(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１に表示する３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース（３，６−ａｎｈｙｄｒｏ−Ｌ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）を含むことを特徴とする皮膚美白用化粧料組成物。
【化１】
0006022603.tif 000003
【請求項２】
下記化学式１に表示される３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース（３，６−ａｎｈｙｄｒｏ−Ｌ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）を含むことを特徴とする皮膚色素沈着疾患の予防または治療用薬剤学的組成物。
【化２】
0006022603.tif 000004
【請求項３】
皮膚色素沈着疾患は、メラニン色素の合成増加で皮膚に局所的に発生し、しみ、そばかす、黒色点、母斑、薬物による色素沈着、炎症後の色素沈着、または皮膚炎に発生する過色素沈着のうちのいずれか１つの請求項２に記載の皮膚色素沈着疾患の予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項４】
下記化学式１に表示される３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース（３，６−ａｎｈｙｄｒｏ−Ｌ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）を含むことを特徴とする炎症性疾患の予防または治療用薬剤学的組成物。
【化３】
0006022603.tif 000005
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学的、酵素的方法により製造された３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース及びその生理学的な効能を用いた産業的用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
紅藻類を構成する主な多糖体である寒天（またはアガロース）は、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとＤ−ガラクトースの２つの単糖体がアルファ１，３結合とベータ１，４結合が交差接続されている重合体である。アガロースを塩酸と硫酸と酢酸のような化学的触媒を用いた非特異的な加水分解を介して生産したアガロオリゴ糖は抗酸化、抗炎症、坑癌、美白、抗アレルギー機能など生理学的な活性が優れることで広く知られている。このように多様な生理活性によってアガロオリゴ糖及び二糖体であるネオアガロビオースは食品産業分野及び美容産業分野で機能性物質として広く用いられている。
【０００３】
上記アガロオリゴ糖を構成する単糖のうち１つである３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの場合、還元末端が不安定で高濃度の強酸及び高温反応条件下においてヒドロキシメチルパルパラルに早く転換されるので、既存の化学的処理を介して単糖体である３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを生産することは、収率が最も低く容易に過分解される問題点がある(Jol et al(1999)Anal Biochem. 268, 213-222, Kim et al(2010)Bull Korean Soc. 31(2)511-514)。また化学的処理による加水分解は生産コストが低く処理条件が単純なので、商業化に多く応用可能であるという長所があるが、非特異的に結合を切断するので、特異的な結合を分解して所望する生産物を得る際には、収率が非常に低くなるという短所がある(Chen et al(2005)Food Technol Biotechnol. 43(1)29-36)。また、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース結合を特異的に切断して単糖を生産する酵素も最近報告されているが、反応産物から３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースのみを分離精製及び定量化する研究は不備である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、上記３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの生理学的活性を糾明してこれを産業的に利用することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース（３，６−ａｎｈｙｄｒｏ−Ｌ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）を含む皮膚美白用化粧料組成物を提供する。
【００１３】
本発明は、また、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース（３，６−ａｎｈｙｄｒｏ−Ｌ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）を含む皮膚色素沈着疾患の予防または治療用薬剤学的組成物を提供する。
【００１６】
皮膚色素沈着疾患は、メラニン色素の合成増加で皮膚に局所的に発生し、しみ、そばかす、黒色点、母斑、薬物による色素沈着、炎症後の色素沈着、または皮膚炎に発生する過色素沈着のうちのいずれか１つであるのが好ましい。
【００１７】
本発明は、また、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを含む炎症性疾患の予防または治療用薬剤学的組成物を提供する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、また、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの美白、保湿、抗酸化、抗炎症などの生理学的活性を最初に糾明することで、これを食品、化粧品、製薬分野で利用できるようにする。よって、紅藻類来由のバイオエネルギー生産時に副産物または醗酵阻害剤と思われる３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースをバイオエネルギー産業において高付加価値物質を創出するのに応用される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明に係るアガロースで３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを製造する工程を示す図で、図内のＤＰは多糖類の重合度（Ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を意味する。
【図２】アガロースで３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを製造及び精製する過程を示すＴＬＣ結果であって、進行段階（Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｓｔｅｐ）でレーン１はアガロース、レーン２は酢酸加水分解物、レーン３はＡｇａ５０Ｄ反応産物、レーン４はｓｄＮＡＢＨ反応産物、レーン５はシリカゲルクロマトグラフィーで分離した３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース、レーン６はバイオゲルＰ２クロマトグラフィーで精製した３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースであり、Ｙ軸のＡＨＧは３，６−アンヒドロガラクトース、ＮＡＢはネオアガロビオースを指称する。
【図３】３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース精製の初段階であるシリカゲルクロマトグラフィーＴＬＣ結果を示すもので、図面内ＡＨＧは３，６−アンヒドロガラクトースを指称する。
【図４】Ｄ−形態の３，６−アンヒドロガラクトースの標準物質（ａ）と本発明を介して精製した３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース（ｂ）のＧＣ／ＭＳ  ｔｏｔａｌ  ｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍを示す図である。
