(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスクリアランス研究における対数減少値（ＬＲＶ）の計算値を上昇させる目的で異種栄養性マウス白血病ウイルス（Ｘ−ＭｕＬＶ）ストックの力価の実測値を上昇させるための方法であって、
ａ）Ｘ−ＭｕＬＶストック、細胞培養培地、指標細胞株およびアッセイプレートを提供する工程；
ｂ）指標細胞株および培地をアッセイプレートに加える工程；
ｃ）Ｘ−ＭｕＬＶストックをアッセイプレート上の細胞株および培地に加える工程；
ｄ）細胞株、培地およびＸ−ＭｕＬＶストックを含むアッセイプレートを遠心分離する工程；
ｅ）遠心分離工程を停止する工程；および
ｆ）結果として生じたＸ−ＭｕＬＶストックの力価を測定する工程であって、結果として生じたＸ−ＭｕＬＶストックの力価は、遠心分離工程（ｆ）の非存在下において測定される場合のＸ−ＭｕＬＶ力価よりも１０倍高い、工程
を含む、方法。
【請求項２】
アッセイプレートが、組織培養プレート、ウェルプレート、フラスコまたは試験管からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
遠心分離工程（ｄ）が、５０×ｇから２４００×ｇまでのｇ力の範囲において５分間から２４時間行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
遠心分離工程（ｄ）が、５００×ｇから１０００×ｇまでのｇ力の範囲において３０分間から１２０分間行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
遠心分離工程（ｄ）中の温度が、４℃から３９℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
遠心分離工程（ｄ）中の温度が、２１℃から３９℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
インキュベートする工程をさらに含み、Ｘ−ＭｕＬＶストック、培地および細胞株を含むアッセイプレートが、遠心分離工程（ｄ）の前にインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
インキュベートする工程をさらに含み、Ｘ−ＭｕＬＶストック、培地および細胞株を含むアッセイプレートが、遠心分離工程（ｄ）の後にインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
インキュベートする工程をさらに含み、Ｘ−ＭｕＬＶストック、培地および細胞株を含むアッセイプレートが、遠心分離工程（ｄ）の前および後にインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
Ｘ−ＭｕＬＶストックが、予め希釈されている、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、出願日が２０１２年３月１３日である米国仮特許出願第６１／６１０，２２０号明細書の優先権の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、ウイルスストックの力価の計算値を上昇させる、ウイルス力価アッセイの感度の上昇に関する。より詳細には、本発明は、感染確率を最大にするがゆえにウイルス力価の測定値を上昇させる目的で、ウイルスまたはウイルス様粒子と指標細胞単層との接触を増加させる、遠心分離によって支援される感染手順の使用に関する。このウイルス力価の上昇は、ウイルスクリアランス研究における対数減少値（ＬＲＶ）の計算において有益であり得る。
【背景技術】
【０００３】
モノクローナル抗体、組換えタンパク質、ワクチン、血液製剤および動物性製品などの生物医薬品は、感染性ウイルスを伝染させるリスクを有する。これは、場合によっては本質的にウイルスまたはウイルス様粒子で汚染されている原料物質が原因である。さらに、生物医薬品の製造方法は、外来性の原料からのウイルス汚染を受けやすい。結果として、生物医薬品の製造者には、製品に汚染ウイルスが含まれていないことを保証するのに十分なウイルスクリアランス工程を製造方法に組み込むことが求められている。このようなウイルスクリアランス工程は、典型的には、ウイルス除去工程、ウイルス不活性化工程またはこれらの工程の組み合わせを含む。生物医薬品の製造方法がこれらのウイルスクリアランス工程を組み込むことは、安全上および規制上の義務である。
