(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出を行うことで、少なくともクリシンを含む第１分画物を有効成分として得るヒアルロン酸合成促進剤（但し、皮膚の不調を抑制、改善するために使用されるものを除く。）の製造方法。
【請求項２】
ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出された第１分画物を水及び酢酸エチルで液−液分配することで、
前記酢酸エチル側に分配される分画物であって少なくともクリシンを含む第２分画物を有効成分として得るヒアルロン酸合成促進剤（但し、皮膚の不調を抑制、改善するために使用されるものを除く。）の製造方法。
【請求項３】
ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出された第１分画物を水及び酢酸エチルで液−液分配し、
前記酢酸エチル側に分配された第２分画物を９０％メタノール及びヘキサンでさらに液−液分配することで、
前記９０％メタノール側に分配される分画物であって少なくともクリシンを含む第３分画物を有効成分として得るヒアルロン酸合成促進剤（但し、皮膚の不調を抑制、改善するために使用されるものを除く。）の製造方法。
【請求項４】
ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出された第１分画物を水及び酢酸エチルで液−液分配し、
前記酢酸エチル側に分配された第２分画物を９０％メタノール及びヘキサンでさらに液−液分配し、
前記９０％メタノール側に分配された第３分画物をシリカゲルクロマトグラフィーで分画することで、
クロロホルム：メタノールが９：１の混合溶媒によりシリカゲルから溶出される分画物であって少なくともクリシンを含む第４分画物を有効成分として得るヒアルロン酸合成促進剤（但し、皮膚の不調を抑制、改善するために使用されるものを除く。）の製造方法。
【請求項５】
クリシンを有効成分として含有するヒアルロン酸合成促進剤（但し、皮膚の不調を抑制、改善するために使用されるものを除く。）。
【請求項６】
ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出を行うことで、少なくともクリシンを含む第１分画物を有効成分として得るＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤（但し、皮膚の不調を抑制、改善するために使用されるものを除く。）の製造方法。
【請求項７】
ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出された第１分画物を水及び酢酸エチルで液−液分配することで、
前記酢酸エチル側に分配される分画物であって少なくともクリシンを含む第２分画物を有効成分として得るＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤（但し、皮膚の不調を抑制、改善するために使用されるものを除く。）の製造方法。
【請求項８】
ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出された第１分画物を水及び酢酸エチルで液−液分配し、
前記酢酸エチル側に分配された第２分画物を９０％メタノール及びヘキサンでさらに液−液分配することで、
前記９０％メタノール側に分配される分画物であって少なくともクリシンを含む第３分画物を有効成分として得るＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤（但し、皮膚の不調を抑制、改善するために使用されるものを除く。）の製造方法。
【請求項９】
ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出された第１分画物を水及び酢酸エチルで液−液分配し、
前記酢酸エチル側に分配された第２分画物を９０％メタノール及びヘキサンでさらに液−液分配し、
前記９０％メタノール側に分配された第３分画物をシリカゲルクロマトグラフィーで分画することで、
クロロホルム：メタノールが９：１の混合溶媒によりシリカゲルから溶出される分画物であって少なくともクリシンを含む第４分画物を有効成分として得るＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤（但し、皮膚の不調を抑制、改善するために使用されるものを除く。）の製造方法。
【請求項１０】
クリシンを有効成分として含有するＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤（但し、皮膚の不調を抑制、改善するために使用されるものを除く。）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸合成促進剤の製造方法、ヒアルロン酸合成促進剤、ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸（ヒアルロナンともいう。）は、Ｎ−アセチルグルコサミン及びグルクロン酸からなる高分子（グリコサミノグリカン）であり、高い水分保持能力を有する。ヒアルロン酸は、水を含有するゲル状の物質として生体内の細胞外基質に広く見られ、生体組織（特に皮膚組織）の粘弾性保持、生体組織の保湿、関節部軟骨の機能維持等に関与することが知られている。また、ヒアルロン酸は、細胞外から細胞内への高分子物質の進入を阻止する、細胞の移動や増殖を調節する、シグナル伝達の場所となる等の機能も有する。
【０００３】
ところで、生体内におけるヒアルロン酸の量は、各種ストレス、紫外線、加齢等により低下する。生体内におけるヒアルロン酸の量が減ると、乾燥による皮膚の不調（しわ、たるみ及びかさつき）や関節痛等の症状が発生することが知られている。生体内のヒアルロン酸の量が減る直接的な原因としては、ヒアルロニダーゼ（ヒアルロン酸分解酵素）や紫外線によりヒアルロン酸が分解されることや、生体内のヒアルロン酸の産生量が減ることを挙げることができる。
【０００４】
このため、生体内におけるヒアルロン酸の量を補う、又は、増やすことができれば、皮膚の不調や関節痛等の症状の予防、抑制及び改善又は正常化を期待することができる。
