(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸の増幅反応または融解温度測定の複数のサイクルにおいて、増幅または融解された標的核酸の量を、該標的核酸の量に応じて発生する光量に応じたレベルの電気信号により検出する検出手段と、
前記検出手段により検出された電気信号を、所定の増幅率で増幅する増幅手段と、
前記増幅反応または融解温度測定の全サイクル数の１／２までのサイクル数である初期段階において前記検出手段により検出された電気信号のレベルの最大値または平均値、及び装置の検出限界値に基づいて、前記初期段階より後の増幅反応または融解温度測定時において検出される電気信号の増幅率を変更するように制御する制御手段と、
を含む核酸検出装置。
【請求項２】
前記検出手段は、前記増幅反応または融解温度測定が進むにつれてレベルが低下する特性を有する電気信号を検出する請求項１記載の核酸検出装置。
【請求項３】
前記増幅反応または融解温度測定に、前記標的核酸の標的配列の領域にハイブリダイズ可能なプローブを用いる請求項１または請求項２記載の核酸検出装置。
【請求項４】
前記プローブは、前記標的配列の領域にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、前記標的配列の領域にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少する請求項３記載の核酸検出装置。
【請求項５】
前記制御手段は、前記初期段階において前記検出手段により検出された電気信号のレベルが、予め定めた範囲を超える場合には、前記増幅反応または融解温度測定の異常を報知する制御、及び前記増幅反応または融解温度測定を停止する制御または前記増幅率を変更しないようにする制御の少なくとも一方を行う請求項１〜請求項４のいずれか１項記載の核酸検出装置。
【請求項６】
前記標的核酸の増幅反応は、リアルタイムＰＣＲである請求項１〜請求項５のいずれか１項記載の核酸検出装置。
【請求項７】
標的核酸の増幅反応または融解温度測定の複数のサイクルにおいて、増幅または融解された標的核酸の量を、該標的核酸の量に応じて発生する光量に応じたレベルの電気信号により検出し、
検出された電気信号を、所定の増幅率で増幅し、
前記増幅反応または融解温度測定の全サイクル数の１／２までのサイクル数である初期段階において検出された電気信号のレベルの最大値または平均値、及び装置の検出限界値に基づいて、前記初期段階より後の増幅反応または融解温度測定時において検出される電気信号の増幅率を変更する
核酸検出方法。
【請求項８】
コンピュータを、
標的核酸の増幅反応または融解温度測定の複数のサイクルにおいて、増幅または融解された標的核酸の量を、該標的核酸の量に応じて発生する光量に応じたレベルの電気信号により検出する検出手段により検出された電気信号を、所定の増幅率で増幅する増幅手段の増幅率であって、前記増幅反応または融解温度測定の全サイクル数の１／２までのサイクル数である初期段階より後の増幅反応または融解温度測定時において検出される電気信号の増幅率を、前記初期段階において前記検出手段により検出された電気信号のレベルの最大値または平均値、及び装置の検出限界値に基づいて変更するように制御する制御手段
として機能させるための核酸検出プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸検出装置、方法、及びプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、リアルタイムＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）などの核酸増幅法や融解温度測定で、増幅または融解された標的核酸の量をモニタリングする場合において、増幅または融解された標的核酸の量に応じた蛍光量を電気信号に変換し、所定の増幅率で増幅して取得することが行われている。一般的には、この増幅率は固定となっており、取得される蛍光量は、ユーザが投入する試薬の量によってコントロールしている。
【０００３】
また、対象物から発せられる蛍光を検出する際に、対象物の情報に基づいて、光電変換増幅率等の検出条件を設定する蛍光検出装置が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
また、予め複数の検出部について共通の値として決められているターゲットＡ／Ｄ値及び標的核酸の増幅前に検出部から出力された受信信号に対応するデフォルト対応受光信号Ａ／Ｄ値に基づいて、デフォルト対応受光信号Ａ／Ｄ値をターゲットＡ／Ｄ値に増幅するための調整後増幅率Ｄ／Ａ値を各検出部について決定する核酸検出装置が提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【０００５】
また、アンプからの増幅度の異なる複数の出力をＡ／Ｄ変換し、そのうち信号が飽和せず、かつ増幅度が最大のものを選択して、選択した信号を処理する光検出装置が提案されている（例えば、特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−８６０３号公報
【特許文献２】特開２００５−２３３９３８号公報
【特許文献３】特開平１０−９６６６６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１の技術では、異なる検出条件（例えば、光電変換増幅率）での検出データを用いて、許容範囲外の検出データを補正して蛍光特性値を求めるものである。また、特許文献２の技術は、複数の検出部各々の受光レベルのばらつきを低減させるものである。このように、特許文献１及び２の技術では、増幅または融解された標的核酸の量を精度良く検出するための適切な増幅率を設定することはできない、という問題がある。
【０００８】
