(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の末端部分のアミノ酸配列である末端アミノ酸配列に基づいて該タンパク質を同定するためのタンパク質同定方法であって、
a)既知である種々のタンパク質と各タンパク質の少なくとも末端アミノ酸配列とが対応付けられた情報を利用して、調査対象として与えられた目的末端アミノ酸配列に該当するタンパク質を検索しタンパク質候補として抽出する同定候補抽出ステップと、
b)該同定候補抽出ステップにおいて抽出されたタンパク質候補が一つである場合に、該候補を前記目的末端アミノ酸配列に対応するタンパク質同定結果として決定する同定結果決定ステップと、
c)前記同定候補抽出ステップにおいて抽出されたタンパク質候補が複数である場合に、その複数のタンパク質候補の末端アミノ酸配列を参照して前記目的末端アミノ酸配列にさらに付加し得るアミノ酸残基を決定し、該アミノ酸残基を前記目的末端アミノ酸配列に付加して作成される末端アミノ酸配列を持つタンパク質が一つに絞られるか否かを、その作成される末端アミノ酸配列毎に調べることによって、どの程度までアミノ酸配列長を延ばしたときにタンパク質が一意に同定可能となるかを予測する同定可能性予測ステップと、
を有することを特徴とするタンパク質同定方法。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質同定方法であって、
前記同定可能性予測ステップは、前記目的末端アミノ酸配列にアミノ酸残基を付加して作成する末端アミノ酸配列の配列長の上限値に達してもタンパク質が一意に同定できない場合に、末端アミノ酸配列からタンパク質の同定が不可であると結論付けることを特徴とするタンパク質同定方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のタンパク質同定方法であって、
既知であるタンパク質のアミノ酸配列情報に基づいて、タンパク質の末端部分の所定長のアミノ酸配列を抽出し、該末端アミノ酸配列とそれに該当するタンパク質とを対応付けて収録した末端配列データベースを構築する末端配列データベース構築ステップをさらに有し、前記同定候補抽出ステップは、与えられた末端アミノ酸配列を前記末端配列データベースに含まれる末端アミノ酸配列と照合することにより、その与えられた末端アミノ酸配列に該当するタンパク質を検索しタンパク質候補として抽出することを特徴とするタンパク質同定方法。
【請求項４】
タンパク質の末端部分のアミノ酸配列である末端アミノ酸配列に基づいて該タンパク質を同定するためのタンパク質同定装置であって、
a)既知である種々のタンパク質と各タンパク質の少なくとも末端アミノ酸配列とが対応付けられた情報を利用して、調査対象として与えられた目的末端アミノ酸配列に該当するタンパク質を検索しタンパク質候補として抽出する同定候補抽出部と、
b)該同定候補抽出部により抽出されたタンパク質候補が一つである場合に、該候補を前記目的末端アミノ酸配列に対応するタンパク質同定結果として決定する同定結果決定部と、
c)前記同定候補抽出部により抽出されたタンパク質候補が複数である場合に、その複数のタンパク質候補の末端アミノ酸配列を参照して前記目的末端アミノ酸配列にさらに付加し得るアミノ酸残基を決定し、該アミノ酸残基を前記目的末端アミノ酸配列に付加して作成される末端アミノ酸配列を持つタンパク質が一つに絞られるか否かを、その作成される末端アミノ酸配列毎に調べることによって、どの程度までアミノ酸配列長を延ばしたときにタンパク質が一意に同定可能となるかを予測する同定可能性予測部と、
を備えることを特徴とするタンパク質同定装置。
【請求項５】
請求項４に記載のタンパク質同定装置であって、
前記同定可能性予測部は、前記目的末端アミノ酸配列にアミノ酸残基を付加して作成する末端アミノ酸配列の配列長の上限値に達してもタンパク質が一意に同定できない場合に、末端アミノ酸配列からタンパク質の同定が不可であると結論付けることを特徴とするタンパク質同定装置。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のタンパク質同定装置であって、
既知であるタンパク質のアミノ酸配列情報に基づいて、タンパク質の末端部分の所定長のアミノ酸配列を抽出し、該末端配列とそれに該当するタンパク質とを対応付けて収録した末端アミノ酸配列データベースを構築する末端配列データベース構築部をさらに備え、
前記同定候補抽出部は、与えられた末端アミノ酸配列を前記末端配列データベースに含まれる末端アミノ酸配列と照合することにより、その与えられた末端アミノ酸配列に該当するタンパク質を検索しタンパク質候補として抽出することを特徴とするタンパク質同定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、解析対象であるタンパク質由来のペプチド混合物を含む被検試料を質量分析することで得られた質量分析データを用いてペプチドのアミノ酸配列を推定することにより、解析対象のタンパク質を同定する方法及びそのための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、タンパク質を網羅的に解析するプロテオーム解析の手法は広く用いられており、その技術的な進歩には著しいものがある。プロテオーム解析分野において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（マトリクス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析装置）を始めとする質量分析装置を用いたタンパク質の同定手法として、データベース検索法がよく知られている。一般に、データベース検索法では、タンパク質由来のペプチド混合物を含む試料に対しＭＳn分析（ｎは２以上の整数）を行うことで得られたＭＳnスペクトルに現れるピークの質量電荷比情報（場合にはよっては強度情報も）を集めたピークリストと、データベースに登録されているタンパク質より理論的に算出される質量電荷比や実際に実験を行って得られたタンパク質のピークリストなどとを照合し、その一致度を手がかりとしてペプチドのアミノ酸配列を決定し、その結果に基づき元のタンパク質を同定する。
