(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
共有結合された第１および第２のドメインを含む分離した組み換え型ＭＨＣポリペプチド、およびジスルフィド結合によってのみ組み換え型ＭＨＣポリペプチドの第１ドメインに共有結合された抗原決定基、を含む組成物であって、ここで、
第１ドメインは、哺乳動物のＭＨＣクラスＩＩβ１ドメインであり、第２ドメインは、哺乳動物のＭＨＣクラスＩＩα１ドメインであり、第２ドメインのアミノ末端は、第１ドメインのカルボキシル末端に共有結合され、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、α２またはβ２のドメインを含まず、
前記ジスルフィド結合は、前記抗原決定基におけるシステイン残基と、前記組み換え型ＭＨＣポリペプチドの前記第１ドメインにおけるシステイン残基との間のジスルフィド結合を含み、
前記抗原決定基がＭＯＧ３５−５５、インスリンＢ：９−２３又はＰＬＰ１３９−１５１を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記組み換え型ＭＨＣポリペプチドの前記第１ドメインは、β１ドメインを含み、前記システイン残基は、システイン１７、システイン７９、またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組み換え型ＭＨＣポリペプチドの前記第１ドメインと前記第２ドメインとの間の前記共有結合は、ペプチドリンカーを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ペプチドリンカーは、長さが少なくとも６のアミノ酸であることを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗原決定基におけるシステイン残基は、非自然発生のシステインを含み、前記組み換え型ＭＨＣポリペプチドの前記第１ドメインにおける前記システイン残基は、非自然発生のシステイン、またはその組み合わせを含むことを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記組み換え型ＭＨＣポリペプチドは、溶液中の凝集を減少させる可能性を有することを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記組み換え型ＭＨＣポリペプチドは、１つ以上の疎水性の残基の、極性または荷電の残基との置換を含む、ＤＲ２ ＭＨＣ β１α１ポリペプチドを含み、ここで、１つ以上の残基は、配列番号１１の、Ｖ１０２、Ｉ１０４、Ａ１０６、Ｆ１０８、およびＬ１１０から選択され、それによって、修飾されていない組み換え型ＭＨＣポリペプチドと比較して、溶液中の凝集が減少することを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
薬学的に許容可能な担体をさらに含むことを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
被験体の、自己免疫性疾患、網膜疾患、ブドウ膜炎、卒中、および認知障害から成る群から選択される障害、または物質依存によって誘発された神経精神障害を処置または阻害するための薬剤の製造における請求項１乃至８のいずれかに記載の組成物の使用であって、該組成物は、その有効な量を被験体に投与することに適していることを特徴とする使用。
【請求項１０】
前記自己免疫疾患は、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、セリアック病、乾癬、全身性紅斑性狼瘡、悪性貧血、重症筋無力症、視神経炎、およびアジソン病から成る群から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
被験体のＩ型糖尿病を処置または阻害するための薬剤の製造における組成物の使用であって、該組成物は、共有結合された第１および第２のドメインを含む分離した組み換え型ＭＨＣポリペプチド、およびジスルフィド結合によってのみ組み換え型ＭＨＣポリペプチドの第１ドメインに共有結合された抗原決定基を含み、および該組成物は、その有効な量を被験体に投与することに適しており、ここで、前記第１ドメインは、哺乳動物のＭＨＣクラスＩＩβ１ドメインであり、前記第２ドメインは、哺乳動物のＭＨＣクラスＩＩα１ドメインであり、前記第２ドメインのアミノ末端は、前記第１ドメインのカルボキシル末端に共有結合され、前記ＭＨＣクラスＩＩ分子は、α２またはβ２のドメインを含まず、前記ジスルフィド結合は、前記抗原決定基におけるシステイン残基と、前記組み換え型ＭＨＣポリペプチドの前記第１ドメインにおけるシステイン残基との間のジスルフィド結合を含み、前記抗原決定基がインスリンＢ：９−２３又はインスリンＢ：１６−２３を含むことを特徴とする使用。
【請求項１２】
前記インスリンＢ：９−２３は、配列番号１、３、および７乃至９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
組成物を生成する方法であって、該方法は、
ジスルフィド結合のみが抗原決定基と組み換え型ＭＨＣポリペプチドとの間で形成されるのに十分な条件下で、抗原決定基と、共有結合された第１および第２のドメインを含む分離した組み換え型ＭＨＣポリペプチドとを接触させる工程、それにより、組成物をもたらす工程を含み、ここで、
前記第１ドメインは、哺乳動物のＭＨＣクラスＩＩβ１ドメインであり、前記第２ドメインは、哺乳動物のＭＨＣクラスＩＩα１ドメインであり、前記第２ドメインのアミノ末端は、前記第１ドメインのカルボキシル末端に共有結合され、前記ＭＨＣクラスＩＩ分子は、α２またはβ２のドメインを含まず、
前記ジスルフィド結合は、前記抗原決定基におけるシステイン残基と、前記組み換え型ＭＨＣポリペプチドの前記第１ドメインにおけるシステイン残基との間のジスルフィド結合を含み、前記抗原決定基がＭＯＧ３５−５５、インスリンＢ：９−２３又はＰＬＰ１３９−１５１を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
ジスルフィド結合が形成されるのに十分な条件は、１００ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＳＤＳ、および０．０１％のＮａＮ３において３７℃で６０時間、抗原決定基と組み換え型ＭＨＣポリペプチドとを接触させる工程を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の組成物を生成するためのキットであって、該キットは、
組み換え型ＭＨＣポリペプチド、および
組み換え型ＭＨＣポリペプチドと抗原決定基との間のジスルフィド結合の形成に十分な条件を提供するための１つ以上の成分を含む溶液、を含み、
前記ジスルフィド結合は、前記抗原決定基におけるシステイン残基と、前記組み換え型ＭＨＣポリペプチドの前記第１ドメインにおけるシステイン残基との間のジスルフィド結合を含み、前記抗原決定基がＭＯＧ３５−５５、インスリンＢ：９−２３又はＰＬＰ１３９−１５１を含むことを特徴とするキット。
【請求項１６】
前記溶液は、１００ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＳＤＳ、および０．０１％のＮａＮ３を含むことを特徴とする、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
抗原決定基をさらに含むことを特徴とする、請求項１５または請求項１６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願への相互参照）＞
本出願は、２０１０年９月３日に出願の、米国仮特許出願第６１／３８０，１９１号の利益を主張し、その全体が引用によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
＜政府支援の承認＞
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた、許可番号ＡＩ４３９６０およびＤＫ０６８８８１の下、政府支援によってなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、ペプチド抗原に共有結合された組織適合性主複合体（ＭＨＣ）ポリペプチドを含む組成物、および、例えば、免疫反応を調節するために、これらの組成物を利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
哺乳動物における特異性抗原に対する免疫反応の開始は、Ｔ細胞へのその抗原の提示によってもたらされる。抗原は、主要組織適合（ＭＨＣ）複合体との関連で、Ｔ細胞へと提示される。ＭＨＣ複合体は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に位置付けられ；ＭＨＣの三次元構造は、提示された抗原が適合する、溝または間隙を含む。Ｔ細胞上の適切な受容体が、必要な共刺激シグナルがある状態でＡＰＣ上のＭＨＣ／抗原複合体と相互作用するとき、Ｔ細胞は、刺激され、細胞毒性Ｔ細胞の機能の誘発、Ｂ細胞活性の誘発、およびサイトカイン生成の刺激を含む、免疫系の活性化事象の特徴がはっきりしたカスケードの様々な態様を引き起こす。
【０００５】
哺乳動物において、２つの基本的なクラスのＭＨＣ分子、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩがある。両方のクラスは、２つの別々のタンパク質の関連によって形成された大きなタンパク質複合体である。各クラスは、細胞膜へ複合体を固着する膜貫通ドメインを含む。ＭＨＣクラスＩ分子は、２つの非共有結合した（ｎｏｎ−ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）タンパク質、α鎖およびβ２ミクログロブリンから形成される。α鎖は、３つの異なるドメイン、α１、α２、およびα３を含む。α１およびα２のドメインの三次元構造は、抗原がＴ細胞への提示に適合する、溝を形成する。α３ドメインは、ＡＰＣの細胞膜へとα鎖を固着する膜貫通配列を含む、免疫グロブリンフォールド様のドメイン（Ｉｇ−ｆｏｌｄ ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ）である。抗原に関係するときの（および適切な共刺激シグナルのある状態での）ＭＨＣクラスＩ複合体は、特異的に認識する任意の細胞を死滅させる機能を果たす、ＣＤ８細胞毒性Ｔ細胞を刺激する。
【０００６】
ＭＨＣクラスＩＩ分子を形成するために非共有結合する２つのタンパク質は、α鎖およびβ鎖と名付けられる。α鎖は、α１およびα２のドメインを含み、β鎖は、β１およびβ２のドメインを含む。抗原が適合する間隙は、α１およびβ１のドメインの相互作用によって形成される。α２およびβ２のドメインは、ＡＰＣの細胞膜へとα鎖およびβ鎖を固着する、膜貫通性免疫グロブリンフォールド様のドメインである。抗原に関係するときの（および適切な共刺激シグナルのある状態での）ＭＨＣクラスＩＩ複合体は、ＣＤ４ Ｔ細胞を刺激する。ＣＤ４ Ｔ細胞は、免疫系における無数の目的に役立ち、それは、とりわけ、炎症反応を開始すること、他の免疫細胞を調節すること、抗体合成のためにＢ細胞を助けること、与えられた病原体に対する適切な免疫反応が達成されるように免疫反応を調節すること、サイトカインを分泌すること、及び／又は膜結合因子を発現することを含む。
【０００７】
ＭＨＣ複合体が免疫系において果たす役割は、これらの複合体が免疫反応を調節するために使用される方法の開発ヘとつながった。例えば、ＭＨＣとの関連で「自己」抗原ペプチド（自己抗原）を認識する活性化Ｔ細胞は、関節リウマチおよび多発性硬化症などの、自己免疫疾患に重要な役割を果たすと知られている。（適切な抗原が充填された）分離したＭＨＣクラスＩＩ分子が、ＭＨＣクラスＩＩ複合体を運ぶＡＰＣに取って代わることができ、抗原特異性のＴ細胞に結合することができるため、分離したＭＨＣ／抗原複合体が自己免疫障害を処置するのに使用され得ると多くの人が提案した（米国特許第５，１９４，４２５号および米国特許第５，２８４，９３５号を参照）。別の関連において、共刺激因子の不存在下における、Ｔ細胞を有する分離したＭＨＣＩＩ／抗原複合体の相互作用が、アネルギーとして知られる非反応性の状態を誘発することが示された（Ｑｕｉｌｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３８：３７０４−３７１２， １９８７）。この観察に従って、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，４６８，４８１号および米国特許第５，１３０，２９７号）およびＣｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，２６０，４２２号）は、このような分離したＭＨＣＩＩ／抗原複合体が、特定の自己抗原性ペプチドに特異的に反応するＴ細胞株をアネルギー化するために治療上投与され得ることを示唆した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
治療上および診断上の適用において分離したＭＨＣ／抗原複合体を使用する概念がかなり有望ではあるが、現在まで報告された様々な方法の主な欠点は、複合体が大きく、結果的に生成し作用させるのが難しいということである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（組み換え型の２つのドメインＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩのポリペプチドなどの）組み換え型ＭＨＣポリペプチドが、安定した複合体を生成するために、ペプチド抗原に共有結合され得ることが、本明細書に示される。本明細書には、ジスルフィド結合によって抗原決定基に共有結合された、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩの組み換え型Ｔ細胞受容体リガンド（ＲＴＬ）ポリペプチドを含む安定した複合体が開示される。本明細書にはまた、例えば、自己免疫疾患を処置または阻害するための、そのような組成物を作る方法および使用の方法が開示される。
【００１０】
幾つかの実施形態において、開示される組成物は、共有結合した第１および第２のドメインを含む、組み換え型ＭＨＣポリペプチドを含み、ここで、第１ドメインは哺乳動物のＭＨＣクラスＩＩβ１ドメインであり、第２ドメインは哺乳動物のＭＨＣクラスＩＩα１ドメインであり、α１ドメインのアミノ末端は、β１ドメインのカルボキシ末端に共有結合され、およびＭＨＣクラスＩＩポリペプチドは、α２またはβ２のドメインを含まず、開示される組成物はさらに、ジスルフィド結合によって組み換え型ＭＨＣポリペプチドに共有結合された抗原決定基（ペプチド抗原など）を含む。他の実施形態において、開示される組成物は、共有結合した第１および第２のドメインを含む組み換え型ＭＨＣポリペプチドを含み、ここで、第１ドメインは哺乳動物のＭＨＣクラスＩα１ドメインであり、第２ドメインは哺乳動物のＭＨＣクラスＩα２ドメインであり、α２ドメインのアミノ末端は、α１ドメインのカルボキシ末端に共有結合され、およびＭＨＣクラスＩポリペプチドはα３ドメインを含まず、開示される組成物はさらに、ジスルフィド結合によって組み換え型ＭＨＣポリペプチドに共有結合された抗原決定基（ペプチド抗原など）を含む。いくつかの例において、組み換え型ＭＨＣポリペプチドは、溶液中の凝集の可能性を減少し、例えば、組み換え型ＭＨＣポリペプチドは、ＭＨＣポリペプチドのβシートプラットフォームにおける１つ以上の疎水性アミノ酸の、極性または荷電のアミノ酸との置換を含む。
【００１１】
いくつかの例において、ジスルフィド結合は、（ＭＨＣクラスＩＩβ１ドメイン中のシステイン残基またはＭＨＣクラスＩαドメイン中のシステイン残基などの）ＭＨＣポリペプチド中の自然発生のシステイン残基を活用して形成される。他の例において、ジスルフィド結合は、突然変異誘発によってＭＨＣポリペプチドにおいて導入されたシステイン残基などの、ＭＨＣポリペプチドにおける非自然発生のシステイン残基を活用して形成される。さらなる例において、ジスルフィド結合は、抗原決定基中の自然発生のシステイン残基を活用して形成される。またさらなる例において、ジスルフィド結合は、突然変異誘発によって抗原決定基において導入されたシステイン残基などの、ペプチド抗原における非自然発生のシステイン残基を活用して形成される。
【００１２】
本明細書にはまた、開示される組成物を作る方法および開示される組成物を生成するためのキットが開示される。いくつかの例において、方法は、組み換え型ＭＨＣポリペプチドと抗原決定基との間のジスルフィド結合の形成を促進するための（例えば、そのための十分な条件を提供するための）、１つ以上の成分を含む、緩衝液または溶液の使用を含む。
【００１３】
開示される組成物を使用する方法はまた、本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、方法は、ジスルフィド結合によって抗原決定基に共有結合された、本明細書に開示される組み換え型ＭＨＣポリペプチドを含む、有効な量の組成物を投与する工程を含む、被験体の自己免疫疾患を処置または阻害する工程を含む。特定の例において、自己免疫疾患は、限定されないが、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、セリアック病、または乾癬を含む。
【００１４】
本開示の前述および他の特徴は、付随の図に関連して進められる、以下の詳細な記載からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１Ａは、「空の（ｅｍｐｔｙ）」ｒＩＡｇ７（−）およびジスルフィドに捕捉された（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｃａｐｔｕｒｅｄ）インスリンＢ：９−２３ペプチド（ＷＴ）を運ぶｒＩＡｇ７を示すクマシーブルーで染色された１０−２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥのデジタル画像である。ｒＩＡｇ７／ペプチドは、より高い分子量の種（２９、３１および３３ｋＤ）として遊走する。サンプルが充填され、処置条件は示される通りであった（Ｒｅｄ、還元；ＮＲ、非還元）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａのレーン７および８に示されるバンドの定量化を示す棒グラフである。
【図２】図２は、示されるように、ＦＩＴＣ標識化インスリンＢ：９−２３のペプチドおよび変異体のｒＩＡｇ７による捕捉の比較を示すデジタル画像である。野生型のインスリンＢ：９−２３ペプチド（Ｃ１９）は、ｒＩＡｇ７によって最も効率的に捕捉された。示されるように、アミノ末端（位置１８まで；Ｃ１８）またはカルボキシル末端（位置２０まで；Ｃ２０）に向かって移動したシステインを有するインスリンＢ：９−２３変異体が捕捉されたが、５０時間のインキュベーション後でさえそれほど効率的ではなかった。ペプチド配列が、デジタル画像の下に示される。
【図３】図３は、ｒＩＡｇ７によるペプチド捕捉の時間的経過を示す１対のデジタル画像である。インスリンＢ：１６−２３ペプチド（ＦＩＴＣ−ＹＬＶＣＧＥＲＧ；配列番号１）とｒＩＡ７は、示された時間の間、１００ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＳＤＳ、および０．０１％のＮａＮ３中で混合された（１０：１、ペプチド：ｒＩＡｇ７）。
