(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンの精製プロセスにおける試料のグリコシル化および末端修飾状況を測定する方法であって、
（1）カチオン交換クロマトグラフィーにより免疫グロブリンを分離し、保持時間の違う画分をそれぞれ収集する工程と、
（2）工程（1）で得られた免疫グロブリンの画分を変性剤により変性させた後、還元剤により還元させることで、軽鎖と重鎖を離させる工程と、
（3）逆相高速液体クロマトグラフィーにより工程（2）で得られた免疫グロブリンの軽鎖と重鎖を分離する工程と、
（4）質量分析法により工程（3）で得られた軽鎖と重鎖の分子量を測定する工程と、
（5）工程（3）で得られたクロマトグラムのデータおよび工程（4）で得られた質量分析法のデータを解析することで、免疫グロブリンのグリコシル化および末端修飾状況を測定する工程とを含み、
前記工程（5）において、工程（3）で得られたクロマトグラムのピーク面積から免疫グロブリンの軽鎖のN末端におけるピログルタミン酸化の割合を計算し、工程（4）で得られた質量分析のデータから免疫グロブリンの重鎖におけるグリコシル型の含有量およびN末端におけるピログルタミン酸化の割合並びにC末端における脱リジンの割合を計算することを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記工程（1）において、通常の強カチオン交換クロマトグラフカラムを採用し、試料用緩衝液として20mMのリン酸ナトリウム緩衝液を使用し、溶出用緩衝液として20mMのリン酸ナトリウムと1Mの塩化ナトリウムを含む緩衝液（pH＝6.0）を使用し、紫外吸收280nmで溶出画分を監視することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（2）において、反応溶液における終濃度が0.2〜3μg/μLとなるような所定量の免疫グロブリンに1〜6Mのグアニジン塩酸塩水溶液10〜30μLを加えて均一に混ぜた後、反応溶液における終濃度が25〜100mMとなるようにジチオトレイトール（DTT）水溶液1〜4μLを加えることで、免疫グロブリンを変性・還元させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（2）において、DTTの終濃度は50mMであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（2）において、免疫グロブリンを変性・還元させる反応温度は50〜65℃であり、反応時間は45〜120分であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（2）において、免疫グロブリンを変性・還元させる反応温度は65℃であり、反応時間は45分であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（3）において、C4逆相高速液体クロマトグラフィーにより工程（2）で得られた免疫グロブリンの軽鎖と重鎖を分離することで、前記軽鎖と重鎖のベースライン分離を実現することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（4）において、0〜5分に流路を廃液へ、5〜16分に流路を質量分析計へ切り替え、ポジティブモードで質量分析法のデータを採集することで、エレクトロスプレーイオン化質量分析法により工程（3）で得られた軽鎖と重鎖の分子量を測定し、
質量分析法の条件として、コーンガス流量50.0L/Hr、脱溶媒ガス流量800.0L/Hr、脱溶媒温度500℃、コーン電圧20〜40V、スキャン範囲400〜2500Da、スキャン時間1sであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記コーン電圧は25〜30Vであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンのIgG1とIgG2サブタイプであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫グロブリンのグリコシル化および末端修飾状況は、免疫グロブリンの軽鎖のN末端におけるピログルタミン酸化、および、重鎖におけるアスパラギン結合グリコシル化、重鎖のN末端におけるピログルタミン酸化、並びに、重鎖のC末端における脱リジンを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の方法の、免疫グロブリンの精製プロセスにおける免疫グロブリンのグリコシル化および末端修飾状況を測定するためのキットへの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオ技術分野に属する。詳しくは、本発明は、免疫グロブリンの精製プロセスにおける試料のグリコシル化および末端修飾状況を測定する方法、および、免疫グロブリンの精製プロセスにおける免疫グロブリンのグリコシル化および末端修飾状況を測定するためのキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
近十年で、モノクローナル抗体はバイオ医薬品分野、ひいては全体医薬品産業において、重大な成功および巨大な発展を獲得した。モノクローナル抗体は、伝統的な低分子医薬品に比べて、特異性が高く、治療効果が顕著で、副作用が少なく、用量が少ないなどのメリットがある。抗体は、薬物分子特性からいうと、より大きな不均一性を有する。抗体の当該特性は色々な要因により引き出され、翻訳後の修飾がその中の最も重要な内在的要因である。一般的に、抗体の翻訳後修飾はグリコシル化、N末端ピログルタミン酸化、C末端脱リジン、脱アミド、酸化、異性化などを含む。抗体薬物の研究開発においては、例えば、分子同定、プロセス開発、品質監視などいくつかの段階に、いずれも翻訳後修飾に対して検出・分析を行う必要がある。
【０００３】
