(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、メロン黄化えそウイルス（ＭＹＳＶ）弱毒株の製造方法：
（ａ）ＭＹＳＶをタバコ属植物の葉に接種する工程、
（ｂ）ＭＹＳＶを接種した植物を３０〜３８℃で処理する工程、および
（ｃ）接種葉からＭＹＳＶ弱毒株を選抜、回収する工程。
【請求項２】
自然界での宿主植物以外の植物がニコチアナ  グルチノサである、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
配列番号１〜３で示すアミノ酸配列をそれぞれコードするＲＮＡを有するＭＹＳＶ弱毒株。
【請求項４】
以下の（１）〜（３）のＲＮＡ
（１）配列番号：１で示すアミノ酸配列の変異配列をコードするＲＮＡ、
（２）配列番号：２で示すアミノ酸配列の変異配列をコードするＲＮＡ、
および
（３）配列番号：３で示すアミノ酸配列の変異配列をコードするＲＮＡ
を有するＭＹＳＶ弱毒株であって、
ＲｄＲｐのＮ末端から１８９番目のアミノ酸がイソロイシン、２５５番目のアミノ酸がアラニン、１６４０番目のアミノ酸がグリシン、１６９２番目のアミノ酸がバリン、２０１５番目のアミノ酸がプロリンであり、ＧＮ／ＧＣタンパク質のＮ末端から８６番目のアミノ酸がグルタミン酸、１６３番目のアミノ酸がプロリン、３３６番目のアミノ酸がバリン、３７１番目のアミノ酸がフェニルアラニン、６２１番目のアミノ酸がリシン、９３５番目のアミノ酸がロイシンであり、ＮＳｓタンパク質のＮ末端から１５番目のアミノ酸がフェニルアラニンである、ＭＹＳＶ弱毒株。
【請求項５】
配列番号６〜８で示す塩基配列を含むＲＮＡを有するＭＹＳＶ弱毒株。
【請求項６】
以下の（１）〜（３）のＲＮＡ
（１）配列番号：６で示す塩基配列の変異配列を含むＲＮＡ、
（２）配列番号：７で示す塩基配列の変異配列を含むＲＮＡ、
および
（３）配列番号：８で示す塩基配列の変異配列を含むＲＮＡ
を有するＭＹＳＶ弱毒株であって、
前記ＲＮＡの塩基配列が、ＲｄＲｐのＮ末端から１８９番目のアミノ酸がイソロイシン、２５５番目のアミノ酸がアラニン、１６４０番目のアミノ酸がグリシン、１６９２番目のアミノ酸がバリン、２０１５番目のアミノ酸がプロリンであり、ＧＮ／ＧＣタンパク質のＮ末端から８６番目のアミノ酸がグルタミン酸、１６３番目のアミノ酸がプロリン、３３６番目のアミノ酸がバリン、３７１番目のアミノ酸がフェニルアラニン、６２１番目のアミノ酸がリシン、９３５番目のアミノ酸がロイシンであり、ＮＳｓタンパク質のＮ末端から１５番目のアミノ酸がフェニルアラニンである塩基配列である、ＭＹＳＶ弱毒株。
【請求項７】
ＳＡ０８−８であるＭＹＳＶ弱毒株。
【請求項８】
請求項３〜７のいずれか１項に記載のＭＹＳＶ弱毒株をウリ科植物に接種することを特徴とする、ウリ科植物における黄化えそ病の防除方法。
【請求項９】
ウリ科植物がキュウリ、メロン、スイカ、シロウリ、トウガン、ユウガオまたはニガウリから選択される、請求項８記載の防除方法。
【請求項１０】
請求項３〜７のいずれか１項に記載のＭＹＳＶ弱毒株を接種することによって得ることができる、黄化えそ病抵抗性のウリ科植物。
【請求項１１】
キュウリ、メロン、スイカ、シロウリ、トウガン、ユウガオまたはニガウリから選択される、請求項１０記載のウリ科植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メロン黄化えそウイルス弱毒株およびその製造方法、ならびに該弱毒株の接種によるウリ科植物における黄化えそ病の防除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キュウリやメロンなどのウリ科植物の栽培において、メロン黄化えそウイルス（Melon yellow spot virus；以下、ＭＹＳＶという場合がある）の感染によって引き起こされる黄化えそ病の発生は、作物の収量や品質の低下を招き、生産者に深刻な打撃を与えている。我が国では、現在までに関東以西の各地で発生が確認されている。高知県では、キュウリ露地栽培の９０％以上、施設栽培の約８０％の圃場で黄化えそ病が発生しており、その被害が大きくなっている。
【０００３】
