(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄または血液から得ることができる細胞集団を含む医薬組成物であって、前記細胞集団は、ＴＣＲアルファ／ベータ陽性細胞およびＣＤ１９陽性細胞が枯渇しており、ＴＣＲガンマ／デルタ陽性細胞を含む、医薬組成物。
【請求項２】
薬学的に許容できる担体を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＴＣＲアルファ／ベータ陽性細胞およびＣＤ１９陽性細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで枯渇させること
を含む、骨髄または血液から細胞集団を製造するための方法。
【請求項４】
ＴＣＲアルファ／ベータ陽性細胞の枯渇が、ＴＣＲアルファ／ベータに対する抗体または抗原結合性断片を使用して実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＣＤ１９陽性細胞の枯渇が、ＣＤ１９に対する抗体または抗原結合性断片を使用して実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
幹細胞移植または骨髄移植に関連してヒトの造血系をｉｎ  ｖｉｔｒｏで再構成するためのものである、請求項３または４に記載の方法の使用。
【請求項７】
ＴＣＲアルファ／ベータおよびＣＤ１９が枯渇している細胞集団をｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造するための、ＴＣＲアルファ／ベータに対する抗体もしくは抗原結合性断片および／またはＣＤ１９に対する抗体もしくは抗原結合性断片の使用。
【請求項８】
ＴＣＲアルファ／ベータおよびＣＤ１９について枯渇している細胞集団を製造するためのキットであって、ＴＣＲアルファ／ベータに対する抗体または抗原結合性断片、およびＣＤ１９に対する抗体または抗原結合性断片を含むキット。
【請求項９】
ＴＣＲアルファ／ベータ陰性かつＣＤ１９陰性である細胞集団をｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造するための、請求項８に記載のキットの使用。
【請求項１０】
幹細胞移植または骨髄移植の後にヒトの造血系を再構成するためのものである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＣＲアルファ／ベータ（ＴＣＲα／β）が枯渇した細胞調製物、さらにそれらの製造ならびに、特に、幹細胞移植に関する、および異なるタイプの癌、例えば、白血病の治療に関する、骨髄および／または免疫系を再構成するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
毎年、欧州では、３１，０００件を超す幹細胞移植が実施され、そのうち、約１３，０００件が同種（ａｌｌｏｇｅｎｏｕｓ）であり、１８，０００件が自家である（Ｂａｌｄｏｍｅｒｏ  Ｈ、Ｇｒａｔｗｏｈｌ  Ｍ、Ｇｒａｔｗｏｈｌ  Ａ、Ｔｉｃｈｅｌｌｉ  Ａ、Ｎｉｅｄｅｒｗｉｅｓｅｒ  Ｄ、Ｍａｄｒｉｇａｌ  Ａ、Ｆｒａｕｅｎｄｏｒｆｅｒ  Ｋ．、Ｔｈｅ  ＥＢＭＴ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｕｒｖｅｙ  ２００９：ｔｒｅｎｄｓ  ｏｖｅｒ  ｔｈｅ  ｐａｓｔ  ｆｉｖｅ  ｙｅａｒｓ．、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、２０１１年２月２８日）。幹細胞移植は、血液学的疾患、腫瘍学的疾患、免疫学的疾患および遺伝性疾患の治療において重要性を増す一方であり（Ｚｉｎｔｌら、Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｔａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．、Ｋｉｎｄｅｒａｒｚｔｌ  Ｐｒａｘ．、１９９１年１〜２月；５９（１〜２）：６〜９頁；Ｚｉｎｔｌ、Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ．、Ｉ．Ｋｉｎｄｅｒａｒｚｔｌ  Ｐｒａｘ．、１９８８年６月；５６（６）：２５９〜６４頁；Ｄｏｗｎ  ＪＤ、Ｍａｕｃｈ  ＰＭ．、Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｔｏｔａｌ−ｂｏｄｙ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｄｏｎｏｒ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．、１９９１年６月；５１（６）：１３０９〜１１頁）、これらの疾患のうちの多くにとって、唯一の長期の治癒の可能性である（Ｅｙｒｉｃｈら、Ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｏｆ  ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ＣＤ３４＋  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ｄｏｎｏｒｓ  ｖｓ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｏｆ  ｕｎｍａｎｉｐｕｌａｔｅｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｆｒｏｍ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｏｎｏｒｓ．、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、２００３年８月；３２（４）：３７９〜９０頁）。
【０００３】
幹細胞移植の主要な合併症は、移植された幹細胞の誤った生着に由来する、レシピエントに対する移植片の反応（移植片対宿主病、ＧｖＨＤまたはＧｖＨＲ）、前処置の毒性、および長期のまたは不完全な免疫の再構成に起因する治療下における感染から生じる。
【０００４】
同種移植の場合、軽減前処置（reduced conditioning)レジメンを用いると、治療関連死の発生率を減少させることができた。移植後の免疫抑制を減らすことによって、悪性組織に対する移植片の免疫学的作用が改善され、レシピエントに対する化学療法に関連した潜在的な副作用が低下する。この移植片対腫瘍効果は、特に、ドナーのＴ細胞およびＮＫ細胞により媒介される。軽減前処置をしても、腫瘍の進行は増加しない（Ｖａｌｃａｒｃｅｌら、Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｖｅｒｓｕｓ  ｒｅｄｕｃｅｄ−ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｍｅｎ  ｆｏｒ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．、２００５年２月；７４（２）：１４４〜５１頁；Ｓｔｒａｈｍら、Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ｄｏｎｏｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｐｅｎｉａ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ．、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、２００７年８月；４０（４）：３２９〜３３頁）。死亡率の増加を回避するためには、腫瘍および感染を制御するように、同種移植の後に免疫系ができるだけ素早く再構成される必要がある。これはＧｖＨＤの発生とバランスを取る必要があり、ＧｖＨＤは、免疫抑制の停止が早過ぎる場合、使用されるアロ反応性Ｔ細胞が多過ぎる場合、または抗原の差が大き過ぎる場合に促進され、実際に、死亡および病的状態を引き起こす。
