(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の生体分子の種類数を定めること；
サンプルを複数の試験部位に晒すことであって、この複数の試験部位中の試験部位の数は、前記生体分子の種類数に等しいかまたはそれよりも大きいこと；
複数の試験部位それぞれにおいて個々の試験環境を確立することであって、この複数の試験部位それぞれにおける試験環境は、その他の複数の試験部位それぞれにおける試験環境と異なるようにすること；
前記生体分子の種類それぞれについて、複数の試験部位それぞれの個々の試験環境の結合効率を同定すること；
複数の試験部位それぞれに関連する検出シグナルを得ること；および、
同定した結合効率と得られた検出シグナルに基づいて、生体分子の種類のいずれか１つの濃度を決定すること；
を含む方法。
【請求項２】
前記個々の試験環境を確立することが、
複数の試験部位それぞれにおいて、温度、電場、磁場、ｐＨおよび緩衝液のタイプからなる環境要因群のうち少なくとも１種の環境要因を制御することによって、制御された環境要因の少なくとも１種が少なくとも２つの複数の試験部位間で異なるようにすること、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記濃度を決定することが、得られた検出シグナルに少なくとも１つの一次関数の推定アルゴリズムを適用することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１種の環境要因を制御することが、
少なくとも１種の環境要因を制御することによって、複数の部位それぞれにおける制御された環境要因の少なくとも１種が、別の複数の試験部位それぞれとは異なるようにすることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記個々の試験環境を確立することが、
少なくとも１種の捕捉因子を提供すること；
複数の試験部位それぞれにおいて、個々の捕捉因子の組成を同定することであって、この複数の試験部位それぞれの捕捉因子の組成は、その他の複数の試験部位それぞれの捕捉因子の組成と異なるようにすること；および、
複数の試験部位それぞれにおいて、同定された組成のうち少なくとも１種の捕捉因子を固定すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１種の捕捉因子が、複数の捕捉因子を含み、ここでこの複数の捕捉因子それぞれは、前記生体分子の種類のうち１種またはそれより多くに対し親和性を示し、該親和性は、前記生体分子の種類のうち１種またはそれより多くに対する別の複数の捕捉因子の親和性とは異なっている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の試験部位それぞれの捕捉因子の組成は、別の複数の試験部位における少なくとも１種の捕捉因子と異なる少なくとも１種の捕捉因子から選択された捕捉因子を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第一の複数の試験部位における捕捉因子の組成が、第二の複数の試験部位における少なくとも１種の捕捉因子と同じ少なくとも１種の捕捉因子から選択された捕捉因子を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記第一の複数の試験部位における少なくとも１種の捕捉因子から選択された捕捉因子の濃度が、第二の複数の試験部位における少なくとも１種の捕捉因子から選択された捕捉因子の濃度より高い、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
マルチウェルプレートの各ウェル中で複数の試験部位それぞれを形成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＭＯＳ基板上に複数の試験部位それぞれを形成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
複数の検出シグナルに関連する検出シグナル供与体の種類数を定めることであって、この検出シグナル供与体の少なくとも１種は、対象の分子であること；
サンプルを複数の試験部位に晒すことであって、この複数の試験部位中の試験部位の数は、前記検出シグナル供与体の種類数に等しいかまたはそれよりも大きいこと；
複数の試験部位それぞれにおいて個々の試験環境を確立することであって、この複数の試験部位それぞれにおける試験環境は、その他の複数の試験部位それぞれにおける試験環境と異なるようにすること；
前記検出シグナル供与体それぞれについて、複数の試験部位それぞれの個々の試験環境の結合効率を同定すること；
複数の試験部位それぞれから複数の検出シグナルのそれぞれを個々に得ること；および、
同定した結合効率と得られた複数の検出シグナルに基づいて、対象の生体分子の濃度を
決定すること、
を含む方法。
【請求項１３】
前記個々の試験環境を確立することが、
複数の試験部位それぞれにおいて、温度、電場、磁場およびｐＨからなる環境要因群のうち少なくとも１種の環境要因を制御することによって、制御された環境要因の少なくとも１種が少なくとも２つの複数の試験部位間で異なるようにすること、
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１種の環境要因を制御することが、
少なくとも１種の環境要因を制御することによって、複数の部位それぞれにおける制御された環境要因の少なくとも１種が、別の複数の試験部位それぞれとは異なるようにすること、
を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記個々の試験環境を確立することが、
少なくとも１種の捕捉因子を提供すること；
複数の試験部位それぞれにおいて、個々の捕捉因子の組成を同定することであって、この複数の試験部位それぞれの捕捉因子の組成は、その他の複数の試験部位それぞれの捕捉因子の組成と異なるようにすること；および、
複数の試験部位それぞれにおいて、同定された組成のうち少なくとも１種の捕捉因子を固定すること、
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１種の捕捉因子が、複数の捕捉因子を含み、ここでこの複数の捕捉因子それぞれは、前記生体分子の種類のうち１種またはそれより多くに対し親和性を示し、該親和性は、前記生体分子の種類のうち１種またはそれより多くに対する別の複数の捕捉因子の親和性とは異なっている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
