(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)：
【化１】
0005955953.tif 000150
(I)、
[式中：
Aは、NまたはC-R2、ここで、
R2は、水素、フルオロまたはクロロを表し、
R1は、水素、フルオロ、クロロ、メチル、エチルまたはメトキシを表し、
そして、
Zは、そのそれぞれが、ヒドロキシにより置換されていてもよい、(C1-C4)-アルキルまた
は(C3-C6)-シクロアルキルを表し、
あるいは、
Zは、下記式：
【化２】
0005955953.tif 000151
の複素環基を表し、
ここで、 *は、ピロロトリアジン部分との結合点を示し、
そして、
R3は、水素またはヒドロキシを表し、
ただし、 R3 がヒドロキシである場合、このヒドロキシは、環窒素原子に隣接して存在する環炭素原子に結合しておらず、
あるいは、        
Zは、下記式：
【化３】
0005955953.tif 000152
のチアゾール基を表し、
ここで、*は、ピロロトリアジン部分との結合点を示し、
そして、
R4は、水素、メチル、エチル、アミノまたはアミノメチルを表し、
あるいは、
Zは、下記式：
【化４】
0005955953.tif 000153
の基を表し、 
ここで、* は、ピロロトリアジン部分との結合点を示し、
R5は、(C3-C6)-シクロアルキル、オキセタニル、テトラヒドロフラニルまたはテトラヒド
ロピラニルを表し、
R6は、水素またはヒドロキシを表し、
R7は、水素またはヒドロキシを表し、
ただし、R7 がヒドロキシである場合、このヒドロキシは、環窒素原子に隣接して存在する環炭素原子に結合しておらず、
そして、
Yは、O、NHまたはNCH3である]
の化合物、またはその医薬上許容される塩、水和物および/または溶媒和物。
【請求項２】
Aは、C-R2であり、ここで、
R2は、水素またはフルオロを表し、
R1は、水素、フルオロ、クロロ、メチル、エチルまたはメトキシを表し、
そして、
Zは、そのそれぞれが、ヒドロキシにより置換されていてもよい、n-プロピル、n-ブチル
またはシクロヘキシルを表し、
あるいは、
Zは、下記式：
【化５】
0005955953.tif 000154
の複素環基を表し、
ここで、* は、ピロロトリアジン部分との結合点を示し、
あるいは、
Zは、下記式：
【化６】
0005955953.tif 000155
のチアゾール基を表し、
ここで、* は、ピロロトリアジン部分との結合点を示し、
そして、
R4は、メチル、エチル、アミノまたはアミノメチルを表し、
あるいは、
Zは、下記式：
【化７】
0005955953.tif 000156
の基を表し、
ここで、* は、ピロロトリアジン部分との結合点を示し、
R5は、シクロプロピルまたはテトラヒドロピラン-4-イルを表し、
R6は、ヒドロキシを表し、
そして、
Yは、Oである、
請求項 1の式(I)の化合物、またはその医薬上許容される塩、水和物および/または溶媒和
物。
【請求項３】
Aは、C-R2であり、ここで、
R2は、水素またはフルオロを表し、
R1は、水素、フルオロ、メチル、エチルまたはメトキシを表し、
そして、
Zは、4-ヒドロキシブチルまたは4-ヒドロキシシクロヘキシルを表し、
あるいは、
Zは、下記式：
【化８】
0005955953.tif 000157
の複素環基を表し、
ここで、*は、ピロロトリアジン部分との結合点を示し、
あるいは、
Zは、下記式：
【化９】
0005955953.tif 000158
のチアゾール基を表し、
ここで、*は、ピロロトリアジン部分との結合点を示し、
そして、
R4は、メチル、エチル、アミノまたはアミノメチルを表し、
あるいは、
Zは、下記式：
【化１０】
0005955953.tif 000159
の基を表し、
ここで、* は、ピロロトリアジン部分との結合点を示し、
そして、
R5は、シクロプロピルを表す、
請求項 1または2の式(I)の化合物、またはその医薬上許容される塩、水和物および/また
は溶媒和物。
【請求項４】
請求項1〜 3のいずれかに規定する式(I)の化合物を調製する方法であって、式(II)のブ
ロモピロロトリアジン：
【化１１】
0005955953.tif 000160
(II)、
[式中、Zは請求項 1〜 3のいずれかに示される意味を有する]、
が、
[A]式(III)のアリールボロン酸またはエステルと、好適なパラジウム触媒および塩基の存
在下で結合されて、
【化１２】
0005955953.tif 000161
(III)、
[式中、AおよびR1は請求項 1〜 3のいずれかに示される意味を有し、
そして、
R8は、水素または(C1-C4)-アルキルを表し、あるいは両方のR8残基が一緒に結合して−(C
H2)2−、-C(CH3)2-C(CH3)2-、-(CH2)3- または −CH2−C(CH3)2−CH2-架橋を形成する]、
式(I)の標的化合物が得られるか、
【化１３】
0005955953.tif 000162
(I)、
[式中、A、ZおよびR1 は請求項 1〜 3のいずれかに示される意味を有する]
あるいは、
[B]まず、式(IV)の対応するボロン酸またはエステル誘導体：
【化１４】
0005955953.tif 000163
(IV)、
[式中、Zは、請求項 1〜 3のいずれかに示される意味を有し、
そして、
R9は、水素または(C1-C4)-アルキルを表し、あるいは両方のR9残基が一緒に結合して、−
(CH2)2−、-C(CH3)2-C(CH3)2-、-(CH2)3- または−CH2−C(CH3)2−CH2-架橋を形成する]
、
へと変換され、次いで、式(V)の臭化アリール：
【化１５】
0005955953.tif 000164
(V)、
[式中、AおよびR1 は、請求項 1〜 3のいずれかに示される意味を有する]、
と、好適なパラジウム触媒および塩基の存在下で結合されてまた、式(I)の標的化合物が
得られる、
【化１６】
0005955953.tif 000165
(I)、
[式中、A、ZおよびR1 は、請求項 1〜 3のいずれかに示される意味を有する]、
ことを特徴とし、
所望により、適切な場合には、以下の工程を行ってもよい、方法： (i)式(I)の化合物を
それらのそれぞれのエナンチオマーおよび/またはジアステレオマーへと分離する工程、
および/または (ii)式(I)の化合物をそれらのそれぞれの水和物、溶媒和物、塩および/ま
たは塩の水和物または溶媒和物へと、対応する溶媒および/または酸による処理により変
換する工程。
【請求項５】
請求項1〜 3のいずれかの化合物、またはその医薬上許容される塩、水和物および/また
は溶媒和物、および一以上の医薬上許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項６】
一以上のさらなる治療薬をさらに含む、請求項 5の医薬組成物。
【請求項７】
加齢黄斑変性 (AMD)、脈絡膜血管新生 (CNV)、糖尿病性網膜症および糖尿病性黄斑浮腫
(DME)の治療または予防のための請求項 5または6の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な5-[(ヒドロキシメチル)アリール]-置換ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミン、かかる化合物の調製方法、かかる化合物を含有する医薬組成物、および、血管新生-関連障害、特に、血管新生-関連眼障害を治療するためのかかる化合物または組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
新血管形成とも称される、血管新生という用語は、新しい血管の形成のプロセスを示す。それは、正常発生において、ならびに、多数の病的状態、例えば、癌、関節リウマチ、組織に対する傷害の後の創傷治癒、アテローム性動脈硬化、乾癬、および眼の疾患等において、関与している。
【０００３】
開発国における視覚の病的状態および失明の大部分の原因である様々な眼障害は、脈絡叢、網膜または虹彩新血管形成または網膜浮腫によって特徴づけられ、引き起こされ、および/またはかかる結果となる [Campochiaro (2004)、Exp. Opin. Biol. Ther. 4: 1395-1402]。
【０００４】
例えば、糖尿病に関連する網膜症は、1型糖尿病における失明の主な原因であり、そしてまた、2型糖尿病においても一般的である。新血管形成を伴う別の眼障害は、加齢黄斑変性 (AMD)である。AMDは、西洋の50歳以上の人々において、最も一般的な視力喪失の原因であり、その有病率は年齢とともに上昇する。AMDは、湿性(wet) (新生血管)または乾性(dry) (非-新生血管)のいずれかとして分類される。湿性(wet) 形態のこの疾患は、もっとも重篤な視力喪失の原因である。
【０００５】
いくつかのその他のそれほど一般的ではないが、にもかかわらず、衰弱性の網膜症には、脈絡叢新生血管膜 (CNVM)、嚢胞様黄斑浮腫 (CME、黄斑浮腫または黄斑性腫脹とも称される)、網膜上膜 (ERM、黄斑パッカー)、および黄斑円孔が含まれる。CNVMにおいて、異常な血管は、網膜層を通過して(through)生育した脈絡膜に由来する。脆弱な新しい血管は容易に壊れ、血液および体液が網膜の層内に貯まる原因となる。疾患、傷害または手術の結果として起こりうるCMEにおいて、体液は網膜黄斑の層内に集まり、かすんだ、歪んだ中心視をもたらす。ERM (黄斑パッカー)は、網膜黄斑の上に形成するセロハン-様膜であり、ぼやけおよび歪みをもたらすことによって、中心視に影響を与える。
【０００６】
網膜色素上皮 (RPE)の肥大性および萎縮性変化、網膜剥離、脈絡叢血管閉塞、網膜血管閉塞、例えば、角膜炎、角膜移植または角膜形成の後の角膜血管新生、(例えば、極度のコンタクトレンズ着用の結果として)低酸素症に起因する角膜血管新生、結膜翼状片(pterygium conjuctivae)、網膜下浮腫、および網膜内浮腫などの障害も関連がある。
【０００７】
血管内皮増殖因子 (VEGF)は、血管新生の重要な修飾物質であることが見出されており、AMDおよび糖尿病性網膜症を含む多数の症状の病理に関係している。さらに、AMD については、ペガプタニブ、ラニビズマブまたはアフリベルセプトなどの抗-VEGF 阻害剤の硝子体内注射が、脈絡叢血管新生および血管漏出を減少させることが示された [Gragoudas (2004)、N. Engl. J. Med. 351: 2805-2816; Rosenfeld (2006)、N. Engl. J. Med. 355: 1419-1431; Dixon (2009)、Expert Opin. Investig. Drugs 18: 1573-1580]。
【０００８】
AMDについての現在の標準治療は、抗-VEGF 治療であるルセンティス (ラニビズマブ)である。しかしながら、ルセンティスで治療されたすべてのAMD 患者の1/3 しか、視覚の改善を示さない [Rosenfeld (2006)、N. Engl. J. Med. 355: 1419-1431]。それゆえVEGF-非依存的作用機序を有する新しい抗血管新生治療的選択肢は、眼疾患、例えば、糖尿病性網膜症およびAMDにおける現在の標準治療を改善する可能性を有する。
【０００９】
ALK1 (アクチビン受容体様キナーゼ-1)は、内皮細胞において優先的に発現し、血管新生に関与する、TGFβ 受容体ファミリーのSer/Thr キナーゼ受容体である。このファミリーのメンバーは、I型およびII型セリン/スレオニンキナーゼ受容体である TβRI およびTβRII およびアクセサリー III型受容体のヘテロ四量体受容体複合体へのリガンド結合によりそれらの生物活性を媒介する。TGFβ ならびに高親和性リガンドである BMP9 およびBMP10は、BMPRII またはActRII とIII型受容体エンドグリンとの受容体複合体においてALK1を活性化することができる [Scharpfenecker (2007)、J. Cell Sci. 120: 964-972]。微小血管内皮細胞におけるALK1へのBMP9の結合は、Smad1/5/8 経路を活性化する [David (2007)、Blood 109 (5): 1953-1961]。BMP9が、内皮細胞の遊走および増殖を阻害することが推論された。しかしながら、ほとんどの研究により、ALK1 受容体活性化は、 内皮細胞遊走、増殖、および管形成を促進することが見出されている [Goumans (2002)、EMBO Journal 21 (7): 1743-1753; Wu (2006)、Microvasc. Res. 71: 12-19]。
【００１０】
BMP9 およびBMP10は、 ALK1 受容体複合体を活性化する。内皮細胞において、TGFβもまた、ALK1を活性化することができるが、一方ほとんどの細胞型においては、TGFβはALK5を介してシグナルを伝える。ALK5 活性化はSmad2/3のリン酸化を導く一方、ALK1 活性化の結果、Smad1/5のリン酸化が起こる。それぞれのSmad シグナル伝達経路は最終的には、特定のセットの標的遺伝子の調節をもたらす: Smad2/3 シグナル伝達は、PAI-1の発現およびId-1の抑制を誘導する一方、Smad1/5 シグナル伝達は、Smad6、Smad7 およびId-1 発現を誘導し、PAI-1 発現を低下させる [Deng (2006)、J. Cell Biol. 134: 1563-1571; Ota (2002)、J. Cell Physiol. 193: 299-318]。
【００１１】
III型受容体エンドグリンは、特に内皮細胞におけるALK1 およびALK5 経路の微調整において役割を果たし、リガンド受容体相互作用を調節している[ten Dijke (2008)、Angiogenesis 11: 79-89]。エンドグリンは、 TGFβ/ALK1-相互作用を促進するが、TGFβ/ALK5-相互作用を低下させる [David (2007)、Blood 109: 1953-1961]。
【００１２】
エンドグリンおよびALK1における突然変異は、遺伝性出血性末梢血管拡張症と称される常染色体優性障害と関連しており(それぞれHHT1 および HHT2)、これらは血管新生障害、例えば、動脈静脈(arterial venous) 形成異常および毛細血管拡張症の特徴を有する[Fernandez-Lopez (2006)、Clin. Med. ＆ Res. 4: 66-78]。ALK1遺伝子の機能的コピーを１コピーしか有さない (ALK1+/-) RIP1-Tag2 マウスは、ALK1wt マウスと比較して、遅延した腫瘍進行およびより低い微小血管密度を示す。同様の観察が可溶性 ALK1-Fc 受容体コンストラクト RAP-041についてもなされており、これは腫瘍血管新生をインビボで阻害し、腫瘍増殖を制限した [Cunha (2010)、J. Exp. Med. 207: 85-100]。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
それゆえ、強力かつ選択的な ALK1 阻害剤の発見が、血管生理および病理におけるALK1の役割をさらに解明するため、そして血管新生および血管再構築に関連する疾患のための可能性のある治療的選択肢を導き出すために、非常に望ましい。
【００１４】
WO 2007/147647-A1において、特定の 3-アリール-置換ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン誘導体がそれまでに刊行された最初の低分子 ALK1 キナーゼ阻害剤であると記載されている。これらの化合物は、無調節な血管増殖の疾患、特に固形腫瘍およびその転移そしてまた眼の血管新生-依存性疾患、例えば、加齢黄斑変性の治療のために有用であるといわれていた。
【００１５】
広範なタンパク質キナーゼに対して特有の阻害プロファイルを有する、様々なピロロ[2,1−f][1,2,4]トリアジン-4-アミン誘導体が、とりわけ、WO 00/71129-A1、WO 2005/121147-A1、WO 2007/056170-A2、WO 2007/061882-A2、WO 2007/064883-A2、WO 2007/064931-A2、WO 2007/079164-A2、WO 2008/089105-A2、WO 2009/136966-A1、およびWO 2010/126960-A1において開示されている。一般的に、これらの化合物は、増殖性および/または血管新生-関連障害、例えば、癌の治療のために有用であると述べられた。しかしながら、これらの刊行物はいずれも、ALK1 が可能性のある標的キナーゼであることについては言及していない。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
驚くべきことに、このたび、5-位にヒドロキシメチルアリール置換基を有するピロロ[2,1−f][1,2,4]トリアジン-4-アミン誘導体が、 ALK1 キナーゼの強力かつ選択的な阻害を示し、それによって、これら化合物は特に、血管新生-関連眼障害の治療のために有用であることが見出された。
【００１７】
したがって、一つの側面において、本発明は、一般式(I)：
【化１】
0005955953.tif 000002
(I)、
[式中：
Aは、NまたはC-R2であり、ここで、
R2は、水素、フルオロまたはクロロを表し、
R1は、水素、フルオロ、クロロ、メチル、エチルまたはメトキシを表し、
そして、
Zは、そのそれぞれが、ヒドロキシにより置換されていてもよい、 (C1-C4)-アルキルまたは(C3-C6)-シクロアルキルを表し、 
あるいは、
Zは、式：
【化２】
0005955953.tif 000003
の複素環基を表し、
ここで、* は、ピロロトリアジン部分との結合点(the point of attachment) を示し、
そして、
R3は、水素またはヒドロキシを表し、
ただし、R3 がヒドロキシである場合、このヒドロキシは、環窒素原子の近傍に位置する(located adjacent to)環炭素原子に結合しておらず(is not attached to)、
あるいは、
Zは、式：
【化３】
0005955953.tif 000004
のチアゾール基を表し、
ここで、*は、ピロロトリアジン部分との結合点を示し、
そして、
R4は、水素、メチル、エチル、アミノまたはアミノメチルを表し、
あるいは、
Zは、式：
【化４】
0005955953.tif 000005
の基を表し、
ここで、*は、ピロロトリアジン部分との結合点を示し、
R5は、(C3-C6)-シクロアルキル、オキセタニル、テトラヒドロフラニルまたはテトラヒドロピラニルを表し、
R6は、水素またはヒドロキシを表し、
R7は、水素またはヒドロキシを表し、
ただし、R7 がヒドロキシである場合、このヒドロキシは、環窒素原子の近傍に位置する環炭素原子に結合しておらず、
そして、
Yは、O、NHまたはNCH3である] 
の5-[(ヒドロキシメチル)アリール]-置換ピロロ[2,1−f][1,2,4]トリアジン-4-アミンに関する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明による化合物は、それらの塩、溶媒和物(solvate)および/または塩の溶媒和物の形態にても存在しうる。
【００１９】
本発明による化合物は、式(I)の化合物およびそれらの塩、溶媒和物および塩の溶媒和物、式(I)に含まれ、以下に言及される式の化合物およびそれらの塩、溶媒和物および塩の溶媒和物、および式(I)に含まれ、例示的態様として以下に言及される化合物およびそれらの塩、溶媒和物および塩の溶媒和物であり、ここで、式(I)に含まれ、以下に言及される化合物は既に塩、溶媒和物および塩の溶媒和物ではないものとする。
【００２０】
本発明の目的のための塩は、好ましくは、本発明による化合物の医薬上許容される塩である (例えば、S. M. Berge et al.、"Pharmaceutical Salts"、J. Pharm. Sci. 1977、66、1-19を参照されたい)。それ自体医薬用途のために好適なものではないが、例えば、本発明による化合物の単離または精製のために利用できる塩もまた含まれる。
【００２１】
医薬上許容される塩には、鉱酸、カルボン酸およびスルホン酸の酸付加塩が含まれ、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸および安息香酸の塩が挙げられる。
【００２２】
本発明の文脈における溶媒和物(Solvates)は、固体または液体状態にて、化学量論的配位により溶媒分子と錯体を形成する本発明による化合物の形態として名付けられる。水和物(Hydrate)は、配位が水によって起こっている溶媒和物の特定の形態である。水和物は、本発明の文脈において好ましい溶媒和物である。
【００２３】
本発明の化合物は、不斉中心の性質により、または制限された回転により、異性体(エナンチオマー、ジアステレオマー)の形態にて存在しうる。不斉中心が(R)-、(S)-、または(R,S)-配置であるいずれの異性体も存在しうる。
【００２４】
二以上の不斉中心が本発明の化合物中に存在する場合、例示された構造のいくつかのジアステレオマーおよびエナンチオマーがしばしば可能であり、純粋なジアステレオマーおよび純粋なエナンチオマーが好ましい態様を表すことも理解されたい。純粋な立体異性体、純粋なジアステレオマー、純粋なエナンチオマー、およびそれらの混合物が、本発明の範囲に含まれることが意図される。
【００２５】
幾何異性体が、二重結合または環についての置換基の性質により、シス (= Z-)またはトランス (= E-) 形態にて存在し得、両方の異性体が本発明の範囲に含まれる。
【００２６】
分離されているか(separated)、純粋であるか、部分的に純粋であるか、またはラセミ混合物におけるものであるかにかかわらず、本発明の化合物のすべての異性体が本発明の範囲に含まれる。該異性体の精製および該異性体混合物の分離(separation)が、当該技術分野において公知の標準的技術によって達成され得る。 例えば、ジアステレオマー混合物は、個々の異性体へと、クロマトグラフィー方法または結晶化によって分離することができ、ラセミ化合物は、それぞれのエナンチオマーへと、キラル相でのクロマトグラフィー方法により、または分割によって、分離することができる。
【００２７】
さらに、上記の化合物のすべての可能な互変異性形態が本発明により含まれる。
【００２８】
特に断りのない限り、以下の定義が、本明細書および請求項の全体にわたって用いられる置換基および残基について適用される:
【００２９】
(C1-C4)-アルキルは、1から4 の炭素原子を有する直鎖または分枝飽和炭化水素ラジカルを表す。例としては、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチルが挙げられる。
【００３０】
(C3-C6)-シクロアルキルは、3から6 の環炭素原子を有する単環式飽和炭化水素ラジカルを表す。例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルが挙げられる。
【００３１】
本文書全体にわたって、簡便性の目的で、単数形の言葉の使用が複数形の言葉よりも好まれるが、一般的に特記しない場合、複数形の言葉も含む意図である。例えば、「患者に有効量の式(I)の化合物を投与することを含む、患者における疾患を治療する方法」という表現は、二以上の疾患の同時の治療ならびに二以上の式(I)の化合物の投与も含む意図である。
【００３２】
好ましい態様において、本発明は、一般式(I)の化合物に関し、ここで、
Aは、C-R2であり、ここで、
R2は、水素またはフルオロを表し、
R1は、水素、フルオロ、クロロ、メチル、エチルまたはメトキシを表し、
そして、
Zは、そのそれぞれが、ヒドロキシにより置換されていてもよい、n-プロピル、n-ブチルまたはシクロヘキシルを表し、
あるいは、
Zは、式：
【化５】
0005955953.tif 000006
の複素環基を表し、 
ここで、*は、ピロロトリアジン部分との結合点を示し、
あるいは、
Zは、式：
【化６】
0005955953.tif 000007
のチアゾール基を表し、 
ここで、* は、ピロロトリアジン部分との結合点を示し、
そして、
R4は、メチル、エチル、アミノまたはアミノメチルを表し、
あるいは、
Zは、式：
【化７】
0005955953.tif 000008
の基を表し
ここで、* は、ピロロトリアジン部分との結合点を示し、
R5は、シクロプロピルまたはテトラヒドロピラン-4-イルを表し、
R6は、ヒドロキシを表し、
そして、
Yは、Oである。
【００３３】
特に好ましい態様において、本発明は、一般式(I)の化合物に関し、ここで、
Aは、C-R2であり、ここで、
R2は、水素またはフルオロを表し、
R1は、水素、フルオロ、メチル、エチルまたはメトキシを表し、
そして、
Zは、4-ヒドロキシブチルまたは4-ヒドロキシシクロヘキシルを表し、
あるいは、
Zは、式：
【化８】
0005955953.tif 000009
の複素環基を表し、
ここで、* は、ピロロトリアジン部分との結合点を示し、
あるいは、
Zは、式：
【化９】
0005955953.tif 000010
のチアゾール基を表し、
ここで、*は、ピロロトリアジン部分との結合点を示し、
そして、
R4は、メチル、エチル、アミノまたはアミノメチルを表し、
あるいは、
Zは、式：
【化１０】
0005955953.tif 000011
の基を表し、
ここで、* は、ピロロトリアジン部分との結合点を示し、
そして、
R5は、シクロプロピルを表す。
【００３４】
別の態様において、本発明は、一般式(I)の化合物に関し、ここで、
Aは、C-R2であり、ここで、
R2は、水素またはフルオロを表す。
【００３５】
さらに別の態様において、本発明は、一般式(I)の化合物に関し、ここで、
Aは、C-R2であり、ここで、
R2は、フルオロを表し、
そして、
R1は、フルオロを表す。
【００３６】
残基のそれぞれの組み合わせまたは好ましい組み合わせにおいて具体的に示される残基の定義はまた、残基について示される特定の組み合わせにかかわりなく、要望通りその他の組み合わせの残基の定義により置換される。二以上の上記の好ましい範囲の組み合わせが特に好ましい。
【００３７】
別の態様において、本発明は、一般式(I)の化合物を調製する方法に関し、この方法は、式(II)のブロモピロロトリアジン：
【化１１】
0005955953.tif 000012
(II)、
[ここで、Zは上記の意味を有する]
が、
[A]式(III)の アリールボロン酸またはエステル(arylboronic acid or ester)と好適なパラジウム触媒および塩基の存在下で結合されて(coupled)、
【化１２】
0005955953.tif 000013
(III)、
[ここで、A および R1は上記の意味を有し、
そして、
R8は、水素または(C1-C4)-アルキルを表すか、あるいは両方のR8残基が一緒に結合して、−(CH2)2−、-C(CH3)2-C(CH3)2-、-(CH2)3- または-CH2-C(CH3)2-CH2- 架橋を形成する]
式(I)の標的化合物が生じるか、
【化１３】
0005955953.tif 000014
(I)、
[ここで、A、Z およびR1 は上記の意味を有する]
あるいは、
[B]まず、式(IV)の対応するボロン酸またはエステル誘導体(boronic acid or ester derivative)へと変換され、
【化１４】
0005955953.tif 000015
(IV)、
[ここで、Zは、上記の意味を有し、
そして、
R9は、水素または(C1-C4)-アルキルを表すか、あるいは両方のR9残基が一緒に結合して、−(CH2)2−、-C(CH3)2-C(CH3)2-、-(CH2)3- または-CH2-C(CH3)2-CH2- 架橋を形成する]
これが次いで、式(V)の臭化アリールと好適なパラジウム触媒および塩基の存在下で結合され(coupled)、
【化１５】
0005955953.tif 000016
(V)、
[ここで、 A およびR1は上記の意味を有する]
また式(I)の標的化合物が生じる、
【化１６】
0005955953.tif 000017
(I)、
[ここで、A、Zおよび R1 は上記の意味を有する]
のいずれかを特徴とし、
所望により、適切な場合には、以下の工程を行ってもよい ：(i)式(I)の化合物をそれらのそれぞれのエナンチオマーおよび/またはジアステレオマーへと、好ましくはクロマトグラフィー方法を用いて分離する工程、および/または (ii)式(I)の化合物をそれらのそれぞれの水和物、溶媒和物、塩および/または塩の水和物または溶媒和物へと、対応する溶媒および/または酸による処理により変換する工程。
【００３８】
上記のように、式(I)の化合物は、ブロモピロロトリアジン (II)とアリールボロン酸エステル(boronate)またはボロン酸 (III)との間のカップリング反応 (「鈴木カップリング」)により合成することができる。このカップリングは、一般的に高温でパラジウム触媒、塩基および不活性溶媒を用いて行われる。触媒および反応条件の概要は、文献においてみることができる [例えば、S. Kotha et al.、Tetrahedron 2002、58、9633-9695; T. E. Barder et al.、J. Am. Chem. Soc. 2005、127、4685-4696を参照されたい]。この反応における好ましい触媒は、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0)である。好ましい塩基は、水溶液として用いられる炭酸ナトリウムである。反応は、反応条件下で不活性な有機溶媒、例えば、1,4-ジオキサン、アセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミド (DMF) またはジメチルスルホキシド (DMSO)中で、または水中でまたはこれらの溶媒の混合物中で行われる。好ましくは、反応は、1,4-ジオキサンと水またはアセトニトリルと水の混合物中で行われる。反応は一般的に+100℃から+250℃の温度で、好ましくは +120℃から +150℃で行われる。加熱は好ましくは単一モードマイクロ波装置によって達成される。反応は通常、不活性ガス雰囲気下、好ましくはアルゴン下にて実施される。
【００３９】
鈴木カップリングのための反応パートナーの逆反応性(inverse reactivity) が時折有利であることがありうる。この目的のために、ブロモピロロトリアジン (II) をまず、上記の方法のいずれかにしたがって、対応するボロン酸エステル(boronate) (IV)へと変換し、次いで臭化アリール (V) とクロスカップリングする(cross-coupled)。(II)の(IV)への変換は金属-媒介ホウ素化(borylation) 反応によって達成される。好ましい方法は、パラジウム-触媒「宮浦ホウ素化(borylation)」である[例えば、J. Takagi et al.、J. Am. Chem. Soc. 2002、124、8001-8006; T. Ishiyama et al.、J. Org. Chem. 1995、60、7508-7510; A. L. S. Thompson et al.、Synthesis 2005、547-550を参照されたい]。クロス-カップリング反応 (IV) + (V) → (I)のための、手順、試薬および溶媒は先のセクションにて言及したものから選択される。
【００４０】
アリールボロン酸 (III) [R8 = H]およびアリールボロン酸エステル(boronate) (III) [R8 = アルキル、または両方のR8 は一緒に結合して、環状ボロン酸(boronic)エステル、例えば、ピナコラトエステルを形成する]は、市販されているか、またはそれらは対応するアリールハライドまたはアリールトリフラートから金属-媒介ホウ素化(borylation) 反応を用いて便宜に調製され得る(参考のため、先のセクションを参照)。ホウ素化(borylation)および引き続く鈴木カップリングは、中間体 (III)の単離および精製を含む２つの別々の工程にて行われ得る。あるいは、ホウ素化(borylation) およびクロス-カップリングは、直接的に、単離および精製を行わずに(III) を用いるワンポット手順として行われ得る。
【００４１】
一級または二級アミン部分が、式(I)の標的化合物におけるZ 基の部分を形成する場合、上記のホウ素化(borylation)およびカップリング反応において、このアミンの保護誘導体を出発ピロロトリアジン (II)として遊離アミン化合物の代わりに使用することがしばしば有利でありうる。この目的のために、常套の一時的アミノ-保護基、例えば、アシル基(例えば、アセチルまたはトリフルオロアセチル) またはカルバメート-型保護基(例えば、Boc-、Cbz- またはFmoc-基)を用いることができる。好ましくは、トリフルオロアセチルまたは Boc 基が用いられる。同様に、カップリング成分 (III)および(V)におけるヒドロキシ官能基を、それぞれ一時的に、この方法の際に、好ましくは 、シリルエーテル誘導体、例えば、トリメチルシリルまたはtert-ブチルジメチルシリルエーテルとしてブロックしてもよい。
【００４２】
これらの保護基は、次いでカップリング反応混合物の水性後処理 (work-up)の際に、同時に切断除去することができ、あるいはそれらは、当該技術分野において公知の標準的方法を用いて引き続く、分離(separate)反応工程において除去される。式(II)、(III)および(V)の、それぞれ、対応する遊離アミンまたはアルコールからの、またはその他の前駆化合物からの、上記の保護中間体の調製(以下のセクション参照)もまた、文献に記載される一般的手順にしたがって容易に達成される [例えば、T. W. Greene and P. Wuts、Protective Groups in Organic Synthesis、Wiley、New York、1999を参照されたい]。
【００４３】
本発明の化合物の調製は、以下の合成スキームによって例証することができる:
【００４４】
スキーム 1
【化１７】
0005955953.tif 000018
【００４５】
式(II)のブロモピロロトリアジンを調製するために使用され得る合成方法は、 (II) に存在するZ 基の化学型にしたがって構成され得る。これらの様々な経路を例示する例を以下に示す(合成スキーム2-6参照)。より詳細な手順は、本発明の具体的中間体および実施例化合物を記載する実験セクションにおいて提供される。
【００４６】
例えば、アルキルまたはヒドロキシアルキル残基をZ 基として含有する式(II)の化合物は、ブロモピロロトリアジン (VI) と式(VII)の末端アルキンとの間のカップリング反応を鍵となる工程 (スキーム 2)として用いることにより得ることができる。この型の反応 (「薗頭反応」) は、通常、パラジウム-銅触媒系および塩基の存在下で行われる。この反応のいくつかの例は、文献に記載されている [例えば、R. Chinchilla and C. Naejera、Chem. Rev. 2007、107、874-922を参照されたい]。本発明において、好ましい銅源は、ヨウ化銅(I)であり、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0) がパラジウム触媒として用いられ、ピロリジンは塩基および溶媒の両方として作用する。カップリング反応は、同時のマイクロ波照射下で有利に行われる。
