(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式(I)で示される化合物であって：
【化１】
0005978232.tif 000052
Ａｒは、フェニル基又はナフチル基であって、任意に、ハロゲン基と；−ＮＯ2基と；−ＮＨ2基と；−Ｃ1-3アルキル基と；−Ｃ1-3アルコキシル基と；−ＳＣ1-3アルキル基と；−ＣＮ基と；−ＣＯＣ1-3アルキル基と；−ＣＯ2Ｃ1-3アルキル基とからなる群から選択される同一又は異なっていてもよい１、２、３又は４つの置換基で置換され、
Ｒ3は、ベンジル基及びＣ1-Ｃ10アルキル基からなる群から選択され、該アルキル基は、分岐した又は分岐していない、環式又は非環式、飽和又は不飽和であってもよく、
Ｒ4はＨであって；
Ｒ1及びＲ2は独立してＨ及びアルキル基からなる群から選択されるか、又は、
Ｒ1及びＲ2は、それらが結合したＣ原子と共に環状基を提供するようにアルキレン鎖を共に形成するか、又は、
Ｒ1及びＲ2の一方は、Ｎに結合するアルキレン鎖を含み、Ｎに結合する前記Ｈはなく、及び、Ｒ1及びＲ2の他方は、Ｈ又はアルキル基を含み、前記アルキル基又はアルキレン鎖は置換されていてもよく；
前記化合物は、組合せに、Ａｒを非置換性フェニル基として、Ｒ3をＣＨ3として、Ｒ4をＨとして、Ｒ1及びＲ2の一方をＨとして、並びに、Ｒ1及びＲ2の他方をＣＨ3として、
有する化合物ではないことを特徴とする、化合物、
又はその薬学的に許容可能な塩、水和物若しくは溶媒和物。
【請求項２】
Ａｒは、ナフチル基であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ａｒは、１−ナフチル基であることを特徴とする、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ａｒは、フェニル基であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ａｒ基は、置換されていることを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
Ａｒは、置換されていないことを特徴とする、請求項１ないし４のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ3は、ベンジル基であることを特徴とする、請求項１ないし６のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ3は、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、又はｎ−へキシル基であることを特徴とする、請求項１〜６に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ3は、ｎ−ペンチル基であることを特徴とする、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ1及びＲ2は相違し、−ＣＲ1Ｒ2の不斉中心の立体化学は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸並びにＬ及びＤアミノ酸の混合物からなる群から選択される構成に一致することを特徴とする、請求項１ないし９のいずれかに記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ1及びＲ2は、天然のαアミノ酸におけるαＣ原子に結合する置換基に一致することを特徴とする、請求項１ないし１０のいずれかに記載の化合物。
【請求項１２】
前記天然のαアミノ酸は、Ｌ−アラニンであることを特徴とする、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ａｒは１−ナフチル基であり、Ｒ3はベンジル基又はｎ−ペンチル基であり、Ｒ1及びＲ2の一方はＨであり、Ｒ1及びＲ2の他方はメチル基であり、Ｒ1及びＲ2が結合する前記Ｃ原子はＬ−キラルを有することを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［フェニル（ベンゾキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート（ＣＰＦ  ３８１）、
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［フェニル（エトキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート（ＣＰＦ３８３）、
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［フェニル（イソプロポキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート（ＣＰＦ３８４）、
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［フェニル（シクロヘキソキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート（ＣＰＦ５０８）、
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［ｐ−ニトロ−フェニル（エトキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート（ＣＰＦ４３０）、
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（ベンゾキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート（ＣＰＦ３７３）、
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（メトキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート（ＣＰＦ３８５）、
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（エトキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート（ＣＰＦ３８６）、
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（イソプロポキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート（ＣＰＦ３８７）、
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（シクロヘキソキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート（ＣＰＦ５０９）、
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［フェニル（ベンゾキシ−α，α−ジメチルグリシン）］ホスフェート（ＣＰＦ３９３）、
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［フェニル（エトキシ−α，α−ジメチルグリシン）］ホスフェート（ＣＰＦ３９４）、
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（ベンゾキシ−α，α−ジメチルグリシン）］ホスフェート（ＣＰＦ３９５）、
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（エトキシ−α，α−ジメチルグリシン）］ホスフェート（ＣＰＦ３９６）、
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［フェニル（ベンゾキシ−Ｌ−プロリニル）］ホスフェート（ＣＰＦ５８３）、
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（ベンゾキシ−Ｌ−プロリニル）］ホスフェート（ＣＰＦ５７７）、
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（３，３−ジメチル−１−ブトキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート（ＣＰＦ５８５）、
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（シクロブトキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート（ＣＰＦ５７８）、
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル−（シクロプロピルメタノキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート（ＣＰＦ５７９）、
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル−（ペントキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート（ＣＰＦ５８１）、
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル−（シクロペントキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート（ＣＰＦ５８２）、
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル−（２−インダノキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート（ＣＰＦ５９７）、
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［フェニル−（ベンゾキシ−Ｌ−メチオニニル）］ホスフェート（ＣＰＦ５８６）、
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル−（ベンゾキシ−Ｌ−フェニルアラニニル）］ホスフェート（ＣＰＦ５８７）、
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル−（２，２−ジメチルプロポキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート（ＣＰＦ５８８）、
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル−（ブトキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート（ＣＰＦ５８９）、
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［フェニル（エトキシ−Ｌ−バリニル）］ホスフェート、
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［フェニル（ベンゾキシ−Ｌ−ロイシニル）］ホスフェート、
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［フェニル（ベンゾキシ−Ｌ−イソロイシニル）］ホスフェート、
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［フェニル（ベンゾキシ−Ｌ−フェニルアラニニル）］ホスフェート、
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［フェニル（ペントキシ−Ｌ−メチオニニル）］ホスフェート、
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（ヘキソキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート、
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（シクロヘキソキシ−Ｌ−バリニル）］ホスフェート、
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（ペントキシ−Ｌ−ロイシニル）］ホスフェート、
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（ベンゾキシ−Ｌ−ロイシニル）］ホスフェート、
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（ペントキシ−Ｌ−イソロイシニル）］ホスフェート、
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（ペントキシ−Ｌ−フェニルアラニニル）］ホスフェート、
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（ベンゾキシ−Ｌ−メチオニニル）］ホスフェート、
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（ペントキシ−α，α−ジメチルグリシン）］ホスフェート、並びに、それらの塩、水和物及び溶媒和物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（ベンゾキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート（ＣＰＦ３７３）、又はその薬学的に許容可能な塩、水和物若しくは溶媒和物であることを特徴とする、化合物。
【請求項１６】
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（ベンゾキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート（ＣＰＦ３７３）であることを特徴とする、化合物。
【請求項１７】
ヒトにおけるがんの予防又は治療方法での使用のためであることを特徴とする、請求項１ないし１６のいずれかに記載の化合物。
【請求項１８】
前記がんは、白血病、すい臓がん、前立腺がん、肺がん、乳がん及び子宮頸がん、並びに、食道がん；胃がん、小腸がん、大腸がん及び結腸がんを含む消化器系のがん；
頭部及び頸部がん；及び、卵巣がん：からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
がんの予防又は治療方法のために使用される化合物であって：
(i)５−フルオロウラシル又は５−フルオロ−２'−デオキシウリジン活性の点で腫瘍細胞において耐性が発達している、又は、発達する潜在力を有する、
(ii)ヌクレオシド輸送体タンパク質の低下したレベルの細胞を伴う；
(iii)ヌクレオシドキナーゼ欠損細胞を伴う；
(iv)  マイコプラズマに感染した細胞を伴う；
(v)チミジル酸シンターゼ(TS)のレベルが増加した細胞を伴う；及び／又は
(vi)異化酵素によるヌクレオシド分解に対する感受性を回避するための患者における使用のためであることを特徴とする、請求項１７又は１８に記載の化合物。
【請求項２０】
前記異化酵素は、チミジンホスホリラーゼ、ウリジンホスホリラーゼ及びデオキシシチジンデアミナーゼからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
他の抗がん治療と併せて使用するためであることを特徴とする、請求項１７ないし２０のいずれかに記載の化合物。
【請求項２２】
有効用量をがんの予防又は治療が必要なヒト患者に投与することを含むがんの予防又は治療方法のために使用する医薬組成物を製造するための、請求項１ないし１６のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項２３】
前記がんは、白血病、すい臓がん、前立腺がん、肺がん、乳がん及び子宮頸がん、並びに、食道がん；胃がん、小腸がん、大腸がん及び結腸がんを含む消化器系のがん；頭部及び頸部がん；及び卵巣がん：からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記使用において：
(i)  がんの予防又は治療において、５−フルオロウラシル又は５−フルオロ−２'−デオキシウリジン活性の点で腫瘍細胞に耐性が発達している、又は、発達する潜在力を有する；
(ii)  ヌクレオシド輸送体タンパク質のレベルが低下した細胞を伴う；
(iii)  ヌクレオシドキナーゼ欠損細胞を伴う；
(iv)  マイコプラズマに感染した細胞を伴う；
(v)  チミジル酸シンターゼ(TS)のレベルが増加した細胞を伴う；及び／又は
(vi)異化酵素によるヌクレオシド分解に対する感受性を回避するための患者における、
請求項２２又は２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記異化酵素は、チミジンホスホリラーゼ、ウリジンホスホリラーゼ及びデオキシシチジンデアミナーゼからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
他の抗がん治療と併せて使用するためであることを特徴とする、請求項２２ないし２５のいずれかに記載の使用。
【請求項２７】
薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は添加剤と組み合わせて、請求項１ないし１６のいずれかに記載の化合物を含有することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２８】
薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は添加剤と共に、請求項１ないし１６のいずれかに記載の化合物を組み合わせるステップを含むことを特徴とする、医薬組成物の調製方法。
【請求項２９】
請求項１に記載の式(I)の化合物を調製するための工程であって、該工程は、式(II)の化合物を式(III)の化合物と反応させるステップを含み、
式中、Ａｒ、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ1及びＲ2が請求項１に記載された意味を有することを特徴とする、工程。
【化２】
0005978232.tif 000053
【化３】
0005978232.tif 000054
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの治療に有用な化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
1957年に、５−フルオロウラシル(5FU)の抗腫瘍活性が発見された。5FUが初めて合成されて以来50年以上、5FUは、1962年にFDAによって承認されたように、乳がん、消化器系のがん、頭部がん、頸部がん及び卵巣がん、特に、結腸直腸がんを含む固形腫瘍の治療に広く使用され続けている。フルオロピリミジンである５−フルオロウラシル(5FU)及び５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(5-FdUrd)は、胃がん、大腸がん及び乳がんといった種々のがんの標準的な治療として葉酸と組み合わせて使用される。また、5FUとロイコボリン(LV)の組み合わせは、大腸がんの標準的化学療法と考えられている。薬剤5FUは、通常、静脈内ボーラス投与又は持続点滴によって投与される。
【０００３】
5FUの抗腫瘍活性は、その類似体5-FdUrdの抗腫瘍活性に匹敵し、一部、5FUのプロドラッグとして作用する。5-FdUrdは1970年にFDAによって承認され、卵巣、乳房及び消化管の癌腫の臨床治療に広く使用されてきた。また、広範な肝臓の抽出に起因して、5-FdUrdは肝臓転移の肝動脈化学療法に有用な薬剤であり、よって、5-FdUrdは5FUに比べて肝臓によってより効率的に代謝される。
【０００４】
しかし、腫瘍細胞での耐性の発現により、薬剤5FU及び5-FdUrdはどちらも活性が損なわれる可能性があるという点において問題が存在する。また、5FUを用いたがんの治療は、神経毒性及び心毒性の副作用を引き起こすことがわかっている。また、毒性は、5FUの腫瘍に対する選択性の欠如に由来する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、５−フルオラシル(5-fluoracil)又は５−フルオロ−２'−デオキシウリジンそれ自体によって示されるがんの治療における活性及び／又は毒性と比較して、増大した活性及び／又は低減した毒性を示す５−フルオロ−２'−デオキシウリジンから誘導される化合物を提供することである。
【０００６】
本発明のさらなる目的は、腫瘍細胞での低レベルの耐性、特に、5FU又は5-FdUrdによって示される腫瘍細胞での耐性と比較して、腫瘍細胞でのより低い耐性を示す５−フルオロ−２'−デオキシウリジンから誘導される化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によると、下記式(I)の化合物であって：
【化１】
0005978232.tif 000002
Ａｒは、縮合した２環性アリール基又は単環性アリール基であって、いずれかのアリール基は炭素環又はヘテロ環であって、任意に置換され、
Ｒ3は、アルキル基であって、任意に置換され、
Ｒ4はＨ又はアルコイル基であって；
Ｒ1及びＲ2は独立してＨ及びアルキル基からなる群から選択されるか、又は、Ｒ1及びＲ2は、それらが結合したＣ原子と共に環状システムを提供するようにアルキレン鎖を共に形成するか、又は、Ｒ1及びＲ2の一つは、Ｎに結合するアルキレン鎖を含み、Ｎに結合する前記Ｈ原子はなく、Ｒ1及びＲ2の一つは、Ｈ又はアルキル基を含み、
アルキル基又はアルキレン鎖は置換されていてもよく；
又は、式(I)の薬学的に許容可能な誘導体若しくは代謝物であり、
前記化合物は、組合せに、Ａｒを非置換性フェニル基として、Ｒ3をＣＨ3として、Ｒ4をＨとして、及びＲ1及びＲ2の一つをＨとして、並びに、Ｒ1及びＲ2の一つをＣＨ3として、有する化合物ではない化合物が提供される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の化合物が、ヒト(homo sapiens)におけるがんの予防又は治療に有用となる活性を示すことがわかった。具体的には、本化合物は、患者においてがんを治療する能力を示すとともに、腫瘍細胞で低下した耐性を示すという有利な特性を示す。特に、本発明の化合物は、５−フルオラシルの細胞活性に相当するか、又はより良好な細胞活性を示すことが可能であるが、５−フルオラシル及び５−フルオロ−２'−デオキシウリジンのそれぞれの耐性に相当するか、又はより低い耐性を有する。
【０００９】
本出願での「耐性」は、治療に対して、低いか、又は低下した反応性を意味する。耐性は、先天性又は後天性である。先天性の耐性は、他の検体又は他の患者と比較して低下した反応性である。後天性の耐性は、特定の患者で、時間の経過と共に低下した有効性であり、例えば、5FU及び／又は5-FdUrdを含む投与計画などのがんを治療するための投与計画の患者への投与を含む治療に関連して、後天性であるか否かである。先天性の耐性及び後天性の耐性はそれぞれ、ヌクレオシド輸送体タンパク質を含む輸送体タンパク質又は必須の同化酵素の下向き調節又は低下した活性か、又は異化酵素の上向き調節に対応できる。
【００１０】
出願人はいかなる理論により拘束されることを望まないが、さらに以下に記載するように、5FU及び／又は5-FdUrdの活性に対する腫瘍細胞での耐性の原因は、ａ）5-FdUrdから5-FdUMPへの最初のリン酸化段階に必要とされるキー酵素であるチミジンキナーゼ(TK)のような活性化キナーゼの欠失；ｂ）チミジル酸シンターゼ(TS)の過剰産生；及び／又はｃ）標的細胞内への輸送の不足である可能性があると仮定される。
【００１１】
驚いたことに、本発明の化合物は、ヌクレオシド輸送体タンパク質のレベルがより低下した細胞、及び／又はヌクレオシドキナーゼ欠損細胞、及び／又はマイコプラズマに感染した細胞で、顕著な細胞増殖抑制活性を示し得ることが見出された。
【００１２】
ヌクレオシドキナーゼ欠損細胞で顕著な細胞増殖抑制活性を維持するという本発明の化合物の有益な特性は、ヌクレオシドキナーゼが欠乏するか、又はヌクレオシドキナーゼの減少したレベルを有する細胞環境、したがって、5-FdUrdを効果的に活性化することができない細胞環境において、in vivoでの臨床的利点をもたらすことができる。
【００１３】
マイコプラズマに感染した細胞は5-FdUrd等のヌクレオシドの活性を大幅に低下させ、これはチミジル酸シンターゼ(TS)の過剰産生に起因すると考えられる。マイコプラズマに感染した細胞における本化合物の現在提案される使用は、TS阻害剤としてさらに作用し、よって本化合物がマイコプラズマに感染した細胞で細胞増殖抑制活性を維持することを可能にするという本化合物の有益な特徴に由来すると仮定される。本発明の化合物を含むプロドラッグは、その親油性の性質により、少なくとも一部ヌクレオシド輸送担体非依存的方法で、標的細胞によって取り込まれる場合があり、したがって、標的細胞膜内でのヌクレオシド又は核酸塩基輸送担体のより低いレベルに起因する潜在的な耐性機序を回避する場合がある。
【００１４】
また、本発明の化合物を含むプロドラッグは、驚いたことに、腫瘍内で上向き調節されることが多い異化酵素チミジンホスホリラーゼ(TP)の作用に非感受性であり、したがって、前記プロドラッグは5-FdUrdに比べて、この異化酵素の存在に、より依存しない。
【００１５】
細胞のマイコプラズマ感染が5-FdUrdを含むヌクレオシドの活性を大幅に低下させることができることが観測された。TP阻害剤の投与は、マイコプラズマに感染した細胞の培養での5-FdUrdの細胞増殖抑制活性を回復させ、5-FdUrdの最終的な細胞増殖抑制活性におけるTPの悪化機能の証拠を提供する。この投与は、マイコプラズマに感染した患者における制約である場合がある。5-FdUrdとは異なり、本発明の5-FdUrdプロドラッグは、これらのマイコプラズマに感染した細胞において高い活性を維持できる。
【００１６】
よって、本化合物は、5-FU及び5-FdUrdの制限の多くを解消する可能性を有する。
【００１７】
５−フルオロウラシル(5FU)は、抗がん剤の最初の例のうちの一つである。5-FUの設計は、フッ素原子と水素原子は同様の大きさを有するが、炭素−フッ素結合は炭素−水素結合に比べてはるかに強いという利用可能な生化学的情報に基づいたものであった。チミジル酸シンターゼは、チミジル酸を生成するためにメチレンテトラヒドロ葉酸から得られたメチル基で、デオキシウリジン一リン酸の5位の水素を置換することにより作用する。5FUは、3種類の異なる経路で細胞毒性効果を発揮する。核酸塩基5FU及びデオキシリボヌクレオシド5-FdUrdは、促進性のヌクレオシド輸送系により細胞内に入る。これらの薬剤の作用機序の一つは、酵素チミジル酸シンターゼ(TS)の阻害である。核酸塩基5FUは、チミジンホスホリラーゼにより、デオキシヌクレオシド５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(5-FdUrd)に変換される。それに続く、チミジンキナーゼによるデオキシヌクレオシド5-FdURdのリン酸化は、細胞毒性ヌクレオチド５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−一リン酸(5-FdUMP)の形成につながる。還元された葉酸である５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸(mTHF)の存在下で、ヌクレオチド(5-FdUMP)は、5位のフッ素原子を除去する酵素の能力の欠如により、チミジル酸シンターゼ(TS)を阻害する。よって、5FU及びFDURの第一の最も重要な作用機序は、酵素チミジル酸シンターゼ(TS)の阻害である。チミジル酸シンターゼ(TS)は（dUMP及びmTHF）の2個の基質を有し、2個の基質はどちらもdTMPの合成を可能にする触媒部位に結合する。5-FdUMPは、チミジル酸シンターゼ(TS)と三元共有結合複合体を形成し、この酵素の活性を阻害し、DNA合成に必要なデオキシチミジン三リン酸の欠乏を引き起こす。また、(5-FdUMP)は、OPRTによる5FUの5-FUMPへの変換、フルオロウリジン二リン酸(FUDP)への変換、リボヌクレオチド還元酵素(RR)によるフルオロデオキシウリジン二リン酸(5-FdUDP)への変換及び最終的な5'-FdUMPへの変換後に合成される。5FU又は5-FdUrdへの薬物曝露後、細胞は、これらの化学療法剤への耐性が発達することが観察された。チミジル酸シンターゼ(TS)の過剰発現は、TS阻害剤の治療効果を低下させ、耐性を引き起こす。いくつかの個体では他の個体に比べてTS標的治療への耐性がより大きいことが観察された。第二に、デオキシヌクレオシドである５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(5-FdUrd)は、順に細胞障害を引き起こすDNAに取り込まれ得るその三リン酸5-FdUTP型に変換可能である。第三に、5FUは、OPRTによるFUMPへの変換及びその後、2段階での、RNAに取り込まれるフルオロウリジン三リン酸(FUTP)への変換により、RNA合成を阻害する可能性がある。これは、5FUのその他の可能性のある作用であると考えられる。
【００１８】
よって、この分子5FUは、5FUの代謝活性化に必要とされるいくつかの代謝段階による5-FdUMPへの非効率的な変換であるので、最適なTS阻害剤をもたらすものではない。細胞が活性部位に対して薬剤と競合するdUMPの過剰量を産生する場合、さらに、耐性が生じ得る。
【００１９】
5-FdUrdは、チミジンキナーゼに対して比較的良好な基質であり、チミジンキナーゼは5-FdUrdを5-FdUMPへと直接変換する。in vitro研究では、いくつかのがん細胞株で、5FUと比較して、5-FdURdが細胞増殖抑制剤として約5000倍を超えて強力であることが実証された。さらに、プロドラッグ5-FdURdは、細胞毒性濃度でリボヌクレオチド代謝物への有意な変換を示さなかった。5-FdUrdが良好な親和性を示す酵素、チミジンホスホリラーゼによって、5-FdUrdの有意な量がその関連する塩基5FUに分解されることをin vivo研究は示した。in vitro及びin vivoでの5-FdUrdの5FUへのこの迅速な加リン酸分解切断は、増強された細胞毒性作用のためのインタクト(intact)な5-FdUrdの細胞への送達において大きな障害を示す。また、経口投与後のラット及びヒトでの腸ホモジネート5-FdUrdの分解は、5-FdUrdがインタクトな5-FdUrdとしてほとんど吸収されないことを示す。
【００２０】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の化合物は、ヒトでのがんの予防又は治療方法での使用のために提供される。好適には、がんは、白血病、すい臓がん、前立腺がん、肺がん、乳がん及び子宮頸がんからなる群から選択される。