抗体IgGのグリコシル化は、重鎖FC領域におけるアスパラギンに起こるN-グリコシル化であり、抗体の重要な構造となる。IgGグリコシル鎖のコアユニットは、2つのN−アセチルグルコサミンと三つのマンノースがダブルY型の構造でつながって構成されているから、末端ガラクトース、コアフコース、末端シアル酸などによって色々なグリコシル鎖構造を形成することができる。IgGのグリコシル化は不均一的であり、異なるグリコシル型と含有量を示す。グリコシル化の差異は、例えば、CDC、ADCC、体内からの消失半減期など抗体の生物学的活性と薬物動態学的特徴に影響を与える。
【０００４】
抗体IgGのN末端アミノ酸がグルタミンである場合、環化反応が起こりピログルタミン酸（pyroglutamic acid、pyroE）は形成されやすい。この反応は自発的に行いてもよく、酵素で触媒する条件で行いてもよい。抗体IgG分子のC末端に脱リジン（-K）が起こりやすい。ほとんどの場合で、これらは抗体の生物学的活性に影響を与えないが、ある抗体のN末端ピログルタミン酸化は該抗体と抗原との結合力に影響を与える可能性があると報告されている。また、N末端におけるグルタミンのピログルタミン酸化およびC末端脱リジンは抗体の電荷分布に影響を与える。電荷特性は抗体品質監視の重要な指標の一つである。
【０００５】
従って、抗体IgGのグリコシル化および末端修飾を迅速に検出できる分析方法を設立することは、抗体の研究開発において重要な意義を持っている。現在、本分野においては、グリコシル化および末端修飾を個別に検出するのが一般的である。酵素分解による蛍光標識法はIgG1グリコシル化の測定における伝統的な定量方法であるが、試料の処理工程がとても複雑であり、時間がかかり、しかも試料の使用量も多い。質量分析法によりIgGの酵素分解断片を測定してグリコシル化分析を行う方法、例えば、パパイン（papain）酵素とIdeS酵素などを使用する方法もあるが、これらの方法では、例えば、酵素切断部位の選択性が高くない、コストが高すぎる、または試料の処理は複雑であるなどの問題があるため、通常工程またはプロセス開発における試料のバッチ検出に適切しない。LC-MSによりペプチドのスペクトルを解析することで、理論的に抗体のグリコシル化および末端修飾をともに検出することができるが、糖含有ペプチドの単離、測定およびデータの分析に多くな技術的困難が存在するため、グリコシル化の定量分析に適切せず、しかも試料の処理工程が複雑であり、時間がかかり、酵素切断により抗体本来の末端修飾に影響を与える可能性もある。免疫グロブリンの精製工程においては、タンパク質の精製状況に関する検出を常に行わなければならず、検出に多くな試料が必要となり、検出に時間がかかることは依然として現在最大の問題となる。従って、現在、抗体の研究開発に適用できる、少量のIgGに対してグリコシル化および末端修飾をともに迅速に測定することについて報告されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記課題を解決するために、本発明は、免疫グロブリン（即ち、抗体）の精製プロセスにおける試料のグリコシル化および末端修飾状況を同時に測定する方法を提供することを目的とするものである。また、免疫グロブリンの精製プロセスにおける免疫グロブリンのグリコシル化および末端修飾状況を測定するためのキットを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、免疫グロブリンの精製プロセスにおける試料のグリコシル化および末端修飾状況を同時に測定する方法を提供する。
【０００８】
かかる方法は、
（1）カチオン交換クロマトグラフィーにより免疫グロブリンを分離し、保持時間の違う画分をそれぞれ収集する工程と、
（2）工程（1）で得られた免疫グロブリンの画分を変性剤により変性させた後、還元剤により還元させることで、軽鎖と重鎖を離させる工程と、
（3）逆相高速液体クロマトグラフィーにより工程（2）で得られた免疫グロブリンの軽鎖と重鎖を分離する工程と、
（4）質量分析法により工程（3）で得られた軽鎖と重鎖の分子量を測定する工程と、
（5）工程（3）で得られたクロマトグラムのデータおよび工程（4）で得られた質量分析のデータを解析することで、免疫グロブリンのグリコシル化および末端修飾状況を測定する工程とを含む。
【０００９】
前記免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンであることが好ましく、ヒト免疫グロブリンIgGがより好ましく、ヒト免疫グロブリンのIgG1とIgG2サブタイプであることがさらに好ましい。
【００１０】
且つ、前記免疫グロブリンのグリコシル化および末端修飾状況は、免疫グロブリンの軽鎖におけるN末端ピログルタミン酸化、および、重鎖におけるアスパラギンのグリコシル化、重鎖のN末端におけるピログルタミン酸化、並びに、重鎖のC末端における脱リジンを含むことが好ましい。
【００１１】
本発明の測定方法では、前記工程（1）において、通常の強カチオン交換クロマトグラフカラムを採用し、試料用緩衝液として20mMのリン酸ナトリウム緩衝液を使用し、溶出用緩衝液として20mMのリン酸ナトリウムと1Mの塩化ナトリウムを含む緩衝液（pH＝6.0）を使用し、紫外吸收280nmで溶出画分を監視する。
【００１２】
詳しくは、前記工程（2）において、反応溶液における終濃度が0.2〜3μg/μLとなるような所定量の免疫グロブリンに1〜6Mのグアニジン塩酸塩水溶液10〜30μLを加えて均一に混ぜた後、反応溶液における終濃度が25〜100mMとなるようにジチオトレイトール（DTT）水溶液1〜4μLを加えることで、免疫グロブリンを変性・還元させる。
【００１３】
好ましくは、前記工程（2）において、DTTの終濃度は50mMである。
【００１４】
好ましくは、前記工程（2）において、免疫グロブリンを変性・還元させる反応温度は50〜65℃であり、反応時間は45〜120minである。
【００１５】
より好ましくは、前記工程（2）において、免疫グロブリンを変性・還元させる反応温度は65℃であり、反応時間は45minである。
【００１６】
