(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド加水分解の方法であって、該方法は、活性型ＬｙｔＭを、２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性の水性環境において、ペプチド基質と接触させる工程を含み、活性型ＬｙｔＭは、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１８０−３１６に対応するフラグメントＬｙｔＭ１８０−３１６または配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＬｙｔＭ１８５−３１６に対して少なくとも９５％の同一性を有し、活性型ＬｙｔＭは、連続する少なくとも４つのグリシンでできた基質に対して配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１８５−３１６に対応する触媒ドメインＬｙｔＭ１８５−３１６のグリシルグリシンエンドペプチダーゼの活性を有し、接触は、０℃乃至３７℃の範囲で行われることを特徴とする、ペプチド加水分解の方法。
【請求項２】
活性型ＬｙｔＭは、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１８０−３１６に対応するフラグメントＬｙｔＭ１８０−３１６または配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＬｙｔＭ１８５−３１６から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド加水分解の方法。
【請求項３】
接触は、１０℃より下の温度で行われることを特徴とする、請求項１又は２に記載のペプチド加水分解の方法。
【請求項４】
グラム陽性細菌の細胞壁のペプチド加水分解の方法であって、ＬｙｔＭの活性型は、２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性の水性環境において、グラム陽性細菌の細胞壁と接触し、活性型ＬｙｔＭは、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１８０−３１６に対応するフラグメントＬｙｔＭ１８０−３１６または配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＬｙｔＭ１８５−３１６に対して少なくとも９５％の同一性を有し、活性型ＬｙｔＭは、連続する少なくとも４つのグリシンでできた基質に対して配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１８５−３１６に対応する触媒ドメインＬｙｔＭ１８５−３１６のグリシルグリシンエンドペプチダーゼの活性を有し、グラム陽性細菌は、スタフィロコッカス属またはミクロコッカス属、または、黄色ブドウ球菌、表面ブドウ球菌、スタフィロコッカス−ロゼウス、スタフィロコッカス−カルノーサス、スタフィロコッカス−ラクティス、スタフィロコッカス−サプロフィティクス、およびミクロコッカス−カゼオリチカス、ミクロコッカス−カンディカンス、ミクロコッカス−ノーシナス、ミクロコッカス−ベルナエを含む群から選択される種に属する細菌であり、接触は、０℃乃至３７℃の範囲で行われることを特徴とする、グラム陽性細菌の細胞壁のペプチド加水分解の方法。
【請求項５】
活性型ＬｙｔＭは、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１８０−３１６に対応するフラグメントＬｙｔＭ１８０−３１６または配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＬｙｔＭ１８５−３１６から選択されることを特徴とする、請求項４に記載のグラム陽性細菌の細胞壁のペプチド加水分解の方法。
【請求項６】
接触は、１０℃より下の温度で行われることを特徴とする、請求項４又は５に記載のグラム陽性細菌の細胞壁のペプチド加水分解の方法。
【請求項７】
グラム陽性細菌に対して、具体的にはスタフィロコッカス属またはミクロコッカス属に対して、静菌剤または殺菌剤として、または表面を殺菌するための、ＬｙｔＭの活性型を含む組成物の使用であって、該組成物は、２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性の水性環境で使用され、ＬｙｔＭの活性型は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１８０−３１６に対応するフラグメントＬｙｔＭ１８０−３１６または配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＬｙｔＭ１８５−３１６に対して少なくとも９５％の同一性を有し、活性型ＬｙｔＭは、連続する少なくとも４つのグリシンでできた基質に対して配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１８５−３１６に対応する触媒ドメインＬｙｔＭ１８５−３１６のグリシルグリシンエンドペプチダーゼの活性を有し、組成物は、１０℃より下の温度で使用されることを特徴とする、組成物の使用。
【請求項８】
ＬｙｔＭの活性型は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１８０−３１６に対応するＬｙｔＭまたは配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＬｙｔＭ１８５−３１６から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
食品産業における静菌剤または殺菌剤としてのＬｙｔＭの活性型の使用であって、  静菌剤または殺菌剤は、ヒトおよび動物性の食品に対する添加剤として、または表面を浄化するために使用されることを特徴とする、請求項７又は８に記載の使用。
【請求項１０】
医療、獣医、診断における、及び／又は化粧品産業における、静菌剤または殺菌剤としての、ＬｙｔＭの活性型の使用であって、静菌剤または殺菌剤は、医療、獣医、診断において、及び／又は化粧品産業において使用されるツールおよび機器の表面を殺菌するために、または病院および研究室での表面を殺菌するために使用されることを特徴とする、請求項７又は８に記載の使用。
【請求項１１】
２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性の反応条件で、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、グリコペプチド、脂質、細胞要素および有用な代謝物を含むグラム陽性細菌から細胞成分を分離するための、ＬｙｔＭの活性型の使用であって、ＬｙｔＭの活性型は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１８０−３１６に対応するフラグメントＬｙｔＭ１８０−３１６または配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＬｙｔＭ１８５−３１６に対して少なくとも９５％の同一性を有し、活性型ＬｙｔＭは、連続する少なくとも４つのグリシンでできた基質に対して配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１８５−３１６に対応する触媒ドメインＬｙｔＭ１８５−３１６のグリシルグリシンエンドペプチダーゼの活性を有し、細胞成分の分離は、１０℃より下の温度で実行される、ことを特徴とする、ＬｙｔＭの活性型の使用。
【請求項１２】
ＬｙｔＭの活性型は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１８０−３１６に対応するＬｙｔＭまたは配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＬｙｔＭ１８５−３１６から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
グラム陽性細菌は、スタフィロコッカス属またはミクロコッカス属、または、黄色ブドウ球菌、表面ブドウ球菌、スタフィロコッカス−ロゼウス、スタフィロコッカス−カルノーサス、スタフィロコッカス−ラクティス、スタフィロコッカス−サプロフィティクス、およびミクロコッカス−カゼオリチカス、ミクロコッカス−カンディカンス、ミクロコッカス−ノーシナス、ミクロコッカス−ベルナエを含む群から選択される種に属する細菌であることを特徴とする、請求項１１又は１２に記載の使用。
【請求項１４】
２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性の反応条件での、グラム陽性細菌、好ましくはスタフィロコッカス属またはミクロコッカス属に属する細菌の診断における、ＬｙｔＭの活性型の使用であって、ＬｙｔＭの活性型は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１８０−３１６に対応するフラグメントＬｙｔＭ１８０−３１６または配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＬｙｔＭ１８５−３１６に対して少なくとも９５％の同一性を有し、活性型ＬｙｔＭは、連続する少なくとも４つのグリシンでできた基質に対して配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１８５−３１６に対応する触媒ドメインＬｙｔＭ１８５−３１６のグリシルグリシンエンドペプチダーゼの活性を有し、ＬｙｔＭの活性型は、１０℃より下の温度で使用される、ことを特徴とする、ＬｙｔＭの活性型の使用。
【請求項１５】
ＬｙｔＭの活性型は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１８０−３１６に対応するＬｙｔＭまたは配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＬｙｔＭ１８５−３１６から選択されることを特徴とする、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
グラム陽性細菌に曝された表面を含浸する又はコーティングするための、ＬｙｔＭの活性型の使用であって、ＬｙｔＭの活性型は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１８０−３１６に対応するフラグメントＬｙｔＭ１８０−３１６または配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＬｙｔＭ１８５−３１６に対して少なくとも９５％の同一性を有し、活性型ＬｙｔＭは、連続する少なくとも４つのグリシンでできた基質に対して配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１８５−３１６に対応する触媒ドメインＬｙｔＭ１８５−３１６のグリシルグリシンエンドペプチダーゼの活性を有し、前記ＬｙｔＭの活性型が表面の含浸として又はコーティングとして使用される条件は、２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性を有していることであり、ＬｙｔＭの活性型は、１０℃より下の温度で使用されることを特徴とする、ＬｙｔＭの活性型の使用。