【０００４】
製造方法におけるウイルスクリアランス工程の有効性の評価は、必須である。ウイルスクリアランスの評価の目的は、製造生産方法が潜在的なウイルス夾雑物を不活性化するおよび／または除去する能力を評価することである。生産スケールの方法を縮小したモデルにおいてウイルスクリアランス工程を評価および検証するために、通常、スパイク研究が使用される。
【０００５】
スパイク研究は、生物製剤の製造過程中間材料にウイルスを加える（または「スパイクする」）ことによって行われる。次いで、この材料（または「供給物（ｆｅｅｄ）」）を、小型化バージョンの製造方法工程（または「単位操作」）に供する。この単位操作の前および後の供給物中のウイルスの量を定量し、この差は、この工程のウイルス減少量を定義する。このウイルス減少量は、典型的には、ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）に換算して表される。このタイプの研究は、「ウイルスクリアランス」、「ウイルス減少」または「ウイルスバリデーション」と呼ばれる。
【０００６】
生物医薬品に対する規制上の期待は、かなりの量のウイルス夾雑物が最終生成物に達する可能性が低いことを保証するために、製造方法が様々なモデルウイルスに対して適切な総ＬＲＶを提供することである。ある方法に対する総ＬＲＶは、関連する各方法工程に対して、縮小されたウイルスクリアランス研究を行うことによって得られる。次いで、各工程に対して得られたＬＲＶを合算することにより、この方法に対する総ＬＲＶが得られる。「直交性」である単位操作のＬＲＶだけが、このように合算され得、これは、ＬＲＶの和を構成する各工程が、異なる機序によってウイルスを排除しなければならないことを意味する。
【０００７】
ウイルスクリアランス研究においてウイルス夾雑物を定量するために最もよく使用されるウイルスアッセイは、５０％組織培養制限量（ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｏｓｅ）（ＴＣＩＤ５０）、プラーク形成単位（ＰＦＵ）およびフォーカス形成単位（ＦＦＵ）アッセイである。これらのアッセイの各々は、試験される材料の希釈物を培養中の好適な細胞に曝露することによって機能する。十分な時間が経過した後、ウイルス感染の徴候について、通常、顕微鏡によって細胞を調べる。次いで、各希釈物において検出された感染事象の数を使用して、ウイルス力価を計算する。
【０００８】
幾つかの単位操作は、ウイルスクリアランスにとって非常に有効であり、工程後の材料にウイルスが検出されない点にまでウイルスを減少させる。これらの場合、工程後の材料におけるウイルス力価は、このウイルスアッセイに対する検出限界以下であると仮定される。検出限界は、アッセイされる材料の量に依存し；より大きいサンプル体積のスクリーニングは、検出限界を低下させる。工程後の材料においてウイルスが検出されないと仮定するとき、この操作に対して測定されるＬＲＶは、究極的には２つの因子：ウイルスの存在について調査／アッセイされる材料の量（これは検出限界を決定する。）およびスパイクされた供給材料におけるウイルスの力価にしか依存しない。
【０００９】
スパイクされた供給物において得ることができる最大のウイルス力価は、ウイルスストックの力価によって限定される。規制ガイドラインには、供給材料は、合計体積の１０％を超える体積のウイルスストックでスパイクされるべきでないと明記されている。さらに、単位操作の実施に対するウイルススパイクの影響に関する実施上の配慮点は、ウイルススパイクのパーセンテージをより低い値に制限することであることが多い。いずれにしても、より高い力価のウイルスストックは、供給材料のより高力価のスパイクを可能にする。これは、ウイルスストックがより高力価であると、非常に有効なウイルスクリアランス工程に対しては、より高いＬＲＶが示されることを意味している。
【００１０】