詳しくは、前記工程（3）において、逆相高速液体クロマトグラフィーにより工程（2）で得られた免疫グロブリンの軽鎖と重鎖を分離することで、前記軽鎖と重鎖のベースライン分離を実現する。本発明の実施形態によれば、液体システムとしてUPLC（Waters、ACQUITY）を採用することができる。カラム：Waters、ACQUITY  UPLC  Column、BEH  C4、1.7μM（粒子径）、300Å（孔径）、2.1×50mm。
【００１７】
移動相の溶出条件は軽鎖と重鎖の分離に大きな影響を与えるため、好ましくは、クロマトグラフィーの条件が以下のとおりである。
【００１８】
カラム温度：55〜65℃、試料注入量：0.2〜3μg、
移動相X：0.1％のメタン酸水溶液、移動相Y：0.1％のメタン酸アセトニトリル液、流速：0.4mL/min、
勾配溶出の条件：
【表１】
0006027258.tif 000002
【００１９】
詳しくは、前記工程（4）において、0〜5minに流路を廃液へ、5〜16minに流路を質量分析計へ切り替え、ポジティブモードで質量分析法のデータを採集することで、エレクトロスプレーイオン化質量分析計で工程（3）で得られた軽鎖と重鎖の分子量を測定する。
【００２０】
好ましくは、質量分析法の条件として、コーンガス流量50.0L/Hr、脱溶媒ガス流量500〜800.0L/Hr、脱溶媒温度350〜500℃、スキャン範囲400〜2500Da、スキャン時間0.5〜2sである。コーン電圧は質量分析計のシグナルに大きな影響を与えるため、好ましくは20〜40Vであり、より好ましくは20〜30Vである。
【００２１】
詳しくは、前記工程（5）において、工程（3）で得られたクロマトグラムのピーク面積から免疫グロブリンの軽鎖のN末端におけるピログルタミン酸化の割合を計算し、工程（4）で得られた質量分析法のデータから、デコンボリューション計算により、免疫グロブリンの重鎖におけるグリコシル型の相対含有量、重鎖のN末端におけるピログルタミン酸化の割合、および重鎖のC末端における脱リジンの割合を計算する。
【００２２】
詳しくは、本発明は、前記方法の、免疫グロブリンの精製プロセスにおける免疫グロブリンのグリコシル化および末端修飾状況を測定するためのキットへの応用も提供する。
免疫グロブリンの還元反応において、タンパク質のジスルフィド結合はDTTの作用により断裂され、同じの軽鎖2本と同じの重鎖2本を生成する。C4逆相高速液体クロマトグラフィーにより軽鎖・重鎖の混合物を分離することで、N末端ピログルタミン酸を含む或いは含まない軽鎖と重鎖（異なるグリコシル型および末端修飾を含むもの）のベースライン分離を実現できる。そして、ESI-MSによりこれらの分子量をオンラインで測定する。異なるグリコシル型または末端修飾を含む重鎖は分子量が異なり、各重鎖の割合がそれぞれその分子量ピークの強さに比例するため、重鎖の質量分析法のデータからグリコシル型の相対含有量および重鎖のN末端におけるピログルタミン酸化の割合並びにC末端における脱リジンの割合が得られる。なお、クロマトグラムのピーク面積から軽鎖のN末端におけるピログルタミン酸化の割合が得られる。
【発明の効果】
【００２３】
現在、本分野では、タンパク質の分子量やその修飾状況を測定する技術がいくつかあるが、本発明の方法に比べて、いずれも欠陥または不足の点が存在する。例えば、質量分析計（MS）、例えばMALDI-MSは、一般的に抗体のタンパク質全体レベルの分子量を測定するために用いられる。質量分析法は試料への適合性がよく、操作が便利であるが、測定した分子量結果の解像度は比較的低い。抗体IgGのグリコシル化を測定する伝統的な定量方法としての酵素分解による蛍光標識法は、NグリコシダーゼPNGaseFを用いてIgGを酵素切断しグリコシル鎖を得て、精製後に蛍光標記し、高速液体クロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動分析を行う方法である。該方法は選択性が高く、正確率が高いが、試料の処理工程が複雑であり、時間がかかり（通常2日を要る）、しかも試料の使用料が多い（一般的に少なくとも100μg）。ESI-MSを用いてIgGの酵素分解断片を測定してグリコシル化分析を行うこともあるが、パパイン酵素の切断部位は選択性が低く、増えた副生する生成物はデータの分析に影響を与える可能性がある。免疫グロブリンG分解酵素S（IdeS）は高い選択性を有するが、コストが高いため、通常工程またはプロセス開発における試料のバッチ検出に適切しない。LC-MSによりパンクレアチンペプチドのスペクトルを解析することで、理論的に抗体のグリコシル化および末端修飾をともに検出することができるが、糖含有ペプチドの単離、測定およびデータの分析に多くな技術的困難が存在し、しかも検出感度が低いため、低含有量のグリコシル基の検出に適切せず、しかも試料の処理工程が複雑であり、時間がかかり、酵素切断により抗体本来の末端修飾に影響を与える可能性もある。
【００２４】
これに対して、本発明の方法では、ESI-MSにより抗体の多価イオンを測定し、そしてデコンボリューション計算を行うことで、解像度と検出結果の正確度（＜30ppm）を大きく向上させる。また、本発明では、試料の処理が簡単であり、還元剤を用いて反応（45min）すればよく、試料の使用量が少なく（5μg）、しかも試料のUPLC-MS検出が16min以内に完成でき、抗体グリコシル化、N末端ピログルタミン酸化およびC末端脱リジンのデータがともに得られる。本発明は、特に試料量の少ない実験、例えば、クローンスクリーニングにおける試料およびプロセス開発工程におけるバッチ試料の迅速検出に適用する。さらに、本発明は、通常使用量（100μg）の試料の検出にも適用する。本発明の方法によれば、各種の抗体、例えばIgG1、IgG2のグリコシル化および末端修飾を検出でき、しかも抗体のプロセス開発工程における試料の検出に適用する。なお、本発明の方法は、カルボキシペプチダーゼBおよびカチオン交換クロマトグラフィー（CEX-HPLC）と併用すれば、抗体の電荷異性体の構造を特定や同定することができる。
【００２５】
