(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＧＥ２合成抑制剤を有効成分として含み、
前記ＰＧＥ２合成抑制剤は、１５−Ｄｅｏｘｙ−Ａ１２，１４−ＰＧＪ２、Ｅｘｉｓｕｌｉｎｄ、ＬｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅＣ４、ｍｋ−８８６、及び、ｃｅｌｅｃｏｘｉｂからなる群から選択される、眼局所投与用のドライアイ、またはコンタクトレンズの使用に起因する眼球痛症の予防または治療用薬学組成物。
【請求項２】
前記薬学組成物は、ＰＧＥ２の発現量を低減させることを特徴とする請求項１に記載の眼球痛症の予防または治療用薬学組成物。
【請求項３】
前記薬学組成物は、懸濁液、酸剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、徐放性製剤、注射剤、軟膏剤、点眼剤、カプセル剤、コンタクトレンズ洗浄剤またはコンタクトレンズ潤滑剤の形態であることを特徴とする請求項１に記載の眼球痛症の予防または治療用薬学組成物。
【請求項４】
前記薬学組成物は、人間を対象とすることを特徴とする請求項１に記載の眼球痛症の予防または治療用薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＧＥ２合成抑制剤を含む眼球痛症治療用薬学組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ドライアイは、全世界的に多様な力学的研究に用いられる研究集団、年齢及び診断基準によって有病率が５．５〜１５％と報告された非常に一般的な疾患である。この疾患は、眼球痛症、不規則な角膜表面、霧視及び変動幅の大きくなった視力（ｂｌｕｒｒｅｄ ａｎｄ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｎｇ ｖｉｓｉｏｎ）及び増加した角膜潰瘍の危険性のような特徴を持つ。不安定な涙液膜から来由した晩成ドライアイ及び乾性角膜炎から変更した角膜透過性は炎症を引き起こすと知られており、これは、涙において炎症媒介であるケモカイン及びサイトカインの増加、結膜上皮による免疫活性及び接着分子（ＨＬＡ−ＤＲ及び細胞間接着分子［ＩＣＡＭ−１］）の発現増加、そして結膜におけるＴ細胞数の増加によって立証された。乾性角結膜炎（ｋｅｒａｔｏｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ ｓｉｃｃａ、ＫＣＳ）から生じた角膜潰瘍は、視力減退、視力喪失、さらには目の消失を引き起こすこともある。ＭＭＰ−９（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９）の濃度及び活性は、ドライアイ患者の涙だけではなく実験用ドライアイ（ＥＤＥ）マウスの角膜上皮及び涙でも大きく増加すると報告されてきた。ドライアイは、一般的に涙が足りないか、またはその成分に変動が生じて涙液膜に異常が生じることで、いろいろな不便な症状を引き起こすようになる。最近、涙液膜の組成の変化による疾患、レーシック手術後に生じるドライアイのような神経原性（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ）要素による新たな形態のドライアイが発生し、その定義がさらに拡大解釈されつつある（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，１４０．５０７，２００５）。
【０００３】
このようなドライアイは、眼科病院を訪問する全体患者の略５０％以上で見られ、老齢人口、特に、更年期を過ぎた女性の７０ないし８０％以上がドライアイによる目の不便さを訴えている。過去には、ドライアイの発生原因が、涙腺における涙の生成低減による水性層の不足であると思われたが、最近には外部刺激による炎症反応または内人性炎症反応が１次要因であると明らかになり、これによる角膜上皮細胞の障害及び角膜上皮細胞と角膜実質細胞との相互作用の低下により発生する慢性的眼球表面損傷が問題となっている。ドライアイは、老化、ホルモン変化、環境的な要因（風、熱、ほこり、タバコの煙、ヘアドライヤー）、瞬ぎ頻度の減少（ＶＤＴ症侯群）、コンタクトレンズ着用、レーシック手術、薬物服用による原因、自己免疫疾患（ルプス、関節リウマチ、シェーグレン症候群）などの多様な原因によって発病する（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，１３７，３３７−３４２，２００４）。
【０００４】
