(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
固形癌に苦しむ患者の生存時間を予測することを補助するための方法であって、
該患者から得られた腫瘍組織サンプル中の腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）でＣＤ２０＋Ｂ細胞の密度を決定すること、
該患者から得られた腫瘍組織サンプル中の腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）で、及び腫瘍の中心（ｃｔ）で、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞又はＣＤ４５ＲＯ＋記憶Ｔ細胞から選択される一つのさらなる細胞型の密度を決定すること、
各密度を所定の参照値と比較すること；及び
ａ）
ａ１）腫瘍の浸潤縁でのＣＤ２０＋Ｂ細胞の密度が、所定の参照値よりも高く；そして
ａ２）腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）での該さらなる細胞型の密度が、所定の参照値よりも高く；そして
ａ３）腫瘍の中心（ｃｔ）での該さらなる細胞型の密度が、所定の参照値よりも高い場合に良好な予後を；
ｂ）
ｂ１）腫瘍の浸潤縁でのＣＤ２０＋Ｂ細胞の密度が、所定の参照値よりも高く；そして
ｂ２）腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）での該さらなる細胞型の密度が、所定の参照値よりも低く；そして
ｂ３）腫瘍の中心（ｃｔ）での該さらなる細胞型の密度が、所定の参照値よりも高いか；又は
ｂ’１）腫瘍の浸潤縁でのＣＤ２０＋Ｂ細胞の密度が、所定の参照値よりも高く；そして
ｂ’２）腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）での該さらなる細胞型の密度が、所定の参照値よりも高く；そして
ｂ’３）腫瘍の中心（ｃｔ）での該さらなる細胞型の密度が、所定の参照値よりも低いか；
又は
ｂ’’１）腫瘍の浸潤縁でのＢ細胞の密度が、所定の参照値よりも低く；そして
ｂ’’２）腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）での該さらなる細胞型の密度が、所定の参照値よりも高く；そして
ｂ’’３）腫瘍の中心（ｃｔ）での該さらなる細胞型の密度が、所定の参照値よりも高いか；
又は
ｂｉ）腫瘍の浸潤縁でのＢ細胞の密度が、所定の参照値よりも高く；そして
ｂｉｉ）腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）での該さらなる細胞型の密度が、所定の参照値よりも低く；そして
ｂｉｉｉ）腫瘍の中心（ｃｔ）での該さらなる細胞型の密度が、所定の参照値よりも低いか；
又は
ｂ’ｉ）腫瘍の浸潤縁でのＢ細胞の密度が、所定の参照値よりも低く；そして
ｂ’ｉｉ）腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）での該さらなる細胞型の密度が、所定の参照値よりも低く；そして
ｂ’ｉｉｉ）腫瘍の中心（ｃｔ）での該さらなる細胞型の密度が、所定の参照値よりも高いか；
又は
ｂ’’ｉ）腫瘍の浸潤縁でのＢ細胞の密度が、所定の参照値よりも低く；そして
ｂ’’ｉｉ）腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）での該さらなる細胞型の密度が、所定の参照値よりも高く；そして
ｂ’’ｉｉｉ）腫瘍の中心（ｃｔ）での該さらなる細胞型の密度が、所定の参照値よりも低い場合に中等度の予後を；
ｃ）
ｃ１）腫瘍の浸潤縁でのＢ細胞の密度が、所定の参照値よりも低く；
ｃ２）腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）での該さらなる細胞型の密度が、所定の参照値よりも低く；そして
ｃ３）腫瘍の中心（ｃｔ）での該さらなる細胞型の密度が、所定の参照値よりも低い場合に不良な予後を提供することからなる工程を含む、方法。
【請求項２】
該さらなる細胞型が、ＣＤ８＋細胞傷害性細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該さらなる細胞型が、ＣＤ４５ＲＯ記憶Ｔ細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該固形癌が、結腸直腸癌である、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
結腸直腸癌に苦しむ患者の生存時間を予測することを補助するための方法であって、
ｉ）該患者から得られた腫瘍組織サンプル中の腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）でＣＤ２０＋Ｂ細胞の密度を決定すること、
ｉｉ）該密度を所定の参照値と比較すること；及び
ｉｉｉ）腫瘍の浸潤縁でのＢ細胞の密度が、所定の参照値よりも高い場合に良好な予後を；及び腫瘍の浸潤縁でのＢ細胞の密度が、所定の参照値よりも低い場合に不良な予後を提供することからなる工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、固形癌に苦しむ患者の生存時間の予後診断のための方法及びキットに関する。
