(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のＡの工程及びＢの工程を含む、脱分化脂肪細胞の製造方法。
Ａ．脂肪組織を０．０２〜０．０５ｗ／ｖ％のコラゲナーゼで処理することにより、成熟脂肪細胞を単離する工程
Ｂ．上記Ａの工程により単離された成熟脂肪細胞より、脱分化脂肪細胞を取得する工程
【請求項２】
次のＡ、ＢおよびＣの工程を含む、間葉系細胞の製造方法。
Ａ．脂肪組織を０．０２〜０．０５ｗ／ｖ％のコラゲナーゼで処理することにより、成熟脂肪細胞を単離する工程
Ｂ．上記Ａの工程により単離された成熟脂肪細胞より、脱分化脂肪細胞を取得する工程
Ｃ．上記Ｂの工程によって製造された脱分化脂肪細胞を分化誘導する工程
【請求項３】
間葉系細胞が、骨芽細胞、筋芽細胞、心筋細胞、内皮細胞、軟骨細胞または脂肪細胞から選ばれるいずれかである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
次のＡの工程及びＢの工程を含む、脱分化脂肪細胞の製造方法。
Ａ．脂肪組織を０．０２〜０．０５ｗ／ｖ％のコラゲナーゼで処理することにより、４０μｍ未満の成熟脂肪細胞を単離する工程
Ｂ．上記Ａの工程により単離された成熟脂肪細胞より、脱分化脂肪細胞を取得する工程
【請求項５】
次のＡ、ＢおよびＣの工程を含む、間葉系細胞の製造方法。
Ａ．脂肪組織を０．０２〜０．０５ｗ／ｖ％のコラゲナーゼで処理することにより、４０μｍ未満の成熟脂肪細胞を単離する工程
Ｂ．上記Ａの工程により単離された成熟脂肪細胞より、脱分化脂肪細胞を取得する工程
Ｃ．上記Ｂの工程によって製造された脱分化脂肪細胞を分化誘導する工程
【請求項６】
間葉系細胞が、骨芽細胞、筋芽細胞、心筋細胞、内皮細胞、軟骨細胞または脂肪細胞から選ばれるいずれかである請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脱分化脂肪細胞（Ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｆａｔ  ｃｅｌｌｓ；ＤＦＡＴ  ｃｅｌｌｓ）の製造方法に関する。さらに詳しくは、脂肪組織を特定の濃度のコラゲナーゼで処理することにより成熟脂肪細胞を単離し、該成熟脂肪細胞より脱分化脂肪細胞を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、脂肪組織から成熟脂肪細胞を単離するために、脂肪組織をコラゲナーゼで処理して組織中の細胞外マトリックスから細胞を切り離し、成熟脂肪細胞のみを採取する方法が行われてきた。この方法において、一般的に０．１ｗ／ｖ％の濃度でコラゲナーゼが使用されている。
この０．１ｗ／ｖ％というコラゲナーゼの濃度は、Ｒｏｄｂｅｌｌが１９６４年に報告したものであり（非特許文献１、２）、現在に至るまで、この濃度のままコラゲナーゼを使用するのが一般的である。しかし、コラゲナーゼはトリプシンと同様に細胞への障害作用があるため、濃度が高いほど細胞に与える傷害が大きくなるという問題がある。【０００３】
本発明者らは脂肪組織から成熟脂肪細胞を単離し、該成熟脂肪細胞より脱分化脂肪細胞を製造している。脱分化脂肪細胞は、単離した成熟脂肪細胞を天井培養法によって培養することで、成熟脂肪細胞が自発的に脱分化を開始することによって得られる多分化能を再獲得した細胞であるため、再生医療の細胞源として有用視されている。
このような脱分化脂肪細胞を大量に製造するには、細胞に極力障害を与えない条件で、脂肪組織より成熟脂肪細胞を効率的に単離することが重要となる。そこで、本発明者らは本発明において、脱分化脂肪細胞を大量に製造するための、脂肪組織の処理にあたり最適なコラゲナーゼ濃度を検討した。【０００４】