また、特許文献３の技術では、測定開始から終了までの全データについて、増幅度の異なる複数の出力を得ているため、測定が長時間になる場合や、取得される信号のレベルが予測困難なため幅広い増幅率の設定が必要な場合には、メモリ容量が増大する、という問題がある。
【０００９】
本発明は上記問題点を解決するためになされたもので、増幅または融解された標的核酸の量を精度良く検出するための適切な増幅率を設定することができる核酸検出装置、方法、及びプログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、第１の発明の核酸検出装置は、標的核酸の増幅反応または融解温度測定の複数のサイクルにおいて、増幅または融解された標的核酸の量を、該標的核酸の量に応じて発生する光量に応じたレベルの電気信号により検出する検出手段と、前記検出手段により検出された電気信号を、所定の増幅率で増幅する増幅手段と、前記増幅反応または融解温度測定の全サイクル数の１／２までのサイクル数である初期段階において前記検出手段により検出された電気信号のレベルの最大値または平均値、及び装置の検出限界値に基づいて、前記初期段階より後の増幅反応または融解温度測定時において検出される電気信号の増幅率を変更するように制御する制御手段と、を含んで構成されている。
【００１１】
第１の発明の核酸検出装置によれば、検出手段が、標的核酸の増幅反応または融解温度測定の複数のサイクルにおいて、増幅または融解された標的核酸の量を、標的核酸の量に応じて発生する光量に応じたレベルの電気信号により検出する。また、増幅手段が、検出手段により検出された電気信号を、所定の増幅率で増幅する。そして、制御手段が、増幅反応または融解温度測定の全サイクル数の１／２までのサイクル数である初期段階において検出手段により検出された電気信号のレベルの最大値または平均値、及び装置の検出限界値に基づいて、初期段階より後の増幅反応または融解温度測定時において検出される電気信号の増幅率を変更するように制御する。
【００１２】
このように、増幅反応または融解温度測定の初期段階において検出された電気信号、及び装置の検出限界値に基づいて、初期段階より後の増幅反応または融解温度測定時の増幅率を決定するため、全データについて増幅度の異なる複数の出力を得る必要がなく、メモリ容量を削減しつつ、増幅または融解された標的核酸の量を精度良く検出するための適切な増幅率を設定することができる。
【００１３】
また、第１の発明において、前記検出手段は、前記増幅反応または融解温度測定が進むにつれてレベルが低下する特性を有する電気信号を検出するようにすることができる。
【００１４】
また、第１の発明において、前記増幅反応または融解温度測定に、前記標的核酸の標的配列の領域にハイブリダイズ可能なプローブを用いることができる。また、前記プローブは、前記標的配列の領域にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、前記標的配列の領域にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するプローブとすることができる。
【００１５】
また、第１の発明において、前記制御手段は、前記初期段階において前記検出手段により検出された電気信号のレベルが、予め定めた範囲を超える場合には、前記増幅反応または融解温度測定の異常を報知する制御、及び前記増幅反応または融解温度測定を停止する制御または前記増幅率を変更しないようにする制御の少なくとも一方を行うようにすることができる。
【００１６】
また、上記目的を達成するために、第２の発明の核酸検出装置は、標的核酸の増幅反応または融解温度測定における複数の時点において、増幅または融解された標的核酸の量を、該標的核酸の量に応じて発生する光量に応じたレベルの電気信号により検出する検出手段と、前記検出手段により検出された電気信号を、異なる複数の増幅率で増幅する増幅手段と、前記複数の時点毎に、前記異なる複数の増幅率各々で増幅された複数の電気信号が取得されるように、前記増幅手段の増幅率を切り替えるように制御する制御手段と、を含んで構成されている。
【００１７】
第２の発明の核酸検出装置によれば、検出手段が、標的核酸の増幅反応または融解温度測定における複数の時点において、増幅または融解された標的核酸の量を、該標的核酸の量に応じて発生する光量に応じたレベルの電気信号により検出する。また、増幅手段が、検出手段により検出された電気信号を、異なる複数の増幅率で増幅する。そして、制御手段が、複数の時点毎に、異なる複数の増幅率各々で増幅された複数の電気信号が取得されるように、増幅手段の増幅率を切り替えるように制御する。
【００１８】
このように、異なる複数の増幅率で増幅された複数の電気信号を取得することで、幅広い増幅率に対応することができ、また、この電気信号を時点毎に増幅率を切り替えて取得することで、例えば、必要な増幅率で増幅された電気信号のみを取得するように切り替えるなど、増幅率の切り替えを柔軟に行うことができる。従って、検出される光量のレベルが予測困難な場合であっても、増幅または融解された標的核酸の量を精度良く検出するための適切な増幅率を設定することができる。
【００１９】
また、第２の発明において、前記制御手段は、取得された複数の電気信号のうち、装置の検出限界値以下のレベルの電気信号を記憶するように制御することができる。これにより、効率的にメモリ容量を削減することができる。
【００２０】
また、第２の発明において、前記制御手段は、取得された複数の電気信号のうち、装置の検出限界値以下のレベルの電気信号であって、かつ現時点で最大値となる電気信号に対応する増幅率で増幅された電気信号の各時点でのレベルを表示するように制御することができる。これにより、現時点で装置が表現できる階調を最も有効に利用した表示を行うことができる。
【００２１】
また、第２の発明において、前記制御手段は、装置の検出限界値を超えた電気信号に対応する増幅率で増幅された電気信号を、次の時点以降取得しないように制御することができる。これにより、よりメモリ容量の削減を図ることができる。
【００２２】