免疫グロブリンはIgG、IgA、IgM、IgD、IgEの5種に分けられ、そのなかIgGはIgG1、IgG2、IgG3、IgG4などのサブタイプに分けられる。現在、市販のモノクローナル抗体薬物の70％〜80％はIgG1類タンパク質に属する。抗体IgG1中のヒト化アミノ酸配列の構成により、キメラ型抗体IgG1、ヒト化抗体IgG1などのタンパク質に分けられる。本発明は、免疫グロブリンの精製プロセスにおける試料のグリコシル化および末端修飾状況を測定する方法、特に免疫グロブリンIgG1、IgG2のグリコシル化および末端修飾状況を測定する方法を提供する。かかる方法によれば、タンパク質の精製プロセスにおける免疫グロブリンのグリコシル化、N末端ピログルタミン酸化およびC末端脱リジンを同時かつ迅速に測定することができる。具体的に、本発明では、タンパク質の精製プロセスにおいて少量のタンパク質を還元することで、軽鎖と重鎖を正確に離させることができ、しかも該免疫グロブリン本来のグリコシル化および末端修飾状況に影響を与えない。還元されたヒト免疫グロブリン（即ち、抗体）を超高速液体クロマトグラフィー−質量分析法により分析することで、少量の免疫グロブリン（特にヒト免疫グロブリン）のグリコシル化、N末端ピログルタミン酸化およびC末端脱リジンを同時かつ迅速に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
以下、添付図面を参照しながら、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【図１Ａ】図1A〜1Dは、実施例1にDTT使用量が抗体Aの軽鎖・重鎖分離状況に対する比較結果を示す図である。
【図１Ｂ】図1A〜1Dは、実施例1にDTT使用量が抗体Aの軽鎖・重鎖分離状況に対する比較結果を示す図である。
【図１Ｃ】図1A〜1Dは、実施例1にDTT使用量が抗体Aの軽鎖・重鎖分離状況に対する比較結果を示す図である。
【図１Ｄ】図1A〜1Dは、実施例1にDTT使用量が抗体Aの軽鎖・重鎖分離状況に対する比較結果を示す図である。
【図２Ａ−１】図2A〜2Cは、実施例1にDTTの還元反応温度および時間が抗体Aの軽鎖・重鎖の分離および末端修飾状況に対する影響を示す図である。
【図２Ａ−２】図2A〜2Cは、実施例1にDTTの還元反応温度および時間が抗体Aの軽鎖・重鎖の分離および末端修飾状況に対する影響を示す図である。
【図２Ａ−３】図2A〜2Cは、実施例1にDTTの還元反応温度および時間が抗体Aの軽鎖・重鎖の分離および末端修飾状況に対する影響を示す図である。
【図２Ｂ−１】図2A〜2Cは、実施例1にDTTの還元反応温度および時間が抗体Aの軽鎖・重鎖の分離および末端修飾状況に対する影響を示す図である。
【図２Ｂ−２】図2A〜2Cは、実施例1にDTTの還元反応温度および時間が抗体Aの軽鎖・重鎖の分離および末端修飾状況に対する影響を示す図である。
【図２Ｂ−３】図2A〜2Cは、実施例1にDTTの還元反応温度および時間が抗体Aの軽鎖・重鎖の分離および末端修飾状況に対する影響を示す図である。
【図２Ｃ−１】図2A〜2Cは、実施例1にDTTの還元反応温度および時間が抗体Aの軽鎖・重鎖の分離および末端修飾状況に対する影響を示す図である。
【図２Ｃ−２】図2A〜2Cは、実施例1にDTTの還元反応温度および時間が抗体Aの軽鎖・重鎖の分離および末端修飾状況に対する影響を示す図である。
【図２Ｃ−３】図2A〜2Cは、実施例1にDTTの還元反応温度および時間が抗体Aの軽鎖・重鎖の分離および末端修飾状況に対する影響を示す図である。
【図３Ａ】図3A〜3Dは、実施例1に溶出勾配1、2、3、4が軽鎖・重鎖クロマトグラフィー分離状況に対する影響比較を示す図である。
【図３Ｂ】図3A〜3Dは、実施例1に溶出勾配1、2、3、4が軽鎖・重鎖クロマトグラフィー分離状況に対する影響比較を示す図である。
【図３Ｃ】図3A〜3Dは、実施例1に溶出勾配1、2、3、4が軽鎖・重鎖クロマトグラフィー分離状況に対する影響比較を示す図である。
【図３Ｄ】図3A〜3Dは、実施例1に溶出勾配1、2、3、4が軽鎖・重鎖クロマトグラフィー分離状況に対する影響比較を示す図である。
【図４Ａ】図4A〜4Dは、実施例1にコーン電圧（20V、25V、30V、40V）が重鎖のデコンボリューションされた分子量の質量スペクトルのピーク強さに対する影響を示す図である。
【図４Ｂ】図4A〜4Dは、実施例1にコーン電圧（20V、25V、30V、40V）が重鎖のデコンボリューションされた分子量の質量スペクトルのピーク強さに対する影響を示す図である。
【図４Ｃ】図4A〜4Dは、実施例1にコーン電圧（20V、25V、30V、40V）が重鎖のデコンボリューションされた分子量の質量スペクトルのピーク強さに対する影響を示す図である。
【図４Ｄ】図4A〜4Dは、実施例1にコーン電圧（20V、25V、30V、40V）が重鎖のデコンボリューションされた分子量の質量スペクトルのピーク強さに対する影響を示す図である。
【図５Ａ】図5Aは、実施例2に抗体Aの還元後に測定されたクロマトグラムを示す図である。
【図５Ｂ−１】図5B-1〜図5B-3は、抗体Aが還元後に測定された軽鎖、ピログルタミン酸化軽鎖および重鎖のマススペクトルをそれぞれ示す図である。
【図５Ｂ−２】図5B-1〜図5B-3は、抗体Aが還元後に測定された軽鎖、ピログルタミン酸化軽鎖および重鎖のマススペクトルをそれぞれ示す図である。
【図５Ｂ−３】図5B-1〜図5B-3は、抗体Aが還元後に測定された軽鎖、ピログルタミン酸化軽鎖および重鎖のマススペクトルをそれぞれ示す図である。
【図５Ｃ】図5Cは、実施例2に抗体Bが還元後に測定されたクロマトグラムを示す図である。
【図５Ｄ−１】図5D-1〜図5D-2は、抗体Bが還元に測定された軽鎖および重鎖のマススペクトルをそれぞれ示す図である。PyroEはN末端ピログルタミン酸、-KはC末端脱リジン、-H2Oは脱水を表す。
【図５Ｄ−２】図5D-1〜図5D-2は、抗体Bが還元に測定された軽鎖および重鎖のマススペクトルをそれぞれ示す図である。PyroEはN末端ピログルタミン酸、-KはC末端脱リジン、-H2Oは脱水を表す。
【図６Ａ−１】図6Aは、実施例3において、抗体Aのカチオン交換樹脂による画分1および画分5が還元後に測定されたクロマトグラムを示す図である。
【図６Ａ−２】図6Aは、実施例3において、抗体Aのカチオン交換樹脂による画分1および画分5が還元後に測定されたクロマトグラムを示す図である。
