(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
0005870327.tif 000025
［式中、
Ｒ１は、
−（ＣＨ2）9ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）4ＣＨ3、
−（ＣＨ2）3ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ2）4ＣＨ3、
−（ＣＨ2）3ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ3、及び
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ＝（ＣＨ2）4−ＣＨ3
からなる群から選択され；そして、
Ｒ２は、−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）13ＣＨ3である]
で表されるα−ガラクトシルセラミド。
【請求項２】
二重結合がシスである、請求項１に記載のα−ガラクトシルセラミド。
【請求項３】
α−ガラクトシルセラミドが、下記式：
【化２】
0005870327.tif 000026
を有する、請求項１に記載のα−ガラクトシルセラミド。
【請求項４】
α−ガラクトシルセラミドが、下記式：
【化３】
0005870327.tif 000027
を有する、請求項１に記載のα−ガラクトシルセラミド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のα−ガラクトシルセラミド、及び医薬として許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項６】
樹状細胞をさらに含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
哺乳動物における自己免疫疾患、癌若しくは感染症を治療又は予防するための、請求項５又は６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
自己免疫疾患が、Ｉ型糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、全身性紅班性狼瘡、ギラン・バレー症候群、抗リン脂質症候群、グッドパスチャー症候群、移植片対宿主疾患、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、強皮症、脈管炎、白斑、ヴェグナー肉芽腫症、関節リウマチ、糸球体腎炎、特発性血小板減少性紫班病、乾癬、及びシェーグレン病からなる群から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のα−ガラクトシルセラミドを併用したワクチンを含む、疾患を予防するために哺乳動物にワクチンを投与するための組成物。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のα−ガラクトシルセラミドを含む、哺乳動物におけるナチュラルキラーＴ細胞を刺激するための組成物。
【請求項１１】
哺乳動物が癌を患っている、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
哺乳動物がＩ型糖尿病を患っている、請求項１０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００４年８月２７日に出願された米国仮出願シリアル第６０／６０５，３６２号の利益を主張し、その内容は全体として本明細書中に援用される。
【０００２】
政府権利
本研究の一部は、国立衛生研究所からの助成金によって支援された。米国政府は本発明における一定の権利を有することが可能である。
【０００３】
発明の分野
本発明は、概して、免疫細胞の活性化に関する。より具体的には、本発明は、ＮＫ Ｔ細胞を調節する化合物の同定に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
関連技術の説明
引用した文献：
【０００５】
【化１】
0005870327.tif 000002
【０００６】
【化２】
0005870327.tif 000003
【０００７】
【化３】
0005870327.tif 000004
【０００８】
【化４】
0005870327.tif 000005
【０００９】
【化５】
0005870327.tif 000006
【００１０】
【化６】
0005870327.tif 000007
【００１１】
ＰＣＴ特許公報ＷＯ９３／０５０５５
米国特許第５，６７９，３４７号
米国特許第５，７８０，４４１号
米国特許第５，８５３，７３７号
米国特許第５，９３６，０７６号
米国特許第６，１６２，６０９号
米国特許第６，２３８，６７６号
【００１２】
ＮＫ Ｔ細胞
「ナチュラルキラーＴ細胞」（ＮＫ Ｔ細胞）と称されるＴリンパ球の新規な系統が、最近同定され、多くの重要な点で慣習的なαβＴ細胞と区別されることが示された（Ｂｅｎｄｅｌａｃら、１９９７；Ｂｅｎｄｅｌａｃ １９９８）。ＮＫ Ｔ細胞は、初めにマウスにおいて同定されたが（Ｂｅｎｄｅｌａｃら、１９９７）、最近の研究は、ヒトにおける表現型及び機能の点で非常に保存されていることを示している（Ｅｘｌｅｙら、１９９７；Ｓｐａｄａら、１９９８；Ｄａｖｏｄｅａｕら、１９９７）。これらのＴ細胞は、ＮＫ系統のマーカーＮＫ１．１（ＮＫＲ−Ｐ１Ｃ）とαβＴ細胞受容体の同時発現のために、異なる集団として初めに認識された。それらは、ＣＤ４＋又はＣＤ４−８−（「二重ネガティブ」又はＤＮ）のいずれかであることが見出され、現在、低又は中程度のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）レベル（ＴＣＲint）、及びいわゆるＮＫ遺伝子座によってコードされた種々のＣ型レクチン受容体（例えば、ＮＫ１．１、ＣＤ６９、ＣＤ９４、及び種々のＬｙ−４９ファミリーメンバー）の発現を含む多くの独特な表現型の特徴を有することが認められている。さらに、正常な基底状態でさえ、活性化した表現型（ＣＤ４４hi、ＣＤ６２Ｌlo、ＩＬ−２Ｒβhi）を指標とするマーカーを発現する。ＮＫ Ｔ細胞は、胸腺及び胸腺外発生の経路に由来し、それらの正常な代謝回転は、骨髄に存在する寿命の長い集団によって補われているようである（Ｅｂｅｒｌら、１９９８）。それらは、正常な肝臓で高レベルまで蓄積され、３０％の常駐の肝臓Ｔ細胞と同程度に含み、同時に腎臓及び骨髄の相当な画分のＴ細胞を構成し、そして、他のリンパ様組織においてより低いが検出可能な数で見出される。
【００１３】
多くのＮＫ Ｔ細胞の主要な性質は、非常に制限された多様性を持ったＴＣＲの発現である。正常な動物における大多数のマウスのＮＫ１．１＋Ｔ細胞のＴＣＲα鎖は、完全に同定され、結合多様性を含まないで生殖細胞系列のＶα１４及びＪα２８１遺伝子セグメントの正確な再配列によって形成される（Ｋｏｓｅｋｉら、１９９１；Ｌａｎｔｚら、１９９４）。この不変のＴＣＲα鎖は、典型的には、半不変的なＴＣＲβ鎖をもって対をなし、ちょうど数種の生殖細胞系列のＶβ遺伝子（通常、マウスにおけるＶβ遺伝子使用、同時に顕著に表されたＶβ２及びＶβ７）に対して高度に歪められたＶβ遺伝子使用を示す。このＴＣＲ構造はまた、ホモロガスな不変のＴＣＲα鎖（Ｖα２４−ＪαＱ）を発現するヒトＮＫ Ｔ細胞に見られ、Ｖβ遺伝子使用（通常、Ｖβ１１）を制限し、つまり、ＮＫ Ｔ細胞は保存された非多形リガンドを認識するに違いない（Ｐｏｒｅｃｅｌｌｉら、１９９３；Ｅｘｌｅｙら、１９９７；Ｌａｎｔｚら、１９９４）。
【００１４】
現在、不変のＴＣＲα鎖を発現する大多数のＮＫ Ｔ細胞は、ＣＤ１ｄ分子、即ち、ヒト、マウス及び可能な全ての哺乳動物の間で保存されている非多型のＭＨＣクラスＩ様細胞表面糖タンパク質の認識によって選別される（Ｂｅｎｄｅｌａｃら、１９９５；Ｅｘｌｅｙら、１９９７；また米国特許第５，６７９，３４７号；第５，８５３，７３７号；及び第６，２３８，６７６号を参照されたい）。ヒトでは、ＣＤ１ファミリーは、染色体１上に位置付けられる５個の非多型遺伝子から成る。これらは、５個の区別されるが、密接に関連した細胞表面糖タンパク質（ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、及びＣＤ１ｅとして称される）をコードし、ＭＨＣクラスＩ抗原提示分子に顕著な構造類似性を有する（Ｚｅｎｇら、１９９７；Ｐｏｒｃｅｌｌｉ、１９９５）。実質的に大部分のデータは、いくつかのヒトＣＤ１タンパク質（ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及びＣＤ１ｃ−集合的にはグループ１ＣＤ１として言及される）は、マイコバクテリア及び他の細菌性病原体の細胞壁に見られる特異的なリガンド及び糖脂質に応答する一組のＴ細胞に対する抗原提示分子として機能する（Ｐｏｒｃｅｌｌｉら、１９９８；Ｐｏｒｃｅｌｌｉら、１９９９）。この役割を実行するＣＤ１タンパク質の能力は、脂質結合タンパク質として作用するそれらの能力に最も起因しており、そのタンパク質の２つの膜の先端ドメインによって形成する深い疎水性ポケット内に疎水性アルキル鎖を捕捉する（Ｍｏｏｄｙら、１９９９）。これは、その疎水性又は極性頭部基が特異的なＣＤ１を制限したＴ細胞のＴＣＲとの直接的な相互作用に接近可能であるように提示されている抗原性脂質へと導く（図１）。
【００１５】
ヒトのグループ１ＣＤ１分子の脂質抗原提示機能の発見は、類似の機能もげっ歯類において保存されたこのファミリーの唯一のメンバーであるＣＤ１ｄタンパク質について存在することを示した。この可能性は、培養細胞から単離したＣＤ１ｄ分子がグリコシルホスファチジルイノシトールと非共有的に関連し、ＣＤ１ｄの疎水性ポケットにおくて結合した自己の糖脂質リガンドを表すことができた（Ｊｏｙｃｅら、１９９８）。おそらく、さらにより顕著なのは、セラミド様糖脂質のファミリー（即ち、α−ガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ）及び関連したα−グリコシルセラミド）は、マウスのＮＫ Ｔ細胞による強力なＣＤ１ｄ制限応答を刺激することができた（Ｋａｗａｎｏら、１９９７）。これらの化合物は、α−アノマーヘキソース糖（ＮＫ Ｔ細胞認識に対して活性なガラクトース又はグルコース）を含有し、通常、β−アノマー糖のみを含有する哺乳動物組織で起こるセラミドとは区別される。著しく、これらの化合物は、現在、最初に単離された供給源である海綿にのみ天然に発生することで知られ、αＧａｌＣｅｒは、腫瘍を有するマウスに注入した場合、免疫活性化の結果として、劇的な腫瘍拒絶を誘導したことが示されたときに免疫学者の関心の対象となった（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，１９９５）。その後、この活性は、ＣＤ１ｄ依存の機構を介してＮＫ Ｔ細胞を急速に活性化するαＧａｌＣｅｒの能力に結びついた。現在、αＧａｌＣｅｒがＣＤ１ｄに結合すること、つまり、ＮＫ Ｔ細胞のＴＣＲに対する測定可能なアフィニティーを有する分子複合体を生み出すことは決定的には示されていない（Ｎａｉｄｅｎｋｏら、１９９９；Ｍａｔｓｕｄａら、２０００；Ｂｅｎｌａｇｈａら、２０００）。このように、αＧａｌＣｅｒは、インビトロ及びインビボの両方において大部分のＮＫ Ｔ細胞の活性化を可能にする有力な試薬を提供する。
【００１６】
最も広く研究されているＮＫ Ｔ細胞を活性化するαＧａｌＣｅｒは、文献的にはＫＲＮ７０００と呼ばれ、げっ歯類においてそれらの抗癌活性に基づいて海綿から最初は単離されたαＧａｌＣｅｒの天然の形態に類似した構造を有する合成分子である（Ｋａｗａｎｏら、１９９７；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、１９９５；Ｉｉｊｉｍａら、１９９８；Ｉｎｏｕｅら、１９９７；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、１９９６ａ、１９９６ｂ；Ｈａｋａｇａｗａら、２０００；Ｕｃｈｉｍｕｒａら、１９９７ａ；Ｕｃｈｉｍｕｒａら、１９９７ｂ；Ｍｏｔｏｋｉら、１９９６ａ；Ｍｏｔｏｋｉら、１９９５；Ｎａｋａｇａｗａら、１９９８；Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、１９９６；Ｍｏｒｉｔａら、１９９５；Ｍｏｔｏｋｉら、１９９６ｂ）。ＫＲＮ７０００の構造を図１に示す。
【００１７】
ＫＲＮ７０００の強力な活性、及び哺乳動物における癌、感染症及び自己免疫疾患の見込みのある治療効果が与えられると、より大きい強力であるか又は異なった活性を有する構造的な類似体を開発する可能性は、明白な関心の領域である。この点について、以前の１つの報告は、実験的なアレルギー性脊髄炎（ＥＡＥ）のマウスモデルにおける自己免疫性を抑制する能力の増加を示した一部切断されたスフィンゴシン塩基を有するＫＲＮ７０００の合成類似体を記載した（Ｍｉｙａｍｏｙｏら、２００１）。この化合物の構造は、それを報告した研究者らによって「ＯＣＨ」と称され、図３に示される。αＧａｌＣｅｒスフィンゴシン塩基で変化した他の変形体は、米国特許第５，９３６，０７６号に同定される。対照的に、脂肪酸鎖の修飾に関するほんの僅かな以前の研究がある。脂肪酸長の変形は、Ｋａｗａｎｏら（１９９７）によって研究されたが、この分析は、非常に制限され、任意の調査している性質を明らかにしない。
【００１８】
１９９７年１１月から現在までに日付された大部分の文献は、ＫＲＮ７０００が哺乳動物の免疫系を活性化する機構を研究している（Ｋａｗａｎｏら、１９９７；Ｂｅｎｌａｇｈａら、２０００；Ｂｕｒｄｉｎら、１９９９；Ｃｒｏｗｅら、２００３；Ｎａｉｄｅｎｋｏら、１９９９；Ｓｉｄｏｂｒｅら、２００２；Ｇｏｄｆｒｅｙら、２０００；Ｓｍｙｔｈ及びＧｏｄｆｒｅｙ，２０００）。これらの研究は、ＫＲＮ７０００の効果に関する最も近い機構が、大部分の造血細胞、並びにいくつかの上皮及び他の細胞系統に発現されるＣＤ１ｄタンパク質へのこの化合物の結合であることを一様に示す。ＫＲＮ７０００のＣＤ１ｄへの結合は、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫ Ｔ細胞）と呼ばれる一組のＴリンパ球のＴ脂肪抗原受容体（ＴＣＲ）による高アフィニティーを用いて認識される分子複合体を生み出す。ＫＲＮ７０００／ＣＤ１ｄ複合体の認識は、肝臓、腎臓及び他のリンパ様臓器に常駐し、潜在的に任意の組織に行き来する可能性を有するＮＫ Ｔ細胞の急速な活性化へと導く。活性化したＮＫ Ｔ細胞は、幅広いケモカイン及び他のサイトカインを急速に分泌し、同時に、樹状細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のような他の細胞型を活性化する能力を有する。ＫＲＮ７０００／ＣＤ１ｄ複合体によるＮＫ Ｔ細胞の活性化に続く一連の出来事は、免疫系に関する多くの可能性のある下流の効果を有することを示している。例えば、ある型の感染において、これは、感染に対する免疫性を高め、治癒を促進するアジュバント効果に導くことができる。あるいは、ある型の自己免疫疾患において、ＫＲＮ７０００によるＮＫ Ｔ細胞の活性化は、組織の破壊を抑制し、疾患を改善する方法において自己免疫応答の進行を変えることができる。後者の効果は、自然発生のＩ型真性糖尿病のマウスモデル（即ち、ＮＯＤマウス血統、図２）において本質的に強力であることを実証している（Ｓｈａｒｉｆら、２００１；Ｓｈａｒｉｆら、２００２；Ｈｏｎｇら、２００１；Ｗａｎｇら、２００１）。