【０００２】
発明の背景
癌は、免疫系と腫瘍の間での相互作用を含む複雑な疾患である１。結腸直腸癌における「高い」腫瘍内及び周囲の適応免疫反応と良好な予後との相関が、以前に報告された。対照的に、Ｔ細胞の「低い」密度は、不良な予後と相関した２−４。実際に、現在利用可能な全ての種々の臨床的及び組織病理学的基準の内５、６、免疫Ｔ細胞浸潤が、生存についての最も重要な予測基準であることが示された２、７−９。これは、また、免疫監視及び免疫編集（ｉｍｍｕｎｏｅｄｉｔｉｎｇ）のマウスモデルにより支持される１０−１２。細胞免疫学及び腫瘍生物学における最近の進歩は、養子Ｔ細胞治療への新たなアプローチを案内しており１３、有望な結果を伴う１４。しかし、依然として、患者において癌の転帰を予測するために医師を助けうる、他の信頼できる方法についての必要性がある。
【０００３】
発明の概要
本発明は、固形癌に苦しむ患者の生存時間を予測するための方法に関し、以下からなる工程を含む：ｉ）前記患者から得られた腫瘍組織サンプル中の腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）でＢ細胞の密度を決定すること、ｉｉ）前記密度を所定の参照値と比較すること、ならびにｉｉｉ）腫瘍の浸潤縁でのＢ細胞の密度が、所定の参照値よりも高い場合に良好な予後を、及び、腫瘍の浸潤縁でのＢ細胞の密度が、所定の参照値よりも低い場合に不良な予後を提供すること。
【０００４】
発明の詳細な説明
統合的分析を適用し、本発明者らは、腫瘍において最も生得的な及び適応性の免疫細胞亜集団を含む２８の異なる細胞型からの遺伝子発現及び細胞密度を研究した。本発明者らは、特定の腫瘍ステージに関連付けられた免疫細胞のクラスターを見出した。それらの内、Ｂ及びＴリンパ球は、コアネットワーク内で組織化され、腫瘍の進行及び好ましい予後と相関する最も顕著な免疫細胞である。特に、本発明者らは、腫瘍の浸潤縁においてＢ細胞の高い密度を伴う患者が、長期の無病生存を有するのに対し、腫瘍の浸潤縁においてＢ細胞の低い密度を伴う患者は、不良な予後を有することを実証した。腫瘍の少なくとも１つの領域（ｉｍ及び／又はｃｔ）におけるＢ細胞マーカーとＣＤ３、ＣＤ８、及びＣＤＲ４５ＲＯからなる群より選択される少なくとも１つのマーカーとの組み合わせは、また、患者のより良好な識別を与えた。
【０００５】
したがって、本発明は、固形癌に苦しむ患者の生存時間を予測するための方法に関し、以下からなる工程を含む：ｉ）前記患者から得られた腫瘍組織サンプル中での腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）でＢ細胞の密度を決定すること、ｉｉ）前記密度を所定の参照値と比較すること、ならびにｉｉｉ）腫瘍の浸潤縁でのＢ細胞の密度が、所定の参照値よりも高い場合に良好な予後を、及び、腫瘍の浸潤縁でのＢ細胞の密度が、所定の参照値よりも低い場合に不良な予後を提供すること。
【０００６】
一実施態様において、患者は、以下からなる群より選択される癌に苦しむ：副腎皮質癌、肛門癌、胆管癌（例えば、肺門（ｐｅｒｉｐｈｉｌａｒ）癌、下部胆管癌、肝内胆管癌）、膀胱癌、骨癌（例えば、骨芽細胞腫、骨軟骨腫（ｏｓｔｅｏｃｈｒｏｎｄｒｏｍａ）、血管腫、軟骨粘液線維腫、骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、骨の巨細胞腫、脊索腫、リンパ腫、多発性骨髄腫）、脳及び中枢神経系の癌（例えば、髄膜腫、星状細胞腫（ａｓｔｏｃｙｔｏｍａ）、乏突起膠腫、上衣腫、神経膠腫、髄芽腫、神経節膠腫、神経鞘腫、胚細胞腫、頭蓋咽頭腫）、乳癌（例えば、非浸潤性乳管癌、浸潤性腺管癌、浸潤性小葉癌、非浸潤性小葉癌、女性化乳房）、キャッスルマン病（例えば、巨大リンパ節過形成、血管胞状リンパ節過形成）、子宮頚癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌（例えば、子宮内膜腺癌、腺棘細胞腫（ａｄｅｎｏｃａｎｔｈｏｍａ）、乳頭状漿液性腺癌（ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｓｅｒｏｕｓ  ａｄｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、明細胞）、食道癌、胆嚢癌（粘液腺癌、小細胞癌）、消化管カルチノイド腫瘍（例えば、絨毛癌、破壊性絨毛腺腫）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓癌（例えば、腎細胞癌）、喉頭及び下咽頭癌、肝臓癌（例えば、血管腫、肝腺腫、限局性結節性過形成、肝細胞癌）、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌）、中皮腫、形質細胞腫、鼻腔及び副鼻腔癌（例えば、鼻腔神経芽細胞腫、正中肉芽腫）、上咽頭癌、神経芽腫、口腔及び咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫（例えば、胎児性横紋筋肉腫、歯槽横紋筋肉腫、多形性横紋筋肉腫）、唾液腺癌、皮膚癌（例えば、黒色腫、非黒色腫皮膚癌）、胃癌、精巣癌（例えば、セミノーマ、非セミノーマ胚細胞癌）、胸腺癌、甲状腺癌（例えば、濾胞癌、未分化癌、低分化癌、甲状腺髄様癌、甲状腺腫）、膣癌、外陰癌、及び子宮癌（例えば、子宮平滑筋肉腫）。
