(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）の存在下で試料中のトロンビンを定量化するためのインビトロイムノアッセイであって、
前記試料をトロンビンの基質結合部位を認識する小分子と接触させる工程であって、前記小分子は、天然起源のヒルジン、合成ヒルジン変異体、ヒルジン誘導体、組換えヒルジン変異体、ヒルジン類似体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される工程と、
前記試料にトロンビンに特異的な抗体を加える工程であって、前記トロンビンに特異的な抗体は、ブロックされた活性部位を有するトロンビンに対して産生される、工程と、
前記抗体の前記トロンビンとの結合を測定する工程と、
存在するトロンビンの量を測定する工程と、
を含み、
前記抗体は、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）、４−アミノフェニルピルビン酸（ＡＰＰＡ）、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子でブロックされた活性部位を有するトロンビンに対して産生される、
イムノアッセイ。
【請求項２】
前記試料は、血液又は血液成分からなる群から選択される生物学的検体である、請求項１に記載のイムノアッセイ。
【請求項３】
前記トロンビンに特異的な抗体は、ポリクローナル抗体又はその断片である、請求項１または２に記載のイムノアッセイ。
【請求項４】
前記イムノアッセイは、固相免疫測定法である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のイムノアッセイ。
【請求項５】
前記固相免疫測定法は、サンドイッチイムノアッセイである、請求項４に記載のイムノアッセイ。
【請求項６】
前記トロンビンの量の測定は、トロンビンの標準曲線で行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のイムノアッセイ。
【請求項７】
アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）を含む試料中のトロンビンを定量化するキットであって、
トロンビンに特異的なポリクローナル抗体又はその断片と、トロンビンの基質結合部位を認識する小分子とを含み、ここで、前記小分子は、天然起源のヒルジン、合成ヒルジン変異体、ヒルジン誘導体、組換えヒルジン変異体、ヒルジン類似体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されており、
前記トロンビンに特異的な抗体は、ブロックされた活性部位を有するトロンビンに対して産生され、ここで、前記抗体は、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）、４−アミノフェニルピルビン酸（ＡＰＰＡ）、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子でブロックされた活性部位を有するトロンビンに対して産生される、
キット。
【請求項８】
前記キットは、イムノアッセイキットである、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
精製トロンビンを更に含む、請求項７または８に記載のキット。
【請求項１０】
アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）とトロンビンとを含む試料中のトロンビンを定量化するためのインビトロイムノアッセイであって、
前記試料をトロンビンの基質結合部位を認識する小分子と接触させる工程であって、前記小分子は、天然起源のヒルジン、合成ヒルジン変異体、ヒルジン誘導体、組換えヒルジン変異体、ヒルジン類似体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される工程と、
前記トロンビンを活性部位がブロックされたトロンビンに対して産生されるトロンビンに特異的な抗体と接触させる工程と、
結合した抗体のレベルを測定する工程と、
を含み、
前記抗体は、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）、４−アミノフェニルピルビン酸（ＡＰＰＡ）、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子でブロックされた活性部位を有するトロンビンに対して産生される、
イムノアッセイ。
【請求項１１】
前記試料は、血液又は血液成分からなる群から選択される生物学的検体である、請求項１０に記載のイムノアッセイ。
【請求項１２】
前記トロンビンに特異的な抗体は、ポリクローナル抗体又はその断片である、請求項１  または１１に記載のイムノアッセイ。
【請求項１３】
前記イムノアッセイは、固相免疫測定法である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のイムノアッセイ。
【請求項１４】
前記固相免疫測定法は、サンドイッチイムノアッセイである、請求項１３に記載のイムノアッセイ。
【請求項１５】
前記トロンビンの量の測定は、トロンビンの標準曲線で行われる、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のイムノアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）を含む試料中のトロンビンを定量化するためのイムノアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
トロンビン（α−トロンビン）は、凝固カスケード又は血栓形成において重要な役割を果たす内因性溶解の（endolytic）セリンプロテアーゼである。トロンビンは、チモーゲンのプロトロンビンの酵素の切断によって生成される。切断は活性化第Ｘ因子（因子Ｘａ）によって行われる。ヒトトロンビンは、軽鎖（〜６ｋＤａの分子量を有する）及び重鎖（〜３１ｋＤａの分子量を有する）からなる。トロンビンは、重鎖内にある活性部位を含む。トロンビンは、アルギニン結合を有するタンパク質の基質に対して高い特異性を有し、その主な基質はフィブリノーゲンである。トロンビンは、フィブリノーゲンを結合してフィブリンに変える。トロンビンはまた、プロテインＣ、血小板、第ＸＩＩＩ因子、及び血漿プロカルボキシペプチダーゼＢ（ＴＡＦＩ）を活性化する。
【０００３】
通常、トロンビンの活性化は血漿中で阻害される。血漿中に存在するトロンビンの主なインヒビターは、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）、及びより少ない程度でヘパリン補助因子ＩＩである。これら両方のインヒビターによる阻害の割合は、ヘパリンの最適濃度の存在下で大きく増加する。トロンビンの他の生理的インヒビターは、α２−マクログロブリン及びα１−アンチトリプシン１−４である。
【０００４】
ＡＴ−ＩＩＩは、トロンビンと因子Ｘａとを結合することによって凝固カスケードを阻害する。ＡＴ−ＩＩＩの阻害活性は、ヘパリンの存在下で著しく増加する。ヒト血漿中のアンチトロンビンＩＩＩの正常濃度は高く、およそ０．１２ｍｇ／ｍＬである。トロンビンの不活性化は、トロンビンがＡＴ−ＩＩＩと等モルの複合体でトラップした結果として生じる。複合体の形成は、トロンビンの活性部位が基質にアクセスすることを防ぐ。アンチトロンビンＩＩＩ−トロンビンの複合体の形成には、トロンビンとＡＴ−ＩＩＩ内の特異的反応性のペプチド結合との間の相互作用が関与する。ヒトＡＴ−ＩＩＩでは、この結合はアルギニン（ａｒｇ）３９３とセリン（ｓｅｒ）３９４との間である。
【０００５】
循環中の異常に高いレベルのトロンビンは凝固カスケードを引き起こす可能性があり、その結果、全身性血液凝固障害が生じる。被検生体試料、例えば、血液試料中のトロンビンのレベルを迅速に定量測定できる方法は、考慮すべき生物医学的関心事である。ヒト及び動物モデルの血漿中のトロンビンの迅速な定量分析は更に、トロンビンを含む止血剤の実験的使用及び日常的使用の安全評価のために非常に重要であり得る。