【請求項１７】
ＬｙｔＭの活性型は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１８０−３１６に対応するＬｙｔＭまたは配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＬｙｔＭ１８５−３１６から選択されることを特徴とする、請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
タンパク質基質からのタグの開裂のための、ＬｙｔＭの活性型の使用であって、該開裂は、連続する少なくとも４つ以上のグリシンを含む配列のタンパク質基質の位置にあり、０℃乃至３７℃の範囲で、２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性において行われ、ＬｙｔＭの活性型は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１８０−３１６に対応するフラグメントＬｙｔＭ１８０−３１６または配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＬｙｔＭ１８５−３１６に対して少なくとも９５％の同一性を有し、活性型ＬｙｔＭは、連続する少なくとも４つのグリシンでできた基質に対して配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１８５−３１６に対応する触媒ドメインＬｙｔＭ１８５−３１６のグリシルグリシンエンドペプチダーゼの活性を有することを特徴とする、ＬｙｔＭの活性型の使用。
【請求項１９】
ＬｙｔＭの活性型は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１８０−３１６に対応するＬｙｔＭまたは配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＬｙｔＭ１８５−３１６から選択されることを特徴とする、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
タンパク質基質が融合タンパク質であることを特徴とする、請求項１８又は１９に記載のＬｙｔＭの活性型の使用。
【請求項２１】
ＬｙｔＭの活性型は、１０℃より下の温度で使用されることを特徴とする、請求項１８乃至２０のいずれか１つに記載のＬｙｔＭの活性型の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド加水分解の方法およびグラム陽性細菌の細胞壁を開裂することができるペプチダーゼ、静菌剤および殺菌剤（例えば溶菌剤）としての使用のための組成物およびその使用、グラム陽性細菌を溶解するためのキット、および黄色ブドウ球菌（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）からのＬｙｔＭの活性型またはその誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブドウ球菌、とりわけ黄色ブドウ球菌によって引き起こされた感染は、急速に現れる薬物耐性が原因で、処置するのがますます難しくなっている。この理由で、ブドウ球菌感染と戦い、とりわけ医師の中で伝染媒体を除去するために新しい治療法を開発することだけでなく、病院を含む環境からこの細菌を除去する、より効率的な方法を計画することも今まで以上に重要である。１つのこのような新しい手法は、溶菌酵素を使用する、細菌細胞の溶菌である。
【０００３】
スタフィロコッカス、例えば黄色ブドウ球菌のペプチドグリカンにおいて固有のペンタグリシン架橋を開裂する、およびそれ故、潜在的な抗ブドウ球菌薬剤としての対象である、リソスタフィンおよびＬｙｔＭなどの、ペプチドグリカンヒドロラーゼが知られている。
【０００４】
リソスタフィンの生物学的な役割は十分確立される。リソスタフィンは、スタフィロコッカス−シミュランスのビオヴァル−スタフィロリティカス（ｂｉｏｖａｒ ｓｔａｐｈｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）によって分泌されたバクテリオシンである。成熟したタンパク質は、産生細菌（ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｏｒｇａｎｉｓｍ）に対して不活性であるが、黄色ブドウ球菌の細胞壁を開裂するのに非常に有効である。成熟したリソスタフィンは、約３７−４０℃の温度、ｐＨ７．５で最適な活性を有するモノマータンパク質であり、９．５の等電点ｐＩを有する（Ｂｒｏｗｄｅｒ Ｈ． Ｐ． ｅｔ ａｌ．， １９６５， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １９：３８３−３８９およびＩｖｅｒｓｅｎ Ｏ． ｅｔ ａｌ．， １９７３， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ３８：２９３−３００）。リソスタフィンは、人工表面上で黄色ブドウ球菌および表面ブドウ球菌（Ｓ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）のバイオフィルムを妨害するために使用されてきたが、カテーテルに対するコーティングとしても試験されてきた。マウスのモデルにおいて、リソスタフィンは、カテーテルが挿入された頚静脈から黄色ブドウ球菌のバイオフィルムを根絶するために、および全身感染の処置のためにも使用されてきた。コトンラットのモデルにおいて、リソスタフィンのクリームは、黄色ブドウ球菌の鼻腔内コロニー形成を根絶するのに有効であることが証明された。ヒトにおいて、リソスタフィンは、メチシリン耐性の黄色ブドウ球菌の大動脈弁心内膜炎を処置するために、実験ベースで使用されてきた。
【０００５】
スタフィロコッカス、とりわけ黄色ブドウ球菌は、中毒症状につながる耐熱性のペプチドエンテロトキシンが原因で、しばしば食中毒を引き起こしかねないことが知られている。大規模な食糧生産が原因で、食物の微生物学的特性を改善するためにブドウ球菌細胞を破壊する酵素の使用は、このような酵素が容易に利用可能で、低コストである場合のみ可能である。その上、食品産業において使用されるスタフィロリティカスの酵素（ｓｔａｐｈｙｌｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ）は、広範囲の温度で、とりわけ食品貯蔵の低温のレジームにおいて、および生産プロセス中に有効であるはずであり、加えて生産のパイプラインおよび他の表面から細菌を取り除くために使用される、薄塩濃度で、即ち、水においてそれらの活性を維持するのに有効であるはずである。市場で利用可能なリソスタフィンは、このような需要を満たしていない。
【０００６】
細菌細胞の溶菌の既知の方法、または具体的な細菌酵素によって細胞壁構造の分解を必要とする細菌細胞壁を破壊する既知の方法がある。これは、それらの細胞壁の特定の構造のためにグラム陽性細菌には特に当てはまる。例えば、リソスタフィンは、黄色ブドウ球菌細胞を溶解するために使用される。既知の細胞溶解の方法では、反応が生理学的条件に類似した条件で行われ、約３０−３７℃の高温で実行される必要がある。このような条件では、タンパク質または核酸などの、分離した細胞成分は、放出された酵素によって分解され得、その活性は、生理学的条件において通常最も高い。効果的な細胞溶解が、低濃度の塩または広範囲の温度、とりわけ低温などの、非生理学的条件において行われるのであれば、このような分解は回避され得る。グラム陽性細菌から、例えば、スタフィロコッカス属から、原形質体、酵素、タンパク質、細胞成分または核酸を分離するために使用される、リソスタフィンを含有しているキットが知られている。
【０００７】
ＬｙｔＭは、黄色ブドウ球菌によって生成された自己分解素である。黄色ブドウ球菌からのＬｙｔＭの遺伝子は、クローン化され、配列された（Ｒａｍａｄｕｒａｉ Ｌ． ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７９：３６２５−３１）。タンパク質は、シグナルペプチド（ＬｙｔＭ１−２５）と合成され、その後、リソスタフィンのＮ末端ドメインとの類似性がないＮ末端ドメインと合成される。ＬｙｔＭのＣ末端ドメインは、閉塞領域、およびリソスタフィンの触媒ドメインとの高い類似点を有する領域に分けられ得る。ＬｙｔＭ構造の分析は、活性部位が閉塞されるために全長のＬｙｔＭが有意な活性を有することができない一方で、触媒ドメイン単独が、全長のタンパク質よりも活性であるべきことを示唆している。グラム陽性細菌の細胞壁は、ペプチドグリカンのペプチド間の架橋に存在するアミノ酸の数および形態が異なることが知られている。グリシルグリシンエンドペプチダーゼは、それらが開裂するペプチド間の架橋において特定数のグリシンを必要とし得る。ＬｙｔＭ１８５−３１６が、テトラグリシンおよびペンタグリシンを開裂するが、トリグリシン（Ｆｉｒｃｚｕｋ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ３５４：５７８−５９０， Ｏｄｉｎｔｓｏｖ Ｓ． Ｇ． ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３５：７７５−８）を開裂しないことが示されている。
【０００８】
Ｂａｒｄｅｌａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００９， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ４１８：６１５−６２４）は、ＬｙｔＭが、ペプチドグリカンまたはペプチドだけでなくタンパク質も開裂することができることを示した。
【０００９】
組換えタンパク質は、ほとんどの場合、それらの続く精製を単純化する付属のタグ（ペプチドまたはタンパク質）との融合タンパク質として生成される。しかしながら、精製後、このようなタグの存在は望ましくない。それ故、具体的なプロテアーゼを使用して、このようなタグを開裂する必要がある。このような酵素は、非常に効果的でなければならないだけでなく、タンパク質の望ましくない開裂を回避するために高度に特異的でなければならない。最も一般に使用されるプロテアーゼは、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ， ＰｒｅＳｃｉｓｉｏｎおよびＴＥＶプロテアーゼである。それらは、かなり高価であり、増加した伝導性の生理学的条件および３０−４０℃の温度範囲でのみ効果的に作用する。このような条件では、精製されたタンパク質は、サンプル中に存在するプロテアーゼの分解活性に曝され、残存量においてさえ、タンパク質の完全性に対する有害作用を有しているかもしれない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
記載される最先端技術の観点から、本発明の目的は、示される欠点を克服すること、およびグラム陽性細菌、とりわけ黄色ブドウ球菌に対して活性なグリシルグリシンエンドペプチダーゼ活性を有する溶菌酵素を送達することであり、これは、効果的に生成され、安定しており、基質に対する高特異性および生産され薄塩濃度の非生理学的な条件下で高活性を提供し、また低温を含む広範囲の温度で効果的となる。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、細菌細胞の溶解における分子生物学、および融合タンパク質からタグおよびタンパク質を開裂するなど、タンパク質の調製に有用な新しいツールを提供することである。