例えば、１０ｍＬのサンプルを調査するときのウイルスアッセイの検出限界は、０．５ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬであると仮定する。試験される単位操作が、工程間で材料の体積の変化がない濾過工程であるとも仮定する。この供給材料は、フィルターの限界に起因して、最大１％のウイルスストックでしかスパイクされない可能性がある。ウイルスストックの力価が７．０ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬである場合、１％のスパイクされた供給材料における力価は、５．０ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬであり得る。単位操作によって、工程後の材料中にウイルスが検出されなくなる場合、報告されるＬＲＶは、「≧４．５」（５．０−０．５）であり得る。しかしながら、利用可能なウイルスストックが、８．０ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬという力価の測定値を有した場合、報告されるＬＲＶは、「≧５．５」であり得ることから、この工程が１０倍高いウイルス除去能力であると判断される証拠が示唆される。
【００１１】
単位操作の報告されるＬＲＶを最大にできる能力は、生物製剤の製造者にとって非常に経済的に価値がある。特にレトロウイルスの場合、規制上の期待に応えるために、製造方法全体にわたる総ＬＲＶに対する具体的な目標値を達成しなければならない。方法に存在する単位操作がこのＬＲＶ目標値を満たすことができない場合、総ＬＲＶ要求を改善するためにさらなる製造工程を追加しなければならない。
【００１２】
さらに、ウイルスクリアランスの検証は、費用のかかる方法であるので、検証されなければならない工程の数を最小にすることが望ましい。ゆえに、より高力価の測定実測値のウイルスストックは、より高いＬＲＶが各単位操作に対して得られるようにでき、最低限の方法工程で目標値の達成が容易になることによって、有意な費用節約がもたらされる。
【００１３】
感染性ウイルス力価を測定するために使用されるアッセイは、材料中に存在するすべての感染性ウイルス粒子を検出するわけではないという点において、通常、不十分である。これらのアッセイの効率は、使用される細胞株、培地添加物および環境条件を含む幾つかの因子によって影響される。生物製剤の製造者は、付加される複雑さおよび検証されなければならない工程の数を最小にしつつ、ウイルスアッセイの効率を高め、ゆえに、ウイルスサンプルの力価の測定値を高める経済的な手法を必要としていることは明らかである。ウイルスサンプルの力価の測定実測値の上昇は、非常に有効なウイルスクリアランス操作に対して示され得るＬＲＶを高め得るので、ウイルスクリアランス研究にとって非常に有益である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の目的は、ウイルスクリアランス研究における対数減少値（ＬＲＶ）の計算値を上昇させる目的で、ウイルスストックの力価の実測値を上昇させるための方法を提供することである。この方法は、ウイルス細胞培養プレートにおける指標細胞の、遠心分離によって支援される感染（または「スピノキュレーション（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）」）を使用して、感染力に基づくアッセイ、例えば、ＴＣＩＤ５０、プラーク形成単位（ＰＦＵ）およびフォーカス形成単位（ＦＦＵ）アッセイにおける力価測定（ｔｉｔｒａｔｅｄ）ウイルスの検出を改善する。
【００１５】
本発明の別の目的は、ウイルスクリアランス研究における対数減少値（ＬＲＶ）の計算値を上昇させる目的で、細胞培養培地、指標細胞株およびウイルスストックを中に含んでいるアッセイプレートを遠心分離（即ち、スピノキュレーション）することによって、ウイルスストックの力価の実測値を上昇させるための方法を提供することであり、ここで、結果として得られるウイルス力価の計算値は、遠心分離（即ち、スピノキュレーション）工程の非存在下において得られるウイルス力価の計算値よりもおよそ１０倍高い。
【００１６】
なおも他の実施形態において、本発明は、ウイルスクリアランス研究における対数減少値（ＬＲＶ）の計算値を上昇させる目的で、ウイルスストックの力価の実測値を上昇させるスピノキュレーションを使用してＴＣＩＤ５０アッセイにおけるレトロウイルスの検出を改善する、組織培養プレートの遠心分離に関する。スピノキュレーションは、低力価のウイルスの細胞感染効率を高めるために使用され、その他の方法では感染が起きる可能性が最も低いであろうウイルスサンプルの希釈物において感染が起きる。これにより、その他の方法よりも高いウイルス力価の計算値を有すると指摘されるウイルスストックがもたらされ、ゆえに、より高い力価のウイルススパイクを、ウイルスクリアランスにおいて使用することができる。ウイルスクリアランス工程は、もはやウイルスを検出できない点にまでウイルスを減少させることが多いので、このより高いスパイクは、より高いＬＲＶ計算値をもたらす。
