(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の遺伝子セットＢの４７個の遺伝子のみの発現レベルを測定し、該発現レベルに基づいて膵臓癌を検出するための試薬であって、前記遺伝子セットＢの４７個の遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを含む膵臓癌を検出するための試薬：
遺伝子セットＢ
（４）Aldo-keto reductase family 1, member B1 (aldose reductase)  （AKR1B1）
（８）Chromosome 11 open reading frame 2  （C11orf2）
（１０）Cyclin Y-like 1  （CCNYL1）
（１３）C-type lectin domain family 4, member D  （CLEC4D）
（１５）Cytochrome b5 reductase 4  （CYB5R4）
（２８）Interferon gamma receptor 1  （IFNGR1）
（３２）Membrane-bound transcription factor peptidase, site 2  （MBTPS2）
（３６）Oligonucleotide/oligosaccharide-binding fold containing 2A  （OBFC2A）
（３８）Peptidylprolyl isomerase H (cyclophilin H)   （PPIH）
（４３）Ribosomal protein, large, P1  （RPLP1）
（５２）Ubiquitination factor E4A  （UBE4A）
（５３）Ubiquitin specific peptidase 15  （USP15）
（５７）Alanyl-tRNA synthetase domain containing 1  （AARSD1）
（５８）Amyloid beta (A4) precursor protein-binding, family B, member 1 (Fe65)   （APBB1）
（５９）BCL2-related protein A1  （BCL2A1）
（６０）Chromosome 9 open reading frame 72  （C9orf72）
（６１）Capping protein (actin filament) muscle Z-line, alpha 1  （CAPZA1）
（６２）CD36 molecule (thrombospondin receptor)   （CD36）
（６３）CD3e molecule, epsilon (CD3-TCR complex)   （CD3E）
（６４）CD58 molecule  （CD58）
（６５）CTAGE family, member 5  （CTAGE5）
（６６）V-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1 (avian)   （ETS1）
（６７）F-box and leucine-rich repeat protein 5  （FBXL5）
（６８）Glucuronidase, beta  （GUSB）
（６９）Huntingtin interacting protein 1 related  （HIP1R）
（７０）High mobility group box 2  （HMGB2）
（７１）Heat shock protein 90kDa alpha (cytosolic), class B member 1  （HSP90AB1）
（７２）IlvB (bacterial acetolactate synthase)-like  （ILVBL）
（７３）IMP (inosine 5'-monophosphate) dehydrogenase 2  （IMPDH2）
（７４）Mbt domain containing 1  （MBTD1）
（７５）Milk fat globule-EGF factor 8 protein  （MFGE8）
（７６）Nascent polypeptide-associated complex alpha subunit  （NACA）
（７７）Nuclear receptor coactivator 5  （NCOA5）
（７８）Non-POU domain containing, octamer-binding  （NONO）
（７９）Peptidylprolyl isomerase A (cyclophilin A)   （PPIA）
（８０）Protein phosphatase 4, regulatory subunit 2  （PPP4R2）
（８１）Protein tyrosine phosphatase-like A domain containing 2  （PTPLAD2）
（８２）RAB14, member RAS oncogene family  （RAB14）
（８３）RNA binding motif protein 14  （RBM14）
（８４）Succinate dehydrogenase complex, subunit A, flavoprotein (Fp)   （SDHA）
（８５）Speedy homolog E3 (Xenopus laevis)   （SPDYE3）
（８６）Serglycin  （SRGN）
（８７）TATA box binding protein  （TBP）
（８８）Transmembrane protein 167A  （TMEM167A）
（８９）Thioredoxin  （TXN）
（９０）Vascular endothelial growth factor B  （VEGFB）
（９１）Zinc finger protein 764  （ZNF764）
【請求項２】
一部配列を含むヌクレオチドがPCR用のフォワードプライマー及びリバースプライマーである、請求項１記載の膵臓癌を検出するための試薬。
【請求項３】
被験体における以下の遺伝子セットＢの４７個の遺伝子のみの発現レベルを測定し、該発現レベルに基づいて膵臓癌の検出を補助する方法：
遺伝子セットＢ
（４）Aldo-keto reductase family 1, member B1 (aldose reductase)  （AKR1B1）
（８）Chromosome 11 open reading frame 2  （C11orf2）
（１０）Cyclin Y-like 1  （CCNYL1）
（１３）C-type lectin domain family 4, member D  （CLEC4D）
（１５）Cytochrome b5 reductase 4  （CYB5R4）
（２８）Interferon gamma receptor 1  （IFNGR1）
（３２）Membrane-bound transcription factor peptidase, site 2  （MBTPS2）
（３６）Oligonucleotide/oligosaccharide-binding fold containing 2A  （OBFC2A）
（３８）Peptidylprolyl isomerase H (cyclophilin H)   （PPIH）
（４３）Ribosomal protein, large, P1  （RPLP1）
（５２）Ubiquitination factor E4A  （UBE4A）
（５３）Ubiquitin specific peptidase 15  （USP15）
（５７）Alanyl-tRNA synthetase domain containing 1  （AARSD1）
（５８）Amyloid beta (A4) precursor protein-binding, family B, member 1 (Fe65)   （APBB1）
（５９）BCL2-related protein A1  （BCL2A1）
（６０）Chromosome 9 open reading frame 72  （C9orf72）
（６１）Capping protein (actin filament) muscle Z-line, alpha 1  （CAPZA1）
（６２）CD36 molecule (thrombospondin receptor)   （CD36）
（６３）CD3e molecule, epsilon (CD3-TCR complex)   （CD3E）
（６４）CD58 molecule  （CD58）
（６５）CTAGE family, member 5  （CTAGE5）
（６６）V-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1 (avian)   （ETS1）
（６７）F-box and leucine-rich repeat protein 5  （FBXL5）
（６８）Glucuronidase, beta  （GUSB）
（６９）Huntingtin interacting protein 1 related  （HIP1R）
（７０）High mobility group box 2  （HMGB2）
（７１）Heat shock protein 90kDa alpha (cytosolic), class B member 1  （HSP90AB1）
（７２）IlvB (bacterial acetolactate synthase)-like  （ILVBL）
（７３）IMP (inosine 5'-monophosphate) dehydrogenase 2  （IMPDH2）
（７４）Mbt domain containing 1  （MBTD1）
（７５）Milk fat globule-EGF factor 8 protein  （MFGE8）
（７６）Nascent polypeptide-associated complex alpha subunit  （NACA）
（７７）Nuclear receptor coactivator 5  （NCOA5）
（７８）Non-POU domain containing, octamer-binding  （NONO）
（７９）Peptidylprolyl isomerase A (cyclophilin A)   （PPIA）
（８０）Protein phosphatase 4, regulatory subunit 2  （PPP4R2）
（８１）Protein tyrosine phosphatase-like A domain containing 2  （PTPLAD2）
（８２）RAB14, member RAS oncogene family  （RAB14）
（８３）RNA binding motif protein 14  （RBM14）
（８４）Succinate dehydrogenase complex, subunit A, flavoprotein (Fp)   （SDHA）
（８５）Speedy homolog E3 (Xenopus laevis)   （SPDYE3）
（８６）Serglycin  （SRGN）
（８７）TATA box binding protein  （TBP）
（８８）Transmembrane protein 167A  （TMEM167A）
（８９）Thioredoxin  （TXN）
（９０）Vascular endothelial growth factor B  （VEGFB）
（９１）Zinc finger protein 764  （ZNF764）
【請求項４】
被験体の遺伝子の発現レベルを、被験体の末梢血細胞のmRNAを用いて測定する、請求項３に記載の膵臓癌の検出を補助する方法。
【請求項５】
遺伝子の発現レベルを、請求項３に記載の遺伝子セットＢの４７個の遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドをターゲットとした定量PCRにより測定する、請求項３又は４に記載の膵臓癌の検出を補助する方法。
【請求項６】
以下の工程を含む、請求項３〜５のいずれか１項に記載の膵臓癌の検出を補助する方法：
（１）被験体より採取した末梢血細胞よりmRNAを抽出する工程；
（２）遺伝子セットＢの４７個の遺伝子をPCRにより増幅し、Ct（Cycle threshold）値を得て、GAPDH等のハウスキーピング遺伝子のCt値により標準化し、標準化Ct値を得る工程；
（３）遺伝子セットＢの各遺伝子の標準化Ct値を判別式に代入し、膵臓癌が陽性である確
率を算出する工程。
【請求項７】
以下の判別式を用いて膵臓癌の検出を補助する請求項６に記載の膵臓癌の検出を補助する方法であって、以下の判別式から算出される数値が０より大きい場合に膵臓癌陽性であると判定する、請求項６記載の膵臓癌の検出を補助する方法：
式：intercept + Σ(beta i × X i)
[式において、intercept は定数、beta iは遺伝子セットＢの４７個の遺伝子のi番目の遺伝子に対する係数、ｘ iは遺伝子セットＢの４７個の遺伝子のi番目の遺伝子の標準化Ct値であり、Σは遺伝子セットＢの４７個の遺伝子のそれぞれの遺伝子のbeta × Xを合計することを示す。]。
【請求項８】
遺伝子セットＢの４７個の遺伝子を用いる判別式におけるintercept及び各遺伝子のbeta iが以下に示す値である、請求項７記載の膵臓癌の検出を補助する方法：
intercept：-329.963
【表２】
0005970123.tif 000008