【図５】分離精製した３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの１Ｈ  ＮＭＲ分析結果を示す図である。
【図６】分離精製した３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの２Ｄ−ＨＳＱＣ  ＮＭＲ分析結果を示す図である。
【図７】３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース、ネオアガロビオース、Ｄ−ガラクトース及び３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトースの美白活性効果を示す図で、図内のα−ＭＳHはα−ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ、ＮＡＢはネオアガロビオース、Ｄ−ＡＨＧ及びＬ−ＡＨＧはそれぞれＤ−ｆｏｒｍとＬ−ｆｏｒｍの３，６−アンヒドロガラクトースを指称する。
【図８】３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース、ネオアガロビオース、Ｄ−ガラクトース及び３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトースの抗酸化活性効果を示す図である。
【図９】ＨＥＭｓでα−ＭＳＨによって誘導されたチロシナーゼ発現に対するＬ−ＡＨＧの効果を示す図あって、ＡはＬ−ＡＨＧの濃度別処理後のα−ＭＳＨに露出した細胞のチロシナーゼ発現結果であり、Ｂは前記Ａの結果をβ−アクチンに対するチロシナーゼの相手強度で表示するグラフである。
【図１０】ＨＥＭｓでα−ＭＳＨによって誘導されたＴＲＰ−１発現に対するＬ−ＡＨＧの効果を示す図であって、ＡはＬ−ＡＨＧの濃度別処理後のα−ＭＳＨに露出した細胞のＴＲＰ−１発現結果であり、Ｂは前記Ａの結果をβ−アクチンに対するＴＲＰ−１の相手強度で表示するグラフである。
【図１１】インビトロでチロシナーゼ活性に対するＬ−ＡＨＧの効果を示す図である。
【図１２】人の角質細胞でＨＡＳ２発現に対するＬ−ＡＨＧの効果を示す図であって、Ａは１００μｇ／ｍＬのＬ−ＡＨＧの時間別処理後のＨＡＳ２発現水準であり、ＢはＬ−ＡＨＧの濃度別処理後のＨＡＳ２発現水準である。
【図１３】人の角質細胞でＥＲＫの燐酸化に対するＬ−ＡＨＧの効果を示す図であって、Ａは１００μｇ／ｍＬのＬ−ＡＨＧの時間別処理後のＥＲＫ燐酸化結果であり、ＢはＬ−ＡＨＧの濃度別処理後のＥＲＫ燐酸化結果である。
【図１４】人の角質細胞でＡＫＴの燐酸化に対するＬ−ＡＨＧの効果を示す図であって、Ａは１００μｇ／ｍＬのＬ−ＡＨＧの時間別処理後のＡＫＴ燐酸化結果であり、ＢはＬ−ＡＨＧの濃度別処理後のＡＫＴ燐酸化結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の構成を具体的に説明する。
【００２４】
本発明は、アガロースと０．５〜６０％（ｗ／ｖ）濃度の弱酸を４０〜１５０℃の温度範囲で１００〜２００ｒｐｍの条件に３０分〜６時間の間反応させてアガロオリゴ糖を製造する段階と、前記アガロオリゴ糖とアガロース分解酵素及びネオアガロビオース加水分解酵素を２０〜４０℃の温度範囲で０〜２００ｒｐｍの条件に３０分〜７日間反応させる段階とを含む３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法に関する。
【００２５】
本発明の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法は、弱酸を用いたマイルド条件にアガロースを加水分解し、酸加水分解産物から得たアガロオリゴ糖を、二糖体を生産するエキソ型のアガロース分解酵素と反応させてネオアガロビオースを生産し、ネオアガロビオース加水分解酵素との追加反応を介して単糖体であるガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを生産することを特徴とする。
【００２６】
前記３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースは、下記化学式１の構造を有することができる。
【００２７】
【化１】
0006022603.tif 000002
【００２８】
次に、図１に示す３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造工程を参照してより詳しく説明する。
【００２９】
第１段階は、アガロースに弱酸を処理してアガロオリゴ糖を製造する段階である。
【００３０】
前記弱酸は、酢酸（Ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、蟻酸（Ｆｏｒｍｉｃ  ａｃｉｄ）、コハク酸（Ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、クエン酸（Ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ）、リンゴ酸（Ｍａｌｉｃ  ａｃｉｄ）、マレイン酸（Ｍａｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）またはシュウ酸（Ｏｘａｌｉｃ  ａｃｉｄ）などを単独または２種以上用いることができる。
【００３１】
前記弱酸は、生産単価及び弱酸中化後に生成される塩の分離を考慮して０．５〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で用いることが好ましい。より詳しくは２０〜４０％（ｗ／ｖ）の濃度で用いることができる。
【００３２】
前記アガロース及び弱酸の反応は、４０〜１５０℃の温度範囲で１００〜２００ｒｐｍの条件に３０分〜６時間の間実施することができる。前記範囲内の場合、弱酸によるアガロースの過分解物を最小化することができる。
【００３３】
前記反応後に得た反応産物は、アガロオリゴ糖に残存する弱酸と過分解物を除去するために洗浄後に乾燥して粉末状態に修得することができる。
【００３４】
前記洗浄溶媒として炭素数１〜６の低級アルコールを用いることができるが、これに特に限定されない。
【００３５】
第２段階は、アガロオリゴ糖の酵素的分解を介して３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを製造する段階であって、前記酵素的分解はエキソ型のアガロース分解酵素を処理して二糖体であるネオアガロビオースを生産し、続いてネオアガロビオース加水分解酵素を処理してＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースに分解することである。
【００３６】
前記酵素反応は、２０〜４０℃の温度範囲で０〜２００ｒｐｍの条件に３０分〜７日間実施することができる。
【００３７】
次に、前記酵素反応をより詳しくは説明する。
【００３８】
まず、アガロオリゴ糖を分解して二糖体であるネオアガロビオースを生産するアガロース分解酵素は、アガロースのＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとの間のβ−１、４−グリコシド結合を切断する酵素（以下、「Ａｇａ５０Ｄ」とする）を用いることができる。
【００３９】
前記アガロース分解酵素は、序列番号１に記載されたアミノ酸序列及び前記序列と序列同一性が８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び９９％以上のアミノ酸序列を含むことができる。
【００４０】