【０００５】
１）受動的ＴＣＤ（ＣＤ３４富化）
これまで、幹細胞移植を必要とする患者は、適切な比較療法としてのＣＤ３４陽性細胞（幹細胞）の細胞調製物を用いて治療されていた。この方法では、ＧｖＨＤにおける主要な役割を果たすＴ細胞は枯渇されている。しかし、Ｔ細胞とともに、またＮＫ細胞とともに、治癒において役割を果たす不可欠な因子（エフェクター細胞集団）も失われている。
【０００６】
移植片対宿主反応（ＧｖＨＲ；ドイツ語：Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔ−Ｗｉｒｔ−Ｒｅａｋｔｉｏｎ；英語：Ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ−Ｄｉｓｅａｓｅ（ＧｖＨＤ））という用語は、同種の骨髄または幹細胞の移植に続いて発生し得る免疫学的反応を言う（Ｊａｃｏｂｓｏｈｎ  ＤＡ、Ｖｏｇｅｌｓａｎｇ  ＧＢ：Ａｃｕｔｅ  ｇｒａｆｔ  ｖｅｒｓｕｓ  ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．、Ｏｒｐｈａｎｅｔ  Ｊ  Ｒａｒｅ  Ｄｉｓ．、２００７年９月４日；２：３５頁）。
【０００７】
ＧｖＨＤにおいて、特に、移植片中に存在するドナーのＴリンパ球が、宿主生物に対して反応する。免疫学的観点からいえば、これは、移植組織リンパ球の、馴染みのない患者の抗原に対する反応である。
【０００８】
急性ＧｖＨＤ（ａＧｖＨＤ）と慢性ＧｖＨＤ（ｃＧｖＨＤ）とは区別することができ、慢性の形態は、移植の１００日後に、急性ＧｖＨＤから、あるいは新規ＧｖＨＤとして発生し得る。
【０００９】
Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｓｃｈｅｍｅによれば、急性形態および慢性形態は、グレードに分けられる。ＧｖＨＤはそれ自体、身体表面上の発疹および水疱、下痢、イレウス、ならびにビリルビンの富化の増加を通して、皮膚、腸および肝臓に出現する。ａＧｖＨＤについては、徴候の面積の和および徴候の重症度に基づいて、グレード０〜グレードＩＶへさらに分けられる。ａＧｖＨＤを回避するために、予防的措置をとることができる。それらの中には、免疫抑制剤、例えば、メトトレキサート（ＭＴＸ）、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、副腎皮質ステロイド、またはこれらの医薬のうちのいずれかの組合せの投与がある。（Ｍａｒｔｉｎｏ  Ｒ、Ｒｏｍｅｒｏ  Ｐら、：「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｌａｓｓｉｃ  Ｇｌｕｃｋｓｂｅｒｇ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＩＢＭＴＲ  Ｓｅｖｅｒｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ  ｆｏｒ  ｇｒａｄｉｎｇ  ａｃｕｔｅ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ＨＬＡ−ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｓｉｂｌｉｎｇ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ．」、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、１９９９年；２４（３）：Ｓ．２８３〜２８７頁、およびＷｉｋｉｐｅｄｉａ、Ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ−Ｒｅａｋｔｉｏｎ）。
【００１０】
ＧｖＨＤを発症するリスクは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）により決定される適合性に密接に依存する。非血縁の海外ドナーおよびＨＬＡ不適合性の提供では、ａＧｖＨＤに罹患する特に高いリスクが存在する。ＨＬＡが同一の同胞ドナーの同種移植に関しては、最適な医学的予防策にもかかわらず、かつ免疫抑制性の医薬の投与にもかかわらず、患者の約３５〜６０％が、軽度〜平均的重症度の急性ＧｖＨＤを発症し、約１０％は、重度の制御可能なＧｖＨＤに罹患する（Ｋａｎｄａ  Ｙ、Ｃｈｉｂａ  Ｓ：「Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  ＨＬＡ−ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｓｉｂｌｉｎｇｓ  ｏｖｅｒ  ｔｈｅ  ｌａｓｔ  ｄｅｃａｄｅ（１９９１−２０００）．」、Ｂｌｏｏｄ、２００３年；１０２（４）：Ｓ．１５４１〜１５４７頁）。
【００１１】
相当な割合（約３０〜６５％）の患者が、幹細胞移植の後に長期にわたり、最も一般的な副作用のうちの１つであり、死亡の原因となる慢性ＧｖＨＤを発症する（Ｒｉｎｇｄｅｎら、Ｔｈｅ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｅｆｆｅｃｔ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｃｈｅｄ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ｄｏｎｏｒｓ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｔｏ  ＨＬＡ−ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｓｉｂｌｉｎｇｓ  ｆｏｒ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．、Ｂｌｏｏｄ．、２００９年３月２６日；１１３（１３）：３１１０〜８頁；Ｒａｔａｎａｔｈａｒａｔｈｏｒｎら、Ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  ｓｔｕｄｙ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ  ａｎｄ  ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ  （ｐｒｏｇｒａｆ，ＦＫ５０６）ｗｉｔｈ  ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ  ａｎｄ  ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  ｆｏｒ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ  ａｆｔｅｒ  ＨＬＡ−ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｓｉｂｌｉｎｇ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．