(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇｌｕ、Ｘ、およびＹを含有する原料に、グルタチオン合成酵素およびγ‐グルタミルシステイン合成酵素を作用させることによりγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを生成する工程を含む、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方法であって、
前記γ‐グルタミルシステイン合成酵素が以下のＡ）〜Ｉ）から選ばれるものであり、
Ａ）サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）微生物由来のγ‐グルタミルシステイン合成酵素
Ｂ）カンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）微生物由来のγ‐グルタミルシステイン合成酵素
Ｃ）エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）微生物由来のγ‐グルタミルシステイン合成酵素
Ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質
Ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質
Ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列からなるタンパク質
Ｇ）配列番号１２のアミノ酸配列と同一性90％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、γ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を有するもの
Ｈ）配列番号１８のアミノ酸配列と同一性90％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、γ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を有するもの
Ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列と同一性90％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、γ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を有するもの
前記グルタチオン合成酵素が以下のＪ）〜Ｏ）から選ばれるものであり、
Ｊ）サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）微生物由来のグルタチオン合成酵素
Ｋ）エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）微生物由来のグルタチオン合成酵素
Ｌ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
Ｍ）配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質
Ｎ）配列番号２のアミノ酸配列と同一性90％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グルタチオン合成酵素活性を有するもの
Ｏ）配列番号８のアミノ酸配列と同一性90％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グルタチオン合成酵素活性を有するもの
前記ＹがＧｌｙであり、かつ、前記ＸがＶａｌ又はｎＶａｌである、製造方法。
【請求項２】
γ‐Ｇｌｕ‐ＸおよびＹを含有する原料に、グルタチオン合成酵素を作用させることによりγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを生成する工程を含む、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方法であって、
前記グルタチオン合成酵素が以下のＪ）〜Ｏ）から選ばれるものであり、
Ｊ）サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）微生物由来のグルタチオン合成酵素
Ｋ）エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）微生物由来のグルタチオン合成酵素
Ｌ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
Ｍ）配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質
Ｎ）配列番号２のアミノ酸配列と同一性90％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グルタチオン合成酵素活性を有するもの
Ｏ）配列番号８のアミノ酸配列と同一性90％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グルタチオン合成酵素活性を有するもの
前記ＹがＧｌｙであり、かつ、前記ＸがＶａｌ又はｎＶａｌである、製造方法。
【請求項３】
前記グルタチオン合成酵素および／またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素が、該酵素の活性を有する微生物の培養物または該培養物の処理物である、請求項１または２に記載のγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方法。
【請求項４】
前記グルタチオン合成酵素および／またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素が精製された酵素である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方法。
【請求項５】
前記グルタチオン合成酵素および／またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素が固定化酵素である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方法。
【請求項６】
グルタチオン合成酵素遺伝子およびγ‐グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の発現が強化されている微生物を、Ｇｌｕ、Ｘ、およびＹからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体が添加された培地であって、少なくともＸが添加された培地で培養し、培地中にγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを生成および蓄積させ、培養物中からγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを採取することを特徴とする、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方法であって、
前記γ‐グルタミルシステイン合成酵素が以下のＡ）〜Ｉ）から選ばれるものであり、
Ａ）サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）微生物由来のγ‐グルタミルシステイン合成酵素
Ｂ）カンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）微生物由来のγ‐グルタミルシステイン合成酵素
Ｃ）エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）微生物由来のγ‐グルタミルシステイン合成酵素
Ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質
Ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質
Ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列からなるタンパク質
Ｇ）配列番号１２のアミノ酸配列と同一性90％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、γ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を有するもの
Ｈ）配列番号１８のアミノ酸配列と同一性90％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、γ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を有するもの
Ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列と同一性90％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、γ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を有するもの
前記グルタチオン合成酵素が以下のＪ）〜Ｏ）から選ばれるものであり、
Ｊ）サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）微生物由来のグルタチオン合成酵素
Ｋ）エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）微生物由来のグルタチオン合成酵素
Ｌ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
Ｍ）配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質
Ｎ）配列番号２のアミノ酸配列と同一性90％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グルタチオン合成酵素活性を有するもの
Ｏ）配列番号８のアミノ酸配列と同一性90％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グルタチオン合成酵素活性を有するもの
前記ＹがＧｌｙであり、かつ、前記ＸがＶａｌ又はｎＶａｌである、製造方法。
【請求項７】
Ｇｌｕ、Ｘ、およびＹからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体を生産する能力を有し、Ｖａｌの生産能が付与または増強され、且つ、グルタチオン合成酵素遺伝子およびγ‐グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の発現が強化されている微生物を培養し、培地中にγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを生成および蓄積させ、培養物中からγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを採取することを特徴とする、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方法であって、
前記γ‐グルタミルシステイン合成酵素が以下のＡ）〜Ｉ）から選ばれるものであり、
Ａ）サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）微生物由来のγ‐グルタミルシステイン合成酵素
Ｂ）カンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）微生物由来のγ‐グルタミルシステイン合成酵素
Ｃ）エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）微生物由来のγ‐グルタミルシステイン合成酵素
Ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質
Ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質
Ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列からなるタンパク質
Ｇ）配列番号１２のアミノ酸配列と同一性90％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、γ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を有するもの
Ｈ）配列番号１８のアミノ酸配列と同一性90％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、γ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を有するもの
Ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列と同一性90％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、γ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を有するもの
前記グルタチオン合成酵素が以下のＪ）〜Ｏ）から選ばれるものであり、
Ｊ）サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）微生物由来のグルタチオン合成酵素
Ｋ）エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）微生物由来のグルタチオン合成酵素
Ｌ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
Ｍ）配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質
Ｎ）配列番号２のアミノ酸配列と同一性90％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グルタチオン合成酵素活性を有するもの
Ｏ）配列番号８のアミノ酸配列と同一性90％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グルタチオン合成酵素活性を有するもの
前記ＹがＧｌｙであり、かつ、前記ＸがＶａｌである、製造方法。
【請求項８】
前記微生物が、エシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物である、請求項６または７に記載のγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方法。
【請求項９】
前記エシェリヒア属に属する微生物がエシェリヒア・コリであり、前記コリネバクテリウム属に属する微生物がコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項８に記載のγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙ（ＸはＣｙｓおよびその誘導体を除くアミノ酸またはアミノ酸誘導体、Ｙはアミノ酸またはアミノ酸誘導体を表す。以下同じ）の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クラスＣに分類されるＧタンパク質であるカルシウムセンシングレセプター（ＣａＳＲ）は、γ‐グルタミル化合物の１つであるグルタチオン（γ‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓ‐Ｇｌｙ）（ＧＳＨ）に応答することが報告されていた（非特許文献１）が、その生理的な意味は明らかとなっていなかった。また、このＣａＳＲは舌細胞にも存在しており何らかの呈味応答を示すと考えられていた（非特許文献２）が、最近、このＣａＳＲが人のコク味（ｋｏｋｕｍｉ）認識に関与していることが明らかとなった（非特許文献３）。同文献では、これまでコク味物質として認識されてきたＧＳＨだけでなく、いくつかのγ‐グルタミル化合物が同様にＣａＳＲに応答することが報告されている。
【０００３】
一般式γ‐Ｇｌｕ‐Ｘまたはγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙ（ＸはＣｙｓおよびその誘導体を除くアミノ酸またはアミノ酸誘導体を表す）で表されるペプチド、例えばγ‐Ｇｌｕ‐Ｍｅｔ、γ‐Ｇｌｕ‐Ｔｈｒ、γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ‐Ｇｌｙは、コク味付与効果を有していることが報告されている（特許文献１）。また、Ｓ‐またはＯ‐カルボキシアルキル化γ‐グルタミルまたはβ‐アスパルチルペプチドのエステル群などもコク味物質として報告されている（特許文献２）。これらのペプチドやエステルはＧＳＨと同様に食品にコク味を付与するが、ＧＳＨと異なり還元型チオール基（‐ＳＨ基）を有していない。一般に、ＧＳＨのような還元型チオール基を有する物質は不安定であり、ジスルフィド結合の形成とともにその力価が低下することが知られている（特許文献２）。よって、還元型チオール基を有していないγ‐Ｇｌｕ‐Ｘまたはγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙ等のコク味付与ペプチドは、安定性等の点で有用であると考えられる。
【０００４】
γ‐グルタミルジペプチドを含有する食品に関する知見としては、４４週間程も長期熟成したゴーダチーズから、各種γ‐グルタミルジペプチドが検出されたとの報告がある（非特許文献４）。同文献では、γ‐Ｇｌｕ‐Ａｌａ、γ‐Ｇｌｕ‐Ｇｌｕ、γ‐Ｇｌｕ‐Ｇｌｎなどの各種γ‐グルタミルジペプチドが検出され、更にγ‐グルタミルジペプチドの含有量は最大で３５９０μｍｏｌ／ｋｇ乾燥重量であったと報告されている。
【０００５】
また、γ‐グルタミルジペプチドに関するその他の知見としては、ミクロコッカス・グルタミカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ）の発酵ブロス解析の例を挙げることができる（非特許文献５）。同文献では発酵ブロスを各種カラムにかけペプチド等を分離し、γ‐Ｇｌｕ‐Ｇｌｕ、γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ、γ‐Ｇｌｕ‐Ｌｅｕを単離したと報告されているが、各種カラム分離の結果見出されたものであり、どの程度の量ブロス中に含まれていたかは不明である。
【０００６】
このように、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘを含む食品や発酵ブロスについての報告例はいくつかあるものの、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙを含むものについては報告例が見当たらない。
【０００７】
γ‐グルタミル化合物の生合成に関する研究としては、ＧＳＨまたはその前駆体であるγ‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓに関する研究が多くなされている。ＧＳＨは、生体内ではγ‐グルタミルシステイン合成酵素によりＧｌｕとＣｙｓからγ‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓが生成し、更にグルタチオン合成酵素によりＧｌｙが結合し、生成することが知られている。γ‐グルタミ
ルシステイン合成酵素はＧＳＨ１遺伝子またはｇｓｈＡ遺伝子に、グルタチオン合成酵素はＧＳＨ２遺伝子またはｇｓｈＢ遺伝子にコードされていることが知られており、その性質が調べられてきた。
【０００８】
例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のγ‐グルタミルシステイン合成酵素の副反応を利用して、テアニン（γ‐グルタミルアニリド）を酵素的に生成する方法が報告されている（特許文献３、非特許文献６）。また、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）のγ‐グルタミルシステイン合成酵素についてＣｙｓ以外のアミノ酸への基質特異性を解析した例も報告されている（非特許文献７）。以上のように、γ‐グルタミルシステイン合成酵素は基質特異性が広いことが知られている。
【０００９】
