(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖化酵素として糸状菌由来セルラーゼを使用してセルロースを加水分解することによる糖液の製造方法であって、セルロースに糖化酵素を添加し一次加水分解した後、該一次加水分解物を一次糖液と固形物に固液分離する工程、固形物に加水して二次加水分解した後、該二次加水分解物を二次糖液と残さに固液分離する工程（但し、該二次加水分解において新たなセルロースを添加しない）、一次糖液および／または二次糖液を限外ろ過膜に通じてろ過し、非透過側より糖化酵素を回収し、透過側より糖液を回収する工程、を含むことを特徴とする糖液の製造方法。
【請求項２】
糸状菌由来セルラーゼがトリコデルマ由来セルラーゼであることを特徴とする、請求項１記載の糖液の製造方法。
【請求項３】
セルロースが、バイオマスをアンモニア処理、水熱処理または希硫酸処理した処理物由来である、請求項１または２記載の糖液の製造方法。
【請求項４】
二次加水分解が、無機塩（カルシウム塩を除く）、親水性有機溶媒、アミノ酸、ノニオン性界面活性剤およびそれらを含有する糖液からなる群から選ばれる１種または２種以上の存在下での加水分解であること特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の糖液の製造方法。
【請求項５】
無機塩（カルシウム塩を除く）が、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、硫酸塩、アンモニウム塩、塩酸塩、燐酸塩、酢酸塩、および硝酸塩からなる群から選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、請求項４に記載の糖液の製造方法。
【請求項６】
無機塩（カルシウム塩を除く）が、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、燐酸二水素ナトリウム、燐酸水素ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、燐酸水素二カリウム、硫酸アンモニウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムからなる群から選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする請求項５に記載の糖液の製造方法。
【請求項７】
親水性有機溶媒が、メタノール、エタノール、１−プロパノール、イソプロパノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ブタノール、アセトン、アセトニトリル、エチレングリコールおよびグリセリンからなる群から選ばれる１以上であることを特徴とする、請求項４に記載の糖液の製造方法。
【請求項８】
アミノ酸が、アルギニン、システイン、グルタミン酸、ヒスチジンおよびリジンからなる群から選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、請求項４に記載の糖液の製造方法。
【請求項９】
一次加水分解物または二次加水分解物の固液分離がプレスろ過であることを特徴とする、請求項１から８のいずれかに記載の糖液の製造方法。
【請求項１０】
糖液を逆浸透膜および／またはナノろ過膜に通じてろ過して糖液を濃縮する工程を含む、請求項１から９のいずれかに記載の糖液の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロースから糖液を製造する方法およびその装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖を原料とした化学品の発酵生産プロセスは、種々の工業原料生産に利用されている。この発酵原料となる糖として、現在、さとうきび、澱粉、テンサイなどの食用原料に由来するものが工業的に使用されているが、今後の世界人口の増加による食用原料価格の高騰、あるいは食用と競合するという倫理的な側面から、再生可能な非食用資源、すなわちセルロース含有バイオマスより効率的に糖液を製造するプロセス、あるいは得られた糖液を発酵原料として、効率的に工業原料に変換するプロセスの構築が今後の課題となっている。【０００３】
セルロース含有バイオマスから糖液を製造する方法として、濃硫酸を使用してセルロースおよびヘミセルロースを酸加水分解して糖液を製造する方法（特許文献１あるいは２）、セルロース含有バイオマスを希硫酸で加水分解処理した後に、さらにセルラーゼなどの酵素処理することより糖液を製造する方法が開示されている（非特許文献１）。また酸を使用しない方法として、２５０℃〜５００℃程度の亜臨界水を使用してセルロース含有バイオマスを加水分解して糖液を製造する方法（特許文献３）、またセルロース含有バイオマスを亜臨界水処理したあとに、さらに酵素処理することにより糖液を製造する方法（特許文献４）、またセルロース含有バイオマスを２４０℃〜２８０℃の加圧熱水で加水分解処理した後に、さらに酵素処理することにより糖液を製造する方法（特許文献５）が開示されている。【０００４】
近年、特にエネルギー使用量および環境負荷が少なく、かつ糖収量が多い酵素を使用したバイオマスの加水分解方法が広く検討されている。しかしながら、こうした酵素を使用する方法の欠点として、酵素費が高いといった課題があった。【０００５】
こうした技術課題を解決する手法として、加水分解に使用した酵素を回収再利用する方法が提案されている。例えば、スピンフィルターによる連続固液分離を行い、得られた糖液を限外ろ過膜に通じてろ過し、酵素を回収する方法（特許文献６）、酵素糖化の段階において界面活性剤を投入することで酵素吸着を抑制し回収効率を向上させる方法（特許文献７）、酵素糖化後の残さを通電処理することで酵素成分を回収する方法（特許文献８）、酵素糖化後の残さを再度新しいバイオマスに再投入することで酵素を回収再利用する方法（特許文献９）、などが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表平１１−５０６９３４号公報
【特許文献２】特開２００５−２２９８２１号公報
【特許文献３】特開２００３−２１２８８８号公報
【特許文献４】特開２００１−９５５９７号公報
【特許文献５】特許３０４１３８０号公報
【特許文献６】特開２００６−８７３１９号公報
【特許文献７】特開昭６３−８７９９４号公報
【特許文献８】特開２００８−２０６４８４号公報
【特許文献９】特開昭５５−１４４８８５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】A. Adenら、“Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover”NREL Technical Report (2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述の通り、酵素を回収・再利用することによる糖液の製造方法について開発されているが、酵素使用量を削減するという観点においてはその効果は不十分であった。したがって、本発明では、従来の方法での酵素使用量の削減効果を上回るプロセスを開発することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を鋭意検討した結果、糖化酵素として糸状菌由来セルラーゼを使用するセルロース加水分解の方法であって、セルロースに糖化酵素を添加し一次加水分解した後、該一次加水分解物を一次糖液と固形物に固液分離する、前記固形物に加水し、二次加水分解した後、該二次加水分解物を二次糖液と残さに固液分離する、一次糖液および／または二次糖液を限外ろ過膜に通じてろ過し、膜側より糖化酵素を回収し、透過側より糖溶液を回収する、工程を含む方法である。【００１０】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１３）の構成を有する。
（１）糖化酵素として糸状菌由来セルラーゼを使用してセルロースを加水分解することによる糖液の製造方法であって、セルロースに糖化酵素を添加し一次加水分解した後、該一次加水分解物を一次糖液と固形物に固液分離する工程、固形物に加水して二次加水分解した後、該二次加水分解物を二次糖液と残さに固液分離する工程（但し、該二次加水分解において新たなセルロースを添加しない）、一次糖液および／または二次糖液を限外ろ過膜に通じてろ過し、非透過側より糖化酵素を回収し、透過側より糖液を回収する工程、を含むことを特徴とする糖液の製造方法。
（２）糸状菌由来セルラーゼがトリコデルマ由来セルラーゼであることを特徴とする、（１）記載の糖液の製造方法。
（３）セルロースが、バイオマスをアンモニア処理、水熱処理または希硫酸処理した処理物由来である、（１）または（２）記載の糖液の製造方法。
（４）二次加水分解が、無機塩（カルシウム塩を除く）、親水性有機溶媒、アミノ酸、ノニオン性界面活性剤およびそれらを含有する糖液からなる群から選ばれる１種または２種以上の存在下での加水分解であること特徴とする、（１）から（３）のいずれかに記載の糖液の製造方法。
（５）無機塩（カルシウム塩を除く）が、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、硫酸塩、アンモニウム塩、塩酸塩、燐酸塩、酢酸塩、および硝酸塩からなる群から選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、（４）に記載の糖液の製造方法。
（６）無機塩（カルシウム塩を除く）が、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、燐酸二水素ナトリウム、燐酸水素ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、燐酸水素二カリウム、硫酸アンモニウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムからなる群から選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする（５）に記載の糖液の製造方法。
（７）親水性有機溶媒が、メタノール、エタノール、１−プロパノール、イソプロパノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ブタノール、アセトン、アセトニトリル、エチレングリコールおよびグリセリンからなる群から選ばれる１以上であることを特徴とする、（４）に記載の糖液の製造方法。
（８）アミノ酸が、アルギニン、システイン、グルタミン酸、ヒスチジンおよびリジンからなる群から選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、（４）に記載の糖液の製造方法。
（９）一次加水分解物または二次加水分解物の固液分離がプレスろ過であることを特徴とする、（１）から（８）のいずれかに記載の糖液の製造方法。
（１０）糖液を逆浸透膜および／またはナノろ過膜に通じてろ過して糖液を濃縮する工程を含む、（１）から（９）のいずれかに記載の糖液の製造方法。
（１１）（１）から（１０）のいずれかに記載の糖液の製造方法のための装置であって、一次加水分解を行う攪拌タンク、二次加水分解を行う二次加水分解槽またはプレスろ過装置、一次加水分解物および二次加水分解物を分離する固液分離装置、一次糖液および／または二次糖液より糖化酵素と糖液を分離する限外ろ過膜装置、を構成として含む装置。
（１２）（１）から（１０）のいずれかに記載の糖液の製造方法のための装置であって、一次加水分解を行う反応槽、温水供給槽を有するプレスろ過装置、プレスろ過装置のろ液を温水供給槽に循環させる循環ライン、一次糖液および／または二次糖液より糖化酵素と糖液を分離する限外ろ過膜装置、を構成として含む装置。
（１３）前記限外ろ過膜装置で得られる糖液を濃縮するための逆浸透膜および／またはナノろ過膜を設置した糖液濃縮装置を構成として含む、（１１）または（１２）に記載の装置。
【発明の効果】
【００１１】
本発明では、一次加水分解後、固液分離を行い得られた固形物に含まれる残存酵素成分を利用した二次加水分解を行うことで、１）糖生産量が増大する効果、２）酵素の回収量が増大する効果がある。したがって、従来技術に対して、経済的に利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の糖液の製造方法の実施の形態を示した略図である。
【図２】図２は、本発明の糖液の製造方法を実施するための装置の形態を示した略図である。
【図３】図３は、本発明の糖液の製造方法を実施するための装置の形態を示した略図である。
【図４】図４は本発明の糖液の製造方法の二次加水分解をプレスろ過室内で行う実施形態を示す略図である。
【図５】図５は、本発明の糖液の製造方法を実施するための装置の形態を示した略図である。
【図６】図６は、本発明の糖液の製造方法を実施するための装置の形態を示した略図である。
【図７】図７は、本発明の糖液の製造方法の二次加水分解をプレスろ過室内で行う実施形態を示す略図である。
【図８】図８は、本発明の本発明の糖液の製造方法を実施するための装置の形態を示した略図である。
【図９】図９は、本発明の糖液の製造方法で得られる二次糖液に含まれる酵素を電気泳動により分析した結果を示す図である。
【図１０】図１０は、本発明の糖液の製造方法の二次加水分解を一次加水分解と独立する二次加水分解槽で行う実施形態を示す略図である。
【図１１】図１１は、本発明の糖液の製造方法の二次加水分解を一次加水分解と独立する二次加水分解槽で行う実施形態を示す略図である。
【図１２】図１２は、本発明の糖液の製造方法の二次加水分解を一次加水分解と独立する二次加水分解槽で行う実施形態を示す略図である。
【図１３】図１３は、本発明の糖液の製造方法の一次加水分解および二次加水分解を同一のタンクで行う実施形態を示す略図である。
【図１４】図１４は、限外ろ過膜装置の前行程に精密ろ過膜装置を設置した実施形態を示す略図である。
【図１５】図１５は、精密ろ過膜モジュールを使用してクロスフローろ過する実施形態を示す略図である。
【図１６】図１６は、精密ろ過膜モジュールを使用してデッドエンドろ過する実施形態を示す略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