【０００３】
一般に、タンパク質の末端部分は切断や修飾が生じていることが多く、末端部分のアミノ酸配列を正確に決定することは、タンパク質を研究するうえで非常に重要である。ところが、上述したような一般的な手法では、タンパク質末端部分（特にＣ末端）のアミノ酸配列は検出されにくく、その解析が困難である場合がよくある。これに対し、従来より、タンパク質末端部分のアミノ酸配列解析のための様々な手法が開発又は提案されている。
【０００４】
例えば非特許文献１には、Ｎ末端ペプチドのアミノ酸配列のフラグメント（断片）を、周知のペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）法を用いて、又はマトリクス・サイエンス社が提供しているデータベース検索エンジンであるマスコット（Mascot）などのＭＳ／ＭＳイオンサーチを用いて同定する手法が開示されている。しかしながら、この手法では、対象とする末端アミノ酸配列が使用するデータベースに収録されている場合にしかタンパク質を同定することができず、同定できなかった場合に、分析者は同定不可という以外に何らの有用な情報も得られない。
【０００５】
一方、非特許文献２や特許文献１には、検索しようとしている末端アミノ酸配列がデータベースに収録されていない場合であってもタンパク質を同定することができるように、デノボシーケンシング（De novo sequencing）を利用して末端アミノ酸配列からタンパク質全体のアミノ酸配列を決定する手法が開示されている。
【０００６】
これら文献で共に参照されているのが非特許文献３である。該文献３では、五つの生物種（出芽酵母、大腸菌、枯草菌、生殖器マイコプラズマ、ヒト）の遺伝子配列に対してＮ末端アミノ酸配列及びＣ末端アミノ酸配列の長さと、アミノ酸配列の特異性、つまり一意性とについて調査がなされており、それぞれのアミノ酸配列からタンパク質を一意に同定できるか否かについて、比較的肯定的な見解が導き出されている。即ち、非特許文献３において得られる実験結果に基づく知見は、「或るタンパク質の末端のアミノ酸配列を或る程度の長さまで決定することにより、そのタンパク質を一意に同定可能である」ということであり、非特許文献２や特許文献１に記載の手法も基本的にはこの知見に基づくものであるといえる。
【０００７】
しかしながら、この分野の技術の進展の速度から鑑みると、非特許文献３はかなり古い文献であり、調査対象とされた五つの生物種のうち、その時点でゲノムが決定・公開されていたのは僅か１種（マイコプラズマ）にすぎない。また、それ以外の四つの生物種においては、調査されたタンパク質の数はゲノム全体の遺伝子、つまりタンパク質の数に比べて有意に少ない。このように全ゲノムについて調査が行われていない生物種については、導出された結論の信頼性が必ずしも高いとはいえない。
【０００８】
そこで、本願発明者がヒトの遺伝子配列について調査を行ったところ、ヒトゲノム全体の９０％以上の遺伝子、つまりタンパク質については、タンパク質末端のアミノ酸配列のみによって該タンパク質を一意に同定することが可能であることが判明した。したがって、「或るタンパク質の末端のアミノ酸配列を或る程度の長さまで決定することにより、そのタンパク質を一意に同定可能である」という知見に基づくタンパク質同定手法は、全般的には適切な方法であるといえる。
【０００９】
しかしながら、ヒトゲノム全体の数％程度の遺伝子においては、末端アミノ酸配列がアミノ酸残基２０個以上の長さまで一致しており、質量分析装置によって測定可能な分子量を持つタンパク質のみに絞り込んだとしても、末端アミノ酸配列のみによってタンパク質を一意に同定することは不可能であることも判明した。即ち、上述した従来の経験的知見に基づくタンパク質同定手法が適用できないケースは、それほど多くないものの確実に存在する。
【００１０】
上述した非特許文献２や特許文献１に記載のタンパク質同定方法では、このようなケースが存在することが考慮されておらず、質量分析の結果として得られた末端アミノ酸配列からタンパク質を一意に同定できなかった場合に、もう少し長い配列長の末端アミノ酸配列が判明すれば同定が可能であるのか、或いは質量分析装置による測定で判明し得る配列長の限界まで末端アミノ酸配列が判明したとしても同定ができないのか、について分析者は知ることができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００９−１３２６４９号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】マクドナルド（L. McDonald）、ほか３名、「ポジショナル・プロテオミクス：セレクティブ・リカバリ・アンド・アナリシス・オブ・エヌ-ターミナル・プロテオリティック・ペプタイズ（Positional proteomics: selective recovery and analysis of N-terminal proteolytic peptides）」、ネイチャ・メソッズ（Nature Methods）、2005年12月、Vol. 2、No. 12、pp.955-957
【非特許文献２】九山（H. Kuyama）、ほか６名、「ア・シンプル・アンド・ハイリー・サクセスフル・シー-ターミナル・シーケンス・アナリシス・オブ・プロテインズ・バイ・マス・スペクトロメトリ（A simple and highly successful C-terminal sequence analysis of proteins by mass spectrometry）」、プロテオミクス（Proteomics）、2008年、Vol. 8、pp.1539-1550