【０００６】
比較的大量の酵素前駆体のプロトロンビンが存在する基礎環境、例えば、血漿試料中で、トロンビンに特異的な抗体を用いるイムノアッセイによるトロンビンの検出は、難しい可能性がある。
【０００７】
米国特許第４７５３８７５号はトロンビンをアッセイするための方法を開示し、その方法では、タグ付き過剰量のトロンビンインヒビター（例えば、タグ付きヒルジン又はタグ付きＡＴ−ＩＩＩ）をトロンビンを含む被検試料と一緒に溶液に混合し、タグ付きインヒビター−トロンビンの複合体と、タグ付き遊離インヒビターとの混合物を形成する。次に、アンチトロンビン抗体を加え、タグ付きインヒビター−トロンビンとトロンビンに特異的な抗体との複合体を形成する。次に、複合体をタグ付き遊離インヒビターから分離し、タグを測定する。３Ｈ−ヒルジンを加え、セルロースと結合したトロンビンに特異的な抗体でトロンビン−ヒルジン複合体を分離することによって、血漿の試料中のトロンビンを検査するためのアッセイを例示する。すなわち、この検査は、例えば、アフィニティークロマトグラフィーのカラム分離の追加の工程を用いる、複雑な分離の工程を必要とする。
【０００８】
米国特許第５２９６３５２号は、トロンビン／ヒルジン−複合体及びその誘導体に対する、またそれらを認識するモノクローナル抗体を開示する。米国特許第５２９６３５２号は、トロンビン／ヒルジン複合体を検出するためのモノクローナル抗体の使用を開示する。同特許は更に、モノクローナル抗体は、被験者の少量の自然発生トロンビンを検出するのに使用できることを開示する。方法は、被験者にヒルジンをトレーサーとして注入し、続いて、形成された複合体トロンビン／ヒルジンをその複合体を認識するモノクローナル抗体を用いて測定することを含む。血漿中に存在するトロンビン−ヒルジン複合体を測定するためにＥＬＩＳＡアッセイを例示する。この検査は、トロンビンを検査するために被験者にヒルジンを注入する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
血液試料中のトロンビンのレベルを測定するためのインビトロで、簡単、迅速、かつ有効な検査の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）の存在下で試料中のトロンビンを定量化するためのインビトロイムノアッセイに関する。
【００１１】
一態様では、イムノアッセイは、試料をトロンビンの基質結合部位を認識する小分子と接触させる工程と、トロンビンを活性部位がブロックされたトロンビンに対して産生されるトロンビンに特異的な抗体と接触させる工程と、結合した抗体のレベルを測定する工程とを含む。
【００１２】
別の態様では、イムノアッセイは、試料をトロンビンの基質結合部位を認識する小分子と接触させる工程と、試料にトロンビンに特異的な抗体を加える工程であって、トロンビンに特異的な抗体は、ブロックされた活性部位を有するトロンビンに対して産生される、工程と、抗体とトロンビンとの結合を測定する工程と、存在するトロンビンの量を測定する工程とを含む。
【００１３】
本発明の一実施形態では、試料は、血液又は血液成分からなる群から選択される生物学的検体である。
【００１４】
本発明の別の実施形態では、小分子は、天然起源のヒルジン、合成ヒルジン変異体、ヒルジン誘導体、組換えヒルジン変異体、模倣物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１５】
更なる実施形態では、トロンビンに特異的な抗体は、ポリクローナル抗体又はその断片である。
【００１６】
本発明の更に別の実施形態では、抗体は、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）、４−アミノフェニルピルビン酸（ＡＰＰＡ）、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチドで、ブロックされた活性部位を有するトロンビンに対して産生される。
【００１７】
本発明の更に別の実施形態では、イムノアッセイは、サンドイッチイムノアッセイ等の固相免疫測定法である。
【００１８】
本発明の更に別の実施形態では、トロンビンの量の測定はトロンビンの標準曲線で行われる。
【００１９】
本発明は、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）を含む試料中のトロンビンを定量化するキットも提供し、キットは、トロンビンに特異的なポリクローナル抗体又はその断片と、トロンビンの基質結合部位を認識する小分子とを含み、トロンビンに特異的な抗体は、ブロックした活性部位を有するトロンビンに対して産生される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】緩衝液の試料中のトロンビンのレベルを測定するために開発したイムノアッセイの性能（ＯＤ値）を示す。
【図２】次第に増加する濃度のトロンビンを添加した血漿試料中で得たＯＤ値（▲）と比較した、次第に増加する濃度のトロンビンを含む緩衝液の試料中の、トロンビンに特異的なイムノアッセイによって得られたＯＤ値（◆）を示す。
【図３】次第に増加する濃度のトロンビンを含む緩衝液の試料及びＡＴ−ＩＩＩを含む試料（▲）、並びに、ＡＴ−ＩＩＩの非存在下で次第に増加する濃度のトロンビンを含む緩衝液の試料（◆）における、トロンビンに特異的なイムノアッセイによって得られたＯＤ値を示す。
【図４】イムノアッセイによってトロンビンを検出することに関して、トロンビン試料にヒルジン及び血漿の混合物を加えることの効果を示す。
【図５】イムノアッセイによってトロンビンを検出することに関して、ヒルジン及びＡＴ−ＩＩＩの混合物を加えることの効果を示す。
【図６】イムノアッセイによってトロンビンを検出することに関して、ヒルジン、ＡＴ−ＩＩＩ及びヘパリンの混合物を加えることの効果を示す。
【図７】試料にヒルジンを加えることによって、トロンビンに特異的なイムノアッセイを用いて血漿試料中のトロンビンを検出するレベルの増加を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
トロンビンに特異的なイムノアッセイによるトロンビンの検出は、血漿中に存在する物質の干渉によって損なわれることが本発明によって判明した。血漿中に検出した干渉は、少なくとも一部分は、ＡＴ−ＩＩＩが存在するためであり得ることも判明した。
【００２２】
更に、本発明により、驚くべきことに、ヒルジンを含む試料にＡＴ−ＩＩＩと共にトロンビンを加えることは、ヒルジンを欠く対照試料と比較して、試料中のトロンビンを検出するトロンビンに特異的なイムノアッセイの能力を増加させる結果となったことが判明した。これらの結果は、ヒルジンがアンチトロンビンＩＩＩの存在下でトロンビンの検出を高めることを示している。
【００２３】