なお、脂肪組織のコラゲナーゼによる処理について、特許文献１において、ウシ科動物組織を０．２５ｖ／ｖ％のコラゲナーゼ濃度で消化させたこと、また、ヒト、イヌ科動物等の脂肪組織が通常の濃度（０．０２％または０．０５％）のコラゲナーゼで全て消化されたことが開示されている。しかし、この文献は、脱分化脂肪細胞を大量に製造することを目的とする、本発明とは異なるものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１４−５１１８２７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＬＯＣＡＬＩＺＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＬＩＰＯＰＲＯＴＥＩＮ  ＬＩＰＡＳＥ  ＩＮ  ＦＡＴ  ＣＥＬＬＳ  ＯＦ  ＲＡＴ  ＡＤＩＰＯＳＥ  ＴＩＳＳＵＥ．  ＲＯＤＢＥＬＬ  Ｍ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９６４  Ｍａｒ；２３９：７５３−５．
【非特許文献２】ＭＥＴＡＢＯＬＩＳＭ  ＯＦ  ＩＳＯＬＡＴＥＤ  ＦＡＴ  ＣＥＬＬＳ．  Ｉ．  ＥＦＦＥＣＴＳ  ＯＦ  ＨＯＲＭＯＮＥＳ  ＯＮ  ＧＬＵＣＯＳＥ  ＭＥＴＡＢＯＬＩＳＭ  ＡＮＤ  ＬＩＰＯＬＹＳＩＳ．  ＲＯＤＢＥＬＬ  Ｍ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９６４  Ｆｅｂ；２３９：３７５−８０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
脱分化脂肪細胞の効率的な製造方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、脂肪組織からの成熟脂肪細胞の単離において、従来、０．１ｗ／ｖ％の濃度で用いられてきたコラゲナーゼの濃度を０．０１ｗ／ｖ％より高く、かつ、０．１ｗ／ｖ％より低い濃度にした場合に従来の濃度と比較して約３倍の高効率で成熟脂肪細胞が採取でき、脱分化脂肪細胞を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は次の（１）〜（６）の脱分化脂肪細胞の製造方法等に関する。
（１）次のＡの工程を含む、脱分化脂肪細胞の製造方法。
Ａ．脂肪組織を０．０１ｗ／ｖ％より高く、かつ、０．１ｗ／ｖ％より低い濃度のコラゲナーゼで処理することにより、成熟脂肪細胞を単離する工程
（２）コラゲナーゼの濃度が０．０２ｗ／ｖ％以上であり、かつ、０．０５％以下である上記（１）に記載の製造方法。
（３）成熟脂肪細胞が６０μｍ未満の大きさである上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）さらに次のＢの工程を含む、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の脱分化脂肪細胞の製造方法。
Ｂ．上記Ａの工程により単離された成熟脂肪細胞より、脱分化脂肪細胞を取得する工程
（５）上記（１）〜（４）のいずれかの方法によって製造された脱分化脂肪細胞を分化誘導する工程を含む、間葉系細胞の製造方法
（６）間葉系細胞が、骨芽細胞、筋芽細胞、心筋細胞、内皮細胞、軟骨細胞または脂肪細胞から選ばれるいずれかである上記（５）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の提供により、単離する成熟脂肪細胞に損傷を与えることなく、高効率で成熟脂肪細胞を採取することが可能となる。また、処理に使用するコラゲナーゼの量を減らすことでコストを抑えることも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】脱分化脂肪細胞の各継代培養時における細胞数を示した図である（実施例１）。
【図２】脱分化脂肪細胞の各継代培養時における細胞数を示した図である（実施例１）。
【図３】脱分化脂肪細胞の各継代培養時における細胞数を示した図である（実施例１）。
【図４】採取された成熟脂肪細胞の細胞数を示した図である（実施例２）。
【図５】採取された成熟脂肪細胞を蛍光染色した結果を示した図である（実施例２）。
【図６】脱分化脂肪細胞の細胞数を示した図である（実施例２）。
【図７】アルカリフォスファターゼ活性を示した図である（実施例３）。
【図８】アリザリンレッドＳ染色の結果を示した図である（実施例３）。
【図９】カルシウム沈着量を示した図である（実施例３）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の「脱分化脂肪細胞の製造方法」は、次のＡの工程を含む、脱分化脂肪細胞の製造方法であれば良く、脱分化脂肪細胞の効率的な製造にあたり有用なその他の工程を含んでいても良い。