黄化えそ病の発生を防ぐためには、ＭＹＳＶの媒介虫であるミナミキイロアザミウマの防除が一般的に行われている。殺虫剤の散布や防虫ネットなどによる侵入防止対策が行われているものの、ミナミキイロアザミウマは殺虫剤に対する感受性の低下が著しく、殺虫剤を散布しても十分な防除効果が得られない場合が多い。また、ミナミキイロアザミウマは微小な昆虫であるので、防虫ネットを利用して侵入防止対策を施したとしても、多くの場合、防虫ネットの隙間などから侵入してＭＹＳＶを媒介する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは、上記事情に鑑みて、ウリ科植物に予防的に接種することによって黄化えそ病に対する抵抗性を付与し、黄化えそ病の発生を抑制するＭＹＳＶ弱毒株を開発するべく、鋭意研究を行ってきた。ＭＹＳＶ強毒株を感染させたタバコ属植物を高温処理し、接種葉からＭＹＳＶを回収、選抜したところ、強毒株に対して干渉効果を有するＭＹＳＶ弱毒株を取得し、本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
すなわち、本発明は、下記に関するものである：
［１］以下の工程を含む、メロン黄化えそウイルス（ＭＹＳＶ）弱毒株の製造方法：
（ａ）ＭＹＳＶを自然界での宿主植物以外の植物の葉に接種する工程、
（ｂ）ＭＹＳＶを接種した植物を高温処理する工程、および
（ｃ）接種葉からＭＹＳＶ弱毒株を選抜、回収する工程；
［２］自然界での宿主植物以外の植物がニコチアナ  グルチノサである、［１］記載の製造方法；
［３］［１］または［２］記載の製造方法によって得ることができるＭＹＳＶ弱毒株；
［４］配列番号１〜３で示すアミノ酸配列をそれぞれコードするＲＮＡまたはその相補鎖を有する、［３］記載のＭＹＳＶ弱毒株；
［５］配列番号１〜３で示すアミノ酸配列をそれぞれコードするＲＮＡまたはその相補鎖の１つまたは複数が、
（ａ）配列番号１〜３で示すアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列をコードするＲＮＡまたはその相補鎖；
（ｂ）配列番号１〜３で示すアミノ酸配列または（ａ）のアミノ酸配列をコードするＲＮＡまたはその相補鎖と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＲＮＡまたはその相補鎖；および
（ｃ）配列番号１〜３で示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするＲＮＡまたはその相補鎖
からなる群より選択されるＲＮＡまたはその相補鎖である、［４］記載のＭＹＳＶ弱毒株；
［６］ＲｄＲｐのＮ末端から１８９番目のアミノ酸がイソロイシン、２５５番目のアミノ酸がアラニン、１６４０番目のアミノ酸がグリシン、１６９２番目のアミノ酸がバリン、２０１５番目のアミノ酸がプロリンであり、ＧＮ／ＧＣタンパク質のＮ末端から８６番目のアミノ酸がグルタミン酸、１６３番目のアミノ酸がプロリン、３３６番目のアミノ酸がバリン、３７１番目のアミノ酸がフェニルアラニン、６２１番目のアミノ酸がリシン、９３５番目のアミノ酸がロイシンであり、ＮＳｓタンパク質のＮ末端から１５番目のアミノ酸がフェニルアラニンである、［５］記載のＭＹＳＶ弱毒株；
［７］配列番号６〜８で示す塩基配列を含むＲＮＡまたはその相補鎖を有する、［３］記載のＭＹＳＶ弱毒株；
［８］配列番号６〜８で示す塩基配列を含むＲＮＡまたはその相補鎖の１つまたは複数が、
（ａ）配列番号６〜８で示す塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を含むＲＮＡまたはその相補鎖；
（ｂ）配列番号６〜８で示す塩基配列または（ａ）の塩基配列を含むＲＮＡまたはその相補鎖と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＲＮＡまたはその相補鎖；および
（ｃ）配列番号６〜８で示す塩基配列と６０％以上の同一性を有する塩基配列を含むＲＮＡまたはその相補鎖
からなる群より選択されるＲＮＡまたはその相補鎖である、［７］記載のＭＹＳＶ弱毒株；
［９］前記ＲＮＡまたはその相補鎖の塩基配列が、ＲｄＲｐのＮ末端から１８９番目のアミノ酸がイソロイシン、２５５番目のアミノ酸がアラニン、１６４０番目のアミノ酸がグリシン、１６９２番目のアミノ酸がバリン、２０１５番目のアミノ酸がプロリンであり、ＧＮ／ＧＣタンパク質のＮ末端から８６番目のアミノ酸がグルタミン酸、１６３番目のアミノ酸がプロリン、３３６番目のアミノ酸がバリン、３７１番目のアミノ酸がフェニルアラニン、６２１番目のアミノ酸がリシン、９３５番目のアミノ酸がロイシンであり、ＮＳｓタンパク質のＮ末端から１５番目のアミノ酸がフェニルアラニンとなるような塩基配列である、［８］記載のＭＹＳＶ弱毒株；