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、末梢血液を材料とし遺伝子発現解析を利用した膵臓癌の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓癌は日本人で部位別がん死亡数（男女計）順位が5番目の消化器系悪性腫瘍であり
、厚生労働省調べでは年間2万3千人の患者が死亡する。癌の発見が非常に難しく、早期に発見されることは稀である。膵臓癌と診断された75％の症例は既に手術不能例であり、発見後１〜２年以内に死亡する極めて予後不良の消化器癌である（国立がんセンターがん対策情報センター調べhttp://ganjoho.jp/public/cancer/data/pancreas.html）。膵臓癌の診断技術の進歩が望まれてから久しく未だ有用な早期診断法は確立されていない。
【０００３】
昨今、DNAマイクロアレイ技術の発展、及びヒトゲノム解読によって、全遺伝子を対象
とした網羅的遺伝子発現解析が可能になった。これにより、新しい癌の診断・予後予測、治療後の再発率の予測などが可能になった。本発明者らのグループは、膵臓癌における遺伝子発現プロファイルを解析し、遺伝子発現プロファイルによる膵臓癌の特異的検出方法を開発し（特許文献１を参照）、DNAマイクロアレイを用いた検出方法を実施している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第2011/024618号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、患者への侵襲も低く、且つ患者からの遺伝子抽出も容易な方法で、膵臓癌に関連して発現が変動する遺伝子を解析して、膵臓癌を検出する方法、並びに膵臓癌を検出するための検出試薬の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、リアルタイムPCRによる検出方法がDNAマイクロアレイを用いた検出方法より低コストで行うことができ、またより迅速な検出が可能になることに鑑み、リアルタイムPCRによる膵臓癌の検出方法を開発すべく膵臓癌患者における遺伝子発現プロファイ
ルを解析した。
【０００７】
その結果、膵臓癌と関連した５６個の遺伝子セットＡと４７個の遺伝子セットＢの２セットの遺伝子セットを見出し、さらにこれらの遺伝子セットの発現レベルと膵臓癌の関係を統計的に判別解析し、５６個又は４７個の遺伝子の発現レベルにより膵臓癌陽性か陰性かを判別できる判別式を開発し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
さらに、本発明は膵臓患者から単離したCD4陽性Ｔ細胞及びマクロファージにおいて、
それぞれ、特定の遺伝子の発現が上昇していることを見出し、被験体からCD4陽性Ｔ細胞
又はマクロファージを単離し、これらの細胞における上記特定の遺伝子発現のレベルを測定することにより、膵臓癌を検出し得ることを見出し本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  以下の５６個の遺伝子セットＡ又は４７個の遺伝子セットＢの２０個の遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを含む膵臓癌を検出するための試薬：
遺伝子セットＡ
（１）Abhydrolase domain containing 3  （ABHD3）
（２）Abl-interactor 1  （ABI1）
（３）Acyl-CoA synthetase long-chain family member 3  （ACSL3）
（４）Aldo-keto reductase family 1, member B1 (aldose reductase)  （AKR1B1）
（５）ATPase, Class VI, type 11B  （ATP11B）
（６）UDP-GlcNAc:betaGal beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 5  （B3GNT5）
（７）BTB and CNC homology 1, basic leucine zipper transcription factor 1  （BACH1）
（８）Chromosome 11 open reading frame 2  （C11orf2）
（９）Chromosome 2 open reading frame 81  （C2orf81）
（１０）Cyclin Y-like 1  （CCNYL1）
（１１）Centromere protein N  （CENPN）
（１２）Complement factor H-related 3  （CFHR3）
（１３）C-type lectin domain family 4, member D  （CLEC4D）
（１４）Collagen, type XVII, alpha 1  （COL17A1）
（１５）Cytochrome b5 reductase 4  （CYB5R4）
（１６）DENN/MADD domain containing 1B  （DENND1B）
（１７）Enoyl CoA hydratase domain containing 3  （ECHDC3）
（１８）Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1  （ENTPD1）
（１９）Family with sequence similarity 198, member B  （FAM198B）
（２０）Family with sequence similarity 49, member B  （FAM49B）
（２１）Fatty acyl CoA reductase 1  （FAR1）
（２２）Fibrinogen-like 2  （FGL2）
（２３）Fibronectin type III domain containing 3B  （FNDC3B）
（２４）Fucose-1-phosphate guanylyltransferase  （FPGT）
（２５）UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine:polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 4 (GalNAc-T4)   （GALNT4）
（２６）HEAT repeat containing 5A  （HEATR5A）
（２７）HIV-1 Tat interactive protein 2, 30kDa  （HTATIP2）
（２８）Interferon gamma receptor 1  （IFNGR1）
（２９）IKBKB interacting protein  （IKBIP）
（３０）Lactate dehydrogenase A  （LDHA）
（３１）Lysophosphatidic acid receptor 6  （LPAR6）
（３２）Membrane-bound transcription factor peptidase, site 2  （MBTPS2）
（３３）Minichromosome maintenance complex binding protein  （MCMBP）
（３４）Mesoderm induction early response 1 homolog (Xenopus laevis)   （MIER1）（３５）Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2  （NFE2L2）
（３６）Oligonucleotide/oligosaccharide-binding fold containing 2A  （OBFC2A）
（３７）Oxysterol binding protein-like 8  （OSBPL8）
（３８）Peptidylprolyl isomerase H (cyclophilin H)   （PPIH）
（３９）Protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 13 like  （PPP1R13L）
（４０）PR domain containing 5  （PRDM5）
（４１）Protein tyrosine phosphatase, receptor type, C  （PTPRC）
（４２）RAB10, member RAS oncogene family  （RAB10）
（４３）Ribosomal protein, large, P1  （RPLP1）
（４４）Ras-related GTP binding D  （RRAGD）
（４５）Solute carrier family 22, member 15  （SLC22A15）
（４６）Solute carrier family 44, member 1  （SLC44A1）
（４７）Schlafen family member 12  （SLFN12）
（４８）S1 RNA binding domain 1  （SRBD1）
（４９）Tet oncogene family member 2  （TET2）
（５０）Transducin-like enhancer of split 2 (E(sp1) homolog, Drosophila)   （TLE2）
（５１）Ubiquitin-conjugating enzyme E2W (putative)   （UBE2W）
（５２）Ubiquitination factor E4A  （UBE4A）
（５３）Ubiquitin specific peptidase 15  （USP15）
（５４）WD repeat and SOCS box containing 1  （WSB1）
（５５）Zinc finger E-box binding homeobox 2  （ZEB2）
（５６）Zinc metallopeptidase (STE24 homolog, S. cerevisiae)   （ZMPSTE24）
遺伝子セットＢ
（４）Aldo-keto reductase family 1, member B1 (aldose reductase)  （AKR1B1）
（８）Chromosome 11 open reading frame 2  （C11orf2）
（１０）Cyclin Y-like 1  （CCNYL1）
（１３）C-type lectin domain family 4, member D  （CLEC4D）
（１５）Cytochrome b5 reductase 4  （CYB5R4）
（２８）Interferon gamma receptor 1  （IFNGR1）
（３２）Membrane-bound transcription factor peptidase, site 2  （MBTPS2）
（３６）Oligonucleotide/oligosaccharide-binding fold containing 2A  （OBFC2A）
（３８）Peptidylprolyl isomerase H (cyclophilin H)   （PPIH）
（４３）Ribosomal protein, large, P1  （RPLP1）
（５２）Ubiquitination factor E4A  （UBE4A）
（５３）Ubiquitin specific peptidase 15  （USP15）
（５７）Alanyl-tRNA synthetase domain containing 1  （AARSD1）
（５８）Amyloid beta (A4) precursor protein-binding, family B, member 1 (Fe65) 
（APBB1）
（５９）BCL2-related protein A1  （BCL2A1）
（６０）Chromosome 9 open reading frame 72  （C9orf72）
（６１）Capping protein (actin filament) muscle Z-line, alpha 1  （CAPZA1）
（６２）CD36 molecule (thrombospondin receptor)   （CD36）
（６３）CD3e molecule, epsilon (CD3-TCR complex)   （CD3E）
（６４）CD58 molecule  （CD58）
（６５）CTAGE family, member 5  （CTAGE5）
（６６）V-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1 (avian)   （ETS1）
（６７）F-box and leucine-rich repeat protein 5  （FBXL5）
（６８）Glucuronidase, beta  （GUSB）
（６９）Huntingtin interacting protein 1 related  （HIP1R）
（７０）High mobility group box 2  （HMGB2）
（７１）Heat shock protein 90kDa alpha (cytosolic), class B member 1  （HSP90AB1）
（７２）IlvB (bacterial acetolactate synthase)-like  （ILVBL）
（７３）IMP (inosine 5'-monophosphate) dehydrogenase 2  （IMPDH2）
（７４）Mbt domain containing 1  （MBTD1）
（７５）Milk fat globule-EGF factor 8 protein  （MFGE8）