Ａ．脂肪組織を０．０１ｗ／ｖ％より高く、かつ、０．１ｗ／ｖ％より低い濃度のコラゲナーゼで処理することにより、成熟脂肪細胞を単離する工程
【００１３】
例えば、「成熟脂肪細胞を単離する工程」には、皮下や内臓等から得られた脂肪組織を０．０１ｗ／ｖ％より高く、かつ、０．１ｗ／ｖ％より低い濃度のコラゲナーゼで処理することに加えて、このコラゲナーゼ処理によって得られた成熟脂肪細胞を含む酵素液を孔径１００および１５０μｍのメッシュでフィルトレーションし、成熟脂肪細胞である単胞性脂肪細胞のみからなる単一の画分として成熟脂肪細胞を単離すること等が挙げられる。
【００１４】
コラゲナーゼの濃度は０．０１ｗ／ｖ％より高く、かつ、０．１ｗ／ｖ％より低い濃度であれば良く、特に０．０２ｗ／ｖ％以上であり、かつ、０．０５％以下であることが好ましい。
【００１５】
製造される成熟脂肪細胞は、６０〜１００μｍ程度の通常の大きさであっても良いが、６０μｍ未満であることが好ましく、特に４０μｍ未満であることが好ましい。
【００１６】
また、本発明の「脱分化脂肪細胞の製造方法」は、さらに、次のＢの工程を含むものであっても良い。
Ｂ．上記Ａの工程により単離された成熟脂肪細胞より、脱分化脂肪細胞を取得する工程
この「脱分化脂肪細胞を取得する工程」には、単離された成熟脂肪細胞を天井培養法によって培養することが挙げられる。
これらの工程を行うにあたり、本発明者らの先願発明（特許第５０５５６１１号、特許第５０５５６１３号）を参照して行っても良い。
【００１７】
本発明の「間葉系細胞の製造方法」は、「脱分化脂肪細胞の製造方法」によって得られた脱分化脂肪細胞を分化誘導する工程を含む、間葉系細胞の製造方法であれば良く、間葉系細胞の製造にあたり有用なその他の工程を含んでいても良い。
「間葉系細胞」には、骨芽細胞、筋芽細胞、心筋細胞、内皮細胞、軟骨細胞または脂肪細胞等が挙げられる。脱分化脂肪細胞を分化誘導する工程では、分化誘導する各細胞に合わせて分化誘導に有用な剤、方法等の従来知られているいずれの方法も用いることができる。
【００１８】
以下、実施例、試験例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００１９】
本発明の実施例、比較例では、特に記載がない限り、次の試料を使用した。
１）酵素
コラゲナーゼ（ＴｙｐｅＩＩ；Ｃ６８８５−１Ｇ，ＳＩＧＭＡ）を使用した。
２）脂肪組織
顎変形症の手術の際に得られたヒト頬脂肪体から脂肪組織を得た。【００２０】
〔実施例１〕
脱分化脂肪細胞の製造方法（１）
工程Ａ．脂肪組織から成熟脂肪細胞を単離する工程
ヒト頬粘膜下に位置する頬脂肪体より採取した脂肪組織５ｇを、コラゲナーゼ（ＴｙｐｅＩＩ；ＳＩＧＭＡ）添加のＮａＨＣＯ３含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＳＩＧＭＡ）に入れ、コラゲナーゼ処理を行った。本発明において該培地におけるコラゲナーゼの濃度を０．０２ｗ／ｖ％とし、比較として０．０１ｗ／ｖ％、０．１０ｗ／ｖ％または０．５０ｗ／ｖ％の濃度としたものも作成した。
各濃度のコラゲナーゼ処理を行った後、ナイロンメッシュにて濾過し、細胞懸濁液を得た。得られた細胞懸濁液を１分間、７００Ｇで遠心分離し、上層に分離される単胞性脂肪画分を新鮮な１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に加え、１分間、７００Ｇの遠心分離を３回繰り返すことで、単胞性脂肪細胞として成熟脂肪細胞を得た。【００２１】
工程Ｂ．成熟脂肪細胞より、脱分化脂肪細胞を取得する工程
工程Ａによって得られた単胞性脂肪細胞を組織培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ，３１０７）に移し、２０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地でフラスコ内を完全に満たし、３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気の気相に調節した炭酸ガス培養装置内にフラスコ底面が上となるように静置して７日間培養した。