【図４】図４は、図３に示される時間的経過の２９ｋＤおよび３１ｋＤのバンドに関するデンシトメトリー結果を示すグラフである。クマシーで染色されたバンドは、捕捉の初速度を測定するために定量化された。
【図５】図５は、内部のジスルフィド結合の存在を示す、ｒＩＡｇ７の全体の質量測定の１対の質量分析プロットである。ｒＩＡｇ７のサンプルは、アルキル化されたか、または還元された且つアルキル化された。アルキル化されたｒＩＡｇ７（左）は、２１，４１６．７Ｄａで第１次ピークを示し、これは、アミノ末端メチオニンを欠くｒＩＡｇ７に対する２１，４２０．６の予期された質量に非常に近く相当する。還元された且つアルキル化されたｒＩＡｇ７（右）は、２１，５３０．３で第１次ピークを示し、これは、アミノ末端メチオニンを欠き、２つの追加のアルキル基を加えたｒＩＡｇ７に対する予期された質量に非常に近く相当する。２１，６６５．５での第二次ピークは、インタクトな（ｉｎｔａｃｔ）アミノ末端メチオニンを有し、２つのアルキル基を加えたｒＩＡｇ７に対する２１，６６５．８の予期された質量に非常に近く相当する。
【図６】図６は、精製されたｒＩＡｇ７およびインスリンＢ：９−２３ペプチドと混合されたｒＩＡｇ７のＳＤＳ−ＰＡＧＥのデジタル画像である（左）。分子量基準が示される。ｒＩＡｇ７に対応するバンド、および２９並びに３１ｋＤでの２つのより高い分子量バンド（真中）は、ゲルから切断され、トリプシンによって消化され、質量分析法によって分析された。ｒＩＡｇ７バンドは、インタクトなＣ１７−Ｃ７９ジスルフィド結合を含む、ジスルフィド結合したペプチドを含んだ（右、下）。２９ｋＤおよび３１ｋＤのバンドの両方は、ｒＩＡｇ７ Ｃ７９を含むペプチドＡＥＬＤＴＡＣＲ（配列番号２）に架橋結合されたインスリンＢ：９−２３ペプチドを含む、ジスルフィド結合したペプチドを含んだ（右、上）
【図７】図７は、ＭＯＧ３５−５５（ＷＴ）、ＭＯＧ３５−５５ Ｓ４２Ｃ変異体、またはＭＯＧ３５−５５ Ｐ４３Ｃ変異体が充填された、精製された組み換え型ヒトＤＲ２（−）のＳＤＳ−ＰＡＧＥのデジタル画像である（左）。サンプルが充填され、処置条件は示される通りであった（Ｒｅｄ、還元；ＮＲ、非還元）。レーン５、６、７、および８（左から右に、ＤＲ２、２９ｋＤ、３１ｋＤおよび３３ｋＤのバンド）のデンシトメトリーデータが、右に示される。
【図８】図８は、マウスＭＯＧ３５−５５ Ｓ４５Ｃ変異体が充填された組み換え型ネズミＩ−ＡｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥのデジタル画像である。サンプルが充填され、処置条件は示される通りであった（Ｒｅｄ、還元；ＮＲ、非還元）。
【図９】図９は、略式の製本簿（ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｇｉｓｔｅｒ）における、ＩＡｇ７に結合されたインスリンＢ：９−２３のモデルである。この製本簿は、Ｃｙｓ１９がＰ４ポケットを占めるときに、インスリンＢ：９−２３の効果的な酸化還元の捕捉を支持し、それを、Ｃ１７−Ｃ７９の鎖内のジスルフィド結合からの適切な距離に置く。
【図１０】図１０は、ジスルフィドに捕捉されたインスリンＢ：９−２３（ｒＩＡｇ７−インスリン）が充填されたｒＩＡｇ７、空のｒＩＡｇ７（ＲＴＬ４５０）、またはビヒクル（トリス緩衝液）によって処置された非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスの生存を示すプロットである。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ビヒクル、ＲＴＬ５５１、またはジスルフィドに捕捉されたＭＯＧ３５−５５（ＲＴＬ５５０−Ｃｙｓ−ＭＯＧ）が充填されたＲＴＬ５５０によって処置されたマウスにおける処置後の時間にわたるＥＡＥスコアを示すグラフである。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、図１１Ａで示されるように処置されたマウスにおける累積的な疾患指数を示す棒グラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ビヒクル（未処置）またはジスルフィドに捕捉されたＭＯＧ３５−５５（ＲＴＬ５５０−Ｃｙｓ−ＭＯＧ）が充填されたＲＴＬ５５０によって処置された、ガンマインターフェロン誘発性のリソソームのチオール還元酵素（ＧＩＬＴ）のノックアウトマウスにおける、処置後の時間にわたるＥＡＥスコアを示すグラフである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、図１２Ａに示されるように処置されたマウスにおける累積的な疾患指数を示す棒グラフである。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドの予測された構造を示す一連のダイヤグラムである。図１３Ａは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＨＬＡ−ＤＲ２ポリペプチドのモデルである。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドの予測された構造を示す一連のダイヤグラムである。図１３Ｂは、典型的なＭＨＣクラスＩＩβ１α１分子のモデルである。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドの予測された構造を示す一連のダイヤグラムである。図１３Ｃは、疎水性の残基を示す、ＨＬＡ−ＤＲ２β１α１分子からの典型的なβ−シートプラットフォームのモデルである。
【図１４】図１４は、典型的なヒト、マウス、およびラットのＭＨＣクラスＩＩβ１α１ポリペプチドのアミノ酸配列のアライメントである。＊は、最適な配列アラインメントのために導入される隙間を示す。矢印は、β１／α１接合を示す。システイン残基は影が付けられている。イタリック体は、β１ドメインとα１ドメインとの間のノンネイティブな（ｎｏｎ−ｎａｔｉｖｅ）リンカー残基を示す。下線が引かれた残基は、溶液中の還元された凝集を有する修飾されたＲＴＬにおいて、セリンまたはアスパルタートと置換されるＲＴＬ３０２（ＤＲ２）内の残基である。配列の識別子は以下のとおりである：ＤＲ２（配列番号１１）、ＤＲ３（配列番号５５）、ＤＲ４（配列番号５６）、ＤＰ２（配列番号１９）、ＤＱ２（配列番号２０）、ＩＡ（配列番号５７）、ＩＡｇ７（配列番号４）、ＩＡｂ（配列番号１４）、およびＲＴ１．Ｂ（配列番号５８）。
【００１６】
＜配列表＞
本明細書に参照される、開示された核酸およびアミノ酸の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２において定義されるように、ヌクレオチド塩基およびアミノ酸のための標準の文字略語を使用して示される。少なくともいくつかの場合において、各核酸配列の１つの鎖だけが示されるが、相補鎖は、示された鎖への任意の言及によって含まれると理解される。
【００１７】
配列表は、２０１１年９月２日に作成された、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと名前が付けられたファイルの形態でＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出され、これは２８，９９１バイトであり、本明細書に引用によって組み込まれる。
配列番号１は、インスリンＢ：１６−２３ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号２は、ｒＩＡｇ７ ＲＴＬアミノ酸７３−８０のアミノ酸配列である。
配列番号３は，インスリンＢ：９−２３ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号４は、ｒＩＡｇ７ ＲＴＬのアミノ酸配列である。
配列番号５は、ヒト・ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）３５−５５ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号６は、マウスＭＯＧ３５−５５ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号７は、インスリンＢ：９−２３ Ｃ１８変異体のアミノ酸配列である。
配列番号８は、インスリンＢ：９−２３ Ｃ２０変異体のアミノ酸配列である。
配列番号９は、インスリンＢ：９−２３ Ｃ１９Ａ変異体のアミノ酸配列である。
配列番号１０は、ｒＩＡｇ７ ＲＴＬアミノ酸１５−２５のアミノ酸配列である。
配列番号１１は、典型的なＤＲ２  ＲＴＬのアミノ酸配列である。
配列番号１２は、ｈＭＯＧ３５−５５ Ｓ４２Ｃ変異体のアミノ酸配列である。
配列番号１３は、ｈＭＯＧ３５−５５ Ｐ４３Ｃ変異体のアミノ酸配列である。
配列番号１４は、ｒＩ−Ａｂ ＲＴＬのアミノ酸配列である。
配列番号１５は、ｍＭＯＧ３５−５５ Ｓ４５Ｃ変異体のアミノ酸配列である。
配列番号１６は、プロテオリピッドタンパク質（ＰＬＰ）１３９−１５１ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１７は、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）２０７−２２０ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１８は、ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）１１−２５ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１９は、典型的なＤＰ２ ＲＴＬのアミノ酸配列である。
配列番号２０は、典型的なＤＱ２ ＲＴＬのアミノ酸配列である。
配列番号２１−２４は、典型的なＭＯＧペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号２５−３０は、典型的なミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３１は、典型的なＰＬＰペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３２−３５は、典型的なコラーゲンＩＩ型ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３６は、光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）１１７７−１１９１ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３７は、アレスチン２９１−３１０ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３８は、ホスデューシン６５−９６ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３９−４２は、典型的なレコベリンペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号４３−４６は、典型的なフィブリノゲン−αペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号４７−５０は、典型的なビメンチンペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号５１は、α−エノラーゼ５−２１ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号５２は、ヒト軟骨糖タンパク質３９ ２５９−２７１ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号５３および５４は、典型的なα２−グリアジンペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号５５は、典型的なＤＲ３ ＲＴＬのアミノ酸配列である。
配列番号５６は、典型的なＤＲ４ ＲＴＬのアミノ酸配列である。
配列番号５７は、典型的なＩＡ ＲＴＬのアミノ酸配列である。
配列番号５８は、典型的なラットＲＴ１．Ｂ ＲＴＬのアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
治療上および診断上の適用において分離されたＭＨＣ／抗原複合体を使用する概念がかなり有望ではあるが、現在まで報告された様々な方法の主な欠点は、複合体が大きく、結果的に生成し作用させるのが難しいということである。この点に関する主な突破口は、組み換え型Ｔ細胞リガンド、またはＲＴＬの開発であった。ＲＴＬは、クラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣ分子のペプチド結合ドメインに相同性のある可溶性の1本鎖ポリペプチドを含む。ペプチドは、免疫反応を調節する多くの方法のいずれかに使用される、抗原結合の間隙およびＲＴＬペプチド複合体に充填され得る。ＲＴＬの欠点は、ペプチドが、単に非共有結合の相互作用によって抗原の間隙に結合され、それ故複合体が比較的不安定であるということである。ＲＴＬも、組み換え型ＭＨＣポリペプチドの遺伝的にコード化されたアミノ末端の伸張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）として含まれる抗原決定基によって構成された。これらの複合体は、安定しているが、個々に設計されなければならず、生成するのに時間がかかる。
【００１９】
本明細書には、抗原決定基が、ジスルフィド結合によってＲＴＬポリペプチド（例えば、β１α１ ＭＨＣクラスＩＩ ＲＴＬポリペプチドまたはα１α２ ＭＨＣクラスＩ ＲＴＬポリペプチド）に共有結合される組成物が開示される。β１α１ポリペプチドの場合には、ＲＴＬポリペプチドと抗原決定基との間のジスルフィド結合は、β１サブユニットにおける内部のジスルフィド結合を妨害する。驚いたことに、ＲＴＬは、この内部のジスルフィド結合が分裂するときでさえ、その構造および機能を維持する。さらに、ジスルフィド結合は、抗原決定基とＭＨＣポリペプチドとの間の安定した結合を提供する。この安定した相互作用は、被験体への投与を意図した医薬組成物において、効能と有効性の両方を維持する点に加え、このような組成物に関する十分な規制基準を満たす点でも特に重要である。さらに、開示される組成物は、単純にＲＴＬに選択された抗原決定基を充填し、このような組成物の生成および試験を促進することによって、急速に且つ好都合に生成され得る。これらの組成物はまた、自己免疫障害などの、被験体における疾患または障害を処置または阻害するための増加した有効性を示す。
【００２０】
いくつかのペプチド抗原は、翻訳後修飾（グリコシル化またはシトルリン化など）を含む。ヒト関節リウマチにおいて、異常な免疫反応の重要な標的は、シトルリン化を受けたタンパク質である。同様に、ＭＢＰのシトルリン化は、多発性硬化症の病理に重要な役割を果たすと示され、ヒトＭＢＰ上の６つの部位が病理学的な設定においてシトルリン化される。これらの修飾されたペプチド抗原は、以前に記載されたＲＴＬのアミノ末端で遺伝的にコード化され得ないが（例えば、米国特許第６，２７０，７７２号；米国特許公開番号２００５／０１４２１４２）、本明細書に記載される化学作用は、この問題に対する現実的解決案を提供する。
【００２１】
抗原決定基とＭＨＣポリペプチドとの間のジスルフィド結合のさらなる利点は、複合体が深部のエンドソームに達するまで、この結合が内在化に続いて維持されることであり、ここで、抗原決定基は、ガンマインターフェロン誘発性のリソソームのチオール還元酵素（ＧＩＬＴ）によって開裂される。その後、抗原決定基は、細胞表面での提示のために全長の（天然の）ＭＨＣクラスＩＩ分子上に再び充填されることが可能であり、免疫寛容反応をもたらし得る。
【００２２】
＜Ｉ．略語および用語＞
ＡＰＣ    抗原提示細胞
ＥＡＥ    実験的自己免疫性脳脊髄炎
ＦＡＣＳ  蛍光活性化細胞分類
ＧＡＤ    グルタミン酸脱炭酸酵素
ＧＩＬＴ  ガンマインターフェロン誘発性のリソソームのチオール還元酵素
ＨＥＬ    ニワトリ卵白リゾチーム
ＨＬＡ    ヒト白血球抗原
ＩＡＡ    ヨードアセトアミド
ＩＲＢＰ  光受容体間レチノイド結合タンパク質
ＭＢＰ    ミエリン塩基性タンパク質
ＭＨＣ    組織適合性主複合体
ＭＯＧ    ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質
ＮＯＤ    非肥満糖尿病マウス
ＰＬＰ    プロテオリピッドタンパク質
ＲＴＬ    組み換え型Ｔ細胞受容体リガンド
ＳＤＳ    硫酸ドデシルナトリウム
【００２３】
特に明記のない限り、技術用語は、慣例的用法に従って使用される。分子生物学の一般的な用語の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９４ （ＩＳＢＮ ０−１９−８５４２８７−９）によって公開された、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ， Ｇｅｎｅｓ Ｖ；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．， １９９４ （ＩＳＢＮ ０−６３２−０２１８２−９）によって公開された、Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；およびＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， １９９５ （ＩＳＢＮ １−５６０８１−５６９−８）によって公開された、Ｒｏｂｅｒｔ Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ （ｅｄ．）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅに見出され得る。
【００２４】
様々な実施形態の検討を促進するために、以下の特定の用語の説明が提供される：
【００２５】
β１α１ポリペプチド：共有結合においてＭＨＣクラスＩＩ分子のα１およびβ１のドメインを含む組み換え型ポリペプチド。適切な配座を保証するために、このようなポリペプチドの配向は、β１ドメインのカルボキシル末端が、α１ドメインのアミノ末端に共有結合されるような配向である。１つの限定しない実施形態において、ポリペプチドは、ヒトβ１α１ポリペプチドであり、ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子に関してはα１およびβ１のドメインを含む。ヒトβ１α１ポリペプチドの、１つの具体的な、限定しない例は、β１ドメインのカルボキシル末端が、ＨＬＡ−ＤＲ分子のα１ドメインのアミノ末端に共有結合される分子である。ヒトβ１α１ポリペプチドのさらなる具体的な限定しない例は、β１ドメインのカルボキシル末端が、ＨＬＡ−ＤＲ（ＡまたはＢのいずれか）、ＨＬＡ−ＤＰ（ＡおよびＢ）、またはＨＬＡ−ＤＱ（ＡおよびＢ）の分子のα１ドメインのアミノ末端に共有結合される分子である。１つの実施形態において、β１α１ポリペプチドは、β２ドメインを含まない。別の実施形態において、β１α１ポリペプチドは、α２ドメインを含まない。また別の実施形態において、β１α１ポリペプチドは、α２またはβ２のドメインをどちらも含まない。典型的なβ１α１ポリペプチドは、米国特許第６，２７０，７７２号；米国特許公開番号２００５／０１４２１４２に記載され、本明細書で提供される（例えば、配列番号４、１１、１４、１９、２０および５５−５８）。
【００２６】