セルロースは、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、稲わら、麦わら、などの草本系バイオマス、あるいは樹木、廃建材などの木質系バイオマスに多量に含まれており、本発明ではこれらセルロース含有バイオマスを原料として好ましく利用することができる。
【００１４】
セルロース含有バイオマスには、セルロースおよびヘミセルロース（以下、セルロースとヘミセルロースの総称として「セルロース」という。）の他に芳香族高分子であるリグニン等を含有しているため、本発明の糖液の製造方法においてバイオマス由来のセルロースを糖液の原料とする場合、前処理を施すことにより酵素による加水分解効率を向上させることができる。セルロース含有バイオマスの前処理方法としては、酸処理、硫酸処理、希硫酸処理、アルカリ処理、苛性ソーダ処理、アンモニア処理、水熱処理、亜臨界水処理、微粉砕処理、蒸煮処理が挙げられるが、本発明においてはアンモニア処理、水熱処理または希硫酸処理であることが好ましい。
【００１５】
アンモニア処理は、特開２００８−１６１１２５号公報および特開２００８−５３５６６４号公報に準拠する。例えば、使用するアンモニア濃度はバイオマスに対して０．１〜１５重量％の範囲で添加し、４〜２００℃、好ましくは９０〜１５０℃で処理する。添加するアンモニアは液体状態、あるいは気体状態のどちらであってもよい。さらに添加する形態は純アンモニアでもアンモニア水溶液の形態でもよい。処理回数は特に限定されず前記処理を１回以上行えばよい。特に前記処理を２回以上行う場合、１回目と２回目以降の処理を異なる条件で実施してもよい。アンモニア処理によって得られた処理物は、さらに酵素による加水分解反応を行うため、アンモニアの中和あるいはアンモニアの除去を行う必要がある。中和は、加水分解物より固形分を固液分離により除去したアンモニアに対し行ってもよいし、固形分を含んだままの状態で行ってもよい。中和に使用する酸試薬は特に限定されない。アンモニアの除去は、アンモニア処理物を減圧状態に保つことでアンモニアを気体状態に揮発させて除去することができる。また除去したアンモニアは、回収再利用してもよい。
【００１６】
希硫酸処理の場合、硫酸の濃度は０．１〜１５重量％であることが好ましく、０．５〜５重量％であることがより好ましい。反応温度は１００〜３００℃の範囲で設定することができ、１２０〜２５０℃で設定することが好ましい。反応時間は１秒〜６０分の範囲で設定することができる。処理回数は特に限定されず前記処理を１回以上行えばよい。特に上記処理を２回以上行う場合、１回目と２回目以降の処理を異なる条件で実施してもよい。希硫酸処理によって得られた加水分解物は、酸を含んでおり、さらにセルラーゼによる加水分解反応を行うため、あるいは発酵原料として使用するために、中和を行う必要がある。
【００１７】
水熱処理の場合、セルロース含有バイオマスが、０．１〜５０重量％となるよう水を添加後、１００〜４００℃の温度で、１秒〜６０分処理する。こうした温度条件において処理することにより、セルロースの加水分解が起こる。処理回数は特に限定されず該処理を１回以上行えばよい。特に該処理を２回以上行う場合、１回目と２回目以降の処理を異なる条件で実施してもよい。
【００１８】
本発明で使用するセルラーゼは、糸状菌由来セルラーゼである。糸状菌としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、セルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、イルペックス属（Ｉｒｐｅｘ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、などの微生物を挙げることができる。これら微生物は、培養液中にセルラーゼを産生するために、その培養液を未精製の糸状菌由来セルラーゼとしてそのまま使用してもよいし、また培養液を精製し、製剤化したもの糸状菌由来セルラーゼ混合物として使用してもよい。糸状菌セルラーゼを精製し、製剤化したものとして使用する場合、プロテアーゼ阻害剤、分散剤、溶解促進剤、安定化剤など、酵素以外の物質を添加したものを、セルラーゼ製剤として使用してもよい。
【００１９】
本発明で使用する糸状菌由来セルラーゼは、トリコデルマ属が産生するセルラーゼ（以下、トリコデルマ由来セルラーゼ）であることが好ましい。また、本発明では、トリコデルマ由来セルラーゼのうち、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）に由来するセルラーゼであることがより好ましく、具体的にはトリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＱＭ９４１４）、トリコデルマ・リーセイＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉＱＭ９１２３）、トリコデルマ・リーセイＲｕｔＣ−３０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉＲｕｔ  Ｃ−３０）、トリコデルマ・リーセイＰＣ３−７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＰＣ３−７）、トリコデルマ・リーセイＣＬ−８４７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉＣＬ−８４７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ７７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＭＣＧ７７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ８０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉＭＣＧ８０）、トリコデルマ・ビリデＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ  ＱＭ９１２３）などのトリコデルマ属の微生物由来のセルラーゼであることが好ましい。また、前記トリコデルマ属に由来する微生物であって、これらを変異剤あるいは紫外線照射などで変異処理を施し、セルラーゼ生産性が向上した変異株由来のセルラーゼであってもよい。
【００２０】
糸状菌由来セルラーゼは、セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、βグルコシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼなどの複数の酵素成分を含む、セルロースを加水分解して糖化する活性を有する酵素組成物である。糸状菌由来セルラーゼは、セルロース分解において、こうした複数の酵素成分が含まれることによって、その協奏効果あるいは補完効果により効率的なセルロースの加水分解を実施することができるため、本発明において好ましく使用される。
【００２１】
セロビオハイドラーゼとは、セルロースの末端部分から加水分解していくことを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．９１としてセロビオハイドラーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００２２】
エンドグルカナーゼとは、セルロース分子鎖の中央部分から加水分解することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．４としてエンドグルカナーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００２３】
エキソグルカナーゼとは、セルロース分子鎖の末端から加水分解することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．７４としてエキソグルカナーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００２４】
βグルコシダーゼとは、セロオリゴ糖あるいはセロビオースに作用することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．２１としてβグルコシダーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００２５】
キシラナーゼとは、ヘミセルロースあるいは特にキシランに作用することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．８としてキシラナーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００２６】
キシロシダーゼとは、キシロオリゴ糖に作用することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．３７としてキシロシダーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００２７】
こうした糸状菌由来セルラーゼ成分は、ゲルろ過、イオン交換、二次元電気泳動など公知手法により分離し、分離した成分のアミノ酸配列分析（Ｎ末端分析、Ｃ末端分析、質量分析）を行い、データベースとの比較により同定することができる。
【００２８】
また糸状菌由来セルラーゼの酵素活性は、アビセル分解活性、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）分解活性、セロビオース分解活性、キシラン分解活性、マンナン分解活性などといった多糖の加水分解活性によって評価することができる。アビセル分解活性に関与する主たるセルラーゼ成分は、セルロース末端部分から加水分解する特徴と有すセロビオハイドラーゼあるいはエキソグルカナーゼである。また、キシラン分解活性に関与する主たるセルラーゼ成分は、キシラナーゼ、キソロシダーゼである。セロビオース分解活性に関与する主たるセルラーゼ成分は、主にβグルコシダーゼである。ＣＭＣ分解活性に関与する主たるセルラーゼ成分は、セロビオハイドラーゼ、エキソグルカナーゼ、エンドグルカナーゼである。ここで“主たる”という意味は、最も分解に関与することが知られていることからの表現であり、これ以外の酵素成分もその分解に関与していることを意味している。
【００２９】
糸状菌由来セルラーゼとしては、粗酵素物が好ましく使用される。粗酵素物は、糸状菌属の微生物がセルラーゼを産生するよう調整した培地中で、任意の期間該微生物を培養した培養上清に由来する。使用する培地成分は特に限定されないが、セルラーゼの産生を促進するために、セルロースを添加した培地が一般的に使用できる。そして、粗酵素物として、培養液をそのまま、あるいは糸状菌体を除去したのみの培養上清が好ましく使用される。
【００３０】
粗酵素物中の各酵素成分の重量比は特に限定されるものではないが、例えば、トリコデルマ・リーセイ由来の培養液には、５０〜９５重量％のセロビオハイドラーゼが含まれており、残りの成分にエンドグルカナーゼ、βグルコシダーゼ等が含まれている。また、トリコデルマ属の微生物は、強力なセルラーゼ成分を培養液中に生産する一方で、βグルコシダーゼに関しては、細胞内あるいは細胞表層に保持しているため培養液中のβグルコシダーゼ活性は低いため、粗酵素物に、さらに異種または同種のβグルコシダーゼを添加してもよい。異種のβグルコシダーゼとしては、アスペルギルス属由来のβグルコシダーゼが好ましく使用できる。アスペルギルス属由来のβグルコシダーゼとして、ノボザイム社より市販されているＮｏｖｏｚｙｍｅ１８８などを例示することができる。粗酵素物に異種または同種のβグルコシダーゼを添加する方法としては、トリコデルマ属の微生物に遺伝子を導入し、その培養液中に産生されるよう遺伝子組換えされたトリコデルマ属の微生物を培養し、その培養液を単離する方法でもよい。
【００３１】
本発明では、前述の糸状菌由来セルラーゼによるセルロースの加水分解を、一次加水分解と二次加水分解に分けて実施することを特徴としている。以下、工程順に説明する。
【００３２】
本発明における一次加水分解とは、糖化酵素と接触していないセルロースに対し、糖化酵素を添加し加水分解ことを行うことを指す。一次加水分解として使用する酵素は、後述の未使用酵素であっても回収酵素であってもよいが、酵素使用量、特に未使用酵素の使用量を削減するという点において、回収酵素および未使用酵素を両方混合して使用することが好ましい。
【００３３】
前述の一次加水分解の反応温度は、４０〜６０℃の範囲であることが好ましく、特にトリコデルマ由来セルラーゼを使用する場合、４５〜５５℃の範囲であることがより好ましい。
【００３４】
一次加水分解の反応時間は、２時間〜２００時間の範囲であることが好ましい。２時間未満であると、十分な糖生成が得られず好ましくない。一方で２００時間を超えると酵素活性が低下し、後述二次加水分解で十分な糖生成および酵素回収を行うことができないため好ましくない。
【００３５】
一次加水分解のｐＨは４．０〜５．５の範囲であることが好ましい。また、糸状菌由来セルラーゼとしてトリコデルマ属由来セルラーゼを使用する場合、その反応最適ｐＨは５．０であり、特に一次加水分解の場合は、加水分解の過程でｐＨの変化が起きるため、酸あるいはアルカリを用いて一定ｐＨを保持しながら実施することが好ましい。
【００３６】
一次加水分解物には、一次糖液と固形物が含まれ、固形物には未分解のセルロースまたはヘミセルロースといった多糖成分、およびリグニンなどの本来糖化酵素によっては分解できない成分が含まれている。さらに、固形物には比較的大量の糸状菌由来セルラーゼが吸着した状態にある。したがって、本発明では、一次加水分解物の固形物に含まれる多糖成分と糸状菌由来セルラーゼで後述の二次加水分解を実施するために、固液分離により得られた固形分を回収することを特徴としている。固液分離の方法としては、遠心分離、プレスろ過が挙げられるが、本発明においてはプレスろ過により固形分を回収することが好ましい。
【００３７】
固液分離としてのプレスろ過が好ましい理由として、１）糖液の回収率が優れる点が挙げられる。本発明は、従来技術に対して、糖回収率および酵素回収率の向上を課題としている。したがって、１回の固液分離でより多くの糖液成分を回収できる固液分離の手法である方が好ましい。固液分離による糖液成分の回収率は、特に二次加水分解後に加水する水の量を増加させることで、向上させることができる。但し、この加水する水の量が増えると、二次糖液としての糖濃度が低くなるため好ましくない。したがって、極力水の使用量を抑えつつ、高い糖回収率を得るという観点で、固液分離はプレスろ過であることが好ましい。また、２）澄明なろ液を得られる点、が挙げられる。本発明では、固液分離で得られた一次糖液および／または二次糖液を限外ろ過膜に通じてろ過に、酵素成分の回収を行う。この限外ろ過膜に通じる糖液として、固形分あるいは微粒子成分が少ないことが膜ファウリングの観点で好ましいが、プレスろ過の場合、固形分あるいは微粒子成分が少ないため、本発明で好ましく使用することができる。
