(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＳＨＲに結合して前記ＴＳＨＲを刺激する単離された抗体分子であって、図４ｂ及び４ｄのアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２３及び３３）から選択される抗体ＶＬドメインを含み、並びに／又は図４ｂ（配列番号２４〜２６）及び４ｄ（配列番号３４〜３６）のＣＤＲＩ、ＩＩ、及びＩＩＩから選択されるＣＤＲを含み、並びに、図３ｂ（配列番号５）及び３ｄ（配列番号１５）のアミノ酸配列から選択される抗体ＶＨドメインを含み、並びに／又は図３ｂ（配列番号６〜８）及び３ｄ（配列番号１６〜１８）のＣＤＲＩ、ＩＩ、及びＩＩＩから選択されるＣＤＲを含む単離された抗体分子。
【請求項２】
前記ＴＳＨＲに対する前記単離された抗体分子の結合が、甲状腺刺激又は阻止活性を有する患者血清ＴＳＨＲ抗体により阻害される、請求項１に記載の単離された抗体分子。
【請求項３】
図４ｂ（配列番号２３）及び４ｄ（配列番号３３）のアミノ酸配列から選択される抗体ＶＬドメイン、及び図３ｂ（配列番号５）及び３ｄ（配列番号１５）のアミノ酸配列から選択される抗体ＶＨドメインを含む、請求項１又は２に記載の単離された抗体分子。
【請求項４】
図３ｂ（配列番号６〜８）又は３ｄ（配列番号１６〜１８）のＣＤＲＩ、ＩＩ、及びＩＩＩを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された抗体分子。
【請求項５】
図４ｂ（配列番号２４〜２６）又は４ｄ（配列番号３４〜３６）のＣＤＲＩ、ＩＩ、及びＩＩＩを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された抗体分子。
【請求項６】
モノクローナル抗体、組換え抗体、又は合成抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離された抗体分子。
【請求項７】
ａ．請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された抗体分子、又は
ｂ．図４ｂ（配列番号２３）若しくは４ｄ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含む抗体ＶＬドメイン、又は
ｃ．図３ｂ（配列番号５）若しくは３ｄ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含む抗体ＶＨドメイン、又は
ｄ．それらの組合せをコードする単離されたヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７に記載の単離されたヌクレオチドを含むベクター。
【請求項９】
請求項７に記載のヌクレオチド、又は請求項８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された抗体分子を含む医薬組成物。
【請求項１１】
治療に使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された抗体分子又は請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ＴＳＨＲ抗体、ＴＳＨ、又はヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモンの活性を特徴付けする方法であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された抗体分子の使用を含むステップを含む方法。
【請求項１３】
哺乳動物細胞の前記ＴＳＨＲを刺激するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、前記細胞を、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された抗体分子、又は請求項１０に記載の医薬組成物と接触させることを含む方法。
【請求項１４】
哺乳動物（ヒトを除く）細胞の前記ＴＳＨＲを刺激するｉｎ  ｖｉｖｏ法であって、前記細胞を、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された抗体分子、又は請求項１０に記載の医薬組成物と接触させることを含む方法。
【請求項１５】
前記ＴＳＨＲに対する被検体自己抗体を検出するための方法であって、そのような被検体自己抗体を含有すると考えられる対象体から単離された試料及び請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体分子を、ＴＳＨＲ又はＴＳＨＲのアミノ酸２２〜２６０（配列番号７５）を含むＴＳＨＲ断片と接触させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体（ＴＳＨＲ）と反応するヒトモノクローナル自己抗体（ＭＡｂ）に関する。ヒトＭＡｂの１つ（Ｋ１−１８）は、ＴＳＨＲに結合し、ＴＳＨＲ環状ＡＭＰ活性を刺激する能力を有する。他方のヒトＭＡｂ（Ｋ１−７０）は、ＴＳＨＲに結合し、ＴＳＨ及びＴＳＨＲ刺激抗体により媒介される環状ＡＭＰの刺激を阻止する能力を有する。両ヒトＭＡｂは、甲状腺機能低下症の臨床症状を呈する患者の末梢リンパ球から単離された。
【背景技術】
【０００２】
甲状腺機能は、下垂体により分泌されるＴＳＨにより調節される（Szkudlinski MW, et
al 2002. Physiological Reviews 82:473-502）。ＴＳＨは、甲状腺細胞の表面にあるＴＳＨＲに結合し、これは、ＴＳＨＲシグナル伝達カスケード開始の最初のステップである。ＴＳＨがＴＳＨＲに結合することにより、甲状腺ホルモン：チロキシン（Ｔ４）及びトリヨードチロニン（Ｔ３）の形成及び放出の刺激がもたらされる。循環中のＴ４及びＴ３のレベル、及び視床下部により分泌される甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）のレベルに関与するフィードバック機序は、ひいては甲状腺刺激を制御するＴＳＨの放出、及び血清中の甲状腺ホルモンのレベルを制御する（Szkudlinski MW, et al 2002  上記）。ＴＳＨＲは、Ｇタンパク質共役受容体であり、３つのドメイン：ロイシンリッチリピートドメイン（ＬＲＤ）、切断ドメイン（ＣＤ）、及び膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）で構成される（Nunez Miguel R,et al 2004.Thyroid 14:991-1011）。
【０００３】
自己免疫甲状腺疾患（ＡＩＴＤ）を有する患者の中には、ＴＳＨＲと反応する自己抗体を発生させる者がいることが、当技術分野で十分に記述されている（Rees Smith B,et al
1988. Endocrine Reviews 9:106-121）。２つの主要なタイプのＴＳＨＲ自己抗体（ＴＲＡｂ）：刺激型及び阻止型が存在する。甲状腺刺激型自己抗体は、ＴＳＨＲに結合し、ＴＳＨの作用を模倣し、それにより甲状腺を刺激して高レベルのＴ４及びＴ３を産生し、これら自己抗体も、刺激活性又はＴＳＨアゴニスト活性を有するＴＲＡｂとして記述されている（Rees Smith B, et al 2007. Thyroid 17:923-938）。甲状腺機能のフィードバック制御機序は、甲状腺刺激性自己抗体が存在すると、もはや有効ではなく、患者は、血清及びその代謝結果における甲状腺ホルモンの過剰により特徴付けられる活動亢進性甲状腺の臨床症状を呈する。この状態は、グレーブス病として知られている。刺激活性を有するＴＲＡｂは、眼窩後方組織のＴＳＨＲとも相互作用し、グレーブス病の眼の兆候の発病に寄与する場合がある。強力な甲状腺刺激物質（ｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１；Ｍ２２とも呼ばれる）として作用するヒトモノクローナル自己抗体が、国際公開第２００４／０５０７０８号Ａ２に詳細に記述されている。ＴＳＨＲ  ＬＲＤと結合したＭ２２  Ｆａｂ複合体の構造は、国際公開第２００８／０２５９９１号Ａ１に記述されているように、２．５５Åの解像度でＸ線結晶解析法により解析されている。ＴＳＨＲ−Ｍ２２複合体の構造解析は、互いの相互作用に関与する受容体残基及び刺激性自己抗体残基に関する詳細な情報を提供する。
【０００４】
Ｍ２２は、ＴＳＨＲ抗体を測定するためのＥＬＩＳＡに使用されている（Zophel, Ketal, Clinica Chimica Acta 2009及びZophel, Ketal, Clinica Chimica Acta 2008）。
【０００５】
ＡＩＴＤの患者では、阻止型ＴＲＡｂが生じる頻度は、刺激性自己抗体よりも少ない。阻止型自己抗体は、ＴＳＨＲに結合し、ＴＳＨが受容体に結合するのを防止するが、ＴＳＨＲ活性を刺激する能力を有していない。結果的に、甲状腺ホルモン（Ｔ４及びＴ３）の形成及び分泌が大きく低減され、このタイプのＴＲＡｂを有する患者は、低活性甲状腺（
甲状腺機能低下症）の臨床症状を呈する場合がある。阻止型自己抗体は、阻止活性又はＴＳＨアンタゴニスト活性を有するＴＲＡｂとして知られている（Rees Smith B, et al 1988  上記、及びRees Smith B, 2007 et al  上記）。阻止活性を有するＴＲＡｂは、妊婦の血清中に存在する場合、胎盤を通過し、胎児甲状腺のＴＳＨＲを阻止する場合があり、新生児甲状腺機能低下に結びつき、発生にとって深刻な結果がもたらされる。更に、阻止活性を有するＴＲＡｂは、罹患母体の母乳中に見出される場合があり、幼児の臨床的甲状腺機能低下を引き起こす場合がある（Evans C, et al 2004 European Journal of Endocrinology 150:265-268）。ＴＳＨアンタゴニスト活性を有するＴＳＨＲに対するヒト自己
抗体（５Ｃ９）が、国際公開第２００８／０９９１８５号Ａ１に詳細に記述されている。ＡＩＴＤ及び循環ＴＲＡｂを有する患者の臨床症状は、ＴＳＨＲ活性に対する自己抗体の効果、つまりＴＲＡｂが刺激又は阻止を引き起こすか否かと関連している。しかしながら、ある患者では、刺激性及び阻止性ＴＲＡｂの混合物が、１つのタイプのＴＲＡｂｓがより高い濃度及び／又は活性であることと関連する全体的な臨床症状と同時に存在する場合があることが提唱されている（Rees Smith B et al 1988  上記；Furmaniak J et al 1993 Springer Seminars in lmmunopathology 14:309-321、及びSchott M et al 2005 Trends in Endocrinology and Metabolism 16:243-248）。更に、刺激性又は阻止性ＴＲＡｂの濃度及び／又は活性は、同じ患者でも疾患の経過中で異なる場合があり、実際、甲状腺機能低下から甲状腺機能亢進までの症状の変動が、同じ患者で経時的に報告されている（Rees Smith B et al 1988  上記；Furmaniak J and Rees Smith B 1993  上記、及びSchott
M et al 2005  上記）。しかしながら、現在利用可能なバイオアッセイを使用して、異
なる生物活性を有するＴＲＡｂを分離する試み又は血清試料中のこれらＴＲＡｂを区別する試みは、困難である。より最近では、国際公開第２００６／０１６１２１号Ａ１に記述されている発明は、Ｒ２５５が突然変異されたＴＳＨＲを使用するバイオアッセイを使用して、刺激型と阻止型のＴＲＡｂを区別する手段を提供している。
【０００６】
ヒト組換えＴＳＨ（Ｔｈｙｒｏｇｅｎ（登録商標））は、ｃＧＭＰ制御下で組換えタンパク質として産生されるヒトＴＳＨの製剤であり、残存又は再発性甲状腺癌の診断を支援するものとして米国ＦＤＡにより承認されている（Duntas L H, Cooper D S 2008 Thyroid 18:509-516）。治療後の甲状腺癌患者のモニタリングは、組換えヒトＴＳＨで甲状腺残存物又は転移を刺激して、その後甲状腺を走査すること、及び／又は血清チログロブリンレベルを測定することを含む（Duntas LH and Cooper DS 2008  上記）。ヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモンは、軽度の甲状腺刺激効果を有する、妊娠中に産生されるホルモンである（Grossmann M et al 1997 Endocrine Reviews 18:476-501）。刺激型又は阻止型ＴＲ
Ａｂの特徴付け、及びそれらがどのようにしてＴＳＨＲと相互作用するのかは、様々な形態のＡＩＴＤを診断及び管理するための改良法を開発するために非常に重要である。加えて、これら研究は、ＴＳＨＲに対する自己免疫反応と関連する疾患を管理するための新しい戦略を開発するために重要である。組換えヒトＴＳＨ以外の強力な甲状腺刺激物質が使用可能であることは、甲状腺癌患者をモニター及び管理するための新しい選択肢を提供する。
【０００７】
過去の関連特許出願
国際公開第２００４／０５０７０８号Ａ２に記述されている発明は、強力な刺激活性を有しＴＳＨＲと相互作用するヒトモノクローナル自己抗体（ＭＡｂ）の詳細な特性を提供する。この自己抗体（Ｍ２２）とＴＳＨＲ  ＬＲＤとの相互作用は、国際公開第２００８／０２５９９１号Ａ１に記述されているように、２分子間の複合体のＸ線回折解析（２．５５Å解像度）から、分子レベルで解析されている。国際公開第２００６／０１６１２１号Ａ１は、患者血清刺激性ＴＳＨＲ自己抗体、患者血清阻止性ＴＳＨＲ自己抗体、及びスクリーニングされている患者に由来する体液試料中のＴＳＨの鑑別スクリーニング及び同定に使用することができる、少なくとも１つの点突然変異を含む突然変異ＴＳＨＲ調製物を開示する。また、ＴＳＨＲ阻止活性を有するマウスＭＡｂ（９Ｄ３３）の産生及び特徴
付けが、国際公開第２００４／０５０７０８号Ａ２に記述されている。９Ｄ３３は、ＴＳＨＲと高親和性（２×１０10Ｌ／ｍｏｌ）で結合し、ＴＳＨ、ｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１（Ｍ２２）及び刺激活性又は阻止活性を有する患者血清ＴＲＡｂの効果的なアンタゴニストである。国際公開第２００８／０９９１８５号Ａ１は、ＴＳＨ、及び患者血清中の刺激性ＴＲＡｂの効果的なアンタゴニストである、ＴＳＨＲに対するヒトＭＡｂ（５Ｃ９）の単離及び特徴付けを開示している。５Ｃ９は、意外にも、ＴＳＨＲ構成的活性（ＴＳＨＲの基礎活性とも呼ばれる）を阻害する、即ちＴＳＨ又はＭ２２が存在しない試験系で環状ＡＭＰの産生を阻害することが見出されている。更に、５Ｃ９は、ＴＳＨＲ活性化突然変異に伴うＴＳＨＲ環状ＡＭＰ活性を阻害することが見出されている。国際公開第２００８／０９１９８１号Ａ２には、ＴＳＨＲ構成的活性を抑制する能力を有するマウスＭＡｂ、及びこのＭＡｂを使用して甲状腺機能亢進症及び甲状腺癌を含む甲状腺疾患を治療するための方法が記述されている。国際公開第２００８／０９１９８１号Ａ２に記載されているＭＡｂの特性は、Chen CR et al 2007 Endocrinology 148:2375-2382にも開示されている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明
抗体Ｋ１−１８及びＫ１−７０を、甲状腺機能低下症及び高レベルのＴＳＨＲ自己抗体を有する５４歳の女性患者の末梢血リンパ球から単離した。この患者は、８年のＡＩＴＤ病歴を有し、最初に甲状腺機能亢進症を呈し、３年間継続したメチマゾールによる治療に応答した。しかしながら、この患者は、甲状腺機能正常状態に達した（つまり、正常な機能を示した）およそ１０か月後に、甲状腺機能低下症を発症し、チロキシンで治療された。この患者は、血液採取時にはおよそ４．５年間、甲状腺機能が低下していた。リンパ球を単離した際、血清ＴＲＡｂレベルは、ＴＳＨ結合阻害アッセイで測定したところ１６０単位／Ｌであった。この血清は、ＴＳＨＲのＴＳＨ刺激を阻止する能力も示した（環状ＡＭＰに基づくアッセイ）。甲状腺ペルオキシダーゼに対する血清自己抗体は、＞５００単位／ｍＬで陽性だった（単位は、国立生物学的製剤研究所（ＮＩＢＳＣ、National Institute for Standards and Control）、ポターズバー、英国の基準調製物６６／３８７である）。この患者のリンパ球を、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）での感染により不死化し、感染細胞の培養上清を、ＴＳＨＲ被覆チューブに対する125Ｉ−ＴＳＨの結合を阻
害する能力についてスクリーニングした。陽性細胞培養に由来する細胞をマウス／ヒト細胞系と融合し、上記のようにスクリーニングした。ＴＳＨＲ自己抗体を分泌する２つの安定クローンを得た。ＩｇＧをクローン培養の上清から精製し、２つのＭＡｂ（Ｋ１−１８及びＫ１−７０）ＩｇＧが、ＴＳＨＲに結合しＴＳＨＲ活性に影響を及ぼす能力を評価した。特に、ＴＳＨＲに対するＴＳＨ結合を阻害するＫ１−１８又はＫ１−７０の能力を研究した。Ｋ１−１８がＴＳＨＲを刺激する能力も研究し、種々の他の甲状腺刺激物質の活性と比較した。ＴＳＨＲを刺激するＴＳＨの能力を阻害するＫ１−７０の能力を研究し、他のＴＳＨアンタゴニストの活性と比較した。更に、刺激性又は阻止性の患者血清ＴＲＡｂが、Ｋ１−１８及びＫ１−７０のＴＳＨＲ結合及び生物活性を阻害する能力を評価した。加えて、ＴＳＨＲ抗体、ＴＳＨ、及び関連化合物用のアッセイにおけるＫ１−１８及びＫ１−７０の使用を調査した。Ｋ１−１８及びＫ１−７０の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の可変領域（Ｖ領域）遺伝子を配列決定し、相補性決定領域（ＣＤＲ）を帰属させた。更に、Ｋ１−７０  Ｆａｂの精製調製物を結晶化し、Ｘ線回折法を使用して解析した。これら解析は、Ｋ１−７０  Ｆａｂの全体的構造、及びＫ１−７０の抗原結合部位のトポグラフィーに関する分子レベルの詳細を提供した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の１つの態様によると、ＴＳＨＲと結合し、前記ＴＳＨＲのリガンド誘導性刺激を低減するが、前記ＴＳＨＲ構成的活性に影響を及ぼさない単離されたヒト抗体分子が提供される。
【００１０】
好ましくは、ＴＳＨＲに結合し、ＴＳＨＲのリガンド誘導性刺激を低減するが、前記ＴＳＨＲ構成的活性に影響を及ぼさず、ＴＳＨＲに対するＴＳＨ及びＭ２２の結合を阻害するという患者血清ＴＳＨ受容体自己抗体の特徴を有する単離されたヒト抗体分子又はその断片が提供される。より好ましくは、単離されたヒト抗体分子又はその断片は、ＴＳＨＲに対して少なくとも１０8Ｌ／ｍｏｌの結合親和性を有すること、及び１０μｇ／ｍＬ未
満の抗体濃度でリガンド誘導性ＴＳＨＲ刺激の検出可能な阻止を引き起こすことができることから選択される患者血清ＴＳＨ受容体自己抗体の少なくとも１つの更なる特徴を有する。更により好ましくは、患者血清ＴＳＨ受容体自己抗体の更なる特徴は、ＴＳＨＲに対して少なくとも１０9Ｌ／ｍｏｌの結合親和性を有すること、及び１μｇ／ｍＬ未満、好
ましくは０．１μｇ／ｍＬ未満の抗体濃度でリガンド誘導性ＴＳＨＲ刺激の検出可能な阻止を引き起こすことができることから選択される。単離されたヒト抗体は、ＴＳＨのアンタゴニスト、及び／又は甲状腺刺激性自己抗体、及び／又は甲状腺刺激性動物抗体、及び／又はヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモンであってもよい。
【００１１】
単離された抗体分子は、ＴＳＨ、Ｍ２２、又はＫ１−１８の少なくとも１つによるＴＳＨ受容体結合の阻害物質であってもよい。
【００１２】
単離された抗体分子は、図５ｂ及び５ｄ（それぞれ、配列番号４１及び５１）のアミノ酸配列から選択される抗体ＶＨドメインを含んでいてもよい。単離された抗体分子は、好ましくは、図５ｂ及び５ｄのアミノ酸配列（それぞれ、配列番号４１及び５１）で構成される抗体ＶＨドメインを含んでいてもよい。単離された抗体分子は、それぞれ、図５ｂ及び５ｄのＣＤＲＩ（配列番号４２及び５２）、ＩＩ（配列番号４３及び５３）、及びＩＩＩ（配列番号４４及び５４）から選択されるＣＤＲを含んでいてもよい。本発明による抗体分子は、これらＣＤＲに対して実質的な相同性を有する１つ又は複数のアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含んでいてもよい。好ましくは、本発明による抗体は、図５ｄに示されているＣＤＲ（配列番号５２、５３、及び５４）に対して７０〜９９．９％のアミノ酸相同性を示す。好ましくは、単離された抗体分子は、図５ｄのＣＤＲＩ、ＩＩ、及びＩＩＩ（配列番号５２、５３、及び５４）を含む。好ましい実施形態では、単離された抗体分子の対応する部分は、これらＣＤＲの１つと、少なくとも７０％同一、より好ましくは少なくとも８０％同一、高度に好ましくは少なくとも９０％同一、特に好ましくは少なくとも９５％同一、及び殊に好ましくは９９．９％同一である。単離された抗体分子は、好ましくは図６ｄのアミノ酸配列（配列番号６９）から選択される抗体ＶＬドメインを含んでいてもよい。単離された抗体分子は、好ましくは図６ｄのアミノ酸配列（配列番号６９）で構成される抗体ＶＬドメインを含んでいてもよい。単離された抗体分子は、図６ｄのＣＤＲＩ（配列番号７０）、ＩＩ（配列番号７１）、又はＩＩＩ（配列番号７２）から選択されるＣＤＲを含んでいてもよい。それに加えて又はその代わりに、本発明による単離された抗体分子は、これらＣＤＲに対して実質的な相同性を有する１つ又は複数のアミノ酸配列を含んでいてもよい。好ましくは、本発明による単離された抗体のＣＤＲは、図６ｄに示されているＣＤＲ（配列番号７０、７１、及び７２）に対して７０〜９９．９％のアミノ酸相同性を示す。好ましい実施形態では、単離された抗体分子は、少なくとも７０％同一、より好ましくは少なくとも８０％同一、高度に好ましくは少なくとも９０％同一、特に好ましくは少なくとも９５％同一、及び殊に好ましくは９９．９％同一である。
【００１３】
好ましくは、単離された抗体分子は、図６ｄのＣＤＲＩ、ＩＩ、及びＩＩＩ（配列番号７０、７１、及び７２）を含む。
【００１４】
単離された抗体分子は、図９ｂ及び９ｃに示されているような、抗原結合部位における荷電残基及び芳香族残基の分布を有する、図９ａに示されているような分子構造を有していてもよい。本発明の別の態様によると、ＴＳＨＲに結合してＴＳＨＲを刺激する単離された株抗体分子が提供され、該単離された株抗体分子は、図４ｂ及び４ｄのアミノ酸配列
（それぞれ、配列番号２３及び３３）から選択される抗体ＶＬドメインを含み、並びに／又はそれぞれ図４ｂ及び４ｄのＣＤＲＩ（配列番号２４及び３４）、Ｉｌ（配列番号２５及び３５）、及びＩＩＩ（配列番号２６及び３６）から選択される１つ又は複数のＣＤＲを含み、並びに／又は図３ｂ及び３ｄのアミノ酸配列（それぞれ、配列番号５及び１５）から選択される抗体ＶＨドメインを含み、並びに／又はそれぞれ図３ｂ及び３ｄのＣＤＲＩ（配列番号６及び１６）、ＩＩ（配列番号７及び１７）、及びＩＩＩ（配列番号８及び１８）から選択される１つ又は複数のＣＤＲを含む。好ましくは、抗体分子は以下のものを含む：（ｉ）それぞれ図４ｂ及び４ｄのＣＤＲＩ（配列番号２４及び３４）、ＩＩ（配列番号２５及び３５）、及びＩＩＩ（配列番号２６及び３６）から選択される１つ又は複数のＣＤＲを含む抗体ＶＬドメイン、及び／又は（ｉｉ）それぞれ図３ｂ及び３ｄのＣＤＲＩ（配列番号６及び１６）、Ｉｌ（配列番号７及び１７）、及びＩＩＩ（配列番号８及び１８）から選択される１つ又は複数のＣＤＲを含む抗体ＶＨドメイン。
【００１５】
ＴＳＨＲに対する単離された抗体分子の結合は、甲状腺刺激又は阻止活性を有する患者血清ＴＳＨＲ抗体により阻害することができる。
【００１６】
ＴＳＨＲに対する単離された抗体分子の結合は、Ｍ２２、Ｋ１−７０、５Ｃ９、９Ｄ３３、及び甲状腺刺激マウスモノクローナル抗体のうちの少なくとも１つにより阻害することができる。
【００１７】
単離された抗体分子は、図４ｂ及び４ｄのアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２３及び３３）から選択される抗体ＶＬドメイン、及び図３ｂ及び３ｄのアミノ酸配列（それぞれ、配列番号５及び１５）から選択される抗体ＶＨドメインを含む。好ましくは、単離された抗体分子は、それぞれ図３ｂ及び３ｄのＣＤＲＩ（配列番号６及び１６）、ＩＩ（配列番号７及び１７）、及びＩＩＩ（配列番号８及び１８）を含む。本発明による抗体分子は、これらＣＤＲに対して実質的な相同性を有する１つ又は複数のアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含んでいてもよい。好ましくは、本発明による抗体分子は、それぞれ図３ｂ及び３ｄに示されているＣＤＲ（配列番号６〜８、及び１６〜１８）に対して、７０〜９９．９％のアミノ酸相同性を示す。好ましい実施形態では、単離された抗体分子は、少なくとも７０％同一、より好ましくは少なくとも８０％同一、高度に好ましくは少なくとも９０％同一、特に好ましくは少なくとも９５％同一、及び殊に好ましくは９９．９％同一である。
【００１８】
単離された抗体分子は、図４ｂ又は４ｄ（それぞれ、配列番号２３及び３３）のアミノ酸配列で構成される抗体ＶＬドメインを含んでいてもよい。単離された抗体分子は、図３ｂ又は３ｄ（それぞれ、配列番号５及び１５）のアミノ酸配列で構成される抗体ＶＨドメインを含んでいてもよい。好ましくは、単離された抗体分子は、それぞれ図４ｂ及び４ｄのＣＤＲＩ（配列番号２４及び３４）、ＩＩ（配列番号２５及び３５）、及びＩＩＩ（配列番号２６及び３６）を含む。
【００１９】
それに加えて又はその代わりに、本発明による抗体は、これらＣＤＲに対して実質的な相同性を有する１つ又は複数のアミノ酸配列を含んでいてもよい。好ましくは、抗体は、それぞれ図４ｂ及び４ｄに示されているＣＤＲ（配列番号２４〜２６、及び３４〜３６）に対して、７０〜９９．９％のアミノ酸相同性を示す。好ましい実施形態では、単離された抗体分子は、少なくとも７０％同一、より好ましくは少なくとも８０％同一、高度に好ましくは少なくとも９０％同一、特に好ましくは少なくとも９５％同一、及び殊に好ましくは９９．９％同一である。
【００２０】
ほとんどの応用では、本発明による抗体分子のＶＨドメインは、ＶＬドメインと共に配置されてＴＳＨＲ結合部位を提供するだろう。幾つかの応用では、ＶＨドメインのみが、
ＴＳＨＲと結合するために提供されてもよい。
【００２１】
抗体ドメインを移植する方法は、当技術分野で周知であり、そのため本発明による抗体分子は、異なる供給源に由来するＶＨ及びＶＬドメイン又はそれらの部分を使用して構築することができる。
【００２２】
本発明の抗体分子に関して本明細書で使用されている「抗体分子」という用語及び「抗体分子（複数）」等の同義の用語は、状況に従って、モノクローナル、組換え、合成、及びポリクローナル抗体、単鎖抗体、多重特異的抗体、並びに結合部分等の免疫グロブリンに基づく結合部分も包含し、当業者であれば、ドメイン抗体、ダイアボディ、並びにｌｇＧ（デルタ）ＣＨ２、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＶＬ、ＶＨ、ｄｓＦｖ、ミニ
