(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物宿主細胞において外来遺伝子由来タンパク質の高レベル生産を可能にするための発現ベクターであって、該ベクターが
（ａ）コドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに改変し発現を微弱化させた翻訳障害性薬剤耐性遺伝子カセット、および
（ｂ）ヒトサイトメガロウイルスプロモーターとウシ成長ホルモン遺伝子ポリA付加シグナルの間に外来遺伝子組み込み用クローニングサイトを含む遺伝子カセット
を含み、
薬剤耐性遺伝子が、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子（NPT遺伝子）であり、
該ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子の5'末端から全長の３４％または１００％の領域におけるコドンが、アラニンはGCA、アルギニンはCGA、アスパラギンはAAU、アスパラギン酸はGAU、システインはUGU、グルタミンはCAA、グルタミン酸はGAA、グリシンはGGU、ヒスチジンはCAU、ロイシンはUUA、リシンはAAA、プロリンはCCA、フェニルアラニンはUUU、セリンはUCA、トレオニンはACU、チロシンはUAU、およびバリンはGUAに改変されており、
該翻訳障害性薬剤耐性遺伝子カセットが、プロモーターとしてエンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーターを使用していることを特徴とする、発現ベクター。
【請求項２】
請求項１に記載の発現ベクターに外来遺伝子を組み込む工程、および該発現ベクターにより宿主細胞を形質転換させる工程を含む、外来遺伝子由来タンパク質の高レベル生産能およびネオマイシン耐性能を有する形質転換体の製造方法。
【請求項３】
以下（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、外来遺伝子由来タンパク質の生産方法。
（ａ）請求項１に記載の発現ベクターに外来遺伝子を組み込む工程
（ｂ）該発現ベクターにより宿主細胞を形質転換させる工程
（ｃ）該形質転換体をネオマイシンが添加された培地で培養する工程
（ｄ）培養された形質転換体から外来遺伝子由来タンパク質を回収する工程
【請求項４】
請求項３（ｃ）の工程において、Chemically Defined medium（CD培地）あるいはCD培地に非動物性の添加物を加えた培地で培養することを特徴とする、請求項３に記載の生産方法。
【請求項５】
以下（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、外来遺伝子由来タンパク質の高レベル生産能を有する形質転換体のスクリーニング方法。
（ａ）請求項１に記載の発現ベクターに外来遺伝子を組み込む工程
（ｂ）該発現ベクターにより宿主細胞を形質転換させる工程
（ｃ）該形質転換体をネオマイシンが添加された培地で培養する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物細胞宿主に外来遺伝子由来タンパク質の高レベル生産能を与える哺乳動物細胞用発現ベクターに関する。本発明の発現ベクターは、特に、大腸菌や酵母を宿主とした遺伝子組換では十分な活性が得られ難く、哺乳類独特の糖鎖修飾や折りたたみが必要である哺乳動物タンパク質の生産に適する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質生産用ベクターは数多く開発され、大腸菌を代表とする細菌、酵母を代表とする真核微生物および昆虫細胞を宿主とする発現系では、タンパク質の発現量も多い。しかしながら哺乳類独特のタンパク質を発現させる場合、正常な立体構造をとらなかったり、糖鎖付加等の翻訳後修飾に問題があることが多い。そこで哺乳類細胞を宿主とした発現系の確立が必要となるが、一般的に発現量が低い場合が多い。また、昆虫細胞よりも高等な動物細胞に対しては組換えウイルスベクターを用いた発現系も使用されるが、組換えウイルスベクターを発現タンパク質から除く作業は極めて煩雑であり、さらにウイルスベクター自体の危険性も否定できない。
【０００３】
哺乳動物細胞を宿主とした組換えタンパク質生産の事例は、組織性プラスミノーゲンアクチベータ（特許文献１）、エリスロポエチン（特許文献２、非特許文献１−３）、IFN-γ（非特許文献４）、IFN-β（特許文献３、非特許文献５）などに見られる。また、モノクローナル抗体の遺伝子組換え生産に関しても数多くの報告がある（特許文献４−６、非特許文献６−８）。さらに哺乳動物細胞用高発現ベクターとしてpNOW/CMV-AA（特許文献７）が挙げられる。このベクターを用いたコングルチニンの生産量は、培養４日間で最大11.8μg/mLであった。しかしながら、これらの事例において組換えタンパク質の十分な生産量が得られているとは考え難い。
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭59-183693号
【特許文献２】特開2002-45191
【特許文献３】特開平７-265084号
【特許文献４】特開平７-67648号
【特許文献５】特開平6-30788号
【特許文献６】特開平6-217786号
【特許文献７】特開平10-179169号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Fermentation Bioengineering,4,257頁,1989年
【非特許文献２】Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,6465頁,1986年
【非特許文献３】Biotechnology,6,67頁,1988年,
【非特許文献４】Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 80,4564頁,1983年
【非特許文献５】Cytotechnology,4,173頁,1990年
【非特許文献６】Biotechnology,10,169頁,1992年
【非特許文献７】J.Immunol.Methods,125,191頁,1989年
【非特許文献８】Biotechnology,10,1455頁,1992年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
哺乳動物細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣細胞（以下CHO細胞）を用いた医薬品の製造は安全が確認されており、現在一般的な手法となっている。哺乳動物細胞を用いた組換えタンパク質製造において、その生産性を上げることは、コストの削減・医療費の抑制などの面から非常に重要である。そのため、効率的な遺伝子導入により高レベル生産能を有する形質転換体を作製するための発現ベクターの開発が必須である。
【０００７】
哺乳動物細胞において組換えタンパク質の高レベル生産を容易に行うためには、効率的な遺伝子導入が必要である。効率的な遺伝子導入とは、クローンのセレクションが容易であるにも関わらず、高レベル生産性クローンが得られる確率が高いことである。すなわち、被形質転換細胞全体に対して薬剤選択後の生存細胞クローン数が相対的に少なく、それにより高レベル生産性クローンのセレクションが容易であること、さらに目的とするタンパク質を生産する細胞の数が少ないにも拘わらず高レベル生産性クローンが出現する期待値が大きいことである。得られる細胞の数が大きいとその分セレクションに時間と労力を要することになり効率が悪く、また潜在的に高レベル生産能をもつクローンを見落とす可能性も高い。
【０００８】
高レベル生産能とは、遺伝子導入により得られた形質転換細胞クローンにおける組換えタンパク質の発現量が多いことであり、これはおもに発現ベクターの性質、性能に由来すると考えられる。遺伝子発現のレベルは染色体上の位置により著しく異なることが見出されており（Annu.Rev.Cell Biol.,6,679頁,1990年）、染色体上の転写活性の高い領域（以下、転写ホットスポット）に目的遺伝子が導入されることで、組換えタンパク質の生産レベルが高くなると予想される。
【０００９】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その課題は、哺乳動物細胞宿主に外来遺伝子由来タンパク質の高レベル生産能を与える哺乳動物細胞用発現ベクターを提供することにある。また、本発明は、該ベクターを利用した形質転換体の製造方法、および該ベクターを利用した外来遺伝子由来タンパク質の生産方法を提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、宿主細胞染色体上の転写ホットスポットにプラスミドDNAが組み込まれ、薬剤（例えば、ネオマイシン、ゼオシン、又はブラストシジン）耐性株として、セレクトされる仕組みを持つ発現ベクターの開発に成功した。遺伝子導入後のG418耐性株における初期クローンの高生産性はNPT遺伝子発現の仕組みに依存し、ゼオシン耐性株における初期クローンの高生産性はゼオシン耐性遺伝子発現の仕組みに依存し、またブラストシジン耐性株における初期クローンの高生産性はブラストシジン耐性遺伝子発現の仕組みに依存する。結果、高レベルで安定的なタンパク質の生産を可能にする発現ベクターを構築でき、本発明を完成した。