トロンビン分子中のヒルジン及びＡＴ−ＩＩＩの結合部位は異なること、及びＡＴ−ＩＩＩとは対照的にヒルジンは小分子であることを考えると、これらの発見は驚くべきことである。トロンビン中のヒルジン結合部位は、トロンビンのフィブリノーゲン結合部位と重複する（Ｃｈａｎｇ  ＪＹ．Ｔｈｅ  ｈｉｒｕｄｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｌｐｈａ−ｔｈｒｏｍｂｉｎ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｓｙｌ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｗｈｉｃｈ  ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｈｉｒｕｄｉｎ−ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９８９  Ｍａｙ  ５；２６４（１３）：７１４１〜６；Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ  ＪＡ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２００５  Ａｕｇ；３（８）：１８６１〜７２）のに対して、ＡＴ−ＩＩＩ結合部位は、トロンビンの触媒部位と重複する（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  ＭＪ．Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｒｉｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＩＩＩ／ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｒｉｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９８２  Ｊｕｌ  １０；２５７（１３）：７３６０〜５；ａｎｄ  Ｍａｒｋｗａｒｄｔら、Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．１９７３  Ｖｏｌ．２，３４３〜３４８）。
【００２４】
トロンビンをＡＴ−ＩＩＩと混合した後にヒルジンを加えることは、ヒルジンの不在下の対照と比較して、トロンビンの検出に増加をもたらすことも判明した。ＡＴ−ＩＩＩを含む血漿試料又は他の試料を検査するとき、ヒルジンはトロンビンに特異的なイムノアッセイで遭遇する干渉を減少させる。
【００２５】
メカニズムに拘束されないで、トロンビン中の抗原群は、トロンビンのＡＴ−ＩＩＩとの結合によって隠される及び／又は変更されるように見え、またヒルジンを加えることは、ＡＴ−ＩＩＩがイムノアッセイに及ぼす干渉を減少させ、その結果イムノアッセイによるトロンビンの検出を増加させるように見える。
【００２６】
これらの発見は、ＡＴ−ＩＩＩのレベルが高い条件下で、すなわち、血漿試料に見られる一般的な条件下で、トロンビンのレベルの測定を可能にするイムノアッセイ方法の開発への道を開く。
【００２７】
本発明は、ＡＴ−ＩＩＩの存在下で試料中のトロンビンを定量化するためのインビトロイムノアッセイを提供し、その方法は、試料をフィブリノーゲン結合部位等のトロンビン基質結合部位を認識する小分子と接触させる工程と、試料にトロンビンに特異的な抗体を加える工程と、抗体とトロンビンとの結合を測定する工程と、存在するトロンビンの量を測定する工程とを含む。
【００２８】
用語「接触」は、小分子を試料と接触させる結合作用を指し、より具体的には、試料中に存在する小分子とトロンビンとの間で結合相互作用が発生するような方法で小分子をトロンビンと接触させる結合作用を指す。
【００２９】
用語「小分子」は、例えば、４００〜５０，０００ダルトン、又は４００〜４０，０００ダルトン、又は４００〜８，０００ダルトン、又は４００〜１０００ダルトン、又は５，０００〜４０，０００ダルトン、又は１，０００〜８，０００ダルトンの範囲等の４００〜１００，０００ダルトンの範囲の分子量を有する分子を指す。小分子は、類似の三次元構造を有するが非重複性配列を示すヒルジンの合成模倣物であり得る。ヒルジンの模倣物は、例えば、ランダムペプチドのファージディスプレイライブラリなどのスクリーニングによって識別することができる。スクリーニングは、トロンビン中の基質結合部位へのヒルジンの結合に対するペプチドの競合に依存することができる。本発明の一実施形態では、ＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイが使用される。トロンビンの触媒部位に特異的なモノクローナル抗体を、ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートをコーティングするのに使用することができる。プレートにブロッキング溶液中のトロンビンを充填し、過剰なトロンビンを数回洗浄して除去する。次に、ブロッキング溶液中のヒルジンを充填し、過剰なヒルジンを洗い流す。次に、プレートに結合したヒルジン（１００％結合のヒルジン）を、標識抗ヒルジンポリクローナル抗体を用いて検出する。ヒルジンのバウンディングは、標識ヒルジン、例えば、３Ｈ−ヒルジンを使用することで検出することができる。試験ウェル中に個々のペプチドがＥＬＩＳＡに含まれ、特定のペプチドの存在によってプレートに結合するヒルジンの減少は、ペプチドが模倣ペプチドの可能性があることを示す。
【００３０】
一実施形態では、トロンビン基質結合部位を認識する小分子は、トロンビンのフィブリノーゲンへの結合の少なくとも５０％を阻害する。本発明の方法で使用する小分子は、ペプチド、合成化合物、天然起源のヒルジン、合成ヒルジン変異体、トロンビン基質結合部位への結合能力を保持するヒルジン誘導体及び／又は組換えヒルジン変異体であり得る。
【００３１】
変異体は、天然起源のヒルジンに比べて、アミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加を含むヒルジンポリペプチドを含む。典型的には、アミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加は、トロンビン基質結合部位に結合するための変異体の能力を変えない。変異体は、非天然起源のアミノ酸残基も含み得る。
【００３２】
誘導体は、グリコシル化変化、アシル化変化及び／又は他の化学変化を含み、例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列に共有結合的に又は非共有結合的に結合するレポーター分子及び／又は他のリガンド等の非アミノ酸の置換基を含む。
【００３３】
模倣物は、必ずしもヒルジンの構造を複製することなく、その三次元の立体構造を再現する能力を有する小分子を非常に多く含む。この模倣物がトロンビンを結合できるように、模倣物は、ヒルジンの完全な複製である必要はなく、またヒルジンの構造に十分に似ている近似であってもよい。
【００３４】
本発明の一実施形態では、小分子は、試料中に存在するトロンビンを中和する量で被検試料に加える。本発明の別の実施形態では、試料中のヒルジンとトロンビンとの間のモル比は、０．６４以上、例えば、０．６７、１．２７、２．５５、５．１０、１０．２０、１２．７６、２０．４１、２５．５２、４０．８２、５１．０５、８１．６３、１０２．５６、２０５．１３、４１０．２６、８１６．３６、及び１６３２．６５、又はそれ以上のモル比である。
【００３５】
一実施形態では、トロンビンは試料中に約１単位で存在すると思われ、ヒルジンは、約０．６４アンチトロンビン単位又はそれ以上加える。
【００３６】
しばしば、用語「中和する」と「阻害する」とは交換可能である。
【００３７】
用語「トロンビン基質結合部位を認識する分子」は、トロンビン基質結合部位に対してアフィニティーを有する分子を指す。本発明の一実施形態では、トロンビン基質結合部位はエキソサイトＩにある。本発明の別の実施形態では、結合の１つの重要な要素は、フィブリノーゲンの場合と同じくトロンビンの活性部位から離れた２０Åの周りに位置するＴｙｒ７６である（Ｔｈｉｅｒｒｙ  Ｒｏｓｅ  ａｎｄ  Ｅｎｒｉｃｏ  Ｄｉ  Ｃｅｒａ．Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ−Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．ＪＢＣ  ２００１Ｖｏｌ  ２７７  Ｎ２１，１８８７５〜１８８０）。
【００３８】
本発明のイムノアッセイは、任意の試料、例えば、血液等の生物学的検体、血漿等の血液成分及び他の血液由来の部分、トロンビン及びアンチトロンビンＩＩＩを含む他の体液等で行うことができる。
【００３９】
