(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
直径が数十μｍから数百μｍの貫通穴を任意の間隔で複数設けたポリジメチルシロキサン(ＰＤＭＳ)製の上部プレートを成形する工程と、
平面状の表面を有するＰＤＭＳ以外のプラスチック製の下部プレートを成形する工程と、
前記下部プレートを酸素プラズマ中に曝して表面に酸素含有基を導入する酸素プラズマ処理工程と、
前記下部プレートの表面を酸素プラズマ処理して酸素含有基を導入した後、濃度が０．０５ｗｔ％〜３ｗｔ％のシランカップリング剤を塗布して細胞やタンパク質の表面と相互作用可能な官能基を導入する工程と、
前記上部プレートと下部プレートを接合する直前に、酸素プラズマ処理し、両プレートを上下に積層し、両プレートを所定圧力で加圧して接合一体化する工程と、
よりなり、前記下部プレートの表面で細胞やタンパク質が付着し易い官能基を備えたウェル底部を形成するとともに、前記上部プレートの貫通穴で細胞やタンパク質が付着し難いウェル側壁部を形成してなることを特徴とするマイクロ化学デバイスの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、各種細胞やタンパク質などをウェルに保持して検査やスクリーニングをするためのマイクロ化学デバイスの製造方法に係わり、更に詳しくはウェルの底面と側壁部での表面状態が異なるマイクロ化学デバイスの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質を基板上に固定化させる場合、一般的な手法ではタンパク質が非特異的に基板上に結合してしまう（非特異的吸着）ため、特定の位置にタンパク質を固定化できない。そこで、非特許文献１には、ＭＥＭＳ技術を用いてシリコーン樹脂（ポリジメチルシロキサン：ＰＤＭＳ）を用い、薄膜のＰＤＭＳフィルムに１０μｍ以下の穴を開け、この穴を基板（ガラス基板）にタンパク質を固定化するためのフルイ（篩）として用いている。この非特許文献１に記載の研究では、ＰＤＭＳフィルムに開ける穴が１０μｍ以下であることと、ＰＤＭＳフィルムは、基板にタンパク質を固定化した時点で基板から剥がされてしまう。
【０００３】
ＰＤＭＳを材料にしたウェル形状、流路形状デバイスに関しては、様々な先行特許が出願されている（例えば、特許文献１）。この特許文献１では、ＰＤＭＳの表面性を改善すべく、ポリエーテル変性界面活性剤をシート内に含有させ、微細構造形成後に酸素プラズマ処理とオルガノシラン溶液処理を施すことで、恒久的に親水化を付与することが可能になり、水との接触角評価で４０°以下になるＰＤＭＳ製のデバイスを製作することができると記載されている。用いたオルガノシランが加水分解を受け、主鎖のシロキサン骨格に水酸基が置換されることで、ＰＤＭＳが親水化されるというものである。
【０００４】
図４に従来の高集積ウェルデバイス１０を示している。従来法では、射出成形でプラスチック製の基板１１の表面に直径が数十μｍから数百μｍのウェル１２，…を複数形成している。このように作製したウェルデバイス１０は、ウェル１２の底部及び側壁部を含めてウェル１２が存在するデバイス面全域が同じ表面状態になっているため、ウェル１２に細胞、タンパク質１３を吸着させようとすると、ウェル１２，１２間表面にも細胞、タンパク質１３，…が吸着してしまう。この現象を防ぐために、ウェルデバイス１０のウェル１２の内面のみを表面処理して、ウェル１２とウェル１２以外の表面との表面状態（水の水滴接触角で説明すると、例えば一例として、ウェル１２の水の水滴接触角が４０°以下、ウェル１２以外の接触角がポリマー本来の水滴接触角である８０°以上）を変えようとしても、ウェル１２の直径が数十μｍから数百μｍであるため、ウェル１２の内面のみを親水化処理することは非常に難しいし、強引に表面処理をした場合はその処理費用が高額かつ不均一な表面処理になってしまう可能性が高い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