【００１１】
本発明は、より具体的には、下記〔１〕〜〔２１〕の発明を提供するものである。
〔１〕下記（ａ）および（ｂ）を含む、哺乳動物宿主細胞において外来遺伝子由来タンパク質の高レベル生産を可能にするための発現ベクター。
（ａ）コドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに改変し発現を微弱化させた翻訳障害性薬剤耐性遺伝子カセット
（ｂ）高転写活性プロモーターと高安定性ポリアデニレーションシグナルの間に外来遺伝子組み込み用クローニングサイトを含む遺伝子カセット
〔２〕〔１〕（ａ）に記載の翻訳障害性薬剤耐性遺伝子カセットのコドンが、ヒトにおいて使用頻度が最も低いコドンに改変されたものであることを特徴とする〔１〕に記載の発現ベクター。
〔３〕〔１〕（ａ）に記載の翻訳障害性薬剤耐性遺伝子カセットのコドンが、アラニンはGCA、アルギニンはCGA、アスパラギンはAAU、アスパラギン酸はGAU、システインはUGU、グルタミンはCAA、グルタミン酸はGAA、グリシンはGGU、ヒスチジンはCAU、ロイシンはUUA、リシンはAAA、プロリンはCCA、フェニルアラニンはUUU、セリンはUCA、トレオニンはACU、チロシンはUAU、および／又はバリンはGUAに改変されたものであることを特徴とする〔１〕に記載の発現ベクター。
〔４〕〔１〕（ａ）に記載の翻訳障害性薬剤耐性遺伝子カセットが、プロモーターとして発現誘導性の低いプロモーターを使用していることを特徴とする〔1〕に記載の発現ベクター。
〔５〕前記活性の低いプロモーターとして、哺乳動物細胞ではほとんど発現しない遺伝子を由来とするプロモーター、又はエンハンサー部分を除去したプロモーターを使用することを特徴とする〔４〕に記載の発現ベクター。
〔６〕〔１〕（ａ）に記載の薬剤耐性遺伝子カセットにおいてコドンの改変領域が、遺伝子カセットの全長の３０％以上であることを特徴とする、〔１〕に記載の発現ベクター。
〔７〕〔１〕（ａ）に記載の薬剤耐性遺伝子が、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子（NTP遺伝子）であることを特徴とする〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の発現ベクター。
〔８〕〔７〕に記載の発現ベクターに外来遺伝子を組み込む工程、および該発現ベクターにより宿主細胞を形質転換させる工程を含む、外来遺伝子由来タンパク質の高レベル生産能およびネオマイシン耐性能を有する形質転換体の製造方法。
〔９〕以下（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、外来遺伝子由来タンパク質の生産方法。
（ａ）〔７〕に記載の発現ベクターに外来遺伝子を組み込む工程
（ｂ）該発現ベクターにより宿主細胞を形質転換させる工程
（ｃ）該形質転換体をネオマイシンが添加された培地で培養する工程
（ｄ）培養された形質転換体から外来遺伝子由来タンパク質を回収する工程
〔１０〕〔９〕（ｃ）の工程において、Chemically Defined medium（CD培地）あるいはCD培地に非動物性の添加物を加えた培地で培養することを特徴とする、〔９〕に記載の生産方法。
〔１１〕以下（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、外来遺伝子由来タンパク質の高レベル生産能を有する形質転換体のスクリーニング方法。
（ａ）〔７〕に記載の発現ベクターに外来遺伝子を組み込む工程
（ｂ）該発現ベクターにより宿主細胞を形質転換させる工程
（ｃ）該形質転換体をネオマイシンが添加された培地で培養する工程
〔１２〕〔１〕（ａ）に記載の薬剤耐性遺伝子が、ゼオシン耐性遺伝子（Zeocinr遺伝子）であることを特徴とする〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の発現ベクター。
〔１３〕〔１２〕に記載の発現ベクターに外来遺伝子を組み込む工程、および該発現ベクターにより宿主細胞を形質転換させる工程を含む、外来遺伝子由来タンパク質の高レベル生産能およびゼオシン耐性能を有する形質転換体の製造方法。
〔１４〕以下（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、外来遺伝子由来タンパク質の生産方法。
（ａ）請求項１２に記載の発現ベクターに外来遺伝子を組み込む工程
（ｂ）該発現ベクターにより宿主細胞を形質転換させる工程
（ｃ）該形質転換体をゼオシンが添加された培地で培養する工程
（ｄ）培養された形質転換体から外来遺伝子由来タンパク質を回収する工程
〔１５〕〔１４〕（ｃ）の工程において、Chemically Defined medium（CD培地）あるいはCD培地に非動物性の添加物を加えた培地で培養することを特徴とする、〔１４〕に記載の生産方法。
〔１６〕以下（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、外来遺伝子由来タンパク質の高レベル生産能を有する形質転換体のスクリーニング方法。
（ａ）〔１２〕に記載の発現ベクターに外来遺伝子を組み込む工程
（ｂ）該発現ベクターにより宿主細胞を形質転換させる工程
（ｃ）該形質転換体をゼオシンが添加された培地で培養する工程
〔１７〕〔１〕（ａ）に記載の薬剤耐性遺伝子が、ブラストシジン耐性遺伝子（Blasticidin遺伝子）であることを特徴とする〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の発現ベクター。
〔１８〕〔１７〕に記載の発現ベクターに外来遺伝子を組み込む工程、および該発現ベクターにより宿主細胞を形質転換させる工程を含む、外来遺伝子由来タンパク質の高レベル生産能およびブラストシジン耐性能を有する形質転換体の製造方法。
〔１９〕以下（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、外来遺伝子由来タンパク質の生産方法。
（ａ）〔１７〕に記載の発現ベクターに外来遺伝子を組み込む工程
（ｂ）該発現ベクターにより宿主細胞を形質転換させる工程
（ｃ）該形質転換体をブラストシジンが添加された培地で培養する工程
（ｄ）培養された形質転換体から外来遺伝子由来タンパク質を回収する工程
〔２０〕〔１９〕（ｃ）の工程において、Chemically Defined medium（CD培地）あるいはCD培地に非動物性の添加物を加えた培地で培養することを特徴とする、〔１９〕に記載の生産方法。
〔２１〕以下（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、外来遺伝子由来タンパク質の高レベル生産能を有する形質転換体のスクリーニング方法。
（ａ）〔１７〕に記載の発現ベクターに外来遺伝子を組み込む工程
（ｂ）該発現ベクターにより宿主細胞を形質転換させる工程
（ｃ）該形質転換体をブラストシジンが添加された培地で培養する工程
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】pNC1コンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV: サイトメガウイルスプロモーター、INRBG : ウサギ成長ホルモンイントロン、PABGH : ウシ成長ホルモン遺伝子ポリA付加シグナル、PdSV: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、NPT: ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼcDNA、PASV: シアミンウイルス４０ポリA付加シグナル、Ampr: 大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）を示す。
【図２】pNC2コンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV: サイトメガウイルスプロモーター、INRBG : ウサギ成長ホルモンイントロン、PABGH : ウシ成長ホルモン遺伝子ポリA付加シグナル、PdSV: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、cdNPT: NPTの全塩基配列のコドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに全塩基配列を改変した翻訳障害性NPT遺伝子、PASV: シアミンウイルス４０ポリA付加シグナル、Ampr: 大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）を示す。
【図３】pNC5コンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV: サイトメガウイルスプロモーター、INRBG : ウサギ成長ホルモンイントロン、PABGH : ウシ成長ホルモン遺伝子ポリA付加シグナル、PdSV: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、cd90NPT: NPTの塩基配列を５‘末端から９０塩基の範囲で、コドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに改変した翻訳障害性NPT遺伝子、PASV: シアミンウイルス４０ポリA付加シグナル、Ampr: 大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）を示す。
