(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体において化学療法誘発性脱毛症を予防または治療するための局所投与用医薬組成物であって、
真皮送達を実質的に回避しつつ表皮に送達されるように製剤化した治療上有効な量のビタミンD化合物および担体を含み、
前記担体が55〜80%(w/w)の無水アブソルートエタノールおよび20〜45%(w/w)のプロピレングリコールを含む無水液体であり、
前記ビタミンD化合物が、化学式(I)：
【化１】
0005978130.tif 000049
〔式中、
aおよびbは各々独立して単結合または二重結合であり
Xはａが二重結合である場合に-CH2であり、またはXはaが単結合である場合に水素もしくはヒドロキシル置換アルキルであり；
R1は、1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、トリ-アルキルシリル、アルコキシル、ヒドロキシルまたは水素であり；
R2は、水素、ヒドロキシル、-O-トリアルキルシリル、または1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシルもしくはアルケニルであり；
R3はbが二重結合である場合に存在せず、またはbが単結合である場合に、R3は水素、ヒドロキシルもしくはアルキルであるか、またはR3およびR1は、それらが結合している炭素原子と共に連結して5〜7員の炭素環を形成していてもよく；
R4はbが二重結合である場合に存在せず、またはbが単結合である場合に水素、ハロゲンもしくはヒドロキシルであり；
R5はaが二重結合である場合に存在せず、またはR5はaが単結合である場合に水素、ハロゲンもしくはヒドロキシルであり；
R6は、1〜5個のヒドロキシル、オキソ、ハロゲン、アルコキシル、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ニトロまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルキル-O-アルキル、アルキル-CO2-アルキルであり；
R7は、1〜3個のヒドロキシル、ハロゲン、アルコキシル、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ニトロまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキルであり；かつ、
R’およびR”は各々、独立して、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、アルキルまたはアルコキシルである〕
で表される化合物または製薬上許容しうるその塩である、前記医薬組成物。
【請求項２】
1,25-ジヒドロキシビタミンD3を3〜100μg/mlの有効濃度で含む、請求項1記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項３】
前記担体が、約40％(w/w)のプロピレングリコールおよび約60％(w/w)の無水アブソルートエタノール(200プルーフ、U.S.)を含む、請求項1記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項４】
前記担体が、30％(w/w)のプロピレングリコール、10％(w/w)のエトキシジグリコール、および60％(w/w)の無水アブソルートエタノールを含む、請求項1記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項５】
前記担体が、30％(w/w)のプロピレングリコール、10％(w/w)のトランスクトール、および60％(w/w)の無水アブソルートエタノールを含む、請求項1記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項６】
前記ビタミンD化合物が、化学式(II)：
【化２】
0005978130.tif 000050
〔式中、
cは単結合または二重結合であり；
R1aは、1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、トリ-アルキルシリルまたは水素であり；
R2aは、水素、ヒドロキシル、-O-トリアルキルシリル、または1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシルもしくはアルケニルであり；
R3a、R4aは、cが二重結合である場合に存在せず、またはcが単結合である場合に各々独立して、1〜3個のヒドロキシルもしくはハロゲン部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシル、ハロゲン、ヒドロキシルもしくは水素であって
R3b、R4b、R5a、R6a、R7aおよびR8aは各々、独立して、1〜3個のヒドロキシルもしくはハロゲン部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシル、ハロゲン、ヒドロキシルもしくは水素であるか、またはR6a、R7aおよびR8aのうちのいずれか2つが連結して3〜7員の炭素環を形成していてもよい〕
で表される化合物または製薬上許容しうるその塩である、請求項１および３〜５のいずれか１項記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項７】
前記ビタミンD化合物が、1,25-ジヒドロキシビタミンD3である、請求項１および３〜６のいずれか１項記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項８】
前記ビタミンD化合物が、1,25-ジヒドロキシビタミンD3；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-23-イン-コレカルシフェロール；1α-ヒドロキシビタミンD3；1α,24-ジヒドロキシビタミンD3、またはMC903ではない、請求項１および３〜６のいずれか１項記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項９】
前記ビタミンD化合物が、正常な角化細胞において当量のカルシトリオールと同様または同一の遺伝子調節プロファイルを呈する、請求項１〜８のいずれか１項記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項１０】
前記ビタミンD化合物が、その発現レベルが当量のカルシトリオールにより促進される1つ以上の遺伝子の発現を促進する、請求項１〜９のいずれか１項記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項１１】
前記ビタミンD化合物が、その発現レベルが当量のカルシトリオールにより抑制される1つ以上の遺伝子の発現を抑制する、請求項１〜１０のいずれか１項記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項１２】
前記ビタミンD化合物が、正常な角化細胞においてHSPA2またはHSF4 mRNA、HSPB1またはDNAJC6 mRNAの発現をモジュレートする、請求項１〜１１のいずれか１項記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項１３】
前記ビタミンD化合物が、正常な角化細胞においてSLC1A1、KCNB2、もしくはKCNN4タンパク質またはSLC1A3タンパク質の発現をモジュレートする、請求項１〜１２のいずれか１項記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項１４】
前記ビタミンD化合物が、アミロイド前駆体タンパク質、ARTS、ASAP1センタウリンb4、BACH1、Bclx、BclxL、BID、Bmf、CENPE、cMyc、コフィリン、コネキシン32、Csk、CtBP1、DcR2、ジメチルヒストンH3 diMeLys4、ジメチルヒストンH3 diMeLys9、ジストロフィン、 ERK5 BIG MAPKBMK1、エストロゲン受容体、FKHRL1 FOXO3a、接着斑キナーゼpp125FAK、FOXP2、グルタミン酸デカルボキシラーゼ65、グルタミン酸デカルボキシラーゼGAD65 67、gチューブリン、HDAC2、HDAC6、ILK、MAPキナーゼ活性化プロテインキナーゼ2 MAPKAPK2、MAPキナーゼERK1, メラノコルチン3受容体、ミオシンIX Myr5、ニューロフィラメント200、一酸化窒素シンターゼbNOS、p120ctn、PAD14、Par4前立腺アポトーシス応答4、プレセニリン1、増殖細胞タンパク質Ki67、プロテインキナーゼBa,、PUMA bbc3、ROCK1、S100、SHPTP2、Sin3A、サブスタンスP受容体、シナプトポジン、腫瘍壊死因子a、ユビキチンC末端ヒドロラーゼL1、ウボモルリンEカドヘリン、ビトロネクチン、Crk II、増殖因子非依存性1、セリントレオニンプロテインホスファターゼ1b、カテプシンD、トランスフォーミング増殖因子b pan、WAVE、プロテインチロシンホスファターゼPESTおよびCD40中の1つ以上のタンパク質の発現を少なくとも約2倍モジュレートする、請求項１〜１３のいずれか１項記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項１５】
前記ビタミンD化合物が、正常な角化細胞に約24時間曝露した後にBACH1、CENPE、cMyc、C-srcチロシンキナーゼ(Csk)、CtBP1、ジメチルヒストンH3 diMeLys4、ジメチルヒストンH3 diMeLys9、エストロゲン受容体、FKHRL1 FOXO3a、FOXP2、HDAC2、MAPキナーゼ活性化プロテインキナーゼ2 MAPKAPK2、MAPキナーゼERK1、メラノコルチン3受容体、増殖細胞タンパク質Ki67、S100、SHPTP2、Sin3A、ARTS、ASAP1センタウリンb4、コフィリン、コネキシン32、ジストロフィン、接着斑キナーゼpp125FAK、gチューブリン、ミオシンIX Myr5、ニューロフィラメント200、p120ctn、PAD14、ROCK1、ウボモルリンEカドヘリン、ビトロネクチン、Bclx、BclxL、BID、Bmf、DcR2、ERK5 BIG MAPKBMK1、インテグリン結合キナーゼ(ILK)、プロテインキナーゼBa、PUMA bbc3、アミロイド前駆体タンパク質、プレセニリン1、グルタミン酸デカルボキシラーゼ65、グルタミン酸デカルボキシラーゼGAD65 67、一酸化窒素シンターゼbNOS、サブスタンスP受容体、シナプトポジン、腫瘍壊死因子aおよびユビキチンC末端ヒドロラーゼL1中の1つ以上のタンパク質の過剰発現を誘導する、請求項１〜１４のいずれか１項記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項１６】
前記ビタミンD化合物が、正常な角化細胞において以下：GST、ケラチン1、ケラチン17、ガレクチン1、S100 A9(カルプロテクチン)、またはS100 A13のうちの1つ以上の過剰発現を誘導する、請求項１〜１５のいずれか１項記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項１７】
前記個体が霊長類動物である、請求項１〜１６のいずれか１項記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項１８】
前記個体がヒトである、請求項１〜１７のいずれか１項記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項１９】
前記個体において脱毛症がまだ始まっていない、請求項１〜１８のいずれか１項項記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項２０】
前記個体が化学療法を受けているかまたは受けようとしている、請求項１〜１９のいずれか１項記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項２１】
化学療法前に、または化学療法と同時に前記個体に投与するための、請求項２０記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項２２】
化学療法の開始後であるが脱毛症の発症前に前記個体に投与するための、請求項２０記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項２３】
化学療法の効力を実質的に低下させることはない、請求項２０記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項２４】
化学療法が全身化学療法である、請求項２０記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項２５】
化学療法が、以下：アントラサイクリン系薬剤(アドリアマイシン／ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン)、5-FU、タモキシフェン、イリノテカン、パクリタキセル(タキソール)、カルボプラチン、エトポシド、シトキサン／シクロホスファミド、シスプラチン、エルロチニブ(タルセバ)、ゲムシタビン、スタウロスポリン、ビンクリスチン、イマチニブ(グリーベック)、ゲフィチニブ(イレッサ)、ソラフェニブ、ダサチニブ、ダクチノマイシン、ヘキサメチルメラミン(HMM、アルトレタミン)、イホスファミド、ブレオマイシン、メトトレキサート、ドセタキセル(タキソテール)、ビンデシン、ビノレルビン、トポテカン、アムサクリン、シタラビン、ブスルファン、メルファラン、ビンブラスチン、ロムスチン(CCNU)、チオテパ、ゲムシタビン、カルムスチン(BCNU)、ミトキサントロン、マイトマイシンC、プロカルバジン、6-メルカプトプリン、ストレプトゾトシン、フルダラビン、ラルチトレキセド(トムデックス)、カペシタビン、およびこれらの等価物のうちの1つ以上を含む、請求項２０記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項２６】
前記ビタミンD化合物を、約0.1μgのカルシトリオール／cm2に相当する投薬量で前記個体に局所的に投与するための、請求項１〜２５のいずれか１項記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項２７】
総投与量が約2〜100μgのカルシトリオール／体重75 kgに相当する、請求項１〜２５のいずれか１項記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項２８】
前記ビタミンD化合物が、個体に以下(1)または(2)の有効濃度で局所的に投与した場合、
(1)  約50μg/mLでは、少なくとも約25日間連続して薬物を投与した後に毒性を生じず、または
(2)  約100μg/mLでは、少なくとも約7日間連続して薬物を投与した後に毒性を生じない、
請求項１〜２７のいずれか１項記載の局所投与用医薬組成物。
【請求項２９】
治療上有効な量のビタミンD化合物が、同時投与した化学療法剤の効力に実質的に干渉することはない、請求項１〜２８のいずれか１項記載の局所投与用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2009年8月14日に出願された米国仮特許出願第61/234,178号に対して優先権を主張するものである。前述の出願の記載内容は、その全てが参照により組み込まれるものとする。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
脱毛症は多くの化学療法剤に共通する悩ましい副作用であり、そのための有効な予防策は今のところ殆ど存在しない。近年の研究では、化学療法を受けている46人の患者のうち35人が、脱毛症を嘔吐より気掛かりな副作用であると評価した(Tierneyら、B. J. Cancer, 62：527-528, 1990)。
【０００３】
現在のところ、脱毛症に悩む患者は、局所用ステロイドの反復適用により脱落した毛髪を再成長させようと努力するか、またはミノキシジルの局所適用により毛髪の成長を維持しようと努力することしかできない。さらに、幾つかの有望な研究が為されてはいるものの、化学療法治療時の副作用としての脱毛症を防ぐ能力を備えた承認治療薬は今のところ存在しない。例えば、若齢ラットモデルを使用して、細菌セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)から調製された生物反応調節物質であるImuVertがシトシンアラビノシドまたはアドリアマイシンにより誘発される脱毛症から動物を保護することが実証された(Husseinら、Science 249：1564-1566、1990)。その後の研究では、ARA-C誘発性の脱毛症からの同様の保護が、組換えインターロイキン-1(IL-1)ベータから観察された(Jimenezら、FASEB J. 1991)。これらの有望な結果にもかかわらず、脱毛症に苦しむ人々においてこの疾患を治療し、さらには癌治療を受けている人々において化学療法誘発性の脱毛症を予防する、安全かつ有効な治療薬が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Tierneyら、B. J. Cancer, 62：527-528, 1990
【非特許文献２】Husseinら、Science 249：1564-1566、1990
【非特許文献３】Jimenezら、FASEB J. 1991
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、脱毛症(例えば、化学療法誘発性脱毛症(CIA))を予防または治療するための、ビタミンD3もしくはカルシトリオールなどのビタミンD化合物およびその類似体またはその代謝産物の使用、その投薬量ならびに製剤に関する。
【０００６】
従って、一つの態様では、本発明は、真皮送達を実質的に回避しつつ表皮に送達されるように製剤化したビタミンD化合物を治療上有効な量で含む医薬組成物を個体に局所的に投与することにより、該個体において脱毛症を予防または治療する方法を提供する。
【０００７】
幾つかの実施形態では、前記医薬組成物は、約40％(w/w)のプロピレングリコールおよび約60％(w/w)の無水アブソルート(anhydrous absolute)エタノール(200プルーフ、U.S.)；または約30％(w/w)のプロピレングリコール、約10％(w/w)のエトキシジグリコールもしくはトランスクトール、および約60％(w/w)の無水アブソルートエタノール(200プルーフ、U.S.)を含む。
【０００８】
他の実施形態では、前記ビタミンD化合物は、化学式(I)：
【化１】
0005978130.tif 000002
【０００９】
〔式中、
aおよびbは各々独立して単結合または二重結合であり；
Xはａが二重結合である場合に-CH2であり、またはXはaが単結合である場合に水素もしくはヒドロキシル置換アルキルであり；
R1は、1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、トリ-アルキルシリル、アルコキシル、ヒドロキシルまたは水素であり；
R2は、水素、ヒドロキシル、-O-トリアルキルシリル、または1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシルもしくはアルケニルであり；
R3はbが二重結合である場合に存在せず、またはbが単結合である場合に、R3は水素、ヒドロキシルもしくはアルキルであるか、またはR3およびR1は、それらが結合している炭素原子と共に連結して5〜7員の炭素環を形成していてもよく；
R4はbが二重結合である場合に存在せず、またはbが単結合である場合に水素、ハロゲンもしくはヒドロキシルであり；
R5はaが二重結合である場合に存在せず、またはR5はaが単結合である場合に水素、ハロゲンもしくはヒドロキシルであり；
R6は、1〜5個のヒドロキシル、オキソ、ハロゲン、アルコキシル、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ニトロまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルキル-O-アルキル、アルキル-CO2-アルキルであり；
R7は、1〜3個のヒドロキシル、ハロゲン、アルコキシル、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ニトロまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキルであり；かつ、
R’およびR”は各々、独立して、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、アルキルまたはアルコキシルである〕
で表される化合物、および製薬上許容しうるその塩である。
【００１０】
幾つかの他の実施形態では、前記ビタミンD化合物は、化学式(II)：
【化２】
0005978130.tif 000003
【００１１】
〔式中、
cは単結合または二重結合であり；
R1aは、1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、トリ-アルキルシリルまたは水素であり；
R2aは、水素、ヒドロキシル、-O-トリアルキルシリル、または1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシルもしくはアルケニルであり；
R3a、R4aは、cが二重結合である場合に存在せず、またはcが単結合である場合に各々独立して1〜3個のヒドロキシルもしくはハロゲン部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシル、ハロゲン、ヒドロキシルもしくは水素であり、
R3b、R4b、R5a、R6a、R7aおよびR8aは各々、独立して、1〜3個のヒドロキシルもしくはハロゲン部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシル、ハロゲン、ヒドロキシルもしくは水素であるか、またはR6a、R7aおよびR8aのうちのいずれか2つが連結して3〜7員の炭素環を形成していてもよい〕
で表される化合物および製薬上許容しうるその塩である。
【００１２】
さらに別の実施形態では、前記ビタミンD化合物は、1,25-ジヒドロキシビタミンD3；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-23-イン-コレカルシフェロール；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-イン-コレカルシフェロール；1α-ヒドロキシビタミンD3；1α,24-ジヒドロキシビタミンD3、またはMC903である。
【００１３】
さらなる実施形態では、前記ビタミンD化合物は、1,25-ジヒドロキシビタミンD3；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-23-イン-コレカルシフェロール；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-イン-コレカルシフェロール；1α-ヒドロキシビタミンD3；1α,24-ジヒドロキシビタミンD3、またはMC903ではない。
【００１４】
他の実施形態では、前記ビタミンD化合物は、正常な角化細胞において当量のカルシトリオールと同様または同一の遺伝子調節プロファイルを呈する。
【００１５】
幾つかの実施形態では、前記ビタミンD化合物は、その発現レベルが当量のカルシトリオールによりモジュレートされる1つ以上の遺伝子の発現をモジュレートする。
【００１６】
さらに別の実施形態では、前記ビタミンD化合物は、正常な角化細胞においてHSPA2またはHSF4 mRNA、HSPB1またはDNAJC6 mRNAの発現をモジュレートする。
【００１７】
別の実施形態では、前記ビタミンD化合物は、正常な角化細胞においてSLC1A1、KCNB2、KCNN4またはSLC1A3タンパク質の発現をモジュレートする。
【００１８】
他の実施形態では、前記ビタミンD化合物は、表3-1および表3-2中の1つ以上のタンパク質の発現を少なくとも約2倍モジュレートする。
【００１９】
さらに別の実施形態では、前記ビタミンD化合物は、該ビタミンD化合物に正常な角化細胞を約24時間曝露した後に、表3-3、3-4、3-5または3-6中の1つ以上のタンパク質の過剰発現を誘導する。
【００２０】
他の実施形態では、前記ビタミンD化合物は、正常な角化細胞において以下：GST、ケラチン1、ケラチン17、ガレクチン1、S100 A9(カルプロテクチン)、またはS100 A13のうちの1つ以上の過剰発現を誘導する。
【００２１】
幾つかの実施形態では、前記脱毛症は、円形脱毛症(AA)、全頭脱毛症(AT)、汎発性脱毛症(AU)、または化学療法誘発性脱毛症(CIA)である。
【００２２】
幾つかの他の実施形態では、前記円形脱毛症に、びまん性円形脱毛症、単発型円形脱毛症(alopecia areata monolocularis)、多発型円形脱毛症(alopecia areata multilocularis)、および髭円形脱毛症(alopecia areata barbae)が含まれる。
【００２３】
さらに別の実施形態では、前記脱毛症から、男性型脱毛症(androgenetic alopecia)(アンドロゲン性脱毛症(alopecia androgenetica))または化学療法後の脱毛症(PCA)は除かれる。
【００２４】
幾つかの実施形態では、前記個体は霊長類動物である。
【００２５】
他の実施形態では、前記個体はヒトである。
【００２６】
他の実施形態では、前記脱毛症は前記個体において始まっていない。
【００２７】
さらに別の実施形態では、前記個体は、化学療法を受けているかまたは受けようとしている。
【００２８】
幾つかの他の実施形態では、前記医薬組成物を、化学療法前に、または化学療法と併用して、前記個体に投与される。
【００２９】
さらに他の実施形態では、前記医薬組成物を、化学療法の開始後であるが脱毛症の発症前に前記個体に投与される。
【００３０】
幾つかの実施形態では、前記医薬組成物は、化学療法の効力を実質的に低下させることはない。
【００３１】
さらに他の実施形態では、前記化学療法は全身化学療法である。
【００３２】
幾つかの実施形態では、前記化学療法は、以下：アントラサイクリン系薬剤(アドリアマイシン／ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン)、5-FU、ベバシズマブ、タモキシフェン、イリノテカン、パクリタキセル(タキソール)、カルボプラチン、エトポシド、シトキサン／シクロホスファミド、シスプラチン、エルロチニブ(タルセバ)、ゲムシタビン、スタウロスポリン、ビンクリスチン、イマチニブ(グリーベック)、ゲフィチニブ(イレッサ)、ソラフェニブ、ダサチニブ、ダクチノマイシン、ヘキサメチルメラミン(Hexamethamelamine)(HMM、アルトレタミン)、イホスファミド、ブレオマイシン、メトトレキサート、ドセタキセル(タキソテール)、ビンデシン、ビノレルビン、トポテカン、アムサクリン、シタラビン、ブスルファン、メルファラン、ビンブラスチン、ロムスチン(CCNU)、チオテパ、ゲムシタビン、カルムスチン(BCNU)、ミトキサントロン(Mitroxantrone)、マイトマイシンC、プロカルバジン、6-メルカプトプリン、ストレプトゾトシン(Sreptozotocin)、フルダラビン、ラルチトレキセド(Raltitrexate)(トムデックス)、カペシタビン、およびこれらの等価物のうちの1つ以上を含む。
【００３３】
さらなる実施形態では、前記ビタミンD化合物を、約0.1μgのカルシトリオール／cm2に相当する投薬量で前記個体に局所的に投与する。
【００３４】
さらに別の実施形態では、総投与量は約2〜100μgのカルシトリオール／体重75 kgに相当する。
【００３５】
別の態様では、本発明は、個体において脱毛症を予防または治療する方法であって、該個体に、化学式(I)：
【化３】
0005978130.tif 000004
【００３６】
〔式中、
aおよびbは各々独立して単結合または二重結合であり
Xはａが二重結合である場合に-CH2であり、またはXはaが単結合である場合に水素もしくはヒドロキシル置換アルキルであり；
R1は、1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、トリ-アルキルシリル、アルコキシル、ヒドロキシルまたは水素であり；
R2は、水素、ヒドロキシル、-O-トリアルキルシリル、または1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシルもしくはアルケニルであり；
R3はbが二重結合である場合に存在せず、またはbが単結合である場合に、R3は水素、ヒドロキシルもしくはアルキルであるか、またはR3およびR1は、それらが結合している炭素原子と共に連結して5〜7員の炭素環を形成していてもよく；
R4はbが二重結合である場合に存在せず、またはbが単結合である場合に水素、ハロゲンもしくはヒドロキシルであり；
R5はaが二重結合である場合に存在せず、またはR5はaが単結合である場合に水素、ハロゲンもしくはヒドロキシルであり；
R6は、1〜5個のヒドロキシル、オキソ、ハロゲン、アルコキシル、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ニトロまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルキル-O-アルキル、アルキル-CO2-アルキルであり；
R7は、1〜3個のヒドロキシル、ハロゲン、アルコキシル、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ニトロまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキルであり；かつ、
R’およびR”は各々、独立して、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、アルキルまたはアルコキシルである〕
で表されるビタミンD化合物または製薬上許容しうるその塩を治療上有効な量で含む医薬組成物を局所的に投与することを含み、ここで該ビタミンD化合物は1,25-ジヒドロキシビタミンD3；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-23-イン-コレカルシフェロール；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-イン-コレカルシフェロール；1α-ヒドロキシビタミンD3；1α,24-ジヒドロキシビタミンD3、またはMC903ではない、前記方法を提供する。
【００３７】
幾つかの実施形態では、前記ビタミンD化合物は、化学式(II)：
【化４】
0005978130.tif 000005
【００３８】
〔式中、
cは単結合または二重結合であり；
R1aは、1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、トリ-アルキルシリルまたは水素であり；
R2aは、水素、ヒドロキシル、-O-トリアルキルシリル、または1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシルもしくはアルケニルであり；
R3a、R4aは、cが二重結合である場合に存在せず、またはcが単結合である場合に各々独立して1〜3個のヒドロキシルもしくはハロゲン部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシル、ハロゲン、ヒドロキシルもしくは水素であって
R3b、R4b、R5a、R6a、R7aおよびR8aは各々、独立して、1〜3個のヒドロキシルもしくはハロゲン部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシル、ハロゲン、ヒドロキシルもしくは水素であるか、またはR6a、R7aおよびR8aのうちのいずれか2つが連結して3〜7員の炭素環を形成していてもよい〕
で表される化合物および製薬上許容しうるその塩である。
【００３９】
別の態様では、本発明は、個体において脱毛症を予防または治療する方法であって、該個体に治療上有効な量のビタミンD化合物を含む医薬組成物を局所的に投与することを含み、ここで該ビタミンD化合物は、該個体に以下(1)または(2)の有効濃度で局所的に投与した場合、(1)約50μg/mLでは少なくとも約25日間連続して薬物を投与した後に毒性を生じず；または(2)約100μg/mLでは少なくとも約7日間連続して薬物を投与した後に毒性を生じない、前記方法を提供する。
【００４０】
さらに別の態様では、本発明は、個体において脱毛症を予防または治療する方法であって、同時投与した化学療法剤の効力に実質的に干渉することなく、該個体において脱毛症を予防または治療するために治療上有効な量でビタミンD化合物を含む医薬組成物を該個体に局所的に投与することを含む前記方法を提供する。
【００４１】
