(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮増殖因子受容体に対抗する、ニモツズマブとの名称のヒト化モノクローナル抗体及びＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシド（ＮｅｕＧｃＧＭ３ガングリオシド）に対抗するワクチンを含む、癌の治療において使用するための、組成物。
【請求項２】
前記ワクチンが、ＮｅｕＧｃＧＭ３を組み込んで有する非常に小さいサイズの粒子（ＶＳＳＰ）（ＮｅｕＧｃＧＭ３／ＶＳＳＰ）を有効成分として有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ワクチンが、アルミナでアジュバント化されたラコツムマブ（Ｒａｃｏｔｕｍｕｍａｂ）抗イディオタイプワクチンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記癌が、ＥＧＦＲ及びＮｅｕＧｃＧＭ３ガングリオシドの標的を共発現する腫瘍である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記腫瘍が、肺、乳房、消化系、泌尿生殖器系、及び、神経外胚葉性組織に由来する肉腫の腫瘍、並びにリンパ増殖性疾患を含む群から選択される癌である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
モノクローナル抗体ニモツズマブの用量が、１００から４００ｍｇの範囲内である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
ワクチンＮｅｕＧｃＧＭ３／ＶＳＳＰ又は抗イディオタイプワクチンの用量が、０．１から２ｍｇの範囲内である、請求項２又は３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの医療の分野に関連し、特にＥＧＦＲ及びＮ−グリコリルガングリオシド（ＮｅｕＧｃＧＭ３）を過剰発現する腫瘍の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）は、現在の臨床評価において最も使用される分子標的の一つである。この分子は、多種のヒト上皮組織において過剰発現する（Ｙａｒｄｅｎ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  Ｍ．  Ｘ．，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００１，  ２：  １２７−１３７）。２種の治療が、ＥＧＦ受容体の機能を阻害するための療法において最も頻繁に使用される：モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）の中和及びチロシンキナーゼ活性を阻害する小分子（ＴＫＩ，チロシンキナーゼ阻害物質）（Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ，  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｔｏｒｔｏｒａ  Ｇ．，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ２００８，  ３５８：  １１６０−１１７４）。そのこともまた示されてきているにもかかわらず、ＥＧＦＲの細胞外ドメインを有するワクチンは、非常に小さいサイズの粒子（ＶＳＳＰ）をアジュバントとして使用した場合に、Ｌｅｗｉｓ肺肉腫のマウスモデルにおける抗転移性効果を生じた（Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｒａｍｉｒｅｚ  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ．  ２００６，  １１９：  ２１９０−２１９９）。抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体での治療は、発がん性シグナルの遮断及びＦｃ受容体により媒介される先天性免疫応答機構の誘導による腫瘍の退行を媒介する（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ，  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００９，１５８：  １−９）。
【０００３】