【００２１】
特に、本発明の化合物は、がんの予防又は治療において、５−フルオラシル又は５−フルオロ−２'−デオキシウリジン活性の点で腫瘍細胞において耐性が発達している、又は、発達する潜在力を有する患者における、がんの予防又は治療方法での使用のためである。例えば、本発明の化合物は、ヌクレオシド輸送体タンパク質の低下したレベルの細胞を伴う患者及び／又はヌクレオシドキナーゼ欠損細胞を伴う患者及び／又はマイコプラズマに感染した細胞を伴う患者における、がんの予防又は治療方法で使用することが可能であり、特に、がんが白血病の場合である。本発明の化合物は、チミジル酸シンターゼ(TS)のレベルが増加した細胞を有する患者における、がんの予防又は治療方法における使用のための代わりであることができ、又は同じであり得る。
【００２２】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の化合物の有効用量をがん治療が必要なヒト患者へ投与することを含むがんの予防又は治療方法が提供される。好適には、がんは、白血病、すい臓がん、前立腺がん、肺がん、乳がん及び子宮頸がんからなる群から選択される。
【００２３】
特に、本発明は、がんの予防又は治療方法において、５−フルオラシル又は５−フルオロ−２'−デオキシウリジンの活性の点で腫瘍細胞において耐性が発達している、又は、発達する潜在力を有する患者を治療するための方法を含む。例えば、本発明の方法は、特にがんが白血病の場合に、ヌクレオシド輸送体タンパク質の低下したレベルの細胞を伴う患者及び／又はヌクレオシドキナーゼ欠損細胞を伴う患者及び／又はマイコプラズマに感染した細胞を伴う患者を治療することを含むことが可能である。本発明の患者を治療するための方法は、チミジル酸シンターゼ(TS)のレベルが増加した細胞を有する患者を治療するための代わりであることができ、又は、同じであり得る。
【００２４】
本出願で使用される「腫瘍」又は「腫瘍細胞」は、別段の指示がない限り、固形腫瘍、及び白血病等のがんをいう。
【００２５】
本発明の化合物は、初めから単独又は他の抗がん治療と併せて、がん患者を治療するために使用することができる。例えば、本発明の化合物は、5-FU及び／又は5-FdUrd等の他の抗がん剤と併せてか、又はロイコボリン(LV)と併せて又はロイコボリン(LV)なしで、及び／又は他の抗がん剤と併せてがんの治療計画において使用できる。また、本発明の化合物は、例えば、ロイコボリン(LV)の有無に関わらず5FU及び／又は5-FdUrd等の他の抗がん剤に患者が反応を示さないか、又は例えば、ロイコボリン(LV)の有無に関わらず5-FU及び／又は5-FdUrd等の他の抗がん剤に耐性を示している患者に使用できる。
【００２６】
置換されているか、又は置換されていないＡｒが１−ナフチル基である本発明の化合物は、例えば、ヌクレオシド輸送体細胞の低下したレベルの細胞を伴う患者、及び／又はキナーゼ欠乏細胞を伴う患者、及び／又はマイコプラズマに感染した細胞を伴う患者、及び／又はチミジル酸シンターゼ(TS)のレベルが増加した細胞を伴う患者などの特に、腫瘍細胞において耐性が発達しているか、又は発達する潜在力を有する患者における、本発明の上記使用及び方法での使用に、特に適している。
【００２７】
本発明のさらなる態様によると、薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は添加剤と組み合わせて、本発明の化合物を含む医薬組成物が提供される。
【００２８】
本発明のその他の態様によると、本発明の化合物を、薬学的に許容可能な添加剤、担体又は希釈剤と組み合わせるステップを含む、医薬組成物の調製方法が提供される。
【００２９】
本発明のその他の態様によると、式(II)の化合物を式(III)の化合物と反応させるステップを含み、式中、Ａｒ、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ1及びＲ2が請求項１に記載された意味を有する本発明の化合物を調製するための工程が提供される。
【化２】
0005978232.tif 000003
【化３】
0005978232.tif 000004
【００３０】
Ａｒ基は置換された又は置換されていないアリール基を含み、ここで、前記「アリール基」という用語及び該基の可能性のある置換は本明細書に定義されている通りである。好適には、Ａｒは5ないし14員の芳香環基である。好ましくは、Ａｒは炭素環である。また、1又は2個の環は、Ｏ、Ｓ及びＮから独立して選択される1、2、3又は4個、好ましくは1個のヘテロ原子を含んでもよい。好ましくは、Ａｒは、縮合二環式炭素環式アリール基である。より好ましくは、Ａｒはナフチル基であり、さらにより好ましくは１−ナフチル基、すなわち、１‐ナフチル位(1-naphthyl position)に結合したＯを介してＰに結合したナフチル基である。好適には、Ａｒは、フェニル基であることが可能である。
【００３１】
同一又は異なる場合がある1、2、3又は4個の置換基がＡｒに存在してもよく、該同一又は異なってもよい1、2、3又は4個の置換基は−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ又は−Ｉであってもよいハロゲン基と；−ＮＯ2基と；−ＮＨ2基と；所望により置換された−Ｃ1-3アルキル基と；所望により置換された−Ｃ1-3アルコキシル基、好ましくはメトキシ（−ＯＣＨ3）基と；所望により置換された−ＳＣ1-3アルキル基と；−ＣＮ基と、所望により置換された−ＣＯＣ1-3アルキル基と；所望により置換された−ＣＯ2Ｃ1-3アルキル基とからなる群から選択され、ここで、前記所望により置換された基は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩであってもよいハロゲン基と、ＮＯ2基とからなる群から独立に選択される1個又は2個以上で6個まで、好ましくは3個の構成(members)で置換されてもよい。Ａｒの特に好ましい置換基は、ハロゲン基（好ましくは、塩素又はフッ素）、トリハロメチル基（好ましくは、トリフルオロメチル基）、シアノ基及びニトロ基等の電子求引基である。
【００３２】
置換基は、Ａｒアリール基のいずれかの位置であってもよい。Ａｒが１−ナフチル基である場合、2、3、4、5、6、7又は8位のいずれかの位置の単一の置換基が好ましい。Ａｒがフェニル基である場合、2（オルト）位又は4（パラ）位の単一の置換基が好ましく、4位がより好ましい。例えば、Ａｒが置換されたフェニル基である場合、Ａｒは３，５−ジクロロ−フェニル基、ｐ−トリフルオロメチル−フェニル基、ｐ−シアノ−フェニル基又はｐ−ニトロ−フェニル基であることが可能である。
【００３３】
好適には、Ｒ3はＣ1-16第1級アルキル基、第2級アルキル基又は第3級アルキル基であり、Ｃ5-7環式アルキル基か、又はＣ1-6アルキルＣ5-11アリール基である炭素環基を含むことができる。より好適には、Ｒ3はＣ1-10アルキル基か、又は、ベンジル基（−ＣＨ2−Ｃ6Ｈ5）等のＣ1-3アルキルＣ5-7アリール基である。環式アルキル基は、炭素環であることが可能であるか、又はＯ、Ｎ及びＳから独立して選択される合計で1、2又は3個の環ヘテロ原子を含むことが可能である。好ましくは、Ｒ3は非置換である。置換される場合、置換基は以下の通りである。
【００３４】
好適には、Ｒ4はＨ又はアルコイル基、すなわち、アルキル−Ｃ（＝Ｏ）−であり、ここで、アルキルはＣ1ないしＣ10である。
【００３５】
Ｒ1及び／又はＲ2がアルキル基であるとき、Ｒ1及び／又はＲ2は、それぞれ、独立して、好適にはＣ1ないしＣ16から選択され、より好適にはＣ1ないしＣ6から選択される。Ｒ1及びＲ2がともにアルキレン鎖を含むとき、該鎖は、好適にはＣ1ないしＣ6であり、不飽和を含んでもよく、前記鎖中にＯ、Ｎ及びＳから独立して選択される合計で、1、2又は3個のヘテロ原子を含んでもよい。Ｒ1及びＲ2の一つがＮに結合しているとき、Ｒ1及びＲ2が結合しているＮ及び前記Ｃ原子を含む合計の環サイズは、好適には4ないし7員環を含み、より好適には5員環を含む。Ｒ1及び／又はＲ2を含むいずれかのアルキル基又はアルキレン鎖は、本明細書に記載される1個又は2個以上の置換基で置換することが可能である。
【００３６】
Ｒ1及びＲ2が異なるとき、Ｒ1及びＲ2が結合する前記Ｃ原子は不斉炭素である。好ましくは、−ＣＲ1Ｒ2の不斉中心の立体化学は、Ｌ−アミノ酸に一致する。しかし、−ＣＲ1Ｒ2の不斉中心の立体化学は、Ｄ−アミノ酸に一致することが可能である。また、化合物の混合物は、Ｌアミノ酸及びＤアミノ酸に一致する不斉中心を有することが可能である。
【００３７】
好適には、Ｒ1及びＲ2は、天然のアルファアミノ酸におけるアルファＣ原子に結合する置換基に対応することが可能である。「天然のアルファアミノ酸」とは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グリシン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、ヒドロキシリジン、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンを意味する。したがって、Ｒ1及びＲ2の一つがＨであることが可能であり、したがって、Ｒ1及びＲ2の一つが下記の部分(moieties)から選択されるＨ又はアルキル基であるであることが可能であるか、又はＲ1及びＲ2が共に下記の部分から選択されるアルキレン鎖を形成することが可能である：
【００３８】
アラニン中に存在する、            ＣＨ3−、
アルギニン中に存在する、          Ｈ2ＮＣ（＝ＮＨ）ＮＨ［ＣＨ2］3−、
アスパラギン中に存在する、        ＮＨ2Ｃ（Ｏ）ＣＨ2−、
アスパラギン酸中に存在する、      ＨＯ2ＣＨ2−、
システイン中に存在する、          ＨＳＣＨ2−、
シスチン中に存在する、            ＨＯ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＨ2ＳＳＣＨ2−、
グリシン中に存在する、            Ｈ−、
グルタミン酸中に存在する、        ＨＯ2ＣＨ2ＣＨ2−、
グルタミン中に存在する、          Ｈ2Ｎ（Ｏ）ＣＣＨ2ＣＨ2−、
ヒスチジン中に存在する、          Ｃ3Ｎ2ＨＣＨ2−、
ヒドロキシリジン中に存在する、    Ｈ2ＮＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2ＣＨ2−、
ヒドロキシプロリン中に存在する、  −ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2−、
イソロイシン中に存在する、        ＣＨ3ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）−、
ロイシン中に存在する、            （ＣＨ3）2ＣＨＣＨ2−、
リジン中に存在する、              Ｈ2ＮＣＨ2（ＣＨ2）3−、
メチオニン中に存在する、          ＣＨ3ＳＣＨ2ＣＨ2−、
フェニルアラニン中に存在する、    ＰｈＣＨ2−、
プロリン中に存在する、            −ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、
セリン中に存在する、              ＯＨＣＨ2−、
スレオニン中に存在する、          ＣＨ3ＣＨ（ＯＨ）−、
トリプトファン中に存在する、      Ｃ8ＮＨ6ＣＨ2−、
チロシン中に存在する、            ＨＯＣ6Ｈ4ＣＨ2−、
バリン中に存在する、              （ＣＨ3）2ＣＨ−。
【００３９】
「薬学的に許容可能な誘導体」とは、薬学的に許容可能ないずれかの、塩、エステル、そのようなエステルの塩、水和物、溶媒和物、又は結晶形、又は代謝物、又は受容者に投与すると、（直接又は間接的に）式(I)の化合物を提供することができる、いかなる他の化合物を意味する。
【００４０】
本明細書におけるアルキル基とは、分岐した又は分岐していない、環式又は非環式の、飽和又は不飽和（例えば、アルケニル基又はアルキニル基）のヒドロカルビルラジカル基を意味する。環式の場合に、アルキレン基は、好ましくはＣ3ないしＣ12であり、より好ましくはＣ5ないしＣ10であり、より好ましくはＣ5ないしＣ7である。非環式の場合に、アルキル基は、好ましくはＣ1ないしＣ16であり、より好ましくはＣ1ないしＣ6である。
【００４１】
本明細書におけるアリール基とは、好適には、5ないし14個の環原子を含む芳香族基を意味する。例えば、Ａｒはフェニル基又はナフチル基である。芳香族基は、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から独立して選択される、1個、2個、3個又は4個、好ましくは1個のヘテロ原子を含む複素芳香族基であってもよい。かかる複素芳香族基の例は、ピリジル基、ピロリル基、フラニル基及びチオフェニル基を含む。
【００４２】
前記アルキル基及びアリール基は、置換されていてもよく、置換されていなくてもよい。置換されている場合に、通常、1ないし3個の置換基が存在し、好ましくは1個の置換基である。置換基は、ハロゲン原子、即ち、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩ原子、並びに、ＣＦ3基及びＣＣｌ3基等のハロメチル基と；オキソ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、カルボキシＣ1-16アルキル基、アルコキシ基、アルコイル基、アルコイルオキシ基、アリールオキシ基、アリーロイル基及びアリーロイルオキシ基等の酸素を含む基と；アミノ基、Ｃ1-6アルキルアミノ基、ジＣ1-6アルキルアミノ基、シアノ基、アジド基及びニトロ基等の窒素を含む基と；チオール基、Ｃ1-6アルキルチオール基、スルホニル基及びスルホキシド基等のイオウを含む基と；それ自体が置換されてもよい複素環基と；それ自体が置換されてもよい、上記で定義されたようなアルキル基と；フェニル基及び置換されたフェニル基等のそれ自体が置換されてもよい、上記で定義されたようなアリール基とを含んでもよい。前記複素環基、アルキル基及びアリール基の置換基は、直前で定義されたものである。Ｒ1及び／又はＲ2における置換基は、Ｒ1及びＲ2が天然のアルファアミノ酸におけるアルファＣ原子に結合する置換基に一致する化合物を提供するための部分を含む。
【００４３】
本明細書におけるアルコキシ基及びアリールオキシ基とは、それぞれ、アルキル−Ｏ−（例えば、アルキル基はＣ1ないしＣ16であり、好ましくはＣ1ないしＣ6である）、及び、アリール−Ｏ−（例えば、アリール基は、Ｏ、Ｓ及びＮから独立して選択される、1個、2個、3個又は4個のヘテロ原子を任意に含む5ないし14員の芳香族単環又は2縮合環部分であり、好ましくはアリール基はフェニル基である）を意味する。
【００４４】
本明細書におけるアルコイル基及びアリーロイル基とは、それぞれ、アルキル−ＣＯ−（例えば、アルキル基はＣ1ないしＣ16であり、好ましくはＣ1ないしＣ6である）、及び、アリール−ＣＯ−（例えば、アリール基は、Ｏ、Ｓ及びＮから独立して選択される、1個、2個、3個又は4個のヘテロ原子を任意に含む、5ないし14員の芳香族単環又は2縮合環部分であり、好ましくはアリール基はフェニル基である）を意味する。
【００４５】
本明細書におけるアルコイルオキシ基及びアリーロイルオキシ基とは、それぞれ、アルキル−ＣＯ−Ｏ（例えば、アルキル基はＣ1ないしＣ16であり、好ましくはＣ1ないしＣ6である）、及び、アリール−ＣＯ−Ｏ（例えば、アリール基は、Ｏ、Ｓ及びＮから独立して選択される、1個、2個、3個又は4個のヘテロ原子を任意に含む、5ないし14員の芳香族単環又は2縮合環部分であり、好ましくはアリール基はフェニル基である）を意味する。
【００４６】
本明細書における複素環基とは、1個以上の、ピロリル基、イミダゾリル基、ピラジオリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、オキサゾリル基、ピロリジニル基、ピロリニル基、イミダゾリジニル基、イミダゾリニル基、ピラゾリジニル基、テトラヒドロフラニル基、ピラニル基、ピロニル基(pyronly)、ピリジル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、ピペリジル基、ピペラジニル基、モルホリニル基、チオナフチル基、ベンゾフラニル基、イソベンゾフリル基、インドリル基、オキシインドリル基、イソインドリル基、インダゾリル基、インドリニル基、７−アザインドリル基、イソインダゾリル基、ベンゾピラニル基、クマリニル基、イソクマリニル基、キノリル基、イソキノリル基、ナフチリジニル基(naphthridinyl)、シンノリニル基、キナゾリニル基、ピリドピリジル基、ベンゾオキサジニル基、キノキサジニル基、クロメニル基、クロマニル基、イソクロマニル基、及び、カルボリニル基を含む基を意味する。
【００４７】
本発明の1つの実施態様では、Ａｒは、好適には、ナフチル基、特に１−ナフチル基、すなわち１−ナフチル位に結合したＯを介してＰに結合したナフチル基である。
【００４８】
本発明の他の実施態様では、Ａｒは、好適には、フェニル基である。
【００４９】
本発明の1つの実施態様では、Ａｒは置換されている。好適な置換基は、本明細書に記載される。
【００５０】
本発明の1つの実施態様では、Ａｒは、非置換の１−ナフチル基である。
【００５１】
本発明の1つの実施態様では、Ａｒは、非置換のフェニル基である。
【００５２】
本発明の1つの実施態様では、Ｒ4はＨ及びアセチル基（ＣＨ3Ｃ（＝Ｏ）−）からなる群から選択され、特にＲ4はＨである。
【００５３】
本発明の1つの実施態様では、Ｒ3はベンジル基及びＣ1ないしＣ10アルキル基を含む群の構成からなる群から選択され、特に、Ｒ3はｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基及びｎ−へキシル基から選択され、より特には、Ｒ3はｎ−ペンチル基である。
【００５４】
本発明の1つの実施態様では、Ｒ1及びＲ2は、本明細書に記載されるように、天然のアルファアミノ酸におけるアルファＣ原子に結合する基に対応する。特に好適な天然のアルファアミノ酸は、好適には、Ｒ1及びＲ2の一つはＨであり、Ｒ1及びＲ2の一つはＣＨ3であり、Ｒ1及びＲ2が結合する前記Ｃ原子はＬ−キラルを有するようなＬ−アラニンである。他の実施態様では、Ｒ1及びＲ2は非天然のアルファアミノ酸におけるアルファＣ原子に結合する基に対応し、例えば、Ｒ1及びＲ2はどちらも好適にはＣＨ3である。
【００５５】
上記実施態様に記載された具体的特徴は、本発明の化合物において、ありとあらゆる組み合わせで組み合わされて、具体的に開示されている。
【００５６】
具体的には、本発明の好適な化合物は、Ａｒは１−ナフチル基であり、Ｒ3はベンジル基であり、Ｒ1及びＲ2の一つはＨであり、Ｒ1及びＲ2の一つはメチル基であり、Ｒ1及びＲ2が結合する前記Ｃ原子はＬ−キラルを有する化合物と、Ａｒは１−ナフチル基であり、Ｒ3はｎ−ペンチル基であり、Ｒ1及びＲ2の一つはＨであり、Ｒ1及びＲ2の一つはメチル基であり、Ｒ1及びＲ2が結合する前記Ｃ原子はＬ−キラルを有する化合物とである。各化合物について、Ｒ4は、最も好適にはＨである。
【００５７】
化学療法を用いたがんの従来の治療は、大部分は、ヌクレオシド類似体の使用に基づく。これらの分子は、天然のピリミジン及びプリンヌクレオシドを模倣するように設計される。細胞によって取り込まれた後に、これらの分子は、（デオキシ）シチジンキナーゼ(dCK)、チミジンキナーゼ(TK)及び／又はヌクレオシド（ヌクレオチド）キナーゼ等の細胞酵素によってリン酸化される。これらの代謝拮抗剤は、その後、DNA/RNA前駆体のde novo合成を阻害することが可能であり、DNA/RNA合成を最終的に抑制し、細胞毒性作用／細胞増殖抑制活性をもたらす（Hatseら、1999；Galmariniら、2002）。
【００５８】
フルオロウラシル(5-FU)、カペシタビン及び５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(5-FdUrd)等のフルオロピリミジン系代謝拮抗剤が、大腸がん、乳がん及び卵巣がんの治療に主に使用される（de Bruinら、2006；Ishikawaら、1998；Walkoら、2005）。細胞内で、これらの薬物は5-FdUMPに代謝され、該5-FdUMPはチミジル酸シンターゼ(TS)及び還元された補助基質５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸と安定な阻害複合体を形成し、これにより、通常の基質dUMPが酵素に結合することを阻害する（Beckら、1994；Tanakaら、2000；Longleyら、2003）。TSは、dUMPのTMPへの変換に関与する酵素であり、したがって、細胞増殖に必須であり、薬物設計の興味深いターゲットとなる。上述のフルオロピリミジンの中で、5-FdUrdは、TKにより触媒され5-FdUMPを生成するリン酸化という1つだけの代謝的変換を必要とする（Longleyら、2003）。この不可避的なリン酸化は、多くの（5-FdUrdを含む）抗がん剤の代謝での律速段階であることが多く、したがって、未だに、ヌクレオシド類似体の治療上の使用を制限する要因の一つである。よって、ヌクレオシド類似体の抗腫瘍効果を改善するための異なる戦略が研究されてきた（Galmariniら、2002）。
【００５９】
生理的条件下でのヌクレオシド一リン酸の荷電特性は、もしあるとしても、細胞膜を介した浸透が不足する結果となる（Mehellouら、2009）。よって、第1のリン酸化段階を回避するためのリン酸化分子の直接投与は、治療上の利点が小さい。したがって、より効果のある薬物送達のための種々のタイプのヌクレオシド５'−一リン酸プロドラッグを使用する律速のリン酸化を回避するための異なる戦略が探索されてきた（Hecker及びErion、2008）。親油性のホスホラミダートヌクレオチドプロドラッグ（プロチド（ProTides））の投与は、抗ウイルス活性／抗がん活性を有する数個の分子に対して成功することを証明した（Harrisら、2001；Congiatuら、2006；McGuiganら、2010）。プロドラッグが細胞内で酵素的切断によりヌクレオシド一リン酸に迅速に変換された後に、リン酸モチーフの電荷をマスキングすることにより、プロドラッグの良好な受動的な膜拡散が達成された（Mehellouら、2009）。
【００６０】
マイコプラズマは、地球で最小の自己複製生物であり、細胞壁の欠如と、非常に小さなゲノム(600-1,200kb)によって特徴付けられる。これらのバクテリアの多くは、寄生性の生活様式であり、無症候性感染を惹起し人体に存在する（Razinら、1998）。これらの原核生物は、優先的に、腫瘍組織に定着する傾向にあることが明らかになり、Huangら(2001)は、非腫瘍形成性組織では20.9-30%がマイコプラズマに感染しているのに比べて、ヒトの胃がん、大腸がん、食道がん、肺がん及び乳がんの39.7-56%がマイコプラズマに感染していることを報告した。Pehlivanら(2005)は、対照組織試料では14%がマイコプラズマに感染しているのに比べて、80%を超える腎細胞がんに罹患している患者の腎組織試料がマイコプラズマに感染していることを明らかにした。Chanら(1996)は、卵巣がん組織で59%の感染率を報告し、他の研究も胃のコンジローマ組織（Sasakiら、1995、Yangら、2010）及び子宮頸部のコンジローマ組織（Kidderら、1998）での高いマイコプラズマ感染率を報告した。それらの減少した遺伝子のセットにより、マイコプラズマはデノボピリミジン及びプリン合成の経路が欠如しており、よって、チミジンホスホリラーゼ(TP)、デオキシシチジンデアミナーゼ等の豊富なサルベージヌクレオシド及びヌクレオチド代謝酵素を発現させる（Razin、1978；Charron及びLangelier、1981；Nealeら、1983；Thamら、1993）。すでに1985年に、汚染された細胞培養物中に存在するマイコプラズマでエンコードされる酵素（例えばTP）が、リンパ球での低下したdTTP取り込みを引き起こすことが観察された（Sinigaglia及びTalmadge、1985）。近年、これらの酵素、特に、マイコプラズマでエンコードされるチミジンホスホリラーゼも、in vitroでの５−トリフルオロチミジンを含むいくつかの化学療法の細胞増殖抑制活性を妨害することが実証された（Bronckaersら、2008；Jetteら、2008；Liekensら、2009）。よって、ヒトの腫瘍組織での抗菌剤又はマイコプラズマでエンコードされる酵素の抑制によるマイコプラズマの除去は、プリン及びピリミジン代謝拮抗剤を用いたがん患者の治療を最適化する可能性があると仮定された（Liekensら、2009）。
【００６１】
本発明は、5-FdUrdのTK-非依存性のホスホラミダートプロドラッグの開発及び評価に基づき、その遊離ヌクレオシド類似体のTP-依存性不活性化に非感受性であることも可能な化合物を提供する。よって、本発明の化合物は、ピリミジン代謝拮抗剤を用いたがん患者の治療を最適化可能なマイコプラズマ非感受性ヌクレオシド類似体プロドラッグを提供することができる。現在合成された5-FdUrdのホスホラミダートプロドラッグの中から、さらに深い研究のために、（Ｒ4をＨとする本発明の特に好適な化合物として以下に同定され、先に記載される）CPF-373が選択された。この分子は、5-FdUMPの帯電した５'−リン酸をマスクするために、ナフチル基及びベンジルアラニニル(benzylalaninyl)基を含む。
【００６２】
重要な薬剤活性化酵素（例えば、TK及びオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ）の活性の低下、薬剤不活性化酵素（すなわち、チミジンホスホリラーゼ）の活性の増大及び／又は標的酵素（例えばTS）の上向き調節を含む、5FU、5-FdUrd及びトリフルオロチミジン(TFT)等のフルオロピリミジンに対する腫瘍細胞耐性の種々の機序が記載された（Agarwalら、1999；Murakamiら、2000；Kosakaら、2004）。また、数種類のがん組織で見られる高いTPレベルが、フルオロピリミジンを用いた治療時の予後不良を予測すると報告されたが（Kamoshidaら、2005；Ciaparroneら、2006；Koopmanら、2009）、他の研究ではこれらの結果は確認されなかった（Ciccoliniら、2004；Koopmanら、2009）。本発明は、可能性のある耐性機序及び腫瘍内微小環境に存在する異化酵素による分解に対する感受性を回避するための5-FdUrdのプロドラッグの開発に基づく。
【００６３】
本発明の化合物、例えば、CPF-373は、5-FdUrdのホスホラミダートプロドラッグであり、本明細書に記載されており、これらの目的を満たすことが可能である。腫瘍細胞内に取り込まれた後、CPF-373は、例えば、酵素的切断直後に、細胞内に5-FdUMPを生成する。31P NMR技術による安定性研究及び酵素／血清研究は、例えば、プロドラッグCPF-373は酸性条件及びアルカリ性条件下で完全に安定であるが、血清又はカルボキシペプチダーゼYの存在下で加水分解され、ヌクレオシド５'−ホスホラミダート誘導体の形成をもたらすことを明らかにした。TKが5-FdUrdの活性化におけるキー酵素であるのに対して、例えば、CPF-373はマウス細胞培養物(L1210)及びヒト細胞培養物(CEM)の両方でその細胞増殖抑制作用を発揮させるのにTKに依存することがはるかに少ないことがわかった。TK等の特定のヌクレオシドキナーゼによる最初のリン酸化の必要性を除いて、プロチドの親油性の性質のために、カルボキシエステラーゼ又はカルボキシペプチダーゼ（すなわち、カルボキシペプチダーゼY）等の酵素によるプロチドのヌクレオシドホスホラミダート誘導体への変換後に、これらの分子はインタクトな腫瘍細胞内にヌクレオシド一リン酸を直接送達することが可能である。これに関して、例えば、CPF-373は、（後天性又は先天性である）修飾されたTK活性を有する腫瘍細胞の治療のための適当な手段である場合がある。また、TK発現はS期依存性であるので、例えば、CPF-373は、それらの複製周期のS期ではない腫瘍細胞に5-FdUMPを効率的に送達することも可能であることが予期される。TS活性研究は、5-FdUrdの５'−一リン酸の効率的な細胞内送達、及び代謝活性化への細胞のTKの実質上の非依存性を再度指摘し、例えば、CPF-373が、野生型及びTK欠損腫瘍細胞株の両方で、TSを抑制可能であったことを明らかにした。
【００６４】
CPF-373等の本発明の化合物は、ヌクレオシド代謝に関与する異化酵素によって不活性化される可能性は低い。実際、5-FdUrdはTPによる酵素加水分解に対して高度の感受性を示し、結果として5-FU及び２−デオキシリボース−１−リン酸が生成されるのに対して、そのプロドラッグ、例えば、CPF-373は、原核生物（すなわち、大腸菌(E.coli)）又は哺乳類（すなわち、ヒト赤血球）のTPの基質ではない。また、5-FdUrdはこの酵素により（不十分にだが、測定可能な程度に）加水分解されるのに対して、ウリジンホスホリラーゼは、例えば、CPF-373を基質として認識しない。いくつかの研究は、多くの腫瘍細胞が、血管新生因子としても作用するTPの上昇したレベルを有することを明らかにした（Koopmanら、2009; Bronckaersら、2009）。また、エンコードされるTPによるin vitroでのいくつかの従来の化学療法の細胞増殖抑制活性を妨害する（Bronckaersら、2008; Jetteら、2008; Liekensら、2009）、マイコプラズマによる腫瘍組織の優先的なコロニー形成についていくつかの報告がある（Sasakiら、1995; Chanら、1996; Huangら、2001; Pehlivanら、2005）。腫瘍細胞が（TPを発現する）マイコプラズマに感染すると、5-FdUrdは顕著に細胞増殖抑制活性を失うが、例えば、CPF-373は細胞増殖抑制活性を失わないという本観察は、これらの観察と完全に一致している。よって、極端なpH条件下で化学的に安定であることが実証されたCPF-373等のTP-非感受性の抗がんプロドラッグの投与は、さらにがん化学療法を改善する場合がある。要するに、CPF-373等のプロチドは、より回復力に富む抗がん剤の開発に向けて興味深い新たなアプローチを提供する。例えば、CPF-373は親薬物5-FdUrdに比べて少なくともいくつかの利点を有する場合があり、該利点とはTKに非依存性の細胞増殖抑制活性を発揮すること、及び腫瘍で上向き調節されることが多いか、又は腫瘍組織のマイコプラズマ感染により外部に発現する場合がある酵素TPによる代謝的な分解に耐性を示すことである。
【００６５】