【図４】pNC6コンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV: サイトメガウイルスプロモーター、INRBG : ウサギ成長ホルモンイントロン、PABGH : ウシ成長ホルモン遺伝子ポリA付加シグナル、PdSV: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、cd180NPT: NPTの塩基配列を５‘末端から１８０塩基の範囲で、コドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに改変した翻訳障害性NPT遺伝子、PASV: シアミンウイルス４０ポリA付加シグナル、Ampr: 大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）を示す。
【図５】pNC7コンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV: サイトメガウイルスプロモーター、INRBG : ウサギ成長ホルモンイントロン、PABGH : ウシ成長ホルモン遺伝子ポリA付加シグナル、PdSV: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、cd270NPT: NPTの塩基配列を５‘末端から２７０塩基の範囲で、コドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに改変した翻訳障害性NPT遺伝子、PASV: シアミンウイルス４０ポリA付加シグナル、Ampr: 大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）を示す。
【図６】pNC1/hMBLコンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV: サイトメガウイルスプロモーター、INRBG : ウサギ成長ホルモンイントロン、hMBL: ヒトマンノース結合レクチンcDNA、PABGH : ウシ成長ホルモン遺伝子ポリA付加シグナル、PdSV: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、NPT: ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼcDNA、PASV: シアミンウイルス４０ポリA付加シグナル、Ampr: 大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）を示す。
【図７】pNC2/hMBLコンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV: サイトメガウイルスプロモーター、INRBG : ウサギ成長ホルモンイントロン、hMBL: ヒトマンノース結合レクチンcDNA、PABGH : ウシ成長ホルモン遺伝子ポリA付加シグナル、PdSV: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、cdNPT: NPTの全塩基配列のコドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに全塩基配列を改変した翻訳障害性NPT遺伝子、PASV: シアミンウイルス４０ポリA付加シグナル、Ampr: 大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）を示す。
【図８】pNC5/hMBLコンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV: サイトメガウイルスプロモーター、INRBG : ウサギ成長ホルモンイントロン、hMBL: ヒトマンノース結合レクチンcDNA、PABGH : ウシ成長ホルモン遺伝子ポリA付加シグナル、PdSV: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、cd90NPT: NPTの塩基配列を５‘末端から９０塩基の範囲で、コドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに改変した翻訳障害性NPT遺伝子、PASV: シアミンウイルス４０ポリA付加シグナル、Ampr: 大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）を示す。
【図９】pNC6/hMBLコンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV: サイトメガウイルスプロモーター、INRBG : ウサギ成長ホルモンイントロン、hMBL: ヒトマンノース結合レクチンcDNA、PABGH : ウシ成長ホルモン遺伝子ポリA付加シグナル、PdSV: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、cd180NPT: NPTの塩基配列を５‘末端から１８０塩基の範囲で、コドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに改変した翻訳障害性NPT遺伝子、PASV: シアミンウイルス４０ポリA付加シグナル、Ampr: 大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）を示す。
【図１０】pNC7/hMBLコンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV: サイトメガウイルスプロモーター、INRBG : ウサギ成長ホルモンイントロン、hMBL: ヒトマンノース結合レクチンcDNA、PABGH : ウシ成長ホルモン遺伝子ポリA付加シグナル、PdSV: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、cd270NPT: NPTの塩基配列を５‘末端から２７０塩基の範囲で、コドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに改変した翻訳障害性NPT遺伝子、PASV: シアミンウイルス４０ポリA付加シグナル、Ampr: 大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）を示す。
【図１１】pZC1コンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV: サイトメガウイルスプロモーター、INRBG : ウサギ成長ホルモンイントロン、PABGH : ウシ成長ホルモン遺伝子ポリA付加シグナル、PdSV: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、Zeo: ゼオシン耐性遺伝子（Sh ble 遺伝子）cDNA、PASV: シアミンウイルス４０ポリA付加シグナル、Ampr: 大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）を示す。
【図１２】pZC2コンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV: サイトメガウイルスプロモーター、INRBG : ウサギ成長ホルモンイントロン、PABGH : ウシ成長ホルモン遺伝子ポリA付加シグナル、PdSV: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、cdZeo: ゼオシン耐性遺伝子（Sh ble 遺伝子）の全塩基配列のコドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに全塩基配列を改変した翻訳障害性ゼオシン耐性遺伝子、PASV: シアミンウイルス４０ポリA付加シグナル、Ampr: 大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）を示す。
【図１３】pZC5コンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV: サイトメガウイルスプロモーター、INRBG : ウサギ成長ホルモンイントロン、PABGH : ウシ成長ホルモン遺伝子ポリA付加シグナル、PdSV: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、cd90Zeo: ゼオシン耐性遺伝子（Sh ble 遺伝子）の塩基配列を５'末端から９０塩基の範囲で、コドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに改変した翻訳障害性ゼオシン耐性遺伝子、PASV: シアミンウイルス４０ポリA付加シグナル、Ampr: 大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）を示す。