一方、グルタチオン合成酵素の基質特異性については、Ｃｙｓの誘導体であるα‐アミノ酪酸（Ａｂｕ）を利用して、γ‐Ｇｌｕ‐ＡｂｕとＧｌｙから、γ‐Ｇｌｕ‐Ａｂｕ‐Ｇｌｙを製造する方法が報告されている（特許文献４）。また、エシェリヒア・コリや３種の植物（大豆、小麦、トウモロコシ）由来のグルタチオン合成酵素の基質特異性について、γ‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓと結合するアミノ酸としてＧｌｙ以外のアミノ酸を検討した例が報告されている（非特許文献８、非特許文献９）。しかし、いずれの例もγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの生合成において、ＸがＣｙｓまたはその誘導体であるγ‐Ｇｌｕ‐Ｘを基質として用いた検討例であり、ＸがＣｙｓおよびその誘導体以外のアミノ酸またはアミノ酸誘導体である場合にγ‐Ｇｌｕ‐Ｘがグルタチオン合成酵素の基質になり得るかは示されていない。唯一、ラットの肝臓由来のグルタチオン合成酵素の基質特異性の検討において、γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌやγ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ（γ‐グルタミルノルバリン）も試された例があるが（非特許文献１０）、γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌは基質にならず、またγ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌは基質になったものの反応性は非常に低いため、本酵素をこれらγ‐グルタミル化合物を基質としたγ‐グルタミルトリペプチドの製造に応用するのは困難であると考えられていた。
【００１０】
また、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製法としては、γ‐ＧＴＰを利用し、γ‐Ｇｌｕ‐Ｌｙｓ‐Ｇｌｙを生成した例も報告されているが（非特許文献１１、１２）、この方法を利用する場合は基質として用いるＬｙｓ‐Ｇｌｙをどのようにして調製するかという問題もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＷＯ２００７／０５５３９３
【特許文献２】ＷＯ２００７／０４２２８８
【特許文献３】ＷＯ２００６／１２１０５５
【特許文献４】特開昭６２‐１６３６９８号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】J.Biol.Chem.,281,8864‐8870(2006)
【非特許文献２】Biochem.Biophys.Res.Commun.,378,414‐418(2009)
【非特許文献３】J.Biol.Chem.,285,1016‐1022(2010)
【非特許文献４】J.Agric.Food.Chem.,57,3738‐3748(2009)
【非特許文献５】J.Biol.Chem.,240,2508‐2511(1965)
【非特許文献６】Biosci.Biotechnol.Biochem.,73、2677‐2683(2009)
【非特許文献７】Agric.Biol.Chem.,45,2839‐2845(1981)
【非特許文献８】Biochem.Biophys.Res.Commun.,352,351‐359(2007)
【非特許文献９】Biochem.J.,391,567‐574(2005)
【非特許文献１０】J.Biol.Chem.,254,5184‐5190(1979)
【非特許文献１１】Recent Highlights in Flavor Chemistry & Biology,[Proceedings of the Wartburg Symposium on Flavor Chemistry and Biology],8th,Eisenach,Germany,Feb.27‐Mar.2,227‐232(2007)
【非特許文献１２】Annals of the New York Academy of Sciences,613,647‐651(1990)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙ（ＸはＣｙｓおよびその誘導体を除くアミノ酸またはアミノ酸誘導体、Ｙはアミノ酸またはアミノ酸誘導体を表す）を製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ（ＸはＣｙｓおよびその誘導体を除くアミノ酸またはアミノ酸誘導体を表す）およびＹ（Ｙはアミノ酸またはアミノ酸誘導体を表す）を原料として、グルタチオン合成酵素を作用させることにより、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙが生成することを見出した。また、本発明者らは、Ｇｌｕ、Ｘ、およびＹを原料として、γ‐グルタミルシステイン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を作用させることにより、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙが生成することを見出した。これらの知見に基づいて、本発明は完成されるに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
【００１６】
（１）Ｇｌｕ、Ｘ（ＸはＣｙｓおよびその誘導体を除くアミノ酸またはアミノ酸誘導体を表す）、およびＹ（Ｙはアミノ酸またはアミノ酸誘導体を表す）を含有する原料に、グルタチオン合成酵素およびγ‐グルタミルシステイン合成酵素を作用させることによりγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを生成する工程を含む、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方法。
（２）γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ（ＸはＣｙｓおよびその誘導体を除くアミノ酸またはアミノ酸誘導体を表す）およびＹ（Ｙはアミノ酸またはアミノ酸誘導体）を含有する原料に、グルタチオン合成酵素を作用させることによりγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを生成する工程を含む、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方法。
（３）前記グルタチオン合成酵素および／またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素が、該酵素の活性を有する微生物の培養物または該培養物の処理物である、前記γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方法。
（４）前記グルタチオン合成酵素および／またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素が精製された酵素である、前記γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方法。
（５）前記グルタチオン合成酵素および／またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素が固定化酵素である、前記γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方法。
（６）前記グルタチオン合成酵素および／またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素が、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、およびエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）からなる群より選ばれる微生物由来である、前記γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方法。
（７）グルタチオン合成酵素遺伝子および／またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の発現が強化されている微生物を、Ｇｌｕ、Ｘ（ＸはＣｙｓおよびその誘導体を除くアミノ酸またはアミノ酸誘導体を表す）、およびＹ（Ｙはアミノ酸またはアミノ酸誘導体を表す）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体が添加された培地で培養し、培地中にγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを生成および蓄積させ、培養物中からγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを採取することを特徴とする、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方
法。
（８）Ｇｌｕ、Ｘ（ＸはＣｙｓおよびその誘導体を除くアミノ酸またはアミノ酸誘導体を表す）、およびＹ（Ｙはアミノ酸またはアミノ酸誘導体を表す）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体を生産する能力を有し、且つ、グルタチオン合成酵素遺伝子および／またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の発現が強化されている微生物を培養し、培地中にγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを生成および蓄積させ、培養物中からγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを採取することを特徴とする、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方法。
（９）前記微生物が、エシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物である、前記γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方法。
（１０）前記エシェリヒア属に属する微生物がエシェリヒア・コリであり、前記コリネバクテリウム属に属する微生物がコリネバクテリウム・グルタミカムである、前記γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方法。
（１１）前記グルタチオン合成酵素遺伝子および／またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素遺伝子がサッカロマイセス・セレビジエ、カンジダ・ユチリス、およびエシェリヒア・コリからなる群より選ばれる微生物由来である、前記γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方法。（１２）前記ＹがＧｌｙである、前記γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙの製造方法。
（１３）前記ＸがＶａｌである、前記γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ‐Ｇｌｙの製造方法。
（１４）前記ＸがｎＶａｌである、前記γ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ‐Ｇｌｙの製造方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】プラスミドｐＥＴ‐ＧＳＨ２の構築を示す図。
【図２】プラスミドｐＥＴ‐ｇｓｈＢの構築を示す図。
【図３】プラスミドｐＥＴ‐ＧＳＨ１の構築を示す図。
【図４】プラスミドｐＱＥ‐ｇｓｈＡの構築を示す図。
【図５】プラスミドｐＥＴ‐ＳｃＧＳＨ１の構築を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（１）本発明により製造されるγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙ
本発明により、γ‐グルタミルトリペプチドであるγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを製造することができる。γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙ中のＧｌｕは、グルタミン酸を示す。また、「‐」はペプチド結合を表す。γ‐Ｇｌｕの「γ」とは、グルタミン酸のγ位のカルボキシル基を介してＸが結合していることを意味する。
【００２０】
「Ｘ」は、２０種類の天然アミノ酸の中でＣｙｓを除く１９種類の天然アミノ酸のいずれか、またはＣｙｓ誘導体を除くアミノ酸誘導体を示す。「Ｙ」は、２０種類の天然アミノ酸のいずれか、またはアミノ酸誘導体を示す。本発明において、ＸおよびＹはそれぞれ独立に選択される。
【００２１】
前記２０種類の天然アミノ酸には、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、プロリン（Ｐｒｏ）などの中性アミノ酸、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）などの酸性アミノ酸、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）などの塩基性アミノ酸、およびフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）などの芳香族アミノ酸が含まれる。
【００２２】
また、アミノ酸誘導体としては、例えばノルバリン（ｎＶａｌ）、ノルロイシン（ｎＬｅｕ）、ｔｅｒｔ‐ロイシン（ｔＬｅｕ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、α‐アミノ酪酸、およびβ‐アミノ酪酸が挙げられる。アミノ酸誘導体の中で、Ｃｙｓ誘導体としては、例えばα‐アミノ酪酸、およびβ‐アミノ酪酸が挙げられる。
【００２３】
本発明において、ＹはＧｌｙであるのが好ましい。すなわち、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙとしては、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙが好ましい。
【００２４】
また、ＹがＧｌｙである場合には、Ｘは疎水性アミノ酸または疎水性アミノ酸誘導体であるのが好ましい。疎水性アミノ酸としては、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、およびＰｈｅ等が挙げられ、疎水性アミノ酸誘導体としてはｎＶａｌ等が挙げられる。Ｘが疎水性アミノ酸または疎水性アミノ酸誘導体である場合には、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙのコク味付与効果が高い。
【００２５】
γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙとしては、特にγ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ‐Ｇｌｙまたはγ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ‐Ｇｌｙが好ましい。
【００２６】
本発明においては、１種のγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙが製造されてもよく、２種以上のγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙが製造されてもよい。
【００２７】
なお、上記アミノ酸およびアミノ酸誘導体は、いずれもＬ‐体である。また、本発明において、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙ、ならびに原料として用いられるＧｌｕ、Ｘ、Ｙ、およびγ‐Ｇｌｕ‐Ｘは、いずれもフリー体もしくはその塩、またはそれらの混合物であってもよい。塩としては、例えば硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩が挙げられる。
【００２８】
（２）本発明に用いられる酵素
本発明に用いられるグルタチオン合成酵素は、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘを基質として認識し、Ｙと結合させることでγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを生成する反応を触媒する活性を有する限り特に限定されない。本発明において、当該反応を触媒する活性を、グルタチオン合成酵素活性という。なお、本発明に用いられるグルタチオン合成酵素は、あらゆるＸおよびＹに関してグルタチオン合成酵素活性を示す必要はなく、Ｘとして選択されたアミノ酸またはアミノ酸誘導体およびＹとして選択されたアミノ酸またはアミノ酸誘導体に関してグルタチオン合成酵素活性を示せばよい。また、複数種のγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙが製造される場合に、単一のグルタチオン合成酵素が当該複数種のγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙ全てを生成する反応を触媒する活性を有する必要はなく、Ｘおよび／またはＹに応じて複数種のグルタチオン合成酵素を利用してもよい。なお、本発明において、グルタチオン合成酵素は、γ‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓまたはγ‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓ誘導体と、Ｇｌｙとから、ＧＳＨまたはγ‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓ誘導体‐Ｇｌｙを生成する反応を触媒する活性を有していてもよく、有していなくてもよい。
【００２９】
本発明に用いられるγ‐グルタミルシステイン合成酵素は、Ｘを基質として認識し、Ｇｌｕと結合させることでγ‐Ｇｌｕ‐Ｘを生成する反応を触媒する活性を有する限り特に限定されない。本発明において、当該反応を触媒する活性を、γ‐グルタミルシステイン合成酵素活性という。なお、本発明に用いられるγ‐グルタミルシステイン合成酵素は、あらゆるＸに関してγ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を示す必要はなく、Ｘとして選択されたアミノ酸またはアミノ酸誘導体に関してγ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を示せばよい。また、基質として複数種のＸを用いる場合に、単一のγ‐グルタミルシステイン合成酵素が当該複数種のＸ全てに関してγ‐グルタミルシステイン合成酵素活性
を示す必要はなく、Ｘに応じて複数種のγ‐グルタミルシステイン合成酵素を利用してもよい。なお、本発明において、γ‐グルタミルシステイン合成酵素は、Ｇｌｕと、ＣｙｓまたはＣｙｓ誘導体とから、γ‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓまたはγ‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓ誘導体を生成する反応を触媒する活性を有していてもよく、有していなくてもよい。
【００３０】
なお、本発明に用いられるグルタチオン合成酵素、および本発明に用いられるγ‐グルタミルシステイン合成酵素を総称して、本発明に用いられる酵素ともいう。
【００３１】
グルタチオン合成酵素は、一般的にＧＳＨ２遺伝子またはｇｓｈＢ遺伝子にコードされる。なお、以下、ＧＳＨ２遺伝子によりコードされるグルタチオン合成酵素を「Ｇｓｈ２タンパク質」あるいは「Ｇｓｈ２」と記載する場合がある。また、ｇｓｈＢ遺伝子によりコードされるグルタチオン合成酵素を「ＧｓｈＢタンパク質」あるいは「ＧｓｈＢ」と記載する場合がある。
【００３２】
γ‐グルタミルシステイン合成酵素は、一般的にＧＳＨ１遺伝子またはｇｓｈＡ遺伝子にコードされる。なお、以下、ＧＳＨ１遺伝子によりコードされるγ‐グルタミルシステイン合成酵素を「Ｇｓｈ１タンパク質」あるいは「Ｇｓｈ１」と記載する場合がある。また、ｇｓｈＡ遺伝子によりコードされるγ‐グルタミルシステイン合成酵素を「ＧｓｈＡタンパク質」あるいは「ＧｓｈＡ」と記載する場合がある。
