(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリン単一可変ドメインを含むＡｎｇ２結合分子であって、前記免疫グロブリン単一可変ドメインが３個の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１が配列番号１６８において示すアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号１７１において示すアミノ酸配列を有し、かつＣＤＲ３が配列番号１７５において示すアミノ酸配列を有する、前記Ａｎｇ２結合分子。
【請求項２】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインがＶＨＨである、請求項１に記載のＡｎｇ２結合分子。
【請求項３】
前記ＶＨＨが配列番号１６６からなる配列を有する免疫グロブリン単一可変ドメインからなる、請求項２に記載のＡｎｇ２結合分子。
【請求項４】
前記ＶＨＨ又は前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、そのＮ末端で修飾または交換を有し、前記修飾が第一アミノ酸の欠失であり、前記交換が第一アミノ酸と別のアミノ酸の置換である、請求項１から３までのいずれか１項に記載のＡｎｇ２結合分子。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか１項に記載のＡｎｇ２結合分子をコードする核酸分子。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の１つまたは複数の発現ベクターを有する宿主細胞。
【請求項８】
請求項１から４までのいずれか１項に記載のＡｎｇ２結合分子を生成するための方法であって、
（ａ）請求項６に記載の１つまたは複数の発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトするステップ、
（ｂ）前記宿主細胞を培養するステップ、および
（ｃ）前記Ａｎｇ２結合分子を回収し精製するステップ
を含む方法。
【請求項９】
活性成分として請求項１から４までのいずれか１項に記載の１つまたは複数のＡｎｇ２結合分子、および少なくとも生理的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１０】
１つまたは複数の他の治療剤をさらに含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
血管新生に対するＡｎｇ２媒介効果と関係がある疾患を治療するための、請求項９または１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
癌および癌性疾患を治療するための、請求項１１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト治療の分野、特に癌に関する治療、ならびにこのような治療において有用な作用物質および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、米国特許出願公開第２００８／００１４１９６号、ＷＯ２００８１０１９８５および米国特許出願公開第２０１１／００２７２８６号中に記載されたように、血管新生は、それによって新たな血管が形成される生物学的プロセスであり、固形腫瘍および転移ならびに眼部疾患を含めた、幾つかの障害の病原と関係している。腫瘍が約１ｍｍ3の臨界サイズに達すると、酸素および栄養素の血中供給を維持してさらなる増殖を可能にするため、それらは血管新生に依存した状態となる。抗血管新生療法は、数タイプの腫瘍に関する重要な治療オプションとなっている。
最も重要な血管新生促進因子の１つは、ＶＥＧＦなどの他の血管新生因子の働きを可能にすることにより血管再構築を制御する、アンギオポイエチン２（Ａｎｇ２）、Ｔｉｅ２受容体のリガンド（Ｔｉｅ２）である。当技術分野では、Ａｎｇ２はＴｉｅ２リガンドとも呼ばれる（米国特許第５，６４３，７５５号、Yancopoulos et al.2000,Nature407:242-248）。
【０００３】
Ａｎｇ２は内皮細胞によって主に発現され、低酸素症および他の血管新生因子によって強く誘導され、腫瘍血管可塑性を制御し、血管をＶＥＧＦおよびＦＧＦ２に応答させることが実証されている（Augustin et al.,Nat Rev Mol Cell Biol.2009 Mar;10(3):165-77）。この役割と一致して、Ａｎｇ２の欠失または阻害は血管新生の低下をもたらす（Falcon et al.,Am J Pathol.2009 Nov;175(5)2159-70）。高いＡｎｇ２血清濃度が、結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣおよびメラノーマを有する患者に関して報告されている（Goede et al.,Br J Cancer.2010 Oct 26;103(9):1407-14）、（Park et al.,Chest.2007 Jul;132(1):200-6）、（Helfrich et al.,Clin Cancer Res.2009 Feb 15;15(4):1384-92）。ＣＲＣ癌では、Ａｎｇ２血清レベルは抗ＶＥＧＦ治療に対する治療応答性と関係がある。
Ａｎｇ−Ｔｉｅ系は２個の受容体（Ｔｉｅ１およびＴｉｅ２）と３個のリガンド（Ａｎｇ１、Ａｎｇ２およびＡｎｇ４）からなる（Augustin et al.,Nat Rev Mol Cell Biol.2009 Mar;10(3):165-77）。Ｔｉｅ２、Ａｎｇ１およびＡｎｇ２はこのファミリーの最も研究されているメンバーであり、Ｔｉｅ１はオーファン受容体であり、血管再構築に関するＡｎｇ４の役割は依然として定義する必要がある。Ａｎｇ２とＡｎｇ１は、Ｔｉｅ２結合および活性化に対して反対の機能を媒介する。Ａｎｇ２媒介Ｔｉｅ２活性化は、内皮細胞活性化、周皮細胞解離、血管外漏出および血管発芽の誘導をもたらす。Ａｎｇ２と対照的に、Ａｎｇ１シグナル伝達は周皮細胞の動員により血管の完全性を維持し、それによって内皮細胞の静止状態を維持する。
【０００４】
アンギオポイエチン２（Ａｎｇ２）は、Ｔｉｅ２受容体型チロシンキナーゼに対する分泌型６６ｋＤａリガンドである（Augustin et al.,Nat Rev Mol Cell Biol.2009 Mar;10(3):165-77）。Ａｎｇ２はＮ末端コイルドコイルドメインとＣ末端フィブリノゲン様ドメインからなり、後者はＴｉｅ２相互作用に必要とされる。Ａｎｇ２は内皮細胞によって主に発現され、低酸素症およびＶＥＧＦを含めた他の血管新生因子によって強く誘導される。Ｔｉｅ２は内皮細胞、造血幹細胞および腫瘍細胞において見られる。Ａｎｇ２−Ｔｉｅ２は腫瘍血管可塑性を制御し、血管をＶＥＧＦおよびＦＧＦ２に応答させることが実証されている。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＡｎｇ２は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）において適切なマイトジェン、化学誘引物質および血管形成の誘導物質として作用することが示されている。Ａｎｇ２は線維芽細胞内の異所で発現されるＴｉｅ２のチロシンリン酸化を誘導し、ＨＵＶＥＣにおけるＥＲＫ−ＭＡＰＫ、ＡＫＴおよびＦＡＫのリン酸化などの下流シグナル伝達事象を促進する。Ａｎｇ１誘導型内皮細胞応答におけるＡｎｇ２のアンタゴニスト的役割が記載されている。
【０００５】
Ａｎｇ２欠損は、マウスにおいて顕著なリンパ系形成欠陥をもたらすことが示されている。Ａｎｇ２の消失は胎児の血管発達に重要でないが、Ａｎｇ２欠損マウスは網膜と腎臓に持続的な血管の欠陥がある。血管新生部位（例えば卵巣）におけるＡｎｇ２発現の動的パターンと共に、これらの発見は、Ａｎｇ２がＶＥＧＦなどの他の血管新生因子の働きを可能にすることにより血管再構築を制御することを示す。
Ａｎｇ２−Ｔｉｅ２系は、血管新生分化転換および腫瘍血管新生の後期段階の間に重要な役割を発揮する。Ａｎｇ２の発現は腫瘍付随内皮において強く上方制御される。特に腫瘍増殖の初期段階中にＡｎｇ２欠損マウスに移植したとき、腫瘍増殖の低下が観察されている。Ａｎｇ２ｍＡｂによるＡｎｇ２の治療的遮断は、様々な腫瘍異種移植片モデルにおいて広い有効性を示している。
前述の米国特許出願公開第２００８／００１４１９６号中に要約されたように、血管新生は、固形腫瘍および転移を含めた幾つかの障害の病原と関係している。
【０００６】
腫瘍増殖の場合、血管新生は、過形成から新形成への移行、ならびに腫瘍増殖および転移用の栄養素の供給に重要であるようである。Folkman et al.,Nature 339-58(1989)は、腫瘍細胞に正常細胞と比較した増殖利点を獲得させている。したがって、抗血管新生療法は、数タイプの腫瘍に関する重要な治療オプションとなっている。これらの療法はＶＥＧＦ経路の遮断に焦点を当てている（Ferrara et al.,Nat Rev Drug Discov.2004 May;3(5):391-400）。
【０００７】
Ａｎｇ２とＡｎｇ１を結合させる抗体および他のペプチド阻害剤は、例えば米国特許第６，１６６，１８５号、同第７，５２１，０５３号、同第７，２０５，２７５号、ならびに米国特許出願公開第２００６／００１８９０９号および米国特許出願公開第２００６／０２４６０７１号中に言及されている。さらに米国特許出願公開第２０１１／００２７２８６号は、関連分子Ａｎｇ１をアンタゴナイズしない特異的Ａｎｇ２モノクローナル抗体を開示する。
しかしながら、現況技術のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）および融合タンパク質には、それらの治療用途の観点で幾つかの欠点がある。それらの分解を防ぐため、それらはほぼ凍結温度で保存しなければならない。さらに、それらは腸管内で急速に消化されるため、経口投与に適していない。癌治療に関するＭＡｂの別の大きな制約は輸送効率が悪いことであり、これが低濃度および腫瘍中の細胞標的化の欠如につながる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、新規な改善型Ａｎｇ２結合分子、すなわちＡｎｇ１とＴｉｅ２の結合ではなくＡｎｇ２とＴｉｅ２の結合を遮断するナノボディを提供することである。
より詳細には本発明の目的は、新規なＡｎｇ２結合分子、および具体的には、哺乳動物Ａｎｇ１ではなく哺乳動物Ａｎｇ２と結合するＡｎｇ２結合分子、および特にヒトＡｎｇ１ではなくヒトＡｎｇ２と結合するＡｎｇ２結合分子を提供することであり、このような分子またはポリペプチドは本明細書に記載する治療および診断目的に適している。本発明のさらなる目的は、Ａｎｇ１ではなくＡｎｇ２と特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを提供することである。
このようなＡｎｇ２結合分子、またはＡｎｇ２アンタゴニストは、血管新生に対するＡｎｇ２媒介効果と関係がある疾患または状態を予防、治療、緩和および／または診断する際に、組成物における薬理学的活性剤として有用である。
このような疾患の例は、乳癌、腎細胞癌、卵巣癌および膵臓癌などの癌または癌性疾患、加齢黄斑変性および糖尿病性網膜症などの眼部疾患、および／または糖尿病性腎症、腎後性不全、腎前性高窒素血症および内因性腎不全などの慢性腎臓病である。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、このような疾患、障害または状態を予防、治療、緩和および／または診断する方法であって、このようなＡｎｇ２結合分子およびこれらを含む組成物の使用ならびに／または投与を含む方法を提供することである。特に本発明の目的は、現在使用されているおよび／もしくは当技術分野で知られている作用物質、組成物ならびに／または方法と比較して利点をもたらす、このような薬理学的活性Ａｎｇ２結合分子、組成物および／または方法を提供することである。これらの利点には、特に前に記載した従来型抗体、またはそれらの断片と比較して、改善された治療および／または薬理学的性質、および／または例えば製造目的での他の有利な性質がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第一の態様により、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むＡｎｇ２結合分子であって、前記免疫グロブリン単一可変ドメインが３個の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１が配列番号１６８〜１７０において示すアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号１７１〜１７３において示すアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有し、かつＣＤＲ３が配列番号１７４〜１７７において示すアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有するＡｎｇ２結合分子を提供する。
さらに本発明は、前記免疫グロブリン単一可変ドメインからなるＡｎｇ２結合分子に関する。
【００１１】
さらに本発明は、配列番号１６７、１６６、１２９および１３８からなる群から選択される配列を有するＡｎｇ２結合分子に関する。
別の態様により、前記Ａｎｇ２結合分子をコードする核酸、および前記核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
さらに本発明は、前記核酸を含む１つまたは複数の発現ベクターを有する宿主細胞に関する。
【００１２】
さらに本発明は、本発明によるＡｎｇ２結合分子を生成または作製するための方法であって、
（ａ）前記核酸分子を含む１つまたは複数の前記ベクターで宿主細胞をトランスフェクトするステップ、
（ｂ）前記宿主細胞を培養するステップ、および
（ｃ）前記Ａｎｇ２結合分子を回収し精製するステップ
を含む方法に関する。
本発明のさらなる態様は、活性成分として１つまたは複数の前記Ａｎｇ２結合分子、および少なくとも生理的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
さらに本発明は、本明細書に記載するＡｎｇ２結合分子、核酸分子、宿主細胞、産物および組成物の適用および使用、ならびに血管新生に対するＡｎｇ２媒介効果と関係がある疾患、好ましくは癌、癌性疾患、および眼部疾患を予防および／または治療するための方法に関する。
本発明のこれらおよび他の態様、実施形態、利点および適用は、本明細書の以下のさらなる記載から明らかとなる。
定義
他に指定または定義しない限り、使用する全ての用語は当技術分野における通常の意味を有し、それは当業者には明らかである。例えば、Sambrook et al,「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」(2nd Ed.),Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989);Lewin,「GenesIV」,Oxford University Press,New York,(1990),and Roitt et al.,「Immunology」(2nd Ed.),Gower Medical Publishing,London,New York(1989)などの標準的な手引き、および本明細書に引用する一般的背景技術を参照のこと。さらに、他に示さない限り、詳しく具体的に記載しない全ての方法、ステップ、技法および操作を実施することができ、当業者には明らかなように、それ自体知られている形式で実施することができる。例えば、標準的な手引き、前述の一般的背景技術、および本明細書に引用するさらなる参照を再度参照のこと。
【００１３】
用語「アンギオポイエチン−２」または「Ａｎｇ２」は、非ヒト種由来（例えば、「マウスＡｎｇ２」など）として示さない限り、ヒトＡｎｇ２またはその生物活性断片（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは  ｉｎ  ｖｉｖｏで血管新生を誘導することができるＡｎｇ２タンパク質の断片）、すなわち、受託番号ＮＭ００１１４７．２を有するヒトＡｎｇ２（変異体１）、受託番号ＮＭ＿００１１１８８８７．１を有するヒトＡｎｇ２（変異体２）、または受託番号ＮＭ＿００１１１８８８８．１を有するヒトＡｎｇ２（変異体３）、および／またはそれらの生物活性断片を指す。マウスＡｎｇ２およびカニクイザルＡｎｇ２などのＡｎｇ２非ヒト種のアミノ酸配列は、それぞれ受託番号ＮＭ＿００７４２６．３（配列番号（配列番号１８８））およびＡＢ１７２６４３．１（配列番号１８７）の下、タンパク質配列データベースから入手可能である。
【００１４】
用語「アンギオポイエチン−１」または「Ａｎｇ１」は、非ヒト種由来（例えば、「マウスＡｎｇ２」など）として示さない限り、ヒトＡｎｇ１またはその生物活性断片（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは  ｉｎ  ｖｉｖｏで血管新生を誘導することができるＡｎｇ１タンパク質の断片）、すなわち、受託番号ＮＭ＿００１１４６．３を有するヒトＡｎｇ１、またはその生物活性断片を指す。
他に示さない限り、用語「免疫グロブリン」および「免疫グロブリン配列」は、重鎖抗体または従来型４鎖抗体を指すために本明細書で使用しようと、一般的な用語として使用し、完全サイズの抗体、その個々の鎖、およびその全部分、ドメインまたは断片をいずれも含む（それぞれＶＨＨドメインまたはＶＨ／ＶＬドメインなどの、抗原結合ドメインまたは断片に限られないが、これらを含む）。さらに、本明細書で使用する用語「配列」（例えば、用語「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「（単一）可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」または「タンパク質配列」など）は、文脈がより限定的な解釈を必要としない限り、関連アミノ酸配列と、それをコードする核酸配列またはヌクレオチド配列の両方を含むと一般に理解すべきである。
【００１５】
本明細書で使用する用語（ポリペプチドまたはタンパク質の）「ドメイン」は、その三次構造をタンパク質の残り部分と独立して保持する能力を有する、フォールディングしたタンパク質構造を指す。一般に、ドメインはタンパク質の別個の機能性を担い、多くの場合、タンパク質および／またはドメインの残り部分の機能を消失させずに、付加する、除去する、または他のタンパク質に移すことができる。
【００１６】
本明細書で使用する用語「免疫グロブリンドメイン」は、（例えば、従来型４鎖抗体または重鎖抗体の鎖など）抗体鎖の球状領域、またはこのような球状領域から本質的になるポリペプチドを指す。免疫グロブリンドメインは、抗体分子の免疫グロブリンフォールディング特性を保持することを特徴とし、それは２βシート中に配置された約７アンチパラレルβ鎖の２層サンドウィッチ構造からなり、保存型ジスルフィド結合により場合によっては安定化する。
本明細書で使用する用語「免疫グロブリン可変ドメイン」は、それぞれ、当技術分野および本明細書の以下で、「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」、「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」、「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」、および「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」と呼ぶ４個の「フレームワーク領域」から本質的になる免疫グロブリンドメインを意味し、これらのフレームワーク領域は、それぞれ、当技術分野および本明細書の以下で、「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」、および「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」と呼ぶ３個の「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」によって中断される。したがって、免疫グロブリン可変ドメインの一般的な構造または配列は以下のように示すことができる：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。抗原結合部位を有することにより抗原に対する抗体に特異性を与えるのは、免疫グロブリン可変ドメイン（複数可）である。
【００１７】
本明細書で使用する用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、別の可変免疫グロブリンドメインと対形成せずに抗原のエピトープと特異的に結合することができる、免疫グロブリン可変ドメインを意味する。本発明の意味における免疫グロブリン単一可変ドメインの一例は、「ドメイン抗体」、免疫グロブリン単一可変ドメインＶＨおよびＶＬ（ＶＨドメインおよびＶＬドメイン）などである。免疫グロブリン単一可変ドメインの別の例は、本明細書で後に定義するような、ラクダ由来の「ＶＨＨドメイン」（または単に「ＶＨＨ」）である。
【００１８】
前述の定義を鑑みて、従来型４鎖抗体の抗原結合ドメイン（当技術分野で知られているＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ分子など）、または（いずれも当技術分野で知られる）このような従来型４鎖抗体由来のＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合ＦｖなどのＦｖ断片、またはｓｃＦｖ断片、またはダイアボディの抗原結合ドメインは、通常は免疫グロブリン単一可変ドメインとしてみなされない。これらの場合、抗原の各エピトープとの結合は通常、１個の（単一）免疫グロブリンドメインによって起こらず、軽鎖と重鎖可変ドメインなどの（結合）免疫グロブリンドメインの対によって、すなわち各抗原のエピトープに一緒に結合する免疫グロブリンドメインのＶＨ−ＶＬ対によって起こるからである。
【００１９】
ＶＨＨとしても知られる「ＶＨＨドメイン」、ＶHＨドメイン、ＶＨＨ抗体ドメイン、およびＶＨＨ抗体は、「重鎖抗体」（すなわち、「軽鎖を欠く抗体」）の抗原結合免疫グロブリン（可変）ドメインとして本来記載されている（Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,Songa EB,Bendahman N,Hamers R.:「Naturally occurring antibodies devoid of light chains」;Nature 363,446-448(1993)）。用語「ＶＨＨドメイン」を選択して、これらの可変ドメインと（本明細書で「ＶHドメイン」または「ＶＨドメイン」と呼ぶ）従来型４鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン、および（本明細書で「ＶLドメイン」または「ＶＬドメイン」と呼ぶ）従来型４鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメインを区別している。ＶＨＨドメインは別の抗原結合ドメイン無しでエピトープと特異的に結合することができる（従来型４鎖抗体におけるＶＨまたはＶＬドメインと対照的に、この場合エピトープはＶＨドメインと共にＶＬドメインによって認識される）。ＶＨＨドメインは、単一免疫グロブリンドメインによって形成される、小さな、確固たる有効な抗原認識単位である。
【００２０】
本発明の文脈では、用語ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ、ＶHＨドメイン、ＶＨＨ抗体断片、ＶＨＨ抗体、ならびに「Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）」および「Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）ドメイン」（「Ｎａｎｏｂｏｄｙ」はＡｂｌｙｎｘ  Ｎ．Ｖ．；Ｇｈｅｎｔ；Ｂｅｌｇｉｕｍ社の商標である）は交互に使用し、例えばＷＯ２００９／１０９６３５、図１中で定義されたいわゆる「ホールマーク残基」によってＶＨドメインと区別される、（構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を有し、第二の免疫グロブリン可変ドメインの存在を必要とせずにエピトープと特異的に結合する）免疫グロブリン単一可変ドメインを表す。
免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばＶＨＨのアミノ酸残基は、例えばRiechmann and Muyldermans,J.Immunol.Methods 231,25-38(1999)の図２中に示されたラクダ由来のＶＨＨドメインに適用したように、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌにより与えられたＶHドメインに関する一般的なナンバリングに従い番号処理する（「Sequence of proteins of immunological interest」,US Public Health Services,NIH Bethesda,MD,Publication No.91）。