【００３８】
本発明における二次加水分解とは、一次加水分解物を固液分離することで得られる固形物に対し、固形物に吸着した糸状菌由来セルラーゼのみで二度目の加水分解を行うことを指す。すなわち、二次加水分解では、新たに糖化酵素を添加せずに、吸着酵素のみで固形物の加水分解を行うことを特徴とする。
【００３９】
本発明では、従来技術（一次加水分解のみ）に対して、新しい酵素を投入せずに二次加水分解を行うことで糖生成量および／または酵素回収率を向上させることを特徴とする。従来技術においても、当然、糖生産量および／または酵素回収はできるが、本発明の二次加水分解を行うことで、より多くの糖と酵素を回収することができる。その大きな理由として、生成糖の除去による酵素阻害の解除がある。一次加水分解後の状態として多量の糖成分が含まれている状態である。そこで、固液分離を行い、加水分解による生成糖（グルコース、キシロース、オリゴ糖）を除去し、さらに加水することで、溶液成分として含まれる生成糖濃度を低下させることができる。これにより酵素の生成物阻害を解除することができ、固形分に吸着した酵素のみで十分な二次加水分解を行うことができる。したがって、酵素使用量は、従来技術と同じであっても、本発明の二次加水分解を行うことによって、従来技術以上の糖および／または酵素を回収することができる。
【００４０】
本発明で加水する水の添加量は、特に限定されないが、二次加水分解時の固形物濃度が１〜２０重量％の間になるよう添加することが好ましい。２０重量％より固形物濃度が多い場合、逆に１重量％より固形物濃度が少ない場合、糖生成量および／または酵素回収量の観点で効率的でなく好ましくない。
【００４１】
前述の二次加水分解の反応温度は、４０〜６０℃の範囲であることが好ましく、特にトリコデルマ由来セルラーゼを使用する場合、４０〜５５℃の範囲であることがより好ましく、さらに５０℃であることがより好ましい。
【００４２】
二次加水分解の反応時間は、５〜１８０分の範囲であることが好ましい。５分未満であると、吸着酵素の回収効率が低く、一方で１８０分以上行っても吸着酵素の回収効率が増加せず非効率的である。
【００４３】
二次加水分解のｐＨは６．０〜８．０の範囲であることが好ましい。また、糸状菌由来セルラーゼとしてトリコデルマ属由来セルラーゼを使用する場合、その反応最適ｐＨは５．０であり、特に一次加水分解の場合は、ｐＨは５．０で実施することが好ましいが、二次加水分解では、吸着酵素の回収を主目的とするため、吸着酵素の回収効率が高いｐＨ６．０〜８．０の範囲で行うことが好ましい。ｐＨ６．０未満であると回収酵素量が低減し、一方でｐＨ８．０を越えると糖化酵素の失活が起きるので好ましくない。すなわち、ｐＨ６．０〜８．０の範囲であれば、糖化酵素の失活が限りなく低い条件で、かつ、糖化酵素の高い回収効率を得ることができる。
【００４４】
二次加水分解物には、二次糖液と固形物が含まれ、一次加水分解と同様、固液分離、好ましくはプレスろ過によってそれらを分離することができる。
【００４５】
二次加水分解においては、ノニオン性界面活性剤、アミノ酸、無機塩（カルシウム塩を除く）、親水性有機溶媒、から選ばれる１以上の化合物を添加することができる。こうした化合物を添加することにより糖生成量、回収酵素量、回収酵素活性のいずれか１以上を増大させることができる。特に、回収酵素活性が高いと、回収酵素再利用時、新規酵素の添加量を削減することができるため経済的に好ましい。
【００４６】
二次加水分解は界面活性剤の存在下であってもよく、中でも、ノニオン性界面活性剤であることが好ましい。これは、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤または両性界面活性剤を使用する場合、糖化酵素の失活を促進し、二次加水分解反応に阻害的に作用するためである、また、回収酵素の活性も失活させるため好ましくない。一方ノニオン性界面活性剤に関しては、高い糖生成効率、および高い酵素の回収効率を得ることができるため、好ましく使用される。
【００４７】
ノニオン性界面活性剤とは、別名、非イオン性界面活性剤とも呼ばれ、界面活性剤の親水部分が非電解質より構成される界面活性剤のことである。ノニオン性界面活性剤の具体例としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシプロピレンブロック共重合体、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンナフチルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、グリセリン脂肪酸エステル、アセチレン系ポリオキシエチレンオキシド等が挙げられ、これらは、単独あるいは２種以上を混合して使用してもよいが、好ましくはポリオキシプロピレンブロック共重合体である。また、ポリオキシプロピレンブロック共重合体の分子量は、５００〜１５０００の範囲であることが好ましい。
【００４８】
前述のノニオン性界面活性剤の添加量は、０．０５〜５重量％の範囲で添加することが好ましい。０．０５重量％未満であると糖化酵素の回収効率が低く、一方で５重量％を超えると糖化酵素の失活が促進され、かつ経済的にも不利になるため好ましくない。
【００４９】
二次加水分解は無機塩の存在下であってもよく、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、硫酸塩、アンモニウム塩、塩酸塩、燐酸塩、酢酸塩、硝酸塩、などの無機塩を使用することができる。更に好ましい無機塩としては、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、燐酸二水素ナトリウム、燐酸水素ナトリウム、塩化カリウム、燐酸水素二カリウム、硫酸アンモニウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、などであり、このうち最も好ましくは、ナトリウム塩である塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、マグネシウム塩である塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムである。こうした無機塩を添加することにより、回収酵素のアビセル分解活性およびキシラン分解活性を高めることができる。
【００５０】
またこうした無機塩の代替物として、海水を使用することもできる。海水中に含まれる無機塩は、塩化ナトリウム２．６〜２．７％、塩化マグネシウム０．３〜０．４％、硫酸マグネシウム０．１〜０．２％、塩化カリウム約０．０７％を一般的に含んでなる最も自然界に大量に存在する無機塩水溶液である。したがって、海水を無機塩水溶液として二次加水分解に使用することができる。海水のｐＨはその塩組成により概ね決定され、一般的にはｐＨ８．２〜８．５の範囲にあり、そのままのｐＨあるいは任意のｐＨに調整して二次加水分解に使用することができる。好ましくは、そのｐＨを５〜８．３の範囲に調整することが、回収酵素のセルラーゼ活性を高める点で好ましい。ｐＨ調整には、硫酸、塩酸など一般的な酸を使用すればよく、特に限定されるものではない。
【００５１】
またこうした無機塩の代替物として、セルロース含有バイオマス、その前処理物、あるいは加水分解後に得られる糖化残さなどをボイラー燃焼させた灰分を無機塩の代替として使用することができる。こうした灰分には、カリウム塩を多く含み、これを水に溶解させることで無機塩水溶液を調整することができる。
【００５２】
前述の無機塩の添加量は、０．０５〜５重量％の範囲で添加することが好ましい。０．０５％重量未満であると糖化酵素の回収効率が低く、一方で５重量％を超えると糖化酵素の失活が促進され、かつ経済的にも不利になるため好ましくない。無機塩水溶液として海水を使用する場合に関しては、海水の希釈倍率１／１０〜１の範囲で設定することが好ましい。
【００５３】
二次加水分解は親水性有機溶媒の存在下であってもよい。本発明でいう親水性有機溶媒とは、２０℃の条件下で水に対し１００ｇ／Ｌ以上の溶解度を示すもののことを指す。一方で、上述条件下で１００ｇ／Ｌ未満の溶解度を示すものを疎水性有機溶媒という。疎水性有機溶媒としては、１−ブタノール（７４ｇ／Ｌ）、１−ペンタノール（２７ｇ／Ｌ）、１−ヘキサノール（５．８ｇ／Ｌ）、酢酸エチル（８３ｇ／Ｌ）、ヘキサン（微量）、クロロホルム（微量）などを例示できるがこの限りではない。本発明でいう親水性有機溶媒の代表的な例として、メタノール、エタノール、１−プロパノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトン、アセトニトリル、エチレングリコール、グリセリンなどを例示できる。こうした親水性有機溶媒を添加することにより、回収酵素のアビセル分解活性を高める効果があるため好ましい。
【００５４】
前述の親水性有機溶媒の添加量は、０．０５〜５重量％の範囲で添加することが好ましい。０．０５重量％未満であると糖化酵素の回収効率が低く、一方で５重量％を超えると糖化酵素の失活が促進され、かつ経済的にも不利になるため好ましくない。
【００５５】
二次加水分解はアミノ酸の存在下であってもよく、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンおよびこれらの誘導体を使用することができる。こうしたアミノ酸のうち、水溶解性が高いアラニン、アルギニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、バリンが好ましく、最も好ましくは、高いアビセル分解活性を示す回収酵素を得ることができるアルギニン、システイン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジンであることが好ましい。
【００５６】
前述のアミノ酸の添加量は、０．０５〜５重量％の範囲で添加することが好ましい。０．０５重量未満であると糖化酵素の回収効率が低く、一方で５重量％を超えると糖化酵素の失活が促進され、かつ経済的にも不利になるため好ましくない。
【００５７】
本発明では、前述の一次糖液および／または二次糖液を限外ろ過膜に通じてろ過し、非透過側より糖化酵素を分離回収し、透過側より糖溶液を回収する。本発明で使用する限外ろ過膜の分画分子量は、単糖であるグルコース（分子量１８０）を透過でき、酵素を阻止できる限外ろ過膜であれば限定されない。具体的には分画分子量５００〜５００００の範囲であればよく、５０００〜５００００の範囲の限外ろ過膜であることがより好ましく、より好ましくは分画分子量１００００〜３００００である。限外ろ過膜の機能膜の素材としては、ポリエーテルサルホン（ＰＥＳ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリフッ化ビニルデン（ＰＶＤＦ）、再生セルロース、セルロース、セルロースエステル、スルホン化ポリスルホン、スルホン化ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリ４フッ化エチレン、などの素材を使用することができるが、再生セルロース、セルロース、セルロースエステルは、セルラーゼによる分解を受けるため、ＰＥＳ、ＰＶＤＦなどの合成高分子を素材とした限外ろ過膜を使用することが好ましい。限外ろ過膜のろ過方式として、デッドエンドろ過、クロスフローろ過があるが、膜ファウリング抑制の観点から、クロスフローろ過であることが好ましい。また使用する限外ろ過膜の膜形態としては、平膜型、スパイラル型、チューブラー型、中空糸型など適宜の形態のものが使用できる。具体的には、ＤＥＳＡＬ社のＧ−５タイプ、Ｇ−１０タイプ、Ｇ−２０タイプ、Ｇ−５０タイプ、ＰＷタイプ、ＨＷＳ  ＵＦタイプ、ＫＯＣＨ社のＨＦＭ−１８０、ＨＦＭ−１８３、ＨＦＭ−２５１、ＨＦＭ−３００、ＨＦＭ−１１６、ＨＦＭ−１８３、ＨＦＭ−３００、ＨＦＫ−１３１、ＨＦＫ−３２８、ＭＰＴ−Ｕ２０、ＭＰＳ−Ｕ２０Ｐ、ＭＰＳ−Ｕ２０Ｓ、Ｓｙｎｄｅｒ社のＳＰＥ１、ＳＰＥ３、ＳＰＥ５、ＳＰＥ１０、ＳＰＥ３０、ＳＰＶ５、ＳＰＶ５０、ＳＯＷ３０、旭化成社製のマイクローザ（登録商標）ＵＦシリーズ分画分子量３０００から１０００００に相当するもの、日東電工株式会社製のＮＴＲ７４１０、ＮＴＲ７４５０などが挙げられる。
【００５８】
二次加水分解に、ノニオン性界面活性剤、無機塩、親水性有機溶媒、アミノ酸などの化合物を添加する場合、その二次糖液には、当然これらの添加した化合物を含むことになる。こうした二次糖液の化合物は、種類および添加量によっては、後段発酵工程に阻害的に作用する可能性もある。こうした場合、二次糖液から限外濾過膜を使用して回収酵素のみを分離回収した後、透過側で得られる無機塩を含む糖液は廃液として処理すればよい。
【００５９】
本発明では、一次糖液および二次糖液を限外ろ過膜に通じてろ過し、透過側より得られた糖液をさらに逆浸透膜および／またはナノろ過に通じてろ過することが好ましい。本発明の場合、本発明では、一次糖液に比べて、二次糖液は、糖濃度が低くなる場合があり、その理由として、１）固形物に吸着した糖化酵素のみを使用した加水分解反応であるため、糖化酵素の絶対量が少ない、２）固形物として残存したリグノセルロースの加水分解効率が低い、といった理由が挙げられる。したがって、二次糖液のみ、あるいは二次糖液と一次糖液を混合して後段の発酵工程で使用する場合、糖濃度が低く、発酵産物濃度が低下することがあるが、糖液を逆浸透膜および／またはナノろ過膜に通じてろ過することによって、糖液の糖濃度の低下を防ぐことができる。なお、ここでいう糖濃度は、単糖成分、特にグルコースおよびキシロースの総量のことを指し、こうした糖濃縮における濃縮倍率などは限定されるものではなく、後段の発酵工程に最適な濃度まで濃縮されるものであれば限定されるものではない。また濃縮前の糖溶液の糖濃度は、特に限定されないが、１０ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌであることが好ましい。また濃縮後の糖濃度は、特に限定されないが、一般的に５０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌの範囲の糖濃度であれば、後段の発酵工程に好ましく使用できる。