また、第２の発明において、前記制御手段は、取得された複数の電気信号の全てが、装置の検出限界値を超えた場合には、前記増幅反応または融解温度測定の異常を報知する制御、及び前記増幅反応または融解温度測定を停止する制御の少なくとも一方を行うようにすることができる。
【００２３】
また、第１及び第２の発明における前記標的核酸の増幅反応としては、リアルタイムＰＣＲを挙げることができる。
【００２４】
また、第３の発明の核酸検出方法は、標的核酸の増幅反応または融解温度測定の複数のサイクルにおいて、増幅または融解された標的核酸の量を、該標的核酸の量に応じて発生する光量に応じたレベルの電気信号により検出し、検出された電気信号を、所定の増幅率で増幅し、前記増幅反応または融解温度測定の全サイクル数の１／２までのサイクル数である初期段階において検出された電気信号のレベルの最大値または平均値、及び装置の検出限界値に基づいて、前記初期段階より後の増幅反応または融解温度測定時において検出される電気信号の増幅率を変更する核酸検出方法である。
【００２５】
また、第４の発明の核酸検出方法は、標的核酸の増幅反応または融解温度測定における複数の時点において、増幅または融解された標的核酸の量を、該標的核酸の量に応じて発生する光量に応じたレベルの電気信号により検出し、検出された電気信号を、異なる複数の増幅率で増幅し、前記複数の時点毎に、異なる複数の増幅率各々で増幅された複数の電気信号が取得されるように、検出された電気信号を増幅する増幅手段の増幅率を切り替える核酸検出方法である。
【００２６】
また、第５の発明の核酸検出プログラムは、コンピュータを、標的核酸の増幅反応または融解温度測定の複数のサイクルにおいて、増幅または融解された標的核酸の量を、該標的核酸の量に応じて発生する光量に応じたレベルの電気信号により検出する検出手段により検出された電気信号を、所定の増幅率で増幅する増幅手段の増幅率であって、前記増幅反応または融解温度測定の全サイクル数の１／２までのサイクル数である初期段階より後の増幅反応または融解温度測定時において検出される電気信号の増幅率を、前記初期段階において前記検出手段により検出された電気信号のレベルの最大値または平均値、及び装置の検出限界値に基づいて変更するように制御する制御手段として機能させるためのプログラムである。
【００２７】
また、第６の発明の核酸検出プログラムは、コンピュータを、標的核酸の増幅反応または融解温度測定における複数の時点において、増幅または融解された標的核酸の量を、該標的核酸の量に応じて発生する光量に応じたレベルの電気信号により検出する検出手段により検出された電気信号を、異なる複数の増幅率で増幅する増幅手段により、前記異なる複数の増幅率各々で増幅された複数の電気信号が取得されるように、前記増幅手段の増幅率を切り替えるように制御する制御手段として機能させるためのプログラムである。
【発明の効果】
【００２８】
以上説明したように、本発明の核酸検出装置、方法、及びプログラムによれば、増幅または融解された標的核酸の量を精度良く検出するための適切な増幅率を設定することができる、という効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本実施の形態の核酸検出装置の構成を示すブロック図である。
【図２】増幅回路の一例を示す図である。
【図３】増幅率を一定として検出された蛍光値の一例を示すグラフである。
【図４】初期段階の蛍光値に基づいて、調整段階の増幅率を変更した場合の蛍光値の一例を示すグラフである。
【図５】図４の調整段階の蛍光値のみを表したグラフである。
【図６】第１の実施の形態の核酸検出装置における核酸検出処理ルーチンの内容を示すフローチャートである。
【図７】第１の実施の形態における検出結果の表示の一例を示す図である。
【図８】第１の実施の形態における検出結果の表示の他の例を示す図である。
【図９】第１の実施の形態における検出結果の表示の他の例を示す図である。
【図１０】４段階の増幅率で増幅された蛍光値の一例を示すグラフである。
【図１１】第２の実施の形態の核酸検出装置における核酸検出処理ルーチンの内容を示すフローチャートである。
【図１２】第２の実施の形態における検出結果の表示の一例を示す図である。
【図１３】第２の実施の形態における検出結果の表示の他の例を示す図である。
【図１４】増幅回路の他の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、図面を参照して、本発明の核酸検出装置の実施の形態を詳細に説明する。
【００３１】
＜第１の実施の形態＞
図１に示すように、第１の実施の形態の核酸検出装置１０は、サンプルに励起光を照射するためのＬＥＤ等で構成された光源１２、励起光の照射により発生した蛍光を受光して受光量に応じたレベルの電気信号を出力するためのフォトダイオード等で構成された受光部１４、受光部１４から出力された電気信号を各々の増幅率で増幅する複数の増幅回路１６ａ〜１６ｎ、増幅された電気信号から１つの電気信号を選択するマルチプレクサ１８、選択されたアナログ信号である電気信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄコンバータ２０、コンピュータ２２、及び操作することにより各種情報を入力すると共に、検出結果等を表示するためのタッチパネルディスプレイ等で構成された表示操作部２４を含んで構成されている。
【００３２】
増幅回路１６ａ〜１６ｎは、例えば、図２に示すような反転増幅回路として構成することができる。図２に示す増幅回路１６ｎの増幅率ｎは、ｎ＝１＋Ｒ２／Ｒ１で定まる。従って、各増幅回路１６ａ、１６ｂ、・・・、１６ｎの増幅率ａ、ｂ、・・・、ｎが所望の値となるように、各増幅回路１６の抵抗値Ｒ１及びＲ２を設定する。なお、各増幅回路１６ａ、１６ｂ、・・・、１６ｎの増幅率ａ、ｂ、・・・、ｎは、各々異なる値である。
【００３３】