【００４７】
結果として得られるアルキン (VIII)は、次いで、通常のパラジウムまたは白金触媒を用いる触媒的水素化に供される。好ましくは、酸化白金(IV)が触媒として用いられ、反応は溶媒として酢酸中で実施される。いくつかの場合において、生成物 (IX)および(X) の混合物は、この手順によって得られるが、これは、いずれにしても、容易にクロマトグラフィー方法によって分離することができる。好ましくは 1,3-ジブロモ-5,5-ジメチルヒダントインを臭素源として用いる、不活性溶媒、例えば、THFまたはDMF中の引き続くブロム化(bromination)反応により、それぞれ、標的ピロロトリアジン(IIa)および(IIb)が生じる。
【００４８】
出発化合物 7-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミン (VI) の調製は、以前に記載されている [WO 2007/056170-A2 (中間体 B) を参照]。
【００４９】
スキーム 2
【化１８】
0005955953.tif 000019
【００５０】
型(IIc)のブロモピロロトリアジン前駆体 (スキーム 3)は、金属、例えば、マグネシウムまたはリチウムによる化合物 (VI)のメタル化、または、有機-マグネシウムまたは有機-リチウム試薬を用いるハロゲン-金属交換によって調製することができる。好ましい金属はマグネシウムであり、これは溶媒、例えば、THFまたはジエチルエーテル中のイソプロピルマグネシウムブロミドによる処理によって(VI)へと導入される。中間体有機-金属種は、次いで、シクロアルカノン(cycloalkanone)またはヘテロシクロアルカノン(heterocycloalkanone) (XI) [R、R' は一緒に結合して、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル環を形成する] と反応され、三級アルコール (XIIa)が得られる。
【００５１】
式(XIIb)の二級アルコールを導く補完的な経路は、ヴィルスマイヤー・ ホルミル化反応を使用し、これにより、アミノピロロトリアジン (XIII) がアルデヒド (XIV)へと変換される (スキーム 3)。側鎖導入は、溶媒、例えば、THFまたはジエチルエーテル中での適当なグリニャール試薬 (XV) [R'' = アルキルまたはシクロアルキル]の引き続く添加によって達成される。最終的に、化合物(XIIa)および(XIIb)の、不活性溶媒、例えば、 THFまたはDMF中での好ましくは 1,3-ジブロモ-5,5-ジメチルヒダントインを用いるブロム化により、それぞれ標的ピロロトリアジン(IIc)および(IId)が提供される。
【００５２】
出発化合物である、ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミン (XIII) の調製は以前に記載されている [WO 2007/056170-A2 (中間体 A) を参照]。
【００５３】
スキーム 3
【化１９】
0005955953.tif 000020
【００５４】
Zが非置換シクロアルキルまたは炭素-結合アザ-ヘテロシクリル基を表す式(II)のピロロトリアジンは、式(XIIc)の三級アルコールの式(XVI)の不飽和炭素環または複素環への、通常の薬剤、例えば、トリフルオロ酢酸無水物、トリフルオロメタンスルホン酸無水物、酸化リン(V)、硫酸またはその他の強酸を用いる、脱水により調製することができる (スキーム 4)。常套の触媒、例えば、パラジウム炭(palladium on charcoal) を用いる引き続く触媒的水素化により式(XVII)の飽和類似体が生じる。水素化工程は、 好ましくは、溶媒、例えば、少量の水性トリフルオロ酢酸を含有するメタノール、エタノール またはTHF中で行われる。最終的に、1,3-ジブロモ-5,5-ジメチルヒダントインによる、上記の通りのブロム化により、標的ピロロトリアジン (IIe)が提供される。
【００５５】
アルコール前駆体(XIIc)自体は、容易にスキーム 3 に示す合成経路によって到達可能である[化合物 (XIIa) の調製参照]。
【００５６】
スキーム 4
【化２０】
0005955953.tif 000021
【００５７】
Zが1,3-チアゾール-4-イル基を表す式(II)のピロロトリアジンは、上記の通りの化合物 (VI)のメタル化により調製することができ、次いで、クロロアセチルクロライドとの反応により中間体 (XVIII)が得られ、次いでチオアミドまたはチオ尿素 (XIX) [R4 は上記定義の通り]との縮合により前駆化合物 (XX)が生じる (スキーム 5)。1,3-ジブロモ-5,5-ジメチルヒダントインによる上記の通りのブロム化により、最終的に標的ピロロトリアジン (IIf)が提供される。
【００５８】
スキーム 5
【化２１】
0005955953.tif 000022
【００５９】
Z がN-環状アミノメチル基を表す式(II)のピロロトリアジンは、ホルムアルデヒドとともにピロロトリアジン (XIII)と型(XXI)の 環状アミンとを、酸性溶媒、例えば、酢酸、または酸と有機溶媒の混合物中で反応させることによって得ることができる(スキーム 6)。結果として得られる生成物 (XXII) の1,3-ジブロモ-5,5-ジメチルヒダントインによる上記の通りのブロム化により、次いで標的ピロロトリアジン (IIg)が提供される。
【００６０】
スキーム 6
【化２２】
0005955953.tif 000023
【００６１】
式 (V)、(VII)、(XI)、(XV)、(XIX)および(XXI) の化合物は、市販されているか、文献から公知であるか、または容易に入手可能な出発物質から文献に記載される標準的方法の適用によって調製することができる。
【００６２】
本発明の化合物は、有用な薬理学的性質を有し、ヒトおよび動物における疾患の予防および治療のために用いられうる。
【００６３】
本発明の化合物は、強力かつ選択的なALK1 キナーゼの阻害剤である。それらはそれゆえ、血管新生-関連障害、特に、血管新生-関連眼障害の治療および/または予防のために用いられうる。
【００６４】
本発明のために、「治療」または「治療する」という用語は、疾患、障害、症状または状況の退行、その発達および/または進行、および/またはその症候を、阻害する、遅延させる、軽減する、緩和する、停止させる、低下させる、または引き起こすことを含む。「予防」または「予防する」という用語には、疾患、障害、症状または状況、その発達および/または進行、および/またはその症候を有する、罹患する、または経験するリスクを低下させることが含まれる。予防という用語には、予防法(prophylaxis)も含まれる。疾患、障害、症状または状況の治療または予防は部分的であっても完全であってもよい。
【００６５】
本発明の化合物により治療および/または予防されうる血管新生-関連眼障害としては、これらに限定されないが、加齢黄斑変性 (AMD)、糖尿病性網膜症、特に、糖尿病性黄斑浮腫 (diabetic macula edema)(DME)、その他の網膜症、例えば、脈絡膜血管新生 (CNV)、脈絡叢新生血管膜 (CNVM)、嚢胞様黄斑浮腫 (CME)、網膜上膜 (ERM)および黄斑円孔、網膜色素上皮 (RPE)の肥大性変化、網膜色素上皮の萎縮性変化、網膜剥離、脈絡叢血管閉塞、網膜血管閉塞、例えば、角膜炎、角膜移植または角膜形成の後の角膜血管新生、(例えば、極度のコンタクトレンズ着用によって誘導される)低酸素症に起因する角膜血管新生、結膜翼状片(pterygium conjunctivae)、網膜下浮腫、および網膜内浮腫が挙げられる。
【００６６】
本発明の文脈における、加齢黄斑変性 (AMD) という用語には、AMDの湿性(wet) (または滲出性、新生血管) および乾性(dry) (または非-滲出性、非-新生血管) 症状の両方が含まれる。
【００６７】
本発明の化合物は、さらに、血管新生に関連する炎症性疾患、例えば、関節リウマチ、乾癬、接触性皮膚炎、喘息、肺高血圧症、多発性硬化症、および腸の炎症性疾患、例えば、クローン病の治療および/または予防のために用いられうる。線維性疾患、例えば、線維症および硬変もまた、本発明の化合物によって治療および/または予防され得る。
【００６８】
それらの活性プロファイルのために、本発明の化合物は、特に、眼障害、例えば、加齢黄斑変性 (AMD)、脈絡膜血管新生 (CNV)、糖尿病性網膜症および糖尿病性黄斑浮腫 (DME)の治療および/または予防のために好適である。
【００６９】
上記の障害は、ヒトにおいてよく特徴づけられているが、哺乳類を含むその他の動物においても同様の病因にて存在し、本発明の化合物によってこれらにおいても治療することができる。
【００７０】
したがって、本発明はさらに、障害、特に、上記の障害の治療および/または予防のための本発明による化合物の使用に関する。
【００７１】
本発明はさらに、障害、特に、上記の障害の治療および/または予防のための医薬組成物を調製するための本発明による化合物の使用に関する。
【００７２】
本発明はさらに、障害、特に、上記の障害の治療および/または予防のための方法における本発明による化合物の使用に関する。
【００７３】
本発明はさらに、有効量の本発明による化合物の少なくとも一つを用いることによる、障害、特に、上記の障害の治療および/または予防のための方法に関する。
【００７４】
本発明の化合物は、単独の医薬品として、または一以上のさらなる治療薬と組み合わせて投与され得、ここで、組み合わせは容認できない有害作用を引き起こさないものである。この併用療法は、上記定義の通りの式(I)の化合物、および一以上のさらなる治療薬を含有する単一の医薬用量製剤の投与、ならびに式(I)の化合物およびそれぞれのさらなる治療薬のその独自の別々の医薬用量製剤における投与を含む。例えば、式(I)の化合物および治療薬は、患者に一緒に単一の経口用量組成物、例えば、錠剤またはカプセル中にて投与してもよいし、あるいはそれぞれの剤は別々の用量製剤にて投与してもよい。
【００７５】
別々の用量製剤が用いられる場合、式(I)の化合物および一以上のさらなる治療薬は、本質的に同じ時期にて (即ち、同時に)または別々にずらした時期にて (即ち、順次に) 投与され得る。
【００７６】
特に、本発明の化合物は、以下のようなものとの固定されているかまたは別々の組み合わせにて用いられうる：VEGF-媒介血管新生の阻害剤、例えば、ACTB-1003、アフリベルセプト、アパチニブ(apatinib)、アキシチニブ、ベバシズマブ、ベバシラニブ(bevasiranib)、BMS-690514、ブリバニブ、セジラニブ、CT-322、ドビチニブ(dovitinib)、E7080、フォレチニブ(foretinib)、KH-902、リニファニブ、MGCD-265、モテサニブ、OTS-102、パゾパニブ、ペガプタニブ、ラニビズマブ、レゴラフェニブ、ルボキシスタウリン(ruboxystaurin)、ソラフェニブ、SU-14813、スニチニブ、テラチニブ(telatinib)、TG-100801、チボザニブ、TSU-68、バンデタニブ、バルガテフ(vargatef)、バタラニブおよびXL-184等、またはその他のシグナル伝達経路の阻害剤、例えば、ACU-4429、ジスルフィラム、E-10030、フェンレチニド、メカミラミン、PF-04523655、シロリムス、ソネプシズマブ(sonepcizumab)、タンドスピロンおよびボロシキシマブ等。
【００７７】
したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明による化合物の少なくとも一つおよび一以上のさらなる治療薬を含む、障害、特に、上記の障害の治療および/または予防のための、医薬組成物に関する。
【００７８】
本発明の化合物はまた、それ自体で、または組成物において、研究および診断において、または分析参照標準等として利用され得る。
【００７９】
別の側面において、本発明は、本発明による化合物の少なくとも一つを、一以上の不活性で、非毒性の、医薬上好適な賦形剤とともに含む医薬組成物、およびその上記の目的のための使用に関する。
【００８０】
本発明による化合物は、全身的におよび/または局所的に作用することができる。この目的のために、それらは、好適な様式で投与され得、例えば、経口、非経口、肺、経鼻、舌、舌下、頬側、直腸、皮膚、経皮、結膜、結膜下、硝子体内、耳または局所的経路等により、投与され得る。
【００８１】
本発明による化合物をこれらの投与経路のために好適な適用形態において投与することが可能である。
【００８２】
経口投与のために好適なものは、従来技術にしたがって機能し、本発明による化合物を迅速におよび/または修飾された様式にて送達し、本発明による化合物を結晶、非結晶および/または溶解形態にて含む適用形態(application form)であり、例えば、錠剤 (非被覆または被覆錠剤、例えば、腸溶コーティング、または、不溶性であるかまたは遅延して溶解して、本発明による化合物の放出を制御するコーティングを備えた錠剤)、口腔内で迅速に崩壊する錠剤、またはフィルム/ウエハー、フィルム/凍結乾燥物(lyophilizate)、カプセル(例えば、ハードまたはソフトゼラチンカプセル)、糖衣錠、顆粒、ペレット、粉末、乳濁液、懸濁液、噴霧剤または溶液等が挙げられる。
【００８３】
非経口投与は、吸収工程を避けて (例えば、静脈内、動脈内、心臓内、脊髄内または腰椎内)、あるいは吸収を含めて (例えば、筋肉内、皮下、皮内、経皮または腹腔内)、行われ得る。非経口投与のために好適な適用形態は、とりわけ、溶液、懸濁液、乳濁液、凍結乾燥物(lyophilizate)または無菌粉末の形態における注射および注入のための調製物である。
【００８４】
その他の投与経路のために好適な形態としては、例えば、吸入のための医薬形態(例えば、粉末吸入器、噴霧器)、点鼻薬、溶液またはスプレー、舌、舌下または頬側投与のための錠剤またはカプセル(例えば、トローチ剤、薬用キャンディー)、坐薬、耳および眼調製物 (例えば、滴下剤(drop)、軟膏)、膣カプセル、水性懸濁液 (ローション、シェイキング(shaking) 混合物)、脂溶性懸濁液、軟膏、クリーム、乳液、ペースト、フォーム、散布剤、および経皮治療システム(例えば、パッチ)が挙げられる。
【００８５】
本発明による化合物は、記載された適用形態へとそれ自体公知の方法で変換されうる。これは、不活性で、非毒性の、医薬上好適な賦形剤とともに混合することによって行われ得る。これらの賦形剤としては、とりわけ、担体 (例えば、結晶セルロース(microcrystalline cellulose)、ラクトース、マンニトール)、溶媒(例えば、液状ポリエチレングリコール)、乳化剤(例えば、ドデシル硫酸ナトリウム)、界面活性剤(例えば、ポリオキシソルビタンオレアート(polyoxysorbitan oleate))、分散剤(例えば、ポリビニルピロリドン)、合成および天然ポリマー (例えば、アルブミン)、安定剤 (例えば、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸等)、着色剤(例えば、無機色素、例えば、酸化鉄等)、および味および/または匂い遮蔽剤が挙げられる。
【００８６】
効果的な結果を達成するためには、一般的に、非経口投与にて、約 0.001 から1 mg/kg体重、好ましくは、約 0.01から 0.5 mg/kg体重の量投与するのが有利であることが判明した。経口投与では、例示的な用量範囲は、約 0.01 から 100 mg/kg体重、好ましくは、約 0.01 から 20 mg/kg体重、およびより好ましくは、約 0.1 から10 mg/kg 体重である。
【００８７】
にもかかわらず、本発明の医薬組成物における有効成分の投与の実際の用量レベルおよび時間経過は、特定の患者、組成物および投与様式のために、患者に対する毒性なく、所望の治療応答を達成するために効果的な有効成分の量を得るために変動しうる。それゆえ適切な場合には、特に、患者の年齢、性別、体重、食事および全身健康状態、投与経路、有効成分に対する個々の応答、調製物の性質、および投与が起こる時間またはその間隔の関数として、述べられた量から逸脱することが必要であることがある。したがって、いくつかの場合において、上記の最少量未満によって管理することが良好なことがあり得、一方、場合によっては述べられた上限を超える必要がある。より多い量の投与の場合には、これらを複数の個々の用量へと一日にわたって分散して(spread) 分割することが望ましいことがありうる。
【００８８】
上記のように、眼障害の治療および/または予防のために、本発明の化合物を投与するための好ましい経路は、眼に対して局所的な経路であるかまたは眼薬送達系によるものである。眼内注射は、かかる目的のために好適な本発明の化合物を投与するための別の様式である。
【００８９】
眼の内部の領域への送達は、カニューレまたは正確に計量された量の所望の製剤を特定の眼の内部の区画または組織 (例えば、後眼房または網膜)に導入するように設計されたその他の侵襲的装置を用いる注射によって達成され得る。眼内注射は硝子体内部 (硝子体内)、結膜の下 (結膜下)、眼の後ろ(眼球後)、強膜の内部、またはテノン嚢の下 (テノン下(sub-Tenon)) に対するものであってよく、徐放性製剤形態におけるものであってよい。その他の投与の眼内経路および注射部位および形態もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００９０】
本発明による化合物は、眼の後ろへの適切な送達を与えるために当業者に公知の方法にて製剤することができ、それは規則的投薬、例えば点眼薬による投薬、または本発明による化合物の徐放、例えば、持続放出を与える送達系を用いることによるものでありうる。
【００９１】
本発明の化合物のための好ましい眼用製剤としては、これら化合物が、かかる適用形態の製造および使用のために好適な賦形剤と混合して、液体の滴下剤(drop)、液体洗浄薬、スプレー、軟膏またはゲルの形態にある、水溶液、懸濁液またはゲルが挙げられる。あるいは、本発明の化合物はリポソームまたは当該技術分野において公知のその他の眼用送達系を介して眼へと適用され得る。
【００９２】
適当な用量レベルは、眼疾患を治療する当業者に公知のあらゆる好適な方法によって決定することができる。好ましくは、活性物質は、局所的投与について、一日1 から 4 回の頻度で、または薬物送達系が用いられる場合はそれより少ない頻度で投与される。典型的には、局所適用のための眼用製剤は、有効成分を約 0.001％から 10％の濃度範囲にて含有する。
【００９３】
以下の例示的な態様は本発明を例証するものである。本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００９４】
以下の試験および実施例におけるパーセンテージは、特に断りのない限り、重量％であり;部は重量部である。液体/液体溶液について報告される溶媒比、希釈比および濃度はそれぞれ体積に基づくものである。
【実施例】
【００９５】
A.実施例
略語および頭字語:
Ac：アセチル
aq.：水性(aqueous) (溶液)
Boc：tert-ブトキシカルボニル
br.：ブロード (1H NMR シグナル)
Cbz：ベンジルオキシカルボニル
Celite（登録商標）： Celite Corp.の登録商標、珪藻土の銘柄
conc.：濃
DCI：直接化学イオン化 (MS)
DCM：ジクロロメタン
DMF：N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO：ジメチルスルホキシド
e.e.：エナンチオマー過剰率
EI：電子衝撃イオン化 (MS)
ent：エナンチオマー、エナンチオマー的に純粋
eq.：当量
ESI：エレクトロスプレーオン化 (MS)
Et：エチル
EtOAc：酢酸エチル
Fmoc：(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル
GC/MS：ガスクロマトグラフィー-結合(coupled) 質量分析
h：時間
Hal：ハロゲン
1H NMR：プロトン核磁気共鳴分光法
HPLC：高速液体クロマトグラフィー
LC/MS：液体クロマトグラフィー-結合(coupled) 質量分析
Me：メチル
MeOH：メタノール
min：分
MS：質量分析
of th.：理論の(of theory) (化学収率)
PdCl2(dppf)：[1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム(II)
Ph：フェニル
rac：ラセミ、ラセミ化合物
Rf：TLC 保持因子
rt：室温
Rt：保持時間 (HPLC)
satd.：飽和
TBAF：フッ化テトラブチルアンモニウム
tBu：tert-ブチル
tert：三級
TFA：トリフルオロ酢酸
TFAA：トリフルオロ酢酸無水物
THF：テトラヒドロフラン
TLC：薄層クロマトグラフィー
【００９６】
分取 HPLC 精製方法:
方法 1:
装置: Gilson Abimed HPLC、バイナリーポンプシステム; カラム: ReproSil C18、250 mm x 30 mm; 溶離液 A: 水 / 1％ アンモニア、溶離液 B: アセトニトリル; グラジエント: 0-3 分 10％ B、5.01-31 分 95％ B、31 分 95％ B; 流速: 50 mL/分; UV 検出: 210 nm。
【００９７】
方法 2:
装置: Gilson Abimed HPLC、バイナリーポンプシステム; カラム: Kromasil-100A C18、5 μm、250 mm x 30 mm; 溶離液 A: 水 / 0.05-0.5％ TFA、溶離液 B: アセトニトリル; グラジエント: 0-5 分 5％ B、5.01-10 分 10％ B、10.01-20 分 40％ B、20.01-27 分 50％ B、27.01-40 分 60％ B、40.01-45 分 90％ B、45.01-60 分 100％ B; 流速: 15-60 mL/分; UV 検出: 210 nm。
【００９８】
方法 3:
装置: Gilson Abimed HPLC、バイナリーポンプシステム; カラム: Grom-Sil-120 ODS-4HE、250 mm x 30 mm; 溶離液 A: 水、溶離液 B: アセトニトリル; グラジエント: 0-3 分 10％ B、3.01-35 分 98％ B、35.01-40 分 98％ B; 流速: 50 mL/分; UV 検出: 210 nm。
【００９９】
方法 4:
装置: Gilson Abimed HPLC、バイナリーポンプシステム; カラム: Grom-Sil-120 ODS-4HE、250 mm x 30 mm; 溶離液 A: 水 / 0.5％ アンモニア、溶離液 B: アセトニトリル; グラジエント: 0-3 分 10％ B、3.01-35 分 98％ B、35.01-40 分 98％ B; 流速: 50 mL/分; UV 検出: 210 nm。
【０１００】
方法 5:
装置: Gilson Abimed HPLC、バイナリーポンプシステム; カラム: Chromatorex C18 10 μm、250 mm x 30 mm; 溶離液 A: 水、溶離液 B: アセトニトリル; グラジエント: 0-3 分 10％ B、5.01-31 分 90％ B、31 分 90％ B; 流速: 50 mL/分; UV 検出: 210 nm。
【０１０１】
方法 6:
装置: Gilson Abimed HPLC、バイナリーポンプシステム; カラム: Chromatorex C18 10 μm、250 mm x 30 mm; 溶離液 A: 水 / 0.5％ TFA、溶離液 B: アセトニトリル; グラジエント: 0-3 分 10％ B、5.01-31 分 90％ B、31 分 90％ B; 流速: 50 mL/分; UV 検出: 210 nm。
【０１０２】
方法 7:
装置: Gilson Abimed HPLC、バイナリーポンプシステム; カラム: ReproSil C18 10 μm、250 mm x 40 mm; 溶離液 A: 水、溶離液 B: アセトニトリル; グラジエント: 0-3 分 10％ B、5.01-31 分 95％ B、31 分 95％ B; 流速: 50 mL/分; UV 検出: 210 nm。
【０１０３】
方法 8:
装置: Gilson Abimed HPLC、バイナリーポンプシステム; カラム: ReproSil C18 10 μm、250 mm x 30 mm; 溶離液 A: 水、溶離液 B: アセトニトリル; グラジエント: 0-3 分 10％ B、5.01-31 分 95％ B、31 分 95％ B; 流速: 50 mL/分; UV 検出: 210 nm。
【０１０４】
方法 9:
装置: Gilson Abimed HPLC、バイナリーポンプシステム; カラム: Waters Sunfire C18 5 μm、250 mm x 20 mm; 溶離液 A: 水、溶離液 B: アセトニトリル; グラジエント: 0 分 20％ B、15 分 60％ B、15.01-19 分 20％ B; 流速: 25 mL/分; UV 検出: 210 nm。
【０１０５】
分析 HPLC、LC/MS およびGC/MS 方法:
方法 1 (HPLC):
機器: DAD 検出付Agilent 1100; カラム: Agilent Zorbax Eclipse XDB-C8 4.6、150 mm x 5 mm; 溶離液 A: 水中0.01％ TFA、溶離液 B: アセトニトリル中0.01％ TFA; グラジエント: 0−1 分 10％ B、4-5 分 90％ B、5.5 分 10％ B; 流速: 2.0 mL/分; 温度: 30℃; UV 検出: 210 nm。
【０１０６】
方法 2 (HPLC):
機器: DAD 検出付HP 1100; カラム: Kromasil 100 RP-18、60 mm x 2.1 mm、3.5 μm; 溶離液 A: 5 mL 過塩素酸 (70％) / L 水、溶離液 B: アセトニトリル; グラジエント: 0 分 2％ B、0.5 分 2％ B、4.5 分 90％ B、6.5 分 90％ B、6.7 分 2％ B、7.5 分 2％ B; 流速: 0.75 mL/分; 温度: 30℃; UV 検出: 210 nm。
【０１０７】
方法 3 (HPLC):
機器: DAD 検出付HP 1100; カラム: Kromasil 100 RP-18、60 mm x 2.1 mm、3.5 μm; 溶離液 A: 5 mL 過塩素酸 (70％) / L 水、溶離液 B: アセトニトリル; グラジエント: 0 分 2％ B、0.5 分 2％ B、4.5 分 90％ B、9 分 90％ B、9.2 分 2％ B、10 分 2％ B; 流速: 0.75 mL/分; 温度: 30℃; UV 検出: 210 nm。
【０１０８】
方法 4 (LC/MS): 
機器: HPLC Agilent 1100 Series を備えるMicromass Platform LCZ; カラム: Thermo Hypersil GOLD 3μ、20 mm x 4 mm; 溶離液 A: 1 L 水 + 0.5 mL 50％ ギ酸、溶離液 B: 1 L アセトニトリル + 0.5 mL 50％ ギ酸; グラジエント: 0.0 分 100％ A → 0.2 分 100％ A → 2.9 分 30％ A → 3.1 分 10％ A → 5.5 分 10％ A; 温度: 50℃; 流速: 0.8 mL/分; UV 検出: 210 nm。
【０１０９】
方法 5 (LC/MS):
機器: HPLC Waters Alliance 2795 / HP 1100を備えるMicromass ZQ; カラム: Phenomenex Synergi 2.5μ MAX-RP 100A Mercury、20 mm x 4 mm; 溶離液 A: 1 L 水 + 0.5 mL 50％ ギ酸、溶離液 B: 1 L アセトニトリル + 0.5 mL 50％ ギ酸; グラジエント: 0.0 分 90％ A → 2.5 分 30％ A → 3.0 分 5％ A → 4.0 分 5％ A; 流速: 2 mL/分; 温度: 50℃; UV 検出: 210 nm。
【０１１０】
方法 6 (LC/MS):
機器: Waters UPLC Acquity を備えるMicromass Quattro Premier; カラム: Thermo Hypersil GOLD 1.9μ、50 mm x 1 mm; 溶離液 A: 1 L 水 + 0.5 mL 50％ ギ酸、溶離液 B: 1 L アセトニトリル + 0.5 ml 50％ ギ酸; グラジエント: 0.0 分 90％ A → 0.1 分 90％ A → 1.5 分 10％ A → 2.2 分 10％ A; 温度: 50℃; 流速: 0.33 mL/分; UV 検出: 210 nm。
【０１１１】
方法 7 (LC/MS):
機器: HPLC Waters Alliance 2795を備えるMicromass ZQ; カラム: Phenomenex Synergi 2.5μ MAX-RP 100A Mercury、20 mm x 4 mm; 溶離液 A: 1 L 水 + 0.5 mL 50％ ギ酸、溶離液 B: 1 L アセトニトリル + 0.5 mL 50％ ギ酸; グラジエント: 0.0 分 90％ A → 0.1 分 90％ A → 3.0 分 5％ A → 4.0 分 5％ A → 4.01 分 90％ A; 流速: 2 mL/分; 温度: 50℃; UV 検出: 210 nm。
【０１１２】
方法 8 (GC/MS):
機器: Micromass GCT、GC6890; カラム: Restek RTX-35、15 m x 200 μm x 0.33 μm; ヘリウムによる一定流量: 0.88 mL/分; オーブン: 70℃; 入口: 250℃; グラジエント: 70℃、30℃/分 → 310℃  (3 分間維持)。
【０１１３】
方法 9 (HPLC):
機器: DAD 検出付Agilent 1100; カラム: Merck Chromolith Speed ROD、150 mm x 5 mm; 溶離液 A: 水中0.01％ ギ酸、溶離液 B: アセトニトリル; グラジエント: 0 分 5％ B、2.5 分 95％ B、3 分 95％ B; 流速: 5.0 mL/分; 温度: 40℃; UV 検出: 210 nm。
【０１１４】
方法 10 (LC/MS):
機器: Waters Acquity SQD UPLC System; カラム: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8μ、50 mm x 1 mm; 溶離液 A: 1 L 水 + 0.25 mL 99％ ギ酸、溶離液 B: 1 L アセトニトリル + 0.25 mL 99％ ギ酸; グラジエント: 0.0 分 90％ A → 1.2 分 5％ A → 2.0 分 5％ A; 温度: 50℃; 流速: 0.40 mL/分; UV 検出: 208-400 nm。
【０１１５】
一般的合成方法 1:
5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン誘導体とアリールボロン酸またはエステル(arylboronic acids or esters)との鈴木カップリング:
【化２３】
0005955953.tif 000024
【０１１６】
5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン A (約 0.5 mmol)、アリールボロン酸 B (1.2 当量)または対応するボロン酸エステル(boronic ester)、例えば、ジメチルボロナートまたはピナコラトボロナート、およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0) (0.1 当量)を、1,4-ジオキサン (約 4.0 mL)および2 M 水性炭酸ナトリウム溶液 (1.5 mL) の混合物にマイクロ波反応器バイアル中にて溶解する。反応容器に圧着により蓋をし(crimp-capped)、混合物を140℃に1時間単一モードマイクロ波装置中で加熱する。冷却後、反応混合物をCeliteのパッドで濾過し、1,4-ジオキサンですすぎ、すべての有機物質を溶出する。合わせたろ液を減圧下で蒸発させて乾燥させ、残渣を分取 HPLCにより精製し、標的化合物 Cを得る。
【０１１７】
一般的合成方法 2:
中間体アリールボロン酸またはエステル(arylboronic acid or ester)を単離しない、臭化アリールのホウ素化(borylation) および引き続く5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン誘導体との鈴木カップリング:
【化２４】
0005955953.tif 000025
【０１１８】
臭化アリール D (約 0.5 mmol)をDMF (3 mL)にマイクロ波反応容器中で溶解し、アルゴンで溶液を5 分間気泡させ(bubbled through)、 [1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]-ジクロロパラジウム(II)-ジクロロメタン錯体 (0.1 当量)、酢酸カリウム (3 当量)およびビス(ピナコラト)ジボロン (1.2 当量)を添加する。容器に圧着により蓋をし(crimp-capped)、混合物を130℃に60 分間単一モードマイクロ波装置中で加熱する。次いで、懸濁液を濾過し、ろ液を別のマイクロ波プロセスバイアルに移し、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0) (0.1 当量)、2 M 水性炭酸ナトリウム溶液 (4 当量)および5−ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン A (1 当量) を添加する。バイアルに圧着により蓋をし(crimp-capped)、混合物を140℃に1時間単一モードマイクロ波装置中で加熱する。こうして得られる粗反応混合物を直接的に分取 HPLC カラムに注入し、標的化合物 Cを分離および精製する。
【０１１９】
出発物質および中間体:
中間体 1A
[2,6-ジフルオロ-4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェニル]メタノール
【化２５】
0005955953.tif 000026
【０１２０】
(4-ブロモ-2,6-ジフルオロフェニル)メタノール (1.03 g、4.62 mmol) を乾燥 1,4-ジオキサン (10 mL) に溶解した。アルゴンで溶液を気泡させ、次いで [1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム-ジクロロメタン錯体 (302 mg、0.37 mmol、0.08 eq.)、無水酢酸カリウム (907 mg、9.24 mmol、2 eq.)およびビス(ピナコラト)ジボロン (1.23 g、4.85 mmol、1.05 eq.) を添加し、混合物を130℃に1時間単一モードマイクロ波装置中で加熱した。冷却の際、混合物を濾過し、溶媒を減圧下で除去した。シクロヘキサン (200 mL) を残渣に添加し、混合物を 勢いよく30 分間撹拌した。溶解しなかった材料を次いで濾過により除去し、シクロヘキサンを留去し(distilled off)、残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー (ジクロロメタン/アセトニトリルグラジエント) により精製した。生成物を含有する画分を合わせ、蒸発させた。標題化合物が茶色がかった固体として自然に結晶化した。収率: 790 mg (63％ of th.)。