【００６０】
本発明で使用されるナノろ過膜あるいは逆浸透膜の素材には、酢酸セルロース系ポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマー、ポリサルホンなどの高分子素材を使用することができるが、前記１種類の素材で構成される膜に限定されず、複数の膜素材を含む膜であってもよい。
【００６１】
本発明で用いるナノろ過膜は、スパイラル型の膜エレメントが好ましく使用される。好ましいナノろ過膜エレメントの具体例としては、例えば、酢酸セルロース系のナノろ過膜エレメントであるＧＥ  Ｏｓｍｏｎｉｃｓ社製ＧＥｓｅｐａ、ポリアミドを機能層とするアルファラバル社製ナノろ過膜エレメントのＮＦ９９またはＮＦ９９ＨＦ、架橋ピペラジンポリアミドを機能層とするフィルムテック社製ナノろ過膜エレメントのＮＦ−４５、ＮＦ−９０、ＮＦ−２００、ＮＦ−２７０またはＮＦ−４００、あるいは架橋ピペラジンポリアミドを主成分とする東レ株式会社製ナノろ過膜のＵＴＣ６０を含む同社製ナノろ過膜エレメントＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０が挙げられ、より好ましくはＮＦ９９またはＮＦ９９ＨＦ、ＮＦ−４５、ＮＦ−９０、ＮＦ−２００またはＮＦ−４００、あるいはＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０であり、さらに好ましくはＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０である。
【００６２】
また、本発明で用いる逆浸透膜は、ナノろ過膜と同様にスパイラル型の膜エレメントが好ましく使用される。好ましい逆浸透膜エレメントの具体例としては、例えば、東レ株式会社製ポリアミド系逆浸透膜モジュールである低圧タイプのＳＵ−７１０、ＳＵ−７２０、ＳＵ−７２０Ｆ、ＳＵ−７１０Ｌ、ＳＵ−７２０Ｌ、ＳＵ−７２０ＬＦ、ＳＵ−７２０Ｒ、ＳＵ−７１０Ｐ、ＳＵ−７２０Ｐの他、逆浸透膜としてＵＴＣ７０を含む高圧タイプのＳＵ−８１０、ＳＵ−８２０、ＳＵ−８２０Ｌ、ＳＵ−８２０ＦＡ、同社酢酸セルロース系逆浸透膜ＳＣ−Ｌ１００Ｒ、ＳＣ−Ｌ２００Ｒ、ＳＣ−１１００、ＳＣ−１２００、ＳＣ−２１００、ＳＣ−２２００、ＳＣ−３１００、ＳＣ−３２００、ＳＣ−８１００、ＳＣ−８２００、日東電工（株）製ＮＴＲ−７５９ＨＲ、ＮＴＲ−７２９ＨＦ、ＮＴＲ−７０ＳＷＣ、ＥＳ１０−Ｄ、ＥＳ２０−Ｄ、ＥＳ２０−Ｕ、ＥＳ１５−Ｄ、ＥＳ１５−Ｕ、ＬＦ１０−Ｄ、アルファラバル製ＲＯ９８ｐＨｔ、ＲＯ９９、ＨＲ９８ＰＰ、ＣＥ４０４０Ｃ−３０Ｄ、ＧＥ製ＧＥ  Ｓｅｐａ、Ｆｉｌｍｔｅｃ製ＢＷ３０−４０４０、ＴＷ３０−４０４０、ＸＬＥ−４０４０、ＬＰ−４０４０、ＬＥ−４０４０、ＳＷ３０−４０４０、ＳＷ３０ＨＲＬＥ−４０４０などが挙げられる。
【００６３】
上述した本発明の糖液の製造方法を実施する装置に関して以下に説明する。
本発明の糖液の製造方法を実施するための装置として、一次加水分解を行う攪拌タンク２、二次加水分解を行う二次加水分解槽２８またはプレスろ過装置８、一次加水分解物および二次加水分解物を分離する固液分離装置（２５、３０）、一次糖液および／または二次糖液より糖化酵素と糖液を分離する限外ろ過膜装置（１２、３３）、を少なくとも構成として含む必要がある。こうした装置に実施形態を説明するために図２〜図８、図１０〜図１６を具体例として示した。図２〜図８、図１０〜図１６に関してその装置特徴を基準に、形態１〜形態４に分類した。形態１は、二次加水分解をプレスろ過槽８内で実施すための装置形態であり、図２〜図８に対応する。
【００６４】
形態１は、プレスろ過室内部に水を循環させることにより、二次加水分解を実施する形態であり、固液分離としてのプレスろ過装置８があれば本発明の二次加水分解を実施することができる装置形態である。利点は、装置構成が単純であり装置コストを低く抑えることが出来る点がある。但し、その一方で、一次糖液および二次糖液の装置内でのコンタミネーションが欠点である。
【００６５】
形態２は、二次加水分解するための二次加水分解槽２８を含む装置形態を示す。形態２では、攪拌タンク２と二次加水分解槽２８を独立して有している。形態２の利点は、二次加水分解槽２８で固形物を再懸濁することができ、二次加水分解の効率が高い点がある。また、特に二次加水分解に添加する化合物の種類あるいは濃度によっては、後段の糖液の発酵にて阻害的に作用する可能性もある。したがって、形態２のように一次加水分解を行う攪拌タンク２に対して、二次加水分解専用の二次加水分解槽２８を保有し、さらには二次糖液専用の固液分離３０、さらに二次糖液専用の限外ろ過膜装置３３が保有されていることは、一次糖液および二次糖液のコンタミネーションを避けることができる利点を有する。その一方で、形態２では、二次加水分解槽２８をはじめとして、設備点数が全体的に増えることに伴い、設備コストが増加するという欠点を有する。
【００６６】
次に形態３として、一次加水分解を行う攪拌タンク２において二次加水分解も行う装置形態を示す図面である。形態３では攪拌タンク２で得られた加水分解物を固液分離し、これを再度攪拌タンク２に戻し、ここに加水して二次加水分解を行う装置形態である。利点は、最も装置点数を減らすことができ設備コストを削減できるということがある。但し、その一方で、一次糖液および二次糖液の装置内でのコンタミネーションが欠点である。
【００６７】
さらに形態４は、固液分離装置２５と限外ろ過膜装置１２の間に精密ろ過膜装置３６を設置した実施形態の部分図面である。精密ろ過膜装置を設置する利点として、固液分離で十分除去できなかった不溶性微粒子を除去でき、後段の限外ろ過膜装置１２の膜目詰まりを低減出来る。
【００６８】
【表１】
0006003056.tif 000002
【００６９】
以下、形態１の二次加水分解をプレスろ過装置内で実施形態に関し、図２〜図８の略図を使用して説明する。
【００７０】
本発明の糖液の製造方法を実施するための装置として、一次加水分解を行う攪拌タンク２、温水供給槽６を有するプレスろ過装置８、プレスろ過装置８のろ液を温水供給槽６に循環させる循環ライン１０、一次糖液および／または二次糖液より糖化酵素と糖溶液を分離する限外ろ過膜装置１２、を構成として含む装置が挙げられる。本発明の糖液の製造方法のための装置について、図面で示される装置を例示して説明する。
【００７１】
図２および図３は、図４で示す温水通水口１５と加水分解物投入口１４を別に有するプレスろ過装置８を使用する際の装置略図である。一方、図５および図６は、図７で示す加水分解物投入口兼温水通水口２１を有するプレスろ過装置８を使用する際の装置の略図である。また、図２および図５は、攪拌タンク２と温水供給槽６を独立して有する装置の略図である。一方、図３および図６は、攪拌タンク２を温水供給槽として併用する場合の装置の略図である。
【００７２】
図２の装置に関して詳細に説明する。一次加水分解を行う攪拌タンク２は、セルロースを供給する供給口３およびリグノセルロースを攪拌混合する撹拌装置４、攪拌タンクを保温する保温設備１を備える。攪拌タンク２で得られた一次加水分解物は、加水分解投入口１４よりプレスろ過装置８に投入される。ここでコンプレッサー９による圧搾により固液分離を行い、プレスろ過室内に保持された固形物に対し、温水供給槽６より温水を、温水通水口１５へ通水する。温水供給槽６は、水供給ライン５、温水を所定温度に保温する温水供給槽保温設備７およびプレスろ過のろ液を循環させる循環ライン１０を備える。プレスろ過で得られた一次糖液および／または二次糖液は、ろ液回収タンク１１に保持され、限外ろ過膜装置１２でろ過される。回収された糖化酵素は、糖化酵素回収ラインを通じて、回収および／または再利用される。
【００７３】
図３の装置に関して詳細に説明する。一次加水分解を行う攪拌タンク２は、セルロースを投入する投入口３およびセルロースを攪拌混合する撹拌装置４、攪拌タンクを保温する保温設備１を備える。攪拌タンク２で得られた一次加水分解物は、加水分解投入口１４よりプレスろ過装置８に投入される。ここでコンプレッサー９による圧搾により固液分離を行い、プレスろ過室内に保持された固形物に対し、温水供給槽６より温水を、温水通水口１５へ通水する。プレスろ過装置８に加水分解投入口１４および温水通水口１５が連結しており、バルブによって流れを切り替えることができる。プレスろ過で得られた一次糖液および／または二次糖液は、ろ液回収タンク１１に保持され、限外ろ過膜装置１２でろ過される。回収された糖化酵素は、糖化酵素回収ラインを通じて、回収および／または再利用される。
【００７４】
図５の装置に関して詳細に説明する。一次加水分解を行う攪拌タンク２は、セルロースを投入する投入口３およびセルロースを攪拌混合する撹拌装置４、攪拌タンクを保温する保温設備１を備える。攪拌タンク２で得られた一次加水分解物は、加水分解物投入口兼温水通水口２１よりプレスろ過装置８に投入される。ここでコンプレッサー９による圧搾により固液分離を行い、プレスろ過室内に保持された固形物に対し、温水供給槽６より温水を、加水分解物投入口兼温水通水口２１へ通水する。温水供給槽６は、水供給ライン５、温水を所定温度に保温する温水供給槽保温設備７およびプレスろ過のろ液を循環させる循環ライン１０を備える。プレスろ過で得られた一次糖液および／または二次糖液は、ろ液回収タンク１１に保持され、限外ろ過膜装置１２でろ過される。回収された糖化酵素は、糖化酵素回収ラインを通じて、回収および／または再利用される。
【００７５】
図６の装置システムに関して詳細に説明する。一次加水分解を行う攪拌タンク２は、セルロースを投入する投入口３およびセルロースを攪拌混合する撹拌装置４、攪拌タンクを保温する保温設備１を備える。攪拌タンク２で得られた一次加水分解物は、加水分解物投入口兼温水通水口２１よりプレスろ過装置８に投入される。ここでコンプレッサー９による圧搾により固液分離を行い、プレスろ過室内に保持された固形物に対し、攪拌タンク２より温水を、加水分解物投入口兼温水通水口２１へ通水する。プレスろ過で得られた一次糖液および／または二次糖液は、ろ液回収タンク１１に保持され、限外ろ過膜装置１２でろ過される。回収された糖化酵素は、糖化酵素回収ラインを通じて、回収および／または再利用される。
【００７６】
前述の装置において、二次加水分解は一次加水分解物をプレスろ過し、得られた固形物を保持したろ過室槽内に、４０〜６０℃の温水を通水および／または循環させることで二次加水分解を行うことができる。プレスろ過後の固形物は含水率が低く、かつ流動性低いため、二次加水分解を別途攪拌槽内などで固形物の再分散を行うのにエネルギー動力を要す。また、予め温水供給槽６で４０〜６０℃の範囲に保温しておいた温水を、プレスろ過室内に通水することで、固形物に吸着した酵素成分の活性を高めることができ、本発明の二次加水分解を実施することができる。温水の通水量は、通水量が多すぎると二次糖液の糖濃度が低くなりすぎるので好ましくない。また一方で通水量が少ないと、ろ過室内の反応温度を十分保持することができず好ましくない。なお、一度通水した水を、４０〜６０℃に加熱し再度循環させることで反応温度を保持でき、二次糖液の糖濃度を高めることができる。温水の通水および／または循環時間は、５分〜１８０分の範囲であることが好ましい。５分より短いと十分な二次加水分解を行うことができず、一方で、１８０分を越えても糖生成速度が飽和してくるためエネルギー的に好ましくない。
【００７７】
プレスろ過装置について、図４および図７に略図として示す。図４は、一次加水分解物を加水分解物投入口１４よりプレスろ過室内２０に投入し、その後圧板１９で圧搾することで固液分離を行う。その後、温水を温水通水口１５より通水し、固形物（一次加水分解物）１８に温水を接触させ、ろ布１７を通じてろ過される。このろ液は、さらに保温装置を経て循環させ、温水通水口１５より再度プレスろ過室内に通水される。これを循環して行うことで、プレスろ過室内で二次加水分解を実施することができる。図７は、温水を加水分解物投入口兼温水通水口２１より温水を供給する方法を示す略図である。すなわち一次加水分解物を加水分解物投入口兼通水口２１よりプレスろ過室内２０に投入し、圧板１９で圧搾することで固液分離を行う。その後、温水を加水分解物投入口兼温水通水口２１より通水し、固形物（一次加水分解物）１８に温水を接触させ、ろ布１７を通じてろ過される。このろ液は、さらに保温装置を経て循環させ、加水分解物投入口兼温水通水口２１より再度プレスろ過室内に通水される。これを循環して行うことで、プレスろ過室内で二次加水分解を実施することができる。プレスろ過室内への温水の通水および／または循環時間は、５分〜１８０分の範囲であることが好ましい。５分より短いと十分な二次加水分解を行うことができず、一方で、１８０分を越えても糖生成速度が飽和してくるためエネルギー的に好ましくない。また、温水の通水量は、通水量が多すぎると二次糖液の糖濃度が低くなりすぎるので好ましくない。また一方で通水量が少ないと、ろ過室内の反応温度を十分保持することができず、好ましくない。こういった場合、一度通水した水を、４０℃〜６０℃に加熱し再度循環させることで反応温度を保持でき、二次糖液の糖濃度を高めることができる。
【００７８】
図２の装置に加え、さらに糖液を濃縮する逆浸透膜および／またはナノろ過膜を設置した糖濃縮装置が付随した装置について、図８に略図として示す。具体的には、限外ろ過膜装置１２のろ液側に、糖溶液タンク２２およびこれとポンプを介して連結したナノろ過膜装置および／または逆浸透膜装置２３、さらにろ液ライン２４を含む装置である。なお、図３、５または６の装置にナノろ過膜装置および／または逆浸透膜装置を接続させる場合は、図２と同様に図３、５または６の装置に付随した限外ろ過膜装置１２の後工程として、図８と同様の方式でナノろ過膜装置および／または逆浸透膜装置を接続させればよい。
【００７９】
次に形態２の二次加水分解を二次加水分解槽で実施する形態に関し、図１０〜図１２で説明する。
【００８０】