式(I)を有する化合物、又は、本発明による医薬組成物は、ヒト患者に、いかなる好適な手段によって投与することができる。
【００６６】
本発明で用いられる薬剤は、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、経皮投与、気道（噴霧）投与、直腸投与、膣内投与、及び、（口腔、及び、舌下投与を含む）局所投与を含む、経口経路又は非経口経路によって投与できる。
【００６７】
経口投与のために、本発明の化合物は、一般的に、錠剤若しくはカプセル剤の製剤、粉末若しくは顆粒として、又は、水溶液若しくは懸濁液として、提供される。
【００６８】
経口用の錠剤は、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、着色剤及び防腐剤等の薬学的に許容可能な添加剤と混合した活性成分を含んでもよい。好適な不活性希釈剤は、炭酸ナトリウム及び炭酸カルシウムと、リン酸ナトリウム及びリン酸カルシウムと、乳糖とを含み、コーンスターチ及びアルギン酸が好適な崩壊剤である。結合剤はでんぷん及びゼラチンであってもよく、存在するのであれば、滑沢剤は、通常、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクである。所望により、前記錠剤は、消化管での吸収を遅らせるために、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリル等の材料で被覆されてもよい。
【００６９】
経口用のカプセル剤は、硬質ゼラチンカプセル剤と、軟質ゼラチンカプセル剤とを含み、前記硬質ゼラチンカプセル剤では、活性成分が固形希釈剤とともに混合され、前記軟質ゼラチンカプセル剤では、活性成分が、水か、若しくはピーナッツオイル、流動パラフィン又はオリーブオイル等の油状物とともに混合される。
【００７０】
直腸投与用の製剤は、例えば、ココアバター又はサリチル酸塩を含む好適な基剤とともに坐剤として提供されてもよい。
【００７１】
膣内投与用に好適な製剤は、活性成分に加えて、当該技術分野で適切であると知られるような担体を含む、ペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、泡沫剤又は噴霧剤の製剤として提供される場合がある。
【００７２】
筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与及び静脈内投与用として、本発明の化合物は、通常、適当なpHに緩衝され、等張性である、滅菌水溶液又は懸濁液で提供される。好適な水性媒体は、リンガー液及び生理食塩水を含む。本発明による水性懸濁液は、セルロース誘導体、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン及びトラガカントゴム等の懸濁剤と、レシチン等の湿潤剤とを含んでもよい。水性懸濁液用の好適な防腐剤は、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル及びｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピルを含む。
【００７３】
また、本発明の化合物はリポソームの製剤として提供されてもよい。
【００７４】
通常、好適な投与量は、1日あたり、受容者の体重1キログラムあたり、0.1ないし300mgの範囲である。好ましい低投与量は、1日あたり、受容者の体重1キログラムあたり、0.5mgであり、より好ましい低投与量は、1日あたり、受容者の体重1キログラムあたり、6mgであり、さらにより好ましい低投与量は、1日あたり、受容者の体重1キログラムあたり、10mgである。好適な投与量は、好ましくは、1日あたり、体重1キログラムあたり、6ないし150mgの範囲であり、最も好ましくは、1日あたり、体重1キログラムあたり、15ないし100mgの範囲である。所望の投与量が、好ましくは、１日の間に適当な間隔で投与される2回、3回、4回、5回又は6回か、若しくはそれ以上の分割投与量(sub-doses)として提供される。これらの分割投与量は、例えば、投与製剤単位あたり10ないし1500mg、好ましくは20ないし1000mg、最も好ましくは50ないし700mgの活性成分を含む投与製剤単位で投与されてもよい。
【００７５】
本発明の実施例は、例示のみの目的で、図１ないし図１１を含む添付の図面を参照して、現在記載される。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、5-FdUrd及びそのホスホラミダートプロドラッグCPF-373の構造式を示す。
【図２Ａ】図２は、チミジンホスホリラーゼ及びウリジンホスホリラーゼのdThd、Urd、5-FdUrd及びCPF-373への効果を示し、ここでデータは少なくとも2回の独立した実験の平均である（±標準偏差）。
【図２Ｂ】図２は、チミジンホスホリラーゼ及びウリジンホスホリラーゼのdThd、Urd、5-FdUrd及びCPF-373への効果を示し、ここでデータは少なくとも2回の独立した実験の平均である（±標準偏差）。
【図２Ｃ】図２は、チミジンホスホリラーゼ及びウリジンホスホリラーゼのdThd、Urd、5-FdUrd及びCPF-373への効果を示し、ここでデータは少なくとも2回の独立した実験の平均である（±標準偏差）。
【図３Ａ】図３は、L1210/0細胞培養物での[5-3H]dUrd（パネルA及びB）及び[5-3H]dCyd（パネルC及びD）からのトリチウム放出、及びL1210/TK-細胞培養物での[5-3H]dCyd（パネルE及びF）からのトリチウム放出により測定された5-FdUrd及びCPF-373によるTSの阻害を示し、ここでデータは2回の独立した実験の平均である（±平均値の標準誤差）。
【図３Ｂ】図３は、L1210/0細胞培養物での[5-3H]dUrd（パネルA及びB）及び[5-3H]dCyd（パネルC及びD）からのトリチウム放出、及びL1210/TK-細胞培養物での[5-3H]dCyd（パネルE及びF）からのトリチウム放出により測定された5-FdUrd及びCPF-373によるTSの阻害を示し、ここでデータは2回の独立した実験の平均である（±平均値の標準誤差）。
【図３Ｃ】図３は、L1210/0細胞培養物での[5-3H]dUrd（パネルA及びB）及び[5-3H]dCyd（パネルC及びD）からのトリチウム放出、及びL1210/TK-細胞培養物での[5-3H]dCyd（パネルE及びF）からのトリチウム放出により測定された5-FdUrd及びCPF-373によるTSの阻害を示し、ここでデータは2回の独立した実験の平均である（±平均値の標準誤差）。
【図３Ｄ】図３は、L1210/0細胞培養物での[5-3H]dUrd（パネルA及びB）及び[5-3H]dCyd（パネルC及びD）からのトリチウム放出、及びL1210/TK-細胞培養物での[5-3H]dCyd（パネルE及びF）からのトリチウム放出により測定された5-FdUrd及びCPF-373によるTSの阻害を示し、ここでデータは2回の独立した実験の平均である（±平均値の標準誤差）。
【図３Ｅ】図３は、L1210/0細胞培養物での[5-3H]dUrd（パネルA及びB）及び[5-3H]dCyd（パネルC及びD）からのトリチウム放出、及びL1210/TK-細胞培養物での[5-3H]dCyd（パネルE及びF）からのトリチウム放出により測定された5-FdUrd及びCPF-373によるTSの阻害を示し、ここでデータは2回の独立した実験の平均である（±平均値の標準誤差）。
【図３Ｆ】図３は、L1210/0細胞培養物での[5-3H]dUrd（パネルA及びB）及び[5-3H]dCyd（パネルC及びD）からのトリチウム放出、及びL1210/TK-細胞培養物での[5-3H]dCyd（パネルE及びF）からのトリチウム放出により測定された5-FdUrd及びCPF-373によるTSの阻害を示し、ここでデータは2回の独立した実験の平均である（±平均値の標準誤差）。
【図４】図４は、5-FdUrdプロチドの活性化の推定機序の案を示す。
【図５】図５は、31P NMRによりモニターされたプロドラッグCPF-373のカルボキシペプチダーゼで仲介される切断を示す。
【図６】図６は、血清中の化合物CPF-373の31P NMRスペクトルを示す。
【図７】図７は、緩衝液pH=1での化合物CPF-373の31P NMRスペクトルを示す。
【図８】図８は、緩衝液pH=8での化合物CPF-373の31P NMRスペクトルを示す。
【図９Ａ】図９は、ヌクレオシド及び関連塩基の19F NMRによるスペクトルを示す：ａ）ホスホリラーゼアッセイを受けた5-FdUrd (A)；ｂ）酵素(TP)のないアッセイ条件下での5-FdUrd及び塩基5FU (B)。
【図９Ｂ】図９は、ヌクレオシド及び関連塩基の19F NMRによるスペクトルを示す：ａ）ホスホリラーゼアッセイを受けた5-FdUrd (A)；ｂ）酵素(TP)のないアッセイ条件下での5-FdUrd及び塩基5FU (B)。
【図１０Ａ】図１０は、リン酸カリウム緩衝液(205nM)中のヌクレオシド及び塩基の19F NMRによるスペクトルを示す：ａ）酵素非存在のホスホリラーゼアッセイを受けた5-FdUrd (A)；酵素(TP)添加後の結果(B)。
【図１０Ｂ】図１０は、リン酸カリウム緩衝液(205nM)中のヌクレオシド及び塩基の19F NMRによるスペクトルを示す：ａ）酵素非存在のホスホリラーゼアッセイを受けた5-FdUrd (A)；酵素(TP)添加後の結果(B)。
【図１１Ａ】図１１は、ホスホリラーゼアッセイでのプロドラッグ化合物CPF 373のスペクトルを示す：ａ）酵素(TP)のないアッセイ条件下のプロドラッグCPF 373 (A)；ｂ）チミジンホスホリラーゼ(TP)の作用を受けたプロドラッグCPF 373 (B)。
【図１１Ｂ】図１１は、ホスホリラーゼアッセイでのプロドラッグ化合物CPF 373のスペクトルを示す：ａ）酵素(TP)のないアッセイ条件下のプロドラッグCPF 373 (A)；ｂ）チミジンホスホリラーゼ(TP)の作用を受けたプロドラッグCPF 373 (B)。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
化合物合成
以下の図１及び合成経路1ないし3に関して、化合物CPF-373 (1)によって例示されるような本発明の化合物は、ホスホロクロリダート(phosphorochloridate)化学を用いて合成され、該ホスホロクロリダート化学はMcGuiganらによって以前に報告された(1993, 1996, 1997)。例えば、アリールホスホロジクロロホスフェート(arylphosphorodichlorophosphate) (2)は、Et3Nの存在下で、１−ナフトール(3)をオキシ塩化リン(4)とカップリングして調製され（合成経路1）、これは、ホスホロクロリダート誘導体(6)を製造するためにEt3Nの存在下でトシル酸Ｌ−アラニンベンジルエステル(5)と反応された（合成経路2）。ヌクレオシド5-FdUrd (7)は、目的化合物CPF-373 (1)を与えるために、Ｎ−メチルイミダゾール(NMI)の存在下でTHF中のホスホロクロリダート誘導体(6)とカップリングすることによって５'プロチドに変換された（合成経路3）。試料は、31P NMRで2つのピークの存在によって確かめられるように、2つのジアステレオマーの混合物として得られた。
【００７８】
【化４】
0005978232.tif 000005
【００７９】
【化５】
0005978232.tif 000006
【００８０】
【化６】
0005978232.tif 000007
【００８１】
無水溶媒はアルドリッチから得られ、さらなる精製なしに用いられた。全ての反応はアルゴン雰囲気下で実施された。反応は、シリカゲル60-F254でプレコーティングされたアルミニウムプレートでの分析TLC及びUV (254nm)下可視化され、及び／又は、31P NMRスペクトルでモニターされた。カラムクロマトグラフィーはシリカゲル(35-70μM)で実施された。プロトン(1H)、炭素(13C)、リン(31P)及びフッ素(19F)NMRスペクトルは、25°Cでブルカーアバンス(Bruker Avance) 500スペクトロメーターで表示された。スペクトルは重水素化溶媒(deuterated solvent)のピークに自動校正され、全ての13C NMR及び31P NMRはプロトンデカップリングされた。分析HPLCは、分析カラムとしてバリアンポラリスC18-A (10μM)を用いてバリアンプロスター(Varian Prostar)（LC ワークステーション−バリアンプロスター335 LC検出器）によって行われた。
【００８２】
低分解能及び高分解能の質量スペクトルは、電子スプレー(ES)を用いてバーミンガム大学によるサービスとして実施された。CHN微量分析は、MEDAC Ltd.（サリー）によるサービスとして実施された。
【００８３】
標準操作A：ジクロロホスフェート(2)の合成
オキシ塩化リン（1.0等量）はアルゴン雰囲気下でジエチルエーテル中の１−ナフトール（1.0等量）の溶液に添加され、その後、無水トリエチルアミン（1.0等量）は-78°Cで滴加され、この反応混合物は1時間攪拌された。その後、前記反応混合物は、3時間室温までゆっくりと温められた。目的化合物の形成が31P NMRによってモニターされた。この混合物は濾過され、その後、窒素下の真空で溶媒留去され、生成物として粗無色の油状物を得て、次のステップでさらなる精製なしで用いられた。
【００８４】
１−ナフチルジクロロホスフェート(2)の合成：
１−ナフトール(3.00g, 20.81mmol)、オキシ塩化リン(1.94mL, 20.81mmol)、トリエチルアミン(2.9mL, 20.81mmol)及び無水ジエチルエーテル(70mL)から標準操作Aに従って調製された。-78°Cで1時間後、反応は室温に上げられたまま、3時間攪拌された。粗生成物が油状物として得られた。この混合物が、ヘキサン−EtOAc (1:1)で溶出するカラムクロマトグラフィーによる精製後に、濾過され、その後、真空で溶媒留去され、無色の油状物(4.59g, 84%) [Rf = 0.93 (ヘキサン-EtOAc, 1:1)]を得た。
31P NMR (202 MHz, CDCl3): δP 5.07; 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δH 7.52-7.71 (m, 4H, ArH), 7.86-7.89 (m, 1H, ArH), 7.95-7.98 (m, 1H, ArH), 8.16-8.19 (m, 1H, ArH).
【００８５】
標準操作B：ホスホロクロリダート(6)の合成
アルゴン雰囲気下、ジクロロメタン中のアリールホスホロジクロリダート（1.0等量）及び適当量のアミノ酸エステル塩（1.0等量）の溶液が、-78°Cで無水トリエチルアミン（2.0等量）に滴加された。1時間後、反応混合物は室温にゆっくりと3時間温められ、目的化合物の形成が31P NMRによってモニターされた。前記反応混合物は、減圧下で濃縮され、残渣はジエチルエーテルに再溶解され、濾過され、窒素下の真空で溶媒除去され、粗無色の油状物を得た。場合によっては、次のステップでさらなる精製なしに用いられた。合成されたアリールホスホロクロリダートは、ヘキサン−EtOAc (7:3)で溶出するカラムクロマトグラフィーによって精製され、無色の油状物として標記化合物を得た。
【００８６】
１−ナフチル（ベンジル−Ｌ−アラニニル）ホスホロクロリダート(6)の合成
前記ホスホロクロリダートは、一般操作Bに従って、１−ナフチルジクロロホスフェート(2.50g, 9.57mmol)、Ｌ−アラニンベンジルエステルトシレート塩(3.36g, 9.57mmol)、乾燥トリエチルアミン(2.66mL, 19.14mmol)及び乾燥ジクロロメタン(35.7mL)を用いて調製された。ヘキサン−EtOAc (7:3)で溶出するカラムクロマトグラフィーでの精製により無色の油状物として標記化合物(1.82g, 47%) [Rf = 0.90 (ヘキサン-EtOAc, 7:3)]を得た。
31P NMR (202 MHz, CDCl3, ジアステレオ異性体の混合物): δP 7.92, 8.14 (Int.: 1.00:1.00); 1H NMR (500 MHz, CDCl3, １：１の割合のジアステレオ異性体の混合物): δH 1.42-1.45 (m, 3H, CHCH3), 4.20-4.23 (m, 1H, CHCH3), 4.78-4.81 (m, 1H, NH), 5.09 (s, 2H, OCH2Ph), 7.09-7.73 (m, 11H, ArH), 7.97-8.12 (m, 1H, ArH).
【００８７】
標準操作C：ヌクレオシドホスホラミダート(Phosphoramidate) (1)の合成
乾燥THF (10mL)中の適当量のヌクレオシド（1.0等量）の溶液が、アルゴン雰囲気下の室温でNMI（5.0等量）に添加された。10分後、反応混合物は無水THF中のホスホロクロリダートの溶液（3.0等量）に滴加された。前記反応は終夜室温で攪拌され、真空で溶媒除去された。得られた油状物はCH2Cl2に溶解され、2回H2Oで洗浄され、その後0.5M HClで洗浄されたか、又は代替的には、粗生成物は、ジエチルエーテルで洗浄された。その後、前記粗生成物は、グラジエントとしてCH2Cl2-MeOHで溶出するシリカカラムクロマトグラフィーによって精製され、ホスホラミダートを得た。
【００８８】
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［α−ナフチル（ベンジル−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート (1)の合成
前記ホスホラミダートは、一般操作Cに従って、５−フルオロ−２'デオキシウリジン(0.25g, 1.01mmol)、NMI (0.40mL, 5.07mmol)及びナフチル（ベンジル−Ｌ−アラニニル）ホスホロクロリダート(0.82g, 3.04mmol)を用いて調製された。CH2Cl2-MeOH (95:5)までCH2Cl2で溶出するグラジエントカラムクロマトグラフィーでの精製により、無色固体として標記化合物(47.0mg, 8%) [Rf = 0.19 (CH2Cl2-MeOH, 95:5)]が提供され、45分間に(100/0から0/100までのH2O/MeOHで)溶出する逆相HPLCは、tR 34.23分及びtR 34.59分でジアステレオマーの2つのピークを示した。
C29H29FN3O9Pの元素分析計算値: C, 56.77; H, 4.76; N, 6.85. 実測値: C, 56.57; H, 5.06; N, 6.72。(実測値: MNa+, 636.1520. C29H29N3O9FNaP 理論値[MNa+], 636.1523); 31P NMR (202 MHz, MeOD, ジアステレオ異性体の混合物): δP 4.24, 4.59; 19F NMR (470 MHz, MeOD): δF -167.36, -167.18; 1H NMR (500 MHz, MeOD): δH 1.34-1.38 (m, 3H, CHCH3), 1.67-1.79 (m, 1H, H-2'), 2.08-2.17 (m, 1H, H-2'), 4.03-4.15 (m, 2H, CHCH3, H-4'), 4.24-4.36 (m, 3H, CH2OP, H-3'), 5.08 (d, 1H, J = 12.0 Hz, OCHHPh), 5.13 (d, 1H, J = 12.0 Hz, OCHHPh), 6.09-6.16 (m, 1H, H-1'), 7.27-7.45 (m, 6H, ArH), 7.47-7.55 (m, 3H, ArH), 7.67-7.72 (m, 2H, ArH, H-6), 7.86-7.90 (m, 1H, ArH), 8.12-8.18 (m, 1H, ArH); 13C NMR (125 MHz, MeOD): δC 20.3 (d, 3JC-P = 7.6 Hz, CH3), 20.5 (d, 3JC-P = 6.5 Hz, CH3), 40.8 (CH2), 40.9 (CH2), 51.8 (CH), 51.9 (CH), 67.6 (d, 2JC-P = 5.3 Hz, CH2), 67.8 (d, 2JC-P = 5.2 Hz, CH2), 68.0 (CH2), 68.1 (CH2), 72.0 (CH), 72.1 (CH), 86.7 (d, 3JC-P = 8.1 Hz, CH), 86.8 (d, 3JC-P = 8.1 Hz, CH), 86.9 (CH), 87.0 (CH), 116.2 (d, 3JC-P = 3.3 Hz, CH), 116.5 (d, 3JC-P = 3.5 Hz, CH), 122.6 (CH), 125.3 (CH), 125.4 (CH), 125.6 (CH), 125.7 (CH), 126.2 (CH), 126.5 (CH), 126.6 (CH), 127.6 (CH), 127.7 (CH), 127.8 (C), 127.9 (C), 128.0 (CH), 128.1 (CH), 128.9 (CH), 129.0 (CH), 129.4 (CH), 129.5 (CH), 129.6 (CH), 129.7 (CH), 136.2 (C), 137.1 (C), 137.2 (C), 141.6 (d, 1JC-F = 233.8 Hz, C), 141.7 (d, 1JC-F = 233.9 Hz, C), 147.8 (d, 2JC-P = 7.7 Hz, C), 147.9 (d, 2JC-P = 7.4 Hz, C), 150.5 (d, 4JC-F = 4.0 Hz, C), 159.3 (d, 2JC-F = 26.1 Hz, C), 174.6 (d, 3JC-P = 5.0 Hz, C), 174.9 (d, 3JC-P = 4.3 Hz, C), m/z (ES) 636 (MH+, 100%)
【００８９】
放射性ピリミジンデオキシヌクレオシド
[5-3H]dCyd（比放射能 (radiospecificity)：22Ci/mmol）及び[5-3H]dUrd（比放射能：15.9Ci/mmol）がモラベックバイオケミカル社（カリフォルニア州ブレア）から得られた。
【００９０】
標準操作D：ホスホラミダートの合成（NMI法）
無水THFに溶解された適当なホスホロクロリダート（3.0等量）がＡｒ雰囲気下で滴加され、無水THF中の5-F-dUrd（1.0等量）の溶液に攪拌された。NMI（5.0等量）が反応混合物に-78°Cで5分間かけて滴加された。15分後、前記反応混合物は室温に上げられたまま、終夜攪拌された。溶媒は真空下で除去され、残渣はDCMに再溶解され、0.5M HClで3回洗浄された。有機相はMgSO4で終夜乾燥され、濾過され、減圧乾固され、溶離液（DCM/MeOH 99:1ないし97:3ないし95:5）のグラジエントを用いるカラムクロマトグラフィーによって精製された。
【００９１】
標準操作E：ホスホラミダートの合成（tBuMgCl法）
tBuMgCl（1.1mol等量THF中の1M溶液）がＡｒ雰囲気下で無水THFに溶解された5-FdUrd（1.0等量）の攪拌溶液に滴加され、その後に（30分後）無水THFに溶解された適当量のホスホロクロリダート（2.0mol等量）が添加された。この反応混合物は室温で終夜攪拌された。溶媒は減圧下で除去され、残渣は溶離液（DCM/MeOH 99:1ないし97:3ないし95:5）のグラジエントを用いるカラムクロマトグラフィーによって精製された。
【００９２】
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［フェニル（ベンゾキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート (CPF 381)
【化７】
0005978232.tif 000008
前記ホスホラミダートは、一般操作Eに従って、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.40g, 1.62mmol)、テトラヒドロフラン中のtert-ブチルマグネシウムクロリド(tBuMgCl) (1.0M, 2.43mL, 2.43mmol)及びフェニル（ベンゾキシ−Ｌ−アラニニル）ホスホロクロリダート(1.08g, 3.20mmol)を用いて調製された。CH2Cl2-MeOH (95:5)までCH2Cl2で溶出するシリカのグラジエントカラムクロマトグラフィーでの精製により無色固体として標記化合物(71.0mg, 8%) [Rf = 0.35 (CH2Cl2-MeOH, 95:5)]を得た。
(実測値: MNa+, 586.1360. C25H27N3O9NaPF 理論値[MNa+], 586.1367); 31P NMR (202 MHz, MeOD): δP 3.74, 4.14; 19F NMR (470 MHz, MeOD): δF -167.57, -167.46; 1H NMR (500 MHz, MeOD): δH 1.35 (d, 3H, J = 7.4 Hz, CHCH3, one diast.), 1.37 (d, 3H, J = 6.9 Hz, CHCH3, one diast.), 1.96-2.32 (m, 2H, H-2'), 3.95-4.08 (m, 2H, CHCH3, H-4'), 4.23-4.34 (m, 3H, CH2OP, H-3'), 5.13 (br d, 1H, J = 12.3 Hz, OCHHPh), 5.16 (br d, 1H, J = 12.3 Hz, OCHHPh, one diast.), 5.17 (br d, 1H, J = 12.2 Hz, OCHHPh, one diast.), 6.16-6.22 (m, 1H, H-1'), 7.17-7.25 (m, 3H, ArH), 7.26-7.40 (m, 7H, ArH), 7.81-7.85 (m, 1H, H-6); 13C NMR (125 MHz, MeOD): δC 20.2 (d, 3JC-P = 7.5 Hz, CH3), 20.4 (d, 3JC-P = 6.2 Hz, CH3), 40.6 (CH2), 40.9 (CH2), 51.6 (CH), 51.8 (CH), 67.5 (d, 2JC-P = 5.3 Hz, CH2), 67.6 (d, 2JC-P = 5.5 Hz, CH2), 68.0 (CH2), 71.8 (CH), 71.9 (CH), 86.6 (d, 3JC-P = 8.0 Hz, CH), 86.8 (d, 3JC-P = 8.3 Hz, CH), 86.9 (CH), 87.0 (CH), 121.4 (d, 3JC-P = 5.1 Hz, CH), 121.5 (d, 3JC-P = 5.6 Hz, CH), 125.5 (d, 5JC-P = 3.2 Hz, CH), 125.8 (d, 5JC-P = 3.2 Hz, CH), 126.3 (CH), 129.0 (CHx2), 129.3 (CHx2), 129.6 (CHx2), 130.8 (CHx2), 140.9 (C), 141.6 (d, 1JC-F = 233.6 Hz, C), 141.7 (d, 1JC-F = 233.6 Hz, C), 150.7 (d, 4JC-F = 5.7 Hz, C), 152.1 (d, 2JC-F = 6.5 Hz, C), 159.2 (d, 2JC-F = 26.3 Hz, C), 174.6 (d, 3JC-P = 4.9 Hz, C), 174.7 (d, 3JC-P = 4.9 Hz, C), m/z (ES) 586 (MNa+, 100%)
45分、1ml/分、λ=275nmで100/0から0/100までのH2O/MeOHで溶出する逆相HPLCは、tR 25.08分(97%)でジアステレオマーの混合物の1つのピークを示した。
【００９３】
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［フェニル（メトキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート(CPF 382)（参考例）
【化８】
0005978232.tif 000009
前記ホスホラミダートは、一般操作Ｄに従って、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.25g, 1.01mmol)、Ｎ−メチルイミダゾール(NMI) (0.40mL, 5.07mmol)及びフェニル（メトキシ−Ｌ−アラニニル）ホスホロクロリダート(0.84g, 3.04mmol)を用いて調製された。CH2Cl2-MeOH (95:5)までCH2Cl2で溶出するグラジエントカラムクロマトグラフィーでの精製により、無色固体として標記化合物(16.0mg, 4%) [Rf = 0.30 (CH2Cl2-MeOH, 95:5)]を得た。
(実測値: MNa+, 510.1045. C19H23N3O9NaPF 理論値[MNa+], 510.1054); 31P NMR (202 MHz, MeOD): δP 3.79, 4.09; 19F NMR (470 MHz, MeOD): δF -167.78, -167.72; 1H NMR (500 MHz, MeOD): δH 1.34 (d, 3H, J = 7.1 Hz, CHCH3, one diast.), 1.36 (d, 3H, J = 7.1 Hz, CHCH3, one diast.), 2.02-2.16 (m, 1H, H-2'), 2.25-2.34 (m, 1H, H-2'), 3.69 (s, 3H, OCH3, one diast.), 3.70 (s, 3H, OCH3, one diast.), 3.93-4.02 (m, 1H, CHCH3), 4.08-4.13 (m, 1H, H-4'), 4.27-4.45 (m, 3H, CH2OP, H-3'), 6.20-6.29 (m, 1H, H-1'), 7.18-7.28 (m, 3H, ArH), 7.35-7.40 (m, 2H, ArH), 7.85 (d, 1H, 3JH-F = 6.4 Hz, H-6); 13C NMR (125 MHz, MeOD): δC 20.2 (d, 3JC-P = 7.5 Hz, CH3), 20.5 (d, 3JC-P = 6.7 Hz, CH3), 40.8 (CH2), 40.9 (CH2), 51.5 (CH3), 51.6 (CH3), 52.7 (CH), 52.8 (CH), 67.5 (d, 2JC-P = 5.5 Hz, CH2), 67.6 (d, 2JC-P = 5.1 Hz, CH2), 72.0 (CH), 72.1 (CH), 86.7 (d, 3JC-P = 8.2 Hz, CH), 86.8 (d, 3JC-P = 8.2 Hz, CH), 86.9 (CH), 87.0 (CH), 121.2 (d, 3JC-P = 4.5 Hz, CH), 121.4 (d, 3JC-P = 4.7 Hz, CH), 125.6 (d, 5JC-P = 2.9 Hz, CH), 125.9 (d, 5JC-P = 2.9 Hz, CH), 126.2 (CH), 130.8 (CH), 130.9 (CH), 141.6 (d, 1JC-F = 233.8 Hz, C), 141.7 (d, 1JC-F = 233.9 Hz, C), 150.6 (d, 4JC-F = 3.6 Hz, C), 152.1 (d, 2JC-P = 6.8 Hz, C), 152.2 (d, 2JC-P = 6.8 Hz, C), 159.4 (d, 2JC-F = 26.0 Hz, C), 175.2 (d, 3JC-P = 4.8 Hz, C), 175.5 (d, 3JC-P = 3.7 Hz, C), m/z (ES) 510 (MNa+, 100%)