一つの態様では、本発明は、個体において脱毛症を予防または治療する方法であって、該個体に、
(1)  正常な角化細胞において当量のカルシトリオールと同様もしくは同一の遺伝子調節プロファイルを呈するか；
(2)  その発現レベルが当量のカルシトリオールによりモジュレートされる1つ以上の遺伝子の発現をモジュレートするか；
(3)  正常な角化細胞においてHSPA2もしくはHSF4 mRNA、HSPB1もしくはDNAJC6 mRNAの発現をモジュレートするか；
(4)  正常な角化細胞においてSLC1A1、KCNB2、KCNN4、SLC1A3タンパク質の発現をモジュレートするか；
(5)  表3-1および表3-2中の1つ以上のタンパク質の発現を少なくとも約2倍モジュレートするか；
(6)  ビタミンD化合物に正常な角化細胞を約24時間曝露した後に、表3-3、3-4、3-5もしくは3-6中の1つ以上のタンパク質の過剰発現を誘導するか；または
(7)  正常な角化細胞において以下：GST、ケラチン1、ケラチン17、ガレクチン1、S100 A9(カルプロテクチン)、もしくはS100 A13のうちの1つ以上の過剰発現を誘導する
ビタミンD化合物を治療上有効な量で含む医薬組成物を局所的に投与することを含み、ここで該ビタミンD化合物は1,25-ジヒドロキシビタミンD3；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-23-イン-コレカルシフェロール；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-イン-コレカルシフェロール；1α-ヒドロキシビタミンD3；1α,24-ジヒドロキシビタミンD3、またはMC903ではない、前記方法を提供する。
【００４２】
さらに別の態様では、本発明は、局所投与用の医薬組成物であって、脱毛症を予防または治療するために治療上有効な量のビタミンD化合物を含み、ここで該ビタミンD化合物は真皮送達を実質的に回避しつつ表皮に送達されるように製剤化されている、該医薬組成物を提供する。
【００４３】
幾つかの態様では、前記医薬組成物は、約40％(w/w)のプロピレングリコールおよび約60％(w/w)の無水アブソルートエタノール(200プルーフ、US)、未変性；または約30％(w/w)のプロピレングリコール、約10％(w/w)のエトキシジグリコールもしくはトランスクトール、および約60％(w/w)の無水アブソルートエタノール(200プルーフ、US)、未変性、を含む。
【００４４】
幾つかの態様では、本発明は、局所投与用の医薬組成物であって、脱毛症を予防または治療するために治療上有効な量のビタミンD化合物を含み、ここで該ビタミンD化合物は化学式(I)：
【化５】
0005978130.tif 000006
【００４５】
〔式中、
aおよびbは各々独立して単結合または二重結合であり
Xはａが二重結合である場合に-CH2であり、またはXはaが単結合である場合に水素もしくはヒドロキシル置換アルキルであり、
R1は、1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、トリ-アルキルシリル、アルコキシル、ヒドロキシルまたは水素であり；
R2は、水素、ヒドロキシル、-O-トリアルキルシリル、または1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシルもしくはアルケニルであり；
R3はbが二重結合である場合に存在せず、またはbが単結合である場合に、R3は水素、ヒドロキシルもしくはアルキルであるか、またはR3およびR1は、それらが結合している炭素原子と共に連結して5〜7員の炭素環を形成していてもよく；
R4はbが二重結合である場合に存在せず、またはbが単結合である場合に水素、ハロゲンもしくはヒドロキシルであり；
R5はaが二重結合である場合に存在せず、またはR5はaが単結合である場合に水素、ハロゲンもしくはヒドロキシルであり；
R6は、1〜5個のヒドロキシル、オキソ、ハロゲン、アルコキシル、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ニトロまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルキル-O-アルキル、アルキル-CO2-アルキルであり；
R7は、1〜3個のヒドロキシル、ハロゲン、アルコキシル、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ニトロまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキルであり；かつ、
R’およびR”は各々、独立して、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、アルキルまたはアルコキシルである〕
で表される化合物または製薬上許容しうるその塩であり、ここで該ビタミンD化合物は1,25-ジヒドロキシビタミンD3；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-23-イン-コレカルシフェロール；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-イン-コレカルシフェロール；1α-ヒドロキシビタミンD3；1α,24-ジヒドロキシビタミンD3、またはMC903ではない、前記医薬組成物を提供する。
【００４６】
幾つかの実施形態では、前記ビタミンD化合物は、化学式(II)：
【化６】
0005978130.tif 000007
【００４７】
〔式中、
cは単結合または二重結合であり；
R1aは、1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、トリ-アルキルシリルまたは水素であり；
R2aは、水素、ヒドロキシル、-O-トリアルキルシリル、または1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシルもしくはアルケニルであり；
R3a、R4aは、cが二重結合である場合に存在せず、またはcが単結合である場合に各々独立して1〜3個のヒドロキシルもしくはハロゲン部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシル、ハロゲン、ヒドロキシルもしくは水素であり；
R3b、R4b、R5a、R6a、R7aおよびR8aは各々、独立して、1〜3個のヒドロキシルもしくはハロゲン部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシル、ハロゲン、ヒドロキシルもしくは水素であるか、またはR6a、R7aおよびR8aのうちのいずれか2つが連結して3〜7員の炭素環を形成していてもよい〕
で表される化合物および製薬上許容しうるその塩である。
【００４８】
幾つかの他の態様では、本発明は、局所投与用の医薬組成物であって、脱毛症を予防または治療するために治療上有効な量のビタミンD化合物を含み、ここで該ビタミンD化合物は、個体に以下(1)または(2)の有効濃度で局所的に投与した場合、
(1)  約50μg/mLでは、少なくとも約25日間連続して薬物を投与した後に毒性を生じず、または
(2)  約100μg/mLでは、少なくとも約7日間連続して薬物を投与した後に毒性を生じない、前記医薬組成物を提供する。
【００４９】
さらに別の態様では、本発明は、局所投与用の医薬組成物であって、脱毛症を予防または治療するために治療上有効な量のビタミンD化合物を含み、ここで治療上有効な量のビタミンD化合物は化学療法剤と同時投与した場合に該化学療法剤の効力に実質的に干渉することはない、該医薬組成物を提供する。
【００５０】
別の態様では、本発明は、局所投与用の医薬組成物であって、脱毛症を予防または治療するために治療上有効な量のビタミンD化合物を含み、ここで治療上有効な量のビタミンD化合物は、
(1)  正常な角化細胞において当量のカルシトリオールと同様もしくは同一の遺伝子調節プロファイルを呈するか；
(2)  その発現レベルが当量のカルシトリオールにより促進される1つ以上の遺伝子の発現をモジュレートするか；
(3)  正常な角化細胞においてHSPA2もしくはHSF4 mRNA、HSPB1もしくはDNAJC6 mRNAの発現をモジュレートするか；
(4)  正常な角化細胞においてSLC1A1、KCNB2、KCNN4、もしくはSLC1A3タンパク質の発現をモジュレートするか；
(5)  表3-1もしくは表3-2中の1つ以上のタンパク質の発現を少なくとも約2倍モジュレートするか；
(6)  ビタミンD化合物に正常な角化細胞を約24時間曝露した後に、表3-3、3-4、3-5もしくは3-6中の1つ以上のタンパク質の過剰発現を誘導するか；または
(7)  正常な角化細胞において以下：GST、ケラチン1、ケラチン17、ガレクチン1、S100 A9(カルプロテクチン)、もしくはS100 A13のうちの1つ以上の過剰発現を誘し、
ここで該ビタミンD化合物は1,25-ジヒドロキシビタミンD3；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-23-イン-コレカルシフェロール；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-イン-コレカルシフェロール；1α-ヒドロキシビタミンD3；1α,24-ジヒドロキシビタミンD3、またはMC903ではない、前記医薬組成物を提供する。
【００５１】
本明細書中に記載した全ての(上記および下記)実施形態は、適切であれば、任意の他の実施形態、例えば本発明の幾つかの態様のうちの1つについてのみ記載した実施形態、および本発明の種々の態様について記載した実施形態と組み合わせることができると考えられることに注意されたい。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図1は、3人の皮膚ドナー全員の全吸収および物質収支の結果、ならびに単回適用から48時間にわたる損傷のないヒト死体皮膚から得られたカルシトリオールの分布を示している。結果は、全質量(ng／cm2)を平均値±SEとして対数目盛で表したものである。
【図２】図2は、増殖培地中に存在する種々の濃度のカルシトリオールに対するHEKa細胞の例示的な増殖曲線を示したものである。カルシトリオール濃度が対数目盛であることに注意されたい。
【図３】図3は膵癌細胞系PaCa2の例示的な増殖曲線を示しており、該増殖曲線は0.1μg/mLのカルシトリオールの存在に応答しなかった。
【図４Ａ】図4Aは、漸増濃度のカルシトリオールの存在下におけるHep-G2細胞およびMCF-7細胞の増殖を示している。
【図４Ｂ】図4Bは、漸増濃度のカルシトリオールの存在下におけるHep-G2細胞およびMCF-7細胞の増殖を示している。
【図５】図5は、0.1μg/mLのカルシトリオールの存在下(×)または非存在下(◆)におけるエルロチニブ(タルセバ)(EGFR Tyrキナーゼ阻害剤)の投与曲線を示している。
【図６】図6は、0.1μg/mLのカルシトリオールの存在下(×)または非存在下(◆)におけるゲフィチニブ(イレッサ)(別のEGFR Tyrキナーゼ阻害剤)の投与曲線を示している。
【図７】図7は、0.1μg/mLのカルシトリオールの存在下(×)または非存在下(◆)におけるソラフェニブの投与曲線を示している。ソラフェニブは数種類のキナーゼ(Raf、VEGF-R2、c-kit、PDGR-R)を阻害することが知られている。
【図８】図8は、0.1μg/mLのカルシトリオールの存在下(×)または非存在下(◆)におけるダサチニブの投与曲線を示している。ダサチニブはBCR/ABL Tyrキナーゼを阻害する。
【図９】図9は、0.1μg/mLのカルシトリオールの存在下(×)または非存在下(◆)におけるスタウロスポリンの投与曲線を示している。スタウロスポリンは、比較的非特異的なキナーゼ阻害剤である。
【図１０】図10は、0.1μg/mLのカルシトリオールの存在下(×)または非存在下(◆)におけるシスプラチンの投与曲線を示している。シスプラチンはDNAアルキル化剤である。
【図１１】図11は、0.1μg/mLのカルシトリオールの存在下(×)または非存在下(◆)におけるカルボプラチンの投与曲線を示している。カルボプラチンもまたDNAアルキル化剤である。
【図１２】図12は、0.1μg/mLのカルシトリオールの存在下(×)または非存在下(◆)におけるイリノテカンの投与曲線を示している。
【図１３】図13は、0.1μg/mLのカルシトリオールの存在下(×)または非存在下(◆)におけるパクリタキソールの投与曲線を示している。
【図１４】図14は、0.1μg/mLのカルシトリオールの存在下(×)または非存在下(◆)における5-FUの投与曲線を示している。
【図１５】図15は、0.1μg/mLのカルシトリオールの存在下(×)または非存在下(◆)におけるゲムシタビンの投与曲線を示している。
【図１６】図16は、0.1μg/mLのカルシトリオールの存在下(×)または非存在下(◆)におけるドキソルビシンの投与曲線を示している。
【図１７】図17は、0.1μg/mLのカルシトリオールの存在下(×)または非存在下(◆)におけるタモキシフェンの投与曲線を示している。
【図１８】図18は、0.1μg/mLのカルシトリオールは正常な角化細胞HEKaを5-FUから保護したが、癌細胞に対する5-FUのED50値に明らかに影響を及ぼすことはなかった、ということを示している。
【図１９】図19は、カルシトリオールは癌細胞系SkBr-3に対するドキソルビシンの細胞毒性効果を明らかに変更することはなかったということを示している。
【図２０Ａ】図20Aは、エトポシドを与えているスプレイグダウリー(Sprague Dawley)ラットにおいては、カルシトリオールの局所製剤は化学療法誘発性脱毛症(CIA)から投与量依存的に保護したということを示している。左パネル：エトポシドのみを与えているラット；中央パネル：エトポシドおよび局所製剤中0.1μgのカルシトリオールの局所適用を施しているラット；右パネル：エトポシドおよび局所製剤中0.3 mgのカルシトリオールの局所適用を施しているラット。
【図２０Ｂ】図20Bは、着色したロングエバンス(Long Evans)ラットにおける同様の結果を示している。
【図２１】図21は、カルシトリオール局所製剤(総投与量0.2μg)はロングエバンス・ラットをシクロホスファミド(CTX)誘発性脱毛症から保護したということを示している。
【図２２Ａ】図22Aは、カルシトリオール局所製剤(総投与量0.2μg)はロングエバンス・ラットをCTX-ドキソルビシン併用化学療法誘発性脱毛症から保護したということを示している。
【図２２Ｂ】図22Bは、シタラビン-ドキソルビシン併用化学療法により処理したラットにおける、併用化学療法誘発性脱毛症からのカルシトリオール局所製剤中のカルシトリオールによる同様の保護結果を示している。
【図２２Ｃ】シタラビン単独で処理したラットにおけるカルシトリオール局所製剤の保護効果を図22Cに示す。
【図２３】図23は、局所用のカルシトリオール局所製剤(総投与量0.2μg)はMIAC51(緑色白血病細胞)を注射したロングエバンス・ラットをCTX誘発性脱毛症から保護したということを示している。
【図２４】図24は、MIAC51(緑色白血病細胞)を注射したロングエバンス・ラットに行ったin vivo実験では、カルシトリオール局所製剤は癌細胞を化学療法から保護しなかったということを示している。
【図２５Ａ】図25Aは、ミニブタ表皮の角質層および該表皮の残りの部分から回収したカルシトリオールの推定レベル(ng/mg)を示している。その量は回収したカルシトリオールの平均値±SDで表されている。nd = 不検出、na = 該当なし。
【図２５Ｂ】図25Bは、ミニブタ表皮の角質層および該表皮の残りの部分から回収したカルシトリオールの推定レベル(ng/mg)を示している。その量は回収したカルシトリオールの平均値±SDで表されている。nd = 不検出、na = 該当なし。
【図２６】図26は、3〜100μg／mLで適用したカルシトリオール濃度の範囲における、適用したカルシトリオールの投与量と表皮内に回収されたカルシトリオール組織レベルとの間の線形に近い相関を示している。
【図２７】図27は、シクロホスファミドを与えている緑色白血病ラットの第1成長期過程に対するカルシトリオールの効果を例示したものである。図27Aはシクロホスファミドを単独で与えているラットを描写したものである。図27Bはシクロホスファミドおよびビヒクルを与えているラットを描写したものであり、図27Cはシクロホスファミドおよびカルシトリオールを与えているラットを描写したものである。
【図２８】図28は、シクロホスファミドを与えている緑色白血病ラットの第2成長期過程に対するカルシトリオールの効果を例示したものである。左から右に向かって、シクロホスファミド単独で処理したラット、シクロホスファミドおよびビヒクルで処理したラット、ならびにシクロホスファミドおよびカルシトリオールで処理したラットである。
【図２９】図29は、シクロホスファミドをドキソルビシンと一緒に与えている緑色白血病ラットの第1成長期過程に対するカルシトリオールの効果を例示したものである。図29Aはシクロホスファミドおよびドキソルビシンだけを与えているラットを描写したものであり、図29Bはシクロホスファミド、ドキソルビシンおよびビヒクルを与えているラットを描写したものであり、図29Cはシクロホスファミド、ドキソルビシンおよびカルシトリオールを与えているラットを描写したものである。
【図３０】図30は、シクロホスファミドをドキソルビシンと一緒に与えている緑色白血病ラットの第2成長期過程に対するカルシトリオールの効果を例示したものである。左から右に向かって、シクロホスファミドおよびドキソルビシンだけで処理したラット、シクロホスファミド、ドキソルビシンおよびビヒクルで処理したラット、ならびにシクロホスファミド、ドキソルビシンおよびカルシトリオールで処理したラットである。
【図３１】図31は、シクロホスファミドをドキソルビシンおよびシタラビンと一緒に与えている緑色白血病ラットの第1成長期過程に対するカルシトリオールの効果を例示したものである。図31Aはシクロホスファミド、ドキソルビシンおよびシタラビンだけを与えているラットを描写したものであり、図31Bはシクロホスホルアミド、ドキソルビシン、シタラビンおよびビヒクルを与えているラットを描写したものであり、図31Cはシクロホスファミド、ドキソルビシン、シタラビンおよびカルシトリオールを与えているラットを描写したものである。
【図３２】図32は、シクロホスファミドをドキソルビシンおよびシタラビンと一緒に与えている緑色白血病ラットの第2成長期過程に対するカルシトリオールの効果を例示したものである。左から右に向かって、シクロホスファミド、ドキソルビシンおよびシタラビンだけで処理したラット、シクロホスファミド、ドキソルビシン、シタラビンおよびビヒクルで処理したラット、ならびにシクロホスファミド、ドキソルビシン、シタラビンおよびカルシトリオールで処理したラットである。
【図３３】図33は、シクロホスファミドをパクリタキソールおよびエトポシドと一緒に与えている緑色白血病ラットの第1成長期過程に対するカルシトリオールの効果を例示したものである。図33Aは、シクロホスファミド、パクリタキセルおよびエトポシドだけを与えているラットを描写したものであり、図33Bはシクロホスホルアミド、パクリタキセル、エトポシドおよびビヒクル与えているラットを描写したものであり、図33Cはシクロホスファミド、パクリタキセル、エトポシドおよびカルシトリオールを与えているラットを描写したものである。
【図３４】図34は、シクロホスファミドをパクリタキセルおよびエトポシドと一緒に与えている緑色白血病ラットの第2成長期過程に対するカルシトリオールの効果を例示したものである。左から右に向かって、シクロホスファミド、パクリタキセルおよびエトポシドだけで処理したラット、シクロホスファミド、パクリタキセル、エトポシドおよびビヒクルで処理したラット、ならびにシクロホスファミド、パクリタキセル、エトポシドおよびカルシトリオールで処理したラットである。
【図３５】図35は、ドキソルビシンをパクリタキセルおよびエトポシドと一緒に与えた緑色白血病ラットの第1成長期過程に対するカルシトリオールの効果を例示したものである。図35Aはドキソルビシン、パクリタキセルおよびエトポシドだけを与えているラットを描写したものであり、図35Bはドキソルビシン、パクリタキセル、エトポシドおよびビヒクルを与えているラットを描写したものであり、図35Cはドキソルビシン、パクリタキセル、エトポシドおよびカルシトリオールを与えているラットを描写したものである。
【図３６】図36は、ドキソルビシンをパクリタキソールおよびエトポシドと一緒に与えている緑色白血病ラットの第2成長期過程に対するカルシトリオールの効果を例示したものである。左から右に向かって、ドキソルビシン、パクリタキソールおよびエトポシドだけで処理したラット、ドキソルビシン、パクリタキソール、エトポシドおよびビヒクルで処理したラット、ならびにドキソルビシン、パクリタキソール、エトポシドおよびカルシトリオールで処理したラットである。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
発明の詳細な説明
本明細書中に記載した発明は、脱毛症(例えば、化学療法誘発性脱毛症)を予防または治療しうるビタミンD化合物の局所製剤を、深部真皮層への送達および／または蓄積を実質的に回避しつつ皮膚の表皮層に選択的に送達または蓄積させることができるという発見に一部基づいている。このことは、ビタミンD化合物の深部蓄積により化学療法レジメンの効力が低下しかねない、化学療法治療を受けている特定の患者において有利な場合がある。また、かかる局所製剤は、腎臓結石を患っている患者などの、過剰量のビタミンD化合物の存在により悪影響を受ける可能性がある病状を有する患者、および特定のビタミンD化合物によるカルシウム動員でその症状が悪化する可能性がある患者においても有利な場合がある。従って、かかる患者においては、ビタミンD化合物の理想的な送達は、血管に富む真皮層ではなく皮膚の表皮層への最少有効投与量の局部的な送達であろう。
【００５４】
また本発明は、ビタミンD化合物が比較的低い濃度／投薬量で正常な角化細胞に対して穏やかな成長刺激効果を呈するが、比較的高い濃度／投薬量では同じ細胞に対して成長抑制効果を呈するという発見にも一部基づいている。従って、本発明は、望ましくない成長抑制効果をもたらすことなく脱毛症からの最適な保護効果を呈する方法および医薬組成物を提供する。
【００５５】
本発明はさらに、ビタミンD化合物が正常な角化細胞において多数の標的遺伝子の発現を活性化または抑制するという発見に基づいており、ひいては特定の治療用途に最も適したビタミンD化合物を選択するための基礎、および同様の生物学的活性を持つ追加のビタミンD類似体を同定するための基礎を提供する。
【００５６】
いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明の製剤は、化学療法薬への薬物干渉(drug interference)を最小限に抑えるという点で有利な場合がある。皮膚の真皮層は血管に富み、この層への局所的な薬物の浸透は全身に送達された化学療法薬への薬物干渉を引き起こし、結果として癌細胞に好ましくない保護効果をもたらす可能性がある。
【００５７】
従って、一つの態様において、本発明は、個体において脱毛症を予防または治療する方法であって、該個体に、真皮への送達および／または蓄積を実質的に回避しつつ表皮に送達および／または蓄積されるように製剤化されたビタミンD化合物を治療上有効な量で含む医薬組成物を局所的に投与することを含む該方法を提供する。
【００５８】
「真皮への送達および／または蓄積を実質的に回避」という用語には、表皮へのビタミンD化合物の送達および／または蓄積と比較すると該ビタミンD化合物の真皮への送達および／または蓄積は約25％未満であること、例えば、表皮に送達される量と比較した場合の真皮へのビタミンD化合物の送達および／または蓄積は約20％未満、約15％未満、約10％未満、約5％未満、約1％未満であるかまたは無い、ということが含まれる。幾つかの実施形態では、表皮への送達および／または蓄積と比較すると、ビタミンD化合物の約1％〜25％、例えば、約1％〜約20％、約1％〜約15％、約1％〜約10％または約1％〜約5％が真皮に送達および／または蓄積される。幾つかの実施形態では、ビタミンD化合物は真皮には送達および／または蓄積されない。幾つかの実施形態では、真皮に送達されるかまたは蓄積されるビタミンD化合物の量は、約0.3 ng／cm2未満、約0.2 ng／cm2未満または約0.1 ng／cm2未満である。
【００５９】
「脱毛症」という用語には、個体の頭部または身体からの不随意の完全または部分的な毛髪の脱落が含まれ、例として円形脱毛症(AA)、全頭脱毛症(AT)、汎発性脱毛症(AU)、または化学療法誘発性脱毛症(CIA)が挙げられる。円形脱毛症としては、びまん性円形脱毛症、単発型円形脱毛症、多発型円形脱毛症、および髭円形脱毛症を挙げることができる。幾つかの実施形態では、脱毛症に男性型脱毛症(アンドロゲン性脱毛症(alopecia androgenetica)、もしくは男性型禿頭症(male baldness))または化学療法後の脱毛症(PCA)は含まない。
【００６０】
脱毛症は、頭部または身体からの毛髪脱落の医学的描写であり、禿頭症程度までを指す場合もある。一般的な体毛の美的脱毛と違って、脱毛症、例えば、アンドロゲン性脱毛症(androgenic alopecia)は不随意なものであって歓迎されない傾向にある。しかし、脱毛症は自らの毛髪を引き抜きたいという心理的な強迫衝動(抜毛症)あるいは自発的なヘアスタイリング手順の予期せぬ結果(きつ過ぎるポニーテールもしくは編みこみによって生じる無意識の「牽引性脱毛症」、または苛性縮毛矯正溶液もしくは熱いヘアアイロンによって生じる頭皮の火傷)により引き起こされる場合もある。時として、脱毛症が鉄欠乏症などの潜在的な医学的関心事の徴候である場合もある。
【００６１】
毛髪脱落が一部だけに生じる場合、その毛髪脱落は「円形脱毛症」として知られている。ヒトの円形脱毛症では、毛髪は身体の数カ所または全ての面から、通常は頭皮から脱落する。頭皮上に禿げた箇所が生じるため、特に初期の段階では、部分禿頭(spot baldness)と呼ばれることがある。症例の1％〜2％では、その症状が頭皮全体(全頭脱毛症)または表皮全体(汎発性脱毛症)に広がる可能性がある。
【００６２】
AAに似ており、かつ同様の原因がある症状は、他の種でも生じる。最も一般的なタイプの円形脱毛症は、頭皮上の1つ以上の円形箇所における毛髪の脱落を伴う。頭皮全体にわたってよりびまん性に毛髪が脱落する場合もあり、この場合、この症状はびまん性円形脱毛症と呼ばれる。単発型円形脱毛症は、頭部のどこにでも生じうる1箇所のみの禿頭症を言い表している。多発型円形脱毛症は、多数の面の毛髪脱落を指す。この疾患は髭だけに限定されることもあり、その場合は髭円形脱毛症と呼ばれる。もし個体が彼／彼女の頭皮上の毛髪全てを失ったならば、この疾患は全頭円形脱毛症と呼ばれる。
【００６３】
「汎発性脱毛症」は、身体上の完全な毛髪脱落が起きた場合であり、化学療法に関連する毛髪脱落がしばしば全身を冒すその様式と似ている。
【００６４】
「アンドロゲン性脱毛症」(男性型脱毛症または男性ホルモン性脱毛症としても知られる)は、雌雄両方のヒト、チンパンジー、およびオランウータンにおける毛髪脱落の一般的な形態である。雄のヒトの場合は特に、この症状は一般に男性型禿頭症としても知られている。毛髪は、両側頭部の上部で始まる明確に定義されたパターンで脱落する。時間と共に生え際が後退して特徴的な「M」字形になる。また、毛髪は頭頂部においても薄くなる。多くの場合は頭の側面および後部周辺の毛髪の縁が残るが、そうでなければこの症状が進行して完全な禿頭になることがある。女性における毛髪脱落パターンは男性型禿頭症とは異なる。女性の場合、毛髪が頭部全体にわたって薄くなり、生え際は後退しない。女性におけるアンドロゲン性脱毛症が完全な禿頭をもたらすことは滅多にない。
【００６５】
「脱毛症を予防する」という用語には、脱毛症に関連する毛髪脱落をその発生前に阻止または抑制することが含まれる。
【００６６】
「脱毛症を治療する」という用語には、脱毛症に関連する毛髪脱落の重症度を軽減すること、または脱毛症に関連する毛髪脱落の範囲を縮小することが含まれる。幾つかの実施形態では、脱毛症を治療する例として脱毛症の改善が挙げられる。
【００６７】
「投与する」という用語には、ビタミンD化合物の1回分または複数回分の投与量を、脱毛症を予防または治療するのに有効な量として個体に提供することが含まれる。ビタミンD化合物の所定の投与プロトコルのための最適な投与速度は、使用する具体的な化合物、製剤化する特定の組成物、適用の様式、特定の投与部位などに関して行う従来の投薬量決定試験を利用して当業者が確認することができる。
【００６８】
「局所的に投与する」という用語には、ビタミンD化合物の1回分または複数回分の投与量を脱毛症を治療または予防するのに有効な量として個体の皮膚に送達することが含まれる。
【００６９】
皮膚は多くの特殊な細胞および構造を包含しており、環境と相互作用する防護壁としての働き、適当な体温を維持するための支援、環境からの感覚情報の収集、および免疫系における積極的な役割の遂行などの多様で重要な機能を有している。
【００７０】
皮膚は3つの層-表皮、真皮、および皮下組織を有する。表皮は皮膚の外層である。その厚みは種々のタイプの皮膚間で異なる。表皮はまぶた上が最も薄く約0.05 mmであり、手のひら上と足の裏上では最も厚く約1.5 mmである。底部から上部に向かって、表皮は以下の5つの層：基底層、有棘層、顆粒層、淡明層(一部の皮膚に見られる)、および角質層、を包含している。
【００７１】
基底層は表皮内の角化細胞の底層であり、表皮細胞の絶え間ない再生に関与している。この層は、かなり頻繁に分裂するたった1列の未分化円柱幹細胞を含有している。該細胞のうち半分は分化して次の層へ移動し、成熟過程に入る。残り半分は基底層に留まり、繰り返し分裂することで該基底層を補充する。有棘層(有棘細胞層とも呼ばれる)内に移動した細胞は、円柱状から多角形に変化する。この層で、細胞はケラチンを合成し始める。顆粒層内の細胞はその核を失っており、暗色の細胞質材料塊を特徴とする。この層では、ケラチンタンパク質および防水性の脂質が生成されかつ組織化されるため、多くの活動が見られる。淡明層は厚い皮膚内にのみ存在し、そこで角質層と顆粒層の間の摩擦および剪断力を減らすのに役立っている。角質層内の細胞は角質細胞として知られている。これらの細胞は平たく押し潰されていて、この角質層に強度を与えるが水の吸収も可能とするケラチンタンパク質で主に構成されている。角質層の構造は単純に見えるが、この層は皮膚の統合性と水和の維持という非常に重要な機能に関与している。
【００７２】
真皮もまた皮膚の部位に応じて厚みが異なる。真皮はまぶた上で約0.3 mmであり、背中上では約3.0 mmである。真皮は、至る所に存在する(層状ではない)3種類の組織：膠原質、弾性組織、および細網繊維から構成されている。真皮の2つの層は乳頭層および網状層である。上部乳頭層は、疎らな配列の膠原繊維を含有している。下部網状層はもっと厚みがあり、皮膚の表面に対して平行に並んだ太い膠原繊維でできている。真皮は多くの特殊な細胞および構造を含有している。例えば、血管および神経はこの層の中を通る。毛包もまた、各毛包に結合している立毛筋と共にこの層内に位置している。毛包の一部は、損傷を受けた表皮を再生させる能力を持つ幹細胞も含有している。幹細胞は真皮-表皮接合部(DEJ)に存在しうる。皮脂(油)腺およびアポクリン(体臭)腺は毛包と関連している。またこの層はエクリン(汗)腺も含有しているが、この腺は毛包とは関連していない。皮下組織は、より大きな血管および神経を収容している脂肪と結合組織との層である。この層は皮膚そのものと身体の温度調節において重要である。この層のサイズは身体各所で異なり、人によっても異なる。
【００７３】
従って、本明細書中で使用する場合、「表皮」には、表皮と真皮の間の接合層(例えば、真皮-表皮接合部すなわちDEJ)、ならびに表皮層を再生させる幹細胞(例えば、毛包(follicular)幹細胞および表皮幹細胞)を含むその5層全て(存在するならば)が含まれる。
【００７４】
幾つかの実施形態では、ビタミンD化合物は、真皮内への送達および／または蓄積を実質的に回避しつつ表皮内に局所的に送達および／または蓄積される。本明細書中で使用する場合、「真皮への送達および／または蓄積を実質的に回避」という用語には、真皮へのビタミンD化合物の約20％、約15％、約10％、約5％または約0％未満の送達／蓄積が含まれる。好適な実施形態では、真皮へのビタミンD化合物の検出可能な送達／蓄積は認められない。
【００７５】
特定の実施形態では、本発明のビタミンD化合物を個体に約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約8日、約9日、約10日、約11日、約12日、約13日、約2週、約3週、約4週、約6週、約8週、約3ヶ月、約4ヶ月、約5ヶ月、約6ヶ月、約7ヶ月、約8ヶ月、約9ヶ月、約10ヶ月、約11ヶ月または約1年にわたって投与する。幾つかの実施形態では、本発明のビタミンD化合物を、治療期間中毎日、または2日に一度、または3日に一度投与しうる。
