(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
NK細胞におけるCD137の発現を誘導または上方制御する腫瘍抗原に対する抗体を含む、患者において癌を処置するための薬学的組成物であって、
抗CD137アゴニスト抗体と組み合わせて使用され、
該アゴニスト抗体が、少なくとも24時間かつ5日より長くはない時間であって、腫瘍抗原に対する該抗体がNK細胞におけるCD137の発現を誘導または上方制御するのに十分な時間の後に、NK細胞の抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）を増強するのに有効な用量で投与され、
該患者における腫瘍細胞の集団が減少する、
前記薬学的組成物。
【請求項２】
抗CD137アゴニスト抗体を含む、患者において癌を処置するための薬学的組成物であって、
NK細胞におけるCD137の発現を誘導または上方制御する腫瘍抗原に対する抗体と組み合わせて使用され、
腫瘍抗原に対する該抗体の投与後、少なくとも24時間かつ5日より長くはない時間であって、腫瘍抗原に対する該抗体がNK細胞においてCD137の発現を誘導または上方制御するのに十分な時間の後に、NK細胞のADCCを増強するのに有効な用量で投与され、
該患者における腫瘍細胞の集団が減少する、
前記薬学的組成物。
【請求項３】
前記腫瘍細胞の集団の減少において相乗効果を与える、請求項1または2記載の薬学的組成物。
【請求項４】
腫瘍抗原に対する該抗体を投与する前に、および前記アゴニスト抗体を投与する前に、前記患者においてNK細胞におけるCD137の発現が測定され、NK細胞におけるCD137の発現の増加後に該アゴニスト抗体が投与される、請求項1〜3のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項５】
抗CD137アゴニスト抗体を含む、NK細胞におけるCD137の発現を誘導または上方制御する腫瘍抗原に対する抗体の抗腫瘍効果を増強するための薬学的組成物であって、
腫瘍抗原に対する該抗体と組み合わせて使用され、
腫瘍抗原に対する該抗体の投与後、少なくとも24時間かつ5日より長くはない時間であって、腫瘍抗原に対する該抗体がNK細胞においてCD137の発現を誘導または上方制御するのに十分な時間の後に、NK細胞のADCCを増強するのに有効な用量で投与される、
前記薬学的組成物。
【請求項６】
前記アゴニスト抗体がモノクローナル抗体である、請求項1〜5のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項７】
腫瘍抗原に対する該抗体が、CD20、Her2、および上皮成長因子受容体（EGFR）のうちの少なくとも一つに特異的である、請求項1〜6のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記癌または腫瘍がリンパ腫または固形腫瘍である、請求項1〜7のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記リンパ腫がB細胞悪性腫瘍である、請求項8記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記B細胞悪性腫瘍が辺縁帯リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、骨髄性白血病、または化学療法抵抗性の毛様細胞性白血病である、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記固形腫瘍が乳癌、大腸癌、頭頸部癌、肺癌、尿生殖器癌、直腸癌、胃癌、または食道癌である、請求項8記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
腫瘍抗原に対する前記抗体がCD20、Her-2、または上皮成長因子受容体（EGFR）に特異的である、請求項1〜11のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
腫瘍抗原に対する前記抗体がリツキシマブ、トラスツズマブ、またはセツキシマブである、請求項1〜12のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
NK細胞におけるCD137の発現を誘導もしくは上方制御する腫瘍抗原に対する抗体の抗腫瘍効果を増強するための、または癌を処置するためのキットであって、
NK細胞におけるCD137の発現を誘導もしくは上方制御する腫瘍抗原に対する該抗体、および抗CD137アゴニスト抗体を含み、
それぞれが凍結乾燥製剤または水溶液の形態で製品に含まれ、
該アゴニスト抗体が、NK細胞においてCD137の発現を誘導または上方制御する腫瘍抗原に対する該抗体の後、少なくとも24時間かつ5日より長くはない期間での投与用である、
前記キット。
【請求項１５】
NK細胞におけるCD137の発現を測定するのに適したユニットを含む、請求項14記載のキット。
【請求項１６】
緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、注射器、および使用説明書を伴う添付文書をさらに含む、請求項14または15記載のキット。
【請求項１７】
癌を処置するためのキットの製造のための、NK細胞におけるCD137の発現を誘導もしくは上方制御する腫瘍抗原に対する抗体、および抗CD137アゴニスト抗体の使用であって、
抗体それぞれが凍結乾燥製剤または水溶液の形態で製品に含まれ、さらに該アゴニスト抗体がNK細胞においてCD137の発現を誘導または上方制御する腫瘍抗原に対する該抗体の後、少なくとも24時間かつ5日より長くはない期間での投与用である、
前記使用。
【請求項１８】
二つの活性成分それぞれが、適合した薬学的担体、癌の処置について標識された適切な容器、または二つの活性成分を含有する一つもしくは複数の単位剤形を含有するパックもしくはディスペンサー装置において製剤化される、請求項17記載の使用。
【請求項１９】
NK細胞におけるCD137の発現を測定するのに適したユニットを含む、請求項17または18記載の使用。
【請求項２０】
緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、注射器、および使用説明書を伴う添付文書をさらに含む、請求項19記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
モノクローナル抗体技術は、最近の四半世紀において最も注目に値する科学的進歩の一つである。この研究の急速なトランスレーションにより、癌を有する何千もの患者の生存が延長されてきた。最初に認可されたモノクローナル抗体であり、CD20に対するマウス-ヒトキメラIgG1抗体であるリツキシマブは、B細胞リンパ腫を有する患者のための標準的治療になってきている。HER2に対するモノクローナル抗体（トラスツズマブ）およびEGF受容体に対するモノクローナル抗体（セツキシマブ）は同様に、それぞれ乳癌、ならびに結腸直腸癌および頭頸部癌の両方を有する選ばれた患者の自然な生長を変化させてきた。
【０００２】
モノクローナル抗体の有望な活性にもかかわらず、難治性癌または進行癌のいずれかを有する患者の間の応答率は、典型的に25％未満で最適以下である。モノクローナル抗体の活性を増強する努力は、細胞傷害性化学療法との種々の併用に焦点を合わせてきた。これは、主として、モノクローナル抗体が機能する免疫機構を無視し、かつ該免疫機構に部分的に拮抗する可能性がある。
【０００３】
適応免疫細胞および自然免疫細胞の両方が、腫瘍細胞の監視および除去に関与する。ナチュラルキラー細胞（NK細胞）は自然免疫細胞の一つであり、自然免疫系の主要な成分を構成する。NK細胞は、腫瘍およびウイルスに感染した細胞の拒絶において主要な役割を果たす。細胞は、標的細胞をアポトーシスにより死なせる、パーフォリンおよびグランザイムと呼ばれるタンパク質の小さな細胞質顆粒を放出することにより、殺傷する。
【０００４】
ナチュラルキラー細胞活性は、厳重に制御され、かつ活性化シグナルを必要とする。例えば、抗体によるFc受容体の活性化により、NK細胞は、抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）を通して細胞を溶解することが可能になる。活性化時に、NK細胞は、グランザイムおよびパーフォリンを含有する顆粒を放出する。パーフォリンは標的細胞の細胞膜中に孔を形成し、それを通してグランザイムおよび付随する分子が中に入り、アポトーシスを誘導することができる。
【０００５】
ADCCは、腫瘍に対するモノクローナル抗体療法が効く主な機構である。しかしながら、従来の細胞傷害性化学療法は骨髄抑制を誘導し、NK細胞の集団を減少させ、それによりADCCの有効性を低下させる。対照的に、NK細胞機能を強化する療法は、非癌細胞に対する毒性を増加することなく、モノクローナル抗体の活性を改善する能力を提供し得る。より高い年齢、進行した疾患、または以前の療法のいずれかにより、増加する人口の癌患者が従来の細胞傷害性化学療法の候補者とならないため、臨床的にこれは重要である。本発明は、この問題点に取り組む。
【発明の概要】
【０００６】
腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体の抗腫瘍効果を増強するための方法が提供される。本発明の方法において、一つまたは複数の腫瘍抗原に対する抗体、およびNK細胞上の一つまたはいくつかの誘導性共刺激分子に対するアゴニスト抗体の連続投与により、ADCC機能が特異的に強化され、ひいては標的細胞の殺傷を増強する。
【０００７】
腫瘍を有すると診断された個体は、第一に腫瘍に対する抗体を投与される。ある時間の後、ADCCのために重要な自然免疫エフェクター細胞であるNK細胞は、CD137、OX40、GITR、CD30、またはICOSなどの誘導性共刺激分子の発現を上方制御する。続いて、NK細胞上の誘導された共刺激分子を標的とする第二の抗体（抗CD137、抗OX40、抗GITR、抗CD30、または抗ICOSを含むがそれらに限定されない）が投与される。いくつかの態様において、第二の作用物質を投与する最適な時期を判定するために、腫瘍に対する抗体の投与後に、前述の共刺激分子の発現が評価される。あるいは、タイミング時期は経験的に判定され、かつ一般に適用される。作用物質の併用およびそれらの連続投与は、単一の作用物質のみの投与では観察されないレベルの腫瘍特異的な治療的相乗作用を与えることが示される。本方法は、腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体の抗腫瘍機能を特異的に増強する。第二の抗体が、腫瘍に対する抗体によりNK細胞上に誘導的に発現されている共刺激分子を標的とするため、本方法は、腫瘍細胞のADCC媒介性の殺傷に関与するNK細胞の特異的刺激を可能にし、一方で他のNK細胞は使わず、それにより潜在性の非特異的副作用を制限する。