【０００７】
本明細書において使用する通り、用語「腫瘍組織サンプル」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、外科的腫瘍切除後又は生検のための組織サンプルの収集後を含む、除去された組織の小片又はスライスを包含する。組織腫瘍サンプルは、腫瘍を囲む浸潤縁を含むものとし、腫瘍の中心を含みうる又は含まないであろう。本明細書において使用する通り、「浸潤縁」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、腫瘍を囲む細胞環境を指す。腫瘍組織サンプルは、もちろん、腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）でＢ細胞の密度を決定する前に、種々の周知の収集後の調製及び保存技術（例えば、固定、保存、凍結など）に供することができる。典型的には、組織腫瘍サンプルは、パラフィン包埋又は凍結されうる。
【０００８】
本発明の方法は、無病生存（ＤＦＳ）又は全生存（ＯＳ）の持続のために特に適している。
【０００９】
本明細書において使用する通り、用語「Ｂ細胞」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、抗原について特異的な膜結合抗体を発現する骨髄において産生された細胞を指す。抗原との相互作用に続き、それは、抗原について特異的な抗体を分泌する形質細胞中に又は記憶Ｂ細胞中に分化する。「Ｂ細胞」及び「Ｂリンパ球」は、互換的に使用される。典型的には、Ｂ細胞は、それらの細胞表面でのＢ細胞マーカーの発現により特徴付けられる。本明細書において使用する通り、用語「Ｂ細胞マーカー」は、特定のＢ細胞について特異的な、Ｂ細胞上の表面分子を指す。本発明における使用のために適したＢ細胞マーカーは、しかし、限定されないが、表面ＩｇＧ、カッパ及びラムダ鎖、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９アルファ）、Ｉｇベータ（ＣＤ７９ベータ）、ＣＤ１９、Ｂ２２０（ＣＤ４５Ｒ）、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２７、又はＢ細胞について特異的な任意の他のＣＤ抗原を含む。典型的には、Ｂ細胞はＣＤ２０＋細胞である。
【００１０】
腫瘍の浸潤縁でのＢ細胞の密度を決定することは、当技術分野における任意の周知の方法により決定されうる。典型的には、そのような方法は、腫瘍組織サンプルを、Ｂ細胞と選択的に相互作用することが可能な少なくとも１つの選択的な結合薬剤と接触させることを含む。選択的な結合薬剤は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、抗体フラグメント、合成抗体、又は他のタンパク質特異的薬剤（例えば核酸又はペプチドアプタマーなど）でありうる。典型的には、選択的な結合薬剤は、Ｂ細胞マーカーのいずれか（例えばこれらの分子のいずれかについて特異的な抗体など）に結合する。好ましいＢ細胞選択的な結合薬剤は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、又はＣＤ３７に結合する。特に好ましいＢ細胞選択的な結合薬剤は、ＣＤ２０に結合する。いくつかの抗体が、先行技術において記載されており、多くの抗体が、また、実施例において記載する通りに商業的に利用可能である。Ｂ細胞の存在を顕微鏡又は自動解析システムにより検出可能にする抗体の検出のために、抗体を、検出可能な標識（例えば酵素、色素原、又は蛍光プローブなど）を用いて直接的にタグ付けしてもよい、又は検出可能な標識を用いてコンジュゲートされた二次抗体を用いて間接的に検出してもよい。
【００１１】
本発明に従った好ましい方法は、免疫組織化学である。典型的には、組織腫瘍サンプルを、最初に、目的の１つのＢ細胞マーカー（例えば、ＣＤ２０）に対して向けられた標識抗体を用いてインキュベートする。洗浄後、目的の前記Ｂ細胞マーカーに結合している標識抗体を、適切な技術により明らかにし、標識の種類に依存して、標識抗体（例えば、放射性、蛍光、又は酵素標識）により生じる。複数の標識を、同時に実施することができる。あるいは、本発明の方法では、増幅システム（染色シグナルを増強するため）及び酵素分子に共役された二次抗体を使用してもよい。そのような共役された二次抗体が、例えば、Dakoから商業的に利用可能である（EnVisionシステム）。対比染色を使用してもよい（例えば、Ｈ＆Ｅ、ＤＡＰＩ、Hoechst）。他の染色方法は、当業者に明らかであろう任意の適した方法又はシステム（自動、半自動、又は手動システムを含む）を使用して達成されうる。
【００１２】
本明細書において使用する通り、Ｂ細胞の密度は、組織サンプルの表面積の１単位当たりでカウントされる、これらの細胞の数として（例えば、腫瘍組織サンプルの表面積のcm2又はmm2当たりでカウントされるＢ細胞の数として）表現されうる。本明細書において使用する通り、Ｂ細胞の密度は、また、サンプルの１容積単位当たりのＢ細胞の数として（例えば、腫瘍組織サンプルのcm3当たりのＢ細胞の数として）表現されうる。本明細書において使用する通り、Ｂ細胞の密度は、また、全細胞（１００%に設定）当たりのＢ細胞のパーセンテージからなりうる。