コンピュータ２２は、核酸検出装置１０全体の制御を司るＣＰＵ３０、後述する核酸検出処理等の各種プログラムを記憶した記憶媒体としてのＲＯＭ３２、ワークエリアとしてデータを一時的に格納するＲＡＭ３４、各種情報が記憶された記憶手段としてのメモリ３６、入出力ポート（Ｉ／Ｏポート）３８、及びこれらを接続するバスを含んで構成されている。また、さらにＨＤＤを設けてもよい。
【００３４】
次に、第１の実施の形態の原理について説明する。ここでは、増幅反応が進むにつれて発生する蛍光量（受光部１４から出力される電気信号）のレベルが低下する反応系について説明する。なお、以下では、増幅回路１６ａ〜１６ｎ各々で増幅された電気信号を「蛍光値」ともいう。
【００３５】
上記のように、発生する蛍光量が低下する反応系において、増幅反応の全反応時間（全サイクル）において、増幅率を一定とした場合の蛍光値の一例を、図３に示す。同図の例では、増幅率を１倍（増幅なし）としている。このように得られた蛍光値の変化に基づいて、ＣＴ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ）を求めることなどが行われる。このＣＴ値を求める場合などのように、蛍光値の変化が大きい増幅反応の後半部分のデータを用いる場合が多いため、増幅反応の後半部分の蛍光値を、より精度良く検出できることが望ましい。
【００３６】
そこで、第１の実施の形態の核酸検出装置１０では、増幅反応の初期段階での蛍光値に基づいて、初期段階より後の増幅反応時（以下、「調整段階」という）において検出される電気信号の増幅率を適切な値に変更する。具体的には、初期段階で検出された蛍光値に基づいて、検出される蛍光値が、装置が表現できる階調の限界値（検出限界値）を最大限に利用して表現されるように、調整段階の増幅率を変更する。例えば、「検出限界値／初期段階の蛍光値の最大値」として増幅率を求めることができる。初期段階の蛍光値に基づいて、調整段階の増幅率を変更した場合の蛍光値の例を図４に示す。また、図４に示す蛍光値の調整段階のみを表示した例を図５に示す。装置が表現できる階調を最大限に利用するため、図５に示すように、蛍光値の変化を詳細に捉えることができ、蛍光値を精度良く検出することができる。
【００３７】
なお、上記の説明では、初期段階の蛍光値の最大値を用いて増幅率を計算する例について説明したが、初期段階の蛍光値の平均値等を用いてもよい。また、増幅率を計算する際、装置の検出限界値に所定のマージンを設けて、実際の検出限界値よりも低めの値を用いてもよい。検出限界値にマージンを設けることで、初期段階の蛍光値よりも調整段階の蛍光値の方が多少高くなる場合でも、検出限界値を超えることなく蛍光値を検出することができる。
【００３８】
次に、第１の実施の形態の核酸検出装置１０の作用について説明する。ここでは、標的核酸の増幅をリアルタイムＰＣＲで行う場合について説明する。まず、図示しない測定部に、検体及びプローブ等の試薬を含むＰＣＲ反応液（サンプル）をセットする。ここで用いるプローブは、標的核酸の標的配列の領域にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、標的配列の領域にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するプローブを用いる。例えば、グアニン消光プローブとして知られているＱＰｒｏｂｅ（登録商標）のようないわゆる蛍光消光プローブを用いることができる。この場合、検出される蛍光値は、増幅反応が進むにつれてレベルが低下する反応系となる。次に、表示操作部２４から測定開始の指示を行うことにより、ＣＰＵ３０により、図６に示す核酸検出処理ルーチンが実行される。
【００３９】
ステップ１００で、リアルタイムＰＣＲのサイクル数を示す変数ｉに１をセットする。
【００４０】
次に、ステップ１０２で、リアルタイムＰＣＲのｉサイクル目の処理をスタートさせる。リアルタイムＰＣＲでは、図示しない温度制御部により測定部の温度を制御して、ＰＣＲ反応液の温度を第１温度（例えば、９５℃）まで上昇させ、第１時間（例えば、６０秒）保つ。この間に、２本鎖ＤＮＡが１本鎖ＤＮＡに変性する。次に、ＰＣＲ反応液の温度を第２温度（例えば、６０℃）まで下降させ、第２時間（例えば、１５秒）保つ。この間に、１本鎖ＤＮＡとプライマーとのアニーリングが起こる。次に、ＰＣＲ反応液の温度を第３温度（例えば、７０℃）に上昇させ、第３時間（例えば、６０秒）保つ。この間に、ＤＮＡポリメラーゼの働きにより、ＤＮＡが合成される。これを１サイクルとする。
【００４１】
次に、ステップ１０４で、上記ステップ１０２でスタートしたＰＣＲにおいて発生する蛍光量に応じた蛍光値を検出する。具体的には、測定部にセットされたＰＣＲ反応液に、光源１２により励起光を照射する。励起光の照射により、ＰＣＲ反応液内では、ＰＣＲにより増幅された標的核酸の量に応じた蛍光が発生する。そして、発生した蛍光が受光部１４で受光されると、受光部１４が受光した蛍光量に応じたレベルの電気信号を出力する。出力された電気信号は、増幅率が異なる複数の増幅回路１６ａ〜１６ｎへ各々入力され、各増幅回路１６ａ〜１６ｎの増幅率に従って増幅されて、出力される。
【００４２】
また、マルチプレクサ１８には、ＣＰＵ３０から所定の増幅率で増幅された電気信号を選択するための選択信号が入力される。ここでは、増幅反応の初期段階（１〜ｎサイクル。例えば、全５０サイクルに対して１〜１５サイクル）であるので、増幅率１倍の増幅回路から出力された電気信号を選択するための選択信号が入力されているものとする。なお、初期段階の増幅率は１倍に限定されず、用いられる検体や試薬、及び装置の検出限界値を考慮して、初期段階の蛍光値が検出限界値を超えないような値であればよい。選択された電気信号は、Ａ／Ｄコンバータ２０でデジタル信号に変換されて、コンピュータ２２に入力され、その電気信号のレベル（蛍光値）がサイクル数ｉと共にメモリ３６に記憶される。
【００４３】