【０００５】
従来、生体内におけるヒアルロン酸の合成促進作用を有する成分として、表皮においてはレチノイン酸、真皮においてはＴＧＦ-β１が広く知られている。また、生体内におけるヒアルロン酸の合成促進作用を有するものとして、様々な天然物及びその分画物（例えば、アガリクスからの抽出物。）が知られている（例えば、引用文献１参照。）。
【０００６】
一方、ソリザヤノキ（Ｏｒｏｘｙｌｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍ。玉胡蝶や木胡蝶といわれることもある。詳細は後述。）からの抽出物を有効成分として含有する抗酸化剤が知られている（例えば、引用文献２参照。）。なお、ソリザヤノキは、原産地では食用として用いられることもある安全な天然物である。
【０００７】
しかしながら、ソリザヤノキからの抽出物やその精製物、特に、ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出される分画物、当該分画物から分画した所定の分画物、又は、ソリザヤノキに含まれるクリシン（ｃｈｒｙｓｉｎ）を有効成分として含有するヒアルロン酸合成促進剤については知られていない。
【０００８】
また、生体内（特に細胞表面）でヒアルロン酸の合成を行う酵素であるＨＡＳ２（ヒアルロン酸合成酵素２）が知られている。ＨＡＳ２は、ＨＡＳ２ｍＲＮＡが発現することにより合成される。つまり、生体内におけるヒアルロン酸の量を補う、又は、増やすためには、ＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現を促進することが有効である。
【０００９】
ヒアルロン酸合成促進剤の場合と同様に、ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出される分画物、当該分画物から分画した所定の分画物、又は、ソリザヤノキに含まれるクリシンを有効成分として含有するＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤についても知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１３−０３５８３５号公報
【特許文献２】特開２００６−３２１７３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、「安全性が高いソリザヤノキから得られる分画物又は成分を用いたヒアルロン酸合成促進剤」を提供することを目的とする。また、「安全性が高いソリザヤノキから得られる分画物又は成分を用いたＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤」を提供することも目的とする。また、「本発明のヒアルロン酸合成促進剤を含有し、ヒアルロン酸合成促進作用を有する医薬品、食品又は化粧料」を提供することも目的とする。さらにまた、「本発明のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤を含有し、ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進作用を有する医薬品、食品又は化粧料」を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の発明者らの鋭意研究の結果、ソリザヤノキからの抽出物やその精製物のうち、「ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出される分画物」、「当該分画物から分画した所定の分画物」及び「クリシン」がヒアルロン酸合成促進作用を有することが判明した。また、そのメカニズムについての研究から、上記各分画物及び成分がＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進作用を有することも判明した。
本発明の発明者らは、以上の知見から本発明を完成させるに至った。本発明は、以下の事項より構成される。
【００１３】
［１］ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出される分画物であって少なくともクリシンを含む第１分画物を、有効成分として含有するヒアルロン酸合成促進剤。
【００１４】
［２］ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出された第１分画物を水及び酢酸エチルで液−液分配するとき、前記酢酸エチル側に分配される分画物であって少なくともクリシンを含む第２分画物を、有効成分として含有するヒアルロン酸合成促進剤。
【００１５】
［３］ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出された第１分画物を水及び酢酸エチルで液−液分配し、前記酢酸エチル側に分配された第２分画物を９０％メタノール及びヘキサンでさらに液−液分配するとき、前記９０％メタノール側に分配される分画物であって少なくともクリシンを含む第３分画物を、有効成分として含有するヒアルロン酸合成促進剤。
【００１６】
［４］ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出された第１分画物を水及び酢酸エチルで液−液分配し、前記酢酸エチル側に分配された第２分画物を９０％メタノール及びヘキサンでさらに液−液分配し、前記９０％メタノール側に分配された第３分画物をシリカゲルクロマトグラフィーで分画するとき、クロロホルム：メタノールが９：１の混合溶媒によりシリカゲルから溶出される分画物であって少なくともクリシンを含む第４分画物を、有効成分として含有するヒアルロン酸合成促進剤。
【００１７】
［５］クリシンを有効成分として含有するヒアルロン酸合成促進剤。
【００１８】
［６］ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出される分画物であって少なくともクリシンを含む第１分画物を、有効成分として含有するＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤。
【００１９】
