(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸管毒素原性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に特異的な殺菌活性を有する新規なバクテリオファージΦＣＪ１９（ＫＣＣＭ１１３６１Ｐ）。
【請求項２】
請求項１による前記バクテリオファージΦＣＪ１９（ＫＣＣＭ１１３６１Ｐ）を有効成分として含む腸管毒素原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用組成物。
【請求項３】
前記感染性疾病が大腸菌症である、請求項２に記載の腸管毒素原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用組成物。
【請求項４】
請求項１による前記バクテリオファージΦＣＪ１９（ＫＣＣＭ１１３６１Ｐ）を有効成分として含む抗生剤。
【請求項５】
請求項１による前記バクテリオファージΦＣＪ１９（ＫＣＣＭ１１３６１Ｐ）を有効成分として含む飼料添加剤又は飲用水添加剤。
【請求項６】
請求項１による前記バクテリオファージΦＣＪ１９（ＫＣＣＭ１１３６１Ｐ）を有効成分として含む消毒剤又は洗浄剤。
【請求項７】
請求項１による前記バクテリオファージΦＣＪ１９（ＫＣＣＭ１１３６１Ｐ）又は請求項２による前記組成物を、ヒトを除いた動物に投与する段階を含む腸管毒素原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療方法。
【請求項８】
前記感染性疾病は大腸菌症である、請求項７に記載の腸管毒素原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸管毒素原性大腸菌に特異的な殺菌活性を示す新規なバクテリオファージ及びこれを含む抗菌組成物に関する。また、本発明は、前記新規なバクテリオファージ又は前記抗菌組成物を用いて動物の疾病を予防又は治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、以下、「Ｅ．ｃｏｌｉ」とする）は、腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）や、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）に属するグラム陰性の短桿菌であって、哺乳動物を始めとする多様な動物の腸管内に存在する正常細菌叢のうち一つである。大腸菌は、ほとんどが非病原性で、日和見感染を誘発し得るが、一部の高病原性菌株は、ヒトを始めとした動物内で多様な腸疾患及び敗血症などを誘発するものと知られている。
【０００３】
大腸菌の種類としては、腸管毒素原性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ、ＥＴＥＣ）、腸管病原性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ、ＥＰＥＣ）、腸管出血性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ、ＥＨＥＣ）、腸管凝集性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏａｇｇｒｅｇａｔｉｖｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ、ＥＡＥＣ）、腸管侵入性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｃｉｖｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ、ＥＩＥＣ）、壊死性大腸菌（Ｎｅｃｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ、ＮＴＥＣ）などがあり、これらのうち、特に腸管毒素原性大腸菌は、養豚で大腸菌感染性疾病を誘発するものと知られている。
【０００４】
現在、養豚産業の大規模集団飼育の趨勢に伴い、豚の大腸菌症は、養豚場で最も頻繁且つ問題視されている疾病として台頭している（非特許文献１）。最近、韓国でも、豚の大腸菌症の発生が増加し、下痢による幼い豚の成長遅延及び斃死により飼育農家に経済的に大きな損失をもたらしている実情にある（非特許文献２）。
【０００５】
このような豚の大腸菌症を予防及び治療するために、従来は、豚に多くの抗生剤を使用してきたが、抗生剤を誤濫用する場合、豚に耐性を誘発したり、各抗生剤が豚の体内に残留する可能性があり、現在は、全世界的に抗生剤の投与に多くの制限を置いている（非特許文献３）。
【０００６】
一方、バクテリオファージ（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）は、特定の細菌に感染し、細菌の成長を抑制・阻害する細菌特異的ウイルスを意味する。バクテリオファージは、抗生剤に比べて宿主特異性に強いだけでなく、最近、抗生剤の使用に対する耐性菌出現の問題が深刻になるにつれて、その活用に対する関心が高まっている（非特許文献４及び５）。
【０００７】
そこで、世界各国でバクテリオファージに対する研究が活発に進められており、バクテリオファージに対する特許出願はもちろん、これを活用した組成物に対して米国食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、ＦＤＡ）の承認などを取得しようとする動きが増加している趨勢である。
【０００８】
バクテリオファージに関する先行技術として、特許文献１では、Ｅ．ｃｏｌｉ  ０１５７：Ｈ菌を統制するための７種のバクテリオファージについて開示しており、特許文献２では、黄色ブドウ球菌に特異的な殺菌活性を有するバクテリオファージについて開示している。また、特許文献３では、細菌細胞膜のペプチドグリカン構造物を特異的に破壊させるバクテリオファージ由来の溶菌タンパク質及びこれによる細菌破砕物について開示している。
【０００９】
しかし、前記のような各先行技術の存在にもかかわらず、養豚を始めとする畜産業において重要な問題となっている腸管毒素原性大腸菌による感染性疾病を予防及び／又は治療するためのバクテリオファージと関連する先行技術は依然として足りていない実情にあり、したがって、このようなバクテリオファージ及びその関連技術の開発が要求されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国登録特許第６，４８５，９０２号
【特許文献２】大韓民国登録特許公報Ｂ１第１０―０９１０９６１号