【０００８】
本発明のいくつかの態様において、誘導性共刺激分子はCD137である。そのような方法において、腫瘍を有すると診断された個体は、第一に腫瘍選択的抗体を投与される。免疫系細胞におけるCD137の発現を上方制御するのに十分な時間の後、CD137のアゴニストである第二の作用物質が投与される。いくつかの態様において、血液細胞におけるCD137発現のレベルが各投与段階の前に測定され、発現における増加が、第二の作用物質が投与されてもよいことを示す。
[本発明1001]
癌細胞抗原に選択的な第一の抗体を個体に投与する段階、および
NK細胞における誘導性共刺激分子の発現を誘導または上方制御するのに十分な時間の後に、NK細胞の抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）を増強するのに有効な用量で該誘導性共刺激分子のアゴニストを該個体に投与する段階
を含む、癌を処置する方法であって、
患者における腫瘍細胞の集団が減少する方法。
[本発明1002]
前記誘導性共刺激分子が、CD137、OX40、GITR、CD30、およびICOSのうちの一つまたは複数である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記アゴニストがモノクローナル抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記第一の抗体が、CD20、CD19、CD22、CD52、Her2、および上皮成長因子受容体（ERFR）のうちの少なくとも一つに特異的である、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記腫瘍細胞の集団の減少において相乗効果を与える、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記第一の抗体を投与する前に、および前記アゴニストを投与する前に、前記患者においてNK細胞における前記誘導性共刺激分子の発現を測定する段階をさらに含み、NK細胞における該誘導性共刺激分子の発現の増加後に該アゴニストを投与する、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記癌がリンパ腫である、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記癌が固形腫瘍である、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記固形腫瘍が乳癌である、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記固形腫瘍が大腸癌である、本発明1008の方法。
[本発明1011]
前記固形腫瘍が頭頸部癌である、本発明1008の方法。
[本発明1012]
癌細胞抗原に選択的な前記抗体がCD20に特異的である、本発明1001の方法。
[本発明1013]
癌細胞抗原に選択的な前記抗体がher-2に特異的である、本発明1001の方法。
[本発明1014]
癌細胞抗原に選択的な前記抗体が上皮成長因子受容体（ERFR）に特異的である、本発明1001の方法。
[本発明1015]
癌細胞抗原に選択的な前記抗体がCD52に特異的である、本発明1001の方法。
[本発明1016]
癌細胞抗原に選択的な前記抗体がCD19に特異的である、本発明1001の方法。
[本発明1017]
癌細胞抗原に選択的な前記抗体がCD22に特異的である、本発明1001の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
（図１）リツキシマブは、CD20陽性腫瘍B細胞とのインキュベーション後に、ヒトNK細胞におけるCD137上方制御を誘導する。3人の健常ドナー由来の末梢血を、リンパ腫細胞株およびトラスツズマブまたはリツキシマブとの24時間培養後に、CD3-CD56+NK細胞におけるCD137発現について解析した。（A）は、CD20-リンパ腫細胞株（OCI-Ly19）またはCD20陽性リンパ腫細胞株（Ramos、DHL-4、Raji）細胞株と培養した、3人の健常ドナー由来の、CD3-CD56+NK細胞中のCD137+細胞のパーセンテージを示す。（B）は、リンパ腫細胞株（OCI-Ly19、Ramos、DHL-4、およびRaji）におけるCD20表面発現を示す。ヒストグラムは、アイソタイプに対するリンパ腫細胞株のMFIにおけるlog10倍の増加に従って、色づけした。（C）は、CD20陽性リンパ腫細胞株Ramosおよびリツキシマブとの24時間培養後の、代表的な健常ドナー由来の、NK細胞サブセットであるCD3-CD56brightおよびCD3-CD56dimにおけるCD137発現を示す。
（図２）抗CD137アゴニストmAbは、腫瘍細胞に対するリツキシマブ媒介性のNK細胞の細胞傷害を増加させる。健常ドナーの末梢血より単離および精製したNK細胞を、以下の5種類の条件を用いた24時間培養後に、CD107aの動員による脱顆粒について解析した：培地のみ；CD20陽性リンパ腫細胞株（Raji、Ramos、もしくはDHL-4）；腫瘍およびリツキシマブ；腫瘍および抗CD137抗体；または、腫瘍、リツキシマブ、および抗CD137アゴニスト抗体（A、Raji、*p＝.01；B、Ramos、*p＝.003；C、DHL-4、*p＝.002）。Raji、Ramos、およびDHL-4腫瘍細胞に対するNK細胞の細胞傷害を、クロム放出アッセイ法において解析した（D〜F）。クロム標識したRaji、Ramos、およびDHL-4細胞と4時間インキュベーションする前に、（材料および方法において説明する通り）あらかじめ活性化したNK細胞を精製した。（D）〜(F）は、培地のみ（◆）、抗CD137（▲）、リツキシマブ（●）、またはリツキシマブおよび抗CD137（■）抗体と培養した、様々なエフェクター（活性化したNK細胞）：標的（Raji）細胞比における、クロム放出による標的細胞の溶解パーセントを示す（D、Raji、*p＝.01；E、Ramos、*p＝.01；F、DHL-4、*p＝.009）。
（図３）抗CD137アゴニストmAbは、インビボでマウス抗CD20 mAbの抗リンパ腫活性を増強する。C57BL/6マウスの腹部の皮下に、5×106個のBL3750リンパ腫腫瘍細胞を接種した。(A)〜(B）腫瘍接種後、マウスは次に、3日目にラットIgG対照（●）、3日目に抗CD20抗体（■）、4日目に抗CD137抗体（◆）、または3日目に抗CD20抗体および4日目に抗CD137抗体（▲）のいずれかを受けた。マウス（1群あたり10匹）を次に、腫瘍成長（A、*p＜.001）および全生存（B、*p＝.048）についてモニターした。(C)〜(D）は、同一の処置順序であるが、腫瘍接種後8日目まで遅らせた処置を伴う、腫瘍成長および生存を示す。マウスは、8日目にラットIgG対照（●）、8日目に抗CD20抗体（■）、9日目に抗CD137抗体（◆）、または8日目に抗CD20抗体および9日目に抗CD137抗体（▲）のいずれかを受けた。マウス（1群あたり10匹）を次に、腫瘍成長（C、*p＜.001）および全生存（D、*p＜.001）についてモニターした。
（図４）抗CD20 mAbおよび抗CD137 mAbの併用活性は、mAb投与の適切な順序を必要とする。C57BL/6マウスの腹部の皮下に、5×106個のBL3750リンパ腫腫瘍細胞を接種した。腫瘍接種後、マウスは次に、3日目にラットIgG対照（●）、3日目に抗CD20 mAbおよび4日目に抗CD137 mAb（▲）、または3日目に抗CD20 mAbおよび3日目に抗CD137 mAb（■）のいずれかを受けた。マウス（1群あたり10匹）を次に、腫瘍成長（A、*p＜.001）および全生存（B、*p＝.001）についてモニターした。
（図５）抗CD137アゴニストmAbによる抗CD20 mAbの抗リンパ腫活性の増強は、NK細胞およびマクロファージに依存する。（A）3日目にIgG対照抗体または抗CD20抗体のいずれかで処置した、腫瘍接種後4日のリンパ腫を有するC57BL/6マウス由来の末梢血細胞サブセットを、CD3-NK1.1+NK細胞（NK）、F4/80+マクロファージ（Mφ）、CD3+CD8+T細胞（CD8）、およびCD3+CD4+T細胞（CD4）におけるCD137発現について解析した（1群あたりn＝3のマウス、*p＝.001）。（B）3日目にIgG対照抗体または抗CD20抗体のいずれかで処置した、腫瘍接種後7日のリンパ腫を有するC57BL/6マウス由来の腫瘍浸潤リンパ球を、CD3-NK1.1+NK細胞（NK）、F4/80+マクロファージ（Mφ）、CD3+CD8+T細胞（CD8）、およびCD3+CD4+T細胞（CD4）におけるCD137発現について解析した（1群あたりn＝3のマウス、*p＝.012、NS＝有意でない）。（C）〜(D）C57BL/6マウスに、5×106個のBL3750リンパ腫腫瘍細胞を接種した。腫瘍接種後、マウスは、3日目にラットIgG対照（●）、3日目の抗CD20抗体および4日目の抗CD137抗体と共に-1、0、5、10、15、20、および25日目に抗アシアロGM1（■）、3日目の抗CD20抗体および4日目の抗CD137抗体と共に-2、0、4、8、12、16、20、および24日目にリポソーム（L.）クロドロナート（▼）、3日目の抗CD20抗体および4日目の抗CD137抗体と共に-1、0、5、10、15、20、および25日目に抗CD8 mAb（◆）、または3日目に抗CD20抗体および4日目に抗CD137抗体（▲）のいずれかを受けた。マウス（1群あたり10匹）を次に、腫瘍成長（C、*p＝.002）および全生存（D、*p＜.001）についてモニターした。
（図６）抗CD137アゴニストmAbは、散在性ヒトリンパ腫異種移植モデルにおいて、インビボでリツキシマブの抗リンパ腫活性を増強する。後眼窩洞（retro-orbital sinus）を通してSCIDマウスの静脈内に、3×106個のルシフェラーゼ標識したRajiリンパ腫腫瘍細胞を接種した。腫瘍接種後、マウスは次に、3日目にラットIgG対照（●）、3日目にリツキシマブ（■）、4日目に抗CD137抗体（◆）、または3日目にリツキシマブおよび4日目に抗CD137抗体（▲）のいずれかを受けた。処置を毎週、全部で4週間続けた。処置後10、20、および30日目の代表的なマウスのルシフェラーゼ画像を示す（A）。マウス（1群あたり5匹）を次に、定量化生物発光（B、*p＝.001）および全生存（C、*p＝.013）についてモニターした。