β１α１遺伝子：β１α１ポリペプチドをコード化する核酸配列を含む組み換え型核酸分子。幾つかの実施形態において、β１α１遺伝子は、β１α１ポリペプチドをコード化する核酸に操作可能に結合されたプロモーター領域を含む。１つの実施形態において、コード化されたβ１α１ポリペプチドは、ヒトβ１α１ポリペプチドである。
【００２７】
α１α２ポリペプチド：共有結合においてＭＨＣクラスＩ分子のα１およびα２のドメインを含むポリペプチド。このようなポリペプチドの配向は、α１ドメインのカルボキシル末端が、α２ドメインのアミノ末端に共有結合されるような配向である。α１α２ポリペプチドは、クラスＩα鎖を全体よりも少なく含み、α鎖のα３ドメインのほとんど又はすべてを省く。α１α２ポリペプチドの具体的な限定しない例は、α１ドメインのカルボキシル末端が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−Ｃの分子のα２ドメインのアミノ末端に共有結合されるポリペプチドである。１つの実施形態において、α３ドメインは、α１α２ポリペプチドから省かれ、したがって、α１α２ポリペプチドはα３ドメインを含まない。
【００２８】
α１α２遺伝子：α１α２ポリペプチドをコード化する核酸配列を含む組み換え型核酸分子。幾つかの実施形態において、α１α２遺伝子は、α１α２ポリペプチドをコード化する核酸に操作可能に結合されたプロモーター領域を含む。１つの実施形態において、コード化されたα１α２ポリペプチドは、ヒトα１α２ポリペプチドである。
【００２９】
抗原：動物へと注入または吸収される組成物を含む、動物において抗体の生成またはＴ細胞反応を刺激し得る化合物、組成物、または物質。抗原は、異種免疫原によって誘発されたものを含む、特異的な体液免疫または細胞免疫の生成物と反応する。用語「抗原」は、本明細書に開示される組み換え型ＭＨＣ分子に関連して提示される抗原ペプチドなどの、すべての関連する抗原エピトープおよび抗原決定基を含む。
【００３０】
自己免疫障害：免疫系が、内因性の抗原に対抗して免疫反応（例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞の反応）をもたらし、結果として組織に対する傷害につながる障害。典型的な自己免疫障害は、限定されないが、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、セリアック病、乾癬、全身性紅斑性狼瘡、悪性貧血、重症筋無力症、およびアディソン病を含む。
【００３１】
同類置換または変異体：アミノ酸残基の、類似した生化学的特性を有する別のアミノ酸残基との置換。ペプチドは、１つ以上のアミノ酸置換、例えば、１、２、５または１０の同類置換などの、１−１０の同類置換、２−５の同類置換、４−９の同類置換を含むことができる。同類置換の具体的な、限定しない例は、以下の例を含む：
【００３２】
【表１】
0006027969.tif 000002
【００３３】
ドメイン：ポリペプチドまたはタンパク質のドメインは、特定の機能と同一視することができるアミノ酸配列の別々の部分である。例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子を構成するαおよびβのポリペプチドは、それぞれ、２つのドメイン、α１、α２、およびβ１、β２を有していると認識されている。同様に、ＭＨＣクラスＩ分子のα鎖は、３つのドメイン、α１、α２、およびα３を有していると認識されている。これらの分子の各々における様々なドメインは、典型的に、アミノ酸配列を結合することによって連結される。１つの実施形態において、組み換え型分子に包含するための特定のドメインの配列を選択するときに、全体のドメインが含まれ、これを確実に行うために、ドメイン配列は、リンカーの一部分、または隣接ドメインの一部分さえ含むために伸張され得る。
【００３４】
様々なＭＨＣ分子ドメインのアミノ酸の正確な数は、哺乳動物の種に依存して、また種内の遺伝子のクラス間で変化する。アミノ酸の数に基づいた正確な構造の定義よりもむしろ、重要なのは、特定のドメインのアミノ酸配列を選択するときのドメイン機能の維持である。その上、選択されるドメインの全体より幾分少ないアミノ酸配列が活用されると、ドメイン機能も維持され得ることを当業者は認識するであろう。例えば、α１ドメインのアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかでの多くのアミノ酸が、ドメイン機能に影響を与えることなく省かれ得る。しかしながら、典型的には、ドメイン配列のどちらかの末端から省かれたアミノ酸の数は、１０未満であり、より典型的には、５未満である。特定の選択されたドメインの機能活性は、抗原特異性のＴ細胞増殖アッセイを使用する本開示によって提供される２つのドメインＭＨＣポリペプチド（例えば、組み換え型クラスＩＩβ１α１またはクラスＩα１α２のポリペプチド）に関連して評価され得る。例えば、特定のβ１ドメインを試験するために、それは、β１α１分子を生成するように、機能的なα１ドメインに結合され、その後、Ｔ細胞増殖アッセイで試験される。生物学的に活性なβ１α１またはα１α２のポリペプチドは、抗原特異性のＴ細胞増殖を、少なくとも約５０％阻害し、故に、成分ドメイン（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｄｏｍａｉｎｓ）が機能的であることを示す。典型的に、このようなポリペプチドは、このアッセイ系におけるＴ細胞増殖を、少なくとも７５％および時には約９０％より多く阻害する。
【００３５】
有効な量：単独でまたは薬学的に許容可能な担体または１以上の追加の薬剤と一緒に、所望の反応を誘発する、組成物または医薬調製物の量。薬剤の有効な量は、被験体の生理的状態の改善、疾患によって引き起こされた症状の緩和、あるいは疾患または疾病の進行の阻害などの、多くの様々な方法で決定され得る。有効な量はまた、様々なインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）、またはインサイツ（ｉｎ ｓｉｔｕ）のアッセイを介して決定され得る。
【００３６】
エピトープ：抗原決定基。これらは、抗原性である、例えば、特異的な免疫反応を引き起こす、分子上の特定の化学基またはペプチド配列である。抗体は、特定の抗原エピトープを結合する。Ｔ細胞の場合において、Ｔ細胞エピトープは、Ｔ細胞受容体によって認識されるＭＨＣ分子に関連して提示される特定の抗原ペプチドである。特に強いＴ細胞反応をもたらすＴ細胞エピトープは、優性のＴ細胞エピトープと指定され得る。
【００３７】
同等物：（実験上または治療上の設定などの）与えられた状況において同じ又は類似した結果をもたらす１つ以上の配列変化を有する（ＲＴＬまたは抗原決定基などの）ポリペプチドは、同等な（または機能的に同等な）ポリペプチドと考えられる。このような配列変化は、限定されないが、同類置換、欠失、変異、フレームシフト、および挿入を含むことができる。
【００３８】
免疫反応：抗原攻撃（ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）などの、免疫原の刺激に対する免疫系の反応。１つの実施形態において、反応は、特定の抗原に特異的である（「抗原特異性の反応」）。抗原攻撃のタイプ（例えば、病原体、アレルゲン、または毒素）によって、異なるタイプの免疫反応が生じ得る。いくつかの例において、免疫反応は、Ｔｈ１反応、Ｔｈ２反応、Ｔｈ３反応、Ｔｈ１７反応、抑制Ｔ細胞反応、遅延型過敏反応、即時型過敏症反応、炎症反応、細胞媒介性免疫反応、特異的な免疫反応、非特異的な免疫反応、先天性の免疫反応、補体系の１つ以上の成分を含む反応、または任意の他の免疫反応を含む。
【００３９】
疾患の阻害または処置：疾患を「阻害すること」は、例えば、自己免疫障害などの疾患を有するか、または自己免疫障害などの疾患にかかりやすいと知られている人において、疾患の完全な進行を阻害することを指す。疾患の阻害は、疾患の部分阻害から略完全な阻害（予防）までのスペクトルに及び得る。いくつかの例において、用語「阻害すること」は、疾患の開始または進行を減少させるか又は遅らせることを指す。疾患または障害を阻害または処置するために有効な量の医薬品化合物を投与される被験体は、そのような障害に対する標準診断技術、例えば、症状の基準、病歴、家族歴、あるいは疾患または障害を進行させる危険因子によって確認され得る。「処置」は、進行し始めた後の、疾患の徴候または症状あるいは病理学的状態を改善する治療上の介入を指す。
【００４０】
分離した：「分離した」核酸は、（例えば、核酸が生じる有機体の細胞中の）他の核酸、例えば、他の染色体および細胞質のＤＮＡおよびＲＮＡから離されて略分離されたか又は精製された。したがって、用語「分離した」は、標準の核酸精製法によって精製された核酸を包含する。該用語はまた、宿主細胞中の組み換えの発現によって調製された核酸の他に、化学的に合成された核酸も包含する。「分離した」ポリペプチドは、（例えば、核酸が生じる有機体の細胞中の）他のポリペプチド、例えば、他のポリペプチドから離されて略分離されたか又は精製された。したがって、用語「分離した」は、標準のタンパク質精製法によって精製されたポリペプチドを包含する。該用語はまた、宿主細胞中の組み換えの発現によって調製されたポリペプチドの他に、化学的に合成されたポリペプチドも包含する。
【００４１】
リンカー：リンカーは、２つのポリペプチドドメインを共有結合するアミノ酸配列である。リンカーは、本開示の組み換えＭＨＣポリペプチドに含まれ得ることで、結合したポリペプチドドメインに循環の自由（ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ ｆｒｅｅｄｏｍ）を与え、それによって、適切なドメインの折畳み及びドメイン間ならびにドメイン内の結合を促進する。一例として、β１α１を含む組み換えポリペプチドにおいて、リンカーは、β１ドメインとα１ドメインとの間で提供され得る。当該技術分野に周知のリンカー配列は、限定されないが、Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ． （Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３９４−３６７， １９８９）に記載される、グリシン（４）−セリンスペーサーを含む。
【００４２】
本開示による組み換え型ＭＨＣクラスＩα１α２ポリペプチドは、α１ドメインのカルボキシル末端をα２ドメインのアミノ末端に連結する共有結合を含む。天然のＭＨＣクラスＩα鎖のα１およびα２のドメインは、典型的には、アミノ酸リンカー配列によってこの配向で共有結合される。この天然のリンカーは、組み換え型の構成物において維持され得るか、あるいは、組み換え型リンカーは、（天然のリンカー配列の代わり又はそれに加えて）α１ドメインとα２ドメインとの間で導入され得る。
【００４３】
核酸分子：限定されないが、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成の（例えば化学的に合成した）ＤＮＡを含む、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマー。核酸分子は、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖の場合、核酸分子は、センス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。
【００４４】
医薬品または薬物：被験体に適切に投与されたときに所望の治療上または予防的な効果を誘発することができる化学化合物または組成物。
【００４５】
薬学的に許容可能な担体：本明細書に記載されるポリペプチドおよび核酸を用いることで有用な薬学的に許容可能な担体は従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， Ｅｄｉｔｏｒ， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ， ２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ （２００５）は、本明細書に開示される融合タンパク質の薬剤送達に適した、組成物および製剤を記載する。
【００４６】
一般に、担体の性質は、使用されている投与の特定の様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水溶性のデキストロース、グリセロールなどの、薬学的且つ生理学的に許容可能な液体を含む注射可能な液体を含む。固形組成物（例えば、粉末剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤の形態）に関して、従来の無毒な固形担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、スターチまたはステアリン酸マグネシウムを含むことができる。生物学的に中性な担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤などの小量の無毒な補助剤、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンラウリン酸モノエステルを含むことができる。
【００４７】
ポリペプチドまたはタンパク質：モノマーがアミド結合によって一緒に連結されるアミノ酸残基であるポリマー。アミノ酸がアルファアミノ酸であるときに、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体のいずれかが使用され得る。本明細書に使用されるような、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、または「タンパク質」は、任意のアミノ酸配列を包含し、糖タンパク質などの修飾された配列を含むように意図される。用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、自然発生のタンパク質に加え、組み換えで又は合成的に生成されるものも包含するように特に意図される。
【００４８】
精製した：用語「精製した」は、絶対的な純度を必要とせず、むしろ、相対語として意図される。したがって、例えば、精製したＭＨＣポリペプチド調製物は、組み換え型ＭＨＣポリペプチドが、細胞または調製物内のその元の環境においてポリペプチドよりも純粋である調製物である。組み換え型ＭＨＣポリペプチド調製物は、典型的には、組み換え型ＭＨＣポリペプチドが、調製物の総タンパク含量の少なくとも５０％を示すように精製される。しかしながら、より高度に精製された調製物は、特定の適用に必要とされ得る。例えば、このような適用のために、ＭＨＣポリペプチドが、総タンパク含量の少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上を含む調製物が利用され得る。
【００４９】
組み換え型：組み換え型の核酸またはポリペプチドは、自然発生でない配列を有するか、または２つ以上のその他の分離した画分の配列の人為的な組み合わせによって作られる配列を有するものである。この人為的な組み合わせは、化学合成、またはより一般には、核酸の分離した画分の人為的操作、例えば、遺伝子工学手法によってしばしば達成される。
【００５０】
配列同一性：アミノ酸配列間の類似点は、配列間の類似点の観点から表され、そうでなければ、配列同一性と呼ばれる。配列同一性は、割合の同一性（あるいは類似性または相同性）の観点から頻繁に測定され、割合が高いほど、２つの配列はより類似している。ＭＨＣドメインポリペプチドの変異体は、標準分析法を使用して並べられる（ａｌｉｇｎｅｄ）ときに、比較的高度な配列同一性を持つ。
【００５１】
比較のための配列のアラインメントの方法は、当該技術分野に周知である。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９４）は、配列アラインメント方法および相同性計算の詳細な考察を提示する。ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９０））は、配列分析プログラム、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘに関連して使用するための、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を含む、いくつかのソースから利用可能である。このプログラムを使用して、配列同一性を測定する方法の記載は、デフォルトパラメーターと同様に、ＮＣＢＩのウェブサイトで入手可能である。
【００５２】
ＭＨＣドメインポリペプチドの変異体は、典型的には、デフォルトパラメーターに対するギャップのある（ｇａｐｐｅｄ）ｂｌａｓｔｐセットである、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ ２．０を使用して、天然のＭＨＣドメインポリペプチドのアミノ酸配列を有する全長アラインメントにわたって計算された、少なくとも５０％の配列同一性を有することを特徴とする。参照配列へのさらなる大きな類似点を有するタンパク質は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性などの、この方法によって評価されるときの増加する割合の同一性を示す。全体より少ない配列が配列同一性のために比較されているとき、変異体は、典型的には、１０−２０のアミノ酸の短いウィンドウ（ｓｈｏｒｔ ｗｉｎｄｏｗｓ）上の少なくとも７５％の配列同一性を有し、参照配列への類似点に依存して、少なくとも８５％または少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有し得る。このような短いウィンドウ上で配列同一性を測定するための方法は、ＮＣＢＩのウェブサイトで記載されている。ＭＨＣドメインポリペプチドの変異体はまた、天然のポリペプチドの生物学的活性を保持する。本開示の目的のために、その活性は、変異体ドメインを適切なβ１α１またはα１α２のポリペプチドに組み込み、結果として生じるポリペプチドの、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で抗原特異性のＴ細胞増殖を阻害するか、あるいはＴ抑制細胞またはＩＬ−１０の発現を誘発する能力を決定することによって好都合に評価される。
【００５３】
被験体：ヒトおよびヒト以外の哺乳動物の両方を含むカテゴリーである、多細胞の脊椎生物。被験体は、ウシおよび羊などの家畜、齧歯類（マウスおよびラットなど）、およびヒト以外の霊長類を含む、獣医の被験体を含む。
【００５４】
耐性：抗原に対する特異的な免疫反応を作り出す縮小されたか又は不在の能力。耐性は、本明細書に記載されるように、２つのドメインＭＨＣ分子がある状態での抗原との接触の結果としてしばしばもたらされる。１つの実施形態において、Ｂ細胞反応は、減少するか又は生じない。別の実施形態において、Ｔ細胞反応は、減少するか又は生じない。あるいは、Ｔ細胞およびＢ細胞の反応の両方は、減少し得るか又は生じ得ない。
【００５５】
他に定義のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本明細書に開示される主題が属する当該技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他に明確に明示していない限り、複数の指示物を含む。同様に、語「または」は、文脈が他に明確に明示していない限り、「および」を含むように意図される。本明細書に記載される方法および物質に類似したまたは同等の方法および物質は、本開示の実施または試験に使用され得るが、適切な方法および物質が以下に記載される。本明細書で言及される、すべての出版物、特許出願、特許および他の参考文献は、それら全体が引用によって組み込まれる。コンフリクト（ｃｏｎｆｌｉｃｔ）の場合においては、用語の説明を含む本明細書が管理する（ｃｏｎｔｒｏｌ）。さらに、物質、方法、および例は、単に例示的であり、限定するようには意図されない。
