(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチド（Ｐ）及び基材（Ｂ）からなり、接着性細胞（Ｓ）の細胞集合体を培養するための細胞集合体培養用基材であって、
（Ｐ）が、配列（７５）のポリペプチド、配列（７６）のポリペプチド、配列（７７）のポリペプチド、配列（７８）のポリペプチド、配列（７９）のポリペプチド及び配列（８０）のポリペプチドからなる群より選ばれる少なくとも１種である細胞集合体培養用基材。
【請求項２】
細胞集合体培養用基材に播種した接着性細胞（Ｓ）のうち、基材に接着する（Ｓ）の割合を示す細胞接着率が４〜２０％である請求項１に記載の細胞集合体培養用基材。
【請求項３】
細胞集合体培養用基材表面におけるポリペプチド（Ｐ）の含有量が、細胞集合体培養用基材の単位面積（ｃｍ２）あたり０．１〜５μｇである請求項１又は２に記載の細胞集合体培養用基材。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の細胞集合体培養用基材を用いて、培養温度２５〜４５℃で１〜１０日間、接着性細胞（Ｓ）を培養する細胞集合体の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞集合体培養用基材及び細胞集合体の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、さまざまな方法で細胞培養が行われている。細胞には、接着性細胞と浮遊性細胞とがあり、接着性細胞の細胞培養としては、例えば、細胞接着性ポリペプチドを有する基材（特許文献１）や、フィブロネクチンを有する基材等の培養基材を用いて、基材に細胞を接着させて培養する方法が知られている。
【０００３】
また、近年、接着性細胞を三次元で培養する細胞集合体培養方法が注目されている。細胞集合体培養は、細胞の集合体を形成させることにより生体に近い三次元の構造体で細胞を培養する方法である。細胞集合体培養により生産された細胞の集合体（細胞集合体）は、薬剤の毒性及び薬理活性評価のシミュレータや、ハイブリッド型人工臓器、バイオリアクタなどの分野において利用されることが期待されている。しかしながら、細胞集合体培養方法に細胞接着性のポリペプチドを有する培養基材を用いると、基材と細胞との接着力が強すぎるため、細胞が三次元構造（細胞集合体）を形成しにくいという問題がある。
【０００４】
そこで、細胞接着性の低い細胞低接着性コーティング材料を有する基材を用いることが試みられている。細胞低接着性コーティング材料としては、アガー、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレート及びポリエチレングリコール等が知られており、幹細胞や肝細胞などの接着性細胞の細胞集合体培養用の細胞培養器や創傷被覆剤などの医療素材に使用されている。
【０００５】
接着性細胞は、培養基材や細胞同士で接着することにより生存のシグナルが入り、アポトーシスを引き起こすカスパーゼの活性を抑制して生存・増殖しているが、培養基材等に接着できない場合、生存シグナルが入らないため、カスパーゼが活性化されアポトーシスを引き起こし、生存・増殖できない。したがって、細胞低接着性コーティング材料を有する基材を用いた場合、アポトーシスが起こりやすく、細胞が生存・増殖しにくいという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−１７０８１０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、接着性細胞を培養する基材であって、アポトーシスを起こしにくく、培養した細胞の生存率が高い細胞集合体を生産することができる細胞集合体培養用基材を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究を重ねてきた結果、本発明に到達した。
すなわち、本願発明の細胞集合体培養用基材は、
ポリペプチド（Ｐ）及び基材（Ｂ）からなり、接着性細胞（Ｓ）を細胞集合体を培養するための細胞集合体培養用基材であって、（Ｐ）がアミノ酸配列（Ｘ）を有するポリペプチドであり、（Ｘ）が下記ペンタペプチド配列、下記ヘキサペプチド配列、Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ配列（１２）及びＡｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ配列（１３）からなる群より選ばれる少なくとも１種である細胞集合体培養用基材である。
ペンタペプチド配列：Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ配列（１）、Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ配列（２）、Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ配列（３）、Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ配列（４）及びＰｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ配列（５）からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列。
ヘキサペプチド配列：Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｐｒｏ配列（６）、Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ配列（７）、Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ配列（８）、Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ配列（９）、Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ配列（１０）及びＰｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ配列（１１）からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の細胞集合体培養用基材は、アポトーシス抑制効果が高く、培養した細胞の生存率が高い細胞集合体を生産することができるという効果を奏する。
また、本発明の細胞集合体の生産方法は、生物活性の高い細胞集合体を生産できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１〜６及び比較例１〜３について、ポリペプチド（Ｐ）のコーティング量に対するＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（マウス間葉系細胞）の細胞接着率の変化を表したグラフである。
【図２】実施例１〜６及び比較例１〜３について、ポリペプチド（Ｐ）のコーティング量に対するＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（マウス骨芽細胞）の細胞接着率の変化を表したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の細胞集合体培養用基材は、ポリペプチド（Ｐ）及び基材（Ｂ）からなり、接着性細胞（Ｓ）の細胞集合体を培養するための細胞集合体培養用基材である。
本発明において細胞集合体培養は、接着性細胞（Ｓ）の集合体を形成させ、（Ｓ）を三次元の構造体として培養する方法である。また、本発明において細胞集合体は、接着性細胞（Ｓ）が多数凝集して三次元の構造体となったものを示す。
【００１２】
ポリペプチド（Ｐ）は、アミノ酸配列（Ｘ）を含む。
アミノ酸配列（Ｘ）は、下記ペンタペプチド配列、下記ヘキサペプチド配列、Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ配列（１２）及びＡｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ配列（１３）からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列。
ペンタペプチド配列：Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ配列（１）、Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ配列（２）、Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ配列（３）、Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ配列（４）、Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ配列（５）からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列。
ヘキサペプチド配列：Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｐｒｏ配列（６）、Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ配列（７）、Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ配列（８）、Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ配列（９）、Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ配列（１０）、Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ配列（１１）からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列。
