(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．３〜６．０μｍの大きさを有し、ＣＤ９＋、ＣＤ１３３−、ＣＤ９０−およびＣＤ３４−である、単離された体性幹細胞。
【請求項２】
該単離された体性幹細胞が多能性であるまたは全能性である、請求項１に記載の単離された体性幹細胞。
【請求項３】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１または２に記載の単離された体性幹細胞。
【請求項４】
前記細胞が非接着性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された体性幹細胞。
【請求項５】
前記細胞がＣＤ９＋、ＣＤ１３３−、ＣＤ９０−、ＣＤ３４−およびＣＤ３４９＋である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離された体性幹細胞。
【請求項６】
被験者から採取した体液サンプルが上層及び下層に分かれるまで前記サンプルを容器中でＥＤＴＡまたはヘパリンとインキュベートし、
上層を収集し、さらに
前記上層から０．３〜６．０μｍの大きさを有し、ＣＤ９＋、ＣＤ１３３−、ＣＤ９０−およびＣＤ３４−である体性幹細胞の集団を単離することを有する、体性幹細胞の集団の調製方法。
【請求項７】
前記体液サンプルが血液または骨髄サンプルである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記被検者がヒトである、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記単離が遠心、フローサイトメトリー、または濾過によって行われる、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記収集後、前記上層をＡＤＰとインキュベートすることをさらに有する、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記インキュベートが、前記サンプルをヘパリンとインキュベートし、前記収集後であって前記単離前に、収集された上層をさらにＥＤＴＡとインキュベートすることによって、行われる、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項６〜１１のいずれか１項に記載の方法によって異なる被検者由来の複数の体性幹細胞の集団を調製し、
調製された前記複数の体性幹細胞の集団から細胞バンクを製造することを有する、細胞バンクの製造方法。
【請求項１３】
加齢に関連する疾患（ａｇｅｉｎｇ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）または癌を有する危険性を評価するために、体性幹細胞の集団における、体性幹細胞の割合を分析するための方法であって、
請求項６〜１１のいずれか１項に記載の方法によって、それぞれが０．３〜６．０μｍの大きさを有し、ＣＤ９＋、ＣＤ１３３−、ＣＤ９０−およびＣＤ３４−である、体性幹細胞の集団を得、
前記体性幹細胞の数を測定し、
前記数が第一の所定の値未満であるか、または、前記数が第二の所定の値を超えるものであるか否かを判定する
ことを有する、方法。
【請求項１４】
ヘパリンをインキュベート工程で使用して、体性幹細胞の集団を得る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記加齢に関連する疾患が、自己修復欠損症（ｓｅｌｆ−ｒｅｐａｉｒ  ｄｅｆｅｃｔ）、変性疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、または糖尿病である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の体性幹細胞を含む、被検者における体性幹細胞の数の増加のための薬剤。
【請求項１７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の体性幹細胞を含む、筋損傷疾患（ｍｕｓｃｌｅ  ｉｎｊｕｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）または筋肉変性疾患（ｍｕｓｃｌｅ−ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）の治療のための薬剤。
【請求項１８】
前記筋肉変性疾患（ｍｕｓｃｌｅ−ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）が、筋ジストロフィー、線維筋痛、ミオパシー、皮膚筋炎、多発性筋炎、横紋筋融解症、または心筋炎である、請求項１７に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１０年８月４日に出願された米国仮特許出願第６１／３７０，６００号；２０１０年９月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／３８３，８４２号；および２０１１年２月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／４４６，６６９号の優先権を主張する。これらの先の出願は、全体を参考で本明細書中に引用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
幹細胞は、多くのまたは全ての細胞系にインビボでまたはインビトロで分化できる多能性または全能性細胞である。これらの多能性により、胚性幹（ＥＳ）細胞は、変性または遺伝性疾患を治療するのにかなり有望であると考えられる。しかし、倫理的配慮がヒトのＥＳ細胞の使用を妨げている。非胚起源の幹細胞がこの障害を回避するであろう。ゆえに、非胚性幹細胞の必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００３】
要約
本発明は、多能性または全能性である、体性幹細胞、および関連方法に関する。
【０００４】
本発明の一つの態様は、０．３〜６．０μｍの大きさ（例えば、０．３〜５．０、０．３〜４．０、および０．３〜３．０μｍの大きさ）を有し、ＣＤ９＋である、単離された体性幹細胞を特徴とする。この単離された体性幹細胞は、ＣＤ９＋ＣＤ３４９＋またはＣＤ９＋ＣＤ３４９−であってもよい。細胞マーカーの後に記載される「＋」のサインは、抗体のアイソタイプコントロールによるより低い蛍光染色に比べて、マーカーに特異的な抗体によるより高い蛍光染色を表す。細胞マーカーの後に記載される「−」のサインは、抗体のアイソタイプコントロールによるのと同じマーカーに特異的な抗体による蛍光染色を表す。一実施形態においては、単離された体性幹細胞は非接着性である。この細胞は、本明細書において「ＳＢ−１細胞」と称する。
【０００５】
他の態様では、本発明は、０．３〜６．０μｍの大きさ（例えば、０．３〜５．０、０．３〜４．０、および０．３〜３．０μｍの大きさ）を有し、ＳＳＥＡ１＋、ＳＳＥＡ４＋、ＣＤ１３＋、またはＳｔｒｏ１＋である、単離された体性幹細胞を特徴とする。一実施形態においては、単離された体性幹細胞は非接着性である。この細胞は、本明細書において「ＳＢ−２細胞」と称する。
【０００６】
さらなる他の態様では、本発明は、体性幹細胞の集団の調製方法を特徴とする。本方法は、被検者（例えば、ヒトまたは非ヒト）から複数の細胞を含む体液サンプル（例えば、血液、骨髄、臍帯血、月経液、及び羊水）を得、前記サンプルが上層及び下層に分かれるまで前記サンプルを容器中で２価カチオンキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、及びクエン酸ナトリウム）またはヘパリンとインキュベートし、上層を集め、さらに前記上層から０．３〜６．０μｍの大きさ（例えば、０．３〜５．０、０．３〜４．０、および０．３〜３．０μｍの大きさ）を有する体性幹細胞の集団を単離することを有する。上層中の細胞集団は、本明細書において「ＳＢ細胞」または「ＳＢ細胞集団」と称する。
【０００７】
ＳＢ細胞集団中の体性幹細胞は、ＣＤ９＋、ＳＳＥＡ１＋、ＳＳＥＡ４＋、ＣＤ１３＋、またはＳｔｒｏ１＋であってもよい。例えば、体性幹細胞はＣＤ９＋ＣＤ３４９＋であってもよい。これらの体性幹細胞は、接着性細胞ではなく、細胞接合子の形態的及び成長上の特徴双方を有していてもよい。さらに、体性幹細胞は、３種全ての胚葉、即ち、内胚葉、外胚葉、及び中胚葉を形成するように誘導されてもよい。
【０００８】
上層からのＳＢ細胞の単離は、細胞の大きさによる方法（例えば、遠心及び濾過）または細胞表面マーカーによる方法（例えば、フローサイトメトリー）によって行われてもよい。
【０００９】
本方法は、さらに、上層を集めた後、ＡＤＰと共にインキュベートして、さらに幹細胞を増殖するために血小板／微粒子を沈殿させることを有していてもよい。加えて、本方法はまた、ヘパリンで処理されたサンプルから得られた上層を２価カチオンキレート剤とインキュベートして、幹細胞の細胞周期をＧ０からＧ１に活性化することを有していてもよい。
【００１０】
さらなる態様では、本発明は、上記方法によって調製されたＳＢ細胞集団を特徴とする。
【００１１】
さらなる別の態様では、本発明は、複数の体性幹細胞の集団を含む細胞バンクを特徴とする。当該集団は、上記方法によって、異なる被検者の体液サンプル、例えば、血液及び骨髄から別々に調製される。
【００１２】
本発明はさらに、サンプル中に含まれる幹細胞の数の増加方法を特徴とする。当該方法は、２価カチオンキレート剤をサンプルに添加し、さらにサンプル中の幹細胞を前記２価カチオンキレート剤とインキュベートすることを有する。上記方法は、キレート剤の添加前であって細胞をキレート剤とインキュベートする後にサンプル中の有益な細胞（例えば、ＳＢ−１細胞、ＳＢ−２細胞、ならびにＳＢ−１細胞及びＳＢ−２細胞双方）の数を測定することを有していてもよい。本方法によって試験される幹細胞の例としては、ＳＢ集団の幹細胞、例えば、ＳＢ−１細胞がある。
【００１３】
老化に伴う疾患または癌を有する危険性に関する被検者の評価方法もまた、本発明の範囲に含まれる。老化に伴う疾患の例としては、自己修復欠損症(self-repair defect)、変性疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、及び糖尿病が挙げられる。本方法は、被検者から特定の体性幹細胞の集団を得、さらに前記体性幹細胞の数を測定することを有する。得られた体性幹細胞は、ＳＢ−１細胞またはＳＢ−２細胞であってもよい。当該細胞は、ＣＤ９＋、ＣＤ３４９＋、ＳＳＥＡ１＋、ＳＳＥＡ４＋、ＣＤ１３＋、またはＳｔｒｏ１＋であってもよい。当該細胞は、それぞれ、０．３〜６．０μｍの大きさを有する。ＳＢ集団の幹細胞は、上記方法によって、好ましくは、体液サンプルを上層及び下層に分離するためにヘパリンを用いて、得られてもよい。
【００１４】
被検者は、前記数が第一の所定の値未満であると前記疾患を有する危険性があるとまたは前記数が第二の所定の値を超えると癌を有する危険性があると、決定される。第一の値は、若く健常な第一のコントロール被検者から得られてもよい。第二の値は、癌を有する第二のコントロール被検者から得られてもよい。
【００１５】