（図７）リツキシマブでコーティングされた自己由来のリンパ腫細胞は、B細胞悪性腫瘍を有するヒト患者由来のNK細胞におけるCD137上方制御を誘導する。B細胞悪性腫瘍および循環腫瘍細胞（CTC）を有する患者由来の末梢血を、培地のみ、トラスツズマブ、またはリツキシマブとの24時間培養後に、CD3-CD56+NK細胞におけるCD137発現について解析した（AおよびB）。（A）は、70％のCTCを伴う辺縁帯リンパ腫（MZL）を有する患者についての、CD3-CD56+NK細胞におけるCD16およびCD137発現を示す。（B）は、濾胞性リンパ腫（FL）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、MZL、マントル細胞リンパ腫（MCL）、びまん性大B細胞リンパ腫（DLBCL）、およびCD20陽性急性リンパ芽球性白血病（ALL）を有する25人の患者のコホートにおいて、CD3-CD56+NK細胞中のCD137+細胞のパーセンテージを示す。（C）は、
0005950824.tif 000002
を有する患者試料由来の、末梢血CTCのパーセンテージと、リツキシマブを伴う24時間培養後のCD3-CD56+NK細胞におけるCD137表面発現との間の相関、R2＝0.87、p＜.001を示す。
（図８）あらかじめ活性化した後のNK細胞におけるCD137誘導および一時性発現。健常ドナー由来の精製したNK細胞を、培地、リツキシマブ、トラスツズマブ、リンパ腫細胞株（Raji、Ramos、DHL-4、またはOCI-Ly19）およびリツキシマブとの24時間培養後に、CD137発現について解析した（A）。健常ドナー由来の精製したNK細胞を、Raji細胞株およびリツキシマブとの0、4、16、24、48、および72時間培養後に、CD137発現について解析した（B）。図8Cに示す実験のために、代表的な健常ドナー由来の末梢血単核細胞を、Raji、Ramos、またはDHL-4およびリツキシマブと24時間インキュベーションした。あらかじめ活性化したNK細胞を次に、細胞傷害アッセイ法を行う前にCD137発現について解析した（C）。
（図９）抗CD137アゴニストmAbは、あらかじめ活性化したNK細胞のサイトカイン放出およびリツキシマブ媒介性の細胞傷害を増加させる。NK細胞のインターフェロン-γ分泌を評価するために、精製したNK細胞を、健常PBMCより単離し、リツキシマブ（10μg/mL）および1：1の比の放射線照射（5,000ラド）したリンパ腫腫瘍細胞（Raji）と共に24時間培養した。24時間後、NK細胞を単離し、純度について評価した（CD3-CD56+フローサイトメトリーにより画定した場合、＞90％の純度）（A〜B）。あらかじめ活性化し、精製したNK細胞を次に、培地のみにおいて、または、抗CD137 mAb（BMS- 663513、10μg/mL）のみ、リツキシマブ（10μg/mL）のみ、もしくはリツキシマブに加えて抗CD137 mAb（両方とも10μg/mL）と共に4時間培養し、上清を収集してELISAによりインターフェロン-γについて解析した（A、*p＝.027）。Raji腫瘍細胞に対するNK細胞の細胞傷害を、事前にNK細胞のあらかじめの活性化を伴うかおよび伴わずに、クロム放出アッセイ法において解析した（B）。あらかじめ活性化した、およびあらかじめ活性化していない、精製したNK細胞を、クロム標識したRajiと4時間インキュベーションした。培地のみ（◆）、抗CD137（▲）、リツキシマブ（●）、またはリツキシマブおよび抗CD137（■）抗体と培養した、様々なエフェクター（実線で描くあらかじめ活性化したNK細胞、および破線で描くあらかじめ活性化していないNK細胞）：標的（Raji）細胞比における、クロム放出による標的細胞の溶解パーセント（*p＝.024）。
（図１０）抗CD137アゴニストmAbは、リツキシマブ媒介性のNK細胞の脱顆粒を増加させる。健常ドナーの末梢血より単離および精製したNK細胞を、培地のみ、CD20陽性リンパ腫細胞株（Raji、Ramos、またはDHL-4）、腫瘍およびリツキシマブ、腫瘍および抗CD137抗体、または、腫瘍、リツキシマブ、および抗CD137アゴニスト抗体との24時間培養後に、CD107aの動員による脱顆粒について解析した。Ramosとの培養後のNK細胞におけるCD107a発現の、代表的なフローサイトメトリープロット。
（図１１）トラスツズマブは、HER2陽性腫瘍細胞とのインキュベーション後に、ヒトNK細胞におけるCD137上方制御を誘導する。3人の健常ドナー由来の末梢血を、乳癌細胞株およびIgG対照、トラスツズマブ、またはリツキシマブとの24時間培養後に、CD3-CD56+NK細胞におけるCD137発現について解析した。（A）は、HER2+乳癌細胞株（BT474M1）との24時間培養後の、代表的な健常ドナー由来のCD3-CD56+NK細胞におけるCD69+およびCD137+の発現を示す。（B）は、乳癌細胞株（MCF7、BT474M1、SKBR3、およびHER18）におけるHER2表面発現を示す。ヒストグラムは、アイソタイプに対する乳癌細胞株のMFIにおけるlog10倍の増加に従って、色づけした。（C）は、可変的にHER2を発現する乳癌細胞株（MCF7、BT474M1、SKBR3、HER18）との24時間培養後のNK細胞CD3-CD56+における、培養した3人の健常ドナー由来のCD137発現を示す。
（図１２）抗CD137アゴニストmAbは、細胞生存率によりアッセイした場合、腫瘍細胞に対するトラスツズマブ媒介性のNK細胞の細胞傷害を増加させる。MCF7、BT474M1、およびHER18と18時間インキュベーションする前に、あらかじめ活性化したNK細胞を精製した。（A）〜(C）は、NK細胞、腫瘍、培地のみ、抗CD137、トラスツズマブ、またはトラスツズマブおよび抗CD137抗体との培養後の、アネキシンおよび7AAD生存率染色によるアポトーシス標的細胞のパーセントを示す（A、MCF7腫瘍株、B、BT474M1腫瘍株、*p＝.03；C、HER18、**p＜.01）。
（図１３）抗CD137アゴニストmAbは、クロム放出によりアッセイした場合、腫瘍細胞に対するトラスツズマブ媒介性のNK細胞の細胞傷害を増加させる。BT474M1腫瘍細胞に対するNK細胞の細胞傷害を、クロム放出アッセイ法において解析した。クロム標識したBT474M1細胞と4時間インキュベーションする前に、あらかじめ活性化したNK細胞を精製した。培地のみ（●）、抗CD137（▼）、リツキシマブ（▲）、またはリツキシマブおよび抗CD137（●）抗体と培養した、様々なエフェクター（活性化したNK細胞）：標的（BT474M1）細胞比における、クロム放出による標的細胞の溶解パーセントを示す（p＝.006）。
（図１４）抗CD137アゴニストmAbは、インビボでトラスツズマブの抗乳癌活性を増強する。nu/nuヌードマウスの腹部の皮下に5×106個のBT474M1乳房腫瘍細胞を、0.72 mg/60日放出β-エストラジオールペレットの皮下注射の1日後に接種した。（A）〜(B）腫瘍接種後、マウスは次に、3日目にラットIgG対照（●）、3日目にトラスツズマブ抗体（■）、4日目に抗CD137抗体（◆）、または3日目にトラスツズマブおよび4日目に抗CD137抗体（▲）のいずれかを受け、各処置を毎週、全部で3週間繰り返した。マウス（1群あたり10匹）を次に、腫瘍成長（A、*p＜.001）および全生存（B、**p＝.003）についてモニターした。
（図１５）抗CD137アゴニストmAbは、HER2特異性を保持する一方で、インビボでトラスツズマブの抗乳癌活性を増強する。nu/nuヌードマウスの左側腹部の皮下に5×106個のMCF7乳房腫瘍細胞を、および右側腹部の皮下に5×106個のHER18乳房腫瘍細胞を、0.72mg/60日放出β-エストラジオールペレットの皮下注射の1日後に接種した。(A)〜(C）腫瘍接種後、マウスは次に、3日目にトラスツズマブ、または3日目にトラスツズマブおよび4日目に抗CD137抗体のいずれかを受け、各処置を毎週、全部で3週間繰り返した。(A）腫瘍モデル。(B）代表的なマウス（1群あたり10匹のうち3匹）を次に、腫瘍成長についてモニターした。(C）トラスツズマブで処置したマウスの左側腹部上のMCF7（○）および右側腹部上のHER18（□□）、ならびにトラスツズマブおよび抗CD137 mAbで処置したマウスの左側腹部上のMCF7（●）および右側腹部上のHER18（■）を含む、処置群および腫瘍タイプによる腫瘍成長（*p＜.001）。
（図１６）抗CD137アゴニストmAbは、HER2+原発乳房腫瘍に対してインビボでトラスツズマブの抗乳癌活性を増強する。SCIDマウスに、200 cGyの全身放射線照射（TBI）の24時間後に、乳房内注射により1×106個のHER2+原発乳房腫瘍細胞を接種した。40日目に、40日目のIgG対照（●）、40日目のトラスツズマブ（■）、41日目の抗CD137 mAb（◆）、または40日目のトラスツズマブおよび41日目の抗CD137 mAb（▲）での処置を含む4群（1群あたり5匹のマウス）のうちの一つに、マウスを無作為化した。処置を各群において毎週、全部で3処置繰り返した。マウスを、腫瘍成長についてモニターした（*p＝.016）。
（図１７）セツキシマブは、EGFR陽性腫瘍細胞とのインキュベーション後に、ヒトNK細胞におけるCD137上方制御を誘導する。3人の健常ドナー由来の末梢血を、頭頸部癌細胞株および培地のみ、リツキシマブ、またはセツキシマブとの24時間培養後に、CD3-CD56+NK細胞におけるCD137発現について解析した。（A）は、頭頸部癌細胞株（103、SCC4、PC1、SCC6）におけるEGFR表面発現を示す。ヒストグラムは、アイソタイプに対する乳癌細胞株のMFIにおけるlog10倍の増加に従って、色づけした。（B）は、可変的にEGFRを発現する頭頸部癌細胞株（SCC6、PC1、およびSCC4）との24時間培養後のNK細胞CD3-CD56+における、培養した3人の健常ドナー由来のCD137発現を示す。
（図１８）抗CD137アゴニストmAbは、細胞生存率によりアッセイした場合、腫瘍細胞に対するセツキシマブ媒介性のNK細胞の細胞傷害を増加させる。SCC6、PC1、およびSCC4と24時間インキュベーションする前に、あらかじめ活性化したNK細胞を精製した。（A）〜（C）は、培地、セツキシマブ、抗CD137、セツキシマブおよび抗CD137抗体を伴う、腫瘍のみまたは腫瘍およびNK細胞との培養後の、アネキシンおよび7AAD生存率染色によるアポトーシス標的細胞のパーセントを示す（A、SCC6、*p＝.002；B、PC1、**p＝.011；C、SCC4、***p＝.001）。