【００１９】
ＮＫ Ｔリンパ球の機能は、完全には解決されないままであるが、様々な研究は、免疫応答の制御におけるこれらのＴ細胞について重要な役割を指摘する。ＮＫ Ｔ細胞の顕著な特徴は、それらのαβＴＣＲを介した刺激に基づく大量のＩＬ−４及びＩＦＮ−γの急速な産生である（Ｅｘｌｅｙら、１９９７；Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏら、１９９４；Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏら、１９９５ａ；Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏら、１９９５ｂ）。実際に、それらの同定、恐らくは免疫活性化の間のＩＬ−４の初期産生の原因となる主要な細胞は、それらは、分極している２型（Ｔｈ２）Ｔ細胞応答における重要な役割を果たすかもしれないことを示唆した。この点では、ＮＫ Ｔ細胞が、マウスにおける異なった種々の病原菌を用いた感染の結果を決定するのに重要な役割を果たすために同定されていることは当然である。さらに、ＮＫ Ｔ細胞の主要な免疫制御の役割は、ヒト及びＮＯＤマウスモデルの両方における自己免疫のＩ型真性糖尿病において提案されている。ヒト患者において、病気にかかりやすい患者における明白な真性糖尿病に対する進行は、循環しているＮＫ Ｔ細胞の数の減少、及びそれらがＩＦＮγの産生を保持しているＩＬ−４を産生するこれらの細胞の能力の欠如と関連する（Ｗｉｌｓｏｎら、１９９８）。これらの発見は、ＮＯＤマウスにおける実質的に同一の観察によって強く支持される。最も重要なことには、多くの研究は、ＮＯＤモデルにおける真性糖尿病の開始が、養子免疫伝達を介した利用可能なＩＬ−４を産生するＮＫ Ｔ細胞の数の増加、又はＶα１４−Ｊα２８１ ＴＣＲαトランス遺伝子の発現によって、遅延され、又は妨げられさえすることができる（Ｈａｎｍｍｏｎｄら、１９９８；Ｌａｌｏｕｘら、２００１）。最近、インビボにおいてαＧａｌＣｅｒ（ＫＲＮ７０００）を用いたＮＯＤマウスの治療が明白な真性糖尿病の開始を変化し、遅延し、又は妨げられさえすることができ（Ｈｏｎｇら、２００１；Ｓｈａｒｉｆら、２００１）、自己免疫障害の調節に関する薬理学的な試薬としてこの化合物及び関連する類似体の開発に対する強力な先例を提供する。
【００２０】
自己免疫疾患
自己免疫疾患は、患者自身の細胞及び組織を攻撃する自己の免疫系の結果である。これは、多発性硬化症、重症筋無力症、アジゾン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、ベーチェット病、クローン病及び潰瘍性大腸炎、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、リウマチ熱、サルコイドーシス、脈管炎、白斑、ヴェグナー肉芽腫症、移植片対宿主病、メニエール病、関節リウマチ、真性糖尿病、全身性紅班性狼瘡（ＳＬＥ）、乾癬、強皮症、特発性血小板減少性紫班病、炎症性腸疾患、糸球体腎炎、及びシェーグレン病を含む広範囲な疾患に帰着し得る。大部分に関して、自己免疫病の病因は理解が不十分であり、全身性紅班性狼瘡のような自己免疫疾患に対するいくつかの治療があるが、全て重大な欠点を有する。つまり、自己免疫疾患に対するより安全でしかもより効果的な治療が必要である。
【００２１】
全身性紅班性狼瘡（ＳＬＥ）は、複数の重要臓器を損傷する一般的な自己免疫疾患であり、最良の利用可能な現在の治療が適用される場合でさえもかなりの死亡率及び致死率を引き起こす（Ｋｏｔｚｉｎ、１９９６；Ｐｉｓｅｔｓｋｙら、１９９７）。
【００２２】
ＳＬＥの発症についても最新のモデルは、Ｂリンパ球の自己反応性、及び種々の自己抗体の産生に焦点を合わせている。疫学の研究及び動物モデルの多量なデータは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）及び特異的な核酸／タンパク質複合体に対する抗体のようなヒトにおけるＳＬＥと関連したある種の自己抗体が、疾患の病因に直接的な役割を果たすという見解を支持する（Ｈａｈｎ、１９９８）。つまり、ＳＬＥの原因及び効果的な治療の研究の主要な目的は、Ｂ細胞コンパートメントに耐性を維持し、Ｂ細胞の自己活性化を制御する機構を同定することである。このような機構は、ＳＬＥの改善された治療及び予防の開発に対する最も効果的な目的を提供するかもしれない。
【００２３】
ここ数年、ＳＬＥのマウスモデルは、この障害に導く基本的な機構の本出願人の理解に大いに貢献している（Ｄａｔｔａ、１９８８；Ｓｉｌｖｅｉｒａ及びＢａｘｔｅｒ、２００１）。ヒト疾病の強く似ている多くの側面に一般的に許容されるＳＬＥの遺伝的なマウスモデルは、ニュージーランドブラック雌性マウス及びニュージーランドホワイト雄性マウスとの間のＦ１交配に発生するものである（ＮＺＢ／Ｗ Ｆ１マウス）。これらのマウスは、ＩｇＭ及び二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）抗体の分泌を伴って、若年齢でＢ細胞の自己反応性の兆候を発生する。約６月齢で、ＮＺＢ／Ｗ Ｆ１マウスは、ＩｇＭからＩｇＧまでの自己抗体分泌の移行を示し、これは、病原性であるカチオン性ＩｇＧ抗ｄｓＤＮＡ抗体の産生と関連し、免疫複合性糸球体腎炎の原因となる（Ｚｅｎｇら、２０００）。類似の方法で、ｌｐｒ突然変異を有するマウスは、年齢依存性の自然発生のＳＬＥ様疾患の発症を提示し、また、ヒトにおけるＳＬＥに特徴的であるｄｓＤＮＡ及び他の標的抗原に対するＩｇＧ抗体の高い力価の発生と関連する。これらのＳＬＥの自然発生のモデルは、Ｂ細胞の自己反応性及びＳＬＥの発症を妨げるのにどんな役割を果たすことができるかを決定するための免疫制御及び寛容の種々の機構を調べる優れたモデル系を提供する。
【００２４】
マウスにおける自然発生のＳＬＥのこれらの遺伝的モデルに加えて、自己免疫にかかりやすくない遺伝的背景におけるＳＬＥの誘導に導くかもしれない過程を研究するために種々のモデルが考案されている。これらのモデルは、自己活性のリンパ球を存続させ、活性化されるようにする正常な免疫寛容の崩壊に導くかもしれない機構を測定する手助けに有用であった。このようなモデルは、一般的に、現実の疾患の正確なシミュレーションを提供しない。ＳＬＥに特有なものと類似する自己抗体産生に導く誘導可能なＢ細胞の自己免疫性の２つのモデルは、Ｒ４Ａ重鎖のトランスジェニックマウスモデル及び自己免疫性マウスモデルを誘導したＭＡＰペプチドである。
【００２５】
Ｂ細胞の自己免疫性のＲ４Ａトランスジェニックマウスモデルは、Ｂ細胞の寛容の機構に関する非常に多くの情報を与える研究の主題であった（Ｂｙｎｏｅら、２０００；Ｋｕｏら、１９９９；Ｂｙｎｏｅら、１９９９）。これらのマウスは、Ｒ４Ａと呼ばれるモノクローナル抗ｄｓＤＮＡ抗体の再配列したＩｇＧ２ｂ重鎖をコードするトランス遺伝子を発現する。初代のＲ４Ａ抗体は、ｄｓＤＮＡに対して中程度のアフィニティーを有し、腎糸球体に堆積物を形成する傾向があるために、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける病原性抗体として分類される。Ｒ４Ａはまた、α−アクチニンであるとして最近同定された、メサンギウム細胞に発現したタンパク質抗原に高アフィニティーで結合することを示す。Ｒ４Ａトランス遺伝子（Ｒ４Ａ Ｔｇ）マウスにおいて、再配列したＩｇＧ２ｂ重鎖は、ｄｓＤＮＡに対する変化するアフィニティー、並びに推定上の非常に多くの非自己免疫特異性を有する抗体を生じる無数の内因性の軽鎖と関連する。
【００２６】
血清の自己抗体の力価は、Ｒ４Ａ Ｔｇマウスにおいてごく僅かであるが、マウスは、抗ｄｓＤＮＡ Ｂ細胞の少なくとも３つの別個の集団を提供する（Ｓｐａｔｚら、１９９７）。正常に削除されたＲ４Ａ Ｔｇマウスの高アフィニティーな抗ｄｓＤＮＡ Ｂ細胞はまた、エストラジオールを用いてこれらのマウスの治療により救出され得る（Ｂｙｎｏｅら、２０００）。このトランスジェニックマウスモデルは、抗ｄｓＤＮＡの認知に対して強力な固有の歪みを有するＢ細胞の選別と生存を制御する因子を研究する感度の良い環境を提供する。
【００２７】
ＭＡＰペプチドを誘導したモデルでは、非自己免疫ＢＡＬＢ／ｃマウスは、多量体化した形態の合成ペプチド（ＤＷＥＹＳＶＷＬＳＮ）を用いて免疫化に続く狼瘡様自己免疫性を発症することを誘導することが可能である（Ｇａｙｎｏｒら、１９９７；Ｐｕｔｔｅｒｍａｎら、１９９８；Ｐｕｔｔｅｒｍａｎら、２０００）。抗原ペプチドは、ｄｓＤＮＡのミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）として機能するコア配列（ＤＷＥＹＳ）を含有する。ペプチドミメトープＤＷＥＹＳＶＷＬＳＮの免疫原性を増加するには、８つに分岐したポリリジン骨格に結合させ、完全フロインドアジュバントに乳化させることである。この多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）結合体を用いて免疫したマウスは、ＩｇＭ及びＩｇＧアイソタイプの抗ｄｓＤＮＡ抗体を生じ、また、ＳＬＥに固有の種々の他の自己抗原に対する抗体、及び腎糸球体におけるＩｇＭ及びＩｇＧ堆積物を生じる。ＭＡＰペプチドで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスから単離した抗ｄｓＤＮＡ抗体は、ＮＺＢ／Ｗ Ｆ１のような自然発生の遺伝的なマウスのＳＬＥモデルから単離した自己抗体にいくつかの顕著な類似性を示す。このモデルは、寛容を崩壊する能力を有する所定の免疫化する刺激の調節された適用に続く正常動物において発症する自己免疫性の調節を評価する機会を提供する。
【００２８】
多くの研究は、自己免疫性真性糖尿病の発症と関連したものと類似したＮＫ Ｔ細胞における異常はまたＳＬＥに存在することを強く示唆する。例えば、Ｔａｋｅｄａ及びＤｅｎｎｅｒｔは、はじめに、Ｃ５７ＢＬ／６ｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおける自己免疫の発症がＮＫ１．１＋細胞の消失と相関することを報告し、インビボにおけるこれらの細胞の欠失が疾患を加速させ、一方、ＮＫ１．１＋細胞の養子免疫伝達が疾患の開始を遅延させることを示した（Ｔａｋｅｄａら、１９９３）。この研究は、インビボの分析においてＮＫ細胞とＮＫ Ｔ細胞との間の区別をしなかったが、インビトロにおいて、ＣＤ３＋ＮＫ１．１＋集団が抗ＤＮＡ自己抗体産生の直接的な阻害を仲介することを示した。その後、Ｍｉｅｚａらは、ＭＲＬ ｌｐｒ／ｌｐｒ、Ｃ３Ｈ ｇｌｄ／ｇｌｄ及びＮＺＢ／Ｗ Ｆ１マウスを含む、狼瘡になりやすいマウスにおける疾患の発症と同時に不変のＶα１４−Ｊα２８１再配列を発現するＮＫ Ｔ細胞の顕著な減少及び結果として生じる消失の発生を示している（Ｍｉｅｚａら、１９９６）。これらの研究者らはまた、Ｖα１４トランスジェニックＭＲＬ ｌｐｒ／ｌｐｒマウスは、Ｖα１４ＮＫ Ｔ細胞のレベルを上方制御するが、リンパ球増殖性疾患の有意な抑制を示し、Ｖα１４ ＮＫ Ｔ細胞はこのＳＬＥの動物モデルにける疾患の開始及び進行において有意な制御的役割を果たすかもしれないことを確実にした。
【００２９】
重要なことに、ＳＬＥを用いたヒトにおける最近の調査結果は、マウスのＳＬＥモデルにおいて発見されたＮＫ Ｔ細胞の欠損と密接に匹敵するものを含むＣＤ１−反応性Ｔ細胞の変化を示している。例えば、Ｓｉｅｌｉｎｇらは、ＳＬＥを有するヒト患者は、循環のリンパ球プールにおいてＣＤ１を制御するＣＤ４−８−Ｔ細胞の数を増加させ、これらの異常なＴ細胞が抗体を産生させ、アイソタイプのスイッチを被ることを報告した（Ｓｉｅｌｉｎｇら、２０００）。これらの細胞は、ＣＤ１ｄと一緒に、Ｂ細胞によって強力に発現していることで知られる２つのヒトＣＤ１アイソフォームの１つであるヒトＣＤ１ｃタンパク質を認識することが見出された。さらにより顕著なのは、Ｏｉｓｈｉらによって報告された結果であり、不変のＴＣＲα鎖を発現するＮＫ Ｔ細胞が、活性なＳＬＥを患っているヒト患者の循環に本質的に存在しないことを示した。コルチコステロイド誘導の緩和に続いて、ＮＫ Ｔ細胞が再度検出することができ、これらの制御性Ｔ細胞の存在と疾患活性のレベルとの間の興味ある逆相関を確認した（Ｏｉｓｈｉら、２００１）。別の最近の研究は、ヒトのＳＬＥにおける多くのこれらの調査結果を確認し（Ｋｏｊｏら、２００１）、全身性硬化症、即ち、核抗原に対する突出した自己抗体産生を含むＳＬＥを有するいくつかの特徴を共有する全身性自己免疫疾患を患っている患者における研究について、非常に類似した調査結果がＳｕｍｉｄａらによって報告された（Ｓｕｍｉｄａら、１９９５）。これらの結果は、マウスモデルで報告された異常性とヒトにおける真のＳＬＥと他の関連した自己免疫疾患との間の強力な相関関係を指示した。ＣＤ４−ＣＤ８−ＮＫ Ｔ細胞の数を増加させることによる自己免疫疾患を治療する方法を開示する米国特許第６，１６２，６０９号も参照されたい。開示されたこれらの細胞を増加させる方法は、それらをＣＤ１ｄ又はその断片に晒すことである。
【００３０】
他の自己免疫疾患は、自己抗体によって少なくとも部分的に仲介される病因を有する点においてＳＬＥと類似しているようだ。これに含まれるものは、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、ギラン・バレー症候群、抗リン脂質症候群、グッドパスチャー症候群、移植片対宿主疾患、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、強皮症、脈管炎、白斑、ヴェグナー肉芽腫症、関節リウマチ、糸球体腎炎、特発性血小板減少性紫班病、及びシェーグレン病である。
【００３１】
ワクチン
Ｔ非依存性抗原及びＴ依存性抗原の両方に対するワクチンが開発され、及び開発中である。Ｔ非依存性免疫応答は、一般的に、効果的なワクチンを生産するために必要な記憶成分を有していないため、Ｔ非依存性抗原に対するワクチンは、しばしば、通常、Ｔ非依存性応答を誘導する病原体の成分、例えば特徴的な多糖を採取し、そして、Ｔ依存性応答を誘導することができる担体分子に成分を結合することによって開発される。したがって、この成分は、願わくば、Ｔ非依存性病原体の成分に対するＴ依存性免疫反応（及び記憶Ｂ細胞産生）を引き起こすＴ依存性抗原の部分となる。しかしながら、これらのワクチンは、Ｔ依存性抗原に対する多くのワクチンと同様に、しばしば、ワクチン化した動物が病原体によるその後のチャレンジを効果的に撃退することができるだけの十分なＴ依存性免疫応答を誘導することができない。ＫＲＮ７０００は、Ｔ細胞を活性化し、Ｔ依存性応答を改善する能力により、ワクチンに対する効果的なアジュバントであることが示されている（ＰＣＴ特許公報ＷＯ９３／０５０５５）。
【００３２】
受動免疫
癌治療の増加している重要な手段は、乳癌を患っている患者の一部において、非ホジキンズリンパ腫（ＮＨＬ）又はＨｅｒ２／ｎｅｕのＣＤ２０のような特異的腫瘍標的分子に対するヒト抗体の投与である。ＮＨＬの治療のための抗ＣＤ２０抗体の効能は、部分的には、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の主要な機能である抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）によって仲介されることが示されている。腫瘍抗原に指向されたこのような受動的に転移された抗体治療の効果を増加するための潜在的に重要な戦略は、ＮＫ細胞の活性化及び増殖を促進するアジュバントの同時投与によってＮＫ活性を増大させることであろう。ＮＫ Ｔ細胞がＩＦＮγを産生するＮＫ細胞の活性化において果たす重要な役割のために、ＮＫ Ｔ細胞のＮＫを刺激する活性をさらに増加する本明細書中に記載した分子は、抗体治療のための価値あるアジュバントであるかもしれない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３３】