【００１２】
発明者は、黄色ブドウ球菌（ＬｙｔＭ）からの自己溶解素、とりわけ、触媒ドメインに対応するフラグメントの安定した且つ活性な形態が、示される欠点を克服し、グラム陽性細菌、とりわけ生理学的条件（特に低い伝導性、薄塩濃度）とは著しく異なる環境下で黄色ブドウ球菌の細胞壁を効果的に分解することができ、低温および高温を含む広範囲の温度にわたって効果的であることを思いがけず発見した。
【００１３】
本発明の本質は、広範囲の温度にわたって、１０ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性の条件で、好ましくは２ｍＳ／ｃｍより下の伝導性の条件でペプチド基質を開裂するために、ＬｙｔＭタンパク質またはその誘導体の安定した形態を使用することが可能であるという事実に基づいている。
【００１４】
この記載によると、用語「ＬｙｔＭの活性型」は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または触媒ドメインＬｙｔＭ１８５−３１６の特徴的なグリシルグリシンエンドペプチダーゼ活性を保持する残基１８５から残基３１６までの黄色ブドウ球菌のタンパク質ＬｙｔＭのアミノ酸配列との同一性または高い相同性を有する配列の、組換えのタンパク質、ポリペプチド、ペプチドを指す。ＬｙｔＭの好ましい活性型は、トリプシンによって全長のＬｙｔＭから開裂したフラグメントＬｙｔＭ１８０−３１６であり、より好ましくはＬｙｔＭ１８５−３１６またはその誘導体である。ＬｙｔＭの活性型は、基質に対してグリシルグリシンエンドペプチダーゼの活性を有しており、それは連続する（ｉｎ ａ ｒｏｗ）少なくとも４つのグリシンでできている。ＬｙｔＭの活性型は、グラム陽性細菌のペプチドグリカンにおけるペプチド間の架橋に対する加水分解活性を実証している。ポリペプチドのアミノ酸配列、または結果的にアミノ酸配列の変化をもたらすそのようなポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列のいくつかの変化が、ポリペプチドの活性に影響を及ぼさないことは明白である。
【００１５】
触媒ドメインである、用語「ＬｙｔＭの活性型の誘導体」または「ＬｙｔＭ１８５−３１６の誘導体」は、ＬｙｔＭまたはＬｙｔＭ１８５−３１６の活性型の配列との同一性または高度な相同性を有するアミノ酸配列のポリペプチドを指し、そのために、コード配列は、活性型の誘導体の活性が変更されない方法で、置換、欠失、挿入によって変更されてきた。
【００１６】
用語「高度に相同性のある配列」は、配列が、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％相同性であることを意味する。
【００１７】
この記載によると、ＬｙｔＭの活性型のための「ペプチド基質」または「タンパク質基質」は、連続する少なくとも４つのグリシンからできた又はそれらを含む、ペプチドまたはポリペプチドまたはタンパク質として理解されるべきであり、これらは、ＬｙｔＭの活性型によって認識され開裂される。とりわけ、連続する少なくとも４つ以上のグリシンでできたグラム陽性細菌ペプチドグリカンにおけるグリシン架橋は、ＬｙｔＭの活性型のためのペプチド基質である。ペプチド基質またはタンパク質基質は、リンカー領域に連続する少なくとも４つのグリシンを含む融合タンパク質であり得る。
【００１８】
ペプチド間の架橋に連続する少なくとも４つのグリシンを有するグラム陽性細菌は、他の属：黄色ブドウ球菌、表面ブドウ球菌、スタフィロコッカス−ロゼウス（Ｓ． ｒｏｓｅｕｓ）、スタフィロコッカス−カルノーサス（Ｓ． ｃａｒｎｏｓｕｓ）、スタフィロコッカス−ラクティス（Ｓ． ｌａｃｔｉｓ）、スタフィロコッカス−サプロフィティクス（Ｓ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、およびミクロコッカス−カゼオリチカス（Ｍ． ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ミクロコッカス−カンディカンス（Ｍ．ｃａｎｄｉｄａｎｓ）、ミクロコッカス−ノーシナス（Ｍ．ｎａｕｃｉｎｕｓ）、ミクロコッカス−ベルナエ（Ｍ．ｖｅｒｎａｅ）などの、ミクロコッカス属の中でもとりわけ、スタフィロコッカス属に属する。
【００１９】
第１の態様では、本発明は、とりわけグラム陽性細菌の細胞壁の、ペプチド加水分解の方法を提供し、ここで、ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体は、１０ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性、より好ましくは２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性の水性環境において、ペプチド基質、好ましくはグラム陽性細菌の細胞壁と接触する。ＬｙｔＭの好ましい活性型は、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２のポリペプチドＬｙｔＭ１８５−３１６またはその誘導体である。ペプチド加水分解の好ましい方法では、約０℃乃至約４５℃の範囲、より好ましくは約０℃乃至約３７℃の範囲、とりわけ１０℃より下の温度で、接触は行われる。その上に、反応のｐＨは、好ましくは、約６乃至約９の範囲、とりわけ約７乃至約９の範囲である。好ましくは、グラム陽性細菌は、スタフィロコッカス属またはミクロコッカス属、より好ましくは、黄色ブドウ球菌、表面ブドウ球菌、スタフィロコッカス−ロゼウス、スタフィロコッカス−カルノーサス、スタフィロコッカス−ラクティス、スタフィロコッカス−サプロフィティクス、およびミクロコッカス−カゼオリチカス、ミクロコッカス−カンディカンス、ミクロコッカス−ノーシナス、ミクロコッカス−ベルナエの種に属する細菌である。
【００２０】
第２の態様では、本発明は、とりわけグラム陽性細菌に対する、具体的にはスタフィロコッカス属またはミクロコッカス属に対する、静菌剤または殺菌剤（例えば溶菌剤）としての使用のための組成物を特に提供し、組成物は、ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体を含み、１０ｍＳ／ｃｍ未満、好ましくは２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性の水性環境で使用するためのものである。好ましい組成物では、ＬｙｔＭの活性型は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリペプチドＬｙｔＭ１８５−３１６、またはその誘導体である。好ましい組成物は、表面を殺菌するために使用されるものであり、好ましくは、液体、エマルジョン、ゲル、噴霧剤、ローション剤またはウェットワイプの形態である。組成物は、適切な担体、防腐剤、香料、バッファー、および細菌を除去するのに有用な他の成分、とりわけ界面活性剤、溶媒、抗生物質、およびバクテリオシンを補足されるかもしれない。
【００２１】
第３の態様では、本発明はまた、とりわけグラム陽性細菌に対する、具体的にはスタフィロコッカス属またはミクロコッカス属に対する、静菌剤または殺菌剤として、またはそれらに対して表面を殺菌するための、ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体を含む組成物の使用を提供し、このような組成物は、１０ｍＳ／ｃｍ未満、好ましくは２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性の水性環境で使用される。組成物の好ましい使用では、ＬｙｔＭの活性型は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリペプチドＬｙｔＭ１８５−３１６、またはその誘導体である。
【００２２】
本発明はまた、１０ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性の水性環境においてグラム陽性細菌の細胞壁を開裂することができるペプチダーゼに関する。ペプチダーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列またはその誘導体を含み、ペプチド基質に対する、とりわけグラム陽性細菌のペプチドグリカンにおいて少なくとも４つのグリシンでできたペプチド間の架橋に対する活性を実証する。好ましいペプチダーゼは、２ｍＳ／ｃｍより下の伝導性の反応条件で活性である。その上、好ましいペプチダーゼは、約０℃乃至約４５℃の範囲、より好ましくは約０℃乃至約３７℃の範囲、とりわけ１０℃より下の温度で活性である。
【００２３】
本発明はまた、食品産業における静菌剤または殺菌剤としての、ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体の使用を提供し、静菌剤または殺菌剤は、１０ｍＳ／ｃｍ未満、好ましくは２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性の反応条件で使用される。ＬｙｔＭの好ましい活性型は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリペプチドＬｙｔＭ１８５−３１６、またはその誘導体である。静菌剤または殺菌剤は、好ましくは、ヒトまたは動物性の食品に対する添加剤として、または具体的にはスタフィロコッカス属またはミクロコッカス属に属する、とりわけグラム陽性細菌に対して、表面を浄化するために使用される。
【００２４】
次の態様では、本発明は、医療、獣医、および診断における、静菌剤または殺菌剤としての、ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体の使用を提供し、静菌剤または殺菌剤は、１０ｍＳ／ｃｍ未満、好ましくは２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性の反応条件で使用される。ＬｙｔＭの好ましい活性型は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリペプチドＬｙｔＭ１８５−３１６、またはその誘導体である。静菌剤または殺菌剤は、好ましくは、とりわけスタフィロコッカス属またはミクロコッカス属に属する、とりわけグラム陽性細菌に対して、医療、獣医、および診断において使用されるツールおよび機器、具体的には病院および研究室における表面を殺菌するために使用される。
【００２５】
また別の態様では、本発明は、１０ｍＳ／ｃｍ未満、好ましくは２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性の反応条件で、グラム陽性細菌から細胞成分を分離するために、ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体の使用を提供する。ＬｙｔＭの好ましい活性型は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリペプチドＬｙｔＭ１８５−３１６、またはその誘導体である。細胞成分の分離は、約０℃乃至約４５℃の範囲、好ましくは０℃乃至３７℃の範囲、より好ましくは１０℃より下の温度で、とりわけスタフィロコッカス属またはミクロコッカス属に属する細菌から、とりわけ黄色ブドウ球菌、表面ブドウ球菌、スタフィロコッカス−ロゼウス、スタフィロコッカス−カルノーサス、スタフィロコッカス−ラクティス、スタフィロコッカス−サプロフィティクス、およびミクロコッカス−カゼオリチカス、ミクロコッカス−カンディカンス、ミクロコッカス−ノーシナス、ミクロコッカス−ベルナエの属まで、好ましくは実行される。