（図１９）抗CD137アゴニストmAbは、クロム放出によりアッセイした場合、腫瘍細胞に対するセツキシマブ媒介性のNK細胞の細胞傷害を増加させる。SCC6腫瘍細胞に対するNK細胞の細胞傷害を、クロム放出アッセイ法において解析した。クロム標識したSCC6細胞と5時間インキュベーションする前に、新鮮なNK細胞およびあらかじめ活性化したNK細胞を精製した。培地のみ（●）、抗CD137（▼）、セツキシマブ（▲）、もしくはセツキシマブおよび抗CD137（■）抗体と培養した、様々なエフェクター（新鮮なNK細胞）：標的（SCC6）細胞比における（**p＝.003）、またはSCC6標的およびセツキシマブおよび抗CD137（◆）抗体を伴う、エフェクターとしてあらかじめ活性化したNK細胞の（*p＝.002）、クロム放出による標的細胞の溶解パーセントを示す。
（図２０）抗CD137アゴニストmAbは、インビボでセツキシマブの抗頭頸部癌活性を増強する。nu/nuヌードマウスの腹部の皮下に、3×106個のSCC6頭頸部腫瘍細胞を接種した。腫瘍接種後、マウスは次に、21日目にラットIgG対照（●）、21日目にセツキシマブ（■）、22日目に抗CD137抗体（◆）、または21日目にセツキシマブおよび22日目に抗CD137抗体（▲）のいずれかを受け、各処置を毎週、全部で3処置繰り返した。マウス（1群あたり10匹）を次に、腫瘍成長についてモニターした（A、*p＜.001）。
（図２１）循環NK細胞は、頭頸部癌を有する患者においてセツキシマブ注入後にCD137を上方制御する。頭頸部癌を有する患者由来の新鮮な末梢血を、CD3-CD56+NK細胞におけるCD137発現について解析した。（A）は、第0相バイオマーカー試験図式（NCT01114256）を示す。（B）は、セツキシマブ注入の前および後の、新鮮な末梢血CD3-CD56+NK細胞中のCD137+細胞のパーセンテージを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
態様の詳細な説明
腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体の抗腫瘍効果を増強するための方法が提供される。本発明の方法において、抗体の併用の連続投与により、ADCC機能が強化され、かつ標的細胞の殺傷が増強される。作用物質の併用および連続投与は、単一の作用物質の投与に対して相乗効果を与えることが示される。腫瘍に対する抗体の投与は、ADCCのために重要な自然免疫エフェクター細胞であるNK細胞における、CD137、OX40、GITR、CD30、またはICOSなどの誘導性共刺激分子の発現を上方制御する。続いて、誘導された共刺激分子を標的とする第二のアゴニスト抗体（抗CD137、抗OX40、抗GITR、抗CD30、または抗ICOSを含むがそれらに限定されない）が投与される。いくつかの態様において、第二の作用物質を投与する最適な時期を判定するために、腫瘍に対する抗体の投与後に、前述の共刺激分子の発現が評価される。あるいは、タイミング時期は経験的に判定され、かつ一般に適用される。第二の抗体が、腫瘍に対する抗体によりNK細胞上に誘導的に発現されている共刺激分子を標的とするため、本方法は、腫瘍細胞のADCC媒介性の殺傷に関与するNK細胞の特異的刺激を可能にし、一方で他のNK細胞は使わず、それにより潜在性の非特異的副作用を制限する。
【００１１】
本発明をさらに説明する前に、本発明が、説明される特定の態様に限定されず、それ自体、当然変動してもよいことが理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用される専門用語は、特定の態様を説明する目的のためのみであり、かつ限定するようには意図されないこともまた、理解されるべきである。
【００１２】
値の範囲が与えられる場合、文脈が明らかに別段に指図しない限り、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の10分の一までの各介在値、およびその規定された範囲における任意の他の規定値または介在値が、本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は独立して、より小さい範囲に含まれてもよく、かつまた、規定された範囲における任意の具体的に除外された限界次第で、本発明内に包含される。規定された範囲が一つまたは両方の限界を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
【００１３】
本明細書において列挙される方法は、論理的に可能である列挙される事象の任意の順序、および事象の列挙される順序において実施されてもよい。
【００１４】
別段の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が帰属する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書において説明されるものと同様または同等の任意の方法および材料がまた、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料を次に説明する。
【００１５】
本明細書において言及されるすべての刊行物は、刊行物が関連して引用される方法および／または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み入れられる。
【００１６】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形である「一つの(a)」、「一つの(an)」、および「その(the)」は、文脈が明らかに別段に指図しない限り、複数の指示物を含むことが注目されなければならない。特許請求の範囲はいかなる任意の要素も排除するように起草され得ることが、さらに注目される。したがって、本言明は、特許請求の範囲の要素の詳説に関連した、「単に」、「のみ」などのような排他的用語の使用、または「否定的」限定の使用について先行語の基準となるように意図される。
【００１７】
本明細書において議論される刊行物は、本出願の提出日より前の開示についてのみ提供されている。本明細書における何も、先行発明の長所により本発明がそのような刊行物に先行する権利を与えられないことの承認として解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、独立して確認される必要があり得る実際の刊行日とは異なる可能性がある。
【００１８】
定義
誘導性共刺激分子： 本明細書において使用される場合、誘導性共刺激分子とは、非限定的にナチュラルキラー（NK）細胞を含む免疫細胞上に発現されるポリペプチドであり、その発現はNK細胞の活性化の間に誘導されるかまたは有意に上方制御される。共刺激分子の活性化は、エフェクター細胞機能を増強し、例えば、活性化したNK細胞により媒介されるADCCを増加させた。そのような誘導性共刺激分子は当業者に公知であり、かつ、非限定的に、CD137、OX40、GITR、CD30、ICOSなどを含む。共刺激分子に結合しかつ共刺激分子を活性化する抗体を含む、そのような分子のアゴニストが、本発明の方法の関心対象である。多くのそのような共刺激分子は、腫瘍壊死因子受容体ファミリー（TNFR）のメンバーである。TNFR関連分子は、いかなる公知の酵素活性も有さず、かつ下流のシグナル伝達経路の活性化については細胞質タンパク質の動員に依存する。
【００１９】
CD137： Ly63、ILA、または4-1 BBともまた呼ばれ得るCD137は、腫瘍壊死因子（TNF）受容体ファミリーのメンバーである。この受容体ファミリーのメンバーおよびその構造的に関連したリガンドは、多種多様の生理学的プロセスの重要な制御因子であり、かつ免疫応答の制御において重要な役割を果たす。CD137は、活性化したNK細胞、TおよびBリンパ球、ならびに単球／マクロファージにより発現される。遺伝子は、細胞外ドメイン中の3個のシステインに富むモチーフ（この受容体ファミリーの特徴）、膜貫通領域、および潜在的なリン酸化部位を含有する短いN末端細胞質部分を有する、255アミノ酸のタンパク質をコードする。初代細胞における発現は、厳密に活性化依存的である。受容体のリガンドは、TNFSF9である。ヒトCD137は、そのリガンドのみに結合することが報告されている。アゴニストは、天然のリガンド（TNFSF9）、アプタマー（McNamara et al. (2008) J. Clin. Invest. 118: 376-386を参照されたい）、および抗体を含む。
【００２０】
CD134： OX40（CD134）およびその結合パートナーであるOX40L（CD252）は、腫瘍壊死因子受容体／腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーであり、かつ活性化したT細胞上、ならびに多数の他のリンパ系細胞上および非リンパ系細胞上に発現される。OX40およびOX40Lは、T細胞、抗原提示細胞、ナチュラルキラー細胞、およびナチュラルキラーT細胞からのサイトカイン産生を制御し、かつサイトカイン受容体シグナル伝達を調節する。
【００２１】
GITR： グルココルチコイド誘導性TNFR関連（Glucocorticoid-Induced TNFR-Related（GITR））タンパク質は、腫瘍壊死因子受容体／腫瘍壊死因子スーパーファミリーに属し、かつ獲得免疫および自然免疫の両方を刺激する。それは、T細胞およびナチュラルキラー（NK）細胞を含むいくつかの細胞および組織において発現され、かつ、主に抗原提示細胞上および内皮細胞上に発現されるそのリガンドであるGITRLにより活性化される。GITR／GITRLシステムは、自己免疫／炎症性応答の発生に関与し、かつ、NK細胞の共活性化を含む機構により感染および腫瘍への応答を増強する。
【００２２】
CD30： 膜貫通受容体CD30（TNFRSF8）およびそのリガンドCD30L（CD153、TNFSF8）は、腫瘍壊死因子（TNF）スーパーファミリーのメンバーであり、かつ活性化した免疫細胞の亜集団において制限された発現を示す。CD30は、TNF受容体スーパーファミリーのI型膜貫通糖タンパク質である。CD30のリガンドは、CD30L（CD153）である。CD30のCD30Lへの結合は、細胞増殖、活性化、分化、およびアポトーシス細胞死を含む多面効果を媒介する。
【００２３】
誘導性共刺激因子（Inducible costimulator）（ICOS）： ICOSは、CD28ファミリーのメンバーである。ICOS発現は、容易に検出可能な休止状態（resting）であり得るが、活性化時に上方制御され得る。ICOSおよびICOS-Lは、一対一のペアであると考えられる。ICOS共刺激は、エフェクター機能を増強する。
