(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−｛［｛［アミノ（イミノ）メチル］アミノ｝（イミノ）メチル］アミノ｝−１−ブロモ−２−メチルベンゼンを含有する植物病原細菌の病原性抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物病原細菌に対して用いられる薬剤であって、病原細菌の病原性の発現を抑制することにより病原細菌による被害の発生を防止する病原性抑制剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、植物における病原細菌による被害を防止するために、各種の殺菌剤が用いられている。昨今では、人畜や有益昆虫、あるいは環境等への害ができるだけ小さい殺菌剤が求められており、例えば、３−置換キノリン化合物又はその塩、及びそれを有効成分として含有する農薬などが提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
しかしながら、このような殺菌剤でも、その散布によって目的の病原細菌だけでなく、病原性を有しない微生物までも死に至らしめる不具合を解消するには至っておらず、環境微生物相の劇的な変動・縮小を引き起こすという問題が残っていた。特に、非病原菌の中には、植物に病害抵抗性を誘導する有益な微生物も存在しており、これらの微生物までも病原菌か否かの区別なく死滅させることは回避したいところであった。
【０００４】
そこで、環境に対して比較的優しく、人体にたいしても安全な薬剤として、天然に存在する桂皮酸に着目した植物病原菌抑制剤も提案されている（例えば、特許文献２参照。）。ただし、この桂皮酸を用いた植物病原菌抑制剤は、一部の真菌に対してのみ効果的であり、病原細菌に適用できるものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−０８８１３９号公報
【特許文献１】特開２０１１−１９０１７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、このような現状を鑑みながら研究を行っていく中で、病原細菌を殺菌するのではなく、その病原細菌の病原性遺伝子の発現を抑制することで、発病を抑制できるのではないかという着想を得るに至った。
【０００７】
そこで、病原細菌の一つとして知られているタバコ野火病菌を供試菌とし、このタバコ野火病菌の鞭毛や線毛の合成を阻害することにより、あるいは鞭毛や線毛の運動性を阻害することにより、病原細菌の病原性を低減できるのではないかという観点から研究開発を行うことにより本発明を成すに至り、環境微生物相に優しい病害防除剤としての病原性抑制剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の植物病原細菌の病原性抑制剤は、４−｛［｛［アミノ（イミノ）メチル］アミノ｝（イミノ）メチル］アミノ｝−１−ブロモ−２−メチルベンゼンを含有するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の植物病原細菌の病原性抑制剤では、病原細菌を死滅させずとも病原性遺伝子の発現を抑制することにより発病を抑えることが可能となる。特に、環境中に多く存在している有益な微生物への影響を抑制でき、環境微生物相に優しい病害防除剤を提供可能とすることができる。また、病原細菌を死滅させるまで至らないことから、耐性菌の発現も抑制されることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】各化合物の鞭毛合成の阻害効果を確認した実験結果一覧である。
【図２】各化合物のSwarming運動能（0.45％ agar）阻害効果を確認した実験結果一覧である。
【図３】各化合物のSwarming運動能（0.25％ agar）阻害効果を確認した実験結果一覧である。
【図４】各化合物のＡＨＬ合成の阻害効果を確認した実験結果一覧である。
【図５】宿主のタバコ葉での病徴進展阻害の状況を確認した実験結果一覧である。
【図６】宿主のタバコ葉での病徴進展阻害の状況を確認した実験結果一覧である。
【図７】各化合物の線毛合成の阻害効果を確認した実験結果一覧である。
【図８】各化合物の他の病原菌に対する鞭毛合成の阻害効果を確認した実験結果一覧である。
【図９】各化合物の他の病原菌に対するSwarming運動能（0.45％ agar）阻害効果を確認した実験結果一覧である。
【図１０】各化合物の他の病原菌に対するＡＨＬ合成の阻害効果を確認した実験結果一覧である。
【図１１】化合物No.1の類縁体の有効性を確認した実験結果一覧である。