【００１３】
上記アミノ酸配列（Ｘ）のうち、細胞の低接着性及びアポトーシス抑制効果の観点から、ペンタペプチド配列が好ましく、さらに好ましくはＧｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ配列（１）である。
【００１４】
ポリペプチド（Ｐ）は、アミノ酸配列（Ｘ）を（Ｐ）の１分子中に少なくとも１個有すればよいが、細胞の低接着性及びアポトーシス抑制効果の観点から、１分子中に１０〜２００個有するものが好ましく、さらに好ましくは４５〜１３０個有するものである。
なお、２種以上のアミノ酸配列（Ｘ）がポリペプチド（Ｐ）１分子中に含まれていてもよい。
【００１５】
ポリペプチド（Ｐ）は、さらに、補助アミノ酸配列（Ｙ）を有してもいい。
補助アミノ酸（Ｙ）は、Ｇｌｙ  Ａｌａ配列、Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ配列（１４）、Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ配列（１５）、Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ配列（１６）、Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ配列（１７）及び下記配列（Ｙ−６）からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
配列（Ｙ−６）：Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  （Ａｌａ）ｆ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｌａ配列。なお、ｆは１〜４４の整数である。
【００１６】
補助アミノ酸配列（Ｙ）のうち、細胞の低接着性およびポリペプチド（Ｐ）の熱安定性の観点から、Ｇｌｙ  Ａｌａ配列、Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ配列（１４）、Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ配列（１５）が好ましく、さらに好ましくはＧｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ配列（１４）である。
【００１７】
ポリペプチド（Ｐ）が補助アミン酸配列（Ｙ）を有する場合、（Ｙ）を（Ｐ）の１分子中に少なくとも１個有すればよいが、細胞の低接着性及びポリペプチド（Ｐ）の熱安定性の観点から、１分子中に１０〜１００個有するものが好ましく、さらに好ましくは１５〜６０個有するものである。
なお、２種以上の補助アミノ酸配列（Ｙ）が（Ｐ）１分子中に含まれていてもよい。
【００１８】
ポリペプチド（Ｐ）が補助アミノ酸配列（Ｙ）を有する場合、ポリペプチド（Ｐ）の熱安定性の観点から、（Ｐ）の分子中に（Ｙ）が複数回繰り返した配列を有することが好ましい。例えば、（Ｇｌｙ  Ａｌａ）ａ配列、（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）ｂ配列、（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ）ｃ配列、（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ）ｄ配列、（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ）ｅ配列及び｛Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  （Ａｌａ）ｆ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｌａ｝ｇ配列が挙げられる。なお、ａは１〜２５の整数、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは１〜８の整数、ｆは１〜４４の整数、ｆが１の場合ｇは１〜７の整数、ｆが２の場合ｇは１〜６の整数、ｆが３又は４の場合ｇは１〜５の整数、ｆが５又は６の場合ｇは１〜４の整数、ｆが７〜１０の整数の場合ｇは１〜３、ｆが１１〜１９の整数の場合ｇは１又は２、ｆが２０〜４４の整数の場合ｇは１である。
【００１９】
（Ｇｌｙ  Ａｌａ）ａ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列（１８）〜（２０）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）ｂ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列（２１）〜（２３）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ）ｃ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列（２４）〜（２６）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ）ｄ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列（２７）〜（２９）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ）ｅ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列（３０）〜（３２）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
｛Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  （Ａｌａ）ｆ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｌａ｝ｇ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列（３３）〜（３５）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
【００２０】
これらの補助アミノ酸配列（Ｙ）のうち、細胞の低接着性及びポリペプチド（Ｐ）の熱安定性の観点から、配列（２１）〜（２３）が好ましく、さらに好ましくは配列（２１）及び（２２）である。
【００２１】
補助アミノ酸配列（Ｙ）は、細胞の低接着性及びポリペプチド（Ｐ）の熱安定性の観点から、Ｇｌｙ及び／又はＡｌａを含むことが好ましい。Ｇｌｙ及び／又はＡｌａを含む場合、これらの合計含有割合（％）は、補助アミノ酸配列（Ｙ）の全アミノ酸個数に基づいて、細胞の低接着性及びポリペプチド（Ｐ）の熱安定性の観点から、１０〜１００が好ましく、さらに好ましくは２０〜９５、特に好ましくは３０〜９０、最も好ましくは４０〜８５である。
【００２２】
補助アミノ酸配列（Ｙ）にＧｌｙ及びＡｌａの両方を含む場合、これらの含有個数割合（Ｇｌｙ／Ａｌａ）は、細胞の低接着性及びポリペプチド（Ｐ）の熱安定性の観点から、０．０３〜４０が好ましく、さらに好ましくは０．０８〜１３、特に好ましくは０．２〜５である。
【００２３】
ポリペプチド（Ｐ）は、さらに、アミノ酸配列（Ｘ’）を有してもいい。
アミノ酸配列（Ｘ’）は、アミノ酸配列（Ｘ）中の１個又は２個のＶａｌがＬｙｓに置換された配列である。
【００２４】
（Ｘ’）としては、アミノ酸配列（Ｘ）中の１個のＶａｌがＬｙｓに置換された下記配列（Ｘ’−１）〜（Ｘ’−４）又はアミノ酸配列（Ｘ）中の２個のＶａｌがＬｙｓに置換された下記配列（Ｘ’−５）〜（Ｘ’−８）を含む。
（Ｘ’−１）：ペンタペプチド配列中の１個のＶａｌがＬｙｓに置換された配列。具体的には、Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ配列（３６）、Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ配列（３７）、Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ配列（３８）、Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ配列（３９）、Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ配列（４０）、Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ配列（４１）、Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ配列（４２）、Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ配列（４３）、Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ配列（４４）又はＰｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ配列（４５）。