哺乳動物の免疫におけるＮＫ Ｔ細胞の重要性により、ＮＫ Ｔ細胞の追加の調節因子の同定及び特徴付けが必要である。本発明はその必要性に取り組む。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
したがって、本発明者らは、多くのαＧａｌＣｅｒの変形体がＮＫ Ｔ細胞を活性化できること、これらの変形体は、化合物を効果的に提示する細胞型において異なること、そして、ＮＫ Ｔ細胞を活性化するために使用される場合、これらの変形体は多様なサイトカインプロフィールを誘導することを発見した。
【００３５】
したがって、ある態様では、本発明は、式Ｉ：
【化７】
0005870327.tif 000008
［式中、
Ｒ１は、少なくとも１個のＣ＝Ｃ結合を有する直線状又は分岐したＣ1−Ｃ27アルケンであるが、−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3でなく、又はＲ１は、Ｃ（ＯＨ）−Ｒ３（ここで、Ｒ３は、少なくとも１個のＣ＝Ｃ結合を有する直線状又は分岐したＣ1−Ｃ26アルケンである）であり；そして、
Ｒ２は、下記（ａ）−（ｅ）：
（ａ）−ＣＨ2（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｂ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｃ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ（ＣＨ3）2；
（ｄ）−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｅ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3
｛式中、Ｘは、５〜１７の範囲の整数である｝
の１つである］
を含むα−ガラクトシルセラミドに関する。
別の態様では、本発明は、式Ｉ：
【化８】
0005870327.tif 000009
［式中、
Ｒ１は、分岐したＣ1−Ｃ27アルカンであり、又は
Ｒ１は、Ｃ（ＯＨ）−Ｒ３（ここで、Ｒ３は、直線状又は分岐したＣ1−Ｃ26アルケンである）であり；そして、
Ｒ２は、下記（ａ）−（ｅ）：
（ａ）−ＣＨ2（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｂ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｃ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ（ＣＨ3）2；
（ｄ）−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｅ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3
｛式中、Ｘは、５〜１７の範囲の整数である｝
の１つである］
を含むα−ガラクトシルセラミドに関する。
追加の態様では、本発明は、式Ｉ：
【化９】
0005870327.tif 000010
［式中、
Ｒ１は、Ｃ6−Ｃ27アルカン又はアルケン（ここで、（ｉ）Ｃ6−Ｃ27アルカン又はアルケンは、Ｃ5−Ｃ15シクロアルカン、Ｃ5−Ｃ15シクロアルケン、ヘテロ環又は芳香族環で置換され、あるいは（ｉｉ）Ｃ6−Ｃ27アルカン又はアルケンは、Ｃ6−Ｃ27アルキル又はアルケニル鎖内に、Ｃ5−Ｃ15シクロアルカン、Ｃ5−Ｃ15シクロアルケン、ヘテロ環又は芳香族環を含む）であり；そして、
Ｒ２は、下記（ａ）−（ｅ）：
（ａ）−ＣＨ2（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｂ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｃ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ（ＣＨ3）2；
（ｄ）−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｅ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3
｛式中、Ｘは、５〜１７の範囲の整数である｝
の１つである］
を含むα−ガラクトシルセラミドに関する。
本発明は、追加的に、式Ｉ：
【化１０】
0005870327.tif 000011
［式中、
Ｒ１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3、−（ＣＨ2）6ＣＨ3、−（ＣＨ2）4Ｃｌ、−（ＣＨ2）16ＣＨ3、−（ＣＨ2）5ＣＨ3、−（ＣＨ2）2ＣＨ3、−（ＣＨ2）4ＣＨ3、−（ＣＨ2）8ＣＨ3、−Ｃ（ＣＨ2）10ＣＨ3、−Ｃ（ＣＨ2）12ＣＨ3から成る群から選択され；そして、
Ｒ２は、下記（ａ）−（ｅ）：
（ａ）−ＣＨ2（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｂ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｃ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ（ＣＨ3）2；
（ｄ）−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｅ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3
｛式中、Ｘは、５〜１７の範囲の整数である｝
の１つである］
を含むα−ガラクトシルセラミドに関する。
更なる態様では、本発明は、式ＩＩ：
【化１１】
0005870327.tif 000012
［式中、
Ｒ１は、直線状若しくは分岐したＣ1−Ｃ27アルカン又はアルケンであり、又は、
Ｒ１は、Ｃ（ＯＨ）−Ｒ３（ここで、Ｒ３は、少なくとも１個のＣ＝Ｃ結合を有する直線状若しくは分岐したＣ1−Ｃ26である）であり、
あるいは、Ｒ１は、Ｃ6−Ｃ27アルカン又はアルケン（ここで、（ｉ）Ｃ6−Ｃ27アルカン又はアルケンは、Ｃ5−Ｃ15シクロアルカン、Ｃ5−Ｃ15シクロアルケン、ヘテロ環又は芳香族環で置換され、あるいは（ｉｉ）Ｃ6−Ｃ27アルカン又はアルケンは、Ｃ6−Ｃ27アルキル又はアルケニル鎖内に、Ｃ5−Ｃ15シクロアルカン、Ｃ5−Ｃ15シクロアルケン、ヘテロ環又は芳香族環を含む）であり；
Ｒ２は、下記（ａ）−（ｅ）：
（ａ）−ＣＨ2（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｂ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｃ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ（ＣＨ3）2；
（ｄ）−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｅ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3
｛式中、Ｘは、５〜１７の範囲の整数である｝
の１つであり；
Ｒ４は、α−ガラクトシル及びβ結合の単糖以外のα結合の単糖である］
を含むグリコシルセラミドに関する。
【００３６】
本発明はまた、上述した任意のα−ガラクトシルセラミド又はグルコシルセラミドを含む医薬組成物に関する。
更なる態様では、本発明は、上述した任意のα−ガラクトシルセラミド又はグルコシルセラミド及び樹状細胞を含む組成物に関する。
【００３７】
本発明はまた、哺乳動物にワクチンを投与する方法に関する。この方法は、任意の上記のα−ガラクトシルセラミド又はグリコシルセラミドを併用してワクチンを投与することを含む。
【００３８】
追加の態様では、本発明は、ＮＫ Ｔ細胞を活性化する方法に関する。この方法は、ＮＫ Ｔ細胞を上述した任意のα−ガラクトシルセラミド又はグリコシルセラミドと接触させることを含む。
【００３９】
本発明は、追加的に、哺乳動物における免疫系を刺激する方法に関する。この方法は、有効量の上記の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む。
本発明は、さらに、樹状細胞を上記の医薬組成物と接触させ、この樹状細胞を哺乳動物に注入することによって哺乳動物の免疫系を刺激する方法を含む。
【００４０】
更なる態様では、本発明は、ＣＤ１ｄタンパク質を発現する細胞の存在下で、ＮＫ Ｔ細胞を活性化する化合物の能力に関してその化合物を評価する方法に関する。この方法は、ＣＤ１ｄタンパク質を発現する１より多くの細胞型の存在下で、化合物をＮＫ Ｔ細胞と組み合わせ、ＮＫ Ｔ細胞が活性化するかどうかを評価することを含む。
本発明はまた、哺乳動物における自己免疫疾患、癌又は感染症を治療又は予防する方法に関する。この方法は、上述した医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、ＣＤ１ｄ制御のＮＫ Ｔ細胞の特異的な活性化因子であるαＧａｌＣｅｒ ＫＲＮ７０００の構造を示す。ＫＲＮ７０００は、（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−Ｎ−ヘキサコサノイル−２−アミノ−１，３，４−オクタデカントリオール）である。それは、Ｃ１８フィトスフィンゴシン塩基及びＣ２６脂肪酸アシル基を含有する。米国特許第５，７８０，４４１号を参照されたい。
【図２】図２は、ＫＲＮ７０００がＮＯＤマウスにおけるＩ型糖尿病の発症を妨げるＨｏｎｇら（２００１）のデータを示す。マウスは、４週齢から開始し、ＫＲＮ７０００の注射を週に２回受けた。上段のグラフは、７５％から約５％まで糖尿病の発生率の減少を示す。下段のグラフは、この効果が、ＣＤ１に対するノックアウト遺伝子座を担持するＮＯＤマウスでは見られないことを示す。これらのマウスは、ＣＤ１制御のＮＫ Ｔ細胞を有しておらず、ＫＲＮ７０００の既知の効果全てを要求する。
【図３】図３は、マウスＥＡＥにおける自己免疫の炎症を抑制する増加した能力を有するαＧａｌＣｅｒの類似体であるＯＣＨの構造を示す。これは、短縮したＣ９スフィンゴシン塩基（Ｃ１８スフィンゴシン塩基とは対照的に）を有する点で、ＫＲＮ７０００構造とは相違する。
【図４】図４は、コア構造、及び本発明で同定されたアミノ置換のセラミド様糖脂質の合成のためのカップリング反応を示す。
【図５Ａ】図５のパネルＡは、コンビナトリアル合成によって生産したセラミド様糖脂質の生物活性スクリーニングの実験結果を示す。ＮＫ ＴハイブリドーマＤＮ３２．Ｄ３は、マイクロタイタープレートのウェル中でＣＤ１ｄをトランスフェクトしたＲＭＡ−Ｓ細胞と一緒に培養した。各セラミド様糖脂質は、０．５〜５００ｎＭの濃度範囲で判定され、上清はＩＬ−２放出の測定のために２４時間後に回収した。活性単位は、ＩＬ−２の最大半分の放出を与えるために要求されるセラミド様糖脂質の濃度の逆数として計算され、全ての値はＫＲＮ７０００の活性に標準化した（１ユニットとして定義される）。点線は、ＫＲＮ７０００についての活性レベルを示す。ＫＲＮ７０００に比較して顕著な活性の増加がある２つのセラミド様糖脂質の構造が示される。
【図５Ｂ−１】パネルＢは、パネルＡ及び表１に記載した実験で試験したセラミド様糖脂質の構造を示す。
【図５Ｂ−２】パネルＢは、パネルＡ及び表１に記載した実験で試験したセラミド様糖脂質の構造を示す。
【図５Ｂ−３】パネルＢは、パネルＡ及び表１に記載した実験で試験したセラミド様糖脂質の構造を示す。
【図５Ｂ−４】パネルＢは、パネルＡ及び表１に記載した実験で試験したセラミド様糖脂質の構造を示す。
【図５Ｂ−５】パネルＢは、パネルＡ及び表１に記載した実験で試験したセラミド様糖脂質の構造を示す。
【図５Ｂ−６】パネルＢは、パネルＡ及び表１に記載した実験で試験したセラミド様糖脂質の構造を示す。
【図５Ｂ−７】パネルＢは、パネルＡ及び表１に記載した実験で試験したセラミド様糖脂質の構造を示す。
【図５Ｂ−８】パネルＢは、パネルＡ及び表１に記載した実験で試験したセラミド様糖脂質の構造を示す。
【図５Ｂ−９】パネルＢは、パネルＡ及び表１に記載した実験で試験したセラミド様糖脂質の構造を示す。
【図５Ｂ−１０】パネルＢは、パネルＡ及び表１に記載した実験で試験したセラミド様糖脂質の構造を示す。
【図５Ｂ−１１】パネルＢは、パネルＡ及び表１に記載した実験で試験したセラミド様糖脂質の構造を示す。
【図５Ｂ−１２】パネルＢは、パネルＡ及び表１に記載した実験で試験したセラミド様糖脂質の構造を示す。
【図５Ｂ−１３】パネルＢは、パネルＡ及び表１に記載した実験で試験したセラミド様糖脂質の構造を示す。
【図５Ｂ−１４】パネルＢは、パネルＡ及び表１に記載した実験で試験したセラミド様糖脂質の構造を示す。
【図５Ｂ−１５】パネルＢは、パネルＡ及び表１に記載した実験で試験したセラミド様糖脂質の構造を示す。
【図５Ｂ−１６】パネルＢは、パネルＡ及び表１に記載した実験で試験したセラミド様糖脂質の構造を示す。
【図５Ｃ】パネルＣは、表１の結果の代表的なグラフを示す。
【図５Ｄ】パネルＤは、ＤＢ０１−１のガラクトースをグルコースで置換している点を除いてＤＢ０１−１と同一のα−グルコシルセラミドであるＤＢ０２−１によるＣＤ１ｄ依存性増殖の刺激を示す。
【図６】図６は、種々の提示細胞型によるセラミド様糖脂質の差表示の実験結果を示す。８個の選択したセラミド様糖脂質に応答してＮＫ ＴハイブリドーマＤＮ３２．Ｄ３によるＩＬ−２産生は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として３種の異なる細胞型を用いて示される（上段）。この実験で使用したセラミド様糖脂質のそれぞれにおけるアミノを結合した側鎖の構造が下段に示される。
【図７】図７は、セラミド様糖脂質の有効性に関して脂肪酸の鎖長の効果を示す。指示された鎖長を有するセラミド様糖脂質は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）としてＲＭＡ−Ｓ／ＣＤ１ｄを用いてＮＫ ＴハイブリドーマＤＮ３２．Ｄ３の刺激に関して試験された。
【図８】図８は、Ｃ２０ＦＡのセラミド様糖脂質の有効性に関して脂肪酸鎖の不飽和度の効果を示す。指示された鎖長及び指示された二重結合を有するセラミド様糖脂質は、図７にあるようなＮＫ ＴハイブリドーマＤＮ３２．Ｄ３の刺激に関して試験された。
【図９】図９は、セラミド様糖脂質ＤＢ０３−４及びＤＢ０３−５によるマウスにおけるインビボでのＩＬ−４産生の選択的刺激を示す。ＤＢ０１−１、ＤＢ０３−４又はＤＢ０３−５の１回の注射後のＩＬ−４及びＩＦＮγの血清レベルを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１１〜１３週齢）は、４．８ナノモルの化合物又はリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）／ベヒクル対照の１回のｉ．ｐ．注射を与えた。血清のサイトカインレベルは、２及び２０時間後に捕捉ＥＬＩＳＡによって測定した。バーは、３匹のマウスの平均プラス標準誤差を示す。ＤＢＯ１−１は、ＫＲＮ７０００に近い同一の構造（Ｃ２６に比べてＣ２４脂肪酸）を有し、複数のバイオアッセイにおいてＫＲＮ７０００とは区別できない活性を有することに気づかれたい。本出願人は、「ＫＲＮ７０００擬似体」としてＤＢ０１−１を使用する。これは、本出願人のグループによって合成されたものであり、本出願人の研究に容易に利用することができ、ＫＲＮ７０００がライセンス制限によて利用できなかったためである。