【図６Ｂ−１】図6Bは、抗体のA画分1および画分5が還元後に測定された重鎖のマススペクトルを示す図である。PyroEはN末端ピログルタミン酸、-KはC末端脱リジン、-H2Oは脱水を表す。
【図６Ｂ−２】図6Bは、抗体のA画分1および画分5が還元後に測定された重鎖のマススペクトルを示す図である。PyroEはN末端ピログルタミン酸、-KはC末端脱リジン、-H2Oは脱水を表す。
【図７】図7は、実施例4において、抗体C（IgG2）が還元後に測定されたクロマトグラムを示す図である。PyroEはN末端ピログルタミン酸、-KはC末端脱リジン、-H2Oは脱水を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、実施例により本発明を詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではないことは当業者が理解すべきものである。
【００２８】
下記実施例において、抗体Aはキメラ型抗体IgG1であり（具体的な作製方法は中国特許：CN101177453B明細書10〜13頁の実施例1〜6に示され、明細書13頁の実施例6でスクリーニングされたC2-11〜12キメラ抗体が本発明の抗体Aである）、抗体Bはヒト化抗体IgG1であり（珠海麗珠単抗生物技術有限公司製、具体的な作製方法は中国特許：CN102675460A明細書12〜18頁の実施例1〜7に示され、明細書17〜18頁の実施例7でスクリーニングされたAT-132抗体が本発明的抗体Bである）、抗体CはAmgen Canada InC.制の完全ヒト抗体IgG2である。
【００２９】
特別に説明しない場合、下記実施例における実験方法はいずれも常法である。また、特別に説明しない場合、下記実施例で使用した薬品原料や試薬材料などはいずれも市販品である。
【実施例】
【００３０】
実施例1  免疫グロブリン還元方法の条件スクリーニング
【００３１】
1.1  還元剤DTTの使用量に対する考察
使用量が異なる4つのDTTを用いて軽鎖・重鎖の分離に対する影響を考察した。抗体A  5μgを4部取り、それぞれ6Mのグアニジン塩酸塩溶液10μLに添加した後、0.1MのDTT溶液2μL、5μL、および、0.5MのDTT溶液2μL、4μLをそれぞれ添加した。最後に、DTT終濃度がそれぞれ10mM、25mM、50mM、100mMとなるように6Mのグアニジン塩酸塩溶液を適量添加し、前記IgG1と65℃で45minを反応させた。
【００３２】
C4逆相高速液体クロマトグラフィーにより前記反応で得られた軽鎖と重鎖を分離した。用いた液体システムはUPLC（Waters、ACQUITY）である。カラム：Waters、ACQUITY  UPLC  Column、BEH  C4、1.7μM（粒子径）、300Å（孔径）、2.1×50mm。クロマトグラフィーの条件は、カラム温度：60℃、試料の注入量：1μg、移動相X：0.1％のメタン酸水溶液、移動相Y：0.1％のメタン酸アセトニトリル液、流速：0.4ml/min、以下通りの勾配溶出の条件である。
【００３３】
【表２】
0006027258.tif 000003
0〜5minに流路を廃液へ、5〜16minに流路を質量分析計へ切り替え、ポジティブモードで質量分析のデータを採集することで、エレクトロスプレーイオン化質量分析計で前記クロマトグラフィーで得られた軽鎖と重鎖の分子量を測定した。質量分析法の条件として、コーンガス流量：50.0L/Hr、脱溶媒ガス流量：800.0L/Hr、脱溶媒温度：500℃、スキャン範囲：400〜2500Da、スキャン時間：1s、コーン電圧：25Vである。
結果は図1A〜1Dに示すように、DTT終濃度が10mMの場合は、抗体Aの軽鎖・重鎖が完全に離れなかった。DTT濃度が25mMの場合は、軽鎖・重鎖がほとんどの場合で完全に離れたが、極めて少ない場合は試料のクロマトグラフィーによる分離が不十分であった。DTT濃度が50〜100mMの場合は、全ての抗体試料の軽鎖・重鎖が完全に離れた。従って、抗体の軽鎖・重鎖の離れとクロマトグラフィーによる分離を確保するため、25〜100mMのDTTを適当の還元剤使用量として0.2〜3μg/μLの抗体に使用する。好ましい使用量は50mMである。
【００３４】
1.2  還元反応の温度と時間に対する考察
抗体A  5μg若干部をそれぞれ6Mのグアニジン塩酸塩溶液10μLに添加し、また0.5M のDTT溶液2μLを添加した。最後に、DTT終濃度が50mMとなるように6Mのグアニジン塩酸塩溶液を適量添加した。37℃、50℃、65℃の3つの反応温度および20min〜120minの反応時間は抗体IgG1の軽鎖・重鎖の分離および末端修飾の結果に対する影響を考察した。クロマトグラフィーおよび質量分析の条件は実施例1.1と同様であった。
【００３５】
実験データはWaters社のBiopharmaLynx  1.3ソフトウェアを用いて処理した。“Intact Protein”モードを選択してデコンボリューション（Deconvolution）処理し、方法のパラメーターは、Lock Mass（Da）：556.2771、TIC Threshold：300〜500、Deconvolution  m/ｚ  Range：軽鎖850〜2000、重鎖950〜1500、Protein  MW RanGe：軽鎖20000〜30000Da、重鎖42000〜60000Daであった。抗体IgGの各グリコシル型の割合は、重鎖のマススペクトルにおける各グリコシル型分子量ピークの強さを正規化方法で算出した。N末端ピログルタミン酸を含む軽鎖とピログルタミン酸を含まない軽鎖とはベースライン分離された。従って、クロマトグラムのピーク面積を積分することで、軽鎖のN末端におけるピログルタミン酸化の割合を計算した。重鎖のN末端におけるピログルタミン酸化およびC末端における脱リジンはG0F重鎖の分子量に対する分析により得た。
【００３６】