【００２４】
「誘導性共刺激分子アゴニスト」は、上述の天然のリガンド、アプタマー、受容体を活性化する誘導性共刺激分子に特異的な抗体、および誘導体、変異体、および、誘導性共刺激分子に選択的に結合する抗体の生物学的活性断片を含む。「変異体」ポリペプチドは、天然配列ポリペプチドと100％未満の配列同一性を有する、下記に定義される生物学的活性ポリペプチドを意味する。そのような変異体は、一つまたは複数のアミノ酸残基が天然配列のN末端もしくはC末端、または内部に付加されたポリペプチド；約1〜40アミノ酸残基が欠失し、かつ任意で一つまたは複数のアミノ酸残基により置換されたポリペプチド；ならびに、結果として生じた産物が天然に存在しないアミノ酸を有するように、アミノ酸残基が共有結合的に改変されている上述のポリペプチドの誘導体を含む。通常、生物学的活性変異体は、天然配列ポリペプチドと少なくとも約90％、好ましくは少なくとも約95％、より好ましくは少なくとも約99％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有すると考えられる。変異体ポリペプチドは、天然にまたは非天然的にグリコシル化され得、すなわち、ポリペプチドは、対応する天然に存在するタンパク質において見出されるグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを有する。
【００２５】
誘導性共刺激分子に特異的なリガンドまたは抗体の断片、特に、生物学的活性断片および／または機能性ドメインに対応する断片が、関心対象である。関心対象の断片は、典型的に、長さが少なくとも約10 aa〜少なくとも約15 aa、通常長さが少なくとも約50 aaであると考えられるが、通常長さは約200 aaを超えず、断片は、由来するポリペプチドと同一であるアミノ酸の連続したストレッチを有すると考えられる。「長さが少なくとも20 aa」の断片は、例えばCD137に特異的な抗体由来、またはTNFSF9由来の20個またはそれ以上の連続したアミノ酸を含むように、例えば意図される。本文脈において、「約」とは、特に列挙された値、またはいくつか（5、4、3、2、または1個）のアミノ酸により大きいかもしくは小さい値を含む。本明細書において説明されるタンパク質変異体は、本発明の範囲内であるポリヌクレオチドによりコードされる。対応する変異体を構築するのに適切なコドンを選択するために、遺伝コードが使用され得る。ポリペプチドを生産するためにポリヌクレオチドが使用されてもよく、および、公知の方法により抗体を生産するために、これらのポリペプチドが使用されてもよい。「融合」ポリペプチドとは、異種のポリペプチドに融合されたかまたは結合されたポリペプチドまたはその部分（例えば、一つまたは複数のドメイン）を含むポリペプチドである。
【００２６】
いくつかの態様において、誘導性共刺激分子アゴニストは抗体である。「抗体」または「抗体部分」という用語は、エピトープに適合しかつエピトープを認識する特異的な形状を有する、任意のポリペプチド鎖を含有する分子構造であり、一つまたは複数の非共有結合相互作用が分子構造とエピトープとの間の複合体を安定化する分子構造を含むように意図される。本発明において使用される抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体は、細胞培養により、または組み換えで再生産され得、かつその抗原性を低下させるように改変することができるため、好ましい。
【００２７】
ポリクローナル抗体は、生産動物に抗原性組成物を注射することによる標準的なプロトコルにより生成させることができる。例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照されたい。タンパク質全体、またはタンパク質のより大きなセクションを使用する場合、生産動物にタンパク質および適したアジュバント（例えば、フロイント、フロイント完全、水中油型乳剤など）を免疫することにより、抗体を生成させてもよい。より小さなペプチドを使用する場合、免疫刺激性結合体を作成するために、ペプチドをより大きな分子と結合させることが有利である。そのような使用のために市販されている、一般的に用いられる結合タンパク質は、ウシ血清アルブミン（BSA）およびキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）を含む。特定のエピトープに対する抗体を生成させるために、完全な配列に由来するペプチドが使用されてもよい。あるいは、タンパク質標的の比較的短いペプチド部分に対する抗体を生成させるためには、ポリペプチドをオボアルブミン、BSA、またはKLHなどの担体タンパク質に連結させると、優れた免疫応答が誘発される可能性がある。あるいは、モノクローナル抗体のために、接種された動物の脾臓由来のものなどの刺激された免疫細胞を単離することにより、ハイブリドーマを形成させてもよい。これらの細胞を次に、細胞培養において無期限に複製することができる、骨髄腫細胞または形質転換細胞などの不死化細胞に融合させ、それにより不死の免疫グロブリン分泌細胞株を生産する。加えて、抗体または抗原結合断片は、遺伝子工学により生産され得る。ヒトに投与された際により少ない免疫応答を生じる、ヒト化、キメラ、または異種ヒト抗体が、本発明における使用のために好ましい。
【００２８】
全体の免疫グロブリン（またはそれらの組み換え対応物）に加えて、エピトープ結合部位を含む免疫グロブリン断片（例えば、Fab'、F(ab')2、または他の断片）が、本発明における抗体部分として有用である。そのような抗体断片は、リシン、ペプシン、パパイン、または他のプロテアーゼの切断により、完全な免疫グロブリンから生成され得る。「断片」、または最少免疫グロブリンは、組み換え免疫グロブリン技術を用いて設計され得る。例えば、本発明における使用のための「Fv」免疫グロブリンは、ペプチドリンカー（例えば、ポリグリシン、またはαヘリックスモチーフもしくはβシートモチーフを形成しない別の配列）を介して軽鎖可変領域を重鎖可変領域に連結することにより生産され得る。
【００２９】
「有効性を増強すること」とは、単一の作用物質で、例えば、腫瘍細胞に特異的なモノクローナル抗体で観察されるアポトーシスのレベルと比較した、腫瘍細胞のADCC媒介性アポトーシスにおける増加を意味する。相乗作用とは、作用物質の併用が単一の作用物質より大きい効果を与え、その効果が併用された作用物質の追加的な効果より大きくなり得ることを意味する。
【００３０】
腫瘍に対する抗体： 多数の抗体が現在、癌の処置のために臨床で使用されており、かつ、他の抗体が臨床開発の様々な段階にある。いくつかの臨床的に有用な抗体が非腫瘍細胞に作用することを、当業者は認識するであろうが、本発明の方法のための関心対象の抗体は、ADCCを通して作用し、かつ典型的に腫瘍細胞に、例えばCD20に選択的である。
【００３１】
B細胞悪性腫瘍の処置のための、多数の抗原および対応するモノクローナル抗体が存在する。一つの普及している標的抗原は、B細胞悪性腫瘍上に見出されるCD20である。リツキシマブは、CD20抗原に対する非結合型キメラモノクローナル抗体である。CD20は、B細胞の活性化、増殖、および分化において重要な機能的役割を有する。CD52抗原は、慢性リンパ球性白血病の処置のために適応されるモノクローナル抗体アレムツズマブにより標的とされる。CD22は、多数の抗体により標的とされ、かつ最近、化学療法抵抗性の毛様細胞性白血病において毒素と併用されて有効性を示している。CD20を標的とする二つの新たなモノクローナル抗体、トシツモマブおよびイブリツモマブが、米国食品医薬品局（FDA）に委ねられている。これらの抗体は、放射性同位元素と結合している。
【００３２】
固形腫瘍において使用されている、本発明の方法において有用なモノクローナル抗体は、非限定的にエドレコロマブおよびトラスツズマブ（ハーセプチン）を含む。エドレコロマブは、結腸および直腸癌に見られる17-1A抗原を標的とし、かつこれらの適応症について欧州で使用が認可されている。その抗腫瘍効果は、ADCC、CDC、および抗イディオタイプネットワークの誘導を通して媒介される。トラスツズマブは、HER-2/neu抗原を標的とする。この抗原は、乳癌の25％〜35％に見られる。トラスツズマブは、以下の種々の様式で働くと考えられる：HER-2受容体発現の下方制御、HER-2タンパク質を過剰発現するヒト腫瘍細胞の増殖の阻害、HER-2タンパク質を過剰発現する腫瘍細胞に対する免疫動員およびADCCを増強すること、および血管新生因子の下方制御。
【００３３】
アレムツズマブ（キャンパス）は、慢性リンパ球性白血病；大腸癌および肺癌の処置において使用され；ゲムツズマブ（マイロターグ）は、急性骨髄性白血病の処置における使用を見出し；イブリツモマブ（ゼバリン）は、非ホジキンリンパ腫の処置における使用を見出し；パニツムマブ（ベクティビックス）は、大腸癌の処置における使用を見出す。
【００３４】
セツキシマブ（アービタックス）はまた、本発明の方法における使用のための関心対象である。抗体は、EGF受容体（EGFR）に結合し、かつ、大腸癌および頭頸部の扁平上皮癌（SCCHN）を含む固形腫瘍の処置において使用されている。
【００３５】
「生物学的試料」という用語は、生物体から得られる様々な試料タイプを包含し、かつ診断またはモニタリングアッセイ法において使用され得る。該用語は、生物学的起源の血液および他の液体試料、生検標本またはそれに由来する組織培養もしくは細胞、およびその子孫などの固形組織試料を包含する。該用語は、試薬での処置、可溶化、またはある特定の成分についての濃縮など、取得後に任意の方法において操作された試料を包含する。該用語は、臨床試料を包含し、また、細胞培養における細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生体液、および組織試料も含む。
【００３６】