【特許文献３】大韓民国公開特許公報Ａ第１０―２００９―００２１４７５号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】パク・ヨンイル、養豚学、先進文化社、３５３―３５９、１９９８
【非特許文献２】ホン・ウィチョル、韓国壇国大学修士学位論文、早期離乳子豚における卵黄抗体の添加効果、２００１
【非特許文献３】Ｍａｓｏｎ  ＨＳ他、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、１３：３８８―３９２、１９９５
【非特許文献４】Ｃｉｓｌｏ、Ｍ他、Ａｒｃｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｅｘｐ．２：１７５―１８３、１９８７
【非特許文献５】キム・ソンフン他、バクテリオファージ、新たな代替抗生剤、ＢｉｏＷａｖｅ  Ｖｏｌ．７  Ｎｏ．１５、２００５、ＢＲＩＣ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者等は、抗生剤の使用による耐性菌の出現及び抗生剤の肉類内残留問題などを解決し、大腸菌感染性疾病を効率的に予防及び治療するために研究を重ねた結果、腸管毒素原性大腸菌に対して特異的な殺菌活性を有する新規なバクテリオファージΦＣＪ１９（ＫＣＣＭ１１３６１Ｐ）を自然界から分離するに至った。
【００１３】
また、前記新規なバクテリオファージの形態的、生化学的、遺伝的特性を同定し、前記バクテリオファージが耐酸性及び耐熱性などに優れることを確認し、これを活用した抗生剤、消毒剤、飼料添加剤、その他組成物を開発し、さらに、大腸菌感染性疾病の予防又は治療のための組成物及びこれを用いた疾病の予防又は治療方法を開発した。
【００１４】
本発明は、腸管毒素原性大腸菌に特異的な殺菌活性を有する新規なバクテリオファージΦＣＪ１９（ＫＣＣＭ１１３６１Ｐ）を提供することを目的とする。
【００１５】
また、本発明は、前記バクテリオファージΦＣＪ１９（ＫＣＣＭ１１３６１Ｐ）を有効成分として含む腸管毒素原性大腸菌による感染性疾病の予防及び／又は治療用組成物を提供することを目的とする。
【００１６】
また、本発明は、前記バクテリオファージΦＣＪ１９（ＫＣＣＭ１１３６１Ｐ）を有効成分として含む抗生剤、飼料添加剤、飲用水添加剤、消毒剤又は洗浄剤を提供することを目的とする。
【００１７】
また、本発明は、前記バクテリオファージΦＣＪ１９（ＫＣＣＭ１１３６１Ｐ）又はこれを有効成分として含む組成物を用いて、ヒトを除いた動物の腸管毒素原性大腸菌感染性疾病を予防及び／又は治療する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の一様態は、腸管毒素原性大腸菌に特異的な殺菌活性を有する新規なバクテリオファージΦＣＪ１９（ＫＣＣＭ１１３６１Ｐ）を提供する。
【００１９】
本発明の更に他の一様態によると、前記バクテリオファージΦＣＪ１９（ＫＣＣＭ１１３６１Ｐ）を有効成分として含む腸管毒素原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用組成物を提供する。
【００２０】
本発明の更に他の一様態によると、前記バクテリオファージΦＣＪ１９（ＫＣＣＭ１１３６１Ｐ）を有効成分として含む抗生剤、飼料添加剤、飲用水添加剤、消毒剤又は洗浄剤を提供する。
【００２１】
本発明の更に他の一様態によると、前記バクテリオファージΦＣＪ１９（ＫＣＣＭ１１３６１Ｐ）又はこれを有効成分として含む組成物を、ヒトを除いた動物に投与する段階を含む腸管毒素原性大腸菌による感染性疾病を予防又は治療する方法を提供する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明のバクテリオファージΦＣＪ１９（ＫＣＣＭ１１３６１Ｐ）は、腸管毒素原性大腸菌を特異的に死滅させるという効果を有する。
【００２３】
また、本発明の前記バクテリオファージΦＣＪ１９（ＫＣＣＭ１１３６１Ｐ）は、耐酸性及び耐熱性に優れ、多様な温度範囲及びｐＨ範囲で腸管毒素原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用物質として活用できるだけでなく、抗生剤、飼料添加剤、飲用水添加剤、消毒剤及び洗浄剤などとして活用できるという効果を有する。
【００２４】
また、本発明は、前記バクテリオファージΦＣＪ１９（ＫＣＣＭ１１３６１Ｐ）又はこれを有効成分として含む組成物を、ヒトを除いた動物に投与することによって、腸管毒素原性大腸菌による感染性疾病を予防又は治療できるという効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】新規なバクテリオファージΦＣＪ１９（ＫＣＣＭ１１３６１Ｐ）（以下、「ΦＣＪ１９」という）の電子顕微鏡写真である。
【図２】新規なバクテリオファージΦＣＪ１９のＰＦＧＥ結果を示した図である。
【図３】新規なバクテリオファージΦＣＪ１９のＳＤＳ―ＰＡＧＥ結果を示した図である。
【図４】新規なバクテリオファージΦＣＪ１９の耐酸性実験結果を示したグラフである。
【図５】新規なバクテリオファージΦＣＪ１９の耐熱性実験結果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明についてより詳細に説明する。本明細書に記載されていない内容は、当該技術分野又は類似分野で熟練した者であれば十分に認識して類推できるものであるので、それについての説明は省略する。
【００２７】
具体的に、本発明の一様態は、
腸管毒素原性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ＥＴＥＣ）に特異的な殺菌活性を有する新規なバクテリオファージΦＣＪ１９（ＫＣＣＭ１１３６１Ｐ）を提供する。
【００２８】
腸管毒素原性大腸菌は、グラム陰性の桿菌であって、ラクトース（Ｌａｃｔｏｓｅ）、フルクトース（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ）を分解することによって酸とガスを生成する好気性または通性嫌気性菌である。腸管毒素原性大腸菌は、普通の培地でもよく育ち、約７℃〜４８℃の温度で発育可能であり、発育最適温度は約３５℃〜３７℃である。また、腸管毒素原性大腸菌はｐＨ４．５〜ｐＨ９の範囲で発育可能である。
【００２９】
