(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シスタチン及び／又はシスタチン分解物を有効成分とする真皮層の皮膚コラーゲン産生促進剤（飲食品の態様を除く）。
【請求項２】
前記シスタチン分解物が、シスタチンをタンパク質分解酵素で分解して得られたものであることを特徴とする請求項１記載の皮膚コラーゲン産生促進剤。
【請求項３】
前記タンパク質分解酵素が、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼから選択されるいずれか１種以上であることを特徴とする請求項２記載の皮膚コラーゲン産生促進剤。
【請求項４】
前記シスタチン分解物が、分子量５００以上、８０００以下であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の皮膚コラーゲン産生促進剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のシスタチン及び／又はシスタチン分解物を配合した皮膚コラーゲン産生促進用化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚の荒れ、シワ、弾性低下等を防止するのに有用な皮膚コラーゲン産生促進剤、皮膚コラーゲン産生促進用飲食品及び皮膚コラーゲン産生促進用化粧料に関する。さらに詳しくは、本発明は、シスタチン及び／またはシスタチンをタンパク質分解酵素で分解して得られるシスタチン分解物を有効成分とする皮膚コラーゲン産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、皮膚のメカニズムに関する研究が進められ、皮膚の乾燥感や肌荒れの原因としてマクロ的には、加齢による新陳代謝の減衰によるもののほかに、太陽光（紫外線）、乾燥、酸化等の作用が複雑に関与していることが確認されてきた。これらの因子による作用によって、真皮の最も主要なマトリックス成分であるコラーゲン繊維が顕著に減少していることが明らかとなってきた。コラーゲン繊維によって保たれていた皮膚のハリや弾力性といった張力保持機構が紫外線等の作用によって、破壊されると、皮膚はシワやたるみを増した状態になる。また、コラーゲンはその分子中に水分を保持することができ、それにより、皮膚をしっとりとした状態に保つことにも役立っているから、外的因子により、コラーゲンが破壊されると肌は、乾燥し、荒れた状態になる。以上のことから、真皮層の主要な成分の一つであるコラーゲンの生合成を促進させることにより、皮膚のシワやたるみを防止でき、しかも安全性の点でも問題のない皮膚コラーゲン産生促進剤が望まれていた。
【０００３】
シスタチンは、システインプロテアーゼインヒビターとして、活性中心にＳＨ基を持つシステインプロテアーゼのタンパク質分解活性を阻害する物質であり、動物組織、細胞、血液及び尿中に見出されている。また、シスタチンの有用な作用として、ウイルスの増殖阻害作用が確認されている(非特許文献１)。また、シスタチンなどの皮膚におけるタンパク質分解酵素の阻害因子を増加させ、皮膚の保水率を改善させるグリシンやプロリンなどのアミノ酸からなる組成物については知られている（特許文献１）。しかし、シスタチン及びその分解物が皮膚コラーゲン産生促進作用を持ち、皮膚コラーゲン産生促進剤として有用であることについては知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2008-174522
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Biochem. Biophys.Res. Commun., vol.127, p.1072, 1985
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、安全性の点で問題のない皮膚コラーゲン産生促進剤を提供することを課題とする。また、本発明は、そのような物質を配合した皮膚コラーゲン産生促進用飲食品及び皮膚コラーゲン産生促進用化粧料を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、これらの課題を解決するために、広く食品素材に含まれている皮膚コラーゲン産生促進作用を示す物質について、鋭意、探索を進めたところ、シスタチンあるいはそのシスタチンを分解して得られるシスタチン分解物が、皮膚のコラーゲン量を増加させることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、以下の態様を含むものである。
（１）シスタチン及び／又はシスタチン分解物を有効成分とする皮膚コラーゲン産生促進剤。
（２）前記シスタチン分解物が、シスタチンをタンパク質分解酵素で分解して得られたものであることを特徴とする（１）記載の皮膚コラーゲン産生促進剤。
（３）前記タンパク質分解酵素が、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼから選択されるいずれか１種以上であることを特徴とする（２）記載の皮膚コラーゲン産生促進剤。
（４）前記シスタチン分解物が、分子量５００以上、８０００以下であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の皮膚コラーゲン産生促進剤。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載のシスタチン及び／またはシスタチン分解物を配合した皮膚コラーゲン産生促進用飲食品。
（６）（１）〜（４）のいずれかに記載のシスタチン及び／またはシスタチン分解物を配合した皮膚コラーゲン産生促進用化粧料。