【００１７】
本発明のさらなる特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲に示される。当業者に明らかであるように、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の多くの改変および変更を行うことができる。前述のおおまかな説明および以下の詳細な説明、特許請求の範囲、ならびに添付の図面は、単に例示的および説明的なものであって、本教示の様々な実施形態の説明を提供するように意図されていることが理解されるべきである。本明細書中に記載される特定の実施形態は、単なる例として提供され、決して限定であることを意味するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】遠心分離の時間に対するウイルス力価の測定値のグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、別段示されない限り、成分の量、材料のパーセンテージまたは比率、反応条件を表すすべての数字、ならびに本明細書および特許請求の範囲において使用される他の数値は、すべての場合において、用語「約」によって修飾されると理解されるべきである。
【００２０】
従って、反対のことが示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に示される数値パラメータは、本発明によって得られるように目指されている所望の特性に応じて変動し得る近似値である。少なくとも、特許請求の範囲への均等論の適用を限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、少なくとも、報告される有効数字の数字に照らして、通常の切り上げの手法を適用することによって解釈されるべきである。本発明の広い範囲を説明している数値の範囲およびパラメータは、近似値であるにもかかわらず、特定の例において示される数値は、できるだけ正確に報告される。
【００２１】
さらに、本明細書中に開示されるすべての範囲は、この中に包含されるすべての部分範囲を含むと理解されるべきである。例えば、「１から１０」という範囲は、１という最小値と１０という最大値との間の（およびこれらを含む）任意およびすべての部分範囲、つまり、１以上の最小値および１０以下の最大値を有する任意およびすべての部分範囲、例えば、５．５から１０を含む。
【００２２】
本発明をさらに詳細に説明する前に、幾つかの用語を定義する。これらの用語の使用は、本発明の範囲を限定せず、本発明の説明を容易にするためだけに使用する。
【００２３】
本明細書中で使用されるとき、文脈に明らかに矛盾しない限り単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その複数形を含む。
【００２４】
本発明の実施は、別段示されない限り、当業者の技術範囲内である細胞生物学、分子生物学、細胞培養、ウイルス学、免疫学などの従来の手法を使用する。これらの手法は、最新の文献および参考文献、具体的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｄｓ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）：Ｃｅｌｉｓ  Ｊ．Ｅ．「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）およびＢａｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５４：１３１−１４３（１９９５）に十分に開示されている。
【００２５】
本明細書において引用されているすべての刊行物および特許出願は、本発明が属する分野の当業者の技術レベルを示すものであり、これらの全体が参照により援用される。
【００２６】
細菌、ウイルス、プリオンなどによる、生物医薬品、例えば、抗体、組換えタンパク質、ワクチン、血液製剤、血漿および動物性製品などの汚染は、十分に対処される必要がある深刻なリスクである。汚染は、種々の方法で生じ得る。例えば、原料の材料（例えば、細胞培養物中の細胞、血液製剤など）が、本質的にウイルスで汚染されているので、汚染が生じ得る。
【００２７】