マルチウェルプレートの各ウェル中で複数の試験部位それぞれを形成することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
ＣＭＯＳ基板上に複数の試験部位それぞれを形成することをさらに含む、請求項１２に記載の方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本発明は、診断テストに関し、より具体的には、親和性に基づく診断テストに関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]患者の枕元、介護人の居場所、または患者の自宅などの患者をケアする現場で実行できる診断テストが、ますます普及しつつある。診断テストとしては、核酸、タンパク質および低分子物質のようなバイオマーカーを同定することを目的とした試験が挙げられる。このような診断テスト装置の多くは、バイオマーカー検出における最先端技術とみなされている親和性に基づくセンサーを取り入れている。
【０００３】
[0003]親和性に基づくバイオセンサーは、「鍵と錠」の原理に従って機能するものであり、このような場合、対象のバイオマーカーに対して極めて高い関連を示す因子を有する分子が検出に用いられる。例えば妊娠検査キットは、ｈＣＧ（（βｈＣＧ）のβ−サブユニットに特異的なモノクローナル抗体を包含するものもある。このような抗体は、例えば金、ラテックスまたはフルオロフォアなどのタグに結合されており、これらのタグが検出に用いられる。結合した抗体と標的分子とが結合すると、タグを有する鍵と錠の対が、例えば可視的な試験ラインによって検出可能になると予想される。
【０００４】
[0004]ＥＬＩＳＡプレートおよびマイクロアレイ（例えば核酸、ペプチドおよびタンパク質）は、似たような原理を取り入れている。図１は、ＥＬＩＳＡ分析１０を示しており、ここで抗体１２は基板１４に固定されている。基板１４は、ウェル内に配置されていてもよい（示さず）。ブロッカー１６は、抗体１２周辺の基板の表面を覆うために提供される。続いて、典型的なＥＬＩＳＡ分析では、対象の分子を含むサンプル１８を一次抗体１２が固定されたウェルに添加する。次にサンプルをしばらくの間インキュベートする。インキュベート中、ブロッカー１６は、誤った結合を回避するために、サンプル中の対象の分子が基板１４の表面に結合しないようにする。インキュベート中に、図２に示すように、対象の分子１８のいくつかが抗体１２のいくつかと結合するようになる。インキュベート後、残ったサンプルを洗浄して、未結合の対象の分子１８を除去する。
【０００５】
[0005]その後、結合した標識２２を有する二次抗体２０をウェルに添加し、インキュベートし、洗浄することにより、図３の配置が得られる。図３に示されるように、標識された二次抗体２０は対象の分子１８に結合し、続いて抗体１２に結合する。従って、抗体２０を解して対象の分子１８に結合した標識２２の数は、標的抗原の濃度に比例する。標識の数は、用いられる標識に応じて、最終的に比色分析、電流滴定、磁気測定、ボルタンメトリー、発光または蛍光検出を用いて検出が可能である。あるいは、表面プラズモン共鳴のような標識を用いないその他の抗体プロセスが使用される場合もある。
【０００６】
[0006]検出分析における２つの主要な特徴としては、感受性および交叉反応性が挙げられ、これらはいずれも検出可能な限界濃度と診断の誤り率に影響を与える。このような試験における感受性は、一般的に、標識の検出精度、抗体抗原対の関連を示す因子、および、表面上のプローブ抗体の有効密度によって制限される。
【０００７】
[0007]親和性に基づくセンサーに関して生じる一つの問題は、センサーのその他のバイオマーカーに対する交叉反応性である。言い換えれば、センサーは、単一種のバイオマーカーまたは対象の分子を感知するのではなく、対象のバイオマーカーではないバイオマーカーも感知してしまう傾向がある。図４に交叉反応性の問題を示したが、ここでＥＬＩＳＡ分析３０は、基板表面３２のほとんどを被覆するブロッカー３６と共に、基板３４に固定された抗体３２を含む。加えて、標識された二次抗体３８が対象の分子４０に結合すると、対象の分子４０は順に一次抗体３２を介して結合する。標識された二次抗体３８はさらに、一次抗体３２に親和性を示し、さらに標識された二次抗体３８にも親和性を示す分子４２にも結合する。従って、例えばP.A Benn et al, “Estimates for the sensitivity and false-positive rates for second trimester serum screening for Down syndrome and trisomy 18 with adjustment for cross identification and doublepositive results,” Prenatal Diagnosis, Vol.21, No.1, pp 46-51, 2001で報告されているように、多種多様のバイオマーカーに対して感受性を有することにより、臨床レベルにおける診断テストの誤りのネガティブ／ポジティブ比を高めてしまう。従って、サンプル中のその他の分子  （二次分子または抗原）が存在すると、それらが一次抗体に結合するために検出可能な限界濃度が影響を受ける。
【０００８】
[0008]分析の精度は、さらに物理吸着の影響を受ける可能性がある。図４にさらに示されているように、ＥＬＩＳＡ分析３０に存在するいくつかの記号４４は、汚染物質かまたは単なる不適合物のいずれかであるが、これらもまた標識された二次抗体３８に結合する可能性がある。従って物理吸着した標識された二次抗体３８は、バックグラウンドシグナルの増加を引き起こす。
【０００９】
[0009]親和性に基づく試験に伴う多様な感受性および干渉の問題を減らすために、一般的に、ある種の分析は、対象の分子の抗体への結合を最大化する試薬と環境条件との組み合わせを見出すことによって最適化される。従って、最適化は、必然的に高度に選択的な抗体を取り入れることとなる。
【００１０】
[0010]交叉反応性およびバックグラウンドの問題を克服することは、新しい分析試験法の開発をかなり遅らせる可能性があり、さらに試験全体のコストと複雑さを高める可能性がある。例えば典型的なＥＬＩＳＡ分析の開発には、許容できる抗体を同定するのに数人の科学者が１年以上もの時間作業をする必要がある。このような開発努力に共通する失敗の根源は、タンパク質の交叉反応性である。
【００１１】