【図１０】図１０は、ＤＢ０３−４及びＤ０３−５がＮＯＤマウスにおける糖尿病を妨げることに関してＫＲＮ７０００より優れていることを確かめた実験結果を示す。６〜８匹の雌性ＮＯＤマウスの一群は、４〜５週齢から開始して、週に一度、プラセボ（ベヒクル）又はＤＢ０１−１（ＫＲＮ７０００として示される）、ＤＢ０３−４又はＤＢ０３−５の注射で処置した。処置は、５回の注射（ＤＢ０３−４）又は７回の注射（ＤＢ０３−５）後に中止した。上段のグラフは、糖尿の指標を示し、下段のグラフは、各集団における生存を示す。
【図１１】図１１は、本発明の種々のセラミド様糖脂質がＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）の発現を刺激することができることを示す実験結果のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明は、種々のセラミド様糖脂質、即ち、α−ガラクトシルセラミド又は他のα−グリコシルセラミド（「セラミド様糖脂質」）、具体的には、ＫＲＮ７０００における部分の変形体が、ＮＫ Ｔ細胞を調節することができるという発見に基づく。本発明はまた、セラミド様糖脂質が、それらを効果的に提示する細胞型で相違し、それらがＮＫ Ｔ細胞を活性化するために使用される場合に様々なサイトカインを誘導することができるという発見に基づく。
【００４３】
一態様において、セラミド様糖脂質は、ＮＫ Ｔ細胞によるサイトカイン産生を活性化する。別の態様において、セラミド様糖脂質は、ＮＫ Ｔ細胞によるサイトカイン産生を抑制する。さらに別の態様では、セラミド様糖脂質は、ＮＫ Ｔ細胞によって産生されるサイトカインの比率を変化する。
【００４４】
定義：
語句「化合物を提示する」は、本明細書中で使用されるとき、細胞が、ＮＫ Ｔ細胞の調節を引き起こす複合体を提供するために細胞表面に化合物を結合することを意味する。
【００４５】
語句「化合物を効果的に提示する」は、本明細書中で使用されるとき、化合物が約１μＭ未満の濃度で存在する場合、細胞が、ＮＫ Ｔ細胞の調節を引き起こす複合体を提供する細胞表面の化合物に結合するであろうことを意味する。
【００４６】
用語「調節する」、「調節」等は、本明細書中で使用されるとき、所定の機能が変化されたことを意味する。例えば、語句「複合体がＮＫ Ｔ細胞の活性又は活性化を調節する」とは、複合体が、ＮＫ Ｔ細胞の活性、例えばサイトカイン産生を、複合体がない場合になされたであろうものとは異なるように引き起こすことを意味する。活性における変更は、例えば、複合体がない場合に産生されたサイトカイン量と比較して複合体の存在下で産生されたサイトカイン量の増加（ＮＫ Ｔ細胞の活性化又は誘導）であり、又は、複合体がない場合に産生されたサイトカイン量と比較して複合体の存在下で産生されたサイトカイン量の減少（ＮＫ Ｔ細胞の抑制）、あるいは、ＮＫ Ｔ細胞によって産生される異なるサイトカインの比率の変化であり得る。
【００４７】
語句「Ｃ6−Ｃ27アルカン」は、本明細書中で使用されるとき、６〜２７個の炭素原子を有する直鎖又は分岐した非環状炭化水素を意味する。代表的な直鎖Ｃ6−Ｃ27アルカンは、−メチル、−エチル、−ｎ−プロピル、−ｎ−ブチル、−ｎ−ペンチル、−ｎ−ヘキシル、−ｎ−ヘプチル、−ｎ−オクチル、−ｎ−ノニル、及び−ｎ−デシルを含む。代表的な分岐したＣ6−Ｃ27アルカンは、−イソプロピル、−ｓｅｃ−ブチル、−イソブチル、−ｔｅｒｔ−ブチル、−イソペンチル、−ネオペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、３−エチルブチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−メチルヘキシル、２−メチルヘキシル、３−メチルヘキシル、４−メチルヘキシル、５−メチルヘキシル、１，２−ジメチルペンチル、１，３−ジメチルペンチル、１，２−ジメチルヘキシル、１，３−ジメチルヘキシル、３，３−ジメチルヘキシル、１，２−ジメチルヘプチル、１，３−ジメチルヘプチル、及び３，３−ジメチルヘプチルを含む。
【００４８】
語句「Ｃ6−Ｃ27アルケン」は、本明細書中で使用されるとき、６〜２７個の炭素原子を有し、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含む直鎖又は分岐した非環状炭化水素を意味する。代表的な直鎖及び分岐したＣ6−Ｃ27アルケンは、−ビニル、−アリル、−１−ブテニル、−２−ブテニル、−イソブチレニル、−１−ペンテニル、−２−ペンテニル、−３−メチル−１−ブテニル、−２−メチル−２−ブテニル、−２，３−ジメチル−２−ブテニル、−１−ヘキセニル、−２−ヘキセニル、−３−ヘキセニル、−１−ヘプテニル、−２−ヘプテニル、−３−ヘプテニル、−１−オクテニル、−２−オクテニル、−３−オクテニル、−１−ノネニル、−２−ノネニル、−３−ノネニル、−１−デセニル、−２−デセニル、−３−デセニル等を含む。
【００４９】
語句「Ｃ5−Ｃ15シクロアルカン」は、本明細書中で使用されるとき、５〜１５個の炭素原子を有する飽和環状炭化水素を意味する。代表的なＣ5−Ｃ15シクロアルカンは、−シクロペンチル、−シクロヘキシル、−シクロヘプチル、−シクロオクチル、−シクロノニル及び−シクロデシルである。語句「Ｃ5−Ｃ15シクロアルカン」はまた、ビシクロアルカン及びトリシクロアルカンを包含する。用語「ビシクロアルカン」は、本明細書中に使用されるとき、８〜１５個の炭素原子及び少なくとも１個の飽和環状アルキル環を有する二環式炭化水素環系を意味する。代表的なビシクロアルカンは、−インダニル、−１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、−５，６，７，８−テトラヒドロナフチル、−ペルヒドロナフチル等を含む。用語「トリシクロアルカン」は、本明細書中で使用されるとき、８〜１５個の炭素原子及び少なくとも１個の飽和環を有する三環式炭化水素環系を意味する。代表的なトリシクロアルカンは、−ピレニル、−１，２，３，４−テトラヒドロアントラセニル、−ペルヒドロアントラセニル、−アセアントレネイル、−１，２，３，４−テトラヒドロペナントレニル、−５，６，７，８−テトラヒドロフェナントレニル、−ペルヒドロフェナントレニル等を含む。
【００５０】
語句「Ｃ5−Ｃ15シクロアルケン」は、本明細書中で使用されるとき、環系において少なくとも１個の炭素−炭素二重結合及び５〜１５個の炭素原子を有する単環式非芳香族炭化水素を意味する。代表的なＣ5−Ｃ15シクロアルケンは、−シクロペンテニル、−シクロペンタジエニル、−シクロヘキセニル、−シクロヘキサジエニル、−シクロヘプテニル、−シクロヘプタジエニル、−シクロヘプタトリエニル、−シクロオクテニル、−シクロオクタジエニル、−シクロオクタトリエニル、−シクロオクタテトラエニル、−シクロノネニル、−シクロノナジエニル、−シクロデセニル、−シクロデカジエニル等を含む。語句「Ｃ5−Ｃ15シクロアルケン」はまた、ビシクロアルケン及びトリシクロアルケンを包含する。用語「ビシクロアルケン」は、本明細書中で使用されるとき、環の１つに少なくとも１個の炭素−炭素二重結合及び８〜１５個の炭素原子を有する二環式炭化水素環系を意味する。代表的なビシクロアルケンは、限定されないが、−インデニル、−ペンタレニル、−ナフタレニル、−アズレニル、−ヘプタレニル、−１，２，７，８−テトラヒドロナフタレニル等を含む。用語「トリシクロアルケン」は、本明細書中で使用されるとき、環の１つに少なくとも１個の炭素−炭素二重結合及び８〜１５個の炭素原子を有する三環式炭化水素環系を意味する。代表的なビシクロアルケンは、限定されないが、−アントラセニル、−フェナントレニル、−フェナレニル、−アセナフタレニル、ａｓ−インダセニル、ｓ−インダセニル等を含む。
【００５１】
用語「ヘテロ環」は、本明細書中で使用されるとき、最大４個のヘテロ原子を含有する飽和、不飽和の非芳香族又は芳香族のいずれかである３〜１０員の単環式又は二環式へテロ環状環を意味する。各々のヘテロ原子は、独立して、四級化し得る窒素；酸素；及び、硫黄（スルホキシド及びスルホンを含む）から選択される。ヘテロ環は、窒素、硫黄、又は炭素原子を介して結合され得る。代表的なヘテロ環は、ピリジル、フリル、チオフェニル、ピロリル、オキサゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、イソキサゾリル、ピラゾリル、イソチアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリンジニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、キノリニル、−イソキノリニル、−クロモニル、−クマリニル、−インドリル、−インドリジニル、−ベンゾ［ｂ］フラニル、−ベンゾ［ｂ］チオフェニル、−インダゾリル、−プリニル、−４Ｈ−キノリジニル、−イソキノリル、−キノリル、−フタルアジニル、−ナフチリジニル、−カルバゾリル、−β−カルボリニル等を含む。用語「ヘテロ環」はまた、ヘテロアリールを含む。用語「ヘテロアリール」は、本明細書中で使用されるとき、単環式及び二環式環系の両方を含む５〜１０員の芳香族ヘテロ環を意味し、環の１つ又は両方の少なくとも１個の炭素原子が、窒素、酸素及び硫黄から独立に選択されるヘテロ原子で置換される。ヘテロアリール環の１つ又は両方は、少なくとも１個の炭素原子を含有する。代表的なヘテロアリールは、ピリジル、フリル、ベンゾフラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、キノリニル、ピロリル、インドリル、オキサゾリル、ベンゾキサゾリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソキサゾリル、ピラゾリル、イソチアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、チアジアゾリル、トリアジニル、シノリニル、フタラジニル、キナゾリニルを含む。
【００５２】
語句「芳香族環」は、本明細書中で使用されるとき、単環式、二環式及び三環式環系の両方を含む５〜１４員の芳香族炭素環式環を意味する。代表的な芳香族環は、フェニル、ナフチル、アントリル及びフェナントリルである。
【００５３】
語句「オキソ」は、本明細書中で使用されるとき、酸素に対する二重結合を意味する。
語句「ハロ」及び「ハロゲン」は、本明細書中で使用されるとき、クロロ、ブロモ、ヨード、及びフルオロを意味する。
【００５４】
用語「ワクチンに対するアジュバント」は、本明細書で使用されるとき、特異抗原の免疫性を非特異的に増加する任意の物質を意味する。
語句「〜の治療」及び「治療すること」は、疾患、障害又はその兆候の改善又は停止を含む。
語句「〜の予防」及び「予防すること」は、疾患、障害又はその兆候の開始の回避を含む。
【００５５】
セラミド様糖脂質
一態様において、本発明は、式Ｉ：
【化１２】
0005870327.tif 000013
［式中、
Ｒ１は、少なくとも１個のＣ＝Ｃ結合を有する直線状又は分岐したＣ1−Ｃ27アルケンであるが、−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3でなく、又はＲ１は、Ｃ（ＯＨ）−Ｒ３（ここで、Ｒ３は、少なくとも１個のＣ＝Ｃ結合を有する直線状又は分岐したＣ1−Ｃ26アルケンである）であり；そして、
Ｒ２は、下記（ａ）−（ｅ）：
（ａ）−ＣＨ2（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｂ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｃ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ（ＣＨ3）2；
（ｄ）−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｅ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3
｛式中、Ｘは、５〜１７の範囲の整数である｝
の１つである］
を含むα−ガラクトシルセラミドであるセラミド様糖脂質に関する。
【００５６】
スフィンゴシン部分中の部分（ａ）−（ｅ）を有するセラミド様糖脂質は、ＮＫ Ｔ細胞を活性することができることで知られている。米国特許第５，９３６，０７６号を参照されたい。しかしながら、この特許は、脂肪酸部分における変形体がＮＫ Ｔ細胞を活性化できるであろうかどうかを評価しなかった。
【００５７】
一態様において、スフィンゴシン部分（Ｒ２）は、ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）13ＣＨ3であり、ＫＲＮ７０００と同じである。それは、この化合物が広く評価されているからである。
【００５８】
実施例で例証されるように、いくつかのセラミド様糖脂質は、ＮＫ Ｔ細胞を活性化する能力においてＫＲＮ７０００と同じであるか、又はそれよりも強力である。これらのセラミド様糖脂質は、種々の脂肪酸長及び不飽和脂肪酸結合の数を有することができる。セラミド様糖脂質の例は、限定されないが、ＤＢ０３−４（ここで、Ｒ１は（ＣＨ2）9ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）4ＣＨ3である）；ＤＢ０３−５（ここで、Ｒ１は（ＣＨ2）2ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ2）4ＣＨ3である）；ＤＢ０３−６（ここで、Ｒ１は（ＣＨ2）3ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ3である）；そして、ＤＢ０３−１０（ここで、Ｒ１は（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ＝（ＣＨ2）4−ＣＨ3である）を含む。
【００５９】
一態様において、セラミド様糖脂質の二重結合は、シス配置を有する。
一態様において、セラミド様糖脂質のＲ２部分は、ＫＲＮ７０００と同じく、即ち、ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）13ＣＨ3である。
【００６０】
一態様において、セラミド様糖脂質は、サイトカイン産生を誘導又は抑制することができる。一態様において、セラミド様糖脂質は、同濃度のＫＲＮ７０００によって誘導されるのと同じか又はそれよりも大きいレベルで、ＮＫ Ｔ細胞によるサイトカイン産生を誘導する。セラミド様糖脂質はまた、それらが導き出すＮＫ Ｔ免疫応答の点で異なる。例えば、ＮＫ Ｔ細胞によって産生される種々のサイトカインの比率は、実施例で例証されるように、異なるセラミド様糖脂質について相違し得る。
【００６１】