（Ｘ’−２）：ヘキサペプチド配列中の１個のＶａｌがＬｙｓに置換された配列。具体的には、Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｐｒｏ配（４６）、Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｒｏ配列（４７）、Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ配列（４８）、Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ配列（４９）、Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ配列（５０）、Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ配列（５１）、Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ配列（５２）、Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ配列（５３）、Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ配列（５４）、Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ配列（５５）、Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ配列（５６）又はＰｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ａｌａ配列（５７）。
（Ｘ’−３）：配列（１２）のアミノ酸配列中の１個のＶａｌがＬｙｓに置換された配列。具体的には、Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ配列（５８）又はＡｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ配列（５９）。
（Ｘ’−４）：配列（１３）のアミノ酸配列中の１個のＶａｌがＬｙｓに置換された配列。具体的には、Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ配列（６０）又はＡｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ配列（６１）。
（Ｘ’−５）：ペンタペプチド配列中の２個のＶａｌがＬｙｓに置換された配列。具体的には、Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ配列（６２）、Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ配列（６３）、Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ配列（６４）、Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ配列（６５）又はＰｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ配列（６６）。
（Ｘ’−６）：ヘキサペプチド配列中の２個のＶａｌがＬｙｓに置換された配列。具体的には、Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｒｏ配列（６７）、Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ配列（６８）、Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ配列（６９）、Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ配列（７０）、Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ配列（７１）又はＰｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ａｌａ配列（７２）。
（Ｘ’−７）：配列（１２）のアミノ酸配列中の２個のＶａｌがＬｙｓに置換された配列。具体的には、Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ配列（７３）。
（Ｘ’−８）：配列（１３）のアミノ酸配列中の２個のＶａｌがＬｙｓに置換された配列。具体的には、Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ配列（７４）。
【００２５】
アミノ酸配列（Ｘ’）のうち、細胞の低接着性及びアポトーシス抑制の観点から、（Ｘ’−１）が好ましく、さらに好ましくはＧｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ配列（３６）である。
ポリペプチド（Ｐ）１分子中には、２種以上の（Ｘ’）を含んでもいい。
【００２６】
ポリペプチド（Ｐ）がアミノ酸配列（Ｘ’）を有するものである場合、（Ｐ）１分子中に（Ｘ’）を少なくとも１個有すればよいが、細胞の低接着性及びアポトーシス抑制の観点から、（Ｐ）１分子中に１〜２０個有するものが好ましく、さらに好ましくは６〜１７個、最も好ましくは１３個である。
【００２７】
また、（Ｐ）１分子中の（Ｘ）の数と（Ｘ’）の数との比（（Ｘ）／（Ｘ’））は、細胞の低接着性及びアポトーシス抑制の観点から、５〜２０が好ましく、さらに好ましくは７〜１５である。
【００２８】
上記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は（Ｘ’）の両端には、介在アミノ酸配列（Ｚ）を含んでもいい。
介在アミノ酸配列（Ｚ）としては、アミノ酸配列（Ｘ）、アミノ酸配列（Ｘ’）及び補助アミノ酸配列（Ｙ）以外のアミノ酸配列が含まれ、アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）及び／又はヒスチジン（Ｈｉｓ）等から構成されるアミノ酸配列が含まれる。
（Ｚ）は、アミノ酸１個又はアミノ酸が２個以上結合したペプチド配列である。（Ｚ）を構成するアミノ酸の数は、ペプチドの熱安定性の観点から、１〜３０個が好ましく、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個である。
【００２９】
ポリペプチド（Ｐ）は、発現させた（Ｐ）の精製または検出を容易にするために、（Ｐ）のＮ又はＣ末端に特殊なアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド（以下これらを「精製タグ」と称する）を有してもいい。精製タグとしては、アフィニティー精製用のタグが利用される。そのような精製タグとしては、ポリヒスチジンからなる６×Ｈｉｓタグ、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＡＵ１タグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＤＤＤＤＫタグ、Ｓタグ、ＣｒｕｚＴａｇ０９ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ２２ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ４１ＴＭ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、Ｈａ．１１タグ及びＫＴ３タグ等がある。
以下に、各精製タグ（ｉ）とそのタグを認識結合するリガンド（ｉｉ）との組み合わせの一例を示す。
（ｉ−１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ）  （ｉｉ−１）グルタチオン
（ｉ−２）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）  （ｉｉ−２）アミロース
（ｉ−３）ＨＱタグ  （ｉｉ−３）ニッケル
（ｉ−４）Ｍｙｃタグ  （ｉｉ−４）抗Ｍｙｃ抗体
（ｉ−５）ＨＡタグ  （ｉｉ−５）抗ＨＡ抗体
（ｉ−６）ＦＬＡＧタグ  （ｉｉ−６）抗ＦＬＡＧ抗体
（ｉ−７）６×Ｈｉｓタグ  （ｉｉ−７）ニッケル又はコバルト
前記精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおけるポリペプチド（Ｐ）をコードする核酸の５’又は３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。
【００３０】
ポリペプチド（Ｐ）は、直鎖構造を有するものである（分岐構造、環状構造及び架橋構造を持たない。）ことが好ましい。なお、直鎖構造にはβシート構造（直鎖状ペプチドが折れ曲がってこの部分同士が平行に並び、その間に水素結合が作られる二次構造）も含まれる。
【００３１】
ポリペプチド（Ｐ）の数平均分子量（以下、Ｍｎと略記）は、細胞の低接着性及びアポトーシス抑制の観点から、５０，０００〜１００，０００が好ましく、さらに好ましくは６０，０００〜８０，０００、特に好ましくは６５，０００〜７５，０００である。なお、Ｍｎは、公知の方法により測定でき、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、測定サンプルを分離し、泳動距離を標準物質と比較することによって求められる。
【００３２】
好ましいポリペプチド（Ｐ）の一部を以下に例示する。
（ｉ）アミノ酸配列（Ｘ）がＧｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（１）の場合
この場合、ポリペプチド（Ｐ）が、Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（１）、Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（３６）及びＧｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  配列（１４）を有するポリペプチドであることが好ましい。具体的には以下の例が挙げられる。