［１０］ＳＡ０８−８である、［３］記載のＭＹＳＶ弱毒株；
［１１］［３］〜［１０］のいずれかに記載のＭＹＳＶ弱毒株をウリ科植物に接種することを特徴とする、ウリ科植物における黄化えそ病の防除方法；
［１２］ウリ科植物がキュウリ、メロン、スイカ、シロウリ、トウガン、ユウガオまたはニガウリから選択される、［１１］記載の防除方法；
［１３］［３］〜［１０］のいずれかに記載のＭＹＳＶ弱毒株を接種することによって得ることができる、黄化えそ病抵抗性のウリ科植物；ならびに
［１４］キュウリ、メロン、スイカ、シロウリ、トウガン、ユウガオまたはニガウリから選択される、［１３］記載のウリ科植物。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、ＭＹＳＶ強毒株に対して干渉効果を有するＭＹＳＶ弱毒株を提供することができる。また、本発明のＭＹＳＶ弱毒株をウリ科植物に接種することによって、ウリ科植物に黄化えそ病に対する抵抗性を付与することができ、媒介虫の防除といった間接的な手段ではない、直接的な手段による黄化えそ病の防除が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、ＭＹＳＶ強毒野生株を接種したキュウリ（Ａ）およびＭＹＳＶ弱毒株を接種したキュウリ（Ｂ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、１つの態様において、メロン黄化えそウイルス（ＭＹＳＶ）弱毒株の製造方法に関するものである。本発明のＭＹＳＶ弱毒株の製造方法は、
（ａ）ＭＹＳＶを自然界での宿主植物以外の植物の葉に接種する工程、
（ｂ）ＭＹＳＶを接種した植物を高温処理する工程、および
（ｃ）接種葉からＭＹＳＶ弱毒株を選抜、回収する工程
を含んでもよい。本発明において、ＭＹＳＶは、ブニヤウイルス科に属するトスポウイルス（tospovirus）属に分類されるものであって、ミナミキイロアザミウマなどのアザミウマ類によって媒介されるものをいう。本明細書において、宿主植物に感染することによってＭＹＳＶによる病害、例えば、子葉にてえそ斑点、本葉にて葉脈透過、葉脈えそ、モザイク、果実にてモザイク、奇形などの病徴を生じる黄化えそ病などを引き起こすものをＭＹＳＶ強毒株といい、宿主植物に感染しても病害を引き起こさないか、または病害が抑制されているものをＭＹＳＶ弱毒株という。また、本発明により製造されたＭＹＳＶ弱毒株は、ＭＹＳＶ強毒株に対して干渉効果を有する。本発明によれば、宿主植物に感染することによって黄化えそ病などの病害を引き起こし得るＭＹＳＶ強毒株などのＭＹＳＶからＭＹＳＶ弱毒株を製造することができる。
【０００９】
本発明において、ＭＹＳＶ弱毒株を製造するためにＭＹＳＶを接種する植物は、ＭＹＳＶの自然界での宿主植物以外の植物であり、その種類は特に限定されるものではない。例示すれば、キュウリ、メロン、スイカ、シロウリ、ニガウリなどのウリ科植物以外の植物が挙げられ、例えば、ニコチアナ  グルチノサ（Nicotiana glutinosa）などのタバコ属植物であってもよい。また、ＭＹＳＶの接種は、自然界での宿主植物以外の植物のいずれの部位に対して行ってもよく、例えば、葉に対して接種してもよい。また、上記植物へのＭＹＳＶの接種は、当該分野で通常用いられる手段を用いて接種してもよく、例えば、カーボンランダム法などを用いて汁液接種してもよい。
【００１０】
ＭＹＳＶを接種した上記植物は、次いで、高温処理に供される。高温処理は、当該分野において病原性ウイルスから当該ウイルスの弱毒株を作出する場合に通常使用され得る条件下で行ってもよく、例えば、３０〜３８℃で５〜２０日間、好ましくは３２〜３６℃で１０〜１８日間、より好ましくは３４℃で１４日間栽培してもよい。
【００１１】