【００５６】
＜ＩＩ．共有結合した組み換え型ＭＨＣポリペプチドおよび抗原決定基＞
本明細書には、ジスルフィド結合によって（精製された抗原決定基などの）抗原決定基に共有結合した、（精製された組み換え型ＭＨＣポリペプチドなどの）組み換え型ＭＨＣポリペプチドを含む組成物が開示される。ＭＨＣポリペプチドは、共有結合した第１および第２のドメインを含む。幾つかの実施形態において、第１ドメインは哺乳動物のＭＨＣクラスＩＩβ１ドメインであり、第２ドメインは哺乳動物のＭＨＣクラスＩＩα１ドメインであり、ここで、α１ドメインのアミノ末端は、β１ドメインのカルボキシル末端に共有結合され、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、α２またはβ２のドメインを含まない。他の実施形態において、第１ドメインは哺乳動物のＭＨＣクラスＩα１ドメインであり、第２ドメインは哺乳動物のＭＨＣクラスＩα２ドメインであり、ここで、α２ドメインのアミノ末端は、α１ドメインのカルボキシル末端に共有結合され、ＭＨＣクラスＩ分子は、α３ドメインを含まない。いくつかの例において、ＭＨＣドメインはヒトＭＨＣドメインである。２つのドメインＭＨＣポリペプチドは、以下に及び米国特許第６，２７０，７７２号；第６，８１５，１７１号；および第７，２６５，２１８号および米国特許公開番号２００８／０２６７９８７および２００５／０１４２１４２；により詳細に記載され、これら各々は、それらの全体が引用によって本明細書に組み込まれる。
【００５７】
組み換え型ＭＨＣポリペプチドは、ジスルフィド結合を介して、ペプチド抗原などの抗原決定基に共有結合される。組み換え型ＭＨＣポリペプチドとペプチド抗原との間の共有結合は、例えば、ジスルフィド結合の形成のための適切な条件下で、組み換え型ＭＨＣポリペプチドとペプチド抗原とを接触させることによって形成される。このような条件は、慣例的な方法を活用する当業者によって決定され得る。典型的な方法は、以下にさらに詳細に議論される（セクションＶ）。
【００５８】
本開示の組み換え型ＭＨＣポリペプチドは、原核細胞または真核細胞において（β１α１ポリペプチドまたはα１α２ポリペプチドなどの）ＭＨＣポリペプチドをコード化する核酸の発現によって容易に生成され得、大量に精製され得る。幾つかの実施形態において、開示される組成物は、抗原決定基と組み換え型ＭＨＣポリペプチドとの間のジスルフィド結合の形成に十分な条件下で、（β１α１ポリペプチドまたはα１α２ポリペプチドなどの）精製された組み換え型ＭＨＣポリペプチドと、（ペプチド抗原などの）抗原決定基とを接触させることによって生成される。
【００５９】
いくつかの例において、ジスルフィド結合は、（ＭＨＣクラスＩＩβ１ドメインにおけるシステイン残基またはＭＨＣクラスＩα１またはα２のドメインにおけるシステイン残基などの）ＭＨＣポリペプチドにおける自然発生のシステイン残基を活用して形成される。いくつかの例において、ジスルフィド結合は、組み換え型ＭＨＣクラスＩＩβ１α１ポリペプチドのＣｙｓ１７を含む。他の例において、ジスルフィド結合は、組み換え型ＭＨＣクラスＩＩβ１α１ポリペプチドのＣｙｓ７９を含む。他の例において、ジスルフィド結合は、組み換え型ＭＨＣクラスＩＩβ１α１ポリペプチドのＣｙｓ１５及び／又はＣｙｓ７９を含む。特定の例において、ジスルフィド結合は、開示される組み換え型ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ β１α１ポリペプチドのＣｙｓ１７及び／又はＣｙｓ７９（例えば、配列番号４などの、ＤＲ２ ＭＨＣポリペプチドのＣｙｓ１７及び／又はＣｙｓ７９）を含む。他の例において、ジスルフィド結合は、開示される組み換え型ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ β１α１ポリペプチドのＣｙｓ１６及び／又はＣｙｓ７８（例えば、配列番号１９などの、ＤＰ２ ＭＨＣポリペプチドのＣｙｓ１６及び／又はＣｙｓ７８）を含む。またさらなる例において、ジスルフィド結合は、開示される組み換え型ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ β１α１ポリペプチドのＣｙｓ１６及び／又はＣｙｓ８０（例えば、ＤＱ２ ＭＨＣポリペプチドのＣｙｓ１６及び／又はＣｙｓ８０、例えば配列番号２０）を含む。他の例において、ジスルフィド結合は、β１α１ポリペプチドの、Ｃｙｓ１５、Ｃｙｓ１６、Ｃｙｓ１７、Ｃｙｓ１８、Ｃｙｓ１９、Ｃｙｓ２０、Ｃｙｓ２１、Ｃｙｓ７６、Ｃｙｓ７７、Ｃｙｓ７８、Ｃｙｓ７９、Ｃｙｓ８０、Ｃｙｓ８１、及び／又はＣｙｓ８２を含む。
【００６０】
他の例において、ジスルフィド結合は、組み換え型ＭＨＣクラスＩα１α２ポリペプチドのＣｙｓ１０１を含む。他の例において、ジスルフィド結合は、組み換え型ＭＨＣクラスＩα１α２ポリペプチドのＣｙｓ１６４を含む。他の例において、ジスルフィド結合は、α１α２ポリペプチドの、Ｃｙｓ９８、Ｃｙｓ９９、Ｃｙｓ１００、Ｃｙｓ１０２、Ｃｙｓ１０３、Ｃｙｓ１０４、Ｃｙｓ１６１、Ｃｙｓ１６２、Ｃｙｓ１６３、Ｃｙｓ１６５、Ｃｙｓ１６６、及び／又はＣｙｓ１６７を含む。
【００６１】
さらなる例において、ジスルフィド結合はまた、ペプチド抗原における自然発生のシステイン残基を活用して形成される。自然発生のシステイン残基は、（組み換え型ＭＨＣポリペプチドまたはドメインまたはペプチド抗原などの）ポリペプチドの天然型配列または野生型配列に生じるシステイン残基を含む。
【００６２】
他の例において、ジスルフィド結合は、突然変異誘発によってＭＨＣポリペプチドにおいて導入されたシステイン残基などの、組み換え型ＭＨＣポリペプチドにおける非自然発生のシステイン残基を活用して形成される。さらなる例において、ジスルフィド結合は、突然変異誘発によってペプチド抗原において導入されたシステイン残基などの、ペプチド抗原における非自然発生のシステイン残基を活用して形成される。非自然発生のシステイン残基は、天然型ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドに生じない、（組み換え型ＭＨＣポリペプチドまたはドメインまたはペプチド抗原などの）ポリペプチドにおいてシステイン残基を含む。いくつかの例において、非自然発生のシステイン残基は、ポリペプチドにおいて任意の他の自然発生のアミノ酸と取って代わるシステイン残基を含む。他の例において、非自然発生のシステイン残基は、ポリペプチドに加えられるか又は挿入される（例えば、ポリペプチドの５’または３’の末端で加えられるか又はポリペプチド中の２つの自然発生の残基間で挿入される）システイン残基を含む。自然発生および非自然発生のシステイン残基の任意の組み合わせは、ジスルフィド結合の形成のために活用することができる。１つの例において、非自然発生のシステインは、ＭＨＣＩＩα１ドメイン、例えば、天然のα１鎖のアミノ酸の位置６２または７２（ＤＲ、ＤＰ、またはＤＱβ１α１のポリペプチドのアミノ酸の位置１５８または１６８など、例えば配列番号１１、１９、または２０）においてアミノ酸残基と取って代わることによって導入される。
【００６３】
ポリペプチドにおいて非自然発生の残基を導入する方法は、当業者に既知であって、ポリペプチドをコード化する核酸分子の部位特異的変異誘発を含む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， ２００１； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， １９９２ （ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ２０００）； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ ｅｄ．， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９９を参照。当業者は、（例えば以下の実施例に記載される方法を活用することによって）例えば、分子モデリングを活用する及び／又は複合体の形成のための構成物を構成し且つ試験することで、組み換え型ＭＨＣポリペプチドまたはペプチド抗原においてシステイン残基に変異させるための適切な残基を識別することができる。
【００６４】
＜Ａ．組み換え型ＭＨＣクラスＩＩβ１α１分子＞
哺乳動物のＭＨＣクラスＩＩαおよびβ鎖のタンパク質のアミノ酸配列に加え、これらのタンパク質をコード化する核酸も同様に、当該技術分野に周知であり、ＧｅｎＢａｎｋ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を含む多数のソースから入手可能である。典型的な配列は、Ａｕｆｆｒａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３０８：３２７−３３３， １９８４（ヒトＨＬＡ ＤＱ α）；Ｌａｒｈａｍｍａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：７３１３−７３１７， １９８３ （ヒトＨＬＡ ＤＱ β）； Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：３５４３−３５４７， １９８３ （ヒトＨＬＡ ＤＲ α）； Ｔｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ４：２８３９−２８４７， １９８５ （ヒトＨＬＡ ＤＲ β）； Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３：７５１５−７５２８， １９８５ （ヒトＨＬＡ ＤＰ α）； Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３：１６０７−１６２１， １９８５ （ヒトＨＬＡ ＤＰ β）； Ｓｙｈａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：３９８５， １９８９ （ラットＲＴ１．Ｂ α）； Ｓｙｈａ−Ｊｅｄｅｌｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １０８９：４１４−４１６， １９９１ （ラットＲＴ１．Ｂ β）； Ｂｅｎｏｉｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：５３４−５３８， １９８３ （マウスＩ−Ａ α）； Ｅｓｔｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：３５９４−３５９８， １９８６ （マウスＩ−Ａ β）において提供され、それらすべては、引用によって本明細書に組み込まれる。１つの実施形態において、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質は、ヒトＭＨＣクラスＩＩタンパク質である。
【００６５】
本開示の組み換え型ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＭＨＣクラスＩＩα鎖のα１ドメインに共有結合されたＭＨＣクラスＩＩβ鎖のβ１ドメインを含む。α１およびβ１のドメインは、哺乳動物のＭＨＣクラスＩＩタンパク質においてよく定義されている。典型的には、α１ドメインは、成熟鎖（ｍａｔｕｒｅ ｃｈａｉｎ）の約１−９０の残基を含むと見なされる。ＭＨＣクラスＩＩタンパク質のα１ドメインとα２ドメインとの間の天然のペプチドリンカー領域は、考察の下、特定のα鎖によって、約７６のアミノ酸から約９３のアミノ酸まで及ぶ。したがって、α１ドメインは、α鎖の約１−９０のアミノ酸残基を含み得るが、当業者は、このドメインのＣ末端切断が、必ずしも正確に定義されない、例えば、α鎖の７０−１００のアミノ酸残基間のどの時点でも生じ得ることを認識するであろう。限定しない例において、α１ドメインは、α鎖の、１−８０、１−８１、１−８２、１−８３、１−８４、１−８５、１−８６、１−８７、１−８８、１−８９、１−９０、１−９１、１−９２、または１−９３のアミノ酸残基を含む。α１ドメインの組成物はまた、哺乳動物の種および問題の特定のα鎖に依存して、これらのパラメーターの外側で変更し得る。当業者は、アミノ酸配列の正確な数値パラメーターが、ドメイン機能の維持ほど重要ではないことを認識するであろう。
【００６６】
同様に、β１ドメインは、典型的には、成熟β鎖の約１−９０の残基を含むと見なされる。ＭＨＣクラスＩＩタンパク質のβ１ドメインとβ２ドメインとの間のリンカー領域は、考察の下、特定のβ鎖によって、β鎖の約８５のアミノ酸から約１００のアミノ酸まで及ぶ。したがって、β１タンパク質は、約１−１００のアミノ酸残基を含み得るが、当業者は、このドメインのＣ末端切断が、必ずしも正確に定義されない、例えば、β鎖の７５−１０５のアミノ酸残基間のどの時点でも生じ得ることを認識するであろう。限定しない例において、β１ドメインは、β鎖の、１−７５、１−７６、１−７７、１−７８、１−７９、１−８０、１−８１、１−８２、１−８３、１−８４、１−８５、１−８６、１−８７、１−８８、１−８９、１−９０、１−９１、１−９２、１−９３、１−９４、１−９５、１−９６、１−９７、１−９８、１−９９、または１−１００のアミノ酸残基を含む。β１ドメインの組成物はまた、哺乳動物の種および問題の特定のβ鎖に依存して、これらのパラメーターの外側で変更し得る。また、当業者は、アミノ酸配列の正確な数値パラメーターが、ドメイン機能の維持ほど重要ではないことを認識するであろう。１つの実施形態において、β１α１分子は、β２ドメインを含まない。別の実施形態において、β１α１分子は、α２ドメインを含まない。またさらなる実施形態において、β１α１分子は、α２またはβ２のドメインをどちらも含まない。
【００６７】
特定の実施形態において、ペプチドリンカーは、β１ドメインとα１ドメインとの間で提供される。典型的には、このリンカーは、長さが少なくとも６のアミノ酸（例えば少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも５０、またはそれ以上のアミノ酸）であり、各ドメインが天然立体配座へと自由に折畳まるように、ドメイン間で柔軟性を提供する機能を果たす。特定の例において、リンカーは、長さが約２乃至２５のアミノ酸（例えば、６乃至２５または１５乃至２０のアミノ酸）である。当業者は、もし組み換え型ＭＨＣポリペプチドに含まれるのであれば、適切なリンカーを選択することができる。リンカー配列は、リンカー配列をコード化するようにＰＣＲプライマーを設計することによって、好都合に提供され得る。
【００６８】
〈Ｂ．組み換え型ＭＨＣクラスＩα１α２分子〉
哺乳動物のＭＨＣクラスＩα鎖タンパク質のアミノ酸配列、同様にこれらのタンパク質をコード化する核酸は、当該技術分野において周知であり、ＧｅｎＢａｎｋ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を含む多数のソースから利用可能である。典型的な配列は、Ｂｒｏｗｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ４５：１７７−１８７，  １９９５（ヒトＨＬＡ−Ａ）；Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．  ３７：２１２−２１６，  １９９３（ヒトＨＬＡ−Ｂ）；Ｓｔｅｉｎｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ３９：１３４−１３４，  １９９２（ヒトＨＬＡ−Ｃ）；Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４１：２３２，  １９９５（ラットＩａ）；Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３９：３５１−３５４，  １９９４（ラットＩｂ）；Ｋｒｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３０６：６０２−６０４，  １９８３（マウスＨ−２−Ｋ）；Ｓｃｈｅｐａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３６：３４８９−３４９５，  １９８６（マウスＨ−２−Ｄ）；及びＭｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１５：６７９−６８２，  １９８２（マウスＨ−２−ｌ）において提供され、これらは、引用により本明細書に組み込まれる。１つの実施形態において、ＭＨＣのクラスＩタンパク質は、ヒトＭＨＣのクラスＩタンパク質である。
【００６９】
本開示の組み換え型ＭＨＣクラスＩ分子は、ＭＨＣクラスＩ鎖のα２ドメインに共有結合する、ＭＨＣクラスＩα鎖のα１ドメインを含む。これらの２つのドメインは、哺乳動物のＭＨＣクラスＩタンパク質において十分に定義されている。典型的に、α１ドメインは、成熟鎖の約１−９０の残基を含むと見なされ、α２ドメインは、約９０−１８０のアミノ酸残基を含むと見なされるが、切断点は正確に定義されず、異なるＭＨＣクラスＩ分子の間で変わる。限定しない例において、α１ドメインは、α鎖の１−８０、１−８１、１−８２、１−８３、１−８４、１−８５、１−８６、１−８７、１−８８、１−８９、１−９０、１−９１、１−９２、又は１−９３のアミノ酸残基を含む。ＭＨＣクラスＩαタンパク質のα２とα３のドメイン間の境界は、典型的に、成熟鎖の１７９−１８３のアミノ酸の領域において生じる。限定しない例において、α２ドメインは、α鎖の８５−１８０、８６−１８０、８７−１８０、８８−１８０、８９−１８０、９０−１８０、９０−１７９、９０−１８１、９０−１８２、又は９０−１８３のアミノ酸残基を含む。α１及びα２のドメインの組成物はまた、哺乳動物の種、及び特に問題のα鎖に依存する、これらのパラメーターの外側で変化し得る。当業者は、アミノ酸配列の正確な数のパラメーターが、ドメイン機能の維持ほどあまり重要ではないことを認識するであろう。１つの実施形態において、α１α２分子は、α３ドメインを含まない。
【００７０】
α１α２構成物は、アミノ酸番号１と１７９−１８３のアミノ酸との間の二重ドメイン（α１及びα２の領域）をコード化する読み枠を増幅することにより、最も好都合に構成され得るが、当業者は、これらエンドポイントにおける幾つかの変化が可能であることを認識するであろう。そのような分子は、α１とα２の間に天然のリンカー領域を含むが、所望されると、リンカー領域は除去され、合成リンカーペプチド（上述のリンカーなど）と交換され得る。
【００７１】
〈Ｃ．修飾されたＭＨＣ分子〉