サイトカイン産生を誘導又は抑制する任意のセラミド様糖脂質の能力は、ＮＫ Ｔ細胞によって産生される任意のサイトカインを測定することによって決定することができる。ＮＫ Ｔ細胞によるサイトカイン産生を測定する方法は、当業者に周知である。当業者に既知の任意の方法は、ＮＫ Ｔ細胞によるサイトカイン産生を測定するために使用することができ、限定されないが、本明細書中に開示したものを含む。一態様において、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４又はＩＦＮγである。ＮＫ Ｔ細胞による産生が、セラミド様糖脂質を用いて調節することができる他のサイトカインは、限定されないが、ＴH２に関連したサイトカイン；サイトカインＩＬ−１３、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦα、及びリンホトキシンを含む。
【００６２】
ＮＫ Ｔ細胞誘導の別の測定は、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）の発現である。図１１を参照されたい。つまり、ＮＫ Ｔ細胞を誘導する任意のセラミド様糖脂質の効果の測定はまた、ＣＤ４０Ｌの発現を測定することによって決定することができる。ＣＤ４０Ｌの発現を測定する方法は、当業者に周知である。当業者に既知の任意の方法は、ＣＤ４０Ｌ発現を測定するために使用することができ、限定されないが、実施例に記載したものを含む。一態様において、ＣＤ４０Ｌレベルは、蛍光標識した抗ＣＤ４０Ｌ抗体で染色し、その後、当業者に周知な方法による細胞選別によって測定することができる。
【００６３】
一態様において、サイトカイン又はＮＫ Ｔ細胞のＣＤ４０Ｌのような細胞表面マーカーの調節は、ＣＤ１ｄを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）株、例えば、ＲＭＡ−Ｓ．ｍＣＤ１ｄのようなリンパ球株、ＪＡＷＳ ＩＩのような骨髄細胞系列の樹状ＡＰＣ株、又はＨｅＬａ．ｈＣＤ１ｄのような上皮ＡＰＣ株を用いて本発明のセラミド様糖脂質を使用して達成される（実施例を参照されたい）。
【００６４】
本発明はまた、式Ｉ：
【化１３】
0005870327.tif 000014
［式中、
Ｒ１は、分岐したＣ1−Ｃ27アルカンであり、又は
Ｒ１は、Ｃ（ＯＨ）−Ｒ３（ここで、Ｒ３は、直線状又は分岐したＣ1−Ｃ26アルケンである）であり；そして、
Ｒ２は、下記（ａ）−（ｅ）：
（ａ）−ＣＨ2（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｂ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｃ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ（ＣＨ3）2；
（ｄ）−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｅ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3
｛式中、Ｘは、５〜１７の範囲の整数である｝
の１つである］
を含むα−ガラクトシルセラミドであるセラミド様糖脂質に関する。
【００６５】
これらのα−ガラクトシルセラミドの一態様において、Ｒ２は、ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）13ＣＨ3、即ち、ＫＲＮ７０００と同じものである。
更なる態様では、本発明は、式Ｉ：
【化１４】
0005870327.tif 000015
［式中、
Ｒ１は、Ｃ6−Ｃ27アルカン又はアルケン（ここで、（ｉ）Ｃ6−Ｃ27アルカン又はアルケンは、Ｃ5−Ｃ15シクロアルカン、Ｃ5−Ｃ15シクロアルケン、ヘテロ環又は芳香族環で置換され、あるいは（ｉｉ）Ｃ6−Ｃ27アルカン又はアルケンは、Ｃ6−Ｃ27アルキル又はアルケニル鎖内に、Ｃ5−Ｃ15シクロアルカン、Ｃ5−Ｃ15シクロアルケン、ヘテロ環又は芳香族環を含む）であり；そして、
Ｒ２は、下記（ａ）−（ｅ）：
（ａ）−ＣＨ2（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｂ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｃ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ（ＣＨ3）2；
（ｄ）−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｅ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3
｛式中、Ｘは、５〜１７の範囲の整数である｝
の１つである］
を含むα−ガラクトシルセラミドであるセラミド様糖脂質に関する。
【００６６】
これらの化合物の一態様において、Ｒ２は、ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）13ＣＨ3、即ち、ＫＲＮ７０００と同じものである。
ある態様において、Ｒ１は、オキソ；ヒドロキシ；ハロゲン；−ＯＣ（Ｏ）Ｒ5；−ＯＲ5；−Ｃ（Ｏ）Ｒ5；又はＮ（Ｒ5）2で置換され、ここで、Ｒ5は、独立して、水素、Ｃ1−Ｃ6アルキル、又はハロゲン、ヒドロキシ、ハロゲン、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ6、−ＯＲ6、−Ｃ（Ｏ）Ｒ6、Ｎ（Ｒ6）2で場合により置換された芳香族環（ここで、各Ｒ6は、独立して、水素又はＣ1−Ｃ6アルキルである）である。
【００６７】
一態様において、Ｒ１は、Ｃ6−Ｃ27アルカン又はアルケンであり、ここで、Ｃ6−Ｃ27アルカン又はアルケンは、Ｃ5−Ｃ15シクロアルカン、Ｃ5−Ｃ15シクロアルケン、ヘテロ環又は芳香族環で置換される。
【００６８】
一態様において、Ｒ１は、Ｃ6−Ｃ27アルカン又はアルケンであり、ここで、Ｃ6−Ｃ27アルカン又はアルケンは、鎖内で、Ｃ5−Ｃ15シクロアルカン、Ｃ5−Ｃ15シクロアルケン、ヘテロ環又は芳香族環を含む。
【００６９】
他の態様において、Ｒ１は、下記の部分：
【化１５】
0005870327.tif 000016
｛式中、（ ）は、式Ｉの化合物に対するＲ１の結合点を表す｝
の１つである。これらの化合物の例は、ＤＢ０３−４、ＤＢ０３−５、及びＹＴＣ０３化合物４、６、１１、１５、１７、１８、２４、２５、２７、２９、３０、３１、３３、３４、３５、３６、３８、３９、４０、４１、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５６、５８、５９、６０及び６１である（実施例、図５及び表１を参照されたい）。特に効果的な化合物は、ＤＢ０３−４及びＹＴＣ０３化合物６、１７、２５、３１、３３、３５、４６、４７、５０、５６、５９及び６０である。これらのα−ガラクトシルセラミドの他の態様において、Ｒ２は、ＫＲＮ７０００のようなＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）13ＣＨ3である。
【００７０】
追加の態様において、本発明は、式Ｉ：
【化１６】
0005870327.tif 000017
［式中、
Ｒ１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3、−（ＣＨ2）6ＣＨ3、−（ＣＨ2）4Ｃｌ、−（ＣＨ2）16ＣＨ3、−（ＣＨ2）5ＣＨ3、−（ＣＨ2）2ＣＨ3、−（ＣＨ2）4ＣＨ3、−（ＣＨ2）8ＣＨ3、−Ｃ（ＣＨ2）10ＣＨ3、−Ｃ（ＣＨ2）12ＣＨ3から成る群から選択され；そして、
Ｒ２は、下記（ａ）−（ｅ）：
（ａ）−ＣＨ2（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｂ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｃ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ（ＣＨ3）2；
（ｄ）−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｅ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3
｛式中、Ｘは、５〜１７の範囲の整数である｝
の１つである］
を含むα−ガラクトシルセラミドであるセラミド様糖脂質に関する。
【００７１】
実施例に例証されるように、例えば、図５の化合物ＹＴＣ０３−４、６、１１、１５、２５、２７、３１、３４、３５、及び３６を参照されたい。
上述した他の実施例と同様に、Ｒ２は、ＫＲＮ７０００のようなＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）13ＣＨ3である。
【００７２】
本発明者らはまた、αＧａｌＣｅｒのガラクトース部分が、他のα結合の単糖で置換でき、得られたα−グリコシルセラミドはＮＫ Ｔ細胞を活性化することができることを発見した。図５Ｄ及び１１、並びに実施例を参照されたい。つまり、本発明はまた、式ＩＩ：
【化１７】
0005870327.tif 000018
［式中、
Ｒ１は、直線状若しくは分岐したＣ1−Ｃ27アルカン又はアルケンであり、又は、
Ｒ１は、Ｃ（ＯＨ）−Ｒ３（ここで、Ｒ３は、少なくとも１個のＣ＝Ｃ結合を有する直線状若しくは分岐したＣ1−Ｃ26アルケンである）であり；
あるいは、Ｒ１は、Ｃ6−Ｃ27アルカン又はアルケン（ここで、（ｉ）Ｃ6−Ｃ27アルカン又はアルケンは、Ｃ5−Ｃ15シクロアルカン、Ｃ5−Ｃ15シクロアルケン、ヘテロ環又は芳香族環で置換され、あるいは（ｉｉ）Ｃ6−Ｃ27アルカン又はアルケンは、Ｃ6−Ｃ27アルキル又はアルケニル鎖内に、Ｃ5−Ｃ15シクロアルカン、Ｃ5−Ｃ15シクロアルケン、ヘテロ環又は芳香族環を含む）であり；
Ｒ２は、下記（ａ）−（ｅ）：
（ａ）−ＣＨ2（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｂ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｃ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ（ＣＨ3）2；
（ｄ）−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）xＣＨ3；
（ｅ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）xＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3
｛式中、Ｘは、５〜１７の範囲の整数である｝
の１つであり；そして、
Ｒ４は、α−ガラクトシル及びβ結合の単糖以外のα結合の単糖である］
を含むグリコシルセラミドであるセラミド様糖脂質に関する。
【００７３】
一態様において、Ｒ４は、α−ガラクトシル以外のα結合の単糖である。
一態様において、α結合の単糖はα−グルコシルである。
別の態様において、α結合の単糖はα−フコシルである。
一態様において、Ｒ４は、β結合の単糖である。
一態様において、β結合の単糖はβ−マンノシルである。
【００７４】
これらの態様のメンバーの例は、ＤＢ０３−８（図５Ｂ）（ここで、Ｒ４はフコースであり、Ｒ１は（ＣＨ2）22−ＣＨ3である）（実施例及び図１１を参照）、及びＤＢ０２−１（ここで、Ｒ４はグルコースである）（実施例及び図５Ｄを参照）である。一態様において、Ｒ２は、ＣＨ（ＯＨ）−（ＣＨ2）13−ＣＨ3である。一態様において、Ｒ１は、（ＣＨ2）22−ＣＨ3であり、Ｒ２は、ＣＨ（ＯＨ）−（ＣＨ2）13−ＣＨ3である。しかしながら、上記で開示したα−ガラクトシルセラミドにおいて有効である任意のＲ１部分は、α−グリコシルセラミドに有用であることが期待されるであろう。これらの態様における単糖（Ｒ４位置で）の例は、グルコース、フコース、ガラクトース、及びマンノースである。
【００７５】
Ｒ４がβ結合の単糖である代表的な例は、ＤＢ０４−８及びＤＢ０４−９である。
【化１８】
0005870327.tif 000019
【００７６】
本発明の代表的ないくつかのセラミド様糖脂質は、下記の表：
【００７７】
【表１】
0005870327.tif 000020
【００７８】
【表２】
0005870327.tif 000021
【００７９】
【表３】
0005870327.tif 000022
【００８０】
に提供される。
インビボ活性は、マウスにおける活性を意味する（実施例参照）。
インビトロ活性は、マウスの細胞アッセイ系における活性を意味する（実施例参照）。
【００８１】
各々のＤＢ０３−３、ＤＢ０３−４、ＤＢ０３−５、ＤＢ０３−７、ＤＢ０３−８、ＤＢ０３−９、ＤＢ０３−１０、及びＹＴＣ０３−１７は、マウスの細胞アッセイ系（実施例参照）を用いるサイトカインの調節でのインビトロアッセイを示し、いくつかの化合物については、活性はまた、インビトロのＮＫ Ｔ細胞系において示されている。例えば、ＤＢ０３−４及びＤＢ０３−５は、インビトロにおいてヒトのＮＫ Ｔ細胞クローンの刺激において活性であり、文献で以前に確立した培養系を用いて評価した場合、増殖応答及びサイトカイン分泌を発揮する（例えば、Ｓｐａｄａ ＦＭ，Ｓｕｇｉｔａ Ｍ，Ｗａｔｔｓ ＧＦＭ，Ｋｏｅｚｕｋａ Ｙ，及びＰｏｒｃｅｌｌｉ ＳＡ．Ｌｏｗ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｕｔ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ１ｄ ｏｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｌｉｎｅａｇｅ ｃｅｌｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３０：３４６８−３４７７（２０００），及びＳｐａｄａ ＦＭ，Ｋｏｅｚｕｋａ Ｙ，Ｐｏｒｅｌｌｉ ＳＡ，ＣＤ１ｄ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｂｙ ｈｕｍａｎ ＮＫ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ；１８８：１５２９−１５３４（１９９８）を参照されたい。また、Ｌｅｅ ＰＴら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．，２００２ Ｓｅｐ；１１０（６）：７９３−８００も参照されたい）。さらに、これらの化合物は、正常な血液標本におけるヒトＮＴ Ｔ細胞に強く結合する糖脂質ヒトＣＤ１ｄ四量体を作製するために使用することができ、これらの糖脂質が、ヒトＣＤ１ｄによって提示された場合、ヒトＮＫ Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体によって激しく認識される（ＮＫ Ｔ細胞を研究するためのＣＤ１ｄ四量体の生産と応用のための方法は、Ｙｕ ＫＯＡ，Ｉｍ ＪＳ，Ｍｏｌａｎｏ Ａ，Ｄｕｔｒｏｎｃ Ｙ，Ｉｌｌａｒｉｏｎｏｖ ＰＡ，Ｆｏｒｅｓｔｅｒ Ｃ，Ｆｕｊｉｗａｒａ Ｎ，Ａｒｉａｓ Ｉ，Ｍｉｙａｋｅ Ｓ，Ｙａｍａｍｕｒａ Ｔ，Ｃｈａｎｇ Ｙ−Ｔ，Ｂｅｓｒａ ＧＳ，Ｐｏｒｃｅｌｌｉ ＳＡ，Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ１ｄ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ＮＫＴ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｕｓｉｎｇ Ｎ−ａｃｙｌ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ α−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），１０２：３３８３−８（２００５）に記載される）。