ＥＧＦＲに対抗するいくつかのヒトモノクローナル抗体が産生されてきていて、セツキシマブ（Ｇａｒｒｅｔｔ  ＣＲ，  ａｎｄ  Ｅｎｇ  Ｃ．，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２０１１；  １１：  ７，  ９３７−４９）及びニモツズマブ（ｍａｔｅｏ  Ｃ，  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９７；  ３：７１−８１）．が挙げられる。ニモツズマブの、ＥＧＦＲを過剰発現する異なる腫瘍の療法における（Ｃｒｏｍｂｅｔ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ．  ２００６，  ５：３７５−３７９）又は他の療法との組合せにおける（Ｃｒｏｍｂｅｔ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００４，  ２２：１６４６−１６５４；  Ｚｈａｏ  ＫＬ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ．  ２０１１  Ｐｒｅ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ８）．抗腫瘍効果が、記載されてきている。一方で、マウスＥＧＦＲに対抗して産生された７Ａ７  ＭＡｂは、Ｌｅｗｉｓ肺肉腫の治療においてＴ細胞により媒介される抗腫瘍効果を示した（Ｇａｒｒｉｄｏ  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ２００７，  ５６：  １７０１−１７１０）。
【０００４】
最も研究された標的の別のものは、ガングリオシドであり、これらはそれらの構造中にシアル酸を含むスフィンゴ糖脂質である。これらの分子は、正常な組織において存在し、腫瘍組織において過剰発現する（Ｚｈａｎｇ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ７３：４２−４９，  １９９７）。シアル酸の２つの型が存在する：Ｎ−アセチル化及びＮ−グリコリル化、後者はヒトの腫瘍において記載され（Ｍａｌｙｋｈ  Ｙ  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．  ２００１，  ８３：７  ６２３−６３４）、両者はガングリオシド（Ｋａｗａｉ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ，  １９９１  Ｃａｎｃｅｒ．  Ｒｅｓ．  （５１）  １２４２−１２４６）及びＮ−グリコリル化糖タンパク質（Ｄｅｖｉｎｅ  Ｐ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９９１，  ５１：  ２１，  ５８２６−５８３６）として記載される。この理由により、これらの分子は多くの悪性腫瘍において同定されてきていて、癌療法のための魅力的な標的となっている。とりわけ、ＮｅｕＧｃＧＭ３ガングリオシドは、１４Ｆ７  ＭＡｂによって特異的に認識される（Ｃａｒｒ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，  ２０００，  １９：  ３，  ２４１−２４７）。このガングリオシドは、異なる腫瘍において種々の方法によって同定されてきている（Ｂｌａｎｃｏ  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ，  ＩＳＲＮ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．  ２０１１，  Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ９５３８０３，  １０  ｐａｇ．，  Ｍａｒｑｕｉｎａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  １９９６，  ５６：  ２２，  ５１６５−５１７１）。
【０００５】
ＮｅｕＧｃＧＭ３／ＶＳＳＰ分子ワクチンを使用する、腫瘍においてＮｅｕＧｃＧＭ３に対抗する活発な免疫療法が公開されてきていて（Ｅｓｔｅｖｅｚ  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｖａｃｃｉｎｅ．  １９９９，  １８：１９０−１９７）、進行乳癌患者においてその免疫原性及びその安全性が示されてきている（Ｃａｒｒ  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ，  ＪＣＯ．  ２００３，  ２１：１０１５−１０２１）。さらに、前臨床段階において、その潜在的抗腫瘍効果（抗転移性）がＮＫ及びＣＤ８＋細胞の細胞応答の機構によって媒介されることが示されてきている（Ｌａｂｒａｄａ  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２０１０，  １０：２，１５３−１６２）。同時に、抗腫瘍効果が抗イディオタイプワクチン（１Ｅ１０抗イディオタイプモノクローナル抗体、Ｎ−グリコリル化ガングリオシドを模倣するラコツムマブ（Ｒａｃｏｔｕｍｕｍａｂ））で免疫化した非小細胞肺癌を有する患者において産生されてきている（Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ．  ２００７，  ６：１２，  １８４７−１８５２）。このワクチンでの公開された結果は、その免疫原性及び安全性を示す（Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ２００２，  １６８：  ２５２３−２５２９）。