【００３３】
本発明に用いられる酵素の由来は特に制限されず、微生物、植物または動物等の任意の生物に由来する酵素を用いることができるが、微生物に由来するものが好ましい。微生物としては、酵母等の真核微生物、あるいは腸内細菌やコリネ型細菌等の細菌が挙げられる。以下、本発明に用いられる酵素をコードする遺伝子について例示する。
【００３４】
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＭＧ１６５５株のｇｓｈＢ遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースにＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＣ＿０００９１３（ＶＥＲＳＩＯＮ  ＮＣ＿０００９１３．２  ＧＩ：４９１７５９９０）として登録されているゲノム配列中、３０８９９００〜３０９０８５０位の配列に相当する。また、前記ＭＧ１６５５株のｇｓｈＡ遺伝子は、上記ゲノム配列中、２８１２９０５〜２８１４４６１位の配列の相補配列に相当する。また、エシェリヒア・コリＫ１２  Ｗ３１１０株のｇｓｈＢ遺伝子の塩基配列、および同遺伝子がコードするアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７および８に示す。また、前記Ｗ３１１０株のｇｓｈＡ遺伝子の塩基配列、および同遺伝子がコードするアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１７および１８に示す。
【００３５】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＳＨ１遺伝子およびＧＳＨ２遺伝子の塩基配列は、それぞれＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（http://www.yeastgenome.org/）に開示されている。また、カンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）のＧＳＨ１遺伝子およびＧＳＨ２遺伝子の塩基配列は、米国特許第７５５３６３８号に開示されている。サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２６１０８）のＧＳＨ２遺伝子の塩基配列、および同遺伝子がコードするアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１および２に示す。また、サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２６１０８）のＧＳＨ１遺伝子の塩基配列、および同遺伝子がコードするアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２１および２２に示す。また、カンジダ・ユチリスＡＴＣＣ２２０２３株のＧＳＨ１遺伝子の塩基配列、および同遺伝子がコードするアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１１および１２に示す。
【００３６】
酵素が由来する生物によって、グルタチオン合成酵素またはγ‐グルタミルシステイン
合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、それらをコードする遺伝子は、配列番号１，７，１１，または１７に示す塩基配列のバリアントであってもよい。各遺伝子のバリアントは、配列番号１，７，１１，または１７に示す塩基配列を参考にして、ＢＬＡＳＴ等によって検索出来る(http://blast.genome.jp/)。また、各遺伝子のバリアントは、各遺伝子のホモログを含む。各遺伝子のホモログとしては、任意の生物、例えば酵母等の真核微生物、あるいは腸内細菌やコリネ型細菌等の細菌の染色体を鋳型にして、例えば配列番号１，７，１１，または１７の塩基配列に基づいて調製される合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲで増幅可能な遺伝子が挙げられる。
【００３７】
また、本発明に用いられる酵素をコードする遺伝子は、グルタチオン合成酵素活性またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする限り、上記のような遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列、例えば配列番号２，８，１２，または１８のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。前記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個を意味する。上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、例えば、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ間で、極性アミノ酸である場合には、Ｇｌｎ、Ａｓｎ間で、塩基性アミノ酸である場合には、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ間で、酸性アミノ酸である場合には、Ａｓｐ、Ｇｌｕ間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、ＡｌａからＳｅｒまたはＴｈｒへの置換、ＡｒｇからＧｌｎ、ＨｉｓまたはＬｙｓへの置換、ＡｓｎからＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＨｉｓまたはＡｓｐへの置換、ＡｓｐからＡｓｎ、ＧｌｕまたはＧｌｎへの置換、ＣｙｓからＳｅｒまたはＡｌａへの置換、ＧｌｎからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＡｒｇへの置換、ＧｌｕからＧｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＬｙｓまたはＡｓｐへの置換、ＧｌｙからＰｒｏへの置換、ＨｉｓからＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＡｒｇまたはＴｙｒへの置換、ＩｌｅからＬｅｕ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＰｈｅへの置換、ＬｅｕからＩｌｅ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＰｈｅへの置換、ＬｙｓからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＨｉｓまたはＡｒｇへの置換、ＭｅｔからＩｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＰｈｅへの置換、ＰｈｅからＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＬｅｕへの置換、ＳｅｒからＴｈｒまたはＡｌａへの置換、ＴｈｒからＳｅｒまたはＡｌａへの置換、ＴｒｐからＰｈｅまたはＴｙｒへの置換、ＴｙｒからＨｉｓ、ＰｈｅまたはＴｒｐへの置換、および、ＶａｌからＭｅｔ、ＩｌｅまたはＬｅｕへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔ）によって生じるものも含まれる。
【００３８】
さらに、上記のような保存的変異を有する遺伝子は、上記のような遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列全体、例えば配列番号２，８，１２，または１８のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつ、グルタチオン合成酵素またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）は、「同一性」（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を指すことがある。
【００３９】
また、本発明に用いられる酵素をコードする遺伝子は、公知の遺伝子配列から調製され
得るプローブ、例えば配列番号１，７，１１，または１７に示す塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、グルタチオン合成酵素活性またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、さらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００４０】
プローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。例えば、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片をプローブとして用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳが挙げられる。
【００４１】
また、本発明に用いられる酵素をコードする遺伝子は、天然型のままでも使用できるが、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変してもよい。
【００４２】
（３）本発明に用いられる酵素の調製
本発明に用いられる酵素を取得する方法は特に限定されない。本発明に用いられる酵素は、該酵素の活性を有する生物、例えば、該酵素の活性を有する微生物の野生株または変異株から調製することができる。また、本発明に用いられる酵素は、該酵素の活性が増強された生物から調製することができ、そのような生物としては、遺伝子工学的手法により本発明に用いられる酵素をコードする遺伝子の発現が増強された形質転換体が挙げられる。なお、「酵素の活性が増強される」とは、本来的に該酵素の活性を有する微生物において該酵素の活性を増大させることに限られず、本来的には該酵素の活性を有さない微生物に該酵素の活性を付与することを含む。
【００４３】
なお、以下に例示する遺伝子の発現を増強する手法は、本発明に用いられる酵素をコードする遺伝子の発現を増強する場合に限られず、任意の遺伝子、例えば後述するＬ‐アミノ酸の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増強する場合にも利用できる。
【００４４】
遺伝子工学的手法により形質転換体を構築しタンパク質の大量生産を行う場合、形質転換される宿主としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞等を用いることができる。形質転換される宿主としては、微生物細胞を用いるのが好ましい。なお、宿主‐ベクター系が開発されている微生物としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、アンスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属真菌等が挙げられる。中でも、エシェリヒア・コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）またはコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ．  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）が好適に用いられる。
【００４５】
遺伝子の発現の増強は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なものに置換することにより達成できる。そのようなプロモーターとしては、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、およびＰＬプロモータ
ー等が挙げられる。また、強力なプロモーターへの置換は、後述する遺伝子の翻訳効率の向上や遺伝子のコピー数の増加と組み合わせて利用できる。
【００４６】
また、遺伝子の発現の増強は、例えば、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することにより翻訳効率を向上させることができる。
【００４７】
また、遺伝子の発現の増強は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。
【００４８】
遺伝子のコピー数の増加は、染色体上に目的の遺伝子を導入することにより達成できる。染色体上への遺伝子の導入は、例えば相同的組み換えを利用して行うことができる。例えば、染色体中に多数のコピーが存在する配列を標的として相同的組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体中に多数のコピーが存在する配列としては、反復ＤＮＡまたは転位因子の末端にある逆方向反復配列等が挙げられるが、これらに限定されない。また、米国特許第５，５９５，８８９号に開示されるように、トランスポゾンに遺伝子を組み込み、それを染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入するよう転移させることも可能である。
【００４９】
また、遺伝子のコピー数の増加は、目的遺伝子を含むベクターを宿主となる生物に導入することによっても達成できる。用いるベクターとしてはマルチコピーベクターが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターはアンピシリン耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。例えば、エシェリヒア・コリに利用できるマルチコピーベクターとしては、ｐＵＣ系のプラスミド、ｐＢＲ３２２系のプラスミド、およびそれらの誘導体等のＣｏｌＥ１複製起点を有するプラスミドが挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位により改変を受けたプラスミドを意味する。ここでの改変には、変異原物質やＵＶ照射を用いる変異誘発処理や、自然突然変異、ランダム変異により生じる改変を含む。エシェリヒア・コリに利用できる好適なベクターとしては、強力なプロモーターを有する市販の発現ベクターであるｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社製）、ｐＵＣ系（タカラバイオ社製）、ｐＰＲＯＫ系（クロンテック社製）、ｐＫＫ２３３‐２（クロンテック社製）、ｐＥＴ系（ノバジェン社製）、ｐＱＥ系（キアゲン社製）等が挙げられる。また、その他のベクターとしては、例えばｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＧＫ１２、ｐＬＦ１４、およびｐＬＦ２２等のエシェリヒア・コリ‐バチラス・サブチリス用シャトルベクター、ｌ１０５９、ｌＢＦ１０１、Ｍ１３ｍｐ９、およびＭｕ  ｐｈａｇｅ（特開平２‐１０９９８５）等のファージベクター、ならびにＭｕ、Ｔｎ１０、Ｔｎ５等のトランスポゾン（Berg, D.E. and Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417 (1983)）が利用できる。なお、例えばトランスポゾンをベクターとして利用する場合には、上述したように、目的の遺伝子が染色体上に転移して導入されることで遺伝子のコピー数が増加する。
【００５０】
上記のようなベクターにプロモーターおよび遺伝子を順に連結したＤＮＡ断片が挿入された発現プラスミドで宿主を形質転換することにより、遺伝子の発現が増強された形質転換体が得られる。なお、ベクターには遺伝子を発現させるのに好適なプロモーターを含んでいるものがあり、そのようなベクターを用い、ベクターに含まれるプロモーターに下流に遺伝子を連結する場合には、別途プロモーターをベクターに挿入する必要はない。また、遺伝子の下流には、転写終結配列であるターミネーターを連結してもよい。ターミネーターとしては、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、エシェリヒア・コリｔｒｐＡ遺伝子のターミネーター等が挙げられる。
【００５１】
形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。例えば、ベクターをエシェリヒア・コリに導入するには、Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Methods in Enzymology 68, 326 (1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)）等、通常のエシェリヒア属細菌の形質転換に用いられる方法により行うことができる。
【００５２】
上記のようにして得られる本発明に用いられる酵素をコードする遺伝子の発現が増強された形質転換体の培養条件、および酵素の生産誘導の条件は、マーカーの種類、プロモーターの種類、および、用いる宿主の種類等に応じて適宜選択すればよい。例えば、エシェリヒア・コリ形質転換体を培養するのに用いる培地としては、２×ＹＴ培地、Ｍ９‐カザミノ酸培地、ＬＢ培地等の通常エシェリヒア・コリを培養するのに用いる培地を好適に用いることができる。
【００５３】
培養後、菌体を回収し、破砕または溶解することにより酵素含有溶液が得られる。菌体の破砕には、例えば、超音波破砕、フレンチプレス破砕またはガラスビーズ破砕を好適に用いることができる。また、細胞を溶解する場合には、例えば、卵白リゾチーム、ペプチダーゼ処理やそれらの適切な組み合わせを用いることができる。なお、破砕または溶解後に残渣が残る場合には、必要に応じて、遠心等により残渣を除去することができる。また、例えば、培養上清中に目的の酵素が存在する場合には、培養上清を酵素含有溶液として利用することができる。
【００５４】
酵素含有溶液からの酵素の回収は、酵素の精製に用いられる公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等が挙げられる。また、目的の酵素を他のタンパク質あるいはペプチドとの融合タンパク質として生産する場合には、融合したタンパク質あるいはペプチドに対する親和性を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより目的の酵素を精製することができる。
【００５５】
なお、上記では、本発明に用いられる酵素をコードする遺伝子の発現が増強された形質転換体を用いた酵素の調製について記載したが、それ以外の場合にも、必要により適宜変更して適用できる。例えば、本発明に用いられる酵素の活性を有する微生物の野生株または変異株等を酵素の取得源として利用する場合にも、菌体を増殖させて目的の酵素を産生させ、酵素を調製することができる。
【００５６】
本発明の方法においては、上記のように精製された酵素を使用してもよく、精製されていない酵素を使用してもよい。精製されていない酵素としては、例えば、酵素を産生する微生物を培養した培養上清や、該微生物の破砕物等の酵素含有溶液が挙げられる。また、本発明の方法においては、酵素は任意の担体に固定化した固定化酵素の状態で利用することができる。さらに、例えば、酵素を産生する微生物の菌体を含む培養物、該培養物から分離・回収した菌体、該菌体を固定化処理、アセトン処理、凍結乾燥処理等した菌体処理物を酵素として使用することもできる。
【００５７】
（４）γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方法
本発明のγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方法（以下、本発明の方法ともいう）は、グルタチオン合成酵素の活性を利用することを特徴とする。
【００５８】
（４‐１）酵素法によるγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造
γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙは、酵素を用いた酵素法により製造することができる。
【００５９】
本発明の方法の第１の態様（以下、第１の態様ともいう）は、γ‐Ｇｌｕ‐ＸおよびＹを含有する原料にグルタチオン合成酵素を作用させることによりγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを生成する工程を含む、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方法である。すなわち、第１の態様においては、グルタチオン合成酵素の作用により反応原料中のγ‐Ｇｌｕ‐ＸにＹが付加されγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙが生成する。