【非特許文献３】ウィルキンス（Marc R. Wilkins）、ほか１１名、「プロテイン・アイデンティフィケイション・ウェズ・エヌ・アンド・シー-ターミナル・シーケンス・タグズ・イン・プロテオーム・プロジェクト（Protein Identification with N and C-Terminal Sequence Tags in Proteome Project）」、ジャーナル・オブ・モレキュラ・バイオロジ（Journal of Molecular Biology）、1998年、Vol. 278、pp.599-608
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上述したように、質量分析及びその結果の解析によって判明した末端アミノ酸配列に基づいてタンパク質を同定するための従来の方法ではいずれも、タンパク質を同定できなかった場合に、そのときに与えられた末端アミノ酸配列では、該当する末端を持つ複数の配列が得られ、そのままでは同定が不可である、という結果が得られるだけであって、それ以上の情報、具体的には、そもそも末端アミノ酸配列に基づく同定が可能なタンパク質であるか否かといった情報さえ得られない。このため、末端アミノ酸配列に基づく同定が不可能なタンパク質であるにもかかわらず、同定できるものと誤った認識をし、末端アミノ酸配列だけで同定と判断してしまうおそれがあった。或いは、逆に、末端アミノ酸配列だけで同定できるケースであるにもかかわらず、それ以外のアミノ酸配列までも調べようとして作業効率を低下させる可能性もあった。
【００１４】
本発明はこうした課題を解決するためになされたものであり、その目的とするところは、与えられた末端アミノ酸配列からタンパク質が一意に同定できない場合でも、その末端アミノ酸配列についてより長い配列を決定することで、同定が可能になるのか否かについての正確な情報を提供することができるタンパク質の同定方法及び同定装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決するために成された本発明に係るタンパク質の同定方法は、タンパク質の末端部分のアミノ酸配列である末端アミノ酸配列に基づいて該タンパク質を同定するためのタンパク質同定方法であって、
a)既知である種々のタンパク質と各タンパク質の少なくとも末端アミノ酸配列とが対応付けられた情報を利用して、調査対象として与えられた目的末端アミノ酸配列に該当するタンパク質を検索しタンパク質候補として抽出する同定候補抽出ステップと、
b)該同定候補抽出ステップにおいて抽出されたタンパク質候補が一つである場合に、該候補を前記目的末端アミノ酸配列に対応するタンパク質同定結果として決定する同定結果決定ステップと、
c)前記同定候補抽出ステップにおいて抽出されたタンパク質候補が複数である場合に、その複数のタンパク質候補の末端アミノ酸配列を参照して前記目的末端アミノ酸配列にさらに付加し得るアミノ酸残基を決定し、該アミノ酸残基を前記目的末端アミノ酸配列に付加して作成される末端アミノ酸配列を持つタンパク質が一つに絞られるか否かを、その作成される末端アミノ酸配列毎に調べることによって、どの程度までアミノ酸配列長を延ばしたときにタンパク質が一意に同定可能となるかを予測する同定可能性予測ステップと、
を有することを特徴としている。
【００１６】
また上記課題を解決するために成された本発明に係るタンパク質の同定装置は、上記発明に係るタンパク質の同定方法を具現化するための装置であり、タンパク質の末端部分のアミノ酸配列である末端アミノ酸配列に基づいて該タンパク質を同定するためのタンパク質同定装置であって、
a)既知である種々のタンパク質と各タンパク質の少なくとも末端アミノ酸配列とが対応付けられた情報を利用して、調査対象として与えられた目的末端アミノ酸配列に該当するタンパク質を検索しタンパク質候補として抽出する同定候補抽出部と、
b)該同定候補抽出部により抽出されたタンパク質候補が一つである場合に、該候補を前記目的末端アミノ酸配列に対応するタンパク質同定結果として決定する同定結果決定部と、
c)前記同定候補抽出部により抽出されたタンパク質候補が複数である場合に、その複数のタンパク質候補の末端アミノ酸配列を参照して前記目的末端アミノ酸配列にさらに付加し得るアミノ酸残基を決定し、該アミノ酸残基を前記目的末端アミノ酸配列に付加して作成される末端アミノ酸配列を持つタンパク質が一つに絞られるか否かを、その作成される末端アミノ酸配列毎に調べることによって、どの程度までアミノ酸配列長を延ばしたときにタンパク質が一意に同定可能となるかを予測する同定可能性予測部と、
を備えることを特徴としている。
【００１７】
本発明に係るタンパク質の同定方法及び同定装置において、「調査対象として与えられた目的末端アミノ酸配列」は、同定対象であるタンパク質を例えば消化酵素により分解して得られたペプチド混合物を質量分析に供し、その結果得られたマススペクトル（ｎが２以上であるＭＳnスペクトルを含む）に基づいて推定された、ペプチド又はペプチド断片のアミノ酸配列の一つであるものとすることができる。こうしたマススペクトルに基づくペプチド又はペプチド断片のアミノ酸配列の推定には、既知の手法、例えばペプチドマスフィンガープリンティング、ペプチドフラグメントフィンガープリンティング、ＭＳ／ＭＳイオンサーチなどを用いればよい。
【００１８】
具体的には例えば、末端アミノ酸配列であると思われるものを分析者が選択して、それを目的末端アミノ酸配列として指定又は入力するようにすればよい。また、分析者による手作業に依らずに、実測のマススペクトルに基づくデータベース検索などによって抽出された複数（通常多数）のタンパク質候補が持つ末端アミノ酸配列の中で、実測マススペクトルから求まるペプチド又はペプチド断片のアミノ酸配列に合致するものを目的末端アミノ酸配列として自動的に選択して設定するようにしてもよい。また、目的末端アミノ酸配列は必ずしも被検試料を質量分析した結果に基づき導き出されたものでなくてもよく、例えば、分析者が任意のアミノ酸配列を末端部分に持つタンパク質を調べたいときに、そのアミノ酸配列を目的末端アミノ酸配列として入力すればよい。
