(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３において記載される配列を有する成熟第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドにおけるアミノ酸置換Ｒ３３８Ｅ／Ｔ３４３Ｒおよびアミノ酸置換Ｒ３１８Ｙ、または未修飾ＦＩＸポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む修飾ＦＩＸポリペプチドであって、
対応するアミノ酸残基は、配列番号３のポリペプチドとの未修飾ＦＩＸポリペプチドのアライメントによって同定され、
未修飾ＦＩＸポリペプチドは、配列番号２、３、２０および３２５のいずれかにおいて記載されるアミノ酸の配列からなり、
修飾ＦＩＸポリペプチドは、配列番号２、３、２０および３２５のいずれかにおいて記載されるアミノ酸残基の配列からなるポリペプチドにおいてまたは血液凝固活性を有するその断片において最大４個のさらなるアミノ酸修飾を含み、ただし、修飾ＦＩＸポリペプチドは修飾Ｆ３４２Ｉ／Ｔ３４３Ｒ／Ｙ３４５Ｔを含有しない、
修飾ＦＩＸポリペプチドは、活性化されると、凝血促進活性の増加を示す、
修飾ＦＩＸポリペプチド。
【請求項２】
さらなるアミノ酸修飾が、グリコシル化部位を導入する、請求項１に記載の修飾ＦＩＸポリペプチド。
【請求項３】
Ｅ４１０での、または未修飾ＦＩＸポリペプチドにおけるアミノ酸残基Ｅ４１０に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換をさらに含み、該置換はＮまたはＳである、請求項１に記載の修飾ＦＩＸポリペプチド。
【請求項４】
４１０に対応する位置でのアミノ酸置換がＮである、請求項３に記載の修飾ＦＩＸポリペプチド。
【請求項５】
配列番号３において記載される配列を有する成熟ＦＩＸポリペプチドの残基４０３での、または未修飾ＦＩＸポリペプチドにおける残基４０３に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、請求項１、３および４のいずれかに記載の修飾ＦＩＸポリペプチド。
【請求項６】
４０３に対応する位置でのアミノ酸置換がＥである、請求項５に記載の修飾ＦＩＸポリペプチド。
【請求項７】
配列番号３において記載される配列を有する成熟ＦＩＸポリペプチドにおけるアミノ酸置換Ｒ３１８Ｙ、Ｒ３３８Ｅ、Ｔ３４３Ｒ、Ｒ４０３ＥおよびＥ４１０Ｎ、または未修飾ＦＩＸポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む、請求項１または５に記載の修飾ＦＩＸポリペプチド。
【請求項８】
置換R318Y/R338E/T343R/R403E/E410N、R318Y/R338E/T343R/E410N、Y155F/R318Y/R338E/T343R/R403E、Y155F/K228N/K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/R403E/E410N、Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/R403E、K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/R403E、R318Y/R338E/T343R、Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R、K228N/R318Y/R338E/T343R/R403E/E410N、K228N/K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/R403E、R318Y/R338E/T343R/R403E/E410S、K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R、K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/E410N、Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/E410N、Y155F/R318Y/R338E/T343RおよびK228N/K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/E410Nの中から選択されるアミノ酸置換、または未修飾ＦＩＸポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む、請求項１−７のいずれかに記載の修飾ＦＩＸポリペプチド。
【請求項９】
置換R318Y/R338E/T343R/R403E/E410N、R318Y/R338E/T343R/E410N、Y155F/R318Y/R338E/T343R/R403E、Y155F/K228N/K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/R403E/E410N、Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/R403E、K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/R403E、R318Y/R338E/T343R、Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R、K228N/R318Y/R338E/T343R/R403E/E410N、K228N/K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/R403E、R318Y/R338E/T343R/R403E/E410SまたはK247N/N249S/R318Y/R338E/T343Rの中から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の修飾ＦＩＸポリペプチド。
【請求項１０】
アミノ酸置換R318Y/R338E/T343R、R318Y/R338E/T343R/R403E/E410NまたはR318Y/R338E/T343R/E410Nを含む、請求項１に記載の修飾ＦＩＸポリペプチド。
【請求項１１】
アミノ酸置換R318Y/R338E/T343R、R318Y/R338E/T343R/R403E/E410N、R318Y/R338E/T343R/R403EまたはR318Y/R338E/T343R/E410Nを含む、請求項１に記載の修飾ＦＩＸポリペプチド。
【請求項１２】
未修飾ＦＩＸポリペプチドが、配列番号２、３、２０または３２５において記載されるアミノ酸の配列からなる、請求項１−１１のいずれかに記載の修飾ＦＩＸポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号２６７、３３０、３３１、３３４、３３６、３４５−３４８、３５３、３５４、３５７−３６０、３６６、３６８、３６９、３７８、３７９、３９３、３９４、３９７、３９８および４０５−４０７のいずれかにおいて記載されるアミノ酸の配列を含む、修飾ＦＩＸポリペプチド。
【請求項１４】
アミノ酸残基の配列が、配列番号２６７、３３０、３３１、３３４、３３６、３４５−３４８、３５３、３５４、３５７−３６０、３６６、３６８、３６９、３７８、３７９、３９３、３９４、３９７、３９８および４０５−４０７のいずれかにおいて記載される配列からなる、請求項１３に記載の修飾ＦＩＸポリペプチド。
【請求項１５】
修飾ＦＩＸポリペプチドのアミノ酸残基の配列が配列番号３９４のアミノ酸残基の配列からなる、修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチド。
【請求項１６】
グリコシル化されている、請求項１５に記載の修飾ＦＩＸポリペプチド。
【請求項１７】
高グリコシル化されている、請求項１５に記載の修飾ＦＩＸポリペプチド。
【請求項１８】
成熟ポリペプチドである、請求項１−１７のいずれかに記載の修飾ＦＩＸポリペプチド。
【請求項１９】
二重鎖ポリペプチドである、請求項１−１８のいずれかに記載の修飾ＦＩＸポリペプチド。
【請求項２０】
単鎖ポリペプチドである、請求項１−１８のいずれかに記載の修飾ＦＩＸポリペプチド。
【請求項２１】
活性化されている、請求項１−１９のいずれかに記載の修飾ＦＩＸポリペプチド。
【請求項２２】
化学修飾および／または翻訳後修飾を含む修飾ＦＩＸポリペプチドであって、修飾はグリコシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、硫酸化、リン酸化、アルブミン化およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分へのコンジュゲートの１つまたは複数を含む、請求項１−２１のいずれかに記載の修飾ＦＩＸポリペプチド。
【請求項２３】
高グリコシル化されている、請求項１−１６および１８−２２のいずれかに記載の修飾ＦＩＸポリペプチド。
【請求項２４】
未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して１つまたは複数のグリコシル化部位を導入および／または排除する、１つまたは複数の修飾を含む、請求項１−１２、１５および１８−２１のいずれかに記載の修飾ＦＩＸポリペプチド。
【請求項２５】
請求項１−２４のいずれかに記載の修飾ＦＩＸポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含む核酸分子。
【請求項２６】
請求項２５に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２７】
ベクターが原核生物ベクターまたは真核生物ベクターである、請求項２６に記載のベクター。
【請求項２８】
ウイルスベクターである、請求項２６に記載のベクター。
【請求項２９】
ベクターが哺乳動物ベクターである、請求項２６−２８のいずれかに記載のベクター。
【請求項３０】
アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、およびサイトメガロウイルス中から選択される、請求項２８に記載のベクター。
【請求項３１】
請求項２６−３０のいずれかに記載のベクターを含む細胞。
【請求項３２】
真核細胞である、請求項３１に記載の細胞。
【請求項３３】
真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３４】
哺乳動物細胞が、ベビーハムスター腎臓細胞または２９３細胞またはＣＨＯ細胞の中から選択される、請求項３３に記載の細胞。
【請求項３５】
薬学的に許容される媒体中に請求項１−２４のいずれかに記載の修飾ＦＩＸポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項３６】
薬学的に許容される媒体中に請求項２５に記載の核酸分子または請求項２６−３０のいずれかに記載のベクターを含む医薬組成物。
【請求項３７】
局所的投与、全身投与、または局所投与用に製剤されている、請求項３５または３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
経口投与、経鼻投与、経肺投与、頬側投与、経皮投与、皮下投与、十二指腸内投与、経腸投与、非経口投与、静脈内投与、または筋肉内投与用に製剤されている、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
徐放性用に製剤されている、請求項３５−３８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項４０】
単一投薬量投与用に製剤されている、請求項３５−３８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項４１】
ＦＩＸの投与によって処置される疾患または状態の処置における使用のための修飾ＦＩＸポリペプチドであって、処置される疾患または状態は血液凝固障害、出血性障害、血友病および出血障害の中から選択される、請求項１−２４のいずれかに記載の修飾ＦＩＸポリペプチド。
【請求項４２】
ＦＩＸの投与によって処置される疾患または状態の処置のための薬剤の調製における使用のための修飾ＦＩＸポリペプチドであって、処置される疾患または状態は血液凝固障害、出血性障害、血友病および出血障害の中から選択される、請求項１−２４のいずれかに記載の修飾ＦＩＸポリペプチド。
【請求項４３】
血友病が、血友病Ｂである、請求項４１または請求項４２に記載の修飾ＦＩＸポリペプチド。
【請求項４４】
ＦＩＸの投与によって処置される疾患または状態の処置における使用のための医薬組成物であって、処置される疾患または状態は血液凝固障害、出血性障害、血友病および出血障害の中から選択される、請求項３５−４０のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項４５】
疾患が血友病である、請求項４４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
優先権の利益は、Ｅｄｗｉｎ  Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｔｈａｎｏｓ、およびＧｒａｎｔ  Ｅｌｌｓｗｏｒｔｈ  Ｂｌｏｕｓｅの、２０１０年１１月３日に提出された「ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＦＡＣＴＯＲ  ＩＸ  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ」と題する米国仮特許出願第６１／４５６，２９８号に対して主張される。
【０００２】
本出願はまた、「ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＦＡＣＴＯＲ  ＩＸ  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ」と題する、本明細書と共に同日に提出された、対応する米国特許出願第［代理人整理番号３３３２８．０４９１８．ＵＳ０１／４９１８］号にも関し、これもまた、米国仮特許出願第６１／４５６，２９８号に対する優先権を主張する。
【０００３】
許可される場合、上記に参照される出願のそれぞれの主題は、その全体が参照によって組み込まれる。
【０００４】
電子的に提供される配列表の参照による組み込み
配列表の電子バージョンは、本明細書と共に提出され、この内容は、それらの全体が参照によって組み込まれる。電子ファイルは、サイズが１．０７メガバイトであり、４９１８ＳＥＱＰＣ１．ｔｘｔという名称である。
【０００５】
修飾ＦＩＸポリペプチドが、提供される。ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、血液凝固活性の増加などのような改善された特性を示すように修飾される。これらのポリペプチドをコードする核酸分子および修飾ＦＩＸポリペプチドを使用するための方法もまた、提供される。
【背景技術】
【０００６】
組換えで産生された第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドは、血友病、特に血友病Ｂの処置について承認されてきた。血栓溶解疾患の処置において有用な抗凝固活性を示すＦＩＸポリペプチドもまた、治療上興味深い。したがって、ＦＩＸは、他の凝固因子のように、凝血促進療法および抗凝固療法にとって重要な治療剤となる。治療上の使用のためのＦＩＸポリペプチドについての必要性がある。そのため、本明細書における目的の中でも、改善された治療特性を有するように設計された修飾ＦＩＸポリペプチドを提供することを目的とする。
【発明の概要】
【０００７】
修飾ＦＩＸポリペプチドが、提供される。提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、改善された凝血促進治療特性を有する。たとえば、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドの中には、血液凝固活性の増加、触媒活性の増加、ＡＴ−ＩＩＩ、ヘパリン、および／もしくはＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体に対する抵抗性の増加、ならびに／またはｉ）クリアランスの減少、ｉｉ）分布容積の改変（たとえば増加もしくは減少）、ｉｉｉ）インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）における回収率の増強、ｉｖ）インビボにおける総タンパク質暴露の増強（つまりＡＵＣ）、ｖ）血清半減期（α−、β−、および／もしくはγ−相）の増加、ならびに／またはｖｉ）平均共鳴時間（ｍｅａｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｔｉｍｅ）（ＭＲＴ）の増加などのような改善された薬物動態学的特性を示すものがある。いくつかの例では、改善された薬物動態学的特性が、グリコシル化の増加および／または低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）に対する結合の減少の結果である。修飾ＦＩＸポリペプチドをコードする核酸および出血障害の処置などのために修飾ＦＩＸポリペプチドを使用するための方法もまた、提供される。
【０００８】
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドの中で、未修飾ＦＩＸポリペプチド中に２つのアミノ酸置換を含むものがあり、第１のアミノ酸置換は、配列番号３において記載される配列を有する成熟ＦＩＸポリペプチドにおける53、61、64、85、103、104、105、106、108、155、158、159、167、169、172、179、202、203、204、205、228、239、241、243、247、249、251、257、259、260、262、265、284、293、312、314、315、316、317、318、319、321、333、338、343、346、345、392、394、400、403、410、412および413の中から選択される位置に対応する位置にあり、第２のアミノ酸置換は、配列番号３において記載される配列を有する成熟ＦＩＸポリペプチドにおける５、５３、６１、６４、８５、１５５、１５８、１５９、１６７、２３９、２６０、２８４、２９３、３１２、３１８、３３３、３３８、３４６、４００、４０３、４１０、４１２、および４１３の中から選択される位置に対応する位置にある。
【０００９】
いくつかの例では、第１または第２のアミノ酸置換が、アラニン（Ａｌａ、Ａ）；アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）；アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）；システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）；グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）；グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）；イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）；ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）；リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）；メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）；プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）；セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）；トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）；トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）；チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）；およびバリン（Ｖａｌ、Ｖ）の中から選択されるアミノ酸残基との置換である、ただし、置換するアミノ酸はそれが置換されるアミノ酸と同じではない。特定の例では、第１のアミノ酸置換が、アラニン；アスパラギン；アスパラギン酸、グルタミン酸；グルタミン；ヒスチジン；イソロイシン；ロイシン；リシン；メチオニン；フェニルアラニン；セリン；トレオニン；チロシン、およびバリンの中から選択されるアミノ酸残基との置換である。たとえば、例示的なアミノ酸置換は、S53A、S61A、D64A、D64N、D85N、A103N、D104N、N105S、K106S、K106N、V108S、Y155F、Y155H、Y155Q、S158A、S158D、S158E、T159A、N167D、N167Q、T169A、T172A、T179A、V202M、V202Y、D203M、D203Y、A204M、A204Y、K228N、E239A、E239N、E239S、E239R、E239K、T241N、H243S、K247N、N249S、I251S、H257F、H257E、H257F、H257Y、H257S、Y259S、N260S、A262S、K265T、Y284N、K293E、K293A、R312Q、R312A、R312Y、R312L、F314N、H315S、K316S、K316N、K316A、K316E、K316S、K316M、G317N、R318A、R318E、R318Y、R318N、S319N、A320S、L321S、R333A、R333E、R333S、R338A、R338E、R338L、T343R、T343E、T343Q、F342I、Y345A、Y345T、N346D、N346Y、K392N、K394S、K400A、K400E、R403A、R403E、E410Q、E410N、E410D、E410S、E410A、T412A、T412VまたはK413Nを含む。他の例示的なアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。
【００１０】
いくつかの場合では、第２のアミノ酸置換が、アラニン；アルギニン；アスパラギン；アスパラギン酸；グルタミン酸；グルタミン；ヒスチジン；ロイシン；リシン；フェニルアラニン；セリン；トレオニン；チロシン；またはバリンの中から選択されるアミノ酸残基との置換である。たとえば、例示的なアミノ酸置換は、K5A、S53A、S61A、D64A、D64N、D85N、Y155F、Y155H、Y155Q、S158A、S158D、S158E、T159A、N167D、N167Q、E239A、E239N、E239S、E239R、E239K、N260S、Y284N、K293E、K293A、R312Q、R312A、R312Y、R312L、R318A、R318E、R318Y、R318N、R333A、R333E、R333S、R338A、R338E、R338L、N346D、N346Y、K400A、K400E、R403A、R403E、E410Q、E410N、E410D、E410S、E410A、T412A、T412VまたはK413Nを含む。他の例示的なアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。
【００１１】
特定の例では、第１のアミノ酸置換が、たとえばＹ１５５Ｆ、Ｋ２４７Ｎ、Ｎ２４９Ｓ、Ｒ３１８Ｙ、Ｒ３３８Ｅ、Ｒ４０３Ｅ、およびＥ４１０Ｎなどのように、１５５、２４７、２４９、３１８、３３８、４０３、および４１０の中から選択される位置に対応する位置にある。さらなる例では、第２のアミノ酸置換が、たとえばＹ１５５Ｆ、Ｋ２４７Ｎ、Ｎ２４９Ｓ、Ｒ３１８Ｙ、Ｒ３３８Ｅ、Ｒ４０３Ｅ、およびＥ４１０Ｎなどのように、１５５、２４７、２４９、３１８、３３８、４０３、および４１０の中から選択される位置に対応する位置にある。
【００１２】
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドの中で、K400E/R403E、R318E/R403E、R318Y/E410N、K228N/R318Y、Y155F/K228N、Y155F/I251S、Y155F/N346D、Y155F/N260S、R338E/T343R、E410N/T412A、E410N/T412V、R318Y/R338E、D85N/K228N、D85N/I251S、K400A/R403A、R338A/R403A、R338E/R403E、K293A/R403A、K293E/R403E、R318A/R403A、R338E/E410N、K228N/E410N、K228N/R338E、K228N/R338AおよびR403E/E410Nに対応するアミノ酸置換の中から選択されるアミノ酸置換を含有するものがある。
【００１３】
いくつかの例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、配列番号３において記載される配列を有する成熟ＦＩＸポリペプチドにおける53、61、64、85、103、104、105、106、108、155、158、159、167、169、172、179、202、203、204、205、228、239、241、243、247、249、251、257、259、260、262、265、284、293、312、314、315、316、317、318、319、321、333、338、343、346、345、392、394、400、403、410、412および413の中から選択される位置の１つまたは複数などに、１つまたは複数のさらなるアミノ酸置換を含有する。たとえば、修飾ＦＩＸポリペプチドは、Y5A、S53A、S61A、D64A、D64N、D85N、A103N、D104N、N105S、K106S、K106N、V108S、Y155F、Y155H、Y155Q、S158A、S158D、S158E、T159A、N167D、N167Q、T169A、T172A、T179A、V202M、V202Y、D203M、D203Y、A204M、A204Y、K228N、E239A、E239N、E239S、E239R、E239K、T241N、H243S、K247N、N249S、I251S、H257F、H257E、H257F、H257Y、H257S、Y259S、N260S、A262S、K265T、Y284N、K293E、K293A、R312Q、R312A、R312Y、R312L、F314N、H315S、K316S、K316N、K316A、K316E、K316S、K316M、G317N、R318A、R318E、R318Y、R318N、S319N、A320S、L321S、R333A、R333E、R333S、R338A、R338E、R338L、T343R、T343E、T343Q、F342I、Y345A、Y345T、N346D、N346Y、K392N、K394S、K400A、K400E、R403A、R403E、E410Q、E410N、E410D、E410S、E410A、T412A、T412VおよびK413N、または保存的アミノ酸置換の中から選択される、さらなるアミノ酸置換を含有することができる。
【００１４】
いくつかの例では、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドが、R318Y/R338E/R403E、D203N/F205T/R318Y、R318Y/R338E/E410N、K228N/R318Y/E410N、R318Y/R403E/E410N、R318Y/R338E/R403E/E410N、D203N/F205T/R318Y/E410N、A103N/N105S/R318Y/R338E/R403E/E410N、D104N/K106S/R318Y/R338E/R403E/E410N、K228N/R318Y/R338E/R403E/E410N、I251S/R318Y/R338E/R403E/E410N、D104N/K106S/I251S/R318Y/R338E/R403E/E410N、D104N/K106S/R318Y/E410N/R338E、I251S/R318Y/E410N/R338E、D104N/K106S/I251S/R318Y/E410N/R338E、A103N/N105S/Y155F、D104N/K106S/Y155F、Y155F/K247N/N249S、A103N/N105S/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N、D104N/K106S/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N、K228N/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N、A103N/N105S/Y155F/R318Y/R338E/R403E/E410N、D104N/K106S/Y155F/R318Y/R338E/R403E/E410N、Y155F/K228N/R318Y/R338E/R403E/E410N、Y155F/I251S/R318Y/R338E/R403E/E410N、Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N、K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N、Y155F/R318Y/R338E/R403E/E410N、K247N/N249S/R318Y/R338E/E240N、Y155F/R318Y/R338E/E410N、Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/E410N、D104N/K106S/Y155F/K228N/K247N/N249S、D104N/K106S/Y155F/K247N/N249S、D104N/K106S/Y155F/K228N、Y155F/K228N/K247N/N249S、R318Y/R338E/R403E/E410S、R318Y/R338E/R403E/E410N/T412V、R318Y/R338E/R403E/E410N/T412A、R318Y/R338E/R403E/T412A、R318Y/R338E/E410S、R318Y/R338E/T412A、R318Y/R338E/E410N/T412V、D85N/K228N/R318Y/R338E/R403E/E410N、N260S/R318Y/R338E/R403E/E410N、R318Y/R338E/N346D/R403E/E410N、Y155F/R318Y/R338E/N346D/R403E/E410N、Y155F/N260S/N346D、K247N/N249S/N260S/R318Y/R338E/R403E/E410N、D104N/K106S/N260S/R318Y/R338E/R403E/E410N、Y155F/N260S/R318Y/R338E/R403E/E410N、R318Y/R338E/T343R/R403E/E410N、D104N/K106S/Y155F/N260S、Y155F/K247N/N249S/N260S、D104N/K106S/Y155F/K247N/N249S/N260S、D104N/K106S/Y155F/K228N、D104N/K106S/Y155F/K247N/N249S、D85N/D203N/F205T、D85N/D104N/K106S/I251S、K293A/R338A/R403A、K293E/R338E/R403E、R338E/R403E/E410N、D203N/F205T/K228N、D203N/F205T/E410N、D203N/F205T/R338E、D203N/F205T/R338A、D203N/F205T/R338E/R403E、K228N/R338E/R403E、K247N/N249S/N260S、D104N/K106S/N260S、K228N/K247N/N249S/D104N/K106S、A103N/N105S/K228N、D104N/K106S/K228N、A103N/N105S/I251S、D104N/K106S/I251S、A103N/N105S/K247N/N249S、D104N/K106S/K247N/N249S、K228N/K247N/N249S、D104N/K106S/K228N/K247N/N249S、K247N/N249S/N260S、D104N/K106S/N260S、Y259F/K265T/Y345TおよびD104N/K106S/K247N/N249S/N260Sに対応するアミノ酸置換の中から選択されるアミノ酸置換を含有する。
【００１５】
未修飾ＦＩＸポリペプチド中に修飾を含有する修飾ＦＩＸポリペプチドであって、修飾が、配列番号３において記載される配列を有する成熟ＦＩＸポリペプチドにおけるアミノ酸置換S61A、D64A、Y155F、N157D、S158A、S158D、S158E、N167D、N167Q、T169A、T172A、D203M、D203Y、A204M、A204Y、E239S、E239R、E239K、H257F、H257E、R312Y、R312L、K316M、R318E、R318Y、T343R、T343E、F342I、N346Y、K400E、E410D、E410S、E410A、T412AおよびＴ４１２Ｖに対応する修飾の中から選択される修飾ＦＩＸポリペプチドもまた、本明細書において提供される。いくつかの例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、２つ以上のアミノ酸置換を含有する。
【００１６】
特定の場合では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、突然変異Ｙ１５５Ｆを含有する。たとえば、Ｙ１５５Ｆならびに配列番号３において記載される配列を有する成熟ＦＩＸポリペプチドの２４７、２４９、３３８、４０３、および４１０に対応する位置の中から選択されるアミノ酸位置に修飾を含有する修飾ＦＩＸポリペプチドが、提供される。一例では、修飾ＦＩＸが、Ｙ１５５Ｆ／Ｋ２４７Ｎ／Ｎ２４９Ｓを含有する。さらなる場合では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、突然変異Ｒ３１８Ｙを含有する。たとえば、Ｒ３１８ＹならびにたとえばＲ３３８Ｅ、Ｒ４０３Ｅ、またはＥ４１０Ｎなどのように、配列番号３において記載される配列を有する成熟ＦＩＸポリペプチドの３３８、４０３、および４１０に対応する位置から選択されるアミノ酸位置に修飾を含有する修飾ＦＩＸポリペプチドが、提供される。
【００１７】
いくつかの例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、配列番号３において記載される配列を有する成熟ＦＩＸポリペプチドの5、53、61、64、85、103、104、105、106、108、148、155、157、158、159、167、169、172、179、202、202、203、204、205、228、239、241、243、247、249、251、257、259、260、262、265、284、293、312、314、315、316、317、318、319、320、321、333、338、343、345、346、392、394、400、403、410、412および413に対応する位置の中から選択されるアミノ酸位置に１つまたは複数のさらなる修飾を含有する。例示的な修飾（複数可）は、アミノ酸置換K5A、S53A、S61A、D64A、D64N、D85N、A103N、D104N、N105S、N105T、K106N、K106N、K106T、V108S、V108T、T148A、Y155F、Y155H、N157D、N157Q、S158A、S158D、S158E、T159A、N167D、N167Q、T169A、T172A、T179A、V202M、V202Y、D203M、D203Y、D203N、A204M、A204Y、F205S、F205T、K228N、E239N、T241N、E239S、E239A、E239R、E239K、H243S、H243T、K247N、N249S、N249T、I251S、I251T、H257F、H257Y、H257E、H257S、N260S、A262S、A262T、Y284N、K293E、K293A、R312Q、R312A、R312Y、R312L、F314N、H315S、K316S、K316T、K316M、G317N、R318E、R318Y、R318N、R318A、S319N、A320S、L321N、L321S、L321T、R333A、R333E、R338A、R338E、T343R、T343E、T343Q、F342I、Y345A、Y345T、N346D、N346T、K392N、K394S、K394T、K400A、K400E、R403A、R403E、E410Q、E410S、E410N、E410A、E410D、T412V、T412AおよびK413Nに対応する修飾の中から選択される。
【００１８】
したがって、アミノ酸置換K400E/R403E、R318E/R403E、R318Y/E410N、R318Y/R338E/R403E、D203N/F205T/R318Y、K228N/R318Y、R318Y/R338E/E410N、K228N/R318Y/E410N、R318Y/R403E/E410N、R318Y/R338E/R403E/E410N、D203N/F205T/R318Y/E410N、A103N/N105S/R318Y/R338E/R403E/E410N、D104N/K106S/R318Y/R338E/R403E/E410N、K228N/R318Y/R338E/R403E/E410N、I251S/R318Y/R338E/R403E/E410N、D104N/K106S/I251S/R318Y/R338E/R403E/E410N、D104N/K106S/R318Y/E410N/R338E、I251S/R318Y/E410N/R338E、D104N/K106S/I251S/R318Y/E410N/R338E、A103N/N105S/Y155F、D104N/K106S/Y155F、Y155F/K228N、Y155F/I251S、Y155F/K247N/N249S、A103N/N105S/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N、D104N/K106S/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N、K228N/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N、A103N/N105S/Y155F/R318Y/R338E/R403E/E410N、D104N/K106S/Y155F/R318Y/R338E/R403E/E410N、Y155F/K228N/R318Y/R338E/R403E/E410N、Y155F/I251S/R318Y/R338E/R403E/E410N、Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N、K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N、Y155F/R318Y/R338E/R403E/E410N、K247N/N249S/R318Y/R338E/E240N、Y155F/R318Y/R338E/E410N、Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/E410N、D104N/K106S/Y155F/K228N/K247N/N249S、D104N/K106S/Y155F/K247N/N249S、D104N/K106S/Y155F/K228N、Y155F/K228N/K247N/N249S、R318Y/R338E/R403E/E410S、R318Y/R338E/R403E/E410N/T412V、R318Y/R338E/R403E/E410N/T412A、R318Y/R338E/R403E/T412A、R318Y/R338E/E410S、R318Y/R338E/T412A、R318Y/R338E/E410N/T412V、D85N/K228N/R318Y/R338E/R403E/E410N、N260S/R318Y/R338E/R403E/E410N、R318Y/R338E/N346D/R403E/E410N、Y155F/N346D、Y155F/R318Y/R338E/N346D/R403E/E410N、Y155F/N260S、Y155F/N260S/N346D、K247N/N249S/N260S/R318Y/R338E/R403E/E410N、D104N/K106S/N260S/R318Y/R338E/R403E/E410N、Y155F/N260S/R318Y/R338E/R403E/E410N、R318Y/R338E/T343R/R403E/E410N、D104N/K106S/Y155F/N260S、Y155F/K247N/N249S/N260S、R338E/T343RおよびD104N/K106S/Y155F/K247N/N249S/N260S、D104N/K106S/Y155F/K228N、D104N/K106S/Y155F/K247N/N249S、T343R/Y345T、E410N/T412A、R410N/T412VおよびR318Y/R338Eに対応する修飾の中から選択される修飾を含有する修飾ＦＩＸポリペプチドが、本明細書において提供される。特定の例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、アミノ酸置換Ｒ３１８Ｙ／Ｒ３３８Ｅ／Ｒ４０３Ｅ／Ｅ４１０Ｎまたは
Ｙ１５５Ｆ／Ｋ２４７Ｎ／Ｎ２４９Ｓ／Ｒ３１８Ｙ／Ｒ３３８Ｅ／Ｒ４０３Ｅ／Ｅ４１０Ｎに対応する修飾を含有する。
【００１９】
いくつかの場合では、未修飾ＦＩＸポリペプチドが、配列番号２、３、２０、もしくは３２５のいずれかにおいて記載されるアミノ酸の配列を含有するまたはその種変異体または配列番号２、３、２０、もしくは３２５のいずれかのＦＩＸと少なくとも６０％の配列同一性を有する変異体であるまたは配列番号２、３、２０、もしくは３２５のいずれかにおいて記載されるアミノ酸の配列を含むＦＩＸポリペプチドの活性断片である。たとえば、種変異体は、配列番号４〜１８のいずれかにおいて記載されるアミノ酸の配列を有することができる。他の例では、配列番号２、３、２０、または３２５のいずれかのＦＩＸと少なくとも６０％の配列同一性を有する変異体が、配列番号７５〜２７２のいずれかにおいて記載されるアミノ酸の配列を有する。さらなる例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、未修飾ＦＩＸポリペプチドの活性断片であり、修飾ＦＩＸポリペプチドが、修飾（複数可）を含有する。
【００２０】
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドのいずれも、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、１つまたは複数のグリコシル化部位を導入するおよび／または排除する、１つまたは複数の修飾を含有することができる。いくつかの例では、グリコシル化部位が、Ｎ−、Ｏ−、およびＳ−グリコシル化部位の中から選択される。一例では、１つまたは複数のＮ−グリコシル化部位が、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して導入される。いくつかの例では、Ｎ−グリコシル化部位が、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドのY1、S3、G4、K5、L6、E7、F9、V10、Q11、G12、L14、E15、R16、M19、E20、K22、S24、F25、E26、E27、A28、R29、E30、V31、F32、E33、T35、E36、R37、T39、E40、F41、W42、K43、Q44、Y45、V46、D47、G48、D49、Q50、E52、S53、N54、L57、N58、G59、S61、K63、D65、I66、N67、S68、Y69、E70、W72、P74、F77、G79、K80、N81、E83、L84、D85、V86、T87、N89、190、K91、N92、R94、K100、N101、S102、A103、D104、N105、K106、V108、S110、E113、G114、R116、E119、N120、Q121、K122、S123、E125、P126、V128、P129、F130、R134、V135、S136、S138、Q139、T140、S141、K142、A146、E147、A148、V149、F150、P151、D152、V153、D154、Y155、V156、S158、T159、E160、A161、E162、T163、I164、L165、D166、I168、T169、Q170、S171、T172、Q173、S174、F175、N176、D177、F178、T179、R180、G183、E185、D186、K188、P189、K201、V202、D203、E213、E224、T225、G226、K228、E239、E240、T241、H243、K247、N249、I251、R252、I253、P255、H257、N258、N260、A261、A262、I263、N264、K265、A266、D276、E277、P278、V280、N282、S283、Y284、D292、K293、E294、N297、I298、K301、F302、G303、S304、Y306、R312、F314、H315、K316、G317、R318、S319、L321、V322、Y325、R327、P329、L330、D332、R333、A334、T335、L337、R338、K341、F342、T343、Y345、N346、H354、E355、G357、R358、Q362、E372、E374、G375、E388、M391、K392、G393、K394、R403、N406、K409、E410、K411、およびK413の中から選択される位置に対応するアミノ酸位置に導入される。
【００２１】
グリコシル化を導入する例示的な修飾は、アミノ酸置換Y1N、Y1N+S3T、S3N+K5S/T、G4T、G4N+L6S/T、K5N+E7T、L6N+E8T、E7N+F9T、F9N++Q11S/T、V10N+G12S/T、Q11N+N13T、G12N+L14S/T、L14N+R16T、E15T、E15N+E17T;R16N+C18S/T、M19N+E21T;E20N+K22T、K22N、S24N+E26T;F25N+E27T;E26N+A28T;E27N+R29T;A28N+E30T;R29N+V31S/T、E30N+F32T;V31N+E33T;F32N+N34T、E33N、T35N+R37S/T、E36T;E36N;R37N、T39N+F41S/T、E40N+W42T、F41N+K43S/T、W42N+Q44S/T、K43N+Y45T;Q44N+V46S/T、Y45N+D47T、V46N+G48S/T、D47N+D49S/T、G48N+Q50S/T、D49N+C51S/T、Q50N+E52S/T、E52N+N54T、S53N+P55S/T、C56S/T、L57N+G59S/T、G59N+S61T;G60S/T、S61N+K63S/T、K63N+D65S/T、D65N+N67S/T、I66N+S68S/T、Y69S/T、Y69N+C71S/T、S68N+E70S/T、E70N+W72S/T、W72N+P74S/T、P74N+G76S/T、F75N、G76N+E78T、E78N+K80T、F77T、F77N+G79S/T、G79N+N81S/T、K80N+C82S/T、E83S/T、E83N+D85S/T、L84N+V86S/T、D85N、V86A、V86N+C88S/T、T87N+N89S/T、I90N+N92S/T、K91S/T、I90N+N92S/T、K91N+G93S/T、R94S/T、R94N+E96S/T、K100N、A103S/T、S102N+D104S/T、A103N+N105S/T、D104N+K106S/T、V107S/T、K106N+V108S/T、V108N+V110S/T、S111N、E113N+Y115S/T、G114N+R116S/T、R116N+A118S/T、E119N+Q121S/T、K122S/T、Q121N+S123S/T、K122N+C124S/T S123N+E125S/T、E125N+A125S/T、P126N+V128S/T、A127N+P129T、V128N+F130S/T、P129N+P131S/T、F130N+C132S/T、R134N、V135N+V137S/T、S136N、S138N、V137N+Q139T;Q139N、T140N+L142S/T、S141N+L143S/T、K142N、A146N+A148S/T、E147N+V149S/T、T148N+F150S/T、V149N+P151S/T、F150N+D152S/T、P151N+V153S/T、D152N+D154S/T、V153N+Y155S/T、D154N+V156S/T、Y155N+N157S/T、V156N、S158N+E160S/T、T159N+A161S/T、E160N+E162S/T、A161N、E162N+I164S/T、T163N+L165S/T、I164N+D166S/T、L165N+N167S/T、D166N+I168S/T、I168N+Q170S/T、T169N、Q170N、S171N+Q173S/T、T172N、Q173N+F175S/T、S174N+N176S/T、F175N+D177S/T、F178S/T、D177N、D177E、F178N+R180S/T、T179N+V181S/T、R180N+V182S/T、G183+E185S/T、G184N+D186T、E185N+A187S/T、D186N+K188S/T、A187N+P189T、K188N+G190S/T、P189N+Q181S/T、G200N+V202T、K201N+D203S/T、K201T、V202N+A204S/T、D203N+F205S/T、E213N+W215S/T、K214T、V223T、E224N+G226S/T、T225N+V227S/T、G226N+K228S/T、V227N+I229T、K228N、H236N+I238T;I238N+E240T;E239N、E240N+E242S/T、E242N、T241N+H243S/T、H243N+E245S/T、K247N+N249S/T、V250N+R252T、I251S/T、I251N+I253S/T、R252N+I254S/T、I253N+P255S/T、P255N+H257S/T、H257N+Y259S/T、N260S/T、A262S/T、A261N+I263S/T、A262N+N264S/T、I263N+K265S/T、K265N+N267S/T、A266N+H268S/T、D276N+P278S/T、P278N+V280S/T、E277N+L279S/T、V280N+N282S/T、Y284S/T、S283N+V285S/T、Y284N、D292N+K294S/T、K293N+Y295S/T、E294N、F299S/T、I298N+L300S/T、K301N+G303S/T、F302N、G303N+G305S/T、S304N+Y306S/T、Y306N+S308S/T、R312N+F314S/T、V313N+H315T、F314N+K316S/T、H315N+G317S/T、K316N+R138S/T、G317N、R318N+A320S/T、S319N+L321S/T、A320N+V322T、L321N+L323S/T、V322N+Q324S/T、Y325N+R327S/T、R327N+P329S/T、P329N+V331S/T、L330N+D332S/T、D332N+A334S/T、R333N、A334N+C336S/T、T335N+L337S/T、L337N、R338N、S339N+K341T、T340N+F342T;K341N、F342N+I344S/T、T343N+Y345S/T、Y345N+N347S/T、M348S/T、G352N+H354T、F353N、F353N+E355T、H354N+G356S/T、H354V、H354I、E355T、E355N+G357S/T、G356N+R358T、G357N+D359S/T、R358N、Q362N+D364S/T、V370N;T371V;T371I;E372T、E372N+E374S/T、E374N、G375N、W385N+E387T;G386N+E388T、E388N+A390S/T、A390N+K392T、M391N+G393S/T、K392N+K394S/T、K392V、G393T、G393N+Y395S/T、K394N+G396S/T、R403N+V405S/T、I408S/T、K409N+K411S/T、E410N、K411N+K413S/T、およびK413Nに対応する修飾の中から選択されるものを含む。いくつかの例では、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上のグリコシル化部位が、導入される。
【００２２】
未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、１つまたは複数のＮ−グリコシル化部位を排除する、１つまたは複数の修飾を含有する修飾ＦＩＸポリペプチドもまた、本明細書において提供される。たとえば、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドのＮ１５７またはＮ１６７に対応するアミノ酸位置のＮ−グリコシル化部位は、排除することができる。Ｎ−グリコシル化部位を排除する例示的な修飾は、アミノ酸置換Ｎ１５７Ｄ、Ｎ１５７Ｑ、Ｎ１６７Ｄ、およびＮ１６７Ｑに対応する修飾の中から選択されるものを含む。さらなる例では、ＦＩＸポリペプチドが、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、１つまたは複数のＯ−グリコシル化部位を排除する、１つまたは複数の修飾を含有する。たとえば、排除することができるＯ−グリコシル化部位は、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドのＳ５３、Ｓ６１、Ｔ１５９、およびＴ１６９の中から選択される位置に対応するアミノ酸位置のものを含む。Ｎ−グリコシル化部位を排除する例示的な修飾は、アミノ酸置換Ｓ５３Ａ、Ｓ６１Ａ、Ｔ１５９Ａ、およびＴ１６９Ａに対応する修飾の中から選択されるものを含む。
【００２３】
未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、１つまたは複数の硫酸化部位を導入するおよび／または排除する、１つまたは複数の修飾を含有する修飾ＦＩＸポリペプチドもまた、提供される。一例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドのＹ１５５位に対応するアミノ酸位置の硫酸化部位を排除する修飾を含有する。例示的なそのような修飾は、アミノ酸置換Ｙ１５５Ｈ、Ｙ１５５Ｆ、およびＹ１５５Ｑに対応するものである。
【００２４】
未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、１つまたは複数のリン酸化部位を導入するおよび／または排除する、１つまたは複数の修飾を含有する修飾ＦＩＸポリペプチドが、提供される。一例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドの位置Ｓ１５８に対応するアミノ酸位置のリン酸化部位を排除する修飾を含有する。例示的なそのような修飾は、アミノ酸置換Ｓ１５８Ａ、Ｓ１５８Ｄ、およびＳ１５８Ｅに対応するものである。未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、１つまたは複数のβ−ヒドロキシル化部位を導入するおよび／または排除する、１つまたは複数の修飾を含有するＦＩＸポリペプチドもまた、提供される。ある場合では、修飾ＦＩＸポリペプチドは、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドの位置Ｄ６４に対応するアミノ酸位置のβ−ヒドロキシル化部位を排除する修飾を含有する。例示的なそのような修飾は、アミノ酸置換Ｄ６４ＮおよびＤ６４Ａに対応するものである。
【００２５】
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドのいずれも、たとえば、アミノ酸置換Y1A、Y1C、Y1D、Y1E、Y1G、Y1H、Y1K、Y1N、Y1P、Y1Q、Y1R、Y1S、Y1T、S3T、K5A、K5I、K5L、K5F、K5E、L6A、L6C、L6D、L6E、L6G、L6H、L6K、L6N、L6P、L6Q、L6R、L6S、L6T、L6M、F9A、F9C、F9D、F9E、F9G、F9H、F9K、F9N、F9P、F9Q、F9R、F9S、F9T、F9I、F9M、F9W、V10A、V10C、V10D、V10E、V10G、V10H、V10K、V10N、V10P、V10Q、V10R、V10S、V10T、V10F、V10I、V10K、V10M、V10W、V10Y、Q11E、Q11D、Q11A、Q11C、Q11G、Q11P、G12D、G12E、G12G、G12H、G12K、G12N、G12P、G12Q、G12R、G12S、G12T、N13A、N13C、N13G、N13H、N13P、N13T、L14A、L14C、L14D、L14E、L14G、L14H、L14K、L14N、L14P、L14Q、L14R、L14S、L14T、L14F、L14I、L14M、L14V、L14W、L14Y、E15D、E15H、E15P、R16E、R16A、R16C、R16G、R16P、R16T、E17A、E17C、E17G、E17P、E17T、C18D、C18E、C18G、C18H、C18K、C18N、C18P、C18Q、C18R、C18S、C18T、M19A、M19C、M19D、M19E、M19G、M19H、M19K、M19N、M19P、M19Q、M19R、M19S、M19T、M19F、M19I、M19M、M19V、M19W、M19Y、E20A、E20C、E20G、E20P、E20T、E21A、E21C、E21G、E21P、K22H、K22P、K22T、S24H、S24P、F25A、F25C、F25D、F25E、F25G、F25H、F25K、F25N、F25P、F25Q、F25R、F25S、F25T、F25I、F25M、F25W、F25Y、E26A、E26C、E26G、E26P、E27A、E27C、E27G、E27H、E27P、E27S、E27T、A28C、A28D、A28E、A28G、A28H、A28K、A28N、A28P、A28Q、A28R、A28S、A28T、R29A、R29C、R29G、R29P、R29F、E30D、E30H、E30P、V31A、V31C、V31D、V31E、V31G、V31H、V31K、V31N、V31P、V31Q、V31R、V31S、V31T、V31F、V31I、V31W、V31Y、F32A、F32C、F32D、F32E、F32G、F32H、F32K、F32N、F32P、F32Q、F32R、F32S、F32T、E33H、E33N、E33P、E33Q、E33S、E33T、N34E、N34D、N34F、N34I、N34L、T35D、T35E、T35A、T35C、T35G、T35P、F41A、F41C、F41D、F41E、F41G、F41H、F41K、F41N、F41P、F41Q、F41R、F41S、F41T、F41M、F41W、F41Y、W42A、W42C、W42D、W42E、W42G、W42H、W42K、W42N、W42P、W42Q、W42R、W42S、W42T、K43A、K43C、K43G、K43P、Q44P、Q44T、Q44、Y45A、Y45C、Y45D、Y45E、Y45G、Y45H、Y45K、Y45N、Y45P、Y45Q、Y45R、Y45S、Y45T、V46A、V46C、V46D、V46E、V46G、V46H、V46K、V46N、V46P、V46Q、V46R、V46S、V46T、V46F、V46I、V46M、V46W、V46Y、D47A、D47C、D47G、D47H、D47P、D47T、G48D、G48E、G48P、G48T、D49H、D49P、D49Q、D49T、Q50A、Q50C、Q50D、Q50G、Q50H、Q50P、Q50T、C51D、C51E、C51G、C51H、C51K、C51N、C51P、C51Q、C51R、C51S、C51T、E52P、E52T、S53A、S53C、S53G、S53H、S53P、S53T、N54H、N54P、N54T、L57A、L57C、L57D、L57E、L57G、L57H、L57K、L57N、L57P、L57Q、L57R、L57S、L57T、L57F、L57I、L57M、L57W、L57Y、G60C、G60D、G60H、G60P、G60T、C62D、C62H、C62P、K63T、D65H、D65T、I66A、I66C、I66D、I66E、I66G、I66H、I66K、I66N、I66P、I66Q、I66R、I66S、I66T、I66M、I66W、I66Y、Y69A、Y69C、Y69D、Y69E、Y69G、Y69H、Y69K、Y69N、Y69P、Y69Q、Y69R、Y69S、Y69T、C71H、C71P、W72A、W72C、W72D、W72E、W72G、W72H、W72K、W72N、W72P、W72Q、W72R、W72S、W72T、W72I、W72Y、F75A、F75C、F75D、F75E、F75G、F75H、F75K、F75N、F75P、F75Q、F75R、F75S、F75T、F77A、F77C、F77D、F77E、F77G、F77H、F77K、F77N、F77P、F77Q、F77R、F77S、F77T、L84A、L84C、L84D、L84E、L84G、L84H、L84K、L84N、L84P、L84Q、L84R、L84S、L84T、L84M、L84W、L84Y、V86I、V86L、V86M、V86F、V86W、V86Y、V86A、V86C、V86D、V86E、V86G、V86H、V86K、V86N、V86P、V86Q、V86R、V86S、V86T、I90A、I90C、I90D、I90E、I90G、I90H、I90K、I90N、I90P、I90Q、I90R、I90S、I90T、I90M、I90W、K91A、K91C、K91G、K91P、N92A、N92C、N92G、N92P、N92T、G93D、G93E、G93H、G93K、G93N、G93P、G93Q、G93R、G93S、G93T、R94A、R94C、R94G、R94P、C95D、C95E、C95G、C95H、C95K、C95N、C95P、C95Q、C95R、C95S、C95T、E96P、E96T、Q97A、Q97C、Q97G、Q97P、F98A、F98C、F98D、F98E、F98G、F98H、F98K、F98N、F98P、F98Q、F98R、F98S、F98T、F98M、F98W、F98Y、K100A、K100C、K100G、K100P、N101H、N101T、A103D、A103E、A103H、A103K、A103N、A103P、A103Q、A103R、A103S、A103T、D104T、K106H、K106P、K106T、V107A、V107C、V107D、V107E、V107G、V107H、V107K、V107N、V107P、V107Q、V107R、V107S、V107T、V108A、V108C、V108D、V108E、V108G、V108H、V108K、V108N、V108P、V108Q、V108R、V108S、V108T、V108F、V108M、V108W、V108Y、S110A、S110C、S110G、S110P、C111D、C111E、C111H、C111K、C111N、C111P、C111Q、C111R、C111S、C111T、T112A、T112C、T112G、T112P、E113D、E113H、E113P、G114D、G114E、G114H、G114K、G114N、G114P、G114Q、G114R、G114S、G114T、Y115A、Y115C、Y115D、Y115E、Y115G、Y115H、Y115K、Y115N、Y115P、Y115Q、Y115R、Y115S、Y115T、Y115M、Y115W、R116P、R116T、L117A、L117C、L117D、L117E、L117G、L117H、L117K、L117N、L117P、L117Q、L117R、L117S、L117T、A118D、A118E、A118H、A118K、A118N、A118P、A118Q、A118R、A118S、A118T、N120D、N120H、N120P、Q121T、S123H、S123T、V128A、V128C、V128D、V128E、V128G、V128H、V128K、V128N、V128P、V128Q、V128R、V128S、V128T、F130A、F130C、F130D、F130E、F130G、F130H、F130K、F130N、F130P、F130Q、F130R、F130S、F130T、V135A、V135C、V135D、V135E、V135G、V135H、V135K、V135N、V135P、V135Q、V135R、V135S、V135T、V135W、V135Y、V137A、V137C、V137D、V137E、V137G、V137H、V137K、V137N、V137P、V137Q、V137R、V137S、V137T、V137M、V137W、V137Y、S138H、S138T、T140D、T140H、S141T、K142H、K142P、L143A、L143C、L143D、L143E、L143G、L143H、L143K、L143N、L143P、L143Q、L143R、L143S、L143T、L143F、L143I、L143M、L143V、L143W、L143Y、R145H、R145P、R145T、A146P、A146T、T148H、T148P、V149A、V149C、V149D、V149E、V149G、V149H、V149K、V149N、V149P、V149Q、V149R、V149S、V149T、V149F、V149I、V149M、V149W、V149Y、F150A、F150C、F150D、F150E、F150G、F150H、F150K、F150N、F150P、F150Q、F150R、F150S、F150T、F150M、F150W、F150Y、D152A、D152C、D152G、D152P、D152S、D152T、V153A、V153C、V153D、V153E、V153G、V153H、V153K、V153N、V153P、V153Q、V153R、V153S、V153T、V153F、V153I、V153M、V153W、V153Y、D154A、D154C、D154G、D154P、D154Q、D154S、Y155A、Y155C、Y155D、Y155E、Y155G、Y155H、Y155K、Y155N、Y155P、Y155Q、Y155R、Y155S、Y155T、Y155M、Y155V、Y155W、V156A、V156C、V156D、V156E、V156G、V156H、V156K、V156N、V156P、V156Q、V156R、V156S、V156T、V156I、V156M、V156W、V156Y、N157A、N157C、N157G、N157H、N157P、N157Q、N157T、S158H、S158P、S158T、T159A、T159C、T159G、T159P、E160A、E160C、E160G、E160P、A161C、A161D、A161E、A161H、A161K、A161N、A161P、A161Q、A161R、A161S、A161T、E162P、E162T、T163A、T163C、T163G、T163P、I164A、I164C、I164D、I164E、I164G、I164H、I164K、I164N、I164P、I164Q、I164R、I164S、I164T、L165A、L165C、L165D、L165E、L165G、L165H、L165K、L165N、L165P、L165Q、L165R、L165S、L165T、L165M、L165W、L165Y、I168A、I168C、I168D、I168E、I168G、I168H、I168K、I168N、I168P、I168Q、I168R、I168S、I168T、F175A、F175C、F175D、F175E、F175G、F175H、F175K、F175N、F175P、F175Q、F175R、F175S、F175T、F178A、F178C、F178D、F178E、F178G、F178H、F178K、F178N、F178P、F178Q、F178R、F178S、F178T、F178M、F178W、F178Y、T179A、T179C、T179G、T179P、R180A、R180C、R180D、R180G、R180H、R180P、V181A、V181C、V181D、V181E、V181G、V181H、V181K、V181N、V181P、V181Q、V181R、V181S、V181T、V181F、V181I、V181M、V181W、V181Y、V182A、V182C、V182D、V182E、V182G、V182H、V182K、V182N、V182P、V182Q、V182R、V182S、V182T、V182F、V182I、V182M、V182W、V182Y、G183D、G183E、G183H、G183K、G183N、G183P、G183Q、G183S、G183T、G184D、G184E、G184H、G184K、G184N、G184P、G184Q、G184R、G184S、G184T、E185A、E185C、E185G、E185H、E185P、E185T、D186A、D186C、D186G、D186H、D186P、D186T、A187C、A187D、A187E、A187G、A187H、A187K、A187N、A187P、A187Q、A187R、A187S、A187T、K188A、K188C、K188G、K188H、K188P、K188T、G190D、G190E、G190H、G190K、G190N、G190P、G190Q、G190R、G190S、G190T、F192A、F192C、F192D、F192E、F192G、F192H、F192K、F192N、F192P、F192Q、F192R、F192S、F192T、F192W、F192Y、W194A、W194C、W194D、W194E、W194G、W194H、W194K、W194N、W194P、W194Q、W194R、W194S、W194T、Q195H、Q195P、Q195T、V196A、V196C、V196D、V196E、V196G、V196H、V196K、V196N、V196P、V196Q、V196R、V196S、V196T、V196F、V196I、V196M、V196W、V196Y、V197A、V197C、V197D、V197E、V197G、V197H、V197K、V197N、V197P、V197Q、V197R、V197S、V197T、V197F、V197I、V197M、V197W、V197Y、L198A、L198C、L198D、L198E、L198G、L198H、L198K、L198N、L198P、L198Q、L198R、L198S、L198T、L198I、L198Y、N199A、N199C、N199G、N199H、N199P、N199S、N199T、G200P、G200T、K201A、K201C、K201D、K201E、K201G、K201H、K201N、K201P、K201Q、K201S、K201T、V202A、V202C、V202D、V202E、V202G、V202H、V202K、V202N、V202P、V202Q、V202R、V202S、V202T、V202F、V202I、V202M、V202W、V202Y、D203A、D203C、D203G、D203P、D203T、A204C、A204D、A204E、A204G、A204H、A204K、A204N、A204P、A204Q、A204R、A204S、A204T、F205A、F205C、F205D、F205E、F205G、F205H、F205K、F205N、F205P、F205Q、F205R、F205S、F205T、F205M、F205V、F205W、F205Y、G207H、G207P、G208C、G208D、G208E、G208H、G208K、G208N、G208P、G208Q、G208R、G208S、G208T、S209A、S209C、S209G、S209P、I210A、I210C、I210D、I210E、I210G、I210H、I210K、I210N、I210P、I210Q、I210R、I210S、I210T、I210F、I210W、I210Y、V211A、V211C、V211D、V211E、V211G、V211H、V211K、V211N、V211P、V211Q、V211R、V211S、V211T、V211F、V211I、V211M、V211W、N212A、N212C、N212G、N212P、E213H、E213P、E213S、E213T、K214T、W215A、W215C、W215D、W215E、W215G、W215H、W215K、W215N、W215P、W215Q、W215R、W215S、W215T、I216A、I216C、I216D、I216E、I216G、I216H、I216K、I216N、I216P、I216Q、I216R、I216S、I216T、V217A、V217C、V217D、V217E、V217G、V217H、V217K、V217N、V217P、V217Q、V217R、V217S、V217T、V217I、V217Y、A219H、A219P、A219T、V223A、V223C、V223D、V223E、V223G、V223H、V223K、V223N、V223P、V223Q、V223R、V223S、V223T、V223M、V223W、V223Y、G226P、V227A、V227C、V227D、V227E、V227G、V227H、V227K、V227N、V227P、V227Q、V227R、V227S、V227T、V227F、V227I、V227M、V227W、V227Y、K228A、K228C、K228G、K228H、K228P、I229A、I229C、I229D、I229E、I229G、I229H、I229K、I229N、I229P、I229Q、I229R、I229S、I229T、I229M、I229W、I229Y、T230A、T230C、T230G、T230P、V231A、V231C、V231D、V231E、V231G、V231H、V231K、V231N、V231P、V231Q、V231R、V231S、V231T、V232A、V232C、V232D、V232E、V232G、V232H、V232K、V232N、V232P、V232Q、V232R、V232S、V232T、V232F、V232I、V232M、V232W、V232Y、A233C、A233D、A233E、A233G、A233H、A233K、A233N、A233P、A233Q、A233R、A233S、A233T、A233V、G234D、G234E、G234H、G234K、G234N、G234P、G234Q、G234R、G234S、G234T、E235H、E235N、E235P、E235Q、E235S、E235T、H236A、H236C、H236G、H236P、N237A、N237C、N237G、N237P、N237T、I238A、I238C、I238D、I238E、I238G、I238H、I238K、I238N、I238P、I238Q、I238R、I238S、I238T、E239A、E239C、E239G、E239P、E240H、E240T、V250A、V250C、V250D、V250E、V250G、V250H、V250K、V250N、V250P、V250Q、V250R、V250S、V250T、V250M、V250W、V250Y、I251A、I251C、I251D、I251E、I251G、I251H、I251K、I251N、I251P、I251Q、I251R、I251S、I251T、I253A、I253C、
I253D、I253E、I253G、I253H、I253K、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253M、I253W、I253Y、I254A、I254C、I254D、I254E、I254G、I254H、I254K、I254N、I254P、I254Q、I254R、I254S、I254T、P255H、H256P、H256T、H257A、H257C、H257G、H257P、N258P、N258T、Y259A、Y259C、Y259D、Y259E、Y259G、Y259H、Y259K、Y259N、Y259P、Y259Q、Y259R、Y259S、Y259T、Y259M、Y259W、Y259F、N260A、N260C、N260G、N260P、A261D、A261E、A261H、A261K、A261N、A261P、A261Q、A261R、A261S、A261T、A262C、A262D、A262E、A262G、A262H、A262K、A262N、A262P、A262Q、A262R、A262S、A262T、I263A、I263C、I263D、I263E、I263G、I263H、I263K、I263N、I263P、I263Q、I263R、I263S、I263T、I263M、I263V、I263W、I263Y、N264A、N264C、N264D、N264G、N264H、N264P、K265A、K265C、K265G、K265H、K265P、K265T、Y266A、Y266C、Y266D、Y266E、Y266G、Y266H、Y266K、Y266N、Y266P、Y266Q、Y266R、Y266S、Y266T、Y266M、Y266W、N267A、N267C、N267G、N267H、N267P、N267T、H268P、D269A、D269C、D269E、D269G、D269H、D269N、D269P、D269Q、D269S、D269T、I270A、I270C、I270D、I270E、I270G、I270H、I270K、I270N、I270P、I270Q、I270R、I270S、I270T、I270M、I270W、A271C、A271D、A271E、A271G、A271H、A271K、A271N、A271P、A271Q、A271R、A271S、A271T、L272A、L272C、L272D、L272E、L272G、L272H、L272K、L272N、L272P、L272Q、L272R、L272S、L272T、L272F、L273A、L273C、L273D、L273E、L273G、L273H、L273K、L273N、L273P、L273Q、L273R、L273S、L273T、L273F、L273I、L273M、L273V、L273W、L273Y、E274A、E274C、E274G、E274P、E274T、L275A、L275C、L275D、L275E、L275G、L275H、L275K、L275N、L275P、L275Q、L275R、L275S、L275T、L275W、L275Y、D276P、D276S、D276T、E277A、E277C、E277G、E277P、E277V、E277N、E277D、E277E、E277Q、E277H、E277I、E277L、E277M、E277F、E277S、E277T、E277W、E277Y、P278T、L279A、L279C、L279D、L279E、L279G、L279H、L279K、L279N、L279P、L279Q、L279R、L279S、L279T、L279I、L279Y、V280A、V280C、V280D、V280E、V280G、V280H、V280K、V280N、V280P、V280Q、V280R、V280S、V280T、V280F、V280I、V280W、V280Y、L281A、L281C、L281D、L281E、L281G、L281H、L281K、L281N、L281P、L281Q、L281R、L281S、L281T、L281F、L281I、L281V、L281W、L281Y、S283A、S283C、S283G、S283P、Y284A、Y284C、Y284D、Y284E、Y284G、Y284H、Y284K、Y284N、Y284P、Y284Q、Y284R、Y284S、Y284T、Y284M、V285A、V285C、V285D、V285E、V285G、V285H、V285K、V285N、V285P、V285Q、V285R、V285S、V285T、V285M、V285W、V285Y、T286A、T286C、T286G、T286P、I288A、I288C、I288D、I288E、I288G、I288H、I288K、I288N、I288P、I288Q、I288R、I288S、I288T、C289D、C289H、C289P、I290A、I290C、I290D、I290E、I290G、I290H、I290K、I290N、I290P、I290Q、I290R、I290S、I290T、I290Y、A291D、A291E、A291H、A291K、A291N、A291P、A291Q、A291R、A291S、A291T、D292A、D292C、D292G、D292P、D292T、K293H、K293P、K293T、Y295A、Y295C、Y295D、Y295E、Y295G、Y295H、Y295K、Y295N、Y295P、Y295Q、Y295R、Y295S、Y295T、Y295W、T296A、T296C、T296G、T296P、N297A、N297C、N297G、N297P、I298A、I298C、I298D、I298E、I298G、I298H、I298K、I298N、I298P、I298Q、I298R、I298S、I298T、F299A、F299C、F299D、F299E、F299G、F299H、F299K、F299N、F299P、F299Q、F299R、F299S、F299T、L300A、L300C、L300D、L300E、L300G、L300H、L300K、L300N、L300P、L300Q、L300R、L300S、L300T、L300F、L300I、L300M、L300V、L300W、L300Y、K301A、K301C、K301G、K301P、K301T、F302A、F302C、F302D、F302E、F302G、F302H、F302K、F302N、F302P、F302Q、F302R、F302S、F302T、G303H、G303P、G303T、S304A、S304C、S304G、S304P、S304T、G305D、G305E、G305H、G305N、G305P、G305Q、G305S、G305T、Y306A、Y306C、Y306D、Y306E、Y306G、Y306H、Y306K、Y306N、Y306P、Y306Q、Y306R、Y306S、Y306T、V307A、V307C、V307D、V307E、V307G、V307H、V307K、V307N、V307P、V307Q、V307R、V307S、V307T、S308P、S308T、W310A、W310C、W310D、W310E、W310G、W310H��W310K、W310N、W310P、W310Q、W310R、W310S、W310T、G311H、V313A、V313C、V313D、V313E、V313G、V313H、V313K、V313N、V313P、V313Q、V313R、V313S、V313T、F314A、F314C、F314D、F314E、F314G、F314H、F314K、F314N、F314P、F314Q、F314R、F314S、F314T、F314M、F314W、F314Y、H315A、H315C、H315G、H315P、K316A、K316C、K316G、K316P、G317C、G317D、G317E、G317H、G317K、G317N、G317P、G317Q、G317R、G317S、G317T、R318A、R318C、R318G、R318P、S319D、S319H、S319N、S319P、S319Q、A320C、A320D、A320E、A320G、A320H、A320K、A320N、A320P、A320Q、A320R、A320S、A320T、L321A、L321C、L321D、L321E、L321G、L321H、L321K、L321N、L321P、L321Q、L321R、L321S、L321T、V322A、V322C、V322D、V322E、V322G、V322H、V322K、V322N、V322P、V322Q、V322R、V322S、V322T、V322W、V322Y、L323A、L323C、L323D、L323E、L323G、L323H、L323K、L323N、L323P、L323Q、L323R、L323S、L323T、L323F、L323I、L323M、L323V、L323W、L323Y、Q324A、Q324C、Q324G、Q324P、Y325A、Y325C、Y325D、Y325E、Y325G、Y325H、Y325K、Y325N、Y325P、Y325Q、Y325R、Y325S、Y325T、Y325W、L326A、L326C、L326D、L326E、L326G、L326H、L326K、L326N、L326P、L326Q、L326R、L326S、L326T、L326F、L326I、L326M、L326V、L326W、L326Y、R327A、R327C、R327G、R327H、R327P、V328A、V328C、V328D、V328E、V328G、V328H、V328K、V328N、V328P、V328Q、V328R、V328S、V328T、V328F、V328I、V328M、V328W、V328Y、L330A、L330C、L330D、L330E、L330G、L330H、L330K、L330N、L330P、L330Q、L330R、L330S、L330T、L330F、L330I、L330V、L330W、L330Y、V331A、V331C、V331D、V331E、V331G、V331H、V331K、V331N、V331P、V331Q、V331R、V331S、V331T、V331F、V331I、V331M、V331W、V331Y、D332A、D332C、D332G、D332P、R333A、R333C、R333D、R333E、R333G、R333H、R333N、R333P、R333Q、R333R、R333S、R333T、A334C、A334D、A334E、A334G、A334H、A334K、A334N、A334P、A334Q、A334R、A334S、A334T、T335A、T335C、T335G、T335P、C336D、C336E、C336H、C336K、C336N、C336P、C336Q、C336R、C336S、C336T、L337A、L337C、L337D、L337E、L337G、L337H、L337K、L337N、L337P、L337Q、L337R、L337S、L337T、R338A、R338E、R338V、R338T、R338C、R338G、R338P、R338I、R338F、R338W、R338S、S339P、S339T、K341A、K341C、K341G、K341P、F342A、F342C、F342D、F342E、F342G、F342H、F342K、F342N、F342P、F342Q、F342R、F342S、F342T、F342M、F342W、T343A、T343C、T343G、T343P、I344A、I344C、I344D、I344E、I344G、I344H、I344K、I344N、I344P、I344Q、I344R、I344S、I344T、Y345F、Y345A、Y345C、Y345D、Y345E、Y345G、Y345H、Y345K、Y345N、Y345P、Y345Q、Y345R、Y345S、Y345T、Y345M、Y345W、N346A、N346C、N346G、N346P、N347H、N347P、M348A、M348C、M348D、M348E、M348G、M348H、M348K、M348N、M348P、M348Q、M348R、M348S、M348T、F349A、F349C、F349D、F349E、F349G、F349H、F349K、F349N、F349P、F349Q、F349R、F349S、F349T、F349I、F349M、F349W、F349Y、C350D、C350H、C350P、C350T、A351E、A351H、A351N、A351P、A351Q、A351R、A351S、A351T、G352A、G352C、G352P、F353A、F353C、F353D、F353E、F353G、F353H、F353K、F353N、F353P、F353Q、F353R、F353S、F353T、F353I、F353M、F353W、H354A、H354C、H354G、H354P、E355A、E355C、E355D、E355G、E355H、E355K、E355N、E355P、E355Q、E355S、E355T、G356D、G356E、G356H、G356K、G356N、G356P、G356Q、G356R、G356S、G356T、G357D、G357E、G357H、G357K、G357N、G357P、G357Q、G357R、G357S、G357T、R358D、R358E、R358H、R358K、R358N、R358P、R358Q、R358R、R358S、R358T、D359A、D359C、D359G、D359P、D359Q、D359S、D359T、S360A、S360C、S360G、S360P、C361D、C361E、C361H、C361K、C361N、C361P、C361Q、C361R、C361S、C361T、V370A、V370C、V370D、V370E、V370G、V370H、V370K、V370N、V370P、V370Q、V370R、V370S、V370T、V370W、V370Y、V373A、V373C、V373D、V373E、V373G、V373H、V373K、V373N、V373P、V373Q、V373R、V373S、V373T、V373F、V373I、V373M、V373W、E374A、E374C、E374G、E374P、G375H、S377A、S377C���S377G、S377P、F378A、F378C、F378D、F378E、F378G、F378H、F378K、F378N、F378P、F378Q、F378R、F378S、F378T、F378W、L379A、L379C、L379D、L379E、L379G、L379H、L379K、L379N、L379P、L379Q、L379R、L379S、L379T、L379I、L379M、L379W、L379Y、T380A、T380C、T380G、T380P、G381D、G381E、G381H、G381K、G381N、G381P、G381Q、G381R、G381S、G381T、I382A、I382C、I382D、I382E、I382G、I382H、I382K、I382N、I382P、I382Q、I382R、I382S、I382T、I382M、I382W、I382Y、I383A、I383C、I383D、I383E、I383G、I383H、I383K、I383N、I383P、I383Q、I383R、I383S、I383T、I383V、S384A、S384C、S384G、S384P、W385A、W385C、W385D、W385E、W385G、W385H、W385K、W385N、W385P、W385Q、W385R、W385S、W385T、W385M、E387A、E387C、E387G、E387H、E387P、E387T、E388H、E388N、E388G、E388P、E388Q、E388T、A390C、A390D、A390E、A390G、A390H、A390K、A390N、A390P、A390Q、A390R、A390S、M391A、M391C、M391D、M391E、M391G、M391H、M391K、M391N、M391P、M391Q、M391R、M391S、M391T、M391F、M391I、M391W、M391Y、K392A、K392C、K392G、K392P、G393C、G393D、G393E、G393H、G393K、G393N、G393P、G393Q、G393R、G393S、G393T、Y395A、Y395C、Y395D、Y395E、Y395G、Y395H、Y395K、Y395N、Y395P、Y395Q、Y395R、Y395S、Y395T、Y398A、Y398C、Y398D、Y398E、Y398G、Y398H、Y398K、Y398N、Y398P、Y398Q、Y398R、Y398S、Y398T、K400H、V401A、V401C、V401D、V401E、V401G、V401H、V401K、V401N、V401P、V401Q、V401R、V401S、V401T、V401F、V401I、V401M、V401W、V401Y、S402A、S402C、S402G、S402P、R403A、R403C、R403G、R403P、R403T、Y404A、Y404C、Y404D、Y404E、Y404G、Y404H、Y404K、Y404N、Y404P、Y404Q、Y404R、Y404S、Y404T、V405A、V405C、V405D、V405E、V405G、V405H、V405K、V405N、V405P、V405Q、V405R、V405S、V405T、V405W、V405Y、N406F、N406H、N406I、N406L、N406P、N406W、N406Y、W407D、W407E、W407F、W407H、W407I、W407K、W407N、W407P、W407Q、W407R、W407S、W407T、W407Y、I408D、I408E、I408H、I408K、I408N、I408P、I408Q、I408R、I408S、I408T、K409F、K409H、K409I、K409P、K409T、K409V、K409W、K409Y、E410H、K411A、K411C、K411G、K411I、K411P、K411T、K411V、K411W、K411Y、K413T、Y1I、S3Q、S3H、S3N、G4Q、G4H、G4N、K5N、K5Q、L6I、L6V、E7Q、E7H、E7N、E8Q、E8H、E8N、F9V、E15Q、E15N、R16H、R16Q、E17Q、E17H、E17N、E20Q、E20H、E20N、E21Q、E21H、E21N、K22N、K22Q、S24Q、S24N、F25V、E26Q、E26H、E26N、E27Q、E27N、R29H、R29Q、E30Q、E30N、F32I、F32V、T35Q、T35H、T35N、E36Q、E36H、E36N、R37H、R37Q、T38Q、T38H、T38N、T39Q、T39H、T39N、E40Q、E40H、E40N、F41I、F41V、K43N、K43Q、Y45I、D47N、D47Q、G48Q、G48H、G48N、D49N、E52Q、E52H、E52N、S53Q、S53N、P55A、P55S、L57V、N58Q、N58S、G59Q、G59H、G59N、G60Q、G60N、S61Q、S61H、S61N、K63N、K63Q、D64N、D64Q、D65N、D65Q、S68Q、S68H、S68N、Y69I、E70Q、E70H、E70N、P74A、P74S、F75I、F75V、G76Q、G76H、G76N、F77I、F77V、E78Q、E78H、E78N、G79Q、G79H、G79N、K80N、K80Q、E83Q、E83H、E83N、L84I、L84V、D85N、D85Q、T87Q、T87H、T87N、K91N、K91Q、N92Q、N92S、R94H、R94Q、E96Q、E96H、E96N、F98I、F98V、K100N、K100Q、S102Q、S102H、S102N、D104N、D104Q、K106N、K106Q、S110Q、S110H、S110N、T112Q、T112H、T112N、E113Q、E113N、Y115I、R116H、R116Q、L117I、L117V、E119Q、E119H、E119N、K122N、K122Q、S123Q、S123N、E125Q、E125H、E125N、P126A、P126S、A127Q、A127H、A127N、P