[0011]また多種多様のバイオマーカーに対して感受性を有するという問題は、試験装置に多数の異なる親和性に基づくセンサーを取り入れ、バイオマーカーの相対濃度を決定することによって軽減される場合もある。しかしながらこのアプローチは、試験装置の製造コスト、および、試験装置の加工に伴うコストを高める。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】P.A Benn et al, “Estimates for the sensitivity and false-positive rates for second trimester serum screening for Down syndrome and trisomy 18 with adjustment for cross identification and doublepositive results,” Prenatal Diagnosis, Vol.21, No.1, pp 46-51, 2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
[0012]低コストの抗体を取り入れた分析を実行する装置および方法に対する必要性がある。さらに、例えば正確な結果を提供する多重化された分析、タンパク質アレイ、ラテラルフロー装置、サンドイッチ分析、競合分析、または、ビーズをベースとしたアレイ等の低コストの分析、および、このようなアレイの使用方法に対する必要性がある。いわゆる最適化された分析よりも正確な結果を提供する方法および装置は、さらなる利点になると思われる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
[0013]一実施態様によれば、バイオマーカーの検出方法は、サンプル中の生体分子の種類数を同定すること、サンプルを複数の試験部位に晒すこと（ここでこの複数の試験部位中の試験部位の数は、同定された生体分子の種類数に等しいかまたはそれよりも大きい）、複数の試験部位それぞれにおいて個々の試験環境を確立すること（ここでこの複数の試験部位それぞれにおける試験環境は、その他の複数の試験部位それぞれにおける試験環境と異なる）、複数の試験部位それぞれに関連する検出シグナルを得ること、および、得られた検出シグナルに基づいて、生体分子の種類のいずれか１つの濃度を決定すること、を含む。
【００１５】
[0014]その他の実施態様によれば、サンプル中のバイオマーカーの濃度を決定する方法は、複数の検出シグナルに関連する検出シグナル供与体（contributer）の量を同定すること（ここでこの検出シグナル供与体の少なくとも１種は、対象の分子である）、サンプルを複数の試験部位に晒すこと（ここでこの複数の試験部位中の試験部位の数は、同定された検出シグナル供与体の種類数に等しいかまたはそれよりも大きい）、複数の試験部位それぞれにおいて個々の試験環境を確立すること（ここでこの複数の試験部位それぞれにおける試験環境は、その他の複数の試験部位それぞれにおける試験環境と異なる）、複数の試験部位それぞれから複数の検出シグナルのそれぞれを個々に得ること、および、得られた複数の検出シグナルに基づいて、対象の生体分子の濃度を決定すること、を含む。
（１）  サンプル中の生体分子の種類数を同定すること；サンプルを複数の試験部位に晒すことであって、この複数の試験部位中の試験部位の数は、同定された生体分子の種類数に等しいかまたはそれよりも大きいこと；複数の試験部位それぞれにおいて個々の試験環境を確立することであって、この複数の試験部位それぞれにおける試験環境は、その他の複数の試験部位それぞれにおける試験環境と異なること；複数の試験部位それぞれに関連する検出シグナルを得ること；および、得られた検出シグナルに基づいて、生体分子の種類のいずれか１つの濃度を決定すること；を含む、バイオマーカーの検出方法。
（２）  同定された生体分子の種類それぞれについて、複数の試験部位それぞれの個々の試験環境の結合効率を同定すること；および、同定された結合効率を濃度の決定に利用すること、をさらに含む、（１）に記載の方法。
（３）  前記濃度を決定することが、得られた検出シグナルに少なくとも１つの一次関数の推定アルゴリズムを適用することを含む、（２）に記載の方法。
（４）  前記個々の試験環境を確立することが、複数の試験部位それぞれにおいて、温度、電場、磁場、ｐＨおよび緩衝液のタイプからなる環境要因群のうち少なくとも１種の環境要因を制御することによって、制御された環境要因の少なくとも１種が少なくとも２つの複数の試験部位間で異なるようにすること、を含む、（１）に記載の方法。
（５）  前記少なくとも１種の環境要因を制御することが、少なくとも１種の環境要因を制御することによって、複数の部位それぞれにおける制御された環境要因の少なくとも１種が、別の複数の試験部位それぞれとは異なるようにすることを含む、（４）に記載の方法。
（６）  前記個々の試験環境を確立することが、少なくとも１種の捕捉因子を提供すること；複数の試験部位それぞれにおいて、個々の捕捉因子の組成を同定することであって、この複数の試験部位それぞれの捕捉因子の組成は、その他の複数の試験部位それぞれの捕捉因子の組成と異なること；および、複数の試験部位それぞれにおいて、同定された組成のうち少なくとも１種の捕捉因子を固定すること；を含む、（１）に記載の方法。
（７）  前記少なくとも１種の捕捉因子は、複数の捕捉因子を含み、ここでこの複数の捕捉因子それぞれは、同定された生体分子の種類のうち１種またはそれより多くに対し親和性を示し、該親和性は、同定された生体分子の種類のうち１種またはそれより多くに対する別の複数の捕捉因子の親和性とは異なっている、（６）に記載の方法。
（８）  前記複数の試験部位それぞれの捕捉因子の組成は、別の複数の試験部位における少なくとも１種の捕捉因子と異なる少なくとも１種の捕捉因子から選択された捕捉因子を含む、（７）に記載の方法。
（９）  第一の複数の試験部位における捕捉因子の組成が、第二の複数の試験部位における少なくとも１種の捕捉因子と同じ少なくとも１種の捕捉因子から選択された捕捉因子を含む、（６）に記載の方法。
（１０）  前記第一の複数の試験部位における少なくとも１種の捕捉因子から選択された捕捉因子の濃度が、第二の複数の試験部位における少なくとも１種の捕捉因子から選択された捕捉因子の濃度より高い、（９）に記載の方法。
（１１）  マルチウェルプレートの各ウェル中で複数の試験部位それぞれを形成することをさらに含む、（１）に記載の方法。
（１２）  ＣＭＯＳ基板上に複数の試験部位それぞれを形成することをさらに含む、（１）に記載の方法。