、Ｂｌｏｏｄ．、１９９８年１０月１日；９２（７）：２３０３〜１４頁）。慢性ＧｖＨＤは、生活の質に不利な影響を及ぼし、職場復帰を遅延させる（Ｗｏｎｇら、Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｆｔｅｒ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｑｕａｌｉｔｙ−ｏｆ−ｌｉｆｅ  ｃｏｎｃｅｒｎｓ．、Ｂｌｏｏｄ．、２０１０年３月２５日；１１５（１２）：２５０８〜１９頁；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄら、Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｎｏｒｍｓ．、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、１９９７年６月；１９（１１）：１１２９〜３６頁）。
【００１２】
さらに、ＧｖＨＤの予防のみならずまた治療も、重度の副作用、例えば、糖尿病、無腐性壊死、クッシング症候群のような副腎皮質ステロイドの副作用、または腎臓障害、高血圧、錯感覚のようなＣｓＡ／タクロリムスの副作用、および全ての種類の一般的な感染を引き起こす可能性がある免疫抑制剤の投与を必要とする（Ｗｏｎｇら、Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｆｔｅｒ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｑｕａｌｉｔｙ−ｏｆ−ｌｉｆｅ  ｃｏｎｃｅｒｎｓ．、Ｂｌｏｏｄ．、２０１０年３月２５日；１１５（１２）：２５０８〜１９頁；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄら、Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｎｏｒｍｓ．、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、１９９７年６月；１９（１１）：１１２９〜３６頁；Ｆｅｒｒａｒａ  ＪＬ、Ｌｅｖｉｎｅ  ＪＥ、Ｒｅｄｄｙ  Ｐ、Ｈｏｌｌｅｒ  Ｅ．、Ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．、Ｌａｎｃｅｔ．、２００９年５月２日；３７３（９６７４）：１５５０〜６１頁）。
【００１３】
免疫の再構成
現在の治療方法の別の欠点は、免疫の再構成の遅延、すなわち、移植患者における機能性の免疫系または造血系の再建の遅延である。免疫系は、再構成に約１〜２年を必要とする。
【００１４】
この期間に、患者が生命にかかわる感染症、とりわけウイルス、細菌もしくは酵母への感染症に罹患するか、または死亡する可能性が増加する（Ｈａｎｄｇｒｅｔｉｎｇｅｒ  Ｒ、Ｋｌｉｎｇｅｂｉｅｌ  Ｔ、Ｌａｎｇ  Ｐら、Ｍｅｇａｄｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ＣＤ３４（＋）  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ＨＬＡ−ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ  ｐａｒｅｎｔａｌ  ｄｏｎｏｒｓ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ．、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２００１年；２７：７７７〜８３頁、およびＰｌａｔｚｂｅｃｋｅｒ  Ｕ、Ｅｈｎｉｎｇｅｒ  Ｇ、Ｂｏｒｎｈａｕｓｅｒ  Ｍ．、Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ３４＋  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ：ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ａｎｄ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．、Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ、２００４年；４５：４４７〜５３頁）。
【００１５】
この理由は、ＣＤ３４陽性幹細胞の富化と共に、免疫の再構成または造血系の再構成を助けることができる全てのＴ細胞、ＮＫ細胞が、さらにアクセサリー細胞集団までが失われているという事実にある。
【００１６】
移植後のＴ細胞の再生、したがって、免疫の再構成は、２つの経路により生じる。いわゆる中心経路は、胸腺依存性であり、完全なままの胸腺を必要とする。胸腺を出たばかりのＴ細胞は、免疫系回復の指標となる。Ｔ細胞受容体切除サークル（ＴＲＥＣ）、および表面抗原ＣＤ４５ＲＡを有する未熟なＴ細胞の測定、特徴解析に適している。Ｔ細胞再構成の周辺経路は、胸腺非依存性であり、多くの前処置レジメンが胸腺に悪い影響を及ぼすため、非常に重要である。移植片と共に導入されている成熟Ｔリンパ球の増殖が、免疫系の再構成を確実にする。
【００１７】
したがって、Ｔ細胞が患者に導入されない、ＣＤ３４＋選択型の移植は、免疫系の再構成の開始の遅延を示す（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄら、Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  １  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｅｌａｐｓｅ  ｏｆ  ｏｒｉｇｉｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．、２００２年；７３：１３３６〜９頁；Ｒｕｔｅｌｌａら、Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５  ｏｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．、２００１年；２９：１５０３〜１６頁；Ｈｅｉｎｉｎｇら、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ａ  ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  １４８  ｐａｔｉｅｎｔｓ．、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、２００７年；３９：６１３〜２２頁）。これらの種類の移植の場合、低いＧｖＨＤの率と引き換えに、免疫の再構成は大幅に遅延する。したがって、現在の弱点は、免疫の再構成の遅延、すなわち、機能性の免疫系の再建の遅延であり、これには、死に至る可能性がある感染のリスクの増加が伴う。
【００１８】
再発
