(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材と、前記基材上に設けられ、所定の刺激により細胞接着性が変化する有機化合物を含む機能性層とを有する細胞培養基材の評価方法であって、
傾斜させた細胞培養基材の機能性層の表面に供給された液滴の転落速度を測定する第１測定工程と、
前記第１測定工程の測定時とは機能性層の細胞接着性が変化する条件下で、傾斜させた細胞培養基材の機能性層の表面に供給された液滴の転落速度を測定する第２測定工程と、
を有し、
第１測定工程で得られた液滴の転落速度と、第２測定工程で得られた液滴の転落速度とに基づいて、機能性層の細胞接着性が変化するか否かの評価を行う前記細胞培養基材の評価方法。
【請求項２】
有機化合物が、温度変化により細胞接着性が変化する温度応答性ポリマーである請求項１に記載の細胞培養基材の評価方法。
【請求項３】
基材と、前記基材上に設けられ、所定の刺激により細胞接着性が変化する有機化合物を含む機能性層とを有する細胞培養基材について、機能性層の状態の評価を行う方法を実施するための装置であって、
前記方法が、
傾斜させた細胞培養基材の機能性層の表面に供給された液滴の転落速度を測定する第１測定工程と、
前記第１測定工程の測定時とは機能性層の細胞接着性が変化する条件下で、傾斜させた細胞培養基材の機能性層の表面に供給された液滴の転落速度を測定する第２測定工程と、
を有し、
第１測定工程で得られた液滴の転落速度と、第２測定工程で得られた液滴の転落速度とに基づいて、機能性層の状態の評価を行う方法であり、
細胞培養基材が配置され、該細胞培養基材を傾斜させるためのステージと、
ステージ上に配置された細胞培養基材の機能性層の表面に液滴を供給するための液滴供給手段と、
転落する液滴を撮影する撮像手段と、
撮像手段により撮影した画像に基づき液滴の転落速度を算出する転落速度算出部と、
ステージ上に配置された細胞培養基材に所定の刺激を付与する刺激付与手段と、
を有する細胞培養基材の評価装置。
【請求項４】
有機化合物が、温度変化により細胞接着性が変化する温度応答性ポリマーである請求項３に記載の細胞培養基材の評価装置。
【請求項５】
基材上に、所定の刺激により細胞接着性が変化する有機化合物を含む機能性層を設けて細胞培養基材を得る工程と、
得られた細胞培養基材について、請求項１に記載の評価方法を実施する工程と、
を有し、
評価の結果、機能性層の細胞接着性が変化していると判定されたものを製品とする細胞培養基材の製造方法。
【請求項６】
有機化合物が、０℃〜８０℃の下限臨界溶解温度を有し、その下限臨界溶解温度以上の温度では細胞接着性を示し、かつ下限臨界溶解温度未満の温度では細胞非接着性を示す温度応答性ポリマーであり、
下限臨界溶解温度以上の温度で、細胞培養基材を４０°の角度に傾斜させ、機能性層の表面に供給された液滴の転落速度を測定する第１測定工程と、
下限臨界溶解温度未満の温度で、細胞培養基材を６０°の角度に傾斜させ、機能性層の表面に供給された液滴の転落速度を測定する第２測定工程と、
を有し、
第１測定工程で得られた液滴の転落速度が０．０５ｍｍ／ｍｓｅｃ〜０．１０ｍｍ／ｍｓｅｃであり、かつ第２測定工程で得られた液滴の転落速度が１．０×１０−３ｍｍ／ｍｓｅｃ〜１．０×１０−４ｍｍ／ｍｓｅｃである場合に機能性層の細胞接着性が変化していると判定する請求項５に記載の細胞培養基材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基材上に機能性層を備える細胞培養基材の評価方法及び評価装置、並びにそのような細胞培養基材の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞をシート状に培養し、トリプシン等の酵素を使用せずに例えば温度を低下させるだけで細胞をシート状に回収する「細胞シート工学」という技術が再生医療分野で注目されている。本技術によって得られる細胞シートは、角膜や歯周組織等の再生医療で既に一定の治療効果が確認され、欧州で既に臨床研究や治験が進められている。また、複数の種類の細胞シートを積層させることによる三次元組織モデルの作製や、血管組織を伴う成熟した組織を生体外で作製することも可能であり、本技術をベースにした研究開発や治療が今後ますます期待される。
【０００３】
