(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖を切断するリボヌクレアーゼであって、
リボヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼ  ＨＩ（ＲＮａｓｅ  ＨＩ）の触媒ドメインの誘導体及びジンクフィンガーＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合ドメインを含む融合タンパク質であり、
ＲＮａｓｅ  ＨＩの触媒ドメインの誘導体は、バチルス・ハロデュランスからのものであり、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１で示されるｒｎｈＡ遺伝子の１７５−５８８までのヌクレオチドによってコードされたポリペプチドを含み、
ＲＮａｓｅ  ＨＩの触媒ドメインの誘導体は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１によってコードされたポリペプチドの配列に基づく基質結合ドメインのＫ８１Ａ、Ｋ８９Ｅ、および、Ｋ１２３Ａのすべてのアミノ酸残基の置換を含み、
ＲＮａｓｅ  ＨＩの触媒ドメインの誘導体は、ＲＮａｓｅ  ＨＩハイブリッド結合ドメインを含まず、
ジンクフィンガーＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合ドメインは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中の特異的な配列に結合する能力を有している、ことを特徴とするリボヌクレアーゼ。
【請求項２】
ジンクフィンガードメインが、ジンクフィンガーＺｆＱＱＲの誘導体であることを特徴とする請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。
【請求項３】
ジンクフィンガードメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２で示される配列ＺｆＱＱＲの１９−３０３までのヌクレオチドによってコードされたポリペプチドであることを特徴とする請求項２に記載のリボヌクレアーゼ。
【請求項４】
リボヌクレアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４で示されるような融合タンパク質ｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲ、またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６で示されるような融合タンパク質ＧＱを含むか、またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８で示されるような融合タンパク質ＧＧＫＫＱを含む、ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のリボヌクレアーゼ。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか一項のリボヌクレアーゼを含む組成物。
【請求項６】
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖のインビトロでの切断のための請求項１乃至４のいずれか一項のリボヌクレアーゼ、または、請求項５の組成物の使用。
【請求項７】
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖の切断は、ジンクフィンガーの結合部位から離れた、２−１６のヌクレオチドにあることを特徴とする請求項６に記載の使用。
【請求項８】
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖の切断が、ジンクフィンガーの結合部位から離れた、５−７のヌクレオチドにあることを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項９】
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖を切断する、ＲＮａｓｅ  ＨＩの操作した変異体を得る方法であって、
前記方法は、
ａ）バチルス・ハロデュランスからのものであり、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１で示されるｒｎｈＡ遺伝子の１７５−５８８までのヌクレオチドによってコードされたポリペプチドを含む、ＲＮａｓｅ  ＨＩ触媒ドメインの誘導体を得る工程と、
ここで、ＲＮａｓｅ  ＨＩの触媒ドメインの誘導体は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１によってコードされたポリペプチドの配列に基づく基質結合ドメインのＫ８１Ａ、Ｋ８９Ｅ、および、Ｋ１２３Ａのすべてのアミノ酸残基の置換を含み、
ＲＮａｓｅ  ＨＩの触媒ドメインの誘導体は、ＲＮａｓｅ  ＨＩハイブリッド結合ドメインを含まず、
ｂ）ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中の特異的な配列に結合する能力を有するジンクフィンガー結合ドメインを含む、工程ａ）で得られたＲＮａｓｅ  ＨＩ触媒ドメインの誘導体を含む融合タンパク質を作ることによって操作したＲＮａｓｅ  ＨＩを得る工程を含む、
ことを特徴とする方法。
【請求項１０】
ジンクフィンガードメインが、ジンクフィンガーＺｆＱＱＲの誘導体であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ジンクフィンガードメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２で示される配列ＺｆＱＱＲの１９−３０３までのヌクレオチドによってコードされたポリペプチドであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列特異的なリボヌクレアーゼＨに関し、それは、ジンクフィンガードメインとの、操作されたリボヌクレアーゼＨＩ（ＲＮａｓｅ  ＨＩ）領域の融合を含む。本発明は遺伝学において適用可能である。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに作用する配列特異的なリボヌクレアーゼは、例えば、核酸、とりわけ、特異的な配列を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのインビトロ操作で、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖の切断を行なうことができるあらゆる用途で役に立つ。インビトロでの使用に加えて、配列特異的な方法でＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを切断する酵素は、ＲＮＡ鋳型上にＤＮＡ鎖を一時的に形成することによって、または、インビボで形成される他のＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを切断するために複製する特定のＲＮＡウイルス感染（例えば、腫瘍ウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎、インフルエンザ）、の治療でも役に立つと分かるかもしれない。
【０００２】
本発明は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合タンパク質またはそのドメインの配列優先性を決定するための方法であって、これによって、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合タンパク質によって認識される配列を決定する方法にも関する。この範囲の本発明は遺伝学に適用可能である。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合タンパク質の配列優先性を決定するための方法は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中の特異的な配列に結合する任意のタンパク質またはそのドメインの配列優先性を決定する際に適用可能であり、これによって、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合タンパク質またはそのドメインによって認識される配列を決定する際にも適用可能である。該方法は、そのようなタンパク質を任意に特異的に操作する技術に相補的に適用することができる。配列特異的なＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合タンパク質は、ＤＮＡ鎖ＲＮＡ鋳型の生成への移行によって複製する特定のＲＮＡウイルス（例えば、腫瘍ウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎、インフルエンザ）の診断で使用することができる。そのようなドメインは、酵素ドメインを含むＤＮＡ−ＲＮＡ結合タンパク質融合のような新しい特異性を含む酵素、例えば、ヌクレアーゼ、ＲＮＡ修飾酵素、または、ＤＮＡ修飾酵素などを得るために、タンパク質工学にも適用することができる。
【背景技術】
【０００３】
特定の位置での核酸の切断が多くの遺伝子工学技術で頻繁に使用されている。広く用いられている市販の制限酵素を含むＤＮＡ分子を断片化する多くの方法がある。さほど多くのＲＮＡ加工酵素が知られているわけではなく、そのほとんどは結果としての低特異性または特異性の完全な欠如を特徴としている。
【０００４】
特許文献１は、キメラジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて、標的とした遺伝的組換または変異を実行するための組成物および方法を記載している。特許文献２は、ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子遺伝子の標的とした編集のためのジンクフィンガーヌクレアーゼの使用と、それによって嚢胞性繊維症の可能性のある治療を与えることについて記載している。特許文献３は、ヒト細胞中の複数のゲノム部位のＤＮＡ配列を修飾することができるジンクフィンガーヌクレアーゼを作るために公に利用可能なジンクフィンガーを用いて、非常に効率的で実践が容易なモジュールのアセンブリ方法の開発について記載している。特許文献１、特許文献２、または、特許文献３のいずれも、ジンクフィンガー、とりわけＺｆＱＱＲとの、ＲＮａｓｅ  ＨＩまたはその一部の融合の使用については記載または示唆しておらず、特に、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの標的とする切断、または、任意のタンパク質によるＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの標的とする任意のタイプの切断の可能性についても開示または示唆していない。特許文献４および特許文献５の記載から、標的としたゲノム編集を促進する多くのジンクフィンガードメインおよびＦｏｋＩヌクレアーゼの融合が知られている。しかしながら、前者のケースとは異なり、天然タンパク質のみ、ＲＮａｓｅ  ＨＩ、および、ジンクフィンガーの融合は、配列特異的な酵素にはつながらない。
【０００５】
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合タンパク質またはそのドメインの配列優先性を決定するための、および、これにより、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合タンパク質によって認識された配列を決定するための方法は、ＳＥＬＥＸ手順の変更形態である。ＳＥＬＥＸは指数関数的増加によるリガンドの系統的な進化を表わしている。この方法の原則は、リガンドに高い親和性を示す核酸配列の大きな分岐したライブラリからの分子の繰り返しの選択および濃縮に基づく。濃縮工程は、リガンドに核酸を結合させ、結合していない配列を除去することにより達成される。この方法は、高い特異性を備えるリガンドを結合させるＲＮＡとＤＮＡのアプタマーを得るために（非特許文献１、非特許文献２）、および、ＤＮＡまたはＲＮＡの結合タンパク質の配列優先性を決定するために（非特許文献３）、これまでのところ用いられてきたが、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに結合するタンパク質には使用されなかった。ＳＥＬＥＸの既知の修飾で使用される記載されたオリゴヌクレオチドライブラリは、一本鎖オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、修飾したＲＮＡ、または、修飾したｓｓＤＮＡ、ＰＮＡ）、または、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）のいずれかからなっていたが、いずれもＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドライブラリの使用を特徴としてはいない。
【０００６】
特許文献１は、キメラジンクフィンガーヌクレアーゼを用い、標的とした遺伝的組換えまたは変異を実行する方法を記載している。特許文献２は、ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子遺伝子の標的とした編集のためのジンクフィンガーヌクレアーゼの使用と、それによって嚢胞性繊維症の可能性のある治療を与えることについて記載している。特許文献３は、ヒト細胞の複数のゲノム部位のＤＮＡ配列を修飾することができるジンクフィンガーヌクレアーゼを作るために公に利用可能なジンクフィンガーを用いて、非常に効率的で実践が容易なモジュールアセンブリ方法の開発について記載している。前述の公開公報のいずれも、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合タンパク質の基質優先性を決定するためのＳＥＬＥＸ方法の使用、または、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中の特定の配列を結合するためのジンクフィンガーの使用、または、とりわけその目的のためのＺｆＱＱＲの使用について記載していない。
【０００７】