【００２１】
このナンバリングに従うと、
ＦＲ１は位置１〜３０にアミノ酸残基を含み、
ＣＤＲ１は位置３１〜３５にアミノ酸残基を含み、
ＦＲ２は位置３６〜４９にアミノ酸残基を含み、
ＣＤＲ２は位置５０〜６５にアミノ酸残基を含み、
ＦＲ３は位置６６〜９４にアミノ酸残基を含み、
ＣＤＲ３は位置９５〜１０２にアミノ酸残基を含み、かつ
ＦＲ４は位置１０３〜１１３にアミノ酸残基を含む。
【００２２】
しかしながら、ＶHドメインおよびＶＨＨドメインに関して当技術分野でよく知られているように、各ＣＤＲ中のアミノ酸残基の合計数は変わる可能性があり、Ｋａｂａｔのナンバリングによって示されるアミノ酸残基の合計数に対応しない可能性があることに留意すべきである（すなわち、実際の配列中でＫａｂａｔのナンバリングに従う１つまたは複数の位置は占有されない可能性があり、または実際の配列はＫａｂａｔのナンバリングにより与えられた数より多くのアミノ酸残基を含有する可能性がある）。これは一般に、Ｋａｂａｔに従うナンバリングが、実際の配列中のアミノ酸残基の実際のナンバリングに対応する、またはそれに対応しない可能性があることを意味する。
類似した形式でＶＨＨドメインに適用することもできる、ＶHドメインのアミノ酸残基のナンバリングに関する別の方法が、当技術分野で知られている。しかしながら、本発明の記載、特許請求の範囲および図面中、他に示さない限り、前に記載したようにＶＨＨドメインに適用するＫａｂａｔによるナンバリングに従う。
ＶＨＨドメイン中のアミノ酸残基の合計数は通常１１０〜１２０の範囲であり、１１２〜１１５の範囲であることが多い。しかしながら、より短い配列およびより長い配列も、本明細書で記載する目的に適している可能性があることに留意すべきである。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態による免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばＶＨＨおよびドメイン抗体は、幾つか独自の構造特性および機能性を有しており、それによってこれらは機能性抗原結合分子として治療において使用するのに非常に有利となる。特に、および非制限的に、（軽鎖可変ドメインと対形成せずに抗原と機能的に結合する性質により「設計」された）ＶＨＨ抗体は、単一の、比較的小さな、機能性抗原結合構造単位として機能することができる。
【００２４】
それらの独自の性質によって、ＶＨＨまたはＶＨ（またはＶＬ）のような本明細書で定義する免疫グロブリン単一可変ドメインは、単独、または巨大ポリペプチド、例えばバイパラトピック分子（biparatopic molecule）の一部のいずれかとして、幾つかの有意な利点をもたらす：
・  １個のドメインのみが高いアフィニティーおよび高い選択性で抗原と結合するのに必要とされ、したがって２個の別ドメインを存在させる必要がなく、正確な空間的立体配座および形状で（すなわち、ｓｃＦｖと同様に特別に設計されたリンカーの使用によって）、これら２個のドメインが存在することを保証する必要もない。
・  免疫グロブリン単一可変ドメインは１個の核酸分子から発現させることが可能であり、（グリコシル化のような）いかなる翻訳後修飾も必要としない。
・  （本明細書でさらに論じるように）免疫グロブリン単一可変ドメインを、容易に多価および多重特異性形式に操作することができる。
・  免疫グロブリン単一可変ドメインは、それらの標的に対して高い特異性とアフィニティー、低い固有の毒性を有し、注入または注射以外の代替経路によって投与することができる。
【００２５】
・  免疫グロブリン単一可変ドメインは、熱、ｐＨ、プロテアーゼおよび他の変性剤または条件に対して非常に安定性があり、したがって冷蔵装置の使用を必要とせずに調製、保存または輸送することができる。
・  免疫グロブリン単一可変ドメインは、小規模および製造規模の両方で、調製するのが容易で比較的安価である。例えば、（例えば、以下でさらに記載するように）微生物発酵を使用して免疫グロブリン単一可変ドメインを生成することができ、例えば従来型抗体のように哺乳動物発現系の使用を必要としない。
・  免疫グロブリン単一可変ドメインは、従来型４鎖抗体およびその抗原結合断片と比較して比較的小さく（約１５ｋＤａ、または従来型ＩｇＧより１０倍小さい）、したがって、（固形腫瘍および他の深部組織だけには限られないがこれらを含めた）組織への（より）高い浸透性を示し、このような従来型４鎖抗体およびその抗原結合断片より多用量で投与することができる。
・  ＶＨＨは（特に、４鎖抗体由来のＶＨドメインと比較した、それらの広いＣＤＲ３ループのため）特異的ないわゆる「腔結合性」を有し、したがって、従来型４鎖抗体およびその抗原結合断片がアクセスできない標的およびエピトープにアクセスすることもできる。
・  （Ward et al.,Nature 341:544-546(1989)により記載されたマウス由来抗原結合ドメインと同様に）、ＶＨＨは非常に可溶性が高く、非常に安定性があり、凝集する傾向がないという固有の利点を有する。
【００２６】
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、それらを入手した具体的な生物供給源、または具体的な調製法に関して制限されない。例えば、ＶＨＨの入手は以下のステップを含み得る：
【００２７】
（１）  天然に存在する重鎖抗体のＶＨＨドメインを単離し、または重鎖抗体もしくはＶＨＨを含むライブラリーをスクリーニングし、そこからＶＨＨを単離するステップ、
（２）  天然に存在する配列を有するＶＨＨをコードする核酸分子を発現させるステップ、
（３）  場合によってはアフィニティー成熟後に、天然に存在する配列を用いて（本明細書に記載するように）ＶＨＨを「ヒト化」するステップ、またはこのようなヒト化ＶＨＨをコードする核酸を発現させるステップ、
（４）  動物種由来、特に人間などの哺乳動物種由来の、天然に存在する抗体からの免疫グロブリン単一可変重鎖ドメインを（本明細書で以下に記載するように）「ラクダ化」するステップ、またはこのようなラクダ化ドメインをコードする核酸分子を発現させるステップ、
（５）  ＶＨを「ラクダ化」するステップ、またはこのようなラクダ化ＶＨをコードする核酸分子を発現させるステップ、
（６）  合成的または半合成的にタンパク質、ポリペプチドもしくは他のアミノ酸配列を調製する技法を使用するステップ、
（７）  核酸合成に関する技法を使用してＶＨＨドメインをコードする核酸分子を調製するステップ、このように得た核酸を次いで発現させるステップ、
（８）  重鎖抗体もしくはＶＨＨをアフィニティー成熟、突然変異誘発（例えば、ランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発）および／または任意の他の技法（複数可）に曝して、ＶＨＨのアフィニティーおよび／または特異性を増大させるステップ、および／または
（９）  前述のステップの組合せまたは選択。
【００２８】
前に記載したステップを実施するのに適した方法および技法は当技術分野では知られており、当業者には明らかである。例えば、特異的抗原またはエピトープと結合するＶＨＨドメインを得るための方法は、ＷＯ２００６／０４０１５３およびＷＯ２００６／１２２７８６中に記載されている。
具体的な実施形態によれば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインまたは本発明のポリペプチドにおいて存在する免疫グロブリン単一可変ドメインは、天然に存在するＶＨＨドメインのアミノ酸配列にほぼ相当するが、（場合によってはアフィニティー成熟後に）「ヒト化」または「配列最適化」、すなわち人間由来の従来型４鎖抗体の可変重鎖ドメイン中の対応する位置（複数可）に存在する１つまたは複数のアミノ酸残基によって、前記天然に存在するＶＨＨ配列のアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸残基が置換されている、アミノ酸配列を有するＶＨＨドメインである。当業者により普通に使用され得る当技術分野で知られている方法を使用して、これを実施することができる。
【００２９】
ヒト化ＶＨＨドメインは１つまたは複数の完全ヒトフレームワーク領域配列を含有することができ、およびさらにより具体的な実施形態では、ヒト生殖細胞系列Ｖｈ３配列ＤＰ−２９、ＤＰ−４７、ＤＰ−５１、またはこれらの一部分由来のヒトフレームワーク領域配列を含有することができ、またはＪＨ５などのＪＨ配列と場合によっては組み合わさりそれと非常に相同的である。したがってヒト化プロトコールは、単独または組合せのいずれかで、ＤＰ４７、ＤＰ２９およびＤＰ５１などの生殖細胞系列ＶＨ遺伝子の対応するフレームワーク１、２および３（ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３）残基と、任意のＶＨＨ残基の置換を含むことができる。本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインの適切なフレームワーク領域（ＦＲ）は、例えばＷＯ２００６／００４６７８中で言及されたフレームワーク領域から選択することができ、具体的にはいわゆる「ＫＥＲＥ」および「ＧＬＥＷ」クラスを含む。例は、ほぼ位置４４〜４７にアミノ酸配列Ｇ−Ｌ−Ｅ−Ｗを有する免疫グロブリン単一可変ドメイン、およびその各々のヒト化相当物である。ヒト化ＶＨＨドメインは、１つまたは複数の完全ヒトフレームワーク領域配列を含有することができる。
【００３０】
例えば、（以下で定義する）１０３Ｐ，Ｒ，Ｓ群および／またはＧＬＥＷ群に属するＶＨＨに関するヒト化置換は、１０８Ｑ〜１０８Ｌである。免疫グロブリン単一可変ドメインをヒト化するための方法は、当技術分野で知られている。
【００３１】
治療用途を鑑みて改善された性質、例えば高いアフィニティーまたは低い免疫原性を有する結合型免疫グロブリン単一可変ドメインは、（例えば、合成、ランダムまたは天然に存在する免疫グロブリン配列から始める）アフィニティー成熟、ＣＤＲ移植、ヒト化、異なる免疫グロブリン配列由来の断片の組合せ、重複プライマーを使用するＰＣＲ構築、および当業者によく知られている免疫グロブリン配列を操作するための類似の技法、または本明細書に記載するような「配列最適化」とも呼ばれる、任意の前述の任意の適切な組合せなどの当技術分野で知られている技法により、個々の結合分子から得ることができる。例えば、標準的な手引き、ならびにさらなる記載および実施例を参照。
適切な場合、高いアフィニティーを有する結合分子は別の結合分子のアフィニティー成熟により得ることができ、アフィニティー成熟分子に関して後者は「親」結合分子となる。
特異的抗原またはエピトープと結合するＶＨＨを得るための方法は、例えばＷＯ２００６／０４０１５３およびＷＯ２００６／１２２７８６中に初期に記載されている。その中でさらに詳細に記載されたように、ラクダ由来のＶＨＨドメインは、人間由来の従来型４鎖抗体のＶＨドメイン中の対応する位置（複数可）に存在する１つまたは複数のアミノ酸残基により、原型ＶＨＨ配列のアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸残基を置換することによって、「ヒト化」することができる（本明細書では「配列最適化」とも呼ぶ、「配列最適化」は、ヒト化以外に、考えられる翻訳後修飾部位の除去などの、改善された性質をＶＨＨに与える１つまたは複数の突然変異による別の配列修飾を包含し得る）。ヒト化ＶＨＨドメインは１つまたは複数の完全ヒトフレームワーク領域配列を含有することができ、およびさらにより具体的な実施形態では、ＤＰ−２９、ＤＰ−４７、ＤＰ−５１、またはこれらの一部分由来のヒトフレームワーク領域配列を含有することができ、ＪＨ５などのＪＨ配列と場合によっては組合せることができる。
【００３２】
「Ｄａｂ」および「ｄＡｂ」としても知られる「ドメイン抗体」は、例えば、Ward,E.S.,et al.:「Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secretedfrom Escherichia coli」;Nature 341:544-546(1989);Holt,L.J.et al.:「Domain antibodies:proteins for therapy」;TRENDS in Biotechnology 21(11):484-490(2003);およびＷＯ２００３／００２６０９中に記載されている（用語「Ｄｏｍａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」および「ｄＡｂ」はＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅグループ会社による商標として使用されている）。
【００３３】
ドメイン抗体は、非ラクダ哺乳動物由来の抗体、特にヒト４鎖抗体のＶＨまたはＶＬドメインにほぼ相当する。単一抗原結合ドメインとして、すなわちそれぞれＶＬまたはＶＨドメインと対形成せずにエピトープを結合させるため、例えばヒト単一ＶＨまたはＶＬドメイン配列のライブラリーを使用することによる、このような抗原結合性に関する具体的な選択が必要とされる。
【００３４】
完全ヒト配列に由来する場合、ドメイン抗体は、ＶＨＨと同様に約１３〜約１６ｋＤａの分子量を有し、例えばヒトにおける治療用途のためのヒト化は必要としない。ＶＨＨドメインの場合と同様に、それらは原核生物発現系でも十分発現され、全体的な製造コストの有意な低下をもたらす。
さらに、ヒト足場または非免疫グロブリン足場だけには限られないが、これらを含めた他の「足場」に、前述の１つまたは複数のＣＤＲを「移植」することができることも当業者には明らかである。このようなＣＤＲ移植に適した足場および技法は、当技術分野では知られている。
互換的に使用することができる用語「エピトープ」と「抗原決定基」は、従来型抗体または本発明のポリペプチドなどの抗原結合分子によって、およびより詳細には前記分子の抗原結合部位によって認識される、ポリペプチドなどのマクロ分子の一部分を指す。エピトープは免疫グロブリンの最小結合部位を画定し、したがって免疫グロブリンの特異性の標的となる。
【００３５】
特定エピトープ、抗原またはタンパク質（またはそれらの少なくとも一部分、断片もしくはエピトープ）「と結合する」ことができるまたは「と特異的に結合する」ことができる、「それに対するアフィニティーを有する」および／または「それに対する特異性を有する」、ポリペプチド（本発明の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、または一般にそれらの抗原結合分子もしくは断片など）は、前記エピトープ、抗原またはタンパク質「用である」もしくは「それらを対象とする」、またはこのようなエピトープ、抗原またはタンパク質に関する「結合」分子であるということができる。この文脈では、Ａｎｇ２結合分子は「Ａｎｇ２中和分子」と呼ぶこともできる。
一般に用語「特異性」は、（本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインなどの）特定抗原結合分子または抗原結合タンパク質分子が結合可能である、異なるタイプの抗原またはエピトープの数を指す。抗原結合分子の特異性は、そのアフィニティーおよび／またはアビディティーに基づいて決定することができる。抗原結合タンパク質と抗原の解離に関する平衡定数（ＫＤ）によって表されるアフィニティーは、抗原結合タンパク質におけるエピトープと抗原結合部位の間の結合強度の指標であり、ＫＤの値が低くなるほど、エピトープと抗原結合分子の間の結合強度は強くなる（あるいは、１／ＫＤであるアフィニティー定数（ＫＡ）としてアフィニティーを表すこともできる）。（例えば、本明細書のさらなる開示に基づき）当業者には明らかであるように、対象の特異的抗原に応じて、それ自体知られている方法でアフィニティーを決定することができる。アビディティーは、（免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはそれを含有するポリペプチドなどの）抗原結合分子と関連抗原の間の結合強度の指標である。アビディティーは、抗原結合分子におけるエピトープとその抗原結合部位の間のアフィニティーと、抗原結合分子上に存在する関連結合部位の数の両方と関連している。
【００３６】
エピトープを認識する（本発明の抗体または免疫グロブリン単一可変ドメインなどの）抗原結合分子の一部分は、「パラトープ」と呼ばれる。
【００３７】
他に示さない限り、用語「Ａｎｇ２結合分子」は、抗Ａｎｇ２抗体、抗Ａｎｇ２抗体断片、「抗Ａｎｇ２抗体様分子」、およびこれらのいずれかとのコンジュゲートを含む。抗体には、モノクローナルおよびキメラモノクローナル抗体があるが、これらだけには限られない。用語「抗体」は、単鎖抗体および直鎖状抗体、例えばＷＯ０２／０５６９１０中に記載されたいわゆる「ＳＭＩＰ」（「Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ」）を含めた、宿主細胞内の組換え発現によって生成したモノクローナル抗体のような完全免疫グロブリン、およびＡｎｇ２結合抗体断片または「抗体様分子」を包含する。抗Ａｎｇ２抗体様分子は、本明細書で定義する免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。抗体様分子に関する他の例は、免疫グロブリンスーパーファミリー抗体（ＩｇＳＦ）、またはＣＤＲ移植分子である。
【００３８】
「Ａｎｇ２結合分子」は、一価Ａｎｇ２結合分子（すなわち、Ａｎｇ２の１個のエピトープと結合する分子）、および「フォーマット型」Ａｎｇ２結合分子とも呼ばれる、２個以上のＡｎｇ２結合免疫グロブリン単一可変ドメインを含有するＡｎｇ２結合分子を指す。フォーマット型Ａｎｇ２結合分子は、Ａｎｇ２結合免疫グロブリン単一可変ドメイン以外に、リンカーおよび／またはエフェクター機能を有する部位、例えばアルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメインのような半減期増大成分、および／または血清アルブミンのような融合パートナーおよび／またはＰＥＧのような結合ポリマーを含むことができる。
フォーマット型Ａｎｇ２結合分子は、あまり好ましくないが、同じまたは重複エピトープを認識する、２個の同一Ａｎｇ２結合免疫グロブリン単一可変ドメインまたは２個の異なる免疫グロブリン単一可変ドメインも含み得る。この場合、２個の免疫グロブリン単一可変ドメインは、Ａｎｇ２ダイマーを形成する２個の各モノマーにおいて、同じまたは重複エピトープと結合し得る。競合ＥＬＩＳＡアッセイを含めた実験データは、モノマーＡｎｇ２結合分子の個別構成単位との比較時の、フォーマット型Ａｎｇ２ダイマーの有意な効能改善を開示する（データ示さず）。
【００３９】
典型的には、本発明のＡｎｇ２結合分子は、（ＢｉａｃｏｒｅまたはＫｉｎＥｘＡアッセイにおいて測定して）１０Ｅ−５〜１０Ｅ−１４モル／リットル（Ｍ）以下、および好ましくは１０Ｅ−７〜１０Ｅ−１４モル／リットル（Ｍ）以下、より好ましくは１０Ｅ−８〜１０Ｅ−１４モル／リットル、およびさらにより好ましくは１０Ｅ−１１〜１０Ｅ−１３モル／リットルの解離定数（ＫD）で、および／または少なくとも１０Ｅ７ＭＥ−１、好ましくは少なくとも１０Ｅ８ＭＥ−１、より好ましくは少なくとも１０Ｅ９ＭＥ−１、少なくとも１０Ｅ１１ＭＥ−１などの会合定数（ＫA）で結合する。１０Ｅ−４Ｍを超える任意のＫD値が、非特異的結合を示すと一般に考えられる。好ましくは本発明のポリペプチドは、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、５００ｐＭ未満などのＫDで、所望の抗原、すなわちＡｎｇ２と結合する。抗原またはエピトープと抗原結合タンパク質の特異的結合は、例えば本明細書に記載するアッセイ、スキャッチャード解析および／または競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）およびサンドウィッチ競合アッセイ、および当技術分野でそれ自体が知られているこれらの異なる変形を含めた、それ自体が知られている任意の適切な方法において決定することができる。
【００４０】
当技術分野で一般に知られ認められているように、標準的な３文字または１文字アミノ酸コードに従いアミノ酸残基を示す。２個のアミノ酸配列を比較するとき、用語「アミノ酸の違い」は、第二配列と比較した、参照配列の位置で示した数のアミノ酸残基の挿入、欠失または置換を指す。置換（複数可）の場合、このような置換（複数可）は保存的アミノ酸置換（複数可）であることが好ましく、これは、アミノ酸残基が類似の化学構造の別のアミノ酸残基に置換されており、ポリペプチドの機能、活性もしくは他の生物学的性質に対してほとんど、または実質的に全く影響がないことを意味する。このような保存的アミノ酸置換は例えばＷＯ９８／４９１８５から当技術分野でよく知られており、この場合保存的アミノ酸置換は、以下のグループ（ｉ）〜（ｖ）中の１個のアミノ酸が同じグループ内の別のアミノ酸残基に置換された置換であることが好ましい：（ｉ）低分子脂肪族、無極性または若干極性がある残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＰｒｏおよびＧｌｙ；（ｉｉ）極性、負に帯電した残基およびそれらの（非帯電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎ；（ｉｉｉ）極性、正に帯電した残基：Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓ；（ｉｖ）高分子脂肪族、無極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＣｙｓ；および（ｖ）芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ。特に好ましい保存的アミノ酸置換は以下の通りである：
ＡｌａからＧｌｙまたはＳｅｒ、ＡｒｇからＬｙｓ、ＡｓｎからＧｌｎまたはＨｉｓ、ＡｓｐからＧｌｕ、ＣｙｓからＳｅｒ、ＧｌｎからＡｓｎ、ＧｌｕからＡｓｐ、ＧｌｙからＡｌａまたはＰｒｏ、ＨｉｓからＡｓｎまたはＧｌｎ、ＩｌｅからＬｅｕまたはＶａｌ、ＬｅｕからＩＩｅまたはＶａｌ、ＬｙｓからＡｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｕ、ＭｅｔからＬｅｕ、ＴｙｒまたはＩｌｅ、ＰｈｅからＭｅｔ、ＬｅｕまたはＴｙｒ、ＳｅｒからＴｈｒ、ＴｈｒからＳｅｒ、ＴｒｐからＴｙｒ、ＴｙｒからＴｒｐまたはＰｈｅ、ＶａｌからＩｌｅまたはＬｅｕ。
【００４１】
ポリペプチドまたは核酸分子は、例えば、それを入手したその元の生物源および／または反応培地または培養培地と比較したとき、別のタンパク質／ポリペプチド、別の核酸、別の生物要素またはマクロ分子、または少なくとも１つの汚染物質、不純物もしくは微量要素などの、前記源または培地において通常結合している少なくとも１つの他の要素からそれを分離したとき、「（そこから）（ほぼ）単離された」状態であると考えられる。特にポリペプチドまたは核酸分子は、それが少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、より詳細には少なくとも１００倍、および最大１０００倍以上精製されたとき「ほぼ単離された」と考えられる。「ほぼ単離された形態で」あるポリペプチドまたは核酸分子は、例えば適切なクロマトグラフィー技法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの適切な技法を使用し決定して、ほぼ相同的であることが好ましい。
【００４２】
（アミノ末端、ＮＨ2末端、Ｎ末端またはアミン末端としても知られる）用語「Ｎ末端」は、遊離アミン基（−ＮＨ2）を有するアミノ酸を末端とする、タンパク質／ポリペプチド（すなわちＡｎｇ２結合分子）の開始部分を指す。ペプチド配列を書く慣習は左にＮ末端を置き、Ｎ末端からＣ末端に配列を書くことである。タンパク質がメッセンジャーＲＮＡから翻訳されるとき、それはＮ末端からＣ末端に作製される。
【００４３】
２個のＡｎｇ２結合分子配列間の「配列同一性」は、その配列間で同一であるアミノ酸の割合を示す。配列同一性は、ＷＯ０８／０２００７９の４９〜５０ページのパラグラフｆ）中に記載されたように計算または決定することができる。「配列類似性」は、同一であるかまたは保存的アミノ酸置換を示すいずれかのアミノ酸の割合を示す。
【００４４】
類似した形式でＶＨＨドメインに適用することもできる、ＶHドメインのアミノ酸残基のナンバリングに関する別の方法が、当技術分野で知られている。しかしながら、本発明の記載、特許請求の範囲および図面中、他に示さない限り、前に記載したようにＶＨＨドメインに適用するＫａｂａｔによるナンバリングに従う。
【００４５】