生物医薬品の製造方法もまた、外来性の原料からのウイルス汚染を受けやすい（例えば、滅菌されていないまたは不適切にしか滅菌されていない材料を使用することによる不注意の持ち込みにおいて）。これらの製品の性質のせいで、生物医薬品の製造者は、高度に規制されており、この製造者には、製品に夾雑物が含まれていないことを保証するのに十分なウイルスクリアランス工程を製造方法に組み込むことが求められている。複数のウイルスクリアランス工程が、製造方法に組み込まれ得る。これらのウイルスクリアランス工程の各々は、生物製剤の製造方法が承認される前に、この有効性について評価される必要があり、ゆえに、検証される必要がある。ウイルスクリアランス工程は、典型的には、ウイルス除去工程またはウイルス不活性化工程を含む。
【００２８】
本明細書中で使用される「ウイルス除去」は、ウイルスがサンプルから物理的に除去される方法を意味する。これは、ナノ濾過またはクロマトグラフィーによって達成されることが多い。ナノ濾過法は、サイズ排除によってウイルスを除去する。ウイルスを除去するためのクロマトグラフィー方法の成功は、使用されるカラムの組成および試薬（例えば、緩衝液）に依存する。
【００２９】
本明細書中で使用される「ウイルス不活性化」は、ウイルスが、非感染性（不活性）の形態で最終生成物に残存し得る方法を意味する。多くのウイルスは、化学的変化によって不活性化され得る脂質またはタンパク質のコートを含む。または、幾つかのウイルス不活性化方法は、ウイルスを完全に変性させる。ウイルス不活性化方法の例としては、溶媒および／または洗浄剤による不活性化、殺菌（例えば、高温への加熱）、ｐＨ不活性化（例えば、酸性ｐＨの使用）および照射（例えば、紫外線（ＵＶ）またはガンマ線照射）が挙げられる。
【００３０】
製造方法における汚染ウイルスの濃度またはウイルス汚染のリスクは、極端に低いことがあるが、ウイルスは、感染性の性質であるので、１つのウイルス粒子でさえも、製造方法の実施全体を損なうのに十分であり得る。製造方法における適切な除去または不活性化の方法を決定するために、特別な措置を講じなければならないのは、この理由のためである。従って、このようなウイルスクリアランス方法の有効性は、評価および検証される必要がある。特にこの目的のために、スパイク研究が考案された。
【００３１】
スパイク研究は、ウイルスクリアランス工程を評価および／または検証するため、ならびにウイルスクリアランス方法において使用される装置を評価および／または検証するために、生産スケールの方法のウイルスクリアランス工程を縮小したモデルを使用する。できるだけ高い力価のウイルスストックが望ましい。これは、試験系に加えることができるウイルススパイクの体積が、Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｍａｎｄａｔｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｔｙ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ（例えば、Ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ））によって限定されていることに一部起因する。
【００３２】
ゆえに、ウイルスストックの力価は、試験材料にスパイクされるウイルスの最大可能濃度を決定する。結果として、生産方法においてウイルスを取り除く試験ユニットの実際の能力が、過小評価されることがある。ウイルス産生に関する本発明者らの知識の現在の限界は、高純度および高力価のウイルスストックを生成する能力を欠く方法に帰する。
【００３３】
本明細書中に提供される手法は、ウイルス力価測定アッセイの効率を高め、これらの手法の非存在下において測定された場合のウイルス力価よりも約１０倍（１０倍）高いウイルス力価の測定値を有するウイルスストックをもたらす。このウイルス力価の測定値の上昇は、非常に有効なウイルスクリアランス操作に対して示され得るＬＲＶを上昇させ得るので、ウイルスクリアランス研究にとって大きな利点である。
【００３４】
５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）アッセイは、サンプル中の感染性のウイルス粒子の数を数えるための方法である。ＴＣＩＤ５０は、接種された培養物の５０％において細胞変性効果をもたらし得る病原因子（ウイルス）の量である。ＴＣＩＤ５０値は、サンプル中の感染性ビリオンの数に比例するが、この数と同じではない。この方法を用いて決定される力価は、典型的には、ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして報告される。