（７６）Nascent polypeptide-associated complex alpha subunit  （NACA）
（７７）Nuclear receptor coactivator 5  （NCOA5）
（７８）Non-POU domain containing, octamer-binding  （NONO）
（７９）Peptidylprolyl isomerase A (cyclophilin A)   （PPIA）
（８０）Protein phosphatase 4, regulatory subunit 2  （PPP4R2）
（８１）Protein tyrosine phosphatase-like A domain containing 2  （PTPLAD2）
（８２）RAB14, member RAS oncogene family  （RAB14）
（８３）RNA binding motif protein 14  （RBM14）
（８４）Succinate dehydrogenase complex, subunit A, flavoprotein (Fp)   （SDHA）（８５）Speedy homolog E3 (Xenopus laevis)   （SPDYE3）
（８６）Serglycin  （SRGN）
（８７）TATA box binding protein  （TBP）
（８８）Transmembrane protein 167A  （TMEM167A）
（８９）Thioredoxin  （TXN）
（９０）Vascular endothelial growth factor B  （VEGFB）
（９１）Zinc finger protein 764  （ZNF764）
【００１０】
[２]  一部配列を含むヌクレオチドがPCR用プライマーである、[１]の膵臓癌を検出する
ための試薬。
【００１１】
[３]  被験体における以下の５６個の遺伝子セットＡ又は４７個の遺伝子セットＢの５６個又は４７個の遺伝子の発現レベルを測定し、該発現レベルに基づいて膵臓癌を検出する方法：
遺伝子セットＡ
（１）Abhydrolase domain containing 3  （ABHD3）
（２）Abl-interactor 1  （ABI1）
（３）Acyl-CoA synthetase long-chain family member 3  （ACSL3）
（４）Aldo-keto reductase family 1, member B1 (aldose reductase)  （AKR1B1）
（５）ATPase, Class VI, type 11B  （ATP11B）
（６）UDP-GlcNAc:betaGal beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 5  （B3GNT5）
（７）BTB and CNC homology 1, basic leucine zipper transcription factor 1  （BACH1）
（８）Chromosome 11 open reading frame 2  （C11orf2）
（９）Chromosome 2 open reading frame 81  （C2orf81）
（１０）Cyclin Y-like 1  （CCNYL1）
（１１）Centromere protein N  （CENPN）
（１２）Complement factor H-related 3  （CFHR3）
（１３）C-type lectin domain family 4, member D  （CLEC4D）
（１４）Collagen, type XVII, alpha 1  （COL17A1）
（１５）Cytochrome b5 reductase 4  （CYB5R4）
（１６）DENN/MADD domain containing 1B  （DENND1B）
（１７）Enoyl CoA hydratase domain containing 3  （ECHDC3）
（１８）Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1  （ENTPD1）
（１９）Family with sequence similarity 198, member B  （FAM198B）
（２０）Family with sequence similarity 49, member B  （FAM49B）
（２１）Fatty acyl CoA reductase 1  （FAR1）
（２２）Fibrinogen-like 2  （FGL2）
（２３）Fibronectin type III domain containing 3B  （FNDC3B）
（２４）Fucose-1-phosphate guanylyltransferase  （FPGT）
（２５）UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine:polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 4 (GalNAc-T4)   （GALNT4）
（２６）HEAT repeat containing 5A  （HEATR5A）
（２７）HIV-1 Tat interactive protein 2, 30kDa  （HTATIP2）
（２８）Interferon gamma receptor 1  （IFNGR1）
（２９）IKBKB interacting protein  （IKBIP）
（３０）Lactate dehydrogenase A  （LDHA）
（３１）Lysophosphatidic acid receptor 6  （LPAR6）
（３２）Membrane-bound transcription factor peptidase, site 2  （MBTPS2）
（３３）Minichromosome maintenance complex binding protein  （MCMBP）
（３４）Mesoderm induction early response 1 homolog (Xenopus laevis)   （MIER1）（３５）Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2  （NFE2L2）
（３６）Oligonucleotide/oligosaccharide-binding fold containing 2A  （OBFC2A）
（３７）Oxysterol binding protein-like 8  （OSBPL8）
（３８）Peptidylprolyl isomerase H (cyclophilin H)   （PPIH）
（３９）Protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 13 like  （PPP1R13L）
（４０）PR domain containing 5  （PRDM5）
（４１）Protein tyrosine phosphatase, receptor type, C  （PTPRC）
（４２）RAB10, member RAS oncogene family  （RAB10）
（４３）Ribosomal protein, large, P1  （RPLP1）
（４４）Ras-related GTP binding D  （RRAGD）
（４５）Solute carrier family 22, member 15  （SLC22A15）
（４６）Solute carrier family 44, member 1  （SLC44A1）
（４７）Schlafen family member 12  （SLFN12）
（４８）S1 RNA binding domain 1  （SRBD1）
（４９）Tet oncogene family member 2  （TET2）
（５０）Transducin-like enhancer of split 2 (E(sp1) homolog, Drosophila)   （TLE2）
（５１）Ubiquitin-conjugating enzyme E2W (putative)   （UBE2W）
（５２）Ubiquitination factor E4A  （UBE4A）
（５３）Ubiquitin specific peptidase 15  （USP15）
（５４）WD repeat and SOCS box containing 1  （WSB1）
（５５）Zinc finger E-box binding homeobox 2  （ZEB2）
（５６）Zinc metallopeptidase (STE24 homolog, S. cerevisiae)   （ZMPSTE24）
遺伝子セットＢ
（４）Aldo-keto reductase family 1, member B1 (aldose reductase)  （AKR1B1）
（８）Chromosome 11 open reading frame 2  （C11orf2）
（１０）Cyclin Y-like 1  （CCNYL1）
（１３）C-type lectin domain family 4, member D  （CLEC4D）
（１５）Cytochrome b5 reductase 4  （CYB5R4）
（２８）Interferon gamma receptor 1  （IFNGR1）
（３２）Membrane-bound transcription factor peptidase, site 2  （MBTPS2）
（３６）Oligonucleotide/oligosaccharide-binding fold containing 2A  （OBFC2A）
（３８）Peptidylprolyl isomerase H (cyclophilin H)   （PPIH）
（４３）Ribosomal protein, large, P1  （RPLP1）
（５２）Ubiquitination factor E4A  （UBE4A）
（５３）Ubiquitin specific peptidase 15  （USP15）
（５７）Alanyl-tRNA synthetase domain containing 1  （AARSD1）
（５８）Amyloid beta (A4) precursor protein-binding, family B, member 1 (Fe65) 
（APBB1）
（５９）BCL2-related protein A1  （BCL2A1）
（６０）Chromosome 9 open reading frame 72  （C9orf72）
（６１）Capping protein (actin filament) muscle Z-line, alpha 1  （CAPZA1）
（６２）CD36 molecule (thrombospondin receptor)   （CD36）
（６３）CD3e molecule, epsilon (CD3-TCR complex)   （CD3E）
（６４）CD58 molecule  （CD58）
（６５）CTAGE family, member 5  （CTAGE5）
（６６）V-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1 (avian)   （ETS1）
（６７）F-box and leucine-rich repeat protein 5  （FBXL5）
（６８）Glucuronidase, beta  （GUSB）
（６９）Huntingtin interacting protein 1 related  （HIP1R）
（７０）High mobility group box 2  （HMGB2）
（７１）Heat shock protein 90kDa alpha (cytosolic), class B member 1  （HSP90AB1）
（７２）IlvB (bacterial acetolactate synthase)-like  （ILVBL）
（７３）IMP (inosine 5'-monophosphate) dehydrogenase 2  （IMPDH2）
（７４）Mbt domain containing 1  （MBTD1）
（７５）Milk fat globule-EGF factor 8 protein  （MFGE8）
（７６）Nascent polypeptide-associated complex alpha subunit  （NACA）
（７７）Nuclear receptor coactivator 5  （NCOA5）
（７８）Non-POU domain containing, octamer-binding  （NONO）
（７９）Peptidylprolyl isomerase A (cyclophilin A)   （PPIA）
（８０）Protein phosphatase 4, regulatory subunit 2  （PPP4R2）
（８１）Protein tyrosine phosphatase-like A domain containing 2  （PTPLAD2）
（８２）RAB14, member RAS oncogene family  （RAB14）
（８３）RNA binding motif protein 14  （RBM14）
（８４）Succinate dehydrogenase complex, subunit A, flavoprotein (Fp)   （SDHA）（８５）Speedy homolog E3 (Xenopus laevis)   （SPDYE3）