図１０の装置システムでは、一次加水分解を行う攪拌タンク２と、二次加水分解を行う二次加水分解槽２８を独立して有する装置システム実施例を示す図面である。固液分離装置２５は、遠心分離、フィルタプレス、ベルトフィルタなど一次加水分解物を固液分離可能な装置であれば限定されない。固液分離装置２５で得られた固形物は、固形物移送手段２６によって二次加水分解槽２８に移送される。固形物移送手段２６としては、ベルトコンベア、スクリューポンプ、など固形物の性状に適した移送手段を選定すれば限定されない。二次加水分解槽２８は、二次加水分解を実施するために少なくとも保温設備２（二次加水分解槽）２７を有してなる。また、固形物を攪拌混合するための攪拌装置２（二次加水分解槽）２９をさらに有してもよい。さらに二次加水分解物を固液分離する固液分離装置２（二次加水分解槽）３０を有してなる。固液分離装置２（二次加水分解槽）３０で分離された二次糖液は、二次糖液回収タンク３２に移送される。二次糖液回収タンク３２の二次糖液は、二次糖液限外ろ過膜装置３３でろ過され酵素の回収を行う。
【００８１】
図１１の装置システムでは、一次加水分解を行う攪拌タンク２と二次加水分解槽２８、固液分離装置２５と固液分離装置２（二次加水分解物）３０、をそれぞれ独立して有するが、限外ろ過膜装置１２は一次糖液および二次糖液共通で使用する場合の実施形態である。図１０と同様、二次加水分解槽２８で得られた二次加水分解物は、固液分離装置２（二次加水分解物）３０にて固液分離され、二次糖液移送ライン３４を通じて、ろ液タンク１１に移送される。ろ液タンク１１に回収された一次糖液および二次糖液は、同時的あるいは逐次的に限外濾過膜１２にてろ過され、酵素と糖を分離する。
【００８２】
図１２の装置システムでは、一次加水分解を行う攪拌タンク２と二次加水分解槽２８を独立で有しているが、固液分離装置２５と限外ろ膜装置１２は一次糖液および二次糖液共通で使用する実施形態である。二次加水分解槽２８で得られた二次加水分解物は、二次加水分解物移送ライン３５を通じて、固液分離装置２５に移送され二次糖液と固形物に分離される。固液分離装置２５で分離された一次糖液および二次糖液は、ろ液回収タンク１１に回収され、同時的あるいは逐次的に限外濾過膜１２にてろ過され、酵素と糖を分離する。
【００８３】
次に形態３の二次加水分解を一次加水分解と同一タンクで実施する形態に関し図１３で説明する。
【００８４】
図１３の装置では、一次加水分解を行う攪拌タンク２で得られた一次加水分解物を固液分離装置２５で分離し、得られた固形物を二次加水分解物移送ライン３５によって、一次加水分解槽に循環させ、一次加水分解槽で二次加水分解を行う実施形態を示す。固液分離装置２５で分離され一次糖液および二次糖液は、ろ液回収タンク１１に回収され、限外ろ過膜装置１２に通じてろ過し、酵素と糖を分離する。
【００８５】
次に限外ろ過膜装置の前工程に精密ろ過膜装置を設置した装置形態に関し、図１４〜図１６で説明する。図１４は、限外ろ過膜装置１２の前工程に精密ろ過膜装置３６を設置した実施形態（部分図面）である。精密ろ過膜装置３６は、固液分離装置３３、またはプレスろ過装置８で得られた一次糖液および／または二次糖液に含まれる不溶性微粒子成分を除去できるものであれば特に限定されないが、平均細孔径０．０１μｍ〜１μｍの範囲の精密ろ過膜を例示することができる。また精密ろ過膜装置３６におけるろ過方式は、クロスフローろ過（図１５）、デッドエンドろ過（図１６）のいずれであってもよい。
【００８６】
図１５は、クロスフローろ過にて精密ろ過を行う精密ろ過装置３６の実施形態であり、精密ろ過膜原水タンク３７に一次糖液および／または二次糖液を貯蔵し、精密ろ過膜３８に対してポンプで循環しながらろ過してもよい。
【００８７】
図１６は、デッドエンドろ過で精密ろ過を行う実施形態である。精密ろ過膜原水タンク３７に一次糖液および／または二次糖液を貯蔵し、精密ろ過膜３８でろ過する。デッドエンドろ過の場合、場合によっては、膜表面の気泡洗浄を行うための圧空供給装置３９を備えていてもよく、また逆洗浄のための逆洗浄ポンプ４０を設置してあってもよい。なお、逆洗浄は、精密ろ過液回収槽４１に回収されたろ液であってもよく、場合によっては一般的な膜洗浄液あるいは薬液であってもよい。精密ろ過膜３８は、平膜、中空糸膜のいずれであってもよい。中空糸膜は、内圧式あるいは外圧式いずれであってもよい。
【実施例】
【００８８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。【００８９】
（参考例１）セルロース前処理物の調整
１．セルロース前処理物１の調整（希硫酸処理）
セルロースとして、稲藁を使用した。セルロースを硫酸１％水溶液に浸し、１５０℃で３０分オートクレーブ処理（日東高圧製）した。処理後、固液分離を行い、硫酸水溶液（以下、希硫酸処理液）と硫酸処理セルロースに分離した。次に硫酸処理セルロースと固形分濃度が１０重量％となるように希硫酸処理液と攪拌混合した後、水酸化ナトリウムによって、ｐＨを５付近に調整した。これをセルロース前処理物１として以下実施例に使用した。【００９０】
２．セルロース前処理物２の調整（アンモニア処理）
セルロースとして、稲藁を使用した。前記セルロースを小型反応器（耐圧硝子工業製、ＴＶＳ−Ｎ２  ３０ｍｌ）に投入し、液体窒素で冷却した。この反応器にアンモニアガスを流入し、試料を完全に液体アンモニアに浸漬させた。リアクターの蓋を閉め、室温で１５分ほど放置した。次いで、１５０℃のオイルバス中にて１時間処理した。処理後、反応器をオイルバスから取り出し、ドラフト中で直ちにアンモニアガスをリーク後、さらに真空ポンプで反応器内を１０Ｐａまで真空引きし乾燥させた。これをセルロース前処理物２として以下実施例に使用した。【００９１】
３．セルロース前処理物３の調整（水熱処理）
セルロースとして、稲藁を使用した。前記セルロースを水に浸し、撹拌しながら１８０℃で２０分間オートクレーブ処理（日東高圧株式会社製）した。その際の圧力は１０ＭＰａであった。処理後は溶液成分（以下、水熱処理液）と処理バイオマス成分に遠心分離（３０００Ｇ）を用いて固液分離した。この処理バイオマス成分をセルロース前処理物３として以下実施例に使用した。【００９２】
（参考例２）糖濃度の測定
糖液に含まれるグルコースおよびキシロース濃度は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：Ｌｕｎａ  ＮＨ２（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）
移動相：ミリＱ：アセトニトリル＝２５：７５（流速０．６ｍＬ／分）
反応液：なし 
検出方法：ＲＩ（示差屈折率）
温度：３０℃。【００９３】
（参考例３）トリコデルマ由来セルラーゼの調整
トリコデルマ由来セルラーゼは以下の方法で調整した。【００９４】
［前培養］
コーンスティップリカー５％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸アンモニウム０．１４％（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸二水素カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化鉄(ＩＩＩ)六水和物０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸銅(ＩＩ)五水和物０．００４％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖｏｌ）、ホウ酸０．０００６％（ｗ／ｖｏｌ）、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２６％（ｗ／ｖｏｌ）となるよう蒸留水に添加し、１００ｍＬを５００ｍＬバッフル付き三角フラスコに張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別にそれぞれ１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ−ＭとＴｗｅｅｎ８０をそれぞれ０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）添加した。この前培養培地にトリコデルマ・リーセイＰＣ３−７を１×１０５個／ｍＬになるように植菌し、２８℃、７２時間、１８０ｒｐｍで振とう培養し、前培養とした（振とう装置：ＴＡＩＴＥＣ社製  ＢＩＯ−ＳＨＡＫＥＲ  ＢＲ−４０ＬＦ）。
【００９５】
［本培養］
コーンスティップリカー５％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ）、セルロース（アビセル）１０％（ｗ／ｖｏｌ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸アンモニウム０．１４％（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸二水素カリウム 0.2%（w/vol）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化鉄(ＩＩＩ)六水和物０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸銅(ＩＩ)五水和物０．００４％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖｏｌ）、ホウ酸０．０００６％（ｗ／ｖｏｌ）、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２６％（ｗ／ｖｏｌ）となるよう蒸留水に添加し、２．５Ｌを５Ｌ容撹拌ジャー（ＡＢＬＥ社製  ＤＰＣ−２Ａ）容器に張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別にそれぞれ１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ−ＭとＴｗｅｅｎ８０をそれぞれ０．１％添加し、あらかじめ前記の方法にて液体培地で前培養したトリコデルマ・リーセイＰＣ３−７を２５０ｍＬ接種した。その後、２８℃、８７時間、３００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍにて培養を行い、遠心分離後、上清を膜ろ過（ミリポア社製  ステリカップ−ＧＶ  材質：ＰＶＤＦ）した。この前述条件で調整した培養液に対し、βグルコシダーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８）をタンパク質重量比として、１／１００量添加し、これをトリコデルマ由来セルラーゼとして、以下、実施例に使用した。【００９６】
（参考例４）セルラーゼ活性測定方法
セルラーゼ活性は、１）アビセル分解活性、２）カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）分解活性、３）セロビオース分解活性、４）キシラン分解活性、の４種の分解活性に分けて、以下の手順で活性を測定評価した。【００９７】
１）アビセル分解活性
酵素液（所定条件で調整）に対し、アビセル（Ｍｅｒｃｋ社製、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ）を１ｇ／Ｌ、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）を１００ｍＭとなるよう添加し、５０℃で２４時間反応させた。反応液は１ｍＬチューブで調整し、前記条件にて回転混和しながら反応を行った。反応後、チューブを遠心分離し、その上清成分のグルコース濃度を測定した。グルコース濃度は、参考例２に記載の方法に準じて測定した。アビセル分解活性は、生成したグルコース濃度（ｇ／Ｌ）をそのまま活性値とした。
【００９８】
２）ＣＭＣ分解活性
酵素液に対し、カルボキシメチルセルロース１０ｇ／Ｌ、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）を１００ｍＭとなるよう添加し、５０℃で０．５時間反応させた。反応液は１ｍＬチューブで調整し、前記条件にて回転混和しながら反応を行った。反応後、チューブを遠心分離し、その上清成分のグルコース濃度を測定した。グルコース濃度は、参考例２に記載の方法に準じて測定した。ＣＭＣ分解活性は、生成したグルコース濃度（ｇ／Ｌ）をそのまま活性値とした。【００９９】
３）セロビオース分解活性
酵素液に対し、セロビオース（和光純薬）５００ｍｇ／Ｌ、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）を１００ｍＭとなるよう添加し、５０℃で０．５時間反応させた。反応液は１ｍＬチューブで調整し、前記条件にて回転混和しながら反応を行った。反応後、チューブを遠心分離し、その上清成分のグルコース濃度を測定した。グルコース濃度は、参考例２に記載の方法に準じて測定した。セロビオース分解活性は、生成したグルコース濃度（ｇ／Ｌ）をそのまま活性値とした。【０１００】
４）キシラン分解活性
酵素液に対し、キシラン（Ｂｉｒｃｈ  ｗｏｏｄ  ｘｙｌａｎ、和光純薬）１０ｇ／Ｌ、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）を１００ｍＭとなるよう添加し、５０℃で４時間反応させた。反応液は１ｍＬチューブで調整し、前記条件にて回転混和しながら反応を行った。反応後、チューブを遠心分離し、その上清成分のキシロース濃度を測定した。キシロース濃度は、参考例２に記載の方法に準じて測定した。キシロース分解活性は、生成したキシロース濃度（ｇ／Ｌ）をそのまま活性値とした。【０１０１】
（実施例１）トリコデルマ由来セルラーゼによるセルロースの加水分解
以下実施例として、トリコデルマ由来セルラーゼを使用したセルロースの加水分解において、一次加水分解、および二次加水分解を行った結果を示す。実験方法は以下の方法で行った。【０１０２】
（工程１：一次加水分解）
セルロース前処理物１〜３（各１ｇ）に蒸留水を加え、トリコデルマ由来セルラーゼ１０ｍｇを添加し、総重量が１０ｇとなるようさらに蒸留水を添加した。さらに本組成物のｐＨが４．５〜５．３の範囲となるよう希釈硫酸あるいは希釈苛性ソーダで調整した。ｐＨを調整した本組成物を枝付試験管に移し（東京理化社製  φ３０  ＮＳ１４／２３）、本組成物を枝付反応容器に移し（東京理化社製  φ３０  ＮＳ１４／２３）、５０℃にて２４時間保温および攪拌し加水分解を行った（東京理化社製：小型メカニカルスターラー  ＣＰＳ−１０００、変換アダプター、三方コック付添加口、保温装置  ＭＧ−２２００）。加水分解物を遠心分離（３０００Ｇ、１０分）にて固液分離し、一次糖液（６ｍＬ）と固形物に分離した。得られた一次糖液のグルコースおよびキシロース濃度は、参考例２記載の方法で測定した。また、一次糖液の糖生成量（ｍｇ）は、以下の式で算出し、この結果を表２にまとめた。
一次糖液の糖生成量（ｍｇ）＝｛２４時間後の糖濃度（ｇ／Ｌ）−０時間後の糖濃度（ｇ／Ｌ）｝×６（ｍＬ）。【０１０３】