本発明はまた、被検者の体性幹細胞の数の増加方法を包含する。本方法は、体性幹細胞の数を増加させる必要のある被検者に、有効量のＳＢ細胞集団の体性幹細胞を投与することを有する。投与前後の有益な細胞（ＳＢ−１細胞等）の相対的な数は、被検者のサンプル（例えば、血液及び骨髄）で測定されうる。一例としては、本方法を実施するにあたって、１０ｎＭ〜５μＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液２５０ｍｌにおける体性幹細胞が使用できる。
【００１６】
最後に、本発明は、筋障害または筋肉の変性疾患(muscle-degenerative disease)の治療方法を特徴とする。本方法は、筋障害または筋肉の変性疾患(muscle-degenerative disease)を治療する必要のある被検者に、有効量のＳＢ細胞集団の体性幹細胞を投与することを有する。筋肉の変性疾患(muscle-degenerative disease)の例としては、筋ジストロフィー、線維筋痛、ミオパシー、皮膚筋炎、多発性筋炎、横紋筋融解症、及び心筋炎が挙げられる。
【００１７】
本発明の一以上の実施形態の詳細を、添付の図面及び下記説明で説明する。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明及び図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
図面の説明
【図１】図１は、Ｐ１ゲート領域(P1-gated region)での細胞の大きさを評価するのに使用される標準ビーズの大きさを示す５つの散布図である。
【図２】図２は、フローサイトメトリーによって分析される際のそれぞれが６μｍ未満の大きさを有するＰ３ゲート領域(P3-gated region)での細胞を示す３つの散布図である。左側のパネルは、大きい（＞６ミクロン）及び小さい細胞を有する全血を示すプロットであり；真ん中のパネルは、精製後のＳＢ細胞集団の細胞を示すプロットであり；および右側のパネルは、緩衝液のみを示すプロットである。
【図３】図３は、Ｐ３ゲート領域(P3-gated region)でのＳＢ細胞集団が、Ｐ２ゲート領域(P2-gated region)でのＳＢ−１細胞及びＰ５ゲート領域(P5-gated region)でのＳＢ−２細胞を含むことを示す３つの散布図である。なお、緩衝液、血小板、及び微粒子は、それぞれ、Ｐ４、Ｐ１、及びＰ２ゲート領域で示された。
【図４】図４は、血液から単離された、Ｐ２ゲート領域(P2-gated region)でのＳＢ−１細胞を示す２つの散布図である。左側のパネルに示されるように、ほとんどすべてのＳＢ−１細胞がＳＹＴＯで陽性に染色された。
【図５】図５は、血液から単離された、Ｐ５ゲート領域(P5-gated region)でのＳＢ−２細胞を示す２つの散布図である。左側のパネルに示されるように、ほとんどすべてのＳＢ−２細胞がＳＹＴＯで陽性に染色された。
【図６】図６は、血液から単離された、Ｐ６ゲート領域(P6-gated region)での赤血球を示す２つの散布図である。左側のパネルに示されるように、すべての赤血球がＳＹＴＯで陰性に染色された。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
本発明は、少なくとも一部は、（ｉ）多能性または全能性幹細胞集団、即ち、ＳＢ細胞集団が、細胞を含まないと考えられていたサンプルから単離できること、（ｉｉ）２価カチオンキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）がこの集団の多能性または全能性幹細胞を活性化し、これらの分化能を失わせることなく増殖させること；および（ｉｉｉ）この多能性または全能性幹細胞の集団が外胚葉、内胚葉、及び中胚葉に分化できるという予想できない知見に基づくものである。この集団のＳＢ−１細胞はＣＤ９に関して陽性に染色され、この集団のＳＢ−２細胞はＳＳＥＡ１＋、ＳＳＥＡ４＋、ＣＤ１３＋、及びＳｔｒｏ１＋の１以上について陽性に染色される。ＳＢ細胞集団、ＳＢ−１細胞、及びＳＢ−２細胞は、ヒトからまたは非ヒトのいずれから単離されてもよい。上記体性幹細胞が得られる、非ヒトの例としては下記がある：霊長類、イヌ、齧歯動物、モルモット、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、及びブタ。換言すると、これらは、以下に制限されないが、ペット動物、家畜動物、実験動物、及び疾患モデル動物が挙げられる。
【００２０】
Ａ．細胞
本発明は、ＳＢ細胞集団、非胚起源から調製される多能性または全能性幹細胞の集団に関する。ＥＳ細胞と同様、この集団の細胞は、全能性または多能性である。より重要なことでは、この集団は、非常に高い収率で容易に得られる。したがって、これを用いて、様々な変性疾患または組織損傷を治療する際の分化、機能性細胞を再生できる。下記実施例に示されるように、上記集団は、インビトロで容易に調製、維持及び拡張でき、さらに通常の技術的アプローチを用いて分化するように誘導できる。加えて、上記集団の幹細胞を動物被検者（例えば、マウス）に移植した後には、悪性腫瘍の証拠はない。正常な染色体対を含むと、これらの幹細胞は細胞系中立(lineage-uncommitted)であり、体の全ての体（非生殖）細胞を形成できる。上記幹細胞はまた、生殖配偶子である精子および／または卵子、ならびに胎盤の胚及び胎児部分の細胞や組織を形成できる。これらの幹細胞は、系統誘導剤(lineage-induction agent)、増殖剤(proliferation agent)、および分化抑制剤(differentiation inhibitory agent)に応答性である。これらの利点により、上記幹細胞は、他の幹細胞の代わりになる。
【００２１】
本明細書における「幹細胞」ということばは、全能性または多能性である、即ち、多くの最終的な分化細胞タイプに分化できる細胞を意味する。全能性幹細胞は、一般的に、いずれの細胞タイプに発達できる。全能性幹細胞は、起源が胚及び非胚双方でありうる。多能性細胞は、一般的に、幾つかの異なる、最終的な分化細胞タイプに分化できる細胞である。分化単能性幹細胞は、１つの細胞タイプのみを生産できるが、非幹細胞と区別する自己再生(elf-renewal)特性を有する。これらの幹細胞は、血液、神経、筋肉、皮膚、消化管、骨、腎臓、肝臓、膵臓、胸腺等の、様々な組織または器官由来であってもよい。
【００２２】
本明細書に開示される幹細胞は、実質的に純粋である。幹細胞またはこれ由来の細胞（例えば、分化細胞）について使用される、「実質的に純粋である」ということばは、特定の細胞が集団内で多数の（即ち、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を超える）細胞を構成することを意味する。通常、細胞の実質的に精製された集団は、調製時に少なくとも約７０％の細胞、一般的に調製時に少なくとも約８０％の細胞、特に調製時に少なくとも約９０％（例えば、９５％、９７％、９９％または１００％）の細胞を構成する。そのため、本発明の方法は、特定のタイプの細胞（例えば、ＳＢ−１細胞）の実質的に純粋な集団が他の細胞タイプが混入することなく得られるという利点がある。
【００２３】
被検者の様々な細胞を含むサンプルを用いて、本発明の細胞集団を調製できる。好ましい実施形態においては、細胞集団を血液または骨髄サンプルから調製する。
【００２４】
この単離集団が実際にＳＢ−１細胞を含むことを確認するために、（１）０．３〜６．０μｍ、好ましくは０．５〜５．０μｍの懸濁液中の細胞の大きさ、および（２）細胞表面マーカーなどの、多数の特徴を試験できる。ＣＤ９等の、細胞表面マーカーに対する抗体が使用できる。抗体を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、または量子ドット等の、適当な標識と共役させてもよい。ＣＤ＋である、ＳＢ−１細胞をさらにフローサイトメトリーを用いて増やしてもよい。
【００２５】
次に、単離されたまたは増やされた細胞を標準的な技術によって試験する。ＳＢ細胞集団の幹細胞の分化能を確認するために、当該分野において既知の方法によって、これらの細胞を、例えば、神経−グリア細胞(neuro-glial cell)、骨細胞、及び含脂肪細胞を形成するように誘導してもよい。例えば、これらの細胞を、継代して、コンフルエンス(confluence)になるまで培養して、骨形成用培地(osteogenic medium)または脂質生成用培地(adipogenic medium)に移し、適当な時間（例えば、３週間）インキュベートしてもよい。骨形成に関する分化能は、カルシウム蓄積の石化によって評価し、これはｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色(von Kossa staining)によって評価できる。脂質生成の分化を試験するには、細胞内脂肪滴をオイルＯレッド(Oil Red O)で染色して、顕微鏡下で観察できる。神経の分化については、これらの細胞を適当な期間（例えば、７日）神経形成用培地(neurogenic medium)でインキュベートした後、血清を枯渇させて、β−メルカプトエタノールをインキュベートしてもよい。分化後、これらは、伸長した軸索様構造物が網目状に配列した屈折性細胞体(refractile cell body)の形態を示す。ＲＴ  ＰＣＲ及び系統特異的マーカーの免疫細胞化学的染色をさらに行うことによって、神経の分化を確認する。マーカーの例としては、ニューロン特異的クラスＩＩＩ  β−チューブリン(neuron specific class III β-tubulin)（Ｔｕｊ−１）、ニューロフィラメント、及びＧＦＡＰがある。
【００２６】
または、単離された細胞の同一性を確認するために、ＳＢ−１細胞が、２価カチオンキレート剤（ＥＤＴＡ）に応答して、すばやく増殖するという発見をうまく利用してもよい。そのためには、単離された細胞を、例えば、ＥＤＴＡと一緒に培養してもよい。このような条件下で、ＳＢ−１細胞は増殖するであろう。これに対して、ＣＤ６６ｅ＋細胞は同じような挙動を示さない。
【００２７】
ＳＢ細胞集団の幹細胞は、自発的な分化、老化、形態学的な変化、成長速度の増加、またはニューロンへの分化能の変化を示さずに、１０、２０、５０、または１００を超える細胞集団倍加(population doublings)で非分化培養培地でさらに増殖できる。これらの幹細胞は、使用するまで標準的な方法で貯蔵できる。
【００２８】
細胞に関して本明細書中で同義で使用される「増殖(proliferation)」および「拡張(expansion)」ということばは、分裂によって同じタイプの細胞の数の増加を意味する。「分化」ということばは、細胞が、例えば、細胞が初期の細胞タイプのものとは異なる一以上の形態学的な特性および／または機能を獲得する際に、特定の機能に特化するようになる発達上のプロセスを意味する。「分化」ということばは、系統分化(lineage commitment)プロセス及び最終分化プロセス双方を包含する。分化は、例えば、免疫組織化学または当業者に既知の他の方法を用いて、系統マーカーの存在または不存在をモニターすることによって、評価してもよい。前駆細胞由来の分化した子孫細胞は、必ずしもそうではないが、幹細胞の起源組織と同じ胚葉または組織に関するものであってもよい。例えば、神経前駆細胞及び筋肉前駆細胞が造血細胞系統に分化してもよい。