（７）シスタチン及び／又はシスタチン分解物を経口摂取又は塗布することによる肌質の改善方法。
（８）シスタチン及び／又はシスタチン分解物を１日あたり１０μｇ以上経口摂取するか、又は０．００１〜２重量％になるよう塗布することによる肌質の改善方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、シスタチン及び／またはシスタチン分解物を有効成分とする皮膚コラーゲン産生促進剤、皮膚コラーゲン産生促進用飲食品及び皮膚コラーゲン産生促進用化粧料が提供される。本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤、皮膚コラーゲン産生促進用飲食品及び皮膚コラーゲン産生促進用化粧料は、皮膚のコラーゲン産生を促進させる作用を有し、皮膚のシワやたるみ、乾燥感や肌荒れの予防や治療に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤の特徴は、シスタチン及び／またはシスタチンをタンパク質分解酵素で分解して得られるシスタチン分解物を有効成分とすることにある。
【００１１】
本発明のシスタチンはどのような由来のものであっても使用可能である。たとえば、ヒト及びウシ由来のシスタチンはすでにその遺伝子配列が明らかになっており、遺伝子組換えによる生産が可能であるが、本発明では、遺伝子工学的手法により生産されたシスタチンも使用可能である。また、シスタチンはウシ初乳中に比較的大量に含有されており、乳から回収したものであっても良い。さらにシスタチンは細胞培養の培養液から回収することも可能であり、このような細胞由来のものであっても使用可能である。
【００１２】
例えば、乳由来のシスタチンについては、公知の方法（特開2000-281587等）に従って製造することが可能であり、生乳や粉乳、脱脂乳、還元乳等から加熱処理、加塩処理、エタノール処理、イオン交換クロマトグラフィーやゲル濾過クロマトグラフィー等の各種クロマト処理、限外濾過処理等を行うことにより、シスタチンを得ることができる。
【００１３】
シスタチン分解物は、シスタチンをトリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼ等のタンパク質分解酵素で分子量が８，０００以下となるように限定分解したペプチド混合物を使用することが可能である。但し、分子量の下限は５００以上であることが好ましい。
【００１４】
本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤は、経口投与あるいは塗布することにより、皮膚コラーゲン産生促進効果を発揮する。本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤を経口投与するに際しては、有効成分であるシスタチンあるいはシスタチン分解物をそのままの状態で用いることもできるが、常法に従い、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤等に製剤化して用いることもできる。本発明において、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の経口剤は、例えば、澱粉、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等の賦形剤を用いて常法によって製剤化される。この種の製剤には、前記賦形剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、着色料、香料等を適宜使用することが出来る。より具体的には、結合剤としては、例えば、澱粉、デキストリン、アラビアガム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、結晶性セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドンが挙げられる。また、崩壊剤としては、例えば、澱粉、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶性セルロース等が挙げられる。界面活性剤としては、大豆レシチン、蔗糖脂肪酸エステル等が、滑沢剤としては、タルク、ロウ、蔗糖脂肪酸エステル、水素添加植物油等が、流動性促進剤としては無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等が挙げられる。
【００１５】
さらには、これらのシスタチンやシスタチン分解物をそのままあるいは製剤化した後、これを栄養剤や飲食品等に配合することも可能である。また、ビタミンＣ等の従来からコラーゲン産生に有効な作用を持つと考えられている成分とともにシスタチンやシスタチン分解物を配合すれば、一層の皮膚コラーゲン産生促進作用が期待できる。なお、シスタチンあるいはシスタチン分解物は、比較的熱に対して安定であるので、シスタチンあるいはシスタチン分解物を含む原料を通常行われるような条件で加熱殺菌することも可能である。
【００１６】