【００１３】
比較のために使用される所定の参照値は、本明細書において以下に記載する通りに決定されうる「カットオブ（ｃｕｔ−ｏｆ）」値からなりうる。各々の生物学的マーカーについての各々の参照（「カットオフ」）値は、以下の工程を含む方法を行うことにより、予め決定してもよい：
ａ）癌患者からの腫瘍組織サンプルの収集を提供すること；
ｂ）工程ａ）で提供された各々の腫瘍組織サンプルについて、対応する癌患者についての実際の臨床転帰に関連する情報（即ち、無病生存（ＤＦＳ）又は全生存（ＯＳ）の持続）を提供すること；
ｃ）任意の定量値の連続を提供すること；
ｄ）工程ａ）で提供したコレクション中に含まれる各々の腫瘍組織サンプルについて、腫瘍の浸潤縁でＢ細胞密度を決定すること；
ｅ）工程ｃ）で提供した１つの特定の任意の定量値について、それぞれ２群において前記腫瘍組織サンプルを分類すること：（ｉ）定量値の前記連続中に含まれる前記の任意の定量値よりも低い前記密度についての定量値を示す組織腫瘍サンプルを含む第１群；（ｉｉ）定量値の前記連続中に含まれる前記の任意の定量値よりも高い前記密度についての定量値を示す組織腫瘍サンプルを含む第２群；それにより、腫瘍組織サンプルの２群は、前記の特定の定量値について得られ、それにおいて、各々の群の腫瘍組織サンプルは別々に列挙される；
ｆ）（ｉ）工程ｅ）で得られた定量値と（ｉｉ）工程ｆ）で定義された第１及び第２群中に含まれた腫瘍組織サンプルが由来する患者での実際の臨床転帰の間で統計的有意性を算出すること；
ｇ）工程ｄ）で提供されたすべての任意の定量値がテストされるまで、工程ｆ）及びｇ）を反復すること；
ｈ）前記の所定の参照値（「カットオフ」値）を、最も高い統計的有意性（最も有意な）が工程ｇ）で算出された任意の定量値からなるとして設定すること。
【００１４】
それは上に開示する通り、前記方法は、不良な及び良好な予後の間の識別を許可する単一「カットオフ」値の設定を許す。実際には、それは、本明細書における実施例中に開示する通り、高い統計的有意値（例えば、低いＰ値）が、一般的に、連続的な任意の定量値の範囲について（単一の任意の定量値についてだけでなく）得られる。このように、上の「カットオフ」値を決定する方法の１つの代替の実施態様において、最小の統計的有意値（有意性の最小閾値、例えば、最大閾値Ｐ値）を任意に設定し、工程ｇ）で算出した統計的有意値がより高い（より有意である、例えば、より低いＰ値）任意の定量値の範囲が保持され、それにより、定量値の範囲が提供される。定量値の前記範囲は、本発明に従った「カットオフ」値からなる。「カットオフ」値のこの特定の実施態様に従い、不良な又は良好な臨床転帰の予後を、工程ｉ）で決定したＢ細胞密度を、前記「カットオフ」値を区切る値の範囲と比較することにより決定することができる。特定の実施態様において、定量値の範囲からなるカットオフ値は、最も高い統計的有意値が見出される定量値（例えば、一般的には、見出される最小Ｐ値）を中心とする値の範囲からなる。
【００１５】
典型的には、所定の参照値は、全細胞（１００%で設定）当たりのＢ細胞密度値（例えば、ＣＤ２０＋細胞の密度）からなりうるが、それは、不良な予後（例えば、短い無病生存時間）と相関し、対照的に、良好な予後（例えば、長い無病生存時間）と相関するＢ細胞密度値からなりうる。
【００１６】
特定の実施態様において、比較工程は、それぞれ２群において細胞密度について測定した定量値の分類を含みうる：（ｉ）細胞密度についての定量値が、所定の対応する参照値よりも高い場合に「Ｈｉ」と呼ばれる第１群及び（ｉｉ）細胞密度についての定量値が、所定の対応する参照値よりも低い場合に「Ｌｏ」と呼ばれる第２群。実施例から、比較ステップの結果が「Ｈｉ」値からなる場合、次に、良好な予後が提供されることが流れる（図１）。逆に、比較ステップの結果が「Ｌｏ」値からなる場合、次に、不良な予後が提供される（図１）。スコアは、また、表１に従って決定されうる。
【００１７】
本発明の方法は、さらに、以下からなる工程を含みうる：ｉ）前記患者から得られた腫瘍組織サンプル中の腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）で及び／又は腫瘍の中心（ｃｔ）で少なくとも１つのさらなる細胞型の密度を決定すること、ならびにｉｉ）前記密度を所定の参照値と比較すること。
【００１８】
典型的には、さらなる細胞型は、Ｔ細胞からなる群より又はＴ細胞の特定のサブセット（細胞傷害性Ｔ細胞もしくは記憶Ｔ細胞を含む）の間で選択される。
【００１９】
本明細書において使用する通り、用語「Ｔ細胞」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、Ｔ細胞系統内の細胞（胸腺細胞、未熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞、及び同様のものを含む）を含む。典型的には、Ｔ細胞は、それらの細胞表面でのＴ細胞マーカーの発現により特徴付けられる。本明細書において使用する通り、用語「Ｔ細胞マーカー」は、特定のＴ細胞について特異的であるＴ細胞上の表面分子を指す。本発明における使用のために適したＴ細胞マーカーは、しかし、限定されないが、表面ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＯ、又はＴ細胞について特異的な任意の他のＣＤ抗原を含む。典型的には、Ｔ細胞はＣＤ３＋細胞である。