ボディ（Minibody）、トリアボディ（Triabody）、テトラボディ（Tetrabody）、（Ｓｃ
Ｆｖ）2、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆ（ａｂ’）3部分（Holliger P, et al 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-6448.）、（Carter PJ 2006 Nat Rev Immunol 6:343-357）等の免疫
グロブリンに基づく結合部分を、それらの代わりに用いることができる。この用語は、そのような物質の断片も包含し、好ましくは該断片はＴＳＨＲに結合し、より好ましくはＫ１−１８又はＫ１−７０の効果を有する。
【００２３】
「甲状腺刺激ホルモン受容体」及び「ＴＳＨＲ」という用語は、図７ａに示されているアミノ酸配列（配列番号７４）を有する全長ヒトＴＳＨＲ、又はそのようなＴＳＨＲと高度な相同性を有するその変異体若しくは断片を指す。好ましくは、そのような変異体及び断片は、図７ａに示されているアミノ酸配列（配列番号７４）と７０〜９９．９％の相同性を有する。好ましい実施形態では、そのような変異体及び断片は、その配列と少なくとも７０％同一、より好ましくは少なくとも８０％同一、高度に好ましくは少なくとも９０％同一、特に好ましくは少なくとも９５％同一、及び殊に好ましくは９９．９％同一である。
【００２４】
本発明の単離された抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体、組換え抗体、又は合成抗体の形態であってもよい。Ｋ１−１８又はＫ１−７０のＶＨ又はＶＬドメインに由来するＣＤＲＩ、ＩＩ、又はＩＩＩは、好適なフレームワークに組み込むことができる。Ｋ１−１８及びＫ１−７０のＶＨ及びＶＬドメイン並びにそれらのＣＤＲの変異体は、当業者に周知の方法を使用して修飾することにより産生することができる。そのような変異体は、付加、欠失、置換、又は挿入突然変異を含む１つ又は複数のアミノ酸配列変異を含んでいてもよい。本発明による抗体分子では、Ｋ１−１８又はＫ１−７０のフレームワークを修飾することもできる。本発明による単離された抗体は、ヒト又は非ヒトのフレームワークを有していてもよい。
【００２５】
本発明の別の態様によると、図４ｂ（配列番号２３）若しくは４ｄ（配列番号３３）若しくは６ｄ（配列番号６９）のアミノ酸配列を含む抗体ＶＬドメイン、図３ｂ（配列番号５）、３ｄ（配列番号１５）、若しくは５ｂ（配列番号４１）、及び５ｄ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含む抗体ＶＨドメイン、又は図３ｂ（配列番号６〜８）、３ｄ（配列番号１６〜１８）、４ｂ（配列番号２４〜２６）、４ｄ（配列番号３４〜３６）、５ｂ（配列番号４２〜４４）、５ｄ（配列番号５２〜５４）、若しくは６ｄ（配列番号７０〜７２）のＣＤＲＩ、ＩＩ、若しくはＩＩＩ、又はこれらの組み合わせを含む、本発明による単離された抗体分子又はその断片をコードする単離されたヌクレオチドが提供される。
【００２６】
単離されたヌクレオチドは、図３ａ（配列番号１）、３ｃ（配列番号１０）、４ａ（配列番号１９）、４ｃ（配列番号２８）、５ａ（配列番号３７）、５ｃ（配列番号４６）、又は６ｃ（配列番号６４）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【００２７】
複数のそのようなヌクレオチドは、例えば、バクテリオファージディスプレイライブラリーで提供することができる。そのようなバクテリオファージディスプレイライブラリーを使用して、単離されたドメイン等の様々な抗体分子又はその断片を発現することができる。
【００２８】
本発明は、本発明による単離されたヌクレオチドを含むベクター、又は本発明によるそのようなベクター若しくはヌクレオチドを含む宿主細胞も提供する。ベクターは、プラスミド、ウイルス、又はその断片であってもよい。多数の異なるタイプのベクターが、当業者に公知である。単離された細胞は、本発明による抗体を発現することができる。好ましくは、単離された細胞は、本発明による抗体を分泌することができる。好ましくは、本発明による単離された細胞は、安定したヘテロハイブリドーマ細胞系に由来する。
【００２９】
本発明の別の態様は、本発明による単離されたドメイン等の単離された抗体分子又はその断片を産生する方法であって、そのような抗体分子又はその断片をコードするヌクレオチドを発現することを含む方法を提供する。
【００３０】
本発明の更なる態様によると、本発明による抗体を産生する方法であって、本発明による１つ又は複数の単離された宿主細胞を培養し、それにより抗体が細胞により発現される方法が提供される。好ましくは、抗体は細胞により分泌される。
【００３１】
本発明の別の態様によると、本発明による単離された抗体分子及び担体を含む医薬組成物が提供される。
【００３２】
本発明による医薬組成物は、ヒト投与に好適であってもよい。好ましくは、本発明による医薬組成物は、対象体の免疫系に対して著しい有害効果を示さない。
【００３３】
本発明による医薬組成物には、種々の形態が企図される。甲状腺関連状態の治療に使用するための本発明による医薬組成物は、注射可能な形態であってもよい。眼部グレーブス病の治療に使用するための本発明による医薬組成物は、好ましくは点眼剤の形態である。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体、アジュバント、又は媒体を有する本発明による単離された抗体を含む。本発明の医薬組成物に使用することができる薬学的に許容される担体、アジュバント、及び媒体には、これらに限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミン等の血清タンパク質、リン酸塩等の緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、硫酸プロタミン等の塩又は電解質、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースに基づく物質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及び羊毛脂が含まれる。本発明の医薬組成物は、経口的に、非経口的に、吸入噴霧により、局所的に、点眼剤により、直腸的に、経鼻的に、頬側に、経膣的に、又は埋め込みリザバーにより投与することができる。本発明者らは、経口投与又は注射による投与を望む。本明細書で使用される場合、「非経口」という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、病巣内、及び頭蓋内注射又は点滴技術を含む。医薬組成物は、例えば無菌注射用の水性又は油性懸濁剤として、無菌注射用製剤の形態であってもよい。この懸濁剤は、好適な分散剤又は湿潤剤（例えば、トウィーン８０等）及び懸濁化剤を使用して、当技術分野で公知の技術により製剤化することができる。また、無菌注射用製剤は、例えば１、３−ブタンジオール中の溶液のような、無毒で非経口的に許容される希釈液又は溶媒中の無菌注射用の液剤又は懸濁剤であってもよい。使用することができる許容される媒体及び溶媒の中には、マンニトール、水、リンゲル液、及び等張性塩化ナトリウム溶液
がある。加えて、無菌固定油が、溶媒又は懸濁媒質として従来通りに使用される。この目的のためには、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含む、任意の無味固定油を使用することができる。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体等の脂肪酸は注射剤の調製に有用であり、オリーブ油又はヒマシ油等の薬学的に許容される天然油、特にそれらのポリオキシエチル化型も同様に有用である。また、これら油剤又は懸濁剤は、Ｐｈ．Ｈｅｌｖ若しくは類似アルコール等の長鎖アルコール希釈剤又は分散剤を含有していてもよい。本発明の医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、並びに水性懸濁剤及び液剤を含むが、これらに限定されない、任意の経口的に許容される剤形で経口投与することができる。経口使用用の錠剤の場合、一般的に使用される担体には、ラクトース及びコーンスターチが含まれる。典型的には、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤も添加される。カプセル形態での経口投与の場合、有用な希釈剤には、ラクトース及び乾燥コーンスターチが含まれる。水性懸濁剤を経口投与する場合、活性成分は、乳化剤及び懸濁化剤と混合されている。所望の場合、ある種の甘味料及び／又は香味料及び／又は着色剤が添加されていてもよい。本発明の医薬組成物は、直腸内投与のために坐剤の形態で提供することもできる。これら組成物は、本発明の化合物を、室温では固体であるが直腸温では液体であり、従って直腸中で融解して活性成分を放出することになる好適な非刺激性賦形剤と混合することにより調製することができる。そのような物質には、これらに限定されないが、ココアバター、蜜ろう、及びポリエチレングリコールが含まれる。本発明の医薬組成物の局所投与は、所望の治療が、局所適用で容易に接近可能な区域又は器官に関与している場合、特に有用である。皮膚への局所的塗布の場合、医薬組成物は、担体中に懸濁又は溶解された活性成分を含有する好適な軟膏剤と共に製剤化されるべきである。本発明の化合物の局所投与用担体には、これらに限定されないが、鉱油、流動石油、白色石油（white petroleum）、プロピレン
グリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ろう、及び水が含まれる。或いは、医薬組成物は、担体中に懸濁又は溶解された活性化合物を含有する好適なローション剤又はクリーム剤と共に製剤化することができる。好適な担体には、これらに限定されないが、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、及び水が含まれる。本発明の医薬組成物は、肛門坐剤製剤又は好適な浣腸製剤により、下部腸管に局所的に適用することもできる。局所経皮的なパッチ剤も本発明に含まれる。本発明の医薬組成物は、経鼻エアロゾル又は吸入により投与することができる。そのような組成物は、医薬製剤化の技術分野で周知の技術により調製され、ベンジルアルコール又は他の好適な保存剤、生物学的利用能を増強する吸収促進剤、フルオロカーボン、及び／又は当技術分野で公知の他の可溶化剤又は分散剤を使用して、生理食塩水中の液剤として調製することができる。
【００３４】
Ｋ１−７０等の、本発明の第１の言及された態様による抗体は、ＴＳＨＲ活性化に関連する状態：異常なレベルのＴＳＨ又はｈＣＧによるグレーブス病、グレーブス眼症（Graves' opthalmopathy）、又は甲状腺機能亢進症の管理及び制御に有用な応用を有する。
【００３５】
Ｋ１−１８等の、本発明の第２の言及された態様による抗体は、様々な臨床状態及び治療状況でＴＳＨＲを刺激するための応用を有する。これら状態には、甲状腺癌及びその転移、多結節性甲状腺腫、又は先天性甲状腺機能低下症の診断及び管理が含まれる。
【００３６】
本発明の別の態様によると、本発明による単離された抗体分子又は医薬組成物の、治療における使用が提供される。本発明は、治療に使用するための、本発明による単離された抗体分子又は医薬組成物も提供する。
【００３７】
本発明の別の態様によると、ＴＳＨＲ抗体、ＴＳＨ、又はヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモンの活性を特徴付けする方法であって、本発明による単離された抗体分子の使用を含むステップを含む方法が提供される。
【００３８】
本発明の別の態様によると、哺乳動物細胞のＴＳＨＲを刺激するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、細胞を、本発明による単離された抗体分子と接触させることを含む方法が提供される。
【００３９】
本発明の別の態様によると、哺乳動物細胞のＴＳＨＲを刺激するためのｉｎ  ｖｉｖｏ法であって、細胞を、本発明による単離された抗体分子と接触させることを含む方法が提供される。好ましくは、甲状腺癌及びその転移、多結節性甲状腺腫、並びに／又は先天性甲状腺機能低下症を有する対象体の細胞を、本発明による単離された抗体と接触させる。
【００４０】
本発明の別の態様によると、哺乳動物細胞のリガンド誘導性ＴＳＨＲ刺激を防止するためのｉｎ  ｖｉｖｏ法であって、ＴＳＨＲを、本発明による単離された抗体分子と接触させることを含む方法が提供される。リガンドは、甲状腺刺激性自己抗体、ＴＳＨ、又はヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモンであってもよい。哺乳動物細胞は、甲状腺細胞又は甲状腺外細胞であってもよい。哺乳動物の甲状腺外細胞は、眼窩後方組織又は前脛骨組織にあってもよい。
【００４１】
本発明のこの態様による方法では、単離された抗体分子は、上記で参照された５Ｃ９又は９Ｄ３３等の別のＴＳＨＲ結合抗体と組み合わせて使用することができる。
【００４２】
甲状腺関連状態は、甲状腺機能亢進症、グレーブス病、グレーブス眼病、及び新生児甲状腺機能亢進症から選択されてもよい。或いは、甲状腺関連状態は、ＡＩＴＤを有する患者の阻止活性を有するＴＲＡｂの存在と関連する甲状腺機能低下症、母体ＴＲＡｂの移動による（胎盤又は母乳を介する）新生児甲状腺機能低下症であってもよい。
【００４３】
上記に記載されている本発明の種々の方法で治療される対象体は、好ましくはヒトである。
【００４４】
本発明の別の態様によると、ＴＳＨＲに対する自己抗体を検出するための診断法であって、そのような自己抗体を含有すると考えられる対象体から単離された試料及び本発明による抗体分子を、ＴＳＨＲと接触させることを含む方法が提供される。
【００４５】
本発明の別の態様によると、ＴＳＨＲに対する本発明による抗体、好ましくはヒト抗体、又はヒト血清中のＴＳＨＲに対する抗体を検出するための診断法であって、ＴＳＨＲに対する抗体のいずれか１つを、ＴＳＨＲのアミノ酸２２〜２６０（ＴＳＨＲ２６０）（図７ｂ；配列番号７５）を含むＴＳＨＲ断片と接触させることを含む方法が提供される。
【００４６】
本発明による方法で使用することができる好適な検出可能標識は、酵素標識、同位体標識、化学発光標識、蛍光、及び染料等からなる群から選択することができる。
【００４７】
従って、同位体標識（125Ｉ、14Ｃ、3Ｈ、又は35Ｓ等）が使用される場合、モニタリングは、本発明による抗体分子の結合に依存する放射能を測定することを含んでいてもよい。放射能は、一般的に、ガンマ計数器又は液体シンチレーション計数器を使用して測定される。
【００４８】
本発明の別の態様によると、ＴＳＨＲ２６０（配列番号７５）に結合する低分子を識別するための方法であって、候補低分子を、例えばＥＬＩＳＡでＴＳＨＲ２６０と接触させること、及びＴＳＨＲ２６０に結合する低分子を選択することを含む方法が提供される。更に、ＴＳＨＲ２６０に対するＴＳＨＲ自己抗体の結合を防止する能力を有する低分子を識別するための方法であって、候補低分子の存在下で、ＴＳＨＲ２６０に対するＴＳＨＲ
自己抗体（刺激性又は阻止性）の結合の阻害を決定すること、及びＴＳＨＲ自己抗体結合を阻害する低分子を選択することを含む方法が提供される。このようにして識別された低分子を開発して、ＴＳＨＲ自己抗体（刺激性又は阻止性）により引き起こされる自己免疫性甲状腺疾患を制御するための新薬を提供することができる。
【００４９】
本発明は、以下のことに関する新しい及び／又は改良された手段を提供する：
１  甲状腺癌及び甲状腺癌転移等の、ＴＳＨＲを発現する甲状腺又は組織のＴＳＨＲを刺激すること。
２  甲状腺においてＴＳＨＲに対する甲状腺刺激性自己抗体結合を防止し、それによりグレーブス病の新しい治療を提供すること。
３  甲状腺外ＴＳＨＲに対するＴＳＨＲ自己抗体結合を防止し（例えば、眼窩後方組織又は前脛骨組織で）、それによりグレーブス眼症及び前脛骨粘液水腫を管理する可能性の向上を提供すること。
４  刺激活性を有するＴＲＡｂの結合に重要なＴＳＨＲアミノ酸を決定すること。
５  阻止活性を有するＴＲＡｂの結合に重要なＴＳＨＲアミノ酸を決定すること。
６  刺激活性及び阻止活性を有するＴＲＡｂの結合に重要なＴＳＨＲアミノ酸を比較すること。
７  阻止性抗体と刺激性抗体とを区別するＴＲＡｂ用の新しいアッセイを開発すること。
８  熱安定性ＴＳＨＲ断片の使用に基づくＴＲＡｂ用の新しいアッセイを開発すること。
９  リガンド誘導性ＴＳＨＲ活性化に重要なＴＳＨＲアミノ酸を決定すること。
１０  リガンド誘導性ＴＳＨＲ不活化に重要なＴＳＨＲアミノ酸を決定すること。
１１  ＴＳＨＲに対する結合に重要な阻止性自己抗体アミノ酸を決定すること。
１２  ＴＳＨ又は甲状腺刺激抗体媒介性ＴＳＨＲ活性化に影響を及ぼす重要な阻止性自己抗体アミノ酸を決定すること。
１３  グレーブス病の甲状腺機能亢進、新生児甲状腺機能亢進、及びグレーブス病の眼兆候を制御すること。或いは、甲状腺関連状態は、ＡＩＴＤを有する患者の阻止活性を有するＴＲＡｂの存在と関連する甲状腺機能低下症、又は母体の阻止型ＴＲＡｂの移動による（胎盤又は母乳を介する）新生児甲状腺機能低下症であってもよい。
１４  ＴＳＨＲに結合する自己抗体により引き起こされる甲状腺疾患を制御する低分子薬物候補をスクリーニングする手段を開発すること。
１５  同じ患者の免疫系及び異なる患者の免疫系により産生された、甲状腺刺激又は阻止活性を有するＴＳＨＲ自己抗体間の分子的相違を理解すること。
１６  刺激性及び阻止性ＴＳＨＲ自己抗体の発生及び産生に関与する免疫学的機序を理解すること。
１７  ＴＳＨとＴＳＨＲ自己抗体との間の分子的模倣の基礎である進化的原動力を含む機序を理解すること。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
本発明による抗体分子及び方法を、添付の図面、図１〜９を例としてのみ参照して、これから記述する。
【図１ａ】ＴＳＨＲに対する125Ｉ標識Ｋ１−７０又は125Ｉ標識Ｋ１−１８の結合及び解離の特徴を示す図である：（ａ）全長ＴＳＨＲに対する125Ｉ標識Ｋ１−７０  ＩｇＧ及びＦａｂの結合の時間的経過。
【図１ｂ】ＴＳＨＲに対する125Ｉ標識Ｋ１−７０又は125Ｉ標識Ｋ１−１８の結合及び解離の特徴を示す図である：（ｂ）ＴＳＨＲ２６０に対する125Ｉ標識Ｋ１−７０  ＩｇＧの結合の時間的経過。
【図１ｃ】ＴＳＨＲに対する125Ｉ標識Ｋ１−７０又は125Ｉ標識Ｋ１−１８の結合及び解離の特徴を示す図である：（ｃ）ＴＳＨＲ２６０に対する125Ｉ標識Ｋ１−７０  Ｆａｂの時間的経過。
【図１ｄ】ＴＳＨＲに対する125Ｉ標識Ｋ１−７０又は125Ｉ標識Ｋ１−１８の結合及び解離の特徴を示す図である：（ｄ）種々のリガンドの存在下における、ＴＳＨＲ（全長）からの125Ｉ標識Ｋ１−７０  ＩｇＧの解離。
【図１ｅ】ＴＳＨＲに対する125Ｉ標識Ｋ１−７０又は125Ｉ標識Ｋ１−１８の結合及び解離の特徴を示す図である：（ｅ）Ｋ１−１８  Ｆａｂの存在下における、ＴＳＨＲ（全長）からの125Ｉ標識Ｋ１−７０  ＩｇＧの解離。
【図１ｆ】ＴＳＨＲに対する125Ｉ標識Ｋ１−７０又は125Ｉ標識Ｋ１−１８の結合及び解離の特徴を示す図である：（ｆ）種々のリガンドの存在下における、ＴＳＨＲ（全長）からの125Ｉ標識Ｋ１−７０  Ｆａｂの解離。
【図１ｇ】ＴＳＨＲに対する125Ｉ標識Ｋ１−７０又は125Ｉ標識Ｋ１−１８の結合及び解離の特徴を示す図である：（ｇ）種々のリガンドの存在下における、ＴＳＨＲ２６０からの125Ｉ標識Ｋ１−７０  ＩｇＧの解離。
【図１ｈ】ＴＳＨＲに対する125Ｉ標識Ｋ１−７０又は125Ｉ標識Ｋ１−１８の結合及び解離の特徴を示す図である：（ｈ）Ｋ１−１８  Ｆａｂの存在下における、ＴＳＨＲ２６０からの125Ｉ標識Ｋ１−７０  ＩｇＧの解離。
【図１ｉ】ＴＳＨＲに対する125Ｉ標識Ｋ１−７０又は125Ｉ標識Ｋ１−１８の結合及び解離の特徴を示す図である：（ｉ）種々のリガンドの存在下における、ＴＳＨＲ２６０からの125Ｉ標識Ｋ１−７０  Ｆａｂの解離。
【図１ｊ】ＴＳＨＲに対する125Ｉ標識Ｋ１−７０又は125Ｉ標識Ｋ１−１８の結合及び解離の特徴を示す図である：（ｊ）全長ＴＳＨＲ及びＴＳＨＲ２６０に対する125Ｉ標識Ｋ１−１８  ＩｇＧの結合の時間的経過。
【図１ｋ】ＴＳＨＲに対する125Ｉ標識Ｋ１−７０又は125Ｉ標識Ｋ１−１８の結合及び解離の特徴を示す図である：（ｋ）種々のリガンドの存在下における、全長ＴＳＨＲからの125Ｉ標識Ｋ１−１８  ＩｇＧの解離。
【図１ｌ】ＴＳＨＲに対する125Ｉ標識Ｋ１−７０又は125Ｉ標識Ｋ１−１８の結合及び解離の特徴を示す図である：（ｌ）種々のリガンドの存在下における、ＴＳＨＲ２６０からの125Ｉ標識Ｋ１−１８  ＩｇＧの解離。
【図２ａ】患者血清のＴＳＨＲ自己抗体の測定結果を示す図である：（ａ）ＴＲＡｂ被覆チューブアッセイ（ＴＳＨ結合の阻害に基づく）での測定値と、ＴＳＨＲ２６０−ＡＰ  ＥＬＩＳＡでの測定値との比較。
【図２ｂ】患者血清のＴＳＨＲ自己抗体の測定結果を示す図である：（ｂ）全長ＴＳＨＲに対するＭ２２結合の阻害に基づくＥＬＩＳＡによる測定と、ＴＳＨＲ２６０に対するＭ２２  Ｆａｂ結合の阻害によるＥＬＩＳＡでの測定との比較。
【図２ｃ】患者血清のＴＳＨＲ自己抗体の測定結果を示す図である：（ｃ）ＴＲＡｂ被覆チューブアッセイ（ＴＳＨ結合の阻害に基づく）での測定と、ＴＳＨＲ２６０被覆プレートに対するＭ２２  Ｆａｂ結合の阻害によるＥＬＩＳＡでの測定との比較。
【図２ｄ】患者血清のＴＳＨＲ自己抗体の測定結果を示す図である：（ｄ）ＴＲＡｂ  ＥＬＩＳＡ（Ｍ２２結合の阻害に基づく）での測定と、ＴＳＨＲ２６０−ＡＰ  ＥＬＩＳＡでの測定との比較。
【図３ａ−１】Ｋ１−１８重鎖（ＨＣ）の可変領域配列を示す図である：（ａ）注釈無し及び注釈付の形式で示されているＫ１−１８  ＨＣのオリゴヌクレオチド配列（配列番号１）。注釈付の形式では、ＰＣＲプライマーに使用された配列には下線が引かれており、個々の相補性定常領域（ＣＤＲ）は四角で囲まれており、定常領域は太字である。
【図３ａ−２】Ｋ１−１８重鎖（ＨＣ）の可変領域配列を示す図である：（ａ）注釈無し及び注釈付の形式で示されているＫ１−１８  ＨＣのオリゴヌクレオチド配列（配列番号１）。注釈付の形式では、ＰＣＲプライマーに使用された配列には下線が引かれており、個々の相補性定常領域（ＣＤＲ）は四角で囲まれており、定常領域は太字である。
【図３ｂ】Ｋ１−１８重鎖（ＨＣ）の可変領域配列を示す図である：（ｂ）（図３ａ）に注釈無し及び注釈付の形式で示されているオリゴヌクレオチド配列に由来するＫ１−１８  ＨＣのアミノ酸配列（配列番号５）。
【図３ｃ】Ｋ１−１８重鎖（ＨＣ）の可変領域配列を示す図である：（ｃ）注釈無し及び注釈付の形式で示されている実際のＮ末端配列（リーダー配列）を有するＫ１−１８  ＨＣの好ましいオリゴヌクレオチド配列（配列番号１０）。注釈付の形式では、ＰＣＲプライマーに使用された配列には下線が引かれており、リーダー配列は小文字で示されており、個々のＣＤＲは四角で囲まれており、定常領域は太字である。
【図３ｄ】Ｋ１−１８重鎖（ＨＣ）の可変領域配列を示す図である：（ｄ）注釈無し及び注釈付の形式で図３ｃに示されているオリゴヌクレオチド配列に由来するリーダー配列を有するＫ１−１８  ＨＣの好ましいアミノ酸配列（配列番号１５）。
【図４ａ−１】Ｋ１−１８軽鎖（ＬＣ）の可変領域配列を示す図である：（ａ）注釈無し及び注釈付の形式で示されているＫ１−１８  ＬＣのオリゴヌクレオチド配列（配列番号１９）。注釈付の形式では、ＰＣＲプライマーに使用された配列には下線が引かれており、個々のＣＤＲは四角で囲まれており、定常領域は太字である。
【図４ａ−２】Ｋ１−１８軽鎖（ＬＣ）の可変領域配列を示す図である：（ａ）注釈無し及び注釈付の形式で示されているＫ１−１８  ＬＣのオリゴヌクレオチド配列（配列番号１９）。注釈付の形式では、ＰＣＲプライマーに使用された配列には下線が引かれており、個々のＣＤＲは四角で囲まれており、定常領域は太字である。
【図４ｂ】Ｋ１−１８軽鎖（ＬＣ）の可変領域配列を示す図である：（ｂ）注釈無し及び注釈付の形式で図４ａに示されているオリゴヌクレオチド配列に由来するＫ１−１８  ＬＣのアミノ酸配列（配列番号２３）。
【図４ｃ−１】Ｋ１−１８軽鎖（ＬＣ）の可変領域配列を示す図である：（ｃ）注釈無し及び注釈付の形式で示されている実際のＮ末端配列（リーダー配列）を有するＫ１−１８  ＬＣの好ましいオリゴヌクレオチド配列（配列番号２８）。注釈付の形式では、ＰＣＲプライマーに使用された配列には下線が引かれており、リーダー配列は小文字で示されており、個々のＣＤＲは四角で囲まれており、定常領域は太字である。
【図４ｃ−２】Ｋ１−１８軽鎖（ＬＣ）の可変領域配列を示す図である：（ｃ）注釈無し及び注釈付の形式で示されている実際のＮ末端配列（リーダー配列）を有するＫ１−１８  ＬＣの好ましいオリゴヌクレオチド配列（配列番号２８）。注釈付の形式では、ＰＣＲプライマーに使用された配列には下線が引かれており、リーダー配列は小文字で示されており、個々のＣＤＲは四角で囲まれており、定常領域は太字である。
【図４ｄ】Ｋ１−１８軽鎖（ＬＣ）の可変領域配列を示す図である：（ｄ）注釈無し及び注釈付の形式で図４ｃに示されているオリゴヌクレオチド配列に由来するリーダー配列を有するＫ１−１８  ＬＣの好ましいアミノ酸配列（配列番号３３）。
【図５ａ−１】Ｋ１−７０重鎖（ＨＣ）の可変領域配列を示す図である：（ａ）注釈無し及び注釈付の形態で示されているＫ１−７０  ＨＣのオリゴヌクレオチド配列（配列番号３７）。注釈付の形式では、ＰＣＲプライマーに使用された配列には下線が引かれており、個々のＣＤＲは四角で囲まれており、定常領域は太字である。
【図５ａ−２】Ｋ１−７０重鎖（ＨＣ）の可変領域配列を示す図である：（ａ）注釈無し及び注釈付の形態で示されているＫ１−７０  ＨＣのオリゴヌクレオチド配列（配列番号３７）。注釈付の形式では、ＰＣＲプライマーに使用された配列には下線が引かれており、個々のＣＤＲは四角で囲まれており、定常領域は太字である。
【図５ｂ】Ｋ１−７０重鎖（ＨＣ）の可変領域配列を示す図である：（ｂ）注釈無し及び注釈付の形式で図５ａに示されるオリゴヌクレオチド配列に由来するＫ１−７０  ＨＣのアミノ酸配列（配列番号４１）。
【図５ｃ】Ｋ１−７０重鎖（ＨＣ）の可変領域配列を示す図である：（ｃ）注釈無し及び注釈付の形式で示されている実際のＮ末端配列（リーダー配列）を有するＫ１−７０  ＨＣの好ましいオリゴヌクレオチド配列（配列番号４６）。注釈付の形式では、ＰＣＲプライマーに使用された配列には下線が引かれており、リーダー配列は小文字で示されており、個々のＣＤＲは四角で囲まれており、定常領域は太字である。
【図５ｄ】Ｋ１−７０重鎖（ＨＣ）の可変領域配列を示す図である：（ｄ）注釈無し及び注釈付の形式で図５ｃに示されているオリゴヌクレオチド配列に由来するリーダー配列を有するＫ１−７０  ＨＣのアミノ酸配列（配列番号５１）。
【図６ａ−１】Ｋ１−７０軽鎖（ＬＣ）の可変領域配列を示す図である：（ａ）注釈無し及び注釈付の形式で示されているＫ１−７０  ＬＣのオリゴヌクレオチド配列（配列番号５５）。注釈付の形式では、ＰＣＲプライマーに使用された配列には下線が引かれており、個々のＣＤＲは四角で囲まれており、定常領域は太字である。