本発明でポリペプチドがさらに他の序列に対して特定の割合（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％）の序列同一性を有するとのことは、前記２つの序列を整列する際、前記序列の比較時に前記割合のアミノ酸残基が同じであることを意味する。前記整列及び百分率相同性または同一性は、当業界に公知された任意の適当なソフトウェアプログラム、例えば文献［ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌなど（ｅｄｓ）１９８７  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０  ｓｅｃｔｉｏｎ  ７．７．１８）］に記載されたものを使用して決定することができる。好ましいプログラムとしては、ＧＣＧ  Ｐｉｌｅｕｐプログラム、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎなど１９８８  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ８５：２４４４−２４４８）、及びＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌなど、Ｎａｔｌ．Ｃｅｎｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｉｎｆ．，ＮａｔｌＬｉｂ．Ｍｅｄ．（ＮＣＩＢ  ＮＬＭ  ＮＩＨ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，及びＡｌｔｓｃｈｕｌなど１９９７  ＮＡＲ２５：３３８９−３４０２）がある。さらに他の好ましい整列プログラムは、ＡＬＩＧＮ  Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＰＡ）として、好ましくは、基本媒介変数を用いる。使用可能なさらに他の序列ソフトウェアプログラムは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ６．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で利用可能なＴＦＡＳＴＡ  Ｄａｔａ  Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  Ｐｒｏｇｒａｍである。
【００４１】
本明細書において「タンパク質」及び「ポリペプチド」は本願で相互交換可能に用いられる。本願では、アミノ酸残基に対して通常の１文字または３文字コードが用いられる。
【００４２】
前記酵素は、サッカロファガス・デグラダンス（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ  ｄｅｇｒａｄａｎｓ）２−４０から由来したものとすることができるが、これに特に限定されない。
【００４３】
前記酵素は、酵素のコーディング領域の前及び後の領域だけではなく、個別コーディング分節との間の介在序列が含まれたポリペプチドを生産するのに連関されたＤＮＡ分節、すなわちコーディング遺伝子により転写及び翻訳される。例えば、序列番号２に記載された序列とすることができるが、これに特に限定されない。
【００４４】
本発明のアガロース分解酵素は、サッカロファガス・デグラダンス（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ  ｄｅｇｒａｄａｎｓ）の培養物の上澄液または上清液から分離及び精製することができ、遺伝工学的再組合技術を用いてサッカロファガス・デグラダンス（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ  ｄｅｇｒａｄａｎｓ）以外の菌株または人工的な化学的合成法などによって生産及び分離することができる。
【００４５】
再組合技術を用いる場合、通常的な再組合タンパク質発現の容易さのために使われる因子、例えば抗生剤抵抗性遺伝子、親和性コラムクロマトグラフィーに使用されるリポータータンパク質またはペプチッドを用いることができ、このような技術は、本願発明が属する技術分野の当業者なら容易に実施可能な範疇に該当する。また本発明のアガロース分解酵素は、サッカロファガス・デグラダンス（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ  ｄｅｇｒａｄａｎｓ）培養物の上澄液または上清液を代替して用いるか、または食用菌株、例えば酵母に形質転換させて形質転換された酵母の培養物の上澄液または上清液を代替して用いることができる。
【００４６】
本発明において、細胞、核酸、タンパク質またはベクターと係わって使用する際、用語「再組合」は、前記細胞、核酸、タンパク質またはベクターが異種核酸またはタンパク質の導入または本来核酸またはタンパク質の変更によって変形されたか、または前記細胞がこのように変形された細胞から由来したことを示す。すなわち、例えば、再組合細胞は、前記細胞の本来（非再組合）形態内では発見されない遺伝子を発現するか、または異なって発現時に非正常的に発現されるか、または全然発現されない本来遺伝子を発現する。
【００４７】
本明細書において「核酸」は、単一本または二重本ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びこれらの化学的変形体を包括する。「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、本願で相互交換可能に使用される。遺伝暗号が退化されているので、特定アミノ酸をエンコードするために１つ以上のコドンを用いることができ、本発明は特定アミノ酸序列をエンコードするポリヌクレオチドを包括する。
【００４８】
核酸序列を細胞内に挿入する用語「導入」は「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」、または「形質転換」または「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」を意味し、核酸序列の真核または原核細胞内への統合に対する言及が含まれ、このとき前記核酸序列は細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体、またはミトコンドリアＤＮＡ）内に統合されて、自律レプリコンに転換されるか、または一時的に発現される。
【００４９】
前記アガロオリゴ糖及びアガロース分解酵素の反応は、２０〜４０℃の温度範囲で０〜２００ｒｐｍの条件に３０分〜７日間実施することができる。より詳しくは、２５〜３５℃の温度範囲で１００〜１５０ｒｐｍの条件に１日〜４日間実施することができる。
【００５０】
前記アガロオリゴ糖が粉末状態の場合、通常の緩衝溶液に溶かして用いることができるが、これに特に限定されない。
【００５１】
次に、前記酵素反応により生産されたネオアガロビオースをＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースで分解することができるネオアガロビオース加水分解酵素は序列番号３に記載されたアミノ酸序列だけでなく、前記酵素の１つ以上の置換、欠損、転位、添加などの変異タンパク質として前記ネオアガロビオース加水分解活性を有するタンパク質も本発明の酵素の権利範囲に含まれ、好ましくは序列番号３に開示されたアミノ酸序列と序列同一性が８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び９９％以上のアミノ酸序列を含む（以下、「ｓｄＮＡＢＨ」とする）。
【００５２】
前記酵素は、サッカロファガス・デグラダンス（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ  ｄｅｇｒａｄａｎｓ）２−４０から由来したものとすることができるが、これに特に限定されない。
【００５３】
前記酵素は、酵素のコーディング領域の前及び後の領域だけでなく、個別コーディング分節との間の介在序列が含まれたポリペプチドを生産するのに連関されたＤＮＡ分節、すなわちコーディング遺伝子を介して転写及び翻訳される。例えば、序列番号４に記載された序列とすることができるが、これに特に限定されない。
【００５４】
前記ネオアガロビオース加水分解酵素は、サッカロファガス・デグラダンス（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ  ｄｅｇｒａｄａｎｓ）の培養物の上澄液または上清液から分離及び精製することができ、遺伝工学的再組合技術を用いてサッカロファガス・デグラダンス（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ  ｄｅｇｒａｄａｎｓ）以外の菌株または人工的な化学的合成法などによって生産及び分離することができる。
【００５５】
再組合技術を用いる場合、通常的な再組合タンパク質発現の容易さのために使用される因子、例えば抗生剤抵抗性遺伝子、親和性コラムクロマトグラフィーに使用されるリポータータンパク質またはペプチッドを用いることができ、このような技術は、本願発明が属する技術分野の当業者なら容易に実施可能な範疇に該当する。また本発明のネオアガロビオース加水分解酵素は、サッカロファガス・デグラダンス（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ  ｄｅｇｒａｄａｎｓ）培養物の上澄液または上清液を代替して用いるか、または食用菌株、例えば酵母に形質転換させて形質転換された酵母の培養物の上澄液または上清液を代替して用いることができる。