「アフィニティー成熟」Ａｎｇ２結合分子、特にＶＨＨまたはドメイン抗体には、それぞれの親Ａｎｇ２結合分子と比較してＡｎｇ２に対して改善されたアフィニティーをもたらす、１つまたは複数のＣＤＲの１つまたは複数の改変がある。本発明のアフィニティー成熟Ａｎｇ２結合分子は、当技術分野で知られている方法により、例えばMarks et al.,1992,Biotechnology 10:779-783、またはBarbas,et al.,1994,Proc.Nat.Acad.Sci,USA 91:3809-3813.;Shier et al.,1995,Gene 169:147-155;Yelton et al.,1995,Immunol.155:1994-2004;Jackson et al.,1995,J.Immunol.154(7):3310-9;およびHawkins et al.,1992,J.Mol.Biol. 226(3):889 896;KS Johnson and RE Hawkins,「Affinity maturation of antibodies using phage display」,Oxford University Press 1996により記載されたように調製することができる。
【００４６】
本発明に関して、「配列番号ｘのアミノ酸配列」は、他に言及しない場合、各配列番号ｘにおいて示す配列と１００％同一であるアミノ酸配列、
ａ）各配列番号ｘにおいて示す配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｂ）各配列番号ｘにおいて示す配列と３、２、または１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列を含む。
用語「癌」および「癌性」は、典型的には制御不能な細胞増殖／繁殖によって特徴付けられる、哺乳動物における生理的状態を言及または記載する。本発明のＡｎｇ２結合分子を用いて治療される癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病があるが、これらだけには限られない。このような癌のより具体的な例には、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化管癌、膵臓癌、膠芽腫、頚部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝性癌、胃癌、メラノーマ、および様々なタイプの頭頸部癌がある。血管新生の異常制御は、本発明の組成物および方法により治療することができる多くの障害をもたらす可能性がある。これらの障害には、非腫瘍形成状態と腫瘍形成状態の両方がある。腫瘍形成状態には前に記載したものがあるが、これらだけには限られない。
【００４７】
非腫瘍形成障害には、望ましくないかもしくは異常な肥大、関節炎、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬プラーク、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症プラーク、未熟児網膜症を含めた糖尿病性および他の増殖性網膜症、水晶体後方線維増殖症、血管新生緑内障、加齢黄斑変性、糖尿病黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植血管新生、角膜移植拒絶反応、網膜／脈絡膜血管新生、閉塞隅角血管新生（ルベオーシス）、眼部血管新生疾患、血管再狭窄、動静脈奇形（ＡＶＭ）、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺肥大（グレーブス病含む）、角膜および他の組織移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺障害／ＡＲＤＳ、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性肺滲出、（例えば、急性脳卒中／閉鎖性頭部障害／外傷と関連した）脳浮腫、滑膜炎、ＲＡにおけるパンヌス形成、骨化性筋炎、肥大性骨形成、骨関節炎（ＯＡ）、難治性腹水、多嚢胞性卵巣症候群、３次元の液性疾患（膵炎、コンパートメント症候群、火傷、腸疾患）、子宮類線維腫、早産、ＩＢＤなどの慢性炎症（クローン病および潰瘍性大腸炎）、腎同種移植片拒絶反応、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくないかもしくは異常な組織塊増殖（非癌性）、血友病性関節炎、肥厚性瘢痕、毛髪増殖の抑制、オスラーウェーバー症候群、化膿性緑内障、水晶体後方線維増殖症、硬皮症、トラコーマ、血管癒着、滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、（心膜炎などと関連がある）心膜滲出液、および胸膜滲出液があるが、これらだけには限られない。
【００４８】
用語「眼部疾患」は、未熟児網膜症を含めた増殖性網膜症、水晶体後方線維増殖症、血管新生緑内障、加齢黄斑変性、糖尿病黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植血管新生、角膜移植拒絶反応、網膜／脈絡膜血管新生を指す。
用語「慢性腎臓病」は、糖尿病性腎症、腎後性不全、腎前性高窒素血症および内因性腎不全を指す。
［発明を実施するための形態］
【００４９】
第一の態様では、本発明は、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むＡｎｇ２結合分子であって、前記免疫グロブリン単一可変ドメインが３個の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１が配列番号１６８〜１７０において示すアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号１７１〜１７３において示すアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有し、かつＣＤＲ３が配列番号１７４〜１７７において示すアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有するＡｎｇ２結合分子に関する。
【００５０】
ＣＤＲ１は
配列番号１６８  DYAIG
配列番号１６９  DYALG
配列番号１７０  YYAIG
から選択される配列を有する。
ＣＤＲ２は
配列番号１７１  AIRSSGGSTYYADSVKG
配列番号１７２  CIRCSGGSTYYADSVKG
配列番号１７３  CISSSGGITYYADSVKG
から選択される配列を有する。
ＣＤＲ３は
配列番号１７４  VPAGRLRFGEQWYPLYEYDA
配列番号１７５  VPAGRLRYGEQWYPIYEYDA
配列番号１７６  SIVPRSKLEPYEYDA
配列番号１７７  DSGGYIDYDCSGLGYDY
から選択される配列を有する。
【００５１】
好ましい実施形態によれば、Ａｎｇ２結合分子は免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、
（ａ）ＣＤＲ１は配列番号１６８において示すアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号１７１において示すアミノ酸配列を有し、かつＣＤＲ３は配列番号１７４において示すアミノ酸配列を有する、または
（ｂ）ＣＤＲ１は配列番号１６８において示すアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号１７１において示すアミノ酸配列を有し、かつＣＤＲ３は配列番号１７５において示すアミノ酸配列を有する、または
（ｃ）ＣＤＲ１は配列番号１６９において示すアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号１７２において示すアミノ酸配列を有し、かつＣＤＲ３は配列番号１７６において示すアミノ酸配列を有する、または
（ｄ）ＣＤＲ１は配列番号１７０において示すアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号１７３において示すアミノ酸配列を有し、かつＣＤＲ３は配列番号１７７において示すアミノ酸配列を有する。
【００５２】
別の好ましい実施形態によれば、Ａｎｇ２結合分子は免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、前記免疫グロブリン単一可変ドメインはＶＨＨまたはドメイン抗体である。
さらにより好ましい実施形態によれば、Ａｎｇ２結合分子は免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、前記免疫グロブリン単一可変ドメインはＶＨＨである。
具体的実施形態によれば、前記ＶＨＨは配列番号１６７、１６６、１２９および１３８からなる群から選択される配列を有する免疫グロブリン単一可変ドメインからなる。
別の態様において本発明は、前記免疫グロブリン単一可変ドメインからなるＡｎｇ２結合分子に関する。
【００５３】
本発明によるＡｎｇ２結合剤の配列は、それらの結合活性の著しい低下無しに、それらのＮ末端で修飾することができる（すなわち、第一アミノ酸の欠失または交換）。この修飾は、（例えば、大腸菌だけには限らないがこれを含めた）細菌宿主における細胞内／細胞質発現中、Ｎ末端メチオニンの同時／翻訳後切断を助長する。
一態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインからなる前記ＶＨＨにＮ末端で修飾または交換があり、前記修飾は第一アミノ酸の欠失であり、前記交換は第一アミノ酸と別のアミノ酸の置換である。
好ましい一実施形態では、Ｎ末端上の第一アミノ酸は、例えばアラニン（Ａ）によって置換されたバリン（Ｖ）またはアスパラギン酸（Ｄ）である。
【００５４】
治療用途を鑑みて改善された性質、例えば高いアフィニティーまたは低い免疫原性を有するＡｎｇ２結合要素は、（例えば、合成、ランダムまたは天然に存在する免疫グロブリン配列から始める）アフィニティー成熟、ＣＤＲ移植、ヒト化、異なる免疫グロブリン配列由来の断片の組合せ、重複プライマーを使用するＰＣＲ構築、および当業者によく知られている免疫グロブリン配列を操作するための類似の技法、または任意の前述の任意の適切な組合せなどの技法により、個々のＡｎｇ２結合要素から得ることができる。例えば、標準的な手引き、ならびにさらなる記載および実施例を参照。
高いアフィニティーを有する本発明のＡｎｇ２結合要素は、別のＡｎｇ２結合要素のアフィニティー成熟により得ることが好ましく、アフィニティー成熟分子に関して後者は「親」Ａｎｇ２結合要素となる。
したがって、さらに別の好ましい実施形態では、本発明のＡｎｇ２結合分子は、前に定義した親免疫グロブリン単一可変ドメインのアフィニティー成熟によって得た免疫グロブリン単一可変ドメインである。
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、ＶＨＨのアフィニティー成熟によって得た免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
【００５５】
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１、１７および８０において示すアミノ酸配列を有するＶＨＨのヒト化に使用されている免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１２７、１３２および１４６において示すアミノ酸配列を有するＶＨＨのヒト化によって得た免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
さらに本発明は、前に定義したＶＨＨのアフィニティー成熟および／または配列最適化によって得たＡｎｇ２結合分子、例えば配列番号１６７、１６６、１２９および１３８として示すアミノ酸配列を有するＶＨＨの配列最適化によって得たＶＨＨに関する。
別のより好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１６７において示すアミノ酸配列を有するＶＨＨのアフィニティー成熟によって得た免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
さらにより好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１６６において示すアミノ酸配列を有するＶＨＨのアフィニティー成熟によって得た免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
【００５６】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１２９において示すアミノ酸配列を有するＶＨＨのアフィニティー成熟によって得た免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
他のさらなる好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１３８において示すアミノ酸配列を有するＶＨＨのアフィニティー成熟によって得た免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
【００５７】
さらに別の実施形態では、本発明の代表的なクラスのＡｎｇ２結合免疫グロブリン単一可変ドメインまたは本発明のポリペプチドにおいて存在するＡｎｇ２結合免疫グロブリン単一可変ドメインは、すなわち重鎖抗体のＶＨＨドメイン中の対応する位置（複数可）に存在する１つまたは複数のアミノ酸残基によって従来型４鎖抗体由来の天然可変重鎖のアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸残基が置換されている、「ラクダ化」された天然に存在するＶＨドメインのアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有する。当業者には明らかであるそれ自体が知られている方法で、これを実施することができ、ＷＯ１９９４／０４６７８をさらに参照されたい。
このようなラクダ化は、ＶＨ−ＶＬ界面に存在するアミノ酸位置およびいわゆるＣａｍｅｌｉｄａｅ  Ｈａｌｌｍａｒｋ残基で優先的に行うことができる（例えばＷＯ１９９４／０４６７８も参照）。このような「ヒト化」および「ラクダ化」技法、ならびにこれらと一致する好ましいフレームワーク領域配列の詳細な記載は、例えばＷＯ２００６／０４０１５３の４６ページと９８ページおよびＷＯ２００６／１２２７８６の１０７ページからさらに得ることができる。
【００５８】
本発明のＡｎｇ２結合要素、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインおよびまたはそれらを含有するポリペプチドは、Ａｎｇ２分子内の１つまたは複数のエピトープと特異的に結合する１つまたは複数の免疫グロブリン単一可変ドメインをそれらが含む点で、Ａｎｇ２に対する特異性を有する。
Ａｎｇ２結合要素とその抗原Ａｎｇ２の特異的結合は、例えば本明細書に記載するアッセイ、スキャッチャード解析および／または競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡおよびＥＬＩＳＡ）、およびサンドウィッチ競合アッセイ、および当技術分野でそれ自体が知られているこれらの異なる変形を含めた、それ自体が知られている任意の適切な方法において決定することができる。
【００５９】
抗原Ａｎｇ２に関して、本発明のＡｎｇ２結合要素、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインは、その種に関するものに限られない。したがって、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインまたはそれらを含有するポリペプチドは、ヒトにおける治療目的を意図する場合、ヒトＡｎｇ２と結合することが好ましい。しかしながら、別の哺乳動物種由来のＡｎｇ２と結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン、またはそれらを含有するポリペプチドも本発明の範囲内にある。一種のＡｎｇ２型と結合する本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、１つまたは複数の他種由来のＡｎｇ２と交差反応する可能性がある。例えば、ヒトＡｎｇ２と結合する本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、１つまたは複数の他の霊長類種のＡｎｇ２と、および／または疾患の動物モデル、例えばサル（特にカニクイザルまたはアカゲザル）、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、および特に血管新生に対するＡｎｇ２媒介効果と関係がある疾患および障害の動物モデル（本明細書で言及する種および動物モデルなど）で使用する１つまたは複数の動物種由来のＡｎｇ２と、交差反応性を示す可能性がある。このような交差反応性を示す本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、研究および／または薬剤開発において有利である。そのことによって、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインを、サル、特にカニクイザルまたはアカゲザル、またはマウスおよびラットなどの承認済み疾患モデルにおいて試験できるからである。
【００６０】
さらに、本発明のＡｎｇ２結合要素は、それらが対象とするＡｎｇ２の特異的ドメインまたは抗原決定基によって限定または定義されない。治療用Ａｎｇ２アンタゴニストの開発における動物モデルとして使用する目的のヒト以外の種に由来する、１つまたは複数のＡｎｇ２分子との交差反応性の点において、Ａｎｇ２結合要素は、ヒトＡｎｇ２と高度の同一性を有する対象Ａｎｇ２領域中のエピトープを認識することが好ましい。例えば、マウスモデルを使用する点において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、Kim H-Z,Jung K,Kim HM,Cheng Y,and Koh GY(2009)中で公開されたＦＬＤ−ドメイン内に全体または部分が位置するエピトープを認識する。設計型アンギオポイエチン−２変異体、ペンタマーＣＯＭＰ−Ａｎｇ２はＴｉｅ２受容体を強く活性化し血管新生を刺激した。Biochim Biophys Acta1793,772-780。
したがって好ましい実施形態によれば、本発明は、Ａｎｇ２結合要素、特に免疫グロブリン単一可変ドメインまたはそれらを含有するポリペプチドに関するものであり、前記免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＦＬＤドメイン内に全体または部分が含有されるエピトープと結合する群から選択される（配列番号１８８〜１９０）。
【００６１】
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、（表面プラズモン共鳴分析法により決定して）、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、５００ｐＭ未満などのアフィニティーでＡｎｇ２と結合することが好ましい。
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定して、１０-6〜１０-10モル／リットル以下の範囲、より好ましくは１０-8〜１０-10モル／リットル以下の範囲、およびさらにより好ましくは１０-9〜１０-10モル／リットル以下の範囲のＩＣ50値を有することが好ましい。
【００６２】
本発明の非制限的ただし好ましい実施形態によれば、本発明のＡｎｇ２結合免疫グロブリン単一可変ドメインまたはそれらを含有するポリペプチドは、１０-5〜１０-12モル／リットル（Ｍ）以下、および好ましくは１０-7〜１０-12モル／リットル（Ｍ）以下、およびより好ましくは１０-8〜１０-12モル／リットル（Ｍ）の解離定数（ＫD）、および／または少なくとも１０-7Ｍ-1、好ましくは少なくとも１０-8Ｍ-1、より好ましくは少なくとも１０-9Ｍ-1、少なくとも１０-12Ｍ-1などの会合定数（ＫA）で、および特に５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、５００ｐＭ未満などのＫDでＡｎｇ２と結合する。Ａｎｇ２に対する本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインのＫDおよびＫA値を決定することができる。
別の実施形態によれば、免疫グロブリン単一可変ドメインは本明細書で定義するドメイン抗体である。
【００６３】
本発明の単一特異性結合分子において存在する免疫グロブリン単一可変ドメインは、すなわち重鎖抗体のＶＨＨドメイン中の対応する位置（複数可）に存在する１つまたは複数のアミノ酸残基によって従来型４鎖抗体由来の天然可変重鎖のアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸残基が置換されている、「ラクダ化」された天然に存在するＶＨドメインのアミノ酸配列に相当する配列を有する。当業者には明らかであるそれ自体が知られている方法で、これを実施することができ、ＷＯ１９９４／０４６７８をさらに参照されたい。このようなラクダ化は、ＶＨ−ＶＬ界面に存在するアミノ酸位置およびいわゆるＣａｍｅｌｉｄａｅ  Ｈａｌｌｍａｒｋ残基で優先的に行うことができる（例えばＷＯ１９９４／０４６７８も参照）。このような「ヒト化」および「ラクダ化」技法、ならびにこれらと一致する好ましいフレームワーク領域配列の詳細な記載は、例えばＷＯ２００６／０４０１５３の４６ページと９８ページおよびＷＯ２００６／１２２７８６の１０７ページからさらに得ることができる。
好ましい実施形態では、Ａｎｇ２分子内の１つまたは複数のエピトープと特異的に結合する１つの免疫グロブリン単一可変ドメインをそれらが含む点で、結合要素はＡｎｇ２に対する特異性を有する。
【００６４】
結合要素とその抗原Ａｎｇ２の特異的結合は、例えば本明細書に記載するアッセイ、スキャッチャード解析および／または競合結合アッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡおよびＥＬＩＳＡ）、およびサンドウィッチ競合アッセイなど、および当技術分野でそれ自体が知られているこれらの異なる変形を含めた、それ自体が知られている任意の適切な方法において決定することができる。
【００６５】
抗原Ａｎｇ２に関して、免疫グロブリン単一可変ドメインは、その種に関するものに限られない。したがって免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒトにおける治療目的を意図する場合、ヒトＡｎｇ２と結合することが好ましい。しかしながら、別の哺乳動物種由来のＡｎｇ２と結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン、またはそれらを含有するポリペプチドも本発明の範囲内にある。一種のＡｎｇ２型と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、１つまたは複数の他種由来の各抗原と交差反応する可能性がある。例えば、ヒト抗原と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、１つまたは複数の他の霊長類種の各抗原と、および／または疾患の動物モデル、例えばサル（特にカニクイザルまたはアカゲザル）、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、および特にＡｎｇ２の阻害によって調節することができる疾患および障害の動物モデル（本明細書で言及する種および動物モデルなど）で使用する１つまたは複数の動物種由来の抗原と、交差反応性を示す可能性がある。このような交差反応性を示す本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、研究および／または薬剤開発において有利である。そのことによって、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインを、サル、特にカニクイザルまたはアカゲザル、またはマウスおよびラットなどの承認済み疾患モデルにおいて試験できるからである。
さらに結合要素は、それらが対象とする抗原の特異的ドメインまたは抗原決定基によって限定または定義されない。治療用Ａｎｇ２アンタゴニストの開発における動物モデルとして使用する目的のヒト以外の種に由来する、１つまたは複数の抗原分子との交差反応性の点において、結合要素は、ヒト抗原と高度の同一性を有する各抗原の領域中のエピトープを認識することが好ましい。例えば、マウスモデルを使用する点において、本発明の単一特異性結合分子中に含有された抗Ａｎｇ２免疫グロブリン単一可変ドメインは、Ａｎｇ２のＥＧＦ−ドメイン内に全体または一部分が位置するエピトープを認識し、これはヒトとマウスの間の高い同一性を示す。
したがって好ましい実施形態によれば、本発明の単一特異性結合分子は、ＦＬＤドメイン内に全体または部分が含有されるエピトープと結合する配列番号１６７、１６６、１２９および１３８からなる群から選択される免疫グロブリン単一可変ドメインであるＡｎｇ２結合分子を含む。
【００６６】
本発明はさらに、本発明によるＡｎｇ２結合分子をコードする核酸に関する。
【００６７】