【０００６】
膜マイクロドメインにおけるＥＧＦＲは、腫瘍細胞の増殖をコントロールすることにおいて本質的な役割を果たす。ＧＭ３ガングリオシドが非常に多種の細胞系統においてＥＧＦＲ依存性増殖を阻害することが、インビボ及びインビトロの両方で示されてきている。ＧＭ３は、ＥＧＦＲキナーゼ活性（ＥＧＦＲ自己リン酸化）を阻害する。ＧＭ３ガングリオシドは、ＥＧＦＲのキナーゼドメインの自己リン酸化を阻害する。ＧＭ３は、ＥＧＦＲ二量体による不活性型からシグナリングへの構造的変換をアロステリックに制御し、それによってキナーゼ細胞内ドメインのリガンド結合部位への自己リン酸化を防止する潜在的許容力を有する（Ｃｏｓｋｕｎ  Ｕ．，  ｅｔ  ａｌ，  ＰＮＡＳ．  ２０１１，  １０８：  ２２，  ９０４４−９０４８）。膜におけるガングリオシドの組成の変化は、ＥＧＦＲシグナルトランスダクションの制御において重要である（Ｚｕｒｉｔａ  ＡＲ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２００１，  ３５：  ４６５−４７２）。
【０００７】
有望な結果が、同時又は交代（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）の抗腫瘍療法の医療行為において予期されている（Ｔａｋｅｄａ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．，  ２００７；  ９８：  ９，  １２９７−１３０２）。しかし、抗腫瘍療法に適用する全てのスキームが、実践において陽性かつ協調的効果を与えるわけではない。抗ＥＧＦＲ  ＭＡｂ（セツキシマブ）及び抗血管内皮増殖因子ＭＡｂ  （ベバシズマブ）を潜在的化学療法薬物計画とともに使用した転移性直腸結腸における第三相臨床試験において、癌の進行の悪化が見られ、ベバシズマブと化学療法のみを受容した患者と比較して重篤な不利な効果までも生じた（Ｔｏｌ  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２００９；  ３６０：６，５６３−７２）。患者における種々の療法の成功的な実施は、これらの療法のための選択された標的、腫瘍の局在性並びに各症例に適用される療法の性質（抗体、ワクチン等）の間の特異的な機能的関係性の結果である。
【０００８】
今日、腫瘍細胞におけるガングリオシド及びＥＧＦＲの間の構造的及び機能的関係性の文献における証拠が存在する。しかしながら、ＥＧＦＲ及びガングリオシド標的に対抗する療法の同じ患者における成功した投与におけるこの関係性の実践的暗示は、臨床又は前臨床試験のいずれにおいても扱われてきていない。本発明の新規性は、抗ＥＧＦＲ療法及び抗ＮｅｕＧｃＧＭ３ワクチンの、これらの標的を共発現する腫瘍における適用に由来する抗腫瘍活性の強調的増強作用の初めての臨床的及び前臨床的提示に負う。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＥＧＦＲ及びＧＭ３  Ｎ−グリコリルガングリオシド標的に特異的に目標化した、これらの標的に別個に対抗する療法によって産生される治療効果を増強する目的での、医薬的癌組成物に関する。一実施形態では、本発明は、ＧＭ３  Ｎグリコリルを標的にするワクチン及びＥＧＦＲに対抗する抗体を含む。別の実施形態では、本発明は、ＮグリコリルＧＭ３を標的にするワクチン及びＥＧＦＲを標的にするワクチンを含む。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の他の実施形態では、ガングリオシド標的に対抗するワクチンは、ＮｅｕＧｃＧＭ３／ＶＳＳＰワクチン及び／又は抗イディオタイプワクチン（アルミナ中でアジュバント化されたラコツムマブＭＡｂ）といったワクチンを含む。別の実施形態では、本発明は、ニモツズマブＭＡｂ及び／又はＥＧＦＲワクチンを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
別の実施形態では、ＥＧＦ受容体に対抗する化合物及びＮｅｕＧｃＧＭ３ガングリオシドに対抗する化合物を含むがん治療における使用のための組成物を包含する。
【００１２】
別の態様では、上に記載した化合物のいずれかを、医薬的に受容可能な賦形剤と混合して含む医薬組成物を提供する。
【００１３】
本発明の化合物は、癌といった状態の治療のための医薬を含めて、医薬として有用であり、医薬の製造のために有用である。
【００１４】
別の実施形態において、本発明の治療的組成物は、がん治療において、とりわけ異なる局在のヒトの腫瘍において有用である。好ましくは、本発明の治療的組成物は、ＥＧＦＲ及びガングリオシドのＮ−グリコリル化改変体を同時に発現するこれらの腫瘍の治療に有用である。最も好ましくは、神経外胚葉性組織に由来する肺、乳房、消化系、泌尿生殖器系及び肉腫の腫瘍並びにリンパ増殖性疾患を治療するために使用される。