【００５６】
前記ネオアガロビオースとネオアガロビオース加水分解酵素の反応は、２０〜４０℃の温度範囲で０〜２００ｒｐｍの条件に３０分〜７日間実施することができる。より詳しくは２５〜３５℃の温度範囲で１００〜１５０ｒｐｍの条件に１日〜４日間実施することができる。
【００５７】
また、本発明の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法は、ネオアガロビオースの分解産物のうち３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースだけを分離精製する段階をさらに実施することができる。
【００５８】
前記３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースは吸着クロマトグラフィーであるシリカゲルクロマトグラフィー及びゲル透過クロマトグラフィーであるバイオゲルＰ２クロマトグラフィーを順次に実施しておおよそ９６％の高純度で分離精製することができる。
【００５９】
精製した産物は、１Ｈ−ＮＭＲと２Ｄ−Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ（ＨＳＱＣ）ＮＭＲ分析を施行して既存に報告された３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの１Ｈｐｐｍと１３Ｃｐｐｍとを比較して構造を同定することができる。
【００６０】
一具体例によれば、本発明の製造方法を介して１００ｇのアガロースから化学的加水分解を介して７６ｇのアガロオリゴ糖を生産し、Ａｇａ５０ＤとｓｄＮＡＢＨ酵素を用いて３７．５５ｇのネオアガロビオースと１５．２１ｇの３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースをそれぞれ生産し、また２種クロマトグラフィーを用いた精製過程を介して３．９８ｇの純粋な３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを精製することができる。
【００６１】
本発明は、さらに３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース（３，６−ａｎｈｙｄｒｏ−Ｌ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）を含む皮膚美白または保湿用化粧料組成物に関する。
【００６２】
また、本発明は、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの皮膚美白または保湿のための美容的用途を提供する。
【００６３】
前記３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースは、既存の美白物質で最も広く知られているアルブチンよりも美白活性がさらに高く、メラニン合成を促進することと係わったチロシナーゼ、ＴＲＰ−１などの発現を濃度依存的方式で抑制する特徴がある。
【００６４】
本発明の一具体例によれば、インビートでチロシナーゼ活性実験において、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースはチロシナーゼ活性を抑制するのでなく、酵素の発現を抑制することで美白効果を示す。
【００６５】
また、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースは、ヒアルロン酸の合成に関与する保湿マーカーであるＨＡＳ２タンパク質の発現を促進する特徴がある。
【００６６】
本発明の一具体例によれば、ＨＡＳ２発現は、ＥＲＫ及びＡＫＴなどの多様な炎症信号伝達経路によって調節されるが、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースはＥＲＫ及びＡＫＴの燐酸化を増加させ、増加された燐酸化されたＥＲＫ及びＡＫＴはＨＡＳ２発現を増加させることができる。
【００６７】
前記３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースは合成して用いるか、または本発明に係る３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法により製造されたものを制限なく用いることができる。
【００６８】
有効量を基準として、前記３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを自体または化粧品学的に許容された担体を混合した組成物を機能性成分で含む化粧料または化粧品を提供するが、一般的な乳化剤形及び可溶化剤形の形態で製造することができる。乳化剤形の化粧品としては、栄養化粧水、クリーム、エッセンスなどがあり、可溶化剤形の化粧品としては柔軟化粧水がある。好適な化粧品の剤形としては、例えば溶液、ゲル、固体または練り無水生成物、水型に油型を分散させて得たエマルジョン、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微細顆粒球またはイオン型（リボゾーム）、非イオン型の小胞分散剤の形態、クリーム、スキン、ローション、パウダー、軟膏、スプレーまたはコンシールスティックの形態で提供される。
【００６９】
また、フォーム（ｆｏａｍ）の形態または圧縮された推進剤をさらに含むエアロゾル組成物の形態としても製造される。
【００７０】
このとき、上記形態の化粧品製造方法と担体は、当業者に自明な事項であって具体的な製造方法の記載については省略する。
【００７１】
また、前記化粧品は、本発明の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースに追加として脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤及びゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発布剤（ｆｏａｍｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型または非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤及びキレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、新水性または油性と調和活性剤、脂質小胞または化粧品に通常的に用いる任意の他の成分のような化粧品学分野において通常的に使用される補助剤を含むことができる。
【００７２】
前記３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを食品または食品添加物として使用する場合、前記３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースをそのまま添加するか、または他の食品または食品成分とともに用いることができ、通常的な方法により適切に使用される。有効成分の混合量はその使用目的（予防、健康または治療的処置）によって適合に決定することができる。一般に、食品製造時、本発明の組成物は原料に対して１５重量％以下、好ましくは１０重量％以下の量に添加される。しかし、健康及び衛生を目的とするか、または健康調節を目的とする長期間の攝取の場合には、前記量は前記範囲以下とすることができ、安全性面から何ら問題もないので、有効成分は前記範囲以上の量であってもよい。
【００７３】
本発明は、さらに３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを含む皮膚色素沈着疾患の予防または治療用薬剤学的組成物に関する。
【００７４】
また、本発明は、皮膚色素沈着疾患の予防または治療のための薬剤学的組成物の製造のための３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの用途を提供する。
【００７５】
本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的組成物の製造に通常的に使用する適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含むことができる。
【００７６】