【００８２】
これらの化合物のいくつかはまた、マウスにおいてサイトカインを調節する活性を示した（実施例を参照されたい）。ＤＢ０３−４及びＤＢ０３−５の両方は、２型サイトカイン、即ち、抗炎症性効果を有し、鈍いＩＦＮγ及びＮＫ細胞のトランス活性化を用いたｉＮＫＴ細胞におけるＩＬ−４の強力な誘導因子であるサイトカインを誘導するバイアスを示した。ＤＢ０３−３は、ＩＬ−４の良好な誘導因子であり、あるマウスの株では、インビトロにおいてＩＦＮγの強力な誘導因子であった。高レベルのＩＦＮγ産生は、しばしば、ＮＫ細胞活性化と関連する。ＤＢ０３−９及びＤＢ０３−１０は、ＩＬ−４の強力な誘導因子であり、ＩＬ−２の弱い誘導因子であり、インビトロにおいてＩＦＮγの中程度の誘導因子である。ＹＴＣ０３−１７は、インビトロの研究において強力なアゴニスト活性を示す。ＤＢ０３−８は、インビトロにおいてｉＮＫＴ細胞の弱いアゴニストであり、ＮＺＢ／Ｗ−Ｆ１マウスにおけるＳＬＥを悪化させる。ＤＢ０３−８は、可能なアンタゴニスト／部分的なアゴニストであるかもしれないと信じられており、即ち、ｉＮＫＴのアンタゴニストとして作用し、又は不成功な部分的活性を刺激するために、ｉＮＫ Ｔの直接的又は間接的な活性を阻害する。
【００８３】
用語「ｉＮＫＴ細胞」は、本明細書中で使用されるとき、マウスにおいてＶα１４−Ｊα１８、及びヒトにおいてＶα２４−Ｊα１８から成る不変のＴＣＲα鎖の再配列を発現するＣＤ１ｄ依存性Ｔ細胞の特異的な小集団を意味する。これらの細胞は、ＣＤ１ｄによって提示されるα−ガラクトシルセラミドに一様に反応的である。これらの細胞はまた、「１型」ＮＫ Ｔ細胞として言及され、種々の型のＮＫ Ｔ細胞間の区別やこれに関連した命名は、Ｇｏｄｆｒｅｙらによる刊行物、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４ Ｍａｒ；４（３）：２３１−７に概説される。強力又は弱いアゴニスト活性の測定のためのＣＤ１ｄを提示する糖脂質に応答してｉＮＫＴ細胞によるサイトカイン産出の測定方法は、Ｙｕ ＫＯＡ，Ｉｍ ＪＳ，Ｍｏｌａｎｏ Ａ，Ｄｕｔｒｏｎｃ Ｙ，Ｉｌｌａｒｉｏｎｏｖ ＰＡ，Ｆｏｒｅｓｔｉｅｒ Ｃ，Ｆｕｊｉｗａｒａ Ｎ，Ａｒｉａｓ Ｉ，Ｍｉｙａｋｅ Ｓ，Ｙａｍａｍｕｒａ Ｔ，Ｃｈａｎｇ Ｙ−Ｔ，Ｂｅｓｒａ ＧＳ，Ｐｏｒｃｅｌｌｉ ＳＡ，Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ１ｄ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ＮＫＴ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｕｓｉｎｇ Ｎ−ａｃｙｌ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ α−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），１０２：３３８３−８（２００５）に記載され、また、Ｇｏｄｆｒｅｙ ＤＩら，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４ Ｍａｒ；４（３）：２３１−７を参照されたい。
【００８４】
ＹＴＣ０３−２４及びＹＴＣ０３−２５は、ＮＺＢ／Ｗ Ｆ１マウス由来の脾臓細胞を用いてインビトロでＩＦＮγと比べてＩＬ−４誘導の増加を示す。ＤＢ０３−６は、ＩＦＮγと比べてＩＬ−４の見せかけの増加、及び最小のＩＬ−２誘導を伴う脾臓細胞の培養物中のアゴニストである。
【００８５】
下記の合成スキームは、セラミド様糖脂質を作製するために使用される合成の方法論を描写する：
【化１９】
0005870327.tif 000023
【００８６】
この合成法を用いて、アジドスフィンゴシン前駆体（化合物８）をＤ−リキソース（化合物１）とアセトン／Ｈ2ＳＯ4を約１８時間室温で反応させることによってＤ−リキソースから調製し、化合物２を得る（工程ａ）。その後、化合物２は、室温で約１６時間、ＣＨ2Ｃｌ2中でｔｅｒｔ−ブチル ジ−プロピルシリル塩化物（ＴＢＤＰＳＣｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）及びＥｔ3Ｎと反応させ、化合物３を得る（工程ｂ）。次いで、化合物３は、約０℃でテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中でトリフェニルホスフィン（Ｐｈ3Ｐ）、１−ブロモデカン、及びＢｕＬｉと反応させ、反応混合物を室温まで加温し、約１８時間室温のままにし、化合物４を得る（工程ｃ）。その後、化合物４は、約３１℃で約２４時間、ＣＨ2Ｃｌ2中で塩化メシル（ＭｓＣｌ）及びピリジンと反応させ、化合物５を得る（工程ｄ）。次いで、化合物５は、約２時間室温でＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ中のＨＣｌと反応させ、化合物５を得る（工程ｅ）。化合物５は、約２０時間室温でＰｄ／ＢａＳＯ4触媒を用いてＨ2と反応させ、化合物６を得る。化合物６は、約９５℃で約４時間、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中でＮａＮ3と反応させ、化合物７を得る。その後、化合物７をテトラ−ブチルアンモニウムフロリド（ＴＢＡＦ）（８０％）と反応させ、アジドスフィンゴシン前駆体（化合物８）を得る。
【００８７】
次に、アジドスフィンゴシン前駆体（化合物８）の３，４−ジヒドロキシ基をイソプロピリデンアセタールとして保護し、２位でクロロ−ジメチルシリルエーテルを有するアセチルを保護したチオフェニルガラクトース（化合物９）にカップルさせ、グリコシル中間体（化合物１０）を得る。α−ガラクトシルアジドスフィンゴシン中間体（化合物１１）は、分子内アグリコン輸送戦略を用いて得られ、それにより、チオグリコシドは、Ｄ．Ｃｒｉｃｈ及びＭ．Ｓｍｉｔｈ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３：９０１５（２００１））によって記載されるように、ベンゼンスルフィニルピペリジン（ＢＳＰ）／トリフルオロメタンスルホン酸無水物（Ｔｆ2Ｏ）によって活性化される。次に、化合物１１のアジド基は、酸塩化物として活性化させた適切な脂肪酸を用いてアミンに還元され、Ｎ−アクリル化され、化合物１２を得る。次に、残存するヒドロキシル保護基は、酸性及び塩基性条件を用いて化合物１２から除去し、セラミド様糖脂質（化合物１３）を得る。また、Ｋ Ｙｕら，ＰＮＡＳ，Ｍａｒｃｈ １，２００５，１０２：（９），３３８３−３３８８を参照されたい。
【００８８】
当業者に既知の他の方法は、セラミド様糖脂質を調製するために使用することができる。例えば、セラミド様糖脂質はまた、米国特許第５，９３６，０７６号に記載される方法論を用いて得られる。
【００８９】
医薬組成物、投与法、及び使用法：
セラミド様糖脂質は、ワクチン、又は自己免疫疾患、種々の癌又は感染症のような障害に有用であると期待されるので、セラミド様糖脂質を含む医薬組成物はまた意図される。
【００９０】
したがって、本発明は、さらに、セラミド様糖脂質及び医薬として許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。
医薬組成物は、当業者に周知な方法を用いて作製することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０thｅｄ．（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ」）、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００（その内容は、参照により明確に本明細書中に援用される），ｐ．８５８−８５６）。
【００９１】
したがって、セラミド様糖脂質の組成物は、過度の実験をすることなく、当該技術分野において周知な手段を用いて、例えば、セラミド様糖脂質を不活性な希釈剤又は食用の担体と組み合わせることによって、経口、舌、舌下、口又は口内投与用に設計することができる。医薬組成物は、ゼラチンカプセルに封入し、又は錠剤に圧搾することができる。経口の治療用投与の目的では、本発明の医薬組成物は、錠剤、トローチ、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ、ウエハース、チューイングガム等の形態であってよい。
【００９２】
錠剤、ピル、カプセル剤、トローチ等はまた、結合剤、受領剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、及び風味剤を含有してもよい。本発明の医薬組成物に使用することができる適した賦形剤は、当業者に周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎを参照されたい）。結合剤の例は、限定されないが、微結晶性セルロース、トラガカント又はゼラチンを含む。希釈剤の例は、限定されないが、スターチ又はラクトースを含む。崩壊剤の例は、限定されないが、アルギン酸、コーンスターチ等を含む。潤滑剤の例は、限定されないが、硫酸マグネシウム又はステアリン酸カリウムを含む。流動促進剤の例は、コロイド状二酸化ケイ素である。甘味剤の例は、限定されないが、スクロース、サッカリン等を含む。風味剤の例は、限定されないが、ペパーミント、メチル・サリチル酸、オレンジ香味料等を含む。これらの種々の組成物を調製するために使用される材料は、使用される量で医薬として純粋であり、非毒性であるべきである。
【００９３】
本発明の医薬組成物は、非経口的に、例えば、静脈、筋内、髄腔内又は皮下注射によって容易に投与することができる。非経口投与は、本発明の組成物を溶液又は懸濁液に取り込むことによって達成することができる。このような溶液又は懸濁液はまた、注射用の水、塩類溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒のような無菌希釈剤を含む。非経口製剤はまた、ベンジルアルコール又はメチルパラベンのような抗菌剤、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤、及びＥＤＴＡのようなキレート剤を含んでもよい。酢酸、クエン酸又はリン酸のような緩衝剤及び塩化ナトリウム又はデキストロースのような等張の調節のための試薬を添加してもよい。非経口調製剤は、ガラス又はプラスチックでできたアンプル、使い捨てのシリンジ又は複数回投与のバイアルに封入することができる。
【００９４】
本発明の医薬組成物は、直腸内に容易に投与することができる。直腸投与は、医薬組成物を直腸又は大腸に投与することを含む。これは、坐薬又は浣腸を用いて達成することができる。坐薬製剤は、当該技術分野において既知の方法によって容易に作製することができる。例えば、坐薬製剤は、約１２０℃までグリセリンを加熱し、グリセリンにセラミド様糖脂質を溶解させ、加熱したグリセリンを混合し、その後、精製した水を添加してもよく、そして、坐薬の鋳型に熱い混合物を注ぐことによって調製することができる。
【００９５】
本発明の医薬組成物は、容易に経皮的に投与することができる。経皮投与は、皮膚を通じて組成物の経皮的な吸収を含む。経皮製剤は、パッチ（例えば、周知なニコチンパッチ）、軟膏、クリーム、ゲル、軟膏（ｓａｌｖｅ）等を含む。
【００９６】
本発明は、治療的に有効量のセラミド様糖脂質を鼻に投与することを含む。本明細書中で使用されるとき、鼻に投与すること又は経鼻投与は、医薬組成物を患者の鼻孔又は鼻腔の粘膜に投与することを含む。組成物の経鼻投与のための医薬組成物は、治療的に有効量のセラミド様糖脂質及び賦形剤を含み、周知な方法によって調製され、例えば、鼻スプレイ、点鼻薬、懸濁液、ゲル、軟膏、クリーム又は粉末として経鼻的に投与されるように適用される。医薬組成物の投与はまた、鼻用タンポン又は鼻スポンジを用いて行ってもよい。
【００９７】
セラミド様糖脂質はまた、樹状細胞のようなＣＤ１ｄを有する抗原提示細胞と有用に組み合わせることができる。この混合物は、ＮＫ Ｔ細胞を活性化することが期待されるであろう。したがって、本発明は、セラミド様糖脂質及び樹状細胞のようなＣＤ１ｄを有する抗原提示細胞を含む医薬組成物を含む。
【００９８】
記憶Ｔ及びＢ細胞の誘導におけるＮＫ Ｔ細胞の活性化の役割に基づいて、当業者は、セラミド様糖脂質が有用なワクチンアジュバントになると理解されるであろう。つまり、更なる態様において、本発明は、セラミド様糖脂質を含む医薬組成物に関し、ここで、医薬組成物はワクチン用のアジュバントとして使用に適している。
【００９９】
本発明はまた、ワクチンを投与する方法に関する。この方法は、上述した任意のセラミド様糖脂質と併用してワクチンを投与することを含む。
ＮＫ Ｔ細胞の誘導におけるＮＫ Ｔ細胞活性化の役割に基づいて、当業者は、セラミド様糖脂質が受動的に投与された抗体の効果を増加させるのに有用なアジュバントとなることを理解するであろう。つまり、更なる態様において、本発明は、セラミド様糖脂質を含む医薬組成物に関し、ここで、医薬組成物は受動的に投与される抗体用のアジュバントとしての使用に適している。
【０１００】
本発明はまた、治療用抗体を投与する方法に関する。この方法は、上述した任意のセラミド様糖脂質を併用して抗体を投与することを含む。
一態様において、使用方法は、セラミド様糖脂質を哺乳動物に投与することを含む。
【０１０１】
加えて、本発明は、ＮＫ Ｔ細胞の活性を調節する方法に関する。この方法は、ＮＫ Ｔ細胞をセラミド様糖脂質と接触させることを含む。一態様において、ＮＫ Ｔ細胞は、セラミド様糖脂質との接触後に、サイトカイン産生の増加を提示する。一態様において、ＮＫ Ｔ細胞は、セラミド様糖脂質との接触後に、サイトカイン産生の減少を提示する。これらの態様におけるサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４又はＩＦＮγであることができる。ＮＫ Ｔ細胞の調節は、特徴的なサイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−４又はＩＦＮγの産生、あるいはＣＤ４０Ｌ発現の増加によって測定することが可能である。
【０１０２】