（ｉ−１）Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（１）を５６個、Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（３６）を８個及びＧｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  配列（１４）を１６個有するポリペプチド（Ｐ１）。
（Ｐ１）として、具体的には、Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（１）が４回繰り返した配列に、Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（３６）１個が化学結合し、さらにＧｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（１）が３回繰り返した配列が化学結合し、さらにＧｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  配列（１４）が２回繰り返した配列が化学結合したアミノ酸ブロック（Ｌ−１）が８回繰り返し化学結合したＭｎ３５，１６４の配列（７５）のポリペプチドが含まれる。
【００３３】
（ｉ−２）Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（１）を１１９個およびＧｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（３６）を１７個  及び  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  配列（１４）を３４個有するポリペプチド（Ｐ２）
（Ｐ２）として、具体的には、上記アミノ酸ブロック（Ｌ−１）が１７回繰り返し化学結合したＭｎ７６，５８１の配列（７６）のポリペプチドが含まれる。
【００３４】
（ｉ−３）Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（１）を４９個およびＧｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（３６）を７個  及び  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  配列（１４）を２８個有するポリペプチド（Ｐ３）
（Ｐ３）として、具体的には、Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（１）が４回繰り返した配列に、Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（３６）１個が化学結合し、さらにＧｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（１）が３回繰り返した配列が化学結合し、Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  配列（１４）が４回繰り返した配列が化学結合したアミノ酸ブロック（Ｌ−２）が７回繰り返し化学結合したＭｎ３５，８６３の配列（７７）のポリペプチド。
【００３５】
（ｉ−４）Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（１）を９１個およびＧｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（３６）を１３個  及び  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  配列（１４）を５２個有するポリペプチド（Ｐ４）
（Ｐ４）として、具体的には、上記アミノ酸ブロック（Ｌ−２）が１３回繰り返し化学結合したＭｎ６９，７７２の配列（７８）のポリペプチド。
【００３６】
（ｉ−５）Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（１）を１２０個およびＧｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（３６）を８個  及び  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  配列（１４）を３２個有するポリペプチド（Ｐ５）
（Ｐ５）として、具体的には、Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  配列（１４）が２回繰り返した配列に、Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（１）が４回繰り返した配列が化学結合し、Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（３６）を結合し、さらにＧｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（１）が１１回繰り返した配列が化学結合し、さらにＧｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  配列（１４）が２回繰り返した配列が化学結合したアミノ酸ブロック（Ｌ−３）が８回繰り返し化学結合したＭｎ７１，４４５の配列（７９）のポリペプチド。
【００３７】
（ｉ−６）Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（１）を９０個およびＧｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（３６）を６個  及び  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  配列（１４）を３６個有するポリペプチド（Ｐ６）
（Ｐ６）として、具体的には、Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  配列（１４）が２回繰り返した配列に、Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（１）が４回繰り返した配列が化学結合し、Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（３６）を結合し、さらにＧｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（１）が１１回繰り返した配列が化学結合し、さらにＧｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  配列（１４）が４回繰り返した配列が化学結合したアミノ酸ブロック（Ｌ−４）が６回繰り返し化学結合したＭｎ６４，６９４の配列（８０）のポリペプチド。
【００３８】
（ｉｉ）アミノ酸配列（Ｘ）がＧｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  配列（６）の場合
（ｉｉ−１）Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  配列（６）を９１個およびＧｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  配列（４６）を１３個  及びＧｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  配列（１４）を５２個有するポリペプチド（Ｐ７）
（Ｐ７）として、具体的には、Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｐｒｏ（６）が４回繰り返した配列に、Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  配列（４６）を結合し、さらにＧｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  配列（６）が３回繰り返した配列が化学結合し、さらにＧｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  配列（１４）が４回繰り返した配列が化学結合したアミノ酸ブロック（Ｌ−５）が１３回繰り返し化学結合したＭｎ７１，１９５の配列（８１）のポリペプチド。
【００３９】
（ｉｉｉ）アミノ酸配列（Ｘ）がＡｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ配列（１２）の場合
（ｉｉｉ−１）Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ配列（１２）を９１個およびＡｌａ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ配列（５８）を１３個  及びＧｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  配列（１４）を５２個有するポリペプチド（Ｐ８）
（Ｐ８）として、具体的には、Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ配列（１２）が４回繰り返した配列に、Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ配列（５８）を結合し、さらにＡｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ配列（１２）が３回繰り返した配列が化学結合し、さらにＧｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  配列（１４）が４回繰り返した配列が化学結合したアミノ酸ブロック（Ｌ−６）が１３回繰り返し化学結合したＭｎ１０５，９３３の配列（８２）のポリペプチド。