−１８１４０７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】熱田京子他、「タンパク質パターニングのためのＰＤＭＳ穴あき構造」、東京大学生産技術研究所、研究速報、第５５巻６号、ｐ４９８〜５０１（２００３年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明が前述の状況に鑑み、解決しようとするところは、表面に直径が数十μｍから数百μｍのウェルを高集積させたプラスチック製のプレートで構成されるマイクロ化学デバイスにおいて、ウェル底部とウェル底部以外との表面状態が異なる（親水化の程度が異なる）ものとすることができ、それにより本来好ましくないプレート表面への細胞、タンパク質の付着を防止することが可能なマイクロ化学デバイスの製造方法を提供する点にある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、前述の課題解決のために、直径が数十μｍから数百μｍの貫通穴を任意の間隔で複数設けたポリジメチルシロキサン(ＰＤＭＳ)製の上部プレートを成形する工程と、平面状の表面を有するＰＤＭＳ以外のプラスチック製の下部プレートを成形する工程と、前記下部プレートを酸素プラズマ中に曝して表面に酸素含有基を導入する酸素プラズマ処理工程と、前記下部プレートの表面を酸素プラズマ処理して酸素含有基を導入した後、濃度が０．０５ｗｔ％〜３ｗｔ％のシランカップリング剤を塗布して細胞やタンパク質の表面と相互作用可能な官能基を導入する工程と、前記上部プレートと下部プレートを接合する直前に、酸素プラズマ処理し、両プレートを上下に積層し、両プレートを所定圧力で加圧して接合一体化する工程と、よりなり、前記下部プレートの表面で細胞やタンパク質が付着し易い官能基を備えたウェル底部を形成するとともに、前記上部プレートの貫通穴で細胞やタンパク質が付着し難いウェル側壁部を形成してなることを特徴とするマイクロ化学デバイスの製造方法を確立した。
【発明の効果】
【０００９】
以上にしてなる本発明に係る発明のマイクロ化学デバイスの製造方法は、ウェルとなる貫通穴を任意の間隔で複数設けたポリジメチルシロキサン(ＰＤＭＳ)製の上部プレートと、平面状の表面を有するＰＤＭＳ以外のプラスチック製の下部プレートとを有し、両プレートを上下に積層し接合一体化する前に、前記下部プレートを酸素プラズマ処理して表面に酸素含有基を導入した後、濃度が０．０５ｗｔ％〜３ｗｔ％のシランカップリング剤を塗布して細胞やタンパク質の表面と相互作用可能な官能基を導入し、その後両プレートを酸素プラズマ処理し、両プレートを所定圧力で加圧して接合一体化することにより、前記下部プレートの表面でウェル底部を形成し、前記上部プレートの貫通穴でウェル側壁部を形成するので、下部プレートの表面を上部プレートの表面と異なる表面状態（親水化の程度が異なる）とすることで、ウェルの底部とそれ以外の部分との表面状態を異ならせ、細胞、タンパク質をウェルの底部に付着（吸着）し易く、その他の上部プレート表面に付着（吸着）し難くすることが容易にでき、その製造も容易である。また、ウェルの大きさは前記上部プレートに形成する貫通穴の直径で決まり、ウェルの深さは上部プレートの厚さで決まり、設計が容易になるとともに、設計の自由度も高い。
【００１０】
本発明では、プラズマ処理後にシランカップリング剤処理を行うが、この処理の主目的はプレート（上部プレート：ＰＤＭＳ製）の親水化では無く、下部プレート（例えば、ポリスチレン、アクリル樹脂、ポリカーボネートなどに代表されるプラスチック樹脂）との恒久接合と、下部プレートの表面処理面に細胞やタンパク質と相互作用ができる官能基を付与する（従って、ウェル底部の表面にこの官能基が存在する）ことにある。そして、前記上部プレートと下部プレートを接合する直前に、酸素プラズマ処理し、両プレートを上下に積層し、両プレートを所定圧力で加圧することで、安定に接合一体化することができる。更に、濃度が０．０５ｗｔ％〜３ｗｔ％のシランカップリング処理後に、酸素プラズマ処理されたウェル底部となる下部プレートの表面は、官能基の存在によって細胞やタンパク質が付着（吸着）し易くなるとともに、細胞に対する毒性を有意に低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のマイクロ化学デバイスを示し、（ａ）は構造を示す簡略斜視図、（ｂ）簡略断面図である。