（１３）  複数の検出シグナルに関連する検出シグナル供与体の種類数を同定することであって、この検出シグナル供与体の少なくとも１種は、対象の分子であること；サンプルを複数の試験部位に晒すことであって、この複数の試験部位中の試験部位の数は、同定された検出シグナル供与体の種類数に等しいかまたはそれよりも大きいこと；複数の試験部位それぞれにおいて個々の試験環境を確立することであって、この複数の試験部位それぞれにおける試験環境は、その他の複数の試験部位それぞれにおける試験環境と異なること；複数の試験部位それぞれから複数の検出シグナルのそれぞれを個々に得ること；および、得られた複数の検出シグナルに基づいて、対象の生体分子の濃度を決定すること、
を含む、サンプル中のバイオマーカーの濃度を決定する方法。
（１４）  前記検出シグナル供与体それぞれについて、複数の試験部位それぞれの個々の試験環境の結合効率を同定すること；および、同定された結合効率を濃度の決定に利用すること；をさらに含む、（１３）に記載の方法。
（１５）  前記個々の試験環境を確立することが、複数の試験部位それぞれにおいて、温度、電場、磁場およびｐＨからなる環境要因群のうち少なくとも１種の環境要因を制御することによって、制御された環境要因の少なくとも１種が少なくとも２つの複数の試験部位間で異なるようにすること、を含む、（１３）に記載の方法。
（１６）  前記少なくとも１種の環境要因を制御することが、少なくとも１種の環境要因を制御することによって、複数の部位それぞれにおける制御された環境要因の少なくとも１種が、別の複数の試験部位それぞれとは異なるようにすること、を含む、（１５）に記載の方法。
（１７）  前記個々の試験環境を確立することが、少なくとも１種の捕捉因子を提供すること；複数の試験部位それぞれにおいて、個々の捕捉因子の組成を同定することであって、この複数の試験部位それぞれの捕捉因子の組成は、その他の複数の試験部位それぞれの捕捉因子の組成と異なること；および、複数の試験部位それぞれにおいて、同定された組成のうち少なくとも１種の捕捉因子を固定すること；を含む、（１３）に記載の方法。
（１８）  前記少なくとも１種の捕捉因子が、複数の捕捉因子を含み、ここでこの複数の捕捉因子それぞれは、同定された生体分子の種類のうち１種またはそれより多くに対し親和性を示し、該親和性は、同定された生体分子の種類のうち１種またはそれより多くに対する別の複数の捕捉因子の親和性とは異なっている、（１７）に記載の方法。
（１９）  マルチウェルプレートの各ウェル中で複数の試験部位それぞれを形成することをさらに含む、（１３）に記載の方法。
（２０）  ＣＭＯＳ基板上に複数の試験部位それぞれを形成することをさらに含む、（１３）に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ＥＬＩＳＡアレイ内の従来技術の試験部位の略図を示しており、ここでサンプルとして基板上に形成された抗体およびブロッカーが試験部位に添加される；
【図２】図２は、試験部位をインキュベートし洗浄した後に、図１に示す抗体のうちいくつかに対象の分子が結合した状態の図１の試験部位を示す。
【図３】図３は、結合した対象の分子に標識された二次抗体が結合するように、標識された二次を添加して、試験部位を再度インキュベートし洗浄した後の、図２に示す試験部位を示す。
【図４】図４は、ＥＬＩＳＡアレイ内の従来技術の試験部位の略図を示しており、ここで標識された二次は交叉反応性のために妨害分子に結合し、さらに基板表面にも物理吸着することにより、所定レベルの試験のバックグラウンドノイズが発生する。
【図５】図５は、マルチサイトバイオセンサーシステムを示しており、このシステムは、検出シグナルを増加させるその他の分子を含むサンプル中の対象の分子の濃度を決定することができるように、単一のサンプルを異なる環境条件に晒すように設計されている。
【図６】図６は、マイクロアレイの形態で多数の異なる試験部位を提供するためのプラットフォームを示す。
【図７】図７は、サンプルが複数の試験環境に晒されるように、プラットフォーム上の様々な試験部位において様々な試験環境を確立するのに使用できる手順を示す。
【図８】図８は、試験部位の略図を示しており、ここで標識された二次は、対象の分子に結合し、さらに交叉反応性によって妨害分子にも結合し、さらに基板表面に物理吸着もするため、所定レベルの試験のバックグラウンドノイズが発生する。
【図９】図９は、図８に示される試験部位と同じように形成され、図８に示される試験部位が晒されたのと同じサンプルに晒された試験部位の略図を示しているが、この試験部位は、インキュベート中、図８に示される試験部位の温度とは異なる温度で維持されており、その結果として異なるシグナル供与体に応じて異なる結合効率が生じる。
【図１０】図１０は、対象の分子の様々な濃度サンプルに関してモデル化された検出シグナルのグラフを示しており、これによれば、検出されたシグナルが、サンプル中の対象の分子の濃度が増加するにつれて直線状に増加していることが示される。
【図１１】図１１は、対象の分子および検出されたシグナルを高めるその他の分子の様々な濃度サンプルに関してモデル化された検出シグナルのグラフを示しており、これによれば、対象の分子によって生じるシグナルが、その他の分子によって生じるシグナルによって打ち消されることが示される。
【図１２】図１２は、図７に記載の手順を用いて、その他の分子によって生じるシグナルの増加分について補正した後の、多数のサンプルにおける計算によって得られた対象の分子からのシグナル供与率のグラフを示す。
【図１３】図１３は、２種の異なる温度で２種の異なる抗体のサンプルから得られた検出シグナルのグラフを、２種の抗体を含むサンプルから得られた予想のシグナルおよび測定シグナルと共に示す。
【図１４】図１４は、図１に示す抗体３の両方を含むサンプルから得られた予想のシグナルと測定シグナルとの相関のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
[0029]本発明の原理をよりよく理解するために、ここで図面に記載された実施態様を参照し、以下で詳細に説明する。それによって本発明の範囲を限定することは目的としないこととする。さらに、本発明は、説明された実施態様に対するあらゆる変更および改変を含み、加えて、本発明に関連する当業者が通常想到すると予想される本発明の原理のさらなる用途を含むこととする。
【００１８】