【００１９】
本発明に係るタンパク質同定方法を実施する同定装置においては、調査対象である目的末端アミノ酸配列が設定されると、同定候補抽出部が、既知である種々のタンパク質と各タンパク質の少なくとも末端アミノ酸配列とが対応付けられた情報を利用し、目的末端アミノ酸配列を末端部分に有するタンパク質を検索する。そして、該当する全てのタンパク質をタンパク質候補として抽出する。このとき、抽出されたタンパク質候補が一つしかなければ、その候補が正しいタンパク質である可能性が高い。そこで、同定結果決定部はその唯一の候補を目的末端アミノ酸配列に対応するタンパク質同定結果として決定し、例えば表示部に表示する。
【００２０】
これに対し、抽出されたタンパク質候補が複数ある場合には、設定された目的末端アミノ酸配列ではタンパク質を一意に同定できない。そこで、この場合、同定可能性予測部が、その目的末端アミノ酸配列からさらにどの程度の数のアミノ酸残基まで判明すればタンパク質が一意に同定可能となるかを調べる。そのために、まず同定可能性予測部は、抽出された複数のタンパク質候補の末端アミノ酸配列を参照して、目的末端アミノ酸配列にさらに付加し得るアミノ酸残基を決定する。これは、目的末端アミノ酸配列にさらに付加し得るアミノ酸残基は、抽出された複数のタンパク質候補の末端アミノ酸配列に含まれている筈であるからである。
【００２１】
例えば目的末端アミノ酸配列にさらに或る１個のアミノ酸残基を付加したときに、抽出された複数のタンパク質候補の中で或る１個のタンパク質のみが該当するとすれば、その１個のアミノ酸残基が付加された目的末端アミノ酸配列でタンパク質を一意に同定できるといえる。目的末端アミノ酸配列に付加し得るアミノ酸残基が複数種存在する場合には、同定可能性予測部は、その全てのアミノ酸残基について同様の判定を行い、仮にアミノ酸残基を付加しても未だタンパク質を一意に同定できない場合には、さらにアミノ酸残基を付加してアミノ酸配列長を延ばす。そうして、付加し得る全てのアミノ酸残基についてタンパク質を一意に同定可能である状態になったならば、例えばそのときの最大のアミノ酸残基付加個数、つまりはアミノ酸配列長の最大の延長長さを求める。これは、その時点で設定されている目的末端アミノ酸配列ではタンパク質を一意に同定できないものの、あとどれだけのアミノ酸残基を実験等により決定すればタンパク質を一意に同定可能となるのか、を示す重要な情報であるから、その結果を例えば表示部に表示し分析者に知らせる。これにより、例えば分析者が指定した目的末端アミノ酸配列ではタンパク質を一意に同定できない場合であっても、タンパク質を同定するうえで有用な情報を分析者に提供することができる。
【００２２】
理論的には、タンパク質が一意に同定できるようになるまで何個でもアミノ酸残基を付加していくことが可能であるものの、実際には、質量分析の結果から予測可能であるペプチドのアミノ酸配列長は質量分析の質量精度により制約を受ける。即ち、実質的に質量分析の結果から求まらないような長いアミノ酸配列長でタンパク質が一意に同定可能であるとの結論が得られても、分析者にはあまり意味がない。
【００２３】
そこで、本発明に係るタンパク質の同定方法において、好ましくは、同定可能性予測ステップは、前記目的末端アミノ酸配列にアミノ酸残基を付加して作成する末端アミノ酸配列の配列長の上限値に達してもタンパク質が一意に同定できない場合に、末端アミノ酸配列からタンパク質の同定が不可であると結論付けるようにするとよい。これにより、実質的に有用な情報を分析者に提供できないにもかかわらず、データ処理に無駄な時間を費やすことを回避することができる。
【００２４】
また、同定候補抽出ステップにて参照される「既知である種々のタンパク質と各タンパク質の少なくとも末端アミノ酸配列とが対応付けられた情報」は、タンパク質とそのアミノ酸配列の全てとが対応付けられたタンパク質データベースであってもよいが、そうしたデータベースは規模が非常に大きくなり、目的末端アミノ酸配列やこれにアミノ酸残基を付加した末端アミノ酸配列を持つタンパク質を検索するのに時間が掛かってしまうことが避けられない。ここでは、各タンパク質のアミノ酸配列全長は不要であり、或る程度の長さの末端部分のアミノ酸配列さえタンパク質に対応付けて収録されていれば十分である。
【００２５】
そこで、本発明に係るタンパク質の同定方法では、既知であるタンパク質のアミノ酸配列情報に基づいて、タンパク質の末端部分の所定長のアミノ酸配列を抽出し、該末端アミノ酸配列とそれに該当するタンパク質とを対応付けて収録した末端配列データベースを構築する末端配列データベース構築ステップをさらに有し、
前記同定候補抽出ステップは、与えられた末端アミノ酸配列を前記末端配列データベースに含まれる末端アミノ酸配列と照合することにより、その与えられた末端アミノ酸配列に該当するタンパク質を検索しタンパク質候補として抽出するようにするとよい。
【００２６】
これにより、該当するタンパク質を迅速に探索することが可能となり、タンパク質同定のためのデータ処理に要する時間を短縮することができる。なお、末端配列データベースは同定実行前の適宜の時点で予め作成しておくようにしてもよいし、或いは、同定を実行する際にその最初に作成するようにしてもよい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明に係るタンパク質の同定方法及び同定装置によれば、例えば質量分析の結果から判明した末端アミノ酸配列に基づいて、その末端アミノ酸配列を末端部分に持つタンパク質を一意に同定することができない場合であっても、さらに何個のアミノ酸残基が判明すればタンパク質を一意に同定することが可能になるのか、或いは、末端アミノ酸配列だけではタンパク質を一意に同定することができないのか、といった、タンパク質を同定するうえで有用な情報を分析者に供することが可能となる。例えば、そうした情報に基づいて分析者は、タンパク質を同定するうえでの今後の実験方針を定めることができるようになる。