【００７６】
特定の実施形態では、本発明のビタミンD化合物を各治療日に1日1回、1日2回、または1日3回投与する。
【００７７】
特定の実施形態では、本発明のビタミンD化合物の各投与を個体の同じ部位、または幾つかの異なる部位に適用する。異なる部位に適用する場合、各部位に対する投与量は同じであっても、または皮膚の厚みおよび(もしあれば)薬物浸透の差などの因子を基に調整してもよい。
【００７８】
特定の実施形態では、化学療法の開始の際に生じうるあらゆるCIAを予防するかまたはその重症度を軽減するために、本発明のビタミンD化合物を化学療法の開始前に2週間連続して毎日1日2回頭皮に局所的に投与する。
【００７９】
「個体」という用語には、脱毛症を患う能力を有する動物が含まれる。ある実施形態では、個体は哺乳動物、例えば、ネコ、イヌ、霊長類動物、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタなどである。幾つかの実施形態では、前記哺乳動物は霊長類動物、例えば、チンパンジー、ヒト、ゴリラ、ボノボ、オランウータン、サルなどである。さらに別の実施形態では、前記哺乳動物はヒトである。
【００８０】
幾つかの実施形態では、前記個体は化学療法治療を受けているかまたは受けようとしている。ある実施形態では、前記個体は投与前にまだ脱毛症の症候を示していないか、またはまだ脱毛症が始まっていない。幾つかの他の実施形態では、前記個体は癌を患っている。
【００８１】
別の態様では、本発明は、個体において脱毛症を予防または治療するために治療上有効な量のビタミンD化合物を含む医薬組成物を該個体に局所的に投与することにより、同時投与した化学療法剤の効力に実質的に干渉するかまたはその効力を低下させることなく、該個体において脱毛症を予防または治療する方法を提供する。
【００８２】
幾つかの実施形態では、本発明の方法および医薬組成物は、化学療法、特に全身化学療法の効力を実質的に低下させることはない。他の実施形態では、本発明の方法および医薬組成物は化学療法の効力を増強する。「同時投与した化学療法剤の効力に干渉することなく」という用語には、ビタミンD化合物が、1種以上の化学療法剤と共に投与された場合に、その1種以上の化学療法剤の生物学的もしくは治療的活性を中断しないか、またはその1種以上の化学療法剤がその望ましい生物学的もしくは治療的活性を発揮するのを阻止しないという状況が含まれる。「同時投与した化学療法剤の効力を低下させることなく」という用語には、ビタミンD化合物が、1種以上の化学療法剤と共に投与した場合に、その1種以上の化学療法剤の生物学的または治療的活性を減少させないという状況が含まれる。
【００８３】
本発明の方法および医薬組成物は、毛包もしくは真皮乳頭に対する細胞毒性効果を有するか、または他の様式で脱毛症を誘発することができる任意の化学療法剤または複数の化学療法剤の組み合わせと共に使用してもよい。「化学療法剤」、「化学療法」、および「化学療法レジメン」という用語には、アントラサイクリン系薬剤(アドリアマイシン／ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン)、5-FU、タモキシフェン、イリノテカン、パクリタキセル(タキソール)、カルボプラチン、エトポシド、シトキサン／シクロホスファミド、シスプラチン、エルロチニブ(タルセバ)、ベバシズマブ、ゲムシタビン、スタウロスポリン、ビンクリスチン、イマチニブ(グリーベック)、ゲフィチニブ(イレッサ)、ソラフェニブ、ダサチニブ、ダクチノマイシン、ヘキサメチルメラミン(HMM、アルトレタミン)、イホスファミド、ブレオマイシン、メトトレキサート、ドセタキセル(タキソテール)、ビンデシン、ビノレルビン、トポテカン、アムサクリン、シタラビン、ブスルファン、メルファラン、ビンブラスチン、ロムスチン(CCNU)、チオテパ、ゲムシタビン、カルムスチン(BCNU)、ミトキサントロン、マイトマイシンC、プロカルバジン、6-メルカプトプリン、ストレプトゾトシン、フルダラビン、ラルチトレキセド(トムデックス)、カペシタビン、およびこれらの等価物が含まれる。
【００８４】
幾つかの実施形態では、前記化学療法は全身化学療法である。
【００８５】
本発明の方法および医薬組成物は、化学療法、特に全身化学療法の効力を実質的に低下させないことが好ましい。好ましくは、本発明の方法および医薬組成物は化学療法の効力を増強する。
【００８６】
また本発明の方法および医薬組成物は、毛髪の菲薄化(hair thinning)を引き起こしうる任意のホルモン療法または生物学的療法と共に使用してもよい。
【００８７】
幾つかの実施形態では、ビタミンD化合物を化学療法剤と同時投与する。「化学療法剤と同時投与」という用語には、化学療法剤と実質的に同じ時期でのビタミンD化合物の投与が含まれる。例えば、ビタミンD化合物を化学療法剤と同時投与してもよいし；ビタミンD化合物を最初に投与し、その直後に化学療法剤を投与してもよいし、または化学療法薬を最初に投与し、その直後にビタミンD化合物を投与してもよい。
【００８８】
幾つかの他の実施形態では、ビタミンD化合物を、脱毛症の発生前に(例えば、毛髪の脱落前に)個体に投与する。特定の実施形態では、ビタミンD化合物を、化学療法の開始後であるが脱毛症の発症前に個体に投与する。他の実施形態では、個体はまだ脱毛症の症候を示していない(例えば、脱毛症がまだ始まっていない)。ビタミンD化合物を化学療法前か化学療法と同時に前記個体に投与してもよい。
【００８９】
「治療上有効な量」という用語には、個体において脱毛症を予防または治療するのに必要であるかまたは十分であるビタミンD化合物の量が含まれる。有効な量は、被験体の大きさおよび重量、病気の種類などといった因子によって異なる可能性がある。当業者であれば、過度の実験を行うことなしに、前述の因子について検討し、前記ビタミンD化合物の有効な量に関して決定を下すことができるであろう。
【００９０】
本発明のビタミンD化合物は、該ビタミンD化合物を必要とする個体に、約0.001μg〜5μgのカルシトリオール／cm2に相当する投薬量で局所的に投与しうる。特定の実施形態では、その範囲は約0.01μg〜0.5μgのカルシトリオール／cm2、または約0.1μg〜0.5μgのカルシトリオール／cm2である。
【００９１】
「カルシトリオールに相当する投薬量」という用語には、0.001μg〜5μgのカルシトリオール／cm2の場合の生物学的および／または治療的活性と実質的に同様の生物学的および／または治療的活性を有するビタミンD化合物の量が含まれる。
【００９２】
「有効濃度」という用語には、局所製剤中の、個体において脱毛症を予防または治療するのに必要であるかまたは十分であるビタミンD化合物の濃度が含まれる。特定の実施形態では、局所製剤中のビタミンD化合物の濃度は、約0.1、0.2、0.5、1.0、2、3、5、10、20、30、50、75、100、150、200、または400μg/mLである。
【００９３】
特定の実施形態では、ビタミンD化合物の総投与量は、約0.025〜400μgのカルシトリオール／体重75 kgに相当する。特定の実施形態では、その範囲は約0.1〜100μgのカルシトリオール／体重75 kg；約0.4〜25μgのカルシトリオール／体重75 kg；または約1、2、3、5、もしくは10μgのカルシトリオール／体重75 kgである。特定の実施形態では、より低い範囲の総投与量は、約0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、または2μgのカルシトリオール／体重75 kgに相当する。特定の実施形態では、高い範囲の総投与量は、約400、200、100、50、25、10、5、2、または1μgのカルシトリオール／体重75 kgに相当する。
【００９４】
さらに別の態様では、本発明は、治療上有効な量のビタミンD化合物を含む医薬組成物を個体に局所的に投与することにより該個体において脱毛症を予防または治療する方法であって、ここで該ビタミンD化合物は、該個体に以下(1)または(2)の有効濃度で局所的に投与した場合、(1)約50μg/mLでは少なくとも約25日間連続して薬物を投与した後に毒性を生じず、または(2)約100μg/mLでは少なくとも約7日間連続して薬物を投与した後に毒性を生じない、前記方法を提供する。
【００９５】
ビタミンD化合物の投与により引き起こされる可能性のある毒性副作用としては、例えば、食欲不振、骨痛、疲労、嘔吐、下痢、便秘、多尿、掻痒、腎不全、口内の金属味、タンパク尿、尿円柱、窒素尿または石灰転移を含む症候を有する高カルシウム血症が挙げられる。
【００９６】
幾つかの実施形態では、前記ビタミンD化合物は、真皮内への送達および／または蓄積を実質的に回避しつつ、ヒト表皮内、特に頭皮または頸部領域の表皮内に送達および／または蓄積されるように製剤化される。当業者であれば、実施例1を利用して、真皮および／もしくは表皮に送達／蓄積されるビタミンD化合物の量、またはその不足を容易に測定することができるであろう。
【００９７】
「ビタミンD化合物」という用語には、式I：
【化７】
0005978130.tif 000008
【００９８】
〔式中、
aおよびbは各々独立して単結合または二重結合であり；
Xはａが二重結合である場合に-CH2であり、またはXはaが単結合である場合に水素もしくはヒドロキシル置換アルキルであり；
R1は、1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、トリ-アルキルシリル、アルコキシル、ヒドロキシルまたは水素であり；
R2は、水素、ヒドロキシル、-O-トリアルキルシリル、または1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシルもしくはアルケニルであり；
R3はbが二重結合である場合に存在せず、またはbが単結合である場合に、R3は水素、ヒドロキシルもしくはアルキルであるか、またはR3およびR1は、それらが結合している炭素原子と共に連結して5〜7員の炭素環を形成していてもよく；
R4はbが二重結合である場合に存在せず、またはbが単結合である場合に水素、ハロゲンもしくはヒドロキシルであり；
R5はaが二重結合である場合に存在せず、またはR5はaが単結合である場合に水素、ハロゲンもしくはヒドロキシルであり；
R6は、1〜5個のヒドロキシル、オキソ、ハロゲン、アルコキシル、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ニトロまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルキル-O-アルキル、アルキル-CO2-アルキルであり；
R7は、1〜3個のヒドロキシル、ハロゲン、アルコキシル、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ニトロまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキルであり；かつ、
R’およびR”は各々、独立して、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、アルキルまたはアルコキシルである〕
の化合物または製薬上許容しうるその塩が含まれる。
【００９９】
幾つかの実施形態では、R1はヒドロキシルであり、R2は水素またはヒドロキシルであり、aは二重結合であり、R5は存在せず、Xは-CH2であり、bは二重結合であり、R3およびR4は存在せず、R6はアルキル(例えば、メチル)であり、かつR7はアルキル(例えば、置換もしくは非置換アルキル、例えば、-(CH2)3CH(CH3)2もしくは-(CH2)3COH(CH3)2などのヒドロキシル置換アルキルもしくはシクロアルキル置換アルキル)またはアルケニル(例えば、-CH=CHCH(CH3)CH(CH3)2)である。
【０１００】
特定の実施形態では、前記ビタミンD化合物は、化学式(II)：
【化８】
0005978130.tif 000009
【０１０１】
〔式中、
cは単結合または二重結合であり；
R1aは、1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、トリ-アルキルシリルまたは水素であり；
R2aは、水素、ヒドロキシル、-O-トリアルキルシリル、または1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシルもしくはアルケニルであり；
R3aおよびR4aは、cが二重結合である場合に存在せず、またはcが単結合である場合に各々独立して、1〜3個のヒドロキシルもしくはハロゲン部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシル、ハロゲン、ヒドロキシルもしくは水素であり
R3b、R4b、R5a、R6a、R7aおよびR8aは各々、独立して、1〜3個のヒドロキシルもしくはハロゲン部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシル、ハロゲン、ヒドロキシルもしくは水素であるか、またはR6a、R7aおよびR8aのうちのいずれか2つが連結して3〜7員の炭素環を形成していてもよい〕
で表される化合物および製薬上許容しうるその塩である。
【０１０２】
ある実施形態では、前記化合物は、R1a、R3aおよびR4aが各々水素である化学式(II)で表される。
【０１０３】
別の実施形態では、前記化合物は、cが単結合である化学式(II)で表される。
【０１０４】
さらに別の実施形態では、前記化合物は、R6aおよびR8aがいずれもメチルである化学式(II)で表される。
【０１０５】
ある実施形態では、前記化合物は、R1aが水素である化学式(II)で表される。
【０１０６】
別の実施形態では、前記化合物は、R2aがヒドロキシルである化学式(II)で表される。
【０１０７】
別の実施形態では、前記化合物は、R7aがヒドロキシルである化学式(II)で表される。
【０１０８】
さらに別の実施形態では、前記化合物は、R5aがヒドロキシルである化学式(II)で表される。
【０１０９】
ある実施形態では、R1aは水素であり、R2aは水素またはヒドロキシルであり、cは単結合であり、R3a、R3b、R4a、R4bおよびR5aは各々水素であり、R6aおよびR7aは各々アルキル(例えば、メチル)であり、かつR8aは水素またはヒドロキシルである。
【０１１０】
別の実施形態では、R1aは水素であり、R2aは水素またはヒドロキシルであり、cは二重結合であり、R3aおよびR4aは存在せず、R3bおよびR4bは水素であり、R5aはアルキル(例えば、メチル)であり、R6aおよびR7aは各々アルキル(例えば、メチル)であり、かつR8aは水素またはヒドロキシルである。
【０１１１】
ある実施形態では、前記ビタミンD化合物は、以下の構造体：
【化９】
0005978130.tif 000010
【０１１２】
またはその立体異性体もしくは製薬上許容しうる塩から選択される。
【０１１３】
特定の実施形態では、前記ビタミンD化合物は、1,25-ジヒドロキシビタミンD3；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-23-イン-コレカルシフェロール；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-イン-コレカルシフェロール；1α-ヒドロキシビタミンD3；1α,24-ジヒドロキシビタミンD3、またはMC903である。
【０１１４】
他の実施形態では、前記ビタミンD化合物は、1,25-ジヒドロキシビタミンD3；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-23-イン-コレカルシフェロール；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-イン-コレカルシフェロール；1α-ヒドロキシビタミンD3；1α,24-ジヒドロキシビタミンD3、またはMC903ではない。
【０１１５】
ビタミンD化合物の他の適切な類似体、代謝産物、誘導体および／または模倣物としては、例えば、1,25-ジヒドロキシビタミンD3(カルシトリオールとしても知られている)、1,25-ジヒドロキシ-16-エン-23-イン-コレカルシフェロール、ならびにビタミンD化合物の他のビタミンD類似体、同族体、模倣物、および誘導体、例えば、以下の特許(各文献はその全内容が参照により組み込まれるものとする)：米国特許第4,391,802号(1α-ヒドロキシビタミンD誘導体)；第4,717,721号(コレステロールまたはエルゴステロールの側鎖より17個長い側鎖を持つ1α-ヒドロキシ誘導体)；第4,851,401号(シクロペンタノ-ビタミンD 類似体)；第4,866,048号ならびに第5,145,846号(アルキニル、アルケニル、およびアルカニル側鎖を持つビタミンD3類似体)；第5,120,722号(トリヒドロキシカルシフェロール)；第5,547,947号(フルオロ-コレカルシフェロール化合物)；第5,446,035号(メチル置換ビタミンD)；第5,411,949号(23-オキサ-誘導体)；第5,237,110号(l9-ノル-ビタミンD化合物)；第4,857,518号(ヒドロキシル化24-ホモ-ビタミンD誘導体)に記載されているものが挙げられる。他の適切な具体例としては、ロカルトロール(ROCALTROL)(Roche Laboratories)；カルシジェックス(CALCIJEX)注射用カルシトリオール；Leo Phannaceuticalsからの治験薬、例えばEB 1089(24a,26a,27a,トリホモ-22,24-ジエン-1α,25-(OH)2-D3)、KH 1060(20-エピ-22-オキサ-24a,26a,27a-トリホモ1a,25-(OH)2-D3)、MC 1288(l,25-(OH)2-20-エピ-D3)およびMC903(カルシポトリオール、1a,24s(OH)2-22-エン-26,27-デヒドロ-D3)；1,25-(OH)2-16-エン-D3、1,25-(OH)2-16-エン-23-イン-D3、および25-(OH)2-16-エン-23-イン-D3を含むRoche Phannaceuticalの薬物；中外製薬の22-オキサカルシトリオール(22-オキサ-1α,25-(OH)2-D3；イリノイ大学からの1α-(OH)-D5；ならびにZK 161422(20-メチル-l,25-(OH)2-D3)およびZK 157202(20-メチル-23-エン-1,25-(OH)2-D3)を含むInstitute of Medical Chemistry-Schering AGからの薬物；1α-(OH)-D2；1α-(OH)-D3、1α-(OH)-D4、25-(OH)-D2；25-(OH)-D3；ならびに25-(OH)-D4が挙げられる。さらなる具体例としては、1α,25-(OH)2-26,27-d6-D3；1α,25-(OH)2-22-エン-D3；1α,25-(OH)2-D3；1α,25-(OH)2-D2；1α,25-(OH)2-D4；1α,24,25-(OH)3-D3；1α,24,25-(OH)3-D2；1α,24,25-(OH)3-D4；1α-(OH)-25-FD3；1α-(OH)-25-FD4；1α-(OH)-25-FD2；1α,24-(OH)2-D4；1α,24-(OH)2-D3；1α,24-(OH)2-D2；1α,24-(OH)2-25-FD4；1α,24-(OH)2-25-FD3；1α,24-(OH)2-25-FD2；1α,25-(OH)2-26,27-F6-22-エン-D3；1α,25(OH)2-26,27-F6-D3；1α,25S-(OH)2-26-F3-D3；1α,25-(OH)2-24-F2-D3；1α,25S,26-(OH)2-22-エン-D3；1α,25R,26-(OH)2-22-エン-D3；1α,25-(OH)2-D2；1α,25-(OH)2-24-エピ-D3；1α,25-(OH)2-23-イン-D3；1α,25-(OH)2-24R-F-D3；1α,25S,26-(OH)2-D3；1α,24R-(OH)2-25F-D3；1α,25-(OH)2-26,27-F6-23-イン-D3；1α,25R-(OH)2-26-F3-D3；1α,25,28-(OH)3-D2；1α,25-(OH)2-16-エン-23-イン-D3；1α,24R,25-(OH)3-D3；1α,25-(OH)2-26,27-F6-23-エン-D3；1α,25R-(OH)2-22-エン-26-F3-D3；1α,25S-(OH)2-22-エン-26-F3-D3；1α,2
5R-(OH)2-D3-26,26,26-d3；1α,25S-(OH)2-D3-26,26,26-d3；および1α,25R-(OH)2-22-エン-D3-26,26,26-d3が挙げられる。さらに別の具体例は、米国特許第6,521,608号(この特許文献の全開示内容は参照により本明細書中に組み込まれるものとする)中に見出すことができる。同様に、例えば、米国特許第6,503,893号、第6,482,812号、第6,441,207号、第6,410,523号、第6,399,797号、第6,392,071号、第6,376,480号、第6,372,926号、第6,372,731号、第6,359,152号、第6,329,357号、第6,326,503号、第6,310,226号、第6,288,249号、第6,281,249号、第6,277,837号、第6,218,430号、第6,207,656号、第6,197,982号、第6,127,559号、第6,103,709号、第6,080,878号、第6,075,015号、第6,072,062号、第6,043,385号、第6,017,908号、第6,017,907号、第6,013,814号、第5,994,332号、第5,976,784号、第5,972,917号、第5,945,410号、第5,939,406号、第5,936,105号、第5,932,565号、第5,929,056号、第5,919,986号、第5,905,074号、第5,883,271号、第5,880,113号、第5,877,168号、第5,872,140号、第5,847,173号、第5,843,927号、第5,840,938号、第5,830,885号、第5,824,811号、第5,811,562号、第5,786,347号、第5,767,111号、第5,756,733号、第5,716,945号、第5,710,142号、第5,700,791号、第5,665,716号、第5,663,157号、第5,637,742号、第5,612,325号、第5,589,471号、第5,585,368号、第5,583,125号、第5,565,589号、第5,565,442号、第5,554,599号、第5,545,633号、第5,532,228号、第5,508,392号、第5,508,274号、第5,478,955号、第5,457,217号、第5,447,924号、第5,446,034号、第5,414,098号、第5,403,940号、第5,384,313号、第5,374,629号、第5,373,004号、第5,371,249号、第5,430,196号、第5,260,290号、第5,393,749号、第5,395,830号、第5,250,523号、第5,247,104号、第5,397,775号、第5,194,431号、第5,281,731号、第5,254,538号、第5,232,836号、第5,185,150号、第5,321,018号、第5,086,191号、第5,036,061号、第5,030,772号、第5,246,925号、第4,973,584号、第5,354,744号、第4,927,815号、第4,804,502号、第4,857,518号、第4,851,401号、第4,851,400号、第4,847,012号、第4,755,329号、第4,940,700号、第4,619,920号、第4,594,192号、第4,588,716号、第4,564,474号、第4,552,698号、第4,588,528号、第4,719,204号、第4,719,205号、第4,689,180号、第4,505,906号、第4,769,181号、第4,502,991号、第4,481,198号、第4,448,726号、第4,448,721号、第4,428,946号、第4,411,833号、第4,367,177号、第4,336,193号、第4,360,472号、第4,360,471号、第4,307,231号、第4,307,025号、第4,358,406号、第4,305,880号、第4,279,826号、および第4,248,791号(これらの文献各々の全開示内容は参照により本明細書中に組み込まれるものとする)も参照されたい。
【０１１６】
利用しうるさらに別の化合物としては、米国特許第6,218,430号および国際公開公報第2005/037755号(これらの文献各々の全開示内容は参照により本明細書中に組み込まれるものとする)により開示されているビス-アリール誘導体などのビタミンD模倣物が挙げられる。本発明のための非セコステロイド性ビタミンD模倣化合物のさらなる具体例は、米国特許第6,831,106号；第6,706,725号；第6,689,922号；第6,548,715号；第6,288,249号；第6,184,422号、第6,017,907号、第6,858,595号、および第6,358,939号(各文献の全開示内容は、参照により本明細書中に組み込まれるものとする)中に見出すことができる。
【０１１７】
利用しうるさらに他の適切なビタミンD3の類似体、代謝産物、および／または誘導体としては、米国特許出願公開第2006/0177374号(その全開示内容は参照により本明細書中に組み込まれるものとする)において同定されているものが挙げられる。
【０１１８】
「ビタミンD類似体」という用語には、構造および機能の点でビタミンDと類似した化合物が含まれる。ある実施形態では、該ビタミンD類似体は、ビタミンD3類似体(例えば、構造および機能の点でビタミンD3と類似した化合物)である。
【０１１９】
「ビタミンD代謝産物」という用語には、ビタミンDの代謝に関連する中間体および生成物である化合物が含まれる。ある実施形態では、該ビタミンD代謝産物はビタミンD3代謝産物(例えば、ビタミンD3の代謝に関連する中間体または生成物である化合物)である。
【０１２０】
「ビタミンD誘導体」という用語には、親化合物(例えば、ビタミンD)から、1個の原子と別の原子または原子団との置き換えにより生じうる化合物が含まれる。ある実施形態では、該ビタミンD誘導体は、ビタミンD3誘導体(例えば、ビタミンD3から1個の原子と別の原子または原子団との置き換えにより生じうる化合物)である。
【０１２１】
「ビタミンD模倣物」という用語には、生物学的過程においてビタミンDを化学的に模倣しうる化合物が含まれる。ある実施形態では、該ビタミンD模倣物はビタミンD3模倣物(例えば、生物学的過程においてビタミンD3を化学的に模倣する化合物)である。
【０１２２】
ビタミンD3は魚肝油または照射酵母の摂取後に吸収される。植物性および動物性の供給源は、不活性なビタミンD前駆体である7-デヒドロコレステロールまたはエルゴステロールのみを含有している。7-デヒドロコレステロールは皮膚に貯蔵されており、日光によりビタミンD3へと転換される。しかし、摂取されたものであろうと紫外線照射により皮膚内に形成されたものであろうと、ビタミンDは活性代謝産物へと変換されなければならない。ビタミンD3は肝酵素により25-ヒドロキシコレカルシフェロールに転換される。その後、腎臓で2種の化合物1,25-ジヒドロキシコレカルシフェロールおよび24,25-ジヒドロキシコレカルシフェロールが形成される。ビタミンDの活性代謝産物は、腸管からのカルシウムの吸収、骨沈着および骨再吸収において重要な役割を果たしている。
【０１２３】
本発明のビタミンD化合物は、例えば正常な角化細胞(例えば、HEKa)において特定の標的遺伝子の発現をアップ-またはダウン-レギュレートするそれらの能力を一部介して、角化細胞においてアポトーシスを阻止する能力などの特定の共通する生物学的活性を共有している。このため、ある特定の実施形態では、本発明のビタミンD化合物は、例えば正常な角化細胞(例えば、HEKa)において、当量のカルシトリオールと同様または同一の遺伝子調節プロファイルを呈することがある。
【０１２４】
本明細書中で使用する場合、「当量(equivalent amount)」には、複数のビタミンD化合物が実質的に同一のモル量で実質的に同一であるかまたは等しい生物学的または治療的活性を有する場合のこの同一モル量が含まれる。しかし、異なるビタミンD化合物が生物学的または治療的活性の点で実質的に同一ではないかまたは等しくない場合は、「当量」という用語には標準ビタミンD化合物(例えば、カルシトリオール)と比較して実質的に同一の量の生物学的または治療的活性を与えるビタミンD化合物の量が含まれる。
【０１２５】
「遺伝子調節プロファイル」という用語には、適当な対照と比較して統計上有意に(例えば、p＜0.05)モジュレートされる(例えば、アップ-またはダウン-レギュレートされる)遺伝子の一覧またはスペクトルが含まれる。例えば、細胞をビタミンD化合物と所定の期間(例えば、24時間)接触させると、標的細胞は、偽(mock)／ビヒクル-処理対照と比較してそのmRNAまたはタンパク質の発現レベルがモジュレートされる(例えばアップ-またはダウン-レギュレートされる)遺伝子のスペクトルを示すことがある。検出の時点でモジュレートされている(例えば、アップ-またはダウン-レギュレートされている)遺伝子の一覧は、その特定の瞬間における細胞の遺伝子発現プロファイルのスナップショットとなる。
【０１２６】
「同様の遺伝子調節プロファイル」という用語には、調べた標的遺伝子の総数のうち50％、60％、70％、80％、90％より多いかまたはそれ以上の該標的遺伝子が実質的に同一方向の遺伝子発現を呈する(例えば、各遺伝子におけるアップ-またはダウン-レギュレーションの規模または程度は異なる場合があるものの、いずれもアップ-レギュレートされるか、またはいずれもダウン-レギュレートされる)という状況が含まれる。
【０１２７】
「同一の遺伝子調節プロファイル」という用語には、調べた標的遺伝子の殆ど全てが同一方向の遺伝子発現を呈する(各遺伝子におけるアップ-またはダウン-レギュレーションの規模または程度は異なる場合があるものの、いずれもアップ-レギュレートされるか、またはいずれもダウン-レギュレートされる)という状況が含まれる。
【０１２８】
ある実施形態では、本発明のビタミンD化合物は、その発現レベルが当量の標準ビタミンD化合物(例えば、カルシトリオール)により促進される1つ以上の標的遺伝子の発現を促進する。他の実施形態では、本発明のビタミンD化合物は、その発現レベルが当量の標準ビタミンD化合物(例えば、カルシトリオール)により抑制される1つ以上の遺伝子の発現を抑制する。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、本発明のビタミンD化合物は、正常な角化細胞においてタンパク質の発現をモジュレートしうる。「タンパク質の発現をモジュレートする」という用語には、正常な角化細胞におけるタンパク質のアップ-レギュレーションおよびダウン-レギュレーションが含まれる。幾つかの実施形態では、該ビタミンD化合物はHSPA2、HSF4 mRNA、HSPB1またはDNAJC6のmRNAの発現をモジュレートする。例えば、幾つかの実施形態では、該ビタミンD化合物は、正常な角化細胞(例えば、HEKa)においてHSPA2もしくはHSF4 mRNAの発現をアップ-レギュレートし、かつ／またはHSPB1もしくはDNAJC6 mRNAの発現をダウン-レギュレートする。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、本発明のビタミンD化合物は、正常な角化細胞においてSLC1A1、KCNB2、KCNN4タンパク質またはSLC1A3タンパク質の発現をモジュレートする。幾つかの実施形態では、該ビタミンD化合物は、正常な角化細胞(例えば、HEKa)においてSLC1A1、KCNB2、もしくはKCNN4タンパク質の発現をアップ-レギュレートし、かつ／またはSLC1A3タンパク質の発現をダウン-レギュレートしうる。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、本発明のビタミンD化合物は、表3-1および表3-2中の1つ以上のタンパク質をモジュレートしうる。例えば、ある実施形態では、該ビタミンD化合物は、例えば正常な角化細胞(例えば、HEKa)において、表3-1中の1つ以上のタンパク質の発現を少なくとも約2倍アップ-レギュレートし、かつ／または表3-2中の1つ以上のタンパク質の発現を少なくとも約2倍ダウン-レギュレートしうる。
【０１３２】
ある特定の実施形態では、本発明のビタミンD化合物は、該ビタミンD化合物に正常な角化細胞(例えば、HEKa)を約24時間曝露した後に、表3-3、3-4、3-5または3-6のいずれか1つに記載の1つ以上のタンパク質の過剰発現を誘導しうる。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、本発明のビタミンD化合物は、正常な角化細胞(例えば、HEKa)において以下：GST、ケラチン1、ケラチン17、ガレクチン1、S100 A9(カルプロテクチン)、またはS100 A13のうちの1つ以上の過剰発現を誘導しうる。
【０１３４】