非特許文献４は、Ｂｓ−ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ（ｒｎｃＳ）発現が、温度感受性プラスミドからの、および、９０−９５％の細胞死をもたらす非許容温度でのｒｎｃＳの転写に依存し、ならびに、生き残ったほぼすべての細胞がｒｎｃＳ発現プラスミドを保持した、菌株の成長について記載している。したがって、著者は、ｒｎｃＳがバシラス・サブティリスで不可欠であると結論づけた。非特許文献５は、ＲＮａｓｅＩＩＩをコードする遺伝子である、ｒｎｃ中の点変異を保有する細菌の表現型について記載している。非特許文献６は、ＳＡＭ結合アプタマードメインの上流の５’−単リン酸化したｙｉｔＪリボスイッチをインビトロで優先的な切断することができた新規なエンドリボヌクレアーゼ（ここではＲＮａｓｅＹと呼ぶ）として同定された、初期の未知なる機能の本質的なタンパク質、ＹｍｄＡについて記載している。Ｈｅｒｓｋｏｖｉｔｚ  Ｍ．Ａ．ら、Ｄａｓｇｕｐｔａ  Ｓ．ら、Ｋａｒｅｎ  Ｓｈａｈｂａｂｉａｎらのだれも、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに結合するＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合タンパク質またはジンクフィンガーの基質優先性を決定するＳＥＬＥＸ方法の使用、あるいは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを得る任意の方法について、記載も示唆もしていない。
【０００８】
特許文献６は、遺伝子の転写領域全体をほぼカバーする二本鎖ＲＮＡ分子の生成と、すでにまたはほぼ標識化されていてもよい小さなＲＮＡ分子を生成するためにＲＮＡエンドヌクレアーゼを用いてこの分子を切断することについて記載している。特許文献７は、二本鎖ＤＮＡのデオキシリボ核酸のＤＮＡ鎖の一本鎖の切断領域を攻撃し、その相補的な領域で他のＤＮＡ鎖を特異的に開裂する新しいヌクレアーゼＢ−１について記載している。特許文献６と特許文献７は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合タンパク質の基質優先性を決定するためのＳＥＬＥＸ方法の使用、あるいは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中の特定の配列の結合のためのジンクフィンガーの使用、あるいは、とりわけ、その目的のためのＺｆＱＱＲの使用には言及していない。
【０００９】
したがって、特定の位置でＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を切断するリボヌクレアーゼが必要とされている。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合タンパク質の基質優先性を決定する改良された方法、あるいは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中の特定の配列の結合のためのジンクフィンガーの使用、あるいは、とりわけ、その目的のためのＺｆＱＱＲの使用に対するニーズがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ  ２０１００７６９３９  Ａ１
【特許文献２】ＷＯ  ０３０８７３４１  Ａ２
【特許文献３】ＷＯ  ２００９１４６１７９  Ａ１
【特許文献４】ＷＯ  ２００７０１４１８１Ａ２
【特許文献５】ＷＯ  ２００７０１４１８２Ａ２
【特許文献６】ＵＳ  ２００６０５７５９０
【特許文献７】ＪＰ  ５４０５９３９２
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，  Ａ．Ｄ．，  Ｓｚｏｓｔａｋ，  Ｊ．Ｗ．，  １９９０．  Ｎａｔｕｒｅ  ３４６，  ８１８-８２２
【非特許文献２】Ｈｕｉｚｅｎｇａ  ＤＥ，  Ｓｚｏｓｔａｋ  ＪＷ．  １９９５．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４（２）：６５６−６５
【非特許文献３】Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ＴＫ  ＆  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ  Ｈ．  １９９０．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：１１０４−１１１０
【非特許文献４】Ｈｅｒｓｋｏｖｉｔｚ  Ｍ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０００  Ｄｅｃ：３８（５）：１０２７−３３，  “  Ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ．”
【非特許文献５】Ｄａｓｇｕｐｔａ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９９８；  ２８  （３）：  ６２９−４０，  “Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｓＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ−−ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｄｓＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．”
【非特許文献６】Ｋａｒｅｎ  Ｓｈａｈｂａｂｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  （２００９）  ２８，  ３５２３−３５３３，  “  ＲＮａｓｅ  Ｙ，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ，  ｉｎｉｔｉａｔｅｓ  ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ”
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記の最先端技術の観点から、提示される本発明の目的は、記載された不利な点を克服し、かつ、特定の位置でＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を切断するリボヌクレアーゼを実現させることである。したがって、本発明は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中の配列を認識する、ジンクフィンガードメインとＲＮａｓｅ  ＨＩの触媒ドメインの組み合わせに基づいて操作した酵素を提供することと、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖のみを切断する配列特異的な酵素を得ることを目的とする。
【００１３】
本発明は、ランダムな配列を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのライブラリを得るための新しく改良された方法、および、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合タンパク質の配列優先性、好ましくは、ジンクフィンガーによる、さらに好ましくはＺｆＱＱＲによる結合のためのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの配列優先性を決定するための該方法の使用を提供することを次の目的としている。そのような方法は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドライブラリをスクリーニングするために有効に使用することができる。本発明は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのライブラリを得る新しい改良された方法を提供することを次の目的とする。
【００１４】
発明者たちは、特定の位置でＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を切断する配列特異的な操作リボヌクレアーゼＨが、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中の特定の配列に結合する能力を有しているジンクフィンガーＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合ドメインとの、ＲＮａｓｅ  ＨＩの触媒ドメインまたはその誘導体を融合させることにより、得られることに不意に気が付いた。
【００１５】
第１の態様では、本発明は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖を切断するリボヌクレアーゼを提供し、リボヌクレアーゼは、ジンクフィンガーＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合ドメインを含む、ＲＮａｓｅ  ＨＩまたはその誘導体の触媒ドメインを含む融合タンパク質であり、ジンクフィンガー結合ドメインは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中の特定の配列に結合する能力を有している。好ましいリボヌクレアーゼは、ＲＮａｓｅ  ＨＩハイブリッド結合ドメインの欠失を含むＲＮａｓｅ  ＨＩの触媒ドメインの誘導体であり、好ましくは、ＲＮａｓｅ  ＨＩの触媒ドメインは、バチルス・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）からのものであり、より好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１で示されるｒｎｈＡ遺伝子のヌクレオチド１７５−５８８によってコードされたポリペプチドを含む。リボヌクレアーゼでは、ＲＮａｓｅ  ＨＩの好ましい触媒ドメインは、Ｋ８１Ａ、Ｋ８９Ｅ、および、Ｋ１２３Ａから選ばれた基質結合領域中の１つのアミノ酸の少なくとも１つの置換を含み、好ましくは、すべての置換Ｋ８１Ａ、Ｋ８９Ｅ、およびＫ１２３Ａを含む。
【００１６】
好ましいリボヌクレアーゼでは、ジンクフィンガードメインは、ジンクフィンガーＺｆＱＱＲの誘導体であり、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２で示される配列ＺｆＱＱＲの１９−３０３までのヌクレオチドによってコードされたポリペプチドである。リボヌクレアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４で示されるような融合タンパク質ｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲを含む。リボヌクレアーゼは好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６で示されるような融合タンパク質ＧＱを含む。リボヌクレアーゼは好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８で示されるような融合タンパク質ＧＧＫＫＱを含む。
【００１７】
次の態様では、本発明は、本発明によるリボヌクレアーゼを含む組成物を提供する。
【００１８】
本発明は、本発明によるリボヌクレアーゼ、あるいは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖の切断のために本発明による組成物にも関連する。そのような使用では、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖の好ましい切断は、ジンクフィンガーの結合部位から離れた、２−１６のヌクレオチド、好ましくは５−７のヌクレオチドにある。
【００１９】
本発明は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖を切断する、操作したＲＮａｓｅ  ＨＩを得る方法も提供し、該方法は、以下の工程を含む：
ａ）好ましくは結合ドメインの除去によって、および／または、基質の結合に関与するアミノ酸の置換によって、基質と結合しないが触媒活性を保持する、ＲＮａｓｅ  ＨＩ触媒ドメインを得る工程、
ｂ）ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中の特定の配列に結合する能力を有する結合ドメインを含む、好ましくは、ジンクフィンガーＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合ドメインを含む、工程ａ）で得られたＲＮａｓｅ  ＨＩ触媒ドメインを含む融合タンパク質を作ることによって操作したＲＮａｓｅ  ＨＩを得る工程。操作したＲＮａｓｅ  ＨＩを得る好ましい方法では、ジンクフィンガードメインは、ジンクフィンガーＺｆＱＱＲの誘導体、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２で示された配列ＺｆＱＱＲのヌクレオチド１９−３０３によってコードされたポリペプチドである。そのような方法では、ＲＮａｓｅ  ＨＩの触媒ドメインは好ましくはバチルス・ハロデュランスからであり、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ：１で示されるｒｎｈＡ遺伝子のヌクレオチド１７５−５８８によってコードされたポリペプチドを含む。ＲＮａｓｅ  ＨＩの触媒ドメインは、好ましくは、少なくともアミノ酸上の置換、欠失、および／または挿入（ｉｎｓｒｅｔｉｏｎ）から選択される基質結合領域の変化を含む。
【００２０】
本発明のＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を切断するリボヌクレアーゼは、ＲＮａｓｅ  ＨＩまたはその誘導体、および、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合ジンクフィンガーの融合を含み、ＲＮａｓｅ  ＨＩはバチルス・ハロデュランスからであり、ジンクフィンガーは、ハイブリッドＤＮＡ−ＲＮＡ中の特定の配列に結合する能力を有している。好ましくは、本発明によるリボヌクレアーゼは、触媒ドメイン・ポリペプチドであるバチルス・ハロデュランスからのＲＮａｓｅ  ＨＩの誘導体であることを特徴とし、さらにより好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示されるｒｎｈＡ遺伝子のヌクレオチド１７５−５８８によってコードされたポリペプチドを含んでいる。同じく好ましくは、本発明によるリボヌクレアーゼは、天然のＲＮａｓｅ  ＨＩの誘導体であることを特徴とし、これは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合ドメインの欠失を包含している。好ましくは、本発明によるリボヌクレアーゼは、触媒ドメイン誘導体ＲＮａｓｅ  ＨＩであることを特徴としており、これは、基質結合領域中のアミノ酸の置換：Ｋ８１Ａ、Ｋ８９ＥおよびＫ１２３Ａを含んでいる。最も好ましくは、本発明によるリボヌクレアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示されるｒｎｈＡ遺伝子のヌクレオチド１７５−５８８によってコードされたポリペプチドであることを特徴としており、ジンクフィンガードメインは、ジンクフィンガーＺｆＱＱＲの誘導体であり、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で示される、ジンクフィンガーＺｆＱＱＲの１９−３０３のヌクレオチドによってコードされたポリペプチドである。