（８６）Serglycin  （SRGN）
（８７）TATA box binding protein  （TBP）
（８８）Transmembrane protein 167A  （TMEM167A）
（８９）Thioredoxin  （TXN）
（９０）Vascular endothelial growth factor B  （VEGFB）
（９１）Zinc finger protein 764  （ZNF764）
【００１２】
[４]  被験体の遺伝子の発現レベルを、被験体の末梢血細胞のmRNAを用いて測定する、[
３]の膵臓癌を検出する方法。
【００１３】
[５]  遺伝子の発現レベルを、[３]の５６個の遺伝子セットＡ又は４７個の遺伝子セットＢの５６個又は４７個の遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドをターゲットとした定量PCRにより測定する、[３]又は[４]の膵
臓癌を検出する方法。
【００１４】
[６]  以下の工程を含む、[３]〜[５]のいずれかの膵臓癌を検出する方法：
（１）被験体より採取した末梢血細胞よりmRNAを抽出する工程；
（２）遺伝子セットＡの５６個の遺伝子又は遺伝子セットＢの４７個の遺伝子をPCRによ
り増幅し、Ct（Cycle threshold）値を得て、GAPDH等のハウスキーピング遺伝子のCt値により標準化し、標準化Ct値を得る工程；
（３）遺伝子セットＡ又は遺伝子セットＢの各遺伝子の標準化Ct値を判別式に代入し、膵臓癌が陽性である確率を算出する工程。
【００１５】
[７]  以下の判別式を用いて膵臓癌を検出する[６]の膵臓癌を検出する方法であって、以下の判別式から算出される数値が０より大きい場合に膵臓癌陽性であると判定する、[６]の膵臓癌を検出する方法：
式：intercept + Σ(beta i × X i)
[式において、intercept は定数、beta iは遺伝子セットＡの５６個の遺伝子又は遺伝子
セットＢの４７個の遺伝子のi番目の遺伝子に対する係数、ｘ iは遺伝子セットＡの５６
個の遺伝子又は遺伝子セットＢの４７個の遺伝子のi番目の遺伝子の標準化Ct値であり、
Σは遺伝子セットＡの５６個の遺伝子又は遺伝子セットＢの４７個の遺伝子のそれぞれの遺伝子のbeta × Xを合計することを示す。]。
【００１６】
[８]  ５６個の遺伝子セットＡを用いる判別式におけるintercept及び各遺伝子のbeta i
が以下に示す値である、[７]の膵臓癌を検出する方法：
intercept: -298.018
【表１】
0005970123.tif 000002
【００１７】
[９]  ４７個の遺伝子セットＢを用いる判別式におけるintercept及び各遺伝子のbeta i
が以下に示す値である、[７]の膵臓癌を検出する方法：
intercept：-329.963
【表２】
0005970123.tif 000003
【００１８】
[１０]  被験体から単離したCD4陽性Ｔ細胞における膵臓癌特異的遺伝子又は被験体から
単離したマクロファージにおける膵臓癌特異的遺伝子の発現レベルを測定し膵臓癌を検出するための試薬であって、以下の(a)〜(g)のCD4陽性Ｔ細胞における７個の膵臓癌特異的
遺伝子の少なくとも１個、又は以下の(c)、(f)、(g)及び(h)のマクロファージにおける４個の膵臓癌特異的遺伝子の少なくとも１個の遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを含む膵臓癌を検出するための試薬：
(a)  Fas cell surface death receptor (FAS)
(b)  BCL2-associated X protein (BAX)
(c)  hydroxyprostaglandin dehydrogenase 15-(NAD) (HPGD)
(d)  interleukin 6 (IL-6)
(e)  interleukin 7 (IL-7)
(f)  peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARG)
(g)  epidermal growth factor receptor pathway substrate 8 (EPS8)
(h)  interleukin 15 (IL-15)。
【００１９】
[１１]  一部配列を含むヌクレオチドがPCR用プライマーである、[１０]の膵臓癌を検出
するための試薬。
【００２０】
[１２]  被験体からCD4陽性Ｔ細胞又はマクロファージを単離し、単離したCD4陽性Ｔ細胞における、以下の(a)〜(g)のCD4陽性Ｔ細胞における７個の膵臓癌特異的遺伝子の少なく
とも１個、又は以下の(c)、(f)、(g)及び(h)のマクロファージにおける４個の膵臓癌特異的遺伝子の少なくとも１個の遺伝子の発現レベルを測定し、該発現レベルに基づいて膵臓癌を検出する方法：
(a)  Fas cell surface death receptor (FAS)
(b)  BCL2-associated X protein (BAX)
(c)  hydroxyprostaglandin dehydrogenase 15-(NAD) (HPGD)
(d)  interleukin 6 (IL-6)
(e)  interleukin 7 (IL-7)
(f)  peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARG)
(g)  epidermal growth factor receptor pathway substrate 8 (EPS8)
(h)  interleukin 15 (IL-15)。
【００２１】
[１３]  被験体の遺伝子の発現レベルを、被験体のCD4陽性Ｔ細胞又はマクロファージのmRNAを用いて測定する、[１２]の膵臓癌を検出する方法。
【００２２】
[１４]  遺伝子の発現レベルを、[１２]のCD4陽性Ｔ細胞における７個の膵臓癌特異的遺
伝子の少なくとも１個、又はマクロファージにおける４個の膵臓癌特異的遺伝子の少なくとも１個の遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドをターゲットとした定量PCRにより測定する、[１２]又は[１３]の膵臓癌を検出する方法
。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の５６個の遺伝子セットＡ又は４７個の遺伝子セットＢの２セットの遺伝子セットの遺伝子のリアルタイムPCRで測定した発現レベルに基づいて、被験体が膵臓癌に罹患
しているか否かを高精度で判定することができる。特に、統計的解析により開発した遺伝子セットＡ又は遺伝子セットＢの５６個又は４７個の遺伝子の発現レベルを変数とした判別式を用いることにより、容易にかつ高精度に膵臓癌を検出することが可能である。
【００２４】
また、本発明のCD4陽性Ｔ細胞における７つの膵臓癌特異的遺伝子、又はマクロファー
ジにおける４つの膵臓癌特異的遺伝子のリアルタイムＰＣＲで測定した発現レベルに基づいて、被験体が膵臓癌に罹患しているか否かを高精度で判定することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．遺伝子発現解析による膵臓癌の検出
本発明の方法で用いる遺伝子は、膵臓癌で発現レベルが変動する９１個の遺伝子である。これらの９１個の遺伝子の発現レベルを測定し発現プロファイルを解析することにより膵臓癌を検出することができる。
【００２６】
本発明の方法で用いる遺伝子は、以下に述べる方法で選択することができる。医師が膵臓癌であると判断した患者を膵臓癌群とし、該膵臓癌群及び健常人群から末梢血単核球を採取し、該単核球からトータルmRNAを単離する。単離したmRNAをヒト遺伝子を含むDNAマ
イクロアレイに適用し、遺伝子の発現レベルを測定し、階層的クラスタリング分析を行い、膵臓癌群と健常人群とで発現レベルに差がある遺伝子を選択する。マイクロアレイ解析で選択された遺伝子について膵臓癌群と健常人群に関してリアルタイムPCRを用いて発現
解析を行う。この際、GAPDH（グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ）等のハウスキーピング遺伝子をコントロールとして発現を解析すればよい。最終的にリアルタイムPCR解析により膵臓癌群で健常人群と発現レベルが異なる遺伝子を膵臓癌特異的遺伝子とし
て選択することができる。
【００２７】
本発明で用いる遺伝子は以下に示す９１個の遺伝子である。かっこ内に遺伝子のSymbol、NCBI RefSeqID及び配列番号を示す。
（１）Abhydrolase domain containing 3  （ABHD3）（NM_138340.4）（配列番号１）
（２）Abl-interactor 1  （ABI1）（NM_005470.3）（配列番号２）
（３）Acyl-CoA synthetase long-chain family member 3  （ACSL3）（NM_004457.3）（配列番号３）
（４）Aldo-keto reductase family 1, member B1 (aldose reductase)  （AKR1B1）（NM_001628.2）（配列番号４）
（５）ATPase, Class VI, type 11B  （ATP11B）（NM_014616.2）（配列番号５）
（６）UDP-GlcNAc:betaGal beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 5  （B3GNT5）
（NM_032047.4）（配列番号６）
（７）BTB and CNC homology 1, basic leucine zipper transcription factor 1  （BACH1）（NM_001186.3）（配列番号７）
（８）Chromosome 11 open reading frame 2  （C11orf2）（NM_013265.3）（配列番号８）（vacuolar protein sorting 51 homolog (S. cerevisiae) (VPS51)とも呼ぶ）
（９）Chromosome 2 open reading frame 81  （C2orf81）（NM_001145054.1）（配列番
号９）
（１０）Cyclin Y-like 1  （CCNYL1）（NM_152523.2）（配列番号１０）
（１１）Centromere protein N  （CENPN）（NM_018455.5）（配列番号１１）
（１２）Complement factor H-related 3  （CFHR3）（NM_021023.5）（配列番号１２）
（１３）C-type lectin domain family 4, member D  （CLEC4D）（NM_080387.4）（配列番号１３）
（１４）Collagen, type XVII, alpha 1  （COL17A1）（NM_000494.3）（配列番号１４）（１５）Cytochrome b5 reductase 4  （CYB5R4）（NM_016230.3）（配列番号１５）
（１６）DENN/MADD domain containing 1B  （DENND1B）（NM_001195215.1）（配列番号
１６）
（１７）Enoyl CoA hydratase domain containing 3  （ECHDC3）（NM_024693.4）（配列番号１７）
（１８）Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1  （ENTPD1）（NM_001776.5）（配列番号１８）
（１９）Family with sequence similarity 198, member B  （FAM198B）（NM_016613.6
）（配列番号１９）
（２０）Family with sequence similarity 49, member B  （FAM49B）（NM_016623.4）
（配列番号２０）
（２１）Fatty acyl CoA reductase 1  （FAR1）（NM_032228.5）（配列番号２１）
（２２）Fibrinogen-like 2  （FGL2）（NM_006682.2）（配列番号２２）
（２３）Fibronectin type III domain containing 3B  （FNDC3B）（NM_022763.3）（配列番号２３）
（２４）Fucose-1-phosphate guanylyltransferase  （FPGT）（NM_003838.4）（配列番
号２４）
（２５）UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine:polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 4 (GalNAc-T4)   （GALNT4）（NM_003774.4）（配列番号２５）
（２６）HEAT repeat containing 5A  （HEATR5A）（NM_015473.3）（配列番号２６）
（２７）HIV-1 Tat interactive protein 2, 30kDa  （HTATIP2）（NM_006410.4）（配列番号２７）
（２８）Interferon gamma receptor 1  （IFNGR1）（NM_000416.2）（配列番号２８）
（２９）IKBKB interacting protein  （IKBIP）（NM_201612.2）（配列番号２９）