【００２８】
また、例えばユニプロット（UniProt）などのような代表的な生物種のプロテオームを収録しているデータベースの場合、同一の遺伝子から生成される異なったタンパク質のアミノ酸配列、即ち、スプライシング・バリアント（splicing variant）が収録されている場合もある。そうしたデータベースを用いる又はそうしたデータベースから末端配列データベースを作成することで、スプライシング・バリアントによって末端アミノ酸配列に差異が存在するような場合でも、従来は困難であったバリアントまで特定したタンパク質の同定が可能となる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明に係るタンパク質の同定方法を実施するための装置の一実施例であるタンパク質同定システムの全体構成図。
【図２】本実施例のタンパク質同定システムにおけるタンパク質同定の手順を示すフローチャート。
【図３】指定された末端アミノ酸配列例（ａ）とこれに対してデータベースから抽出されたタンパク質のアミノ酸配列の一例（ｂ）を示す図。
【図４】図３（ａ）に示した末端アミノ酸配列に基づいてタンパク質同定のための配列予測を実行する際の説明図。
【図５】本発明の変形例であるタンパク質同定システムの全体構成図。
【図６】本発明の変形例であるタンパク質同定システムの全体構成図。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明に係るタンパク質の同定方法を実施するタンパク質同定装置の一実施例について、添付図面を参照して説明する。図１は本実施例のタンパク質同定システムの全体構成図、図２は本システムにおけるタンパク質同定処理手順を示すフローチャートである。
【００３１】
本実施例のタンパク質同定システムは、質量分析計１と、スペクトルデータ収集部２と、アミノ酸配列推定部３と、タンパク質データベース７と、同定処理部４と、表示部５と、入力部６と、を備える。同定処理部４は本発明に係るタンパク質同定方法を実施するための特徴的な構成要素であり、調査末端配列入力部４１、データベース検索部４２、配列長予測部４３、情報読込部４４、データベース作成・管理部４５、末端配列データベース４６、などの機能ブロックを含む。ここで、質量分析計１以外は、コンピュータを中心に構成することができ、主要な機能はコンピュータにインストールされた専用の制御・処理用ソフトウエアをコンピュータ上で実行することにより実現されるものとすることができる。
【００３２】
質量分析計１は特にその構成を問わないが、高い質量精度、質量分解能が要求されるとともに、通常、衝突誘起解離（ＣＩＤ）を伴うＭＳn分析を実行する必要があることから、例えば、エレクトロスプレイイオン化（ＥＳＩ）イオン源やＭＡＬＤＩイオン源を用いたイオントラップ飛行時間型質量分析計又はＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計などが用いられる。
【００３３】
同定対象であるタンパク質は、例えばトリプシン等適宜の消化酵素を用いた前処理によりペプチド断片に分解される。このペプチド混合物は、タンパク質のＮ−及びＣ−末端ペプチドと、Ｎ−及びＣ−末端ペプチド以外のペプチドである内部ペプチドと、が混在したものである。そこで、周知のタンパク質末端配列解析法により、Ｎ−及び／又はＣ−末端ペプチドのスペクトルデータを質量分析計１を用いて測定する。スペクトルデータ収集部２は質量分析計１によって得られたマススペクトルデータ、ＭＳnスペクトルデータを収集して一旦記憶する。末端ペプチドのアミノ酸配列は主としてＭＳn（典型的にはＭＳ2）スペクトルデータから推定される。アミノ酸配列はデノボ解析法又はＭＳ／ＭＳイオンサーチにより求めることができる。ＭＳ／ＭＳイオンサーチを利用する場合には、ペプチド由来の分子イオンであると推測されるイオンをプリカーサイオンに設定してＭＳ2分析（場合によってはｎが３以上のＭＳn分析）を実行し、それによって得られたＭＳnスペクトルのピーク情報を後述するアミノ酸配列の推定に利用すればよい。
【００３４】
アミノ酸配列推定部３は上述したように得られたマススペクトルデータ及びＭＳnスペクトルデータに基づいて、タンパク質のＮ−及び／又はＣ−末端ペプチドのアミノ酸配列を推定する。例えばＭＳ／ＭＳイオンサーチを利用する場合には、ＭＳ2スペクトルのパターンとタンパク質データベース７から求まるペプチドのＭＳ2スペクトルパターンとの一致度を調べることで、ペプチドのアミノ酸配列を推定する。ここで用いるタンパク質データベース７としては一般に公開されている様々なデータベース（例えばSwiss-Protデータベースなど）を利用することができる。また、デノボシーケシングにより配列解析が可能である場合には、ＭＳ2スペクトルからマニュアルで（即ち、データベース検索に拠らずに）アミノ酸配列を求める。
【００３５】
同定処理部４には、上述したように被検試料に対する質量分析の結果から推定されたタンパク質の末端部分のアミノ酸配列が調査対象として供される。この同定処理部４に含まれる末端配列データベース４６は、上述したようなタンパク質データベースやゲノム配列データベースに収録されているタンパク質末端部分のアミノ酸配列をインデクスとし、それに合致する、つまりはそうしたアミノ酸配列を末端部分に持つタンパク質の情報、エントリ名やアクセッション番号などを収録したデータベースである。情報読込部４４は例えばインターネット等の通信回線を通じて外部からデータを受領する機能を有し、上記タンパク質データベース７やそのほかのデータベースから必要な情報を収集する。データベース作成・管理部４５は情報読込部４４が受領した情報を整理して、末端配列データベース４６を構築し、また必要に応じて末端配列データベース４６を更新する。
【００３６】
続いて、同定処理部４において、末端配列データベース４６を利用し目的とするタンパク質を同定する際の処理手順を図２に従って説明する。