GC-MS (方法 8): Rt = 5.36 分; MS (EI): m/z (％) = 270.3 (15) [M]+。
【０１２１】
中間体 2A
[3,5-ジフルオロ-4-(ヒドロキシメチル)フェニル]ボロン酸
【化２６】
0005955953.tif 000027
【０１２２】
[4-({[tert-ブチル(ジメチル)シリル]オキシ}メチル)-3,5-ジフルオロフェニル]ボロン酸 (19.3 g、63.9 mmol; 粗物質、Hattori、Bioorg. Med. Chem. 2006、14、3258-3262の方法によって調製) を400 mL 水性酢酸 (66％) に溶解し40℃で5時間撹拌した。溶液を次いで減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲルでの フラッシュクロマトグラフィー (グラジエント溶出、ジクロロメタン中0％から2％メタノール) により精製し、 3.46 g (25％ of th.、LC-MS 純度 87％) の標題化合物を得た。
LC-MS (方法 7): Rt = 0.50 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 171.2 (100) [M-OH]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 187.3 (100) [M-H]-。
【０１２３】
中間体 3A
(4-ブロモ-2-クロロフェニル)メタノール
【化２７】
0005955953.tif 000028
【０１２４】
標題化合物をWO 2004/074270-A2 [実施例 A(147)、工程 1]に記載されている手順にしたがって調製した。
1H NMR (400 MHz、CDCl3): δ (ppm) = 2.00 (br、1H)、4.74 (s、2H)、7.38 (d、1H)、7.43 (dd、1H)、7.53 (d、1H)。
【０１２５】
中間体 4A 
(4-ブロモ-2-メチルフェニル)メタノール
【化２８】
0005955953.tif 000029
【０１２６】
標題化合物をEP 1 544 208-A1 (参照実施例 14)に記載されている手順にしたがって調製した。
1H NMR (400 MHz、CDCl3): δ (ppm) = 1.62 (t、3H)、2.32 (s、3H)、4.64 (d、2H)、7.23 (d、1H)、7.32 (s、1H)、7.33 (d、1H)。
【０１２７】
中間体 5A
(5-ブロモピリジン-2-イル)メタノール
【化２９】
0005955953.tif 000030
【０１２８】
メチル 5-ブロモピリジン-2-カルボキシラート (2.00 g、9.27 mmol) をエタノール (20.0 mL) に溶解した。水素化ホウ素ナトリウム (1.05 g、27.8 mmol) を0℃で添加し、混合物を室温で18時間撹拌した。混合物を次いで減圧下で濃縮し、1 N 塩酸でクエンチし、固体炭酸カリウムで中和し、ジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、蒸発させて、1.57 g (90％ of th.) の標題化合物を得た。
LC-MS (方法 6): Rt = 0.56 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 188.0 (100) [M+H]+。
【０１２９】
中間体 6A 
[6-(ヒドロキシメチル)ピリジン-3-イル]ボロン酸
【化３０】
0005955953.tif 000031
【０１３０】
脱気 DMF (120 mL)中の中間体 5A (1.50 g、7.98 mmol) およびビス(ピナコラト)ジボロン (2.23 g、8.28 mmol) の溶液にアルゴン雰囲気下で、1,1'-ビス-(ジフェニルホスフィノ)フェロセン-パラジウム(II) クロライド (292 mg、0.40 mmol) および酢酸カリウム (2.35 g、23.9 mmol) を添加した。混合物を80℃に18時間加熱し、次いで室温に冷却した。懸濁液を濾過し、残渣をジオキサンで洗浄した。合わせたろ液を減圧下で濃縮し、油性残渣を50 mL 酢酸エチルおよび 50 mL シクロヘキサンに取り(taken up)、室温で一晩静置した。結果として得られた沈殿を濾過により収集し、捨てた(discarded)。ろ液を蒸発させ、残渣を再び100 mL 酢酸エチルに溶解し、50 mL 水で2回抽出した。水層を濃縮して690 mg (56％ of th.) の標題化合物を得、これをさらに精製せずに用いた。
LC-MS (方法 6): Rt = 0.18 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 154.0 (100) [M+H]+。
【０１３１】
中間体 7A
3-(4-アミノピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)プロパ-2-イン-1-オール
【化３１】
0005955953.tif 000032
【０１３２】
出発物質 7-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミンをWO 2007/056170-A2 (中間体 B)に記載されている手順にしたがって合成した。
【０１３３】
7-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミン (1.0 g、4.69 mmol)、ヨウ化銅(I) (89 mg、0.47 mmol、0.1 eq.)およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0) (542 mg、0.47 mmol、0.1 eq.) をマイクロ波反応器バイアルに充填し、1時間空にした(evacuated)。 容器を次いでアルゴンで通風し(vented)、ピロリジン (15 mL)および2-プロピン-1-オール (2.63 g、47 mmol、10 eq.) を添加し、容器を圧着により蓋をし(crimp-capped)、85℃に120 分間単一モードマイクロ波装置中で加熱した。冷却後、反応混合物を120 mL の濃水性塩化アンモニウム溶液に注ぎ、酢酸エチルで2回抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ 、蒸発させ、 残渣をフラッシュクロマトグラフィー (Biotage シリカカラム、酢酸エチル) により精製した。結果として得られた生成物 (222 mg) はLC-MS (方法 6) により純粋にみえ、さらなる変換のために用いた。
HPLC (方法 2): Rt = 2.59 分;
LC-MS (方法 6): Rt = 0.28 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 189.2 (100) [M+H]+。
【０１３４】
中間体 8Aおよび中間体 9A 
3-(4-アミノピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)プロパン-1-オール
および
7-プロピルピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミン
【化３２】
0005955953.tif 000033
【０１３５】
中間体 7A (444 mg、2.36 mmol) をアルゴン雰囲気下で酢酸 (18 mL) に溶解した。酸化白金(IV) (40 mg、0.18 mmol、0.08 eq.) を添加し、混合物を勢いよく3時間室温で水素雰囲気下で周囲圧力で撹拌した。触媒を次いで濾過により除去し、溶媒を留去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー (Biotage シリカカラム、シクロヘキサン/酢酸エチル グラジエント)に供した。中間体8A (185 mg、41％ of th.)および 9A (170 mg、41％ of th.) が２つの異なるクロマトグラフィー画分において得られた:
中間体 8A:
HPLC (方法 2): Rt = 2.68 分; 
LC-MS (方法 4): Rt = 0.83 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 193.1 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 191.1 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.80 (m、2H)、2.86 (t、J = 7.7 Hz、2H)、3.45 (m、2H)、4.49 (t、J = 5.1 Hz、1H)、6.41 (d、J = 4.2 Hz、1H)、6.69 (d、J = 4.2 Hz、1H)、7.50 (br. s、2H)、7.78 (s、1H)。
中間体 9A:
HPLC (方法 1): Rt = 3.22 分;
LC-MS (方法 4): Rt = 1.23 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 177.1 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 175.2 (30) [M-H]-。
【０１３６】
中間体 10A
3-(4-アミノ-5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)プロパン-1-オール
【化３３】
0005955953.tif 000034
【０１３７】
中間体 8A (105 mg、0.55 mmol) をTHF (8.75 mL)に溶解し、-20℃に冷却した。1,3-ジブロモ-5,5-ジメチルヒダントイン (78.1 mg、0.5 eq.) を添加し、混合物を−20℃で1時間撹拌した。反応を次いで 0.5 mL 濃水性亜ジチオン酸ナトリウム溶液でクエンチし、室温まで昇温させ、酢酸エチルと水とに分配した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を留去した。 収率: 145 mg (98％ of th.)。
HPLC (方法 1): Rt = 2.96 分; HPLC (方法 2): Rt = 2.95 分;
LC-MS (方法 5): Rt = 1.03 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 271.0 (100) および 273.0 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 269.0 (99) および271.0 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.75 (m、2H)、2.83 (t、J = 8.1 Hz、2H)、3.43 (m、2H)、4.50 (t、J = 5.4 Hz、1H)、6.62 (s、1H)、7.81 (s、1H)。
【０１３８】
中間体 11A 
5-ブロモ-7-プロピルピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミン
【化３４】
0005955953.tif 000035
【０１３９】
中間体 9A (110 mg、0.62 mmol) をTHF (4.44 mL)に溶解し、-20℃に冷却した。1,3-ジブロモ-5,5-ジメチルヒダントイン (89 mg、0.5 eq.) を添加し、混合物を−20℃で1時間撹拌した。反応を次いで  0.5 mL 濃水性亜ジチオン酸ナトリウム溶液でクエンチし、室温まで昇温させ、酢酸エチルと水とに分配した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を留去した。収率: 154 mg (85％ 純粋、82％ of th.)。
HPLC (方法 1): Rt = 3.78 分;
LC-MS (方法 7): Rt = 1.55 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 255.0 (99) および 257.2 (100) [M+H]+。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 0.91 (t、J = 7.3 Hz、3H)、1.65 (m、2H)、2.79 (t、J = 7.6 Hz、2H)、3.31 (s、2H)、6.63 (s、1H)、7.95 (s、1H)。
【０１４０】
中間体 12A 
4-(4-アミノピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)ブタ-3-イン-1-オール
【化３５】
0005955953.tif 000036
【０１４１】
7-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミン (1.0 g、4.69 mmol)、ヨウ化銅(I) (89 mg、0.47 mmol、0.1 eq.)およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0) (542 mg、0.47 mmol、0.1 eq.) をマイクロ波反応器バイアルに充填し、1時間空にした(evacuated)。容器を次いでアルゴンで通風し(vented)、ピロリジン (15 mL)および3-ブチン-1-オール (3.36 g、47 mmol、10 eq.) を添加し、容器を圧着により蓋をし(crimp-capped)、85℃に120 分間単一モードマイクロ波装置中で加熱した。冷却後、反応混合物を120 mLの濃水性塩化アンモニウム溶液に注ぎ、酢酸エチルで2回抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィー (Biotage シリカカラム、酢酸エチル) により精製した。結果として得られた生成物 (735 mg)はさらなる変換のために十分に純粋であった(HPLCにより66％)。
HPLC (方法 2): Rt = 2.77 分;
LC-MS (方法 4): Rt = 0.96 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 203.1 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 201.1 (100) [M-H]-。
【０１４２】
中間体 13A 
4-(4-アミノピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)ブタン-1-オール
【化３６】
0005955953.tif 000037
【０１４３】
中間体 12A (607 mg、3.00 mmol) を酢酸 (64 mL) に溶解し、酸化白金(IV) (50 mg、0.22 mmol、0.07 eq.) を添加した。混合物を水素雰囲気下で周囲圧力で15時間撹拌した。触媒を次いで濾過により除去し、ろ液を減圧下で蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィー (Biotage シリカカラム、酢酸エチル) により精製した。収率: 350 mg (57％ of th.)。
HPLC (方法 2): Rt = 2.92 分;
LC-MS (方法 4): Rt = 0.94 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 207.1 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 205.3 (100) [M-H]-。
【０１４４】
中間体 14A 
4-(4-アミノ-5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)ブタン-1-オール
【化３７】
0005955953.tif 000038
【０１４５】
中間体 13A (330 mg、1.60 mmol) をTHF (26 mL) に-20℃で溶解し、1,3-ジブロモ-5,5-ジメチルヒダントイン (229 mg、0.80 mmol) を添加した。混合物を -20℃で 1時間撹拌した。反応を次いで濃水性亜硫酸ナトリウム溶液 (0.5 mL)でクエンチした。酢酸エチルを添加し、水層を分離し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させた。粗生成物を引き続き分取 HPLC (方法 2) により精製し、175 mg (84％ of th.) の標題化合物を得た。
HPLC (方法 1): Rt = 3.13 分;
LC-MS (方法 5): Rt = 1.23 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 285.0 (98) および287.0 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 283.0 (100) および285.0 (98) [M-H]-。
1H-NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.39-1.48 (m、2H)、1.60-1.69 (m、2H)、3.31 (t、J = 7.3 Hz、2H)、3.40 (m、2H)、4.46 (br. s、1H)、6.61 (s、1H)、7.82 (s、1H)。
【０１４６】
中間体 15A
4-アミノピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-カルバルデヒド
【化３８】
0005955953.tif 000039
【０１４７】
出発物質である、ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミンをWO 2007/056170-A2 (中間体 A)に記載されている手順にしたがって合成した。
【０１４８】
ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミン (20.5 g、152 mmol) を150 mL DMFに溶解した。氷冷下で、塩化ホスホリル (31.3 mL、336 mmol) を、内部温度が30℃を超えて上がらないような速度で滴下した。混合物を次いで2日間 50℃で加熱した。冷却後、さらに一部の塩化ホスホリル (14.2 mL、152 mmol) を添加し、撹拌をさらに24時間50℃で続けた。冷却後、反応バッチをゆっくりと2.0 L 飽和水性重炭酸ナトリウム溶液および2.0 L 酢酸エチルの混合物に注いだ。固体重炭酸ナトリウムをガス発生が止まるまで添加した。層を分離し、水層を0.5 L 酢酸エチルで抽出し、合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。残渣を 100 mL ジイソプロピルエーテルに懸濁し、室温で10 分間撹拌し、次いで濾過した。乾燥残渣を6 N 塩酸 (500 mL)中で1時間 50℃で撹拌し、次いで氷/水混合物 (1000 mL)に注いだ。混合物を注意深く固体重炭酸ナトリウムで中和し、30 分間室温で撹拌し、次いで再び濾過した。残渣を水およびリグロインで洗浄し20.6 g (83％ of th.)の白色結晶を得、これを次の工程にさらに精製せずに用いた。
【０１４９】
中間体 16A
4-アミノ-5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-カルバルデヒド
【化３９】
0005955953.tif 000040
【０１５０】
中間体 15A (20.6 g、127 mmol) を525 mL DMFに溶解した。0℃で、1,3-ジブロモ-5,5-ジメチルヒダントイン (21.8 g、76.2 mmol) を添加し、混合物を1時間氷冷下で撹拌し、さらに2時間室温で撹拌した。結果として得られた懸濁液を濾過し、残渣をDMFおよびジエチルエーテルで洗浄した。ろ液を捨て、残っているほとんど可溶性でない結晶を乾燥させ、20.0 g (65％ of th.、HPLCにより80％純度) の標題化合物を得た。この物質をさらに精製せずに用いた。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 7.42 (s、1H)、8.12 (s、1H)、10.22 (s、1H)。
【０１５１】
中間体 17A
(4-アミノ-5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)(シクロプロピル)メタノール
【化４０】
0005955953.tif 000041
【０１５２】
中間体 16A (500 mg、1.66 mmol) を乾燥 THF (30 mL)に懸濁した。0℃で、0.5 Mの、シクロプロピルマグネシウムブロミドのジエチルエーテル中の溶液(10 mL、5.0 mmol)を添加した。混合物を室温で1時間撹拌した。次いで、さらに一部のグリニャール溶液 (6.6 mL、3.3 mmol) を添加した。30 分間室温でのさらなる撹拌の後、反応を飽和水性塩化アンモニウム溶液でクエンチし、酢酸エチル (2 x 20 mL) で抽出した。合わせた有機層を塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮した。残渣を分取 HPLC (方法 4) により精製した。 収率: 0.14 g (29％ of th.)。
LC-MS (方法 6): Rt = 0.75 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 283.0 (100) [M+H]+。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 0.35 (m、3H)、0.45 (m、1H)、1.28 (m、1H)、4.62 (t、1H)、5.26 (d、1H)、6.75 (s、1H)、7.84 (s、1H)。
【０１５３】
中間体 18A
(4-アミノ-5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)メタノール
【化４１】
0005955953.tif 000042
【０１５４】
アルゴンでパージした(purged)、凝縮器、温度計および滴下漏斗を備えた50 mL 三つ口フラスコ中で、グリニャール試薬を、乾燥 THF (14 mL)中のマグネシウムくず(turning) (484 mg、19.9 mmol) および4-クロロテトラヒドロピラン (2.4 g、19.9 mmol)から調製した。この溶液に0℃でTHF (20 mL)中の中間体 16A (1.2 g、3.98 mmol) の懸濁液を添加し、反応混合物を1時間室温で撹拌させた。それを次いで飽和水性塩化アンモニウム溶液でクエンチし、酢酸エチル (2 x 50 mL) で抽出した。有機層を塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮した。残渣を分取 HPLC (方法 3)により精製した。収率: 0.5 g (38％ of th.)。
LC-MS (方法 6): Rt = 0.66 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 327.0 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 325.1 (100) [M-H]-。
【０１５５】
中間体 19A 
8-(4-アミノピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)-1,4-ジオキサスピロ[4.5]デカン-8-オール
【化４２】
0005955953.tif 000043
【０１５６】
出発物質である7-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミンをWO 2007/056170-A2 (中間体 B)に記載されている手順にしたがって合成した。
【０１５７】
7-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミン (9.20 g、35.41 mmol) をTHF (105 mL)にアルゴン下で室温で溶解した。クロロトリメチルシラン (9.08 mL、7.77 g、70.82 mmol、2 eq.) を添加し、混合物を室温で3時間撹拌した。それを次いで0℃に冷却し、2-プロピルマグネシウムクロライド (74 mLの THF 中2.0 M 溶液、149 mmol、4.2 eq.) を添加した。混合物を室温まで昇温させつつさらに3時間撹拌した。次いで、1,4-ジオキサスピロ[4.5]デカン-8-オン (8.38 g、53.12 mmol、1.5 eq.) を添加し、撹拌をさらに16時間続けた。反応を濃水性塩化アンモニウム溶液および氷の1:1 混合物でpH 値が6-7に達するまでクエンチした。混合物を2部の酢酸エチルで抽出し、合わせた有機抽出物を無水炭酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して乾燥させた。標題化合物をジエチルエーテルから結晶化した。 収率: 6.05 g (58％ of th.)。
HPLC (方法 1): Rt = 2.89 分;
LC-MS (方法 6): Rt = 0.38 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 291.2 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 289.4 (100) [M-H]-。
【０１５８】
中間体 20A 
7-(1,4-ジオキサスピロ[4.5]デカ-7-エン-8-イル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミン
【化４３】
0005955953.tif 000044
【０１５９】
中間体 19A (2.81 g、60％ 純度、5.82 mmol) をピリジン(18 mL)に0℃で溶解した。無水トリフルオロ酢酸 (2.46 mL、3.66 g、17.45 mmol、3 eq.) をゆっくりと添加し、反応混合物を周囲温度で16時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣を水と酢酸エチルとに分配した。有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させた。残渣をジエチルエーテルで0℃で粉砕し、2.95 g (HPLCにより92％ 純粋、99％ of th.) の標題化合物を得た。
HPLC (方法 1): Rt = 4.55 分;
LC-MS (方法 5): Rt = 2.28 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 369.1 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 367.1 (100) [M-H]-。
【０１６０】
中間体 21A 
7-(1,4-ジオキサスピロ[4.5]デカ-8-イル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミン
【化４４】
0005955953.tif 000045
【０１６１】
中間体 20A (2.95 g、10.8 mmol) をメタノール (1.07 L) にアルゴン下で溶解した。パラジウム炭 (10％、400 mg) を添加し、混合物を24時間水素雰囲気下で周囲圧力および室温で勢いよく撹拌した。触媒を濾過により除去し、溶媒を減圧下で留去して、2.11 g (71％ of th.) の標題化合物を得た。
HPLC (方法 1): Rt = 3.14 分;
LC-MS (方法 6): Rt = 0.68 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 275.3 (100) [M+H]+。
【０１６２】
中間体 22A 
4-(4-アミノピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)シクロヘキサノン
【化４５】
0005955953.tif 000046
【０１６３】
中間体 21A (2.11 g、7.69 mmol) を1 M 塩酸 (23 mL)およびメタノール (6.80 mL)の混合物に0℃で溶解し、氷冷下で3時間撹拌した。次いで、pH 値を濃水性重炭酸ナトリウム溶液の添加により6-7に調整した。混合物を 3部のジクロロメタンで抽出し、合わせた有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣 (923 mg、52％ of th.) を次の合成工程においてさらに精製せずに用いた。
HPLC (方法 2): Rt = 3.06 分;
LC-MS (方法 4): Rt = 1.02 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 231.1 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 229.2 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.86 (ddd、2H)、2.25-2.36 (m、4H)、2.59 (ddd、2H)、3.59 (m、1H)、6.45 (d、1H)、6.82 (d、1H)、7.60 (br. s、1H)、7.82 (s、1H)。
【０１６４】
中間体 23A 
トランス-4-(4-アミノピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)シクロヘキサノール
【化４６】
0005955953.tif 000047
【０１６５】
中間体 22A (452 mg、1.96 mmol) をTHF (15 mL)に溶解し、溶液を0℃に冷却した。水素化アルミニウムリチウム溶液 (THF中1M、2.94 mL、2.94 mmol) を滴下した。引き続き、溶液を0℃で10 分間撹拌し、次いで濃水性塩化アンモニウム溶液の添加によりクエンチした。混合物を3 部のジクロロメタンで抽出し、合わせた有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣 (360 mg、77％ 純度、61％ of th.) を次の合成工程にさらに精製せずに用いた。
HPLC (方法 1): Rt = 2.62 分;
LC-MS (方法 6): Rt = 0.29 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 233.2 (100) [M+H]+。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.30 (m、2H)、1.42 (m、2H)、1.91 (m、2H)、1.99 (m、2H)、2.97 (tt、1H)、3.45 (m、1H)、4.60 (d、1H)、6.39 (d、1H)、6.79 (d、1H)、7.53 (br. s、2H)、7.80 (s、1H)。
【０１６６】
中間体 24A 
トランス-4-(4-アミノ-5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)シクロヘキサノール
【化４７】
0005955953.tif 000048
【０１６７】
中間体 23A (360 mg、85％ 純度、1.19 mmol) をTHF (8 mL) に-20℃で溶解し、1,3-ジブロモ-5,5-ジメチルヒダントイン (188 mg、0.66 mmol、0.55 eq.) を添加した。混合物を−20℃で1時間撹拌し、次いで 0.5 mL 濃水性亜ジチオン酸ナトリウム溶液を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した。有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させた。粗生成物 (463 mg、66％ 純度、83％ of th.) を次の合成工程にさらに精製せずに用いた。
HPLC (方法 1): Rt = 3.22 分;
LC-MS (方法 7): Rt = 1.03 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 311.2 および 313.0 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 309.2 (50) および311.2 (40) [M-H]-。
【０１６８】
中間体 25A
tert-ブチル 3-(4-アミノピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)-3-ヒドロキシピペリジン-1-カルボキシラート
【化４８】
0005955953.tif 000049
【０１６９】
出発物質である 7-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミンをWO 2007/056170-A2 (中間体 B)に記載されている手順にしたがって合成した。
【０１７０】
7-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミン (17.29 g、81 mmol) をTHF (214 mL) にアルゴン下で室温で溶解した。クロロトリメチルシラン (20.60 mL、17.63 g、162 mmol、2 eq.) を添加し、混合物を室温で3時間撹拌した。次いで、それを 0℃に冷却し、2−プロピルマグネシウムクロライド (170 mLのTHF中 2.0 M 溶液、340 mmol、4.2 eq.) を添加した。混合物をさらに3時間室温まで昇温させつつ撹拌した。次いで、tert-ブチル 3−オキソピペリジン-1-カルボキシラート (25.00 g、121 mmol、1.5 eq.) を添加し、撹拌をさらに16時間続けた。反応を、濃水性塩化アンモニウム溶液および氷の1:1 混合物でpH 値が6-7に達するまでクエンチした。混合物を2部の酢酸エチルで抽出し、合わせた有機抽出物を無水炭酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して乾燥させた。標題化合物が残渣のジエチルエーテル (50 mL)での粉砕により結晶化した。結晶をジエチルエーテルで洗浄し、乾燥させ、17.20 g (64％ of th.) を得た。