【図６ａ−２】Ｋ１−７０軽鎖（ＬＣ）の可変領域配列を示す図である：（ａ）注釈無し及び注釈付の形式で示されているＫ１−７０  ＬＣのオリゴヌクレオチド配列（配列番号５５）。注釈付の形式では、ＰＣＲプライマーに使用された配列には下線が引かれており、個々のＣＤＲは四角で囲まれており、定常領域は太字である。
【図６ｂ】Ｋ１−７０軽鎖（ＬＣ）の可変領域配列を示す図である：（ｂ）注釈無し及び注釈付の形式で図６ａに示されているオリゴヌクレオチド配列に由来するＫ１−７０  ＬＣのアミノ酸配列（配列番号５９）。
【図６ｃ】Ｋ１−７０軽鎖（ＬＣ）の可変領域配列を示す図である：（ｃ）注釈無し及び注釈付の形式で示されている実際のＮ末端配列（リーダー配列）を有するＫ１−７０  ＬＣの好ましいオリゴヌクレオチド配列（配列番号６４）。注釈付の形式では、ＰＣＲプライマーに使用された配列には下線が引かれており、リーダー配列は小文字で示されており、個々のＣＤＲは四角で囲まれており、定常領域は太字である。
【図６ｄ】Ｋ１−７０軽鎖（ＬＣ）の可変領域配列を示す図である：（ｄ）注釈無し及び注釈付の形式で図６ｃに示されているオリゴヌクレオチド配列に由来するリーダー配列を有するＫ１−７０  ＬＣの好ましいアミノ酸配列（配列番号６９）。
【図６ｅ】Ｋ１−７０軽鎖（ＬＣ）の可変領域配列を示す図である：（ｅ）エドマン分解反応により決定された実際のＮ−末端アミノ酸配列（アミノ酸２〜２１）（配列番号７３）。
【図７ａ】ヒトＴＳＨＲのアミノ酸配列を示す図である：（ａ）ヒトＴＳＨＲのコンセンサスアミノ酸配列を示している（アミノ酸１〜７６４（配列番号７４）（受入番号Ｐ１６４７３、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=protein&val=62298994）。
【図７ｂ】ヒトＴＳＨＲのアミノ酸配列を示す図である：（ｂ）ヒトＴＳＨＲアミノ酸１〜２６０のコンセンサスアミノ酸配列を示している。リーダー配列（アミノ酸１〜２１）は小文字で示されており、精製用に付加されたヒスチジン配列は、Ｃ−末端に太字で示されている（配列番号７５）。
【図７ｃ】ヒトＴＳＨＲのアミノ酸配列を示す図である：（ｃ）ヒトＴＳＨＲ  ＬＲＤ  Ｃ−ＣＡＰのアミノ酸配列を示している。リーダー配列（アミノ酸１〜２１）は小文字で示されており、精製用に付加されたヒスチジン配列は、Ｃ−末端に太字で示されている（配列番号７６）。
【図８−１】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−２】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−３】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−４】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−５】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−６】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−７】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−８】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−９】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−１０】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−１１】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−１２】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−１３】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−１４】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−１５】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−１６】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−１７】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−１８】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−１９】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−２０】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−２１】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−２２】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−２３】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−２４】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−２５】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−２６】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−２７】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−２８】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−２９】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−３０】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−３１】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−３２】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−３３】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−３４】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−３５】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−３６】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−３７】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−３８】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−３９】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−４０】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−４１】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−４２】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−４３】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−４４】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−４５】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−４６】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−４７】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−４８】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−４９】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−５０】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−５１】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−５２】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−５３】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−５４】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−５５】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−５６】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−５７】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−５８】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−５９】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−６０】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−６１】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−６２】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−６３】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−６４】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−６５】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−６６】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−６７】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−６８】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−６９】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−７０】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−７１】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−７２】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−７３】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−７４】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−７５】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−７６】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−７７】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−７８】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−７９】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−８０】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−８１】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−８２】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−８３】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−８４】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−８５】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−８６】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−８７】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−８８】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−８９】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−９０】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−９１】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−９２】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−９３】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−９４】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−９５】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−９６】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−９７】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−９８】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−９９】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−１００】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−１０１】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−１０２】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−１０３】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−１０４】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−１０５】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−１０６】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図８−１０７】２．２２Å分解能でのＫ１−７０  Ｆａｂの座標を示す図である。
【図９ａ】（ａ）Ｋ１−７０  Ｆａｂ構造−Ｊｏｙ形式での構造表示。
【図９ｂ】（ｂ）Ｋ１−７０  Ｆａｂの結合部位の静電ポテンシャル。
【図９ｃ】（ｃ）Ｋ１−７０  Ｆａｂの結合部位の芳香族アミノ酸。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
方法
リンパ球単離及びヒトモノクローナルＴＳＨＲ自己抗体のクローニング
モノクローナル自己抗体Ｋ１−１８及びＫ１−７０は、国際公開第２００４／０５０７０８号Ａ２に記述されている手順を使用して単離した。リンパ球は、８年のＡＩＴＤ病歴及び高レベルのＴＲＡｂを有する患者から採取された血液試料から単離した。患者の同意及び組織内倫理委員会の承認を得た。この患者は最初に甲状腺機能亢進症と診察され、メチマゾールによる治療後に甲状腺機能正常状態に達したが、血液採取のおよそ４．５年前に、甲状腺機能低下症を発病した。血液採取時に、患者は、チロキシン（１日５０μｇ）による治療を受けていた。リンパ球を、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）（欧州培養細胞系統保存機関−ＥＣＡＣＣ（European Collection of Cell Cultures）；ポートンダウン、ＳＰ４  ＯＪＧ、英国）に感染させ、国際公開第２００４／０５０７０８号Ａ２に記述されているようにマウスマクロファージ支持細胞層で培養した。ＴＳＨＲ自己抗体を分泌する不死化リンパ球を、マウス／ヒトハイブリッド細胞系Ｋ６Ｈ６／Ｂ５（ＥＣＡＣＣ）と融合させ、限界希釈により４回クローン化して単一コロニーを得た。細胞培養上清中のＴＳＨＲ自己抗体の存在は、クローニングの異なる段階において、ＴＳＨＲに対する標識ＴＳＨ結合の阻害により検出した（国際公開第２００４／０５０７０８号Ａ２）。ＴＳＨＲ自己抗体を産生する２つの単一クローンを増殖させ、自己抗体を精製するために上清を培養から回収した。一方のクローンをＫ１−１８と称し、他方をＫ１−７０と称した。
【００５２】
Ｋ１−１８及びＫ１−７０の精製、特徴付け、及び標識化
ＴＳＨＲヒトＭＡｂ  ＩｇＧは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、英国）を用いたプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して、Sanders J et al 2004.Thyroid 2004 14:560-570に記述されているように培養上清から精製し、純度は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で評価した。重鎖アイソタイプは、放射状拡散アッセイ（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ；バーミンガム、Ｂ２９  ６ＡＴ、英国）を使用して決定し、軽鎖アイソタイプは、抗ヒトカッパ鎖及び抗ヒトラムダ鎖特異的マウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ社製、プール、英国）を用いたウェスタンブロッティングで決定した。精製したＫ１−１８  ＩｇＧを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１ｍｍｏｌ／Ｌの終濃度のシステイン、及び２ｍｍｏｌ／Ｌの終濃度のＥＤＴＡを含有する１３７ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ2ＨＰＯ4、２．７ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣＬ、１．４７ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．４）中１００：１のＩｇＧ／酵素比のマーキュリーパパイン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製、プール、英国）を用いて、３７℃で４時間処理した。反応は、室温で３０分間ヨードアセトアミド（５０ｍｍｏｌ／Ｌの終濃度）を添加することにより停止させた。その後、反応混合物をＭａｂＳｅｌｅｃｔカラムに通し、あらゆる完全ＩｇＧ又はＦｃ断片をＦａｂ調製物から除去した。Ｆａｂ含有溶液を、３．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＮ3を含有するＰＢＳで透析し、必要に応じて、Ｃｅｎｔｒｉｐｒ
ｅｐ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ウォトフォード、ＷＤ１８  ８ＹＨ、英国）を使用して濃縮した。Ｋ１−７０  Ｆａｂは、２００：１のＩｇＧ／酵素比を使用し、酵素による消化は３７℃で１時間であったという点を除いて、同様の方法を使用して取得した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、完全ＩｇＧがＦａｂ調製物中では検出できないことを示した。ＩｇＧ調製物は、Sanders J et al 1999. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism.1999 84: 3797-3802に記述されているように125Ｉで標識したか、又はビオチンヒドラジド（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、クラムリントン、英国）で標識した（Rees Smith et al 2004. Thyroid 14:830-835）。
【００５３】
ＴＳＨＲに対する、125Ｉ−ＴＳＨ又は125Ｉ標識ヒトＭＡｂ結合の阻害
結合阻害アッセイは、国際公開第２００４／０５０７０８号Ａ２に記述されるように、ＴＳＨＲ被覆チューブを使用して実施した。このアッセイでは、１００μＬの試験試料（ＭＡｂ調製物、患者血清又は未標識ＴＳＨ）及び５０μＬの開始緩衝液（ＲＳＲ  Ｌｔｄ社製）を、ＴＳＨＲ被覆チューブ中でゆっくりと振とうしながら室温で２時間インキュベ
ートした。吸引した後、チューブを洗浄し、１００μＬの125Ｉ標識タンパク質（５×１
０4ｃｐｍ）を添加し、振とうしながら室温で１時間インキュベートした。その後、チュ
ーブを吸引し、洗浄し、ガンマ計数器で計数した。標識タンパク質結合の阻害は、１００×［１−（試験物質の存在下で結合したｃｐｍ／対照物質の存在下で結合したｃｐｍ）］として計算した。これら実験で使用したＭＡｂ調製物は、上述のＫ１−１８、Ｋ１−７０、Ｍ２２、５Ｃ９、９Ｄ３３だった。ＴＳＭＡｂ  １〜７は、マウス甲状腺刺激性ＭＡｂである（国際公開第０３／０１８６３号、及びSanders J et al 2002、上記）。対照物質は、健常供血者血清の貯留、又は個々の健常供血者血清、又は種々の実験結果に示されるような他の物質であった。
【００５４】
ＴＳＨＲに対するヒトＭＡｂ  ＩｇＧ結合のスキャチャード分析
５０μＬのアッセイ緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．８、及び０．１％  トリトンＸ−１００）中の未標識Ｋ１−１８又はＫ１−７０  ＩｇＧ、及び５０μＬの開始緩衝液（ＲＳＲ  Ｌｔｄ社製）、及び５０μＬの125
Ｉ標識Ｋ１−１８又はＫ１−７０  ＩｇＧ（アッセイ緩衝液中で３０，０００ｃｐｍ）を、それぞれＴＳＨＲ被覆チューブ中で２時間室温で振とうさせながらインキュベートし（最大結合は、これら条件下で生じた）、吸引し、１ｍＬのアッセイ緩衝液で２回洗浄し、ガンマ計数器で計数した。結合したＩｇＧの濃度対結合／遊離をプロットし（Scatchard G 1949.Annals of the New York Academy of Sciences 51:660-672）、結合定数を導出した。
【００５５】
ＥＬＩＳＡにより測定された、ＴＳＨＲに対するＴＳＨ結合の阻害
ＴＳＨＲ被覆ＥＬＩＳＡウエルに対するＴＳＨ−ビオチン結合に基づくＴＲＡｂ  ＥＬＩＳＡを、以前に記述されているように使用した（Bolton J, et al 1999 Clinical Chemistry 45:2285-2287）。このアッセイでは、７５μＬの試験試料を、プレートウエル中にある７５μＬの出発緩衝液に添加し、約５００振とう／分で振とうしながら室温で２時間インキュベートした。洗浄した後、１００μＬのＴＳＨ−ビオチンを添加し、振とうせずに２５分間インキュベーションを継続した。ウエルを再び洗浄し、既述の標準的手順を使用して反応を発生させ、各ウエルの吸光度を４５０ｎｍで測定した。
【００５６】
ＴＳＨ−ビオチン結合の阻害は、１００×［１−（４５０ｎｍの試験試料吸光度／４５０ｎｍの陰性対照試料吸光度）］として計算した。これら実験で使用したＭＡｂ調製物は、上述のＫ１−１８、Ｋ１−７０、Ｍ２２、５Ｃ９、９Ｄ３３だった。ＴＳＭＡｂ  １〜７は、マウス甲状腺刺激性ＭＡｂである（国際公開第０３／０１８６３号、及びSanders J et al 2002、上記）。対照物質は、健常供血者血清の貯留、又は種々の実験結果に示されるような他の物質であった。
【００５７】
ＥＬＩＳＡでの、ＴＳＨＲに対するＭ２２結合の阻害
ＴＳＨＲ被覆ＥＬＩＳＡウエルに対する標識Ｍ２２（Ｍ２２Ｆａｂ−ＰＯＤ）の結合に基づくＴＲＡｂ  ＥＬＩＳＡを使用した（Rees Smith B, et al 2004、上記）。このアッセイは、第１のインキュベーションが１時間であったことを除いて、ＴＳＨ−ビオチンに基づくＥＬＩＳＡと同様に実施した。結果は、数式：１００×［１−（４５０ｎｍの試験試料吸光度／４５０ｎｍの陰性対照試料吸光度）］を使用して、Ｍ２２結合の阻害として表した。これら実験で使用したＭＡｂ調製物は、上述のＫ１−１８、Ｋ１−７０、Ｍ２２、５Ｃ９、９Ｄ３３だった。ＴＳＭＡｂ  １〜７は、マウス甲状腺刺激性ＭＡｂである（国際公開第０３／０１８６３号、及びSanders J,2002、上記）。対照物質は、健常供血者血清の貯留、又は種々の実験結果に示されるような他の物質であった。
【００５８】
ＴＳＨＲ刺激の分析
Ｋ１−１８又はＫ１−７０  ＩｇＧ及び他の調製物が、ヒトＴＳＨＲで形質移入された
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で環状ＡＭＰの産生を刺激する能力を、国際公開第２００４／０５０７０８号Ａ２に記述されているように試験した。１細胞当たりおよそ５×１０4又はおよそ５×１０5個のいずれかでＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞を、１ウエル当たり３×１０4細胞で９６穴プレートに播種し、ウシ胎仔血清を有していない
ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｔｄ社製、ペーズリー、英国）に適応させ、その後試験試料（ＴＳＨ、ＩｇＧ、又は患者血清）を添加し（１００μＬ、環状ＡＭＰアッセイ緩衝液、つまり、１ｇ／Ｌグルコース、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、２２２ｍｍｏｌ／Ｌスクロース、１５ｇ／Ｌウシ血清アルブミン、及び０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ３イソブチル−１−メチルキサンチン  ｐＨ７．４を含有する無ＮａＣｌのハンクス緩衝化塩溶液；環状ＡＭＰアッセイ低張性緩衝液で希釈）、３７℃で１時間インキュベートした。試験溶液を除去した後、細胞を溶解し、溶解産物中の環状ＡＭＰ濃度を、Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ社製；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、英国の直接環状ＡＭＰ相関性−ＥＩＡキットを使用してアッセイした。結果は、細胞溶解産物（２００μＬ）中の環状ＡＭＰのｐｍｏｌ／ｍＬとして表されている。幾つかの実験は、等張性緩衝液条件下で実施した。これら実験では、クレブスリンガーＨｅｐｅｓ緩衝液（ＫＲＨ緩衝液）を使用した（１２４ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１．２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＳＯ4、１．４５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ2、１．２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、８ｍｍｏｌ／グルコース、０．５ｇ／Ｌウシ血清アルブミン、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ３イソブチル−１−メチルキサンチン、ｐＨ７．４）。細胞が必要な密度に達することを可能にし、培養培地を除去し、１ｍＬのＫＲＨ緩衝液で細胞を洗浄した。その後、新しいＫＲＨ緩衝液を添加し、細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。その後、緩衝液を除去し、試験試料（ＴＳＨ、ＭＡｂ調製物、血清試料等）を含有する新しいＫＲＨ緩衝液と取り換えた。その後、低張性条件下（つまり、環状ＡＭＰアッセイ緩衝液中）での実験について上述されているように、次のステップを実施した。幾つかの実験では、上述のように測定された種々の調製物（例えば、ＴＳＨ、ヒトＭＡｂ、患者血清）のＴＳＨＲ刺激活性に対する種々のＭＡｂの効果を評価した。これは、（ａ）試料単独の刺激活性を（ｂ）種々のＭＡｂの存在下での刺激活性と比較することにより実施した。
【００５９】
アンタゴニスト（阻止）活性の測定
Ｋ１−７０  ＩｇＧ及び他の調製物が、ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞で、ブタ（ｐ）ＴＳＨ、天然ヒト（ｈ）ＴＳＨ及び組換えヒト（ｒｈ）ＴＳＨ、ＭＡｂ  Ｍ２２、ＭＡｂ
Ｋ１−１８、並びに患者血清ＴＲＡｂの刺激活性を阻害する能力を評価した。これは、Ｋ１−７０  ＩｇＧ（又は試験されている他の調製物）の非存在下及び存在下での、ＴＳＨ、Ｍ２２、Ｋ１−１８、又はＴＲＡｂの刺激効果を比較することにより実施した。このアッセイは、環状ＡＭＰアッセイ緩衝液で希釈された５０μＬのＫ１−７０（又は試験されている他の調製物）を、細胞ウエルに添加し、その後５０μＬのＴＳＨ又はＭ２２又はＫ１−１８又は患者血清（環状ＡＭＰアッセイ緩衝液で適切に希釈されていた）を添加してインキュベートしたことを除いては上述のように実施し、上述の刺激アッセイと同様に試験した。Ｋ１−７０に加えて、阻止型ＴＲＡｂを有する患者に由来する他のＭＡｂ及び血清を、このアッセイで試験した。
【００６０】
ＴＳＨＲに対するＫ１−１８及びＫ１−７０結合の結合及び解離
全長ＴＳＨＲ及びＴＳＨＲ２６０に対する、Ｋ１−１８  ＩｇＧ、Ｋ１−１８  Ｆａｂ、Ｋ１−７０  ＩｇＧ、及びＫ１−７０  Ｆａｂ結合の結合及び解離を、Nakatake N, et
al Thyroid 2006,16;1077-1084に記述されているような方法を使用して研究した。全長
ＴＳＨＲ又はＴＳＨＲ２６０を、ＴＳＨＲに対する適切なマウスＭＡｂで予め被覆されていたプラスチックチューブに被覆した。結合実験では、１００μＬの125Ｉ標識ＩｇＧ又
はＦａｂを、ＴＳＨＲ被覆チューブ中で５〜１８０分間室温でインキュベートした。その後、チューブを吸引し、アッセイ緩衝液で洗浄し、ガンマ計数器で計数した。解離実験で
は、１００μＬの125Ｉ標識ＩｇＧ又はＦａｂを、ＴＳＨＲ被覆チューブ中で１８０分間
室温でインキュベートし、その後１ｍｇ／ｍｌの種々のＭＡｂ  ＩｇＧ又はＦａｂ調製物を１０μＬ添加し、０〜１８０分間室温でインキュベーションした。様々な時点で、チューブを吸引し、洗浄し、計数した。幾つかの実験では、ＴＳＨ又は緩衝液を、ＭＡｂ調製物の代りに添加した。
【００６１】
ＴＳＨＲのアミノ酸突然変異
特定の突然変異をＴＳＨＲ配列に導入するために使用される方法は、国際公開第２００６／０１６１２１号Ａに記述されている。更に、Ｆｌｐ−Ｉｎ系を使用して突然変異ＴＳＨＲ構築体をＣＨＯ細胞に形質移入することも、国際公開第２００６／０１６１２１号Ａに記述されている。野生型又は突然変異ＴＳＨＲのいずれかを発現するＦｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞を９６穴プレートに播種し、アミノ酸突然変異を含有するＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞で環状ＡＭＰ活性を刺激する種々の調製物の能力を試験するために使用した。これら実験を、野生型ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞を使用して得られた同様の実験と比較した。野生型又は突然変異ＴＳＨＲのいずれかを発現するＦｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞は、上述のようなＴＳＨ、刺激性抗体、又は患者血清ＴＲＡｂの刺激活性を阻止する種々の調製物の能力を研究する実験でも使用した。
【００６２】
ＴＳＨＲ２６０−アルカリホスファターゼ（ＴＳＨＲ２６０−ＡＰ）構築体の産生
ＴＳＨＲ  ２６０構築体（ヒトＴＳＨＲのコード化アミノ酸１〜２６０；アミノ酸１〜２１はリーダー配列である）は、全長ヒトＴＳＨＲをテンプレートとして使用して増幅し（Oda Y, et al 1998. Journal of Molecula rEndocrinology 20:233-244）、クローニングベクターｐＳＥＡＰ２−ｂａｓｉｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）をテンプレートとして使用して、分泌アルカリホスファターゼ（１７個のアミノ酸のアルカリホスファターゼリーダー配列を除く）のコード配列に連結した。２つのＰＣＲ反応を実施し、第１の反応では、Ｎ末端にＥｃｏＲＩ制限部位、及びＣ末端に１アミノ酸リンカー（アスパラギン）及び分泌アルカリホスファターゼの最初の８個のアミノ酸（１７個のアミノ酸のリーダー配列を除く）を付加した特異的プライマー配列番号７７及び配列番号７８プライマー（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ社製）を用いて増幅された全長ＴＳＨＲを使用した。第２のＰＣＲは、分泌アルカリホスファターゼのＮ末端に、ＴＳＨＲのアミノ酸２５４〜２６０及び１アミノ酸リンカー（アスパラギン）、並びに分泌アルカリホスファターゼ遺伝子のＣ末端に、６ヒスチジンタグ、終止コドン、及びＸｈｏＩ制限部位を付加するプライマー配列番号７９及び配列番号８０を用いて増幅されたクローニングベクターｐＳＥＡＰ２−ｂａｓｉｃを使用して実施した。ＰＣＲ反応は、９４℃で１分間、４０℃で１分間、及び７２℃で１分間の３０サイクル、その後７２℃で７分間で実施した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルに流し、ＤＮＡを、製造業者の説明書に従ってｇｅｎｅｃｌｅａｎ  ＩＩキット（Ａｎａｃｈｅｍ  Ｌｔｄ社製、ルートン）を使用して抽出した。その後、精製ＰＣＲ産物１及び２を使用して、ＴＳＨＲ  ２６０−アルカリホスファターゼ遺伝子全体を構築するための第３のＰＣＲをセットアップした。２００ｎｇのＰＣＲ１産物及び２００ｎｇのＰＣＲ２産物及びＰＣＲ３を含有するＰＣＲ３反応を、９４℃で１．５分間、６５℃で１．５分間、及び７２℃で１．５分間の７サイクルで実施した。その後、温度を２分間９４℃に再び上昇させ、プライマー配列番号７７及び８０を添加し、その後９４℃で１分間、５２℃で１分間、及び７２℃で２分間の３０サイクルを行った。ＰＣＲ３産物を、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ制限部位を使用してｐＦａｓｔＢａｃ１にクローニングし、突然変異の存在は、サンガークールソン法（Sanger F et al 1997. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 74:5463-5467）による配列決定を使用して確認した。組換えＤＮＡは、国際公開第２００８／０２５９９１号Ａ１に記述されているように、Ｂａｃ
ｔｏ  Ｂａｃバキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、英国）を使用して製作し、Ｓｆ−９細胞に形質移入して組換えバキュロウイルス株を取得及び増幅した。ＴＳＨＲ２６０−ＡＰは、国際公開第２００８／０２５９９１号Ａ１に記述されているよう
に、昆虫細胞で発現した。
【００６３】
ＴＳＨＲ２６０−ＡＰに基づくＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡは、二価ＴＳＨＲ抗体が、ＥＬＩＳＡプレートウエルに被覆されたＴＳＨＲに対して１つの抗原結合部位で結合し、液相中のＴＳＨＲ２６０−ＡＰに対して別の抗原結合部位で結合する、すなわち架橋を形成する能力に基づいて確立した。ＣＨＯ細胞で発現された界面活性剤可溶化全長受容体形態のＴＳＨＲを、以前に記述されているように、Ｃ末端抗体によりＥＬＩＳＡプレートウエルに被覆した（Bolton J et al 1999、上記）
。このアッセイでは、７５μＬの開始緩衝液（ＴＲＡｂ  ＥＬＩＳＡについて記述されているような；Bolton J et al 1999、上記）及び７５μＬの試験試料（患者血清又はモノ
クローナル抗体）を、界面活性剤可溶化全長ＴＳＨＲで被覆されたＥＬＩＳＡプレートウエルに添加し、振とうしながら（５００ｒｐｍ）室温で２時間インキュベートした。その後、ウエルの内容物を除去し、ウエルを洗浄緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．８、１％トリトンＸ−１００）で３回洗浄し、その後１００μＬのＴＳＨＲ２６０−ＡＰ（０．２ｇ／Ｌ  ＭｇＣｌ2−６Ｈ2Ｏ及び２ｇ／Ｌ  ＢＳＡを含有する洗浄緩衝液で希釈）を添加した。振とうしながら（５００ｒｐｍ）室温で１時間インキュベーションした後、ウエルを空にし、洗浄し（３回）、１００μＬのｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮｐｐ）基質（Ｅｕｒｏｐａ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌｔｄ社製、エリー、ケンブリッジ  英国）を添加し、プレートを暗所で４５分間インキュベートした。その後、１００μＬの停止溶液（１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ）を添加し、４０５ｎｍの吸光度を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーで測定した。結果を、ＯＤ405nm
の吸光度値として表し、一群の健常供血者（ＨＢＤ）血清で観察されたものより高い値は、試料中にＴＳＨＲ自己抗体が存在することを示した。幾つかの実験では、ＣＨＯ細胞で発現された突然変異Ｒ２５５Ｄを含有する組換えＴＳＨＲの可溶化調整物を使用して、ＥＬＩＳＡプレートウエルを被覆した。
【００６４】
ＴＳＨＲ  ＬＲＤ  Ｃ−ＣＡＰ構築体の産生
アミノ酸３０６〜３８４が取り除かれたヒトＴＳＨＲのアミノ酸１〜４０９をコードするＴＳＨＲ  ＬＲＤ  Ｃ−ＣＡＰ構築体を、全長ヒトＴＳＨＲをテンプレートとして使用して増幅した（Oda Y, et al 1998. Journal of Molecular Endocrinology 20:233-244）。２つのＰＣＲ反応を実施し、第１の反応では、Ｔ７プライマー（配列番号８１）、及びＴＳＨＲのアミノ酸３０５のＣ末端側にＴＳＨＲのアミノ酸３８５〜３４２を付加した特異的プライマー配列番号８２（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ社製、ジリンガム、ドーセット、英国）を用いて増幅された全長ＴＳＨＲを使用した。第２のＰＣＲは、ＢＧＨ逆方向プライマー配列番号８３、及びＴＳＨＲのアミノ酸３８５のＮ末端側にＴＳＨＲのアミノ酸２９８〜３０５を付加する特異的プライマー（配列番号８４）を用いて増幅された全長ＴＳＨＲを使用して実施した。ＰＣＲ反応は、９４℃で１分間、４０℃で１分間、及び７２℃で２分間の３０サイクル、その後７２℃で７分間で実施した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルに流し、ＤＮＡを、製造業者の説明書に従ってＧｅｎｅｃｌｅａｎ  ＩＩキット（Ａｎａｃｈｅｍ  Ｌｔｄ社製、ルートン）を使用して抽出した。その後、精製ＰＣＲ産物１及び２を使用して、アミノ酸３０６〜３８４が取り除かれ、Ｓｅｒ３０５がＴｙｒ３８５に連結した連続ＴＳＨＲ配列を構築する第３のＰＣＲをセットアップした。２００ｎｇのＰＣＲ１産物及び２００ｎｇのＰＣＲ２産物及びＰＣＲ３を含有するＰＣＲ３反応を、９４℃で１．５分間、６５℃で１．５分間、及び７２℃で１．５分間の７サイクルで実施した。その後、温度を２分間９４℃に再び上昇させ、Ｔ７プライマー（配列番号８１）及びＢＧＨＲプライマー（配列番号８３）を添加し、その後９４℃で１分間、５２℃で１分間、及び７２℃で２分間の３０サイクルを行った。その後、アミノ酸３０６〜３８４が取り除かれたＴＳＨＲ配列を含有するＰＣＲ３産物を１％アガロースゲルに流し、ＤＮＡを、製造業者の説明書に従ってＧｅｎｅｃｌｅａｎ  ＩＩキット（Ａｎａｃｈｅｍ  Ｌｔｄ社製）を使用して抽出した。精製ＰＣＲ３産物を、ＴＳＨＲ  ＬＲＤ  Ｃ−ＣＡＰ遺
伝子構築用のテンプレートとしてＰＣＲ４で使用した。２００ｎｇのＰＣＲ３をテンプレートＤＮＡとして含有するＰＣＲ４反応は、Ｔ７プライマー（配列番号８１）、及びＴＳＨＲ配列（アミノ酸３０６〜３８４を欠失した１〜４０９）のアミノ酸４０９のＣ末端側に、６ヒスチジンタグ、終止コドン、及びＸｈｏＩ制限部位を付加する特異的プライマー（配列番号８５）を用いて増幅した。ＰＣＲ４反応は、９４℃で１分間、４０℃で１分間、及び７２℃で１分間の３０サイクル、その後７２℃で１０分間で実施した。ＰＣＲ４産物を、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限部位を使用してｐＦａｓｔＢａｃ１にクローニングし、突然変異の存在は、サンガークールソン法（Sanger F et al 1997. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 74:5463-5467）による配列決定を使用して確認した。組換えＤＮＡは、国際公開第２００８／０２５９９１号Ａ１に記述されているように、Ｂａｃ  ｔｏ  Ｂａｃバキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ペーズリー、英国）を使用して製作し、Ｓｆ−９細胞に形質移入して組換えバキュロウイルス株を取得及び増幅した。ＴＳＨＲ  ＬＲＤ  Ｃ−ＣＡＰ（図７ｃ；配列番号７６）は、国際公開第２００８／０２５９９１号Ａ１に記述されている手順を使用して、昆虫細胞で発現させた。
【００６５】
様々なＴＳＨＲ調製物の安定性の比較
組換えＴＳＨＲの様々な調製物の温度安定性を比較した。ＣＨＯ細胞で発現された全長可溶化ＴＳＨＲ、昆虫細胞で発現されたＴＳＨＲ２６０、昆虫細胞で発現されたＴＳＨＲ２６０−ＡＰ、及び昆虫細胞で発現されたＴＳＨＲ．ＬＲＤ  Ｃ−ＣＡＰを試験した。上記に列挙されている調製物の各々の等量を、−８０℃保管庫から取り出し、氷上解凍し、対照としての試料を−８０℃に戻し、バルクを室温（２０〜２５℃）で２４時間又は４８時間保管した。室温で２４時間又は４８時間後、ＴＳＨＲ調製物を−８０℃で保管し、その後下述のように試験した。ＥＬＩＳＡプレートウエルを、被覆緩衝液（Bolton J et al
1999、上記）中１μｇ／ｍＬのマウスＴＳＨＲ  ＭＡｂ  １４Ｃ４のＦ（ａｂ’）2調製物（Jeffreys J et al 2002, Thyroid 12:1051-1061及びSanders J et al 2007 Thyroid 17:395-410）で被覆した。研究中のＴＳＨＲ調製物を、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．８、１％容積／容積  トリトンＸ−１００、１ｇ／Ｌ  ＢＳＡ、２００ｍｇ／Ｌ  ＮａＮ３で希釈し、１５０μＬをＥＬＩＳＡプレートウエルに添加した（四重重複で）。４℃で終夜インキュベーションして、抗体（１４Ｃ４  Ｆ（ａｂ’）２）被覆ウエルに対するＴＳＨＲ調製物の結合を可能にした後、ウエルを洗浄し、７５μＬのアッセイ緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．８、１％容積／容積  トリトンＸ−１００、１ｇ／Ｌ  ＢＳＡ）及び７５μＬの健常供血者血清と共に、ＥＬＩＳＡプレート振とう器で毎分５００回振とうしながら室温で１時間インキュベートした。その後、ウエルの内容物を空にし、ウエルを洗浄し、１００μＬのＭ２２  Ｆａｂ−ペルオキシダーゼ結合体（上記を参照）を各ウエルに添加した。振とうせずに２５分間室温でインキュベーションした後、プレートウエルを再度洗浄し、その後１００μＬのテトラメチルベンジジンを添加し、室温で振とうせずに更に２５分間インキュベーションした。反応は、５０μＬの０．５ｍｏｌ／Ｌ  Ｈ2ＳＯ4を添加することにより停止させ、各ウエルの４５０ｎｍでの吸光度を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーで測定した。
【００６６】
可変領域遺伝子解析
Ｋ１−１８又はＫ１−７０重鎖及び軽鎖の可変（Ｖ）領域遺伝子は、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）反応用のｍＲＮＡを産生するために、１×１０7個のヘテロハイブリドーマ
細胞（分泌Ｋ１−１８  ＩｇＧ又はＫ１−７０  ＩｇＧ）から調製された全ＲＮＡを使用して、国際公開第２００４／０５０７０８号Ａ２に記述されているように決定した。医学研究審議会のＶ−ｂａｓｅ（http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/）を使用して設計され、
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（ペーズリー、ＰＡ４  ９ＲＦ、英国）により合成された、特異的ＩｇＧ１  ＨＣ及びカッパＬＣのセンス及びアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドプライ
マーを、Ｋ１−１８ｍＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ反応で使用した。上述のように調製された特異的ＩｇＧ１  ＨＣ及びラムダＬＣプライマーを、Ｋ１−７０ｍＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ反応で使用した。ＲＴ反応は、５０℃で１５分間、その後９４℃で１５秒間、５０℃で３０秒間、及び７２℃で３０秒間の４０サイクルのＰＣＲで実施した。ＤＮＡ産物をｐＵＣ１８にクローニングし、サンガークールソン法（Sanger F, et al 1977、上記）により配列決定した。Ｖ領域配列を、Ｉｇ  ｂｌａｓｔ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）を使用して、入手可能なヒトＩｇ遺伝子の配列と比較した。ＣＤＲは、カバット法（Kabat E et al 1991 Sequences of proteins of immunological interest (US Public Health service, Bethesda, MD) Fifth edition）及びＩｇ  ｂｌａｓｔ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）により帰属させた。２巡目のｍＲＮＡ単離は、限界希
釈により更に再クローン化を受けたＫ１−７０及びＫ１−１８ハイブリドーマ細胞系の両方から実施した。Ｖ領域配列（Ｋ１−１８  ＨＣ、Ｋ１−１８  ＬＣ、Ｋ１−７０  ＨＣ、及びＫ１−７０  ＬＣ）は、ｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって取得し、その後上述のようにクローニング及び配列決定した。加えて、ＲＴ−ＰＣＲ反応は、また、Ｖ領域の各々のそれぞれのリーダー配列の５’末端に対応する、特異的に設計されたＰＣＲプライマーを使用して実施した。これにより、Ｋ１−１８及びＫ１−７０のＨＣ及びＬＣ  Ｖ領域のＮ−末端の、実際のオリゴヌクレオチド配列（及び派生アミノ酸配列）の特定が可能になった。加えて、Ｋ１−７０  ＬＣタンパク質のＮ−末端アミノ酸配列を、Ａｌｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社（バーミンガム、英国）によるエドマン分解反応により分析した。これは、ピログルタミン酸アミノペプチダーゼを用いてＫ１−７０  ＬＣタンパク質調製物のＮ−末端を「脱ブロッキング」した後で可能だった。精製Ｋ１−７０  Ｆａｂ（１０μｇ）を、２．５ｍＵのピログルタミン酸アミノペプチダーゼ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ2ＨＰＯ4  ｐＨ７．０；１０ｍｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール、及び１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ中）で、６時間７５℃で処理した。等しい容積のＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液を添加し、１００℃で５分間加熱した後、Ｋ１−７０  Ｆａｂを、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでＨＣ（Ｆｄ部分）及びＬＣに分離した。ＬＣバンドを、注意深くゲルから切り出し、Ｎ−末端タンパク質配列を決定した。数巡のＲＴ−ＰＣＲを繰り返し、Ｋ１−１８  ＨＣ、Ｋ１−１８  ＬＣ、及びＫ１−７０  ＨＣの配列決定することにより、Ｖ領域配列は以前に得られたものと同じであったが、Ｋ１−７０  ＬＣ  Ｖ領域配列は異なっていたことが確認された。数巡のＲＴ−ＰＣＲの繰り返し実験で得られたＫ１−７０  ＬＣ配列は、エドマン反応により得られた２〜２１連続Ｎ末端アミノ酸のタンパク質配列（図６ｅ；配列番号７３）、及びＫ１−７０  Ｆａｂの結晶構造中のＬＣアミノ酸の電子密度（図８）と一致しており、結果的に、好ましいＫ１−７０  ＬＣ配列（図６ｃ及び６ｄ、（それぞれ、配列番号６４及び６９））として結論付けた。
【００６７】
Ｋ１−７０  ＦａｂのＸ線回折解析
上述のように調製されたＫ１−７０  Ｆａｂ溶液を、９０００Ｄａカットオフを有するｉＣＯＮ濃縮器（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、ラフバラ、英国）を使用して、１５．５ｍｇ／ｍＬに濃縮し、等分して−２０℃で保管した。Ｋ１−７０  Ｆａｂの結晶は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ社製（ニューマーケット、英国）のＳｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｓｃｒｅｅｎ１  ｓｐａｒｓｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｓｃｒｅｅｎを使用し、蒸気拡散の懸滴法を使用して育晶した。幾つかの結晶が多くの条件で取得され、その全てをスクリーニングして、Ｂｉｏｆｏｃｕｓ  ＤＰＩ社（サフランウォールデン、英国）でのＸ線回折解析に最も好適な結晶を特定した。３０％ＰＥＧ４００、０．１ＭナトリウムＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、０．２Ｍ塩化マグネシウム中で育晶した結晶を選択した。それをウエル溶液で洗浄し、液体窒素に浸漬することにより瞬間凍結した。データセットを、Ｒｉｇａｋｕ  Ｒ−Ａｘｉｓ  ＩＶイメージプレート検出器で収集し、ＭＯＳＦＬＭ及びＳＣＡＬＡ（ＣＣＰ４プログラムスイート（Collaborative computational project, number 4. 1994. "The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography". Acta Cryst. D50, 760-763）から）を使用して、指数付けし、積分し、スケーリ
ングした。タンパク質構造データベース（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）からの３つの構造１ＬＩＬ（ＶＬ及びＣＬドメイン）、２Ｂ０Ｓ（ＶＨドメイン）、及び２ＥＨ７（ＶＬドメイン）を、配列アラインメントに基づく分子置換に使用するために選択した。２つの完全なＦａｂ  Ｋ１−７０分子が非対称単位中に存在しており、その結果生じたモデルを、ＲＥＦＭＡＣ５（ＣＣＰ４）を使用して、厳重な幾何学的重み付けをして１０サイクルの原子精密化にかけた。電子密度図は、分子置換及び初期精密化をモデル構築プログラムＣＯＯＴ（Emsley P, Cowtan K 2004. Nature 355: 472-475）で検討した後で計算し、自動モデル再構築は、ＢＵＣＣＡＮＥＥＲ（ＣＣＰ４）を使用して実施した。モデルを再検討して残りの欠けている特徴を全て手作業で構築し、ＲＥＦＭＡＣ５（ＣＣＰ４）を使用してモデルを精密化した。その後、ＣＯＯＴの水配置機能を使用して水分子を付加し、ＲＥＦＭＡＣ５（ＣＣＰ４）を使用して精密化した。Ｆａｂ  Ｋ１−７０の構造幾何学は、ＰＲＯＣＨＥＣＫ（ＣＣＰ４）及びＲＡＭＰＡＧＥ（ＣＣＰ４）を使用して点検した。最後に、モデル中の残基を、カバット付番方式（Kabat E et al 1991、上記）に従って再付番した。
【００６８】
大腸菌での組換えＫ１−７０  Ｆａｂのクローニング及び発現