【表２】
0006003056.tif 000003
【０１０４】
（工程２：二次加水分解）
工程１で得られた固形物に総重量が１０ｇとなるようさらに蒸留水を添加した。さらに本組成物のｐＨが４．５〜５．３の範囲となるよう希釈硫酸あるいは希釈苛性ソーダで調整した。本組成物を枝付試験管に移し（東京理化社製  φ３０  ＮＳ１４／２３）、本組成物を枝付反応容器に移し（東京理化社製  φ３０  ＮＳ１４／２３）、５０℃にて１時間保温および攪拌し二次加水分解を行った（東京理化社製：小型メカニカルスターラー  ＣＰＳ−１０００、変換アダプター、三方コック付添加口、保温装置  ＭＧ−２２００）。加水分解物を遠心分離（３０００Ｇ、１０分）にて固液分離し、二次糖液（６ｍＬ）と固形残さに分離した。二次糖液のグルコースおよびキシロース濃度は、参考例２記載の方法で測定した。また、二次糖液の糖生成量（ｍｇ）は、以下の式で算出した。
二次糖液の糖生成量（ｍｇ）＝｛１時間後の糖濃度（ｇ／Ｌ）−０時間後の糖濃度（ｇ／Ｌ）｝×６（ｍＬ）。【０１０５】
この結果を表３にまとめた。二次加水分解では、特段酵素の添加は行っていないが、１時間の保温により、糖濃度が増加することが判明した。すなわち、固形物中に残存している一次糖液または固形物への吸着酵素のみで二次加水分解反応が見られた。【０１０６】
【表３】
0006003056.tif 000004
【０１０７】
（工程３：糖化酵素の回収）
工程１の一次加水分解で得られた一次糖液（６ｍＬ）、および工程２の二次加水分解で得られた二次糖液（６ｍＬ）を混合し、この溶液より糖化酵素の回収を行った。    【０１０８】
上記溶液を分画分子量１００００の限外ろ過膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ  ｂｉｏｔｅｃｈ社製  ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０  材質：ＰＥＳ）でろ過し、膜画分が１ｍＬになるまで４５００Ｇにて遠心した。蒸留水１０ｍＬを膜画分に添加し、再度膜画分が１ｍＬになるまで４５００Ｇにて遠心した。この後、膜画分から酵素を回収した。回収した酵素のタンパク質濃度は、ＢＣＡ測定キット（ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ、ピアス社）を使用して行い、牛アルブミン（２ｍｇ／ｍＬ）を標品として、５６２ｎｍの吸光度を測定し、比色定量を行った。回収できた酵素濃度（ｍｇ／ｍＬ）を膜画分の溶液量１ｍＬで乗じて、回収できた糖化酵素量を算出した。その結果、表４に見られる通り、１．６〜２．６ｍｇの酵素が回収できることが判明した。【０１０９】
【表４】
0006003056.tif 000005
【０１１０】
（実施例２）二次加水分解における反応温度と糖生成量／回収酵素量への影響
実施例１の工程２において、反応温度を２５℃〜９０℃の温度で設定し、二次加水分解を実施した際の二次糖液（６ｍＬ）中の糖生成量（グルコース、ｇ）を表５に示す。本発明の二次加水分解では、４０〜６０℃の範囲、すなわち、トリコデルマ由来セルラーゼの反応最適温度において糖生成量が最も増大することが判明した。【０１１１】
【表５】
0006003056.tif 000006
【０１１２】
また、実施例１の工程２において、反応温度を２５〜９０℃の温度で設定し、工程３の糖化酵素の回収を行い、回収できた糖化酵素量を算出した。その結果、表６に見られる通り、二次加水分解の反応温度４０〜６０℃において糖化酵素の回収酵素量が増大することが判明した。また、さらに好ましい二次加水分解の温度は、５０℃であることが確認できた。【０１１３】
【表６】
0006003056.tif 000007
【０１１４】
（実施例３）回収酵素の分析
実施例１における工程３で得られた回収酵素（セルロース前処理物２）に関して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動を行い、回収酵素成分に関して分析を行った。まず、回収酵素に同量のサンプル処理バッファー（ＡＴＴＯ社製  Ｅｚ  Ａｐｐｌｙ）を混合し、１００℃で１０分処理した。処理サンプルを１５％電気泳動用ゲル（ＡＴＴＯ社製  ｅ−ＰＡＧＥＬ）へ５μLアプライし電気泳動を行った（４０ｍＡ、３０分）。ゲルを取り出し、クマシーブリリアントブルー染色後（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製  Ｂｉｏ−ｓａｆｅ  ＣＢＢ）、蒸留水で脱色を行った。得られた電気泳動のゲル染色した結果を図９に示す。４０℃〜６０℃において、特にトリコデルマ由来セルラーゼ成分のうち、セロビオハイドラーゼが回収酵素成分として含まれることが確認できた。【０１１５】
（実施例４）二次加水分解における反応時間と糖生成量／回収酵素量の関係
実施例１の工程２において、反応時間を０〜７２０分の範囲で設定し、二次加水分解を実施した際の二次糖液（６ｍＬ）中の糖生成量（グルコース、ｇ）を表７に示す。本発明の二次加水分解は、少なくとも５分以上行うことで、十分な糖生成量を得ることができることが判明した。一方で、１８０分を超える範囲においては回収酵素量に変化かが見られなかった。【０１１６】
【表７】
0006003056.tif 000008
【０１１７】
次に、実施例１の工程２において、反応時間を０〜７２０分の範囲で設定し、工程３の糖化酵素の回収を行い、回収できた糖化酵素量を算出した。その結果、表８に見られる通り、本発明の二次加水分解は少なくとも５分以上行うことで、十分な回収酵素量を得ることができることが判明した。一方で、１８０分を超える範囲においては回収酵素量に変化が見られなかった。【０１１８】
【表８】
0006003056.tif 000009
【０１１９】
（実施例５）二次加水分解におけるｐＨと回収酵素量との関係
実施例１の工程２では、ｐＨ４．５〜５．３の範囲となるよう希釈硫酸あるいは希釈苛性ソーダで調整して５０℃にて実施したが、本実施例では、ｐＨを３〜１０の各ｐＨ範囲となるように希釈緩衝液を使用して設定し、二次加水分解を５０℃で実施した。緩衝液としては、ｐＨ３〜８の範囲では、２ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液を使用し、ｐＨ９〜１０の範囲では、２ｍＭのグリシン水酸化ナトリウム緩衝液を使用した。ｐＨ以外は実施例１同様の方法で実施した。その結果、表９に見られる通り、二次加水分解のｐＨを６．０〜８．０の範囲で行うことで回収酵素量を増大させることができることが判明した。【０１２０】
【表９】
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【０１２１】
（実施例６）二次加水分解におけるノニオン性界面活性剤の添加量と回収酵素量の関係
ノニオン性界面活性剤として、プルロニックＦ−６８（ＢＡＳＦ社製）を使用した。実施例１の工程２において、プルロニックＦ−６８を最終濃度０．０１〜５％の範囲になるよう添加し二次加水分解を実施した。ノニオン性界面活性剤の添加以外は実施例１同様の方法で実施した。その結果、表１０に見られる通り、ノニオン性界面活性剤を０．０５％〜２％の範囲で添加することにより、回収酵素量を増大させることができた。【０１２２】
【表１０】
0006003056.tif 000011
【０１２３】
（参考例４）一次加水分解物の大量調整
一次加水分解物の大量調整は、セルロース前処理物３（２ｋｇ）に、トリコデルマ由来セルラーゼ２０ｇを添加し、総重量が２０ｋｇとなるようさらに蒸留水を添加した。さらに本組成物のｐＨが４．５〜５．３の範囲となるよう希釈硫酸あるいは希釈苛性ソーダで調整した。この液を液温が４５〜５０℃を保つよう保温しながら、かつｐＨが４．５〜５．３の範囲を保つように希釈硫酸、希釈苛性ソーダを添加して２４時間酵素とセルロース前処理物３を反応させた（以下反応後の液を酵素糖化スラリー液という）。【０１２４】
（比較例１）プレスろ過による固液分離（一次加水分解後の固液分離）
参考例４で得られた酵素糖化スラリー液１０Ｌを用いて以下の手順でプレスろ過を実施した。プレスろ過は小型フィルタプレス装置（薮田産業製フィルタプレス  ＭＯ−４）を用いた。ろ布はポリエステル製織布（薮田産業製  Ｔ２７３１Ｃ）を使用した。酵素糖化スラリー液１０Ｌを小型タンクの中に入れて下から圧縮空気で曝気しながら液投入口を開いてエアーポンプ（タイヨーインタナショナル製  ６６０５３−３ＥＢ）で徐々にろ室内に酵素糖化スラリー液を投入した。投入後１分間出てきたろ液はろ液に濁りが残っているため小型タンク内に戻した。徐々にエアーポンプの駆動圧力を上昇させてろ室内の圧力を上昇させていき、ろ液が出てくるまで圧入工程を行った。この時の最大圧入圧力は０．１５ＭＰａであった。以上の圧入工程に要した時間は３０分であった。【０１２５】
次にろ室に付設されているダイヤフラムを膨らませて圧搾工程を行った。徐々に圧搾圧力を上昇させていき、０．５ＭＰａまで上昇させてから約３０分間放置してろ液を回収した。以上圧搾工程に要した時間は４０分であった。【０１２６】
圧搾工程終了後、ダイヤフラム、タンク内の圧力を開放した後、得られた固形物を回収した。得られたろ液の総量は９．０Ｌであった。残りの液成分については装置デッドボリュームのために損失した。得られたろ液、すなわち比較例１の一次糖液の糖濃度を測定したところグルコース濃度が３５ｇ／Ｌ、キシロース濃度が７ｇ／Ｌであった。すなわち、比較例１でのグルコース生産量は、３１５ｇ、キシロース生産量は６３ｇであった（表１１）。【０１２７】
（比較例２）プレスろ過による固液分離（一次加水分解後の固液分離、固形物の洗浄）
参考例４で得られた酵素糖化スラリー液１０Ｌを用いて、以下手順でプレスろ過を実施した。プレスろ過は比較例１と同様の装置を使用して実施し、圧入工程まで比較例１と同様の条件で実施した。圧搾工程は、０．２ＭＰａまで圧搾圧力を上昇させて５分程度ろ液を回収した。この時点で回収できたろ液量は、８Ｌであった。得られたろ液、すなわち比較例２の一次糖液の糖濃度を測定したところグルコース濃度が３５ｇ／Ｌ、キシロース濃度が７ｇ／Ｌであった。したがって、この一次加水分解のグルコース生産量（一次糖液の糖生産量）は２８０ｇ、キシロース生産量が５６ｇであった（表１１）。【０１２８】
次にプレスろ過室内に残った固形物の水洗浄を以下の手順で実施した。なお本操作は、二次加水分解ではない。【０１２９】
タンク内に１８℃の蒸留水２．５Ｌを添加し、圧入圧力を０．２ＭＰａにしてろ液が出なくなるまで圧入工程を行った。次にろ室に付設されているダイヤフラムを膨らませて圧搾工程を行った。徐々に圧搾圧力を上昇させていき、０．５ＭＰａまで上昇させてから約３０分間放置してろ液を回収した。以上圧搾工程に要した時間は３５分であった。圧搾工程終了後、ダイヤフラム、タンク内の圧力を開放した後、得られた固形物を回収した。得られたろ液の総量は、３．５Ｌであった。残りの液成分については装置デッドボリュームのために損失した。得られたろ液、すなわち比較例２の二次糖液の糖濃度を測定したところグルコース濃度が１４ｇ／Ｌ、キシロース濃度が３．１ｇ／Ｌであった。したがって、この時のグルコース生産量は４９ｇ、キシロース生産量が１１ｇであった（表１１）。【０１３０】
【表１１】
0006003056.tif 000012
【０１３１】
（実施例６）プレスろ過室内での二次加水分解
参考例４で得られた酵素糖化スラリー液１０Ｌを用いて、以下手順で固液分離および二次加水分解を実施した。【０１３２】
プレスろ過は、比較例２と同様の装置ならびに条件で実施した。すなわち回収できたろ液量は、８Ｌであった。得られたろ液、すなわち実施例２の一次糖液の糖濃度を測定したところグルコース濃度が３５ｇ／Ｌ、キシロース濃度が７ｇ／Ｌであった。したがって、この時点でのグルコース生産量は２８０ｇ、キシロース生産量が５６ｇであった。これを実施例６の一次糖液の糖生産量として表１２にまとめた。【０１３３】
次にプレスろ過室内での二次加水分解を以下手順で実施した。【０１３４】
圧搾工程中よりタンク内に蒸留水２．５Ｌを添加した。その後、タンクをラバーヒーターにて蒸留水温度が５０℃になるまで加熱した。温まったところで、ろ室へスラリー液と同じ方法でこの５０℃の温水をろ室に投入した。また、ここで得られたろ液は全てタンク内に戻して循環させるようにした。この循環状態をろ液が出始めた段階から１時間行った。なお、ろ液の温度を測定したところ、１０分後に４０℃、１５分後以降は４５℃で一定となった。圧入圧力は０．１５ＭＰａで一定とした。１２０分経過後、ろ液側をタンクへの循環から取り出しに切り替えて、圧入圧力を０．２ＭＰａにしてろ液がでなくなるまで圧入工程を行った。次にろ室に付設されているダイヤフラムを膨らませて圧搾工程を行った。徐々に圧搾圧力を上昇させていき、０．５ＭＰａまで上昇させてから約３０分間放置してろ液を回収した。以上圧搾工程に要した時間は３５分であった。圧搾工程終了後、ダイヤフラム、タンク内の圧力を開放した後、得られた固形物を回収した。得られたろ液の総量は、３．５Ｌであった。残りの液成分については装置デッドボリュームのために損失した。得られたろ液の糖濃度を測定したところグルコース濃度が２８ｇ／Ｌ、キシロース濃度が５ｇ／Ｌであった。したがって、この時のグルコース生産量は９８ｇ、キシロース生産量が１７．５ｇであった。これを実施例６の二次加水分解ならびに固液分離で得られた二次糖液の糖生産量として表１２にまとめた。【０１３５】
【表１２】
0006003056.tif 000013
【０１３６】
比較例１および比較例２の二次加水分解を実施しない場合と、表１２の実施例６を比較すると、本発明の二次加水分解を実施することによって、糖生産量が大幅に増大することが判明した。【０１３７】
（実施例７）プレスろ過室の二次加水分解で得られた糖化酵素の回収量
実施例６で得られた一次糖液（６ｍＬ）および二次糖液（６ｍＬ）を混合し、この糖液より糖化酵素の回収を行った。なお比較のため、比較例２で得られた一次糖液（６ｍＬ）および固形物洗浄液（６ｍＬ）を混合し、この糖液より糖化酵素の回収も行った。糖液を分画分子量１００００の限外ろ過膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ  ｂｉｏｔｅｃｈ社製  ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０  材質：ＰＥＳ）でろ過し、膜画分が１ｍＬになるまで４５００Ｇにて遠心した。蒸留水１０ｍＬを膜画分に添加し、再度膜画分が１ｍＬになるまで４５００Ｇにて遠心した。この後、膜画分から酵素を回収した。回収した酵素のタンパク質濃度は、ＢＣＡ測定キット（ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅｇｅｎｔ  ｋｉｔ、ピアス社）を使用して行い、牛アルブミン（２ｍｇ／ｍＬ）を標品として、５６２ｎｍの吸光度を測定し、比色定量を行った。回収できた酵素濃度（ｍｇ／ｍＬ）を膜画分の溶液量１ｍＬで乗じて、回収できた糖化酵素量を算出した。その結果、表１３に見られる通り、比較例２の糖液より回収した酵素量に対して、実施例６では温水の通水による効果により糖化酵素の回収量が増大することが確認できた。【０１３８】