腸管毒素原性大腸菌は、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）と類似する毒素を生産するので、腸管毒素原性大腸菌に感染すると、コレラに感染した場合と類似する病症を示すようになる。前記生産される毒素は、大きく分けて、易熱性毒素（ｈｅａｔ―ｌａｂｉｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ、ＬＴ）及び耐熱性毒素（ｈｅａｔ―ｓｔａｂｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ、ＳＴ）の二つに区別される。前記易熱性毒素は、約６０℃で約１０分間加熱する場合に活性を失う毒素であって、前記耐熱性毒素は、約１００℃で約３０分間加熱しても活性を失わない耐性を示す毒素である。
【００３０】
腸管毒素原性大腸菌は、小腸の上部で増殖し、腸管毒素原性大腸菌の濃度が腸液の単位体積（１ｍｌ）当たり約１０７ｃｆｕ（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｕｎｉｔ）〜１０８ｃｆｕに到逹した場合、大腸菌症を始めとした大腸菌感染性疾病を誘発するようになる。
【００３１】
バクテリオファージ（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）は、特定の細菌に感染し、当該細菌の成長を抑制・阻害する細菌特異的ウイルスであって、単一あるいは二重鎖のＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）又はＲＮＡ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を遺伝物質として含むウイルスを意味する。
【００３２】
本発明のバクテリオファージΦＣＪ１９は、腸管毒素原性大腸菌を選択的に感染させる種特異性を有するバクテリオファージであって、正二十面体の頭部（ｉｓｏｍｅｔｒｉｃ  ｃａｐｓｉｄ）を有し、尾部（ｔａｉｌ）が観察されない構造（図１）を有する、形態学上、ポドウイルス（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するバクテリオファージである。
【００３３】
バクテリオファージΦＣＪ１９の塩基配列と別のバクテリオファージの解読塩基配列との相同性を比較した結果は、［表２］の通りである。バクテリオファージΦＣＪ１９の耐酸性においては、ｐＨ４．０からｐＨ１１．０まで活性を失わずに安定的であり（図４）、耐熱性においては、５３℃で２時間露出したときまでは活性を維持したが、６０℃では６０分露出時から時間の経過と共に活性が減少した（図５）。バクテリオファージΦＣＪ１９のＤＮＡ塩基配列は、配列リスト上の配列番号１と同じである。
【００３４】
前記バクテリオファージΦＣＪ１９は、本発明者等が新規に分離したバクテリオファージであって、２０１３年１月３０日付で韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ソウル市西大門区弘済１洞３６１―２２１）に寄託番号ＫＣＣＭ１１３６１Ｐで寄託した。
【００３５】
本発明の更に他の一様態によると、前記バクテリオファージΦＣＪ１９を有効成分として含む腸管毒素原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用組成物を提供する。
【００３６】
前記バクテリオファージΦＣＪ１９は、腸管毒素原性大腸菌を特異的に死滅させ得る抗菌活性を示すので、腸管毒素原性大腸菌による感染で誘発される各疾病を予防又は治療するための目的で用いることができる。前記バクテリオファージΦＣＪ１９を用いた腸管毒素原性大腸菌感染性疾病の例として、好ましくは、大腸菌症（Ｃｏｌｉｂａｃｉｌｌｏｓｉｓ）、より好ましくは、豚大腸菌症（Ｃｏｌｉｂａｃｉｌｌｏｓｉｓ  ｉｎ  ｐｉｇｓ）を挙げることができるが、これに制限されることはない。
【００３７】
前記「大腸菌症」とは、動物に病原性大腸菌が感染して発生する疾病を意味し、その症状として、敗血症、下痢（新生期下痢及び離乳後下痢）、毒血症（浮腫病及び脳脊髄血管症）などが表れる。このうち、敗血症は、生後２日〜３日以内の新生期に主に発生する急性の全身感染症であって、斃死率が非常に高い。下痢は、１週齢〜２週齢以内の哺乳期及び離乳直後に多発する腸管感染症であって、斃死または発育障害の原因となる。毒血症は、離乳後８週齢〜１２週齢の子豚で主に発病し、浮腫及び神経症状が表れてから急死を起こす場合が頻繁に発生する。
【００３８】
本発明で使用される「予防」という用語は、前記バクテリオファージΦＣＪ１９及び／又は前記バクテリオファージΦＣＪ１９を有効成分として含む組成物を、ヒトを除いた動物に提供し、該当疾病を抑制させたり、発病を遅延させる全ての行為を意味する。
【００３９】
本発明で使用される「治療」という用語は、前記バクテリオファージΦＣＪ１９及び／又は前記バクテリオファージΦＣＪ１９を有効成分として含む組成物を、ヒトを除いた動物に提供し、既に感染した該当疾病の症状を好転又は改善させる全ての行為を意味する。
【００４０】
本発明の前記腸管毒素原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用組成物は、前記バクテリオファージΦＣＪ１９を５×１０２ｐｆｕ／ｍｌ〜５×１０１２ｐｆｕ／ｍｌで含有することが好ましく、前記バクテリオファージΦＣＪ１９を１×１０６ｐｆｕ／ｍｌ〜１×１０１０ｐｆｕ／ｍｌで含有することがより好ましい。
【００４１】
本発明の前記腸管毒素原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができ、前記担体と共に製剤化され、食品、医薬品、飼料添加剤及び飲用水添加剤などとして提供され得る。本発明で使用される「薬学的に許容可能な担体」という用語は、生物体を刺激せず、投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体又は希釈剤を意味する。
【００４２】
本発明に使用可能な前記担体の種類は、特に制限されることはなく、当該技術分野で通常的に使用され、薬学的に許容される担体であればいずれも使用可能である。前記担体の非制限的な例としては、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールなどを挙げることができる。これらは、単独で使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。
【００４３】