HPLC (方法 2): Rt = 3.53 分;
LC-MS (方法 5): Rt = 1.36 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 334.1 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 332.0 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.19-1.43 (m、9H)、1.72-1.88 (m、2H)、2.38-2.46 (m、1H)、3.02-3.20 (m、1H)、3.44-3.96 (m、4H)、6.58 (d、1H)、6.81 (d、1H)、7.82 (s、1H)。
【０１７１】
中間体 26A 
rac-tert-ブチル 3-(4-アミノ-5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)-3-ヒドロキシピペリジン-1-カルボキシラート
【化４９】
0005955953.tif 000050
【０１７２】
中間体 25A (120 mg、0.36 mmol) をTHF (6.0 mL) に-20℃で溶解し、1,3-ジブロモ-5,5-ジメチルヒダントイン (51 mg、0.18 mmol、0.5 eq.) を添加した。混合物を−20℃で2時間撹拌し、次いで濃水性亜硫酸ナトリウム溶液 (0.5 mL) でクエンチした。酢酸エチルを添加し、水層を分離し、有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させた。標題化合物 (148 mg、95％ of th.) が明黄色固体として得られた。
HPLC (方法 1): Rt = 4.03 分;
LC-MS (方法 5): Rt = 1.99 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 412.0 (90)および 414.0 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 410.0 (100) および412.0 (85) [M-H]-。
【０１７３】
中間体 27A
tert-ブチル 5-{4-[(トリフルオロアセチル)アミノ]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}-3,6-ジヒドロピリジン-1(2H)-カルボキシラート
【化５０】
0005955953.tif 000051
【０１７４】
中間体 25A (8.32 g、24.95 mmol) をピリジン(116 mL) に0℃で溶解した。無水トリフルオロ酢酸 (8.81 mL、13.10 g、62.36 mmol、2.5 eq.) をゆっくりと添加し、反応混合物を周囲温度で16時間撹拌した。次いで、それを再び0℃に冷却し、150 mLのジエチルエーテルを添加した。混合物を0℃で撹拌していると、標題化合物がゆっくりと沈殿した。生成物を最終的に濾別し(filtered off)、ジエチルエーテルで洗浄した。ろ液を減圧下で蒸発させ、残渣をジエチルエーテルで0℃で粉砕し、ジエチルエーテルでの洗浄後、2回目の(second crop)標題化合物を得た。これら2回分(two crops)を合わせて7.80 g (HPLCにより92％ 純粋、76％ of th.) の標題化合物を黄色結晶として得た。
HPLC (方法 1): Rt = 3.91 分;
LC-MS (方法 7): Rt = 2.45 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 412.2 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 410.2 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.48 (s、9H)、1.92 (m、2H)、3.58 (m、2H)、6.90 (d、1H)、7.30 (d、1H)、8.03-8.10 (m、1H)、8.42 (s、1H)。
【０１７５】
中間体 28A 
rac-tert-ブチル 3-(4-アミノピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)ピペリジン-1-カルボキシラート
【化５１】
0005955953.tif 000052
【０１７６】
中間体 27A (7.80 g、92％ 純度、17.54 mmol) をメタノール (400 mL) に溶解した。トリフルオロ酢酸 (6.76 mL、10.0 g、88 mmol、5 eq.)、水 (3.16 mL、175 mmol、10 eq.)および 10％ パラジウム炭 (30 mg) を添加し、混合物を24時間室温および周囲圧力で水素化した。触媒を次いで濾過により除去し、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗生成物 (8.79 g、75％ 純粋、定量的収率) を次の合成工程にさらに精製せずに用いた。
HPLC (方法 1): Rt = 3.64 分;
LC-MS (方法 7): Rt = 1.26 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 318.3 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 316.4 (100) [M-H]-。
【０１７７】
中間体 29A 
7-[(3R)-ピペリジン-3-イル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミン トリフルオロアセテート
【化５２】
0005955953.tif 000053
【０１７８】
出発物質である、ベンジル (R)-3-(4-アミノ-5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)ピペリジン-1-カルボキシラートは、WO 2007/056170-A2 (中間体 DDD) に記載されている。
【０１７９】
1.50 g (3.49 mmol)のこの物質を16時間 室温および周囲圧力で、メタノール (50 mL) およびトリフルオロ酢酸 (2.70 mL) の混合物中、10％ パラジウム炭 (30 mg) の存在下で水素化した。引き続き、触媒を濾過により除去し、すべての揮発性物質を減圧下で蒸発させ1.10 g (95％ of th.) の標題化合物を得た。
HPLC (方法 2): Rt = 2.17 分;
LC-MS (方法 6): Rt = 0.17 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 218 (100) [M+H]+。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.75 (m、2H)、1.92 (m、1H)、2.05 (m、1H)、2.93 (m、1H)、3.06 (m、1H)、3.31 (d、1H)、3.50 (d、1H)、3.57 (m、1H)、6.78 (d、1H)、7.20 (m、1H)、8.10 (s、1H)、8.63 (m、1H)、8.82 (m、1H)、9.02 (br. s、1H)。
【０１８０】
中間体 30A 
tert-ブチル (3R)-3-(4-アミノピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)ピペリジン-1-カルボキシラート
【化５３】
0005955953.tif 000054
【０１８１】
中間体 29A (1.10 g、5.06 mmol) をジクロロメタン (6.60 mL) に懸濁し、トリエチルアミン (1.55 mL、1.13 g、11.14 mmol、2.20 eq.) を添加し、混合物を30 分間出発物質が完全に溶解するまで撹拌した。次いで、ジ-tert-ブチルジカーボネート (1.22 g、5.57 mmol、1.1 eq.) を添加し、反応混合物を16時間撹拌した。引き続き、5％ 水性クエン酸を添加し、相を分離し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させた。残渣を分取 HPLC (方法 2)により精製した。収率: 595 mg (37％ of th.)。
HPLC (方法 2): Rt = 4.01 分;
LC-MS (方法 5): Rt = 1.54 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 318.1 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 316.1 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.38 (s、9H)、1.45 (m、2H)、1.72 (m、2H)、2.02 (m、2H)、2.90 (m、1H)、3.17 (m、1H)、3.85 (m、1H)、4.08 (m、1H)、6.47 (d、1H)、6.80 (d、1H)、7.58 (br. s、1H)、7.81 (s、1H)。
【０１８２】
中間体 31A
rac-tert-ブチル 3-(4-アミノ-5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)ピペリジン-1-カルボキシラート
【化５４】
0005955953.tif 000055
【０１８３】
中間体 28A (8.28 g、75％ 純度、14.39 mmol) をTHF (222 mL)に-20℃で溶解し、1,3-ジブロモ-5,5-ジメチルヒダントイン (2.06 g、7.19 mmol、0.5 eq.) を添加した。混合物を-20℃で2時間撹拌し、次いで濃水性亜硫酸ナトリウム溶液 (0.5 mL) でクエンチした。酢酸エチルを添加し、水層を分離し、有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させた。標題化合物 (6.30 g、86％ of th.) が明黄色固体として得られた。
LC-MS (方法 5): Rt = 2.27 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 396.0 (80)および397.9 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 394.0 (90) および 396.0 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.35 (s、9H)、1.40-1.44 (m、2H)、1.71 (m、1H)、1.98 (m、1H)、2.95 (m、1H)、3.20 (m、1H)、3.75 (m、1H)、4.00 (m、1H)、6.67 (s、1H)、7.86 (s、1H)。
【０１８４】
中間体 32A 
tert-ブチル (3R)-3-(4-アミノ-5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)ピペリジン-1-カルボキシラート
【化５５】
0005955953.tif 000056
【０１８５】
標題化合物を中間体 30A から出発してラセミ混合物 (中間体 31A) と同様にして調製した。分析データは中間体 31Aについて示されたものと同じであった。 
【０１８６】
中間体 33A 
1-(4-アミノ-5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)-2-クロロエタノン
【化５６】
0005955953.tif 000057
【０１８７】
化合物をWO 2007/056170-A2 (中間体 N、工程 1)に記載されている手順にしたがって調製した。
HPLC (方法 1): Rt = 4.27 分;
LC-MS (方法 5): Rt = 1.70 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 289.0 (75) および290.9 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 287.0 (75) および288.9 (100) [M-H]-。
【０１８８】
中間体 34A 
5-ブロモ-7-(2-メチル-1,3-チアゾール-4-イル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミン
【化５７】
0005955953.tif 000058
【０１８９】
中間体 33A (100 mg、0.35 mmol)およびチオアセトアミド (30 mg、0.40 mmol、1.15 eq.) をマイクロ波反応バイアル中で1,4-ジオキサン (3.0 mL)に溶解した。バイアルに圧着により蓋をし(crimp-capped)、混合物を130℃に60 分間単一モードマイクロ波装置中で加熱した。冷却後、溶媒を留去し、残渣をアセトニトリルで粉砕し、濾過した。ろ液を捨てた。標題化合物を結晶固体として単離した。 収率: 99 mg (92％ of th.)。
HPLC (方法 1): Rt = 4.00 分;
LC-MS (方法 6): Rt = 1.05 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 310.0 (90)および312 (100) [M+H]+。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 2.71 (s、3H)、7.20 (s、1H)、8.02 (s、1H)、8.28 (s、1H)。
【０１９０】
中間体 35A
5-ブロモ-7-(2-エチル-1,3-チアゾール-4-イル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミン
【化５８】
0005955953.tif 000059
【０１９１】
中間体 33A (100 mg、0.35 mmol)およびチオプロピオンアミド (32 mg、0.36 mmol、1.05 eq.) をエタノール (3.0 mL) 中で4.5 時間の期間かけて還流した。冷却後、混合物を酢酸エチルと水性重炭酸ナトリウム溶液とに分配した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を留去した。生成物を減圧下で乾燥させ、91 mg (0.28 mmol、81％ of th.) の標題化合物をオフホワイトの固体として得た。
HPLC (方法 1): Rt = 4.30 分;
LC-MS (方法 7): Rt = 1.84 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 324.2 (100) および325.8 (98) [M+H]+。
【０１９２】
中間体 36A 
7-(2-アミノ-1,3-チアゾール-4-イル)-5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミン
【化５９】
0005955953.tif 000060
【０１９３】
中間体 33A (100 mg、0.35 mmol)およびチオ尿素 (32 mg、0.41 mmol、1.2 eq.) を1,4-ジオキサン (3 mL)にマイクロ波反応バイアル中で懸濁し、次いでマイクロ波反応バイアルを圧着により蓋をした(crimp-capped)。混合物を120℃に60 分間単一モードマイクロ波装置中で加熱した。冷却の際、水を添加し、結果として得られた沈殿を濾過により収集し、ジオキサンで洗浄した。オフホワイトの固体を減圧下で乾燥させ 、98 mg (91％ of th.) の標題化合物を得た。
HPLC (方法 1): Rt = 3.19 分;
LC-MS (方法 5): Rt = 1.25 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 310.9 (95)および312.9 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 309.0 (100)および310.9 (70) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 7.17 (s、1H)、7.52 (s、1H)、8.07 (s、1H)。
【０１９４】
中間体 37A
1-{4-[(4-アミノ-5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)メチル]ピペラジン-1-イル}-2,2,2-トリフルオロエタノン
【化６０】
0005955953.tif 000061
【０１９５】
化合物をWO 2007/056170-A2 (実施例 416、工程 6)に記載されている手順にしたがって調製した。
【０１９６】
中間体 38A
5-ブロモ-7-(モルホリン-4-イルメチル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミン
【化６１】
0005955953.tif 000062
【０１９７】
化合物をWO 2007/064931-A2 (中間体 C)に記載されている手順にしたがって調製した。
【０１９８】
中間体 39A
7-(モルホリン-4-イルメチル)-5-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)ピロロ[2,1-f]-[1,2,4]トリアジン-4-アミン
【化６２】
0005955953.tif 000063
【０１９９】
脱気 DMF (120 mL)中の中間体 38A (5.59 g、17.9 mmol) およびビス(ピナコラト)ジボロン (10.0 g、39.4 mmol) の溶液に、アルゴン雰囲気下で、1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン-パラジウム(II) クロライド (786 mg、1.07 mmol)および酢酸カリウム (7.03 g、71.6 mmol) を添加した。混合物を80℃に5時間加熱し、次いで室温に冷却した。tert-ブチルメチルエーテル (100 mL) を添加し、懸濁液を濾過した、ろ液を減圧下で蒸発させて乾燥させ、残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー (グラジエント溶出、ジクロロメタン中2％から5％ メタノール) により精製し、いくらかの対応するボロン酸(boronic acid)誘導体を含有する、1.30 g (20％ of th.) の標題化合物を得た。この生成物をさらに精製せずに用いた。
LC-MS (方法 6): Rt = 0.73 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 360.3 (30) [M+H]+。
【０２００】
中間体 40A
5-[4-({[tert-ブチル(ジメチル)シリル]オキシ}メチル)-3,5-ジフルオロフェニル]-7-(モルホリン-4-イルメチル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミン
【化６３】
0005955953.tif 000064
【０２０１】
標題化合物を、中間体 38A (200 mg、0.64 mmol)および[4-({[tert-ブチル(ジメチル)シリル]オキシ}メチル)-3,5-ジフルオロフェニル]ボロン酸(boronic acid) (314 mg、0.77 mmol、74％ 純度; Hattori、Bioorg. Med. Chem. 2006、14、3258-3262の方法によって調製)から一般的合成方法1によって得た。粗生成物の精製を分取 HPLC (方法 3)により行った。収率: 110 mg (32％ of th.、LC-MS 純度 92％)。
LC-MS (方法 6): Rt = 1.18 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 490.1 (30) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 488.3 (100) [M-H]-。
【０２０２】
中間体 41A 
メチル 4-[4-アミノ-7-(モルホリン-4-イルメチル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル]-2-フルオロベンゾアート
【化６４】
0005955953.tif 000065
【０２０３】
標題化合物を、中間体 38A (200 mg、0.64 mmol)および [3-フルオロ-4-(メトキシカルボニル)フェニル]ボロン酸 (139 mg、0.71 mmol)から一般的合成方法1により得た。 粗生成物の精製を、分取 HPLC (方法 3)により行った。収率: 80 mg (32％ of th.)。
LC-MS (方法 6): Rt = 0.66 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 386.1 (80) [M+H]+。
【０２０４】
中間体 42A 
4-[4-アミノ-7-(モルホリン-4-イルメチル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル]ベンズアルデヒド
【化６５】
0005955953.tif 000066
【０２０５】
脱気 DMF (9.0 mL)中の中間体 38A (300 mg、0.96 mmol) の溶液に、(4−ホルミルフェニル)ボロン酸 (216 mg、1.44 mmol)、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0) (111 mg、0.1 mmol)および2 M 水性炭酸ナトリウム溶液 (2.4 mL) を添加した。混合物を90℃にアルゴン下で 17時間加熱し、次いで室温に冷却し、直接的に分取 HPLC (方法 3)により精製した。 収率: 150 mg (46％ of th.)。
LC-MS (方法 6): Rt = 0.44 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 338.2 (30) [M+H]+。
【０２０６】
中間体 43A
5-ブロモ-6-メチル-7-(モルホリン-4-イルメチル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミン
【化６６】
0005955953.tif 000067
【０２０７】
化合物をWO 2007/056170-A2 (中間体 O)に記載されている手順にしたがって調製した。
【０２０８】
中間体 44A 
1-[(4-アミノピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)メチル]ピペリジン-4-オール
【化６７】
0005955953.tif 000068
【０２０９】
4-ヒドロキシピペリジン (3.62 g、35.8 mmol)および37％ ホルマリン溶液 (2.9 g、35.8 mmol) を酢酸 (150 mL) に溶解し、室温で1時間撹拌した。この溶液に酢酸 (150 mL)中のピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミン (2.0 g、14.9 mmol; WO 2007/056170-A2、中間体 Aに記載されている手順にしたがって調製した) の溶液を添加し、混合物を60℃で2時間撹拌した。溶媒を次いで蒸発させ、残渣を 200 mLの半濃縮(half-concentrated)水性炭酸水素カリウム溶液に取り(taken up)、200 mL ジクロロメタンで抽出した。有機層を水 (2 x 50 mL)で洗浄し、捨てた。合わせた水層を蒸発させて乾燥させ、残渣をジクロロメタンおよびメタノールの10:1 混合物(2 x 100 mL)で処理した。有機抽出物を蒸発させ、残渣を分取 HPLC (方法 4) により精製し、1.16 g (15％ of th.) の標題化合物を得た。
LC-MS (方法 7): Rt = 0.18 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 248.3 (30) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 246.5 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.35 (br. m、2H)、1.67 (br. m、2H)、2.07 (t、2H)、2.70 (br. m、2H)、3.38 (br. m、1H)、3.75 (s、2H)、4.51 (br、1H)、6.52 (d、1H)、6.84 (d、1H)、7.62 (br、2H)、7.82 (s、1H)。
【０２１０】
中間体 45A 
1-[(4-アミノ-5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)メチル]ピペリジン-4-オール
【化６８】
0005955953.tif 000069
【０２１１】
中間体 44A (1.10 g、4.45 mmol) をDMF (16.5 mL) に溶解し、-20℃に冷却した。1,3-ジブロモ-5,5-ジメチルヒダントイン (636 mg、2.22 mmol) を10 分毎に約 100 mg部ずつ添加した。引き続き、混合物を室温でさらに1時間撹拌し、次いで直接的に分取 HPLC (方法 4) により精製した。収率: 0.61 g (42％ of th.)。
LC-MS (方法 4): Rt = 0.75 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 326.0 (30) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 324.0 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.35 (br. m、2H)、1.67 (br. m、2H)、2.08 (t、2H)、2.68 (br. m、2H)、3.39 (br. m、1H)、3.74 (s、2H)、4.51 (br、1H)、6.69 (s、1H)、7.86 (s、1H)。
【０２１２】
中間体 46A
1-[(4-アミノピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)メチル]ピロリジン-3-オール
【化６９】
0005955953.tif 000070
【０２１３】
3-ピロリジノール (1.56 g、17.9 mmol)および37％ ホルマリン溶液 (1.45 g、17.9 mmol) を酢酸 (75 mL)に溶解し、室温で10 分間撹拌した。この溶液に酢酸 (75 mL)中のピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミン (2.0 g、14.9 mmol) の溶液を添加し、混合物を60℃で4時間撹拌した。蒸発後、残渣を200 mL の1 N 水性炭酸カリウム溶液に取り、酢酸エチル (3 x 200 mL)で抽出した。合わせた有機層を塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣を分取 HPLC (方法 4) により精製し、390 mg (11％ of th.) の標題化合物を得た。
LC-MS (方法 4): Rt = 0.22 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 234.2 (20) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 223.0 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.50 (br. m、1H)、1.94 (m、1H)、2.34 (dd、1H)、2.44 (dd、1H)、2.60 (dd、1H)、2.71 (dd、1H)、3.84 (dd、2H)、4.15 (br、1H)、4.65 (d、1H)、6.52 (d、1H)、6.83 (d、1H)、7.61 (br、2H)、7.82 (s、1H)。
【０２１４】
中間体 47A 
1-[(4-アミノ-5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)メチル]ピロリジン-3-オール
【化７０】
0005955953.tif 000071
【０２１５】
中間体 46A (0.9 g、3.86 mmol) をDMF (14.2 mL)に溶解し、-20℃に冷却した。1,3-ジブロモ-5,5-ジメチルヒダントイン (606 mg、2.12 mmol) を10 分毎に約 100 mg部ずつ添加し、撹拌を室温で1時間続けた。混合物を10％ 水性炭酸水素カリウム溶液 (50 mL)と酢酸エチル (100 mL)とに分配した。水層をさらに一部の酢酸エチル (100 mL)、次いでジクロロメタン (100 mL)で抽出した。合わせた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、蒸発させ、残渣を分取 HPLC (方法 4) により精製した。 収率: 0.44 g (37％ of th.)。
LC-MS (方法 6): Rt = 0.21 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 314.0 (100) [M+H]+。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.50 (br. m、1H)、1.95 (m、1H)、2.34 (dd、1H)、2.45 (m、1H)、2.60 (m、1H)、2.70 (dd、1H)、3.84 (dd、2H)、4.15 (br、1H)、4.65 (d、1H)、6.71 (s、1H)、7.86 (s、1H)。
【０２１６】
中間体 48A
1-[(4-アミノピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)メチル]ピペリジン-3-オール
【化７１】
0005955953.tif 000072
【０２１７】
標題化合物を3-ヒドロキシピペリジン (1.80 g、17.9 mmol) を出発物質として用いて、中間体 46Aと同様にして調製した。反応混合物の濃縮後、残渣を飽和水性炭酸カリウム溶液に取り、300 mL ジクロロメタンで抽出した。有機層を塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣を分取 HPLC (方法 4)により精製し、650 mg (18％ of th.) の標題化合物を得た。
LC-MS (方法 6): Rt = 0.16 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 248.2 (60) [M+H]+。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 0.99 (m、1H)、1.37 (br. m、1H)、1.57 (br. m、1H)、1.74 (m、2H)、1.88 (t、1H)、2.68 (br. m、1H)、2.83 (br. dd、1H)、3.41 (br. m、1H)、3.78 (dd、2H)、4.54 (d、1H)、6.52 (d、1H)、6.84 (d、1H)、7.61 (br、2H)、7.82 (s、1H)。
【０２１８】
中間体 49A
1-[(4-アミノ-5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)メチル]ピペリジン-3-オール
【化７２】
0005955953.tif 000073
【０２１９】
中間体 47Aの調製と同様にして、標題化合物を中間体 48A (690 mg、2.79 mmol) から調製し、348 mg (93％ LC-MS 純度、36％ of th.) の生成物を分取 HPLC (方法 4)による精製後に得た。 
LC-MS (方法 4): Rt = 0.85 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 226.0 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 223.9 (70) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 0.99 (m、1H)、1.37 (m、1H)、1.57 (br. m、1H)、1.74 (m、2H)、1.89 (m、1H)、2.66 (br. m、1H)、2.81 (br. m、1H)、3.41 (br. m、1H)、3.77 (dd、2H)、4.54 (d、1H)、6.70 (s、1H)、7.86 (s、1H)。
【０２２０】
中間体 50A
1-({4-アミノ-5-[4-({[tert-ブチル(ジメチル)シリル]オキシ}メチル)-3,5-ジフルオロフェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}メチル)ピペリジン-3-オール
【化７３】
0005955953.tif 000074
【０２２１】
標題化合物を、中間体 49A (200 mg、0.61 mmol)および[4-({[tert-ブチル(ジメチル)シリル]オキシ}メチル)-3,5-ジフルオロフェニル]ボロン酸 (222 mg、0.74 mmol; Hattori、Bioorg. Med. Chem. 2006、14、3258-3262の方法によって調製)から、一般的合成方法1により得た。粗生成物の精製を、分取 HPLC (方法 3) により行った。収率: 153 mg (50％ of th.)。
LC-MS (方法 7): Rt = 1.55 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 504.1 (100) [M+H]+。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 0.11 (s、6H)、0.86 (s、9H)、1.01 (m、1H)、1.40 (br. m、1H)、1.59 (br. m、1H)、1.77 (m、2H)、1.94 (m、1H)、2.72 (br. m、1H)、2.87 (br. m、1H)、3.43 (m、1H)、3.82 (dd、2H)、4.55 (d、1H)、4.74 (s、2H)、6.75 (s、1H)、7.18 (dd、2H)、7.95 (s、1H)。
【０２２２】
中間体 51A
rac-tert-ブチル 3-{4-アミノ-5-[3,5-ジフルオロ-4-(ヒドロキシメチル)フェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}-ピロリジン-1-カルボキシラート
【化７４】
0005955953.tif 000075