Ｋ１−７０  ＨＣ  ＲＴ−ＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼで切断し、Ｋ１−７０  ＬＣ  ＰＣＲ産物をＳａｃＩ及びＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼで切断し、ＨＣ及びＬＣ  ｃＤＮＡを、両方ともｌａｃＺプロモーターの制御下でＩｍｍｕｎｏｚａｐ  Ｈ／Ｌベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｅｕｒｏｐｅ社製；アムステルダム、オランダ）（Matthews I, et al 2002 Laboratory Investigation 82:1-11）に
クローニングした。プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ｍｉｄｉプラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｌｔｄ社製、クローリー、英国）を使用して調製し、Ｋ１−７０  ＨＣ及びＬＣ  ｃＤＮＡの存在は、サンガークールソン法（Sanger F, et al 1977、上記）を使用して配列決定することにより確認した。プラスミドＤＮＡを、大腸菌株ＨＢ２１５１（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、リトルチャルフォント、英国）に形質転換し、ＬＢアンピシリン（トリプトン  １０ｇ／Ｌ、酵母抽出物  ５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、１００μｇ／ｍｌ終濃度のアンピシリン）寒天プレート（１５ｇ／Ｌの寒天）上で終夜３７℃で増殖させた。前培養（３ｍＬ  ＬＢアンピシリン＋１％グルコース中に１つのコロニー）を、振とうしながら３０℃で終夜増殖させた。組換えＦａｂの産生は、グルコースが存在すると阻害される。終夜インキュベーションした後の前培養を、１／１００に希釈し（５ＯｍＬ  ＬＢアンピシリン中０．５ｍＬ）、ＯＤ600が１．２になるまで
３０℃で増殖させ、その後スクロースを添加し（終濃度０．３ｍｏｌ／Ｌ）、培養物を、ＯＤ600が１．２に戻るまで３０℃で増殖させた。その後、イソプロピル−β−Ｄチオガ
ラクトシド（ＩＰＴＧ）を、終濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加し、培養物を振とうしながら２３℃で２４時間インキュベートし続けた。その後、培養物を、４℃で３０分間３０００ｒｐｍで遠心分離し、培養上清を回収した。培養上清を０．４５μｍフィルターでろ過し、ＰＢＳ（８．１ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ2ＨＰＯ4、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＨ2
ＰＯ4、２．７ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１３７ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４）で
終夜透析した。Ｋ１−７０プラスミド（ＨＢ２１５１／Ｋ１−７０）で形質転換されたＨＢ２１５１細胞に由来する、ＩＰＴＧ無しでグルコースと共に増殖させた、つまり誘導しなかった培養上清を陰性対照として使用した。培養上清を、（ａ）ＴＳＨＲに対するＴＳＨ結合を阻害するそれらの能力、（ｂ）ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞で環状ＡＭＰ産生のＴＳＨ媒介性刺激を阻害するそれらの能力についてアッセイした。
【００６９】
結果
Ｋ１−１８又はＫ１−７０を分泌する安定細胞系の単離及びクローニング
２０ｍＬの患者血液から得たリンパ球（２６×１０6）を、ＥＢＶに感染させ、４８穴
プレートの１ウエル当たり１×１０6細胞で、マウスマクロファージの支持細胞層に播種
した。ＥＢＶ感染後１３日目に、プレートウエル上清を、125Ｉ−ＴＳＨ結合の阻害につ
いてモニターした。陽性クローンを、ＴＳＨＲに対するそれらの効果（刺激性又は阻止性）に関して更に試験した。陽性ウエルの細胞（使用したアッセイのいずれかで陽性）を増殖させ、Ｋ６Ｈ６／Ｂ５ハイブリドーマ細胞系と融合させ、９６穴プレートに播種した。125Ｉ−ＴＳＨ結合阻害活性を有する抗体を安定して産生する２つのクローンを取得し、
４回再クローン化した。それらクローンのうちの１つは、ＴＳＨＲ刺激活性を示したＫ１−１８と称するヒトＭＡｂを分泌した。ヘテロハイブリドーマ培養上清から精製されたＫ１−１８抗体は、カッパ軽鎖を有するサブクラスＩｇＧ１だった。もう１つの安定クローンは、ＴＳＨＲで形質移入されたＣＨＯ細胞で環状ＡＭＰ産生のＴＳＨ刺激を阻止する能力を示した、Ｋ１−７０と称するヒトＭＡｂを分泌した。ヘテロハイブリドーマ培養上清から精製されたＫ１−７０抗体は、ラムダ軽鎖を有するサブクラスＩｇＧ１だった。
【００７０】
ＴＳＨＲ被覆チューブに対する125Ｉ−ＴＳＨ結合の阻害
ＴＳＨＲ被覆チューブに対する標識ＴＳＨの結合を阻害する、様々な濃度のＫ１−１８又はＫ１−７０  ＩｇＧの能力は、表１ａ及び１ｂに示されている。表１ａに示されているように、健常供血者（ＨＢＤ）血清で希釈されたＫ１−１８  ＩｇＧは、１μｇ／ｍＬ濃度でおよそ９５％の125Ｉ−ＴＳＨ結合の最大阻害を示した。Ｋ１−１８  ＩｇＧの阻
害効果は、１〜０．００１μｇ／ｍＬの濃度で用量依存性だった。Ｋ１−１８の阻害効果は、同じ濃度のＭ２２  ＩｇＧの効果と同等であった。１μｇ／ｍＬのＫ１−１８  ＩｇＧは、５Ｃ９  ＩｇＧ１、ＴＳＭＡｂ  １〜７  ＩｇＧ又は９Ｄ３３  ＩｇＧよりも強力な125Ｉ−ＴＳＨ結合の阻害物質である（表１ａ）。125Ｉ−ＴＳＨ結合に対する効果を阻害するＫ１−７０  ＩｇＧ又はＦａｂは、表１ｂに示されている。ＨＢＤ血清で希釈されたＫ１−７０  ＩｇＧは、０．０３μｇ／ｍＬで１３．５±２．３％から１００μｇ／ｍＬで９５．９±０．８％に及ぶ用量依存的阻害を示した。Ｋ１−７０  Ｆａｂの阻害効果は、同じ濃度のＫ１−７０  ＩｇＧの効果と同等であった（表１ｂ）。表１ａ及び１ｂは、被覆チューブアッセイ緩衝液で稀釈されたＫ１−１８及びＫ１−７０及び様々なＭＡｂｓによる、ＴＳＨＲ被覆チューブに対する125Ｉ−ＴＳＨの結合に対する効果も示してお
り、５Ｃ９以外の全てのＭＡｂの場合には、これら効果は、ＭＡｂがＨＢＤ血清で希釈された場合に観察された結果と同等であった。表２ａは、Ｋ１−１８、Ｋ１供与体血清、及びＫ１供与体血清ＩｇＧの様々な調製物による、ＴＳＨＲ被覆チューブに対する125Ｉ−
ＴＳＨ結合の阻害を示す。この実験では、およそ１２％阻害が、ＨＢＤ血清で希釈されたわずか０．０１μｇ／ｍＬのＫ１−１８  ＩｇＧで観察され、阻害は、１０μｇ／ｍＬのＫ１−１８  ＩｇＧでの９５％阻害まで用量依存的な様式で増加した。ＨＢＤ血清中０．０１μｇ／ｍＬのＫ１−１８  Ｆａｂは、５．６±７．３％阻害を示し、阻害は、１０μｇ／ｍＬでの８２．２±０．９％最大阻害まで用量依存的な様式で増加した。これは、ＨＢＤ血清で希釈された供与体血清ＩｇＧによる125Ｉ−ＴＳＨ結合阻害と比較することが
でき、０．１２５ｍｇ／ｍＬでの１３．７±１．３％阻害は、１ｍｇ／ｍＬでの７６．５±１．５％阻害へと用量依存的な様式で増加する。様々な希釈の供与体血清も、１／１６０希釈での９．１±０．８％阻害から１／１０希釈での８１．１±０．４％阻害まで、125Ｉ−ＴＳＨ結合の用量依存的阻害を示した。表２ａのデータは、精製Ｋ１−１８  Ｉｇ
Ｇが、Ｋ１供与体血清ＩｇＧと比較して、ＴＳＨ結合阻害の点で６６００倍より活性であったことを示した。Ｋ１−１８  ＩｇＧ及び供与体血清ＩｇＧを、アッセイ緩衝液で希釈した場合、Ｋ１−１８  ＩｇＧがＴＳＨ結合を阻害する能力は、供与体血清ＩｇＧの阻害能力より４７００倍大きかった（表２ａ）。表２ｂは、国立生物学的製剤研究所（ＮＩＢＳＣ；ポターズバー、英国）の甲状腺刺激自己抗体基準調製物９０／６７２の効果と比較した、被覆チューブアッセイでの、Ｋ１−１８の様々な調製物によるＴＳＨＲに対する125Ｉ−ＴＳＨ結合の阻害を示す。ＨＢＤ血清で希釈されたＫ１−１８  ＩｇＧは、６９Ｎ
ＩＢＳＣ  ９０／６７２単位／ｍｇの125Ｉ−ＴＳＨ結合阻害活性を示した（３つの濃度
のＫ１−１８  ＩｇＧで計算された活性の平均；３０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、及び３００ｎｇ／ｍＬ）（表２ｂ）。同じ実験で計算されたＫ１−１８  Ｆａｂ（血清で希釈）の125Ｉ−ＴＳＨ結合結合阻害活性は、４６ＮＩＢＳＣ  ９０／６７２単位／ｍｇだ
った（３０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、及び３００ｎｇ／ｍＬのＫ１−１８  Ｆａｂでの活性を使用して計算した）（表２ｂ）。これは、１３１ＮＩＢＳＣ単位／ｍｇのＭ２２  ＩｇＧ  125Ｉ−ＴＳＨ結合阻害活性と比較することができる（表２ｂ）。ＮＩＢＳ
Ｃ  ９０／６７２の活性と比較した、供与体血清及び供与体血清ＩｇＧの希釈物の125Ｉ
−ＴＳＨ結合阻害活性は、表２ｃに示されている。供与体血清の125Ｉ−ＴＳＨ結合阻害
活性は、０．０７５ＮＩＢＳＣ  ９０／６７２単位／ｍＬであり（４０×及び２０×希釈での値の平均）、ＨＢＤ血清で希釈された供与体血清ＩｇＧの125Ｉ−ＴＳＨ結合阻害活
性は、０．０１１単位／ｍｇだった（０．１、０．３、及び１．０ｍｇ／ｍＬでの値の平均）（表２ｃ）。これは、６３．３ＮＩＢＳＣ  ９０／６７２単位／ｍｇ（３０、１００、及び３００ｎｇ／ｍＬでの値の平均）の同じ実験で測定されたＫ１−１８  ＩｇＧ（ＨＢＤ血清で希釈）の活性、及び１１４単位／ｍｇ（１０、３０、及び１００ｎｇ／ｍＬでの値の平均）のＫ１−７０  ＩｇＧ（ＨＢＤ血清で希釈）の活性と比較することができる（表２ｃ）。結果的に、このアッセイ系では、Ｋ１−１８  ＩｇＧの比活性は、供与体血清ＩｇＧの比活性の５７５５倍だった。同様に、Ｋ１−７０  ＩｇＧの比活性は、供与体血清ＩｇＧの比活性の１０，３６４倍だった。
【００７１】
ＴＳＨＲ被覆チューブに結合するＫ１−１８及びＫ１−７０のスキャチャード解析
ＴＳＨＲ（全長）に対するＫ１−１８  ＩｇＧの結合親和性は、６．７±１．０×１０9Ｌ／ｍｏｌ（平均±ＳＤ；ｎ＝３）であり、Ｋ１−１８  Ｆａｂの結合親和性は、１．
８±１．０×１０9Ｌ／ｍｏｌ（平均±ＳＤ；ｎ＝３）だった。ＴＳＨＲ２６０に対する
Ｋ１−１８  ＩｇＧの結合親和性は、５．９±１．０×１０9Ｌ／ｍｏｌ（平均±ＳＤ；
ｎ＝３）だった。ＴＳＨＲ（全長）に対するＫ１−７０  ＩｇＧの結合親和性は、３．９±０．８×１０10Ｌ／ｍｏｌ（平均±ＳＤ；ｎ＝３）であり、Ｋ１−７０  Ｆａｂの結合親和性は、２．３±０．３×１０10Ｌ／ｍｏｌ（平均±ＳＤ；ｎ＝３）だった。ＴＳＨＲ２６０に対するＫ１−７０  ＩｇＧの結合親和性は、３．１±０．４×１０10Ｌ／ｍｏｌ（平均±ＳＤ；ｎ＝３）であり、Ｋ１−７０  Ｆａｂの結合親和性は、９．３±０．４×１０9Ｌ／ｍｏｌ（平均±ＳＤ；ｎ＝３）だった。これは、６．０±０．９×１０9Ｌ／ｍｏｌ（平均±ＳＤ、ｎ＝５）のＴＳＨＲ（全長）に対するブタＴＳＨの結合親和性と比較することができる（Nakatake et al 2006、上記）。
【００７２】
ＥＬＩＳＡにより測定されたＴＳＨＲに対するＴＳＨ−ビオチン結合の阻害
ＴＳＨＲ被覆ＥＬＩＳＡプレートウエルへのＴＳ−Ｈビオチン結合に対するＫ１−１８
ＩｇＧの効果を研究し、種々の他のＭＡｂの効果と比較した。表３ａに示されているように、ＨＢＤ血清で希釈されたＫ１−１８  ＩｇＧは、ＴＳＨ−ビオチン結合に対して用量依存的な阻害効果を示し、０．０１μｇ／ｍＬで１０．０±０．８％阻害、１μｇ／ｍＬで９６．２±０．２％の本質的に最大阻害、及び３μｇ／ｍｌ以上の濃度で最大阻害プラトーだった。これは、０．０１μｇ／ｍＬで１７．５±２．０％及び１μｇ／ｍＬで９８．３±０．０％のＭ２２  ＩｇＧ（ＨＢＤ血清で希釈）阻害効果と比較することができる（表３ａ）。１μｇ／ｍＬ（ＨＢＤ血清で希釈）でのＫ１−１８  ＩｇＧのＴＳＨ−ビオチン結合阻害活性は、表３ａに示されている例により示されている５Ｃ９  ＩｇＧ、ＴＳＭＡｂ  １〜７  ＩｇＧ、及び９Ｄ３３  ＩｇＧより大きかった。ＥＬＩＳＡアッセイ緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８、０．１％容積／容積トリトンＸ−１００、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）で希釈されたＫ１−１８  ＩｇＧを試験すると、阻害効果は、希釈をＨＢＤ血清で行った場合と本質的に同じだった（表３ａ）。表３ｂの例により示されているように、ＨＢＤ血清又はＥＬＩＳＡアッセイ緩衝液で希釈されたＫ１−１８  Ｆａｂも、ＥＬＩＳＡでのＴＳＨ−ビオチン結合の効果的な阻害物質だった。１００μｇ／ｍＬの対照ＭＡｂ  ＩｇＧ（グルタミン酸デカルボキシラーゼに対するヒトＭＡｂである５Ｂ３）を添加したＥＬＩＳＡアッセイ緩衝液で希釈されたＫ１−１８  ＩｇＧの阻害効果は、表３ｃに示されている。対照ＭＡｂ  Ｋ１−１８  ＩｇＧを含有する緩衝液で希釈した場合、ＢＳＡを含有する緩衝液又はＨＢＤ血清で
希釈した場合と同様のＴＳＨ−ビオチン結合阻害活気を示した（表３ｃ）。結果的に、高濃度（１００μｇ／ｍＬ）の無関係なヒトＭＡｂ  ＩｇＧの存在は、Ｋ１−１８  ＩｇＧ、Ｍ２２  ＩｇＧ、及び５Ｃ９  ＩｇＧのいずれの阻害活性にも効果を示さなかった。表３ｄは、ＴＳＨＲへのＴＳＨ−ビオチン結合に対するＫ１−７０の影響を示しており、これらは、Ｋ１−１８又はＭ２２の効果と同等である（表３ａ＆３ｂ）。ＨＢＤ血清で希釈されたＫ１−７０  ＩｇＧは、ＴＳＨ−ビオチン結合に対して用量依存的な阻害効果を示し、０．０１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、及び１μｇ／ｍＬで、それぞれ１３．６±１．４％、７４．１±０．４％、及び９７．４±０．２％の阻害であった。Ｋ１−７０  Ｆａｂは、同様に活性であり、０．０１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、及び１μｇ／ｍＬで、それぞれ１８．２±０．６％、８８．３±０．３％、及び９６．９±０．１％の阻害であった。Ｋ１−７０  ＩｇＧ又はＦａｂ調製物がＥＬＩＳＡアッセイ緩衝液で希釈された場合、阻害活性は、ＨＢＤ血清で製作された希釈物と比較して本質的に同じだった（表３ｄ）。ＴＳＨＲ被覆ＥＬＩＳＡプレートウエルに対するＭ２２  Ｆａｂ−ＰＯＤの結合を阻害するＫ１−１８  ＩｇＧの能力は、表４ａに示されている。ＨＢＤ血清で希釈されたＫ１−１８  ＩｇＧは、用量依存的な様式でＭ２２  Ｆａｂ−ＰＯＤ結合を阻害し、特に、２１．０±１．３％、８１．６±０．５％、及び９７．２±０．１％の阻害が、それぞれ０．０３μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、及び３μｇ／ｍＬで観察された。この効果は、０．０３μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、及び３μｇ／ｍＬで、それぞれ５１．０±２．４％、９３．２±０．３％、及び９８．０±０．２％であるＭ２２  ＩｇＧ（ＨＢＤ血清で希釈）の阻害効果と同等である。Ｋ１−１８  Ｆａｂは、Ｋ１−１８  ＩｇＧと同様の、Ｍ２２  Ｆａｂ−ＰＯＤ結合を阻害する能力を示した（表４ｂ）。表４ａに示されているように、ＴＳＨＲに対する標識Ｍ２２の結合を阻害するＫ１−１８及びＭ２２の能力は、５Ｃ９、ＴＳＭＡｂ  １〜７、及び９Ｄ３３の阻害活性より大きかった。ＥＬＩＳＡアッセイ緩衝液で希釈した場合、研究された全てのＭＡｂの阻害効果は、ＨＢＤ血清で希釈した場合に観察された阻害効果に類似していた（表４ａ及びｂ）。ＴＳＨＲへのＭ２２  Ｆａｂ−ＰＯＤ結合に対するＫ１−１８の阻害効果は、Ｋ１−７０の効果と比較することができる（表４ｃ）。ＨＢＤ血清で希釈されたＫ１−７０  ＩｇＧは、０．０３μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、及び３μｇ／ｍＬで、それぞれ３４．５±３．８％、９１．１±０．３％、及び９７．６±０．１％の阻害を示した。Ｋ１−７０  ＩｇＧをＥＬＩＳＡアッセイ緩衝液で希釈した場合、同様の阻害パーセントが観察された（表４ｃ）。表４ｃに例示されているように、ＨＢＤ血清又はＥＬＩＳＡアッセイ緩衝液で希釈されたＫ１−７０  Ｆａｂは、Ｋ１−７０  ＩｇＧと同様のＭ２２−ＰＯＤ結合阻害活性を示した。
【００７３】
ＴＳＨＲ被覆チューブに対する125Ｉ標識Ｋ１−１８  ＩｇＧ又はＦａｂ結合の阻害
０．０１〜１００μｇ／ｍＬ（ＨＢＤ血清で希釈）濃度の対照ヒトＭＡｂ  ４Ｂ４  ＩｇＧの存在下では、125Ｉ−Ｋ１−１８  ＩｇＧの結合は、本質的に影響を受けなかった
（表５ａ）。これは、様々な濃度の未標識Ｋ１−１８  ＩｇＧ（ＨＢＤ血清で希釈）の効果と比較することができ、０．００１、０．０１、０．１、及び１．０μｇ／ｍＬの増加する用量は、それぞれ１１．１±４．４％、２２．９±２．４％、６９．０±０．５％、及び９１．７±０．８％の125Ｉ標識Ｋ１−１８結合の阻害を引き起こした。０．００１
〜１００μｇ／ｍＬの濃度で試験された未標識Ｋ１−１８  Ｆａｂは、１０．３±２．２％（０．０３μｇ／ｍＬで）〜８４．８±０．９％（１００μｇ／ｍＬで）の範囲の阻害を示した（表５ｂ）。また、Ｋ１−７０  ＩｇＧ及びＦａｂ（両方とも、０．００１〜１００μｇ／ｍＬの濃度範囲で試験された）は、１０μｇ／ｍＬのＫ１−７０  ＩｇＧでの９５．１±０．３％及び３μｇ／ｍＬのＫ１−７０  Ｆａｂでの９２．８±１．１％の本質的に完全な阻害まで、125Ｉ−Ｋ１−１８  ＩｇＧ結合を用量依存的な様式で阻害した
（表５ｂ）。加えて、125Ｉ−Ｋ１−１８  ＩｇＧの結合は、Ｍ２２  ＩｇＧ、Ｍ２２  
Ｆａｂ、５Ｃ９  ＩｇＧ、ＴＳＭＡｂ  １〜７  ＩｇＧ、及び９Ｄ３３  ＩｇＧにより用量依存的な様式で阻害された（表５ａ及び５ｂ）。同じ実験を、被覆チューブアッセイ緩
衝液で希釈された種々のＭＡｂ調製物を使用して実施した場合、それぞれの調製物の阻害効果は、５Ｃ９  ＩｇＧの場合を除いて、ＨＢＤ血清で希釈された場合に観察された効果と同等であった（表５ａ）。アッセイ緩衝液で希釈された５Ｃ９の場合、１００μｇ／ｍＬでの最大阻害は、ＨＢＤ血清で希釈された場合の５７．７±２．４％と比較して、９１．３±０．４％であり、０．０１μｇ／ｍＬでの阻害は、それぞれ１１．７±１．８％及び−１．８±２．７％だった（表５ａ）。ＴＳＨＲ被覆チューブに対する125Ｉ−Ｋ１−
１８  ＩｇＧの結合は、リンパ球供与体血清により阻害され、１：２０及び１：１０の血清希釈でそれぞれ３５．２％及び５９．３％の阻害がもたらされた（表５ｃ）。２０人のグレーブス病患者に由来する血清は、125Ｉ−Ｋ１−１８  ＩｇＧの結合を阻害し、阻害
効果は、125Ｉ−ＴＳＨ結合に対する阻害効果と同等であった（表５ｃ）。表５ｃは、125Ｉ−Ｋ１−１８  ＩｇＧ及び125Ｉ−ＴＳＨ結合の両方に対する阻止性ＴＲＡｂを有する
２人の患者に由来する血清（Ｂ１及びＢ２）、及び刺激性ＴＲＡｂを有する２人の患者に由来する血清（Ｓ１及びＳ２）の希釈物の効果も示す。ＴＳＨＲ被覆チューブに対する125Ｉ−Ｋ１−１８  Ｆａｂ結合に対する種々のＭＡｂの効果は、表５ｄに示されている。
未標識Ｋ１−１８  ＩｇＧ及びＫ１−１８  Ｆａｂは、両方とも125Ｉ−Ｋ１−１８  Ｆ
ａｂ結合に対して用量依存的な阻害効果を示し、これら効果は、Ｍ２２  ＩｇＧ、Ｍ２２
Ｆａｂ、及びＫ１−７０  ＩｇＧの効果と同等であった（表５ｄ）。５Ｃ９  ＩｇＧ、ＴＳＭＡｂ  １〜７  ＩｇＧ、及び９Ｄ３３  ＩｇＧも、125Ｉ−Ｋ１−１８  Ｆａｂ結
合を阻害したが、それら効果は、Ｍ２２、Ｋ１−１８、及びＫ１−７０調製物と比較してより小さかった（表５ｄ）。
【００７４】
ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞での環状ＡＭＰ産生の刺激
Ｋ１−１８  ＩｇＧは、ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞での環状ＡＭＰ産生を、表６ａに示されているように用量依存的な様式で刺激した。低張性緩衝液では、０．１ｎｇ／ｍＬ  Ｋ１−１８  ＩｇＧが存在すると、環状ＡＭＰのレベルは、１．５６±０．３２ｐｍｏｌ／Ｌであり、１．０ｎｇ／ｍＬでは、４．０８±０．２８ｐｍｏｌ／Ｌであり、１０ｎｇ／ｍＬでは、３１．６６±５．０６ｐｍｏｌ／Ｌであり、１００ｎｇ／ｍＬでは、６４．９５±９．６１ｐｍｏｌ／Ｌであり、１０００ｎｇ／ｍＬでは、環状ＡＭＰのレベルは６７．９０±１０．４４ｐｍｏｌ／Ｌであった。低張性緩衝液中の様々な濃度のＫ１−１８  Ｆａｂでの環状ＡＭＰレベルは、１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、及び１０００ｎｇ／ｍＬのＫ１−１８  Ｆａｂで、それぞれ１．７２±０．８２ｐｍｏｌ／Ｌ、９．９９±３．５２ｐｍｏｌ／Ｌ、５３．２２ｐｍｏｌ／Ｌ、及び６６．９４±６．９３ｐｍｏｌ／Ｌだった。低張性緩衝液中の１ｎｇ／ｍＬのＭ２２  Ｆａｂは、２９．８０±０．９７ｐｍｏｌ／Ｌの環状ＡＭＰ産生を刺激し、１０ｎｇ／ｍＬでは、５７．４１±５．０５ｐｍｏｌ／Ｌの環状ＡＭＰ産生を刺激した（表６ａ）。表６ａは、等張性条件下で試験された、ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞での環状ＡＭＰ刺激に対するＫ１−１８  ＩｇＧ又はＦａｂの効果も示している。表６ａの例により示されているように、Ｋ１−１８及びＫ１−７０は両方とも、等張性条件下で環状ＡＭＰ産生の増加を引き起こしたが、産生された環状ＡＭＰのレベルは、低張性条件を使用した実験と比較してより低かった。低張性緩衝液で試験されたＭ２２  ＩｇＧ及びＫ１−１８  ＩｇＧの刺激活性の比較は、表６ｂに示されている。３ｎｇ／ｍＬ濃度では、Ｍ２２  ＩｇＧは、２４．３±２．３ｐｍｏｌ／ｍＬの環状ＡＭＰを刺激し、Ｋ１−１８  ＩｇＧは、８．３±０．５ｐｍｏｌ／ｍＬの環状ＡＭＰを刺激した。１０ｎｇ／ｍＬでは、Ｍ２２  ＩｇＧ及びＫ１−１８  ＩｇＧは、それぞれ５０．３±１．６及び２５．０±１．０ｐｍｏｌ／ｍＬの環状ＡＭＰの刺激を引き起こし、１００ｎｇ／ｍＬでは、それぞれ６４．６±１．９及び６２．６±２．７ｐｍｏｌ／ｍＬの刺激を引き起こした。また、Ｋ１−１８  ＩｇＧ及びＦａｂの刺激活性を、ＮＩＢＳＣ基準調製物９０／６７２の活性と比べて評価した（表６ｃ）。Ｋ１−１８  ＩｇＧの計算された環状ＡＭＰ刺激活性は、１５５ＮＩＢＳＣ  ９０／６７２単位／ｍｇだった（３つの濃度のＫ１−１８  ＩｇＧで計算された活性の平均；１ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、及び１０ｎｇ／ｍＬ）（表６ｃ）。同じ実験の中で計算された
Ｋ１−１８  Ｆａｂの環状ＡＭＰ刺激活性は、２２ＮＩＢＳＣ  ９０／６７２単位／ｍｇであった（１０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、及び１００ｎｇ／ｍＬのＫ１−１８  Ｆａｂでの活性を使用して計算した）（表６ｃ）。これは、２８６ＮＩＢＳＣ単位／ｍｇのＭ２２  ＩｇＧ環状ＡＭＰ刺激活性と比較することができる（表６ｃ）。比較のために、等張性及び低張性緩衝液中での、ブタＴＳＨ、天然ヒトＴＳＨ、及び組換えヒトＴＳＨの刺激活性が、表６ｄに示されている。
【００７５】
表６ｅに示されている更なる例は、様々な組合せで一緒に混合された場合のＫ１−１８
ＩｇＧ、Ｍ２２  ＩｇＧ、又はｐＴＳＨの刺激効果に関する。ｐＴＳＨ、Ｍ２２、又はＫ１−１８の刺激効果は、同じ濃度の刺激物質単独の効果と比較して、２つの刺激物質が一緒に混合された場合、増強されると考えられる。特に、０．１ｎｇ／ｍＬのｐＴＳＨ単独での１１．０１±０．９９ｐｍｏｌ／ｍＬ（平均±ＳＤ）の環状ＡＭＰ産生、及び１ｎｇ／ｍＬのＭ２２  ＩｇＧでの３５．１７±６．３８ｐｍｏｌ／ｍＬ（平均±ＳＤ）の環状ＡＭＰ産生は、０．１ｎｇ／ｍＬのｐＴＳＨ及び１ｎｇ／ｍＬのＭ２２  ＩｇＧが一緒に混合された場合、４７．２２±３．８９ｐｍｏｌ／ｍＬ（平均±ＳＤ）に増加した。また、０．１ｎｇ／ｍＬのｐＴＳＨ及び１０ｎｇ／ｍＬのＫ１−１８  ＩｇＧの混合物は、これら刺激物質単独よりも大きな刺激効果を示した（表６ｅ）。更に、一緒に混合された２つの刺激抗体は、同じ濃度の単一の抗体よりも強力だった。例えば、５ｎｇ／ｍＬのＫ１−１８  ＩｇＧに応答して、２９．９５±１．１８ｐｍｏｌ／ｍＬ（平均±ＳＤ）の環状ＡＭＰが産生され、０．５ｎｇ／ｍＬのＭ２２  ＩｇＧに応答して、２０．２０±２．４８ｐｍｏｌ／ｍＬ（平均±ＳＤ）が産生された一方で、一緒に混合された５ｎｇ／ｍＬのＫ１−１８及び０．５ｎｇ／ｍＬのＭ２２に応答して、４４．０１±７．１９ｐｍｏｌ／ｍＬ（平均±ＳＤ）の環状ＡＭＰが産生された（表６ｅ）。
【００７６】
Ｋ１−１８及びＫ１−７０供与体血清並びに供与体血清ＩｇＧが環状ＡＭＰを刺激する能力を、ＮＩＢＳＣ  ９０／６７２の刺激活性と比較した２つの実験の結果は、表６ｆ及び６ｇ示されている。実験１では、供与体血清の刺激活性は、３０倍希釈での１．７±０．４ｐｍｏｌ／ｍＬのＨＢＤ血清の効果と比較して、同じ希釈で４．７±０．１ｐｍｏｌ／ｍＬの環状ＡＭＰであり、一方で供与体血清ＩｇＧの刺激活性は、３０μｇ／ｍＬで７．７±１．０ｐｍｏｌ／ｍＬであり、これは０．０１３単位／ｍｇのＮＩＢＳＣ  ９０／６７２と比べた活性を表していた（表６ｆ）。実験２では、３０倍希釈の供与体血清は、９．５±０．７ｐｍｏｌ／ｍＬまでの環状ＡＭＰの刺激を引き起こし、その一方で３０μｇ／ｍＬの供与体血清ＩｇＧは、１５．６±０．７ｐｍｏｌ／ｍＬまでの刺激を引き起こし、これは０．０１４単位／ｍｇのＮＩＢＳＣ  ９０／６７２と比べた活性を表していた（表６ｇ）。Ｋ１−１８  ＩｇＧ  ＴＳＨＲ刺激活性は、表６ｈに示されている例により示されるように、ＴＳＨアンタゴニスト活性（Ｋ１−７０及び５Ｃ９）を有するヒトＭＡｂにより阻害された。特に、１０ｎｇ／ｍＬのＫ１−１８  ＩｇＧは、５０．０±３．３ｐｍｏｌ／ｍＬまでの環状ＡＭＰの刺激を引き起こし、これは、０．１μｇ／ｍＬのＫ１−７０  ＩｇＧの存在下では、３．８±１．０ｐｍｏｌ／ｍＬに低減された（９２％阻害）。１０ｎｇ／ｍＬのＫ１−１８  ＩｇＧ及び０．１μｇ／ｍＬの５Ｃ９  ＩｇＧの存在下では、環状ＡＭＰレベルは、４．４±１．５ｐｍｏｌ／ｍＬだった（９１％阻害）。より高い濃度のＫ１−７０  ＩｇＧ又は５Ｃ９  ＩｇＧでは、阻害効果は完全だった（１００％阻害）（表６ｈ）。更なる実験では、Ｋ１−１８  ＩｇＧの刺激活性に対する、５Ｃ９  ＩｇＧと一緒に混合されたＫ１−７０  ＩｇＧの効果を研究した（表６ｉ）。表６ｉに示されているように、１０ｎｇ／ｍＬでのＫ１−１８  ＩｇＧ刺激は、０．１μｇ／ｍＬの５Ｃ９  ＩｇＧ又は０．１μｇ／ｍＬのＫ１−７０  ＩｇＧにより効果的に阻害された。Ｋ１−７０  ＩｇＧ及び５Ｃ９  ＩｇＧを混合して、最終総濃度を０．１μｇ／ｍＬにした場合も、Ｋ１−１８  ＩｇＧの刺激活性が効果的に阻害された（９７．３％阻害）。しかしながら、より低濃度では、一緒に混合された場合、Ｋ１−７０  ＩｇＧ及び５Ｃ９  ＩｇＧは、１つの抗体単独よりも効果的なＫ１−１８  ＩｇＧ刺激活性の阻害物質だ