【００２１】
配列特異的なリボヌクレアーゼＨは、ＲＮＡの修飾に関する研究を含む、ＲＮＡ質量分析法に関する核酸の特異的かつ局所的な断片化で使用することができる。本発明は、第３世代シーケンシングのためのＲＮＡのフラグメントを生成するために使用され得る。配列特異的な操作したＲＮａｓｅＨは、特定の配列を含むウイルスＲＮＡを検知するまたはマッピングするために使用することができ、一本鎖ＲＮＡはＤＮＡでアニーリングされ、結果として生じるハイブリッドは切断される。本発明は、フラグメントのシャッフルとｍＲＮＡのライゲーションによるタンパク質の操作に使用することができ、フラグメントは特定の操作したリボヌクレアーゼＨによる消化によって得られる。本発明は、インビボの持続的なＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの部位特異的な切断を配向するために使用することができる。
【００２２】
新しい特徴を含む酵素は、異なる機能性を含む複数のドメインの融合を構築することによって得ることができる。配列に依存したやり方でＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を切断するリボヌクレアーゼの操作は、２つのタンパク質ドメイン：操作したＲＮａｓｅ  ＨＩ、および、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合ジンクフィンガーの融合に基づく。バチルス・ハロデュランスからのＲＮａｓｅ  ＨＩは、配列とは無関係のやり方で、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖を加水分解する酵素である。ジンクフィンガーＺｆＱＱＲは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中の十分に定義された配列に結合する能力を有している。融合酵素の実施形態の１つでは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖に対してリボヌクレアーゼ活性を示すドメインは、触媒ドメイン（ｃａｔと呼ばれる）をコードするバチルス・ハロデュランス  ｒｎｈＡからの遺伝子のフラグメントである。それは１７５−５８８のヌクレオチドｒｎｈＡ遺伝子のフラグメントであり、バチルス・ハロデュランスからの天然タンパク質ＲＮａｓｅ  ＨＩの５９−１９６のアミノ酸残基の領域に対応する。天然の遺伝子から、ハイブリッド結合ドメイン（ＨＢＤ）をコードするフラグメントは、配列と無関係にＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを結合するその能力のゆえに、除去される。ＺｆＱＱＲを含む触媒ドメインの融合は、ｃａｔ−ＺｆＱＱＲと呼ばれた。操作した触媒ドメインは、基質結合領域に導入された３つのアミノ酸置換：Ｋ８１Ａ、Ｋ８９Ｅ、およびＫ１２３Ａを有する。置換は陽電気を帯びたリジンを含んでおり、それは既知の基質結合領域の近くに局在している。結合部位での置換は、酵素を不活性化するようには意図されていないが、それによって、酵素の基質結合が付加的なＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合ドメインの存在に依存するようになる。融合酵素の配列特異性を与えるドメインは、ジンクフィンガーＺｆＱＱＲである。融合酵素では、１９−３０３のヌクレオチドのジンクフィンガーＺｆＱＱＲをコードする遺伝子フラグメントが用いられ、それはタンパク質の７−１０１のアミノ酸残基の領域に対応する。さらに、融合酵素の領域間リンカー領域は、ＧＱおよびＧＧＫＫＱと呼ばれる２つの変異体を生成するために修飾された。ＧＱは、融合酵素の位置１３８−１４８のアミノ酸をコードするフラグメントを欠いたＺｆＱＱＲとの、Ｋ８１Ａ、Ｋ８９Ｅ、および、Ｋ１２３Ａでの置換を含む触媒ドメインの融合である。ＧＧＫＫＱは、融合酵素の位置１３８−１３９および１４１−１４６のアミノ酸をコードするフラグメントを欠いた、ＺｆＱＱＲを含むＫ８１Ａ、Ｋ８９Ｅ、およびＫ１２３Ａでの置換を含む触媒ドメインの融合である。生成したコンストラクトの記載は表１にまとめられる。
【００２３】
【表１】
0006022556.tif 000002
【００２４】
次の態様では、本発明は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合タンパク質またはそのドメインの基質優先性を決定する方法を提供する。そのような方法により、タンパク質またはそのドメインによって認識される、および／または、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中のタンパク質領域によって結合される、好ましい配列を決定することが可能となる。
【００２５】
本発明は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合タンパク質またはそのドメインの配列優先性を決定する方法を提供し、該方法は以下の工程を含む：
ａ）ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド基質のライブラリの混合物に、精製したタンパク質またはそのドメインを接触させる工程であって、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド基質は、中心部分、好ましくは９または１０のヌクレオチド位置に、無作為な配列を含み、フランキング配列は固定され、試験されるタンパク質またはそのドメインが、それに対する親和性を有している配列結合することを可能にする、工程、
ｂ）結合したＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含むタンパク質またはそのドメインの、レジン、好ましくはグルタチオンアガロースへの固定化によって、結合していないＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを分離する工程、
ｃ）結合していないハイブリッドを取り除く工程、
ｄ）好ましくはグルタチオンを含有する緩衝液を加えることによって、関連するＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドと一緒に、組換え型タンパク質を分離する工程、
ｅ）ＰＣＲ、好ましくはＲＴ−ＰＣＲを用いて、分離したハイブリッドを増幅する工程であって、増幅反応において、無作為化領域のフランキング配列上の既知の配列に相補的なプライマーが用いられ、プライマーの１つでのＰＣＲ反応中に、ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターの配列は、ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロの転写のための二本鎖ＤＮＡを得るために加えられる、工程、
ｆ）ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを得るために、ＲＮａｓｅＨ活性と、ＲＮＡ鋳型の３’末端に相補的なＤＮＡプライマーとを持っていない逆転写酵素を用いて、逆転写を行う工程を含み、工程ａ）乃至ｆ）は好ましくは繰り返される。
【００２６】
本方法の好ましい実施形態では、プロモータ配列は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ配列を含み、ＲＮＡポリメラーゼはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである。好ましくは、タンパク質またはそのドメインは、組換え型タンパク質または組み換え型ドメインである。タンパク質またはそのドメインは好ましくはジンクフィンガーを含む。好ましい実施形態では、タンパク質またはそのドメインは、ジンクフィンガードメインおよびＧＳＴの融合であり、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ：３７にコードされたジンクフィンガードメインおよびＧＳＴの融合である。好ましいタンパク質またはそのドメインは、ＲＮａｓｅ  ＨＩまたはその誘導体の融合であり、ＲＮａｓｅ  ＨＩは、バチルス・ハロデュランスからであり、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ：１で示されるｒｎｈＡ遺伝子のヌクレオチド１７５−５８８によってコードされたポリペプチドとジンクフィンガーを含む。ジンクフィンガーは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中の特定の配列に結合する能力を好ましくは有しており、好ましいジンクフィンガーは、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２で示される配列ＺｆＱＱＲの１９−３０３までのヌクレオチドによってコードされた配列のＺｆＱＱＲである。
【００２７】
さらに、本発明の態様は、以下の工程を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのライブラリを得る方法を提供している：
ａ）ＲＮＡＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータ配列を含む、不変の配列に隣接する、中央の位置に縮重配列を包含しているＤＮＡオリゴヌクレオチドのライブラリをＰＣＲ増幅する工程、
ｂ）鋳型として工程ａ）で得られた二本鎖ＤＮＡ上のＲＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡ鎖を合成する工程、
ｃ）ＲＮａｓｅＨ活性を持っていない逆転写酵素を用いて、工程ｂ）で得られたＲＮＡの３’末端にある不変な配列に相補的なプライマーの逆転写を行う工程であって、逆転写の間、ＲＮＡ鎖は分離されず、完全に相補的なＲＮＡ鎖とＤＮＡ鎖からなるハイブリッドが得られる、工程。好ましくは、そのような方法では、オリゴヌクレオチドは、無作為の９または１０のヌクレオチド位置を含む中央の位置に、縮重配列を含有する。さらにより好ましくは、プロモータ配列は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータ配列を含み、ＲＮＡポリメラーゼはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである。
【００２８】
本発明に記載されるように、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドにおける、配列特異的なＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合タンパク質によって認識される配列の全領域と、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合タンパク質またはそのドメインの基質優先性を決定するために、ＳＥＬＥＸ方法の修飾が開発され、それによって、タンパク質によって優先的に結合されたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド配列の選択のサイクルを繰り返すことが可能となる（図１０）。このプロセスでの新しい要素は、次のサイクルに使用されるために、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのライブラリの増幅と再現の方法である。それは、ＲＮＡポリメラーゼ、好ましくはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータ配列を含む不変な配列に隣接する中央の位置に縮重配列を含有するＤＮＡオリゴヌクレオチドのライブラリのＰＣＲ増幅を使用することを含んでいる。結果として生じる二本鎖ＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼ、好ましくはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いるＲＮＡ鎖の合成のための鋳型として使用される。一本鎖ＲＮＡのプールが得られ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのライブラリを得るために、逆転写用の鋳型として役立つ。逆転写酵素は、ＲＮＡの３’末端に存在する不変の配列に相補的なプライマーを伸ばす。リボヌクレアーゼＨ活性を除去した酵素（リボヌクレアーゼＨ活性を所有しない逆転写酵素）による逆転写の間、ＲＮＡ鎖は分離せず、完全に相補的ＲＮＡ鎖とＤＮＡ鎖からなるハイブリッドの生成を可能にする。鋳型ＲＮＡが配列の中央部で不均一であったため、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのライブラリはこのようして得られる。ＳＥＬＥＸ方法の開発された修飾の有効性は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドと結合するジンクフィンガーＺｆＱＱＲをリガンドとして用いて確認された。ＺＦＱＱＲが操作の結果得られ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＤＮＡ鎖中の５つの「ＧＧＧＧＡＡＧＡＡ−３」配列と結合する（Ｓｈｉ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ−ＲＮＡ  ｈｙｂｒｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  １９９５．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ｖｏｌ．  ２６８）。この実施例については、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼドメイン（ＧＳＴと呼ばれる）とのＺＦＱＱＲ融合が用いられた。
【００２９】
本明細書で引用される公開公報と参考文献は、引用により本明細書に完全に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
本発明をよりよく理解するために、本発明の実施形態のいくつかの例が図に示される。
【００３１】