【００４０】
ポリペプチド（Ｐ）は、人工的に製造でき、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）、及び遺伝子組み換え法等によって容易に製造できる。有機合成法に関しては、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）又は続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。有機合成法及び遺伝子組み換え法とも、ポリペプチド（Ｐ）を作製できるが、ポリペプチド（Ｐ）を安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
【００４１】
本発明の細胞集合体培養用基材は、上記ポリペプチド（Ｐ）を有していることにより、基材を用いて細胞を培養した際に、細胞表面に存在するインテグリンと（Ｐ）が結合し、細胞内にシグナルが伝達されるので、アポトーシス抑制効果が発揮されると推察される。
【００４２】
基材（Ｂ）の素材としては、プラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリアルフォオレフィン、ポリプトピレン、ポリエチレン及びこれらの複合体等）及び／又は無機物（例えば、ガラス、セラミックス、金属及びこれらの複合体等）が挙げられる。
（Ｂ）の素材としては、プラスチックやガラスなど、透明で培養中の細胞を顕微鏡観察ができるものが好ましい。
【００４３】
基材（Ｂ）としては、従来の細胞培養（細胞集合体培養及び従来の接着培養）に用いる基材を制限無く使用できるが、入手が容易である観点から、細胞培養容器が好ましい。細胞培養容器としては、マルチウェルプレート（例えば、６穴プレート、２４穴プレート及び９６穴プレート等）やシャーレ（例えば、直径（ｍｍ）；３５、６０及び１００等）、Ｔ−フラスコ（例えば、容量（ｍｌ）；２５、７５、１５０及び２２５等）、ローラーボトル（例えば、培養面積（ｃｍ２）；６９０、９７０、１２００及び１３００等）等が用いられる。
【００４４】
本発明において、細胞集合体培養用基材表面におけるポリペプチド（Ｐ）のコーティング量は、細胞の低接着性及びアポトーシス抑制の観点から、細胞集合体培養用基材の単位面積（ｃｍ２）あたり０．１〜５μｇが好ましく、さらに好ましくは１．０〜２．１μｇである。
【００４５】
細胞集合体培養用基材表面におけるポリペプチド（Ｐ）のコーティング量は、具体的には、下記の測定法により測定できる。
＜ポリペプチド（Ｐ）のコーティング量の測定＞
Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ＴＨＥＲＭＯ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）付属のＲｅａｇｅｎｔＡ溶液：ＲｅａｇｅｎｔＢ溶液：ＲｅａｇｅｎｔＣ溶液＝２５：２４：１の混合液（Ｃ）を作成する。細胞集合体培養用基材に対して、測定したい基材の表面積に対して３１２．５μＬ／ｃｍ２で混合液（Ｃ）を加え、３７℃で２時間静置する。
静置２時間後に、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）とＣｕ＋のキレート生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて室温で測定する。さらに、あらかじめウシ血清アルブミンにより作成した検量線からコーティング量を得る。
【００４６】
本発明の細胞集合体培養用基材は、基材（Ｂ）及びポリペプチド（Ｐ）からなるものであればよく、ポリペプチド（Ｐ）が基材（Ｂ）の表面に物理吸着及び／又は化学結合（イオン結合及び／又は水素結合）したものが含まれる。
物理吸着させる方法としては、ポリペプチド（Ｐ）の水溶液に、基材（Ｂ）を浸して、３７℃で所定の時間吸着させる方法が含まれる。吸着後は、余剰の溶液を除去もしくは乾燥させることにより、細胞集合体培養基材を得ることができる。
化学結合させる方法としては、基材（Ｂ）がプラスチック材料の場合は、例えば、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド又はカルボジイミド等の存在下で、基材（Ｂ）とペプチド（Ｐ）を接触させることによりエステル化又はアミド化させ、洗浄乾燥させる方法等が含まれる。基材（Ｂ）が金属材料又は無機材料の場合、シランカップリング剤又はチタンカップリング剤などを基材（Ｂ）と反応させた後、ぺプチド（Ｐ）とグルタルアルデヒドで架橋させ、洗浄乾燥させる方法が含まれる。
上記のうち、細胞の低接着性及びアポトーシス抑制の観点から、物理吸着が好ましい。
【００４７】
本発明において接着性細胞（Ｓ）としては、一般的に接着性細胞に分類される細胞が含まれ、具体的には、幹細胞、前駆細胞、上皮細胞、内皮細胞及び癌細胞等が挙げられる。
【００４８】
細胞集合体培養用基材に播種した接着性細胞（Ｓ）のうち、基材に接着する（Ｓ）の割合を示す細胞接着率は、細胞集合体の培養に用いる観点から、４〜２０％であることが好ましく、さらに好ましくは１０〜２０％である。
【００４９】
細胞接着率は、具体的には下記測定法によって測定できる。
細胞集合体培養用基材に、ポリペプチド（Ｐ）を付着させた部分の面積に対して３１２．５μＬ／ｃｍ２で０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、純度９９．５重量％塩化ナトリウムを０．８５重量％含有するリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと略記））を加えて２回洗浄し、さらに脱イオン水をポリペプチド（Ｐ）を付着させた部分の面積に対して３１２．５μＬ／ｃｍ２で加えて１回洗浄する。
次に、血清を含まないＤＭＥＭ培地（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）をポリペプチド（Ｐ）を付着させた部分の面積に対して３１２．５μＬ／ｃｍ２で加え、３７℃インキュベーター内に１時間保存する。１時間後、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（大日本製薬株式会社製）を、ポリペプチド（Ｐ）を付着させた部分の面積に対して２万ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて２時間放置して培養する。
培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、細胞に直接当たらないように注意しながら生理食塩水をポリペプチド（Ｐ）を付着させた部分の面積に対して３１２．５μＬ／ｃｍ２で加え、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去する。次にＰＢＳをポリペプチド（Ｐ）を付着させた部分の面積に対して１５６．２５μＬ／ｃｍ２で加え、さらにテトラカラーワン（生化学工業株式会社）をポリペプチド（Ｐ）を付着させた部分の面積に対して３１．２５μＬ／ｃｍ２で加え、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置する。
４時間後に、ホルマザン生成量（Ｘ）を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定する。
ポリペプチド（Ｐ）の代わりにフィブロネクチンを用いた比較用細胞集合体培養用基材を作成し、上記と同様の実験を行う。ここで、基材表面におけるフィブロネクチンのコーティング量は、０．５μｇ／ｃｍ２以上であり、播種したすべての細胞が接着したことを顕微鏡観察で確認したものを用いる。この比較用細胞集合体培養用基材のホルマザン生成量（Ｘ０）を測定する。（Ｘ０）が細胞接着率１００％であるとして、（Ｘ）及び（Ｘ０）を下記式に当てはめ、細胞接着率を算出する。
細胞接着率（％）＝（Ｘ）／（Ｘ０）×１００
【００５０】
本発明の細胞集合体の生産方法は、上記細胞集合体培養用基材を用いて接着性細胞（Ｓ）を培養する方法である。
本発明の細胞集合体の生産方法は、上記細胞集合体培養用基材を使用する以外は、従来の細胞集合体の生産方法と同様でいい。例えば、下記工程（１）〜（２）により生産する方法が含まれる。
（１）細胞集合体培養用基材と細胞懸濁液とを接触させる工程
（２）所定の温度で所定の時間培養する工程
【００５１】
工程（１）において、細胞集合体培養用基材は、上記細胞集合体培養用基材である。
【００５２】
工程（１）において、細胞懸濁液は、培地中に細胞を懸濁させた水溶液である。
培地としては、無血清培地及び血清培地が含まれる。
無血清培地としては、Ｇｒａｃｅ培地、ＩＰＬ−４１培地、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ培地、Ｏｐｔｉ−ＰＲＯＴＭＳＦＭ培地、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＴＭＩ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３培地、ＣＤ−ＣＨＯ  ＡＧＴＴＭ培地、ＲＰＭＩ培地、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＴＣ−１００培地、Ｓｆ−９００ＩＩ培地、Ｅｘ−ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地及びこれらの混合培地等が挙げられる。