通常、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）をニコチアナ  グルチノサに接種すると、植物の抵抗性反応によって感染は接種部分のみに留まり、局部病斑を形成する。しかし、ＴＭＶを接種したニコチアナ  グルチノサに高温処理を行うと抵抗性反応が発揮されず、全身に感染が広がることが知られている（Oguni et al. 1983. Induction of attenuated strain of tobacco mosaic virus by serial passage through Nicotiana glutinosa plants alternately infected with the virus systemically at 30-38C and locally at 25C）。しかしながら、ＭＹＳＶをニコチアナ  グルチノサの葉に接種し、高温処理に供したところ、ＭＹＳＶの感染は全身に広がらず、接種葉に局部病斑を形成するのみであることを本発明者らは確認した。本発明において、高温処理に供した上記植物のいずれの部位からＭＹＳＶ弱毒株を選抜、回収してもよいが、好ましくは、この接種葉からＭＹＳＶ弱毒株を選抜、回収する。ＭＹＳＶ弱毒株の選抜、回収は、当該分野にて通常用いられる方法に従ってもよく、例えば、ニコチアナ  グルチノサの接種葉から回収したウイルスを、局部病斑を形成することが知られているセンニチコウに接種することによって、ウイルス株ごとに単離してもよい。さらに、センニチコウの局部病斑部分からウイルスを回収し、キュウリなどの宿主植物に接種し、ＭＹＳＶの感染が確認された宿主植物について、黄化えそ病の病徴の有無またはその程度を肉眼で確認し、ＭＹＳＶ弱毒株の選抜を行ってもよい。ＭＹＳＶ感染の有無は、当該分野において通常用いられる手段に従って確認すればよく、例えば、ＭＹＳＶに対する血清を用いたＥＬＩＳＡなどによって確認してもよい。また、ＭＹＳＶ弱毒株の選抜・回収する工程は、１回行うだけでもよいが、ＭＹＳＶによる病害を全く示さないか、または病害がより抑制された所望のＭＹＳＶ株が得られるまで適宜繰り返してもよい。
【００１２】
また、本発明は、別の態様において、本発明の製造方法によって得ることができるＭＹＳＶ弱毒株に関する。本発明のＭＹＳＶ弱毒株は、宿主植物に感染してもＭＹＳＶによる病害、例えば、子葉でのえそ斑点、本葉での葉脈透過、葉脈えそ、モザイク、もしくは果実でのモザイク、奇形などの黄化えそ病に特有の病徴を引き起こさないか、または病害が抑制されているので、本発明のＭＹＳＶ弱毒株をウリ科植物などの植物に接種した場合、植物の収量および品質に重大な影響を及ぼさない。一方で、本発明のＭＹＳＶ弱毒株はＭＹＳＶ強毒株に対して干渉効果を有するので、本発明のＭＹＳＶ弱毒株は、接種した植物にＭＹＳＶによる病害に対する抵抗性を付与することができる。
【００１３】
また、本発明のＭＹＳＶ弱毒株は、配列番号１〜３で示すアミノ酸配列をそれぞれコードするＲＮＡまたはその相補鎖を有するものでもよい。あるいは、本発明のＭＹＳＶ弱毒株は、配列番号１〜３で示すアミノ酸配列をそれぞれコードするＲＮＡまたはその相補鎖の１つまたは複数が、（ａ）配列番号１〜３で示すアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列をコードするＲＮＡまたはその相補鎖、（ｂ）配列番号１〜３で示すアミノ酸配列または（ａ）のアミノ酸配列をコードするＲＮＡまたはその相補鎖と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＲＮＡまたはその相補鎖、および（ｃ）配列番号１〜３で示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするＲＮＡまたはその相補鎖からなる群より選択されるＲＮＡまたはその相補鎖である、上記ＭＹＳＶ弱毒株でもよい。
詳細には、本発明のＭＹＳＶ弱毒株は、配列番号１〜３で示すアミノ酸配列をそれぞれコードするＲＮＡまたはその相補鎖を有するものであるか、あるいは、配列番号１〜３で示すアミノ酸配列をそれぞれコードするＲＮＡまたはその相補鎖の１つまたは複数（例えば、２もしくは３）が、（ａ）配列番号１〜３で示すアミノ酸配列において、１または数個（例えば、２、３、４、５、６、７、８もしくは９個）のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列をコードするＲＮＡまたはその相補鎖；（ｂ）配列番号１〜３で示すアミノ酸配列または（ａ）のアミノ酸配列をコードするＲＮＡまたはその相補鎖と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＲＮＡまたはその相補鎖；および、（ｃ）配列番号１〜３で示すアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％）の同一性を有するアミノ酸配列をコードするＲＮＡまたはその相補鎖からなる群より選択されるＲＮＡまたはその相補鎖である、上記ＭＹＳＶ弱毒株でもよい。