【図２】本発明のマイクロ化学デバイスの技術思想を示す簡略断面図である。
【図３】本発明のマイクロ化学デバイスの製造方法を示す説明図である。
【図４】従来の高集積ウェルデバイスを示す簡略断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
次に、添付図面に示した実施形態に基づき、本発明を更に詳細に説明する。本発明のマイクロ化学デバイスは、高集積ウェルデバイスに分類されるものであり、プレートの表面に多数のウェル（有底穴）が形成されたものである。本発明では、ウェル底部の表面状態をウェル底部以外の表面とは異ならせることにより、細胞やタンパク質をウェル底部に吸着させるデバイスを提案する。
【００１３】
図１（ａ）に示すように、本発明のマイクロ化学デバイス１の構成は、プラスチック製の上部プレート２とプラスチック製の下部プレート３から構成されており、直径が数十μｍから数百μｍの貫通穴４，…を任意のピッチ間で設けた上部プレート２と平面状の表面を有する下部プレート３とを別々に作成する。この場合、前記上部プレート２、下部プレート３とは表面状態が異なることが重要である。即ち、前記上部プレート２と下部プレート３の表面状態を異ならせるには、前記上部プレート２と下部プレート３とが異種材料の組合せであっても良いし、それぞれのプレートで表面処理プロセスを変えても良く、更に、異種材質かつ表面処理プロセスも変えるという手法でも良い。そして、前記上部プレート２と下部プレート３とを上下に積層し、両プレートを接合一体化することにより、前記上部プレート２の貫通穴４と前記下部プレート３の表面５とでウェル６が形成される。つまり、図１（ｂ）に示すように、前記下部プレート３の表面５でウェル６底部を形成するとともに、前記上部プレート２の貫通穴４でウェル６側壁部を形成する。図中符号７は、細胞、タンパク質である。
【００１４】
このように、マイクロ化学デバイス１を構成することにより、ウェル６の底部（下部プレート３の表面５）の表面状態をウェル６の底部以外の表面（ウェル側壁部及び上部プレート２の表面）とは異ならせることができる。それにより、各種細胞、タンパク質７などをウェル６の底部にのみ吸着させることが可能となり、更に、細胞、タンパク質７の洗浄工程においてウェル６内に入った細胞、タンパク質７などが流れ出難くなるという特長を発揮できる。尚、上部プレート２に設ける直径が数十μｍから数百μｍの貫通穴４のプレート厚み方向の断面形状は、特に限定する必要はない。一般的には、ストレートあるいは、ウェル底部に行くほど先細りするコーン形状となる。
【００１５】
更に詳しく、本発明のマイクロ化学デバイス１の製造方法を図１及び図３に基づいて説明する。前記上部プレート２の材質は特に限定されず、下部プレート３との組合せにより、上部プレート２に設けた貫通穴４が、細胞、タンパク質７を入れるウェル６になり、このウェル６の直径が数十μｍから数百μｍであるため、厚くても数百μｍの厚みのシートを必要とする。そこで、上部プレート２の製作の１例として、ＰＤＭＳシートが挙げられる。このシートは、射出成形で液状シリコーン樹脂（例えば信越化学工業製ＫＥ−１９３５（Ａ／Ｂ）、ＫＥ−１９５０−３０（Ａ／Ｂ））から成形で製作しても良いし、市販のシリコーンシートを使用しても良い。そして、ＰＤＭＳシート（上部プレート２）に、貫通穴４を炭酸ガスレーザーで設けた。
【００１６】