また、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液及び／又は静菌剤などの他の通常の添加剤を添加して使用してもよく、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び／又は潤滑剤などを付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒又は錠剤などに製剤化して使用してもよい。
【００４４】
本発明の前記腸管毒素原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用組成物の投与方式は、特に制限されることはなく、当該技術分野で通常的に使用する方式に従うことができる。前記投与方式の非制限的な例として、組成物の経口投与又は非経口投与方式を挙げることができる。
【００４５】
前記経口投与用剤形の非制限的な例としては、トローチ剤（ｔｒｏｃｈｅｓ）、ローゼンジ（ｌｏｚｅｎｇｅ）、錠剤、水溶性懸濁液、油性懸濁液、調製粉末、顆粒、エマルジョン、ハードカプセル、ソフトカプセル、シロップ又はエリキシル剤などを挙げることができる。
【００４６】
本発明の組成物を錠剤又はカプセルなどの剤形に製剤化するために、ラクトース、サッカロース（Ｓａｃｃｈａｒｏｓｅ）、ソルビトール（Ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、マンニトール（Ｍａｎｎｉｔｏｌ）、澱粉、アミロペクチン（Ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ）、セルロース（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）又はゼラチン（Ｇｅｌａｔｉｎ）などの結合剤；第二リン酸カルシウム （ｄｉｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）などの賦形剤；コーンスターチ又はサツマイモ澱粉などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｓｔｅａｒａｔｅ）、ステアリン酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ  ｓｔｅａｒａｔｅ）、フマル酸ステアリルナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｔｅａｒｙｌ  ｆｕｍａｒａｔｅ）又はポリエチレングリコールワックス（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｗａｘ）などの潤滑油などを含んでもよく、カプセル剤形の場合、前記した物質以外にも、脂肪油などの液体担体などをさらに含有してもよい。
【００４７】
本発明の組成物の非経口投与方法としては、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与又は局部投与などを用いてもよく、前記組成物を疾患部位に塗布又は噴霧する方法を用いてもよいが、これらに制限されることはない。
【００４８】
前記非経口投与のための剤形は、例えば、皮下注射、静脈注射又は筋肉内注射などの注射用形態；坐剤注入方式；又は呼吸器を通じて吸入を可能にするエアロゾル剤などのスプレー用に製剤化してもよいが、これに制限されることはない。前記注射用剤形に製剤化するためには、本発明の組成物を安定剤又は緩衝剤と共に水で混合することによって溶液又は懸濁液に製造し、これをアンプル（ａｍｐｏｕｌｅ）又はバイアル（ｖｉａｌ）の単位投与用に製剤化してもよい。前記エアロゾル剤などのスプレー用に剤形化する場合、水分散された濃縮物又は湿潤粉末が分散するように推進剤などが添加剤と共に配合されてもよい。
【００４９】
本発明の前記腸管毒素原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用組成物の適切な塗布、噴霧又は投与量は、前記組成物の製剤化方法、投与方式、投与時間及び／又は投与経路はもちろん、投与対象となる動物の年齢、体重、性別、疾病症状の程度、摂取する食物、排泄速度などの各要因によって多様化することができ、通常、熟練した獣医であれば、目的とする治療に効果的な投与量を容易に決定して処方することができる。
【００５０】
本発明の更に他の一様態によると、前記バクテリオファージΦＣＪ１９を有効成分として含む抗生剤を提供する。
【００５１】
本発明に使用される「抗生剤」という用語は、薬剤の形態でヒトを含む動物に提供され、菌を死滅させ得る効能を有する製剤を意味し、防腐剤、殺菌剤及び抗菌剤を総称する概念に該当する。
【００５２】
本発明の前記バクテリオファージΦＣＪ１９を有効成分として含む抗生剤は、従来の抗生剤に比べて腸管毒素原性大腸菌に対する特異性が非常に高いので、益菌は死滅させず、特定の病原菌のみを死滅させることができ、薬物耐性を誘導しないので、従来の抗生剤に比べて製品寿命が延長された新規抗生剤として提供できるという利点を有する。
【００５３】
本発明の更に他の一様態によると、前記バクテリオファージΦＣＪ１９を有効成分として含む飼料添加剤及び飲用水添加剤を提供する。
【００５４】
本発明の前記飼料添加剤又は飲用水添加剤は、前記バクテリオファージΦＣＪ１９又はこれを含む組成物を飼料添加剤又は飲用水添加剤の形態で別途製造し、これを飼料又は飲用水に混合させる方式で使用してもよく、前記バクテリオファージΦＣＪ１９又はこれを含む組成物を飼料又は飲用水の製造時に直接添加する方式で使用してもよい。
【００５５】
本発明の前記飼料添加剤又は飲用水添加剤として使用される前記バクテリオファージΦＣＪ１９又は前記バクテリオファージΦＣＪ１９を含む組成物は、液状又は乾燥状態であってもよく、乾燥した粉末の形態であることが好ましい。
【００５６】
本発明の前記飼料添加剤又は飲用水添加剤を乾燥した粉末の形態で製造するための乾燥方法は、特に制限されることはなく、当該技術分野で通常的に使用する方法に従うことができる。前記乾燥方法の非制限的な例としては、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥などを挙げることができる。これらは、単独で使用されてもよく、２種以上の方法を共に用いる方式で行われてもよい。
【００５７】