一方、炎症を減らすために使われる非特異的なＣＯＸ酵素抑制剤であるＮＡＳＡＩＤは、プロスタグランジンレベルを非特異的に減らす効果を持っている。この薬物は、炎症及び痛症を減らすと知られているが、ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｓ、ｌｉｐｏｘｉｎｓ、ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｙｅｉｃｏｓ ａｔｅｔｒａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄｓなどを生成する付加的な活性化が起きることも知られている。眼科領域では非特異的ＣＯＸ酵素抑制剤が開発されて点眼剤として使われているが、前記の付加的炎症産物の活性化による角膜穿孔などの深刻な副作用が学界に報告されている。
【０００５】
これに、本発明者らは、ドライアイをはじめとして眼球痛症を引き起こす眼疾患を治療または予防するための薬学組成物を開発しようと鋭意努力した結果、眼球痛症症状のある患者の涙が正常人に比べてＰＧＥ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２）の発現レベルが高いことを確認し、ＰＧＥ２合成抑制剤を動物モデルに点眼した場合に眼球痛症治療効果があることを確認し、本発明を完成するようになった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、ＰＧＥ２合成抑制剤を有効成分として含む眼球痛症の予防または治療用薬学組成物を提供し、ＰＧＥ２のレベルを測定できる眼球痛症診断用キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、眼球痛症症状のある患者の涙においてＰＧＥ２のレベルが高くてＰＧＤ２のレベルが低いことに着目して、ＰＧＥ２合成抑制剤を有効成分として含む眼球痛症の予防または治療用薬学組成物を提供し、ＰＧＥ２レベルを低下させる眼球痛症緩和剤をスクリーニングする方法を提供する。さらに、患者の涙のＰＧＥ２レベル、ＰＧＤ２レベル及びＣＯＸ２レベルを測定して眼球痛症を診断できるキット及び眼球痛症診断のための情報を提供できる。
【０００８】
本発明は、前記課題を解決するために、ＰＧＥ２合成抑制剤を有効成分として含む眼球痛症の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【０００９】
本発明は、他の具体例において、ＰＧＥ２合成抑制剤を有効成分として含む眼球痛症の予防または改善用健康機能食品を提供する。
【００１０】
本発明において、前記ＰＧＥ２合成抑制剤は、５−Ｄｅｏｘｙ−Ａ１２、１４−ＰＧＪ２、Ｅｘｉｓｕｌｉｎｄ、ＮＳ−３９８、ＬｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅＣ４、ｍｋ−８８６、Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｆ ＭＫ−８８６、ＭＦ６３、Ｔｈｉｅｎｏｐｙｒｒｏｌｅ、Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ ｄｉｓｕｌｐｈｏｎａｍｉｄｅ、Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ及びγ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｅｎｏｌｉｄｅからなる群から選択されることを特徴とする。
【００１１】
本発明において、前記薬学組成物は、ＰＧＥ２の発現量を低減させることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明において、前記眼球痛症は、ドライアイ、炎症性眼疾患またはコンタクトレンズの使用に起因する眼球痛症であることを特徴とする。
【００１３】
本発明において、前記薬学組成物は、懸濁液、酸剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、徐放性製剤、注射剤、軟膏剤、点眼剤、カプセル剤、コンタクトレンズ洗浄剤またはコンタクトレンズ潤滑剤の形態であることを特徴とし、前記薬学組成物は、人間を対象とすることを特徴とする。
【００１４】
本発明において、前記健康機能食品は、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、粉末剤または飲み物の形態であることを特徴とする。
【００１５】
本発明は、さらに他の具体例において、（ａ）配列番号１と表示されるＰＧＥ２タンパク質を含む細胞に分析する試料を接触させる段階と、（ｂ）前記タンパク質の量または活性を測定する段階と、（ｃ）前記タンパク質の量または活性が減少調節されると測定される時、前記試料が眼球痛症を緩和させる物質であることを判別する段階と、を含む眼球痛症緩和剤のスクリーニング方法を提供する。
【００１６】
本発明は、さらに他の具体例において、（ａ）配列番号１と表示されるＰＧＥ２タンパク質をコーディングする遺伝子を含む細胞に分析する試料を接触させる段階と、（ｂ）前記遺伝子の発現量を測定する段階と、（ｃ）前記遺伝子の発現量が減少調節されると測定される時、前記試料が眼球痛症を緩和させる物質であることを判別する段階と、を含む眼球痛症緩和剤のスクリーニング方法を提供し、前記ＰＧＥ２タンパク質をコーディングする遺伝子は、配列番号２と表示されることを特徴とする。