本明細書中で使用する場合、「アルキル」という用語には、1〜20個の炭素原子、例えば、1〜7個の炭素原子、または1〜4個の炭素原子を含む完全に飽和した分岐または非分岐(例えば、直鎖状もしくは線状)の炭化水素部分が含まれる。アルキル部分の代表例としては、メチル、エチル、n-プロピル、イソ-プロピル、n-ブチル、sec-ブチル、イソ-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、n-ヘキシル、3-メチルヘキシル、2,2-ジメチルペンチル、2,3-ジメチルペンチル、n-ヘプチルが挙げられる。
【０１３５】
さらに、「アルキル」という用語には、「非置換アルキル」と「置換アルキル」の両方が含まれる。アルキル部分に対する置換基の代表例は、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、ハロゲンまたはアミノ(例えば、アルキルアミノ、ジ-アルキルアミノ、アリールアミノ、ジ-アリールアミノ)である。
【０１３６】
本明細書中で使用する場合、「アルコキシ」という用語には、アルキルが本明細書中で先に定義したものであるアルキル-O-が含まれる。アルコキシ部分の代表例としては、限定するものではないが、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、2-プロポキシ、ブトキシ、tert-ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、シクロプロピルオキシ-、シクロヘキシルオキシ-などが挙げられる。幾つかの実施形態では、アルコキシ基は約1〜7個の炭素、例えば1〜4個の炭素を有する。アルコキシという用語には、置換アルコキシが含まれる。置換アルコキシ基の具体例としてはハロゲン化アルコキシ基が挙げられる。ハロゲン置換アルコキシ基の具体例は、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、クロロメトキシ、ジクロロメトキシ、およびトリクロロメトキシである。
【０１３７】
「アルコキシアルキル」という用語には、先に定義したアルキル基であって、そのアルキル基がアルコキシで置換されているものが含まれる。さらに、「アルコキシアルキル」という用語には、「非置換アルコキシアルキル」と「置換アルコキシアルキル」の両方が含まれる。アルコキシアルキル部分に対する置換基の代表例としては、限定するものではないが、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、ハロゲンまたはアミノ(例えば、アルキルアミノ、ジ-アルキルアミノ、アリールアミノ、ジ-アリールアミノ)が挙げられる。
【０１３８】
「アルケニル」という用語には、少なくとも1個の炭素-炭素二重結合を有する分岐または非分岐の炭化水素が含まれる。アルケニル部分の代表例としては、限定するものではないが、ビニル、プロパ-1-エニル、アリル、ブテニル、イソプロペニルまたはイソブテニルが挙げられる。さらに、「アルケニル」という用語には、「非置換アルケニル」と「置換アルケニル」の両方が含まれる。アルケニル部分に対する置換基の代表例としては、限定するものではないが、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、ハロゲンまたはアミノ(例えば、アルキルアミノ、ジ-アルキルアミノ、アリールアミノ、ジ-アリールアミノ)が挙げらっれる。
【０１３９】
「アルキニル」という用語には、少なくとも1個の炭素-炭素三重結合を有する分岐または非分岐の炭化水素が含まれる。アルキニル部分の代表例としては、限定するものではないが、エチニル、プロパ-1-イニル(プロパルギル)、ブチニル、イソプロピニルまたはイソブチニルが挙げられる。さらに、「アルキニル」という用語には、「非置換アルキニル」と「置換アルキニル」の両方が含まれる。アルキニル部分に対する置換基の代表例としては、限定するものではないが、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、ハロゲンまたはアミノ(例えば、アルキルアミノ、ジ-アルキルアミノ、アリールアミノ、ジ-アリールアミノ)が挙げられる。
【０１４０】
本明細書中で使用する場合、「シクロアルキル」という用語には、3〜12個の炭素原子、例えば、3〜8個、または3〜7個の炭素原子を持つ飽和または不飽和の単環式、二環式または三環式炭化水素基が含まれる。典型的な単環式炭化水素基としては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシルおよびシクロヘキセニルが挙げられる。典型的な二環式炭化水素基としては、例えば、ボルニル、インジル、ヘキサヒドロインジル、テトラヒドロナフチル、デカヒドロナフチル、ビシクロ[2.1.1]ヘキシル、ビシクロ[2.2.1]ヘプチル、ビシクロ[2.2.1]ヘプテニル、6,6-ジメチルビシクロ[3.1.1]ヘプチル、および2,6,6-トリメチルビシクロ[3.1.1]ヘプチル、ビシクロ[2.2.2]オクチルが挙げられる。三環式炭化水素基の具体例としては、例えば、アダマンチルが挙げられる。
【０１４１】
「シクロアルキル」という用語には、「非置換シクロアルキル」と「置換シクロアルキル」の両方が含まれる。シクロアルキル部分に対する置換基の代表例としては、限定するものではないが、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、ハロゲンまたはアミノ(例えば、アルキルアミノ、ジ-アルキルアミノ、アリールアミノ、ジ-アリールアミノ)が挙げられる。
【０１４２】
「アリール」という用語には、環部分に6〜20個の炭素原子を有する単環式または二環式の芳香族炭化水素基が含まれる。アリール部分の代表例としては、限定するものではないが、フェニル、ナフチル、アントラシル、フェナントリルまたはテトラヒドロナフチルが挙げられる。さらに、「アリール」という用語には、「非置換アリール」と「置換アリール」の両方が含まれる。アリール部分に対する置換基の代表例としては、限定するものではないが、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、ハロゲンまたはアミノ(例えば、アルキルアミノ、ジ-アルキルアミノ、アリールアミノ、ジ-アリールアミノ)が挙げられる。
【０１４３】
「ヘテロアリール」という用語には、炭素原子およびO、NまたはSから選択される1〜5個のヘテロ原子から選択される5〜10個の環員を含有する単環式または二環式のヘテロアリール部分が含まれる。ヘテロアリール基の具体例としては、限定するものではないが、チエニル、フリル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサ-2,3-ジアゾリル、オキサ-2,4-ジアゾリル、オキサ-2,5-ジアゾリル、オキサ-3,4-ジアゾリル、チア-2,3-ジアゾリル、チア-2,4-ジアゾリル、チア-2,5-ジアゾリル、チア-3,4-ジアゾリル、3-,4-,または5-イソチアゾリル、2-,4-,または5-オキサゾリル、3-,4-,または5-イソキサゾリル、3-または5-1,2,4-トリアゾリル、4-または5-1,2,3-トリアゾリル、テトラゾリル、2-,3-,または4-ピリジル、3-または4-ピリダジニル、3-,4-,または5-ピラジニル、2-ピラジニル、2-,4-,または5-ピリミジニルが挙げられる。ヘテロアリール基は、単環式、二環式、三環式、または多環式でありうる。
【０１４４】
「ヘテロアリール」という用語にはさらに、そのヘテロ芳香環が1個以上のアリール環、脂環式の環、またはヘテロシクリル環と縮合している基であって、結合の基または位置がヘテロ芳香環上または縮合アリール環上にある基が含まれる。かかるヘテロアリール部分の代表例としては、限定するものではないが、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、インドリジニル、プリニル、キノリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、ベンズイソキノリニル、チエノ[2,3-b]フラニル、フロ[3,2-b]-ピラニル、5H-ピリド[2,3-d]-o-オキサジニル、1H-ピラゾロ[4,3-d]-オキサゾリル、4H-イミダゾ[4,5-d]チアゾリル、ピラジノ[2,3-d]ピリダジニル、イミダゾ[2,1-b]チアゾリル、イミダゾ[1,2-b][1,2,4]トリアジニル、7-ベンゾ[b]チエニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキセピニル、ベンゾオキサジニル、1H-ピロロ[1,2-b][2]ベンゾアゼピニル、ベンゾフリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾトリアゾリル、ピロロ[2,3-b]ピリジニル、ピロロ[3,2-c]ピリジニル、ピロロ[3,2-c]ピリジニル、ピロロ[3,2-b]ピリジニル、イミダゾ[4,5-b]ピリジニル、イミダゾ[4,5-c]ピリジニル、ピラゾロ[4,3-d]ピリジニル、ピラゾロ[4,3-c]ピリジニル、ピラゾロ[3,4-c]ピリジニル、ピラゾロ[3,4-d]ピリジニル、ピラゾロ[3,4-b]ピリジニル、イミダゾ[1,2-a]ピリジニル、ピラゾロ[1,5-a]ピリジニル、ピロロ[1,2-b]ピリダジニル、イミダゾ[1,2-c]ピリミジニル、ピリド[3,2-d]ピリミジニル、ピリド[4,3-d]ピリミジニル、ピリド[3,4-d]ピリミジニル、ピリド[2,3-d]ピリミジニル、ピリド[2,3-b]ピラジニル、ピリド[3,4-b]ピラジニル、ピリミド[5,4-d]ピリミジニル、ピラジノ[2,3-b]ピラジニル、またはピリミド[4,5-d]ピリミジニルが挙げられる。さらに、「ヘテロアリール」という用語には、「非置換ヘテロアリール」と「置換ヘテロアリール」の両方が含まれる。
【０１４５】
「アリール」または「ヘテロアリール」基の芳香環は、置換されていないものでも、または1ヶ所以上の環の位置において、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アルコキシ、シクロアルキルオキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、アリールアルキルオキシ、ヘテロアリールアルキルオキシ、ヘテロシクリルアルキルオキシ、ケトン(例えば、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アロイル、アリールアルキルカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル)、エステル(例えば、アルコキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロシクリルオキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、シクロアルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、ヘテロアリールカルボニルオキシ、ヘテロシクリルカルボニルオキシ)、カーボネート(例えば、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、ヘテロアリールオキシカルボニルオキシ)、カルバメート(例えば、アルコキシカルボキシルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノ、アルケニルオキシカルボニルアミノ、アルキニルオキシカルボニルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アルキルアミノカルボニルオキシ、ジ-アルキルアミノカルボニルオキシ、アリールアミノカルボニルオキシ)、カルバモイル(例えば、アルキルアミノカルボニル、ジ-アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アリールアルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル)、アミド(例えば、アルキルカルボニルアミノ、アルキルカルボニルアルキルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ)、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、アミノ(例えば、アルキルアミノ、ジ-アルキルアミノ、アリールアミノ、ジ-アリールアミノ、およびアルキルアリールアミノ)、スルホニル(例えば、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アリールアルキルスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アルコキシスルホニル、アリールオキシスルホニル、ヘテロアリールオキシスルホニル、シクロアルキルスルホニル、ヘテロシクリルスルホニル)、スルファモイル、スルホンアミド、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィナート、チオエーテル(例えば、アルキルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ)、ウレイド、イミノ、アミジノ、チオカルボキシル(例えば、アルキルチオカルボニル、アリールチオカルボニル)、スルフィニル(例えば、アルキルスルフィニル、アリールスルフィニル)、カルボキシルを含む置換基で置換されているものでもよく、ここで上記の各炭化水素基は1個以上のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ハロゲン、ヒドロキシまたはアルコキシ基で置換されていてもよい。
【０１４６】
本明細書中で使用する場合、「ヘテロシクリル」または「ヘテロシクロ」という用語には、例えば、4-、5-、6-、もしくは7-員の単環式、7-、8-、9-、10-、11-、もしくは12-員の二環式または10-、11-、12-、13-、14-もしくは15-員の三環式の環系であってかつO、SおよびNから選択される少なくとも1個のヘテロ原子を含有しており、そのNおよびSが様々な酸化状態に酸化されていてもよい、無置換のまたは置換されている飽和または不飽和の非芳香族の環または環系が含まれる。ある実施形態では、ヘテロシクリル部分は、5〜7個の環原子を含有し、かつO、SまたはNから選択されるさらなるヘテロ原子を含有していてもよい飽和単環式の環である。複素環基がヘテロ原子または炭素原子に結合していてもよい。ヘテロシクリルとしては、縮合または架橋した複数の環ならびにスピロ環式の環を挙げることができる。ヘテロシクリル部分の具体例としては、例えば、ジヒドロフラニル、ジオキソラニル、ジオキサニル、ジチアニル、ピペラジニル、ピロリジン、ジヒドロピラニル、オキサチオラニル、ジチオラン、オキサチアニル、チオモルホリノ、オキシラニル、アジリジニル、オキセタニル、オキセパニル、アゼチジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、ピロリジニル、テトラヒドロピラニル、ピペリジニル、モルホリノ、ピペラジニル、アゼピニル、オキサピニル、オキサゼパニル、オキサチアニル、チエパニル、アゼパニル、ジオキセパニル、およびジアゼパニルが挙げられる。
【０１４７】
「ヘテロシクリル」という用語には、1、2または3個の置換基、例えば、=O、=S、ハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アルコキシ、シクロアルキルオキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、アリールアルキルオキシ、ヘテロアリールアルキルオキシ、ヘテロシクリルアルキルオキシ、ケトン(例えば、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アロイル、アリールアルキルカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル)、エステル(例えば、アルコキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロシクリルオキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、シクロアルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、ヘテロアリールカルボニルオキシ、ヘテロシクリルカルボニルオキシ)、カーボネート(例えば、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、ヘテロアリールオキシカルボニルオキシ)、カルバメート(例えば、アルコキシカルボキシルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノ、アルケニルオキシカルボニルアミノ、アルキニルオキシカルボニルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アルキルアミノカルボニルオキシ、ジアルキルアミノカルボニルオキシ、アリールアミノカルボニルオキシ)、カルバモイル(例えば、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アリールアルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル)、アミド(例えば、アルキルカルボニルアミノ、アルキルカルボニルアルキルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ)、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アミノ(例えば、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノ)、スルホニル(例えば、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アリールアルキルスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アルコキシスルホニル、アリールオキシスルホニル、ヘテロアリールオキシスルホニル、シクロアルキルスルホニル、ヘテロシクリルスルホニル)、スルファモイル、スルホンアミド、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィナート、チオエーテル(例えば、アルキルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ)、ウレイド、イミノ、アミジノ、チオカルボキシル(例えば、アルキルチオカルボニル、アリールチオカルボニル)、スルフィニル(例えば、アルキルスルフィニル、アリールスルフィニル)、カルボキシルで置換されていてもよい本明細書中で定義した複素環基が含まれ、ここで上記の各炭化水素基は1個以上のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ハロゲン、ヒドロキシまたはアルコキシ基で置換されていてもよい。
【０１４８】
「ヘテロシクリルアルキル」という用語は、ヘテロシクリルで置換されたアルキルである。該用語には、1個以上のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ハロゲン、ヒドロキシまたはアルコキシ基で置換されていてもよい無置換のおよび置換されたヘテロシクリルアルキル部分が含まれる。
【０１４９】
「カルボニル」または「カルボキシ」という用語には、酸素原子に二重結合で連結された炭素(C=O)を含有する化合物および部分が含まれる。カルボニルはさらに、本発明の化合物がその意図された機能を果たすことを可能にする任意の部分で置換されていてもよい。例えば、カルボニル部分は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アミノなどで置換されていてもよい。カルボニルを含有する部分の具体例としては、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、アミド、エステル、尿素、無水物などが挙げられる。
【０１５０】
「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」という用語には、-OHまたは-O-を持つ基が含まれる。
【０１５１】
「ハロゲン」という用語には、フッ素、臭素、塩素、ヨウ素などが含まれる。
【０１５２】
「過ハロゲン化」という用語には、全ての水素がハロゲン原子に置き換えられている部分が含まれる。
【０１５３】
本発明のビタミンD化合物、またはそれらの製薬上許容しうる塩、溶媒和物またはそのプロドラッグは1つ以上の不斉中心を含有していてもよく、またそれ故に、絶対立体化学の観点から(R)-もしくは(S)-またはアミノ酸に関しては(D)-もしくは(L)-と定義されうるエナンチオマー、ジアステレオマー、および他の立体異性形態を生じていてもよい。本発明は、全てのこうした存在しうる異性体、ならびにそれらのラセミ体および光学的に純粋な形態を含むものとする。光学的に活性な(＋)および(-)、(R)-および(S)-、または(D)-および(L)-異性体は、キラルシントンもしくはキラル試薬を使用して調製してもよいし、またはキラルカラムを使用するHPLCなどの従来技術を利用して分割してもよい。本明細書中に記載した化合物がオレフィン二重結合または他の幾何学的不斉中心を含有している場合であって、かつ特に指定しない限り、該化合物はE体とZ体両方の幾何異性体を含むものとする。同様に、全ての互変異性体もまた組み込まれるものとする。
【０１５４】
「立体異性体」という用語には、同一の結合により結合しているが異なる三次元構造を有する同一原子で構成されている、互換性のない化合物が含まれる。本発明は様々な立体異性体およびその混合物を意図したものであり、その分子が互いに重ね合わせることのできない鏡像である2種の立体異性体を指すエナンチオマーを含む。
【０１５５】
本発明は、1個以上の原子が、同じ原子番号を有するがその原子質量または質量数は通常自然界に見られる原子質量または質量数と異なっている原子で置き換えられている、全ての製薬上許容しうる同位体標識ビタミンD化合物を含む。
【０１５６】
本発明の化合物に含めるのに適した同位体の具体例には、水素の同位体(例えば、2Hおよび3H)、炭素の同位体(例えば、11C、13Cおよび14C)、塩素の同位体(例えば36Cl)、フッ素の同位体(例えば18F)、ヨウ素の同位体(例えば、123Iおよび125I)、窒素の同位体(例えば、13Nおよび15N)、酸素の同位体(例えば、15O、17Oおよび18O)、リンの同位体(例えば32P)、ならびに硫黄の同位体(例えば35S)が含まれる。重水素、すなわち2Hなどのより重い同位体による置換は、より高い代謝安定性がもたらす幾つかの治療上の利点、例えば、延長されたin vivo 半減期または軽減された投薬要件を提供しうる。同位体標識ビタミンD化合物は通常、これまで用いられてきた非標識試薬の代わりに適当な同位体標識試薬を使用して、当業者に公知の従来技術により調製することができる。
【０１５７】
「プロドラッグ」という用語には、生理的条件下で、または加溶媒分解により、本発明の生物学的に活性な化合物へと転換されうる化合物が含まれる。従って、「プロドラッグ」という用語は、本発明の化合物の製薬上許容しうる代謝前駆体を指す。プロドラッグは、該プロドラッグを必要とする被験体に投与された時点では不活性な場合もあるが、in vivoで本発明の活性化合物へと転換される。プロドラッグは、典型的には、例えば血中での加水分解または消化管もしくは肝臓における転換により、in vivoで速やかに転換されて本発明の親化合物を生じる。このプロドラッグ化合物は多くの場合、哺乳綱の生物において溶解度、組織適合性または遅延放出という利点を提供する(Bundgard, H., Design of Prodrugs (1985)、pp. 7-9, 21-24 (Elsevier, Amsterdam)を参照されたい)。
【０１５８】
プロドラッグについての考察は、Higuchi, T.,ら、“Pro-drugs as Novel Delivery Systems,” A.C.S. Symposium Series, Vol. 14、およびBioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, Anglican Pharmaceutical Association arid Pergamon Press, 1987に記載されている。
【０１５９】
「製薬上許容しうる塩」としては、酸付加塩と塩基付加塩の両方が挙げられる。「製薬上許容しうる酸付加塩」とは、遊離塩基の生物学的な有効性および特性を保持しており、生物学的にも他の面でも望ましくないものではなく、かつ無機酸(例えば、限定するものではないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など)、および有機酸(例えば、限定するものではないが、酢酸、2,2-ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、4-アセトアミド安息香酸、カンフル酸、カンファー-10-スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、炭酸、桂皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン-1,2-ジスルホン酸、エタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、2-オキソ-グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、ナフタレン-1,5-ジスルホン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、1-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、4-アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアン酸、p-トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ウンデシレン酸など)を用いて形成される塩を指す。
【０１６０】
「製薬上許容しうる塩基付加塩」は、遊離酸の生物学的な効果および特性を保持しており、生物学的にも他の面でも望ましくないものではない塩を指す。これらの塩は、遊離酸への無機塩基または有機塩基の付加により調製する。無機塩基由来の塩としては、限定するものではないが、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、鉛塩、銅塩、マンガン塩、アルミニウム塩などが挙げられる。好適な無機塩は、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、およびマグネシウム塩である。有機塩基由来の塩としては、限定するものではないが、第一級、第二級、および第三級アミンの塩、天然の置換アミンを含む置換アミンの塩、環状アミンの塩ならびに塩基性イオン交換樹脂(例えば、アンモニア、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、デアノール、2-ジメチルアミノエタノール、2-ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、ベネタミン、ベンザチン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、プリン類、ピペラジン、ピペリジン、N-エチルピペリジン、ポリアミン樹脂など)の塩が挙げられる。
【０１６１】
結晶化により本発明の化合物の溶媒和物が生じることが多い。本明細書中で使用する場合、「溶媒和物」という用語は、1つ以上の溶媒分子と共に本発明の化合物の分子を1つ以上含む凝集体を指す。溶媒は水であってもよく、この場合の溶媒和物は水和物である。あるいは、溶媒は有機溶媒であってもよい。つまり、本発明の化合物は、水和物(例えば、一水和物、二水和物、半水和物、セスキ水和物、三水和物、四水和物など)、ならびに対応する溶媒和形態として存在することができる。本発明の化合物は真の溶媒和物でありうるが、他の場合では、本発明の化合物は偶然存在した水または水と偶然存在した多少の溶媒との混合物を保持しているだけという可能性がある。
【０１６２】
「医薬組成物」という用語には、本発明の化合物(例えば、ビタミンD化合物)と、該ビタミンD化合物を個体へ送達するための当分野で一般に受け入れられている媒体との製剤が含まれる。かかる媒体としては、全ての製薬上許容しうるその担体、希釈剤または賦形剤が挙げられる。
【０１６３】
幾つかの実施形態では、本発明の組成物を任意の上皮表面に局所的に投与することができる。「上皮表面」としては、身体の外面を覆うか、または皮膚および粘膜の表面を含むがこれらに限定されない中空構造に沿って存在する組織面が挙げられる。かかる上皮表面としては、口、咽頭、食道、肺、目、耳、鼻、頬、舌、膣、首、泌尿生殖器、消化管(alimentary)、および肛門直腸の表面が挙げられる。
【０１６４】
組成物は、局所投与の際に用いられる慣用の様々な形態に製剤化することができる。これらの形態としては、例えば、半固体および液体の投薬形態、例えば溶液または懸濁液、ゲル、クリーム、エマルション、ローション、スラリー、散剤、噴霧剤、発泡剤、パスタ剤、軟膏、ろう膏、香膏、または滴剤が挙げられる。
【０１６５】
局所適用のために慣用の担体としては、ペクチン、ゼラチンおよびその誘導体、ポリ乳酸もしくはポリグリコール酸のポリマーまたはそのコポリマー、セルロース誘導体(例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、もしくは酸化セルロース)、グアーガム、アカシアガム、カラヤガム、トラガカントガム、ベントナイト、寒天、カルボマー、褐藻(bladderwrack)、セラトニア、デキストランおよびその誘導体、ガハッチガム、ヘクトライト、イスパキュラハスク、ポリビニルピロリドン、シリカおよびその誘導体、キサンタンガム、カオリン、タルク、デンプンおよびその誘導体、パラフィン、水、植物油および動物油、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリセロール、エタノール、プロパノール、プロピレングリコール(グリコール類、アルコール類)、不揮発性油、ナトリウム、カリウム、アルミニウム、マグネシウムまたはカルシウムの塩(例えば、塩化物、炭酸塩、炭酸水素塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩、酢酸塩、グルセプテートもしくは酒石酸塩)が挙げられる。
【０１６６】
薬物の持続時間と滞留時間を向上させるため、そして達成される予防的効力を改善するために、局所用薬剤のための標準的な配合方法を前記ビタミンD化合物に適用することができる。
【０１６７】
また、局所用経皮パッチを使用することもできる。経皮パッチは、身体への本発明の組成物の制御送達を提供するという追加の利点を有する。かかる投薬形態は、適切な媒体中に薬剤を溶解または分散させることにより作製することができる。
【０１６８】
散剤および噴霧剤には、前記ビタミンD化合物の他に、担体、例えば、ラクトース、タルク、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物を含有させることができる。噴霧剤にはさらに、慣用の噴射剤、例えば、クロロフルオロハイドロカーボンおよび揮発性非置換炭化水素類、例えばブタンおよびプロパンを含有させることができる。
【０１６９】
通常、水性エアゾールは、前記ビタミンD化合物の水溶液または懸濁液を従来の製薬上許容しうる担体および安定剤と一緒に製剤化することにより作製する。担体および安定剤は個々の化合物の要件によって異なるが、典型的には例として、非イオン性界面活性剤(例えば、ツイーン(Tweens)、プルロニック(Pluronics)、ポリエチレングリコールなど)、血清アルブミンなどのタンパク質、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、グリシンなどのアミノ酸、緩衝液、塩、糖または糖アルコールが挙げられる。一般に、エアゾールは等張液から調製する。本発明のエアゾールまたは任意の他の送達手段の作成は、当分野で公知の方法のいずれかにより行うことができる。例えば、エアゾール送達の場合、前記化合物を、任意の適切な担体と一緒に微粉化した形態で噴射剤と共に供給する。
【０１７０】
液化噴射剤は、典型的には周囲条件で気体であって、これが加圧下で凝縮したものである。該噴射剤は、プロパンおよびブタン、または他の低級アルカン(例えば、最大で5個の炭素を持つもの)を含む、当分野で許容されかつ公知のものであればよい。前記組成物は適当な噴射剤とバルブを備えた容器内に保持され、該バルブの動作により放出されるまで高圧下で維持される。
【０１７１】