【００６０】
第１の態様において、基質として用いられるγ‐Ｇｌｕ‐Ｘは、任意の手法により製造すればよい。例えば、ＧｌｕおよびＸを含有する原料を用いて、γ‐グルタミルシステイン合成酵素を用いた酵素反応によりγ‐Ｇｌｕ‐Ｘを生成することができる。また、例えば、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ生産能を有する微生物の菌体あるいは培養上清から回収することにより、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘを得ることができる。なお、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ生産能を有する微生物とは、微生物の野生株または変異株であってもよく、遺伝子工学的手法を用いて作製された形質転換体であってもよい。γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ生産能を有する形質転換体は、例えば、γ‐グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子を公知の手法により適当な株に導入することにより取得できる。
【００６１】
本発明の方法の第１の態様は、さらに、上記のような手法によりγ‐Ｇｌｕ‐Ｘを生成する工程を含んでいてもよい。すなわち、例えば、第１の態様の一態様（以下、第２の態様ともいう）は、ＧｌｕおよびＸを含有する原料にγ‐グルタミルシステイン合成酵素を作用させることによりγ‐Ｇｌｕ‐Ｘを生成する工程（以下、工程（Ａ）ともいう）、および工程（Ａ）で生成したγ‐Ｇｌｕ‐ＸおよびＹを含有する原料にグルタチオン合成酵素を作用させることによりγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを生成する工程（以下、工程（Ｂ）ともいう）を含む、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方法である。すなわち、第２の態様においては、γ‐グルタミルシステイン合成酵素の作用によりＧｌｕおよびＸからγ‐Ｇｌｕ‐Ｘが生成し、さらにグルタチオン合成酵素の作用によりＹが付加されγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙが生成する。
【００６２】
第２の態様において、工程（Ａ）と工程（Ｂ）は別個に進行してもよい。例えば、工程（Ａ）で生成したγ‐Ｇｌｕ‐Ｘを回収して、回収したγ‐Ｇｌｕ‐Ｘを用いて工程（Ｂ）を進行させてもよい。また、例えば、工程（Ａ）におけるγ‐Ｇｌｕ‐Ｘの生成が平衡に達した後に、グルタチオン合成酵素、Ｙ、またはその両方を反応系に添加することで工程（Ｂ）を進行させてもよい。
【００６３】
また、第２の態様において、工程（Ａ）と工程（Ｂ）は同時に進行してもよい。両工程は、反応過程の全期間において同時に進行してもよく、また、反応過程の一部の期間においてのみ同時に進行してもよい。両工程を同時に進行させる場合には、反応系に両酵素、ならびにＧｌｕ、Ｘ、およびＹを共存させればよい。例えば、それら全てを反応開始時に共存させることで、両工程を同時に開始させることができる。また、工程（Ａ）を開始した後、反応過程の任意の時点においてグルタチオン合成酵素、Ｙ、あるいはその組み合わせを反応系に添加することで工程（Ｂ）を進行させてもよい。
【００６４】
本発明の方法のさらなる態様（以下、第３の態様ともいう）は、Ｇｌｕ、Ｘ、およびＹを含有する原料にγ‐グルタミルシステイン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を作用させることによりγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを生成する工程を含む、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方法である。すなわち、第３の態様においては、γ‐グルタミルシステイン合成酵素の作用によりＧｌｕおよびＸからγ‐Ｇｌｕ‐Ｘが生成し、さらにグルタチオン合成酵素の作用によりＹが付加されγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙが生成すると考えられる。
【００６５】
第３の態様においては、γ‐グルタミルシステイン合成酵素およびグルタチオン合成酵素、ならびにＧｌｕ、Ｘ、およびＹを反応系に共存させることにより、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを生成することができる。また、例えば、先にγ‐グルタミルシステイン合成酵素を作用させ、続いて、任意の時点でグルタチオン合成酵素を追加的に反応系に添加して作用させてもよい。なお、第３の態様においてグルタチオン合成酵素を追加的に作用させる場合には、グルタチオン合成酵素が作用する時点でＧｌｕ、Ｘ、またはその両方が反応系に残存していなくともよい。
【００６６】
なお、以下、第１の態様におけるγ‐Ｇｌｕ‐ＸおよびＹ、第２の態様におけるＧｌｕ、Ｘ、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ、およびＹ、ならびに第３の態様におけるＧｌｕ、Ｘ、およびＹを総称して、「基質」ともいう。また、以下、第１の態様におけるグルタチオン合成酵素、ならびに第２および第３の態様におけるγ‐グルタミルシステイン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を総称して、「酵素」ともいう。
【００６７】
いずれの態様においても、酵素反応は水あるいは緩衝液等の水性溶媒中で行われるのが好ましい。酵素反応は、例えば、反応液中に各基質および各酵素を含有させることで行われてもよく、また、各基質を含有する反応液を固定化酵素に供給することにより行われてもよい。反応液のｐＨは用いる酵素が機能する限り特に限定されず、用いる酵素の性質に応じて適宜設定することができる。反応液のｐＨは、例えば、好ましくはｐＨ５〜１０であり、より好ましくは７〜９であり、特に好ましくは７．５〜８．５である。
【００６８】
反応液中の各基質の濃度は特に限定されないが、例えば、１μＭ以上であるのが好ましく、１００μＭ以上であるのがより好ましく、１ｍＭ以上であるのが特に好ましい。また、濃度の上限は特に限定されないが、例えば、通常２Ｍ以下であり、１Ｍ以下であるのが好ましい。また、例えば収率の観点から、反応液中の各基質の濃度をそろえる方が好ましい場合がある。すなわち、例えば、第１の態様においては、γ‐Ｇｌｕ‐ＸおよびＹの濃度の比が１：１に近い方が好ましい場合があり、第２または第３の態様においては、Ｇｌｕ、Ｘ、およびＹの濃度の比が１：１：１に近い方が好ましい場合がある。また、用いる酵素の性質等によっては、各基質の濃度に差があるのが好ましい場合もあり得る。
【００６９】
反応液中の各酵素の濃度、または固定化された各酵素の濃度は特に限定されず、酵素の性質、Ｘの種類、Ｙの種類、原料の濃度、反応温度、および反応時間等の諸条件に応じて適宜設定すればよい。反応液中の各酵素の濃度は、例えば、１μｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌであるのが好ましく、１０μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌであるのがより好ましい。また、固定化された各酵素の濃度は、例えば、２〜２００ｍｇ／ｇ担体が好ましく、１０〜１００ｍｇ／ｇ担体であるのがより好ましい。
【００７０】
反応液中には、酵素反応に必須な因子が存在することが好ましい。酵素反応に必須な因子としては、グルタチオン合成酵素による反応、およびγ‐グルタミルシステイン合成酵素による反応の双方において、ＡＴＰが挙げられる。ＡＴＰは、ペプチド結合形成のためのエネルギー源として利用される。本発明の方法において、ＡＴＰは、本発明に用いられる酵素がペプチド結合形成にＡＴＰを利用できるように反応系に供給されればよい。例えば、ＡＴＰはγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを生成および蓄積させる反応液に粉末のまま、あるいは水溶液として供給することができる。また、さらに実用的には、高価なＡＴＰを直接添加する代わりに、ＡＴＰ再生系を利用してもよい。すなわち、ＡＴＰ再生能を有する精製酵素、粗酵素、菌体処理物、または菌体等の触媒とＡＴＰ再生に用いられる基質とを反応系に添加することで、消費されたＡＴＰを再生しながらγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの生成を継続することが可能である。ＡＴＰ再生系を利用するための方法としては、具体的には、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃ．  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）の培養菌体と炭素源を添加する方法（Biosci. Biotechnol. Biochem., 65, 644‐650 (2001)）ポリリン酸
キナーゼとポリリン酸を添加する方法（J. Biosci. Bioeng., 91, 557‐563 (2001)）、およびクレアチンホスホリラーゼとクレアチンリン酸を添加する方法等が挙げられる。
【００７１】
また、用いられる酵素によっては、反応液中に種々のカチオン、例えばＭｇ2+が存在するのが好ましい場合がある。そのような場合には、カチオンがキレートされない反応液組成を用いるのが好ましいが、カチオンの作用が保持されていれば何ら制限を受けない。例えば、カチオンがキレートされる可能性が少ない緩衝液としては、ＨＥＰＥＳバッファー、ＭＥＳバッファー、ＧＴＡ広域バッファー等が挙げられる。さらに、反応液中には、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの生成を達成できる限りにおいて、その他の任意の成分が存在しうる。例えば、アルコール類、エステル類、ケトン類、アミド類等の有機溶媒を含有させることもできる。
【００７２】
反応温度は用いる酵素が機能する限り特に限定されず、酵素の性質に応じて適宜設定することができる。反応温度は例えば通常１０℃〜８０℃であり、２０℃〜７０℃が好ましい。例えばエシェリヒア・コリ由来の酵素を利用する場合には、反応温度は３０℃〜４０℃であるのが好ましい。
【００７３】
反応時間は特に限定されず、酵素の性質や反応温度等の諸条件に応じて適宜設定すればよい。反応時間は例えば通常５分〜２００時間であるのが好ましい。
【００７４】
いずれの態様においても、反応の過程において、各基質、各酵素、およびその他の成分を単独で、あるいは任意の組み合わせで追加的に反応系に添加してもよい。これらの成分は１回または複数回添加されてもよく、連続的に添加されてもよい。また、反応開始から反応終了まで均一の条件を用いてもよく、反応の過程において条件を変化させてもよい。なお、反応の過程において条件を変化させるとは、例えば固定化酵素を利用する場合等において、反応温度や酵素濃度等の条件を空間的に変化させることを含む。例えば、第２または第３の態様において固定化酵素を利用する場合には、γ‐グルタミルシステイン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を混在して配置してもよく、位置的に分離させて配置してもよい。
【００７５】
また、例えば、第２または第３の態様において、グルタチオン合成酵素とγ‐グルタミルシステイン合成酵素の作用する好適な条件が互いに異なる場合には、反応の過程において、γ‐グルタミルシステイン合成酵素に好適な条件からグルタチオン合成酵素に好適な条件へと変化させることが有効であり得る。
【００７６】
本発明の方法において、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの生成は、化合物の検出または同定に用いられる任意の手法により確認することができる。そのような手法としては、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＧＣ／ＭＳ、およびＮＭＲ等が挙げられる。
【００７７】
本発明により製造されたγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙは、通常用いられるペプチドの精製法を用いて単離することができる。例えば、必要により遠心分離等により固形物を除いた反応液上清から、イオン交換樹脂や膜処理法、晶析法などの操作を組み合わせて、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを単離することができる。
【００７８】
（４‐２）発酵法によるγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造
γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙは、上述の酵素法に限られず、微生物を用いた発酵法によっても製造することができる。
【００７９】
具体的には、例えば、γ‐グルタミルシステイン合成酵素およびグルタチオン合成酵素の活性を有する微生物を培養し、Ｇｌｕ、Ｘ、およびＹからγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを生成さ
せ、菌体内および／または培養液中にγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを蓄積させることができる。基質として用いられるＧｌｕ、Ｘ、およびＹは、培地に添加されてもよく、用いられる微生物により生合成されてもよい。γ‐グルタミルシステイン合成酵素およびグルタチオン合成酵素の活性を有する微生物は、γ‐グルタミルシステイン合成酵素および／またはグルタチオン合成酵素の活性が増強されている微生物であるのが好ましい。
【００８０】
また、例えば、グルタチオン合成酵素の活性を有する微生物を培養し、γ‐Ｇｌｕ‐ＸおよびＹからγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを生成させ、菌体内および／または培養液中にγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを蓄積させることができる。基質として用いられるγ‐Ｇｌｕ‐ＸおよびＹは、培地に添加されてもよく、用いられる微生物により生合成されてもよい。グルタチオン合成酵素の活性を有する微生物は、グルタチオン合成酵素の活性が増強されている微生物であるのが好ましい。
【００８１】
蓄積したγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙは、培養物から回収することができる。なお、上記いずれの場合にも、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙは培養液中に蓄積させるのが好ましい。
【００８２】
以下、酵素法と同様に、発酵法の各態様で基質として用いられるＧｌｕ、Ｘ、およびＹ、あるいはγ‐Ｇｌｕ‐ＸおよびＹを総称して、「基質」ともいう。また、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを生成する微生物を、単に「微生物」ともいう。
【００８３】
微生物としては、特に限定されないが、例えば腸内細菌科に属する細菌やコリネ型細菌を必要により適宜改変して用いることができる。ここでいう改変としては、例えば、γ‐グルタミルシステイン合成酵素および／またはグルタチオン合成酵素の活性の増強や、後述する１以上の基質を生産する能力の付与または増強が挙げられる。
【００８４】
腸内細菌科に属する細菌としては、エシェリヒア(Escherichia)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、パントエア(Pantoea)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、セラチア(Serratia)属、エルビニア(Erwinia)属、サルモネラ(Salmonella)属、およびモルガネラ(Morganella)属に属する細菌等が挙げられる。具体的にはＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）データベースに記載されている分類により腸内細菌科に属するものが利用できる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）。腸内細菌科に属する細菌としては、エシェリヒア属に属する細菌を好ましく用いることができる。
【００８５】
エシェリヒア属細菌としては、ナイトハルトらの著書（Neidhardt,F.C.et.al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C.,1208, table 1）に挙げられるもの、例えばエシェリヒア・コリ等が利用できる。エシェリヒア・コリの野生株としては、例えばＫ１２株又はその誘導体、エシェリヒア・コリ  ＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４７０７６）、及びＷ３１１０株（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２７３２５）等が挙げられる。
【００８６】
コリネ型細菌としては、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）第８版５９９頁（１９７４）に定義されている一群の微生物であり、好気性、グラム陽性、非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌に分類される微生物が利用できる。コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム属細菌を好ましく用いることができる。なお、コリネ型細菌は、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在はコリネバクテリウム属細菌として統合された細菌（Int.J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)）、及びコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリウム属細菌を含む。コリネバクテリウム属細菌としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムを好ましく用いることができる。
【００８７】
これらの菌株を入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所  P.O. Box 1549, Manassas, VA 2010812301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America）より分譲を受けることができる。すなわち、菌株毎に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることができる。各菌株に対応する登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている（http://www.atcc.org/参照）。
【００８８】
微生物は、１以上の基質を生産する能力を有していてもよい。微生物が１以上の基質を生産する能力を有する場合には、微生物により生合成された１以上の基質は、そのままγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの生成に利用されうる。
【００８９】