【０２２３】
出発物質 tert-ブチル 3-(4-アミノ-5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]-トリアジン-7-イル)ピロリジン-1-カルボキシラートの調製は、WO 2007/056170-A2 (中間体 I) に記載されている。
【０２２４】
この化合物 (60 mg、0.16 mmol)を、一般的合成方法1にしたがって中間体 2A (47 mg、0.17 mmol、1.1 eq.)とカップリングした。粗生成物を分取 HPLC (方法 2) により精製し、67 mg (84％ of th.) の標題化合物を得た。
HPLC (方法 2): Rt = 4.08 分;
LC-MS (方法 7): Rt = 1.66 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 446.2 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 444.3 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.39 (s、9H)、2.10 (m、1H)、2.33 (m、1H)、3.37 (m、2H)、3.46 (m、1H)、3.70-3.89 (m、2H)、4.51 (s、2H)、6.80 (s、1H)、7.15 (m、2H)、8.03 (s、1H)。
【０２２５】
中間体 52A
rac-tert-ブチル 3-{4-アミノ-5-[3,5-ジフルオロ-4-(ヒドロキシメチル)フェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}-3-ヒドロキシピペリジン-1-カルボキシラート
【化７５】
0005955953.tif 000076
【０２２６】
中間体 26A (148 mg、0.35 mmol)および(4-ブロモ-2,6-ジフルオロフェニル)メタノール (75 mg、0.34 mmol) を、一般的合成方法2にしたがってカップリングした。粗生成物の精製を、分取 HPLC (方法 2) を用いて行った。 収率: 46 mg (28％ of th.)。
HPLC (方法 3): Rt = 3.90 分;
LC-MS (方法 7): Rt = 1.56 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 476.2 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 474.2 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.22-1.58 (m、10H)、1.80 (m、2H)、3.19 (m、1H)、3.48 (m、1H)、3.62 (m、1H)、3.74 (m、1H)、4.00 (m、1H)、4.52 (m、2H)、5.39 (t、1H)、6.78 (s、1H)、7.10 (m、2H)、7.94 (s、1H)。
【０２２７】
中間体 53A
tert-ブチル 4-{4-アミノ-5-[4-(ヒドロキシメチル)フェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}ピペリジン-1-カルボキシラート
【化７６】
0005955953.tif 000077
【０２２８】
出発物質である、 tert-ブチル 4-(4-アミノ-5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)-ピペリジン-1-カルボキシラートを、WO 2007/056170-A2 (実施例 1、工程 3)に記載されている手順にしたがって調製した。
【０２２９】
この化合物 (400 mg、1.01 mmol) を次いで、一般的合成方法1にしたがって4-(ヒドロキシメチル)フェニルボロン酸 (184 mg、1.21 mmol、1.2 eq.) と反応させた。粗生成物を分取 HPLC (方法 2)により精製し、326 mg (76％ of th.) の標題化合物を得た。
HPLC (方法 2): Rt = 4.07 分;
LC-MS (方法 6): Rt = 1.06 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 424.3 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 422.3 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.52-1.65 (m、2H)、1.92-2.00 (m、2H)、2.89 (br. s、2H)、3.10 (m、1H)、3.28-3.37 (m、2H)、4.06 (d、2H)、4.60 (s、2H)、6.68 (s、1H)、7.47 (s、5H)、8.02 (s、1H)。
【０２３０】
中間体 54A
rac-tert-ブチル 3-{4-アミノ-5-[3,5-ジフルオロ-4-(ヒドロキシメチル)フェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}-ピペリジン-1-カルボキシラート
【化７７】
0005955953.tif 000078
【０２３１】
中間体 31A (200 mg、0.39 mmol) および中間体 2A (138 mg、0.51 mmol、1.3 eq.) を一般的合成方法1にしたがって反応させ、130 mg (72％ of th.) の標題化合物を分取 HPLC (方法 2) による精製の後、得た。
HPLC (方法 3): Rt = 4.23 分;
LC-MS (方法 6): Rt = 1.17 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 460.1 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 458.1 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.39 (s、9H)、1.48 (m、2H)、1.74 (m、2H)、2.93 (m、1H)、3.22 (m、1H)、3.85 (m、1H)、4.11 (m、1H)、4.53 (s、2H)、6.78 (s、1H)、7.12 (m、2H)、8.02 (s、1H)。
【０２３２】
中間体 55A
tert-ブチル (3R)-3-{4-アミノ-5-[3,5-ジフルオロ-4-(ヒドロキシメチル)フェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}ピペリジン-1-カルボキシラート
【化７８】
0005955953.tif 000079
【０２３３】
エナンチオマー的に純粋なR-異性体を、一般的合成方法2にしたがって、中間体 32A (115 mg、0.28 mmol)と(4-ブロモ-2,6-ジフルオロフェニル)メタノール (76 mg、0.33 mmol、1.2 eq.)とのカップリングにより合成した。収率: 48 mg (38％ of th.)。
【０２３４】
あるいは、標題化合物を、分取キラル HPLC [カラム: セレクター(selector)、ポリ(N-メタクリロイル-L-ロイシン-tert-ブチルアミド) に基づくキラルシリカゲル相、250 mm x 20 mm; 溶離液: 酢酸エチル/イソヘキサン 4:1; 流速: 20 mL/分; UV 検出: 260 nm] を用いて中間体 54A (40 mg)からのラセミ化合物の分離により得た。収率: 20 mg (R-異性体)。
【０２３５】
分析キラル HPLC [カラム: セレクター、ポリ(N-メタクリロイル-L-ロイシン-tert-ブチルアミド) に基づくキラルシリカゲル相、250 mm x 4 mm; 溶離液: 酢酸エチル/イソヘキサン 4:1; 流速: 1 mL/分; UV 検出: 260 nm]: Rt = 5.68 分; e.e. ＞99.5。
【０２３６】
HPLC (方法 3): Rt = 4.23 分;
LC-MS (方法 6): Rt = 1.17 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 460.1 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 458.1 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.39 (s、9H)、1.48 (m、2H)、1.74 (m、2H)、2.93 (m、1H)、3.22 (m、1H)、3.85 (m、1H)、4.11 (m、1H)、4.53 (s、2H)、6.78 (s、1H)、7.12 (m、2H)、8.02 (s、1H)。
【０２３７】
中間体 56A
tert-ブチル (3S)-3-{4-アミノ-5-[3,5-ジフルオロ-4-(ヒドロキシメチル)フェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}ピペリジン-1-カルボキシラート
【化７９】
0005955953.tif 000080
【０２３８】
エナンチオマー的に純粋なS-異性体を、中間体 55Aについて記載されているように分取キラル HPLCを用いて中間体 54A (40 mg)からのラセミ化合物の分離により得た。収率: 19 mg (S-異性体)。
【０２３９】
分析キラル HPLC [カラム:セレクター、ポリ(N-メタクリロイル-L-ロイシン-tert-ブチルアミド) に基づくキラルシリカゲル相、250 mm x 4 mm; 溶離液: 酢酸エチル/イソヘキサン 4:1; 流速: 1 mL/分; UV 検出: 260 nm]: Rt = 7.87 分; e.e. ＞99.5。
【０２４０】
HPLC (方法 3): Rt = 4.23 分;
LC-MS (方法 6): Rt = 1.17 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 460.1 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 458.1 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.39 (s、9H)、1.48 (m、2H)、1.74 (m、2H)、2.93 (m、1H)、3.22 (m、1H)、3.85 (m、1H)、4.11 (m、1H)、4.53 (s、2H)、6.78 (s、1H)、7.12 (m、2H)、8.02 (s、1H)。
【０２４１】
中間体 57A
[2-フルオロ-6-メチル-4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェニル]メタノール
【化８０】
0005955953.tif 000081
【０２４２】
(4-ブロモ-2-フルオロ-6-メチルフェニル)メタノール (2.0 g、9.13 mmol) をマイクロ波反応器バイアル中の1,4-ジオキサン (20.0 mL) に溶解し、溶液をアルゴンでフラッシュした(flushed)。次いで、ビス(ピナコラト)ジボロン (2.43 g、9.59 mmol)、1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン-パラジウム(II) クロライド (298 mg、0.37 mmol) および酢酸カリウム (1.34 g、13.7 mmol) を添加し、反応容器に圧着により蓋をし(crimp-capped)、混合物を130℃に1時間単一モードマイクロ波装置中で加熱した。冷却後、反応混合物を濾過し、ろ液を蒸発させた。残渣をシクロヘキサン (100 mL) で処理し、10 分間撹拌した。溶液を再び濾過し、ろ液を蒸発させ、残渣をクロマトグラフィー (Biotage 25M シリカカートリッジ、15 mL/分 流速のジクロロメタン) により精製した。標題化合物を含有する画分を合わせ、蒸発させたところ、標題化合物が黄色固体 (2.18 g、90％ of th.)として自然に結晶化した。
1H NMR (400 MHz、DMSO-d6): δ (ppm) = 1.30 (s、12H)、2.39 (s、3H)、4.51 (m、2H)、5.01 (t、1H)、7.14 (d、1H)、7.31 (s、1H)。
【０２４３】
中間体 58A
[2-エチル-6-フルオロ-4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェニル]メタノール
【化８１】
0005955953.tif 000082
【０２４４】
標題化合物を、1,4-ジオキサン (20 mL)中の (4−ブロモ-2-エチル-6-フルオロフェニル)メタノール (2.00 g、8.58 mmol)、ビス(ピナコラト)ジボロン (2.29 g、9.01 mmol)、1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン-パラジウム(II) クロライド (280 mg、0.34 mmol)および酢酸カリウム (1.26 g、12.87 mmol) を用いて、中間体 57Aと同様にして合成し、精製した。収率: 黄色結晶として 2.16 g (90％ of th.)。
1H NMR (400 MHz、DMSO-d6): δ (ppm) = 1.17 (t、3H)、1.30 (s、12H)、2.76 (q、2H)、4.50 (m、2H)、5.03 (t、1H)、7.14 (d、1H)、7.32 (s、1H)。
【０２４５】
中間体 59A
[2-フルオロ-6-メトキシ-4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェニル]メタノール
【化８２】
0005955953.tif 000083
【０２４６】
標題化合物を、1,4-ジオキサン (20 mL)中の、(4−ブロモ-2-メトキシ-6-フルオロフェニル)メタノール (2.00 g、8.51 mmol)、ビス(ピナコラト)ジボロン (2.27 g、8.90 mmol)、1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン-パラジウム(II) クロライド (278 mg、0.34 mmol)および酢酸カリウム (1.25 g、12.76 mmol) を用いて、中間体 57Aと同様にして合成し、精製した。 収率: 黄色結晶として1.81 g (75％ of th.)。
1H NMR (400 MHz、DMSO-d6): δ (ppm) = 1.30 (s、12H)、3.83 (s、3H)、4.47 (m、2H)、4.86 (t、1H)、6.97 (d、1H)、7.02 (s、1H)。
【０２４７】
中間体 60A
1-(4-アミノピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)シクロヘキサノール
【化８３】
0005955953.tif 000084
【０２４８】
7-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミン (1.20 g、5.63 mmol) をTHF (25 mL)にアルゴン下で室温で溶解した。クロロトリメチルシラン (1.43 mL、11.27 mmol) を添加し、混合物を室温で3時間撹拌した。次いで、それを0℃に冷却し、2-プロピルマグネシウムクロライド (11.8 mLのTHF中 2.0 M 溶液、23.7 mmol) を添加し、反応混合物を室温まで昇温させつつ、撹拌をさらに3時間維持した。次いで、シクロヘキサノン (0.88 mL、8.45 mmol) を添加し、撹拌を16時間続けた。反応をpH が6-7に達するまで、濃水性塩化アンモニウム溶液および氷の混合物 (1:1)でクエンチした。混合物を2部の酢酸エチルで抽出し、合わせた有機抽出物を無水炭酸ナトリウムで乾燥させ 、濃縮して乾燥させた。こうして得られた生成物をさらに精製せずに用いた(HPLCにより純度〜68％) 。収率: 1.87 g (97％ of th.)。
LC-MS (方法 5): Rt = 1.10 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 233 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 231 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、DMSO-d6): δ (ppm) = 1.28-1.33 (m、1H)、1.42-1.50 (m、2H)、1.58-1.63 (m、1H)、1.67-1.78 (m、4H)、2.13-2.23 (m、2H)、6.69 (d、1H)、7.20 (d、1H)、8.02 (s、1H)、8.58 (br. s、1H)、9.00 (br. s、1H)。
【０２４９】
中間体 61A
1-(4-アミノ-5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)シクロヘキサノール
【化８４】
0005955953.tif 000085
【０２５０】
中間体 60A (80 mg、0.34 mmol) をTHF (5.0 mL)に溶解し、混合物を-20℃に冷却した。1,3-ジブロモ-5,5-ジメチルヒダントイン (49 mg、0.17 mmol) を一回で添加し、撹拌を1時間続けた。反応を濃水性亜ジチオン酸ナトリウム溶液 (0.5 mL) でクエンチし、混合物を酢酸エチルで抽出した。有機抽出物を塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を留去し、98 mg (91％ of th.) の標題化合物を得た。
LC-MS (方法 4): Rt = 1.90 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 311 (95) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 309 (90) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、DMSO-d6): δ (ppm) = 1.20-1.33 (m、1H)、1.42-1.52 (m、2H)、1.58-1.78 (m、5H)、2.15-2.23 (m、2H)、5.01 (br. s、2H)、6.63 (s、1H)、7.82 (s、1H)。
【０２５１】
中間体 62A
tert-ブチル {[4-(4-アミノ-5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)-1,3-チアゾール-2-イル]メチル}カルバメート
【化８５】
0005955953.tif 000086
【０２５２】
中間体 33A (109 mg、0.38 mmol) およびtert-ブチル (2-アミノ-2-チオキソエチル)カルバメート (79 mg、0.41 mmol) をエタノール (6.5 mL) に溶解した。混合物を20時間加熱して還流させた。混合物を次いで濾過し、ろ液を蒸発させた。残渣をアセトニトリルで粉砕し、67 mg (42％ of th.) の標題化合物を茶色がかった-灰色結晶固体として得た。
LC-MS (方法 7): Rt = 1.81 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 425 (80) および 427 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 423 (50) および 425 (100) [M-H]-。
【０２５３】
中間体 63A
tert-ブチル 3-{4-アミノ-5-[3-フルオロ-4-(ヒドロキシメチル)-5-メトキシフェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]-トリアジン-7-イル}ピペリジン-1-カルボキシラート
【化８６】
0005955953.tif 000087
【０２５４】
中間体 31A (120 mg、0.30 mmol) および中間体 59A (104 mg、0.36 mmol) をマイクロ波反応器バイアル中でアセトニトリル (2.0 mL) に溶解し、アルゴンでフラッシュした(flushed)。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0) (35 mg、0.03 mmol) および2.0 M aq. 炭酸ナトリウム溶液 (0.5 mL) を添加し、混合物を150℃に1時間単一モードマイクロ波装置中で加熱した。冷却後、混合物を濾過し、ろ液を蒸発させた。残渣を フラッシュクロマトグラフィー (Biotage 25M シリカカートリッジ、ジクロロメタン + 2-5％ メタノール、流速 10 mL/分) により精製し、51 mg (36％ of th.) の標題化合物を得た。 
LC-MS (方法 6): Rt = 1.16 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 472 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 470 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、DMSO-d6): δ (ppm) = 1.31-2.10 (m、13H)、2.88-2.91 (m、2H)、3.19-3.27 (m、2H)、3.87 (s、1H)、4.12 (m、1H)、4.50 (m、1H)、4.82 (t、1H)、6.68 (s、1H)、6.83 (d、1H)、6.90 (s、1H)、7.92 (s、1H)。
【０２５５】
中間体 64A
tert-ブチル 3-{4-アミノ-5-[3-フルオロ-4-(ヒドロキシメチル)-5-メチルフェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}ピペリジン-1-カルボキシラート
【化８７】
0005955953.tif 000088
【０２５６】
中間体 31A (120 mg、0.30 mmol)および中間体 57A (97 mg、0.36 mmol) をマイクロ波反応器バイアル中でアセトニトリル (2.0 mL) に溶解し、アルゴンでフラッシュした(flushed)。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0) (35 mg、0.03 mmol)および2.0 M aq. 炭酸ナトリウム溶液 (0.5 mL) を添加し、混合物を1時間単一モードマイクロ波装置中で150℃に加熱した。冷却後、混合物を濾過し、ろ液を蒸発させた。残渣をフラッシュクロマトグラフィー (Biotage 25M シリカカートリッジ、ジクロロメタン + 2-5％ メタノール、流速 10 mL/分) により精製し、110 mg (71％ of th.) の標題化合物を得た。
LC-MS (方法 4): Rt = 2.03 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 456 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 454 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、DMSO-d6): δ (ppm) = 1.31-2.11 (m、13H)、2.42 (s、3H)、2.88-2.91 (m、2H)、3.17-3.30 (m、2H)、3.80 (m、1H)、4.54 (m、1H)、4.82 (t、1H)、6.64 (s、1H)、7.04 (d、1H)、7.12 (s、1H)、7.93 (s、1H)。
【０２５７】
中間体 65A
tert-ブチル 3-{4-アミノ-5-[3-フルオロ-4-(ヒドロキシメチル)-5-メチルフェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}ピロリジン-1-カルボキシラート
【化８８】
0005955953.tif 000089
【０２５８】
出発物質である、tert-ブチル 3-(4-アミノ-5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)ピロリジン-1-カルボキシラートをWO 2007/056170-A2 (中間体 I) に記載されている手順にしたがって合成した。
【０２５９】
tert-ブチル 3-(4-アミノ-5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)ピロリジン-1-カルボキシラート (120 mg、0.31 mmol) をマイクロ波反応器バイアル中でアセトニトリル (2.2 mL) に溶解し、アルゴンでフラッシュした(flushed)。中間体 57A (100 mg、0.38 mmol)、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0) (36 mg、0.03 mmol)および2.0 M aq. 炭酸ナトリウム溶液 (0.5 mL) を添加し、混合物を1時間単一モードマイクロ波装置中で150℃に加熱した。冷却後、混合物を濾過し、ろ液を蒸発させた。残渣をフラッシュクロマトグラフィー (Biotage 25M シリカカートリッジ、ジクロロメタン + 2-5％ メタノール、流速 10 mL/分) により精製し、91 mg (54％ of th.) の標題化合物を得た。
LC-MS (方法 5): Rt = 2.00 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 442 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 440 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、DMSO-d6): δ (ppm) = 1.41 (m、9H)、2.00-2.48 (m、2H)、3.29-3.53 (m、3H)、3.71-3.90 (m、2H)、4.55 (m、2H)、4.99 (t、1H)、6.63 (s、1H)、7.06 (d、1H)、7.12 (s、1H)、7.92 (s、1H)。
【０２６０】
中間体 66A
rac-tert-ブチル 3-{4-アミノ-5-[3-エチル-5-フルオロ-4-(ヒドロキシメチル)フェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}ピロリジン-1-カルボキシラート
【化８９】
0005955953.tif 000090
【０２６１】
出発物質である、 tert-ブチル 3-(4-アミノ-5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)ピロリジン-1-カルボキシラートをWO 2007/056170-A2 (中間体 I) に記載されている手順にしたがって合成した。
【０２６２】
tert-ブチル 3-(4-アミノ-5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)ピロリジン-1-カルボキシラート (111 mg、0.29 mmol)、中間体 58A (98 mg、0.35 mmol)およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0) (17 mg、0.015 mmol) をマイクロ波反応器バイアル中でアセトニトリル (2.3 mL) および2 M 水性炭酸ナトリウム溶液 (0.53 mL) の混合物に溶解した。5 分間アルゴンを用いて脱気した後、反応容器に圧着により蓋をし(crimp-capped)、混合物を1時間単一モードマイクロ波装置中で150℃に加熱した。室温まで冷却した後、飽和水性重炭酸ナトリウム溶液を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。 残渣を分取 HPLC (方法 5) により精製した。 収率: 83 mg (63％ of th.)。
HPLC (方法 9): Rt = 1.61 分;
LC-MS (方法 10): Rt = 1.02 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 456.4 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 454.4 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.22 (t、3H)、1.41 (s、9H)、2.1 (m、1H)、2.80 (q、2H)、3.30-3.43 (m、2H)、3.44-3.51 (m、1H)、3.78 (m、1H)、4.55 (d、2H)、5.00 (t、1H)、6.68 (s、1H)、7.09 (d、1H)、7.15 (s、1H)、7.95 (s、1H)。
【０２６３】
中間体 67A
rac-tert-ブチル 3-{4-アミノ-5-[3-エチル-5-フルオロ-4-(ヒドロキシメチル)フェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}ピペリジン-1-カルボキシラート
【化９０】
0005955953.tif 000091
【０２６４】
中間体 31A (148 mg、0.29 mmol)、中間体 58A (98 mg、0.35 mmol)およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0) (17 mg、0.015 mmol) をマイクロ波反応器バイアル中でアセトニトリル (2.3 mL) および2 M 水性炭酸ナトリウム溶液 (0.67 mL) の混合物に溶解した。5 分間アルゴンを用いて脱気した後、反応容器に圧着により蓋をし(crimp-capped)、混合物を1時間単一モードマイクロ波装置中で150℃に加熱した。室温まで冷却した後、飽和水性重炭酸ナトリウム溶液を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣を分取 HPLC (方法 5) により精製した。収率: 105 mg (76％ of th.)。
HPLC (方法 9): Rt = 1.71 分;
LC-MS (方法 10): Rt = 1.08 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 470.4 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 468.4 (75) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.22 (t、3H)、1.38 (s、9H)、1.50 (m、1H)、1.65-1.90 (m、2H)、2.06 (m、1H)、2.80 (q、2H)、2.98 (m、1H)、3.20-3.43 (m、2H)、3.8 (m、1H)、4.08 (m、1H)、4.55 (d、2H)、5.02 (t、1H)、6.65 (s、1H)、7.07 (d、1H)、7.13 (s、1H)、7.93 (s、1H)。
【０２６５】
中間体 68A
rac-メチル 4-{4-アミノ-7-[シクロプロピル(ヒドロキシ)メチル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル}-2-メトキシ-ベンゾアート
【化９１】
0005955953.tif 000092
【０２６６】
中間体 17A (250 mg、0.88 mmol)、[3-メトキシ-4-(メトキシカルボニル)フェニル]ボロン酸 (223 mg、1.06 mmol)およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0) (102 mg、0.088 mmol) を1,4-ジオキサン (5.5 mL) および2 M 水性炭酸ナトリウム溶液 (1.32 mL) の混合物にアルゴン下で溶解し、16時間還流下で加熱した。この後、さらに一部のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0) (102 mg、0.088 mmol) を添加し、加熱をさらに24時間続けた。室温まで冷却した後、反応混合物を濾過し、ろ液を濃縮し、残渣を分取 HPLC (方法 7) により精製した。 収率: 130 mg (80％ 純度、32％ of th.)。
LC-MS (方法 10): Rt = 0.80 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 369.3 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 367.3 (75) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 0.41 (m、3H)、0.49 (m、1H)、1.37 (m、1H)、3.81 (s、3H)、4.68 (d、1H)、6.92 (s、1H)、7.13 (dd、1H)、7.22 (d、1H)、7.77 (d、1H)、8.05 (s、1H)。
【０２６７】
中間体 69A
7-(プロパ-1-エン-2-イル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミン
【化９２】
0005955953.tif 000093
【０２６８】
出発物質である、7-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミンをWO 2007/056170-A2 (中間体 B)に記載されている手順にしたがって合成した。
【０２６９】
アルゴン雰囲気下で、7-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミン (426 mg、2 mmol)および 4,4,5,5-テトラメチル-2-(プロパ-1-エン-2-イル)-1,3,2-ジオキサボロラン (420 mg、2.5 mmol) を1,2-ジメトキシエタン (10 mL)および水性炭酸ナトリウム溶液 (2 M、4 mL) の混合物に溶解した。反応混合物を脱気し、1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセンパラジウム(II) クロライド (73 mg、0.1 mmol) を添加した。90℃で一晩撹拌した後、反応混合物を酢酸エチル (40 mL) で希釈し、水 (10 mL) を添加し、層を分離した。水層を酢酸エチル (2 x 40 mL) で抽出し、合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー (puriFlash、Interchim、シクロヘキサン/酢酸エチル 1:1から100％酢酸エチルのグラジエント) により精製し、標題生成物をわずかに黄色の固体として得た。収率: 304 mg (81％ of th.).