Ｔ細胞枯渇のさらなる欠点は、ＣＤ３４幹細胞移植の後に、そもそも幹細胞移植を行う理由であった基礎疾患（通常、白血病）が、より頻繁に再発するリスクが高まることである（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ  ＭＭ、Ｇａｌｅ  ＲＰ、Ｓｏｎｄｅｌ  ＰＭら、Ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．、Ｂｌｏｏｄ、１９９０年；７５：５５５〜６２頁）。また、基礎疾患の再発は、抗白血病作用を有するＮＫ細胞（ナチュラルキラー細胞）の除去に起因する（Ｒｕｇｇｅｒｉ  Ｌ、Ｍａｎｃｕｓｉ  Ａ、Ｃａｐａｎｎｉ  Ｍら、Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｅ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００５年；１７：２１１〜７頁）。
【００１９】
２）能動的ＴＣＤ（ＣＤ３枯渇）
最近、Ｔ細胞は枯渇しているが、ＮＫ細胞、単核球、顆粒球、およびＣＤ３４陰性幹細胞前駆細胞は移植片中に存在するＣＤ３枯渇細胞調製物が使用された。ＧｖＨＤのリスクおよび治療に関連する早期死亡のリスク（早期治療関連死亡（ｅａｒｌｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ）、ＴＲＭ）は低下したが、これらの細胞調製物はまた、生存率の測定可能な増加にも（Ｌｅｅ  ＣＫ、ＤｅＭａｇａｌｈａｅｓ−Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  Ｍら：「Ｄｏｎｏｒ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｆｏｒ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＣＤ３＋  Ｔ−ｃｅｌｌ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ  ｇｒａｆｔ．」、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２００３年；３１（２）：Ｓ．１２１〜１２８頁、およびＷｉｋｉｐｅｄｉａ、Ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ−Ｒｅａｋｔｉｏｎ）、免疫の再構成の改善にもつながらなかった。
【発明の概要】
【００２０】
第１の態様では、本発明は、組成物、特に、骨髄または血液から得ることが可能な細胞集団を含む医薬組成物に関する。本発明によれば、この細胞集団は、ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）アルファ／ベータ陽性細胞が枯渇している。したがって、ＴＣＲガンマ／デルタ陽性Ｔ細胞は、この（医薬）組成物中に見出されることになるが、ＴＣＲアルファ／ベータ陽性である細胞は、非常に少数に過ぎないもしくはほとんどないか、または最良の場合には、全くない。
【００２１】
枯渇という用語は、細胞集団からの細胞の顕著な低下に関する。枯渇とは、（例えば、細胞表面マーカー、例えば、ＴＣＲアルファ／ベータまたはＣＤ１９の存在により定義される）細胞型が、少なくとも２対数目盛、好ましくは、少なくとも３対数目盛、特に好ましくは、少なくとも４対数目盛（例えば、４．６対数目盛）、最も好ましくは、少なくとも４〜５対数目盛減少することと言うことができる。
【００２２】
対数目盛による除去は、以下の通りである：１ｌｏｇ＝不要な細胞の９０％の除去、２ｌｏｇ＝９９％、３ｌｏｇ＝９９．９％、および４ｌｏｇ＝９９．９９％。分離性能を計算するための方法は、当業者に公知であり、例えば、Ｂｏｓｉｏら、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、２００９年に記載されている。
【００２３】
そのような枯渇を、細胞表面マーカーのＴＣＲアルファ／ベータを使用して実施し、場合によりまた、ＣＤ１９も使用して実施する。枯渇は、現況技術において公知の任意の技法、例えば、パニング、エルトリエーションまたは磁気細胞分離を用いて実施することができる。好ましいのは、枯渇効率が高いことから、磁気細胞分離（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）を使用する枯渇である。
【００２４】
血液から得ることができる細胞集団は、特に、白血球アフェレーシスまたは骨髄穿刺により得られる細胞調製物である。好ましくは、細胞調製物は、幹細胞を動員する薬物を用いてあらかじめ処置された健常なドナーから得る。
【００２５】
好ましくは、この（医薬）組成物の細胞集団はまた、ＣＤ１９陽性細胞に関しても枯渇している。これにより、細胞集団はＢ細胞を含まない。これにより、エプスタイン−バー−ウイルス（ＥＢＶ）が医薬組成物を投与されている患者に伝播する可能性を皆無にし、したがって、免疫抑制剤を投与する必要性が低下するかまたはない。
【００２６】
医薬組成物の好ましい実施形態では、組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容できる担体または添加剤をさらに含む。そのような担体または添加剤は、当業者に公知である。
【００２７】
癌、例えば、白血病、および他の疾患、例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、無顆粒球症、Ｂ−サラセミア、先天性異常（ＨＨＳ）、ならびに同種移植が適応であるか、またはＴＣＲアルファ／ベータが枯渇した細胞調製物の治療効果が予想される固形腫瘍（例えば、神経芽細胞腫、肉腫等）に対して、医薬組成物を投与することができる。
【００２８】
さらに、造血系の良好な再構成を達成するためには、同種移植の間に、十分な量のＣＤ３４＋細胞（レシピエントの体重１ｋｇ当たり、少なくとも２，０００，０００〜４，０００，０００個）を導入する必要があり、免疫抑制を差し控えるかまたは免疫抑制せずにすますためには、レシピエントの体重１ｋｇ当たり、少なくとも２５，０００個のＴＣＲアルファ／ベータ陽性Ｔ細胞を投与すべきである。ＥＢＶ感染およびそこから生じる合併症のリスクを減少させなければならない場合には、移植片からＣＤ１９が枯渇するまで除去されるＢ細胞は、可能な限り少ない数で存在すべきであり、そうでなければ、Ｂ細胞は、後から、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、例えば、抗ＣＤ１９抗体を投与することによって、レシピエント中で除去すべきである。
【００２９】
枯渇させた細胞集団のヒト患者に投与すべき量は典型的には、２×１０10個のリンパ球〜１×１０11個のリンパ球の間である。
【００３０】
さらなる態様では、本発明は、医薬組成物の製造のための、骨髄から得られる細胞集団の使用を指し、この細胞集団は、ＴＣＲアルファ／ベータ陽性細胞が枯渇している。
【００３１】
さらなる態様では、本発明は、幹細胞移植および／または骨髄移植の後にヒトの造血系を再構成するための医薬組成物の使用に関する。この再構成は、これまでに公知の（例えば、未変性の骨髄、または骨髄もしくは血液もしくは白血球アフェレーシス後に、動員し、処理した血液から得られたＣＤ３４陽性の幹細胞を用いる）再構成と比較して著しく速く、したがって、血液構成成分の輸血の必要性を減少させ、免疫抑制性の医薬の完全な放棄または減少を可能にして、副作用を低下させ、感染を減少させ、移植片レシピエントの死亡のリスクを低下させる。
【００３２】