った。例えば、０．００１μｇ／ｍＬでは、Ｋ１−７０  ＩｇＧ及び５Ｃ９  ＩｇＧは個々には、阻害を引き起こさなかったが（それぞれ０％及び１％）、一緒に混合して同じ終濃度の総ＩｇＧ（つまり、０．００１μｇ／ｍＬ）にした場合、阻害は２５．５％だった。また表６ｉは、Ｋ１−７０  ＩｇＧ（１００μｇ／ｍＬ）の存在下での環状ＡＭＰ濃度が、アッセイ緩衝液の存在下で観察された濃度と同様であり、一方で５Ｃ９  ＩｇＧ（１００μｇ／ｍＬ）の存在下での環状ＡＭＰの濃度は、より低かった（それぞれ０．８９±０．１３、０．８９±０．１５、及び０．５５±０．１４）（三重重複測定での平均±ＳＤ）ことを示した。Ｋ１−７０  ＩｇＧ及び５Ｃ９  ＩｇＧを一緒に混合した場合（１００μｇ／ｍＬの終濃度の総ＩｇＧ）、環状ＡＭＰ濃度は、緩衝液の存在下で観察されたレベル未満には低減されなかった（つまり、基礎又は構成的活性レベルより低くはない）。比較して、Ｍ２２  ＩｇＧ（３ｎｇ／ｍＬ）刺激活性の本質的に完全な阻害は、１μｇ／ｍＬの５Ｃ９  ＩｇＧ又は１μｇ／ｍＬのＫ１−７０  ＩｇＧで観察され（それぞれ、９７．１％及び９６．６％阻害）、０．１μｇ／ｍＬの５Ｃ９  ＩｇＧ又は０．１μｇ／ｍＬのＫ１−７０  ＩｇＧでの阻害は、それぞれ９２．８％及び７５．５％だった（表６ｊ）。しかしながら、５Ｃ９及びＫ１−７０を一緒に混合して、０．１μｇ／ｍＬの最終総ＩｇＧ濃度にした場合、９１．９％阻害が観察された（表６ｊ）。Ｋ１−１８  ＩｇＧ刺激活性に対する、Ｋ１−７０  ＩｇＧ及び９Ｄ３３  ＩｇＧ混合物の効果は、表６ｋに示されている。９Ｄ３３  ＩｇＧの場合は、１μｇ／ｍＬで９５％阻害が観察されたが、Ｋ１−７０  ＩｇＧは０．１μｇ／ｍＬで同じ阻害（９５％阻害）を示した。しかしながら、２つの阻止性ＭＡｂ（９Ｄ３３及びＫ１−７０）を一緒に混合して、０．１μｇ／ｍＬの最終総ＩｇＧ濃度にした場合も、９５％阻害が観察された（表６ｋ）。９Ｄ３３  ＩｇＧは、１０μｇ／ｍＬでＭ２２  ＩｇＧ環状ＡＭＰ刺激を本質的に完全に阻害することができたが（９４％阻害）、Ｋ１−７０  ＩｇＧ（１μｇ／ｍＬ）は、より低い濃度で同様の効果（９６％阻害）を示した（表６ｌ）。Ｍ２２活性の本質的に完全な阻害は（９６％の阻害）は、１μｇ／ｍＬの９Ｄ３３及びＫ１−７０混合物で明白だった（表６ｌ）。これは、ＴＳＨ刺激活性に対する９Ｄ３３及びＫ１−７０混合物（１μｇ／ｍＬ）の阻害効果と同等である（９７％阻害）（表６ｍ）。しかしながら、ＴＳＨ刺激活性は、９Ｄ３３
ＩｇＧ単独（１００μｇ／ｍＬで９５％阻害）によるよりも、Ｋ１−７０  ＩｇＧ単独（１μｇ／ｍＬで９８％阻害）によって、より効果的に阻害されたことは注目されるべきである（表６ｍ）。表６ｎは、ＴＳＨ、Ｍ２２  ＩｇＧ、及びＫ１−１８  ＩｇＧのＴＳＨＲ刺激活性に対する、リンパ球供与体血清及び阻止活性を有するＴＲＡｂを含有する３つの患者血清（Ｂ１〜Ｂ３）の効果を示す。供与体血清は、ＴＳＨ、Ｍ２２  ＩｇＧ、及びＫ１−１８  ＩｇＧ刺激活性を阻害した（それぞれ、６３．８％、８０．１％、及び７９．５％阻害）。ＴＳＨ及びＭ２２  ＩｇＧ刺激に対する強力な阻害効果を示した阻止性ＴＲＡｂを有する３つの異なる血清も、Ｋ１−１８  ＩｇＧの刺激活性を阻害した（表６ｎ）。ＴＳＨ、Ｍ２２  ＩｇＧ、又はＫ１−１８  ＩｇＧの刺激活性に対する、これら異なる患者血清の阻害効果は同等だった。
【００７７】
アンタゴニスト（阻止）活性の測定
ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞を３ｎｇ／ｍＬのブタＴＳＨと共にインキュベーションすることにより、６２．６±３．９ｐｍｏｌ／ｍＬまでの環状ＡＭＰ産生の刺激が引き起こされた（表７ａ）。増加する量のＫ１−７０  ＩｇＧの存在下では、ブタＴＳＨの刺激活性は、用量依存的な様式で阻害された。特に、０．０１、０．０５、０．１、及び１μｇ／ｍＬのＫ１−７０  ＩｇＧの存在下では、環状ＡＭＰのレベルは、それぞれ６０．１±１．６、３１．４±１．９、５．８±２．８、及び２．０±０．２ｐｍｏｌ／ｍＬであり、これは、対照ＭＡｂ  ＩｇＧ（５Ｂ３）の効果と比べて、それぞれ４．０％、４９．８％、９０．７％、及び９６．８％阻害に相当する（表７ａ）。表７ａは、比較のため、５Ｃ９  ＩｇＧの阻害効果も示す。２つの異なる実験条件下におけるブタＴＳＨの刺激活性に対するＫ１−７０  Ｆａｂの効果は、表７ｂに示されている。１μｇ／ｍＬのＫ１−７０  Ｆａｂの存在下では、ブタＴＳＨ刺激活性は、両条件下で（つまり、等張性培地中
及び低張性培地中で）本質的に完全に阻害された。Ｋ１−７０  Ｆａｂの効果は、研究された濃度範囲（０．００３μｇ／ｍＬ〜３μｇ／ｍＬ）で用量依存的であり、わずか０．０５μｇ／ｍＬのＦａｂが、１μｇ／ｍＬの対照ＭＡｂの存在下で（等張性条件下で）、ブタＴＳＨ刺激を３９．５±１．９  ｐｍｏｌ／ｍＬから２８．９±１．１ｐｍｏｌ／ｍＬの環状ＡＭＰへと低減する能力を示した（表７ｂ）。低張性条件下でのＫ１−７０  Ｆａｂの効力は、等張性条件下で観察された効力に類似していた（表７ｂ）。Ｋ１−７０  ＩｇＧは、濃度を増加させても（０．００１〜１００μｇ／ｍＬの範囲）、表７ｃに示されている例により示されているように、ＴＳＨＲの構成的（基礎）活性を阻害するいかなる能力も示さなかった。これは、比較のために表７ｃで示されているように、５Ｃ９  ＩｇＧの効果とは対照的である。同じ実験で試験された阻止性マウス抗体９Ｄ３３は、ＴＳＨＲ構成的活性に影響を及ぼす能力を示さず（表７ｃ）、いくらか弱い刺激活性（基礎活性の約２倍）が、高濃度の９Ｄ３３で観察された。
【００７８】
Ｋ１−７０  ＩｇＧの阻止活性を、表７ｄに示されているように、リンパ球供与体血清の阻止活性と比較した。１ｎｇ／ｍＬのブタＴＳＨと共にインキュベーションした後の環状ＡＭＰレベルは、６１．７±４．３ｐｍｏｌ／ｍＬであり、このレベルは、供与体血清（１０倍希釈）の存在下では、１４．９±１．２ｐｍｏｌ／ｍＬ（７５．９％阻害）に低下し、２０倍希釈の血清では５１．６±２．６ｐｍｏｌ／ｍＬに低下した（１６．４％阻害）。より高い希釈の供与体血清は、ＴＳＨ刺激活性に対して検出可能な効果を示さなかった。供与体血清の効果は、０．１μｇ／ｍＬで１０倍希釈血清と同様の効果を示したＫ１−７０  ＩｇＧの効果と比較することができる（それぞれ、６７．６％及び７５．９％阻害）（表７ｄ）。Ｋ１−７０  ＩｇＧは、表７ｅの例により示されるように、ブタＴＳＨ、ヒトＴＳＨ、及びヒト組換えＴＳＨの環状ＡＭＰ刺激活性を阻止する能力を示した。０．１μｇ／ｍＬのＫ１−７０  ＩｇＧは、低張性培地条件下で試験された３つのＴＳＨ調製物全ての刺激活性の効果的な阻止物質だった。Ｋ１−７０  ＩｇＧの阻止活性は、等張性培地条件下ではそれほど効果的ではなかった（表７ｅ）。ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞での環状ＡＭＰ産生のＭ２２  ＩｇＧ媒介性刺激に対するＫ１−７０  ＩｇＧの効果は、表７ｆに示されている。３ｎｇ／ｍＬのＭ２２  ＩｇＧで観察された環状ＡＭＰレベルは、３３．１±１．８ｐｍｏｌ／ｍＬであり、これらは、Ｋ１−７０  ＩｇＧの存在下では、例えば、０．１μｇ／ｍＬで４．３±２．４ｐｍｏｌ／ｍＬに減少した（８７％阻害）（表７ｆ）。Ｋ１−７０  ＩｇＧの効果は、同じ実験で試験された５Ｃ９  ＩｇＧの効果と同等であった（表７ｆ）。更に、Ｋ１−７０  ＩｇＧは、グレーブス病の患者に由来する血清中でＴＲＡｂの環状ＡＭＰ刺激活性を阻止する能力を示し、表７ｇ〜７ｋの例は、１００μｇ／ｍＬ濃度のＫ１−７０  ＩｇＧが、研究された１５個の血清全てで刺激活性の完全な阻害を引き起こしたことを示す（Ｔ１〜Ｔ１５の阻害は９０．８％〜９８．７％の範囲だった）。血清Ｔ１〜Ｔ１５の刺激活性に対するＫ１−７０  ＩｇＧの効果は、１つの血清、つまり、Ｔ１１を除いて、同じ実験で試験された５Ｃ９  ＩｇＧ及び９Ｄ３３  ＩｇＧの効果と同等であった（表７ｊ）。血清Ｔ１１の刺激活性は、１００μｇ／ｍＬの５Ｃ９  ＩｇＧによりごく弱く阻害されたが（８．５％阻害）、１００μｇ／ｍＬのＫ１−７０の存在下では、阻害は本質的に完全だった（９５．１％阻害）（表７ｊ）。Ｔ１１の効果的な阻害（８７．１％）は、１００μｇ／ｍＬの９Ｄ３３でも観察された（表７ｊ）。３つのグレーブス病血清（血清Ｔ１１を含む）の刺激活性に対する、様々な濃度（０．０１〜１００μｇ／ｍＬ）の様々な阻止性ＭＡｂの効果は、表７ｌ〜７ｎに、より詳細に示されている。これら実験は、５Ｃ９  ＩｇＧが効果をほとんど又は全く示さなかった血清Ｔ１１の場合を除いて、Ｋ１−７０  ＩｇＧ、５Ｃ９  ＩｇＧ、及び９Ｄ３３
ＩｇＧが、ほんの０．１μｇ／ｍＬの低濃度で効果的な阻害物質であることを示した（表７ｎ）。表７ｏは、Ｋ１−７０  ＩｇＧ及び５Ｃ９  ＩｇＧが１つの実験で一緒に混合された場合、ブタＴＳＨ刺激が、この２つの阻止性ＭＡｂにより阻害されることを示す。これら実験により、この２つの阻止性ＭＡｂは、環状ＡＭＰ産生のＴＳＨ刺激を阻害するそれらの能力を組み合わせると効果的だったことが示された。加えて、ＴＳＨＲ構成的活
性に対する、一緒に混合されたＫ１−７０  ＩｇＧ及び５Ｃ９  ＩｇＧの効果を試験した。表７ｃ及び７ｐに示されているように、Ｋ１−７０  ＩｇＧは、５Ｃ９  ＩｇＧとは対照的にＴＳＨＲの基礎活性に効果を示さなかった。Ｋ１−７０及び５Ｃ９  ＩｇＧを一緒に混合して、２μｇ／ｍＬの最終ＩｇＧ濃度にすると、環状ＡＭＰレベルは、緩衝液のみが存在する場合の５８．０４±８．５２ｐｍｏｌ／ｍＬ（平均±ＳＤ、ｎ＝３）から、５５．２８±６．１７ｐｍｏｌ／ｍＬ（平均±ＳＤ、ｎ＝３）へとわずかに低下し、つまり４．８％阻害だった（表７ｐ）。しかしながら、５Ｃ９  ＩｇＧを５Ｂ３  ＩｇＧ（グルタミン酸デカルボキシラーゼに対する対照抗体）と混合して、２μｇ／ｍＬの最終ＩｇＧ濃度にすると、ＴＳＨＲ構成的活性は、基礎値の５２．１％にまで阻害された（環状ＡＭＰレベル  ２７．７８±２．９６ｐｍｏｌ／ｍＬ；平均±ＳＤ、ｎ＝３）（表７ｐ）。これら実験により、Ｋ１−７０  ＩｇＧの存在下では、５Ｃ９  ＩｇＧは、ＴＳＨＲ構成的活性の効果的な阻害物質として作用することができないことが示される。
【００７９】
Ｋ１−１８刺激活性に対するＴＳＨＲ突然変異の効果
環状ＡＭＰ産生の刺激に対するＫ１−１８  ＩｇＧの効果を、以下のアミノ酸突然変異を有するＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞を使用して試験した：Ｌｙｓ５８Ａｌａ、Ａｒｇ８０Ａｌａ、Ｔｙｒ８２Ａｌａ、Ｇｌｕ１０７Ａｌａ、Ａｒｇ１０９Ａｌａ、Ｌｙｓ１２９Ａｌａ、Ｐｈｅ１３０Ａｌａ、Ｐｈｅ１３４Ａｌａ、Ｌｙｓ１８３Ａｌａ、Ａｓｐ２０３Ａｌａ、Ａｒｇ２５５Ａｓｐ（表８ａ〜ｋ、及び表１０の要約）。ＴＳＨＲアミノ酸Ｌｙｓ５８、Ａｒｇ８０、Ｔｙｒ８２、Ｇｌｕ１０７、Ａｒｇ１０９、Ｌｙｓ１２９、Ｐｈｅ１３０、Ｐｈｅ１３４、及びＡｓｐ２０３のアラニンへの突然変異は、環状ＡＭＰ産生を刺激するＫ１−１８  ＩｇＧの能力に効果を示さなかった。環状ＡＭＰ産生を刺激するＫ−１８  ＩｇＧの能力は、突然変異Ｌｙｓ１８３Ａｌａ及びＡｒｇ２５５Ａｓｐを含有するＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞で完全に失われ、Ｋ１−１８  ＩｇＧに応答した環状ＡＭＰ濃度は、環状ＡＭＰ緩衝液のみの存在下で観察された濃度と同様であった（表８ｉ及び８ｋ）。しかしながら、ＴＳＨに対する応答性は、Ｌｙｓ１８３Ａｌａ及びＡｒｇ２５５Ａｓｐ突然変異で保持された。更なる一連の実験で、Ｋ１−１８  ＩｇＧ環状ＡＭＰ刺激活性に対する、ＴＳＨＲの種々のアミノ酸の突然変異の効果を更に試験した（表１４ａ〜１４ｖ、及び表１６の要約）。ＴＳＨＲ残基Ａｓｐ４３、Ｉｌｅ６０、Ｇｌｕ６１、Ｔｈｒ１０４、Ｈｉｓ１０５、Ｌｙｓ２５０、Ａｒｇ２５５、Ｔｈｒ２５７、Ａｓｐ２７６、Ｓｅｒ２８１の突然変異（アラニンへの）は、環状ＡＭＰ産生を刺激するＫ１−１８
ＩｇＧの能力に効果を示さなかった。ＴＳＨＲ  Ａｓｐ１５１、Ｇｌｕ１７８、Ｌｙｓ２０９、Ｇｌｎ２３５、Ｇｌｕ２５１のアラニンへの突然変異は、Ｋ１−１８  ＩｇＧ刺激活性の小さな低減を引き起こしたが、これら突然変異は、ＴＳＨ刺激活性にも効果を示し、従ってこれらＴＳＨＲ残基との相互作用は、Ｋ１−１８に特異的であるとは見なされなかった。対照的に、ＴＳＨＲ  Ｇｌｕ１５７Ａｌａ、Ｌｙｓ１８３Ａｓｐ、Ｔｙｒ１８５Ａｌａ、及びＡｓｐ２３２Ａｌａの突然変異は、環状ＡＭＰを刺激するＫ１−１８  ＩｇＧの能力の喪失もたらした（野生型活性の２０％未満；表１４ｇ、１４ｉ、１４ｊ、１４ｍ）。更に、Ｔｙｒ２０６、Ｔｒｐ２５８、及びＡｒｇ２７４がアラニンに突然変異されたＴＳＨＲを刺激するＫ１−１８  ＩｇＧの能力は、野生型活性のおよそ４０〜６０％に低減された（表１４ｋ、１４ｓ、１４ｔ）。
【００８０】
Ｋ１−７０阻止活性に対するＴＳＨＲ突然変異の効果
環状ＡＭＰ産生のＴＳＨ刺激に対するＫ１−７０  ＩｇＧの効果を、以下のアミノ酸のアラニンへの突然変異を有するＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞を使用して試験した：Ｌｙｓ５８、Ａｒｇ８０、Ｔｙｒ８２、Ｇｌｕ１０７、Ａｒｇ１０９、Ｌｙｓ１２９、Ｐｈｅ１３０、Ｐｈｅ１３４、Ｌｙｓ１８３、及びＡｓｐ２０３。加えて、ＴＳＨＲ突然変異Ａｒｇ２５５Ａｓｐの効果を試験した。（表９ａ〜ｋ、及び表１０の要約）。ＴＳＨＲアミノ酸Ａｒｇ８０、Ｇｌｕ１０７、Ｌｙｓ１２９、Ｐｈｅ１３０、Ｐｈｅ１３４、及びＡｓｐ２０３のアラニンへの突然変異は、ＴＳＨ刺激性環状ＡＭＰ産生を阻害するＫ１−７０
ＩｇＧの能力に効果を示さなかった。ＴＳＨ刺激性環状ＡＭＰ産生を阻害するＫ１−７０の能力は、ＴＳＨＲ  Ｌｙｓ５８、Ｔｙｒ８２、Ａｒｇ１０９、及びＬｙｓ１８３のアラニンへの突然変異により低減された。突然変異Ｌｙｓ５８Ａｌａが、最も大きな効果を示し（表９ａ）、Ａｒｇ１０９Ａｌａ、Ｌｙｓ１８３Ａｌａと続き、Ｔｙｒ８２Ａｌａが最も小さな効果を示した（それぞれ、表９ｅ、９ｉ、９ｃ、及び表１０）。しかしながら、研究された突然変異はいずれも、ＴＳＨ刺激性環状ＡＭＰ産生を阻止するＫ１−７０  ＩｇＧの能力の完全な喪失を引き起こさなかった。更なる一連の実験で、Ｋ１−７０  ＩｇＧ阻止活性に対する、ＴＳＨＲの種々のアミノ酸の突然変異の効果を更に試験した（表１５ａ〜１５ｖ、及び表１６の要約）。ＴＳＨＲで形質移入されたＣＨＯ細胞でのＴＳＨ刺激性環状ＡＭＰ産生を阻害するＫ１−７０の能力は、ＴＳＨＲ  Ａｓｐ４３、Ｔｈｒ１０４、Ｈｉｓ１０５、Ａｓｐ１５１、Ｔｙｒ１８５、Ｔｙｒ２０６、Ｌｙｓ２０９、Ａｓｐ２３２、Ｇｌｎ２３５、Ｇｌｕ２５１、Ａｒｇ２５５、Ｔｈｒ２５７、Ｔｒｐ２５８、及びＡｒｇ２７４のアラニンへの突然変異でも、突然変異Ａｓｐ１６０Ｌｙｓ及びＬｙｓ１８３Ａｓｐでも影響を受けなかった。ＴＳＨＲ  Ｇｌｕ１７８及びＳｅｒ２８１の突然変異（アラニンへの）は、ＴＳＨの刺激活性を阻止するＫ１−７０  ＩｇＧに能力に小さな効果を示した（野生型活性の８０〜１００％；表１５ｈ及び１５ｖ）。ＴＳＨＲ  Ｇｌｕ６１、Ｌｙｓ２５０、及びＡｓｐ２７６のアラニンへの突然変異は、Ｋ１−７０  ＩｇＧ阻止活性に対してある程度の効果を引き起こし（野生型の６０〜８０％）（表１５ｃ、１５ｏ、１５ｕ）、ＴＳＨＲ突然変異Ｉｌｅ６０Ａｌａは、野生型活性の４０〜６０％までのＫ１−７０  ＩｇＧ阻止活性の低減を引き起こした（表１５ｂ）。
【００８１】
ＴＳＨＲに対する125Ｉ標識Ｋ１−７０  ＩｇＧ又はＦａｂ結合の阻害
ＴＳＨＲ被覆チューブに対する125Ｉ−Ｋ１−７０  ＩｇＧの結合は、未標識Ｋ１−７
０  ＩｇＧにより用量依存的な様式で阻害され、０．００３μｇ／ｍＬ、０．０３μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、及び３μｇ／ｍＬの濃度（ＨＢＤ血清で希釈）で、阻害は、それぞれ１０．２±２．４％、３６．５±１．９％、８４．４±０．８％、及び９２．０±０．５％であった（表１１ａ）。表１１ａに示されているように、125Ｉ−Ｋ１−７Ｏ  
ＩｇＧの結合は、Ｍ２２  ＩｇＧ（ＨＢＤ血清で希釈）によって非常に類意した様式で阻害され、０．００３μｇ／ｍＬ、０．０３μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、及び３μｇ／ｍＬ濃度で６．２％（二重重複測定の平均）、３３．８±０．９％、８４．６±１．１％、及び９１．６±０．５％阻害であった。Ｍ２２  Ｆａｂは、より低濃度で125Ｉ−Ｋ１
−７Ｏ  ＩｇＧ結合を阻害するより大きな効力を示し、０．００３μｇ／ｍＬ、０．０３μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、及び３μｇ／ｍＬ濃度（ＨＢＤ血清中）で、１６．７±６．０％、６０．２±１．８％、８９．９±０１％、及び９２．０±０．３％阻害であった（表１１ａ）。また、Ｋ１−１８  ＩｇＧ及びＦａｂは、用量依存的な様式でＴＳＨＲに対する125Ｉ−Ｋ１−７０  ＩｇＧ結合を阻害した（表１１ｂ）。０．０３μｇ／ｍＬ
、０．３μｇ／ｍＬ、及び３μｇ／ｍＬ（ＨＢＤ血清中）のＫ１−１８  ＩｇＧの希釈物は、それぞれ２０．０±１．９％、７３．９±０．６％、及び９１．０の±０．３％阻害を示し、０．０３μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、及び３μｇ／ｍＬ（ＨＢＤ血清中）のＫ１−１８  Ｆａｂは、それぞれ１０．２±２．１％、６０．９±１．１％、及び８０．５±０．６％阻害を示した（表１１ｂ）。対照的に、より高い濃度の５Ｃ９  ＩｇＧが、125Ｉ−Ｋ１−７０  ＩｇＧ結合の阻害に必要とされ、１５．４±３．４％阻害には１μ
ｇ／ｍＬが必要とされ、１００μｇ／ｍＬは、６８．５±０．７％阻害を示した（表１１ａ）。また、表１１ａ及び１１ｂは、アッセイ緩衝液中で、125Ｉ−Ｋ１−７０結合に対
する種々のヒトＭＡｂの効果を示す。効果は、希釈物をアッセイ緩衝で製作した場合、ＨＢＤ血清と比較してより強力である。ＴＳＨＲへの125Ｉ−Ｋ１−７Ｏ  ＩｇＧ結合に対
するＴＳＨＲ刺激活性（ＴＳＭＡｂ  １〜７）及びＴＳＨＲ阻止活性（９Ｄ３３）を有するＴＳＨＲに対する様々なマウスモノクローナル抗体の効果は、表１１ｃに示されている。試験したＴＳＭＡｂは全て、125Ｉ−Ｋ１−７０  ＩｇＧ結合を阻害する能力を示し、
１００μｇ／ｍＬ濃度（ＨＢＤ血清中）は、３３．５±３．７％（ＴＳＭＡｂ  ３）〜５
９．６±０．６％（ＴＳＭＡｂ  ５）の範囲の阻害を引き起こした（表１１ｃ）。１００μｇ／ｍＬ（ＨＢＤ血清中）の９Ｄ３３  ＩｇＧは、５１．１±１．７％阻害を示した（表１１ｃ）。これらＭＡｂをアッセイ緩衝液で希釈した場合、阻害％は、ＨＢＤ血清と比較して、ある場合にはわずかにより高く、他の場合にはわずかにより低かった（表１１ｃ）。更なる実験により、ＴＳＨＲに対する125Ｉ−ｋ１−７０  Ｆａｂ結合も、Ｋ１−１
８  ＩｇＧ、Ｋ１−１８  Ｆａｂ、Ｍ２２  ＩｇＧ、Ｍ２２  Ｆａｂ、Ｋ１−７０  ＩｇＧ、Ｋ１−７０  Ｆａｂ、及びマウスＴＳＭＡｂにより、用量依存的な様式で効果的に阻害されたことが示された（表１１ｄ）。１５．９％〜８０．０％の範囲の125Ｉ−ＴＳＨ
結合阻害活性を有する（ＴＳＨＲ被覆チューブアッセイで）ＴＳＨＲ自己抗体を含有するグレーブス病患者血清（ｎ＝２０）も、ＴＳＨＲに対する125Ｉ−Ｋ１−７０  ＩｇＧ又
はＦａｂ結合を阻害する能力を示した（それぞれ、１９．２％〜７７．６％及び、１５．９％〜７２．８％の範囲）（表１１ｅ）。試験された３つの未標識リガンドの阻害％は、各血清の場合、同等だった（表１１ｅ）。ＨＢＤ血清（ｎ＝１０）はいずれも、125Ｉ標
識ＴＳＨ、Ｋ１−７０  ＩｇＧ又はＦａｂ結合に効果を示さなかった（表１１ｅ）。表１１ｅは、ＴＳＨＲ刺激活性を有する２つの血清（Ｓ１及びＳ２）、及びＴＳＨＲ阻止活性を有する２つの血清（Ｂ１及びＢ２）を使用した実験の例を示す。いずれのタイプの活性を有する血清も、125Ｉ標識ＴＳＨ、Ｋ１−７０  ＩｇＧ又はＦａｂを用量依存的な様式
で阻害し、様々なリガンドの結合を阻害する度合いは、各血清で同等であった（表１１ｅ）。
【００８２】
ＴＳＨＲに対するＫ１−１８及びＫ１−７０結合の動力学
ＴＳＨＲ（全長）被覆チューブに対する125Ｉ標識Ｋ１−７０  ＩｇＧ及びＦａｂの結
合は、室温で、１８０分後に最大に達した（それぞれ、４５．５％及び３７．１％結合）。５０％最大結合は、約３５分後に生じた（図１ａ）。ＴＳＨＲ２６０被覆チューブに対する125Ｉ標識Ｋ１−７０  ＩｇＧ結合は、１８０分で３６．２％達し、５０％最大結合
は、６０分間のインキュベーション後に観察された（図１ｂ）。ＴＳＨＲ２６０に対する125Ｉ標識Ｋ１−７０  Ｆａｂ結合の時間的経過は、Ｋ１−７０  ＩｇＧで観察された経
過と同様であり、６０分間のインキュベーション後に３７．３％の最大結合、およそ６０分後に５０％最大結合であった（図１ｃ）。未標識Ｋ１−７０  ＩｇＧ若しくはＦａｂ、Ｋ１−１８  ＩｇＧ若しくはＦａｂ、Ｍ２２  ＩｇＧ（全て１ｍｇ／ｍＬ）、ブタＴＳＨ（１００ｍＵ／ｍＬ）、又はアッセイ緩衝液を、ＴＳＨＲ（全長）被覆チューブに結合した125Ｉ−Ｋ１−７０  ＩｇＧ又は125Ｉ−Ｋ１−７０  Ｆａｂのいずれかに添加することでは、１８０分間インキュベーションした後でさえ、検出可能な解離がもたらされなかった（図１ｄ、１ｅ、及び１ｆ）。しかしながら、未標識Ｍ２２  Ｆａｂ（１ｍｇ／ｍＬ）を、ＴＳＨＲ被覆チューブに結合した125Ｉ−Ｋ１−７０  ＩｇＧ又は125Ｉ−Ｋ１−７０
Ｆａｂに添加した後では、それぞれ、結合時の計数の４１．２％及び２７．９％が、１８０分のインキュベーション後に解離した（図１ｄ及び１ｆ）。ＴＳＨＲ２６０に結合した125Ｉ標識Ｋ１−７０  ＩｇＧに対する、種々の未標識リガンドの解離効果は、図１ｇ
に示されている。ブタＴＳＨ、Ｍ２２  ＩｇＧ、及びＫ１−１８  ＩｇＧは効果を示さなかったが、Ｍ２２  Ｆａｂ及びＫ１−７０  Ｆａｂは、３０分間のインキュベーション後に、結合した125Ｉ標識Ｋ１−７０  ＩｇＧのおよそ３０％をＴＳＨＲ２６０から解離さ
せ、その後解離は、更に最長１８０分間は増加しなかった（図１ｇ）。Ｋ１−１８  Ｆａｂは、図１ｈに示されているように、同様の効果を示した。ＴＳＨＲ２６０被膜チューブに対する125Ｉ−Ｋ１−７０  Ｆａｂ結合は、未標識Ｋ１−７０  ＩｇＧ、Ｋ１−１８  
ＩｇＧ、Ｍ２２  ＩｇＧ（全て１ｍｇ／ｍＬ）、ブタＴＳＨ（１００ｍＵ／ｍＬ）、又はアッセイ緩衝液と共にインキュベーションすることでは解離されなかった。未標識Ｍ２２
Ｆａｂ又はＫ１−７０  Ｆａｂ（１ｍｇ／ｍＬ）とのインキュベーションは、ＴＳＨＲ２６０に対する125Ｉ−Ｋ１−７０  Ｆａｂ結合の解離を引き起こした（それぞれ、５８
．９％及び６２％）（図１ｉ）。ＴＳＨＲ被覆チューブに対する125Ｉ標識Ｋ１−１８  
ＩｇＧの結合は、室温で１８０分後に、全長ＴＳＨＲで被覆したチューブの場合は、３２
．７％の最大値に達し、ＴＳＨＲ２６０で被覆したチューブの場合には２３．３％に達した（図１ｊ）。５０％最大結合は、全長ＴＳＨＲの場合は、およそ４５分後に、ＴＳＨＲ２６０の場合は、およそ５０分後に観察された（図１ｊ）。全長ＴＳＨＲ被覆チューブに結合した125Ｉ標識Ｋ１−１８  ＩｇＧは、未標識ブタＴＳＨとのインキュベーションに
よっては、わずかにしか解離されなかったが、未標識Ｋ１−１８  ＩｇＧ、Ｍ２２  ＩｇＧ、Ｋ１−７０  ＩｇＧ、Ｋ１−１８  Ｆａｂ、及びＫ１−７０  Ｆａｂとのインキュベーションは、わずかにより大きな効果を示した（１８０分後におよそ２５％解離）（図１ｋ）。対照的に、Ｍ２２  Ｆａｂは、６０分間のインキュベーション後、全長ＴＳＨＲに結合した125Ｉ−Ｋ１−１８  ＩｇＧの２９％解離を引き起こし、１８０分間のインキュ
ベーション後では、４３％解離に増加した（Ｍ２２  Ｆａｂと共に６０分間及び１８０分間インキュベーションした後のそれぞれ２４．５％及び１９．８％と比較して、Ｍ２２  Ｆａｂの非存在下では、結合した125Ｉ−Ｋ１−１８  ＩｇＧは３４．５％）（図１ｋ）
。ＴＳＨＲ２６０被覆チューブに対する125Ｉ標識Ｋ１−１８  ＩｇＧ結合の場合、ブタ
ＴＳＨとのインキュベーションは、解離効果を示さなかった（図１ｌ）。対照的に、未標識Ｍ２２  Ｆａｂ、Ｋ１−７０  Ｆａｂ、及びＫ１−１８  Ｆａｂとのインキュベーションは、結合した125Ｉ−Ｋ１−１８  ＩｇＧをＴＳＨＲ２６０から解離させた。Ｍ２２  
Ｆａｂ及びＫ１−７０  Ｆａｂの存在下での解離は迅速だったが（３０分間のインキュベーション後、およそ５０％）、Ｋ１−１８  Ｆａｂとのインキュベーションでは、５０％解離は９０分後に引き起こされた（図１ｌ）。完全Ｍ２２  ＩｇＧ、Ｋ１−７０  ＩｇＧ、及びＫ１−１８  ＩｇＧは、ＴＳＨＲ２６０から125Ｉ−Ｋ１−１８  ＩｇＧを解離さ
せる能力がより劣っており、１８０分間のインキュベーション後に、およそ３０％解離が観察された（図１ｌ）。別々の一連の実験では、125Ｉ標識ブタＴＳＨは、ＴＳＨＲ２６
０被覆チューブに結合できなかったことが示された。全長ＴＳＨＲで被覆されたチューブに対する125Ｉ−ＴＳＨの結合は、以前に記述されていた（Nakatake et al 2006、上記）。
【００８３】
ＴＳＨＲ２６０−ＡＰに基づくＥＬＩＳＡにおけるＫ１−１８又はＫ１−７０  ＩｇＧの効果
ＥＬＩＳＡプレートウエルに固定化された全長ＴＳＨＲと、液相中のＴＳＨＲ２６０−ＡＰとの間に「架橋」を形成するＫ１−１８  ＩｇＧの能力は、表１２ａに示されている例により示されている。ＯＤ４０５ｎｍ値は、Ｋ１−１８  ＩｇＧ（ＨＢＤ血清で希釈）濃度の増加と共に、用量依存的な様式で増加した。特に、ＯＤ４０５ｎｍ値は、ＨＢＤ血清のみが存在する場合の−０．００２のＯＤ４０５ｎｍと比較して、０．００５、０．０５、０．５、１０、及び１００μｇ／ｍＬのＫ１−１８  ＩｇＧで、それぞれ０．０１３、０．１９１、０．５１１、０．６６０、及び０．７０６だった。Ｋ１−７０  ＩｇＧ（ＨＢＤ血清で希釈）も、架橋ＥＬＩＳＡでウエルに結合し、０．００５、０．０５、０．５、１０、及び１００μｇ／ｍＬのＫ１−７０  ＩｇＧ濃度で、それぞれ０．０４５、０．２９０、０．６６１、０．７３８、及び０．７９４のＯＤ４０５ｎｍ値を示した（表１２ａ）。Ｋ１−１８及びＫ１−７０  ＩｇＧの効果は、表１２ａに示されているように、ＴＳＨＲ２６０−ＡＰ調製物に結合するＭ２２  ＩｇＧの能力と比較することができる。このアッセイでは、増加する用量のＭ２２  ＩｇＧ（０．００５μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの範囲、ＨＢＤ血清で希釈）は、増加する量のＴＳＨＲと結合し、ＯＤ４０５ｎｍ値は０．０４５〜０．７９６の範囲だった。ＭＡｂの希釈物を、ＨＢＤ血清ではなくＥＬＩＳＡアッセイ緩衝液で製作した場合、４５０ｎｍの吸光度は、特に５Ｃ９の場合により高かった（表１２ａ）。二価ＩｇＧがＴＳＨＲの２つの分子に結合する「架橋型」ＥＬＩＳＡの原理を、表１２ｂに示されている実験結果により更に検証した。ＴＳＨＲ（Ｍ２２、５Ｃ９、Ｋ１−１８、及びＫ１−７０）に対するヒトＭＡｂの完全ＩｇＧは、ＥＬＩＳＡにおいて用量依存的な結合を示したが、同じＭＡｂの一価Ｆａｂ断片は、応答をほとんど又は全く示さなかった（表１２ｂ）。マウスＴＳＭＡｂ  １〜７も、表１２ｃの例により示されているように、ＴＳＨＲ２６０−ＡＰ  ＥＬＩＳＡのウエルに結合した。ＯＤ４０