「癌」、「新生物」、「腫瘍」、および「癌腫」という用語は、本明細書において互換的に使用され、細胞増殖の制御の有意な欠失により特徴づけられる異常性成長表現型を呈するように、相対的に自律的成長を呈する細胞を指す。一般に、本出願における検出または処置のための関心対象の細胞は、前癌性（例えば、良性）、悪性、前転移性（pre-metastatic）、転移性、および非転移性細胞を含む。癌性細胞の検出は特に関心対象である。「正常細胞」の文脈において使用される「正常」という用語は、形質転換されていない表現型の細胞、または調べられる組織タイプの非形質転換細胞の形態を呈する細胞を指すように意味される。「癌性表現型」とは一般に、癌性細胞に特有である様々な生物学的現象の任意を指し、その現象は癌のタイプによって異なり得る。癌性表現型は一般に、例えば、細胞の成長または増殖における異常（例えば、制御されていない成長または増殖）、細胞周期の制御における異常、細胞移動性における異常、細胞-細胞の相互作用における異常、または転移における異常などにより同定される。関心対象の癌は、非限定的に、白血病、リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、骨髄腫、および骨髄増殖性疾患を含む造血癌；肉腫、黒色腫、腺腫、固形組織の癌腫、口腔、咽喉、咽頭および肺の扁平上皮癌、肝臓癌、子宮頚部、膀胱癌、および腎細胞癌のような尿生殖器癌、頭頸部癌、胃腸管癌、ならびに神経系癌、乳頭腫のような良性病変などを含む。
【００３７】
本明細書において使用される「固形腫瘍」という句は、通常嚢胞または液体領域を含有しない組織の異常な塊を指す。固形腫瘍は、良性または悪性であり得る。様々なタイプの固形腫瘍は、それらを形成する細胞のタイプにちなんで命名されている。固形腫瘍の例は、肉腫、癌腫、リンパ腫などである。
【００３８】
特異的な癌エピトープ、またはエピトープの組み合わせに対するモノクローナル抗体は、マーカーを発現する癌細胞集団の標的化および／または除去を可能にする。マーカーを発現する細胞集団をスクリーニングするためにモノクローナル抗体を用いる種々の技術が用いられ得、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体での「パンニング」、およびフローサイトメトリーを含む（例えば、米国特許第5,985,660号；およびMorrison et al. Cell, 96:737-49 (1999)を参照されたい）。これらの技術は、生検試料の免疫組織化学において；癌細胞により血液および他の生体液中へ排出されたマーカーの存在を検出する際に、細胞の特定の集団のスクリーニングを可能にする。
【００３９】
「処置」、「処置すること」、「処置する」などの用語は、一般に、望ましい薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指すように、本明細書において使用される。効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防する観点において予防的であってもよく、かつ／または、疾患および／もしくは疾患に起因する有害作用についての部分的もしくは完全な安定化もしくは治癒の観点において治療的であってもよい。本明細書において使用される「処置」とは、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の処置を包含し、かつ以下を含む：（a）疾患もしくは症状に罹患しやすい可能性があるが、まだそれを有すると診断されていない対象において、疾患もしくは症状が起きるのを予防すること；（b）疾患症状を阻害すること、すなわち、その発生を阻止すること；または（c）疾患症状を緩和すること、すなわち、疾患もしくは症状の退縮を引き起こすこと。
【００４０】
「レシピエント」、「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、かつ診断、処置、または療法が望まれる任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。
【００４１】
「治療標的」とは、抗腫瘍活性を誘導または増強するために標的とされ得る、腫瘍細胞および／または非腫瘍（免疫）細胞により発現される分子を指す。
【００４２】
方法
腫瘍細胞に対する抗体の投与により誘導される細胞殺傷の有効性を増強するための方法が提供される。最初の腫瘍に対する抗体の有効用量が患者に投与され、ADCCのために重要な自然免疫エフェクター細胞であるNK細胞における、CD137、OX40、GITR、CD30、またはICOSなどの誘導性共刺激分子の上方制御を誘導する。続いて、CD137、OX40、GITR、CD30、またはICOSを含むがそれらに限定されない、これらの分子の一つに対する第二のアゴニスト抗体の有効用量が個体に投与され、ここで、第二の抗体は、第一の抗体により標的とされる腫瘍細胞のADCC殺傷を増強するのに十分である。第二の抗体が、腫瘍に対する抗体によりNK細胞上に誘導的に発現されている共刺激分子を標的とするため、本方法は、腫瘍細胞のADCC媒介性の殺傷に関与するNK細胞の特異的刺激を可能にし、一方で他のNK細胞は使わず、それにより潜在性の非特異的副作用を制限する。
【００４３】
いくつかの態様において、腫瘍に対する抗体により誘導される共刺激分子（CD137、OX40、GITR、CD30、またはICOを含むがそれらに限定されない）のレベルが、患者の試料、通常患者の血液試料またはその細胞画分において測定される。基線として、腫瘍に対する抗体を投与する前の試料において共刺激分子のレベルが測定されてもよく、かつ腫瘍に対する抗体の投与後の発現における増加が測定されてもよい。
【００４４】
本発明のいくつかの態様において、腫瘍選択的抗体の有効用量が患者に投与され、その後、免疫系細胞、特にNK細胞におけるCD137発現の上方制御のために十分な時間を経過させる。十分な時間とは、通常少なくとも約12時間、より通常少なくとも約18時間、および通常少なくとも約24時間であり、かつ、少なくとも約2日、少なくとも約3日であってもよく、かつ約5日より長くはなく、通常約4日より長くはない。CD137の上方制御後に、CD137アゴニストの有効用量が個体に投与され、ここで、アゴニストは、第一の抗体により標的とされる腫瘍細胞のADCC殺傷を増強するのに十分である。いくつかの態様において、CD137のレベルが、患者の試料、通常患者の血液試料またはその細胞画分において測定される。基線として、腫瘍選択的抗体を投与する前の試料においてCD137のレベルが測定されてもよく、かつ腫瘍選択的抗体の投与後の発現における増加が測定されてもよい。NK細胞におけるCD137の発現における望ましい増加は、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍であるか、またはそれより高い。血液細胞全体において測定された場合、発現における増加は、混入している非応答性細胞の数のためにより低い可能性がある。
【００４５】
「癌細胞の成長を低下させること」は、癌細胞の増殖を低下させること、および腫瘍細胞のアポトーシスを増加させることを含むが、それらに限定されない。癌細胞成長における低下が達成されているか否かは、[3H]-チミジンの取り込み；ある期間に渡って細胞数を計数する段階；関心対象の癌に関連したマーカーを検出および／または測定する段階などを含むがそれらに限定されない、任意の公知のアッセイ法を用いて容易に判定することができる。
【００４６】
物質、または物質の特定量が癌を処置するのに有効であるか否かは、生検、X線造影検査、CATスキャン、および個体の血液における癌に関連した腫瘍マーカーの検出を含むがそれらに限定されない、癌のための様々な公知の診断アッセイ法の任意を用いて評価することができる。物質は、全身的にまたは局所的に、通常全身的に投与することができる。
【００４７】
製剤
本発明の方法において使用される一つまたは複数の抗体を含む治療用製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態において、望ましい純度を有する抗体を任意の生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤と混合することにより（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）、保存のために調製されてもよい。抗体組成物は、良好な医療業務と一致した様式において、製剤化され、投薬され、かつ投与されるであろう。本文脈における考慮のための因子は、処置される特定の癌、個々の患者の臨床状態、剤の送達の部位、投与の方法、投与のスケジューリング、および医師に公知である他の因子を含む。投与される抗体の「治療的有効量」は、そのような考慮により支配されるであろう。
【００４８】
治療用量は、少なくとも約0.01μg/kg体重、少なくとも約0.05μg/kg体重；少なくとも約0.1μg/kg体重、少なくとも約0.5μg/kg体重、少なくとも約1μg/kg体重、少なくとも約2.5μg/kg体重、少なくとも約5μg/kg体重であってもよく、かつ約100μg/kg体重より多くはない。そのような指標基準は、例えば、抗体断片の使用において、または抗体結合体の使用において、活性作用物質の分子量について調整されることが、当業者により理解されるであろう。投与量はまた、投与の経路のために変動させてもよい。
【００４９】
許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、かつ、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（オクタデシジメチルベンジル（octadecyidimethylbenzyl）アンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；およびm-クレゾールなど）；低分子量（約10残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖、二糖、および他の炭水化物；EDTAなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩を形成する対イオン；金属複合体（例えば、Zn-タンパク質複合体）；ならびに／または、TWEEN.（商標）、PLURONICS.（商標）、もしくはポリエチレングリコール（PEG）などの非イオン性界面活性剤を含む。インビボ投与のために使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、無菌ろ過膜を通したろ過により容易に達成される。
【００５０】