基質を生産する能力とは、微生物を培地中で培養したときに、培地中または菌体内に基質を生成し、培地中または菌体から回収できる程度に蓄積する能力を意味する場合がある。例えば、基質を生産する能力を有する微生物は、好ましくは０．０５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．１ｇ／Ｌ以上、特に好ましくは０．２ｇ／Ｌ以上の量の基質を生産し培地に蓄積することができる微生物でありうる。なお、微生物により生合成された基質はそのままγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの生成に利用されうるため、基質を生産する能力とは、当該基質を培地中に添加しなくとも、培地中または菌体内にγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを生成し、培地中または菌体から回収できる程度に蓄積する能力を意味する場合がある。
【００９０】
基質を生産する能力を有する微生物としては、例えば公知のＬ‐アミノ酸生産菌を好適に用いることができる。また、基質を生産する能力を有する微生物は、本来的に基質を生産する能力を有するものであってもよく、基質を生産する能力を有するように改変されたものであってもよい。また、基質を生産する能力を有する微生物は、野生株または親株よりも基質を生産する能力が増強された微生物であってもよい。基質を生産する能力は、公知の手法により微生物に付与または増強することができる。
【００９１】
微生物に基質、例えばＬ‐アミノ酸を生産する能力を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ‐アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、１９８６年５月３０日初版発行、第７７‐１００頁参照）。ここで、Ｌ‐アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ‐アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００９２】
Ｌ‐アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、Ｌ‐アミノ酸のアナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ‐メチル‐Ｎ’‐ニトロ‐Ｎ‐ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくはエチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ‐アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
【００９３】
γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの発酵生産に用いる宿主となるアミノ酸生産菌としては、例えば以下のものが挙げられる。Ｌ‐グルタミン酸生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）ＡＴＣＣ１３８６９株より取得さ
れたｏｄｈＡ欠損株に、Ｖ１９７Ｍ変異を有するｍｖｉＮ遺伝子を導入した組換え株（特開２０１０‐１６１９７０）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ｇｌｔＡ（クエン酸シンターゼ）遺伝子を導入したパントエア・アグロメランスＡＪ１３３５５株（特許第４２８５５８２号）、エシェリヒア属に属し、グルタミンシンセターゼの３９７位のチロシン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型グルタミンシンセターゼを有する菌株（米国特許出願公開第２００３‐０１４８４７４号明細書）などが例示できる。Ｌ‐バリン生産菌としては、エシェリヒア・コリＶＬ１９７０株（米国特許第５６５８７６６号）、エシェリヒア属に属し、生育のためにリポ酸を要求する変異および／またはＨ+‐ＡＴＰａｓｅを欠損する変異を有する菌株、および、これらの性質に加えて、少なくともｉｌｖＧ、ｉｌｖＭ、ｉｌｖＥおよびｉｌｖＤの各遺伝子を発現し、且つ、スレオニンデアミナーゼ活性を発現しないｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤＮＡ断片が細胞内に導入されたエシェリヒア属細菌（ＷＯ９６／０６９２６）などが例示できる。
【００９４】
また、Ｌ‐アミノ酸生産能の付与又は増強は、Ｌ‐アミノ酸の生合成に関与する酵素活性を増強することによっても行うことが出来る。Ｌ‐アミノ酸の生合成に関与する酵素活性の増強は、例えば、該酵素をコードする遺伝子の発現を増強させることで達成できる。
【００９５】
また、微生物は、培地中に添加された各基質を取り込む能力が向上するよう改変されていてもよい。また微生物は、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを菌体外に排出する能力が向上するよう改変されていてもよい。
【００９６】
なお、グルタチオン合成酵素および／またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素の活性の増強、基質を生産する能力の付与または増強、その他の任意の改変等の微生物の改変は、どのような順番で行われてもよい。
【００９７】
微生物を培養する際の培養条件は、微生物が増殖できる限り特に制限されず、微生物の培養に通常用いられる条件を、必要により適宜修正して用いることができる。例えば、培地としては炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の成分を含有する通常の培地を用いることができる。培養は、例えば、２５℃〜３７℃で、ｐＨを５〜８に制御し、好気的条件下で５〜２００時間行うことができる。なお、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
【００９８】
微生物の培養に際して、培地に各基質を添加する。各基質は、培養開始時から培地に含まれていてもよく、培養途中の任意の時点で培地に添加されてもよい。添加のタイミングは、培養時間等の条件に応じて適宜変更できるが、一例としては、培養終了時の好ましくは０〜５０時間前、より好ましくは０．１〜２４時間前、特に好ましくは０．５〜６時間前に添加することができる。各基質は、１回または複数回添加されてもよく、連続的に添加されてもよい。
【００９９】
培地に添加される基質の種類は、微生物が有する基質を生産する能力に応じて適宜変更することができる。例えば、微生物がいずれの基質を生産する能力も有しない場合には、全ての基質が培地に添加される。「全ての基質」とは、発酵法の態様に応じて、「Ｇｌｕ、Ｘ、およびＹ」または「γ‐Ｇｌｕ‐ＸおよびＹ」をいう。また、微生物が１以上の基質を生産する能力を有する場合には、当該１以上の基質は培地に添加されなくてもよく、添加されていてもよい。また、微生物が全ての基質を生産する能力を有する場合には、いずれの基質も培地に添加されなくてもよく、添加されていてもよい。すなわち、発酵法においては、いずれの基質を生産する能力も有しない微生物、あるいは、１またはそれ以上の基質を生産する能力を有する微生物を、少なくとも当該微生物により生産される基質以外の全ての基質が添加された培地で培養することで、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを生産できる。また、発酵法においては、いずれの基質も添加されていない培地、あるいは、１またはそれ以上の基質が添加された培地で、少なくとも当該培地に添加された基質以外の全ての基質を生産する能力を有する微生物を培養することで、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを生産できる。
【０１００】
各基質の濃度は特に限定されないが、例えば、初期濃度として１μＭ以上であるのが好ましく、１００μＭ以上であるのがより好ましく、１ｍＭ以上であるのが特に好ましい。また、濃度の上限は特に限定されないが、例えば、通常２Ｍ以下であり、１Ｍ以下であるのが好ましい。また、例えば培養途中で各基質を培地へ添加する場合には、添加の態様等に応じて各基質の濃度を適宜変更すればよい。また、例えば収率の観点から、培地中の各基質の濃度をそろえる方が好ましい場合がある。
【０１０１】
各基質を含む培地での培養に先立って、前培養を行ってもよい。前培養に用いる培地は、各基質を含んでいてもよく、含んでいなくもよい。
【０１０２】
発酵法においてペプチドの生成に用いられるＡＴＰは、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを生成する微生物においてエネルギー代謝で生成するＡＴＰであってもよい。また、ＡＴＰ再生系が強化された微生物をγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを生成する微生物と共存させることにより、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの生産効率を向上させることも可能である（共培養系）。共培養系としては、例えば、通常のエネルギー代謝によるＡＴＰ再生系が強化された微生物やポリリン酸キナーゼの作用でＡＴＰを再生する能力を有する微生物を培養液中に共存させる方法（特公平７‐１６４３１、特公平６‐６９３８６）が利用できる。
【実施例】
【０１０３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。
【０１０４】
実施例１：サッカロマイセス・セレビシエ由来グルタチオン合成酵素遺伝子（ＧＳＨ２）発現プラスミドｐＥＴ‐ＧＳＨ２の構築
サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２６１０８）のグルタチオン合成酵素をコードするＧＳＨ２遺伝子の発現プラスミドｐＥＴ‐ＧＳＨ２を以下の手順で構築し、エシェリヒア・コリに導入した。なお、構築手順の概要を図１に示す。
【０１０５】
（１‐１）酵母用発現プラスミドｐＡＵＲ‐ＧＳＨ２の構築
まず、酵母用発現プラスミドｐＡＵＲ‐ＧＳＨ２を、タカラバイオに委託し、以下の手順で構築した。
【０１０６】
サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株のＧＳＨ２遺伝子の塩基配列（配列番号１）を基に作製したプライマーＡ（配列番号３）およびプライマーＢ（配列番号４）、ならびに鋳型としてサッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株の染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ＧＳＨ２遺伝子を含む配列の増幅を行った。プライマーＡは、サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株の染色体ＤＮＡのＧＳＨ２遺伝子の開始コドンを含む領域の５’末端にＫｐｎＩ認識配列および酵母発現プラスミドｐＡＵＲ１２３の部分配列を付加したものである。プライマーＢは、ＧＳＨ２遺伝子のＣ末端塩基配列と相補的な塩基配列に、Ｈｉｓタグをコードする配列と相補的な塩基配列、終止コドン（ＴＡＡ）と相補的な塩基配列、ＸｂａＩ認識配列、および酵母発現プラスミドｐＡＵＲ１２３の部分配列を付加したものである。ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、マニュアルに従って行った。増幅された断片をＩｎ‐Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて酵母用発現プラスミドｐＡＵＲ１２３（タカラバイオ社製）のＫｐｎＩ‐ＸｂａＩサイトに導入し、酵母用発現プラスミドｐＡＵＲ‐ＧＳＨ２を取得した。
【０１０７】
（１‐２）エシェリヒア・コリ用発現プラスミドｐＥＴ‐ＧＳＨ２の構築
続いて、エシェリヒア・コリ用発現プラスミドｐＥＴ‐ＧＳＨ２を以下の手順で構築した。
【０１０８】
日本バイオサービス社より、サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株のＧＳＨ２遺伝子の塩基配列（配列番号１）を基に作製したプライマーＣ（配列番号５）およびプライマーＤ（配列番号６）を購入した。プライマーＣは、サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株の染色体ＤＮＡのＧＳＨ２遺伝子の開始コドンを含む領域の５’末端にＮｄｅＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーＤは、上記のｐＡＵＲ‐ＧＳＨ２のＧＳＨ２遺伝子の終止コドンの外側の塩基配列と相補的な塩基配列の５’末端にＸｈｏＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。
【０１０９】
プライマーＣおよびプライマーＤ、ならびに鋳型として上記のｐＡＵＲ‐ＧＳＨ２を用いたＰＣＲにより、ＧＳＨ２遺伝子を含む配列の増幅を行った。ＰＣＲは、プラスミドＤＮＡ、０．２μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、１．２５ｕｎｉｔのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、１０μＬの５ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ緩衝液（タカラバイオ社製）、各２．５ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）を含む反応液５０μｌを調製し、９８℃で１０秒加温した後、９８℃で１０秒間、５６℃で５秒間、７２℃で２分間の工程を３０回繰り返し、さらに７２℃で１分間加温することにより行った。
【０１１０】
ＰＣＲ後の反応液３μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、ＧＳＨ２遺伝子断片に相当する約１．５ｋｂのＤＮＡ断片が増幅していることを確認した後、残りの反応液からＥｔｈａｃｈｉｎｍａｔｅ（ニッポンジーン社製）を用いて該ＤＮＡ断片を精製し、２５μｌのｄＨ2Ｏに溶解した。次に、得られたＤＮＡ溶液全量を用い、該ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断した後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、１５μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＥＢ（キアゲン社製）に溶解した。
【０１１１】
１μｇの発現プラスミドｐＥＴ‐２１ａ（＋）（ノバジェン社製）を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔを用いて精製し、１５μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＥＢに溶解した。次に、得られたＤＮＡ溶液全量を用い、ＤＮＡ断片をＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）（ＣＩＡＰ）で脱リン酸化した後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔを用いて精製し、１０μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＥＢに溶解した。
【０１１２】
上記で得られたＧＳＨ２遺伝子を含む約１．５ｋｂのＤＮＡ断片および上記で得られた発現プラスミドｐＥＴ‐２１ａ（＋）の約５．４ｋｂのＤＮＡ断片を、ＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社製）を用いて、１６℃で３０分間反応させ連結した。該反応液を用いてエシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（タカラバイオ社製）を、ヒートショック法により形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ［１０ｇ／Ｌバクトトリプトン（ディフコ社製）、５ｇ／Ｌイーストエキス（ディフコ社製）、５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム（Ｗａｋｏ社製）］寒天培地に塗布した後、３７℃で一晩培養した。
【０１１３】
生育してきた形質転換体のコロニーより、公知の方法によりプラスミドを抽出し、その塩基配列を公知の方法により決定した。得られたプラスミドは、３’末端にＨｉｓタグをコードする配列が付加されたサッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株由来ＧＳＨ２遺伝子が、Ｔ７プロモーター下流に連結されたプラスミドであり、該プラスミドをｐＥＴ‐
ＧＳＨ２と命名した。なお、サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株由来ＧＳＨ２遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１および配列番号２に示す。
【０１１４】
続いて、ｐＥＴ‐ＧＳＨ２を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株コンピテントセル（ノバジェン社製）を、ヒートショック法により形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後、３７℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、ｐＥＴ‐ＧＳＨ２が保持されていることを確認した。このｐＥＴ‐ＧＳＨ２を保持するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ‐ＧＳＨ２と命名した。
【０１１５】
実施例２：Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加組換え型Ｇｓｈ２の精製
実施例１で得られたエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ‐ＧＳＨ２を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し３７℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液のうち２ｍｌを１００ｍｌのＬＢ培地が入った試験管に接種した。３７℃で２時間振とう培養後、終濃度が０．５ｍｍｏｌ／Ｌになるようにイソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、さらに３０℃で４時間培養した。培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。
【０１１６】
該湿菌体を、３００ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ８．０の１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス‐塩酸バッファー１０ｍｌに懸濁し超音波処理により破砕した後、遠心分離して得られる上清から、Ｈｉｓタグ付加タンパク質精製キットであるＮｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６
Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用い、マニュアルに従いＨｉｓタグ付加組換え型Ｇｓｈ２を精製し、続いて、ＰＤ‐１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、マニュアルに従い脱塩を行った。この精製および脱塩されたＧｓｈ２を、精製Ｇｓｈ２として以降の実験に用いた。
【０１１７】
実施例３：精製Ｇｓｈ２を用いたγ‐グルタミルトリペプチドの生成
実施例２で取得したサッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株由来の精製Ｇｓｈ２を用い、γ‐グルタミルバリン（γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ）あるいはγ‐グルタミルノルバリン（γ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ）を基質とするγ‐グルタミルトリペプチドの生成を検討した。下記組成の反応液（ｐＨ８．０）２００μｌをそれぞれ調製し、３７℃で１６時間反応を行った。
〔反応液組成〕
精製Ｇｓｈ２                                      １２．４μｇ／２００μｌ
Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）                  １００    ｍｍｏｌ／Ｌ
γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌまたはγ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ      １２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
グリシン                                          １２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）                      １２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸マグネシウム                                  １２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）                        ２    ｍｍｏｌ／Ｌ
【０１１８】
反応終了後、反応生成物をＨＰＬＣにより分析した。分析条件は、下記の通りである。（１）ＨＰＬＣ：ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｌ‐２０００シリーズ
（２）分離カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ  ４μ  Ｈｙｄｒｏ‐ＲＰ  ８０Ａ、内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ、粒子径４μｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）
（３）カラム温度：４０℃
（４）移動相Ａ：５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ２．５）
（５）移動相Ｂ：アセトニトリル
（６）流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
（７）溶出条件：溶出は、移動相Ａおよび移動相Ｂの混合液を用いて行った。混合液に対する移動相Ｂの比率は以下の通りである。０分（０％）、０分〜５分（０％〜２．５％）、５分〜１５分（２．５％）、１５分〜３０分（２．５％〜４０％）、３０分〜３０．１分（４０％〜０％）、３０．１分〜５０分（０％）。
（８）検出：ＵＶ２１０ｎｍ
【０１１９】
上記測定の結果、それぞれの反応生成物のピークは、γ‐グルタミルバリルグリシン（γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ‐Ｇｌｙ）およびγ‐グルタミルノルバリルグリシン（γ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ‐Ｇｌｙ）の標品のピークと保持時間が一致し、γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ‐Ｇｌｙおよびγ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ‐Ｇｌｙであると判断した。定量の結果、γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ‐Ｇｌｙ濃度は０．１３ｍｍｏｌ／Ｌ、γ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ‐Ｇｌｙ濃度は６．０ｍｍｏｌ／Ｌであった。
【０１２０】
さらに、標品のγ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ‐Ｇｌｙのピークと保持時間が一致した画分をＨＰＬＣで分取し、質量分析装置を用いてγ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ‐Ｇｌｙであることを確認した。具体的には、分取したペプチドを６‐アミノキノリル‐Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＱＣ）を用いて蛍光誘導体化し、ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳにより検出することより行った。手順は以下の通りである。
【０１２１】
適当な濃度に希釈した分取画分溶液２．５μｌ、または１μＭのγ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ‐Ｇｌｙを含む標準液２．５μｌに、ＭｉｌｌｉＱ水２．５μｌ、５μＭ内部標準物質溶液（Ｌ‐ａｌａｎｉｎｅ‐３，３，３‐ｄ３、シグマ社（Ａｌａ‐Ｄ３）、安定同位体で標識されている。）５μｌ、および硼酸緩衝液（日本ウォーターズ社製ＡｃｃＱ‐Ｆｌｏｕｒ（登録商標）試薬キット付属品）３０μｌを添加した。この混合物に、ＡＱＣ試薬溶液（上記試薬キットの試薬粉末をアセトニトリル１ｍｌ中に溶解することにより調製）１０μｌを添加した。得られた混合物を１０分間、５５℃で加熱後、０．１％のギ酸水溶液１００μｌを加え、分析サンプルとした。
【０１２２】
次に、分析サンプルを、逆相液体クロマトグラフィーにより分離させた。分離条件は下記の通りである。
（１）ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズ
（２）分離カラム：Ｕｎｉｓｏｎ  ＵＫ‐Ｐｈｅｎｙｌ、内径２．０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒子径３μｍ（Ｉｍｔａｋｔ社製）
（３）カラム温度：４０℃
（４）移動相Ａ：２５ｍＭギ酸水溶液をアンモニア水でｐＨ６．０に調整した水溶液
（５）移動相Ｂ：メタノール
（６）流速：０．２５ｍｌ／ｍｉｎ
（７）溶出条件：溶出は、移動相Ａおよび移動相Ｂの混合液を用いて行った。混合液に対する移動相Ｂの比率は以下の通りである。０分（５％）、０分〜１７分（５％〜４０％）、１７分〜１７．１分（４０％〜８０％）、１７．１分〜１９分（８０％）、１９分〜１９．１分（８０％〜５％）、１９．１分〜２７分（５％）。
【０１２３】
その後、上記分離条件によって溶出されたγ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ‐Ｇｌｙの誘導体化物を質量分析計に導入してマスクロマトグラムを取得した。分析条件は下記の通りである。（１）質量分析装置：ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ３２００  ＱＴＲＡＰ
（２）検出モード：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ポジティブイオンモード）
（３）選択イオン：表１
【０１２４】
【表１】
0005978579.tif 000002
【０１２５】
得られた結果を解析ソフトＡｎａｌｙｓｔ  ｖｅｒ１．４．２（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ社製）を用いて解析し、標品のγ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ‐Ｇｌｙのピークと保持時間が一致したピークが、γ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ‐Ｇｌｙのピークであることを確認した。
【０１２６】
実施例４：大腸菌由来グルタチオン合成酵素遺伝子（ｇｓｈＢ）発現プラスミドｐＥＴ‐ｇｓｈＢの構築
エシェリヒア・コリＫ‐１２  Ｗ３１１０株のグルタチオン合成酵素をコードするｇｓｈＢ遺伝子の発現プラスミドｐＥＴ‐ｇｓｈＢを以下の手順で構築した。なお、構築手順の概要を図２に示す。
【０１２７】
日本バイオサービス社より、エシェリヒア・コリＫ‐１２  Ｗ３１１０株のｇｓｈＢ遺伝子の塩基配列（配列番号７）を基に作製したプライマーＥ（配列番号９）およびプライマーＦ（配列番号１０）を購入した。プライマーＥは、エシェリヒア・コリＫ‐１２  Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡのｇｓｈＢ遺伝子の開始コドンを含む領域の５’末端にＮｄｅＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーＦは、ｇｓｈＢ遺伝子のＣ末端塩基配列と相補的な塩基配列の５’末端にＸｈｏＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。
【０１２８】
プライマーＥおよびプライマーＦ、ならびに鋳型としてエシェリヒア・コリＫ‐１２  Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ｇｓｈＢ遺伝子を含む配列の増幅を行った。ＰＣＲは、染色体ＤＮＡ、０．２μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、１．２５ｕｎｉｔのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、１０μＬの５ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ緩衝液（タカラバイオ社製）、各２．５ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）を含む反応液５０μｌを調製し、９８℃で１０秒加温した後、９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、７２℃で１．６分間の工程を３０回繰り返し、さらに７２℃で１分間加温することにより行った。
【０１２９】
ＰＣＲ後の反応液の５μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、ｇｓｈＢ遺伝子断片に相当する約１．０ｋｂのＤＮＡ断片が増幅していることを確認した後、残りの反応液からＥｔｈａｃｈｉｎｍａｔｅ（ニッポンジーン社製）を用いて該ＤＮＡ断片を精製し、３０μｌのｄＨ2Ｏに溶解した。次に、得られたＤＮＡ溶液全量を用い、該ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断した後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔを用いて精製し、１５μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＥＢに溶解した。
【０１３０】
上記で得られたｇｓｈＢ遺伝子を含む約１．０ｋｂのＤＮＡ断片および実施例１（１‐２）と同様に調製した発現プラスミドｐＥＴ‐２１ａ（＋）の約５．４ｋｂのＤＮＡ断片を、ＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社製）を用いて、１６℃で３０分間反応させ連結した。該反応液を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株コンピテントセル（ノバジェン社製）を、ヒートショック法により形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ［１０ｇ／Ｌバクトトリプトン（ディフコ社製）、５ｇ／Ｌイーストエキス（ディフコ社製）、５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム（Ｗａｋｏ社製）］寒天培地に塗布した後、３７℃で一晩培養した。
【０１３１】
生育してきた形質転換体のコロニーより、公知の方法によりプラスミドを抽出し、その塩基配列を公知の方法により決定した。得られたプラスミドは、３’末端にＨｉｓタグをコードする配列が付加されたエシェリヒア・コリＫ‐１２  Ｗ３１１０株由来ｇｓｈＢ遺伝子が、Ｔ７プロモーター下流に連結されたプラスミドであり、該プラスミドをｐＥＴ‐ｇｓｈＢと命名した。また、このｐＥＴ‐ｇｓｈＢを保持するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ‐ｇｓｈＢと命名した。なお、エシェリヒア・コリＫ‐１２  Ｗ３１１０株由来ｇｓｈＢ遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７および配列番号８に示す。
【０１３２】
実施例５：Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加組換え型ＧｓｈＢの精製
実施例４で得られたエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ‐ｇｓｈＢを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し３７℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液のうち１ｍｌを５０ｍｌのＬＢ培地が入った試験管に接種した。３７℃で２時間振とう培養後、終濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌになるようにイソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、さらに３７℃で３時間培養した。培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。
【０１３３】
該湿菌体を２ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（ノバジェン社製）に懸濁し室温で２０分間緩やかに振とう後、遠心分離して得られる上清から、Ｈｉｓタグ付加タンパク質精製キットであるＮｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用い、マニュアルに従いＨｉｓタグ付加組換え型酵素を精製し、続いて、ＰＤ‐１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、マニュアルに従い脱塩を行った。この精製および脱塩されたＧｓｈＢを、精製ＧｓｈＢとして以降の実験に用いた。
【０１３４】
実施例６：精製ＧｓｈＢを用いたγ‐グルタミルトリペプチドの生成
実施例５で取得したエシェリヒア・コリＫ‐１２  Ｗ３１１０株由来の精製ＧｓｈＢを用い、γ‐グルタミルバリン（γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ）あるいはγ‐グルタミルノルバリン（γ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ）を基質とするγ‐グルタミルトリペプチドの生成を検討した。下記組成の反応液（ｐＨ８．０）２００μｌをそれぞれ調製し、３７℃で１６時間反応を行った。
〔反応液組成〕
精製ＧｓｈＢ                                      ４３．６μｇ／２００μｌ
Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）                  １００    ｍｍｏｌ／Ｌ
γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌまたはγ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ      １２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
グリシン                                          １２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）                      １２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸マグネシウム                                  １２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）                        ２    ｍｍｏｌ／Ｌ
【０１３５】
反応終了後、実施例３と同条件のＨＰＬＣにより反応生成物の同定および定量を行ったところ、２．６ｍｍｏｌ／Ｌのγ‐グルタミルバリルグリシン（γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ‐Ｇｌｙ）、１０．９ｍｍｏｌ／Ｌのγ‐グルタミルノルバリルグリシン（γ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ‐Ｇｌｙ）の生成が確認された。
【０１３６】
なお、標品のγ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ‐Ｇｌｙのピークと保持時間が一致した画分についてはＨＰＬＣで分取し、質量分析装置を用いてγ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ‐Ｇｌｙであることを確認した。具体的な分析手順は、実施例３においてγ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ‐Ｇｌｙを分析した際の手順と同様である。γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ‐Ｇｌｙ測定の際の、第１および第２のマ
スアナライザーでの選択イオンは、表１に記載のγ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ‐Ｇｌｙの選択イオンに準ずる。
【０１３７】
実施例７：カンジダ・ユチリス由来γ‐グルタミルシステイン合成酵素遺伝子（ＧＳＨ１）発現プラスミドｐＥＴ‐ＧＳＨ１の構築
カンジダ・ユチリスＡＴＣＣ２２０２３株のγ‐グルタミルシステイン合成酵素をコードするＧＳＨ１遺伝子の発現プラスミドｐＥＴ‐ＧＳＨ１を以下の手順で構築し、エシェリヒア・コリに導入した。なお、構築手順の概要を図３に示す。
【０１３８】
（７‐１）酵母用発現プラスミドｐＡＵＲ‐ＧＳＨ１の構築
まず、酵母用発現プラスミドｐＡＵＲ‐ＧＳＨ１を、タカラバイオに委託し、以下の手順で構築した。
【０１３９】
カンジダ・ユチリスＡＴＣＣ２２０２３株のＧＳＨ１遺伝子の塩基配列（配列番号１１）を基に作製したプライマーＧ（配列番号１３）およびプライマーＨ（配列番号１４）、ならびに鋳型としてカンジダ・ユチリスＡＴＣＣ２２０２３株の染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ＧＳＨ１遺伝子を含む配列の増幅を行った。プライマーＧは、カンジダ・ユチリスＡＴＣＣ２２０２３株の染色体ＤＮＡのＧＳＨ１遺伝子の開始コドンを含む領域の５’末端にＫｐｎＩ認識配列および酵母発現プラスミドｐＡＵＲ１２３の部分配列を付加したものである。プライマーＨは、ＧＳＨ１遺伝子のＣ末端塩基配列と相補的な塩基配列に、Ｈｉｓタグをコードする配列と相補的な塩基配列、終止コドン（ＴＡＡ）と相補的な塩基配列、ＸｂａＩ認識配列、および酵母発現プラスミドｐＡＵＲ１２３の部分配列を付加したものである。ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、マニュアルに従って行った。増幅された断片をＩｎ‐Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて酵母用発現プラスミドｐＡＵＲ１２３（タカラバイオ社製）のＫｐｎＩ‐ＸｂａＩサイトに導入し、酵母用発現プラスミドｐＡＵＲ‐ＧＳＨ１を取得した。
【０１４０】
（７‐２）エシェリヒア・コリ用発現プラスミドｐＥＴ‐ＧＳＨ１の構築
続いて、エシェリヒア・コリ用発現プラスミドｐＥＴ‐ＧＳＨ１を以下の手順で構築した。
【０１４１】
日本バイオサービス社より、カンジダ・ユチリスＡＴＣＣ２２０２３株のＧＳＨ１遺伝子の塩基配列（配列番号１１）を基に作製したプライマーＩ（配列番号１５）およびプライマーＪ（配列番号１６）を購入した。プライマーＩは、カンジダ・ユチリスＡＴＣＣ２２０２３株の染色体ＤＮＡのＧＳＨ１遺伝子の開始コドンを含む領域の５’末端にＮｈｅＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーＪは、上記のｐＡＵＲ‐ＧＳＨ１のＧＳＨ１遺伝子の終止コドンの外側の塩基配列と相補的な塩基配列の５’末端にＸｈｏＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。