次に、ステップ１０６で、上記ステップ１０４で検出された蛍光値に異常があるか否かを判定する。検体や試薬等の種類に基づいて、予め初期段階での蛍光値の適性範囲を定めておき、検出された蛍光値がこの適性範囲内であれば異常なしと判定して、ステップ１０８へ移行する。一方、検出された蛍光値が適性範囲外であれば異常ありと判定して、ステップ１１４へ移行する。
【００４４】
ステップ１０８で、サイクル数を示す変数ｉがｎとなったか否かを判定することにより、初期段階の蛍光値の検出を終了したか否かを判定する。ｉ≠ｎの場合には、まだ初期段階の蛍光値の検出を終了していないため、ステップ１１０へ移行して、変数ｉを１インクリメントして、ステップ１０２へ戻って、ＰＣＲの次のサイクルの処理を繰り返す。ｉ＝ｎとなった場合には、ステップ１１２へ移行する。
【００４５】
ステップ１１２では、メモリ３６に記憶された初期段階（１〜ｎサイクル）の蛍光値から、最大値を取得する。そして、例えば、調整段階の増幅率を、「（装置の検出限界値−マージン）／初期段階の蛍光値の最大値」として決定する。一例として、取得された初期段階の蛍光値の最大値を「２２０」、装置の検出限界値を「２０００」、マージンを「１５０」とした場合には、調整段階の増幅率は、（２０００−１５０）／２２０＝８．４倍と決定することができる。そして、決定した増幅率で増幅された電気信号を選択するための選択信号を、マルチプレクサ１８に入力する。なお、決定した増幅率と一致する増幅率の増幅回路が存在しない場合には、決定した増幅率に最も近く、かつ決定した増幅率以下の増幅率の増幅回路からの電気信号を選択するようにするとよい。
【００４６】
一方、上記ステップ１０６で蛍光値に異常ありと判定されてステップ１１４へ移行した場合には、調整段階の増幅率を変更しないように決定する。ここでは、初期段階の増幅率は１倍であるため、調整段階においても増幅率を１倍とする。
【００４７】
次に、ステップ１１６で、変数ｉを１インクリメントし、次のステップ１１８で、リアルタイムＰＣＲのｉサイクル目の処理をスタートさせる。
【００４８】
次に、ステップ１２０で、上記ステップ１０４と同様に蛍光値を検出する。ただし、上記ステップ１１２を経由して本ステップへ移行した場合には、初期段階の蛍光値を用いて決定された増幅率を選択するための選択信号がマルチプレクサ１８に入力されている。従って、上記ステップ１１２で決定された増幅率で増幅された電気信号が選択される。また、上記ステップ１１４を経由して本ステップへ移行した場合には、増幅率が変更されていないため、そのまま増幅率１倍の増幅回路から出力された電気信号が選択される。選択された電気信号は、Ａ／Ｄコンバータ２０でデジタル信号に変換されて、コンピュータ２２に入力され、メモリ３６にサイクル数ｉと共に記憶される。
【００４９】
次に、ステップ１２２で、サイクル数を示す変数ｉがｋとなったか否かを判定することにより、全サイクル数を終了したか否かを判定する。例えば、ｋは５０回とすることができる。ｉ≠ｋの場合には、まだ全サイクル数を終了していないため、ステップ１１６へ戻って、変数ｉを１インクリメントして、ＰＣＲの次のサイクルの処理を繰り返す。ｉ＝ｋとなった場合には、ステップ１２４へ移行する。
【００５０】
ステップ１２４では、メモリ３６に記憶された蛍光値を、例えば、図７に示すようなサイクル数−蛍光値のグラフにプロットし、検出結果として表示操作部２４に表示して、処理を終了する。
【００５１】
以上説明したように、第１の実施の形態の核酸検出装置によれば、増幅反応の初期段階において検出された蛍光値、及び装置の検出限界値に基づいて、初期段階より後の増幅反応時（調整段階）の増幅率を決定するため、装置が表現できる階調を最大限に利用して蛍光値の変化を詳細に捉えることができ、蛍光値を精度良く検出することができる。このような増幅率を自動的に設定することができる。
【００５２】
また、熱安定性が高いプローブを用いることで、ＰＣＲ反応中に予めプローブを入れておくことができ、また、温度変化の可逆的な反応を繰り返すことができる。さらに、第１の実施の形態のように消光プローブを用いることで、ＰＣＲサイクルの初期段階において検出された蛍光値からプローブ量を類推することができ、そのＰＣＲ過程で未知の濃度の反応液を測定し、後のＴｍ解析の光量を最適なゲインに調整しておくことができる。
【００５３】
なお、第１の実施の形態では、検出結果を表示する際に、検出された蛍光値をそのままプロットしたグラフを表示する場合について説明したが、これに限定されない。例えば、図８に示すように、初期段階の蛍光値を、上記ステップ１１２で決定した調整段階の増幅率で増幅した値に補正して表示するようにしてもよい。また、第１の実施の形態では、サイクル毎に検出した離散的な蛍光値を表示しているが、図９に示すように、平滑化やベースライン補正を行うことにより、滑らかなグラフに補正して表示するようにしてもよい。また、第１の実施の形態では、全サイクル終了後に検出結果を表示する場合について説明したが、１サイクル終了する毎に、蛍光値をプロットして表示するようにしてもよい。
【００５４】
また、第１の実施の形態では、例えば全サイクル数５０サイクルのうち、１〜１５サイクルを初期段階とする場合について説明したが、初期段階は、全サイクル数の１／２、１／３、または１／４とするなど、適宜設定可能である。初期段階のサイクル数を多くすると、調整段階の増幅率をより適切に決定することができる。初期段階のサイクル数を少なくすると、適切に設定された増幅率により精度良く蛍光値が検出できるサイクル数が多くなる。使用する検体の特徴に応じて、適切な初期段階のサイクル数を設定することが好ましい。また、サイクル数ではなく、全反応時間の１／２、１／３、１／４等としてもよい。
【００５５】
また、第１の実施の形態では、初期段階において検出された蛍光値に異常がある場合には、調整段階の増幅率を変更しないように制御する場合について説明したが、増幅反応自体を停止するように制御してもよい。また、これらの制御に替えて、またはこれらの制御と共に、初期段階の蛍光値に異常が生じたことを示すメッセージを表示操作部に表示するなどして報知するようにしてもよい。
【００５６】