【００３５】
このアッセイによってウイルスが全く検出されないとき、このサンプルに対する最大可能力価は、最低検出限界（ＬＯＤ）の計算を用いて決定される。この計算は、アッセイの感度を考慮しており、何かを検出するアッセイなしでサンプル中に存在し得る最大量のウイルスを報告する。これらの計算の結果は、サンプルにおける実際の力価がＸ以下であることを意味する「≦Ｘ」として報告される力価である（９５％の確実性まで）。このＬＯＤ計算は、もっぱら、試験されるサンプルの量およびアッセイ前のサンプルに対して行われる任意の事前の希釈に依存する。
【００３６】
感染性ウイルス力価は、通常、プラーク形成単位（ＰＦＵ）アッセイまたは５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）アッセイによって定量される。これらの手法の両方ともが、ウイルス含有溶液の段階希釈物を、感受性の宿主細胞を含む組織培養物に加える工程を含む。次いで、この細胞に対する感染事象の数を数えることによって、元のサンプル中のウイルスの量が計算される。これらのアッセイによって検出されるウイルスの量は、ウイルスが宿主細胞に感染する能力およびこのウイルスが宿主細胞に感染する割合によって限定される。
【００３７】
細胞培養物を遠心分離することによってレトロウイルスによる細胞の感染を増加させるという発想は、公知であり、例えば、Ｆｏｒｓｔｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈ  ６０：１７１を参照のこと。Ｆｏｒｓｔｅｌｌは、感染中の遠心分離、即ちスピノキュレーションによって、レトロウイルスが宿主細胞にレポーター遺伝子を形質導入する能力が高められることを証明した。
【００３８】
本明細書中に教示され、これまでに本発明者らに知られていなかったように、本発明者らは、組織培養またはアッセイプレートの遠心分離（即ち、本明細書中で、スピノキュレーションまたは細胞培養物の遠心分離接種と称される方法）が、ＴＣＩＤ５０アッセイにおけるレトロウイルスの検出を改善すると見られることを見出した。
【００３９】
本明細書中に教示され、これまでに本発明者らに知られていなかったように、異種栄養性マウス白血病ウイルス（Ｘ−ＭｕＬＶ）が、遠心分離された、指標細胞株を播種した組織培養プレートまたはアッセイプレート上で力価測定されるとき、プレート上の細胞株にウイルスが加えられた後の組織培養プレートの遠心分離またはスピノキュレーション工程は、元のストックのウイルス力価が、標準的な方法によってＴＣＩＤ５０アッセイが行われるときよりもおよそ１０倍高いと計算されるように、ＴＣＩＤ５０アッセイの感度を予想外に高める。遠心分離またはスピノキュレーション工程の追加以外は、当該分野で公知の通常の標準的なＴＣＩＤ５０アッセイとして、このＴＣＩＤ５０アッセイは行われる。
【００４０】
スピノキュレーションが働く正確な機序は不明である。この遠心力は、ウイルスを細胞上に沈降させるには不十分である。いかなる１つの理論にも拘束されることを望むものではないが、より効率的なウイルスの付着を可能にする細胞表面のいくらかの変形が存在し得ると仮定される。レトロウイルスは、細胞表面に対して固有の電荷に基づく斥力を有すると知られているので、このことは、レトロウイルスにとって特に有効であり得る。
【００４１】
ウイルスストックの力価を上昇させるためにスピノキュレーションを使用することは、現在に至るまでずっと、ウイルスクリアランス研究などの分野において使用されていない手法である。本発明者らは、ウイルスストック（即ち、Ｘ−ＭｕＬＶストック）を、標準的なＴＣＩＤ５０法であるが、ウイルスを加えた後に時間を延ばしながら細胞培養プレートの遠心分離（即ちスピノキュレーション）（例えば、１８００ＲＰＭ）を追加することによって力価測定したとき、ウイルスストックの力価の測定値が徐々に上昇することを予想外にも見出した。
【００４２】
ウイルスストックの力価の測定値は、この測定値を測定するために使用される方法および／または工程に依存する。本発明者らは、本明細書中に教示されるようなスピノキュレーション法による標準的なＴＣＩＤ５０アッセイの改変が、ウイルスストックの力価に対して予想外にも高い感度を提供することを見出し、これは、既存のウイルスストック（例えば、Ｘ−ＭｕＬＶ）の力価を効率的に１０倍上昇させるという利点を有する。