５ｎｍのシグナルは、１０μｇ／ｍＬ濃度ＴＳＭＡｂ  １〜７で、０．１０３〜０．５６１の範囲であった（表１２ｃ）。マウスＴＳＨＲ阻止性ＭＡｂ  ９Ｄ３３も、このアッセイ系で結合し、ＯＤ４０５ｎｍのシグナルは、１０μｇ／ｍＬで０．４８１だった（表１２ｄ）。刺激活性を有するＴＲＡｂを含有する患者血清、つまりＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞で環状ＡＭＰ活性を刺激する能力を示した血清は、ＴＳＨＲ２６０−ＡＰ  ＥＬＩＳＡのウエルと反応した。表１２ｅは、様々な希釈で試験された６つの異なる血清の例を示しており、ＯＤ４０５ｎｍシグナルは、ＨＢＤ血清中１／５希釈で０．４０７〜０．９２４の範囲であった。更に、阻止型ＴＳＨＲ自己抗体を有する患者由来の血清は、表１２ｆの例により示されているように、ＴＳＨＲ２６０−ＡＰ  ＥＬＩＳＡのウエルに結合し、ＯＤ４０５ｎｍシグナルは、ＨＢＤ血清中１／１０希釈で０．３２３〜０．８９６の範囲だった。表１２ｇには、ＴＳＨＲ２６０−ＡＰ  ＥＬＩＳＡにおける患者血清の結合の、より多くの例が示されている。ＴＳＨＲ２６０−ＡＰ  ＥＬＩＳＡでのＴＲＡｂ濃度は、ＮＩＢＳＣ基準調製物９０／６７２で作成した検量線から計算し、ＴＳＨＲ被覆チューブアッセイを使用して同じ血清中で測定されたＴＲＡｂ濃度と比較した（ＮＩＢＳＣ  Ｕ／Ｌとして表されている）。ＴＳＨＲ２６０−ＡＰ  ＥＬＩＳＡを使用して行われたＴＲＡｂ測定と、全長ＴＳＨＲに対するＴＳＨ結合を阻害することにより行われたＴＲＡｂ測定（被覆チューブアッセイ）との一致は全体的に良好であった（ｒ＝０．９１３、ｎ＝５７）（図２ａ）。表１２ｈは、患者血清ＴＲＡｂが、ＥＬＩＳＡプレートウエルに被覆されたＴＳＨＲ２６０に対する、ペルオキシダーゼで標識されたＭ２２  Ｆａｂの結合を阻害する能力を有することを示す。全長ＴＳＨＲに対するＭ２２  Ｆａｂ結合の阻害に基づくアッセイでのＴＲＡｂ測定値の比較は、ＴＳＨＲ２６０に対するＭ２２  Ｆａｂ結合の阻害に基づくアッセイの結果と良好に相関していた（ｒ＝０．７６１；ｎ＝５６）（図２ｂ）。他の比較データは、図２ｃ及び２ｄに示されている。抗体の結合に対するＴＳＨＲ
Ｒ２５５突然変異の効果を、ＴＳＨＲ２６０−ＡＰ  ＥＬＩＳＡで試験した。これら実験では、突然変異Ｒ２５５Ｄを含有するＴＳＨＲの全長調製物を、プレートウエルに被覆し、上述の標準的プロトコールを使用してＥＬＩＳＡを実施した。表１２ｉに示されているように、Ｋ１−７０  ＩｇＧ又は９Ｄ３３  ＩｇＧの結合は、ＴＳＨＲ  Ｒ２５５Ｄ突然変異により、ほんのわずかに影響を受けたに過ぎなかった。対照的に、Ｍ２２  ＩｇＧ結合は、ＴＳＨＲ  Ｒ２５５Ｄ突然変異により著しい影響を受け、ＯＤシグナルは、研究された全ての濃度で低減された（表１２ｉ）。ＴＳＨＲ  Ｒ２５５Ｄ突然変異は、突然変異受容体を使用したアッセイでは、より高い濃度のＫ１−１８  ＩｇＧにほとんど効果を示さなかったが、より低い濃度（０．１μｇ／ｍＬ以下）は、効果がはるかにより低かった（表１２ｉ）。また、表１２ｊは、ＴＳＨＲ  Ｒ２５５Ｄ被覆プレートを使用した場合、野生型ＴＳＨＲと比較して、１０個のグレーブス病血清（ＴＳＨＲ刺激活性又は阻止活性について選択されなかった）のＯＤ４０５ｎｍシグナルが低減されたことを示す。シグナルの低減の度合いは、異なる血清で異なっていた（表１２ｊ）。患者ＴＳＨＲ阻止性血清は、ＴＳＨＲ２６０−ＡＰ  ＥＬＩＳＡでウエルに結合し（表１２ｆ）、ＴＳＨＲ  Ｒ２５５Ｄに対する同じ血清の結合は、表１２ｋに示されている。野生型ＴＳＨＲ及びＲ２５５Ｄ突然変異ＴＳＨＲの実験におけるＯＤ４０５ｎｍシグナル値は類似しており、結果的に、阻止性血清の結合に対するＴＳＨＲ  Ｒ２５５Ｄ突然変異の効果は、このアッセイ系では明確には現れない。ＴＳＨＲ２６０−ＡＰ  ＥＬＩＳＡでの患者阻止性血清の結合に対するＲ２５５Ｄ突然変異の効果は、甲状腺刺激活性を有する患者血清の結合に対する同じ突然変異の効果と比較することができる。表１２ｌは、ＴＳＨＲ  Ｒ２５５Ｄに対する６つの刺激性血清（Ｓ１〜Ｓ６血清は、表１２ｅと同じである）の結合を示す。６つの血清全ての場合で、ＴＳＨＲ  Ｒ２５５Ｄを用いたアッセイでのＯＤ４０５ｎｍ値は、野生型ＴＳＨＲと比較してより低かった。シグナル低減の度合いは異なっており、血清Ｓ４、Ｓ５、及びＳ６（ＨＢＤ貯溜血清で１：５希釈）の場合、シグナルは、野生型ＴＳＨＲを用いた実験での０．６４６、０．４０７、及び０．５３１から、ＴＳＨＲ  Ｒ２５５Ｄを用いた実験での０．１９３、０．１３３、及び０．３４２にそれぞれ低下した（表１２ｌ）。高レベルのＴＲＡｂを有する血清の場合のＯＤ４０５ｎｍ値の低減（表１２ｅ及び
１２ｌの血清Ｓ１〜Ｓ３）は、より高い血清希釈で明らかに明白だった。例えば、血清Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３（ＨＢＤ貯留で１：２０希釈）の場合、野生型ＴＳＨＲを用いた実験での０．５８３、０．４０７、及び０．４５３のＯＤ４０５ｎｍシグナルは、ＴＳＨＲ  Ｒ２５５Ｄを用いた実験での０．１９３、０．１１７、及び０．２１０にそれぞれ明らかに低減した。表１２ｋ及び１２ｌに示されている例は、ある場合には、ＴＳＨＲ刺激活性を有する血清は、Ｒ２５５Ｄ突然変異を含有するＴＳＨＲに対する結合の差異に少なくとも基づいて、ＴＳＨＲ阻止活性を有する血清と区別することができることを示唆する。刺激活性を有する患者血清の結合は、この突然変異により影響を受ける傾向があるが、阻止活性を有する患者血清の結合には、その傾向がない。
【００８４】
様々なＴＳＨＲ調製物の温度安定性
温度安定性実験では、全長ＴＳＨＲに対するＭ２２  Ｆａｂ−ペルオキシダーゼの結合の、ＥＬＩＳＡにおけるＯＤ４５０ｎｍ値は、（ａ）−８０℃で保管された調製物（未処理）、（ｂ）室温で２４時間インキュベートした後で−８０℃に戻された調製物、（ｃ）室温で４８時間インキュベートした後で−８０℃に戻された調製物の場合、それぞれ１．７４８、０．２６８、及び０．１２６だった。結果的に、４８時間及び２４時間室温で保管された全長ＴＳＨＲ調製物は、未処理調製物と比べて、それぞれ７％及び１５％の活性しか示さなかった。Ｍ２２  Ｆａｂ−ペルオキシダーゼ結合のＯＤ４５０ｎｍ値は、未処理ＴＳＨＲ２６０の場合は２．２９３であり、２４時間及び４８時間室温で保管されたＴＳＨＲ２６０の場合は、それぞれ１．８３６及び１．６７６だった。室温で２４時間及び４８時間保管されたＴＳＨＲ２６０の活性は、未処理調製物に比べて、それぞれ８０％及び７３％だった。同様の結果は、ＴＳＨＲ２６０−ＡＰの場合に観察され、ＯＤ４５０ｎｍは、未処理試料の場合の２．３９５と比較して、室温で２４時間及び４８時間保管された試料の場合、それぞれ２．１０６及び１．９８３だった。これは、未処理ＴＳＨＲ２６０−ＡＰと比較して、２４時間及び４８時間の室温保管後では、結合活性が８８％及び８３％だったことを表した。未処理ＴＳＨＲ  ＬＲＤ  Ｃ−ＣＡＰを用いた実験では、ＯＤ４５０ｎｍは、１．８２６であり、２４時間及び４８時間の室温保管後では、それぞれ１．１５８及び１．１５５だった。ＴＳＨＲ  ＬＲＤ  Ｃ−ＣＡＰは、未処理調製物と比べて、室温で２４時間及び４８時間の保管後に６３％の活性を示した。上述の実験は、Ｍ２２に結合するＴＳＨＲ２６０、ＴＳＨＲ２６０−ＡＰ、及びＴＳＨＲ  ＬＲＤ  Ｃ−ＣＡＰの能力が、室温保管処理後に、全長ＴＳＨＲ調製物より大きかったことを示した。これは、ＴＳＨＲ２６０、ＴＳＨＲ２６０−ＡＰ、及びＴＳＨＲ  ＬＲＤ  Ｃ−ＣＡＰが、全長ＴＳＨＲと比較して室温でより安定していることを示す。
【００８５】
可変領域配列
Ｋ１−１８をコードする遺伝子の配列分析は、ＨＣ  Ｖ領域遺伝子が、ＶＨ５−５１＊０１ファミリーに由来し、Ｄ遺伝子は、Ｄ３−１６＊０２（又はＤ３−１６＊０１）ファミリーに由来し、ＪＨ遺伝子は、Ｊ３＊０２ファミリーに由来していたことを示した。ＬＣの場合、Ｖ領域遺伝子は、Ｖ３−２０＊０１ファミリーに由来し、Ｊ領域遺伝子は、ＪＫ−１＊０１生殖細胞系に由来していた。ＨＣヌクレオチド及びアミノ酸配列は、図３（配列番号１〜１８）に示されており、ＬＣヌクレオチド及びアミノ酸配列は、図４（配列番号１９〜３６）に示されている。ＨＣ遺伝子配列には、生殖細胞系配列と比較して体細胞突然変異；特に、ＣＤＲ１における１つのサイレント突然変異及び１つの置換突然変異、ＣＤＲ２における１つのサイレント突然変異及び３つの置換突然変異、ＦＲＷ３における３つの置換突然変異、並びにＣＤＲにおける１つのサイレント突然変異及び１つの置換突然変異が存在する。ＣＤＲの置換突然変異／沈黙突然変異（Ｒ／Ｓ）比は２．７であるが、これら突然変異に加えて、ＣＤＲ３に８塩基対長の挿入が存在する。ＨＣ  ＣＤＲ１（配列番号６及び１６）は、５アミノ酸長であり、ＣＤＲ２（配列番号７及び１７）は、１７アミノ酸長であり、ＣＤＲ３（配列番号８及び１８）は、１３アミノ酸長である（それぞれ、図３ｂ及び３ｄ）。ＬＣ配列には、ＣＤＲ１に２つの置換突然変異、ＦＷＲ２に
１つのサイレント突然変異、及びＣＤＲ３に３つの置換突然変異が存在しており、全体のＲ／Ｓ突然変異比は、５．０である（ＦＷＲ及びＣＤＲ）。ＬＣ  ＣＤＲ１（配列番号２４及び３４）は、１２個のアミノ酸で構成されており、ＣＤＲ２（配列番号２５及び３５）は、７個のアミノ酸で構成されており、ＣＤＲ３（配列番号２６及び３６）は、９個のアミノ酸で構成されている（それぞれ、図４ｂ及び４ｄ）。Ｋ１−７０  ＨＣ  Ｖ領域は、ＶＨ５−５１＊０１生殖細胞系に由来し、Ｄ遺伝子は、Ｄ１−７＊０１ファミリーに由来し、ＪＨ遺伝子はＪ４＊０２ファミリーに由来する。ＬＣ遺伝子は、ＬＪ７＊０１に由来するＪＬ遺伝子と組み合わされたＬＶ１−５１＊０１生殖細胞系に由来する。このＨＣヌクレオチド及びアミノ酸配列は、図５（配列番号３７〜５４）に示されており、好ましいＬＣヌクレオチド及びアミノ酸配列は、図６ｃ及び６ｄ（配列番号６３〜７２）に示されている。Ｋ１−７０  ＨＣ配列には、ＦＷＲ１に３つの置換突然変異、ＣＤＲ１に３つの置換突然変異、ＦＷＲ２に１つの置換突然変異、ＣＤＲ２に２つのサイレント突然変異、ＦＷＲ３に４つの置換突然変異、及びＦＷＲ４に１つの置換突然変異が存在する。全体の（ＦＷＲ及びＣＤＲ）Ｒ／Ｓ突然変異比は、６．０である。加えて、ＣＤＲ３には２つの挿入；Ｖ遺伝子とＤ遺伝子との間の接合部にある５塩基対の挿入、Ｄ遺伝子とＪ遺伝子との間の接合部にある１２塩基対の挿入が存在する（図５ｂ及び５ｄ；配列番号４１及び５１）。ＨＣ  ＣＤＲ１（配列番号４２及び５２）は、５アミノ酸長であり、ＣＤＲ２（配列番号４３及び５３）は、１７アミノ酸長であり、ＣＤＲ３（配列番号４４及び５４）は、１０アミノ酸長である（それぞれ、図５ｂ及び５ｄ）。Ｋ１−７０  ＬＣ遺伝子は、ＦＷＲ１に１つのサイレント突然変異、ＦＷＲ２に１つのサイレント突然変異及び１つの置換突然変異、及びＦＷＲ３に１つの置換突然変異を示す。ＣＤＲ１に１つのサイレント突然変異及び２つの置換突然変異、並びにＣＤＲ３に２つの置換突然変異が存在する。全体の（ＦＷＲ及びＣＤＲ）Ｒ／Ｓ突然変異比は、２．０である。加えて、ＬＣ  Ｖ遺伝子とＪ遺伝子との間には２塩基対の挿入がある。ＬＣ  ＣＤＲ１（配列番号７０）は、１３個のアミノ酸で構成されており、ＣＤＲ２（配列番号７１）は、７個のアミノ酸で構成されており、ＣＤＲ３（配列番号７２）は、１１個のアミノ酸で構成されている（図６ｄ）。
【００８６】
Ｋ１−７０  Ｆａｂの構造
Ｆａｂ  Ｋ１−７０の構造を、２．２２Åの分解能で決定した（図８）。ラマチャンドランプロットパラメーター及び精密化統計値は、妥当な構造精密化に許容される範囲内にあった。非対称単位は、２つの完全なＦａｂ  Ｋ１−７０分子、Ｆａｂ  Ａ及びＦａｂ  Ｂを含有している。Ｆａｂ  Ａは、重鎖Ａ及び軽鎖Ｂを含有し、Ｆａｂ  Ｂは、重鎖Ｃ及び軽鎖Ｄを含有している。２つのＦａｂ分子は、肘角度が異なるため（Ｆａｂ  Ａ＝１４５．５°、Ｆａｂ  Ｂ＝１６３．１°）、非結晶学的対称性では関連付けられない。この構造の主鎖電子密度に破綻はないが、末端にある幾つかの残基は見当らない。Ｆａｂ  Ａでは、重鎖Ａ及び軽鎖Ｂは、それぞれ残基１〜２２７及び４〜２１１で構成されており、Ｆａｂ  Ｂでは、重鎖Ｃ及び軽鎖Ｄは、それぞれ残基１〜２２７及び２〜２１２で構成されている。Ｆａｂ  Ａ及びＦａｂ  Ｂの残基は、カバット方式（KabatEetal1991、上記）に従って付番されている。詳細は、図８及び９ａを参照されたい。電子密度は、重鎖Ａの残基１、５８、１２９、及び２１３の側鎖；軽鎖Ｂの残基１８、９４、１１０、１２６、１５６、１６３、及び１６６の側鎖；重鎖Ｃの残基１、５８、及び２１８の側鎖；並びに軽鎖Ｄの残基１７、１８、９４、１０８、１５６、１７２、１８４、１８７、及び１９０の側鎖について観察することができなかった。電子密度図中にこれら側鎖が存在しないことは、主として、それらが結晶構造の溶媒接触可能領域に位置するため、高度に可動性であることを示す。ＬＳＱＫＡＢ（ＣＣＰ４）を使用して計算したＦａｂの２つの分子の標準偏差（ｒ．ｍ．ｓ．ｄ）は、ＶＨドメイン（１１７個のＣα原子）では０．２０Åであり、ＶＬドメイン（１０６個のＣα原子）では０．２３Åであり、ＣＨドメイン（９６個のＣα原子）では０．２２Åであり、ＣＬドメイン（９７個のＣα原子）では０．２９Åである。これは、たとえ２つのＦａｂ分子間の肘角度が異なっていても、ドメインそれ自
体は、最小限の相異を示していることを実証する。Ｋ１−７０  Ｆａｂの構造は、標準的であり（図９ａ）、６つのＣＤＲがとる標準的な構造は、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、及びＬＣ  ＣＤＲ３の場合、それぞれ１、１、及び２であり、ＨＣ  ＣＤＲ１及びＨＣ  ＣＤＲ２の場合、それぞれ１及び２Ａである。ＨＣ  ＣＤＲ３は、配列及び立体構造における変異がより大きいため、いかなる標準クラスにも帰属されていない。ジスルフィド結合は、システイン残基ＬＣ２３−ＬＣ８８、ＬＣ１３４−ＬＣ１９４、ＨＣ２２−ＨＣ９２、ＨＣ１４２−ＨＣ２０８の間に存在する。Ｋ１−７０  Ｆａｂ  ＬＣの結晶構造では、ＣＤＲ１は１３残基長であり、ＬＣ  ＣＤＲ２は７残基長であり、ＬＣ  ＣＤＲ３は１１残基長である。ＨＣ  ＣＤＲ１は、５個の残基で構成され、ＨＣ  ＣＤＲ２は１７個の残基で構成され、ＨＣ  ＣＤＲ３は１２個の残基で構成されている。構造を更に解析するために、ＬＣ  ＣＤＲ３  Ａｒｇ９４及びＨＣ  ＣＤＲ２  Ａｒｇ５８の側鎖を加えた（これらの電子密度は、回折データセットに見当らなかった）。構造に関する下記の説明では、括弧中の値は、これら側鎖を含めて取得された値を指す。ＬＣ内には１５８個の水素結合があり、ＨＣ内には１７７個の水素結合がある。ＬＣからの５２（５２）個の残基は、ＨＣからの４４（４５）個の残基とのインターフェース接触に関与している。２つの鎖をそれらの相対位置に維持する７個の水素結合及び２個の塩橋が存在する。ＬＣ  ＣＤＲ１の溶媒接触可能表面積（ＡＳＡ）は、５２５（４８５）Å2であり、ＬＣ  ＣＤＲ
２は５０８（５０８）Å2であり、ＬＣ  ＣＤＲ３は２５７（４４２）Å2であり、ＨＣ  ＣＤＲ１は１２０Å2であり、ＨＣ  ＣＤＲ２は７５９（８４２）Å2であり、ＨＣ  ＣＤＲ３は５５７（５２８）Å2である。Ｋ１−７０  Ｆａｂの抗原結合部位表面の荷電アミ
ノ酸の分布を分析し、図９ｂに示す。結合部位の表面は、一方の側には負荷電残基が多く、他方の側には正荷電残基が多い。抗原結合表面にある酸性パッチには、ＬＣからは残基：Ａｓｐ２７Ｂ（ＣＤＲ１）、Ａｓｐ５０（ＣＤＲ２）、Ａｓｐ９２（ＣＤＲ３）が寄与しており、ＨＣからは残基：Ａｓｐ３１（ＣＤＲ１）、Ａｓｐ５４、及びＡｓｐ５６（ＣＤＲ２）、並びにＡｓｐ９６（ＣＤＲ３）が寄与している。塩基性パッチには、ＬＣからは残基：Ｌｙｓ５３及びＡｒｇ５４（ＣＤＲ１）及びＡｒｇ９４（ＣＤＲ３）が寄与しており、ＨＣからは残基：Ａｒｇ５８（ＣＤＲ２）及びＡｒｇ１０１（ＣＤＲ３）が寄与している。加えて、ＣＤＲ領域外にあるＬＣ  Ｌｙｓ６６も、表面の塩基性パッチに寄与している。全体として、Ｋ１−７０の抗原結合表面にある正荷電区域は、主にＬＣ残基で構成されており、負荷電区域はＨＣ残基で構成されている。また、Ｋ１−７０の抗原結合表面は、芳香族残基に富んでおり、ＨＣ及びＬＣ  ＣＤＲからの５個のチロシン、１個のフェニルアラニン、及び３個のトリプトファンがある（図９ｃ）。加えて、ＦＲＷ領域からの４個のチロシン及び１個のフェニルアラニンが、表面区域に寄与している。Ｋ１−７０抗原結合区域の表面は、全体的に高度に不規則であり、中心付近にくぼみがある。このくぼみは、主に芳香族残基及びＬＣ  Ａｓｐ５０に囲まれている（図９ｂ及び９ｃ）。更に、くぼみの内部も芳香族残基により占められている。これは、芳香族の接触が、Ｋ１−７０とＴＳＨＲとの間の相互作用に重要であり、ＴＳＨＲ表面の突出した芳香族残基が、Ｋ１−７０表面のくぼみに「嵌合」する可能性を示唆する。
【００８７】
組換えＫ１−７０  Ｆａｂ
表１７ａは、大腸菌培養上清中の組換えＫ１−７０  Ｆａｂが、ＴＳＨＲに対する125
Ｉ−ＴＳＨ結合を阻害する能力を有していたことを示す。阻害効果は、より低希釈の培養上清で完全であるが（１：２希釈で９１．９％）、上清の希釈を増加させることにより、用量依存的な阻害効果が引き起こされた（１：２５６希釈で２７．９％阻害）（表１７ａ）。ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞での環状ＡＭＰ産生のＴＳＨ媒介性刺激に対するＫ１−７０  Ｆａｂの効果は、表１７ｂに示されている。培養上清の様々な希釈物は、１：５希釈で８９．３％阻害から１：４０希釈で３９．７％阻害まで、環状ＡＭＰ刺激の用量依存的阻害を示した（表１７ｂ）。非誘導大腸菌培養に由来する対照培養上清は、ＴＳＨ結合の検出可能な阻害、又はＴＳＨ媒介性環状ＡＭＰ刺激の阻害をもたらさなかった（表１７ａ＆ｂ）。
【００８８】
要約及び結論
上述の実験は、非常に異なる生物活性を有する、ＴＳＨＲに対する２つのモノクローナル自己抗体（Ｋ１−１８  刺激性、Ｋ１−７０  阻止性）を、患者のリンパ球の単一調製物から単離することができることを示す。結果的に、患者の免疫系は、両タイプのＴＳＨＲ自己抗体、つまり刺激型及び阻止型を同時に産生していた。モノクローナル自己抗体の形態で単離されれば（上述のように）、２つのタイプのＴＳＨＲ自己抗体の特性を、互いからの干渉を受けずに調査することができる。ＴＳＨＲ刺激活性を有する新しいヒトＭＡｂ（Ｋ１−１８）の特徴を記述し、他の幾つかの公知のＴＳＨＲ  ＭＡｂの特徴と比較した。具体的には、刺激性ヒトＭＡｂ（Ｍ２２）、阻止性ヒトＭＡｂ（５Ｃ９）、阻止性ヒトＭａｂ（Ｋ１−７０）、阻止性マウスＭＡｂ（９Ｄ３３）、及びマウス阻止性ＭＡｂ（ＴＳＭＡｂ  １〜７）の特徴である。また、ＴＳＨアンタゴニスト活性を有する新しいヒトＭＡｂ（Ｋ１−７０）の特徴を記述し、公知のＭＡｂの特徴と比較した。具体的には、阻止性ヒトＭＡｂ（５Ｃ９）、阻止性マウスＭＡｂ（９Ｄ３３）、刺激性ヒトＭＡｂ（Ｍ２２）、刺激性ヒトＭＡｂ（Ｋ１−１８）、及びマウス刺激性ＭＡｂ（ＴＳＭＡｂ  １〜７）の特徴である。新しいヒト刺激性ＴＳＨＲ  ＭＡｂ  Ｋ１−１８が、ＴＳＨＲに対する未標識ＴＳＨの結合の阻害、ＴＳＨＲに対する互いの結合の阻害、ＴＳＨＲに対する阻止性ヒトＭＡｂ（５Ｃ９及びＫ１−７０）の結合の阻害、マウス阻止性及び刺激性ＭＡｂ（９Ｄ３３及びＴＳＭＡｂ  １〜７）の結合の阻害の点で、Ｍ２２と類似した特性を有することが示された。また、患者血清ＴＲＡｂは、ＴＳＨＲに対するＫ１−１８の結合を阻害した。更に、Ｍ２２及びＫ１−１８は、両方とも高親和性でＴＳＨＲに結合し、アルカリホスファターゼに結合されたアミノ酸２２〜２６０で構成されるＴＳＨＲ断片に結合することができる。Ｍ２２及びＫ１−１８等の抗体は、ＴＳＨＲ環状ＡＭＰ活性を刺激する能力を有するが、２つの抗体の効力は約１．５倍異なる。本研究は、異なる患者のＴＳＨＲ刺激性自己抗体の特性が類似しており、それらが、これまで研究されているグレーブス病の患者全てのＴＳＨＲ刺激性自己抗体の特性を代表することを示す。Ｋ１−１８の特徴の要約は、表１３ａに示されている。本発明者らの実験は、新しい阻止型ヒトＭＡｂ  Ｋ１−７０（刺激性ＭＡｂ  Ｋ１−１８と同じリンパ球試料から取得された）が、ＴＳＨＲに対する未標識ＴＳＨの結合を阻害する能力、ＴＳＨＲに対するヒトＭＡｂ（Ｍ２２、Ｋ１−１８、及び５Ｃ９）の結合を阻害する能力、ＴＳＨＲに対するマウス阻止性及び刺激性ＭＡｂ（９Ｄ３３及びＴＳＭＡｂ  １〜７）の結合を阻害する能力を有することも示した。更に、ＴＳＨＲに対するＫ１−７０の結合は、患者血清ＴＲＡｂにより阻害された。Ｋ１−７０は、強力なＴＳＨアンタゴニスト活性、及び試験した全ての患者血清ＴＲＡｂによるＴＳＨＲの刺激を阻止する能力を示した。Ｋ１−７０は、５Ｃ９よりも効果的な、ＴＳＨＲに対するＴＳＨ結合の阻害物質であることが示された。Ｋ１−７０は、高親和性でＴＳＨＲに結合し、アルカリホスファターゼに結合されたアミノ酸２２〜２６０のＴＳＨＲ断片に結合する��とができる。結果的に、Ｋ１−７０は、ＴＳＨＲに対する高い結合親和性、ＴＳＨＲに対するＴＳＨ及びＭ２２結合を阻害する能力、及び低濃度の抗体でリガンド誘導性ＴＳＨＲ刺激を阻止する能力を含む、阻止性ＴＲＡｂを有する患者血清の特徴を有する。しかしながら、Ｋ１−７０は、ＴＳＨＲ構成的活性に影響を及ぼさず、その一方で５Ｃ９は影響を及ぼす。Ｋ１−７０特徴の要約は、表１３ｂに示されている。ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞での環状ＡＭＰ活性を刺激するＫ１−１８の能力は、ＴＳＨＲが、Ｇｌｕ１５７Ａｌａ、Ｌｙｓ１８３Ａｌａ、Ｔｙｒ１８５Ａｌａ、Ａｓｐ２３２Ａｌａ、又はＡｒｇ２５５Ａｓｐの突然変異を起こしている場合に失われた。ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞でのＴＳＨ媒介性環状ＡＭＰ活性を阻止する１−７０の能力は、ＴＳＨＲ突然変異Ｌｙｓ５８Ａｌａ、Ｉｌｅ６０Ａｌａ、Ａｒｇ１０９Ａｌａ、Ｌｙｓ１８３Ａｌａ、Ｌｙｓ２５０Ａｌａの場合に低減され、ＴＳＨＲ突然変異Ｔｙｒ８２Ａｌａによりわずかに低減された。Ｋ１−１８及びＫ１−７０の両方並びにＭ２２は、ＴＳＨＲ２６０−ＡＰに基づくＥＬＩＳＡで、２２〜２６０のＴＳＨＲ断片と良好に反応した。更に、一群の患者血清ＴＳＨＲ自己抗体は、同じアッセイで、ＴＳＨＲアミノ酸２２〜２６０と良好
に反応した。いずれのタイプのＴＲＡｂ活性（刺激性及び阻止性）を有する患者血清も、ＥＬＩＳＡにおいてＴＳＨＲ２６０と結合した。加えて、アミノ酸２２〜２６０のＴＳＨＲ断片で被膜されたＥＬＩＳＡプレートウエルは、Ｍ２２−ペルオキシダーゼ（ＲＳＲ  Ｌｔｄ社製）と良好に結合し、このＭ２２−ペルオキシダーゼ結合は、一群の患者血清ＴＳＨＲ自己抗体により阻害された。患者血清ＴＳＨＲ自己抗体によるＭ２２−ペルオキシダーゼ結合のこの阻害は、全長ＴＳＨＲに対するＭ２２−ペルオキシダーゼ結合の阻害と類似していた。驚くべきことに、従って、アミノ酸２２〜２６０のＴＳＨＲ断片（又は恐らくはより小さな断片）は、ＴＳＨＲ自己抗体の日常的アッセイに十分であると考えられる。更に、Ｍ２２は、ＴＳＨＲ（ＴＳＨＲ  ＬＲＤ  Ｃ−ＣＡＰ）のより長い断片にも良好に結合した。安定性研究では、ＴＳＨＲ２６０、ＴＳＨＲ２６０−ＡＰ、及びＴＳＨＲ
ＬＲＤ  Ｃ−ＣＡＰに結合するＭ２２の能力は、それらが室温で予めインキュベートされた後では、同じ条件下で予めインキュベートされた全長ＴＳＨＲ調製物よりも、大きかった。これは、ＴＳＨＲ２６０、ＴＳＨＲ２６０−ＡＰ、及びＴＳＨＲ  ＬＲＤ  Ｃ−ＣＡＰが、全長ＴＳＨＲと比較して、室温でより安定していることを示す。ＴＳＨＲ突然変異Ａｒｇ２５５Ａｓｐは、Ｋ１−７０  ＩｇＧの結合に効果を示さなかったが、Ｋ１−１８  ＩｇＧ（より低濃度の、つまり０．１μｇ／ｍＬ以下）は、突然変異受容体にそれほど効果的に結合しなかった。様々な患者血清ＴＲＡｂを用いた実験により、ＴＳＨＲ刺激活性を有する血清を、Ｒ２５５Ｄ突然変異を含有するＴＳＨＲに対する結合の差異に基づいて、ＴＳＨＲ阻止活性を有する血清と区別することができることが示唆される。刺激活性を有する患者血清の結合は、この突然変異により影響を受けるが、阻止活性を有する患者血清の結合は、それほど又は全く影響を受けない。本実験は、Ｋ１−１８及びＫ１−７０のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を提供する。Ｋ１−１８、Ｋ１−７０の重鎖Ｖ遺伝子は、他の刺激性ヒトＭＡｂ  Ｍ２２重鎖Ｖ遺伝子と同じファミリーに属する同じ生殖細胞系に由来するが、それらは全て、異なるファミリーに由来するＤ及びＪ遺伝子と組み合わせられており、更に、Ｋ１−１８ではカッパ軽鎖が使用されているが、Ｍ２２及びＫ１−７０ではラムダ軽鎖が使用されている。５Ｃ９（別の阻止型ヒトＭＡｂ）生殖細胞系遺伝子は、５Ｃ９及びＫ１−７０ではＪ４重鎖遺伝子が使用されていることを除いて、Ｍ２２、Ｋ１−１８、及びＫ１−７０とは異なる。刺激性ＭＡｂ（Ｍ２２及びＫ１−１８）及び阻止性ＭＡｂ（５Ｃ９及びＫ１−７０）のＣＤＲのアミノ酸配列は、特に重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３内で本質的に異なる。これら観察は、４つのヒト自己抗体の各々が別々の生殖細胞系に由来することを示している。また、異なるＣＤＲ配列が、ＴＳＨＲに対して同様の生物活性を示す場合がある。Ｘ線回折データは、抗原結合部位のトポグラフィーを含むＫ１−７０  Ｆａｂ構造の分子的詳細を提供する。Ｋ１−７０  ＨＣ（配列番号４６）及びＫ１−７０  ＬＣ（配列番号６４を有する配列番号６３）の大腸菌でのクローニング及び発現により産生された組換えＫ１−７０  Ｆａｂは、ＴＳＨＲに対する125Ｉ標識ＴＳ
Ｈ結合を阻害する能力、及びＴＳＨＲ環状ＡＭＰ活性のＴＳＨ媒介性刺激を阻害する能力を示した。全体として、本結果は、Ｋ１−１８及びＫ１−７０等の本発明による抗体が、以前に記述されているＴＳＨＲ  ＭＡｂ（Ｍ２２及び５Ｃ９）、及び自己免疫性甲状腺疾患を有する患者に由来する様々な血清に見出されるＴＳＨＲ自己抗体と同様のＴＳＨＲ結合活性及びＴＳＨＲ機能に対する同様の生物学的効果を有することを示している。
【００８９】
【表１ａ】
0005978360.tif 000002
0005978360.tif 000003
【００９０】
【表１ｂ】
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0005978360.tif 000005
【００９１】
【表２ａ】
0005978360.tif 000006
【００９２】
【表２ｂ】
0005978360.tif 000007
【００９３】
【表２ｃ】
0005978360.tif 000008
【００９４】
【表３ａ】
0005978360.tif 000009
0005978360.tif 000010
【００９５】
【表３ｂ】
0005978360.tif 000011
【００９６】
【表３ｃ】
0005978360.tif 000012
【００９７】
【表３ｄ】
0005978360.tif 000013
【００９８】
【表４ａ】
0005978360.tif 000014
0005978360.tif 000015
【００９９】
【表４ｂ】
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【０１００】