【図１】ジンクフィンガーＺｆＱＱＲを含む遺伝子融合ｒｎｈＡ遺伝子の最終的なＤＮＡコンストラクトの調製、および、バチルス・ハロデュランス遺伝子配列からのＲＮａｓｅ  ＨＩ中での置換の調製において使用される、ＳＥＱ  ＩＤ：１１−２５のプライマーの配列を示す。
【図２】特異的な気質として消化アッセイで使用された、ジンクフィンガーＺｆＱＱＲのための結合部位を含有する、ＳＥＱ  ＩＤ：９（図２（Ａ）−ＲＮＡ鎖）およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０（図２（Ｂ）−ＤＮＡ鎖）で示されるＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの配列である。
【図３】ジンクフィンガーの結合部位を含む基質ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの切断と、マグネシウムイオンと亜鉛イオンの存在への切断の依存の結果として生じる消化産物を示す。レーン１−１４に示された消化反応は、以下に示されるように、０．０５μＭの放射能で標識化された基質、０．５μＭの標識化されていない基質、２５ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、異なる酵素のある状態またはない状態、および、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および／または２０μＭ  ＺｎＳＯ４の存在下で、３７°Ｃで３０分間行われた。レーン１：切断していない基質、レーン２：バチルス・ハロデュランスからの１２．５  ｎＭ  ＲＮａｓｅ  ＨＩ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０μＭ  ＺｎＳＯ４、レーン３：６２５ｎＭ  ｃａｔ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０μＭ  ＺｎＳＯ４、レーン４：５ｎＭ  ｃａｔ−ＺｆＱＱＲ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０μＭ  ＺｎＳＯ４、レーン５：２５ｎＭ  ｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０μＭ  ＺｎＳＯ４、レーン６：バチルス・ハロデュランスからの１２．５ｎＭ  ＲＮａｓｅ  ＨＩ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、レーン７：６２５ｎＭ  ｃａｔ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、レーン８：５ｎＭ  ｃａｔ−ＺｆＱＱＲ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、レーン９：２５ｎＭ  ｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、レーン１０：バチルス・ハロデュランスからの１２．５ｎＭ  ＲＮａｓｅ  ＨＩ、２０μＭ  ＺｎＳＯ４、レーン１１：６２５ｎＭ  ｃａｔ、２０μＭ  ＺｎＳＯ４、レーン１２：５ｎＭ  ｃａｔ−ＺｆＱＱＲ、２０μＭ  ＺｎＳＯ４、レーン１３：２５ｎＭ  ｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲ、２０μＭ  ＺｎＳＯ４、レーン１４：マーカーサイズ１０−１００ヌクレオチド一本鎖ＲＮＡの放射能で標識化したアイソトープ・リン３３（ＵＳＢ）（星印（＊）は独特の切断部位に印をつけた）
【図４】ジンクフィンガーの結合部位を含む基質ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの切断、および、マグネシウムイオンと亜鉛イオンの存在への、ｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲの変異体ＧＱによる切断の依存の結果生じる消化産物を示す。レーン１−１４に示された消化反応は、以下に示されるように、５０ｎＭのＧＱ変異体、０．０５μＭの放射能で標識化した基質、０．５μＭの標識化していない基質、２５ｍＭ  トリス（ｐＨ８．０）、２０μＭ  ＺｎＳＯ４、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、様々なＭｇＣｌ２濃度で３７°Ｃで３０分間、行われた。レーン１：切断していない基質、レーン２：０．０５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、レーン３：０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、レーン４：０．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、レーン５：０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、レーン６：１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、レーン７：２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、レーン８：５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、レーン９：１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、レーン１０：マーカーサイズ１０−１００ヌクレオチド一本鎖ＲＮＡの放射能で標識化したアイソトープ・リン３３（ＵＳＢ）。
【図５】ジンクフィンガーの結合部位を含む基質ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの切断、および、マグネシウムイオンと亜鉛イオンの存在への、ｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲの変異体ＧＧＫＫＱによる切断の依存から結果として生じる消化産物を示す。レーン１−１４に示された消化反応は、以下に示されるように、５０ｎＭ  ＧＧＫＫＱ変異体、０．０５μＭの放射能で標識化した基質、０．５μＭの標識化していない基質、２５ｍＭ  トリス（ｐＨ８．０）、２０μＭ  ＺｎＳＯ４、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、ＭｇＣｌ２の様々な濃度で３７°Ｃで３０分間、行われた。レーン１：切断されていない基質、レーン２：０．０５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、レーン３：０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、レーン４：０．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、レーン５：０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、レーン６：１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、レーン７：２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、レーン８：５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、レーン９：１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、レーン１０：マーカーサイズ１０−１００ヌクレオチド一本鎖ＲＮＡの放射能で標識化したアイソトープ・リン３３（ＵＳＢ）。
【図６】ジンクフィンガーＺｆＱＱＲの結合部位を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの基質鎖ＲＮＡ上のｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲ、ＧＱ変異体、および、ＧＧＫＫＱ変異体によって生成された切断部位のマッピングを示す。レーン１−１４に示された消化反応は、以下に示されるように、０．０５μＭの放射能で標識化された基質、０．５μＭの標識化されていない基質、２５ｍＭ  トリス（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、異なる酵素がある状態またはない状態でおよび、適切な濃度のＭｇＣｌ２および／または２０μＭ  ＺｎＳＯ４の存在下で、３７°Ｃで３０分間、行われた。レーン１：切断されていない基質、レーン２：３５ｎＭ  ｃａｔＡＥＡ−ＺＦＱＱＲ、２０μＭ  ＺｎＳＯ４、レーン３：５０ｎＭ  ＧＱ変異体、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０μＭ  ＺｎＳＯ４、レーン４：５０ｎＭ  ＧＧＫＫＱ変異体、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０μＭ  ＺｎＳＯ４、レーン５：ｓｓＲＮＡのリボヌクレアーゼＴ１切断、レーン６：ｓｓＲＮＡ基質のアルカリ性の加水分解。
【図７】配列の上の矢印によって示される、ｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲによるジンクフィンガーＺｆＱＱＲの結合部位を含む基質ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの切断位置を示し、大きな黒い矢印は主要な切断部位を示し、小さな矢印は追加部位（上鎖ＲＮＡ、下鎖ＤＮＡ、ボックスでマークしたＺｆＱＱＲのための結合部位）を示している。
【図８】配列の上の矢印によって示される、ｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲのＧＱ変異体によるジンクフィンガーＺｆＱＱＲのための結合部位を含む基質ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの切断位置を示し、大きな黒い矢印は主要な切断部位を示し、小さな矢印は追加部位（上鎖ＲＮＡ、下鎖ＤＮＡ、ボックスでマークされたＺｆＱＱＲのための結合部位）を示している。
【図９】配列の上の矢印によって示される、ｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲのＧＧＫＫＱ変異体によるジンクフィンガーＺｆＱＱＲのための結合部位を含む基質ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの切断位置を示し、大きな黒い矢印は主要な切断部位を示し、小さな矢印は追加部位（上鎖ＲＮＡ、下鎖ＤＮＡ、ボックスでマークしたＺｆＱＱＲのための結合部位）を示している。
【図１０】本発明によって修飾されるＳＥＬＥＸ手順の１つの回の異なる段階を表わす図を示している。
【図１１】バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロの転写のプロセス中に一本鎖ＲＮＡを得るためのＤＮＡオリゴヌクレオチド鋳型の配列を示す。鋳型Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２６）は、ジンクフィンガーＺｆＱＱＲのための結合部位を含んでいる。鋳型Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２７）、ジンクフィンガーＺｆＱＱＲのための結合部位を含んでおらず、制限酵素ＸｈｏＩのための独特の切断部位を有している。鋳型９Ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２８）は９つのヌクレオチド縮重領域（「Ｎ」とマークされた単一の縮重ヌクレオチド）を含む。
【図１２】ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを得るプロセスを示す。ＤＮＡフラグメントは、６Ｍの尿素を含む１５％変性ポリアクリルアミドゲル中で分離させた。５５のヌクレオチドの長いＤＮＡオリゴヌクレオチドの５’末端とプライマー２は、放射性同位元素リン３３で標識化された。レーン１：０．５ｐｍｏｌの標識化プライマー。レーン２：０．２５ｐｍｏｌの逆転写生成物、レーン３：０．２５ｐｍｏｌの５５  ｎｔ標識化されたＤＮＡオリゴヌクレオチド
【図１３】ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを得るプロセスを示す。ＤＮＡフラグメントは１５％の天然ポリアクリルアミドゲル中に分離させた。５５のヌクレオチドの長いＤＮＡオリゴヌクレオチドの５’末端とプライマー２は、放射性同位元素リン３３で標識化された。レーン１：０．５ｐｍｏｌ標識化プライマー、レーン２：０．２５ｐｍｏｌの逆転写生成物、レーン３：０．２５ｐｍｏｌ逆転写生成物の消化した５単位のリボヌクレアーゼＨ、レーン４：０．２５ｐｍｏｌ逆転写生成物の消化した１単位のリボヌクレアーゼＨ、レーン５：０．２５ｐｍｏｌの５５ｎｔの標識化されたＤＮＡオリゴヌクレオチド
【図１４】連続した回のＳＥＬＥＸ手順で、ジンクフィンガーＺｆＱＱＲのための結合部位を含む二本鎖ＤＮＡ（Ａ）と、ＺｆＱＱＲのための結合部位を含んでいない二本鎖ＤＮＡ（Ｂ）との間の割合の変化を例証する棒グラフを示す（「Ｏ」は、Ａ：Ｂが１：１００００の比率のハイブリッドの混合物で始まる入力を意味し、Ｉ−Ｖは連続する回の数である）。
【図１５】ＷｅｂＬｏｇｏを用いて、４０の配列に由来する配列ロゴを示している。
【図１６】ジンクフィンガーＺｆＱＱＲに一定のＫＤを決定するために用いられたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの配列を示し、１６Ａは文献に記載された結合部位を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであり、１６Ｂは５回のＳＥＬＥＸの後に共通配列を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドである。
【図１７】反応混合物中のジンクフィンガーＺｆＱＱＲの濃度に依存して、ニトロセルロースフィルター上で保持された放射能で標識化された基質の量の変動を表わすグラフを示す（パーセント結合として表される）。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下の実施例は、本発明を例証し、その特定の態様について説明するためにのみ提示され、本発明を限定するためではなく、したがって、天賦の請求項で定義されるその全範囲と同等にみなされてはならない。
【００３３】