【００４３】
既存のウイルスストックの力価を１０倍上昇させることは、ウイルスクリアランス検証研究において意図される目的でこのようなウイルスストックを使用したとき達成される対数減少値（ＬＲＶ）に直接の影響を及ぼす。ウイルスクリアランス研究において本明細書中に提供されるようなスピノキュレーション法を使用することは、試験されているクリアランス操作によって、単位操作後の材料においてウイルスが検出されなくなるとき、レトロウイルスに対してさらなる１ＬＲＶを本質的に提供する。このような場合において、ウイルスクリアランス方法に対するＬＲＶは、もっぱら、スパイクされた材料中のウイルスの力価および試験された単位操作後の材料の量に基づく。スピノキュレーションは、スパイクされた材料のウイルスの力価の測定値を１ｌｏｇ上昇させるので、これは、クリアランスにおける１ＬＲＶの増加にそのまま変換される（従来使用されていた方法による、スパイクされた供給物の力価測定に対して）。
【００４４】
生物製剤の製造者が、レトロウイルスのクリアランスに対して満たされなければならない難しい目標を有することを考えると（典型的には、方法全体にわたって合計１２から２０ＬＲＶ）、本明細書中に教示されるようなスピノキュレーション法の使用は、予想外にも、さらなる１ＬＲＶを達成する能力をウイルス濾過工程に提供し、これにより、典型的には、濾液中にウイルスが検出されなくなる。さらに、本明細書中に教示されるスピノキュレーション法は、すべてのウイルスクリアランス工程において使用することができ、ウイルスを検出不可能なレベルにまで減少させるのに十分効果的である１ＬＲＶを各工程に対して潜在的に付加する。これは潜在的に、典型的なＭＡｂ方法に対して、レトロウイルスの場合、合計２から４ＬＲＶを付加し得る。
【００４５】
以下の実施例は、本発明をさらに説明する目的で提供されるが、決して限定として受け取られるべきでない。さらに、以下の実施例は、本発明の方法を行う方法および実施する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために提供されるものであって、本発明者が自身の発明とみなす範囲を限定することを目的としていない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関して正確性を保証する試みが行われているが、いくらかの実験誤差および偏差が説明されるべきである。別段示されない限り、温度は、セルシウス度（℃）であり、化学反応は、大気圧または示されるような膜間圧において行われ、用語「外界温度」とは、およそ２５℃のことを指し、「雰囲気圧」とは、大気圧のことを指す。
【００４６】
本発明は、本発明の例示を意図した以下の実施例によってさらに明確にされるだろう。
【実施例】
【００４７】
［実施例１］
使用された試験材料：
Ａ）異種栄養性マウス白血病ウイルス（Ｘ−ＭｕＬＶ）
１）株：ＡＴＣＣ  ＶＲ−１４４７
２）Ｐｒｅｐタイプ：精製されたＶＳＰ  Ｘ−ＭｕＬＶ  Ｍｋ１
３）Ｌｏｔ  ＃ＣＰ２；生成日：２００９年１１月
４）記録されている力価：５．９４ｌｏｇＴＣＩＤ５０／ｍｌ
Ｂ）マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）
１）株：ＡＴＣＣ  ＶＲ−１３４６
２）Ｐｒｅｐタイプ：ＶＳＰ  ＭＶＭ  Ｍｋ２．１
３）記録されている力価：１０．４ｌｏｇＴＣＩＤ５０／ｍｌ
Ｃ）プレート調製
１）実験の前日に、標準的なプロトコルによって、９６ウェルプレートにＰＧ−４細胞（＃１から＃１６とラベルした。）を播種した（各ウェルは、５．０μｇポリブレン／ｍｌ（最終濃度は、接種後、２．５μｇ／ｍｌになり得る。）を含む１００μｌの培地を含む。）。
２）また、標準的なプロトコルによって、９６ウェルプレートに、３２４Ｋ細胞（＃１７から＃２０とラベルした。）を播種した。
【００４８】
Ｄ）ウイルスストックの希釈
１）５０ｍｌのチューブに、Ｘ−ＭｕＬＶストックウイルスから単一の１０倍段階希釈物（１０−２から１０−８）を調製した。
（ａ）７本のチューブに＃２から＃８までラベルした。
（ｂ）以下の培地を希釈のために使用した：
（１）１％ＦＢＳ、１×Ｐｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ、１×Ｌ−Ｇｌｕｔ、１×ＮＥＡＡが補充されたＭｃＣｏｙ培地（標準的なＸ−ＭｕＬＶ力価測定プロトコルに従って）。