【００１７】
本発明は、さらに他の具体例において、（ａ）配列番号３と表示されるＣＯＸ２タンパク質を含む細胞に分析する試料を接触させる段階と、（ｂ）前記タンパク質の量または活性を測定する段階と、（ｃ）前記タンパク質の量または活性が減少調節されると測定される時、前記試料が眼球痛症を緩和させる物質であることを判別する段階と、を含む眼球痛症緩和剤のスクリーニング方法を提供する。
【００１８】
本発明は、さらに他の具体例において、（ａ）配列番号３と表示されるＣＯＸ２タンパク質をコーディングする遺伝子を含む細胞に分析する試料を接触させる段階と、（ｂ）前記遺伝子の発現量を測定する段階と、（ｃ）前記遺伝子の発現量が減少調節されると測定される時、前記試料が眼球痛症を緩和させる物質であることを判別する段階と、を含む眼球痛症緩和剤のスクリーニング方法を提供し、前記ＣＯＸ２タンパク質をコーディングする遺伝子は、配列番号４と表示されることを特徴とする。
【００１９】
本発明は、さらに他の具体例において、ＣＯＸ２抑制剤を有効成分として含む眼球痛症の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【００２０】
本発明は、さらに他の具体例において、（ａ）患者から分離された生物学的試料から、配列番号１と表示されるＰＧＥ２のレベルを測定する段階と、（ｂ）前記ＰＧＥ２のレベルを正常対照群試料のレベルと比較する段階と、を含む眼球痛症診断のための情報提供方法を提供する。
【００２１】
本発明において、前記情報提供方法は、ＰＧＤ２またはＣＯＸ２のレベルを測定して正常対照群試料のレベルと比較する段階をさらに含むことを特徴とする。このとき、ＰＧＥ２及びＣＯＸ２レベルが正常対照群より過発現され、ＰＧＤ２レベルが正常対照群より低発現される場合に眼球痛症があると判断する。
【００２２】
本発明は、さらに他の具体例において、ＰＧＥ２に付着したタンパク質に特異的に結合する抗体を含む眼球痛症診断または予測用キットを提供する。
【００２３】
本発明において、前記眼球痛症診断または予測用キットは、ＰＧＤ２に付着したタンパク質またはＣＯＸ２に付着したタンパク質に特異的に結合する抗体をさらに含むことを特徴とする。
【００２４】
前記キットは、ＰＧＥ２、ＰＧＤ２及びＣＯＸ２に検出のためのタンパク質を付着させ、前記付着タンパク質に特異的に結合する抗体を含むことを特徴とする。前記付着したタンパク質は、西洋わさび由来のペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリホスファターゼまたはβ−ガラクトシダーゼである。
【００２５】
本発明において、前記ＰＧＥ２、ＰＧＤ２及びＣＯＸ２のレベルは、酵素−結合された免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、ガスクロマトグラフィーー／質量分析（ＧＣ-ＭＳ）、液体クロマトグラフィーー／質量分析（ＬＣ-ＭＳ）またはＬＣ-ＭＳ／ＭＳによって測定することを特徴とする。
【００２６】
本発明の組成物は、薬剤学的組成物、機能性食品（ｎｅｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）組成物または食品組成物で製造される。
【００２７】
本発明の組成物が薬剤学的組成物で製造される場合、本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容される担体を含む。本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤に通常的に用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アラビアガム、燐酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、けい酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁液剤、保存剤などをさらに含む。薬剤学的に許容される好適な担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口投与でき、非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与、粘膜投与及び点眼投与などで投与する。
【００２８】
本発明の薬剤学的組成物の好適な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄の速度及び反応感応性のような要因によって多様に処方される。本発明の薬剤学的組成物の投与量は、大人基準として一日当り０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、０．０１〜８０ｍｇ／ｋｇ（体重）、０．１〜６０ｍｇ／ｋｇ（体重）である。また、医者または薬師の判断によって日程時間間隔で１日１回ないし数回に分割投与してもよい。特に、点眼投与の場合には、０．００１ないし３％（ｗ／ｖ、以下、同一）、望ましくは、０．０１ないし１％ほどの製剤を１日１回ないし数回点眼する。