本発明の別の態様において、上述の障害の処置のために有用な材料を含有する製品が提供される。製品は、容器およびラベルを含む。適した容器は、例えば、瓶、バイアル、注射器、および試験管を含む。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。容器は、状態を処置するために有効である組成物を保持し、かつ無菌の接続口を有してもよい（例えば、容器は、静脈注射用溶液バッグまたは皮下注射針により突き刺すことが可能な栓を有するバイアルであってもよい）。組成物における活性作用物質は、上述の一つまたは複数の抗体である。容器上のラベル、または容器と一緒になったラベルは、組成物が最適な状態を処置するために使用されることを示す。それはさらに、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、およびブドウ糖溶液などの、薬学的に許容される緩衝剤を含む第二の容器を含んでもよい。製品はさらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、注射器、および使用説明書を伴う添付文書を含む、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料を含んでもよい。
【００５１】
本発明の方法における使用に適した抗体およびアゴニストは、例えば、活性成分を含有する一つまたは複数の単位剤形を含有するパックまたはディスペンサー装置で提示される、キット形態において提供されてもよい。そのようなパックまたは装置は、例えば、ブリスターパックなどの、金属またはプラスチックのホイルを含んでもよい。パックまたはディスペンサー装置には、投与のための説明書が添付されてもよい。本発明の方法において有用である作用物質を含む組成物は、適合した薬学的担体において製剤化されてもよく、また、調製され、適切な容器中に配置され、かつ適応される状態の処置について標識されてもよい。ラベル上に示される適した状態は、癌の処置を含んでもよい。キットはまた、例えば、当技術分野において公知である通り、誘導性共刺激分子に特異的に結合する検出可能な標識された試薬、および発現についての参照などを含む、NK細胞における誘導性共刺激分子の発現を測定するのに適したユニットを含んでもよい。
【００５２】
試験
10年前より以前の癌処置の代表的な例は、急速に増殖する腫瘍細胞による、細胞周期阻害剤またはDNA損傷剤などの作用物質に対する増加した感受性を仮定した、従来の細胞傷害性化学療法に限定されていた。この代表的な例は、非ホジキンリンパ腫の処置のために表面マーカーCD20を標的とする、最初の治療用モノクローナル抗体であるリツキシマブの、米国食品医薬品局の認可により、1997年に変化した。モノクローナル抗体は、従来の細胞傷害性化学療法を上回る特有の利点−より低い全身毒性を伴う良好な耐容性、最小のオフターゲット作用を伴う腫瘍に対する選択性、および頻繁な有糸分裂を起こさず緩徐に増殖する細胞を標的とする能力を有する。
【００５３】
リツキシマブの認可の後、HER2（ヒト上皮成長因子受容体2）に対するヒト化IgG1抗体であるトラスツズマブが、HER2+乳癌について1998年に認可された。2004年に、EGFR（上皮成長因子受容体）を標的とするキメラIgG1抗体であるセツキシマブが、結腸直腸癌について認可された。2006年に、セツキシマブはまた、頭頸部癌の処置についても認可された。HER2+胃癌および食道癌の最近の同定により証明される通り、癌療法は今や、新たな抗体または現存の抗体が向けられ得る新規標的および公知標的の両方の発見に焦点が当てられている。
【００５４】
従来の化学療法と対照的に、モノクローナル抗体は、最小の直接細胞傷害を実証する。抗体機能の多数の機構が証拠により裏付けられているが、抗腫瘍活性の主要な機構は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）による。ADCCにより起こる細胞傷害は、抗体が標的とする腫瘍細胞に結合するFc受容体を有するナチュラルキラー（NK）細胞またはマクロファージ／単球により媒介される。抗体に結合するNK細胞のFc受容体は、NK細胞を活性化し、抗体が標的とする腫瘍細胞においてアポトーシスを引き起こすサイトカインおよび細胞傷害性顆粒の放出を結果としてもたらす。増加したNK細胞機能は、ADCCを強化し、かつ改善された抗腫瘍活性を結果としてもたらす。
【００５５】
本発明は、抗体でコーティングされた腫瘍細胞の認識後に、ADCCのために重要な自然エフェクター細胞であるNK細胞上に誘導的に発現される共刺激分子を同定する。腫瘍に対する抗体による上方制御後に、これらの共刺激分子（CD137、OX40、GITR、CD30、またはICOSを含むがそれらに限定されない）を続いて、これらのエフェクター細胞により媒介されるADCCを増強するためにアゴニスト抗体で標的化する。腫瘍標的特異的抗体の数が増加することを考慮すると、これは、モノクローナル抗体により直接標的化される任意の癌タイプについて治療的意味を有する。
【００５６】
NK細胞機能を増強するアゴニスト抗体の臨床的有益性は、腫瘍細胞により発現される標的と腫瘍特異的抗体との数によってのみ限定される。過去10年間に渡るリツキシマブ、トラスツズマブ、およびセツキシマブの影響を考慮すると、標的および抗体を発見する努力は、引き続き積極的な研究の領域である可能性が高い。アゴニストNK細胞抗体の適用は、非ホジキンリンパ腫、乳癌、結腸直腸癌および頭頸部癌を超えて拡大するであろうが、これらの4種は、臨床的有益性の大きさを実証する。
【００５７】
抗体でコーティングされた腫瘍細胞がNK細胞の活性化を引き起こし、その殺傷活性が次に、CD137に対する第二の活性化抗体により刺激され得る。アゴニスト抗CD137抗体の添加は、任意の抗腫瘍抗体の治療効果を増強するための一般的なアプローチである。
【実施例】
【００５８】
実施例1
CD137の増加したNK細胞発現が、リツキシマブでコーティングされたCD20+リンパ腫へのNK細胞の曝露後に起こる。抗腫瘍ADCCを増強するためにアゴニスト抗体でCD137を標的化することは、抗体でコーティングされた腫瘍細胞への曝露後のNK細胞における増加した表面発現に依存する。第二の抗体が、腫瘍に対する抗体（リツキシマブ、トラスツズマブ）によりNK細胞上に誘導的に発現される共刺激分子（CD137）を標的とするため、本方法は、腫瘍細胞（リンパ腫、乳癌）のADCC媒介性の殺傷に関与するNK細胞の特異的刺激を可能にし、一方で他のNK細胞は使わず、それにより潜在性の非特異的副作用を制限する。
【００５９】
本発明者らは、慢性リンパ球性白血病（CLL）、辺縁帯リンパ腫（MZL）、およびCD20+急性リンパ芽球性白血病（ALL）のために循環CD20+腫瘍細胞を有する患者より、末梢血単核細胞（PBMC）を単離した。トラスツズマブまたはリツキシマブとの培養後に、フローサイトメトリーによりPBMCを解析した。リツキシマブとの培養後に、CD137+NK細胞のパーセントは、基線の1〜2％から、CD16（Fc受容体）の同時的な下方制御と共に22〜43％まで増加した。トラスツズマブとの培養後には活性化が起きなかったため、これは抗体依存的であると考えられた。図1A〜1Cに示す通り、リツキシマブは、CD20陽性腫瘍B細胞とのインキュベーション後に、ヒトNK細胞におけるCD137上方制御を誘導する。3人の健常ドナー由来の末梢血を、リンパ腫細胞株およびトラスツズマブまたはリツキシマブとの24時間培養後に、CD3-CD56+NK細胞におけるCD137発現について解析した。
【００６０】
抗CD137アゴニストmAbは、図2A〜2Fに示す通り、腫瘍細胞に対するリツキシマブ媒介性のNK細胞の細胞傷害を増加させる。健常ドナーの末梢血より単離および精製したNK細胞を、以下の5種類の条件で24時間培養後に、CD107aの動員による脱顆粒について解析した：培地のみ；CD20陽性リンパ腫細胞株（Raji、Ramos、もしくはDHL-4）；腫瘍およびリツキシマブ；腫瘍および抗CD137抗体；または、腫瘍、リツキシマブ、および抗CD137アゴニスト抗体。図3A〜3Dに示す通り、抗CD137アゴニストmAbでの抗リンパ腫活性の増強もある。
【００６１】
抗CD20 mAbおよび抗CD137 mAbの併用活性は、図4A〜4Bに示す通り、mAb投与の適切な順序を必要とし、かつNK細胞およびマクロファージに依存する。図5A〜5Dに示す通り、3日目にIgG対照抗体または抗CD20抗体のいずれかで処置した、腫瘍接種後4日のリンパ腫を有するC57BL/6マウス由来の末梢血細胞サブセットを、CD3-NK1.1+NK細胞（NK）、F4/80+マクロファージ（Mφ）、CD3+CD8+T細胞（CD8）、およびCD3+CD4+T細胞（CD4）におけるCD137発現について解析し；3日目にIgG対照抗体または抗CD20抗体のいずれかで処置した、腫瘍接種後7日のリンパ腫を有するC57BL/6マウス由来の腫瘍浸潤リンパ球を、CD3-NK1.1+NK細胞（NK）、F4/80+マクロファージ（Mφ）、CD3+CD8+T細胞（CD8）、およびCD3+CD4+T細胞におけるCD137発現について解析した。
【００６２】
同系マウスモデルにおいて観察される抗CD20Abおよび抗CD137Ab療法の相乗作用を、異種移植無胸腺ヌードマウスモデルにおいて、リツキシマブ、トラスツズマブ、およびセツキシマブと共に抗CD137Abの活性を試験することにより検証する。このモデルは、リツキシマブ、トラスツズマブ、およびセツキシマブの前臨床試験のために以前に使用されている。リンパ腫モデルにおいては、Balb/cヌードnu/nuマウスに、ホタルルシフェラーゼをトランスフェクションした3×106個のRaji細胞を0日目に接種し、および3日目にリツキシマブ（10μg/g重量、IP）で処置し、その後4日目に150μgのラット抗マウス抗CD137AbのIPを行った。CD137、CD69、およびCD16のNK細胞発現をアッセイするために、3日目のリツキシマブ処置の前、4日目の抗CD137Ab処置の前、および5日目に血液を回収した。3日目のAb療法の前に、IPルシフェリン注射（200μL）後に生物発光画像化を行い、毎週繰り返した。リツキシマブを伴うCD137の効果が、図6A〜6Cに示す散在性ヒトリンパ腫異種移植モデルにおいて示される。
【００６３】
リツキシマブでコーティングされた自己由来のリンパ腫細胞は、図7A〜7Cに示す通り、B細胞悪性腫瘍を有するヒト患者由来のNK細胞におけるCD137上方制御を誘導する。B細胞悪性腫瘍および循環腫瘍細胞（CTC）を有する患者由来の末梢血を、培地のみ、トラスツズマブ、またはリツキシマブとの24時間培養後に、CD3-CD56+NK細胞におけるCD137発現について解析した。あらかじめ活性化した後のNK細胞におけるCD137の誘導および一時性発現の速度論を、図8A〜8Cにおいて解析する。
【００６４】
腫瘍成長は、抗CD20Ab単独療法または抗CD137Ab単独療法のいずれかでおよそ50％低下した。しかしながら、腫瘍接種後、抗CD20Abで処置したすべてのマウスが60日より前に死に、および抗CD137Abで処置したマウスの50％のみが100日目に生きていた。3日目の抗CD20Ab、その後4日目の抗CD137Abでの処置は、マウスの90％において腫瘍の完全な退縮および100日目での生存を結果としてもたらした。観察される相乗作用がNK細胞機能に依存するかどうかを判定するために、-1日、0日、およびその後処置群の明らかな分離が観察された点である20日目まで5日毎に、抗アシアロGM1でNK細胞を除去した。抗アシアロGM1でのNK細胞の除去は、併用療法の有益性を取り消した。