（３０）Lactate dehydrogenase A  （LDHA）（NM_005566.3）（配列番号３０）
（３１）Lysophosphatidic acid receptor 6  （LPAR6）（NM_005767.5）（配列番号３１）
（３２）Membrane-bound transcription factor peptidase, site 2  （MBTPS2）（NM_015884.3）（配列番号３２）
（３３）Minichromosome maintenance complex binding protein  （MCMBP）（NM_024834.3）（配列番号３３）
（３４）Mesoderm induction early response 1 homolog (Xenopus laevis)   （MIER1）（NM_020948.3）（配列番号３４）
（３５）Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2  （NFE2L2）（NM_006164.4）（配列番号３５）
（３６）Oligonucleotide/oligosaccharide-binding fold containing 2A  （OBFC2A）（NM_001031716.2）（配列番号３６）（nucleic acid binding protein 1 (NABP1)とも呼ぶ）
（３７）Oxysterol binding protein-like 8  （OSBPL8）（NM_020841.4）（配列番号３
７）
（３８）Peptidylprolyl isomerase H (cyclophilin H)   （PPIH）（NM_006347.3）（配列番号３８）
（３９）Protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 13 like  （PPP1R13L）（NM_006663.3）（配列番号３９）
（４０）PR domain containing 5  （PRDM5）（NM_018699.3）（配列番号４０）
（４１）Protein tyrosine phosphatase, receptor type, C  （PTPRC）（NM_002838.4）（配列番号４１）
（４２）RAB10, member RAS oncogene family  （RAB10）（NM_016131.4）（配列番号４
２）
（４３）Ribosomal protein, large, P1  （RPLP1）（NM_001003.2）（配列番号４３）
（４４）Ras-related GTP binding D  （RRAGD）（NM_021244.4）（配列番号４４）
（４５）Solute carrier family 22, member 15  （SLC22A15）（NM_018420.2）（配列番号４５）
（４６）Solute carrier family 44, member 1  （SLC44A1）（NM_080546.4）（配列番号４６）
（４７）Schlafen family member 12  （SLFN12）（NM_018042.4）（配列番号４７）
（４８）S1 RNA binding domain 1  （SRBD1）（NM_018079.4）（配列番号４８）
（４９）Tet oncogene family member 2  （TET2）（NM_017628.4）（配列番号４９）
（５０）Transducin-like enhancer of split 2 (E(sp1) homolog, Drosophila)   （TLE2）（NM_003260.4）（配列番号５０）
（５１）Ubiquitin-conjugating enzyme E2W (putative)   （UBE2W）（NM_018299.4）（配列番号５１）
（５２）Ubiquitination factor E4A  （UBE4A）（NM_004788.3）（配列番号５２）
（５３）Ubiquitin specific peptidase 15  （USP15）（NM_006313.2）（配列番号５３
）
（５４）WD repeat and SOCS box containing 1  （WSB1）（NM_015626.8）（配列番号５４）
（５５）Zinc finger E-box binding homeobox 2  （ZEB2）（NM_014795.3）（配列番号
５５）
（５６）Zinc metallopeptidase (STE24 homolog, S. cerevisiae)   （ZMPSTE24）（NM_005857.4）（配列番号５６）
（５７）Alanyl-tRNA synthetase domain containing 1  （AARSD1）（NM_025267.3）（
配列番号５７）
（５８）Amyloid beta (A4) precursor protein-binding, family B, member 1 (Fe65) 
（APBB1）（NM_001164.4）（配列番号５８）
（５９）BCL2-related protein A1  （BCL2A1）（NM_004049.3）（配列番号５９）
（６０）Chromosome 9 open reading frame 72  （C9orf72）（NM_018325.4）（配列番号６０）
（６１）Capping protein (actin filament) muscle Z-line, alpha 1  （CAPZA1）（NM_006135.2）（配列番号６１）
（６２）CD36 molecule (thrombospondin receptor)   （CD36）（NM_000072.3）（配列
番号６２）
（６３）CD3e molecule, epsilon (CD3-TCR complex)   （CD3E）（NM_000733.3）（配列番号６３）
（６４）CD58 molecule  （CD58）（NM_001779.2）（配列番号６４）
（６５）CTAGE family, member 5  （CTAGE5）（NM_005930.3）（配列番号６５）
（６６）V-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1 (avian)   （ETS1）（NM_005238.3）（配列番号６６）
（６７）F-box and leucine-rich repeat protein 5  （FBXL5）（NM_012161.3）（配列
番号６７）
（６８）Glucuronidase, beta  （GUSB）（NM_000181.3）（配列番号６８）
（６９）Huntingtin interacting protein 1 related  （HIP1R）（NM_003959.2）（配列番号６９）
（７０）High mobility group box 2  （HMGB2）（NM_002129.3）（配列番号７０）
（７１）Heat shock protein 90kDa alpha (cytosolic), class B member 1  （HSP90AB1）（NM_007355.3）（配列番号７１）
（７２）IlvB (bacterial acetolactate synthase)-like  （ILVBL）（NM_006844.4）（
配列番号７２）
（７３）IMP (inosine 5'-monophosphate) dehydrogenase 2  （IMPDH2）（NM_000884.2
）（配列番号７３）
（７４）Mbt domain containing 1  （MBTD1）（NM_017643.2）（配列番号７４）
（７５）Milk fat globule-EGF factor 8 protein  （MFGE8）（NM_005928.2）（配列番
号７５）
（７６）Nascent polypeptide-associated complex alpha subunit  （NACA）（NM_005594.4）（配列番号７６）
（７７）Nuclear receptor coactivator 5  （NCOA5）（NM_020967.2）（配列番号７７）（７８）Non-POU domain containing, octamer-binding  （NONO）（NM_007363.4）（配
列番号７８）
（７９）Peptidylprolyl isomerase A (cyclophilin A)   （PPIA）（NM_021130.4）（配列番号７９）
（８０）Protein phosphatase 4, regulatory subunit 2  （PPP4R2）（NM_174907.2）（配列番号８０）
（８１）Protein tyrosine phosphatase-like A domain containing 2  （PTPLAD2）（NM_001010915.3）（配列番号８１）（3-hydroxyacyl-CoA dehydratase 4 (HACD4)とも呼ぶ
）
（８２）RAB14, member RAS oncogene family  （RAB14）（NM_016322.3）（配列番号８
２）
（８３）RNA binding motif protein 14  （RBM14）（NM_006328.3）（配列番号８３）
（８４）Succinate dehydrogenase complex, subunit A, flavoprotein (Fp)   （SDHA）（NM_004168.3）（配列番号８４）
（８５）Speedy homolog E3 (Xenopus laevis)   （SPDYE3）（NM_001004351.4）（配列
番号８５）
（８６）Serglycin  （SRGN）（NM_002727.2）（配列番号８６）
（８７）TATA box binding protein  （TBP）（NM_003194.4）（配列番号８７）
（８８）Transmembrane protein 167A  （TMEM167A）（NM_174909.4）（配列番号８８）
（８９）Thioredoxin  （TXN）（NM_003329.3）（配列番号８９）
（９０）Vascular endothelial growth factor B  （VEGFB）（NM_003377.4）（配列番号９０）
（９１）Zinc finger protein 764  （ZNF764）（NM_033410.3）（配列番号９１）
上記９１個の遺伝子（１）〜（９１）の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号１〜９１に示す。
【００２８】
本発明の方法において用いるヌクレオチドは、上記配列を含むヌクレオチド又はその断片配列からなるヌクレオチドを含む。また、本発明に用いるヌクレオチドは、上記配列番号で示される塩基配列を有するヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド及びその断片配列からなるヌクレオチドも含まれる。このようなヌクレオチドとしては、例えば、上記塩基配列との配列同一性の程度が、全体の平均で約80％以上、好ましくは約90％以上、より好ましくは約95％以上、特に好ましくは約98％以上である塩基配列を含有するヌクレオチド等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））に記載の
方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「１XSSC、0.1％  SDS、37℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「0.5XSSC、0.1％  SDS、42℃」
程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「0.2XSSC、0.1％  SDS、65℃」程度の条
件である。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い配列同一性を有するヌクレオチドを単離し得る。ただし、上記のSSC、SDS及びに温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記もしくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーションの反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。さらに、これらの遺伝子はバリアントを有する場合もあり、本発明で用いる遺伝子には上記遺伝子のバリアントも含まれる。バリアントの塩基配列は遺伝子データベースにアクセスすることにより得ることができる。本発明のヌクレオチドは該バリアントの塩基配列を含むヌクレオチド又はその断片配列からなるヌクレオチドも含む。
【００２９】
また、本発明で用いるヌクレオチドは、上記遺伝子のセンス鎖よりなるヌクレオチド、
アンチセンス鎖よりなるヌクレオチドのいずれをも用いることができる。
【００３０】
本発明において、遺伝子の発現レベルとは、遺伝子の発現量、発現強度又は発現頻度をいい、通常、遺伝子に対応する転写産物の産生量、又はその翻訳産物の産生量、活性等により解析することができる。また、発現プロファイルとは、各遺伝子の発現レベルに関する情報をいう。遺伝子の発現レベルは、絶対値で表してもよく、また相対値で表してもよい。なお、発現プロファイルを発現パターンという場合もある。
【００３１】