【００１５】
上に記載される化合物の任意の適した製剤は、当該分野で公知の方法による投与のために調製してもよい。有用な賦形剤又はキャリアの選択は、意図した投与経路及び投与される化合物の特性に基づいて、過度の実験を要せずに達成することができる。
【００１６】
任意の適した投与経路は、患者基準を治療する医師に従って使用してもよく、限定されずに、非経口、静脈内、筋肉内、経皮、局所的及び皮内を含む。各投与経路のための適した製剤の調製は、当該分野で公知である。
【００１７】
各成分の製剤は、希釈剤及び、いくつかの場合においては、アジュバント、緩衝剤、保存剤等をしばしば含む。これらの化合物はまた、リポソーム又はマイクロエマルション組成物中で投与されてもよい。
【００１８】
注射のために、製剤は、液体溶液若しくは懸濁体又は注射の前に液体中で溶液若しくは懸濁体のために適した固体形態といった、従来の形態で調製することができる。適した賦形剤には、例えば、水、食塩水、デキストロース及び同様な化合物が含まれる。
【００１９】
本発明の化合物は、単独で又は他の治療剤と組み合わせて使用してもよい。特別な実施形態では、本発明は、治療する腫瘍の型のために使用される従来の化学療法及び／又は放射との組合せを参照する。
【００２０】
別の実施形態では、本発明はまた、癌治療におけるＥＧＦＲ及びＧＭ３  Ｎ−グリコリルガングリオシド標的に対して向けられた療法の同時の、互い違いの（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）又は交代の（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）使用に関する。
【００２１】
ＥＧＦＲに対抗する化合物及びＧＭ３  Ｎ−グリコリルガングリオシド標的に対抗する化合物は、別個に、さらには異なる時間で及び異なる頻度で投与される。両方の化合物は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内又は腹腔内等といった任意の公知の経路で投与されてもよい。多くの実施形態では、少なくとも１つ及び任意で２つの治療剤を、非経口で投与することができる。
【００２２】
本発明の化合物又は組成物を別の抗癌剤と組み合わせて使用する場合、本発明は、例えば、同時の、互い違いの（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）又は交代の（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）治療を提供する。従って、本発明の化合物は、別個の医薬組成物中で同時に投与してもよく、ここで本発明の化合物は、他の抗癌剤の前又は後で、秒、分、時間、日又は週の相違をもって投与することができる。
【００２３】
本発明は、本明細書中に記載の化合物の組合せの、それを必要とする対象への腫瘍増殖をコントロール又は低減するために効果的な量での投与を含む、腫瘍増殖をコントロール及び／又は阻害するための方法を提供する。特定の実施形態では、腫瘍増殖は、異なる臨床段階で、ただし、腫瘍がＥＧＦＲ及びＮ−グリコリルＧＭ３を共発現する場合において、腫瘍と関連する。特別の実施形態では、本発明は、神経外胚葉性組織に由来する肺、乳房、消化系、泌尿生殖器系及び肉腫の腫瘍並びにリンパ増殖性疾患に関する。
【００２４】
本発明は、このような治療を必要とする対象における癌を治療する方法であって、このような障害を治療するために有用な、治療的に有効な量のＥＧＦＲに対抗する化合物を対象に投与するための方法及びＮｅｕＧｃＧＭ３ワクチン又は抗イディオタイプワクチンを所望の効果を増強するために有効な量で対象に投与するための方法を含む、方法もまた含む。本発明に従う改善は、疾患の臨床的症状の部分的な又は完全な退行又は安定化に関する。本発明の別の実施形態では、改善することは、腫瘍サイズを減少させること及び／又は対象においての増加した生存率を誘導することを意味する。
【００２５】
特定の実施形態において、本発明は、第１の誘導相及び第２の維持相を含む。特別な実施形態において、誘導相は、患者に抗ＥＧＦＲワクチンを約０．１〜２ｍｇの範囲の用量で、約７〜１４日の期間の間、約８〜１４週間の間投与することを含む。この期間の間、患者はＮｅｕＧｃＧＭ３ワクチン又は抗イディオタイプワクチンを約０．１〜２ｍｇの範囲の用量で約７〜１４日の間隔で含むＮｅｕＧｃＧＭ３抗ガングリオシド療法を投与されるであろう。
【００２６】
本発明は、抗ＥＧＦＲを約１００〜４００ｍｇの範囲の用量で約６〜１０週間の時間間隔の間で伴う受動的療法を患者に投与することを含む方法を含む。別の実施形態では、抗ＥＧＦＲ療法は、ＥＧＦＲに対抗するワクチンを約０．１〜２ｍｇの範囲の用量で約７〜１４日の時間間隔で投与することを含む。その期間の間、患者は、ＮｅｕＧｃＧＭ３ワクチン又は抗イディオタイプワクチンを約０．１〜２ｍｇの範囲の用量で約７〜１４日の時間間隔で追加して受容するであろう。
【００２７】