本発明の薬剤学的組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、精製、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの外用剤及び滅菌注射溶液の形態に剤形化して用いることができ、好ましくは、クリーム、ゲル、パッチ、噴霧剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、リニメント剤、パスタ剤またはカタプラズマ剤の形態で使用される。
【００７７】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストローズ、スクロース、オリゴ糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、未晶質セルロース、ポリビニールピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油を有することができる。
【００７８】
製剤化する場合には、普通用いる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調剤することが好ましい。
【００７９】
経口投与のための固形製剤としては、精製、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記化合物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを交ぜて調剤することが好ましい。また単純な賦形剤以外にマグネシウムステアレートタルクのような潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤としては、懸濁液剤、内容液剤、油剤、シロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、液体パラフィン以外に多様な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれることができる。非経口投与のための製剤としては、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁液剤、油剤、凍結乾燥製剤、坐剤などが含まれる。非水性溶剤、懸濁液剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用される。坐剤の基材としては、ｗｉｔｅＰＳｏｌ、マクロゴ−ル、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリンジ、グリセロゼラチンなどが使用される。
【００８０】
本発明の薬剤学的組成物は、皮膚に適用することができる皮膚外用剤の剤形としてクリーム、ゲル、パッチ、噴霧剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、リニメント剤、パスタ剤またはカタプラズマ剤の皮膚外用剤形態の薬剤学的組成物として製造して用いることができるが、これに限定されない。
【００８１】
本発明の薬剤学的組成物の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者により適切に選択することができる。しかし、好ましい効果のため、本発明の組成物は、１日に０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇで、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇで投与した方がよい。外用投与は、一日に一度投与することもでき、数回分けて投与することもできる。前記投与量は、いかなる面においても本発明の範囲を限定するものではない。
本発明は、さらに３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの有効量を好ましくはこれを含む薬剤学的または化粧料組成物形態で投与する段階を含む美白または保湿を要求する哺乳動物、好ましくは人間皮膚の美白または保湿のための美容または医療方法に関する。
【００８２】
同様に、本発明は、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを含む薬剤学的または化粧料組成物を皮膚に塗布する段階を含む色素沈着の調節と係わる皮膚の病態、疾患及び／または病便、好ましくはメラニン色素の合成増加により皮膚に局所的に発生し、しみ、そばかす、黒色点、母斑、薬物による色素沈着、炎症後の色素沈着、及び皮膚炎に発生する過色素沈着から選択された１つ以上を治療する美容または医療方法を提供する。
【００８３】
３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを含む薬剤学的または化粧料組成物の塗布頻度は、それぞれの被験者の必要に応じて変わりやすく、塗布頻度は毎月ないし１日１０回、好ましくは毎週ないし１日４回、さらに好ましくは１週当り３回ないし１日３回、最も好ましくは１日１回または２回が提案される。
【００８４】
また、本発明は、皮膚、好ましくは顔、首、首線、手、わき、股座、ヒジ及び／または膝の皮膚、さらに好ましくは、顔、首及び／または手の局所部位の治療、管理及び／または洗浄のための薬剤学的または化粧料組成物の製造において３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの用途に関する。
【００８５】
本発明は、さらに３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを含む炎症性疾患の予防または治療用薬剤学的組成物を提供する。
【００８６】
また、本発明は、薬剤学的有効量の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを含む炎症性疾患の予防または治療用組成物を個体に投与する段階を含む動物の炎症性疾患治療方法を提供する。
【００８７】
さらに、本発明は、炎症性疾患の予防または治療のための薬剤学的組成物の製造のための３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの用途を提供する。
【００８８】
前記３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースは、亜硝酸塩（ｎｉｔｒｉｔｅ、ＮＯ２）の生成を抑制する抗酸化活性があり、これは海藻類を構成する他の二糖及び単糖であるネオアガロビオースとガラクトース、そしてＤ−形態の３，６−アンヒドロガラクトースと比較した場合、最も高く現われて炎症性疾患の予防または治療用薬剤学的組成物として用いることができる（図８参照）。
【００８９】
前記炎症性疾患治療方法に使用される薬剤学的組成物及び投与方法は、上述したので、この２つの間に共通する内容は、本明細書の複雑性を避けるため、その記載を省略する。一方、前記炎症性疾患予防または治療用薬剤学的組成物を投与することができる個体はすべての動物を含む。例えば、犬、猫、マウスのような人間を除いた動物とすることができる。
【００９０】
前記薬剤学的組成物の有効成分の有効量は、疾患の治療をするのに要求される量を意味する。よって、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された有効成分及び他の成分の種類及び含量、剤形の種類及び患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、同時使用する薬物を含めた多様な因子に応じて調節することができる。
【００９１】
さらに「治療」は、症状を軽減させるか、症状の原因を一時的または永久的に除去するか、または症状の出現及び上記の疾病、障害または疾患の進行を予防または鈍化させることを含むが、これに限定されない。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
以下、本発明を、実施例を介して詳しく説明する。下記実施例は本発明を例示することであるだけ本発明の範囲が下記実施例に限定されるのではない。
【００９３】
＜実施例１＞酢酸を用いたアガロースの加水分解
海藻類を構成する代表的な多糖体であるアガロースを、酢酸を用いて加水分解した。５％（ｗ／ｖ）のアガロースを３Ｍ酢酸と８０℃で７０分間反応させた後に乾燥させて酢酸を除去した。また、エチルアルコールを使った洗浄過程を介して乾燥後に残存している酢酸及び加水分解時に生成される過分解物を除去して純粋な粉末状態のアガロオリゴ糖を生産した（図２）。
【００９４】
＜実施例２＞Ａｇａ５０Ｄ、ｓｄＮＡＢＨを用いた３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの生産