本発明によって使用されるトロンビンに特異的な抗体は、活性部位がブロックされたトロンビンに対して産生される。用語「ブロックされた活性部位を有するトロンビン」は、活性部位に結合したペプチドを有するトロンビンを指す。本発明の一実施形態では、トロンビンの活性部位は、Ｐ４〜Ｐ２’のクレフトに存在する（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ  ＪＡ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２００５  Ａｕｇ；３（８）：１８６１〜７２の図２に示される）。ペプチド（本明細書で「ブロッキングペプチド」と呼ばれる）は、例えば、約４００〜１０００ダルトンの範囲で三アミノ酸ペプチド誘導体、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）、４−アミノフェニルピルビン酸（ＡＰＰＡ）又は４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ）であり得る。用語「活性部位」は、用語「触媒部位」と交換可能である。
【００４０】
トロンビンに特異的な抗体は、トロンビンに結合特異性を示す及び／又はトロンビン結合が可能であるのであれば、モノクローナル抗体、単鎖、Ｆａｂ免疫グロブリン発現ライブラリの生成物を含むＦａｂ断片、ポリクローナル抗体又はその断片であり得る。
【００４１】
用語「ポリクローナル抗体」は、異種性抗体の集団を指す。これは、トロンビン内で異なるエピトープに特異的な抗原結合機能を有する抗体を含んでもよい。ポリクローナル抗体は、例えば、ウサギ、ヤギ、ロバ、及びヒツジ等の哺乳類種の動物をヒトトロンビンで免疫することにより生成されてもよい。免疫に使用されるトロンビンは、精製ヒトプロトロンビンから調製することができる。免疫の経路は、皮内、腹腔内、皮下、筋肉内、頭蓋内、及び／又は静脈内が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
用語「モノクローナル抗体」は、抗体産生細胞の単一クローン、例えば、ハイブリドーマ細胞の単一クローンから作製される抗体医薬を指す。典型的には、モノクローナル抗体はハイブリドーマ技術によって作製される。用語「ハイブリドーマ」は、所望する抗体を大量に作製する、例えば、モノクローナル抗体を作製するために操作された細胞を指す。モノクローナル抗体を作製するには、トロンビンで免疫した動物（例えば、任意の哺乳類種）の脾臓からＢ細胞を除去することができる。免疫に使用されるトロンビンは、精製ヒトプロトロンビンから調製することができる。免疫の経路は、皮内、腹腔内、皮下、筋肉内、頭蓋内、及び／又は静脈内が挙げられるが、これらに限定されない。次に、Ｂ細胞は、培養中に不確定に増殖することができる骨髄腫腫瘍細胞と融合されることができる。この融合は、細胞膜をより透過性にすることにより行なうことができる。融合細胞は癌細胞であるので、急速かつ不確定に増殖させることができ、所望する抗体を大量に作製することができる。作製された抗体は、トロンビンに対する特異性及びアフィニティーを検査することができる。モノクローナル抗体を調製する方法、及び特異性を判定する方法は、当技術分野では公知である（例えば、Ｓｈｉｖａｎａｎｄ  Ｐａｎｄｅｙ．「ＨＹＢＲＩＤＯＭＡ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＦＯＲ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ」Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１０；Ｖｏｌｕｍｅ  １，Ｉｓｓｕｅ  ２：８８〜９４を参照されたい）。
【００４３】
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の作製及び精製は、当技術分野では周知である（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｅｄｓ．Ｅｌｅｆｔｈｅｒｉｏｓ  Ｐ  Ｄｉａｍａｎｄｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｄｏｒｅ  Ｋ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６，Ｃｈａｐｔｅｒ  ５）。トロンビンに特異的な抗体は組換え可能である（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｅｄｓ．Ｅｌｅｆｔｈｅｒｉｏｓ  Ｐ  Ｄｉａｍａｎｄｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｄｏｒｅ  Ｋ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６，Ｃｈａｐｔｅｒ  ６）。
【００４４】
検出するために抗体を標識することは、当技術分野では周知である（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｅｄｓ．Ｅｌｅｆｔｈｅｒｉｏｓ  Ｐ  Ｄｉａｍａｎｄｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｄｏｒｅ  Ｋ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８）。
【００４５】
「抗体を検出する」及び「標識抗体／抗体を標識する」は、発見されることが可能な抗体を指す。抗体を検出することは、検出可能なシグナルに又はシグナルを発生する部分に、直接的に、又は間接的に（例えば、別の抗体を通して）結合させてもよい。シグナルは、放射性（例えば、放射性ヨード、トリチウム、炭素、硫黄等）で比色定量することによる蛍光シグナル等であり得る。シグナルを発生する基質に作用するシグナルを発生する部分としては、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）［好適な基質としては、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）；ＯＰＤ；２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸二アンモニウム塩が挙げられる］；アルカリホスファターゼ［好適な基質としては、リン酸ｐ−ニトロフェニル二ナトリウム塩が挙げられる］；及びβ−ガラクトシダーゼ［好適な基質としては、Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドが挙げられる］が挙げられるが、これらに限定されない。シグナルは、アビジン−ビオチン結合システムを利用して増幅されてもよい。
【００４６】
抗原の抗原決定基と特異的抗体の抗原結合部分との間の結合相互作用に依存する異なるタイプのイムノアッセイは、当該技術分野において周知であり（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｅｄｓ．Ｅｌｅｆｔｈｅｒｉｏｓ  Ｐ  Ｄｉａｍａｎｄｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｄｏｒｅ  Ｋ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８〜１９）、例えば、固相免疫測定法、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、例えば、二部位（抗原を固定化抗体と標識抗体との間にサンドイッチする、サンドイッチタイプ）イムノアッセイ、アビジン−ビオチンイムノアッセイシステム、ウエスタンブロット、免疫沈殿、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ（蛍光（flurescent）マーカーが抗体と抱合する、例えば、フルオレスセイン、ローダミン等）、免疫沈殿、化学発光イムノアッセイ（化学構造修飾上の光を取り除く有機分子が使用される、例えば、イソルミノール、ピロガロール、ルシフェリン、ルミノール等）、生物発光イムノアッセイ、免疫ブロッティング技術等がある。「抗原決定基」は、抗体によって認識される抗原中の領域を指す。