これらのうち、細胞の安定性の観点から、Ｏｐｔｉ−ＰＲＯＴＭＳＦＭ培地、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＴＭＩ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３培地、ＣＤ−ＣＨＯ  ＡＧＴＴＭ培地、ＤＭＥＭ培地及びこれらの混合培地が好ましく、さらに好ましくはＯｐｔｉ−ＰＲＯＴＭＳＦＭ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３培地、ＤＭＥＭ培地及びこれらの混合培地である。
血清培地としては、一般の培地（ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥ培地、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＴＣ−１００培地、Ｓｆ−９００ＩＩ培地、Ｅｘ−ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地及びこれらの混合培地等）に血清を加えたもの等が挙げられる。血清としては、ヒト血清、及び動物血清（ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、ヒツジ血清、ブタ血清、ウサギ血清、ニワトリ血清、ラット血清、及びマウス血清等）が含まれる。
【００５３】
培地中には、成長因子を添加してもいい。成長因子としては、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＴＧＦ）、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ：ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：ＧＭ−ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＥＰＯ）、トロンボポエチン（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＴＰＯ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦまたはＦＧＦ２）、肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）等が挙げられる。
【００５４】
細胞としては、上記接着性細胞（Ｓ）を用いる。
細胞懸濁液中の細胞の濃度（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、細胞の生存率の観点から、１０３〜１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌが好ましく、さらに好ましくは１０４〜１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌである。
細胞懸濁液の温度は、通常細胞培養に用いられる温度であれば特に制限ないが、細胞の生存率の観点から、２５〜４５℃が好ましく、さらに好ましくは３０〜４０℃で、最も好ましくは３７℃である。
細胞懸濁液のｐＨは、通常細胞培養に用いられるｐＨであれば特に制限ないが、細胞の生存率の観点から、ｐＨ６．０〜８．０が好ましく、さらに好ましくはｐＨ６．５〜７．５である。
細胞集合体培養用基材と細胞懸濁液とを接触させる方法としては、細胞集合体培養用基材に細胞懸濁液を加える方法及び細胞懸濁液中に細胞集合体培養用基材を浸す方法が挙げられる。
【００５５】
工程（２）において、培養温度は、細胞の生存率の観点から、２５〜４５℃が好ましく、さらに好ましくは３０〜４０℃で、最も好ましくは３７℃である。
培養時間は、細胞の生存率の観点から、１〜１０日間が好ましく、さらに好ましくは３〜７日間である。
培養容器がＵ底プレートである場合、細胞集合体形成性の観点から、静置培養することが好ましい。
培養容器が平底プレート、シャーレ、Ｔ−フラスコ、ローラーボトルである場合、細胞集合体形成性の観点から、旋回培養することが好ましい。
旋回培養の場合、攪拌の回転数は、細胞の生存率・細胞集合体形成率の観点から、３０〜１２０ｒｐｍが好ましく、さらに好ましくは６０〜８０ｒｐｍである。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例及び比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下、特に定めない限り、％は重量％、部は重量部を示す。
【００５７】
＜実施例１＞
（１）ポリペプチド（Ｐ１）の作製
特表平３−５０２９３５号公報中の実施例記載の方法に準じて、遺伝子組換え大腸菌により製造し、カラムクロマトグラフィーにて精製した、Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（１）が４回繰り返した配列に、Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（３６）１個が化学結合し、さらにＧｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（１）が３回繰り返した配列が化学結合し、さらにＧｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  配列（１４）が２回繰り返した配列が化学結合したアミノ酸ブロック（Ｌ−１）が８回繰り返し化学結合したＭｎ３５，１６４の配列（７５）のポリペプチド（Ｐ１）を得た。
【００５８】
（２）細胞集合体培養用基材［ＰＢ１］の作製
ポリペプチド（Ｐ１）１ｍｇを脱イオン水１ｍＬに溶解し、さらに、０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、純度９９．５重量％塩化ナトリウムを０．８５重量％含有するＰＢＳ）で希釈して、ポリペプチド（Ｐ１）溶液（Ａ１）〜（Ａ４）｛溶液（Ａ１）〜（Ａ４）中のポリペプチド（Ｐ１）の濃度（μｇ／ｍＬ）；（Ａ１）：０．０１、（Ａ２）：１、（Ａ３）：１０、（Ａ４）：１００｝を作製した。この溶液（Ａ１）〜（Ａ４）を９６穴のポリスチレンプレート（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）中の８穴ずつにそれぞれ５０μＬ／穴で投入し、室温（約２５℃）で２時間放置した。アスピレーターを用いて溶媒を除去した後、生理食塩水（０．９重量／容量％  塩化ナトリウム水溶液）１００μＬ／穴で２回洗浄し、さらに脱イオン水１００μＬ／穴で洗浄して、基材の表面にポリペプチド（Ｐ１）を有する細胞集合体培養用基材［ＰＢ１］（コーティング量が異なるＰＢ１−１〜ＰＢ１−４）を得た。
【００５９】
＜実施例２＞
（１）ポリペプチド（Ｐ２）の作製
実施例１と同様にして、上記アミノ酸ブロック（Ｌ−１）が１７回繰り返し化学結合したＭｎ７６，５８１の配列（７６）のポリペプチド（Ｐ２）を作製した。
（２）細胞集合体培養用基材［ＰＢ２］の作製
ポリペプチド（Ｐ１）をポリペプチド（Ｐ２）に変更したこと以外同様にして、基材の表面にポリペプチド（Ｐ２）を有する細胞集合体培養用基材［ＰＢ２］（コーティング量が異なるＰＢ２−１〜ＰＢ２−４）を得た。
【００６０】
＜実施例３＞
（１）ポリペプチド（Ｐ３）の作製
実施例１と同様にして、Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（１）が４回繰り返した配列に、Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（３６）１個が化学結合し、さらにＧｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（１）が３回繰り返した配列が化学結合し、Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  配列（１４）が４回繰り返した配列が化学結合したアミノ酸ブロック（Ｌ−２）が７回繰り返し化学結合したＭｎ３５，８６３の配列（７７）のポリペプチド（Ｐ３）を作製した。
（２）細胞集合体培養用基材［ＰＢ３］の作製
ポリペプチド（Ｐ１）をポリペプチド（Ｐ３）に変更したこと以外同様にして、基材の表面にポリペプチド（Ｐ３）を有する細胞集合体培養用基材［ＰＢ３］（コーティング量が異なるＰＢ３−１〜ＰＢ３−４）を得た。
【００６１】
＜実施例４＞
（１）ポリペプチド（Ｐ４）の作製
実施例１と同様にして、上記アミノ酸ブロック（Ｌ−２）が１３回繰り返し化学結合したＭｎ６９，７７２の配列（７８）のポリペプチド（Ｐ４）を作製した。
（２）細胞集合体培養用基材［ＰＢ４］の作製
ポリペプチド（Ｐ１）をポリペプチド（Ｐ４）に変更したこと以外同様にして、基材の表面にポリペプチド（Ｐ４）を有する細胞集合体培養用基材［ＰＢ４］（コーティング量が異なるＰＢ４−１〜ＰＢ４−４）を得た。
【００６２】
＜実施例５＞
（１）ポリペプチド（Ｐ５）の作製
実施例１と同様にして、Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  配列（１４）が２回繰り返した配列に、Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（１）が４回繰り返した配列が化学結合し、Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（３６）を結合し、さらにＧｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（１）が１１回繰り返した配列が化学結合し、さらにＧｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  配列（１４）が２回繰り返した配列が化学結合したアミノ酸ブロック（Ｌ−３）が８回繰り返し化学結合したＭｎ７１，４４５の配列（７９）のポリペプチド（Ｐ５）を作製した。