前述の考察は、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩの分子、並びにこれら分子の様々なドメインを事前に発生させる例を使用する一方で、当業者は、これらの分子とドメインの変化が、記載されるものと同じ方法で作られ且つ利用され得ることを認識するであろう。したがって、ＭＨＣポリペプチド又は分子のドメイン（例えば、ＭＨＣクラスＩＩβ１ドメイン）に対する、本明細書における言及は、参照された分子の自然発生の形態、同様に、自然発生の形態のアミノ酸配列に基づくが、１つ以上のアミノ酸配列の変化を含む分子を含む。そのような変異体ポリペプチドはまた、それらが自然発生の分子と共有するアミノ酸配列同一性の程度において、定義され得る。典型的に、ＭＨＣドメイン変異体は、自然発生のＭＨＣドメインの配列と、少なくとも８０％の配列同一性を共有する。より高度に保存された変異体は、自然発生の配列と、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列同一性を共有する。ＭＨＣドメインポリペプチドの変異体はまた、自然発生のポリペプチドの生物学的活性を保持する。本開示の目的のため、その活性は、適切なβ１α１又はα１α２のポリペプチドにおける変異体ドメインを組み込むことにより、及びインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での抗原特異性のＴ細胞増殖を阻害する、結果として生じるポリペプチドの能力を測定することにより、都合よく評価される。抗原特異性のＴ細胞増殖の測定方法は、当業者に周知である（例えば、Ｈｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ８０：２−１２，  ２００５を参照）。
【００７２】
変異体ＭＨＣドメインポリペプチドは、アミノ酸配列において自然発生のＭＨＣポリペプチド配列と異なるが、具体化された生物学的活性を保持するタンパク質を含む。前記タンパク質は、例えば、特定部位の突然変異誘発又はポリメラーゼ連鎖反応によってドメインをコード化する分子のヌクレオチド配列の操作により、生成され得る。最も単純な修飾は、１つ以上のアミノ酸の、類似の生化学的特性を有するアミノ酸との置換に関与する。これらいわゆる同類置換は、結果として生ずるタンパク質の活性に最小の影響を及ぼすかもしれない。幾つかの実施形態において、開示された組み換え型ＭＨＣポリペプチドは、天然のＭＨＣポリペプチド、或いはβ１α１又はα１α２のＭＨＣポリペプチドの自己凝集を減少させる１以上のアミノ酸変化を含む、修飾されたＭＨＣポリペプチドを含む。例えば、米国特許公開番号２００５／０１４２１４２、及びＨｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ８０：２−１２，  ２００５を参照し、その両方は、引用により本明細書に組み込まれる。本開示の修飾されたＭＨＣポリペプチドは、天然のＭＨＣポリペプチドにおいて見出される自己結合界面内に位置する、又はそれを定義する溶媒を暴露した標的部位での１以上のアミノ酸変化を導入するために、合理的に設計され、構成される。修飾されたＭＨＣポリペプチドにおいて変更される自己結合界面は、典型的に、天然のＭＨＣポリペプチドの、又は天然のＭＨＣポリペプチドを組み込む「修飾されない」β１α１或いはα１α２のＭＨＣポリペプチドの自己凝集を媒介する、１以上のアミノ酸残基を含む。自己結合界面は、天然のＭＨＣポリペプチドの一次構造と相互に関連付けられるが、この界面は、天然のポリペプチドがインタクトなＭＨＣ複合体から分離し、「修飾されない」β１α１又はα１α２のＭＨＣ分子に関連して組み込まれる時に、凝集を促進する表面特徴として現われるだけである。本明細書に記載の典型的なＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、結合したβ１とα１のドメインを含む）の場合において、天然のβ１α１構造は、インタクトなＭＨＣＩＩ複合体において見出される免疫グロブリンフォールド様のβ２とα２のドメインの除去の後に、特定の溶媒に曝露された、自己結合残基又はモチーフを示すだけである。修飾されていないβ１α１ＭＨＣ分子の凝集を媒介する、これら同じ残基又はモチーフは、溶媒のアクセス不能な構成に仮定的に「埋め込まれ（ｂｕｒｉｅｄ）」、又は他に、天然又は前駆体のＭＨＣＩＩ複合体（おそらく免疫グロブリンフォールド様のβ２とα２のドメインとの関連性を通じて）において「マスクされる（ｍａｓｋｅｄ）」（例えば、自己凝集の媒介を妨げる）。
【００７３】
幾つかの実施例において、非常に少ない凝集プローンフォーム（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｐｒｏｎｅ  ｆｏｒｍ）をもたらすためのＭＨＣクラスＩＩ成分を含むＭＨＣ分子の表面修飾は、例えば、非疎水性の残基（例えば、極性の残基又は荷電された残基）と、ＭＨＣ成分のβ−シートプラットフォームにおいて同定される、１つ以上の疎水性の残基を交換することによって達成することができる。図１３Ａ−Ｃは、典型的なＨＬＡ−ＤＲ２ポリペプチド、典型的なβ１α１分子、及び疎水性のβ−シートプラットフォーム残基を表し、それぞれ、修飾のために標的とされ得る。幾つかの例において、β−シートプラットフォームの中心コア部分の１以上の疎水性アミノ酸、例えば、ヒトＤＲ２のＭＨＣクラスＩＩβ１α１ＲＴＬ（例えば、配列番号１１）のＶ１０２、Ｉ１０４、Ａ１０６、Ｆ１０８、及びＬ１１０の１つ以上が、修飾される。他の例において、β−シートプラットフォームの中心コア部分の１以上の疎水性アミノ酸、例えば、ヒトＤＲ２のＭＨＣクラスＩＩβ１α１ＲＴＬ（例えば、配列番号１９）のＶ９８、Ａ１０２、及びＦ１０４の１つ以上が、修飾される。更なる例において、β−シートプラットフォームの中心コア部分の１以上の疎水性アミノ酸、例えば、ヒトＤＱ２のＭＨＣクラスＩＩβ１α１ＲＴＬ（例えば、配列番号２０）のＶ１０４、及びＧ１０８の１以上が、修飾される。当業者は、他のＭＨＣクラスＩＩ分子又はβ１α１分子において対応するアミノ酸を識別することができる。例えば、図１４で提供される、ヒト、マウス、又はラットのＲＴＬのアラインメントを参照する。
【００７４】
特定の実施例において、同定された疎水性のβ−シートプラットフォームアミノ酸の１以上は、極性の残基（例えばセリン）又は荷電された残基（例えばアスパラギン酸）のいずれかへと変更される。幾つかの例において、（配列番号１１の：又は別のβ１α１ポリペプチドにおいて対応するアミノ酸）Ｖ１０２、Ｉ１０４、Ａ１０６、Ｆ１０８、及びＬ１１０の５つすべては、極性の残基又は荷電された残基へと変更される。１つの例において、配列番号１１の（又は他のβ１α１ポリペプチドにおいて対応するアミノ酸）Ｖ１０２、Ｉ１０４、Ａ１０６、Ｆ１０８、及びＬ１１０の各々は、アスパラギン酸残基に変更される。
【００７５】
他の例において、追加の疎水性の標的残基は、ＭＨＣ分子に組み込まれるクラスＩＩＭＨＣ分子のβ−シートプラットフォーム部分の自己結合の特徴を変更するための修飾に利用可能である。図１３Ｃを参照すると、図解されたβ−シートプラットフォームの左アーム（ｌｅｆｔ  ａｒｍ）は、非疎水性の（例えば、極性又は荷電された）残基に修飾され得る、配列番号１１（或いは他のβ１α１ポリペプチドにおいて対応するアミノ酸）の３つの記された疎水性の残基（頂部乃至底部）、Ｌ１４１、Ｖ１３８、及びＡ１３３の別々の「モチーフ」を含む。幾つかの例において、配列番号１１のＬ１４１、Ｖ１３８、及びＡ１３３は、配列番号１９のＬ１３９、Ｖ１３６、及びＤ１３１、或いは、配列番号２０のＶ１４１、Ｋ１３８、及びＶ１３３に対応する。また、図１３Ｃを参照すると、様々な標的の疎水性の残基は、配列番号１１（或いは他のβ１α１ポリペプチドにおいて対応するアミノ酸）のＬ９、Ｆ１９、Ｌ２８、Ｆ３２、Ｖ４５、及びＶ５１を含む、コアβ−シートモチーフの右側に印づけられ、それらは、ＭＨＣ分子修飾のための１以上の追加の、自己結合の、又は自己関連させる標的「モチーフ」と見なされ得る。幾つかの例において、配列番号１１のＬ９、Ｆ１９、Ｌ２８、Ｆ３２、Ｖ４５、及びＶ５１は、配列番号１９のＬ９、Ｆ１９、Ｌ２６、Ｉ３０、Ｖ４３、及びＶ４９、或いは、配列番号２０のＶ９、Ｔ１９、Ｖ２８、Ｉ３２、Ｖ４５、及びＶ５１に対応する。当業者は、他のＭＨＣクラスＩＩ分子又はβ１α１分子において対応するアミノ酸を識別することができる。３つの残基のいずれか１つ又はそれらの組み合わせは、非疎水性の残基に対する修飾に向けられ得、モノマーのＭＨＣ分子を増加させ得る。
【００７６】
本明細書に開示の修飾されたＭＨＣ分子は、対応する修飾されないＭＨＣ分子（例えば、天然のＭＨＣポリペプチドを含んでおり、修飾されない、自己結合界面を持つ）と比較して、溶液中の単分散の（モノマー）分子の割合の増加をもたらす。特定の実施形態において、水溶液中の単分散の種として存在する修飾されないＭＨＣ分子の割合は、合計のＭＨＣタンパク質の１％もの低さ、典型的には５−１０％以下の低さであり、修飾されないＭＨＣ分子のバランスは、高次凝集の形態において見出される。対照的に、本明細書に開示の修飾されたＭＨＣ分子は、溶液に少なくとも１０％−２０％の単分散の種をもたらす。他の実施形態において、溶液中のモノマーの種の割合は、合計のＭＨＣタンパク質の２５％−４０％、しばしば５０％−７５％から、８０％、９０％、９５％、又はそれ以上までの範囲に及び、凝集されたＭＨＣ種の割合の比例した減少は、比較可能な条件下で、対応する修飾されないＭＨＣ分子について観察された分量と比較される。
【００７７】
〈Ｄ．抗原決定基〉
開示された組成物は、上述のものなどの、組み換え型ＭＨＣポリペプチドに共有結合される抗原決定基（ペプチド抗原など）を含む。クラスＩ又はクラスＩＩのＭＨＣ分子に慣習的に関連し、Ｔ細胞によって認識される、任意の抗原のペプチドは、この目的に使用することができる。多くのソースから抗原のペプチドは詳細に特徴づけられ、ミツバチ毒液アレルゲン、チリダニアレルゲン、細菌によって作られる毒素（破傷風毒素など）、及び自己免疫性疾患に関与するヒト組織抗原から抗原のペプチドを含む。前記ペプチドの詳細な考察は、米国特許第５，５９５，８８１号；第５，４６８，４８１号；及び第５，２８４，９３５号で提供され；これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる。
【００７８】
当該技術分野で周知のように（例えば米国特許第５，４６８，４８１号を参照）、ＡＰＣの表面上のＭＨＣ複合体における抗原の提示は、一般に全体の抗原のペプチドに関与しない。むしろ、β１ドメインとα１ドメインの（ＭＨＣの場合）、又はα１ドメインとα２ドメインの（ＭＨＣ  Ｉの場合）間の溝に位置づけられるペプチドは、典型的に、全体の抗原のペプチドの小断片である。「Ｊａｎｅｗａｙ  ＆  Ｔｒａｖｅｒｓ  （Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９７）」で考察されるように、ＭＨＣクラスＩ分子のペプチド溝に位置づけられるペプチドは、結合ポケットの大きさにより抑圧され、典型的には長さが８−１５のアミノ酸であり、より典型的には長さが８−１０のアミノ酸である（しかし、可能な例外に関して、「Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３７１：６２６−６２９，  １９９４」を参照）。対照的に、ＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチド溝に位置するペプチドは、このように抑圧されず、しばしばかなり大きく、典型的には少なくとも長さが１１のアミノ酸（約１３−２５のアミノ酸など）である。ＭＨＣ分子へ充填するためのペプチド断片は、合成ペプチド合成機械（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｍａｃｈｉｎｅ）の使用など、標準の手段によって調製することができる。
【００７９】
典型的な抗原決定基は、自己免疫性疾患の病因において識別されたペプチドを含む。幾つかの例において、抗原決定基は、関節リウマチ（例えば、ＩＩ型コラーゲン）、重症筋無力症（アセチルコリン受容体）、多発性硬化症（ＭＢＰ、ＰＬＰ、又はＭＯＧ）、ブドウ膜炎又は他の網膜の疾患（光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）、アレスチン、レコベリン、及びフォスデューシン）、及び糖尿病（インスリン）の病因において識別されたペプチドである。
【００８０】
特定の抗原決定基は、限定されないが、ＭＯＧ  ３５−５５（配列番号５）、ＭＯＧ  １−２５（ＧＱＦＲＶＩＧＰＲＨＰＩＲＡＬＶＧＤＥＶＥＬＰＣＲ；配列番号２１）、ＭＯＧ  ９４−１１６（ＧＧＦＴＣＦＦＲＤＨＳＹＱＥＥＡＡＭＥＬＫＶＥ；配列番号２２）、ＭＯＧ  １４５−１６０（ＶＦＬＣＬＱＹＲＬＲＧＫＬＲＡＥ；配列番号２３）、又はＭＯＧ  １９４−２０８（ＬＶＡＬＩＩＣＹＮＷＬＨＲＲＬ；配列番号２４）などのＭＯＧペプチド；ＭＢＰ  １０−３０（ＲＨＧＳＫＹＬＡＴＡＳＴＭＤＨＡＲＨＧＦＬ；配列番号２５）、ＭＢＰ  ３５−４５（ＤＴＧＩＬＤＳＩＧＲＦ；配列番号２６）、ＭＢＰ  ７７−９１（ＳＨＧＲＴＱＤＥＮＰＶＶＨＦ；配列番号２７）、ＭＢＰ  ８５−９９（ＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲ；配列番号２８）、ＭＢＰ  ９５−１１２（ＩＶＴＰＲＴＰＰＰＳＱＧＫＧＲＧＬＳ；配列番号２９）、又はＭＢＰ  １４５−１６４（ＶＤＡＱＧＴＬＳＫＩＦＫＬＧＧＲＤＳＲＳ；配列番号３０）などのＭＢＰペプチド；及び、ＰＬＰ  １３９−１５１（ＣＨＣＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦＶＧ；配列番号１６）、又はＰＬＰ  ９５−１１６（ＧＡＶＲＱＩＦＧＤＹＫＴＴＩＣＧＫＧＬＳＡＴ；配列番号３１）などのＰＬＰペプチドを含む。追加の典型的な抗原決定基は、限定されないが、ＩＩ型コラーゲン２６１−２７４（ＡＧＦＫＧＥＱＧＰＫＧＥＰＧ；配列番号３２）、ＩＩ型コラーゲン２５９−２７３（ＧＩＡＧＦＫＧＥＱＧＰＫＧＥＰ；配列番号３３）、ＩＩ型コラーゲン２５７−２７０（ＥＰＧＩＡＧＦＫＧＥＱＧＰＫ；配列番号３４）、又は修飾されたＩＩ型コラーゲン２５７−２７０（ＡＰＧＩＡＧＦＫＡＥＱＡＡＫ；配列番号３５）などのＩＩ型コラーゲンペプチドを含む。
【００８１】
更に典型的な抗原決定基は、ＩＲＢＰ  １１７７−１１９１（ＡＤＧＳＳＷＥＧＶＧＶＶＰＤＶ；配列番号３６）などのＩＲＢＰペプチド；アレスチン２９１−３１０（ＮＲＥＲＲＧＩＡＬＤＧＫＩＫＨＥＤＴＮＬ；配列番号３７）などのアレスチンペプチド；フォスデューシン６５−９６（ＫＥＲＭＳＲＫＭＳＩＱＥＹＥＬＩＨＱＤＫＥＤＥＧＣＬＲＫＹＲＲＱ；配列番号３８）などのフォスデューシンペプチド；又は、レコベリン４８−５２（ＱＦＱＳＩ；配列番号３９）、レコベリン６４−７０（ＫＡＹＡＱＨＶ；配列番号４０）、レコベリン６２−８１（ＰＫＡＹＡＱＨＶＦＲＳＦＤＡＮＳＤＧＴＬ；配列番号４１）、レコベリン１４９−１６２（ＥＫＲＡＥＫＩＷＡＳＦＧＫＫ；配列番号４２）などのレコベリンペプチドを含む。追加の典型的な抗原決定基は、フィブリノゲン−α４０−５９（ＶＥＲＨＱＳＡＣＫＤＳＤＷＰＦＣＳＤＥＤ；配列番号４３）、フィブリノゲン−α６１６−６２５（ＴＨＳＴＫＲＧＨＡＫＳＲＰＶＲＧＩＨＴＳ；配列番号４４）、フィブリノゲン−α７９−９１（ＱＤＦＴＮＲＩＮＫＬＫＮＳ；配列番号４５）、又はフィブリノゲン−α１２１−１４０（ＮＮＲＤＮＴＹＮＲＶＳＥＤＬＲＳＲＩＥＶ；配列番号４６）などのフィブリノゲン−αペプチド；ビメンチン５９−７９（ＧＶＹＡＴＲＳＳＡＶＲＬＲＳＳＶＰＧＶＲＬ；配列番号４７）、ビメンチン２６−４４（ＳＳＲＳＹＶＴＴＳＴＲＴＹＳＬＧＳＡＬ；配列番号４８）、ビメンチン２５６−２７５（ＩＤＶＤＶＳＫＰＤＬＴＡＡＬＲＤＶＲＱＱ；配列番号４９）、又はビメンチン４１５−４３３（ＬＰＮＦＳＳＬＮＬＲＥＴＮＬＤＳＬＰＬ；配列番号５０）などのビメンチンペプチド；α−エノラーゼ５−２１（ＫＩＨＡＲＥＩＦＤＳＲＧＮＰＴＶＥ；配列番号５１）などのα−エノラーゼペプチド；或いは、ヒト軟骨糖タンパク質３９  ２５９−２７１（ＰＴＦＧＲＳＦＴＬＡＳＳＥ；配列番号５２）などのヒト軟骨糖タンパク質３９ペプチドを含む。
【００８２】
他の例において、抗原決定基は、α２−グリアジン６１−７１（ＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰ；配列番号５３）又はα２−グリアジン５８−７７（ＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱ；配列番号５４）などのα２−グリアジンペプチドを含む。
【００８３】
幾つかの例において、抗原決定基はまた、グリコシル化又はシトルリン化などの修飾を含む。他の例において、抗原決定基は、１つ以上の追加のアミノ酸置換を含む。
【００８４】
幾つかの実施形態において、抗原決定基（ペプチド抗原など）は、ｐ４位置にシステイン残基を含む。幾つかの実施形態において、抗原決定基は、ＭＨＣポリペプチド（ＭＨＣクラスＩＩβ１α１ポリペプチドなど）のＰ４ポケットを占めることができるシステイン残基を含む。システイン残基は、抗原決定基中の自然発生の（天然の）システイン残基であり、又は、非自然発生のシステイン残基（例えば、突然変異又はペプチド合成により誘発される）であり得る。当業者は、抗原決定基のｐ４位置を識別することができる（例えば、「Ｃｏｒｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：５０５−５１１，  ２０００；  Ｌａｔｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：６９９−７１０，  ２０００」を参照）。例えば、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子は、ペプチドのためのコア結合モチーフによって特徴付けられたペプチド結合プリファランス（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）を有し、ペプチドのアンカー残基は、各々の対立遺伝子の特徴的なポケットに結合する。ポケットに結合するペプチド残基は「アンカー残基」と考えられる。Ｐ４ポケットは、ＭＨＣクラスＩＩ分子内の天然のジスルフィド結合の近くに位置している。それ故、Ｐ４ポケットを占めるシステインを有するペプチド抗原は、天然のジスルフィド結合を分裂させて、ＭＨＣポリペプチドを有するジスルフィド結合を形成することができる。すべてのＭＨＣ分子のモチーフを識別するための資源が利用可能である（例えば、ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅの世界的なウェブ上にて）。また、以下の実施例６を参照する。システイン残基は、例えば突然変異誘発によって、抗原決定基へ導入され、本明細書に開示の方法を利用して組み換え型ＭＨＣポリペプチドを有するジスルフィド結合を形成するそれらの能力に関して試験され得る。
【００８５】
幾つかの例において、自然発生の抗原決定基は、システイン残基を含まず、抗原決定基は、非自然発生のシステイン残基を導入するために修飾される。幾つかの例において、抗原決定基は、例えば、突然変異誘発又はペプチド合成によって、１つ以上のシステイン残基を含むため（例えば、ｐ４位置に非自然発生のシステイン残基を導入するため）、又は１つ以上のシステイン残基を取り除くために修飾される。幾つかの例において、非自然発生のシステインは、抗原決定基のアミノ末端又はカルボキシ末端に存在する。他の例において、非自然発生のシステインは、抗原決定基のアミノ末端の半分、抗原決定基のアミノ末端の３分の１、又は抗原決定基のアミノ末端の４分の１に存在する。更なる例において、非自然発生のシステインは、抗原決定基のカルボキシ末端の半分、抗原決定基のカルボキシ末端の３分の１、又は抗原決定基のカルボキシ末端の４分の１に存在する。
【００８６】