本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤を塗布するに際しては、その使用目的に応じて、通常用いられる公知の成分に配合することによって、液剤、固形剤、半固形剤等の各種剤形に調製することが可能で、好ましい組成物として軟膏、ゲル、クリーム、スプレー剤、貼付剤、ローション、粉末等が挙げられる。例えば、本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤をワセリン等の炭化水素、ステアリルアルコール、ミリスチン酸イソプロピル等の高級脂肪酸低級アルキルエステル、ラノリン等の動物性油脂、グリセリン等の多価アルコール、グリセリン脂肪酸エステル、モノステアリン酸、ポリエチレングリコール等の界面活性剤、無機塩、ロウ、樹脂、水及び、要すればパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ブチル等の保存料に混合することによって、皮膚コラーゲン産生促進用化粧料や医薬品を製造することができる。
【００１７】
本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤の経口投与による有効量は、その製剤形態、投与方法、使用目的、及びこれを適用される患者の年齢、体重、病状により適宜規定され一定でないが、ラットを用いた動物実験の結果によると、皮膚コラーゲン産生促進作用を示すためには、シスタチンン及び／またはシスタチン分解物をラット体重１ｋｇ当たり１０μｇ以上摂取する必要があることが判った。したがって、外挿法によると、通常、成人一人当たり一日１０μｇ以上のシスタチン及び／またはシスタチン分解物を摂取すれば効果が期待できるので、この必要量を確保できるよう飲食品に配合するか、あるいは、医薬として投与すれば良い。なお、投与は必要に応じて一日数回に分けて行うことも可能である。
【００１８】
本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤の塗布による有効量は、剤形により異なるが、適用する組成物全量を基準として、好ましくは、０．００１〜２重量％となるように、シスタチン及び／またはシスタチン分解物を配合すれば良い。ただし、入浴剤のように使用時に希釈されるものは、さらに配合量を増やすことができる。
【実施例】
【００１９】
以下に、実施例及び試験例を示して本発明を詳細に説明するが、これらは単に本発明の実施態様を例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
Ｓセファロース ３,０００ｇ を充填したカラムを脱イオン水で充分洗浄し、脱脂乳１０,０００Ｌを通液し、脱イオン水で充分洗浄した後、０．１〜１．０Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配で溶出した。得られた画分を９０℃で１０分間加熱処理し、遠心分離することにより沈澱を除去した。そして、牛乳由来塩基性シスタチンを含む溶出画分を再度ＭｏｎｏＳイオン交換クロマトグラフィーで分画した。さらに、この画分をＦＰＬＣシステムによりＭｏｎｏＱイオン交換クロマトグラフィー、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２ゲル濾過クロマトグラフィーを行い、さらにＨＰＬＣシステムにてヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びＣ４逆相クロマトグラフィーで順次処理し、シスタチン５８ｍｇ（画分Ａ）を得た。なお、このようにして得られたシスタチンは、そのまま皮膚コラーゲン産生促進剤として使用可能である。
【実施例２】
【００２１】
５％乳清タンパク質溶液１０，０００Ｌを９０℃で１０分間加熱処理し、遠心分離することにより沈澱を除去した。さらに、カルボキシメチル化パパインをトレシルトヨパール（Ｔｒｅｓｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、東ソー社製） に結合させた担体をカラムに充填後、０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で平衡化し、先の乳清タンパク質溶液を通液した。通液後、０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液と０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で順次カラムを洗浄した。次いで、２０ｍＭ 酢酸−０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液でシステインプロテアーゼを溶出させた。溶出画分を直ちに１Ｍ水酸化ナトリウム溶液で中和し、ＭｏｎｏＳ陰イオン交換クロマトグラフィー、さらにＨＰＬＣシステムにてヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びＣ４逆相クロマトグラフィーで順次処理して分画し、牛乳由来塩基性シスタチン４８ｍｇ（画分Ｂ）を得た。なお、このようにして得られたシスタチンは、そのまま皮膚コラーゲン産生促進剤として使用可能である。
【実施例３】
【００２２】
実施例１で得られた画分Ａ２５ｍｇを、水１００ｍｌに懸濁し、最終濃度が１％となるようにパンクレアチンを加えて、３７℃で５時間酵素処理した。そして、９０℃で５分間加熱処理して酵素を失活させた後、凍結乾燥して、シスタチン分解物２３ｍｇ（画分Ｃ）を得た。また、実施例２で得られた画分Ｂ  ２５ｍｇを、同様に処理し、シスタチン分解物 ２４ｍｇ（画分Ｄ）を得た。なお、このようにして得られたシスタチン分解物の分子量は、８，０００以下であり、そのまま皮膚コラーゲン産生促進剤として使用可能である。
【００２３】
［試験例１］