（２）細胞集合体培養用基材［ＰＢ５］の作製
ポリペプチド（Ｐ１）をポリペプチド（Ｐ５）に変更したこと以外同様にして、基材の表面にポリペプチド（Ｐ５）を有する細胞集合体培養用基材［ＰＢ５］（コーティング量が異なるＰＢ５−１〜ＰＢ５−４）を得た。
【００６３】
＜実施例６＞
（１）ポリペプチド（Ｐ６）の作製
実施例１と同様にして、Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  配列（１４）が２回繰り返した配列に、Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（１）が４回繰り返した配列が化学結合し、Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（３６）を結合し、さらにＧｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  配列（１）が１１回繰り返した配列が化学結合し、さらにＧｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  配列（１４）が４回繰り返した配列が化学結合したアミノ酸ブロック（Ｌ−４）が６回繰り返し化学結合したＭｎ６４，６９４の配列（８０）のポリペプチド（Ｐ６）を作製した。
（２）細胞集合体培養用基材［ＰＢ６］の作製
ポリペプチド（Ｐ１）をポリペプチド（Ｐ６）に変更したこと以外同様にして、基材の表面にポリペプチド（Ｐ６）を有する細胞集合体培養用基材［ＰＢ６］（コーティング量が異なるＰＢ６−１〜ＰＢ６−４）を得た。
【００６４】
＜比較例１＞
ポリペプチド（Ｐ１）をポリビニルアルコール（以下、ＰＶＡと略記する）（日本塩ビ・ポバール社製、品名：ＪＰ−１８）に変更したこと以外、実施例１と同様にして、基材の表面にポリビニルアルコールを有する比較用の細胞集合体培養用基材［ＰＢ７］（コーティング量が異なるＰＢ７−１〜ＰＢ７−４）を得た。
【００６５】
＜比較例２＞
ポリペプチド（Ｐ１）をアガロース（ナカライテスク社製、品名：アガロース−ＲＥ）に変更したこと以外、実施例１と同様にして、基材の表面にアガロースを有する比較用の細胞集合体培養用基材［ＰＢ８］（コーティング量が異なるＰＢ８−１〜ＰＢ８−４）を得た。
【００６６】
＜比較例３＞
ポリペプチド（Ｐ１）をフィブロネクチン（和光社製、品名：Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ，ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｐｌａｓｍａ）に変更したこと以外、実施例１と同様にして、基材の表面にフィブロネクチンを有する比較用の細胞集合体培養用基材［ＰＢ９］（コーティング量が異なるＰＢ９−１〜ＰＢ９−４）を得た。
【００６７】
＜比較例４＞
細胞集合体培養用基材として市販されている、基材の表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基含有ポリマー（以下、ＭＰＣと略記する）を有するＬＩＰＩＤＵＲＥＴＭ−ｃｏａｔ（日油株式会社製）を細胞集合体培養用基材［ＰＢ１０］として用いた。
【００６８】
＜比較例５＞
細胞集合体培養用基材として市販されている、基材の表面に光架橋超親水性ポリマーを有するＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅＴＭ（住友ベークライト株式会社製）を細胞集合体培養用基材［ＰＢ１１］として用いた。
【００６９】
＜細胞集合体培養用基材（ＰＢ１〜ＰＢ６及びＰＢ９）のコーティング量の測定＞
Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ＴＨＥＲＭＯ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に付属のＲｅａｇｅｎｔ  Ａ溶液：Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｂ溶液：Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃ溶液＝２５：２４：１の混合液（Ｃ）を得た。細胞集合体培養用基材（コーティング量の異なるＰＢ１−１）〜（ＰＢ６−４）と（ＰＢ９−１）〜（ＰＢ９−４）の各ウェルに混合液（Ｃ）を１００μＬ加え、３７℃で２時間静置した。
２時間後に、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）とＣｕ＋とからなるキレートの生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、あらかじめウシ血清アルブミンにより作成した検量線からコーティング量を得た。これらの結果を表１に示す（これらの結果は各々８穴分の平均データである。）。
【００７０】
＜細胞集合体培養用基材（ＰＢ７）のコーティング量の測定＞
コーティングプレート片（１ｇ）を蒸留水５０ｍｌに加え、６０℃で３０分間加熱した。加熱後、ろ液を回収した。また、ろ過後のプレート片を０．１Ｎ  ＨＣｌ水５０ｍｌで１時間放置し、熱水２００ｍｌで洗いこみながらろ過した。それぞれのろ液を合わせて５００ｍｌにフィルアップした。
フィルアップ後、２０ｍｌを５０ｍｌメスフラスコに加えて、ホウ酸溶液（ホウ酸４０ｇ／ｌ）を１５ｍｌ添加した。その後、Ｉ２溶液（ＫＩ２５ｇ＋Ｉ２１２．５ｇ／１Ｌ）を３ｍｌ加え、５０ｍｌにフィルアップした。
室温で、６９０ｎｍの吸光度（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＶＥＲＳＡ  ＭＡＸ  ｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ）からＰＶＡの濃度を算出した。これらの結果を表１に示す（これらの結果は各々８穴分の平均データである。）。
【００７１】
＜細胞集合体培養用基材（ＰＢ８）のコーティング量の測定＞
０．５Ｍ  ２−シアノアセタミド水溶液５０μｌ及びホウ酸―リン酸緩衝液（０．３Ｍホウ砂と０．３Ｍリン酸一水素カリウムを混合し、ｐＨ８．０に調整したもの）２５０μｌ加え、混合物をよく振り混ぜた後、９８℃で３０分間加熱した。
室温で、３３１ｎｍで励起した３８３ｎｍでの蛍光を測定（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ  ＧＥＭＩＮＩ  ＥＭ）し、アガロース濃度を算出した。これらの結果を表１に示す（これらの結果は各々８穴分の平均データである。）。
【００７２】
＜評価：Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（マウス間葉系細胞）の細胞接着率＞
血清を含まないＤＭＥＭ培地（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を５０μＬ／穴で［ＰＢ１］〜［ＰＢ９］にそれぞれ添加し、３７℃インキュベーター内に１時間保存した。１時間後、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本製薬株式会社製）を１万ｃｅｌｌｓ／５０μＬ／穴で添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて２時間放置して培養した。
培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、生理食塩水を細胞に直接当たらないように注意しながら１００μＬ／穴で添加し、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去した。次にＰＢＳを５０μＬ／穴で添加し、さらにテトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／穴で添加して、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置した。
４時間後に、ホルマザン生成量（Ｘ）を、４５０ｎｍ（参照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定した。
比較例３の基材［ＰＢ９−４］については、播種したすべての細胞が接着したことを顕微鏡観察で確認したので、これを細胞接着率が１００％であるとして、ホルマザン生成量（Ｘ０）を測定した。（Ｘ）及び（Ｘ０）を下記式に当てはめ、細胞接着率を算出した。
細胞接着率（％）＝（Ｘ）／（Ｘ０）×１００
細胞接着率は、当該吸光度の高さに比例する。これらの結果を表１に示す（これらの結果は各々８穴分の平均データである。）。また、得られた結果について、縦軸をＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の細胞接着率（％）、横軸をコーティング量（μｇ／ｃｍ２）としてプロットし、グラフを作成した（図１）。
【００７３】
＜評価：ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（マウス骨芽細胞）の細胞接着率＞
血清を含まないＤＭＥＭ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を５０μＬ／穴で［ＰＢ１］〜［ＰＢ９］に添加し、３７℃インキュベーター内に１時間保存した。１時間後、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（大日本製薬株式会社製）を１万ｃｅｌｌｓ／５０μＬ／穴で添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて２時間放置して培養した。