一態様において、ＮＫ Ｔ細胞は、生きている哺乳動物内に存在する。一態様において、動物は、活性化したＮＫ Ｔ細胞によって影響を受けた自己免疫疾患、癌又は感染症を患っているか又はその危険にある哺乳動物である。他の態様において、哺乳動物は、Ｉ型糖尿病のような自己免疫疾患を患っているか又はその危険にある。これらの態様において、セラミド様糖脂質は、直接的に該哺乳動物に投与することができ、あるいは、初めに生体外で樹状細胞に添加され、その後、セラミド様糖脂質を取り込んだ樹状細胞を哺乳動物に注入することができる。一態様において、これらの生体外の態様における樹状細胞は、同じ哺乳動物由来である。一態様において、哺乳動物はヒトである。α−ガラクトシルセラミドと樹状細胞とを生体外で組み合わせる方法は、当業者に周知である。α−ガラクトシルセラミドと樹状細胞を生体外で組み合わせるための当業者に既知の任意の方法は、セラミド様糖脂質と樹状細胞とを生体外で組み合わせるために本発明の方法に使用することができる。代表的な方法論は、限定されないが、Ｄ．Ｈ．Ｃｈａｎｇら，Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ＮＫＴ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ−ｃｅｒａｍｉｄｅ ｌｏａｄｅｄ ｍａｔｕｒｅ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．，Ｍａｙ ２，２００５，２０１（９）：１５０３−１７；Ｓ．Ｆｕｊｉｉら，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｖａｌｐｈａ２４＋ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ ｃｅｒａｍｉｄｅ−ｐｕｌｓｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｊａｎ １５，２００３；２７２（１−２）：１４７−５９；及び、Ｓ．Ｆｕｊｉｉら，Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ＩＦＮ−ｇａｍｍａ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ＮＫＴ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ−ｌｏａｄｅｄ ＤＣｓ，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｓｅｐ．３，２００２，（９）：８６７−７４に記載されるものを含む。
【０１０３】
本発明は、付加的に、哺乳動物における免疫系を刺激する方法に関する。この方法は、有効量のセラミド様糖脂質を哺乳動物に投与することを含む。一態様において、哺乳動物に対する有効量のセラミド様糖脂質は、医薬組成物として投与される。一態様において、哺乳動物は癌を患っている。他の態様において、哺乳動物はＩ型糖尿病を患っている。さらに他の態様において、哺乳動物は、関節リウマチのような炎症性疾患を患っている。
【０１０４】
関連した態様において、この方法は、樹状細胞をセラミド様糖脂質と接触させ、その後、この樹状細胞を哺乳動物に注入することを含む。一態様において、樹状細胞は、セラミド様糖脂質の医薬組成物と接触される。
【０１０５】
実施例に記載される実験に例証されるように、ＮＫ Ｔ細胞を活性化することができるセラミド様糖脂質は、使用される抗原提示細胞に依存して、ＮＫ Ｔ細胞誘導のプロフィールの点で異なる。例えば、あるセラミド様糖脂質は、ある抗原提示細胞の存在下で、あるサイトカインを誘導することができるが、他のものはそうではない。つまり、ＮＫ Ｔ細胞を誘導するためのα−ガラクトシルセラミド又は他のα−グリコシルセラミドのような化合物の能力は、１より多くの型の抗原提示細胞を用いることによって最良に測定される。つまり、本発明は、ＣＤ１ｄタンパク質を発現する細胞の存在下で、ＮＫ Ｔ細胞を活性化する化合物の能力についてその化合物を評価する方法に関する。この方法は、化合物をＣＤ１ｄタンパク質を発現する１より多くの細胞型の存在下で、ＮＫ Ｔ細胞と組み合わせ、その後、ＮＫ Ｔ細胞が活性化されるかどうかを評価することを含む。この細胞型は、例えば、限定されずに、リンパ球様細胞又は上皮細胞であり得る。実施例を参照されたい。ＮＫ Ｔ細胞の活性化は、当業者に周知な方法を用いてサイトカイン産生の増加を測定することによって決定することができ、限定されないが、本明細書中に記載したものを含む（例えば、実施例並びに図５Ａ及び６に報告したデータを参照されたい）。
【０１０６】
試験化合物は、ＣＤ１ｄに結合し、ＮＫ Ｔ細胞を活性又は抑制することを要求されるであろう任意の化合物であり得る。実施例は、リポタイコ酸、α−ガラクトシルセラミド、及び他のα−グリコシルセラミド、例えば、上述したセラミド様糖脂質を含む。
【０１０７】
本発明は、さらに、活性化したＮＫ Ｔ細胞によって影響を受ける自己免疫疾患、癌、又は感染症を患っている又はそれを発症する危険性を有する哺乳動物を治療する方法に関する。本発明は、さらに、ＮＫ Ｔ細胞の活性を調節することによって影響を受ける哺乳動物における障害の治療又は予防のための方法に関する。代表的な障害は、限定されないが、自己免疫疾患、癌、慢性アレルギー性疾患又は感染症を含む。一態様において、哺乳動物における障害は、ＮＫ Ｔ細胞を活性化することによって治療され又は予防される。一例は、β膵島細胞の破壊を阻害するためのＮＫ Ｔ細胞の活性化によるＩ型糖尿病の治療である。別の態様では、哺乳動物の障害は、ＮＫ Ｔ細胞の活性を抑制することによって治療又は予防される。一例は、Ｏ．Ａｋｂａｒｉら，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ＮＫＴ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ＩＬ−４ ａｎｄ ＩＬ−１３ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｌｌｅｒｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｉｒｗａｙ ｈｙｐｅｒｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ，Ｍａｙ ２００３ ９（５）：５８２−５８８に記載されるようなＮＫ Ｔ細胞を抑制することによるアレルギー性気道過反応、アレルギー喘息のモデルの治療である。
【０１０８】
さらに別の態様において、哺乳動物における障害は、２型又は１型サイトカイン産生を支持して応答を偏らせるために、ＮＫ Ｔ細胞によって産生されるサイトカインを変化することによって治療され又は予防される。この方法は、哺乳動物にセラミド様糖脂質を投与することを含む。一態様において、セラミド様糖脂質は、医薬組成物として投与される。一態様において、哺乳動物は、自己免疫疾患、例えば、Ｉ型糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、全身性紅班性狼瘡、ギラン・バレー症候群、抗リン脂質症候群、グッドパスチャー症候群、移植片対宿主疾患、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、強皮症、脈管炎、白斑、ヴェグナー肉芽腫症、関節リウマチ、糸球体腎炎、特発性血小板減少性紫班病、乾癬、及びシェーグレン病を患っているか又はその危険にある。一態様において、自己免疫疾患は、Ｉ型糖尿病である。一態様において、障害は、喘息又はアトピー性皮膚炎のような慢性アレルギー性皮膚炎である。上述した他の態様と同様に、医薬組成物は、上述した方法によって哺乳動物に直接的に投与してもよく、あるいは、初めに樹状細胞に生体外で添加し、その後、この樹状細胞を哺乳動物に注入してもよい。
【０１０９】
障害の治療又は予防に有効であるセラミド様糖脂質の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。加えて、インビトロ又はインビボアッセイは、場合によって、最適な投与量の範囲を同定する手助けに採用することができる。採用される正確な投与量はまた、投与経路、治療される障害の重症度に依存するであろうし、例えば、出版された臨床研究を考慮して医師の判断及び各々の患者の状況により決定されるべきである。しかしながら、適した効果的な投与量は、典型的には、毎週約１，０００ミクログラム／キログラム体重又はそれ未満であるとはいえ、典型的には、毎週約１マイクログラム〜約１０，０００マイクログラム／キログラム体重の範囲である。一態様において、効果的な投与量は、毎週約１０〜約５，０００マイクログラム／キログラム体重の範囲である。別の態様において、効果的な投与量は、毎週約５０〜約１，０００マイクログラム／キログラム体重の範囲である。別の態様において、効果的な投与量は、毎週約７５〜約５００マイクログラム／キログラム体重の範囲である。本明細書中に記載される効果的な有効量は、投与される全量を意味し、即ち、１より多くのセラミド様糖脂質が投与される場合、効果的な投与量は、投与される全量に対応する。セラミド様糖脂質は、毎週１回又は分割した服用として投与することができる。
【０１１０】
セラミド様糖脂質は、ヒトに使用される前に、所望の治療的又は予防的活性についてインビトロ又はインビボでアッセイすることができる。動物のモデル系は、安全性及び有効性を実証するために使用することができる。
【０１１１】
本発明の態様は、下記の実施例に記載される。本明細書中の請求の範囲内の他の態様は、明細書又は本明細書中に開示される発明の実施を考慮して、当業者に明確となるであろう。明細書、並びに実施例は、実施例に追随する請求の範囲によって意図される発明の範囲及び精神を伴って、例示のみと考えられることが意図される。
【実施例】
【０１１２】
実施例
免疫及び自己免疫の調節因子としてのα−ガラクトシルセラミド及び他のα−グリコシルセラミドのアミノ置換した誘導体
【０１１３】
免疫調節活性を有するα−ガラクトシルセラミドの新規なアミノ置換形態の生産及び同定  ＯＣＨ及び自己免疫組織の障害を妨げるその増加した性質の発見は、本出願人のグループに、ＫＲＮ７０００の構造に基づく大多数の類似体の評価を実行する強い刺激を与えた。本出願人が選択した戦略は、ＫＲＮ７０００のアミノ結合の脂肪酸鎖の修飾又は置換に基づく類似体の開発であった。この選択は、２つの思慮によって導かれた。まず第一に、ある研究がＯＣＨの発見に伴って、他の研究者によってスフィンゴシン塩基の修飾をすでに開始していたため、この領域は全く新規でなかった。米国特許第５，９３６，０７６号も参照されたい。対照的に、ほんの僅かな従前の研究は、脂肪酸鎖の修飾に見られた。脂肪酸鎖の長さの変形体は、Ｋａｗａｎｏら（１９９７）によって研究されたが、この分析は、非常に制限され、いかなる興味ある特性を示さなかった。また、これらの化合物を製造する効果的な方法が開発された。
【０１１４】
これらの方法を用いて、本出願人は、６０個を超える新規なアミノ置換のＫＲＮ７０００の類似体を製造した。これらは、ＣＤ１ｄを発現する種々の細胞型の存在下で、又は組織培養プレート表面に結合した組換えＣＤ１ｄタンパク質の存在下で、ＮＫ Ｔ細胞ハイブリドーマを活性化する化合物の能力を評価する機能的なアッセイでスクリーニングした（図５）。
【０１１５】
図５Ａに報告されるＣＤ１ｄを発現する種々の型の細胞の存在下で、ＮＫ Ｔ細胞のハイブリドーマを活性化する化合物の能力は、マウスのＮＫ Ｔ細胞のハイブリドーマの刺激アッセイを用いて測定した。ＣＤ１ｄをトランスフェクトしたＲＭＡ−Ｓ細胞を１００マイクロリットルのセラミド様糖脂質の種々の濃度を含有する完全培地中で６時間３７℃で平底の組織培養プレートに５０，０００細胞／ウェルで播種した。次に、プレートを遠心し（４３０ｇ、３分）、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。その後、５，０００個のＮＫＴハイブリドーマ細胞（クローンＤＮ３Ａ４．１−２）を１００マイクロリットルの培地に１２時間刺激するために添加した。細胞不含の上清をインキュベーションの終わりに回収し、標準的な捕捉ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２についてアッセイした。セラミド様糖脂質の相対的な潜在能力は、最大半分の応答での有効濃度の逆数（１／ＥＣ50）から計算され、ＫＲＮ７０００について観察された潜在能力に対して標準化によりユニットとして表した。セラミド様糖脂質の構造は、図５Ｂに示した。
【０１１６】
これらのスクリーニングアッセイの結果は、本出願人のコレクションの５〜１０％の間の類似体が、ＫＲＮ７０００に等しいか又はそれよりも大きい潜在能力を有することを示した（潜在能力はＮＫ Ｔ細胞の最大半分の応答を与えるために要求されるモル濃度によって決定される）。図５Ａに示されるそれぞれのアッセイにおいて、７個の化合物は、ＫＲＮ７０００よりも実質的に大きな潜在能力を示した。加えて、潜在能力の増加を伴うこれら７個の化合物は、ＫＲＮ７０００と比較した場合、最大活性の増加を示した（試験した化合物の希釈の範囲でアッセイにおいて達成された最高レベルの応答として定義される；データ示さず）。
【０１１７】
表１は、化合物ＹＴＣ０３−４２からＹＴＣ０３−６１の化合物についての増殖アッセイ、ＩＬ−４アッセイ、及びＩＦＮγアッセイの結果を示し、増殖を誘導し、２つのサイトカインを誘導する能力、並びにＩＬ−４からＩＦＮγの比率の変化を示す。図５Ｃは、サイトカイン応答についての表１に報告した結果の代表的なグラフを示す。表１及び図５Ｃは、正常マウスの脾臓細胞によるサイトカイン産生がセラミド様糖脂質で刺激されることを示す。表１及び図５Ｃに報告されたサイトカイン応答は、次の手順によって測定した：Ｃ５８ＢＬ／６由来のバルクな脾臓細胞は、２００マイクロリットルの完全培地で５００ｎＭの濃度まで希釈したセラミド様糖脂質を一緒に９６ウェルの平底組織培養プレートで３００，０００／ウェルで播種した。３７℃で４８時間後、１５０マイクロリットルの上清をサイトカイン測定のために取り出した。ＩＬ−４及びＩＦＮγの上清レベルは、標準的な酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、捕捉及びビオチン化検出抗体対（それぞれ、クローン１１Ｂ１１／ＢＶＤ６−２４Ｇ２−ビオチン、及びＲ４−６Ａ２／ＸＭＧ１．２−ビオチン、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて測定した。サイトカインの含有量は、ストレプトアビジン−セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（Ｚｙｍｅｄ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）とＴＭＢ−Ｔｕｒｂｏ基質（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、又はその代わりにストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｚｙｍｅｄ）と４−ニトロフェニル二ナトリウム・６水和物基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を用いて示され、それぞれ４５０又は４０５ｎｍでマイクロプレートリーダー（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ）上で読まれる。ＩＬ−４及びＩＦＮγについての標準は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）からである。
【０１１８】