まず分析者は、調査したい末端アミノ酸配列を一つ指定する。例えば、アミノ酸配列推定部３においてタンパク質の末端部分を含むペプチドのアミノ酸配列が推定された場合、いくつかの候補がその確度を示す指標（例えばランク、スコアなど）とともに挙げられる。そこで、分析者はその候補の中の一つを選択して指示すればよい。この指示を受けて調査末端配列入力部４１は指定された末端アミノ酸配列（以下「調査対象末端配列」という）をデータベース検索部４２へと送る（ステップＳ１）。
【００３７】
データベース検索部４２は、調査対象末端配列を末端配列データベース４６中の末端アミノ酸配列と照合し、調査対象末端配列を含むタンパク質を全て抽出する（ステップＳ２）。当然のことながら、調査対象末端配列がＮ末端ペプチドであると推定された配列である場合には、データベース検索部４２は、末端配列データベース４６中のタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列との照合を実施する。また、調査対象末端配列がＣ末端ペプチドであると推定された配列である場合には、データベース検索部４２は、末端配列データベース４６中のタンパク質のＣ末端のアミノ酸配列との照合を実施する。
【００３８】
次に、データベース検索部４２は、調査対象末端配列を持つタンパク質が末端配列データベース４６中に存在したか否かを判定する（ステップＳ３）。ここで、調査対象末端配列を持つタンパク質が末端配列データベース４６中に存在しないと判定された場合には、与えられた調査対象末端配列は新規の（タンパク質データベース７中にも存在しない）末端アミノ酸配列を持つタンパク質であると考えられる。この場合には、本実施例のシステムではタンパク質を同定することができないため、未知の末端アミノ酸配列である又は未知のタンパク質である旨を表示部５により表示して（ステップＳ４）、処理を終了する。
【００３９】
一方、調査対象末端配列を持つタンパク質が末端配列データベース４６中に存在すると判定された（ステップＳ３でＹｅｓである）場合には、データベース検索部４２は、抽出されたタンパク質の個数が１個のみであるか否かを判定する（ステップＳ５）。抽出されたタンパク質の個数が１である（ステップＳ５でＹｅｓである）場合には、調査対象末端配列を持つタンパク質は１個しかなく、これは、指定された末端アミノ酸配列からタンパク質を一意に同定可能であることを意味する。そこで、抽出された１個のタンパク質に対応したエントリ名、或いはそれに付随して得られるアミノ酸配列情報、タンパク質の構造などの各種情報を末端配列データベース４６から読み出して表示部５により表示し（ステップＳ６）、処理を終了する。
【００４０】
以上のステップＳ６までの処理により、分析者が指定した末端アミノ酸配列を用いてデータベース検索を実行し、タンパク質を一意に同定可能である場合にはその結果を分析者に提示するという、基本的な機能は達成される。
【００４１】
データベース検索によって抽出されたタンパク質の個数が２以上である（ステップＳ５でＮｏである）場合、即ち、ステップＳ１において指定された末端アミノ酸配列からタンパク質を一意に同定することができない場合には、ステップＳ７以降の処理に進む。ステップＳ７以降の処理は、このまま分析者が実験結果に基づく末端アミノ酸配列の決定作業を続行していった場合に、そのアミノ酸配列がいずれのタンパク質の末端部分であるのかを一意に決めるために、どのくらいの配列長さまで末端アミノ酸配列を調べる必要があるのか、を予測する処理である。実験結果に基づいて推定された末端アミノ酸配列の配列内方側に結合する次のアミノ酸残基が何であるのかは実際に測定を実行しない限り判明しないものの、可能性のある全てのケースについて、実際の測定を行うことなく、事前に検証することが可能である。また、アミノ酸は２０種類存在するが、この場合には、その２０種類全てのアミノ酸について検証する必要はない。何故なら、もともと既知のタンパク質データベース７に基づいて作成された末端配列データベース４６に収録されている末端アミノ酸配列しか検索対象とならないから、この末端配列データベース４６を利用してステップＳ３で存在が確認された末端アミノ酸配列に含まれるアミノ酸（アミノ酸残基）のみを検証すれば十分であるからである。
【００４２】
そこで、配列長予測部４３は、ステップＳ２で抽出された２個以上のタンパク質のアミノ酸配列を参照して、ステップＳ１で与えられた調査対象末端配列に付加し得る次のアミノ酸残基を特定する。このとき、特定されるアミノ酸残基は通常、１種類ではなく、複数種類である。そして、その特定されたアミノ酸残基を１個だけ付加した新たな末端アミノ酸配列を作成する（ステップＳ７）。調査対象末端配列の配列長がＮ（Ｎは１以上の整数）であれば、ステップＳ７で新たに作成される末端アミノ酸配列の配列長がＮ＋１である。また、後述するようにステップＳ１０からステップＳ７に戻り、このステップＳ７の処理を実行するときには、ここで新たにアミノ酸残基が１個付加される末端アミノ酸配列は、その直前のステップＳ７で新たに作成された、つまりは少なくともアミノ酸残基が１個以上付加された調査対象末端配列である。
【００４３】
そのあと、配列長予測部４３は、アミノ酸残基を１個だけ付加することによって新たに作成された末端アミノ酸配列を末端部分に有するタンパク質がそれぞれ１個ずつであるか否かを判定する（ステップＳ８）。即ち、これは、ステップＳ７において、与えられた末端アミノ酸配列にアミノ酸残基を１個だけ加えて配列長が１だけ長い末端アミノ酸配列としたときに、その全ての末端アミノ酸配列において必ずタンパク質が一意に同定できるようになるか、或いは、依然としてタンパク質が一意に同定できないのか、を判定する処理である。ステップＳ８でＹｅｓである場合には、ステップＳ７において、与えられた末端アミノ酸配列にアミノ酸残基を１個追加することによって、タンパク質が一意に同定可能となることを意味する。そこで、その旨をそのときの末端アミノ酸配列の配列長又は追加するアミノ酸残基の個数とともに表示部５に表示して（ステップＳ９）処理を終了する。このときには、始めに指定した調査対象末端配列ではタンパク質の同定結果は得られないものの、分析者は、始めに指定した調査対象末端配列に対してアミノ酸残基があと何個判明すればタンパク質を一意に同定できるようになるかを知ることができる。