また、第１の実施の形態では、調整段階の増幅率を一定とする場合について説明したが、調整段階の増幅率を複数段階で切り替えるようにしてもよい。例えば、増幅反応が進むにつれて蛍光値が低下する反応系では、調整段階でのサイクル数が進むにつれて、徐々に増幅率を上げるように切り替えることができる。
【００５７】
また、第１の実施の形態では、標的核酸の標的配列の領域にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、標的配列の領域にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するプローブを用いる場合について説明したが、これに限定されない。標的核酸の標的配列の領域にハイブリダイズしたときに蛍光を発し、標的配列の領域にハイブリダイズしないときに蛍光強度が減少するプローブを用いてもよい。
【００５８】
また、第１の実施の形態では、増幅反応が進むにつれて蛍光値が低下する反応系について説明したが、増幅が進むにつれて蛍光値が増加する反応系についても適用可能である。この場合、検体の種類等に基づいて、初期段階の蛍光値から調整段階の蛍光値を推定し、調整段階の蛍光値を装置の検出限界値を最大限利用して表現できるような増幅率を決定すればよい。
【００５９】
また、第１の実施の形態では、増幅率が各々異なる複数の増幅回路の出力である電気信号から、マルチプレクサにより適切な増幅率で増幅された電気信号を選択してコンピュータに入力する場合について説明したが、これに限定されない。例えば、増幅回路で増幅された電気信号各々をコンピュータに入力し、ＣＰＵにより適切な増幅率で増幅された電気信号を選択してメモリに記憶するようにしてもよい。
【００６０】
なお、第１の記実施の形態では、リアルタイムＰＣＲによる増幅反応の場合について説明したが、標的核酸の融解温度測定にも本発明を適用することができる。この場合、上記核酸検出処理ルーチンの１サイクルを、測定点となる温度毎（例えば、１℃毎）とすればよい。例えば、０〜１００℃の範囲で１℃毎に融解温度測定を実施する場合に、０〜１０℃を初期段階、１１〜１００℃を調整段階とし、初期段階で検出された蛍光値に基づいて、調整段階の増幅率を決定するようにすればよい。
【００６１】
＜第２の実施の形態＞
次に、第２の実施の形態について説明する。なお、第２の実施の形態の核酸検出装置の構成は、第１の実施の形態の核酸検出装置１０の構成と同一であるため、同一符号を付して詳細な説明を省略する。
【００６２】
次に、第２の実施の形態の原理について説明する。ここでは、増幅反応が進むにつれて発生する蛍光量（受光部１４から出力される電気信号）のレベルが増加する反応系について説明する。発生する蛍光量が増加する反応系において、４段階の増幅率で増幅された蛍光値の一例を、図１０に示す。同図の例では、増幅率を１倍、１．８倍、２．８倍、及び５倍の４段階としている。増幅率が大きいほど、装置が表現できる階調の限界値（検出限界値、ここでは、例えば「２５６」）を有効に利用することができるため、精度良く蛍光値を検出することができる。
【００６３】
しかし、図１０の例で、４段階の中で最大の増幅率（５倍）で増幅された蛍光値は、２１サイクル目辺りで検出限界値を超えており、それ以降のサイクルでは正しい蛍光値が取得できていない。特に、蛍光値の変化の予測が困難な場合には、予め適切な増幅率を設定しておくことは難しく、仮に、上記の例で増幅率５倍のみを設定していた場合には、正常な検出結果を得られなくなってしまう。
【００６４】
そこで、図１０に示したように、複数の増幅率で増幅された蛍光値を各々取得することで、幅広い増幅率に対応させる。ただし、各増幅率で増幅された蛍光値を全サイクル分取得すると、大きなメモリ容量を必要とするため、増幅反応の１サイクル毎に、複数の増幅率を切り替えながら蛍光値を取得する。図１０の例では、１サイクル目に１倍で増幅された（増幅なしの）蛍光値、１．８倍で増幅された蛍光値、２．８倍で増幅された蛍光値、及び５倍で増幅された蛍光値を各々取得する。次に、２サイクル目で、同様に、１倍、１．８倍、２．８倍、及び５倍で増幅された蛍光値を各々取得する。３サイクル目以降も同様に繰り返す。このように、サイクル毎に複数の増幅率で増幅された蛍光値を切り替えて取得することで、蛍光値が飽和した増幅率や、ある程度蛍光値の変化などが把握できた段階で必要ないと判断できる増幅率での蛍光値を、次のサイクル以降取得しないようにすることができる。これにより、蛍光値のレベルが予測困難な場合でも、複数の増幅率で対応することが可能で、かつメモリ容量を削減することができる。
【００６５】
また、最大の増幅率で増幅された蛍光値が検出限界値を超えた場合には、その次に大きな増幅率で増幅された蛍光値を検出結果とすることで、装置が表現できる階調を有効に利用した検出結果となるため、精度良く蛍光値を検出することができる。
【００６６】
次に、第２の実施の形態の核酸検出装置１０の作用について説明する。ここでは、標的核酸の増幅をリアルタイムＰＣＲで行う場合について説明する。まず、図示しない測定部に、検体及びプローブ等の試薬を含むＰＣＲ反応液（サンプル）をセットする。ここで用いるプローブは、標的核酸の標的配列の領域にハイブリダイズしたときに蛍光を発し、標的配列の領域にハイブリダイズしないときに蛍光強度が減少するプローブを用いる。この場合、検出される蛍光値は、増幅反応が進むにつれてレベルが増加する反応系となる。次に、表示操作部２４から測定開始の指示を行うことにより、ＣＰＵ３０により、図１１に示す核酸検出処理ルーチンが実行される。なお、第１の実施の形態における核酸検出処理ルーチンと同一の処理については、同一符号を付して詳細な説明を省略する。
【００６７】
ステップ１００で、リアルタイムＰＣＲのサイクル数を示す変数ｉに１をセットし、次に、ステップ１０２で、リアルタイムＰＣＲのｉサイクル目の処理をスタートさせる。
【００６８】