【００４７】
抗体をポリスチレン製マイクロタイターウェルに結合させる（コーティングさせる）ために、以下の実施例に明記するように、抗原に特異的な抗体をｐＨ  ９〜９．６の炭酸緩衝液で希釈することができる。共有結合が報告されている（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｅｄｓ．Ｅｌｅｆｔｈｅｒｉｏｓ  Ｐ  Ｄｉａｍａｎｄｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｄｏｒｅ  Ｋ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２４）。コーティング工程は、ブロッキング溶液、例えば、ＢＳＡの存在下で、抗原に特異的な抗体をウェル中でインキュベートすることによって通常行なわれる。第２の抗体は、コーティングする抗体に結合する抗原を検出するために使用することができる。第２の抗体を標識することができる。次に、充当した抗原（例えば、トロンビン）の標準物質は、検量線用に作成することができる（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｅｄｓ．Ｅｌｅｆｔｈｅｒｉｏｓ  Ｐ  Ｄｉａｍａｎｄｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｄｏｒｅ  Ｋ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２４）。用語「コーティング抗体」、「捕獲抗体」、及び「固定化抗体」は、固形支持体の表面に存在する抗体を通常指す。コーティング抗体は、抗原を結合する部分が試料に存在する抗原と接触可能であるように方向付けることができる。検出が間接的である場合（例えば、第の２抗体を通して行われる）、第２の検出抗体は、捕獲抗体を生成するために使用される種とは異なる種で生成することができる。
【００４８】
用語「トロンビン量の測定」は、定性測定又は定量測定を指す。
【００４９】
ＥＬＩＳＡは、定性的又は定量的であり得る。定性的結果は、被検試料内のトロンビンの存在に対して、単純な陽性又は陰性の結果を提供する。２〜３回の標準偏差（検査に固有の誤差）は、陽性の試料を陰性の試料と区別するために典型的には使用される。定量的ＥＬＩＳＡでは、試料の光学濃度（ＯＤ）を、典型的には既知量の精製トロンビンの段階希釈である標準曲線と比較する。本発明の一実施形態では、トロンビンの異なる既知濃度を以下のように調製する。４３．９μｇ／ｍＬの濃度のトロンビン標準溶液を、ブロッキング緩衝液（１％  Ｉ−Ｂｌｏｃｋを含有する０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で６．２７μｇ／ｍＬ（６２７０ｎｇ／ｍＬ）の濃度に希釈する。次に、前回希釈した溶液から１００μＬをブロッキング緩衝液１００μＬが入ったチューブに移すことで、希釈したトロンビン基準溶液を段階的に２倍希釈（７回）する。６２７０ｎｇ／ｍＬから４９ｎｇ／ｍＬまで希釈した８種類の希釈液を調製する。次に、上述のトロンビン希釈液をそれぞれ、ブロッキング緩衝液で更に希釈し（１：１０）、トロンビンの最終濃度４．９ｎｇ／ｍＬ、９．８ｎｇ／ｍＬ、１９．５ｎｇ／ｍＬ、３９、７８ｎｇ／ｍＬ、１５６．７ｎｇ／ｍＬ、３１３．５ｎｇ／ｍＬ、及び６２７ｎｇ／ｍＬを得た。次の工程で、最終のトロンビン溶液をそれぞれ１００μＬ、あらかじめコーティングしたマイクロＥＬＩＳＡプレートに移し、小分子を加えることなく以下に詳細説明するように免疫測定を行なう。免疫測定は自動化することができる（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｅｄｓ．Ｅｌｅｆｔｈｅｒｉｏｓ  Ｐ  Ｄｉａｍａｎｄｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｄｏｒｅ  Ｋ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２１）。
【００５０】
本発明の一実施形態では、固相免疫測定法が行われる。チューブ、ビーズ、磁性微粒子材料、プラスチックビーズ、プラスチック支持体、カラム、小シート、及びアッセイプレート、例えば、マイクロタイターウェル等の様々な固相を使用することができる。
【００５１】
本発明の一実施形態では、下記の開発した二部位（サンドイッチタイプ）のイムノアッセイを使用して、被検試料中のトロンビンを検出する。第１の工程で、トロンビン基質結合部位を認識する小分子を被検試料に加える。小分子は、少なくとも１ＮＩＨ単位のトロンビンを中和する最終濃度、例えば、２０ＮＩＨ単位のトロンビンを中和する量で加えるヒルジンであり得る。トロンビンを含む試料を、約１５分間小分子と一緒にインキュベートすることができる。次に、小分子を含む試料をピペットでとり、過剰量のトロンビンに特異的なポリクローナル抗体（「捕獲抗体」）であらかじめコーティングした固相にインキュベートする。このインキュベート中に、試料中のトロンビンが捕獲抗体と結合し（bounds to）、次に他の試料成分すべてを洗い流す。次に、過剰量のトロンビンに特異的な標識ポリクローナル抗体を加える。インキュベーション後に、過剰量の標識抗体を洗い流し、結合した標識抗体のシグナルを測定する（例えば、光学濃度［ＯＤ］を測定することによる）。上述の既知量の精製トロンビンを用いて作成したトロンビン標準曲線と比較及び外挿することで、トロンビンのレベルの定量化／測定を行うことができる。このイムノアッセイの実施形態では、トロンビンに特異的な同じポリクローナル抗体が、捕獲抗体及び標識抗体として役立つ。
【００５２】
別の実施形態では、モノクローナル抗体が、捕獲抗体として、及び標識抗体として使用される。そのような実施形態では、捕獲抗体及び標識抗体は異なり、互いの結合を妨害しないように、トロンビン上の個別のエピトープを認識しなければならない。一実施形態では、トロンビンに特異的なモノクローナル抗体は、基質結合部位に向けられない。
【００５３】
例示的なＥＬＩＳＡでは、トロンビンに特異的な捕獲抗体、例えば、ポリクローナル抗体は、マイクロタイターウェルに過剰にあらかじめコーティングされる。より具体的には、抗体溶液（例えば、２ｍｇ／ｍＬの濃度のタンパク質）をコーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸緩衝液；ｐＨ＝９．６）で１：２００〜１：１００の範囲、例えば、１：５００に希釈し、希釈した抗体１００μＬを各ウェルに加える。マイクロタイタープレートを２〜８℃で一晩インキュベートする。次に、コーティング溶液を捨て、マイクロタイタープレートを洗浄緩衝液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）２００μＬ／ウェルで３回洗浄する。続いて、２００μＬのブロッキング緩衝液（１％  Ｉ−Ｂｌｏｃｋを含む洗浄緩衝液）を各ウェルに加え、マイクロタイタープレートを３７℃で１時間インキュベートする。インキュベート終了時に、ブロッキング緩衝液を取り除く。被検試料、例えば、生体液等をそれぞれ、トロンビンの基質結合部位を認識する小分子と接触させる。試料は、小分子と一緒に約１５分間インキュベートすることができる。被検試料は、ブロッキング緩衝液で１：５に希釈することができ、次に、希釈した各試料１００μＬをあらかじめコーティングしたウェルに加える。次に、プレートを３７℃で１時間インキュベートする。インキュベート期間後に試料溶液を捨て、ウェルを洗浄緩衝液で洗浄する。次に、ブロッキング緩衝液で１：２００〜１：１００の範囲、例えば、１：５００に希釈した、トロンビンを検出するＨＲＰ抱合ポリクローナル抗体を含む１００μＬの溶液（例えば、２ｍｇ／ｍＬの濃度のタンパク質を有するストック溶液から）を、各ウェルに加える。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、上述のように洗浄緩衝液で洗浄し、ＥＬＩＳＡ（ＨＲＰ基質）用の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）液体基質システム１００μＬを各ウェルに加える。プレートを室温で約６０分間（強い青色が高濃度のトロンビンを含むウェルで観察されるまで）インキュベートする。１００μＬの停止液（１Ｍの塩酸）を各ウェルに加えて反応を止める。プレートをＯＤ４５０ｎｍで読み取り、試料中のトロンビンの正確な濃度を、上述したようにトロンビンの既知濃度から作成したトロンビン標準曲線と比較することによって、外挿することができる。典型的には、トロンビンの標準曲線の線形範囲を使用して、被検試料中のトロンビンの正確な濃度を計算する。