本発明の前記飼料添加剤又は飲用水添加剤には、非病原性の他の微生物がさらに添加されてもよい。前記添加され得る微生物の非制限的な例としては、タンパク質分解酵素、脂質分解酵素及び／又は糖転移酵素を生産できるバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの枯草菌；牛の胃などの嫌気的条件で生理的活性及び有機物分解能を有するラクトバチルス菌株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）；家畜の体重を増加させ、牛乳の産乳量を増加させ、飼料の消化吸収率を高める効果を有するアスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）などの糸状菌；及びサッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母からなる群を挙げることができる。これらは、単独で使用されてもよく、２種以上を混合して使用されてもよい。
【００５８】
本発明の前記バクテリオファージΦＣＪ１９を有効成分として含む飼料添加剤又は飲用水添加剤は、必要に応じてその他添加剤をさらに含んでもよい。前記使用可能な添加剤の非制限的な例としては、飼料又は飲用水の品質低下を防止するために添加する結着剤、乳化剤、保存剤など；飼料又は飲用水の効用増大のために添加するアミノ酸剤、ビタミン剤、酵素剤、生菌剤、香味剤、非タンパク質態窒素化合物、ケイ酸塩剤、緩衝剤、着色剤、抽出剤又はオリゴ糖などがあり、その他に、飼料混合剤などをさらに含んでもよい。これらは、単独で使用されてもよく、２種以上が共に添加されてもよい。
【００５９】
本発明の前記飼料添加剤は、飼料１００重量部に対して、０．０５重量部〜１０重量部で含有されることが好ましく、０．１重量部〜２重量部で含有されることがより好ましい。本発明の前記飲用水添加剤は、飲用水１００重量部に対して、O．０００１重量部〜０．０１重量部で含有されることが好ましく、０．００１重量部〜０．００５重量部で含有されることがより好ましい。前記範囲内で、腸管毒素原性大腸菌に対するバクテリオファージΦＣＪ１９の活性が十分に発揮されるという利点がある。
【００６０】
本発明の更に他の一様態によると、前記バクテリオファージΦＣＪ１９を有効成分として含む飼料添加剤又は飲用水添加剤を添加したり、前記バクテリオファージΦＣＪ１９を直接添加することによって製造された飼料又は飲用水を提供する。
【００６１】
本発明で使用される飼料は、特に制限されることはなく、当該技術分野で通常的に使用される飼料であってもよい。前記飼料の非制限的な例としては、穀物類、根果類、食品加工副産物類、藻類、繊維質類、製薬副産物類、油脂類、澱粉類、粕類又は穀物副産物類などの植物性飼料；タンパク質類、無機物類、油脂類、鉱物性類、単細胞タンパク質類、動物性プランクトン類又は食物などの動物性飼料を挙げることができる。これらは、単独で使用されてもよく、２種以上を混合して使用されてもよい。
【００６２】
本発明で使用される飲用水は、特に制限されることはなく、当該技術分野で通常的に使用される飲用水であってもよい。
【００６３】
本発明の更に他の一様態によると、前記バクテリオファージΦＣＪ１９を有効成分として含む消毒剤又は洗浄剤を提供する。前記消毒剤又は洗浄剤の剤形は、特に制限されることはなく、当該技術分野で知られている剤形に製造して使用してもよい。
【００６４】
前記消毒剤は、腸管毒素原性大腸菌を除去するために散布されてもよく、動物の活動領域、屠殺場、斃死地域、調理場所又は調理設備などに散布されてもよいが、これに制限されることはない。
【００６５】
前記洗浄剤は、腸管毒素原性大腸菌に露出したり、露出する可能性がある動物の皮膚表面又は身体の各部位などを洗浄する用途で使用されてもよいが、これに制限されることはない。
【００６６】
本発明の更に他の一様態によると、前記バクテリオファージΦＣＪ１９又は前記バクテリオファージΦＣＪ１９を有効成分として含む組成物を用いて腸管毒素原性大腸菌による感染性疾病を予防又は治療する方法を提供する。
【００６７】
本発明の前記予防又は治療方法は、具体的に、腸管毒素原性大腸菌によって感染したり、感染する危険があるヒトを除いた対象体に、前記バクテリオファージΦＣＪ１９又は前記バクテリオファージΦＣＪ１９を有効成分として含む組成物を薬学的に有効な量で投与する段階を含む。前記バクテリオファージΦＣＪ１９又はこれを含む組成物の適切な１日の総使用量は、正しい医学的判断範囲内で処置医によって決定することができ、これは、当該技術分野の通常の知識を有する者にとって自明な事項である。前記ヒトを除いた対象体は、腸管毒素原性大腸菌に感染したり、感染する危険がある豚である。
【００６８】
特定の動物に対する前記バクテリオファージΦＣＪ１９又は前記バクテリオファージΦＣＪ１９を有効成分として含む組成物の具体的な薬学的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、該当個体の年齢、体重、一般的な健康状態、性別又は食餌はもちろん、前記バクテリオファージΦＣＪ１９又はこれを含む組成物の投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間などを考慮して決定することができ、同時又は異時に共に使用される薬物のその他組成物の成分などを始めとした多くの因子、及び医薬分野でよく知られている類似因子によって多様化することができる。
【００６９】
本発明の前記バクテリオファージΦＣＪ１９又は前記バクテリオファージΦＣＪ１９を有効成分として含む組成物は、薬学的製剤の形態で動物に噴霧式鼻腔投与してもよく、動物の飼料又は飲用水に直接添加し、これを摂食させる方式で投与してもよく、飼料添加剤又は飲用水添加剤の形態で飼料又は飲用水に混合して投与してもよい。
【００７０】
本発明の前記バクテリオファージΦＣＪ１９又は前記バクテリオファージΦＣＪ１９を有効成分として含む組成物の投与経路及び投与方式は、特に制限されることはなく、目的とする該当組織に前記バクテリオファージΦＣＪ１９又はこれを含む組成物が到逹し得る限り、任意の投与経路及び投与方式に従うことができる。すなわち、前記バクテリオファージΦＣＪ１９又は前記バクテリオファージΦＣＪ１９を有効成分として含む組成物は、経口又は非経口の多様な経路を介して投与されてもよく、その投与経路の非制限的な例としては、口腔、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、鼻腔内又は吸入などを挙げることができる。
【００７１】
以下では、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。ただし、これら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されることはない。
【００７２】
［実施例１］腸管毒素原性大腸菌に感染するバクテリオファージの分離
【００７３】
＜実施例１―１＞
【００７４】
バクテリオファージのスクリーニング及び単一バクテリオファージの分離