別の実施形態では、本発明の第２相治療方法は、毒性及び／又は疾患の臨床的症状が出現しない維持療法として投与されるために設計された治療スケジュールを含む。維持相では、ワクチンは、好ましくは上に記載した用量で及び約１〜３月の時間間隔で投与される。別の実施形態では、受動的療法は、約１４日〜３月の間隔で投与される。療法スキームは、約１〜５年の期間で投与することができる。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲに向けられた治療剤及びＮｅｕＧｃＧＭ３ワクチン又は抗イディオタイプワクチンは、同時に投与される。ＥＧＦＲに向けられた治療剤及びＮｅｕＧｃＧＭ３ワクチン又は抗イディオタイプワクチンは、時には対象において同じ時に使用される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ＮｅｕＧｃＧＭ３抗ガングリオシド療法は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内又は腹腔内注射により投与することができ、一方で抗ＥＧＦＲ療法は、皮下、静脈内又は筋肉内経路で投与することができる。他の実施形態では、投与部位は、輸入リンパ節の存在によって決定される。
【００３０】
別の実施形態では、療法の適用の間に、患者の何らかの生化学的及び画像的パラメータが記録される。細胞性及び液性免疫は、好ましくは患者の血液を使用して分析される。血液試験は、週ごとから６月ごとまでの範囲の頻度で実施される。
【００３１】
本発明で使用される「共発現」とは、両方の標的が発現するが密接な構造的関係性を有していてもいなくてもよいことを意味し、この定義の運用基準は、蛍光顕微鏡及び画像の重ねあわせを可能にするプロセッサを使用する、二重染色によるＥＧＦＲ及びＮ−グリコリル化ガングリオシド（ＮｅｕＧｃＧＭ３）発現を決定することによるものである。
【００３２】
本発明で使用される「共局在」とは、両方の標的が構造的に密接であることを指し、この決定のための運用基準は、共焦点顕微鏡を使用する二重染色によるＥＧＦＲ及びＮ−グリコリル化ガングリオシド（ＮｅｕＧｃＧＭ３）発現の定義によるものである。
【００３３】
さらなる実施形態では、本発明は、ＥＧＦＲに対抗する化合物及びＮｅｕＧｃＧＭ３ガングリオシドに対抗する化合物の、患者において腫瘍増殖を遅延させるための医薬を調製するための使用であって、下記：
（ａ）最初に患者にＥＧＦ受容体に対抗する化合物を含む医薬を投与する工程、及び
（ｂ）引き続いて同じ患者にＮｅｕＧｃＧＭ３ガングリオシドに対抗する化合物を含む医薬を投与する工程
を含む治療計画に従う上記使用を包含する。
【００３４】
投与は、この順番で又は逆の順番で、すなわち、最初に患者にＮｅｕＧｃＧＭ３ガングリオシドに対抗する化合物を含む医薬を投与する工程、及び引き続いて同じ患者にＥＧＦ  受容体に対抗する化合物を含む医薬を投与する工程、ですることができる。
【００３５】
特別な実施形態では、本発明は、ＥＧＦＲ及びＮｅｕＧｃＧＭ３ガングリオシド標的を共発現する腫瘍の療法のための試薬のキットを包含し、当該キットは、ＥＧＦＲに対抗する化合物及びＮｅｕＧｃＧＭ３ガングリオシドに対抗する別の化合物の同時の、互い違いの（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）又は交代の（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）投与を含む。
【００３６】
（異なる局在のヒト腫瘍におけるＥＧＦＲ及びＮ−グリコリル化ガングリオシド（ＮｅｕＧｃＧＭ３）の共発現の決定）
腫瘍におけるＥＧＦＲ及びＮｅｕＧｃＧＭ３治療標的の発現の測定は、このような目的のために当該分野で記載された方法のいずれかを使用して実施することができる。このような測定は、  異なる局在及び起源の腫瘍において、ホルモル中で事前に固定した腫瘍サンプル上で又は新鮮な組織スライス上で実施される。好ましい実施形態では、検出は、ＥＧＦＲ及びＧＭ３  Ｎ−グリコリル化改変体認識のための免疫学的技術を用いることにより実施される。特に、免疫組織化学及び明視野顕微鏡学は、共発現を決定するための両方の分子の免疫認識又は免疫蛍光及び蛍光顕微鏡のために、又は共局在を決定するための免疫蛍光及び共焦点顕微鏡学のために、別個に使用することができる。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態では、ＥＧＦＲは、ＥＰ０５８６００２Ｂ１に記載されるｉｏｒ  ｅｇｆ／Ｒ３ｍ  ＭＡｂ（５〜２０μｇ／ｍｌ）を使用して検出することができ、及びＮｅｕＧｃＧＭ３は、ＵＳ６，４２９，２９５又はＥＰ０９７２７８２Ｂ１に記載される１４Ｆ７  ＭＡｂ（５〜２５μｇ／ｍｌ）を使用して検出することができる。本発明の一実施形態では、両方の分子の別個の免疫認識（単純な染色）のために、Ｄａｋｏ、ＬＳＡＢＲ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＤＡＢ（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）を検出システムとして使用することができる。