【００５４】
本発明の一実施形態では、捕獲抗体は、抗ヒトトロンビンヒツジポリクローナル抗体（例えば、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ製の抗体；カタログ番号ＳＡＨＴ−ＡＰ）である。本発明の別の実施形態では、ポリクローナル抗体を産生させるために使用する免疫原は、活性部位がＰＰＡＣＫでブロックされた精製ヒトプロトロンビンから調製したトロンビンである。本発明の別の更なる実施形態では、検出する抗体は、ＨＲＰ抱合ヒツジ抗ヒトトロンビン抗体（例えば、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ製の抗体；カタログ番号ＳＡＨＴ−ＨＲＰ）である。
【００５５】
本発明の別の実施形態では、間接ＥＬＩＳＡアッセイを使用する。例示的な間接ＥＬＩＳＡでは、被検試料を、トロンビンの基質結合部位、例えば、フィブリノーゲン結合部位を認識する小分子と接触させ、次に、固相、例えば、マイクロタイタープレートのウェルに加え、そこでプラスチックに、例えば、電荷相互作用を通して、付着する時間を与える。次に、非反応タンパク質の溶液、例えば、ウシ血清アルブミン又はカゼインを加え、被検試料内に存在する抗原によってコーティングされない状態を保持するウェル中の任意のプラスチック表面をブロックする。次の工程で、トロンビンを特異的に結合する一次抗体を各ウェルに加える。その後、一次抗体を結合する二次抗体を各ウェルに加える。二次抗体は付着した酵素を有し、それは抗体の結合特性に無視できる効果を有する。次に、この酵素用の基質を加える。この基質は、酵素と反応すると色が変わる。色の変化は、二次抗体が一次抗体と結合したことを示す。典型的には、非結合の抗体が取り除かれるように、一次抗体及び二次抗体を加えた後プレートを洗浄する。別の実施形態では、酵素に連結した１つの抗体が、試料内のトロンビンの有無を検出するために使用される。分光計を使用して、色の強度に対して定量値を与える。検出可能なシグナルは、放射性（例えば、放射性ヨード、トリチウム、炭素、硫黄等）で比色定量することによる蛍光シグナル等であり得る。
【００５６】
本発明は、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）を含む試料中のトロンビンを定量化するキットを提供する。キットは、トロンビンに特異的なポリクローナル抗体と、トロンビンの基質結合部位を認識する小分子の構成要素と、を含み、トロンビンに特異的な抗体は、ブロックされた活性部位を有するトロンビンに対して産生される。キットは、取扱説明書、及び／又は標準曲線作成用の精製トロンビンを含み得る。キットの構成要素は、粉末、溶液及び／又はそれらの組み合わせとして提供され得る。溶液は冷凍形態で提供され得る。以上又は以下に引用する出願、特許、及び刊行物の開示は、参考として本明細書に組み込まれる。
【００５７】
以下の実施例は例示であり、限定するものではない。
【実施例】
【００５８】
材料及び方法
イムノアッセイ手順：
１．マイクロＥＬＩＳＡプレートを捕獲抗体でコーティングする。
マイクロＥＬＩＳＡプレート（９６ウェル；Ｃｏｓｔａｒ；カタログ番号９０１８）を抗ヒトトロンビンヒツジポリクローナル抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ；カタログ番号ＳＡＨＴ−ＡＰ；ポリクローナル抗体産生に使用した免疫原は活性部位がＰＰＡＣＫでブロックされた精製ヒトプロトロンビンから調製したトロンビンであった）でコーティングした。以下の手順でコーティングを行った。抗体をコーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸緩衝液；ｐＨ＝９．６；Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｃ−３０４１）で１：５００に希釈し、希釈した抗体１００μＬを各ウェルに加えた。次に、マイクロＥＬＩＳＡプレートを２〜８℃で一晩（約１６時間）インキュベートした。次に、コーティング溶液を捨て、ウェルを洗浄緩衝液［０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｐ−１３７９）を含むＰＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ；カタログ番号０２−０２３−ＳＡ）］２００μＬ／ウェルで３回洗浄した。続いて、ブロッキング緩衝液［１％  Ｉ−Ｂｌｏｃｋ（Ｔｒｏｐｉｘ；カタログ番号ＡＩ３００）を含む洗浄緩衝液］２００μＬを各ウェルに加え、ＥＬＩＳＡプレートを３７℃で１時間インキュベートした。被検試料を加える前にブロッキング緩衝液を取り除いた。
【００５９】
２．被検試料及び標識結合抗体をあらかじめコーティングしたウェルに加え、標識結合抗体のシグナルを測定する。
被検試料をブロッキング緩衝液で１：５に希釈し、希釈した各試料１００μＬをあらかじめコーティングしたマイクロＥＬＩＳＡプレートに加えた。次に、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート期間後に試料溶液を捨て、ウェルを上述の洗浄緩衝液２００μＬ／ウェルで３回洗浄し、ＨＲＰ抱合アンチトロンビン抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ；カタログ番号ＳＡＨＴ−ＨＲＰ；ブロッキング緩衝液で１：５００に希釈；「標識抗体」）１００μＬを各ウェルに加えた。未処置のブタ血漿を陰性対照として用いた。ブロッキング緩衝液中の既知濃度のトロンビン（４．９〜６２７ｎｇ／ｍＬ）を陽性対照として用いた。陰性対照群及び陽性対照群のＯＤ結果は下記の結果に示されない。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、上述の洗浄緩衝液２００μＬ／ウェルで３回洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ−ＨＲＰ基質；Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ−０４４０）１００μＬを各ウェルに加えた。プレートを室温（約２２±３℃）で約６０分間（強い青色が最高濃度のトロンビンを含むウェルで観察されるまで）インキュベートした。１００μＬの停止液（１Ｍの塩酸；Ｒｉｅｄｅｌ  ｄｅ  Ｈａｅｎ；カタログ番号３０７２１）を各ウェルに加えて反応を止めた。プレートをＯＤ４５０ｎｍで読み取った。得られたＯＤ値の上昇は、試料中のトロンビンのより高い濃度を示す。試料中のトロンビンの正確な濃度を、既知量の精製トロンビンを用いて作成したトロンビンの標準曲線と比較することによって外挿する。トロンビンの標準曲線の線形範囲を使用して、試料中の正確なトロンビンの濃度を計算する。
【００６０】
以下の実施例で使用する異なる濃度のトロンビンの調製