好ましい実施形態では、大腸菌において発現されるとき本発明によるＡｎｇ２結合分子は、以下の配列から選択されるヌクレオチド配列によってコードされている。
配列番号１７８
GAGGTACAGCTGGTCGAGTCAGGTGGCGGATTAGTGCAGCCTGGGGGTTCTCTGCGCTTATCTTGTGCCGCATCAGGCTTCACACTGGATGACTACGCCATCGGCTGGTTCCGGCAAGCGCCTGGAAAAGAACGCGAAGGTGTTTCAGCAATCCGTTCAAGCGGTGGTTCAACATATTACGCCGACTCTGTTAAAGGACGCTTCACCATTAGCTCCGACAATAGTAAAAATACAGTCTACTTACAAATGAACAGTTTACGCCCAGAAGATACTGCGGTATACTATTGCGCTGCCGTGCCTGCTGGTCGCTTACGCTTTGGCGAGCAATGGTATCCTCTGTACGAGTACGACGCCTGGGGACAGGGTACGCTGGTAACGGTTTCAAGC
配列番号１７９
GAAGTGCAACTGGTTGAGTCAGGTGGCGGACTGGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGCCTGAGTTGCGCAGTTAGCGGTATTACCCTGGATGATTATGCAATTGGTTGGTTTCGCCAAGCCCCAGGCAAAGAGCGTGAAGGCGTTAGCGCAATTCGTAGCAGCGGTGGTAGCACCTATTATGCCGATTCAGTTAAAGGCCGTTTTACGATCAGCAGCGATAACAGTAAAAACACGGTTTATCTGCAAATGAACTCATTACGTCCAGAGGACACTGCAGTTTACTATTGCGCAGCAGTTCCGGCAGGTCGTCTGCGTTATGGTGAACAGTGGTATCCGATTTATGAATATGATGCATGGGGTCAAGGTACACTGGTTACAGTGAGTAGC
配列番号１８０
GAAGTGCAGTTAGTCGAAAGTGGCGGAGGCCTGGTACAACCTGGTGGCAGTCTGCGCTTATCTTGTGCCGCTTCAGGTTTTACATTCGACGACTACGCCCTGGGGTGGTTCCGGCAAGCGCCTGGAAAAGAACGTGAGGGCGTTTCATGCATTCGTTGTTCAGGTGGTTCAACCTATTATGCCGATAGTGTAAAAGGTCGGTTCACCATTAGTAGCGACAATAGCAAGAATACAGTCTATCTGCAAATGAACTCTTTACGTCCTGAAGATACTGCGGTGTACTACTGCGCTGCATCAATCGTTCCTCGTTCAAAACTTGAACCTTACGAGTACGACGCCTGGGGTCAGGGTACGTTAGTAACGGTGTCAAGC
および
配列番号１８１
GAAGTGCAACTGGTTGAGTCAGGTGGCGGTTTAGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGCCTGAGTTGCGCAGCCAGCGGTTTTGCACTGGATTATTATGCAATTGGTTGGTTTCGCCAAGCCCCAGGCAAAGAGCGTGAAGGCGTTAGCTGTATTAGCAGCAGCGGTGGTATTACCTATTATGCCGATTCAGTTAAAGGCCGTTTTACGATCTCTCGTGATAATAGTAAAAACACGGTTTACCTGCAGATGAACTCATTAAGACCAGAGGACACTGCAGTTTACTATTGTGCAACCGATAGCGGTGGCTATATTGATTATGATTGTAGCGGTCTGGGCTACGATTATTGGGGACAAGGTACGCTGGTGACAGTTAGCAGC
【００６８】
本発明は、本発明の単一特異性結合分子をコードする核酸分子に関する。このような核酸分子は本明細書では「本発明の核酸」と呼ぶこともでき、本明細書で定義する遺伝子構築物の形であってもよい。本発明の核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ（目的の宿主細胞または宿主生物での発現に特異的に適合させたコドンを使用したＤＮＡなど）であってよい。本発明の一実施形態によれば、本発明の核酸は、本明細書で前に定義したようにほぼ単離された形である。
【００６９】
本発明のさらなる態様は、本発明による前記Ａｎｇ２結合分子をコードする核酸分子を含む発現ベクターに関する。
好ましい実施形態では、本発明の核酸は例えばプラスミド、コスミドもしくはＹＡＣなどのベクターの形であってもよく、その中に存在する可能性があり、および／またはその一部分である可能性がある。
【００７０】
ベクターは特に発現ベクター、すなわち単一特異性結合分子の発現をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで、（すなわち、適切な宿主細胞、宿主生物および／または発現系において）もたらすことができるベクターであってよい。このような発現ベクターは、例えばプロモーター（複数可）、エンハンサー（複数可）、ターミネーター（複数可）などの１つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結した、少なくとも１個の本発明の核酸を一般に含む。特異的宿主中での特異的配列の発現を鑑みた、このようなエレメントおよびそれらの選択は当業者の一般常識である。例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、組み込み因子、選択マーカー、リーダー配列、レポーター遺伝子などの、本発明の二重特異性分子の発現に有用または必要な制御エレメントおよび他のエレメントの具体例は、例えばＷＯ２００６／０４０１５３の１３１〜１３３ページで開示されている。
【００７１】
このようなベクターは、１つまたは複数の本発明の単一特異性結合分子を発現する、またはこれらを発現することができる、および／または本発明の核酸を含有する。
本発明の核酸は、本明細書で与える本発明のポリペプチドに関するアミノ酸配列の情報に基づき、それ自体が知られている方法で調製または入手することができ（例えば、自動ＤＮＡ合成および／または組換えＤＮＡ技術により）、および／または適切な天然源から単離することができる。
【００７２】
別の態様では本発明は、本発明によるＡｎｇ２結合分子をコードする核酸分子を含む、１つまたは複数の発現ベクターを有する宿主細胞に関する。
特に好ましい実施形態によれば、前記宿主細胞は細菌細胞であり、他の有用な細胞は酵母細胞、真菌細胞または哺乳動物細胞である。
適切な細菌細胞には、大腸菌、プロテウス、シュードモナスの株などのグラム陰性菌株、およびバシラス、ストレプトミセス、スタフィロコッカス、およびラクトコッカスの株などのグラム陽性菌株由来の細胞がある。適切な真菌細胞には、トリコデルマ、ニューロスポラ、およびアスペルギルスの種由来の細胞がある。適切な酵母細胞には、サッカロミセス（例えばサッカロミセスセレビシアエ）、シゾサッカロミセス（例えばシゾサッカロミセスポンベ）、ピキア（例えばピキアパストリスおよびピキアメタリカ）、およびハンセヌラの種由来の細胞がある。
【００７３】
適切な哺乳動物細胞には、例えばＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞などがある。しかしながら、両生類細胞、昆虫細胞、植物細胞、および異種タンパク質の発現用に当技術分野で使用される任意の他の細胞も使用することができる。
さらに本発明は、本発明の単一特異性結合分子の製造法を提供し、このような方法は一般に、
本発明の単一特異性結合分子の発現を可能にする条件下で、単一特異性結合分子をコードすることができる核酸を含む宿主細胞を培養するステップ、
培養由来の宿主細胞により発現されたポリペプチドを回収または単離するステップ、および
本発明の単一特異性結合分子を場合によってはさらに精製および／または修飾および／または製剤化するステップを含む。
【００７４】
好ましい実施形態は、配列番号１６７、１６６、１２９および１３８を有するＡｎｇ２結合分子を生成するための方法であって、
（ａ）１つまたは複数の前記ベクターで宿主細胞をトランスフェクトするステップ、
（ｂ）前記宿主細胞を培養するステップ、および
（ｃ）前記Ａｎｇ２結合分子を回収し精製するステップ
を含む方法を示す。
産業規模での生成に関して、好ましい宿主生物には、大規模発現、生成および発酵、ならびに特に大規模な医薬的発現、生成および発酵に適した、大腸菌、ピキアパストリス、およびサッカロミセスセレビシアエの株がある。
具体的な発現系の選択は、特定翻訳後修飾、より具体的にはグリコシル化に関する要件に一部分は依存する。グリコシル化が望ましいまたは必要な本発明の単一特異性結合分子の生成は、発現タンパク質をグリコシル化する能力を有する哺乳動物発現宿主の使用を必要とし得る。この点で、得られるグリコシル化パターン（すなわち、結合残基の種類、数および位置）が、発現に使用する細胞または細胞系に依存することは、当業者には明らかである。
【００７５】
本発明の単一特異性結合分子は、前述のように細胞において細胞内で（例えば、サイトゾル内、周辺質内または封入体内で）生成することができ、次いで宿主細胞から単離し場合によってはさらに精製することができ、またはそれらは細胞外で（例えば、宿主細胞を培養する培地で）生成することができ、次いで培養培地から単離し場合によってはさらに精製することができる。
適切な具体的発現ベクター、形質転換またはトランスフェクション法、選択マーカー、タンパク質発現の誘導法などの、ポリペプチドの組換え生成に使用するための方法および試薬、培養条件は、当技術分野で知られている。同様に、本発明のポリペプチドの製造法において有用なタンパク質の単離および精製技法は、当業者によく知られている。
【００７６】
これらのペプチドは、本発明のＶＨＨ由来のＣＤＲ３に相当する。それらは、特にそれらをコードする核酸分子は、免疫グロブリン鎖中のＣＤＲ３を置換するためのＣＤＲ移植、または非免疫グロブリン足場、例えばプロテアーゼ阻害剤、ＤＮＡ結合タンパク質、チトクロームｂ５６２、ヘリックスバンドルタンパク質、ジスルフィド架橋ペプチド、リポカリンもしくはアンチカリンへの挿入に有用であり、したがってこのような足場に標的結合性をもたらす。ＣＤＲ移植の方法は当技術分野でよく知られており、例えば（げっ歯類抗体由来のＣＤＲのヒト抗体のＦｖフレームワークへの移植を通常含む）抗体のヒト化に広く使用されている。
【００７７】
本発明のＣＤＲ３を含有する免疫グロブリンまたは非免疫グロブリン足場を得るため、このような分子をコードするＤＮＡは、分子生物学の標準的な方法に従い、例えば遺伝子合成によって、オリゴヌクレオチドアニーリングによって、または例えばDaugherty et al.,1991,Nucleic Acids Research,Vol.19,9,2471-2476により記載された重複ＰＣＲ断片によって得ることができる。非免疫グロブリン足場にＶＨＨＣＤＲ３を挿入するための方法はNicaise et al.,2004,Protein Science,13,1882-1891によって記載されている。
さらに本発明は、少なくとも１個の本発明の単一特異性結合分子、および場合によってはそれ自体が知られているこのような組成物の１つまたは複数のさらなる要素を、すなわち目的とする組成物の用途に応じて、含有または包含する製品または組成物に関する。
さらなる態様では本発明は、医薬品としての本発明の単一特異性結合分子の使用に関する。
【００７８】
さらに別の態様では、本発明は、癌、癌性疾患または眼部疾患を治療するための方法における本発明の単一特異性結合分子の使用に関する。
医薬用途のため、本発明の単一特異性結合分子またはそれを含有するポリペプチドを、少なくとも１個の本発明の単一特異性結合分子、および少なくとも１個の生理的に許容される担体、希釈剤または賦形剤および／またはアジュバント、および場合によっては１つまたは複数のさらなる薬学的に活性があるポリペプチドおよび／または化合物を含む医薬調製物または組成物として製剤化することができる。非制限的な例として、このような製剤は、経口投与、（静脈内、筋肉内または皮下注射または静脈内注入などによる）非経口投与、局所投与、吸入、皮膚パッチ、インプラント、座薬などによる投与に適した形であってよい。投与の形式に応じて固体、半固体または液体であってよい、このような適切な投与形、ならびにその調製において使用するための方法および担体は当業者には明らかであり、本明細書でさらに記載する。
したがって、さらなる態様において本発明は、少なくとも１個の単一特異性結合分子、特に本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインまたはそれを含有するポリペプチド、および少なくとも１個の適切な（すなわち医薬用途に適した）担体、希釈剤または賦形剤、および場合によっては１つまたは複数のさらなる活性物質を含有する医薬組成物に関する。
【００７９】
本発明の単一特異性結合分子は、それ自体が知られている任意の適切な方法で製剤化および投与することができる。特に免疫グロブリン単一可変ドメインに関しては、例えばＷＯ２００４／０４１８６２、ＷＯ２００４／０４１８６３、ＷＯ２００４／０４１８６５、ＷＯ２００４／０４１８６７およびＷＯ２００８／０２００７９、ならびに標準的手引き、Remington's Pharmaceutical Sciences,18thEd.,Mack Publishing Company,USA(1990),Remington,the Science and Practice of Pharmacy,21thEdition,Lippincott Williams and Wilkins(2005);またはthe Handbook of Therapeutic Antibodies(S.Dubel,Ed.),Wiley,Weinheim,2007など（例えば２５２〜２５５ページ参照）を参照。
【００８０】
例えば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、従来型抗体および抗体断片（ＳｃＦｖおよびダイアボディ含む）および他の薬学的に活性があるタンパク質に関する、それ自体が知られている任意の方法で製剤化および投与することができる。このような製剤、およびこれらを調製するための方法は当業者には明らかであり、例えば、非経口投与（例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、管腔内、動脈内もしくはクモ膜下投与）に適した、または局所（すなわち、経皮もしくは真皮内）投与に適した調製を含む。
【００８１】
非経口投与に適した調製物は、例えば注入または注射に適した、滅菌溶液、懸濁液、分散剤またはエマルジョンであってよい。このような調製物に適した担体または希釈剤には、例えば非制限的に、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、およびハンクス液などの滅菌水および薬学的に許容される水性バッファーおよび溶液、水油、グリセロール、エタノール、プロピレングリコールなどのグリコール、またはならびに鉱油、動物油および植物油、例えばピーナッツ油、ダイズ油、ならびにこれらの適切な混合物がある。通常、水溶液または懸濁液が好ましい。
したがって、本発明の単一特異性結合分子は全身、例えば経口的に、不活性希釈剤または吸収性可食担体などの薬学的に許容される賦形剤と組合せて投与することができる。経口治療投与のため、本発明の二重特異性結合分子は１つまたは複数の賦形剤と組合せることができ、摂取可能な錠剤、口内錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、カシェ剤などの形で使用することができる。このような組成物および調製物は、少なくとも０．１％の本発明のＡｎｇ２結合分子を含有しなければならない。組成物および調製物中のそれらの割合は当然ながら変えることができ、所与の単位剤形の約２重量％〜約６０重量％であることが好都合であり得る。このような治療上有用な組成物における本発明の二重特異性結合分子の量は、有効な投薬レベルが得られるような量である。
【００８２】
錠剤、ピル、カプセルなどは、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤および甘味剤または香味剤、例えばＷＯ０８／０２００７９の１４３〜１４４ページに言及されたものも含有し得る。単位剤形がカプセルである場合、それは前述のタイプの物質以外に、植物油またはポリエチレングリコールなどの液体担体を含有し得る。様々な他の物質がコーティングとして、または他の場合、固体状単位剤形の物理形を修飾するため存在する可能性がある。例えば錠剤、ピル、またはカプセルは、ゼラチン、ワックス、セラックまたは糖などでコーティングすることができる。シロップまたはエリキシル剤は、本発明の二重特異性結合分子、甘味剤としてスクロースまたはフルクトース、防腐剤としてメチルおよびプロピルパラベン、チェリーもしくはオレンジフレーバーなどの色素および香味剤を含有し得る。当然ながら、任意の単位剤形の調製において使用する任意の物質は、利用する量で薬学的に許容され実質的に無毒でなければならない。さらに本発明の二重特異性結合分子は、徐放性調製物およびデバイスに組み込むことが可能である。
【００８３】
経口投与用の調製物および製剤には腸溶性コーティングを施すこともでき、これにより胃内環境に対する耐性を本発明の構築物に与え腸を通過させることが可能である。より一般的には、経口投与用の調製物および製剤は、胃腸管の任意の望ましい部位への送達に適したように製剤化することができる。さらに、適切な座薬を胃腸管への送達に使用することができる。
本発明の単一特異性結合分子は、ＷＯ０８／０２００７９の１４４および１４５ページにさらに記載されたように、注入または注射により静脈内もしくは腹腔内投与することもできる。
本発明の単一特異性結合分子の局所投与に関しては、ＷＯ０８／０２００７９の１４５ページにさらに記載されたように、固体または液体であってよい皮膚学的に許容される担体と組合せ、組成物または製剤として皮膚にそれらを投与することが一般に望ましい。
【００８４】
一般に、ローションなどの液体組成物中の本発明の単一特異性結合分子の濃度は約０．１重量％〜２５重量％、好ましくは約０．５重量％〜１０重量％である。ゲルまたは粉末などの半固体または固体組成物中の濃度は約０．１重量％〜５重量％、好ましくは約０．５重量％〜２．５重量％である。
【００８５】
治療における使用に必要な本発明の単一特異性結合分子の量は、選択する個々の単一特異性結合分子だけでなく、投与の経路、治療する状態の性質、ならびに患者の年齢および状態によっても変わり、最終的には担当医または臨床医の裁量による。さらに、本発明の単一特異性結合分子の用量は、標的細胞、腫瘍、組織、移植片、または臓器に応じて変わる。望ましい用量は一回用量で、または適切な間隔、例えば１日当たり２、３、４回またはそれより多くの小用量で投与する分割用量として好都合に示すことができる。小用量自体は、例えば幾つかの別個ばらばらに区切った投与に、注入器からの多数回吸入または眼部への複数回滴剤適用などに、さらに分けることができる。
【００８６】
投与レジメンは長期間、毎日の治療を含むことができる。「長期間」によって、少なくとも２週間、および好ましくは数週間、数ヶ月、または数年の間を意味する。この投薬範囲において必要な改変は、本明細書の教示を考慮し単なる通常の実験を使用して、当業者により決定することができる。Remington's Pharmaceutical Sciences(Martin,E.W.,ed.4),Mack Publishing Co.,Easton,PAを参照。何らかの合併症があった場合、個々の医師により投薬を調節することもできる。
さらなる実施形態によれば、本発明は、
血管新生に対するＡｎｇ２媒介および／またはＡｎｇ２関連効果と関係がある、または本発明の単一特異性結合分子を用いたＮｏｔｃｈシグナル伝達経路および／またはＴｉｅ２シグナル伝達経路の調節により予防、治療または緩和することができる、特に人間における障害、疾患または状態の予防、治療および／または緩和のため、
このような療法を必要とする患者の治療法であって、薬学的に活性がある量の少なくとも１個の本発明の単一特異性結合分子、例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン、またはそれらを含有する医薬組成物を、必要性のある対象に投与するステップを含む方法、
血管新生に対するＡｎｇ２媒介および／またはＡｎｇ２関連効果と関係がある障害、疾患または状態を予防、治療または緩和するための医薬品の調製、
前述の目的で使用する医薬組成物または医薬品における活性成分として
などの治療目的での、本発明の単一特異性結合分子、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインまたはそれらを含有するポリペプチドの使用に関する。
【００８７】
具体的な態様では、前記障害、疾患または状態は、本明細書で定義する癌または癌性疾患である。
好ましい実施形態では、本発明は、乳癌、腎細胞癌、卵巣癌および膵臓癌などの癌および癌性疾患を治療するための前記医薬組成物に関する。
別の態様によれば、疾患は、血管新生に対するＡｎｇ２媒介および／またはＡｎｇ２媒介効果と関係がある、または単一特異性結合分子を用いたＮｏｔｃｈシグナル伝達経路および／またはＴｉｅ２シグナル伝達経路の調節により治療または緩和することができる眼部疾患である。
別の好ましい実施形態では、本発明は、加齢黄斑変性および糖尿病性網膜症などの眼部疾患を治療するための前記医薬組成物に関する。
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、慢性腎臓病を治療するための前記医薬組成物に関する。
治療する癌／癌性疾患、眼部疾患および／または慢性腎臓病に応じて、本発明の単一特異性結合分子を単独で、または１つまたは複数の他の治療剤と組合せて使用することができる。
【００８８】
好ましい実施形態では、本発明は、癌細胞におけるＤＮＡ損傷修復剤および／または抗有糸分裂薬のような化学療法剤（例えばタキソール）、または血管新生を阻害する治療活性化合物（抗ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ受容体阻害剤などの抗血管新生薬、例えばアバスチン、ニンテダニブ（ｎｉｔｅｄａｎｉｂ）もしくはスニチニブ）、またはｍＴＯＲ阻害剤などのシグナル伝達経路阻害剤（例えばテムシロリムス）、またはホルモン療法剤（例えばタモキシフェン）などの１つまたは複数の他の治療剤をさらに含む、１つまたは複数の前記Ａｎｇ２結合分子を活性成分として含む医薬組成物に関する。
他の治療剤を、場合によっては同じ医薬調製物の要素として同時に、または単一特異性結合分子の投与の前後に、投与することができる。
【００８９】
特定の実施形態では、他の治療剤は、非制限的に（および各リガンドを含めた受容体の場合）、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＨＥＲ２−ｎｅｕ、Ｈｅｒ３、ＡｕｒｏｒａＡ、ＡｕｒｏｒａＢ、ＰＬＫおよびＰＩ３キナーゼ、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＥＲ、Ｒａｆ、ＫＳＰ、ＰＤＫ１、ＰＴＫ２、ＩＧＦ−ＲまたはＩＲの阻害剤の群から選択される１つまたは複数の阻害剤であってよい。
他の治療剤のさらなる例は、ＣＤＫ、Ａｋｔ、ｓｒｃ／ｂｃｒａｂｌ、ｃＫｉｔ、ｃＭｅｔ／ＨＧＦ、ｃ−Ｍｙｃ、Ｆｌｔ３、ＨＳＰ９０、ｈｅｄｇｅｈｏｇアンタゴニストの阻害剤、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｍｅｋ、ｍＴｏｒ、ＮＦｋａｐｐａＢ、プロテアソーム、Ｒｈｏの阻害剤、ｗｎｔシグナル伝達の阻害剤、またはユビキチン化経路の阻害剤、またはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の別の阻害剤である。
Ａｕｒｏｒａ阻害剤の例は、非制限的にＰＨＡ−７３９３５８、ＡＺＤ−１１５２、ＡＴ９２８３、ＣＹＣ−１１６、Ｒ−７６３、ＶＸ−６８０、ＶＸ−６６７、ＭＬＮ−８０４５、ＰＦ−３８１４７３５である。
ＰＬＫ阻害剤の一例はＧＳＫ−４６１３６４である。
ＶＥＧＦ阻害剤の例はアバスチン（Ｒｏｃｈｅ）、アフリベルセプト（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）である。
ｒａｆ阻害剤の例は、ＢＡＹ−７３−４５０６（さらにＶＥＧＦＲ阻害剤）、ＰＬＸ４０３２、ＲＡＦ−２６５（さらに追加的にＶＥＧＦＲ阻害剤）、ソラフェニブ（さらに追加的にＶＥＧＦＲ阻害剤）、およびＸＬ２８１である。
ＫＳＰ阻害剤の例は、イスピネシブ、ＡＲＲＹ−５２０、ＡＺＤ−４８７７、ＣＫ−１１２２６９７、ＧＳＫ２４６０５３Ａ、ＧＳＫ−９２３２９５、ＭＫ−０７３１、およびＳＢ−７４３９２１である。
【００９０】
ｓｒｃおよび／またはｂｃｒ−ａｂｌ阻害剤の例は、ダサチニブ、ＡＺＤ−０５３０、ボスチニブ、ＸＬ２２８（さらにＩＧＦ−１Ｒ阻害剤）、ニロチニブ（さらにＰＤＧＦＲおよびｃＫｉｔ阻害剤）、イマチニブ（さらにｃＫｉｔ阻害剤）、およびＮＳ−１８７である。
ＰＤＫ１阻害剤に関する一例はＢＸ−５１７である。