（ｃ）４９．５ｍｌの培地を＃２のチューブに加えた。＃３から＃８のチューブには４５ｍｌの培地を加えた。
（ｄ）０．５ｍｌのウイルスストックを＃２のチューブに加え、混合した。
（ｅ）５ｍｌを＃２のチューブから＃３のチューブに移し、混合した。１０倍の段階希釈を＃８のチューブまで続けた。
２）５０ｍｌチューブに、ＭＶＭストックウイルスの単一の１０倍段階希釈物（１０−２から１０−１３）を調製した。
（ａ）１２本のチューブを＃２から＃１３までラベルした。
（ｂ）以下の培地を希釈のために使用した：
（１）１％ＦＢＳ、１×Ｐｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ、１×Ｌ−Ｇｌｕｔ、１×ＮＥＡＡが補充されたＤＭＥＭ培地（標準的なＭＶＭ力価測定プロトコルに従って）。
（ｃ）１９．８ｍｌの培地を＃２のチューブに加えた。＃３から＃７には１８ｍｌの培地を加えた。
３）０．２ｍｌのウイルスストックを＃２のチューブに加え、混合した。
４）２ｍｌを＃２のチューブから＃３のチューブに移し、混合した。１０倍の段階希釈を＃１３のチューブまで続けた。
【００４９】
Ｅ）ウイルス力価測定
１）上で調製された希釈物を使用して、標準的なプロトコルによって、Ｘ−ＭｕＬＶおよびＭＶＭを力価測定した。
（ａ）Ｘ−ＭｕＬＶ：プレート＃１から＃１６にわたって１０−３から１０−８まで力価測定した。
（ｂ）ＭＶＭ：プレート＃１７から＃２０にわたって１０−８から１０−１３まで力価測定した。
２）すべてのプレートを、遠心分離の順番までおよびその後、３７℃、５％ＣＯ２恒温器内に置いた。
【００５０】
Ｆ）スピノキュレーション
１）プレートを、下記の（ｅ）項に提供されている表１に明記されている時間にわたって遠心分離した。
（ａ）０分のコントロールは、単に恒温器内に放置しただけだった。
（ｂ）速度：１８００ＲＰＭ＝６７０×ｇ
（ｃ）温度：２５℃に設定
（ｄ）各プレートを、このランの全時間にわたって連続的に遠心した（即ち、開始／停止なし）。
（ｅ）表１
【００５１】
【表１】
0005970601.tif 000002
【００５２】
Ｇ）プレートを、適切な読み出し時間まで（ＸＭＬＶは７日間、ＭＶＭは１０日間）３７℃、５％ＣＯ２においてインキュベートし、次いで、プレートをスコアリングした。
【００５３】
Ｈ）表２および３に結果を示す。
【００５４】
【表２】
0005970601.tif 000003
【００５５】
【表３】
0005970601.tif 000004
【００５６】
コントロールと比較して、表２において、ＸＭＬＶを含むプレートを９０分間遠心した後、約１．５ｌｏｇのウイルス力価の増加が見られた。表３におけるＭＶＭプレートでは、コントロールと有意差はなかった。
【００５７】
図１は、遠心分離の時間に対する、ウイルス力価の測定値のグラフ表示である。ウイルスを加えた後の様々な時間にわたる１８００ＲＰＭでの９６ウェルプレートの遠心分離を加えて、標準的なＴＣＩＤ５０法によって、Ｘ−ＭｕＬＶストックを力価測定した。時間を延ばしつつプレートを遠心すると、ウイルス力価の測定値が徐々に上昇するのが見られ、最も大きな上昇は、最初の６０分以内に生じた。
【００５８】
上に示された開示は、独立した有用性を備える、複数の異なる発明を包含し得る。これらの発明の各々は、好ましい形態で開示されてきたが、本明細書中に開示および例証されるようなこれらの特定の実施形態は、多数のバリエーションが存在し得るので、限定の意味でみなされるべきでない。本発明の主題は、本明細書中に開示される様々なエレメント、特徴、機能および／または特性の新規および非自明の組み合わせおよび部分組み合わせのすべてを含む。以下の特許請求の範囲は、特に、新規および非自明とみなされるある特定の組み合わせおよび部分組み合わせに注目している。特徴、機能、エレメントおよび／または特性の他の組み合わせおよび部分組み合わせで具体化される発明は、本願からの優先権を主張している出願または関連出願において特許請求されている可能性がある。このような特許請求の範囲は、異なる発明に関するかまたは同じ発明に関するかに関係なく、および元の特許請求の範囲に対する範囲より広いか、狭いか、等しいか、または異なるかに関係なく、本開示の発明の主題の範囲内に含められるとみなされる。
【図１】
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