45分、1ml/分、λ=275nmで100/0から0/100までのH2O/MeOHで溶出する逆相HPLCは、tR 23.11分及びtR 24.11分(74%:24%)でジアステレオマーの2つのピークを示した。
【００９４】
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［フェニル（エトキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート(CPF 383)
【化９】
0005978232.tif 000010
前記ホスホラミダートは、一般操作Dに従って、５−フルオロ−２'デオキシウリジン(0.10g, 0.40mmol)、Ｎ−メチルイミダゾール(NMI) (0.16mL, 2.03mmol)及びフェニル（エトキシ−Ｌ−アラニニル）ホスホロクロリダート(0.35g, 1.21mmol)を用いて調製された。CH2Cl2-MeOH (95:5)までCH2Cl2で溶出するグラジエントカラムクロマトグラフィーでの精製により無色固体として標記化合物(10.0mg, 5%) [Rf = 0.11 (CH2Cl2-MeOH, 95:5)]を得た。
(実測値: MNa+, 524.1202. C20H25N3O9NaPF理論値[MNa+], 524.1210); 31P NMR (202 MHz, MeOD): δP 3.83, 4.11; 19F NMR (470 MHz, MeOD): δF -167.67, -167.61; 1H NMR (500 MHz, MeOD): δH 1.25 (t, 3H, J = 7.1 Hz, CH2CH3, one diast.), 1.26 (t, 3H, J = 7.1 Hz, CH2CH3, one diast.), 1.34 (d, 3H, J = 7.2 Hz, CHCH3, one diast.), 1.36 (d, 3H, J = 7.2 Hz, CHCH3, one diast.), 2.02-2.15 (m, 1H, H-2'), 2.24-2.34 (m, 1H, H-2'), 3.90-4.00 (m, 1H, CHCH3,), 4.08-4.19 (m, 3H, CH2CH3, H-4'), 4.27-4.45 (m, 3H, CH2OP, H-3'), 6.20-6.28 (m, 1H, H-1'), 7.18-7.28 (m, 3H, ArH), 7.34-7.39 (m, 2H, ArH), 7.85 (d, 1H, 3JH-F = 6.4 Hz, H-6); 13C NMR (125 MHz, MeOD): δC 14.4 (CH3), 15.4 (CH3), 20.3 (d, 3JC-P = 7.6 Hz, CH3), 20.5 (d, 3JC-P = 6.5 Hz, CH3), 40.8 (CH2), 40.9 (CH2), 51.6 (CH), 51.7 (CH), 62.4 (CH2), 62.5 (CH2), 67.5 (d, 2JC-P = 5.4 Hz, CH2), 67.6 (d, 2JC-P = 5.4 Hz, CH2), 72.0 (CH), 72.1 (CH), 86.7 (d, 3JC-P = 8.1 Hz, CH), 86.8 (d, 3JC-P = 8.3 Hz, CH), 86.9 (CH), 87.0 (CH), 121.3 (d, 3JC-P = 4.8 Hz, CH), 121.4 (d, 3JC-P = 4.6 Hz, CH), 125.6 (d, 5JC-P = 4.6 Hz, CH), 125.8 (d, 5JC-P = 4.8 Hz, CH), 126.3 (CH), 130.8 (CH), 130.9 (CH), 141.6 (d, 1JC-F = 233.7 Hz, C), 141.8 (d, 1JC-F = 233.8 Hz, C), 150.8 (br C), 152.0 (d, 2JC-P = 7.1 Hz, C), 152.1 (d, 2JC-P = 7.1 Hz, C), 159.6 (d, 2JC-F = 26.0 Hz, C), 174.8 (d, 3JC-P = 5.4 Hz, C), 175.1 (d, 3JC-P = 4.4 Hz, C), m/z (ES) 524 (MNa+, 100%)
45分、1ml/分、λ=275nmで100/0から0/100までのH2O/MeOHで溶出する逆相HPLCは、tR 25.63分及びtR 26.40分(71%:27%)でジアステレオマーの2つのピークを示した。
【００９５】
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［フェニル（イソプロポキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート(CPF 384)
【化１０】
0005978232.tif 000011
前記ホスホラミダートは、一般操作Dに従って、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.25g, 1.01mmol)、Ｎ−メチルイミダゾール(NMI) (0.40mL, 5.07mmol)及びフェニル（イソプロポキシ−Ｌ−アラニニル）ホスホロクロリダート(0.93g, 3.04mmol)を用いて調製された。CH2Cl2-MeOH (95:5)までCH2Cl2で溶出するグラジエントカラムクロマトグラフィーでの精製により、無色固体として標記化合物 (31.0mg, 6%) [Rf = 0.21 (CH2Cl2-MeOH, 95:5)]を得た。
(実測値: MNa+, 538.1370. C21H27N3O9NaPF 理論値[MNa+], 538.1367); 31P NMR (202 MHz, MeOD): δP 3.87, 4.13; 19F NMR (470 MHz, MeOD): δF -167.64, -167.56; 1H NMR (500 MHz, MeOD): δH 1.22-1.26 (m, 6H, CH(CH3)2), 1.33 (d, 3H, J = 7.1 Hz, CHCH3, one diast.), 1.35 (d, 3H, J = 7.1 Hz, CHCH3, one diast.), 2.00-2.15 (m, 1H, H-2'), 2.23-2.34 (m, 1H, H-2'), 3.88-3.96 (m, 1H, CHCH3), 4.08-4.14 (m, 1H, H-4'), 4.27-4.45 (m, 3H, CH2OP, H-3'), 4.98 (hept, 1H, J = 6.1 Hz, CH(CH3)2), 6.20-6.29 (m, 1H, H-1'), 7.17-7.29 (m, 3H, Ar-H), 7.34-7.40 (m, 2H, Ar-H), 7.84 (d, 1H, 3JH-F = 6.4 Hz, H-6); 13C NMR (125 MHz, MeOD): δC 20.3 (d, 3JC-P = 7.6 Hz, CH3), 20.5 (d, 3JC-P = 6.4 Hz, CH3), 21.9 (CH3x2), 22.0 (CH3x2), 40.8 (CH2), 40.9 (CH2), 51.7 (CH), 51.8 (CH), 67.5 (d, 2JC-P = 5.4 Hz, CH2), 67.6 (d, 2JC-P = 5.2 Hz, CH2), 70.2 (CH), 70.3 (CH), 72.0 (CH), 72.1 (CH), 86.6 (d, 3JC-P = 8.2 Hz, CH), 86.8 (d, 3JC-P = 8.2 Hz, CH), 86.9 (CH), 87.0 (CH), 121.2 (d, 3JC-P = 4.7 Hz, CH), 121.4 (d, 3JC-P = 4.9 Hz, CH), 125.6 (d, 5JC-P = 7.1 Hz, CH), 125.9 (d, 5JC-P = 7.1 Hz, CH), 126.3 (CH), 130.8 (CH), 130.9 (CH), 141.8 (d, 1JC-F = 234.5 Hz, C), 141.9 (d, 1JC-F = 234.4 Hz, C), 150.7 (d, 4JC-F = 3.7 Hz, C), 152.0 (d, 3JC-P = 6.2 Hz, C), 152.1 (d, 3JC-P = 6.2 Hz, C), 159.3 (d, 2JC-F = 26.3 Hz, C), 159.4 (d, 2JC-F = 26.0 Hz, C), 174.3 (d, 3JC-P = 5.6 Hz, C), 174.6 (d, 3JC-P = 4.6 Hz, C), m/z (ES) 538 (MNa+, 100%)
45分、1ml/分、λ=275nmで100/0から0/100までのH2O/MeOHで溶出する逆相HPLCは、tR 28.93分及びtR 29.45分 (44%:52%)でジアステレオマーの2つのピークを示した。
【００９６】
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［フェニル（シクロヘキソキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート(CPF 508)
【化１１】
0005978232.tif 000012
前記ホスホラミダートは、一般操作Dに従って、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.30g, 1.21mmol)、Ｎ−メチルイミダゾール(NMI) (0.48mL, 6.09mmol)及びフェニル（シクロヘキソキシ−Ｌ−アラニニル）ホスホロクロリダート(1.026g, 3.65mmol)を用いて調製された。CH2Cl2-MeOH (95:5)までCH2Cl2で溶出するグラジエントカラムクロマトグラフィーでの精製により、無色固体として標記化合物(6.7mg, 3%) [Rf = 0.45 (CH2Cl2-MeOH, 95:5)]を得た。
(実測値: MNa+, 565.48. C24H31N3O9NaPF 理論値[MNa+], 565.49); 31P NMR (202 MHz, MeOD): δP 3.86, 4.15; 19F NMR (470 MHz, MeOD): δF -167.68, -167.62; 1H NMR (500 MHz, MeOD): δH 1.26-1.40 (m, 3H, CHCH3), 1.41-1.50 (m, 4H, CH(CH2)5), 1.52-1.61 (m, 1H, CH(CH2)5), 1.70-1.88 (m, 5H, CH(CH2)5), 2.00-2.14 (m, 1H, H-2'), 2.23-2.34 (m, 1H, H-2'), 3.90-3.98 (m, 1H, CHCH3), 4.07-4.14 (m, 1H, H-4'), 4.29-4.39 (m, 2H, CH2OP), 4.40-4.45 (m, 1H, H-3'), 4.72-4.78 (m, 1H, CH(CH2)5), 6.20-6.28 (m, 1H, H-1'), 7.18-7.29 (m, 3H, ArH), 7.34-7.39 (m, 2H, ArH), 7.85 (d, 1H, 3JH-F = 6.6 Hz, H-6); 13C NMR (125 MHz, MeOD): δC 20.3 (d, 3JC-P = 7.3 Hz, CH3), 20.6 (d, 3JC-P = 6.5 Hz, CH3), 24.6 (CH2), 26.4 (CH2), 32.3 (CH2), 32.4 (CH2), 40.9 (CH2), 51.7 (CH), 51.9 (CH), 67.5 (d, 2JC-P = 5.3 Hz, CH2), 67.7 (d, 2JC-P = 5.3 Hz, CH2), 72.0 (CH), 72.1 (CH), 74.9 (CH), 86.6 (d, 3JC-P = 8.5 Hz, CH), 86.8 (d, 3JC-P = 8.5 Hz, CH), 86.9 (CH), 87.0 (CH), 121.3 (CH), 121.4 (CH), 121.5 (CH), 121.6 (CH), 125.6 (CH), 125.7 (CH), 125.8 (CH), 125.9 (CH), 126.3 (CH), 130.1 (CH), 141.5 (d, 1JC-F = 234.0 Hz, C), 150.7 (d, 4JC-P = 4.0 Hz, C), 152.0 (d, 2JC-P = 7.2 Hz, C), 152.1 (d, 2JC-P = 7.2 Hz, C), 159.4 (d, 2JC-F = 26.3 Hz, C), 174.3 (d, 3JC-P = 4.6 Hz, C), 174.5 (d, 3JC-P = 4.3 Hz, C); m/z (ES) 565 (MNa+, 100%)
45分、1ml/分、λ=275nmで100/0から0/100までのH2O/MeOHで溶出する逆相HPLCは、tR 30.00分及びtR 30.45分 (33%:65%)でジアステレオマーの2つのピークを示した。
【００９７】
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［ｐ−ニトロ−フェニル（エトキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート(CPF 430)
【化１２】
0005978232.tif 000013
前記ホスホラミダートは、一般操作Dに従って、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.25g, 1.01mmol)、Ｎ−メチルイミダゾール(NMI) (0.40mL, 5.07mmol)及びｐ−ニトロ−フェニル（エトキシ−Ｌ−アラニニル）ホスホロクロリダート(1.02g, 3.04mmol)を用いて調製された。CH2Cl2-MeOH (95:5)までCH2Cl2で溶出するグラジエントカラムクロマトグラフィーでの精製により、無色固体として標記化合物(77.0mg, 14%) [Rf = 0.24 (CH2Cl2-MeOH, 95:5)]を得た。
(実測値: MNa+, 569.1066. C20H24N4O11NaPF 理論値[MNa+], 569.1061); 31P NMR (202 MHz, MeOD): δP 3.63, 3.67; 19F NMR (470 MHz, MeOD): δF -167.89, -167.82; 1H NMR (500 MHz, MeOD): δH 1.24 (t, 3H, J = 7.0 Hz, CH2CH3), 1.25 (t, 3H, J = 7.0 Hz, CH2CH3), 1.36-1.40 (m, 3H, CHCH3), 2.16-2.25 (m, 1H, H-2'), 2.30-2.38 (m, 1H, H-2'), 3.95-4.00 (m, 1H, CHCH3), 4.09-4.19 (m, 3H, CH2CH3, H-4'), 4.32-4.48 (m, 3H, CH2OP, H-3'), 6.21-6.29 (m, 1H, H-1'), 7.46 (d, 1H, J = 8.7 Hz, ArH), 7.49 (d, 1H, J = 8.7 Hz, ArH), 7.85 (d, 1H, 3JH-F = 6.6 Hz, H-6), 7.87 (d, 1H, 3JH-F = 6.6 Hz, H-6), 8.29 (d, 2H, J = 8.7 Hz, ArH); 13C NMR (125 MHz, MeOD): δC 14.5 (CH3), 14.6 (CH3), 20.3 (d, 3JC-P = 7.5 Hz, CH3), 20.4 (d, 3JC-P = 6.4 Hz, CH3), 40.8 (CH2), 51.6 (CH), 51.7 (CH), 62.5 (CH2), 67.8 (d, 2JC-P = 5.5 Hz, CH2), 68.0 (d, 2JC-P = 5.2 Hz, CH2), 71.8 (CHx2), 86.4 (CH), 86.5 (CH), 87.0 (d, 3JC-P = 7.5 Hz, CH), 122.1 (d, 3JC-P = 5.2 Hz, CH), 122.5 (d, 3JC-P = 5.0 Hz, CH), 125.7 (CH), 126.0 (CH), 126.6 (CH), 141.3 (d, 1JC-F = 233.6 Hz, C), 141.5 (d, 1JC-F = 233.7 Hz, C), 146.2 (C), 150.6 (d, 4JC-P = 4.6 Hz, C), 156.9 (d, 2JC-P = 2.6 Hz, C), 157.0 (d, 2JC-P = 2.6 Hz, C), 159.3 (d, 2JC-F = 26.3 Hz, C), 174.6 (d, 3JC-P = 4.6 Hz, C), 174.9 (d, 3JC-P = 3.7 Hz, C), m/z (ES) 569 (MNa+, 100%)
45分、1ml/分、λ=275nmで100/0から0/100までのH2O/MeOHで溶出する逆相HPLCは、tR 31.63分及びtR 31.89分(11%:85%)でジアステレオマーの2つのピークを示した。
【００９８】
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（ベンゾキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート(CPF 373)
【化１３】
0005978232.tif 000014
前記ホスホラミダートは、一般操作Dに従って、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.25g, 1.01mmol)、Ｎ−メチルイミダゾール(NMI) (0.40mL, 5.07mmol)及び１−ナフチル（ベンゾキシ−Ｌ−アラニニル）ホスホロクロリダート(0.82g, 3.04mmol)を用いて調製された。CH2Cl2-MeOH (95:5)までCH2Cl2で溶出するグラジエントカラムクロマトグラフィーでの精製により、無色固体として標記化合物(47.0mg, 8%) [Rf = 0.19 (CH2Cl2-MeOH, 95:5)]が得られた。
(実測値: MNa+, 636.1520. C29H29N3O9NaPF 理論値[MNa+], 636.1523); 31P NMR (202 MHz, MeOD): δP 4.24, 4.59; 19F NMR (470 MHz, MeOD): δF -167.36, -167.18; 1H NMR (500 MHz, MeOD): δH 1.34-1.38 (m, 3H, CHCH3), 1.67-1.79 (m, 1H, H-2'), 2.08-2.17 (m, 1H, H-2'), 4.03-4.15 (m, 2H, CHCH3, H-4'), 4.24-4.36 (m, 3H, CH2OP, H-3'), 5.08 (d, 1H, J = 12.0 Hz, OCHHPh), 5.13 (d, 1H, J = 12.0 Hz, OCHHPh), 6.09-6.16 (m, 1H, H-1'), 7.27-7.45 (m, 6H, ArH), 7.47-7.55 (m, 3H, ArH), 7.67-7.72 (m, 2H, ArH, H-6), 7.86-7.90 (m, 1H, ArH), 8.12-8.18 (m, 1H, ArH); 13C NMR (125 MHz, MeOD): δC 20.3 (d, 3JC-P = 7.6 Hz, CH3), 20.5 (d, 3JC-P = 6.5 Hz, CH3), 40.8 (CH2), 40.9 (CH2), 51.8 (CH), 51.9 (CH), 67.6 (d, 2JC-P = 5.3 Hz, CH2), 67.8 (d, 2JC-P = 5.2 Hz, CH2), 68.0 (CH2), 68.1 (CH2), 72.0 (CH), 72.1 (CH), 86.7 (d, 3JC-P = 8.1 Hz, CH), 86.8 (d, 3JC-P = 8.1 Hz, CH), 86.9 (CH), 87.0 (CH), 116.2 (d, 3JC-P = 3.3 Hz, CH), 116.5 (d, 3JC-P = 3.5 Hz, CH), 122.6 (CH), 125.3 (CH), 125.4 (CH), 125.6 (CH), 125.7 (CH), 126.2 (CH), 126.5 (CH), 126.6 (CH), 127.6 (CH), 127.7 (CH), 127.8 (C), 127.9 (C), 128.0 (CH), 128.1 (CH), 128.9 (CH), 129.0 (CH), 129.4 (CH), 129.5 (CH), 129.6 (CH), 129.7 (CH), 136.2 (C), 137.1 (C), 137.2 (C), 141.6 (d, 1JC-F = 233.8 Hz, C), 141.7 (d, 1JC-F = 233.9 Hz, C), 147.8 (d, 2JC-P = 7.7 Hz, C), 147.9 (d, 2JC-P = 7.4 Hz, C), 150.5 (d, 4JC-F = 4.0 Hz, C), 159.3 (d, 2JC-F = 26.1 Hz, C), 174.6 (d, 3JC-P = 5.0 Hz, C), 174.9 (d, 3JC-P = 4.3 Hz, C), m/z (ES) 636 (MNa+, 100%)
45分、1ml/分、λ=275nmで100/0から0/100までのH2O/MeOHで溶出する逆相HPLCは、tR 34.23分及びtR 34.59分(23%:76%)でジアステレオマーの2つのピークを示した。
【００９９】
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（メトキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート(CPF 385)
【化１４】
0005978232.tif 000015
前記ホスホラミダートは、一般操作Dに従って、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.25g, 1.01mmol)、Ｎ−メチルイミダゾール(NMI) (0.40mL, 5.07mmol)及び１−ナフチル（メトキシ−Ｌ−アラニニル）ホスホロクロリダート(0.99g, 3.04mmol)を用いて調製された。CH2Cl2-MeOH (95:5)までCH2Cl2で溶出するグラジエントカラムクロマトグラフィーでの精製により、無色固体として標記化合物 (7.0mg, 1%) [Rf = 0.23 (CH2Cl2-MeOH, 95:5)]を得た。
(実測値: MNa+, 560.1198. C23H25N3O9NaPF 理論値[MNa+], 560.1210); 31P NMR (202 MHz, MeOD): δP 4.31, 4.56; 19F NMR (470 MHz, MeOD): δF -167.51, -167.37; 1H NMR (500 MHz, MeOD): δH 1.34 (d, 3H, J = 6.7 Hz, CHCH3, one diast.), 1.36 (d, 3H, J = 6.7 Hz, CHCH3, one diast.), 1.76-1.87 (m, 1H, H-2'), 2.12-2.22 (m, 1H, H-2'), 3.64 (s, 3H, OCH3, one diast.), 3.65 (s, 3H, OCH3, one diast.), 4.03-4.13 (m, 2H, CHCH3, H-4'), 4.30-4.38 (m, 2H, CH2OP), 4.41 (dd, 1H, J = 2.5 Hz, J = 5.8 Hz, H-3'), 6.12-6.19 (m, 1H, H-1'), 7.41-7.46 (m, 1H, ArH), 7.50-7.58 (m, 3H, ArH), 7.70-7.76 (m, 2H, H-6, ArH), 7.87-7.91 (m, 1H, ArH), 8.15-8.20 (m, 1H, ArH); 13C NMR (125 MHz, MeOD): δC 20.3 (d, 3JC-P = 7.1 Hz, CH3), 20.4 (d, 3JC-P = 6.5 Hz, CH3), 40.7 (CH2), 40.8 (CH2), 51.6 (CH3), 51.7 (CH3), 52.7 (CH), 52.8 (CH), 67.8 (d, 2JC-P = 5.7 Hz, CH2), 67.5 (d, 2JC-P = 5.7 Hz, CH2), 72.0 (CH), 72.1 (CH), 86.7 (d, 3JC-P = 7.9 Hz, CH), 86.9 (d, 3JC-P = 8.5 Hz, CH), 86.9 (CH), 87.0 (CH), 116.2 (d, 3JC-P = 3.1 Hz, CH), 116.5 (d, 3JC-P = 3.5 Hz, CH), 122.5 (CH), 122.6 (CH), 125.4 (CH), 125.5 (CH), 125.6 (CH), 125.7 (CH), 126.1 (CH), 126.2 (CH), 126.5 (CH), 126.6 (CH), 127.6 (CH), 127.7 (Cx2), 127.8 (CH), 127.9 (CH), 128.9 (CH), 129.0 (CH), 136.3 (C), 141.6 (d, 1JC-F = 233.4 Hz, C), 141.7 (d, 1JC-F = 234.1 Hz, C), 147.8 (d, 2JC-P = 7.9 Hz, C), 148.0 (d, 2JC-P = 7.2 Hz, C), 150.6 (C), 159.4 (d, 2JC-F = 27.0 Hz, C), 175.2 (d, 3JC-P = 3.9 Hz, C), 175.5 (d, 3JC-P = 3.9 Hz, C), m/z (ES) 560 (MNa+, 100%)
45分、1ml/分、λ=275nmで100/0から0/100までのH2O/MeOHで溶出する逆相HPLCは、tR 28.45分及びtR 28.85分 (73%:25%)でジアステレオマーの2つのピークを示した。
【０１００】
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（エトキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート(CPF 386)
【化１５】
0005978232.tif 000016
前記ホスホラミダートは、一般操作Dに従って、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.25g, 1.01mmol)、Ｎ−メチルイミダゾール(NMI) (0.40mL, 5.07mmol)及び１−ナフチル（エトキシ−Ｌ−アラニニル）ホスホロクロリダート(1.04g, 3.04mmol)を用いて調製された。CH2Cl2-MeOH (95:5)までCH2Cl2で溶出するグラジエントカラムクロマトグラフィーでの精製により、無色固体として標記化合物(47.0mg, 4%) [Rf = 0.25 (CH2Cl2-MeOH, 95:5)]を得た。
(実測値: MNa+, 574.1360. C24H27N3O9NaPF 理論値[MNa+], 574.1367); 31P NMR (202 MHz, MeOD): δP 4.34, 4.55; 19F NMR (470 MHz, MeOD): δF -167.31, -167.16; 1H NMR (500 MHz, MeOD): δH 1.20 (t, 3H, J = 7.0 Hz, CH2CH3, one diast.), 1.21 (t, 3H, J = 7.0 Hz, CH2CH3, one diast.), 1.33-1.37 (m, 3H, CHCH3), 1.73-1.86 (m, 1H, H-2'), 2.12-2.21 (m, 1H, H-2'), 4.01-4.07 (m, 1H, CHCH3), 4.08-4.13 (m, 3H, CH2CH3, H-4'), 4.31-4.43 (m, 3H, CH2OP, H-3'), 6.11-6.19 (m, 1H, H-1'), 7.39-7.46 (m, 1H, ArH), 7.50-7.57 (m, 3H, ArH), 7.68-7.75 (m, 2H, ArH, H-6), 7.86-7.91 (m, 1H, ArH), 8.15-8.20 (m, 1H, ArH); 13C NMR (125 MHz, MeOD): δC 14.4 (CH3), 20.3 (d, 3JC-P = 7.4 Hz, CH3), 20.5 (d, 3JC-P = 6.2 Hz, CH3), 40.8 (CH2), 40.9 (CH2), 51.8 (CH), 51.9 (CH), 62.4 (CH2), 62.5 (CH2), 67.8 (d, 2JC-P = 4.6 Hz, CH2), 67.9 (d, 2JC-P = 4.6 Hz, CH2), 72.0 (CH), 72.1 (CH), 86.7 (d, 3JC-P = 8.4 Hz, CH), 86.8 (d, 3JC-P = 8.4 Hz, CH), 86.9 (CH), 87.0 (CH), 116.1 (d, 3JC-P = 3.5 Hz, CH), 116.5 (d, 3JC-P = 3.5 Hz, CH), 122.6 (CH), 125.4 (CH), 125.5 (CH), 125.7 (CH), 125.8 (CH), 126.1 (CH), 126.2 (CH), 126.5 (CH), 126.6 (CH), 127.5 (CH), 127.6 (C), 127.7 (C), 127.8 (CH), 127.9 (CH), 128.9 (CH), 129.0 (CH), 136.3 (C), 141.6 (d, 1JC-F = 233.3 Hz, C), 141.7 (d, 1JC-F = 233.4 Hz, C), 147.8 (d, 2JC-P = 6.9 Hz, C), 148.0 (d, 2JC-P = 6.9 Hz, C), 150.6 (C), 159.3 (d, 2JC-F = 26.3 Hz, C), 174.8 (d, 3JC-P = 4.8 Hz, C), 175.1 (d, 3JC-P = 4.0 Hz, C); m/z (ES) 574 (MNa+, 100%)