Ｒｈｏ阻害剤に関する一例はＢＡ−２１０である。
【００９１】
ＰＩ３キナーゼ阻害剤に関する例は、ＰＸ−８６６、ＢＥＺ−２３５（さらにｍＴｏｒ阻害剤）、ＸＬ４１８（さらにＡｋｔ阻害剤）、ＸＬ−１４７、およびＸＬ７６５（さらにｍＴｏｒ阻害剤）である。
ｃＭｅｔまたはＨＧＦの阻害剤に関する例は、ＸＬ−１８４（さらにＶＥＧＦＲ、ｃＫｉｔ、Ｆｌｔ３の阻害剤）、ＰＦ−２３４１０６６、ＭＫ−２４６１、ＸＬ−８８０（さらにＶＥＧＦＲの阻害剤）、ＭＧＣＤ−２６５（さらにＶＥＧＦＲ、Ｒｏｎ、Ｔｉｅ２の阻害剤）、ＳＵ−１１２７４、ＰＨＡ−６６５７５２、ＡＭＧ−１０２、およびＡＶ−２９９である。
ｃ−Ｍｙｃ阻害剤に関する一例はＣＸ−３５４３である。
【００９２】
Ｆｌｔ３阻害剤に関する例は、ＡＣ−２２０（さらにｃＫｉｔおよびＰＤＧＦＲの阻害剤）、ＫＷ２４４９、レスタウルチニブ（さらにＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＰＫＣの阻害剤）、ＴＧ−１０１３４８（さらにＪＡＫ２の阻害剤）、ＸＬ−９９９（さらにｃＫｉｔ、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲおよびＶＥＧＦＲの阻害剤）、スニチニブ（さらにＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲおよびｃＫｉｔの阻害剤）、およびタンズチニブ（さらにＰＤＧＦＲ、およびｃＫｉｔの阻害剤）である。
ＨＳＰ９０阻害剤に関する例はタネスピマイシン、アルベスピマイシン、ＩＰＩ−５０４およびＣＮＦ２０２４である。
ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤に関する例は、ＣＹＴ−９９７（さらにチューブリンと相互作用）、ＴＧ１０１３４８（さらにＦｌｔ３の阻害剤）、およびＸＬ−０１９である。
Ｍｅｋ阻害剤に関する例は、ＡＲＲＹ−１４２８８６、ＰＤ−３２５９０１、ＡＺＤ−８３３０、およびＸＬ５１８である。
ｍＴｏｒ阻害剤に関する例は、テムシロリムス、ＡＰ−２３５７３（さらにＶＥＧＦ阻害剤として作用）、エベロリムス（さらにＶＥＧＦ阻害剤）、ＸＬ−７６５（さらにＰＩ３キナーゼ阻害剤）、およびＢＥＺ−２３５（さらにＰＩ３キナーゼ阻害剤）である。
Ａｋｔ阻害剤に関する例はペリフォシン、ＧＳＫ−６９０６９３、ＲＸ−０２０１、およびトリシリビンである。
【００９３】
ｃＫｉｔ阻害剤に関する例はＡＢ−１０１０、ＯＳＩ−９３０（さらにＶＥＧＦＲ阻害剤として作用）、ＡＣ−２２０（さらにＦｌｔ３およびＰＤＧＦＲの阻害剤）、タンズチニブ（さらにＦｌｔ３およびＰＤＧＦＲの阻害剤）、アキシチニブ（さらにＶＥＧＦＲおよびＰＤＧＦＲの阻害剤）、ＸＬ−９９９（さらにＦｌｔ３、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＦＧＦＲの阻害剤）、スニチニブ（さらにＦｌｔ３、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲの阻害剤）、およびＸＬ−８２０（さらにＶＥＧＦＲおよびＰＤＧＦＲ阻害剤として作用）、イマチニブ（さらにｂｃｒ−ａｂｌ阻害剤）、ニロチニブ（さらにｂｃｒ−ａｂｌおよびＰＤＧＦＲの阻害剤）である。
ｈｅｄｇｅｈｏｇアンタゴニストに関する例はＩＰＩ−６０９およびＣＵＲ−６１４１４である。
【００９４】
ＣＤＫ阻害剤に関する例はセリシクリブ、ＡＴ−７５１９、Ｐ−２７６、ＺＫ−ＣＤＫ（さらにＶＥＧＦＲ２およびＰＤＧＦＲを阻害）、ＰＤ−３３２９９１、Ｒ−５４７、ＳＮＳ−０３２、ＰＨＡ−６９０５０９、およびＡＧ０２４３２２である。
プロテアソーム阻害剤に関する例はボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、およびＮＰＩ−００５２（さらにＮＦｋａｐｐａＢの阻害剤）である。
ＮＦｋａｐｐａＢ経路阻害剤に関する一例はＮＰＩ−００５２である。
ユビキチン化経路阻害剤に関する一例はＨＢＸ−４１１０８である。
好ましい実施形態では、他の治療剤は抗血管新生薬である。
【００９５】
抗血管新生薬に関する例は、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲおよびＶＥＧＦＲまたはそれぞれのリガンドの阻害剤（例えば、ペガプタニブのようなＶＥＧＦ阻害剤または抗ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブ）、およびサリドマイドであり、このような抗血管新生薬は、非制限的に、ベバシズマブ、モテサニブ、ＣＤＰ−７９１、ＳＵ−１４８１３、テラチニブ、ＫＲＮ−９５１、ＺＫ−ＣＤＫ（さらにＣＤＫの阻害剤）、ＡＢＴ−８６９、ＢＭＳ−６９０５１４、ＲＡＦ−２６５、ＩＭＣ−ＫＤＲ、ＩＭＣ−１８Ｆ１、ＩＭｉＤｓ（免疫調節薬）、サリドマイド誘導体ＣＣ−４０４７、レナリドミド、ＥＮＭＤ０９９５、ＩＭＣ−Ｄ１１、Ｋｉ２３０５７、ブリバニブ、セジラニブ、ＸＬ−９９９（さらにｃＫｉｔおよびＦｌｔ３の阻害剤）、１Ｂ３、ＣＰ８６８５９６、ＩＭＣ３Ｇ３、Ｒ−１５３０（さらにＦｌｔ３の阻害剤）、スニチニブ（さらにｃＫｉｔおよびＦｌｔ３の阻害剤）、アキシチニブ（さらにｃＫｉｔの阻害剤）、ベムラフェニブ（ＰＬＸ４０３２、ＲＧ７２０４またはＲＯ５１８５４２６としても知られ、ゼルボラフとして市販される）、Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害剤、ＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ）として知られるクリゾチニブおよびＲＯＳ１（ｃ−ｒｏｓ腫瘍形成遺伝子１、受容体チロシンキナーゼ）阻害剤、レスタウルチニブ（さらにＦｌｔ３およびＰＫＣの阻害剤）、バタラニブ、タンズチニブ（さらにＦｌｔ３およびｃＫｉｔの阻害剤）、パゾパニブ、ＧＷ７８６０３４、ＰＦ−３３７２１０、ＩＭＣ−１１２１Ｂ、ＡＶＥ−０００５、ＡＧ−１３７３６、Ｅ−７０８０、ＣＨＩＲ２５８、ソラフェニブトシレート（さらにＲａｆの阻害剤）、ＲＡＦ−２６５（さらにＲａｆの阻害剤）、バンデタニブ、ＣＰ−５４７６３２、ＯＳＩ−９３０、ＡＥＥ−７８８（さらにＥＧＦＲおよびＨｅｒ２の阻害剤）、ＢＡＹ−５７−９３５２（さらにＲａｆの阻害剤）、ＢＡＹ−７３−４５０６（さらにＲａｆの阻害剤）、ＸＬ８８０（さらにｃＭｅｔの阻害剤）、ＸＬ−６４７（さらにＥＧＦＲおよびＥｐｈＢ４の阻害剤）、ＸＬ８２０（さらにｃＫｉｔの阻害剤）、およびニロチニブ（さらにｃＫｉｔおよびｂｃｒ−ａｂｌの阻害剤）およびニテダニブから選択される。
【００９６】
他の治療剤はＥＧＦＲ阻害剤から選択することもでき、それは低分子量ＥＧＦＲ阻害剤または抗ＥＧＦＲ抗体であってよい。抗ＥＧＦＲ抗体に関する例は、非制限的にセツキシマブ、パニツムマブ、マツズマブであり、低分子量ＥＧＦＲ阻害剤に関する一例はゲフィチニブである。ＥＧＦＲモジュレーターに関する別の例はＥＧＦ融合毒素である。
【００９７】
本発明の二重特異性結合分子と組合せて使用するのに有用なＥＧＦＲおよびＨｅｒ２阻害剤の中には、ラパチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ、トラスツズマブ、ニモツズマブ、ザルツムマブ、バンデタニブ（さらにＶＥＧＦＲの阻害剤）、ペルツズマブ、ＸＬ−６４７、ＨＩＫＩ−２７２、ＢＭＳ−５９９６２６、ＡＲＲＹ−３３４５４３、ＡＶ４１２、ｍＡＢ−８０６、ＢＭＳ−６９０５１４、ＪＮＪ−２６４８３３２７、ＡＥＥ−７８８（さらにＶＥＧＦＲの阻害剤）、ＡＲＲＹ−３３３７８６、ＩＭＣ−１１Ｆ８、Ｚｅｍａｂがある。
【００９８】
本発明の単一特異性結合分子を用いた治療において併用することが有利であり得る他の作用物質は、トシツモマブおよびイブリツモマブチウキセタン（２つの放射標識抗ＣＤ２０抗体）、アレムツズマブ（抗ＣＤ５２抗体）、デノスマブ、（破骨細胞分化因子リガンド阻害剤）、ガリキシマブ（ＣＤ８０アンタゴニスト）、オファツムマブ（ＣＤ２０阻害剤）、ザノリムマブ（ＣＤ４アンタゴニスト）、ＳＧＮ４０（ＣＤ４０リガンド受容体モジュレーター）、リツキシマブ（ＣＤ２０阻害剤）またはマパツムマブ（ＴＲＡＩＬ−１受容体アゴニスト）またはＯＭＰ−２１Ｍ１８（ＤＩＩ４阻害剤）である。
【００９９】
本発明の二重特異性結合分子と組合せて使用することができる他の化学療法剤は、ホルモン、ホルモンアナログおよび抗ホルモン剤（例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、フルベストラント、メゲストロールアセテート、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、シプロテロンアセテート、フィナステリド、ブセレリンアセテート、フルドロコルチゾン、フルオキシメステロン、メドロキシプロゲステロン、オクトレオチド、アルゾキシフェン、パシレオチド、バプレオチド）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、リアロゾール、エキセメスタン、アタメスタン、フォルメスタン）、ＬＨＲＨアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、ゴセレリンアセテート、リュープロリド、アバレリックス、セトロレリックス、デスロレリン、ヒストレリン、トリプトレリン）、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、ペメトレキセドのような葉酸代謝拮抗剤、５フルオロウラシル、カペシタビン、デシタビン、ネルアラビン、およびゲムシタビンのようなピリミジンアナログ）、メルカプトプリンチオグアニン、クラドリビンおよびペントスタチン、シタラビン、フルダラビンなどのプリンおよびアデノシンアナログ、抗腫瘍機能抗体（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシンおよびイダルビシン、マイトマイシン−Ｃ、ベロマイシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、ピクサントロン、ストレプトゾシンのようなアントラサイクリン系）、白金誘導体（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ロバプラチン、サトラプラチン）、アルキル化剤（例えば、エストラムスチン、メクロレタミン、メルファラン、クロラムブシル、ブサルファン、ダカルバジン、シクロホスファミド、イフォスファミド、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、カルムスチンおよびロムスチンなどのニトロソウレア、チオテパ）、抗有糸分裂薬（例えば、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンフルニンおよびビンクリスチンのようなビンカアルカロイド、ならびにパクリタキセル、ドセタキセルおよびそれらの製剤、ラロタキセル、シモタキセルのようなタキサン、およびイクサベピロン、パツピロン、ＺＫ−ＥＰＯのようなエポチロン）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシドおよびエトポフォス、テニポシド、アムサクリン、トポテカン、イリノテカンのようなエピポドフィロトキシン）、ならびにアミフォスチン、アナグレリド、インターフェロンα、プロカルバジン、ミトタン、およびポルフィマー、ベキサロテン、セレコキシブなどの種種多様な化学療法剤だけには限られないが、これらから選択することができる。
【０１００】
本発明の二重特異性結合分子の特に好ましい組合せパートナーは、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））のようなＶＥＧＦアンタゴニスト、ニテダニブ、ソラフェニブおよびスニチニブである。
【０１０１】
本発明の別の実施形態によれば、
ａ）前に定義した本発明の結合分子とサンプルを接触させるステップ、および
ｂ）前記サンプルと前記結合分子の結合を検出するステップ、および
ｃ）ステップ（ｂ）で検出した結合と標準を比較するステップであって、前記サンプルと比較した結合の差が血管新生に対するＶＥＧＦおよび／またはＡｎｇ２媒介効果と関係がある疾患または障害を示すステップ
によって、疾患を診断する方法を提供する。
この用途および他の用途のため、特異的結合対、ビオチン−（ストレプト）アビジン結合対などの一部である官能基の導入などにより、本発明の単一特異性結合分子をさらに修飾することが有用であり得る。このような官能基を使用して、すなわち結合対の形成を介して、結合対の他の半分と結合する別のタンパク質、ポリペプチドまたは化学化合物と、本発明の結合分子を連結させることが可能である。例えば、本発明の単一特異性結合分子はビオチンと結合させることが可能であり、アビジンまたはストレプトアビジンと結合した別のタンパク質、ポリペプチド、化合物または担体と連結させることが可能である。例えば、検出可能シグナル生成物質がアビジンまたはストレプトアビジンと結合する診断系において、このような結合した本発明の単一特異性結合分子は、例えばレポーターとして使用することができる。
【０１０２】
本発明の単一特異性結合分子またはポリペプチド、およびこれらを含む組成物の有効性は、対象の具体的疾患または障害に応じて、任意の適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞ベースアッセイ、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイおよび／またはそれ自体が知られている動物モデル、またはこれらの任意の組合せを使用して試験することができる。適切なアッセイおよび動物モデルは当業者には明らかであり、例えば、本明細書で記載し以下の実施例で使用するするアッセイ、増殖アッセイなどを含む。
【０１０３】
本発明の単一特異性結合分子は、アフィニティー成熟、ヒト化、およびヒトにおける低免疫原性を確実にするための潜在的翻訳後修飾部位の除去、および生物物理学的安定性の改善に関する、詳細にわたる配列最適化プロセスを経ている。予想外に、これらのデータは、本発明の単一特異性結合分子が、従来技術の結合分子の性質より優れた性質を有することを示す。特にこのような性質は、例えば図９〜１０、１３〜１４、１６〜１９のデータから得ることができる、Ａｎｇ１中和と比較したＡｎｇ２中和に対する高い選択性、例えば、図６、９、１３、１６、１８および２０ならびに表１２〜１３、１６〜１７、２０〜２２のＥＬＩＳＡデータから得ることができる、高い効能でのＡｎｇ２−Ｔｉｅ２相互作用の競合阻害、および例えば表７（例７）中に示すようなアルファスクリーンアッセイでのＶＨＨに関するＩＣ５０（ｎＭ）値、および表８、１４、１８および２３中の組換えヒトＡｎｇ２、カニクイザルＡｎｇ２、マウスＡｎｇ２における精製ＶＨＨのアフィニティーＫＤ（ｎＭ）である。
【０１０４】
これは、本発明の単一特異性結合分子が、癌、癌性疾患、眼部疾患および／または慢性腎臓病などの血管新生に対するＡｎｇ２媒介効果と関係がある疾患および障害において、治療有効性を有する有望な候補であることを示す。
図１〜４、６〜７、９〜１０、１２〜１４および１６〜２０中の軸の注釈。Ｘ軸はＯＤ４５０（ｎｍ）を表し、Ｙ軸は競合ｌｏｇ（Ｍ）を表す。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１−１Ａ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断する精製ＶＨＨ（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１−１Ｂ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断する精製ＶＨＨ（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１−１Ｃ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断する精製ＶＨＨ（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１−１Ｄ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断する精製ＶＨＨ（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１−２Ａ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断する精製ＶＨＨ（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１−２Ｂ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断する精製ＶＨＨ（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１−２Ｃ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断する精製ＶＨＨ（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図２−１Ａ】ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２相互作用を遮断する精製ＶＨＨ（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図２−１Ｂ】ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２相互作用を遮断する精製ＶＨＨ（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図２−１Ｃ】ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２相互作用を遮断する精製ＶＨＨ（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図２−１Ｄ】ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２相互作用を遮断する精製ＶＨＨ（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図２−２Ａ】ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２相互作用を遮断する精製ＶＨＨ（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図２−２Ｂ】ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２相互作用を遮断する精製ＶＨＨ（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図２−２Ｃ】ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２相互作用を遮断する精製ＶＨＨ（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図３Ａ】ｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２相互作用を遮断する精製ＶＨＨ（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図３Ｂ】ｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２相互作用を遮断する精製ＶＨＨ（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図４Ａ】ｈＡｎｇ１−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断する精製ＶＨＨ（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図４Ｂ】ｈＡｎｇ１−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断する精製ＶＨＨ（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図４Ｃ】ｈＡｎｇ１−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断する精製ＶＨＨ（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図４Ｄ】ｈＡｎｇ１−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断する精製ＶＨＨ（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図４Ｅ】ｈＡｎｇ１−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断する精製ＶＨＨ（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図４Ｆ】ｈＡｎｇ１−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断する精製ＶＨＨ（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図４Ｇ】ｈＡｎｇ１−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断する精製ＶＨＨ（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図４Ｈ】ｈＡｎｇ１−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断する精製ＶＨＨ（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図４Ｉ】ｈＡｎｇ１−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断する精製ＶＨＨ（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図５】ＶＨＨ２８Ｄ１０のアフィニティー成熟変異体の配列アラインメントの図である。このアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系列ＶＨ３／ＪＨコンセンサス配列と一直線に並べる。残基はＫａｂａｔに従い番号処理し、ＣＤＲはＡｂＭの定義に従い太字で示す。置換された残基には下線を引く。
【図６Ａ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０のアフィニティー成熟変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図６Ｂ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０のアフィニティー成熟変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図６Ｃ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０のアフィニティー成熟変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図７Ａ】ｈＡｎｇ１−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０のアフィニティー成熟変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図７Ｂ】ｈＡｎｇ１−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０のアフィニティー成熟変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図７Ｃ】ｈＡｎｇ１−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０のアフィニティー成熟変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図８Ａ】ｈＶＨ３−ＪＨコンセンサス配列とＶＨＨ１Ｄ０１（Ａ）およびＶＨＨ１Ｄ０１の配列最適化変異体（Ｂ）の配列アラインメントの図である。このアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系列ＶＨ３／ＪＨコンセンサス配列と一直線に並べる。残基はＫａｂａｔに従い番号処理し、ＣＤＲはＡｂＭの定義に従い太字で示す。それらのヒト相当物に突然変異した残基には下線を引く。問題の潜在的翻訳後修飾部位は枠で囲う。
【図８Ｂ】ｈＶＨ３−ＪＨコンセンサス配列とＶＨＨ１Ｄ０１（Ａ）およびＶＨＨ１Ｄ０１の配列最適化変異体（Ｂ）の配列アラインメントの図である。このアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系列ＶＨ３／ＪＨコンセンサス配列と一直線に並べる。残基はＫａｂａｔに従い番号処理し、ＣＤＲはＡｂＭの定義に従い太字で示す。それらのヒト相当物に突然変異した残基には下線を引く。問題の潜在的翻訳後修飾部位は枠で囲う。