なお、上記ＭＹＳＶ弱毒株において、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）のＮ末端から１８９番目のアミノ酸はイソロイシン、２５５番目のアミノ酸はアラニン、１６４０番目のアミノ酸はグリシン、１６９２番目のアミノ酸はバリン、２０１５番目のアミノ酸はプロリンであり、ＧＮ／ＧＣタンパク質のＮ末端から８６番目のアミノ酸はグルタミン酸、１６３番目のアミノ酸はプロリン、３３６番目のアミノ酸はバリン、３７１番目のアミノ酸はフェニルアラニン、６２１番目のアミノ酸はリシン、９３５番目のアミノ酸はロイシンであり、ＮＳｓタンパク質のＮ末端から１５番目のアミノ酸はフェニルアラニンであってもよい。
【００１４】
また、本発明のＭＹＳＶ弱毒株は、配列番号６〜８で示す塩基配列含むＲＮＡまたはその相補鎖を有するものであってもよい。あるいは、本発明のＭＹＳＶ弱毒株は、配列番号６〜８で示す塩基配列を含むＲＮＡまたはその相補鎖の１つまたは複数が、（ａ）配列番号６〜８で示す塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を含むＲＮＡまたはその相補鎖、（ｂ）配列番号６〜８で示す塩基配列または（ａ）の塩基配列を含むＲＮＡまたはその相補鎖と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＲＮＡまたはその相補鎖、および（ｃ）配列番号６〜８で示す塩基配列と６０％以上の同一性を有する塩基配列を含むＲＮＡまたはその相補鎖からなる群より選択されるＲＮＡまたはその相補鎖である、上記ＭＹＳＶ弱毒株でもよい。
詳細には、本発明のＭＹＳＶ弱毒株は、配列番号６〜８で示す塩基配列含むＲＮＡまたはその相補鎖を有するものであるか、あるいは、配列番号６〜８で示す塩基配列を含むＲＮＡまたはその相補鎖の１つまたは複数（例えば、２もしくは３）が、（ａ）配列番号６〜８で示す塩基配列において、１または数個（例えば、６、９、１２、１５、１８、２１、２４もしくは２７個）の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を含むＲＮＡまたはその相補鎖、（ｂ）配列番号６〜８で示す塩基配列または（ａ）の塩基配列を含むＲＮＡまたはその相補鎖と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＲＮＡまたはその相補鎖、および（ｃ）配列番号６〜８で示す塩基配列と６０％以上（好ましくは、７０％、８０％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％）の同一性を有する塩基配列を含むＲＮＡまたはその相補鎖からなる群より選択されるＲＮＡまたはその相補鎖である、上記ＭＹＳＶ弱毒株でもよい。なお、上記ＭＹＳＶ弱毒株において、前記ＲＮＡまたはその相補鎖の塩基配列は、ＲｄＲｐのＮ末端から１８９番目のアミノ酸がイソロイシン、２５５番目のアミノ酸がアラニン、１６４０番目のアミノ酸がグリシン、１６９２番目のアミノ酸がバリン、２０１５番目のアミノ酸がプロリンであり、ＧＮ／ＧＣタンパク質のＮ末端から８６番目のアミノ酸がグルタミン酸、１６３番目のアミノ酸がプロリン、３３６番目のアミノ酸がバリン、３７１番目のアミノ酸がフェニルアラニン、６２１番目のアミノ酸がリシン、９３５番目のアミノ酸がロイシンであり、ＮＳｓタンパク質のＮ末端から１５番目のアミノ酸がフェニルアラニンとなるような塩基配列であってもよい。
【００１５】