培養した細胞シートの接着、脱着の制御は、例えば、基材上に固定したポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）等の機能性層を介して行われる。このポリマーは、主に温度に応答して水和能が変化する材料であり、臨界溶解温度未満の温度では周囲の水に対する親和性が向上し、ポリマーが水を取り込み膨潤して表面に細胞を接着しにくくする性質（細胞非接着性）を示し、同温度以上の温度ではポリマーから水が脱離することでポリマーが収縮し表面に細胞を接着しやすくする性質（細胞接着性）を示すものである。細胞の脱接着性は、上記ＰＩＰＡＡｍの固定化密度や鎖長に影響を受けることが知られており、したがって、細胞の脱接着性の良否を検討するため、機能性層の状態を評価する手法の開発が望まれている。
【０００４】
基材上に機能性層を設けた細胞培養基材を評価する従来の方法として、（特許文献１）が知られている。（特許文献１）には、０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド等の温度応答性ポリマーを被覆した細胞培養基材の表面上に、細胞を播種後、４８時間以内に蛋白質加水分解酵素を使わずに温度処理だけで細胞を当該基材表面から剥離して回収し、生細胞と反応する試薬を用いて分光計で定量する、温度応答性細胞培養基材の評価方法が開示されている。培養細胞は、基材表面積当たり１００〜１００００個／ｃｍ２となるように個々の状態で基材表面上に付着していることが必要とされる。すなわち、細胞をシートの状態で回収すると、細胞間接着によって細胞が引っ張られる力の影響が無視できないため、（引用文献１）では個々の状態（まばらな状態）で基材上に播種することにより細胞間接着の影響を排除し、基材と細胞との相互作用のみを反映した結果を得ている。
【０００５】
上記（特許文献１）に記載の評価方法は、細胞培養を実施するため、評価を行うために少なくとも数時間〜数十時間を要するという問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−８２１２３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで本発明は、上記従来の状況に鑑み、細胞培養を実施する必要がなく、短時間でＰＩＰＡＡｍ等からなる機能性層の状態を評価することができる方法、及びその方法を実施するための評価装置を提供することを目的とする。また、上記評価方法を利用して、機能性層の状態が良であるような細胞培養基材を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＰＩＰＡＡｍ等の、所定の刺激により細胞接着性が変化する有機化合物を含む機能性層の状態によって、その機能性層の表面における液体のはじき挙動が異なる点に着目した。そして、細胞接着性が変化する前後の条件下において、機能性層の表面を転落する液滴の速度を測定し、それらの複数の速度値を指標として機能性層の状態を評価できることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【０００９】
（１）基材と、前記基材上に設けられ、所定の刺激により細胞接着性が変化する有機化合物を含む機能性層とを有する細胞培養基材の評価方法であって、
傾斜させた細胞培養基材の機能性層の表面に供給された液滴の転落速度を測定する第１測定工程と、
前記第１測定工程の測定時とは機能性層の細胞接着性が変化する条件下で、傾斜させた細胞培養基材の機能性層の表面に供給された液滴の転落速度を測定する第２測定工程と、
を有し、
第１測定工程で得られた液滴の転落速度と、第２測定工程で得られた液滴の転落速度とに基づいて、機能性層の状態の評価を行う前記細胞培養基材の評価方法。
（２）有機化合物が、温度変化により細胞接着性が変化する温度応答性ポリマーである上記（１）に記載の細胞培養基材の評価方法。
（３）上記（１）又は（２）に記載の評価方法を実施するための装置であって、
細胞培養基材が配置され、該細胞培養基材を傾斜させるためのステージと、
ステージ上に配置された細胞培養基材の機能性層の表面に液滴を供給するための液滴供給手段と、
転落する液滴を撮影する撮像手段と、
撮像手段により撮影した画像に基づき液滴の転落速度を算出する転落速度算出部と、
ステージ上に配置された細胞培養基材に所定の刺激を付与する刺激付与手段と、
を有する細胞培養基材の評価装置。
【００１０】
（４）基材上に、所定の刺激により細胞接着性が変化する有機化合物を含む機能性層を設けて細胞培養基材を得る工程と、
得られた細胞培養基材について、上記（１）に記載の評価方法を実施する工程と、
を有し、
評価の結果、機能性層の状態が良と判定されたものを製品とする細胞培養基材の製造方法。