さらなる態様では、本発明は、方法、特に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞集団を調製するための方法に関する。この方法は、以下のステップ、すなわち、
−  ドナーの骨髄または血液（とりわけ、ＴＣＲアルファ／ベータ陽性細胞、およびＴＣＲガンマ／デルタ陽性細胞を含む集団のものである）を提供するステップと、
−  細胞集団から、ＴＣＲアルファ／ベータ陽性細胞を枯渇させるステップと
を含む。
【００３３】
好ましくは、ＴＣＲアルファ／ベータ陽性細胞の枯渇は、ＴＣＲアルファ／ベータに対する抗体または抗原結合性断片を使用して実施される。配列番号４〜１４に記載の、受容体であるＴＣＲアルファ／ベータのタンパク質配列またはヌクレオチド配列に基づいて（表１および配列プロトコールを参照されたい）、ＴＣＲアルファ／ベータに対する抗体もしくは抗原断片、またはその誘導体もしくはコンジュゲートを製造し、ＴＣＲアルファ／ベータ陽性細胞の枯渇のために使用することができる。
【００３４】
好ましい実施形態では、この方法は、以下のステップ、すなわち、
−  細胞集団から、ＣＤ１９陽性細胞を枯渇させるステップ
をさらに含む。このステップは、細胞集団から、ＴＣＲアルファ／ベータ陽性細胞を枯渇させるステップの前に、その後に、またはそれと並行して実施することができる。
【００３５】
この方法では、ＣＤ１９陽性細胞の枯渇を、ＣＤ１９に対する抗体または抗原結合性断片を使用して実施することができる。表面マーカーであるＣＤ１９のタンパク質配列またはヌクレオチド配列（配列番号１〜３）に基づいて（表１および配列プロトコールを参照されたい）、ＣＤ１９に対する抗体または抗原結合性断片、その誘導体またはコンジュゲートを製造し、ＣＤ１９陽性細胞の枯渇のために使用することができる。
【００３６】
現況技術により、（現況技術において公知である）ＴＣＲアルファ／ベータおよびＣＤ１９のタンパク質配列またはヌクレオチド配列を知っている当業者が、抗体、抗原結合性断片、またはその誘導体もしくはコンジュゲートを、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９７５年）：Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｕｓｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．、Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５〜４９７頁；Ｓｈｉｒａｈａｔａ  Ｓ、Ｋａｔａｋｕｒａ  Ｙ、Ｔｅｒｕｙａ  Ｋ．（１９９８年）：Ｃｅｌｌ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ、５７、Ｓ．１１１〜１４５頁；Ｃｏｌｅ  ＳＰ、Ｃａｍｐｌｉｎｇ  ＢＧ、Ａｔｌａｗ  Ｔ、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｄ、Ｒｏｄｅｒ  ＪＣ．（１９８４年）：Ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６２、Ｓ．１０９〜１２０頁）を用いて製造することが可能である。
【００３７】
表１：表面マーカーであるＣＤ１９、および受容体のサブユニットであるＴＣＲアルファ／ベータ（ＴＣＲＡ／ＴＲＢＣ）のヒトのタンパク質配列およびヌクレオチド配列の呼称および配列番号。受容体サブユニットであるＴＣＲベータ（ＴＲＢＣ）については、２つのタンパク質配列およびｃＤＮＡ配列を、各欄に示す。最初のアミノ酸、および配列番号１１、「Ｅ」（配列番号１３中では、「ＧＡＧ」に該当する）は、スプライシング部位上に位置し、したがって、可変であると思われる。したがって、タンパク質配列である配列番号１０および対応するヌクレオチド配列中で、このアミノ酸およびヌクレオチドは特定されない。
【００３８】
【表１】
0005955871.tif 000002
【００３９】
さらなる態様では、本発明は、幹細胞または骨髄の移植に関連するヒトの免疫系および造血系の再構成のための、本明細書に記載する方法の使用に関する。
【００４０】
異なる態様では、本発明は、骨髄移植に関連するヒトの免疫系の再構成のための、骨髄または血液から得られる細胞集団の使用に関し、細胞集団は、ＴＣＲアルファ／ベータを発現する細胞が枯渇している。上記したように、この使用についてＣＤ１９陽性細胞もまた枯渇している。
【００４１】
さらなる態様では、本発明は、ＴＣＲアルファ／ベータ、および／またはＣＤ１９が枯渇している細胞集団を製造するための、ＴＣＲアルファ／ベータに対する抗体もしくは抗原結合性断片のみか、またはＴＣＲアルファ／ベータに対する抗体もしくは抗原結合性断片およびＣＤ１９に対する抗体もしくは抗原結合性断片のいずれかの使用に関する。
【００４２】
さらなる態様では、本発明は、ＴＣＲアルファ／ベータ、および／またはＣＤ１９が枯渇している細胞集団を製造するためのキットに関する。そのようなキットは、ＴＣＲアルファ／ベータに対する抗体もしくはその抗原結合性断片、および／またはＣＤ１９に対する抗体もしくはその抗原結合性断片を含む。
【００４３】
さらなる態様では、本発明はまた、ＴＣＲアルファ／ベータ陰性かつＣＤ１９陰性である細胞集団を製造するための、記載のキットの使用にも関する。この細胞集団は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて利用可能であり、研究目的を意図し得るか、または場合により薬学的に許容できる担体および／または添加剤を含む医薬組成物として利用可能であり得る。
【００４４】
一実施形態では、本発明は、手術または治療によりヒトまたは動物の身体を治療するための方法、およびヒトまたは動物の身体に対して実行される診断方法は指さない。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】幹細胞移植後に、＞２００細胞／μｌが達成されるまでの免疫の再構成を示すグラフである。ＣＤ３４が富化された末梢血幹細胞（歴史的対照、Ｎ＝１３）と比較して、移植後に、＞２００細胞／μｌが達成されるまでの、ＴＣＲαβ／ＣＤ１９が枯渇している末梢血幹細胞（Ｎ＝１１）の免疫の再構成を示す。幹細胞移植後の、ＣＤ３４が富化された細胞を用いた免疫の再構成についてのデータは、以下の刊行物、すなわち、Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．、２００１年；１１４：４２２〜３２頁から得た。
【図２】幹細胞移植後のＧｖＨＤを示すグラフである。ＴＣＲαβ／ＣＤ１９が枯渇したハプロ同一性移植片を投与されている患者における急性ＧｖＨＤの発生率。対照群（歴史的対照）：ＣＤ３４が富化された、ハプロ同一性移植片を投与した患者、ならびに同一性非血縁ドナーから得られた未処理の骨髄およびＧｖＨＤの予防のためのメトトレキサート／ＣｓＡを投与した患者。対照群のデータは、Ｌａｎｇら、２００７年、Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ  ｆｕｒ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｚｉｎ、Ｎｒ．１：３２〜３９頁から得た。