異なる濃度のトロンビンを調製するために、Ｏｍｒｉｘ社内標準（４３．９μｇ／ｍＬ）を使用した。異なる濃度を得るために、そのトロンビン標準をブロッキング緩衝液（上記の成分を参照のこと）で６．２７μｇ／ｍＬ（６２７０ｎｇ／ｍＬ）の濃度に希釈した。次に、前回希釈した溶液から１００μＬをブロッキング緩衝液１００μＬが入ったチューブに移すことで、希釈したトロンビン標準溶液を段階的に２倍希釈（７回）した。６２７０ｎｇ／ｍＬから４９ｎｇ／ｍＬまで希釈した８種類の希釈液を調製した。次に、上述のトロンビン希釈液をそれぞれ、更に希釈し（１：１０）、被検試料にした。
【００６１】
実施例１−試料中のトロンビンを検出するサンドイッチＥＬＩＳＡ
被検試料中のトロンビンを検出するために、二部位（サンドイッチタイプ）のイムノアッセイを開発した。手短に、トロンビンを含む試料を、過剰量のアンチトロンビンポリクローナル抗体（「捕獲抗体」）であらかじめコーティングした固相にピペットで移し、「材料及び方法」の項で説明したようにインキュベートした。このインキュベート中に、試料中のトロンビンは捕獲抗体と結合し（bounds to）、次に他の試料成分すべてを洗い流した。次に、過剰量の標識アンチトロンビン抗体を加えた。インキュベート後に、過剰量の標識抗体を洗い流した。このイムノアッセイでは、同じポリクローナル抗体を捕獲抗体及び検出／標識抗体として用いた。ポリクローナル抗体は、アフィニティー精製したＩｇＧヒツジ抗ヒトトロンビンであった。抗体は、活性部位／触媒部位がＰＰＡＣＫでブロックされた精製ヒトトロンビン（精製したプロトロンビンから調製）を免疫原として用いて産生した。ＰＰＡＣＫは、トロンビンの触媒部位に結合するペプチドである。
【００６２】
この実験では、上記の開発したイムノアッセイが試料中のトロンビンのレベルを検出する能力を調べた。このために、次第に増加する濃度のトロンビンを含むブロッキング緩衝液の試料を調製し（上述したように、試料中のトロンビンの最終濃度は、約４．９ｎｇ／ｍＬ、約９．８ｎｇ／ｍＬ、約１９．５ｎｇ／ｍＬ、約３９ｎｇ／ｍＬ、約７８ｎｇ／ｍＬ、約１５６．７ｎｇ／ｍＬ、約３１３．５ｎｇ／ｍＬ、及び約６２７ｎｇ／ｍＬに調製した）、上項の「材料及び方法」の項で詳細に説明したようにイムノアッセイを行った。標識結合抗体のシグナルが各試料で検出され、結果を図１に示す。
【００６３】
結合抗体のシグナルは、正確な濃度のトロンビンを含む緩衝液の試料中のトロンビンの濃度に直接関係することが判明した。最も低い５種類の希釈液は線形範囲内であった。
【００６４】
したがって、このイムノアッセイは、（既知量の精製トロンビンを用いて作成したトロンビンの標準曲線と比較することで）トロンビンを含む緩衝液の被検試料中のトロンビンのレベルを測定するために使用することができるツールであると結論付けられた。
【００６５】
実施例２−トロンビンに特異的なイムノアッセイによるトロンビンの検出への血漿中に存在する物質の干渉
先の実験は、前述のイムノアッセイがトロンビンを含む緩衝液の試料中のトロンビンを検出する能力を示している。この実験では、上記の開発したイムノアッセイが、次第に増加する濃度のトロンビン（実施例１と同じ）を添加したブタ血漿試料（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｋｉｂｕｔｚ  Ｌａｈａｖ  Ｉｓｒａｅｌ）から入手）中のトロンビンを検出する能力を調べた。同等の濃度のトロンビンを含むブロッキング緩衝液を、基準として用いた。上記のようにイムノアッセイを行い、両群［すなわち、群１−トロンビンを添加した血漿試料（▲）、及び群２−トロンビンを含む緩衝液の試料（◆）］のＯＤ値を図２に示す。
【００６６】
血漿中のトロンビンに対して得られたＯＤ結果は、同じ濃度のトロンビンでブロッキング緩衝液中のトロンビンに対して得られたＯＤ結果よりはるかに低いことが分かる。したがって、イムノアッセイは、血漿中に存在する物質の干渉によって損なわれることが判明した。
【００６７】
実施例３−トロンビンに特異的なイムノアッセイによるトロンビンの検出へのＡＴ−ＩＩＩの干渉
実施例２は、トロンビンに特異的なイムノアッセイに干渉する物質が血漿中にあることを示している。ヒト血漿中のＡＴ−ＩＩＩの正常濃度は高く、およそ０．１２ｍｇ／ｍＬである。血漿中に存在するＡＴ−ＩＩＩがイムノアッセイに干渉する因子であるかどうかを調べるために、次の実験を行った。
【００６８】
このために、ＡＴ−ＩＩＩを含む試料（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ；カタログ番号４３３；ブロッキング緩衝液で最終濃度１ＩＵ／ｍＬに希釈）、又はＡＴ−ＩＩＩを含まない試料（上述のブロッキング緩衝液溶液）を調製した。次に、異なる濃度のトロンビンをこれらの試料に加えた（上述したように、最終濃度４．９、９．８、及び１９．５ｎｇ／ｍＬに調製した）。試料中のトロンビンを検出するために、上述したようにイムノアッセイを行った。
【００６９】
ＡＴ−ＩＩＩの存在下で得られたＯＤ結果は、ＡＴ−ＩＩＩの非存在下で得られたＯＤ結果よりはるかに低いことが分かる（図３）。
【００７０】
ＡＴ−ＩＩＩは、トロンビンイムノアッセイに干渉を引き起こすことが判明した。したがって血漿中に検出される干渉（実施例２）は、少なくとも一部は、ＡＴ−ＩＩＩの存在のためであり得ることを示している。
【００７１】
実施例４−血漿中のトロンビンを検出するためのイムノアッセイにおいてヒルジンを加えることの有益な効果
ヒルジンはヒル類に自然に生じる６５アミノ酸の小さなペプチドであり、抗凝血性の特性を有する。ヒルジンはトロンビン中のフィブリノーゲン結合部位（基質結合部位）に結合し、一方でＡＴ−ＩＩＩはトロンビン中の触媒部位／活性部位に結合する。次の実験の組で、トロンビンに特異的なイムノアッセイにおいてＡＴ−ＩＩＩ干渉にヒルジンを加えることの効果を調べた。
【００７２】
このために、ＡＴ−ＩＩＩを含む異なる溶液［以下の溶液１、４、及び７を参照］を調製し、異なる濃度のヒルジンを、異なる溶液に混合した（以下の群２、３、５、６、８及び９を参照）。次に、異なる濃度のトロンビンを混合液に加え、イムノアッセイを行った。
【００７３】
溶液１〜９の調製：
１．ＡＴ−ＩＩＩ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ；カタログ番号４３３）をブロッキング緩衝液で希釈する、最終濃度１ＩＵ／ｍＬ。
２．溶液１＋ヒルジン（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号９４５８１）、最終濃度１Ｕ／ｍＬ（１Ｕのヒルジンは１ＡＴＵ（アンチトロンビン単位［ＡＴＵ］；１ＡＴＵは１ＮＩＨ単位のトロンビンを中和するインヒビターの量として定義する）に相当）。
３．溶液１＋ヒルジンのみ加える、最終濃度５Ｕ／ｍＬ。
４．溶液１＋ヘパリン（Ｐｈａｒｍａｃａｒｅ）、最終濃度１０ＩＵ／ｍＬ。ヘパリンは、ＡＴ−ＩＩＩによってトロンビンの不活性化を増加させる。
５．溶液４＋ヒルジン、最終濃度１Ｕ／ｍＬ。
６．溶液４＋ヒルジン、最終濃度５Ｕ／ｍＬ。
７．ブタ血漿。
８．７＋ヒルジン、最終濃度１Ｕ／ｍＬ。
９．７＋ヒルジン、最終濃度５Ｕ／ｍＬ。
【００７４】
次に、上述した（「材料及び方法」の項を参照）方法で、最終濃度４．９ｎｇ／ｍＬ、９．８ｎｇ／ｍＬ、１９．５ｎｇ／ｍＬ、３９ｎｇ／ｍＬ、７８ｎｇ／ｍＬ、１５６．７ｎｇ／ｍＬ、３１３．５ｎｇ／ｍＬ、及び６２７ｎｇ／ｍＬでトロンビンを各溶液（１〜９）に加えた。この実験では、トロンビンを、ＡＴ−ＩＩＩと共にヒルジンを含む溶液２、３、５、６、８及び９に加えた。
【００７５】
調製した試料（異なる濃度のトロンビンで混合した溶液１〜９）を希釈し、あらかじめコーティングしたＥＬＩＳＡプレートにピペットで移し、「材料及び方法」の項に明記したようにＯＤレベルを測定した。
【００７６】
トロンビンを含む異なる試料のＯＤ値を図４、５及び６に示す。図４では、試料はブタ血漿である（試料は溶液７〜９で調製した）。図５では、試料はＡＴ−ＩＩＩを含む溶液である（試料は溶液１〜３で調製した）。図６では、試料はＡＴ−ＩＩＩ及びヘパリンを含む溶液である（試料は溶液４〜６で調製した）。
【００７７】
ヒルジンを加えることは、用量依存的様式で、トロンビンに特異的なイムノアッセイにおけるＡＴ−ＩＩＩの干渉を減少させることが観察された。