（５）有機化合物が、０℃〜８０℃の下限臨界溶解温度を有し、その下限臨界溶解温度以上の温度では細胞接着性を示し、かつ下限臨界溶解温度未満の温度では細胞非接着性を示す温度応答性ポリマーであり、
下限臨界溶解温度以上の温度で、細胞培養基材を４０°の角度に傾斜させ、機能性層の表面に供給された液滴の転落速度を測定する第１測定工程と、
下限臨界溶解温度未満の温度で、細胞培養基材を６０°の角度に傾斜させ、機能性層の表面に供給された液滴の転落速度を測定する第２測定工程と、
を有し、
第１測定工程で得られた液滴の転落速度が０．０５ｍｍ／ｍｓｅｃ〜０．１０ｍｍ／ｍｓｅｃであり、かつ第２測定工程で得られた液滴の転落速度が１．０×１０−３ｍｍ／ｍｓｅｃ〜１．０×１０−４ｍｍ／ｍｓｅｃである場合に機能性層の状態を良と判定する上記（４）に記載の細胞培養基材の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、細胞培養を実施する必要がなく、短時間で細胞培養基材の温度応答性等を評価することができる。また、細胞の脱接着性に優れる細胞培養基材を効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明に係る細胞培養基材の評価方法を説明するための図である。
【図２】本発明に係る細胞培養基材の評価装置の一実施形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、図面に基づき本発明を詳細に説明する。まず、本発明の評価対象である細胞培養基材の構成について述べる。
細胞培養基材は、基材上（通常は、基材の片面側）に、所定の刺激により細胞接着性が変化する有機化合物を含む機能性層を設けて構成される。基材と機能性層の間は、一般には直接密着しているが、必要に応じて、機能性層の固定化を容易にするプライマー層等の中間層が介在していても良い。
【００１４】
細胞培養基材は、細胞及び培地を収容する細胞培養容器の内底面に設置されて使用される。したがって、基材は、細胞培養容器の底板を兼ねていても良いし、底板や側壁等から形成された容器の内底面に、後から基材及び機能性層の積層体を接合させる形態であっても良い。容器に後から接合させる積層体の形態である場合、基材は板状又はフィルム状であり、基材の、機能性層が設けられた側と反対側には、細胞培養容器の底板に接合させるための粘着剤層及び剥離シートを適宜設けることができる。
【００１５】
基材の材料は特に限定されない。具体的には、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ＴＡＣ（トリアセチルセルロース）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、アクリル樹脂等の樹脂材料や、ガラス、石英等の無機材料が挙げられ、樹脂材料が好ましく用いられる。
【００１６】
基材の、機能性層が設けられる側の表面は、易接着処理された表面であることができる。「易接着処理」とは、例えば、ポリエステル、アクリル酸エステル、ポリウレタン、ポリエチレンイミン、シランカップリング剤、ペルフルオロオクタンスルホン酸（ＰＦＯＳ）等の易接着剤による処理を指す。
【００１７】
機能性層を構成する有機化合物としては、所定の刺激により細胞接着性が変化する機能を有するものであれば特に限定されない。例えば、刺激を加えることにより細胞接着性から細胞非接着性へと変化する刺激応答性ポリマーが好ましく用いられる。刺激応答性ポリマーとしては、温度応答性ポリマー、ｐＨ応答性ポリマー、イオン応答性ポリマー、光応答性ポリマー等を挙げることができ、作製しようとする細胞シートに適したものを適宜選択することができる。特に、温度応答性ポリマーが、温度変化により細胞接着性が変化し、刺激の付与が容易であることから好ましい。
【００１８】
温度応答性ポリマーとして、例えば、細胞を培養する温度では細胞接着性を示し、作製した細胞シートを剥離する時の温度では細胞非接着性を示すものを用いると良い。具体的には、臨界溶解温度未満の温度では周囲の水に対する親和性が向上し、ポリマーが水を取り込んで膨潤して表面に細胞を接着しにくくする性質（細胞非接着性）を示し、同温度以上の温度ではポリマーから水が脱離することでポリマーが収縮して表面に細胞を接着しやすくする性質（細胞接着性）を示すものを用いると良い。このような臨界溶解温度は、下限臨界溶解温度と呼ばれる。下限臨界溶解温度Ｔが０℃〜８０℃、さらに好ましくは０℃〜５０℃である温度応答性ポリマーを用いると良い。Ｔが０℃〜８０℃であると、細胞を安定的に培養できるからである。
【００１９】