HPLC (方法 10): Rt = 0.83 分;
LC-MS (方法 10): Rt = 0.57 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 175.1 (100) [M+H]+。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 2.15 (s、3H)、5.22 (m、1H)、6.30 (m、1H)、6.73 (d、1H)、6.91 (d、1H)、7.69 (m、1H)、7.91 (s、1H)。
【０２７０】
中間体 70A
7-イソプロピルピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミン
【化９３】
0005955953.tif 000094
【０２７１】
中間体 69A (149 mg、0.86 mmol) をエタノールおよび酢酸エチルの混合物(1:1、40 mL)にアルゴン下で溶解した。パラジウム炭 (10％、9.1 mg) を添加し、混合物を16時間水素雰囲気下で周囲圧力および室温で勢いよく撹拌した。この後、触媒を濾過により除去し、溶媒を減圧下で留去し、131 mg (80％ of th.) の標題化合物を無色固体として得た。この生成物を次の合成工程にさらに精製せずに用いた。
HPLC (方法 10): Rt = 0.81 分;
LC-MS (方法 10): Rt = 0.56 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 177.0 (100) [M+H]+。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.27 (d、6H)、3.36 (m、1H)、6.41 (d、1H)、6.80 (d、1H)、7.48-7.59 (m、2H)、7.80 (s、1H)。
【０２７２】
中間体 71A
5-ブロモ-7-イソプロピルピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-アミン
【化９４】
0005955953.tif 000095
【０２７３】
中間体 70A (125 mg、0.71 mmol) を乾燥 THF (21 mL)に溶解し、−78℃に冷却した。1,3-ジブロモ-5,5-ジメチルヒダントイン (81 mg、0.28 mmol) を等しい2部にて(in two equal portions)添加した。反応混合物を-78℃で1時間撹拌し、次いで室温まで一晩昇温させた。水 (20 mL)の添加および20 分間のさらなる撹拌の後、沈殿した固体を濾過により収集し 、減圧下で乾燥させた。こうして得た粗生成物 (209 mg、＞100％ of th.) を次の合成工程にさらに精製せずに用いた。
HPLC (方法 9): Rt = 1.35 分。
LC-MS (方法 10): Rt = 0.91 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 257.0 (100) [M+H]+。
【０２７４】
中間体 72A
rac-1-(4-アミノ-5-ブロモピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)エタノール
【化９５】
0005955953.tif 000096
【０２７５】
中間体 16A (500 mg、1.66 mmol) をTHF (10 mL) に懸濁し、0℃に冷却した。メチルマグネシウムブロミド溶液 (ジエチルエーテル中3 N、1.7 mL) を添加し、反応混合物を30 分間撹拌した。次いで、飽和水性塩化アンモニウム溶液を添加し、混合物を酢酸エチル(2 x 20 mL)で抽出した。合わせた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、235 mg (46％ of th.) の標題生成物を得、これを次の合成工程にさらに精製せずに用いた。
LC-MS (方法 5): Rt = 0.73 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 259.1 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 257.1 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.41 (d、3H)、5.16 (m、1H)、5.30 (m、1H)、6.70 (s、1H)、7.85 (s、1H)。
【０２７６】
調製実施例:
【０２７７】
実施例 1
[4-(4-アミノ-7-プロピルピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル)フェニル]メタノール
【化９６】
0005955953.tif 000097
【０２７８】
標題化合物を、中間体 11A (100 mg、0.39 mmol) および4-(ヒドロキシメチル)フェニルボロン酸 (60 mg、0.39 mmol) から、一般的合成方法1により得た。粗生成物の精製を、分取 HPLC (方法 2) により行った。 収率: 33 mg (30％ of th.)。
HPLC (方法 1): Rt = 3.47 分; HPLC (方法 2): Rt = 3.78 分;
LC-MS (方法 4): Rt = 0.91 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 283.2 (100) [M+H]+。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 0.97 (t、J = 7.4 Hz、3H)、1.71 (m、2H)、3.31 (s、2H)、4.52 (s、2H)、6.54 (s、1H)、7.42 (s、4H)、7.89 (s、1H)。
【０２７９】
実施例 2
[4-(4-アミノ-7-プロピルピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル)-2,6-ジフルオロフェニル]メタノール
【化９７】
0005955953.tif 000098
【０２８０】
標題化合物を、中間体 11A (118 mg、0.46 mmol)および(4-ブロモ-2,6-ジフルオロフェニル)メタノール (108 mg、0.49 mmol)から、一般的合成方法2 により得た。粗生成物の精製を、分取 HPLC (方法 2) により行った。 収率: 59 mg (40％ of th.)。
HPLC (方法 2): Rt = 3.94 分;
LC-MS (方法 7): Rt = 1.47 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 319.3 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 317.3 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 0.95 (t、3H)、1.71 (m、2H)、4.52 (m、2H)、5.26 (t、1H)、6.64 (s、1H)、7.10 (m、2H)、7.91 (s、1H)。
【０２８１】
実施例 3
3-{4-アミノ-5-[4-(ヒドロキシメチル)フェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}プロパン-1-オール
【化９８】
0005955953.tif 000099
【０２８２】
標題化合物を、一般的合成方法1にしたがって中間体 10A (100 mg、0.37 mmol)および4-(ヒドロキシメチル)フェニルボロン酸 (67 mg、0.44 mmol、1.2 eq.)から得た。粗生成物を分取 HPLC (方法 2)により精製し、73 mg (66％ of th.) の標題化合物を無色固体として得た。
HPLC (方法 1): Rt = 2.91 分; HPLC (方法 2): Rt = 3.14 分;
LC-MS (方法 6): Rt = 0.60 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 299.3 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 297.4 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.84 (m、2H)、2.95 (t、J = 7.6 Hz、2H)、3.50 (m、2H)、4.58 (s、2H)、6.67 (s、1H)、7.41 (s、4H)、8.03 (s、1H)。
【０２８３】
実施例 4
4-{4-アミノ-5-[4-(ヒドロキシメチル)フェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}ブタン-1-オール
【化９９】
0005955953.tif 000100
【０２８４】
標題化合物を、中間体 14A (75 mg、0.26 mmol)および4-(ヒドロキシメチル)フェニルボロン酸 (48 mg、0.32 mmol)から、一般的合成方法1により得た。粗生成物の精製を、分取 HPLC (方法 2) により行った。収率: 66 mg (80％ of th.)。
HPLC (方法 2): Rt = 3.28 分;
LC-MS (方法 6): Rt = 0.68 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 313.3 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 311.2 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.48-1.51 (m、2H)、1.67-1.70 (m、2H)、2.91 (t、J = 7.6 Hz、2H)、3.42 (t、J = 6.4 Hz、2H)、4.58 (s、2H)、6.67 (s、1H)、7.42 (s、4H)、8.03 (s、1H)。
【０２８５】
実施例 5 
{4-アミノ-5-[3,5-ジフルオロ-4-(ヒドロキシメチル)フェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}-(シクロプロピル)メタノール
【化１００】
0005955953.tif 000101
【０２８６】
標題化合物を、一般的合成方法1により中間体 17A (125 mg、0.44 mmol)および中間体 2A (114 mg、0.53 mmol) から得た。粗生成物を分取 HPLC (方法 3) により精製した。 収率: 73 mg (48％ of th.)。
LC-MS (方法 7): Rt = 1.09 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 347.3 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 345.3 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 0.39 (m、3H)、0.48 (m、1H)、1.35 (m、1H)、4.54 (d、2H)、4.67 (m、1H)、5.26 (m、2H)、6.80 (s、1H)、7.14 (m、2H)、7.92 (s、1H)。
【０２８７】
実施例 6 
{4-アミノ-5-[3,5-ジフルオロ-4-(ヒドロキシメチル)フェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)メタノール
【化１０１】
0005955953.tif 000102
【０２８８】
標題化合物を、一般的合成方法1により中間体 18A (200 mg、0.61 mmol)および中間体 2A (158 mg、0.73 mmol) から得た。粗生成物を分取 HPLC (方法 3) により精製した。 収率: 125 mg (52％ of th.)。
LC-MS (方法 5): Rt = 1.29 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 391.1 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 389.0 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.24 (br. d、1H)、1.36 (m、2H)、1.68 (br. d、1H)、2.03 (m、1H)、2.60 (t、2H)、3.82 (m、2H)、4.54 (s、2H)、4.95 (br. d、1H)、5.28 (br、1H)、5.33 (br、1H)、6.73 (s、1H)、7.14 (m、2H)、7.93 (s、1H)。
【０２８９】
実施例 7
トランス-4-{4-アミノ-5-[3,5-ジフルオロ-4-(ヒドロキシメチル)フェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}シクロヘキサノール
【化１０２】
0005955953.tif 000103
【０２９０】
標題化合物を、中間体 24A (323 mg、85％ 純度、0.88 mmol)および中間体 1A (286 mg、1.06 mmol、1.2 eq.) から、一般的合成方法1により得た。粗生成物の精製をまずフラッシュクロマトグラフィー (Biotage シリカ充填(packed)カートリッジ、溶離液、ジクロロメタン/メタノール 95:5)により行った。さらなる精製を分取 HPLC (方法 2)により行った。収率: 72 mg (21％ of th.)。
HPLC (方法 2): Rt = 3.37 分;
LC-MS (方法 7): Rt = 1.01 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 375.3 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 373.3 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.32 (m、2H)、1.50 (m、2H)、1.98 (m、2H)、2.04 (m、2H)、3.04 (tt、1H)、3.47 (m、1H)、4.51 (m、2H)、4.61 (d、1H)、5.26 (t、1H)、6.60 (s、1H)、7.12 (m、2H)、7.91 (s、1H)。
【０２９１】
実施例 8
rac-{4-[4-アミノ-7-(ピロリジン-3-イル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル]-2,6-ジフルオロフェニル}メタノール
【化１０３】
0005955953.tif 000104
【０２９２】
中間体 51A (67 mg、0.15 mmol) をジクロロメタン(6 mL) 中30％のトリフルオロ酢酸の溶液に0℃で溶解した。反応混合物をこの温度で20 分間撹拌し、次いで、すべての揮発性物質を減圧下で除去した。残渣を分取 HPLC (方法 2) により精製した。こうして得られた生成物を酢酸エチルに溶解し、飽和水性炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を留去し、 21 mg (41％ of th.) の標題化合物を得た。
HPLC (方法 2): Rt = 2.96 分;
LC-MS (方法 6): Rt = 0.34 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 346.1 (20) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 344.2 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.94 (m、1H)、2.22 (m、1H)、2.94 (m、1H)、3.00-3.16 (m、2H)、3.40 (m、2H)、3.72 (m、1H)、4.51 (s、2H)、5.22 (br. s、1H)、6.71 (s、1H)、7.11 (m、2H)、7.92 (s、1H)。
【０２９３】
実施例 9
rac-3-{4-アミノ-5-[3,5-ジフルオロ-4-(ヒドロキシメチル)フェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}ピペリジン-3-オール
【化１０４】
0005955953.tif 000105
【０２９４】
中間体 52A (46 mg、0.10 mmol) をジクロロメタン(1.5 mL)中30％のトリフルオロ酢酸の溶液に0℃で溶解した。反応混合物をこの温度で30 分間撹拌し、次いで、すべての揮発性物質を減圧下で除去した。残渣を分取 HPLC (方法 2) により精製した。こうして得られた生成物を酢酸エチルに溶解し、飽和水性炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を留去し、20 mg (55％ of th.) の標題化合物を得た。
HPLC (方法 2): Rt = 2.94 分;
LC-MS (方法 4): Rt = 1.01 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 358.1 (100) [M-H2O+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 374.1 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.48 (m、1H)、1.89 (m、2H)、2.40-2.69 (m、2H)、2.92 (d、1H)、3.02 (d、1H)、3.40 (m、1H)、4.52 (m、2H)、5.26 (t、1H)、5.45 (s、1H)、6.72 (s、1H)、7.13 (m、2H)、7.94 (s、1H)。
【０２９５】
実施例 10
{4-[4-アミノ-7-(ピペリジン-4-イル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル]フェニル}メタノール
【化１０５】
0005955953.tif 000106
【０２９６】
中間体 53A (324 mg、0.77 mmol) をジクロロメタン (15 mL) に溶解した。トリフルオロ酢酸 (1.5 mL) を添加し、混合物を室温で16時間撹拌した。さらに一部のトリフルオロ酢酸 (1.5 mL) を添加し、HPLC (方法 1) が出発物質の完全な変換を示すまで、撹拌を続けた。すべての揮発性物質を次いで減圧下で除去し、残渣を分取 HPLC (方法 1) により精製し、 226 mg (91％ of th.) の標題化合物を得た。
HPLC (方法 1): Rt = 3.37 分; HPLC (方法 2): Rt = 2.90 分;
LC-MS (方法 4): Rt = 0.90 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 324.1 (75) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 322.2 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.79-1.95 (m、2H)、2.16-2.23 (m、2H)、3.05-3.19 (m、2H)、3.37-3.52 (m、3H)、4.56 (s、2H)、5.49 (s、2H)、6.66 (s、1H)、7.43 (s、4H)、8.03 (s、1H)、8.39-8.50 (m、1H)、8.65-8.69 (m、1H)。
【０２９７】
実施例 11
(4-{4-アミノ-7-[(3R)-ピペリジン-3-イル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル}-2,6-ジフルオロフェニル)メタノール
【化１０６】
0005955953.tif 000107
【０２９８】
中間体 55A (35 mg、0.08 mmol) をジクロロメタン(1.5 mL)中30％のトリフルオロ酢酸の溶液に0℃で溶解した。反応混合物をこの温度で30 分間撹拌し、次いで、すべての揮発性物質を減圧下で除去した。残渣を分取 HPLC (方法 2) により精製した。こうして得られた生成物を酢酸エチルに溶解し、飽和水性炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を留去し、18 mg (66％ of th.) の標題化合物を得た。
HPLC (方法 2): Rt = 3.10 分;
LC-MS (方法 6): Rt = 0.55 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 360.2 (20) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 358.3 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.67 (m、2H)、1.83 (m、1H)、2.75 (m、1H)、2.86 (m、1H)、3.20 (d、1H)、3.41 (m、2H)、4.53 (m、2H)、5.29 (t、1H)、6.70 (s、1H)、7.11 (m、1H)、7.94 (s、1H)。
【数１】
0005955953.tif 000108
【０２９９】
実施例 12
(4-{4-アミノ-7-[(3S)-ピペリジン-3-イル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル}-2,6-ジフルオロフェニル)メタノール
【化１０７】
0005955953.tif 000109
【０３００】
標題化合物を、中間体 55Aから実施例 11への変換について記載したものと同じ方法により、中間体 56A (19 mg、0.04 mmol) から得た。収率: 12 mg (81％ of th.)。
【０３０１】
HPLC、LC-MS および 1H-NMR データは実施例11について示すものと同一であった。
【０３０２】
実施例 13
{4-[4-アミノ-7-(2-メチル-1,3-チアゾール-4-イル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル]フェニル}メタノール 
【化１０８】
0005955953.tif 000110
【０３０３】
中間体 33A (60 mg、0.21 mmol)およびチオアセトアミド (15 mg、0.20 mmol、0.95 eq.) を1,4-ジオキサン (2 mL) に溶解し、4.5 時間還流した。冷却後、4-(ヒドロキシメチル)フェニルボロン酸 (38 mg、0.25 mmol、1.2 eq.)、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0) (59 mg、0.07 mmol、0.25 eq.)および2 M 水性炭酸ナトリウム溶液 (0.4 mL) を添加した。混合物を穏やかに100℃で16時間撹拌した。次いで、さらに一部のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0) (24 mg、0.1 eq.) を添加し、100℃での撹拌をさらに4時間続けた。反応混合物を次いで濾過し、ろ液を減圧下で蒸発させ、残渣を分取 HPLC (方法 2)により精製し、28 mg (40％ of th.) の標題化合物をオフホワイト結晶として得た。 
HPLC (方法 1): Rt = 3.85 分; HPLC (方法 2): Rt = 3.60 分;
LC-MS (方法 6): Rt = 0.94 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 338.2 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 336.1 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 2.73 (s、3H)、4.58 (s、2H)、7.17 (s、1H)、7.45 (d、J = 8.3 Hz、2H)、7.50 (d、J = 8.3 Hz、2H)、8.09 (s、1H)、8.33 (s、1H)。
【０３０４】
実施例 14
{4-[4-アミノ-7-(2-メチル-1,3-チアゾール-4-イル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル]-2,6-ジフルオロフェニル}メタノール
【化１０９】
0005955953.tif 000111
【０３０５】
標題化合物を、中間体 34A (75 mg、0.24 mmol)および中間体 1A (78 mg、0.29 mmol、1.2 eq.)から、一般的合成方法1により得た。粗生成物の精製を、分取 HPLC (方法 2) により行った。収率: 27 mg (30％ of th.)。
HPLC (方法 1): Rt = 3.79 分;
LC-MS (方法 6): Rt = 1.03 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 374.0 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 372.2 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 2.72 (s、3H)、4.53 (s、2H)、7.18-7.27 (m、2H)、8.11 (s、1H)、8.33 (s、1H)。
【０３０６】
実施例 15
{4-[4-アミノ-7-(2-エチル-1,3-チアゾール-4-イル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル]フェニル}メタノール
【化１１０】
0005955953.tif 000112
【０３０７】
中間体 35A (91 mg、0.28 mmol) を4-(ヒドロキシメチル)フェニルボロン酸 (51 mg、0.34 mmol、1.2 eq.) と一般的合成方法1にしたがって反応させた。粗生成物を分取 HPLC (方法 2) により精製し、68 mg (69％ of th.) の標題化合物を無色結晶として得た。
HPLC (方法 1): Rt = 3.73 分;
LC-MS (方法 6): Rt = 1.05 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 352.2 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 350.3 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.36 (t、J = 7.6 Hz、3H)、3.06 (q、J = 7.6 Hz、2H)、4.58 (s、2H)、7.19 (s、1H)、7.46 (d、J = 8.0 Hz、2H)、7.52 (d、J = 8.0 Hz、2H)、8.12 (s、1H)、8.36 (s、1H)。
【０３０８】
実施例 16
{4-[4-アミノ-7-(2-エチル-1,3-チアゾール-4-イル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル]-2,6-ジフルオロフェニル}メタノール
【化１１１】
0005955953.tif 000113
【０３０９】
標題化合物を、中間体 35A (34 mg、0.11 mmol)および中間体 1A (34 mg、0.13 mmol、1.2 eq.)から、一般的合成方法1により得た。粗生成物の精製を、分取 HPLC (方法 2) により行った。収率: 16 mg (40％ of th.)。
HPLC (方法 1): Rt = 4.04 分;
LC-MS (方法 6): Rt = 1.15 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 388.0 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 386.1 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.38 (t、3H)、3.06 (q、2H)、4.55 (s、2H)、7.20-7.31 (m、3H)、8.16 (s、1H)、8.38 (s、1H)。
【０３１０】
実施例 17
{4-[4-アミノ-7-(2-アミノ-1,3-チアゾール-4-イル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル]フェニル}メタノール
【化１１２】
0005955953.tif 000114
【０３１１】
標題化合物を、中間体 36A (55 mg、0.18 mmol)および4-(ヒドロキシメチル)フェニルボロン酸 (32 mg、0.21 mmol)から、一般的合成方法1により得た。粗生成物の精製を、分取 HPLC (方法 2) により行った。収率: 29 mg (49％ of th.)。
HPLC (方法 1): Rt = 3.03 分;
LC-MS (方法 5): Rt = 1.21 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 339.1 (30) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 337.1 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 4.58 (m、2H)、5.75 (m、1H)、6.93 (s、1H)、7.05 (m、2H)、7.43 (m、4H)、7.55 (s、1H)、8.08 (s、1H)。
【０３１２】
実施例 18
{4-[4-アミノ-7-(ピペラジン-1-イルメチル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル]フェニル}メタノール
【化１１３】
0005955953.tif 000115
【０３１３】
中間体 37A (200 mg、0.49 mmol)、4-(ヒドロキシメチル)フェニルボロン酸 (90 mg、0.59 mmol、1.2 eq.)およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0) (57 mg、0.05 mmol、0.1 eq.) を1,4-ジオキサン (4.0 mL) および2 M 水性炭酸ナトリウム溶液 (1.0 mL) の混合物にマイクロ波反応器バイアル中で溶解した。反応容器に圧着により蓋をし(crimp-capped)、混合物を140℃に1時間単一モードマイクロ波装置中で加熱した。冷却後、混合物を Celiteのパッドで濾過し、これを 1,4-ジオキサンですすぎすべての有機物質を溶出させた。合わせたろ液を減圧下で蒸発させて乾燥させ、残渣を分取 HPLC (方法 1) により精製し、75 mg (45％ of th.) の標題化合物を得た。
HPLC (方法 1): Rt = 2.85 分;
LC-MS (方法 4): Rt = 0.93 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 339.1 (30) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 337.2 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 2.38 (br. s、4H)、2.63 (m、4H)、3.80 (s、2H)、4.55 (s、2H)、5.26 (br. s、1H)、6.60 (s、1H)、7.39 (s、4H)、7.90 (s、1H)。
【０３１４】
実施例 19
{4-[4-アミノ-7-(モルホリン-4-イルメチル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル]フェニル}メタノール
【化１１４】
0005955953.tif 000116
【０３１５】
標題化合物を、中間体 38A (200 mg、0.64 mmol)および4-(ヒドロキシメチル)フェニルボロン酸 (116 mg、0.77 mmol、1.2 eq.) から一般的合成方法1にしたがって得た。粗生成物を分取 HPLC (方法 2) により精製した。こうして得た物質を数mLのアセトニトリルおよび水の混合物に溶解し、2 M 水性炭酸ナトリウム溶液を添加し、混合物を10 分間撹拌した。この時間の間に、標題化合物が沈殿した。結晶を濾過により単離し、減圧下で乾燥させ、95 mg (49％ of th.) の無色固体を得た。
HPLC (方法 1): Rt = 3.21 分;
LC-MS (方法 4): Rt = 0.93 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 340 (1) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 338.2 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 2.47 (m、4H)、3.31 (s、4H)、3.53 (t、2H)、3.82 (s、1H)、4.56 (d、2H)、5.22 (t、1H)、6.63 (s、1H)、7.42 (s、4H)、7.90 (s、1H)。
【０３１６】
実施例 20
{4-[4-アミノ-7-(モルホリン-4-イルメチル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル]-2,6-ジフルオロフェニル}メタノール
【化１１５】
0005955953.tif 000117
【０３１７】
THF (2.2 mL)中の中間体 40A (110 mg、0.22 mmol) の溶液に0.45 mL (0.45 mmol)のTHF中のフッ化テトラブチルアンモニウム (TBAF) の1 M 溶液を添加し、混合物を室温で1時間撹拌した。反応混合物を次いで減圧下で蒸発させ、残渣を 3 mL のメタノールに懸濁し、室温で5 分間撹拌した。結果として得られた沈殿を濾過し、少量のメタノールで洗浄し、減圧下で乾燥させ、68 mg (81％ of th.) の標題化合物を得た。
LC-MS (方法 4): Rt = 1.03 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 376.0 (80) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 374.1 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 2.45 (br. m、4H)、3.56 (t、4H)、3.82 (s、2H)、4.54 (d、2H)、5.27 (t、1H)、6.75 (s、1H)、7.16 (m、2H)、7.95 (s、1H)。