ある実施形態では、前記ビタミンD化合物を予防的に投与することができる。予防的用途の場合、前記ビタミンD化合物を潜在的な脱毛症に先立って適用することができる。その適用時期を最適化することにより、前記ビタミンD化合物の予防的有効性を最大限に高めることができる。該適用時期は、投与の様式、投与量、組成物の安定性および有効性、投薬の頻度(例えば、単回適用または複数回の投薬)によって異なる。当業者であれば、前記ビタミンD化合物の予防的有効性を最大限に高めるのに要する最も適当な時間間隔を決定することができるであろう。
【０１７２】
前記ビタミンD化合物は、組成物中に存在する場合、一般に総重量の約0.000001％〜約100％、より好ましくは約0.001％〜約50％、および最も好ましくは約0.01％〜約25％という量で存在する。
【０１７３】
担体を含む本発明の組成物の場合、該組成物は、例えば、少なくとも1種の担体を約1重量％〜約99重量％、好ましくは約50重量％〜約99重量％、および最も好ましくは約75重量％〜約99重量％含む。
【０１７４】
また、本発明の組成物の個々の構成要素は予め混合しておいてもよいし、または治療構成要素の所望の濃度レベルを達成する目的で、かつ該構成要素が最終的に互いに密に混ざり合う限りは、予め決めておいた投薬量に応じて各構成要素を同一環境に別々に加えてもよい。さらに、本発明を連続的または断続的に投与または送達してもよい。
【０１７５】
ある実施形態では、前記製剤は、約40％(w/w)のプロピレングリコールおよび約60％(w/w)の無水アブソルートエタノール(200プルーフ、US)中に、場合によっては他の少量の製薬上許容しうる賦形剤、担体、または希釈剤(例えば、約0.4％(w/v)のホスホリポン(Phospholipon)90G)と共に製剤化された前記ビタミンD活性成分を含む。別の実施形態では、前記製剤は、約30％(w/w)のプロピレングリコール、約10％(w/w)のエトキシジグリコールまたはトランスクトール、および約60％(w/w)の無水アブソルートエタノール(200プルーフ、US)中に、場合によっては他の少量の製薬上許容しうる賦形剤、担体、または希釈剤(例えば、約0.4％(w/v)のホスホリポン90G)と共に製剤化されたビタミンD活性成分を含む。幾つかの実施形態では、エタノールは無水アブソルート200プルーフ(U.S.)の未変性エタノール(米国薬局方)である。本明細書中に記載した製剤は、前記活性ビタミンD化合物の一定レベルの皮膚への浸透および送達を提供し、かつ脱毛症を予防するかまたは脱毛症、特に化学療法誘発性脱毛症(CIA)の重症度を軽減するための有効な手段を提供する。
【０１７６】
ある特定の実施形態では、前記医薬組成物は、約40％(w/w)のプロピレングリコール(米国薬局方グレード)および約60％(w/w)の無水アブソルートエタノール(200プルーフ、US)、未変性、米国薬局方、を含む。
【０１７７】
幾つかの実施形態では、前記医薬組成物は、約40％(w/w)のプロピレングリコール(例えば、米国薬局方グレードのものかまたはより高品質のもの)、および約60％(w/w)の無水アブソルートエタノール(200プルーフ、US)、未変性(例えば、米国薬局方グレードのものかまたはより高品質のもの)を含む。
【０１７８】
他の実施形態では、前記医薬組成物は、約30％(w/w)のプロピレングリコール、約10％(w/w)のエトキシジグリコールまたはトランスクトール、および約60％(w/w)の無水アブソルートエタノール(200プルーフ、U.S.)を含む。
【０１７９】
さらに別の実施形態では、前記医薬組成物は、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、または1％のホスホリポン(例えば、ホスホリポン90G)を含む。
【０１８０】
他の実施形態では、プロピレングリコールおよび／または無水アブソルートエタノールの正確なパーセンテージ(w/w)を、前記の40％：60％比に基づいて変更してもよい。例えば、プロピレングリコールと無水アブソルートエタノールとの％比を、20：80；25：75；30：70；35：65；36：64；37：63；38：62；39：61；41：59；42：58；43：57；44：56；45：55などどしてもよい。かかる他の製剤の有効性は、当分野で承認されている技術、例えば実施例Iに記載した手順を使用して検証することができる。
【０１８１】
ある特定の実施形態では、前記製剤中の無水アブソルートエタノールを95％エタノール、96％エタノール、97％エタノール、98％エタノール、または99％エタノールと置き換えてもよい。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、前記医薬組成物はさらに微量の他の不活性成分、賦形剤、または構成要素を含んでいてもよい。かかる成分の存在が前記ビタミンD化合物の有効性またはその皮膚浸透／蓄積挙動に実質的に影響を及ぼすことはない。
【０１８３】
本発明のビタミンD化合物は、真皮層には実質的に浸透させることなく表皮に送達する目的で製剤化される。Roche Dermatologyにより開発された以前の別の製剤は、1回の適用につき約500〜1000μgという投与量で使用した場合にCIAから保護する効果はなく、また第I相試験ではヒト被験体の大多数において皮膚炎を引き起こした。Rocheのこの同一製剤はラット緑色白血病モデル(後掲)においても有効ではなかった。
【０１８４】
本発明の代表的な製剤の1つは、以下の(非限定的)手順に従って調製することができる：
【表１】
0005978130.tif 000011
【０１８５】
処方Iは次のように調製する：カルシトリオールをエタノールに溶解させる；次に、プロピレングリコールを加え、得られた溶液が見た目に透明で均一となるまで混合する。上記製剤の比重はおよそ0.875 g/mLである。上記処方の目標濃度をw/vで表すと1.05μg/mLである。
【表２】
0005978130.tif 000012
【０１８６】
処方IIは次のように調製する：カルシトリオールをエタノールに溶解させる；次に、プロピレングリコールを加え、得られた溶液が見た目に透明で均一となるまで混合する。上記製剤の比重はおよそ0.875 g/mLである。上記処方の目標濃度をw/vで表すと3.15μg/mLである。
【０１８７】
使用した試薬は全て、米国薬局方グレードの試薬(米国薬局方の要件を満たすもの)である。
【０１８８】
本発明の製剤を使用する場合、約0.2μgという投薬量(2μg/mLの局所用溶液を100μL投与する)は新生仔ラットにおいてCIAから保護する。この情報を元に、当業者であれば治療する哺乳動物の平均体重に基づいて適当な投薬レベルを容易に調整することができる。例えば、ヒト被験体に、総投与量約2.5μg、5μg、10μg、25μg、50μg、75μg、または100μgのカルシトリオール(もしくは他の当量のビタミンD化合物)を使用してもよい。予備的な動物毒性試験により、約100μgという投与量は皮膚刺激を与えず、かつ実質的な真皮への浸透を伴うことなく(例えば、極端に低い真皮への浸透率)表皮への優れた浸透を呈することが示されている。追加の投薬情報については上記の説明を参照されたい。
【実施例】
【０１８９】
以下の実施例は本発明のある特定の態様を例示したものであって、いかなる点も限定するものではない。実施例を明確にしかつ例示する目的で詳細に記載したが、当業者であれば、本発明の真の範囲を逸脱することなくその形態および詳細に種々の変更を行いうることは理解されよう。
【実施例１】
【０１９０】
実施例1.フランツのヒト皮膚有限用量モデル(Franz Human Skin Finite Dose Model)を使用したin vitroでのカルシトリオールの経皮吸収の評価
本実施例は、種々のカルシトリオール製剤の経皮吸収薬物動態を評価するために設計したものである。有限用量技術およびフランツ拡散セルを利用し、in vitroで、ヒト死体皮膚において吸収を測定した。このin vitro ヒト死体皮膚モデルは、局所的に適用した薬物の経皮吸収の研究および薬物動態の測定のための有益な手段であることが証明されている。該モデルでは、典型的なin vivo条件に適合する温度および湿度でヒト死体皮膚が維持される特別設計の拡散セルに取り付けた該皮膚を使用した。有限用量(例えば、4〜7 mg/cm2)の製剤を皮膚の外側の表面に適用し、該皮膚の内側の表面を浸したレセプター溶液における薬物の出現速度をモニタリングすることにより薬物吸収を測定した。その後、全吸収、吸収速度、ならびに皮膚における含有量を規定するデータをこのモデルにおいて正確に測定した。この方法には、in vivo 経皮吸収動態を正確に予測した歴史的前例がある。従って、このヒト皮膚に関するin vitro 有限用量モデルにより、カルシトリオールなどのビタミンD化合物、経皮吸収薬物動態の特性評価が可能となった。
【０１９１】
本実験では、48時間の投与期間にわたるカルシトリオールの経皮吸収について、3人の死体皮膚ドナー各人に対し1製剤あたり3つの複製(replicate)皮膚片上で、カルシトリオールを含有する6種の製剤を試験した。投与適用後の事前に選択しておいた時点で、真皮レセプター溶液を全部取り出し、新しいレセプター溶液と取り換え、またアリコートをその後の分析のために取っておいた。さらに、角質層、表皮、および真皮を回収し、薬物含有量について評価した。これらの試料を、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)によりカルシトリオール含有量について分析した。本実験で使用したプロトコルの簡単な説明を以下に記載する。
【０１９２】
死後24〜48時間以内に入手した、皮膚病の明らかな徴候がないヒト死体体幹部の皮膚を本試験に使用した。この皮膚をダーマトームで採取し、低温保存し、さらに水不浸透性のプラスチック袋に密封してから、実験の日まで＜-70℃で保存した。使用前に皮膚を〜37℃の水中で解凍し、次いで水道水ですすぐことにより、全ての付着血液または他の物質を表面から取り除いた。単一ドナーから得た皮膚を、静置型2.0 cm2 フランツ拡散セルに取り付けるには十分な大きさの、より小さな複数の断片に切り分けた。各製剤に対して1ドナーあたり3つの複製(replicates)を試験した。真皮側のチャンバーはリン酸緩衝等張食塩水(PBS)(pH 7.4±0.1)のレザバー溶液でその最大容量まで満たし、また表皮側のチャンバーは周囲実験室環境に曝しておいた。難水溶性化合物の水溶解度を増大させることが知られている非イオン性界面活性剤ボルポ(Volpo)(オレス-20)をPBSに加えてもよい。レザバー溶液中のボルポは、経皮吸収の際の拡散シンク条件を保証するものであり、また試験皮膚のバリア特性に影響を及ぼさないことが知られている。その後、真皮レザバー溶液が〜600 RPMで磁気的に撹拌されている拡散装置内に前記セルを置き、その温度を32.0±1.0℃という皮膚の表面温度が得られるように維持した。
【０１９３】
各皮膚片の統合性を保証するために、試験品の適用前にトリチウム水に対するその浸透性を調べた。短い(0.5〜1時間)平衡期間の後、3H2O (NEN、Boston、MA、sp. Act. 〜0.5μCi/mL)を、露出した表面全体が覆われるように点滴器で皮膚の上面全体に層状に重ねた(およそ250〜500μL)。5分後、3H2O水層を除去した。30分でレザバー溶液を採集し、液体シンチレーション計測法により放射能含有量について分析した。3H2Oの吸収が1.56μL-equ／cm2未満の皮膚標本を条件に合うものとみなした。使用した皮膚サンプルは全て、約0.50μL-equ／cm2未満の3H2O吸収を示した(結果は示さず)。
【０１９４】
用量投与およびサンプル採集：投与の直前に投与前サンプルを採取し、レザバー溶液を、0.2％のボルポ(オレス-20としても知られる、水溶液への薬物の混和性を確保するために使用される非イオン性界面活性剤)を含む0.1×PBSの新鮮な溶液と取り換えた。チムニーをフランツセルから取り外し、皮膚の表皮表面に十分アクセスできるようにした。その後、10μLの製剤／cm2を送達するよう設定された容積式ピペットを使用して、全ての製剤を皮膚片に適用した。この投与量を、該ピペットのテフロン(登録商標)チップを用いて表面に広げた。適用から5〜10分後に、フランツセルのチムニー部分を取り換えた。投与から事前に選択しておいた時間(6、12、24、および48時間)後に、レザバー溶液を全部除去し、新鮮なレザバー溶液と取り換え、また所定量のアリコートをその後の分析のためにとっておいた。
【０１９５】
各ドナーから入手した単一皮膚片をセルに取り付け、該セルを投与はしないが皮膚から拡散する物質(内因性カルシトリオールである可能性がある)の出現について評価するために使用した。最後のサンプルを採集した後、皮膚表面を80：20のエタノール：水で2回洗浄(各量1.0 mL)することにより、該皮膚表面から未吸収の製剤を採集した。洗浄後、皮膚をチャンバーから取り出し、表皮と真皮に分けた。各層を80：20のエタノール：水で一晩抽出した。
【０１９６】
カルシトリオールの定量は、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)により行った。簡単に述べると、Agilent 1100シリーズLC/MSDを備えたHewlett-Packard 1100シリーズHPLCシステム上でHPLCを行った。A)水中0.1％の酢酸アンモニウムとB)メタノール中0.1％の酢酸アンモニウムからなる溶媒系を、Phenomenex Luna C18 (2)カラム(100A、3μ 100×4.6 mm)に流速0.550 mL/分で流した。ニート標準(neat standard)から連日作成した外部標準曲線を用いて、ピーク面積を濃度に定量化した。採集日に分析を行わなかったサンプルは-20℃以下で貯蔵した。
【０１９７】
予備試験(pilot study)では、前記の6種の製剤グループからの単一製剤を、単一ドナーに対して約5μL/cm2の投与量で6つのチャンバーに投与した。レセプター溶液を0、2、4、8、12、24、32、および48時間で採集した。最後のレセプター溶液サンプル後、先に記載した通りに表面を洗浄して皮膚を分析のために採集した。全てのサンプルを処理し、カルシトリオール含有量について分析した。
【０１９８】
ピボタル試験(pivotal study)の最終設計は、予備試験、特に、適用した投与量、レセプター溶液のサンプリングスケジュール、およびサンプルの処理方法に関して観察された結果に基づいて行った。これらの修正を行うことで、ピボタル試験サンプル中のカルシトリオールの検出および定量を最適化した。例えば、予備プロトコルではレザバーサンプルを2、4、8、12、24、32、および48時間で採取すると記載したが、予備試験後には、レザバーサンプル中のカルシトリオールのより良い検出レベルを促進するために該レザバーサンプルを6、12、24、および48時間で採取することに決めた。さらに、予備試験後に、2 cm2に20μLの投与(その際の投与量は10μL/cm2であった)はレザバー溶液サンプル中のカルシトリオールの検出を改善すると判断した。ただし、非投与チャンバーは1 cm2で保持した。以下のパラメータ：a)全吸収(全レザバー溶液の合計)；b)全試験期間にわたる浸透の速度および程度；ならびにc)適用した投与量の物質収支、を算出した。データ評価の際、a)いずれかのサンプルが＜LLQ (定量下限値)であったならば、そのサンプルは非データ値として扱ってもよい。放射性サンプル(例えば、水完全性試験(water integrity test))の場合、LLQを、事前に決定しておいたブランクサンプルの平均バックグラウンドと定義した。研究者の裁量で、LLQより小さい全ての値をゼロ値、または主要パラメータを算出する目的で測定した実測値とし；b)外れ値と疑われる値は、その値が残りの一連の複製チャンバーから得た同じ値の平均値±3SD範囲より大きいかどうかを確認するか、またはDeanおよびDixonの外れ値検定(Dean and Dixon Outlier test)により判断した。研究者の裁量で、外れ値とした値をデータの総合計から除外し(ただし、文中およびデータ表中にはそういうものとして記載した)；c)あるチャンバー内で、所与の時点の値が非データ値とされたかまたは他の理由で欠損していた場合、この時点の値を補間値に置き換えることで関連パラメータを算出した。補間値は、以下の隣接値：
・所与の3点：(T1,A)、(T2,B)および(T3,C)、(B)は欠損、
・ここでT = 時間およびA〜C = 測定されたデータ値
・推定されるB = A - [((A-C)/｜T1-T3｜)×(｜T1-T2｜)]
を結ぶ線を基に算出した。
【０１９９】
統計的評価のために、ドナー間の反復試験結果(replicates)を平均化し、各主要パラメータについて標準偏差を算出した。その後、ドナー間平均値を順に並べ、ドナー全体の母平均を標準誤差と併せて算出した。試験物質間の差はスチューデントのt検定を用いて評価した。
【０２００】
このプロトコルを使用して、以下の試験製剤：
・A：(1 ppm)：100 ppmのカルシトリオール濃縮物(ロット番号H、下記参照)0.2 mL(1％(w/v))を200プルーフのエタノール(1μg/mL)19.8 mL(99％(w/v))に溶解させたもの
・B (1 ppm)：最初に、100 ppmのカルシトリオール濃縮物(ロット番号H、下記参照)0.2 mL(1％(w/v))を200プルーフのエタノール11.8 mL(59％(w/v))に溶解させて；次にプロピレングリコール8 mL(40％(w/v))を加え、透明かつ均一になるまで混合したもの(1μg/mL)
・C (1 ppm)：最初に、100 ppmのカルシトリオール濃縮物(ロット番号H、下記参照)0.2 mL(1％(w/v))を200プルーフのエタノール11.8 mL(59％(w/v))に溶解させて；次にプロピレングリコール6 mL(30％(w/v))およびエトキシジグリコール2 mL(10％(w/v))を加え、透明かつ均一になるまで混合したもの(1μg/mL)
・D (3 ppm)：最初に、100 ppmのカルシトリオール濃縮物(ロット番号H、下記参照)0.6 mL(3％(w/v))を200プルーフのエタノール11.4 mL(57％(w/v))に溶解させて；次いでプロピレングリコール6 mL(30％(w/v))を加え、透明かつ均一になるまで混合し；最後にエトキシジグリコール2 mL(10％(w/v))を加え、透明かつ均一になるまで混合したもの(3μg/mL)
・E (1 ppm)：最初に、100 ppmのカルシトリオール濃縮物(ロット番号H、下記参照)0.2 mL(1％(w/v))を200プルーフのエタノール(DP-04-099)11.72 mL(58.6％(w/v))に溶解させて；次にプロピレングリコール6 mL(30％(w/v))を加え、透明かつ均一になるまで混合し；次にトランスクトールP 2 mL(10％(w/v))を加え、透明かつ均一になるまで混合し；最後に、ホスホリポン90G濃縮物(ロット番号G、下記参照)0.08 mL(0.4％(w/v))を加えて溶液中に分散させてから、透明かつ均一になるまで混合したもの(1μg/mL)
・F (3 ppm)：最初に、100 ppmのカルシトリオール濃縮物(ロット番号H、下記参照)0.6 mL(3％(w/v))を200プルーフのエタノール11.32 mL(56.6％(w/v))に溶解させて；次にプロピレングリコール6 mL(30％(w/v))を加え、透明かつ均一になるまで混合し；次にトランスクトールP 2 mL(10％(w/v))を加え、透明かつ均一になるまで混合し；最後に、ホスホリポン90G濃縮物(ロット番号G、下記参照)0.08 mL(0.4％(w/v))を加えて溶液中に分散させてから、透明かつ均一になるまで混合したもの(31μg/mL)
・G：200プルーフのエタノール50 g(50％(w/v))をホスホリポン90G 50 g(50％(w/v))と混合し、透明かつ均一になるまで混合したもの
・H：カルシトリオール0.01 mg (0.01％(w/v))を200プルーフのエタノール100 mL(99.99％(w/v))に完全に溶解させたもの
を評価した。
【０２０１】
本試験で使用した試薬は全て、分析試薬グレードのものかまたはより高品質のものである。特別な試薬の供給元は、最終報告書の文中で各化学物質の初出後に記す。
【０２０２】
本試験の結果を以下の要約表にまとめた：
【表３】
0005978130.tif 000013
【０２０３】
上記データは、カルシトリオールは、評価した試験製剤からin vitroでヒト死体皮膚に浸透したが、該皮膚を貫通したとは限らないことを示している。各ドナーからのブランク(非投与)皮膚片は、内因性カルシトリオールと一致するHPLC/MS共溶出ピークを示した。レザバー溶液中に存在する量は、全試験製剤にわたって本質的に同一であり、かつ非投与皮膚片と同様であることから、皮膚片から放出された内因性カルシトリオールの拡散である可能性が高い。試験製剤チャンバーと非投与チャンバーとの間には殆ど違いが見られなかったので、レザバー溶液に見られた量が局所的に適用した試験製剤に由来するカルシトリオールを表している可能性は低い。
【０２０４】
カルシトリオール吸収の証拠は、図1に見られるように、2種の製剤(AおよびB)を投与した皮膚片における真皮含有量として観察された。皮膚真皮層において測定可能なレベルが非投与皮膚片からは見られなかったので、これら2種の試験製剤からの測定可能な真皮レベルは適用した投与量に由来する吸収を表していると解釈した。さらに、試験製剤を投与した全ての表皮サンプルが、非投与皮膚片よりも高いカルシトリオールレベル(〜3×から〜17×)を示した。表皮カルシトリオール含有量に基づいて順序付けると、試験製剤は次のように並んだ：
D＞F＞E＞C＞B＞A＞＞＞非投与皮膚。
【０２０５】
より高濃度(3μg/mL対1μg/mL)のカルシトリオールを含有する試験製剤(DおよびF)がより高い表皮含有量を示したということと、この順序は一致する。非常によく似た順位が表面洗浄結果(皮膚の表面からの残留試験物質の回収)において観察された。非投与ブランク皮膚片の表面洗浄においてはカルシトリオールは認められなかった。
【実施例２】
【０２０６】
実施例2.カルシトリオールへの表皮細胞培養物の応答に関与する主要タンパク質の同定 - リアルタイムPCR(RTPCR)
本実施例および後述する幾つかの実施例により、カルシトリオールの活性化経路内のタンパク質または遺伝子の正体に関する追加情報を提供する。これらの実験により、ビタミンD化合物への表皮細胞の細胞応答に関与する作用機序および主要タンパク質／遺伝子の同定が可能となる。
【０２０７】
具体的に述べると、角化細胞細胞系HEKaのカルシトリオールへの曝露は細胞プロセスに有意な影響をもたらすことを見出した。本明細書中に記載した実験では、カルシトリオール誘導性の、カルシウムチャネル輸送の変化と熱ショックタンパク質調節の変化に関与する主要タンパク質／遺伝子の同定に重点を置いた。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RTPCR)法を本実施例で用いることにより、イオンチャネル、輸送タンパク質、および熱ショックタンパク質に関与する遺伝子のmRNAのレベルにおける変化を確認した。
【０２０８】
PCRアレイをスクリーニング手段として使用して、細胞内のカルシトリオールの生物学的作用様式について知見を提供する可能性がある一連の分子標的を評価した。リアルタイムPCR定量を利用してmRNAレベルの変化を評価することにより、事前に選択しておいた80種の経路特異的標的(付録参照)を含有する複数のサブセットにおけるmRNAレベルを評定した。PCRアレイ分析には、2つの遺伝子群(熱ショックタンパク質に関連する遺伝子群(SABiosciences)、ならびに神経科学イオンチャネルおよび輸送体に関連する遺伝子群(SABioscience))を用いた。
【０２０９】
細胞培養：初代ヒト表皮角化細胞(HEKa)を、ヒト角化細胞増殖用サプリメント(Cascade Biologics, Inc., Portland OR)を加えたエピライフ培地(Epilife Medium)(Cascade Biologics, Inc., Portland OR)中で維持した。細胞を37℃、5％CO2で増殖させた。
【０２１０】
HEKa細胞のD3処理：HEKa細胞を、0.1μg/mLのカルシトリオールまたは対照ビヒクルで処理した。カルシトリオールの最終濃度を0.1μg/mLとするために、1 mgのカルシトリオールを2 mLのエタノールに溶解させてから、得られたストックのうちの1μLを5 mLの培地に加えた。ビヒクル対照群の細胞は、1μLのエタノールを含有する5 mLの培地で処理した。処理の開始から3、6、16、24、48、または72時間後に細胞を回収した。
【０２１１】
RNA単離：RNeasyミニキット(RNeasy Mini kit)(Qiagen, Inc., Valencia CA)を製造業者の使用説明書に従って使用して、種々の処理時点でRNA単離のために細胞を溶解させた。RNAは、260 nmにおける光学密度を測定することにより定量化した。第一鎖合成：RT2第一鎖合成キット(RT2 First Strand Synthesis kit)(SABiosciences., Frederick MD)を製造業者の勧めにより使用して、1μgの全RNAから第一鎖cDNAを合成した。
【０２１２】
リアルタイムPCR：前記第一鎖合成からの生成物を水で希釈し、SYBRグリーンマスターミックス(SYBR green master mix)(SABiosciences., Frederick MD)を混合してからPCRアレイにのせた。リアルタイムPCRは、Biorad CFX96上のPCRアレイ(熱ショックタンパク質アレイ、ならびに神経科学およびイオンチャネルアレイ(SABiosciences, Frederick MD)で行った。データ分析は、SABiosciencesのウェブサイト上で利用できるPCRアレイデータ分析ソフトウェアを用いて行った。
【０２１３】
下記表2-1に、カルシトリオール処理後にHEKa細胞において調節された、熱ショックタンパク質遺伝子アレイ上の遺伝子を示す。結果は、2回の別個の実験において調節されたのはそれらの遺伝子だけだったことを示している。
【表４】
0005978130.tif 000014
【０２１４】
HEKa細胞においてカルシトリオール処理によりmRNAレベルで調節された遺伝子のうちの2つは、HSPB1およびHSPA2である。HSPB1は、細胞膜だけでなくサイトゾル、ミトコンドリア、およびゴルジ体においても発現される27 kDaのタンパク質である。HSPA2は、細胞膜および核に存在する70 kDaのタンパク質であり、HSF1により調節される。HSPB1およびHSPA2はいずれもアポトーシスに関わっている。HSF4はレチノイン酸により調節され、細胞分化に関与している。DNAJC6はHSP40群のタンパク質に属している。DNAJC6はクラスリン被覆小孔および細胞質に存在する。
【０２１５】
同様に、神経科学およびイオンチャネルアレイから得られた、3回の別個の実験を通して一貫していた結果を、下記表2-2にまとめた。
【表５】
0005978130.tif 000015
【０２１６】
グルタミン酸輸送体およびカリウムチャネルにおける変化が一貫して観察された。SLC1A1(EAAC1またはEAAT3としても知られている)は、興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸の膜を横断する輸送に主として関与することが知られている。この溶質キャリアタンパク質は、心臓および皮膚などの組織内の神経系の外側に認められる。ラットの角化細胞では、創傷治癒におけるグルタミン酸シグナル伝達およびSLC1A1の関与を示す証拠がある(Geneverら、1999)。現在は黒色腫に対する臨床試験中の薬物であるリルゾール(Riluzole)によるSLC1A1の阻害(Clinical Trials.gov, Mosby's Drug Consult、第13版)は、皮膚細胞におけるSLC1A1の生物学的役割を示唆するものである。SLC1A1が損傷した運動ニューロンにおける抗アポトーシス機序に関わっている(Kiryu-Seoら、2006)ことを考慮すると、SLC1A1がHEKa細胞においてD3処理によりアップレギュレートされるという本実験での観察結果は、潜在的な防御機構経路のつながりを示唆している。
【０２１７】
SLC1A3(EAAT1またはEA6としても知られている)は、ナトリウム依存性のグルタミン酸およびアスパラギン酸輸送を可能にする別の溶質キャリアである。主として脳内のグリア細胞に見られるこの輸送体は、シナプス間隙のグルタミン酸の除去に関与しており、それによってシナプス後ニューロンの長期にわたる脱分極を防いでいる。SLC1A3はグリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)およびホスホジエステラーゼ6B (PDE6B)と相互作用することが知られている。SCL1A3が細胞毒性の低減に関与している可能性がある。
【０２１８】
KCNN4は、カリウム中間／小コンダクタンス・カルシウム活性化チャネル、サブファミリーN、メンバー4である。その活性化に続いて細胞膜が過分極化し、細胞内へのカルシウムの流入が増大する。このカリウムチャネルは神経系の外側の組織の多くに局在している。
【０２１９】
KCNB2(カリウム電位依存性チャネル、Shab-関連サブファミリー、メンバー2)は、カルシトリオール処理後約24時間でアップレギュレートされた。このカリウムチャネルは、神経伝達物質の放出、インスリンの分泌および平滑筋の収縮を調節する上で重要である。
【０２２０】
カルシトリオールをこれらの実験に使用したが、当業者であれば、本発明の他のビタミンD化合物(例えば、本明細書中で先に記載したもの)もまた標的遺伝子発現を調節するという点で同様の活性を呈しうることは容易に理解されよう。ある特定の実施形態では、本発明のビタミンD化合物は、これらの実験におけるカルシトリオールの遺伝子調節プロファイルと同様または同一の遺伝子調節プロファイル、例えば、カルシトリオールにより同様にアップレギュレートされる1つ以上の標的遺伝子の発現((mRNAおよび／もしくはタンパク質)をアップレギュレートするか、またはカルシトリオールにより同様にダウンレギュレートされる1つ以上の標的遺伝子の発現(mRNAおよび／またはタンパク質)をダウンレギュレートする遺伝子調節プロファイルを呈すると考えられる。
【実施例３】
【０２２１】
実施例3.カルシトリオールへの表皮細胞培養物の応答に関与する主要タンパク質の同定 - 抗体アレイ
また、カルシトリオール刺激時のタンパク質変化の評価を、700種を上回る潜在的標的タンパク質における変化をスクリーニングすることが可能な抗体マイクロアレイを利用して行った。
【０２２２】
本実験では、700種を上回る標的タンパク質に対する抗体を包含する抗体マイクロアレイ(パノラマ(Panorama)XP725抗体アレイ、Sigma)を利用することにより、カルシトリオールでそれぞれ約3、6、または24時間処理したHEKa細胞におけるタンパク質濃度／レベルの変化を評定した。簡単に述べると、処理したHEKa細胞をまず回収し、次いで抽出することにより、可溶性タンパク質上清を得た。各サンプル(1 mg/mL)からの抽出タンパク質サンプル(計〜1 mg)の２つの画分を、各々蛍光色素(それぞれCy3およびCy5)で標識した。過剰な色素を該タンパク質サンプルから除去し、得られた標識タンパク質サンプルをマイクロアレイ・インキュベーションのために使用した。
【０２２３】
遅い時点(例えば、6時間または24時間)での特定の標的タンパク質の発現レベルを早い時点(例えば、3時間)での同発現レベルと比較して測定するために、前記サンプルを異なる標識により分類した(例えば、3時間抽出物はCy3で、6時間または24時間抽出物はCy5で標識した)。その後、等量の全タンパク質を含有するこれら2種の標識サンプルを混合した(例えば、Cy3で標識した3時間サンプルを、Cy5で標識した6時間または24時間サンプルとそれぞれ混合した)。マイクロアレイチップを用いてインキュベートした後(製造業者の推奨プロトコルに従った)、該チップを洗浄し乾燥させた。その後、該マイクロアレイを蛍光レーザースキャナで走査することにより、Cy3およびCy5色素の相対蛍光強度を測定した。
【０２２４】
特定の種類の標的タンパク質の量が経時的に増加(または減少)するならば、遅い時点と関連している色素(例えば、Cy5)はより多く(または少なく)マイクロアレイにより保持されることになる。例えば、本実験では、最も早い時点(例えば、3時間)をベースラインとして使用することにより、2つの遅い時点での相対的タンパク質発現レベル(例えば、6時間対24時間)を決定した。より多くのCy5が6〜24時間の間に前記アレイに保持されるならば、標的タンパク質の発現レベルはその期間にわたって上昇する。反対に、6時間と24時間との間に保持されるCy5に減少が認められるならば、標的タンパク質発現レベルは低下する。
【０２２５】
この方法を利用した初期分析では、＞2倍の相対的発現レベル変化(上昇または低下)を呈する標的タンパク質に着目した。全体としては、カルシトリオール処理(24時間)HEKa細胞を使用した抗体アレイ実験により、ビタミンであるカルシトリオールに応答してその発現レベルが有意に変更された以下の標的タンパク質(表3-1および3-2中)を同定した：