45分、1ml/分、λ=275nmで100/0から0/100までのH2O/MeOHで溶出する逆相HPLCは、tR 30.77分及びtR 31.20分(51%:48%)でジアステレオマーの2つのピークを示した。
【０１０１】
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（イソプロポキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート(CPF 387)
【化１６】
0005978232.tif 000017
前記ホスホラミダートは、一般操作Eに従って、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.10g, 0.40mmol)、テトラヒドロフラン中のtert-ブチルマグネシウムクロリド(tBuMgCl) (1.0M, 0.61mL, 0.61mmol)及び１−ナフチル（イソプロポキシ−Ｌ−アラニニル）ホスホロクロリダート(0.31g, 0.89mmol)を用いて調製された。CH2Cl2-MeOH (95:5)までCH2Cl2で溶出するグラジエントカラムクロマトグラフィーでの精製により、無色固体として標記化合物(71.0mg, 17%) [Rf = 0.21 (CH2Cl2-MeOH, 95:5)]を得た。
(実測値: MNa+, 588.1521. C25H29N3O9NaPF 理論値[MNa+], 588.1523); 31P NMR (202 MHz, MeOD): δP 4.38, 4.58; 19F NMR (470 MHz, MeOD): δF -167.43, -167.26; 1H NMR (500 MHz, MeOD): δH 1.19-1.23 (m, 6H, CH(CH3)2), 1.34-1.38 (m, 3H, CHCH3), 1.68-1.84 (m, 1H, H-2'), 2.09-2.20 (m, 1H, H-2'), 3.96-4.05 (m, 1H, CHCH3), 4.07-4.12 (m, 1H, H-4'), 4.29-4.38 (m, 2H, CH2OP), 4.39-4.42 (m, 1H, H-3'), 4.93-5.01 (m, 1H, CH(CH3)2), 5.10-6.18 (m, 1H, H-1'), 7.40-7.46 (m, 1H, ArH), 7.50-7.57 (m, 3H, ArH), 7.70-7.75 (m, 2H, H-6, ArH), 7.87-7.92 (m, 1H, ArH), 8.16-8.20 (m, 1H, ArH); 13C NMR (125 MHz, MeOD): δC 20.3 (d, 3JC-P = 7.1 Hz, CH3), 20.5 (d, 3JC-P = 6.6 Hz, CH3), 21.8 (CH3), 21.9 (CH3), 22.0 (CH3), 22.1 (CH3), 40.8 (CH2), 40.9 (CH2), 51.9 (CH), 52.0 (CH), 67.8 (d, 2JC-P = 4.5 Hz, CH2), 67.9 (d, 2JC-P = 4.8 Hz, CH2), 70.2 (CH), 70.3 (CH), 72.0 (CH), 72.1 (CH), 86.6 (CH), 86.7 (CH), 86.9 (d, 3JC-P = 8.6 Hz, CH), 87.0 (d, 3JC-P = 8.6 Hz, CH), 116.2 (d, 3JC-P = 2.5 Hz, CH), 116.5 (d, 3JC-P = 2.7 Hz, CH), 122.6 (CH), 125.5 (CH), 125.7 (CH), 126.1 (CH), 126.2 (CH), 126.5 (CH), 127.5 (CH), 127.6 (C), 127.7 (C), 127.8 (CH), 127.9 (CH), 128.9 (CH), 129.0 (CH), 136.3 (C), 141.6 (d, 1JC-F = 233.2 Hz, C), 141.7 (d, 1JC-F = 233.4 Hz, C), 147.7 (d, 2JC-P = 7.6 Hz, C), 147.9 (d, 2JC-P = 7.7 Hz, C), 150.5 (C), 159.4 (d, 2JC-F = 26.2 Hz, C), 174.4 (d, 3JC-P = 5.0 Hz, C), 174.7 (d, 3JC-P = 5.1 Hz, C); m/z (ES) 588 (MNa+, 100%)
45分、1ml/分、λ=275nmで100/0から0/100までのH2O/MeOHで溶出する逆相HPLCは、tR 32.20分及びtR 32.80分(27%:69%)でジアステレオマーの2つのピークを示した。
【０１０２】
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（シクロヘキソキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート(CPF 509)
【化１７】
0005978232.tif 000018
前記ホスホラミダートは、一般操作Dに従って、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.30g, 1.21mmol)、Ｎ−メチルイミダゾール(NMI) (0.48mL, 6.09mmol)及びフェニル（シクロヘキソキシ−Ｌ−アラニニル）ホスホロクロリダート(1.45g, 3.65mmol)を用いて調製された。CH2Cl2-MeOH (95:5)までCH2Cl2で溶出するグラジエントカラムクロマトグラフィーでの精製により、無色固体として標記化合物(6.7mg, 3%) [Rf = 0.47 (CH2Cl2-MeOH, 95:5)]を得た。
(実測値: MNH4+, 623.2261. C28H37N4O9NaPF 理論値[MNH4+], 623.2282); 31P NMR (202 MHz, MeOD): δP 4.35, 4.52; 19F NMR (470 MHz, MeOD): δF -167.31, -167.17; 1H NMR (500 MHz, MeOD): δH 1.30-1.43 (m, 3H, CHCH3), 1.44-1.56 (m, 4H, CH(CH2)5), 1.57-1.66 (m, 1H, CH(CH2)5), 1.67-1.83 (m, 5H, CH(CH2)5), 1.84-1.93 (m, 1H, H-2'), 2.09-2.20 (m, 1H, H-2'), 3.98-4.06 (m, 1H, CHCH3), 4.07-4.15 (m, 1H, H-4'), 4.29-4.38 (m, 2H, CH2OP), 4.39-4.44 (m, 1H, H-3'), 4.67-4.76 (m, 1H, CH(CH2)5), 6.09-6.19 (m, 1H, H-1'), 7.38-7.57 (m, 5H, ArH), 7.68-7.75 (m, 1H, ArH), 7.79-7.92 (m, 1H, ArH), 8.17 (d, 1H, 3JH-F = 6.6 Hz, H-6); 13C NMR (125 MHz, MeOD): δC 20.4 (d, 3JC-P = 8.0 Hz, CH3), 20.6 (d, 3JC-P = 6.5 Hz, CH3), 24.5 (CH2), 26.3 (CH2), 32.3 (CH2), 40.8 (CH2), 51.8 (CH), 51.9 (CH), 67.8 (CH2), 72.0 (CH), 72.2 (CH), 75.0 (CH), 86.7 (d, 3JC-P = 8.2 Hz, CH), 87.0 (CH), 116.1 (d, 3JC-P = 2.5 Hz, CH), 116.4 (d, 3JC-P = 3.0 Hz, CH), 122.6 (CH), 124.8 (CH), 125.9 (CH), 126.1 (CH), 126.2 (CH), 126.4 (CH), 126.5 (CH), 126.6 (CH), 127.6 (CH), 127.7 (Cx2), 127.8 (CH), 127.9 (CH), 128.9 (CH), 129.0 (CH), 136.3 (C), 141.6 (C), 148.0 (d, 2JC-P = 7.2 Hz, C), 150.6 (C), 159.4 (d, 2JC-F = 27.0 Hz, C), 175.2 (d, 3JC-P = 3.9 Hz, C), 175.5 (d, 3JC-P = 3.9 Hz, C); m/z (ES) 623 (MNH4+, 100%)
45分、1ml/分、λ=275nmで100/0から0/100までのH2O/MeOHで溶出する逆相HPLCは、tR 30.50分及びtR 31.48分(27%:69%)でジアステレオマーの2つのピークを示した。
【０１０３】
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［フェニル（ベンゾキシ−α,α−ジメチルグリシン）］ホスフェート(CPF 393)
【化１８】
0005978232.tif 000019
前記ホスホラミダートは、一般操作Eに従って、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.40g, 1.62mmol)、テトラヒドロフラン中のtert-ブチルマグネシウムクロリド(tBuMgCl) (1.0M, 2.43mL, 2.43mmol)及びフェニル（ベンゾキシ−α,α−ジメチルグリシン）ホスホロクロリダート(1.17g, 3.20mmol)を用いて調製された。CH2Cl2-MeOH (95:5)までCH2Cl2で溶出するグラジエントカラムクロマトグラフィーでの精製により、無色固体として標記化合物(69.0mg, 7%) [Rf = 0.27 (CH2Cl2-MeOH, 95:5)]を得た。
(実測値: MNa+, 600.1527. C26H29N3O9NaPF 理論値[MNa+], 600.1523); 31P NMR (202 MHz, MeOD): δP 2.42, 2.47; 19F NMR (470 MHz, MeOD): δF -167.80, -167.62; 1H NMR (500 MHz, MeOD): δH 1.51-1.60 (m, 6H, C(CH3)2), 1.89-1.97 (m, 1H, H-2', one diast.), 2.07-2.15 (m, 1H, H-2', one diast.), 2.21 (ddd, 1H, J = 3.4 Hz, 5.9 Hz, 13.5 Hz, H-2', one diast.), 2.29 (ddd, 1H, J = 3.2 Hz, 6.1 Hz, 13.5 Hz, H-2', one diast.), 4.00-4.07 (m, 1H, H-4'), 4.22-4.31 (m, 2H, CH2OP), 4.32-4.36 (m, 1H, H-3', one diast.), 4.37-4.41 (m, 1H, H-3', one diast.), 5.08-5.18 (m, 2H, OCH2Ph), 6.19-6.25 (m, 1H, H-1'), 7.20-7.26 (m, 3H, ArH), 7.27-7.39 (m, 7H, ArH), 7.74 (d, 3JH-F = 6.4 Hz, H-6, one diast.), 7.80 (d, 3JH-F = 6.4 Hz, H-6, one diast.); 13C NMR (125 MHz, MeOD): δC 27.5 (CH3), 27.7 (d, 3JC-P = 7.1 Hz, CH3), 27.8 (d, 3JC-P = 7.1 Hz, CH3), 40.8 (CH2), 40.9 (CH2), 58.2 (C), 58.3 (C), 67.6 (d, 2JC-P = 5.5 Hz, CH2), 67.7 (d, 2JC-P = 5.5 Hz, CH2), 68.3 (CH2), 71.9 (CH), 72.0 (CH), 86.6 (d, 3JC-P = 8.1 Hz, CH), 86.8 (d, 3JC-P = 7.3 Hz, CH), 86.9 (CH), 121.4 (d, 3JC-P = 4.8 Hz, CH), 121.6 (d, 3JC-P = 4.5 Hz, CH), 125.6 (CH), 125.8 (CH), 125.9 (CH), 126.1 (CH), 126.2 (CH), 129.3 (CH), 129.4 (CH), 129.6 (CH), 130.7 (CH), 130.8 (CH), 137.2 (C), 137.3 (C), 141.8 (d, 1JC-F = 233.7 Hz, C), 150.6 (C), 152.1 (d, 4JC-F = 7.0 Hz, C), 152.1 (d, 4JC-F = 7.6 Hz, C), 159.3 (d, 2JC-F = 26.1 Hz, C), 159.4 (d, 2JC-F = 26.1 Hz, C), 176.5 (d, 3JC-P = 4.0 Hz, C), 176.6 (d, 3JC-P = 3.8 Hz, C), m/z (ES) 600.1 (MNa+, 100%)
35分、1ml/分、λ=275nmで100/0から0/100までのH2O/MeOHで溶出する逆相HPLCは、tR 17.71 (96%)でジアステレオマーの混合物の1つのピークを示した。
【０１０４】
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［フェニル（エトキシ−α,α−ジメチルグリシン）］ホスフェート(CPF 394)
【化１９】
0005978232.tif 000020
前記ホスホラミダートは、一般操作Dに従って、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.20g, 0.80mmol)、Ｎ−メチルイミダゾール(NMI) (0.31mL, 4.0mmol)及びフェニル（エトキシ−α,α−ジメチルグリシン）ホスホロクロリダート(0.73g, 2.40mmol)を用いて調製された。CH2Cl2-MeOH (95:5)までCH2Cl2で溶出するグラジエントカラムクロマトグラフィーでの精製により、無色固体として標記化合物(25.0mg,6%) [Rf = 0.24 (CH2Cl2-MeOH, 95:5)]を得た。
(実測値: MNa+, 538.1367. C21H27N3O9NaPF 理論値[MNa+], 538.1367); 31P NMR (202 MHz, MeOD): δP 2.49, 2.52; 19F NMR (470 MHz, MeOD): δF -167.62, -167.58; 1H NMR (500 MHz, MeOD): δH 1.24 (t, 3H, J = 7.1 Hz, CH2CH3, one diast.), 1.26 (t, 3H, J = 7.1 Hz, CH2CH3, one diast.), 1.44-1.54 (m, 6H, C(CH3)2), 1.95-2.04 (m, 1H, H-2', one diast.), 2.13-2.21 (m, 1H, H-2', one diast.), 2.24 (ddd, 1H, J = 3.1 Hz, J = 6.3 Hz, J = 13.5 Hz, H-2', one diast.), 2.31 (ddd, 1H, J = 3.2 Hz, J = 6.1 Hz, J = 13.7 Hz, H-2', one diast.), 4.08-4.19 (m, 3H, CH2CH3, H-4'), 4.33-4.49 (m, 3H, CH2OP, H-3'), 6.20-6.30 (m, 1H, H-1'), 7.23-7.28 (m, 3H, ArH), 7.33-7.40 (m, 2H, ArH), 7.80 (d, 3JH-F = 6.4 Hz, H-6, one diast.), 7.88 (d, 3JH-F = 6.4 Hz, H-6, one diast.); 13C NMR (125 MHz, MeOD): δC 14.4 (CH3), 14.5 (CH3), 27.5 (d, 3JC-P = 7.3 Hz, CH3), 27.7 (d, 3JC-P = 7.6 Hz, CH3), 27.8 (d, 3JC-P = 7.6 Hz, CH3), 40.8 (CH2), 40.9 (CH2), 58.1 (C), 62.6 (CH2), 62.7 (CH2), 67.6 (d, 2JC-P = 6.7 Hz, CH2), 67.7 (d, 2JC-P = 5.8 Hz, CH2), 71.9 (CH), 72.0 (CH), 86.6 (d, 3JC-P = 8.1 Hz, CH), 86.8 (d, 3JC-P = 7.6 Hz, CH), 86.9 (CH), 121.4 (d, 3JC-P = 4.4 Hz, CH), 121.6 (d, 3JC-P = 4.4 Hz, CH), 125.6 (CH), 125.8 (CH), 125.9 (CH), 126.1 (CH), 126.2 (CH), 130.7 (CH), 130.8 (CH), 130.9 (CH), 141.8 (d, 1JC-F = 233.5 Hz, C), 150.6 (C), 150.7 (C), 152.2 (d, 4JC-F = 7.3 Hz, C), 152.3 (d, 4JC-F = 6.9 Hz, C), 159.2 (d, 2JC-F = 20.3 Hz, C), 159.4 (d, 2JC-F = 20.4 Hz, C), 176.6 (d, 3JC-P = 4.2 Hz, C), 176.8 (d, 3JC-P = 4.6 Hz, C), m/z (ES) 538.1 (MNa+, 100%)
45分、1ml/分、λ=275nmで100/0から0/100までのH2O/MeOHで溶出する逆相HPLCは、tR 18.76分及びtR 20.44分(68%:30%)でジアステレオマーの2つのピークを示した。
【０１０５】
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（ベンゾキシ−α,α−ジメチルグリシン）］ホスフェート(CPF 395)
【化２０】
0005978232.tif 000021
前記ホスホラミダートは、一般操作Dに従って、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.40g, 1.62mmol)、Ｎ−メチルイミダゾール(NMI) (0.64mL, 8.0mmol)及び１−ナフチル（ベンゾキシ−α,α−ジメチルグリシン）ホスホロクロリダート(2.00g, 4.80mmol)を用いて調製された。CH2Cl2-MeOH (95:5)までCH2Cl2で溶出するグラジエントカラムクロマトグラフィーでの精製により、無色固体として標記化合物(16.4mg,6%) [Rf = 0.15 (CH2Cl2-MeOH, 95:5)]を得た。
(実測値: MNa+, 650.1678. C30H31N3O9NaPF 理論値[MNa+], 650.1680); 31P NMR (202 MHz, MeOD): δP 2.87, 3.03; 19F NMR (470 MHz, MeOD): δF -167.95, -167.13; 1H NMR (500 MHz, MeOD): δH 1.37-1.42 (m, 6H, C(CH3)2), 1.61-1.69 (m, 1H, H-2', one diast.), 1.79-1.87 (m, 1H, H-2', one diast.), 2.06 (ddd, 1H, J = 3.0 Hz, J = 6.1 Hz, J = 13.6 Hz, H-2', one diast.), 2.15 (ddd, 1H, J = 3.2 Hz, J = 5.9 Hz, J = 13.7 Hz, H-2', one diast.), 3.98-4.04 (m, 1H, H-4'), 4.19-4.35 (m, 3H, CH2OP, H-3'), 5.09-5.13 (m, 1H, OCHHPh), 5.18-5.19 (m, 1H, OCHHPh), 6.05-6.15 (m, 1H, H-1'), 7.28-7.40 (m, 7H, ArH), 7.48-7.55 (m, 3H, ArH), 7.62 (d, 3JH-F = 6.4 Hz, H-6, one diast.), 7.70 (d, 3JH-F = 6.4 Hz, H-6, one diast.), 7.86-7.90 (m, 1H, ArH), 8.17-8.22 (m, 1H, ArH); 13C NMR (125 MHz, MeOD): δC 27.5 (d, 3JC-P = 4.4 Hz, CH3), 27.9 (d, 3JC-P = 7.3 Hz, CH3), 28.0 (d, 3JC-P = 7.3 Hz, CH3), 40.7 (CH2), 40.8 (CH2), 65.2 (C), 67.8 (d, 2JC-P = 6.5 Hz, CH2), 68.3 (CH2), 72.0 (CH), 72.1 (CH), 86.6 (d, 3JC-P = 8.2 Hz, CH), 86.8 (d, 3JC-P = 7.8 Hz, CH), 86.9 (CH), 116.3 (d, 3JC-P = 3.2 Hz, CH), 116.7 (d, 3JC-P = 2.9 Hz, CH), 122.8 (CH), 122.9 (CH), 125.4 (CH), 125.5 (CH), 125.6 (CH), 126.0 (CH), 126.1 (CH), 126.4 (CH), 126.5 (CH), 127.4 (CH), 127.5 (CH), 127.7 (CH), 127.8 (CH), 127.9 (C), 128.0 (CH), 128.9 (CH), 129.3 (CH), 129.4 (CH), 129.6 (CH), 136.2 (C), 137.3 (C), 141.8 (d, 1JC-F = 234.4 Hz, C), 147.9 (d, 3JC-P = 7.7 Hz, C), 148.0 (d, 3JC-P = 8.2 Hz, C), 150.7 (d, 4JC-F = 3.7 Hz, C), 159.5 (d, 2JC-F = 25.8 Hz, C), 159.6 (d, 2JC-F = 25.8 Hz, C), 176.5 (C), 176.6 (C), m/z (ES) 650.0 (MNa+, 100%)
45分、1ml/分、λ=275nmで100/0から0/100までのH2O/MeOHで溶出する逆相HPLCは、tR 20.80分及びtR 21.00分(72%:24%)でジアステレオマーの2つのピークを示した。
【０１０６】
５−フルオロ−２'デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（エトキシ−α,α−ジメチルグリシン）］ホスフェート(CPF 396)
【化２１】
0005978232.tif 000022
前記ホスホラミダートは、一般操作Eに従って、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.40g, 1.62mmol)、テトラヒドロフラン中のtert-ブチルマグネシウムクロリド(tBuMgCl) (1.0M, 2.43mL, 2.43mmol)及び１−ナフチル（エトキシ−α,α−ジメチルグリシン）ホスホロクロリダート(1.14g, 3.20mmol)を用いて調製された。CH2Cl2-MeOH (95:5)までCH2Cl2で溶出するグラジエントカラムクロマトグラフィーでの精製により、無色固体として標記化合物(54.0mg, 2%) [Rf = 0.10 (CH2Cl2-MeOH, 95:5)]を得た。
(実測値: MNa+, 588.1528. C25H29N3O9NaPF 理論値[MNa+], 588.1523); 31P NMR (202 MHz, MeOD): δP 2.91, 3.03; 19F NMR (470 MHz, MeOD): δF -167.38, -167.21; 1H NMR (500 MHz, MeOD): δH 1.24 (t, 3H, J = 7.1 Hz, CH2CH3, one diast.), 1.25 (t, 3H, J = 7.1 Hz, CH2CH3, one diast.), 1.50-1.55 (m, 6H, C(CH3)2), 1.68-1.76 (m, 1H, H-2', one diast.), 1.87-1.94 (m, 1H, H-2', one diast.), 2.09 (ddd, 1H, J = 2.9 Hz, J = 6.3 Hz, J = 13.4 Hz, H-2', one diast.), 2.19 (ddd, 1H, J = 3.0 Hz, J = 6.3 Hz, J = 13.8 Hz, H-2', one diast.), 4.07-4.10 (m, 1H, H-4'), 4.16 (q, 2H, J = 7.1 Hz, CH2CH3), 4.36-4.41 (m, 3H, CH2OP, H-3'), 6.10-6.18 (m, 1H, H-1'), 7.40-7.46 (m, 1H, ArH), 7.50-7.59 (m, 3H, ArH), 7.66-7.72 (m, 2H, ArH, H-6), 7.85-7.91 (m, 1H, ArH), 8.18-8.24 (m, 1H, ArH); 13C NMR (125 MHz, MeOD): δC 14.4 (CH3), 27.5 (br s, CH3), 27.9 (d, 3JC-P = 6.1 Hz, CH3), 28.0 (d, 3JC-P = 6.1 Hz, CH3), 40.7 (CH2), 40.8 (CH2), 58.2 (C), 58.3 (C), 62.6 (CH2), 67.8 (d, 2JC-P = 4.9 Hz, CH2), 67.9 (d, 2JC-P = 4.5 Hz, CH2), 72.0 (CH), 72.1 (CH), 86.7 (d, 3JC-P = 7.7 Hz, CH), 86.9 (d, 3JC-P = 7.3 Hz, CH), 87.0 (CH), 116.3 (d, 3JC-P = 3.2 Hz, CH), 116.6 (d, 3JC-P = 2.9 Hz, CH), 122.8 (CH), 122.9 (CH), 125.4 (CH), 125.6 (CH), 125.7 (CH), 126.0 (CH), 126.1 (CH), 126.5 (CH), 127.4 (CH), 127.5 (CH), 127.7 (CH), 127.8 (CH), 127.9 (C), 128.0 (C), 128.9 (CH), 136.2 (C), 141.8 (d, 1JC-F = 233.5 Hz, C), 148.0 (d, 2JC-P = 7.3 Hz, C), 148.1 (d, 2JC-P = 7.6 Hz, C), 150.5 (C), 150.6 (C), 159.3 (d, 2JC-F = 26.2 Hz, C), 159.4 (d, 2JC-F = 26.6 Hz, C), 176.8 (C), 176.9 (C); m/z (ES) 588.1 (MNa+, 100%)
45分、1ml/分、λ=275nmで100/0から0/100までのH2O/MeOHで溶出する逆相HPLCは、tR 16.05分(96%)でジアステレオマーの混合物の１つのピークを示した。
【０１０７】
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［フェニル（ベンゾキシ−Ｌ−プロリニル）］ホスフェート(CPF 583)
【化２２】
0005978232.tif 000023
THF (10mL)で、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.25g, 1.01mmol)、NMI (0.41g, 5.07mmol, 0.40mL)及びフェニル（ベンゾキシ−Ｌ−プロリニル）−ホスホクロリダート(0.77g, 2.03mmol)から標準操作Dに従って調製された。生成物が、カラム精製と、その後の2回の分取TLC精製とによって白色固体(0.010g, 2%)として得られた。
31P-NMR (MeOD, 202 MHz) δ 1.82
19F-NMR (MeOD, 470 MHz) δ - 167.91 
1H-NMR (MeOD, 500 MHz) δ 7.84 (d, J = 7.18 Hz, 1H, H-塩基), 7.39 - 7.33 (m, 7H, H-Ar), 7.22 - 7.19 (m, 3H, H-Ar), 6.26 - 6.23 (m, 1H, H-1'), 5.22 - 5.13 (m, CH2Phエステル), 4.40 - 4.35 (m, 3H, NCH, 2 x H-5'), 4.33 - 4.28 (m, 1H, H-3'), 4.06 - 4.04 (m, 1H, H-4'), 3.36 - 3.32 (m, 2H, NCH2), 2.26 - 2.19 (m, 1H, H-2'), 2.18 - 2.13 (m, 1H, CH2-L-Pro), 2.00 - 1.81 (m, 4H, 3 x H, CH2-L-Pro, 1 x H, H-2')
13C-NMR (MeOD, 125 MHz) δ 174.81 (C=O, エステル), 159.40 (C=O, 塩基), 152.0 (d, 2JC-P = 6.32 Hz, OC-Ar), 150.71 (C=O, 塩基), 141.88 (1JC-F = 232 Hz, CF, 塩基), 137.23 (C-Ar), 131.33, 129.70, 129.48, 129.45, 129.30, 126.45 (CH-Ar), 125.80, 125.53 (2 x d, 2JC-F = 29.0 Hz, CH-塩基), 121.00, 120.96 (CH-Ar), 87.80 (C-1'), 86.80 (C-4'), 72.02 (C-3'), 68.16 (CH2Ph), 67.64 (d, 2JC-P = 4.65 Hz, C-5'), 62.40 (d, 2JC-P = 5.60 Hz, NCH), 48.03 (d, 2JC-P = 4.80 Hz, NCH2), 41.07 (C-2'), 32.18, 32.11 (CH2-L-Pro), 26.29, 26.21 (CH2-L-Pro).