129A、P129S、P131A、P131S、G133Q、G133H、G133N、R134H、R134Q、S136Q、S136H、S136N、S138Q、S138N、T140Q、T140N、S141Q、S141H、S141N、K142N、K142Q、T144Q、T144H、T144N、R145Q、A146Q、A146H、A146N、E147Q、E147H、E147N、T148Q、T148N、P151A、P151S、D152N、D152Q、D154N、Y155I、S158Q、S158N、T159Q、T159H、T159N、E160Q、E160H、E160N、E162Q、E162H、E162N、T163Q、T163H、T163N、L165I、L165V、D166N、D166Q、T169Q、T169H、T169N、S171Q、S171H、S171N、T172Q、T172H、T172N、S174Q、S174H、S174N、F175I、F175V、D177N、D177Q、F178I、F178V、T179Q、T179H、T179N、R180Q、E185Q、E185N、D186N、D186Q、K188N、K188Q、P189A、P189S、F192I、F192V、F192IH、P193A、P193S、W194I、L198V、N199Q、G200Q、G200H、G200N、D203N、D203Q、F205I、G207Q、G207N、S209Q、S209H、S209N、E213Q、E213N、K214N、K214Q、T218Q、T218H、T218N、A219Q、A219N、A220Q、A220H、A220N、E224Q、E224H、E224N、T225Q、T225H、T225N、G226Q、G226H、G226N、K228N、K228Q、T230Q、T230H、T230N、E239Q、E239H、E239N、E240Q、E240N、T241Q、T241H、T241N、E242Q、E242H、E242N、T244Q、T244H、T244N、E245Q、E245H、E245N、K247N、K247Q、R248H、R248Q、R252H、R252Q、P255A、P255S、Y259I、K265N、K265Q、Y266I、L272I、L272V、E274Q、E274H、E274N、L275I、L275V、D276N、D276Q、E277Q、E277H、E277N、P278A、P278S、L279V、S283Q、S283H、S283N、Y284I、T286Q、T286H、T286N、P287A、P287S、D292N、D292Q、K293N、K293Q、E294Q、E294H、E294N、Y295I、T296Q、T296H、T296N、F299I、F299V、K301N、K301Q、F302I、F302V、G303Q、G303N、S304Q、S304H、S304N、Y306I、S308Q、S308H、S308N、G309Q、G309H、G309N、G311Q、G311N、R312H、R312Q、F314I、F314V、K316N、K316Q、R318H、R318Q、L321I、L321V、Y325I、R327Q、P329A、P329S、D332N、D332Q、T335Q、T335H、T335N、L337I、L337V、R338H、R338Q、S339Q、S339H、S339N、T340Q、T340H、T340N、K341N、K341Q、F342I、F342V、T343Q、T343H、T343N、Y345I、M348I、M348V、F349V、G352Q、G352H、G352N、F353V、D359N、S360Q、S360H、S360N、G363Q、G363H、G363N、D364N、D364Q、S365Q、S365H、S365N、G366Q、G366H、G366N、G367Q、G367H、G367N、P368A、P368S、T371Q、T371H、T371N、E372Q、E372H、E372N、E374Q、E374H、E374N、G375Q、G375N、T376Q、T376H、T376N、S377Q、S377H、S377N、F378I、F378V、L379V、T380Q、T380H、T380N、S384Q、S384H、S384N、G386Q、G386H、G386N、E387Q、E387N、M391V、K392N、K392Q、K394N、K394Q、Y395I、G396Q、G396H、G396N、I397Q、I397H、I397N、Y398I、T399Q、T399H、T399N、K400N、K400Q、S402Q、S402H、S402N、R403H、R403Q、Y404I、K409N、K409Q、E410Q、E410N、K411N、K411Q、T412Q、T412H、T412N、K413N、K413Q、L414I、L414V、T415Q、T415H、T415N、R252A、H268A、K293A、K400A、R403A、R403EおよびK411Aの中から選択される１つまたは複数の修飾などのような、当技術分野において知られている、任意の他の突然変異を含有することができる。
【００２６】
いくつかの場合では、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドが、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン、および／またはＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体に対する抵抗性の増加を示す。たとえば、修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の、アンチトロンビンＩＩＩおよび／またはヘパリンに対する抵抗性の増加を示すことができる。さらなる場合では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、触媒活性の増加を示す。これは、ＦＶＩＩＩａの存在下または非存在下におけるものとすることができる。たとえば、修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の触媒活性を示すことができる。
【００２７】
修飾ＦＩＸポリペプチドは、たとえばクリアランスの減少（たとえば、未修飾ＦＩＸポリペプチドのクリアランスの少なくとももしくは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）、分布容積の改変（たとえば、未修飾ＦＩＸポリペプチドの分布容積の少なくとももしくは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の減少または未修飾ＦＩＸポリペプチドの分布容積の少なくとももしくは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、もしくはそれ以上の増加）、インビボにおける回収率の増加（たとえば、未修飾ＦＩＸポリペプチドのインビボにおける回収率の少なくとももしくは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、もしくはそれ以上の）、インビボにおける総修飾ＦＩＸポリペプチド暴露の増加（たとえば、未修飾ＦＩＸポリペプチドのインビボにおける総暴露の少なくとももしくは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、もしくはそれ以上の増加）、血清半減期の増加（たとえば、未修飾ＦＩＸポリペプチドの血清半減期の少なくとももしくは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、もしくはそれ以上の）、および／または未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較した平均共鳴時間（ＭＲＴ）の増加（たとえば、未修飾ＦＩＸポリペプチドのインビボにおけるＭＲＴの少なくとももしくは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、もしくはそれ以上の増加）などのような、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して改善された薬物動態学的特性をさらに示すことができる。いくつかの場合では、改善された薬物動態学的特性が、血清半減期の増加であり、血清半減期が、α、β、ま��はγ相である。
【００２８】
いくつかの場合では、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドが、未修飾ＦＩＸポリペプチドの凝血促進活性よりも、たとえば少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上などのように、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、凝血促進活性の増加を示す。
【００２９】
いくつかの例では、未修飾ＦＩＸポリペプチドが、配列番号３において記載されるアミノ酸の配列を有する。したがって、配列番号７５〜２７２のいずれかにおいて記載されるアミノ酸の配列を有する修飾ＦＩＸポリペプチドが、本明細書において提供される。他の例では、未修飾ＦＩＸポリペプチドが、修飾（複数可）を除いて、配列番号３において記載されるポリペプチドと４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する、対立遺伝子または種変異体などのような、配列番号３において記載されるポリペプチドの変異体である。
【００３０】
いくつかの場合では、提供される修飾ＦＩＸポリペプチドが、ヒトポリペプチドである。他の場合では、それらが、非ヒトポリペプチドである。さらなる例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、成熟ポリペプチドである。単鎖および二重鎖ＦＩＸポリペプチドならびに活性または活性化ＦＩＸポリペプチドもまた、提供される。いくつかの例では、活性化が、第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）または組織因子／第ＶＩＩａ因子複合体によるタンパク質分解性の切断によって達成される。
【００３１】
いくつかの例では、提供される修飾ＦＩＸポリペプチドが、修飾された一次配列のみを有する。他の例では、化学修飾または翻訳後修飾が、含有される［たとえば、修飾ＦＩＸポリペプチドは、グリコシル化される、カルボキシル化される、ヒドロキシル化される、硫酸化される、リン酸化される、アルブミン化される（ａｌｂｕｍｉｎａｔｅ）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分にコンジュゲートされる］。キメラＦＩＸポリペプチドおよび融合ＦＩＸポリペプチドもまた、提供される。
【００３２】
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、ポリペプチドが未修飾ＦＩＸポリペプチドの少なくとも１つのＦＩＸ活性（たとえば第ＶＩＩＩａ因子結合、第Ｘ因子結合、リン脂質結合、および／または血液凝固活性）を保持する限り、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれ以上の修飾または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは６０もしくはそれ以上の修飾を含有することができる。たとえば、修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドの少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の活性を保持することができる。いくつかの例では、保持される活性が、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、増加する。他の例では、保持される活性が、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、減少する。活性は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、エクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）、またはインビボにおいて測定することができる。
【００３３】
提供される修飾ＦＩＸポリペプチドのいずれかをコードするヌクレオチドの配列を含有する核酸分子が、本明細書において提供される。核酸分子を含有するベクターもまた、提供される。ベクターは、たとえば原核生物ベクター、ウイルスベクター（たとえばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、もしくはサイトメガロウイルス）、または真核生物ベクター（たとえば哺乳動物ベクター）とすることができる。これらのベクターを含有する細胞もまた、提供される。細胞は、たとえば哺乳動物細胞［たとえばベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ−２１）または２９３細胞またはＣＨＯ細胞］などのような真核細胞とすることができる。典型的に、細胞は、修飾ＦＩＸポリペプチドを発現する。したがって、本明細書において提供される細胞のいずれかによって産生される修飾ＦＩＸポリペプチドもまた、提供される。
【００３４】
薬学的に許容可能な媒体中に治療有効濃度または量の、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドを含有する医薬組成物が、提供される。いくつかの例では、医薬組成物が、経口投与、経鼻投与、経肺投与、頬側投与、経皮投与、皮下投与、十二指腸内投与、経腸投与、非経口投与、静脈内投与、または筋肉内投与などのような局所的投与、全身投与、または局所投与用に製剤される。さらなる例では、それが、徐放性または単一投薬量投与用に製剤される。
【００３５】
対象が、提供される医薬組成物を投与することによって処置される方法であって、対象が、ＦＩＸまたは凝血促進薬の投与によって処置される疾患または状態を有する方法が提供される。いくつかの場合では、疾患または状態が、活性ＦＩＸ（ＦＩＸａ）または活性化されていないＦＩＸの投与によって処置される。いくつかの例では、医薬組成物を用いる処置が、疾患または状態と関連する症状を回復させるまたは軽減する。ＦＩＸまたは凝血促進薬の投与によって処置される疾患または状態と関連する症状における変化について対象をモニターする工程を含有する方法もまた、提供される。
【００３６】
それらの方法を使用して処置されることとなる疾患または状態は、血液凝固障害、血液障害、出血性障害、血友病、および出血障害の中から選択することができる。いくつかの例では、血友病が、血友病Ｂである。方法はまた、たとえば血漿精製もしくは組換え凝固因子、ビタミンＫ、ビタミンＫ誘導体、およびプロテインＣ阻害因子などのような凝血促進薬、血漿、血小板、赤血球、またはコルチコステロイドなどのような、１つまたは複数のさらなる凝固因子を投与することを含むことができる。
【００３７】
包装材料および包装材料内に含有される、提供される修飾ＦＩＸポリペプチドを含有する医薬組成物を含有する製品もまた、提供される。修飾ＦＩＸポリペプチドは、ＦＩＸまたは凝血促進薬の投与によって処置可能な疾患の処置に有効であり、包装材料は、修飾ＦＩＸポリペプチドが、ＦＩＸまたは凝血促進薬の投与によって処置可能な疾患の処置に使用されることを示すラベルを含む。
【００３８】
本明細書において提供される医薬組成物のいずれか、組成物の投与のためのデバイス、および所望により、投与のための説明書を含有するキットもまた、提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、血液凝固カスケードを示す。図は、ＦＸａの非依存性産生に関する血液凝固の内因性経路および外因性経路ならびに凝固形成のためにトロンビンおよびフィブリンを生成する共通経路への経路の収束を表している。これらの経路は相互接続している。図は、１つまたは複数のペプチド結合の切断によって酵素前駆体が活性型プロテアーゼに転換される活性化カスケードに関与する分子の順序を示す。次いで活性型プロテアーゼは、カスケードにおける次の酵素前駆体分子のための活性化プロテアーゼとして作用し、最終的に凝固形成をもたらす。
【図２】図２は、血液凝固の細胞に基づくモデルを示す［たとえばHoffman et al.(2001)Thromb Haemost 85:958-965を参照されたい］。図は、３つの相に分けて血液凝固イベントを示しており、血液凝固の開始はＴＦ産生細胞上のＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体によるＦＸからＦＸａへの活性化によって達成され、ＦＸａ／ＦＶａによる活性化後に少量のトロンビンの生成をもたらす。増幅はトロンビンが血小板に結合し、活性化する際に生じ、ＦＶＩＩＩａ／ＦＩＸａおよびＦＶａ／ＦＸａ複合体を形成する適切な血液凝固因子の十分な量の活性化を開始する。血液凝固の伝播は、創傷部位の多数の活性型血小板の表面で生じ、創傷部位に凝固を確立するために十分なフィブリンをフィブリノゲンから生成するために十分多量なトロンビン生成のバーストをもたらす。
【図３−１】図３は、種変異体および修飾第ＩＸ因子ポリペプチド（配列番号２〜５、１４、２０、１７２、２６７、２４７、３２５、３４６〜３４７、３６０、３６５〜３６６、４０６）を含む種々の第ＩＸ因子ポリペプチドのアライメントである。同様に含まれるのは、突然変異Ｖ８６Ａ／Ｅ２７７Ａ／Ｒ３３８Ａを含有する米国特許第７，７００，７３４号からの配列番号６および米国特許第７，１２５，８４１号からの配列番号２である。「＊」は、その行における残基またはヌクレオチドがアライメントの全ての配列において同一であることを意味し、「：」は保存的置換が認められることを意味し、「．」は、半保存的置換が認められることを意味する。本明細書において記載されるとおり配列番号３における位置に対応する残基は、配列番号３とのアライメントによって決定され得る。Ｙ１５５、Ｒ３１８、Ｒ３３８、Ｔ３４３、Ｒ４０３およびＥ４１０に対応する残基は枠で囲んで示される。
【図３−２】図３は、種変異体および修飾第ＩＸ因子ポリペプチド（配列番号２〜５、１４、２０、１７２、２６７、２４７、３２５、３４６〜３４７、３６０、３６５〜３６６、４０６）を含む種々の第ＩＸ因子ポリペプチドのアライメントである。同様に含まれるのは、突然変異Ｖ８６Ａ／Ｅ２７７Ａ／Ｒ３３８Ａを含有する米国特許第７，７００，７３４号からの配列番号６および米国特許第７，１２５，８４１号からの配列番号２である。「＊」は、その行における残基またはヌクレオチドがアライメントの全ての配列において同一であることを意味し、「：」は保存的置換が認められることを意味し、「．」は、半保存的置換が認められることを意味する。本明細書において記載されるとおり配列番号３における位置に対応する残基は、配列番号３とのアライメントによって決定され得る。Ｙ１５５、Ｒ３１８、Ｒ３３８、Ｔ３４３、Ｒ４０３およびＥ４１０に対応する残基は枠で囲んで示される。
【図３−３】図３は、種変異体および修飾第ＩＸ因子ポリペプチド（配列番号２〜５、１４、２０、１７２、２６７、２４７、３２５、３４６〜３４７、３６０、３６５〜３６６、４０６）を含む種々の第ＩＸ因子ポリペプチドのアライメントである。同様に含まれるのは、突然変異Ｖ８６Ａ／Ｅ２７７Ａ／Ｒ３３８Ａを含有する米国特許第７，７００，７３４号からの配列番号６および米国特許第７，１２５，８４１号からの配列番号２である。「＊」は、その行における残基またはヌクレオチドがアライメントの全ての配列において同一であることを意味し、「：」は保存的置換が認められることを意味し、「．」は、半保存的置換が認められることを意味する。本明細書において記載されるとおり配列番号３における位置に対応する残基は、配列番号３とのアライメントによって決定され得る。Ｙ１５５、Ｒ３１８、Ｒ３３８、Ｔ３４３、Ｒ４０３およびＥ４１０に対応する残基は枠で囲んで示される。
【図３−４】図３は、種変異体および修飾第ＩＸ因子ポリペプチド（配列番号２〜５、１４、２０、１７２、２６７、２４７、３２５、３４６〜３４７、３６０、３６５〜３６６、４０６）を含む種々の第ＩＸ因子ポリペプチドのアライメントである。同様に含まれるのは、突然変異Ｖ８６Ａ／Ｅ２７７Ａ／Ｒ３３８Ａを含有する米国特許第７，７００，７３４号からの配列番号６および米国特許第７，１２５，８４１号からの配列番号２である。「＊」は、その行における残基またはヌクレオチドがアライメントの全ての配列において同一であることを意味し、「：」は保存的置換が認められることを意味し、「．」は、半保存的置換が認められることを意味する。本明細書において記載されるとおり配列番号３における位置に対応する残基は、配列番号３とのアライメントによって決定され得る。Ｙ１５５、Ｒ３１８、Ｒ３３８、Ｔ３４３、Ｒ４０３およびＥ４１０に対応する残基は枠で囲んで示される。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
概要
Ａ．定義
Ｂ．止血およびそれにおける第ＩＸ因子の役割
１．血小板の粘着および凝集
２．凝固カスケード
ａ．開始
ｂ．増幅
ｃ．伝播
３．凝固の調節
Ｃ．第ＩＸ因子（ＦＩＸ）構造および機能
１．ＦＩＸ構造
２．ＦＩＸ翻訳後修飾
３．ＦＩＸ活性化
４．ＦＩＸ機能
５．生物製剤としてのＦＩＸ
Ｄ．修飾ＦＩＸポリペプチド
１．例示的なアミノ酸置換
ａ．グリコシル化の改変
ｉ．グリコシル化の利点
ｉｉ．グリコシル化が改変された、例示的な修飾ＦＩＸポリペプチド
（ａ）．非天然グリコシル化部位（複数可）の導入
（ｂ）．天然グリコシル化部位の排除
ｂ．ＡＴ−ＩＩＩおよびヘパリンに対する抵抗性の増加
ｉ．ＡＴ−ＩＩＩ
ｉｉ．ヘパリン
ｉｉｉ．ＡＴ−ＩＩＩおよびヘパリンに対する抵抗性が増加した、例示的なＦＩＸポリペプチド
ｃ．触媒活性を増加させるための突然変異
ｄ．ＬＲＰ結合を減少させるための突然変異
ｅ．翻訳後修飾を改変するための他の突然変異
２．組合せの修飾
ａ．活性を増加させるための修飾
ｂ．リン脂質に対する親和性を増加させるまたはコラーゲンへの結合を低下させる修飾
ｃ．阻害因子に対する抵抗性を増加させるためのさらなる修飾
ｄ．グリコシル化を改変するためのさらなる修飾
ｅ．プロテアーゼに対する抵抗性を増加させるための修飾
ｆ．免疫原性を低下させるための修飾
ｇ．例示的な組合せの修飾
３．コンジュゲートおよび融合タンパク質
Ｅ．ＦＩＸポリペプチドの産生
１．ベクターおよび細胞
２．発現系
ａ．原核生物発現
ｂ．酵母
ｃ．昆虫および昆虫細胞
ｄ．哺乳動物細胞
ｅ．植物
２．精製
３．融合タンパク質
４．ポリペプチド修飾
５．ヌクレオチド配列
Ｆ．修飾ＦＩＸポリペプチド活性の評価
１．インビトロアッセイ
ａ．グリコシル化
ｂ．他の翻訳後修飾
ｃ．タンパク質分解活性
ｄ．凝固活性
ｅ．他のタンパク質および分子への結合および／またはそれによる阻害
ｅ．リン脂質親和性
２．非ヒト動物モデル
３．臨床アッセイ
Ｇ．製剤および投与
１．製剤
ａ．投薬量
ｂ．剤形
２．修飾ＦＩＸポリペプチドの投与
３．修飾ＦＩＸポリペプチドをコードする核酸の投与（遺伝子療法）
Ｈ．治療上の使用
血友病
ａ．血友病Ｂ
ｂ．血友病Ａ
Ｊ．併用療法
Ｋ．製品およびキット
Ｌ．実施例
【００４１】
Ａ．定義
他に特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、発明（複数可）が属する分野の技術者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書における全開示を通して言及される全ての特許、特許出願、公開出願、および刊行物、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、データベース、ウェブサイト、ならびに他の出版物は、他に特に述べられない限り、それらの全体が参照によって組み込まれる。本明細書における用語について、複数の定義がある場合、本部における定義が優先される。ＵＲＬまたは他のそのような識別子もしくはアドレスが参照される場合、そのような識別子は、変化し得、また、インターネット上の特定の情報は移り変わり得るが、等価な情報は、インターネットを検索することによって見出すことができることが理解されたい。それに対する参照は、そのような情報の有用性および公的な普及を証明する。
【００４２】
本明細書において使用されるように、凝固経路または凝固カスケードは、不溶性フィブリン血餅の形成に至る、一連の活性化事象を指す。凝固カスケードまたは凝固経路において、セリンプロテアーゼの不活性タンパク質（チモーゲンとも呼ばれる）は、１つまたは複数のペプチド結合の切断によって活性プロテアーゼに変換され、次いで、これは、カスケードにおける次のチモーゲン分子のための活性化プロテアーゼとして働く。カスケードの最終タンパク質分解工程において、フィブリノーゲンは、トロンビンによってフィブリンにタンパク質分解によって切断され、次いで、これは、傷害の部位で架橋して、血餅を形成する。
【００４３】
本明細書において使用されるように、「止血」は、器官または身体部分における出血または血流の停止を指す。止血という用語は、血管傷害の後の失血を予防するための血液凝血〜続く組織修復の後の血餅の溶解の全プロセスを包含することができる。
【００４４】
本明細書において使用されるように、「凝血」または「凝固」は、不溶性フィブリン血餅の形成を指すまたは血液の凝固因子が、凝固カスケードにおいて相互作用し、不溶性フィブリン血餅の形成を最終的にもたらすプロセスを指す。
【００４５】
本明細書において使用されるように、「プロテアーゼ」は、共有結合性のペプチド結合の加水分解を触媒する酵素である。これらの名称は、チモーゲン形態ならびにその活性化単鎖形態、活性化二重鎖形態、および活性化多重鎖形態を含む。明確にするために、プロテアーゼに対する言及は、全ての形態を指す。プロテアーゼは、たとえば、それらの活性部位の触媒活性および標的基質のペプチド結合を切断するメカニズムに依存して、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼを含む。
【００４６】
本明細書において使用されるように、セリンプロテアーゼまたはセリンエンドペプチダーゼは、酵素の活性部位におけるセリン残基の存在によって特徴づけられるペプチダーゼのクラスを指す。セリンプロテアーゼは、原核生物および真核生物における消化酵素として機能するだけではなく、血液凝血および炎症を含む体内における広範囲の機能に参加する。セリンプロテアーゼによる切断のメカニズムは、セリンによる、標的ペプチド結合の求核攻撃に基づく。システイン、トレオニン、もしくはアスパラギン酸と結合した水分子または金属もまた、この役割を果たすことができる。セリン、ヒスチジン、およびアスパラギン酸の一列に並んだ側鎖は、ほとんどのセリンプロテアーゼに共通の触媒３残基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｔｒｉａｄ）を形成する。セリンプロテアーゼの活性部位は、ポリペプチド基質が結合するくぼみとして形づくられる。
【００４７】
本明細書において使用されるように、「第ＩＸ因子」またはＦＩＸポリペプチドは、組換えで産生されるポリペプチド、合成によって産生されるポリペプチド、ならびに肝臓および血液を含むが、これらに限定されない細胞または組織から抽出されたまたは単離された第ＩＸ因子ポリペプチドを含むが、これらに限定されない、任意の第ＩＸ因子ポリペプチドを指す。第ＩＸ因子について区別なく使用される代替の名称は、第９因子（Ｆａｃｔｏｒ  ９）、クリスマス因子、血漿トロンボプラスチン成分（ＰＴＣ）、凝固因子ＩＸ、および血清因子ＩＸを含む。第ＩＸ因子についての略語は、ＦＩＸおよびＦ９を含む。第ＩＸ因子は、ヒトおよび非ヒト起源の動物を含むが、これらに限定されない異なる種由来の関連ポリペプチドを含む。ヒト第ＩＸ因子（ｈＦＩＸ）は、第ＩＸ因子、対立遺伝子変異アイソフォーム［Ｔ１４８Ａ（配列番号２０もしくは３２５）またはＴ４１２Ｐ突然変異を有する対立遺伝子変異体など］、核酸からの合成分子、ヒト組織および細胞から単離されたタンパク質、ならびにその修飾形態を含む。例示的な未修飾成熟ヒト第ＩＸ因子ポリペプチドは、未修飾および野生型天然第ＩＸ因子ポリペプチド（配列番号３において記載される配列を含有するポリペプチドなど）ならびにプロペプチドおよび／またはシグナルペプチドを含む未修飾および野生型前駆体第ＩＸ因子ポリペプチド（配列番号２において記載される配列を有する前駆体ＦＩＸポリペプチドなど）を含むが、これらに限定されない。当業者は、成熟第ＩＸ因子ポリペプチド（配列番号３）の参照位置が、シグナルペプチドおよびプロペプチド配列を含有する第ＩＸ因子ポリペプチドである前駆体ＦＩＸポリペプチド配列番号２と比較した場合、４６アミノ酸残基ずつ異なることを認識するであろう。したがって、配列番号３の第１のアミノ酸残基は、配列番号２の４７番目の（第４７）アミノ酸残基「に対応する」。
【００４８】
用語「第ＩＸ因子」はまた、残基１３２Ｃおよび２８９Ｃの間でジスルフィド結合によって連結されるＦＩＸ軽鎖（配列番号２のアミノ酸４７〜１９１および配列番号３のアミノ酸１〜１４５に対応する）ならびにＦＩＸ重鎖（配列番号２のアミノ酸２２７〜４６１および配列番号３のアミノ酸１８１〜４１５に対応する）を含有する、第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）と呼ばれる第ＩＸ因子ポリペプチドの活性化形態を包含する（配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドに対応する）。ＦＩＸａは、アミノ酸残基Ｒ１４５およびＲ１８０の後のタンパク質分解性の切断によって成熟ＦＩＸポリペプチド（たとえば、配列番号３において記載されるもの）から産生される。タンパク質分解性の切断は、たとえば、活性化第ＸＩ因子（ＦＸＩａ）または組織因子／活性化第ＶＩＩ因子（ＴＦ／ＦＶＩＩａ）複合体によって、実行することができる。本明細書において提供されるＦＩＸポリペプチドは、化学修飾または翻訳後修飾などによって、さらに修飾することができる。そのような修飾は、グリコシル化、ペグ化、アルブミン化（ａｌｂｕｍｉｎａｔｉｏｎ）、ファルネシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化、および当技術分野において知られている他のポリペプチド修飾を含むが、これらに限定されない。
【００４９】
第ＩＸ因子は、ヒトおよび非ヒト種を含む、任意の種由来の第ＩＸ因子を含む。非ヒト起源のＦＩＸポリペプチドは、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ、トリ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、魚、カエル、また他の霊長動物の第ＩＸ因子ポリペプチドを含むが、これらに限定されない。非ヒト起源の例示的なＦＩＸポリペプチドは、たとえばチンパンジー（パン  トログロディテス、配列番号４）、アカゲザル（マカク  ムラッタ、配列番号５）、マウス（ムス  ムスクルス、配列番号６）、ラット（ラッタス  ノルベジクス、配列番号７）、モルモット（テンジクネズミ、配列番号８）、ブタ（サス  スクロファ、配列番号９）、イヌ（カニス  ファミリアリス、配列番号１０）、ネコ（イエネコ、配列番号１１）、ウサギ（オリクトラガス  クニクラス、配列番号１２）、ニワトリ［ガルス  ガルス（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）、配列番号１３］、雌ウシ［ボース  タウルス（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）、配列番号１４］、ヒツジ［オービス  アリエス（Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ）、配列番号１５］、カエル（ゼノパス  トロピカリス、配列番号１６）、ゼブラフィッシュ（ダニオ  レリオ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）、配列番号１７）、日本フグ（トラフグ、配列番号１８）を含む。
【００５０】
ＦＩＸポリペプチドに対する言及はまた、単鎖形態または二重鎖形態、活性を有するその切断形態をした前駆体ポリペプチドおよび成熟ＦＩＸポリペプチドをも含み、対立遺伝子変異体および種変異体、スプライス変異体によってコードされる変異体、ならびに配列番号２において記載される前駆体ポリペプチドまたはその成熟形態（配列番号３）に対して、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む、他の変異体を含む。配列番号７５〜２７２および３２６〜４１７の修飾ＦＩＸポリペプチドならびにその変異体などのような修飾ＦＩＸポリペプチドが含まれる。ＦＩＸポリペプチドのＦＶＩＩＩａ結合、第Ｘ因子結合、リン脂質結合、および／または血液凝固活性などのような、ＦＩＸの少なくとも１つの活性を保持するものもまた含まれる。活性を保持することによって、活性は、保持される活性のレベルが、検出可能な効果を得るのに十分である限り、野生型ＦＩＸと比較して、低下させるまたは増加させるなどのように、改変することができる。ＦＩＸポリペプチドは、組織特異的アイソフォームおよびその対立遺伝子変異体、核酸の翻訳によって調製される合成分子、組換え法を通しての、より短いポリペプチドのライゲーションを含む合成などのような化学合成によって生成されるタンパク質、ヒトおよび非ヒトの組織および細胞から単離されるタンパク質、キメラＦＩＸポリペプチドおよびその修飾形態を含むが、これらに限定されない。ＦＩＸポリペプチドはまた、十分な長さであるまたは完全長成熟ポリペプチドの少なくとも１つの活性（必要に応じて、活性化に際して）を保持するのに適切な領域を含む、ＦＩＸの断片または部分をも含む。ＦＩＸポリペプチドはまた、化学修飾または翻訳後修飾を含有するものおよび化学修飾または翻訳後修飾を含有しないものをも含む。そのような修飾は、ペグ化、アルブミン化、グリコシル化、ファルネシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化、および当技術分野において知られている他のポリペプチド修飾を含むが、これらに限定されない。
【００５１】
本明細書において使用されるように、対応する残基は、アライメントされた場所に存在する残基を指す。関連ポリペプチドまたは変異ポリペプチドは、当業者らに知られている任意の方法によってアライメントされる。そのような方法は、典型的に、マッチを最大限にし、マニュアルアライメントを使用するならびに入手可能な多数のアライメントプログラム（たとえばＢＬＡＳＴＰ）および当業者らに知られている他のものを使用することによるなどのような方法を含む。ポリペプチドの配列をアライメントすることによって、当業者は、指標として、保存された同一のアミノ酸残基を使用して、対応する残基を同定することができる。たとえば、第ＩＸ因子ポリペプチドの配列をアライメントすることによって、当業者は、指標として、保存された同一のアミノ酸残基を使用して、対応する残基を同定することができる。たとえば、配列番号３（成熟第ＩＸ因子）のアミノ酸位置１におけるチロシン（Ｙ１）は、配列番号２のアミノ酸位置４７におけるチロシン（Ｙ４７）に対応する。他の場合では、対応する領域を、同定することができる。たとえば、Ｇｌａドメインは、配列番号３のアミノ酸位置Ｙ１からＶ４６に、また、配列番号２のアミノ酸位置Ｙ４７からＶ９２に対応する。当業者はまた、ヒト配列および非ヒト配列の間のならびにそれらの中の対応するアミノ酸残基を見出すために、指標として保存アミノ酸残基を利用することができる。たとえば、配列番号３（ヒト）のアミノ酸残基Ｑ１１およびＰ７４は、配列番号１４（ウシ）のＲ１１およびＱ７４に対応する。対応する位置はまた、たとえばタンパク質構造のコンピューターシミュレーションアラインメントを使用することによる構造のアラインメントに基づくものとすることができる。他の場合では、対応する領域を、同定することができる。
【００５２】
本明細書において使用されるように、アミノ酸置換に関する同じ置換は、他の第ＩＸ因子ポリペプチドにおける対応する位置における、配列番号３における参照アミノ酸位置での同様の置換を指す。たとえば、配列番号３におけるアミノ酸残基Ｒ３１８でのチロシンの置換に関しての同じ置換は、配列番号１４におけるアミノ酸残基Ｒ３１９でのチロシンの置換である（たとえば図３を参照されたい）。たとえば、配列番号３におけるアミノ酸残基Ｅ４１０でのアスパラギンの置換に関する同じ置換は、配列番号３６６におけるアミノ酸残基Ｓ４１０でのアスパラギンの置換である。同じアミノ酸の置換に対する言及は、対応する位置での、置換される残基と異なるアミノ酸残基の置換を指すことが理解される。
【００５３】
本明細書において使用されるように、「プロ領域」、「プロペプチド」、または「プロ配列」は、切断されて、成熟タンパク質を産生する領域またはセグメントを指す。これは、触媒機構を遮蔽し、したがって、触媒中間体の形成を予防することによって（つまり基質結合部位を立体的に閉鎖することによって）、タンパク質分解活性を抑制するように機能するセグメントを含むことができる。プロ領域は、成熟した生物学的活性ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸の配列であり、少数のアミノ酸ほどの小さなものとすることができるまたは多重ドメイン構造とすることができる。
【００５４】
本明細書において使用されるように、「成熟第ＩＸ因子」は、シグナル配列およびプロペプチド配列を欠くＦＩＸポリペプチドを指す。典型的に、シグナル配列は、翻訳の間に、タンパク質を、小胞体（ＥＲ）−ゴルジ経路を介しての分泌に導き、ＥＲへの挿入の後に切断される。プロペプチド配列は、典型的に、タンパク質の翻訳後修飾において機能し、細胞からのタンパク質の分泌前に切断される。したがって、成熟ＦＩＸポリペプチドは、典型的に、分泌タンパク質である。一例では、成熟ヒトＦＩＸポリペプチドが、配列番号３において記載される。配列番号３において記載されるアミノ酸配列は、配列番号３が、配列番号２のアミノ酸残基１〜２８に対応するシグナル配列を欠き、また、配列番号２のアミノ酸残基２９〜４６に対応するプロペプチド配列を欠くという点で、配列番号２において記載される前駆体ポリペプチドと異なる。成熟ＦＩＸポリペプチドに対する言及は、単鎖チモーゲン形態および二重鎖形態を包含する。したがって、成熟ＦＩＸポリペプチドに対する言及はまた、ジスルフィド結合によって結合される重鎖および軽鎖を含有する二重鎖形態（配列番号２のアミノ酸１９２〜２２６に対応する活性化ペプチドを有していない）をも指す。
【００５５】
本明細書において使用されるように、ＦＩＸに関する「野生型」および「天然」は、自然界においてヒトおよび他の動物を含む生物において存在する対立遺伝子変異体を含む天然ＦＩＸ遺伝子または天然に存在するＦＩＸ遺伝子によってコードされるＦＩＸポリペプチドを指す。種に無関係の野生型第ＩＸ因子に対する言及は、任意の種の野生型第ＩＸ因子を包含するように意図される。コード前駆体ポリペプチド、その断片、ならびにシグナルペプチドを欠く成熟形態およびその任意の翻訳前または翻訳後処理形態または修飾形態などのようなその処理形態が、野生型ＦＩＸポリペプチドの中に含まれる。グリコシル化、カルボキシル化、およびヒドロキシル化による修飾を含むが、これらに限定されない、翻訳後修飾されるものもまた、天然ＦＩＸポリペプチドの中に含まれる。天然ＦＩＸポリペプチドはまた、単鎖形態および二重鎖形態をも含む。たとえば、ヒトは、天然ＦＩＸを発現する。例示的な野生型ヒトＦＩＸのアミノ酸配列は、配列番号２および３ならびにその対立遺伝子変異体において記載される。他の動物はチンパンジー（パン  トログロディテス、配列番号４）、アカゲザル（マカク  ムラッタ、配列番号５）、マウス（ムス  ムスクルス、配列番号６）、ラット（ラッタス  ノルベジクス、配列番号７）、モルモット（テンジクネズミ、配列番号８）、ブタ（サス  スクロファ、配列番号９）、イヌ（カニス  ファミリアリス、配列番号１０）、ネコ（イエネコ、配列番号１１）、ウサギ（オリクトラガス  クニクラス、配列番号１２）、ニワトリ（ガルス  ガルス、配列番号１３）、雌ウシ（ボース  タウルス、配列番号１４）、ヒツジ（オービス  アリエス、配列番号１５）、カエル（ゼノパス  トロピカリス、配列番号１６）、ゼブラフィッシュ（ダニオ  レリオ、配列番号１７）、日本フグ（トラフグ、配列番号１８）を含むが、これらに限定されない天然ＦＩＸを産生する。
【００５６】
本明細書において使用されるように、種変異体は、マウスおよびヒトなどのような異なる哺乳動物種を含む様々な種の中のポリペプチドにおける変異体を指す。
【００５７】
本明細書において使用されるように、対立遺伝子変異体は、同じ種のメンバーの中のタンパク質における変異を指す。
【００５８】
本明細書において使用されるように、スプライス変異体は、２つ以上の種類のｍＲＮＡをもたらす、ゲノムＤＮＡの転写一次産物のディファレンシャルプロセシング（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）によって産生される変異体を指す。
【００５９】
本明細書において使用されるように、チモーゲンは、活性化切断などのような成熟切断を含むタンパク質分解性の切断ならびに／または他のタンパク質（複数可）および／もしくは補因子（複数可）との複合体形成によって活性化されるプロテアーゼを指す。チモーゲンは、タンパク質分解酵素の不活性前駆体である。そのような前駆体は、必ずしも大きいというわけではないが、活性形態よりも一般に大きい。セリンプロテアーゼに関して、チモーゲンは、触媒切断および自己触媒切断を含む特異的な切断によってまたは活性酵素を生成する活性化補因子の結合によって活性酵素に変換される。たとえば、一般に、チモーゲンは、単鎖形態で存在する。チモーゲンは、一般に、不活性であり、１つまたは複数のタンパク質分解部位での触媒切断または自己触媒切断によって成熟活性ポリペプチドに変換されて、二重鎖などのような多重鎖ポリペプチドを生成することができる。したがって、チモーゲンは、活性化因子の作用によってタンパク質分解酵素に変換される酵素的に不活性なタンパク質である。切断は、自己活性化によって達成することができる。多くの凝固タンパク質は、チモーゲンであり、それらは不活性であるが、血管損傷の後の凝固系の開始に際して切断され、活性化されるようになる。ＦＩＸに関して、ＦＩＸポリペプチドは、ＦＩＸの二重鎖形態（ＦＩＸａ）を産生するために、たとえば活性化ＦＸＩ（ＦＸＩａ）またはＦＶＩＩａ（ＴＦと結合した）などのようなプロテアーゼによる切断まで、チモーゲンとして血漿中に存在する。
【００６０】
本明細書において使用されるように、活性化配列は、活性プロテアーゼを形成するために、活性化切断または成熟切断に必要とされる部位である、チモーゲンにおけるアミノ酸の配列を指す。活性化配列の切断は、自己触媒によってまたは活性化パートナーによって触媒することができる。
【００６１】
本明細書において使用されるように、活性化切断は、一種の成熟切断であり、これは、完全な酵素活性の発達に必要とされるコンホメーション変化を誘発する。これは、たとえば、切断により、キモトリプシンにおけるＡｓｐ１９４などのようなプロテアーゼの保存領域と相互作用して、活性に必要とされるコンホメーション変化を誘発する新しいＮ−末端を生成する、セリンプロテアーゼについての古典活性化経路である。活性化は、プロテアーゼの多重鎖形態の産生をもたらすことができる。いくつかの場合では、プロテアーゼの単鎖形態は、タンパク質分解活性を示すことができる。
【００６２】
本明細書において使用されるように、「活性化第ＩＸ因子」または「ＦＩＸａ」は、ＦＩＸａポリペプチドの任意の二重鎖形態を指す。二重鎖形態は典型的にタンパク質分解性の切断に起因するが、合成によって産生することができる。活性化第ＩＸ因子は、したがって、血液凝固活性が低い、チモーゲン様の二重鎖形態、ＦＶＩＩＩａおよびＦＸへの結合に際して起こる、完全に活性化された形態、ならびに完全に活性化された二重鎖形態で存在するまたは完全に活性化された形態へのコンホメーション変化を起こす突然変異形態を含む。たとえば、ＦＩＸポリペプチドの単鎖形態（たとえば配列番号３を参照されたい）は、成熟ＦＩＸポリペプチドのアミノ酸残基Ｒ１４５およびＲ１８０の後のタンパク質分解によって切断される。切断産物、ＦＩＸ重鎖およびＦＩＸ軽鎖は、ジスルフィド結合（配列番号３のＦＩＸにおけるアミノ酸残基１３２Ｃおよび２８９Ｃの間の）によって共に保持され、二重鎖活性化ＦＩＸ酵素を形成する。タンパク質分解性の切断は、たとえば活性化第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）およびＴＦと複合体の活性化第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）によって実行することができる。
【００６３】
本明細書において使用されるように、ＦＩＸポリペプチドの「特性」は、物理的または構造的特性、そのような三次元構造、ｐＩ、半減期、コンホメーション、および他のそのような物理的特徴を指す。
【００６４】
本明細書において使用されるように、ＦＩＸポリペプチドの「活性」は、第ＩＸ因子ポリペプチドによって示される任意の活性を指す。そのような活性は、インビトロおよび／またはインビボにおいて試験することができ、凝固活性もしくは血液凝固活性、凝血促進活性、第Ｘ因子（ＦＸ）活性化を達成するためのなどのようなタンパク質分解活性もしくは触媒活性；抗原性（抗ＦＩＸ抗体に結合する能力もしくはそれへの結合についてあるポリペプチドと競合する能力）；第ＶＩＩＩａ因子もしくは第Ｘ因子に結合する能力；および／またはリン脂質に結合する能力を含むが、これらに限定されない。活性は、たとえば、インビトロにおいてまたはインビボにおいて凝固を測定することによって、承認されるアッセイを使用して、インビトロにおいてまたはインビボにおいて評価することができる。そのようなアッセイの結果は、ポリペプチドが、インビボにおけるポリペプチドの活性に相互に関連し得る活性を示すことを示し、インビボ活性は、生物学的活性と呼ぶことができる。ＦＩＸの修飾形態の機能性または活性を決定するためのアッセイは、当業者らに知られている。ＦＩＸポリペプチドの活性を評価するための例示的なアッセイは、血液凝固活性を評価するためのプロトロンボプラスチン時間（ＰＴ）アッセイもしくは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイまたは触媒活性もしくはタンパク質分解活性を評価するための、合成基質を使用する発色アッセイを含む。
【００６５】
本明細書において使用されるように、「少なくとも１つの活性を示す」または「少なくとも１つの活性を保持する」は、同じ条件下で同じ形態の未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較した、修飾ＦＩＸポリペプチドによって示される活性を指す。たとえば、二重鎖形態の修飾ＦＩＸポリペプチドは、同じ実験条件下で、二重鎖形態の未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較され、２つのポリペプチドの間の唯一の差異は、研究中の修飾である。他の例では、単鎖形態の修飾ＦＩＸポリペプチドは、同じ実験条件下で、単鎖形態の未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較され、２つのポリペプチドの間の唯一の差異は、研究中の修飾である。典型的に、同じ形態の未修飾ＦＩＸポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持するまたは示す修飾ＦＩＸポリペプチドは、インビボにおいて投与された場合、修飾ＦＩＸポリペプチドが、凝血促進治療薬として治療的に有効となるのに十分な量の活性を保持する。一般に、凝血促進薬としての治療的効能を保持するための修飾ＦＩＸポリペプチドについて、保持される活性の量は、凝血促進薬としての治療的効能を示す同じ形態の未修飾ＦＩＸポリペプチドの活性の０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、もしくはそれ以上またはその前後である。必要であれば、凝血促進薬としての治療的効能を維持するために必要とされる活性の量は、経験的に決定することができる。典型的に、活性の０．５％〜２０％、０．５％〜１０％、０．５％〜５％の保持は、インビボにおいて凝血促進薬としての治療的効能を保持するのに十分である。
【００６６】
修飾ＦＩＸポリペプチドによって示されるまたは保持される活性は、凝固活性もしくは血液凝固活性、凝血促進活性；第Ｘ因子（ＦＸ）活性化を達成するためのなどのようなタンパク質分解活性もしくは触媒活性；抗原性（抗ＦＩＸ抗体に結合する能力もしくはそれへの結合についてあるポリペプチドと競合する能力）；第ＶＩＩＩａ因子もしくは第Ｘ因子に結合する能力；および／またはリン脂質に結合する能力を含むが、これらに限定されない任意の活性とすることができることが理解される。いくつかの場合では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、増加した活性を保持することができる。いくつかの場合では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、減少した活性を保持することができる。修飾ＦＩＸポリペプチドの活性は、問題の修飾を含有していないポリペプチドと比較して、１％の活性、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の活性を含むが、これらに限定されない、未修飾ポリペプチドの活性のうちの任意のレベルの百分率とすることができ、両方のポリペプチドは、同じ形態をしている。たとえば、修飾ＦＩＸポリペプチドは、同じ形態をした未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、増加したまたは減少した活性を示すことができる。たとえば、それは、未修飾ＦＩＸポリペプチドの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％の活性を保持することができる。他の実施形態では、活性における変化が、未修飾ＦＩＸよりも、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、またはそれ以上大きい。保持されることとなる特定のレベルは、ポリペプチドの意図される使用についての関数であり、経験的に決定することができる。活性は、たとえば、本明細書において記載されるものなどのようなインビトロアッセイまたはインビボアッセイを使用して、測定することができる。
【００６７】
本明細書において使用されるように、「凝固活性」または「血液凝固活性」または「凝血促進活性」は、ポリペプチドが凝固を達成する能力を指す。血液凝固活性を評価するためのアッセイは、当業者らに知られており、プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイまたは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイを含む。
【００６８】
本明細書において使用されるように、ＦＩＸに関する「触媒活性」または「タンパク質分解活性」は、ＦＩＸタンパク質が、基質のタンパク質分解性の切断を触媒する能力を指し、区別なく使用される。そのような活性を評価するためのアッセイは、当技術分野において知られている。たとえば、ＦＩＸのタンパク質分解活性は、Ｍｅｓ−Ｄ−ＣＨＤ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣなどのような発色基質を使用して測定することができ、基質の切断は、線形回帰によって決定される吸光度および基質加水分解の速度によってモニターされる。
【００６９】
本明細書において使用されるように、ドメイン（典型的に、３またはそれ以上、一般に、５または７またはそれ以上のアミノ酸の配列）は、構造的におよび／または機能的に分子の他の部分と異なり、同定可能である、タンパク質またはコード核酸などのような分子の部分を指す。たとえば、ドメインは、１つもしくは複数の構造モチーフから構成されるタンパク質内で、独立して折り畳まれた構造を形成することができるおよび／またはタンパク質分解活性などのような機能的活性により認識される、ポリペプチド鎖のそれらの部分を含む。タンパク質は、１つまたは２つ以上の異なるドメインを有することができる。たとえば、ドメインは、プロテアーゼドメインまたはｇｌａドメインを定めるモチーフに対する相同性などのような、関連するファミリーメンバーに対する、その中の配列の相同性によって、同定する、定める、または区別することができる。他の例において、ドメインが、タンパク質分解活性など、その機能によってまたはＤＮＡ結合、リガンド結合、および二量体化などのような、生体分子と相互作用する能力によって区別することができる。ドメインは、ドメインが、独立してまたは他の分子に融合して、たとえばタンパク質分解活性またはリガンド結合などのような活性を実行することができるように、独立して、生物学的機能または生物学的活性を示すことができる。ドメインは、アミノ酸の線状配列またはアミノ酸の非線状配列とすることができる。多くのポリペプチドは、複数のドメインを含有する。そのようなドメインは、知られており、当業者らによって同定することができる。本明細書における例証のために、定義は、提供されるが、名称によって特定のドメインを認識することは、当技術分野における技術の範囲内に十分にあることが理解されたい。必要に応じて、適切なソフトウェアを、ドメインを同定するために利用することができる。
【００７０】
本明細書において使用されるように、プロテアーゼドメインは、プロテアーゼの触媒活性部分である。プロテアーゼのプロテアーゼドメインに対する言及は、これらのタンパク質のいずれかの単鎖形態、二重鎖形態、および多重鎖形態を含む。タンパク質のプロテアーゼドメインは、たとえば触媒中心などのような、そのタンパク質分解活性に必要とされる、そのタンパク質の必須の特性を全て含有する。ＦＩＸに関して、プロテアーゼドメインは、触媒３残基を含めて、キモトリプシン／トリプシンファミリープロテアーゼドメインと、相同性および構造的特徴を共有する。たとえば、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドにおいて、プロテアーゼドメインは、アミノ酸位置１８１〜４１２に対応する。
【００７１】
本明細書において使用されるように、ガンマ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）ドメインは、タンパク質、たとえば、Ｇｌａを形成するためのビタミンＫ依存性カルボキシル化による、グルタミン酸残基、一般に、全てではないが、ほとんどのグルタミン酸残基の翻訳後修飾を含有するビタミンＫ依存性タンパク質の部分を指す。Ｇｌａドメインは、カルシウムイオンの高親和性結合および負電荷リン脂質への結合を担う。典型的に、Ｇｌａドメインは、ビタミンＫ依存性タンパク質の成熟形態のＮ−末端で始まり、保存芳香族残基で終わる。成熟ＦＩＸポリペプチドにおいて、Ｇｌａドメインは、配列番号３において記載される例示的なポリペプチドのアミノ酸位置１〜４６に対応する。Ｇｌａドメインは、十分に知られており、それらの場所は、特定のポリペプチドにおいて同定することができる。様々なビタミンＫ依存性タンパク質のＧｌａドメインは、Ｎ−末端の疎水性残基の、細胞表面膜上の負電荷リン脂質との相互作用を媒介する疎水性パッチへのクラスタリングを含めて、配列相同性、構造的相同性、および機能的相同性を共有する。例示的な他のＧｌａ含有ポリペプチドは、ＦＶＩＩ、ＦＸ、プロトロンビン、プロテインＣ、プロテインＳ、オステオカルシン、マトリックスＧｌａタンパク質、成長停止特異的タンパク質６（Ｇａｓ６）、およびプロテインＺを含むが、これらに限定されない。
【００７２】
本明細書において使用されるように、上皮成長因子（ＥＧＦ）ドメイン（ＥＧＦ−１またはＥＧＦ−２）は、上皮成長因子（ＥＧＦ）配列の特異的な３０〜４０のアミノ酸部分に対して配列相同性を共有する、タンパク質の部分を指す。ＥＧＦドメインは、ジスルフィド結合に関与することが示された（ＥＧＦにおいて）、６つのシステイン残基を含む。ＥＧＦドメインの主な構造は、Ｃ−末端の短い二本鎖シートへのループが後続する二本鎖ベータシートである。ＦＩＸは、２つのＥＧＦドメイン：ＥＧＦ−１およびＥＧＦ−２を含有する。これらのドメインは、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドの、アミノ酸位置４７〜８３および８４〜１２５にそれぞれ対応する。
【００７３】
本明細書において使用されるように、「未修飾ポリペプチド」または「未修飾ＦＩＸ」およびその文法的な変化形は、本明細書において提供される修飾のために選択される出発ポリペプチドを指す。出発ポリペプチドは、ポリペプチドの天然に存在する野生型形態とすることができる。さらに、出発ポリペプチドは、それが、天然野生型アイソフォームと異なるように、改変するまたは変異させることができるが、それにもかかわらず、本明細書において産生される、引き続いて修飾されるポリペプチドと比較して、出発未修飾ポリペプチドと本明細書において呼ばれる。したがって、未修飾参照タンパク質と比較して、特定の活性または特性における望ましい増加または減少を有するように修飾された、当技術分野において知られている既存のタンパク質は、出発未修飾ポリペプチドとして選択し、使用することができる。たとえば、グリコシル化を改変するための１つまたは複数のアミノ酸残基における変化などのように、１つまたは複数の単一アミノ酸変化によってその天然形態から修飾され、望ましい特性における増加または減少のいずれかを有するタンパク質は、同じまたは異なる特性のさらなる修飾のための、本明細書において未修飾と呼ばれる、標的タンパク質とすることができる。当技術分野において知られている例示的な修飾ＦＩＸポリペプチドは、たとえばSchuettrumpf et al., (2005) Blood 105(6):2316-23;Melton et al., (2001) Blood Coagul. Fibrinolysis 12(4):237-43;Cheung et al., (1992) J. Biol. Chem. 267:20529-20531;Cheung et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:11068-11073;Hopfner et al., (1997) EMBO J. 16:6626-6635;Sichler et al., (2003) J. Biol. Chem. 278:4121-4126;Begbie et al., (2005) Thromb. Haemost. 94(6):1138-47;Chang, J. et al., (1998) J. Biol. Chem. 273(20):12089-94;Yang, L. et al., (2002) J. Biol. Chem. 277(52):50756-60;Yang, L. et al., (2003) J. Biol. Chem. 278(27):25032-8；米国特許第５９６９０４０号、第５６２１０３９号、第６４２３８２６号、第７１２５８４１号、第６０１７８８２号、第６５３１２９８号；米国特許出願公開第２００３０２１１０９４号、第２００７０２５４８４０号、第２００８０１８８４１４号、第２００８０００４２２号、第２００８００５０７７２号、第２００８０１４６４９４号、第２００８００５０７７２号、第２００８０１８７９５５号、第２００４０２５４１０６号、第２００５０１４７６１８号、第２００８０２８０８１８号、第２００８０１０２１１５号、第２００８０１６７２１９号、および第２００８０２１４４６１号；ならびに国際特許出願公開ＷＯ２００７１１２００５、ＷＯ２００７１３５１８２、ＷＯ２００８０８２６１３、ＷＯ２００８１１９８１５、ＷＯ２００８１１９８１５、ＷＯ２００７１４９４０６、ＷＯ２００７１１２００５、およびＷＯ２００４１０１７４０において記載される任意のＦＩＸポリペプチドを含む。
【００７４】
本明細書において使用されるように、「修飾第ＩＸ因子ポリペプチド」および「修飾第ＩＸ因子」は、未修飾第ＩＸ因子ポリペプチドと比較して、１つまたは複数のアミノ酸差異を有するＦＩＸポリペプチドを指す。１つまたは複数のアミノ酸差異は、１つもしくは複数のアミノ酸置換（交換）、アミノ酸挿入、もしくはアミノ酸欠失などのようなアミノ酸突然変異とすることができるまたは全ドメインの挿入もしくは欠失およびその任意の組合せとすることができる。典型的に、修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、一次配列における１つまたは複数の修飾を有する。たとえば、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、またはそれ以上のアミノ酸差異を有することができる。任意の修飾は、結果として生じるポリペプチドが、たとえば触媒活性、タンパク質分解活性、ＦＶＩＩＩａに結合する能力、またはリン脂質に結合する能力などのような、天然ＦＩＸポリペプチドと関連する、少なくとも１つのＦＩＸ活性を示す限り、企図される。
【００７５】
本明細書において使用されるように、「アンチトロンビンＩＩＩ」または「ＡＴ−ＩＩＩ」は、セリンプロテアーゼ阻害因子（セルピン）である。ＡＴ−ＩＩＩは、分泌の間に切断されて、４３２アミノ酸の成熟アンチトロンビン（配列番号２２）を放出する、４６４のアミノ酸残基（配列番号２１）を含有する前駆体タンパク質として合成される。
【００７６】
本明細書において使用されるように、「ヘパリン」は、抗凝固特性を有する、直鎖で、高度に硫酸化されたグリコサミノグリカンのうちの、異成分からなるグループを指す。ヘパリンは、ＡＴ−ＩＩＩに結合して、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体を形成することができる。
【００７７】
本明細書において使用されるように、「ＡＴ−ＩＩＩおよび／またはヘパリンに対する抵抗性の増加」は、未修飾ＦＩＸポリペプチドなどのような参照ポリペプチドと比較した、ＡＴ−ＩＩＩのみ、ヘパリンのみ、および／またはＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体の阻害効果に対する、修飾ＦＩＸポリペプチドなどのようなポリペプチドの感受性の減少についての任意の量を指す。ＡＴ−ＩＩＩ、ヘパリン、および／またはＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体に対する抵抗性の増加は、ＡＴ−ＩＩＩ、ヘパリン、および／またはＡＴ−ＩＩＩ複合体に対する修飾ＦＩＸポリペプチドの結合を評価することによって、アッセイすることができる。抵抗性の増加はまた、ＡＴ−ＩＩＩ、ヘパリン、またはＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体の存在下において、ＦＩＸポリペプチドの触媒または血液凝固活性の阻害を測定することによって、アッセイすることができる。阻害因子へのポリペプチドの結合または阻害因子によるポリペプチドの酵素活性の阻害を決定するためのアッセイは、当技術分野において知られている。たとえばＡＴ−ＩＩＩまたはＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体などのような、共有結合性の阻害因子について、阻害についての二次速度定数を測定することができる。たとえばヘパリンなどのような、非共有結合性の阻害因子について、ｋｉを測定することができる。さらに、ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサー機器でなどのような表面プラズマ共鳴もまた、１つまたは複数の定められる条件を使用して、ＡＴ−ＩＩＩ、ヘパリン、および／またはＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体へのＦＩＸポリペプチドの結合を測定するために使用することができる。しかしながら、ＡＴ−ＩＩＩまたはＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体などのような共有結合性の阻害因子については、結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）のみをＢＩＡｃｏｒｅを使用して測定することができ、ヘパリンなどのような非共有結合性の阻害因子については、結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）および解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）の両方を測定することができる。ＦＩＸ血液凝固活性に対するたとえばＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンの阻害効果を決定するためのアッセイもまた、当技術分野において知られている。たとえば、修飾ＦＩＸポリペプチドが、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンの存在下または非存在下においてその基質ＦＸを切断する能力を測定することができ、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンが反応を阻害する程度を決定することができる。これは、ＡＴ−ＩＩＩの存在下または非存在下において、未修飾ＦＩＸポリペプチドがその基質ＦＸを切断する能力と比較することができる。その代わりに、ＦＩＸポリペプチドの阻害についての二次速度定数を測定し、未修飾ＦＩＸポリペプチドの阻害についての二次速度定数と比較することができる。阻害についての二次速度定数を比較する場合、阻害に対する抵抗性の増加は、阻害の二次速度定数の減少を意味する。ＡＴ−ＩＩＩおよび／またはヘパリンに対する抵抗性の増加を示す修飾ポリペプチドは、未修飾ポリペプチドと比較して、たとえば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の、それぞれＡＴ−ＩＩＩ、ヘパリン、および／またはＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体の効果に対する抵抗性の増加を示す。
【００７８】
本明細書において使用されるように、補因子は、他の特異的なタンパク質または分子に結合して、活性複合体を形成するタンパク質または分子を指す。いくつかの例では、補因子への結合が、最適なタンパク質分解活性に必要とされる。たとえば、ＦＶＩＩＩａは、ＦＩＸａの補因子である。ＦＩＸａへのＦＶＩＩＩａの結合は、その基質（ＦＸ）に対するＦＩＸａのタンパク質分解活性の増加をもたらすコンホメーション変化を誘発する。
【００７９】
本明細書において使用されるように、グリコシル化部位は、炭水化物部分を付加することができる、ポリペプチドにおけるアミノ位置を指す。典型的に、グリコシル化タンパク質は、炭水化物部分の付加のために、アスパラギンまたはセリンなどのような１つまたは複数のアミノ酸残基を含有する。
【００８０】
本明細書において使用されるように、天然グリコシル化部位は、炭水化物部分が野生型ポリペプチドにおいて付加されるアミノ酸の位置を指す。ＦＩＸにおいて６つの天然グリコシル化部位；配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドにおけるアミノ酸位置に対応するＮ１５７およびＮ１６７での２つのＮ−グリコシル化部位ならびにＳ５３、Ｓ６１、Ｔ１５９、Ｔ１６９、Ｔ１７２、およびＴ１７９での６つのＯ−グリコシル化部位がある。
【００８１】
本明細書において使用されるように、非天然グリコシル化部位は、野生型ポリペプチドにおいて存在しない、修飾ポリペプチドにおいて炭水化物部分が付加されるアミノ酸の位置を指す。非天然グリコシル化部位は、アミノ酸置換によってＦＩＸポリペプチドの中に導入することができる。Ｏ−グリコシル化部位は、たとえば、天然残基のセリンまたはトレオニンとのアミノ酸置換によって、生成することができる。Ｎ−グリコシル化部位は、たとえば、モチーフＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｃｙｓを確立することによって、生成することができ、ここで、Ｘａａは、プロリンではない。アミノ酸修飾によるこのコンセンサス配列の生成は、たとえば、天然アミノ酸残基のアスパラギンとの単一アミノ酸置換、天然アミノ酸残基のセリン、トレオニン、もしくはシステインとの単一アミノ酸置換、または天然残基のアスパラギンとの第１のアミノ酸置換および天然残基のセリン、トレオニン、もしくはシステインとの第２のアミノ酸置換を含む二重アミノ酸置換を含むことができる。
【００８２】
本明細書において使用されるように、「グリコシル化のレベルの増加」およびその任意の文法的な変化形は、参照ポリペプチドまたはタンパク質と比較した、ポリペプチドに連結された炭水化物の量の増加を指す。炭水化物は、Ｎ結合型、Ｏ結合型、Ｃ結合型とすることができるまたは任意の他の連結によって付加することができる。グリコシル化のレベルは、未修飾ポリペプチドのグリコシル化のレベルと比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上、増加させることができる。ポリペプチドのグリコシル化のレベル（つまり炭水化物の量）を決定するためのアッセイは、当技術分野において知られている。たとえば、炭水化物含有量またはグリコシル化のレベルは、高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー、蛍光体支援炭水化物電気泳動（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅａｓｓｉｓｔｅｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（ＦＡＣＥ）、連続的なエキソグリコシダーゼ消化、質量分析、ＮＭＲ、ゲル電気泳動、または本明細書において記載されるもしくは当技術分野において知られている任意の他の方法によって評価することができる。
【００８３】
本明細書において使用されるように、「生物学的活性」は、化合物、組成物、または他の混合物のインビボ投与に際して結果として生じる、化合物のインビボ活性または生理学的応答を指す。したがって、生物学的活性は、そのような化合物、組成物、および混合物の治療上の効果および医薬活性を包含する。生物学的活性は、そのような活性を試験するまたは使用するために設計されるインビトロ系において観察することができる。したがって、本明細書における目的上、ＦＩＸポリペプチドの生物学的活性は、血液凝固活性を包含する。
【００８４】
本明細書において使用されるように、薬物動態学的特性は、身体における、ＦＩＸポリペプチドなどのような薬剤または作用物質の作用に関連する特性、特に、薬剤が身体に吸収され、分布し、代謝され、排除される速度を指す。薬物動態は、様々なパラメーターによって評価することができる。これらは、クリアランス、分布容積、インビボ回収率、インビボにおける総修飾ＦＩＸポリペプチド暴露、血清半減期、および平均共鳴時間（ＭＲＴ）を含むが、これらに限定されない。ポリペプチドの薬物動態学的特性は、たとえば、ヒトまたは動物モデルへのポリペプチドの投与および様々な時点での身体におけるＦＩＸの量の評価などのような、当技術分野においてよく知られている方法を使用して評価することができる。クリアランス、分布容積、インビボ回収率、インビボにおける総修飾ＦＩＸポリペプチド暴露、血清半減期、および平均共鳴時間（ＭＲＴ）などのような様々なパラメーターは、当技術分野においてよく知られており、本明細書において記載される計算を使用して評価される。
【００８５】
本明細書において使用されるように、「薬物動態学的特性の改善」は、たとえば未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較した、修飾ＦＩＸポリペプチドなどのようなポリペプチドの薬物動態学的特性における望ましい変化を指す。変化は、増加または減少とすることができる。
【００８６】
本明細書において使用されるように、クリアランスは、投与の後の、対象の身体からの、ポリペプチドなどのような作用物質の除去を指す。クリアランスは、実施例６において記載されるものなどのような、当技術分野においてよく知られている方法を使用して評価することができる。たとえば、ＦＩＸポリペプチドをマウスに投与するアッセイを実行することができ、身体からのポリペプチドのクリアランスは、様々な時点で血漿中のＦＩＸの量を測定し、用量／ＡＵＣ０−ｉｎｆとしてクリアランスを計算することによって、評価することができる。未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較した、修飾ＦＩＸポリペプチドのクリアランスの改善は、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較した、修飾ＦＩＸポリペプチドのクリアランスにおける減少を指す。修飾ＦＩＸポリペプチドのクリアランスは、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％まで減少し得る。
【００８７】
本明細書において使用されるように、平均共鳴時間（ＭＲＴ）は、ＦＩＸポリペプチドが投与の後に身体において存在する時間を指す。ＭＲＴは、実施例６において記載されるものなどのような、当技術分野においてよく知られている方法を使用して評価することができる。たとえば、ＦＩＸポリペプチドをマウスに投与するアッセイを実行することができ、ポリペプチドのＭＲＴは、様々な時点で血漿中のＦＩＸの量を測定し、ＡＵＭＣ０−ｌａｓｔ／ＡＵＣ０−ｌａｓｔとしてＭＲＴを計算することによって評価することができ、ＡＵＣ０−ｌａｓｔは、曲線下面積の合計であり、ＡＵＭＣ０−ｌａｓｔは、１次モーメント曲線下面積の合計である。未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較した、修飾ＦＩＸポリペプチドのＭＲＴの改善は、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較した、修飾ＦＩＸポリペプチドのＭＲＴにおける増加を指す。修飾ＦＩＸポリペプチドのＭＲＴは、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上まで増加することができる。
【００８８】
本明細書において使用されるように、インビボ回収率は、投与されるＦＩＸポリペプチドの総量に関して、投与の後のある期間の後に循環において検出可能なＦＩＸポリペプチドの百分率を指す。インビボ回収率は、実施例６において記載されるものなどのような、当技術分野においてよく知られている方法を使用して評価することができる。たとえば、ＦＩＸポリペプチドをマウスに投与するアッセイを実行することができ、評価されるポリペプチドのインビボ回収率は、Ｃｍａｘでの血漿中のＦＩＸの量を測定し、それを、投与されたＦＩＸの量と比較するによって評価することができる。未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較した、修飾ＦＩＸポリペプチドのインビボ回収率の改善は、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較した、修飾ＦＩＸポリペプチドのインビボ回収率における増加を指す。修飾ＦＩＸポリペプチドのインビボ回収率は、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上まで増加することができる。
【００８９】
本明細書において使用されるように、血漿半減期（ｔ１／２）は、ＦＩＸポリペプチドの排除半減期またはＦＩＸポリペプチドの血漿濃度がその最初のまたは投与の後の最大の濃度の２分の１に達した時間を指す。血漿半減期への言及は、α−、β−、および／またはγ−相の間の血漿半減期を含む。血漿半減期は、実施例６において記載されるものなどのような、当技術分野においてよく知られている方法を使用して評価することができる。たとえば、ＦＩＸポリペプチドをマウスに投与するアッセイを実行することができ、ポリペプチドの血漿半減期は、様々な時点で血漿中のＦＩＸの量を測定することによって評価することができる。Ｔ１／２βは、たとえば、血漿ＦＩＸ濃度対時間曲線の対数線形プロットの終末相（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｈａｓｅ）の間の、負の傾きによって割った−ｌｎ２として計算される。未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較した、修飾ＦＩＸポリペプチドの血漿半減期の改善は、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較した、修飾ＦＩＸポリペプチドの血漿半減期における増加を指す。修飾ＦＩＸポリペプチドの血漿半減期は、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上まで増加することができる。
【００９０】
本明細書において使用されるように、インビボにおける暴露は、投与されたＦＩＸポリペプチドの濃度時間曲線下の血漿面積またはＡＵＣに関しての、投与の後の循環におけるＦＩＸポリペプチドの量を指す。インビボにおける暴露は、実施例６において記載されるものなどのような、当技術分野においてよく知られている方法を使用して評価することができる。たとえば、ＦＩＸポリペプチドをマウスに投与するアッセイを実行することができ、ポリペプチドのインビボ回収率は、様々な時点で血漿中のＦＩＸの量（つまりＡＵＣ）を測定し、それを、投与されたＦＩＸの量と比較するによって評価することができる。未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較した、修飾ＦＩＸポリペプチドのインビボにおける暴露の改善は、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較した、修飾ＦＩＸポリペプチドのインビボにおける暴露における増加を指す。修飾ＦＩＸポリペプチドのインビボにおける暴露は、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上まで増加することができる。
【００９１】
本明細書において使用されるように、分布容積は、投与の後の、血漿および身体の残りの間のＦＩＸポリペプチドの分布を指す。それは、血漿においてポリペプチドの観察される濃度をもたらすように、ポリペプチドの量が均一に分布する必要がある容積として定義される。分布容積は、実施例６において記載されるものなどのような、当技術分野においてよく知られている方法を使用して評価することができる。たとえば、定常状態分布容積（ＭＲＴ＊Ｃｌとして計算される）であるＶｓｓおよび終末消失定数（β）に基づく分布容積［Ｃｌ／（ｌｎ２／Ｔ１／２β）として計算］であるＶｚは、ＦＩＸポリペプチドをマウスに投与するアッセイにおいて評価することができ、血漿におけるＦＩＸの濃度は、様々な時点で決定される。未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較した、修飾ＦＩＸポリペプチドの分布容積の改善は、クリアランスについてのタンパク質のメカニズムおよび安全性プロファイルに依存して、修飾ＦＩＸポリペプチドの分布容積における増加または減少のいずれかを指すことができる。たとえば、ポリペプチドが複数のコンパートメントの中で分布する場合、修飾ＦＩＸポリペプチドの分布容積の減少は、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、対象のコンパートメントにおける薬剤暴露および活性の有意な増加をもたらすことができる（たとえば血管コンパートメント対血管外コンパートメント）。他の場合では、たとえば、薬剤安全性がＣｍａｘによって制限される場合、他のコンパートメントへの再分布（たとえば内皮細胞の表面への結合）は、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、対象のコンパートメント内のより長い終末半減期および／または作用持続時間ならびに優れた安全性プロファイルをもたらし得る。修飾ＦＩＸポリペプチドの分布容積は、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％減少し得る。他の例では、修飾ＦＩＸポリペプチドの分布容積が、未修飾ＦＩＸポリペプチドの分布容積の少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上まで増加する。
【００９２】
本明細書において使用されるように、用語「評価する」およびその文法的な変化形は、ポリペプチドの活性についての絶対値を得るという意味でおよびまた活性のレベルを示す指数、比、百分率、視覚的値、または他の値を得るという意味でも、定量的決定および定質的決定を含むように意図される。評価は、直接的または間接的なものであってもよい。たとえば、ポリペプチドによる基質の切断の検出は、産物の直接的な測定によるものとすることができるまたは切断された基質の結果として生じる活性を決定することによって間接的に測定することができる。
【００９３】
本明細書において使用されるように、「キモトリプシンナンバリング」は、配列番号１９の成熟ウシキモトリプシンポリペプチドのアミノ酸ナンバリングを指す。たとえば第ＩＸ因子のプロテアーゼドメインなどのような他のプロテアーゼのプロテアーゼドメインのアラインメントは、キモトリプシンを用いてなすことができる。そのような場合、キモトリプシンのアミノ酸に対応する、第ＩＸ因子のアミノ酸は、キモトリプシンアミノ酸のナンバリングが与えられる。対応する位置は、マニュアルアライメントを使用してまたは入手可能な多数のアライメントプログラムを使用することによって（たとえばＢＬＡＳＴＰ）、当業者によって、そのようなアライメントによって決定することができる。対応する位置はまた、たとえばタンパク質構造のコンピューターシミュレーションアラインメントを使用することによる構造のアラインメントに基づくものとすることができる。ポリペプチドのアミノ酸が開示される配列におけるアミノ酸に対応するという記載は、ＧＡＰアルゴリズムなどのような標準的なアライメントアルゴリズムを使用して、同一性または相同性を最大にするための、開示される配列とのポリペプチドのアライメント（保存アミノ酸がアライメントされる）に際して同定されるアミノ酸を指す。配列番号３において記載されるＦＩＸポリペプチドのアミノ酸位置１８１〜４１５の対応するキモトリプシンナンバーは、表１において提供される。配列番号３において記載される配列と比較したアミノ酸位置は、標準のフォントとし、それらの位置のアミノ酸残基は、太字とし、対応するキモトリプシンナンバーは、イタリック体とする。たとえば、成熟キモトリプシン（配列番号１９）との成熟第ＩＸ因子（配列番号３）のアライメントに際して、第ＩＸ因子におけるアミノ酸位置１８１のバリン（Ｖ）は、Ｖ１６のキモトリプシンナンバリングが与えられる。続くアミノ酸は、それに応じてナンバリングされる。一例では、成熟第ＩＸ因子（配列番号３）のアミノ酸位置２１３のグルタミン酸（Ｅ）は、キモトリプシンナンバリングに基づいてアミノ酸位置Ｅ４９に対応する。残基が、プロテアーゼにおいて存在するが、キモトリプシンにおいて存在しない場合、アミノ酸残基は文字表記が与えられる。たとえば、キモトリプシンナンバリングによるＡ９５ａおよびＡ９５ｂは、成熟第ＩＸ因子配列（配列番号３）に関するナンバリングによるＡ２６１およびＡ２６２にそれぞれ対応する。
【００９４】
表1. 第IX因子のキモトリプシンナンバリング
【表１−１】
0006027221.tif 000002
【表１−２】
0006027221.tif 000003
【００９５】
本明細書において使用されるように、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ならびにペプチド核酸（ＰＮＡ）およびその混合物を含むその類似体を含む。核酸は、一本鎖または二本鎖とすることができる。蛍光または放射ラベルなどの検出可能なラベルなどを用いて所望によりラベルされるプローブまたはプライマーを指す場合、一本鎖分子が、企図される。そのような分子は、典型的に、それらの標的が、統計的にユニークとなるような長さであるまたはライブラリーのプロービングもしくはプライミングのために低コピー数（典型的に５未満、一般に３未満）のものとする。一般に、プローブまたはプライマーは、対象の遺伝子と相補的なまたは同一の配列の少なくとも１４、１６、または３０の連続ヌクレオチドを含有する。プローブおよびプライマーは、１０、２０、３０、５０、１００、またはそれ以上の核酸長とすることができる。
【００９６】
本明細書において使用されるように、ペプチドは、２〜４０のアミノ酸長であるポリペプチドを指す。
【００９７】
本明細書において使用されるように、本明細書において提供されるアミノ酸の様々な配列において生じるアミノ酸は、それらの知られている３文字または１文字の略語に従って同定される（表２）。様々な核酸断片において生じるヌクレオチドは、当技術分野においてルーチン的に使用される標準的な単一の文字の名称を用いて命名される。
【００９８】
本明細書において使用されるように、「アミノ酸」は、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物である。ポリペプチドは、２つまたはそれ以上のアミノ酸を含有する。本明細書における目的上、アミノ酸は、２０の天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸、およびアミノ酸類似体（つまりα−炭素が側鎖を有するアミノ酸）を含む。
【００９９】
J. Biol. Chem., 243:3557-3559 (1968)、および適合する米国特許法施行規則§§１．８２１〜１．８２２に記載される標準的なポリペプチド命名法に合わせて、アミノ酸残基についての略語を表２Ａに示す。
【０１００】
表2A-対応の表
【表２−１】
0006027221.tif 000004
【０１０１】
本明細書における式によって表される全てのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシル末端への従来の方向に、左から右への配向を有することに留意されたい。さらに、語句「アミノ酸残基」は、対応の表（表２）において列挙されるアミノ酸ならびに米国特許法施行規則§§１．８２１〜１．８２２において言及されるものおよび参照によって本明細書において組み込まれるものなどのような修飾アミノ酸および例外的なアミノ酸を含むように、広く定義される。アミノ酸残基配列の始まりまたは終わりのダッシュは、１つまたは複数のアミノ酸残基のさらなる配列に対する、ＮＨ２などのようなアミノ末端基に対する、またはＣＯＯＨなどのようなカルボキシル末端基に対するペプチド結合を示すことに留意されたい。
【０１０２】
本明細書において使用されるように、「天然に存在するアミノ酸」は、ポリペプチドにおいて生じる２０種のＬ−アミノ酸を指す。
【０１０３】
本明細書において使用されるように、「非天然アミノ酸」は、表２において列挙される天然に存在するアミノ酸のうちの１つではない、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物を指す。したがって、天然に存在しないアミノ酸は、たとえば、２０種の天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸の類似体を含み、アミノ酸のＤ−立体異性体を含むが、これらに限定されない。例示的な非天然アミノ酸は、当業者らに知られており、修飾第ＩＸ因子ポリペプチド中に含むことができる。
【０１０４】
本明細書における目的上、保存的アミノ酸交換は、ポリペプチドおよびそのドメインにおいてなされてもよい。ただし、結果として生じるタンパク質がＦＩＸの活性を示す。表２Ｂにおいて記載されるものなどのような保存的アミノ酸交換は、タンパク質分解活性を排除しないものである。アミノ酸の適した保存的交換は、当業者に知られており、結果として生じる分子の生物学的活性を改変することなく、一般になされ得る。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須の領域における単一アミノ酸の交換が生物学的活性を実質的に改変しないことを認識する（たとえば、Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub.co., p. 224を参照されたい）。ＭＴＳＰの触媒活性断片、特に単鎖プロテアーゼ部分もまた定義内に含まれる。保存的なアミノ酸交換は、以下の表２Ｂに記載される交換に従ってなされる。
【０１０５】
表2B
【表２−２】
0006027221.tif 000005
【０１０６】
他の交換もまた許容可能であり、経験的にまたは知られている保存的交換に従って決定されてもよい。
【０１０７】
本明細書において使用されるように、ＤＮＡコンストラクトは、自然界において見出されない様式で組み合わせられ、並べられたＤＮＡのセグメントを含有する一本鎖もしくは二本鎖、線状、または環状のＤＮＡ分子である。ＤＮＡコンストラクトは、ヒトの操作の結果として存在し、操作された分子のクローンおよび他のコピーを含む。
【０１０８】
本明細書において使用されるように、ＤＮＡセグメントは、特定の性状を有する、より大きなＤＮＡ分子の部分である。たとえば、特定のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、プラスミドまたはプラスミド断片などのような、より長いＤＮＡ分子の部分であり、５’から３’方向に読み取られる場合、特定のポリペプチドのアミノ酸の配列をコードする。
【０１０９】
本明細書において使用されるように、ポリヌクレオチドという用語は、５’端から３’端に読み取られるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドベースの一本鎖ポリマーまたは二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡおよびＤＮＡを含み、天然源から単離する、インビトロにおいて合成する、または天然分子および合成分子の組合せから調製することができる。ポリヌクレオチド分子の長さは、ヌクレオチド（「ｎｔ」と省略）または塩基対（「ｂｐ」と省略）により本明細書において示される。ヌクレオチドという用語は、状況が可能にする場合、一本鎖分子および二本鎖分子に使用される。この用語が、二本鎖分子に適用される場合、用語は、全長を表すために使用され、塩基対という用語と等価であることが理解されるであろう。二重鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖はわずかに長さが異なることがあり得、そしてその端がずれることがあり得、したがって、二重鎖ポリヌクレオチド分子内の全てのヌクレオチドが対になることができるとは限らないことが当業者らによって認識されるであろう。そのような対でない端は、一般に、２０ヌクレオチド長を超えないであろう。
【０１１０】
本明細書において使用されるように、「一次配列」は、ポリペプチドにおけるアミノ酸残基の配列を指す。
【０１１１】