【図１２】化合物No.4の類縁体の有効性を確認した実験結果一覧である。
【図１３】化合物No.8の類縁体の有効性を確認した実験結果一覧である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の植物病原細菌の病原性抑制剤は、上述したように、病原細菌の一つとして知られているタバコ野火病菌を供試菌として見出されたものであり、その重要な病原性因子である鞭毛合成能、鞭毛運動能及び菌体密度感知機構（クオラムセンシング）等は阻害するが、その生育自体は阻害しないものである。
【００１２】
このような病原性抑制剤を見出すために、まずは、MicroHitFinder(Maybridge社)のケミカルライブラリを用い、目的とする化合物の検索を行った。
【００１３】
すなわち、ライブラリにおける14400品目/180プレートの各サンプルを、タバコ野火病菌の野生株に、それぞれ終濃度が100μＭとなるように処理して、２４時間培養を行って、一次スクリーニングを行った。
【００１４】
一次スクリーニングは、
（１）鞭毛合成あるいは糖鎖修飾：Flagellin抗体によるWestern blotting、
（２）鞭毛運動能：0.25％agar含有ＭＭＭＦプレートによるSwarmingアッセイ、
（３）ＡＨＬ合成能：クロモバクテリウムによるビオラセイン呈色アッセイ、
（４）抗生物質感受性：Cm含有ディスクによる阻止円プレートアッセイ
の４項目で行った。
【００１５】
さらに、静菌剤として有望な化合物の候補として、
（１）菌の増殖を阻害しないこと、
（２）劇物でないこと、
（３）抗生物質耐性を付与しないこと、
の観点での選別を行い、最終的に、以下の８種類の化合物を、病原性抑制剤として有望な化合物として特定した。
【化１】
0005950333.tif 000002
【００１６】
ちなみに、８種類のうち、化合物No.1が、amino[(4-methylbenzyl)thio]methaniminium chloride（アミノ［（４−メチルベンジル）チオ］メタンイミンクロライド）であり、化合物No.4が4-{[{[amino(imino)methyl]amino}(imino)methyl]amino}-1-bromo-2-methyl
benzene（４−｛［｛［アミノ（イミノ）メチル］アミノ｝（イミノ）メチル］アミノ｝−１−ブロモ−２−メチルベンゼン）であり、化合物No.8が、acridin-9-amine（アクリジン-9-アミン）である。
【００１７】
以下に説明する二次スクリーニングによって、先の８種類の化合物から、上記の３種類を特定した。なお、各化合物に対する溶媒には、ジメチルスルホキシド（DMSO）を用いた。
【００１８】
まず、鞭毛合成に及ぼす各化合物の影響を再度調べた。
終夜培養したPtaを新しい培地で1/100に希釈し、各化合物を終濃度50μＭ、100μＭ、200μＭとして４８時間処理し、anti-Fla抗体のWestern blotting解析により合成阻害効果を評価した結果を図１に示す。
図１に示すように、すべての化合物処理で、濃度依存的な鞭毛合成阻害効果が認められた。特に、化合物No.1と化合物No.4が濃度依存的に強い鞭毛合成阻害効果を示した。
【００１９】
次に、運動能に及ぼす各化合物の影響を再度調べた。
Ptaに各化合物を終濃度10μＭ及び100μＭとして２４時間処理し、軟寒天培地上でのSwarming運動能（0.45％ agar）阻害効果を評価した結果を図２に示す。同様に、終濃度100μＭとして２４時間処理し、軟寒天培地上でのSwarming運動能（0.25％ agar）阻害効果を評価した結果を図３に示す。
ほとんどの化合物処理によって、濃度依存的な運動能阻害効果が確認された。
【００２０】
次に、ＡＨＬ合成に及ぼす各化合物の影響を再度調べた。
クロモバクテリウムCV026株を包埋したプレート上に、各化合物を終濃度50μＭ及び100μＭとして２４時間処理したPta培養液を直接接種し、ビオラセインの呈色を比較した結果を図４に示す。
この場合、化合物No.1と化合物No.4は強いＡＨＬ合成阻害効果を示したが、化合物No.8は高濃度処理時のみ効果を示した。
【００２１】
次に、病原性に及ぼす各化合物の影響を調べるため、宿主のタバコ葉での病徴進展阻害の状況を確認した。
Ptaに各化合物を終濃度100μＭで２４時間処理した培養液を1/10に希釈し、10μｌの希釈液を針で傷を付けた葉上に摂取し、その後10日間23℃で培養した結果を図５に示す。また、希釈液に切り葉を20分間浸漬させた後、10日間23℃で培養した結果を図６に示す。