【図１４】pZC7コンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV: サイトメガウイルスプロモーター、INRBG : ウサギ成長ホルモンイントロン、PABGH : ウシ成長ホルモン遺伝子ポリA付加シグナル、PdSV: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、cd180Zeo: ゼオシン耐性遺伝子（Sh ble 遺伝子）の塩基配列を５'末端から１８０塩基の範囲で、コドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに改変した翻訳障害性ゼオシン耐性遺伝子、PASV: シアミンウイルス４０ポリA付加シグナル、Ampr: 大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）を示す。
【図１５】pZC1/hMBLコンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV: サイトメガウイルスプロモーター、INRBG : ウサギ成長ホルモンイントロン、hMBL: ヒトマンノース結合レクチンcDNA、PABGH : ウシ成長ホルモン遺伝子ポリA付加シグナル、PdSV: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、Zeo: ゼオシン耐性遺伝子（Sh ble 遺伝子）cDNA、PASV: シアミンウイルス４０ポリA付加シグナル、Ampr: 大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）を示す。
【図１６】pZC2/hMBLコンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV: サイトメガウイルスプロモーター、INRBG : ウサギ成長ホルモンイントロン、hMBL: ヒトマンノース結合レクチンcDNA、PABGH : ウシ成長ホルモン遺伝子ポリA付加シグナル、PdSV: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、cdZeo: ゼオシン耐性遺伝子（Sh ble 遺伝子）の全塩基配列のコドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに全塩基配列を改変した翻訳障害性ゼオシン耐性遺伝子、PASV: シアミンウイルス４０ポリA付加シグナル、Ampr: 大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）を示す。
【図１７】pZC5/hMBLコンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV: サイトメガウイルスプロモーター、INRBG : ウサギ成長ホルモンイントロン、hMBL: ヒトマンノース結合レクチンcDNA、PABGH : ウシ成長ホルモン遺伝子ポリA付加シグナル、PdSV: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、cd90Zeo: ゼオシン耐性遺伝子（Sh ble 遺伝子）の塩基配列を５'末端から９０塩基の範囲で、コドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに改変した翻訳障害性ゼオシン耐性遺伝子、PASV: シアミンウイルス４０ポリA付加シグナル、Ampr: 大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）を示す。
【図１８】pZC７/hMBLコンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV: サイトメガウイルスプロモーター、INRBG : ウサギ成長ホルモンイントロン、hMBL: ヒトマンノース結合レクチンcDNA、PABGH : ウシ成長ホルモン遺伝子ポリA付加シグナル、PdSV: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、cd180Zeo: ゼオシン耐性遺伝子（Sh ble 遺伝子）の塩基配列を５'末端から１８０塩基の範囲で、コドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに改変した翻訳障害性ゼオシン耐性遺伝子、PASV: シアミンウイルス４０ポリA付加シグナル、Ampr: 大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）を示す。
【図１９】pBC1コンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV: サイトメガウイルスプロモーター、INRBG : ウサギ成長ホルモンイントロン、PABGH : ウシ成長ホルモン遺伝子ポリA付加シグナル、PdSV: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、Bsd: ブラストシジン耐性遺伝子（bsd 遺伝子）cDNA、PASV: シアミンウイルス４０ポリA付加シグナル、Ampr: 大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）を示す。
【図２０】pBC6コンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV: サイトメガウイルスプロモーター、INRBG : ウサギ成長ホルモンイントロン、PABGH : ウシ成長ホルモン遺伝子ポリA付加シグナル、PdSV: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、cd120Bsd: ブラストシジン耐性遺伝子（bsd 遺伝子）の塩基配列を５'末端から１２０塩基の範囲で、コドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに改変した翻訳障害性ブラストシジン耐性遺伝子、PASV: シアミンウイルス４０ポリA付加シグナル、Ampr: 大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）を示す。
【図２１】pBC1/hMBLコンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV: サイトメガウイルスプロモーター、INRBG : ウサギ成長ホルモンイントロン、hMBL: ヒトマンノース結合レクチンcDNA、PABGH : ウシ成長ホルモン遺伝子ポリA付加シグナル、PdSV: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、Bsd: ブラストシジン耐性遺伝子（bsd 遺伝子）cDNA、PASV: シアミンウイルス４０ポリA付加シグナル、Ampr: 大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）を示す。
【図２２】pBC6/hMBLコンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV: サイトメガウイルスプロモーター、INRBG : ウサギ成長ホルモンイントロン、hMBL: ヒトマンノース結合レクチンcDNA、PABGH : ウシ成長ホルモン遺伝子ポリA付加シグナル、PdSV: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、cd120Bsd: ブラストシジン耐性遺伝子（bsd 遺伝子）の塩基配列を５'末端から１２０塩基の範囲で、コドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに改変した翻訳障害性ブラストシジン耐性遺伝子、PASV: シアミンウイルス４０ポリA付加シグナル、Ampr: 大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明者らは、薬剤耐性遺伝子（NPT遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、又はブラストシジン耐性遺伝子）のコドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに改変して、薬剤耐性遺伝子の発現性を極めて減衰させたものにすることにより、組み込まれるプラスミド遺伝子が染色体上の極めて高い発現性をもつ位置に導入されない限り、形質転換体ではあっても培地中の薬剤セレクション（ネオマイシンセレクション（G418が例示できる）、ゼオシンセレクション、又はブラストシジンセレクション）に対して生存が困難であるようにした。
【００１４】
すなわち、本発明は、哺乳動物宿主細胞において遺伝子組換えタンパク質の高レベル生産を誘導するための発現ベクターを提供する。
本発明の発現ベクターは、バックボーンベクター上に、下記（ａ）および（ｂ）を含むことによって構築される。
（ａ）コドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに改変し発現を微弱化させた翻訳障害性薬剤耐性遺伝子カセット