好適な温度応答性ポリマーとしては、アクリル系ポリマー又はメタクリル系ポリマーが挙げられる。より具体的には、例えばポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（Ｔ＝３２℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（Ｔ＝２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（Ｔ＝３２℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（Ｔ＝約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、及びポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（Ｔ＝３２℃）等が挙げられる。
【００２０】
これらのポリマーを形成するためのモノマーとしては、放射線照射によって重合し得るモノマーを用いることができる。モノマーとしては例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（もしくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体、及びビニルエーテル誘導体等が挙げられ、これらの１種以上を使用することができる。モノマーが一種類単独で使用された場合、基材上に形成されるポリマーはホモポリマーとなり、モノマーが複数種一緒に使用された場合、基材上に形成されるポリマーはヘテロポリマーとなるが、本発明においてはいずれの形態も適用可能である。
【００２１】
また、増殖細胞の種類によってＴを調節する必要がある場合や、機能性層の親水・疎水性のバランスを調整する必要がある場合等には、上記以外の他のモノマー類をさらに加えて共重合しても良い。さらに、上記ポリマーとその他のポリマーとのグラフト又はブロック共重合体、あるいは上記ポリマーと他のポリマーとの混合物を用いて機能性層を構成しても良い。また、ポリマー本来の性質が損なわれない範囲で架橋することも可能である。
【００２２】
温度応答性ポリマー等の有機化合物を含む機能性層は、従来知られた手法を適宜採用して基材上に形成することができる。例えば、重合により目的の刺激応答性ポリマーを形成するモノマーと、該モノマーを溶解しうる有機溶媒と含む塗布用組成物を調製し、これを慣用の塗布方法に従って、基材の表面に塗布して塗膜を形成し、次に、該塗膜に放射線照射等の適当な手段により塗膜中のモノマーを重合してポリマーを形成するとともに、基材の表面とポリマーとの間にグラフト化反応を生じさせることにより形成することができる。
【００２３】
機能性層の膜厚は、例えば、０．５ｎｍ〜３００ｎｍの範囲内とすると良く、特に１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲内であることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２４】
次に、本発明の細胞培養基材の評価方法及び評価装置について述べる。本発明の評価方法は、傾斜させた細胞培養基材の機能性層の表面に供給された液滴の転落速度を測定する第１測定工程と、第１測定工程の測定時とは機能性層の細胞接着性が変化する条件下で、傾斜させた細胞培養基材の機能性層の表面に供給された液滴の転落速度を測定する第２測定工程とを有することを特徴とする。
【００２５】
ここで「第１測定工程の測定時とは機能性層の細胞接着性が変化する条件下で測定する」とは、具体的には、機能性層を構成する有機化合物の種類によって異なるが、機能性層の状態が細胞接着性から細胞非接着性に変化する臨界条件（温度、ｐＨ、光照射条件等）を挟む２つの条件下で第１及び第２の測定を行うことをいう。例えば、機能性層が下限臨界溶解温度を有する温度応答性ポリマーからなる場合は、機能性層が細胞接着性を示す下限臨界溶解温度以上の温度で第１測定工程を実施し、機能性層が細胞非接着性を示す下限臨界溶解温度未満の温度で第２測定工程を実施する。なお、２つの条件での測定について、いずれを第１ないし第２測定工程とするかは任意である。
【００２６】