【００２９】
本発明の薬剤学的及び健康食品商の組成物は、当業者が容易に行える方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いて製剤化することで単位用量形態に製造されるか、または多用量容器内に入れて製造される。
【００３０】
本発明の具現例によれば、本発明の組成物の剤形は、溶液、懸濁液、シロップ剤、エマルジョン、リポソーム、エキス剤、酸剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、徐放性製剤、点眼剤、カプセル剤、コンタクトレンズ洗浄剤及びコンタクトレンズ潤滑剤であり、分散剤または安定化剤をさらに含む。
【００３１】
本発明で“診断”とは、病理状態の存在または特徴を確認することをいい、特定疾病または疾患に対する一客体の感受性を判定すること、一客体が特定疾病または疾患を現在持っているかどうかを判定すること、特定疾病または疾患にかかった一客体の予後を判定することを含む。
【００３２】
本発明のスクリーニング方法を言及しつつ使われる用語“試料”は、遺伝子の発現量に影響を及ぼすか、タンパク質の量または活性に影響を及ぼすかどうかを検査するために、スクリーニング時に用いられる未知の候補物質を意味する。前記試料は、化学物質、ヌクレオチド、アンチセンス−ＲＮＡ及び天産物抽出物を含むが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
遺伝子の発現量変化の測定は、当業界で公知の多様な方法を通じて行われる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（２００１））、ノーザンブロッティング（Ｐｅｔｅｒ Ｂ．Ｋａｕｆｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０２−１０８，ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ）、ｃＤＮＡマイクロアレイを用いた混成化反応（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（２００１））またはイン・サイチュ混成化反応（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（２００１））を用いて行える。
【００３４】
ＲＴ−ＰＣＲプロトコルによって行う場合には、先ず、試料を処理した細胞から総ＲＮＡを分離した後、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを製造する。引き継いで、一本鎖ｃＤＮＡを鋳型で用いて、遺伝子−特異的プライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行う。遺伝子−特異的プライマーセットは、下記の表２に挙げられている。次いで、ＰＣＲ増幅産物を電気泳動し、形成されたバンドを分析して遺伝子の発現量変化を測定する。
【００３５】
タンパク質の量の変化は、当業界で公知の多様な免疫分析方法を通じてなされる。例えば、放射能免疫分析、放射能免疫沈澱、免疫沈澱、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）、キャプチャ−ＥＬＩＳＡ、抑制または競争分析、そしてサンドイッチ分析を含むが、これらに限定されるものではない。前記免疫分析または免疫染色の方法は、Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｅ．Ｔ．Ｍａｇｇｉｏ，ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９８０；Ｇａａｓｔｒａ，Ｗ．，Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ），ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，１９８４；及びＥｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。例えば、本発明の方法が放射能免疫分析方法によって行われる場合、放射性同位体（例えば、Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｐ３２及びＳ３５）で標識されたタンパク質−特異抗体が用いられる。本発明の方法がＥＬＩＳＡ方式で行われる場合、本発明の特定実施例は、（ａ）試料が処理された細胞から抽出物を固体基質の表面にコーティングする段階と、（ｂ）タンパク質−特異抗体と前記細胞抽出物とを反応させる段階と、（ｃ）前記段階（ｂ）の結果物を酵素が結合された二次抗体と反応させる段階と、（ｄ）前記酵素の活性を測定する段階と、を含む。