【図９−１Ａ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（１０−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（１０−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（１１−３）相互作用を遮断するＶＨＨ１Ｄ０１の精製配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図９−１Ｂ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（１０−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（１０−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（１１−３）相互作用を遮断するＶＨＨ１Ｄ０１の精製配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図９−２Ａ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（１０−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（１０−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（１１−３）相互作用を遮断するＶＨＨ１Ｄ０１の精製配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図９−２Ｂ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（１０−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（１０−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（１１−３）相互作用を遮断するＶＨＨ１Ｄ０１の精製配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図９−３Ａ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（１０−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（１０−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（１１−３）相互作用を遮断するＶＨＨ１Ｄ０１の精製配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図９−３Ｂ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（１０−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（１０−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（１１−３）相互作用を遮断するＶＨＨ１Ｄ０１の精製配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１０】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断するＶＨＨ１Ｄ０１の精製配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１１Ａ】ｈＶＨ３−ＪＨコンセンサス配列とＶＨＨ３７Ｆ０２（Ａ）、サイクル１（Ｂ）、ＶＨＨ３７Ｆ０２のサイクル２（Ｃ）配列最適化変異体の配列アラインメントの図である。このアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系列ＶＨ３／ＪＨコンセンサス配列と一直線に並べる。残基はＫａｂａｔに従い番号処理し、ＣＤＲはＡｂＭの定義に従い太字で示す。それらのヒト相当物に突然変異した残基には下線を引く。問題の潜在的翻訳後修飾部位は枠で囲う。
【図１１Ｂ】ｈＶＨ３−ＪＨコンセンサス配列とＶＨＨ３７Ｆ０２（Ａ）、サイクル１（Ｂ）、ＶＨＨ３７Ｆ０２のサイクル２（Ｃ）配列最適化変異体の配列アラインメントの図である。このアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系列ＶＨ３／ＪＨコンセンサス配列と一直線に並べる。残基はＫａｂａｔに従い番号処理し、ＣＤＲはＡｂＭの定義に従い太字で示す。それらのヒト相当物に突然変異した残基には下線を引く。問題の潜在的翻訳後修飾部位は枠で囲う。
【図１１Ｃ】ｈＶＨ３−ＪＨコンセンサス配列とＶＨＨ３７Ｆ０２（Ａ）、サイクル１（Ｂ）、ＶＨＨ３７Ｆ０２のサイクル２（Ｃ）配列最適化変異体の配列アラインメントの図である。このアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系列ＶＨ３／ＪＨコンセンサス配列と一直線に並べる。残基はＫａｂａｔに従い番号処理し、ＣＤＲはＡｂＭの定義に従い太字で示す。それらのヒト相当物に突然変異した残基には下線を引く。問題の潜在的翻訳後修飾部位は枠で囲う。
【図１２−１】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（１４−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（１４−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（１４−３）相互作用を遮断するＶＨＨ３７Ｆ０２の精製サイクル１配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１２−２】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（１４−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（１４−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（１４−３）相互作用を遮断するＶＨＨ３７Ｆ０２の精製サイクル１配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１２−３】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（１４−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（１４−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（１４−３）相互作用を遮断するＶＨＨ３７Ｆ０２の精製サイクル１配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１３−１Ａ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（１５−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（１５−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（１５−３）相互作用を遮断するＶＨＨ３７Ｆ０２の精製サイクル２配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１３−１Ｂ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（１５−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（１５−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（１５−３）相互作用を遮断するＶＨＨ３７Ｆ０２の精製サイクル２配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１３−２】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（１５−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（１５−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（１５−３）相互作用を遮断するＶＨＨ３７Ｆ０２の精製サイクル２配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１３−３】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（１５−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（１５−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（１５−３）相互作用を遮断するＶＨＨ３７Ｆ０２の精製サイクル２配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１４】ｈＡｎｇ１−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断するＶＨＨ３７Ｆ０２の精製サイクル２配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１５Ａ】ｈＶＨ３−ＪＨコンセンサス配列とＶＨＨ２８Ｄ１０（Ａ）、サイクル１配列最適化変異体（Ｂ）、サイクル２変異体（Ｃ）、およびＶＨＨ２８Ｄ１０のサイクル３（Ｄ）配列最適化変異体の配列アラインメントの図である。このアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系列ＶＨ３／ＪＨコンセンサス配列と一直線に並べる。残基はＫａｂａｔに従い番号処理し、ＣＤＲはＡｂＭの定義に従い太字で示す。それらのヒト相当物に突然変異した残基には下線を引く。問題の潜在的翻訳後修飾部位は枠で囲う。
【図１５Ｂ】ｈＶＨ３−ＪＨコンセンサス配列とＶＨＨ２８Ｄ１０（Ａ）、サイクル１配列最適化変異体（Ｂ）、サイクル２変異体（Ｃ）、およびＶＨＨ２８Ｄ１０のサイクル３（Ｄ）配列最適化変異体の配列アラインメントの図である。このアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系列ＶＨ３／ＪＨコンセンサス配列と一直線に並べる。残基はＫａｂａｔに従い番号処理し、ＣＤＲはＡｂＭの定義に従い太字で示す。それらのヒト相当物に突然変異した残基には下線を引く。問題の潜在的翻訳後修飾部位は枠で囲う。
【図１５Ｃ】ｈＶＨ３−ＪＨコンセンサス配列とＶＨＨ２８Ｄ１０（Ａ）、サイクル１配列最適化変異体（Ｂ）、サイクル２変異体（Ｃ）、およびＶＨＨ２８Ｄ１０のサイクル３（Ｄ）配列最適化変異体の配列アラインメントの図である。このアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系列ＶＨ３／ＪＨコンセンサス配列と一直線に並べる。残基はＫａｂａｔに従い番号処理し、ＣＤＲはＡｂＭの定義に従い太字で示す。それらのヒト相当物に突然変異した残基には下線を引く。問題の潜在的翻訳後修飾部位は枠で囲う。
【図１５Ｄ】ｈＶＨ３−ＪＨコンセンサス配列とＶＨＨ２８Ｄ１０（Ａ）、サイクル１配列最適化変異体（Ｂ）、サイクル２変異体（Ｃ）、およびＶＨＨ２８Ｄ１０のサイクル３（Ｄ）配列最適化変異体の配列アラインメントの図である。このアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系列ＶＨ３／ＪＨコンセンサス配列と一直線に並べる。残基はＫａｂａｔに従い番号処理し、ＣＤＲはＡｂＭの定義に従い太字で示す。それらのヒト相当物に突然変異した残基には下線を引く。問題の潜在的翻訳後修飾部位は枠で囲う。
【図１６−１Ａ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（１８−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（１８−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（１８−３）相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０の精製サイクル１配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１６−１Ｂ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（１８−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（１８−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（１８−３）相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０の精製サイクル１配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１６−１Ｃ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（１８−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（１８−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（１８−３）相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０の精製サイクル１配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１６−２Ａ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（１８−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（１８−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（１８−３）相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０の精製サイクル１配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１６−２Ｂ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（１８−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（１８−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（１８−３）相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０の精製サイクル１配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１６−２Ｃ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（１８−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（１８−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（１８−３）相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０の精製サイクル１配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１６−３Ａ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（１８−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（１８−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（１８−３）相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０の精製サイクル１配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１６−３Ｂ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（１８−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（１８−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（１８−３）相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０の精製サイクル１配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１６−３Ｃ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（１８−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（１８−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（１８−３）相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０の精製サイクル１配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１７Ａ】ｈＡｎｇ１−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０の精製サイクル１配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１７Ｂ】ｈＡｎｇ１−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０の精製サイクル１配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１８−１Ａ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（２０−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（２０−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（２０−３）相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０の精製配列最適化Ｃ50Ｘ−Ｃ53Ｘ変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１８−１Ｂ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（２０−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（２０−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（２０−３）相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０の精製配列最適化Ｃ50Ｘ−Ｃ53Ｘ変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１８−２】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（２０−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（２０−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（２０−３）相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０の精製配列最適化Ｃ50Ｘ−Ｃ53Ｘ変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１８−３】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（２０−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（２０−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（２０−３）相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０の精製配列最適化Ｃ50Ｘ−Ｃ53Ｘ変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図１９】ｈＡｎｇ１−ｈＴｉｅ２相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０の精製配列最適化Ｃ50Ｘ−Ｃ53Ｘ変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図２０−１Ａ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（２２−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（２２−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（２２−３）相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０の精製サイクル２配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図２０−１Ｂ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（２２−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（２２−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（２２−３）相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０の精製サイクル２配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図２０−１Ｃ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（２２−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（２２−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（２２−３）相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０の精製サイクル２配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図２０−２Ａ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（２２−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（２２−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（２２−３）相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０の精製サイクル２配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図２０−２Ｂ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（２２−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（２２−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（２２−３）相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０の精製サイクル２配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図２０−２Ｃ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（２２−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（２２−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（２２−３）相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０の精製サイクル２配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図２０−３Ａ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（２２−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（２２−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（２２−３）相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０の精製サイクル２配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【図２０−３Ｂ】ｈＡｎｇ２−ｈＴｉｅ２（２２−１）、ｍＡｎｇ２−ｍＴｉｅ２（２２−２）、およびｃＡｎｇ２−ｃＴｉｅ２（２２−３）相互作用を遮断するＶＨＨ２８Ｄ１０の精製サイクル２配列最適化変異体（ＥＬＩＳＡ）の図である。