【表６】
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【表７】
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【０２２６】
同じタンパク質抗体アレイ法を用いた24時間でのカルシトリオール処理HEKa細胞の評価により、有意にアップレギュレートされた約50種のタンパク質を同定した。これらのタンパク質は一般に、次の4つのカテゴリに分けられる：(i)転写および細胞周期の制御(表3-3)；(ii)構造、細胞骨格および接着タンパク質(表3-4)；(iii)アポトーシス調節タンパク質(表3-5)；ならびに(iv)神経細胞分化およびアルツハイマー病(表3-6)。
【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【実施例４】
【０２２７】
実施例4.カルシトリオールへの表皮細胞培養物の応答に関与する主要タンパク質の同定 - プロテオーム解析
一連のHEKa培養物をカルシトリオールで処理し、細胞ペレットをカルシトリオール3曝露から3、6、および24時間後に回収した。その後、該細胞ペレットを、2-Dゲルおよびウェスタンブロット分析などのプロテオミクス法を利用して分析した。以下に記載した実験では、HEKa細胞を0.1μg/mLのカルシトリオールで処理してから、3-、6-、および24時間で得たサンプルを2-Dゲル電気泳動およびこれに関連する比較分析により調べた(結果は示さず)。
【０２２８】
合計で、約458個のタンパク質スポットの分析を、対照サンプルと3-、6-、および24時間処理サンプルとを比較する比較試験において実施した。統計的に有意な示差変化を示す6個のスポットを同定した。これらのスポットを切り取り、それらのタンパク質をトリプシン消化による配列同定および質量分析特性評価に供した。
【０２２９】
結果(表4-1)は、ケラチンがよくある混入物として観察されることが多いのとは対照的に、HEKa角化細胞サンプルからの6個のスポット群は純粋な内因性ケラチンを含有していたことを示している。2種のS100タンパク質を、グルタチオンS-トランスフェラーゼおよびガレクチン1とともに強力に調節されるものと同定した。ガレクチン1がグリコシル化されたとする証拠があった。
【表１２】
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【０２３０】
前記2種のS100タンパク質(A9およびA13)は、カルプロテクチンファミリーのタンパク質に属する。該ファミリーには、21の異なるタイプのこれら低分子量タンパク質が存在する。これらのS100タンパク質はカルシウムを結合し(EF-ハンドモチーフ)、それぞれのタイプが細胞特異的な様式で、かつ環境因子に依存するレベルで発現される。様々な疾患が、変化したS100タンパク質レベルと関連している(心筋症、神経変性および炎症性の障害、ならびに癌)。該S100タンパク質は、前記抗体アレイの結果においても、カルシトリオールに接触させるとアップレギュレートされるものと同定されていることに注意されたい。
【実施例５】
【０２３１】
実施例5.角化細胞の増殖に対するカルシトリオールの効果
一連のHEKa培養物を種々の濃度のカルシトリオールで処理してから、該HEKa細胞の増殖挙動を所定の増殖期間後に分析した。全ての実験を96ウェルプレートフォーマットで行った。各ウェルは、約100μLの培地中に同量のHEKa細胞を含有していた(通常は2,000〜5,000個の細胞／ウェル)。カルシトリオールをエタノールに溶解させることによりストック溶液を作製した。該ストック溶液を、4.0μg/mL〜約15.5 ng/mLの範囲にわたって増殖培地に1：2で連続希釈した(9種の試験濃度)。各試験濃度のカルシトリオール約100μLを対応する試験ウェルに加え、最終量を約200μL／ウェルとした。試験したカルシトリオール濃度は2.0〜0.008μg/mL(例えば、前記96ウェルプレートのカラム2〜10に対応)の範囲内であった。カラム11を陰性対照(カルシトリオール不含)として使用した。全ての実験を2回ずつ行った。
【０２３２】
図2に示すように、カルシトリオールを約0.008〜2.0μg/mLの濃度範囲にわたってHEKa細胞に滴下した。最低レベルのカルシトリオールはHEKa細胞における寛容性が高く、カルシトリオールはHEKa細胞の増殖を穏やかに刺激する(10〜20％以下)ように見えた。しかし、約1.0μg/mL以上のカルシトリオール濃度では、細胞増殖は阻害された。カルシトリオールに対するHEKa細胞の全般的な用量反応は、約6週間の期間にわたる19回の一連の個別実験を通して一貫していた(データは示さず)。
【実施例６】
【０２３３】
実施例6.癌細胞の増殖に対するカルシトリオールの効果
正常な角化細胞HEKaで観察されるものとは違い、試験した殆どの癌または不死化細胞系(例えば、SkBr-3(Her2が過剰発現される乳腺癌)、SKMEL-28(黒色腫)、PaCa2(膵癌)、NCI-ES-0808、およびNIH-3T3(不死化した繊維芽細胞))に関しては有意な増殖促進または増殖阻害効果は観察されなかった。かかる癌／不死細胞系により呈示された1つの例示的な増殖曲線(膵癌細胞系PaCa2のもの)を図3に示す。PaCa2の増殖は広範囲のカルシトリオール濃度にわたって影響を受けなかったことに注目されたい。
【０２３４】
試験した癌細胞系のうちの2つ、MCF-7(p53変異を伴う乳癌)およびHepG2(肝癌)は、低ビタミンD3濃度(0.05〜0.25μg/mL)でのカルシトリオール刺激と高カルシトリオール濃度(＞0.5μg/mL)でのカルシトリオール阻害に対して同じように応答した。図4を参照されたい。
【０２３５】
これらのデータは、被験ビタミンD化合物は、正常な角化細胞(例えばHEKa)にある特定の濃度限界値まで適用した場合、癌細胞の増殖を同時に促進することなくこれらの正常な角化細胞の増殖を促進することができるかもしれないということを示唆している。濃度限界値を超えると、該ビタミンD化合物も実は正常な角化細胞の増殖を阻害しうる。
【実施例７】
【０２３６】
実施例7.カルシトリオールがHEKa細胞に与える様々な化学療法薬からの保護効果
本実施例により、殆ど例外なく、本発明のビタミンD化合物は、殆どのタイプの最先端化学療法薬の細胞毒性効果から正常な角化細胞(例えばHEKa)を保護しうることを証明した。具体的に述べると、17種の抗癌薬を試験することにより、これらの薬物の細胞毒性効果に対するカルシトリオールの影響を評価した。薬物の名称およびそれらの各作用機序を下記表に列挙した。
【表１３】
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【０２３７】
最初の一連の実験では、数多くのキナーゼ阻害剤ベースの薬物を、0.1μg/mLのカルシトリオールがHEKa細胞に保護効果を提供するその能力を評定するために設計されたアッセイに使用した。これらの薬物としては、以下：エルロチニブ(タルセバ)、EGFR Tyrキナーゼ阻害剤；ゲフィチニブ(gefutubib)、EGFR Tyrキナーゼ阻害剤；数種のTyrキナーゼ(Raf、VEGF-R2、c-kit、PDGR-R)の阻害剤であるソラフェニブ；BCR／ABL Tyrキナーゼ阻害剤であるダサチニブ；および比較的非特異的なキナーゼ阻害剤であるスタウロスポリンが挙げられる。
【０２３８】
これらの実験で得た投与曲線は、低い薬物投薬レベル(全身に送達される化学療法を受けている患者の皮膚に影響を及ぼすレベルと違わない)では、カルシトリオールは一定の増殖刺激を提供してHEKa細胞を保護する(図5〜9を参照されたい)という一般的な傾向を示した。さらに、カルシトリオールは、より非特異的なキナーゼ阻害剤と比較すると、より特異的なキナーゼ阻害剤からのより顕著な保護効果を有しているように見えた。
【０２３９】
同様に、カルシトリオールはまた、低い投薬レベルのアルキル化剤、例えばシスプラチンおよびカルボプラチンからの中程度のレベルの保護も呈した(図10および11を参照されたい)。
【０２４０】
イリノテカンは恐らく、トポイソメラーゼIとの相互作用を通じて細胞増殖を阻害する。イリノテカンからの陽性の保護効果もまたカルシトリオールの存在下で観察された(図12)。
【０２４１】
パクリタキソールは有糸分裂阻害剤である。0.1μg/mLのカルシトリオールの存在は、パクリタキソールからの若干の保護効果を提供した(図13)。
【０２４２】
ピリミジン代謝拮抗物質ベースの薬物、例えば5-フルオロウラシル(5-FU)は、幾つかの様式で作用するが、主としてチミジル酸シンターゼ阻害剤として作用する。5-FUはDNA複製に必要なチミジンの合成を遮断する。このため、5-フルオロウラシルは、光線性(日光性)角化症および幾つかのタイプの皮膚基底細胞癌を治療するために局所的に使用されている。0.1μg/mLのカルシトリオールが存在した場合に、5-FUからの穏やかな保護効果が一応見られた(図14)。
【０２４３】
ゲムシタビンは、デオキシシチジンの2'炭素上の水素原子がフッ素原子で置き換えられているヌクレオシド類似体である。フルオロウラシルおよび他のピリミジン類似体と同様に、ゲムシタビンはDNA複製の際に核酸構成単位のうちの1つ(この場合はシチジン)に取って代わる。ゲムシタビンは様々な癌腫：非小細胞性肺癌、膵癌、膀胱癌、および乳癌の治療に用いられる。図15は、0.1μg/mLのカルシトリオールが存在した場合に、ゲムシタビンからの穏やかな保護効果が一応見られたことを示している。
【０２４４】
一方、カルシトリオールがドキソルビシンの細胞毒性効果からの有意な保護効果を提供したようには見えなかった(図16)。さらに、タモキシフェンからの保護効果はいずれも弱かった(図17)。タモキシフェンは腫瘍および他の組織標的上のエストロゲン受容体に競合的に結合して、DNA合成を低下させてかつエストロゲンの作用を阻害する核複合体を産生する。
【０２４５】
上記データと同じく、図18のデータは、HEKa角化細胞がカルシトリオールにより増殖刺激を受けたこと、また5-FUからのある程度の保護がHEKa細胞において観察されたことを示している。興味深いことに、試験した3種の癌細胞系Hep-G2、PaCa-2、およびSKMEL-28では、5-FU処理に対するそのED50曲線は0.1μg/mLのカルシトリオールをさらに補ったものと大して違わなかった。Hep-G2細胞はカルシトリオール処理により穏やかに刺激されたが、その5-FU ED50曲線はカルシトリオールの存在下であっても実質的に変化することはなかった。
【０２４６】
同様に、試験を行った以下の4種の癌細胞系：Hep-G2、MCF-7、PC-3およびPaCa-2を0.1μg/mLのカルシトリオールに2代継代分の期間曝露しても、これらの細胞の他の薬物(例えば、ドキソルビシン、シスプラチン、およびエルロチニブ)への応答が変更されることはなかった。
【０２４７】
これらの結果は、(例えば5-FUを使用する)化学療法の際に、カルシトリオールが癌細胞に対する該化学療法の有効性に拮抗することなく正常な角化細胞(例えばHEKa)を保護する可能性があることを示唆している。
【０２４８】
HEKa細胞において観察されたものとほぼ同じく、カルシトリオールが癌／不死化細胞(例えば、SkBr-3、SKMEL-28、PaCa-2、MCF-7、NCI-ES-0808、Hep-G2、およびNIH-3T3)に対するドキソルビシンの細胞毒性効果を明らかに変化させたようには見えなかった(図19を参照されたい)。
【０２４９】
さらに、市販薬とカルシトリオールとの生じうる相乗効果についても調査した。これらの実験では、選択した市販薬を、細胞インキュベーションのために最終所望濃度より4倍高い濃度から始めて連続希釈した。一方で0.4μg/mLのカルシトリオールのストックを調製し、その後該ストックを前記の連続希釈した薬物と混合した(比率は1：1とした)。この薬物／カルシトリオール混合物をその後少なくとも15分間インキュベートしてから、細胞培地に加えた(比率は100μL対100μLとした)。その結果、最終カルシトリオール濃度は0.1μg/mLとなった。
【０２５０】
薬物治療期間は通常3日間とした。この3日間の最後に、96ウェルプレートのバックグラウンドODを280 nmで読み取ってから、20μLの「基質セルタイター96アクエアス・ワン・ソリューション試薬(Substrate Cell Titer 96 Aqueous One Solution Reagent)」(Promega)を各ウェルに加えた。このプレートを37℃のインキュベーターに戻し入れ、490 nmにおけるそのODを、ODがおよそ1.5に達するまで各時刻に読み取った。正味のOD増加は、基質添加前のOD読取り値を差し引くことにより算出した。
【０２５１】
前記薬物が前記細胞に与える影響は、種々の濃度でのODを対照ウェル(薬物なし)のODと関連付けて比較することにより算出した。薬物濃度の関数としての正味ODの結果をプロットし、これを利用してED50値を決定した。
【０２５２】
HEKa細胞の結果の分析により、カルシトリオールと大部分の試験薬物(例えば、5-FU、ドキソルビシン、タモキシフェン、イリノテカン、パクリタキセル、カルボプラチン、スタウロスポリン、ビンクリスチン、シスプラチン、エルロチニブ、ゲムシタビン、イマチニブ、ゲフィチニブ、ソラフェニブおよびダサチニブ)との相互作用は生じないことが示された。他の細胞で薬物の組み合わせを試験した場合にも同じ結果が得られた。したがって、いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、カルシトリオールと上記薬物の作用機序は異なっていると思われる。
【実施例８】
【０２５３】
実施例8.カルシトリオールによる細胞の前処理：化学療法薬の存在下および非存在下におけるカルシトリオールの細胞ベースアッセイ試験
細胞の生存能力を評価するための上記の細胞ベースのアッセイを本実施例に利用することにより、選択した化学療法薬の作用からのカルシトリオールの潜在的な保護効果を評定した。各細胞系を、0.1μg/mLのカルシトリオールの存在下で細胞2代継代分の期間増殖させた。次に、これらの前処理済み細胞を用いて細胞ベースのアッセイを組み立てた。さらに、無処理細胞を使用して二重の薬物／カルシトリオール濃度での並列実験を確立した。これにより、化学療法薬投与前のカルシトリオール長期曝露の潜在的効果の対照比較(side-by-side comparison)が可能となった。
【０２５４】
5種の各細胞系を0.1μg/mLのカルシトリオールの存在下で細胞2代継代分の期間増殖させた後、HEKa細胞のみがその全般的な増殖および形態の点で有意に影響を受けた。前記4種の癌細胞系は増殖し続け、またそれらの全体的な形態的外観が変化することはなかった。しかし、HEKa細胞はカルシトリオール長期曝露後に増殖を止め、またそれらの形態は、カルシトリオール処理前のより枝分かれした外観とは対照的に、一方向に伸びたものに変化した。この細胞系について、新たな細胞群を使用し、化学療法薬の存在下における試験の前にカルシトリオールの存在下で1代継代分だけ曝露した。
【０２５５】
一般的に使用される3種の化学療法薬(ドキソルビシン、シスプラチンおよびエルロチニブ)を、カルシトリオール処理細胞を評価するために選択した。市販薬とカルシトリオールとの生じるうる相乗または保護効果について調査した。これらの実験では、該市販薬を、細胞インキュベーションのために最終所望濃度より4倍高い濃度から始めて連続希釈した。0.4μg/mLのカルシトリオールのストックを調製し、該ストックを前記の連続希釈した薬物に加えた(比率は1：1とした)。この薬物とカルシトリオールとの混合物を少なくとも15分間インキュベートしてから前記細胞に加えた(比率は100μL対100μLとした)。その結果、最終カルシトリオール濃度は0.1μg/mLとなった。
【０２５６】
前記アッセイは、一貫性を与え、かつ直接比較を可能にするために、先に記載した方法に従って実施した。結果は生存細胞の総数の測定に基づくものとした。その結果(示さず)は、カルシトリオール前処理は細胞培養物への化学保護効果に必要なものではないということを示していた。前処理群と同時処理群の結果はほぼ同一であった。従って、カルシトリオールの局所適用は、化学療法剤の全身送達と同時期に行うことができる。段階的な適用は必要ない。
【実施例９】
【０２５７】
実施例9.新規カルシトリオール製剤による化学療法誘発性脱毛症(CIA)からの保護
脱毛症は化学療法の最も悩ましい副作用の1つであり、そのための治療的介入は現時点では存在しない。新生仔ラットは、成長期の毛包パターンがヒトのそれと似ていることから、化学療法誘発性脱毛症(CIA)を研究するための優れたモデルであることが証明されている。
【０２５８】
本研究では、セコステロイドであるカルシトリオール(米国薬局方グレード)を局所製剤(40％(w/w)のプロピレングリコール、米国薬局方；および60％(w/w)の脱水アルコール、200プルーフ、未変性、米国薬局方)として送達することにより、投与量および時間依存的な様式でCIAを治療／予防した。
【０２５９】
具体的に述べると、仔のいるロングエバンス・ラットおよびスプレイグダウリー・ラットをHarlan Laboratories, Inc.から購入した。それらラットを、適当な動物取扱規則に従って飼育し給餌した。仔ラットを実験開始前に48時間順応させた。セコステロイドであるカルシトリオールの製剤(上掲)またはビヒクル対照(カルシトリオール不含)を、5日目に開始して6日間連続して、毎日頭部および頸部の面に局所的に適用した。ラットをその同腹仔および母親から6時間の期間隔離した。その後、処理面の汚れをせっけんおよび水で清潔にし、仔ラットをその同腹仔のもとに戻した。13日目に、ラットにエトポシド(1.5 mg/kgを3日間毎日)またはシクロホスファミド(CTX)(37.5 mg/kgを1回)、またはシクロホスファミド(35 mg/kgを1回)とドキソルビシン(2.5 mg/kgを3日間毎日)との組み合わせのいずれかを与えた。全ての化学療法剤はSigmaから購入し、全量0.1 mLを腹腔内に(i.p.)投与した。化学療法の最終投与から10日後に脱毛症が記録された。
【０２６０】
ラットに緑色白血病を移植する実験のために、生後5日目に、ラットを無作為に3つの群(各45匹)に分けた。全てのラットに、0.1 mLの無血清(SF)RPMI中1×105個の緑色白血病細胞系MIAC51を与えた(i.p.)。MIAC51は、L-グルタミンおよび10％ウシ胎仔血清を補ったRPMI 1640中、5％CO2、湿度100％のインキュベータにおいて37℃で培養した。細胞を50％コンフルエントな状態(1.5×106 mL)まで増殖させてから、50 mLコニカルチューブに採集し、室温で600g×10分遠心分離し、さらにSF-RPMI中に1×106 /mLの濃度で再懸濁した。第1群のラットには追加の処理は行わなかった。第2群のラットには、13日目に局所用ビヒクルおよびCTXを与えた。第3群のラットには、13日目に局所用カルシトリオール製剤(0.1μg)およびCTXを与えた。局所適用は先に記載した通りに実施した。
【０２６１】
生後23日目に、全てのラットから血液サンプルを採取し、分別を実施した。白血病に罹ったラットを犠牲にし、白血病に罹っていないラットは生かしておいて31日目に2回目の分別を行い、いかなる点であっても白血病が検出されれば動物をCO2での窒息により犠牲にした。
【０２６２】
結果は、全身の脱毛症はエトポシドを与えた群で観察されたということを示している。一方、0.1μgのカルシトリオールで6時間処理したラットでは、全ての動物において部分的で局部的な保護が観察された。0.3μgのカルシトリオールを与えている群では全身の保護が達成された。図20Aおよび20Bを参照されたい。
【０２６３】
シクロホスファミドを与えた群においては、対照ラットは完全に脱毛したが、0.1μgのカルシトリオールを与えたラットではエトポシドについて観察されたものと同様の保護が達成された。また、0.3μgのカルシトリオールの投与により、シクロホスファミド処理ラットにおいてその全身が保護された。図21を参照されたい。他の化学療法または併用化学療法レジメンを用いた際の同様の結果を図22A、22B、22Cおよび23に示す。
【０２６４】
ラットに緑色白血病を移植した別個の実験では、予備的結果はカルシトリオールの局所適用によるシクロホスファミドからの癌細胞の保護を示さなかった。図24を参照されたい。
【０２６５】
結論として、被験製剤中のカルシトリオールを用いた前処理により、癌細胞を保護することなくCIAからの保護が提供された。局所用カルシトリオールは、単独ならびに併用化学療法により誘発されるCIAから投与量依存的な様式でCIAを予防した。さらに、局所用カルシトリオールは、化学療法の細胞毒性効果から癌細胞を保護することなくCIAを予防した。
【実施例１０】
【０２６６】
実施例10.複数回の化学療法レジメン(Multi-Chemotherapy Regimens)を受けている緑色白血病ラットにおける局所用カルシトリオールによるCIAの保護
本研究では、複数コースの(multi-course)化学療法により誘発される脱毛症の動物モデルにおいて、局所用カルシトリオール溶液の保護効果を検証した。本研究に使用したラットは、20-メチルコラントレンの胃への点滴注入とその後のラット新生仔への緑色白血病細胞の注射により開発されたラット緑色白血病細胞系であるMIAC51を保有するものであった。MIAC51細胞系はヒト緑色白血病の特徴(白血病、白血病性腹水および緑色種形成)を示す悪性の骨髄性白血病を引き起こす。Jimenezら、Science 238： 1278-1280 (1987)を参照されたい。
【０２６７】
今までのところ、化学療法誘発性脱毛症(CIA)を試験するための有効なin vitroまたは無脊椎動物モデルは存在しない。最もよく使用されるモデルの中では、Jimenezらにより開発された新生仔ラットがヒトとの直接的な相関を示した(Int J Cancer 1996；65：97-103、参照により組み込まれるものとする)。その後、毛を刈り取ることにより第2成長期段階を誘導することが可能であり、またその結果複数コースの化学療法を試験することが可能となるラットモデルが開発された。このモデルを使用することで、頻用される脱毛性化学療法(例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、パクリタキセル、エトポシド、およびシタラビン、ならびにそれらの組み合わせ)について試験することができる。
【０２６８】
化学療法誘発性脱毛症のための保護剤を試験する場合、その試験物質が化学療法から毛包、さらには癌細胞を保護するのか、および／または療法に干渉するのかを判断することが最も大切である。Jimenezらにより開発された新生仔ラット白血病モデルは、白血病の進行、白血病の治療、化学療法剤との潜在的な相互作用に対する前記ビタミンD化合物のあらゆる効果と、化学療法誘導性脱毛症の予防に対する前記ビタミンD化合物の効果を同時に試験する機会を提供する。またこのモデルは、同一動物における試験薬剤の複数サイクルにより何度も毛包が保護されるのかという問いの答えも提供する。さらに、着色したロングエバンス・ラットを使用することで、その試験により試験薬剤が毛色を保護するかどうかの判定も可能となる。
【０２６９】
カルシトリオール製剤は、米国薬局方グレードのプロピレングリコール(40％w/w)と無水アブソルートエタノール、200プルーフ(60％w/w)とを含有するビヒクル中に米国薬局方グレードのカルシトリオールを含有する透明で無水の液体である。これらの研究におけるカルシトリオールの濃度は〜0.2μg/100μL(2μg/mL)とした。この試験物質を氷上で受け取り、到着次第速やかに4〜5℃で保存した。その後、ロットを氷上で維持しながら4.5 mLチューブに小分けした。動物群は1変数あたり40匹以上であるため、それぞれ4.5 mL単位の試験物質を4〜5℃でロット番号を記したポリプロピレンチューブに入れた。この4.5 mLチューブの試験物質を暗い箱の中で保管し、実験ごとに必要な量だけを冷却装置から取り出した。4.5 mLチューブに入れた試験物質サンプルを一定の間隔でアッセイすることにより、カルシトリオールレベルを測定した。実験の際、ラットを処理している間はチューブを氷上に維持した。
【０２７０】
前記ビヒクルは、米国薬局方グレードのプロピレングリコール(40％w/w)と米国薬局方グレードの無水かつ未変性のアブソルートエタノール、200プルーフ(60％w/w)で構成されている。実験の際には、この対照ビヒクルを前記試験物質と全く同じように取り扱った。
【０２７１】
前記試験物質と前記ビヒクルそのものの両方を試験した。各試験群は、本研究にとって統計的に有意である40匹の動物で構成した。この数にはモデルの自然減が算入されており、それは動物の数が減少するあらゆる不測の事態に備えてのことである。全ての動物に、該動物が5日齢となった時点でMIAC51を注射した。5つの化学療法レジメンを試験した：シクロホスファミド、シクロホスファミド／ドキソルビシン、シクロホスファミド／ドキソルビシン／シタラビン、シクロホスファミド／パクリタキセル／エトポシドおよびドキソルビシン／パクリタキセル／エトポシド。試験群は、以下：化学療法なし、化学療法のみ、化学療法＋ビヒクル、化学療法＋試験物質＝化学療法レジメンあたり160匹の動物、とした。従って、使用した動物の最終的な推定数は次の通りとなった：5通りの併用化学療法レジメン×160匹の動物＝800匹の仔／ラット。第2成長期相の成体ラットモデルを使用した実験では、癌のない動物(例えば、化学療法を生き延びた動物)だけを使用し、一方で白血病の初期徴候を明らかに示す動物は安楽死させた。
【０２７２】
シェイの(Shay's)緑色白血病MIAC51細胞系の培養：MIAC51は、先に記載したように、湿度100％の5％CO2インキュベーターにおいて37℃で培養した(Science 1987；238：1278-80)。細胞は、非組織培養物処理フラスコ(Falcon)においてL-グルタミンおよび10％ウシ胎仔血清(Gibco Invitrogen、Carlsbad、CA)を補ったRPMI 1640培地(Gibco Invitrogen、Carlsbad、CA)中で増殖させた。動物への細胞の注射前に、該細胞を50％コンフルエントな状態まで増殖させてからコニカルチューブに採集した。その後、細胞を600 gで10分間室温で遠心分離し、さらにウシ胎仔血清不含RPMI 1640中に濃度 1×106で再懸濁した。その後、この細胞懸濁液を滅菌条件下で29ゲージ(ga).1/2 ccのインスリン注射器に移した。
【０２７３】
MIAC51の注射：いずれの仔ラットもMIAC51注射の時点で5日齢であり、それらを手で保定した。右脚を優しく引っ張り、対象面をアルコール綿棒で消毒した。その後、MIAC51を腹腔内に注射した。注射器の針、経路およびセルは滅菌されており、注射の度に新しい注射器を使用した。白血病の初期徴候の発生は大抵21〜33日目に観察された。このため、血液塗抹標本を23および31日目に作成した。癌のない動物のみ31日目に剃毛し、残りは安楽死させた。
【０２７４】
新生仔ラットにおける第1成長期段階での試験および対照物質の投与：各同腹仔には、その頭部および頸部の面およそ2 cm2にビヒクルまたは試験物質を局所的に投与した。5および6日齢のラットには、それらがさらに小さいため、100μLを4等分した量である25μLずつ4回適用した。試験物質またはビヒクルは、目盛り付きマイクロピペットで200μL滅菌チップを使用して適用した。試験物質またはビヒクルを頭部表面に適用した後、完全に吸収されるまで手袋をはめた指で擦り込んだ。その後すぐに、新たな4分の1量を該頭部に適用し、100μLの試験物質またはビヒクル全てを適用するまで前記手順を繰り返した。7、8、9および10日齢の動物には50μL量を2回適用した。より日齢の高い動物には、100μLを1回の投与で適用することが可能であった。試験する物質の適用は頭部および頸部に行い、耐溶剤性ニトリル手袋を用いて右手の人差し指で10秒間擦り込んだ。この適用法の背景にある論理的根拠は、異なる日齢では飽和速度が異なる場合があり、また試験物質またはビヒクルの送達も異なる場合があるということである。溶液を皮膚に完全に浸透させてから、仔ラットを特別設計の隔離コンパートメントを備えたケージ内に6時間隔離した。その後、仔ラットを低刺激の実験室用ハンドソープ(Soft-Cide EC、VWR international)で洗い、ペーパータオルで丁寧に拭いた。
【０２７５】
新生仔ラットへの第1成長期段階での化学療法の投与：40匹の仔ラットに各化学療法レジメを与え、40匹に各化学療法レジメおよび試験物質を与え、さらに40匹に各化学療法レジメおよびビヒクルを与えた。対照として、40匹の動物には化学療法を与えなかった。各同腹仔の重量の平均値を求め、これを利用して適切な濃度の化学療法を調製した。化学療法は、29 ga. 1/2cc インスリン注射器を使用し、動物の重量に応じておよそ100μLの量で腹腔内に注射した。注射の際、各仔ラットの右脚を優しく引っ張り、対象面をアルコール綿棒で消毒した。
【０２７６】
成体ラットにおける第2成長期段階での試験および対照物質の投与：血液塗抹標本の血液学的分析により31日目に癌のないことが証明された生存ラットを手で保定し、頭部および頸部の面(2〜3 cm2)を剃毛した。9日後、ラットが40日齢〜45日齢までである時点で、ビヒクルまたは試験物質のいずれかをその頭部および頸部の面に適用した。100μLの量を1回の投与でその頭部および頸部に適用し、耐溶剤性ニトリル手袋を用いて右手の人差し指で10秒間擦り込んだ。溶液を皮膚に完全に浸透させてから、ラットを1匹ずつケージ内に隔離した。その後、ラットを低刺激の実験室用ハンドソープ(Soft-Cide EC、VWR international)で洗い、ペーパータオルで丁寧に拭いた。
【０２７７】
第2成長期段階の成体ラットへの化学療法の投与：各群に5種の異なる化学療法レジメンのうちの1つを与え、シタラビンを併用して与えるものについては47日目に開始、かつ53日目に終了とした。重量の平均値を求め、これを利用して適切な濃度の化学療法を調製した。化学療法剤は、29 ga. 1/2cc インスリン注射器を使用し、動物の重量に応じておよそ100μLの量で腹腔内に注射した。化学療法を投与する際、ラットは麻酔を使用せず手で保定した。注射面をアルコール綿棒で消毒した。
【０２７８】
投与の経路：試験物質およびビヒクルは皮膚に適用した。化学療法は腹腔内に注射した。
【０２７９】
投与の頻度および期間ならびに投与のレベルおよび量：試験物質およびビヒクルを、毛周期の第1および第2成長期の両方に対して6日間毎日投与した。試験物質はプロピレングリコール／エタノール中に濃度2μg/mLのカルシトリオールを含有しており、ビヒクルはプロピレングリコール／エタノール・ビヒクルのみを含有していた。化学療法剤は、重量を基におよそ100μLの量で腹腔内に与えた。
【０２８０】
脱毛症の目視観測および格付け：全頭部(頭部および頸部)または全身の脱毛症を、次の等級を使用して格付けした：0 ＝脱毛症なし；1＋＝0〜25％の脱毛症；2＋＝25〜50％の脱毛症；3＋＝50〜75％の脱毛症；4＋＝75〜100％の脱毛症。ケージのルーチン観測を行いつつ脱毛症を格付けするために、この目視観測の等級を日常的に使用した。また、全ての同腹仔または成体ラットが毛を失った時点で、写真記録をこの等級で補完した。
【実施例１１】
【０２８１】
実施例11.皮膚吸収試験：ゲッチンゲン・ミニブタ(Gottingen Minipigs(登録商標))へのカルシトリオール溶液の局所適用およびex vivo ブタ皮膚におけるカルシトリオールの定量
ブタは、その皮膚がヒトのものとよく似ているため、皮膚経路の送達を伴う毒性試験において頻繁に用いられる。このため、ブタを本試験で使用することにより、ゲッチンゲン・ミニブタ(登録商標)においてカルシトリオール局所製剤の皮膚耐容性および皮膚浸透を経皮投与後7日間評価した。
【０２８２】
3匹の雄と3匹の雌のゲッチンゲン・ミニブタ(登録商標)からなるある処理群には、試験物質またはプラセボ物質を5ヶ所の別々の投与部位に0(プラセボ)、1、3、10、および30μg/mLの投与濃度で経皮的に投与した。1匹の雄ミニブタからなる追加の処理群には、試験物質またはプラセボ物質を2ヶ所の別々の投与部位にそれぞれ0(プラセボ)および100μg/mLの投与濃度で経皮的に投与した。プラセボまたは試験物質は、試験期間中の7日間、両群に1日2回およそ6時間おいて、適用部位あたり4 mg/cm2 (6 cm×6 cmの試験面積中144 mg、または種々の濃度の前記活性成分およびビヒクルを含有する試験溶液166μLに相当する)の適用量で投与した。
【０２８３】
罹患率、死亡率、損傷、ならびに食物および水の利用率に関する観察を、全ての動物について1日2回行った。臨床観察は毎日行った。皮膚反応の評価は、試験前に行い、さらに毎日投与前に行った。試験前および最後(7日目)に体重を測定し記録した。理学的検査は試験前に行った。試験終了時に剖検を実施し、処理済みおよび無処理の皮膚片を採集して保存した。これらの皮膚部位ならびに処理部位近くの無処理の皮膚部位それぞれの顕微鏡検査を行った。
【０２８４】