【図３】（ＡおよびＢ）胸腺依存性Ｔ細胞再構成の確認から得られた、Ｔ細胞受容体βのレパートリーの多様性解析を示す図である。例示的に、ＣＤＲ３のスペクトルのタイピングによる、ＴＣＲβのレパートリーの多様性解析の結果を、ある患者の場合の、第１２日（図３Ａ）および第３３日（図３Ｂ）における、胸腺依存性Ｔ細胞再構成の測定について示す。Ｔ細胞受容体のＣＤＲ３領域は、生殖系列によりコードされていない唯一の超可変領域である。このＴＣＲαβ領域は、胸腺において、一部は組換えにより製造される。この方法は、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、２００８年１０月；４２、Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ５４〜９頁に記載されている。
【図４】胸腺から生じたＴ細胞の定量化のために、末梢血中のＴ細胞受容体切除サークル（ＴＲＥＣ）を示すグラフである。例示的に、末梢血中のＴ細胞受容体切除サークル（ＴＲＥＣ）の測定結果を、Ｔ細胞が移植後に胸腺において製造されることを確認するために示す。この方法は、多くの研究において、胸腺の活性を評価するために、移植後に使用されている。この方法は、Ｚｈｏｎｇｈｕａ  Ｙｉ  Ｘｕｅ  Ｚａ  Ｚｈｉ、２００７年８月２８日；８７（３２）：２２６５〜７頁に記載されている。
【図５】（Ａ、ＢおよびＣ）小児に関する臨床結果を示すグラフである。患者のＴ細胞再生の比較解析。１．移植片：ＭＵＤドナーの未処理の骨髄（２００８年）２．移植片：母親の、ＣＤ３／ＣＤ１９が枯渇しているＰＢＳＣ（２００９年）３．移植片：父親のＴＣＲα／β／ＣＤ１９が枯渇しているＰＢＳＣ（第２の移植の９ヵ月後）グラフは、骨髄移植後の異なる時点における、（左から右へ）ＣＤ３陽性細胞（Ａ）、ＣＤ４陽性細胞（Ｂ）およびＣＤ８陽性細胞（Ｃ）の濃度（細胞／マイクロリットル）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明の利点
過去数年の間になされた改善にもかかわらず、幹細胞移植には依然として、急増する疾病率および初期の移植関連死が伴う。幹細胞移植の主要な合併症は、拒絶反応（移植片対宿主病）およびそれらの治療、緩慢な免疫の再構成および造血系の再構成、ならびにそれらの結果として生じた移植後の感染、さらに、前処置の毒性から生じる。
【００４７】
ＴＣＲアルファ／ベータが枯渇した細胞またはＴＣＲアルファ／ベータおよびＣＤ１９が枯渇した細胞（枯渇した細胞集団）の使用を通して、血液学的な幹細胞移植を操作することが可能であり、結果として、幹細胞移植の後の主要な合併症、すなわち、移植片対宿主病、さらに、幹細胞移植の後の緩慢な免疫の再構成、ならびに結果的に死に至る可能性がある細菌、ウイルスおよび酵母への感染に対する持続的易罹患性が、顕著に低下する。
【００４８】
同時に、細胞混合物の移植組織対腫瘍の反応性は同じままである。すなわち、患者にとって、再発のリスクの増加はないことが予想される。さらなる利点は、移植片のより安定な生着である。
【００４９】
いわゆる主要な合併症の顕著な低下により、これらの合併症の治療のために通常使用し、重度の副作用をもたらす（かつ高いコストを招く）可能性がある医薬を劇的に減少させるかまたは完全に放棄することが可能である。ＧｖＨＤの予防のための免疫抑制性の医薬の放棄を通して、免疫系の薬物誘発性の抑制の結果生じる、例えば、感染（敗血症、カンジダ症、単純ヘルペス等）のような副作用を回避することができる。
【００５０】
結果として、標準的な患者の寿命、および治療の成功が、著しく改善され得、同時に、治療のためのコストを低下させることもできる。上記した医薬は、例えば、ミコフェノール酸モフェチルのようなＧｖＨＤを予防するための医薬である。
【００５１】
枯渇した細胞集団は、感染およびＧｖＨＤの減少を可能にするのみならず、また、軽減前処置レジメン（ＲＩＣ）を使用することも可能にする。軽減前処置レジメンは、同種移植の場合、治療関連死亡の発生率を低下させることができ、悪性組織に対する移植片の免疫学的作用を利用しようとする場合に投与することができる。腫瘍に対する移植片のこの作用は、特に、ドナーのＴ細胞およびＮＫ細胞により影響を受け、したがって、ＣＤ３４が富化された幹細胞調製物と共に使用することはできない。
【００５２】
この点において、適切な同等の治療と比較して、顕著な追加の利益が存在する。これは、適切な同等の治療を用いた場合には、まだ達成されたことがない持続可能な改善が、治療に関連する利益、特に、疾患の治癒、生存時間の顕著な延長、重度の症状が長期に存在しないこと、および重度の副作用の広範な回避に関して達成されるからである。
【００５３】
ＴＣＲアルファ／ベータを枯渇させる戦略を使用すると、早期の免疫の再構成が得られ、１００個超のＣＤ４細胞／μｌの値が、Ａｖｅｒｓａら（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ａｃｕｔｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｗｉｔｈ  Ｔ−ｃｅｌｌ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｏｎｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｏｎｅ  ｆｕｌｌｙ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ  ＨＬＡ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ．、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．、１９９８年１０月２２日；３３９（１７）：１１８６〜９３頁）が報告しているような１０ヵ月と比較して、移植から６週間以内に得られる。
【００５４】
技術的な結果
ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＴＣＲαβ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）を用いて実施される枯渇の実行（枯渇）は、枯渇の効率が非常に堅調であり、平均対数枯渇は４．６であることを示している（図１）。
【００５５】
ＣＤ１９は、Ｔ細胞上の表面分子である。ＣＤ１９陽性細胞という用語は、ＣＤ１９分子、例えば、抗体が、Ｔ細胞表面上のＣＤ１９分子に特異的に結合することができる細胞を言う。
【００５６】
ＴＣＲアルファ−ベータは、Ｔ細胞上の表面分子である。ＴＣＲアルファ／ベータ陽性細胞という用語は、ＴＣＲアルファ／ベータ結合性分子、例えば、抗体が、Ｔ細胞表面上のＴＣＲアルファ／ベータ分子に特異的に結合することができる細胞を言う。
【００５７】
抗体は、分子に結合するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＵＳＡ）、または結合能力を保持するかもしくは結合能力の大部分を保持する、これらの抗体の誘導体を意味する。これらの抗体の好ましい誘導体は、キメラ抗体であり、それらは、例えば、可変領域またはマウスまたはラットとヒト定常領域とのキメラ抗体を含む。また、用語「抗体」は、二機能性もしくは二重特異性の抗体、および単鎖から得られたＦｖｓ（ＳｃＦｖ）のような抗体の構築物、または抗体融合タンパク質も含む。用語「ＳｃＦｖ」（単鎖Ｆｖ断片）は、当業者に公知であり、断片は組換えにより製造されるのが好ましい。
【００５８】
抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る。用語「ヒト化抗体」は、例えば、ＣＤＲ３のような、少なくとも１つの抗体の結合部位（（相補性決定領域（ＣＤＲ））、好ましくは、６つのＣＤＲの全てが、所望の特異性を有するヒト抗体から得られたＣＤＲで置換されたことを意味する。場合により、非ヒト定常領域（複数可）も、ヒト抗体の定常領域（複数可）で置換された。ヒト抗体を製造するための方法が、例えば、ＥＰ０２３９４００Ａ１およびＷＯ９０／０７８６１Ａ１に記載されている。
【００５９】
抗原結合性断片という用語は、例えば、分離された軽鎖および重鎖であるＦａｂ、Ｆａｂ／ｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２のような、上記の定義に従う抗体の断片を言う。抗原結合性断片は、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含むことができるが、必ずしも両方を一緒に含まなくてもよい。
【００６０】
臨床結果
１１人の患者を治療した。８人の患者には、ハプロイドドナーから得られた、ＴＣＲαβが枯渇した移植片を用い、３人の患者には、一致した非血縁のドナーから得られた移植片を用いた。
【００６１】
非常に堅調な枯渇、したがって、移植片中のＴＣＲαβ+Ｔ細胞の細胞数が少ないことにより、移植後に、例えば、ＭＭＦまたはＣｓＡのような免疫抑制性の医薬の形態をとるＧｖＨＤの予防を受け入れる必要がなかった。
【００６２】
移植片対宿主病が、治療患者において低下した（図２）。いずれの場合も、ＧｖＨＤの症状を、皮膚上のみに認めることができ、症状は、一時的なものに過ぎなかった。患者の３６％がＧｖＨＤの段階Ｉを示し、１８％がＧｖＨＤの段階ＩＩを示した。ＧｖＨＤの段階ＩＩＩは観察されなかった。移植後に免疫抑制薬の形態でＧｖＨＤ予防役が投与されていないことから、これは注目すべきである。１１人の患者のうち１０人において、移植片が、第７日と第９日との間に生着した。
【００６３】
全ての患者において、免疫の再構成の強力な加速が観察された。図１に示すように、免疫の再構成が、ＴＣＲαβ／ＣＤ１９が枯渇した細胞集団を用いる場合には、ＣＤ３／ＣＤ１９が枯渇した細胞（移植片）を用いる場合よりも著しく速かった。
【００６４】
ＣＤ３４が富化された末梢血幹細胞（ヒストリカルコントロール、Ｎ＝１３）と比較して、移植後に、＞２００細胞／μｌが達成されるまでの、ＴＣＲαβ／ＣＤ１９が枯渇している末梢血幹細胞の免疫の再構成（Ｎ＝１１）を示す。幹細胞移植の後の、ＣＤ３４が富化された細胞を用いた免疫の再構成に関するデータは、以下の刊行物、すなわち、Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．、２００１年８月；１１４（２）：４２２〜３２頁から得た。
【００６５】
これらの患者の全てにおいて、非常に速い免疫の再構成が観察された。このことは、実に驚くべきことであり、今のところ説明することができない。というのは、再構成はまた、未処理（unmanipulated)の骨髄の投与と比較しても、著しく速いからである。未処理の骨髄は、免疫を再構成するドナーの細胞を全て含有し、したがって、未処理の骨髄を用いる場合には、ＴＣＲアルファ／ベータおよびＣＤ１９が枯渇した細胞調製物を投与する場合よりも、より速い免疫の再構成が予想されるはずであった。ＴＣＲアルファ／ベータおよびＣＤ１９が枯渇した細胞調製物は、顕著により少ない免疫を再構成する細胞を含有する。
【００６６】
図５は、３回の連続的幹細胞移植を受けた患者の免疫の再構成を示す。第１の幹細胞移植は、ＭＵＤドナーに由来し、未処理の骨髄を用い、第２の幹細胞移植は、ハプロイドドナーに由来し、ＣＤ３／ＣＤ１９が枯渇している末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）を用いた。両方の場合、免疫系の再構成は生じなかった。患者に、第３の幹細胞移植を、父親から得られたＴＣＲアルファ／ベータおよびＣＤ１９が枯渇したＰＢＳＣを用いて投与した場合にのみ、非常に速い免疫の再構成が生じた。
【００６７】
ＴＣＲアルファ／ベータおよびＣＤ１９移植の症例において、ＧｖＨＤが予想外に増加することはなかった（図２）。治療のために、免疫抑制剤は投与しなかったが、皮膚のみがＧｖＨＤにより影響を受け、ＧｖＨＤの症状は、一時的なものに過ぎなかったことに留意する必要がある。
【００６８】
速い免疫の再構成の理由は、ＴＣＲガンマ／デルタ細胞であり得るであろう。ＴＣＲガンマ／デルタ細胞は、移植片としてのＴＣＲアルファ／ベータが枯渇した細胞調製物中に存在するが、ＣＤ３４陽性の幹細胞移植片中には存在しない。
【００６９】
幹細胞および骨髄移植
骨髄移植のために、約１リットルの骨髄−血液の混合物を、ドナーの骨盤骨から、全身麻酔下で取り出す。
【００７０】
血液から幹細胞を取り出すために、幹細胞の製造および骨髄から血液循環系へのそれらの移動を刺激する身体自体のホルモン様物質を、ドナーに数日にわたり投与する。骨髄または血液幹細胞を取り出すためのドナーの前処理のための方法は、現況技術であり、当業者に公知である。
【００７１】
手順
血液幹細胞移植の目的は、レシピエントに、血液細胞に分化することができる健常な幹細胞集団を授けることである。それにより、レシピエントの欠損したまたは病的な細胞が交換される（ＢｅｅｒｓおよびＢｅｒｋｏｗ、２０００年）。同種移植の場合、組織を、健常なドナーから得る。これは、同一性同胞双生児（identical sibling twin）、ＨＬＡ同一性同胞（HLA-identical sibling）、非ＨＬＡ家族（non-HLA family member（不一致の血縁のドナー））、ハプロイド同一性ドナー、または非血縁のＨＬＡ適合性のドナーであり得る。同種移植の主要な標的は、例えば、レシピエントの骨髄のような、病気の、または欠陥のある造血系を、健常な機能性の（免疫系を含む）造血系で完全に置換することである。しかしまた、幹細胞移植は、自家、すなわち、患者自身の細胞を用いて実施することもできる。
【００７２】
ドナー（ＩｄＳｉｂ、ＭＵＤ、ハプロイドドナー）
第一選択のドナーは、関連の組織適合性抗原のＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤＲＢ１およびＤＱＢ１に関して同一性の同胞（Ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  Ｓｉｂｌｉｎｇ＝ＩｄＳｉｂ）である。しかし、そのような同一性同胞は、症例の約３０％においてのみ見出すことができるに過ぎず、したがって、しばしば、ＨＬＡ同一性の非血縁のドナー（一致した非血縁のドナー、ＭＵＤ）を見出すことが必要になる（Ｏｔｔｉｎｇｅｒら、２００１年）。決して全ての組織適合性抗原が知られているわけでなく、限定された数の対立遺伝子のみを試験することができるに過ぎないことから、同一性非血縁ドナーでは、同胞のドナーよりも、一致する程度が低いことを想定する必要がある。
【００７３】
患者集団のかなりの部分は、ドナーがいないままである。これらの患者の場合、そのＨＬＡ対立遺伝子の１つのハプロタイプのみにおいてレシピエントと一致する、すなわち、ハプロ同一性である血縁のドナーを使用することができる。
【００７４】
造血幹細胞移植のために、非血縁のドナー（ＭＵＤ）の移植片が使用されることが最も多い（Ｂｌｏｏｄ、２００３年；１０１（４）：１６３０〜６頁）。
【００７５】
ＭＵＤ：未処理（unmanipulated)の移植片