本明細書において使用されるように、２つのタンパク質または核酸の間の「類似性」は、タンパク質のアミノ酸の配列または核酸のヌクレオチド配列の間の関連性を指す。類似性は、残基の配列の同一性および／または相同性の程度ならびにそこに含有される残基に基づくものとすることができる。タンパク質または核酸の間の類似性の程度を評価するための方法は、当業者らに知られている。たとえば、配列類似性を評価するためのある方法において、２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、配列の間で最大のレベルの同一性が得られるようにアライメントされる。「同一性」は、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列が一様である程度を指す。アミノ酸配列のアライメントおよびある程度のヌクレオチド配列のアラインメントはまた、アミノ酸（またはヌクレオチド）における保存的な差異および／または頻繁な交換を考慮することができる。保存的な差異は、含まれる残基の物理化学的特性を保存する差異である。アラインメントは、全体的（配列の全体の長さにわたるおよび全ての残基を含む、比較される配列のアラインメント）または局所的（最も類似する１つまたは複数の領域のみを含む配列の部分のアラインメント）なものとすることができる。
【０１１２】
本明細書において使用されるように、用語「相同性」および「同一性」は、区別なく使用されるが、タンパク質についての相同性は、保存的アミノ酸変化を含むことができる。一般に、対応する位置を同定するために、アミノ酸の配列は、最も高度な程度のマッチが得られるように、アライメントされる［たとえばComputational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073を参照されたい］。
【０１１３】
本明細書において使用されるように、「配列同一性」は、試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの間の比較における、同一のアミノ酸（またはヌクレオチド塩基）の数を指す。相同性ポリペプチドは、所定の数の同一アミノ酸残基または相同性アミノ酸残基を指す。相同性は、同一残基と同様に、保存的なアミノ酸交換を含む。配列同一性は、それぞれのサプライヤーによって確立されるデフォルトギャップペナルティーを用いて使用される標準的なアライメントアルゴリズムプログラムによって決定することができる。相同性核酸分子は、所定の数の同一ヌクレオチドまたは相同性ヌクレオチドを指す。相同性は、同一残基と同様に、コードアミノ酸を変化させない交換（つまり「サイレント交換」）を含む。実質的に相同性の核酸分子は、典型的に、中程度のストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーで、核酸の全長に沿ってまたは対象の完全長核酸分子の少なくとも約７０％、８０％、もしくは９０％に沿ってハイブリダイズする。ハイブリダイズする核酸分子におけるコドンの代わりに縮重コドンを含有する核酸分子もまた、企図される。（タンパク質の相同性の決定のために、保存的アミノ酸は、同一のアミノ酸と同様にアライメントすることができ、この場合、同一性の百分率および相同性百分率は、変わる）。任意の２つの核酸分子が、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％「同一の」ヌクレオチド配列を有する（または任意の２つのポリペプチドが、そのようなアミノ酸配列を有する）かどうかは、「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどのような、知られているコンピューターアルゴリズムを使用して、たとえば、Pearson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)におけるデフォルトパラメーターを使用して、決定することができる［他のプログラムは、ＧＣＧプログラムパッケージ［Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I): 387 (1984)］、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ［Atschul, S.F., et al., J. Molec. Biol. 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego (1994), and Carillo et al. SIAM J Applied Math 48: 1073 (1988)を含む］。たとえば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎデータベースのＢＬＡＳＴ機能は、同一性を決定するために使用することができる。他の市販で入手可能なまたは公的に入手可能なプログラムは、ＤＮＡＳｔａｒ「ＭｅｇＡｌｉｇｎ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧ）「Ｇａｐ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ））を含む。タンパク質および／または核酸分子の相同性または同一性のパーセントは、たとえば、ＧＡＰコンピュータープログラムを使用して配列情報を比較することによって決定することができる［たとえば、Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)によって改訂されたNeedleman et al. J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)］。手短かに言えば、ＧＡＰのプログラムは、２つの配列のうちの短い方のシンボルの総数によって割った、類似する、アライメントされたシンボル（つまりヌクレオチドまたはアミノ酸）の数として類似性を定義する。ＧＡＰ���ログラムのためのデフォルトパラメーターは、（１）単項比較マトリックス（同一の場合には１および同一でない場合には０という値を含有する）ならびにSchwartz and Dayhoff, eds. , Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)によって記載されるGribskov et al. Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986)の加重比較マトリックス；（２）それぞれのギャップに対する３．０のペナルティーおよびそれぞれのギャップにおけるそれぞれのシンボルに対するさらなる０．１０のペナルティー；ならびに（３）エンドギャップに対するペナルティーなし、を含むことができる。
【０１１４】
そのため、本明細書において使用されるように、用語「同一性」は、試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの間の比較を表す。１つの非限定的な例では、「〜に少なくとも９０％同一の」は、参照ポリペプチドと比較した、９０〜１００％の同一性パーセントを指す。９０％またはそれ以上のレベルでの同一性は、例証目的と仮定して、１００アミノ酸の試験および参照ポリヌクレオチド長が比較され、試験ポリペプチドにおけるアミノ酸の多くとも１０％（つまり１００のうち１０）が参照ポリペプチドのアミノ酸と異なるという事実を示す。類似する比較は、試験ポリヌクレオチドおよび参照ポリヌクレオチドの間でなすことができる。そのような差異は、アミノ酸配列の全長にわたってランダムに分布した点突然変異として表され得る、またはそれらは最大に許容できる、たとえば１０／１００のアミノ酸差異（約９０％の同一性）まで、様々な長さの１つまたは複数の場所にクラスター形成し得る。差異は、核酸またはアミノ酸の交換、挿入、または欠失として定義される。約８５〜９０％以上の相同性または同一性のレベルでは、結果は、プログラムおよびギャップパラメーターセットに非依存性であるはずであり、そのような高度なレベルの同一性は、ソフトウェアに頼ることなく容易に評価できることが多い。
【０１１５】
本明細書において使用されるように、用語「実質的に同一の」または「類似する」は、当業者らによって理解されるように、状況により変わるが、当業者らは、そのようなものを評価することができることもまた理解されたい。
【０１１６】
本明細書において使用されるように、配列のアライメントは、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における対応する位置をアライメントするための相同性（類似性および／または同一性）の使用を指す。典型的に、５０％またはそれ以上の同一性によって関係する２つまたはそれ以上の配列が、アライメントされる。配列のアライメントセットは、対応する位置でアライメントされる２つまたはそれ以上の配列を指し、ゲノムＤＮＡ配列とアライメントされる、ＥＳＴおよび他のｃＤＮＡなどのような、ＲＮＡに由来するアライメント配列を含むことができる。
【０１１７】
本明細書において使用されるように、「特異的にハイブリダイズする」は、標的核酸分子への核酸分子（たとえばオリゴヌクレオチド）の相補的塩基対合によるアニーリングを指す。当業者らは、特定の分子の長さおよび組成などのような、特異的ハイブリダイゼーションに影響を及ぼすインビトロパラメーターおよびインビボパラメーターに精通している。インビトロハイブリダイゼーションに特に関連するパラメーターは、アニーリング温度および洗浄温度、緩衝液組成、ならびに塩濃度をさらに含む。非特異的結合核酸分子を除去するための例示的な洗浄条件は、高ストリンジェンシーでは０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、中ストリンジェンシーでは０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃である。等価なストリンジェンシー条件は、当技術分野において知られている。当業者は、特定の適用に適切な標的核酸分子への核酸分子の特異的なハイブリダイゼーションを達成するために、これらのパラメーターを容易に調整することができる。
【０１１８】
本明細書において使用されるように、単離もしくは精製ポリペプチドもしくはタンパク質またはその生物学的活性部分は、タンパク質が由来する組織の細胞に由来する細胞性物質または他の混入タンパク質が実質的にないまたは化学的に合成される場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質が実質的にない。調製物は、そのような純度を評価するために当業者らによって使用される薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動、および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などのような標準的な分析方法によって決定されるように、容易に検出可能な不純物がそれらにないまたは十分に純粋であり、さらなる精製が、物質のタンパク質分解活性および生物学的活性などのような物理的特性および化学的特性を検出可能に変化させないであろうと思われる場合、実質的に不純物がないと決定することができる。実質的に化学的に純粋な化合物を産生するための化合物の精製のための方法は、当業者らに知られている。しかしながら、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物となり得る。そのような場合、さらなる精製は、化合物の特異的活性を増加させ得る。
【０１１９】
細胞性物質が実質的にないという用語は、タンパク質が単離されるまたは組換えで産生される細胞の細胞性構成成分からタンパク質が分離されている、タンパク質の調製物を含む。一実施形態では、細胞性物質が実質的にないという用語が、約３０％未満（乾燥重量による）の非プロテアーゼタンパク質（本明細書において混入タンパク質とも呼ばれる）、一般に、約２０％未満の非プロテアーゼタンパク質または１０％の非プロテアーゼタンパク質または約５％未満の非プロテアーゼタンパク質を有するプロテアーゼタンパク質の調製物を含む。プロテアーゼタンパク質またはその活性部分が、組換えで産生される場合、それもまた、実質的に培地がない、すなわち、培地は、プロテアーゼタンパク質調製物の容量の２０％、１０％、または５％未満、その前後、またはそれと等しい。
【０１２０】
本明細書において使用されるように、化学的前駆体または他の化学物質が実質的にないという用語は、タンパク質が、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されている、プロテアーゼタンパク質の調製物を含む。この用語は、約３０％（乾燥重量による）、２０％、１０％、５％以下、またはそれ未満の化学的前駆体または非プロテアーゼ化学物質もしくは構成成分を有するプロテアーゼタンパク質の調製物を含む。
【０１２１】
本明細書において使用されるように、組換えＤＮＡ法を使用することによる組換え法による産生は、クローニングＤＮＡによりコードされるタンパク質を発現させるための、分子生物学のよく知られている方法の使用を指す。
【０１２２】
本明細書において使用されるように、ベクター（またはプラスミド）は、その発現または複製のいずれかのために細胞の中に異種核酸を導入するために使用される別個のエレメントを指す。ベクターは、典型的にエピソームのままであるが、ゲノムの染色体の中への遺伝子またはその部分の統合を達成するように設計することができる。細菌人工染色体、酵母人工染色体、および哺乳動物人工染色体などのような人工染色体であるベクターもまた企図される。そのような媒体の選択および使用は、当業者らによく知られている。
【０１２３】
本明細書において使用されるように、発現は、核酸がｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。核酸が、ゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、適切な真核生物宿主細胞または真核生物宿主生物が選択される場合、ｍＲＮＡのスプライシングなどのようなプロセシングを含むことができる。
【０１２４】
本明細書において使用されるように、発現ベクターは、そのようなＤＮＡ断片の発現を達成することができる、プロモーター領域などのような調節配列と作動可能に連結されるＤＮＡを発現することができるベクターを含む。そのようなさらなるセグメントは、プロモーター配列およびターミネーター配列を含むことができ、所望により、１つまたは複数の複製開始点、１つまたは複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、およびその他同種のもの含むことができる。発現ベクターは、プラスミドまたはウイルスＤＮＡに一般に由来するまたは両方のエレメントを含有することができる。したがって、発現ベクターは、適切な宿主細胞の中への導入に際してクローニングＤＮＡの発現をもたらす、プラスミド、ファージ、組換えウイルス、または他のベクターなどのような組換えＤＮＡコンストラクトまたは組換えＲＮＡコンストラクトを指す。適切な発現ベクターは、当業者らによく知られており、真核細胞および／または原核細胞において複製可能なベクターならびにエピソームのままのベクターまたは宿主細胞ゲノムの中に統合するベクターを含む。
【０１２５】
本明細書において使用されるように、ベクターはまた、「ウイルスベクター」または「ウイルス性ベクター」を含む。ウイルス性ベクターは、細胞の中に外因性遺伝子を移入する（媒体またはシャトルとして）ように外因性遺伝子に作動可能に連結される、操作されたウイルスである。
【０１２６】
本明細書において使用されるように、アデノウイルスは、ヒトにおいて結膜炎および上気道感染症を引き起こすＤＮＡ含有ウイルスのグループのいずれかを指す。
【０１２７】
本明細書において使用されるように、裸のＤＮＡは、ワクチンおよび遺伝子療法に使用することができるヒストンなしのＤＮＡを指す。裸のＤＮＡは、形質転換またはトランスフェクションと呼ばれる遺伝子移入プロセスの間に細胞から細胞に移される遺伝物質である。形質転換またはトランスフェクションにおいて、レシピエント細胞によって取り込まれる精製ＤＮＡまたは裸のＤＮＡは、レシピエント細胞に、新しい特徴または表現型を与えるであろう。
【０１２８】
本明細書において使用されるように、操作可能にまたは作用可能に連結されたは、ＤＮＡセグメントを指す場合、セグメントが、意図される目的に一致して機能するように、たとえば、転写がプロモーターにおいて開始し、コードセグメントを通ってターミネーターに進むように配置されることを意味する。
【０１２９】
本明細書において使用されるように、タンパク質の活性または遺伝子もしくは核酸の発現を調整する作用物質は、タンパク質の活性を減少させるもしくは増加させるまたは他の場合には改変するまたはいくつかの様式において、細胞における核酸の発現をアップレギュレートするもしくはダウンレギュレートするまたは改変する。
【０１３０】
本明細書において使用されるように、「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、異なるポリペプチドに作動可能に連結されたポリペプチドを指す。本明細書において提供されるキメラタンパク質または融合タンパク質は、１つもしくは複数のＦＩＸポリペプチドもしくはその部分ならびに任意の１つもしくは複数の転写／翻訳制御シグナルについての１つもしくは複数の他のポリペプチド、シグナル配列、局在化のためのタグ、精製のためのタグ、免疫グロブリンＧのドメインの一部、および／または標的作用物質を含むことができる。キメラＦＩＸポリペプチドはまた、他のポリペプチドと交換されるポリペプチドのそれらの内因性ドメインまたは内因性領域を有するものをも含む。これらのキメラタンパク質または融合タンパク質は、融合タンパク質として組換え手段によって産生されるもの、たとえばスルフヒドリル基へのカップリングを通した化学的カップリングなどのように、化学的手段によって産生されるもの、ならびに少なくとも１つのポリペプチド（つまりＦＩＸ）またはその部分が、リンカー（複数可）を介して直接的または間接的に他のポリペプチドに連結される任意の他の方法により産生されるものを含む。
【０１３１】
本明細書において使用されるように、作動可能に連結されたは、融合タンパク質を指す場合、インフレームで互いに融合されるプロテアーゼポリペプチドおよび非プロテアーゼポリペプチドを指す。非プロテアーゼポリペプチドは、プロテアーゼポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に融合することができる。
【０１３２】
本明細書において使用されるように、標的作用物質は、細胞表面受容体などのような細胞表面分子への特異的な結合を提供する、タンパク質またはその有効な部分などのような任意の部分であり、受容体は、いくつかの場合では、結合したコンジュゲートまたはその部分を内部移行することができる。標的作用物質はまた、たとえば、コンジュゲートのアフィニティー単離または精製、表面へのコンジュゲートの付加、またはコンジュゲートもしくはコンジュゲートを含有する複合体の検出を促進するもしくは容易にする作用物質とすることもできる。
【０１３３】
本明細書において使用されるように、分子の誘導体または類似体は、分子から誘導される部分または分子の修飾バーションを指す。
【０１３４】
本明細書において使用されるように、「疾患または障害」は、感染症、後天性状態、遺伝的状態を含むが、これらに限定されない原因または状態に起因し、同定可能な症状により特徴づけられる、生物における病的状態を指す。本明細書における対象の疾患および障害は、凝固タンパク質によって媒介されるものおよび凝固タンパク質が病因または病状において役割を果たすものを含む、凝固を伴うものを含む。疾患および障害はまた、血友病などにおいて、タンパク質の欠如によって引き起こされるものを含み、本明細書において特に関心があるのは、凝固タンパク質における欠損の欠乏症により凝固が生じないそれらの障害である。
【０１３５】
本明細書において使用されるように、「凝血促進薬」は、血液凝固を促進する任意の物質を指す。
【０１３６】
本明細書において使用されるように、「抗凝固薬」は、血液凝固を阻害する任意の物質を指す。
【０１３７】
本明細書において使用されるように、「血友病」は、血液凝血因子における欠乏症によって引き起こされる出血障害を指す。血友病は、たとえば、凝血因子の欠如、発現の低下、または機能の低下の結果となり得る。最も一般的な型の血友病は、血友病Ａであり、これは、第ＶＩＩＩ因子における欠乏症に起因する。第２の一般的な型の血友病は、血友病Ｂであり、これは、第ＩＸ因子における欠乏症に起因する。ＦＸＩ欠乏症と呼ばれる血友病Ｃは、より軽度な、それほど一般的でない形態の血友病である。
【０１３８】
本明細書において使用されるように、「先天性血友病」は、遺伝する血友病の型を指す。先天性血友病は、凝血因子遺伝子の突然変異、欠失、挿入、または他の修飾に起因し、凝血因子の産生は、欠如している、低下している、または機能しない。たとえば、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子などのような凝血因子遺伝子における遺伝性の突然変異は、先天性血友病、血友病ＡおよびＢをそれぞれもたらす。
【０１３９】
本明細書において使用されるように、「後天性血友病」は、ＦＶＩＩＩを不活性化する自己抗体の産生に由来する、成人期において発症する血友病の型を指す。
【０１４０】
本明細書において使用されるように、「出血障害」は、対象が、出血を制御する能力が減少している状態を指す。出血障害は、遺伝し得または獲得され得、また、たとえば、凝固経路における欠損もしくは欠乏症、血小板活性における欠損もしくは欠乏症、または血管の欠損に起因し得る。
【０１４１】
本明細書において使用されるように、「後天性出血障害」は、肝臓疾患、ビタミンＫ欠乏症、またはクマジン（ワルファリン）もしくは他の抗凝固薬による療法などのような状態によって引き起こされる凝血欠乏症に起因する出血障害を指す。
【０１４２】
本明細書において使用されるように、疾患または状態を有する対象を「処置する」は、本明細書において提供されるポリペプチド、組成物、または他の産物が、対象に投与されることを意味する。
【０１４３】
本明細書において使用されるように、治療剤、治療レジメン、放射線防護剤、または化学療法剤は、ワクチンを含む従来の薬剤および薬剤療法を意味し、これらは、当業者らに知られている。放射線治療剤は、当技術分野においてよく知られている。
【０１４４】
本明細書において使用されるように、処置は、状態、障害、または疾患の症状が回復するまたは有益に改変される任意の様式を意味する。したがって、処置は、予防法、療法、および／または治療法を包含する。処置はまた、本明細書における組成物の任意の、医薬としての使用をも包含する。処置はまた、本明細書において提供される修飾ＦＩＸおよび組成物の任意の、医薬としての使用をも包含する。
【０１４５】
本明細書において使用されるように、医薬組成物または他の治療薬の投与によるなどのような処置による特定の疾患または障害の症状の回復は、永久的なものまたは一時的なもの、永続的なものまたは一過性のものにかかわらず、組成物または治療薬の投与に帰し得るまたは関連し得る、症状の任意の緩和を指す。
【０１４６】
本明細書において使用されるように、予防または予防法は、疾患または状態を発症する危険性を低下させる方法を指す。予防法は、疾患もしくは状態を発症する危険性の減少および／または症状の悪化もしくは疾患の進行の予防または症状の悪化もしくは疾患の進行の危険性の低下を含む。
【０１４７】
本明細書において使用されるように、特定の疾患を処置するための化合物または組成物の有効量は、疾患と関連する症状を回復させるまたはいくつかの様式では低下させるのに十分な量である。上記量は、単一投与量として投与することができまたはレジメンに従って投与することができ、それによって、それは、有効となる。その量は、疾患を治癒することができるが、典型的に、疾患の症状を回復させるために投与される。典型的に、反復投与が、症状の所望の回復を達成するために必要とされる。
【０１４８】
本明細書において使用されるように、「治療有効量」または「治療有効用量」は、治療上の効果をもたらすのに少なくとも十分な化合物を含有する作用物質、化合物、物質、または組成物を指す。有効量は、疾患または障害の症状を予防する、治癒する、回復させる、阻止する、または部分的に阻止するために必要な治療剤の含量である。
【０１４９】
本明細書において使用されるように、処置されることとなる「患者」または「対象」は、ヒトまたは哺乳動物を含む非ヒト動物を含む。哺乳動物は、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、およびサルなどのような霊長動物；イヌ、ウマ、ネコ、ブタ、ヤギ、雌ウシなどのような家畜化された動物；ならびにマウス、ラット、ハムスター、およびアレチネズミなどのようなげっ歯動物を含む。
【０１５０】
本明細書において使用されるように、組合せは、２つのアイテムの間のまたはそれ以上のアイテムの間の任意の関連を指す。関連は、空間的なものとすることができるまたは共通の目的のための２つもしくはそれ以上のアイテムの使用を指すことができる。
【０１５１】
本明細書において使用されるように、組成物は、２つまたはそれ以上の産物または化合物（たとえば作用物質、修飾因子、調節因子など）の任意の混合物を指す。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性製剤もしくは非水性製剤、またはそれらの任意の組合せとすることができる。
【０１５２】
本明細書において使用されるように、「製品」は、作製され、販売される産物である。本出願の全体にわたって使用されるように、この用語は、包装製品に含有される修飾プロテアーゼポリペプチドおよび核酸を包含するように意図される。
【０１５３】
本明細書において使用されるように、流体は、流動することができる任意の組成物を指す。したがって、流体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリーム、および他のそのような組成物の形態をしている組成物を包含する。
【０１５４】
本明細書において使用されるように、「キット」は、包装された組合せを指し、所望により、組合せのエレメントを使用する方法を実施するための試薬および他の産物および／または成分を含む。たとえば、本明細書において提供される修飾プロテアーゼポリペプチドまたは核酸分子ならびに投与、診断、および生物学的活性または生物学的特性の評価を含むが、これらに限定されない目的のための他のアイテムを含有するキットが提供される。キットは、所望により、使用のための説明書を含む。本明細書において使用されるように、抗体は、軽鎖および重鎖の可変領域から構成される、Ｆａｂ断片などのような抗体断片を含む。
【０１５５】
本明細書において使用されるように、受容体は、特定のリガンドに対する親和性を有する分子を指す。受容体は、天然に存在する分子または合成分子とすることができる。受容体はまた、当技術分野において抗リガンドと呼ぶこともできる。
【０１５６】
本明細書において使用されるように、動物は、これらに限定されないが、ヒト、ゴリラ、およびサルを含む霊長動物；マウスおよびラットなどのようなげっ歯動物；ニワトリなどのような家禽；ヤギ、雌ウシ、シカ、ヒツジなどのような反芻動物；ブタなどのようなヒツジに近い動物ならびに他の動物などのような任意の動物を含む。非ヒト動物は、企図される動物としてヒトを除外する。本明細書において提供されるプロテアーゼは、任意の源、動物、植物、原核生物、および菌類に由来するものである。
【０１５７】
本明細書において使用されるように、遺伝子療法は、そのような療法が求められる障害または状態を有する哺乳動物、特にヒトの標的細胞である、ある種の細胞の中へのＤＮＡなどのような異種核酸の移入を伴う。ＤＮＡなどのような核酸は、直接的またはベクターもしくは他のデリバリービヒクルなどにおいてＤＮＡなどの異種核酸が発現し、それによって、コードされる治療産物が産生される様式で、選択される標的細胞の中に導入される。その代わりに、ＤＮＡなどのような異種核酸は、いくつかの様式において、治療産物をコードするＤＮＡの発現を媒介することができるまたはそれは、いくつかの様式において、直接的または間接的に治療産物の発現を媒介する、ペプチドまたはＲＮＡなどのような産物をコードすることができる。遺伝的療法はまた、欠陥遺伝子を置換するまたは核酸が導入される哺乳動物もしくは細胞により産生される遺伝子産物を補充する遺伝子産物をコードする核酸を送達するために使用することもできる。導入された核酸は、哺乳動物宿主において通常産生されないまたは治療有効量でもしくは治療的に有用な時に産生されない、プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼなどのような治療化合物をコードすることができる。治療産物をコードする、ＤＮＡなどのような異種核酸は、産物またはその発現を増強するまたはその他の場合には改変するために、罹患した宿主の細胞の中への導入の前に、修飾することができる。遺伝的療法はまた、遺伝子発現の阻害因子またはリプレッサーまたは他の修飾因子のデリバリーを伴い得る。
【０１５８】
本明細書において使用されるように、異種核酸は、核酸が発現する細胞によってインビボにおいて通常産生されないまたは細胞によって産生されるが、異なる座にあるもしくは異なって発現されるまたは転写、翻訳、もしくは他の調節可能な生化学的プロセスに影響を及ぼすことによって、ＤＮＡなどのような内因性核酸の発現を改変する媒介物を媒介するもしくはコードする核酸である。異種核酸は、一般に、核酸が導入される細胞にとって内因性ではないが、他の細胞から得られたまたは合成的に調製されたものである。異種核酸は、内因性のものとすることができるが、異なる座から発現するまたはその発現が改変された核酸である。一般に、必ずではないが、そのような核酸は、細胞によってまたは核酸が発現される細胞と同じ方法で通常産生されないＲＮＡおよびタンパク質をコードする。ＤＮＡなどのような異種核酸はまた、ＤＮＡなどのような外来性核酸と呼ぶこともできる。したがって、異種核酸または外来性核酸は、ＤＮＡなどのような核酸分子対応物がゲノムにおいて見出されるように、全く同じ配向または位置に存在しない核酸分子を含む。それはまた、他の生物または種に由来する核酸分子を指すこともできる（つまり外因性）。
【０１５９】
核酸が発現される細胞に対して異種または外来性であるとして当業者が認識するまたは考えるであろう、ＤＮＡなどのような任意の核酸は、本明細書において異種核酸によって包含され、異種核酸は、内因的にも発現する、外因的に追加される核酸を含む。異種核酸の例は、薬剤抵抗性を付与するタンパク質などのような追跡可能なマーカータンパク質をコードする核酸、抗癌剤、酵素、およびホルモンなどのような治療的に有効な物質をコードする核酸、ならびに抗体などのような他の種類のタンパク質をコードする、ＤＮＡなどのような核酸を含むが、これらに限定されない。異種核酸によってコードされる抗体は、異種核酸が導入された細胞の表面上に分泌され得るまたは発現され得る。
【０１６０】
本明細書において使用されるように、遺伝子療法のための治療的に有効な産物は、異種核酸、典型的にＤＮＡによってコードされ、宿主の中への核酸の導入に際して、遺伝性疾患もしくは後天性疾患の症状、徴候を回復させるもしくは排除するまたは疾患を治癒する産物が発現される、産物である。ＲＮＡｉおよびアンチセンスなどのような生物学的活性核酸分子もまた含まれる。
【０１６１】
本明細書において使用されるように、ポリペプチドが、アミノ酸の記載される配列から「本質的になる」という説明は、完全長ポリペプチドの記載される部分またはその断片のみが存在することを意味する。ポリペプチドは、他の源からのさらなるアミノ酸を所望により含むことができ、一般にそれらを含み、またはそれを他のポリペプチドの中に挿入することができる。
【０１６２】
本明細書において使用されるように、単数形「１つの（ａ）」「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他に特に明らかに指示しない限り、複数の指示物を含む。したがって、たとえば、「細胞外ドメイン」を含む化合物への言及は、１つまたは複数の細胞外ドメインを有する化合物を含む。
【０１６３】
本明細書において使用されるように、範囲および量は、「約」、その特定の値または範囲として表現することができる。約はまた、まさにその量をも含む。したがって、「約５塩基」は、「約５塩基」およびまた「５塩基」をも意味する。
【０１６４】
本明細書において使用されるように、「所望による」または「所望により」は、引き続いて記載される事象または状況が、生じるまたは生じないことおよび説明が、前記事象または状況が生じる場合およびそれが生じない場合を含むことを意味する。たとえば、所望により交換される基は、基が交換されないまたは交換されることを意味する。
【０１６５】
本明細書において使用されるように、任意の保護基、アミノ酸、および他の化合物についての略語は、他に示されない限り、それらの共通の使用法、認識される略語、またはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature［(1972) Biochem. 11:1726を参照されたい］に従うものとする。
【０１６６】
Ｂ．止血およびそれにおける第ＩＸ因子の役割
修飾ＦＩＸａポリペプチドを含む修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドおよびその触媒活性断片が、本明細書において提供される。第ＩＸ因子ポリペプチドは、止血の調節およびプロセスにおいて役割を果たし、したがって、治療剤として使用することができる。臨床的使用のためのＦＩＸなどのような治療タンパク質の有効なデリバリーは、薬学に対する主な課題である。一度血流に入ると、これらのタンパク質は、腎臓における（糸球体）濾過または血液におけるタンパク質分解などのようなタンパク質排除のための通常の経路を使用する代謝およびクリアランスを含む様々な生理学的プロセスによって、短時間内に、循環から絶えず排除される。一度胃腸管内腔に入ると、これらのタンパク質は、内腔のプロテアーゼによって絶えず消化される。後者は、静脈内注射において治療剤として使用されるタンパク質の半減期に影響を及ぼす、制限的なプロセスになり得る。さらに、血液中の阻害因子は、治療タンパク質の活性を特異的に阻害し得る。たとえば、アンチトロンビン（ＡＴ−ＩＩＩ）、ヘパリン、およびＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体は、ＦＩＸの血液凝固活性を阻害し得る。薬物動態学的および薬力学的特性の改善、触媒活性の増加、ならびに／または阻害因子に対する抵抗性の増加を含む、特性の改善を有するＦＩＸのより効果的な変異体が、必要とされる。
【０１６７】
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、血清半減期の増加などのような薬物動態学的特性の改善；アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）、ヘパリン、およびＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体などのような阻害因子に対する抵抗性の増加；触媒活性の増加；またはその任意の組合せを含む、特性の改善を示す。したがって、血液凝固活性が増加した修飾ＦＩＸポリペプチドが提供される。したがって、これらのポリペプチドは、たとえば、止血を調整するための治療薬として、様々な使用および適用を有する。以下の議論は、第ＩＸ因子およびその修飾の議論の前に、凝固プロセスおよびこのプロセスにおける第ＩＸ因子の役割の概説を提供する。
【０１６８】
止血は、血管系に対する傷害に起因する出血を止める生理学的メカニズムである。正常な止血は、細胞性構成成分および可溶性血漿タンパク質に依存し、血餅の形成に最終的に至る一連のシグナリング事象を伴う。傷害が血管に対して生じ、内皮細胞が損害を与えられた後に、凝固は、素速く開始される。凝固の一次フェーズにおいて、血小板は、活性化されて、傷害の部位で止血性の血栓を形成する。二次止血が続き、血漿凝固因子が伴い、これは、タンパク質分解カスケードにおいて作用し、血小板血栓を強化するフィブリン鎖の形成をもたらす。
【０１６９】
血管傷害に際して、傷害を与えられた直後のエリアへの血流は、血管の収縮によって制限され、内皮下の結合組織上に新しく露出した線維状コラーゲンに血小板が粘着することを可能にする。この粘着は、フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）に依存性であり、これは、傷害の３秒以内に内皮に結合し、それによって、血小板の粘着および凝集を容易にする。凝集した血小板の活性化は、ＡＤＰ、ＡＴＰ、トロンボキサン、およびセロトニンを含む様々な因子の分泌をもたらす。粘着分子、フィブリノーゲン、ｖＷＦ、トロンボスポンジン、およびフィブロネクチンもまた、放出される。そのような分泌は、血小板のさらなる粘着および凝集、血小板活性化および血管収縮の増加、ならびに血液凝固酵素複合体のアセンブリーのためのプラットホームとして働く、血小板表面上の陰イオン性リン脂質の暴露を促進する。血小板は、形状を変化させ、仮足形成に至り、これは、他の血小板への凝集をさらに容易にし、緩い血小板血栓をもたらす。
【０１７０】
ペプチダーゼの凝血カスケード（凝固カスケード）は、同時に開始される。凝固カスケードは、タンパク質分解性の切断を伴う一連の活性化事象を含む。そのようなカスケードにおいて、セリンプロテアーゼの不活性タンパク質（チモーゲンとも呼ばれる）は、１つまたは複数のペプチド結合の切断によって活性プロテアーゼに変換され、次いで、これは、カスケードにおける次のチモーゲン分子のための活性化プロテアーゼとして働き、最終的に、フィブリンの架橋によって血餅形成をもたらす。たとえば、カスケードは、トロンビンなどのような活性化分子（プロトロンビンの切断に由来する）を生成し、これは、血小板をさらに活性化し、また、フィブリノーゲンの切断に由来するフィブリンを生成する。次いで、フィブリンは、血餅を安定化するために血小板血栓のまわりに架橋ポリマーを形成する。傷害の修復に際して、フィブリンは、主要な構成成分がプラスミノーゲンおよび組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）である線溶系によって消化される。これらのタンパク質の両方は、重合フィブリンの中に組み込まれ、それらは、相互作用して、プラスミンを生成し、これは、順番に、フィブリンに作用して、前に形成された血餅を溶解する。血餅形成の間に、凝固因子阻害因子はまた、傷害部位を除く血餅形成を予防するために血液中を循環する。
【０１７１】
傷害から血餅形成および続く線溶までの系の相互作用は、下記に記載される。
【０１７２】
１．血小板の粘着および凝集
血液の凝血は、正常な条件下で能動的に回避される。血管内皮は、血管拡張を支持し、血小板の粘着および活性化を阻害し、凝固を抑制し、フィブリン切断を増強し、かつ抗炎症性の特徴をしている。血管内皮細胞は、亜酸化窒素（ＮＯ）およびプロスタサイクリンなどのような分子を分泌し、これは、血小板の凝集を阻害し、血管を拡張する。これらの分子の放出は、可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）およびｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼＩ（ｃＧＫＩ）を活性化し、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）レベルを増加させ、これは、血管壁における平滑筋の弛緩を引き起こす。さらに、内皮細胞は、ＣＤ３９などのような細胞表面ＡＤＰアーゼを発現し、これは、血小板から放出されたＡＤＰをアデニンヌクレオチド血小板阻害因子に変換することによって、血小板の活性化および凝集を制御する。内皮はまた、線溶カスケードにおける酵素の調節において重要な役割を果たす。内皮細胞は、プラスミノーゲン（アネキシンＩＩ）およびウロキナーゼの受容体の発現ならびに組織型プラスミノーゲン活性化因子およびウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子の分泌を通してプラスミンの生成を直接的に促進し、これらの全ては、血餅クリアランスを促進する。血栓形成促進性の調節の最終層において、内皮細胞は、ヘパラン硫酸を産生することによって、凝固カスケードを阻害する際に能動的な役割を果たし、これは、トロンビンおよび他の凝固因子のアンチトロンビンＩＩＩ阻害の反応速度を増加させる。
【０１７３】
しかしながら、急性血管外傷下で、血管収縮性のメカニズムが、優勢であり、内皮は、自然に、血栓形成促進性、凝固促進性（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｔｏｒｙ）、および炎症促進性になる。これは、内皮拡張剤：アデノシン、ＮＯ、およびプロスタサイクリンの低下；ならびにそれらの収縮を誘発するための、血管平滑筋細胞に対する、ＡＤＰ、セロトニン、およびトロンボキサンの直接的な作用によって達成される（Becker, Heindl et al. . 2000）。止血性の血栓の形成に至る内皮の機能における変化に対する主なトリガーは、血液および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成成分の間の内皮細胞壁の損失である［Ruggeri (2002) Nat Med 8:1227-1234］。循環する血小板は、内皮の病変のエリアを同定し、識別し、暴露した内皮下層に接着する。様々な血栓形成性の基質および局所的に生成されたアゴニストまたは放出されたアゴニストとのそれらの相互作用は、血小板活性化をもたらす。このプロセスは、２つのステージ、１）粘着：表面への初期の連結および２）凝集：血小板−血小板接着を有するとして記載されている［Savage et al. (2001) Curr Opin Hematol 8:270-276］。
【０１７４】
血小板粘着は、循環する血小板が、細胞表面上のコラーゲン結合タンパク質との相互作用を通しておよびこれもまた内皮上に存在するｖＷＦとの相互作用を通して暴露したコラーゲンに結合する場合、開始される。ｖＷＦタンパク質は、内皮によって２つの方向に；基底面に（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌｌｙ）および血流の中に分泌される可変サイズの多量体構造である。ｖＷＦはまた、第ＶＩＩＩ因子に結合し、これは、第ＶＩＩＩ因子の安定化および循環におけるその存続において重要である。
【０１７５】
血小板粘着および続く活性化は、ｖＷＦが、ＧＰＩｂ（血小板糖タンパク質受容体複合体ＧＰＩｂ−ＩＸ−Ｖの一部）にそのＡ１ドメインを介して結合する場合、達成される。ｖＷＦおよびＧＰＩｂの間の相互作用は、ずり応力における増加が、ＧＰＩｂに対するｖＷＦの親和性の対応する増加をもたらすように、剪断力によって調節される。白血球上のＶＬＡ−２としても知られているインテグリンα１β２は、血小板上の主要なコラーゲン受容体であり、この受容体を通した結合は、血小板活性化に寄与する細胞内シグナルを生成する。α１β２を通した結合は、低親和性コラーゲン受容体、ＧＰ  ＶＩの結合を容易にする。これは、免疫グロブリンスーパーファミリーの一部であり、血小板活性化のための最も強力な細胞内シグナルを生成する受容体である。血小板活性化は、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）の放出をもたらし、これは、トロンボキサンＡ２に変換される。
【０１７６】
血小板活性化はまた、血小板インテグリンαＩＩｂβ３としても知られている血小板糖タンパク質ＩＩｂ−ＩＩＩａ（ＧＰ  ＩＩｂ−ＩＩＩａ）受容体の表面発現をもたらす。ＧＰ  ＩＩｂ−ＩＩＩａ受容体は、これらの受容体を通して血小板を連結するフィブリノーゲン分子により互いの血小板の粘着（つまり凝集）を可能にする。これは、傷害の部位での血小板血栓の形成をもたらして、さらなる失血を予防するのを助けるが、損害を与えられた血管組織は、凝固カスケードおよび血小板血栓のまわりで安定化フィブリン網の形成を開始する因子を放出する。
【０１７７】
２．凝固カスケード
凝固経路は、それぞれの酵素が、チモーゲンまたは不活性形態として血漿中に存在する、タンパク質分解経路である。チモーゲンの切断は、前駆体分子から活性形態を放出するために調節される。経路は、活性化プロセスを制御する、一連のポジティブフィードバックループおよびネガティブフィードバックループとして機能し、最終目標は、トロンビンを産生することであり、次いで、これは、可溶性フィブリノーゲンをフィブリンに変換して、血餅を形成することができる。凝固因子および他のタンパク質は、１つまたは複数の、凝固の内在性経路、外因性経路、または共通経路を通して、血液凝固に参加する。下記に議論されるように、これらの経路は、相互に連絡し、血液凝固は、活性化の細胞ベースのモデルを通しておそらく起こる。
【０１７８】
トロンビンの生成は、歴史的に、３つの経路、活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）の生成のための代替経路を提供する内在性経路（経路の全ての構成成分が、血漿に対して内在性であることを示唆する）および外因性経路（経路の１つまたは複数の構成成分が、血漿に対して外因性であることを示唆する）ならびにトロンビン形成をもたらす最終共通経路に分けられてきた（図１）。これらの経路は、凝固を達成するために、相互に連絡した、相互依存性のプロセスに共に参加する。これらの経路を説明する凝固の細胞ベースのモデルが、開発された（図２）［Hoffman et al. (2001) Thromb Haemost 85:958-965］。このモデルにおいて、「外因性」経路および「内在性」経路は、それぞれ、異なる細胞表面、組織因子（ＴＦ）を有する細胞、および血小板上で達成される。凝固のプロセスは、異なるフェーズ、開始、増幅、および伝播に分類され、この間に、外因性経路および内在性経路は、様々なステージで機能して、血餅形成のための、十分な量のフィブリノーゲンをフィブリンに変換するために必要とされるトロンビンの大量の著しい増加をもたらす。
【０１７９】
ａ．開始
ＦＶＩＩは、凝固カスケードの開始を担う凝固因子であると考えられ、この開始は、ＴＦとのその相互作用に依存性である。ＴＦは、平滑筋細胞、線維芽細胞、単球、リンパ球、顆粒球、血小板、および内皮細胞などのような様々な細胞によって発現される膜貫通糖タンパク質である。骨髄性細胞および内皮細胞は、それらが、炎症促進性サイトカインなどによって刺激される場合のみ、ＴＦを発現する。しかしながら、平滑筋細胞および線維芽細胞は、ＴＦを恒常的に発現する。したがって、一度、これらの細胞が、組織傷害の後に血流に接すると、凝固カスケードは、血漿中の第ＶＩＩ因子またはＦＶＩＩａとのＴＦの結合によって速やかに開始される。ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体は、ＦＶＩＩａのＴＦへの直接的な結合によってまたはＦＶＩＩのＴＦへの結合および次いで、ＦＸａ、ＦＩＸａ、ＦＸＩＩａ、もしくはＦＶＩＩａそれ自体などのような血漿プロテアーゼによるＦＶＩＩのＦＶＩＩａへの続く活性化によって形成することができる。ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体は、ＴＦを有する細胞に固定されたままであり、それは、少量のＦＸをＦＸａに活性化し、これは、凝固の「外因性経路」として知られている。
【０１８０】
ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体はまた、少量のＦＩＸをＦＩＸａに切断する。ＦＸａは、その補因子ＦＶａと結合して、これもまた、ＴＦを有する細胞上で、プロトロンビンをトロンビンに次いで変換することができる複合体を形成する。しかしながら、産生された少量のトロンビンは、完全な凝血に必要とされるフィブリン形成を支持するのに不十分である。さらに、あらゆる活性ＦＸａおよび活性ＦＩＸａは、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）および他のセルピンによって循環において阻害され、これについては、下記により詳細に議論される。これは、通常、循環において血餅形成を予防するであろう。しかしながら、傷害の存在下において、血管系への損害は、血小板凝集およびトロンビン形成のこの部位での活性化をもたらし、それによって、凝固シグナルの増幅を可能にする。
【０１８１】
ｂ．増幅
増幅は、トロンビンが血小板に結合し、血小板を活性化する場合、起こる。活性化血小板は、それらのアルファ顆粒からＦＶを放出し、これは、トロンビンによって活性化されて、ＦＶａになる。トロンビンはまた、血小板膜上でＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体からＦＶＩＩＩを放出し、活性化し、ＦＸＩを切断して、ＦＸＩａにする。これらの反応は、それらの表面上にＦＶａ、ＦＶＩＩＩａ、およびＦＩＸａを有する活性化血小板を生成し、これは、伝播ステージの間のトロンビン生成の大量の著しい増加のためのステージを準備するものである。
【０１８２】
ｃ．伝播
凝固の伝播は、傷害の部位の多くの血小板の表面で生じる。上記に記載されるように、活性化血小板は、それらの表面上に、ＦＸＩａ、ＦＶＩＩＩａ、およびＦＶａを有する。外因性経路が達成されるのは、ここにおいてである。ＦＸＩａは、ＦＩＸを活性化して、ＦＩＸａにし、これは、次いで、ＦＶＩＩＩａと結合することができる。このプロセスは、ＴＦを有する細胞上のＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体によるＦＩＸの切断によって生成される少量のＦＩＸａに加えて、その補因子、ＦＶＩＩＩａ、カルシウム、および適したリン脂質表面と複合体を形成した大量のＦＩＸａを生成する。この複合体は、テナーゼまたは第Ｘ因子活性化複合体複合体と呼ばれ、それは、第Ｘ因子（ＦＸ）を切断して、活性化し、第Ｘａ因子（ＦＸａ）にする。ＦＸａ分子は、ＦＶａに結合して、プロトロンビンを活性化してトロンビンにするプロトロンビナーゼ複合体を生成する。トロンビンは、より多くの血小板を活性化するためにポジティブフィードバックループにおいて作用し、増幅フェーズについて記載されるプロセスを再度開始する。
【０１８３】
直後に、フィブリノーゲンから十分な量のフィブリンを生成して、止血性のフィブリン血餅を形成するのに十分に多い、著しく増加したトロンビンを生成するための、適切な複合体を有する、十分な数の活性化血小板がある。フィブリノーゲンは、トロンビンによって切断された場合、フィブリノペプチドＡおよびフィブリノペプチドＢを放出する、血漿において可溶性の二量体である。次いで、フィブリノペプチドＢは、トロンビンによって切断され、この第２のタンパク質分解性の切断によって自発的に形成されたフィブリン単量体は、不溶性ゲルを形成する。重合したフィブリンは、非共有結合性の力および静電力によって共に保持され、トロンビンによるＦＸＩＩＩの切断によって産生されるトランスアミド化（ｔｒａｎｓａｍｉｄａｔｉｎｇ）酵素因子ＸＩＩＩａ（ＦＸＩＩＩａ）によって安定化される。トロンビンはまた、ＴＡＦＩをも活性化し、これは、血餅表面でプラスミン生成を低下させることによって線溶を阻害する。さらに、トロンビンは、それ自体、さらなる安定化のために血餅の構造の中に組み込まれる。これらの不溶性フィブリン凝集体（血餅）は、凝集した血小板（血栓）と共に、損害を与えられた血管をブロックし、さらなる出血を予防する。
【０１８４】
３．凝固の調節
凝固の間、カスケードは、さらなる血餅形成を阻害するために、恒常的な刺激プロセスによって調節される。調節は、ａ）フィブリン血餅形成による組織の虚血を制限するのに、およびｂ）組織傷害の部位にのみ血餅形成を局在化することによって、広範囲の血栓症を予防するのに重要である。
【０１８５】
調節は、いくつかの阻害分子の作用によって達成される。たとえば、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）および組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ）は、凝固カスケードにおける因子を阻害するために恒常的に働く。ＴＦＰＩは、主に、ＦＸａおよびＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体を阻害する。対照的に、セリンプロテアーゼ阻害因子（セルピン）であるＡＴ−ＩＩＩは、主に、トロンビン、ＦＸａ、およびＦＩＸａを阻害する。ＡＴ−ＩＩＩによるこれらの凝固因子の阻害は、ヘパリンによって非常に増強され、これは、ＡＴ−ＩＩＩに結合して、阻害反応を加速する活性化コンホメーション変化を誘発する。ヘパリンはまた、ＡＴ−ＩＩＩ非依存性の様式においてＦＩＸａ／ＦＶＩＩＩａ複合体の活性を阻害することができる（Yuan et al. , (2005) Biochemistry 44:3615-3625）。血小板活性化を介して刺激されるさらなる因子、プロテインＣは、ＦＶａおよびＦＶＩＩＩａのタンパク質分解性の切断および不活性化によって凝固を調節する。プロテインＳは、プロテインＣの活性を増強する。さらに、凝固阻害に寄与する他の因子は、必須の膜タンパク質、トロンボモジュリンであり、これは、血管内皮細胞によって産生され、トロンビンに対する受容体として働く。トロンビンのトロンボモジュリンへの結合は、トロンビン凝血促進活性を阻害し、またプロテインＣ活性化にも寄与する。
【０１８６】
線溶、フィブリン血餅の崩壊もまた、凝固を調節するためのメカニズムを提供する。血餅における架橋フィブリン多量体は、セリンプロテアーゼであるプラスミンによって可溶性ポリペプチドに分解される。プラスミンは、その不活性前駆体プラスミノーゲンから生成することができ、２つの方法において：フィブリン血餅の表面の組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）との相互作用によっておよび細胞表面のウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）との相互作用によってフィブリン血餅の部位に動員される。第１のメカニズムは、血管内の血餅の溶解を担う主要なメカニズムであると思われる。第２のものは、血餅融解を媒介することができるが、組織リモデリング、細胞移動、および炎症において主要な役割を果たすことができる。
【０１８７】
血餅融解もまた、２つの方法において調節される。第一に、効率的なプラスミン活性化および線溶は、血餅表面でまたは細胞膜上で形成される複合体においてのみ生じるが、血液中に遊離しているタンパク質は、非効率的な触媒であり、速やかに不活性化される。第二に、プラスミノーゲン活性化因子およびプラスミンは、プラスミノーゲン活性化因子に作用するプラスミノーゲン活性化因子阻害因子１型（ＰＡＩ−１）およびＰＡＩ−２ならびにプラスミンを不活性化するα２−抗プラスミンおよびα２−マクログロブリンなどのような分子によって不活性化される。正常な状況下で、凝固および線溶の間の適時のバランスは、血管傷害の後の、血餅の効率的な形成および除去をもたらすが、望まれない血栓症エピソードまたは出血エピソードを同時に予防する。
【０１８８】
Ｃ．第ＩＸ因子（ＦＩＸ）構造および機能
活性または機能の改善を有する修飾ＦＩＸポリペプチドが、本明細書において提供される。ＦＩＸは、凝固カスケードに関与するポリペプチドである。凝固カスケードにおけるＦＩＸの役割は、その構造および活性化のメカニズムに関連する。本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドによる凝固の修飾もまた、その構造および活性化のメカニズムに関連づけられることが理解される。これらの特徴は、未修飾ＦＩＸポリペプチドと同じとなり得る。他の場合では、これらの特徴は、本明細書において提供されるＦＩＸポリペプチドにおいて修飾され、したがって、活性または特性が改変されたまたは改善されたポリペプチドをもたらすことができる。たとえば、ＦＩＸポリペプチドの修飾は、ＦＩＸポリペプチドの１つまたは複数の活性を改変することができる。たとえば、野生型ＦＩＸポリペプチドと比較して、グリコシル化のレベルの増加を示す修飾ＦＩＸポリペプチドが提供される。修飾ＦＩＸポリペプチドは、したがって、インビボアッセイを使用して試験される場合に、野生型ＦＩＸポリペプチドと比較して、クリアランスの低下および血清半減期の増加などのような、薬物動態学的特性の改善を示すことができる。ＡＴ−ＩＩＩ、ヘパリン、およびＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体などのような阻害因子に対する抵抗性の増加ならびに／または触媒活性の増加を示す修飾ＦＩＸポリペプチドもまた、提供される。したがって、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、改善された治療特性を示す修飾ＦＩＸポリペプチドが、提供される。ＦＩＸポリペプチドおよび修飾ＦＩＸポリペプチドの構造的および機能的特徴の要約を下記に記載する。
【０１８９】
第ＩＸ因子は、ビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼであり、止血における重要な凝固因子である。それは、肝臓において単鎖チモーゲンとして合成され、凝固カスケードの一部として活性化されるまでこの不活性化状態で血液中を循環する。ＦＸＩａまたはＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体によるＦＩＸチモーゲンから活性化ＦＩＸ（ＦＩＸａ）への活性化の後に、ＦＩＸａは、その補因子、ＦＶＩＩＩａに結合する。結果として生じるＦＩＸａ／ＦＶＩＩＩａ複合体は、ＦＸに結合して、ＦＸａに活性化し、したがって、止血を確立するために上記に記載される凝固カスケードを継続する。血液中のＦＩＸの濃度は、約４〜５μｇ／ｍｌであり、それは、約１８〜２４時間の半減期を有する。
【０１９０】
クリスマス病または第ＩＸ因子欠乏症としても知られている血友病Ｂは、ＦＩＸ遺伝子における任意の１つまたは複数の様々な突然変異に起因するＦＩＸの欠乏症または機能障害によって引き起こされる。血友病Ａほど一般的ではないが、血友病Ｂは、再発性の関節の出血が、滑膜肥大、滑膜、軟骨、および骨の破壊を伴う慢性滑膜炎に至り、進行性で重症の関節損傷のために、慢性痛、関節の硬直、および運動制限に至り得る、深刻な疾患のままである。再発性の筋肉出血もまた、急性痛、腫脹、および運動制限をもたらすが、他の部位の出血が、罹患および死亡の一因となり得る。処置は、典型的に、組換えＦＩＸ（ｒＦＩＸ）を用いる置換療法によるものである。血友病Ｂなどのような第ＩＸ因子療法に適用可能な疾患および状態を処置するために、改善された治療薬として働くことができる、活性化に際して凝固活性の増加を有するように設計される修飾ＦＩＸポリペプチドが、本明細書において提供される。
【０１９１】
１．ＦＩＸ構造
ヒトＦＩＸ遺伝子は、Ｘ染色体上に位置し、約３４ｋｂ長であり、８つのエクソンを有する。ヒトＦＩＸ転写物は、２８０３ヌクレオチドであり、短い５’非翻訳領域、１３８３ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（終止コドンを含む）、および３’非翻訳領域を含有する。１３８３ヌクレオチドオープンリーディングフレーム（またはＦＩＸ  ｍＲＮＡ；配列番号１）は、細胞性分泌経路に第ＩＸ因子ポリペプチドを導く２８アミノ酸Ｎ末端シグナルペプチド（配列番号２のアミノ酸１〜２８）を含有する４６１アミノ酸前駆体ポリペプチド（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ００７４０；配列番号２）をコードする。疎水性シグナルペプチドに加えて、ＦＩＸ前駆体ポリペプチドはまた、切断された場合に、ＦＩＸａへの活性化までチモーゲンとして血液中を循環する４１５アミノ酸成熟ポリペプチド（配列番号３）を放出する１８アミノ酸プロペプチド（配列番号２のアミノ酸２９〜４６）をも含有する。シグナルペプチドおよびプロペプチドに加えて、ＦＩＸ前駆体はまた、以下のセグメントおよびドメインを含有する：Ｇｌａドメイン（配列番号３において記載される成熟ＦＩＸタンパク質のアミノ酸１〜４６に対応する配列番号２のアミノ酸４７〜９２）、上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメイン１（ＥＧＦ１；配列番号３において記載される成熟ＦＩＸタンパク質のアミノ酸４７〜８３に対応する配列番号２のアミノ酸９３〜１２９）、ＥＧＦ２（配列番号３において記載される成熟ＦＩＸタンパク質のアミノ酸８４〜１２５に対応する配列番号２のアミノ酸１３０〜１７１）、軽鎖（配列番号３において記載される成熟ＦＩＸタンパク質のアミノ酸１〜１４５に対応する配列番号２のアミノ酸４７〜１９１）、活性化ペプチド（配列番号３において記載される成熟ＦＩＸタンパク質のアミノ酸１４６〜１８０に対応する配列番号２のアミノ酸１９２〜２２６）、重鎖（配列番号３において記載される成熟ＦＩＸタンパク質のアミノ酸１８１〜４１５に対応する配列番号２のアミノ酸２２７〜４６１）、およびセリンプロテアーゼドメイン（配列番号３において記載される成熟ＦＩＸタンパク質のアミノ酸１８１〜４１３に対応する配列番号２のアミノ酸２２７〜４５９）。
【０１９２】
プロトロンビン、凝固因子ＶＩＩおよびＸ、ならびにプロテインＣ、Ｓ、およびＺなどのような他のビタミンＫ依存性タンパク質のように、ＦＩＸのＧｌａドメインは、カルシウムイオンの存在下において、細胞のリン脂質膜と相互作用する膜結合モチーフである。ビタミンＫ依存性タンパク質は、これらのタンパク質のＧｌａドメインにおいてクラスター形成されるアミノ酸であるγ−カルボキシグルタミン酸の翻訳後合成のためにビタミンＫを必要とする。ＦＩＸ  Ｇｌａドメインは、１２のグルタミン酸残基を有し、これらは、それぞれ、潜在的なカルボキシル化部位となる。そのため、それらの多くは、γ−カルボキシグルタミン酸残基を生成するために、カルボキシル化によって修飾される。カルシウムイオンによって占められた場合に、膜への結合を達成するために脂質二重層の中に挿入される、ＦＩＸポリペプチド中の疎水性残基を暴露するようにＧｌａドメインの正確な折り畳みを促進する、高および低親和性両方の、ＦＩＸ  Ｇｌａドメイン中の、合計８つのＣａ２＋結合部位がある。
【０１９３】
Ｇｌａドメインに加えて、ＦＩＸポリペプチドはまた、２つのＥＧＦ様ドメインをも含有する。ＥＧＦ様ドメインはそれぞれ、ＥＧＦタンパク質において観察される同じパターンをした各ドメインにおいて、３つのジスルフィド結合を形成する６つの高度に保存されたシステイン残基を含有する。第１のＥＧＦ様ドメイン（ＥＧＦ１）は、カルシウムイオンによって占められた場合に、分子の正確な折り畳みに寄与し、生物学的活性を促す、高親和性Ｃａ２＋結合部位を含有するカルシウム結合ＥＧＦドメインである［Rao et al. , (1995) Cell 82:131-141］。第２のＥＧＦドメイン（ＥＧＦ２）は、カルシウム結合部位を含有していない。
【０１９４】
ＦＩＸのセリンプロテアーゼドメインまたは触媒ドメインは、ＦＩＸａのタンパク質分解活性を担うドメインである。他のセリンプロテアーゼのように、ＦＩＸは、Ｈ２２１、Ｄ２６９、およびＳ３６５（キモトリプシンナンバリングによるＨ５７、Ｄ１０２、およびＳ１９５に対応する）からなるセリンプロテアーゼ触媒３残基を含有する。
【０１９５】
ＦＩＸａへの成熟ＦＩＸの活性化は、Ｒ１４５−Ａ１４６結合およびＲ１８０−Ｖ１８１結合（配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドに関するナンバリング）のタンパク質分解性の切断によって達成され、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸタンパク質のアミノ酸１４６〜１８０に対応する活性化ペプチドを放出する。したがって、活性化の後に、ＦＩＸａは、２つの鎖；軽鎖および重鎖からなる。軽鎖は、Ｇｌａドメイン、ＥＧＦ１、およびＥＧＦ２ドメインを含有し、重鎖は、プロテアーゼドメインを含有する。２つの鎖は、Ｃ１３２およびＣ２８９の間の単一のジスルフィド結合によって共に保持される。
【０１９６】
２．ＦＩＸ翻訳後修飾
第ＩＸ因子前駆体ポリペプチドは、血液の中に分泌される成熟チモーゲンになるように広範囲な翻訳後修飾を受ける。そのような翻訳後修飾は、γ−カルボキシル化、β−ヒドロキシル化、シグナルペプチドおよびプロペプチドの切断、ＯおよびＮ結合型グリコシル化、硫酸化、ならびにリン酸化を含む。Ｎ末端シグナルペプチドは、小胞体（ＥＲ）にポリペプチドを導き、その後にそれは切断される。細胞からの分泌の直前に、プロペプチドは、切断部位の前の４つのアミノ酸内の少なくとも２つのアルギニン残基を認識する、たとえばＰＡＣＥ／フューリンなどのようなプロセシングプロテアーゼによって切断される。
【０１９７】
単一酵素、ビタミンＫ依存性ガンマカルボキシラーゼは、ＥＲ中のγ−カルボキシル化ＦＩＸを触媒する［Berkner (2000) J. Nutr.. 130:1877-80］。カルボキシル化反応において、γ−カルボキシラーゼは、ＦＩＸプロペプチドに結合し、ポリペプチドのＧｌａドメインにおけるグルタミン酸残基のγ−炭素上の第２のカルボキシル化を触媒する（つまり、Ｇｌｕからγ−カルボキシグルタミルまたはＧｌａに）。グルタミン酸残基が全てγ−カルボキシル化されることを仮定すると、ＦＩＸは、１２のＧｌａ残基を含有し、最初の１０個は、他のビタミンＫ依存性タンパク質と相同性の位置にある。次いで、ＦＩＸのＧｌａドメインは、基質を放出する前に、クラスター中のグルタミン酸を全て前進的に（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅｌｙ）カルボキシル化する［Morris et al. 1995; Berkner 2000; Stenina et al. 2001］。
【０１９８】
ＦＩＸもまた、部分的にβ−ヒドロキシル化される。この修飾は、ＥＧＦ１におけるＤ６４（配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドに対応する）のβ−炭素をヒドロキシル化するジオキシゲナーゼによって実行される。ヒトＦＩＸポリペプチドのおよそ３分の１が、β−ヒドロキシル化される。Ｄ６４は、ＦＩＸのＥＧＦ１ドメインにおける高親和性Ｃａ２＋結合部位に寄与するが、この残基のヒドロキシル化は、Ｃａ２＋結合にも生物学的活性にも必要であるように思われない［Derian et al., (1989) J. Biol. Chem. 264:6615-6618, Sunnerhagen et al., (1993) J. Biol. Chem. 268: 23339-23344］。さらなる翻訳後修飾は、位置１５５のチロシンでのスルホン化および位置１５８のセリン残基でのリン酸化を含む。第ＩＸ因子のこれらの翻訳後修飾は、ＦＩＸのインビボ回収率の寄与に関係した［Kaufman (1998) Thromb. Haemost. 79:1068-1079、米国特許第７，５７５，８９７号］。
【０１９９】
ＦＩＸは、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドのＮ１５７およびＮ１６７に対応する活性化ペプチドにおけるアスパラギン残基でＮ結合型グリコシル化される。翻訳後修飾はまた、Ｏ結合型二糖および三糖を有する位置５３（配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドに対応する）にセリン残基をももたらすが、位置６１のセリン残基は、Ｏ結合型四糖を含有する［Nishimura et al., (1989) J Biol. Chem. 264:20320-20325, Harris et al., (1993) Biochemistry 32:6539-6547］。さらに、アミノ酸位置１５９および１６９（配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドに対応する）のトレオニン残基は、Ｏ−グリコシル化される［Agarwala et al., (1994) Biochemistry 33:5167-5171］。アミノ酸位置１７２および１７９のトレオニン残基もまた、Ｏ−グリコシル化され得る。
【０２００】
３．ＦＩＸ活性化
第ＩＸ因子は、タンパク質分解性の切断によって活性化されるまで、最小のタンパク質分解活性を有するチモーゲンとして主に循環する。活性化は、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体または第ＸＩａ因子によって達成することができる。ＴＦ／ＦＶＩＩａによる活性化は、内在性経路を通してのものであるが、ＦＸＩａによる活性化は、上記に記載される外因性経路を通してのものである。活性化のプロセスは、連続的なものであるように思われ、Ａｒｇ１４５−Ａｌａ１４６結合が最初に切断され、Ａｒｇ１８０−Ｖａｌ１８１結合の切断がその後に続く［Schmidt et al. (2003) Trends Cardio. Med. 13:39-45］。タンパク質分解性の切断は、活性化ペプチドを放出し、アミノ酸位置１３２および２８９（配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドに対応するナンバリング）の２つのシステインの間のジスルフィド結合によって共に保持される、軽鎖（配列番号３のアミノ酸位置１〜１４５に対応する）および重鎖（配列番号３のアミノ酸位置１８１〜４１５に対応する）を含有する二重鎖ＦＩＸａ分子を形成する。
【０２０１】
ＦＸ中の少なくとも２つのエキソサイトは、ＦＩＸ／ＴＦ／ＦＶＩＩａ三元複合体を形成するために、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体中のＴＦへの結合に関与するように思われる［Chen et al., (2002) Thromb. Haemost. 88:74-82］。研究は、ＦＩＸのＥＧＦ１ドメインが、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体によるＦＩＸ活性化に必要とされることを示唆する。たとえば、ＦＩＸのＥＧＦ１ドメインにおけるＧ４８（配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドに関する）の突然変異は、ＴＦ／ＦＶＩＩａによるその活性化を低下させる［Wu et al., (2000) Thromb. Haemost. 84:626-634］。さらに、ＦＩＸのＥＧＦ１ドメインは、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体におけるＴＦと相互作用することが示された［Zhong et al., (2002) J. Biol. Chem 277:3622］。対照的に、しかしながら、ＥＧＦ１ドメインは、ＦＸＩａによるＦＩＸ活性化に必要とされるように思われない。Ｇｌａドメインもまた、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体への結合およびそのため活性化に関与する。ＦＩＸのＧｌａドメインは、ＴＦにおける、ＦＸと同じ領域と相互作用し、これもまた、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体によって活性化される［Kirchhofer et al., (2000) Biochem. 39:7380-7387］。
【０２０２】
活性化ペプチドの切断および放出の後に、Ｖ１８１（配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドに対応する；キモトリプシンナンバリングによるＶ１６）の新しいアミノ末端が生成される。活性化ペプチドの放出は、コンホメーション変化を促進し、それによって、Ｖ１８１のアミノ基が活性部位の中に入り、Ｄ３６４の側鎖カルボキシレートと塩ブリッジを形成する。そのような変化は、その変化によりＳ３６５のヒドロキシル側鎖がその基質、ＦＸの切断部位を加水分解することができる反応性の種に変換するので、チモーゲン状態の活性状態への変換に必要とされる。さらなるコンホメーション変化がＦＶＩＩＩａとの結合などによって誘発され、最大の触媒活性を有するＦＩＸａポリペプチドを生成するまで、活性化ＦＩＸａポリペプチドは、チモーゲン様のコンホメーションのままである。
【０２０３】
４．ＦＩＸ機能
ＦＩＸは、凝固経路において重要な役割を果たし、欠乏症またはＦＩＸ活性の欠如は、血友病Ｂに至る。一度、ＦＩＸからＦＩＸａに活性化されたら、ＦＩＸａは、順番に、大量のＦＸを、凝固に必要とされるＦＸａに活性化するように機能する。そうするために、ＦＩＸａは、活性化血小板のリン脂質表面上で、内在性テナーゼ複合体とも呼ばれるＦＩＸａ／ＦＶＩＩＩａ複合体を形成するためにその補因子、第ＶＩＩＩａ因子に最初に結合しなければならない。ＦＩＸのＧｌａドメインおよびＥＧＦ２ドメインの両方は、リン脂質への安定した結合にとって重要である。次いで、ＦＩＸａ／ＦＶＩＩＩａ複合体は、ＦＸに結合してこの凝固因子を切断し、ＦＩＸａを形成する。
【０２０４】
ＦＩＸａは、その補因子、ＦＶＩＩＩａおよび生理学的基質、ＦＸの非存在下において事実上不活性である。実験的研究は、これが主に９９ループに起因することを示す。ＦＩＸａにその補因子が結合していない場合、Ｙ１７７は、Ｙ９９およびＫ９８（キモトリプシンナンバリングによる、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドのＹ２６６およびＫ２６５に対応する）の側鎖が基質結合を妨げる不活性コンホメーションにおいて９９ループを固定する。ＦＩＸａへのＦＶＩＩＩａの結合は、このチモーゲン様のコンホメーションを解き放ち、放出し、ＦＸは、次いで、ＦＩＸａ／ＦＶＩＩＩａ複合体と結合し、解き放たれた９９ループを再配列し、引き続いて活性部位のくぼみに結合することができる［Sichler et al., (2003) J. Biol. Chem. 278:4121-4126］。リン脂質へのＦＩＸａの結合およびＣａ２＋の存在は、反応をさらに増強する。
【０２０５】
ＦＩＸａ／ＦＶＩＩＩａ相互作用のいくつかのモデルが、提唱されてきた［たとえばAutin et al., (2005) J. Thromb. Haemost. 3:2044-2056, Stoilova-McPhie et al., (2002) Blood 99: 1215-1223, Bajaj et al., (2001) J. Biol. Chem. 276:16302-16309, Schmidt et al., (2003) Trends Cardiovasc. Med. 13:39-45を参照されたい］。ＦＩＸａは、ＦＩＸａポリペプチドの２つ以上のドメインを伴う相互作用においてＦＶＩＩＩａに結合する。ＦＶＩＩＩａは、３つの非共有結合鎖：Ａ１、Ａ２、およびＡ３−Ｃ１−Ｃ２からなるヘテロ二量体である。Ａ３−Ｃ１−Ｃ２はまた、軽鎖とも呼ばれる。ＦＩＸａのプロテアーゼドメインは、ＦＶＩＩＩａのＡ２サブユニットと相互作用するように思われる。研究は、ＦＩＸａの２９３ヘリックス（キモトリプシンナンバリングによる１２６ヘリックス）、３３０ヘリックス（キモトリプシンナンバリングによる１６２ヘリックス）、およびＮ３４６（キモトリプシンナンバリングによるＮ１７８）が、ＦＶＩＩＩａのＡ２サブユニットとの相互作用に関与することを示唆する。ＦＩＸａのＥＧＦ１／ＥＧＦ２ドメインは、ＦＶＩＩＩａのＡ３サブユニットと相互作用する。さらに、ＦＩＸａのＧｌａドメインは、ＦＶＩＩＩａのＣ２ドメインと相互作用することが仮定される。カルシウムイオンおよびリン脂質もまた、ＦＩＸａおよびＦＶＩＩＩａの結合に寄与する。たとえば、リン脂質の存在は、約２０００倍まで、ＦＶＩＩＩａへのＦＩＸａの結合を増加させる［Mathur et al., (1997) J. Biol. Chem. 272:］。ＦＩＸａ／ＦＶＩＩＩａ複合体によるＦＸの結合の後に、ＦＩＸａのプロテアーゼドメイン（または触媒ドメイン）は、ＦＸａを形成するためのＲ１９４−Ｉ１９５でのＦＸの切断を担う。
【０２０６】
ＦＩＸａの活性は、上記に議論されるように、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体などのような阻害分子および低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）などのような他のクリアランスのメカニズムによって調節される。ＬＲＰは、肝臓、脳、胎盤、および肺を含む様々な組織上に発現される膜糖タンパク質である。ＬＲＰは、ＦＩＸａに加えて、アポリポタンパク質、リパーゼ、プロテイナーゼ、プロテイナーゼ阻害剤複合体、およびマトリックスタンパク質を含むが、これらに限定されない広範囲のタンパク質および複合体に結合する。ＦＩＸのチモーゲン形態または不活性形態は、ＬＲＰに結合しない。もっと正確に言えば、活性化に際して、ＬＲＰ結合部位が暴露される［Neels et al., (2000) Blood 96:3459-3465］。この結合部位は、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドの残基３４２〜３４６にわたるプロテアーゼドメインにおけるループに位置する［Rohlena et al., (2003) J. Biol. Chem. 278:9394-9401］。
【０２０７】
５．生物製剤としてのＦＩＸ
第ＩＸ因子は、完全に、血液凝固プロセスに関与し、その活性化形態（ＦＩＸａ）において、それは、ＦＶＩＩＩａとテナーゼ複合体を形成し、ＦＸをＦＸａに活性化する。ＦＸａは、リン脂質、カルシウム、およびＦＶａと共に、プロトロンビンをトロンビンに変換し、これは、順番に、フィブリノーゲンをフィブリン単量体に切断し、したがって、強固で網目の血餅の形成を促進する。多くの研究は、外因性ＦＩＸが、血友病を有する患者において血液凝血を促す能力を実証した。たとえば、ＦＩＸが欠損している血友病Ｂ患者は、外因性ＦＩＸを用いる置換療法によって処置することができる。初期の置換療法は、ＭｏｎｏＮｉｎｅ（登録商標）第ＩＸ因子およびＡｌｐｈａ−ｎｉｎｅ−ＳＤ（登録商標）第ＩＸ因子として販売される治療薬などのような血漿精製ＦＩＸを利用した。Ｂｅｂｕｌｉｎ（登録商標）ＶＨ、ＦＸおよび低量のＦＶＩＩとのＦＩＸの精製濃縮物；Ｋｏｎｙｎｅ（登録商標）８０（Ｂａｙｅｒ）、ＦＩＩ、ＦＸ、および低レベルのＦＶＩＩとのＦＩＸの精製濃縮物；ＰＲＯＰＬＥＸ（登録商標）Ｔ（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ＦＩＩ、ＦＶＩＩ、およびＦＸと共にＦＩＸを含有する、プールされた正常ヒト血漿からの調製された熱処理産物；ならびにＰｒｏｆｉｌｎｉｎｅ  ＳＤ（登録商標）（Ａｌｐｈａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含む、血漿精製ＦＩＸ複合体治療薬もまた、使用されてきた。より最近では、しかしながら、ヒト組換え第ＩＸ因子[ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）凝固因子ＩＸ（組換え体）、Ｗｙｅｔｈ]が、手術背景における出血の制御および予防を含む、血友病Ｂ患者における出血エピソードの制御および予防における使用のために承認されてきた。ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）凝固因子ＩＸ（組換え体）は、配列番号２０において記載されるアミノ酸配列を有し、血漿由来第ＩＸ因子のＡｌａ１４８対立形質と同一である。したがって、配列番号３において記載される野生型ＦＩＸポリペプチドと比較して、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）、凝固因子ＩＸ（組換え体）は、Ｔ１４８Ａ突然変異を含有する。
【０２０８】
凝血促進薬としてのその使用に加えて、ＦＩＸの不活性形態または触媒活性が低下した形態は、血栓症の疾患および状態の処置などにおいて、抗凝血薬として使用することができる。
【０２０９】
典型的に、ＦＩＸは、静脈内に投与されるだけでなく、経口的に、全身性に、頬側に、経皮に、筋肉内に、および皮下に投与することもできる。ＦＩＸは、一度または複数回、投与することができる。一般的に、複数回の投与は、凝固を達成するために、ＦＩＸを用いる処置レジメンにおいて使用される。
【０２１０】
本明細書において下記に議論されるように、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドはまた、未修飾または野生型または他の治療的に活性なＦＩＸポリペプチドが使用されることが知られている、任意の処置あるいは製薬の方法において使用することもできる。そのような使用、方法、およびプロセスにおいて、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、野生型または未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、改善された特性を示す。
【０２１１】
Ｄ．修飾ＦＩＸポリペプチド
修飾第ＩＸ因子ポリペプチドが、本明細書において提供される。ＦＩＸポリペプチドは、野生型または未修飾ＦＩＸポリペプチドの一次配列における１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換（交換）によって修飾することができる。結果として生じる修飾ポリペプチドは、未修飾または野生型ＦＩＸポリペプチドと比較した、改善された特性または活性を示す。たとえば、修飾第ＩＸ因子および第ＩＸａ因子ポリペプチドの修飾ＦＩＸａポリペプチドおよび断片を含む修飾第ＩＸ因子ポリペプチドは、高グリコシル化を含む、改変されたグリコシル化などのような改変された翻訳後修飾および／またはリン酸化もしくは硫酸化の減少などのような改変されたリン酸化もしくは硫酸化；ＡＴ−ＩＩＩおよび／もしくはヘパリンなどのような阻害因子に対する抵抗性の増加；ＬＲＰへの結合の減少；触媒活性の増加；クリアランスの減少およびインビボにおける血清半減期の増加を含む、改善された薬物動態学的特性；血液凝固活性の増加；またはその任意の組合せを有することができる。典型的に、修飾ＦＩＸポリペプチドは、凝血促進活性を示す。したがって、それらの単鎖チモーゲン形態からの活性化および補因子、ＦＶＩＩＩａへの続く結合に際して増加した血液凝固活性を示す修飾ＦＩＸポリペプチドが、本明細書において提供される。そのような修飾ＦＩＸポリペプチドは、たとえば血友病Ｂなどのような不十分な凝固によって特徴づけられる疾患または状態を有する患者に投与することができる。
【０２１２】
いくつかの例では、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドが、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、ＡＴ−ＩＩＩ、ヘパリン、およびＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体を含む阻害因子に対する抵抗性の増加を示す。そのような修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、血液凝固活性の増加を示すことができる。さらなる例では、本明細書において提供される修飾第ＩＸ因子ポリペプチドが、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、改変されたグリコシル化レベルおよび／またはグリコシル化の種類の改変などのような、改変された翻訳後修飾を示す。
【０２１３】
いくつかの例では、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドが、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、グリコシル化の増加を示す。したがって、高グリコシル化ＦＩＸポリペプチドが、本明細書において提供される。修飾ＦＩＸポリペプチドは、炭水化物成分が連結される、少なくとも１つの非天然グリコシル化部位（つまり未修飾または野生型ＦＩＸポリペプチドにおいて見出されないグリコシル化部位）の組み込みにより、グリコシル化の増加を示すことができる。そのような修飾ＦＩＸポリペプチドは、クリアランスの減少および血清半減期の増加を含む、インビボにおける改善された薬物動態学的特性を示すことができる。非天然グリコシル化部位および続く炭水化物成分の導入は、１つまたは複数の他のタンパク質とのＦＩＸポリペプチドの相互作用を立体的に妨げることによって、修飾ＦＩＸポリペプチドの活性をさらに改善することができる。たとえば、グリコシル化部位は、炭水化物成分がこの部位に付加される場合に、それがＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体との修飾ＦＩＸポリペプチドの相互作用を立体的に妨げ、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンに対する抵抗性が増加したポリペプチドをもたらすように、導入することができる。これは、さらに、循環からのポリペプチドのクリアランスを低下させることができる。したがって、新しいグリコシル化部位の導入の効果は、炭水化物成分がまた、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体などのような他のタンパク質との相互作用をも立体的に妨げる場合、数倍になり得る。
【０２１４】
たとえば、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、１つまたは複数の非天然グリコシル化部位を導入する、１つまたは複数の修飾を含有することができる。たとえば、１、２、３、４、５、６、またはそれ以上の非天然グリコシル化部位を導入することができる。導入することができるグリコシル化部位は、Ｎ−グリコシル化部位、Ｏ−グリコシル化部位、またはその組合せを含むが、これらに限定されない。したがって、グリコシル化を促進する細胞においてまたはインビトログリコシル化の後に産生される場合、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、天然グリコシル化部位（たとえば、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドのＳ５３、Ｓ６１、Ｎ１５７、Ｎ１６７、Ｔ１５９、Ｔ１６９、Ｔ１７２、およびＴ１７９に対応する天然グリコシル化部位）に連結される炭水化物成分に加えて、それぞれ異なる非天然グリコシル化部位に連結される１、２、３、４、５、６、またはそれ以上の炭水化物成分を含有することができる。特定の例では、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドが、１つまたは複数の非天然Ｎ−グリコシル化部位を含有する。したがって、修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、Ｎ−グリコシル化のレベルの増加を示すことができる。
【０２１５】
たとえば、グリコシル化が増加した修飾ＦＩＸポリペプチドはまた、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、溶解性の増加、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン抵抗性の増加、血清半減期の増加、免疫原性の減少、および／または血液凝固活性の増加をも示すことができる。そのような修飾ＦＩＸポリペプチドは、血友病または傷害などのような、出血障害または出血事象の処置において使用することができ、ＦＩＸポリペプチドは、血液凝固を促進するために機能することができる。いくつかの場合では、グリコシル化の増加を示す、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドはまた、タンパク質を不活性またはほとんど不活性にする、１つまたは複数の修飾をも含有することができる。そのようなポリペプチドは、そのため、抗凝固薬活性の増加を示すことができ、血栓症の事象、状態、または疾患の処置において使用することができる。典型的に、しかしながら、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、凝血促進薬である。
【０２１６】
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドはまた、他の活性および／または特性をも示すことができる。たとえば、修飾ＦＩＸポリペプチドのいくつかは、触媒活性を増加させる１つまたは複数の修飾を含有する。他の例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、リン酸化、硫酸化、ヒドロキシル化、および／またはグリコシル化を減少させる、１つまたは複数の修飾を含有する。さらなる例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、ＦＩＸおよびＬＲＰの間の相互作用に干渉する修飾を含有する。ＬＲＰへのＦＩＸの結合を妨害することによって、循環からのＦＩＸのクリアランスを減少させることができる。したがって、ＬＲＰへのＦＩＸの結合を低下させる修飾は、インビボにおけるＦＩＸの薬物動態学的特性を改善することができる。
【０２１７】
１つもしくは複数の非天然グリコシル化部位を導入するまたは阻害因子に対する抵抗性を増加させる修飾などのような、本明細書において記載されるアミノ酸置換などのような修飾は、配列番号２において記載される配列を有する前駆体ＦＩＸポリペプチドを含む任意のＦＩＸポリペプチド（たとえば未修飾もしくは野生型ＦＩＸポリペプチド）、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドにおいて、または配列番号２もしくは配列番号３において記載されるＦＩＸポリペプチドに対して少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有するＦＩＸポリペプチドにおいて、なすことができる。アミノ酸残基に対する本明細書における言及は、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドのナンバリングに関するものであることが理解される。配列番号３と他のＦＩＸポリペプチドの配列のアライメントによって、前駆体、成熟、または他の活性形態などのような任意の形態の他のＦＩＸポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基を同定することは、当業者のレベルの範囲内にある（たとえば図３を参照されたい）。本明細書において提供される任意のアミノ酸置換は、異なるまたは置換アミノ酸残基と同じでない、対応するアミノ酸残基でなすことができる。本明細書において記載される活性または特性について、任意の結果として生じる修飾ＦＩＸポリペプチドを試験することは、当業者のレベルの範囲内にある。
【０２１８】
たとえば、アミノ酸置換などのような修飾は、当技術分野において記載されるものなどのような、任意の種、対立遺伝子、または修飾変異体においてなすことができる。ＦＩＸの対立遺伝子変異体は、Ｔ１４８ＡおよびＴ４１２Ｐを含むが、これらに限定されない。本明細書において提供されるアミノ酸置換のいずれも、突然変異Ｔ１４８ＡまたはＴ４１２Ｐを含有する第ＩＸ因子とすることができる。たとえば、任意のアミノ酸置換などのような修飾は、配列番号３２５または配列番号２０において記載されるＦＩＸポリペプチドにおいてなすことができる。本明細書における修飾のための例示的な種変異体は、それらの配列が配列番号４〜１８においてそれぞれ記載されるチンパンジー、アカゲザル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ニワトリ、雌ウシ、ヒツジ、カエル、ゼブラフィッシュ、および日本フグＦＩＸポリペプチド由来のＦＩＸポリペプチドを含む、ヒトおよび非ヒトポリペプチドを含むが、これらに限定されない。ＦＩＸポリペプチドにおける修飾は、一次配列の修飾およびポリペプチドの一次配列におけるものではない修飾を含む、当技術分野において記載されるものなどのような、他の修飾をも含有するＦＩＸポリペプチドに対してなすことができる（たとえば、本明細書において記載されるアミノ修飾をなすことができる、例示的な修飾ＦＩＸポリペプチドを記載するＤ．６部を参照されたい）。
【０２１９】
他の例では、アミノ酸置換などのような修飾が、配列番号２もしくは配列番号３の活性断片などのようなＦＩＸポリペプチドの任意の活性断片または当技術分野において記載されるものなどのような種、対立遺伝子、もしくは修飾変異体の活性断片においてなすことができる。活性断片は、ポリペプチドの触媒活性ドメインまたは本明細書において記載されるアミノ酸置換などのようなアミノ酸修飾を含有する触媒活性部分を含有するアミノ酸の連続配列を含有する。活性断片は、配列番号３において記載されるＦＩＸポリペプチドなどのようなポリペプチドの成熟形態の活性の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上を示す。
【０２２０】
ＦＩＸポリペプチドの修飾はまた、異なるＦＩＸポリペプチドのハイブリッドであるポリペプチドおよび知られているポリペプチドの配列に基づいて、組換えで調製されたまたは当技術分野において知られている他の方法によって合成されたもしくは構築された合成ＦＩＸポリペプチドの修飾をも含む。たとえば、第ＦＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）および第Ｘ因子（ＦＸ）を含むが、これらに限定されない他の凝固因子ファミリーメンバーとのＦＩＸのアライメントに基づいて、ファミリーメンバーの間の相同性ドメインは、容易に同定される。ＦＩＸポリペプチドのキメラ変異体は、構築することができ、１つもしくは複数のアミノ酸または全ドメインは、対応するファミリーメンバーのアミノ酸配列を使用して、ＦＩＸアミノ酸配列において置換される。さらに、キメラＦＩＸポリペプチドは、１つもしくは複数のアミノ酸または全ドメインが、異なる種のアミノ酸配列を使用して、ヒトＦＩＸアミノ酸配列において置換されるものを含む。そのようなキメラタンパク質は、出発未修飾ＦＩＸポリペプチドとして本明細書において使用することができる。