【００２０】
本明細書において使用する通り、用語「細胞傷害性Ｔ細胞」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、Ｔ細胞を指し、一度、ＭＨＣ−抗原複合体により活性化されると、タンパク質パーフォリンを放出し、それは標的細胞の原形質膜中に孔を形成する；これは、イオン及び水が標的細胞中に流れることを起こし、それが膨張し、最終的に溶解するようにする。細胞傷害性Ｔ細胞は、また、グランザイム（パーフォリン形成孔を介して標的細胞に入り、アポトーシス（細胞死）を誘導することができるセリンプロテアーゼ）を放出する。大半の細胞傷害性Ｔ細胞は、細胞表面上に存在するタンパク質ＣＤ８を有し、それは、クラスＩ  ＭＨＣ分子の部分に誘引される。典型的には、細胞傷害性Ｔ細胞はＣＤ８＋細胞である。
【００２１】
本明細書において使用する通り、用語「記憶Ｔ細胞」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、それらが最初に遭遇する抗原に特異的であり、二次免疫応答の間に求められうるＴ細胞のサブセットを指す。記憶Ｔ細胞は、ＣＤＲ４５ＲＯのそれらの細胞表面での発現により特徴付けられる。典型的には、記憶Ｔ細胞はＣＤ４５ＲＯ＋細胞である。
【００２２】
特定の実施態様において、本発明の方法は、さらに、以下からなる工程を含みうる：ｉ）前記患者から得られた腫瘍組織サンプル中の腫瘍の中心（ｃｔ）においてＴ細胞の密度を決定すること、及びｉｉ）前記密度を所定の参照値と比較すること。
【００２３】
特定の実施態様において、本発明の方法は、さらに、以下からなる工程を含みうる：ｉ）前記患者から得られた腫瘍組織サンプル中の腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）でＴ細胞の密度を決定すること、及びｉｉ）前記密度を所定の参照値と比較すること。
【００２４】
特定の実施態様において、本発明の方法は、さらに、以下からなる工程を含みうる：ｉ）前記患者から得られた腫瘍組織サンプル中の腫瘍の中心（ｃｔ）においてＴ細胞の密度を決定すること、ｉｉ）前記患者から得られた腫瘍組織サンプル中の腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）でＴ細胞の密度を決定すること、及びｉｉｉ）前記密度を所定の参照値と比較すること。
【００２５】
特定の実施態様において、本発明の方法は、さらに、以下からなる工程を含みうる：前記患者から得られた腫瘍組織サンプル中の腫瘍の中心（ｃｔ）において細胞傷害性Ｔ細胞の密度を決定すること、及びｉｉ）前記密度を所定の参照値と比較すること。
【００２６】
特定の実施態様において、本発明の方法は、さらに、以下からなる工程を含みうる：前記患者から得られた腫瘍組織サンプル中の腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）で細胞傷害性Ｔ細胞の密度を決定すること、及びｉｉ）前記密度を所定の参照値と比較すること。
【００２７】
特定の実施態様において、本発明の方法は、さらに、以下からなる工程を含みうる：ｉ）前記患者から得られた腫瘍組織サンプル中の腫瘍の中心（ｃｔ）において細胞傷害性Ｔ細胞の密度を決定すること、ｉｉ）前記患者から得られた腫瘍組織サンプル中の腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）で細胞傷害性Ｔ細胞の密度を決定すること、及びｉｉｉ）前記密度を所定の参照値と比較すること。
【００２８】
特定の実施態様において、本発明の方法は、さらに、以下からなる工程を含みうる：前記患者から得られた腫瘍組織サンプル中の腫瘍の中心（ｃｔ）において細胞傷害性Ｔ細胞の密度を決定すること、及びｉｉ）前記密度を所定の参照値と比較すること。
【００２９】
特定の実施態様において、本発明の方法は、さらに、以下からなる工程を含みうる：前記患者から得られた腫瘍組織サンプル中の腫瘍の中心（ｃｔ）において記憶Ｔ細胞の密度を決定すること、及びｉｉ）前記密度を所定の参照値と比較すること。
【００３０】
特定の実施態様において、本発明の方法は、さらに、以下からなる工程を含みうる：前記患者から得られた腫瘍組織サンプル中の腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）で記憶Ｔ細胞の密度を決定すること、及びｉｉ）前記密度を所定の参照値と比較すること。
【００３１】
特定の実施態様において、本発明の方法は、さらに、以下からなる工程を含みうる：ｉ）前記患者から得られた腫瘍組織サンプル中の腫瘍の中心（ｃｔ）において記憶Ｔ細胞の密度を決定すること、ｉｉ）前記患者から得られた腫瘍組織サンプル中の腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）で記憶Ｔ細胞の密度を決定すること、及びｉｉｉ）前記密度を所定の参照値と比較すること。
【００３２】