【０１４２】
プライマーＩおよびプライマーＪ、ならびに鋳型として上記のｐＡＵＲ‐ＧＳＨ１を用いたＰＣＲにより、ＧＳＨ１遺伝子を含む配列の増幅を行った。ＰＣＲは、プラスミドＤＮＡ、０．２μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、１．２５ｕｎｉｔのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、１０μＬの５ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ緩衝液（タカラバイオ社製）、各２．５ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）を含む反応液５０μｌを調製し、９８℃で１０秒加温した後、９８℃で１０秒間、５６℃で５秒間、７２℃で２分間の工程を３０回繰り返し、さらに７２℃で１分間加温することにより行った。
【０１４３】
ＰＣＲ後の反応液３μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、ＧＳＨ１遺伝子断片に相当
する約２．０ｋｂのＤＮＡ断片が増幅していることを確認した後、残りの反応液からＥｔｈａｃｈｉｎｍａｔｅ（ニッポンジーン社製）を用いて該ＤＮＡ断片を精製し、２５μｌのｄＨ2Ｏに溶解した。次に、得られたＤＮＡ溶液全量を用い、該ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで切断した後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔを用いて精製し、１５μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＥＢに溶解した。
【０１４４】
上記で得られたＧＳＨ１遺伝子を含む約２．０ｋｂのＤＮＡ断片および実施例１（１‐２）と同様に調製した発現プラスミドｐＥＴ‐２１ａ（＋）の約５．４ｋｂのＤＮＡ断片を、ＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社製）を用いて、１６℃で３０分間反応させ連結した。該反応液を用いてエシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（タカラバイオ社製）を、ヒートショック法により形質転換し、該形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ［１０ｇ／Ｌバクトトリプトン（ディフコ社製）、５ｇ／Ｌイーストエキス（ディフコ社製）、５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム（Ｗａｋｏ社製）］寒天培地に塗布した後、３７℃で一晩培養した。
【０１４５】
生育してきた形質転換体のコロニーより、公知の方法によりプラスミドを抽出し、その塩基配列を公知の方法により決定した。得られたプラスミドは、３’末端にＨｉｓタグをコードする配列が付加されたカンジダ・ユチリスＡＴＣＣ２２０２３株由来ＧＳＨ１遺伝子が、Ｔ７プロモーター下流に連結されたプラスミドであり、該プラスミドをｐＥＴ‐ＧＳＨ１と命名した。なお、カンジダ・ユチリスＡＴＣＣ２２０２３株由来ＧＳＨ１遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１１および配列番号１２に示す。
【０１４６】
続いて、ｐＥＴ‐ＧＳＨ１を用いてエシェリヒア・コリＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株コンピテントセル（ノバジェン社製）を、ヒートショック法により形質転換し、該形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗布した後、３７℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、ｐＥＴ‐ＧＳＨ１が保持されていることを確認した。このｐＥＴ‐ＧＳＨ１を保持するエシェリヒア・コリＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を、エシェリヒア・コリＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＥＴ‐ＧＳＨ１と命名した。
【０１４７】
実施例８：Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加組換え型Ｇｓｈ１の精製
実施例７で得られたエシェリヒア・コリＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＥＴ‐ＧＳＨ１を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む３ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し３７℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液のうち２ｍｌを１００ｍｌのＬＢ培地が入った坂口フラスコに接種した。３７℃で２時間振とう培養後、終濃度が０．５ｍｍｏｌ／Ｌになるようにイソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、さらに３０℃で４時間培養した。培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。
【０１４８】
該湿菌体を、３００ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ８．０の１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス‐塩酸バッファー１０ｍｌに懸濁し超音波処理により破砕した後、遠心分離して得られる上清から、Ｈｉｓタグ付加タンパク精製キットであるＮｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用い、マニュアルに従いＨｉｓタグ付加組換え型Ｇｓｈ１を精製し、続いて、ＰＤ‐１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、マニュアルに従い脱塩を行った。この精製および脱塩されたＧｓｈ１を、精製Ｇｓｈ１として以降の実験に用いた。
【０１４９】
実施例９：精製Ｇｓｈ１を用いたγ‐グルタミルジペプチドの生成
実施例８で取得したカンジダ・ユチリスＡＴＣＣ２２０２３株由来の精製Ｇｓｈ１を用い、ノルバリンを基質とするγ‐グルタミルジペプチドの生成を検討した。下記組成の反応液（ｐＨ８．０）２００μｌを調製し、３７℃で１６時間反応を行った。
〔反応液組成〕
精製Ｇｓｈ１                                      ２４．６μｇ／２００μｌ
Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）                  １００    ｍｍｏｌ／Ｌ
ノルバリン                                        １２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
グルタミン酸                                      １２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）                      １２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸マグネシウム                                  １２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）                        ２    ｍｍｏｌ／Ｌ
【０１５０】
反応終了後、実施例３と同条件のＨＰＬＣにより反応生成物の同定および定量を行ったところ、３．８ｍｍｏｌ／Ｌのγ‐グルタミルノルバリン（γ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ）の生成が確認された。
【０１５１】
実施例１０：大腸菌由来γ‐グルタミルシステイン合成酵素遺伝子（ｇｓｈＡ）発現プラスミドｐＱＥ‐ｇｓｈＡの構築
エシェリヒア・コリＫ‐１２  Ｗ３１１０株のγ‐グルタミルシステイン合成酵素をコードするｇｓｈＡ遺伝子の発現プラスミドｐＱＥ‐ｇｓｈＡを以下の手順で構築した。なお、構築手順の概要を図４に示す。
【０１５２】
日本バイオサービス社より、エシェリヒア・コリＫ‐１２  Ｗ３１１０株のｇｓｈＡ遺伝子の塩基配列（配列番号１７）を基に作製したプライマーＫ（配列番号１９）およびプライマーＬ（配列番号２０）を購入した。プライマーＫは、エシェリヒア・コリＫ‐１２
Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡのｇｓｈＡ遺伝子の開始コドンを含む領域の５’末端にＮｃｏＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーＬは、ｇｓｈＡ遺伝子のＣ末端塩基配列と相補的な塩基配列の５’末端にＸｈｏＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。
【０１５３】
プライマーＫおよびプライマーＬ、ならびに鋳型としてエシェリヒア・コリＫ‐１２  Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲによりｇｓｈＡ遺伝子を含む配列の増幅を行った。ＰＣＲは、染色体ＤＮＡ、０．２μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、１．２５ｕｎｉｔのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、１０μＬの５ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ緩衝液（タカラバイオ社製）、各２．５ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）を含む反応液５０μｌを調製し、９８℃で１０秒加温した後、９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、７２℃で１．６分間の工程を３０回繰り返し、さらに７２℃で１分間加温することにより行った。
【０１５４】
ＰＣＲ後の反応液の５μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、ｇｓｈＡ遺伝子断片に相当する約１．６ｋｂのＤＮＡ断片が増幅していることを確認した後、残りの反応液からＥｔａｃｈｉｎｍａｔｅ（ニッポンジーン社製）を用いて該ＤＮＡ断片を精製し、３０μｌのｄＨ2Ｏに溶解した。次に、得られたＤＮＡ溶液全量を用い、該ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで切断した後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔを用いて該ＤＮＡ断片を精製し、１５μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＥＢに溶解した。
【０１５５】
１μｇの発現ベクターｐＱＥ‐ＴｒｉＳｙｓｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで切断後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ
Ｋｉｔを用いて精製し、１５μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＥＢ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に溶解した。
【０１５６】
上記で得られたｇｓｈＡ遺伝子を含む約１．６ｋｂのＤＮＡ断片および上記で得られた発現プラスミドｐＱＥ‐ＴｒｉＳｙｓｔｅｍの約５．８ｋｂのＤＮＡ断片を、ＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社製）を用いて、１６℃で３０分間反応させ連結した。該反応液を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株コンピテントセル（ノバジェン社製）を、ヒートショック法により形質転換し、該形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ［１０ｇ／Ｌバクトトリプトン（ディフコ社製）、５ｇ／Ｌイーストエキス（ディフコ社製）、５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム（Ｗａｋｏ社製）］寒天培地に塗布した後、３０℃で一晩培養した。
【０１５７】
生育してきた形質転換体のコロニーより、公知の方法によりプラスミドを抽出し、その塩基配列を公知の方法により決定した。得られたプラスミドは、３’末端にＨｉｓタグをコードする配列が付加されたエシェリヒア・コリＫ‐１２  Ｗ３１１０株由来ｇｓｈＡ遺伝子が、Ｔ７プロモーター下流に連結されたプラスミドであり、該プラスミドをｐＱＥ‐ｇｓｈＡと命名した。また、このｐＱＥ‐ｇｓｈＡを保持するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＱＥ‐ｇｓｈＡと命名した。なお、エシェリヒア・コリＫ‐１２  Ｗ３１１０株由来ｇｓｈＡ遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１７および配列番号１８に示す。
【０１５８】
実施例１１：Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加組換え型ＧｓｈＡの精製
実施例１０で得られたエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＱＥ‐ｇｓｈＡを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し３０℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液のうち１ｍｌを５０ｍｌのＬＢ培地が入った坂口フラスコに接種した。３０℃で５時間振とう培養後、終濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌになるようにイソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、さらに３０℃で１６時間培養した。培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。
【０１５９】
該湿菌体を２ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（ノバジェン社製）に懸濁し室温で２０分間緩やかに振とう後、遠心分離して得られる上清から、Ｈｉｓタグ付加タンパク質精製キットであるＮｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用い、マニュアルに従いＨｉｓタグ付加組換え型酵素を精製し、続いて、ＰＤ‐１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、マニュアルに従い脱塩を行った。この精製および脱塩されたＧｓｈＡを、精製ＧｓｈＡとして以降の実験に用いた。
【０１６０】
実施例１２：精製ＧｓｈＡを用いたγ‐グルタミルジペプチドの生成
実施例１１で取得したエシェリヒア・コリＫ‐１２  Ｗ３１１０株由来の精製ＧｓｈＡを用い、バリンあるいはノルバリンを基質とするγ‐グルタミルジペプチドの生成を検討した。下記組成の反応液（ｐＨ８．０）２００μｌをそれぞれ調製し、３７℃で１６時間反応を行った。
〔反応液組成〕
精製ＧｓｈＡ                                      ３８．６μｇ／２００μｌ
Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）                  １００    ｍｍｏｌ／Ｌ
バリンあるいはノルバリン                          １２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
グルタミン酸                                      １２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）                      １２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸マグネシウム                                  １２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）                        ２    ｍｍｏｌ／Ｌ
【０１６１】
反応終了後、実施例３と同条件のＨＰＬＣにより反応生成物の同定および定量を行ったところ、１．１ｍｍｏｌ／Ｌのγ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ、５．６ｍｍｏｌ／Ｌのγ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌの生成が確認された。
【０１６２】
実施例１３：精製ＧｓｈＡおよび精製ＧｓｈＢを用いたアミノ酸からのトリペプチドの生成
実施例１１で取得したエシェリヒア・コリＫ‐１２  Ｗ３１１０株由来の精製ＧｓｈＡおよび実施例５で取得したエシェリヒア・コリＫ‐１２  Ｗ３１１０株由来の精製ＧｓｈＢを用い、γ‐グルタミルトリペプチドの生成を検討した。下記組成の反応液（ｐＨ８．０）２００μｌをそれぞれ調製し、３７℃で１６時間反応を行ったところ、０．０４８ｍｍｏｌ／Ｌのγ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ‐Ｇｌｙおよび１．２ｍｍｏｌ／Ｌのγ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ‐Ｇｌｙが生成した。
〔反応液組成〕
精製ＧｓｈＡ                                      １９．３μｇ／２００μｌ
精製ＧｓｈＢ                                      ２１．８μｇ／２００μｌ
Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）                  １００    ｍｍｏｌ／Ｌ
バリンあるいはノルバリン                          １２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
グルタミン酸                                      １２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
グリシン                                          １２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）                      １２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸マグネシウム                                  １２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）                        ２    ｍｍｏｌ／Ｌ
【０１６３】
実施例１４： サッカロマイセス・セレビシエ由来γ‐グルタミルシステイン合成酵素遺伝子（ＧＳＨ１）発現プラスミドｐＥＴ−ＳｃＧＳＨ１の構築
サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株のγ‐グルタミルシステイン合成酵素をコードするＧＳＨ１遺伝子（以下、同遺伝子をＳｃＧＳＨ１、同遺伝子にコードされるγ‐グルタミルシステイン合成酵素をＳｃＧｓｈ１ともいう）の発現プラスミドｐＥＴ−ＳｃＧＳＨ１を以下の手順で構築し、エシェリヒア・コリに導入した。なお、構築手順の概要を図５に示す。
【０１６４】
（１４−１）酵母用発現プラスミドｐＡＵＲ−ＳｃＧＳＨ１の構築
まず、酵母用発現プラスミドｐＡＵＲ−ＳｃＧＳＨ１を、タカラバイオに委託し、以下の手順で構築した。
【０１６５】
サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株のＧＳＨ１遺伝子の塩基配列（配列番号２１）を基に作製したプライマーＭ（配列番号２３）およびプライマーＮ（配列番号２４）、ならびに鋳型としてサッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株の染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲによりＧＳＨ１遺伝子を含む配列の増幅を行った。プライマーＭは、サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株の染色体ＤＮＡのＧＳＨ１遺伝子の開始コドンを含む領域の５’末端にＫｐｎＩ認識配列および酵母発現プラスミドｐＡＵＲ１２３の部分配列を付加したものである。プライマーＮは、ＧＳＨ１遺伝子のＣ末端塩基配列と相補的な塩基配列にＨｉｓタグをコードする配列と相補的な塩基配列、終止コドン（ＴＡＡ）に相補的な塩基配列、ＸｂａＩ認識配列、および酵母発現プラスミドｐＡＵＲ１２３の部分配列を付加したものである。ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  ポリメラーゼを用い、マニュアルに従って行った。
【０１６６】
増幅された断片をＩｎ‐Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｋｉｔを用いてマニュアルに基づき酵母用発現プラスミドｐＡＵＲ１２３のＫｐｎＩ‐ＸｂａＩサイトに
導入し、酵母用発現プラスミドｐＡＵＲ‐ＳｃＧＳＨ１を作成した。
【０１６７】
（１４−２）エシェリヒア・コリ用発現プラスミドｐＥＴ−ＳｃＧＳＨ１の構築
続いて、エシェリヒア・コリ用発現プラスミドｐＥＴ−ＳｃＧＳＨ１を以下の手順で構築した。
【０１６８】
日本バイオサービス社より、サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株のＧＳＨ１遺伝子の塩基配列（配列番号２１）を基に作製したプライマーＯ（配列番号２５）およびプライマーＰ（配列番号２６）を購入した。プライマーＯは、サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株の染色体ＤＮＡのＧＳＨ１遺伝子の開始コドンの次からを含む領域の５’末端にＳｐｅＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーＰは、上記のｐＡＵＲ‐ＳｃＧＳＨ１のＳｃＧＳＨ１遺伝子の終止コドンの外側の塩基配列と相補的な塩基配列の５’末端にＳａｌＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。
【０１６９】
プライマーＯおよびプライマーＰ、ならびに鋳型として上記のｐＡＵＲ−ＳｃＧＳＨ１を用いたＰＣＲにより、ＳｃＧＳＨ１遺伝子を含む配列の増幅を行った。ＰＣＲは、プラスミドＤＮＡ、０．２μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、１．２５ｕｎｉｔのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、１０μＬの５ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ緩衝液（タカラバイオ社製）、各２．５ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）を含む反応液５０μｌを調製し、９８℃で１０秒加温した後、９８℃で１０秒間、５６℃で５秒間、７２℃で２分間の工程を３０回繰り返し、さらに７２℃で１分間加温することにより行った。
【０１７０】
ＰＣＲ後の反応液の３μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、ＳｃＧＳＨ１遺伝子断片に相当する約２．０ｋｂのＤＮＡ断片が増幅していることを確認した後、残りの反応液からＥｔｈａｃｈｉｎｍａｔｅを用いて該ＤＮＡ断片を精製し、２５μｌのｄＨ2Ｏに溶解した。次に、得られたＤＮＡ溶液全量を用い、該ＤＮＡを制限酵素ＳｐｅＩおよびＳａｌＩで切断した後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔを用いて該ＤＮＡ断片を精製し、１５μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＥＢに溶解した。
【０１７１】
１μｇの発現プラスミドｐＥＴ−２１ａ（＋）を制限酵素ＮｈｅＩおよびＳａｌＩで切断後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔを用いて該ＤＮＡ断片を精製し、１５μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＥＢに溶解した。次に、得られたＤＮＡ溶液全量を用い、該ＤＮＡ断片をＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，Ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ（ＣＩＡＰ）で脱リン酸化した後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ
Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔを用いて精製し、１０μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＥＢに溶解した。
【０１７２】
上記で得られたＳｃＧＳＨ１遺伝子を含む約２．０ｋｂのＤＮＡ断片および上記で取得した発現ベクターｐＥＴ−２１ａ（＋）の約５．４ｋｂのＤＮＡ断片を、ＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１を用いて、１６℃で３０分間反応させ連結した。該反応液を用いてエシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（タカラバイオ社製）を、ヒートショック法により形質転換し、該形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後、３７℃で一晩培養した。
【０１７３】
生育してきた形質転換体のコロニーより、公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、その塩基配列を公知の方法により決定した。得られたプラスミドは、３’末端にＨｉｓタグ配列をコードする配列が付加されたサッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株由来ＧＳＨ１遺伝子が、Ｔ７プロモーター下流に連結されたプラスミドであり、ｐＥＴ−ＳｃＧＳＨ１と命名した。なお、サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株由来ＧＳＨ１遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２１および
配列番号２２に示す。
【０１７４】
続いて、ｐＥＴ−ＳｃＧＳＨ１を用いてエシェリヒア・コリＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株コンピテントセルを、ヒートショック法により形質転換し、該形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗布した後、３７℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、ｐＥＴ−ＳｃＧＳＨ１が保持されていることを確認した。このｐＥＴ−ＳｃＧＳＨ１を保持するエシェリヒア・コリＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を、エシェリヒア・コリＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＥＴ−ＳｃＧＳＨ１と命名した。
【０１７５】
実施例１５：Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加組換え型ＳｃＧｓｈ１の精製
実施例１４で得られたエシェリヒア・コリＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＥＴ−ＳｃＧＳＨ１を１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む３ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し３７℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液のうち２ｍｌを１００ｍｌのＬＢ培地が入った坂口フラスコに接種した。３７℃で２時間振とう培養後、終濃度が０．５ｍｍｏｌ／Ｌになるようにイソプロピル−β―Ｄ―チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、さらに３０℃で４時間培養した。培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。
【０１７６】
該湿菌体を、５ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に懸濁しタンパクを抽出した後、遠心分離して得られる上清から、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用い、説明書に従いＨｉｓタグ付加組換え型ＳｃＧｓｈ１を精製した。続いて、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、説明書に従い脱塩を行った。この精製および脱塩されたＳｃＧｓｈ１を、精製ＳｃＧｓｈ１として以降の実験に用いた。
【０１７７】
実施例１６：精製ＳｃＧｓｈ１を用いたγ‐グルタミルジペプチドの生成
実施例１５で取得したサッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株由来の精製ＳｃＧｓｈ１を用い、バリン、ノルバリン、あるいはα‐アミノ酪酸（Ａｂｕ）を基質とするγ‐グルタミルジペプチドの生成を検討した。下記組成の反応液（ｐＨ８．５）２００μｌをそれぞれ調製し、３０℃で２４時間反応を行った。
〔反応液組成〕
精製ＳｃＧｓｈ１                                ４０．５μｇ／２００μｌ
Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．５）                  ５０    ｍｍｏｌ／Ｌ
バリン、ノルバリン、またはα‐アミノ酪酸        １０    ｍｍｏｌ／Ｌ
グルタミン酸                                    １０    ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）                    １０    ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸マグネシウム                                １０    ｍｍｏｌ／Ｌ
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）                      ２    ｍｍｏｌ／Ｌ
グリセロール                                    ２０    ％（Ｖｏｌ．／Ｖｏｌ．）
【０１７８】
反応終了後、実施例３に記載の条件にて反応生成物をＨＰＬＣにより分析したところ、それぞれの反応生成物のピークはγ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ、γ‐Ｇｌｕ−ｎＶａｌ、およびγ‐Ｇｌｕ−Ａｂｕの標品のピークと保持時間が一致し、γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ、γ‐Ｇｌｕ−ｎＶａｌ、およびγ‐Ｇｌｕ−Ａｂｕであると判断した。定量の結果、γ‐Ｇｌｕ−Ｖａｌ濃度は０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、γ‐Ｇｌｕ−ｎＶａｌ濃度は４．７ｍｍｏｌ／Ｌ、γ‐Ｇｌｕ−Ａｂｕ濃度は８．２ｍｍｏｌ／Ｌであった。
【０１７９】
実施例１７：精製ＳｃＧｓｈ１および精製Ｇｓｈ２を用いたアミノ酸からのトリペプチド
の生成
実施例１５で取得したサッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株由来の精製ＳｃＧｓｈ１と実施例２で取得したサッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株由来の精製Ｇｓｈ２を用い、γ‐グルタミルトリペプチドの生成を検討した。下記組成の反応液（ｐＨ９．０）２００μｌを調製し、３０℃で８時間反応を行ったところ、０．１１ｍｍｏｌ／Ｌのγ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌおよび０．０８ｍｍｏｌ／Ｌのγ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ‐Ｇｌｙが生成した。
〔反応液組成〕
精製ＳｃＧｓｈ１                              １２７    μｇ／２００μｌ
精製Ｇｓｈ２                                      ７    μｇ／２００μｌ
Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ９．０）                  ５０    ｍｍｏｌ／Ｌ
バリン                                          １０    ｍｍｏｌ／Ｌ
グルタミン酸                                    １０    ｍｍｏｌ／Ｌ
グリシン                                        １０    ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）                    １０    ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸マグネシウム                                １０    ｍｍｏｌ／Ｌ
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）                      ２    ｍｍｏｌ／Ｌ
グリセロール                                    ２０    ％（Ｖｏｌ．／Ｖｏｌ．）
【産業上の利用可能性】
【０１８０】
本発明により、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙを製造することができる。
【０１８１】
配列表の説明
配列番号１：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧＳＨ２遺伝子の塩基配列
配列番号２：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧｓｈ２タンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧＳＨ２遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー（プライマーＡ）
配列番号４：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧＳＨ２遺伝子を増幅するためのリバースプライマー（プライマーＢ）
配列番号５：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧＳＨ２遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー（プライマーＣ）
配列番号６：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧＳＨ２遺伝子を増幅するためのリバースプライマー（プライマーＤ）
配列番号７：エシェリヒア・コリ由来のｇｓｈＢ遺伝子の塩基配列
配列番号８：エシェリヒア・コリ由来のＧｓｈＢタンパク質のアミノ酸配列
配列番号９：エシェリヒア・コリ由来のｇｓｈＢ遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー（プライマーＥ）
配列番号１０：エシェリヒア・コリ由来のｇｓｈＢ遺伝子を増幅するためのリバースプライマー（プライマーＦ）
配列番号１１：カンジダ・ユチリス由来のＧＳＨ１遺伝子の塩基配列
配列番号１２：カンジダ・ユチリス由来のＧｓｈ１タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１３：カンジダ・ユチリス由来のＧＳＨ１遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー（プライマーＧ）
配列番号１４：カンジダ・ユチリス由来のＧＳＨ１遺伝子を増幅するためのリバースプライマー（プライマーＨ）
配列番号１５：カンジダ・ユチリス由来のＧＳＨ１遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー（プライマーＩ）
配列番号１６：カンジダ・ユチリス由来のＧＳＨ１遺伝子を増幅するためのリバースプライマー（プライマーＪ）
配列番号１７：エシェリヒア・コリ由来のｇｓｈＡ遺伝子の塩基配列
配列番号１８：エシェリヒア・コリ由来のＧｓｈＡタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１９：エシェリヒア・コリ由来のｇｓｈＡ遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー（プライマーＫ）
配列番号２０：エシェリヒア・コリ由来のｇｓｈＡ遺伝子を増幅するためのリバースプライマー（プライマーＬ）
配列番号２１：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧＳＨ１遺伝子の塩基配列
配列番号２２：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧｓｈ１タンパク質のアミノ酸配列配列番号２３：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧＳＨ１遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー（プライマーＭ）
配列番号２４：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧＳＨ１遺伝子を増幅するためのリバースプライマー（プライマーＮ）
配列番号２５：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧＳＨ１遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー（プライマーＯ）
配列番号２６：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧＳＨ１遺伝子を増幅するためのリバースプライマー（プライマーＰ）
【図１】
0005978579.tif 000003
【図２】
0005978579.tif 000004
【図３】
0005978579.tif 000005
【図４】
0005978579.tif 000006
【図５】
0005978579.tif 000007
【配列表】
0005978579000001.app