【実施例】
【０１０６】
材料および方法
ａ）ヒトまたはマウスＴｉｅ２受容体を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｈ安定発現細胞系の作製
ヒトＴｉｅ２（ＮＭ＿０００４５９．３、配列番号１８２）、マウスＴｉｅ２（ＮＭ＿０１３６９０．２、配列番号１８３）、およびカニクイザルＴｉｅ２（配列番号１８４）をコードするｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１−ｎｅｏ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）にクローニングする。ヒトＴｉｅ２またはマウスＴｉｅ２を過剰発現するヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞を樹立するため、親ＨＥＫ２９３Ｈ細胞に、Ｆｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）およびそれぞれｐｃＤＮＡ３．１−ｎｅｏ−ｈＴｉｅ２またはｐｃＤＮＡ３．１−ｎｅｏ−ｍＴｉｅ２で脂質介在トランスフェクションを施した。全ての条件に関して、１ｍｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を加えることによって、トランスフェクション後２日でトランスフェクタントを選択する。ヒト、マウスおよびカニクイザルＴｉｅ２に関して、最終高発現クローンを、ＦＡＣＳＡｒｉａ細胞選別装置（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、それぞれＰＥ標識抗ヒトＴｉｅ２（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳ）、ＰＥ標識抗マウスＴｉｅ２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）および２ステップヤギ抗ヒトＴｉｅ２（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳ）と結合する単細胞選別クローン、次にＰＥ標識ロバ抗ヤギ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）によって選択する。
【０１０７】
ｂ）マウスまたはカニクイザルＡｎｇ２を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｈ細胞系の作製、ならびに組換えマウスおよびカニクイザルＡｎｇ２馴化培地の作成
Ｎ末端ＦＬＡＧタグマウスＡｎｇ２（ＮＭ＿００７４２６．３、配列番号１８５）、およびカニクイザルＡｎｇ２（ＡＢ１７２６４３．１、配列番号１８６）をコードするｃＤＮＡを、ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）にクローニングする。マウスＡｎｇ２またはカニクイザルＡｎｇ２を一過的に過剰発現するヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞を、ＨＥＫ２９３Ｔ親細胞系において、それぞれｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ−ｍＡｎｇ２またはｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ−ｃＡｎｇ２（Ｆｕｇｅｎｅ；Ｒｏｃｈｅ）の脂質介在トランスフェクションによって作製する。作成は１．５リットルのＣＦ１０バッグで行い、１．５Ｌの馴化培地（ＣＭ）をトランスフェクション後５日で回収する。
【０１０８】
ｃ）ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞における組換えカニクイザルＴｉｅ２／Ｆｃキメラの作成
Ｔｉｅ２の細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡを、適切な制限部位を使用して発現プラスミドｐＳｅｃＴａｇ２ｂにサブクローニングし、Ｆｃ融合タンパク質を作製する。ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのトランスフェクションは、生存細胞１×１０6個／ｍＬの開始細胞密度および１μｇのプラスミドＤＮＡ／細胞１０6個で、プラスミドのＭｅｇａｏｒｅｐ調製物（Ｑｉａｇｅｎ）、Ｏｐｔｉｍｅｍ−Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２９３−フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造者により記載されたように実施する。トランスフェクトした細胞は３７℃で７日間撹拌フラスコにおいて培養する。馴化培地（ＣＭ）を４０００ｇで１０分間の遠心分離によって採取し、滅菌フィルター（０．４５μｍ膜）を介して濾過する。
【０１０９】
ＤＰＢＳで平衡状態にした５ｍｌのＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅプロテインＡカラムに５ｍｌ／分でＣＭを充填することにより、アフィニティークロマトグラフィーを使用してＦｃ融合タンパク質を精製する。ＤＰＢＳでの洗浄ステップ後、結合したＦｃタンパク質を１０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファーｐＨ３．０で溶出させ、１Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０を加えることにより後にｐＨ７．０に中和する。精製したタンパク質はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（１０ｋＤａ分子量カットオフ）遠心濃縮器で濃縮し、バッファーはＤＰＢＳに交換する。タンパク質の存在は標準的な分析法（Ｅｘｐｅｒｉｏｎ  Ｐｒｏ２６０キット−ＢｉｏＲａｄを用いた電気泳動、質量分析法）で確認する。タンパク質はサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに分析し、エンドトキシン含有量を決定する（Ｅｎｄｏｓａｆｅ  ＰＴＳキット−Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）。
【０１１０】
ｄ）ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞における組換えヒト、カニクイザル、マウスおよびラットＡｎｇ２−ＦＬＤの作成
分子クローニングおよび細胞培養は、Ｔｉｅ２−Ｆｃ融合タンパク質に関して記載したように実施する。ヒスタグタンパク質の精製のため、ＤＰＢＳで平衡状態にした２ｍｌのＮｉ2+キレートセファロース高速カラム（Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ−ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に５ｍｌ／分でＣＭを充填する。非特異的結合を妨げるための４％溶出バッファー（ＤＰＢＳ＋０．５％イミダゾール）の存在下での充填後、カラムをＤＰＢＳで洗浄する。Ａｎｇ２−ＦＬＤタンパク質は、０．５％イミダゾールを含有するＤＰＢＳを用いてカラムから溶出させる。その後、限外濾過ステップを濃縮およびバッファー交換のため行った（１０ｋＤａ分子量カットオフ）。タンパク質のアリコートを、Ｔｉｅ２−Ｆｃに関して記載したような分析特徴付けのため保持する。
【０１１１】
（例１  組換えヒトＡｎｇ２を用いた免疫処置はラマにおいて体液性免疫応答を誘導する）
１．１．免疫処置
Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）の承認後、４匹のラマ（指定番号４０６、４０８、４５４、４５５）を、組換えヒトＡｎｇ２（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳ）の４回の筋肉内注射（第０日：５０μｇ、第１４日：２０μｇ、第２８日：１７．５μｇ、および第４２日：１７．５μｇの用量）によって免疫処置した。第０日の初回抗原刺激注射用にフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ、ＵＳＡ）、および追加抗原刺激注射用にフロイント不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ、ＵＳＡ）で抗原を製剤化する。
【０１１２】
１．２．ラマにおいて誘導された免疫応答の評価
ＥＬＩＳＡによりヒトＡｎｇ２に対する動物における免疫応答の誘導を評価するため、第０日（前免疫）、第３５日および第４６日（末梢血リンパ球［ＰＢＬ］回収の時間）に血清を回収する。要約すると、１μｇ／ｍＬの組換えヒトＡｎｇ２（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を、９６ウエルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に４℃で一晩固定した。ウエルはカゼイン溶液（ＰＢＳ＋１％カゼイン）でブロッキングする。連続血清希釈液を加えた後、特異的に結合した免疫グロブリンを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ラマ免疫グロブリン（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＴＸ、ＵＳＡ）を使用し、および次に基質ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）の存在下での酵素反応で検出し、ヒトＡｎｇ２に対する有意な抗体依存免疫応答が誘導されることを示す。抗体応答は、従来型抗体とＢ細胞レパートリーを発現する重鎖単独抗体の両方によって増大する。結合した免疫グロブリンは、従来型ラマＩｇＧ１抗体または重鎖単独ラマＩｇＧ２もしくはＩｇＧ３抗体を特異的に認識する抗体を用いて、検出することができるからである。ヒトＡｎｇ２を注射した全てのラマにおいて、ヒトＡｎｇ２を特異的に対象とする従来型抗体とＢ細胞を発現する重鎖単独抗体により、抗体応答が増大する。それぞれのラマに関するＡｎｇ２血清力価応答を表１中に示す。
【０１１３】
【表１】
0005970734.tif 000002
【０１１４】
凡例：（＊）
低（または＋／−）：１，０００≧ＨＳＤS/N≧2＜１，５００
適度（または＋）：１，５００≧ＨＳＤS/N≧2＜１３，５００
良（または＋＋）：１３，５００≧ＨＳＤS/N≧2＜３６５，０００
優（または＋＋＋）：ＨＳＤS/N≧2≧３６５，０００
（＊）ＨＳＤ、最高血清希釈；Ｓ／Ｎ≧２、シグナル対ノイズ比≧２
【０１１５】
（例２  重鎖単独抗体断片レパートリーのクローニングおよびファージの調製）
最終免疫原注射の後、重鎖単独抗体を産生するＢ細胞の供給源としての免疫組織を、免疫処置したラマから回収する。典型的には、最終抗原注射後第４日と第１０日に回収する２つの１５０ｍＬ血液サンプル、および最終抗原注射後第４日に回収する１つのリンパ節生検を動物毎に回収する。血液サンプルから、製造者の説明書（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）に従いＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅを使用して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製する。ＷＯ０５／０４４８５８の例３（４６ページ）中に記載されたように、（動物番号４０６から事前に得たものではない）ＰＢＭＣおよびリンパ節生検から、全ＲＮＡを抽出し、それをＲＴ−ＰＣＲ用の出発物質として使用し、ＶＨＨコードＤＮＡセグメントを増幅させる。それぞれの免疫処置したラマに関して、その動物の回収した全ての免疫組織から単離した全ＲＮＡをプールすることにより、ライブラリーを構築する。要約すると、ＰＣＲ増幅ＶＨＨレパートリーを、ＶＨＨライブラリーのファージディスプレイを容易にするよう設計したベクターに、特異的制限部位を介してクローニングする。このベクターはｐＵＣ１１９に由来し、ＬａｃＺプロモーター、Ｍ１３ファージｇＩＩＩタンパク質コード配列、アンビシリンまたはカルベニシリン耐性遺伝子、マルチクローニングサイトおよびハイブリッドｇＩＩＩ−ｐｅＩＢリーダー配列を含有する。ＶＨＨコード配列と一致して、このベクターは、Ｃ末端ｃ−ｍｙｃタグおよびＨｉｓ６タグをコードする。ファージは標準的なプロトコールに従い調製し、さらなる使用のため４℃での濾過滅菌後に保存する。
【０１１６】
（例３  ファージディスプレイによるＡｎｇ２特異的ＶＨＨの選択）
全てのラマから得てファージライブラリーとしてクローニングしたＶＨＨレパートリーを、多数の選択条件を適用して、異なる選択戦略で使用する。変数には、ｉ）Ａｎｇ２タンパク質形式：ビオチニル化Ｃ末端ヒスタグ完全長組換えヒトＡｎｇ２（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）およびＣ末端ヒスタグ完全長マウスＡｎｇ２（ＧｅｎｅＡｒｔ、現在Ｉｎｖｕｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡで作成）、ｉｉ）Ａｎｇ２提示法、：マウスＡｎｇ２で直接コーティングしたプレート、またはビオチニル化ヒトＡｎｇ２との溶液中でのインキュベーション、次にニュートラビジンコーティングプレート上での捕捉、およびｉｉｉ）抗原濃度がある。全ての選択は９６ウエルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で行う。
【０１１７】
多ラウンドの選択を以下のように実施する。固体または溶液相選択形式に関するＡｎｇ２調製を、多数の濃度で前に記載したように示す（ビオチニル化ヒトＡｎｇ２：５０、５、０．５、０．０５および０．００５ｎＭ、マウスＡｎｇ２：１０、１、０．１および０．０１μｇ／ｍＬ）。ファージライブラリーとの２時間のインキュベーション、次に詳細な洗浄後、室温で１５〜３０分間トリプシン（１ｍｇ／ｍＬ）を用いて、結合したファージを溶出させる。次いでトリプシン活性を、０．８ｍＭプロテアーゼ阻害剤ＡＢＳＦを施すことによりすぐに中和する。バックグラウンド対照として、ｗ／ｏ抗原の選択を平行して実施する。バックグラウンドに優る増大を示すファージのアウトプットを使用して大腸菌を感染させる。感染した大腸菌細胞を使用して、次の選択ラウンド用にファージを調製し（ファージレスキュー）、または個々のＶＨＨクローンの分析用にＬＢ寒天プレート（アンピシリン＋グルコース２％）上に平板培養する。特異的結合剤または遮断剤に関する選択アウトプットのスクリーニングのため、一種のコロニーを寒天プレートから採取し、１ｍＬの９６ディープウエルプレート中で増殖させる。グルコースの不在下でＩＰＴＧ（０．１〜１ｍＭ最終）を加えることによって、ＬａｃＺ制御ＶＨＨ発現を誘導する。（約８０ｕＬの体積の）周辺質抽出物を、（例えば、本明細書に引用するＷＯ２００６／０４０１５３中に開示されたような）標準的なプロトコールに従い調製する。簡単に言うと、培養物を４，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。ペレットは一晩、または−２０℃で１時間凍結した。次に、ペレットを４０分間室温で解凍し、１５ｍｌｐｅｒｉバッファー（５０ｍＭのＮａＨＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ）中で再懸濁し１時間撹拌した。周辺質画分は、１４０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により単離した。
【０１１８】
（例４  Ａｎｇ２−Ｔｉｅ２およびＡｎｇ１−Ｔｉｅ２ＥＬＩＳＡおよびアルファスクリーン競合アッセイにおける周辺質抽出物のスクリーニング）
発現されたＶＨＨを含有する周辺質抽出物をヒトＡｎｇ２−ヒトＴｉｅ２アルファスクリーン競合アッセイでスクリーニングして、それらの遮断能力を評価する。要約すると、ヒトＴｉｅ２／Ｆｃキメラ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を、ビオチンのＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を使用してビオチニル化する。ＦＬＡＧタグヒトＡｎｇ２（Ａｌｅｘｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）は、抗ＦＬＡＧＭ２抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）でコーティングしたアクセプタービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳ）を使用して捕捉する。ヒトＡｎｇ２とその受容体ヒトＴｉｅ２の結合を阻害するＶＨＨの能力を評価するため、発現されたＶＨＨを含有する１：２５希釈の周辺質抽出物を、０．１ｎＭのＦＬＡＧタグヒトＡｎｇ２とインキュベートする。この混合物に、アクセプタービーズおよび０．３ｎＭのビオチニル化ヒトＴｉｅ２／Ｆｃキメラを加え、室温で２時間さらにインキュベートする。最後に、ストレプトアビジン結合ドナービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳ）を加え、この混合物を室温で２時間さらにインキュベートする。アッセイバッファーはＰＢＳ＋０．０３％Ｔｗｅｅｎ−２０＋０．１％ＢＳＡである。６８０ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの放出波長を使用し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して蛍光を測定する。蛍光シグナルの低減は、ヒトＡｎｇ２とヒトＴｉｅ２の結合が周辺質抽出物で発現されたＶＨＨにより遮断されることを示す。少なくとも５０％ヒトＡｎｇ２−ヒトＴｉｅ２の相互作用を遮断可能なＶＨＨを、確認ＥＬＩＳＡベース競合アッセイでスクリーニングする。さらに、マウスＡｎｇ２との結合に関する交差反応性およびヒトＡｎｇ１に対する選択性も、競合ＥＬＩＳＡにおいて評価する。要約すると、ヒトまたはマウスＴｉｅ２／Ｆｃキメラ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）は、９６ウエルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において４℃において一晩２μｇ／ｍＬで固定する。ウエルは１％カゼイン溶液でブロッキングする。発現されたＶＨＨを含有する１：５希釈の周辺質抽出物を、アッセイのタイプに従い以下のＡｎｇ種、０．０２ｎＭのＦＬＡＧタグヒトＡｎｇ２、ＦＬＡＧタグマウスＡｎｇ２を含有する馴化培地の１：３，０００希釈液、または０．０２ｎＭのＦＬＡＧタグヒトＡｎｇ１（Ａｌｅｘｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）とインキュベートする。この混合物をＴｉｅ２／Ｆｃコーティングウエルに加え、室温で２時間インキュベートする。
【０１１９】
Ａｎｇの残留結合は、ＨＲＰ結合抗ＦＬＡＧＭ２抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を使用して検出する。
【０１２０】
第二スクリーニングサイクルにおいて、非常に多様なマウスＡｎｇ２交差反応遮断ＶＨＨをもたらした選択アウトプットの、発現されたＶＨＨを含有する周辺質抽出物を１：３００希釈でスクリーニングする。ヒトＡｎｇ２とヒトＴｉｅ２、マウスＡｎｇ２とマウスＴｉｅ２の結合を阻害するＶＨＨ、およびヒトＡｎｇ１とヒトＴｉｅ２の結合の阻害を示さないＶＨＨを選択する。配列分析によって、３８の異なるＢ細胞系統に属する８６の特有なＶＨＨが明らかになった。それぞれのＢ細胞系統で見られた特有な配列変異体の合計数、使用した代表的なＶＨＨおよび選択条件を表２中に示す。アルファスクリーンおよびＥＬＩＳＡベーススクリーニングのデータの概要は表３中に与える。全ての特有ＶＨＨのアミノ酸配列は配列表中（配列番号１〜８６）および表４中に示す。
【０１２１】
【表２】
0005970734.tif 000003
0005970734.tif 000004
0005970734.tif 000005
【表３】
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【表４】
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【０１２２】
（例５  精製した抗Ａｎｇ２ＶＨＨの特徴付け）
例４中に記載したスクリーニングから選択した阻害性抗Ａｎｇ２ＶＨＨのサブセットを、さらに精製し特徴付けする。選択したＶＨＨは、大腸菌ＴＧ１において、ｃ−ｍｙｃ、Ｈｉｓ６タグタンパク質として発現させる。発現は１ｍＭのＩＰＴＧを加えることにより誘導し、３７℃で４時間継続させる。細胞培養物をスピン処理した後、ペレットの凍結−解凍により周辺質抽出物を調製する。これらの抽出物は出発物質として使用し、ＶＨＨはＩＭＡＣおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価して９５％以上の純度を得る。
【０１２３】
５．１．ＥＬＩＳＡにおけるｈＡｎｇ２遮断ＶＨＨの評価
ＶＨＨの遮断能力を、ヒトＡｎｇ２−ヒトＴｉｅ２遮断アッセイにおいて評価する。要約すると、２μｇ／ｍＬのＴｉｅ２／Ｆｃキメラ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を、９６ウエルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にコーティングする。固定濃度０．０２ｎＭのＦＬＡＧタグヒトＡｎｇ２（Ａｌｅｘｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、（ＰＢＳ＋０．１％カゼイン＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中に希釈した）精製ＶＨＨの希釈系列に加え、コーティング状態ヒトＴｉｅ２受容体と２時間インキュベートする。ヒトＡｎｇ２の残留結合は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ＦＬＡＧＭ２（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を使用して検出する（図１）。参照分子はＡｂ５３６のＦａｂ断片（ＵＳ２００９／０１９１２１２）（図１−１）、またはペプチボディＡＭＧ３８６のペプチド成分（ＷＯ２００４／０９２２１５中の配列番号２５）（図１−２）である。陰性対照として、無関係なＶＨＨを使用する。ヒトＡｎｇ２−ヒトＴｉｅ２相互作用を遮断したＶＨＨに関するＩＣ50値を、それぞれ表５−１および表５−２中に示す。
【０１２４】
【表５】
0005970734.tif 000023
【０１２５】
【表６】
0005970734.tif 000024
【０１２６】
５．２．遮断ＥＬＩＳＡにおけるマウスおよびカニクイザルＡｎｇ２に対する交差反応性の評価