結果は図2と表1に示す。その中、図2A-1〜図2A-3から、還元温度が37℃の場合は、抗体の軽鎖・重鎖が完全に離れず、この温度で還元反応が不十分であることがわかった。図2B-1〜図2B-3および図2C-1〜図2C-3から、還元温度が50℃および65℃まで昇温する（反応時間≧45分）場合は、抗体の軽鎖・重鎖の分離状況が比較的に良くから、DTTによる還元反応は50℃以上の高温で比較的に十分であることがわかった。また、下記の表1から、同一の還元温度で反応時間を延長するにつれて、試料の軽鎖・重鎖が末端修飾の割合は増える傾向があり、同様に、同一の反応時間で反応温度を昇温するにつれて、試料の軽鎖・重鎖が末端修飾の割合も増加することがわかった。なお、高温条件はN末端におけるピログルタミン酸化およびC末端における脱リジン反応を促進する可能性があることを考慮し、試料の作製プロセスが末端修飾に対する影響を考察することが必要になる。表1に示すように、45分≦反応時間≦120分の時、末端修飾データの変化幅は大きくないため、用いた試料作製の条件が抗体の末端修飾に対する影響が少ない。
【００３７】
【表３】
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従って、還元反応の条件を、50〜65℃で、反応時間：45分≦反応時間≦120分とした。
【００３８】
1.3  方法の精密度と再現性
最適化された実験条件（抗体A  5μg若干部をそれぞれ6Mのグアニジン塩酸塩溶液10μLに添加し、さらに0.5MのDTT溶液2μLを添加した。最後に、DTT終濃度が50mMとなるように6Mのグアニジン塩酸塩溶液を適量添加し、65℃で45min反応させた。）で、本発明の方法で抗体Aのグリコシル化、N末端ピログルタミン酸環化およびC末端脱リジンを測定する際の精密度と再現性を評価した。クロマトグラフィーおよび質量分析の条件は実施例1.1と同様であった。データの処理方法は実施例1.2  と同様であった。
【００３９】
5回を連続して測定し、結果は表2に示す。IgG1の各グリコシル型の割合、N末端ピログルタミン酸環化およびC末端脱リジンの修飾割合について、測定結果はRSD％がいずれも0.5％未満であった。また、グリコシル型の含量について、測定結果はRSD％が7％未満であった。
【００４０】
同様に処理された試料を5つ測定し、結果は表3に示す。N末端ピログルタミン酸環化およびC末端脱リジンの修飾割合について、測定結果はRSD％がいずれも1％未満であった。また、グリコシル型の含量について、測定結果はRSD％が6％未満であった。
【００４１】
【表４】
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【表５】
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従って、本発明の方法は精密度と再現性に優れる。
【００４２】
1.4  移動相の最適化
逆相高速液体クロマトグラフィーを用い、移動相の溶出勾配がクロマトグラフィーによる軽鎖・重鎖の分離に対する影響を考察した。試料として抗体A  5μgを用いて6Mのグアニジン塩酸塩溶液10μLに添加し、さらに0.5MのDTT溶液2μLを添加した。最後に、DTT終濃度が50mMとなるように6Mのグアニジン塩酸塩溶液を適量添加し、65℃で45min反応させた。異なる移動相勾配により反応生成物を分離し、そのほかのクロマトグラフィーの条件および質量分析の条件は実施例1.1と同様であった。移動相Xは0.1％のメタン酸水溶液、移動相Yは0.1％のメタン酸アセトニトリル液、流速は0.4mL/minであった。下記のように溶出勾配を4つ考察した。
【００４３】
勾配1：0〜5min、10％Y；5〜5.1min、10％〜18％Y；5.1〜15min、18％〜28％Y；15〜15.1min、28％〜90％Y； 15.1〜19.0min、90％Y；19.0〜19.1min、90％〜10％Y、19.1〜22.0min、10％Y。
勾配2：0〜5min、10％Y；5〜5.1min、10％〜25％Y；5.1〜8min、25％〜27％Y；8〜18min、27％〜30％Y； 18〜18.1min、30％〜90％Y；18.1〜21.0min、90％Y；21.0〜21.1min、90％〜10％Y、21.1〜24.0min、10％Y。
勾配3：0〜5min、10％Y；5〜5.1min、10％〜25％Y；5.1〜8min、25％〜26％Y；8〜18min、26％〜28％Y； 18〜18.1min、28％〜90％Y；18.1〜21.0min、90％Y；21.0〜21.1min、90％〜10％Y、21.1〜24.0min、10％Y。
勾配4：0〜5min、10％Y；5〜5.1min、10％〜25％Y；5.1〜6min、25％〜26％Y；6〜10min、26％〜27％Y； 10〜15min、27％〜32％Y；15〜15.1min、32％〜90％Y；15.1〜18.0min、90％Y；18.0〜18.1min、90％〜10％Y、18.1〜21.0min、10％Y。
【００４４】
軽鎖および重鎖のクロマトグラフィーによる分離結果は図3に示す。従って、軽鎖・重鎖のベースライン分離に最適化の移動相溶出勾配は、勾配4：0〜5min、10％Y；5〜5.1min、10％〜25％Y；5.1〜6min、25％〜26％Y；6〜10min、26％〜27％Y； 10〜15min、27％〜32％Y；15〜15.1min、32％〜90％Y；15.1〜18.0min、90％Y；18.0〜18.1min、90％〜10％Y、18.1〜21.0min、10％Yである。
【００４５】
1.5質量分析条件の最適化
最適化された移動相溶出勾配（0〜5min、10％Y；5〜5.1min、10％〜25％Y；5.1〜6min、25％〜26％Y； 6〜10min、26％〜27％Y；10〜15min、27％〜32％Y；15〜15.1min、32％〜90％Y；15.1〜18.0min、90％Y； 18.0〜18.1min、90％〜10％Y、18.1〜21.0min、10％Y）を用いて、質量分析のパラメーターがベースライン分離後の軽鎖および重鎖の質量分析シグナルに対する影響を考察した。コーンガス流量、脱溶媒ガス流量および脱溶媒温度などは、質量分析のシグナルに対する影響が少ないため、ほとんど質量分析計製造会社に勧められたパラメーターを採用する。本発明の方法では、コーン電圧を最適化した。試料として抗体A  5μgを用いて、6Mのグアニジン塩酸塩溶液10μLに添加し、さらに0.5MのDTT溶液2μLを添加した。最後に、DTT終濃度が50mMとなるように6Mのグアニジン塩酸塩溶液を適量添加し、65℃で45min反応させた。実施例1.1と同様のクロマトグラフィー条件で反応生成物を分離し、質量分析法におけるコーン電圧をそれぞれ20V、25V、30Vおよび40Vと設定し、そのほかのクロマトグラフィーの条件は実施例1.1と同様であった。電圧の昇圧に伴い、軽鎖・重鎖のトータルイオン流（ピーク面積）がいずれも増加するが、図4A〜図4Dに示すように、重鎖のデコンボリューションによる分子量の質量分析のシグナルは20〜25Vの範囲で顕著に増加し、25〜30Vの範囲で顕著に増加せず、40Vで顕著に低下することがわかった。従って、本発明の方法では、質量分析におけるコーン電圧を25〜30Vと設定した。