【００３８】
ＥＧＦＲが腫瘍細胞の細胞膜上に局在し、一方ＧＭ３Ｎ−グリコリルが膜中及び細胞質中に局在するとすれば、免疫認識は、反応の強度が２０％以上の陽性度である場合に陽性であるとみなされる。
【００３９】
好ましい実施形態では、両方の分子の共発現は、以前に免疫認識が両方の分子について別個に陽性であったこれらの腫瘍サンプルにおいてのみ、二重染色技術を使用して検出し及び蛍光顕微鏡法により分析することができる。好ましい実施形態では、ＥＧＦＲの免疫認識は、Ｉｏｒ  ｅｇｆ／Ｒ３ｍ  ｍＡｂ（５〜２０μｇ／ｍｌ）と１時間、次いでローダミンとコンジュゲートしたＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）とのインキュベーションによって実施される。別の好ましい実施形態では、ＮｅｕＧｃＧＭ３免疫検出は、ビオチン化１４Ｆ７  ｍＡｂ（５〜２０μｇ／ｍｌ）を３０分、次いで、ＦＩＴＣコンジュゲート化ストレプとアビジン（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）を使用して実施される。
【００４０】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を例示し、及びそれによって例示する役目を果たすが、いずれの場合においても限定と考えるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ＥＧＦＲは、ＮｅｕＧｃＧＭ３ガングリオシドと一緒に異なるマウス腫瘍において局在する。Ｌｅｗｉｓ類表皮カルシノーマ（Ａ〜Ｃ）及びマウスミエローマＰ３−Ｘ６３−Ａｇ．８６５３（Ｄ〜Ｆ）で誘導された肺転移におけるＥＧＦＲ及びＮｅｕＧｃＧＭ３ガングリオシドの局在（Ｃ及びＦ）。
【図２】ＮｅｕＧｃＧＭ３（ＮｅｕＧｃＧＭ３／ＶＳＳＰ）抗ガングリオシドワクチンと組み合わせての抗ＥＧＦＲ療法（７Ａ７  ＭＡｂ）は、Ｌｅｗｉｓ肺肉腫を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの生存性を協調的に増加させる。
【図３】非小細胞肺肉腫を有する患者におけるＥＧＦＲに対抗する受動的療法（ニモツズマブ）及びＮｅｕＧｃＧＭ３（ラコツムマブ（Ｒａｃｏｔｕｍｕｍａｂ）／アルミナ）  抗ガングリオシドワクチンに対する客観的応答。
【図４】後腹膜−膵周囲血管周囲細胞腫を有する患者におけるＮｅｕＧｃＧＭ３（ＮｅｕＧｃＧＭ３／ＶＳＳＰ）ガングリオシドワクチン療法と組み合わせての抗ＥＧＦＲ（ニモツズマブ）に対する驚異的な臨床応答。
【実施例】
【００４２】
（例１：異なるヒト腫瘍におけるＥＧＦＲ及びＮｅｕＧｃＧＭ３ガングリオシド共発現の測定）
腫瘍サンプルを、中性緩衝化ホルマリン中で固定して、当業者に公知であるパラフィン封入技術によって加工した。
【００４３】
５ミクロンの厚さを有して得られた組織セクションを、６０℃で３０分間維持し、一連の減少するアルコール中で脱パラフィン化及び再水和し、蒸留水中で１０分間保持してＴＢＳで５分間洗浄した。全組織タンパク質の反応性を、市販の溶液（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）で３０分間ブロックした。ＥＧＦＲを、ｉｏｒ  ｅｇｆ／Ｒ３ｍ（２０μｇ／ｍｌ）を１時間の間使用して免疫検出した。ＮｅｕＧｃＧＭ３の免疫認識を、１４Ｆ７  （ＭＡｂ  ２０μｇ／ｍｌ）を３０分間使用して実施した。一次抗体の反応後、両方の場合において、使用した検出システムは、Ｄａｋｏ、ＬＳＡＢＲ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＤＡＢ（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）であった。組織セクションを、脱水して、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンコントラストを使用した（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）。陰性対照は、一次抗体（Ｉｏｒ  ｅｇｆ／Ｒ３ｍ  ＭＡｂ  ｏｒ  １４Ｆ７  ＭＡｂ）をＴＢＳ洗浄溶液（１Ｘ）で置き換えることにより得て、乳管カルシノーマを陽性対照として使用した。
【００４４】
ＥＧＦＲの免疫認識は、腫瘍細胞の細胞膜上に局在して、ＮｅｕＧｃＧＭ３ガングリオシドは、細胞質内及び／又は細胞の細胞膜中で検出された。
【００４５】