前記の追加の細胞密度について、比較工程は、また、それぞれ２群において各々の細胞密度について測定した定量値の分類を含みうる：（ｉ）細胞密度についての定量値が、所定の対応する参照値よりも高い場合に「Ｈｉ」と呼ばれる第１群及び（ｉｉ）細胞密度についての定量値が、所定の対応する参照値よりも低い場合に「Ｌｏ」と呼ばれる第２群。
【００３３】
Ｂ細胞密度について及び追加の密度について行われた分類の複合体であるスコアを、また、表１−９において描写する通りに算出し、比較工程の結果を理解することをより簡単にしうる。
【００３４】
本発明の方法は、現在使用されるステージング方法（例えば、ＵＩＣＣ−ＴＮＭ）よりも高い精度である。したがって、本発明の方法は、抗癌処置の有効性をモニタリングするために適用することができる。例えば、本発明は、薬剤を用いた被験者の処置の有効性をモニタリングするための方法を提供し、以下の工程を含む：（ｉ）本発明に従った方法を実施することにより、前記薬剤を投与する前に患者の生存時間を予測すること、（ｉｉ）本発明に従った方法を実施することにより、前記薬剤を投与した後に患者の生存時間を予測すること、（ｉｉｉ）工程ａ）の生存時間を、工程ｂ）の生存時間と比較すること、及びｉｖ）薬剤が、工程ｂ）の生存時間が工程ａ）の生存時間よりも高い場合、癌の処置について効果的であるとの結論を提供すること。結論がネガティブである場合において、次に、医師は、異なる投与量を処方することにより又は投与すべき別の薬剤を処方することにより、処置を適応しうる。本発明の方法は、また、患者が処置（例えば、免疫療法薬剤）への応答者と考えられるか否かを決定するために特に適しうる。典型的には、良好な予後が本発明の方法により提供された場合、患者が処置について適格でありうる。本発明の方法は、また、アジュバント治療（例えば、化学療法）が要求されるか否かを決定するために特に適しうる。例えば、良好な予後が本発明の方法により提供された場合、その後の抗癌処置は、任意のアジュバント化学療法を含まないことがある。しかし、不良な予後が本発明の方法により提供された場合、次に、患者は、アジュバント化学療法について適格でありうる。
【００３５】
本発明は、上に記載する細胞密度を決定するための手段を含む、本発明の方法を実施するためのキットを含む。例えば、本発明に従ったキットは、抗体の１つ又は組み合わせ又はセットを含みうるが、抗体の各々の種類は１つの細胞型に対して特異的に向けられる。適した手段は、抗体、抗体誘導体、抗体フラグメント、及び同様のものを含む。本発明のキットは、場合により、本発明の方法を実施するために有用な追加の構成成分を含みうる。例として、キットは、体液（例えば、緩衝液）、１つ又は複数のサンプルコンパートメント、本発明の方法の性能を記載する指示資料、及び同様のものを含みうる。
【００３６】
本発明を、さらに、以下の図面及び実施例により例示する。しかし、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するものとして任意の方法で解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】カプランマイヤー曲線は、腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）でのＣＤ２０細胞密度に従った無病生存の持続を例示する（テストコホート、ｎ＝１０７）。細胞の密度についてのカットオフ値を、コホートの最適ｐ値で定義した。
【図２】カプランマイヤー曲線は、腫瘍の中心（ｃｔ）でのＣＤ８細胞密度との組み合わせにおいて、腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）でのＣＤ２０細胞密度に従った無病生存の持続を例示する（テストコホート、ｎ＝１０７）。ＣＤ２０及びＣＤ８細胞の密度についてのカットオフ値を、コホートの最適ｐ値で定義した。
【図３】カプランマイヤー曲線は、腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）でのＣＤ８細胞密度との組み合わせにおいて、腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）でのＣＤ２０細胞密度に従った無病生存の持続を例示する（テストコホート、ｎ＝１０７）。ＣＤ２０及びＣＤ８細胞の密度についてのカットオフ値を、コホートの最適ｐ値で定義した。
【図４】カプランマイヤー曲線は、腫瘍の中心（ｃｔ）でのＣＤ３細胞密度との組み合わせにおいて、腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）でのＣＤ２０細胞密度に従った無病生存の持続を例示する（テストコホート、ｎ＝１０７）。ＣＤ２０及びＣＤ３細胞の密度についてのカットオフ値を、コホートの最適ｐ値で定義した。
【図５】カプランマイヤー曲線は、腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）でのＣＤ３細胞密度との組み合わせにおいて、腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）でのＣＤ２０細胞密度に従った無病生存の持続を例示する（テストコホート、ｎ＝１０７）。ＣＤ２０及びＣＤ３細胞の密度についてのカットオフ値を、コホートの最適ｐ値で定義した。