図１に示すように、基材１０及び機能性層２０を含む細胞培養基材１を角度αで傾斜させ、その傾斜させた機能性層２０の表面に、液滴Ｌを供給する。液滴Ｌは機能性層２０上を転落するため、その時の転落速度をカメラ等の撮像手段を用いて測定する。なお、液滴Ｌとしては通常水が用いられるが、場合によりアルコール等の他の液体を用いても良い。機能性層２０は、臨界条件を境にして表面の親水性・疎水性等の性質が変わり、転落する液滴Ｌの速度もそれに応じて変化するため、第１及び第２測定工程で得られる２つの転落速度から、機能性層が適切に機能していることが確認でき、また、細胞の脱接着性の良否を評価することができる。例えば、機能性層が親水性となり細胞の脱離性が高まるほど、一般に転落速度は遅くなる。さらに、転落速度は、機能性層の固定化量にも依存する。すなわち、例えば温度応答性ポリマーの場合には基材に対する固定化量が大きくなるほど転落速度は遅くなるため、転落速度の値から固定化量の大小を知ることができる。その際、第１及び第２測定工程の２つの条件下で測定を行うため、見積もられる固定化量の信頼性・精度が高まる。
【００２７】
図１において、液滴Ｌの量は、適切な転落速度の値が得られれば良く特に限定されない。例えば、１μＬ〜１ｍＬ程度とすることができ、第１及び第２測定工程で同一の量とすることが好ましい。また、細胞培養基材１を傾斜させる角度αは、測定される転落速度が適度な値になるよう適宜調節される。具体的には、１°〜９０°とすることができる。角度αは、第１及び第２測定工程で同一の値とすることが好ましいが、第１及び第２測定工程の転落速度が大きく異なり、かつ角度αと転落速度との相関が明らかである場合は、第１及び第２測定工程の双方で転落速度を精度良く測定できるように、一方の工程における角度αを他方よりも小さく（大きく）しても良い。
【００２８】
以上の評価方法を細胞培養基材の製造工程において利用することにより、機能性層の状態（固定化量、細胞の脱接着性）が良好な細胞培養基材を効率的に製造することができる。一例として、機能性層が、０℃〜８０℃の下限臨界溶解温度を有し、その下限臨界溶解温度以上の温度では細胞接着性を示し、かつ下限臨界溶解温度未満の温度では細胞非接着性を示す温度応答性ポリマーを含む細胞培養基材について、下限臨界溶解温度以上及び未満の温度条件で、細胞培養基材を所定の角度に傾斜させ、液滴の転落速度を測定する第１及び第２測定工程を実施し、第１測定工程で得られた液滴の転落速度が、第２測定工程で得られた液滴の転落速度と異なり、各値を比較してそれらが機能性層の親水・疎水性の振るまいを反映していることを確認するとよい。より具体的には、例えば、細胞培養基材を４０°の角度に傾斜させた第１測定工程で得られた液滴の転落速度が０．０５ｍｍ／ｍｓｅｃ〜０．１０ｍｍ／ｍｓｅｃであり、かつ細胞培養基材を６０°の角度に傾斜させた第２測定工程で得られた液滴の転落速度が１．０×１０−３ｍｍ／ｍｓｅｃ〜１．０×１０−４ｍｍ／ｍｓｅｃである場合に、機能性層の状態が良好であると判定することができる。このような判定作業は、従来のような細胞培養を実施しないため、極めて短時間で行うことができる。さらに、複数の細胞培養基材を製造するにあたり、予め、いくつかの細胞培養基材を用いて細胞培養を行い、その細胞培養結果と第１測定工程及び第２測定工程により得られる転落速度の値との相関を調べて各転落速度の好適範囲（又は閾値）を求めておき、それ以降に製造される他の細胞培養基材の転落速度の値が上記好適範囲（又は閾値）に含まれるか否かをもって製品の良否の判定作業を行っても良い。この場合でも、細胞培養は当初にのみ行えば済むため、細胞培養基材の量産工程の全体として大幅な効率化を図ることができる。
【００２９】
図２に、上述の評価方法を実施するための装置の一実施形態を示す。この評価装置は、細胞培養基材１が配置され、その細胞培養基材１を傾斜させるためのステージ１１と、ステージ１１上に配置された細胞培養基材１の機能性層の表面に液滴Ｌを供給するためのシリンジ等の液滴供給手段１２と、転落する液滴Ｌを撮影する撮像手段１３ａ、１３ｂと、それらの撮像手段により撮影した画像に基づき液滴Ｌの転落速度を算出する転落速度算出部１４とを有している。
【００３０】
ステージ上の細胞培養基材１は、拡散板１６を通過させた光源１５からの光で照明される。撮像手段１３ａ、１３ｂは、転落する液滴を捉えることができれば良く、具体的にはＣＣＤ等を備える高速度カメラが好適に用いられる。図２に示すように複数の撮像手段１３ａ、１３ｂを用い、例えばステージの上方及び側方から撮影することによって、より高精度に転落速度を測定することができるが、いずれか一方の撮像手段のみでも構わない。また、ステージ１１は、設定した角度に細胞培養基材を傾斜させるための駆動装置が設けられ、また、機能性層の細胞接着性を変化させるためのヒーター、冷却装置、光源等の所定の刺激を付与する刺激付与手段１７が、ステージ１１に接続され、あるいは別途設けられている。液滴供給手段１２は、設定した量の液滴Ｌを滴下できるよう設定されている。また、転落速度算出部は、撮像手段により取得される画像を解析し、液滴の転落速度を算出する機能を有している。速度を算出する際には、例えば、図１における液滴Ｌの前方端Ｌ１又は後方端Ｌ２に着目し、その端部の変位量から求めることができる。