【００２６】
本発明はまた、１０ｍＳ／ｃｍ未満、好ましくは２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性の反応条件で、グラム陽性細菌、とりわけスタフィロコッカス属またはミクロコッカス属に属する細菌の診断における、ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体の使用を提供し、ＬｙｔＭの好ましい活性型は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリペプチドＬｙｔＭ１８５−３１６、またはその誘導体である。
【００２７】
別の態様では、本発明は、グラム陽性細菌に曝された表面を含浸する又はコーティングするために、ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体の使用を提供し、ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体が表面の含浸として又はコーティングとして使用される条件は、１０ｍＳ／ｃｍ未満、好ましくは２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性を有していることである。ＬｙｔＭのこのような好ましい活性型は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリペプチドＬｙｔＭ１８５−３１６、またはその誘導体である。
【００２８】
本発明はまた、ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体を含むグラム陽性細菌の溶解のためのキットを提供し、ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体は、１０ｍＳ／ｃｍ未満、好ましくは２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性の環境で使用される。ＬｙｔＭのこのような好ましい活性型は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリペプチドＬｙｔＭ１８５−３１６、またはその誘導体である。細菌細胞の溶解は、グラム陽性細菌から細胞成分、とりわけＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、グリコペプチド、脂質、細胞要素および有用な代謝物を分離するために実行される。
【００２９】
ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体は、タンパク質基質、好ましくは融合タンパク質からのタグの酵素開裂によってタンパク質を調製する方法において使用されている。融合タンパク質は、タンパク質のコード配列が、タグをコード化する配列に関連付けられる、導入された／操作された核酸から発現系において生成された組換えタンパク質である。リンカー配列は、組換えの融合タンパク質からタグから開裂するために使用される具体的なプロテアーゼのための認識配列をコード化するように設計されている。ＬｙｔＭの活性型が、タグから開裂するために使用されるときに、ペプチドのリンカーは、連続する少なくとも４つ以上のグリシンを含有していなければならない。
【００３０】
次の態様では、本発明は、融合タンパク質であるタンパク質基質からタグの酵素開裂によってタンパク質を調製する方法を提供し、前記方法は、以下の工程を含む：融合タンパク質は、タンパク質をコード化する配列を、連続する少なくとも４つ以上のグリシンを有するリンカーをコード化する配列と関連付けることによって形成され、次の工程では、ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体によって融合タンパク質を開裂する。ＬｙｔＭの好ましい活性型は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のＬｙｔＭ１８５−３１６、またはその誘導体である。方法の第２の工程は、好ましくは、１０ｍＳ／ｃｍ未満、好ましくは２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性で、及び／又は約０℃乃至約４５℃の範囲、より好ましくは０℃乃至３７℃の範囲、とりわけ１０℃より下の温度で実行される。
【００３１】
本発明はまた、開裂が、連続する少なくとも４つ以上のグリシンを含むタンパク質基質のリンカー領域にある、タンパク質基質から、好ましくは融合タンパク質からの、タグまたはタンパク質の開裂のためのＬｙｔＭの活性型またはその誘導体の使用を提供する。
好ましくは、ＬｙｔＭの活性型は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のＬｙｔＭ１８５−３１６、またはその誘導体である。好ましくは、開裂は、１０ｍＳ／ｃｍ未満、好ましくは２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性で、及び／又は約０℃乃至約４５℃の範囲、より好ましくは０℃乃至３７℃の範囲、とりわけ１０℃より下の温度で実行される。
【００３２】
ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体は、医療、獣医または診断において静菌剤または殺菌剤（例えば溶菌剤）として使用されるかもしれない。ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体は、１０ｍＳ／ｃｍ未満、好ましくは２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性の反応条件下で、好ましくは使用される。ＬｙｔＭの好ましい活性型は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のＬｙｔＭ１８５−３１６、またはその誘導体である。ＬｙｔＭの活性型を含む静菌剤または殺菌剤は、好ましくはスタフィロコッカス属またはミクロコッカス属に属するグラム陽性細菌に対して使用される。このような静菌剤または殺菌剤は、医療、獣医、および診断において使用されるツールおよび機器の表面、病院および研究室での表面を殺菌するのに、および細菌によって汚染され得る表面上の界面活性剤として有用である。このような薬剤は、単独で、または細菌を除去するために使用される他の成分、とりわけ、界面活性剤、溶媒、抗生物質、バクテリオシンまたは他の酵素と組み合わせて使用され得る。薬剤は、組み合わされて使用されるが、このような組成物は、適切な担体、安定剤、バッファーまたは他の添加剤をさらに含んでもよい。ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体は、液体、エマルション、ゲル、噴霧剤、ローション剤、ウェットワイプなどの形態で、静菌剤または殺菌剤として使用され得る。
【００３３】
ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体は、好ましくはスタフィロコッカス属またはミクロコッカス属に属する、グラム陽性細菌の特定の属、具体的には、黄色ブドウ球菌、表面ブドウ球菌、スタフィロコッカス−ロゼウス、スタフィロコッカス−カルノーサス、スタフィロコッカス−ラクティス、スタフィロコッカス−サプロフィティクスの他に、ミクロコッカス−カゼオリチカス、ミクロコッカス−カンディカンス、ミクロコッカス−ノーシナス、ミクロコッカス−ベルナエなどの属の診断のための成分として使用される。ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体は、１０ｍＳ／ｃｍ未満、より好ましくは２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性の条件下で、好ましくは使用される。ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体は、細菌の種または株の直接的な診断のために、細菌の具体的なペプチド加水分解を実行するためのツールとして、および例えば、ＰＣＲ、核酸ハイブリッド形成、免疫学的方法および免疫蛍光検査法の方法、ＥＬＩＳＡ、および酵素アッセイまたは他の方法などの、細胞成分に基づいた方法などによる、さらなる診断のための予備的な細胞溶解の段階で使用され得る。
【００３４】
ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体は、グラム陽性細菌の細胞壁を殺菌するための、例えば、１０ｍＳ／ｃｍ未満、好ましくは２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性の反応条件下で、グラム陽性細菌の細胞から成分を分離するためのツールとして使用される。ＬｙｔＭの好ましい活性型は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のＬｙｔＭ１８５−３１６、またはその誘導体である。細胞成分の分離は、約０℃乃至約４５℃の範囲、好ましくは０℃乃至３７℃の範囲、とりわけ１０℃より下の温度で実行され得る。ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体は、スタフィロコッカス属またはミクロコッカス属、具体的には、黄色ブドウ球菌、表面ブドウ球菌、スタフィロコッカス−ロゼウス、スタフィロコッカス−カルノーサス、スタフィロコッカス−ラクティス、スタフィロコッカス−サプロフィティクスの他に、ミクロコッカス−カゼオリチカス、ミクロコッカス−カンディカンス、ミクロコッカス−ノーシナス、ミクロコッカス−ベルナエなどの属の細胞から成分を分離するために、好ましくは使用される。細菌を溶解するための細菌細胞壁の分解は、界面活性剤、または他の酵素などの、細胞壁の構造を弱める他の因子を加えることによって援助され得る。細胞壁の分解はまた、原形質体を放出し、細菌細胞の形質転換を可能にし、核酸、タンパク質、ペプチドの他に、長鎖の炭水化物などの有用な代謝物を分離するために実行され得る。
【００３５】
ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体は、とりわけＬｙｔＭ１８５−３１６またはその誘導体は、それ故、グラム陽性の細菌細胞壁を殺菌するように、例えば、１０ｍＳ／ｃｍ未満、好ましくは２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性の反応条件下で、グラム陽性細菌の細胞成分を分離するように意図されたキットにおいて使用される。このようなキットはまた、本発明によって包含される。
【００３６】
ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体は、食品産業において静菌剤または殺菌剤として使用される。ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体は、１０ｍＳ／ｃｍ未満、好ましくは２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性の反応条件下で、好ましくは使用される。ＬｙｔＭの好ましい活性型は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリペプチドＬｙｔＭ１８５−３１６、またはその誘導体である。ＬｙｔＭの活性型を含む静菌剤または殺菌剤は、好ましくはスタフィロコッカス属またはミクロコッカス属に属するグラム陽性細菌に対して使用される。このような静菌剤または殺菌剤は、食物に接触する表面、とりわけ、食品産業において使用されるツールおよび機器の他に、食物または中間産物に接触する部屋を殺菌するために、ヒトまたは動物性の食品に対する添加剤として使用される。ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体は、とりわけ、酪農（ｄａｉｒｙ）産業および酪農製品において使用される。
【００３７】
ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体は、グラム陽性細菌に曝された表面を含浸する又はコーティングするために使用され、それが含浸またはコーティングとして使用される環境は、１０ｍＳ／ｃｍ未満、好ましくは２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性を有している。ＬｙｔＭの好ましい活性型は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリペプチドＬｙｔＭ１８５−３１６、またはその誘導体である。ＬｙｔＭの活性型は、ポリマー、コポリマーのような担体、またはナノボールまたはナノチューブ、例えばカーボンナノチューブなどのナノ担体と共役し得るか又はそれらに加えられ得る。コーティングまたは含浸された表面は、様々な表面、例えば、部屋、ツール、機械、器具、医療用具、診断機器、実験室用機器に関係し得る。ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体を含む層によって含浸またはコーティングされたこのような表面は、グラム陽性細菌に対する静菌剤または殺菌剤として長時間作用する。
【００３８】
ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体は、化粧品産業において静菌剤または殺菌剤として使用される。ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体は、１０ｍＳ／ｃｍ未満、好ましくは２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性の反応条件下で、好ましくは使用される。ＬｙｔＭの好ましい活性型は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリペプチドＬｙｔＭ１８５−３１６、またはその誘導体である。ＬｙｔＭの活性型を含む静菌剤または殺菌剤は、好ましくはスタフィロコッカス属またはミクロコッカス属に属するグラム陽性細菌に対して使用される。このような静菌剤または殺菌剤は、その微生物学的特性を改善する化粧品に対する添加剤として、または液体、クリーム剤、エマルジョンおよびローション剤に対する添加剤として、または表面を殺菌するための又は化粧品産業において使用されるツールおよび機器のような、様々な器具の表面を殺菌するための薬剤として使用されている。
【００３９】
ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体は、連続する少なくとも４つ以上のグリシンの配列に対して非常に高い特異性を有するペプチダーゼである。ＬｙｔＭによって認識された配列は、タンパク質においては非常にまれである。その上、ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体によって行われた開裂は、約０℃乃至約４５℃の広範囲の温度にわたって、より好ましくは０℃乃至３７℃の範囲で、とりわけ１０℃より下の低温で、１０ｍＳ／ｃｍ未満またはさらに２ｍＳ／ｃｍより下などの低い伝導性の条件で非常に効果的である。それ故、ＬｙｔＭは、他のプロテアーゼの活性が抑えられる条件でさえ、タンパク質基質からタンパク質を開裂することができる。この利点は、プロテアーゼまたは他の不純物を汚染する分解活性が、著しく減少される又はそれらの活性が無視できる条件下で、ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体を使用することを可能にする。ＬｙｔＭの活性型またはその誘導体は、タンパク質基質、好ましくは融合タンパク質からタンパク質を開裂するために使用され、開裂は、連続する少なくとも４つ以上のグリシンを含む配列のタンパク質基質のリンカーの位置にある。
【００４０】
＜ＬｙｔＭの活性型は、細菌のペプチドグリカンを直接的に認識する＞
特定の成分（例えば、タンパク質、テイコ酸およびリポテイコ酸）を消失した細胞壁の異なる調製に対する、リゾスタフィンおよびＬｙｔＭの親和性、および市販の精製されたペプチドグリカンも、プルダウンアッセイにおいて比較された（図２）。すべての場合において、リソスタフィンは、様々な有効性を備える細胞壁の製剤と結合した（図２Ａ）。ＬｙｔＭ１８５−３１６は、超音波処理された、未精製の細胞壁の抽出物と効率的に結合しなかった。塩及び／又は最終的にいくつかの阻害剤のアクセスを恐らく排除した、細胞壁のさらなる洗浄後、ＬｙｔＭ１８５−３１６は、プルダウンアッセイにおいて効率的に結合された。さらなる精製は、結合に大きな影響を及ぼさなかった。これらの結果は、ＬｙｔＭ１８５−３１６が、細胞壁と直接的に結合し、細胞壁の他の成分よりもむしろペプチドグリカンと相互作用することを示す（図２Ｂ）。
【００４１】
＜ＬｙｔＭの様々なフラグメントの役割およびペプチドグリカンへのＬｙｔＭの結合のための活性部位の完全性の必要性＞
ペプチドグリカン結合におけるＬｙｔＭの様々なフラグメントの役割は、プルダウンアッセイにおいて試験された（図３Ａ）。上清および結合された画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）におけるタンパク質の量は、全長のタンパク質（ＬｙｔＭ２６−３１６）がペプチドグリカンを結合しないことを示して比較された。アラニンへのＺｎ２＋リガンドＡｓｎ１１７の変異は、触媒ドメインの活性中心へのアクセスをブロックしないはずであるが、そのような変化は、ペプチドグリカン結合に対して有意な影響を与えなかった。分離されたＮ末端ドメイン（ＬｙｔＭ２４−１０５）もまた、ペプチドグリカンと結合しなかったが、ＬｙｔＭ（ＬｙｔＭ１８５−３１６）の活性型は、ペプチドグリカンと効果的に結合していた。２つの他のＺｎ２＋リガンドＨ２１０およびＤ２１４が、アラニンに別々に変異させられたときに、タンパク質は、結合する能力を失った。モチーフＨｘＨからアラニンへの第４のＺｎ２＋リガンド、Ｈｉｓ２９３の交換は、結果的に、非可溶性タンパク質（Ｏｄｉｎｔｓｏｖ Ｓ． Ｇ． ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３５：７７５−８５）をもたらし、これはアッセイを妨げた。ＨｘＨモチーフからアラニンへの第１のヒスチジンＨｉｓ２９１の交換は、結果的に、それほど効果的ではなかったが、ペプチドグリカン結合を完全に無効にしなかった。
【００４２】
有効なペプチドグリカン結合のための活性中心の完全性の必要性も、阻害剤の効果を試験にすることによって確認された。イオンキレート剤が、ペプチドグリカンへのＬｙｔＭ１８５−３１６の結合を阻害することが示された（図３Ｂ、レーン１−２）。しかしながら、弱いイオンＺｎ２＋キレート剤、グリシンヒドロキサマート、および他のプロテアーゼ阻害剤は、ペプチドグリカン結合に影響を及ぼさなかった（図３Ｂ、レーン３−６）。結果は、活性中心のアクセス可能性および完全性が、ペプチドグリカン（図３）へのＬｙｔＭタンパク質の活性な結合に必要であることを示す。持続した完全性を備える利用可能な活性中心を有するこのようなＬｙｔＭの活性型の例は、トリプシンによって全長のＬｙｔＭからＮ末端ドメインおよび閉塞領域を開裂することによって生成されたＬｙｔＭ１８０−３１６、および大腸菌において発現された組換えＬｙｔＭ１８５−３１６である。
【００４３】
＜ＬｙｔＭの活性型における細胞壁を標的とするドメイン（ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｔａｒｇｅｎｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）（ＣＷＴ）の欠如＞
リソスタフィンおよびＬｙｔＭ１８５−３１６の両方は、黄色ブドウ球菌ペプチドグリカンにおいてペンタグリシンの相互架橋を結合する。両方のタンパク質は、恐らく少なくとも部分的に活性部位溝における相互作用によってなどで、相互架橋を認識する。リソスタフィンは、特異性を提供する細胞壁を結合する付加的なドメインを有する。全長のＬｙｔＭおよびＬｙｔＭ１８５−３１６は、このようなドメインを欠き、それ故、特にＳｓａＡ（ブドウ球菌の分泌抗原Ａ）に対する観察された高い相同性を考慮すると、全長のタンパク質のＮ末端ドメインが、そのような役割を果たす可能性があった。しかしながら、全長のタンパク質ＬｙｔＭも別々に生成されたＮ−末端ドメインＬｙｔＭ２４−１０５も、ペプチドグリカンを結合しないため、実験はそのような可能性を反証している。
【００４４】
＜ＬｙｔＭの活性型の基質選択性＞
ＬｙｔＭ（ＬｙｔＭ１８５−３１６）の活性型は、精製されたペプチドグリカンをより効果的に結合する一方で、リソスタフィンは、粗抽出物により好適に結合し、これは、リソスタフィンが細胞壁の他の成分も認識することを示唆している。本発明の著者は、ＬｙｔＭの活性型が、ブドウ球菌のペプチドグリカンを直接的に結合し、塩及び／又は阻害剤のアクセスをより効果的に排除し得る、２０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ ｐＨ７．５で洗浄したペプチドグリカンを結合することを示した。
【００４５】
＜細菌プロテアーゼに対するＬｙｔＭの活性型の耐性＞
本発明の著者は、大腸菌において組換えタンパク質として効果的に生成された、ＬｙｔＭ、とりわけＬｙｔＭ１８５−３１６の活性型が、ブドウ球菌のプロテアーゼの存在下で非常に安定していることを示した。
【００４６】
＜ＬｙｔＭの活性型は、黄色ブドウ球菌の生細胞を効果的に溶解する＞
著者は、外部から適用された（ｅｘｔｅｒｎａｌｌｙ ａｐｐｌｉｅｄ）ＬｙｔＭの活性型が、グラム陽性細菌、とりわけ黄色ブドウ球菌の生細胞を、低い伝導性の条件でそれらの細胞壁のペプチド基質を結合および溶解することによって、効果的に溶解することを示した。外部から適用されたＬｙｔＭは、ブドウ球菌の成長を阻害しており、黄色ブドウ球菌細胞の溶菌につながる静菌剤または殺菌剤として作用し、これは、細胞懸濁液の光学密度の変化によってモニタリングされた細胞溶解の実施された試験において証明された。初期の実験は、インビトロでの実験においてテトラグリシンおよびペンタグリシンを消化する、ＬｙｔＭ１８５−３１６の能力のみを示した。細菌の生細胞の溶液に外部から適用されたＬｙｔＭの活性型が、即座に分解されず、黄色ブドウ球菌の生細胞の細胞壁においてペプチド基質を効果的に結合し分解することができることは明白ではなかった。