[0030]図５を参照すると、一般的に１００と示されるマルチサイト式バイオセンサーシステムの概略図が示される。バイオセンサーシステム１００は、出入力装置１０２、処理回路１０４、および、メモリー１０６を含む。出入力装置１０２は、ユーザーインターフェース、グラフィカルユーザーインターフェース、キーボード、ポインティングデバイス、リモートおよび／またはローカルコミュニケーションリンク、ディスプレイ、および、外部で作製した情報をバイオセンサーシステム１００に提供することができ、さらにバイオセンサーシステム１００内部の情報を外部に伝達することができるその他の装置を含んでいてもよい。
【００１９】
[0031]処理回路１０４は、適切には、汎用のコンピューター処理回路であってもよく、例えばマイクロプロセッサー、および、それに関連する回路機構である。ここで処理回路１０４は、それに起因するオペレーションを実行することを可能にする。
【００２０】
[0032]メモリー１０６内には、様々なプログラムインストラクション１０８がある。プログラムインストラクション１０８は、そのうちいくつかは以下でさらに詳細に説明されるが、処理回路１０４、および／または、必要に応じてその他の何らかの構成要素によって実行可能である。またメモリー１０６内には、親和性のデータベース１１０も配置されている。
【００２１】
[0033]バイオセンサーシステム１００はさらに、環境制御器１１２、および、一式の環境検知器１１４を含む。この実施例において、図６に示されるマイクロアレイ１２０内で、環境制御器１１２は、環境条件を確立してをれを維持するように設計される。マイクロアレイプラットフォーム１２０を形成するのに様々な方法が使用可能である。一例として、米国特許第５，８０７，５２２号は、マイクロアレイの形成方法を開示している。マイクロアレイプラットフォーム１２０は、多数の異なるサブアレイ１２２を含む。サブアレイ１２２は、多数の試験部位１２４を含む。サブアレイ１２２の数、それに加えてそれぞれのサブアレイ１２２内の試験部位１２４の数は、本発明の範囲内で様々であってよい。この実施態様において、環境制御器１１２は、マイクロアレイプラットフォーム１２０内の温度プロファイルを確立するのに使用することができる。それぞれの試験部位１２４内の正確な温度は、一式の検知器１１４によって検出してもよい。
【００２２】
[0034]システム１００はさらに、標識読取装置１１６を含む。標識読取装置１１６は、システム１００のその他の構成要素と共に単一の装置中に含まれていてもよい。あるいはシステム１００の１個またはそれより多くの構成要素が、分離装置として提供されてもよく、この分離装置は、システム１００のその他の構成要素から離れて配置されていてもよい。
【００２３】
[0035]試験部位１２４は、対象の生体分子を捕捉するのに有効な捕捉因子を用いて製造される。図７の手順１３０を参照しながら、バイオセンサーシステム１００に関するさらなる詳細を示す。図７の手順１３０のうち少なくとも一部を実行するために、プロセッサー１０４がプログラムインストラクション１０８を実行する。異なる実施態様において、手順１３０は、特定の基準に応じてそれより多くの、または、それより少ない工程が含まれるように改変してもよい。
【００２４】
[0036]ブロック１３２において、対象の分子を同定し、続いて対象の分子に親和性を有する抗体を同定する（ブロック１３４）。続いて、少なくとも２種の異なる環境条件について対象の分子の同定された抗体との結合効率の係数（αｉ）を同定し（ブロック１３６）、親和性のデータベース１１０のうち１つに保存する（ブロック１３８）。
【００２５】
[0037]続いて、試験されるサンプル中に存在する可能性が高い試験シグナルの干渉またはノイズの考えられる発生源を同定する（ブロック１４０）。シグナル干渉を同定することとは、例えば、同定された抗体にも親和性を有する、サンプル内の考えられるまたは可能性のある分子を同定することである。続いて、ノイズ発生源それぞれの同定された抗体との結合効率の係数（αｎ）を異なる環境条件（ブロック１４２）それぞれについて同定し、親和性のデータベース１１０（ブロック１４４）のいずれか１つに保存する。
【００２６】
[0038]ブロック１４６において、マイクロアレイプラットフォーム１２０を、試験部位１２４それぞれにおいて望ましい量の選択された捕捉因子を堆積させることによって製造する。その代りの実施態様において、単一のマイクロアレイプラットフォーム１２０内で２種の別個の試験を行えるように、試験部位１２４の部分集合を第一の捕捉因子を用いて製造し、一方で、試験部位１２４のその他の部分集合を第二の捕捉因子を用いて製造してもよい。また、単一のマイクロアレイプラットフォーム１２０内の追加の立体配置を用いてもよい。一例として、１つのサブアレイ１２２内のそれぞれの試験部位を同じ捕捉因子を用いて製造してもよいし、一方で、それぞれのサブアレイ１２２が異なる捕捉因子を含む。この実施態様において、特定の捕捉因子を用いて製造された試験部位１２４の数を、上記で同定されたノイズ発生源と対象の分子との総数と少なくとも同数になるように選択する。
【００２７】
[0039]マイクロアレイプラットフォーム１２０を製造したら、選択された試験部位１２４群にサンプルを導入する（ブロック１４８）。選択された試験部位１２４群それぞれの環境がまだ確立されていない場合、選択された試験部位１２４群それぞれで様々な試験環境が確立されるように、選択された試験部位１２４群それぞれの環境を制御する（ブロック１５０）。この実施例において、制御される環境条件は、温度である。従って、マイクロアレイプラットフォーム１２０全体にわたり温度プロファイルを確立する。これは、具体的な実施態様に応じて、選択された試験部位１２４群それぞれまたはサブアレイ１２２に適したヒーター／クーラーを提供することによって達成される可能性がある。その他の実施態様において、マイクロアレイプラットフォーム１２０全体に温度勾配が確立されるように、マイクロアレイプラットフォーム１２０の一方の末端に熱を加え、マイクロアレイプラットフォーム１２０の逆の末端に熱が吸収されるようにヒートシンクを取り付ける。
【００２８】
[0040]続いて、確立された試験環境で、サンプルを予め決められた時間インキュベートする（ブロック１５２）。インキュベート中、選択された試験部位１２４群それぞれの実際の試験環境を一式の環境検知器１１４によってモニターし、確立された試験環境の指標となるデータを処理回路１０４に提供する（ブロック１５４）。サンプルを十分にインキュベートしたら、試験部位１２４を洗浄し（ブロック１５６）、標識された二次抗体を、選択された試験部位１２４群に導入し（ブロック１５８）、インキュベートする（ブロック１６０）。続いて選択された試験部位１２４群を洗浄し（ブロック１６２）、標識読取装置１１６によって試験部位１２４中に残った標識を検出する（ブロック１６４）。シグナルが選択された試験部位１２４群中に残った標識の数と関連することに基づいて、処理回路１０４によって、サンプル内の１種またはそれより多くの対象の分子の濃度を計算する。