結果は、ゲッチンゲン・ミニブタ(登録商標)への0、1、3、10、30、および100μg/mLの濃度でのカルシトリオール局所製剤の経皮投与は寛容性が高かったことを示している。いずれかの処理部位においても、生存、臨床所見、皮膚刺激性、体重、皮膚の肉眼または顕微鏡検査への処理の影響は見られなかった(データは示さず)。組織内分布試験から得たデータは、カルシトリオールは殆どの角質層と表皮サンプルの他の部分で測定できたが、真皮サンプルでは測定できなかったということを示している(唯一の例外は、100μg/mLの投与量を適用した1匹の雄ミニブタである)。この一連の実験では、雄は雌よりも高いカルシトリオール組織レベルを示すように見えた。組織レベルに対する最も明らかな適用投与量との相関は表皮で観察され、カルシトリオール濃度が3〜100μg/mLと増加するにつれて線形に近い増大を示した。
【０２８５】
具体的に述べると、前記プラセボ(プロピレングリコール(米国薬局方)とエタノール(未変性)無水、200プルーフ - U.S.、米国薬局方との40/60混合物(w/w))およびカルシトリオール局所製剤を、予め考案しておいた濃度1、3、10、30、および100μg/gで使用した。この試験物質をそのまま(希釈せずに)投与した。これらのプラセボおよび試験物質の製剤を毎日使用するために一旦それぞれ所要の濃度に調剤し、室温で保存した。
【０２８６】
実験に使用したことがない3匹の雄と3匹の雌のゲッチンゲン・ミニブタ(登録商標)(およそ4〜5月齢)は全て、Marshall BioResources、North Rose、New Yorkから入手した。もう1匹の雄(入手時におよそ4.5月齢)を後にストック群から移入した。単純無作為化手順を使用して、4匹の雄および3匹の雌の動物(無作為化の時点での重さはそれぞれ11.75〜15.55 kgおよび14.50〜16.65 kgであった)をプラセボ群と処理群に割り当てた。前記のプラセボおよび試験物質を、試験期間中の7日間、1日2回およそ6時間おいて経皮的に投与した。投与濃度は0、1、3、10、30、および100μg/mLとし、4 mg/cm2(144 mgまたは166μLの試験溶液に相当する)の適用量で投与した。投与開始前(第1群および第2群でそれぞれ4日前および5日前)に、電気バリカンを使用して適用部位から毛を刈り取った。皮膚が擦りむけないように気を付けた。各動物の背部表面を、第1群に関しては5ヶ所の適用部位に分け、第2群に関しては2ヶ所の適用部位に分けた。各適用部位はおよそ6×6 cmとし、各部位の間には少なくとも2 cmの間隔を置いた。プラセボおよび試験物質の製剤を、ガラス撹拌棒または適当な器具を用いて指定適用部位に均一に適用した。投与前に、以前の投与に由来する残留試験物質を、水道水で湿らせた柔らかいペーパータオル(すなわち、ワイプオール(WyPall)(登録商標))を使用して優しく取り除いた。
【０２８７】
本試験の最後に、皮膚を腹側正中切開部から反転させて、処理済みおよび無処理の皮膚片を採集し保存した。6×6 cm四方の投与部位片は、まずその表面を低刺激のせっけんと水との混合物(例えば、水またはその等価物中1％のアイボリー石けん(Ivory Soap))で徹底的に洗うことにより、あらゆる残留局所試験製剤を取り除いた。その後、洗浄した皮膚片をエタノールできれいに拭き、脂肪層まで、この層を含むように切除した。切除する面が投与面よりも大きい場合は、該投与面に消えないインクで印を付けることにより、投与した皮膚面を線引きした。1.5 cm×1.5 cm片を平らに置き、サランラップ(登録商標)(またはその等価物)で二重に包んでから、液体窒素中で急速冷凍した。このサンプルを-70℃で保存し、分析のためにドライアイスにのせて翌日配達便で発送した。各皮膚片を適切に(例えば、動物識別、試験番号、日付などで)識別した。
【０２８８】
分析先に届き次第、皮膚片を防水ビニール袋に入れ、温水(30℃〜35℃まで)中に浸すことにより解凍した。各皮膚片を蒸留脱イオン水で優しくすすぎ、残留する試験物質および血液を全て除去した。全ての皮下組織(例えば、脂肪)を、メスを使った手作業での剥離により除去した。前記投与面の中央部分に4つの別個の1 cm2の円(複製(replicates))を描き、各部位をその後識別してから実面積(actual area)を記録した。次に、これらの複製試験部位を、1 cm2パンチを使用して皮膚シートから切り取った。皮膚片の重さを量り、その重量を記録した。各複製分画面に、該面の表面のおよそ10％〜25％が光沢を帯びるまで十分な回数(10回以下〜20回以下)テープストリッピング(トランスポア(Transpore)(商標)、3M)を行った。この工程により、角質層および残留する表面投与物質を除去した。
【０２８９】
テープストリッピング後、皮膚をおよそ1〜1.5分間60℃までの熱に曝露することにより表皮(角質層がないもの(sans stratum corneum)、以下単に「表皮」と記す)と真皮に分けた。次いで、この皮膚層を、先の細い鉗子またはメスを使用して細かく裂いた。表皮および真皮の重さを量り、その重量を記録した。
【０２９０】
抽出の際は、全ての皮膚サンプルを1 mLの無水エタノール(Sigma-Aldrich、米国薬局方／米国国民医薬品集(NF)グレード)中で抽出した。テープ片は5 mLのアセトニトリル(EMD、HPLCグレード)中で抽出した。抽出はいずれも室温でおよそ24時間行った。500μLの量のテープ片抽出物を真空遠心分離により乾燥させてから100μLの無水アセトニトリルで再構成した。同様に、表皮抽出物を乾燥させてから100μLの80：20のエタノール：水で再構成した。
【０２９１】
カルシトリオールの定量は紫外および質量分光検出器を備えた逆相高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)により行った。検出の下限値は0.4 ng/mLと推定した。
【０２９２】
角質層(テープ片)、表皮および真皮から得たカルシトリオールの定量に関する結果を表11-1〜11-4に要約した。図25Aおよび25Bはそれぞれ角質層および表皮におけるレベルを例示したものであり、図26は雄だけの表皮レベルを例示したものである。角質層データは、2つの異なる単位、ng/cm2(テープストリッピングしたサンプルにおいて回収したカルシトリオールの量をサンプル面積の関数として表すための単位)および推定μg／組織mgで提供した。ただし、μg/mgとして報告した濃度は、層分離前の総サンプル重量から該サンプルの表皮および真皮の重量を引いたその差により測定したものである(テープ片に付着しているため実重量による測定よりも好ましい)。表皮および真皮のサンプルは、該サンプルから測定された量を皮膚層の実際の湿重量で割ったものを用いて、組織濃度(ng/mg)として報告した。
【表１４】
0005978130.tif 000024
【表１５】
0005978130.tif 000025
【表１６】
0005978130.tif 000026
【表１７】
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【０２９３】
データは、カルシトリオールは殆どの角質層および表皮のサンプルで測定できたが、真皮サンプルでは測定できなかったことを示している(唯一の例外は、100μg/mLの投与量を適用した1匹の雄ミニブタである)。このことは、先に実施例1において記載したフランツのヒト皮膚有限用量モデルで得られた結果と一致している。
【０２９４】
評価した組織サンプル全てにおいて、雄のミニブタは概して雌のミニブタよりも高いカルシトリオール組織レベルを示すように見えた。
【０２９５】
最高濃度のカルシトリオールは角質層のものとして観察された。角質層における含有量は推定値であり、その高い濃度は、表面洗浄工程により除去されなかった皮膚の毛穴の奥のカルシトリオールの存在を反映している可能性があるが、角質層の新油性の高い基質へのカルシトリオールの溶解度が原因となっている可能性もある。
【０２９６】
しかし、組織レベルに対する最も明らかな適用投与量との相関は表皮で観察され、3〜100μg／適用mLのカルシトリオール濃度で線形に近い増大を示した。
【実施例１２】
【０２９７】
実施例12.複数コースの化学療法を受けている緑色白血病ラットにおける局所用溶液試験
ロングエバンス・ラット(Harlan Laboratories, Inc)は、到着時には3日齢であった。この動物の重量を、到着時および実験の終了までの毎日、電子スケール(American Scientific Products TL 410s)を使用して求めた。実験の開始前にラットを2日間飼育した。その後、動物を無作為に4つの群に分けた。全てのラットに、下記のようにMIAC51を与えた。
【０２９８】
・第1群(n=27)にはさらなる処理は行わなかった。
【０２９９】
・第2群(n=40)には化学療法のみを与えた。
【０３００】
・第3群(n=40)には化学療法および下記の局所用ビヒクルを与えた。
【０３０１】
・第4群(n=40)には化学療法および局所用カルシトリオールを与えた。
【０３０２】
処理は生後6日目に開始した。0.1 mLの量の局所用カルシトリオールをラットの頭部および頸部の上に局所的に適用した。毛周期の第1成長期については、6および7日目に、ビヒクルまたはカルシトリオールのいずれかを、飽和を避けるために25μLの量で4回適用した。8、9、10および11日目には50μLの量を2回適用した。毛周期の第2成長期については、ラットを40日目から45日目まで毎日0.1 mLのビヒクルまたはカルシトリオールで処理した。適用毎に、ニトリル製の実験用手袋をはめた右手の人差し指で2 cm2の面を10秒間擦る必要があった。処理が終了してから、各ラットを一匹ずつ6時間隔離した。その後、各ラットの頭部および背部を低刺激のハンドソープ(VWR InternationalからのSoft CIDE-EC)および蒸留水で洗った。その後、仔ラットをその母親の元に返してから動物飼育室に戻した。毛周期の第2成長期については、成体ラットを同腹仔と一緒にそれらのケージに戻し入れてから動物飼育室に戻した。
【０３０３】
生後5日目に、全てのラットに、0.1 mLの無血清(SF)RPMI中の1×105 MIAC51をその腹腔内に与えた。MIAC51は、L-グルタミンおよび10％ウシ胎仔血清を補ったRPMI 1640中で、5％CO2、100％湿度のインキュベーターにおいて37℃で培養した。細胞を50％コンフルエントな状態(1.5×106 mL)まで増殖させてから50 mLコニカルチューブに採集し、室温にて10分間600gで遠心分離し、さらに注射前にSF-RPMI中に1×106 /mLの濃度で再懸濁した。
【０３０４】
生後23日目に、血液サンプルを全てのラットから採取して分別を実施した。白血病に罹ったラットを犠牲にし、白血病に罹っていないラットをさらなる実験に使用した。31日目に2回目の分別を実施し、白血病の動物を犠牲にした。生き延びた動物は、2セット目のビヒクルまたはカルシトリオール処理の投与前に2cm2の面積の毛を剃り、15日後に2コース目の化学療法を与えた。第2および第1成長期相の両方において、化学療法処理の10日後に脱毛症が記録された。
【０３０５】
各ラットの脱毛症の程度は、以下の等級：
0 ＝脱毛症なし
1＋＝0〜25％の脱毛症
2＋＝25〜50％の脱毛症
3＋＝50〜75％の脱毛症
4＋＝75〜100％の脱毛症
により決定した。
【０３０６】
実験用化合物
2.3μg/gのカルシトリオール製剤をビヒクル(40重量％のプロピレングリコールおよび60重量％の無水で200プルーフのエタノール)で希釈することにより最終濃度を2μg/mLとした。1mLのバイアルを小分けし、冷却装置内で4℃に維持した。各実験に際して、2.3μg/gのカルシトリオールおよびビヒクルが入ったバイアルを1つ取り出し、実験手順中は氷上に置いた。使用しなかった調製物は廃棄した。
【０３０７】
A.シクロホスファミド単独
化学療法の投与
若齢ラット：13日目に、全てのラットに、シクロホスファミド(CTX)(Sigma Aldrich、ロット番号068k1131) 37.5 mg/kgを、1/2 ccインスリン注射器29G 1/2”(B-D)を使用し全量0.1 mLのH2O／マンニトール混合物としてその腹腔内に与えた。
【０３０８】
成体ラット：2コース目の化学療法の際、150 mg/kgのシクロホスファミドを、麻酔をかけた(50 mg/kgのケタミン／5 mg/kgのキシラジン)47日齢のラットに、1/2 ccインスリン注射器29G 1/2”(B-D)を使用し全量0.1 mLのH2O／マンニトール混合物としてその腹腔内に与えた。
【０３０９】
結果を表12-1および12-2に示す。具体的に述べると、1回目の化学療法(表12-1および図27)後は、シクロホスファミドを単独で、またはシクロホスファミドをビヒクルと一緒に与えている全てのラットで重度の脱毛症(＋4)が生じた。これに対して、シクロホスファミドをカルシトリオールと一緒に与えたラットはいずれも、対照群と同様に脱毛症の徴候を全く呈示しなかった。表12-2に示すように、2回目の化学療法後に同様の結果が得られた(図28も参照されたい)。
【表１８】
0005978130.tif 000028
【表１９】
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【０３１０】
さらに、本実験により、カルシトリオールの局所製剤を与えているラットの生存率は化学療法を単独で、またはビヒクルと一緒に与えているそれらのラットと実質的に似ていることが示された。表12-3に示すように、シクロホスファミドおよびカルシトリオール局所製剤で処理したそれらの動物の生存率(25％)は、シクロホスファミド単独で処理したそれらのラット(20％)ならびにシクロホスファミドおよびビヒクルで処理したそれらのラット(23％)と似ていた。
【表２０】
0005978130.tif 000030
【０３１１】
要約すると、シクロホスファミド群では、カルシトリオールは両方の毛周期においてCIAからの100％の保護を提供し、かつ20〜25％の範囲内にあるその治癒率に干渉することはなかった。
【０３１２】
B.シクロホスファミドおよびドキソルビシン
化学療法の投与
若齢ラット：13日目に、全てのラットに、シクロホスファミド(CTX)(Sigma Aldrich、ロット番号068k1131) 37.5 mg/kgを、1/2 ccインスリン注射器29G 1/2”(B-D)を使用し全量0.1 mLのH2O／マンニトール混合物としてその腹腔内に与えた。13、14、および15日目に、ラットに0.1 mLの蒸留水中の塩酸ドキソルビシン(Sigma Aldrich、ロット番号038k1349)(ADM)2.5 mg/kgをI.P.で与えた。
【０３１３】
成体ラット：2コース目の化学療法の際、47日目に、150 mg/kgのシクロホスファミドを、麻酔をかけた(50 mg/kgのケタミン／5 mg/kg キシラジン)ラットに、1/2 ccインスリン注射器29G 1/2”(B-D)を使用し全量0.1 mLのH2O／マンニトール混合物としてその腹腔内に与えた。2コース目の化学療法の際は、47〜49日目に、先に記載した通りにラットに20 mg/kgのADMを与えた。
【０３１４】
結果を表12-4および12-5に示す。具体的に述べると、1回目の化学療法(表12-4および図29)後は、シクロホスファミドおよびドキソルビシンだけを、またはこれらをビヒクルと一緒に与えている全てのラットで重度の脱毛症(＋4)が生じた。これに対して、シクロホスファミドおよびドキソルビシンをカルシトリオールと一緒に与えたラットはいずれも、対照群と同様に脱毛症の徴候を全く呈示しなかった。表12-5に示すように、2回目の化学療法後に同様の結果が得られた(図30も参照されたい)。
【表２１】
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【表２２】
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【０３１５】
さらに、本実験により、カルシトリオールの局所製剤を与えているラットの生存率は化学療法を単独で、またはビヒクルと一緒に与えているそれらのラットと実質的に似ていることが示された。表12-6に示すように、シクロホスファミドおよびドキソルビシンをカルシトリオールの局所製剤と併用して処理したそれらの動物の生存率(50％)は、化学療法単独で処理したそれらのラット(53％)ならびに化学療法およびビヒクルで処理したそれらのラット(55％)と似ていた。
【表２３】
0005978130.tif 000033
【０３１６】
要約すると、シクロホスファミドおよびドキソルビシン群では、カルシトリオールは両方の毛周期においてCIAからの100％の保護を提供し、かつ50〜55％の範囲内にあるその治癒率に干渉することはなかった。
【０３１７】
C.シクロホスファミド、ドキソルビシンおよびシタラビン
化学療法の投与
若齢ラット：13日目に、全てのラットに、シクロホスファミド(CTX)(Sigma Aldrich、ロット番号068k1131) 30 mg/kgを、1/2 ccインスリン注射器29G 1/2”(B-D)を使用し全量0.1 mLのH2O／マンニトール混合物としてその腹腔内に与えた。13、14、および15日目に、ラットに0.1 mLの蒸留水中の2.0 mg/kgの塩酸ドキソルビシン(Sigma Aldrich、ロット番号038k1349)(ADM)をその腹腔内に与え、さらに13〜19日目に該ラットに50 mg/kgのシタラビンを与えた。
【０３１８】
成体ラット：2コース目の化学療法の際は、麻酔をかけた(50 mg/kgのケタミン／5 mg/kgのキシラジン)ラットに、100 mg/kgのシクロホスファミドを1日、20 mg/kgのドキソルビシンを3日間、さらに100 mg/kgのシタラビン7日間投与した。
【０３１９】
結果を表12-7および12-8に示す。具体的に述べると、1回目の化学療法(表12-7および図31)後は、シクロホスファミド、ドキソルビシンおよびシタラビンだけを、またはシクロホスファミド、ドキソルビシンおよびシタラビンをビヒクルと一緒に与えている全てのラットで重度の脱毛症(＋4)が生じた。これに対して、シクロホスファミド、ドキソルビシンおよびシタラビンをカルシトリオールと一緒に与えたラットはいずれも、対照群と同様に脱毛症の徴候を全く呈示しなかった。表12-8に示すように、2回目の化学療法後に同様の結果が得られた(図32も参照されたい)。
【表２４】
0005978130.tif 000034
【表２５】
0005978130.tif 000035
【０３２０】
さらに、本実験により、カルシトリオールの局所製剤を与えているラットの生存率は化学療法を単独で、またはビヒクルと一緒に与えているそれらのラットと実質的に似ていることが示された。表12-9に示すように、シクロホスファミド、ドキソルビシンおよびシタラビンをカルシトリオールの局所製剤と併用して処理したそれらの動物の生存率(78％)は、化学療法単独で処理したそれらのラット(80％)ならびに化学療法およびビヒクルで処理したそれらのラット(75％)と似ていた。
【表２６】
0005978130.tif 000036
【０３２１】
要約すると、シクロホスファミド、ドキソルビシンおよびシタラビン群では、カルシトリオールは両方の毛周期においてCIAからの100％の保護を提供し、かつ75〜80％の範囲内にあるその治癒率に干渉することはなかった。
【０３２２】
D.シクロホスファミド、パクリタキセルおよびエトポシド
化学療法の投与
若齢ラット：13日目に、全てのラットに、シクロホスファミド(CTX)(Sigma Aldrich、ロット番号068k1131) 37.5 mg/kgを、1/2 ccインスリン注射器29G 1/2”(B-D)を使用し全量0.1 mLのH2O／マンニトール混合物としてその腹腔内に与えた。11〜13日目に、ラットに、0.1 mLのジメチルスルホキシド(Sigma Aldrich、ロット番号078K1428)中の2.5mg/kgのパクリタキセル(タキソール)と特殊な溶媒(標準操作手順を参照されたい)およびHBSS中に希釈した1.5 mg/kgのエトポシド(VP-16)(Sigma Aldrich、ロット番号047K1162)を同時に与えた。
【０３２３】
成体ラット：2コース目の化学療法の際は、47日目に、150 mg/kgのシクロホスファミドを、麻酔をかけた(50 mg/kgのケタミン／5 mg/kgのキシラジン)ラットに、1/2 ccインスリン注射器29G 1/2”(B-D)を使用し全量0.1 mLのH2O／マンニトール混合物としてその腹腔内に与えた。2コース目の化学療法の際は、45〜48日目に、先に記載した通りにラットに10 mg/kgのタキソールおよび15 mg/kgのVP-16を与えた。
【０３２４】
結果を表12-10および12-11に示す。具体的に述べると、1回目の化学療法(表12-10および図33)後は、シクロホスファミド、パクリタキセルおよびエトポシドだけを、またはシクロホスファミド、パクリタキセルおよびエトポシドをビヒクルと一緒に与えている全てのラットで重度の脱毛症(＋4)が生じた。これに対して、シクロホスファミド、パクリタキセルおよびエトポシドをカルシトリオールと一緒に与えたラットはいずれも、対照群と同様に脱毛症の徴候を全く呈示しなかった。表12-11に示すように、2回目の化学療法後に同様の結果が得られた(図34も参照されたい)。
【表２７】
0005978130.tif 000037
【表２８】
0005978130.tif 000038
【０３２５】
さらに、本実験により、カルシトリオールの局所製剤を与えているラットの生存率は化学療法を単独で、またはビヒクルと一緒に与えているそれらのラットと実質的に似ていることが示された。表12-12に示すように、シクロホスファミド、パクリタキセルおよびエトポシドをカルシトリオールの局所製剤と併用して処理したそれらの動物の生存率(83％)は、化学療法単独で処理したそれらのラット(83％)ならびに化学療法およびビヒクルで処理したそれらのラット(78％)と似ていた。
【表２９】
0005978130.tif 000039
【０３２６】
要約すると、シクロホスファミド、パクリタキセルおよびエトポシド群では、カルシトリオールは両方の毛周期においてCIAからの100％の保護を提供し、かつ78〜83％の範囲内にあるその治癒率に干渉することはなかった。
【０３２７】
E.ドキソルビシン、パクリタキセルおよびエトポシド
化学療法の投与
若齢ラット：13〜15日目に、全てのラットに、1/2 ccインスリン注射器29G 1/2”(B-D)を使用して0.1 mLの蒸留水中の2.5 mg/kgの塩酸ドキソルビシン(Sigma Aldrich、ロット番号038k1349)(ADM)をその腹腔内に与えた。同時に、ラットに2.5 mg/kgのパクリタキセル(タキソール)(Sigma Aldrich、ロット番号078k1428)および1.5 mg/kgのエトポシド(VP-16)(Sigma Aldrich、ロット番号047k1162)を与えた。
【０３２８】
成体ラット：2コース目の化学療法の際は、上記化学療法を、麻酔をかけたラット(50 mg/kgのケタミン／5 mg/kgのキシラジン)に対して、1/2 ccインスリン注射器29G 1/2”(B-D)を使用し総量0.1 mLとして腹腔内で47〜49日目に開始した。2コース目の投薬量は次の通りとした：20 mg/kgのADM、10 mg/kgのタキソールおよび15 mg/kgのVP-16。
【０３２９】
結果を表12-12および12-14に示す。具体的に述べると、1回目の化学療法(表12-13および図35)後は、ドキソルビシン、パクリタキセルおよびエトポシドだけを、またはドキソルビシン、パクリタキセルおよびエトポシドをビヒクルと一緒に与えている全てのラットで重度の脱毛症(＋4)が生じた。これに対して、ドキソルビシン、パクリタキセルおよびエトポシドをカルシトリオールと一緒に与えたラットはいずれも、対照群と同様に脱毛症の徴候を全く呈示しなかった。表12-14に示すように、2回目の化学療法後に同様の結果が得られた(図36も参照されたい)。
【表３０】
0005978130.tif 000040
【表３１】
0005978130.tif 000041
【０３３０】
さらに、本実験により、カルシトリオールの局所製剤を与えているラットの生存率は化学療法を単独で、またはビヒクルと一緒に与えているそれらのラットと実質的に似ていることが示された。表12-15に示すように、ドキソルビシン、パクリタキセルおよびエトポシドをカルシトリオールの局所製剤と併用して処理したそれらの動物の生存率(80％)は、化学療法単独で処理したそれらのラット(80％)ならびに化学療法およびビヒクルで処理したそれらのラット(83％)と似ていた。
【表３２】
0005978130.tif 000042
【０３３１】
要約すると、ドキソルビシン、パクリタキセルおよびエトポシド群では、カルシトリオールは両方の毛周期においてCIAからの100％の保護を提供し、かつ80〜83％の範囲内にあるその治癒率に干渉することはなかった。
【実施例１３】
【０３３２】
実施例13.ゲッチンゲン・ミニブタ(登録商標)における局所用カルシトリオールの4週間の皮膚毒性試験
対照、ビヒクル、および試験物質の調製：未使用の対照物質(0.9％注射用塩化ナトリウム、米国薬局方)を試験で使用するために毎週調剤し、冷蔵保存した。ビヒクル(プロピレングリコール(米国薬局方)とエタノール(未変性、無水)(200プルーフ、米国薬局方)との重量比40/60(w/w)混合物)、およびカルシトリオール(米国薬局方、比重0.875)を含有する試験物質は受け取った時の状態で使用し、純度について何の調整も行わなかった。該試験物質は5.07、10.31、および55.34μg/mLの濃度で受け取った。該試験物質はそのまま(希釈せずに)投与した。これらのビヒクルおよび試験物質を試験で使用するために毎週調剤し冷蔵保存した。時には、試験中に必要に応じて追加の試験材料を調剤した。
【０３３３】
投与：投与前に、動物の背部から毛を刈り取った。対照動物には2ヶ所の試験部位を設けた；部位1はビヒクルで、また部位2は生理的食塩水で処理した。各部位は450 cm2とし、脊椎により左右両側に分け、その角には消えないマーカーで印を付けておいた。対照群のこれら2ヶ所の試験部位はほぼ均等に分けられていた。必要に応じて度々毛の刈り取りを行った。皮膚が擦りむけないように気を付けた。対照物質、ビヒクル、および試験物質を、試験期間中の4週間(29日間連続して)、1日2回、およそ6時間おいて経皮的に投与した。製剤はガラス撹拌棒または適当な器具を用いて適用部位に均一に適用した。次回の投与前に、水道水で湿らせたワイプオールを用いて残留する試験材料を優しく取り除いた。必要であれば、清潔で乾いたワイプオールを用いて部位の水気を拭き取った。全ての動物に投与した投与量は、前記の適当な製剤にして1800 mgであった。投与濃度は5.07、10.31、および55.34μg/mLであり、2.1 mLの投与量で投与した。対照物質およびビヒクルを、処理群と同じ方法で対照群に投与した。対照動物への投与量は、ビヒクルを1.0 mL、生理的食塩水を0.9 mLとした。観察された臨床徴候の重症度が原因で、23日目には55.34μg/mLの全ての動物に投与を行わなかった。24日目に全ての動物に対して投与を再開した。
【０３３４】
結果：本試験は、皮膚適用により4週間1日2回投与した場合のカルシトリオール局所用溶液の潜在的な亜慢性毒性を評価するために行った。4匹の動物／性／ゲッチンゲン・ミニブタ(登録商標)群からなる3つの処理群に、カルシトリオール局所用溶液を5.07、10.31、および55.34μg/mLの各投与濃度で投与した。4匹の動物／性からなる追加の1群を対照として使用し、ビヒクル(プロピレングリコール、米国薬局方、とエタノール(未変性、無水)200プルーフ、米国薬局方、との重量比40/60(w/w)混合物)、および対照物質(0.9％注射用塩化ナトリウム、米国薬局方)を与えた。カルシトリオール局所用溶液またはビヒクルを、450 cm2の試験部位に対して4 mg/cm2の投与量で、29日間連続して1日2回、皮膚適用により全ての群に投与した。
【０３３５】
罹患率、死亡率、損傷、ならびに食物および水の利用率に関する観察を、全ての動物について1日2回行った。臨床観察は毎週行った。体重を毎週測定して記録した。適用部位における変化について、第1週の間は各投与後に、その後第2〜4週の間は週に1回(2回目の投与後に)、皮膚刺激性の採点を行った。検眼鏡検査は試験前に行い、さらに最終剖検前の全ての生存ラットに行った。理学的検査は試験前に行った。心電図検査は、試験前、投与前、ならびに1日目および投与最終週の間の1回目の投与から1〜2時間後に行った。臨床病理学的評価用の血液および尿のサンプルを試験前および最終剖検前の全ての動物から採集した。前記試験物質の血漿濃度の測定用の血液サンプルを、1日目および27日目の指定した時点で全ての生存動物から採集した。試験種における濃度-時間データから前記試験物質についてのトキシコキネティック(TK)パラメータを決定した。試験終了時には、剖検検査を実施し、臓器重量を記録し、さらに選択した組織を顕微鏡で調べた。
【０３３６】
55.34μg/mL濃度での雄1匹を、試験の28日目にぎりぎりの所で安楽死させた。この動物には、安楽死前に活動の減少、食欲欠乏、および振戦が認められた。この動物の病的状態の原因は、致死レベルに近い血中カルシウムレベルの高さであったと考えられる。残りのミニブタは全て、試験の30日目に予定されていたそれらの終末まで生き延びた。試験の第3週および第4週の期間中、55.34μg/mL濃度で殆どのミニブタにおいて、活動の減少、食欲欠乏、嘔吐、および振戦が観察された。試験の最終週または最後の2週間の間に、55.34μg/mL濃度で雄および雌において軽度の刺激が観察された。5.07および10.31μg/mLでの処理した雄および雌の平均体重および体重の増加は対照と同程度であった。55.34μg/mL濃度で雄および雌はいずれも、試験の最後の2週間の間にかなりの量の体重が減少し、またこの期間中の雄および雌における平均体重はかなり低かった。
【０３３７】
試験前および最後の検眼鏡検査では、いずれの動物においても検眼鏡による異常は認められなかった。前記カルシトリオール局所用溶液は質的な心電図異常を引き起こすことはなかったが、末期の投与前と投与後の間で群平均心拍数の軽度の増加が見られた。この心拍数の増加は、試験期間中のこれらのミニブタにおけるカルシウムレベルの顕著な上昇と明らかに関連している。カルシトリオール局所用溶液が心電図の定量パラメータに与える投与量関連効果は他に見られなかった。最終評価では、雄または雌においてカルシトリオール局所用溶液に関連する血液学上、凝固上または尿検査上の変化は観察されなかった。幾つかの臨床化学上の変更が55.34μg/mL濃度で見られたが、最も注目すべきは、観察されたカルシウムレベルの致死レベルに近い高さであった。見られた他の変化は、低い塩化物値、ならびに高いコレステロール、グルコース、尿素窒素、およびトリグリセリドの値であった。
【０３３８】
カルシトリオール局所用溶液に関連する肉眼的病理所見は、55.34μg/mL濃度での1匹の雌の軽度の不整面からなる胃粘膜に限られていた。55.34μg/mL濃度では、対照と比較して、いずれの性別においても絶対的および相対的な腎臓重量の増加および胸腺重量の減少が見られた。カルシトリオール局所用溶液に関連する直接的な顕微鏡所見は、骨、腎臓、心臓、処理した皮膚、胸腺、および甲状腺に見られた。また、カルシトリオール局所用溶液に関連する直接的な所見には、多中心性血管変化および多中心性粘膜鉱化が含まれていた。試験物質に関連する間接的な顕微鏡所見は膵臓で認められた。これらの微視的変化は両方の性別において見られ、また該変化は55.34μg/mL濃度で投与した動物に限られていた。
【０３３９】
大腿骨、胸骨、および肋骨の微視的変化は、骨幹皮質骨および骨小腔に限られていた。それらの変化は骨ジストロフィーおよび好塩基性基質の沈着を特徴としていた。腎臓の微視的観察結果は、鉱化、細管変性／再生、および亜急性の炎症を特徴としていた。心筋層の微視的観察結果は、筋原繊維の鉱化、亜急性の炎症および血管変化であった。さらに、1匹の雄と1匹の雌には心内膜の鉱化が生じていた。多中心性の粘膜／上皮鉱化は、その程度の高い箇所から順に、胃粘膜、肺、喉頭、気管、前立腺、唾液顎下腺、および膀胱において観察された。カルシトリオール局所用溶液に関連する血管変化は広範囲にわたって見られ、主に小型〜中型の血管に影響を及ぼしていた。それらの変化は主に心臓および骨小腔内で、また散発的に種々の臓器／器官系で観察された。処理した皮膚の微視的変化は、表皮の過形成および過角化ならびに真皮浅層(superficial dermis)での血管周囲混合細胞の炎症を特徴としていた。胸腺、甲状腺および膵臓の微視的変化は、それぞれリンパ球枯渇、ろ胞細胞肥大および単細胞壊死を特徴としていた。
【０３４０】
本試験の結果を踏まえると、55.34μg/mL濃度で見られた臨床化学および微視的変化に基づく無毒性量(NOAEL)は10.31μg/mLであると考えられる。
【０３４１】
参考文献：
Diker-Cohen T, Koren R, Liberman UA, Ravid A Vitamin D protects keratinocytes from apoptosis induced by osmotic shock, oxidative stress, and tumor necrosis factor.” Ann N Y Acad Sci. 2003 Dec；1010：350-3.