二重染色：ＥＧＦＲを、Ｉｏｒ  ｅｇｆ／Ｒ３ｍ  ＭＡｂ（抗ＥＧＦＲ）で検出して、次いでＦＩＴＣ−コンジュゲート化ストレプトアビジン（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）とインキュベートした。ＮｅｕＧｃＧＭ３を、ビオチン化１４Ｆ７  ＭＡｂで、及び引き続いてローダミンにコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）で検出した。腫瘍細胞における両方の分子の共発現を、画像中の黄色で同定した。組織セクションを、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、日本）に接続したカメラを使用してデジタル化及び分析した。デジタル化イメージの分析のために、ＩｍａｇｅＪ  ｉｍａｇｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．４３ｕを使用した。
【００４６】
表１は、ＥＧＦＲ  及びＮｅｕＧｃＧＭ３  ガングリオシドが共発現する異なる局在からの腫瘍を示す。
強度：−陰性  ＋弱い  ＋＋中程度、＋＋＋強い。
【表１】
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【００４７】
（例２．マウス腫瘍モデルにおけるＥＧＦＲ及びＮｅｕＧｃＧＭ３ガングリオシドの共発現及び共局在測定）
使用したマウス腫瘍モデルは、Ｌｅｗｉｓ肺肉腫（３ＬＬ−Ｄ１２２）、及びミエローマＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｘ６３）であった。
【００４８】
二重染色を実施して共発現／共局在を決定した。ＥＧＦＲの免疫認識を、７Ａ７  ＭＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）、ビオチン化との１時間のインキュベーション、その後ＦＩＴＣコンジュゲート化ストレプトアビジン（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）とのインキュベーションにより実施した。ＮｅｕＧｃＧＭ３の免疫染色は、１４Ｆ７  ＭＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）との３０分間のインキュベーション、その後ローダミンにコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）とのインキュベーションにより決定した。陰性対照は、一次抗体（７Ａ７  ＭＡｂ又は１４Ｆ７  ＭＡｂ）をＴＢＳ洗浄溶液（１Ｘ）で置き換えることにより得た。共発現は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、日本）及びＩｍａｇｅＪ  ｉｍａｇｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．４３ｕを使用するデジタル化画像の分析を使用することにより決定した。共局在は、共焦点レーザー顕微鏡Ｆｌｏｕｖｉｅｗ  ＦＶ５００（Ｏｌｙｍｐｕｓ、日本）により決定した。
【００４９】
図１は、種々のマウスモデルからの腫瘍サンプルにおけるＥＧＦＲ及びＮｅｕＧｃＧＭ３の共局在を示す。ＥＧＦＲは、ビオチン化７Ａ７  ＭＡｂその後ＦＩＴＣカップリング化ストレプトアビジンで同定した。黄色は、色オーバーレイによるマウスモデルの腫瘍細胞における両方の分子の共局在（Ｃ及びＦ）を同定する。
【００５０】
（例３．ＮｅｕＧｃＧＭ３／ＶＳＳＰワクチン及び７Ａ７  ｍＡｂで治療したＬｅｗｉｓ肺肉腫を保有するＣ５７ＢＬ／６マウスの生存性の測定）
（自然転移モデル）
動物は、右足蹠に２ｘ１０５細胞のＬｅｗｉｓ類表皮カルシノーマ（３ＬＬ−Ｄ１２２）を０．０５ｍｌの体積で接種し、これは実験プロトコールの０日目に相当した。実験の３日目に、動物を各１０匹の動物の４つの実験群へと無作為分別した。２４日目に、腫瘍が８〜９ｍｍの体積に到達した場合に、一次腫瘍外科手術を実施した。４８日目から、動物の臨床的状態の観察を開始した。生存性データを、ログランク検定、ｐ＜０．０５を使用して分析して、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロット上に表示した。結果には等条件で実施した３つの実験を含む。
【００５１】
実験群
未治療対象（Ｔ）
受動的抗ＥＧＦＲ療法：７Ａ７  ＭＡｂ、静脈内に２００μｌの食塩水溶液中５６μｇの用量で、３、５、７、９、３１、３３及び３５日目に。
活性抗ＮｅｕＧｃＧＭ３療法：ＮｅｕＧｃＧＭ３／ＶＳＳＰワクチン、皮下に２００μｌ中２００μｇの用量で、７、２１、３５及び４７日目に。
群２及び３について記載されるように抗ＥＧＦＲ及び抗ＮｅｕＧｃＧＭ３療法の同時投与。
【００５２】
図２ａは、Ｌｅｗｉｓ肺肉腫で誘導した肺転移モデル上での抗ＥＧＦＲ及び抗ＮｅｕＧｃＧＭ３（群４）療法の同時投与が動物の生存性を他の実験群と比較して６０％で増加させたことを示す。生存している動物（群４の１つ）を、実験の終了後１週間で犠牲にして、それらの肺を除去した。顕微鏡的分析は、１匹の動物のみが２つの肺転移を示したことを示し、残りの動物の肺が正常であったことを知らせた（図２ｂ）。この結果は、ＥＧＦＲ及びＮｅｕＧｃＧＭ３が共局在するこのマウス腫瘍モデルで研究された抗ＥＧＦＲ及び抗ＮｅｕＧｃＧＭ３療法の抗腫瘍の強力な協調性を提示する（例２を参照）。
【００５３】