培養４日後には大部分の細胞がフラスコ天井面にしっかりと接着し、大型の脂肪滴の周辺に種々の大きさの脂肪滴を有する多胞性脂肪細胞へと形態変化した。培養６日後には脂肪滴がさらに小さくなり、脂肪滴をまったく持たない線維芽細胞様の形態に変化する細胞が多数観察された。
培養７日後にフラスコ内の培地を２０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、細胞接着面が底面になるようにして炭酸ガス培養装置内で１０日間培養を続けた。培地交換は４日毎に行った。脂肪滴を持たない細胞は活発に増殖し、培養１０日後にはフラスコ内の細胞は線維芽細胞様の細胞のみとなり、コンフルエントに達した。
この線維芽細胞様の細胞は、活発な増殖能を有し、またＤＥＸ、ＩＮＳ、ＩＢＭＸ等の分化誘導剤により、脂肪滴を有する脂肪細胞に再分化する分化能を有することから、単胞性脂肪細胞由来の脱分化脂肪細胞として作出された。【００２２】
作出された脱分化脂肪細胞を１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように２０％ＦＢＳ添加したＤＭＥＭ培地に再浮遊させた。その後、コラーゲンタイプＩＩを塗布した組織培養用の培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ，３００１）中に播種し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気の気相に調節した炭酸ガス培養装置内に静置して培養した。なお、培地の交換は４日ごとに行った。培養８日後、本発明の脱分化脂肪細胞がコンフルエントに到達した段階で細胞数を数えた（図１〜３、Ｐ１）。
その後、２回目の継代培養を行い、同様に細胞数を数えた（図１〜３、Ｐ２）後、さらに３回目の継代培養を行い、同様に細胞数を数えた（図１〜３、Ｐ３）。【００２３】
その結果、図１〜３に示されるように、コラゲナーゼの濃度を０．０２ｗ／ｖ％として脂肪組織から単離した成熟脂肪細胞を用いた場合、コラゲナーゼの濃度を０．０１ｗ／ｖ％、０．１０ｗ／ｖ％、０．５０ｗ／ｖ％とした場合と比べて、有意に大量の脱分化脂肪細胞が製造できることが確認された。図１〜３以外にも同様の試験を複数回行ったが、いずれもコラゲナーゼの濃度を０．０２ｗ／ｖ％とした場合に、有意に大量の脱分化脂肪細胞を製造することができ、同様の結果であった。【００２４】
〔実施例２〕
脱分化脂肪細胞の製造方法（２）
１．成熟脂肪細胞数の比較
実施例１と同様の方法に、ヒトの頬脂肪体より採取した脂肪組織をコラゲナーゼ処理した。各濃度のコラゲナーゼ処理を１時間行った後、１００μｍのセルストレーナー（ＢＤ  ＦＡＬＣＯＮ）を用いて細胞外基質成分を除去した後、濾過および低速遠心分離を行い、成熟脂肪細胞分画を得た。この各コラゲナーゼ濃度の浮遊細胞分画２００μｌ中に含まれる細胞数をコールターカウンター：Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（登録商標）  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ３（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ，ＵＳＡ）を用いて測定し、採取された成熟脂肪細胞数を比較した。この測定は各濃度それぞれ３回行った。【００２５】
２．成熟脂肪細胞分画の大きさによる分取
上記１において低速遠心分離後に単離した浮遊細胞分画を、４０μｍのセルストレーナー（ＢＤ  ＦＡＬＣＯＮ）で濾過し、得られた細胞分画を４０μｍ未満の細胞分画とした。また、同じく１００μｍのセルストレーナーで濾過後、さらに４０μｍのセルストレーナーで４０μｍ未満の細胞分画を排除して得た細胞分画を４０μｍ以上１００μｍ未満の細胞分画とした。【００２６】
上記１、２により得られた成熟脂肪細胞数を図４に示した。図４に示されるように、６０μｍ以上１００μｍ未満の範囲の大きさの成熟脂肪細胞は、いずれのコラゲナーゼ濃度であっても同程度の数の成熟脂肪細胞が採取された。一方で、６０μｍ未満の大きさの成熟脂肪細胞は、コラゲナーゼ濃度を０．０２ｗ／ｖ％とした場合に、他の濃度と比較して有意に大量に採取できることが示された。さらに、４０μｍ未満の大きさの成熟脂肪細胞は、コラゲナーゼ濃度を０．０２ｗ／ｖ％とした場合に、他の濃度とした場合と比べて６倍以上採取できることが確認できた。【００２７】