【図６】カプランマイヤー曲線は、腫瘍の中心（ｃｔ）でのＣＤ４５ＲＯ細胞密度との組み合わせにおいて、腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）でのＣＤ２０細胞密度に従った無病生存の持続を例示する（テストコホート、ｎ＝１０７）。ＣＤ２０及びＣＤ４５ＲＯ細胞の密度についてのカットオフ値を、コホートの最適ｐ値で定義した。
【図７】カプランマイヤー曲線は、腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）でのＣＤ４５ＲＯ細胞密度との組み合わせにおいて、腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）でのＣＤ２０細胞密度に従った無病生存の持続を例示する（テストコホート、ｎ＝１０７）。ＣＤ２０及びＣＤ４５ＲＯ細胞の密度についてのカットオフ値を、コホートの最適ｐ値で定義した。
【図８】カプランマイヤー曲線は、腫瘍の中心（ｃｔ）でのＣＤ８細胞密度との組み合わせにおいて、腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）でのＣＤ２０細胞密度に従った無病生存の持続を例示する（テストコホート、ｎ＝１０７）。ＣＤ２０及びＣＤ８細胞の密度についてのカットオフ値を、コホートの最適ｐ値で定義した。群「ｈｅｔ」は、浸潤縁（ｉｍ）でのＨｉ又はＬｏ  ＣＤ２０細胞密度と、腫瘍の中心（ｃｔ）での及び浸潤縁（ｉｍ）でのＨｉ又はＬｏ  ＣＤ８細胞との組み合わせの無病生存の持続を例示する。
【図９】カプランマイヤー曲線は、腫瘍の中心（ｃｔ）での及び浸潤縁（ｉｍ）でのＣＤ３細胞密度との組み合わせにおいて、腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）でのＣＤ２０細胞密度に従った無病生存の持続を例示する（テストコホート、ｎ＝１０７）。ＣＤ２０及びＣＤ３細胞の密度についてのカットオフ値を、コホートの最適ｐ値で定義した。群「ｈｅｔ」は、浸潤縁（ｉｍ）でのＨｉ又はＬｏ  ＣＤ２０細胞密度と、腫瘍の中心（ｃｔ）での及び浸潤縁（ｉｍ）でのＨｉ又はＬｏ  ＣＤ３細胞との組み合わせの無病生存の持続を例示する。
【図１０】カプランマイヤー曲線は、腫瘍の中心（ｃｔ）での及び浸潤縁（ｉｍ）でのＣＤ４５ＲＯ細胞密度との組み合わせにおいて、腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）でのＣＤ２０細胞密度に従った無病生存の持続を例示する（テストコホート、ｎ＝１０７）。ＣＤ２０及びＣＤ４５ＲＯ細胞の密度についてのカットオフ値を、コホートの最適ｐ値で定義した。群「ｈｅｔ」は、浸潤縁（ｉｍ）でのＨｉ又はＬｏ  ＣＤ２０細胞密度と、腫瘍の中心（ｃｔ）での及び浸潤縁（ｉｍ）でのＨｉ又はＬｏ  ＣＤ４５ＲＯ細胞との組み合わせの無病生存の持続を例示する。
【図１１】カプランマイヤー曲線は、腫瘍の浸潤縁（ｉｍ）でのＣＤ２０細胞密度に従った無病生存の持続を例示する（検証コホート、ｎ＝４１５）。細胞の密度についてのカットオフ値を、コホートの最適ｐ値で定義した。
【００３８】
実施例１：
材料＆方法：
患者：
Laennec/HEGP（Hopital Europpeen George Pompidou）Hospitalで一次切除を受けた結腸直腸癌を伴う患者を、無作為に選択した（Ｎ＝１０７）。検証コホート（Ｎ＝４１５）は、以前に記載された（Galon J, Costes A, Sanchez-Cabo F, et al. Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science 2006; 313: 1960-4.）。再発までの時間又は無病時間は、再発患者について手術の日から確認された腫瘍再発日まで及び無病患者について手術の日から最後の経過観察の日までの時間期間として定義した。安全なＷｅｂベースのデータベース（ＴＭＥ．ｄｂ）によって、臨床データ及びハイスループット技術からのデータを統合した（３６）。
【００３９】
組織マイクロアレイの構築
組織マイクロアレイ機器（Beecher Instruments, Alphelys, Plaisir, France）を使用して、本発明者らは、腫瘍の２つの異なる代表的な領域を選択した。腫瘍の中心（ｃｔ）及び浸潤縁（ｉｍ）を、パラフィン包埋組織ブロックからパンチングした（それぞれ０．６mm及び１mm直径）。組織マイクロアレイを構築し、免疫組織化学的染色のために５μm切片に切断した。
【００４０】
免疫組織化学
抗原回復及び内因性ペルオキシダーゼ活性のクエンチング後、切片を、６０分間にわたり室温で、ＣＤ３（ＳＰ７）、ＣＤ８（４Ｂ１１）、ＣＤ４５ＲＯ（ＯＰＤ４）、及びＣＤ２０に対する抗体（Ｌ２６；DAKO, Carpinteria, CA）を用いてインキュベートした。Envision+システム（二次抗体に共役させた酵素コンジュゲートポリマー骨格）及びＤＡＢ−クロモゲンを適用した（Dako, Copenhagen, Denmark）。組織切片を、Harrisのヘマトキシリンを用いて対比染色した。スライドを、画像分析ワークステーション（SpotBrowser, Alphelys, Plaisir, France）を使用して分析した。密度を、組織の表面積（mm2）当たりの陽性細胞の数として記録した。各々の重複について、平均密度を、さらなる統計分析のために使用した。