MS (ES+) m/e: 612 (MNa+, 100%), 590 (MH+, 1%) 精密質量: C27H29FN3O9P 理論値589.51
【０１０８】
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（ベンゾキシ−Ｌ−プロリニル）］ホスフェート(CPF 577)
【化２３】
0005978232.tif 000024
THF (10mL)で、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.25g, 1.01mmol)、NMI (0.41g, 5.07mmol, 0.40mL)及び１−ナフチル（ベンゾキシ−Ｌ−プロリニル）−ホスホクロリダート(0.84g, 2.03mmol)から標準操作Dに従って調製された。生成物が、カラム精製と、その後の2回の分取TLC精製とによって白色固体(0.006g, 1%)として得られた。
31P-NMR (MeOD, 202 MHz) δ 2.27
19F-NMR (MeOD, 121 MHz) δ- 167.46
1H-NMR (MeOD, 500 MHz) δ 8.14 - 8.12 (m, 1H, H-Ar), 7.90 - 7.89 (m, 1H, H-Ar), 7.74 - 7.71 (m, 2H, 1 x H-Ar, 1 x H-塩基), 7.56 - 7.42 (m, 4H, H-Ar), 7.36 - 7.33 (m, 5H, H-Ar), 6.13 (t, J = 6.38 Hz, H-1'), 5.22 - 5.13 (m, 2H, CH2Ph), 4.49 - 4.46 (m, 1H, NCH), 4.42 - 4.33 (m, 2H, H-5'), 4.25 - 4.23 (m, 1H, H-3'), 4.06 - 4.04 (m, 1H, H-4'), 3.36 - 3.34 (m, 2H, NCH2), 2.23 - 2.15 (m, 1H, CH2-L-Pro), 2.10 - 2.02 (m, 2H, 1 x H, CH2-L-Pro, 1 x H, H-2'), 1.97 - 1.77 (m, 2H, CH2-L-Pro), 1.63 - 1.57 (m, 1H, H-2')
13C-NMR (MeOD, 125 MHz) δ 174.82 (C=O, エステル), 159.52 (C=O, 塩基), 150.54 (C=O, 塩基), 147.84, 147.78 (d, 2JC-P = 6.03 Hz, OC-Ar), 141.75, 139.97 (2 x d, 1JC-F = 232 Hz, CF, 塩基), 137.20, 136.34 (C-Ar), 129.76, 129.65, 129.44, 129.36, 129.27, 129.06, 128.95, 128.04, 128.75, 126.56 (CH-Ar), 125.41 (d, 2JC-F = 30.0 Hz, CH-塩基), 122.13 (CH-Ar), 115.76 (d, 3JC-P = 3.3 Hz, CH-Ar), 87.06 (C-1'), 86.79 (C-4'), 72.23 (C-3'), 68.15 (d, 2JC-P = 5.46 Hz, C-5'), 68.08 (CH2Ph), 62.53 (d, 2JC-P = 5.60 Hz, NCH), 48.26 (d, 2JC-P = 5.34 Hz, NCH2), 40.97 (C-2'), 32.16, 32.09 (CH2-L-Pro), 26.22, 26.15 (CH2-L-Pro).
【０１０９】
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル（３，３−ジメチル−１−ブトキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート(CPF 585)
【化２４】
0005978232.tif 000025
THF (10mL)で、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.25g, 1.01mmol)、NMI (0.41g, 5.07mmol, 0.40mL)及び１−ナフチル−（３，３−ジメチル−１−ブトキシ−Ｌ−アラニニル）−ホスホクロリダート(1.21g, 3.04mmol)から標準操作Dに従って調製された。生成物が、カラム精製と、その後の2回の分取TLC精製とによって白色固体(0.010g, 2%)として得られた。
31P-NMR (MeOD, 202 MHz) δ 4.48, 4.33
19F-NMR (MeOD, 470 MHz) δ - 167.30, - 167.47
1H-NMR (MeOD, 500 MHz) δ 8.20 - 8.17 (m, 1H, H-Ar), 7.91 - 7.89 (m, 1H, H-Ar), 7.77 - 7.72 (m, 2H, H-Ar), 7.58 - 7.51 (m, 3H, H-塩基, 2 x H-Ar), 7.46 - 7.41 (2 x t, 1H, J = 7.8 Hz, H-Ar), 6.19 - 6.13 (m, 1H, H-1'), 4.42 - 4.40 (m, 1H, 1 x H-5'), 4.38 - 4.32 (m, 2H, H-3', 1 x H-5'), 4.14 - 4.00 (m, 4H, H-4', CHCH3, OCH2CH2(CH3)3), 2.21 - 2.13 (m, 1H, 1 x H-2'), 1.91 - 1.76 (m, 1H, 1 x H-2'), 1.52 - 1.48 (m, 2H, OCH2CH2(CH3)3), 1.37 - 1.35 (m, 3H, CHCH3), 0.92, 0.91 (2 x s, 9H, OCH2CH2(CH3)3) 13C-NMR (MeOD, 125 MHz) δ 175.16, 174.84 (2 x d, 3JC-P = 4.75 Hz, C=O, エステル), 159.56, 159.35 (C=O, エステル), 150.61 (C=O, エステル), 148.00, 147.86 (2 x d, 2JC-P = 6.25 Hz, OC-Ar), 141.78, 141.73 (2 x d, 1JC-F = 232 Hz, CF, 塩基), 136.28 (C-Ar), 128.98, 128.95, 127.92, 127.90, 127.58, 126.57, 126.20, 126.14 (CH-Ar), 125.63, 125.55 (2 x d, 2JC-F = 34 Hz, CH, 塩基), 122.65, 122.63 (CH-Ar), 116.48, 116.15 (2 x d, 3JC-P = 3.0 Hz, CH-Ar), 87.01, 86.94 (C-1'), 86.73, 86.68 (d, 3JC-P = 7.75 Hz, C-4'), 72.18, 72.07 (C-3'), 67.87, 67.85 (2 x d, 2JC-P = 5.0 Hz, C-5'), 64.08, 64.05 (OCH2CH2(CH3)3), 51.86 (d, 3JC-P = 5.5 Hz, CHCH3), 42.74 (OCH2CH2(CH3)3), 40.91, 40.83 (C-2'), 29.96 (OCH2CH2(CH3)3), 20.50, 20.34 (2 x d, 3JC-P = 6.5 Hz, CHCH3).
MS (ES+) m/e: 630 (MNa+, 100%), 608 (MH+, 10%) 精密質量: C28H35FN3O9P 理論値607.56
【０１１０】
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル−（シクロブトキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート(CPF 578)
【化２５】
0005978232.tif 000026
THF (10mL)で、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.23g, 0.93mmol)、NMI (0.38g, 4.67mmol, 0.37mL)及び１−ナフチル−（シクロブトキシ−Ｌ−アラニニル）−ホスホクロリダート(0.85g, 2.33mmol)から標準操作Dに従って調製された。生成物が、カラム精製と、その後の分取TLC精製とによって白色固体(0.010g, 2%)として得られた。
31P-NMR (MeOD, 202 MHz) δ 4.54, 4.36
19F-NMR (MeOD, 470 MHz) δ - 167.12, - 167.29
1H-NMR (MeOD, 500 MHz) δ 8.18 - 8.17 (m, 1H, H-Ar), 7.81 - 7.87 (m, 1H, H-Ar),
7.74 - 7.71 (m, 2H, 1 x H-Ar, 1 x H-塩基), 7.60 - 7.53 (m, 3H, H-Ar), 7.46 - 7.43 (2 x t, J = 8.0 Hz, 1H, H-Ar), 6.18 - 6.12 (m, 1H, H-1'), 5.00 - 4.95 (m, 1H, OCH エステル), 4.41 - 4.36 (m, 3H, 2 x H-5', H-3'), 4.11 - 4.00 (m, 2H, H-4', CHCH3), 2.36 - 2.27 (m, 2H, CH2), 2.18 - 1.98 (m, 3H, CH2 エステル, 1 x H-2'), 1.82 - 1.56 (m, 3H, CH2 エステル, 1 x H-2'), 1.36 - 1.34 (m, 3H, CHCH3)
13C-NMR (MeOD, 125 MHz) δ 175.97, 173.34 (C=O, エステル), 159.88 (C=O, 塩基), 151.64 (C=O, 塩基), 146.58 (OC-Ar), 141.15 (d, 1JC-F = 220 Hz, CF, 塩基), 136.28 (C-Ar), 128.93, 127.89, 127.54, 126.52, 126.18, 126.14 (CH-Ar), 125.53, 125.44 (2 x d, 2JC-F = 32.5 Hz, CH-塩基), 122.63 (CH-Ar), 116.46, 116.44 (2 x d, 3JC-P = 2.5 Hz, CH-Ar), 86.98 (d, 3JC-P = 6.25 Hz, C-4'), 86.71 (C-1'), 72.14, 72.04 (C-3'), 71.07 (OCH エステル), 67.83 (d, 2JC-P = 7.38 Hz, C-5'), 51.66 (d, 2JC-P = 8.75 Hz, CHCH3), 40.89, 40.83 (C-2'), 31.03 (OCHCH2), 20.43 (CHCH3), 14.23 (CH2 エステル).
MS (ES+) m/e: 600 (MNa+, 100%), 578 (MH+, 10%) 精密質量: C26H29FN3O9P 理論値577.50
【０１１１】
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル−（シクロプロピルメタノキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート(CPF 579)
【化２６】
0005978232.tif 000027
THF (10mL)で、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.25g, 1.01mmol)、NMI (0.41g, 5.07mmol, 0.40mL)及び１−ナフチル−（シクロプロピルメタノキシ−Ｌ−アラニニル）−ホスホクロリダート(0.93g, 2.54mmol)から標準操作Dに従って調製された。生成物が、カラム精製によって白色固体(0.056g, 10%)として得られた。
31P-NMR (MeOD, 202 MHz) δ 4.58, 4.30
19F-NMR (MeOD, 470 MHz) δ -167.18, -167.22 
1H-NMR (MeOD, 500 MHz) δ 8.18 (d, J = 7.0 Hz, 1H, H-Ar), 7.89 - 7.87 (m, 1H, H-Ar), 7.73 - 7.70 (m, 2H, H-Ar), 7.58 - 7.53 (m, 3H, H-Ar), 7.45 - 7.40 (2 x t, J = 8.0 Hz, 1H, H-Ar), 6.17 - 6.11 (m, 1H, H-1'), 4.43 - 4.41 (m, 1H, H-5'), 4.38 - 4.32 (m, 2H, H-5', H-3'), 4.11 - 4.04 (m, 2H, H-4', CHCH3), 3.95 - 3.85 (m, 2H, OCH2 エステル), 2.19 - 2.11 (m, 1H, H-2'), 1.84 - 1.72 (m, 1H, H-2'), 1.38, 1.36 (2 x d, J = 5.0 Hz, 3H, CHCH3), 1.15 - 1.07 (m, 1H, OCH2CH エステル), 0.59 - 0.50 (m, 2H, CH2 エステル), 0.30 - 0.24 (m, 2H, CH2 エステル)
13C-NMR (MeOD, 125 MHz) δ 175.25, 174.94 (2 x d, 3JC-P = 4.75 Hz, C=O, エステル), 159.54, 159.35 (C=O, 塩基), 150.60, 150.56 (C=O, 塩基), 148.05, 147.86 (2 x d, 2JC-P = 7.5 Hz, OC-Ar), 141.79, 141.73 (2 x d, 1JC-F = 232 Hz, CF, 塩基), 136.29 (C-Ar), 128.94 (d, 3JC-P = 4.4 Hz, CH-Ar), 127.89 (d, 4JC-P = 3.7 Hz, CH-Ar), 127.56, 126.55, 126.52, 126.19, 126.16 (CH-Ar), 125.64, 125.53 (2JC-F = 34 Hz, CH-塩基), 122.65 (CH-Ar), 116.54, 116.24 (2 x d, 4JC-P = 2.6 Hz, CH-Ar), 87.04, 86.99 (C-1'), 86.90, 86.73 (2 x d, 3JC-P = 7.1 Hz, C-4'), 72.18, 72.07 (C-3'), 71.21, 71.18 (OCH2, エステル), 67.87, 67.84 (明瞭なt, 2JC-P = 5.0 Hz, C-5'), 51.88 (d, 2JC-P = 10.0 Hz, CHCH3), 40.91, 40.83 (C-2'), 20.60, 20.46 (2 x d, 3JC-P = 6.5 Hz, CHCH3), 10.69 (OCH2CH エステル), 3.70, 3.65 (2 x CH2, エステル).
MS (ES+) m/e: 600 (MNa+, 100%), 578 (MH+, 15%) 精密質量: C26H29FN3O9P 理論値577.50.
HPLCb (H2O/アセトニトリル  ３５分間で100/0から0/100まで) Rt 12.91分
【０１１２】
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル−（テトラヒドロピロキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート(CPF 580)
【化２７】
0005978232.tif 000028
THF (10mL)で、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.25g, 1.01mmol)、tBuMgCl (1.1mL, 1.1mmol)及び１−ナフチル−（テトラヒドロピロキシ−Ｌ−アラニニル）−ホスホクロリダート(0.80g, 2.03mmol)から標準操作Eに従って調製された。生成物が、カラム精製と、その後の2回の分取TLC精製とによって白色固体(0.010g, 1.6%)として得られた。
31P-NMR (MeOD, 202 MHz) δ 3.77, 3.22
19F-NMR (MeOD, 470 MHz) δ - 168.27, -168.35
1H-NMR (MeOD, 500 MHz) δ 8.60 (d, J = 7.0 Hz, 2H, H-Ar), 8.22 - 8.19 (m, 1H, H-Ar), 7.92 - 7.91 (d, J = 5.50 Hz, 1H, H-Ar), 7.60 - 7.45 (m, 4H, H-Ar, H-塩基), 6.29 - 6.25 (m, 1H, H-1'), 5.25 - 5.17 (m, 1H, H-3'), 4.96 - 4.87 (m, 1H, CH-エステル), 4.28 - 4.26 (m, 1H, H-4'), 4.11 - 4.03 (m, 1H, CHCH3), 3.88 - 3.66 (m, 4H, 2 x OCH2a' エステル, 2 x H-5'), 3.55 - 3.50 (m, 2H, 2 x OCH2a'' エステル), 2.63 - 2.30 (m, 2H, H-2'), 1.91 - 1.85 (m, 2H, 2 x CH2b' エステル), 1.65 - 1.54 (m, 2H, CH2b'' エステル), 1.39 - 1.35 (m, 3H, CHCH3).
13C-NMR (MeOD, 125 MHz) δ 174.34 (C=O, エステル), 159.24 (C=O, 塩基), 150.76 (C=O, 塩基), 148.03 (OC-Ar), 141.97 (d, 1JC-F = 238 Hz, CF, 塩基), 136.37 (C-Ar), 
128.97, 128.56, 127.61, 127.57, 126.58, 126.23, 126.16, 126.12, 125.84 (CH-Ar), 122.70 (d, 2JC-F = 24.0 Hz, CH-塩基), 116.62, 116.37 (CH-Ar), 87.54 (d, 3JC-P = 5.40 Hz, C-4'), 86.60, 86.57 (C-1'), 79.82, 79.47 (C-3'), 71.45 (CH-エステル), 66.12, 66.08 (2 x OCH2a エステル), 66.02 (C-5'), 51.83 (CHCH3), 39.97, 39.94 (C-2'), 32.65, 32.57 (2 x CH2b エステル), 20.45, 20.30 (CHCH3).
MS (ES+) m/e: 630 (MNa+, 100%), 608 (MH+, 10%) 精密質量: C27H31FN3O10P 理論値607.52.
【０１１３】
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル−（ペントキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート(CPF 581)
【化２８】
0005978232.tif 000029
THF (10mL)で、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.25g, 1.01mmol)、tBuMgCl (1.1mL, 1.1mmol)及び１−ナフチル−（ペントキシ−Ｌ−アラニニル）−ホスホクロリダート(0.78g, 2.03mmol)から標準操作Eに従って調製された。生成物が、カラム精製によって白色固体(0.047g, 8%)として得られた。
31P-NMR (MeOD, 202 MHz) δ 4.48, 4.32
19F-NMR (MeOD, 470 MHz) δ -167.18, -167.29
1H-NMR (MeOD, 500 MHz) δ 8.25 - 8.17 (m, 1H, H-Ar), 8.05 - 7.95 (m, 2H, H-Ar), 7.85 - 7.60 (m, 2H, H-Ar, H-塩基), 7.65 - 7.48 (m, 3H, H-Ar), 6.30 - 6.18 (m, 1H, H-1'), 4.60 - 4.37 (m, 3H, 2 x H-5', H-3'), 4.28 - 4.00 (m, 4H, H-4', CHCH3, OCH2CH2CH2CH2CH3), 2.32 - 2.12 (m, 1H, H-2'), 1.95 - 1.75 (m, 1H, H-2'), 1.70 - 1.55 (m, 2H, OCH2CH2CH2CH2CH3), 1.50 - 1.28 (m, 7H, 4 x H OCH2CH2CH2CH2CH3, CHCH3), 0.83, 0.82 (2 x d, J = 7.9 Hz, 3H, OCH2CH2CH2CH2CH3) 
13C-NMR (MeOD, 125 MHz) δ 175.22, 174.91 (C=O, エステル), 159.5 (C=O, 塩基), 150.54 (C=O, 塩基), 147.90, 147.88 (OC-Ar), 141.75 (d, 1JC-F = 225 Hz, CF, 塩基), 136.37 (C-Ar), 128.95, 127.90, 127.56, 126.55, 126.19 (CH-Ar), 125.64, 125.53 (2 x d, 2JC-F = 34.0 Hz, CH-塩基), 122.65 (CH-Ar), 116.51, 116.21 (CH-Ar), 87.03, 86.96 (C-1'), 86.85, 86.74 (C-4'), 72.16, 72.05 (C-3'), 67.87 (d, 2JC-P = 5.0 Hz, C-5'), 66.54 (OCH2), 51.87, 51.81 (d, 2JC-P = 7.5 Hz, CHCH3), 40.87, 40.80 (C-2'), 29.35, 29.10 (CH2 エステル), 23.33 (CH2 エステル), 20.60, 20.43 (2 x d, 3JC-P = 6.5 Hz, CHCH3), 14.28 (CH3, エステル).
MS (ES+) m/e: 616 (MNa+, 100%), 594 (MH+, 10%) 精密質量: C27H33FN3O9P 理論値593.54.