幾つかの例において、ペプチド抗原は、インスリンＢ：９−２３などのインスリンペプチド（例えば、配列番号３）を含む。このペプチドは、位置１９（配列番号３の位置１１）に自然発生のシステイン残基を含み、それは、幾つかの実施例においてＭＨＣポリペプチドのシステインを有するジスルフィド結合を形成することができる。別の例において、ペプチド抗原は、ＭＯＧ  ３５−５５（例えば、配列番号５又は６）などのＭＯＧペプチドを含む。このペプチドは、自然発生のシステイン残基を含まない。幾つかの例において、ＭＯＧ  ３５−５５の１つの残基は、ＭＨＣポリペプチドのシステインを有するジスルフィド結合を形成することができるシステイン残基（例えば、配列番号１２、１３、及び１５のいずれか１つ）に変異させられる。更なる例において、ペプチドは、ＰＬＰ  １３９−１５１（例えば、配列番号１６）などのＰＬＰペプチドである。
【００８７】
〈ＩＩＩ．医薬製剤、及び自己免疫疾患を処置又は阻害する方法〉
ペプチド抗原に共有結合されるＭＨＣポリペプチドを含む、開示された組成物は、抗原特異性のＴ細胞によって媒介される疾病を処置又は阻害するために使用することができる。前記疾病は、アレルギー、移植拒絶反応及び自己免疫疾患（限定されないが、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、セリアック病、乾癬、自己免疫疾患、ブドウ膜炎、視神経炎、悪性貧血、重症筋無力症、及びアディソン病を含む）を含む。開示された組成物はまた、認知障害及び／又は精神神経の機能障害（物質依存によって誘導されるものなど）、網膜障害（網膜変性、黄斑症、網膜症、網膜剥離、又は緑内障など）を含む他の疾病を処置又は阻害するために使用することができる。これら疾病を処置するために使用され得るＭＨＣポリペプチドの様々な形態は、以前に記載されており、それらのシステムの中で使用される方法は、本開示の組成物に等しく有用である。典型的な方法論は、米国特許第５，１３０，２９７号、第５，２８４，９３５号、第５，４６８，４８１号、第５，７３４，０２３号、及び５，１９４，４２５号（引用により本明細書に組み込まれる）に記載される。また、２０１１年１月２８日出願の、米国仮特許出願第６１／４３７，３１６号；２０１１年１月３１日出願の、米国仮特許出願第６１／４３８，００４号；及び２０１１年４月７日出願の、米国仮特許出願第６１／５１６，９１８号；２０１０年３月８日出願の、米国特許出願第１２／６６１，０３８号；米国特許公開番号２０１１／０００８３２；及び「Ｈｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ」を参照し、そのすべては、引用により本明細書に組み込まれる。
【００８８】
一例として、ペプチド抗原に共有結合される有効な量のＭＨＣポリペプチドを含む組成物は、自己反応性Ｔ細胞個体群中のアネルギーを誘発するために被験体に投与され得、又は、これらＴ細胞個体群は、毒性の部分により共役されるＭＨＣ／ペプチド複合体の投与により処置され得る。或いは、ＭＨＣ／ペプチド複合体は、Ｔ抑制細胞を誘導するため、又はサイトカイン発現特性を修飾するために、被験体に投与され得る。
【００８９】
被験体（ヒト又は非ヒトの哺乳動物など）への投与のため、本明細書に開示のペプチド抗原に共有結合される組み換え型ＭＨＣポリペプチドは、一般に薬学的に許容可能な担体と組み合わせる。一般に、担体の性質は、使用されている投与の特定の形態に依存する。本開示に役立つ薬学的に許容可能な担体及び賦形剤は、従来のものである。例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  Ｅｄｉｔｏｒ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ，  ２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （２００５）」を参照。例えば、非経口の製剤は、通常、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水溶性のデキストロース、グリセロールなどの薬学的及び生理学的に許容可能な流体を含む、注射可能な流体を含む。固形組成物（例えば、粉末剤、丸剤、錠剤、又はカプセル剤の形態）のため、従来の無毒な固形の担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、又はステアリン酸マグネシウムを含むことができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤又は乳化剤、防腐剤、ｐＨ緩衝剤などの小量の無毒な補助的な物質、例えば、酢酸ナトリウム又はモノラウリン酸ソルビタンを含むことができる。
【００９０】
当該技術分野で既知なように、タンパク質ベースの医薬品は、食物摂取によって単に非能率的に送達され得る。しかしながら、特に、遅延放出の組成物において処方されれば、製薬のタンパク質の丸剤ベースの形態はまた、代わりに皮下に投与され得る。遅延放出製剤は、コレステロールなど生物学的適合のマトリックスと標的タンパク質を組み合わせることにより生成され得る。タンパク質医薬品を投与する別の方法は、小型の浸透圧のポンプの使用による。上述のように、生物学的適合の担体も、この送達方法と併用して使用されるであろう。追加の起こり得る送達方法は、吸入（Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１８６８−１８７１，  １９９７）及び経皮送達（Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １３：４１１−４２０，  １９９６）による、深い肺送達を含む。
【００９１】
本開示の医薬組成物は、それらの意図した目的を達成する任意の手段によって投与され得る。幾つかの実施形態において、抗原決定基に共有結合する組み換え型ＭＨＣポリペプチドを含む、有効な量の開示された組成物は、自己免疫障害を処置又は阻害するために自己免疫障害の被験体に投与される。ペプチド抗原に共有結合される選択されたＭＨＣポリペプチドを含む組成物の投与のための量及びレジメンは、担当の臨床医によって決定され得る。治療適用に有効な量は、処置される疾病の性質及び重症度、選択された特定のＭＨＣポリペプチド及びペプチド抗原、患者及び他の臨床的な因子の年齢並びに状態に依存して、変化する。典型的に、用量範囲は、約０．１μｇ／ｋｇの体重から約１００ｍｇ／ｋｇの体重である。他の適切な範囲は、約１００μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの体重、又は、約５００μｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇの体重の用量を含む。服薬スケジュールは、被験体のタンパク質に対する感受性など、多くの臨床的な因子に依存して、毎週１回から毎日１回まで変わり得る。服薬スケジュールの例は、毎週２回、毎週３回又は毎日の３μｇ／ｋｇの用量の投与；毎週２回、毎週３回又は毎日の７μｇ／ｋｇの用量の投与；毎週２回、毎週３回又は毎日の１０μｇ／ｋｇの用量の投与；又は、毎週２回、毎週３回又は毎日の３０μｇ／ｋｇの用量の投与である。服薬スケジュールの追加の例は、毎週２回、毎週３回又は毎日の約１ｍｇ／ｋｇの用量の投与；毎週２回、毎週３回又は毎日の約５ｍｇ／ｋｇの用量の投与；又は、毎週２回、毎週３回又は毎日の約１０ｍｇ／ｋｇの用量の投与である。
【００９２】
抗原決定基に共有結合される、開示されたＭＨＣ分子の１以上を含む医薬組成物は、正確な投与量の個々の投与に適した、単位剤形に処方することができる。１つの具体的な限定しない例において、単位投与量は、抗原決定基に共有結合される、約１ｎｇから約１０００ｍｇまでのＭＨＣポリペプチドを含み得る（約１０ｎｇ乃至７００ｍｇ、約１ｍｇ乃至５００ｍｇ、約５ｍｇ乃至２５０ｍｇ、又は約１０ｍｇ乃至１００ｍｇ（例えば約７０ｍｇ）など）。投与される活性組成物の量は、処置されている被験体、苦痛の重症度、及び投与の方法に依存し、処方する臨床医の判断に依存するのが最も良い。これらの境界内で、投与される製剤は、処置されている被験体において所望される効果を達成するのに有効な量の活性な組成物の量を含む。幾つかの例において、ＭＨＣ分子は、毎日、毎週、毎週２回、又は毎月投与される。
【００９３】
本開示の化合物は、局所、経口、筋肉内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、皮内、鞘内、皮下、眼内、吸入、又は坐薬などの様々な方法で、被験体（自己免疫障害を有する、又は自己免疫障害を進行する危険性のある被験体など）に投与することができる。１つの例において、化合物は被験体に皮下投与される。別の例において、化合物は被験体に静脈内投与される。投与の特定の形態及び投与レジメンは、担当臨床医によって選択され、その場合の詳細（例えば、被験体、疾患、関与する疾患の状態、処置が予防的であるかどうか）を考慮に入れる。処置は、数日乃至数カ月、又は更に数年の期間にわたり、毎月、隔月、毎週、毎日、又は毎日複数の量の組成物を含み得る。
【００９４】
幾つかの例において、抗原決定基に共有結合される、有効な量（治療上有効な量など）の開示された組み換え型ＭＨＣポリペプチドは、被験体の自己免疫障害（多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、セリアック病、乾癬、全身性紅斑性狼瘡、又は視神経炎など）を処置又は阻害するのに必要な抗原に共有結合される、ＭＨＣポリペプチド（ＭＨＣクラスＩＩβ１α１ポリペプチド、又はＭＨＣクラスＩα１α２ポリペプチドなど）の量でもよい。
【００９５】
〈ＩＶ．共有結合されたＭＨＣポリペプチド及びペプチド抗原の更なる使用〉
ペプチド抗原に共有結合されるＭＨＣポリペプチドを含む本開示の組成物は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）及びインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の適用に役立つ。実際は、これらのポリペプチドの生物学的活性の結果として、それらは、ＭＨＣ分子を発現する、インタクトな精製されたＭＨＣ分子、又はＡＰＣのいずれかの代わりに、多数の適用において使用され得る。セクションＩＩＩ（上記）で考察されるように、本開示の組成物は、自己免疫障害を有する、又は当該障害の危険性のある被検体の自己免疫障害を処置又は阻害するのに役立つ。追加の適用が以下に記載される。
【００９６】
開示された組成物のインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の適用は、抗原特異性のＴ細胞の検出、定量化、及び精製を含む。ＭＨＣ由来の複合体の様々な形態をこれらの目的に使用する方法は、周知であり、例えば米国特許第５，６３５，３６３号、第５，５９５，８８１号、及び第６，８１５，１７１号に記載される。そのような適用のため、ペプチド抗原に共有結合されるＭＨＣポリペプチドを含む、開示された組成物は、溶液中で遊離し、又はプラスチックディッシュ、マイクロタイタープレート、膜、又はビーズの表面などの固形の支持物に付けられ得る。典型的に、そのような表面は、プラスチック、ナイロン又はニトロセルロースである。遊離した溶液中のペプチド抗原に共有結合されるＭＨＣポリペプチドを含む組成物は、蛍光の活性化された細胞分類（ＦＡＣＳ）などの適用に役立つ。抗原特異性のＴ細胞の検出及び定量化のため、ポリペプチドは、好ましくは、放射性核種（例えば、インジウム−１１１などのガンマ線を放射するソース）、常磁性の同位体、蛍光のマーカー（例えば、フルオレセイン）、酵素（アルカリフォスファターゼなど）、補助因子、化学発光の化合物、及び生物発光の化合物などの、検知可能なマーカーにより標識化される。ＭＨＣポリペプチドへのそのようなラベルの結合は、標準分析法（例えば、米国特許第５，７３４，０２３号；引用により本明細書に組み込まれる）を使用して達成され得る。
【００９７】
検出され、定量化され、又はそうでなければ操作されるべきＴ細胞は、一般的に、被験体から除去された生体サンプルの中に存在する。生体サンプルは、典型的に血液又はリンパ液であるが、リンパ節、腫瘍、関節などの組織サンプルも含み得る。サンプル中のＴ細胞を操作するために使用される方法の正確な詳細は、行われる操作のタイプ、及び生体サンプルとＭＨＣ分子の両方の物理的形態に依存することが認識される。一般的には、ペプチド抗原に共有結合されるＭＨＣポリペプチドを含む組成物は、生体サンプルに加えられ、混合物は、結合を可能にする十分な時間（例えば約５分から数時間まで）でインキュベートされる。ペプチド抗原に共有結合されるＭＨＣポリペプチドを含む組成物に結合されたＴ細胞の検出及び定量化は、蛍光顕微鏡法及びＦＡＣＳ（ＭＨＣ／ペプチドは蛍光のラベルを含む）を含む、多くの方法によって行われ得る。ＥＬＩＳＡ及び放射免疫定量法などの標準の免疫測定も、ＭＨＣ／ペプチド複合体が固形の支持物に結合される、Ｔ細胞−ＭＨＣ／ペプチド複合体を定量化するために使用され得る。幾つかの例において、抗原特異性のＴ細胞個体群の定量化は、疾患の経過を監視するのに役立つ。例えば、多発性硬化症の被験体において、抗原反応的なＴ細胞の数を減らすために施される治療の効果は、被験体に存在する前記Ｔ細胞の数を定量化するために、抗原（ＭＢＰなど）に共有結合されるＭＨＣを使用して監視され得る。
【００９８】
ＦＡＣＳはまた、抗原特異性のＴ細胞が、濃縮の目的などのためにサンプルから除去されるべき場合に特に役立ち得る、生体サンプルからＴ細胞−ＭＨＣ／ペプチド複合体を分離するために使用され得る。ＭＨＣ／ペプチド複合体が磁気ビーズに結合される場合、Ｍ「Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １１：２３１−２３８，  １９９０」に記載されるように、結合Ｔ細胞個体群が精製され得る。
【００９９】
生体サンプル中の具体的な抗原特異性のＴ細胞個体群は、標的とされたＴ細胞によって認識されるペプチドを含むペプチド抗原に共有結合される、ＭＨＣポリペプチドを含む組成物によるサンプルのインキュベーションによって、アネルギー化され得る。したがって、これら組成物が、他の共同刺激的な分子の欠如下でＴ細胞受容体に結合するとき、アネルギーの状態はＴ細胞中で誘発される。そのような手法は、標的とされたＴ細胞個体群が、様々な自己免疫性疾患などの、自己抗原を認識するという状況に役立つ。或いは、標的とされたＴ細胞個体群は、毒性の部分と共役されるＭＨＣ／ペプチド複合体による、生体サンプルのインキュベーションによって、直接死滅させられ得る。
【０１００】
Ｔ細胞はまた、本開示のポリペプチドによって抗原特異性の方法で活性化され得る。例えば、ペプチド抗原に共有結合されるＭＨＣポリペプチドを含む、開示された組成物は、プラスチックディッシュ又は磁気ビーズなどの、固体表面に対して高密度で接着され得る。固体表面上のポリペプチドへのＴ細胞の暴露は、共同刺激的な分子の欠如にもかかわらず、抗原特異性の方法でＴ細胞を刺激し、活性化することができる。これはおそらく、共同刺激が活性化に不要であるＭＨＣ／ペプチド複合体に結合するＴ細胞上のＴ細胞受容体の十分な数に起因する。
【０１０１】
１つの実施形態において、Ｔ抑制細胞が誘発される。したがって、ペプチド抗原に共有結合されるＭＨＣポリペプチドを含む組成物が、適切なコンテキスト中のＴ細胞受容体に結合するとき、Ｔ抑制細胞はインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で誘発される。１つの実施形態において、エフェクター機能は修飾され、サイトカイン特性は、ＭＨＣ／ペプチド複合体でのインキュベーションによって変更される。
【０１０２】
〈Ｖ．ペプチド抗原に共有結合される組み換え型ＭＨＣポリペプチドを作るための方法及びキット〉
幾つかの実施形態において、開示された組成物は、抗原決定基とＭＨＣポリペプチドの間のジスルフィド結合の形成に十分な条件下で、組み換え型ＭＨＣポリペプチド（β１α１ポリペプチド、或いはα１α２ポリペプチド）と、抗原決定基（ペプチド抗原など）を接触させることにより調製される。幾つかの実施形態において、１つ以上（１、２、３、４、５、又はそれ以上など）の抗原決定基は、抗原決定基とＭＨＣポリペプチドの間のジスルフィド結合の形成に十分な条件下で、組み換え型ＭＨＣポリペプチド（β１α１ポリペプチド、或いはα１α２ポリペプチド）によりインキュベートされ、それにより、各々が異なる抗原決定基に結合されるＭＨＣポリペプチドの混合された個体群を生成する。他の実施例において、異なる抗原決定基に結合されるＭＨＣポリペプチドの混合された個体群は、ジスルフィド結合の形成に十分な条件下で、組み換え型ＭＨＣポリペプチドにより各々の抗原決定基をインキュベートし、次に、抗原決定基に共有結合される、結果として生じるＭＨＣポリペプチドを一緒に混合することにより、生成される。幾つかの例において、ＭＨＣポリペプチドは各々の反応において同じである。他の実施例において、ＭＨＣポリペプチドは、各反応において異なり、ＭＨＣポリペプチド及び／又は抗原決定基の混合された個体群を生成する。
【０１０３】
幾つかの実施形態において、組み換え型ＭＨＣポリペプチドと抗原決定基の間のジスルフィド結合の形成に十分な条件は、１つ以上の抗原決定基のモル過剰を含む。幾つかの実施例において、組み換え型ＭＨＣポリペプチドに対する抗原決定基の比率は、少なくとも１．１：１（少なくとも、１．５：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、５０：１、５０：１、１００：１、又はそれ以上など）である。他の例において、組み換え型ＭＨＣポリペプチドに対する抗原決定基の比率は、約１：１乃至約５００：１（約２：１乃至１００：１、約５：１乃至５０：１、又は約１０：１乃至２０：１など）である。１つの限定しない実施例において、組み換え型ＭＨＣポリペプチドに対する抗原決定基の比率は、約１０：１である。当業者は、開示された組成物がまた、例えば、インキュベーションの時間及び／又は温度等の他の反応パラメーターを調整することによって、ＭＨＣポリペプチドのモル過剰を抗原決定基に接触させることにより、生成され得ることを認識するであろう。
【０１０４】
幾つかの実施形態において、抗原決定基と組み換え型ＭＨＣポリペプチドの間のジスルフィド結合の形成に十分な条件は、ジスルフィド結合を形成するのに十分な温度及び期間で、抗原決定基のレドックス捕捉（ｒｅｄｏｘ  ｃａｐｔｕｒｅ）を促進する、緩衝液又は溶液中でのインキュベーションを含む。レドックス捕捉のための典型的な溶液は、約５乃至約８．５（例えば、約５．５乃至８．０、約６乃至７．５、又は約６．５乃至８．５等）のｐＨを有する溶液を含む。幾つかの例において、溶液のｐＨは、約６．０乃至７．０（約６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６．６．７、６．８、６．９、又は７．０など）である。１つの限定しない例において、溶液は、約６．５のｐＨを有する。幾つかの例において、より低いｐＨ（例えば、約６乃至７）を利用することで、ＭＨＣポリペプチドと抗原決定基の間のジスルフィド結合の形成を促進し、抗原決定基によってホモダイマーの形成を減少させる。ＭＨＣポリペプチドが、ジスルフィド結合形成（例えば、約２−５Åなど、約１−１０Åの範囲内）に関与する、システイン残基に近い酸性アミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を含むとき、これは特に有利であり得る。幾つかの例において、溶液は、随意に、軽度の還元剤（グルタチオン、β−メルカプトエタノール、又はジチオトレイトールなど）を含み、それはまた、抗原決定基によってホモダイマー形成を減少させることができる。
【０１０５】