【実施例】
【００３１】
次に、実施例及び比較例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３２】
・細胞培養基材の製造
ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（アルドリッチ社）を２％含み、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを、最終モノマー濃度がそれぞれ３０重量％、３５重量％及び４０重量％となるようにイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）に溶解させて３種類の溶液を調製した。続いて、基材としてポリスチレンフィルムシート（ＰＳ）を用い、このＰＳ上に前記の３種類のＮ−イソプロピルアクリルアミド溶液をコーティングし、電子線照射装置を用いて電子線照射を行い、ＰＳ表面にポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）からなる機能性層をグラフト重合により形成した。ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが結合したＰＳを、５℃のイオン交換水を用いて洗浄し、その後乾燥して３種類の細胞培養基材を得た。３０重量％、３５重量％及び４０重量％のモノマー濃度に対応する細胞培養基材をそれぞれ試料１〜３とする。また、比較例として、ＰＳのみからなるシートについて試料１〜３と同様の測定を行った。
【００３３】
・第１測定工程
接触角測定装置ＤＭ−５０１（商品名、協和界面科学社製）のステージに試料１〜３を順に載置し、ヒーター温度をポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの下限臨界溶解温度（Ｔ＝３２℃）以上である４０℃、ステージの傾斜角を４０°に設定した。続いて、マイクロシリンジにより試料１〜３の表面に純水を１μＬ滴下した。滴下後、転落する液滴の側方からＣＣＤカメラで測定間隔１００ｍｓｅｃの条件で撮影し、液滴の前方端の変位から液滴の転落速度（第１転落速度という）を算出した。
【００３４】
・第２測定工程
接触角測定装置ＤＭ−５０１（商品名、協和界面科学社製）のステージに試料１〜３を順に載置し、ヒーター温度をポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの下限臨界溶解温度（Ｔ＝３２℃）未満である２５℃、ステージの傾斜角を６０°に設定した。続いて、マイクロシリンジにより試料１〜３の表面に純水を１μＬ滴下した。滴下後、転落する液滴の側方からＣＣＤカメラで測定間隔１００ｍｓｅｃの条件で撮影し、液滴の前方端の変位から液滴の転落速度（第２転落速度という）を算出した。
測定結果を表１に示す。
【表１】
0005928008.tif 000002
【００３５】
表１に示すように、試料１〜３の全てにおいて第１転落速度と第２転落速度が異なることから、細胞培養基材の表面に機能性層が形成されていることが確認された。一方、ＰＳのみの場合は、機能性層を有しないため第１転落速度と第２転落速度は変わらなかった。また、第２転落速度の値が第１転落速度よりも小さいことから、下限臨界溶解温度未満の温度では機能性層は親水性となり、細胞非接着性を示すことが明らかとなった。さらに、第１及び第２転落速度の値は機能性層のモノマー濃度（ＰＩＰＡＡｍの固定化量）を反映しており、モノマー濃度が高いほど、転落速度は低下することが分かった。試料１と試料２は、第２転落速度では差が見られなかったが、第１転落速度では差が見られたことから、両者は判別可能であることを確認した。
【００３６】
本発明では、２つの温度条件下で転落速度を測定するため、ＰＩＰＡＡｍの固定化量の大小をより高い分解能で知ることができる。
【符号の説明】
【００３７】
１    細胞培養基材
１０  基材
１１  ステージ
１２  液滴供給手段
１３ａ、１３ｂ  撮像手段
１４  転落速度算出部
１５  光源
１６  拡散板
１７  刺激付与手段
２０  機能性層
Ｌ    液滴
Ｌ１  前方端
Ｌ２  後方端
α    角度
【図１】
0005928008.tif 000003
【図２】
0005928008.tif 000004