HPLCb (H2O/アセトニトリル  35分間で100/0から0/100まで) Rt 15.56分
【０１１４】
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル−（シクロペントキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート(CPF 582)
【化２９】
0005978232.tif 000030
THF (10mL)で、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.25g, 1.01mmol)、tBuMgCl (1.1mL, 1.1mmol)及び１−ナフチル−（シクロペントキシ−Ｌ−アラニニル）−ホスホクロリダート(0.77g, 2.03mmol)から標準操作Eに従って調製された。生成物が、カラム精製によって白色固体(0.030g, 5%)として得られた。
31P-NMR (MeOD, 202 MHz) δ 4.53, 4.37
19F-NMR (MeOD, 470 MHz) δ - 167.07, -167.19
1H-NMR (MeOD, 500 MHz) δ 8.18 - 8.16 (m, 1H, H-Ar), 7.89 - 7.85 (m, 1H, H-Ar), 7.70 (明瞭なt, J = 6.50 Hz, 2H, H-Ar), 7.57 - 7.50 (m, 3H, 2 x H-Ar, H-塩基), 7.45 - 7.40 (m, 1H, H-Ar), 6.16 - 6.11 (m, 1H, H-1'), 5.15 - 5.09 (m, 1H, OCH エステル), 4.41 - 4.30 (m, 3H, 2 x H-5', H-3'), 4.11 - 4.08 (m, 1H, H-4'), 4.04 - 3. 98 (m, 1H, CHCH3), 2.19 - 2.10 (m, 1H, H-2'), 1.86 - 1.73 (m, 3H, OCHCH2 エステル), 1.73 - 1.56 (m, 6H, H-2', CH2 エステル), 1.35, 1.34 (2 x d, J = 6.57 Hz, CHCH3)
13C-NMR (MeOD, 125 MHz) δ 174.68, 174.64 (C=O, エステル), 159.27 (C=O, 塩基), 150.51 (C=O, 塩基), 147.86 (d, 2JC-P = 7.5 Hz, OC-Ar), 141.78, 141.72 (2 x d, 1JC-F = 232 Hz, CF-塩基), 136.30 (C-Ar), 128.95, 128.54, 127.94, 127.80, 127.60, 127.56, 127.17, 126.80, 126.54, 126.19, 126.16 (CH-Ar), 125.66, 125.53 (2 x d, 2JC-F = 34 Hz, CH-塩基), 122.65, 122.61 (CH-Ar), 116.53, 116.22 (2 x d, 4JC-P = 3.75 Hz, CH-Ar), 86.99, 86.96 (C-1'), 86.70 (d, 3JC-P = 7.50 Hz, C-4'), 79.64, 79.61 (OCH エステル), 72.21, 72.07 (C-3'), 67.89, 67.85 (2 x d, 2JC-P = 5.0 Hz, C-5'), 51.92 (d, 2JC-P = 5.0 Hz, CHCH3), 40.92, 40.86 (C-2'), 33.65, 33.61, 33.52, 33.47 (2 x CH2 エステル), 24.68, 24.66 (CH2 エステル), 20.45, 20.30 (2 x d, 3JC-P = 6.25 Hz, CHCH3).
MS (ES+) m/e: 614 (MNa+, 100%), 592 (MH+, 30%) 精密質量: C27H31FN3O9P 理論値591.52
HPLCb (H2O/アセトニトリル  35分間で100/0から0/100まで) Rt 14.03分
【０１１５】
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル−（２−インダノキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート(CPF 597)
【化３０】
0005978232.tif 000031
THF (20mL)で、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.30g, 1.22mmol)、tBuMgCl (1.34mL, 1.34mmol)及び１−ナフチル−（２−インダノキシ−Ｌ−アラニニル）−ホスホクロリダート(1.06g, 2.43mmol)から標準操作Eに従って調製された。生成物が、カラム精製によって白色固体(0.045g, 6%)として得られた。
31P-NMR (MeOD, 202 MHz) δ 4.62, 4.30
19F-NMR (MeOD, 470 MHz) δ - 167.14, - 167.34 
1H-NMR (MeOD, 500 MHz) δ 8.15 - 8.12 (m, 1H, H-Ar, Naph), 7.89 - 7.87 (m, 1H, H-Ar, Naph), 7.72 - 7.67 (m, 2H, H-Ar, Naph), 7.56 - 7.46 (m, 3H, 2 x H-Ar, H-塩基), 7.40 - 7.37 (m, 1H, H-Ar), 7.20 - 7.12 (m, 4H, H-Ar, Ph), 6.14 - 6.08 (m, 1H, H-1'), 5.49 - 5.46 (m, 1H, OCH エステル), 4.32 - 4.26 (m, 3H, 2 x H-5', H-3'), 4.04 - 3.98 (m, 1H, H-4', CHCH3), 3.30 - 3.24 (m, 2H, 2 x CH エステル), 2.99 - 2.91 (m, 2H, 2 x CH エステル), 2.14 - 2.07 (m, 1H, H-2'), 1.75 - 1.64 (m, 1H, H-2'), 1.33 -  1.29 (m, 3H, CHCH3)
13C-NMR (MeOD, 125 MHz) δ 175.02, 174.66 (2 x d, 3JC-P = 3.75 Hz, C=O, エステル), 159.48 (2JC-F = 25.0 Hz, C=O, 塩基), 150.57 (C=O, 塩基), 147.97, 147.80 (2 x d, 2JC-P = 7.5 Hz, OC-Ar), 141.73, 141.68 (2 x d, 1JC-F = 232.5 Hz, CF-塩基), 141.54, 141.49, 141.48, 139.10, 136.27, 136.26 (C-Ar), 129.01, 128.94, 128.91, 127.91, 127.87, 128.85, 127.80, 127.77, 127.60, 127.57, 127.50, 126.20, 126.18, 125.69 (CH-Ar), 125.50, 125.43 (2 x d, 2JC-F = 25 Hz, CH-塩基), 122.64, 122.60, 121.85 (CH-Ar), 116.57, 116.26 (2 x d, 4JC-P = 2.5 Hz, CH-Ar), 86.96 (C-1'), 86.87, 86.66 (2 x d, 3JC-P = 7.50 Hz, C-4'), 77.85, 79. (OCH エステル), 72.21, 72.07 (C-3'), 67.77, 67.75 (2 x d, 2JC-P = 6.25 Hz, C-5'), 51.97, 51.82 (CHCH3), 40.91, 40.86 (C-2'), 40.44, 40.43, 40.38, 40.34 (2 x CH2 エステル), 20.30, 20.16 (2 x d, 3JC-P = 6.25 Hz, CHCH3)
【０１１６】
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［フェニル−（ベンゾキシ−Ｌ−メチオニニル）］ホスフェート(CPF 586)
【化３１】
0005978232.tif 000032
THF (10mL)で、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.25g, 1.01mmol)、NMI (0.41g, 5.07mmol, 0.40mL)及びフェニル−（ベンゾキシ−Ｌ−メチオニニル）−ホスホクロリダート(0.7g, mmol)から標準操作Dに従って調製された。生成物が、カラム精製によって淡黄色固体(0.014g, 2%)として得られた。
31P-NMR (MeOD, 202 MHz) δ 4.34, 3.94
19F-NMR (MeOD, 470 MHz) δ - 167.40, - 167.69 
1H-NMR (MeOD, 500 MHz) δ 7.83 - 7.80 (m, 1H, H-Ar), 7.74 - 7.72 (m, 1H, H-Ar),
7.64 - 7.62 (m, 1H, H-Ar), 7.37 - 7.32 (m, 6H, H-Ar, H-塩基), 7.26 - 7.17 (m, 2H, H-Ar), 6.25 - 6.17 (m, 1H, H-1'), 5.18, 5.13 (ABシステム, JAB = 12.0 Hz, 2H, CH2Ph), 4.40 - 4.35 (m, 1H, H-3'), 4.32 - 4.22 (m, 2H, H-5'), 4.16 - 4.03 (m, 2H, NHCH, H-4'), 2.44, 2.36 (2 x t, J = 7.50 Hz, CH2S), 2.16 - 2.08 (m, 1H, 1 x H-2'), 1.98 - 1.82 (m, 6H, 1 x H-2', NHCHCH2CH2SCH3),
MS (ES+) m/e: 646 (MNa+, 100%), 624 (MH+, 10%) 精密質量: C27H31FN3O9PS 理論値623.56
【０１１７】
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル−（ベンゾキシ−Ｌ−フェニルアラニニル）］ホスフェート(CPF 587)
【化３２】
0005978232.tif 000033
THF (10mL)で、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.25g, 1.01mmol)、NMI (0.41g, 5.07mmol, 0.40mL)及び１−ナフチル−（ベンゾキシ−Ｌ−フェニルアラニニル）−ホスホクロリダート(1.45g, mmol)から標準操作Dに従って調製された。生成物が、カラム精製によって白色固体(0.007g, 1%)として得られた。
31P-NMR (MeOD, 202 MHz) δ 4.27, 4.14
19F-NMR (MeOD, 470 MHz) δ - 166.99, - 167.18 
1H-NMR (MeOD, 500 MHz) δ 8.11 - 8.00 (m, 1H, H-Ar, Ar), 7.89 - 7.85 (m, 1H, H-Ar), 7.69 - 7.67 (m, 1H, H-Ar), 7.60 - 7.49 (m, 3H, 2 x H-Ar, H-塩基), 7.37 - 7.33 (m, 2H, H-Ar), 7.25 - 7.12 (m, 10H, H-Ar), 6.09 - 6.04 (m, 1H, H-1'), 5.11 - 5.01 (m, 2H, CH2Ph), 4.29 - 4.18 (m, 1H, CHCH3), 4.15 - 4.08 (m, 1H, H-3'), 4.02 - 3.95 (m, 2H, H-5'), 3.86 - 3.67 (m, 1H, H-4'), 3.14 - 3.10 (m, 1H, 1 x NHCHCH2Ph), 2.91 - 2.82 (m, 1H, 1 x NHCHCH2Ph), 2.12 - 2.06, 2.00 - 1.95 (2 x m, 1H, H-2'), 1.68 - 1.62, 1.42 - 1.36 (2 x m, 1H, H-2') 
【０１１８】
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル−（２，２−ジメチルプロポキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート(CPF 588)
【化３３】
0005978232.tif 000034
THF (10mL)で、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.25g, 1.01mmol)、NMI (0.41g, 5.07mmol, 0.40mL)及び１−ナフチル−（２，２−ジメチルプロポキシ−Ｌ−アラニニル）−ホスホクロリダート(0.77g, mmol)から標準操作Dに従って調製された。生成物が、カラム精製によって白色固体(0.006g, 1%）として得られた。
31P-NMR (MeOD, 202 MHz) δ 4.56, 4.33
19F-NMR (MeOD, 470 MHz) δ - 167.32, - 167.43 
1H-NMR (MeOD, 500 MHz) δ 8.19 - 8.16 (m, 1H, H-Ar, Ar), 7.91 - 7.89 (m, 1H, H-Ar), 7.74 - 7.71 (m, 2H, H-Ar), 7.57 - 7.51 (m, 3H, 2 x H-Ar, H-塩基), 7.46 - 7.41 (m, 1H, H-Ar), 6.17 - 6.10 (m, 1H, H-1'), 4.42 - 4.30 (m, 3H, H-3', 2 x H-5'), 4.13 - 4.07 (m, 2H, H-4', CHCH3), 3.86, 3.75 (ABシステム, JAB = 10.50 Hz, 2H, CH2C(CH3)3), 2.18 - 2.10 (m, 1H, H-2'), 1.81 - 1.70 (m, 1H, H-2'), 1.41 - 1.38 (m, 3H, CHCH3), 0.95, 0.94 (2 x s, 9H, CH2C(CH3)3)
【０１１９】
５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−Ｏ−［１−ナフチル−（ブトキシ−Ｌ−アラニニル）］ホスフェート(CPF 589)
【化３４】
0005978232.tif 000035
THF (10mL)で、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(0.25g, 1.01mmol)、NMI (0.41g, 5.07mmol, 0.40mL)及び１−ナフチル−（ブトキシ−Ｌ−アラニニル）−ホスホクロリダート(0.75g, mmol)から標準操作Dに従って調製された。生成物が、カラム精製によって白色固体(0.006g, 1%)として得られた。
31P-NMR (MeOD, 202 MHz) δ 4.52, 4.35
19F-NMR (MeOD, 470 MHz) δ - 167.36, - 167.49 
1H-NMR (MeOD, 500 MHz) δ 8.19 - 8.16 (m, 1H, H-Ar, Naph), 7.1 - 7.89 (m, 1H, H-Ar, Naph), 7.75 - 7.72 (m, 2H, H-Ar, Naph), 7.58 - 7.51 (m, 3H, 2 x H-Ar, H-塩基), 7.46 - 7.41 (m, 1H, H-Ar), 6.18 - 6.11 (m, 1H, H-1'), 4.42 -  4.40 (m, 1H, 1 x H-5'), 4.37 - 4.32 (m, 2H, 1 x H-5', H-3'), 4.12 - 4.01 (m, 4H, H-4', CHCH3, OCH2 CH2CH2CH3), 2.20 - 2.12 (m, 1H, H-2'), 1.85 - 1.73 (m, 1H, H-2'), 1.61 - 1.54 (m, 2H, OCH2CH2CH2CH3), 1.39 - 1.31 (m, 5H, OCH2CH2CH2CH3, CHCH3), 0.93 -  0.89 (m, 3H, OCH2CH2CH2CH3)
【０１２０】
生物学的アッセイ
本発明の化合物に関する実験データが以下に記載される。
【０１２１】
細胞培養物
マウス白血病L1210/0細胞及びヒトT-リンパ球CEM/0細胞はアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)（メリーランド州ロックビル）から得られた。ヒト膠芽腫U87細胞はE.Menue博士によって好意的に提供された（パスツール研究所、フランスパリ）。チミジンキナーゼ−欠損CEM/TK-細胞は、S.Eriksson教授（現在、ウプサラ大学、スウェーデンウプサラ）及びA.Karlsson教授（カロリンスカ研究所、スウェーデンストックホルム）からの供与物であった。チミジンキナーゼ−欠損L1210/TK-は、５−ブロモ−２’-dUrdに対する耐性についての選択後のL1210/0細胞由来であった（Balzariniら、1982）。マイコプラズマ・ヒオリニス (Mycoplasma hyorhinis) (ATCC)での関連細胞株の感染は、慢性的に感染した細胞株を生じ、さらにL1210.Hyor及びU87.Hyorとして記載された。全ての細胞は、10%ウシ胎仔血清 (FBS)（バイオクロム  AG、ドイツベルリン）、10mM Hepes及び1mMピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン）含有ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM)（インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド）で維持された。細胞は、5% CO2の気相の加湿型培養器 (humidified incubator)で37°Cで増殖された。
【０１２２】
細胞増殖抑制アッセイ
単層細胞（U87及びU87.Hyor）が、10,000細胞／ウェルで48ウェルマイクロタイタープレート（Nunc（商標）、デンマークロスキレ）に播種された。24時間後、試験化合物を含む等量の新鮮な培地が添加された。5日目に、細胞はトリプシン処理され、細胞計数分析装置(Coulter counter)（アナリス、ベルギースアーリー）で計測された。懸濁細胞（L1210/0, L1210/TK-, L1210.Hyor, CEM/0, CEM/TK-）は、一定量の前記試験化合物の存在下で、60,000細胞／ウェルで96ウェルマイクロタイタープレート（Nunc（商標））に播種された。前記細胞は、48時間(L1210)又は72時間(CEM)増殖可能であり、その後、細胞計数分析装置で計測された。50%抑制濃度(IC50)は、50%まで生存細胞の数を減少するのに必要な化合物濃度として定義された。
【０１２３】
アッセイ1
試料は、広範な腫瘍細胞株に対する生物活性についてアッセイされ、データは以下の表１で表示された。データはμMでのCC50、すなわち、50%まで細胞増殖を抑制するのに必要とされる細胞増殖抑制濃度として表される。用いられた前記細胞株は、L1210/0（白血病細胞株）、FM3A/0（乳がん細胞株）、Cem/0（急性リンパ性白血病細胞株）及びHeLa（子宮頸部細胞株）であった。
【０１２４】
また、表１は、5FU、5-FdUrd及び参照化合物CPF 382、CPF 437及びCPF 438についての比較データを含む。CPF 382の構造は上記のとおりである。CPF 437及びCPF 438のそれぞれの構造は以下のとおりである。
【化３５】
0005978232.tif 000036
【化３６】
0005978232.tif 000037
【０１２５】
表１のデータから分かるように、本発明の化合物は、5-FUの細胞増殖抑制活性と同一か、又はよりよい細胞増殖抑制活性を示す一方、ヌクレオシドキナーゼ−欠損細胞での顕著な細胞増殖抑制活性を示す。ヌクレオシドキナーゼ−欠損細胞でのかかる細胞増殖抑制活性は、5-FdUrdの細胞増殖抑制活性に対して正反対である。
【０１２６】
表１のデータから分かるように、本発明の化合物のTK-細胞での活性は、参照化合物CPF 382、CPF 437及びCPF 438の細胞増殖抑制活性よりも顕著に大きくなる。
【０１２７】
【表１−１】
0005978232.tif 000038
【０１２８】
【表１−２】
0005978232.tif 000039
【０１２９】
【表１−３】
0005978232.tif 000040
【０１３０】
アッセイ2
また試料は、マイコプラズマに感染した細胞での試料の活性の％保持率についてアッセイされた。結果は以下の表２に記載される。結果は、本発明の化合物が、5-FdURDによって示される活性と対照的に、マイコプラズマに感染した細胞で高い活性を保持できることを示す。チミジンホスホリラーゼ(TP)阻害剤の投与が、マイコプラズマに感染した細胞の培養で5-FdUrdの細胞増殖抑制活性を回復し、5-FdUrdの最終的な細胞増殖抑制活性において、悪化させるTPの役割の証拠を提示している。細胞のマイコプラズマ感染は、5-FdUrdを含むヌクレオシドの活性を大きく減少することが知られているので、マイコプラズマに感染下でのいくつかのヌクレオシドの活性は、マイコプラズマに感染した患者に潜在的利益を提供する。
【０１３１】
表２
マイコプラズマ陰性及び陽性の細胞における5-FdUrd及び本発明の化合物についてのμMでのCC50値、及び、マイコプラズマ感染での活性％保持率。「％保持率」は、L1210/Hyorに対するL1210に関して測定したCC50値の割合の測定値であり、CC50L1210 × 100 ÷ CC50L1210/Hyorとして計算される。
【０１３２】
【表２】
0005978232.tif 000041
【０１３３】
さらなる実験（以下のアッセイ3ないし8）は、本発明の前記化合物CPF 373に関して実施された。
【０１３４】
アッセイ3
TK-構成成分及びTK-欠損腫瘍細胞株に対する5-FdUrd及びそのプロドラッグCPF-373の細胞増殖抑制活性
5-FdUrd及びCPF-373の細胞増殖抑制活性は、異なるTK-発現腫瘍細胞株及びTK-欠損腫瘍細胞株で決定された。表３で示されるように、5-FdUrdは、その細胞増殖抑制活性に対してTKの発現に強く依存する。そのIC50は、L1210/TK-細胞 (IC50:3.1μM)対野性型L1210/0細胞 (IC50:0.0008μM)について4,000倍に、及びCEM/TK-細胞(IC50:1.5μM)対CEM/0細胞(IC50:0.028μM)について50倍に増加した。対照的に、5-FdUrdプロドラッグCPF-373の細胞増殖抑制活性は、野生型の細胞と比較したとき、TK-欠損細胞で実質的に変化せずに保持された（IC50：各々、L1210/TK-及びL1210/0細胞について0.027μM及び0.011μM、及び、CEM/TK-及びCEM/0細胞について0.32μM及び0.089μM）。CPF-373の細胞増殖抑制活性は野生型のL1210/0及びCEM/0細胞に対する5-FdUrdよりも3ないし10倍劣っているものの、TK-欠損腫瘍細胞株での5-FdUrdよりも5ないし100倍優れていることを示した（表３参照）。
【０１３５】
表３
異なる細胞株でのIC50値によって示される5-FdUrd及びCPF-373の細胞増殖抑制活性
【０１３６】
【表３】
0005978232.tif 000042
【０１３７】
アッセイ4
5-FdUrd及びそのプロドラッグCPF-373の細胞増殖抑制活性における腫瘍細胞培養物のマイコプラズマ感染の影響
L1210/0細胞培養物はマイコプラズマ種Ｍ・ヒオリニスで感染された（細胞はL1210.Hyorと称された）。5-FdUrdは、マイコプラズマに感染したL1210.Hyor細胞に対するその細胞増殖抑制活性を300分の1 (IC50:0.24μM)に顕著に失った。また、5-FdUrdは、感染していないU87細胞と比較されたとき、U87.Hyor細胞培養物で400分の1にその細胞増殖抑制活性を失った（表３参照）。際立って対照的には、前記5-FdUrdプロドラッグCPF-373は、L1210/0及びL1210.Hyorの細胞培養物の両方で類似の細胞増殖抑制能を保持した（IC50：各々、0.011及び0.025μM）。U87及びU87.Hyorの細胞培養物でその細胞増殖抑制活性に対して評価されたとき、このプロドラッグについて類似の観察が行われた（IC50：各々、0.035及び0.039μM）。したがって、遊離のヌクレオシド5-FdUrdはマイコプラズマ・ヒオリニスに感染した腫瘍細胞株に対するその細胞増殖抑制能を顕著に失った一方、そのプロドラッグCPF-373の抗増殖能はマイコプラズマ感染に非依存的であった。
【０１３８】
アッセイ５
実験は、チミジンホスホリラーゼ(TP)の存在下でCPF 373の安定性を評価するために実施された。前記実験は図９ないし１１に図示され、以下に議論されるように、各々はNMRスペクトルを含む。腫瘍で頻繁に上向き調節される異化酵素TPの作用への本発明の化合物の非感受性が、本発明の化合物を、5-FdUrdよりも異化酵素TPにより非依存的にすることを本アッセイは示す。
【０１３９】
大腸菌から精製されたチミジンホスホリラーゼ(TP)による5-FdUrd及びそのプロチド化合物CPF 373のホスホリラーゼアッセイ
ヌクレオシド5-FdUrdは、エールリッヒ腹水腫瘍から精製されたウリジンホスホリラーゼと同様に、大腸菌から精製されたチミジンホスホリラーゼを用いる加リン酸分解反応(phosphorolytic reaction)によってその関連塩基5FUに分解され得る。この分解が、以下の合成経路に従う5-FdUrdの限定された治療上の有効性についての理由の1つであることが示唆されている。
【０１４０】
【化３７】
0005978232.tif 000043
【０１４１】
前記ホスホリラーゼアッセイは、in situ 19F NMRを用いて、大腸菌から精製されたチミジンホスホリラーゼによる加リン酸分解に関して実施された。プロチド化合物CPF 373への応用は構造の切断を防止しようとする試みであり、したがって、前記酵素の作用を回避する。
【０１４２】
pH=7.4の2種類のリン酸カリウム緩衝液、200nM溶液及び300nM溶液のそれぞれが、リン酸供与体として用いられた。酵素のユニットが、基準として用いられる1分間あたりのイノシン約0.25mgを加水分解するのに必要な酵素量として定義された。アッセイは30分間行われた。
【０１４３】
5-FdUrdのホスホリラーゼアッセイ
最初に、重水素化メタノールに前もって溶解した5-FdUrd及び5FUの19F NMR (470MHz)スペクトルが記録された。5-FdUrdが〜δ-167.21ppmでシングレットを示し、5FUは〜δ-169.30ppmでシングレットを示した。したがって、前記ホスホリラーゼアッセイは、酵素チミジンホスホリラーゼ(TP) (20.7UNI)の添加前に、ブランク(blank)を記録して、リン酸カリウム緩衝液（200nM溶液；pH=7.4）の存在下で、重水素化メタノールに5-FdUrdを溶解することによって実施された。19F NMRスペクトルは、25°Cで記録され、図９のスペクトルAで示されるように、〜δ-165.17ppmでの5-FdUrdのシングレットと、5FUに起因する〜δ-169.50ppmでの新しいピークとを示した。
【０１４４】
その後、関連塩基へのヌクレオシドの切断を証明するために、新たな実験が、図９のスペクトルBで示されるように、TS酵素なしの上記と同一の条件で、ヌクレオシド類似体5-FdUrd及び関連塩基5FUの等モルを溶解することによって実施された。このスペクトルは、図９のスペクトルAで以前に観察された同一の化学シフトを有する2つのシングレットを示した。これらのデータは、前記5FUは〜δ-169.50ppmでの化学シフトを有し、したがって、酵素(TP)の加リン酸分解作用を有することを実証した。遊離塩基5FUへのヌクレオシド5-FdURdの変換は66%であった。