具体的には、ＰＤＭＳシートの厚みは、５０μｍ又は１００μｍである。ＰＤＭＳシートの穴開け加工に使用した炭酸ガスレーザーは、パナソニックＳＵＮＸ製ＬＰ−４００である。レーザー加工条件の一例として、レーザーパワーが４０％で、走査速度が１０ｍｍ／ｓｅｃである。ＰＤＭＳシートの１．４×１．４ｍｍエリアにφ１００μｍの貫通穴４を等間隔に縦横に形成し、この１．４×１．４ｍｍエリアをＰＤＭＳシート内に複数エリア製作した。
【００１７】
尚、上部プレート２の穴加工は炭酸ガスレーザーによる加工に限定されず、貫通穴４の大きさに応じて、ＵＶレーザー、ピコ秒レーザー、ヘムト秒レーザーなどを用いることが可能である。更に、リソグラフィー手法を用いて、直径が数十〜数百μｍのＵＶレジストパターンを作製し、このレジストパターンをマスター型としてニッケル電鋳プレートを製作し、このニッケル電鋳プレートを介して、各種貫通穴４を上部プレート２に設けることも可能である。このようなプレートを介して上部プレート２に貫通穴４を設ける場合は、穴の形状が円形にこだわらず、四角形、六角形などの多角形形状も可能となる。
【００１８】
下部プレート３の材質は特に限定されず、上部プレート２との接合が可能なプラスチック樹脂で、射出成形やその他の成形方法で製作することが可能であれば特に限定されない。更にデバイスの大きさも特に限定されない。
【００１９】
上部プレート２と下部プレート３との接合は、図３に示すようにする。先ず、下部プレート３を酸素プラズマ中に曝して表面に酸素含有基を導入し（酸素プラズマ処理）、その後、シランカップリング水溶液に浸漬し（シランカップリング処理）、乾燥炉にて脱水処理することで表面に官能基を導入する。その後、常温まで冷却して洗浄する。そして、前記上部プレート２と下部プレート３を接合する直前に、酸素プラズマ処理し、両プレートを接合し、所定圧力で加圧し、一体化する。この際に、加熱しても良い。
【００２０】
このように、本発明は、２種類のプラスチック製の上部プレート２と下部プレート３を正確に位置合わせして接合一体化し、上部プレート２に形成した直径が数十μｍから数百μｍの貫通穴４でウェル６の側壁部を形成し、下部プレート３の表面５でウェル６の底部を形成する。ここで、上部プレート２と下部プレート３との位置合わせは、一般的に用いられる手法を採用することが可能である。例えば、上部プレート２側の４角にφ５００μｍの貫通穴を設け、この上部プレート２のφ５００μｍ貫通穴に入る凸形状（円柱：φ５００μｍより１０〜２０μｍ小さい直径）を下部プレート３に設ける。
【００２１】
本発明は、各種細胞やタンパク質７が上部プレート２のウェル６以外に付着することを防止するため、ウェル６の底部とそれ以外の部分との表面状態を異ならせる。そのため、上部プレート２と下部プレート３それぞれプレート材料を異種材質にすること、それぞれのプレートにおいて表面状態を変えるための表面処理方法を変える。これらの手法により、高集積デバイスの各ウェル６においては、ウェル底部とウェル底部を除くウェル側壁部との表面状態が異なり（水の水滴接触角で表現すると接触角が異なり）、各種細胞やタンパク質７がウェル部以外に付着することを防止できる。
【００２２】
その目的のために、本実施形態では、前記下部プレート３のみをシランカップリング処理を施している。シランカップリング剤の１例として、３−アミノプロピルメトキシシランが挙げられ、その処理によって下部プレートの表面にアミノ基を導入できる。シランカップリング剤の濃度に関しては０．０５ｗｔ%から１０ｗｔ%程度が望ましい。このアミノ基がウェル底部の表面に存在することで、細胞やタンパク質との総合作用により、細胞、タンパク質をウェル底部に吸着させることが可能となる。上部プレート２と下部プレート３との接合に関しては、シランカップリング剤の濃度が高い方が接合の安定性に寄与する一方、細胞、タンパク質への毒性も高くなる。
【００２３】