以下の実施例において、特段示されていない限り、標準的な材料および方法が、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．  １９８９．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載されるように用いられ、あるいは、特定の材料および方法についてのメーカーの推薦に従って進められる。本明細書で使用されるように、特段指定のない限り、アミノ酸、および、ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドについて標準的な略語が用いられる。
【００３４】
＜実施例１＞バチルス・ハロデュランスからのｒｎｈＡ遺伝子フラグメントの発現ベクターｐＥＴ  ３０ｂへのクローン化
バチルス・ハロデュランスからのｒｎｈＡ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、ｒｎｈＡ  ＲＮａｓｅ  ＨＩ（遺伝子ＩＤ  ８９３８０１，ＢＨ０８６３）のＤＮＡ配列である）を保有するベクターｐＥＴ１５ａは私的なソースから得られた。ｃａｔ（触媒ドメイン）をコードする遺伝子のフラグメントは、鋳型としてｒｎｈＡ遺伝子を保有するｐＥＴ１５ａと、５０ｐｍｏｌの各プライマーＢｈｃａｔｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２）およびＢｈｃａｔｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１１）（図１参照）、および、１７５−５８８のヌクレオチドに対応するｒｎｈＡ遺伝子フラグメントをコードするＤＮＡを含む１Ｕ  Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）とで行われる標準的な条件下で、ＰＣＲ技術を使用することにより増幅され、ベクターＤＮＡ  ｐＥＴ  ３０ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）は、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で消化された。ＤＮＡを含有する反応混合物を、ＴＡＥ緩衝液中の０．７％アガロースゲル上で分離し、予想されるサイズ４３０ｂｐおよび５３１３ｂｐに対応するフラグメントをそれぞれ、再単離用のキット（Ｇｅｌ  ｏｕｔ，Ａ＆Ａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、ゲルから再単離した。その後、５０ｎｇの再単離したｒｎｈＡ遺伝子フラグメントと２５ｎｇの切断したベクターｐＥＴ  ３０ｂを、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で処理し、リガーゼを熱失活させた。その後、ライゲーション反応混合物を細菌細胞の形質転換に使用した。大腸菌の形質転換受容性のある細菌（Ｔｏｐ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を、ライゲーション反応混合物（５０μｌの細菌細胞当たり２０−２００ナノグラム）で形質転換した。３０μｇ／μｌｍｌのカナマイシンを補充したＬＢ−寒天プレート上で形質転換体を選択した。所望の組み換え型を含む形質転換体の選択は制限地図の分析に基づき、その後、サンプルを配列決定してコンストラクトの配列を確認した。
【００３５】
＜実施例２＞ジンクフィンガーＺｆＱＱＲをコードする遺伝子の発現ベクターｐＥＴ２８ｂへのクローン化
ジンクフィンガーＺｆＱＱＲをコードする遺伝子の合成は、Ｓｈｉ  Ｙ，  Ｂｅｒｇ  ＪＭ．  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ−ＲＮＡ  ｈｙｂｒｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９９５．  ｖｏｌ．  ２６８，  ２８２−２８４の記事からのアミノ酸配列に基づいて、Ｅｐｏｃｈ‘ｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅから注文された（ジンクフィンガーＺＦＱＱＲ遺伝子の合成されたＤＮＡの配列であるＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２を参照）。ＺｆＱＱＲをコードするＤＮＡと、ＤＮＡベクターｐＥＴ２８ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を、制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化した（酵素はＦｅｒｍｅｎｔａｓ社からのもので、反応は、メーカーの指示に従って緩衝液２Ｘ  Ｙｅｌｌｏｗ中で、３７°Ｃで１時間、１ｍｇのＤＮＡ当たり１つの酵素単位で行われた）。反応混合物をＴＡＥ緩衝液中の０．７％アガロースゲル上で分離し、実施例１のように処理した。その後、５０ナノグラムの再単離したＺｆＱＱＲ遺伝子と２５ナノグラムの消化したベクターｐＥＴ２８ｂを、室温で１時間、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ。メーカーによって供給された緩衝液中で反応を行なった）によってライゲートさせた。リガーゼを７５°Ｃで１０分間、インキュベーションによって熱失活させた。その後、実施例１のように細菌細胞に形質転換するためにライゲーション反応混合物を使用した。
【００３６】
＜実施例３＞ジンクフィンガーＺｆＱＱＲをコードする遺伝子の、バチルス・ハロデュランスｒｎｈＡからの遺伝子のフラグメントを含む発現ベクターｐＥＴ  ３０ｂへのクローン化
ベクターｐＥＴ２８ｂからのＺｆＱＱＲをコードする遺伝子のフラグメントを、ＰＣＲ技術によって増幅した。その反応は、鋳型としてＺｆＱＱＲ遺伝子と、５０ｐｍｏｌの各プライマーＢｈｚｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１３）およびＫｍｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１４）（図１参照）を含む１ＵのＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を保有するｐＥＴ２８ｂ上で行われた標準的な条件下で実施された。ベクターｐＥＴ３０ｂ中のＲＮａｓｅ  ＨＩの触媒ドメインをコードする遺伝子のフラグメントを、ＰＣＴ技術によって増幅した。その反応は、鋳型としてｃａｔ遺伝子と、５０ｐｍｏｌの各プライマーＫｍｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１４）およびＢｈｃａｔｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２（図１参照）を含む１ＵのＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を保有するｐＥＴ３０ｂ上で行われた標準的な条件下で実施された。精製されたＰＣＲ生成物を、バクテリオファージＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）でリン酸化した。両方の反応からのＤＮＡ（２０ナノグラム）を組み合わせ、ライゲートし、ライゲーション反応混合物を、実施例１のように、細菌細胞に形質転換した。
【００３７】
＜実施例４＞位置Ｋ８１Ａ、Ｋ８９Ｅ、およびＫ１２３Ａでアミノ酸置換を導入する融合酵素をコードする遺伝子の変異誘発
実施例３で生成されたフラグメントのライゲーションは、読み取り枠が当初、ｃａｔをコードする遺伝子の一部と末端でＺｆＱＱＲをコードする遺伝子フラグメントとを含んでいたコンストラクトを作成した。得られたＤＮＡコンストラクトは、タンパク質の位置８１、８９、および１２３でアミノ酸残基をコードするヌクレオチドにおいてＰＣＲ技術を用いて置換を導入するために鋳型として役立った。置換は段階的に導入され、最初は、残基８１（リジンからアラニンへの置換）および８９（グルタミン酸に対するリジンの置換）をコードする置換ヌクレオチドであり、そのようなコンストラクトを得た後にのみ、位置１２３（リジンからアラニンへの置換）の残基をコードするヌクレオチドを形質転換するために、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、鋳型としてｃａｔ−ＺｆＱＱＲ遺伝子と、５０ｐｍｏｌの各プライマーＫ８１Ａｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１７）、Ｋ８１Ａｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１６）、Ｋ８９Ｅｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１９）、Ｋ８９Ｅｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１８）、Ｋ１２３Ａｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２１）、および、Ｋ１２３Ａｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２０）を含む１ＵのＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を保有するｐＥＴ２８ｂ上で行われた標準的な条件下で実施された（図１参照）。
【００３８】
実施例１のように、精製されたＰＣＲ生成物を処理し、ライゲーション反応混合物を細菌細胞に形質転換した。ｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲをコードする遺伝子の最終的な配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３で示され、タンパク質配列の結果として生じるアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４で示される。
【００３９】
＜実施例５＞ドメイン間リンカー領域の長さを短くする、位置Ｋ８１Ａ、Ｋ８９Ｅ、およびＫ１２３Ａでのアミノ酸置換を含む融合酵素をコードする遺伝子の変異誘発
実施例４で生成されたコンストラクトは、末端でｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲをコードする読み取り枠を保有し、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３の遺伝子中のドメイン間リンカー４０９−４４９をコードする領域でＰＣＲ技術を用いて領域間リンカーを短くするための鋳型として役立った。ＰＣＲ反応は、鋳型としてｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲ遺伝子と、５０ｐｍｏｌの各プライマーｄｅｌ１１ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２２）およびｄｅｌ１１ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２３）（これらはＧＱと呼ばれる変異体を生成するために使用された）、あるいは、プライマーｄｅｌ５ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２４）およびｄｅｌ５ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２５）（これらはＧＧＫＫＱと呼ばれる変異体を生成するために使用された）をそれぞれ含む１ＵのＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を保有するｐＥＴ３０ｂ上で行われた標準的な条件下で実施された（プライマー配列については図１参照）。
【００４０】
実施例１のように、精製されたＰＣＲ生成物を処理し、ライゲーション反応混合物を細菌細胞に形質転換した。変異体ＧＱをコードする遺伝子の最終配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５で示される位置１３８−１４８のアミノ酸と、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６で示されるタンパク質配列の結果として生じるアミノ酸配列をコードするフラグメントによって短くされたドメイン間リンカーを含むｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲである。変異体ＧＧＫＫＱをコードする遺伝子の最終配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７で示される位置１３８−１３９のアミノ酸と、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８で示されるタンパク質配列の結果として生じるアミノ酸配列をコードするフラグメントによって短くされたドメイン間リンカーを含むｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲである。
【００４１】
＜実施例６＞イオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質の発現および精製
バチルス・ハロデュランスからの完全長のＲＮａｓｅ  ＨＩをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＥＴ１５ａ、ｃａｔをコードする遺伝子を含むｐＥＴ  ３０ｂ、ｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲをコードする遺伝子を含むｐＥＴ  ３０ｂ、および、変異体ＧＱをコードする遺伝子を含むｐＥＴ  ３０ｂ、および、変異体ＧＧＫＫＱをコードする遺伝子を含むｐＥＴ３０をそれぞれ、大腸菌株ＥＲ２５６６（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に形質転換した。ＩＰＴＧでタンパク質発現を誘発し、Ｎｉ−ＮＴＡレジン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で、標準的な手順に従って、タンパク質を精製した。
【００４２】
＜実施例７＞融合酵素のヌクレアーゼ活性アッセイ
バチルス・ハロデュランス、ｃａｔ、ｃａｔ−ＺｆＱＱＲ、および、ｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲからの完全長のＲＮａｓｅ  ＨＩの酵素活性および特異性に対する、反応におけるマグネシウムイオンと亜鉛イオンの存在の効果を試験した。活性アッセイは、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および／または２０μＭ  ＺｎＳＯ４の存在を含んでいた。基質ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖の５’末端を、放射性同位元素リン３３で標識化した。消化反応は０．０５μＭの放射性同位元素で標識化した基質と０．５μＭの標識化していない基質を含んでいた。