本発明の方法において、被験体における上記９１の遺伝子のうち、（１）〜（５６）までの５６遺伝子の遺伝子セットＡ、又は（４）、（８）、（１０）、（１３）、（１５）、（２８）、（３２）、（３６）、（３８）、（４３）、（５２）、（５３）及び（５７）〜（９１）の４７遺伝子の遺伝子セットＢの発現レベルを指標に膵臓癌を検出する。
【００３２】
発現レベルの測定は、遺伝子の転写産物、すなわちmRNAの測定により行ってもよいし、遺伝子の翻訳産物、すなわちタンパク質の測定により行ってもよい。好ましくは、遺伝子の転写産物の測定により行なう。遺伝子の転写産物には、mRNAから逆転写されて得られたcDNAも含まれる。
【００３３】
遺伝子の転写産物の測定は、上記の遺伝子の塩基配列の全部又は一部を含むヌクレオチドをプローブ又はプライマーとして用いて遺伝子発現の程度を測定すればよい。遺伝子発現の程度は、定量しようとする遺伝子又はその断片をターゲットとした定量PCR法、マイ
クロアレイ（マイクロチップ）を用いた方法、ノーザンブロット法等で測定することが可能である。好ましくは定量PCR法で遺伝子発現を測定する。
【００３４】
定量PCR法としては、アガロースゲル電気泳動法、蛍光プローブ法、RT-PCR法、リアル
タイムPCR法、ATAC-PCR法(Kato,K.et al.,Nucl.Acids Res.,25,4694-4696,1997)、Taqman
PCR法（SYBR（登録商標）グリーン法）（Schmittgen TD,Methods25,383-385,2001）、Body Map法(Gene,174,151-158(1996))、Serial analysis of gene expression(SAGE)法（米国特許第527,154号、第544,861号、欧州特許公開第0761822号）、MAGE法(Micro-analysis
of Gene Expression)（特開2000-232888号）等がある。リアルタイムPCRとしては、例えばTaqMan（登録商標）プローブを用いた方法等が挙げられる。ここに挙げた方法はいずれも公知の方法で行うことができる。
【００３５】
PCR法は公知の手法で行うことができる。用いるプライマーの塩基長は、５〜50、好ま
しくは10〜30、さらに好ましくは15〜25である。通常、標的遺伝子の塩基配列に基づいてフォワードプライマー及びリバースプライマーが設計される。本発明の方法において、配列番号１〜９１の標的遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーの配列を設計することができる。
【００３６】
これらの方法を用いて、上記遺伝子の全部又は一部から転写されたメッセンジャーRNA
（mRNA）の量を測定すればよい。
【００３７】
DNAマイクロアレイ（DNAチップ）は、前記遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを適当な基板上に固定化することにより作製することができる。
【００３８】
固定基板としては、ガラス板、石英板、シリコンウェハーなどが挙げられる。基板の大きさとしては、例えば3.5mm×5.5mm、18mm×18mm、22mm×75mmなどが挙げられるが、これは基板上のプローブのスポット数やそのスポットの大きさなどに応じて様々に設定することができる。ポリヌクレオチド又はその断片の固定化方法としては、ヌクレオチドの荷電
を利用して、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミンなどのポリ陽イオンで表面処理した固相担体に静電結合させたり、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などの官能基を導入した固相表面に、アミノ基、アルデヒド基、SH基、ビオチンなどの官能基を導入したヌクレオチドを共有結合により結合させることもできる。固定化は、アレイ機を用いて行えばよい。上記２０個の遺伝子又はその断片を基板に固相化してDNAマイクロ
アレイを作製し、該DNAマイクロアレイと蛍光物質で標識した被験体由来のmRNAまたはcDNAを接触させ、ハイブリダイズさせ、DNAマイクロアレイ上の蛍光強度を測定することにより、mRNAの種類と量を決定することができる。その結果、被験体において発現が変動している遺伝子がわかり、遺伝子発現プロファイルを得ることができる。被験体由来のmRNAを標識する蛍光物質は、限定されず、市販の蛍光物質を用いることができる。例えば、Cy3
、Cy5等を用いればよい。mRNAの標識は公知の方法で行うことができる。DNAマイクロアレイを用いた方法は、上記遺伝子のmRNAにハイブリダイズするヌクレオチドプローブの使用により測定することができる。測定に用いるプローブの塩基長は、10〜50bp、好ましくは15〜25bpである。
【００３９】
遺伝子の翻訳産物の測定は、翻訳されたタンパク質を定量するか、又はタンパク質の活性を測定すればよい。タンパク質の定量はELISA等の免疫測定法により行うことができる
。
【００４０】
遺伝子の転写産物を測定する場合の試料は、被験体の細胞を用い、細胞からmRNAを抽出単離すればよい。細胞は、限定されないが、血液中の細胞が好ましく、その中でも末梢血液中の白血球、特に単核球（PBMC）が好ましい。単核球は、血液成分分離装置を用いたアフェレーシスによって単離することもできるし、末梢血液から密度勾配遠心分離法により単離してもよい。密度勾配遠心分離による単核球の単離は、公知のFicoll-Paque（登録商標）比重遠心法により行うことができる。
【００４１】
本発明の方法により、被験体が膵臓癌に罹患しているか否かを評価判定し、膵臓癌に罹患するリスクの程度を評価判定することができる。また、被験体が膵臓癌に罹患するリスクが高いか否かを評価判定することができる。さらに、膵臓癌に罹患している被験体における病態予測、予後予測が可能になる。本発明は、膵臓癌に罹患しているか否か、あるいは罹患するリスクが高いかの判定、並びに病態予測及び予後予測を行うための補助的データを取得する方法でもある。
【００４２】
例えば、被験体において、上記５６個の遺伝子セットＡ又は４７個の遺伝子セットＢのうち、膵臓癌患者において発現が亢進する遺伝子の発現が亢進しているか、膵臓癌患者において発現が減弱する遺伝子の発現が減弱しているか、あるいは膵臓癌患者において発現が亢進する遺伝子の発現が亢進し、かつ膵臓癌患者において発現が減弱する遺伝子の発現が減弱している場合、被験体は膵臓癌に罹患していると評価判定することができ、又は被験体は膵臓癌に罹患するリスクが大きいと評価判定することができる。例えば、膵臓癌患者において発現が亢進する遺伝子の発現が健常人に比べ有意に亢進している場合、又は膵臓癌患者において発現が減弱する遺伝子の発現が健常人に比べ有意に減弱している場合、被験体は膵臓癌に罹患しているか、又は膵臓癌に罹患するリスクが高いと評価判定することができる。ここで、有意に亢進しているとは、統計学的に有意差をもって発現が亢進していると決定できることをいい、例えば遺伝子発現の絶対値又は相対値が1.2倍以上、好
ましくは1.5倍以上、さらに好ましくは２倍以上に亢進している場合をいう。また、有意
に減弱しているとは、統計学的に有意差をもって発現が減弱していると決定できることをいい、例えば遺伝子発現の絶対値又は相対値が３分の２以下、好ましくは２分の１以下、さらに好ましくは３分の１以下に減弱している場合をいう。ここで、評価、判定とは予測ともいう。また、本発明において、上記の膵臓癌に罹患しているか否かの評価判定、膵臓癌に罹患するリスクの評価判定、病態予測、予後予測等を広く膵臓癌の検出という。
【００４３】
また、上記５６個の遺伝子セットＡ又は４７個の遺伝性セットＢのすべての遺伝子発現プロファイルを得て、発現プロファイルを解析することにより、被験体の病態又は膵臓癌に罹患するリスクを評価判定することができる。被験体から得られた発現プロファイルが膵臓癌患者群で得られた発現プロファイルと類似している場合、被験体は膵臓癌に罹患していると評価判定することができ、被験体から得られた発現プロファイルが膵臓癌群で得られた発現プロファイルと類似している場合、被験体は膵臓癌に罹患しているか、又は膵臓癌に罹患するリスクが大きいと評価判定することができる。また、被験体から得られた発現プロファイルを健常人で得られた発現プロファイルと比較し、健常人の発現プロファイルとの相違により、評価判定することもできる。
【００４４】
遺伝子発現プロファイルは、蛍光強度等の発現シグナルのパターンが、デジタル数値で又は色を有する画像で記録される。遺伝子発現プロファイルの比較は、例えばパターン比較ソフトウェアを用いて行うことができ、判別分析、コックスハザード分析等を利用することができる。あらかじめ病態を評価判定し、病態予測又は予後予測を行うための判別分析モデルを構築し、該判別分析モデルに被験体から得られた遺伝子発現プロファイルに関するデータを入力し、病態を評価判定し、病態予測又は予後予測を行うこともできる。例えば、判別分析により判別式を得て、蛍光強度と病態、病態予測又は予後予測を関連付け、判別式に被験体の発現シグナル数値を代入することにより、病態を評価判定し、病態予測又は予後予測を行うことができる。
【００４５】
本発明は、本発明の５６個の遺伝子セットＡ又は４７個の遺伝子セットＢの塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを含む膵臓癌を検出するための試薬又はキットを包含する。該試薬は、前記遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドをプライマー又はプローブとして含む試薬であり、また前記遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを固相化したマイクロアレイ等の基板である。PCRキットの場合、他に熱安定性ポリメラーゼ、
逆転写酵素、デオキシヌクレオチド３リン酸、ヌクレオチド３リン酸等を含んでいてもよい。
【００４６】
この試薬又はキットは、上記５６個の遺伝子セットＡ又は４７個の遺伝子セットＢのそれぞれの５６個又は４７個の遺伝子の全ての遺伝子の一部配列を含むヌクレオチドを含んでいる。
【００４７】
また、本発明の方法において、あらかじめ膵臓癌に罹患しているか否かを検出し、膵臓癌に罹患するリスクの程度を評価判定し、又は病態予測若しくは予後予測を行うための判別式を構築し、当該判別式に被験体から得られた５６個の遺伝子セットＡ又は４７個の遺伝子セットＢの発現レベルに関するデータを入力し、膵臓癌に罹患しているか否かを検出し、膵臓癌に罹患するリスクの程度を評価判定し、又は病態予測若しくは予後予測を行うこともできる。例えば、判別分析により判別式を得て、発現レベルと病態、病態予測又は予後予測を関連付け、判別式に被験体の発現レベルを代入することにより、病態を評価判定し、病態予測又は予後予測を行うことができる。発現レベルを示す数値としては、例えば、リアルタイムPCRによって目的遺伝子の増幅を行ったときの増幅産物がある一定量に
達したときのサイクル数（Cycle threshold: Ct)が挙げられる。横軸に増幅のサイクル数、縦軸にPCR増幅産物量をプロットして、増幅曲線を作成し、PCR増幅産物量の値に閾値（Threshold）を設定したときに閾値と増幅曲線が交わる点のサイクル数がCt値となる。プ
ローブを用いた場合は、蛍光強度を用いることもできる。発現レベルを測定するときは、被験体の状態に関らず普遍的に一定レベルで発現している遺伝子の発現レベルに対する相対値を用いるのが好ましい。普遍的に一定レベルで発現している遺伝子として、ハウスキーピング遺伝子が挙げられ、例えば、グリセロアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ（GAP
DH）が挙げられる。同一サンプルにおいて、各遺伝子の発現レベルの測定と同時にGAPDH
の発現レベルを内部標準として測定し、各遺伝子の発現レベルをGAPDHの発現レベルに対
する相対値で表せばよい。例えば、リアルタイムPCRで発現レベルを測定する場合、発現
量が一定のハウスキーピング遺伝子（内部標準）について、リアルタイムPCRを行い、Ct
値を求める。次いで、目的の遺伝子についてハウスキーピング遺伝子と同じ条件でリアルタイムPCRを行い、Ct値を求める。目的の遺伝子のCt値をハウスキーピング遺伝子のCt値
で除し、標準化Ct値を求めて、判別式作成のための遺伝子定量値として用いればよい。一方、各遺伝子の発現レベルが蛍光強度で表される場合、各遺伝子の蛍光強度をGAPDHの蛍
光強度で除すればよい。
【００４８】
判別分析は、２群以上の母集団から抽出した標本データを得て、どの母集団に属するか不明のサンプルデータがある場合に、このサンプルデータがどの母集団に属するか調べる方法である。本発明においては５６個の遺伝子セットＡ及び４７個の遺伝子セットＢのそれぞれの５６個又は４７個の遺伝子の発現レベルに関する数値からなる多変量データ（x1、x2、・・・xn）を説明変数として用いて、判別分析を行う。
【００４９】
このような判別分析の手法は公知であり、代表的な判別分析法として、サポートベクターマシン（support vector machine：SVM)による判別、線形判別関数による判別、ロジスティック回帰分析等があり、どのような手法を用いてもよいが、非線形への拡張が可能な線形カーネルをもつサポートベクターマシン（support vector machine; SVM)を用いることが好ましい。
【００５０】
サポートベクターマシンを用いた判別式の作成においては、１つのサンプルをテストセット(testing set)とし、他を訓練セット（training set)とする交差検証法(Leave-one-out cross-validation; LOOCV）を行えばよい。