【０２２１】
出発未修飾参照ポリペプチドの本明細書において提供される修飾は、アミノ酸置換もしくは交換、アミノ酸の追加もしくは欠失、またはその任意の組合せを含む。たとえば、修飾ＦＩＸポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、またはそれ以上の修飾位置を有するものを含む。いくつかの例では、ＦＩＸのある活性または特性を改変するためになされる修飾はまた、またはその代わりに、もう１つの他の活性または特性に影響を及ぼすことができる。たとえば、阻害因子に対する抵抗性を増加させるためになされる修飾はまた、またはその代わりに、触媒活性を増加させることができる。他の例では、新しいグリコシル化部位を導入するためになされる修飾がまた、阻害因子に対する抵抗性の増加および／または触媒活性の増加をもたらすことができる。さらなる例では、ＬＲＰへの結合の減少のためになされる修飾はまた、またはその代わりに、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンなどのような阻害因子に対する抵抗性を増加させる。したがって、本明細書において記載される修飾は、典型的に、ＦＩＸ活性または特性に対するそれらの意図される影響に関して記載されるが、本明細書において記載される修飾のいずれも、単独でまたは１つもしくは複数の他の修飾と共に、他の予測されない活性または特性における変化をもたらし得ることが理解される。
【０２２２】
本明細書において提供される任意の修飾は、当業者に知られている任意の他の修飾と組み合わせることができる。典型的に、結果として生じる修飾ＦＩＸポリペプチドは、それがその二重鎖形態をしている場合、凝固活性の増加を示す。修飾の結果として改変することができる活性または特性は、凝固もしくは血液凝固活性；凝血促進活性；第Ｘ因子（ＦＸ）活性化を達成するためのなどのようなタンパク質分解活性もしくは触媒活性；抗原性（抗ＦＩＸ抗体に結合する能力もしくはそれへの結合についてあるポリペプチドと競合する能力）；ＦＶＩＩＩａ、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン、および／もしくは第Ｘ因子に結合するための能力；リン脂質に結合するための能力；３次元構造；ｐＩ；および／またはコンホメーションを含むが、これらに限定されない。本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドの中で、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）に対する抵抗性の増加、ヘパリンに対する抵抗性の増加、グリコシル化の増加などのような、改変されたグリコシル化、触媒活性の増加、ならびにｉ）クリアランスの減少、ｉｉ）分布容積の改変、ｉｉｉ）インビボにおける回収率の増強、ｉｖ）インビボにおける総タンパク質暴露の増強（つまりＡＵＣ）、ｖ）血清半減期（α−、β−、および／もしくはγ−相）の増加、ならびに／またはｖｉ）平均共鳴時間（ＭＲＴ）の増加などのような改善された薬物動態学的特性を有するものが本明細書において提供される。
【０２２３】
いくつかの例では、修飾は、ＦＩＸポリペプチドの２つまたはそれ以上の特性または活性に影響を及ぼすことができる。たとえば、修飾は、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、修飾ＦＩＸポリペプチドのＡＴ−ＩＩＩ抵抗性の増加および触媒活性の増加をもたらすことができる。他の例では、非天然Ｎ−グリコシル化部位を導入し、したがって、哺乳動物細胞などのような適切な細胞において発現される場合に、ポリペプチドのグリコシル化レベルを増加させることができる修飾もまた、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、修飾ＦＩＸポリペプチドの触媒活性の増加をもたらすことができる。本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、修飾の効果の範囲を同定するために、それぞれの特性および活性についてアッセイすることができる。そのようなアッセイは、当技術分野において知られており、下記に記載される。典型的に、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドの特性および／または活性に対する変化は、ＦＶＩＩＩａに対する結合ならびに／またはＦＸの結合および活性化などのような、しかし限定されない、他のＦＩＸ活性または特性を保持しながら、なされる。したがって、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、ＦＩＸポリペプチドの野生型形態または出発形態と比較して、ＦＶＩＩＩａ結合および／またはＦＸ結合ならびに活性化を保持する。典型的に、そのような活性は、野生型タンパク質または出発タンパク質と比較して、実質的に不変である（１％、５％、または１０％未満変化する）。他の例では、修飾ＦＩＸポリペプチドの活性が、野生型ポリペプチドまたは出発ＦＩＸポリペプチドと比較して、増加するまたは減少する。活性は、インビトロにおいてまたはインビボにおいて評価することができ、たとえば成熟野生型天然ＦＩＸポリペプチド（配列番号３）、野生型前駆体ＦＩＸポリペプチド（配列番号２）、または出発物質として使用される当業者に知られている任意の他のＦＩＸポリペプチドなどのような未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較することができる。
【０２２４】
本明細書において提供される修飾は、当業者にとってルーチン的なものなどのような標準的な組換えＤＮＡ技術によってなすことができる。標的タンパク質における任意の１つまたは複数のアミノ酸の突然変異を達成するための、当技術分野において知られている任意の方法を利用することができる。方法は、コード核酸分子の標準的な部位特異的突然変異誘発または固相ポリペプチド合成法によるものを含む。
【０２２５】
炭水化物部分の追加、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の追加、Ｆｃドメイン、血清アルブミン、および／または他のタンパク質の追加を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの一次配列にあるまたはない他の修飾は、修飾ＦＩＸポリペプチドまたはそのコンジュゲートにおいて含むことができる。たとえば、そのようなさらなる修飾は、タンパク質の安定性または半減期を増加させるためになすことができる。
【０２２６】
結果として生じる修飾ＦＩＸポリペプチドは、単鎖チモーゲンポリペプチドであるものおよび二重鎖チモーゲン様のポリペプチドであるもの（つまり、補因子、ＦＶＩＩＩａに結合していないＦＩＸａポリペプチド）を含む。単鎖ポリペプチドである、本明細書において提供される任意の修飾ＦＩＸポリペプチドは、修飾ＦＩＸａ（つまり二重鎖形態）を生成するために活性化することができる。修飾ＦＩＸポリペプチドの活性は、その二重鎖形態において典型的に示される。
【０２２７】
１．例示的なアミノ酸置換
配列番号３のナンバリングに関する残基のナンバリングと共に本明細書において下記に記載される１つまたは複数のアミノ酸置換を含有する修飾ＦＩＸポリペプチドが、本明細書において提供される。同じアミノ酸置換は、他のＦＩＸポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基においてなすことができる（たとえば、対応するアミノ酸残基の同定の例証のために図３を参照されたい）。アミノ酸置換は、改変されたグリコシル化（たとえば非天然グリコシル化部位の導入もしくは天然グリコシル化部位の排除によって）、ＡＴ−ＩＩＩおよび／もしくはヘパリンに対する抵抗性の増加、触媒活性の増加、ＬＲＰ結合の減少、ならびに／または翻訳後修飾の改変を付与する。結果として生じる修飾ＦＩＸポリペプチドは、たとえば、改善された薬力学的または薬物動態学的活性による、改善された治療上の効能を示す。
【０２２８】
特に、本明細書において下記に提供される修飾ＦＩＸポリペプチドにおけるアミノ酸置換の非限定的な例は、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドに関するナンバリングにより、任意の１つまたは複数のアミノ酸残基１５５、３１８、３３８、３４３、４０３、および／または４１０でのものである（キモトリプシンナンバリングによって、それぞれ、アミノ酸残基［１５５］、１５０、１７０、１７５、２３３、および／または２４０に対応する）。他のＦＩＸポリペプチドにおける１５５、３１８、３３８、３４３、４０３、および／または４１０のいずれかに対応する残基は、配列番号３との配列アライメントによって決定することができる（たとえば図３を参照されたい）。配列番号３に関するナンバリングによるアミノ酸残基１５５、３１８、３３８、３４３、４０３、および／または４１０のいずれかでの本明細書において提供されるアミノ酸置換は、本明細書において別記されるように、他のＦＩＸポリペプチドにおいてなすことができることが理解される。本明細書において提供される他のアミノ酸置換のいずれかに対応する残基はまた、本明細書において例示されるように、他のＦＩＸポリペプチドにおいて同定することもできることもまた、理解される（たとえば図３）。
【０２２９】
特に、アミノ酸残基Y155(Y155F)、Y155L、Y155H、R318A、R318Y、R318E、R318F、R318W、R318D、R318I、R318K、R318L、R318M、R318N、R318S、R318V、R318Y、R338A、R338E、T343R、T343E、T343D、T343F、T343I、T343K、T343L、T343M、T343Q、T343S、T343V、T343W、T343Y、R403A、R403E、E410Q、E410S、E410N、E410A、E410Dでのチロシンのアミノ酸置換または保存的アミノ酸置換（たとえば表２Ｂを参照されたい）が、本明細書において提供される。いくつかの例では、アミノ酸置換が、Ｙ１５５Ｆ、Ｒ３１８Ｙ、Ｒ３１８Ｅ、Ｒ３３８Ｅ、Ｔ３４３Ｒ、Ｒ４０３Ｅ、および／もしくはＥ４１０Ｎまたはその保存的アミノ酸置換である。
【０２３０】
たとえば、本明細書においてデータによって示されるように、配列番号３に関する位置Ｒ３１８（キモトリプシンナンバリングによる１５０）でのアミノ酸置換は、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体による阻害に対する抵抗性を付与する。位置Ｒ３３８（キモトリプシンナンバリングによるＲ１７０）でのアミノ酸置換もまた、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体による阻害に対する抵抗性を付与する。この点において、アミノ酸位置Ｒ３３８は、インビトロ凝血アッセイにおいて５〜１０倍増強した凝血活性を示すことが報告されている自然突然変異の部位（Ｒ１７０Ｌ）である（国際特許出願公開ＷＯ２０１００２９１７８）。記載されるアッセイは、精製タンパク質ではなく、条件培地を用いて実行され、タンパク質濃度は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定された。その結果として、これらのデータは、野生型コンパレーター調製物と比較して、Ｒ３３８Ｌ（Ｒ１７０Ｌ）調製物における活性物質のより高度な画分または凝血アッセイにおいて活性な、より高度なレベルの混入物を反映することができた。しかしながら、本明細書において示されるように、位置３３８（１７０）にＡ、Ｅ、およびＬを含有する変異体は、ＦＸ活性化に対する効率が３．５〜４倍増加する。本明細書において見出されるように、Ｒ３３８Ｅ突然変異は、さらに、ヘパリン／ＡＴ−ＩＩＩ複合体による阻害に対して約８８倍の抵抗性および補因子ＦＶＩＩＩａへの結合の２倍の増強を示した。
【０２３１】
位置３４２〜３４５（キモトリプシンナンバリングによる１７４〜１７７）からの、ＦＩＸへの４アミノ酸トロンビンループｓｗａｐ突然変異は、ｓＬＲＰへのＦＩＸａの結合を低下させることが報告されている［Rohlena et al., (2003) J. Biol. Chem. 9394-9401を参照されたい］。位置Ｔ３４３（キモトリプシンナンバリングによるＴ１７５）での残基の突然変異は、ＦＩＸの薬物動態学的（ＰＫ）特性に有意な影響を付与しなかった。しかしながら、突然変異Ｔ３４３Ｒ（キモトリプシンナンバリングによるＴ１７５Ｒ）は、約３．１の倍数までＦＸの活性化のための触媒効能を増加させ、ヘパリン／ＡＴ−ＩＩＩ複合体に対する約５．６倍の抵抗性をもたらし、約１．６倍の倍数までＦＶＩＩＩａに対する親和性を増加させることが本明細書において見出される。
【０２３２】
また、本明細書において示されるように、位置Ｒ４０３（キモトリプシンナンバリングによるＲ２３３）での突然変異は、ヘパリン／ＡＴ−ＩＩＩ複合体による阻害に対する抵抗性を付与する。Ｅ４１０Ｎなどのような位置Ｅ４１０（キモトリプシンナンバリングによるＥ２４０）での突然変異は、ＦＸの活性化のための触媒効能において、有意な、これまでに観察されていない１．３〜２．８倍の増加をもたらす。
【０２３３】
また、その点で示されるように、補因子ＦＶＩＩＩへの結合の増強では、Ｒ３３８およびＴ３４３（キモトリプシンナンバリングによるＲ１７０およびＴ１７５）での突然変異、特にＲ３３８ＥおよびＴ３４３Ｒにおいて相乗効果がある。相乗効果はまた、位置Ｒ３３８およびＥ４１０での突然変異（キモトリプシンナンバリングによるＲ１７０およびＥ２４０）、特にＲ３３８ＥおよびＥ４１０Ｎの間で観察された。本明細書において例示される２つの二重突然変異体、Ｒ３３８Ｅ／Ｔ３４３ＲおよびＲ３３８Ｅ／Ｅ４１０Ｎは、２４〜２８倍改善された、ＦＶＩＩＩａへの結合を示すが、それぞれの単一突然変異は、単独で、１．６〜２．２倍まで結合を増強する。
【０２３４】
下記に記載されるように改変された特性または活性を付与することが見出された、本明細書において提供されるＦＩＸポリペプチドにおける他の例示的なアミノ酸置換は、配列番号３に関する1、5、53、61、64、85、103、104、105、106、108、148、157、158、159、167、169、172、179、202、203、204、205、228、239、241、243、247、249、251、257、259、260、262、284、293、312、314、315、316、317、319、320、321、333、342、345、346、392、394、400、412、または413の中からの任意のアミノ酸残基または対応するアミノ酸残基でのものとすることができる。たとえば、本明細書において提供されるＦＩＸポリペプチドにおける例示的なアミノ酸置換はまた、配列番号３において記載される配列を有する成熟ＦＩＸポリペプチドにおけるY1N、K5A、S53A、S61A、S61C、S61D、S61E、S61F、S61G、S61I、S61K、S61L、S61P、S61R、S61V、S61W、S61Y、D64A、D64C、D64F、D64H、D64I、D64L、D64M、D64N、D64P、D64R、D64S、D64T、D64W、D85N、A103N、D104N、N105S、N105T、K106N、K106S、K106T、V108S、V108T、T148A、N157D、N157E、N157F、N157I、N157K、N157L、N157M、N157Q、N157R、N157V、N157W、N157Y、S158A、S158D、S158E、S158F、S158G、S158I、S158K、S158L、S158M、S158R、S158V、S158W、S158Y、T159A、N167D、N167Q、N167E、N167F、N167G、N167H、N167I、N167K、N167L、N167M、N167P、N167R、N167V、N167W、N167Y、T169A、T169D、T169E、T169F、T169G、T169I、T169K、T169L、T169M、T169P、T169R、T169S、T169V、T169W、T169Y、T172A、T172D、T172E、T172F、T172G、T172I、T172K、T172L、T172M、T172P、T172R、T172S、T172V、T172W、T172Y、T179A、V202M、V202Y、D203N、D203M、D203Y、D203F、D203H、D203I、D203K、D203L、D203R、D203V、D203W、A204M、A204Y、A204F、A204I、A204W、F205S、F205T、K228N、E239A、E239S、E239R、E239K、E239D、E239F、E239I、E239L、E239M、E239N、E239T、E239V、E239W、E239Y、T241N、H243S、H243T、K247N、N249S、N249T、I251S、H257F、H257E、H257D、H257I、H257K、H257L、H257M、H257Q、H257R、H257S、H257V、H257W、H257Y、N260S、A262S、A262T、Y284N、K293E、K293A、R312A、R312Y、R312L、R312C、R312D、R312E、R312F、R312I、R312K、R312L、R312M、R312P、R312Q、R312S、R312T、R312V、R312W、R312Y、F314N、H315S、K316M、K316D、K316F、K316H、K316I、K316L、K316M、K316R、K316S、K316T、K316V、K316W、K316Y、G317N、S319N、A320S、L321N、L321S、L321T、R333A、R333E、F342I、F342D、F342E、F342K、F342L、F342M、F342S、F342T、F342V、F342W、F342Y、Y345A、Y345T、N346D、N346Y、N346E、N346F、N346H、N346I、N346K、N346L、N346M、N346Q、N346R、N346T、N346V、N346W、K392N、K394S、K394T、K400A、K400E、K400C、K400D、K400F、K400G、K400L、K400M、K400P、K400S、K400T、K400V、K400Y、T412A、T412V、T412C、T412D、T412E、T412F、T412G、T412I、T412M、T412P、T412W、T412Y、K413Nまたは対応するアミノ酸残基位置における同じ置換をも含むが、これらに限定されない。
【０２３５】
たとえば、本明細書において提供される修飾（たとえばアミノ酸置換）によって改変される、例示的な特性および活性は、以下のように記載される。
【０２３６】
ａ．グリコシル化の改変
本明細書において提供される修飾第ＩＸ因子ポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、改変されたグリコシル化レベルおよび／または改変されたグリコシル化の種類を示すことができる。いくつかの例では、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドが、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、グリコシル化の増加を示す。したがって、修飾ＦＩＸポリペプチドの中で、本明細書において記載されるのは、高度にグリコシル化されたＦＩＸポリペプチドである。
【０２３７】
ｉ．グリコシル化の利点
多くの哺乳動物タンパク質は、多様な数の炭水化物鎖を用いてグリコシル化され、これらのそれぞれが、異なる炭水化物構造を有することができる。そのような炭水化物は、タンパク質の安定性、溶解性、活性、血清半減期、および免疫原性において重要な役割を有することができる。したがって、タンパク質の特性および活性は、グリコシル化の量および／または種類を調整することによって改変することができる。たとえば、グリコシル化は、安定性、溶解性を増加させることによっておよびタンパク質の免疫原性を低下させることによって、ポリペプチドの血清半減期を増加させることができる。これは、治療用ポリペプチドについて特定に興味深く、治療用ポリペプチドの溶解性、血清半減期、および安定性の増加は、治療上の効能の増加をもたらすことができる。
【０２３８】
オリゴ糖は、認識、シグナル伝達、および粘着などのような細胞内および細胞間事象において重要である。炭水化物はまた、分泌タンパク質の折り畳みを支援する。ポリペプチドが、たとえばグリコシル化が可能な真核細胞において産生される場合、それが、グリコシル化されるように、グリコシル化部位は、グリコシド結合を介しての単糖およびオリゴ糖のポリペプチドへの付加のための部位を提供する。いくつかの種類のタンパク質グリコシル化がある。Ｎ結合型およびＯ結合型グリコシル化は、主なクラスであり、アスパラギン残基またはセリンもしくはトレオニン残基が、それぞれ、修飾される。他の種類のグリカンは、グリコサミノグリカンおよびグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−アンカーを含む。グリコサミノグリカンは、セリンのヒドロキシ酸素に付加されるが、ＧＰＩアンカーは、グリカン鎖を介して、疎水性脂質アンカーにタンパク質を付加する。Ｃ−グリコシル化はまた、コンセンサス配列Ｔｒｐ−Ｘ−Ｘ−Ｔｒｐで起こり得、配列における第１のトリプトファン残基のインドール側鎖は、α−マンノピラノシル基を用いて修飾される［Furmanek et al., (2000) Acta Biochim. Pol. 47:781-789］。
【０２３９】
しかしながら、潜在的なグリコシル化部位の存在は、その部位が、ＥＲにおける翻訳後プロセシングの間にグリコシル化されるであろうということを保証するものではない。さらに、グリコシル化のレベルは、グリカン構造でのように、任意の所定の部位で変わり得る。特定の部位でのグリコシル化のレベルおよび種類における差異は、潜在的なグリコシル化部位のあたりの配列構成および二次構造に、少なくとも部分的に起因し得る。
【０２４０】
Ｏ結合型グリコシル化は、セリン、トレオニン、ヒドロキシリシン、またはヒドロキシプロリン残基のヒドロキシル基を介しての、Ｎ−アセチルガラクトサミンなどのような糖単位の付加を含む。それは、１つの単糖の付加によって開始され、この後に、他のものが追加され、成熟Ｏ−グリカン構造が形成される。Ｏ−グリコシル化は、高度な割合のセリン残基、トレオニン残基、およびプロリン残基を有する配列において、より可能性が高くなるが、Ｏ−グリコシル化について知られているモチーフはない。さらに、広がったβターンなどのような二次構造エレメントもまた、Ｏ−グリコシル化を促し得る。Ｏ−グリコシル化は、共通のコア構造を欠く。その代わりに、いくつかの種類のグリカンは、Ｏ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｏ−ＧａｌＮＡｃ）、Ｏ−Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）、Ｏ−フコース、およびＯ−グルコースを含めて、選択されるＯ−グリコシル化部位に付加することができる。
【０２４１】
Ｏ−グリコシル化とは対照的に、Ｎ結合型グリコシル化コンセンサス配列モチーフは、十分に特徴づけられている。Ｎ結合型グリコシル化の間に、１４残基オリゴ糖は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｃｙｓコンセンサスモチーフ中のアスパラギン残基に移され、ここで、Ｘは、Ｐｒｏ以外の任意のアミノ酸である。次いで、グリコシルトランスフェラーゼは、酵素的にサッカライドを切り、マンノース残基にさらなる糖単位を付加する。コンセンサスモチーフに近接する配列もまた、グリコシル化がコンセンサス配列で起こるかどうかに影響を及ぼし得る。したがって、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｃｙｓコンセンサス配列の存在は、Ｎ結合型グリコシル化が起こるのに必要とされるが、必ずしも十分でない。いくつかの場合では、近接配列に対する変化が、それまで１つもなかった、コンセンサスモチーフでのグリコシル化をもたらす［Elliot et al., (2004) J. Biol. Chem. 279:16854-16862］。
【０２４２】
Ｎ結合型オリゴ糖は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３の共通のコア構造を共有する。哺乳動物において３つの主な種類のＮ結合型サッカライドがある：高マンノースオリゴ糖、複雑なオリゴ糖、およびハイブリッドオリゴ糖。高マンノースオリゴ糖は、本質的に、いくつかのマンノース残基を有する２つのＮ−アセチルグルコサミンを含有する。いくつかの場合では、最終のＮ結合型高マンノースオリゴ糖は、それがタンパク質に付加される前の前駆体オリゴ糖と同数のマンノース残基を含有する。複雑なオリゴ糖は、たいてい、コア構造において２つを超えるＮ−アセチルグルコサミン含めて、任意の数のマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、およびフコースサッカライドを含有することができる。
【０２４３】
グリコシル化は、タンパク質のタンパク質分解を低下させることによって、タンパク質の安定性を増加させることができ、熱分解、変性剤に対する暴露、酸素フリーラジカルによる損害、およびｐＨの変化からタンパク質を保護することができる。グリコシル化はまた、標的タンパク質が、細胞表面受容体を含む他のタンパク質への結合を伴うクリアランスメカニズムを回避することを可能にすることができる。炭水化物のシアル酸構成成分は、特に、タンパク質の血清半減期を増強することができる。シアル酸部分は高度に親水性であり、標的タンパク質の疎水性残基を遮蔽することができる。これは、溶解性を増加させ、タンパク質の凝集および沈殿を減少させる。凝集の減少は、タンパク質に対して産生されている免疫応答の可能性を減少させる。さらに、炭水化物は、免疫系から、免疫原性の配列を遮蔽することができ、炭水化物部分によって占められる空間の容量は、免疫系によって調査される、利用可能な表面積を減少させることができる。これらの特性は、標的タンパク質の免疫原性における低下に至り得る。
【０２４４】
治療用ポリペプチドのグリコシル化のレベルおよび／または種類の修飾は、ポリペプチドのインビボにおける活性に影響を及ぼし得る。グリコシル化のレベルを増加させることによって、組換えポリペプチドは、血清半減期の増加、血清クリアランスの低下、および免疫原性の低下により、より安定させることができる。これは、ポリペプチドのインビボにおける活性を増加させ、同等の治療効果を達成するために、投薬の用量および／または頻度の低下をもたらすことができる。たとえば、ダルベポエチンアルファ（ＤＡ）と呼ばれるリコンビナントヒトエリスロポエチン（ｒＨｕＥＰＯ）の高グリコシル化形態は、インビボにおける活性が増加しており、作用持続時間が長い。高グリコシル化ＤＡポリペプチドの炭水化物およびシアル酸含有量の増加は、未修飾ｒＨｕＥＰＯよりも３倍の血清半減期をもたらす。この血清半減期の増加は、生物学的利用率の増加およびクリアランスの低下をもたらし、これは、投薬をそれほど頻繁でないものにするおよび／または用量をより低くすることができ、患者にとっての、関連する利便性が増加し、副作用の危険性が低下し、患者コンプライアンスが改善される。
【０２４５】
ｉｉ．グリコシル化が改変された、例示的な修飾ＦＩＸポリペプチド
未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、改変されたグリコシル化を示すように修飾される修飾ＦＩＸポリペプチドが、本明細書において提供される。修飾ＦＩＸポリペプチドは、それぞれ、非天然グリコシル化部位の組み込みまたは天然グリコシル化部位の欠失などによって、グリコシル化の増加または減少を示すことができる。たとえば、修飾ＦＩＸポリペプチドは、１、２、３、４、またはそれ以上の非天然Ｎ−グリコシル化部位を含有することができる。非天然Ｎ−グリコシル化部位は、アミノ酸置換（複数可）［もしくは交換（複数可）］、挿入（複数可）、または欠失（複数可）またはその任意の組合せによって導入することができ、アミノ酸置換（複数可）、挿入（複数可）、および／または欠失（複数可）は、グリコシル化モチーフＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｃｙｓの確立をもたらし、ここで、Ｘａａは、プロリンではない。他の例では、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドが、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、グリコシル化部位の数を減少させることができ、典型的に、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、グリコシル化のレベルの低下をもたらす。さらなる例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、野生型ＦＩＸと同じレベルのグリコシル化を示すが、異なる種類のグリコシル化を示す。たとえば、修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドと同数のグリコシル化部位および同じレベルのグリコシル化を示すことができるが、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、たとえばＮ−およびＯ−グリコシル化の異なる相対量などのような、異なる種類のグリコシル化を有することができる。
【０２４６】
（ａ）．非天然グリコシル化部位（複数可）の導入
特定の例では、非天然Ｎ−グリコシル化部位が、アミノ酸置換によって導入される。いくつかの場合では、アミノ酸置換による非天然Ｎ−グリコシル化部位の生成が、たった１つのアミノ酸置換を必要とする。たとえば、未修飾ＦＩＸポリペプチドがＧｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ配列を含有する場合、Ｎ−グリコシル化部位は、アスパラギンとのグリシンの単一のアミノ酸交換によって生成され、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ  Ｎ−グリコシル化モチーフを生成することができる。他の例では、未修飾ＦＩＸポリペプチドがＡｓｎ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ配列を含有する場合、Ｎ−グリコシル化部位は、システイン（またはトレオニンまたはセリン）とのメチオニンの単一アミノ酸交換によって生成することができる。他の場合では、アミノ酸置換による非天然Ｎ−グリコシル化部位の生成が、１つ以上アミノ酸置換を必要とする。たとえば、未修飾ＦＩＸポリペプチドがＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ配列を含有する場合、Ｎ−グリコシル化部位は、２つのアミノ酸置換：アスパラギンとのグリシンのアミノ酸交換およびシステイン（またはトレオニンまたはセリン）とのフェニルアラニンのアミノ酸交換によって生成され、Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｃｙｓ  Ｎ−グリコシル化モチーフを生成することができる。したがって、当業者は、ＦＩＸポリペプチドにおける任意の位置に１つまたは複数の非天然Ｎ−グリコシル化部位を導入することができる。
【０２４７】
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドを生成するために、非天然グリコシル化部位がＦＩＸポリペプチドの中に導入される位置は、典型的に、その部位で連結される任意の炭水化物成分が、ＦＩＸポリペプチドの構造、機能、および／もしくは凝血促進活性に不利に干渉しないようにまたは非天然グリコシル化部位を導入するためにポリペプチドに対してなされるアミノ酸修飾（複数可）が、ＦＩＸポリペプチドの構造、機能、もしくは活性に不利に干渉しないように選択される。したがって、非天然グリコシル化部位は、ＦＩＸポリペプチドにおける任意の位置の中に導入することができる、ただし、結果として生じる修飾ＦＩＸポリペプチドが、野生型または未修飾ＦＩＸポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持する。反対に、１つまたは複数の非天然グリコシル化部位は、阻害分子とのＦＩＸの相互作用に関与し得る部位で、修飾ＦＩＸポリペプチドの中に導入することができる。新しいグリコシル化部位に連結される炭水化物成分は、阻害分子および修飾ＦＩＸの間の相互作用を立体的に妨げることができる。そのような立体障害は、血液凝固活性が増加した修飾ＦＩＸポリペプチドをもたらすことができる。たとえば、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドにおいて含有される非天然グリコシル化部位に連結される炭水化物成分は、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体との修飾ＦＩＸの相互作用を立体的に妨げることができる。これは、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンの阻害効果に対する修飾ＦＩＸポリペプチドの抵抗性の増加をもたらすことができる。
【０２４８】
したがって、非天然グリコシル化部位は、Ｇｌａドメイン、ＥＧＦ１ドメイン、ＥＧＦ２ドメイン、活性化ペプチド、および／またはプロテアーゼドメインの中に導入することができる、ただし、結果として生じる修飾ＦＩＸポリペプチドが、野生型または未修飾ＦＩＸポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持する。他の例では、非天然グリコシル化部位が、ＥＧＦ２ドメインまたはプロテアーゼドメインの中に導入される。結果として生じる修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持する。いくつかの例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、未修飾ＦＩＸポリペプチドの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上の触媒活性を保持する。他の例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、未修飾ＦＩＸポリペプチドの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のＦＸに対する結合活性を保持する。他の例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、未修飾ＦＩＸポリペプチドの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のＦＶＩＩＩａに対する結合活性を保持する。いくつかのアッセイにおいておよび／またはいくつかの条件下において、修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸタンパク質と比較して、活性の増加を示すことができる（たとえば、インビボにおける薬力学的活性および／またはＡＴＩＩＩ／ヘパリンもしくは血漿の存在下における触媒活性）。
【０２４９】
表３は、非天然Ｎ−グリコシル化部位を導入することによってグリコシル化レベルを増加させるために、修飾ＦＩＸポリペプチド中に含まれる、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドのアミノ酸位置に対応する、例示的なアミノ酸置換の非限定的な例を提供する。そのような突然変異に関して、第１のアミノ酸（１文字略語）は、置換されるアミノ酸に対応し、番号は、配列番号３に関する成熟ＦＩＸポリペプチド配列における位置に対応し、第２のアミノ酸（１文字略語）は、その位置の第１のアミノ酸と置換する、選択されるアミノ酸に対応する。突然変異のためのアミノ酸位置はまた、必要に応じて、キモトリプシンナンバリングスキームによっても参照される（つまり突然変異がＦＩＸプロテアーゼドメイン内に位置する場合）。修飾アミノ酸位置が対応するキモトリプシン番号を有していない（つまり、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドに対応するアミノ酸位置１８１〜４１５内になく、上記の表１において記載されていない）場合、位置は、成熟ＦＩＸナンバリングを使用して、括弧中に表される。たとえば、キモトリプシンナンバリングを指す場合、Ａ１０３Ｎは、対応するキモトリプシン番号を有しておらず、Ａ［１０３］Ｎとして記載される。下記の表３において、修飾ＦＩＸポリペプチドの例示的なアミノ酸配列が記載される配列識別子（配列番号）が同定される。修飾によって生成される非天然グリコシル化部位の位置もまた、表３において同定される。
【０２５０】
いくつかの場合では、１つのアミノ酸置換だけが、非天然Ｎ−グリコシル化部位を生成するために必要とされる。たとえば、位置８５（配列番号３において記載された成熟ＦＩＸポリペプチドに対応する）でのアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）は、結果として生じる修飾ＦＩＸポリペプチドにおけるアミノ酸位置８５で、ＥＧＦ２ドメインにおける非天然グリコシル化部位を生成するためにアスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）と置換することができる。他の例では、位置２５１（配列番号３において記載された成熟ＦＩＸポリペプチドに対応する）でのイソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）が、結果として生じる修飾ＦＩＸポリペプチドにおけるアミノ酸位置２４９で、プロテアーゼドメインにおける非天然Ｎ−グリコシル化部位を生成するためにセリン（Ｓｅｒ、Ｓ）と置換することができる。他の場合では、２つのアミノ酸置換が、新しいグリコシル化部位を生成するために必要とされる。たとえば、結果として生じる修飾ＦＩＸポリペプチドにおけるアミノ酸位置１０３で、ＥＧＦ２ドメインにおいて非天然Ｎ−グリコシル化部位を生成するために、位置１０３（配列番号３において記載される成熟ＦＩＸのナンバリングに基づく）でのアラニン（Ａｌａ、Ａ）は、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）と置換することができ、位置１０５でのアスパラギンは、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）と置換することができる。他の例では、アミノ酸位置２４３でプロテアーゼドメインにおいて非天然Ｎ−グリコシル化部位を生成するために、位置２４１でのトレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）が、アスパラギンと置換され、位置２４３でのヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）が、セリンと置換される。
【０２５１】
表3.
【表３】
0006027221.tif 000006
【０２５２】
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、２つまたはそれ以上の非天然Ｎ−グリコシル化部位の導入をもたらす修飾を含有することができる。たとえば、表３において記載される修飾は、組み合わせられ、２、３、４、５、６、またはそれ以上の非天然Ｎ−グリコシル化部位を含有する修飾ＦＩＸポリペプチドをもたらすことができる。任意の２つまたはそれ以上の、表３において記載される修飾は、組み合わせることができる。たとえば、アミノ酸交換Ｄ１０４Ｎ／Ｋ１０６Ｓ／Ｋ２２８Ｎを含有する修飾ＦＩＸポリペプチドが、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドの中に含まれ、それぞれ、アミノ酸位置１０４および２２８（配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドに対応するナンバリング）に２つの非天然グリコシル化部位を有するＦＩＸポリペプチドがもたらされる。他の例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、アミノ酸交換Ｄ８５Ｎ／Ｋ２４７Ｎ／Ｎ２４９Ｓ／Ｋ３９２Ｎ／Ｋ３９４Ｓを含有することができ、それぞれアミノ酸位置８５、２４７、および３９２（配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドに対応するナンバリング）に３つの非天然グリコシル化部位を有するＦＩＸポリペプチドがもたらされる。表４は、２つまたはそれ以上の非天然Ｎ−グリコシル化部位を有する例示的なＦＩＸポリペプチドを記載する。
【０２５３】
表4.
【表４】
0006027221.tif 000007
【０２５４】
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、１つまたは複数の非天然Ｎ−グリコシル化部位などのような、１つまたは複数の非天然グリコシル化部位を含有することができる。したがって、グリコシル化を促進する細胞において発現される場合または当技術分野においてよく知られているインビトロにおける技術を使用してグリコシル化される場合、修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、グリコシル化のレベルの増加を示すことができる。グリコシル化のレベルは、未修飾または野生型ＦＩＸポリペプチドのグリコシル化のレベルと比較して、少なくともまたは少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上まで増加させることができる。
【０２５５】
１つまたは複数の非天然グリコシル化部位を導入するために本明細書において記載される修飾は、本明細書において記載されるまたは当技術分野において知られている任意の他の突然変異と組み合わせることができる。典型的に、結果として生じる修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、血液凝固活性の増加を示す。たとえば、１つまたは複数の非天然グリコシル化部位を導入する、１つまたは複数の修飾は、ＡＴ−ＩＩＩおよび／もしくはヘパリンなどのような阻害因子に対する抵抗性を増加させる、触媒活性を増加させる、内因活性を増加させる、リン脂質への結合を増加させる、ＬＲＰへの結合を減少させる、ならびに／または薬物動態学的および／もしくは薬力学的特性を改善する修飾（複数可）と組み合わせることができる。
【０２５６】
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、１つまたは複数の非天然グリコシル化部位を含有し、グリコシル化のレベルの増加などのような改変されたグリコシル化を有し、たとえばその基質（ＦＸ）に対する触媒活性などのような、ＦＩＸの少なくとも１つの活性を保持する。典型的に、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドによって示される触媒活性の少なくともまたは少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％。９５％、またはそれ以上を保持する。グリコシル化のレベルの増加は、未修飾ＦＩＸと比較して、１つまたは複数の以下の特性を変異体に与えることによって、修飾ＦＩＸポリペプチドの薬物動態学的特性を改善することができる：ｉ）クリアランスの減少、ｉｉ）分布容積の改変、ｉｉｉ）インビボにおける回収率の増強、ｉｖ）インビボにおける総タンパク質暴露の増強（つまりＡＵＣ）、ｖ）血清半減期（α、β、および／もしくはγ相）の増加、ならびに／またはｖｉ）平均共鳴時間（ＭＲＴ）の増加。改変されたグリコシル化を有する修飾ＦＶＩＩポリペプチドの血液凝固活性は、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて、未修飾ＦＩＸポリペプチドまたは野生型ＦＩＸポリペプチドの凝固活性と比較して、少なくともまたは少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上まで、増加させることができる。
【０２５７】
（ｂ）．天然グリコシル化部位の排除
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、グリコシル化部位の数を減少させることができる。典型的に、グリコシル化部位の数の低下は、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、グリコシル化のレベルの低下をもたらす。除去することができる天然グリコシル化部位は、たとえば、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸの位置１５７および１６７に対応するアミノ酸位置の天然Ｎ−グリコシル化部位ならびに配列番号３において記載される成熟ＦＩＸの位置５３、６１、１５９、１６９、１７２、および１７９に対応するアミノ酸位置の天然Ｏ−グリコシル化部位を含む。
【０２５８】
任意の１つまたは複数の天然グリコシル化部位は、アミノ酸置換（複数可）、挿入（複数可）、もしくは欠失（複数可）またはその任意の組合せによって除去することができる。たとえば、アミノ酸置換、欠失、および／または挿入は、Ａｓｎ／Ｘａａ／Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｃｙｓモチーフ（ここでＸａａはプロリンではない）を破壊するためになされ、それによって、位置１５７または１６７のＮ−グリコシル化部位を除去することができる。他の例では、Ｏ−グリコシル化部位が、位置５３もしくは６１でのセリン残基のアミノ酸置換もしくは欠失または位置１５９もしくは１６９でのトレオニン残基のアミノ酸置換もしくは欠失などによって、除去される。結果として生じる修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持する。いくつかの例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、未修飾ＦＩＸポリペプチドの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上の触媒活性を保持する。他の例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、未修飾ＦＩＸポリペプチドの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のＦＸに対する結合活性を保持する。他の例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、未修飾ＦＩＸポリペプチドの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のＦＶＩＩＩａに対する結合活性を保持する。いくつかのアッセイにおいておよび／またはいくつかの条件下において、修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸと比較して、特性の増強を示すことができる（たとえば、インビボにおける回収率の増加、インビボにおけるＡＵＣの増加、および／またはインビボにおけるクリアランスの減少を含むが、これらに限定されない）。
【０２５９】
表５は、天然Ｎ−グリコシル化部位を除去するまたは排除することによってグリコシル化レベルを減少させるために、修飾ＦＩＸポリペプチド中に含まれる、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドのアミノ酸位置に対応する、例示的なアミノ酸置換の非限定的な例を提供する。下記の表５において、修飾ＦＩＸポリペプチドの例示的なアミノ酸配列が記載される配列識別子（配列番号）が同定される。
【０２６０】
表5.
【表５】
0006027221.tif 000008
【０２６１】
１つまたは複数の天然グリコシル化部位を排除するために本明細書において記載される修飾は、本明細書において記載されるまたは当技術分野において知られている任意の他の突然変異と組み合わせることができる。典型的に、結果として生じる修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、血液凝固活性の増加を示す。たとえば、１つまたは複数の天然グリコシル化部位を排除する、１つまたは複数の修飾は、非天然グリコシル化部位を導入する、ＡＴ−ＩＩＩおよび／もしくはヘパリンなどのような阻害因子に対する抵抗性を増加させる、触媒活性を増加させる、内因活性を増加させる、リン脂質への結合を増加させる、または薬物動態学的および／もしくは薬力学的特性を改善する修飾（複数可）と組み合わせることができる。
【０２６２】
１つまたは複数の天然グリコシル化部位を排除する本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、たとえばその基質ＦＸに対する触媒活性などのような、ＦＩＸの少なくとも１つの活性を保持する。典型的に、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドによって示される触媒活性の少なくともまたは少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％。９５％、またはそれ以上を保持する。いくつかの場合では、改変されたグリコシル化を有する修飾ＦＶＩＩポリペプチドの血液凝固活性は、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて、未修飾ＦＩＸポリペプチドまたは野生型ＦＩＸポリペプチドの凝固活性と比較して、少なくともまたは少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上まで、増加させることができる。
【０２６３】
ｂ．ＡＴ−ＩＩＩおよびヘパリンに対する抵抗性の増加
ＦＩＸの活性は、凝固プロセスの調節の一部として、血液中の因子によって阻害され得る。したがって、ＡＴ−ＩＩＩおよびヘパリンを含む阻害因子の阻害効果に対する抵抗性の増加を示す修飾ＦＩＸポリペプチドが、本明細書において提供される。いくつかの例では、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドが、ヘパリンに対する結合親和性の低下ならびに／またはＡＴ−ＩＩＩのみおよび／もしくはＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体による阻害に対する二次速度定数の減少を示す。さらなる例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、ＡＴ−ＩＩＩのみまたはヘパリンのみに対する抵抗性の増加を示す。したがって、ＡＴ−ＩＩＩ、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体、および／またはヘパリンに対する抵抗性の増加を示す修飾ＦＩＸポリペプチドが、本明細書において提供される。
【０２６４】
ｉ．ＡＴ−ＩＩＩ
アンチトロンビンＩＩＩ（アンチトロンビンまたはＡＴ−ＩＩＩとしても知られている）は、重要な抗凝固セルピン（セリンプロテアーゼ阻害因子）である。ＡＴ−ＩＩＩは、４６４アミノ酸残基を含有する前駆体タンパク質として合成される（配列番号２１）。分泌の過程において、３２残基シグナルペプチドは、切断されて、４３２アミノ酸成熟ヒトアンチトロンビン（配列番号２２）を生成する。５８ｋＤａ  ＡＴ−ＩＩＩ糖タンパク質は、血液中に循環し、セリンプロテアーゼ阻害因子（セルピン）として機能して、凝固系の多くのセリンプロテアーゼを阻害する。ＡＴ−ＩＩＩはまた、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、および程度はより少ないが、ＦＶＩＩａの活性をも阻害することが示されたが、ＡＴ−ＩＩＩの主要な標的は、トロンビン、第Ｘａ因子、および第ＩＸａ因子である。
【０２６５】
ＡＴ−ＩＩＩの作用は、診療において抗凝固薬として広く使用される、天然に存在するヘパラン硫酸または様々な組織由来ヘパリンなどのようなグリコサミノグリカンによって非常に増強される。二次分子に結合することなく典型的に有効である他のセルピンと異なり、標的凝固因子との、ヘパリンの非存在下における、ＡＴ−ＩＩＩの反応は、非常にゆっくりとしている。ヘパリンの非存在下において、ＡＴ−ＩＩＩの反応性ループ配列は、ゆっくりとした反応性の決定因子を提供する。ＡＴ−ＩＩＩの反応性ループ中心における保存Ｐ２−Ｐ１’残基の突然変異誘発は、たとえば、ヘパリンの存在下ではなく非存在下において、プロテアーゼとのＡＴ−ＩＩＩの相互作用に影響を及ぼす。
【０２６６】
ＡＴ−ＩＩＩは、反応性中心ループにおけるコンホメーションの変化を誘発する、ヘパリンにおける特有の五糖配列に対して高度に特異的な様式で結合する。そのようなコンホメーションにおいて、ＡＴ−ＩＩＩの反応性中心ループは、より効率的に、セリンプロテアーゼの反応部位と相互作用することができ、阻害を達成することができる。証拠は、ＡＴ−ＩＩＩへのヘパリンの結合が、ＡＴ−ＩＩＩとのＦＩＸａ、トロンビン、およびＦＸａの相互作用を促す、新しいエキソサイトを生成することを示唆する。位置２５３のチロシンおよび位置２５５のグルタミン酸は、たとえば、ヘパリン結合によって生成され、ＡＴ−ＩＩＩのみにより観察される阻害と比較してＡＴ−ＩＩＩによるＦＩＸａの急速な阻害の増加を促す、ＡＴ−ＩＩＩ上のエキソサイトの重要な決定因子であることが示されてきた［Izaguirre et al., (2006) J. Bio Chem 281:13424-13432］。
【０２６７】
突然変異の研究もまた、第ＩＸａ因子におけるどの残基がＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンとの相互作用に関与するかをいくらか示した。たとえば、成熟ＦＩＸポリペプチドの位置３１８（キモトリプシンナンバリングによる位置１５０に対応する）でのアルギニンの修飾は、３３倍〜７０倍まで、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンとのこの突然変異体の反応性を低下させる［Yang, L. et al., (2003) J. Biol. Chem. 278(27):25032-8］。ＦＩＸａ突然変異体およびＡＴ−ＩＩＩの間の反応性の低下は、ＡＴ−ＩＩＩがヘパリンに結合していない場合ほど顕著ではないが、成熟ＦＩＸａポリペプチドの位置３１８のアルギニンおよびＡＴ−ＩＩＩの間の相互作用が、ＡＴ−ＩＩＩがヘパリン活性化コンホメーションをしている場合に達成されることを示す。
【０２６８】
ｉｉ．ヘパリン
ヘパリンは、上記に議論されるＡＴ−ＩＩＩ依存性の様式およびＡＴ−ＩＩＩ非依存性の様式の両方で、内在性テナーゼ複合体において、ＦＩＸａの活性を阻害することができる。研究は、ヘパリンによるＦＩＸａ活性のＡＴ−ＩＩＩ非依存性の阻害が、ＦＶＩＩＩａ−ＦＩＸａ相互作用を破壊する、ＦＩＸａ上のエキソサイトへのオリゴ糖結合の結果であることを示す［Yuan et al., (2005) Biochem. 44:3615-3625, Misenheimer et al., (2007) Biochem. 46:7886-7895, Misenheimer et al. (2010) Biochem. 49:9977-10005］。ヘパリンに結合するエキソサイトは、位置３３８（キモトリプシンナンバリングによる位置１７０に対応する）のアルギニンから少なくとも位置４０３（キモトリプシンナンバリングによる位置２３３に対応する）のアルギニンにわたる電気陽性領域における第ＩＸａ因子プロテアーゼドメイン中にある。このエキソサイトは、その補因子、ＦＶＩＩＩａとのＦＩＸａの相互作用に重大なＦＩＸａの領域と重複する。したがって、ＦＩＸａへのヘパリンの結合は、ＦＶＩＩＩａとのＦＩＸａの相互作用を阻害し、したがって、内在性テナーゼ活性を低下させる。
【０２６９】
ｉｉｉ．ＡＴ−ＩＩＩおよびヘパリンに対する抵抗性が増加した、例示的なＦＩＸポリペプチド
ＡＴ−ＩＩＩ、ヘパリン、および／またはＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体に対するその抵抗性を増加させる修飾を、ＦＩＸポリペプチドに対してなすことができる。一般的に、そのような修飾ＦＩＸポリペプチドは、ＦＩＸポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持する。典型的に、そのような修飾は、ＡＴ−ＩＩＩ、ヘパリン、および／またはＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体とのＦＩＸａの相互作用に関与する、ＦＩＸポリペプチドの任意の位置の１つまたは複数のアミノ酸交換を含む。そのような修飾は、たとえば、ＡＴ−ＩＩＩのみとの修飾ＦＩＸａポリペプチドの相互作用の速度の低下、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体に対する修飾ＦＩＸａポリペプチドの相互作用の速度の低下、および／またはヘパリンのみに対する修飾ＦＩＸａポリペプチドの結合親和性の低下をもたらすことができる。いくつかの例では、修飾（複数可）が、１つまたは複数の非天然グリコシル化部位を導入する。新しいグリコシル化部位に連結される炭水化物成分は、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体との修飾ＦＩＸの相互作用を立体的に妨げ、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンの阻害効果に対する修飾ＦＩＸポリペプチドの抵抗性の増加をもたらすことができる。そのため、修飾ＦＩＸａポリペプチドは、内在性テナーゼ活性に関して、ＡＴ−ＩＩＩ、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン、および／またはヘパリンの天然阻害効果に対する抵抗性の増加を示す。凝血促進治療薬としての対象への投与の後などに、適切なインビトロアッセイまたはインビボアッセイにおいて評価した場合、修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、血液凝固活性の増加を示すことができる。
【０２７０】
本明細書において下記に記載されるように、当業者は、ＡＴ−ＩＩＩ、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン、および／またはヘパリンに対して増加した抵抗性を示す修飾ＦＩＸａポリペプチドを経験的にまたは合理的に設計することができる。そのような修飾ＦＩＸポリペプチドは、修飾ＦＩＸポリペプチドがＡＴ−ＩＩＩ、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン、および／またはヘパリンに対して抵抗性の増加を示すかどうかを決定するための、当業者に知られているアッセイにおいて試験することができる。たとえば、修飾ＦＩＸポリペプチドは、ＡＴ−ＩＩＩ、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン、および／またはヘパリンへの結合について試験することができる。一般的に、ＡＴ−ＩＩＩ、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン、および／またはヘパリンに対する抵抗性を増加させた修飾ＦＩＸポリペプチドは、ヘパリンへの結合の減少および／もしくは親和性の減少ならびに／またはＡＴ−ＩＩＩおよび／もしくはＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンとの相互作用の速度の減少を示すであろう。典型的に、そのようなアッセイは、ＦＩＸ（ＦＩＸａ）の活性化形態を用いてならびに補因子、ＦＶＩＩＩａおよびリン脂質の非存在下または存在下において実行される。
【０２７１】
ＡＴ−ＩＩＩ、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン、および／またはヘパリンに対する抵抗性の増加を示す修飾ＦＩＸポリペプチドが、本明細書において提供される。本明細書において提供されるＦＩＸポリペプチド変異体は、１つまたは複数のアミノ酸位置２０２、２０３、２０４、２０５、２２８、２３９、２５７、２６０、２９３、３１２、３１６、３１８、３１９、３２１、３３３、３３８、３４２、３４６、４００、４０３、または４１０で修飾される（キモトリプシンナンバリングによるアミノ酸位置３８、３９、４０、４１、６３、７４、９２、９５、１２６、１４３、１４５、１４８、１５０、１５１、１５３、１６５、１７０、１７４、１７８、２３０、２３３、および２４０にそれぞれ対応する）。これらのアミノ酸残基は、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、またはアミノ酸交換によってなどのような修飾であってもよい。同定される残基は、任意の他のアミノ酸と置換または交換することができる。その代わりに、アミノ酸挿入は、標的アミノ酸残基の近傍における標的アミノ酸残基またはタンパク質構造のコンホメーションを改変するために使用することができる。
【０２７２】
任意のアミノ酸残基はまた、同定される位置の内因性アミノ酸残基と交換することができる。典型的に、置換アミノ酸は、それが、ＦＩＸおよびＡＴ−ＩＩＩまたはヘパリンの間の相互作用に干渉するように選ばれる。たとえば、修飾は、ヘパリンとのＦＩＸポリペプチドの相互作用に干渉するように、アミノ酸位置２６０、２９３、３３３、３３８、３４６、４００、および４１０でなすことができる（キモトリプシンナンバリングによるアミノ酸位置９５、１２６、１６５、１７０、１７８、２３０、２３３、および２４０にそれぞれ対応する）。他の例では、修飾が、ＡＴ−ＩＩＩとのＦＩＸポリペプチドの相互作用に干渉するように、アミノ酸位置２０３、２０４、２０５、２２８、２３９、３１２、３１４、３１６、３１８、３１９、３２１、および３４２でなされる（キモトリプシンナンバリングによるアミノ酸位置３９、４０、４１、６３、７４、１４３、１４５、１４８、１５０、１５１、１５３、および１７４にそれぞれ対応する）。
【０２７３】
いくつかの例では、新しいグリコシル化部位が、アミノ酸置換によって導入される。新しいグリコシル化部位に連結される炭水化物成分は、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体との修飾ＦＩＸの相互作用を立体的に妨げ、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンの阻害効果に対する修飾ＦＩＸポリペプチドの抵抗性の増加をもたらすことができる。たとえば、位置４１０（キモトリプシンナンバリングによる２４０位に対応する）のグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）は、位置４１０に新しいグリコシル化部位を導入するために、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）と置換することができる。他の例では、位置２３９（キモトリプシンナンバリングによる位置７４に対応する）のグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）が、位置２３９に新しいグリコシル化部位を導入するために、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）と置換される。ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンに対する抵抗性を増加させるために新しいグリコシル化部位を導入する他の突然変異は、たとえばＤ２０３Ｎ／Ｆ２０５Ｔ、Ｒ３１８Ｎ／Ａ３２０Ｓ、Ｎ２６０Ｓ、およびＦ３１４Ｎ／Ｋ３１６Ｓ（キモトリプシンナンバリングによるＤ３９Ｎ／Ｆ４１Ｔ、Ｒ１５０Ｎ／Ａ１５２Ｓ、Ｎ９５Ｓ、およびＦ１４５Ｎ／Ｋ１４８Ｓに対応する）を含む。
【０２７４】
ＡＴ−ＩＩＩ、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン、および／またはヘパリンに対する抵抗性を増加させるために、修飾がなされる他の例では、位置２０２（キモトリプシンナンバリングによる位置３８に対応する）のバリン残基が、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）もしくはチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）と置換される；位置２０３（キモトリプシンナンバリングによる位置３９に対応する）のアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）が、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）もしくはチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）と置換される；位置２０４（キモトリプシンナンバリングによる位置４０に対応する）のアラニン（Ａｌａ、Ａ）が、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）もしくはチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）と置換される；位置２３９（キモトリプシンナンバリングによる７４位に対応する）のグルタミン酸が、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、もしくはリシン（Ｌｙｓ、Ｋ）と置換される；位置２５７（キモトリプシンナンバリングによる位置９２に対応する）のヒスチジンが、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、もしくはセリン（Ｓｅｒ、Ｓ）と置換される；位置２９３（キモトリプシンナンバリングによる位置１４３に対応する）のリシン（Ｌｙｓ、Ｋ）が、アラニン（Ａｌａ、Ａ）もしくはグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）と置換される；位置３１２（キモトリプシンナンバリングによる位置１４３に対応する）のアルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）が、アラニン（Ａｌａ、Ａ）もしくはグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）と置換される；位置３１６（キモトリプシンナンバリングによる１４８に対応する）のリシンが、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、もしくはメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）と置換される；位置３１８（キモトリプシンナンバリングによる位置１５０に対応する）のアルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）が、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、もしくはトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）と置換される；位置３３３（キモトリプシンナンバリングによる位置１６５に対応する）のアルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）が、アラニン（Ａｌａ、Ａ）もしくはグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）と置換される；位置３３８（キモトリプシンナンバリングによる位置１７０に対応する）のアルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）が、アラニン（Ａｌａ、Ａ）もしくはグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）と置換される；位置４００（キモトリプシンナンバリングによる位置２３０に対応する）のリシン（Ｌｙｓ、Ｋ）が、アラニン（Ａｌａ、Ａ）もしくはグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）と置換される；ならびに／または位置４０３（キモトリプシンナンバリングによる位置２３３に対応する）のアルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）が、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、もしくはアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）と置換される。
【０２７５】
チロシンである、残基Ｒ３１８もしくは３１８に対応するＦＩＸポリペプチドにおける残基でのアミノ酸置換、たとえばＲ３１８Ｙまたはその保存的アミノ酸置換を含有する修飾ＦＩＸポリペプチドが、本明細書において提供される。たとえば、チロシンについての保存的アミノ酸残基は、フェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）を含むが、これらに限定されない。グルタミン酸である、残基Ｒ４０３もしくは４０３に対応するＦＩＸポリペプチドにおける残基でのアミノ酸置換、たとえばＲ４０３Ｅまたはその保存的アミノ酸置換を含有する修飾ＦＩＸポリペプチドもまた、提供される。たとえば、グルタミン酸についての保存的アミノ酸残基はアスパラギン酸（Ｄ）を含むが、これらに限定されない。
【０２７６】
さらなる実施形態において、組合せ突然変異体を生成することができる。アミノ酸位置２０２、２０３、２０４、２５７、２３９、２９３、３１２、３１６、３１８、３３３、３３８、４００、４０３、および４１０（キモトリプシンナンバリングによるアミノ酸位置３８、３９、４０、７４、９２、１２６、１４３、１４８、１５０、１６５、１７０、２３０、２３３、および２４０にそれぞれ対応する）に２つ以上の突然変異を有するものが、そのような組合せ突然変異体の中に含まれる。たとえば、修飾ＦＩＸポリペプチドは、２、３、４、５、またはそれ以上の同定される位置にアミノ酸交換を有することができる。したがって、修飾ポリペプチドは、ＡＴ−ＩＩＩ、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン、および／またはヘパリンの阻害効果に対する修飾ＦＩＶポリペプチドの抵抗性の増加をもたらすことができる１、２、３、４、５、またはそれ以上の突然変異を示すことができる。ＡＴ−ＩＩＩ、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン、および／またはヘパリンの阻害効果に対する修飾ＦＩＸポリペプチドの抵抗性を増加させるために本明細書において記載される、任意の１つまたは複数の突然変異は、組み合わせることができる。
【０２７７】
表６は、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドのアミノ酸位置に対応する、同定される残基での例示的なアミノ酸置換の非限定的な例を提供する。これらの中に、例示的な組合せ突然変異が含まれる。述べられるように、そのようなＦＩＸポリペプチドは、ＡＴ−ＩＩＩ、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン、および／またはヘパリンに対する抵抗性を増加させるように設計され、そのため、ＡＴＩＩＩ、ヘパリン／ＡＴＩＩＩ、ヘパリン、血漿、血清、または血液を含むインビボ、エクスビボ、またはインビトロアッセイにおいて血液凝固活性が増加している。そのような突然変異に関して、第１のアミノ酸（１文字略語）は、置換されるアミノ酸に対応し、番号は、配列番号３に関する成熟ＦＩＸポリペプチド配列における位置に対応し、第２のアミノ酸（１文字略語）は、その位置の第１のアミノ酸と置換する、選択されるアミノ酸に対応する。突然変異のためのアミノ酸位置はまたキモトリプシンナンバリングスキームによっても参照される。下記の表６において、修飾ＦＩＸポリペプチドの例示的なアミノ酸配列が記載される配列識別子（配列番号）が同定される。
【０２７８】
表6.
【表６−１】
0006027221.tif 000009
【表６−２】
0006027221.tif 000010
【表６−３】
0006027221.tif 000011
【０２７９】
ＡＴ−ＩＩＩおよび／またはヘパリンなどのような阻害因子に対する抵抗性を増加させるための、本明細書において記載される修飾は、本明細書において記載されるまたは当技術分野において知られている任意の他の突然変異と組み合わせることができる。典型的に、結果として生じる修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、血液凝固活性の増加を示す。たとえば、ＡＴ−ＩＩＩおよび／またはヘパリンなどのような阻害因子に対する抵抗性を増加させる、１つまたは複数の修飾は、非天然グリコシル化部位を導入する、１つもしくは複数の天然グリコシル化部位を排除する、１つもしくは複数の天然硫酸化、リン酸化、もしくはヒドロキシル化部位を排除する、触媒活性を増加させる、内因活性を増加させる、リン脂質への結合を増加させる、または薬物動態学的および／もしくは薬力学的特性を改善する修飾（複数可）と組み合わせることができる。結果として生じる修飾ＦＩＸポリペプチドは、典型的に、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、血液凝固活性の増加を示す。
【０２８０】
ＡＴ−ＩＩＩのみ、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体、および／またはヘパリンのみに対する抵抗性の増加を有する修飾ＦＩＸポリペプチドは、インビボまたはインビトロにおいて、未修飾または野生型ＦＩＸポリペプチドの親和性、阻害の程度、または阻害についての二次速度定数と比較して、少なくともまたは少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上のヘパリンに対する親和性、特定の条件下での阻害の程度、またはＡＴＩＩＩもしくはヘパリン／ＡＴＩＩＩによる阻害に対する二次速度定数の低下を示すことができる。したがって、修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドによって示される抵抗性の少なくともまたは少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上のＡＴ−ＩＩＩのみ、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体、および／またはヘパリンのみに対する抵抗性の増加を示すことができる。そのような修飾ＦＩＸポリペプチドによるＡＴ−ＩＩＩ、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体、および／またはヘパリンに対する抵抗性の増加はまた、ＡＴ−ＩＩＩ、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体、ヘパリン、血液、血漿、または血清の存在下において、インビボまたはインビトロにおいて、凝固活性の増加または凝固活性の持続時間の改善として明らかにすることもできる。修飾ＦＩＸポリペプチドの凝固活性は、インビボまたはインビトロにおいて、未修飾ＦＶＩＩポリペプチドまたは野生型ＦＩＸポリペプチドの凝固活性と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上まで増加させることができる。ＡＴ−ＩＩＩ、ヘパリン／ＡＴ−ＩＩＩ複合体、および／またはヘパリンに対する抵抗性を増加させる修飾を含有する修飾ＦＩＸポリペプチドはまた、未修飾ＦＩＸａと比較して、治療指数の増強を示すこともできる。
【０２８１】
ｃ．触媒活性を増加させるための突然変異
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸと比較して、ポリペプチドの触媒活性を増加させるために１つまたは複数の修飾を含有することができる。たとえば、修飾は、結果として生じる修飾ＦＩＸポリペプチドが、ＦＶＩＩＩａに対する親和性の増加を有するように、その補因子、ＦＶＩＩＩａとのＦＩＸの相互作用に関与するアミノ酸に対してなすことができ、それによって、ＦＶＩＩＩａが飽和濃度で存在しない条件下でＦＸに対する活性の増加を示す。修飾はまた、補因子ＦＶＩＩＩａの存在下および／または非存在下におけるＦＸの活性化に対する修飾ＦＩＸポリペプチドの活性または触媒効率が未修飾ポリペプチドの活性または触媒効率と比較して増加するように、ＦＩＸポリペプチドのプロテアーゼドメインに対してなすこともできる。
【０２８２】
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチド中に含むことができる例示的な修飾は、位置２５９、２６５、３４５、４１０、および４１２（キモトリプシンナンバリングによる９４、９８、１７７、２４０、および２４２に対応する）でのアミノ酸置換を含む。これらの位置でのアミノ酸は、任意の他のアミノ酸残基と置換することができる。いくつかの例では、位置２５９のチロシンが、フェニルアラニンと置換される；位置２６５のリシンが、トレオニンと置換される；および／または位置３４５のチロシンが、トレオニンと置換される。さらなる例では、位置４１０のグルタミン酸が、グルタミン、セリン、アラニン、またはアスパラギン酸と置換される。一例では、位置４１２のトレオニンが、バリンまたはアラニンと置換される。
【０２８３】
上記挙げられる修飾は、単に例示的なものにすぎない。本明細書において記載される他の多くの修飾はまた、触媒活性の増加をももたらす。たとえば、ＡＴ−ＩＩＩおよび／もしくはヘパリンなどのような阻害因子に対する抵抗性を増加させる、非天然グリコシル化部位を導入する、１つもしくは複数の天然グリコシル化部位を排除する、１つもしくは複数の天然硫酸化、リン酸化、もしくはヒドロキシル化部位を排除する、内因活性を増加させる、リン脂質への結合を増加させる、ＬＲＰへの結合を減少させる、ならびに／または薬物動態学的および／もしくは薬力学的特性を改善するためにＦＩＸポリペプチドの中に導入される修飾はまた、活性の増加を示す修飾ＦＩＸポリペプチドをももたらすこともできる。
【０２８４】
表７は、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドのアミノ酸位置に対応する、同定される残基での例示的なアミノ酸置換の非限定的な例を提供する。そのような突然変異に関して、第１のアミノ酸（１文字略語）は、置換されるアミノ酸に対応し、番号は、配列番号３に関する成熟ＦＩＸポリペプチド配列における位置に対応し、第２のアミノ酸（１文字略語）は、その位置の第１のアミノ酸と置換する、選択されるアミノ酸に対応する。突然変異のためのアミノ酸位置はまたキモトリプシンナンバリングスキームによっても参照される。下記の表７において、修飾ＦＩＸポリペプチドの例示的なアミノ酸配列が記載される配列識別子（配列番号）が同定される。
【０２８５】
表7.
【表７】
0006027221.tif 000012
【０２８６】
触媒活性を増加させるために本明細書において記載される修飾は、本明細書において記載されるまたは当技術分野において知られている任意の他の突然変異と組み合わせることができる。典型的に、結果として生じる修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、血液凝固活性の増加を示す。たとえば、触媒活性を増加させる１つまたは複数の修飾は、ＡＴ−ＩＩＩおよび／もしくはヘパリンなどのような阻害因子に対する抵抗性を増加させる、非天然グリコシル化部位を導入する、１つもしくは複数の天然グリコシル化部位を排除する、１つもしくは複数の天然硫酸化、リン酸化、もしくはヒドロキシル化部位を排除する、内因活性を増加させる、リン脂質への結合を増加させる、または薬物動態学的および／もしくは薬力学的特性を改善する修飾（複数可）と組み合わせることができる。結果として生じる修飾ＦＩＸポリペプチドは、典型的に、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、血液凝固活性の増加を示す。
【０２８７】
触媒活性の増加を有する修飾ＦＩＸポリペプチドは、インビボまたはインビトロにおいて、未修飾または野生型ＦＩＸポリペプチドの触媒活性と比較して、少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上の活性を示すことができる。そのような修飾ＦＩＸポリペプチドの触媒活性の増加はまた、凝固活性、凝固活性の持続時間の増加、および／または治療指数の増強として明らかにすることができる。修飾ＦＩＸポリペプチドの凝固活性は、インビボまたはインビトロにおいて、未修飾ＦＶＩＩポリペプチドまたは野生型ＦＩＸポリペプチドの凝固活性と比較して、少なくともまたは少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上まで増加させることができる。
【０２８８】
ｄ．ＬＲＰ結合を減少させるための突然変異
ＦＩＸａは、肝臓、脳、胎盤、および肺を含む様々な組織上に発現される膜糖タンパク質である低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）への結合によって体循環から取り除かれ得る。したがって、ＬＲＰへの結合の減少を示す修飾ＦＩＸポリペプチドが、本明細書において提供される。これは、たとえば、ｉ）クリアランスの減少、ｉｉ）分布容積の改変、ｉｉｉ）インビボにおける回収率の増強、ｉｖ）インビボにおける総タンパク質暴露の増強（つまりＡＵＣ）、ｖ）血清半減期（α、β、および／もしくはγ相）の増加、ならびに／またはｖｉ）平均共鳴時間（ＭＲＴ）の増加を含む、修飾ＦＩＸポリペプチドの改善された薬物動態学的特性をもたらすことができる。そのような修飾ＦＩＸポリペプチドは、血液凝固活性の増加を示すことができる。
【０２８９】
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、ＬＲＰ結合部位において１つまたは複数の修飾を含有することができる。この結合部位は、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドの残基３４２〜３４６にわたるプロテアーゼドメインにおけるループに位置することが想定される。アミノ酸置換、挿入、または欠失によってなどのような位置３４２〜３４６（キモトリプシンナンバリングによる位置１７４〜１７８に対応する）での１つまたは複数の修飾は、修飾ＦＩＸポリペプチドおよびＬＲＰの間の相互作用に干渉し、結合親和性の減少をもたらすことができる。ＬＲＰへの修飾ＦＩＸポリペプチドの結合は、当業者に知られているアッセイを使用して試験することができる［たとえばRohlena et al., (2003) J. Biol. Chem. 278:9394-9401を参照されたい］。結果として生じる改善された薬物動態学的特性はまた、下記に記載されるものを含む、よく知られているインビボアッセイを使用して試験することもできる。
【０２９０】
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチド中に含むことができる例示的な修飾は、位置３４３、３４４、３４５、および３４６（キモトリプシンナンバリングによる１７５、１７６、１７７、および１７８に対応する）でのアミノ酸置換を含む。これらの位置でのアミノ酸は、任意の他のアミノ酸残基と置換することができる。いくつかの例では、位置３４３のトレオニンが、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、もしくはアルギニンと置換される；位置３４４のフェニルアラニンが、イソロイシンと置換される；位置３４５のチロシンが、トレオニン、アラニン、もしくはアラニンと置換される；および／または位置３４６のアスパラギンが、アスパラギン酸もしくはチロシンと置換される。任意の１つまたは複数のこれらの例示的なアミノ酸置換は、互いにまたは本明細書において記載される他の修飾と組み合わせることができる。
【０２９１】
アルギニンである、残基Ｔ３４３もしくは３４３に対応するＦＩＸポリペプチドにおける残基でのアミノ酸置換、たとえばＴ３４３Ｒまたはその保存的アミノ酸置換を含有する修飾ＦＩＸポリペプチドが、本明細書において提供される。たとえば、アルギニンについての保存的アミノ酸残基は、リシン（Ｋ）を含むが、これらに限定されない。
【０２９２】
表８は、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドのアミノ酸位置に対応する、同定される残基での例示的なアミノ酸置換の非限定的な例を提供する。そのような突然変異に関して、第１のアミノ酸（１文字略語）は、置換されるアミノ酸に対応し、番号は、配列番号３に関する成熟ＦＩＸポリペプチド配列における位置に対応し、第２のアミノ酸（１文字略語）は、その位置の第１のアミノ酸と置換する、選択されるアミノ酸に対応する。突然変異のためのアミノ酸位置はまたキモトリプシンナンバリングスキームによっても参照される。下記の表８において、修飾ＦＩＸポリペプチドの例示的なアミノ酸配列が記載される配列識別子（配列番号）が同定される。
【０２９３】
表8.
【表８】
0006027221.tif 000013
【０２９４】
ＬＲＰへの結合を減少させるために本明細書において記載される修飾は、本明細書において記載されるまたは当技術分野において知られている任意の他の突然変異と組み合わせることができる。典型的に、結果として生じる修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、血液凝固活性の増加を示す。たとえば、ＬＲＰへの結合を減少させる１つまたは複数の修飾は、ＡＴ−ＩＩＩおよび／もしくはヘパリンなどのような阻害因子に対する抵抗性を増加させる、触媒活性を増加させる、非天然グリコシル化部位を導入する、１つもしくは複数の天然グリコシル化部位を排除する、１つもしくは複数の天然硫酸化、リン酸化、もしくはヒドロキシル化部位を排除する、ＦＶＩＩＩａの存在下および／もしくは非存在下において活性を増加させる、リン脂質への結合を増加させる、または薬物動態学的および／もしくは薬力学的特性を改善する修飾（複数可）と組み合わせることができる。結果として生じる修飾ＦＩＸポリペプチドは、典型的に、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、血液凝固活性の増加を示す。
【０２９５】
ＬＲＰへの結合が減少した修飾ＦＩＸポリペプチドは、インビトロにおいて、ＬＲＰへの未修飾または野生型ＦＩＸポリペプチドの結合と比較して、少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上の減少を示すことができる。そのような修飾ＦＩＸポリペプチドによるＬＲＰへの結合の減少は、ｉ）クリアランスの減少、ｉｉ）分布容積の改変、ｉｉｉ）インビボにおける回収率の増強、ｉｖ）インビボにおける総タンパク質暴露の増強（つまりＡＵＣ）、ｖ）血清半減期（αγ、β、および／もしくはγ相）の増加、ならびに／またはｖｉ）平均共鳴時間（ＭＲＴ）の増加などのような、改善された薬物動態学的特性をもたらすことができる。さらに、そのような改変は、血液凝固活性、凝固活性の持続時間の増加、および／または治療指数の増強をもたらすことができる。修飾ＦＩＸポリペプチドの凝固活性は、インビボまたはインビトロにおいて、未修飾ＦＶＩＩポリペプチドまたは野生型ＦＩＸポリペプチドの凝固活性と比較して、少なくともまたは少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上まで増加させることができる。
【０２９６】
ｅ．翻訳後修飾を改変するための他の突然変異
野生型ＦＩＸは、哺乳動物細胞における発現に際して翻訳後に修飾される。第ＩＸ因子前駆体ポリペプチドは、血液の中に分泌される成熟チモーゲンになるように広範囲な翻訳後修飾を受ける。そのような翻訳後修飾は、γ−カルボキシル化、β−ヒドロキシル化、Ｏ−およびＮ結合型グリコシル化、硫酸化、ならびにリン酸化を含む。上記に議論されるように、グリコシル化のレベルは、たとえば、新しい非天然グリコシル化部位を導入するおよび／または天然グリコシル化部位を排除することによって改変することができる。同様に、他の翻訳後修飾は、γ−カルボキシル化、β−ヒドロキシル化、硫酸化、および／またはリン酸化部位を導入するおよび／または排除することなどによって改変することができる。
【０２９７】
任意の１つまたは複数の天然のγ−カルボキシル化、β−ヒドロキシル化、硫酸化、またはリン酸化部位は、アミノ酸置換または欠失などによって排除することができる。たとえば、未修飾ＦＩＸポリペプチドは、Ｇｌａドメイン中の任意の１つまたは複数の１２のグルタミン酸残基（配列番号３において記載される成熟ＦＩＸの位置７、８、１５、１７、２０、２１、２６、２７、３０、３３、３６、および４０に対応する）のアミノ酸置換によって修飾することができる。これらの残基は、典型的に、野生型ＦＩＸにおいて、γ−カルボキシグルタミル（またはＧｌａ）にγ−カルボキシル化される。したがって、アミノ酸交換または欠失によってなどのようなグルタミン酸残基の除去は、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、修飾ＦＩＸポリペプチドにおけるγ−カルボキシル化のレベルを低下させることができる。同様に、野生型ＦＩＸにおいて通常β−ヒドロキシル化されている位置６４のアスパラギン酸残基は、アミノ酸交換または欠失などによって除去することができる。排除することができるさらなる翻訳後修飾部位は、たとえば、野生型ＦＩＸにおいて典型的に硫酸化されている位置１５５のチロシンおよび野生型ＦＩＸにおいて典型的にリン酸化されている位置１５８のセリン残基を含む。
【０２９８】
他の例では、非天然翻訳後修飾部位が、アミノ酸置換または挿入などによって導入することができる。たとえば、さらなるグルタミン酸残基は、Ｇｌａドメインの中に導入することができる。そのようなグルタミン酸残基は、たとえば哺乳動物細胞における発現に際して、修飾ＦＩＸポリペプチドにおいてγ−カルボキシグルタミル（またはＧｌａ）にγ−カルボキシル化され得る。同様に、１つまたは複数の非天然β−ヒドロキシル化、硫酸化、またはリン酸化部位は、導入することができる。
【０２９９】
１つまたは複数の天然翻訳後修飾部位が排除された、修飾ＦＩＸポリペプチドが、本明細書において提供される。γ−カルボキシル化、β−ヒドロキシル化、硫酸化、および／またはリン酸化部位を含む、１つまたは複数の翻訳後修飾部位を排除するために修飾された修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持する。いくつかの例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、未修飾ＦＩＸポリペプチドの少なくともまたは少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上の触媒活性を保持する。他の例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、未修飾ＦＩＸポリペプチドの少なくともまたは少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のＦＶＩＩＩａに対する結合活性を保持する。いくつかのアッセイにおいておよび／またはいくつかの条件下において、修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸタンパク質と比較して、活性の増加を示すことができる（たとえば、インビボにおける薬力学的活性および／またはＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンもしくは血漿の存在下における活性の増加）。
【０３００】
フェニルアラニンである、残基Ｙ１５５もしくは１５５に対応するＦＩＸポリペプチドにおける残基でのアミノ酸置換、たとえばＹ１５５Ｆまたはその保存的アミノ酸置換を含有する修飾ＦＩＸポリペプチドが、本明細書において提供される。たとえば、フェニルアラニンについての保存的アミノ酸残基は、メチオニン（Ｍ）、ロイシン（Ｌ）、またはチロシン（Ｙ）を含むが、これらに限定されない。
【０３０１】
表９は、それぞれ位置６４、１５５、および１５８の天然β−ヒドロキシル化、硫酸化、および／またはリン酸化部位を排除するために、修飾ＦＩＸポリペプチド中に含まれる、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドのアミノ酸位置に対応する、例示的なアミノ酸置換の非限定的な例を提供する。下記の表９において、修飾ＦＩＸポリペプチドの例示的なアミノ酸配列が記載される配列識別子（配列番号）が同定される。
【０３０２】
表9.