次に、ステップ２００で、上記ステップ１０２でスタートしたＰＣＲにおいて発生する蛍光量に応じた蛍光値を検出する。具体的には、第１の実施の形態と同様に、測定部にセットされたＰＣＲ反応液に、光源１２により励起光を照射する。励起光の照射により、ＰＣＲ反応液内では、ＰＣＲにより増幅された標的核酸の量に応じた蛍光が発生する。そして、発生した蛍光が受光部１４で受光されると、受光部１４が受光した蛍光量に応じたレベルの電気信号を出力する。出力された電気信号は、増幅率が異なる複数の増幅回路１６ａ〜１６ｎへ各々入力され、各増幅回路１６ａ〜１６ｎの増幅率に従って増幅されて、出力される。ここでは、増幅回路１６ａの増幅率ａ、増幅回路１６ｂの増幅率ｂ、・・・、増幅回路１６ｎの増幅率ｎの順に増幅率が高いものとする。
【００６９】
また、マルチプレクサ１８には、ＣＰＵ３０から増幅率を切り替えながら選択するための選択信号が入力される。選択される増幅率は、ＣＰＵ３０により設定され、ＲＯＭ３２に記憶されている。ここでは、初期設定として、増幅率ａ、ｂ、・・・、ｎの全てが設定されているものとする。選択された電気信号は、Ａ／Ｄコンバータ２０でデジタル信号に変換されて、コンピュータ２２に入力され、その電気信号のレベル（蛍光値）がサイクル数ｉ及び選択された増幅率と共にメモリ３６に記憶される。
【００７０】
より具体的には、まず、増幅率ａを選択するための選択信号がＣＰＵ３０からマルチプレクサ１８に入力されると、増幅率ａの増幅回路１６ａから出力された電気信号が選択される。選択された電気信号は、Ａ／Ｄコンバータ２０でデジタル信号に変換されて、コンピュータ２２に入力され、その電気信号のレベル（蛍光値）がサイクル数ｉ及び増幅率ａと共にメモリ３６に記憶される。次に、増幅率ｂを選択するための選択信号がＣＰＵ３０からマルチプレクサ１８に入力され、上記と同様に、増幅率ｂの増幅回路１６ｂから出力された電気信号が選択され、蛍光値がサイクル数ｉ及び増幅率ｂと共にメモリ３６に記憶される。この処理を設定された増幅率毎に繰り返す。これにより、サイクルｉにおいて、増幅率ａ、ｂ、・・・、ｎで増幅された蛍光値が各々取得される。
【００７１】
なお、以下では、ｉサイクル目において増幅率ａで増幅された蛍光値を「蛍光値ｉａ」と表記する。増幅率ｂ〜ｎで増幅された蛍光値についても同様である。
【００７２】
次に、ステップ２０２で、上記ステップ２００で検出された蛍光値の中で、装置の検出限界値を超えた蛍光値が存在するか否かを判定する。検出限界値を超える蛍光値が存在する場合には、ステップ２０４へ移行し、存在しない場合には、ステップ２１０へ移行する。ここでは、いずれの蛍光値も検出限界値を超えていなかったものとして、ステップ２１０へ移行する。
【００７３】
ステップ２１０では、メモリ３６に記憶されている蛍光値のうち、ｉサイクル目で検出された蛍光値（直近の上記ステップ２００で検出された蛍光値）が最大のものを選択する。そして、選択した蛍光値に対応する増幅率で増幅された１〜ｉサイクル目まで蛍光値を表示操作部２４に表示する。ここでは、蛍光値１ａ〜蛍光値ｉａが表示される。
【００７４】
次に、ステップ１２２で、サイクル数を示す変数ｉがｋとなったか否かを判定することにより、全サイクル数を終了したか否かを判定する。例えば、ｋは５０回とすることができる。ｉ≠ｋの場合には、まだ全サイクル数を終了していないため、ステップ１１０へ移行して、変数ｉを１インクリメントして、ステップ１０２へ戻り、ＰＣＲの次のサイクルの処理を繰り返す。
【００７５】
上記処理の繰り返しにより、２０サイクル目までいずれの蛍光値も検出限界値を超えなかった場合に、上記ステップ２１０で表示される検出結果の一例を、図１２に示す。ここでは、２０サイクル目までいずれの蛍光値も検出限界値を超えていないため、最大の増幅率ａで増幅された蛍光値１ａ〜蛍光値２０ａが検出結果として表示されている。そして、次の２１サイクル目で、増幅率ａで増幅された蛍光値２１ａが検出限界値を超えた場合には、上記ステップ２０２で肯定判定されて、ステップ２０４へ移行する。
【００７６】
ステップ２０４では、上記ステップ２００で検出された蛍光値のうち、検出限界値以下の蛍光値が存在するか否かを判定する。検出限界値以下の蛍光値が存在する場合には、ステップ２０６へ移行し、存在しない場合には、ステップ２１２へ移行する。ここでは、増幅率ａで増幅された蛍光値２１ａのみが検出限界値を超えており、他の増幅率で増幅された蛍光値（蛍光値２１ｂ、・・・、蛍光値２１ｎ）は検出限界値を超えていなかったものとして、ステップ２０６へ移行する。
【００７７】
ステップ２０６では、上記ステップ２０２で検出限界値を超えたと判定された蛍光値２１ａに対応する増幅率ａで増幅された１〜ｉサイクル目までの全ての蛍光値１ａ〜蛍光値２０ａをメモリ３６から削除する。また、次のステップ２０８で、ＲＯＭ３２に記憶されている増幅率の設定のうち、増幅率ａの設定を解除する。
【００７８】
上記ステップ２０６を経由してステップ２１０へ移行すると、既に蛍光値１ａ〜蛍光値２０ａは削除されているため、メモリ３６に記憶されている蛍光値のうち、２１サイクル目で検出された蛍光値が最大のものは、蛍光値２１ｂとなる。従って、表示操作部２４に、検出結果として蛍光値１ｂ〜蛍光値２１ｂが表示される。
【００７９】
そして、ステップ１２２、１１０を経て、ステップ１０２へ戻り、ＰＣＲの次のサイクルの処理を繰り返す。このとき、次のステップ２００では、上記ステップ２０８において、増幅率ａの設定が解除されているため、ＣＰＵ３０からマルチプレクサ１８に増幅率ａを選択するための選択信号が入力されなくなり、増幅率ａで増幅された蛍光値の取得が停止される。
【００８０】
上記処理の繰り返しにより、上記ステップ１２２で、ｉ＝ｋになったと判定された場合には、処理を終了する。例えば、５０サイクル目において蛍光値５０ｂが検出限界値を超えなかった場合に、上記ステップ２１０で表示される検出結果の一例を、図１３に示す。最大の増幅率ａで増幅された蛍光値が検出限界値を超えたため、その次に大きな増幅率である増幅率ｂで増幅された蛍光値１ｂ〜蛍光値５０ｂが検出結果として表示される。