ＲＮＡ：
ＡＧＡＡＣＵＡＧＵＧＧＡＵＣＡＡＣＣＧＧＧＣＵＧＣＡＧＧＡＡＵＵＣＧＡＵＡＵＣＡＡＧＣＵＵＡＵＣＧＡＵＡＣＣＧＵＧＧＣＧＧＵＵＣＵＵＣＣＣＣＡＡＧＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９）
ＤＮＡ：
ＧＣＴＴＧＧＧＧＡＡＧＡＡＣＣＧＣＣＡＣＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＴＴＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９）
および、２５ｍＭ  トリス（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および／または、２０μＭ  ＺｎＳＯ４、２ｍＭ  ＤＴＴ。反応は以下のものを含んでいた：バチルス・ハロデュランスからの完全長の１２．５ｎＭのＲＮａｓｅ  ＨＩ、６２５ｎＭのｃａｔ、５ｎＭのｃａｔ−ＺｆＱＱＲ、または、２５ｎＭのｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲ。消化反応は３７°Ｃで行われ、５０％の最終濃度にフォルムアミドを加えることにより、３０分後には止まった。消化産物を、６Ｍの尿素を含有する１２％変性ポリアクリルアミドゲル中に分離させた（図３を参照）。ゲルを真空乾燥器で乾燥させ、Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｃｒｅｅｎｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に一晩中晒した。オーディオラジオグラム（ａｕｄｉｏｒａｄｉｏｇｒａｍ）をＴｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｓｃａｎｎｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でスキャンした。
【００４３】
２０μＭ  ＺｎＳＯ４の存在下、および、ＭｇＣｌ２の欠如下で、ｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲによる基質消化は、独特なサイズの生成物を生成する。そのような基質がバチルス・ハロデュランス、ｃａｔ、および、ｃａｔ−ＺｆＱＱＲからの完全長のＲＮａｓｅ  ＨＩによって消化されるときには、この場所での切断は生じない。
【００４４】
変異体ＧＱおよびＧＧＫＫＱによる基質切断の特異性に対するリンカー長さの減少の効果が測定された。条件は、反応中の亜鉛の存在下での様々なマグネシウムイオンの濃度を分析した。活性アッセイは、上記のように、０．０５ｍＭ−１０ｍＭの範囲のＭｇＣｌ２と、２０μＭ  ＺｎＳＯ４、および、緩衝液組成物の存在を含んでいた。基質ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖の５’末端を、放射性同位元素リン３３で標識化した。消化反応は、０．０５μＭの放射性同位元素で標識化された基質および０．５μＭの標識化されていない基質（図２）、２５ｍＭ  トリス（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および、２０μＭ  ＺｎＳＯ４、２ｍＭ  ＤＴＴを含んでいた。反応では、５０ｎＭの変異体ＧＱと５０ｎＭの変異体ＧＧＫＫＱを用いた。消化反応を上記のように行い、その結果を、ＧＱについては図４に、ＧＧＫＫＱについては図５に示した。リンカーのＧＱ変異体については、反応中のＭｇ２＋の最適な濃度は１ｍＭであり、ＧＧＫＫＱ変異体については、それは２ｍＭだった。
【００４５】
ｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲ、および、そのＧＱとＧＧＫＫＱの変異体によって生成されたジンクフィンガーＺｆＱＱＲのための結合部位を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド基質中の切断部位を正確に決定するために、分解物を含むポリアクリルアミドゲル中で切断産物を分離させ、１つのヌクレオチドによって異なるフラグメントの分離を可能にする。基質ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖の５’末端を、放射性同位元素リン３３で標識化した。消化反応は、０．０５μＭの放射性同位元素で標識化した基質と０．５μＭの標識化していない基質（図２を参照）、２５ｍＭ  トリス（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２０μＭ  ＺｎＳＯ４、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２（変異体ＧＱの場合）、および、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（変異体ＧＧＫＫＱの場合）、および、２ｍＭ  ＤＴＴを含んでいた。反応は、０．１μＭ  ｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲ、５０ｎＭの変異体ＧＱ、および、５０ｎＭの変異体ＧＧＫＫＱを含んでいた。消化反応は３７°Ｃで行われ、５０％の最終濃度にフォルムアミドを加えることにより、１時間後に止まった。Ａｍｂｉｏｎの推薦（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ）に従って、アルカリ性の加水分解によって、１つのヌクレオチドによって異なるフラグメントを含むサイズマーカーを得た。消化産物を、６Ｍの尿素（図６を参照）を含む１２％変性ポリアクリルアミドゲル中で分離させた。同定された配列長さの結果として生じるフラグメントを、基質の配列上でマッピングし、ｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲのための切断の主産物は５４のヌクレオチドの長さを有していることが分かった（図７を参照）。それは、ジンクフィンガーＺｆＱＱＲのための結合部位から離れた反対の鎖７ヌクレオチドにある。ＧＱとＧＧＫＫＱの場合、切断の主産物は５６のヌクレオチドの長さを有し（ＧＱに関しては図８を参照、ＧＧＫＫＱに関しては図９を参照）、それはジンクフィンガーＺｆＱＱＲのための結合部位から離れた反対の鎖５ヌクレオチドにある。
【００４６】
本発明の新しいリボヌクレアーゼは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖を切断し、ジンクフィンガーＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合ドメインを含むリボヌクレアーゼＨＩ（ＲＮａｓｅ  ＨＩ）の触媒ドメインを含むことができる融合タンパク質であり、ここで、ジンクフィンガー結合ドメインは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中の特定の配列に結合する能力を有している。好ましい得られた融合タンパク質は、ｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲ、ＧＱ、ＧＧＫＫＱである。
【００４７】
ヌクレアーゼドメインが、基質に結合後、基質の複数の場所で何度も切断する加工性の酵素であるため、ＲＮａｓｅ  ＨＩ領域とジンクフィンガーを融合させることにより、配列特異的な操作したＲＮａｓｅＨが得られ得るということは明白ではなかった。さらに、以前に記載されたように、ＲＮａｓｅ  ＨＩのｃａｔフラグメントの融合により配列特異的な酵素を得ることができないように、不変のＲＮａｓｅＨをジンクフィンガーへ融合しても配列特異的な酵素を得ることはできない。いかなる理論にも縛られることなく、これが可能な理由はほとんどない−ＲＮａｓｅ  ＨＩは、常に何度も切断する加工性の酵素であり、他のドメインと融合したジンクフィンガーは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中のその結合配列とは結合せず、切断条件は最適ではなく、ｃａｔドメインは、ジンクフィンガーの存在にもかかわらず基質と結合し、あるいは、これらすべてが重要だった。
【００４８】
さらに、基質結合領域の置換：ｃａｔのＫ８１Ａ、Ｋ８９Ｅ、およびＫ１２３Ａは、配列特異的な酵素につながるということが明らかではなかった。特効薬を入手できないことを説明する複数の仮説がある：ｃａｔ領域は亜鉛ドメインの存在にかかわらず基質と結合することができる、あるいは、結合領域の置換は、酵素の触媒作用に影響を与え、不活性な変異体を生成することができたかもしれなかった、あるいは、タンパク質中のアミノ酸の置換は、適切に折り畳むことができない、つまり、可溶性ではない変異体をもたらすことができる。ｃａｔドメインによる結合の不安定化により、結合部位から定義された距離で切断する酵素を得ることができるということを確信させる先行技術で利用可能なデータまたは提案はなかった。
【００４９】
＜実施例８＞基質ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの調製
３つの７８ヌクレオチドの長い一本鎖ＤＮＡを合成して、それぞれ鋳型Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２６）、鋳型Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２７）、および、鋳型９Ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２８）と名付けた。ＰＣＲ技術を用いて、二本鎖ＤＮＡを作成するために、これらのオリゴヌクレオチドを鋳型として使用した。その反応は、およそ０．１ｐｍｏｌの鋳型と、１０ｐｍｏｌの各プライマー１および２を含む１単位のＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の標準的な条件下で行われた：
プライマー１：
ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＴＣＡＣＴＡＡＧＣＡＴＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３３）
プライマー２：
ＧＡＧＡＴＣＴＡＧＡＣＧＧＡＡＣＡＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３４）
【００５０】
プライマー１および２をＰＣＲ反応中の二本鎖ＤＮＡの増幅に使用し、プライマー２は逆転写反応でも用いた。
【００５１】
反応条件：１分間に９８°Ｃの初期の変性、その後の１５秒間、９８°Ｃでの１５サイクルの変性、１５秒間７２°Ｃでの再生（各サイクルごとに１°Ｃずつ、５８°Ｃの最終的な温度までの温度の低下）、７２°Ｃでの２秒間の伸長、その後の９８°Ｃでの１５秒間の１０サイクル、５８°Ｃでの１５秒間の再生、および、７２°Ｃでの２秒間の伸張。反応混合物をフェノールで抽出し、採取した水相を、０．５Ｍの酢酸ナトリウムｐＨ４．５とエタノールで沈殿させた。沈殿物を空気乾燥させ、水中で再懸濁させた。転写ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７（Ａｍｂｉｏｎ）用のキットを使用することにより、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ配列を含む二本鎖ＤＮＡ鋳型上で、一本鎖ＲＮＡ転写物を得た。その反応は、２００−５００ナノグラムのＤＮＡを含む標準条件下で行われた。転写反応物を、６Ｍの尿素とＴＢＥ緩衝液を含む１５％変成ポリアクリルアミドゲル中で分離し、紫外線下で臭化エチジウムを用いて視覚化した。５５のヌクレオチドの長さに対応するバンドを切除し、ゲルからのＲＮＡの溶出を、Ｃｏｓｔａｒ  Ｓｐｉｎ  Ｘ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて標準手順によって行った。
【００５２】
ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を取り除いた逆転写酵素を用いて、一本鎖ＲＮＡの鋳型上でＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを得た。２００ｐｍｏｌのプライマー２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３４）と２００ｐｍｏｌの
一本鎖ＲＮＡを、７０°Ｃで２分間インキュベートし、その後、氷上で２分間インキュベートした。調製した鋳型を逆転写にさらした。その反応は、最終濃度の１ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、２００ｐｍｏｌのプライマーアニーリングした鋳型、４２°Ｃで２時間、逆転写酵素（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を含まない４０単位のＲｉｂｏＬｏｃｋ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）および４００単位のＲｅｖｅｒｔＡｉｄ  Ｈ  で、メーカーによって供給された緩衝液において４０μｌで行われた。反応混合物からのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを、標準手順でＧ−２５  ｒａｓｉｎ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用することにより、緩衝液とｄＮＴＰｓから分離した。
【００５３】