【表４ｃ】
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【０１０１】
【表５ａ】
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0005978360.tif 000019
0005978360.tif 000020
【０１０２】
【表５ｂ】
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0005978360.tif 000022
【０１０３】
【表５ｃ】
0005978360.tif 000023
0005978360.tif 000024
【０１０４】
【表５ｄ】
0005978360.tif 000025
0005978360.tif 000026
0005978360.tif 000027
【０１０５】
【表６ａ】
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【０１０６】
【表６ｂ】
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【０１０７】
【表６ｃ】
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【０１０８】
【表６ｄ】
0005978360.tif 000031
【０１０９】
【表６ｅ】
0005978360.tif 000032
【０１１０】
【表６ｆ】
0005978360.tif 000033
【０１１１】
【表６ｇ】
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【０１１２】
【表６ｈ】
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【０１１３】
【表６ｉ】
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【０１１４】
【表６ｊ】
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【０１１５】
【表６ｋ】
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【０１１６】
【表６ｌ】
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【０１１７】
【表６ｍ】
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【０１１８】
【表６ｎ】
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【０１１９】
【表７ａ】
0005978360.tif 000042
【０１２０】
【表７ｂ】
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【０１２１】
【表７ｃ】
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【０１２２】
【表７ｄ】
0005978360.tif 000045
【０１２３】
【表７ｅ】
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【０１２４】
【表７ｆ】
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【０１２５】
【表７ｇ】
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【０１２６】
【表７ｈ】
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【０１２７】
【表７ｉ】
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【０１２８】
【表７ｊ】
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【０１２９】
【表７ｋ】
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【０１３０】
【表７ｌ】
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【０１３１】
【表７ｍ】
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【０１３２】
【表７ｎ】
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【０１３３】
【表７ｏ】
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【０１３４】
【表７ｐ】
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【０１３５】
【表８ａ】
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【０１３６】
【表８ｂ】
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【０１３７】
【表８ｃ】
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【０１３８】
【表８ｄ】
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【０１３９】
【表８ｅ】
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【０１４０】
【表８ｆ】
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【０１４１】
【表８ｇ】
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【０１４２】
【表８ｈ】
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【０１４３】
【表８ｉ】
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【０１４４】
【表８ｊ】
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【０１４５】
【表８ｋ】
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【０１４６】
【表９ａ】
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【０１４７】
【表９ｂ】
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【０１４８】
【表９ｃ】
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【０１４９】
【表９ｄ】
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【０１５０】
【表９ｅ】
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【０１５１】
【表９ｆ】
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【０１５２】
【表９ｇ】
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【０１５３】
【表９ｈ】
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【０１５４】
【表９ｉ】
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【０１５５】
【表９ｊ】
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【０１５６】
【表９ｋ】
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【０１５７】
【表１０】
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【０１５８】
【表１１ａ】
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【０１５９】
【表１１ｂ】
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【０１６０】
【表１１ｃ】
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【０１６１】
【表１１ｄ】
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【０１６２】
【表１１ｅ】
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【０１６３】
【表１２ａ】
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【０１６４】
【表１２ｂ】
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【０１６５】
【表１２ｃ】
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【０１６６】
【表１２ｄ】
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【０１６７】
【表１２ｅ】
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【０１６８】
【表１２ｆ】
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【０１６９】
【表１２ｇ】
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【０１７０】
【表１２ｈ】
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【０１７１】
【表１２ｉ】
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【０１７２】
【表１２ｊ】
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【０１７３】
【表１２ｋ】
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【０１７４】
【表１２ｌ】
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【０１７５】
【表１３ａ】
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【０１７６】
【表１３ｂ】
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【０１７７】
【表１４ａ】
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【０１７８】
【表１４ｂ】
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【０１７９】
【表１４ｃ】
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【０１８０】
【表１４ｄ】
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【０１８１】
【表１４ｅ】
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【０１８２】
【表１４ｆ】
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【０１８３】
【表１４ｇ】
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【０１８４】
【表１４ｈ】
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【０１８５】
【表１４ｉ】
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【０１８６】
【表１４ｊ】
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【０１８７】
【表１４ｋ】
0005978360.tif 000116
【０１８８】
【表１４ｌ】
0005978360.tif 000117
【０１８９】
【表１４ｍ】
0005978360.tif 000118
【０１９０】
【表１４ｎ】
0005978360.tif 000119
【０１９１】
【表１４ｏ】
0005978360.tif 000120
【０１９２】
【表１４ｐ】
0005978360.tif 000121
【０１９３】
【表１４ｑ】
0005978360.tif 000122
【０１９４】
【表１４ｒ】
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【０１９５】
【表１４ｓ】
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【０１９６】
【表１４ｔ】
0005978360.tif 000125
【０１９７】
【表１４ｕ】
0005978360.tif 000126
【０１９８】
【表１４ｖ】
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【０１９９】
【表１５ａ】
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【０２００】
【表１５ｂ】
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【０２０１】
【表１５ｃ】
0005978360.tif 000130
【０２０２】
【表１５ｄ】
0005978360.tif 000131
【０２０３】
【表１５ｅ】
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【０２０４】
【表１５ｆ】
0005978360.tif 000133
【０２０５】
【表１５ｇ】
0005978360.tif 000134
【０２０６】
【表１５ｈ】
0005978360.tif 000135
【０２０７】
【表１５ｉ】
0005978360.tif 000136
【０２０８】
【表１５ｊ】
0005978360.tif 000137
【０２０９】
【表１５ｋ】
0005978360.tif 000138
【０２１０】
【表１５ｌ】
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【０２１１】
【表１５ｍ】
0005978360.tif 000140
【０２１２】
【表１５ｎ】
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【０２１３】
【表１５ｏ】
0005978360.tif 000142
【０２１４】
【表１５ｐ】
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【０２１５】
【表１５ｑ】
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【０２１６】
【表１５ｒ】
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【０２１７】
【表１５ｓ】
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【０２１８】
【表１５ｔ】
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【０２１９】
【表１５ｕ】
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【０２２０】
【表１５ｖ】
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【０２２１】
【表１６】
0005978360.tif 000150
【０２２２】
【表１７ａ】
0005978360.tif 000151
【０２２３】
【表１７ｂ】
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【図１ａ】
0005978360.tif 000153
【図１ｂ】
0005978360.tif 000154
【図１ｃ】
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【図１ｄ】
0005978360.tif 000156
【図１ｅ】
0005978360.tif 000157
【図１ｆ】
0005978360.tif 000158
【図１ｇ】
0005978360.tif 000159
【図１ｈ】
0005978360.tif 000160
【図１ｉ】
0005978360.tif 000161
【図１ｊ】
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【図１ｌ】
0005978360.tif 000163
【図２ａ】
0005978360.tif 000164
【図２ｂ】
0005978360.tif 000165
【図２ｃ】
0005978360.tif 000166
【図２ｄ】
0005978360.tif 000167
【図３ａ−１】
0005978360.tif 000168
【図３ａ−２】
0005978360.tif 000169
【図３ｂ】
0005978360.tif 000170
【図３ｃ】
0005978360.tif 000171
【図３ｄ】
0005978360.tif 000172
【図４ａ−１】
0005978360.tif 000173
【図４ａ−２】
0005978360.tif 000174
【図４ｂ】
0005978360.tif 000175
【図４ｃ−１】
0005978360.tif 000176
【図４ｃ−２】
0005978360.tif 000177
【図４ｄ】
0005978360.tif 000178
【図５ａ−１】
0005978360.tif 000179
【図５ａ−２】
0005978360.tif 000180
【図５ｂ】
0005978360.tif 000181
【図５ｃ】
0005978360.tif 000182
【図５ｄ】
0005978360.tif 000183
【図６ａ−１】
0005978360.tif 000184
【図６ａ−２】
0005978360.tif 000185
【図６ｂ】
0005978360.tif 000186
【図６ｃ】
0005978360.tif 000187
【図６ｄ】
0005978360.tif 000188
【図６ｅ】
0005978360.tif 000189
【図７ａ】
0005978360.tif 000190
【図７ｂ】
0005978360.tif 000191
【図７ｃ】
0005978360.tif 000192
【図８−１】
0005978360.tif 000193
【図８−２】
0005978360.tif 000194
【図８−３】
0005978360.tif 000195
【図８−４】
0005978360.tif 000196
【図８−５】
0005978360.tif 000197
【図８−６】
0005978360.tif 000198
【図８−７】
0005978360.tif 000199
【図８−８】
0005978360.tif 000200
【図８−９】
0005978360.tif 000201
【図８−１０】
0005978360.tif 000202
【図８−１１】
0005978360.tif 000203
【図８−１２】
0005978360.tif 000204
【図８−１３】
0005978360.tif 000205
【図８−１４】
0005978360.tif 000206
【図８−１５】
0005978360.tif 000207
【図８−１６】
0005978360.tif 000208
【図８−１７】
0005978360.tif 000209
【図８−１８】
0005978360.tif 000210
【図８−１９】
0005978360.tif 000211
【図８−２０】
0005978360.tif 000212
【図８−２１】
0005978360.tif 000213
【図８−２２】
0005978360.tif 000214
【図８−２３】
0005978360.tif 000215
【図８−２４】
0005978360.tif 000216
【図８−２５】
0005978360.tif 000217
【図８−２６】
0005978360.tif 000218
【図８−２７】
0005978360.tif 000219
【図８−２８】
0005978360.tif 000220
【図８−２９】
0005978360.tif 000221
【図８−３０】
0005978360.tif 000222
【図８−３１】
0005978360.tif 000223
【図８−３２】
0005978360.tif 000224
【図８−３３】
0005978360.tif 000225
【図８−３４】
0005978360.tif 000226
【図８−３５】
0005978360.tif 000227
【図８−３６】
0005978360.tif 000228
【図８−３７】
0005978360.tif 000229
【図８−３８】
0005978360.tif 000230
【図８−３９】
0005978360.tif 000231
【図８−４０】
0005978360.tif 000232
【図８−４１】
0005978360.tif 000233
【図８−４２】
0005978360.tif 000234
【図８−４３】
0005978360.tif 000235
【図８−４４】
0005978360.tif 000236
【図８−４５】
0005978360.tif 000237
【図８−４６】
0005978360.tif 000238
【図８−４７】
0005978360.tif 000239
【図８−４８】
0005978360.tif 000240
【図８−４９】
0005978360.tif 000241
【図８−５０】
0005978360.tif 000242
【図８−５１】
0005978360.tif 000243
【図８−５２】
0005978360.tif 000244
【図８−５３】
0005978360.tif 000245
【図８−５４】
0005978360.tif 000246
【図８−５５】
0005978360.tif 000247
【図８−５６】
0005978360.tif 000248
【図８−５７】
0005978360.tif 000249
【図８−５８】
0005978360.tif 000250
【図８−５９】
0005978360.tif 000251
【図８−６０】
0005978360.tif 000252
【図８−６１】
0005978360.tif 000253
【図８−６２】
0005978360.tif 000254
【図８−６３】
0005978360.tif 000255
【図８−６４】
0005978360.tif 000256
【図８−６５】
0005978360.tif 000257
【図８−６６】
0005978360.tif 000258
【図８−６７】
0005978360.tif 000259
【図８−６８】
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【図８−６９】
0005978360.tif 000261
【図８−７０】
0005978360.tif 000262
【図８−７１】
0005978360.tif 000263
【図８−７２】
0005978360.tif 000264
【図８−７３】
0005978360.tif 000265
【図８−７４】
0005978360.tif 000266
【図８−７５】
0005978360.tif 000267
【図８−７６】
0005978360.tif 000268
【図８−７７】
0005978360.tif 000269
【図８−７８】
0005978360.tif 000270
【図８−７９】
0005978360.tif 000271
【図８−８０】
0005978360.tif 000272
【図８−８１】
0005978360.tif 000273
【図８−８２】
0005978360.tif 000274
【図８−８３】
0005978360.tif 000275
【図８−８４】
0005978360.tif 000276
【図８−８５】
0005978360.tif 000277
【図８−８６】
0005978360.tif 000278
【図８−８７】
0005978360.tif 000279
【図８−８８】
0005978360.tif 000280
【図８−８９】
0005978360.tif 000281
【図８−９０】
0005978360.tif 000282
【図８−９１】
0005978360.tif 000283
【図８−９２】
0005978360.tif 000284
【図８−９３】
0005978360.tif 000285
【図８−９４】
0005978360.tif 000286
【図８−９５】
0005978360.tif 000287
【図８−９６】
0005978360.tif 000288
【図８−９７】
0005978360.tif 000289
【図８−９８】
0005978360.tif 000290
【図８−９９】
0005978360.tif 000291
【図８−１００】
0005978360.tif 000292
【図８−１０１】
0005978360.tif 000293
【図８−１０２】
0005978360.tif 000294
【図８−１０３】
0005978360.tif 000295
【図８−１０４】
0005978360.tif 000296
【図８−１０５】
0005978360.tif 000297
【図８−１０６】
0005978360.tif 000298
【図８−１０７】
0005978360.tif 000299
【図９ａ】
0005978360.tif 000300
【図９ｂ】
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【図９ｃ】
0005978360.tif 000302
【図１ｋ】
0005978360.tif 000303
【配列表】
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