【表９】
0006027221.tif 000014
【０３０３】
β−ヒドロキシル化、硫酸化、および／またはリン酸化部位を排除するために本明細書において記載される修飾は、本明細書において記載されるまたは当技術分野において知られている任意の他の突然変異と組み合わせることができる。典型的に、結果として生じる修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、血液凝固活性の増加を示す。たとえば、１つまたは複数の天然β−ヒドロキシル化、硫酸化、および／またはリン酸化部位を排除する１つまたは複数の修飾は、ＡＴ−ＩＩＩおよび／もしくはヘパリンなどのような阻害因子に対する抵抗性を増加させる、グリコシル化の増加などのようなグリコシル化を改変する、触媒活性を増加させる、内因活性を増加させる、リン脂質への結合を増加させる、または薬物動態学的および／もしくは薬力学的特性を改善する修飾（複数可）と組み合わせることができる。
【０３０４】
１つまたは複数の天然β−ヒドロキシル化、硫酸化、および／またはリン酸化部位を排除する、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、たとえばその基質ＦＸに対する触媒活性または補因子ＦＶＩＩＩａへの結合などのような、ＦＩＸの少なくとも１つの活性を保持する。典型的に、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドによって示される触媒活性の少なくともまたは少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％。９５％、またはそれ以上を保持する。いくつかの場合では、修飾ＦＩＸポリペプチドの血液凝固活性は、インビボまたはインビトロにおいて、未修飾ＦＶＩＩポリペプチドまたは野生型ＦＩＸポリペプチドの凝固活性と比較して、少なくともまたは少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上まで増加する。
【０３０５】
２．組合せの修飾
野生型ＦＩＸポリペプチドと比較して、１つもしくは複数の非天然グリコシル化部位を含有する、１つもしくは複数の天然グリコシル化部位が排除されている、１つもしくは複数の天然β−ヒドロキシル化、硫酸化、および／もしくはリン酸化部位が排除されている、またはＡＴ−ＩＩＩ、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン、および／もしくはヘパリンなどのような阻害因子に対する抵抗性の増加をもたらすことができる修飾を有する、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドもまた、他の修飾を含有することができる。いくつかの例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、１つまたは複数の非天然グリコシル化部位を導入する修飾を含有し、また、ＦＩＸならびにＡＴ−ＩＩＩ、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体、および／またはヘパリンなどのような阻害因子の間の相互作用に干渉する修飾をも含有する。他の例では、１つまたは複数の天然β−ヒドロキシル化、硫酸化、および／またはリン酸化部位を排除する修飾が、阻害因子に対する抵抗性を増加させる修飾および／または１つもしくは複数のグリコシル化部位を導入する修飾と組み合わせることができる。したがって、上記表３〜９において記載される１つまたは複数の突然変異は、上記表３〜９において記載される他の突然変異のいずれかと組み合わせることができる。したがって、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、Ｎ−グリコシル化などのようなグリコシル化の増加；ＡＴ−ＩＩＩ、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン、および／もしくはヘパリンに対する抵抗性の増加；β−ヒドロキシル化、硫酸化、および／もしくはリン酸化の減少；ならびに／または触媒活性の増加を示すものが、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドの中に含まれる。
【０３０６】
さらに、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドのいずれも、任意の１つまたは複数のさらなる修飾を含有することができる。いくつかの例では、さらなる修飾が、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、改変された特性および／または活性をもたらす。典型的に、そのようなさらなる修飾は、それら自体、修飾ポリペプチドの血液凝固活性の増加および／またはポリペプチドの安定性の増加をもたらすものである。したがって、結果として生じる修飾ＦＩＸポリペプチドは、典型的に、血液凝固活性の増加を示す。
【０３０７】
さらなる修飾は、たとえば、当技術分野において知られている任意のアミノ酸交換、アミノ酸欠失、またはアミノ酸挿入、典型的に、ＦＩＸポリペプチドの血液凝固活性および／または安定性を増加させる任意のものを含むことができる。本明細書において提供される任意の修飾ＦＩＸポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のさらなるアミノ酸修飾を含有することができる。典型的に、結果として生じる修飾ＦＩＸポリペプチドは、たとえば触媒活性または補因子ＦＶＩＩＩａへの結合などのような、野生型または未修飾ポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持する。
【０３０８】
一次配列におけるさらなる修飾は、翻訳後修飾を達成するためにＦＩＸポリペプチドになすことができる。たとえば、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、米国特許出願公開２００８０２８０８１８号において記載される非天然Ｏ結合型もしくはＳ結合型グリコシル化部位または国際特許出願公開ＷＯ２００９１３００１９８およびＷＯ２００９１３７２５４において記載される非天然グリコシル化部位を含む、当技術分野において記載されるもののいずれかなどのような、上記に記載されるものを含むおよびそれ以外の非天然グリコシル化部位を含有することができる。
【０３０９】
他の例では、さらなる修飾が、他の因子、分子、およびタンパク質とのその相互作用が改変されるように、ＦＩＸポリペプチド配列に対してなすことができる。たとえば、第Ｘ因子との相互作用に関与するアミノ酸残基は、ＦＸへの修飾ＦＩＸポリペプチドの親和性および／または結合が増加するように修飾することができる。他の修飾は、ＦＶＩＩＩａ、ヘパリン、アンチトロンビンＩＩＩ、およびリン脂質との相互作用に関与するアミノ酸の修飾を含むが、これらに限定されない。
【０３１０】
ポリペプチドのコンホメーションまたは折り畳みを改変するさらなる修飾もまた、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドに対してなすことができる。これらは、たとえば、新しいジスルフィド結合が形成されるような、システインとの１つもしくは複数のアミノ酸の置換またはα−ヘリックスコンホメーションを安定化する修飾を含み、それによって、修飾ＦＩＸポリペプチドに対して活性の増加を与える。
【０３１１】
修飾はまた、修飾ＦＩＸポリペプチドの安定性を増加させるように作用するものなどのような部分に引き続いて連結することができるアミノ酸残基を導入するためになすことができる。たとえば、システイン残基は、ポリマー、そのようなポリエチレングリコール（ＰＥＧ）へのコンジュゲーションを促進するために導入することができる（国際特許出願公開ＷＯ２００９１４００１５）。ＦＩＸポリペプチドの安定性はまた、潜在的なタンパク質分解部位を除去するなど、潜在的なタンパク質分解部位を修飾することによって改変し、それによって、プロテアーゼに対する修飾ＦＩＸポリペプチドの抵抗性を増加させることができる（たとえば米国特許出願公開第２００８０１０２１１５号を参照されたい）。
【０３１２】
さらに、アミノ酸交換、アミノ酸欠失、またはアミノ酸挿入は、修飾ＦＩＸポリペプチドが、リン脂質膜に対する結合性および／または親和性の増加を示すように、内因性Ｇｌａドメインにおいてなすことができる。そのような修飾は、単一のアミノ酸交換、アミノ酸欠失、および／もしくはアミノ酸挿入を含むことができるまたは複数のアミノ酸のアミノ酸交換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸挿入を含むことができる。たとえば、内因性Ｇｌａドメインの全てまたは一部分は、異種Ｇｌａドメインの全てまたは一部分と置換することができる。他の例では、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドが、内因性Ｇｌａドメインにおける欠失または通常γ−カルボキシル化される位置における交換を示すことができる。その代わりに、アミノ酸交換は、さらなる潜在的なガンマカルボキシル化部位を導入するようになすことができる。
【０３１３】
以下の部は、ＦＩＸポリペプチドの安定性および／または血液凝固活性の増加を達成するための、当技術分野において記載される例示的な修飾の非限定的な例を記載する。上記に議論されるように、そのような修飾はまた、本明細書において提供される任意の修飾ＦＩＸポリペプチドにおいてさらに含むことができる。下記に言及されるアミノ酸位置は、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドに対応する。対応する突然変異は、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドの対立遺伝子変異体、種変異体、またはスプライス変異体などのような他のＦＩＸポリペプチドにおいてなすことができる。
【０３１４】
ａ．活性を増加させるための修飾
一例では、第Ｘ因子に対する触媒活性の増加をもたらすさらなる修飾が、本明細書において提供される修飾第ＩＸ因子ポリペプチドに対してなすことができる。たとえば、修飾は、結果として生じる修飾ＦＩＸポリペプチドが、ＦＶＩＩＩａが飽和していない条件下で、ＦＶＩＩＩａに対する親和性を増加させ、それによってＦＸに対する増加した活性を示すように、その補因子、ＦＶＩＩＩａとの相互作用に関与するアミノ酸に対してなすことができる。基質ＦＸの活性化について、未修飾ＦＩＸａポリペプチドまたはＦＩＸａ／ＦＶＩＩＩａ複合体の活性と比較して、ＦＩＸａポリペプチドおよび／またはＦＩＸａ／ＦＶＩＩＩａ複合体の触媒効率を増加させる修飾もまた、ＦＩＸにおいてなすことができる。
【０３１５】
修飾ＦＩＸポリペプチドの内因活性を増加させるための、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドにおいて含むことができるさらなる修飾の例は、Hopfner et al., (1997) EMBO J. 16:6626-6635;Kolkman et al., (2000) Biochem. 39:7398-7405;Sichler et al., (2003) J. Biol. Chem. 278:4121-4126;Begbie et al., (2005) Thromb. Haemost. 94(6):1138-47;米国特許第６５３１２９８号、ならびに米国特許出願公開第２００８０１６７２１９号および第２００８０２１４４６１号において記載されるものを含むが、これらに限定されない。修飾ＦＩＸポリペプチドの内因活性の増加をもたらすことができる、当技術分野において記載される例示的なアミノ酸修飾の非限定的な例は、１つまたは複数のV86A、V86N、V86D、V86E、V86Q、V86G、V86H、V86I、V86L、V86M、V86F、V86S、V86T、V86W、V86Y、Y259F、A261K、K265T、E277V、E277A、E277N、E277D、E277Q、E277G、E277H、E277I、E277L、E277M、E277F、E277S、E277T、E277W、E277Y、R338A、R338V、R338I、R338F、R338W、R338S、R338T、Y345F、I383V、E388Gを含む。たとえば、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、アミノ酸交換Y259F/K265T、Y259F/K265T/Y345F、Y259F/A261K/K265T/Y345F、Y259F/K265T/Y345F/I383V/E388GまたはY259F/A261K/K265T/Y345F/I383V/E388Gを含有することができる。他の例では、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドが、活性化ペプチドを除去する修飾（Δ１５５〜１７７）を含有することができ［たとえばBegbie et al., (2005) Thromb. Haemost. 94(6):1138-47を参照されたい］、これは、インビボにおいて活性を増加させることができるのみならず、クリアランスを減少させることもできる。
【０３１６】
ｂ．リン脂質に対する親和性を増加させるまたはコラーゲンへの結合を低下させる修飾
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドはまた、リン脂質に対する親和性を増加させるための１つまたは複数のさらなる修飾を含有することができる。ＦＩＸの血液凝固活性は、活性化血小板の表面上に発現されるものなどのようなリン脂質に対するポリペプチドの結合性および／または親和性を増加させることによって増強することができる。これは、たとえば、内因性ＦＩＸ  Ｇｌａドメインを修飾することによって、達成することができる。修飾は、ホスファチジルセリンおよび他の負電荷リン脂質に結合するための能力が増加した修飾ＦＩＸポリペプチドをもたらす、ＦＩＸポリペプチドのＧｌａドメインにおける１つまたは複数の位置のアミノ酸交換によって達成することができる。本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドに対してなすことができる、リン脂質結合および／または親和性を増加させるためのさらなる修飾の例は、米国特許第６，０１７，８８２号において記載されるものを含むが、これらに限定されない。たとえば、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、アミノ酸位置１１、１２、２９、３３、および／または３４（配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドに対応する）に１つまたは複数の修飾を含有することができる。例示的なそのような修飾は、アミノ酸交換Ｋ５Ｉ、Ｋ５Ｌ、Ｋ５Ｆ、Ｋ５Ｅ、Ｑ１１Ｅ、Ｑ１１Ｄ、Ｒ１６Ｅ、Ｒ２９Ｆ、ならびに／またはＮ３４Ｅ、Ｎ３４Ｄ、Ｎ３４Ｆ、Ｎ３４Ｉ、Ｎ３４Ｌ、Ｔ３５Ｄ、およびＴ３５Ｅである。
【０３１７】
他の態様では、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドはまた、コラーゲンに対する親和性を低下させるための１つまたは複数のさらなる修飾を含有することもできる。ＦＩＸの血液凝固活性は、内皮細胞上の細胞外マトリックスの表面上に存在するコラーゲンＩＶに対するポリペプチドの結合および／または親和性を低下させることによって増強させることができる。コラーゲンＩＶへの結合の低下は、修飾ＦＩＸポリペプチドの循環の増加、したがって、インビボにおける血液凝固活性の増加をもたらすことができる。これは、たとえば、コラーゲンＩＶとの相互作用を担う、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドのアミノ酸残基３〜１１のＦＩＸ  Ｇｌａドメインを修飾することによって達成することができる［Cheung et al., (1992) J. Biol. Chem. 267:20529-20531; Cheung et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:11068-11073］。修飾は、コラーゲンＩＶに結合する能力が減少した修飾ＦＩＸポリペプチドをもたらす、ＦＩＸポリペプチドのＧｌａドメインにおける１つまたは複数の位置でのアミノ酸交換によって達成することができる。本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドに対してなすことができる、リン脂質結合および／または親和性を増加させるためのさらなる修飾の例は、Schuettrumpf et al., (2005) Blood 105(6):2316-23;Melton et al., (2001) Blood Coagul. Fibrinolysis 12(4):237-43;およびCheung et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:11068-11073において記載されるものを含むが、これらに限定されない。たとえば、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、アミノ酸交換Ｋ５Ａおよび／またはＶ１０Ｋを含有することができる。
【０３１８】
ｃ．阻害因子に対する抵抗性を増加させるためのさらなる修飾
たとえば、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）／ヘパリンによる阻害などのような、阻害因子に対する修飾ＦＩＸポリペプチドの抵抗性を増加させることによって、ＦＩＸポリペプチドの活性を増加させる、さらなる修飾を含むことができる。典型的に、これは、ＡＴ−ＩＩＩ、ヘパリン、またはＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体との相互作用に関与する、１つまたは複数の残基の修飾によって達成することができる。例示的なそのような修飾は、たとえば米国特許第７，１２５，８４１号；米国特許出願公開第２００４０１１０６７５号；国際特許出願公開ＷＯ２００２０４０５４４；Chang, J. et al., (1998) J. Biol. Chem. 273(20):12089-94;Yang, L. et al., (2002) J. Biol. Chem. 277(52):50756-60;Yang, L. et al., (2003) J. Biol. Chem. 278(27):25032-8;Rohlena et al., (2003) J. Biol. Chem. 278(11):9394-401;Sheehan et al., (2006) Blood 107(10):3876-82;Buyue et al. (2008) Blood 112:3234-3241において記載されるものを含む。ＡＴ−ＩＩＩおよび／またはヘパリンによる阻害を減少させるために含むことができる修飾の非限定的な例は、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドのアミノ酸位置Ｒ２５２、Ｈ２５６、Ｈ２５７、Ｋ２６５、Ｈ２６８、Ｋ２９３、Ｒ３１８、Ｒ３３３、Ｒ３３８、Ｋ４００、Ｒ４０３、Ｋ４０９、またはＫ４１１に対応するアミノ酸位置での修飾を含むが、これらに限定されない。たとえば、本明細書において提供されるＦＩＸポリペプチドは、アミノ酸交換Ｒ２５２Ａ、Ｈ２５７Ａ、Ｈ２６８Ａ、Ｋ２９３Ａ、Ｒ３１８Ａ、Ｒ３３３Ａ、Ｒ３３８Ａ、Ｋ４００Ａ、Ｒ４０３Ａ、Ｒ４０３Ｅ、および／またはＫ４１１Ａを含有することができる。
【０３１９】
ｄ．グリコシル化を改変するためのさらなる修飾
修飾は、上記に記載されるものに加えて、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、修飾ＦＩＸポリペプチドのグリコシル化を改変するために、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドの中に組み込むことができる。たとえば、修飾ＦＩＸポリペプチドは、修飾ＦＩＸポリペプチドの中に１つまたは複数の非天然グリコシル化部位を導入する、１つまたは複数の修飾を含有することができる。したがって、適切な系において発現される場合、修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、改変されたグリコシル化パターンを示すことができる。いくつかの例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、Ｎ−グリコシル化の増加またはＯ−グリコシル化の増加などのような、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、グリコシル化の増加を示す。
【０３２０】
ＦＩＸポリペプチドのグリコシル化プロファイルを改変するために、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチド中に含むことができるさらなる修飾の例は、国際特許出願公開ＷＯ２００９１３０１９８、ＷＯ２００９０５１７１７、およびＷＯ２００９１３７２５４において記載されるものを含むが、これらに限定されない。グリコシル化を増加させるために、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチド中に含むことができる例示的な修飾は、Y1N、Y1N+S3T、S3N+K5S/T、G4T、G4N+L6S/T、K5N+E7T、L6N+E8T、E7N+F9T、F9N+Q11S/T、V10N+G12S/T、Q11N+N13T、G12N+L14S/T、L14N+R16T、E15T、E15N+E17T;R16N+C18S/T、M19N+E21T;E20N+K22T、K22N、S24N+E26T;F25N+E27T;E26N+A28T;E27N+R29T;A28N+E30T;R29N+V31S/T、E30N+F32T;V31N+E33T;F32N+N34T、E33N、T35N+R37S/T、E36T;E36N;R37N、T39N+F41S/T、E40N+W42T、F41N+K43S/T、W42N+Q44S/T、K43N+Y45T;Q44N+V46S/T、Y45N+D47T、V46N+G48S/T、D47N+D49S/T、G48N+Q50S/T、D49N+C51S/T、Q50N+E52S/T、E52N+N54T、S53N+P55S/T、C56S/T、L57N+G59S/T、G59N+S61T;G60S/T、S61N+K63S/T、K63N+D65S/T、D65N+N67S/T、I66N+S68S/T、Y69S/T、Y69N+C71S/T、S68N+E70S/T、E70N+W72S/T、W72N+P74S/T、P74N+G76S/T、F75N、G76N+E78T、E78N+K80T、F77T、F77N+G79S/T、G79N+N81S/T、K80N+C82S/T、E83S/T、E83N+D85S/T、L84N+V86S/T、D85N、V86A、V86N+C88S/T、T87N+N89S/T、I90N+N92S/T、K91S/T、I90N+N92S/T、K91N+G93S/T、R94S/T、R94N+E96S/T、K100N、A103S/T、S102N+D104S/T、A103N+N105S/T、D104N+K106S/T、V107S/T、K106N+V108S/T、V108N+V110S/T、S111N、E113N+Y115S/T、G114N+R116S/T、R116N+A118S/T、E119N+Q121S/T、K122S/T、Q121N+S123S/T、K122N+C124S/T S123N+E125S/T、E125N+A125S/T、P126N+V128S/T、A127N+P129T、V128N+F130S/T、P129N+P131S/T、F130N+C132S/T、R134N、V135N+V137S/T、S136N、S138N、V137N+Q139T;Q139N、T140N+L142S/T、S141N+L143S/T、K142N、A146N+A148S/T、E147N+V149S/T、T148N+F150S/T、V149N+P151S/T、F150N+D152S/T、P151N+V153S/T、D152N+D154S/T、V153N+Y155S/T、D154N+V156S/T、Y155N+N157S/T、V156N、S158N+E160S/T、T159N+A161S/T、E160N+E162S/T、A161N、E162N+I164S/T、T163N+L165S/T、I164N+D166S/T、L165N+N167S/T、D166N+I168S/T、I168N+Q170S/T、T169N、Q170N、S171N+Q173S/T、T172N、Q173N+F175S/T、S174N+N176S/T、F175N+D177S/T、F178S/T、D177N、D177E、F178N+R180S/T、T179N+V181S/T、R180N+V182S/T、G183+E185S/T、G184N+D186T、E185N+A187S/T、D186N+K188S/T、A187N+P189T、K188N+G190S/T、P189N+Q181S/T、G200N+V202T、K201N+D203S/T、K201T、V202N+A204S/T、D203N+F205S/T、E213N+W215S/T、K214T、V223T、E224N+G226S/T、T225N+V227S/T、G226N+K228S/T、V227N+I229T、K228N、H236N+I238T;I238N+E240T;E239N、E240N+E242S/T、E242N、T241N+H243S/T、H243N+E245S/T、K247N+N249S/T、V250N+R252T、I251S/T、I251N+I253S/T、R252N+I254S/T、I253N+P255S/T、P255N+H257S/T、H257N+Y259S/T、N260S/T、A262S/T、A261N+I263S/T、A262N+N264S/T、I263N+K265S/T、K265N+N267S/T、A266N+H268S/T、D276N+P278S/T、P278N+V280S/T、E277N+L279S/T、V280N+N282S/T、Y284S/T、S283N+V285S/T、Y284N、D292N+K294S/T、K293N+Y295S/T、E294N、F299S/T、I298N+L300S/T、K301N+G303S/T、F302N、G303N+G305S/T、S304N+Y306S/T、Y306N+S308S/T、R312N+F314S/T、V313N+H315T、F314N+K316S/T、H315N+G317S/T、K316N+R138S/T、G317N、R318N+A320S/T、S319N+L321S/T、A320N+V322T、L321N+L323S/T、V322N+Q324S/T、Y325N+R327S/T、R327N+P329S/T、P329N+V331S/T、L330N+D332S/T、D332N+A334S/T、R333N、A334N+C336S/T、T335N+L337S/T、L337N、R338N、S339N+K341T、T340N+F342T;K341N、F342N+I344S/T、T343N+Y345S/T、Y345N+N347S/T、M348S/T、G352N+H354T、F353N、F353N+E355T、H354N+G356S/T、H354V、H354I、E355T、E355N+G357S/T、G356N+R358T、G357N+D359S/T、R358N、Q362N+D364S/T、V370N;T371V;T371I;E372T、E372N+E374S/T、E374N、G375N、W385N+E387T;G386N+E388T、E388N+A390S/T、A390N+K392T、M391N+G393S/T、K392N+K394S/T、K392V、G393T、G393N+Y395S/T、K394N+G396S/T、R403N+V405S/T、I408S/T、K409N+K411S/T、E410N、K411N+K413S/T、お���びK413Nを含むが、これらに限定されない。
【０３２１】
ｅ．プロテアーゼに対する抵抗性を増加させるための修飾
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドはまた、プロテアーゼに対するポリペプチドの抵抗性の増加をもたらす、さらなる修飾を含有することができる。たとえば、１つまたは複数の潜在的なタンパク質分解性切断部位を除去するアミノ酸交換は、なすことができる。修飾ＦＩＸポリペプチドは、したがって、プロテアーゼに対してより抵抗性になり、それによって、修飾ポリペプチドの安定性および半減期を増加させることができる。
【０３２２】
プロテアーゼに対する抵抗性を増加させるために、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドにおいて含むことができるさらなる修飾の例は、米国特許出願公開第２００８０１０２１１５号および国際特許出願公開ＷＯ２００７１４９４０６において記載されるものを含むが、これらに限定されない。プロテアーゼ抵抗性を増加させるために、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチド中に含むことができる例示的な修飾は、Y1H、Y1I、S3Q、S3H、S3N、G4Q、G4H、G4N、K5N、K5Q、L6I、L6V、E7Q、E7H、E7N、E8Q、E8H、E8N、F9I、F9V、V10Q、V10H、V10N、G12Q、G12H、G12N、L14I、L14V、E15Q、E15H、E15N、R16H、R16Q、E17Q、E17H、E17N、M19I、M19V、E20Q、E20H、E20N、E21Q、E21H、E21N、K22N、K22Q、S24Q、S24H、S24N、F25I、F25V、E26Q、E26H、E26N、E27Q、E27H、E27N、A28Q、A28H、A28N、R29H、R29Q、E30Q、E30H、E30N、V31Q、V31H、V31N、F32I、F32V、E33Q、E33H、E33N、T35Q、T35H、T35N、E36Q、E36H、E36N、R37H、R37Q、T38Q、T38H、T38N、T39Q、T39H、T39N、E40Q、E40H、E40N、F41I、F41V、W42S、W42H、K43N、K43Q、Y45H、Y45I、V46Q、V46H、V46N、D47N、D47Q、G48Q、G48H、G48N、D49N、D49Q、E52Q、E52H、E52N、S53Q、S53H、S53N、P55A、P55S、L57I、L57V、N58Q、N58S、G59Q、G59H、G59N、G60Q、G60H、G60N、S61Q、S61H、S61N、K63N、K63Q、D64N、D64Q、D65N、D65Q、I66Q、I66H、I66N、S68Q、S68H、S68N、Y69H、Y69I、E70Q、E70H、E70N、W72S、W72H、P74A、P74S、F75I、F75V、G76Q、G76H、G76N、F77I、F77V、E78Q、E78H、E78N、G79Q、G79H、G79N、K80N、K80Q、E83Q、E83H、E83N、L84I、L84V、D85N、D85Q、V86Q、V86H、V86N、T87Q、T87H、T87N、I90Q、I90H、I90N、K91N、K91Q、N92Q、N92S、G93Q、G93H、G93N、R94H、R94Q、E96Q、E96H、E96N、F98I、F98V、K100N、K100Q、S102Q、S102H、S102N、A103Q、A103H、A103N、D104N、D104Q、K106N、K106Q、V107Q、V107H、V107N、V108Q、V108H、V108N、S110Q、S110H、S110N、T112Q、T112H、T112N、E113Q、E113H、E113N、G114Q、G114H、G114N、Y115H、Y115I、R116H、R116Q、L117I、L117V、A118Q、A118H、A118N、E119Q、E119H、E119N、K122N、K122Q、S123Q、S123H、S123N、E125Q、E125H、E125N、P126A、P126S、A127Q、A127H、A127N、V128Q、V128H、V128N、P129A、P129S、P131A、P131S、G133Q、G133H、G133N、R134H、R134Q、V135Q、V135H、V135N、S136Q、S136H、S136N、V137Q、V137H、V137N、S138Q、S138H、S138N、T140Q、T140H、T140N、S141Q、S141H、S141N、K142N、K142Q、L143I、L143V、T144Q、T144H、T144N、R145H、R145Q、A146Q、A146H、A146N、E147Q、E147H、E147N、T148Q、T148H、T148N、V149Q、V149H、V149N、P151A、P151S、D152N、D152Q、V153Q、V153H、V153N、D154N、D154Q、Y155H、Y155I、V156Q、V156H、V156N、S158Q、S158H、S158N、T159Q、T159H、T159N、E160Q、E160H、E160N、A161Q、A161H、A161N、E162Q、E162H、E162N、T163Q、T163H、T163N、I164Q、I164H、I164N、L165I、L165V、L165Q、L165H、D166N、D166Q、I168Q、I168H、I168N、T169Q、T169H、T169N、S171Q、S171H、S171N、T172Q、T172H、T172N、S174Q、S174H、S174N、F175I、F175V、F175H、D177N、D177Q、F178I、F178V、F178H、T179Q、T179H、T179N、R180H、R180Q、V181Q、V181H、V181N、V182Q、V182H、V182N、G183Q、G183H、G183N、G184Q、G184H、G184N、E185Q、E185H、E185N、D186N、D186Q、A187Q、A187H、A187N、K188N、K188Q、P189A、P189S、G190Q、G190H、G190N、F192I、F192V、F192IH、P193A、P193S、W194S、W194H、W194I、V196Q、V196H、V196N、V197Q、V197H、V197N、L198I、L198V、L198Q、L198H、N199Q、N199S、G200Q、G200H、G200N、K201N、K201Q、V202Q、V202H、V202N、D203N、D203Q、A204Q、A204H、A204N、F205I、F205V、G207Q、G207H、G207N、G208Q、G208H、G208N、S209Q、S209H、S209N、I210Q、I210H、I210N、V211Q、V211H、V211N、E213Q、E213H、E213N、K214N、K214Q、W215S、W215H、I216Q、I216H、I216N、V217Q、V217H、V217N、T218Q、T218H、T218N、A219Q、A219H、A219N、A220Q、A220H、A220N、V223Q、V223H、V223N、E224Q、E224H、E224N、T225Q、T225H、T225N、G226Q、G226H、G226N、V227Q、V227H、V227N、K228N、K228Q、I229Q、I229H、I229N、T230Q、T230H、T230N、V231Q、V231H、V231N、V232Q、V232H、V232N、A233Q、A233H、A233N、G234Q、G234H、G234N、E235Q、E235H、E235N、I238Q、I238H、I238N、E239Q、E239H、E239N、E240Q、E240H、E240N、T241Q、T241H、T241N、E242Q、E242H、E242N、T244Q、T244H、T244N、E245Q、E245H、E245N、K247N、K247Q、R248H、R248Q、V250Q、V250H、V250N、I251Q、I251H、I251N、R252H、R252Q、I253Q、I253H、I253N、I254Q、I254H、I254N、P255A、P255S、Y259H、Y259I、A261Q、A261H、A261N、A262Q、A262H、A262N、I263Q、I263H、I263N、K265N、K265Q、Y266H、Y266I、D269N、D269Q、I270Q、I270H、I270N、A271Q、A271H、A271N、L272I、L272V、L273I、L273V、E274Q、E274H、E274N、L275I、L275V、D276N、D276Q、E277Q、E277H、E277N、P278A、P278S、L279I、L279V、V280Q、V280H、V280N、L281I、L281V、S283Q、S283H、S283N、Y284H、Y284I、V285Q、V285H、V285N、T286Q、T286H、T286N、P287A、P287S、I288Q、I288H、I288N、I290Q、I290H、I290N、A291Q、A291H、A291N、D292N、D292Q、K293N、K293Q、E294Q、E294H、E294N、Y295H、Y295I、T296Q、T296H、T296N、I298Q、I298H、I298N、F299I、F299V、L300I、L300V、K301N、K301Q、F302I、F302V、G303Q、G303H、G303N、S304Q、S304H、S304N、G305Q、G305H、G305N、Y306H、Y306I、V307Q、V307H、V307N、S308Q、S308H、S308N、G309Q、G309H、G309N、W310S、W310H、G311Q、G311H、G311N、R312H、R312Q、V313Q、V313H、V313N、F314I、F314V、K316N、K316Q、G317Q、G317H、G317N、R318H、R318Q、S319Q、S319H、S319N、A320Q、A320H、A320N、L321I、L321V、V322Q、V322H、V322N、L323I、L323V、Y325H、Y325I、L326I、L326V、R327H、R327Q、V328Q、V328H、V328N、P329A、P329S、L330I、L330V、V331Q、V331H、V331N、D332N、D332Q、R333H、R333Q、A334Q、A334H、A334N、T335Q、T335H、T335N、L337I、L337V、R338H、R338Q、S339Q、S339H、S339N、T340Q、T340H、T340N、K341N、K341Q、F342I、F342V、T343Q、T343H、T343N、I344Q、I344H、I344N、Y345H、Y345I、M348I、M348V、F349I、F349V、A351Q、A351H、A351N、G352Q、G352H、G352N、F353I、F353V、E355Q、E355H、E355N、G356Q、G356H、G356N、G357Q、G357H、G357N、R358H、R358Q、D359N、D359Q、S360Q、S360H、S360N、G363Q、G363H、G363N、D364N、D364Q、S365Q、S365H、S365N、G366Q、G366H、G366N、G367Q、G367H、G367N、P368A、P368S、V370Q、V370H、V370N、T371Q、T371H、T371N、E372Q、E372H、E372N、V373Q、V373H、V373N、E374Q、E374H、E374N、G375Q、G375H、G375N、T376Q、T376H、T376N、S377Q、S377H、S377N、F378I、F378V、L379I、L379V、T380Q、T380H、T380N、G381Q、G381H、G381N、I382Q、I382H、I382N、I383Q、I383H、I383N、S384Q、S384H、S384N、W385S、W385H、G386Q、G386H、G386N、E387Q、E387H、E387N、E388Q、E388H、E388N、A390Q、A390H、A390N、M391I、M391V、K392N、K392Q、G393Q、G393H、G393N、K394N、K394Q、Y395H、Y395I、G396Q、G396H、G396N、I397Q、I397H、I397N、Y398H、Y398I、T399Q、T399H、T399N、K400N、K400Q、V401Q、V401H、V401N、S402Q、S402H、S402N、R403H、R403Q、Y404H、Y404I、V405Q、V405H、V405N、W407S、W407H、I408Q、I408H、I408N、K409N、K409Q、E410Q、E410H、E410N、K411N、K411Q、T412Q、T412H、T412N、K413N、K413Q、L414I、L414V、T415Q、T415H、およびT415N（配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドに対応するナンバリング）を含むが、これらに限定されない。
【０３２３】
ｆ．免疫原性を低下させるための修飾
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドに対するさらなる修飾は、タンパク質由来の１つまたは複数のＴ細胞エピトープの活性における実質的な低下またはその排除、つまり、ポリペプチドの脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）をもたらす、少なくとも１つのアミノ酸残基の修飾を含むことができる。いずれかのＭＨＣクラスＩＩリガンド内の特定の位置の１つまたは複数のアミノ酸修飾は、たとえばヒト対象などのような対象に治療薬として投与される場合に、免疫原性が低下した脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）ＦＩＸポリペプチドをもたらすことができる。たとえば、米国特許出願公開第２００４０２５４１０６号において開示される任意の１つまたは複数の修飾は、免疫原性を低下させるために、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチド中に含むことができる。
【０３２４】
ＦＩＸポリペプチドの免疫原性の低下に寄与することができる例示的なアミノ酸修飾は、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドに対応するナンバリングによる任意の１つまたは複数の以下の修飾：Y1A、Y1C、Y1D、Y1E、Y1G、Y1H、Y1K、Y1N、Y1P、Y1Q、Y1R、Y1S、Y1T、S3T、L6A、L6C、L6D、L6E、L6G、L6H、L6K、L6N、L6P、L6Q、L6R、L6S、L6T、L6M、F9A、F9C、F9D、F9E、F9G、F9H、F9K、F9N、F9P、F9Q、F9R、F9S、F9T、F9I、F9M、F9W、V10A、V10C、V10D、V10E、V10G、V10H、V10K、V10N、V10P、V10Q、V10R、V10S、V10T、V10F、V10I、V10M、V10W、V10Y、Q11A、Q11C、Q11G、Q11P、G12D、G12E、G12G、G12H、G12K、G12N、G12P、G12Q、G12R、G12S、G12T、N13A、N13C、N13G、N13H、N13P、N13T、L14A、L14C、L14D、L14E、L14G、L14H、L14K、L14N、L14P、L14Q、L14R、L14S、L14T、L14F、L14I、L14M、L14V、L14W、L14Y、E15D、E15H、E15P、R16A、R16C、R16G、R16P、R16T、E17A、E17C、E17G、E17P、E17T、C18D、C18E、C18G、C18H、C18K、C18N、C18P、C18Q、C18R、C18S、C18T、M19A、M19C、M19D、M19E、M19G、M19H、M19K、M19N、M19P、M19Q、M19R、M19S、M19T、M19F、M19I、M19M、M19V、M19W、M19Y、E20A、E20C、E20G、E20P、E20T、E21A、E21C、E21G、E21P、K22H、K22P、K22T、S24H、S24P、F25A、F25C、F25D、F25E、F25G、F25H、F25K、F25N、F25P、F25Q、F25R、F25S、F25T、F25I、F25M、F25W、F25Y、E26A、E26C、E26G、E26P、E27A、E27C、E27G、E27H、E27P、E27S、E27T、A28C、A28D、A28E、A28G、A28H、A28K、A28N、A28P、A28Q、A28R、A28S、A28T、R29A、R29C、R29G、R29P、E30D、E30H、E30P、V31A、V31C、V31D、V31E、V31G、V31H、V31K、V31N、V31P、V31Q、V31R、V31S、V31T、V31F、V31I、V31W、V31Y、F32A、F32C、F32D、F32E、F32G、F32H、F32K、F32N、F32P、F32Q、F32R、F32S、F32T、E33H、E33N、E33P、E33Q、E33S、E33T、T35A、T35C、T35G、T35P、F41A、F41C、F41D、F41E、F41G、F41H、F41K、F41N、F41P、F41Q、F41R、F41S、F41T、F41M、F41W、F41Y、W42A、W42C、W42D、W42E、W42G、W42H、W42K、W42N、W42P、W42Q、W42R、W42S、W42T、K43A、K43C、K43G、K43P、Q44P、Q44T、Q44、Y45A、Y45C、Y45D、Y45E、Y45G、Y45H、Y45K、Y45N、Y45P、Y45Q、Y45R、Y45S、Y45T、V46A、V46C、V46D、V46E、V46G、V46H、V46K、V46N、V46P、V46Q、V46R、V46S、V46T、V46F、V46I、V46M、V46W、V46Y、D47A、D47C、D47G、D47H、D47P、D47T、G48D、G48E、G48P、G48T、D49H、D49P、D49Q、D49T、Q50A、Q50C、Q50D、Q50G、Q50H、Q50P、Q50T、C51D、C51E、C51G、C51H、C51K、C51N、C51P、C51Q、C51R、C51S、C51T、E52P、E52T、S53A、S53C、S53G、S53H、S53P、S53T、N54H、N54P、N54T、L57A、L57C、L57D、L57E、L57G、L57H、L57K、L57N、L57P、L57Q、L57R、L57S、L57T、L57F、L57I、L57M、L57W、L57Y、G60C、G60D、G60H、G60P、G60T、C62D、C62H、C62P、K63T、D65H、D65T、I66A、I66C、I66D、I66E、I66G、I66H、I66K、I66N、I66P、I66Q、I66R、I66S、I66T、I66M、I66W、I66Y、Y69A、Y69C、Y69D、Y69E、Y69G、Y69H、Y69K、Y69N、Y69P、Y69Q、Y69R、Y69S、Y69T、C71H、C71P、W72A、W72C、W72D、W72E、W72G、W72H、W72K、W72N、W72P、W72Q、W72R、W72S、W72T、W72I、W72Y、F75A、F75C、F75D、F75E、F75G、F75H、F75K、F75N、F75P、F75Q、F75R、F75S、F75T、F77A、F77C、F77D、F77E、F77G、F77H、F77K、F77N、F77P、F77Q、F77R、F77S、F77T、L84A、L84C、L84D、L84E、L84G、L84H、L84K、L84N、L84P、L84Q、L84R、L84S、L84T、L84M、L84W、L84Y、V86A、V86C、V86D、V86E、V86G、V86H、V86K、V86N、V86P、V86Q、V86R、V86S、V86T、I90A、I90C、I90D、I90E、I90G、I90H、I90K、I90N、I90P、I90Q、I90R、I90S、I90T、I90M、I90W、K91A、K91C、K91G、K91P、N92A、N92C、N92G、N92P、N92T、G93D、G93E、G93H、G93K、G93N、G93P、G93Q、G93R、G93S、G93T、R94A、R94C、R94G、R94P、C95D、C95E、C95G、C95H、C95K、C95N、C95P、C95Q、C95R、C95S、C95T、E96P、E96T、Q97A、Q97C、Q97G、Q97P、F98A、F98C、F98D、F98E、F98G、F98H、F98K、F98N、F98P、F98Q、F98R、F98S、F98T、F98M、F98W、F98Y、K100A、K100C、K100G、K100P、N101H、N101T、A103D、A103E、A103H、A103K、A103N、A103P、A103Q、A103R、A103S、A103T、D104T、K106H、K106P、K106T、V107A、V107C、V107D、V107E、V107G、V107H、V107K、V107N、V107P、V107Q、V107R、V107S、V107T、V108A、V108C、V108D、V108E、V108G、V108H、V108K、V108N、V108P、V108Q、V108R、V108S、V108T、V108F、V108M、V108W、V108Y、S110A、S110C、S110G、S110P、C111D、C111E、C111H、C111K、C111N、C111P、C111Q、C111R、C111S、C111T、T112A、T112C、T112G、T112P、E113D、E113H、E113P、G114D、G114E、G114H、G114K、G114N、G114P、G114Q、G114R、G114S、G114T、Y115A、Y115C、Y115D、Y115E、Y115G、Y115H、Y115K、Y115N、Y115P、Y115Q、Y115R、Y115S、Y115T、Y115M、Y115W、R116P、R116T、L117A、L117C、L117D、L117E、L117G、L117H、L117K、L117N、L117P、L117Q、L117R、L117S、L117T、A118D、A118E、A118H、A118K、A118N、A118P、A118Q、A118R、A118S、A118T、N120D、N120H、N120P、Q121T、S123H、S123T、V128A、V128C、V128D、V128E、V128G、V128H、V128K、V128N、V128P、V128Q、V128R、V128S、V128T、F130A、F130C、F130D、F130E、F130G、F130H、F130K、F130N、F130P、F130Q、F130R、F130S、F130T、V135A、V135C、V135D、V135E、V135G、V135H、V135K、V135N、V135P、V135Q、V135R、V135S、V135T、V135W、V135Y、V137A、V137C、V137D、V137E、V137G、V137H、V137K、V137N、V137P、V137Q、V137R、V137S、V137T、V137M、V137W、V137Y、S138H、S138T、T140D、T140H、S141T、K142H、K142P、L143A、L143C、L143D、L143E、L143G、L143H、L143K、L143N、L143P、L143Q、L143R、L143S、L143T、L143F、L143I、L143M、L143V、L143W、L143Y、R145H、R145P、R145T、A146P、A146T、T148H、T148P、V149A、V149C、V149D、V149E、V149G、V149H、V149K、V149N、V149P、V149Q、V149R、V149S、V149T、V149F、V149I、V149M、V149W、V149Y、F150A、F150C、F150D、F150E、F150G、F150H、F150K、F150N、F150P、F150Q、F150R、F150S、F150T、F150M、F150W、F150Y、D152A、D152C、D152G、D152P、D152S、D152T、V153A、V153C、V153D、V153E、V153G、V153H、V153K、V153N、V153P、V153Q、V153R、V153S、V153T、V153F、V153I、V153M、V153W、V153Y、D154A、D154C、D154G、D154P、D154Q、D154S、Y155A、Y155C、Y155D、Y155E、Y155G、Y155H、Y155K、Y155N、Y155P、Y155Q、Y155R、Y155S、Y155T、Y155M、Y155V、Y155W、V156A、V156C、V156D、V156E、V156G、V156H、V156K、V156N、V156P、V156Q、V156R、V156S、V156T、V156I、V156M、V156W、V156Y、N157A、N157C、N157G、N157H、N157P、N157Q、N157T、S158H、S158P、S158T、T159A、T159C、T159G、T159P、E160A、E160C、E160G、E160P、A161C、A161D、A161E、A161H、A161K、A161N、A161P、A161Q、A161R、A161S、A161T、E162P、E162T、T163A、T163C、T163G、T163P、I164A、I164C、I164D、I164E、I164G、I164H、I164K、I164N、I164P、I164Q、I164R、I164S、I164T、L165A、L165C、L165D、L165E、L165G、L165H、L165K、L165N、L165P、L165Q、L165R、L165S、L165T、L165M、L165W、L165Y、I168A、I168C、I168D、I168E、I168G、I168H、I168K、I168N、I168P、I168Q、I168R、I168S、I168T、F175A、F175C、F175D、F175E、F175G、F175H、F175K、F175N、F175P、F175Q、F175R、F175S、F175T、F178A、F178C、F178D、F178E、F178G、F178H、F178K、F178N、F178P、F178Q、F178R、F178S、F178T、F178M、F178W、F178Y、T179A、T179C、T179G、T179P、R180A、R180C、R180D、R180G、R180H、R180P、V181A、V181C、V181D、V181E、V181G、V181H、V181K、V181N、V181P、V181Q、V181R、V181S、V181T、V181F、V181I、V181M、V181W、V181Y、V182A、V182C、V182D、V182E、V182G、V182H、V182K、V182N、V182P、V182Q、V182R、V182S、V182T、V182F、V182I、V182M、V182W、V182Y、G183D、G183E、G183H、G183K、G183N、G183P、G183Q、G183S、G183T、G184D、G184E、G184H、G184K、G184N、G184P、G184Q、G184R、G184S、G184T、E185A、E185C、E185G、E185H、E185P、E185T、D186A、D186C、D186G、D186H、D186P、D186T、A187C、A187D、A187E、A187G、A187H、A187K、A187N、A187P、A187Q、A187R、A187S、A187T、K188A、K188C、K188G、K188H、K188P、K188T、G190D、G190E、G190H、G190K、G190N、G190P、G190Q、G190R、G190S、G190T、F192A、F192C、F192D、F192E、F192G、F192H、F192K、F192N、F192P、F192Q、F192R、F192S、F192T、F192W、F192Y、W194A、W194C、W194D、W194E、W194G、W194H、W194K、W194N、W194P、W194Q、W194R、W194S、W194T、Q195H、Q195P、Q195T、V196A、V196C、V196D、V196E、V196G、V196H、V196K、V196N、V196P、V196Q、V196R、V196S、V196T、V196F、V196I、V196M、V196W、V196Y、V197A、V197C、V197D、V197E、V197G、V197H、V197K、V197N、V197P、V197Q、V197R、V197S、V197T、V197F、V197I、V197M、V197W、V197Y、L198A、L198C、L198D、L198E、L198G、L198H、L198K、L198N、L198P、L198Q、L198R、L198S、L198T、L198I、L198Y、N199A、N199C、N199G、N199H、N199P、N199S、N199T、G200P、G200T、K201A、K201C、K201D、K201E、K201G、K201H、K201N、K201P、K201Q、K201S、K201T、V202A、V202C、V202D、V202E、V202G、V202H、V202K、V202N、V202P、V202Q、V202R、V202S、V202T、V202F、V202I、V202M、V202W、V202Y、D203A、D203C、D203G、D203P、D203T、A204C、A204D、A204E、A204G、A204H、A204K、A204N、A204P、A204Q、A204R、A204S、A204T、F205A、F205C、F205D、F205E、F205G、F205H、F205K、F205N、F205P、F205Q、F205R、F205S、F205T、F205M、F205V、F205W、F205Y、G207H、G207P、G208C、G208D、G208E、G208H、G208K、G208N、G208P、G208Q、G208R、G208S、G208T、S209A、S209C、S209G、S209P、I210A、I210C、I210D、I210E、I210G、I210H、I210K、I210N、I210P、I210Q、I210R、I210S、I210T、I210F、I210W、I210Y、V211A、V211C、V211D、V211E、V211G、V211H、V211K、V211N、V211P、V211Q、V211R、V211S、V211T、V211F、V211I、V211M、V211W、N212A、N212C、N212G、N212P、E213H、E213P、E213S、E213T、K214T、W215A、W215C、W215D、W215E、W215G、W215H、W215K、W215N、W215P、W215Q、W215R、W215S、W215T、I216A、I216C、I216D、I216E、I216G、I216H、I216K、I216N、I216P、I216Q、I216R、I216S、I216T、V217A、V217C、V217D、V217E、V217G、V217H、V217K、V217N、V217P、V217Q、V217R、V217S、V217T、V217I、V217Y、A219H、A219P、A219T、V223A、V223C、V223D、V223E、V223G、V223H、V223K、V223N、V223P、V223Q、V223R、V223S、V223T、V223M、V223W、V223Y、G226P、V227A、V227C、V227D、V227E、V227G、V227H、V227K、V227N、V227P、V227Q、V227R、V227S、V227T、V227F、V227I、V227M、V227W、V227Y、K228A、K228C、K228G、K228H、K228P、I229A、I229C、I229D、I229E、I229G、I229H、I229K、I229N、I229P、I229Q、I229R、I229S、I229T、I229M、I229W、I229Y、T230A、T230C、T230G、T230P、V231A、V231C、V231D、V231E、V231G、V231H、V231K、V231N、V231P、V231Q、V231R、V231S、V231T、V232A、V232C、V232D、V232E、V232G、V232H、V232K、V232N、V232P、V232Q、V232R、V232S、V232T、V232F、V232I、V232M、V232W、V232Y、A233C、A233D、A233E、A233G、A233H、A233K、A233N、A233P、A233Q、A233R、A233S、A233T、A233V、G234D、G234E、G234H、G234K、G234N、G234P、G234Q、G234R、G234S、G234T、E235H、E235N、E235P、E235Q、E235S、E235T、H236A、H236C、H236G、H236P、N237A、N237C、N237G、N237P、N237T、I238A、I238C、I238D、I238E、I238G、I238H、I238K、I238N、I238P、I238Q、I238R、I238S、I238T、E239A、E239C、E239G、E239P、E240H、E240T、V250A、V250C、V250D、V250E、V250G、V250H、V250K、V250N、V250P、V250Q、V250R、V250S、V250T、V250M、V250W、V250Y、I251A、I251C、I251D、I251E、I251G、I251H、I251K、I251N、I251P、I251Q、I251R、I251S、I251T、I253A、I253C、I253D、I253E、I253G、I2
53H、I253K、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253M、I253W、I253Y、I254A、I254C、I254D、I254E、I254G、I254H、I254K、I254N、I254P、I254Q、I254R、I254S、I254T、P255H、H256P、H256T、H257A、H257C、H257G、H257P、N258P、N258T、Y259A、Y259C、Y259D、Y259E、Y259G、Y259H、Y259K、Y259N、Y259P、Y259Q、Y259R、Y259S、Y259T、Y259M、Y259W、N260A、N260C、N260G、N260P、A261D、A261E、A261H、A261K、A261N、A261P、A261Q、A261R、A261S、A261T、A262C、A262D、A262E、A262G、A262H、A262K、A262N、A262P、A262Q、A262R、A262S、A262T、I263A、I263C、I263D、I263E、I263G、I263H、I263K、I263N、I263P、I263Q、I263R、I263S、I263T、I263M、I263V、I263W、I263Y、N264A、N264C、N264D、N264G、N264H、N264P、K265A、K265C、K265G、K265H、K265P、Y266A、Y266C、Y266D、Y266E、Y266G、Y266H、Y266K、Y266N、Y266P、Y266Q、Y266R、Y266S、Y266T、Y266M、Y266W、N267A、N267C、N267G、N267H、N267P、N267T、H268P、D269A、D269C、D269E、D269G、D269H、D269N、D269P、D269Q、D269S、D269T、I270A、I270C、I270D、I270E、I270G、I270H、I270K、I270N、I270P、I270Q、I270R、I270S、I270T、I270M、I270W、A271C、A271D、A271E、A271G、A271H、A271K、A271N、A271P、A271Q、A271R、A271S、A271T、L272A、L272C、L272D、L272E、L272G、L272H、L272K、L272N、L272P、L272Q、L272R、L272S、L272T、L272F、L273A、L273C、L273D、L273E、L273G、L273H、L273K、L273N、L273P、L273Q、L273R、L273S、L273T、L273F、L273I、L273M、L273V、L273W、L273Y、E274A、E274C、E274G、E274P、E274T、L275A、L275C、L275D、L275E、L275G、L275H、L275K、L275N、L275P、L275Q、L275R、L275S、L275T、L275W、L275Y、D276P、D276S、D276T、E277A、E277C、E277G、E277P、P278T、L279A、L279C、L279D、L279E、L279G、L279H、L279K、L279N、L279P、L279Q、L279R、L279S、L279T、L279I、L279Y、V280A、V280C、V280D、V280E、V280G、V280H、V280K、V280N、V280P、V280Q、V280R、V280S、V280T、V280F、V280I、V280W、V280Y、L281A、L281C、L281D、L281E、L281G、L281H、L281K、L281N、L281P、L281Q、L281R、L281S、L281T、L281F、L281I、L281V、L281W、L281Y、S283A、S283C、S283G、S283P、Y284A、Y284C、Y284D、Y284E、Y284G、Y284H、Y284K、Y284N、Y284P、Y284Q、Y284R、Y284S、Y284T、Y284M、V285A、V285C、V285D、V285E、V285G、V285H、V285K、V285N、V285P、V285Q、V285R、V285S、V285T、V285M、V285W、V285Y、T286A、T286C、T286G、T286P、I288A、I288C、I288D、I288E、I288G、I288H、I288K、I288N、I288P、I288Q、I288R、I288S、I288T、C289D、C289H、C289P、I290A、I290C、I290D、I290E、I290G、I290H、I290K、I290N、I290P、I290Q、I290R、I290S、I290T、I290Y、A291D、A291E、A291H、A291K、A291N、A291P、A291Q、A291R、A291S、A291T、D292A、D292C、D292G、D292P、D292T、K293H、K293P、K293T、Y295A、Y295C、Y295D、Y295E、Y295G、Y295H、Y295K、Y295N、Y295P、Y295Q、Y295R、Y295S、Y295T、Y295W、T296A、T296C、T296G、T296P、N297A、N297C、N297G、N297P、I298A、I298C、I298D、I298E、I298G、I298H、I298K、I298N、I298P、I298Q、I298R、I298S、I298T、F299A、F299C、F299D、F299E、F299G、F299H、F299K、F299N、F299P、F299Q、F299R、F299S、F299T、L300A、L300C、L300D、L300E、L300G、L300H、L300K、L300N、L300P、L300Q、L300R、L300S、L300T、L300F、L300I、L300M、L300V、L300W、L300Y、K301A、K301C、K301G、K301P、K301T、F302A、F302C、F302D、F302E、F302G、F302H、F302K、F302N、F302P、F302Q、F302R、F302S、F302T、G303H、G303P、G303T、S304A、S304C、S304G、S304P、S304T、G305D、G305E、G305H、G305N、G305P、G305Q、G305S、G305T、Y306A、Y306C、Y306D、Y306E、Y306G、Y306H、Y306K、Y306N、Y306P、Y306Q、Y306R、Y306S、Y306T、V307A、V307C、V307D、V307E、V307G、V307H、V307K、V307N、V307P、V307Q、V307R、V307S、V307T、S308P、S308T、W310A、W310C、W310D、W310E、W310G、W310H、W310K、W310N、W310P、W310Q、W310R、W310S、W310T、G311H、V313A、V313C、V313D、V313E、V313G、V313H、V313K、V313N、V313P、V313Q、V313R、V313S、V313T、F314A、F314C、F314D、F314E、F314G、F314H、F314K、F314N、F314P、F314Q、F314R、F314S、F314T、F314M、F314W、F314Y、H315A、H315C、H315G、H315P、K316A、K316C、K316G、K316P、G317C、G317D、G317E、G317H、G317K、G317N、G317P、G317Q、G317R、G317S、G317T、R318A、R318C、R318G、R318P、S319D、S319H、S319N、S319P、S319Q、A320C、A320D、A320E、A320G、A320H、A320K、A320N、A320P、A320Q、A320R、A320S、A320T、L321A、L321C、L321D、L321E、L321G、L321H、L321K、L321N、L321P、L321Q、L321R、L321S、L321T、V322A、V322C、V322D、V322E、V322G、V322H、V322K、V322N、V322P、V322Q、V322R、V322S、V322T、V322W、V322Y、L323A、L323C、L323D、L323E、L323G、L323H、L323K、L323N、L323P、L323Q、L323R、L323S、L323T、L323F、L323I、L323M、L323V、L323W、L323Y、Q324A、Q324C、Q324G、Q324P、Y325A、Y325C、Y325D、Y325E、Y325G、Y325H、Y325K、Y325N、Y325P、Y325Q、Y325R、Y325S、Y325T、Y325W、L326A、L326C、L326D、L326E、L326G、L326H、L326K、L326N、L326P、L326Q、L326R、L326S、L326T、L326F、L326I、L326M、L326V、L326W、L326Y、R327A、R327C、R327G、R327H、R327P、V328A、V328C、V328D、V328E、V328G、V328H、V328K、V328N、V328P、V328Q、V328R、V328S、V328T、V328F、V328I、V328M、V328W、V328Y、L330A、L330C、L330D、L330E、L330G、L330H、L330K、L330N、L330P、L330Q、L330R、L330S、L330T、L330F、L330I、L330V、L330W、L330Y、V331A、V331C、V331D、V331E、V331G、V331H、V331K、V331N、V331P、V331Q、V331R、V331S、V331T、V331F、V331I、V331M、V331W、V331Y、D332A、D332C、D332G、D332P、R333A、R333C、R333D、R333E、R333G、R333H、R333N、R333P、R333Q、R333R、R333S、R333T、A334C、A334D、A334E、A334G、A334H、A334K、A334N、A334P、A334Q、A334R、A334S、A334T、T335A、T335C、T335G、T335P、C336D、C336E、C336H、C336K、C336N、C336P、C336Q、C336R、C336S、C336T、L337A、L337C、L337D、L337E、L337G、L337H、L337K、L337N、L337P、L337Q、L337R、L337S、L337T、R338A、R338C、R338G、R338P、S339P、S339T、K341A、K341C、K341G、K341P、F342A、F342C、F342D、F342E、F342G、F342H、F342K、F342N、F342P、F342Q、F342R、F342S、F342T、F342M、F342W、T343A、T343C、T343G、T343P、I344A、I344C、I344D、I344E、I344G、I344H、I344K、I344N、I344P、I344Q、I344R、I344S、I344T、Y345A、Y345C、Y345D、Y345E、Y345G、Y345H、Y345K、Y345N、Y345P、Y345Q、Y345R、Y345S、Y345T、Y345M、Y345W、N346A、N346C、N346G、N346P、N347H、N347P、M348A、M348C、M348D、M348E、M348G、M348H、M348K、M348N、M348P、M348Q、M348R、M348S、M348T、F349A、F349C、F349D、F349E、F349G、F349H、F349K、F349N、F349P、F349Q、F349R、F349S、F349T、F349I、F349M、F349W、F349Y、C350D、C350H、C350P、C350T、A351E、A351H、A351N、A351P、A351Q、A351R、A351S、A351T、G352A、G352C、G352P、F353A、F353C、F353D、F353E、F353G、F353H、F353K、F353N、F353P、F353Q、F353R、F353S、F353T、F353I、F353M、F353W、H354A、H354C、H354G、H354P、E355A、E355C、E355D、E355G、E355H、E355K、E355N、E355P、E355Q、E355S、E355T、G356D、G356E、G356H、G356K、G356N、G356P、G356Q、G356R、G356S、G356T、G357D、G357E、G357H、G357K、G357N、G357P、G357Q、G357R、G357S、G357T、R358D、R358E、R358H、R358K、R358N、R358P、R358Q、R358R、R358S、R358T、D359A、D359C、D359G、D359P、D359Q、D359S、D359T、S360A、S360C、S360G、S360P、C361D、C361E、C361H、C361K、C361N、C361P、C361Q、C361R、C361S、C361T、V370A、V370C、V370D、V370E、V370G、V370H、V370K、V370N、V370P、V370Q、V370R、V370S、V370T、V370W、V370Y、V373A、V373C、V373D、V373E、V373G、V373H、V373K、V373N、V373P、V373Q、V373R、V373S、V373T、V373F、V373I、V373M、V373W、E374A、E374C、E374G、E374P、G375H、S377A、S377C、S377G、S377P、F378A、F378C、F378D、F378E、F378G、F378H、F378K、F378N、F378P、F378Q、F378R、F378S、F378T、F378W、L379A、L379C、L379D、L379E、L379G、L379H、L379K、L379N、L379P、L379Q、L379R、L379S、L379T、L379I、L379M、L379W、L379Y、T380A、T380C、T380G、T380P、G381D、G381E、G381H、G381K、G381N、G381P、G381Q、G381R、G381S、G381T、I382A、I382C、I382D、I382E、I382G、I382H、I382K、I382N、I382P、I382Q、I382R、I382S、I382T、I382M、I382W、I382Y、I383A、I383C、I383D、I383E、I383G、I383H、I383K、I383N、I383P、I383Q、I383R、I383S、I383T、S384A、S384C、S384G、S384P、W385A、W385C、W385D、W385E、W385G、W385H、W385K、W385N、W385P、W385Q、W385R、W385S、W385T、W385M、E387A、E387C、E387G、E387H、E387P、E387T、E388H、E388N、E388P、E388Q、E388T、A390C、A390D、A390E、A390G、A390H、A390K、A390N、A390P、A390Q、A390R、A390S、M391A、M391C、M391D、M391E、M391G、M391H、M391K、M391N、M391P、M391Q、M391R、M391S、M391T、M391F、M391I、M391W、M391Y、K392A、K392C、K392G、K392P、G393C、G393D、G393E、G393H、G393K、G393N、G393P、G393Q、G393R、G393S、G393T、Y395A、Y395C、Y395D、Y395E、Y395G、Y395H、Y395K、Y395N、Y395P、Y395Q、Y395R、Y395S、Y395T、Y398A、Y398C、Y398D、Y398E、Y398G、Y398H、Y398K、Y398N、Y398P、Y398Q、Y398R、Y398S、Y398T、K400H、V401A、V401C、V401D、V401E、V401G、V401H、V401K、V401N、V401P、V401Q、V401R、V401S、V401T、V401F、V401I、V401M、V401W、V401Y、S402A、S402C、S402G、S402P、R403A、R403C、R403G、R403P、R403T、Y404A、Y404C、Y404D、Y404E、Y404G、Y404H、Y404K、Y404N、Y404P、Y404Q、Y404R、Y404S、Y404T、V405A、V405C、V405D、V405E、V405G、V405H、V405K、V405N、V405P、V405Q、V405R、V405S、V405T、V405W、V405Y、N406F、N406H、N406I、N406L、N406P、N406W、N406Y、W407D、W407E、W407F、W407H、W407I、W407K、W407N、W407P、W407Q、W407R、W407S、W407T、W407Y、I408D、I408E、I408H、I408K、I408N、I408P、I408Q、I408R、I408S、I408T、K409F、K409H、K409I、K409P、K409T、K409V、K409W、K409Y、E410H、K411A、K411C、K411G、K411I、K411P、K411T、K411V、K411W、K411YまたはK413Tに対応する任意の１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。
【０３２５】
ｇ．例示的な組合せの修飾
未修飾ＦＩＸポリペプチドの１つまたは複数の特性または活性に影響を及ぼすように設計される２つ以上の修飾を有する修飾ＦＩＸポリペプチドが、本明細書において提供される。いくつかの例では、２つまたはそれ以上の修飾が、ＦＩＸポリペプチドの２つまたはそれ以上の特性または活性を改変する。修飾は、１つまたは複数のグリコシル化、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンに対する抵抗性、ヘパリンに対する抵抗性、触媒活性、ＬＲＰへの結合、内因活性、リン脂質結合および／または親和性、プロテアーゼに対する抵抗性、半減期、ならびにＦＶＩＩＩａおよびＦＸなどのような他の因子または分子との相互作用が改変されるように、ＦＩＸポリペプチドに対してなすことができる。典型的に、２つまたはそれ以上の修飾は、結果として生じる修飾ＦＩＸポリペプチドが、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、血液凝固活性の増加、血液凝固活性の持続時間の増加、および／または治療指数の増強を有するように、組み合わせられる。修飾は、アミノ酸交換、アミノ酸挿入、またはアミノ酸欠失を含むことができる。２つまたはそれ以上の修飾を含有する修飾ＦＩＸポリペプチドの血液凝固活性の増加、血液凝固活性の持続時間の増加、および／または治療指数の増強は、出発ＦＩＸａポリペプチドまたは未修飾ＦＩＸａポリペプチドの活性と比較して、少なくともまたは少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上まで増加させることができる。
【０３２６】
１つ、２つ、またはそれ以上の活性または特性を改変するために未修飾ＦＩＸポリペプチドの中に導入される、２つまたはそれ以上の修飾を含有する修飾ＦＩＸポリペプチドが、本明細書において提供される。修飾ＦＩＸポリペプチドは、２、３、４、５、６、またはそれ以上の修飾を含有することができる。たとえば、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、位置２０３に非天然グリコシル化部位を導入するための、アミノ酸交換Ｄ２０３ＮおよびＦ２０５Ｔなどのような、一次配列の中に非天然グリコシル化部位を組み込むことによる、グリコシル化を増加させるための修飾ならびにＲ３３８Ｅなどのような、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンに対する抵抗性を増加させるための修飾を含有することができる（残基は、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドに対応する）。
【０３２７】
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、もっぱら表３〜９において記載されるものから選択される２つ以上の修飾を有することができる。他の例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、２つ以上の修飾を含有し、１つまたは複数の修飾が、表３〜９において記載されるものから選択され、１つまたは複数の修飾が、たとえば当技術分野において記載される修飾などのような、表３〜９において記載されていないさらなる修飾である。いくつかの例では、１つまたは複数のさらなる修飾が、触媒活性の増加、阻害因子に対する抵抗性の増加、血小板およびリン脂質に対する親和性および／または結合の増加、プロテアーゼ抵抗性の増加、免疫原性の減少、ならびにＰＥＧ成分などのような成分へのコンジュゲーションを促進するものをもたらすものなどのような、上記、部Ｄ．３．ａ〜ｆにおいて記載されるものから選択することができる。
【０３２８】
非限定的な例示的な組合せの修飾は、表１０において提供される。これらの例示的な組合せの修飾は、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性の増加、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンに対する抵抗性の増加、ヘパリンに対する抵抗性の増加、触媒活性の増加、および改変されたグリコシル化を含むが、これらに限定されない、ＦＩＸポリペプチドの２つ以上の活性または特性を改変するように設計される、２つ以上の修飾を含む。そのような組合せの修飾を含有する修飾ＦＩＸポリペプチドは、血液凝固活性の増加、血液凝固活性の持続時間の増加、および／または治療指数の増強を有することができる。下記の表１０において、修飾ＦＩＸポリペプチドの例示的なアミノ酸配列が記載される配列識別子（配列番号）が同定される。
【０３２９】
表10.