実施例１から生産した酸加水分解物から単糖体であるＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースに分解するためにエキソ型（ｅｘｏ−ｔｙｐｅ）の二糖体生産酵素であるＡｇａ５０Ｄ（大韓民国公開特許第２０１０−００４０４３８号参照）と反応させて、反応産物としてネオアガロビオースを生産した。
【００９５】
Ａｇａ５０Ｄ反応が終了した後にネオアガロビオースから単糖体であるＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを生産するためにＡｇａ５０Ｄ反応産物をｓｄＮＡＢＨ酵素（大韓民国公開特許第２０１０−０１０８２４１号参照）と反応させた。酵素反応条件は１００ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．４）に５％（ｗ／ｖ）アガロオリゴ糖を溶かした後３０℃において１５０ｒｐｍの条件に３日間反応させた。酵素反応時に使用した酵素の量は、Ａｇａ５０Ｄが１０ｍｇ、ｓｄＮＡＢＨが２．５ｍｇであった（図２）。
【００９６】
＜実施例３＞シリカゲルクロマトグラフィーとバイオゲルＰ２クロマトグラフィーを用いた分離精製
実施例１と２によって生産された反応産物のうちに３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースだけを分離精製するためにクロマトグラフィーを実施した。反応産物をセルライトに吸着させてパウダー形態のサンプルを製造した後に吸着クロマトグラフィーであるシリカゲルクロマトグラフィーを実施した。移動相は、クロロホルム：メタノール：水をそれぞれ７８：２０：２（ｖ／ｖ／ｖ）の割合で混合した溶媒を使用し、全体移動相の溶媒の体積は３Ｌであった。一分画の体積は２０ｍＬであって、総１５０分画のサンプルをＴＬＣで分析した後にそのうち３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースがある分画を集めた。さらに進行するバイオゲルＰ２クロマトグラフィーは分子量により物質が分離されるので、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースがある分画のうちから３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースと分子量が類似するＤ−ガラクトースがある分画は除去した（図３）。
【００９７】
バイオゲルＰ２クロマトグラフィーを介して二糖体及び重合度が低いアガロオリゴ糖から３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースだけを純粋にすることができる。このときに使用する移動相は水であり、一分画当たり体積は２ｍＬであった。各分画のうちＴＬＣ上から３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトーススパッだけを示す分画のみを集めて高純度の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを得た（図２）。
【００９８】
図２に示すように、実施例１〜３を介して１００ｇのアガロースから化学的加水分解を介して７６ｇのアガロオリゴ糖を生産し、Ａｇａ５０ＤとｓｄＮＡＢＨ酵素を用いて３７．５５ｇのネオアガロビオースと１５．２１ｇの３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースをそれぞれ生産した。さらに２種クロマトグラフィーを用いた精製過程を介して３．９８ｇの純粋な３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを精製した。
【００９９】
また、図３に示すように、湧出体積（Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｖｏｌｕｍｅ）（Ｌ）の０．２５〜０６７では何も現れず、０．７７〜１．７７では３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース及びガラクトースを除外した異なる糖が現れ（濃縮した後のバイオゲルＰ２クロマトグラフィーに使用したサンプル）、１．８７〜２．６７では、ガラクトースと異なる糖が現れた。
【０１００】
＜実施例４＞ＧＣ／ＭＳ分析による３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの定性及び定量
実施例３によって生産された高純度の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースをＧＣ／ＭＳで分析して定量した。ＧＣ／ＭＳ分析のための誘導体化過程は次のようになる。精製したサンプルをスピードバッグで乾燥した後に５０μｌの２％（ｗ／ｖ）のＯ−メチルヒドロキシルアミンヒドロクロライド／ピリジン（Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｉｎ  ｐｙｒｉｄｉｎｅ）を入れて７５℃において３０分間反応させた。そして、８０μｌのＮ−メチル−Ｎ−（トリメチルシリル）トリプルオロアセタマイド（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）を入れて４０℃において１５０ｒｐｍで３０分間反応させた。ＧＣ／ＭＳ分析のための機器条件は次のようになる。分析時に使用したコラムはＤＢ５−ＭＳ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｃｏｌｕｍｎであり、ＧＣコラム温度条件は先に１００℃において３．５分間維持し、１６０℃まで昇温させた後２０分間維持した。その後２００℃まで昇温した後に１５分間維持し、最後に２８０℃まで昇温した後に５分間維持した。１μｌのサンプルを９．６の分割比（ｓｐｌｉｔ  ｒａｔｉｏ）で分析した（図４）。
【０１０１】
＜実施例５＞１Ｈ−ＮＭＲと２Ｄ  ＨＳＱＣ  ＮＭＲ分析による３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの構造糾明
実施例１〜３によって生産された高純度の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース化学構造の糾明のためにＮＭＲ分析をした。２ｍｇの３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースサンプルをＤ２Ｏに溶かし、化学的移動（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｈｉｆｔ）を計算するために内部標準（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｓｔａｎｄａｒｄ）で３−（トリメチルシリル）−プロピオニック−２，２，３，３−ｄ４アシッド（３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ−２、２、３、３−ｄ４  ａｃｉｄ）を入れた。１Ｈ−ＮＭＲと２Ｄ  ＨＳＱＣ  ＮＭＲの化学的移動は、この以前に報告された文献の結果値と比較して構造を糾明して確認した（Ｓｕｇａｎｏ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６（２２）６８１２−６８１８，Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８２）Ａｕｓｔ  Ｊ  Ｃｈｅｍ．３５（４）８５３−８５６）（図５及び図６）。
【０１０２】
＜実施例６＞分離、精製した３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの美白効果及び抗酸化活性の調査
実施例１〜３によって生産された高純度の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの美白活性を測定するために黒色腫細胞（ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌ）であるＢ１６Ｆ１０を培養した。メラニン生成を促進するホルモンであるα−メラニン細胞刺激ホルモン(α−ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎg  ｈｏｒｍｏｎｅ）を処理する前に美白剤として最も広く使用されるアルブチンと紅藻類を構成する糖類であるネオアガロビオース、Ｄ−ガラクトース、３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトース、そして３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースをそれぞれ１，１０，１００μｇ／ｍＬで処理した後にα−メラニン細胞刺激ホルモンと反応を実施した。４日を一緒に培養した後に４７５ｎｍ吸光度を測定してメラニン含量を分析した。