実施例１で得られた画分Ａ及び実施例３で得られた画分Ｃについて、ラットを用いた動物実験によりコラーゲン産生促進作用を調べた。７週齢のＷｉｓｔａｒ系雄ラットを、生理食塩水投与群（Ａ群）、実施例１で得られた画分Ａをラット体重１ｋｇ当たり１０μｇ投与する群（Ｂ群）、実施例１で得られた画分Ａをラット体重１ｋｇ当たり１００μｇ投与する群（Ｃ群）、実施例３で得られた画分Ｃをラット体重１ｋｇ当たり１０μｇ投与する群（Ｄ群）、実施例３で得られた画分Ｃをラット体重１ｋｇ当たり１００μｇ投与する群（Ｅ群）の５試験群（ｎ＝６）に分け、それぞれを毎日１回ゾンデで投与して１０週間飼育した。皮膚のコラーゲン量については、ラットの真皮をＮｉｍｎｉらの方法（Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ２９２頁， １９６７年 参照）に準じて処理した後、可溶性画分に含まれるヒドロキシプロリン量を測定した。ヒドロキシプロリンはコラーゲンのみに含まれる特殊なアミノ酸で、コラーゲンを構成する全アミノ酸の約１０％を占めることからコラーゲン量の推定ができる（浅野隆司ら，Ｂｉｏ Ｉｎｄｕｓｔｏｒｙ，１２頁， ２００１年 参照）。その結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
0005955499.tif 000002
【００２５】
この結果、１０週間後の可溶性画分中ヒドロキシプロリン量は、Ａ群に比べ、Ｂ群、Ｃ群、Ｄ群及びＥ群で有意に高い値を示した。このことから、シスタチン及びシスタチン分解物には皮膚コラーゲン産生促進作用があることが明らかとなり、皮膚コラーゲン産生促進剤として有用であることが示された。また、この皮膚コラーゲン産生促進作用はシスタチンまたはシスタチン分解物をラット体重１ｋｇ当たり最低１０μｇ投与した場合に認められることが明らかとなった。
【００２６】
［試験例２］
実施例２で得られた画分Ｂ及び実施例３で得られた画分Ｄについて、正常ヒト線維芽細胞株〔白人女性の皮膚より採取されたＣＣＤ４５ＳＫ（ＡＴＣＣＲＬ １５０６）〕を用いた実験により皮膚コラーゲン産生促進作用を調べた。１０容量％ウシ胎児血清（以下ＦＢＳと略記）含有変法イーグル培地（ＭＥＭ、１０‐１０１、大日本製薬社製）を用いて、正常ヒト線維芽細胞株を４×１０４個／ウエル／０．４ｍｌとなるように２４ウエルプレートに播種して、５％炭酸ガス、飽和水蒸気下、３７℃で２４時間培養した後、０．６容量％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地に置換した。そして、実施例２で得られた画分Ｂ及び実施例３で得られた画分Ｄを、各ウエルに０．１容量％となるように添加（ｎ＝６）して、２４時間培養した後、β−アミノプロピオニトリルを５０μｇ／ｍｌ、トリチウム−Ｌ−プロリンを１μＣｉ／ｍｌとなるように添加して、さらに２４時間培養して培養液を得た。このようにして得られた培養液より、Ｗｅｂｓｔｅｒらの方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２０頁，１９７９年 参照）に従いコラーゲン画分を分画し、コラーゲン画分に取り込まれた放射能を測定した。なお、対照として、シスタチン及びシスタチン分解物を添加しないで同様の試験を行った。その結果を表２に示す。
【００２７】
【表２】
0005955499.tif 000003
【００２８】
これによると、シスタチン及びシスタチン分解物を添加した群は、シスタチン及びシスタチン分解物を添加していない群（対照）に比べていずれも２倍以上のコラーゲン産生促進能を示した。このことから、シスタチン及びシスタチン分解物には、皮膚線維芽細胞に働きかけ、コラーゲン産生を促進する作用があることが明らかとなり、皮膚コラーゲン産生促進剤として有用であることが示された。
【実施例４】
【００２９】
表３に示す配合の皮膚コラーゲン産生促進用飲料を常法により製造した。製造した飲料の風味は良好で、常温１年間保存によっても風味が劣化することはなく、沈殿等の問題もなかった。
【００３０】
【表３】
0005955499.tif 000004
【実施例５】
【００３１】
表４に示す配合のドウを常法により作製し、成形した後、焙焼して皮膚コラーゲン産生促進用ビスケットを製造した。
【００３２】
【表４】
0005955499.tif 000005
【実施例６】
【００３３】
表５に示す配合の皮膚コラーゲン産生促進剤を常法により製造した。
【００３４】
【表５】
0005955499.tif 000006
【実施例７】
【００３５】
表６に示す配合の化粧水を常法により製造した。
【００３６】
【表６】
0005955499.tif 000007
【実施例８】
【００３７】
表７に示す配合のクリームを常法により製造した。
【００３８】
【表７】
0005955499.tif 000008
【００３９】
［試験例３］
実施例７で得られた化粧水及び実施例８で得られたクリームを用いて、実使用テストを行った。比較品としては、シスタチンを除いた以外は実施例７及び８と同じ配合のものを用いた。顔面のたるみや小ジワが認められる乾燥肌を有する成人女子２０人を、それぞれ１０人ずつ無作為に２群（Ａ、Ｂ群）に、また、手に肌荒れが認められる女子２０人を、それぞれ１０人ずつ無作為に２群（Ｃ、Ｄ群）に分け、Ａ群の顔面には本発明品の化粧水２ｇを、Ｂ群の顔面には比較品の化粧水２ｇを、Ｃ群の手指には本発明品のクリーム２ｇを、Ｄ群の手指には比較品のクリーム２ｇを、それぞれ１日２回通常の使用状態と同様に１０日間塗布した。結果を表８に示す。
【００４０】
【表８】
0005955499.tif 000009
【００４１】
表８の結果より、本発明品の化粧水は、比較品の化粧水に比べて、乾燥感の改善、肌荒れ等の改善が顕著であり、皮膚コラーゲン産生促進効果に優れていることが実証された。また、本発明品のクリームについても、比較品のクリームに比べて、乾燥感の改善、肌荒れに顕著な改善がみられ、肌荒れ等の自然増悪抑制効果を有することが明らかとなった。