表１は、化合物ＹＴＣ０３−４２からＹＴＣ０３−６１によるＣＤ１ｄに依存した増殖の刺激を示す。結果は、下記の手順に従って脾臓細胞の増殖アッセイを用いて得た：Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のバルクな脾臓細胞は、示された濃度まで完全培地に希釈した指示したセラミド様糖脂質と共に９６ウェルの平底組織培養プレートで３００，０００／ウェルで播種した。３７℃で４８時間後、プレートウェルは、５０マイクロＣｉ／ｍｌの3Ｈ−チミジンを含有する２０マイクロリットルの培地を添加され、さらに１８時間インキュベートした。細胞増殖は、パルスした細胞を９６ウェルのフィルターマット上にかき集め、１４５０ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ機器（Ｗａｌｌａｃ／Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）上でシンチレーションカウントによって測定した。図５Ｄは、ＤＢ０２−１（ＤＢ０１−１のガラクトースをグルコースで置換した点を除いてＤＢ０１−１と同一のα−グルコシルセラミド）によるＣＤ１ｄに依存した増殖の刺激を示す。図５Ｄに報告された結果は、表１に与えられた増殖に関するデータを得るために使用したのと同じ方法によって得た。
【０１１９】
表１．ＥＣ50は、3Ｈ−チミジンの取り込みによって測定した脾臓細胞培養の増殖における５０％最大の応答を与える糖脂質の濃度ある。つまり、より高いＥＣ50値は、ＮＫ Ｔ細胞の刺激に依存した増殖についてより低い能力を表す。各々の糖脂質の５００ｎＭで４８時間刺激した脾臓細胞培養の培養上清におけるＩＬ−４及びＩＦＮγレベルは、ＥＬＩＳＡにより測定した。サイトカインの濃度は、ｎｇ／ｍｌである。ＮＤは、アッセイによる検出のために信頼できるレベル以下を示す。カッコ内の値は、ＫＲＮ７０００様のＤＢ０１−１化合物に対するＩＬ−４／ＩＦＮγの比率により割った各化合物のＩＬ−４／ＩＦＮγの比率である。
【０１２０】
【表４】
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【０１２１】
類似体の構造／活性の関係
スクリーニングアッセイから浮上した最も関心のある化合物は、２種の一般的なカテゴリーに主に分類される。それらは、様々な程度の不飽和度を持つ一部切断された脂肪アシル鎖を含有するα−ガラクトシルセラミドであるか、又はアミドの分岐した枝に芳香族を有するα−ガラクトシルセラミドのいずれかである。本出願人の結果は、ＫＲＮ７０００のアミノ置換におけるこれらの変更が、化合物の生物学的活性における少なくとも３つの可能な効果：１）有効性／活性の変化、２）効果的に化合物を提示する細胞型の変化、そして、３）産生されるサイトカインの型の点でＮＫ Ｔ細胞活性の成果の変化を有することができることを指示する。これらの効果の例示は、追随する図によって提供される。
【０１２２】
図６は、様々な型の抗原提示細胞（ＡＰＣ）をＮＫ Ｔ細胞活性化アッセイに使用する場合、様々な強力なセラミド様糖脂質の異なる提示を示す。選択された８個のセラミド様糖脂質に応答してＮＫ ＴハイブリドーマＤＮ３２Ｄ３によるＩＬ−２産生は、抗原提示細胞として３種の異なる細胞型を用いて測定した。ＲＭＡ−Ｓ．ｍＣＤ１ｄは、マウスのＣＤ１ｄを発現するためにトランスフェクトされたマウスのリンパ腫株である。ＪＡＷＳ ＩＩは、マウスＣＤ１ｄを天然に発現するマウスの樹状細胞株である。ＨｅＬａ．ｈＣＤ１ｄは、ヒトＣＤ１ｄを発現するようにトランスフェクトされたヒト子宮頸癌細胞株である。アッセイは、図５Ａに記述した結果について上述したのと同じ方法で行われた。
【０１２３】
例えば、化合物がリンパ細胞株（ＲＭＡ−Ｓ）に発現したＣＤ１ｄ分子によって提示される場合、ＹＴＣ０３−１７はＫＲＮ７０００よりも顕著に強力であることに気づかれたい。これら２つの化合物は、上皮腫瘍細胞株（ＨｅＬａ）に発現したＣＤ１ｄ分子によっておおよそ等しく提示される。樹状細胞株（ＪＡＷＳ−ＩＩ）を抗原提示細胞として使用する場合、ＹＴＣ０３−１７に対してほんの僅かな応答であるか、又は全く応答がない。ビフェニル置換が活性化合物を生じることができることを実証することに加えて、これらの研究は、化合物が提示されるＣＤ１ｄを有する細胞型に活性が顕著に依存することを示す。
【０１２４】
図６はまた、いくつかのアッセイにおいて、潜在性の増加を示す追加のフェニルを含有する類似体を示す。再度、結果は、使用される抗原提示細胞の型に全く依存する。例えば、ＹＴＣ０３−３０は、ＨｅＬａ細胞によって提示される場合、非常な有効性（ＫＲＮ７０００の少なくとも１００倍）を有するが、ＲＭＡ−Ｓ細胞によって提示された場合には、ＫＲＮ７０００と同じ有効性を有することに気づかれたい。
【０１２５】
図７は、脂肪酸鎖が完全に飽和である場合、Ｎ結合の脂肪酸の長さを変える効果を示す。この特別な系でＣ１２の長さで起こる最適な活性を伴って、有効性における鎖長の明確な影響があるように見えることに気づかれたい。抗原提示細胞の性質を変えることによってこの効果がどのように影響を受けるかは、調査されることを残す。図８は、脂肪酸鎖がＣ２０で一定に保持する場合、脂肪酸鎖に不飽和を導入する効果を示す。有効性における劇的な効果は、非常に増加した有効性を伴うジ不飽和類似体（ＤＢ０３−４）で観察される。再度、抗原提示細胞の性質を変えることによってこの効果がどのように影響を受けるかについて調査されることを残す。各々の類似体の相対的な有効性は、図５Ａに記載した結果についての上述したマウスＮＫ Ｔ細胞のハイブリドーマＤＮ３Ａ４．１−２によるＩＬ−２産生を測定することによって決定した。
【０１２６】
図８は、Ｃ２０の脂肪酸セラミド様糖脂質の有効性における脂肪酸鎖の不飽和度の効果を示す。指示した鎖長及び指示した数の二重結合を有するセラミド様糖脂質は、図７に記載した結果についての上述のマウスＮＫ Ｔ細胞のハイブリドーマＤＮ３Ａ４．１−２によるＩＬ−２産生を測定することによってＮＫ ＴハイブリドーマＤＮ３２．Ｄ３の刺激について試験した。
【０１２７】
ＫＲＮ７０００類似体の最も興味ある性質は、ある場合に、親化合物を用いた追随の刺激を発生するものとは量的に異なる免疫応答を発揮することができるということである。これは、Ｙａｍａｍｕｒａ及び共同研究者らによって公表されたように、スフィンゴシンの鎖長の変形体であるＯＣＨを用いた場合であることを示す（Ｍｉｙａｍｏｔｏら、２００１）。その場合、インビボでマウスに投与した場合、ＯＣＨは、インターロイキン−４（ＩＬ−４）の選択的産生を発揮し、ＫＲＮ７０００の注射後に観察されるインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）の強力な産生を刺激しないことを示した。ＮＫ Ｔ細胞によるこのＩＬ−４産生の選択的活性は、中枢神経系の自己免疫疾患のＥＡＥモデルにおけるＯＣＨの治療効果の増加に対して基礎となると提案された。本出願人は、本件のいくつかのセラミド様糖脂質を用いてＮＫ Ｔ細胞応答の性質に同様のインビボ効果を観察した。図９に示すように、不飽和のＣ２０脂肪酸（ＤＢ０３−４及びＤＢ０３−５）を含有する２種のセラミド様糖脂質は、マウスへの注射後２時間、強力なＩＬ−４応答を発揮する。これらの応答は、ＫＲＮ７０００に構造的にほとんど同一（Ｃ２６の代わりにＣ２４の脂肪酸、その他は同じ）である類似体のＤＢ０１−１について見られ応答と同じであり、見たところその活性の点で区別できない。しかしながら、ＤＢ０１−１はまた注射後２０時間で強力なＩＦＮγ応答を引き出すが、ＩＦＮγのこの遅い波は、２種のＣ２０のセラミド様糖脂質を用いた場合には見られない。この選択的ＩＬ−４誘導は、ＯＣＨ類似体について報告されたのと実質的に同じであり、つまり、インビボでの質的に異なった免疫調節効果を誘導するＫＲＮ７０００のアミノ置換した類似体に関する可能性を例証する。図９で報告された結果は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＤＢ０１−１、ＤＢ０３−４又はＤＢ０３−５の１回注射を投与後、ＩＬ−４及びＩＦＮγの血清レベルを測定することによって得た。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１１〜１３週齢）に４．８ナノモルのセラミド様糖脂質又はＰＢＳ／ベヒクル対照の１回のｉ．ｐ．注射を与えた。血清サイトカインレベルは、捕捉ＥＬＩＳＡによって２及び２０時間後に測定した。バーは、３匹のマウスの平均＋標準誤差である。
【０１２８】
図１１は、ＣＤ４０Ｌ発現の刺激における種々のＫＲＮ７０００類似体の種々の効果を示す。図１１はまた、これらのセラミド様糖脂質のガラクトース部分が、なおもいくつかの活性を保持している場合、別の単糖で置換され得ることを示す。これは、ＤＢ０３−８（ガラクトースに代えてフコースを有する）がＣＤ４０Ｌを誘導することができたためである。図１１に報告したセラミド様糖脂質によるＣＤ４０Ｌの上方制御は、１８時間、０．５μＭのセラミド様糖脂質の存在下で、２：１の比でＲＭＡ−Ｓ／ＣＤ１ｄを用いてＮＫ ＴハイブリドーマＤＮ３Ａ４．１−２をインキュベートすることによって得た。その後、細胞を再度懸濁させ、ＣＤ５及びＣＤ４０Ｌに特異的なｍＡｂを用いて標識した。ＣＤ４０Ｌのレベルは、ＣＤ５染色に対してゲートを設けた集団のＦＡＣＳ分析によって測定した。
【０１２９】
α−グルコシルセラミドＤＢ０２−１によるＣＤ１ｄに依存した増殖の刺激を示す図５Ｄも参照されたい。ＤＢ０２−１はまた、ＩＦＮγ及びＩＬ−４の両方を含む有意なサイトカイン産生を刺激した。興味深いことに、インビトロで脾臓細胞培養におけるＤＢ０２−１に応答して産生させたＩＦＮγレベルは、類似体の全ての濃度でＤＢ０１−１によって刺激したものよりも顕著に低かったが、ＩＬ−４レベルは、１００μＭ又はそれより大きい投与量にほぼ等しかった。これは、ＤＢ０２−１が、ＴＨ２を基礎としたサイトカイン応答を刺激する可能性を有するＮＫ Ｔ細胞アゴニストであることを示唆する。
【０１３０】
ＩＬ−４産生の選択的増加が一連の多くの自己免疫疾患に保護的又は治療的であり得るという広く浸透した考え方が与えられたので、本出願人は、糖尿病傾向のＮＯＤマウスにおけるＤＢ０３−４及びＤＢ０３−５のような化合物の有効性を調査するために研究を開始した。この研究は、本件のセラミド様糖脂質がＮＯＤマウスの糖尿病の予防において、ＫＲＮ７０００とＫＲＮ７０００に類似のＤＢ０１−１より優れていることを示す（図１０）。図１０は、Ｉ型糖尿病がセラミド様糖脂質で処置したＮＯＤマウスにおいて遅延し又は妨げられることを示す。図１０で報告された結果は、３つの群（各々９〜１２匹の雌性ＮＯＤマウスからなる）を５週齢から開始して、セラミド様糖脂質で処置することによって得た。指示したセラミド様糖脂質（ＤＢ０３−４、ＤＢ０３−５又はＫＲＮ７０００）は、２００マイクログラム／ｋｇの投与量で週に一度、ｉ．ｐ．で注射した。処置を１１週齢で中断し、糖尿（上段）及び死亡（下段）について毎週監視した。
【０１３１】
セラミド様糖脂質を用いたマウスのインビボ処置に関わる実験について、セラミド様糖脂質は、０．２ｍｌのＰＢＳ＋０．０２５％のＴｗｅｅｎ−２０、又はベヒクル単独のｉ．ｐ．若しくはｉ．ｖ．注射によって投与させた。典型的な投与量は、動物当り１回投与で約４〜５ナノモルである。ｉ．ｐ．、ｉ．ｖ．又はｐ．ｏ．経路によるマウスへのα−ガラクトシルセラミドの投与に関する代表的な参考文献は、Ｓ．Ｓｈａｒｉｆら，Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ ｔｒａｔｍｅｎｔ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｔｈｅ ｏｎｓｅｔ ａｎｄ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｎａｔ Ｍｅｄ．，Ｓｅｐ．７，２００１，（９）：１０５７−６２及びＫ．Ｍｉｙａｍｏｔｏら，Ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｂｙ ｉｎｄｕｃｎｇ ＴＨ２ ｂｉａｓ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ．Ｏｃｔ．４，２００１，４１３（６８５５）：５３１−４である。
【０１３２】
これらの研究は、αＧａｌＣｅｒの一団の新規な免疫学的に活性な類似体を同定した。これらの化合物は、以前に研究され、十分に立証されたこのファミリーの原型のＫＲＮ７０００とは構造上有意に相違する。本出願人は、疾患の予防及び治療における様々な応用に関して優れた試薬とさせるであろうある種の類似体の多くの重要な特徴をすでに実証した。これらの化合物はまた、アレルギー疾患に対する免疫治療、及び癌の治療のためのワクチンに対する応答の刺激のためのアジュバントとして有用である。
【０１３３】
上記を考慮して、本発明のいくつかの利点が達成され、他の利点が実現することが見られるであろう。
本発明の範囲から逸脱することなしに上記の方法及び組成物に様々な変形をなすことができるが、上記の記載に含有され及び添付の図面に示される全ての事項は、例示として解釈され、限定的な意味ではないであろうことが意図される。
【０１３４】
本明細書に引用した全ての参考文献は、参照により本明細書中に援用される。本明細書中の参考文献の検討は、著者によってなされた主張を単に要約したことを意図し、いかなる文献も先行技術を構成することを承認するものではない。本出願人は、引用した参考文献の正確さ及び適切さを問題にする権利を留保する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ−１】
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【図５Ｂ−２】
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【図５Ｂ−３】
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【図５Ｂ−４】
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【図５Ｂ−５】
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【図５Ｂ−６】
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【図５Ｂ−７】
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【図５Ｂ−８】
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【図５Ｂ−９】
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【図５Ｂ−１０】
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【図５Ｂ−１１】
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【図５Ｂ−１２】
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【図５Ｂ−１３】
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【図５Ｂ−１４】
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【図５Ｂ−１５】
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【図５Ｂ−１６】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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