【００５１】
本発明の方法においては、リアルタイムPCRを用いて発現レベルを測定し、サポートベ
クターマシンを用いて構築した以下の判別式Iを用いればよい。 
式I：intercept + Σ(beta i × X i) > 0 ならば 膵臓癌陽性
[式Ｉにおいて、intercept は定数、beta iは遺伝子セットＡの５６個の遺伝子又は遺伝
子セットＢの４７個の遺伝子のi番目の遺伝子に対する係数、X iは遺伝子セットＡの５６個の遺伝子又は遺伝子セットＢの４７個の遺伝子のi番目の遺伝子の標準化Ct値であり、
Σは遺伝子セットＡの５６個の遺伝子又は遺伝子セットＢの４７個の遺伝子のそれぞれの遺伝子のbeta × Xを合計することを示す。]
５６個の遺伝子セットＡ及び４７個の遺伝子セットＢについて上記の式Ｉにそれぞれの遺伝子のCt値を入れ計算し、算出された数値が０を超える場合に、膵臓癌が陽性であると判定することができる。ここで、膵臓癌が陽性であるとは、膵臓癌に罹患していると判定することができ、膵臓癌に罹患するリスクが高いと判定することができることをいう。
【００５２】
ここで、（１）〜（５６）までの５６遺伝子の遺伝子セットＡ、又は（４）、（８）、（１０）、（１３）、（１５）、（２８）、（３２）、（３６）、（３８）、（４３）、（５２）、（５３）及び（５７）〜（９１）の４７遺伝子の遺伝子セットＢについて、interceptの値及び各遺伝子のbetaは以下のとおりである。遺伝子セットＡ及びＢの各遺伝
子のbetaは、それぞれ、表３及び４に示す。 
遺伝子セットＡのintercept: -298.018
遺伝子セットＢのintercept： -329.963
【００５３】
【表３】
0005970123.tif 000004
【００５４】
【表４】
0005970123.tif 000005
【００５５】
本発明の方法による膵臓癌の検出は、例えば、以下の工程で行う。
（１）被験体より採取した末梢血細胞よりmRNAを抽出する。
（２）遺伝子セットＡの５６個の遺伝子又は遺伝子セットＢの４７個の遺伝子をPCRによ
り増幅し、Ct（Cycle threshold）値を得て、GAPDH等のハウスキーピング遺伝子のCt値に
より標準化し、標準化Ct値を得る。
（３）遺伝子セットＡについては、遺伝子セットＡの各遺伝子の標準化Ct値を判別式Ａに代入し、膵臓癌が陽性である確率Ｐを求める。遺伝子セットＢについては、遺伝子セットＢの各遺伝子の標準化Ct値を判別式Ｂに代入し、Ｐを求める。
（４）Ｐが０を超える場合に、前記被験体は膵臓癌が陽性であると評価判定することができる。
【００５６】
本発明は本発明の膵臓癌を検出する方法により、被験体の膵臓癌を検出するシステムを包含する。
【００５７】
本発明の膵臓癌を検出するシステムは、
(a)  被験体の遺伝子発現プロファイルに関するデータを入力する手段、ここで入力され
る遺伝子発現プロファイルに関するデータとは、例えば、各遺伝子における標準化Ct値等の各遺伝子の発現レベルを示すデータである；
(b)  構築した判別式を記憶している記憶手段、
(c)  (a)の入力手段を用いて入力したデータを(b)の記憶手段に記憶されている判別式に
適用して、膵臓癌の病態の決定を行うためのデータ処理手段、及び
(d)  予測された膵臓癌の病態の決定、病態予測、予後予測を出力する出力手段、
を含むシステムである。
【００５８】
(a)のデータを入力する手段は、キーボード又はデータを記憶した外部記憶装置等を含
む。(b)の記憶手段はハードディスク等を含む。データ処理手段は、記憶手段から判別モ
デルを受け取るとともに、入力されたデータを処理して、処理結果を出力手段に送り、出力手段で処理結果が表示される。データ処理手段は、データを演算処理する中央演算処理装置（CPU）等を含む。また、出力手段は、結果を表示するモニタやプリンタを含む。
【００５９】
本発明のシステムは、市販のパーソナルコンピュータ等を用いて構築することが可能である。
【００６０】
２．CD4陽性Ｔ細胞又はマクロファージにおける膵臓癌特異的遺伝子
被験体のCD4陽性Ｔ細胞又はマクロファージ中の遺伝子発現レベルを測定し、発現プロ
ファイルを解析することにより膵臓癌を検出することができる。
【００６１】
CD4陽性Ｔ細胞又はマクロファージは、被験体の末梢血より単離すればよく、CD4陽性Ｔ細胞は、CD4の発現を指標に単離することができ、マクロファージはCD14の発現を指標に
単離することができる。これらの細胞の単離は、FACS、フローサイトメーターを用いて行うことができ、例えばFACS vantage(ベクトン・ディッキンソン社製)、FACS Calibur(ベ
クトン・ディッキンソン社製)等を用いることができる。また、抗CD4抗体又は抗CD14抗体を結合させた磁性粒子を用いて、磁気分離装置により単離することができる。このような磁気分離装置として、例えばautoMACS（登録商標）(Miltenyi Biotec)等が挙げられる。
【００６２】
CD4陽性Ｔ細胞又はマクロファージにおける膵臓癌特異的遺伝子の発現レベルは、単離
したCD4陽性細胞又はマクロファージからトータルRNAを抽出し、１．と同様にして測定することができる。
【００６３】
膵臓癌患者のCD4陽性Ｔ細胞において、以下の(a)〜(g)の７つの遺伝子の発現レベルが
上昇している。これら７つの遺伝子をCD4陽性Ｔ細胞における膵臓癌特異的遺伝子と呼ぶ
。従って、被験体から単離した、CD4陽性細胞において、これらの７つの遺伝子の少なく
とも１個、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個又は７個の遺伝子、好ましくは７個すべての遺伝子の発現レベルが健常人に対して上昇している場合、該被験体は膵臓癌
に罹患していると評価判定することができ、又は被験体は膵臓癌に罹患するリスクが大きいと評価判定することができる。
【００６４】
(a)  Fas cell surface death receptor (FAS) （NM_000043.4）（配列番号９２）
(b)  BCL2-associated X protein (BAX) （NM_004324.3）（配列番号９３）
(c)  hydroxyprostaglandin dehydrogenase 15-(NAD) (HPGD) （NM_ 000860.5）（配列番号９４）
(d)  interleukin 6 (IL-6) （NM_000600.3）（配列番号９５）
(e)  interleukin 7 (IL-7) （NM_000880.3）（配列番号９６）
(f)  peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARG) （NM_ 005037.5）（配列番号９７）
(g)  epidermal growth factor receptor pathway substrate 8 (EPS8) （NM_004447.5）（配列番号９８）
また、膵臓癌患者のマクロファージにおいて、上記の(c)  HPGD、(f)  PPARG、(g)  EPS8及び(h)  interleukin 15 (IL-15) （NM_ 000585.4）（配列番号９９）の４つの発現が上昇している。これら４つの遺伝子をマクロファージにおける膵臓癌特異的遺伝子と呼ぶ。従って、被験体から単離したマクロファージにおいて、これらの４つの遺伝子の少なくとも１個、例えば、１個、２個、３個又は４個の遺伝子、好ましくは４個すべての遺伝子の発現レベルが健常人に対して上昇している場合、該被験体は膵臓癌に罹患していると評価判定することができ、又は被験体は膵臓癌に罹患するリスクが大きいと評価判定することができる。
【００６５】
また、CD4陽性Ｔ細胞における７つの膵臓癌特異的遺伝子とマクロファージにおける４
つの膵臓癌特異的遺伝子に共通する(c)HPGD遺伝子、(f)PPARG遺伝子及び(g)ESP8遺伝子の３つの遺伝子をCD4陽性Ｔ細胞及びマクロファージにおける膵臓癌特異的遺伝子と呼ぶ。
【００６６】
被験体からCD4陽性Ｔ細胞又はマクロファージにおいて、(c)HPGD遺伝子、(f)PPARG遺伝子及び(g)ESP8遺伝子の３つの遺伝子の少なくとも１個、例えば、１個、２項又は３個の
遺伝子、好ましくは３個すべての遺伝子の発現レベルが健常人に対して上昇している場合、該被験体は膵臓癌に罹患していると評価判定することができ、又は被験体は膵臓癌に罹患するリスクが大きいと評価判定することができる。
【００６７】
さらに、CD4陽性Ｔ細胞における膵臓癌特異的遺伝子とマクロファージにおける膵臓癌
特異的遺伝子の発現レベルを組合せて測定し、膵臓癌に罹患していると評価判定することができ、又は被験体は膵臓癌に罹患するリスクが大きいと評価判定することができる。すなわち、被験体から単離したCD4陽性Ｔ細胞における７つの膵臓癌特異的遺伝子の少なく
とも１個の遺伝子、及び被験体から単離したマクロファージにおける４つの膵臓癌特異的遺伝子の少なくとも１個の遺伝子、好ましくはCD4陽性T細胞における７個すべての遺伝子とマクロファージにおける４個すべての遺伝子の計１１個の遺伝子の発現レベルを測定し、これらの遺伝子の発現レベルが健常人に対して上昇している場合、該被験体は膵臓癌に罹患していると評価判定することができ、又は被験体は膵臓癌に罹患するリスクが大きいと評価判定することができる。
【００６８】
本発明は、本発明のCD4陽性Ｔ細胞における７つの膵臓癌特異的遺伝子セット、又はマ
クロファージにおける４つの膵臓癌特異的遺伝子セットの塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを含む膵臓癌を検出するための試薬又はキットを包含する。該試薬は、前記遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドをプライマー又はプローブとして含む試薬であり、また前記遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを固相化したマイクロアレイ等の基板である。PCRキットの場合、他に熱安定性ポリメラーゼ、逆転写酵素、デオキ
シヌクレオチド３リン酸、ヌクレオチド３リン酸等を含んでいてもよい。
【００６９】
この試薬又はキットは、上記CD4陽性Ｔ細胞における７つの膵臓癌特異的遺伝子セット
、又はマクロファージにおける４つの膵臓癌特異的遺伝子セットのそれぞれの７つ又は４つの遺伝子の少なくとも１つ、好ましくは全ての遺伝子の一部配列を含むヌクレオチドを含んでいる。
【実施例】
【００７０】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００７１】
実施例１  遺伝子発現解析による膵臓癌の検出
本実施例において、用いた材料及び実験の方法は以下の通りであった。
対象
医師が膵臓癌と診断した患者から採取した血液を膵臓癌症例とした。対照群としては自治体主催における住民健診において同意を得た受診者の善意により提供された血液を下記検査項目により検索し正常値を示した受診者のみを健常人とした。
【００７２】
検査項目
収縮期血圧、拡張期血圧、赤血球数、白血球数、ヘモグロビン値、ヘマトクリット値、肝機能（GOT、GPT、γ-GTP）、腎機能（クレアチニン値）、脂質代謝（ＬＤＬ-c、ＨＤＬ-c、総コレステロール値）、尿タンパク、尿鮮血
【００７３】
末梢血液採取およびRNA抽出
パクスジーンRNA採血管（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社  医療機器製造販売
認証番号：218AFBZX00014000）を用いて、患者より末梢血液を採取した。
【００７４】
RNA抽出及びハイブリダイゼーション
パクスジーンRNA採血管よりPAXgene Blood RNA Kit（PreAnalytiX GmbH，Hombrechtikon，Switzerland）を用いて、プロトコールにしたがってRNAを抽出した。
【００７５】
マイクロアレイ解析
抽出したRNAを元にQuickAmp Labeling Kit，1color（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）を用いてRNAを増幅し、同時にCy3色素にてラベル化を行った。ラベル化RNAをGene Expression Hybridization Kit（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）を使用して混合した後、Whole Human Genomeマイクロアレイ（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）にハイブリダイゼーションを行った。マイクロアレイによる解析は膵臓癌検体17
例、健常人検体13例を行った。なお、RNAの増幅からハイブリダイゼーションまでの行程
はAgilent Technologiesが公表している実験プロトコールに従って作業を行った。
【００７６】
マイクロアレイのイメージ解析及び遺伝子の選出
マイクロアレイ上の各スポットの蛍光強度はマイクロアレイスキャナ（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）にて獲得した。獲得したイメージはFeature Extraction ソフトウェア（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）にて各スポットの蛍光強度の数値
化を行った。この数値化により、そのスポット上に配置されているプローブの蛍光強度が算定された。
【００７７】