【００７５】
韓国・忠清道洪城郡広川地域のサンファ原種農場地域の養豚糞便及び環境サンプルから収得した試料５０ｍｌを４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、その上澄液を０．４５μｍのフィルターでろ過することによって試料液を準備し、これを用いてソフトアガーオーバーレイ（ｓｏｆｔ  ａｇａｒ  ｏｖｅｒｌａｙ）方法を行った。前記ソフトアガーオーバーレイ方法とは、トップアガー（ｔｏｐ―ａｇａｒ、０．７％の寒天を用いて固体培地上に付けること）で成長する宿主細胞を用いてバクテリオファージの溶菌を観察する方法をいう。
【００７６】
具体的に、韓国ソウル大学獣医学科獣医伝染病学室で分離した腸管毒素原性大腸菌（ＳＮＵＪＧ２８０）振盪培養液（ＯＤ６００＝２）１５０μｌと１０×ＬＢ培地（トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｎｅ）、１０ｇ／ｌ；酵母抽出物、５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ、１０ｇ／ｌ）２ｍｌに前記試料ろ過液１８ｍｌを混合し、これを３０℃で１８時間培養した後、前記培養液を４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上澄液を０．４５μｍのフィルターを用いてろ過した。その次に、ＬＢ平板培地上に０．７％（ｗ／ｖ）の寒天３ｍｌと腸管毒素原性大腸菌（ＳＮＵＪＧ２８０）振盪培養液（ＯＤ６００＝２）１５０μｌとの混合液を注いで固めた後、その上に前記試料液１０μｌを滴下し、３０℃で１８時間培養することによって溶菌斑の形成を確認した。
【００７７】
一つの溶菌斑には一種類のバクテリオファージが存在すると知られているので、前記形成された溶菌斑から単一バクテリオファージを分離しようとした。具体的に、前記溶菌斑を４００μｌのＳＭ溶液（ＮａＣｌ、５．８ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ、２ｇ／ｌ；１Ｍ  Ｔｒｉｓ―Ｃｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍｌ）に加え、４時間放置することによってバクテリオファージ溶液を収得した。続いて、バクテリオファージ溶液１００μｌを０．７％（ｗ／ｖ）の寒天５ｍｌ及び腸管毒素原性大腸菌（ＳＮＵＪＧ２８０）振盪培養液（ＯＤ６００＝２）１５０μｌと混合し、１５０ｍｍ直径のＬＢ平板培地を用いたソフトアガーオーバーレイを行い、完全に溶菌されるまで培養した。培養が終了した後、前記ＬＢ平板培地に５ｍｌのＳＭ溶液を加え、室温で４時間放置することによってバクテリオファージ溶液を収得した。
【００７８】
前記溶液を回収し、１％（ｖ／ｖ）のクロロホルムを加えた後、１０分間混合し、４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行うことによって上澄液を収得し、前記上澄液を０．４５μｍのフィルターでろ過することによって最終試料を収得した。
【００７９】
＜実施例１―２＞
【００８０】
バクテリオファージの大量培養及び精製
【００８１】
前記実施例１―１で収得したバクテリオファージを腸管毒素原性大腸菌（ＳＮＵＪＧ２８０）を用いて大量に培養し、これからバクテリオファージを精製した。
【００８２】
具体的に、腸管毒素原性大腸菌（ＳＮＵＪＧ２８０）を振盪培養し、１．５×１０１０ｃｆｕになるように株分けし、４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、これを４ｍｌのＳＭ溶液に再浮遊させた。これにバクテリオファージを１．５×１０６ｐｆｕで接種し、ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）＝０．０００１と滴定した後、常温で２０分間定置させた。続いて、これを１５０ｍｌのＬＢ培地に接種し、３０℃で５時間培養した。
【００８３】
培養が終了した後、最終体積の１％（ｖ／ｖ）になるようにクロロホルムを添加して２０分間撹拌し、制限酵素であるＤＮａｓｅ  ＩとＲＮａｓｅ  Ａをそれぞれ最終濃度が１μｇ／ｍｌになるように添加し、３０℃で３０分間定置させた。その次に、最終濃度がそれぞれ１Ｍと１０％（ｗ／ｖ）になるようにＮａＣｌとポリエチレングリコールを加え、４℃で３時間さらに定置させ、４℃で１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行うことによって沈殿物を収得した。
【００８４】
前記収得した沈殿物を５ｍｌのＳＭ溶液に懸濁させ、２０分間室温で定置させた後、１ｍｌのクロロホルムを加えて撹拌し、４℃で４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行うことによって上澄液を収得した。前記上澄液を０．４５μｍのフィルターでろ過した後、グリセロール密度勾配法（密度：４０％、５％のグリセロール）を用いた超遠心分離（３５，０００ｒｐｍ、１時間、４℃）を行い、バクテリオファージを精製した。
【００８５】
本発明者は、養豚糞から試料を採取し、腸管毒素原性大腸菌に対する特異的殺菌活性を有する前記バクテリオファージを「Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ΦＣＪ１９」と命名し、２０１３年１月３０日に韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ソウル市西大門区弘済１洞３６１―２２１）に寄託番号第ＫＣＣＭ１１３６１Ｐ号で寄託した。
【００８６】
＜実施例２＞
【００８７】
ΦＣＪ１９の大腸菌感染性の比較
【００８８】
前記実施例１で精製したバクテリオファージΦＣＪ１９が腸管毒素原性大腸菌（ＳＮＵＪＧ２８０）以外の他の大腸菌に対しても溶菌活性を示すか否かを確認するために、交差感染を行った。
【００８９】
具体的に、２種の腸管毒素原性大腸菌（ＳＮＵＪＧ２８０及びＣＡＮＲＯ８（カナダのゲルフ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｕｅｌｐｈ）から入手））と１２種の非病原性大腸菌（ＭＣ４１００、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、２６１６、２８１、１９１７、ＤＨ５ａ、ＧＭ２９２９、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）、Ｗ３１１０、Ｋ１２Ｇ、０１２２ΔＬＴ）をそれぞれ培養することによって培養液を収得し、前記それぞれの培養液と前記精製したバクテリオファージΦＣＪ１９を用いたソフトアガーオーバレイ方法を行い、溶菌斑の形成有無を確認した。
