｉ）項目１０〜２１のいずれか一項に記載のプロセスによって固形ワクチンを調製するステップ、次に、
（ｉｉ）固形ワクチンを個々の単位用量小袋の中へパッケージングするステップ
を含む、パッケージングされたワクチンを調製するためのプロセス。
（項目２３）  前述の項目のいずれか一項に記載のプロセスによって調製されたワクチン。
（項目２４）  被験体において免疫応答を起こす方法であって、項目２３に記載のワクチンを該被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目２５）  ワクチン抗原を調製するためのプロセスであって、
（ｉ）抗原を含む液体組成物における該抗原の濃度を増加させて、濃縮された抗原を提供するステップ、
（ｉｉ）該濃縮された抗原を凍結乾燥させて、凍結乾燥ワクチン抗原を提供するステップ、および
（ｉｉｉ）該凍結乾燥ワクチン抗原を水性緩衝液中に再構成して、再構成された抗原を提供するステップ
を含む、プロセス。
（項目２６）  ステップ（ｉ）が遠心濾過、限外濾過、または接線流濾過を用いる、項目２５に記載のプロセス。
（項目２７）  ステップ（ｉｉｉ）における再構成がリン酸緩衝液を用いる、項目２５または項目２６に記載のプロセス。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１Ａ】図１は、遠心濾過のＳＥＣクロマトグラフを示す。ｘ軸は、保持時間（分）を示し、ｙ軸は、吸光度単位を示す。図１Ａは、出発抗原を示す。図１Ｂは４５分後の保持分を示す。図１Ｃは４５分後の濾液を示す。
【図１Ｂ】図１は、遠心濾過のＳＥＣクロマトグラフを示す。ｘ軸は、保持時間（分）を示し、ｙ軸は、吸光度単位を示す。図１Ａは、出発抗原を示す。図１Ｂは４５分後の保持分を示す。図１Ｃは４５分後の濾液を示す。
【図１Ｃ】図１は、遠心濾過のＳＥＣクロマトグラフを示す。ｘ軸は、保持時間（分）を示し、ｙ軸は、吸光度単位を示す。図１Ａは、出発抗原を示す。図１Ｂは４５分後の保持分を示す。図１Ｃは４５分後の濾液を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１７３】
遠心濾過
遠心濾過については、１０ｋＤａのカットオフを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）デバイスを用い、５０００ｒｐｍで行った。
【０１７４】
以下の３つの遠心分離時間を試験した：１５分間、３０分間、および４５分間。保持分（濃縮物）および濾液を、インフルエンザウイルス血球凝集素の位置を見るために調べた。図１は、抗原が、４５分後、保持分になお存在することを示している。抗原濃度は、１５分後に３倍、３０分後に６倍、４５分後に１３倍であった。抗原回復は、１５分後に４０％、３０分後に４１％、４５分後に５５％であった。したがって、４５分間がさらなる研究のために選択された。
【０１７５】
さらなる研究において、抗原を、遠心分離後、凍結乾燥させ、さらなる濃縮がもたらされた。スクロースを、リオプロテクタントとして、単独で（２つの異なる濃度で）、またはマンニトールと共に用いた。凍結乾燥材料を再構成した。再構成された試料は、目に見える凝集物を含有した。出発材料と比較して、（ＥＬＩＳＡによって測定された）ＨＡ含有量は以下のように濃縮された：
【０１７６】
【表１】
0005976639.tif 000002
したがって、遠心分離と凍結乾燥の組み合わせは、インフルエンザウイルスＨＡ含有量において＞２５倍の濃縮を与えることができる。２つの遠心分離された試料をまたＳＲＩＤによって評価し、それらは、ＨＡ含有量において２１．１×および３５．１×の増加を示し、より高濃度のスクロースレベルが、やはり、より良い結果を与えた。
【０１７７】
限外濾過
限外濾過は、再生セルロースでできている１０ｋＤａカットオフの膜を有するＡｍｉｃｏｎ（商標）撹拌細胞濃縮器を用い、加圧窒素下で１時間行った。
【０１７８】
凍結乾燥が行われ、続いて再構成して、凍結乾燥前の容積に戻す場合には、再構成された材料は、出発材料に匹敵する（ＳＲＩＤによって測定された場合）ＨＡ含有量を有し、機能性抗原の損失がないことを示した。再構成された材料は、＞２週間、安定であった。
【０１７９】
本発明は、例としてのみ記載されているのであって、本発明の範囲および精神の内に留まりながら、改変され得ることは理解されているであろう。
【０１８０】
【数１】
0005976639.tif 000003
【０１８１】
【数２】
0005976639.tif 000004
【図１Ａ】
0005976639.tif 000005
【図１Ｂ】
0005976639.tif 000006
【図１Ｃ】
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