GeneSpring GX（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）を用いて、マイクロアレイ上の全プローブの蛍光強度数値のノーマライゼーションを行った。
【００７８】
各プローブの発現増強減弱を示すノーマライズされた数値を元に各プローブの蛍光強度およびFlag情報から各遺伝子発現量の解析を行い、膵臓癌群と健常人群とで遺伝子発現量に差がある解析結果となった遺伝子を364個選出した。
【００７９】
リアルタイムPCRによる遺伝子発現量の測定
上記364個の遺伝子にハウスキーピング遺伝子16個、実験コントロール3個、18SrRNAを1個追加し合計384個とし、これら384個について一度にリアルタイムPCRでの測定が可能なCustom Profiler RT2 PCR Arrays（QIAGEN GmbH, Hilden, Germany）を用いて癌症例およ
び健常人に関して遺伝子発現量の測定を行った。リアルタイムPCR装置はLightCycler（登録商標） 480 リアルタイムPCRシステム（F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Switzerland）を使用した。リアルタイムPCRによる測定は膵臓癌検体28例、健常人検体27例を行っ
た。なお、リアルタイムPCRにおける測定作業はQIAGENが公表しているRT2 HT First Strand HandbookおよびRT2 Profiler PCR Array Handbookに従った。
【００８０】
リアルタイムPCRによる遺伝子発現量測定結果の解析および膵臓癌特異的遺伝子の選出
まずハウスキーピング遺伝子16個の中からコントロール遺伝子として測定数値（Ct値）の標準化に使用するコントロール遺伝子を設定した後に、リアルタイムPCRによる測定を
おこなった365個の遺伝子のCt値をコントロール遺伝子のCt値で標準化した。その標準化
された数値を用いて統計的手法による解析を行った結果、膵臓癌特異的遺伝子を選出した。
【００８１】
本実施例において以下の結果が得られた。
コントロール遺伝子
ハウスキーピング遺伝子15個の中で、膵臓癌検体28例におけるCt値の平均が24.71、健
常人検体27例におけるCt値の平均が24.59であり、膵臓癌群と健常人群との有意差検定に
おけるp値が0.4565であり有意差が無いことが確認できたことから、コントロール遺伝子
を「GAPDH」に決定した。
【００８２】
膵臓癌特異的遺伝子
膵臓癌検体28例、健常人検体27例のリアルタイムPCRの測定結果から得られたCt値を標
準化し統計的解析手法により解析した結果、リストにある91個の遺伝子を膵臓癌特異的遺伝子として選出した。選出した遺伝子を表５に示す。
【００８３】
【表５】
0005970123.tif 000006
【００８４】
このうち、膵臓癌が陽性／陰性の判定には以下の2セットのいずれかの遺伝子群を用い
て判定を行う事ができる。
＜セットA＞
No.1〜56までの56遺伝子
＜セットB＞
No.4、8、10、13、15、28、32、36、38、43、52、53及び57〜91までの47遺伝子
【００８５】
膵臓癌判定式および判定結果
膵臓癌の陽性／陰性の判定には、以下の判別式を使用する。判別式の構築方法の詳細については後述する。
式Ｉ  ：  intercept + Σ(beta i × X i) > 0 ならば 膵臓癌陽性
[式Ｉにおいて、intercept は定数、beta iは５６個（セットA）もしくは４７個（セットB）の遺伝子のi番目の遺伝子に対する係数、X iは５６個（セットA）もしくは４７個（セットB）の遺伝子のi番目の遺伝子の標準化Ct値であり、Σは５６個（セットA）もしくは
４７個（セットB）の遺伝子のそれぞれの遺伝子のbeta × Xを合計することを示す。]
【００８６】
セットAの場合はIntercept=-298.018であり、セットBの場合はIntercept=-329.963となる。betaはそれぞれ表６の通りである。遺伝子セットＡ及び遺伝子セットＢに対する判別式を、それぞれ、判別式Ａ及び判別式Ｂと呼ぶ。
【００８７】
【表６】
0005970123.tif 000007
【００８８】
これらの判別式を用いてクロスバリデーションによる感度・特異度の推定を膵臓癌検体28例、健常人検体27例に行ったところ、以下の結果となった。
セットA：     感度93％、特異度100％
セットB：     感度89％、特異度96％
【００８９】
以下に膵臓癌検出のための判別式の作成方法について詳細に記す。
金沢大学および関連医療機関で収集され、リアルタイムPCR解析が実施された55例（膵
がん28例、健常人27例）の遺伝子発現データに対して、遺伝子間の相関構造を正則化したFisherの線形判別法を用いて判別を行った。なお、遺伝子の選択には、線形カーネルをもつサポートベクターマシンと逐次変数消去法を応用した方法を用いた。全55例の内、一つの症例をテストセット、残り全てを訓練セットとする交差検証法（leave-one-out cross-validation; LOOCV）を実施した。なお、遺伝子選択は交差検証のステップ毎に行った。
判別精度の評価には、感度、特異度を主に用いた。判別に用いる遺伝子数を変化させたところ、LOOCVによる判別精度は遺伝子数が56個程度でほぼピークとなり、それ以上ではほ
ぼ横ばいであった。なお、56個のときの感度は0.93、特異度は1.00であった。
【００９０】
最後に、全55例を訓練セットとみなして、以上の方法を適用し、56個の遺伝子を選択し、将来の患者の判別に用いる判別アルゴリズムを作製した。
【００９１】
実施例２  CD4陽性Ｔ細胞及びマクロファージにおける膵臓癌特異的遺伝子
本実施例において、用いた材料及び実験の方法は以下の通りであった。
【００９２】
対象
医師が画像、細胞診等、臨床診療上膵臓癌と診断した患者から採取した血液を膵臓癌症例とした。対象群としては健診において同意を得て、明らかな癌を有しない受診者のみを健常人とした。
【００９３】
末梢血液採取および細胞の単離
ヘパリン添加採血管を用いて患者より末梢血液を採取し、フィコール密度勾配遠心分離法(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)にて、末梢血単核球(PBMCs)を分離した。
分離したPBMCsをビーズ標識抗CD4抗体、ビーズ標識抗CD14抗体(Miltenyi Biotec, Cologne, Germany)と反応させた後、磁気カラムを用いてCD4陽性T細胞とCD14陽性細胞(マクロファージ)を単離した。
【００９４】
単離した細胞より、Micro RNA Isolation kit (STRATAGENE, La Jolla, CA, USA)を用
い、製造元のプロトコールにしたがってRNAを抽出した。
【００９５】
マイクロアレイ試験法
抽出したRNAを元にQuick Amp Labeling Kit,1color (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) を用いてRNA を増幅し、同時にCy3色素にてラベル化を行った。ラベル化RNAをGene Expression Hybridization kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)を使用し混合した後、Whole Human Genome マイクロアレイ(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)にハイブリダイゼーションを行った。なお、RNA増幅からハイブリダイゼーションまでの工程はAgilent Technologiesが公表している実験プロトコールに従って作業を行った。
【００９６】
アレイデータ解析および遺伝子の選出（１）
マイクロアレイ上の各スポットの蛍光強度はマイクロアレイスキャナー(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)にて獲得した。獲得したイメージファイルはFeature Extractionソフトウェア(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)にて各スポットの蛍光強度の数値化を行った。この数値化により、そのスポット上に配置されているプローブの蛍光強度が算定された。
【００９７】
算定された数値を基にBRB array tools(NCI, http://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html)を用いて遺伝子発現解析を行った。膵臓癌症例31例と健常人22例のCD4陽性T細胞およびマクロファージの発現量に統計学的に有意差のあり、生物学的特徴に意義のある5
遺伝子PPARG(peroxisome proliferator-activated receptor gamma)**, EPS8(epidermal growth factor receptor pathway substrate 8)**,HPGD(hydroxyprostaglandin dehydrogenase 15-(NAD))**,FAS(Fas cell surface death receptor)**,BAX (BCL2-associated X protein)**を選出した。(**P<0.01)
【００９８】
血清中サイトカインおよびケモカイン濃度測定ならびに遺伝子の選出（２）
膵臓癌症例および健常人における血清中のサイトカインおよびケモカイン濃度をMultiplex Bead Immunoassays kit, Human Cytokine 27-Plex Panel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)で測定した。血清は膵臓癌症例50例と健常人27例から得た。Interleukin (IL)-6**,IL-7**, IL-15**,IL-8*のサイトカイン濃度が健常人と比較して膵臓癌症例で有意に上
昇した。また、MCP-1**,IP-10**のケモカイ濃度もまた有意な上昇を示した。膵臓癌症例
と健常人の血清中サイトカインおよびケモカイン濃度に有意差のあるタンパクを6個選出
した。(**P<0.01,*P<0.05)
【００９９】
リアルタイムPCRによる遺伝子発現量の測定
上記（１）（２）より選出された11遺伝子を使用し、膵臓癌症例31例のCD4陽性T細胞およびマクロファージ、健常人22例のCD4陽性T細胞およびマクロファージより、リアルタイムPCRにて発現解析を行った。
【０１００】
RNAについては、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)にてRNAを鋳型とするcDNAを合成した。合成されたcDNAに増幅試薬と選出されたターゲット遺伝子のプローブおよびハウスキーピング遺伝子(18S ribosomal RNA)のプローブを混合した後、リアルタイムPCR装置Rotor-Gene Q(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)を用いたマルチプレックスPCRアッセイで発現量の測定を行った。
【０１０１】
定量方法はターゲット遺伝子およびハウスキーピング遺伝子の検量線から算出されたそれぞれの定量値をもとに、ターゲット遺伝子の定量値をハウスキーピング遺伝子の定量値で除算するTwo Standard Curve法で発現量を算出した結果、膵臓癌特異的遺伝子を選出した。なお、逆転写から発現量の定量までの工程はQIAGENのプロトコールにしたがって作業を行った。
【０１０２】
本実施例において以下の結果が得られた。
CD4陽性T細胞における膵臓癌特異的遺伝子
膵臓癌31症例と健常人22例のCD4陽性T細胞において、リアルタイムPCRで11遺伝子の発
現量を測定し解析した結果FAS**,BAX**,HPGD**,IL-6*,IL-7*,PPARG*,EPS8*遺伝子は健常
人と比較して膵臓癌症例で有意に上昇した。前記7遺伝子をCD4陽性T細胞における膵臓癌
特異的遺伝子として選出した。(**P<0.01,*P<0.05)
【０１０３】
マクロファージにおける膵臓癌特異的遺伝子
膵臓癌31症例と健常人22例のマクロファージにおいて、リアルタイムPCRで11遺伝子の
発現量を測定し解析した結果、EPS8**,HPGD**,IL-15*,PPARG*遺伝子は健常人と比較して
膵臓癌症例で有意に上昇した。前記4遺伝子をマクロファージにおける膵臓癌特異的遺伝
子として選出した。(**P<0.01,*P<0.05)
【０１０４】
CD4陽性T細胞とマクロファージにおける膵臓癌特異的遺伝子
CD4陽性T細胞とマクロファージで共に健常人と比較し膵臓癌症例で有意に上昇したPPARG,EPS8, HPGDの3遺伝子をCD4陽性T細胞およびマクロファージにおける膵臓癌特異的遺伝
子とした。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明により、低侵襲で簡便かつ高精度な膵臓癌検出が可能になる。
【要約】
【課題】膵臓癌に関連して発現が変動する遺伝子を解析して、膵臓癌を検出する方法並びに検出試薬の提供。
【解決手段】特定の５６個又は４７個の遺伝子セットの塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを含む膵臓癌を検出するための試薬、並びに特定の５６個又は４７個の遺伝子の発現レベルを測定し、該発現レベルに基づいて膵臓癌を検出する方法。
【選択図】なし【配列表】
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