【表１０−１】
0006027221.tif 000015
【表１０−２】
0006027221.tif 000016
【表１０−３】
0006027221.tif 000017
【表１０−４】
0006027221.tif 000018
【表１０−５】
0006027221.tif 000019
【表１０−６】
0006027221.tif 000020
【表１０−７】
0006027221.tif 000021
【表１０−８】
0006027221.tif 000022
【０３３０】
３．コンジュゲートおよび融合タンパク質
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、ポリマーなどのような、他のポリペプチドまたは他の成分に対してコンジュゲートするまたは融合することができる。いくつかの実例では、コンジュゲーションまたは融合は、血清半減期を増加させるために達成される。本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドを融合することができる例示的なポリペプチドは、血清アルブミン、Ｆｃ、ＦｃＲｎ、およびトランスフェリンを含むが、これらに限定されない［たとえばSheffield, W.P. et al., (2004) Br. J. Haematol. 126(4):565-73；米国特許出願公開第２００５０１４７６１８号；国際特許出願公開ＷＯ２００７１１２００５、およびＷＯ２００４１０１７４０を参照されたい］。
【０３３１】
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、デキストラン、ポリエチレングリコール（ペグ化（ＰＥＧ））、もしくはシアリル成分または天然ポリマーもしくは糖ポリマーなどのような他のそのようなポリマーなどのようなポリマーに対してコンジュゲートすることができる。一例では、ポリペプチドが、別記されるように、デキストランに対してコンジュゲートされる［Zambaux et al., (1998) J. Protein Chem. 17(3):279-84］。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体を共有結合する（コンジュゲートする）こと（つまり「ペグ化」）によって、ポリペプチドを修飾する様々な方法は、当技術分野において知られている（たとえばＵＳ２００６０１０４９６８、ＵＳ５６７２６６２、ＵＳ６７３７５０５、およびＵＳ２００４０２３５７３４を参照されたい）。ペグ化のための技術は、特殊なリンカーおよびカップリング化学作用（たとえばHarris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002を参照されたい）、単一のコンジュゲーション部位への複数のＰＥＧ成分の付加（分岐ＰＥＧの使用を介してなど；たとえばVeronese et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002を参照されたい）、部位特異的ペグ化および／またはモノペグ化（たとえばChapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999を参照されたい）、部位特異的酵素的ペグ化（たとえばSato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002を参照されたい）、ならびに糖ＰＥＧ化（米国特許出願公開第２００８００５０７７２号、第２００８０１４６４９４号、第２００８００５０７７２号、第２００８０１８７９５５号、および第２００８０２０６８０８号）を含むが、これらに限定されない。当技術分野において記載される方法および技術は、単一のタンパク質分子に付加された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体を有するタンパク質を産生することができる（たとえばＵ．Ｓ．２００６／０１０４９６８を参照されたい）。したがって、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、米国特許第５，９６９，０４０号、第５，６２１，０３９号、第６，４２３，８２６号、米国特許出願公開第２００３０２１１０９４号、第２００７０２５４８４０号、第２００８０１８８４１４号、第２００８０００４２２号、第２００８００５０７７２号、第２００８０１４６４９４号、第２００８００５０７７２号、第２００８０１８７９５５号、および第２００８０２０６８０８号、国際特許出願公開ＷＯ２００７１１２００５、ＷＯ２００７１３５１８２、ＷＯ２００８０８２６１３、ＷＯ２００８１１９８１５、ＷＯ２００８１１９８１５において記載されるいずれかなどのような、当技術分野において知られている任意の方法を使用して、糖ペグ化（ｇｌｙｃｏｐｅｇｙｌａｔｅ）を含めて、ペグ化することができる。
【０３３２】
いくつかの実例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、他の成分へのコンジュゲーションを促進するためのアミノ酸置換を含む。たとえば、システイン残基は、ポリマーへのコンジュゲーションを促進するためにＦＩＸポリペプチドの中に組み込むことができる。この目的のための例示的なアミノ酸置換修飾は、D47C、Q50C、S53C、L57C、I66C、N67C、S68C、E70C、W72C、P74C、K80C、L84C、V86C、N89C、I90C、K91C、R94C、K100C、N101C、S102C、A103C、D104C、N105C、K106C、V108C、E114C、R116C、E119C、N120C、Q121C、S123C、E125C、P129C、S138C、T140C、S141C、K142C、A146C、E147C、E162C、T163C、I164C、L165C、D166C、N167C、I168C、T169C、Q170C、S171C、T172C、Q173C、S174C、F175C、N176C、D177C、F178C、T179C、R180C、E185C、D186C、K188C、P189C、K201C、V202C、D203C、E224C、T225C、K228C、E239C、E240C、T241C、H243C、K247C、N249C、R252C、H257C、N260C、A261C、A262C、I263C、K265C、E277C、F314C、R318C、L321C、K341C、E372C、E374C、M391C、K392C、N406C、K413CおよびT415C（配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドに対応する）を含むが、これらに限定されない。
【０３３３】
Ｅ．ＦＩＸポリペプチドの産生
ＦＩＸのその修飾ＦＩＸポリペプチドまたはドメインを含むＦＩＸポリペプチドは、タンパク質精製および組換えタンパク質発現のための、当技術分野においてよく知られている方法によって得ることができる。所望の遺伝子をコードする核酸の同定のための、当業者に知られている任意の方法を使用することができる。当技術分野において利用可能な任意の方法は、細胞源または組織源などから、たとえば肝臓などからＦＩＸポリペプチドまたは他のビタミンＫポリペプチドをコードする完全長（つまり全コード領域を包含する）ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡクローンを得るために使用することができる。本明細書において記載される修飾ＦＩＸポリペプチドは、部位特異的突然変異誘発などによって操作することができる。
【０３３４】
ＦＩＸは、核酸分子のクローニングおよび単離について、当技術分野において知られている任意の利用可能な方法を使用してクローニングするまたは単離することができる。そのような方法は、核酸のＰＣＲ増幅ならびに核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体ベースのスクリーニング、および活性ベースのスクリーニングを含む、ライブラリーのスクリーニングを含む。
【０３３５】
たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を含む、核酸の増幅のための方法は、ＦＩＸポリペプチドをコードする核酸分子を単離するために使用することができる。核酸含有物質は、ＦＩＸコード核酸分子を単離することができる出発物質として使用することができる。たとえば、ＤＮＡ調製物およびｍＲＮＡ調製物、細胞抽出物、組織抽出物（たとえば、肝臓から）、流体試料（たとえば血液、血清、唾液）、健常および／または病気の対象に由来する試料は、増幅法において使用することができる。核酸ライブラリーもまた、出発物質の源として使用することができる。プライマーは、ＦＩＸコード分子を増幅するために設計することができる。たとえば、プライマーは、ＦＩＸが生成される発現配列に基づいて設計することができる。プライマーは、ＦＩＸアミノ酸配列の逆翻訳に基づいて設計することができる。増幅により生成される核酸分子は、配列を決定し、ＦＩＸポリペプチドをコードすることを確認することができる。
【０３３６】
ベクター、たとえばタンパク質発現ベクターまたはコアタンパク質コードＤＮＡ配列の増幅のために設計されたベクターの中に合成遺伝子をクローニングする目的で制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するリンカー配列を含む、さらなるヌクレオチド配列を、ＦＩＸコード核酸分子に結合することができる。さらに、機能的ＤＮＡエレメントを特定するさらなるヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩコード核酸分子に作動可能に連結することができる。そのような配列の例は、細胞内タンパク質発現を容易にするよう設計されたプロモーター配列およびタンパク質分泌を容易にするよう設計された分泌配列を含むが、これらに限定されない。タンパク質結合領域を特定する配列などのようなさらなるヌクレオチド配列もまた、ＦＩＸコード核酸分子に連結することができる。そのような領域は、特異的標的細胞の中へのＦＩＸの取り込みを容易にするまたは他の場合には合成遺伝子の薬物動態を増強させる配列を含むが、これらに限定されない。
【０３３７】
次いで、同定され、単離された核酸は、適切なクローニングベクターの中に挿入することができる。当技術分野において知られている多くのベクター宿主系を使用することができる。可能性として考えられるベクターは、プラスミドまたは修飾ウイルスを含むが、これらに限定されない、しかしベクター系は、使用される宿主細胞と適合性でなければならない。そのようなベクターは、ラムダ誘導体などのようなバクテリオファージまたはｐＢＲ３２２プラスミド誘導体もしくはｐＵＣプラスミド誘導体などのようなプラスミドまたはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を含むが、これらに限定されない。クローニングベクターの中への挿入は、たとえば、相補的付着末端を有するクローニングベクターの中にＤＮＡ断片をライゲーションすることによって達成することができる。挿入は、ＴＯＰＯクローニングベクターを使用して達成することができる（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。ＤＮＡを断片化するために使用される相補的制限部位が、クローニングベクター中に存在しない場合、ＤＮＡ分子の端は、酵素的に修飾することができる。その代わりに、所望される任意の部位は、ＤＮＡ末端上にヌクレオチド配列（リンカー）をライゲーションすることによって産生することができる；これらのライゲーションされたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的化学合成オリゴヌクレオチドを含有することができる。代替方法では、切断されたベクターおよびＦＩＸタンパク質遺伝子は、ホモポリマーテーリングによって修飾することができる。組換え分子は、たとえば形質転換、トランスフェクション、感染、電気穿孔、および超音波穿孔（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を介して宿主細胞の中に導入することができ、遺伝子配列の多くのコピーが、生成される。
【０３３８】
特定の実施形態では、単離ＦＩＸタンパク質遺伝子、ｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡ配列を組み込む組換えＤＮＡ分子を用いる宿主細胞の形質転換が、遺伝子の複数のコピーの生成を可能にする。したがって、遺伝子は、形質転換体を成長させ、形質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離し、必要な場合には単離組換えＤＮＡから、挿入された遺伝子を回収することによって、多量に得ることができる。
【０３３９】
１．ベクターおよび細胞
１つまたは複数のＦＩＸタンパク質の組換え発現のために、ＦＩＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列の全てまたは一部分を含有する核酸は、適切な発現ベクター、つまり、挿入タンパク質コード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有するベクターに挿入することができる。例示的なそのようなベクターは、たとえばｐＣＭＶなどのような任意の哺乳動物発現ベクターである。必要な転写シグナルおよび翻訳シグナルはまた、ＦＩＸ遺伝子についての天然プロモーターおよび／またはそれらのフランキング領域によって供給することもできる。
【０３４０】
ＦＩＸまたは修飾ＦＩＸをコードする核酸を含有するベクターもまた、提供される。ベクターを含有する細胞もまた、提供される。細胞は、真核細胞および原核細胞を含み、ベクターは、その中での使用に適した任意のベクターである。
【０３４１】
ベクターを含有する、内皮細胞を含む原核細胞および真核細胞が、提供される。そのような細胞は、細菌細胞、酵母細胞、菌類細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞を含む。細胞は、コードＦＩＸタンパク質が細胞によって発現される条件下で上記細胞を成長させ、かつ発現ＦＩＸタンパク質を回収することによって、ＦＩＸポリペプチドまたはその修飾ＦＩＸポリペプチドを産生するために使用される。本明細書における目的上、ＦＩＸは、培地の中に分泌させることができる。
【０３４２】
一実施形態では、ＦＩＸ活性を有し、ＦＩＸポリペプチドの全てもしくは一部分を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列またはその複数のコピーを含有するベクターが、提供される。ベクターは、細胞におけるＦＩＸポリペプチドもしくは修飾ＦＩＸポリペプチドの発現について選択することができるまたはＦＩＸタンパク質が、分泌タンパク質として発現されるように選択することができる。ＦＩＸが発現される場合、核酸は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−接合因子シグナル配列もしくはその部分などのような分泌シグナルまたは天然シグナル配列をコードする核酸に連結される。
【０３４３】
様々な宿主−ベクター系は、タンパク質コード配列を発現するために使用することができる。これらは、ウイルス（たとえばワクシニアウイルス、アデノウイルス、および他のウイルス）を用いて感染させた哺乳動物細胞株；ウイルス（たとえばバキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞株；酵母ベクターを含有する酵母などのような微生物；またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡを用いて形質転換された細菌を含むが、これらに限定されない。ベクターの発現エレメントは、それらの強度および特異性において変わる。使用される宿主−ベクター系に依存して、多くの適した転写エレメントおよび翻訳エレメントのいずれか１つを使用することができる。
【０３４４】
ベクターの中へのＤＮＡ断片の挿入について当業者らに知られている任意の方法が、適切な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列を含有するキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡおよび合成技術ならびにインビボ組換え体（遺伝的組換え）を含むことができる。ＦＩＸポリペプチドもしくは修飾ＦＩＸポリペプチドまたはそのドメイン、誘導体、断片、もしくは相同体のタンパク質をコードする核酸配列の発現は、遺伝子またはその断片が、（１つまたは複数の）組換えＤＮＡ分子を用いて形質転換された宿主において発現するように、第２の核酸配列によって調節することができる。たとえば、タンパク質の発現は、当技術分野において知られている任意のプロモーター／エンハンサーによって制御することができる。特定の実施形態では、プロモーターが、ＦＩＸタンパク質についての遺伝子に対して天然のものではない。使用することができるプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーター［Bernoist and Chambon, Nature 290:304-310 (1981)］、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復配列において含有されるプロモーター［Yamamoto et al. Cell 22:787-797 (1980)］、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター［Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981)］、メタロチオネイン遺伝子の調節配列［Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)］；β−ラクタマーゼプロモーター［Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543］またはｔａｃプロモーター［DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)］などのような原核生物発現ベクター；”Useful Proteins from Recombinant Bacteria”:Scientific American 242:79-94 (1980)）もまた参照されたい；ノパリン合成酵素プロモーター［Herrara-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1984)］またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター［Garder et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)］を含有する植物発現ベクターならびに光合成酵素リブロースビスリン酸カルボキシラーゼのプロモーター［Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984)］；Ｇａｌ４プロモーターなどのような酵母および他の菌類に由来するプロモーターエレメント、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、ならびに組織特異性を示し、トランスジェニック動物において使用されてきた以下の動物転写制御領域：膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域［Swift et al., Cell 38:639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)］；膵臓ベータ細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域［Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985)］、リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域［Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984);Adams et al., Nature 318:533-538 (1985);Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)］、精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞、および肥満細胞において活性なマウス乳癌ウイルス制御領域［Leder et al., Cell 45:485-495 (1986)］、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域［Pinckert et al., Genes and Devel. 1:268-276 (1987)］、肝臓において活性なアルファ−フェトプロテイン遺伝子制御領域［Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235:53-58 1987)］、肝臓中で活性なアルファ−１抗トリプシン遺伝子制御領域［Kelsey et al., Genes and Devel. 1:161-171 (1987)］、骨髄性細胞において活性なベータグロビン遺伝子制御領域［Magram et al., Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986)］、脳のオリゴデンドロサイト細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域［Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987)］、骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域［Shani, Nature 314:283-286 (1985)］および視床下部の性腺刺激細胞において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域［Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986)］を含むが、これらに限定されない。
【０３４５】
特定の実施形態では、ＦＩＸポリペプチドもしくは修飾ＦＩＸポリペプチドまたはそのドメイン、断片、誘導体、もしくは相同体をコードする核酸に作用可能に連結されるプロモーター、１つまたは複数の複製開始点、および所望により、１つまたは複数の選択マーカー（たとえば抗生物質抵抗性遺伝子）を含有するベクターが、使用される。ＦＩＸポリペプチドの発現のためのベクターおよび系は、よく知られているピキアベクター（たとえばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手可能）、特にコードタンパク質の分泌のために設計されるベクターを含む。哺乳動物細胞における発現のための例示的なプラスミドベクターは、たとえば、ｐＣＭＶを含む。イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の形質転換のための例示的なプラスミドベクターは、たとえば、ｐＱＥ発現ベクターを含む（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡから入手可能；系について記載する、Ｑｉａｇｅｎによって出版さる文献もまた参照されたい）。ｐＱＥベクターは、イー・コリにおける組換えタンパク質の、厳重に調節された、高度なレベルの発現を提供するためのファージＴ５プロモーター（イー・コリＲＮＡポリメラーゼにより認識される）および二重のｌａｃオペレーター抑圧モジュール、効率的な翻訳のための合成リボソーム結合部位（ＲＢＳＩＩ）、６ＸＨｉｓタグコード配列、ｔ０およびＴ１転写ターミネーター、ＣｏｌＥ１複製開始点、ならびにアンピシリン抵抗性を付与するためのベータ−ラクタマーゼ遺伝子を有する。ｐＱＥベクターは、組換えタンパク質のＮ−またはＣ−末端のいずれかに６ｘＨｉｓタグを置くことを可能にする。上記プラスミドは、３つの全てのリーディングフレームのためのマルチクローニングサイトを提供し、Ｎ−末端６×Ｈｉｓタグ付きタンパク質の発現を提供するｐＱＥ３２、ｐＱＥ３０、およびｐＱＥ３１を含む。イー・コリ細胞の形質転換のための他の例示的なプラスミドベクターは、たとえば、ｐＥＴ発現ベクターを含む（米国特許第４，９５２，４９６号を参照されたい；ＮＯＶＡＧＥＮ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能；系を記載する、Ｎｏｖａｇｅｎによって出版されている、文献もまた参照されたい）。そのようなプラスミドは、Ｔ７ｌａｃプロモーター、Ｔ７ターミネーター、誘発性イー・コリｌａｃオペレーター、およびｌａｃリプレッサー遺伝子を含有するｐＥＴ１１ａ；Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーター、およびイー・コリｏｍｐＴ分泌シグナルを含有するｐＥＴ１２ａ−ｃ；ならびにＨｉｓカラムを用いる精製において使用されるＨｉｓ−Ｔａｇ（商標）リーダー配列およびカラムでの精製の後での切断を可能にするトロンビン切断部位、Ｔ７−ｌａｃプロモーター領域、およびＴ７ターミネーターを含有するｐＥＴ１５ｂおよびｐＥＴ１９ｂ（ＮＯＶＡＧＥＮ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を含む。
【０３４６】
２．発現系
ＦＩＸポリペプチド（修飾および未修飾）は、たとえば、宿主細胞、宿主動物の中への、ＦＩＸをコードする核酸分子の導入およびインビトロにおける、ＦＩＸをコードする核酸分子からの発現などのような、インビトロおよびインビボにおける方法を含む、タンパク質産生のための、当技術分野において知られている任意の方法によって産生することができる。ＦＩＸおよび修飾ＦＩＸポリペプチドは、投与および処置に必要な、必要とされる量および形態のＦＩＸポリペプチドを産生するのに適した任意の生物において発現することができる。発現宿主は、イー・コリ、酵母、植物、昆虫細胞、ヒト細胞株およびトランスジェニック動物を含む哺乳動物細胞などのような原核生物および真核生物を含む。発現宿主は、タンパク質産生レベルおよび発現したタンパク質上に存在する翻訳後修飾の種類において異なり得る。発現宿主の選定は、これらの因子ならびに調節および安全性の考慮、産生コスト、ならびに精製の必要性および方法などのような他の因子に基づいてなすことができる。
【０３４７】
真核生物宿主における発現は、サッカロマイセス・セレビシエおよびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのような酵母、ショウジョウバエの細胞および鱗翅目の昆虫の細胞などのような昆虫細胞、タバコ、トウモロコシ、イネ、藻類、およびアオウキクサ属などのような植物および植物細胞における発現を含むことができる。発現のための真核細胞はまた、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞などのような哺乳動物細胞株をも含む。真核生物の発現宿主はまた、たとえば、血清、乳、および卵における産生を含む、トランスジェニック動物における産生を含む。野生型ＦＩＸポリペプチドの産生のためのトランスジェニック動物は、当技術分野において知られており（米国特許出願公開第２００２−０１６６１３０号および第２００４−０１３３９３０号）、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドの産生に適合し得る。
【０３４８】
ＦＩＸの発現のための、多くの発現ベクターが、入手可能であり、当業者に知られている。発現ベクターの選定は、宿主発現系の選定により影響を及ぼされる。そのような選択は、十分に、当業者の技術のレベルの範囲内にある。一般に、発現ベクターは、転写プロモーターならびに所望によりエンハンサー、翻訳シグナル、ならびに転写終結シグナルおよび翻訳終結シグナルを含むことができる。安定した形質転換に使用される発現ベクターは、形質転換細胞の選択および維持を可能にする選択マーカーを典型的に有する。いくつかの場合において、複製開始点は、細胞におけるベクターのコピー数を増幅させるために使用することができる。
【０３４９】
ＦＩＸまたは修飾ＦＩＸポリペプチドはまた、タンパク質融合物として利用するまたは発現することができる。たとえば、融合物は、ポリペプチドに対してさらなる機能性を追加するために生成することができる。融合タンパク質の例は、シグナル配列、局在化のためなどのようなタグ、たとえばｈｉｓ６タグもしくはｍｙｃタグまたは精製のためのタグ、たとえばＧＳＴ融合物、ならびにタンパク質分泌および／または膜結合を指示するための配列の融合物を含むが、これらに限定されない。
【０３５０】
一実施形態では、ＦＩＸポリペプチドまたは修飾ＦＩＸポリペプチドが、活性形態で発現することができ、それによって、活性化は、分泌の後に、ポリペプチド活性化第ＸＩ因子（ＦＸＩａ）のインキュベーションによって達成される。他の実施形態では、プロテアーゼは、不活性なチモーゲン形態で発現させることができる。
【０３５１】
ＦＩＸポリペプチドの産生の方法は、ＦＩＸポリペプチドの生成を助けることができる１つまたは複数のさらなる異種ポリペプチドの同時発現を含むことができる。たとえば、そのようなポリペプチドは、ＦＩＸポリペプチドの翻訳後プロセシングに寄与することができる。例示的なポリペプチドは、プロペプチド配列などのようなＦＩＸ前駆体配列の切断を助けるペプチダーゼ、たとえばグリコシル化、ヒドロキシル化、カルボキシル化、またはリン酸化によってなどのような、ＦＩＸポリペプチドの修飾に参加する酵素を含むが、これらに限定されない。ＦＩＸと同時発現することができる例示的なペプチダーゼは、ＰＡＣＥ／フューリン（またはＰＡＣＥ−ＳＯＬ）であり、これは、ＦＩＸプロペプチド配列の切断を助ける。ＦＩＸポリペプチドのカルボキシル化を助ける例示的なタンパク質は、ワルファリン感受性酵素ビタミンＫ  ２，３−エポキシドレダクターゼ（ＶＫＯＲ）であり、これは、ビタミンＫ依存性γ−カルボキシラーゼによる補因子としての利用のための還元ビタミンＫを産生する［Ｗａｊｉｈ  ｅｔ  ａｌ．,  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８０（３６）３１６０３−３１６０７］。この酵素のサブユニット、ＶＫＯＲＣ１は、γカルボキシル化を増加させるために、修飾ＦＩＸポリペプチドと同時発現させることができる。１つまたは複数のさらなるポリペプチドは、ＦＩＸポリペプチドと同じ発現ベクターまたは異なるベクターから発現させることができる。
【０３５２】
ａ．原核生物発現
原核生物（とりわけイー・コリ）は、大量のＦＩＸを産生するための系を提供する［たとえばPlatis et al. (2003) Protein Exp. Purif. 31(2): 222-30およびKhalilzadeh et al. (2004) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31(2): 63-69を参照されたい］。イー・コリの形質転換は、当業者らによく知られている単純で速い技術である。イー・コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）についての発現ベクターは、高度なレベルのタンパク質発現を誘発するのにおよび宿主細胞に対していくらかの毒性を示すタンパク質を発現するのに有用である誘発性プロモーターを含有することができる。誘発性プロモーターの例は、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７ＲＮＡプロモーターおよびＳＰ６ＲＮＡプロモーター、ならびに温度調節性λＰＬプロモーターを含む。
【０３５３】
ＦＩＸは、イー・コリの細胞質内環境において発現させることができる。細胞質は、還元環境であり、いくつかの分子については、これは、不溶性封入体の形成をもたらし得る。ジチオトレイトールおよびβ−メルカプトエタノールなどのような還元剤ならびに変性剤（たとえばグアニジン−ＨＣｌおよび尿素など）は、タンパク質を再可溶化するために使用することができる。代替アプローチは、酸化環境ならびにシャペロニン様イソメラーゼおよびジスルフィドイソメラーゼを提供し、可溶性タンパク質の産生に至る、細菌の細胞膜周辺腔におけるＦＩＸの発現である。典型的に、タンパク質を周辺質に向けるリーダー配列は、発現されることとなるタンパク質に融合される。次いで、リーダーは、周辺質の内部で、シグナルペプチターゼによって除去される。周辺質標的リーダー配列の例は、ペクチン酸リアーゼ遺伝子に由来するｐｅｌＢリーダーおよびアルカリホスファターゼ遺伝子に由来するリーダーを含む。いくつかの場合において、周辺質の発現は、培地の中への発現タンパク質の漏出を可能にする。タンパク質の分泌は、培養上清からの速やかで単純な精製を可能にする。分泌されないタンパク質は、周辺質から浸透圧溶解により得ることができる。細胞質内発現に類似して、いくつかの場合において、タンパク質は、不溶性になり得、変性剤および還元剤は、可溶化および再折り畳みを容易にするために使用することができる。誘発および成長の温度もまた、発現レベルおよび溶解性に影響を及ぼし得る。典型的に、２５℃および３７℃の間の温度が、使用される。突然変異もまた、発現タンパク質の溶解性を増加させるために使用することができる。典型的に、細菌は、非グリコシル化タンパク質を産生する。したがって、本明細書において提供される、高度にグリコシル化されたＦＩＸポリペプチドの産生のために、グリコシル化は、宿主細胞からの精製の後にインビトロにおいて追加することができる。
【０３５４】
ｂ．酵母
サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、およびピキア・パストリスなどのような酵母は、ＦＩＸのための有用な発現宿主である［たとえばSkoko et al. (2003) Biotechnol. Appl. Biochem. 38(Pt3):257-65を参照されたい］。酵母は、エピソーム複製ベクターを用いてまたは相同組換えによる、安定した染色体の統合によって形質転換することができる。典型的に、誘発性プロモーターは、遺伝子発現を調節するために使用される。そのようなプロモーターの例は、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７、およびＧＡＬ５ならびにＣＵＰ１などのようなメタロチオネインプロモーターを含む。発現ベクターは、形質転換ＤＮＡの選択および維持のために、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３、およびＵＲＡ３などのような選択マーカーを含むことが多い。酵母において発現されるタンパク質は、可溶性であることが多く、Ｂｉｐなどのようなシャペロニンおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの同時発現は、発現レベルおよび溶解性を改善することができる。さらに、酵母において発現されるタンパク質は、サッカロマイセス・セレビシエに由来する酵母接合型アルファ−因子分泌シグナルなどのような分泌シグナルペプチド融合物およびＡｇａ２ｐ接合接着受容体またはアークスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）グルコアミラーゼなどのような酵母細胞表面タンパク質との融合物を使用して、分泌のために指示され得る。プロテアーゼ切断部位（たとえばＫｅｘ−２プロテアーゼ）は、ポリペプチドが分泌経路を出る場合に、融合配列をポリペプチドから除去するよう操作することができる。酵母はまた、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフでのグリコシル化も可能である。
【０３５５】
ｃ．昆虫および昆虫細胞
特にバキュロウイルス発現系を使用する昆虫および昆虫細胞は、ＦＩＸまたはその修飾形態などのようなポリペプチドを発現するのに有用である［たとえばMuneta et al. (2003) J. Vet. Med. Sci. 65(2):219-23を参照されたい］。血リンパにおける発現を含む昆虫細胞および昆虫幼虫は、高レベルのタンパク質を発現し、高等真核生物によって使用されるほとんどの翻訳後修飾が可能である。バキュロウイルスは、安全性を改善し、真核生物の発現の調節性の問題を低下させる制限的な宿主範囲を有する。典型的に、発現ベクターは、高レベルの発現のために、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターなどのようなプロモーターを使用する。一般的に使用されるバキュロウイルス系は、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）およびカイコ核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）などのようなバキュロウイルスならびにヨトウガに由来するＳｆ９、シューダレティア・ユニプンクタ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）（Ａ７Ｓ）およびオオカバマダラ（ＤｐＮ１）などのような昆虫細胞株を含む。高度な発現のために、発現されることとなる分子のヌクレオチド配列は、ウイルスのポリヘドリン開始コドンのすぐ下流に融合される。哺乳動物分泌シグナルは、昆虫細胞において厳密に処理され、発現タンパク質を培地の中に分泌するために使用することができる。さらに、細胞株シューダレティア・ユニプンクタ（Ａ７Ｓ）およびオオカバマダラ（ＤｐＮ１）は、哺乳動物細胞株に類似するグリコシル化パターンを有するタンパク質を産生する。
【０３５６】
昆虫細胞における代替発現系は、安定して形質転換された細胞の使用である。Ｓｃｈｎｉｅｄｅｒ  ２（Ｓ２）およびＫｃ細胞（キイロショウジョウバエ）およびＣ７細胞（ヒトスジシマカ）などのような細胞株は、発現に使用することができる。ショウジョウバエメタロチオネインプロモーターは、カドミウムまたは銅を用いる重金属誘発の存在下で高度なレベルの発現を誘発するために使用することができる。発現ベクターは、ネオマイシンおよびヒグロマイシンなどのような選択マーカーの使用によって典型的に維持される。
【０３５７】
ｄ．哺乳動物細胞
哺乳動物発現系は、ＦＩＸポリペプチドを発現するために使用することができる。発現コンストラクトは、アデノウイルスなどのようなウイルス感染によってまたはリポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランなどのような直接的ＤＮＡ移入によってならびに電気穿孔および微量注射などのような物理的手段によって、哺乳動物細胞に移入することができる。哺乳動物細胞のための発現ベクターは、ｍＲＮＡキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列（Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）、およびポリアデニル化エレメントを典型的に含む。そのようなベクターは、高度なレベルの発現のための転写プロモーター−エンハンサー、たとえばＳＶ４０プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長末端反復配列を含むことが多い。これらのプロモーター−エンハンサーは、多くの細胞型において活性である。組織プロモーターおよび細胞型プロモーターならびにエンハンサー領域もまた、発現に使用することができる。例示的なプロモーター／エンハンサー領域は、エラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳癌ウイルス、アルブミン、アルファフェトプロテイン、アルファ１抗トリプシン、ベータグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖２、および生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御などのような遺伝子に由来するものを含むが、これらに限定されない。選択マーカーは、発現コンストラクトを有する細胞を選択し、維持するために使用することができる。選択マーカー遺伝子の例は、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、およびチミジンキナーゼを含むが、これらに限定されない。ＴＣＲ−ζおよびＦｃεＲＩ−γなどのような細胞表面シグナリング分子を有する融合物は、活性状態にあるタンパク質の、細胞表面上での発現を指示することができる。
【０３５８】
多くの細胞株は、哺乳動物発現に利用可能であり、マウス、ラット、ヒト、サル、およびニワトリならびにハムスターの細胞を含む。例示的な細胞株は、ＢＨＫ（つまりＢＨＫ−２１細胞）、２９３−Ｆ、ＣＨＯ、ＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  （ＣＨＯＸ；  Ｅｘｃｅｌｌｇｅｎｅ）、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳ０（非分泌）および他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマ細胞株およびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３Ｓ、２９３Ｔ、２Ｂ８、およびＨＫＢの細胞を含むが、これらに限定されない。細胞株はまた、分泌タンパク質の細胞培養液からの精製を容易にする無血清培地に適合させて利用可能である。１つのそのような例は、無血清ＥＢＮＡ−１細胞株である［Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42］。血漿由来ＦＩＸと類似する構造および翻訳後修飾を示す組換えＦＩＸポリペプチドの発現は、当技術分野において知られている。ビタミンＫ依存性タンパク質発現を最適化するための方法は、知られている。たとえば、培養液におけるビタミンＫの補足またはビタミンＫ依存性γ−カルボキシラーゼの同時発現［Wajih et al., J. Biol. Chem. 280(36)31603-31607］は、ＦＩＸポリペプチドなどのようなビタミンＫ依存性タンパク質の翻訳後修飾を助けることができる。
【０３５９】
ｅ．植物
トランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物は、ＦＩＸの発現に使用することができる。発現コンストラクトは、微粒子銃などのような直接的ＤＮＡ移入およびプロトプラストの中へのＰＥＧ媒介性移入を使用してならびにアグロバクテリウム媒介性形質転換を用いて、植物に典型的に移入される。発現ベクターは、プロモーター配列およびエンハンサー配列、転写終結エレメント、ならびに翻訳制御エレメントを含むことができる。発現ベクターおよび形質転換技術は、シロイヌナズナおよびタバコなどのような双子葉植物宿主ならびにトウモロコシおよびイネなどのような単子葉植物宿主の間で通常分けられる。発現に使用される植物プロモーターの例は、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボースビスリン酸カルボキシラーゼプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターおよびＵＢＱ３プロモーターを含む。ヒグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼ、およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどのような選択マーカーは、形質転換細胞の選択および維持を容易にするために使用されることが多い。形質転換植物細胞は、細胞、凝集体（カルス組織）として培養において維持することができる、または完全な植物に再生成させることができる。植物は、哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するので、これは、これらの宿主においてＦＩＸを産生するための選定に影響を及ぼし得る。トランスジェニック植物細胞はまた、タンパク質を産生するよう操作された藻類を含むこともできる［たとえばMayfield et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100:438-442を参照されたい］。植物は、哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するので、これは、これらの宿主においてＦＩＸを産生するための選定に影響を及ぼし得る。
【０３６０】
２．精製
宿主細胞に由来するＦＩＸポリペプチドの精製のための方法は、選定される宿主細胞および発現系に依存する。分泌分子については、タンパク質は、細胞を除去した後に培養液から一般に精製される。細胞内発現については、細胞を溶解させ、タンパク質を抽出物から精製することができる。トランスジェニック植物およびトランスジェニック動物などのようなトランスジェニック生物が、発現に使用される場合、組織または器官は、溶解した細胞抽出物を作製するために出発物質として使用することができる。さらに、トランスジェニック動物産生は、乳または卵におけるポリペプチドの産生を含むことができ、これは、収集することができ、必要であれば、さらに、タンパク質を抽出し、さらに、当技術分野における標準的な方法を使用して精製することができる。
【０３６１】
ＦＩＸは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ分画クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー、硫安塩析、キレートクロマトグラフィー、ならびにイオン交換クロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない、当技術分野において知られている標準的なタンパク質精製技術を使用して精製することができる。たとえば、ＦＩＸポリペプチドは、下記実施例１において記載されるようなアニオン交換クロマトグラフィーによって精製することができる。ＦＩＸポリペプチドを精製するための例示的な方法は、機能的Ｇｌａドメインを有する任意のポリペプチドの結合を可能にするイオン置換カラムの使用、その後に続く、カルシウムの存在下における溶出によるものである。アフィニティー精製技術もまた、調製の効率および純度を改善するために使用することができる。たとえば、ＦＩＸに結合する抗体、受容体、および他の分子を、アフィニティー精製において使用することができる。発現コンストラクトはまた、ｍｙｃエピトープ、ＧＳＴ融合物、またはＨｉｓ６などのようなアフィニティータグを追加するように操作し、タンパク質に対して、それぞれ、ｍｙｃ抗体、グルタチオン樹脂、およびＮｉ−樹脂を用いてアフィニティー精製することができる。純度は、ゲル電気泳動技術および染色技術ならびに分光光度計技術を含む、当技術分野において知られている任意の方法によって評価することができる。
【０３６２】
ＦＩＸポリペプチドは、発現させ、精製して、不活性形態（チモーゲン形態）とすることができるまたは、代わりに、発現プロテアーゼは、自己触媒などによって活性形態に精製することができる。たとえば、Ｒ１４５およびＲ１８０の後のタンパク質分解性の切断を介して活性化されたＦＩＸポリペプチドは、インビトロにおいて調製することができる（つまＦＩＸａ；二重鎖形態）。ＦＩＸポリペプチドは、最初に、哺乳動物細胞における産生、その後に続く精製を含むが、これらに限定されない、本明細書において記載される産生の方法のいずれかによって調製することができる。ＦＩＸポリペプチドの、活性プロテアーゼ形態、ＦＩＸａへの切断は、第ＸＩａ因子とのインキュベーションによって達成することができる。いくつかの例では、これが、カルシウムおよびリン脂質の存在下において実行される。
【０３６３】
３．融合タンパク質
修飾ＦＩＸポリペプチドおよび１つまたは複数の他のポリペプチドを含有する融合タンパク質もまた、提供される。適した経路による投与のために製剤されるそのような融合タンパク質を含有する医薬組成物が、提供される。融合タンパク質は、任意の順番で、修飾ＦＩＸポリペプチドならびに抗体またはその断片、成長因子、受容体、リガンド、および他のそのような作用物質などのような作用物質を連結することによって、ＦＩＸポリペプチドの精製を容易にする、ＦＩＸポリペプチドの薬力学的特性を、たとえば、標的細胞もしくは標的組織にポリペプチドを向けることによって改変する、および／またはＦＩＸポリペプチドの発現もしくは分泌を増加させる目的で、形成される。典型的に、任意のＦＩＸ融合タンパク質は、非融合ポリペプチドと比較して、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の血液凝固活性を含む、非融合ＦＩＸポリペプチドと比較して、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の血液凝固活性を保持する。
【０３６４】
ＦＩＸポリペプチドの、他のポリペプチドとの連結は、直接的にまたはリンカーを介して間接的に達成することができる。一例では、連結が、ヘテロ二官能性剤を介するなどのような化学的連結またはチオール連結または他のそのような連結によるものとすることができる。融合はまた、組換え手段によって達成することもできる。他のポリペプチドに対するＦＩＸポリペプチドの融合は、ＦＩＸポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に対するものとすることができる。本明細書中で提供されるＦＩＸポリペプチドを有する融合タンパク質において使用することができるポリペプチドの非限定的な例は、たとえば、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）ポリペプチド、免疫グロブリンＧに由来するＦｃドメイン、アルブミン、または異種シグナル配列を含む。融合タンパク質は、イー・コリマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）などのような、細胞によるタンパク質の取り込みを助ける、さらなる成分を含有することができる（国際ＰＣＴ出願ＷＯ０１／３２７１１を参照されたい）。
【０３６５】
融合タンパク質は、標準的な組換え技術によって産生することができる。たとえば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片は、従来の技術に従って、インフレームで、たとえば、ライゲーションのための平滑端または付着端の末端、適切な末端を提供するための制限酵素による消化、適宜、粘着端の補充、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処置、および酵素的ライゲーションを利用することによって、共にライゲーションすることができる。他の実施形態では、融合遺伝子が、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技術によって合成することができる。代わりに、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子断片の間の相補的オーバーハングを起こすアンカープライマーを使用して実行することができ、引き続いて、遺伝子断片をアニールし、再増幅させてキメラ遺伝子配列を生成することができる［たとえばAusubel et al. (eds.) Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley & Sons, 1992を参照されたい］。そのうえ、融合部分を既にコードしている多くの発現ベクターが、市販で入手可能である（たとえばＧＳＴポリペプチド）。ＦＩＸコード核酸は、融合部分がインフレームでプロテアーゼタンパク質に連結されるように、そのような発現ベクターの中にクローニングすることができる。
【０３６６】
４．ポリペプチド修飾
修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾（もしくは裸の）ポリペプチド鎖または翻訳後修飾ポリペプチドとして調製することができる。いくつかの適用のために、翻訳後修飾または他の化学的修飾を有していない「裸の」形態で修飾ＦＩＸを調製することは望ましいものとなり得る。裸のポリペプチド鎖は、翻訳後にＦＩＸを修飾しない適した宿主において調製することができる。そのようなポリペプチドはまた、インビトロ系において、化学的ポリペプチド合成を使用して調製することができる。他の適用のために、特定の修飾は、所望されるものとなり得る。特に、本明細書における目的のために、高度にグリコシル化されたＦＩＸポリペプチドを産生するための修飾ＦＩＸポリペプチドのグリコシル化は、好ましい。そのようなグリコシル化は、哺乳動物発現系などのような適切な発現系を使用してインビボにおいて、インビトロにおいて［たとえばMikami et al. (2006) J. Biotechnol. 127:65-78を参照されたい］、またはたとえば、ＦＩＸポリペプチドが原核細胞において発現され、酵素的グリコシル転移を使用してインビトロにおいてさらに修飾されるインビボおよびインビトロ方法の組合せで［たとえばSchwarz et al., (2010) Nature Chem. Biol. 6:264-266を参照されたい］実行することができる。さらに、ペグ化、アルブミン化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化、または他の知られている修飾が、所望され得る。修飾は、インビトロにおいてまたはたとえば、そのような修飾をもたらす、適した宿主において修飾ＦＩＸを産生することによってなすことができる。
【０３６７】
５．ヌクレオチド配列
ＦＩＸまたは修飾ＦＩＸポリペプチドをコードする核酸分子が、本明細書において提供される。核酸分子は、任意のコードＦＩＸポリペプチドの対立遺伝子変異体またはスプライス変異体を含む。本明細書において提供される例示的な核酸分子は、配列番号７５〜２７２のいずれかにおいて記載されるポリペプチドをコードするいずれかのものなど、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドをコードするいずれかのものである。一実施形態では、本明細書において提供される核酸分子が、少なくとも５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、または９９％の配列同一性を有するまたは中もしくは高ストリンジェンシーの条件下で、本明細書において提供されるＦＩＸポリペプチドをコードする完全長の任意の核酸の少なくとも７０％に沿ってハイブリダイズする。たとえば、本明細書において提供される核酸分子は、配列番号１において記載される核酸配列に対して、少なくともまたは少なくとも約５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、または９９％の配列同一性を有する。他の実施形態では、核酸分子が、本明細書において提供されるＦＩＸポリペプチドのいずれかをコードする縮重コドン配列を有するものを含むことができる。
【０３６８】
Ｆ．修飾ＦＩＸポリペプチド活性の評価
ＦＩＸポリペプチドの活性および特性は、インビトロにおいておよび／またはインビボにおいて評価することができる。そのような評価のためのアッセイは、当業者らに知られており、試験された活性および結果を、治療活性およびインビボ活性と相互に関連されることが知られている。一例では、ＦＩＸ変異体が、未修飾ＦＩＸおよび／または野生型ＦＩＸと比較して、評価することができる。そのようなアッセイは、ＦＶＩＩＩａ、リン脂質、および／またはカルシウムの存在下または非存在下において実行することができる。インビトロアッセイは、たとえば、凝固アッセイ、結合アッセイ、タンパク質アッセイ、および分子生物学アッセイを含む、細胞ベースのアッセイなどのような、当業者に知られている任意の検査アッセイを含む。インビボアッセイは、動物モデルにおけるＦＩＸアッセイおよびヒトに対する投与を含む。いくつかの場合において、ＦＩＸポリペプチドの活性は、アッセイ決定因子に対して、血液、血清、または他の体液を評価することによってインビボにおいて決定することができる。本明細書において提供されるものなどのようなＦＩＸ変異体もまた、治療効果などのような活性または特性を評価するためにインビボにおいて試験することができる。
【０３６９】
典型的に、本明細書において記載されるアッセイは、ＦＩＸの二重鎖活性化形態、つまりＦＩＸａに関してのものである。Ｒ１４５およびＲ１８０の後のタンパク質分解性の切断を介して活性化されたＦＩＸポリペプチドは、インビトロにおいて調製することができる。ＦＩＸポリペプチドは、最初に、哺乳動物細胞における産生、その後に続く精製を含むが、これらに限定されない、本明細書において記載される産生の方法のいずれかによって調製することができる。ＦＩＸポリペプチドの、ＦＩＸの活性プロテアーゼ形態への切断は、活性化第ＸＩ因子（ＦＸＩａ）とのインキュベーションによって達成することができる。活性化ポリペプチドは、本明細書において記載される、ＦＩＸ活性を測定するためのアッセイのいずれかにおいて使用することができる。そのようなアッセイはまた、単鎖チモーゲン形態を用いる実行することもできる。たとえば、単鎖チモーゲンＦＩＸポリペプチドは、そのような形態が、典型的に、ＦＩＸの血液凝固活性に必要とされるタンパク質分解活性または触媒活性を示さないので、陰性対照を提供することができる。さらに、そのようなアッセイはまた、ＦＩＸの活性を増大することができる、ＦＶＩＩＩａなどのような補因子ならびにリン脂質および／またはカルシウムなどのような他の分子の存在下において実行することができる。
【０３７０】
１．インビトロアッセイ
例示的なインビトロアッセイは、ポリペプチド修飾および活性を評価するためのアッセイを含む。修飾は、当技術分野において知られている、グリコシル化、γ−カルボキシル化、および他の翻訳後修飾を評価するインビトロアッセイ、タンパク質アッセイ、ならびにコンホメーションアッセイを使用して評価することができる。活性についてのアッセイは、ＦＶＩＩＩａおよび第Ｘ因子などのような他の凝固因子とのＦＩＸ相互作用の測定、ＦＩＸポリペプチドのタンパク質分解活性を決定するためのタンパク質分解アッセイ、ホスファチジルセリンおよび他のリン脂質に対するＦＩＸポリペプチドの結合性および／または親和性を決定するためのアッセイ、ならびに凝固に対するＦＩＸポリペプチドの効果を決定するための細胞ベースのアッセイを含むが、これらに限定されない。
【０３７１】
修飾ＦＩＸポリペプチドの濃度は、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；Ｂｒａｄｆｏｒｄ法、Ｌｏｗｒｙ法、ＢＣＡ法；ＵＶ吸光度、ならびにこれらに限定されないが、免疫学的方法、放射性の方法、蛍光性の方法、および関連する方法などのような他の定量化可能なタンパク質ラベル法を含むが、これらに限定されない、当技術分野においてよく知られている方法によって評価することができる。
【０３７２】
ＦＩＸポリペプチドの切断またはＦＩＸプロテアーゼ活性によって産生される産物を含む、タンパク質分解反応の切断産物の評価は、発色基質切断、ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学的検査、免疫沈降、ＮＨ２−末端配列決定、蛍光、およびタンパク質ラベル化を含むが、これらに限定されない方法を使用して実行することができる。
【０３７３】
修飾ＦＩＸポリペプチドの構造的特性もまた、評価することができる。たとえば、修飾ＦＩＸポリペプチドのＸ線結晶解析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、および低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏ−ＥＭ）は、ＦＩＸポリペプチドの３次元構造および／またはＣａ２＋結合性もしくは補因子結合性などのようなＦＩＸポリペプチドの他の特性を評価するために実行することができる。
【０３７４】
さらに、ＦＩＸ分解の存在および程度は、硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）および電気泳動にかけられたＦＩＸ含有試料のウェスタンブロッティングなどのような標準的な技術によって測定することができる。プロテアーゼに暴露されたＦＩＸポリペプチドはまた、修飾ＦＩＸポリペプチドの切断部位の場所または変化を決定するためにＮ−末端配列決定にかけることもできる。
【０３７５】
ａ．グリコシル化
ＦＩＸポリペプチドは、当技術分野においてよく知られている方法を使用して、グリコシル化の存在について評価することができる。ポリペプチドのグリコシル化は、高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー［Townsend et al., (1991) Glycobiology 1:139-147］または蛍光体支援炭水化物電気泳動（ＦＡＣＥ）［Kumar et al., (1996) Biotechnol. Appl. Biochem. 24:207-214.］、連続的なエキソグリコシダーゼ消化［Watzlawick et al., (1992) Biochemistry 31:12198-12203; Tyagarajan et al., (1996) Glycobiology, 6:83-93］、質量分析［Gillece-Castro et al., (1990) Meth. Enzymol. 193: 689-712;Duffin et al., (1992) Anal. Chem. 64:1440-1448;Papac et al., (1997) in Techniques in Glycobiology (Townsend R.R. and Hotchkiss A.T. eds.) Marcel Decker, Inc., New York, pp. 33-52;Fu et al., (1994) Carbohydr. Res. 261:173-186］、およびＮＭＲ［Fu et al., (1994) Carbohydr. Res. 261:173-186］などのような種々様々の方法を使用して、その酵素的にまたは化学的に放出された炭水化物プールから特徴づけることができる。
【０３７６】
たとえば、化学的放出は、無水ヒドラジンとのインキュベーションによって、糖タンパク質からＮ結合型グリカンおよびＯ結合型グリカンを放出するヒドラジン分解によって達成することができる。酵素的放出は、エンドグリコシダーゼであるペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）によって達成することができ、これは、もともとグリコシル化されているＡｓｎ残基をＡｓｐに加水分解しながら、ポリペプチドから、もとのままのほとんどの共通のＮ結合型炭水化物を取り出す。ＦＩＸポリペプチドのヒドラジン分解処置またはエンドグリコシダーゼ処置は、蛍光体ラベルまたは発色団ラベルを用いてタグを付けることができる還元末端を生成する。ラベルＦＩＸポリペプチドは、蛍光体支援炭水化物電気泳動（ＦＡＣＥ）によって分析することができる。グリカンに対する蛍光性タグはまた、ＨＰＬＣによる単糖分析、複雑なグリコシル化パターンのプロファイリングまたはフィンガープリンティングに使用することもできる。例示的なＨＰＬＣ方法は、親水性相互作用クロマトグラフィー、電子相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーを含む。例示的なグリカンプローブは、３−（アセチルアミノ）−６−アミノアクリジン（ＡＡ−Ａｃ）および２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）を含むが、これらに限定されない。炭水化物部分はまた、グリコシル化ＦＩＸポリペプチドを認識する特異的な抗体の使用を通して検出することができる。
【０３７７】
ある方法では、質量分析は、部位特異的な炭水化物異質性を評価するために使用される。これは、収集されたＨＰＬＣ画分のマトリックス支援レーザー脱離イオン化法質量分析［Sutton et al., (1994) Anal. Biochem. 218:34-46; Ploug et al., (1998) J. Biol. Chem. 273:13933-13943］またはエレクトロスプレーイオン化質量分析と直接的に接続された逆相ＨＰＬＣ（ＬＣ／ＥＳＩＭＳ）［たとえばHuddleston et al., (1993) Anal. Chem. 65:877-884; Medzihradsky et al., (2008) Methods Mol. Biol. 446:293-316を参照されたい］を含むことができる。一例では、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｃｙｓモチーフ内のアスパラギン残基などのような潜在的なＮ−グリコシル化部位でのグリコシル化が、ＬＣ／ＥＳＩＭＳによって評価される。ＦＩＸポリペプチドにおける潜在的なＮ−グリコシル化部位は、同定することができ、個々のペプチド上のこれらの部位を分離するタンパク質分解酵素を、選択することができる。次いで、消化混合物は、衝突活性化によって診断上の炭水化物イオンを生成する方法であるＬＣ／ＥＳＩＭＳによって分析される（３３）。たとえば、診断上の炭水化物イオンは、ｍ／ｚ  ２０４、２７４、および２９２、３６６、ならびに６５７に特徴的な非還元末端オキソニウムイオンを含み、これらは、それぞれ、Ｎ−アセチルヘキソサミン、ノイラミン（シアル）酸、ヘキソシル−Ｎ−アセチルヘキソサミン、およびシアリル−ヘキソシル−Ｎアセチルヘキソサミンの存在を示す。選択的なイオンモニタリング（ＳＩＭ）によるこれらのイオンの存在の同定に加えて、ＬＣ／ＥＳＩＭＳ方法はまた、分子量をも評価するためにペプチドを分析し、これは、どのペプチド、そのため、どの潜在的Ｎ−グリコシル化部位が炭水化物を含有するかを示すために使用することができる。
【０３７８】
ｂ．他の翻訳後修飾
ＦＩＸポリペプチドは、グリコシル化以外の翻訳後修飾の存在について評価することができる。そのようなアッセイは、当技術分野において知られており、ヒドロキシル化、硫酸化、リン酸化、およびカルボキシル化を測定するためのアッセイを含む。β−ヒドロキシル化を測定するための例示的なアッセイは、アルカリ性加水分解にかけられたＦＩＸポリペプチドの逆相ＨＰＬＣ分析を含む［Przysiecki et al. (1987) PNAS 84:7856-7860］。ＦＩＸポリペプチドのカルボキシル化およびγ−カルボキシル化は、他のビタミンＫ依存性ポリペプチドについて記載されるように、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）分析を用いるマススペクトロメトリーを使用して評価することができる［たとえばHarvey et al. J Biol Chem 278:8363-8369, Maun et al. Prot Sci 14:1171-1180を参照されたい］。プロペプチド（プロＦＩＸ）を含有するＦＩＸポリペプチドの、翻訳後γ−カルボキシレート修飾を担うカルボキシラーゼとの相互作用もまた、評価することができる。カルボキシラーゼの、フルオレセインラベルプロＦＩＸポリペプチドとのインキュベーションの後の解離定数（Ｋｄ）は、異方性によって結合カルボキシラーゼの量を決定することによって測定することができる［Lin et al. (2004) J Biol Chem 279:6560-6566］。カルボキシル化を測定するための他の例示的なアッセイは、アルカリ性加水分解にかけられたＦＩＸポリペプチドの逆相ＨＰＬＣ分析を含む［Przysiecki et al. (1987) PNAS 84:7856-7860］。
【０３７９】
リン酸化を測定するための例示的なアッセイは、ホスホセリンおよび／もしくはホスホチロシンアミノ酸残基に対するまたはセリンリン酸化ＦＩＸポリペプチドに対するリン酸化部位特異的抗体の使用を含む。ＦＩＸポリペプチドを産生する細胞の３２Ｐの代謝ラベル化もまた、リン酸化を評価するために使用することができ、ラベルＦＩＸポリペプチドは、精製し、放射性ホスフェートの組み込みについて分析することができる。チロシン硫酸化のための例示的なアッセイは、ＦＩＸポリペプチドを産生する細胞の３５Ｓラベル化を含む。そのような方法において、細胞は、３５Ｓ−Ｓ２ＳＯ４または３５Ｓメチオニンとインキュベートされ、３５Ｓの組み込みは、３５Ｓメチオニン試料に対する標準化によって決定される。
【０３８０】
ｃ．タンパク質分解活性
修飾ＦＩＸポリペプチドは、合成基質およびその天然基質、第Ｘ因子の両方に対するタンパク質分解活性について試験することができる。修飾ＦＩＸポリペプチド（ＦＩＸａ）の活性化形態は、アッセイにおいて典型的に使用される。ＣＨ３ＳＯ２−ＬＧＲ−ｐＮＡペプチドなどのような合成基質を使用するアッセイは、ＦＩＸａポリペプチドの酵素的切断活性を測定するために用いることができる。ＦＩＸａの存在下におけるＣＨ３ＳＯ２−ＬＧＲ−ｐＮＡの加水分解は、切断反応試料からのｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）の産生を評価することによって測定することができる。試料におけるｐＮＡの量は、４０５ｎｍでの試料の吸光度に比例し、したがって、ＦＩＸａ試料におけるタンパク質分解活性の程度を示す。ＦＩＸａ切断活性を評価するために使用することができるさらなる例示的な蛍光発生基質は、Ｍｅｓ−Ｄ−ＣＨＤ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ  ＦＩＸａ１０１４８）およびＨ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＰＨＧ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ  ＦＩＸａ３６８８）を含むが、これらに限定されず、切断は、ＡＭＣおよび蛍光発生エステル基質、４−メチルウンベリフェリルｐ’−グアニジノベンゾエート（ＭＵＧＢ）の放出によって評価され、切断は、４−メチルウンベリフェロン蛍光体（４−ＭＵ）の放出によって評価される（たとえば実施例３を参照されたい）。エチレングリコールなどのようなＦＩＸａ触媒活性を増強する分子は、そのようなアッセイにおいて用いることができる［Sturzebecher et al. (1997) FEBS Lett. (412) 295-300］。
【０３８１】
ＦＩＸａのタンパク質分解活性はまた、下記実施例４において記載されるように、活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）への第Ｘ因子（ＦＸ）の変換を測定することによって評価することができる。本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドを含むＦＩＸａポリペプチドは、ＦＶＩＩＩａ、リン脂質小胞（ホスファチジルセリンおよび／またはホスファチジルコリン）、ならびにＣａ２＋の存在下において、ＦＸポリペプチドとインキュベートすることができ、ＦＸａを産生するためのＦＸの切断は、Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ  ＦＸａ（ＣＨ３ＳＯ２−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）などのような蛍光発生基質またはＳ２２２２もしくはＳ２７６５（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｓ  ＡＢ、Ｍｏｌｎｄａｌ、Ｓｗｅｄｅｎ）などのような発色基質を使用してアッセイすることができ、これらは、ＦＸａによって特異的に切断される。
【０３８２】
ｄ．凝固活性
ＦＩＸポリペプチドは、当技術分野においてよく知られているアッセイを使用することによって凝固活性について試験することができる。たとえば、アッセイのいくつかは、２ステージ凝血アッセイ［Liebman et al., (1985) PNAS 82:3879-3883］；プロトロンビン時間アッセイ（ＰＴ、これは、外因性経路におけるＦＩＸａのＴＦ依存性活性を測定することができる）；ＰＴ試験の改良であるアッセイ；活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ、これは、ＦＩＸａのＴＦ非依存性活性を測定することができる）；活性化凝血時間（ＡＣＴ）；再石灰化活性化凝血時間；リー−ホワイト凝血時間；またはトロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）［Pusateri et al. (2005) Critical Care 9:S15-S24］を含むが、これらに限定されない。たとえば、修飾ＦＩＸポリペプチドの凝固活性は、ＰＴベースのアッセイによって決定することができ、ＦＩＸは、ＦＩＸ欠損血漿において希釈され、Ｄａｄｅ  ＢｅｈｒｉｎｇからのＩｎｎｏｖｉｎ（商標）として入手可能なものなどのようなプロトロンビン時間試薬（リン脂質およびカルシウムを有する組換えＴＦ）と混合される。血餅形成は、光学的に検出され、血餅までの時間は、決定され、ＦＩＸ欠損血漿のみに対して比較される。下記に記載されるものなどのような動物モデルにおけるインビボ凝固アッセイもまた、ＦＩＸポリペプチドの凝固活性を評価するために実行することができる。
【０３８３】
ｅ．他のタンパク質および分子への結合および／またはそれによる阻害
阻害アッセイは、たとえばアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）、ヘパリン、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体、ｐ−アミノベンズアミジン、セリンプロテアーゼ阻害因子、およびＦＩＸ特異的抗体などのようなＦＩＸ阻害因子に対する修飾ＦＩＸポリペプチドの抵抗性を測定するために使用することができる。他の阻害因子についての阻害の評価もまた、試験することができ、他のセリンプロテアーゼ阻害因子を含むが、これらに限定されない。阻害は、ＦＶＩＩＩａありおよび／またはなしでプレインキュベートされたＦＩＸポリペプチドとの阻害因子のインキュベーションによって評価することができる。次いで、ＦＩＸの活性は、上記に記載される、任意の１つまたは複数の活性アッセイまたは凝固アッセイを使用して測定することができ、阻害因子による阻害は、阻害因子とインキュベートされなかったＦＩＸポリペプチドの活性との、阻害因子とインキュベートされたＦＩＸポリペプチドの活性の比較によって評価することができる。たとえば、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンによる修飾ＦＩＸポリペプチドの阻害は、実施例５において記載されるように評価することができる。ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体による野生型ＦＩＸａまたはＦＩＸａ変異体の阻害は、ＦＩＸａとＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンをインキュベートし、小分子基質、メシル−Ｄ−ＣＨＧ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ  ＦＩＸａ；Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ）に対するＦＩＸａの触媒活性を測定することによって評価される。そのようなアッセイは、ＦＶＩＩＩａの存在下または非存在下において実行することができる。
【０３８４】
ＦＩＸポリペプチドは、他の凝固因子および阻害因子に対する結合について試験することができる。たとえば、ＦＶＩＩＩａなどのような補因子、ＦＸおよびＦＩＸなどのような基質、ならびにアンチトロンビンＩＩＩおよびヘパリンなどのような阻害因子とのＦＩＸの直接的なおよび間接的な相互作用は、免疫沈降、カラム精製、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、蛍光偏光（ＦＰ）、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、円二色性（ＣＤ）、タンパク質断片補足性アッセイ（ＰＣＡ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、光散乱、沈降平衡、小ゾーンゲル濾過クロマトグラフィー、ゲル遅延、ファーウェスタンブロッティング、蛍光偏光、ヒドロキシルラジカルタンパク質フットプリント、ファージディスプレー、および様々な２−ハイブリッド系を含むが、これらに限定されない、当技術分野において知られている任意の結合アッセイを使用して評価することができる。
【０３８５】
ｅ．リン脂質親和性
ホスファチジルセリン（ＰＳ）および他のリン脂質に対する修飾ＦＩＸポリペプチドの結合性および／または親和性は、当技術分野においてよく知られているアッセイを使用して決定することができる。高度に純粋なリン脂質[たとえば既知濃度のウシＰＳおよび卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）これは、Ｓｉｇｍａなどから入手可能である]は、有機溶媒において、小さな単層リン脂質小胞を調製するために使用することができる。これらのＰＳ／ＰＣ小胞へのＦＩＸポリペプチドの結合は、入射光に対する９０°での相対的な光散乱によって決定することができる。ＰＳ／ＰＣ単独でのおよびＰＳ／ＰＣ／ＦＩＸでの光散乱の強度は、解離定数を決定するために測定される［Harvey et al., (2003) J. Biol. Chem. 278:8363-8369］。ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサー機器でなどのような表面プラズマ共鳴もまた、リン脂質膜に対するＦＩＸポリペプチドの親和性を測定するために使用することができる［Sun et al., (2003) Blood 101:2277-2284］。
【０３８６】
２．非ヒト動物モデル
非ヒト動物モデルは、修飾ＦＩＸポリペプチドの活性および安定性を評価するために使用することができる。たとえば、非ヒト動物は、疾患または状態についてのモデルとして使用することができる。非ヒト動物は、疾患進行に対する効果をモニターするために、ＦＩＸ変異体の投与の前に、疾患および／または表現型誘導物質を注射することができる。遺伝モデルもまた、有用である。１つまたは複数の遺伝子の過剰発現、過小発現、またはノックアウトによって疾患または状態を模倣するマウスなどのような動物は、生成することができる。そのような動物は、当技術分野においてよく知られているトランスジェニック動物産生技術または天然に存在する突然変異株もしくは誘発突然変異株を使用することによって生成することができる。ＦＩＸと関連する疾患の有用な非ヒト動物モデルの例は、出血障害、特に血友病のモデルを含むが、これらに限定されない。これらの非ヒト動物モデルは、野生型ＦＩＸポリペプチドと比較して、ＦＩＸ変異体の活性をモニターするために使用することができる。
【０３８７】
動物モデルはまた、修飾ＦＩＸポリペプチドの安定性、半減期、クリアランス、ならびに他の薬物動態学的および薬力学的特性をモニターするために使用することもできる。そのようなアッセイは、修飾ＦＩＸポリペプチドを比較するのにならびにさらなる非ヒト動物試験およびヒト試験のための用量および用量レジメンを計算するのに有用である。たとえば修飾ＦＩＸポリペプチドは、マウスの尾部静脈の中に注射することができる。次いで、血液試料は、注射の後の時点で採取され（数分、数時間、および数日後など）、次いで、修飾ＦＩＸポリペプチドの薬物動態学的および薬力学的特性は、ＥＬＩＳＡまたはラジオイムノアッセイによって、ＦＩＸａ活性およびタンパク質濃度について特定の時点で血清または血漿をモニターすることなどによって評価される（たとえば実施例６を参照されたい）。血液試料はまた、ａＰＴＴアッセイなどのような方法において凝固活性について試験することができる（たとえば実施例６を参照されたい）。
【０３８８】
修飾ＦＩＸポリペプチドは、血友病のための動物モデルを使用して、治療有効性について試験することができる。非限定的な一例では、マウスなどのような動物モデルを、使用することができる。血友病のマウスモデルは、当技術分野において入手可能であり、ＦＩＸ欠損マウス（実施例７において利用されるものなど）および突然変異体ＦＩＸポリペプチドを発現するマウスを含み、修飾ＦＩＸポリペプチドを試験するために用いることができる［Wang et al., (1997) PNAS 94:11563-11566;Lin et al., (1997) Blood 90:3962-3966;Kundu et al., (1998) Blood 92: 168-174;Sabatino et al., (2004) Blood 104(9):2767-2774;およびJin et al., (2004) Blood 104:1733-1739；実施例７もまた、参照されたい］。
【０３８９】
ＦＩＸ欠乏症の他のモデルは、欠陥ＦＩＸを発現するまたは肝臓が切除された血友病のイヌを含む［Evans et al., (1989) PNAS 86:10095; Mauser et al., (1996) Blood 88:3451; and Kay et al., (1994) PNAS 91:2353-2357］。
【０３９０】
３．臨床アッセイ
多くのアッセイは、臨床的使用のためのＦＩＸの活性を評価するのに利用可能である。そのようなアッセイは、インビボにおける凝固、タンパク質安定性、および半減期の評価ならびに表現型アッセイを含むことができる。表現型アッセイおよびＦＩＸ処置の治療効果を評価するためのアッセイは、ＦＩＸの血中レベルの評価［たとえば、肥満度指数（ＢＭＩ）について修正するための、投与前のならびに第１の投与の後、最後の投与直後、および中間の時点を含む投与の後の時点の血清ＦＩＸの測定］、未修飾ＦＩＸおよび／もしくは野生型ＦＩＸまたは偽薬を用いて処置される対象と比較した、長い間にわたる症状の回復を含む、ＦＶＩＩ処置に対する表現型の応答を含む。ＦＩＸ活性を評価するための臨床アッセイの例は、Franchini et al., (2005) Thromb Haemost. 93(6):1027-1035;Shapiro et al., (2005) Blood 105(2):518-525;およびWhite et al., (1997) Thromb. Haemost. 78(1):261-265などにおいて見出すことができる。患者は、ルーチン的な投与もしくは反復投与のためのある期間にわたりまたは出血、外傷、もしくは手術手技などのような急性事象に応じた投与の後に定期的にモニターすることができる。
【０３９１】
Ｇ．製剤および投与
出血障害の処置における使用のための組成物は、本明細書において提供される。そのような組成物は、治療有効量の本明細書において記載される第ＩＸ因子ポリペプチドを含有する。有効濃度のＦＩＸポリペプチドまたは薬学的に許容可能なその誘導体は、全身投与、局所投与、または局所的投与のための適した医薬担体または医薬媒体と混合される。化合物は、選択される障害の処置に有効な量で含まれる。組成物における活性化合物の濃度は、活性化合物の吸収、不活性化、排泄率、投薬スケジュール、および投与される量ならびに当業者に知られている他の因子に依存するであろう。
【０３９２】
本明細書において提供される化合物の投与に適した医薬担体または医薬媒体は、当業者らに知られている任意のそのような担体を含み、投与の特定のモードに適したものとなる。治療有効量の本明細書において記載されるＦＩＸポリペプチドを含む医薬組成物は、投与の直前に、滅菌水などを用いて再構成される凍結乾燥粉末として提供することができる。
【０３９３】
１．製剤
修飾ＦＩＸを含有する医薬組成物は、選択される量のポリペプチドを、１つまたは複数の生理学的に許容可能な担体または賦形剤と混合することによって、任意の従来の様式において製剤することができる。担体または賦形剤の選択は、投与する医者の技術の範囲内にあり、多くのパラメーターに依存し得る。これらは、たとえば、投与のモード（すなわち、全身、経口、経鼻、経肺、局所的、局所、または任意の他のモード）および処置される障害を含む。本明細書において提供される医薬組成物は、単一投薬量（直接的）投与のためにまたは希釈もしくは他の修飾のために製剤することができる。製剤における化合物の濃度は、意図される処置に有効な、投与の際の量のデリバリーに有効である。典型的に、組成物は、単一投薬量の投与のために製剤される。組成物を製剤するために、化合物またはその混合物の重量分率は、処置される状態が軽減するまたは回復するような有効濃度で、選択される媒体において溶解される、懸濁される、分散される、または他の場合には混合される。
【０３９４】
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、二重鎖ＦＩＸａタンパク質として対象に対する投与のために製剤することができる。修飾ＦＩＸポリペプチドは、製剤前に、当技術分野において知られている任意の方法によって活性化することができる。たとえば、ＦＩＸは、ビーズ上に固定されたＦＸＩａなどのようなＦＸＩａとのインキュベーションによって活性化することができる。カルシウムは、修飾ＦＩＸａタンパク質の完全な活性化および正確な折り畳みを保証するためにこれらのプロセス中に含むことができる。本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドはまた、単鎖タンパク質として投与のために製剤することもできる。本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、単鎖形態および二重鎖形態が、自己活性化を排除するまたは制御するために、培地の適切な選択によって、任意の比において医薬組成物において含有されるように、製剤することができる。
【０３９５】
化合物は、微粒子化された形態もしくは他の適した形態で懸濁させることができるまたはより可溶性の活性産物を産生するために誘導体化することができる。結果として生じる混合物の形態は、投与の意図されるモードおよび選択される担体または媒体における化合物の溶解性を含む、多くの因子に依存する。結果として生じる混合物は、溶液、懸濁液、乳濁液、および他のそのような混合物であり、非水性または水性の混合物、クリーム、ゲル、軟膏剤、乳剤、液剤、エリキシル剤、ローション、懸濁剤、チンキ剤、ペースト、泡、エアロゾル、灌注剤、スプレー剤、坐剤、包帯、または全身投与、局所投与、もしくは局所的投与に適している任意の他の製剤として製剤することができる。筋肉内投与、非経口投与、または関節内投与などのような局所的内部投与については、ポリペプチドは、等張緩衝生理食塩水などのような水性ベースの培地において溶液懸濁剤として製剤することができるまたは内部投与のために意図される生体適合性支持体もしくは生体接着性のものと組み合わせられる。有効濃度は、標的とされる状態を回復させるのに十分であり、経験的に決定することができる。組成物を製剤するために、化合物の重量分率は、標的とされる状態が軽減するまたは回復するような有効濃度で、選択される媒体において溶解される、懸濁される、分散される、または他の場合には混合される。
【０３９６】
一般に、薬学的に許容可能な組成物は、規制当局に対する承認を考慮して調製され、他のものは、動物およびヒトにおける使用のための、一般に承認される薬局方に従って調製される。医薬組成物は、アイソフォームが共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体などのような担体を含むことができる。そのような医薬担体は、落花生油、ダイズ油、鉱油、およびゴマ油などのような、石油起源、動物起源、野菜起源、または合成起源のものを含む、水および油などのような、滅菌した液体とすることができる。医薬組成物が静脈内に投与される場合、水は、典型的な担体となる。食塩水ならびに水性デキストロース溶液および水性グリセロール溶液は、特に注射可能な溶液のための、液体担体として利用することができる。組成物は、有効成分と共に、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、またはカルボキシメチルセルロースなどのような希釈剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、および滑石などのような滑沢剤；ならびにデンプン、アラビアゴムなどのような天然ゴム、ゼラチン、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリジン、セルロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドン、ならびに当業者らに知られている他のそのような結合剤などのような結合剤を含有することができる。適した医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、石粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノールを含む。組成物はまた、望ましい場合、少数の量の湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤、たとえばアセテート、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレアート、および他のそのような作用物質を含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、および徐放性製剤の形態をとることができる。治療化合物およびラクトースまたはデンプンなどのような、適した粉末ベースの粉末ミックスを含有する、たとえば、吸入器または注入器における使用のためのゼラチンのカプセル剤およびカートリッジは、製剤することができる。組成物は、伝統的な結合剤およびトリグリセリドなどのような担体と共に坐剤として製剤することができる。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、および他のそのような作用物質などのような、標準的な担体を含むことができる。経口投与のための調製物もまた、ボーマン−バーク阻害因子、コンジュゲーションボーマン−バーク阻害因子、アプロチニン、およびカモスタットなどのようなプロテアーゼ阻害因子と共に適切に製剤することができる。適した医薬担体の例は、E. W. Martinによる「Remington’s Pharmaceutical Sciences」において記載される。そのような組成物は、対象または患者への適切な投与のための形態を提供するために、適した量の担体と共に、一般に精製形態において、治療有効量の化合物を含有す��であろう。
【０３９７】
製剤は、投与のモードに適するはずである。たとえば、修飾ＦＩＸは、注射による（たとえばボーラス注射または継続注入による）非経口投与のために製剤することができる。注射可能な組成物は、油性媒体または水性媒体において、懸濁剤、液剤、または乳剤としてそのような形態をとることができる。滅菌した注射可能な調製物はまた、たとえば１，４−ブタンジオールにおける液剤として、無毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶剤における、滅菌した注射可能な液剤または懸濁剤とすることができる。滅菌した不揮発性油は、溶剤または懸濁媒として慣習的に利用される。この目的のために、合成モノグリセリドもしくは合成ジグリセリド、脂肪酸（オレイン酸を含む）、ゴマ油、やし油、落花生油、綿実油、および他の油のような天然に存在する植物油、またはオレイン酸エチルのような合成脂肪性媒体を含むが、これらに限定されない任意の無刺激の不揮発性油を、利用することができる。緩衝液、保存剤、酸化防止剤、および適した成分は、必要に応じて組み込むことができるまたはその代わりに、製剤を含むことができる。
【０３９８】
ポリペプチドは、組成物におけるただ一つの薬学的に活性な成分として製剤することができる、または他の活性成分と組み合わせることができる。ポリペプチドは、抗体などのような標的作用物質へのコンジュゲーションなどによって、デリバリーのために標的にすることができる。組織標的リポソームを含むリポソーム懸濁剤もまた、薬学的に許容可能な担体として適し得る。これらは、当業者らに知られている方法に従って調製することができる。たとえば、リポソーム製剤は、米国特許第４，５２２，８１１号において記載されるように調製することができる。リポソームデリバリーはまた、徐放性製剤を含むこともでき、フィブロネクチンを用いて修飾される、コラーゲンゲルおよびリポソームなどのような医薬マトリックスを含む［たとえばWeiner et al., (1985) J. Pharm. Sci. 74(9):922-5を参照されたい］。本明細書において提供される組成物は、これらに限定されないが、不活性担体またはコロイド分散系などのような、デリバリーを容易にする１つまたは複数のアジュバントをさらに含有することができる。そのような不活性担体の代表的で非限定的な例は、水、イソプロピルアルコール、ガス状フルオロカーボン、エチルアルコール、ポリビニルピロリドン、プロピレングリコール、ゲル産生物質、ステアリルアルコール、ステアリン酸、鯨ろう、ソルビタンモノオレアート、メチルセルロース、およびその２つまたはそれ以上の適した組合せから選択することができる。
【０３９９】
活性化合物は、処置される対象に対して望ましくない副作用の非存在下において、薬学的に許容可能な担体において、治療的に有用な効果を発揮するのに十分な量で含まれる。治療有効濃度は、本明細書において提供されるアッセイなどのような知られているインビトロ系およびインビボ系において化合物を試験することによって経験的に決定することができる。
【０４００】
ａ．投薬量
投与される治療剤の正確な量または用量は、特定のＦＩＸポリペプチド、投与の経路、ならびにその疾患の重症度ならびに対象の体重および全身状態などのような他の考慮に依存する。治療剤の局所的濃度が、いくつかの場合において、全身投与に際して安全性を伴って達成することができるものよりも、局所的投与の後に、高いものとなり得るが、治療剤の局所的投与は、典型的に、全身投与のあらゆるモードよりも低い用量を必要とするであろう。必要であれば、特定の投薬量および持続時間ならびに処置プロトコールは、経験的に決定するまたは推定することができる。たとえば、組換えＦＩＸポリペプチドおよび天然ＦＩＸポリペプチドの例示的な用量は、適切な投薬量を決定するための出発点として使用することができる。たとえば、ｒＦＩＸａに活性化された組換えＦＩＸ（ｒＦＩＸａ）ポリペプチド、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）第ＩＸ因子は、様々な用量で、出血の処置のためにならびに予防的および手術背景において、血友病Ｂを有する患者に投与されてきた。組換えＦＩＸを用いる処置の投薬量および持続時間は、第ＩＸ因子欠乏症の重症度、出血の位置および程度、ならびに患者の臨床状態、年齢、および第ＩＸ因子の回収率に依存する。たとえば重症の血友病Ｂを有する患者（＜１ＩＵ／ｄＬのＦＩＸ活性；正常活性の１％（１ＩＵは、１ｍＬの正常なプールされた血漿における第ＩＸ因子の活性に相当する）は、中程度の（１〜５ＩＵ／ｄＬのＦＩＸ活性；正常活性の１〜５％）または軽度の（＞５〜＜４０ＩＵ／ｍＬのＦＩＸ活性；正常活性の＞５〜＜４０％）血友病Ｂを有する患者よりも、ＦＩＸの注入をより必要とするであろう。ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）第ＩＸ因子の初回推定用量は、以下の式を使用して決定することができる：必要とされる単位＝体重（ｋｇ）×所望される第ＩＸ因子の増加（正常のＩＵ／ｄＬまたは％）×観察される回収率の逆数（ＩＵ／ｄＬ当たりのＩＵ／ｋｇ）。成人および小児（＜１５歳）患者による臨床研究において、１キログラムの体重当たりのＢｅｎｅＦＩＸの１ＩＵは、第ＩＸ因子の循環活性を以下のように増加させた：成人：０．８±０．２ＩＵ／ｄＬ［範囲０．４〜１．２ＩＵ／ｄＬ］；小児：０．７±０．３ＩＵ／ｄＬ［範囲０．２〜２．１ＩＵ／ｄＬ］。したがって、成人患者については：必要とされる第ＩＸ因子ＩＵの数（ＩＵ）＝体重（ｋｇ）×所望される第ＩＸ因子の増加（％またはＩＵ／ｄＬ）×１．３（ＩＵ／ｄＬ当たりのＩＵ／ｋｇ）および小児患者については：必要とされる第ＩＸ因子ＩＵの数（ＩＵ）＝体重（ｋｇ）×所望される第ＩＸ因子の増加（％またはＩＵ／ｄＬ）×１．４（ＩＵ／ｄＬ当たりのＩＵ／ｋｇ）。表１１は、様々な出血エピソードのために使用される典型的な投薬を記載する。
【０４０１】
表11.