上記ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーションおよび／またはハイブリダイゼーション後の洗浄に用いる溶液の組成、温度などによって決定され得る条件であって、当業者によって適宜設定され得る。例えば、J. Sambrook et al.,“Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition”, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されるような条件が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液（Denhardt's solution）、０．５％  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、５０℃、より好ましくは６８℃にてプローブとハイブリダイズさせた後で、２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの溶液中で室温にて洗浄してもよいが、ストリンジェンシーを増大させるために、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄してもよい。あるいは、ハイブリダイズさせた後で、６５℃で、２×ＳＳＰＥ（Frederick M. Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, 1987, John Wiley & Sons, Hoboken NJ.に記載）および０．１％  ＳＤＳを含む溶液中で１５分を２回、次いで０．５×ＳＳＰＥおよび０．１％  ＳＤＳを含む溶液中でさらに１５分を２回、さらに０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％  ＳＤＳを含む溶液中で１５分を２回洗浄してもよく、あるいは、６５℃で、２×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳおよびホルムアミド（５〜５０％）を含む溶液中で１５分を２回、０．５×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳおよびホルムアミド（５〜５０％）を含む溶液中でさらに１５分を２回、次いで０．１×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳおよびホルムアミド（５〜５０％）を含む溶液中で１５分を２回洗浄を行ってもよい。
【００１６】
上記アミノ酸配列および塩基酸配列の相同性は、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング（株）製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（（株）ジェネティクス製）を用いて測定することができる。
【００１７】
また、本発明のＭＹＳＶ弱毒株は、本明細書においてＳＡ０８−８と命名するウイルス株であってもよい。なお、このＳＡ０８−８は、特許法施行規則第２７条の３の規定に従い、本出願人が分譲可能であることを保証する。
【００１８】
また、本発明は、さらなる態様において、本発明のＭＹＳＶ弱毒株をウリ科植物に接種することを特徴とする、ウリ科植物における黄化えそ病の防除方法に関する。上述のように、本発明のＭＹＳＶ弱毒株は、接種によって、接種した植物に黄化えそ病などのＭＹＳＶによる病害に対する抵抗性を付与することができる。そのため、本発明のＭＹＳＶ弱毒株を予防的に接種することによって、黄化えそ病などのＭＹＳＶによる病害を予防または軽減することができる。ＭＹＳＶ弱毒株を接種する植物としては、キュウリ、メロン、スイカ、シロウリ、トウガン、ユウガオ、ニガウリなどのウリ科植物が挙げられる。
【００１９】
さらに、本発明は、もう１つの態様において、本発明のＭＹＳＶ弱毒株を接種することによって得ることができる、黄化えそ病抵抗性のウリ科植物に関する。上述のように、本発明のＭＹＳＶ弱毒株はＭＹＳＶ強毒株に対して干渉効果を有するので、ＭＹＳＶを接種することによって、接種した植物に黄化えそ病などのＭＹＳＶによる病害に対する抵抗性を付与することができる。本発明によってＭＹＳＶによる病害に対する抵抗性を付与し得る植物としては、キュウリ、メロン、スイカ、シロウリ、トウガン、ユウガオ、ニガウリなどのウリ科植物が挙げられる。