その溶液はまた、洗浄剤（例えば、イオン性洗浄剤、両性イオン洗浄剤、又は非イオン洗浄剤）を含む。適切な洗浄剤は、当業者により選択され、硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルフォナート（ＣＨＡＰＳ）、［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルフォナート（ＣＨＡＰＳＯ）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）洗浄剤（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０など）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）洗浄剤（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００など）、又はＢｒｉｊ（登録商標）洗浄剤（Ｂｒｉｊ（登録商標）３５など）を含む。幾つかの例において、溶液は、約０．０２５−０．０７５％、又は約０．０５％などの、約０．０１−０．１％の洗浄剤（例えば、約０．０１％、０．０１５％、０．０２％、０．０２５％、０．０３％、０．０３５％、０．０４％、０．０４５％、０．０５％、０．０５５％、０．０６％、０．０６５％、０．０７％、０．０７５％、０．０８％、０．０８５％、０．０９％、０．０９５％、又は０．１％の洗浄剤）を含む。１つの非限定的な例において、溶液は、約０．０５％のＳＤＳを含む。幾つかの実施形態において、溶液は、１つ以上の塩（例えばＮａＣｌ）及び／又は保存剤（例えばＮａＮ３）などの、追加の成分を含む。特定の例において、溶液は、１００ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＳＤＳ、及び０．０１％のＮａＮ３を含む。
【０１０６】
幾つかの実施形態において、抗原決定基及び組み換え型ＭＨＣポリペプチドは、およそ室温（例えば、２２乃至２５℃）乃至７５℃で、約１乃至７２時間インキュベートされる。幾つかの例において、抗原決定基及び組み換え型ＭＨＣポリペプチドは、約３７℃乃至約７５℃、例えば、約３７℃乃至約７５℃、約４５℃乃至約６５℃、又は約５０℃乃至約６０℃で接触される。幾つかの例において、反応温度は、約３７℃乃至約６０℃（約３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、又は６０℃など）である。幾つかの例において、反応時間は、約２時間乃至約７２時間、約２４時間乃至約６０時間、又は約３６時間乃至５０時間など、約１時間乃至８４時間である。他の実施例において、抗原決定基及び組み換え型ＭＨＣポリペプチドは、約１時間、２時間、３時間、６時間、１２時間乃至約７２時間、又はそれ以上（約１２時間、１６時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、５０時間、５５時間、６０時間、７２時間、又はそれ以上など）で接触される。１つの限定しない例において、抗原決定基及び組み換え型ＭＨＣポリペプチドは、約６０時間、約３７℃で接触される。
【０１０７】
本明細書にはまた、ジスルフィド結合によって抗原決定基に共有結合される組み換え型ＭＨＣポリペプチド（β１α１ポリペプチド、或いはα１α２ポリペプチドなど）を含む、開示された組成物を生成するためのキットが開示される。幾つかの実施形態において、キットは、組み換え型ＭＨＣポリペプチドをコード化する組み換え型ＭＨＣポリペプチド又は核酸（例えば、発現ベクトル中の組み換え型ＭＨＣポリペプチドをコード化する核酸）、及びジスルフィド結合の形成用の１以上の成分を含む溶液（上述の溶液など）を含む。１つの例において、溶液は、約０．０５％のＳＤＳを含み、約６．５のｐＨを有する。特定の例において、溶液は、１００ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＳＤＳ、及び０．０１％のＮａＮ３を含む。
【０１０８】
追加の実施形態において、キットはまた、１つ以上の抗原決定基（１つ以上の抗原のペプチドなど）を含む。抗原のペプチドは、当業者によって選択され得るが、限定されないが、上記セクションＩＩＤで開示されたものである。キットは、核酸（例えば、細菌又は真核細胞）、追加の緩衝液（例えば、透折緩衝液）、及び／又は、組み換え型ＭＨＣポリペプチドと、ジスルフィド結合によって共有結合される抗原決定基を含む組成物を生成する方法を実行するための説明書のための細胞など、追加の成分を含むことができる。
【０１０９】
以下の実施例は、特定の特異的な特徴及び／又は実施形態を示すために提供される。これら実施例は、記載される特異的な特徴又は実施形態に対して本開示を限定するためには解釈されるべきでない。
【実施例】
【０１１０】
〈実施例１〉
〈材料及び方法〉
〈ｒＩＡｇ７の設計、発現、生成及び精製〉
組み換え型Ｔ細胞受容体リガンド（ＲＴＬ）の設計、クローニング、及び発現の一般的な方法は、以前に記載されている（Ｂｕｒｒｏｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １２：７７１−７７８，  １９９９；  Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：２４１７０−２４１７６，  ２００１；  Ｈｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ８０：２−１２，  ２００５；  Ｆｏｎｔｅｎｏｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７７：３８７４−３８８３，  ２００６；その全ては引用により本明細書に組み込まれる）。ネズミＩ−Ａｓ−由来のＲＴＬ４００（Ｏｆｆｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７５：４１０３−４１１１，  ２００５）を、組み換え型ＩＡｇ７（ＲＴＬ４５０シリーズ）遺伝子の構成のためにテンプレートとして使用した。
【０１１１】
テンプレートを修飾するために具体的に設計される対となるオリゴプライマーを合成し、ｒＩＡｇ７（ＲＴＬ４５０；配列番号４）を生じさせるために使用した。遺伝子を、ＮｃｏＩとＸｈｏＩの制限酵素（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）を使用してｐＥＴ２１ｄ（＋）ベクターへ方向性に（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｌｙ）結紮し、陽性のコロニー選択のため、Ｎｏｖａ  ｂｌｕｅの大腸菌の宿主（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。構成物の一次配列を、ＤＮＡ配列によって確認した。その後、確認された配列を有するプラスミド構成物を、発現のために大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。これらのタンパク質の発現、精製及びリフォールディングは、以前に記載された手順に従った（Ｈａｕｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８９：１７２３−１７３４，  １９９９）。簡潔に、対象のプラスミド構成物を含んでいるＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、３７℃でカルベニシリン（５０ｍｇ／ｍｌ）を含んでいるルリア＝ベルターニ（ＬＢ）ブロス中の対数中期（ｍｉｄ−ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ  ｐｈａｓｅ）（ＯＤ６００＝０．６−０．８）に対して１リットルの培養物中で成長させた。組み換え型タンパク質生成を、０．５ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシドの追加によって誘発した。３時間のインキュベーションの後、細胞を、遠心分離によって採取し、処理の前に−８０℃で保存した。細胞のすべての後の操作を４℃で行った。細胞ペレットを、氷冷のＰＢＳ、ｐＨ７．４中で再懸濁し、塩／氷／水浴で冷却された細胞懸濁液により４×２０秒で超音波処理した。その後、細胞懸濁液を遠心分離し、上清の断片を捨て、細胞ペレットを再懸濁し、ＰＢＳで３時間洗浄し、その後、２０ｍＭのエタノールアミン／６Ｍの尿素、ｐＨ１０を４時間再懸濁した。遠心分離後、可溶化されたｒＩＡｇ７を含む上清を集め、精製まで４℃で保存した。
【０１１２】
ＸＫ２６／２０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の中でソース３０Ｑ陰イオン交換培地（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ／ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を使用する高速タンパク質液体クロマトグラフィー・イオン交換クロマトグラフィーによる、ｒＩＡｇ７に関与する濃度の精製を、緩衝液Ｂ（２０ｍＭのエタノールアミン、ｐＨ１０．０、６Ｍの尿素、２ＭのＮａＣｌ）で負荷し、次に、緩衝液Ａ（ＮａＣｌを引いた緩衝液Ｂ）により平衡に保った。およそ１００ｍｌの溶解物サンプルを１．５−２．０ｍｌ／分で充填した。タンパク質を、工程勾配（１０５ｍｌの１％のＢ、７５ｍｌの２％のＢ、１２０ｍｌの３％のＢ、７０ｍｌの４％のＢ）を使用して、その後直線勾配（１３０ｍｌの４％乃至１００％のＢ）により溶出し、次に、５ｍｌ／分の流量で、２３ｍｌの１００％のＢにより取り除いた。ｒＩＡｇ７を含む断片を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる断片の分析に基づいて収集し、貯蔵し、緩衝液Ｃ（６Ｍの尿素、２０ｍＭのエタノールアミン、ｐＨ１０、２００ｍＭのＮａＣｌ）に対して広範囲に透析した。均質性に対する精製のため、緩衝液Ｃ中のＨＲ１６／５０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）におけるＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５培地（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）上でサイズ排除クロマトグラフィーを使用する完了工程を使用した。精製されたｒＩＡｇ７を含む断片を貯蔵し、０．１ｍｇ／ｍｌまで希釈し、ｒＩＡｇ７を、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．５に対して０．１ｍｇ／ｍｌでの広範囲な透析により、リフォールディングした。その後、タンパク質を短期貯蔵（４℃）のため１ｍｇ／ｍｌにまで濃縮し、又は−８０℃での長期貯蔵のため液体Ｎ２中でスナップ凍結した（ｓｎａｐ−ｆｒｏｚｅｎ）。精製されたｒＩＡｇ７の最終的な収量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって推測されるように、約９０％純粋）は、１５及び３０ｍｇ／Ｌの細菌培養間で異なる。
【０１１３】
〈レドックス捕捉条件〉
２００μｇ／ｍｌでの１０：１のペプチド：ｒＩＡｇ７、１００ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．５；１５０ｍＭのＮａＣｌ；０．０５％のＳＤ；及び０．０１％のＮａＮ３の混合物を、生成した。任意の沈澱のため混合物を検査した後に、反応を３７℃で６０時間インキュベートした。レドックス捕捉条件がＭＨＣによってペプチド捕捉を促進する能力の分析を、以下のように行った：様々な時点の２０μｌのアリコートを、２倍の電気泳動サンプル緩衝液（１％のグリセロール、５００ｍＭのトリス、０．２％のＳＤＳ、及びｐＨ８．０でのブロモフェノールブルー）の等量と混合した。その後、サンプルを３０分間氷の上に置き、β−メルカプトエタノールにより、又はβ−メルカプトエタノールなしで、９０℃で６分間加熱して、１０−２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、その後クマシーブルー染色を行い、タンパク質を視覚化した。タンパク質を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ  ５及びＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を使用するデンシトメトリー走査によって定量化した。
【０１１４】
〈動物〉
生後７−８週のＣ５７ＢＬ／６のオスのマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  （Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＭＥ）から得た。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド上のガンマインターフェロン誘発性のリソソームのチオール還元酵素（ＧＩＬＴ）のノックアウトマウスも、得た（Ｍａｒｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：１３６１−１３６５，  ２００１）。マウスを、制度上のガイドラインに従って、Ｐｏｒｔｌａｎｄ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｆｆａｉｒｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，  ＯＲ，  ＵＳＡ）にある動物資源設備に収容した。研究を、実験動物の使用のための国立衛生研究所のガイドラインに従って行い、プロトコルは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。
【０１１５】
〈抗原〉
ヒト組み換え型ＭＯＧ（ｒｈＭＯＧ）を、Ｂｅｔｔａｄａｐｕｒａ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ７０：１５９３−１５９９，  １９９８）に記載する。合成のヒトｈＭＯＧ−３５−５５（ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ；配列番号５）、マウスＭＯＧ（ｍＭＯＧ）（ＭＥＶＧＷＹＲＰＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ；配列番号６）、インスリンＢ：９−２３（ＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧ；配列番号３）、同様に、短くされ、システインにより置換された変異体を、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ．  （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）により合成した。
【０１１６】
〈活性ＥＡＥの誘発及びＲＴＬ５５１による処置〉
マウスを、２ｍｇ／ｍｌの熱により死滅した結核菌（Ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＭＴｂ）を含む完全フロインドアジュバントの等量における、１００μｇのｒｈＭＯＧペプチド又は１００μｇのｍＭＯＧ−３５−５５ペプチドにより免疫化した。全てのマウスにまた、免疫化に関連して、０日目及び２日目に、７５及び２００ｎｇの百日咳毒素を腹腔内に注入した。マウスを、以下のスケールに従い、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の徴候のために評価した：０、正常；１、尾の引きずり又は軽度の後肢の虚弱；２、中程度の後肢の虚弱又は軽度の運動失調症；３、中程度に深刻な後肢の虚弱；４、深刻な後肢の虚弱又は軽度の前肢の虚弱、或いは、中程度の運動失調症；５、単なる中程度の前肢の虚弱による対麻痺；及び６、深刻な前肢の虚弱又は深刻な運動失調症による対麻痺或いは瀕死状態。ＥＡＥの臨床症状の発症時（臨床的なスコアが２以上であった時、１０−１３日目）に、マウスを２つのグループに分け、８日間、抗ヒスタミン剤に加えて、対照として１００μｌの２０ｍＭのトリス−ＨＣｌにより、又は、１ｍｇ／ｍｌのＩ−Ａｂ−由来のｒＩＡｂ（ＲＴＬ５５０；「空」）、ＲＴＬ５５１（遺伝的にコード化したＭＯＧ−３５−５５アミノ末端拡張を有するｒＩＡｂ）、又はＲＴＬ５５０−Ｃｙｓ−ＭＯＧ（ｒＩＡｂ／ＭＯＧ）により、静脈内で処置する。抗ヒスタミン剤の効果は、ＳＪＬ／Ｊ（Ｈｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７２：４５５６−４５６６，  ２００４）又はＣ５７ＢＬ／６のマウスにおけるＥＡＥ誘発及び進行時には観察されなかった。遊離ペプチド、ＳＪＬ／Ｊに対するＰＬＰ−１３９−１５１、及び抗ヒスタミン剤でのＣ５７ＢＬ／６のマウスに対するＭＯＧ−３５−５５のモル当量の投与は、未処置のマウスと比較して、ＥＡＥを有するマウスに対して著しい臨床的な利点を有していなかった。マウスを疾患スコアの変化のために監視し、エキソビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）分析のために安楽死させられるまで、示されるような処置により追加免疫した。
【０１１７】
〈実施例２〉
〈抗原ペプチドのジスルフィド捕捉〉
ヒトＤＲ−、ＤＰ−及びＤＱ−、ネズミのＩ−Ａｂ、Ｉ−Ａｓ、及びルイスラットのＲＴ１．Ｂに由来する単一の鎖の構成物の設計及び特徴付け、名付けられた組み換え型Ｔ細胞受容体リガンド（ＲＴＬ）は、以前に記載されている。ＲＴＬの構成物は、Ｔ細胞行動を調節する能力を有し（Ｂｕｒｒｏｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：４３８６−４３９５，  ２００１）、ＥＡＥ（ヒト多発性硬化症のための動物モデル）、慢性のベリリウム疾患、ブドウ膜炎（Ａｄａｍｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ．  ４７：２５５５−２５６１，  ２００６）及び卒中（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｏｋｅ  ４０：２５３９−２５４５，  ２００９）を含む様々な自己免疫障害における、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）及びインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での有効性を有する。
【０１１８】
単一のポリペプチド（ｒＩＡｇ７；ＲＴＬ４５０シリーズ）として発現された、ＭＨＣクラスＩＩ分子のβ１とα１のドメインを含むＩＡｇ７の組み換え型形態（ｒＩＡｇ７）を、設計した。ＩＡｇ７由来の構成物は、大腸菌で容易に生成され、水溶性の緩衝液において正常に動作し、抗原のペプチドを結合する。ＭＨＣクラスＩＩβ１ドメインはすべて、システイン１７とシステイン７９の間のジスルフィド結合を含む。インスリンＢ：９−２３は、ＩＡｇ７を結合し、位置１９にシステイン残基を含む、抗原のペプチドである。（実施例１に記載の）インスリンＢ：９−２３の存在下でｒＩＡｇ７をジスルフィド捕捉状態にさらし、その後、非還元条件下でサンプルを電気泳動にさらすと、より高度に明らかな分子量の多くのバンドが現われた。より高度な分子量バンドは、サンプルが還元条件下で電気泳動にさらされた時には現われなかった（図１）。より高度な分子量バンドは、インスリンＢ：９−２３がジスルフィド捕捉条件下でｒＩＡｇ７に加えられた時にのみ存在し、Ｂ：Ｃ１７−Ｃ７９ジスルフィド結合の破壊によって、ｒＩＡｇ７に共有結合的に繋ぎとめられている９−２３のペプチドのシステイン１９が原因であった。ＩＡｇ７／ペプチド複合体（ＷＴ）は、空のｒＩＡｇ７分子より高い分子量の種（２９及び３１ｋＤの種）として遊走した。