【００４４】
ステップＳ８においてＮｏである場合、即ち、末端アミノ酸配列をアミノ酸残基1個分だけ延ばしても依然としてタンパク質を一意に同定できない場合には、直前のステップＳ７において新たに作成された末端アミノ酸配列の配列長が事前に定めた所定の上限値未満であるか否かを判定し（ステップＳ１０）、そのときの配列長が所定上限値未満であればステップＳ７へと戻る。即ち、ステップＳ７〜Ｓ１０の繰り返しによって、配列長が最大限、所定上限値に一致する個数までアミノ酸残基を元の調査対象末端配列に追加してゆき、その間に異なるアミノ酸残基を追加した全ての末端アミノ酸配列においてタンパク質が一意に同定できるようになればステップＳ８からＳ９へと進む。一方、配列長が所定上限値に一致するような個数だけアミノ酸残基を付加することで末端アミノ酸配列を延ばしても、依然としてタンパク質を一意に決めることができないケースが存在する場合には、ステップＳ１０でＮｏと判定される。このときには、タンパク質同定のための配列長推定処理をこれ以上継続してもタンパク質の同定に至らないと判断できるから、その旨を表示部５により表示し（ステップＳ１１）、処理を終了する。
【００４５】
ステップＳ１０における「所定上限値」は、例えば使用する質量分析計の性能（質量精度や質量分解能など）などに応じて予め決めておけばよい。例えば、現在の質量分析計ではその性能の制約から、通常、２０個程度のアミノ酸配列長のペプチドまでしか高い確度で以てアミノ酸配列を決定することができない。そこで、「所定上限値」を「２０」と定めておけばよい。将来的に質量分析計の性能が向上し、より長いアミノ酸配列長のペプチドまでその配列の決定が可能になれば、それに応じて「所定上限値」を適宜大きくすればよい。
【００４６】
以上のようにして、本実施例のタンパク質同定システムによれば、実験の結果等に基づいて与えられた調査対象の末端アミノ酸配列でタンパク質が一意に同定可能である場合にはその旨が表示部５に表示される一方、調査対象の末端アミノ酸配列でタンパク質が一意に同定できない場合でも、あと何個のアミノ酸残基が判明すればタンパク質の同定が可能となるかの予測結果が表示部５に表示される。また、所定の上限値まで末端アミノ酸配列の配列長を延ばしてもタンパク質を一意に同定できる可能性がない場合には、その旨が表示部５に表示される。これにより、タンパク質が同定できない場合でも、以降の実験のために有用な情報が分析者に提供されることになる。
【００４７】
次に、図３及び図４により、図２に示したタンパク質同定処理の具体例を説明する。
図３（ａ）に示すように、この例において調査対象末端配列は、Ｎ末端ペプチドであると推定されたアミノ酸残基が５個結合した［ＡＣＤＥＦ］である。この調査対象末端配列に対しステップＳ２のデータベース検索を行った結果、図３（ｂ）に示すような、７種のタンパク質が抽出されたものとする。図３（ｂ）は、それら７種のタンパク質のＮ末端側の１５残基分のアミノ酸配列を示したものであり、当然のことながら、タンパク質全体のアミノ酸配列はこれよりも遙かに長い。また、これらは全て、説明のための仮想的なアミノ酸配列であり、実在のものではない。
【００４８】
図３（ｂ）に示した７種のタンパク質はいずれも、調査対象末端配列［ＡＣＤＥＦ］をＮ末端部分に有している。そのため、ステップＳ３ではＹｅｓと判定され、続くステップＳ５ではＮｏと判定される。つまり、これは、最初に分析者が指定した調査対象末端配列ではタンパク質が一意に決定できない例である。
【００４９】
ステップＳ５の直後にステップＳ７を初めて実行する際に、与えられる末端アミノ酸配列は調査対象末端配列である［ＡＣＤＥＦ］である。この配列に対しその内方側、つまりはアミノ酸残基Ｆの隣に結合する、Ｎ末端から６番目のアミノ酸残基を特定する。Ｎ末端から６番目に結合するアミノ酸残基として、実験に基づくものではなく理論的な調査を行うとすれば、２０種類のアミノ酸全てを候補として挙げることができる。しかしながら、現実的には、末端配列データベース４６に存在しないアミノ酸配列は調べても意味がないので、末端配列データベース４６に収録されている末端アミノ酸配列の中のみから、Ｎ末端から６番目に結合するアミノ酸残基を探索すればよい。したがって、これは、結局のところ、ステップＳ２において抽出された７種類のタンパク質をさらに絞り込むことが可能か、という問題に帰着される。即ち、Ｎ末端から６番目のアミノ酸残基としては、これら７種類のタンパク質のアミノ酸配列においてＮ末端から６番目に位置しているアミノ酸残基のみを検討すればよい。
【００５０】
図３（ｂ）に示すように、Ｎ末端から６番目のアミノ酸残基は全て「Ｇ」であるから、ステップＳ７が初めて実行される際に作成される新たな末端アミノ酸配列は［ＡＣＤＥＦ］に「Ｇ」を付加した［ＡＣＤＥＦＧ］の１種類のみである（図４（ａ）参照）。ただし、７種類のタンパク質は全て、この末端アミノ酸配列［ＡＣＤＥＦＧ］を有しているから、ステップＳ８ではＮｏと判定される。上述したように、ステップＳ１０における「所定上限値」が「２０」であるとすると、このときの末端アミノ酸配列の配列長は「６」であって「２０」未満であるから、ステップＳ１０ではＹｅｓと判定され、ステップＳ７へと戻る。
【００５１】