(ClinicalTrials.gov, Mosby's Drug Consult, 13th Edition).
Genever PG, MAxfield, SJ, Kennovin GD, Maltman J, Bowgen CH, Raxworthy MJ, Skerry TM. Evidence for a novel glutamate-mediated signaling pathway in keratinocytes. J Invest Dermatol. 1999 Mar； 112 (3)： 337-42.
Kiryu-Seo S, Gamo K, Tachibana T, Tanaka K, Kiyama H. Unique anti apoptotic activity of EAAC1 in injured motor neurons. The EMBO Journal (2006) 25, 3411-3421.
Nollen EA, Bruntsing JF, Roelofsen H, Weber La, Kampinga HH.  In vivo chaperon activity of heat shcok protein 70 and thermotolerance. Mol Cell Biol 1999； 19： 2069-79.
Rocchi P, Jugpal P, SoA, Sinneman S, Ettinger S, Fazli L, Nelson C, Gleave M.  Small interence RNA targeting heat shcok protein 27 inhibits the growth of prostatic cell lines and induces apoptosis via caspase 3 activation in vitro BJU Int 2006.
Marenholz I, Heizmann CW, Fritz G (2004). S100 proteins in mouse and man： from evolution to function and pathology (including an update of the nomenclature). Biochem. Biophys. Res. Commun. 322 (4)： 1111-22.
本明細書中で引用した全ての参考文献は、参照により組み込まれるものとする。本発明の実施形態として例えば以下を挙げることができる。
［実施形態１］
個体において脱毛症を予防または治療する方法であって、該個体に、真皮送達を実質的に回避しつつ表皮に送達されるように製剤化したビタミンD化合物を治療上有効な量で含む医薬組成物を局所的に投与することを含む前記方法。
［実施形態２］
前記医薬組成物が、約40％(w/w)のプロピレングリコールおよび約60％(w/w)の無水アブソルートエタノール(200プルーフ、U.S.)；または約30％(w/w)のプロピレングリコール、約10％(w/w)のエトキシジグリコールもしくはトランスクトール、および約60％(w/w)の無水アブソルートエタノール(200プルーフ、U.S.)を含む、実施形態1記載の方法。
［実施形態３］
前記ビタミンD化合物が、化学式(I)：
【化１０】
0005978130.tif 000043
〔式中、
aおよびbは各々独立して単結合または二重結合であり
Xはａが二重結合である場合に-CH2であり、またはXはaが単結合である場合に水素もしくはヒドロキシル置換アルキルであり；
R1は、1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、トリ-アルキルシリル、アルコキシル、ヒドロキシルまたは水素であり；
R2は、水素、ヒドロキシル、-O-トリアルキルシリル、または1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシルもしくはアルケニルであり；
R3はbが二重結合である場合に存在せず、またはbが単結合である場合に、R3は水素、ヒドロキシルもしくはアルキルであるか、またはR3およびR1は、それらが結合している炭素原子と共に連結して5〜7員の炭素環を形成していてもよく；
R4はbが二重結合である場合に存在せず、またはbが単結合である場合に水素、ハロゲンもしくはヒドロキシルであり；
R5はaが二重結合である場合に存在せず、またはR5はaが単結合である場合に水素、ハロゲンもしくはヒドロキシルであり；
R6は、1〜5個のヒドロキシル、オキソ、ハロゲン、アルコキシル、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ニトロまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルキル-O-アルキル、アルキル-CO2-アルキルであり；
R7は、1〜3個のヒドロキシル、ハロゲン、アルコキシル、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ニトロまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキルであり；かつ、
R’およびR”は各々、独立して、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、アルキルまたはアルコキシル〕
で表される化合物または製薬上許容しうるその塩である、実施形態1記載の方法。
［実施形態４］
前記ビタミンD化合物が、化学式(II)：
【化１１】
0005978130.tif 000044
〔式中、
cは単結合または二重結合であり；
R1aは、1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、トリ-アルキルシリルまたは水素であり；
R2aは、水素、ヒドロキシル、-O-トリアルキルシリル、または1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシルもしくはアルケニルであり；
R3a、R4aは、cが二重結合である場合に存在せず、またはcが単結合である場合に各々独立して、1〜3個のヒドロキシルもしくはハロゲン部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシル、ハロゲン、ヒドロキシルもしくは水素であって
R3b、R4b、R5a、R6a、R7aおよびR8aは各々、独立して、1〜3個のヒドロキシルもしくはハロゲン部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシル、ハロゲン、ヒドロキシルもしくは水素であるか、またはR6a、R7aおよびR8aのうちのいずれか2つが連結して3〜7員の炭素環を形成していてもよい〕
で表される化合物または製薬上許容しうるその塩である、実施形態1記載の方法。
［実施形態５］
前記ビタミンD化合物が、1,25-ジヒドロキシビタミンD3；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-23-イン-コレカルシフェロール；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-イン-コレカルシフェロール；1α-ヒドロキシビタミンD3；1α,24-ジヒドロキシビタミンD3、またはMC903である、実施形態1記載の方法。
［実施形態６］
前記ビタミンD化合物が、1,25-ジヒドロキシビタミンD3；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-23-イン-コレカルシフェロール；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-イン-コレカルシフェロール；1α-ヒドロキシビタミンD3；1α,24-ジヒドロキシビタミンD3、またはMC903ではない、実施形態1記載の方法。
［実施形態７］
前記ビタミンD化合物が、正常な角化細胞において当量のカルシトリオールと同様または同一の遺伝子調節プロファイルを呈する、実施形態1記載の方法。
［実施形態８］
前記ビタミンD化合物が、その発現レベルが当量のカルシトリオールにより促進される1つ以上の遺伝子の発現を促進する、実施形態1記載の方法。
［実施形態９］
前記ビタミンD化合物が、その発現レベルが当量のカルシトリオールにより抑制される1つ以上の遺伝子の発現を抑制する、実施形態1記載の方法。
［実施形態１０］
前記ビタミンD化合物が、正常な角化細胞においてHSPA2またはHSF4 mRNA、HSPB1またはDNAJC6 mRNAの発現をモジュレートする、実施形態1記載の方法。
［実施形態１１］
前記ビタミンD化合物が、正常な角化細胞においてSLC1A1、KCNB2、もしくはKCNN4タンパク質またはSLC1A3タンパク質の発現をモジュレートする、実施形態1記載の方法。
［実施形態１２］
前記ビタミンD化合物が、表3-1および表3-2中の1つ以上のタンパク質の発現を少なくとも約2倍モジュレートする、実施形態1記載の方法。
［実施形態１３］
前記ビタミンD化合物が、正常な角化細胞に約24時間曝露した後に表3-3、3-4、3-5または3-6中の1つ以上のタンパク質の過剰発現を誘導する、実施形態1記載の方法。
［実施形態１４］
前記ビタミンD化合物が、正常な角化細胞において以下：GST、ケラチン1、ケラチン17、ガレクチン1、S100 A9(カルプロテクチン)、またはS100 A13のうちの1つ以上の過剰発現を誘導する、実施形態1記載の方法。
［実施形態１５］
前記脱毛症が、円形脱毛症(AA)、全頭脱毛症(AT)、汎発性脱毛症(AU)、または化学療法誘発性脱毛症(CIA)である、実施形態1記載の方法。
［実施形態１６］
円形脱毛症に、びまん性円形脱毛症、単発型円形脱毛症、多発型円形脱毛症、および髭円形脱毛症が含まれる、実施形態1記載の方法。
［実施形態１７］
前記脱毛症に、男性型脱毛症(アンドロゲン性脱毛症)または化学療法後の脱毛症(PCA)が含まれない、実施形態1記載の方法。
［実施形態１８］
前記個体が霊長類動物である、実施形態1記載の方法。
［実施形態１９］
前記個体がヒトである、実施形態1記載の方法。
［実施形態２０］
前記個体において脱毛症がまだ始まっていない、実施形態1記載の方法。
［実施形態２１］
前記個体が化学療法を受けているかまたは受けようとしている、実施形態1記載の方法。
［実施形態２２］
前記医薬組成物を化学療法前に、または化学療法と同時に前記個体に投与する、実施形態21記載の方法。
［実施形態２３］
前記医薬組成物を化学療法の開始後であるが脱毛症の発症前に前記個体に投与する、実施形態21記載の方法。
［実施形態２４］
前記医薬組成物が化学療法の効力を実質的に低下させることはない、実施形態21記載の方法。
［実施形態２５］
化学療法が全身化学療法である、実施形態21記載の方法。
［実施形態２６］
化学療法が、以下：アントラサイクリン系薬剤(アドリアマイシン／ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン)、5-FU、タモキシフェン、イリノテカン、パクリタキセル(タキソール)、カルボプラチン、エトポシド、シトキサン／シクロホスファミド、シスプラチン、エルロチニブ(タルセバ)、ゲムシタビン、スタウロスポリン、ビンクリスチン、イマチニブ(グリーベック)、ゲフィチニブ(イレッサ)、ソラフェニブ、ダサチニブ、ダクチノマイシン、ヘキサメチルメラミン(HMM、アルトレタミン)、イホスファミド、ブレオマイシン、メトトレキサート、ドセタキセル(タキソテール)、ビンデシン、ビノレルビン、トポテカン、アムサクリン、シタラビン、ブスルファン、メルファラン、ビンブラスチン、ロムスチン(CCNU)、チオテパ、ゲムシタビン、カルムスチン(BCNU)、ミトキサントロン、マイトマイシンC、プロカルバジン、6-メルカプトプリン、ストレプトゾトシン、フルダラビン、ラルチトレキセド(トムデックス)、カペシタビン、およびこれらの等価物のうちの1つ以上を含む、実施形態21記載の方法。
［実施形態２７］
前記ビタミンD化合物が、約0.1μgのカルシトリオール／cm2に相当する投薬量で前記個体に局所的に投与される、実施形態1記載の方法。
［実施形態２８］
総投与量が約2〜100μgのカルシトリオール／体重75 kgに相当する、実施形態27記載の方法。
［実施形態２９］
個体において脱毛症を予防または治療する方法であって、該個体に、化学式(I)：
【化１２】
0005978130.tif 000045
〔式中、
aおよびbは各々独立して単結合または二重結合であり
Xはａが二重結合である場合に-CH2であり、またはXはaが単結合である場合に水素もしくはヒドロキシル置換アルキルであり；
R1は、1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、トリ-アルキルシリル、アルコキシル、ヒドロキシルまたは水素であり；
R2は、水素、ヒドロキシル、-O-トリアルキルシリル、または1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシルもしくはアルケニルであり；
R3はbが二重結合である場合に存在せず、またはbが単結合である場合に、R3は水素、ヒドロキシルもしくはアルキルであるか、またはR3およびR1は、それらが結合している炭素原子と共に連結して5〜7員の炭素環を形成していてもよく；
R4はbが二重結合である場合に存在せず、またはbが単結合である場合に水素、ハロゲンもしくはヒドロキシルであり；
R5はaが二重結合である場合に存在せず、またはR5はaが単結合である場合に水素、ハロゲンもしくはヒドロキシルであり；
R6は、1〜5個のヒドロキシル、オキソ、ハロゲン、アルコキシル、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ニトロまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルキル-O-アルキル、アルキル-CO2-アルキルであり；
R7は、1〜3個のヒドロキシル、ハロゲン、アルコキシル、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ニトロまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキルであり；かつ、
R’およびR”は各々、独立して、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、アルキルまたはアルコキシルである〕
で表されるビタミンD化合物または製薬上許容しうるその塩を治療上有効な量で含む医薬組成物を局所的に投与することを含み、ここで該ビタミンD化合物は1,25-ジヒドロキシビタミンD3；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-23-イン-コレカルシフェロール；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-イン-コレカルシフェロール；1α-ヒドロキシビタミンD3；1α,24-ジヒドロキシビタミンD3、またはMC903ではない、前記方法。
［実施形態３０］
前記ビタミンD化合物が、化学式(II)：
【化１３】
0005978130.tif 000046
〔式中、
cは単結合または二重結合であり；
R1aは、1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、トリ-アルキルシリルまたは水素であり；
R2aは、水素、ヒドロキシル、-O-トリアルキルシリル、または1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシルもしくはアルケニルであり；
R3a、R4aは、cが二重結合である場合に存在せず、またはcが単結合である場合に各々独立して、1〜3個のヒドロキシルもしくはハロゲン部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシル、ハロゲン、ヒドロキシルもしくは水素であり、
R3b、R4b、R5a、R6a、R7aおよびR8aは各々、独立して、1〜3個のヒドロキシルもしくはハロゲン部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシル、ハロゲン、ヒドロキシルもしくは水素であるか、またはR6a、R7aおよびR8aのうちのいずれか2つが連結して3〜7員の炭素環を形成していてもよい〕
で表される化合物または製薬上許容しうるその塩である、実施形態29記載の方法。
［実施形態３１］
個体において脱毛症を予防または治療する方法であって、該個体に治療上有効な量のビタミンD化合物を含む医薬組成物を局所的に投与することを含み、ここで該ビタミンD化合物は、該個体に以下(1)または(2)の有効濃度で局所的に投与した場合、
(1)  約50μg/mLでは、少なくとも約25日間連続して薬物を投与した後に毒性を生じず、または
(2)  約100μg/mLでは、少なくとも約7日間連続して薬物を投与した後に毒性を生じない、
前記方法。
［実施形態３２］
個体において脱毛症を予防または治療する方法であって、同時投与した化学療法剤の効力に実質的に干渉することなく、該個体において脱毛症を予防または治療するためのビタミンD化合物を治療上有効な量で含む医薬組成物を該個体に局所的に投与することを含む前記方法。
［実施形態３３］
個体において脱毛症を予防または治療する方法であって、該個体に、
(1)  正常な角化細胞において当量のカルシトリオールと同様または同一の遺伝子調節プロファイルを呈するか；
(2)  その発現レベルが当量のカルシトリオールによりモジュレートされる1つ以上の遺伝子の発現をモジュレートするか；
(3)  正常な角化細胞においてHSPA2またはHSF4 mRNA、HSPB1またはDNAJC6 mRNAの発現をモジュレートするか；
(4)  正常な角化細胞においてSLC1A1、KCNB2、もしくはKCNN4タンパク質またはSLC1A3タンパク質の発現をモジュレートするか；
(5)  表3-1および表3-2中の1つ以上のタンパク質の発現を少なくとも約2倍モジュレートするか；
(6)  ビタミンD化合物に正常な角化細胞を約24時間曝露した後に表3-3、3-4、3-5または3-6中の1つ以上のタンパク質の過剰発現を誘導するか；あるいは、
(7)  正常な角化細胞において以下：GST、ケラチン1、ケラチン17、ガレクチン1、S100 A9(カルプロテクチン)、またはS100 A13のうちの1つ以上の過剰発現を誘導する
ビタミンD化合物を治療上有効な量で含む医薬組成物を局所的に投与することを含み、ここで該ビタミンD化合物は1,25-ジヒドロキシビタミンD3；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-23-イン-コレカルシフェロール；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-イン-コレカルシフェロール；1α-ヒドロキシビタミンD3；1α,24-ジヒドロキシビタミンD3、またはMC903ではない、前記方法。
［実施形態３４］
局所投与用の医薬組成物であって、脱毛症を予防または治療するために治療上有効な量のビタミンD化合物を含み、ここで該ビタミンD化合物は真皮送達を実質的に回避しつつ表皮に送達されるように製剤化されている、前記医薬組成物。
［実施形態３５］
約40％(w/w)のプロピレングリコールおよび約60％(w/w)の無水アブソルートエタノール(200プルーフ、US)、未変性；または約30％(w/w)のプロピレングリコール、約10％(w/w)のエトキシジグリコールもしくはトランスクトール、および約60％(w/w)の無水アブソルートエタノール(200プルーフ、US)、未変性、を含む、実施形態34記載の医薬組成物。
［実施形態３６］
局所投与用の医薬組成物であって、脱毛症を予防または治療するために治療上有効な量のビタミンD化合物を含み、ここで該ビタミンD化合物は化学式(I)：
【化１４】
0005978130.tif 000047
〔式中、
aおよびbは各々独立して単結合または二重結合であり
Xはａが二重結合である場合に-CH2であり、またはXはaが単結合である場合に水素もしくはヒドロキシル置換アルキルであり；
R1は、1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、トリ-アルキルシリル、アルコキシル、ヒドロキシルまたは水素であり；
R2は、水素、ヒドロキシル、-O-トリアルキルシリル、または1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシルもしくはアルケニルであり；
R3はbが二重結合である場合に存在せず、またはbが単結合である場合に、R3は水素、ヒドロキシルもしくはアルキルであるか、またはR3およびR1は、それらが結合している炭素原子と共に連結して5〜7員の炭素環を形成していてもよく；
R4はbが二重結合である場合に存在せず、またはbが単結合である場合に水素、ハロゲンもしくはヒドロキシルであり；
R5はaが二重結合である場合に存在せず、またはR5はaが単結合である場合に水素、ハロゲンもしくはヒドロキシルであり；
R6は、1〜5個のヒドロキシル、オキソ、ハロゲン、アルコキシル、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ニトロまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルキル-O-アルキル、アルキル-CO2-アルキルであり；
R7は、1〜3個のヒドロキシル、ハロゲン、アルコキシル、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ニトロまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキルであり；かつ、
R’およびR”は各々、独立して、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、アルキルまたはアルコキシルである〕
で表される化合物または製薬上許容しうるその塩であり、ここで該ビタミンD化合物は1,25-ジヒドロキシビタミンD3；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-23-イン-コレカルシフェロール；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-イン-コレカルシフェロール；1α-ヒドロキシビタミンD3；1α,24-ジヒドロキシビタミンD3、またはMC903ではない、前記医薬組成物。
［実施形態３７］
前記ビタミンD化合物が、化学式(II)：
【化１５】
0005978130.tif 000048
〔式中、
cは単結合または二重結合であり；
R1aは、1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、トリ-アルキルシリルまたは水素であり；
R2aは、水素、ヒドロキシル、-O-トリアルキルシリル、または1〜3個のハロゲン、ヒドロキシル、シアノまたは-NR’R”部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシルもしくはアルケニルであり；
R3a、R4aは、cが二重結合である場合に存在せず、またはcが単結合である場合に各々独立して、1〜3個のヒドロキシルもしくはハロゲン部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシル、ハロゲン、ヒドロキシルもしくは水素であって
R3b、R4b、R5a、R6a、R7aおよびR8aは各々、独立して、1〜3個のヒドロキシルもしくはハロゲン部分で置換されていてもよいアルキル、アルコキシル、ハロゲン、ヒドロキシルもしくは水素であるか、またはR6a、R7aおよびR8aのうちのいずれか2つが連結して3〜7員の炭素環を形成していてもよい〕
で表される化合物または製薬上許容しうるその塩である、実施形態36記載の医薬組成物。
［実施形態３８］
局所投与用の医薬組成物であって、脱毛症を予防または治療するために治療上有効な量のビタミンD化合物を含み、ここで該ビタミンD化合物は、個体に以下(1)または(2)の有効濃度で局所的に投与した場合、
(1)  約50μg/mLでは、少なくとも約25日間連続して薬物を投与した後に毒性を生じず、または
(2)  約100μg/mLでは、少なくとも約7日間連続して薬物を投与した後に毒性を生じない、
前記医薬組成物。
［実施形態３９］
局所投与用の医薬組成物であって、脱毛症を予防または治療するために治療上有効な量のビタミンD化合物を含み、ここで治療上有効な量のビタミンD化合物は化学療法剤と同時投与した場合に該化学療法剤の効力に実質的に干渉することはない、前記医薬組成物。
［実施形態４０］
局所投与用の医薬組成物であって、脱毛症を予防または治療するために治療上有効な量のビタミンD化合物を含み、ここで治療上有効な量のビタミンD化合物は、
(1)  正常な角化細胞において当量のカルシトリオールと同様または同一の遺伝子調節プロファイルを呈するか；
(2)  その発現レベルが当量のカルシトリオールによりモジュレートされる1つ以上の遺伝子の発現をモジュレートするか；
(3)  正常な角化細胞においてHSPA2またはHSF4 mRNA、HSPB1またはDNAJC6 mRNAの発現をモジュレートするか；
(4)  正常な角化細胞においてSLC1A1、KCNB2、もしくはKCNN4タンパク質またはSLC1A3タンパク質の発現をモジュレートするか；
(5)  表3-1および表3-2中の1つ以上のタンパク質の発現を少なくとも約2倍モジュレートするか；
(6)  該ビタミンD化合物に正常な角化細胞を約24時間曝露した後に表3-3、3-4、3-5または3-6中の1つ以上のタンパク質の過剰発現を誘導するか；あるいは、
(7)  正常な角化細胞において以下：GST、ケラチン1、ケラチン17、ガレクチン1、S100 A9(カルプロテクチン)、またはS100 A13のうちの1つ以上の過剰発現を誘導し、
ここで該ビタミンD化合物は1,25-ジヒドロキシビタミンD3；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-23-イン-コレカルシフェロール；1,25-ジヒドロキシ-16-エン-イン-コレカルシフェロール；1α-ヒドロキシビタミンD3；1α,24-ジヒドロキシビタミンD3、またはMC903ではない、前記医薬組成物。
【図１】
0005978130.tif 000051
【図２】
0005978130.tif 000052
【図３】
0005978130.tif 000053
【図４Ａ】
0005978130.tif 000054
【図４Ｂ】
0005978130.tif 000055
【図５】
0005978130.tif 000056
【図６】
0005978130.tif 000057
【図７】
0005978130.tif 000058
【図８】
0005978130.tif 000059
【図９】
0005978130.tif 000060
【図１０】
0005978130.tif 000061
【図１１】
0005978130.tif 000062
【図１２】
0005978130.tif 000063
【図１３】
0005978130.tif 000064
【図１４】
0005978130.tif 000065
【図１５】
0005978130.tif 000066
【図１６】
0005978130.tif 000067
【図１７】
0005978130.tif 000068
【図１８】
0005978130.tif 000069
【図１９】
0005978130.tif 000070
【図２０Ａ】
0005978130.tif 000071
【図２０Ｂ】
0005978130.tif 000072
【図２１】
0005978130.tif 000073
【図２２Ａ】
0005978130.tif 000074
【図２２Ｂ】
0005978130.tif 000075
【図２２Ｃ】
0005978130.tif 000076
【図２３】
0005978130.tif 000077
【図２４】
0005978130.tif 000078
【図２５Ａ】
0005978130.tif 000079
【図２５Ｂ】
0005978130.tif 000080
【図２６】
0005978130.tif 000081
【図２７】
0005978130.tif 000082
【図２８】
0005978130.tif 000083
【図２９】
0005978130.tif 000084
【図３０】
0005978130.tif 000085
【図３１】
0005978130.tif 000086
【図３２】
0005978130.tif 000087
【図３３】
0005978130.tif 000088
【図３４】
0005978130.tif 000089
【図３５】
0005978130.tif 000090
【図３６】
0005978130.tif 000091