（ｂ）高転写活性プロモーターと高安定性ポリアデニレーションシグナルの間に外来遺伝子組み込み用クローニングサイトを含む遺伝子カセット
【００１５】
本発明は、薬剤耐性遺伝子カセット（シストロン）の構成として、薬剤耐性遺伝子のコドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いコドンに改変し、薬剤耐性遺伝子の発現誘導性を低下させたプロモーターを使用し、遺伝子導入により形質転換された宿主細胞における薬剤耐性遺伝子の発現機構を著しく障害せしめるものである。本発明において、「遺伝子カセット」とは、プロモーター、構造遺伝子、ポリアデニレーションシグナル（polyA）を基本構成とする転写・翻訳によりタンパク質を発現する単位を意味するが、これらのいずれかに関連するかもしくは任意のDNA配列を挿入配列として含んでいてもよい。本発明の、薬剤耐性遺伝子カセットはプロモーターを弱化しただけのものとは異なり、転写ホットスポットへプラスミド遺伝子が導入された薬剤耐性株を特異的に獲得できるよう導くことから、「翻訳障害性薬剤耐性遺伝子カセット」と定義する。本発明において、薬剤耐性遺伝子は特に限定されるものではないが、好ましくはネオマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、NTP遺伝子）、ゼオシン耐性遺伝子、又はブラストシジン耐性遺伝子を例示することができる。
【００１６】
本発明において「哺乳動物において使用頻度の最も低いコドン」とは、ヒトにおいて使用頻度の最も低いコドンを好ましい例として挙げることができる。ヒトにおいて使用頻度の最も低いコドンとしては、Kimらの文献（Gene, 199,293頁,1997年）に開示されたコドンを挙げることができる。より具体的なコドンとして、アラニンはGCA、アルギニンはCGA、アスパラギンはAAU、アスパラギン酸はGAU、システインはUGU、グルタミンはCAA、グルタミン酸はGAA、グリシンはGGU、ヒスチジンはCAU、ロイシンはUUA、リシンはAAA、プロリンはCCA、フェニルアラニンはUUU、セリンはUCA、トレオニンはACU、チロシンはUAU、および／又はバリンはGUAを例示することができるが、コドンはこれらに限定されるものではない。
【００１７】
本発明において「発現を微弱化する」とは、遺伝子の発現が転写および／又は翻訳の段階で弱められていることを示し、具体的にはコドンを上記「哺乳動物において使用頻度の最も低いコドン」に改変することにより得ることができる。
該「翻訳障害性薬剤耐性遺伝子カセット」において、コドンが改変される領域は特に制限されるものではないが、遺伝子カセットの全長の３０％以上（例えば、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％）の領域におけるコドンが改変されることが好ましい。コドンの改変領域の範囲は、ベクターの他の条件を考慮して任意に決定することができる。
【００１８】
該「翻訳障害性薬剤耐性遺伝子カセット」のプロモーターとしては、哺乳動物細胞では通常発現し難いタンパク質遺伝子のプロモーターを由来とするもの、または通常のプロモーターからエンハンサーを除去したものを使用でき、より具体的には、SV40のウイルス抗原プロモーターからエンハンサー領域を除去したものか（Mol.Cell Biol.,6,2593頁,1986年)、またはこれと同等に発現性の極めて低いプロモーターを使用することが好ましい。
【００１９】
プラスミドDNAの宿主細胞染色体上の転写ホットスポットへの組み込みは、薬剤耐性遺伝子カセットの持つ特性からネオマイシン（G418セレクション、ゼオシンセレクション、又はブラストシジンセレクション等により結果的に達成されることになるが、染色体上の転写ホットスポットにおける外来遺伝子由来タンパク質の発現自体は強力に誘導される必要がある。このため、タンパク質遺伝子を組み込むマルチクローニングサイト（以下、MCSと記載する）のプロモーターおよびポリアデニレーションシグナル（以下、polyAと称する）は最も強い発現誘導性をもつものの中から選択する。プロモーターとしては、ヒトサイトメガロウイルスImmediate Early（hCMV MIE:Cell,41,521頁,1985年）プロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターとアデノウイルスプロモーターの融合プロモーターであるCMV5 プロモーター（Nucleic Acid Research, 30, 2頁,  2002年）、β-アクチンプロモーター（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,4831頁,1987年）、polyAにはウシ成長ホルモン由来のpolyA配列（DNA 5,115頁,1986年）等が挙げられる。本明細書中ではこの目的とするタンパク質遺伝子を組み込むマルチクローニングサイトをもつDNA断片を「遺伝子発現カセット」と称する。
【００２０】
本発明の発現ベクターとしては、実施例で具体的に記載した発現ベクターを例示することができるが、これらに制限されるものではない。
また、本発明は、上記発現ベクターに外来遺伝子を組み込む工程、および該発現ベクターにより宿主細胞を形質転換させる工程を含む、外来遺伝子由来タンパク質の高レベル生産能および薬剤耐性能を有する形質転換体の製造方法を提供する。
具体的には、発現させたいタンパク質をコードする外来遺伝子を本発明の発現ベクターのマルチクローニングサイト（以下、MCSと記載）に組み込んだ後、トランスフェクション法（ここで言うトランスフェクション法とはリポフェクチン法、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法など当業者が周知の方法を挙げることができる）を利用して該発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、薬剤（ネオマシン、ゼオシン、又はブラストシジン）に対する耐性でセレクションを行い、タンパク質の高生産性形質転換体を得る方法が挙げられる。
【００２１】
本発明において宿主細胞としては、外来遺伝子由来タンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はないが、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）を挙げることができる。
薬剤セレクションで生存した形質転換細胞の多くは既に相対的にタンパク質の高い発現レベルを達成しているが、その中からさらに高レベル生産能をもつ形質転換細胞を選択するために、タンパク質の発現レベルの測定をしてもよい。
【００２２】
また、本発明は、以下（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、外来遺伝子由来タンパク質の産生方法を提供する。
（ａ）本発明の発現ベクターに外来遺伝子を組み込む工程
（ｂ）該発現ベクターにより宿主細胞を形質転換させる工程
（ｃ）該形質転換体を薬剤（ネオマイシン、ゼオシン、又はブラストシジン）が添加された培地で培養する工程
（ｄ）培養された形質転換体から外来遺伝子由来タンパク質を回収する工程
本発明において、上記（ｃ）の工程においては、薬剤（ネオマイシン、ゼオシン、又はブラストシジン）が添加された培地で培養を行うことにより、高効率のタンパク質発現を示す形質転換体（コロニー）を選択することが出来る。選択された形質転換体は、引き続き同じ培地において培養を続けてもよいし、他の培地、例えば大量発現用の培地に移して培養を行ってもよい。
本発明において、形質転換体を培養又は馴化させる培地は特に制限されないが、好ましくは無血清培地、より好ましくはCD培地あるいはCD培地に非動物性の添加物を加えた培地を例示することができる。
本発明において培養された形質転換体から外来遺伝子由来タンパク質を回収する際には、当業者に公知の方法（フィルトレーション（濾過）、遠心分離、およびカラム精製等）でタンパク質を精製してもよい。外来遺伝子由来タンパク質は、精製を容易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可能である。
【００２３】
さらに、本発明は、以下（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、外来遺伝子由来タンパク質の高レベル生産能を有する形質転換体のスクリーニング方法を提供する。
（ａ）本発明の発現ベクターに外来遺伝子を組み込む工程
（ｂ）該発現ベクターにより宿主細胞を形質転換させる工程
（ｃ）該形質転換体を薬剤（ネオマイシン、ゼオシン、又はブラストシジン）が添加された培地で培養する工程
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２５】
〔実施例１〕pNC1, pNC2, pNC5, pNC6, pNC7の構築
当業者に周知の方法を用いて本発明のベクターであるpNC1, pNC2, pNC5, pNC6, pNC7を構築した。バックボーンベクターpNC1の全塩基配列を配列番号：１に記載する。pNC1は塩基配列No1784-No2578の間に野生型のNPTのcDNAを有する（図１）。