【００２９】
本明細書中で同義で使用される、「系統分化(lineage commitment)」および「指定(specification)」ということばは、幹細胞が、特定の限られた範囲の分化細胞タイプを形成するように拘束された前駆細胞を生じるように幹細胞が受けるプロセスを意味する。拘束された前駆細胞は、しばしば、自己再生または細胞分裂できる。
【００３０】
「最終分化(terminal differentiation)」ということばは、細胞の成熟した十分分化した細胞への最終分化を意味する。例えば、神経前駆細胞及び筋肉前駆細胞は、造血細胞系列に分化して、その最終分化によって特定の細胞タイプの成熟した血球になることができる。一般的に、最終分化は、細胞周期及び増殖休止からの離脱(withdrawal)に関連する。本明細書に使用される、「前駆細胞」ということばは、特定の細胞系統に拘束され、一連の細胞分裂によってこの系統の細胞を生じる細胞を意味する。前駆細胞の例としては、筋芽細胞があり、これは唯一の細胞タイプに分化する能力を持つが、それ自体は完全に成熟または完全に分化していない。
【００３１】
複数の上記幹細胞集団を有する細胞バンクまたはライブラリーは、本発明の範囲に含まれる。これらの幹細胞は、ヒト細胞であってもまたは非ヒト細胞であってもよい。このバンクは、異なる被検者から別々にＳＢ細胞集団を集め；このＳＢ集団の特性を明らかにして、それぞれについて少なくとも１つの所定の特性を得、さらにその少なくとも１つの所定の特性に従って各ＳＢ細胞集団を分類することによって製造してもよい。そのバンクを製造するために、さらにＳＢ細胞集団を拡張してもよい。特性の例としては、被検者の名前、性別、健康状態（遺伝病及びＭＨＣ情報を含む）などがある。
【００３２】
Ｂ．細胞の用途：
例えば、ＳＢ−１細胞を含む、上記ＳＢ細胞集団は、様々な様式で使用できる。
【００３３】
スクリーニング方法：
ＳＢ細胞集団における上記幹細胞は、薬剤が細胞タイプに関連する疾患を治療するのに有用であることを示す形で特定の細胞タイプに影響を及ぼすことができる薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイに使用することができる。例えば、病気（例えば、変性疾患）を治療するための薬剤候補を同定する方法に幹細胞を使用することができる。本方法は、試験化合物を幹細胞を接触させ、その病気でダウンレギュレートするポリペプチドの発現レベルを測定する工程を含む。試験化合物の存在下での発現レベルが、その化合物の不存在下でのレベルに比べて高ければ、その化合物はその病気を治療するための候補であることが示される。このような病気の例としては、糖尿病、神経変性疾患、関節炎、癌、または自己免疫疾患がある。発現レベルは、ｍＲＮＡレベルでまたはタンパク質レベルでのいずれかで測定されうる。
【００３４】
したがって、本発明の一態様は、細胞を試験物質と接触させることによるＳＢ細胞集団の未分化細胞の機能を変える物質の同定方法に関する。試験物質の不存在下での機能に比べた際の試験物質の存在下での細胞の機能または遺伝子発現の変化は、その試験物質が細胞の機能または遺伝子発現を変化させる物質であることを示す。「試験物質」ということばは、細胞の機能または遺伝子発現を変化させる能力について試験している分子を意味する。本方法は通常所望の活性を有する従来未知の分子を同定するためのスクリーニングアッセイとして使用されるが、本発明のスクリーニング方法はまた、既知の物質が特定の活性を有することを確認するのにも使用できる。
【００３５】
上記機能は、一般的に細胞で発現する（または発現しない）遺伝子の発現であってもよく、また、上記物質は、発現遺伝子の発現のレベルを増加する若しくは減少することによって、または細胞で未発現遺伝子の発現を刺激する（例えば、系統に特異的な抗原の発現を誘導する）ことによって機能を変化させるものであってもよい。
【００３６】
一実施形態においては、細胞の機能に影響を及ぼす物質は、幹細胞の分化を誘導し、これにより分化細胞を生産するものである。このような分化細胞は、多能性ヒト幹細胞（例えば、造血幹細胞）であってもまたは最終分化細胞（例えば、筋肉細胞、神経細胞、血球、結合組織、または上皮細胞）であってもよい。このようにして、本方法は、ＳＢ細胞集団の幹細胞の、膵臓ベータ細胞、肝細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、または他の細胞タイプ等の最終分化細胞への分化を誘導する物質を同定するために使用できる。このようにして同定された物質または化合物は、変性疾患、癌または免疫疾患の治療に使用できる。
【００３７】
発現レベルは、ｍＲＮＡレベルでまたはタンパク質レベルでのいずれかで測定されうる。サンプルのｍＲＮＡレベルの測定方法は当該分野において既知である。ｍＲＮＡレベルを測定するためには、細胞を溶解して、精製の有無にかかわらず、溶解物中のｍＲＮＡのレベルは、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ（検出可能なように標識された遺伝子に特異的なＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いた）および定量的または半定量的ＲＴ−ＰＣＲ（適当な遺伝子に特異的なプライマーを用いた）によって測定されうる。または、定量的または半定量的ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、検出可能なように（例えば、蛍光または酵素で）標識されたＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いて組織切片または未溶解の細胞懸濁液で行ってもよい。別のｍＲＮＡ定量方法としては、ＲＮＡ保護アッセイ（ＲＰＡ）法および遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）法、さらにアレイを用いた(array-based)技術などがある。
【００３８】
サンプル中のタンパク質レベルの測定法もまた当該分野において既知である。これらの方法の中には、標的タンパク質に特異的に結合する抗体（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体）を用いるものもある。そのようなアッセイにおいて、抗体それ自身または抗体に結合する二次抗体を、検出可能なように標識してもよい。または、抗体をビオチンに結合させてもよい。その存在は、検出可能なように標識されたアビジン（ビオチンに結合するポリペプチド）によって測定することができる。方法の感度を高めるために、これらのアプローチの組み合わせ（「多層サンドイッチ」アッセイを含む）を使用してもよい。タンパク質測定アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット）を、体液または細胞の溶解物に適用してもよく、また、他の方法（例えば、免疫組織学的な方法または蛍光フローサイトメトリー）を組織切片または非溶解細胞懸濁に適用してもよい。適切な標識としては、放射性核種（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼ）、蛍光／発光剤（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、ＧＦＰ、ＢＦＰ、およびナノ粒子（例えば、Quantum Dot Corporation, Palo Alto, CA によって供給されるＱｄｏｔＴＭ）が挙げられる。他の適用できる方法としては、定量的免疫沈降または補体結合アッセイが挙げられる。
【００３９】
試験化合物または物質は、例えば、ポリヌクレオチド、ペプチド、ペプチド類似物、ビニル性のペプトイド(vinylogous peptoid)等のペプトイド、有機小分子などの、いずれのタイプの分子であってもよく、ＳＢ細胞集団の幹細胞の機能を変化させるのに種々な方法で作用することができる。例えば、細胞によって発現される細胞表面レセプターに結合し、これにより通常レセプターに結合し、レセプターを介して作用するリガンドの結合によって仲介される機能を変化させることによって、試験物質を細胞外で作用させてもよい。または、試験物質は、受動的にまたは活性トランスポーターメカニズムによりのいずれかで、細胞膜を通過して、機能を変化させるように細胞内で作用するものであってもよい。
【００４０】
ペプチド試験物質は、アミノ酸またはアミノ酸類似体であってもよく、３〜４残基から数百または数千までの範囲であってもよい。ペプチド試験物質は、化学合成によって、またはタンパク質精製、続いてタンパク質分解、必要によりクロマトグラフィー若しくは電気泳動法によるさらなる精製の方法を用いることによって調製されても、またはコードするポリヌクレオチドから発現させてもよい。ペプチド試験物質は、既知のペプチド、例えば、天然のペプチドに基づくものであってもよいが、例えば、１以上のアミノ酸類似体を含むことによって天然の配列から変化させたものであってもよい。
【００４１】
ポリヌクレオチド物質は、ホスホジエステル結合によって共に結合する２以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列であってもよい。ポリヌクレオチド物質は、遺伝子またはその一部でありうるＲＮＡまたはＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡｉ物質、合成ポリデオキシ−リボ核酸配列などであってもよく、一本鎖または二本鎖、さらにはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであってもよい。ポリヌクレオチド物質は、細胞から単離することができる天然の核酸分子であってもよく、さらには、例えば、化学合成法によってまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による等の酵素反応によって調製できる、合成分子であってもよい。様々な実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ヌクレオシド若しくはヌクレオチド類似体、またはホスホジエステル結合以外の骨格結合を含んでもよい。このようなヌクレオチド類似体、さらにはこのようなヌクレオチド類似体を含むポリヌクレオチドは、当該分野において既知であり、市販されている(Pagratis et al., Nature Biotechnol. 15:68-73, 1997)。
【００４２】
ポリヌクレオチド試験物質は、本明細書で開示されている方法または当該分野で既知の他の方法を用いて、ＳＢ細胞集団の幹細胞と接触させるまたは当該幹細胞に導入することができる。通常、ただし必ずしもそうとは限らないが、ポリヌクレオチドを細胞に導入し、それで、直接的に、または転写若しくは翻訳または双方の後にその機能に影響を与える。例えば、ポリヌクレオチドは、細胞内で発現して、細胞の機能を変化させる、ペプチド試験物質をコードしていてもよい。また、ポリヌクレオチドの試験物質は、アンチセンス分子、リボザイムまたは三重化合物(triplexing agent)であってもよく、またはそれらをコードしていてもよく、これらは１以上の特異的標的核酸分子をターゲットにするように設計されてもよい。
【００４３】