培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、生理食塩水を細胞に直接当たらないように注意しながら１００μＬ／穴で添加し、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去した。次にＰＢＳを５０μＬ／穴で添加し、さらにテトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／穴で添加して、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置した。
４時間後に、ホルマザン生成量（Ｘ）を、４５０ｎｍ（参照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定した。
比較例３の基材［ＰＢ９−４］については、播種したすべての細胞が接着したことを顕微鏡観察で確認したので、これを細胞接着率が１００％であるとして、ホルマザン生成量（Ｘ０）を測定した。（Ｘ）及び（Ｘ０）を下記式に当てはめ、細胞接着率を算出した。
細胞接着率（％）＝（Ｘ）／（Ｘ０）×１００
細胞接着率は、当該吸光度の高さに比例する。これらの結果を表１に示す（これらの結果は各々８穴分の平均データである。）。また、得られた結果について、縦軸をＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の細胞接着率（％）、横軸をコーティング量（μｇ／ｃｍ２）としてプロットし、グラフを作成した（図２）。
【００７４】
【表１】
0006017776.tif 000002
【００７５】
＜評価：ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（マウス骨芽細胞）のアポトーシス活性＞
実施例１〜６の［ＰＢ１−３］、［ＰＢ２−３］、［ＰＢ３−３］、［ＰＢ４−３］、［ＰＢ５−３］、［ＰＢ６−３］、比較例１〜３の［ＰＢ７−３］、［ＰＢ８−３］及び［ＰＢ９−３］、比較例４〜５の［ＰＢ１０］、［ＰＢ１１］それぞれ３穴ずつに、血清を含まないＤＭＥＭ培地（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を５０μＬ／穴で添加し、３７℃インキュベーター内に１時間保存した。１時間後、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（大日本製薬株式会社製）を１万ｃｅｌｌｓ／５０μＬ／穴で添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて２４時間放置して培養した。
培養終了後、Ｃａｓｐａｓｅ−ＧｌｏＴＭ３／７  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、Ｃａｓｐａｓｅ活性を測定した。Ｃａｓｐａｓｅ反応液１００μＬ／穴で添加し、室温で３時間放置した。３時間後、蛍光強度は、ルミネッセンスプレートリーダー  ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ  Ｐｌｕｓ  ＬＢ９６（ベルトールドテクノロジー社製）を用いて測定した。完全に非接着性である［ＰＢ７−３］の活性を１００％として、Ｃａｓｐａｓｅ活性を相対値で表した。これらの結果を表２に示す（これらの結果は各々３穴分の平均データである。）。
【００７６】
【表２】
0006017776.tif 000003
【００７７】
＜実施例７＞
細胞懸濁液１００μｌ（１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を細胞集合体培養用基材［ＰＢ１−３］に加えた。３７℃、５％ＣＯ２下で７日間静置培養し、細胞集合体を得た。
【００７８】
＜実施例８＞
細胞懸濁液１００μｌ（１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を細胞集合体培養用基材［ＰＢ２−３］に加えた。３７℃、５％ＣＯ２下で７日間静置培養し、細胞集合体を得た。
【００７９】
＜実施例９＞
細胞懸濁液１００μｌ（１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を細胞集合体培養用基材［ＰＢ３−３］に加えた。３７℃、５％ＣＯ２下で７日間静置培養し、細胞集合体を得た。
【００８０】
＜実施例１０＞
細胞懸濁液１００μｌ（１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を細胞集合体培養用基材［ＰＢ４−３］に加えた。３７℃、５％ＣＯ２下で７日間静置培養し、細胞集合体を得た。
【００８１】
＜実施例１１＞
細胞懸濁液１００μｌ（１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を細胞集合体培養用基材［ＰＢ５−３］に加えた。３７℃、５％ＣＯ２下で７日間静置培養し、細胞集合体を得た。
【００８２】
＜実施例１２＞
細胞懸濁液１００μｌ（１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を細胞集合体培養用基材［ＰＢ６−３］に加えた。３７℃、５％ＣＯ２下で７日間静置培養し、細胞集合体を得た。
【００８３】
＜比較例６＞
細胞懸濁液１００μｌ（１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を細胞集合体培養用基材［ＰＢ７−３］に加えた。３７℃、５％ＣＯ２下で７日間静置培養し、細胞集合体を得た。
【００８４】
＜比較例７＞
細胞懸濁液１００μｌ（１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を細胞集合体培養用基材［ＰＢ８−３］に加えた。３７℃、５％ＣＯ２下で７日間静置培養し、細胞集合体を得た。
【００８５】
＜比較例８＞
細胞懸濁液１００μｌ（１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を細胞集合体培養用基材［ＰＢ１０］に加えた。３７℃、５％ＣＯ２下で７日間静置培養し、細胞集合体を得た。
【００８６】
＜比較例９＞
細胞懸濁液１００μｌ（１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を細胞集合体培養用基材［ＰＢ１１］に加えた。３７℃、５％ＣＯ２下で７日間静置培養し、細胞集合体を得た。
【００８７】
＜比較例１０＞
細胞懸濁液１００μｌ（１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を細胞集合体培養用基材［ＰＢ９−３］に加えた。３７℃、５％ＣＯ２下で７日間静置培養したが、細胞集合体は得られなかった。
【００８８】
＜細胞集合体の活性評価；ミトコンドリア活性＞
７日間培養後、細胞集合体にテトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／穴で添加して、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置した。
４時間後に、ホルマザン生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定した。生細胞数は細胞集合体に核放出溶液（０．２％クリスタルバイオレット、０．２Ｍクエン酸３ナトリウム、２％Ｔｗｅｅｎ２０）を加え、１時間置くことで生細胞の核を細胞から放出させ、血球計数盤を用いて核数を測定した。ホルマザン生成量を生細胞数で標準化し、細胞集合体のミトコンドリア活性とした。得られたミトコンドリア活性は、細胞接着培養用プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  社製、ＣｏｓｔａｒＴＭ）を用いて培養した細胞のミトコンドリア活性を１００％とした相対値で表した。これらの結果を表３に示す。
【００８９】
【表３】
0006017776.tif 000004
【００９０】
表１の結果から、基材の表面にフィブロネクチンを有する比較例３の基材は、フィブロネクチンによるコーティング量が増えるにつれて細胞接着率が高くなることが分かる。
一方、本発明の細胞集合体培養用基材や比較例１〜２の細胞集合体培養用基材は、コーティング量が増えるにつれて細胞接着率が低くなり、細胞集合体培養に適した低細胞接着率とすることができることが分かる。
また、表２の結果から、比較例１〜２及び４〜５の細胞集合体培養用基材と比較して、本発明の細胞集合体培養用基材はアポトーシス活性が１７〜３５％と低く、細胞集合体培養に適していることが分かる。
さらに、表３の結果から、本発明の細胞集合体培養用基材を用いることで、高いミトコンドリア活性を保持できることを確認した。細胞のエネルギー代謝はミトコンドリアにより行われており、ミトコンドリア活性が高いことから、活性の高い細胞集合体が得られたことがわかる。
以上のことから、本発明の細胞集合体培養用基材は、細胞接着率が低いにもかかわらず、アポトーシス活性が低く、本発明の細胞集合体培養用基材を用いれば、活性の高い細胞集合体を得ることができることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明の細胞集合体培養用基材は、細胞のロスが少なく、生物活性を高い状態で維持した細胞集合体を生産できる。また、本発明の細胞集合体培養用基材を用いて生産した細胞集合体は、毒性試験や創薬におけるスクリーニング試験、細胞移植治療などに用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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