【００６５】
抗CD137アゴニストmAbは、図9A〜9Bに示す通り、あらかじめ活性化したNK細胞のサイトカイン放出およびリツキシマブ媒介性の細胞傷害を増加させる。NK細胞のインターフェロン-γ分泌を評価するために、精製したNK細胞を、健常PBMCより単離し、リツキシマブ（10μg／mL）および1：1の比の放射線照射（5,000ラド）したリンパ腫腫瘍細胞（Raji）と共に24時間培養した。24時間後、NK細胞を単離し、純度について評価した。あらかじめ活性化した、精製したNK細胞を次に、培地のみにおいて、または、抗CD137 mAbのみ、リツキシマブのみ、もしくはリツキシマブに加えて抗CD137 mAbと共に4時間培養し、上清を収集してELISAによりインターフェロン-γについて解析した。Raji腫瘍細胞に対するNK細胞の細胞傷害を、事前にNK細胞のあらかじめの活性化を伴うかおよび伴わずに、クロム放出アッセイ法において解析した。抗CD137アゴニストmAbはまた、図10に示す通り、リツキシマブ媒介性のNK細胞の脱顆粒を増加させる。
【００６６】
実施例2
CD137の増加したNK細胞発現が、トラスツズマブでコーティングされたHER2+乳癌へのNK細胞の曝露後に起こる。本発明者らは次に、トラスツズマブでコーティングされた乳癌への曝露後に、CD137の発現がNK細胞において同様に増加するかどうかを判定した。本発明者らは、健常ドナーの血液よりNK細胞を単離し、それらをトラスツズマブまたはリツキシマブと共に24時間、MCF7（HER2を発現しない乳癌細胞株）およびSKBR3（HER2を過剰発現する乳癌細胞株）を含む乳癌細胞株に添加した。NK細胞を次に、図11に示す通り、フローサイトメトリーによりCD137発現について解析した。
【００６７】
CD137のNK細胞発現を、乳癌細胞株について上記に詳述した通り、セツキシマブ（10μg／mL）、リツキシマブ（10μg／mL）、またはトラスツズマブ（10μg／mL）でコーティングされた適切な腫瘍細胞株との共培養後に測定した。CD3およびCD56についてのフローサイトメトリーを、NK細胞単離の純度を評価するために行った。CD69、CD107、およびCD16を含む活性化の追加的なマーカーを、フローサイトメトリーパネルに含めた。大腸癌細胞株は、HCT-8（EGFR+）およびSW620（EGFR）を含み、かつ扁平上皮頭頸部癌細胞株は、TE3（EGFR+HER2-）およびTE4（EGFR-HER2+）を含む。
【００６８】
図12A〜12Cに示す通り、抗CD137アゴニストmAbは、細胞生存率によりアッセイした場合、腫瘍細胞に対するトラスツズマブ媒介性のNK細胞の細胞傷害を増加させる。MCF7、BT474M1、およびHER18と18時間インキュベーションし、アポトーシスを評価する前に、あらかじめ活性化したNK細胞を精製した。
【００６９】
抗体および腫瘍細胞での刺激後の活性化したNK細胞の機能的能力をまた、クロム放出アッセイ法により測定した。HER2+乳癌に対する活性を調査するために、正常血液より単離したNK細胞を、SKBR3（HER2+）およびトラスツズマブとの共培養により活性化した。これらの曝露したNK細胞を、その活性化を評価するために、フローサイトメトリーによりCD137およびCD69発現について試験した。活性化したNK細胞を、トラスツズマブ（10μg／mL）、抗CD137Ab（10μg／mL）、またはトラスツズマブ＋抗CD137Ab（両方とも10μg／mL）と共に、12.5：1、25：1、50：1、および100：1の比のクロム標識したSKBR3標的細胞に添加する。HCT-8（EGFR+）細胞株およびセツキシマブでEGFR+大腸癌に対する、ならびにTE3（EGFR+HER2-）細胞株およびセツキシマブでEGFR+頭頸部癌に対するインビトロ機能活性を調査するために、同様の活性化及び殺傷アッセイ法を行う。図13に示す通り、抗CD137アゴニストmAbは、クロム放出によりアッセイした場合、腫瘍細胞に対するトラスツズマブ媒介性のNK細胞の細胞傷害を増加させる。
【００７０】
裏付ける証拠が同系マウスリンパ腫モデルにおいて提供されており、抗CD137アゴニストmAbは、インビボでトラスツズマブの抗乳癌活性を増強する。図14A〜14Bに示す通りである。nu/nuヌードマウスの腹部の皮下に5×106個のBT474M1乳房腫瘍細胞を、0.72 mg/60日放出β-エストラジオールペレットの皮下注射の1日後に接種した。腫瘍接種後、マウスは次に、3日目にラットIgG対照、3日目にトラスツズマブ抗体、4日目に抗CD137抗体、または3日目にトラスツズマブおよび4日目に抗CD137抗体のいずれかを受け、各処置を毎週、全部で3週間繰り返した。マウスを次に、腫瘍成長および全生存についてモニターした。
【００７１】
図15A〜15Cに示す通り、抗CD137アゴニストmAbは、HER2特異性を保持する一方で、インビボでトラスツズマブの抗乳癌活性を増強する。nu/nuヌードマウスの左側腹部の皮下に5×106個のMCF7乳房腫瘍細胞を、および右側腹部の皮下に5×106個のHER18乳房腫瘍細胞を、0.72mg/60日放出β-エストラジオールペレットの皮下注射の1日後に接種した。腫瘍接種後、マウスは次に、3日目にトラスツズマブ、または3日目にトラスツズマブおよび4日目に抗CD137抗体のいずれかを受け、各処置を毎週、全部で3週間繰り返した。代表的なマウスを次に、腫瘍成長についてモニターした。
【００７２】
抗CD137アゴニストmAbは、図16に示す通り、HER2+原発乳房腫瘍に対してインビボでトラスツズマブの抗乳癌活性を増強する。SCIDマウスに、200 cGyの全身放射線照射（TBI）の24時間後に、乳房内注射により1×106個のHER2+原発乳房腫瘍細胞を接種した。40日目に、40日目のIgG対照、40日目のトラスツズマブ、41日目の抗CD137 mAb、または40日目のトラスツズマブおよび41日目の抗CD137 mAbでの処置を含む4群のうちの一つに、マウスを無作為化した。処置を各群において毎週、全部で3処置繰り返した。マウスを、腫瘍成長についてモニターした。
【００７３】
実施例3
セツキシマブは、図17A〜17Bに示す通り、EGFR陽性腫瘍細胞とのインキュベーション後に、NK細胞におけるCD137上方制御を誘導する。3人の健常ドナー由来の末梢血を、頭頸部癌細胞株および培地のみ、リツキシマブ、またはセツキシマブとの24時間培養後に、CD3-CD56+NK細胞におけるCD137発現について解析し、発現を増加させることを示した。
【００７４】
図18A〜18Cに示す通り、抗CD137アゴニストmAbは、細胞生存率によりアッセイした場合、腫瘍細胞に対するセツキシマブ媒介性のNK細胞の細胞傷害を増加させる。SCC6、PC1、およびSCC4と24時間インキュベーションする前に、あらかじめ活性化したNK細胞を精製した。アポトーシス標的細胞のパーセントを、培地、セツキシマブ、抗CD137、セツキシマブおよび抗CD137抗体を伴う、腫瘍のみまたは腫瘍およびNK細胞との培養後に、アネキシンおよび7AAD生存率染色により測定した。
【００７５】
抗CD137アゴニストmAbは、クロム放出によりアッセイした場合、腫瘍細胞に対するセツキシマブ媒介性のNK細胞の細胞傷害を増加させる。SCC6腫瘍細胞に対するNK細胞の細胞傷害を、クロム放出アッセイ法において解析した。クロム標識したSCC6細胞と5時間インキュベーションする前に、新鮮なNK細胞およびあらかじめ活性化したNK細胞を精製した。様々なエフェクター（新鮮なNK細胞）：標的（SCC6）細胞比におけるクロム放出による標的細胞の溶解パーセントを、図19に示す。
【００７６】
抗CD137アゴニストmAbは、インビボでセツキシマブの抗頭頸部癌活性を増強する。図20に示す通り、nu/nuヌードマウスの腹部の皮下に、3×106個のSCC6頭頸部腫瘍細胞を接種した。腫瘍接種後、マウスは、21日目にラットIgG対照、21日目にセツキシマブ、22日目に抗CD137抗体、または21日目にセツキシマブおよび22日目に抗CD137抗体のいずれかを受け、各処置を毎週、全部で3処置繰り返した。マウスを次に、腫瘍成長についてモニターした。
【００７７】
循環NK細胞は、頭頸部癌を有する患者においてセツキシマブ注入後にCD137を上方制御することを、さらに示した（図21A〜21B）。頭頸部癌を有する患者由来の新鮮な末梢血を、CD3-CD56+NK細胞におけるCD137発現について解析し、上方制御されることを示した。
【００７８】
抗体でコーティングされた腫瘍細胞への曝露後に、NK細胞上に活性化特異的標的（CD137）が出現すること、およびこれらの宿主細胞上のCD137標的に対する第二の抗体が、多数の腫瘍モデルにおいて相乗的な抗腫瘍活性を有することの実証は、革新的であり、かつ患者の看護にとって強い衝撃である。アゴニスト抗CD137抗体（例えば、BMS-663513）は、現在、初期相の臨床治験中であり、および多数の主要な製薬会社により前臨床開発中である。およそ300人の患者が、BMS抗体で第I相および第II相治験において処置されている。無視してもよい単一の作用物質の活性が、10％未満の応答率で観察されている。
【００７９】
本発明者らのインビトロのデータに基づくと、同時的なリツキシマブなどの腫瘍を標的とする抗体なしでは、NK細胞機能における有意な増加は観察されない。しかしながら、両方の抗体を併用する場合、NK細胞機能が劇的に増加する。本発明は、固形腫瘍における最小の単剤の活性にもかかわらず、抗CD137併用抗体療法の臨床価値を実証する機会を有するため、非常に重要である。免疫調節を通した相乗作用に基づく療法は、多くのタイプの癌を有する患者の生存を改善することへの革新的でかつ代表的な例を変化させるアプローチである。
【００８０】
より広く、本発明者らは、抗体でコーティングされた腫瘍細胞への曝露後に、OX40およびGITRなどの、CD137以外の多数の他の共刺激分子がNK細胞において上方制御されることを観察している。CD137と同様に、アゴニスト抗体を用いたこれらの誘導性共刺激分子の標的化は、NK細胞機能を刺激および増強し、増加したADCCをもたらすことが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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