スクリーニングされる候補薬剤または化合物（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド類似物、ペプトイド、抗体、小分子、または他の薬剤）は、当該分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法の多数のアプローチのいずれかを用いて得ることができる。そのようなライブラリーとしては下記がある：ペプチドライブラリー、ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能を有するが、酵素分解に対して耐性のある新規な非ペプチド骨格を有する分子のライブラリー）；空間的にアドレス可能な(spatially addressable)平行固相又は液相ライブラリー；デコンボリューション(deconvolution)またはアフィニティクロマトグラフィー選択によって得られる合成ライブラリー；および「１−ビーズ１−化合物(one-bead one-compound)ライブラリー。例えば、Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145参照。分子ライブラリーの合成方法の例は、例えば、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; and Gallop et al., 1994 J. Med. Chem. 37:1233に見出すことができる。化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Houghten, 1992, Biotechniques 13:412-421）、またはビーズ（Lam, 1991, Nature 354:82-84）、チップ（Fodor, 1993, Nature 364:555-556）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Cull et al., 1992, PNAS USA 89:1865-1869）、またはファージ（Felici 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310；および米国特許第５，２２３，４０９号）上に提示されてもよい。
【００４４】
変性疾患の治療
本明細書に開示されるＳＢ細胞集団の幹細胞を、ヒト胚操作の道徳的配慮をさけて、変性または遺伝性疾患の治療に使用できる。
【００４５】
そうするためには、例えば、組織または器官の適当な発達に必須な機能遺伝子が欠失した、患者からＳＢ細胞集団を単離してもよい。次に、機能的な型の遺伝子をコードする発現核酸ベクターをＳＢ細胞集団の幹細胞に導入してもよい。リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン−介在トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、またはウィルス介在技術等の、様々な技術により幹細胞内にそのベクターを導入することができる。細胞の多能性に影響を与えない方法が好ましい。そのような技術の記述は、例えば、米国特許第７，４２２，７３６号および第５，５９１，６２５号に見出すことができる。幹細胞中に機能的遺伝子をデリバリーした後に、当該分野で既知の方法を用いて患者に細胞を移植返してもよい。幹細胞は患者から生産されるので、治療は免疫拒絶を引き起こさない。
【００４６】
または、健常な被検者から調製されるＳＢ細胞集団から万能ドナー細胞(universal donor cell)を作製してもよい。万能ドナー細胞の作製方法は、当該分野で既知であり、ＳＢ細胞集団から万能多能性幹細胞(universal pluripotent stem cell)を作製する方法を以下に記載する。
【００４７】
適当な条件下で、移植した幹細胞を、機能的な組織または器官に発達させてもよい。この発達を促進するため、細胞の発達を誘導する因子を患者に投与してもよい。このような因子は、低分子化合物、ペプチド、および核酸でありうる。例としては、以下に制限されないが、トランスフォーミング増殖因子β、骨形成タンパク質、および神経成長因子が挙げられる。
【００４８】
万能多能性幹細胞(universal pluripotent stem cell)はまた、系統発生および分化の発達メカニズムまたは分化メカニズムを研究するためにも有用である。モデルシステム等の細胞を用いて特定の組織または器官への全能性多能性幹細胞を発達を誘導する条件を同定することができる。さらに、当該分野で既知の分化ｃＤＮＡスクリーニングを用いて発達中に役割を果たす遺伝子を単離することができる。特定の系統、例えば、上述した神経グリア系統に発達するように誘発された細胞からｃＤＮＡライブラリーを作製してもよい。次に、このライブラリーを用いて、分化して発現した遺伝子を単離、研究してもよい。これらの単離された遺伝子は、各プロセスでの役割を規定するためにさらに研究されてもよい。関連する技術は当該分野において既知である。例えば、米国特許第７，４２２，７３６号を参照。多能性幹細胞はまた、当該分野において既知の方法を用いて動物の器官またはクローンに発達させるのに使用できる。したがって、これらの細胞は、ペットや畜産業において価値があり、絶滅寸前の動物を保護するために使用できる。
【００４９】
一態様において、本発明は、患者の変性疾患の治療方法を特徴とする。本方法は、変性疾患の治療を必要とする患者に有効量の上記幹細胞を投与することを有する。一実施形態において、これらの細胞の少なくとも一は組み換え核酸を含む。組み換え核酸はポリペプチドをコードし、幹細胞はポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含んでもよい。変性疾患の例としては、糖尿病、神経変性疾患、及び関節炎が挙げられる。神経変性疾患の例としてはパーキンソン病がある。
【００５０】
他の態様において、本発明は患者の自己免疫疾患の治療方法を特徴とする。本方法は、自己免疫疾患の治療を必要とする患者に有効量の上記組成物を投与することを有する。
【００５１】
上記疾患の一に対して治療されるべき患者は、その特定の疾患に対する標準的な診断技術によって同定されうる。「治療する」は、疾患、疾患の症状、疾患に続発する病状、または障害／疾患になりやすい素因を治す(cure)、緩和する(alleviate)、軽減する(relieve)、治療する(remedy)、発症を遅延させる(delay)、予防する(prevent)、または改善する(ameliorate)ことを目的として、その疾患に罹患しているまたはその疾患を発症する危険性のある患者への組成物（例えば、細胞組成物）の投与を意味する。「有効量」は、治療される患者に医学的に望ましい結果をもたらすことができる組成物の量を意味する。治療方法は単独で行われてもまたは他の薬若しくは治療と組み合わせて行われてもよい。
【００５２】
変性疾患は、遺伝子異常、損傷、適正な細胞分化の欠損（例えば、細胞の増殖性疾患におけるもの）、通常の身体疲労、またはライフスタイルの選択によるものであるかどうかにかかわらず、感染組織または器官の機能または構造が経時的に進行して低下する疾患を意味する。変性疾患の例としては、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ））；他の神経システム障害（例えば、横断性脊髄炎、脳または脊髄への外傷後に起こる脱髄、急性脳障害、頭部外傷、脊髄損傷、抹消神経損傷、脳虚血損傷、ＣＮＳの遺伝性ミエリン疾患、てんかん、周産期仮死、呼吸停止、酸素欠乏症、てんかん重積症、シャイ・ドレーガー症候群、自閉症、および脳卒中）；癌または関連癌治療（例えば、化学療法）に起因する症状；代謝異常（例えば、糖尿病／真性糖尿病及びニーマン・ピック病）；自己免疫または炎症関連疾患（例えば、エリテマトーデス、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、前立腺炎、変形性関節症、骨粗鬆症、リウマチ関節炎、紅斑性狼瘡、糖尿病、及び喘息）；眼疾患（例えば、緑内障、網膜色素変性、ノリエ病、及び黄斑変性）；心臓および循環器疾患（例えば、アテローム性動脈硬化、心不全心筋梗塞、及び心臓血管疾患）；血液疾患（例えば、ウィスコット・アルドリッチ症候群）；筋ジストロフィー；消化器疾患；腎疾患；肝疾患；肺疾患；副腎障害（例えば、アジソン病）；損傷に起因する症状（例えば、新しい傷、加齢により損傷を受けた細胞及び加齢により損傷を受けた組織を含む、やけど、発作、損傷組織）；加齢に関連する症状（例えば、男性型脱毛症および円形脱毛症等の、脱毛症）；ウィルス性疾患（例えば、Ｃ型肝炎および後天性免疫不全疾患など）；ならびに臓器移植または幹細胞を上記疾患に関連する兆候および／または症状を回復させる、再生させる、または改善させるために使用できる他の疾患が挙げられる。本発明の方法は、勃起不全の治療および女性のための美容整形手術または乳房インプラントにおいて使用することができる。
【００５３】
被検者の脳またはＣＮＳ組織損傷の治療方法または当該疾患の症状の軽減方法は、本発明の範囲に含まれる。本方法は、脳組織が損傷を受けているまたは脳組織の損傷を発症する危険性のある被検者を同定することを含む。被検者は、ヒトまたはネコ、イヌ、またはウマ等の非ヒト哺乳動物でありうる。脳組織の損傷の例としては、脳虚血（例えば、慢性脳卒中）または神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、脊髄小脳疾患、またはハンチントン病）によって引き起こされる損傷が挙げられる。治療されるべき被検者は、対象となる状態または疾患を診断する標準的な技術によって同定されうる。治療方法は、有効量の上記幹細胞または活性薬剤／化合物の有効量をこのような治療を必要とする被検者に投与することを含む。
【００５４】
幹細胞の治療効果は、標準的な方法に従って評価されうる。例えば、脳血管新生を促進する効果を確認するのには、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、ドップラー超音波撮像（ＤＵＩ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、およびプロトン磁気共鳴分光学（１Ｈ−ＭＲＳ）等の、標準的な脳画像検査技術によって処置前後に被検者を検査できる。例えば、１Ｈ−ＭＲＳは、脳代謝活性に関連する生化学的情報を得るための非侵襲手段の代表である(Lu et al., 1997, Magn. Reson. Med. 37, 18-23)。この技術は、幹細胞移植を行うまたは行わないにかかわらず脳虚血にかかわりのある代謝変化を評価するのに適用できる。例えば、神経の健全性のマーカーである脳中のＮ−アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）濃度を調べるのに使用されうる。神経デブリス(neuronal debris)におけるＮＡＡの再分配および捕捉は定量的な神経マーカーとしてのその使用を制限するが、脳虚血における脳中のＮＡＡ濃度の減少が神経欠損または機能障害の指標と考えられうる(Demougeot et al., 2004, J. Neurochem. 90, 776-83)。したがって、１Ｈ−ＭＲＳによって測定される、ＮＡＡレベルは、脳虚血後の幹細胞移植の効果を追跡ための有用な指標である。