前記固体基質として好適なものは、炭化水素ポリマー（例えば、ポリスチレン及びポリプロピレン）、ガラス、金属またはゲルであり、最も望ましくは、マイクロタイタープレートである。前記二次抗体に結合された酵素は、発色反応、蛍光反応、発光反応または赤外線反応を触媒する酵素を含むが、これに限定されず、例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ及びシトクロムＰ４５０を含む。前記二次抗体に結合する酵素としてアルカリホスファターゼが用いられる場合には、基質としてブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ナフトール−ＡＳＢ１−ホスフェート及びＥＣＦ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）のような発色反応基質が用いられ、ホースラディッシュペルオキシダーゼが用いられる場合には、クロロナフトール、アミノエチルカルバゾール、ジアミノ−ベンジジン、Ｄ−ルシフェリン、ルシゲニン（ビス−Ｎ−メチルアクリジニウム硝酸塩）、レセルピンベンジルエーテル、ルミノール、アムプレックスレッド試薬（１０−アセチル−３、７−ジヒドロキシフェノキサジン）、ＴＭＢ（３，３，５，５−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ（２，２´−Ａｚｉｎｅ−ｄｉ［３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ］）及びｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）のような基質が用いられる。前記ＥＬＩＳＡ方法において最終的な��素の活性測定またはシグナルの測定は、当業界で公知の多様な方法によって行われる。もし、レーベルとしてビオチンが用いられた場合にはストレプトアビジンでもって、ルシフェラーゼが用いられた場合にはルシフェリンでもってシグナルを容易に検出できる。
【００３６】
診断用キットとして活用するために、ＰＧＥ２、ＰＧＤ２及びＣＯＸ２は検出可能に標識されることが望ましい。生分子の標識に使用可能な多様な方法が当業者によく知られており、本発明の範疇内で考慮される。前記方法は、Ｔｉｊｓｓｅｎ，´Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙｓ´，Ｂｕｒｄｅｎ．ＲＨ ａｎｄ ｖｏｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｕｒｇ（Ｅｄｓ）、Ｖｏｌｕｍｅ １５（１９８５），´Ｂａｓｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ´；Ｄａｖｉｓ ＬＧ，Ｄｉｂｍｅｒ ＭＤ；Ｂａｔｔｅｙ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９９０），Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，（Ｅｄｓ）´Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ´ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７），ｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ´Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ´，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃに記述されている。
【００３７】
当業者に公知の標識方法及び多くの他の標識がある。本発明で使える標識種類の例としては、酵素、放射性同位体、コロイド金属、蛍光化合物、化学発光化合物及び生発光化合物がある。
【００３８】
通常的に使われる標識は、蛍光物質（例えば、フルレシン、ローダミン、テキサスレッドなど）、酵素（例えば、西洋わさび由来のペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、放射性同位体（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）、ビオチン、ジゴキシゲニン、コロイド金属、化学発光または生発光化合物（例えば、ジオキセタン、ルミノールまたはアクリジニウム）を含むが、これらに限定されるものではない。酵素またはビオチニル基の共有結合法、ヨード化法、リン酸化法、ビオチン化法などのような標識方法が当業界に周知である。
【００３９】