［７］ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出された第１分画物を水及び酢酸エチルで液−液分配するとき、前記酢酸エチル側に分配される分画物であって少なくともクリシンを含む第２分画物を、有効成分として含有するＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤。
【００２０】
［８］ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出された第１分画物を水及び酢酸エチルで液−液分配し、前記酢酸エチル側に分配された第２分画物を９０％メタノール及びヘキサンでさらに液−液分配するとき、前記９０％メタノール側に分配される分画物であって少なくともクリシンを含む第３分画物を、有効成分として含有するＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤。
【００２１】
［９］ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出された第１分画物を水及び酢酸エチルで液−液分配し、前記酢酸エチル側に分配された第２分画物を９０％メタノール及びヘキサンでさらに液−液分配し、前記９０％メタノール側に分配された第３分画物をシリカゲルクロマトグラフィーで分画するとき、クロロホルム：メタノールが９：１の混合溶媒によりシリカゲルから溶出される分画物であって少なくともクリシンを含む第４分画物を、有効成分として含有するＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤。
【００２２】
［１０］クリシンを有効成分として含有するＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤。
【００２３】
［１１］上記［１］〜［５］のいずれかに記載のヒアルロン酸合成促進剤を含有する、ヒアルロン酸合成促進作用を有する医薬品、食品又は化粧料。
【００２４】
［１２］上記［６］〜［１０］のいずれかに記載のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤を含有する、ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進作用を有する医薬品、食品又は化粧料。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、後述する試験例からも分かるように、「安全性が高いソリザヤノキから得られる分画物又は成分を用いたヒアルロン酸合成促進剤」、「安全性が高いソリザヤノキから得られる分画物又は成分を用いたＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤」、「本発明のヒアルロン酸合成促進剤を含有し、ヒアルロン酸合成促進作用を有する医薬品、食品又は化粧料」及び「本発明のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤を含有し、ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進作用を有する医薬品、食品又は化粧料」を提供することができる。
【００２６】
なお、本明細書及び各図面では、濃度について単に「％」と記載するときは、体積／体積（Ｖ／Ｖ）で算出したパーセント濃度を表す。
また、本明細書及び各図面では、混合溶媒の成分比率（例えば、上記の「９：１」）は、溶媒の体積の比率を表す。
【００２７】
本発明におけるクリシン（ｃｈｒｙｓｉｎ。５，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｐｈｅｎｙｌ−４Ｈ−ｃｈｒｏｍｅｎ−４−ｏｎｅ。）は、以下の式（１）に記載する化合物である。
【化１】
0005976025.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】実施形態１〜５における第１分画物〜第４分画物及びクリシンを説明するために示すフローチャートである。
【図２】試験例１〜５における試料ａ〜ｅを説明するために示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明のヒアルロン酸合成促進剤、ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸合成促進作用を有する医薬品、食品又は化粧料、及び、ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進作用を有する医薬品、食品又は化粧料について、実施形態に基づいて説明する。
【００３０】
［実施形態］
図１は、実施形態１〜５における第１分画物〜第４分画物及びクリシンを説明するために示すフローチャートである。なお、図１で第４分画物とクリシンとの間が破線で結ばれているのは、後述するように、実施形態５におけるクリシンが第４分画物から単離されたものに限られないためである。
【００３１】
本発明のヒアルロン酸合成促進剤及びＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤は、上記［１］〜［１０］に記載した第１分画物、第２分画物、第３分画物、第４分画物又はクリシンを有効成分として含有する。
以下、上記の各有効成分について、図１及び実施形態１〜５により説明する。また、上記のヒアルロン酸合成促進剤又はＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤を含有する医薬品、食品又は化粧料について、実施形態６により説明する。
【００３２】
［実施形態１］
実施形態１に係るヒアルロン酸合成促進剤及びＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤は、ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出される分画物であって少なくともクリシンを含む第１分画物を、有効成分として含有する。
【００３３】