【表１３】
0006003056.tif 000014
【０１３９】
（実施例８）糖化酵素の回収および再利用
比較例２および実施例６で得られた一次糖液（８Ｌ）、および二次糖液（３．５Ｌ）をそれぞれ混合し、この各混合溶液１１．５Ｌより糖化酵素の回収を行った。糖化酵素の回収は、分画分子量１００００の限外ろ過膜（ＧＥ製  ＳＥＰＡ  ＰＷシリーズ  機能面材質：ポリエーテルスルホン）の平膜をセットした小型平膜ろ過装置（ＧＥ製  Ｓｅｐａ（登録商標）  ＣＦ  ＩＩ  Ｍｅｄ／Ｈｉｇｈ  Ｆｏｕｌａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して実施した。原水側流速２．５Ｌ／分、膜フラックスが０．１ｍ／Ｄと一定になるように操作圧力を制御しながら１１．５Ｌのうち１１Ｌをろ過した。そのため、原水側には０．５Ｌの糖化酵素を回収した。次に、得られた０．５Ｌの回収酵素をセルロース前処理物３（１ｋｇ）に添加し、さらに蒸留水を加え、総重量が１０ｋｇとなるように調整した。さらに本組成物のｐＨが４．５〜５．３の範囲となるよう希釈硫酸あるいは希釈苛性ソーダで調整した。この液を液温が４５〜５０℃を保つよう保温しながら、かつｐＨが４．５〜５．３の範囲を保つように希釈硫酸、希釈苛性ソーダを添加して２４時間酵素とセルロース前処理物３を反応させた。その結果、表１４に見られる通り、比較例２の糖液（一次・二次）からの回収酵素を使用した糖生成量よりも、実施例６の糖液（一次・二次）からの回収酵素を使用した糖生成量の方が多いことが確認できた。【０１４０】
【表１４】
0006003056.tif 000015
【０１４１】
（実施例９）一次糖液および二次糖液の逆浸透膜（ＲＯ膜）による濃縮
実施例６の一次糖液および二次糖液各１Ｌの逆浸透膜（ＲＯ膜）による濃縮を行った。まず、一次糖液および二次糖液を細孔径０．４５μｍの精密ろ過膜による前ろ過を行った。得られた各膜処理液１Ｌを使用してＲＯ膜濃縮を実施した。ＲＯ膜は架橋全芳香族系逆浸透膜“ＵＴＣ８０”（東レ株式会社製）を使用し、このＲＯ膜を小型平膜ろ過装置（ＧＥ製  Ｓｅｐａ（登録商標）  ＣＦ  ＩＩ  Ｍｅｄ／Ｈｉｇｈ  Ｆｏｕｌａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）にセットし、原水温度を２５℃、高圧ポンプの圧力を３ＭＰａでろ過処理を行った。この処理により０．７Ｌの透過液を得た。この時のグルコースおよびキシロース濃度は表１５に示す通りであり、本発明の一次糖液および二次糖液は、ＲＯ膜による濃縮によって糖濃度を高めることができることが確認できた。【０１４２】
【表１５】
0006003056.tif 000016
【０１４３】
（実施例１０）一次糖液および二次糖液のナノろ過膜（ＮＦ膜）による濃縮
実施例８の一次糖液および二次糖液各１Ｌのナノろ過膜（ＮＦ膜）による濃縮を行った。【０１４４】
まず、一次糖液および二次糖液を細孔径０．４５μｍの精密ろ過膜による前ろ過を行った。得られた各膜処理液１Ｌを使用してNF膜濃縮を実施した。ＮＦ膜は架橋ピペラジンポリアミド系ナノろ過膜“ＵＴＣ６０”（東レ株式会社製）を使用し、このNF膜を小型平膜ろ過装置（ＧＥ製Ｓｅｐａ（登録商標） ＣＦＩＩＭｅｄ／Ｈｉｇｈ Ｆｏｕｌａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）にセットし、原水温度を２５℃、高圧ポンプの圧力を３ＭＰａでろ過処理を行った。この処理により０．７Ｌの透過液を得た。この時のグルコースおよびキシロース濃度は表１６に示す通りであり、本発明の一次糖液および二次糖液は、ＮＦ膜による濃縮によって糖濃度を高めることができることが確認できた。【０１４５】
【表１６】
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【０１４６】
（比較例３）遠心分離による固液分離（一次加水分解後の固液分離）
実施例７得られた酵素糖化スラリー液１０Ｌを用いて、以下の手順で遠心分離を実施した。【０１４７】
５００ｍＬ遠沈管２５本に酵素糖化スラリー４００ｍＬを投入し、３０００Ｇで１０分遠心分離した。各遠沈管より、２４０ｍＬの上清を回収でき、これを２５本分、すなわち合計６Ｌ回収することができた。各遠沈管において、残りの１６０ｍＬ（合計４Ｌ）は遠沈管の固形物として回収した。得られたろ液、すなわち実施例８の一次糖液の糖濃度を測定したところグルコース濃度が３５ｇ／Ｌ、キシロースが７ｇ／Ｌであった。したがって、この固液分離として遠心分離を行い得られる糖は、グルコース生産量（一次糖液の糖生産量）は２１０ｇ、キシロース生産量が４２ｇであった（表１７）。【０１４８】
（比較例４）遠心分離による固液分離（一次加水分解後の固液分離、固形物の洗浄）
実施例７得られた酵素糖化スラリー液１０Ｌを用いて、以下の手順で遠心分離を実施した。【０１４９】
５００ｍＬ遠沈管２５本に酵素糖化スラリー４００ｍＬを投入し、比較例３記載の方法と同様に遠心分離し、合計６Ｌ回収することができた。【０１５０】
各遠沈管において、残りの１６０ｍＬ（合計４Ｌ）は遠沈管の固形物として回収した。得られたろ液、すなわち実施例８の一次糖液の糖濃度を測定したところグルコース濃度が３５ｇ／Ｌ、キシロースが７ｇ／Ｌであった。したがって、この固液分離として遠心分離を行い得られる糖は、グルコース生産量（一次糖液の糖生産量）は２１０ｇ、キシロース生産量が４２ｇであった（表１７）。【０１５１】
次に、残った固形物の水洗浄を以下の手順で実施した。本操作は、二次加水分解ではない。【０１５２】
上記遠心分離で回収した固形物に加水し、再度遠心分離により固液分離を行い糖液を回収した。遠沈管２５本に残った各沈殿成分１６０ｍＬに対し、１００ｍＬの蒸留水を加水した。このとき蒸留水の温度は１８℃であった。加水後、遠沈管を軽く回転混和した後、再度、３０００Ｇで１０分遠心分離した。遠心分離後、各遠沈管より、１５０ｍＬの上清が回収でき、２５本分、すなわち合計３．７５Ｌ回収することができた。得られた上清、すなわち比較例４の二次糖液の糖濃度を測定したところグルコース濃度が２１ｇ／Ｌ、キシロース濃度が４ｇ／Ｌであった。したがって、この時のグルコース生産量は７９ｇ、キシロース生産量が１５ｇであった（表１７）。【０１５３】
【表１７】
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【０１５４】
（実施例１１）遠心分離による固液分離（一次加水分解および二次加水分解）
参考例４得られた酵素糖化スラリー液１０Ｌを用いて、以下の手順で遠心分離を実施した。【０１５５】
５００ｍＬ遠沈管２５本に酵素糖化スラリー４００ｍＬを投入し、比較例３記載の方法と同様に遠心分離し、合計６Ｌ回収することができた。【０１５６】
次に残った固形物に対して以下の手順で二次加水分解を実施した。
５００ｍＬ遠沈管２５本に酵素糖化スラリー４００ｍＬを投入し、３０００Ｇで１０分遠心分離した。遠心分離後、各遠沈管より、２４０ｍＬの上清を回収でき、これを２５本分、すなわち合計６Ｌ回収することができた。各遠沈管において、残りの１６０ｍＬ（合計４Ｌ）は遠沈管の沈殿成分として回収した。得られたろ液、すなわち実施例１１の一次糖液の糖濃度を測定したところグルコース濃度が３５ｇ／Ｌ、キシロースが７ｇ／Ｌであった。したがって、この固液分離として遠心分離を行い得られる糖は、グルコース生産量（一次糖液の糖生産量）は２１０ｇ、キシロース生産量が４２ｇであった。これを一次加水分解の場合の糖生産量（一次糖液の糖生産量）として、表１７にまとめた。【０１５７】
次に、上記遠心分離で回収した沈殿成分に加水し、再度遠心分離により固液分離を行い糖液を回収した。遠沈管２５本に残った各沈殿成分１６０ｍＬに対し、予め５０℃に保温しておいた１００ｍＬの蒸留水を加水した。加水後、遠沈管を軽く回転混和した後、５０℃に設定した恒温槽内で、１時間放置した。放置後、遠沈管を軽く回転混和した後、再度、３０００Ｇで１０分遠心分離した。遠心分離後、各遠沈管より、１５０ｍＬの上清が回収でき、２５本分、すなわち合計３．７５Ｌ回収することができた。得られた上清、すなわち実施例１１の二次糖液の糖濃度を測定したところグルコース濃度が２９ｇ／Ｌ、キシロース濃度が５ｇ／Ｌであった。したがって、この時のグルコース生産量は１０９ｇ、キシロース生産量が１９ｇであった（表１８）。【０１５８】
【表１８】
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【０１５９】
表１７の比較例３および比較例４の二次加水分解を実施しない場合と、表１８の実施例１１を比較すると、本発明の二次加水分解を実施することによって、糖生産量が大幅に増大することが判明した。ただし、実施例１１と固液分離をプレスろ過で実施した実施例６に比べると、固液分離を遠心分離で実施した場合は糖生産量が低いことが表１２と表１８の比較により判明した。これは、固液分離による糖回収効率が、遠心分離よりプレスろ過の方が高いことが主な要因である。【０１６０】
（実施例１２）二次加水分解における回収酵素のセルロース分解活性
実施例１（セルロース前処理物３，５０℃）、実施例２（セルロース前処理物３，２５℃）および実施例５（セルロース前処理物３，プルロニックＦ−６８：０．１％、０．２５％、０．５％、１％、２％）の条件で二次加水分解を行い、回収した回収酵素のセルラーゼ活性を、参考例４の方法にて測定した。活性値は、実施例１（５０℃）の条件で回収した酵素活性を基準（活性＝１）として相対値で表１９にまとめた。キシラン分解活性に関しては、検出できない条件も存在し、これらをＮＤ（ｎｏｔ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ）と表記した。また、基準である実施例１に関してもキシラン分解活性はＮＤであったため、実施例５のプルロニックＦ−６８、０．５％の際のキシラン分解活性を１として相対活性を記した。
【０１６１】
【表１９】
0006003056.tif 000020
【０１６２】
２５℃条件における回収酵素（実施例２）のすべてのセルラーゼ活性はなく、一方で、５０℃、さらには、５０℃かつノニオン性界面活性剤（プルロニックＦ−６８）を含む条件（実施例５）の回収酵素である方が、セルラーゼ活性全般が優れているという結果を得た。【０１６３】
（比較例５）カチオン性およびアニオン性界面活性剤の酵素回収への添加効果
二次加水分解に添加する化合物として、アニオン性（陰イオン性）界面活性剤として、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、カチオン性界面活性剤として、塩化ベンザルコニウム１％を使用した。実施例１（セルロース前処理物３）において、前述の界面活性剤を最終濃度１％になるよう添加し二次加水分解を実施した。実施例１と同様の手順で回収酵素を取得し、回収酵素のセルラーゼ活性を測定したが、いずれの条件においても活性を検出することができなかった。したがって、回収酵素の活性を保持したまま回収するためには、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤は使用できないことが確認できた。
【０１６４】
（実施例１３）二次加水分解における無機塩の種類と回収酵素活性の関係
二次加水分解に添加する化合物として、各種無機塩（塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、燐酸二水素ナトリウム、燐酸水素ナトリウム、塩化カリウム、燐酸水素二カリウム、塩化アンモニウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム）を使用した。実施例１（セルロース前処理物３）において、前述の各無機塩を最終濃度１％になるよう添加し二次加水分解を実施した。添加後のｐＨは、５．５〜６．０の範囲になるよう水酸化ナトリウムまたは塩酸にて調整した。無機塩の添加以外は実施例１同様の条件（５０℃、１時間）で実施した。活性値は、実施例１（セルロース前処理物３，５０℃）の条件で回収した酵素活性を基準（活性＝１）として相対値で表２０にまとめた。キシラン分解活性に関しては、検出できない条件も存在し、これらをＮＤ（ｎｏｔ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ）と表記した。また、基準である実施例１に関してもキシラン分解活性はＮＤであったため、燐酸水素二カリウムの際のキシラン分解活性を１として相対活性を記した。
【０１６５】
【表２０】
0006003056.tif 000021
【０１６６】
その結果、表２０に見られる通り、無機塩を添加しない場合に比べ、無機塩を添加した方が回収酵素量は増加する傾向にあることが判明した。但し、カルシウム系の無機塩である塩化カルシウムでは回収酵素活性がほとんどないことが判明した。また、同じカルシウム塩である硫酸カルシウム、炭酸水素カルシウムも同様に検討したが、これらカルシウム塩の水溶解性が低く、所定濃度（最終濃度１％）まで溶解できず実施することができなかった。したがって、無機塩の中でもカルシウム系の無機塩は本発明の二次加水分解に添加する化合物としては不適であることが判明した。【０１６７】
（実施例１４）二次加水分解における無機塩の添加濃度の影響
無機塩の添加濃度による影響に関して、ナトリウム塩である塩化ナトリウムを使用して確認した。実施例１３と同じ手順で塩化ナトリウム濃度を０％、０．１％、０．５％、１％、５％で二次加水分解を行い、回収した回収酵素のセルロース分解活性を参考例４に準じて測定した。活性値は、実施例１（５０℃）の条件で回収した酵素活性を基準（活性＝１）として相対値で表２１にまとめた。キシラン分解活性に関しては、検出できない条件も存在し、これらをＮＤ（ｎｏｔ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ）と表記した。また、基準である実施例１に関してもキシラン分解活性はＮＤであったため、塩化ナトリウム０．５％の際のキシラン分解活性を１として相対活性を記した。