【０１０３】
その結果３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが他の処理群より美白活性が非常に優れており、実際の美白活性機能性物質としてよく知られたアルブチンよりも活性が高く示された（図７）。
【０１０４】
＜実施例７＞分離、精製した３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの抗酸化活性
実施例１〜３によって生産された高純度の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの抗酸化活性を測定するためにＲＡＷ２６４．７細胞培養液のｎｉｔｒｉｔｅ（ＮＯ２）の濃度をＧｒｉｅｓｓ反応方法で測定した。２μｇ／ｍＬ濃度のリポポリサカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃａｈｒｉｄｅｓ）を細胞に処理しながらネオアガロビオース、ガラクトース、３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトース、そして３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースをそれぞれ５０，１００，２００μｇ／ｍＬ濃度で処理した後に一緒に処理して抗酸化活性測定をした。２４時間を一緒に培養した後に５４０ｎｍ吸光度を測定して抗酸化活性分析した。
【０１０５】
その結果３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが他の処理群よりも抗酸化活性が非常に優れており、これは以前に報告された３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトースの活性よりも高く示された（図８）。
【０１０６】
＜実施例８＞３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの人の表皮メラニン細胞で美白効果実験
メラニンは皮膚及び髪の毛の色を決定する天然色素である。メラニンの知られた主要機能は吸収及び散乱された紫外線の照射による紫外線によるＤＮＡ損傷から保護するものである。しかし、過糧のメラニン生成または非正常的な分布は、しみ、そばかす、老人性黒点などの不規則的な皮膚過色素沈着を誘発する。紫外線の照射はα−ＭＳＨ（α−ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、ＡＣＴＨ及びそれらの関連収容体であるｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ  １  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＭＣ１Ｒ）の水準を増加させてチロシナーゼ及びチロシナーゼ関連タンパク質（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＴＲＰｓ）を含めてメラニン生合成酵素の発現を促進することが先行研究で明らかになった。銅含有糖蛋白質であるチロシナーゼは特定細胞器官、すなわち、メラニン細胞でのみ生成されるメラニン小体でメラニン合成のための重要な速度−調節段階酵素である。よって、チロシナーゼ発現の減少は皮膚着色を抑制するための良い戦略であるものと看做される。
【０１０７】
また、ＴＲＰ−１は、構造的にチロシナーゼと連関されていて、〜４０％アミノ酸相同性を共有し、チロシナーゼのようにメラニン小体に存在する。先行研究報告によると、ＴＲＰ−１の突然変異結果、青白い皮膚または髪の毛色が現れ、眼皮膚白皮症の特定タイプで現れる。また、ＴＲＰ−１は、ＴＲＰ−１発現抑制が低色素沈着症と連関されているので、メラニン生合成で役割を担当するものと提示されている。
【０１０８】
したがって、Ｌ−ＡＨＧの皮膚美白活性可能性を評価するため、α−ＭＳＨにより誘導されたチロシナーゼ及びＴＲＰ−１発現に対するＬ−ＡＨＧの効果を調査した。
【０１０９】
そのための細胞として適当に着色された新生児包皮来由の人の表皮メラニン細胞（Ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ、ＨＥＭｓ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ））を使用した。細胞は５％  ＣＯ２を含む加湿雰囲気で３７℃の温度条件に培養した。ＨＥＭｓに対する生長培地はＨＭＧＳを添加したＭｅｄｉｕｍ  ２５４（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｏｒｅｇｏｎ、ＵＳＡ））である。
【０１１０】
ＨＥＭ（１×１０５）を６−ｃｍディッシュで２４時間の間培養した。何日間１００ｎＭ  α−ＭＳＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）に露出する前に前記細胞に０，２５，５０及び１００μｇ／ｍＬ濃度の３，６−ａｎｈｙｄｒｏ−Ｌ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ（Ｌ−ＡＨＧ）を１時間の間処理した。溶菌バッファ［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭ  Ｎａ２  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，２．５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１ｍＭ  β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１ｍＭ  Ｎａ３  ＶＯ４、１ｇ／ｍＬ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）及びｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ  ｔａｂｌｅｔ］で細胞を溶解した。タンパク質濃度は、染料が結合されたタンパク質分析キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて製造社のマニュアルに応じて測定した。溶解されたタンパク質（２０−４０μｇ）に対して１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、誘電泳動によってポリビニリデンフルオライド（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ、ＰＶＤＦ）メンブレインでトランスファした（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）。ブロティング後、５％スキムミルク（ＭＢ  ｃｅｌｌ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で２時間の間メンブレインをブロッキングして１次抗体（ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ＨＲＰ）とともに、４℃でオーバーナイト間インキュベーションした。続いて、前記メンブレインを２次抗体（ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）とともに、インキュベーションし、化学発光検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて抗体が結合されたタンパク質を検出した。対照群としてβ−アクチンの発現水準を測定した。データは２回独立実験の代表値を示すものである。
【０１１１】