【００７８】
これらの結果は、ＡＴ−ＩＩＩを含む試料において、トロンビンに特異的なイムノアッセイによるトロンビンの検出を向上させるためには、トロンビンの基質結合部位に結合可能な小分子のヒルジンを被検試料に加えることが有益であることを示している。
【００７９】
実施例５−血漿中のトロンビンを検出するためのトロンビンに特異的なイムノアッセイにおいてヒルジンを加えることの有益な効果
上記の実験の結果は、ＡＴ−ＩＩＩを含む試料にヒルジンを加えることは、特異的なイムノアッセイにおいてトロンビンの検出を向上させることを示している。上記の実験では、ＡＴ−ＩＩＩと共にヒルジンを含む試料にトロンビンを加えた。しかしながら、被検血漿試料は既にトロンビンを含み、ほとんどのトロンビンはアンチトロンビンＩＩＩに付着している。そのような場合、ヒルジンはトロンビン−ＡＴ−ＩＩＩの複合体に作用する必要がある。次の実験は、既にトロンビン及びＡＴ−ＩＩＩを含む血漿試料中のトロンビンを検出するためのイムノアッセイにおいて、ヒルジンの有益な効果を検討する。
【００８０】
次の実験の組では、様々な濃度のトロンビンをブタ血漿の試料に添加した（最終濃度４．９ｎｇ／ｍＬ〜６２７ｎｇ／ｍＬ；「材料及び方法」の項の試料の調製を参照）。３つの群の試料を調製した。次の工程で、ヒルジンを群のうちの２つに、最終濃度１Ｕ／ｍＬ（■）又は２０Ｕ／ｍＬ（●）で加えた。第３の群にはヒルジンを加えず、この群を対照（▲）として用いた。トロンビンが上述のＥＬＩＳＡアッセイによって異なる群で検出された。この実験では、５Ｕ／ｍＬのヒルジンを補充した非添加のブタ血漿を陰性対照として用いた（陰性対照の結果は示さず）。結果を図７に示す。
【００８１】
試料に加えたヒルジンと試料中に存在するトロンビンとの間のモル比を下表１に示す。
【表１】
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＊  １トロンビンＵは約４００ｎｇ／ｍＬトロンビンに相当する。
【００８２】
トロンビンを添加した血漿の試料にヒルジンを加えることは、イムノアッセイでトロンビンを検出する能力にヒルジンの濃度に依存した増加が生じることが判明した。結果は更に、ヒルジンとトロンビンとの間のモル比が０．６３７７５５以上のとき、イムノアッセイの、トロンビンを検出する能力の増加が観察されたことを示している。
【００８３】
〔実施の態様〕
（１）  アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）の存在下で試料中のトロンビンを定量化するためのインビトロイムノアッセイであって、前記試料をトロンビンの基質結合部位を認識する小分子と接触させる工程と、前記試料にトロンビンに特異的な抗体を加える工程であって、前記トロンビンに特異的な抗体は、ブロックされた活性部位を有するトロンビンに対して産生される、工程と、前記抗体の前記トロンビンとの結合を測定する工程と、存在するトロンビンの量を測定する工程と、を含む、イムノアッセイ。
（２）  前記試料は、血液又は血液成分からなる群から選択される生物学的検体である、実施態様１に記載のイムノアッセイ。
（３）  前記小分子は、天然起源のヒルジン、合成ヒルジン変異体、ヒルジン誘導体、組換えヒルジン変異体、模倣物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施態様１又は２に記載のイムノアッセイ。
（４）  前記トロンビンに特異的な抗体は、ポリクローナル抗体又はその断片である、実施態様１〜３のいずれかに記載のイムノアッセイ。
（５）  前記抗体は、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）、４−アミノフェニルピルビン酸（ＡＰＰＡ）、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチドで、ブロックされた活性部位を有するトロンビンに対して産生される、実施態様１〜４のいずれかに記載のイムノアッセイ。
【００８４】
（６）  前記イムノアッセイは、固相免疫測定法である、実施態様１〜５のいずれかに記載のイムノアッセイ。
（７）  前記固相免疫測定法は、サンドイッチイムノアッセイである、実施態様６に記載のイムノアッセイ。
（８）  前記トロンビンの量の測定は、トロンビンの標準曲線で行われる、実施態様１〜７のいずれかに記載のイムノアッセイ。
（９）  アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）を含む試料中のトロンビンを定量化するキットであって、トロンビンに特異的なポリクローナル抗体又はその断片と、トロンビンの基質結合部位を認識する小分子とを含み、前記トロンビンに特異的な抗体は、ブロックされた活性部位を有するトロンビンに対して産生される、キット。
（１０）  前記小分子は、天然起源のヒルジン、合成ヒルジン変異体、ヒルジン誘導体、組換えヒルジン変異体、模倣物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施態様９に記載のキット。
【００８５】
（１１）  前記抗体は、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）、４−アミノフェニルピルビン酸（ＡＰＰＡ）、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチドで、ブロックされた活性部位を有するトロンビンに対して産生される、実施態様９又は１０に記載のキット。
（１２）  前記キットは、イムノアッセイキットである、実施態様９〜１１のいずれかに記載のキット。
（１３）  精製トロンビンを更に含む、実施態様９〜１２のいずれかに記載のキット。
（１４）  アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）とトロンビンとを含む試料中のトロンビンを定量化するためのインビトロイムノアッセイであって、前記試料をトロンビンの基質結合部位を認識する小分子と接触させる工程と、前記トロンビンを活性部位がブロックされたトロンビンに対して産生されるトロンビンに特異的な抗体と接触させる工程と、結合した抗体のレベルを測定する工程と、を含む、イムノアッセイ。
（１５）  前記試料は、血液又は血液成分からなる群から選択される生物学的検体である、実施態様１４に記載のイムノアッセイ。
【００８６】
（１６）  前記小分子は、天然起源のヒルジン、合成ヒルジン変異体、ヒルジン誘導体、組換えヒルジン変異体、模倣物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施態様１４又は１５に記載のイムノアッセイ。
（１７）  前記トロンビンに特異的な抗体は、ポリクローナル抗体又はその断片である、実施態様１４〜１６のいずれかに記載のイムノアッセイ。
（１８）  前記抗体は、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）、４−アミノフェニルピルビン酸（ＡＰＰＡ）、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチドで、ブロックされた活性部位を有するトロンビンに対して産生される、実施態様１４〜１７のいずれかに記載のイムノアッセイ。
（１９）  前記イムノアッセイは、固相免疫測定法である、実施態様１４〜１８のいずれかに記載のイムノアッセイ。
（２０）  前記固相免疫測定法は、サンドイッチイムノアッセイである、実施態様１９に記載のイムノアッセイ。
【００８７】
（２１）  前記トロンビンの量の測定は、トロンビンの標準曲線で行われる、実施態様１４〜２０のいずれかに記載のイムノアッセイ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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