pNC2は、pNC1の塩基配列No1784-No2578の配列を、配列番号：２に記載の配列に置換したものである。pNC2の置換領域にはNPTの全塩基配列のコドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに全塩基配列を改変した翻訳障害性NPT遺伝子が導入されている（図２）。
pNC5は、pNC1の塩基配列No1784-No2578の配列を、配列番号：３に記載の配列に置換したものである。pNC5の置換領域にはNPTの塩基配列を５‘末端から９０塩基（コドン改変率１１．３％）の範囲で、コドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに改変した翻訳障害性NPT遺伝子が導入されている（図３）。
pNC6は、pNC1の塩基配列No1784-No2578の配列を、配列番号：４に記載の配列に置換したものである。pNC6の置換領域にはNPTの塩基配列を５‘末端から１８０塩基（コドン改変率２２．６％）の範囲で、コドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに改変した翻訳障害性NPT遺伝子が導入されている（図４）。
pNC7は、pNC1の塩基配列No1784-No2578の配列を、配列番号：５に記載の配列に置換したものである。pNC7の置換領域にはNPTの塩基配列を５‘末端から２７０塩基（コドン改変率３４．０％）の範囲で、コドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに改変した翻訳障害性NPT遺伝子が導入されている（図５）。
【００２６】
〔実施例２〕pNC1/hMBL, pNC2/hMBL, pNC5/hMBL, pNC6/hMBL, pNC7/hMBLの構築
当業者に周知の方法を用いて本発明のベクターであるpNC1, pNC2, pNC5, pNC6, pNC7の塩基配列No1267-No1275を配列番号：６に記載のヒトマンナン結合レクチン（MBL）をコードするcDNA(以下hMBLと記載する)に置換し、pNC1/hMBL（図６）、pNC2/hMBL（図７）、pNC5/hMBL（図８）、pNC6/hMBL（図９）、pNC7/hMBL（図１０）を構築した。
【００２７】
〔実施例３〕pNC1/hMBL, pNC2/hMBL, pNC5/hMBL, pNC6/hMBL, pNC7/hMBLのCHO細胞への導入と、CD培地あるいはCD培地に非動物性の添加物を加えた培地を用いた、G418セレクション
10μｇのpNC1/hMBL, pNC2/hMBL, pNC5/hMBL, pNC6/hMBL, pNC7/hMBLをリポフェクチン法（LipofectamineTM LTX, Invitrogenを使用）を用いて２５ｃｍ2のカルチャーフラスコ中の5.0 x 105個のCHO細胞（CHO DG44 cell）に遺伝子導入した。導入方法は製造業者の使用説明書に従った。遺伝子導入４８時間後、細胞数を計測した後、細胞を4mM Gluta MAXTM-I (Invitrogen)を含むIS CHO-CD w/ Hydrolysate培地(IS Japan)にて希釈した。９６ウェルマイクロタイタープレート中に1000 cells/well, 100 cells/wellの濃度で５枚ずつ計１０枚（960ウェル）播き、５％炭酸ガス存在下で３７℃、約３週間培養したところ、生存した細胞が見られた（G418耐性クローン）。生存細胞から任意にG418耐性クローンを選択し、4mM Gluta MAXTM-I (Invitrogen)を含むIS CHO-CD w/ Hydrolysate培地（IS Japan）ともに２４ウェルプレートに移し、細胞が各ウェルの１／３以上を占めるまで培養した。各株に0.4mLを滅菌チューブに取り、200g、２分間遠心した。上清を捨て、細胞を0.1mLの新しい培地（4 mM Gluta MAXTM-I ((Invitrogen)を含むIS CHO-CD w/ Hydrolysate培地(IS Japan)）に懸濁し、細胞数を計測した後、細胞数を5.0 x 105cells/mLになるように培地で希釈後、0.2mLを新しい24ウェルプレートに移し、５％炭酸ガス存在下で３７℃、７２時間培養し、9300g、２分間の遠心後に上清を回収した。続いて培養上清中のMBLの生産量を測定した。
【００２８】
〔実施例４〕pNC1/hMBL, pNC5/hMBL, pNC6/hMBL, pNC7/hMBL形質導入クローンによるMBLの生産量の測定
生産量の検定はELISAにて実施した。コーティングバッフアー（15 mM, Na2CO3, 35 mM NaHCO3, 0.05 % NaN3, pH 9.6）で希釈した1μg/mL抗ヒトMBL抗体（日本・旭川医大・大谷博士より譲渡）で96ウェルプレート（F96 MAXI SORP Nunc-Immuno plate,Cat no. 442404, Nunc）に４℃、１６時間でコートした。4% Block Ace（大日本住友製薬株式会社）でブロッキングした後、７２時間培養上清（1/1000-1/100000希釈）、精製したヒトMBL（旭川医大・大谷博士より譲渡）のＣＨＯ細胞用無血清培地IS CHO-CD w/ Hydrolysate培地（IS Japan）による２倍希釈系列（20〜0.3125 ng/mL）およびIS CHO with Hydrolysate培地（IS Japan）をそれぞれ100μLずつアプライし、３７℃で１時間インキュベートした。さらに0.1μｇ/mLのビオチン化ヒトMBLモノクローナル抗体（旭川医大・大谷博士より譲渡）と３７℃、１時間インキュベートした。37℃で30分間インキュベートしたVECTASTAIN Elite ABC kit STANDARD（Reagent A 2 drops,Regent B 2 drops / 5 mL, Vector）を100μL/wellずつアプライし、37℃で45分間反応させた。さらに室温で30分間インキュベートしたPEROXIDASE SUBSTRATE KIT TMB（2 drops of Buffer, 3 drops of TMB, 2 drops of HYDROGEN PEROXIDE / 5 mL, Vector）を100μL/wellずつアプライし、室温で15分間反応させた後、1Mリン酸を100μL/wellずつ入れて反応を停止させた。タンパク質濃度の測定はマイクロプレートリーダー（Model680, BioRad社製）を用いて行なった。表１にELISA法にて得られた結果、ヒトMBL生産量の高い上位３サンプルを示す。最も生産レベルの高かったクローンは、コドン未改変のベクターと比較して優位に高い生産性が得られた。
【００２９】
【表１】
0006022518.tif 000002
【００３０】
〔実施例５〕pNC1/hMBL, pNC2/hMBL, pNC5/hMBL, pNC6/hMBL, pNC7/hMBL形質導入細胞クローンによるhMBLの生産量
本発明の発現ベクターpNC1, pNC2, pNC5, pNC6, pNC7により発現されたhMBLの各クローンの発現量の分布を表２に示す。
pNC1では５０株のG418耐性株のうち、７２．０％はhMBLを0μｇ／mL以上５μｇ／mL未満で生産していた。また５０株のうち１４株（２８．０％）は５μｇ／mL以上であった。また５０株のうち７株（１４．０％）は１０μｇ／mL以上であった。最も高い生産レベルを示したものは１５．０μｇ／mL／３dayであった。
pNC2では５０株のG418耐性株のうち、４０．０％はhMBLを0μｇ／mL以上５μｇ／mL未満で生産していた。また５０株のうち３０株（６０．０％）は５μｇ／mL以上であった。また５０株のうち１４株（２８．０％）は１０μｇ／mL以上であった。さらに５０株のうち２株（４．０％）は１５μｇ／mL以上であった。最も高い生産レベルを示したものは２３．３μｇ／mL／３dayであった。
pNC5では５０株のG４１８耐性株のうち７０％はhMBLを0μｇ／mL以上５μｇ／mL未満で生産していた。また５０株のうち１５株（３０．０％）は５μｇ／mL以上であった。最も高い生産レベルを示したものは９．９μｇ／mL／３dayであった。
pNC6では５０株のG418耐性株のうち、６０．０％はhMBLを0μｇ／mL以上５μｇ／mL未満で生産していた。また５０株のうち２０株（４０．０％）は５μｇ／mL以上であった。また５０株のうち４株（８．０％）は１０μｇ／mL以上であった。さらに５０株のうち１株（２．０％）は１５μｇ／mL以上であった。最も高い生産レベルを示したものは１６．０μｇ／mL／３dayであった。
pNC7では５０株のG418耐性株のうち、５６．０％はhMBLを0μｇ／mL以上５μｇ／mL未満で生産していた。また５０株のうち２２株（４４．０％）は５μｇ／mL以上であった。さらに５０株のうち１６株（３２．０％）は１０μｇ／mL以上であった。驚くべきことに５０株のうち１３株（２６．０％）は１５μｇ／mL以上であった。最も高い生産レベルを示したものは４６．１μｇ／mL／３dayであった。
これは文献等で報告されている代表的な発現ベクターによる遺伝子増幅前の初期クローンのデータと比較して最も高い水準であった（ＤＮＡ，７，６５１頁，１９８８年；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０．１４５５頁，１９９２年；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，６６２頁，１９９０年；Ｇｅｎｅ，７６，１９頁，１９８９年；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，６４頁，１９９１年）。