【００２０】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的かつ詳細に説明するが、実施例はあくまで例示説明であって、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２１】
ＭＹＳＶ弱毒株の作出
植物ウイルスから当該ウイルスの弱毒株を作出する方法として、低温処理、紫外線照射または局部病斑形成植物への連続接種などの方法が当該分野において知られている。ＭＹＳＶ弱毒株を作成するにあたり、これらの方法を試みた。しかしながら、病原性の低い弱毒株を選抜することはできなかった。植物ウイルス弱毒株の作出方法として、高温処理を用いる方法も知られている。しかし、通常行われている全身感染寄主植物（ＭＹＳＶの場合、キュウリが該当する）を利用した高温処理では、病原性の低いＭＹＳＶ弱毒株を選抜することはできなかった。また、タバコモザイクウイルス弱毒株の作出方法として知られている局部感染寄主植物（ニコチアナ  グルチノサ（Nicotiana glutinosa））に接種して高温処理をし、その上位葉に移行したウイルスから選抜する方法は、ＭＹＳＶが上位葉へ移行しないので適用不可能であった。
【００２２】
そこで、キュウリに黄化えそ症状を発現するＭＹＳＶ強毒株（Ｃ９５Ｓ）をタバコ属植物の一種であるニコチアナ  グルチノサにカーボンランダム法によって汁液接種し、３４℃で１４日間高温処理した。高温処理した後で、接種葉を磨砕することによって、接種葉からウイルスを回収した。回収したウイルスを含む汁液を、センニチコウに汁液接種した。接種葉に形成された局部病斑から単離したウイルスをキュウリに接種して、病原性の低いＭＹＳＶ弱毒株の選抜を繰り返した。センニチコウを用いたウイルス単離を４回、キュウリによる選抜を１３回行った。子葉でのえそ斑点、および本葉での葉脈透過、葉脈えそ、モザイクなどの黄化えそ病に特有の病徴を呈さないキュウリについて、ＭＹＳＶ感染の有無を、ＥＬＩＳＡ法によって確認したところ、キュウリに対して病原性を示さないＭＹＳＶ弱毒株（ＳＡ０８−８）を選抜した。なお、上記ウイルス株は、特許法施行規則第２７条の３の規定に従い、本出願人が分譲可能であることを保証する。
【実施例２】
【００２３】
ＭＹＳＶ弱毒株の接種による黄化えそ病抵抗性の付与
１次接種としてＭＹＳＶ弱毒株（ＳＡ０８−８）をキュウリ（品種：ＺＱ−７）の子葉に汁液接種し、その２２日後（本葉３〜４枚展開期）にＭＹＳＶ弱毒株の感染を確認した。次いで、２次接種として強毒株のＭＹＳＶ（Ｃ０５Ｔ）を最頂葉に接種した。比較のために、１次接種のみで２次接種を行わなかったものと、１次接種せずに２次接種のみ行ったものも調製した。
その結果を、表１に示す。１次接種としてＭＹＳＶ弱毒株を接種したものでは、２次接種の有無に関わらず、一部の株で軽微なモザイク症状が認められたにとどまったのに対し、１次接種せずに２次接種のみ行ったものでは、ほとんどの株に強い黄化えそ症状が認められた。
【００２４】
【表１】
0005870417.tif 000002
【実施例３】
【００２５】
ＭＹＳＶ弱毒株のゲノムＲＮＡ配列決定
Takeuchi et al. (2009) First report of Melon yellow spot virus infecting balsam pear ( Momordica charantia L.) in Japan，Journal of General Plant Pathology Volume 75, 154-156に記載された方法に準じてＭＹＳＶ弱毒株（ＳＡ０８−８）のゲノムＲＮＡ配列を決定し、アミノ酸配列を推定した。親ウイルス株Ｃ９５Ｓおよび強毒野生株Ｃ０５Ｔと比較した結果、ＲＮＡ依存ＲＮＡ複製酵素（ＲｄＲｐ）で５か所、ＧＮ／ＧＣタンパク質で６か所およびＮＳｓタンパク質で１か所、ＳＡ０８−８に特徴的なアミノ酸が確認された。
【００２６】
【表２】
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【実施例４】
【００２７】
現地実証試験における干渉効果の確認（ハウスでの防除試験）