【０３１８】
実施例 21
{4-[4-アミノ-7-(モルホリン-4-イルメチル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル]-2-フルオロフェニル}メタノール
【化１１６】
0005955953.tif 000118
【０３１９】
THF (2.0 mL) 中の中間体 41A (65.0 mg、0.17 mmol)の懸濁液に、0.2 mL (0.2 mmol)のTHF中の水素化アルミニウムリチウムの1 M 溶液を添加し、混合物を室温で1時間撹拌した。結果として得られた溶液を水でクエンチし、次いで直接的に分取 HPLC (方法 3) により精製し、35 mg (58％ of th.) の標題化合物を得た。 
LC-MS (方法 6): Rt = 0.98 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 358.1 (20) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 356.2 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 2.46 (br. m、4H)、3.56 (t、4H)、3.83 (s、2H)、4.60 (d、2H)、5.32 (t、1H)、6.70 (s、1H)、7.27 (dd、2H)、7.55 (t、1H)、7.94 (s、1H)。
【０３２０】
実施例 22
{4-[4-アミノ-7-(モルホリン-4-イルメチル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル]-2-クロロフェニル}メタノール
【化１１７】
0005955953.tif 000119
【０３２１】
中間体 39A (200 mg、0.56 mmol)、中間体 3A (112 mg、0.51 mmol)およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0) (58 mg、0.05 mmol) を1,4-ジオキサン (4.0 mL) および2 M 水性炭酸ナトリウム溶液 (1.0 mL) の混合物にマイクロ波反応器バイアル中で溶解した。反応容器に圧着により蓋をし(crimp-capped)、混合物を140℃に1時間単一モードマイクロ波装置中で加熱した。冷却後、混合物を濾過し、ろ液を分取 HPLC (方法 3) により精製し、48 mg (23％ of th.) の標題化合物を得た。
LC-MS (方法 6): Rt = 0.53 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 374.1 (80) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 372.2 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 2.46 (br. m、4H)、3.56 (t、4H)、3.83 (s、2H)、4.61 (d、2H)、5.45 (t、1H)、6.70 (s、1H)、7.44 (dd、1H)、7.49 (d、1H)、7.63 (t、1H)、7.94 (s、1H)。
【０３２２】
実施例 23
{4-[4-アミノ-7-(モルホリン-4-イルメチル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル]-2-メチルフェニル}メタノール
【化１１８】
0005955953.tif 000120
【０３２３】
実施例 28の調製と同様にして、中間体 39A (200 mg、0.56 mmol) を中間体 4A (102 mg、0.51 mmol) と反応させて、9 mg (5％ of th.) の標題化合物を得た。
LC-MS (方法 4): Rt = 1.00 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 354.3 (10) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 372.2 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 2.30 (s、3H)、2.45 (br. m、4H)、3.56 (t、4H)、3.83 (s、2H)、4.54 (d、2H)、5.13 (t、1H)、6.63 (s、1H)、7.26 (s、1H)、7.26 (d、1H)、7.45 (d、1H)、7.91 (s、1H)。
【０３２４】
実施例 24
{5-[4-アミノ-7-(モルホリン-4-イルメチル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル]ピリジン-2-イル}メタノール
【化１１９】
0005955953.tif 000121
【０３２５】
標題化合物を、中間体 38A (200 mg、0.64 mmol)および中間体 6A (147 mg、0.96 mmol) から一般的合成方法1により得た。 粗生成物を分取 HPLC (方法 4) により精製した。残っている不純物を生成物をアセトニトリル (2 mL)に懸濁し、残っている固体を濾過により収集することにより除去した。収率: 27 mg (12％ of th.)。
LC-MS (方法 4): Rt = 0.78 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 341 (10) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 339.3 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 2.46 (br. m、4H)、3.56 (t、4H)、3.84 (s、2H)、4.62 (d、2H)、5.46 (t、1H)、6.73 (s、1H)、7.54 (d、1H)、7.86 (dd、1H)、7.95 (d、1H)、8.56 (s、1H)。
【０３２６】
実施例 25
1-({4-アミノ-5-[3,5-ジフルオロ-4-(ヒドロキシメチル)フェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}メチル)ピペリジン-4-オール
【化１２０】
0005955953.tif 000122
【０３２７】
標題化合物を、中間体 45A (200 mg、0.61 mmol)および中間体 2A (159 mg、0.74 mmol) から一般的合成方法1により得た。粗生成物を分取 HPLC (方法 3) により精製した。収率: 103 mg (43％ of th.)。
LC-MS (方法 4): Rt = 0.98 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 390.1 (60) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 388.2 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.36 (br. m、2H)、1.68 (br. m、2H)、2.12 (br. m、2H)、2.75 (br. m、2H)、3.41 (br. m、1H)、3.79 (s、2H)、4.51 (d、1H)、4.54 (d、2H)、5.27 (t、1H)、6.72 (s、1H)、7.15 (m、2H)、7.94 (s、1H)。
【０３２８】
実施例 26
1-({4-アミノ-5-[3,5-ジフルオロ-4-(ヒドロキシメチル)フェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}メチル)ピロリジン-3-オール
【化１２１】
0005955953.tif 000123
【０３２９】
標題化合物を、中間体 47A (110 mg、0.35 mmol)および中間体 2A (91.3 mg、0.42 mmol) から一般的合成方法1により得た。粗生成物を分取 HPLC (方法 3) により精製した。 収率: 69 mg (52％ of th.)。
LC-MS (方法 4): Rt = 0.25 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 376.1 (20) [M+H]+。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.54 (m、1H)、1.98 (m、1H)、2.43 (br. d、1H)、2.69 (m、1H)、2.79 (dd、1H)、3.93 (dd、2H)、4.18 (br、1H)、4.53 (d、2H)、4.69 (d、1H)、5.27 (t、1H)、6.75 (s、1H)、7.16 (m、2H)、7.95 (s、1H)。
【０３３０】
実施例 27
1-({4-アミノ-5-[3,5-ジフルオロ-4-(ヒドロキシメチル)フェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}メチル)ピペリジン-3-オール
【化１２２】
0005955953.tif 000124
【０３３１】
THF (3.0 mL)中の中間体 50A (150 mg、0.30 mmol) の溶液に、THF中の0.60 mL (0.60 mmol)のフッ化テトラブチルアンモニウム (TBAF)の1 M 溶液を添加し、混合物を室温で1時間撹拌した。反応混合物を次いで濃縮し、残渣を分取 HPLC (方法 3) により精製し、65 mg (56％ of th.) の標題化合物を得た。
LC-MS (方法 7): Rt = 0.33 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 390.3 (100) [M+H]+。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.02 (br. m、1H)、1.40 (br. m、1H)、1.60 (br. m、1H)、1.77 (br. m、2H)、1.95 (br. m、1H)、2.73 (br. m、1H)、2.88 (br. m、1H)、3.43 (br. m、1H)、3.83 (br. m、2H)、4.54 (br. d、3H)、5.27 (t、1H)、6.74 (s、1H)、7.15 (m、2H)、7.95 (s、1H)。
【０３３２】
実施例 28
トランス-4-{4-アミノ-5-[3-エチル-5-フルオロ-4-(ヒドロキシメチル)フェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}シクロヘキサノール
【化１２３】
0005955953.tif 000125
【０３３３】
中間体 24A (120 mg、0.39 mmol)および中間体 58A (130 mg、0.46 mmol) をアセトニトリル (3.0 mL) にマイクロ波反応器バイアル中で溶解し、アルゴンでフラッシュした(flushed)。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0) (22 mg、0.02 mmol)および2.0 M aq. 炭酸ナトリウム溶液 (0.7 mL) を添加し、混合物を1時間単一モードマイクロ波装置中で150℃に加熱した。冷却後、混合物を濾過し、ろ液を蒸発させた。残渣を分取 HPLC (方法 2) により精製し、36 mg (23％ of th.) の標題化合物を得た。
LC-MS (方法 6): Rt = 0.82 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 385 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 383 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、DMSO-d6): δ (ppm) = 1.24 (t、3H)、1.28-1.38 (m、2H)、1.46-1.54 (m、2H)、1.94-1.97 (m、2H)、2.01-2.05 (m、2H)、2.82 (q、2H)、3.03 (m、1H)、3.47 (m、1H)、4.53 (m、2H)、4.61 (d、1H)、5.02 (t、1H)、6.58 (s、1H)、7.08 (d、1H)、7.15 (s、1H)、7.90 (s、1H)。
【０３３４】
実施例 29
トランス-4-{4-アミノ-5-[3-フルオロ-4-(ヒドロキシメチル)-5-メトキシフェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}シクロヘキサノール
【化１２４】
0005955953.tif 000126
【０３３５】
中間体 24A (120 mg、0.39 mmol)および中間体 59A (163 mg、80％ 純度、0.46 mmol) をアセトニトリル (2.0 mL) にマイクロ波反応器バイアル中で溶解し、アルゴンでフラッシュした(flushed)。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0) (45 mg、0.04 mmol)および2.0 M aq. 炭酸ナトリウム溶液 (0.5 mL) を添加し、混合物を1時間単一モードマイクロ波装置中で150℃に加熱した。冷却後、混合物を濾過し、ろ液を蒸発させた。残渣を分取 HPLC (方法 2) により精製し、6 mg (4％ of th.) の標題化合物を得た。
LC-MS (方法 5): Rt = 1.36 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 387 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 385 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、DMSO-d6): δ (ppm) = 1.24-1.33 (m、2H)、1.42-1.53 (m、2H)、1.90-1.93 (m、2H)、2.00-2.04 (m、2H)、3.04 (m、1H)、3.46 (m、1H)、3.82 (s、3H)、4.48 (m、2H)、4.60 (d、1H)、4.83 (t、1H)、6.60 (s、1H)、6.85 (d、1H)、6.90 (s、1H)、7.91 (s、1H)。
【０３３６】
実施例 30
{4-[4-アミノ-7-(ピペリジン-3-イル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル]-2-フルオロ-6-メトキシフェニル}メタノール
【化１２５】
0005955953.tif 000127
【０３３７】
中間体 63A (50 mg、0.11 mmol) をジクロロメタン(5.0 mL)中30％のトリフルオロ酢酸の溶液に0℃で溶解した。反応混合物をこの温度で30 分間撹拌し、次いで、すべての揮発性物質を減圧下での蒸留により除去した。残渣を分取 HPLC (方法 2) により精製した。こうして得られた生成物を酢酸エチルに溶解し、飽和水性炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を留去し 、30 mg (76％ of th.) の標題化合物を得た。
LC-MS (方法 6): Rt = 0.59 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 372 (10) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 370 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、DMSO-d6): δ (ppm) = 1.50-2.08 (m、4H)、2.94 (m、2H)、3.17-3.30 (m、3H)、3.85 (s、3H)、4.51 (m、2H)、4.82 (t、1H)、6.60 (s、1H)、6.84 (d、1H)、6.89 (s、1H)、7.90 (s、1H)。
【０３３８】
実施例 31
{4-[4-アミノ-7-(ピペリジン-3-イル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル]-2-フルオロ-6-メチルフェニル}メタノール
【化１２６】
0005955953.tif 000128
【０３３９】
中間体 64A (110 mg、0.21 mmol) をジクロロメタン(5.0 mL)中30％のトリフルオロ酢酸の溶液に0℃で溶解した。反応混合物をこの温度で30 分間撹拌し、次いで、すべての揮発性物質を減圧下での蒸留により除去した。残渣を分取 HPLC (方法 2) により精製した。こうして得られた生成物を酢酸エチルに溶解し、飽和水性炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を留去し、 59 mg (78％ of th.) の標題化合物を得た。
LC-MS (方法 4): Rt = 1.10 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 356 (40) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 354 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、DMSO-d6): δ (ppm) = 1.44-2.08 (m、4H)、2.42 (s、3H)、2.94 (m、2H)、3.17-3.27 (m、3H)、4.53 (m、2H)、4.98 (t、1H)、6.54 (s、1H)、7.06 (d、1H)、7.11 (s、1H)、7.90 (s、1H)。
【０３４０】
実施例 32
{4-[4-アミノ-7-(ピロリジン-3-イル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル]-2-フルオロ-6-メチルフェニル}メタノール
【化１２７】
0005955953.tif 000129
【０３４１】
中間体 65A (90 mg、0.17 mmol) をジクロロメタン(5.0 mL)中30％のトリフルオロ酢酸の溶液に0℃で溶解した。反応混合物をこの温度で30 分間撹拌し、次いで、すべての揮発性物質を減圧下での蒸留により除去した。残渣を分取 HPLC (方法 2) により精製した。こうして得られた生成物を酢酸エチルに溶解し、飽和水性炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を留去し、27 mg (47％ of th.) の標題化合物を得た。
LC-MS (方法 4): Rt = 1.03 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 342 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 340 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、DMSO-d6): δ (ppm) = 1.80-2.21 (m、2H)、2.43 (s、3H)、2.78-2.81 (m、1H)、2.85-3.02 (m、2H)、3.22-3.27 (m、1H)、3.63 (m、1H)、4.55 (br. s、2H)、4.98 (t、1H)、6.63 (s、1H)、7.06 (d、1H)、7.11 (s、1H)、7.90 (s、1H)。
【０３４２】
実施例 33
1-{4-アミノ-5-[3,5-ジフルオロ-4-(ヒドロキシメチル)フェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}-シクロヘキサノールトリフルオロアセテート
【化１２８】
0005955953.tif 000130
【０３４３】
中間体 61A (95 mg、0.31 mmol)および中間体 1A (87 mg、0.32 mmol) をDMF (2.0 mL) にマイクロ波反応容器中で溶解し、アルゴンでフラッシュした(flushed)。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0) (35 mg、0.03 mmol)および2.0 M aq. 炭酸ナトリウム溶液 (0.5 mL) を添加し、混合物を1時間単一モードマイクロ波装置中で150℃に加熱した。冷却後、混合物を濾過し、ろ液を直接的に分取 HPLC (方法 2) により精製し、6 mg (4％ of th.) の標題化合物を得た。
LC-MS (方法 6): Rt = 1.05 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 375 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 373 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、DMSO-d6): δ (ppm) = 1.20-1.33 (m、1H)、1.42-1.51 (m、2H)、1.60-1.82 (m、5H)、2.17-2.28 (m、2H)、4.51 (s、2H)、6.76 (s、1H)、7.17 (m、2H)、8.02 (s、1H)。
【０３４４】
実施例 34
(4-{4-アミノ-7-[2-(アミノメチル)-1,3-チアゾール-4-イル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル}-2,6-ジフルオロフェニル)メタノール
【化１２９】
0005955953.tif 000131
【０３４５】
中間体 62A (67 mg、0.16 mmol)、中間体 1A (51 mg、0.19 mmol)、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0) (18 mg、0.02 mmol)および2.0 M aq. 炭酸ナトリウム溶液 (0.94 mL) を1,4-ジオキサン (2.50 mL) にマイクロ波反応器バイアル中で溶解した。バイアルに圧着により蓋をし(crimp-capped)、混合物を140℃に3時間単一モードマイクロ波装置中で加熱した。次いで、反応混合物を濾過し、ろ液をアセトニトリルで希釈し、ジエチルエーテルで処理した。結果として得られた沈殿を収集し、分取 HPLC (方法 2) により精製した。こうして得られた生成物 (15 mg)を引き続きジクロロメタン(2 mL) 中20％ のトリフルオロ酢酸溶液で20 分間処理した。揮発性物質を蒸留により除去し、残渣を濃水性炭酸ナトリウム溶液で処理し、酢酸エチルで抽出した。有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を留去し、標題化合物 (10 mg、13％ of th.) を無色固体として得た。  
LC-MS (方法 4): Rt = 1.12 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 389 (25) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 387 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 4.24 (s、2H)、4.53 (m、2H)、5.30 (t、1H)、7.18-7.23 (m、3H)、8.11 (s、1H)、8.40 (s、1H)。
【０３４６】
実施例 35
ent-{4-[4-アミノ-7-(ピロリジン-3-イル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル]-2,6-ジフルオロフェニル}メタノール (エナンチオマー 1)
【化１３０】
0005955953.tif 000132
【０３４７】
標題化合物を、分取キラル HPLC [カラム: Daicel Chiralpak AD-H、250 mm x 20 mm; 溶離液: イソヘキサン/エタノール 35:65; 流速: 20 mL/分; UV 検出: 220 nm] を用いてラセミ体の実施例 8 (54 mg) の分離により得た。収率: 12.5 mg。
【０３４８】
分析キラル HPLC [カラム: Daicel Chiralpak AD-H、5 μm、250 mm x 4.6 mm; 溶離液: イソヘキサン/エタノール 50:50 + 0.2％ ジエチルアミン; 流速: 1.0 mL/分; 温度: 40℃; UV 検出: 220 nm]: Rt = 9.452 分、e.e. ＞99％。
HPLC (方法 9): Rt = 0.70 分;
LC-MS (方法 10): Rt = 0.42 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 346.1 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 344.0 (100) [M-H]-。
【０３４９】
実施例 36
ent-{4-[4-アミノ-7-(ピロリジン-3-イル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル]-2,6-ジフルオロフェニル}メタノール (エナンチオマー 2)
【化１３１】
0005955953.tif 000133
【０３５０】
標題化合物を、分取キラル HPLC [カラム: Daicel Chiralpak AD-H、250 mm x 20 mm; 溶離液: イソヘキサン/エタノール 35:65; 流速: 20 mL/分; UV 検出: 220 nm] を用いてラセミ体の実施例 8 (54 mg) の分離により得た。収率: 14 mg。
【０３５１】
分析キラル HPLC [カラム: Daicel Chiralpak AD-H、5 μm、250 mm x 4.6 mm; 溶離液: イソヘキサン/エタノール 50:50 + 0.2％ ジエチルアミン; 流速: 1.0 mL/分; 温度: 40℃; UV 検出: 220 nm]: Rt = 13.695 分、e.e. ＞99％。
HPLC (方法 9): Rt = 0.71 分;
LC-MS (方法 10): Rt = 0.42 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 346.1 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 344.0 (100) [M-H]-。
【０３５２】
実施例 37
rac-{4-[4-アミノ-7-(ピロリジン-3-イル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル]-2-エチル-6-フルオロフェニル}メタノール
【化１３２】
0005955953.tif 000134
【０３５３】
中間体 66A (72 mg、0.158 mmol) をジクロロメタン (3.8 mL) に0℃で溶解し、トリフルオロ酢酸 (1.0 mL) を添加した。反応混合物を0℃で40 分間撹拌し、次いで、すべての揮発性物質を減圧下で除去した。残渣を分取 HPLC (方法 6) により精製した。合わせた生成物を含有する画分を飽和水性炭酸ナトリウム溶液を用いて塩基性 pHに調整し、濃縮して乾燥させた。結果として得られた残渣を酢酸エチル (50 mL) に懸濁し、濾過した。有機層を塩水 (5 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を留去し、31 mg (56％ of th.) の標題化合物を得た。
HPLC (方法 9): Rt = 0.81 分;
LC-MS (方法 10): Rt = 0.55 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 356.3 (50) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 354.2 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.23 (t、3H)、1.84-2.24 (m、1H)、2.81 (q、2H)、2.80-2.99 (m、1H)、3.00-3.72 (m、1H)、4.56 (d、2H)、5.00 (t、1H)、6.68 (s、1H)、7.09 (d、1H)、7.14 (m、2H)、7.92 (s、1H)。
【０３５４】
実施例 38
rac-{4-[4-アミノ-7-(ピペリジン-3-イル)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル]-2-エチル-6-フルオロフェニル}メタノール
【化１３３】
0005955953.tif 000135
【０３５５】
中間体 67A (108 mg、0.230 mmol) をジクロロメタン (5.2 mL) に0℃で溶解し、トリフルオロ酢酸 (1.4 mL) を添加した。反応混合物を0℃で40 分間撹拌し、次いで、すべての揮発性物質を減圧下で除去した。残渣を分取 HPLC (方法 6) により精製した。合わせた生成物を含有する画分を飽和水性炭酸ナトリウム溶液を用いて塩基性 pHに調整し、濃縮して乾燥させた。結果として得られた残渣を酢酸エチル (50 mL) に懸濁し、 濾過した。有機層を塩水 (5 mL) で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を留去し、83 mg (85％ of th.) の標題化合物を得た。
HPLC (方法 9): Rt = 0.81 分;
LC-MS (方法 10): Rt = 0.58 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 370.3 (50) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 368.3 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.22 (t、3H)、1.51-1.72 (m、2H)、2.00-2.10 (m、1H)、2.51-2.65 (m、2H)、2.81 (q、2H)、2.95-3.03 (m、1H)、3.20-3.27 (m、1H)、4.56 (d、2H)、5.00 (t、1H)、6.60 (s、1H)、7.07 (d、1H)、7.14 (m、2H)、7.91 (s、1H)。
【０３５６】
実施例 39 
rac-{4-アミノ-5-[3-エチル-5-フルオロ-4-(ヒドロキシメチル)フェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}(シクロプロピル)メタノール
【化１３４】
0005955953.tif 000136
【０３５７】
中間体 17A (83 mg、0.29 mmol)、中間体 58A (98 mg、0.35 mmol)およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0) (17 mg、0.015 mmol) をアセトニトリル(2.3 mL) および2 M 水性炭酸ナトリウム溶液 (0.53 mL)の混合物にマイクロ波反応器バイアル中で溶解した。5 分間アルゴンを用いて脱気した後 、反応容器に圧着により蓋をし(crimp-capped)、混合物を1時間単一モードマイクロ波装置中で150℃に加熱した。室温まで冷却した後、飽和水性重炭酸ナトリウム溶液を添加し、混合物を酢酸エチルで3回抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣を分取 HPLC (方法 5) により精製し、標題化合物を得た。収率: 63 mg (61％ of th.)。
HPLC (方法 9): Rt = 1.13 分;
LC-MS (方法 10): Rt = 0.78 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 357.3 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 355.3 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 0.39 (m、3H)、0.48 (m、1H)、1.23 (t、3H)、1.35 (m、1H)、2.81 (q、2H)、4.56 (d、2H)、4.68 (m、1H)、5.01 (m、1H)、5.21 (m、1H)、6.76 (s、1H)、7.09 (d、1H)、7.14 (s、1H)、7.90 (s、1H)。
【０３５８】
実施例 40 
rac-{4-アミノ-5-[4-(ヒドロキシメチル)-3-メトキシフェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}(シクロプロピル)メタノール
【化１３５】
0005955953.tif 000137
【０３５９】
中間体 68A (130 mg、0.353 mmol) をテトラヒドロフラン (6.9 mL) に溶解し、0℃に冷却した。水素化アルミニウムリチウム溶液 (ジエチルエーテル中1M、0.78 mL) を滴下し、反応混合物を一晩室温まで昇温させた。反応混合物を次いで水でクエンチし、濾過した。ろ液を濃縮し、残渣を分取 HPLC (方法 8) により精製し、標題化合物を得た。収率: 63 mg (51％ of th.)。
LC-MS (方法 10): Rt = 0.62 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 341.2 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 339.1 (100) [M-H]-。
【０３６０】
実施例 41
ent-4-アミノ-5-[4-(ヒドロキシメチル)-3-メトキシフェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}-(シクロプロピル)メタノール (エナンチオマー 1)
【化１３６】
0005955953.tif 000138
【０３６１】
標題化合物を、分取キラル HPLC [カラム: Daicel Chiralpak IC、5 μm、250 mm x 20 mm; 溶離液: tert-ブチルメチルエーテル/メタノール 85:15; 流速: 15 mL/分; 温度: 40℃; UV 検出: 220 nm] を用いてラセミ体の実施例 40 (63 mg) の分離により得た。収率: 17 mg。
【０３６２】
分析キラル HPLC [カラム: Daicel Chiralpak IC、5 μm、250 mm x 4.6 mm; 溶離液: tert-ブチルメチルエーテル/メタノール 85:15; 流速: 1.0 mL/分; 温度: 40℃; UV 検出: 220 nm]: Rt = 4.76 分、e.e. ＞99％。