【００２９】
[0041]選択された試験部位１２４群の特定の１種について標識読取装置１１６によって得られたシグナルは、対象の分子と、それぞれのノイズ発生源（例えば妨害分子）等のシグナルの供与体との合計であることから、１種またはそれより多くの対象の分子の濃度計算が可能である。一例として、図８は、基板１８４上に形成された抗体１８２を含む試験部位１８０１を示す。抗原１８６が、いくつかの抗体１８２に結合している。さらにいくつかの妨害的な抗原１８８も、いくつかの抗体１８２に結合している。これらの結合した抗原１８６それぞれと、結合した妨害的な抗原１８８のそれぞれに、標識された二次抗体１９０が結合している。またいくつかの標識された二次抗体１９０は、ブロックされた基板１８４の表面に物理吸着もしている。
【００３０】
[0042]それぞれの供与体に起因する可能性があるシグナルの相対的比率は、特定の供与体の濃度、その他の供与体の濃度、および、それぞれの供与体の最初に堆積した捕捉因子に対する相対的な親和性に依存する。この関係は、以下の方程式で示される。
【００３１】
【数１】
0005925683.tif 000002
[0043]従って、選択された試験部位１２４群の数は、少なくとも妨害的な供与体の数に１を足した数に等しいため、検出されたシグナルの数は、同定された妨害的な供与体の数に対象の分子の数を足した数に相当すると予想される。様々な発生源の総合的なシグナル供与率、加えて総合的なシグナルの値は、試験部位によって異なると予想される。例えば図９は試験部位１８０２を示しており、この試験部位１８０２は、試験部位１８０１と同じように製造され、試験部位１８０１で用いられたサンプルと同一なサンプルに晒されたものである。それぞれの試験部位１８０ｘにおける試験環境は異なっている。従って、対象の分子に結合した標識された二次抗体１９０は、図８では２個であるが、図９では４個に増加している。加えて、妨害的な抗原に結合した標識された二次抗体１９０は、図８では２個であるが、図９では３個に増加している。
【００３２】
[0044]従って、サンプル中で３種のノイズ供与体、例えば一次抗体の部位に非特異的に結合してバイオマーカーの結合を妨げる分析物、サンドイッチを形成して誤ったシグナルを発生させる分析物、および、試験部位の表面に物理吸着して誤ったシグナルを発生させる分析物が同定される場合、対象の分子とあわせて４つの試験部位（例えば試験部位１２４のうち４つ）が、ブロック１４４で製造される最小限の数のセルである。それゆえに、４つのシグナルは、以下の方程式で示されるようにして得られると予想される：
【００３３】
【数２】
0005925683.tif 000003
[0045]各項は、結合効率の係数αに比例していることから、分子の親和性およびその他の分析条件（例えば物質輸送）の関数である。従って、それぞれの試験部位１２４に同じサンプルが用いられ、さらにそれぞれの試験部位１２４における特定の環境についての対象の分子と妨害的な抗原の結合効率とが既知であるため、手順１３０から、４つの方程式および４つの未知数が提供される。従って、それぞれの供与体の濃度は、よく知られた方式で確認することができる。従って、サンプル内の複数の対象の分子の濃度も確認することができる。実際にはシグナルにはノイズがあるので、いずれかの特定のシグナルに用いられる値を推測するために一次関数の推定アルゴリズムを用いてもよい。加えて、手順１３０の精度を改善するために、コントロール部位として１またはそれより多くのセンサー部位を用いてもよい。
【００３４】
[0046]ブロック１４８で制御される環境要因を選択する際に重要なことは、それぞれの供与体に関する結合効率の係数が、選択された試験部位１２４群それぞれで選択された異なる環境におけるその他の供与体に関する結合効率の係数と比較して、一次関数的に変化しないようにすることである。サンプル中のシグナル供与体間の結合効率に大きい差が生じる環境要因が、精度を改善すると予想される。単一の環境要因が結合効率に十分な差を提供することが最適であると予想される。しかしながら、必要に応じて、未知の量を解析するのに十分なデータが提供されるように複数の要因を様々な組み合わせで改変させてもよい。追加の因子が含まれる場合、試験部位の最低限の数、および、それに続くコンピューター処理の複雑さが増加する。
【００３５】
[0047]前述の例において、それぞれの試験部位１２４内の温度は、異なる結合効率が得られるように制御された。ＣＭＯＳ技術を取り入れた実施態様において、チップ内の温度勾配は、例えばポリシリコン製の抵抗器、または、一体型のペルチェ素子などのチップ上の抵抗器を用いて確立することができる。それぞれの試験部位内の温度を正確に測定するために、低出力のチップ上の温度センサーを用いてもよい。従って、マルチサイト式バイオセンサーは、印刷回路基板、ガラス、プラスチック基板上に提供してもよいし、または、金、ガラス、エポキシ、ポリマーまたはゲルコーティングされたＣＭＯＳチップ上に提供してもよいし、または、例えば９６ウェルプレートのようなウェルプレート中に提供することも可能である。必要に応じて、印刷回路基板またはＣＭＯＳチップ中に制御、目盛りを提供することもでき、さらには制御の感知も提供することができる。ＣＭＯＳ技術は、複数の感知部位をごく近接させて作製することを可能にする。これは、非制御環境下の要因の均一性を試験部位間で維持するのに役立つ。チップは、マイクロフルイディクスまたは毛細管の原理を単独で用いたシステムの一部であってもよいし、または、別々に提供された装置とともに使用してもよい。シグナルの推定および分析データは、必要に応じてＣＭＯＳチップ上にハードコードしてもよい。
【００３６】