【００８１】
また、上記ステップ２０４で、検出限界値以下の蛍光値が存在しないと判定されて、ステップ２１２へ移行した場合には、ＰＣＲを終了し、蛍光値が正しく取得されていない旨のメッセージを表示操作部２４に表示するなどして異常を報知して、処理を終了する。
【００８２】
以上説明したように、第２の実施の形態の核酸検出装置によれば、１サイクル毎に増幅率を切り替えながら、複数の増幅率で増幅された蛍光値を取得するため、取得される蛍光値のレベルが予測困難な場合にも対応可能であり、メモリ容量を削減することもできる。また複数の増幅率の中で最も適切な増幅率で増幅された蛍光値、例えば、装置の検出限界値を超えない蛍光値の中で最大のものを検出結果とすることで、増幅された標的核酸の量を精度良く検出することができる。このような増幅率を自動的に設定することができる。また、増幅反応や融解温度測定は、測定自体にかかる時間が長いため、増幅率の切り替えに多少の時間を要しても、測定時間全体に与える影響は小さい。
【００８３】
なお、第２の実施の形態では、リアルタイムＰＣＲによる増幅反応の場合について説明したが、標的核酸の融解温度測定にも本発明を適用することができる。この場合、サイクル毎ではなく、測定点となる温度毎（例えば、１℃毎）に、増幅率を切り替えながら複数の蛍光値を検出するようにするとよい。
【００８４】
また、第２の記実施の形態では、装置の検出限界値を超えた蛍光値に対応する増幅率で増幅された現サイクルまでの蛍光値を全て削除すると共に、以降のサイクルでその増幅率で増幅された蛍光値を取得しないようにする場合について説明したが、これに限定されない。例えば、メモリ容量に余裕があれば、ここまで取得された蛍光値は削除することなく、以降のサイクルでの蛍光値の取得のみを停止するようにしてもよい。また、測定開始からの所定サイクルで検出された蛍光値に基づいて、所定の閾値以下の蛍光値を削除すると共に、以降のサイクルでその所定の閾値以下となった蛍光値に対応する増幅率の設定を解除するようにしてもよい。これにより、よりメモリ容量を削減することができる。
【００８５】
また、第２の実施の形態では、検出結果を表示する際に、検出された蛍光値をそのままプロットしたグラフを表示する場合について説明したが、これに限定されない。例えば、サイクル毎に検出した離散的な蛍光値を、平滑化やベースライン補正を行うことにより、滑らかなグラフに補正して表示するようにしてもよい。
【００８６】
また、第２の実施の形態では、標的核酸の標的配列の領域にハイブリダイズしたときに蛍光を発し、標的配列の領域にハイブリダイズしないときに蛍光強度が減少するプローブを用いる場合について説明したが、これに限定されない。標的核酸の標的配列の領域にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、標的配列の領域にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するプローブを用いてもよい。
【００８７】
また、第２の実施の形態では、増幅反応が進むにつれて蛍光値が増加する反応系について説明したが、増幅が進むにつれて蛍光値が低下する反応系についても適用可能である。
【００８８】
また、上記第１及び第２の実施の形態では、増幅反応をリアルタイムＰＣＲとする場合について説明したが、これに限定されず、ＬＡＭＰ法、インベーダ法、ＲＴ−ＰＣＲ等であってもよい。また、検出される光は蛍光に限定されず、検体の種類や増幅反応の手法に応じて、例えば、赤外光等を検出するようにしてもよい。
【００８９】
また、上記第１及び第２の実施の形態では、増幅率が異なる複数の増幅回路を設ける場合について説明したが、１つの増幅回路において異なる複数の増幅率に切り替えるようにしてもよい。例えば、１つの増幅回路１６を図１４に示すような構成とすることができる。この増幅回路１６の増幅率は、１＋Ｒ1／Ｒ２で、Ｒ１＝Ｒ１１＋Ｒ１２＋Ｒ１３＋・・・＋Ｒ１ｎである。従って、所望の増幅率を得るための抵抗値Ｒ１となるように、ＣＰＵからの選択信号により、抵抗Ｒ１２、Ｒ１３、・・・、Ｒ１ｎに並列接続されたスイッチのオンオフを制御するようにするとよい。なお、上記第１及び第２の実施の形態では、複数の増幅回路１６ａ〜１６ｎをあわせた構成が本発明の増幅手段の一例であり、図１４の例では、１つの増幅回路１６が本発明の増幅手段の一例である。
【００９０】
また、上記第１及び第２の実施の形態では、検出結果を表示操作部に表示する場合について説明したが、核酸検出装置に印字装置を設けて、検出結果を紙などの媒体に印字出力するようにしてもよいし、可搬性記録媒体に記録するようにしてもよいし、ネットワークを介して接続された外部装置に検出結果を出力するようにしてもよい。
【００９１】
なお、上記の核酸検出処理ルーチンを規定したプログラムを記録媒体に記録して提供するようにしてもよい。
【符号の説明】
【００９２】
１０ 核酸検出装置
１２ 光源
１４ 受光部
１６、１６ａ〜１６ｎ 増幅回路
１８ マルチプレクサ
２０ Ａ／Ｄコンバータ
２２ コンピュータ
２４ 表示操作部
３０ ＣＰＵ
３２ ＲＯＭ
３４ ＲＡＭ
３６ メモリ
【図１】
0005955680.tif 000002
【図２】
0005955680.tif 000003
【図３】
0005955680.tif 000004
【図４】
0005955680.tif 000005
【図５】
0005955680.tif 000006
【図６】
0005955680.tif 000007
【図７】
0005955680.tif 000008
【図８】
0005955680.tif 000009
【図９】
0005955680.tif 000010
【図１０】
0005955680.tif 000011
【図１１】
0005955680.tif 000012
【図１２】
0005955680.tif 000013
【図１３】
0005955680.tif 000014
【図１４】
0005955680.tif 000015