【００５５】
遺伝子療法
本明細書に記載される幹細胞は、外来の、組み換えポリペプチドを発現させるために使用できる。したがって、組換核酸を含むこのような幹細胞は、本発明の範囲に含まれる。組換核酸は、ポリペプチドをコード化してもよく、幹細胞は上記ポリペプチドをコード化するｍＲＮＡを含んでもよい。
【００５６】
これらの幹細胞は、β２−ミクログロブリン遺伝子を発現しないまたは細胞に対するＴリンパ球が仲介する反応を誘発するクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）遺伝子によってコード化される１以上のタンパク質を発現しないように、遺伝子操作されてもよい。これらの細胞は、移植片の宿主拒絶反応を引き起こさないため、万能ドナー細胞として使用できる。
【００５７】
したがって、本発明は、被検者の異種核酸を導入する方法を特徴とする。本方法は、幹細胞の少なくとも一が異種核酸を含む、上記幹細胞を得、当該細胞を上記を必要とする被検者に投与する工程を含む。異種核酸は、ポリペプチドをコード化してもよい。
【００５８】
「異種(heterologous)」ということばは、核酸の部分に関して用いられる場合、核酸が性質において互いに同じ関係では見出されない２以上の配列を含むことを示す、相対的なことばである。例えば、組換により製造される核酸は、一般的に、新しい機能的核酸を作製するために合成により配置される非関連遺伝子由来の２以上の配列、例えば、ある源由来のプロモーターおよび異なる源由来のコーディング領域を有する。したがって、これらの２つの核酸はこの意味において互いに異種である。細胞に添加されると、組換核酸は、細胞の内因性の遺伝子に対しても異種となるであろう。したがって、染色体において、異種核酸は、染色体に組み込まれた外来の（自然発生でない）核酸、または外来の（自然発生でない）染色体外核酸を含むであろう。これに対して、変異細胞に由来する内因性の核酸配列を含むので、染色体の自然的に転座した断片は、本願の意味においては異種であるとは考えられないであろう。同様にして、異種タンパク質は、タンパク質が性質において互いに同じ関係では見出されない２以上の配列を含むことを示す（例えば、２つの配列が単一の核酸配列によってコード化される、「融合タンパク質」）。このようなタンパク質は、組換技術によって作製することができる。
【００５９】
例えば、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターに関して用いられる場合には、「組換」ということばは、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、異種核酸若しくはタンパク質の導入または天然の核酸若しくはタンパク質の変更によって修飾された、あるいは細胞がそのように修飾された細胞由来であることを示す。したがって、例えば、組換細胞は、天然（自然発生）形態の細胞中では見い出されない遺伝子を発現するまたは発現下若しくは非発現下で正常にまたは異常に発現する天然遺伝子の２次コピーを発現する。
【００６０】
上記幹細胞および方法は、当該分野において既知の様々な遺伝子療法に使用できる。遺伝子療法は、ex vivoおよびin vivo技術双方を包含する。詳細には、上記幹細胞は、オリゴヌクレオチドモジュレーターまたはモジュレーターをコード化する核酸分子を用いてex vivoで遺伝子操作されてもよく、この際操作された細胞は、次いで治療される患者に提供される。細胞培養物は、例えば、（例えば、機械的分離によって）細胞を分離し、製薬上許容できる担体（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）と細胞をよく混合することによって、患者への投与を目的として製剤化されてもよい。または、細胞を、適当な細胞適合性支持体上で培養し、患者に移植してもよい。操作された細胞は、一般的に、異種またはアロタイプ拒絶を回避するように自己細胞である。このようなex vivoでの方法は当該分野において既知である。
【００６１】
細胞は、当該分野において既知の技術を用いてオリゴヌクレオチドまたは核酸分子の投与によって操作されてもよい。例えば、「裸の」核酸分子（米国特許第５，６７９，６４７号）またはサポニン（例えば、米国特許第５，７３９，１１８号参照）またはカチオン性ポリアミン（例えば、米国特許第５，８３７，５３３号参照）等の、細胞による核酸分子の取り込みを促進する１以上の他の物質を組成物中に配合される核酸分子の直接注射によって；微小粒子照射(microparticle bombardment)（例えば「遺伝子銃」を用いて；Biolistic, Dupont）によって；脂質、細胞表面レセプターまたはトアンスフェクト剤で核酸分子を被覆することによって；リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセルに核酸分子をカプセル化することによって；核に入ることが知られているペプチドに連結させた核酸分子の投与によって；またはレセプターを特異的に発現する細胞型をターゲットにするのに使用できる、レセプターが仲介するエンドサイトーシスを受けるリガンドに連結させた核酸分子の投与によって、オリゴヌクレオチドおよび他の核酸分子を投与してもよい。
【００６２】
エンドソームを崩壊して、核酸がリソソームによる分解を受けないように、リガンドが融合ウィルスペプチドを含む、核酸リガンド複合体を形成をしてもよい；または特異的なレセプターを標的にすることによって、核酸分子をin vivoでの細胞の特異的な取り込み及び発現に対して標的化してもよい。加えて、細胞核内でのアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入、発現及び蓄積に関する効果的な方法が、米国特許第６，２６５，１６７号に記載され、これにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドを核内でセンスｍＲＮＡにハイブリッド形成させて、アンチセンスオリゴヌクレオチドがプロセッシングされるまたは細胞質に輸送されるのを防止する。本発明はまた、当該分野において既知の相同組換による核酸分子の細胞内導入および続いての宿主細胞への発現を目的としたＤＮＡ内への取り込みをも包含する。
【００６３】
また、ポリヌクレオチドを、適当な発現ベクターに組み込んでもよい。遺伝子療法用途に適する数多くのベクターが当該分野において既知である（例えば、Viral Vectors: Basic Science and Gene Therapy, Eaton Publishing Co. (2000)参照）。
【００６４】
発現ベクターは、プラスミドベクターであってもよい。プラスミドＤＮＡの作製および精製方法は、迅速でかつ簡便である。加えて、プラスミドＤＮＡは、一般的に、宿主細胞のゲノムに組み込まれずに、染色体への組み込みが引き起こす遺伝毒性の問題を排除する個々の存在としてエピソームの位置に維持される。様々なプラスミドが現在容易に商業的に入手可能であり、大腸菌(Escherichia coli)や枯草菌(Bacillus subtilis)由来のものがあり、多くが特に哺乳動物システムへの使用を目的として設計されている。本発明に使用されうるプラスミドの例としては、以下に制限されないが、真核生物発現ベクターである、ｐＲｃ／ＣＭＶ(Invitrogen)、ｐＣＲ２．１(Invitrogen)、ｐＡｄ／ＣＭＶ及びｐＡｄ／ＴＲ５／ＧＦＰｑ(Massie et al., (1998) Cytotechnology 28:53-64)が挙げられる。具体的な実施形態においては、プラスミドは、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ２(Invitrogen)、ｐＡｄＣＭＶ５(IRB-NRC)、ｐｃＤＮＡ３(Invitrogen)、ｐＡｄＭＬＰ５(IRB-NRC)、またはＰＶＡＸ(Invitrogen)である。
【００６５】
発現ベクターは、ウィルス系ベクターであってもよい。ウィルス系ベクターの例としては、以下に制限されないが、複製欠損性レトロウィルス、レンチウィルス、アデノウィルスおよびアデノ関連ウィルス(adeno-associated virus)由来のものが挙げられる。レトロウィルスベクターおよびアデノ関連ウィルスベクターは、現在、in vivoに、特にヒトに外因性オリゴヌクレオチドまたは遺伝子をトランスファーするために選択される組換遺伝子デリバリーシステムである。これらのベクターにより、遺伝子を効率よく細胞にデリバリーし、トランスファーされた核酸は、宿主の染色体ＤＮＡに安定的に一体化される。レトロウィルスを使用するための主な必要条件として、特に細胞集団に野生型ウィルスが蔓延する可能性があるという点で、ウィルスの使用の安全性を確保することがある。レトロウィルスベクターの起源となりうる、レトロウィルスとしては、以下に制限されないが、モロニーマウス白血病ウィルス、膵臓壊死ウィルス、ラウス肉腫ウィルス、ハーベイ肉腫ウィルス、トリ白血病ウィルス、テナガザル白血病ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、アデノウィルス、骨髄増殖性肉腫ウィルス、および乳癌ウィルスなどが挙げられる。特異的なレトロウィルスとしては、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭがあり、これらは当業者によく知られている。
【００６６】
細胞のバンク化(cell banking)
本発明は、異なる幹細胞系に簡便に系統的にアクセスするための幹細胞バンクまたはライブラリーを特徴とする。バンクまたはライブラリーのＳＢ細胞集団は、健常な被検者または利用者、例えば、研究者に有益であろう既知の病態または病気の症状を有する被検者由来である。また、上記幹細胞から分化した細胞を有する細胞バンクまたはライブラリーもまた、本発明の範囲に含まれる。幹細胞から分化した細胞の例としては、脳細胞、神経、星状膠細胞、グリア細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、軟骨細胞、骨細胞、膵島細胞、脂肪細胞、心臓細胞、肝細胞、腎細胞、肺細胞、筋細胞、および眼細胞が挙げられる。被検者は、ヒトまたは非ヒト脊椎動物であってもよい。幹細胞は、ヒト、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ等の、いずれの哺乳動物器官由来であってもよい。
【００６７】
バンクまたはライブラリーの細胞は、表現型情報、形態学的特徴、分化プロフィール、血液型、主要組織適合遺伝子複合体、ドナーの病状、または遺伝子型情報（例えば、遺伝子、またはゲノム若しくはミトコンドリアＤＮＡに関連した特定の核酸配列の一塩基多型（ＳＮＰ））等の、所定の特性に従って分類される。細胞は、幹細胞を生存させ、機能を維持するのに適切な条件下で（一般的に、凍結することによって）保存される。分類は以下に制限されないが、情報が入力された集積された文書記録(assembled written record)またはコンピューターデータベース等の、各細胞集団で得られた特性の一元化記録を作成することであってもよい。実質的に、本実施形態は、幹細胞バンクの作製に関する。幹細胞バンクによって、利用者のニーズに適する特定の幹細胞サンプルを複数のサンプルから容易に選択できる。したがって、本発明の他の実施形態は、別の源から得られる複数の幹細胞サンプルを含み、少なくとも一の所定の特性に従って特徴付けられ、分類される幹細胞バンクに関連する。別の実施形態は、複数の源から幹細胞サンプルを集め；少なくとも一の所定の特性に従ってサンプルを分類し、さらに細胞を生存可能な状態で維持する条件下で細胞を保存することを含む、幹細胞バンクの確立方法に関する。