【０１４５】
リン酸カリウム緩衝液の当初濃度が200nMから205nMまで上昇されたとき、基質5-FdUrdは図１０で示されるように、塩基5-FUに完全に変換された。
【０１４６】
プロチド化合物CPF 373のホスホリラーゼアッセイ
ホスホリラーゼアッセイは、上記の操作及び条件に従って、安定性を調査するためにベンジルＬ−アラニンフェニル誘導体CPF 373に適用された。プロチド化合物CPF 373が、図１１のスペクトルAで示されるように、TP酵素なしで解析した試料の化学シフトと、図１１のスペクトルBで示されるように、TPの存在下で解析した試料の化学シフトとを比較することによって示されるように、完全に安定となることを証明した。19F NMRは4日後に繰り返され、前記プロチド化合物CPF 373はもう一度安定となることが示された。
【０１４７】
これらの実験は、前記ヌクレオシド5-FdUrdが30分未満の半減期でチミジンホスホリラーゼの存在下での加リン酸分解反応によってその関連塩基5FUに急速に分解される一方、プロドラッグ化合物CPF 373は3日までの長時間曝露でTP酵素反応に対して顕著な安定性を示すことを実証した。この重要な結果は、本発明の5-FdUrdプロチド誘導体が5-FdUrdの治療上の効果に都合が良いことを示した。
【０１４８】
アッセイ6
大腸菌でエンコードされるTP、及び、ヒトでエンコードされるTP及びUPへの5-FdUrd及びCPF-373の曝露
天然のチミジン(dThd)、ウリジン(Urd)、5-FdUrd及びCPF-373に対するチミジンホスホリラーゼの基質特異性が、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって検討された。500μL反応緩衝液(10mM TrisHCl; 300μM NaCl; 1mM EDTA; 2mM KH2PO4/K2HPO4)の全量に、100μMの試験化合物と、組換えTP又はUP（ヒトTP:8.6ng/μL; 大腸菌TP:3.0ng/μL; ヒトUP:4ng/mL）とを含む反応混合物が、室温でインキュベーションされた。異なる時点（すなわち、0、20、40分）で、前記反応混合物の100μL容量が採取され、酵素を不活性化するために95°Cで3分間加熱された。この反応生成物は逆相RP-8カラム（メルク、ドイツダルムシュタット）で分離され、HPLC分析（アリアンス2690、ウォーターズ、マサチューセッツ州ミルフォード）によって定量された。チミンからのdThdの分離は、98%分離緩衝液（50mM NaH2PO4及び5mMヘプタンスルホン酸、pH3.2）及び2%アセトニトリルから、20%分離緩衝液+80%アセトニトリルまでの直線グラジエント(linear gradient)（8分間、98%分離緩衝液+2%アセトニトリル；98%分離緩衝液+2%アセトニトリルないし20%分離緩衝液+80%アセトニトリルの5分間の直線グラジエント；10分間の20%分離緩衝液+80%アセトニトリルの後、98%分離緩衝液+2%アセトニトリルでの平衡）によって実施された。UVを利用した検出(UV-based detection)は267nmで実施された。ウラシルからのUrdの分離は、100%分離緩衝液（上記参照）から、60%分離緩衝液+40%アセトニトリルまでの直線グラジエント（3分間の100%分離緩衝液；100%分離緩衝液ないし60%分離緩衝液+40%アセトニトリルの6分間の直線グラジエント；6分間の60%分離緩衝液+40%アセトニトリルの後、100%分離緩衝液での平衡）によって実施された。UVを利用した検出は258nmで実施された。
【０１４９】
チミジン及びウリジンホスホリラーゼによる5-FdUrd及びCPF-373の加リン酸分解
5-FdUrd及びそのプロドラッグCPF-373は、大腸菌又はヒト赤血球由来の精製チミジンホスホリラーゼ、及び、ヒト腫瘍由来の精製ウリジンホスホリラーゼに曝露された。大腸菌及びヒトTPは、dThd及び5-FdUrdを、それらの遊離の塩基に急速に変換した一方、CPF-373は、それらの酵素存在下で完全に安定に保持された（図２）。類似の実験条件下で、ウリジンは、ヒトUPによってウラシルに変換されたが、大腸菌TP又はヒトTPによって変換されなかった。両方の化合物がUPに曝露されるとき、dThd及びCPF-373は酵素によって影響されなかった一方、5-FdUrdは僅かに加水分解された（図２、パネルC）。
【０１５０】
アッセイ7
チミジル酸シンターゼ (Thymidylate synthase) (TS)活性測定
インタクトなL1210/0及びL1210/TK-細胞でのTSの活性は、TSによって触媒される反応で（[5-3H]dUrd又は[5-3H]dCydから前記細胞で形成される）[5-3H]dUMPからのトリチウム放出の評価によって測定された。本方法は、Balzarini & De Clercq (1984)によって詳細に記載されている。簡潔には、細胞培養物（500μL DMEM培養培地）は、〜3x106個のL1210細胞、及び、適当量の試験化合物（5-FdUrd及びCPF-373）を含むように調製された。37°Cでの前記細胞と前記化合物とのプレインキュベーション30分、2時間及び4時間後、1μCiの[5-3H]dUrd又は[5-3H]dCydが前記細胞培養物に添加された。30分間のインキュベーション後、100μLの細胞懸濁液が採取され、500μLの活性炭の冷した懸濁液（VWR、ベルギーハースローデ）（TCA 5%中に100mg/ml）に添加された。10分後、前記懸濁液は13,000rpmで10分間で遠心分離された後、400μLの上清の放射活性が、オプティフェーズハイセーフ(OptiPhase HiSafe)（パーキンエルマー、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて液体シンチレーターで計測された。
【０１５１】
5-FdUrd及びCPF-373によるチミジル酸シンターゼ(TS)の阻害
5-FdUrdの細胞増殖抑制活性の主要な標的は、チミジル酸シンターゼ(TS)である。インタクトな腫瘍細胞での前記TS活性は、[5-3H]デオキシウリジン([5-3H]dUrd)又は[5-3H]デオキシシチジン([5-3H]dCyd)に曝露されたインタクトなL1210/0細胞培養物での前記トリチウム放出を測定することによって直接的にモニターされた。実際には、[5-3H]dUrd又は[5-3H]dCydの[5-3H]dUMPへの細胞内変換後、ピリミジン塩基のC-5トリチウム原子は、TSで触媒される還元的メチル化の間に放出される。したがって、5-FdUrd及びそのプロドラッグCPF-373の、[5-3H]dUrd及び[5-3H]dCydからのトリチウム放出阻害能は、種々の化合物濃度でL1210/0細胞培養物において評価された。5-FdUrdは、in situでのTSの潜在的な阻害剤であることを証明した。[5-3H]dCyd及び[5-3H]dUrdからのトリチウム放出に対するそのIC50は、約0.0007-0.0009μMであった（表４参照）。
【０１５２】
表４
（5-FdUrd及びCPF-373への30分間曝露後に[5-3H]dUrd及び[5-3H]dCydからトリチウム放出によって決定されるときの）インタクトなL1210/0腫瘍細胞でのTSに対する5-FdUrd及びCPF-373のIC50値
【０１５３】
【表４】
0005978232.tif 000044
【０１５４】
トリチウム放出でのCPF-373の阻害活性は、特に、前記細胞と前記薬剤との30分間のみのプレインキュベーション後、5-FdUrdの阻害活性よりも顕著に少なかった（〜200分の1）(IC50:0.16-0.19μM)。しかし、インタクトな腫瘍細胞でTS活性を測定する前の5-FdUrd及びCPF-373との前記細胞のより長時間のプレインキュベーション（4時間まで）が、in situでのTSに対するプロドラッグのより顕著な阻害活性を示した（図３）。実際には、3Ｈ放出の阻害は5-FdUrdのより長いプレインキュベーション時間で2倍だけ増加された一方、CPF-373の阻害能は10倍増大した（図３、パネルA及びB、及びC及びD）。
【０１５５】
腫瘍細胞と、5-FdUrd及びCPF-373との少なくとも4時間のプレインキュベーションは、これらの薬剤の50%細胞増殖抑制活性濃度とまさに同程度である薬剤濃度でインタクトな腫瘍細胞においてTS阻害をもたらす。
【０１５６】
したがって、本観察は、5-FdUrdプロドラッグは、阻害のための標的酵素としてのTSに到達する前に、種々の代謝変換ステップを必要とすることを示し、CPF-373はその最終的な細胞増殖抑制活性を発揮するための5-FdUrdの効果的なプロドラッグとして作用するとの見解を支持する。
【０１５７】
また、5-FdUrd及びCPF-373の存在下でのTSの活性は、外部から供給された基質として[5-3H]dCydを用いてインタクトなL1210/TK-細胞で測定された（TK欠損のため、[5-3H]dUrdは使用できない）。表５及び図３（パネルE及びF）で示されるように、TSの50%阻害をもたらすのに必要な5-FdUrdの濃度は、野性型のL1210/0細胞と比較するとき(IC50:0.0003μM)、TK-欠損L1210/TK-細胞で5,700分の1に減少した(IC50:1.4μM)。対照的に、TSに対するCPF-373の阻害活性は、L1210/TK-細胞では実質的に変化せずに保持された（L1210/TK-細胞でのIC50:0.053μM、対、L1210/0細胞での0.013μM）。
【０１５８】
表５
（5-FdUrd及びCPF-373とのプレインキュベーション4時間後に[5-3H]dCydからのトリチウム放出によって決定されるときの）インタクトなL1210/0及びL1210/TK-細胞でのTSに対する5-FdUrd及びCPF-373のIC50値
【０１５９】
【表５】
0005978232.tif 000045
【０１６０】
アッセイ8
安定性アッセイ
カルボキシペプチダーゼY (EC 3.4.16.1)アッセイ
カルボキシペプチダーゼYに対するプロドラッグCPF-373の酵素安定性がin situ 31P NMR (202MHz)を用いて検討された。実験はｄ6−アセトン(150μL)にCPF-373 (3.0mg)を溶解し、TRIZMA緩衝液pH7.6 (300μL)を添加することによって実施された。この溶液はNMRチューブに入れられ、25°Cでの31P-NMR実験がブランク実験として記録された。酵素カルボキシペプチダーゼY (0.2mg)はTRIZMA (150μL)に溶解され、前記NMRチューブのホスホラミダート誘導体の溶液に添加された。次に、前記チューブはNMR機器に配置され、25°Cで14時間、31P-NMR実験（64スキャン）を4分毎に稼働するように設定された。データはブルカートップスピン(Bruker Topspin) 2.1プログラムで処理され、解析された。カルボキシペプチダーゼY及びTRIZMA緩衝液はシグマ−アルドリッチから購入された。
【０１６１】
ヒト血清
ヒト血清の存在下での前記プロドラッグCPF-373の安定性が、in situ 31P NMR (202MHz)を用いて検討された。前記プロチドCPF-373(1) (5.0mg)は、DMSO (0.05mL)及びD2O (0.15mL)に溶解された。その後、試料はNMRチューブに移され、（対照NMRのブランクの読み取りを得るために十分な溶媒とともに）37°CでNMRチャンバーに挿入された。その後、0.3mlのヒト血清が前記NMRチューブの試料に急速に添加された。NMR実験は、15分毎に12時間30分間データを記録するようにプログラムされた。（生物学的な媒体及び濃度による可能性が最も高い）余分なノイズ及び粗悪なシミングプロファイル(poor shimming profiles)のため、個別のスペクトルはさらに処理された。標準的なフーリエ変換処理後、各スペクトルは、基線なしにスペクトルのピークの頻度及び面積を単に表すためにデコンボリューションされた（ローレンツ−ガウスデコンボリューション (Lorentz-Gauss deconvolution)）。記録されたデータは、ブルカートップスピン2.1プログラムで処理され、解析された。
【０１６２】
pH1の緩衝液
pH=1での加水分解に対する前記プロドラッグCPF-373の安定性が、in situ 31P NMR (202MHz)を用いて検討された。前記プロチドCPF-373(1) (2.6mg)はMeOD (0.1mL)に溶解された後、（等量の0.2M HCl及び0.2M KClから調製された）0.5mL緩衝液(pH=1)が添加された。その後、前記試料はNMRチューブに移され、31P NMR実験が12分毎に14時間データを記録しながら37°Cで実施された。データは、ブルカートップスピン2.1プログラムで処理され、解析された。
【０１６３】
pH8の緩衝液
pH=8での加水分解に対する前記プロドラッグCPF-373の安定性が、in situ 31P NMR (202MHz)を用いて検討された。前記プロチドCPF-373(1) (4.9mg)はMeOD (0.1mL)に溶解された後、（0.1M Na2HPO4の溶液から調製され、0.1M HClによって調整された）0.5mL緩衝液(pH=8)が添加された。その後、前記試料はNMRチューブに移され、31P NMR実験が12分毎に14時間データを記録しながら37°Cで実施された。データは、ブルカートップスピン2.1プログラムで処理され、解析された。
【０１６４】
安定性の検討
前記プロドラッグCPF-373(1)の化学的安定性の検討が、in situ 31P NMRを用いて、前記化合物を、ヒト血清に及び水性緩衝液（pH1.0及びpH8.0）に曝露することによって実施された。各実験は、適当な重水素化溶媒でプロチドを溶解し、そして、規定時間の間隔でスキャンし、約14時間37°Cで試料を解析しながら実施された。より良い解明のために、最初のスペクトル（下部のグラフ）及びデコンボリューションされたスペクトル（上部グラフ）が報告される。ホスホラミダートCPF-373 (1)の安全性アッセイは、ヒト血清でのインキュベーション後、図６で示すように、12時間30分後に73%の未変化の化合物を示した。
【０１６５】
スペクトルは、〜δ2.00でヒト血清に固有のシングレットのピークと、〜δ4.50で親の二重のピークとを示し、該親は、4時間15分後にδ7.20でシングレットのピークとして示されるアミノアシルホスホラミダート中間体に加水分解された。
【０１６６】
化学的な加水分解が極端な実験条件、すなわち、37°CでpH1.0及びpH8.0で評価されるとき、酸性及び塩基性の両方の緩衝液条件でのプロドラッグCPF-373 (1)の完全な安定性が観察された。スペクトルは、図７及び８で示されるように、12分毎の規則的な間隔でスキャンしながら14時間記録された。pH1.0で試験した前記プロチド(1)は、アッセイの時間中、δ4.35;4.50でジアステレオマーの一定のダブレットのピークを示した（図７）。また、pH8.0で、前記スペクトルはδ4.48で前記プロドラッグの持続性のピークと、緩衝液のピークに対応するδ2.55でシングレットのピークとを示した（図８）。
【０１６７】
5-FdUrdホスホラミダートの代謝
図４で示されるように、取込み後、細胞内のプロチドの活性化の推定機序は、アミノアシル部分のエステルを加水分解するカルボキシぺプチダーゼ型の酵素によって仲介される第1の酵素活性化ステップ（ステップa）と、その後の、アリール基の自発環化及び後続の自発置換（ステップb）と、水によって仲介される不安定環の開環（ステップc）とを含む。最後のステップは、インタクトな細胞でヌクレオシドモノホスフェートの放出を伴う、ホスホラミダーゼ型の酵素によって仲介されるP-N結合の加水分解（ステップd）を含む（図４）（McGuiganら、2009；Mehellouら、2010）。
【０１６８】
CPF-373 (1)についての提案されている代謝経路と、5-FdUrdホスホラミダート誘導体のエステルモチーフが開裂されるか、開裂されないかを証明するために、インタクトな腫瘍細胞で推定活性化の第1段階を模倣するために設計された酵素インキュベーション実験が実施された。前記化合物(1)はTRIZMA緩衝液で（カテプシンAとしても知られる）カルボキシぺプチダーゼＹと共にインキュベーションされ、(1)の変換が31P NMRによってモニターされた。スペクトルは、図５で示されるように、4分毎の定期的な間隔でスキャンしながら14時間記録された。より良い分解能に対して、最初のスペクトル（下部のグラフ）及びデコンボリューションされたスペクトル（上部グラフ）が示される。
【０１６９】
31P NMRで、前記プロドラッグCPF-373 (1)は、前記ホスホラミダートのキラルホスフェート中心の特徴的なダブリングアップ(doubling-up)を有する親として知られる2つのジアステレオマーに対応する2つのピークδ4.07;4.23として示された。カテプシンAの添加後、前記化合物は4分後にエステルモチーフを欠く中間体δ4.95;5.16に急速に加水分解され、実際には、アミノアシルホスホラミダート中間体に急速に代謝されたので、アリール基の消失によってこのアッセイでの最終産物の、この中間体は持続しなかった（図４でのステップaないしc）。前記中間体は、アキラルホスフェート中心のため、δ6.85でシングレットピークとして示された。したがって、酵素アッセイスペクトルは、26分以内の推定中間体への完全な変換を伴って、親〜δ4.00の速い代謝を示し、アッセイの14時間中、一貫して存在しながらさらに留まった。ヌクレオシド一リン酸を放出するＰ−Ｎ結合の開裂は、予想通り、酵素実験で検出されなかった。この実験は、プロチドCPF-373 (1)の第1の活性化ステップが十分に有効な場合があり、したがって、インタクトな腫瘍細胞でヌクレオシド一リン酸代謝産物の最終的な送達を可能にする場合があることを示す。
【０１７０】
結論
結論として、本発明は、抗がんヌクレオシド類似体５−フルオロ−２'−デオキシウリジン(5-FdUrd)の新規のホスホラミダートヌクレオチドプロドラッグを提供し、該プロドラッグは合成され、それらの細胞増殖抑制活性について評価された。5-FdUrdは、チミジンキナーゼ(TK)−欠損のマウス白血病L1210及びヒトリンパ球CEMの細胞培養物でその細胞増殖抑制能を実質的に消失した一方、本発明の化合物、例えばCPF-373は、野性型及びTK-欠損腫瘍細胞の両方でそれらの抗増殖活性を顕著に保持し、したがって、それらの細胞増殖抑制作用を発揮するのに細胞内TK活性に全く非依存的であった。例えばCPF-373は、それらの細胞でその細胞増殖抑制活性とよく相関した薬剤濃度で、TK-欠損及び野生型の細胞株でチミジル酸シンターゼ(TS)を阻害することが発見された。CPF-373は、チミジンホスホリラーゼ(TP)及びウリジンホスホリラーゼ(UP)などの異化酵素による不活性化に感受性があるように見えない。これらの発見は、5-FdUrdは腫瘍細胞培養物でTPを発現するマイコプラズマの存在下で、その細胞増殖抑制能を実質的に消失するが、CPF-373は消失しないという観察に基づいている。したがって、CPF-373などの本発明の化合物は、(i)腫瘍細胞の潜在的な耐性機序（例えば、低下したTK活性）を回避し、(ii)活性がしばしば腫瘍細胞で上向き調節されるか、又はマイコプラズマが感染した腫瘍組織で発現されるTPなどの異化酵素によって分解されない新規の5-FdUrdホスホラミダートプロドラッグである。Vande Voorde, J.ら、Biochemical Pharmacology 82 (2011) 441-452は、全体として引用により本明細書に取り込まれる。
【０１７１】
以下に示すように、本発明の実施態様は、（2011年9月5日に出版された） McGuigan,C.ら、J.Med.Chem. 2011, 54 7247-7258で開示され、その内容が全体として引用により本明細書に取り込まれる。
【０１７２】
以下の表６は、IC50、すなわち50%まで腫瘍細胞増殖を抑制するのに必要とされる化合物濃度の観点から、腫瘍細胞株に対する5-FU、5-FdUrd、参考例CPF 382及び本発明の化合物の細胞増殖抑制活性を表示する。データは、少なくとも2つないし4つの独立した実験の平均(±SD)である。式(I)のＡｒに対応し、フェニル(Ph)又は１−ナフチル(Nap)のいずれかである「アリール」、式(I)のＲ3に対応する「エステル」、及び、アルファＣ原子及び式(I)のＣＲ1Ｒ2に対応する該アルファＣ原子の置換基を有するアミノ酸を示す「AA」に関して、表６は、参考例CPF 382及び本発明の化合物のホスホラミダートモチーフを同定する。表６は、表１で言及した化合物のいくつかの追加データと同様に、上記の表１で以前に言及されていない本発明の化合物も開示する。
【０１７３】
【表６−１】
0005978232.tif 000046
【０１７４】
【表６−２】
0005978232.tif 000047
【０１７５】
以下の表７は、IC50、すなわち50%まで細胞増殖を抑制するための化合物濃度の観点から、マイコプラズマ・ヒオリニス(L1210.Hyor)で感染された、野生型のマウス白血病L1210細胞培養物(L1210/0)及びL1210細胞培養物における5-FdUrd、参考例CPF 382及び本発明の化合物の細胞増殖抑制活性を表示する。データは、少なくとも2ないし4回の独立した実験の平均(±SD)である。表７は、１−ナフチルを意味する「Naph」を伴って、表６に関して上述されたように、参考例CPF 382及び本発明の化合物のホスホラミダートモチーフを同定する。表７は、表２で言及した化合物のいくつかの追加データと同様に、上記の表２で以前に言及されていない本発明の化合物を開示する。
【０１７６】
【表７−１】
0005978232.tif 000048
【０１７７】
【表７−２】
0005978232.tif 000049
【０１７８】
【表７−３】
0005978232.tif 000050
【０１７９】
以下の表８は、IC50、すなわち50%まで腫瘍細胞増殖を抑制するのに必要とされる化合物濃度の観点から、hEnt1輸送体を含む(Cem/hEnt-1)か、若しくはhEnt1輸送体を欠いている(Cem/hEnt-0) CEM細胞培養物での5-FdUrd及び本発明の化合物の細胞増殖抑制活性を表示する。データは、少なくとも2ないし4回の独立した実験の平均(±SD)である。表８は、１−ナフチルを意味する「Naph」を伴って、表６に関して上述されるように、本発明の化合物のホスホラミダートモチーフを同定する。本発明の化合物は、hENT1-欠損CEM細胞に対してわずか7ないし15分の1に抗増殖活性を消失させるため、本発明の化合物は、5-FdUrdに比べて、前記hENT1輸送体の存在により少なく依存することを表８のデータは示す。これらの観察は、類似の実験条件下での5-FuDrd及びFdUMPの抗増殖活性の20-ないし60-倍の消失と比較して、輸送阻害剤（すなわち、ジピリダモール及びNBMPR）の存在下で、本発明の化合物のわずか2ないし7分の1に減少した細胞増殖抑制活性に一致する。
【０１８０】
【表８】
0005978232.tif 000051
【０１８１】
以下のように化合物CPF 381に関して検討が実施された。酵素ホスホリラーゼアッセイは、リン酸カリウム緩衝液（300nM溶液、pH7.4）の存在下で、チミジンホスホリラーゼ（大腸菌から精製されたTP）を用いて実施された。5分、14時間及び72時間後の19F NMRスペクトルは、加リン酸分解の証拠を全く示さなかった。5-FdUrdと対照的に、CPF 381は、チミジンホスホリラーゼに対して基質であるとしても、非常に弱い。
【０１８２】
化学的な加水分解が、pH1及びpH8の実験条件下で評価され、31P NMRによってモニターされた。酸性条件下(pH1)のアッセイ中（14時間）、2種類のジアステレオマーを示す2本のピークのみが表示された。31P NMRスペクトルで新たなシグナルが形成されないことは、化合物CPF 381が酸性媒体で非常に安定であることを示す。化合物CPF 381が弱塩基性条件下(pH8)でのアッセイに供されたとき、同一の結果が観察された。
【０１８３】
以下のように化合物CPF 581に関して検討が実施された。カルボキシぺプチダーゼYアッセイを用いる酵素的検討が実施され、化合物CPF 581、カルボキシぺプチダーゼY及びTrizma緩衝液(pH7.6)はアセトン−ｄ6に溶解され、31P NMRスペクトル (202MHz)スペクトルは、14時間にわたって規則的な間隔（7分毎）で記録された。化合物CPF 581が、エステル(R3)部分を欠いている第1代謝産物であり、おおよそ類似の割合で代謝される両方のジアステレオマーに急速に加水分解された。第1代謝産物のさらなる代謝は、5分未満の推定半減期を伴って、約45分以内にＡｒを欠いているアニオン性の第2代謝産物の形成をもたらした。したがって、最初の活性化ステップの割合は、ホスホラミダートの良好な生物活性に対して必要なもののうちの1つと一般的に考えられる。トリエチルアミン及び水の存在下での化合物CPF 373の化学的な加水分解が、前記アニオン性の第2代謝産物のジアンモニウム塩を生成し、すなわち、Trizmaで化合物CPF 581由来の酵素的第2代謝産物のみを含む化合物CPF 373由来の最終アッセイ試料に添加された。前記試料はδP6.85ppmにシングルピークのみを示し、本発明のホスホラミダート化合物の代謝経路及び活性化のこの部分を強く支持する31P NMRスペクトルを有した。
【０１８４】
以下のように化合物CPF 386に関して検討が実施された。ヒト血清の存在下での化合物CPF 386の安定性がin situ 31P NMRを用いて検討された。DMSO及びD2Oでの化合物CPF 386の対照31P NMRデータが記録された。その後、NMR試料はヒト血清で処理され、37°Cでさらなる31P NMR実験に即座に供された。前記31P NMRデータは14時間にわたって15分毎に記録された。スペクトルは、〜δP2.00ppmにヒト血清に固有のシングルピークと、〜δP4.59及び4.84ppmに化合物CPF386に対応する2本のピークとを示した。約6時間45分後、前記化合物は、δP5.79ppmにシングルピークとして、R3 (Et)を欠いている中間体に部分的に加水分解された。11時間30分後、δP7.09ppmでシングルピークとして示されたＡｒ（１−ナフチル）を欠いている第2代謝産物の形成が観察された。13時間30分後、反応混合物は、提案される第1代謝産物(3%)及び第2代謝産物(1%)とともに、96%の親化合物CPF 386を含んだ。
【０１８５】
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【図１】
0005978232.tif 000055
【図２Ａ】
0005978232.tif 000056
【図２Ｂ】
0005978232.tif 000057
【図２Ｃ】
0005978232.tif 000058
【図３Ａ】
0005978232.tif 000059
【図３Ｂ】
0005978232.tif 000060
【図３Ｃ】
0005978232.tif 000061
【図３Ｄ】
0005978232.tif 000062
【図３Ｅ】
0005978232.tif 000063
【図３Ｆ】
0005978232.tif 000064
【図４】
0005978232.tif 000065
【図５】
0005978232.tif 000066
【図６】
0005978232.tif 000067
【図７】
0005978232.tif 000068
【図８】
0005978232.tif 000069
【図９Ａ】
0005978232.tif 000070
【図９Ｂ】
0005978232.tif 000071
【図１０Ａ】
0005978232.tif 000072
【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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