[0048]温度は、様々な試験環境を確立するために用いることができる環境要因というだけではない。F.A. Armstrong, “Recent developments in dynamic electrochemical studies of adsorbed enzymes and their active sites,” Current Opinion in Chemical Biology, Vol. 9, No. 2, pp 110-117, 2005, R. J. Heaton et al., “Electrostatic surface plasmon resonance: direct electric field-induced hybridization and denaturation in monolayer nucleic acid films and label-free discrimination of base mismatches,” Proceedings of National Academy of Science, Vol. 98, No. 7, pp. 3701-3704, 2001、および、I. Wong et al., “Dynamic control of biomolecular activity using electrical interfaces,” Soft Matter.Vol. 3, No. 3, pp 267-274, 2007で報告されているように、インキュベートが行われる電場は分子結合の効率を変化させることが示される。
【００３７】
[0049]いくつかの実施態様において、それぞれの試験部位内の電場は、その他の試験部位それぞれにおける電場とは異なるように制御することもできる。電場は、例えば局所濃度、ｐＨなどを変化させるのに用いることができる。基礎となるメカニズムは、電気分解およびイオン引力を含む。ＡＣシグナルの使用はさらに、例えば電気流体力学の作用によって、サンプル内のイオン運動をつくりだすことによって局所的な混合を提供することができる。前述の作用を提供する電圧範囲の多くは、ＣＭＯＳ互換性である。従って、表面電極を有するＣＭＯＳチップが使用可能である。望ましい作用に応じて、特定の試験部位に１、２またはそれより多くの電極が提供されてもよく、さらに、試験サンプルに晒されていてもよいし、または、試験サンプルから隔離されていてもよい。その他の製造方法は、電極（例えばＩＴＯ、金）を備えたスライドガラス、または、印刷電極（例えば炭素、金、銀）を備えたプラスチックもしくは紙の薄膜を包含する。
【００３８】
[0050]試験環境を制御するためのその他のアプローチは、磁気ビーズ、および、制御された磁場の使用によるものである。磁気ビーズは、各種生体分子、例えば抗体、エポキシ、核酸またはアプタマーに対して高親和性を有する分子で官能化されている。磁気ビーズがセンサー部位を通過して移動すると、それらに異なる分子が異なる割合で結合し、それによって試験部位の表面を掻き取り、試験部位を「クリーニング」すると予想される。試験部位内の磁場の制御は、各試験部位で起こる「クリーニング」の程度に影響を与え、それによって、異なる分子の結合効率を、分子と抗体との間に形成された結合強度に応じて変化させる。様々な実施態様において、ＣＭＯＳ一体型コイルは中程度の磁場しか発生させることができないため、外部の磁石を用いて、望ましい値になるまで磁場にバイアスをかけてもよい。
【００３９】
[0051]様々な試験環境を確立するために用いられるさらなる実施態様は、試験部位を製造する際に複数の捕捉因子を包含する。捕捉因子の相対濃度を変化させることによって、特定のサンプル中の供与体に関する結合効率を、それぞれの試験部位ごとに変化させることができる。それぞれの試験部位における捕捉因子の組成は、様々な抗体、アプタマー、核酸、または、その他の生体分子であり得る。従って、捕捉因子の相対濃度を変化させることによって少なくとも２つの供与体間の効率において十分な変化を生じさせることができさえすれば、それら捕捉因子はあまり特異的でなくても有用な可能性がある。
【００４０】
[0052]類似の実施態様において、複数の部位間で一種の捕捉因子の濃度を改変させた組成によって、１種またはそれより多くの供与体の結合効率を変化させることができる。その他のアプローチは、スポットを洗浄しながら異なる試験部位において異なる圧力を用いて親和性を調節することである。圧力の改変は、流体工学的な機構で達成することができる。
【００４１】
[0053]標識読取装置１１６に包含されるセンサーまたはセンサー群のタイプは、用いられる具体的な標識に応じて様々であると予想される。従って、様々な実施態様において、発光、蛍光、比色、電気化学、インピーダンスおよび磁気センサーを使用することが可能である。このようなセンサーは、選択された１またはそれより多くの試験部位によって生産されたシグナルを個々に分離できるように設計されると予想される。同様に、一式の環境検知器１１４に包含されるセンサーとしては、ＩＲセンサーおよびホールセンサーが挙げられる。試験部位表面上の磁気ビーズの密度をモニターするために、ＡＭＲセンサーまたはＧＭＲセンサーが備えられていてもよい。電気化学的な実施態様において、ＩＳＦＥＴまたはＣＭＯＳベースの電荷検出回路が用いられる可能性がある。
【実施例】
【００４２】
[0054]マウス抗ストレプトアビジンモノクローナル抗体、および、ウサギ抗ストレプトアビジンポリクローナル抗体を用いた実験から抽出されたパラメーターに基づくシミュレーションモデルを用いて、手順１３０の有効性を検証した。このシミュレーションにおいて、２つの試験部位で２種の異なる温度を確立し、同時に両方の試験部位で同じ標識および同じ捕獲分子を用いることで、２種の異なる試験部位における抗体の親和性を調節することによって２種の異なる抗体を識別した。
【００４３】
[0055]最初のうちは、様々な濃度のＡＢ（ひし形の抗体）で検出されたシグナルが発生した。図１０のグラフ４００に、ＡＢ（ひし形の抗体）の純粋なサンプルから得られたシグナルの結果を示す。グラフ４００は、ＡＢ（ひし形の抗体）の濃度が１ｐｇ／ｍｌから２ｐｇ／ｍｌ、４ｐｇ／ｍｌ、続いて８ｐｇ／ｍｌに増加した際に、検出されたシグナルが実質的に直線的に増加することを示す。
【００４４】
[0056]図１１は、様々な濃度のＡＢ（円形の抗体）の存在下で、ＡＢ（ひし形の抗体）が１ｐｇ／ｍｌから２ｐｇ／ｍｌ、４ｐｇ／ｍｌ、続いて８ｐｇ／ｍｌに増加した際に得られたシグナルのグラフ４１０を示す。ＡＢ（ひし形の抗体）およびＡＢ（円形の抗体）は、グラフ４１０の結果をもたらすモデリングのために選択された温度で似たような結合効率を示した。ＡＢ（ひし形の抗体）が１ｐｇ／ｍｌから２ｐｇ／ｍｌ、４ｐｇ／ｍｌ、続いて８ｐｇ／ｍｌに増加した際に、ＡＢ（円形の抗体）の濃度は、それぞれ８ｐｇ／ｍｌから４ｐｇ／ｍｌになり、８ｐｇ／ｍｌになり、４ｐｇ／ｍｌに戻った。グラフ４１０から、ＡＢ（円形の抗体）の存在が、ＡＢ（ひし形の抗体）によって生じるシグナルを消してしまったことが示される。
【００４５】