ＭＵＤの状況における未処理の移植片の場合、ＧｖＨＤが、主要な合併症である。ＧｖＨＤの重症例は、生命にかかわるとみなすべきであり、免疫抑制性物質を用いる大規模な治療を必要とし、そうした治療に対しては、約４０％の応答率が記載されている（Ｖｏｇｅｌｓａｎｇら、２００３年）。急性ＧｖＨＤの段階ＩＩ〜ＩＶ：Ｖ：３３％；Ｃ：５１％、および段階ＩＩＩ〜ＩＶ：Ｖ：１１．７％；Ｃ：２４．５％（Ｆｉｎｋｅら、Ｌａｎｃｅｔ、２００９年）。
【００７６】
代替として、ＧｖＨＤを低下させ、必要なＧｖＨＤの予防を行いながら副作用を回避するために、ＣＤ３４が富化された移植片が、ＭＵＤの状況において使用された。欠点は、すでに記載したような結果を全て伴う、免疫の再構成の遅延である。
【００７７】
実際の移植
実際の移植は、２つの相に分けることができる。導入または移植する骨髄または幹細胞の拒絶が進行しないように、化学療法および／または放射線療法を通して前処置を行って、レシピエントの免疫系を破壊する。すなわち、移植片が生着するように、レシピエントの準備を進める。これが良好に達成されるほど、移植片が生着しないかまたは拒絶されるリスクは緩慢に現れる。前処置の強度にもよるが、達成すべき目標は、患者内に残存する白血病性または悪性の細胞を破壊することである。第０日に、移植を静脈内から実施する。移植片が生着し、即時の毒性が減退するまで、通常、患者は、そのような症例に適した病棟に留まる。移植片が生着し、即時の毒性が減弱した後、最初の３ヵ月の間、綿密にモニターする必要がある。モニターの度合は、ドナーおよび合併症のタイプに大きく依存し、次第に、定期的な生涯にわたるアフターケアに移行させる。
【００７８】
適応症
同種幹細胞移植を必要とする適応症は全て、本発明の細胞集団または医薬組成物を用いて治療することができる。先天性および後天性、悪性および非悪性の重度の造血系疾患は全て一般に、同種幹細胞移植に適応である。さらなる適応症は、化学療法または放射線療法の用量強化に応答する悪性の疾患である。
【００７９】
現在、ＧｖＨＤをより良好に制御するために、シクロスポリン、コルチコステロイド、代謝拮抗剤のような免疫抑制剤、およびモノクローナル抗リンパ球性抗体が、常法に従って使用されている。
【００８０】
ＴＣＲα／β+細胞の枯渇
ＴＣＲα／β＋の枯渇は、例えば、Ｃｈａｌｅｆｆら、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ、２００７年、９、７４６〜７５４頁に記載されており、または、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨのそれぞれのプロトコールの記載にも従う。
【００８１】
ＴＣＲα／β+細胞枯渇／ＣＤ１９+細胞枯渇の組合せ
白血球アフェレーシス生成物を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液（ＨＳＡを加えて、０．５％（ｗ／ｖ）の最終濃度とする）を用いて希釈してから、磁気標識化を行う。白血球アフェレーシス生成物を、白血球アフェレーシス生成物の３倍の体積まで希釈するが、最大体積が、６００ｍｌを上回ることはない。
【００８２】
細胞を、２００×ｇ、室温（＋１９℃〜＋２５℃）で、１５分（ｍｉｎ．）間遠心分離する。上清を廃棄する。標識化に最適な重量は、８８ｇ（±５ｇ）である。ペレットを再懸濁させ、重量を決定する。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＴＣＲα／β−ビオチン、およびＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＣＤ１９試薬、すなわち、１つのバイアル（７．５ｍｌ）のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＴＣＲα／β−ビオチン、および１つのバイアルの（７．５ｍｌの）ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＣＤ１９を用いて、細胞を標識する。バイアルは、＋２℃〜＋８℃で保存し、冷温で処理する。細胞と試薬とを混合する。インキュベーション時間は、２５ｒｐｍ、室温（＋１９℃〜＋２５℃）における３０ｍｉｎ．とする。
【００８３】
白血球アフェレーシス生成物と緩衝液とを混合し、軽く撹拌し、続いて、３００×ｇ、室温（＋１９℃〜＋２５℃）で、１５ｍｉｎ間中断することなく遠心分離する。上清を廃棄する。ペレットを再懸濁させ、洗浄する。緩衝液を、約１９０ｇの重量に達するまで添加し、ＴＣＲα／β−ビオチン標識化細胞を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）抗ビオチン試薬を用いて磁気標識化する。＋２℃〜＋８℃で冷却した（７．５ｍｌの）ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）抗ビオチン試薬を、細胞に添加し、細胞を３５ｒｐｍで軽く撹拌しながら、室温（＋１９℃〜＋２５℃）で、３０ｍｉｎ．間インキュベートする。
【００８４】
白血球アフェレーシス生成物と５００ｍｌの緩衝液とを、軽く撹拌し、混合し、続いて、３００×ｇ、室温（＋１９℃〜＋２５℃）で、中断しながら１５ｍｉｎ．間遠心分離する。上清を廃棄する。ペレットを、１５０ｇに達するまで再懸濁させる。０．４×１０9細胞／ｍｌの最大濃度を忠実に守ることが推奨される。
【００８５】
プログラムＤＥＰＬＥＴＩＯＮ３．１を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）plus計測器上で開始し、製造元のＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨが提供する指示に従う。自動分離が終了したら、細胞濃度を決定する。自動分離後には、細胞から、ＴＣＲアルファ／ベータおよびＣＤ１９が、約３〜５ｌｏｇ目盛枯渇している。得られたＴＣＲアルファ／ベータおよびＣＤ１９が枯渇した細胞調製物は、移植に適した溶液中に再懸濁させてから、移植のために使用することができる。当業者であれば、そのような溶液を知っている。
【実施例】
【００８６】
実施例：移植
５人は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）と診断され、３人は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）と診断され、１人は、無顆粒球症と診断され、１人は、ベータ−サラセミアと診断され、１人は、先天性異常（ＨＨＳ）と診断された、１１人の患者に移植を行った。これらの患者のうち、５人には、幹細胞移植がすでに１回実施されていた。他の３人の患者には、幹細胞移植がすでに２または３回実施されていた。
【００８７】
移植後の免疫抑制が観察された患者はいなかった。
【００８８】
実施例：ＭＵＤドナー
ベータ−サラセミアを有する１人の患者、ＡＬＬを有する１人の患者、および先天性異常を有する１人の患者に、ＴＣＲアルファ／ベータが枯渇しており、ＣＤ１９が枯渇している細胞調製物である、ＭＵＤドナーから得られたドナー材料を投与した。
【００８９】
実施例：慢性ＧｖＨＤ
ハプロイドドナーから得られた材料を投与した１人の患者が、軽度の進行が伴う慢性ＧｖＨＤを発症した。
【００９０】
ＭＵＤドナーから得られた材料を投与した患者で、慢性ＧｖＨＤを発症する者はいなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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