【００６８】
幹細胞集団を生存可能な状態で維持する条件下で各容器に収納された複数の幹細胞集団；少なくとも一の処理モジュール、ディスプレイ、及び各幹細胞集団に関する少なくとも一の特性の情報を有する保存媒体を含むデータベースコンピューター；ならびに情報をユーザーによる指令時に前記ディスプレイ上で見ることができるための少なくとも一のプログラムコードモジュールを含む、幹細胞バンク化システムは、本発明の範囲に含まれる。特定の実施形態では、本発明は、幹細胞集団が病気の症状を有する被検者から得られる幹細胞を含む幹細胞バンク化システムを特徴とする。上記病気の症状としては、上記変性疾患がある。ＳＢ細胞集団を異なる病気を有する異なる被検者から集め、幹細胞の特性を明らかにする。特性（複数の特性）をデータベースコンピューターに入力する。加えて、または代わりに、細胞の特徴を、病気の症状に必ずしも関連しない特定の表現型に基づいて明らかにする。例えば、肝臓胞の特性は、異なる代謝能の遺伝的基礎、またはこれに関連する基本的な生理機能を研究するために、カフェイン、アルコール、薬剤等の特定の化合物の代謝能に基づいて明らかにすることができる。他の細胞型は、機能的および／または形態学的表現型に基づいて特徴付けることができる。
【００６９】
特定の実施形態において、ＳＢ細胞集団の幹細胞から分化した細胞を、操作されたベクター、または他の遺伝的材料の導入により分化または脱分化に影響を与える状態にさらしてもよい。脱分化は、あまり分化していない細胞の特性を呈するような細胞の操作を含む。
【００７０】
本発明の幹細胞ライブラリーは、上記したようにして変性疾患、癌または免疫疾患を治療するのに使用されてもよい物質または化合物をスクリーニングするのに使用できる。ライブラリーは、ハイスループットスクリーニング(high throughput screening)に適し、特定の被検者に特に有効な物質を同定するのに使用できる。ハイスループットスクリーニングでは、幹細胞を、マルチウェルプレートの若しくはスライドガラスのウェルまたはマイクロチップに入れ、試験物質と接触させてもよい。一般的に、細胞及び溶液を操作するために、および特に試験される機能に関して、細胞をモニターするために、ロボットを簡便に使用できるように、細胞を、一列に、特にアドレス可能な列に(in an addressable array)配置する。ハイスループットフォーマトを用いる利点としては、多数の試験物質を平行に試験でき、必要であれば、コントロール反応を試験条件と同じ条件下で行うことができることがある。そのため、本発明のスクリーニング方法は、幹細胞の機能を変えることができる物質、例えば、細胞を所望の細胞型に分化するように誘導する、または、例えば、高レベルの調節分子の発現を維持することによって、自然の分化(spontaneous differentiation)を阻害する物質を同定するために、１つの、数種の、または多数の試験物質をスクリーニングする手段を提供する。
【００７１】
万能ドナー細胞
上記幹細胞は、遺伝子操作して、移植を目的とした組織適合性ドナー細胞または組織を作製してもよい。移植及び細胞治療の目的は、機能不全の(failing)組織または器官を機能性ドナー組織または器官にうまく置換することである。しかしながら、移植を成功させるためには、以下の２つの主要な障壁を克服する必要がある：適切なドナー組織または器官の入手可能性及び免疫拒絶。機能不全の組織または器官の置換および拒絶の治療は、限られた数の許容できるドナーおよび毒性のある免疫抑制剤及び長期間の免疫抑制プロトコールを組み合わせて一緒に投与する必要があることによって、限定される。現在の実験的な移植プロトコールは、主に、同胞ドナー、他の少数の(small pools of)同種異系ドナー、及び異種ドナーに依存している。上記遺伝子操作された幹細胞を用いれば、これらの限定を克服できる。
【００７２】
より詳細には、本明細書で記載される幹細胞は、その表面クラスＩＩ  ＭＨＣ分子を発現しないように遺伝子操作してもよい。より好ましくは、細胞を、実質的に全ての細胞表面クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子を発現しないように操作される。本明細書中で使用される、「発現しない」ということばは、反応を誘発するのに不十分な量が細胞表面に発現することまたは発現するタンパク質が不足するため反応を誘発しないことのどちらかを意味する。
【００７３】
ＭＨＣ分子は、ＨＬＡ分子、詳細にはクラスＨＬＡ  Ａ、ＢおよびＣ、ならびにクラスＩＩ  ＨＬＡ  ＤＰ、ＤＱ、およびＤＲ、ならびにそのサブクラスのＨＬＡ分子を指す。この技術は、通常、ヒトＭＨＣに特異的であると解釈されるが、本明細書では、ドナー細胞種由来の等価のＭＨＣ遺伝子を包含することを意図し、例えば、細胞がブタ由来である場合には、ＨＬＡということばは、ＭＨＣ  ＩまたはＩＩにかかわらず、等価のブタＭＨＣ分子を指す。クラスＩＩ  ＭＨＣ分子を除去すると、ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、遺伝子操作された内皮細胞を認識しない；クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子双方を除去すると、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞は修飾細胞を認識しない。
【００７４】
幹細胞で行われる好ましい遺伝子修飾としては、１）集合(assembly)および細胞表面へのクラスＩＩ  ＭＨＣ分子の輸送ならびに抗原的ペプチドのローディング(loading)で機能する内因性不変鎖遺伝子を破壊する、および２）全てのクラスＩ  ＭＨＣ分子の細胞表面発現に必要なタンパク質をコードする、内因性β２−ミクログロブリン遺伝子（β２Ｍ遺伝子）を破壊する、ことがある。または、単に不変鎖遺伝子を破壊する。不変鎖は、抗原ペプチド断片をＭＨＣ  クラスＩＩ分子に挿入するのに必要であると考えられる。また、抗原ペプチド及びＭＨＣは、Ｔ細胞によって認識される。抗原ペプチドがないと、Ｔ細胞による認識は一般的に行われない、またはＭＨＣ  クラスＩＩ分子は適切に折り畳まれない。したがって、不変鎖を欠損した細胞では、ペプチドの提示(presentation)は無効であり、ほんのわずかな量の細胞表面ＭＨＣが得られたとしても、不変鎖を欠損した細胞はペプチドを欠損しているので、非免疫原性である。
【００７５】
これらの遺伝子の破壊は、相同組換遺伝子の標的技術によって達成されうる。これらの技術は、当該分野において既知である。例えば、米国特許第６９１６６５４号及び第６９８６８８７号を参照。
【００７６】
組成物
本発明は、上記細胞または活性薬剤／化合物を含む薬剤組成物を提供する。薬剤組成物は、治療上有効な量の細胞または活性薬剤／化合物、および、必要であれば他の活性物質を、製薬上許容できる担体と混合することによって調製できる。担体は、投与経路によって、様々な形態を有しうる。他の活性物質の例としては、既知のまたは上記のスクリーニング方法によって同定される活性化合物が挙げられる。
【００７７】
上記薬剤組成物は、従来の薬剤賦形剤及び調製方法を用いることによって調製できる。全ての賦形剤を、崩壊剤、溶媒、造粒剤、湿潤剤および結合剤と一緒に混合してもよい。本明細書中で使用される、「有効量」または「治療上有効な量」ということばは、特定の疾患の少なくとも１つの症状またはパラメータを測定可能な程度に改善できる量を意味する。治療上有効な量の上記幹細胞は、当該分野において既知の方法によって測定できる。疾患を治療するのに有効な量は、当業者に既知の経験的方法によって容易に測定できる。患者に投与されるべき正確な量は、疾患の状態および重篤度ならびに患者の健康状態によって異なるであろう。症状またはパラメータの測定可能な程度の改善(measurable amelioration)は、当業者によって決定されることができるまたは医師に対して患者によって報告されることができる。上記疾患の症状またはパラメータの臨床学的にまたは統計学的に有意な減退または改善は本発明の範囲に含まれると解されるであろう。臨床的に有意な減退または改善は、患者および／または医師に認識できることを意味する。
【００７８】
「製薬上許容できる」というフレーズは、ヒトに投与した時に、生理学的に許容でき、通常望まれない反応を引き起こさないような組成物の分子的実態および他の成分を意味する。好ましくは、「製薬上許容できる」いうことばは、哺乳類、より好ましくはヒトでの使用に対して連邦若しくは州政府のまたは米国薬局方もしくは他の一般的に承認された薬局方にリストされている監督官庁によって承認されることを意味する。製薬上許容できる塩、エステル、アミド、及びプロドラッグは、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、炎症、アレルギー反応などを引き起こすことなく患者の組織に接触させて使用するのに適しており、理にかなった利益／リスク比に見合っていて、使用目的に有効である、それらの塩（例えば、カルボン酸塩、アミノ酸付加塩）、エステル、アミド、およびプロドラッグを意味する。
【００７９】
上記薬剤組成物に適用される担体は、化合物と一緒に投与される希釈剤、賦形剤、またはベヒクルを指す。このような薬剤担体は、水または油等の、滅菌液体であってもよい。水または水溶液、食塩水、ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液を、特に注射溶液用の、担体として好ましく使用される。適切な薬剤担体は、"Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin, 18th Editionに記載される。
【００８０】
上記幹細胞は、輸液または注射（例えば、静脈内、くも膜下、筋肉内、腔内、気管内、腹腔内、または皮下）、経口、経皮に、または当該分野において既知の他の方法によって、個体に投与されてもよい。投与は、２週間に１回、１週間に１回、またはより頻度多くであってもよいが、頻度は病気または疾患の維持相中は減らしてもよい。
【００８１】
異種および自己細胞双方を用いることができる。前者の場合には、宿主反応を避けるまたは最小限にするためにＨＬＡ適合を行わなければならない。後者の場合には、自己細胞を被検者から増殖(enrich)、精製し、後の使用のために保存される。細胞は、ex vivoで宿主または移植Ｔ細胞の存在下で培養され、宿主中に再導入される。これは、宿主が細胞を自身であると認識し、Ｔ細胞活性の減少をよりもたらすという利点がある。
【００８２】
投与量および投与回数は、当業者に既知の急性期の少なくとも１つまたはより好ましくは１超の臨床的兆候を減少または消失させて、寛解期の維持を確認する、臨床的兆候に依存する。より一般的には、投与量および投与回数は、上記組成物による処置を検討している病気の状態または疾患の病理的兆候ならびに臨床的および亜臨床的症状の減退に一部依存している。投与量および投与計画は、当業者によって認識されているように、治療される患者または哺乳動物患者の共役効果および副作用ならびに医師の判断に加えて、投与される被検者の年齢、性別、健康状態によって調節されうる。上記方法すべてにおいて、幹細胞を、１×１０４〜１×１０１０／回で被検者に投与できる。