【００４６】
実施例2  本発明のUPLC-MS法で抗体Aと抗体B（IgG1）のグリコシル化および末端修飾状況を測定する
【００４７】
最適化された還元条件（抗体A  5μgを6Mのグアニジン塩酸塩溶液10μLに添加し、さらに0.5MのDTT溶液2μLを添加した。最後に、DTT終濃度が50mMとなるように6Mのグアニジン塩酸塩溶液を適量添加し、65℃で45min反応させた。）、UPLC分離（実施例1.1と同様）、ESI-MS検出（実施例1.1と同様）およびデータの正規化処理（実施例1.2と同様）で抗体Aと抗体Bのグリコシル化および末端修飾を分析した。抗体Aの軽鎖および重鎖のN末端における最初のアミノ酸は、いずれもグルタミン（GLn）であり、ピログルタミン酸環化しやすい。抗体Bの軽鎖のN末端における最初のアミノ酸はグルタミン酸（GLU）であり、ピログルタミン酸環化しにくいが、重鎖にあるのは環化しやすいグルタミンである。図5Aは抗体Aが還元された後に本発明のUPLC-MS法で測定したクロマトグラムである。図5Bは該抗体を測定して得られたマススペクトルである。その中、図5B-1は図5Aに保持時間が8.19minのピークに対応する無修飾の軽鎖（LC）のデコンボリューションによるマススペクトルであり、分子量が23056Daである。図5B-2は図5Aに保持時間が9.67minのピークに対応するN末端ピログルタミン酸化された軽鎖のデコンボリューションによるマススペクトルであり、分子量が23039Daである。図5B-3は図5Aに保持時間が11.27minのピークに対応する重鎖（HC）のデコンボリューションによるマススペクトルであり、図5B-3に異なる質量の質量分析ピークはそれぞれ異なるグリコシル型および末端修飾を含むIgG1の分子量を表し、その測定した分子量と理論分子量は表4に示す。該方法で測定した抗体Aの軽鎖・重鎖の分子量は理論値に非常によい一致で、正確度が高く、しかも質量の差がわずか17Daの質量分析ピーク、例えば、50542Da（G0F、ピログルタミン酸、脱リジン）と50559Da（G0F、脱リジン）を区別することができるため、解像度が高いことがわかった。図5Cは抗体Bが還元された後に本発明のUPLC-MS法で測定したクロマトグラムである。図5Dは該抗体を測定して得られたマススペクトルである。その中、図5D-1は図5Cに保持時間が11.57minのピークに対応する軽鎖（LC）のデコンボリューションによるマススペクトルであり、ピログルタミン酸化されないものの分子量は23056Daである。図5D-2は図5Cに保持時間が13.26minのピークに対応する重鎖（HC）のデコンボリューションによるマススペクトルであり、図5D-2に異なる質量の質量分析ピークはそれぞれ異なるグリコシル型および末端修飾を含むIgG1の分子量を表す。抗体Aと同様に、抗体Bの軽鎖・重鎖の分子量の測定値は理論値に非常によい一致である。正規化で計算により、抗体Bの重鎖N末端におけるピログルタミン酸化とC末端における脱リジンはそれぞれ70.6％と97.8％であり、G0F、G1F、G2FおよびG0の含有量はそれぞれ65.7％、26.5％、4.6％と3.2％であった。
【００４８】
【表６】
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【００４９】
実施例3  本発明のUPLC-MS法で抗体Aの精製後の各画分のグリコシル化および末端修飾状況を測定する
【００５０】
抗体Aの精製プロセスにおいて、通常の強カチオン交換クロマトグラフカラムを採用し、試料用緩衝液として20mMのリン酸ナトリウム緩衝液を使用し、溶出用緩衝液として20mMのリン酸ナトリウムと1Mの塩化ナトリウムを含む緩衝液（pH＝6.0）を使用し、流速200〜400cm/hで溶出し、紫外吸收280nmで溶出画分を監視した。保持時間ごとに抗体Aの画分：画分1（4000〜4300min）、画分2（4300〜4500min）、画分3（4500〜4650min）、画分4（4650〜4800min）、画分5（4800〜5100min）を収集した。最適化された還元条件（抗体A  5μgを6Mのグアニジン塩酸塩溶液10μLに添加し、さらに0.5MのDTT溶液2μLを添加した。最後に、DTT終濃度が50mMとなるように6Mのグアニジン塩酸塩溶液を適量添加し、65℃で45min反応させた。）、UPLC分離（実施例1.1と同様）、ESI-MS検出（実施例1.1と同様）およびデータの正規化処理（実施例1.2と同様）で該IgG1の各画分のグリコシル化および末端修飾を分析した。結果は表5、図6A-1〜図6A-2および図6B-1〜図6B-2に示す。
【００５１】
【表７】
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【００５２】
図6A-1〜図6A-2は画分1と画分5が還元後に測定されたクロマトグラムであり、図6B-1〜図6B-2は画分1と画分5の重鎖のマススペクトルである。
【００５３】
測定結果からわかるように、画分1から画分5までは、軽鎖のN末端におけるピログルタミン酸化（95.36％〜48.16％）と重鎖におけるピログルタミン酸化（86.49％〜65.53％）が順番に減少し、グリコシル化部分について、G1Fは14.39％（画分1）から8.27％（画分5）に低下し、Man5とG0F-GNはそれぞれ5.53％と6.72％から9.16％と14.11に増加した。従って、本発明の方法は、抗体の精製プロセスにおける試料のグリコシル化および末端修飾の差異を監視するに用いられる。