LC-MS (方法 10): Rt = 0.67 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 341.2 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 339.1 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 0.40 (m、3H)、0.48 (m、1H)、1.36 (m、1H)、3.83 (s、3H)、4.54 (d、2H)、4.68 (m、1H)、5.07 (t、1H)、5.25 (d、1H)、6.74 (s、1H)、7.00 (s、1H)、7.03 (d、1H)、7.47 (d、1H)、7.89 (s、1H)。
【０３６３】
実施例 42
ent-4-アミノ-5-[4-(ヒドロキシメチル)-3-メトキシフェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}-(シクロプロピル)メタノール (エナンチオマー 2)
【化１３７】
0005955953.tif 000139
【０３６４】
標題化合物を、分取キラル HPLC [カラム: Daicel Chiralpak IC、5 μm、250 mm x 20 mm; 溶離液: tert-ブチルメチルエーテル/メタノール 85:15; 流速: 15 mL/分; 温度: 40℃; UV 検出: 220 nm] を用いてラセミ体の実施例 40 (63 mg) の分離により得た。収率: 25 mg。
【０３６５】
分析キラル HPLC [カラム: Daicel Chiralpak IC、5 μm、250 mm x 4.6 mm; 溶離液: tert-ブチルメチルエーテル/メタノール 85:15; 流速: 1.0 mL/分; 温度: 40℃; UV 検出: 220 nm]: Rt = 6.37 分、e.e. ＞99％。
LC-MS (方法 10): Rt = 0.67 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 341.2 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 339.1 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 0.40 (m、3H)、0.48 (m、1H)、1.36 (m、1H)、3.83 (s、3H)、4.54 (d、2H)、4.68 (m、1H)、5.07 (t、1H)、5.25 (d、1H)、6.74 (s、1H)、7.00 (s、1H)、7.03 (d、1H)、7.47 (d、1H)、7.89 (s、1H)。
【０３６６】
実施例 43
[4-(4-アミノ-7-イソプロピルピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル)-2,6-ジフルオロフェニル]メタノール
【化１３８】
0005955953.tif 000140
【０３６７】
中間体 71A (181 mg、0.709 mmol)、中間体 1A (239 mg、0.887 mmol)およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0) (41 mg、0.035 mmol) をN,N-ジメチルホルムアミド (12.5 mL) および2 M 水性炭酸ナトリウム溶液 (1.42 mL) の混合物にマイクロ波反応器バイアル中で溶解した。反応容器に圧着により蓋をし(crimp-capped)、混合物を130℃に2時間単一モードマイクロ波装置中で加熱した。室温まで冷却した後、反応混合物をCeliteで濾過し、濃縮した。結果として得られた残渣を酢酸エチル (100 mL) に溶解し、水および塩水 (それぞれ10 mL)で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー (puriFlash、Interchim、シクロヘキサン/酢酸エチル 1:1から100％酢酸エチル グラジエント)、次いで、分取 HPLC (方法 6) により精製した。生成物を含有する画分を合わせ、飽和水性炭酸ナトリウム溶液を用いて塩基性 pHに調整した。アセトニトリル溶媒を除去し、沈殿した生成物を濾過により収集した。収率: 69 mg (31％ of th.)。
HPLC (方法 9): Rt = 1.35 分;
LC-MS (方法 10): Rt = 0.90 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 319.0 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 317.0 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.30 (d、6H)、3.42 (m、1H)、4.54 (s、2H)、5.26 (s、1H)、6.65 (s、1H)、7.14 (m、2H)、7.94 (s、1H)。
【０３６８】
実施例 44
rac-1-{4-アミノ-5-[3,5-ジフルオロ-4-(ヒドロキシメチル)フェニル]ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-7-イル}エタノール
【化１３９】
0005955953.tif 000141
【０３６９】
中間体 72A (230 mg、0.743 mmol)、中間体 2A (192 mg、0.89 mmol)およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0) (86 mg、0.074 mmol) を1,4-ジオキサン  (4.6 mL) および2 M 水性炭酸ナトリウム溶液 (1.16 mL)の混合物にマイクロ波反応器バイアル中で溶解した。反応容器に圧着により蓋をし(crimp-capped)、混合物を140℃に1時間単一モードマイクロ波装置中で加熱した。室温まで冷却した後、反応混合物を分取 HPLC (方法 8) により精製し、48 mgの物質を得、これをさらに分取 HPLC (方法 9) により精製した。収率: 11 mg (4.6％ of th.)。
LC-MS (方法 5): Rt = 0.89 分; MS  (ESIpos): m/z (％) = 321.3 (100) [M+H]+、MS (ESIneg): m/z (％) = 319.3 (100) [M-H]-。
1H NMR (400 MHz、d6-DMSO): δ (ppm) = 1.47 (d、3H)、4.54 (m、2H)、5.16-5.39 (m、2H)、6.74 (s、1H)、6.88 (m、1H)、7.14 (m、2H)、7.94 (s、1H)。
【０３７０】
B.：生物活性の評価
略語および頭字語:
ATCC：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
ATP：アデノシン三リン酸
Bq：ベクレル
BrdU：5-ブロモ-2-デオキシウリジン
BSA：ウシ血清アルブミン
CHO：チャイニーズハムスター卵巣
cpm：分あたりカウント
Ct：サイクル閾値
DMEM/F12：ダルベッコ変法イーグル培地 / ハムF12培地 (1:1)
DMSO：ジメチルスルホキシド
DNA：デオキシリボ核酸
DTT：ジチオスレイトール
EDTA：エチレンジアミン-テトラ酢酸
ENGS MV：微小血管内皮細胞培地
FAM：カルボキシフルオセインサクシニミジルエステル
FCS：ウシ胎仔血清
hBMP9：ヒト骨形態形成因子 9
HEPES：4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸
HMVEC：ヒト微小血管内皮細胞
HPMC：ヒドロキシプロピルメチルセルロース
HTRF：ホモジニアス時間分解蛍光
HUVEC：ヒト血管内皮細胞
[I]：阻害剤濃度
IC50： 50％ 阻害効果を示す濃度
LDH：乳酸デヒドロゲナーゼ
mRNA：メッセンジャーリボ核酸
NADH：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
Nonidet P40：4-エチルフェノキシ-ポリ(エチレングリコール)エーテル (n = 11)
PBS：リン酸緩衝食塩水
PE：ポリエチレン
PEG：ポリエチレングリコール
PK：ピルビン酸キナーゼ
p.o.：経口
qPCR：定量的ポリメラーゼ連鎖反応
RNA：リボ核酸
RTL バッファー：RNeasy 溶解バッファー
SEQ ID NO：配列番号
SFM：無血清培地
TAMRA：カルボキシテトラメチルローダミン
Tris：2-アミノ-2-ヒドロキシメチルプロパン-1,3-ジオール
Triton X-100：4-tert-オクチルフェノキシ-ポリ(エチレングリコール)エーテル (n = 10)
【０３７１】
本発明の化合物の活性の実証は、当該技術分野において周知の、インビトロ、エクスビボ、およびインビボアッセイにより達成され得る。例えば、本発明の化合物の活性を実証するために、以下のアッセイを用いることができる。
【０３７２】
B-1a.組み込まれた放射標識のシンチレーションを用いるインビトロ酵素阻害(フラッシュプレート(flashplate) アッセイ)
試験原理:
DMSOに希釈された被験化合物を、対応するアッセイバッファー中にて好適な基質/補助基質 (ここでは: ビオチン化 α-カゼインおよび33P-ATP)と混合する。目的の酵素 (ここでは: ALK1 キナーゼ) の添加により酵素反応を開始させる。放射標識の基質への酵素-触媒組み込みをシンチレーションにより測定する。組み込まれた放射標識を、ビオチン化基質のストレプトアビジン-被覆マイクロタイタープレート(フラッシュプレート(flashplate))への特異的結合および同時の洗浄工程により遊離放射標識から分離する。シンチレーションシグナル強度 (分あたりカウント、cpm) は酵素活性に比例する。酵素阻害の結果、シグナル強度が低下する。被験化合物のIC50 値を、cpm-対-[I]プロットにより決定する。
【０３７３】
反応バッファー:
反応バッファーは、50 mM Tris pH 8.0 (Sigma)、1 mM MnCl2 (Sigma)、0.01％ Nonidet P40 (Fluka)、0.5 x 完全(Complete) EDTA-非含有(free)プロテアーゼ阻害剤(Roche;セリンプロテアーゼおよびシステインプロテアーゼの阻害(ただし、メタロ-プロテアーゼは阻害しない)のためのいくつかのプロテアーゼ阻害剤の混合物を含有する; 1 錠は50 ml 細胞抽出物のために十分なプロテアーゼ阻害剤を含有する; このアッセイに用いられる濃度は100 ml中の1 錠に対応する)を含有する。
【０３７４】
その他のバッファー:
1.)ストップ溶液: ダルベッコ(Dulbecco's) PBS (PAA、Pasching、Austria)、25 mM EDTA (Sigma)、25μM ATP (Roche)、0.05％ Triton X-100 (Sigma);
2.)飽和バッファー: ダルベッコ(Dulbecco's) PBS (PAA、Pasching、Austria)、100 μM ATP (Roche)、0.2％ Triton X-100 (Sigma);
3.)洗浄バッファー: ダルベッコ(Dulbecco's) PBS (PAA、Pasching、Austria)。
【０３７５】
酵素溶液:
ALK1 (Invitrogen、Paisley、United Kingdom) ストック溶液 (35.7 ng/μl) が4 ng/μlに希釈される; 反応における終濃度は1 ng/μlである。
【０３７６】
基質溶液:
脱リン酸化 α-カゼイン (Sigma)を製造業者のプロトコール (Pierce、Bonn、Germany)にしたがってビオチン化する結果、61.6 μMのストック溶液が得られる。簡単に説明すると、EZ-Link（登録商標）Sulfo-NHS-Biotin 試薬 (スルホサクシニミジル-6-(ビオチンアミド)ヘキサノエート(hexanoate); Pierce、Bonn、Germany)を等モル濃度にてα-カゼインに添加し、氷上で2時間インキュベートする。その後、ビオチン試薬を透析 (2 x 2 時間および一晩)により除去する。
【０３７７】
非放射性(cold) (非標識化) ATP (Roche)の100 mM 溶液を各試験の前に1:100に希釈する。基質混合(mix)のために、α-カゼインを2.22 μMに希釈すると、反応中、1 μM α-カゼインの終濃度となる。さらに、非放射性 ATP を添加すると、1.11 μM 溶液が得られ、その結果、反応中、500 nMの終濃度となる。
【０３７８】
放射性 ATP 溶液:
ストック溶液 (9.25 MBq/25 μlの 33P-ATP; Perkin Elmer、Rodgau、Germany) を希釈して651.2 Bq/μlとする。これは162.8 Bq/μlの終濃度に対応する。
【０３７９】
化合物溶液:
化合物を100％ DMSO (10 mM ストック溶液)に溶解し、希釈して 2 mMとする。さらなる希釈を段階的に行って、DMSO中 1:3.16とする。
【０３８０】
段階的(step-by-step)プロトコール:
9 μlの体積の基質溶液を、384 ウェルマイクロタイタープレート (Greiner Bio-One、Solingen、Germany)の各ウェルに提供する。1 μlの化合物溶液および5 μlの放射性 ATP 溶液を添加する。酵素反応を、5 μlの酵素溶液の添加により開始させる。混合物を60 分間室温でインキュベートし、次いで10 μlのストップ溶液の添加により停止させる。384 ウェルマイクロタイターフラッシュプレート(flashplate) (Perkin Elmer、Rodgau、Germany)をウェル当たり50 μlの飽和バッファーで少なくとも 60 分間飽和させる。引き続き、20 μlの体積を捨て、20 μlの停止させたALK1 反応混合物により置換する。ビオチン化基質のフラッシュプレート(flashplate)への結合を室温で一晩インキュベーションして行う。結合した基質を非結合成分から洗浄工程の繰り返し (ウェル当たり3 x 50 μl 洗浄バッファー)により分離する。最終的に、50 μlの洗浄バッファーを添加し、シンチレーションシグナル (cpm)を好適なカウンター (Perkin Elmer、Rodgau、Germany)において測定する。
【０３８１】
本発明の個々の化合物についてのIC50 値を以下の表 1に列挙する:
【０３８２】
表 1
【表１】
0005955953.tif 000142
【表２】
0005955953.tif 000143
【０３８３】
B-1b. ALK1 キナーゼアッセイ (ProQinase プロトコール)
ALK1 (Invitrogen、Carlsbad、CA、USA) キナーゼ活性を、96-ウェル PerkinElmer FlashPlates（商標） (Boston、MA、USA)中でγ-33P-ATP およびカゼイン (Sigma、St. Louis、MO、USA)を基質として用いて放射測定アッセイにてProQinase GmbH (Freiburg、Germany)で測定した。化合物を1 x 10-4 M から3 x 10-9 Mの範囲の10の濃度にて全体積50 μlで終DMSO 濃度各1％にて試験した。アッセイ成分を以下の順に混合した:
-20 μl アッセイバッファー (70 mM HEPES-NaOH、pH 7.5、3 mM MgCl2、3 mM MnCl2、2 μM オルトバナジウム酸ナトリウム、1.2 mM DTT);
-5 μl γ-33P-ATP (水中1.0 μM、ウェル当たりおよそ6 x 105 cpm);
-5 μl 被験化合物溶液 (10％ DMSO中);
-10 μl 基質 (200 μg/ml、1.0 μg/50 μl 終濃度) / 酵素 (4 μg/ml、20 ng/50 μl ＝ 5.5 nM 終濃度) 溶液 (1:1 混合物)。
【０３８４】
反応混合物を30℃で60 分間インキュベートし、50 μlの2％ (v/v) リン酸を添加することにより停止させた。プレートを吸引し、200 μl 0.9％ (w/v) 塩化ナトリウムで2回洗浄した。33Pi の取り込みをマイクロプレートシンチレーションカウンター (Microbeta、Wallac)にて決定した。すべてのアッセイはBeckmanCoulter/SAGIAN（商標） Core Systemを用いて行った。
【０３８５】
標識化 ATPの非特異的基質結合から得られる中央値をバックグラウンドレベルとして設定し、阻害剤の非存在下で測定した中央値をALK1 キナーゼの完全活性を反映するものとしてみなした。バックグラウンド活性 (ba)を完全活性 (fa) 値ならびに被験化合物を含有するサンプルから得られる値(被験化合物活性、tca)から差し引いた。後者における残余(residual)活性を以下のようにして計算した:
残余活性 (％) ＝100 x [(tca-ba)/(fa-ba)]
【０３８６】
各濃度についての残余活性および化合物のIC50 値をQuattro Workflow V3.1.0 (Quattro Research GmbH、Munich、Germany) を用いて計算した。IC50 決定のための適合(fitting)モデルは「S字形応答 (勾配変化のある法面(variable slope))」であり、パラメーターである「トップ(top)」を100％ に固定し、「ボトム(bottom)」を0％とした。用いた適合(fitting)方法は最小二乗適合(fit)であった。
【０３８７】
このアッセイからの代表的な IC50 値を以下の表 2に列挙する:
表 2
【表３】
0005955953.tif 000144
【０３８８】
B-2a. Smad7 標的遺伝子誘導: HMVEC 細胞アッセイおよび TaqMan 発現分析
ALK1 受容体の BMP9による活性化は、Smad1/5 シグナル伝達経路を誘導し、標的遺伝子である Smad6、Smad7 およびId-1の発現を増強する。Smad7-mRNAのBMP9-刺激内皮細胞における誘導を、ALK1 キナーゼ 阻害剤の細胞有効性をモニターするために決定した。
【０３８９】
ヒト微小血管内皮細胞(HMVECadult、Cell Systems、St. Katharinen) をすべての補充物(supplement)を有する完全ENGS MV培地(LifeLine Cell Technology)に96 ウェルプレートにてウェル当たり10 000 細胞で播種した。4時間の37℃で加湿インキュベーター中7.5％ CO2でのインキュベーションの後、培地を最少培地 (補充物(supplement)を有さず、 0.02％ FCSを含有するENGS MV) に交換した。16時間後、被験化合物または培地 (対照) を培養物に添加し、次いで30 分後hBMP9 (R＆D Systems) の添加を行った。1から4時間後培地を除去し、プレートを穏やかにリン酸緩衝食塩水で洗浄し、細胞をウェル当たり150 μl の氷冷 RLT バッファー (Qiagen)で溶解した。
【０３９０】
全細胞 RNAを製造業者(Invitrogen、USA)の指示にしたがって、Trizol（登録商標） 試薬プロトコールで単離し、DNAseIで処理して、ゲノムDNAコンタミネーションを除去した。
【０３９１】
hSmad7のmRNA 分布の相対的定量のために、各サンプルからの全RNAをまず製造業者のプロトコールにしたがってImProm-II Reverse Transcription System (Promega、USA) を用いて逆転写した。最終体積を水で200 μlに調整した。
【０３９２】
選択した mRNAの相対的定量のために、Applied Bioscience ABI 7900HT Sequence Detection System を製造業者の指示およびプロトコールにしたがって用いた。PCR 反応を、 hSmad7- およびハウスキーピング遺伝子 L32-mRNAを定量するために設定した。hSmad7およびL32についてのフォワードおよびリバースプライマーおよびプローブをApplied Bioscience ABI Primer Express（商標） ソフトウェアを用いて設計し、Eurogentec (Belgium)により合成した。hSmad7 フォワードプライマー配列は: プライマー 1 (配列番号 1) であった。 hSmad7 リバースプライマー配列は: プライマー 2 (配列番号 2)であった。レポーター色素としてFAMで、クエンチャーとしてTAMRAで標識化したプローブ 1 (配列番号 3)をhSmad7のためのプローブとして用いた。L32 フォワードプライマー配列は: プライマー 3 (配列番号 4)であった。L32 リバースプライマー配列は: プライマー 4 (配列番号 5)であった。レポーター色素としてFAMで、クエンチャーとしてTAMRAで標識化した、プローブ 2 (配列番号 6)をL32のためのプローブとして用いた。
【０３９３】
配列番号表:
【表４】
0005955953.tif 000145
【０３９４】
以下の試薬をウェル当たり全部で 20 μl添加して調製した: 1 x qPCR-MasterMix (Eurogentec、Belgium) および hSmad7 フォワードおよびリバースプライマー、各 200 nM、200 nM hSmad7 FAM/TAMRA-標識化プローブ 1 (配列番号 3)、および5 μlのテンプレート cDNA。同様に、ウェル当たり全部で 20 μlの第二ミックス(second mix)を、並行するサンプルにてL32 FAM/TAMRA-標識化プローブ 2 (配列番号 6)およびL32 フォワードおよびリバースプライマーを添加して用いて調製した。 
【０３９５】
サーマルサイクリングパラメーターは、50℃で2 分間、次いで95℃で10 分間、次いで、40 サイクルの、95℃で15 秒間の融解および60℃で1 分間のアニーリング/伸長であった。
【０３９６】
相対的発現の計算:
Ct (サイクル閾値) 値をΔΔCt 方法 (デルタ-デルタ Ct)によりPCR 産物量曲線のターニング・ポイントから計算した:
ΔCt = CthSmad7  CtL32; 相対的発現 = 2(15-ΔCt)。
【０３９７】
被験化合物のIC50 値は異なる化合物濃度での相対的 Smad7 発現に基づいて計算した。代表的な値を以下の表 3に列挙する :
【０３９８】
表 3
【表５】
0005955953.tif 000146
【０３９９】
B-2b. Smad7 標的遺伝子誘導: HUVEC 細胞アッセイおよび TaqMan 発現分析
ALK1 阻害剤のインビトロ効力を細胞に基づくアッセイにて試験した。骨形成タンパク質 9 (BMP9)はヒト血管内皮細胞(HUVEC) におけるSmad7 mRNA 発現をALK1の活性化を介して誘導する。
【０４００】
ウェル当たり1.5 x 104 の継代 2のHUVEC (Lonza、Basel、Switzerland) を、96-ウェルプレート中のEGM-2 添加物および増殖因子(Lonza、CC-3156 およびCC-4176)を含有するEBM-2 培地に播種した。4時間後、培地を0.2％ ウシ胎仔血清 (FCS)を有するEBM-2に変え、細胞を20時間加湿インキュベーターにて37℃、5％ CO2で飢餓させた。 被験化合物を0 から 10 000 nMの異なる11の濃度で、1 ng/mlの組換えヒト BMP9 タンパク質(4 mM 塩酸、0.1％ BSAに10 μg/mlにて溶解; R＆D Systems、Minneapolis、MN、USA、3209BP)による細胞の3時間の刺激の1時間前に添加した。培地を除去し、細胞を100 μlのRLT バッファー (Qiagen、Hilden、Germany) 中で溶解した。RNA をQiagen RNeasy 96 Kit (注文番号74182)を用いて製造業者の指示にしたがって単離し、65 μlのRNAse-非含有水を用いてカラムから溶出した。定量的 RT-PCRのための逆転写をRNAse-非含有 96-ウェル丸底プレート中でOmniscript Kit (Qiagen、205113) を用いて行った。ウェル当たり、6.8 μl の、2 μl 10x RT-バッファー、2 μl dNTPs (各5 mM)、1.6 μl ランダムプライマー N6 (125 μM)、0.25 μl Rnase Out (40 U/μl) および 1 μl Omniscript Reverse Transcriptaseを含有する反応マスターミックス(master mix) を添加した。13.2 μlの RNA/水混合物の添加後、プレート内容物を混合し、1時間37℃でインキュベートし、全体積を80 μl のRNAse-非含有水の添加により各ウェル中100 μlに調整した。
【０４０１】
ヒト Smad7 mRNAの定量を、Eurogentec qPCR Mastermix Plus (RT-QP2X-03-075+; Cologne、Germany) を用い、ヒト L32をハウスキーピング参照 mRNAとして用いてTaqManにて行った。qPCR 反応あたり、2.8 μlのプライマーミックス、10 μlのマスターミックス、2.2 μlの水および 5 μlのcDNA を添加した。サーマルサイクリングパラメーターは、50℃で2 分間、次いで95℃で10 分間、次いで、40 サイクルの、95℃で15秒間の融解および60℃で1 分間のアニーリング/伸長であった。
【０４０２】
阻害剤を添加せずに1 ng/ml BMP9によって誘導されたSmad7 mRNA レベルを100％ 誘導と設定し、％ 阻害をこの値を用いて各被験化合物について計算した。各被験化合物について、それぞれの値を四連で決定した。IC50 値をMicrosoft Excelを用いて決定した。用いた適合方法は、重み付き、制約無し ML-適合(fit)であった。
【０４０３】
このアッセイからの代表的な IC50 値を以下の表 4に列挙する:
表 4
【表６】
0005955953.tif 000147
【０４０４】
B-3.レーザー-誘導性脈絡叢新血管形成 (CNV) モデルにおける全身的有効性
この研究の目的は、一日一回の被験化合物の全身投与 (i.p.)の結果、レーザー-誘導性脈絡膜血管新生のラットモデルにおいて血管漏出および/または脈絡叢新血管形成の低下がもたらされるか否かを決定することであった。
【０４０５】
この目的のために、眼の異常の目に見える兆候がない16匹の有色(pigmented) 褐色-ドブネズミ(Norway rat)を選択し、無作為に各8匹の動物の2群に分けた。0日目に、動物を腹腔内注射 (15 mg/kg キシラジンおよび80 mg/kg ケタミン)により麻酔した。瞳孔を散大させるための1滴の 0.5％ トロピカミドの点眼の後、脈絡膜血管新生を、150 mW での100 msの 532 nm アルゴンレーザー光凝固を用いて右眼の視神経乳頭の周りに6つの75 μmの大きさの脈絡叢熱傷を作ることによって誘導した。被験化合物および媒体対照 (10％ エタノール、90％ PEG 400)を一日一回腹腔内 (i.p.) 注射により投与し、0および1日目に50 mg/kgの被験化合物を投薬し、次いで20 mg/kgの投薬を2日目から23日目まで継続した。すべての動物の体重を開始の前および研究の間一日一回記録した。
【０４０６】
血管造影を21日目にハイデルベルク(Heidelberg's) 網膜血管造影写真 (HRA) を用いて行った。麻酔および瞳孔散大の後、10％ フルオレセインナトリウム色素を皮下に注入し、画像を色素注射の10 分後に記録した。血管造影図上のフルオレセインの血管漏出をマスクをした様式で2名の審査者が評価し、0 (漏出無し) から 3 (強度に染色)までにスコア付けした。
【０４０７】
23日目の安楽死の後、眼を収集し、4％ パラホルムアルデヒド溶液中で1 時間室温で固定した。洗浄後、網膜を注意深く剥ぎ、強膜-脈絡膜を平坦に乗せ(flat-mounted)、FITC-イソレクチン B4 抗体によるブロッキングの後、インキュベートした。平坦に乗せた(flat-mounted) プレパラートを 488 nm 励起波長にて蛍光顕微鏡 (Apotom)下で調べた。脈絡膜血管新生の体積を、Axiovision 4.6 ソフトウェアを用いた画像の形態計測分析によりスコア付けした。
【０４０８】
本発明の化合物の代表として実施例11について、以下の結果がこのモデルにおいて得られた:
【表７】
0005955953.tif 000148
【０４０９】
B-4.レーザー-誘導性脈絡叢新血管形成 (CNV) モデルにおける局所的有効性
この研究の目的は、1日2回の被験化合物の局所的投与 (点眼薬)の結果、レーザー-誘導性脈絡膜血管新生のラットモデルにおいて血管漏出および/または脈絡叢新血管形成の低下がもたらされるか否かを決定することであった。
【０４１０】
この目的のために、眼の異常の目に見える兆候のない65匹の有色(pigmented) 褐色-ドブネズミを選択し、無作為に6種類の群に割り当てた (n-数については、下記表を参照)。0日目に、動物を腹腔内注射 (15 mg/kg キシラジンおよび80 mg/kg ケタミン)により麻酔した。瞳孔を散大させるための1滴の 0.5％ トロピカミドの点眼の後、脈絡膜血管新生を、532 nm アルゴンレーザー (損傷サイズ: 50 μm; レーザー強度: 150 mW; 刺激持続時間: 100 ms) を用いて動物あたり1つの眼の網膜に6つの穴を焦がすことにより(ブルッフ膜の破壊) 誘導した。被験化合物および媒体対照を1日2回それぞれの点眼薬を損傷した眼に滴下することにより局所的に投与した。被験化合物を以下の通り投与した: 20 mg/mlのそれぞれの被験化合物を100％ 流動パラフィンまたは水性媒体 (水中、HPMC 15 cP 3.5％、ポリソルベート 80 0.5％、NaCl 0.9％)に懸濁して含有する10 μlの点眼薬製剤を損傷した眼に1日2回10から14 時間の間隔で完全な観察期間である23日間適用した。対照動物にはそれぞれの媒体 (100％ 流動パラフィンまたは水性媒体)を局所的に1日2回与えた。すべての動物の体重を、開始の前および研究の間一日一回記録した。
【０４１１】
血管造影を21日目に蛍光眼底カメラ (Kowe) を用いて行った。ここで、麻酔および瞳孔散大の後に、10％ フルオレセインナトリウム色素を皮下に注入し、画像を色素の注射の2 および10 分後に記録した。血管造影図上でのフルオレセインの血管漏出を3人の群の割り付け (被験化合物対媒体)を知らせられていない異なる審査者が評価し、0 (漏出無し) から3 (強度に染色)までスコア付けした。
【０４１２】
23日目に、動物を屠殺し、眼を収集し、4％ パラホルムアルデヒド溶液中で1 時間室温で固定した。洗浄の後、網膜を注意深く剥ぎ、洗浄し、ブロッキングし、FITC-イソレクチン B4 抗体で染色することにより脈管構造を可視化した。次いで、強膜-脈絡膜を平坦に乗せ(flat-mounted) 、蛍光顕微鏡 (Keyence Biozero) 下で488 nm 励起波長にて調べた。脈絡叢新血管形成の面積 (μm2)をImageTool ソフトウェアを用いて測定した。
【０４１３】
本発明の代表的化合物として、実施例 7 および11について、このモデルにおいて以下の結果が得られた:
【表８】
0005955953.tif 000149
【０４１４】
本発明を特定の態様に言及して開示してきたが、本発明のその他の態様および改変は本発明の真の精神と枠を逸脱することなく当業者によって設計可能であることが明白である。請求項はすべてのかかる態様および等価な改変を含むよう構築されていると意図される。
【０４１５】
C.医薬組成物に関連する実施例
本発明による医薬組成物は以下のように例証することができる:
【０４１６】
無菌静脈内(i.v.) 溶液:
本発明の所望の化合物の5 mg/mL 溶液を、無菌の、注射用水を用いて作ることができ、pH を必要であれば調整する。溶液を 1−2 mg/mLに無菌 5％ ブドウ糖(dextrose)により投与のために希釈し、静脈内(i.v.)注入として約 60 分間かけて投与する。
【０４１７】
静脈内(i.v.) 投与のための凍結乾燥粉末:
無菌調製物を、以下を用いて調製することができる： (i) 凍結乾燥粉末としての100-1000 mgの本発明の所望の化合物、(ii) 32-327 mg/mLのクエン酸ナトリウム、および(iii) 300-3000 mg デキストラン 40。製剤を、無菌の、注射用生理食塩水または5％ ブドウ糖(dextrose) で10 から 20 mg/mLの濃度に再構成し、これをさらに生理食塩水または5％ ブドウ糖(dextrose) で0.2 から 0.4 mg/mLに希釈し、静脈内(i.v.) ボーラスとして、または15-60 分間かけて静脈内(i.v.)注入により投与する。
【０４１８】
筋肉内懸濁液:
以下の溶液または懸濁液を筋肉内注射のために調製することができる:
50 mg/mLの、所望の本発明の水-不溶性化合物; 5 mg/mL カルボキシメチルセルロースナトリウム; 4 mg/mL Tween 80; 9 mg/mL 塩化ナトリウム; 9 mg/mL ベンジルアルコール。
【０４１９】
ハードシェル(Hard shell) カプセル:
多数の単位カプセルを、標準的2ピース硬ゼラチンカプセルに各100 mgの所望の本発明の粉末状化合物、150 mgのラクトース、50 mgのセルロースおよび 6 mgのステアリン酸マグネシウムを充填することにより調製する。
【０４２０】
軟ゼラチンカプセル:
本発明の所望の化合物の、食用油(digestible oil)、例えば、ダイズ油、綿実油またはオリーブ油中の混合物を、容積型ポンプにより溶融ゼラチンに注入して100 mgの有効成分を含有する軟ゼラチンカプセルを形成させることによって調製する。カプセルを洗浄し、乾燥させる。所望の本発明の化合物を、ポリエチレングリコール、グリセリンおよびソルビトールの混合物に溶解して、水-混和性 医薬ミックス(medicine mix)を調製することができる。
【０４２１】
錠剤:
多数の錠剤を、用量単位が、100 mgの 所望の本発明の化合物、0.2 mgのコロイド状二酸化ケイ素、5 mgのステアリン酸マグネシウム、275 mgの結晶セルロース(microcrystalline cellulose)、11 mgのでんぷん、および 98.8 mgのラクトースとなるように常套の手順により調製する。適当な水性および非-水性コーティングを適用して、おいしさを増し、上品さ(elegance)および安定性を改善し、あるいは吸収を遅延させてもよい。
【０４２２】
眼への局所適用のための溶液または懸濁液(点眼薬):
無菌製剤を100 mgの本発明の所望の化合物を凍結乾燥粉末として5 mL の無菌生理食塩水中に再構成して調製することができる。保存料として、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、硝酸フェニル水銀などを約 0.001重量％ から1重量％の範囲にて用いてもよい。
【配列表】
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