【００８３】
評価方法
本明細書に開示される幹細胞及び方法は、被検者を評価するのに使用できる。通常、若い健常な被検者は、幹細胞（ＳＳＥＡ４＋細胞、ＣＤ６６ｅ＋／ＢＬＳＣｓ、またはＣＤ９＋／ＳＢ−１細胞）の割合（％）が比較的より高い。下記実施例４で討論されるように、これらの細胞の数または割合（％）は、被検者の年齢に比例してまたは遺伝子異常若しくは望ましくない環境因子への暴露により減少する。この減少により、損傷後の組織の修復能等の、被検者の幹細胞が関連する能力が低下する。
【００８４】
また、下記実施例４に示されるように、これらの変化は、加齢が関連する疾患を有する被検者の危険性を評価するのに使用できる。例えば、被検者が平均レベルより高い場合には、彼または彼女は、損傷後の組織の修復能に優れ、癌を発症する危険性が高い。換言すると、被検者からのサンプル中の上記幹細胞が高レベルであるということは、被検者が、（１)組織の損傷を修復する、損傷から回復する、及び病原体を防御する能力がより高い、および（２）自己免疫疾患、心血管疾患、糖尿病、及び加齢が関連する他の疾患を発症する可能性がより低い若い発達状態(development status)であることを示す。これに対して、このようなより高いレベルは、癌を有する危険性がより高いことと正の相関関係にある。
【００８５】
下記特定の実施例は、単に詳細に説明するものであり、残りの開示を制限するものではないと解される。さらに詳細に説明しなくとも、当業者は、本明細書の記載に基づいて、本発明を十分利用できると考えられる。本明細書に引用される全ての公報は、参考で全体を本明細書中に引用される。さらに、下記で提案されるメカニズムは、本発明の範囲を限定するものではない。
【００８６】
実施例１
血液サンプルまたは骨髄サンプルをヒトから採取し、抗凝固ＥＤＴＡチューブまたはヘパリンチューブに入れた。チューブを４℃で６〜４８時間攪拌した後、サンプルは２層に分かれた。上層は、ＳＢ細胞集団を含み、これをさらにＣ６  ａｃｃｕｒｉフローサイトメトリー、免疫細胞化学、及びＲＮＡ抽出／ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。下層は、６．０μｍ以上の大きさである、赤血球及び白血球を含んだ。
【００８７】
上層の粒子を、フローサイトメトリーのサイズビーズ(size bead)によって分析した。これらは６．０μｍ未満であることが分かった。血小板及び微粒子(microparticle)は６．０μｍより小さいが核を持たないので、ＤＡＰＩまたはＳＹＴＯで染色できないことが知られている。粒子を試験するために、ＤＡＰＩ及びＳＹＴＯ染色を行った。結果から、多くの粒子が双方の染料、即ち、ＤＡＰＩ及びＳＹＴＯで陽性に染色されたので、これらの粒子は血小板や微粒子ではなくＤＮＡ核を有する細胞であることが示唆された。さらに、ＤＡＰＩ陰性の粒子は約０．０１〜１．５μｍであることが分かった。これらの結果から、上層（ＳｔｅｍＢｉｏｓ細胞集団またはＳＢ細胞集団と称する）は細胞／幹細胞、血漿板及び微粒子を含んでいたことが示唆される。
【００８８】
ＤＡＰＩ陽性粒子が確かに細胞であることを確認するために、これらの粒子を細胞培養ディッシュに播種し、３％ＦＢＳならびに１０ｍＭ  ｂＦＧＦ及びＥＧＦを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で培養した。
【００８９】
１週間培養した後、ディッシュを顕微鏡下で試験した。粒子の数が増加し、また、３μｍ超の大きさの細胞が多く現れたことが分かった。再度ＤＡＰＩ染色をすると、粒子中にＤＮＡが示される。数週間培養した後、幾つかの細胞が球状物を形成した。加えて、幾つかの細胞が、プライマー：ＡＧＣ  ＴＧＡ  ＡＣＧ  ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＴＣＡ  ＣＴ  （配列番号：１）およびＴＧＣ  ＴＧＴ  ＡＧＣ  ＣＡＡ  ＡＴＴ  ＣＧＴ  ＴＧ（配列番号：２）を用いた、ＲＴ−ＰＣＲによって示されるようにＧＡＰＤＨ遺伝子発現を発揮した。
【００９０】
ＤＡＰＩ陽性粒子が細胞であることをさらに確認するために、粒子を、標準的な技術を用いて、インキュベートし、ＧＦＰ発現カセットを含むレンチウィルス(Lenti virus)を感染させた。インキュベーション後、粒子がＧＦＰを発現することが分かった。レンチウィルスはＧＦＰを発現できるように染色体に組み込まれなくてはならないので、この結果から、粒子が染色体を含むことが示唆される。
【００９１】
これらの結果から、３μｍ未満のこれらの粒子が確かに細胞であり、増殖して３μｍ超の大きさの細胞を生じることが分かった。
【００９２】
次に、この細胞をＣ６  ａｃｃｕｒｉフローサイトメトリーにかけて、大きさを確認した。詳細には、０．１〜７μｍの大きさのビーズをＦＩＴＣと共役させて、フローサイトメトリーによって分析した。図１に示されるこれらのビーズの散乱パターンに基づいて、図２に示されるＰ３ゲート領域(P3 gated region)にある細胞の大きさを測定したところ、０．３〜６μｍであった。これに対して、赤血球（ＲＢＣ）はそれぞれ約６μｍの大きさであり、Ｔリンパ球はそれぞれ約６〜７μｍの大きさであった。ＤＡＰＩでさらに分析したところ、Ｐ３ゲート領域(P3 gated region)にある９０％の粒子が核染色を示すので、生きた細胞であることが示される。
【００９３】
次に、ＥＤＴＡチューブを用いて調製されたＳＢ細胞集団の細胞全てを、細胞マーカー分析にかけた。単離されたＳＢ細胞集団のＰ３ゲート領域にある細胞の７０％超（図３）がＣＤ９に対して強く陽性に染色され、９８％がＳＹＴＯによって陽性に染色された（図４）ことが分かった。場合によっては、ＳＢ細胞集団のＰ３ゲート領域にある細胞の９０％という多くがＣＤ９＋であった。ＳＹＴＯによって陽性に染色されたこれらのＣＤ９＋細胞を「ＳＢ−１細胞」と称する。また、ＳＢ細胞集団のＰ３ゲート領域にある細胞の約１５％（図３）がＳＳＥＡ１＋、ＳＳＥＡ４＋、ＣＤ１３＋、および／またはＳｔｒｏ１＋に対して陽性に染色された。また、これらの細胞のほとんどすべてが、ＳＹＴＯによって陽性に染色された（図５）。これらは、「ＳＢ−２細胞」と称する。これに対して、Ｐ６ゲート領域にあるＣＤ２３５ａ＋  ＲＢＣは、ＳＹＴＯによって陰性に染色された（図６）。
【００９４】
さらに、試験された全てのＳＢ細胞集団がＣＤ３４９＋細胞を含むことが分かった。ＣＤ９＋細胞のうち、約２５％という高い割合の細胞がＣＤ３４９＋であった。ＲＴ−ＰＣＲ分析から、ＳＢ細胞集団の幹細胞は、Ｓｏｘ２及びＣＸＣＲ４ではなく、ＣＤ９、ＣＤ３４９、Ｏｃｔ４、及びＮａｎｏｇを発現したことが示される。ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーを、下記に示す。
【００９５】
【化１】
0006022455.tif 000002
【００９６】
４０個の異なる血液サンプルをフローサイトメトリーによってさらに分析したところ、ＳＢ細胞集団の上記Ｐ３ゲート領域が、５％未満のＣＤ３１＋、ＣＸＣＲ４＋、ＣＤ６６＋および／またはＣＤ２７１＋である細胞を含んだことが示される。殆どのサンプルで、この領域は、１％未満の、ＣＤ６６ｅまたはＣＤ６６ａ陽性である細胞を含んだ一方で、３サンプルのみが２％超の、ＣＤ６６ｅまたはＣＤ６６ａ陽性である細胞を含んだ。これから、割球様幹細胞がＳＢ幹細胞集団の主成分ではないことが示唆された。確かに、ＣＤ９＋またはＣＤ９＋ＣＤ３４９＋細胞がＳＢ幹細胞集団の主成分であることが分かった。
【００９７】
さらに、ＳＢ細胞集団の細胞の幾つかが、間葉幹細胞（ＭＳＣ）に対するマーカーである、ＣＤ９０に陽性であった；さらに、幾つかが、造血幹細胞（ＨＳＣ）に対するマーカーである、ＣＤ３４に陽性であった。しかし、これらの細胞は、ＳＢ細胞集団の上記Ｐ３ゲート領域にある細胞の１％未満占めていただけであった。加えて、ＳＢ細胞集団の上記Ｐ３ゲート領域にある細胞の１％未満がＣＤ１３３に対して陽性に染色された。
【００９８】
しかしながら、ＳＢ細胞集団が血小板を含む可能性があるとしても、血小板の半減期はたった５〜９日である。ＳＢ細胞集団は、ＥＤＴＡまたはヘパリンチューブに採取された後１２日以上４℃で生存でき、依然としてＣＤ９及びＣＤ３４９発現が非常に強い。
【００９９】
興味深いことに、１つのアッセイにおいて、ＳＢ細胞集団を、免疫疾患のある１８歳の患者から調製した。このサンプルを上記幹細胞マーカーについて試験したところ、この患者は、他の健常な人々（コントロールレベル）に比べて、より高いレベルの、ＳＳＥＡ４、ＣＤ６６ｅ、ＣＸＣＲ４、ＳＳＥＡ１、Ｓｔｒｏ１、ＣＤ３４、ＣＤ９、ＣＤ３４９、ＣＤ５６、またはＣＤ１８４を有していることが分かった。
【０１００】
実施例２
アッセイを行ったところ、上記指摘されるように、増殖するＳＢ細胞は異なる細胞系に分化できる幹細胞であることが示された。
【０１０１】
簡潔にいうと、ＳＢ細胞集団を、上記したようにして被検者から得た。次に、この細胞を、分化培地で培養した。２週間後、培養物中で、ＣＤ９＋ＣＤ３４９＋及びＣＤ９＋ＣＤ３４９−細胞が球状物を形成し、球状物を有する細胞がＳＳＥＡ４（ＥＳ細胞マーカー）、ＣＤ６６ｅ（ＢＬＳＣマーカー）、ＣＤ９０、及びＣＤ７３に対して陽性であることが分かった。また、ＳＢ細胞集団の幹細胞が接合子様構造物を形成し、コラーゲン被覆プレートで多層状に生育することも分かった。
【０１０２】
追加のアッセイを行い、ＳＢ細胞集団がさらに外胚葉（例えば、神経系細胞及び表皮細胞）、中胚葉（例えば、含脂肪細胞、骨形成原細胞、及び筋肉細胞）、及び内胚葉（例えば、肝細胞及び島細胞）に分化できるかを試験した。分化マーカーをリアルタイムで検出するのに使用される全てのプライマーを下記に列挙する：
【０１０３】
【化２】
0006022455.tif 000003
【０１０４】
【化３】
0006022455.tif 000004
【０１０５】
骨髄由来のＳＢ細胞集団を、ニューロン（外胚葉）及び島細胞（内胚葉）の形成のための初期マーカーである、ネスチンを発現するように誘導した。簡潔にいうと、ＳＢ細胞集団を、２〜４週間、標準的な培地で培養した後、１０ｍＭ  グルココルチコイド及び１０％  ＦＢＳを含む誘導培地に切り替えた。１カ月処理した後、ＲＮＡを抽出して、遺伝子発現をリアルタイムＰＣＲ(Real Time PCR)によって測定した。ネスチンの発現をプライマー対：配列番号：３７及び３８を用いたＲＴ−ＰＣＲによって検出した。
【０１０６】
内胚葉細胞の特性を、その多角形によって決定した。２つの肝細胞マーカー（トランスフェリン及びアルブミン）および３つの島細胞マーカー（インスリン、α−フェトプロテイン及びＨＮＦ４  α）の発現を検出した。加えて、ウェスタンブロット及びＥＬＩＳＡ双方により、分化細胞でのアルブミンの発現をも検出した。これらの結果から、ＳＢ細胞集団の幹細胞は肝細胞に分化し、島細胞に分化するものもあったことが示される。
【０１０７】