インビートでチロシナーゼ分析は、既報告された方法（Ｉｓｈｉｈａｒａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（Ｔｏｋｙｏ）１９９１；４４：２５−３２；Ａｎ  ＳＭ、Ｋｏｈ  ＪＳ、Ｂｏｏ  ＹＣ、Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ２０１０；２４：１１７５−１１８０）を少し変形して実行した。簡単に言って、２５０μｌの０．１Ｍポタシウムフォスフェートバッファ（ｐＨ６．８）を２４−ウェルプレート上に入れ、２５μｌのキノコ来由のチロシナーゼ（２０００ｕｎｉｔ／ｍＬ）、２５μｌの試料及び２２５μｌの蒸溜水を前記ウェルに付加した。前記プレートは、２５℃において１０分間インキュベーションし、２５μｌの１ｍＭＬ−チロシンを前記ウェルに付加して基質として使用した。２５℃において１０分間インキュベーションした後、ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｓｕｎｒｉｓｅ−Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃａｎ、Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて４７５ｎｍで各ウェルの吸光度を測定した。各測定する対照群に対する変化率（％）で表示した。Ｌ−チロシンを基質として使用し、アルブチンを養成対照群として使用した。結果は未処理対照群に対してチロシナーゼ相手活性として表現した。
【０１１２】
図９に示すように、α−ＭＳＨにより誘導されたチロシナーゼ発現を比較すると、１００μｇ／ｍＬのＬ−ＡＨＧを処理した場合、ＨＥＭｓでα−ＭＳＨにより誘導されたチロシナーゼ発現が有意的に減少した。
【０１１３】
また、Ｌ−ＡＨＧ処理によるチロシナーゼ発現減少と類似に（図９Ａ）、ＴＲＰ−１発現は、ＨＥＭｓでＬ−ＡＨＧ濃度依存的方式に減少した（図１０）。
【０１１４】
次に、無細胞分析システムを用いてチロシナーゼ活性に対するＬ−ＡＨＧの効果を調査した。多くの報告で、キノコ来由のチロシナーゼは精製形態で直ちに用いることができ、モデルとして一次的に使用したと記載している。Ｌ−チロシンの競争的抑制剤であるアルブチン（Ａｒｂｕｔｉｎ）は養成対照群として使用し、これはキノコのチロシナーゼ活性を抑制する（図１１）。結果は、未処理対照群に対するチロシナーゼの相手活性として表示した。データは３回独立実験から平均±Ｓ．Ｄ．として示し、単一統計比較のためにスチューデントテストを使用した。統計的意義に対する基準としてｐ＜０．０５の有意性値を使用した。別表は、未処理対照群と比較して有意的な差（ｐ＜０．０５）を示すものである。
【０１１５】
図１１に示すように、Ｌ−ＡＨＧは、キノコのチロシナーゼ活性においてどのような有意的な減少も誘導しなかった。アルブチンは２００μＭの濃度で、４０％までチロシナーゼ活性を減少させた。
【０１１６】
前記結果を総合すると、Ｌ−ＡＨＧは、チロシナーゼ及びＴＲＰ−１の発現を抑制する新規の低色素沈着剤であることを示唆する。
【０１１７】
＜実施例９＞３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの人の角質細胞で保湿効果実験
ヒアルロナン（Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ、ＨＡ）は、Ｄ−グルクロン酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンで構成されたグリコサミノグリカンである。多量の水を保管することができる能力により、ＨＡは水分バランス及び浸透圧を調節することにおいて重要な役割を担当する。 ＨＡは、ＨＡＳ１、２及び３により細胞膜で合成され、特にＨＡＳ２は人の正常組職で現れる。先行研究において、ＨＡＳ２の遺伝子欠乏はマウスモデルで胎児期致死率を誘発し、成人の皮膚の表皮及び真皮で減少されたＨＡＳ２遺伝子発現を見せる。よって、ＨＡＳ２発現増加は皮膚恒常性を維持するための良い戦略とすることができる。ＨＡＳ２発現に対するＬ−ＡＨＧの誘導時点及び濃度を測定するため、ウエスタンブロット分析を実行した。
【０１１８】
このために使用された細胞は、ＨａＣａＴ細胞として１０％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンが添加されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ（登録商標）  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａｕｃｋｌａｎｄ、ＮＺ）を用いて５％  ＣＯ２雰囲気下で３７℃で培養した。
【０１１９】
細胞（１×１０５）を６−ｃｍディッシュで２４時間の間培養した後、無血清培地でさらに２４時間の間飢えさせてキナーゼの活性化に対するＦＢＳの影響を除去した。その後、日程時間及び濃度で３，６−ａｎｈｙｄｒｏ−Ｌ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ（Ｌ−ＡＨＧ）を処理した。溶菌バッファ［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２．５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１ｍＭ  β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｇ／ｍＬ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）及びｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ  ｔａｂｌｅｔ］で細胞を溶解させた。タンパク質濃度は、染料が結合されたタンパク質分析キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いて製造社のマニュアルに応じて測定した。溶解されたタンパク質（２０−４０μｇ）に対して１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、誘電泳動によりポリビニリデンフルオライド（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＶＤＦ））メンブレインでトランスファした（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ、ＵＳＡ）。ブロティング後、５％スキムミルクで２時間の間メンブレインをブロッキングし、１次抗体（ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ＨＲＰ）とともに、４℃でオーバーナイト間インキュベーションした。続いて、前記メンブレインを２次抗体（ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）とともに、インキュベーションし、化学発光検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて抗体が結合されたタンパク質を検出した。データは２回独立実験の代表値を示した。
【０１２０】
図１２に示すように、Ｌ−ＡＨＧは、処理３時間後ＨＡＳ２発現を増加させた。また、Ｌ−ＡＨＧは、濃度依存的な方式でＨＡＳ２発現を増加させた。
【０１２１】
ＨＡＳ２発現は、ＭＡＰＫｓ及びＡＫＴなどの多様な炎症信号伝達経路によって調節されることが既に明かされている。よって、多様な炎症信号伝達経路でＬ−ＡＨＧの効果を測定した。
【０１２２】
図１３Ａに示すように、１００μｇ／ｍＬのＬ−ＡＨＧは、処理３時間後、ＥＲＫの燐酸化を有意的に増加した。ＥＲＫの燐酸化に対するＬ−ＡＨＧの濃度依存的な効果を測定するため、２５，５０及び１００μｇ／ｍＬのＬ−ＡＨＧを処理した。Ｌ−ＡＨＧによち誘導されたＨＡＳ２発現と類似に（図１３Ｂ）、ＥＲＫの燐酸化はＬ−ＡＨＧ濃度依存的な方式で増加した。
【０１２３】
図１４Ａに示すように、１００μｇ／ｍＬのＬ−ＡＨＧは、処理３時間後、ＡＫＴの燐酸化を有意的に増加させた。ＡＫＴの燐酸化に対するＬ−ＡＨＧの濃度依存的な効果を測定するため、２５，５０及び１００μｇ／ｍＬのＬ−ＡＨＧを処理した。Ｌ−ＡＨＧは、濃度依存的な方式でＡＫＴの燐酸化を増加させた（図１４Ｂ）。
【０１２４】
前記結果を総合すると、Ｌ−ＡＨＧにより誘導されたＥＲＫ及びＡＫＴの燐酸化は、Ｌ−ＡＨＧによるＨＡＳ２発現増加に寄与するものと見られる。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本発明は、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを美白剤として用いることができる。
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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