遺伝子増幅による組換細胞のスクリーニングには通常６ヶ月から１年を要し、かつ培養条件や増幅刺激剤濃度による差異が大きいため、発現ベクターのプライマリーな性能比較は増幅前の初期クローンの発現レベルで行うのが適当と考えられる。これにより本発明の発現ベクターの性能は極めて高いことが判明した。この結果、本発明のベクターは、得られるG418耐性株の数が極めて低い一方、非常に高い効率で目的物質タンパク質の高生産性細胞株の確立を可能にすることが確かめられた。これにより、本発明の発現ベクターは非常に高いタンパク質発現レベルを可能にすることが証明された。
【００３１】
【表２】
0006022518.tif 000003
【００３２】
〔実施例６〕pZC1, pZC2, pZC5, pZC7の構築
当業者に周知の方法を用いて本発明のベクターであるpZC1, pZC2, pZC5, pZC7を構築した。pZC1はバックボーンベクターpNC1の塩基配列No1784-No2578の間に、配列番号：7  に記載の野生型のゼオシン耐性遺伝子（Sh ble 遺伝子）のcDNAを有する（図11）。pZC2は、pNC1の塩基配列No1784-No2578の配列を、配列番号：8 に記載の配列に置換したものである。pZC2の置換領域にはゼオシン耐性遺伝子の全塩基配列のコドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに全塩基配列を改変した翻訳障害性ゼオシン耐性遺伝子が導入されている（図12）。
pZC5は、pNC1の塩基配列No1784-No2578の配列を、配列番号：9 に記載の配列に置換したものである。pZC5の置換領域にはゼオシン耐性遺伝子の塩基配列を５'末端から９０塩基（コドン改変率２４．０％）の範囲で、コドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに改変した翻訳障害性ゼオシン耐性遺伝子が導入されている（図13）。
pZC７は、pNC1の塩基配列No1784-No2578の配列を、配列番号：10 に記載の配列に置換したものである。pZC７の置換領域にはゼオシン耐性遺伝子の塩基配列を５'末端から180塩基（コドン改変率４８．０％）の範囲で、コドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに改変した翻訳障害性ゼオシン耐性遺伝子が導入されている（図14）。
【００３３】
〔実施例７〕pZC1/hMBL, pZC2/hMBL, pZC5/hMBL, pZC7/hMBLの構築
当業者に周知の方法を用いて本発明のベクターであるpZC1, pZC2, pZC5, pZC7の塩基配列No1267-No1275を配列番号：６に記載のヒトマンナン結合レクチン（MBL）をコードするcDNA(以下hMBLと記載する)に置換し、pZC1/hMBL（図15）、pZC2/hMBL（図16）、pZC5/hMBL（図17）、pZC7/hMBL(図18)を構築した。
【００３４】
〔実施例８〕pZC1/hMBL, pZC2/hMBL, pZC5/hMBL, pZC7/hMBLのCHO細胞への導入と、CD培地あるいはCD培地に非動物性の添加物を加えた培地を用いた、Zeocinセレクション
10μｇのpZC1/hMBL, pZC2/hMBL, pZC5/hMBL, pZC7/hMBLをリポフェクチン法（LipofectamineTM LTX, Invitrogenを使用）を用いて２５ｃｍ2のカルチャーフラスコ中の5.0 x 105個のCHO細胞（CHO DG44 cell）に遺伝子導入した。導入方法は製造業者の使用説明書に従った。遺伝子導入４８時間後、細胞数を計測した後、細胞を4mM Gluta MAXTM-I (Invitrogen)と200μg/mL Zeocin( Invitrogen)を含むIS CHO-CD w/ Hydrolysate培地(IS Japan)にて希釈した。９６ウェルマイクロタイタープレート中に4000 cells/well, 濃度で５枚ずつ（480ウェル）播き、５％炭酸ガス存在下で３７℃、約３週間培養したところ、生存した細胞が見られた（ゼオシン耐性クローン）。生存細胞から任意にゼオシン耐性クローンを選択し、4mM Gluta MAXTM-I (Invitrogen) と200μg/mL Zeocin( Invitrogen)を含むIS CHO-CD w/ Hydrolysate培地（IS Japan）ともに２４ウェルプレートに移し、細胞が各ウェルの１／３以上を占めるまで培養した。各株に0.4mLを滅菌チューブに取り、200g、２分間遠心した。上清を捨て、細胞を0.1mLの新しい培地（4 mM Gluta MAXTM-I ((Invitrogen)を含むIS CHO-CD w/ Hydrolysate培地(IS Japan)）に懸濁し、細胞数を計測した後、細胞数を5.0 x 105 cells/mLになるように培地で希釈後、0.2mLを新しい24ウェルプレートに移し、５％炭酸ガス存在下で３７℃、７２時間培養し、9300g、２分間の遠心後に上清を回収した。続いて培養上清中のMBLの生産量を測定した。
【００３５】
〔実施例９〕pZC1/hMBL, pZC5/hMBL, pZC7/hMBL形質導入クローンによるMBLの生産量の測定
生産量の検定はELISAにて実施した。コーティングバッフアー（15 mM, Na2CO3, 35 mM NaHCO3, 0.05 % NaN3, pH 9.6）で希釈した1μg/mL抗ヒトMBL抗体（日本・旭川医大・大谷博士より譲渡）で96ウェルプレート（F96 MAXI SORP Nunc-Immuno plate,Cat no. 442404, Nunc）に４℃、１６時間でコートした。4% Block Ace（大日本住友製薬株式会社）でブロッキングした後、７２時間培養上清（1/1000-1/100000希釈）、精製したヒトMBL（旭川医大・大谷博士より譲渡）のＣＨＯ細胞用無血清培地IS CHO-CD w/ Hydrolysate培地（IS Japan）による２倍希釈系列（20〜0.3125 ng/mL）およびIS CHO with Hydrolysate培地（IS Japan）をそれぞれ100μLずつアプライし、３７℃で１時間インキュベートした。さらに0.1μｇ/mLのビオチン化ヒトMBLモノクローナル抗体（旭川医大・大谷博士より譲渡）と３７℃、１時間インキュベートした。37℃で30分間インキュベートしたVECTASTAIN Elite ABC kit STANDARD（Reagent A 2 drops,Regent B 2 drops / 5 mL, Vector）を100μL/wellずつアプライし、37℃で45分間反応させた。さらに室温で30分間インキュベートしたPEROXIDASE SUBSTRATE KIT TMB（2 drops of Buffer, 3 drops of TMB, 2 drops of HYDROGEN PEROXIDE / 5 mL, Vector）を100μL/wellずつアプライし、室温で15分間反応させた後、1Mリン酸を100μL/wellずつ入れて反応を停止させた。タンパク質濃度の測定はマイクロプレートリーダー（Model680, BioRad社製）を用いて行なった。表３にELISA法にて得られた結果、ヒトMBL生産量の高い上位５サンプルを示す。最も生産レベルの高かったコドン改変のベクターのクローンは、コドン未改変のベクターと比較して同等の生産性を示していた。
【００３６】
【表３】
0006022518.tif 000004
【００３７】
〔実施例１０〕pZC1/hMBL, pZC5/hMBL, pZC7/hMBL形質導入細胞クローンによるhMBLの生産量
本発明の発現ベクターpZC1、pZC5、及びpZC7により発現されたhMBLの各クローンの発現量の分布を表４に示す。
pZC1では５０株のZeocin耐性株のうち、７０．０％はhMBLを0μｇ／mL以上５μｇ／mL未満で生産していた。また５０株のうち１５株（３０．０％）は５μｇ／mL以上であった。また５０株のうち４株（８．０％）は１０μｇ／mL以上であった。さらに５０株のうち１株（２．０％）は１５μｇ／mL以上であった。最も高い生産レベルを示したものは１５．1μｇ／mL／３dayであった。
pZC5では５０株のZeocin耐性株のうち８４．０％はhMBLを0μｇ／mL以上５μｇ／mL未満で生産していた。また５０株のうち８株（１６．０％）は５μｇ／mL以上であった。さらに５０株のうち１株（２．０％）は１０μｇ／mL以上であった。最も高い生産レベルを示したものは１２．２μｇ／mL／３dayであった。
pZC7では４９株のZeocin耐性株のうち、７５．５％はhMBLを0μｇ／mL以上５μｇ／mL未満で生産していた。また４９株のうち１２株（２４．５％）は５μｇ／mL以上であった。また４９株のうち１株（２．０％）は１０μｇ／mL以上であった。最も高い生産レベルを示したものは１０．１μｇ／mL／３dayであった。