弱毒ウイルス（ＳＡ０８−８）を子葉に汁液接種したキュウリ（品種：ＺＱ−７）の苗と、無接種のキュウリの苗とをビニルハウスで栽培し、強毒ウイルスに対する干渉効果を調査した。ハウスには伝染源として強毒系統のＭＹＳＶ（Ｔ１−１３）を接種したキュウリ苗を同時に定植した。葉の症状について０〜４の５段階（０：無病徴、１：生育に影響を及ぼさない程度のモザイク・退緑、２：えそ症状、３：葉全面のえそ、４：枯死）で調査し、発病の推移をみた。その結果を、表３に示す。無接種キュウリでは９月上旬より病徴が認められ始め、生育に悪影響を及ぼすと考えられる指数２以上の症状が徐々に増加したが、弱毒ウイルス接種キュウリでは、初期から軽度の症状が見られたものの、栽培終了時まで指数２以上の症状はほとんど認められなかった。なお、強毒ウイルスを接種したキュウリでは、栽培初期から強いウイルス症状が認められた。このことから、弱毒ウイルスを接種することで強毒ウイルスに対する干渉効果が発揮され、黄化えそ病の予防が可能であることが明らかとなった。
【００２８】
【表３】
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【実施例５】
【００２９】
現地実証試験における干渉効果の確認（強毒発生圃場での暴露試験）
弱毒ウイルス（ＳＡ０８−８）を子葉に汁液接種したキュウリ（品種：ＺＱ−７）の苗と、無接種のキュウリの苗とを、強毒系統のＭＹＳＶが発生している圃場に持ち込み、７日後に回収して施設内で栽培し、回収２０日後の葉の症状を０〜４の５段階（０：無病徴、１：生育に影響を及ぼさない程度のモザイク・退緑、２：えそ症状、３：葉全面のえそ、４：枯死）で調査した。その結果を、表４に示す。無接種のキュウリでは全株で程度３の激しい症状が発現したが、弱毒ウイルス接種株では生育に問題ないと考えられる程度１の症状が認められたのみであった。このことから、弱毒ウイルスを接種することで強毒ウイルスに対する干渉効果が発揮され、強毒ウイルスによる症状の発現を抑えることが可能であることが明らかとなった。
【００３０】
【表４】
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【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明により、ＭＹＳＶ強毒株に対して干渉効果を有するＭＹＳＶ弱毒株を提供することができる。また、本発明のＭＹＳＶ弱毒株をウリ科植物に接種することによって、ウリ科植物に黄化えそ病に対する抵抗性を付与することができ、媒介虫の防除といった間接的な手段ではない、直接的な手段による黄化えそ病の防除が可能となる。
【配列表フリーテキスト】
【００３２】
SEQ ID NO: 1: RNA dependent RNA polymerase amino acid sequence of Melon yellow spot virus
SEQ ID NO: 2: GN/GC protein amino acid sequence of Melon yellow spot virus
SEQ ID NO: 3: NSs amino acid sequence of Melon yellow spot virus
SEQ ID NO: 4: NSm amino acid sequence of Melon yellow spot virus
SEQ ID NO: 5: Nucleocapsid amino acid sequence of Melon yellow spot virus
SEQ ID NO: 6: RNA dependent RNA polymerase gene-encoding sequence of Melon yellow spot virus
SEQ ID NO: 7: GN/GC protein gene-encoding sequence of Melon yellow spot virus
SEQ ID NO: 8: NSs gene-encoding sequence of Melon yellow spot virus
SEQ ID NO: 9: NSm gene-encoding sequence of Melon yellow spot virus
SEQ ID NO: 10: Nucleocapsid gene-encoding sequence of Melon yellow spot virus
【図１】
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【配列表】
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