【００４７】
＜ＬｙｔＭおよびリソスタフィンの活性型の活性は、異なる方法でｐＨに依存する＞
ペプチドグリカンヒドロラーゼの活性は、細胞懸濁液の光学密度の変化のモニタリングによって黄色ブドウ球菌の細胞壁の溶解試験において決定された。光学密度の有意でない減少が、恐らく細胞壁酵素の残余の酵素活性が原因で、酵素が加えられることなく、対照において観察された。それ故、５９５ｎｍでのＯＤのすべての値は、対照の１パーセントとして表わされる。１００％に近い値は低い活性を示す一方で、低いパーセンテージは、酵素の高活性を示している。リソスタフィンおよびＬｙｔＭ１８５−３１６の両方は、約６ｐＨ（５０ｍＭのリン酸緩衝液）でわずかに効果的であったが、約７ｐＨではより効果的であった。ｐＨ７乃至９（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ）のさらなる増加は、リソスタフィンの活性に影響がほとんどなかったが、ＬｙｔＭ１８５−３１６活性の増加に影響を及ぼした（図５）。本発明の著者は、ＬｙｔＭの活性型が、約６乃至約９ｐＨの範囲で、とりわけ約７乃至約９ｐＨの範囲で、効果的に作用することを示した。
【００４８】
＜反応条件の伝導性へのＬｙｔＭの活性型およびリソスタフィンの活性の依存＞
思いがけず、ＬｙｔＭの活性型による細菌の溶解の有効性が、反応緩衝液に略依存することが分かった。例えば、ＬｙｔＭ１８５−３１６の活性は、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌにおけるよりも２０ｍＭのトリス−ＨＣｌにおける方が高く（両方ともｐＨ８．０で）、トリスがｐＨ８．０でグリシンと交換されたときにさらに高かった。しかしながら、グリシンは、異なる組成物のバッファーの存在下で加えられるときに活性を増強しないため、アロステリック活性化剤として作用しない。伝導性への活性の依存性の類似した結果も、異なる組成物のバッファーに関して観察された（図８）。
【００４９】
ＬｙｔＭ１８５−３１６およびリソスタフィンの溶解作用は、明白な方法で、バッファーの伝導性に依存し（図６）；低い伝導性のバッファーでは、リソスタフィンによる黄色ブドウ球菌の細胞壁の分解は、それが間、低い伝導性のバッファーでは最適に作用するが、高い伝導性のバッファーではそれほど効果的ではないＬｙｔＭ１８５−３１６とは対照的に、効果的ではない。
【００５０】
伝導性は、両方のパラメーター、イオンの濃度およびそれらの移動性を反映している。ＬｙｔＭ１８５−３１６活性に対する伝導性の効果は、０から５００ｍＭまでＮａＣｌの濃度を変更することによって、様々なイオン強度の溶液中で試験された。リソスタフィンおよびＬｙｔＭ１８５−３１６の活性は、予測される方法で、イオン強度に依存することが分かったが、この実験における伝導性は、イオン強度により直接的に相互に関連した（図７）。
【００５１】
ＬｙｔＭ（ＬｙｔＭ１８５−３１６）の活性型は、１００ｍＭのＮａＣｌ濃度にほぼ相当する、約１０ｍＳ／ｃｍの伝導性の塩の低濃度を有する溶液中で作用する。ＬｙｔＭ１８５−３１６の好ましい高活性が、再蒸留水中と同様に、典型的な移動性の一価のカチオンおよびアニオンに対して、１５−２０ｍＭのイオンのおよその合計の濃度に対応する、２ｍＳ／ｃｍより下の伝導度の溶液中で示された。
【００５２】
＜ＬｙｔＭの活性型およびリソスタフィンの活性の温度への依存＞
ＬｙｔＭの活性型が、約０℃から約５０℃の広範囲の温度にわたって、とりわけ約０℃から約４５℃の範囲の温度で、好ましくは０℃から３７℃の温度で、より好ましくは０℃から２５℃、とりわけ１０℃より下の温度で、効果的に作用する安定したタンパク質であることが示された。特に驚くべきことは、ＬｙｔＭ１８５−３１６がリソスタフィンより数倍活性である約４℃の温度でのＬｙｔＭの活性型が、高活性であることである。
【００５３】
それ故、参考文献を有する記載において引用される公報はすべて、引用文として含まれている。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
本発明をよりよく理解するために、用途のいくつかの例および図が、ほんの一例として提示された。
【００５５】
【図１】（Ａ）は、全長のＬｙｔＭおよびプリプロリソスタフィン（ｐｒｅｐｒｏｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ）におけるドメインの概略的な組織を示す：ＳＰ−シグナルペプチド、ＮＤ−Ｎ末端ドメイン、ＯＲ−閉塞領域、ＣＤ−触媒ドメイン、ＣＷＴ−細胞壁を標的とするドメイン。アライメントは、触媒ドメインの領域でこれらの２つのタンパク質の有意な類似性を示す。モチーフＨｘ３ＤおよびＨｘＨは、触媒残基を含有している。Ｈｘ３Ｄモチーフぬいおける両方のアミノ酸、ＨｉｓおよびＡｓｐは、ＨｘＨモチーフにおける第２のＨｉｓと同様に、Ｚｎ２＋のリガンドである。ＨｘＨモチーフの第１のＨｉｓは、Ｚｎ２＋の近傍に位置するが、イオンを調整しない。アラニンに変異させられた、示された（太字）残基を有するＬｙｔＭの変異体が試験された。ＨｘＨモチーフの第２のＨｉｓがアラニンに変異させられた変異体は、不溶性が原因で使用することができなかった。（Ｂ）は、用途の例に使用される、リソスタフィン（Ｌｓｓ）、ＬｙｔＭおよびそのフラグメントの概略図を示す。
【図２】図２は、様々な方法で処置された黄色ブドウ球菌の細胞壁を有する、（Ａ）リソスタフィン、（Ｂ）ＬｙｔＭ１８５−３１６および（Ｃ）ＬｙｔＭ２６−３１６のプルダウンアッセイの結果を示す。（１）入力（Ｉｎｐｕｔ）（調節タンパク質）、（２）超音波処理された未精製の細胞壁、（３）洗浄した未精製の細胞壁、（４）ＳＤＳ処置された細胞壁、（５）ＴＣＡ処置された細胞壁、（６）トリプシン処理した細胞壁、（７）精製したペプチドグリカン、（８）市販のペプチドグリカン（Ｆｌｕｋａ）。入力（レーン１）として使用された又はプルダウンされた（ｐｕｌｌｅｄ ｄｏｗｎ）（レーン２−８）タンパク質は、抗ＬｙｔＭ抗体とのウェスタンブロッティングによって視覚化された。
【図３】図３は、黄色ブドウ球菌からの精製されたペプチドグリカンでのプルダウンアッセイの結果を示す。（Ａ）全長のＬｙｔＭおよびその様々なフラグメントは、直接的に（対照、Ｃ）またはペプチドグリカン結合（ＰＧ）および上清（Ｓ）画分へ分離後に、ゲル電気泳動およびクマシー染色を変性することによって分析された。（Ｂ）ＬｙｔＭ１８５−３１６は、様々なプロテアーゼ阻害剤の存在下でペプチドグリカンによってインキュベートされ、プルダウン後のペレット画分は、抗ＬｙｔＭ抗体とのゲル電気泳動およびウェスタンブロッティングを変性することによって分析された。（１）１０ｍＭのＥＤＴＡ、（２）１ｍＭの１，１０−フェナントロリン（ｐｈｅｎａｎｔｒｏｌｉｎｅ）、（３）１０ｍＭのＮ−アセチルグルコサミン（ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｚａｍｉｎｅ）、（４）１０ｍＭのグリシンヒドロキサマート、（５）１ｍＭのＰＭＳＦ、（６）１ｍＭのＥ−６４、（Ｃ）阻害剤のない制御（ｃｏｎｔｒｏｌ）。
【図４】図４は、黄色ブドウ球菌細胞および分泌されたブドウ球菌のプロテアーゼの存在下でのＬｙｔＭ１８５−３１６の活性型の安定性試験の結果を示す。タンパク質ＬｙｔＭ１８５−３１６は、１時間（１ｈ）または４時間（４ｈ）、黄色ブドウ球菌の細胞（（＋）Ｓ．Ａ）によって、または同じ条件ではあるが黄色ブドウ球菌の細胞なし（（−）Ｓ．ａ．）でインキュベートされた。３７℃（０ｈ）でインキュベートされなかった同一量のタンパク質ＬｙｔＭ１８５−３１６は、対照として使用された。インキュベーション後、サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル剤上で電気泳動的に分離され、抗ＬｙｔＭ抗体とのウェスタンブロット・ハイブリッド形成によって視覚化された。
【図５】図５は、それぞれ、ｐＨ７．０（四角形）、８．０（円形）および９．０（三角形）での、５０ｍＭのトリス緩衝液中のリソスタフィン（実線）およびＬｙｔＭ１８５−３１６（点線）の活性を示す。黄色ブドウ球菌細胞は、指数増殖期に集められ、明白な（ａｐｐａｒｅｎｔ）ＯＤ５９５〜１．８に対して試験バッファー中で洗浄され再懸濁された。ＬｙｔＭ１８５−３１６またはリソスタフィンの付加（両方とも１８ｍＭの終末濃度で）は、細胞溶解につながり、これは光散乱を減少させ、それ故明白なＯＤ５９５を減少させた。ＯＤのいくらかの減少も酵素の欠如下で観察されたために、すべてのＯＤ５９５値は、酵素のない対照のパーセントとして表わされた。
【図６】図６は、ＬｙｔＭ１８５−３１６（白の（ｏｐｅｎ）四角形）およびリソスタフィン（黒の（ｃｌｏｓｅｄ）四角形）のインビトロでの溶解作用に対する様々なバッファーの効果を示す。溶解は、以下のバッファー中で行われた：（１）ｄｄ 水、（２）グリシン−ＮａＯＨ、（３）Ｄ，Ｌ−アラニン−ＮａＯＨ、（４）ジグリシン−ＮａＯＨ、（５）ビシン−ＮａＯＨ、（６）トリグリシン−ＮａＯＨ、（７）トリス＝ＨＣｌ、（８）Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ、（９）リン酸緩衝液、（１０）Ｌ−アルギニン−ＨＣｌ、（１１）Ｌ−グルタミン酸−ＮａＯＨ、（１２）ジアミノピメリン酸−ＮａＯＨ。すべてのバッファーは、８．０に調節されたｐＨを有する５０ｍＭであって、データは、６０分の反応後に集められた。バッファーの伝導性は、黄色ブドウ球菌細胞の付加後に室温で測定された。
【図７】図７は、リソスタフィンおよびＬｙｔＭ１８５−３１６の溶解作用に対する反応緩衝液のイオン強度の効果を示す。溶解は、０〜５００ｍＭのＮａＣｌを補足された、２０ｍＭのグリシンバッファー ｐＨ８．０中で、標準的な条件（実施例９ｂ）で行われた。反応の伝導性は、黄色ブドウ球菌細胞の付加後に室温で測定された。提示された結果は、３７℃での溶解反応の６０分後に集められた。
【図８】図８は、リソスタフィンおよびＬｙｔＭ１８５−３１６の溶解作用に対する様々な反応条件の効果を示す。（Ａ）グリシンの効果。溶解実験は、１００Ｍのグリシン−ＮａＯＨ、ｐＨ８．０（Ｇｌｙ）、５０ｍＭのトリス＝ＨＣｌ、ｐＨ８．０、および５０ｍＭのトリス＝ＨＣｌ ｐＨ８．０中の１００ｍＭのグリシン（Ｇｌｙ）中で行われた。（Ｂ）細胞溶解における、モノグリシン（Ｇｌｙ）、ジグリシン（２Ｇｌｙ）およびトリグリシン（３Ｇｌｙ）の効果。バッファーは、ＮａＯＨを使用して、８．０に調節されたｐＨを有する５０ｍＭとして作られた。比較のために、ｄｄ 水中の溶解も確認された。（Ｃ）様々なアミノ酸の効果。Ｄ，Ｌ−アラニン−ＮａＯＨ（Ａｌａ）、Ｌ−アルギニン−ＨＣｌ（Ａｒｇ）、Ｌ−グルタミン酸−ＮａＯＨ（Ｇｌｕ）、（１２）ｐＨ  ８．０のジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）−ＮａＯＨが試験された。溶解実験は、実施例８に記載されるように行われた。
【図９】図９は、様々な温度におけるＬｙｔＭ（ＬｙｔＭ１８５−３１６）の活性型およびリソスタフィン（Ｌｓｓ）の活性の比較を示す。結果は、黄色ブドウ球菌の細胞懸濁液の最初のＯＤのパーセント（％ＯＤ６００）として示される。結果は、４℃、２３℃および３７℃の温度において各酵素にとって最適なバッファー中で６０分間行われた反応に関して得られた。