３．蛍光染色
上記２．において分取した４０μｍ未満の細胞分画または４０μｍ以上１００μｍ未満の細胞分画について、脂肪滴（トリグリセリド）に陽性を示すＡｄｉｐｏｒｅｄ（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｌｉｖｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）および核に陽性を示すＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，５μｇ／ｍｌ）にて２０分染色を行い、蛍光顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ）にて観察を行った。
その結果、図５に示されるように、４０μｍ未満の細胞分画（図５、Ａ）も４０μｍ以上１００μｍ未満の細胞分画（図５、Ｂ）のいずれもトリグリセリドおよび核が染色されたことから、成熟脂肪細胞であることが確認できた。【００２８】
４．脱分化脂肪細胞数の比較
４０μｍ未満の細胞分画または４０μｍ以上１００μｍ未満の細胞分画の成熟脂肪細胞を１フラスコあたり、１×１０４個ずつ播種し、天井培養を行った。天井培養開始後６日目の細胞数を測定した後、その後７日目にフラスコを反転し、１０日目、１４日目、１８日目の脱分化脂肪細胞の数を測定した。
その結果、図６に示されるように、４０μｍ未満の成熟脂肪細胞の方が４０μｍ以上１００μｍ未満の成熟脂肪細胞に比較して、天井培養開始６日目から有意に多く、脱分化脂肪細胞へ脱分化することが確認できた。【００２９】
５．細胞表面抗原の確認
上記４．にて得られた４０μｍ未満の成熟脂肪細胞または４０μｍ以上１００μｍ未満の成熟脂肪細胞から得られた脱分化脂肪細胞をそれぞれ継代培養し、１継代目の細胞を１×１０５個ずつ１０ｃｍ  ｄｉｓｈに播種し、６０％コンフルエントの細胞を回収した。これを５×１０５／ｔｕｂｅに分注した。
それぞれの脱分化脂肪細胞について、ＣＤ１３（ＰＥ−ＣＤ１３）、ＣＤ４４（ＦＩＴＣ−ＣＤ４４）、ＣＤ４５（ＦＩＴＣ−ＣＤ４５）、ＣＤ７３（ＰＥ−ＣＤ７３）、ＣＤ９０（ＡＰＣ−ＣＤ９０）、ＣＤ１０５（ＡＰＣ−ＣＤ１０５）、ＣＤ１４６（ＰＥ−ＣＤ１４６）、ＣＤ２７１（ＰＥ−ＣＤ２７１）、ＳＴＲＯ−１（ＦＩＴＣ−ＳＴＲＯ１）（いずれもＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で２０分間反応させた。その後、反応後の細胞をＰＢＳで洗浄し、フローサイトメーターにて陽性細胞の割合を計測した。
その結果、表１に示されるように、４０μｍ未満の細胞分画から得られた脱分化脂肪細胞は４０μｍ以上１００μｍ未満の細胞分画から得られた脱分化脂肪細胞に対して間葉系幹細胞のマーカーであるＣＤ１４６陽性細胞の割合が約１．５〜２倍多いことが確認できた。【００３０】
【表１】
0005991687.tif 000002
【００３１】
従って、これら１．〜５．の結果より、４０μｍ未満の成熟脂肪細胞を得ることにより、効率的に脱分化脂肪細胞が製造できることが示された。また、脂肪組織より４０μｍ未満の成熟脂肪細胞を得るには、コラゲナーゼ濃度を０．０２ｗ／ｖ％として採取することが特に好ましいことも確認できた。【００３２】
〔実施例３〕
間葉系細胞の製造方法
実施例２において得た４０μｍ未満の細胞分画から得られた脱分化脂肪細胞と４０μｍ以上１００μｍ未満の細胞分画から得られた脱分化脂肪細胞を継代培養し、１継代目の細胞を１×１０４個ずつ１２ウェルプレートに播種した、コンフルエントになったら、骨芽細胞誘導培地にて２１日間誘導培養を行った。