【００９０】
前記結果は、下記の表１に示す。
【００９１】
【表１】
0005970138.tif 000002
【００９２】
前記表１に示したように、実施例１で精製したバクテリオファージΦＣＪ１９は、非病原性大腸菌において７種（ＭＣ４１００、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、ＧＭ２９２９、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）、Ｗ３１１０、及び０１２２ΔＬＴ）に対して溶菌活性を示し、残りの５種（２６１６、２８１、１９１７、ＤＨ５ａ、及びＫ１２Ｇ）に対しては溶菌活性を示さないことを確認することができた。
【００９３】
＜実施例３＞
【００９４】
ΦＣＪ１９の形態観察
【００９５】
前記実施例１で精製したバクテリオファージΦＣＪ１９を０．０１％のゼラチン溶液で希釈し、２．５％のグルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）溶液で固定した。これを炭素コーティングされた雲母板（ｃａｒｂｏｎ―ｃｏａｔｅｄ  ｍｉｃａ  ｐｌａｔｅ（ｃａ．２．５ｍｍ×２．５ｍｍ））に滴下して１０分間適応させた後、滅菌蒸留水で洗浄した。炭素被膜（ｃａｒｂｏｎ  ｆｉｌｍ）を銅グリッド（ｃｏｐｐｅｒ  ｇｒｉｄ）上に取り付け、２％の酢酸ウラニル（ｕｒａｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）で３０秒〜６０秒間染色し、乾燥を行った後、透過電子顕微鏡（ＪＥＭ―１０１１、８０ｋＶ、倍率×１２０，０００〜×２００，０００）で検鏡した（図１）。
【００９６】
図１は、バクテリオファージΦＣＪ１９の電子顕微鏡写真を示した図で、形態学上、正二十面体の頭部を有し、尾部を有さない形態型を示すことから、ポドウイルスに属することが分かった。
【００９７】
＜実施例４＞
【００９８】
ΦＣＪ１９の全体のゲノムＤＮＡのサイズ分析
【００９９】
前記実施例１で精製したバクテリオファージΦＣＪ１９からゲノムＤＮＡを抽出した。
【０１００】
具体的に、精製されたバクテリオファージΦＣＪ１９培養液に２０ｍＭのＥＤＴＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、５０μｇ／ｍｌのタンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ）、及び０．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）を加えて５０℃で１時間定置し、同一の体積のフェノール（ｐＨ８．０）を加えて撹拌した後、室温で１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行うことによって上澄液を収得した。
【０１０１】
前記上澄液を同一の体積のＰＣ（フェノール：クロロホルム＝１：１）と混合し、室温で１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行うことによって上澄液を収得した。前記上澄液を同一の体積のクロロホルムと混合し、室温で１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、その上澄液を収得した。前記上澄液に３Ｍの酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）を全体体積の１０％（ｖ／ｖ）になるように加えて混合し、２倍体積の冷たい９５％のエタノールを加えて混合した後、−２０℃で１時間定置させた。続いて、０℃で１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離を行った後、上澄液を除去することによって沈殿物を収得した後、これに５０μｌのＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ―ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加えて溶解した。前記で抽出されたＤＮＡを１０倍希釈し、ＯＤ２６０で吸光度を測定することによって濃度を測定した。
【０１０２】
その次に、１μｇのＤＮＡを１％のＰＦＧＥ（ｐｕｌｓｅ―ｆｉｅｌｄ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）アガロースゲルにローディングし、バイオ・ラッド（ＢＩＯＲＡＤ）ＰＦＧＥシステム７番プログラム（サイズ範囲２５ｋｂ〜１００ｋｂ；スイッチタイムランプ（ｓｗｉｔｃｈ  ｔｉｍｅ  ｒａｍｐ）０．４秒〜２．０秒、線形（ｌｉｎｅａｒ  ｓｈａｐｅ）；順方向電圧（ｆｏｒｗａｒｄ  ｖｏｌｔａｇｅ）１８０Ｖ；逆方向電圧（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｖｏｌｔａｇｅ）１２０Ｖ）を用いて常温で２０時間展開した（図２）。
【０１０３】
図２は、バクテリオファージΦＣＪ１９のゲノムＤＮＡの電気泳動写真であって、バクテリオファージΦＣＪ１９のゲノムＤＮＡは、約５４ｋｂのサイズを示すことを確認することができた。図２において、Ｍは、サイズ測定の基準になるＤＮＡである。
【０１０４】
＜実施例５＞
【０１０５】
ΦＣＪ１９のタンパク質パターン分析
【０１０６】
１０１０ｐｆｕ／ｍｌ力価（ｔｉｔｅｒ）の精製されたバクテリオファージΦＣＪ１９溶液１５μｌと５×ＳＤＳ試料溶液３μｌとを混合して５分間加熱した後、１２％のＳＤＳ―ＰＡＧＥを行った（図３）。
【０１０７】
図３は、バクテリオファージΦＣＪ１９を対象にして行ったＳＤＳ―ＰＡＧＥ結果を示す電気泳動写真であって、約４４ｋＤａ、４０．５ｋＤａ、３７ｋＤａ、２０ｋＤａ及び１７ｋＤａサイズの主要タンパク質を確認することができた。
【０１０８】
＜実施例６＞
【０１０９】
ΦＣＪ１９の遺伝的特性分析
【０１１０】