本実施形態では、上部プレート２にシリコーン樹脂を用いた例を示したが、シリコーン樹脂以外のポリマー材料として、ポリスチレンが挙げられる。ポリスチレンの場合もＰＤＭＳの場合と同様に５０μｍから数百μｍ厚みのシートにレーザー加工で、直径が数十μｍから数百μｍの貫通穴４を設けることが可能である。ポリスチレンの場合は下部プレート３に同材料であるポリスチレンを用いた場合、酸素プラズマ処理を経てシランカップリング処理後に、上部プレート２と熱接着させることが可能である。
更に、環状オレフィンポリマーを上部プレート２に用いた場合も同様の加工プロセスが可能であり、下部プレート３に同材料の環状オレフィンポリマーを用いた場合は、酸素プラズマ処理、シランカップリング処理後に、上部プレート２と下部プレート３とを拡散接合で接合することも可能である。オレフィン系樹脂の場合は接合時に常温で加圧のみで拡散接合が可能であるが、アクリル系樹脂（ＰＭＭＡなど）の場合は加熱加圧する。何れの場合にも、５０℃から１２０℃に接合面を加熱することで、接合時間を短縮することが可能となる。
【００２４】
上述したように、本発明で用いるシランカップリング剤は、上部プレートと下部プレートとを接合して形成されるウェル底部の表面に、細胞やタンパク質と相互作用が可能な官能基を導入することが目的である。従って、使用するシランカップリング剤は、３−アミノプロピルメトキシシランに限定されることなく、細胞やタンパク質と相互作用ができる官能基を導入できるシランカップリング剤を適宜選択すれば良い。即ち、シランカップリング剤の化学構造式で説明すると、次のようになる。
【００２５】
【化１】
0005870813.tif 000002
【００２６】
そして、各種官能基（Ｙ）として以下のものを用いることができる。
アミノ基（−ＮＨ２）の場合は、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、３−（Ｎ−フェニル）アミノプロピルトリメトキシシランなどを用いることができる。
イソシアネート基（−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）の場合は、３−イソシアネートプロピルトリエトキシシラン、３−イソシアネートプロピルトリメトキシシランなどを用いることができる。
ウレイド基（−ＮＨＣＯＮＨ２）の場合は、３−ウレイドプロピルトリエトキシシランなどを用いることができる。
メルカプト基（−ＳＨ）の場合は、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリエトキシシランなどを用いることができる。
カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）の場合は、カルボン酸無水物などを用いることができる。
【００２７】
このような各種官能基を適宜、細胞、タンパク質の種類に応じて用いることができる。また、使用する溶媒は、シランカップリング剤を溶媒に溶かす必要があることから、デバイスの耐溶剤性を考慮して純水以外にアルコール系（例えば、メタノール、エタノールなど）を用いることが可能であり、必要に応じては、純水とアルコールとの混合溶媒を用いても良い。
【００２８】
一方、表面処理するプレート側は、シランカップリング剤溶液中に浸漬される際に、プレート表面が十分に溶液に濡れる必要があることから、プラズマ処理をする必要がある。尚、プラズマ処理に関しては、酸素プラズマ処理に限定はされず、使用するシランカップリング剤溶液にデバイスが十分に濡れる状態（溶剤をデバイス表面に滴下した際の水滴接触角４０°以下が好ましい）になるプラズマ照射条件であれば問題ない。また、シランカップリング剤の濃度にも特に限定されず、接合する上部プレート２、下部プレート３との種類、使用する細胞、タンパク質への毒性の種類を考慮して、溶媒に溶ける濃度で調整すればよい。更に、シランカップリング剤に限定させることもなく、チタン系のカップリング剤など加水分解するものであれば良い。一般的に、加水分解性の有機基を備えたものを用いることができ、ＯＨ基が生成する必要がある。
【００２９】