pZCにおいて外来タンパク質の産生量が最も高いクローンの生産量は１５．１μg／mL／３dayであり、pNCにおいて外来タンパク質の産生量が最も高いクローンの生産量は４６．１μg／ml／３dayであった。このことからpNCは、構成部位として含む薬剤耐性遺伝子のコドンを使用頻度の最も低いものに改変することにより、外来タンパク質の生産性を顕著に高めることが明らかとなった。またpZCについては、薬剤耐性遺伝子のコドン改変領域をC末端側からにすること、あるいは配列の中心部からにすること、または、改変するコドンとしないコドンを交互に配置させる等が考えられ、いずれにしても改変されるコドンを調整することでpNCの場合と同様に薬剤セレクション効率が上がり、当該ベクターが形質転換受容性細胞の染色体上の極めて高い発現性をもつ位置に挿入されるものと考えられる。
【００３８】
【表４】
0006022518.tif 000005
【００３９】
〔実施例11〕pBC1, pBC6の構築
当業者に周知の方法を用いて本発明のベクターであるpBC1, pBC6を構築した。pBC1はバックボーンベクターpNC1の塩基配列No1784-No2578の間に、配列番号：１１に記載の野生型のブラストシジン耐性遺伝子（bsd 遺伝子）のcDNAを有する（図１９）。
pBC6は、pNC1の塩基配列No1784-No2578の配列を、配列番号：１２に記載の配列に置換したものである。pBC6の置換領域にはブラストシジン耐性遺伝子の塩基配列を５'末端から１２０塩基（コドン改変率３０．１％）の範囲で、コドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに改変した翻訳障害性ブラストシジン耐性遺伝子が導入されている（図20）。
【００４０】
〔実施例１２〕pBC1/hMBL, pBC6/hMBLの構築
当業者に周知の方法を用いて本発明のベクターであるpBC1, pBC6の塩基配列No1267-No1275を配列番号：６に記載のヒトマンナン結合レクチン（MBL）をコードするcDNA(以下hMBLと記載する)に置換し、pBC1/hMBL（図21）、pBC6/hMBL(図22)を構築した。
【００４１】
〔実施例１３〕pBC1/hMBL, pBC6/hMBLのCHO細胞への導入と、CD培地あるいはCD培地に非動物性の添加物を加えた培地を用いた、ブラストシジンセレクション
10μｇのpBC1/hMBL, pBC6/hMBLをリポフェクチン法（LipofectamineTM LTX, Invitrogenを使用）を用いて２５ｃｍ2のカルチャーフラスコ中の5.0 x 105個のCHO細胞（CHO DG44 cell）に遺伝子導入した。導入方法は製造業者の使用説明書に従った。遺伝子導入４８時間後、細胞数を計測した後、細胞を4mM Gluta MAXTM-I (Invitrogen)と10μg/mL Blasticidin ( Invitrogen)を含むIS CHO-CD w/ Hydrolysate培地(IS Japan)にて希釈した。９６ウェルマイクロタイタープレート中に4000 cells/well, 濃度で５枚ずつ（480ウェル）播き、５％炭酸ガス存在下で３７℃、約３週間培養したところ、生存した細胞が見られた（ブラストシジン耐性クローン）。生存細胞から任意にブラストシジン耐性クローンを選択し、4mM Gluta MAXTM-I (Invitrogen) と10μg/mL Blasticidin (Invitrogen)を含むIS CHO-CD w/ Hydrolysate培地（IS Japan）ともに２４ウェルプレートに移し、細胞が各ウェルの１／３以上を占めるまで培養した。各株に0.4mLを滅菌チューブに取り、200g、２分間遠心した。上清を捨て、細胞を0.1mLの新しい培地（4 mM Gluta MAXTM-I ((Invitrogen)を含むIS CHO-CD w/ Hydrolysate培地(IS Japan)）に懸濁し、細胞数を計測した後、細胞数を5.0 x 105 cells/mLになるように培地で希釈後、0.2mLを新しい24ウェルプレートに移し、５％炭酸ガス存在下で３７℃、７２時間培養し、9300g、２分間の遠心後に上清を回収した。続いて培養上清中のMBLの生産量を測定した。
【００４２】
〔実施例１４〕pBC1/hMBL, pBC6/hMBL形質導入クローンによるMBLの生産量の測定
生産量の検定はELISAにて実施した。コーティングバッフアー（15 mM, Na2CO3, 35 mM NaHCO3, 0.05 % NaN3, pH 9.6）で希釈した1μg/mL抗ヒトMBL抗体（日本・旭川医大・大谷博士より譲渡）で96ウェルプレート（F96 MAXI SORP Nunc-Immuno plate,Cat no. 442404, Nunc）に４℃、１６時間でコートした。4% Block Ace（大日本住友製薬株式会社）でブロッキングした後、７２時間培養上清（1/1000-1/100000希釈）、精製したヒトMBL（旭川医大・大谷博士より譲渡）のＣＨＯ細胞用無血清培地IS CHO-CD w/ Hydrolysate培地（IS Japan）による２倍希釈系列（20〜0.3125 ng/mL）およびIS CHO with Hydrolysate培地（IS Japan）をそれぞれ100μLずつアプライし、３７℃で１時間インキュベートした。さらに0.1μｇ/mLのビオチン化ヒトMBLモノクローナル抗体（旭川医大・大谷博士より譲渡）と３７℃、１時間インキュベートした。37℃で30分間インキュベートしたVECTASTAIN Elite ABC kit STANDARD（Reagent A 2 drops,Regent B 2 drops / 5 mL, Vector）を100μL/wellずつアプライし、37℃で45分間反応させた。さらに室温で30分間インキュベートしたPEROXIDASE SUBSTRATE KIT TMB（2 drops of Buffer, 3 drops of TMB, 2 drops of HYDROGEN PEROXIDE / 5 mL, Vector）を100μL/wellずつアプライし、室温で15分間反応させた後、1Mリン酸を100μL/wellずつ入れて反応を停止させた。タンパク質濃度の測定はマイクロプレートリーダー（Model680, BioRad社製）を用いて行なった。表５にELISA法にて得られた結果、ヒトMBL生産量の高い上位５サンプルを示す。最も生産レベルの高かったコドン改変のベクターのクローンは、コドン未改変のベクターと比較して同等の生産性を示していた。
【００４３】
【表５】
0006022518.tif 000006
【００４４】
〔実施例１５〕pBC1/hMBL, pBC6/hMBL形質導入細胞クローンによるhMBLの生産量
本発明の発現ベクターpBC1及びpBC6により発現されたhMBLの各クローンの発現量の分布を表6に示す。
pBC1では５６株のBlasticidin耐性株のうち、８３．９％はhMBLを0μｇ／mL以上５μｇ／mL未満で生産していた。また５６株のうち９株（２６．１％）は５μｇ／mL以上であった。また５６株のうち１株（１．８％）は１０μｇ／mL以上であった。最も高い生産レベルを示したものは１１．２μｇ／mL／３dayであった。
pBC6では５9株のBlasticidin耐性株のうち６６．１％はhMBLを0μｇ／mL以上５μｇ／mL未満で生産していた。また５９株のうち２０株（３３．９％）は５μｇ／mL以上であった。さらに５９株のうち３株（５．１％）は１０μｇ／mL以上であった。最も高い生産レベルを示したものは１２．５μｇ／mL／３dayであった。
pBCにおいて外来タンパク質の産生量が最も高いクローンの生産量は１２．５μg／mL／３dayであり、pNCにおいて外来タンパク質の産生量が最も高いクローンの生産量は４６．１μg／mL／３dayであった。このことからpNCは、構成部位として含む薬剤耐性遺伝子のコドンを使用頻度の最も低いものに改変することにより、外来タンパク質の生産性を顕著に高めることが明らかとなった。またpBCについては、薬剤耐性遺伝子のコドン改変領域をC末端側からにすること、あるいは配列の中心部からにすること、または、改変するコドンとしないコドンを交互に配置させる等が考えられ、いずれにしても改変されるコドンを調整することでpNCの場合と同様に薬剤セレクション効率が上がり、当該ベクターが形質転換受容性細胞の染色体上の極めて高い発現性をもつ位置に挿入されるものと考えられる。
【００４５】
【表６】
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【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明により、哺乳動物細胞を宿主として高レベルの外来遺伝子由来タンパク質生産を可能にする発現ベクターを提供することができる。また、哺乳動物本来の翻訳後修飾および高い生物活性を有するタンパク質を生産できる。それゆえ、バイオ医薬品等のタンパク質性有用物質の生産原価を大幅に引き下げることができる。
さらに、本発明によるタンパク質の生産方法は、ウイルスや微生物を使用しないため、安全性の高いタンパク質生産が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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