【０１６８】
【表２１】
0006003056.tif 000022
【０１６９】
表２１に示すように無機塩としての塩化ナトリウムを０．１％添加するのみで回収酵素のアビセル分解活性が向上し、さらに０．５％以上添加によりすべての分解活性に関し、未添加時に比べ大きく向上することが判明した。【０１７０】
（実施例１５）無機塩添加と二次加水分解温度との関係
塩化ナトリウム１％の条件において、二次加水分解の温度を、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃の各温度に設定し、回収酵素の活性を測定した。活性値は、実施例１（セルロース前処理物３，５０℃）の条件で回収した酵素活性を基準（活性＝１）として相対値で表２２にまとめた。キシラン分解活性に関しては、検出できない条件も存在し、これらをＮＤ（ｎｏｔ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ）と表記した。また、基準である実施例１に関してもキシラン分解活性はＮＤであったため、塩化ナトリウム１％、６０℃の際のキシラン分解活性を１として相対活性を記した。【０１７１】
【表２２】
0006003056.tif 000023
【０１７２】
表２２に示すように塩化ナトリウム存在下では、特にアビセル分解活性に関して、温度が５０℃に近づくほど回収酵素活性が増大する傾向にあるが、６０℃ではむしろ活性が減少することが判明した。ＣＭＣ分解活性、セロビオース分解活性に関しては、温度依存的な回収量の増加は確認できず、６０℃を超えても分解活性は低下しなかった。キシラン分解活性に関しては、３０℃〜５０℃までは回収酵素の分解活性が増大するが、６０℃になると激減することが判明した。【０１７３】
（実施例１６）二次加水分解における無機塩としての海水利用
実施例１３〜１５において、無機塩の添加により回収酵素量および活性が増大することが確認できた。そこで、無機塩を含む水溶液として「海水」にて代替できるか検討した。海水は、神奈川県三崎漁港付近で採取した海水（ｐＨ８．３、固形物溶解量３．２％）を使用した。なお海水のｐＨ調整には硫酸を使用し、ｐＨ６．５（海水１Ｌ当たり硫酸２４ｍｇ添加）、ｐＨ５．０（海水１Ｌ当たり硫酸５０ｍｇ添加），ｐＨ３．８（海水１Ｌ当たり硫酸１００ｍｇ添加）に調整した。二次加水分解における海水添加量は、最終濃度５０％（希釈率１／２）となるように固形物に添加し、５０℃で１時間二次加水分解を行った。回収できた酵素活性を表２３に示す。活性値は、実施例１（セルロース、前処理物３，５０℃）の条件で回収した酵素活性を基準（活性＝１）として相対値で表２３にまとめた。キシラン分解活性に関しては、検出できない条件も存在し、これらをＮＤ（ｎｏｔ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ）と表記した。また、基準である実施例１（セルロース、前処理物３，５０℃）に関してキシラン分解活性はＮＤであったため、の海水ｐＨ３．８の際のキシラン分解活性を１として相対活性を記した。【０１７４】
【表２３】
0006003056.tif 000024
【０１７５】
表２３に示すように無機塩として海水を使用した場合においても、回収酵素のセルラーゼ活性が向上することが確認できた。また、塩化ナトリウムなど試薬無機塩を使用した際の各分解活性と同様な傾向を示すことが判明した。但し、ｐＨ３．８では、アビセル分解活性が、その他ｐＨ条件に比べ低下することが分かった。【０１７６】
（実施例１７）海水添加と二次加水分解温度との関係
海水の中でも、添加効果の最も優れた海水ｐＨ５．０の条件において、二次加水分解の温度を、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃の各温度に設定し、回収酵素の活性を測定した。活性値は、実施例１（セルロース前処理物３，５０℃）の条件で回収した酵素活性を基準（活性＝１）として相対値で表２４にまとめた。キシラン分解活性に関しては、検出できない条件も存在し、これらをＮＤ（ｎｏｔ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ）と表記した。また、基準である実施例１（セルロース、前処理物３，５０℃）に関してキシラン分解活性はＮＤであったため、の海水温度６０℃の際のキシラン分解活性を１として相対活性を記した。【０１７７】
【表２４】
0006003056.tif 000025
【０１７８】
表２４に示すように海水存在下では、特にアビセル分解活性に関して、温度が５０℃に近づくほど活性が増大する傾向にあり、６０℃ではむしろ活性が減少することが判明した。ＣＭＣ分解活性、セロビオース分解活性に関しては、温度依存的な回収量の増加は確認できず、６０℃を超えても分解活性は低下しなかった。キシラン分解活性に関しては、３０℃〜５０℃までは回収酵素の分解活性が増大するが、６０℃になると激減することが判明した。こうした傾向は、実施例１５の塩化ナトリウムで得られた傾向と類似したものであった。【０１７９】
（実施例１８）二次加水分解におけるアミノ酸の添加量と回収酵素量の関係
二次加水分解に添加する化合物として、各種アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン）を使用した。実施例１（セルロース前処理物３，５０℃）において、前述の各アミノ酸を最終濃度１％になるよう添加し二次加水分解を実施した。なお、アスパラギン酸、チロシンは、所定濃度まで溶解できず、最終濃度１％に調整できなかった。添加後のｐＨは、５．５〜６．５の範囲になるよう塩酸および／または水酸化ナトリウムで調整した。アミノ酸の添加以外は実施例１同様の方法で実施した。活性値は、実施例１（セルロース、前処理物３，５０℃）の条件で回収した酵素活性を基準（活性＝１）として相対値で表２５にまとめた。キシラン分解活性に関しては、検出できない条件も存在し、これらをＮＤ（ｎｏｔ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ）と表記した。また、基準である実施例１（セルロース、前処理物３，５０℃）に関してキシラン分解活性はＮＤであったため、活性が検出されたリジンでのキシラン分解活性を１としてヒスチジンの相対活性を記した。【０１８０】
【表２５】
0006003056.tif 000026
【０１８１】
その結果、表２５に示す通り、アミノ酸を添加しない場合に比べ、各種アミノ酸を添加した方が回収酵素量は増加する傾向にあることが判明した。またアミノ酸の中でも、特に、グルタミン酸、リジン、ヒスチジン、アルギニン、システイン、を添加することにより、回収酵素活性を増大できることが判明した。特にアビセル分解活性に関してシステインの添加効果が高いことが確認できた。また、リジン、ヒスチジンに関しては、特にキシラン分解活性の向上が確認できた。【０１８２】
（実施例１９）アミノ酸添加と二次加水分解温度との関係
二次加水分解に添加する化合物として、アミノ酸の中でも、添加効果の最も優れたシステイン１％の条件において、二次加水分解の温温度を、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃の各温度に設定し、回収酵素の活性を測定した。活性値は、実施例１（セルロース前処理物３，５０℃）の条件で回収した酵素活性を基準（活性＝１）として相対値で表２６にまとめた。キシラン分解活性に関しては、いずれの条件でも検出できず、ＮＤ（ｎｏｔ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ）と表記した。【０１８３】
【表２６】
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【０１８４】
表２６に示すようにシステイン存在下では、特にアビセル分解活性に関して、温度が５０℃に近づくほど活性が増大する傾向にあり、６０℃ではむしろ活性が減少することが判明した。ＣＭＣ分解活性、セロビオース分解活性に関しては、温度依存的な回収量の増加は確認できず、６０℃を超えても分解活性は低下しなかった。キシラン分解活性に関しては、いずれの温度においても活性が確認できなかった。【０１８５】
（実施例２０）二次加水分解における親水性有機溶媒の添加量と回収酵素活性の関係
二次加水分解に添加する化合物として、親水性有機溶媒（メタノール、エタノール、１−プロパノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトン、アセトニトリル、エチレングリコール、グリセリン）を使用した。実施例１（セルロース前処理物３，５０℃）において、前述の親水性有機溶媒を最終濃度１％になるよう添加し二次加水分解を実施した。親水性有機溶媒の添加以外は実施例１同様の方法で実施した。活性値は、実施例１（セルロース前処理物３，５０℃）の条件で回収した酵素活性を基準（活性＝１）として相対値で表２７にまとめた。キシラン分解活性に関しては、いずれの条件でも検出できず、ＮＤ（ｎｏｔ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ）と表記した。【０１８６】
【表２７】
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【０１８７】
その結果、表２７に見られる通り、親水性有機溶媒を添加することにより回収酵素活性、特にアビセル分解活性を増大できることが判明した。【０１８８】
（比較例６）二次加水分解における疎水性有機溶媒の添加による効果
二次加水分解に添加する化合物として、ｎ−ヘキサン、１−ブタノール、１−ペンタノールを実施例１９と同じ手順で実施したが、疎水性有機溶媒が水相と分離してしまい、限外ろ過膜による回収が困難であった。酵素回収如何に関わらず、疎水性有機溶媒では操作性の悪さを理由として、二次加水分解に添加する化合物としては不適であることが判明した。【０１８９】
（実施例２１）親水性有機溶媒添加と二次加水分解温度との関係
二次加水分解に添加する化合物として、実施例２０に用いた親水性有機溶媒の１つであるエタノール１％の条件において、二次加水分解の温度を、３０℃、４０℃、５０℃（実施例２０と同じ）、６０℃の各温度に設定し、回収酵素の活性を測定した。活性値は、実施例１（セルロース前処理物３，５０℃）の条件で回収した酵素活性を基準（活性＝１）として相対値で表２８にまとめた。キシラン分解活性に関しては、いずれの条件でも検出できず、ＮＤ（ｎｏｔ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ）と表記した。【０１９０】
【表２８】
0006003056.tif 000029
【０１９１】
エタノール存在下では、特にアビセル分解活性に関して、温度が５０℃に近づくほど活性が増大する傾向にあり、６０℃ではむしろ活性が減少することが判明した。ＣＭＣ分解活性、セロビオース分解活性に関しては、温度依存的な回収量の増加は確認できず、６０℃を超えても分解活性は低下しなかった。キシラン分解活性に関しては、いずれの温度でも活性を検出することができなかった。【０１９２】
（比較例７）二次加水分解における水溶性高分子の添加による効果
二次加水分解に添加する化合物として、各種水溶性高分子を使用した。水溶性高分子は、ポリアリルアミン−ＨＣｌ−３Ｓ（ＰＡＡ−３Ｓ、日東紡）、ポリアリルアミン−ＨＣｌ−１０Ｓ（ＰＡＡ−１０Ｓ、日東紡）、ポリエチレングリコール＃４０００（ＰＥＧ＃４０００、ナカライテスク）、ポリエチレングリコール＃６０００（ＰＥＧ＃６０００、ナカライテスク）、ポリエチレングリコール＃２０，０００（ＰＥＧ＃２０，０００、和光純薬）、ポリビニルアルコール５００（ＰＶＡ、和光純薬）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ、シグマアルドリッチ）を使用した。実施例１（セルロース、前処理物３，５０℃）において、前述の水溶性高分子を最終濃度１％になるよう添加し二次加水分解を実施した。なお、添加後のｐＨは、５．５〜６．５の範囲になるよう塩酸および／または水酸化ナトリウムで調整した。水溶性高分子の添加以外は実施例１同様の方法で実施した。活性値は、実施例１（セルロース、前処理物３，５０℃）（５０℃）の条件で回収した酵素活性を基準（活性＝１）として相対値で表２９にまとめた。キシラン分解活性に関しては、検出できない条件も存在し、これらをＮＤ（ｎｏｔ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ）と表記した。【０１９３】
【表２９】
0006003056.tif 000030
【０１９４】
水溶性高分子存在下では、すべての分解活性に関して、添加による回収酵素の活性増大は確認されなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１９５】
本発明で得られる糖液は、種々の発酵産物の糖原料として使用することができる。
【符号の説明】
【０１９６】
１  保温設備
２  攪拌タンク
３  セルロース供給口
４  攪拌装置
５  水供給ライン
６  温水供給槽
７  温水供給槽保温設備
８  プレスろ過装置
９  コンプレッサー
１０  循環ライン
１１  ろ液回収タンク
１２  限外ろ過膜装置
１３  糖化酵素回収ライン
１４  加水分解物投入口
１５  温水通水口
１６  外枠
１７  ろ布
１８  固形物（一次加水分解物）
１９  圧板
２０  プレスろ過室内
２１  加水分解物投入口兼温水通水口
２２  糖溶液タンク
２３  ナノろ過膜装置または逆浸透膜装置
２４  ろ液ライン
２５  固液分離装置
２６  固形物移送手段
２７  保温設備２（二次加水分解槽）
２８  二次加水分解槽
２９  攪拌装置２（二次加水分解槽）
３０  固液分離装置２（二次加水分解物）
３１  二次糖液タンク
３２  二次糖液回収タンク
３３  二次糖液限外ろ過膜装置
３４  二次糖液移送ライン
３５  二次加水分解物移送ライン
３６  精密ろ過膜装置
３７  精密ろ過膜原水タンク
３８  精密ろ過膜
３９  圧空供給装置
４０  逆洗ポンプ
４１  精密ろ過液回収槽
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図９】
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