開発されたプロトコルが相補的なＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの形成につながることを確認するために、放射能で標識化した放射性同位元素リン３３プライマー２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３４）を用いて、逆転写を行った（上記のように）。適切なサイズのＤＮＡ（予想される長さは５５のヌクレオチドである）の合成は、結果として生じるＤＮＡのサイズと対照の５５のヌクレオチドの長いＤＮＡオリゴヌクレオチドサイズを比較することで確認された。サンプルを、ＴＢＥ緩衝液中に６Ｍの尿素を含有する１５％変成ポリアクリルアミドゲル中で分離した（図１２を参照）。ゲルを空気乾燥器で乾燥させ、Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｃｒｅｅｎｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に一晩中晒した。オーディオラジオグラムをＴｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｓｃａｎｎｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でスキャンした。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの作成は、リボヌクレアーゼＨによって逆転写の生成物を消化することによって、および、ＴＢＥ緩衝液中の１５％天然ポリアクリルアミドゲルにおける対照の５５ヌクレオチド長のＤＮＡオリゴヌクレオチドとの反応の生成物の遊走を比較することによって、確認された（図１３を参照）。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖の消化は、３７°Ｃで３０分間、１および５単位のＲＮａｓｅ  Ｈ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で、メーカーによって供給される緩衝液中で１０μｌで行われた。
【００５４】
＜実施例９＞ジンクフィンガーＺｆＱＱＲを含むＧＳＴ融合タンパク質のクローン化、発現、および、精製
ＧＳＴとのジンクフィンガードメインの融合を得るために、ＺＦＱＱＲをコードする遺伝子をクローン化し、発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を作った。ジンクフィンガーＺｆＱＱＲをコードする遺伝子の合成は、Ｓｈｉ  Ｙ，  Ｂｅｒｇ  ＪＭ．  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ−ＲＮＡ  ｈｙｂｒｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９９５．  ｖｏｌ．  ２６８，  ２８２−２８４の記事からアミノ酸配列に基づいて、Ｅｐｏｃｈ‘ｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから注文された。ＺｆＱＱＲをコードするＤＮＡをＰＣＲ技術を用いて増幅した。プライマーＺＦｆおよびＺＦｒを合成し、ＧＳＴドメインとジンクフィンガーＺｆＱＱＲをコードする遺伝子の融合のＤＮＡコンストラクトの調製に使用した。反応は、標準的な条件と、５０ｐｍｏｌの各プライマーＺＦｆおよびＺＦｒを含む１単位のＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で行われた：
ＺＦｆ：
ＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＡＣＣＣＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３５）
ＺＦｒ：
ＣＧＧＧＡＡＡＡＣＡＧＣＡＴＴＣＣＡＧＧＴＡＴＴＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３６）
【００５５】
ジンクフィンガーＺｆＱＱＲおよびベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１  ＤＮＡをコードするＤＮＡを、制限酵素ＳｍａＩおよびＸｈｏＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で消化した。ＳｍａＩ消化はメーカーの推薦に従って緩衝液１Ｘ  Ｙｅｌｌｏｗで行った。このあと、緩衝液を、反応中の最終濃度の２Ｘ  Ｙｅｌｌｏｗに加えた（３７°Ｃで１時間、１ｍｇのＤＮＡのための１単位の酵素単位ＸｈｏＩ）。反応は、ＴＡＥ緩衝液中の０．７％アガロースゲル上で分離し、予想されるサイズに対応するフラグメントを、アガロースゲル（Ｇｅｌ  ｏｕｔ，  Ａ＆Ａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）からの再単離用キットを用いて、ゲルから再単離した。その後、ジンクフィンガーＺｆＱＱＲをコードする５０ナノグラムの再単離したＤＮＡと、２５ナノグラムの切断ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１を、１時間室温で、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ。反応はメーカーから提供された緩衝液で行った）でライゲートした。リガーゼを１０分間７５°Ｃでインキュベートすることにより熱失活させた。その後、ライゲーション反応混合物は、細菌株大腸菌Ｔｏｐ１０  Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換するために使用された。形質転換体は、１００μｇ／ｍｌアンピシリンで選択された。所望の組み換え型を含む適切な形質転換体の選択は、制限地図の分析に基づき、その後、クローンを配列決定してコンストラクトの配列を確認した。
【００５６】
ジンクフィンガーＺｆＱＱＲをコードするプラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−１遺伝子を、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）：（Ｐｒｏｍｅｇａ）に形質変換させた。一晩培養した形質転換体は、２時間、３７°Ｃで、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体のＬＢに接種された。この後、ＩＰＴＧを加え（最終濃度１ｍＭ）、さらに５時間、２５°Ｃで振動させながら培養物をインキュベートした。誘導後、培養物を４°Ｃで１０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離機にかけ、２ｍｌのＳＴＥで洗浄し、１０分間、１０，０００ｇで遠心分離機にかけた。培養物から結果として生じるペレット剤を３５ｍｌのＰＢＳ中で再懸濁し、その後、細菌細胞は１３６０気圧下でフレンチプレス（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＬＴＤ）を介して単一の継代によって分離した。２０分間、４°Ｃの２００００ｇで超遠心分離機の遠心分離によって溶菌液を浄化した。標準的な手順によってグルタチオン・セファロース・レジン（ｒａｓｉｎ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でタンパク質を精製した。
【００５７】
＜実施例１０＞ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドへのタンパク質の結合、結合していないハイブリッドの分離、および、レジンからのタンパク質−ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド複合体の溶出
ジンクフィンガーＺｆＱＱＲに対するＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの結合反応は、４０μｌで行われ、２００ｐｍｏｌのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ジンクフィンガーＺｆＱＱＲを含む１ｐｍｏｌのＧＳＴ融合、２５ｍＭ  トリス  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２０μＭ  ＺｎＳＯ４、２ｍＭ  ＤＴＴを含んでいた。反応は３０分間室温で行われた。この後、反応物を７．５μｌのグルタチオン・セファロース・レジンに加え、振動させながら（１，４００ｒｐｍ）２２°ＣでＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  ｃｏｍｐａｃｔ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で３０分間インキュベートした。次の段階では、レジンを１００μｌの緩衝液Ｐ（２５ｍＭ  トリス（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２０μＭ  ＺｎＳＯ４、２ｍＭ  ＤＴＴ）で３回洗浄し、各回、サンプルを室温で２分間、１０００ｇで遠心分離にかけ、上澄みを取り除いた。次の工程は溶出であり、３０μｌの緩衝液Ｅと室温で１０分間のインキュベーションで２度繰り返した。各インキュベーションの後、サンプルを室温で２分間１０００ｇで遠心分離機にかけ、上澄みをチューブに移した。二本鎖ＤＮＡを得るために、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに関連するジンクフィンガーを含むＧＳＴ融合を含有する５μｌの溶出液を、ＰＣＲを用いて増幅にさらし、その後、ＲＮＡを転写し、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを実施例８のような逆転写によって合成した。得られたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドをＳＥＬＥＸの次のラウンドの出発物質であった。
【００５８】
＜実施例１１＞対照ＳＥＬＥＸ
対照のＳＥＬＥＸ方法は、ジンクフィンガーＺｆＱＱＲのための結合部位を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド（ハイブリッドＡ。鋳型Ａ  ＳＥＱ  ＩＤ：２６に形成される）と、そのような結合部位を有しておらず、その代わりにＸｈｏＩ制限部位を有しているハイブリッド（Ｂハイブリッド。鋳型Ｂ  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２７に形成される）の混合物上で行われた。５ラウンドのＳＥＬＥＸを、１：１００００の比率のハイブリッドＡ：Ｂの混合物からなる対照プール上で行った。２つの配列を区別するために、各ラウンド後の溶出液のＰＣＲ増幅に由来する１００ナノグラムのＤＮＡを、３７°Ｃで１６時間、２つの酵素単位ＸｈｏＩで消化した。消化産物を、ＴＢＥ緩衝液中の１５％天然ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ゲルを０．５μｇ／ｍｌの最終濃度の臭化エチジウム溶液中で２分間インキュベートした。バンドは、画像ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ  Ｆｌｕｏｒｏ−Ｓ（ＢｉｏＲａｄ）を電子保管するためのＣＣＤカメラを用いて、紫外線下で視覚化された。切断していないＤＮＡ（７８ｂｐ）と、消化産物（５５および２３の塩基対）に対応するバンドの強度は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて測定され、各ラウンドの後にＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの鋳型上で得られたＤＮＡの相対的な比率が計算された（図１４参照）。ＧＳＴとジンクフィンガーＺｆＱＱＲの融合を含む５ラウンドの選択の後、ＺｆＱＱＲのための結合部位を保有するＤＮＡとそのような配列のないＤＮＡとの比率は、１：１，７に変化した。このことは、ＳＥＬＥＸ手順を行うことによって、対照配列のプールが、ＺｆＱＱＲに特異的に結合された配列によって、８５００倍も濃縮されたことを意味している。
【００５９】
＜実施例１２＞
ＳＥＬＥＸライブラリＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド
次の段階では、中央のランダムな配列（鋳型９Ｎ上で生成される−ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２８）を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのライブラリは、ＳＥＬＥＸ手順を行うために、かつ、実施例１１のようにジンクフィンガーＺｆＱＱＲの配列優先性を決定するために使用された。選択されたハイブリッドの配列を決定するために、５ラウンドのＳＥＬＥＸ後に溶出液の鋳型上で得られた５００ナノグラムのＤＮＡ  ＰＣＲ生成物を、メーカーから提供された緩衝液中で５単位のＸｂａＩ酵素（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で消化した。消化産物を、ＴＢＥ緩衝液中の１５％の天然ポリアクリルアミドゲル上で分離した。４３の塩基対のフラグメント長さに対応するバンドを、標準手順に従ってゲルから取り除いて単離した。コンカテマーを得るために、１００ナノグラムの消化したＤＮＡフラグメントを、室温で３時間、メーカーから提供された緩衝液中のバクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）でライゲートした。リガーゼを１０分間７５°Ｃでインキュベートすることで熱失活させた。２００ナノグラムのＤＮＡプラスミドベクターｐＵＣ１８（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を、３７°Ｃで３時間、メーカーから提供された緩衝液中のＸｂａＩ酵素で消化させた。反応混合物は、ＴＡＥ中の０．７％アガロースゲルで分離し、予想されるサイズに対応するフラグメントは、アガロースゲルからの再単離用キット（Ｇｅｌ  ｏｕｔ，Ａ＆Ａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてゲルから再単離する。そのように調製したベクターおよびコンカテマーをライゲートし、その後、細菌株に形質転換した。所望の組み換え型を含む適切な形質転換体の選択はコロニーの色の分析に基づき、１２のクローンを配列決定し、表２に示されるようなＳＥＬＥＸ手順によって得られた合計４２のフラグメントを含むことが分かった。
【００６０】
【表２】
0006022556.tif 000003
ジンクフィンガーＺｆＱＱＲで行われた５ラウンドの改良されたＳＥＬＥＸ手順の最後にＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの鋳型で得られたＤＮＡを配列決定し、その後、９つのヌクレオチド縮重領域を含む配列のライブラリから獲得したＳＥＬＥＸ手順で得られた配列
【００６１】