分化誘導培地（ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ−ＩＮＤＵＣＩＮＧ  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＭＥＤＩＵＭ（図面においてＩＭまたはＯｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｄｉｕｍと示す場合がある））の組成は増殖培地（Ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ（図面においてＧＭと示す場合がある））［ＤＭＥＭ、１０％（ｖ／ｖ）  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ；１３Ｂ１０３，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ），１％  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ］に１００ｎＭ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ），１０ｍＭ  ｂ−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ），５０ｍＭ  Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ−２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加したものである。
この骨芽細胞誘導の評価は、アルカリフォスファターゼ活性、アリザリンレッドＳ染色、カルシウム定量試験にて行った。【００３３】
１．アルカリフォスファターゼ活性
誘導開始０、３、５、７、１０、１４日目の細胞を回収し、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いてタンパク量を測定およびアルカリフォスファターゼ活性の測定を行った。
その結果、図７に示すように、４０μｍ未満の細胞分画から得た脱分化脂肪細胞（図７、ｕｎｄｅｒ  ４０μｍ  ＩＭ）の方が、４０μｍ以上１００μｍ未満の細胞分画から得た脱分化脂肪細胞（図７、４０−１００μｍ  ＩＭ）に比較して、誘導開始３、５、７日目に有意に高いアルカリフォスファターゼ活性を示した。【００３４】
２．アリザリンレッドＳ染色
誘導開始０、７、１４、２１日目の細胞を１０％中性ホルマリン緩衝液で固定し、アリザリンレッドＳ染色液  （Ｗａｋｏ）を用いて１０分染色を行った。
その結果、図８に示すように、４０μｍ未満の細胞分画から得た脱分化脂肪細胞（図８、ｕｎｄｅｒ  ４０μｍ  Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｄｉｕｍ）は４０μｍ以上１００μｍ未満の細胞分画から得た脱分化脂肪細胞（図８、４０−１００μｍ  Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｄｉｕｍ）に比較して、誘導開始７日目に有意に強いアリザリンレッドＳ染色を示した。【００３５】
３．カルシウム定量試験
誘導開始０、７、１４、２１日目のカルシウム沈着量をＣａ−Ｅテストキットを用いて測定した。
その結果、図９に示すように、４０μｍ未満の成熟脂肪細胞から得た脱分化脂肪細胞（図９、ｕｎｄｅｒ  ４０μｍ  ＩＭ）は、４０μｍ以上１００μｍ未満の成熟脂肪細胞から得た脱分化脂肪細胞（図９、４０−１００μｍ  ＩＭ）に比較して、誘導開始７および２１日目に有意に多いカルシウム沈着量を示した。なお、増殖培地にて培養した脱分化脂肪細胞（図９、ｕｎｄｅｒ  ４０μｍ  ＧＭおよび４０−１００μｍ  ＧＭ）は、いずれも誘導開始２１日までカルシウムの沈着は見られなかった。【００３６】
従って、これら１．〜３．の結果より、４０μｍ未満の細胞分画から得られた脱分化脂肪細胞も、４０μｍ以上１００μｍ未満の細胞分画から得られた脱分化脂肪細胞もいずれも間葉系細胞に分化誘導できることが確認できた。そして、４０μｍ未満の細胞分画から得られた脱分化脂肪細胞の方が、間葉系細胞の誘導に有用であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明の提供により、単離する成熟脂肪細胞に損傷を与えることなく、効率的に成熟脂肪細胞を採取することが可能となる。本発明の提供により、大量に脱分化脂肪細胞を製造できるため、再生医療の細胞源として幅広く使用することも可能となる。
【図１】
0005991687.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図５】
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