[0057]シミュレーションにおいて、ＡＢ（ひし形の抗体）およびＡＢ（円形の抗体）の結合効率を、２種の異なる温度について誤差６％でモデル化した。ＡＢ（ひし形の抗体）の結合効率は、基準として第一の試験部位における結合効率に合わせたところ、第二の試験部位において０．６に減少した。ＡＢ（円形の抗体）の結合効率は、基準として第一の試験部位における結合効率に合わせたところ、第二の試験部位において０．３に減少した。ＡＢ（ひし形の抗体）およびＡＢ（円形の抗体）の同じ組み合わせがグラフ４１０の作製に用いられ、ここで図７の手順１３０を用いて２つの試験部位間に温度差をもたせてデータが作製された。シミュレーションシナリオから得られた結果を図１２のグラフ４２０に示す。
【００４６】
[0058]図１２において、手順１３０に基づいてコンピューターで計算したＡＢ（ひし形の抗体）により生じた検出シグナルを４２２のラインで示す。図４で示された純粋なＡＢ（ひし形の抗体）に基づくシグナルを４２４のラインで示す。ライン４２２の傾きと４２４の傾きとを比較すると、発生したシグナル（ライン４２２）と実際のシグナル（ライン４２４）との間に優れた相関が示され、変動は１０％未満であった。
【００４７】
[0059]また図７の手順１３０は、異なる温度で異なる抗体の組み合わせから得られたシグナルの組み合わせを予想する計算を用いることによって実験的も検証を行った。この実験において、ウサギｐＡｂ、マウスｍＡｂ、およびビオチンを含むストレプトアビジンプレート上の試験部位を異なる温度に晒した。１つの試験部位を２３℃で確立し、第二の試験部位を４７℃で確立した。高い温度で、ｐＡｂ、ｍＡｂおよびビオチンについての結合効率がそれぞれ２．５倍、１．９倍、および１倍増加した。
【００４８】
[0060]図１３のグラフ４３０に、異なる濃度のｐＡｂおよびｍＡｂ抗体から得られた検出シグナルを示す。図１３において、ライン４３２は、２３℃においてｐＡｂの純粋なサンプルから検出されたシグナルを示し、ライン４３４は、４７℃においてｐＡｂの純粋なサンプルから検出されたシグナルを示す。加えてライン４３６は、２３℃においてｍＡｂの純粋なサンプルから検出されたシグナルを示し、ライン４３８は、４７℃においてｍＡｂの純粋なサンプルから検出されたシグナルを示す。
【００４９】
[0061]続いて、図７の手順１３０に関して上述した計算を用いて、両方の試験部位でｐＡｂとｍＡｂの両方を含むサンプルに関して検出されると予想されるシグナルを予想した。図１３において、三角形４４０は、２３℃でｐＡｂ／ｍＡｂを１：１の比率で混合したサンプルから得られると予想される推定シグナルを示し、ひし形４４２は、手順１３０に基づいて４７℃でｐＡｂ／ｍＡｂを１：１の比率で混合したサンプルから得られると予想される推定シグナルを示す。
【００５０】
[0062]続いてｐＡｂおよびｍＡｂを１：１の比率で混合して実験をを行い、様々な濃度でシグナルを得た。図１３において、プラスの記号（＋）４４４は、２３℃においてｐＡｂ／ｍＡｂ混合サンプルから得られた実験シグナルを示し、四角形４４６は、４７℃においてｐＡｂ／ｍＡｂ混合サンプルから得られた実験シグナルを示す。図１３からわかるように、推定シグナルの傾きと実験シグナルの傾きとの間に優れた相関が認められる。
【００５１】
[0063]図１４に実験シグナルと推定シグナルとのさらなる比較を示す。図１４において、円形４５０として示されるデータポイントは、２３℃におけるｐＡｂ／ｍＡｂ混合サンプルについての推定シグナルと実験シグナルとの間の相関を示し、四角形４５２は、４７℃におけるｐＡｂ／ｍＡｂ混合サンプルについての推定シグナルと実験シグナルとの間の相関を示す。
【００５２】
[0064]従って、標識の検出シグナルの増加を引き起こすその他の抗体の存在下でさえも、対象の分子の濃度を得ることができる。また特定の分析についてのバックグラウンドノイズも、検出されたシグナルを有意に増加させる可能性がある。このようなバックグラウンドノイズを減らしたり、または、取り除いて手順１３０の感度を高めるために、様々な先進的な検出および制御法を用いてもよい。
【００５３】
[0065]従って、手順１３０は、様々な試験部位のプラットフォームで使用することができ、このようなプラットフォームとしては、９６ウェルプレート、それより少ないウェルまたは追加のウェルを有するプレート、マイクロアレイプラットフォーム、印刷回路基板プラットフォーム、ＣＭＯＳチッププラットフォーム、多重化分析、タンパク質アレイ、ラテラルフロー装置、サンドイッチ分析、競合分析、ビーズをベースとしたアレイ、または、その他の適切なプラットフォームが挙げられる。手順１３０はさらに、様々な対象の分子の検出にも使用することもでき、さらに、抗体に加えて異なるタイプの分子の検出にも使用することもできる。一例として、手順１３０もまた、核酸、タンパク質、または、低分子物質の検出に使用することもできる。
【００５４】
[0066]図面および前述の詳細な説明で本発明を図解して詳細に説明したが、同様のものが説明されたとみなされ、本質的に制限されないこととする。当然のことながら、好ましい実施態様のみを示したが、本発明の本質の範囲内のあらゆる変化、改変およびさらなる用途が保護されることが望ましい。
【符号の説明】
【００５５】
１０  ＥＬＩＳＡ分析
３０  ＥＬＩＳＡ分析
１２  一次抗体
１４  基板
１６  ブロッカー
１８  サンプル
１８  対象の分子、一次抗体
２０  二次抗体
２２  標識
３２  一次抗体
３４  基板
３６  ブロッカー
３８  二次抗体
４０  対象の分子
４４  記号
１００  バイオセンサーシステム
１０２  出入力装置
１０４  処理回路
１０６  メモリー
１０８  プログラムインストラクション
１１０  データベース
１１２  環境制御器
１１４  一式の環境検知器
１２０  マイクロアレイプラットフォーム
１２２  サブアレイ
１２４  試験部位
１１６  標識読取装置
１３０  手順
１３２〜１６６  ブロック
１８２  抗体
１８４  基板
１８６  抗原
１８８  妨害的な抗原
１９０  標識された二次抗体
【図１】
0005925683.tif 000004
【図２】
0005925683.tif 000005
【図３】
0005925683.tif 000006
【図４】
0005925683.tif 000007
【図５】
0005925683.tif 000008
【図６】
0005925683.tif 000009
【図７】
0005925683.tif 000010
【図８】
0005925683.tif 000011
【図９】
0005925683.tif 000012
【図１０】
0005925683.tif 000013
【図１１】
0005925683.tif 000014
【図１２】
0005925683.tif 000015
【図１３】
0005925683.tif 000016
【図１４】
0005925683.tif 000017