【０１１９】
アミノ末端ＦＩＴＣに結合したＢ：９−２３誘導体を生成し、ペプチド結合、及び、現れた様々なより高度な分子量バンドが特徴づけられる速度を測定するために使用した。最も効率的なジスルフィド補足インスリンＢ：９−２３のペプチドは、位置１９でＣｙｓを有する野生型の配列であった（図２）。システインが位置１８（ＳＨＬＶＥＡＬＹＬＣＡＧＥＲＧ；配列番号７）又は２０（ＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＡＣＥＲＧ；配列番号８）に移動したインスリンＢ：９−２３の変異体は、補足されるジスルフィドであったが、効果は著しく少ない（図２）。
【０１２０】
〈実施例３〉
〈ｒＩＡｇ７によるジスルフィド捕捉の時間経過〉
クマシーによって染色したバンド（示されるように。２９ｋＤ及び３１ｋＤ）を、捕捉の初速度を測定するために定量化した（図３）。インスリンＢ：１６−２３のペプチド（ＦＩＴＣ−ＹＬＶＣＧＥＲＧ；配列番号１）及びｒＩＡｇ７を、１００ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＳＤＳ、及び０．０１％のＮａＮ３中で混合し（１０：１、ペプチド：ｒＩＡｇ７）、示された時間の間のインキュベートを可能にした。デンシトメトリー結果を図４に示す。
【０１２１】
Ｂ：９−２３のシステインがアラニン（ＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＡＧＥＲＧ；配列番号９）に修飾されたペプチドは、補足されるジスルフィドでなかった。更に、アミノ末端を切断したＢ：９−２３のペプチド変異体を、ジスルフィドを補足する能力に関して試験した。効率的に補足され得る最短のペプチドは、Ｂ：９−２３のＣ−末端８アミノ酸を含む、ＦＩＴＣにより標識化された８−ｍｅｒのインスリンＢ：１６−２３であった。このペプチドは、約１時間の最大の捕捉率の半分を有した。
【０１２２】
〈実施例４〉
〈質量分析を使用するジスルフィド捕捉の分析〉
タンパク質消化と質量分析の質量分析の組合せを、インスリンＢ：９−２３のペプチドがどのように捕捉されるか、同様に捕捉の化学作用をより明確に測定するために使用した。一次配列を、ペプチド、及び、ｒＩＡｇ７のトリプシン消化後に得られるペプチドのジスルフィドと架橋結合した種を予測するために使用した。予測されたペプチドの質量電荷比（ｍ／ｚ）を計算した。完全なトリプシンの消化を、特有のｍ／ｚ値を有する対象のペプチドをもたらすために予想し（表１）、質量分析法がジスルフィド捕捉の性質を明らかにし得ることを示唆する。
【０１２３】
【表２】
0006027969.tif 000003
【０１２４】
表１は、ｒＩＡｇ７とインスリンＢ：９−２３の予測されたトリプシンの断片を示し、ｒＩＡｇ７、インスリンＢ：９−２３、及び潜在的なジスルフィドと架橋結合した種の対象のトリプシン消化断片のモノアイソトピック質量（ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ  ｍａｓｓｅｓ）（ｍ）、トリプシンの可能な荷電状態（ｚ）、及びｍ／ｚ比率を含む。遊離したシステイン残基のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）によるカルボキシイミドメチル化（ｃａｒｂｏｘｙｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）の際、利用可能ならば、質量を５７単位増加する。モノアイソトピック質量を、ウェブブラウザインタフェース計算機（ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／）を使用して計算した。カルボキシ末端のグリシンが、インスリンＢ：９−２３のペプチドから開裂されないことに注意する。
【０１２５】
全体の質量測定は、ｒＩＡｇ７がインタクトな内部ジスルフィド結合を含有することを確認した（図５）。インスリンＢ：９−２３を、レドックス捕捉条件下でｒＩＡｇ７によりインキュベートし、更なるジスルフィド交換反応をＩＡＡの追加によってクエンチした。その後、サンプルを沸騰させ、１０−２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる非還元条件下で分離した。電気泳動による分離後、ｒＩＡｇ７（約２６ｋＤ）に対応するゲル切片、及び２９ｋＤ並びに３１ｋＤのより高度な分子量バンドを、インスリンＢ：９−２３のペプチドにより充填されるｒＩＡｇ７を含むレーンから切除した。ゲル切片をトリプシンにより消化し、ＭＳにより分析した。プロセスと結果の概要を図６に示す。
【０１２６】
インタクトなＣ１７−Ｃ７９ジスルフィド結合を含有する、ジスルフィドに結合したトリプシンの断片と一致する質量対電荷（ｍ／ｚ）比率を有するペプチド断片を、非還元のｒＩＡｇ７サンプルで容易に観察した（表２）。還元された及びアルキル化されたｒＩＡｇ７のトリプシン消化は、１５−２５（ＧＥＣＹＦＴＮＧＴＱＲ；配列番号１０）及び７３−８０（ＡＥＬＤＴＡＣＲ；配列番号２）のシステインによりアルキル化されたペプチド断片に対応した、ｍ／ｚ比率を有するペプチド断片を含んでいた（図６）。非還元の２９ｋＤ及び３１ｋＤの結合は、両方とも、ｍ／ｚのインスリンＢに結合したｒＩＡｇ７ジスルフィドから７３−８０のペプチドに対応するｍ／ｚ比率を有するペプチドを含んでいた（図６）。Ｃｙｓ−１７での結合に一致するｍ／ｚ値を有するペプチドも観察した。データは、優先的なジスルフィド捕捉、及び、インスリンＢ：９−２３のペプチドのＣｙｓ−１９の、少なくとも平衡時間点（約５０時間の捕捉）のＣｙｓ−７９のｒＩＡｇ７への挿入を示唆する。
【０１２７】
インスリンＢ：９−２３に結合されるｒＩＡｇ７のアミノ酸７３−８０のトリプシンペプチドを容易に検出した。様々なサンプルからのトリプシンの断片を、ｒＩＡｇ７によるインスリンＢ：９−２３のペプチドのインキュベーション後に検出された対象の混合されたジスルフィド種を測定する目的で、Ｘｃａｌｉｂｕｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）を使用して分析した。ｒＩＡｇ７  ７３−８０に関連する、還元し、アルキル化した＋２イオンを、容易に観察した。
【０１２８】
【表３】
0006027969.tif 000004
【０１２９】
〈実施例５〉
〈他のクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に由来するＲＴＬによるペプチドのジスルフィド捕捉〉
Ｐ４ポケット位置に単一のシステイン置換基を有するペプチド、及び、異なるＭＨＣ対立遺伝子を結合するのに適切なアンカー残基を生成し、組み換え型ＤＲ２（図７）、組み換え型Ｉ−Ａｂ（図８）、及び組み換え型ＤＲ４  ＲＴＬによるそのような抗原のペプチドのジスルフィド捕捉の結果をもたらした。ジスルフィド捕捉の効果は、補足されるペプチド中のシステイン置換の位置、使用されるＭＨＣ対立遺伝子の結合モチーフに対していかに十分にペプチドが適合するか、及びペプチドの酸化還元反応の状態に依存した。
【０１３０】
組み換え型ヒトＤＲ２（配列番号１１）を、システイン残基（配列番号５）を含まない野生型ＭＯＧ３５−５５ペプチド；位置４２でセリンの代わりにシステインを含むために設計されたＭＯＧ３５−５５  Ｓ４２Ｃ変異体（ＭＥＶＧＷＹＲＣＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ；配列番号１２）；或いは、位置４３でプロリンの代わりにシステインを含むために設計されたＭＯＧ３５−５５  Ｐ４３Ｃ変異体（ＭＥＶＧＷＹＲＳＣＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ；配列番号１３）で、充填する。変異させられていないＭＯＧ３５−５５（ＷＴ）で充填されたｒＤＲ２は、より高い明らかな分子量の種を形成せず、Ｓ４２Ｃ変異体は、より効率的に、Ｐ４３Ｃ変異体より高い明らかな分子量の種を形成した（図７）。これは、ｒＩＡｇ７に類似している、ｒＤＲ２に対するペプチド結合の記録が、捕捉の効果に影響を与える因子であることを示す。
【０１３１】
組み換え型ネズミＩ−Ａｂ（配列番号１４）を、Ｓ４５Ｃで変異したマウスＭＯＧ３５−５５（ＭＥＶＧＷＹＲＰＰＦＣＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ；配列番号１５）で充填した。より高い明らかな分子量の種を、還元条件下で形成した（図８）。ＰＬＰ−１３９−１５１（ＨＣＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦ；配列番号１６）などの幾つかのペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩのβ１ドメインのＣ１７−Ｃ７９ジスルフィド結合により妨害する代わりに、システインに結合した連結するホモ二量体のペプチドを形成した。これは、ＰＬＰペプチド配列によるものであり、又は、特定のペプチド調製の人為的結果であったかもしれない。
【０１３２】
〈実施例６〉
〈ジスルフィドにより補足されたペプチドによるＲＴＬの設計〉
ネズミＨ２−ＩＡｇ７及びヒトＨＬＡ−ＤＱ８から自然に処理されたペプチドを、保存された化学的な特徴を有する９−ｍｅｒのコア配列モチーフを定義するために使用した（Ｗｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０６：１９０−１９９，  ２００２；  Ｌｅｖｉｓｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５：１４７３−１４８３，  ２００３；  Ｓｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１５：２２６８−２２７６，  ２００５）。９−ｍｅｒ量体のコア配列が、ＩＡｇ７とＤＱ８の糖尿病誘発性のクラスＩＩＭＨＣ分子に関する複雑な結合モチーフを示した一方で、ＩＡｇ７とＤＱ８の結晶学的な構造分析により支持された、自然に処理されたペプチドを配列する１つの明確な結果は、両方のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子が、カルボキシ末端の方に酸性のアミノ酸を含有するペプチドを好み（ｆａｖｏｒ）、多くのペプチドが、Ｃ末端の方に２倍又は３倍の酸性の残基の移動（ｒｕｎｓ）を含む両方の対立遺伝子から分離されたことである（Ｗｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０６：１９０−１９９，  ２００２；  Ｓｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１５：２２６８−２２７６，  ２００５）。ＩＡｇ７とＤＱ８の構造の特徴付けは、Ｐ９ポケットの特有の特徴を明らかに文書化し、酸性のｐ９残基は、ＩＡｇ７のα鎖のＡｒｇ７６によるイオン対の形成を可能にし、ペプチド：ＭＨＣの複合体を安定させるように思われる（Ｃｏｒｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：５０５−５１１，  ２０００；  Ｌａｔｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：６９９−７１０，  ２０００；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２：５０１−５０７，  ２００１；  Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １２０：１５７８−１５９０，  ２０１０）。ＩＡｇ７とＤＱ８の構造間の重要な違いは、Ｐ４ポケットであり、それにおいて、ＤＱ８は大きな残基を好むように思われる（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２：５０１−５０７，  ２００１）。従来の結合記録におけるインスリンＢ：９−２３のペプチドのアラインメントは、ＨＬＡ−ＤＱ８構造に対する結合が３Å分割を決定したとき、インスリンＢ：９−２３のための場合であるようにＴｙｒ１６がＩＡｇ７のＰ４ポケットを占めることを示唆する（ＰＤＢ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃１ＪＫ８）（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２：５０１−５０７，  ２００１）。しかしながら、研究のモデル化は、代替の従来のものでない結合モチーフがまた、妥当性があるもの、特に、インスリンＢ：９−２３のＴｙｒ−１６が、ＩＡｇ７のＰ１ポケットを占め、Ｐ９ポケット中の酸性の接触に寄与するペプチドのカルボキシル末端を占めるものであることを、強く示唆する。この非従来型結合記録は、すべてのＭＨＣクラスＩＩβ鎖（全長のＭＨＣクラスＩＩにおけるＣ１５−Ｃ７９）に保存される、Ｃ１７−Ｃ１９の鎖内のジスルフィド結合から適切な距離で、Ｐ４ポケット中にＣ１９を置き、その結果、この高度に保存されたジスルフィド結合への挿入によってジスルフィド捕捉が起こり得る（図９）
【０１３３】
この非従来型の結合記録を支持する詳細の多くについて、結合ペプチド｛１ＥＳＯ、ＩＡｇ７＋ＧＡＤ−２０７−２２０（ＹＥＩＡＰＶＦＶＬＬＥＹＶＴ；配列番号１７）（Ｃｏｒｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：５０５−５１１，  ２０００）；１Ｆ３Ｊ、ＩＡｇ７＋ＨＥＬ−１１−２５（ＡＭＫＲＨＧＬＤＮＹＲＧＹＳＬ；配列番号１８）（Ｌａｔｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：６９９−７１０，  ２０００）を有する、ＩＡｇ７の結晶構造により説明することができる。３点を注目する。最初に、ＩＡｇ７のＰ１ポケットは最大のポケットであり、ＧＡＤ−２０７−２２０ペプチドを含んでいる１ＥＳＯ構造における、疎水性のイソロイシン及び３つの埋没された水分子によって、単に部分的に占める（Ｃｏｒｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：５０５−５１１，  ２０００）。親水性及び疎水性の残基の両方は、Ｐ１ポケットの表面を形成する。これらは、親水性のα鎖Ｈｉｓ２４、及び、β鎖Ａｓｎ８２、Ｔｈｒ８６、及びＧｌｕ８７、並びに、疎水性のα鎖残基Ｔｙｒ８、Ｌｅｕ３１、Ｐｈｅ３２、Ｔｒｐ４３、Ｉｌｅ５２、及びＰｈｅ５４を含む。この多様なセットの残基は、インスリンＢＴｙｒ−１６の収容を含む、Ｐ１残基のタイプ及び大きさにおける広範囲の特異性を許容する。次に、Ｐ４ポケットは、小さい一方で、特性が疎水性であり、バリン残基によって単に部分的に占められる。追加の空間は、インスリンＢ：９−２３のＣｙｓ−１９、同様に、ロイシン又はイソロイシンなどのわずかに大きな疎水性の残基を収容することができる。第３に、２つの配向は、ＩＡｇ７中のＰ９側鎖に関して起こり得るように思われる。一方は、適切なペプチド溝へと下方を指し、もう一方は横向きを指す。Ｐ９ポケットの浅さは、カルボキシル基を提供するカルボキシル末端でｐ８に終わる、小さな側鎖（グリシン、アラニン、及びおそらくセリン）又は短いペプチドのみが、下方の配向に収容することができることを示唆する。陽性に負荷された環境は、陰性に負荷された残基を好むが、ＩＡｇ７構造で観察された特有の横向きの配向（Ｃｏｒｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：５０５−５１１，  ２０００）は、大きな側鎖に培地を収容させることができる。したがって、構造のデータは、本明細書に開示のデータによって示唆された非従来型の記録を支持し、ＩＡｇ７が、Ｐ４ポケットを占めるＴｙｒ−１６を有するインスリンＢ：９−２３のペプチドを収容することを可能にする。
【０１３４】
〈実施例７〉
〈ジスルフィドにより補足されたペプチドを有する組み換え型ＩＡｇ７が、ＮＯＤマウスを処置する〉
非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスを、ジスルフィドにより補足されたＢ：９−２３のペプチドを有する組み換え型ＩＡｇ７、ＲＴＬ４５０（「空の」ｒＩＡｇ７）、又はビヒクルにより処置した。その後、生存を測定した。ジスルフィドにより補足されたＢ：９−２３による処置を受けたマウスは、他の両方のグループよりもより良い生存を示した（図１０）。
【０１３５】
〈実施例８〉
〈ジスルフィドにより補足されたペプチドを有する組み換え型ＤＲ２がＥＡＥマウスを処置する〉
ＥＡＥをマウスに誘発し、マウスをその後、ジスルフィドにより補足されたＭＯＧ３５−５５のペプチドを有するＲＴＬ５５０、ＲＴＬ５５１（遺伝的にコード化されたＭＯＧ−３５−５５アミノ末端拡張を有するｒＩＡｂ）、又はビヒクルにより処置した。その後、臨床的なＥＡＥスコアを測定した。ジスルフィドにより補足されたＭＯＧ３５−５５を有するＲＴＬ５５０（ＲＴＬ−Ｃｙｓ−ＭＯＧ）により処置されたマウスは、ＲＴＬ５５１により処置されたマウスと比較して、類似の疾患経過及び累積疾患指数を有していた（図１１Ａ及びＢ；表３）。
【０１３６】
【表４】
0006027969.tif 000005
【０１３７】
〈実施例９〉
〈ジスルフィドにより補足されたペプチドによる、ＧＩＬＴノックアウトマウスの処置〉
ＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６  ＧＩＬＴ−／―マウスに誘発した。マウスを、ビヒクル、又は、ジスルフィドにより補足されたＭＯＧ３５−５５ペプチド（ＲＴＬ５５０−Ｃｙｓ−ＭＯＧ）を有するＲＴＬ５５０により処置し、ＥＡＥスコアを測定した。ジスルフィドにより補足されたＭＯＧ３５−５５ペプチドを有するＲＴＬ５５０による処置は、ビヒクルで処置したマウスと比較して、ＥＡＥスコアを有意に改善しなかった（図１２Ａ及び１２Ｂ）。処置された及び処置されていないマウスの疾患経過を、表４に示す。
【０１３８】
【表５】
0006027969.tif 000006
【０１３９】
本開示の原則が適用され得る、多くの起こり得る実施形態を考慮して、示された実施形態が実施例のみであり、本発明の範囲を限定するものとして捉えられるべきでないことを認識されたい。むしろ、本発明の範囲は、以下の請求項によって定義される。それ故、我々は、本発明として、これらの請求項の範囲及び精神の中に生ずるものすべてを請求する。
【図８】
0006027969.tif 000007
【図９】
0006027969.tif 000008
【図１３Ａ−１３Ｃ】
0006027969.tif 000009
【図１４】
0006027969.tif 000010
【図１Ａ】
0006027969.tif 000011
【図１Ｂ】
0006027969.tif 000012
【図２】
0006027969.tif 000013
【図３】
0006027969.tif 000014
【図４】
0006027969.tif 000015
【図５】
0006027969.tif 000016
【図６】
0006027969.tif 000017
【図７】
0006027969.tif 000018
【図１０】
0006027969.tif 000019
【図１１Ａ】
0006027969.tif 000020
【図１１Ｂ】
0006027969.tif 000021
【図１２Ａ】
0006027969.tif 000022
【図１２Ｂ】
0006027969.tif 000023
【配列表】
0006027969000001.app