【表１１】
0006027221.tif 000023
【０４０２】
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、天然組換えＦＩＸと比較して、低下した投薬量および／または低下した頻度で有効となり得る。たとえば、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、またはそれ以上などのような、それほど頻繁でない投薬間隔で投与することができる。他の例では、より少ない用量の修飾ＦＩＸポリペプチドを投与することができる。たとえば、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、凝固を達成するために一度だけ投与することができる。いくつかの実施形態では、修飾ＦＩＸの投薬量が、天然ＦＩＸと比較して低下する。たとえば、投薬量は、１ＩＵ／ｋｇ、２ＩＵ／ｋｇ、３ＩＵ／ｋｇ、４ＩＵ／ｋｇ、５ＩＵ／ｋｇ、６ＩＵ／ｋｇ、７ＩＵ／ｋｇ、８ＩＵ／ｋｇ、９ＩＵ／ｋｇ、１０ＩＵ／ｋｇ、２０ＩＵ／ｋｇ、３０ＩＵ／ｋｇ、４０ＩＵ／ｋｇもしくは５０ＩＵ／ｋｇ、６０ＩＵ／ｋｇ、７０ＩＵ／ｋｇ、８０ＩＵ／ｋｇ、９０ＩＵ／ｋｇ、または１００ＩＵ／ｋｇ未満またはそれくらいとすることができる。処置の用量、持続時間、および注射の間の間隔は、出血の重症度および処置に対する患者の応答に応じて変わるであろう、また、適宜、調整することができる。未修飾ＦＩＸと比較した、修飾ＦＩＸの活性のレベルおよび半減期などのような因子は、投薬量の決定をなす場合、考慮に入れることができる。特定の投薬量およびレジメンは、経験的に決定することができる。たとえば、未修飾ＦＩＸポリペプチドよりも長い半減期を示す修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドよりも低い用量および／または低い頻度で投与することができる。同様に、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、増加した血液凝固活性を示す修飾ＦＩＸポリペプチドを使用する、治療効果に必要とされる投薬量は、頻度および量を低下させることができる。特定の投薬量およびレジメンは、経験的に当業者によって決定することができる。
【０４０３】
ｂ．剤形
医薬品の治療的に活性な化合物およびその誘導体は、典型的に、単位剤形または複数回の剤形で製剤され、投与される。製剤は、適した量の化合物または薬学的に許容可能なその誘導体を含有する、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒、滅菌した非経口液剤または非経口懸濁剤、経口液剤または懸濁剤、および油水乳剤を含むが、これらに限定されない剤形で、ヒトおよび動物に対する投与のために提供することができる。それぞれの単位用量は、必要とされる医薬担体、医薬媒体、または医薬希釈剤と関連して、望ましい治療効果をもたらすのに十分な所定の量の治療的に活性な化合物を含有する。単位用量形態の例は、アンプルおよびシリンジならびに個々に包装される錠剤またはカプセル剤を含む。いくつかの例では、単位用量が、投与前に再構成される凍結乾燥散剤として提供される。たとえば、ＦＩＸポリペプチドは、注射のための単一用量液剤を生成するために、適した液剤を用いて再構成される凍結乾燥散剤として提供することができる。いくつかの実施形態では、凍結乾燥散剤が、滅菌蒸留水を用いる再構成によって、緩衝液または食塩水におけるＦＩＸポリペプチドをもたらすように、ＦＩＸポリペプチドおよび塩などのような、さらなる構成成分を含有することができる。単位用量形態は、分割してまたはそれを複数にして投与することができる。複数用量形態は、分離した単位用量形態で投与されるように、単一の容器中に包装される複数の同一単位剤形である。複数用量形態の例は、バイアル、錠剤もしくはカプセル剤のボトル、またはパイントもしくはガロンのボトルを含む。したがって、複数用量形態は、包装において分離されない複数の単位用量である。
【０４０４】
２．修飾ＦＩＸポリペプチドの投与
本明細書において提供されるＦＩＸポリペプチド（つまり活性化合物）は、体液または他の組織試料などのような混合物をＦＩＸポリペプチドと接触させることによって、インビトロ、エクスビボ、またはインビボにおいて投与することができる。たとえば、エクスビボにおいて化合物を投与する場合、対象からの体液または組織試料は、たとえばバイパス機械におけるチューブまたはフィルターなどのようなチューブまたはフィルター上にコーティングされているＦＩＸポリペプチドと接触させることができる。インビボにおいて投与される場合、活性化合物は、液体形態、半液体形態、または固体形態において、任意の適切な経路によって、たとえば経口的に、経鼻的に、経肺で、非経口的に、静脈内に、皮内に、皮下に、関節内に、槽内に眼内に、脳室内に、鞘内に、筋肉内に、腹腔内に、気管内に、または局所におよびその任意の２つまたはそれ以上の任意の組合せによって、投与することができ、投与のそれぞれの経路に適した様式において製剤される。修飾ＦＩＸポリペプチドは、１回または２回、３回、４回、もしくは治療効果を達成するために必要とされる任意の回数などのように、１回よりも多く投与することができる。複数回の投与は、任意の経路または経路の組合せを介して達成することができ、１時間ごと、２時間ごと、３時間ごと、４時間ごとに、またはそれ以上で投与することができる。
【０４０５】
投与に最も適した経路は、処置されることとなる疾患状態、たとえば出血障害の場所に依存して変わるであろう。一般に、ＦＩＸポリペプチドは、約２〜５分間の投与（注入）時間と共に、静脈内ボーラス注射によって投与されるであろう。他の例では、ＦＩＸの望ましい血液レベルが、血漿レベルによって確かめられるように、活性剤の継続注入によって維持することができる。主治医は、毒性または骨髄、肝臓、もしくは腎臓の機能障害により、投薬量を下げるために、どのようにかついつ療法を終了させる、中断する、調整するかを知っているであろうということに留意されたい。反対に、主治医はまた、臨床応答が適当でない場合に、どのようにかついつ処置をより高度なレベルに調整するかをも知っているであろう（有毒な副作用防止する）。他の例では、出血障害の場所が、ＦＩＸ製剤が代替経路を介して投与されることを示してもよい。たとえば、脳の中への（たとえば脳室内）投与を含む局所的投与は、患者がこの領域における出血を経験している場合、実行されてもよい。同様に、関節における出血の処置のために、関節への治療剤の注射による局所的投与（つまり関節内手段、静脈内手段、または皮下手段）を利用することができる。他の例では、たとえば、クリーム、ゲル、もしくは軟膏剤として製剤された、皮膚への治療剤の局所投与または吸入によるまたは気管内の肺への投与が、出血がこれらのエリアに局在化している場合、適切であってもよい。
【０４０６】
修飾ＦＩＸポリペプチドが、デポー調製物として製剤される場合、長時間作用性製剤は、植え込み（たとえば皮下にもしくは筋肉内に）または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、たとえば、治療化合物は、適したポリマー物質もしくは疎水性物質（たとえば許容可能な油中の乳剤として）またはイオン置換樹脂と共にまたはわずかに可溶性の誘導体として、たとえばわずかに可溶性の塩として製剤することができる。
【０４０７】
組成物は、所望の場合、活性成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有することができる包装、キット、またはディスペンサーデバイスにおいて提供することができる。包装は、たとえば、ブリスターパック等の金属箔またはプラスチック箔を含有する。パックまたはディスペンサーデバイスは、投与のための説明書を添付することができる。活性剤を含有する組成物は、包装材料、本明細書において提供される作用物質、および作用物質が提供される障害を示すラベルを含有する製品として包装することができる。
【０４０８】
３．修飾ＦＩＸポリペプチドをコードする核酸の投与（遺伝子療法）
修飾ＦＩＸポリペプチドをコードする核酸分子および遺伝子療法に適したそれらをコードする発現ベクターの組成物もまた、提供される。タンパク質を送達するのではなく、全身的にもしくは他の経路などによりインビボにおいてまたはリンパ球を含む細胞の除去、その中への核酸の導入、および宿主もしくは適合性のあるレシピエントへの再導入などによりエクスビボにおいて核酸を投与することができる。
【０４０９】
修飾ＦＩＸポリペプチドは、核酸分子の発現によって細胞および組織に送達することができる。修飾ＦＩＸポリペプチドは、修飾ＦＩＸポリペプチドをコードする核酸分子として投与することができ、エクスビボ技術および直接的インビボ発現を含む。核酸は、当業者らに知られている任意の方法によって細胞および組織に送達することができる。単離核酸配列は、さらなる操作のためにベクターの中に組み込むことができる。本明細書において使用されるように、ベクター（またはプラスミド）は、その発現または複製のいずれかのために細胞の中に異種ＤＮＡを導入するために使用される別個のエレメントを指す。そのような媒体の選択および使用は、当業者の技術の範囲内に十分にある。
【０４１０】
コード核酸分子の発現による修飾ＦＩＸポリペプチドの投与のための方法は、組換えベクターの投与を含む。ベクターは、複製の起点の包含などによりエピソームのままとなるように設計することができるまたは細胞における染色体の中に統合するよう設計することができる。修飾ＦＩＸポリペプチドはまた、非ウイルス性ベクターを使用して、エクスビボ遺伝子発現療法において使用することができる。たとえば、細胞は、修飾ＦＩＸポリペプチドコード核酸をゲノムの場所の中に統合し、調節配列に作動可能に連結されるまたは結果として、それが、ゲノムの場所における調節配列に作動可能に連結されて配置されることなどによって、修飾ＦＩＸポリペプチドを発現するように操作することができる。次いで、そのような細胞は、処置を必要とする患者などのような対象に局所的にまたは全身的に投与することができる。
【０４１１】
ウイルス性ベクターは、たとえばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、および遺伝子療法のために設計される他のものを含み、利用することができる。ベクターは、エピソームのままとすることができるまたは処置される対象の染色体の中に統合することができる。修飾ＦＩＸポリペプチドは、ウイルスによって発現させることができ、修飾ＦＩＸゼポリペプチドは、処置を必要とする対象に投与される。遺伝子療法に適したウイルス性ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、および上記に述べられている他のものを含む。たとえば、アデノウイルス発現技術は、当技術分野においてよく知られており、アデノウイルス産生および投与方法もまた、よく知られている。アデノウイルス血清型は、たとえばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から利用可能である。アデノウイルスは、エクスビボにおいて使用することができる、たとえば、細胞は、処置を必要とする患者から単離され、修飾ＦＩＸポリペプチド発現アデノウイルスベクターを用いて形質導入される。適した培養期間の後、形質導入された細胞は、対象に局所的および／または全身的に投与される。代わりに、修飾ＦＩＸポリペプチド発現アデノウイルス粒子は、単離され、対象の疾患または状態を予防する、処置する、または回復させるために、治療有効量のデリバリーのために、薬学的に許容可能な担体において製剤される。典型的に、アデノウイルス粒子は、対象体重１キログラム当たり１個の粒子から１０１４個の粒子の範囲、一般に、対象体重１キログラム当たり１０６個または１０８個の粒子から１０１２個の粒子の間の用量で送達される。いくつかの場面において、細胞表面膜タンパク質もしくは標的細胞に特異的な抗体または標的細胞上の受容体に対するリガンドなどのような、細胞を標的にする作用物質と共に核酸源を提供することが望ましい。ＦＩＸはまた、デリバリーのために、特定の細胞型の中に向けることもできる。たとえば、ＦＩＸポリペプチドをコードするアデノウイルスベクターは、肝細胞などのような非分裂細胞における安定した発現に使用することができる［Margaritis et al. (2004) J Clin Invest 113:1025-1031］。他の例では、ＦＩＸポリペプチドをコードするウイルス性ベクターまたは非ウイルス性ベクターが、続くデリバリーのために、単離細胞の中に形質導入することができる。ＦＩＸの発現およびデリバリーのためのさらなる細胞型は、線維芽細胞および内皮細胞を含むが、これらに限定されない。
【０４１２】
核酸分子は、人工染色体および他の非ウイルス性ベクターの中に導入することができる。ＡＣＥＳなどのような人工染色体［Lindenbaum et al., (2004) Nucleic Acids Res. 32(21):e172を参照されたい］は、アイソフォームをコードし、発現するように操作することができる。手短かに言えば、哺乳動物人工染色体（ＭＡＣ）は、細胞の中に大きなペイロードの遺伝子情報を自律複製非統合方式において導入するための手段を提供する。ＭＡＣの中で特有に、哺乳動物サテライトＤＮＡベースの人工染色体発現（ＡＣＥ）は、異なる種の細胞株において再現性よくデノボ生成され、宿主細胞の染色体から容易に精製することができる。次いで、精製された哺乳動物ＡＣＥは、様々なレシピエント細胞株に再導入することができ、ＡＣＥは、長期間、選択圧の非存在下においてＡＣＥ系を使用して安定して維持される。このアプローチを使用して、１つまたは２つの遺伝子標的を特異的に積むことがＬＭＴＫ（−）およびＣＨＯ細胞中で達成された。
【０４１３】
修飾ＦＩＸポリペプチドをコードする核酸を導入する他の方法は、酵母における２工程遺伝子置換技術であり、酵母人工染色体（ＹＡＣ）においてクローニングされる完全アデノウイルスゲノム［Ａｄ２；Ketner et al. (1994) PNAS 91: 6186-6190］ならびにＹＡＣクローンにおける特異的な領域を標的とするためのアデノウイルス配列、関心のある遺伝子のための発現カセット、ならびにポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーを含有するプラスミドを用いて始まる。ＹＡＣは、より大きな遺伝子の組み込みを可能にするので、特に関心がある。このアプローチは、哺乳動物細胞または全動物に対する遺伝子移入のための、記載される修飾ＦＩＸポリペプチドのいずれかをコードする核酸を運ぶ、アデノウイルスベースのベクターの構築に使用することができる。
【０４１４】
核酸は、リポソームなどのような媒体にカプセル化するまたは細菌細胞、特に弱毒化された細菌などのような細胞の中に導入するまたはウイルス性ベクターの中に導入することができる。たとえば、リポソームが利用される場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、たとえば、特定の細胞型に対して向性のカプシドタンパク質またはその断片、サイクリングにおいて内部移行を起こすタンパク質に対する抗体、および細胞内局在化を標的にし、細胞内半減期を増強させるタンパク質が、ターゲティングのためにおよび／または取り込みを容易にするために使用することができる。
【０４１５】
エクスビボおよびインビボにおける方法については、修飾ＦＩＸポリペプチドをコードする核酸分子は、処置されることとなる、適したドナーまたは対象からの細胞の中に導入される。療法の目的のために核酸を導入することができる細胞は、たとえば、処置されることとなる疾患または状態に適切な任意の所望の利用可能な細胞型を含み、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などのような血球；様々な幹細胞または前駆細胞、特にたとえば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓、およびそれらの他の源から得られる幹細胞などのような造血幹細胞または造血前駆細胞を含むが、これらに限定されない。
【０４１６】
エクスビボ処置については、処置されることとなる対象と適合性のあるドナーに由来する細胞または処置されることとなる対象からの細胞は、除去され、核酸は、これらの単離細胞の中に導入され、修飾細胞は、対象に投与される。処置は、たとえば患者の中に植え込まれる多孔質膜内にカプセル化されるものなどのように、直接的投与を含む（たとえば、それぞれ、その全体が参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第４，８９２，５３８号および第５，２８３，１８７号を参照されたい）。インビトロにおける哺乳動物細胞の中への核酸の移入に適した技術は、リポソームならびにカチオン脂質（たとえばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、およびＤＣ−Ｃｈｏｌ）の使用、電気穿孔法、微量注射法、細胞融合法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、ならびにリン酸カルシウム沈降法を含む。ＤＮＡデリバリーの方法は、インビボにおいて修飾ＦＩＸポリペプチドを発現させるために使用することができる。そのような方法は、電気穿孔、超音波、およびリン酸カルシウムデリバリーの使用などのように、局所的および全身的なデリバリーを含む、核酸のリポソームデリバリーおよび裸のＤＮＡのデリバリーを含む。他の技術は、微量注射、細胞融合、染色体媒介性遺伝子移入、ミクロセル媒介性遺伝子移入、およびスフェロプラスト融合を含む。
【０４１７】
修飾ＦＩＸポリペプチドのインビボ発現は、さらなる分子の発現に連結させることができる。たとえば、修飾ＦＩＸポリペプチドの発現は、操作されたウイルスなどにおいて、細胞毒性産物の発現と連結することができるまたは細胞毒性ウイルスにおいて発現させることができる。そのようなウイルスは、治療的効果のために標的とされる特定の細胞型を標的にすることができる。発現修飾ＦＩＸポリペプチドは、ウイルスの細胞毒性を増強させるように使用することができる。
【０４１８】
修飾ＦＩＸポリペプチドのインビボ発現は、細胞特異的プロモーターまたは組織特異的プロモーターなどのような特異的な調節配列に、修飾ＦＩＸポリペプチドコード核酸分子を作動可能に連結することを含むことができる。修飾ＦＩＸポリペプチドはまた、とりわけ標的細胞型および／または標的組織において感染するおよび／または複製するベクターから発現することができる。誘発性プロモーターは、修飾ＦＩＸポリペプチド発現を選択的に調節するために使用することができる。例示的な調節可能な発現系は、ドキシサイクリン誘発性遺伝子発現系であり、これは、組換えＦＩＸ発現を調節するために使用されてきた［Srour et al., (2003) Thromb. Haemost. 90(3):398-405］。
【０４１９】
核酸分子は、裸の核酸としてまたはベクター、人工染色体、リポソーム、および他の媒体において、全身投与、局所経路、局所的経路、および投与の他の経路によって対象に投与することができる。全身およびインビボにおけるものである場合、核酸分子または核酸分子を含有する媒体は、細胞を標的にすることができる。
【０４２０】
投与はまた、細胞または組織を典型的に標的にするベクターまたは細胞の投与などによって直接的なものとすることができる。たとえば、腫瘍細胞および増殖は、修飾ＦＩＸポリペプチドのインビボ発現についての標的細胞となり得る。修飾ＦＩＸポリペプチドのインビボ発現に使用される細胞はまた、患者にとって自己となる細胞をも含む。そのような細胞は、患者から取り出され、修飾ＦＩＸポリペプチドの発現のための核酸を、導入し、次いで、注射または植え付けなどによって患者に投与することができる。
【０４２１】
Ｈ．治療上の使用
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドおよび核酸分子は、未修飾ＦＩＸが利用される任意の状態の処置に使用することができる。したがって、たとえば、修飾ＦＩＸポリペプチドは、血友病などのような、先天性および後天性の出血障害を含む出血障害の処置のために凝血促進薬として使用することができる。典型的に、そのため、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、出血障害の処置において使用される凝血促進薬である。他の特定の例では、しかしながら、修飾ＦＩＸポリペプチドを、抗凝血薬として使用することができる。たとえば、その基質、ＦＸに対する触媒活性の欠乏をもたらす、１つまたは複数の修飾をも含有する、高度にグリコシル化された修飾ＦＩＸポリペプチドは、血栓症の障害を処置するために抗凝血薬として使用することができる。
【０４２２】
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、単独でまたは他の作用物質と組み合わせて治療活性を有する。本明細書において提供される修飾ポリペプチドは、治療活性を保持するが、改善された薬物動態学的および薬力学的特性、阻害因子に対する抵抗性の増加、ならびに／または改善された触媒活性などのような修飾された特性を示すように設計される。そのような修飾された特性および活性は、たとえば、ポリペプチドの治療有効性を改善することができる。本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドおよびコード核酸分子は、未修飾ＦＩＸが利用される任意の状態の処置に使用することができる。この部は、例示的な使用および投与方法を提供する。これらの記載される療法は、単に例示的なものであり、修飾ＦＩＸポリペプチドの適用を限定しない。
【０４２３】
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、様々な治療薬およびＦＩＸが利用される診断法において使用することができる。そのような方法は、記載されるおよび以下に挙げられる生理学的状態および医学的状態の処置の方法を含むが、これらに限定されない。本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、野生型ＦＩＸと比較して、同じ効果を達成するためのより低い用量を含む、インビボ活性および治療効果の改善、より持続される治療効果、ならびに投与および処置における他の改善を示す。
【０４２４】
本明細書において記載される修飾ＦＩＸポリペプチドは、未修飾ＦＩＸポリペプチドと比較した、薬物動態学的および薬力学的特性の改善、触媒活性の増加、阻害因子に対する抵抗性の増加、および／または血液凝固活性の増加を示すことができる。そのようなポリペプチドは、たとえば、先天性および後天性の出血障害を含む出血障害の処置のために凝血促進薬として使用することができる。いくつかの例では、非天然グリコシル化部位を有する、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドはまた、修飾ＦＩＸポリペプチドが抗凝固薬となり、たとえば、血栓症の疾患および障害を処置するために使用することができる、凝固を阻害する修飾ＦＩＸポリペプチドをもたらす修飾をも含有する。本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、より長く続く、より安定した療法を送達するために使用することができる。修飾ＦＩＸポリペプチドを使用する治療的改善の例は、より低い投薬量、より少ないおよび／またはより頻度が低い投与、副作用の減少、ならびに治療効果の増加を含むが、これらに限定されない。
【０４２５】
典型的に、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、凝血促進薬であり、先天性および後天性の出血障害を含む出血障害を処置するために使用することができる。特定の例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、他の修飾および未修飾ＦＩＸポリペプチドが処置のために使用されている治療方法における使用について意図される。単独でまたは他の凝血促進薬を含む他の作用物質と組み合わせて、修飾ＦＩＸポリペプチドを用いて処置することができる例示的な疾患および障害は、血液凝固障害、血液疾患、出血性障害、血友病、特に血友病Ｂ、外傷および手術と関連する出血を含む後天性の血液障害を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＦＩＸポリペプチドによって処置されることとなる出血が、脳、内耳領域、眼、肝臓、肺、腫瘍組織、胃腸管などのような器官において生じる。他の実施形態では、出血が、出血性胃炎および大量の子宮出血などにおいてびまん性である。
【０４２６】
血友病などのような出血障害を有する患者は、抜歯を含む手術または外傷の間に、出血および過度の出血のために危険にさらされることが多い。そのような患者は、修飾ＦＩＸポリペプチドを用いて処置することができる急性出血性関節症（関節における出血）、慢性血友病性関節症、血腫（筋肉、腹膜後、舌下、および咽頭後方など）、他の組織における出血、血尿（腎管からの出血）、脳出血、ならびに消化管出血（ＵＧＩ出血など）を有することが多い。したがって、いくつかの例では、修飾ＦＩＸポリペプチドが、対象における、外傷または手術による出血エピソードまたは血小板の数もしくは活性の低下を処置するために使用される。手術を受ける患者のための例示的な方法は、出血を予防するための処置および手術の前、その間、またはその後の処置を含む。
【０４２７】
典型的に、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、修飾ＦＩＸポリペプチドと比較して、改善された血液凝固活性を示すが、いくつかの例では、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドが、１つまたは複数の非天然グリコシル化部位を含有することができ、また、機能的なペプチダーゼ活性を欠く。そのような修飾ＦＩＸポリペプチドは、血液凝固を阻害するための治療方法において使用することができる（たとえば米国特許第６，３１５，９９５号を参照されたい）。血液凝固を阻害する修飾ＦＩＸポリペプチドは、虚血性および血栓症の障害のための処置の抗凝固方法において使用することができる。深部静脈血栓症（ＤＶＴ）または浅静脈血栓症（ＳＶＴ）を有する患者などのような、過度の凝血の危険性が増加している外科患者において、抗凝血薬である本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、手術における過度の凝血を予防するために投与することができる。いくつかの場合において、処置は、ＦＩＸ単独で実行される。いくつかの場合において、ＦＩＸは、処置されることとなる状態または疾患によって必要とされるように、さらなる抗凝固因子と共に投与される。
【０４２８】
修飾ＦＩＸポリペプチドを用いる疾患および状態の処置は、注射、経肺、経口、および経皮投与を含むが、これらに限定されない、本明細書において記載される適した製剤を使用する、投与の任意の適したルートによって達成することができる。必要であれば、特定の投薬量および持続時間ならびに処置プロトコールは、経験的に決定するまたは推定することができる。たとえば、上記に記載されるＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）凝固因子ＩＸ（組換え体）の推奨される投薬量などのような、組換えＦＩＸポリペプチドおよび天然ＦＩＸポリペプチドの例示的な用量は、適切な投薬量を決定するための出発点として使用することができる。高度にグリコシル化され、インビボにおける半減期が増加したまたは阻害因子に対する抵抗性が増加したもしくは触媒活性が増加した修飾ＦＩＸポリペプチドは、投薬量および／または頻度の低下に有効になり得る。未修飾ＦＩＸポリペプチドについての投薬量および投薬量レジメンは、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドについての投薬量を決定するためのガイダンスとして使用することができる。未修飾ＦＩＸと比較した、修飾ＦＩＸの半減期および活性のレベルなどのような因子は、そのような決定をなす際に使用することができる。特定の投薬量およびレジメンは、経験的に決定することができる。
【０４２９】
投薬量レベルおよびレジメンは、知られている投薬量およびレジメンに基づいて決定することができ、必要ならば、修飾ポリペプチドの特性の変化に基づいて推定することができるおよび／または様々な因子に基づいて経験的に決定することができる。そのような因子は、個人の体重、健康状態、年齢、利用される特異的な化合物の活性、性別、食事、投与の時間、排泄の速度、薬剤の組み合わせ、疾患の重症度および過程、ならびに疾患に対する患者の素因および処置する医師の判断を含む。有効成分、ポリペプチドは、典型的に、薬学的に有効な担体と組み合わせられる。単一剤形または多剤形を産生するために担体物質と組み合わせることができる有効成分の量は、処置される宿主および投与の特定のモードに依存して変わり得る。
【０４３０】
血液の凝血時間に対するＦＩＸポリペプチドの効果は、全血部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、活性化凝血時間（ＡＣＴ）、再石灰化活性化凝血時間、またはリー−ホワイト凝血時間を含むが、これらに限定されない、当技術分野において知られている凝血試験のいずれかを使用してモニターすることができる。
【０４３１】
患者の状態の改善に際して、必要であれば、維持用量の化合物または組成物を投与することができ、投与量、剤形、もしくは投与の回数またはそれらの組合せを修正することができる。いくつかの場合において、対象は、疾患症状のあらゆる再発に際してまたはスケジューリングされた投薬量に基づいて、長期ベースでの断続的な処置を必要とし得る。他の場合において、さらなる投与は、出血、外傷、または手術手技などのような急性事象に応じて必要とされ得る。
【０４３２】
血友病
血友病は、１つまたは複数の血液凝固因子における欠乏症によって引き起こされる出血障害である。それは、組織損傷の部位に血餅を形成する能力の減少によって特徴づけられる。先天性のＸ連鎖血友病は、血友病Ａおよび血友病Ｂまたはクリスマス病を含み、これらは、それぞれ、ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸにおける欠乏症によって引き起こされる。血友病Ａは、１０，００００人の男性のうち１人の割合で起こるが、血友病Ｂは、５０，０００人の男性のうち１人に起こる。
【０４３３】
血友病を有する患者は、再発性の関節および筋肉出血に罹患し、これは、特発性のものまたは外傷に応じてのものとすることができる。出血は、重症の急性の痛みを引き起こし、移動を制限し、滑膜肥大を含む二次的合併症に至り得る。さらに、関節において再発する出血は、慢性滑膜炎を引き起こし得、これは、関節の損害を引き起こし、滑膜、軟骨、および硬骨を破壊し得る。
【０４３４】
本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドおよび本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドをコードする核酸は、血友病と関連する出血状態の処置を含めて、血友病のための療法において使用することができる。本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、たとえば、特発性出血エピソードを制御するもしくは予防するためにまたは外傷もしくは手術手技に応じての出血を制御するもしくは予防するために使用することができる。
【０４３５】
本明細書における修飾ＦＩＸポリペプチドは、改善された血清半減期、阻害因子に対する抵抗性の増加、触媒活性の増加、および／または血液凝固活性の増加などのような、薬物動態学的および薬力学的特性の改善を示すことができる。したがって、修飾ＦＩＸポリペプチドは、血友病のための、より長く続くまたは他の場合には改善された療法を送達するために使用することができる。修飾ＦＩＸポリペプチドを使用する治療的改善の例は、たとえば、より低い投薬量、より少ないおよび／またはより頻度が低い投与、副作用の減少、ならびに治療効果の増加を含むが、これらに限定されない。
【０４３６】
修飾ＦＩＸポリペプチドは、たとえば、動物モデルを使用することによって、治療有効性について試験することができる。たとえば、ＦＩＸ欠損マウスまたは血友病についての任意の他の知られている疾患モデルは、修飾ＦＩＸポリペプチドを用いて処置することができる。疾患症状の進行および表現型は、修飾ＦＩＸポリペプチドの効果を評価するためにモニターされる。修飾ＦＩＸポリペプチドはまた、偽薬対照および／または未修飾ＦＶＩＩを使用する対照と比較した、インビボにおける有効性を評価するために、臨床試験などにおいて動物モデルおよび対象に投与することもできる。
【０４３７】
ａ  血友病Ｂ
血友病Ｂは、ＦＩＸ治療薬の投与により有効に管理することができる。重症の血友病Ｂを有する患者は、＜１ＩＵ／ｄＬのＦＩＸ活性（正常活性の１％）を有し、中程度の血友病Ｂを有する患者は、１〜５ＩＵ／ｄＬのＦＩＸ活性（正常活性の１〜５％）を有し、軽度の血友病Ｂを有する患者は、＞５〜＜４０ＩＵ／ｍＬのＦＩＸ活性（正常活性の＞５〜＜４０％）を有する。適切な量のＦＩＸを用いる、特定の出血エピソードの適した予防的な代理の療法および／または処置を用いると、患者は、標準の寿命に達することができる。ＦＩＸの投与は、手術、外傷の間の、抜歯の間の、または関節血症、血尿、鼻出血もしくは胃腸管出血などのような粘膜皮膚の出血、骨膜下骨もしくは軟部組織における嚢胞性の病変、または頭蓋出血、脊柱管出血などのような神経学的合併症を引き起こす血腫と関連する出血を軽減するように、出血を制御するのを支援することができる。血友病を有する患者における死亡は、中枢神経系における出血の結果であることが多い。血友病患者における他の深刻な合併症は、凝固因子治療薬および疾患に対する阻害因子の発生を含む。
【０４３８】
血友病Ｂ患者におけるＦＩＸ遺伝子における最も頻繁な改変は、点突然変異、特にミスセンス突然変異である。同定されたＦＩＸ突然変異のほとんどは、ＦＩＸ遺伝子のコード領域におけるアミノ酸残基において起こり、進化的に保存されたアミノ酸に影響を及ぼすことが多い。血友病の重症度は、突然変異の性質に依存する。コード領域における突然変異は、プロテアーゼ活性、補因子結合、シグナルペプチド、またはプロペプチド切断の改変、翻訳後修飾、およびその活性化形態へのＦＩＸの切断の阻害を含む、ＦＩＸポリペプチドの多くの異なる特性または活性に影響を及ぼすことができる。他の種類の点突然変異は、不安定な切断ＦＩＸポリペプチドを産生するナンセンス突然変異ならびに最終的に異常なＦＩＸ分子をもたらすフレームシフト突然変異（小さな欠失および挿入）を含む。さらに、ＦＩＸ点突然変異は、プロモーター領域中に見出すことができ、これは、いくつかの特定の遺伝子調節タンパク質についての認識配列を破壊し、凝固因子ＩＸの転写の低下をもたらし得る。転写異常の結果としてのＦＩＸの減少は、血友病Ｂライデンと呼ばれる。プロモーター領域における例示的な突然変異は、ＨＮＦ−４結合部位の崩壊を含み、これは、アンドロゲン受容体によるＦＩＸ転写の調節に影響を及ぼす。この種の血友病の重症度は、血液中のアンドロゲンのレベルによって決定され、これは、思春期の間に増加し、ＦＩＸ転写欠乏症を部分的に軽減する［Kurachi et al. (1995)］。他のミスセンスヌクレオチド変化は、第ＩＸ因子一次ＲＮＡ転写産物のプロセシングに影響を及ぼす。たとえば、いくつかの突然変異は、進化的に保存されたドナースプライス（ＧＴ）およびアクセプタースプライス（ＡＧ）コンセンサス配列に起こり、これは、潜在性のスプライスジャンクションを生成し、スプライソソームのアセンブリーを破壊し得る。血友病のいくつかの重症の症例（約１０％）は、ＦＩＸ遺伝子における大きな欠失の症状を示す。
【０４３９】
ＦＩＸ欠乏症、したがって血友病Ｂの処置は、ほとんどの場合、ＦＩＸの組換え形態、精製血漿ＦＩＸ調製物、または精製血漿濃縮物を含むＦＩＸの投与を伴う。したがって、同様に、本明細書における修飾ＦＩＸポリペプチドおよび修飾ＦＩＸポリペプチドをコードする核酸は、血友病Ｂの処置のために使用することができる。本明細書における修飾ＦＩＸポリペプチドは、改善された血清半減期、阻害因子に対する抵抗性の増加、触媒活性の増加、および／または血液凝固活性の増加などのような、薬物動態学的および薬力学的特性の改善を示すことができる。したがって、修飾ＦＩＸポリペプチドは、血友病のための、改善された療法を送達するために使用することができる。修飾ＦＩＸポリペプチドを使用する治療的改善の例は、たとえば、より低い投薬量、より少ないおよび／またはより頻度が低い投与、副作用の減少、ならびに治療効果の増加を含むが、これらに限定されない。
【０４４０】
ｂ．血友病Ａ
血友病Ａは、血友病の全ての症例の約８５％を占めるが、Ｘ染色体上の第ＶＩＩＩ因子遺伝子における（１つまたは複数の）突然変異に起因し、ＦＶＩＩＩタンパク質の欠乏症または機能障害に至る。ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）凝固因子ＩＸ（組換え体）などのような組換えＦＩＸポリペプチドまたは血漿精製ＦＩＸポリペプチドを含む天然ＦＩＸポリペプチドを用いる血友病Ａの処置は、典型的に、天然ＦＩＸポリペプチドが凝固を達成するための触媒活性のためにＦＶＩＩＩａを必要とするので、推奨されない。しかしながら、ＦＩＸ内因活性を増加させるための１つまたは複数の修飾を含有する、本明細書において記載されるものなどのような修飾ＦＩＸポリペプチドは、血友病Ｂの処置において使用することができる。そのようなポリペプチドは、ＦＶＩＩＩ非依存性活性を有し、したがって、血友病Ａ患者における凝固薬として機能することができる。たとえば、１つもしくは複数の非天然グリコシル化部位を導入するもしくは排除するための１つもしくは複数の修飾ならびに／またはＡＴ−ＩＩＩおよび／もしくはヘパリンに対する抵抗性を増加させるための１つもしくは複数の修飾を含有するならびにＦＶＩＩＩａの非存在下において修飾ＦＩＸポリペプチドの活性を増加させるための１つもしくは複数の修飾をも含有するものなどのような上記に記載される修飾ＦＩＸポリペプチドは、血友病Ａを有する患者における出血エピソードを処置するために使用することができる。
【０４４１】
ＦＩＸポリペプチドがＦＶＩＩＩａ非依存性の様式において作用することができるような、ＦＩＸポリペプチドの内因活性を増加させるための修飾は、上記および他のところに記載されており［たとえばHopfner et al., (1997) EMBO J. 16:6626-6635;Kolkman et al., (2000) Biochem. 39:7398-7405;Sichler et al., (2003) J. Biol. Chem 278:4121-4126;Begbie et al., (2005) Thromb Haemost. 94(6):1138-47、米国特許第６，５３１，２９８号ならびに米国特許出願公開第２００８０１６７２１９号および第２００８０２１４４６１号を参照されたい］、アミノ酸置換V86A、V86N、V86D、V86E、V86Q、V86G、V86H、V86I、V86L、V86M、V86F、V86S、V86T、V86W、V86Y、Y259F、A261K、K265T、E277V、E277A、E277N、E277D、E277Q、E277G、E277H、E277I、E277L、E277M、E277F、E277S、E277T、E277W、E277Y、R338A、R338V、R338I、R338F、R338W、R338S、R338T、Y345F、I383VおよびE388Gを含むが、これらに限定されない。たとえば、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、アミノ酸交換Y259F/K265T、Y259F/K265T/Y345F、Y259F/A261K/K265T/Y345F、Y259F/K265T/Y345F/I383V/E388GまたはY259F/A261K/K265T/Y345F/I383V/E388Gを含み、内因活性の増加を示すことができる。そのため、そのような修飾ＦＩＸポリペプチドは、血友病Ａの処置において使用することができる。
【０４４２】
Ｊ．併用療法
修飾ＦＩＸポリペプチドおよび本明細書において記載される修飾ＦＩＸポリペプチドをコードする核酸分子のいずれも、他の生物学的製剤、小分子化合物、および手術を含むが、これらに限定されない他の治療剤または手技と組み合わせて、その前に、それと断続的に、またはそれに続いて、投与することができる。ＦＩＸが指示されるまたは使用されてきたならびに他の作用物質および処置が利用可能である、上記に例証されるものを全て含む任意の疾患または状態について、ＦＩＸは、それと組み合わせて使用することができる。したがって、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドは、同様に使用することができる。処置されることとなる疾患または状態に依存して、例示的な組合せは、他の血漿精製凝固因子または組換え凝固因子、凝血促進薬、抗凝血薬、抗凝固抗体、グリコサミノグリカン、ヘパリン、ヘパリノイド、ヘパリン誘導体、ヘパリン様の薬剤、ワルファリンおよびクマリン誘導体などのようなクマリンとの組合せを含むが、これらに限定されない。凝血促進特性を有する、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドとの併用療法において使用することができるさらなる凝血促進薬は、ビタミンＫ、ビタミンＫ誘導体、他の凝固因子、およびプロテインＣ阻害因子を含むが、これらに限定されない。抗凝固特性を有する、本明細書において提供される修飾ＦＩＸポリペプチドとの併用療法において使用することができるさらなる抗凝血薬は、β２アドレナリン受容体アンタゴニスト、神経ペプチドＶ２アンタゴニスト、プロスタサイクリン類似体、トロンボキサンシンターゼ阻害因子、カルシウムアゴニスト、エラスターゼ阻害因子、非ステロイド系抗炎症性分子、トロンビン阻害因子、リポキシゲナーゼ阻害因子、ＦＶＩＩａ阻害因子、ＦＸａ阻害因子、ホスホジエステラーゼＩＩＩ阻害因子、フィブリノゲン、ビタミンＫアンタゴニスト、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストを含むが、これらに限定されない。
【０４４３】
Ｋ．製品およびキット
修飾ＦＩＸポリペプチドをコードする核酸についての修飾ＦＩＸポリペプチドまたはその誘導体もしくは生物学的活性部分の医薬化合物は、包装材料、ＦＩＸ媒介性の疾患または障害の処置に有効な医薬組成物、および修飾ＦＩＸポリペプチドまたは核酸分子が、ＦＩＸ媒介性の疾患または障害の処置について使用されることになっていることを示すラベルを含有する製品として包装することができる。
【０４４４】
本明細書において提供される製品は、包装材料を含有する。医薬製品の包装における使用のための包装材料は、当業者らによく知られている。たとえば、それぞれ、その全体が本明細書において組み込まれる米国特許第５，３２３，９０７号、第５，０３３，２５２号、および第５，０５２，５５８号を参照されたい。医薬包装材料の例は、ブリスターパック、ボトル、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、シリンジ、ボトル、ならびに選択される製剤ならびに投与および処置の意図されるモードに適した任意の包装材料を含むが、これらに限定されない。任意のＦＩＸ媒介性の疾患または障害に対する様々な処置のように、本明細書において提供される化合物および組成物の多くの製剤が、企図される。
【０４４５】
修飾ＦＩＸポリペプチドおよび核酸分子はまた、キットとして提供することもできる。キットは、本明細書におけて記載される医薬組成物および投与のためのアイテムを含むことができる。たとえば、修飾ＦＩＸは、シリンジ、吸入器、投薬カップ、ドロッパー、またはアプリケーターなどのような投与のためのデバイスと共に提供することができる。キットは、所望により、投薬量、投薬レジメン、および投与のモードのための説明書を含む、適用のための説明書を含むことができる。キットはまた、本明細書において記載される医薬組成物および診断のためのアイテムを含むことができる。たとえば、そのようなキットは、ＦＩＸの濃度、量、もしくは活性を測定するためのアイテムまたは対象のＦＩＸ調節システムを含むことができる。
【０４４６】
以下の実施例は、説明の目的のみのために含まれ、本発明の範囲を限定するようには意図されない。
【実施例】
【０４４７】
【実施例１】
【０４４８】
第ＩＸ因子ポリペプチドのクローニングおよび発現
Ａ．ＦＩＸ遺伝子のクローニング
４６１アミノ酸ヒトＦＩＸ前駆体ポリペプチド（Ｐ００７４０；配列番号１において記載）をコードする核酸を、伸長因子−１α（ＥＦ−１α）コアプロモーターならびにヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）１型末端反復配列のＲセグメントおよびＵ５配列の部分（Ｒ−Ｕ５’）を含む複合プロモーターｈＥＦ１−ＨＴＬＶを含有する哺乳動物発現ベクター、ｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ２（本明細書においてｐＦＵＳＥと略す）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ；配列番号２３）にクローン化した。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＣＦ  Ｄｒｙ−Ｄｏｗｎ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を供給者によって指定された条件に従って用いた。
【０４４９】
インフュージョンプロセスのためにヒト免疫グロブリン１（ｈＩｇＧ１）Ｆｃ部分を含まないプラスミドｐＦＵＳＥを、ｐＦＵＳＥ−Ａｃｃ−Ｆ１フォワードプライマー：ＧＴＧＣＴＡＧＣＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧ（配列番号２４）およびｐＦＵＳＥ−Ａｃｃ−Ｒ３リバースプライマー：ＣＡＴＧＧＴＧＧＣＣＣＴＣＣＴＴＣＧＣＣＧＧＴＧＡＴＣ（配列番号２５）でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて直線化し、アクセプターＤＮＡとして用いた。ＦＩＸの全長コード配列を、ＦＩＸ−ｗｔｓｐ−Ｉｎｖｉｖｏ−Ｆ１フォワードプライマー：ＣＧＡＡＧＧＡＧＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＣＧＣＧＴＧＡＡＣＡＴＧＡＴＣ（配列番号２６）およびＦＩＸ−Ｉｎｖｉｖｏ−Ｒ１リバースプライマー：ＴＧＴＣＴＧＧＣＣＡＧＣＴＡＧＣＡＣＴＴＡＡＧＴＧＡＧＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＣＣ（配列番号２７）と共にヒトＦＩＸ  ｃＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を鋳型として用いてＰＣＲによって増幅した。上に記載の２つのＦＩＸドナー増幅プライマー配列に関して、フォワードおよびリバースプライマー配列それぞれにおけるＦＩＸ「ＡＴＧ」開始および「ＴＡＡ」終止コドンの相補配列の両方に下線をつけた。１８ｎｔ長相同性領域、Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎのための非アニーリング５’プライマー末端を太字で示す。標準的ＰＣＲ反応およびサーモサイクリング条件をＰｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と共に製造者によって推奨されるとおり用いた。アクセプターおよびドナーＰＣＲ産物の両方を、次いでイー・コリ由来ｄａｍメチル化ＰＣＲ鋳型バックグラウンドを除去するためにＤｐｎＩ制限酵素で消化した。次いでそれらを混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応を供給者によって指定された条件を用いて実施した。反応混合物をイー・コリＸＬ１  Ｂｌｕｅ  ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。コロニーを２５ｐｐｍ  Ｚｅｏｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を添加した２ｘＹＴアガープレート上で選択した。プラスミドＤＮＡを選択されたクローンから単離し、正確なクローニングを検証するために配列決定した。
【０４５０】
Ｂ．ＦＩＸ変異体の生成
ＦＩＸ変異体を、新たに合成するＤＮＡに設計された突然変異を組み込むためのプライマーとして働く特異的に設計したオリゴヌクレオチドと共にＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造者の説明書に従って用いて生成した。望まれる突然変異を含む相補的プライマーを、クローン化ＦＩＸ  ｃＤＮＡ配列を鋳型として含有する精製した二重鎖スーパーコイルｐＦＵＳＥプラスミドＤＮＡを用いるサイクルにおいて伸長した。プライマーの伸長は、新たに合成される鎖への対象の突然変異の組み込みをもたらし、ねじれ型ニック（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｎｉｃｋｓ）を含む突然変異プラスミドを生じた。増幅に続いて、イー・コリ由来ｐＦＵＳＥ  ＤＮＡのｄａｍメチル化親鎖を除去するために突然変異導入産物をＤｐｎＩ制限酵素で消化した。次いでＤＮＡをイー・コリＸＬ１  Ｂｌｕｅ  ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、２５ｐｐｍ  Ｚｅｏｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を添加した２ｘＹＴアガープレート上での選択が続いた。プラスミドＤＮＡを選択されたクローンから単離し、ＦＩＸ遺伝子上の望まれる位置（複数可）での突然変異（複数可）の組み込みを検証するために配列決定した。
【０４５１】
ＦＩＸ変異体を生成するために用いた各相補的プライマー対由来のオリゴヌクレオチドの内の１つのヌクレオチド配列を表１２に提供する。置換されたアミノ酸をコードするヌクレオチドトリプレット配列を大文字で示す。たとえば置換Ａ１０３Ｎ／Ｎ１０５Ｓ（キモトリプシンナンバリングによるＡ［１０３］Ｎ／Ｎ［１０５］Ｓ；配列番号７７）を含有するＦＩＸ変異体を生成するために、Ａ１０３Ｎ／Ｎ１０５ＳフォワードプライマーおよびＡ１０３Ｎ／Ｎ１０５Ｓフォワードに相補的であるプライマーを９−ｂｐ「ＧＣＴｇａｔＡＡＣ」野生型配列を９−ｂｐ「ＡＡＴｇａｔＡＧＣ」突然変異配列で置き換えるために用いた（変更したヌクレオチドトリプレットを大文字で記す）。
【０４５２】
下の表１２は、ＦＩＸ突然変異誘発に用いたオリゴヌクレオチドプライマーを記載する。突然変異体トリプレットを大文字で示し、プライマー名は、プライマーを用いた突然変異誘発の結果として産生された（キモトリプシンナンバリングによる）、突然変異体に対応する。
【０４５３】
表12.
【表１２−１】
0006027221.tif 000024
【表１２−２】
0006027221.tif 000025
【表１２−３】
0006027221.tif 000026
【表１２−４】
0006027221.tif 000027
【０４５４】
下の表１３は、配列番号３において記載される成熟ＦＩＸポリペプチドと比較したナンバリングおよびキモトリプシンナンバリングを用いて示す突然変異を有する生成されたＦＩＸ変異体を記載する。
【０４５５】
表13. FIX変異体
【表１３−１】
0006027221.tif 000028
【表１３−２】
0006027221.tif 000029
【表１３−３】
0006027221.tif 000030
【表１３−４】
0006027221.tif 000031
【表１３−５】
0006027221.tif 000032
【表１３−６】
0006027221.tif 000033
【表１３−７】
0006027221.tif 000034
【表１３−８】
0006027221.tif 000035
【表１３−９】
0006027221.tif 000036
【表１３−１０】
0006027221.tif 000037
【表１３−１１】
0006027221.tif 000038
【表１３−１２】
0006027221.tif 000039
【０４５６】
Ｃ．ＦＩＸポリペプチドの発現および精製
野生型および変異体のＦＩＸポリペプチドをＣＨＯ発現（ＣＨＯＸ）細胞（Ｅｘｃｅｌｌｇｅｎｅ）において発現した。ＣＨＯ発現（ＣＨＯＸ）細胞をＤＭ２０４Ｂ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において維持し、産生種培地に接種するために用いた。種培地を同じ培地で生存細胞（ｖｃ）１ｍＬ当たりおよそ１．４ｘ１０７個まで増殖させ、およそ１００ｍＬをＤＭ２０４Ｂ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｅｄｉａおよそ１．０Ｌに接種するために用い、したがって接種密度は１．２ｘ１０６ｖｃ／ｍＬであった。この培養物をトランスフェクションの日に１３〜１６ｘ１０６ｖｃ／ｍＬに達するように３日間増殖させた。ＦＩＸプラスミドＤＮＡ（３．２ｍｇ）をポリエチレンイミン「ＭＡＸ」［ＰＥＩ−２０．５ｍｇ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）］と混合し、ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ＴｆＭＡＸ２  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）で１．０Ｌに希釈することによってトランスフェクション複合体を形成した。次いでこの混合物を産生培地１．０Ｌに添加した。細胞にトランスフェクション混合物を加えたもの１．０Ｌアリコートを２個の３Ｌバッフル付きフェルンバッハフラスコに分割し、粗ＦＩＸを回収する前に４日間発現させた。次いで培養上清を濾過によって回収し、ＦＩＸを精製した。
【０４５７】
１０Ｌ以上の大規模培養物をＷＡＶＥ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において産生した。ＤＭ２０４Ｂ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｅｄｉａ  ４．６Ｌで接種密度１．２ｘ１０６ｖｃ／ｍＬまで上に記載のとおり増殖させた種培養物およそ４００ｍＬを２０Ｌ  ｗａｖｅ  ｂａｇに接種した。細胞が３日後に細胞密度１３〜１６ｘ１０６ｖｃ／ｍＬに達するようにＷＡＶＥ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒを揺動角度６度、揺動速度２４ｒｐｍ、３７．１℃に設定した。ＦＩＸプラスミドＤＮＡ  １６ｍｇおよびＰＥＩ  １０２．５ｍｇをトランスフェクション複合体を形成するように合わせ、最初の接種の３日後にＷＡＶＥ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ内の培養物に添加する前にＴｆＭＡＸ２  ５．０Ｌ中に希釈した。トランスフェクション複合体にＴｆＭＡＸ培地を加えたものをｗａｖｅ  ｂａｇに添加し、ＷＡＶＥ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒの揺動角度を８℃に、温度を３３℃に（他の設定は同じままで）設定した。培養物を粗ＦＩＸを回収する前に４日間発現させた。ｗａｖｅ  ｂａｇの内容物をＣＵＮＯデプスフィルターを通じて培養上清を回収する前に３時間、４℃で静置し、次いでＦＩＸを精製した。
【０４５８】
機能的Ｇｌａドメインを有するＦＩＸポリペプチドが吸着し、カルシウム溶出工程が続くＣａｐｔｏ  Ｑ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＦＩＸポリペプチドを精製した。典型的にはＥＤＴＡ（１０ｍＭ）、Ｔｒｉｓ（２５ｍＭ、ｐＨ８．０）およびＴｗｅｅｎ−８０（０．００１％）をトランスフェクトした細胞由来の培養上清に添加した。試料を、緩衝液Ｂ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．００１％Ｔｗｅｅｎ−８０）で予め平衡化したＣａｐｔｏ  Ｑ  ｃｏｌｕｍｎにロードし、緩衝液Ａ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００１％Ｔｗｅｅｎ−８０）での平衡化が続いた。試料のロードの完了直後にカラムを１４％緩衝液Ｂ（８６％緩衝液Ａ）で２０カラム容量洗浄した。次いで緩衝液Ｃ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．００１％Ｔｗｅｅｎ−８０、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２）をプールとして採取するＦＩＸポリペプチドを溶出するためにカラムに添加した。
【０４５９】
溶出プールをＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてさらに精製した。試料を緩衝液Ｄ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、０．００１％Ｔｗｅｅｎ−８０）２容量で希釈することによって添加のために調製した。希釈試料を緩衝液Ｆ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１Ｍ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００１％Ｔｗｅｅｎ−８０）に続いて緩衝液Ｅ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００１％Ｔｗｅｅｎ−８０）で予め平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  ｃｏｌｕｍｎにロードした。４％緩衝液Ｆ（９６％緩衝液Ｅ）での洗浄後、４〜４０％緩衝液Ｆの勾配をカラムに適用し、画分を採取した。次いでＦＩＸポリペプチドを含有する画分をプールした。
【０４６０】
Ｄ．グリコシル化ポリペプチドを濃縮するための精製
修飾ＦＩＸポリペプチドのグリコシル化の程度をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて推定した。過剰グリコシル化を修飾ＦＩＸポリペプチドの移動パターンの野生型ＦＩＸ、Ｂｅｎｅｆｉｘ（登録商標）Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ＦＩＸとの比較によって評価した。酵素の過剰グリコシル化形態は遅く移動し、野生型ポリペプチドよりも高い見かけの分子量を示す。Ｅ２４０Ｎ突然変異（２４０位に非天然Ｎ−グリコシル化部位を導入する）を含有するポリペプチドは部分的にしかグリコシル化されていないこと（およそ２０％グリコシル化）が認められた。過剰グリコシル化形態を濃縮するために、上に記載の精製プロセスの変更を実施した。
【０４６１】
精製の最初の工程は、上に記載のとおりＣａｐｔｏ  Ｑ  ｃｏｌｕｍｎを用いて実施した。このカラムからの溶出プールを緩衝液Ｄ（上に記載のとおり）２容量で希釈し、試料を緩衝液Ｆ（上に記載のとおり）に続いて緩衝液Ｅ（上に記載のとおり）で予め平衡化したＨｅｐａｒｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにロードした。次いでカラムを０％から７０％緩衝液Ｆの勾配で展開し、画分を採取した。Ｅ４１０Ｎ変異体の過剰グリコシル化形態はカラムからおよそ３５％緩衝液Ｆ中に溶出し、非グリコシル化形態はおよそ５０％緩衝液Ｆ中に溶出した。採取した各プールをＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  ｃｏｌｕｍｎ上で上に記載のとおりさらに精製した。この方法によりＥ４１０Ｎ変異体のおよそ８０％過剰グリコシル化形態を含有するプールを得た。過剰グリコシル化の程度をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法の目視検査によって推定した。
【実施例２】
【０４６２】
ＦＸの活性化および活性部位滴定剤（Ａｃｔｉｖｅ  Ｓｉｔｅ  Ｔｉｔｒａｎｔ）フルオレセイン−モノ−ｐ’−グアニジノベンゾエート（ＦＭＧＢ）を用いる触媒的に活性なプロテアーゼ（ＦＸａ）濃度の決定
第Ｘ因子（ＦＸ）の保存物中で触媒的に活性になり得るＦＸの濃度を決定した。次いでＦＸのこの保存物をＦＸに対するＦＩＸ変異体の触媒活性を算出するための次の研究で用いた。ＦＸのＦＸａへの活性化に続いて、活性部位滴定アッセイを本質的にBock et al.(Archives of Biochemistry and Biophysics(1989)273:375-388)によって記載のとおり、蛍光発生エステル基質フルオレセイン−モノ−ｐ’グアニジノベンゾエート（ＦＭＧＢ）を用いて、いくつかの若干の変更を伴って実行した。ＦＭＧＢはＦＸａと直ちに反応し（しかしＦＸまたは不活性プロテアーゼとは反応せず）、ＦＭＧＢ濃度が飽和しており、脱アシル化が特に遅く、触媒作用の律速である条件下で事実上安定なアシル−酵素中間体を形成する。これらの条件下で、ＦＸａプロテアーゼは、一回の触媒代謝回転を受け、フルオレセインフルオロフォアを放出する。蛍光の最初のバーストをフルオレセイン蛍光の外部濃度標準曲線で較正すると、活性部位の濃度を算出できる。
【０４６３】
Ａ．ＦＸａへのＦＸの活性化
触媒的に活性になり得るＦＸの保存液中の濃度をラッセルクサリヘビ毒（Ｒｕｓｓｅｌｌ’ｓ  Ｖｉｐｅｒ  Ｖｅｎｏｍ）でのＦＸ試料の活性化によって決定し、ＦＭＧＢでの活性ＦＸ（ＦＸａ）の滴定を続けた。ＦＸ酵素前駆体保存物はバックグラウンドＦＸａ活性を減少させるために供給者によってＤＦＰ（ジイソプピルフルオロホスフェート）およびＥＧＲ−ｃｍｋで最初に予備処理された。ＦＸａ活性化反応物は、最終濃度１０μＭ  ＦＸ（Ａ２８０吸光度および吸光係数１．１６に基づく）で、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％ＰＥＧ８０００を含有する反応緩衝液ｐＨ  ８．１中、最終容量５０〜１００μＬに調製した。活性化は、Ｒｕｓｓｅｌｌ’ｓ  Ｖｉｐｅｒ  Ｖｅｎｏｍ（ＲＶＶ−Ｘａｓｅ；Ｈｅａｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）の最終濃度５μｇ／ｍＬ（反応物１００μＬ当たり９８μｇ／ｍＬ希釈物を５μＬ、または反応物５０μＬ当たり２．５μＬ）の３７℃、４５〜６０分間の活性化時間での添加によって開始した（１５分ごとに試料を採取することおよびＳｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ  ＦＸａ蛍光発生基質の切断における増加を検査することによって完全な活性化を表すことが既に決定されている）。反応を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＰＥＧ  ８０００を含有する１／１０容量のクエンチ緩衝液ｐＨ８．１でクエンチした。
【０４６４】
Ｂ．活性部位滴定
活性部位滴定アッセイを、０．４ｃｍｘ１ｃｍの石英キュベット中の反応容量１ｍＬで継続的に撹拌しながら実施した。反応物は、３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％  ＰＥＧ８０００を含有するアッセイ緩衝液ｐＨ７．４中に１００〜４００ｎＭの新鮮活性化ＦＸａおよび５μＭ  ＦＭＧＢを含有した。ＦＭＧＢを乾燥重量に基づいて保存濃度０．０１ＭでＤＭＦ中に調製し、濃度をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）における吸光係数１９，４９８Ｍ−１ｃｍ−１を用いて４５２ｎｍでの吸光分光法によって確認した。アッセイは１ｍＭ  ＦＭＧＢ（最終濃度５μＭ）５μＬを１×アッセイ緩衝液１ｍＬに添加することによって開始し、ＦＸａの最終濃度約１００〜４００ｎＭでの添加の前にＦＭＧＢのバックグラウンド加水分解を約１５０〜２００秒間最初に測定した。反応のバースト相におけるフルオレセイン蛍光の放出をさらに３６００秒間追跡した。
【０４６５】
ＦＸａによるＦＭＧＢの触媒作用に続いて放出されるフルオレセインの量は、遊離フルオレセインの標準曲線を用いて決定した。フルオレセイン標準溶液は保存濃度約７０〜１５０ｍＭでＤＭＦ中に新鮮調製し、正確な濃度を０．１Ｎ  ＮａＯＨにおける吸光係数８９，１２５Ｍ−１ｃｍ−１を用いる４９６ｎｍでの標準条件下の吸光分光法によって確認した。次いで遊離フルオレセインの標準曲線を吸光度較正済フルオレセイン標準物の１×アッセイ緩衝液への２０ｎＭから最終濃度２６０〜３００ｎＭへの滴定によって作成した。
【０４６６】
データ分析のために、反応トレースをＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅに導入し、自発的ＦＭＧＢ加水分解の初期測定速度の外挿によってバックグラウンド加水分解の寄与を曲線から減算した（典型的には総蛍光バーストの５％未満）。補正曲線を、Δ蛍光＝Ａｍｐ（１−ｅ−Ｋｔ）＋Ｂｔ［式中Ａｍｐ＝上に概説した飽和アッセイ条件下でのバースト相の振幅、Ｋはアシル酵素形成に関して観察された一次速度定数、およびＢはＦＭＧＢの完全代謝回転に関するバルク速度定数（ｂｕｌｋ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）である］の形の線形成分（脱アシル化の低速を表すため）を有する単一指数方程式（ｓｉｎｇｌｅ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｑｕａｔｉｏｎ）にフィットさせた。活性ＦＸａプロテアーゼの濃度を振幅に関するフィットパラメーターのフルオレセイン標準曲線との比較によって算出した。複数のアッセイから値を測定し、平均をとり、標準偏差を決定した。調製物中の活性ＦＸａの量は、ＦＩＸａによって活性化され得る保存調製物中のＦＸの濃度を直接表す。この活性部位滴定値を下の実施例４において記載する補因子依存アッセイ（ｃｏｆａｃｔｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｓｓａｙ）などの間接アッセイにおいて用いるＦＸの濃度を算出する場合に使用した。
【実施例３】
【０４６７】
ＦＩＸの活性化および活性部位滴定剤４−メチルウンベリフェリル−ｐ’−グアニジノベンゾエート（ＭＵＧＢ）を用いる触媒的に活性なプロテアーゼ（ＦＩＸａ）濃度の決定
第ＩＸ因子（ＦＩＸ）酵素前駆体の保存溶液中で触媒的に活性になり得るＦＩＸの濃度を、ＦＩＸ変異体を含むＦＩＸ試料の第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ；Ｈｅａｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）での活性化に続く、活性第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）の４−メチルウンベリフェリル−ｐ’グアニジノベンゾエート（ＭＵＧＢ）での滴定によって決定した。
【０４６８】
Ａ．ＦＩＸのＦＩＸａへの活性化
ＦＩＸポリペプチド調製物中の総タンパク質濃度を各変異体に固有の吸光係数（すなわち、ε２８０＝Ｔｒｙ残基数×１４９０＋Ｔｒｐ残基数×５５００＋Ｃｙｓ残基数×１２５）を用いてＡ２８０吸光度によって決定した。ＦＩＸのＦＩＸａへの活性化反応物を、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％ＰＥＧ  ８０００を含有する反応緩衝液ｐＨ  ８．１中の最終容量２００〜５００μＬに最終濃度１０μＭ  ＦＩＸで調製した。活性化は、３７℃、６０分間の活性化時間でのＦＩＸａまたはビオチン化ＦＸＩａの最終濃度２０ｎＭへの添加によって開始した。６０分間の活性化時間は、１５分ごとに試料を採取することおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって総切断をアッセイすることによって完全な活性化を表すことが予め決定されていた。
【０４６９】
次いで活性化反応において用いた遊離ＦＸＩａまたはビオチン化ＦＸＩａを、同じ結果をもたらす２つの方法（それぞれ９５〜９７％を超える触媒ＦＸＩａを除去する）の内の１つを用いて試料から除去した。遊離ＦＸＩａを除去するために用いた第一の方法では、ＦＸＩａで開始した活性化反応物を最終濃度５０ｎＭの抗ＦＸＩａモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ２０３７７）と６０分間、３７℃で混合した。遊離ＦＸＩａの抗体捕捉には、追加的１２０分間、室温での洗浄済ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｄｙｎａｌ  Ｂｅａｄｓ（３０ｍｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の最終濃度２５％容量：容量への添加が続いた。Ｄｙｎａｌ  Ｂｅａｄｓを製造者の説明書に従って溶液から除去した。ビオチン化ＦＸＩａを除去するために用いた第二の方法では、ビオチン化ＦＸＩａを用いた活性化反応物を、最終濃度１０％容量：容量のＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｅ  Ｄｙｎａｌ  Ｂｅａｄｓ（１０ｍｇ／ｍＬ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と６０分間、室温で混合した。次いでＤｙｎａｌ  Ｂｅａｄｓを製造者の説明書に従って除去した。ＦＸＩａの除去に続いて、活性化ＦＩＸａ試料の総タンパク質濃度を各変異体に固有の吸光係数（上に記載のとおり）を用いてＡ２８０吸光度によって決定した。
【０４７０】
Ｂ．ＦＩＸａの活性部位滴定
活性化保存溶液中の触媒的に活性なＦＩＸａの濃度を、ＦＩＸａ試料を蛍光発生エステル基質、４−メチルウンベリフェリル−ｐ’−グアニジノベンゾエート（ＭＵＧＢ）での滴定によって決定した。原則的な滴定アッセイは、ＭＵＧＢのＦＩＸａとの緩徐な反応性を考慮するためのいくつかの若干の変更を伴って本質的にPayne et al.（Biochemistry(1996)35:7100-7106）によって記載のとおり実施した。ＭＵＧＢはＦＩＸａと直ちに反応し（しかしＦＩＸまたは不活性プロテアーゼとは反応せず）、ＭＵＧＢ濃度が飽和しており、脱アシル化が特に遅く、触媒作用の律速である条件下で事実上安定なアシル−酵素中間体を形成する。これらの条件下でＦＩＸａプロテアーゼは、一回の触媒代謝回転を受け、４−メチルウンベリフェロンフルオロフォア（４−ＭＵ）を放出する。蛍光の最初のバーストを４−ＭＵ蛍光の外部濃度標準曲線で較正すると、活性部位の濃度を算出できる。
【０４７１】
アッセイを、０．４ｃｍｘ１ｃｍの石英キュベット中の反応容量１ｍＬで継続的に撹拌しながら５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．１％  ＰＥＧ８０００を含有するアッセイ緩衝液ｐＨ７．６で実施した。ＭＵＧＢを乾燥重量に基づいて保存濃度０．０４ＭでＤＭＳＯ中に調製し、ＤＭＳＯ中２ｍＭの実施濃度に希釈した。滴定アッセイを１×アッセイ緩衝液に２ｍＭ  ＭＵＧＢ  ４μＬを最終濃度８μＭで添加することによって開始し、ＦＩＸａまたはＦＩＸａ変異体の最終濃度約１００〜２００ｎＭ（ＦＸＩａ除去後に活性化反応物について決定した総タンパク質濃度に基づく）での添加の前にＭＵＧＢのバックグラウンド加水分解を最初に約２００〜３００秒間測定した。反応のバースト相における４−ＭＵ蛍光の放出を初期バーストおよび続く定常状態相から十分なデータを得るために合計２時間追跡した。
【０４７２】
ＦＩＸａによるＭＵＧＢの触媒作用に続いて放出される４−ＭＵの量を４−ＭＵの標準曲線を用いて決定した。４−ＭＵ標準溶液はＤＭＳＯ中に０．５Ｍの保存濃度で調製し、濃度を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ９．０における吸光係数１９，０００Ｍ−１ｃｍ−１を用いる３６０ｎｍでの吸光分光法によって確認した。遊離４−ＭＵの標準曲線を吸光度較正済４−ＭＵの１×アッセイ緩衝液への２０ｎＭから最終濃度２６０〜３００ｎＭ  ４−ＭＵへの滴定によって作成した。
【０４７３】
データ分析のために、反応トレースをＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅに導入し、自発的ＭＵＧＢ加水分解の初期測定速度の外挿によってバックグラウンド加水分解の寄与を曲線から減算した（典型的には総蛍光バーストの５％未満）。補正された曲線を、Δ蛍光＝Ａｍｐ（１−ｅ−Ｋｔ）＋Ｂｔ（式中Ａｍｐ＝上に概説した飽和アッセイ条件下でのバースト相の振幅、Ｋはアシル酵素形成に関して観察された一次速度定数、およびＢはＭＵＧＢの完全代謝回転に関するバルク速度定数である）の形の線形成分（定常状態相における脱アシル化の低速を表すため）を有する単一指数方程式にフィットさせた。活性ＦＩＸａプロテアーゼの濃度を振幅に関するフィットパラメーターの４−ＭＵ標準曲線との比較によって算出した。複数のアッセイから値を測定し、平均をとり、標準偏差を決定した。次いで活性化され得る保存溶液中のＦＩＸ酵素前駆体の濃度を、ＦＩＸ酵素前駆体のＡ２８０決定総濃度に、完全に活性化された試料に関して実験的に決定された活性割合値（ｆｒａｃｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖｅ  ｖａｌｕｅ）（活性ＦＩＸａの濃度／ＦＩＸａの総濃度）を掛けることによって決定した。
【実施例４】
【０４７４】
基質、第Ｘ因子に対するＦＩＸａの触媒活性の決定
基質、第Ｘ因子（ＦＸ）に対するＦＩＸａ変異体の触媒活性を、合成基質Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ  ＦＸａについて、ＦＩＸａによる活性化において生成されるＦＸａの活性をアッセイすることによる蛍光発生アッセイにおいて間接的に評価した。活性化プロテアーゼ（ＦＩＸａ）の濃度より基質プロテアーゼ（ＦＸ）が少なくとも１０００倍を超えて過剰であった場合の動力学的速度定数を算出するために様々なＦＸ濃度を用いた。簡潔には活性化され、活性部位滴定されたＦＩＸａを組換えＦＶＩＩＩ、リン脂質小胞およびアルファ−トロンビン（ＦＶＩＩＩをＦＶＩＩＩａに活性化する）を含むカルシウム含有緩衝液中でインキュベートし、テナーゼ（Ｘａｓｅ）複合体を形成させた。次にアッセイ開始前にアルファ−トロンビンの活性を高度に特異的なトロンビン阻害物質、ヒルジンの添加によってクエンチした。ＦＩＸａ変異体（Ｘａｓｅ複合体の部分として）を次にアッセイを開始するために様々な濃度のＦＸおよび蛍光基質Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ  ＦＸａ（ＣＨ３ＳＯ２−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）と混合した。ＦＸａによるＳｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ  ＦＸａの触媒作用に続く遊離フルオロフォア、ＡＭＣ（７−アミノ−４−メチルクマリン）の放出を次に一定期間連続的に評価し、ＦＩＸａ変異体の動力学的速度定数を決定した。
【０４７５】
Ａ．アッセイプロトコール
ＦＶＩＩＩａおよびリン脂質の存在下でのＦＩＸａによるＦＸ活性化の動力学的速度を評価するアッセイのために、最初に組換えＦＶＩＩＩ（Ｋｏｇｅｎａｔｅ  ＦＳ（登録商標）；  Ｂａｙｅｒ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を製造者の説明書に従って添付の希釈剤５ｍＬ中に懸濁した。次いでＦＶＩＩＩのモル濃度を吸光係数１．５６７ｍｇ−１ｍＬ  ｃｍ−１および分子量１６３．６ｋＤａを用いて２８０ｎｍでの吸光度によって決定した。ＦＩＸ変異体を上の実施例１〜３において記載されるとおり発現、精製、活性化および活性部位滴定した。次いでＦＩＸａ変異体を１×緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  ＣａＣｌ２／０．１％ＢＳＡ／０．１％ＰＥＧ−８０００、ｐＨ７．４）２００μＬ容量中へ１６ｐＭの濃度に系列希釈した。ＦＩＸａおよびリン脂質の存在下でのＦＶＩＩＩのＦＶＩＩＩａへの活性化のための調製物において、アルファ−トロンビン（Ｈｅａｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）およびヒルジン（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）をそれぞれ１×緩衝液Ａ  １．０ｍＬ容量中へ６４ｎＭおよび６４０ｎＭにそれぞれ希釈した。再構成ＦＶＩＩＩを、２６７μＭの新鮮再懸濁リン脂質（７５％ホスファチジルコリン（ＰＣ）／２５％ホスファチジルセリン（ＰＳ）；ＰＳ／ＰＣ小胞直径約１２０ｎｍ；Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を含有する１×緩衝液Ａ  １０ｍＬ容量中へ濃度２６７ｎＭにさらに希釈した。上のＦＶＩＩＩ／ＰＣ／ＰＳ溶液６００μＬと１６ｐＭ野生型ＦＩＸａまたはＦＩＸａ変異体希釈物１００μＬおよび６４ｎＭアルファ−トロンビン溶液５０μＬとを混合し、続いて１５分間、２５℃でのインキュベーションによってＦＶＩＩＩをＦＶＩＩＩａに活性化した。次にＦＸ活性化についての動力学的アッセイを開始する前に活性化反応を上の６４０ｎＭヒルジン溶液５０μＬの５分間、２５℃での添加によってクエンチした。Ｘａｓｅ複合体溶液８００μＬ中の試薬の最終濃度は、以下のとおりであった：２ｐＭ  ＦＩＸａ変異体、２００ｎＭ  ＦＶＩＩＩａ、２００μＭ  ＰＣ／ＰＳ小胞、４ｎＭアルファ−トロンビン（阻害済）および４０ｎＭヒルジン。
【０４７６】
各Ｘａｓｅ複合体溶液（ＦＩＸａ／ＦＶＩＩＩａ／リン脂質／Ｃａ２＋）合計２５μＬを予め定義したプレートマップ（ＦＩＸａ変異体４種／プレート）に従って９６ウエルハーフエリア黒色アッセイプレートに分注した。活性部位滴定し、ＤＦＰ／ＥＧＲ−ｃｍｋ処理したＦＸ（上の実施例２を参照されたい）の９００ｎＭ溶液を１．０ｍＭ  Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ  Ｘａ基質を含有する１×緩衝液Ａ  ５．６ｍｌ中に調製した。これは、検査したＦＸの最高濃度および４種のアッセイのための十分な容量を表した。次いでＦＸ／Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ  Ｘａ溶液を１．０ｍＭ  Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ  Ｘａを含有する１×緩衝液Ａ  最終容量２．５ｍｌで８チャネルディープウエルポリプロピレンプレート中に１．８倍系列希釈し、９００ｎＭ、５００ｎＭ、２７７．８ｎＭ、１５４．３ｎＭ、８５．７ｎＭ、４７．６ｎＭ、２５．６ｎＭおよび０ｎＭ  ＦＸの最終希釈物を得た。代替的にいくつかのアッセイにおいては、ＦＸ／Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ  Ｘａ溶液を１．０ｍＭ  Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ  Ｘａを含有する１×緩衝液Ａ  最終容量２．５ｍｌで１２チャネルディープウエルポリプロピレンプレート中に１．５倍系列希釈し、９００ｎＭ、６００ｎＭ、４００ｎＭ、２６６．７ｎＭ、１７７．８ｎＭ、１１８．５ｎＭ、７９．０ｎＭ、５２．７ｎＭ、３５．１ｎＭ、２３．４ｎＭ、１５．６ｎＭおよび０ｎＭ  ＦＸの最終希釈物を得た。典型的にはアッセイ反応は、ＦＸ／Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ  Ｘａ希釈物２５μＬを、各ＦＩＸａ変異体（Ｘａｓｅ複合体）２５μＬを含む４つのアッセイプレートに分配するようにプログラムしたＢｉｏＭｅｋ  ＦＸ  ｌｉｑｕｉｄ  ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いて開始した。アッセイにおける試薬の最終濃度は、次のとおりであった：１ｐＭ  ＦＩＸａ、１００ｎＭ  ＦＶＩＩＩａ、１００μＭ  ＰＣ／ＰＳ小胞、０．５ｍＭ  Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ  Ｘａ、２ｎＭアルファ−トロンビン（阻害済）、２０ｎＭヒルジンおよび０ｎＭから４５０ｎＭのＦＸ希釈物。反応をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒにおいて３０分間、３７℃でモニターした。遊離ＡＭＣの標準曲線を０μＭから１００μＭ  ＡＭＣに及ぶ用量範囲を用いる続くデータ分析計算においてＲＦＵからμＭへの変換係数として利用した。
【０４７７】
Ｂ．データ分析
ＦＩＸａによるＦＸの触媒作用の定常状態動力学を決定するために用いる全ての方程式は、参考文献Petersen,et al.(1985)Biochem.J.225:149-158の“Zymogen-Activation Kinetics:Modulatory effects of trans-4-(aminomethyl)cyclohexane-1-carboxylic acid and poly-D-lysine on plasminogen activation”に記載されたものに基づく。スキームＡ（下を参照されたい）に記載した系の定常状態動力学に関する理論は、産物の放物型蓄積（ｐａｒａｂｏｌｉｃ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）を表す方程式（１）の表現によって記載される。
【０４７８】
【化１】
0006027221.tif 000040
【０４７９】
スキームＡの機序により、ａ０は活性化プロテアーゼ（ＦＩＸａ）の濃度であり、ｚ０は酵素前駆体（ＦＸ）の濃度であり、ＫａおよびＫｚは酵素前駆体の活性酵素（ＦＸａ）への活性化因子触媒転換に関するＫｃａｔおよびＫＭを示し、ＫｅおよびＫＳは所与の時間ｔにわたるＦＸａによる基質から産物への転換に関するＫｃａｔおよびＫＭを示す：
方程式（１）
【０４８０】
【数１】
0006027221.tif 000041
プログレス曲線の分析のために方程式（１）を、蛍光発生基質のＦｘａ加水分解の定常状態動力学を非依存的に決定し、化合物定数Ｋ２に置き換えた方程式（２）の形に再計算した。
方程式（２）
【０４８１】
【数２】
0006027221.tif 000042
１×緩衝液Ａ中のＳｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒ  ＦＸａでのＦＸａ活性が３１３．０μＭのＫＭおよび１４６．４ｓ−１のＫｃａｔ値を有すると非依存的に決定した。これらの値の方程式（３）への代入は、９０ｓ−１のＫ２補正係数を与えた。
方程式（３）
【０４８２】
【数３】
0006027221.tif 000043
【０４８３】
ＦＩＸａ触媒活性の程度を決定するために、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で集めた生データを．ＸＭＬファイルまたは．ＴＸＴファイルとして出力した。さらなる非線形データ分析を自動化曲線フィッテイングおよびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ｓｐｒｅａｄｓｈｅｅｔ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＩＤＢＳ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）での統計分析のためのソフトウェアパッケージＸＬｆｉｔ４で実施、またはＸＥ  Ｒｕｎｎｅｒ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｍｏｄｕｌｅ（ＩＤＢＳ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いるＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅで直接実施した。集計表テンプレートを、各ＦＸ濃度で検査したＦＩＸａ変異体の放物型反応速度（ｐａｒａｂｏｌｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｖｅｌｏｃｉｔｉｅｓ）（μＭ／秒２）を方程式（４）に示す標準直角双曲線の関数（すなわちミカエリスメンテン方程式）に自動的にフィットするように設定し、ＶｍａｘおよびＫＭについてのフィット値を得た。
方程式（４）
【０４８４】
【数４】
0006027221.tif 000044
次いで検査したＦＩＸａ変異体についてのＫｃａｔ値を方程式（５）によるＶｍａｘ（μＭ／秒２）に対するフィット値から算出した。
方程式（５）
【０４８５】
【数５】
0006027221.tif 000045
特異的定数Ｋｃａｔ／ＫＭをＫＭのフィット値および（上の方程式（５）の計算から生じる）算出されたＫｃａｔから直接算出した。
【０４８６】
表１４〜１９は、アッセイしたＦＩＸａ変異体それぞれについての触媒活性を記載する。同様にアッセイしたのは組換え野生型ＦＩＸａ（Ｃａｔａｌｙｓｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＷＴと称する；上の実施例１に記載のとおり生成した）、血漿精製ＦＩＸａ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）およびＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）［Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）、Ｗｙｅｔｈ］であった。表１４〜１５は、触媒活性についての動力学的定数Ｋｃａｔ／ＫＭ（Ｍ−１ｓ−１）としておよび野生型ＦＩＸａの活性の百分率として［活性は各ＦＩＸａ変異体のその基質、ＦＸに対する触媒活性、Ｋｃａｔ／ＫＭ（Ｍ−１ｓ−１）である］表した結果を示す。個々の速度定数ＫｃａｔおよびＫＭを表１６〜１７および表１８〜１９にそれぞれ示す。表１５、１７および１９は追加的ＦＩＸａ変異体についてのデータを示し、表１４、１６および１８におけるＦＩＸａ変異体についての追加的反復実験（ｎ）を含んで算出された新たな総平均を提供する。ＦＩＸａ変異体の活性を野生型ＦＩＸａと比較する場合は、活性におけるいかなる差異も突然変異（複数可）の結果であり、たとえば異なる発現系に関連する翻訳後修飾における差異の結果ではないことを確実にするために変異体ＦＩＸａポリペプチドについて用いたのと同じ条件を用いて発現および精製した組換え野生型ＦＩＸａポリペプチドと比較した。したがって比較に用いた野生型ＦＩＸａポリペプチドは、配列番号１において記載されるＦＩＸ遺伝子のクローニングから生成され、ＣＨＯＸ細胞から配列番号３において記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとして発現された実施例１において記載される組換え野生型ＦＩＸａ（すなわちＣａｔａｌｙｓｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＷＴ  ＦＩＸ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）であった。標準偏差（Ｓ．Ｄ．）、変動係数（百分率として；％ＣＶ）および実施アッセイ数（ｎ）も各動力学的パラメーターについて提供する。