【００４１】
統計分析
カプランマイヤー曲線を使用し、無病生存に対する免疫パラメータの影響を評価した。これらのパラメータの有意性を、ログランク検定を用いて算出した。本発明者らは、中央値及び「最小Ｐ値」アプローチを使用して、患者の無病生存に基づくカットオフを適用し、患者をＨｉ群及びＬｏ群に分けた。対比較のために、ウィルコクソン順位和検定を使用した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意と考えた。全ての分析を、統計ソフトウェアＲ及びStatviewを用いて実施した。
【００４２】
結果：
腫瘍の中心及び浸潤縁からの組織マイクロアレイを使用したインサイチュ試験を実施した。Ｂ細胞（ＣＤ２０）、Ｔ細胞（ＣＤ３）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８）、及び記憶Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＯ）についての免疫染色を、専用の画像分析ワークステーションを用いて定量化した。腫瘍内の免疫細胞密度の正確な測定を、免疫細胞をカウントし、組織の表面積を測定することにより実施した。本発明者らは、Ｂ細胞密度に従って無病生存を評価した。カプランマイヤー曲線は、細胞（ＣＤ３）及び細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８）及び記憶Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＯ）密度との組み合わせ又は無しにおける患者の生存率に対するＣＤ２０の予後相関効果（pejorative effect）を例示した（図１〜図１０）。腫瘍の浸潤縁における高いＣＤ２０密度を伴う患者は、中心領域における低いＣＤ２０密度を伴う患者よりも良好な無病生存率を有した（図１）。ＣＤ２０及びＣＤ３、ＣＤ８及びＣＤＲ４５ＲＯマーカーの組み合わせは、非常に異なる転帰を伴う患者の群を定義した。例えば、ＣＤ２０  Ｌｏ（ｉｍ）ならびに、腫瘍の少なくとも１つの領域においてＣＤ３、ＣＤ８、及びＣＤＲ４５ＲＯからなる群より選択される少なくとも１つの「Ｌｏ」マーカーを伴う患者は、劇的な転帰を有していた。対照的に、ＣＤ２０  Ｈｉ（ｉｍ）ならびに、腫瘍の少なくとも１つの領域においてＣＤ３、ＣＤ８、及びＣＤＲ４５ＲＯからなる群より選択される少なくとも１つの「Ｈｉ」マーカーを伴う患者は、良好な転帰を有した（表１１）。本発明者らは、組織マイクロアレイにより４１５の結腸直腸癌患者の非依存的コホートを分析することにより、結果を検証した。同様の結果が見出された（図１１）。長い無病生存は、腫瘍の浸潤縁において高密度のＣＤ２０＋細胞（Ｈｉ  ＣＤ２０（ｉｍ））を含む腫瘍を伴う患者の間で観察された。腫瘍（ｉｍ及び／又はｃｔ）の少なくとも１つの領域においてＣＤ３、ＣＤ８、及びＣＤＲ４５ＲＯからなる群より選択される少なくとも１つの「Ｈｉ」マーカーを伴う患者は、最良の転帰を有した。同様のハザード比率及びＰ値が、両コホートにおいて見出された。
【００４３】
結論：
結論として、腫瘍の浸潤縁において高密度のＢ細胞を伴う患者は、長期の無病生存を有していたのに対し、腫瘍の浸潤縁において低密度のＢ細胞を伴う患者は、不良な予後を有していた。このマーカーと、腫瘍（ｉｍ及び／又はｃｔ）の少なくとも１つの領域においてＣＤ３、ＣＤ８、及びＣＤＲ４５ＲＯからなる群より選択される少なくとも１つのマーカーとの組み合わせは、また、患者のより良好な識別を与えた。免疫学的スコアは次に表１−１０に従って算出することができる。
【００４４】
【表１】
0005970560.tif 000002
【００４５】
【表２】
0005970560.tif 000003
【００４６】
【表３】
0005970560.tif 000004
【００４７】
【表４】
0005970560.tif 000005
【００４８】
【表５】
0005970560.tif 000006
【００４９】
【表６】
0005970560.tif 000007
【００５０】
【表７】
0005970560.tif 000008
【００５１】
【表８】
0005970560.tif 000009
【００５２】
【表９】
0005970560.tif 000010
【００５３】
【表１０】
0005970560.tif 000011
【００５４】
【表１１】
0005970560.tif 000012
【００５５】
参考文献：
本願を通して、種々の参考文献が、本発明が関係する技術分野の状態を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により、本明細書により組み入れられる。
【００５６】
【表１２】
0005970560.tif 000013
【図１】
0005970560.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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