【００５４】
実施例4  本発明のUPLC-MS法で抗体C（IgG2）のグリコシル化および末端修飾状況を測定する
【００５５】
最適化された還元条件（抗体A  5μgを6Mのグアニジン塩酸塩溶液10μLに添加し、さらに0.5MのDTT溶液2μLを添加した。最後に、DTT終濃度が50mMとなるように6Mのグアニジン塩酸塩溶液を適量添加し、65℃で45min反応させた。）、UPLC分離（実施例1.1と同様）、ESI-MS検出（実施例1.1と同様）およびデータの正規化処理（実施例1.2と同様）で抗体Cのグリコシル化および末端修飾を分析した。図7は抗体Cが還元された後に本発明のUPLC-MS法で測定したクロマトグラムであり、軽鎖（LC）の保持時間が6.6min、重鎖（HC）の保持時間が13.7minであった。抗体Cの軽鎖および重鎖のN末端における最初のアミノ酸はグルタミン酸（GLU）であり、環化でピログルタミン酸を形成しにくいため、ピログルタミン酸化された軽鎖または重鎖を検出できなかったが、重鎖のほとんどがC末端において脱リジンされた。抗体Cのグリコシル型は、主にG0F、G1F、Man5、G0およびG2Fを含み、これらに対応する脱リジン含有重鎖の分子量が50206Da、50367Da、49978Da、50059Daおよび50531Daであり、理論値に一致である、その含有量がそれぞれ58.0％、19.5％、13.7％、6.6％、2.2％であった。従って、本発明の方法は、免疫グロブリンIgG2のグリコシル化および末端修飾の検出にも適用する。
【００５６】
実施例5  本発明のキットを用いて抗体Aのグリコシル化および末端修飾状況を測定する方法
【００５７】
キットは試薬Aと試薬Bからなり、その中、試薬Aが6Mのグアニジン塩酸塩溶液、試薬Bが0.5MのDTT溶液である。
【００５８】
キットを用いて抗体Aのグリコシル化および末端修飾状況を検出する方法は下記に詳しく示す。
【００５９】
抗体A 20μg（タンパク質の濃度は1μg/μLを超える必要があり、1μg/μL未満であれば、分画分子量10kDaの限外濾過遠心管で濃縮すればよい）に、溶液の総体積が36μLとなるように所定量の試薬Aを添加し、さらに試薬B 4μLを添加し、65℃で45min反応させた。UPLCにより反応生成物を分離し（実施例1.1と同様）、ESI-MS検出（実施例1.1と同様）およびデータの正規化処理（実施例1.2と同様）で抗体Aのグリコシル化および末端修飾を分析した。連続的に5日間で実験を繰り返した（新たに試料を作製して測定を行った）。
【００６０】
結果から、抗体Aの軽鎖および重鎖は効果的に離れて、クロマトグラフィーによりベースライン分離が実現された。表6に示すように、連続的に5日間繰り返したところ、軽鎖のN末端におけるピログルタミン酸化、重鎖のN末端におけるピログルタミン酸化および重鎖のC末端における脱リジンの測定値は相対標準偏差RSD％が2％未満であり、グリコシル鎖G0F、G1FおよびG0の相対含有量の測定値は相対標準偏差RSD％が5％未満であり、Man5およびG0F〜GNの相対標準偏差が10％未満であった。従って、本発明の方法は、標準化の操作を実現でき、しかも再現性が良好であるため、免疫グロブリンのグリコシル化および末端修飾を測定するキットに用いられる。
【００６１】
【表８】
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以上、本発明の具体的な実施形態について説明したが、これらは本発明を限定するものではなく、当業者が本発明の要旨を逸脱しない範囲内に行う各種の変更または変形は、いずれも本発明の範囲に含むものである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ａ−３】
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【図２Ｂ−１】
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【図２Ｂ−２】
0006027258.tif 000018
【図２Ｂ−３】
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【図２Ｃ−１】
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【図２Ｃ−２】
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【図２Ｃ−３】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ−１】
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【図５Ｂ−２】
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【図５Ｂ−３】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ−１】
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【図５Ｄ−２】
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【図６Ａ−１】
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【図６Ａ−２】
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【図６Ｂ−１】
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【図６Ｂ−２】
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【図７】
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