検出方法には、オートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡、直接及び間接酵素反応などがあるが、こられに制限されるものではない。通常的に使われる検出分析法には、放射性同位体または非放射性同位体方法がある。これらは、そのうちでもウェスタンブロッティング、オーバレイ分析法、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ）及びＩＲＭＡ（Ｉｍｍｕｎｅ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ）、ＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ）、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ ＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）、ＦＩＡ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ）及びＣＬＩＡ（Ｃｈｅｍｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｅ Ａｓｓａｙ）がある。
【発明の効果】
【００４０】
本発明によるＰＧＥ２合成抑制剤を有効成分として含む眼球痛症の予防または治療用薬学組成物を用いれば、ＰＧＥ２の発現レベルを選択的に抑制させることで眼球痛症症状をなおし、さらにはドライアイの治療及び予防に効果がある。また、ＰＧＥ２、ＰＧＤ２及びＣＯＸ２の量を検出するキットを用いて臨床で容易に眼球痛症症状を診断することができ、ドライアイ患者だけではなく眼科手術後の患者の状態把握に広く活用される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】眼球痛症症状のある患者の涙に含まれているＰＧＥ２／ＰＧＤ２レベル程度と患者の症状程度との関連性を示すグラフである。
【図２】眼球痛症を引き起こしたマウスにＣＯＸ２抑制剤を点眼した後、眼球不便感程度を示す結果である。
【図３】眼球痛症を引き起こしたマウスにＣＯＸ２抑制剤を点眼した後、ＴＮＦ−ａｌｐｈａのｍＲＮＡレベルを測定した結果である。
【図４】眼球痛症を引き起こしたマウスにＣＯＸ２抑制剤を点眼した後、ＩＬ−１のｍＲＮＡレベルを測定した結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
以下、本発明を下記の実施例によって詳細に説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するものであり、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。
【００４３】
実施例１
眼球痛症患者の涙成分の分析
ｎｏｎ−Ｓｊｏｇｒｅｎ型眼球痛症症状を示す患者２３人及び正常眼１７人の涙を、ポリエステル纎維ロッド（ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ ｆｉｂｅｒ ｒｏｄ（ＴＲＡＮＳＯＲＢ(R) ＷＩＣＫＳ，ＦＩＬＴＲＯＮＡ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ））を用いて収集した後、ナノレベルの液体クロマトグラフィータンテム質量分析（Ｎａｎｏ−ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＬＣ-ＭＳ／ＭＳ））方法により、涙中のプロスタグランジンのレベルを測定した（ａｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ／ＭＤＳ Ｓｃｉｅｘ ４０００ Ｑｔｒａｐ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＡＢ／ＭＤＳ Ｓｃｉｅｘ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，Ｃａｎａｄａ）を利用）。
その結果、眼球痛症症状を示す患者群の涙中のＰＧＥ２レベルが正常眼に比べて３倍以上増加し、ＰＧＤ２レベルは、正常眼の７％レベルに減少したことが分かる（表１）。
【００４４】
【表１】
0005870211.tif 000002
【００４５】
実施例２
ＰＧＥ２レベルによる眼球痛症症状程度の確認
眼球痛症症状を示す患者群及び正常群で、涙の採取前の症状の程度を、視覚痛症尺度（Ｖｉｓｕａｌ ａｎａｌｏｇｕｅ ｓｃａｌｅ）を用いて確認した。視覚痛症尺度は、０から１０までの目盛りになっており、０は、症状のない状態、１０は、耐えられない痛症あるいは不便感を表現する状態であり、患者の症状程度を点数化して確認した。これを、プロスタグランジンレベルの変化と関連があるかどうかを統計学的に分析した。
その結果、眼球痛症による患者の不便感が増加するほど、ＰＧＥ２／ＰＧＤ２割合の値が増加することが分かる（図１）。
【００４６】
実施例３
眼球痛症を引き起こしたマウス実験