（例４．ニモツズマブ抗体及びラコツムマブ（Ｒａｃｏｔｕｍｕｍａｂ）／アルミナワクチンでの療法を受けているがん患者の生存性の測定）
ヒト肺腫瘍のサンプルでの治療標的ＥＧＦＲ及びＮｅｕＧｃＧＭ３ガングリオシドの頻繁な共局在／共発現の所見（例１）；及び例３に示された前臨床的証明が与えられたので、我々は、抗ＥＧＦＲ（ニモツズマブ抗体）及び抗ガングリオシド（ラコツムマブ（Ｒａｃｏｔｕｍｕｍａｂ）／アルミナ抗イディオタイプワクチン）療法での同時の治療を研究することを進行した。各腫瘍部位について標準的な療法を受容したことのある肺癌患者及び疾患進行をすでに有していた肺癌患者における抗ＥＧＦＲ（ニモツズマブ抗体）及び抗ガングリオシド（ラコツムマブ（Ｒａｃｏｔｕｍｕｍａｂ）／アルミナ抗イディオタイプワクチン）療法での同時の治療を研究することを進行した。
【００５４】
表２は、ラコツモマブ（Ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）（１Ｅ１０／アルミナ）ワクチンの単独療法としての又はニモツズマブと組み合わせての拡張された使用プログラム（思いやりのある）からの試験結果を示す。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有し、進行した段階での（再発性及び／又は転移性）癌患者の生存性を、それの上で観察する。この研究上での患者が全ての確立された標準的治療ラインを受容したことがあって、一時的緩和性の非癌特異的療法の候補のみであったこと、及び治験に含まれる時間において、それらは疾患進行を有していたこと．は注目すべきことである。両方の標的に同時に対抗する療法を受容した患者の群では、単一療法のみを受容した者と比較して、治療の２年目での全体の生存度での優位な増加が観察された。
【００５５】
表２．治療の２年目での抗ＥＧＦＲ（ニモツズマブ抗体）及び抗ガングリオシド（ラコツムマブ（Ｒａｃｏｔｕｍｕｍａｂ）／アルミナ抗イディオタイプワクチン）療法で治療した非小細胞肺癌を有する患者の増加した生存性
【表２】
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【００５６】
図３は、ＮＳＣＬＣを有する患者におけるＥＧＦＲに対抗する受動的療法（ニモツズマブ）及びＮｅｕＧｃＧＭ３抗ガングリオシドワクチン（ラコツモマブ（Ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）／アルミナ）に対する客観的応答を示し、ＮＳＣＬＣを有する患者とは、上記のように、一時的緩和性の非癌特異的療法に対してのみの候補であった、全ての確立された標準的治療ラインを受容して、及び治験に含まれる時間において疾患進行を有した患者であった。図３Ａは、診断の時間での腫瘍の局在及び程度を示す。図３Ｂは、治療後２年でのコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）からの結果を示す。後者の図のみで、見ることができる気腫の水疱に関連する透明性が増加した領域を有する線維芽性応答の領域が観察され、及び肺腫瘍病変は観察されない。３年後にも同じ放射線写真画像のままである。この結果は、療法の結果としての非常に進行した腫瘍の驚異的な完全な寛解を指示する。
【００５７】
（例５．ニモツズマブ抗体及びＮｅｕＧｃＧＭ３／ＶＳＳＰワクチンで治療した後腹膜−膵周囲血管周囲細胞腫を有する患者における臨床的応答の測定）
図４は、放射線療法及び化学療法への応答のない、後腹膜−膵周囲血管周囲細胞腫（軟部組織腫瘍）を有する患者の腹部の連続コンピュータ断層撮影法を示す。患者は、最初の診断から１８月後に抗ＥＧＦＲ（ニモツズマブ）及び抗ガングリオシド（ＮｅｕＧｃＧＭ３／ＶＳＳＰワクチン）を受容した。患者は、臍周囲領域での重大な痛み及び拍動する腫瘍塊並びに１５キロより大きい重量損失を被った。図４Ａ及びＢは、療法の開始時間に該当する；Ｃ及びＤは、３年後の評価に該当する。治療の３年後に、腫瘍サイズが同じままである両方の画像により証明されるように、疾患の安定化を観察することができる。そして、７２月評価において、患者は優良な生活の質を維持し、及び彼の勤労生活を継続することが可能である。腫瘍塊の低減に向かっての傾向もまた見ることができる。要約すると、治療に比べて驚くべき臨床的利益がある。
【００５８】
本発明に記載されるような、抗ＥＧＦＲ及び抗ガングリオシド免疫療法で治療された癌患者は、治療の長期の間、優良な寛容性（有意な毒性がない）を呈する。療法は、疾患の安定化、生活の質の増大、無増悪期間及び患者の全体的生存性を促進する。上に記載した療法は、伝統的な抗ＥＧＦＲ又は抗ガングリオシド単一療法を受容する患者で観察されるものよりも優れた効果を有する。
【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図１】
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【図２】
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