内胚葉細胞の特性をそのフィラメント様特徴によって明らかになった。ＳＢ細胞集団の幹細胞の神経細胞への分化をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって確認し、これにより、ＣＤ１３３、ネスチン、微小管結合タンパク質ＩＩ(microtubule-associate protein II)、ＧＡＢＡレセプター、ＮＲ４Ａ２、Ｎ−ｃａｍ、チロシンヒドロキシラーゼ、ニューロフィラメント、及びＴａｕ等の、多くの神経マーカーの発現を検出した。
【０１０８】
さらに、血液由来のＳＢ細胞集団を、含脂肪細胞または骨形成原細胞、即ち、中胚葉に分化するように誘導した。より詳しくは、２人のドナー、ドナー２９及びドナー３２の血液由来のＳＢ細胞集団を、培地、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥで順次培養した。次に、培地を、８週間、含脂肪細胞分化培地(Invitrogen)に置換した。含脂肪細胞を、オイル−レッドーＯ(Oil-red-O)を用いて染色し、ＯＤ４９０  ＥＬＩＳＡスペクトロメーター（OD490 ELISA spectrophotometer）で検出した。ドナー２９は、ＳＢ細胞集団のずば抜けて高い細胞数を有し、これにより、高含脂肪細胞数となった。または、培地を骨形成培地(osteogenesis medium)(Invitrogen)に置換した。培地置換してから２〜４週間で、骨形成原細胞を観察した。骨形成原細胞をアリザリンレッドで染色し、細胞からアリザリンレッドを抽出することによって検出した。この際、アリザリンレッドはスペクトロメーターでＯＤ  ４０５ｎｍで測定した。
【０１０９】
他の内胚葉細胞への誘導には、ＳＢ集団の幹細胞を、１０ｎＭ  グルココルチコイド及び１０％  ＦＢＳを含む培地で培養した。１カ月処理した後、ＲＮＡを細胞から抽出し、幾つかの遺伝子の発現をリアルタイムＰＣＲで測定した。ミオシン重鎖及び骨格筋ミオシン軽鎖の検出可能な発現から、ＳＢ細胞集団の幹細胞が心筋細胞や骨格筋細胞に分化したことが示される。
【０１１０】
ＥＳ細胞と同様、ＳＢ細胞集団は、ＭＥＦフィーダー細胞の上部で増殖／成長し、ＭＥＦフィーダー細胞上で球状物を形成できるであろう。また、ＥＳ細胞と同様、同様の条件下では、ＳＢ細胞集団は、異なる型の細胞を形成し、細胞の自己切断の接合体様構造物を形成できるであろう。
【０１１１】
上記結果から、ＳＢ細胞集団は一般的に組織では休眠状態であることが示唆される。シグナルを受け取る、例えば、損傷を受けると、活性化され、適当な組織に分化して、損傷を受けた組織を修復する。ゆえに、ＳＢ細胞集団は、成熟多能性幹細胞を含み、遺伝子療法、遺伝子のバンク化(gene banking)、薬剤のスクリーニング、及び万能ドナー細胞(universal donor cell)の作製に使用できる。また、これらの細胞は、変性疾患、自己免疫疾患、または癌を治療するのに使用できる。
【０１１２】
実施例３
ＳＢ−１細胞を含む、ＳＢ細胞集団の幹細胞への２価カチオンキレート剤であるＥＤＴＡの役割を試験するために、アッセイを行った。
【０１１３】
簡潔にいうと、ＳＢ細胞集団を、上記実施例１と同様にして、それぞれ、ＥＤＴＡチューブ及びヘパリンチューブを用いて被検者から得た。２集団におけるＳＢ細胞の数を標準的な方法によって測定した。結果を下記に示す。
【０１１４】
【表１】
0006022455.tif 000005
【０１１５】
ＥＤＴＡチューブ及びヘパリンチューブにおける１〜６．０μｍの細胞／粒子の割合（％）は、それぞれ、約５．８％及び０．２％であった。この結果から、ＥＤＴＡはＳＢ−１細胞の数を増加させたことが示唆される。
【０１１６】
さらに、ヘパリンチューブで調製されたＳＢ細胞集団を２サンプルに分けた。一方をＥＤＴＡ含有培地でインキュベートし（「ヘパリン＋ＥＤＴＡ」）；他方をＥＤＴＡを含まない培地でインキュベートした（「ヘパリン」）。３日間培養した後、２サンプルにおける小細胞（＜３μｍ）の割合を測定した。また、２サンプルにおける大細胞（＞３μｍ）の割合を測定した。結果を下記に示す。
【０１１７】
【表２】
0006022455.tif 000006
【０１１８】
これらの結果から、ＥＤＴＡの存在下では、ＳＢ細胞集団中の小細胞の数が３００％（１６１：４０）を超えて増加し；これに対して、大細胞（即ち、非ＳＢ細胞）の数はたった２５％（１０：８）しか増加しなかったことが示される。
【０１１９】
また、１被検者からのセルサイトメトリーのデータから、ＥＤＴＡはＳＢ細胞集団の上記Ｐ３ゲート領域(P3-gated region)で３９．５％から６５．１％にまでサンプル中のＣＤ９＋／ＳＢ−１細胞の数を増加させたことが示された。これに対して、ヘパリンチューブを用いて調製されたＳＢ細胞集団は、ＳＳＥＡ１＋及びＣＤ６６ｅ＋である細胞の割合がかなりより高い、即ち、２〜１０％であった。
【０１２０】
ＥＤＴＡチューブでの細胞／粒子数の増加は、おそらく、血小板及び微粒子の数の増加によるものであった。確かに、ＥＤＴＡは血小板や微粒子が凝集体を形成して沈殿するのを防止できる。この可能性を排除するために、ヘパリンチューブから調製されたＳＢ細胞集団を４８〜７２時間ＥＤＴＡと共にインキュベートした後、セルサイトメトリーを行った。粒子数の増加のほとんどは幹細胞によるものであり、その大きさは１μｍ〜６．０μｍの範囲であることが分かった。細胞数は５０％増加した。
【０１２１】
ＣＤ９＋細胞をさらに精製する（または、血小板及び微粒子を除去する）ために、ＥＤＴＡチューブから調製したＳＢ細胞集団を約２４時間ＡＤＰと共にインキュベートした。ＣＤ９＋ＣＤ３４９＋細胞がこのＡＤＰとのインキュベートによってさらに増殖することが分かった。ＣＤ９＋ＣＤ３４９＋細胞はＡＤＰと共にインキュベートしたＳＢ細胞集団の上記Ｐ３ゲート領域(P3-gated region)にある細胞の１５．９％を占めた；これに対して、ＣＤ９＋ＣＤ３４９＋細胞はＡＤＰと共にインキュベートしなかったＳＢ細胞集団の上記Ｐ３ゲート領域(P3-gated region)にある細胞の９．９％しか占めなかった。
【０１２２】
これらの結果から、ＥＤＴＡは、６．０μｍより小さくＣＤ９＋には陽性に染色されるがＣＤ６６ｅ＋またはＳＳＥＡ４＋細胞には陽性に染色されない、ＳＢ−１細胞の数を特異的に増加させたことが示される。このメカニズムは、ＥＤＴＡが（おそらくＺｎ＋＋をキレート化することによって）ｐ５３の機能を抑制でき、これにより幹細胞がＧ０の休止段階から存在して、細胞周期Ｇ０に入ることができることに関係がある。ｐ５３タンパク質は、適切に畳まれて機能性タンパク質を形成するのにＺｎ＋＋を必要とするので、ＥＤＴＡによるＺｎ＋＋キレート化は幹細胞の活性化の重要なステップであろう。ＥＤＴＡは他の２価イオンをキレート化することにより、Ｇ０相にある幹細胞を活性化し、幹細胞を増殖、拡張させることができる可能性がある。
【０１２３】
実施例４
以下で述べるように、ＳＢ細胞集団の細胞数を測定することを用いることによって、加齢に関連する疾患または癌を有する被検者の危険性を評価できる。
【０１２４】
フローサイトメトリーによると、５０歳を超える２人の健常な男性は２人とも、ＳＢ細胞集団の上記Ｐ３ゲート領域(P3-gated region)のＣＤ３４９＋細胞の割合（％）が１５％未満、即ち、それぞれ１２．０％及び４．２％であった。これ対して、２５歳より若い２人の健常な男性のＳＢ細胞集団のＣＤ３４９＋細胞の割合（％）は２人とも、１５％超、即ち、それぞれ１８．６％及び２２．９％であった。これらの結果から、若い健常な被検者は、それぞれ、年配の健常な被検者に比べて、ＳＢ細胞集団の細胞数が比較的より高いことが示される。この加齢に関連する減少は、損傷後の組織の修復能等の、被検者の幹細胞による能力を低下させる。
【０１２５】
またフローサイトメトリーによって測定されるように、ＳＳＥＡ４＋細胞は、若い癌生存者から単離されたＳＢ細胞集団の上記Ｐ３ゲート領域(P3-gated region)の細胞の３５．６％を占めた。この細胞数は、若い健常な人々のグループの平均値よりかなり高い。このより高い平均ＳＳＥＡ４数に基づくと、この被検者は損傷した組織の修復能に優れ、癌を発症する危険性が高いと、予測される。この評価結果は、（１）眼のレーシック手術や腹部手術からの迅速な回復等の、被検者の良好な修復能の履歴によって及び（１）被検者の癌の履歴によって裏付けられる。同様の評価結果が本明細書に記載されるＣＤ９＋細胞を用いてなされうる。
【０１２６】
上記結果から、上記ヘパリンチューブから調製された、ＳＢ細胞集団の幹細胞（例えば、ＳＳＥＡ４＋細胞／ＳＢ−２またはＣＤ９＋／ＳＢ−１細胞）は、in vivoでの薬剤のスクリーニング、損傷または感染から回復する予後、及び癌診断のバイオマーカーとして使用できる。高レベルのＳＳＥＡ４＋またはＣＤ９＋細胞は、被検者がより良好な組織損傷の修復能、損傷からの回復能、及び病原体の防御能を有する若い発達状態であることを示す。これに対して、これは癌を有する危険性がより高いことと正の相関関係がある。
【０１２７】
実施例５
In vivoでの細胞追跡アッセイにおいて、ヒト骨髄サンプルから単離された、ＳＢ細胞集団由来の１０６個の細胞を、ＳＣＩＤマウスの尾静脈に注射した（実験ＳＣＩＤマウス）。コントロールとして、ＰＢＳをＳＣＩＤマウスの尾静脈に注射した（コントロールＳＣＩＤマウス）。３０、６０、及び９０日後、骨髄、血液、及び筋肉を実験及びコントロールＳＣＩＤマウス双方から集めた。マウスの骨髄サンプルをフローサイトメトリーを用いて分析した。結果から、ＭＳＣマーカー（即ち、ヒトＣＤ１０５、ＥＧＦレセプター、Ｓｔｒｏ１、及びＣＸＣＲ１）、ＢＬＳＣマーカー（即ち、ＣＥＡ）、および微小胚性様幹細胞（ＶＳＥＬ）マーカー（即ち、ＣＤ１３３）が実験ＳＣＩＤマウスでは検出されたが、コントロールＳＣＩＤマウスでは検出されなかったことが示される。これらの結果から、ＢＬＳＣ、ＶＳＥＬ、及びＭＳＣがＳＢ細胞集団の幹細胞の下流にあることが示唆される。加えて、マウスの筋肉サンプルから抽出されたＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ヒト筋原因子４（myogenic factor 4）、ＳＭ２２、Ｐａｘ７、及びＧＡＰＤＨがリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって検出された。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで筋肉マーカーを検出するのに使用された全てのプライマーを以下に列挙する。
【０１２８】
【表３】
0006022455.tif 000007
【０１２９】
他の実施形態
本明細書に開示されるすべての特徴は、いずれの組み合わせで組み合わされてもよい。本明細書に開示される各特徴は、同じ、等価の、または同様の目的に適う別の特徴に置換されてもよい。ゆえに、特記しない限り、開示される各特徴は、一連の等価のまたは同様の特徴の一例であるのみである。
【０１３０】
本発明の多数の実施形態が記載されている。にもかかわらず、本発明の概念および範囲を逸脱することなく、様々な変更がなされることは理解されるであろう。したがって、他の実施形態が下記特許請求の範囲に含まれる。
【図１】
0006022455.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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