ＶＨＨがマウスＡｎｇ２とマウスＴｉｅ２の結合、およびカニクイザルＡｎｇ２とカニクイザルＴｉｅ２の結合を阻害するかどうか決定するため、競合ＥＬＩＳＡを実施する。要約すると、２μｇ／ｍＬの組換えマウスＴｉｅ２−ＦｃまたはカニクイザルＴｉｅ２−Ｆｃを、一晩４℃において９６ウエルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にコーティングする。コーティングしたウエルは１％カゼイン溶液でブロッキングする。ＦＬＡＧタグマウスＡｎｇ２（一過性ＨＥＫトランスフェクション由来の馴化培地の１：３，０００希釈液）、またはＦＬＡＧタグカニクイザルＡｎｇ２（一過性ＨＥＫトランスフェクション由来の馴化培地の１：８００希釈液）、および（ＰＢＳ＋０．１％カゼイン＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中に希釈した）精製ＶＨＨの希釈系列を、結合平衡状態に達するまでコーティング状態Ｔｉｅ２−Ｆｃ受容体と室温で２時間インキュベートする。ＦＬＡＧ−ｍＡｎｇ２またはＦＬＡＧ−ｃＡｎｇ２の残留結合は、ＨＲＰ結合抗ＦＬＡＧＭ２ｍＡｂ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を使用して検出する。参照分子はＡｂ５３６のＦａｂ断片（マウス：図２−１）、またはペプチボディＡＭＧ３８６のペプチド成分（マウス：図２−２；カニクイザル：図３）である。陰性対照として、無関係なＶＨＨを使用する。マウスＡｎｇ２−マウスＴｉｅ２相互作用を遮断したＶＨＨに関するＩＣ50値を表６−１中に示す。マウスおよびカニクイザルＴｉｅ２とマウスおよびカニクイザルＡｎｇ２の結合を遮断したＶＨＨに関するＩＣ50値を、それぞれ表６−２中に示す。
【０１２７】
【表７】
0005970734.tif 000025
【０１２８】
【表８】
0005970734.tif 000026
【０１２９】
５．３．ＥＬＩＳＡにおけるヒトＡｎｇ１に対するヒトＡｎｇ２遮断ＶＨＨの選択性の評価
抗Ａｎｇ２遮断ＶＨＨがヒトＡｎｇ１とヒトＴｉｅ２の結合に選択的であるかどうか決定するため、競合ＥＬＩＳＡを実施する。要約すると、２μｇ／ｍＬの組換えヒトＴｉｅ２−Ｆｃ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を、一晩４℃において９６ウエルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にコーティングする。コーティングしたウエルは１％カゼイン溶液でブロッキングする。固定濃度（０．０２ｎＭ）のＦＬＡＧタグ組換えヒトＡｎｇ１（Ａｌｅｘｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、および（ＰＢＳ＋０．１％カゼイン＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中に希釈した）精製ＶＨＨの希釈系列を、結合平衡状態に達するまでコーティング状態受容体Ｔｉｅ２−Ｆｃと室温で２時間インキュベートする。ＦＬＡＧ−ｈＡｎｇ１の残留結合は、ＨＲＰ結合抗ＦＬＡＧＭ２ｍＡｂを使用して検出する。参照分子はペプチボディＡＭＧ３８６のペプチド成分である（図４）。陰性対照として、無関係なＶＨＨを使用する。ヒトＡｎｇ１−ヒトＴｉｅ２相互作用を遮断したＶＨＨに関する指標ＩＣ50値を表７中に示す。
【０１３０】
【表９】
0005970734.tif 000027
【０１３１】
５．４．ヒト、マウス、カニクイザルＡｎｇ２−ＶＨＨ相互作用のアフィニティーの決定
ヒト、マウス、およびカニクイザルＡｎｇ２との結合に対するＶＨＨのアフィニティーを、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析（ＢｉａｃｏｒｅＴ１００）を使用して決定する。要約すると、ＶＨＨおよび基準化合物をアミンカップリングによりＣＭ５チップ上に固定する。多サイクルの動的手法を使用する。異なる濃度のヒト、マウス、およびカニクイザルＡｎｇ２−ＦＬＤ（０．４−１−２．６−６．４−１６−４０−１００ｎＭ）を注射する。Ａｎｇ２−ＦＬＤ種を２分間で会合させ、４５μＬ／分の流速において２０分間で解離させる。注射の間に、２５ｍＭ  ＮａＯＨの１０秒間パルスおよび６０秒間の安定期で表面を再生する。会合／解離のデータは、１：１相互作用モデル（Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合）の適用によって評価する。アフィニティー定数ＫDは得られた会合および解離速度定数ｋaおよびｋdから計算し、表８中に示す。
【０１３２】
【表１０】
0005970734.tif 000028
【０１３３】
（例６  選択したＶＨＨのアフィニティー成熟）
ＶＨＨ２８Ｄ１０の変異体（Ｃ50Ｓ／Ｓ53ＮおよびＱ108Ｌ置換を有する０００２７−例７．３）をアフィニティー成熟に施す。
【０１３４】
第一サイクルでは、エラープローンＰＣＲ法を使用して、フレームワーク（ＦＷ）と相補性決定領域（ＣＤＲ）の両方にアミノ酸置換をランダムに導入する。１ｎｇのＶＨＨ０００２７ｃＤＮＡ鋳型を使用するＧｅｎｅｍｏｒｐｈＩＩランダム突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用し、次にラウンド１の０．１ｎｇの産物を使用する第二のエラープローンＰＣＲにより、２ラウンドのＰＣＲベース手法で突然変異誘発を実施する。洗練ステップ後、ＰＣＲ産物は特有制限部位を介して、ＶＨＨライブラリーのファージディスプレイを容易にするよう設計したベクターに挿入する。連続ラウンドの溶液中選択を、低濃度のビオチニル化組換えヒトＡｎｇ２（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）およびトリプシン溶出液を使用して実施する。（約８０ｕＬの体積の）周辺質抽出物を標準法に従い調製し、ＰｒｏｔｅＯｎ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）オフレートアッセイで、組換えヒトＡｎｇ−ＦＬＤとの結合に関してスクリーニングする。要約すると、ＧＬＣ  ＰｒｏｔｅＯｎセンサーチップで、「リガンドチャンネル」Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５およびＬ６（ならびに参照チャンネルとしてＬ１／Ｌ２）に組換えヒトＡｎｇ−ＦＬＤをコーティングする。アフィニティー成熟クローンの周辺質抽出物は１：１０希釈し、「検体チャンネル」Ａ１−Ａ６に注入する。アフィニティー成熟ＶＨＨと同じ方法で調製および試験し、オフレート改善を計算するための参照として働く参照ＶＨＨ０００２７の、平均オフレートを計算する。上位２５のアフィニティー成熟変異体を表９中に示す。ＶＨＨを配列決定し（表１０−Ａ）、オフレートを改善するのに有用なアミノ酸突然変異を確認する（表１０−Ｂ）。
【０１３５】
【表１１】
0005970734.tif 000029
【０１３６】
最初に、Ｋａｂａｔ位置２７、２９、１００ｂおよび１００ｉにおける突然変異の組合せを含有する１２個のＶＨＨ変異体を構築する（表１１、図５）。これら４突然変異の異なる組合せを、別のＤ54Ｇ置換（例６．３）を含有する配列最適化ＶＨＨ０００４２骨格（図１７−Ｂ）に移す。アミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系列ＶＨ３／ＪＨコンセンサス配列と一直線に並べる。残基はＫａｂａｔに従い番号処理し、ＣＤＲはＡｂＭの定義（Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア）に従いグレーで示す。Ｃ末端ｃ−ｍｙｃタグおよび（ヒス）６タグと一致した発現ベクターｐＡＸ１００に、構築物をクローニングする。ＶＨＨ変異体を大腸菌において生成させ、ＩＭＡＣおよびＳＥＣにより精製する。配列は表１１中に示す。これら全てのＶＨＨは、ｈＡｎｇ２／ｈＴｉｅ２（例５．１；結果は図６および表１２中に示す）、およびｈＡｎｇ１／ｈＴｉｅ２競合ＥＬＩＳＡ（例５．３；結果は図７および表１２中に示す）において分析する。さらに、ｐＨ７でのそれぞれの変異体の溶解温度（Ｔm）を、Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）の取り込み時の蛍光シグナルの温度依存的変化に基づくサーマルシフトアッセイで決定する（Ericsson et al,Anal.Biochem.357(2006),pp289-298）（表１２）。
【０１３７】
【表１２】
0005970734.tif 000030
0005970734.tif 000031
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【０１３８】
【表１３】
0005970734.tif 000035
【０１３９】
【表１４】
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【０１４０】
【表１５】
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【０１４１】
有効性の観点から、Ｔmおよび配列予想ＶＨＨ００９０８を、アフィニティー成熟と配列最適化を組み合わせた第２サイクルに組み込む（例７．３）。
【０１４２】
（例７  選択したＶＨＨ１Ｄ０１、２８Ｄ１０および３７Ｆ０２の配列最適化）
７．１  ＶＨＨ１Ｄ０１
抗Ａｎｇ２ＶＨＨ１Ｄ０１のアミノ酸配列（図８−Ａ参照）を、ヒト生殖細胞系列ＶＨ３／ＪＨコンセンサス配列と一直線に並べる。残基はＫａｂａｔに従い番号処理し、ＣＤＲはＡｂＭの定義（Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア）に従いグレーで示す。それらのヒト相当物に突然変異した残基には下線を引く。問題の潜在的翻訳後修飾部位は枠で囲う。このアラインメントは、１Ｄ０１が参照生殖細胞系列配列と比較して６個のフレームワーク突然変異を含有することを示す。位置１４、４１、７１、７４、８３および１０８における非ヒト残基を、それらのヒト生殖細胞系列相当物との置換用に選択する。これらの位置にヒト残基の異なる組合せ（図８−Ｂ）を有する一組の７個の１Ｄ０１変異体を、構築し生成する（例５）。平行して、これら７個の変異体の３個で、位置Ｄ54Ｇ55における潜在的Ａｓｐ異性体化部位をＤ54Ｇ置換の導入によって除去し、およびこれら７個の変異体の１個で、位置Ｅ1における潜在的ｐｙｒｏＧｌｕ形成部位をＥ1Ｄ置換によって除去する（ＡＡ配列は表１５中に列挙する）。
【０１４３】
これらの変異体は、ヒト（図９−１）、マウス（図９−２）およびカニクイザル（図９−３）Ａｎｇ２／Ｔｉｅ２競合ＥＬＩＳＡ（例５．１；例５．２）、ｈＡｎｇ１／ｈＴｉｅ２競合ＥＬＩＳＡ（例５．３；図１０）において精製タンパク質として特徴付ける。さらに、それぞれの変異体の溶解温度（Ｔm）をサーマルシフトアッセイで決定する（例６）。データの概要は表１３において見ることができる。さらに、ヒト生殖細胞系列とのＦＲ同一率％は、ＡｂＭの定義（Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア）に従い計算する。ヒト、カニクイザル、マウスおよびラットＡｎｇ２に関するＶＨＨ００９２１のアフィニティーは表１４中に示す（例５．４）。
【０１４４】
【表１６】
0005970734.tif 000040
【０１４５】
【表１７】
0005970734.tif 000041
【０１４６】
【表１８】
0005970734.tif 000042
0005970734.tif 000043
【０１４７】
７．２  ＶＨＨ３７Ｆ０２
抗Ａｎｇ２ＶＨＨ３７Ｆ０２のアミノ酸配列（図１２−Ａ参照）を、ヒト生殖細胞系列ＶＨ３／ＪＨコンセンサス配列と一直線に並べる。残基はＫａｂａｔに従い番号処理し、ＣＤＲはＡｂＭの定義（Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア）に従いグレーで示す。それらのヒト相当物に突然変異した残基には下線を引く。問題の潜在的翻訳後修飾部位は枠で囲う。このアラインメントは、３７Ｆ０２が参照生殖細胞系列配列と比較して４個のフレームワーク突然変異を含有することを示す。位置６０、７４、８３および１０８における非ヒト残基を、それらのヒト生殖細胞系列相当物との置換用に選択する。平行して、位置Ｄ54Ｇ55における潜在的Ａｓｐ異性体化部位をＤ54Ｇ置換の導入によって除去する。これらの位置にヒト残基の異なる組合せ（図１２−Ｂ）を有する一組の３サイクル１３７Ｆ０２変異体を構築し生成する（例５；ＡＡ配列は表２１−１中に列挙する）。
【０１４８】
これらの変異体は、ヒト（図１２−１）、マウス（図１２−２）およびカニクイザル（図１２−３）Ａｎｇ２／Ｔｉｅ２競合ＥＬＩＳＡ（例５．１；例５．２）において精製タンパク質として特徴付ける。さらに、それぞれの変異体の溶解温度（Ｔm）をサーマルシフトアッセイで決定する（例６）。データの概要は表１６において見ることができる。さらに、ヒト生殖細胞系列とのＦＲ同一率％は、ＡｂＭの定義（Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア）に従い計算する。
【０１４９】
【表１９】
0005970734.tif 000044
【０１５０】
ＮＮＫライブラリー手法を使用して、ＣＤＲ３中の２箇所の潜在的翻訳後修飾部位：ｉ）位置１００ｅにおける酸化感受性Ｍｅｔ、およびｉｉ）位置Ｄ95Ｓ96におけるＡｓｐ異性体化部位をノックアウトする。Ｄ54Ｇは許容されるので（ＶＨＨ０００４６および００９２０、表１６および表１７）、ＮＮＫ手法を使用して、この潜在的Ａｓｐ異性体化部位をノックアウトすることはなかった。
【０１５１】
最後に、位置Ｄ95、Ｓ96およびＭ100eに他の全アミノ酸に対する置換があるＶＨＨクローンを含有する３個のＮＮＫライブラリーを、ｈＡｎｇ２／ｈＴｉｅ２競合アルファスクリーンアッセイでスクリーニングする（例２）。要約すると、発現されたＶＨＨを含有する周辺質抽出物を３個の異なる希釈でスクリーニングし（親ＶＨＨ３７Ｆ０２のＥＣ20、ＥＣ50およびＥＣ80にほぼ相当）、異なる希釈点での阻害率％の変化を親３７Ｆ０２と比較する。スクリーニング結果および表１７中に示すデータに基づいて、（ＶＨＨ００９２０骨格をベースとし、）、Ｄ95Ｓ96とＭ100eの異なるノックアウトの組合せを有する、さらなる８個のサイクル２ＶＨＨ変異体を構築する（図１１−Ｃ；ＡＡ配列は表１９−２中に列挙する）。
【０１５２】
これらの変異体は、ヒト（図１３−１）、マウス（図１２−２）およびカニクイザル（図１２−３）Ａｎｇ２／Ｔｉｅ２競合ＥＬＩＳＡ（例５．１；例５．２）、ｈＡｎｇ１／ｈＴｉｅ２競合ＥＬＩＳＡ（例５．３；図１４）において精製タンパク質として特徴付ける。さらに、それぞれの変異体の溶解温度（Ｔm）をサーマルシフトアッセイで決定する（例６）。データの概要は表１７において見ることができる。さらに、ヒト生殖細胞系列とのＦＲ同一率％を計算する。ヒト、カニクイザル、マウスおよびラットＡｎｇ２に関するＶＨＨ００９２８のアフィニティーは表１８中に示す。
【０１５３】
【表２０】
0005970734.tif 000045
【０１５４】
【表２１】
0005970734.tif 000046
【０１５５】
【表２２】
0005970734.tif 000047
【０１５６】
【表２３】
0005970734.tif 000048
0005970734.tif 000049
【０１５７】
７．３  ＶＨＨ２８Ｄ１０
抗Ａｎｇ２ＶＨＨ２８Ｄ１０のアミノ酸配列（図１５−Ａ参照）を、
ヒト生殖細胞系列ＶＨ３／ＪＨコンセンサス配列と一直線に並べる。残基はＫａｂａｔに従い番号処理し、ＣＤＲはＡｂＭの定義（Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア）に従いグレーで示す。それらのヒト相当物に突然変異した残基には下線を引く。問題の潜在的翻訳後修飾部位は枠で囲う。このアラインメントは、２８Ｄ１０が参照生殖細胞系列配列と比較して５個のフレームワーク突然変異を含有することを示す。位置１４、７１、７４、８３および１０８における非ヒト残基を、それらのヒト生殖細胞系列相当物との置換用に選択する。平行して、位置Ｄ54Ｇ55における潜在的Ａｓｐ異性体化部位をＤ54Ｇ置換の導入によって除去する。位置５０における遊離システインはＡｌａ、ＴｈｒまたはＳｅｒとの置換によって除去した。最後に、これらの位置にヒト残基の異なる組合せを有する一組の１１サイクル２８Ｄ１０変異体を構築し生成する（図１５−Ｂ参照；ＡＡ配列は表２４−１中に列挙する）。
【０１５８】
これらの変異体は、ヒト（図１６−１）、マウス（図１６−２）およびカニクイザル（図１６−３）Ａｎｇ２／Ｔｉｅ２競合ＥＬＩＳＡ（例５．１；例５．２）、ｈＡｎｇ１／ｈＴｉｅ２競合ＥＬＩＳＡ（例５．３；図１７）において精製タンパク質として特徴付ける。さらに、それぞれの変異体の溶解温度（Ｔm）をサーマルシフトアッセイで決定する（例６）。データの概要は表２０において見ることができる。さらに、ヒト生殖細胞系列とのＦＲ同一率％を計算する。
【０１５９】
【表２４】
0005970734.tif 000050
【０１６０】
別組の変異体（サイクル２）を作製して、位置Ａ24Ｖにおけるアフィニティー成熟置換を調べ、Ｃ50Ｘ−Ｃ53Ｘ変異体をさらに調べる（表２１；図１５−Ｃ；ＡＡ配列は表２３−４−２中に列挙する）。これらの変異体は、ヒト（図１８−１）、マウス（図１８−２）およびカニクイザル（図１８−３）Ａｎｇ２／Ｔｉｅ２競合ＥＬＩＳＡ（例５．１；例５．２）、ｈＡｎｇ１／ｈＴｉｅ２競合ＥＬＩＳＡ（例５．３；図１９）において精製タンパク質として特徴付ける。さらに、それぞれの変異体の溶解温度（Ｔm）をサーマルシフトアッセイで決定する（例６）。
【０１６１】
【表２５】
0005970734.tif 000051
【０１６２】
平行して、ＮＮＫライブラリー手法を使用して、ＣＤＲ２中の２箇所の潜在的翻訳後修飾部位、位置Ｄ52aＳ53およびＤ54Ｓ55における２連続Ａｓｐ異性体化部位をノックアウトする。Ｄ54Ｇは許容されるので（例６；表２０）、ＮＮＫ手法を使用して、この潜在的Ａｓｐ異性体化部位をノックアウトすることはなかった。最後に、位置Ｄ52aおよびＳ53に他の全アミノ酸に対する置換があるＶＨＨクローンを含有する２個のＮＮＫライブラリーを、ｈＡｎｇ２／ｈＴｉｅ２競合アルファスクリーンアッセイでスクリーニングする（例２）。要約すると、発現されたＶＨＨを含有する周辺質抽出物を、（参照００９０２のＥＣ20、ＥＣ50およびＥＣ80にほぼ相当する）３個の異なる希釈でスクリーニングし、異なる希釈点での阻害率％の変化を参照００９０２と比較する。スクリーニング結果および表２１中に示すデータに基づいて、（００９０８骨格をベースとする）、さらなる７個のサイクル３ＶＨＨ変異体を構築する（図１５−Ｄ参照）。最終目的は、高い有効性、高い熱安定性を保持するかまたは示し、ＶＨＨ２８Ｄ１０と比較してノックアウトされた関連ＰＴＭ部位を有するＶＨＨ変異体を構築することである（ＡＡ配列は表２４−３中に列挙する）。これらの変異体は、ヒト（図２０−１）、マウス（図２０−２）およびカニクイザル（図２０−３）Ａｎｇ２／Ｔｉｅ２競合ＥＬＩＳＡ（例５．１；例５．２）、ｈＡｎｇ１／ｈＴｉｅ２競合ＥＬＩＳＡ（例５．３）において精製タンパク質として特徴付ける。さらに、それぞれの変異体の溶解温度（Ｔm）をサーマルシフトアッセイで決定する（例６）。データの概要は表２２において見ることができる。さらに、ヒト生殖細胞系列とのＦＲ同一率％を計算する。最適配列変化を、非アフィニティー成熟変異体ＶＨＨ００９５６に最後に施した（図１５−Ｄ）。ヒト、マウス、カニクイザルおよびラットＡｎｇ２に対するＶＨＨ００９１９、００９３８および００９５６のアフィニティーは表２３中に示す。
【０１６３】
【表２６】
0005970734.tif 000052
【０１６４】
【表２７】
0005970734.tif 000053
【０１６５】
【表２８】
0005970734.tif 000054
0005970734.tif 000055
【０１６６】
【表２９】
0005970734.tif 000056
【０１６７】
【表３０】
0005970734.tif 000057
0005970734.tif 000058
【図１−１Ａ】
0005970734.tif 000059
【図１−１Ｂ】
0005970734.tif 000060
【図１−１Ｃ】
0005970734.tif 000061
【図１−１Ｄ】
0005970734.tif 000062
【図１−２Ａ】
0005970734.tif 000063
【図１−２Ｂ】
0005970734.tif 000064
【図１−２Ｃ】
0005970734.tif 000065
【図２−１Ａ】
0005970734.tif 000066
【図２−１Ｂ】
0005970734.tif 000067
【図２−１Ｃ】
0005970734.tif 000068
【図２−１Ｄ】
0005970734.tif 000069
【図２−２Ａ】
0005970734.tif 000070
【図２−２Ｂ】
0005970734.tif 000071
【図２−２Ｃ】
0005970734.tif 000072
【図３Ａ】
0005970734.tif 000073
【図３Ｂ】
0005970734.tif 000074
【図４Ａ】
0005970734.tif 000075
【図４Ｂ】
0005970734.tif 000076
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
0005970734.tif 000078
【図４Ｅ】
0005970734.tif 000079
【図４Ｆ】
0005970734.tif 000080
【図４Ｇ】
0005970734.tif 000081
【図４Ｈ】
0005970734.tif 000082
【図４Ｉ】
0005970734.tif 000083
【図５−１】
0005970734.tif 000084
【図５−２】
0005970734.tif 000085
【図６Ａ】
0005970734.tif 000086
【図６Ｂ】
0005970734.tif 000087
【図６Ｃ】
0005970734.tif 000088
【図７Ａ】
0005970734.tif 000089
【図７Ｂ】
0005970734.tif 000090
【図７Ｃ】
0005970734.tif 000091
【図８Ａ】
0005970734.tif 000092
【図８Ｂ】
0005970734.tif 000093
【図９−１Ａ】
0005970734.tif 000094
【図９−１Ｂ】
0005970734.tif 000095
【図９−２Ａ】
0005970734.tif 000096
【図９−２Ｂ】
0005970734.tif 000097
【図９−３Ａ】
0005970734.tif 000098
【図９−３Ｂ】
0005970734.tif 000099
【図１０】
0005970734.tif 000100
【図１１Ａ】
0005970734.tif 000101
【図１１Ｂ】
0005970734.tif 000102
【図１１Ｃ】
0005970734.tif 000103
【図１２−１】
0005970734.tif 000104
【図１２−２】
0005970734.tif 000105
【図１２−３】
0005970734.tif 000106
【図１３−１Ａ】
0005970734.tif 000107
【図１３−１Ｂ】
0005970734.tif 000108
【図１３−２】
0005970734.tif 000109
【図１３−３】
0005970734.tif 000110
【図１４】
0005970734.tif 000111
【図１５Ａ】
0005970734.tif 000112
【図１５Ｂ−１】
0005970734.tif 000113
【図１５Ｂ−２】
0005970734.tif 000114
【図１５Ｃ】
0005970734.tif 000115
【図１５Ｄ】
0005970734.tif 000116
【図１６−１Ａ】
0005970734.tif 000117
【図１６−１Ｂ】
0005970734.tif 000118
【図１６−１Ｃ】
0005970734.tif 000119
【図１６−２Ａ】
0005970734.tif 000120
【図１６−２Ｂ】
0005970734.tif 000121
【図１６−２Ｃ】
0005970734.tif 000122
【図１６−３Ａ】
0005970734.tif 000123
【図１６−３Ｂ】
0005970734.tif 000124
【図１６−３Ｃ】
0005970734.tif 000125
【図１７Ａ】
0005970734.tif 000126
【図１７Ｂ】
0005970734.tif 000127
【図１８−１Ａ】
0005970734.tif 000128
【図１８−１Ｂ】
0005970734.tif 000129
【図１８−２】
0005970734.tif 000130
【図１８−３】
0005970734.tif 000131
【図１９】
0005970734.tif 000132
【図２０−１Ａ】
0005970734.tif 000133
【図２０−１Ｂ】
0005970734.tif 000134
【図２０−１Ｃ】
0005970734.tif 000135
【図２０−２Ａ】
0005970734.tif 000136
【図２０−２Ｂ】
0005970734.tif 000137
【図２０−２Ｃ】
0005970734.tif 000138
【図２０−３Ａ】
0005970734.tif 000139
【図２０−３Ｂ】
0005970734.tif 000140
【図２０−３Ｃ】
0005970734.tif 000141
【配列表】
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