本発明は、一般的にシリコーン樹脂をポリカーボネート、ポリブチレンテレフタレート、ポリフェニレンオキシド、ポリアミドなどと接合するために用いる接着性シリコーン樹脂（例えば、信越化学工業製のＸ−３４−１６２５Ａ／Ｂ，ＫＥ−２０９０−５０Ａ／Ｂなど）を用いる接合プロセスとは異なる。更に、プラズマ処理をしないで各種プライマーを用いる接合プロセスとも異なる。
【実施例１】
【００３０】
上部プレートの材質はＰＤＭＳであり、下部プレートの材質はポリスチレンである。そして、ウェル径はφ１００μｍ、ウェル深さは５０μｍである。
【００３１】
下部プレート表面処理の具体例を以下に示す。酸素プラズマ処理条件は、下部プレートをプラズマ処理装置（ヤマトマテリアル株式会社製、ＰＤＣ２１０）内に設置した後、装置内を窒素ガスでパージし、０．０１ＭＰａまで減圧後、酸素を１００ｃｃ導入、ＲＦ出力３００Ｗで５秒から６０秒放電する。
【００３２】
シランカップリング剤処理は、３−アミノプロピルトリメトキシシランを純水中に０．０５，０．５，１，３，５，７，１０，１５ｗｔ％の各濃度になるように調整した。各濃度のシランカップリング溶液中に、酸素プラズマ処理後の下部プレートを、２０秒から３００秒の間、浸漬させ、下部プレート表面にシランカップリング剤を反応させる。
【００３３】
上部プレートと下部プレートとの接合処理の具体例を以下に示す。上部プレート、下部プレートともに接合面に酸素プラズマ処理を実施。酸素プラズマ処理条件は、それぞれのプレートをプラズマ処理装置内に設置した後、装置内を窒素ガスでパージし、０．０１ＭＰａまで減圧後、酸素を１００ｃｃ導入、ＲＦ出力３００Ｗで５秒から３０秒放電。その後、酸素プラズマ面を合わせて両プレート間を接合。この場合、この場合、０．０１ＭＰａから０．１ＭＰａの圧力で接合面を加圧、その後５０℃から１２０℃まで加熱すると接合が効率よく行うことができる。
【００３４】
このように製造したマイクロ化学デバイスを用いて各種細胞の毒性テスト評価を行った。その手順を以下に示す。
【００３５】
１．Hybridoma
・生細胞５０，０００個を細胞培養培地（ＲＰＭＩ １６４０）  １ｍｌ中に懸濁させる。
・テストデバイスに１ｍｌ全量を入れる。
・遠心分離器（条件の１例として５００ｒｐｍ、３ｍｉｎ）。
・培養培地で２回洗浄。
・約１時間静置。
・トリハンブルー染色を行い、死んでいる細胞を染色。
・セルカウンターで細胞を計測。
【００３６】
２．Mouse ES細胞
・生細胞５０，０００個を細胞培養培地（ＧＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）  １ｍｌ中に懸濁させる。
・テストデバイスに１ｍｌ全量を入れる。
・遠心分離器（条件の１例として５００ｒｐｍ、３ｍｉｎ）。
・培養培地で２回洗浄。
・約１時間静置。
・トリハンブルー染色を行い、死んでいる細胞を染。
・セルカウンターで細胞を計測。
【００３７】
シランカップリング剤処理の各濃度における上部プレートと下部プレートの接合性と細胞の毒性評価の結果を併せて表１に示す。
【表１】
0005870813.tif 000003
【００３８】
この結果から分かるように、シランカップリング剤処理の濃度が０．０５ｗｔ％〜１０ｗｔ％の場合で両プレートの接合性が良好であると同時に、Mouse ES細胞の生存率が７５〜１００％、Hybridomaの生存率が７０〜１００％となった。特に、シランカップリング剤処理の濃度が０．０５ｗｔ％〜３ｗｔ％の場合、Mouse ES細胞の生存率が９０〜１００％、Hybridomaの生存率が８０〜１００％となった。
【符号の説明】
【００３９】
１  マイクロ化学デバイス
２  上部プレート
３  下部プレート
４  貫通穴
５  下部プレートの表面
６  ウェル
７  細胞、タンパク質
【図１】
0005870813.tif 000004
【図２】
0005870813.tif 000005
【図３】
0005870813.tif 000006
【図４】
0005870813.tif 000007