【図１０】図１０は、様々な温度でのＬｙｔＭの活性型の活性を示す。結果は、黄色ブドウ球菌の細胞懸濁液の最初のＯＤのパーセント（％ＯＤ６００）として示される。結果は、それぞれ、０、４、１０、１５、２３、３７および４５℃の温度において各酵素にとって最適なバッファー中で６０分間行われた反応に関して得られた。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
下記の実施例は、本発明を例証する且つその特定の態様を説明するためだけに提示され、本発明を限定するためには提示されず、それ故、添付の請求項で定義される、その全体の範囲と確認されるべきではない。
【実施例】
【００５７】
＜実施例１＞
＜ＬｙｔＭタンパク質の様々な形態の生成＞
ＬｙｔＭ２４−１０５、ＬｙｔＭ１８５−３１６およびＬｙｔＭ２６−３１６のタンパク質に対応するＤＮＡのフラグメントを、以前に記載された全長のＬｙｔＭクローン（Ｏｄｉｎｔｓｏｖ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３５：７７５−７８５）からＰＣＲによって増幅し、ｐＥＴ１５ｍｏｄベクトルに挿入し、それぞれ、ｐＥＴ１５ｍｏｄＬｙｔＭ２４−１０５、ｐＥＴ１５ｍｏｄＬｙｔＭ１８５−３１６、ｐＥＴ１５ｍｏｄＬｙｔＭ２６−３１６と呼んだヒスチジンのタグを、ＬｙｔＭフラグメントのためにコード化された構成物のＮ末端部分へ融合した。続く配列ＭＧＨＨＨＨＨＨＥＦのＨｉｓｔａｇは、ＬｙｔＭ１８５−３１６のコード配列に先行した。ＬｙｔＭ２４−１０５、ＬｙｔＭ１８５−３１６  ｉ  ＬｙｔＭ２６−３１６の可溶型を、Ｏｄｉｎｔｓｏｖ Ｓ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３５：７７５−７８５においてＬｙｔＭ１８５−３１６に関して記載される方法で、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）中で構成物を発現させることによって得た。タンパク質発現を、細菌増殖（０．８のＯＤ５９５）の対数増殖期中に、１ｍＭのＩＰＴＧの付加によって誘発し、２５℃で４時間継続した。組換えタンパク質を、Ｎｉ２＋負荷（ｌｏａｄｅｄ）の、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）アガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ）上の親和性クロマトグラフィーによって精製し、製造業者の記載に従った、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上のゲル濾過が続いた。以下に提示される実施例において、安定した、Ｈｉｓｔａｇを有する活性型ＬｙｔＭ１８５−３１６を使用したが、Ｈｉｓｔａｇを有するまたは有さない活性型ＬｙｔＭの結合および活性に違いは観察されなかった。
【００５８】
点変異体Ｎ１１７Ａ、Ｈ２１０Ａ、Ｄ２１４Ａ、Ｈ２９１Ａ、Ｈ２９３Ａを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅキットを使用して、ＰＣＲに基づいた突然変異生成によって作り出した。すべての変異体を、ベクトルｐＥＴ１５ｍｏｄＬｙｔＭ１８５−３１６上で生成した。変異したタンパク質の発現および精製は、タンパク質ＬｙｔＭ１８５−３１６に対するものと同じであった。提示された実施例で使用されるリソスタフィン（成熟した形態）を、Ｓｉｇｍａから購入し、さらなる精製なしで使用した。
【００５９】
＜実施例２＞
＜ポリクローナル抗体−ＬｙｔＭ１８５−３１６抗体の生成＞
ＬｙｔＭ１８５−３１６に対するポリクローナル抗体を、ラビット（Ｐｉｎｅｄａ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）において育てた。抗体精製を、製造業者の指示に従って、ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に結合されたＬｙｔＭ１８５−３１６タンパク質に対する親和性によって行った。洗浄後、抗体を、１００ｍＭのグリシン ｐＨ２．７によって溶出した。溶出剤のｐＨを、２Ｍのトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０の１／１０の容積を加えることによってすぐに中和した。溶出剤中の抗体の濃度を、ＯＤ２８０での吸収に基づいて推測した。
【００６０】
＜実施例３＞
＜黄色ブドウ球菌からの細胞壁のフラグメントおよびペプチドグリカンの生成＞
３７℃でＣＡＳＯ培養液の培地において成長した黄色ブドウ球菌の後期の対数期の培養物を、遠心分離によって採取し、バッファーＡ（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５）中で再懸濁し、２０分間オートクレーブ滅菌した。粗抽出物を、３分間細胞を超音波処理した後に得た。付属のウォールポリマー（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｗａｌｌ ｐｏｌｙｍｅｒｓ）を、下記の方法によって取り除いた：
−  ＳＤＳ処置した壁を、３０分間４％のＳＤＳ中で沸騰させた、
−  トリプシン処理した壁を、３７℃で８時間のトリプシン消化（０．５ｍｇ／ｍｌ）によって調製した。
−  トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）処置を、４℃での１０％のＴＣＡ中の４８時間のインキュベーションによって行った。
−  精製されたペプチドグリカンを、上に記載されるすべての方法を組み合わせることによって、以前にＯｄｉｎｔｓｏｖ Ｓ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３５：７７５−７８５に記載されたように調製した。
これらの処置の各々の後に、細胞壁を、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５中で広範囲に洗浄した。
【００６１】
＜実施例４＞
＜プルダウンアッセイにおけるペプチドグリカンへのＬｙｔＭおよびリソスタフィンの様々な形態の結合＞
結合を評価するために、実施例１において生成された２μｇのタンパク質およびリソスタフィン（Ｓｉｇｍａ）を、細胞壁または実施例３において生成されたペプチドグリカン（１００μｇ）および市販の精製されたペプチドグリカン（Ｆｌｕｋａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ，７７１４０）と混合し、１５分間室温でインキュベートした。その後、可溶性および不溶性の画分を、遠心分離によって分離し、ペプチドグリカンを、バッファー ２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌによって洗浄した。可溶性画分および洗浄したペプチドグリカンを、ローディングバッファーと混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離したタンパク質を、セミドライ式転写によってＥＣＬ細胞膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上に転写し、その後、実施例２において生成されたＬｙｔＭ１８５−３１６タンパク質に対する０．５μｇ／ｍｌの精製された抗体によってインキュベートした。ヤギ抗ラビットのペルオキシダーゼ共役の第２抗体（Ｓｉｇｍａ）を、製造業者の推奨に従って、ウェスタンブロットのルミノール試薬（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して検出した。リソスタフィンも抗体によって認識した。結果を図２に示す。ＬｙｔＭ（ＬｙｔＭ１８５−３１６）の活性型は、リソスタフィンより細胞壁の異なる成分を認識する。即ち、リソスタフィンおよび活性型ＬｙｔＭ１８５−３１６の親和性が、細胞壁の様々な製剤とプルダウンアッセイにおいて比較され、該細胞壁から、ペプチドグリカンとは別に、異なる成分を取り除いた（図２）。
【００６２】
細胞壁を、未精製で使用する（レーン２）か、または２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５における追加の洗浄工程（レーン３）、脂質成分を取り除くはずのＳＤＳ処置（レーン４）、テイコイル酸を取り除くと考えられるＴＣＡ処置（レーン５）、細胞壁からタンパク質成分を取り除くと予想することができる、トリプシン処置（レーン６）に晒した。プルダウンアッセイもまた、ＳＤＳ、ＴＣＡ、およびトリプシン処置の組み合わせによって未精製の細胞壁の製剤から得た、「精製された」ペプチドグリカンとともに（レーン７）、および商業的供給源（Ｆｌｕｋａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ）からの精製されたペプチドグリカンとともに（レーン８）行った。すべての場合において、リソスタフィンは、異なる有効性を有するにもかかわらず、細胞壁の製剤に結合した。
【００６３】
得た結果は、恐らく黄色ブドウ球菌の細胞壁のリソスタフィンと非ペプチドグリカンの成分との間の相互作用が原因で、粗抽出物へのリソスタフィンの結合が、最も効果的であったことを示す（図２Ａ）。対照的に、ＬｙｔＭ１８５−３１６は、追加の洗浄なしで超音波処理された抽出物によって効果的に結合されなかった。しかしながら、プルダウンアッセイ前に、細胞壁が追加の洗浄工程に晒されたときに、ＬｙｔＭ１８５−３１６は効果的に結合された。２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５で洗浄することによるこの精製は、反応条件下で塩濃度を減少させ得るが、潜在的な阻害要素が超音波処理された細胞壁から取り除かれた可能性はある。さらなる精製は、プルダウンアッセイの結果に対する効果はほとんどなかった。それ故、著者は、活性型ＬｙｔＭ１８５−３１６が、細胞壁の他の成分よりもむしろ、主としてペプチドグリカンと相互作用することを示した（図２Ｂ）。（予測されるシグナルペプチド、ＬｙｔＭ２６−３１６のない）全長のＬｙｔＭは、ペプチドグリカン製剤のいずれかによって効果的にプルダウンされなかった。微量のタンパク質が、いくつかの場合においてプルダウンの画分で検出され得るが、ペプチドグリカン純度が増加する系統的傾向は観察されなかった（図２Ｃ）ため、この効果は特異的ではなかった。
【００６４】
＜実施例５＞
＜ＬｙｔＭの様々なフラグメントを有する精製された黄色ブドウ球菌のペプチドグリカンのプルダウンアッセイ＞
ＬｙｔＭの様々なフラグメントの結合を評価するために、実施例１において生成された２μｇのタンパク質を、実施例３において生成された、精製されたペプチドグリカンと混合し、１５分間室温でインキュベートした。その後、可溶性および不溶性の画分を、遠心分離によって分離した、ペプチドグリカンを、１ｍｌのバッファーＡ（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５；５０ｍＭのＮａＣｌ）によって洗浄した。可溶性分画（Ｓ）および洗浄したペプチドグリカン（ＰＧ）を、試験されたＬｙｔＭフラグメントである対照（Ｃ）の存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離したローディングバッファーと混合した。
【００６５】
サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、標準のプロトコルに従ってクマシーによって染色した。結果を図３Ａに示す。結果は、全長のＬｙｔＭ（ＬｙｔＭ２６−３１６）が酵素ＬｙｔＭ２４−１０５の分離したＮ末端ドメインと同様に、精製されたペプチドグリカンを結合しないことを示す。唯一の効果的な結合は、ＬｙｔＭ（ＬｙｔＭ１８５−３１６）の活性型に関して観察され得た。ペプチドグリカンに対する親和性も、変異体ＬｙｔＭ２６−３１６ Ｎ１１７ＡおよびＬｙｔＭ１８５−３１６ Ｈ２１０Ａ、Ｄ２１４Ａ、Ｈ２９１Ａに関して試験したが、これらの変異体は、ペプチドグリカンに非常に弱く結合するか、あるいは完全に結合する能力を失った。結果は、ペプチドグリカンの効果的な結合のために、活性中心の持続した完全性を有するＬｙｔＭの活性型が必要とされることを示す。
【００６６】
＜実施例６＞
＜プロテアーゼ阻害剤が存在下でのＬｙｔＭの活性型のプルダウンアッセイ＞
試験を実施例４でのように行ったが、ペプチドグリカン結合に対するプロテアーゼ阻害剤の効果を確認するために、タンパク質ＬｙｔＭ１８５−３１６を、終末濃度での様々な阻害剤の存在下で、精製されたペプチドグリカンによってインキュベートした：（１）１０ｍＭのＥＤＴＡ、（２）１ｍＭの１，１０−フェナントロリン、（３）１０ｍＭのＮ‐アセチルグルコサミン、（４）１０ｍＭのグリシンヒドロキサマート、（５）１ｍＭのＰＭＳＦおよび（６）１ｍＭのＥ−６４ システインプロテアーゼ阻害剤（トランス−エポキシスクシニル−Ｌ−ロイシルアミド（４−グアニジノ）ブタン）、（Ｃ）阻害剤のない制御。結果を図３Ｂに示す。得た結果は、金属イオンキレート剤、ＥＤＴＡおよび１，１０−フェナントロリンが、ペプチドグリカンへの活性型ＬｙｔＭ１８５−３１６の結合に効果がある（図３Ｂ、レーン１−２）一方で、グリシンヒドロキサマートおよびプロテアーゼ阻害剤のような、Ｚｎ２＋イオンの弱いキレート剤が、ペプチドグリカン結合に対する効果がなかった（図３Ｂ、レーン３−６）ことを示す。
【００６７】
＜実施例７＞
＜細菌プロテアーゼの存在下でのＬｙｔＭの活性型の安定性＞
実施例１で得た３μｇのＬｙｔＭ１８５−３１６を、３７℃で１時間および４時間、黄色ブドウ球菌の〜１０６の細胞によってインキュベートした。３７℃でインキュベートしていないＬｙｔＭ１８５−３１６を、対照として使用した。インキュベーション後、サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、実施例４に記載される方法に従う、サンプル２で得た抗体とのウェスタンブロット・ハイブリッド形成が続いた。得た結果を図４に示す。検出されたバンドは、ＬｙｔＭ１８５−３１６に相当する。より低いバンドがすべてのサンプルの中に存在し、その強度はそれらの間に違いはない。バンドは対照において検出されるため、その存在は黄色ブドウ球菌細胞の存在が原因で、ＬｙｔＭ１８５−３１６の分解に起因しない。それ故、著者は、黄色ブドウ球菌細胞の存在下で活性型ＬｙｔＭ１８５−３１６の高い安定性を示した。
【００６８】
＜実施例８＞
＜細胞懸濁液の光学密度の変化によって測定されるような細胞壁溶解アッセイ（混濁除去のアッセイ（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ａｓｓａｙ））＞
ａ）ＬｙｔＭの活性型およびリソスタフィンの効力に対するｐＨの効果
振とうしながら３７℃でＣＡＳＯ培地上で成長した黄色ブドウ球菌細胞を、対数期に採取し、２００μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを補足された約１．８のＯＤ５９５に対する、５０ｍＭのトリス ｐＨ７．０または５０ｍＭのトリス ｐＨ８．０または５０ｍＭのトリス ｐＨ９．０の試験バッファー中で洗浄し、懸濁した。実施例１で得たＬｙｔＭ１８５−３１６およびリソスタフィン（Ｓｉｇｍａ）を、１８ｎＭの終末濃度まで加え、２００μｌの反応混合物を、マイクロタイタープレートに移動した。プレートを、５分ごとに２秒間振とうしながら、３７℃でインキュベートした。懸濁液のＯＤを、インキュベーションの０、２０、４０、６０、９０および１２０分後に５９５ｎｍで測定した。酵素のない対照においてＯＤがいくらか減少したことが観察されたため、図５でのすべての値は、酵素のない対照のパーセントとして示される。約７乃至約９の範囲のｐＨ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ）の増加は、リソスタフィン活性にほとんど効果がなかったが、ＬｙｔＭ１８５−３１６の活性を増強したことが実証された。
【００６９】
ｂ）ＬｙｔＭの活性型およびリソスタフィンの効力に対するバッファー条件（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）の効果。
ａ）溶解反応を、（Ａ）１００ｍＭのグリシン−ＮａＯＨ ｐＨ８．０，５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０および５０ｍＭのトリス ＨＣｌ ｐＨ８．０中の１００ｍＭのグリシンのバッファー中の反応に対するグリシンの効果を確認するために、（Ｂ）ＮａＯＨでの８．０に調節されたｐＨでの５０ｍＭのバッファー中および蒸留水中の細胞溶解に対するモノグリシン、ジグリシンおよびトリグリシンの効果を確認するために、（Ｃ）様々なアミノ酸：５０ｍＭのＬ−アルギニン−ＨＣｌ、Ｄ，Ｌ−アラニン−ＮａＯＨ、Ｌ−アルギニン−ＨＣｌ、Ｌ−グルタミン酸−ＮａＯＨ、ジアミノピメリン酸−ＮａＯＨ（すべてｐＨ８．０）の効果を確認するために行ったことを例外として、実験を行った。得た結果を図８に示す。すべての試験したバッファーは異なる組成物のバッファーであったが、８．０の同じｐＨであった。
【００７０】
グリシンバッファーは、最も好ましいことが分かった。それ故、グリシン単独が、他のバッファーに対する添加剤としてＬｙｔＭを活性化するかどうかを確認した。結果は、グリシンにそのような効果がないことを示している。ＬｙｔＭの活性型が、２つのグリシン間のペプチド結合を断つことを考慮して、ジグリシンおよびトリグリシンが、モノグリシンと同じ効果を有するか否かも確認した。結果はそれを否認した。ＬｙｔＭの活性型の活性が、モノグリシンを含有しているバッファーにおいて最も高く、ＬｙｔＭ基質とは関連していないことが示された。ＬｙｔＭ１８５−３１６の高活性も、再蒸留水で観察された。ＬｙｔＭ１８５−３１６の活性に対するいくつかの他のアミノ酸の効果も試験した。活性は、アミノ酸の試験した溶液によって変化したが、それらはどれも、グリシンバッファーにおけるほど高くはなかった。バッファーと酵素活性との間の関連性を明らかにするために、反応緩衝液の物理化学的特徴およびここで記載される酵素の活性を、実施例９において試験した。
【００７１】
＜実施例９＞
＜ＬｙｔＭおよびリソスタフィンの反応条件、および溶解作用の効果＞
ａ）様々なバッファーの効果
振とうしながら３７℃でＣＡＳＯ培地上で成長した黄色ブドウ球菌細胞を、対数期に遠心分離によって採取し、８．０に設定されたｐＨで５０ｍＭのバッファー中、または２００μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを補足された再蒸留水中で洗浄し、懸濁した。細胞を、１．８のＯＤ５９５に対して試験したバッファー中で希釈した。実施例１で得たＬｙｔＭ１８５−３１６およびリソスタフィン（Ｓｉｇｍａ）を、１８ｎＭの終末濃度まで加え、２００μｌの反応混合物を、マイクロタイタープレートに移動した。プレートを、５分ごとに２秒間振とうしながら、３７℃でインキュベートした。試験の最初に、適切なバッファーまたは水中で懸濁された細胞の伝導性を、伝導度計ＭｅｔｅＬａｂ ＣＤＭ２３０（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ， Ｆｒａｎｃｅ）を使用して測定した。伝導度測定を、黄色ブドウ球菌細胞の付加後に室温で行った。懸濁液のＯＤを、反応の６０分後に５９５ｎｍの波長で測定した。溶解作用を、対照ＯＤ５９５（反応に対するのと同じであるが、酵素が加えられていないサンプル）のパーセントとして示す。生細胞上でエリスロマイシンを加えることなく同じ反応は終了した。各実験を、４つの類似（ｐａｒａｌｌｅｌｅｓ）とともに２回行った。結果を図６に示す。同じ結果を、エリスロマイシンを補足した及びエリスロマイシンのないサンプルのために得た。ＬｙｔＭ（ＬｙｔＭ１８５−３１６）の活性型が、低い伝導性のバッファーに非常に効果的である一方で、低い伝導性の条件でのリソスタフィンによる黄色ブドウ球菌の細胞壁の分解が僅かであることが思いがけず分かった。
【００７２】
ＬｙｔＭの活性型の活性は、２ｍＳ／ｃｍより下の伝導性の反応条件において、および１ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性の条件においてさえ特に高かった。ＬｙｔＭ１８５−３１は、再蒸留水では効果的に作用するが、リソスタフィン活性は、そのような条件ではほとんど検出できなかった。
【００７３】
ｂ）バッファーのイオン強度の効果
ａ）溶解反応を、０乃至５００ｍＭのＮａＣｌを補足した、２０ｍＭのグリシンバッファー ｐＨ８．０中で行ったことを例外として、部分的に実験を行った。伝導度測定の結果を図７に示す。著者は、リソスタフィンとは対照的に、ＬｙｔＭ（ＬｙｔＭ１８５−３１６）の活性型が、とりわけ１０ｍＳ／ｃｍ未満、好ましくは５ｍＳ／ｃｍ未満、より好ましくは２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導性の反応条件下で、低い伝導性のバッファー中で効果的であることを示した。
【００７４】
＜実施例１０＞
＜ＬｙｔＭ（ＬｙｔＭ１８５−３１６）の活性型およびリソスタフィン（Ｌｓｓ）の効力に対する温度の効果＞
振とうしながら３７℃でＣＡＳＯ培地上で成長した黄色ブドウ球菌細胞を、対数期に遠心分離によって採取し、ＬｙｔＭに対して５０ｍＭのグリシンバッファー ｐＨ７．５中で、およびリソスタフィンに対して１５０ｍＭのＮａＣｌを補足した同じバッファー中で、ＯＤ５９５での１．８の最終的な光学密度まで懸濁した。実施例１で得たＬｙｔＭ１８５−３１６およびリソスタフィン（Ｓｉｇｍａ）を、通用した、１８ｎＭ（等しいモル量）の終末濃度まで加え、２００μｌの反応混合物を、６０分間試験した温度でインキュベートした。その後、光学密度の変化を、ＯＤ５９５で測定した。図９および図１０に示される結果を、黄色ブドウ球菌の細胞懸濁液の最初のＯＤのパーセントとして示す。ＬｙｔＭ（ＬｙｔＭ１８５−３１６）の活性型は、０℃乃至４５℃までの広範囲の温度にわたって細菌を溶解していた。４℃で、ＬｙｔＭ１８５−３１６は、リソスタフィンよりも４倍以上活性である。
【００７５】
配列のリスト：
−  ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１は、黄色ブドウ球菌からの全長のＬｙｔＭのアミノ酸配列に相当する。
−  ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２は、黄色ブドウ球菌からのＬｙｔＭ１８５−３１６のアミノ酸配列に相当する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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