前記実施例１で精製したバクテリオファージΦＣＪ１９の遺伝子的特性を調査するために、バクテリオファージΦＣＪ１９のＤＮＡを遺伝子分析機器ＦＬＸチタンシーケンサー（ｔｉｔａｎｉｕｍ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）（Ｒｏｃｈｅ）を使用して分析した。（株）マクロジェン（Ｍａｃｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）でＧＳとデ・ノボアセンブリソフトウェア（ｄｅ  ｎｏｖｏ  ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ｒｏｃｈｅ）を使用して遺伝子を組み合わせた。転写解読枠（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）は、ＧｅｎｅＭＡｒｋ．ｈｍｍ、Ｇｌｉｍｍｅｒ  ｖ３．０２及びＦＧＥＮＥＳＢソフトウェアを使用して行われた。ＢＬＡＳＴＰとインタープロスキャン（ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ）プログラムを使用して転写解読枠の名前を命名（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）した。
【０１１１】
前記バクテリオファージの塩基配列は、既存に報告されたバクテリオファージの塩基配列と多様な類似性を示したが、全ての断片が１００％一致するバクテリオファージはないことが確認された。ここで、前記バクテリオファージは、新規に分離されたバクテリオファージであることを確認することができた。
【０１１２】
下記の表２は、バクテリオファージΦＣＪ１９の塩基配列と他のバクテリオファージの解読塩基配列との相同性を比較した結果を示したものである。
【０１１３】
【表２】
0005970138.tif 000003
【０１１４】
前記製造されたバクテリオファージΦＣＪ１９のＤＮＡを遺伝子分析機器を使用して分析した塩基配列の一部結果は、配列番号１と同じである。
【０１１５】
＜実施例７＞
【０１１６】
ｐＨによるΦＣＪ１９の安定性の調査
【０１１７】
バクテリオファージΦＣＪ１９が胃腸内の低いｐＨで安定性を保有できるか否かを確認するために、多様なｐＨ範囲（ｐＨ３．０、ｐＨ３．５、ｐＨ４．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．４、ｐＨ７．５、ｐＨ８．３、ｐＨ９．２及びｐＨ１１．０）で安定性の調査実験を実施した。
【０１１８】
実験のために、多様なｐＨ溶液（酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ４．０、ｐＨ５．５及びｐＨ６．４）、クエン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ３．０及びｐＨ３．５）、リン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．９及びｐＨ７．４）、Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．２、ｐＨ９．０、ｐＨ９．８及びｐＨ１１．０））をそれぞれ０．２Ｍで製作した。
【０１１９】
前記各ｐＨ溶液１８０μｌと５．０×１０１０ＰＦＵ／ｍｌ力価のバクテリオファージ溶液２０μｌを混ぜ、各ｐＨ溶液の濃度を１Ｍにした後、常温で２時間定置した。対照群は、同一の方法で５．０×１０１０ＰＦＵ／ｍｌのバクテリオファージ溶液２０μｌをＳＭ溶液１８０μｌに混ぜた後、常温で２時間定置した。その次に、これらを段階的に希釈し、ソフトアガーオーバーレイ方法を用いて各段階の希釈液を１０μｌずつ落とした後、３０℃で１８時間培養し、溶菌の有無を通じて力価を測定した（図４）。
【０１２０】
図４は、バクテリオファージΦＣＪ１９の耐酸性実験結果を示した図である。図４に示したように、対照群と比較すると、バクテリオファージΦＣＪ１９は、ｐＨ４．０からｐＨ１１．０まで活性を失わずに安定的であることを確認することができた。
【０１２１】
＜実施例８＞
【０１２２】
温度によるΦＣＪ１９の安定性の調査
【０１２３】
バクテリオファージの製品剤形のうち飼料添加剤として用いる場合、バクテリオファージの剤形過程で発生する熱に対する安定性を確認するための実験を行った。
【０１２４】
具体的に、５．０×１０１０ＰＦＵ／ｍｌ濃度のバクテリオファージΦＣＪ１９の溶液１００μｌを３７℃、４２℃、５３℃及び６０℃の温度条件下でそれぞれ０分、３０分、６０分及び１２０分間定置させた。その次に、前記処理した実験培養液を段階的に希釈し、ソフトアガーオーバーレイ方法で各段階の希釈液を１０μｌずつ落とした後、３０℃で１８時間培養し、溶菌の有無を通じて力価を測定した（図５）。
【０１２５】
図５は、バクテリオファージΦＣＪ１９の耐熱性実験結果を示した図である。図５に示したように、バクテリオファージΦＣＪ１９は、５３℃で２時間露出したときまでは活性を維持したが、６０℃では６０分露出時から時間の経過と共に活性が減少することが分かった。
【０１２６】
＜実施例９＞
【０１２７】
野生分離株腸管毒素原性大腸菌に対するΦＣＪ１９の感染範囲の調査
【０１２８】
バクテリオファージΦＣＪ１９が実験に使用された腸管毒素原性大腸菌（ＳＮＵＪＧ２８０）の他に、韓国ソウル大学獣医科大学及びカナダのゲルフ大学で分離した野生分離株腸管毒素原性大腸菌１５株に対して溶菌活性の有無を確認した。
【０１２９】
具体的に、各菌株の振盪培養液（ＯＤ６００＝２）１５０μｌを混ぜてソフトアガーオーバーレイ方法を進行し、１０９ｐｆｕ／ｍｌ力価のバクテリオファージΦＣＪ１９の溶液を１０μｌずつ落とした後、３０℃で１８時間培養し、溶菌斑の形成有無を観察した。
【０１３０】
前記結果は、下記の表３に示す。
【０１３１】
【表３】
0005970138.tif 000004
【０１３２】
前記表３に示したように、バクテリオファージΦＣＪ１９は、一般の養豚農家で豚の下痢の原因菌として相当部分を占めているＥＴＥＣ  Ｏ―血清型Ｏ１４９（ＳＮＵ１０７、ＳＮＵＦ４、ＳＮＵＪＧ２８０、ＳＮＵ３２２０、ＣＡＮＲＯ８）に対して感染能を示しており、さらに、Ｆ―血清型Ｋ８８（ＳＮＵ１０７、ＳＮＵ１６０、ＳＮＵ１６２、ＳＮＵＦ４、ＳＮＵ３２２０、ＣＡＮＲＯ８、ＳＮＵＪＧ２８０）、Ｋ９９（ＳＮＵ２６１８）に対する感染能を示しているので、現場への適用時に優れた効率性を示すと期待される。
【受託番号】
【０１３３】
寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１３６１Ｐ
受託日付：２０１３０１３０
【図１】
0005970138.tif 000005
【図２】
0005970138.tif 000006
【図３】
0005970138.tif 000007
【図４】
0005970138.tif 000008
【図５】
0005970138.tif 000009
【配列表】
0005970138000001.app