これを根拠にして、ＺＦＱＱＲ結合共通配列５’−ＧＧＮＣＧＧＮＧＧＧ−３’（図１５）は、ＷｅｂＬｏｇｏ（Ｃｒｏｏｋｓ  ＧＥ，  Ｈｏｎ  Ｇ，  Ｃｈａｎｄｏｎｉａ  ＪＭ，  Ｂｒｅｎｎｅｒ  ＳＥ  ＷｅｂＬｏｇｏ：  Ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｌｏｇｏ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １４：１１８８−１１９０，  （２００４），  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ＴＤ，  Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ＲＭ．  １９９０．  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｏｇｏｓ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ｗａｙ  ｔｏ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８：６０９７−６１００）を用いて得られた。
【００６２】
＜実施例１３＞ＳＥＬＥＸ共通配列へのジンクフィンガーＺｆＱＱＲの結合
５ラウンドのＳＥＬＥＸの後に得られた共通配列がジンクフィンガーによって結合していることを確認するために、ニトロセルロースフィルター結合方法を用いて一定のＫＤを測定した。アッセイは、文献に記載の放射能で標識化された基質（ＬＤＮＡ、ＬＲＮＡ）と、共通配列（ＣＤＮＡ、ＣＲＮＡ）で行われた（図１６参照）。
ＬＤＮＡ：ＴＣＡＣＴＧＧＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＴＣＣＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２９）
ＬＲＮＡ：ＧＡＧＧＡＵＵＣＵＵＣＵＵＣＣＣＣＡＧＵＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３０）
ＣＤＮＡ：ＴＣＡＣＴＧＧＴＣＧＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３１）
ＣＲＮＡ：ＧＡＧＧＡＵＵＣＣＣＡＣＣＧＡＣＣＡＧＵＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３２）
【００６３】
結合反応は、２ｎＭの標識化基質、非特異性的な競合相手としての２μｇのポリｄＩ−ｄＣ、２５ｍＭ  トリス（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２０μＭ  ＺｎＳＯ４、２ｍＭ  ＤＴＴを含んでいた。結合反応物を室温で３０分間インキュベートし、その後、ニトロセルロースフィルターを介してすぐにろ過し、２５ｍＭ  トリス（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２０μＭ  ＺｎＳＯ４、２ｍＭ  ＤＴＴの８回分の反応緩衝液で洗浄した。放射能で標識化された基質の保留に由来する信号の強度の測定は、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｓｃａｎｎｅｒと、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  ソフトウェアを用いて、ニトロセルロースフィルターのオーディオラジオグラム上で行われた。ＫＤ結合定数を測定し、両方の基質に関して類似しており、  文献に記載された基質の結合について１８８±３８ｎＭ、および、ＳＥＬＥＸ共通配列について１５５±３２ｎＭであった（図１７）。
【００６４】
＜記載で特定した配列のリスト＞
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１−バチルス・ハロデュランス（完全長）からの遺伝子ｒｎｈＡリボヌクレアーゼＨＩ（遺伝子ＩＤ  ８９３８０１  ＢＨ０８６３）のＤＮＡ配列；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２−ジンクフィンガーＺｆＱＱＲのヌクレオチド配列；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３−ジンクフィンガーＺｆＱＱＲとの、置換Ｋ８１Ａ、Ｋ８９Ｅ、およびＫ１２３Ａを含む、バチルス・ハロデュランスからのリボヌクレアーゼＨＩのフラグメントを含有する酵素融合をコードする遺伝子のヌクレオチド配列（ｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲと呼ばれる）；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４−ジンクフィンガーＺｆＱＱＲとの、置換Ｋ８１Ａ、Ｋ８９Ｅ、Ｋ１２３Ａを含む、バチルス・ハロデュランスからのリボヌクレアーゼＨＩのフラグメントを含有する融合のアミノ酸配列（ｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲと呼ばれる）；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５−ｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲ（位置１３８−１４８のアミノ酸をコードするフラグメントによって短くされたジンクフィンガーＺｆＱＱＲドメイン間リンカーを含む、位置Ｋ８１Ａ、Ｋ８９Ｅ、およびＫ１２３Ａのタンパク質のアミノ酸配列における変化をもたらす置換を含む、バチルス・ハロデュランスからのリボヌクレアーゼＨＩのフラグメントを含有する酵素融合）のＧＱ変異体をコードする遺伝子のヌクレオチド配列（ＧＱと呼ばれる）
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６−ｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲのＧＱ変異体のアミノ酸配列（酵素融合）（ＧＱと呼ばれる）；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７−ｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲ（位置１３８−１３９および１４１−１４６のアミノ酸をコードするフラグメントによってドメイン間リンカーを含む、ジンクフィンガーＺｆＱＱＲを含む、位置Ｋ８１Ａ、Ｋ８９Ｅ、およびＫ１２３Ａでのタンパク質のアミノ酸配列における変化をもたらす置換を含むバチルス・ハロデュランスからのリボヌクレアーゼＨＩのフラグメントを含有する酵素融合）のＧＧＫＫＱ変異体のヌクレオチド配列（ＧＧＫＫＱと呼ばれる）；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８−酵素融合のＧＧＫＫＱ変異体のアミノ酸配列（ＧＧＫＫＱと呼ばれる）；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９−ＺｆＱＱＲのための結合配列を含む基質のＲＮＡ鎖；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０−ＺｆＱＱＲのための結合配列を含む基質のＤＮＡ鎖；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１１−Ｂｈｃａｔｆプライマーのヌクレオチド配列；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２−Ｂｈｃａｔｒプライマーのヌクレオチド配列；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１３−ＢｈＺｆプライマーのヌクレオチド配列；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１４−Ｋｍｆプライマーのヌクレオチド配列；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１５−Ｋｍｒプライマーのヌクレオチド配列；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１６−Ｋ８１Ａｒプライマーのヌクレオチド配列；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１７−Ｋ８１Ａｆプライマーのヌクレオチド配列；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１８−Ｋ８９Ｅｒプライマーのヌクレオチド配列；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１９−Ｋ８９Ｅｆプライマーのヌクレオチド配列；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２０−Ｋ１２３Ａｒプライマーのヌクレオチド配列；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２１−Ｋ１２３Ａｆプライマーのヌクレオチド配列；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２２−ｄｅｌ１１ｆプライマーのヌクレオチド配列；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２３−ｄｅｌ１１ｒプライマーのヌクレオチド配列；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２４−ｄｅｌ５ｆプライマーのヌクレオチド配列；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２５−ｄｅｌ５ｒプライマーのヌクレオチド配列；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２６−ＺｆＱＱＲのための結合部位を含むＳＥＬＥＸ方法の対照に使用された基質のＤＮＡ鎖の配列（鋳型Ａ）；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２７−ＺｆＱＱＲのための結合部位を有しておらず、その代わりにＸｈｏＩ制限部位を有する、ＳＥＬＥＸ方法の対照に使用された基質のＤＮＡ鎖の配列（鋳型Ｂ）；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２８−中央のノナヌクレオチドランダムな配列を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのライブラリの構造に使用された基質のＤＮＡ鎖の配列（鋳型９Ｎ）；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２９−ＫＤを決定するために使用されたＺｆＱＱＲ結合配列を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＤＮＡ鎖のヌクレオチド配列；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３０−ＫＤを決定するために使用されたＺｆＱＱＲ結合配列を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖のヌクレオチド配列；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３１−ＫＤを決定するために使用されたＳＥＬＥＸから推論される共通配列を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＤＮＡ鎖のヌクレオチド配列；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３２−ＫＤを決定するために使用されたＳＥＬＥＸから推論される共通配列を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖のヌクレオチド配列；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３３−プライマー１−ＰＣＲ反応における鋳型Ａ、Ｂ、および９ＮのＤＮＡの増幅に使用されたプライマー；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３４−プライマー２−ＰＣＲ反応における鋳型Ａ、Ｂ、および９ＮのＤＮＡの増幅に使用されたプライマー；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３５−プライマーＺＦｆ−ＧＳＴドメインをコードする融合遺伝子と、ジンクフィンガーＺｆ−ＱＱをコードする遺伝子のＤＮＡコンストラクトの調製のためにＰＣＲで使用されたプライマー；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３６−プライマーＺＦｒ−ＧＳＴドメインをコードする融合遺伝子と、ジンクフィンガーＺｆ−ＱＱをコードする遺伝子のＤＮＡコンストラクトの調製のためにＰＣＲで使用されたプライマー；
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３７−ＧＳＴドメインの融合をコードする遺伝子と、ジンクフィンガーＺｆＱＱＲをコードする遺伝子のヌクレオチド配列である（融合ＧＳＴ−ＺｆＱＱＲ）。
【００６５】
【化１】
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【００６６】
【化２】
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【００６７】
【化３】
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【００６８】
【化４】
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【００６９】
【化５】
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【００７０】
【化６】
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【００７１】
【化７】
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【００７２】
【化８】
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【００７３】
【化９】
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【００７４】
【化１０】
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【００７５】
【化１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１５】
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【配列表】
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