Ｂ６マウスを、ｄｒｙ ｅｙｅ ｃｈａｍｂｅｒを用いて眼球痛症を引き起こす環境に１週間露出させた後、実験群と対照群とに分け、ＰＧＥ合成抑制剤として知られた各物質を実験群に点眼した。実験群には、５μｇ／ｍｌのｃｅｌｅｃｏｘｉｂ（ｓｉｇｍａ）を一日に２回点眼し、対照群には、０．１％のヒアルロン酸を点眼した。
点眼して１週間後に実験群及び対照群マウスの角膜損傷状態を、標準化されたプロトコルを用いて測定した。その結果、ｃｅｌｅｃｏｘｉｂを点眼した実験群の場合、角膜損傷の程度が有意的に減少したことが分かる（図２）。
また、点眼して１週間後に実験群及び対照群マウスの眼球を摘出し、眼球表面でのＴＮＦ−ａｌｐｈａ、ＩＬ−１ ｍＲＮＡのレベルを実時間ＲＴ−ＰＣＲで測定した。その結果、ｃｅｌｅｃｏｘｉｂを点眼した実験群の場合、ＴＮＦ−ａｌｐｈａ、ＩＬ−１ ｍＲＮＡレベルが急減したことが分かる（図３、図４）。
【００４７】
実施例４
眼球痛症患者を対象にしたＰＧＥ２合成抑制剤投与実験
眼球痛症症状のある患者を対象としてＰＧＥ２合成抑制剤を点眼し、対照群と比べて瞬ぎの回数が減少したかどうかを確認した。使われたＰＧＥ２合成抑制剤は、１５−Ｄｅｏｘｙ−Ａ１２、１４−ＰＧＪ２、Ｅｘｉｓｕｌｉｎｄ、ＮＳ−３９８、Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ Ｃ４、ｍｋ−８８６、Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｆ ＭＫ−８８６、ＭＦ６３、Ｔｈｉｅｎｏｐｙｒｒｏｌｅ、Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ ｄｉｓｕｌｐｈｏｎａｍｉｄｅ、Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ、γ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｅｎｏｌｉｄｅを使った。
その結果、ＰＧＥ合成抑制剤を点眼した場合、眼球の不便感を低減させて対照群に比べて瞬ぎの回数が減少したことが分かる（表２）。
【００４８】
【表２】
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【００４９】
実施例５
眼球痛症患者を対象にした選択的ＣＯＸ２抑制剤投与実験
選択的ＣＯＸ２抑制剤が、非選択的ＣＯＸ２抑制剤に比べて眼球痛症症状の減少に効果的であるかどうかを確認するために、選択的ＣＯＸ２抑制剤、非選択的ＣＯＸ２抑制剤及びＮＳＡＩＤを投与した。眼球痛症症状のある患者を対象として選択的ＣＯＸ２抑制剤を点眼し、非選択的ＣＯＸ２抑制特性を持つ対照群（Ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ）と比較して瞬ぎの回数が減少したかどうかを確認した。使われた選択的ＣＯＸ２抑制剤は構造的に分類し、各代表物質としてＮｉｍｅｓｕｌｕｄ、Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ、Ｍｅｌｏｘｉｃａｍ、Ｓ−２４７４（３，５−ｄｉ−ｔｅｒｔ−ｂｕｒｙｌ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｓｙｌｉｄｅｎｅ）、ｃｉｓ−Ｓｔｉｌｂｅｎｅｓを使い、選択的ＣＯＸ２抑制剤特性を持つＮＳＡＩＤとして、Ｉｂｕｐｒｏｆｅｎを含んでいる。
その結果、選択的ＣＯＸ２抑制剤を点眼した場合、眼球の不便感を低減させて対照群に比べて瞬ぎの回数が減少したことが分かる（表３）。
【００５０】
【表３】
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【００５１】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業者において、このような具体的技術は単に望ましい実施様態であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されるものではないという点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は請求項とそれらの等価物によって定義されるといえる。
【００５２】
＜産業上の利用可能性＞
本発明によるＰＧＥ２合成抑制剤を有効成分として含む眼球痛症の予防または治療用薬学組成物を用いれば、ＰＧＥ２の発現レベルを選択的に抑制させることで眼球痛症症状をなおし、さらにはドライアイの治療及び予防に効果があって有用である。
【００５３】
＜配列リストＦｒｅｅ Ｔｅｘｔ＞
配列番号１及び２は、それぞれＰＧＥ２タンパク質配列及び前記タンパク質をコーディングする遺伝子配列を示し、配列番号３及び４は、それぞれＣＯＸ２タンパク質配列及び前記タンパク質をコーディングする遺伝子配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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