各化合物が、DMSO処理区と比較して、病徴の進展を阻害していることが確認された。
【００２２】
次に、線毛合成に及ぼす各化合物の影響を調べた。
終夜培養したPtaを新しい培地で1/100に希釈し、各化合物を終濃度100μＭとして２４時間処理し、anti-pili抗体のWestern blotting解析により合成阻害効果を評価した結果を図７に示す。
図７に示すように、鞭毛合成を阻害する化合物が、線毛合成も阻害することが確認できた。
【００２３】
ここまで、タバコ野火病菌（Pseudomonas syringae pv. tabaci6605）を用いて各化合物の効果の確認を行ってきたが、タバコ野火病菌以外に、ダイズ斑点細菌病菌（Pseudomonas syringae pv. glycinea rece4）、トマト斑葉細菌病菌（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000）、シロクローバ葉枯細菌病菌（Pseudomonas cichorii KN52）、イネ内穎褐変病菌（Pantoea ananatis NARCB200120, AZ200124）、アブラナ科植物黒腐病菌（Xanthomonas campestris pv. campestris XcA）、ジャガイモ輪紋病菌（Erwinia chrysanthemi 92-31）、イネもみ枯細菌病菌（Burkholderia glumae Pg-10）に対して、同様にWestern blotting解析により鞭毛合成の阻害効果を評価した結果を図８に示す。
多くの病原菌に対して、鞭毛合成の阻害効果が確認された。
【００２４】
また、各化合物のトマト斑葉細菌病菌（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000）、ダイズ斑点細菌病菌（Pseudomonas syringae pv. glycinea rece4）、ジャガイモ輪紋病菌（Erwinia chrysanthemi 92-31）、イネ内穎褐変病菌（Pantoea ananatis NARCB200120, AZ200124）、シロクローバ葉枯細菌病菌（Pseudomonas cichorii KN52）に対するSwarming運動能の抑制効果を同様に評価した結果を図９に示す。
各化合物において、多くの病原菌に対して、Swarming運動能の抑制効果が確認された。
【００２５】
また、各化合物のイネ内穎褐変病菌（Pantoea ananatis NARCB200120, AZ200124）、イネもみ枯細菌病菌（Burkholderia glumae Pg-10）に対して、同様にＡＨＬ合成の阻害効果を評価した結果を図１０に示す。
化合物No.1、化合物No.4、化合物No.8においてＡＨＬ合成阻害効果を確認できた。
【００２６】
以上の結果から、
化合物No.1：amino[(4-methylbenzyl)thio]methaniminium chloride（アミノ［（４−メチルベンジル）チオ］メタンイミンクロライド）、
化合物No.4：4-{[{[amino(imino)methyl]amino}(imino)methyl]amino}-1-bromo-2-
methylbenzene（４−｛［｛［アミノ（イミノ）メチル］アミノ｝（イミノ）メチル］アミノ｝−１−ブロモ−２−メチルベンゼン）、
化合物No.8：acridin-9-amine（アクリジン-9-アミン）が、病原性抑制剤として有望であることが判明した。
【００２７】
なお、それぞれの化合物の類縁体において、より有望な化合物が存在する可能性があることから、それぞれの化合物の類縁体に対して、鞭毛合成とSwarming運動能の評価を行った結果を図１１〜１３に示す。
図１１〜１３より、いずれにおいても類縁体よりも、当初の化合物の方が効果的であることが確認された。
【図１】
0005950333.tif 000003
【図２】
0005950333.tif 000004
【図３】
0005950333.tif 000005
【図４】
0005950333.tif 000006
【図５】
0005950333.tif 000007
【図６】
0005950333.tif 000008
【図７】
0005950333.tif 000009
【図８】
0005950333.tif 000010
【図９】
0005950333.tif 000011
【図１０】
0005950333.tif 000012
【図１１】
0005950333.tif 000013
【図１２】
0005950333.tif 000014
【図１３】
0005950333.tif 000015