ステップＳ７を２回目に実行する際に、与えられる末端アミノ酸配列は［ＡＣＤＥＦＧ］であり、配列内方側、つまりはアミノ酸残基Ｇの次に結合する、Ｎ末端から７番目のアミノ酸残基を、図３（ｂ）に示す７種類のタンパク質のアミノ酸配列に基づいて特定すると、「Ａ」と「Ｆ」の２種類存在することが分かる。したがって、ステップＳ７において新たに作成される末端アミノ酸配列は［ＡＣＤＥＦＧ］に「Ａ」と「Ｆ］とをそれぞれ加えた、［ＡＣＤＥＦＧＡ］及び［ＡＣＤＥＦＧＦ］の２種類であり、それぞれ図３（ｂ）中に連番で示した、タンパク質１、２、３、４とタンパク質５、６、７がこれら末端アミノ酸配列を持つ（図４（ｂ）参照）。この段階では依然として、タンパク質を一意に決めることができない。何故なら、実験によっていずれかの末端アミノ酸配列［ＡＣＤＥＦＧＡ］又は［ＡＣＤＥＦＧＦ］、が得られたとしても、候補となるタンパク質は４又は３種類存在するからである。
【００５２】
以下同様にして、ステップＳ１０からＳ７へと戻ると、新たに［ＡＣＤＥＦＧＡＨ］、［ＡＣＤＥＦＧＡＫ］、［ＡＣＤＥＦＧＡＹ］、［ＡＣＤＥＦＧＦＦ］、［ＡＣＤＥＦＧＦＴ］の５種類の末端アミノ酸配列が作成される（図４（ｃ）参照）。この場合、仮に実験によって［ＡＣＤＥＦＧＡＨ］や［ＡＣＤＥＦＧＡＹ］である末端アミノ酸配列が得られたとしたならば、候補となるタンパク質はそれぞれ１種類のみであるから、タンパク質を一意に同定することができる。しかしながら、実験によって得られる末端アミノ酸配列が［ＡＣＤＥＦＧＡＫ］であった場合には、タンパク質２、３のいずれであるか区別がつかない。したがって、依然としてステップＳ８でＮｏと判定され、ステップＳ１０を経てＳ７へと戻る。
【００５３】
こうした処理を繰り返し、５回目のステップＳ７の処理において、新たに［ＡＣＤＥＦＧＡＨＩＫ］、［ＡＣＤＥＦＧＡＫＩＩ］、［ＡＣＤＥＦＧＡＫＣＧ］、［ＡＣＤＥＦＧＡＹＱＥ］、［ＡＣＤＥＦＧＦＦＹＴ］、［ＡＣＤＥＦＧＦＦＹＰ］、［ＡＣＤＥＦＧＦＴＰＹ］の７種類の末端アミノ酸配列が作成され、それら末端アミノ酸配列にはそれぞれ１個ずつタンパク質が対応付けられる。それにより、ステップＳ８の処理でＹｅｓと判定され、この時点での末端アミノ酸配列の配列長「１０」を表示するか、或いは、これと等価の情報として「確実にタンパク質を同定するには、あと５個のアミノ酸残基を決定する必要あり」といった情報を表示部５により表示して処理を終了する。
このようにして、タンパク質を同定できなかった場合でも、今後の実験の実行や実験計画の立案に有用な情報を分析者に提供することができる。
なお、以上の説明ではＮ末端のアミノ酸配列を例に挙げたが、Ｃ末端のアミノ酸配列についても全く同様の手法で処理が可能であることは明らかである。
【００５４】
［変形例１］
なお、上記実施例のタンパク質同定システムでは、質量分析を用いた実験によってタンパク質の末端部分のアミノ酸配列を決定した上で、末端配列データベース４６を用いたデータベース検索を実行している。これに対し、質量分析の結果から求まるペプチド由来のイオンの質量電荷比m/z値を入力としてタンパク質の同定を実行するように、システムを変形することもできる。
【００５５】
この場合、図１に記載のシステムにおいて、調査末端配列入力部４１を通常のデータベース検索エンジンに置き換えるとともに、このデータベース検索エンジンによってタンパク質データベース７に対する検索を実行できるようにすればよい。即ち、図５に示すように、アミノ酸配列推定部３及びタンパク質データベース７の機能を同定処理部４に取り込み、スペクトルデータ収集部２で収集されたペプチドマスフィンガープリンティング又はペプチドフラグメントフィンガープリンティングの結果（スペクトルピーク情報）を利用して、タンパク質データベース７からそのスペクトルピーク情報に合致するアミノ酸配列を持つタンパク質を抽出し、さらにそのスペクトルピーク情報に相当するペプチドが末端部分に位置する末端アミノ酸配列を末端配列データベース４６から抽出すればよい。これによって、ステップＳ２までの処理が終了するから、上述したようにステップＳ３以降の処理を実施すればよい。
【００５６】
［変形例２］
アミノ酸配列の全長が既知であるタンパク質の数は膨大であり、この情報を収録するタンパク質データベースのサイズは１０GBを超える巨大なものとなっている。また、このデータサイズは将来的にはさらに増加することが見込まれる。こうしたことから、上記実施例のシステムでは、末端アミノ酸配列とタンパク質とを関連付ける情報のみを用いて編集し直した末端配列データベース４６をタンパク質データベース７とは別に構築している。しかしながら、ＳＳＤ（Solid State Drive）等を用いた記憶装置の大容量化及び高速化など、ハードウエアの進歩のいかんによっては、末端配列データベース４６を敢えて構築する必要はなくなり、タンパク質データベース７を直接検索することで、上記実施例のシステムと同様の処理を実現することができる。この場合のシステムの構成例を図６に示す。
【００５７】
即ち、このシステムでは、データベース作成・管理部４５の機能を末端配列データ収集機能としてデータベース検索部４２に組み込んでデータベース検索部４２’とし、アミノ酸配列推定部３とデータベース検索部４２’がいずれもタンパク質データベース７を参照して処理を実行する。このデータベース検索部４２’は、上記実施例においてデータベース作成・管理部４５が末端配列データベース４６を構築する際に行った処理（作業）を、毎回のデータベース検索を実行する直前に実行すればよい。
【００５８】
また、上記実施例や変形例はいずれも本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
【符号の説明】
【００５９】
１…質量分析計
２…スペクトルデータ収集部
３…アミノ酸配列推定部
４…同定処理部
４１…調査末端配列入力部
４２…データベース検索部
４３…配列長予測部
４４…情報読込部
４５…データベース作成・管理部
４６…末端配列データベース
５…表示部
６…入力部
７…タンパク質データベース
【図１】
0006003842.tif 000002
【図２】
0006003842.tif 000003
【図３】
0006003842.tif 000004
【図４】
0006003842.tif 000005
【図５】
0006003842.tif 000006
【図６】
0006003842.tif 000007