【０４８７】
ＦＩＸａ変異体の観察された触媒活性は、いくつかの変異体（たとえば、ＦＩＸａ−Ｆ３１４Ｎ／Ｈ３１５Ｓ、ＦＩＸａ−Ｇ３１７Ｎ、ＦＩＸａ−Ｒ３１８Ｎ／Ａ３２０ＳおよびＦＩＸａ−Ｋ４００Ｅ／Ｒ４０３Ｅ）での検出不可能なＸａｓｅ活性から、野生型ＦＩＸａと比較してＦＸの活性化についてのＫｃａｔ／ＫＭにおける１０倍を超える増加までの範囲であった。触媒活性における最も大きな増加のいくつかを示したＦＩＸａ−Ｒ３３８Ｅ、ＦＩＸａ−Ｒ３３８Ａ、ＦＩＸａ−Ｔ３４３Ｒ、ＦＩＸａ−Ｅ４１０Ｎならびに、これらの組合せＦＩＸａ−Ｒ３１８Ｙ／Ｒ３３８Ｅ／Ｅ４１０Ｎ、ＦＩＸａ−Ｒ３１８Ｙ／Ｒ３３８Ｅ／Ｒ４０２Ｅ／Ｅ４１０Ｎ、ＦＩＸａ−Ｒ３１８Ｙ／Ｒ３３８Ｅ／Ｔ３４３Ｒ／Ｒ４０２Ｅ／Ｅ４１０Ｎ、ＦＩＸａ−Ｒ３１８Ｙ／Ｒ３３８Ｅ／Ｔ３４３Ｒ／Ｅ４１０ＮおよびＦＩＸａ−Ｒ３３８Ｅ／Ｔ３４３Ｒなどを含むいくつかの変異体は、野生型ＦＩＸａと比較して顕著に増加した触媒活性を示した。単一または複数の追加的グリコシル化部位を有するいくつかのＦＩＸａ変異体は野生型活性に近いもの（たとえばＦＩＸａ−Ｉ２５１Ｓ、ＦＩＸａ−Ｄ８５Ｎ／Ｉ２５１Ｓ、ＦＩＸａ−Ｋ６３Ｎ、ＦＩＸａ−Ｋ２４７Ｎ／Ｎ２４９ＳおよびＦＩＸａ−Ｋ６３Ｎ／Ｋ２４７Ｎ／Ｎ２４９Ｓ）または、他の突然変異と組み合わされた場合に改善された活性（たとえばＦＩＸａ−Ｋ２４７Ｎ／Ｎ２４９Ｓ／Ｒ３３８Ｅ／Ｔ３４３Ｒ／Ｒ４０３ＥおよびＦＩＸａ−Ｋ２４７Ｎ／Ｎ２４９Ｓ／Ｒ３１８Ｙ／Ｒ３３８Ｅ／Ｔ３４３Ｒ／Ｒ４０３Ｅ／Ｅ４１０Ｎ）を示したが、他は低下した触媒活性を示した。増加した触媒活性は、ＫｃａｔもしくはＫＭまたはより頻繁には両方のパラメーターにおける改善のためであった。
【０４８８】
表14. FIXa変異体の触媒活性(Ｋcat/ＫM)
【表１４−１】
0006027221.tif 000046
【表１４−２】
0006027221.tif 000047
【表１４−３】
0006027221.tif 000048
【表１４−４】
0006027221.tif 000049
【表１４−５】
0006027221.tif 000050
【表１４−６】
0006027221.tif 000051
【表１４−７】
0006027221.tif 000052
【表１４−８】
0006027221.tif 000053
【表１４−９】
0006027221.tif 000054
【表１４−１０】
0006027221.tif 000055
†BHK-21細胞において産生；＊E410Nの80％グリコシル化形態
【０４８９】
表15. FIXa変異体の触媒活性(Ｋcat/ＫM)
【表１５−１】
0006027221.tif 000056
【表１５−２】
0006027221.tif 000057
【表１５−３】
0006027221.tif 000058
【表１５−４】
0006027221.tif 000059
【表１５−５】
0006027221.tif 000060
【表１５−６】
0006027221.tif 000061
【表１５−７】
0006027221.tif 000062
【表１５−８】
0006027221.tif 000063
【表１５−９】
0006027221.tif 000064
【表１５−１０】
0006027221.tif 000065
【表１５−１１】
0006027221.tif 000066
【表１５−１２】
0006027221.tif 000067
【表１５−１３】
0006027221.tif 000068
【表１５−１４】
0006027221.tif 000069
【表１５−１５】
0006027221.tif 000070
【表１５−１６】
0006027221.tif 000071
【表１５−１７】
0006027221.tif 000072
【表１５−１８】
0006027221.tif 000073
【表１５−１９】
0006027221.tif 000074
†BHK-21細胞において産生；＊E410Nの80％グリコシル化形態
【０４９０】
表16. FIXa変異体の触媒活性(Ｋcat)
【表１６−１】
0006027221.tif 000075
【表１６−２】
0006027221.tif 000076
【表１６−３】
0006027221.tif 000077
【表１６−４】
0006027221.tif 000078
【表１６−５】
0006027221.tif 000079
【表１６−６】
0006027221.tif 000080
【表１６−７】
0006027221.tif 000081
【表１６−８】
0006027221.tif 000082
【表１６−９】
0006027221.tif 000083
†BHK-21細胞において産生；＊E410Nの80％グリコシル化形態
【０４９１】
表17. FIXa変異体の触媒活性(Ｋcat)
【表１７−１】
0006027221.tif 000084
【表１７−２】
0006027221.tif 000085
【表１７−３】
0006027221.tif 000086
【表１７−４】
0006027221.tif 000087
【表１７−５】
0006027221.tif 000088
【表１７−６】
0006027221.tif 000089
【表１７−７】
0006027221.tif 000090
【表１７−８】
0006027221.tif 000091
【表１７−９】
0006027221.tif 000092
【表１７−１０】
0006027221.tif 000093
【表１７−１１】
0006027221.tif 000094
【表１７−１２】
0006027221.tif 000095
【表１７−１３】
0006027221.tif 000096
【表１７−１４】
0006027221.tif 000097
【表１７−１５】
0006027221.tif 000098
【表１７−１６】
0006027221.tif 000099
【表１７−１７】
0006027221.tif 000100
【表１７−１８】
0006027221.tif 000101
†BHK-21細胞において産生；＊E410Nの80％グリコシル化形態
【０４９２】
表18. FIXa変異体の触媒活性(ＫM)
【表１８−１】
0006027221.tif 000102
【表１８−２】
0006027221.tif 000103
【表１８−３】
0006027221.tif 000104
【表１８−４】
0006027221.tif 000105
【表１８−５】
0006027221.tif 000106
【表１８−６】
0006027221.tif 000107
【表１８−７】
0006027221.tif 000108
【表１８−８】
0006027221.tif 000109
【表１８−９】
0006027221.tif 000110
【表１８−１０】
0006027221.tif 000111
【表１８−１１】
0006027221.tif 000112
【表１８−１２】
0006027221.tif 000113
【表１８−１３】
0006027221.tif 000114
【表１８−１４】
0006027221.tif 000115
†BHK-21細胞において産生；＊E410Nの80％グリコシル化形態
【０４９３】
表19. FIXa変異体の触媒活性(ＫM)
【表１９−１】
0006027221.tif 000116
【表１９−２】
0006027221.tif 000117
【表１９−３】
0006027221.tif 000118
【表１９−４】
0006027221.tif 000119
【表１９−５】
0006027221.tif 000120
【表１９−６】
0006027221.tif 000121
【表１９−７】
0006027221.tif 000122
【表１９−８】
0006027221.tif 000123
【表１９−９】
0006027221.tif 000124
【表１９−１０】
0006027221.tif 000125
【表１９−１１】
0006027221.tif 000126
【表１９−１２】
0006027221.tif 000127
【表１９−１３】
0006027221.tif 000128
【表１９−１４】
0006027221.tif 000129
【表１９−１５】
0006027221.tif 000130
【表１９−１６】
0006027221.tif 000131
【表１９−１７】
0006027221.tif 000132
【表１９−１８】
0006027221.tif 000133
【表１９−１９】
0006027221.tif 000134
【表１９−２０】
0006027221.tif 000135
【表１９−２１】
0006027221.tif 000136
【表１９−２２】
0006027221.tif 000137
【表１９−２３】
0006027221.tif 000138
†BHK-21細胞において産生；＊E410Nの80％グリコシル化形態
【実施例５】
【０４９４】
アンチトロンビン／ヘパリン複合体によるＦＩＸａの阻害の決定
アンチトロンビン／ヘパリン複合体（ＡＴ−ＩＩＩ／へパリン）による野生型ＦＩＸａまたはＦＩＸａ変異体の阻害を、小分子基質、メシル−Ｄ−ＣＨＧ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ  ＦＩＸａ；Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ）に対するＦＩＸａの触媒活性についての種々の濃度のＡＴ−ＩＩＩ／へパリンによる阻害のレベルを測定することによって評価した。予め定義されたアッセイ条件下でＦＩＸａ変異体の触媒活性の５０％阻害（ＩＣ５０）のために必要であったＡＴ−ＩＩＩのモル濃度に相当するＫ０．５値を検査した各ＦＩＸａ変異体について決定する。阻害反応を低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）または全長未分画ヘパリン（ＵＦＨ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の存在下で実施した、後者は阻害速度の増加を考慮して変更したプロトコール条件を必要とする。ＡＴ−ＩＩＩ／ＵＦＨ複合体による野生型ＦＩＸａまたはＦＩＸａ変異体の阻害についての見かけの二次速度定数（Ｋａｐｐ）も変更したプロトコール（ＡＴ−ＩＩＩ／ＵＦＨ複合体とのインキュベーション時間を変更した）を用いて直接評価した。
【０４９５】
Ａ．アンチトロンビン／ＬＭＷＨ複合体によるＦＩＸａの阻害
ＬＭＷＨ存在下での阻害反応のために、１×緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）１．２ｍＬ容量中の２μＭ  ＬＭＷＨの溶液中への血漿精製ヒトＡＴ−ＩＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）の２０μＭ保存物の希釈によってＡＴ−ＩＩＩ／ＬＭＷＨ（最終２μＭ  ＬＭＷＨ）の２００ｎＭ溶液を調製した。ＡＴ−ＩＩＩ／ＬＭＷＨのこの溶液をアッセイにおける最高濃度として用いた。ＡＴ−ＩＩＩ／ＬＭＷＨ溶液を少なくとも３０分間、室温でインキュベートし、次いで２μＭ  ＬＭＷＨを含有する１×緩衝液Ａの最終容量４００μＬで９６ディープウエルポリプロピレンプレート中に１．５倍系列希釈し、２００ｎＭ、１３３．３ｎＭ、８８．９ｎＭ、５９．３ｎＭ、３９．５ｎＭ、２６．３ｎＭ、１７．６ｎＭおよび０ｎＭ（すなわちＡ−Ｈ列）の希釈物を得た。合計２５μＬを９６ウエルＶ底保存プレートのそれらそれぞれの列に分注し、全ての行（すなわち１〜１２）を満たした。ＦＩＸａ変異体を最初に１×緩衝液Ａ中に１００ｎＭへ希釈した。次に各１００ｎＭ  ＦＩＸａ変異体３６μＬを１×緩衝液Ａ  ２ｍＬ中、１．８ｎＭの濃度へ希釈し、次いで予め定義したプレートマップ（プレート１枚当たりＦＩＸａ変異体４種）に従ってこの溶液６０μＬを９６ウエルＶ底保存プレートに分注した。
【０４９６】
アッセイ反応は、各ＦＩＸａ変異体に対して計２枚の重複アッセイプレートにおいて１ウエル当たりＡＴ−ＩＩＩ／ＬＭＷＨの各希釈物２５μＬを含有するプレートにＦＩＸａ溶液２５μＬを分配するようにプログラムしたＢｉｏＭｅｋ  ＦＸ  ｌｉｑｕｉｄ  ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いて開始した。最終阻害アッセイ条件は：０．９ｎＭ  ＦＩＸａおよび、１μＭ  ＬＭＷＨ中の０から１００ｎＭまでの範囲のＡＴ−ＩＩＩ希釈物であった。反応物２５μＬアリコートを、アッセイ緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４、６０％エチレングリコール）中に１．６ｍＭメシル−Ｄ−ＣＨＧ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣを１ウエル当たり２５μＬ含有する９６ウエル黒色ハーフエリアプレートにＢｉｏＭｅｋ  ＦＸによって移す前に、阻害反応物を１分間、室温（約２５℃）でさらにインキュベートした。最終濃度５ｍｇ／ｍＬのポリブレン（ヘキサジメトリンブロミド）をＡＴ−ＩＩＩ／ＬＭＷＨ反応をクエンチするために緩衝液Ｂに添加した。ＦＩＸａの残存活性を２５℃に設定した蛍光読み取り装置において基質切断の初速度を６０分間追跡することによって評価した。残存活性の決定のための最終アッセイ条件は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４中の０．４５ｎＭ  ＦＩＸａ変異体、０．８ｍＭメシル−Ｄ−ＣＨＧ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、３０％エチレングリコールおよび５ｍｇ／ｍＬポリブレンである。
【０４９７】
ＡＴ−ＩＩＩ／ＬＭＷＨによるＦＩＸａまたはＦＩＸａ変異体に対する阻害の程度を決定するために、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で集めた生データを．ＸＭＬファイルとして出力した。さらなる非線形データ分析を、自動化曲線フィッテイングおよびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ｓｐｒｅａｄｓｈｅｅｔ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＩＤＢＳ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）での統計分析のためのソフトウェアパッケージＸＬｆｉｔ４で実施した、またはＸＥ  Ｒｕｎｎｅｒ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｍｏｄｕｌｅ（ＩＤＢＳ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いるＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅで直接実施した。テンプレートを、各実験ＡＴ−ＩＩＩ濃度で各ＦＩＸａ反復についてのＡＴ−ＩＩＩ希釈系列、ＡＴ−ＩＩＩのＦＩＸａに対する比およびＶｉ／Ｖｏ比を算出するために用いた。集計表テンプレートを、各実験ＡＴ−ＩＩＩ濃度で各ＦＩＸａ反復についてのＡＴ−ＩＩＩ希釈系列、ＡＴ−ＩＩＩのＦＩＸａに対する比およびＶｉ／Ｖｏ比を算出するために用いた。残存ＦＩＸａ活性（Ｖｉ／Ｖｏとして表す）対ＡＴ−ＩＩＩ濃度の非線形回帰分析をＸＬｆｉｔ４ならびに、（（Ｃ＋（Ａｍｐ＊（１−（Ｘ／（Ｋ０．５＋Ｘ）））））；式中Ｃ＝オフセット（アッセイの経過において１００％阻害に達しないデータセットの外挿を可能にするために０に固定）、Ａｍｐ＝フィットおよびＫ０．５の振幅（アッセイ条件下で最大半量の阻害のために必要なＡＴ−ＩＩＩの濃度に相当する）、の形の双曲線阻害方程式を用いて処理した。いくつかのＦＩＸａ変異体について、ＡＴ−ＩＩＩ／ＬＭＷＨはＡＴ−ＩＩＩの検査した最高濃度で総プロテアーゼ活性の１０〜１５％未満を阻害し、標準スクリーニング条件下でのアッセイについて検出の上限を表している。したがって１０％未満の最大阻害を有する変異体は、９９９ｎＭの下限Ｋ０．５値に帰され、ほとんどの場合は報告された値より大きなＡＴ−ＩＩＩ抵抗性を有すると予測される。
【０４９８】
表２０は、ＡＴ−ＩＩＩ／ＬＭＷＨを用いて実施したアッセイの結果を提供する。結果は、フィトされたＫ０．５パラメーターとしておよび、野生型ＦＩＸａと比較した各変異体についてのＡＴ−ＩＩＩ抵抗性の程度をフィットされたＫ０．５値の比（Ｋ０．５変異体／Ｋ０．５野生型）として表す表現としての両方で表す。ＦＩＸａ変異体のＫ０．５パラメーターを野生型ＦＩＸａと比較する場合、活性におけるいかなる差異も突然変異（複数可）の結果であり、たとえば異なる発現系に関連する翻訳後修飾における差異の結果ではないことを確実にするために変異体ＦＩＸａポリペプチドについて用いたのと同じ条件を用いて発現および精製した組換え野生型ＦＩＸａポリペプチドと比較した。したがって比較に用いた野生型ＦＩＸａポリペプチドは、配列番号１において記載されるＦＩＸ遺伝子のクローニングから生成され、配列番号３において記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとしてＣＨＯＸ細胞から発現された実施例１において記載される組換え野生型ＦＩＸａ（すなわちＣａｔａｌｙｓｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＷＴ  ＦＩＸ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）であった。いくつかのＦＩＸａ変異体は、野生型ＦＩＸａ（Ｃａｔａｌｙｓｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＷＴ  ＦＩＸａ）と比較して２０倍を超えて増加したＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性を示した。たとえばＦＩＸａ−Ｒ３１８Ａ／Ｒ４０３Ａ、ＦＩＸａ−Ｒ３１８Ｅ／Ｒ３４０Ｅ、ＦＩＸａ−Ｒ３１８Ａ、ＦＩＸａ−Ｒ３１８Ｅ、ＦＩＸａ−Ｋ４００Ｅ、ＦＩＸａ−Ｒ３３８Ｅ／Ｒ４０３ＥおよびＦＩＸａ−Ｋ４００Ａ／Ｒ４０３Ａは、ＡＴ−ＩＩＩに顕著な抵抗性を示す群に含まれる。
【０４９９】
表20. AT-III/LMWHによるFIXa変異体の阻害
【表２０−１】
0006027221.tif 000139
【表２０−２】
0006027221.tif 000140
【表２０−３】
0006027221.tif 000141
＊A 999nMのＫ0.5値は、アッセイ条件下で10%未満の阻害を有するこれらの変異体についての下限値を示す。
【０５００】
Ｂ．アンチトロンビン／ＵＦＨ複合体によるＦＩＸａの阻害
ＡＴ−ＩＩＩ／ＵＦＨ複合体（未分画全長ヘパリン）によるＦＩＸａ変異体の阻害を評価するために上に記載したのと同じアッセイを若干の変更を伴って用いて追加的実験を実施した。全長、未分画ヘパリン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、長いヘパリン鎖によって提供される「鋳型」効果によるＦＩＸａ変異体突然変異の阻害反応の速度増加への影響を観察するために低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）の代わりに用いた[たとえばOlson et al.(2004)Thromb Haemost 92(5),929-939を参照されたい]。
【０５０１】
ＵＦＨの存在下での阻害反応のために、ＡＴ−ＩＩＩ／ＵＦＨ（最終１μＭ  ＵＦＨ）の７０ｎＭ、６００ｎＭ、２０００ｎＭ、６０００または１００００ｎＭ溶液を、１×緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）１．４ｍＬ中の過剰量ＵＦＨ（２から２０μＭ）溶液中への血漿精製ヒトＡＴ−ＩＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）２０μＭ保存物の希釈によって調製した。ＡＴ−ＩＩＩ／ＵＦＨ溶液も、１μＭ  ＵＦＨを含有する１×緩衝液Ａの最終容量４６０μＬで９６ウエルディープウエルポリプロピレンプレートにおいて１．５倍系列希釈する前に３０分間、室温でインキュベートした。変更したアッセイのためのＡＴ−ＩＩＩの最終希釈は、ＡＴ−ＩＩＩの開始濃度に依存して、７０ｎＭ〜０ｎＭ、６００ｎＭ〜０ｎＭ、１００ｎＭ〜０ｎＭまたは５０００ｎＭ〜０ｎＭ（すなわち列Ａ〜Ｈ）の範囲であった。標準条件下でＡＴ−ＩＩＩ阻害への増加した抵抗性を示したこれらの変異体を、さらに高い濃度のＡＴ−ＩＩＩを用いてさらに検査した。各ＡＴ−ＩＩＩ希釈物の合計３５μＬを９６ウエルＶ底保存プレートのそれらそれぞれの列に全ての行を満たすように（すなわち１〜１２）分注した。ＦＩＸａ変異体を１×緩衝液Ａ中に１００ｎＭに最初に希釈した。次に各１００ｎＭ  ＦＩＸａ変異体の１５μＬを１×緩衝液Ａ  ２．０ｍＬ中で濃度０．６ｎＭへ希釈し、次いで同様に予め定義したプレートマップ（プレート１枚当たりＦＩＸａ変異体４種）に従ってこの溶液７０μＬを９６ウエルＶ底保存プレートに分注した。
【０５０２】
アッセイ反応は、各ＦＩＸａ変異体に対して計２枚の重複アッセイプレートにおいて１ウエル当たりＡＴ−ＩＩＩ／ＬＭＷＨの各希釈物３５μＬを含有するプレートにＦＩＸａ溶液３５μＬを分配するようにプログラムしたＢｉｏＭｅｋ  ＦＸ  ｌｉｑｕｉｄ  ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いて開始した。最終阻害アッセイ条件は：０．３ｎＭ  ＦＩＸａおよび、１μＭから１０μＭの範囲のＵＦＨ中に最も高いＡＴ−ＩＩＩ濃度に依存して３５ｎＭから０ｎＭ、３００ｎＭから０ｎＭ、１０００ｎＭから０ｎＭ、３０００ｎＭから０ｎＭまたは５０００ｎＭから０ｎＭの範囲のＡＴ−ＩＩＩ希釈物であり、ヘパリンは過剰のままであった。反応物４０μＬアリコートを、アッセイ緩衝液Ｃ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４、８２％エチレングリコールおよび５ｍｇ／ｍＬポリブレン）中に２．５ｍＭメシル−Ｄ−ＣＨＧ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣを１ウエル当たり２０μＬ含有する９６ウエル黒色ハーフエリアプレートにＢｉｏＭｅｋ  ＦＸによって移す前に、阻害反応物を１０秒間、室温（約２５℃）でさらにインキュベートした。最終濃度５ｍｇ／ｍＬのポリブレン（ヘキサジメトリンブロミド）をＡＴ−ＩＩＩ／ＵＦＨ反応をクエンチするために緩衝液Ｃに添加した。ＦＩＸａの残存活性を２５℃に設定した蛍光読み取り装置において基質切断の初速度を６０分間追跡することによって評価した。残存活性の決定のための最終アッセイ条件は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４中の０．２ｎＭ  ＦＩＸａ変異体、０．８３ｍＭメシル−Ｄ−ＣＨＧ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、３０％エチレングリコールおよび５ｍｇ／ｍＬポリブレンであった。データ分析をＡＴ−ＩＩＩ／ＬＭＷＨ阻害アッセイについて上に記載したとおりに実施した。
【０５０３】
ＬＭＷＨで見出されたとおりＡＴ−ＩＩＩ／ＵＦＨは、検査した最高濃度のＡＴ−ＩＩＩで多数のＦＩＸａ変異体について総プロテアーゼ活性の１０〜１５％未満を阻害し、それにより標準スクリーニング条件下でのアッセイについて検出の上限を表している。したがって１０％未満の最大阻害を有するこれらの変異体は、９９９ｎＭの下限Ｋ０．５値に帰され、ほとんどの場合は報告された値より大きなＡＴ−ＩＩＩ抵抗性を有すると予測される。９９９ｎＭのＫ０．５値を最初に示したいくつかのＦＩＸａ変異体を、より高いＡＴ−ＩＩＩ濃度で再検査し、アッセイの感度を拡げ、ＡＴ−ＩＩＩ抵抗性の明確なレベルを提供した。これらの変異体が、最も高い検査ＡＴ−ＩＩＩ濃度（１０００ｎＭから５０００ｎＭ）で１０％未満の最大阻害をまだ維持した場合、９９９９ｎＭの下限Ｋ０．５値に帰され、これらの変異体は報告された値よりも大きなＡＴ−ＩＩＩ抵抗性を有することが予測される。
【０５０４】
表２１〜２２は、ＡＴ−ＩＩＩ／ＵＦＨを用いて実施したアッセイの結果を提供する。表２２は、追加的ＦＩＸａ変異体についてのデータを表し、表２１中のＦＩＸａ変異体についての追加的反復実験（ｎ）を含んで算出した新たな総平均を提供する。結果は、フィトされたＫ０．５パラメーターとしておよび、野生型ＦＩＸａと比較した各変異体についてのＡＴ−ＩＩＩ抵抗性の程度をフィットされたＫ０．５値の比（Ｋ０．５変異体／Ｋ０．５野生型）として表す表現としての両方で表される。いくつかのＦＩＸａ変異体は、野生型ＦＩＸａと比較して１００から５００倍を超えて増加したＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性を示した。たとえばFIXa-R318A/R403A、FIXa-R318A、FIXa-R318Y、FIXa-R338A/R403A FIXa-D203N/F205T/R318Y、FIXa-R318Y/R338E/R403E、FIXa-R318Y/R338E/R403E、FIXa-R318Y/R338E/E410N、R318Y/R338E/T343R/N346Y/R403E/E410NおよびFIXa-R318Y/R403E/E410Nは、ＡＴ−ＩＩＩに顕著な抵抗性を示すこの群に含まれる。
【０５０５】
表21. AT-III/UFHによるFIXa変異体の阻害
【表２１−１】
0006027221.tif 000142
【表２１−２】
0006027221.tif 000143
【表２１−３】
0006027221.tif 000144
【表２１−４】
0006027221.tif 000145
【表２１−５】
0006027221.tif 000146
【表２１−６】
0006027221.tif 000147
【表２１−７】
0006027221.tif 000148
【表２１−８】
0006027221.tif 000149
【表２１−９】
0006027221.tif 000150
【表２１−１０】
0006027221.tif 000151
【表２１−１１】
0006027221.tif 000152
【表２１−１２】
0006027221.tif 000153
【表２１−１３】
0006027221.tif 000154
【表２１−１４】
0006027221.tif 000155
【表２１−１５】
0006027221.tif 000156
【表２１−１６】
0006027221.tif 000157
【表２１−１７】
0006027221.tif 000158
【表２１−１８】
0006027221.tif 000159
【表２１−１９】
0006027221.tif 000160
＊999nMのＫ0.5値は、標準アッセイ条件下(35nM~0nM AT-III)で10%未満の阻害を有するこれらの変異体についての下限値を示す。
＊50%超のWTＫcat/ＫM(実施例4、表14を参照されたい)および初めに999nMのＫ0.5値を付された変異体はアッセイの感度を拡げるより高いAT-III濃度で再検査された。
＊9999nMのＫ0.5値は感度を拡げたアッセイ条件下(1000nM~0nM AT-IIIおよび5000~0nM AT-III)で10%未満の阻害を有するこれらの変異体についての下限値を示す。
【０５０６】
表22. AT-III/UFHによるFIXa変異体の阻害
【表２２−１】
0006027221.tif 000161
【表２２−２】
0006027221.tif 000162
【表２２−３】
0006027221.tif 000163
【表２２−４】
0006027221.tif 000164
【表２２−５】
0006027221.tif 000165
【表２２−６】
0006027221.tif 000166
【表２２−７】
0006027221.tif 000167
【表２２−８】
0006027221.tif 000168
【表２２−９】
0006027221.tif 000169
【表２２−１０】
0006027221.tif 000170
【表２２−１１】
0006027221.tif 000171
【表２２−１２】
0006027221.tif 000172
【表２２−１３】
0006027221.tif 000173
【表２２−１４】
0006027221.tif 000174
【表２２−１５】
0006027221.tif 000175
【表２２−１６】
0006027221.tif 000176
【表２２−１７】
0006027221.tif 000177
【表２２−１８】
0006027221.tif 000178
【表２２−１９】
0006027221.tif 000179
【表２２−２０】
0006027221.tif 000180
＊999nMのＫ0.5値は、標準アッセイ条件下(35nM~0nM AT-III)で10%未満の阻害を有するこれらの変異体についての下限値を示す。
＊50%超のWTＫcat/ＫM(実施例4、表14を参照されたい)および初めに999nMのＫ0.5値を付された変異体はアッセイの感度を拡げるより高いAT-III濃度で再検査された。
＊10000nMのＫ0.5値は感度を拡げたアッセイ条件下(1000nM~0nM AT-IIIおよび5000~0nM AT-III)で10%未満の阻害を有するこれらの変異体についての下限値を示す。
【０５０７】
Ｃ．アンチトロンビン／ＵＦＨ複合体によるＦＩＸａの阻害についての二次速度定数（Ｋａｐｐ）の決定
上の実施例５Ｂにおける記載と同じアッセイを若干の変更を伴って用いてＡＴ−ＩＩＩ／ＵＦＨによるＦＩＸａ変異体の阻害についての二次速度定数（Ｋａｐｐ）を測定するために追加的実験を実施した。この方法は、伝統的である競合的な動力学的方法または不連続な方法よりも複数の変異体について同時に二次速度定数を評価するためにより適している［たとえばOlson et al.(2004)Thromb Haemost 92(5),929-939を参照されたい］。
【０５０８】
ＵＦＨ存在下での阻害反応のために、１×緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）１．０ｍＬ容量中の過剰量ＵＦＨ溶液（２μＭ）中への血漿精製ヒトＡＴ−ＩＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）の２０μＭ保存物の希釈によってＡＴ−ＩＩＩ／ＵＦＨの１０００ｎＭ溶液を調製した。ＡＴ−ＩＩＩ／ＵＦＨ溶液を、２μＭ  ＵＦＨを含有する１×緩衝液Ａの最終容量５００μＬで９６ディープウエルポリプロピレンプレートにおいて２．０倍系列希釈する前に３０分間、室温でインキュベートした。変更したＫａｐｐアッセイのためのＡＴ−ＩＩＩの最終希釈物は５００ｍＭ〜０ｍＭ（すなわち列Ａ〜Ｈ）の範囲であった。各ＡＴ−ＩＩＩ希釈物の合計３５μＬを９６ウエルＶ底保存プレートのそれらそれぞれの列に全ての行を満たすように（すなわち１〜１２）分注した。ＦＩＸａ変異体を最初に１×緩衝液Ａ中に１００ｎＭへ希釈した。次に各１００ｎＭ  ＦＩＸａ変異体の５０μＬを１×緩衝液Ａ  ２．５ｍＬ中に濃度２．０ｎＭへ希釈し、次いで上記と同様に予め定義したプレートマップ（プレート１枚当たりＦＩＸａ変異体４種）に従ってこの溶液７０μＬを９６ウエルＶ底保存プレートに分注した。
【０５０９】
アッセイ反応は、各ＦＩＸａ変異体に対して計２枚の重複アッセイプレートにおいて１ウエル当たりＡＴ−ＩＩＩ／ＵＦＨの各希釈物３５μＬを含有するプレートにＦＩＸａ溶液３５μＬを分配するようにプログラムしたＢｉｏＭｅｋ  ＦＸ  ｌｉｑｕｉｄ  ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いて開始した。最終阻害アッセイ条件は：１．０ｎＭ  ＦＩＸａおよび、１μＭ  ＵＦＨ中の５００ｎＭから０ｎＭまでの範囲のＡＴ−ＩＩＩ希釈物であり、ヘパリンは過剰のままであった。阻害反応物を、予測される阻害速度定数に応じて室温（約２５℃）で種々の時間さらにインキュベートし、アッセイにおけるＡＴ−ＩＩＩの最高濃度（５００ｎＭ）で９０％超阻害が達成され得るように調節した。典型的なインキュベーション時間を各変異体または変異体の種類について特異的に決定したが、全般的には表２３に概説したインキュベーション時間に従った。
【０５１０】
表23. 予測されるＫapp値に基づくアッセイインキュベーション時間
【表２３】
0006027221.tif 000181
【０５１１】
望まれるインキュベーション時間後、アッセイ緩衝液Ｃ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４、８２％エチレングリコールおよび５ｍｇ／ｍＬポリブレン）中に２．５ｍＭメシル−Ｄ−ＣＨＧ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣを１ウエル当たり２０μＬ含む９６ウエル黒色ハーフエリアプレートに反応物の４０μＬアリコートをＢｉｏＭｅｋ  ＦＸによって移した。最終濃度５ｍｇ／ｍＬのポリブレン（ヘキサジメトリンブロミド）をＡＴ−ＩＩＩ／ＵＦＨ反応をクエンチするために緩衝液Ｃに添加した。ＦＩＸａの残存活性を２５℃に設定した蛍光読み取り装置において基質切断の初速度を６０分間追跡することによって評価した。残存活性の決定のための最終アッセイ条件は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４中の０．６７ｎＭ  ＦＩＸａ変異体、０．８３ｍＭメシル−Ｄ−ＣＨＧ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、３０％エチレングリコールおよび５ｍｇ／ｍＬポリブレンであった。ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅおよびＸＥ  Ｒｕｎｎｅｒ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｍｏｄｕｌｅ（ＩＤＢＳ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いた実施例ＢにおいてＡＴ−ＩＩＩ／ＵＦＨ阻害アッセイについて上に記載したのと類似するやり方でＫ０．５値を算出するためのデータ分析を実施した。実施例５Ｂに概説した擬一次条件下でのアッセイ設定を用いて、種々のインキュベーション時間を検査することにより、次の方程式：
【０５１２】
方程式（１）
【数６】
0006027221.tif 000182
【０５１３】
方程式（２）
【数７】
0006027221.tif 000183
を用いてＡＴ−ＩＩＩによる阻害についての見かけの二次速度定数（ｋａｐｐ）を算出することが可能である。
【０５１４】
ｔ１／２（アッセイの時間によって定義される）でのＫ０．５＝［ＡＴ−ＩＩＩ］についてのフィット値を仮定すると、ＡＴ−ＩＩＩによる所与のＦＩＸａ変異体の阻害についてのＫｏｂｓおよびそれによりＫａｐｐを算出するために必要な全ての値が入手可能になる。算出されたＫａｐｐ値は、文献において典型的に報告される値を示すことから本算出において１．２の一定値をもたらす阻害の化学量論（Ｓ．Ｉ．）における変化のいかなる潜在的影響も考慮していない［たとえばOlson et al.(2004)Thromb Haemost 92(5),929-939を参照されたい］。
【０５１５】
表２４は、ＡＴ−ＩＩＩ／ＵＦＨを用いて実施した二次速度アッセイの結果を提供する。結果は、フィトされたＫａｐｐパラメーターとしておよび、野生型ＦＩＸａと比較した各変異体についてのＡＴ−ＩＩＩ抵抗性の程度をそれらのフィットされたＫａｐｐ値の比（Ｋａｐｐ野生型／Ｋａｐｐ変異体）として表す表現としての両方で表す。いくつかのＦＩＸａ変異体は、野生型ＦＩＸａと比較して１０，０００〜２０，０００倍を超えて増加したＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性を示した。たとえば、FIXa-R318A、FIXa-R318Y、FIXa-R338A/R403A、FIXa-R318Y/R338E/R403E、FIXa-R318Y/R338E/R403E、FIXa-K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E、FIXa-R318Y/R338E/R403E、FIXa-K228N/I251S/R318Y/R338E/R403E/E410N、FIXa-R318Y/R338E/E410NおよびFIXa-R318Y/R338E/R403E/E410Nは、ＡＴ−ＩＩＩに顕著な抵抗性を示すこの群に含まれる。
【０５１６】
表24. AT-III/UFHによる阻害についての二次速度定数
【表２４−１】
0006027221.tif 000184
【表２４−２】
0006027221.tif 000185
【表２４−３】
0006027221.tif 000186
【表２４−４】
0006027221.tif 000187
【表２４−５】
0006027221.tif 000188
【表２４−６】
0006027221.tif 000189
【表２４−７】
0006027221.tif 000190
【表２４−８】
0006027221.tif 000191
【表２４−９】
0006027221.tif 000192
【表２４−１０】
0006027221.tif 000193
【表２４−１１】
0006027221.tif 000194
【表２４−１２】
0006027221.tif 000195
【表２４−１３】
0006027221.tif 000196
【表２４−１４】
0006027221.tif 000197
【表２４−１５】
0006027221.tif 000198
【表２４−１６】
0006027221.tif 000199
【表２４−１７】
0006027221.tif 000200
【表２４−１８】
0006027221.tif 000201
【表２４−１９】
0006027221.tif 000202
【表２４−２０】
0006027221.tif 000203
【表２４−２１】
0006027221.tif 000204
【表２４−２２】
0006027221.tif 000205
【表２４−２３】
0006027221.tif 000206
【表２４−２４】
0006027221.tif 000207
【表２４−２５】
0006027221.tif 000208
【実施例６】
【０５１７】
ＦＩＸａポリペプチドの薬物動態学的および薬力学的分析
ＦＩＸａ変異体ポリペプチドの薬物動態学的（ＰＫ）および薬力学的（ＰＤ）特性を静脈内投与後の種々の時点でのマウス血漿中の変異体ＦＩＸの量を測定することによって評価した。２種のアッセイを血漿中のＦＩＸａを定量するために用いた。薬物動態学的特性を評価するためにＥＬＩＳＡをマウス血漿中の総ＦＩＸタンパク質を定量するために用い、ＦＩＸ依存凝固アッセイ（ＦＩＸ欠失血漿を用いる活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイ）を血漿中のＦＩＸポリペプチドの血液凝固活性を定量するために用い、薬力学的特性を評価した。
【０５１８】
動物。Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）によって供給されたオスＣＤ−１マウス（３０〜４０ｇｍ）を処理前の少なくとも３日間隔離した。系列ＰＫ研究のために、オスＣＤ−１マウス（３０〜３７ｇｍ）に留置頸動脈血管カニューレを装着した。ＰＤまたはＰＫ実験に用いる前は、濾過水道水および食餌を自由摂取させた。
【０５１９】
Ａ．投与および血液採取
マウス（１時点当たりＮ＝３）にＦＩＸポリペプチドを尾静脈を介して静脈内投与（ＰＫ研究用に約１．４ｍｇ／ｋｇおよびＰＤ研究用に約４００ＩＵ／ｋｇ、用量容量２ｍｌ／ｋｇ）した。投与後の適切な時点で動物を麻酔し、最終的な心穿刺を用いてクエン酸を含むシリンジに血液を抜いた（０．５〜１ｍＬ）。十分な量のタンパク質が得られなかったいくつかの実験では、ずらして配置した時点での系列採血のために合計４〜６匹だけの動物を用い、過剰な血液量を除去することなく全ての時点で採取するために全過程のそれぞれについてマウス２匹を用いた。血液は、０．９％生理食塩水を含む０．１ｍＬシリンジに少量の血液を最初に除去することによって覚醒動物を拘束して試料採取した。次いで０．１Ｍクエン酸ナトリウム４．５μＬを含むシリンジを取り付け、血液０．０５ｍＬをシリンジに抜き、血液を１．５ｍＬチューブに移した。最初のシリンジを再び取り付け、生理食塩水０．０７ｍＬをカニューレを通じて戻した。プロセスを繰り返す場合カニューレは次の時点まで蓋をしておいた。全ての研究に関して血液試料を採取１５分間以内に遠心分離し（９０００ｒｐｍ、８分間、４℃）、血漿を除去し、直ちに液体窒素中で新鮮凍結し、分析まで凍結保存（−７０℃）した。
【０５２０】
Ａ．ＰＫ評価
クエン酸処理血液試料を投与後１４４０分までの種々の時点（すなわち、投与前、２、４、１０、３０、６０、１２０、２４０、３６０、４８０、９６０および１４４０分）で最終実験のために心穿刺によってまたは系列実験のために留置カテーテルによって採取した。ｒＦＩＸの血漿濃度を、検出および捕捉の抗体（＃ＦＩＸ−ＥＩＡ、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ａｎｃａｓｔｅｒ、ＯＮ）の対応する対を利用する第Ｘ因子特異的ＥＬＩＳＡを用いて決定した。簡潔には、ＦＩＸに対するアフィニティー精製ポリクローナル抗体をプレートのウエルにコートする。プレートを洗浄し、ＦＩＸを含有する血漿試料を添加する。血漿試料をプレート上で１：７５０および１：１５００に希釈する。未結合物質を除去するためにプレートを洗浄後、ＦＩＸに対するペルオキシダーゼコンジュゲート検出抗体を捕捉されたＦＩＸに結合させるためにプレートに添加する。未結合コンジュゲート抗体を除去するためにプレートを洗浄後、化学発光基質とのインキュベーションによってペルオキシダーゼ活性が発現され、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ上、４２５ｎＭで読み取る。標準曲線は、濃度範囲全体にわたって直線的であり、濃度０．８２ｐｇ／ｍｌから３０ｎｇ／ｍｌに及ぶ。抗体親和性における差異を排除するためにＦＩＸ変異体それ自体を標準曲線のために用いる。各試料を２枚の別々のアッセイプレートで測定し、標準曲線の範囲内の測定値を血漿試料中のＦＩＸ変異体の濃度を算出するために用いる。
【０５２１】
ＰＤ評価。ｒＦＩＸの血漿薬力学的活性を活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイおよびＦＩＸ欠乏ヒト血漿（ＳＴＡＣＬＯＴ  Ｃ．Ｋ．ＰＲＥＳＴ  ｋｉｔ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ、Ａｓｎｉｅｒｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を製造者の説明書に従って用いて定量した。簡潔には、ａＰＴＴアッセイには、セファリン（血小板代替物）および活性化因子［コアリン（ｋｏａｌｉｎ）］存在下での血漿のカルシウム再加（ｒｅｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が関与する。ＦＩＸ欠乏ヒト血漿を用いる場合、ａＰＴＴアッセイはＦＩＸに対して特異的である。ａＰＴＴアッセイを製造者の製品挿入物に記載のとおり実施した。簡潔にはクエン酸処理血液試料をＰＫ評価について記載したのと同じ時点で採取した。血漿試料を、０．１％ウシ血清アルブミン（Ｐｒｏｂｕｍｉｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中に１：１００で希釈した。希釈血漿または標準物をＦＩＸ欠乏ヒト血漿およびセファリン/カオリン試薬と合わせ、１８０秒間インキュベートした。血液凝固をカルシウム（ＣａＣｌ２）の添加によって開始させた。秒数での血液凝固時間をＳＴＡｒｔ４  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ、Ａｓｎｉｅｒｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて測定した。既知の濃度のｒＦＩＸから作成した標準曲線を用いて血漿ＦＩＸ濃度を対数濃度対対数時間標準曲線プロットから内挿し、次いでバックグラウンドＦＩＸ活性（投与前動物から）を減算した。第ＩＸ因子活性についての定量の下限は約１０ｎｇ／ｍＬであった。
【０５２２】
ＰＤおよびＰＫデータ分析。ｒＦＩＸ変異体でのマウス研究からのＰＤ（ａＰＴＴ）およびＰＫ（ＥＬＩＳＡ）パラメーターをＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（ｖ５．１、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）での非コンパートメント解析を用いて算出した。ｒＦＩＸ変異体のＰＤおよびＰＫの両方は、見かけの双指数関数的血漿減衰（ｂｉｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｐｌａｓｍａ  ｄｅｃａｙ）に従った。検査した各変異体について選択されたパラメーターをＰＤ（ａＰＴＴアッセイを用いた）に関しては表２５に、ＰＫ（ＥＬＩＳＡアッセイを用いた）に関しては表２６〜２７に提供する。表２６は、追加的ＦＩＸａ変異体に関するデータを示し、表２６のＦＩＸａ変異体についての追加的実験反復（ｎ）を含んで算出された新たな総平均を提供する。ＰＤパラメーターは、ハーフタイム（終末、分）、ＭＲＴ（ＭＲＴ０−ｉｎｆ、分）、曲線下面積（ＡＵＣ）０〜最終（分μｇ／ｍＬ）／用量（ｍｇ／ｋｇ）；最大濃度（Ｃｍａｘ；（μｇ／ｍＬ）／用量（μｇ／ｋｇ）、Ｖｄ（ｍＬ／ｋｇ）およびクリアランス（Ｃｌ、ｍＬ／ｍｉｎ／ｋｇ）を含んだ。
【０５２３】
薬物動態学的パラメーターを算出するために用いた定義および式
血漿半減時間（血漿ＦＩＸ濃度対時間プロファイルの終末相でのＦＩＸポリペプチドの半減期；Ｔ１／２・β（血漿ＦＩＸ濃度対時間曲線の対数直線プロットの終末相における負勾配で割った−ｌｎ２として算出）；ＭＲＴ０−ｌａｓｔは身体に存在するＦＩＸポリペプチドの平均時間であり；ＡＵＭＣ０−ｌａｓｔ／ＡＵＣ０−ｌａｓｔとして算出される（式中ＡＵＭＣ０−ｌａｓｔは初期モーメント対時間曲線の下の総面積であり、以下でＡＵＣと記載される）；ＡＵＣ０−ｌａｓｔ／用量は［ＡＵＣ（０−ｔ）］として算出され、式中ｔはＩＶ用量（ｍｇ／ｋｇ）で割ったＦＩＸポリペプチドの測定可能な血漿濃度での最終時点であり；ＡＵＣ０−ｉｎｆ／用量は［ＡＵＣ（０−ｔ）＋Ｃｔ／（ｌｎ２／Ｔ１／２・β）］として算出され、式中ｔはＩＶ用量（ｍｇ／ｋｇ）で割ったＦＩＸポリペプチドの測定可能な血漿濃度を有する最終時点であり；Ｃｍａｘ／用量（ｍｇ／ｋｇ当たりｕｇ／ｍＬ）、Ｃｍａｘは最大に測定された血漿ＦＩＸ濃度に対応する投与後時間であり；Ｃｌは（用量／ＡＵＣ０−ｉｎｆ）として算出される全身クリアランスであり；Ｖｓｓは定常状態分布容積であり；ＭＲＴ＊Ｃｌとして算出され；ＶＺは終末排出定数（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）（β）に基づく分布容積であり；Ｃｌ／（ｌｎ２／Ｔ１／２・β）として算出される。
【０５２４】
表25. aPTT アッセイによって評価したFIX変異体のPD特性
【表２５】
0006027221.tif 000209
【０５２５】
表26. ELISAによって評価したFIX変異体のPK特性
【表２６−１】
0006027221.tif 000210
【表２６−２】
0006027221.tif 000211
【表２６−３】
0006027221.tif 000212
【表２６−４】
0006027221.tif 000213
【表２６−５】
0006027221.tif 000214
【表２６−６】
0006027221.tif 000215
【表２６−７】
0006027221.tif 000216
【表２６−８】
0006027221.tif 000217
【表２６−９】
0006027221.tif 000218
【表２６−１０】
0006027221.tif 000219
【表２６−１１】
0006027221.tif 000220
【表２６−１２】
0006027221.tif 000221
【表２６−１３】
0006027221.tif 000222
＊E410Nの80%グリコシル化形態
【０５２６】
表27. ELISAによって評価したFIX変異体のPK特性
【表２７−１】
0006027221.tif 000223
【表２７−２】
0006027221.tif 000224
【表２７−３】
0006027221.tif 000225
【表２７−４】
0006027221.tif 000226
【表２７−５】
0006027221.tif 000227
【表２７−６】
0006027221.tif 000228
【表２７−７】
0006027221.tif 000229
【表２７−８】
0006027221.tif 000230
【表２７−９】
0006027221.tif 000231
【表２７−１０】
0006027221.tif 000232
【表２７−１１】
0006027221.tif 000233
【表２７−１２】
0006027221.tif 000234
【表２７−１３】
0006027221.tif 000235
【表２７−１４】
0006027221.tif 000236
【表２７−１５】
0006027221.tif 000237
【表２７−１６】
0006027221.tif 000238
【表２７−１７】
0006027221.tif 000239
【表２７−１８】
0006027221.tif 000240
【表２７−１９】
0006027221.tif 000241
【表２７−２０】
0006027221.tif 000242
【表２７−２１】
0006027221.tif 000243
【表２７−２２】
0006027221.tif 000244
【表２７−２３】
0006027221.tif 000245
【表２７−２４】
0006027221.tif 000246
【表２７−２５】
0006027221.tif 000247
【表２７−２６】
0006027221.tif 000248
【表２７−２７】
0006027221.tif 000249
【表２７−２８】
0006027221.tif 000250
【表２７−２９】
0006027221.tif 000251
【表２７−３０】
0006027221.tif 000252
【表２７−３１】
0006027221.tif 000253
【実施例７】
【０５２７】
ＦＩＸポリペプチドの凝血促進活性のインビボ評価
ＦＩＸ欠損マウス（ＦＩＸ−／−マウス）を用いる血友病ＢのマウスモデルをＦＩＸポリペプチドの凝血促進活性を評価するために確立した。マウスをＦＩＸポリペプチドで処理し、２０分間に失われた血液量をＦＩＸポリペプチドの凝血促進活性を決定するために測定した。
【０５２８】
Ａ．野生型ＦＩＸ凝血促進活性のインビボ評価
オスＦＩＸ−／−マウスをケタミン／キシラジンカクテル（生理食塩水中４５ｍｇ／ｍｌおよび３．６ｍｇ／ｍｌ）の腹腔内投与によって麻酔し、体温降下が生じないことを確実にするために温めたプラットホーム（３９℃）上に置いた。処置室を温度８２Ｆに維持した。尾部切断の１０分前に尾部を予め温めたＰＢＳ、１０ｍＬに浸漬した（１５ｍＬ遠心管；３９℃）。７から１５匹のマウスに組換えヒトＦＩＸ［Ｂｅｎｅｆｉｘ（登録商標）Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）、Ｗｙｅｔｈ］またはＢｅｎｅｆｉｘ（登録商標）Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）と同じである緩衝液（０．２３４％塩化ナトリウム、８ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、０．８％ショ糖、２０８ｍＭグリシン、０．００４％ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０）に希釈した修飾ＦＩＸポリペプチドを一回注射で尾静脈を介して注射した。マウスの陰性対照群は緩衝液だけを受けた。注射し損ねた場合は、動物を研究から排除した。
【０５２９】
ＦＩＸポリペプチドまたは緩衝液の注射は、尾部切断の５分前に行った。尾部切断はカミソリ刃を用いて尾部末端から５ｍｍで行い、血液をＰＢＳ中に２０分間採取した。採取期の最後に総失血を評価した。採取チューブを混合し、各試料の１ｍＬアリコートを取り、ヘモグロビン含有量についてアッセイした。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを滅菌水中、１対４に希釈し、１００μＬを１ｍＬ試料に添加して溶血させた。次いで試料の吸光度を５４６ｎｍの波長で測定した。失血量を算出するために、ＰＢＳ中に希釈し、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で上のとおり溶血させた既知の容量のマウス血液の５４６ｎｍでの吸光度を測定することによって作成した標準曲線に対して吸光度を読み取った。値を平均値±ＳＥＭとして表す。
【０５３０】
１．野生型ＦＩＸ血液凝固活性を評価する用量反応研究
ＦＩＸ−／−マウスにおいてＢｅｎｅｆｉｘ（登録商標）Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）の０．０３、０．１、０．３および１ｍｇ／ｋｇでの血液凝固活性を評価するための用量反応研究を実施した。この実験において、緩衝液のみの群における失血は８３５．４２±２４．５５μｌであり、０．１、０．３および１ｍｇ／ｋｇでのＢｅｎｅｆｉｘ（登録商標）Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）処理によって顕著に減少した［５５８．５９±５６．６３μＬ、４１５．８１±６６．７２μＬおよび２７０．７５±５７．４８μＬへ；クラスカル−ワリスに続くダンポストテスト（Ｄｕｎｎ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｔｅｓｔ）を用いてｐ＜０．０５］。０．０３ｍｇ／ｋｇの検査した最低用量では値は７３１．６６±５９．１６μＬであった。非線形回帰を用いて算出したＥＤ５０値を下の表２８に示す。
【０５３１】
２．ＦＩＸａ−Ｒ３１８Ｙ／Ｒ３３８Ｅ／Ｒ４０３Ｅ／Ｅ４１０Ｎ、ＦＩＸａ−Ｒ３１８Ｙ／Ｒ３３８Ｅ／Ｅ４１０ＮおよびＦＩＸａ−Ｙ１５５Ｆ／Ｋ２４７Ｎ／Ｎ２４９Ｓ／Ｒ３１８Ｙ／Ｒ３３８Ｅ／Ｒ４０３Ｅ／Ｅ４１０Ｎの血液凝固活性を評価する用量反応
ＦＩＸａ−Ｒ３１８Ｙ／Ｒ３３８Ｅ／Ｒ４０３Ｅ／Ｅ４１０Ｎ（キモトリプシンナンバリングによるＲ１５０Ｙ／Ｒ１７０Ｅ／Ｒ２３３Ｅ／Ｅ２４０Ｎ）、ＦＩＸａ−Ｒ３１８Ｙ／Ｒ３３８Ｅ／Ｅ４１０Ｎ（キモトリプシンナンバリングによるＲ１５０Ｙ／Ｒ１７０Ｅ／Ｅ２４０Ｎ）およびＦＩＸａ−Ｙ１５５Ｆ／Ｋ２４７Ｎ／Ｎ２４９Ｓ／Ｒ３１８Ｙ／Ｒ３３８Ｅ／Ｒ４０３Ｅ／Ｅ４１０Ｎ（キモトリプシンナンバリングによるＹ［１５５］Ｆ／Ｋ８２Ｎ／Ｎ８４Ｓ／Ｒ１５０Ｙ／Ｒ１７０Ｅ／Ｒ２３３Ｅ／Ｅ２４０Ｎ）の血液凝固活性を様々な用量で評価した用量反応研究を実施した。
【０５３２】
ＦＩＸａ−Ｒ３１８Ｙ／Ｒ３３８Ｅ／Ｒ４０３Ｅ／Ｅ４１０Ｎでの処理は、失血の顕著な抑制を０．０１、０．０３、０．１、０．３および１ｍｇ／ｋｇ（それぞれ４３４．６５±７３．７５μＬ、４９７．２８±５０．９２μＬ、２３０．８１±３９．６７μＬ、２６１．９４±５８．７９μＬおよび２５１．５６±４１．８１μＬ）において緩衝液のみの対照と比較して（８１１．４５±２６．６３μＬ；クラスカル−ワリスに続くダンポストテストを用いてｐ＜０．０５）もたらした。０．００３ｍｇ／ｋｇに用量を減少させると、失血値は対照レベルに近い７８６．８３±４４．３９μＬになった。
【０５３３】
ＦＩＸａ−Ｒ３１８Ｙ／Ｒ３３８Ｅ／Ｅ４１０Ｎでの処理も失血の顕著な抑制を０．０３、０．１、０．３および１ｍｇ／ｋｇ（それぞれ５７１．６７±５０．４５μＬ、４２５．４２±４３．６５μＬ、２６３．４７±４２．６６μＬおよび７８．１９±１３．４２μＬ）において緩衝液のみの対照と比較して（８４５．１４±２３．６３μＬ；クラスカル−ワリスに続くダンポストテストを用いてｐ＜０．０５）もたらした。０．００１ｍｇ／ｋｇに用量を減少させると、失血値は対照レベルに近い７７７．１６±５３．７２μＬになった。
【０５３４】
ＦＩＸａ−Ｙ１５５Ｆ／Ｋ２４７Ｎ／Ｎ２４９Ｓ／Ｒ３１８Ｙ／Ｒ３３８Ｅ／Ｒ４０３Ｅ／Ｅ４１０Ｎでの処理は、検査した突然変異体での失血の最も顕著な抑制：０．０１、０．０３および０．１ｍｇ／ｋｇにおいてそれぞれ４６０．０３±７４．６０μＬ、３９３．４８±７５．１６μＬおよび１５７．２８±２８．８９μＬを、緩衝液のみの対照と比較して（８５１．４４±４４．２５μＬ；クラスカル−ワリスに続くダンポストテストを用いてｐ＜０．０５）もたらした。非線形回帰を用いて算出したＥＤ５０値を下の表２８に示す。
【０５３５】
表28.
【表２８】
0006027221.tif 000254
【０５３６】
３．野生型ＦＩＸ血液凝固活性を評価する反応持続時間
Ｂｅｎｅｆｉｘ（登録商標）Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）の０．５ｍｇ／ｋｇでの効果の持続時間を評価する研究をＦＩＸー／−マウスで実施した。尾部切断の４８時間、２４時間、１６時間、８時間、２時間、３０分および５分前にマウスに静脈投与した。この実験において対照群を０％抑制と設定して対照群からの抑制を決定した。失血の抑制は５分、３０分、２、４、８、１６、２４および４８時間においてそれぞれ、媒体対照から５９．７±１１．９％、４８．２５±１２．８４％、５７．７４±９．１０％、５６．０４±８．４６％、３２．０９±７．９２％、１２．９４±７．３３％、３８．７５±１１．４７％および０．６４±１１．３％であった（平均値およびＳＥＭ、ｎ＝マウス８〜３３匹、実験３回から）。
【０５３７】
４．ＦＩＸａ−Ｒ３１８Ｙ／Ｒ３３８Ｅ／Ｒ４０３Ｅ／Ｅ４１０Ｎ血液凝固活性を評価する反応持続時間
ＦＩＸａ−Ｒ３１８Ｙ／Ｒ３３８Ｅ／Ｒ４０３Ｅ／Ｅ４１０Ｎの０．５ｍｇ／ｋｇでの効果の持続時間を評価する研究をＦＩＸ−／−マウスで実施した。尾部切断の９６時間、７２時間、４８時間、３２時間、２４時間、１６時間、８時間、４時間、２時間、３０分および５分前にマウスにｉ．ｖ．投与した。この実験において対照群を０％抑制と設定して対照群からの抑制を決定した。失血の抑制は、５分、３０分、２、４、８、１６、２４、３２、４８、７２および９６時間においてそれぞれ媒体対照から９３．２６±２．０４％、９６．３０±３．７０％、８５．８６±６．５２％、６９．４±９．９２％、８９．０５±３．６９％、７８．４８±８．７１％、６３．３３±６．７０％、４７．９７±１０．０７％、３．１±８．２２％、−１３．５２±１０．５９％および−１２．８２±７．３１％であった（平均値およびＳＥＭ、ｎ＝マウス８〜４５匹、実験４回から）。
【０５３８】
ＦＩＸ−／−マウスについての注：
マウスのＦＩＸノックアウト群体はオスＦＩＸノックアウトマウス由来の凍結保存精子を用いたインビトロ受精によって作製した。ＦＩＸノックアウト対立遺伝子を有する動物を選択するためにＰＣＲに基づくプロトコールを用いて全ての子孫を遺伝子型同定した。これらの動物のさらなる交配およびそれらの子孫（ＰＣＲに基づく遺伝子型同定後）は、ＰＣＲによって確認されたとおりＦＩＸノックアウト動物（すなわち、ＦＩＸ遺伝子がＸ染色体上にあることからヘミ接合性のオスおよびホモ接合性のメス）を産生した。この初期ＦＩＸ群体の全てのメンバーの遺伝子型のＰＣＲ確認後、真のノックアウト動物はノックアウト子孫だけを産生できることから、全群体の子孫のＰＣＲ確認を終了した。しかし群体から「引退した種畜」を何度か遺伝子型同定した。全ての群体の子孫の遺伝子型同定を終了したおよそ７カ月後、引退した種畜の遺伝子型同定は、群体における非ノックアウト（または野生型）動物の存在を明確に示した。この結果に基づいて、ノックアウト群体の全てのメンバーを遺伝子型同定し、全ての非ノックアウト動物を同定し、群体から排除した。群体遺伝子型同定の結果は、不十分なＤＮＡ調製のためにオスマウスの１９％が野生型であり、オスマ動物の４％が不明確であることを示した。野生型および「不明確な」オス（およびメス）の両方を群体から排除した。
【０５３９】
したがってＦＩＸノックアウト群体にはある時点で１匹または複数匹の非ノックアウト動物が混入し、したがって群体のオスの１９〜２３％の間まで時間と共に増加した野生型ＦＩＸ遺伝子を含有するわずかな非ノックアウト動物が含まれていた（インビボ実験はオスマウスだけを用いる）。この応用において作成および報告されたＦＩＸデータに関して、全てのインビトロデータは影響を受けない。インビボデータに関しては、混入が全ての化合物に同様に影響し、したがって変異体の序列またはそれらのＢｅｎｅＦＩＸとの比較のいずれにも影響しないことが推定および予測される。混入した動物が内在性ＦＩＸを既に有したことから、有効性および持続時間実験においてそれらは、真の血友病動物よりも少ない血液を失い、外来性ＦＩＸの投与からより少ない利益を得ており、したがって全ての化合物に関するデータの「拡散」または可変性を増加させた。混入は、全ての化合物を実際よりもわずかに低い強度に見せた場合もあったが、ＢｅｎｅＦＩＸに対するそれらの比は変更されない（すなわち本発明者らのリード分子の強度および持続時間の利点は影響されない）。
【０５４０】
Ｂ．野生型ＦＩＸ凝血促進活性のインビボ評価−新規群体データ
下に記載するデータは、上に記載の確認済ＦＩＸ−／−マウスから再構築した新規群体由来である。マウスを種畜として用いる前に遺伝子型同定によって二重に確認した。下に記載する全てのデータは、両親が二重に確認された繁殖単位から生まれたマウス由来である。全ての交替用種畜も新たな繁殖単位の開始前にＦＩＸ−／−として二重確認される。
【０５４１】
オスＦＩＸ−／−マウスをケタミン／キシラジンカクテル（生理食塩水中４５ｍｇ／ｍｌおよび３．６ｍｇ／ｍｌ）の腹腔内投与によって麻酔し、体温降下が生じないことを確実にするために温めたプラットホーム（３９℃）上に置いた。処置室を温度８２Ｆに維持した。尾部切断の１０分前に尾部を予め温めたＰＢＳ、１０ｍＬに浸漬した（１５ｍＬ遠心管；３９℃）。７から１５匹のマウスに、組換えヒトＦＩＸ［Ｂｅｎｅｆｉｘ（登録商標）Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）、Ｗｙｅｔｈ］またはＢｅｎｅｆｉｘ（登録商標）Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）と同じである緩衝液（０．２３４％塩化ナトリウム、８ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、０．８％ショ糖、２０８ｍＭグリシン、０．００４％ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０）に希釈した修飾ＦＩＸポリペプチドを一回注射で尾静脈を介して注射した。マウスの陰性対照群は緩衝液だけを受けた。注射し損ねた場合は、動物を研究から排除した。
【０５４２】
ＦＩＸポリペプチドまたは緩衝液の注射は、尾部切断の５分前に行った。尾部切断はカミソリ刃を用いて尾部末端から５ｍｍで行い、血液をＰＢＳ中に２０分間採取した。採取期の最後に総失血を評価した。採取チューブを混合し、各試料の１ｍＬアリコートを取り、ヘモグロビン含有量についてアッセイした。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを滅菌水中、１対４に希釈し、１００μＬを１ｍＬ試料に添加して溶血させた。次いで試料の吸光度を５４６ｎｍの波長で測定した。失血量を算出するために、ＰＢＳ中に希釈し、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で上のとおり溶血させた既知の容量のマウス血液の５４６ｎｍでの吸光度を測定することによって作成した標準曲線に対して吸光度を読み取った。値を平均値±ＳＥＭとして表す。
【０５４３】
１．ＦＩＸ血液凝固活性を評価する用量反応研究
Ｂｅｎｅｆｉｘ（登録商標）Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）およびＦＩＸポリペプチドの血液凝固活性をＦＩＸ−／−マウスにおいて用量を変化させて評価するための用量反応研究を実施した。これらの実験におけるＥＤ５０値を非線形回帰を用いて算出し、下の表２９に示す。
【０５４４】
表29. 用量反応ED50値
【表２９−１】
0006027221.tif 000255
【表２９−２】
0006027221.tif 000256
【表２９−３】
0006027221.tif 000257
【表２９−４】
0006027221.tif 000258
【表２９−５】
0006027221.tif 000259
【表２９−６】
0006027221.tif 000260
【表２９−７】
0006027221.tif 000261
【表２９−８】
0006027221.tif 000262
【表２９−９】
0006027221.tif 000263
【０５４５】
２．野生型ＦＩＸ血液凝固活性を評価する反応持続時間
Ｂｅｎｅｆｉｘ（登録商標）Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）の０．５ｍｇ／ｋｇでの効果の持続時間を評価するための研究をＦＩＸー／ーマウスで実施した。尾部切断の４８時間、３２時間、２４時間、１６時間、８時間、４時間、２時間および５分前にマウスに静脈投与した。この実験において対照群を０％抑制と設定して対照群からの抑制を決定した。失血の抑制は、５分、２、４、８、１６、２４、３２および４８時間においてそれぞれ媒体対照から６８．６±５．８％、６４±６．９８％、５４．７±６．１３％、４３．４±６．８６％、１３．７±５．５３％、２４．９±６．１１％、１１．７±４．８８％および５．６±４．１７％であった（平均値およびＳＥＭ、ｎ＝マウス１０〜３５匹、実験３回から）。
【０５４６】
３．ＦＩＸポリペプチド凝血促進活性を評価する反応持続時間
ＦＩＸポリペプチドの０．５ｍｇ／ｋｇでの効果の持続時間を評価するための研究をＦＩＸー／ーマウスで実施した。尾部切断の７２時間、４８時間、３２時間、２４時間、８時間および５分前にまたは尾部切断の７２時間、４８時間、および１時間前にマウスにｉ．ｖ．投与した。これらの実験において対照群を０％抑制と設定して対照群からの抑制を決定した。失血の抑制は、％抑制（平均値およびＳＥＭ）として表３０に示す。
【０５４７】
表30. 失血の抑制
【表３０−１】
0006027221.tif 000264
【表３０−２】
0006027221.tif 000265
【表３０−３】
0006027221.tif 000266
【表３０−４】
0006027221.tif 000267
【表３０−５】
0006027221.tif 000268
【表３０−６】
0006027221.tif 000269
【表３０−７】
0006027221.tif 000270
【表３０−８】
0006027221.tif 000271
【表３０−９】
0006027221.tif 000272
【表３０−１０】
0006027221.tif 000273
【表３０−１１】
0006027221.tif 000274
【表３０−１２】
0006027221.tif 000275
【実施例８】
【０５４８】
ＦＩＸａのその補因子第ＶＩＩＩａ因子への機能性補因子結合（ＫＤ−ａｐｐ）の決定
基質第Ｘ因子（ＦＸ）の存在下またはその飽和での補因子第ＶＩＩＩａ因子（ＦＶＩＩＩａ）に対するＦＩＸａ変異体の機能性補因子結合（ＫＤ−ａｐｐ）を、ＦＩＸａによる活性化で生じるＦＸａの合成基質Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ  ＦＸａでの活性をアッセイすることによる蛍光発生アッセイにおいて間接的に評価した。補因子（ＦＶＩＩＩａ）が活性化プロテアーゼ（ＦＩＸａ）の濃度より少なくとも１０００倍過剰であるＦＶＩＩＩａ濃度の範囲を見かけの動力学的速度定数（ＫＤ−ａｐｐ）を算出するために用いた。実験は、基質ＦＸの飽和レベルで触媒活性を評価する前に、テナーゼ（Ｘａｓｅ）複合体を形成するリン脂質小胞の存在下でＦＩＸａと補因子（ＦＶＩＩＩａ）を種々の濃度で予めインキュベートする実施例４（基質、第Ｘ因子に対するＦＩＸａの触媒活性の決定）に記載したアッセイの変形であるように設計した。簡潔には、活性化および活性部位滴定されたＦＩＸａをカルシウム含有緩衝液中でリン脂質小胞とインキュベートし、別に組換えＦＶＩＩＩをアルファ−トロンビンで活性化する（ＦＶＩＩＩａに）。次いでアッセイ開始前に、アルファ−トロンビンの活性を高度に特異的なトロンビン阻害物質、ヒルジンの添加によってクエンチした。次いでＦＩＸａ変異体をＸａｓｅ複合体を形成するように様々な濃度のＦＶＩＩＩａと混合し、次にアッセイを開始するために飽和濃度のＦＸおよび蛍光基質Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ  ＦＸａ（ＣＨ３ＳＯ２−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）と混合した。ＦＸａによるＳｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ  ＦＸａの触媒作用に続く遊離フルオロフォア、ＡＭＣ（７−アミノ−４−メチルクマリン）の放出を次いで連続的経時的に評価し、ＦＩＸａ変異体の動力学的速度定数を決定した。
【０５４９】
Ａ．アッセイプロトコール
種々のＦＶＩＩＩａ濃度およびリン脂質の存在下でＦＩＸａによるＦＸ活性化の動力学的速度を評価するアッセイのために、最初に組換えＦＶＩＩＩ（Ｋｏｇｅｎａｔｅ  ＦＳ（登録商標）；  Ｂａｙｅｒ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を添付の希釈剤１ｍＬ中に再懸濁した。次いでＦＶＩＩＩのモル濃度を吸光係数１．５６７ｍｇ−１ｍＬ  ｃｍ−１および分子量１６３．６ｋＤａを用いて２８０ｎｍでの吸光度によって決定した。ＦＩＸ変異体を上の実施例１〜３において記載したとおり発現、精製、活性化および活性部位滴定した。次いでＦＩＸａ変異体を１×緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  ＣａＣｌ２／０．１％ＢＳＡ／０．１％ＰＥＧ−８０００、ｐＨ７．４）１ｍＬ容量中に８ｐＭ（４×）の濃度に系列希釈した。リン脂質の存在下でのＦＶＩＩＩのＦＶＩＩＩａへの活性化のための調製物において、アルファ−トロンビン（Ｈｅａｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）およびヒルジン（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を製造者の保存濃度から１：１００に１×緩衝液Ａ中へそれぞれ希釈した。再構成したＦＶＩＩＩを、４００μＭの新鮮再懸濁リン脂質［７５％ホスファチジルコリン（ＰＣ）／２５％ホスファチジルセリン（ＰＳ）；ＰＳ／ＰＣ小胞直径約１２０ｎｍ；Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ］を含有する１×緩衝液Ａ１．６ｍＬ容量中に濃度１６００ｎＭ（最高用量の４×）へさらに希釈した。上のＦＶＩＩＩ／ＰＣ／ＰＳ溶液を最終濃度１５ｎＭのアルファ−トロンビン溶液と混合し、続く１５分間、２５℃でのインキュベーションによってＦＶＩＩＩをＦＶＩＩＩａに活性化した。次に、４００μＭ  ＰＣ／ＰＳ小胞を含有する１×緩衝液Ａ中への活性化ＦＶＩＩＩａ最終用量０．５ｍＬの１２チャネルディープウエルポリプロピレンプレートにおける１．５倍系列希釈を開始する前に活性化反応を最終濃度１５０ｎＭへのヒルジンの５分間、２５℃での添加によってクエンチした。ＦＶＩＩＩａ（×４）の最終濃度は、１２点アッセイについて１６００ｎＭ、１０６６．７ｎＭ、７１１．１ｎＭ、４７４．１ｎＭ、３１６．１ｎＭ、２１０．７ｎＭ、１４０．５ｎＭ、９３．６ｎＭ、６２．４３ｎＭ、４１．６ｎＭ．２７．８ｎＭおよび０ｎＭであり、代替的な２倍希釈系列での８点アッセイについて；１６００ｎＭ、６００ｎＭ、４００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭおよび０ｎＭであった。ＦＶＩＩＩａの希釈系列を、次に４×ＦＩＸａ希釈物（各１２．５μＬ）と１：１で９６ウエルハーフエリア黒色アッセイプレートにおいて、予め定義したプレートマップ（ＦＩＸａ変異体４種／プレート）に従って混合し、種々の濃度のＦＶＩＩＩａとＸａｓｅ複合体を形成するように１５分間、２５℃で予めインキュベートした。最終２×溶液（２５μＬ）は次のとおり：４ｐＭ  ＦＩＸａ変異体、１６００〜０ｎＭ  ＦＶＩＩＩａ、２００μＭ  ＰＣ／ＰＳ小胞、７．５ｎＭアルファ−トロンビン（阻害済）および７５ｎＭヒルジン。
【０５５０】
活性部位滴定し、ＤＦＰ／ＥＧＲ−ｃｍｋ処理したＦＸ（上の実施例２を参照されたい）の１０００ｎＭ（×２）の溶液を１．０ｍＭ  Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ  Ｘａ基質を含有する１×緩衝液Ａ  ２０ｍＬ中に調製し、４種のアッセイのために十分な容量を提供した。これは実施例４、表１６に報告したＫＭ値より少なくとも５〜２０倍高いＦＸの２×飽和濃度を示した。典型的にはアッセイ反応は、ＦＸ／Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ  Ｘａ希釈物２５μＬを、各ＦＩＸａ変異体およびＦＶＩＩＩａ希釈物（Ｘａｓｅ複合体）２５μＬを含む４枚のアッセイプレートに分配するようにプログラムしたＢｉｏＭｅｋ  ＦＸ  ｌｉｑｕｉｄ  ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いて開始した。アッセイにおける試薬の最終濃度は、次のとおりであった：２ｐＭ  ＦＩＸａ、４００〜０ｎＭ  ＦＶＩＩＩａ、１００μＭ  ＰＣ／ＰＳ小胞、０．５ｍＭ  Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ  Ｘａ、３．８ｎＭアルファ−トロンビン（阻害済）、３８ｎＭヒルジンおよび５００ｎＭのＦＸ。反応を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒにおいて３０分間、３７℃でモニターした。遊離ＡＭＣの標準曲線を０μＭから１００μＭ  ＡＭＣに及ぶ用量範囲を用いる続くデータ分析計算においてＲＦＵからμＭへの変換係数として利用した。
【０５５１】
Ｂ．データ分析
ＦＩＸａ変異体のＦＶＩＩＩａに対する機能的親和性をそれらの触媒活性に基づいて決定するために、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で集めた生データを．ＴＸＴファイルとして出力した。さらなる非線形データ分析を、ＸＥ  Ｒｕｎｎｅｒ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｍｏｄｕｌｅ（ＩＤＢＳ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いるＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅで直接実施した。データ分析は、若干の変更を伴って本質的に実施例４Ｂにおいて記載のとおりであった。Ａベーステンプレートを、各ＦＶＩＩＩａＸ濃度で検査したＦＩＸａ変異体の放物型反応速度（μＭ／秒２）を方程式（１）に示す標準直角双曲線の関数（すなわちミカエリスメンテン方程式）に自動的にフィットするように設定し、ＶｍａｘおよびＫＤ−ａｐｐのフィット値を得た。
【０５５２】
方程式（１）
【数８】
0006027221.tif 000276
【０５５３】
表３１は、アッセイしたＦＩＸａ変異体それぞれについての機能的親和性（ＫＤ−ａｐｐ）を記載する。同様にアッセイしたのは組換え野生型ＦＩＸａ（Ｃａｔａｌｙｓｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＷＴと称する；上の実施例１に記載のとおり生成した）、血漿精製ＦＩＸａ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）およびＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）［Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）、Ｗｙｅｔｈ］であった。表ＸＸは、親和性に関する動力学的定数ＫＤ−ａｐｐ（ｎＭ）として、およＦＩＸａ変異体と比較した野生型ＦＩＸａの機能的親和性の比として（各ＦＩＸａ変異体の機能的親和性は、基質ＦＸの活性化についてのＫＤ−ａｐｐ（ｎＭ）によって定義される）表した結果を示す。ＦＩＸａ変異体の活性を野生型ＦＩＸａと比較する場合は、活性におけるいかなる差異も突然変異（複数可）の結果であり、たとえば異なる発現系に関連する翻訳後修飾における差異の結果ではないことを確実にするために変異体ＦＩＸａポリペプチドについて用いたのと同じ条件を用いて発現および精製した組換え野生型ＦＩＸａポリペプチドと比較した。したがって比較に用いた野生型ＦＩＸａポリペプチドは、配列番号１において記載されるＦＩＸ遺伝子のクローニングから生成され、ＣＨＯＸ細胞から配列番号３において記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとして発現された実施例１において記載される組換え野生型ＦＩＸａ（すなわちＣａｔａｌｙｓｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＷＴ  ＦＩＸ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）であった。標準偏差（Ｓ．Ｄ．）、変動係数（百分率として；％ＣＶ）および実施アッセイ数（ｎ）も提供する。
【０５５４】
いくつかの変異体は、野生型と類似の親和性またはＫＤ−ａｐｐにおける名目上の増加を示したが（たとえば、ＦＩＸａ−Ｒ３１８Ｙ／Ｒ３３８ＥおよびＦＩＸａ−Ｒ３１８Ｙ／Ｒ３３８Ｅ／Ｒ４０３Ｅ／Ｅ４１０Ｎ）、いくつかの変異体は、ＫＤ−ａｐｐにおける６〜１０倍を超える増加を有する機能的親和性における顕著な増加を表した。突然変異Ｒ３３８Ｅ、Ｔ３４３ＲおよびＥ４１０Ｎの組合せを有する変異体は、機能的親和性において最も大きな改善を示した。たとえば、FIXa-R338E/T343R、FIXa-R318Y/R338E/T343R/E410N、FIXa-R318Y/R338E/E410N、FIXa-Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/R403E/E410N、FIXa-R338E/E410NおよびFIXa-K228N/247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/E410Nはこの群に含まれる。
【０５５５】
表31. FIXa変異体の機能的補因子親和性(ＫD-app)
【表３１−１】
0006027221.tif 000277
【表３１−２】
0006027221.tif 000278
【表３１−３】
0006027221.tif 000279
【表３１−４】
0006027221.tif 000280
【表３１−５】
0006027221.tif 000281
【表３１−６】
0006027221.tif 000282
【表３１−７】
0006027221.tif 000283
【表３１−８】
0006027221.tif 000284
【表３１−９】
0006027221.tif 000285
【表３１−１０】
0006027221.tif 000286
【表３１−１１】
0006027221.tif 000287
【実施例９】
【０５５６】
血友病Ｂ血漿中のＦＩＸ変異体の凝固活性の決定
ＦＩＸ変異体についての凝固活性を、製造者の説明書に従って、１％未満凝固活性を有する単一のドナー由来のヒト血友病Ｂ血漿（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．、Ｏｖｅｒｌａｎｄ  Ｐａｒｋ、Ｋａｎｓａｓ）における活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイによって決定した。簡潔には、ａＰＴＴアッセイには、精製リン脂質（血小板代替物）ならびに活性化因子［カオリンおよびスルファチド（ｓｕｌｐｈａｔｉｄｅ）］の混合物の存在下での血漿のカルシウム再加が関与する。最終濃度１００ｎＭ、１０ｎＭまたは１ｎＭでＦＩＸ変異体を血友病Ｂ血漿に添加したＦＩＸ変異体と共にＤａｐｔｔｉｎ（登録商標）ＴＣ  ａＰＴＴ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ  ＧｍｂＨ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）を本質的に製造者の製品挿入物に記載のとおり用いてａＰＴＴアッセイを実施した。簡潔には、ＦＩＸ変異体を活性部位滴定した酵素前駆体濃度（実施例２）に基づいて1×緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／０．５％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）中に１μＭへ希釈した。次にＦＩＸ変異体をクエン酸処理ヒト血友病Ｂ血漿（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ）中へ１００ｎＭ、１０ｎＭおよび１ｎＭに直接系列希釈した。血漿中の各ＦＩＸ希釈物の１００μＬ容量をＤａｐｔｔｉｎ（登録商標）ＴＣ  ａＰＴＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  １００μＬと混合し、３７℃、１８０秒間インキュベートした。血液凝固を２５ｍＭカルシウム（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ、Ａｓｎｉｅｒｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）１００μＬの添加によって開始した。秒数での血液凝固時間をＳＴＡｒｔ４  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ、Ａｓｎｉｅｒｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて測定した。各実験は、典型的には５％ＣＶ未満を示す２種の独立した凝固時間測定値の平均を示す。
【０５５７】
表３２は、アッセイした各ＦＩＸ変異体についての凝固活性を記載する。同様にアッセイしたのは組換え野生型ＦＩＸａ（Ｃａｔａｌｙｓｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＷＴと称する；上の実施例１に記載のとおり生成した）およびＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）［Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）、Ｗｙｅｔｈ］であった。表ＸＸは、検査した３種のＦＩＸ濃度；１００ｎＭ、１０ｎＭおよび１ｎＭ［各ＦＩＸ濃度はプールされた正常血漿（ＰＮＰ）におけるＦＩＸの正常濃度の約１００％、約１０％および約１％を表す］それぞれにおいて凝固するまでの時間として表す結果を示す。同一のアッセイ条件下で、１００％ＰＮＰは、３１．３±２．０秒の凝固時間を示し、血友病Ｂ血漿中のＰＮＰの１０％および１％希釈物についての凝固時間は、それぞれ４２．７±１．７および５５．０±４．７秒である（ｎ＝４）。これらの分析において用いられた血友病Ｂ血漿について凝固までの時間は、８３．２±９．２秒と評価された（ｎ＝５）。検査した変異体の多くは、野生型ＦＩＸａと比較して類似のまたはわずかに延長した凝固時間を実証し、ここで比較のために用いられた野生型ＦＩＸａポリペプチドは、ＣＨＯＸ細胞から配列番号３において記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとして発現された実施例１において記載される組換え野生型ＦＩＸａ（すなわちＣａｔａｌｙｓｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＷＴ  ＦＩＸ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）であった。一方いくつかの変異体は、顕著に短縮された凝固時間を示した。この群に含まれる変異体は、FIXa-R318Y/R338E/T343R、FIXa-R318Y/R338E/E410N、FIXa-R338E/T343R/E410N、FIXa-R318Y/R338E/T343R/E410N、FIXa-K247N/N249S/R338E/T343R/E410NおよびFIXa-K228N/247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/E410Nである。
【０５５８】
表32. 血友病B血漿におけるFIX変異体の凝固活性(aPTT)
【表３２−１】
0006027221.tif 000288
【表３２−２】
0006027221.tif 000289
【表３２−３】
0006027221.tif 000290
【表３２−４】
0006027221.tif 000291
【表３２−５】
0006027221.tif 000292
【表３２−６】
0006027221.tif 000293
【表３２−７】
0006027221.tif 000294
【表３２−８】
0006027221.tif 000295
【表３２−９】
0006027221.tif 000296
【表３２−１０】
0006027221.tif 000297
【表３２−１１】
0006027221.tif 000298
【表３２−１２】
0006027221.tif 000299
【表３２−１３】
0006027221.tif 000300
【表３２−１４】
0006027221.tif 000301
【表３２−１５】
0006027221.tif 000302
【表３２−１６】
0006027221.tif 000303
【０５５９】
変更が当業者に明らかであることから、本発明が添付の特許請求の範囲の範囲によってのみ限定されることが意図される。
【図１】
0006027221.tif 000304
【図２】
0006027221.tif 000305
【図３−１】
0006027221.tif 000306
【図３−２】
0006027221.tif 000307
【図３−３】
0006027221.tif 000308
【図３−４】
0006027221.tif 000309
【配列表】
0006027221000001.app