ソリザヤノキ（Ｏｒｏｘｙｌｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍ）は、ノウゼンカズラ科オロキシルム属、樹高７ｍ〜１２ｍの落葉高木植物である。原産地は東南アジア、インド及び中国であり、これらの地域では山斜面や渓流沿いに自生している。ソリザヤノキの開花期は７〜８月であり、種子は１０月〜１２月に採取できる。ソリザヤノキの種子は、これらの地域で入手することができる一般流通品である。
【００３４】
なお、東南アジア等では、ソリザヤノキの果実、若葉、つぼみ等が食用品として用いられている。また、ソリザヤノキには薬効があるとされ、声がれや言語障害の治療、傷の治療（血止め）、健胃、咳止め等に用いられている。
【００３５】
ソリザヤノキの種子は、胚芽・胚乳の他に翼状の薄膜（種子を遠くまで飛散させるための部位）を有し、全体として薄い片状体をなす。
第１分画物を得るために用いるソリザヤノキの種子は、上記薄膜が付いているものであってもよいし、上記薄膜を取り除いたものであってもよい。本明細書及び各図面においては、「ソリザヤノキの種子」は、上記薄膜が付いているものと、上記薄膜を取り除いたものとの両方を含む。
【００３６】
実施形態１に係るヒアルロン酸合成促進剤及びＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤を得るためには、例えば、ソリザヤノキから採取した種子を干して自然乾燥させた乾燥物を用いることができる。また、ソリザヤノキの種子の無加工物、加熱乾燥物、冷凍乾燥物、冷凍物等を用いることもできる。
【００３７】
抽出にあたっては、例えば、ソリザヤノキの種子をそのまま用いてもよいし、細かく切断して用いてもよいし、粉末状にして用いてもよい。
【００３８】
本明細書において「水性有機溶媒」とは、親水性の有機溶媒を主成分とする溶媒のことをいう。「親水性の有機溶媒」とは、水と分離せずに混じりあう有機溶媒のことをいう。親水性の有機溶媒としては、低級脂肪族アルコール及びアセトンを例示することができる。低級脂肪族アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等の一価アルコールや、１,３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、ペンチレングリコール、イソプレングリコール等の多価アルコールを例示することができる。
水性有機溶媒は、２種類以上の有機溶媒を含有してもよい。
【００３９】
水性有機溶媒は、水を含有してもよい。なお、水性有機溶媒が水を含有する場合、親水性の有機溶媒が主成分か否かは、構成成分のうち水を除いて考える。つまり、親水性の有機溶媒より水の方が多い場合でも、有機溶媒の中で親水性の有機溶媒が主成分であれば、本明細書でいう「水性有機溶媒」である。
水性有機溶媒が水を含有する場合、水性有機溶媒は、上記親水性の有機溶媒を３０％以上含有することが好ましく、５０％以上含有することが一層好ましい。
【００４０】
第１分画物の具体例としては、ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒を用いた抽出により得られる抽出液、当該抽出液の希釈液又は濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、及び、これらの粗精製物若しくは精製物を挙げることができる。
【００４１】
なお、後述の試験例に示すように、ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒を用いて抽出される分画物にはクリシンが含まれている。よって、抽出液、濃縮液、希釈液、乾燥物、粗精製物、精製物等からクリシンを除去するような処理を行わない限りは「クリシンを含む」という条件は満たされる。これは、後述する第２分画物〜第４分画物についても同様である。
【００４２】
抽出は、ソリザヤノキの種子に含まれる可溶性の分画物を水性有機溶媒に溶出させ得る限り特に限定されず、常法に従って行うことができる。抽出の際には、特殊な方法や装置を採用する必要はなく、任意の方法や装置を採用することができる。
【００４３】
抽出の方法の例としては、常温で抽出する方法や、水性有機溶媒の沸点以下の温度に加熱して抽出する方法、加熱還流下で抽出する方法を挙げることができる。この際、ソリザヤノキの種子を浸漬するだけでもよいし、溶媒とともに撹拌してもよい。水性有機溶媒の量は、例えば、抽出原料の５〜５０倍量（重量比）とすることができる。抽出時間は、例えば、１〜７２時間とすることができる。抽出温度は、例えば、室温〜９５℃とすることができる。
【００４４】
水性有機溶媒による抽出を行う前に、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、石油エーテル等の非極性溶媒を用いた脱脂処理を行ってもよい。
【００４５】
可溶性の分画物を溶出させた後、濾過、遠心分離等の処理を施して抽出残渣を除くことにより、抽出液を得ることができる。得られた抽出液から当該抽出液の希釈液、濃縮液、乾燥物、粗精製物、精製物等を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理をさらに行ってもよい。
【００４６】
第１分画物の精製として、脱色、脱臭等を目的とする精製を行なってもよい。当該精製には、例えば、各種吸着処理や各種分離処理（例えば、活性炭、吸着樹脂、イオン交換樹脂、シリカゲル、ゲル濾過剤を用いる処理）を用いることができる。これは、後述する第２分画物〜第４分画物においても同様である。
【００４７】
［実施形態２］
実施形態２に係るヒアルロン酸合成促進剤及びＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤は、ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出された第１分画物を水及び酢酸エチルで液−液分配するとき、酢酸エチル側に分配される分画物であって少なくともクリシンを含む第２分画物を、有効成分として含有する。
【００４８】
第１分画物は、上記実施形態１に記載した方法で得ることができる。
【００４９】
液−液分配は、第１分画物から第２分画物を分離可能な限り特に限定されず、常法に従って行うことができる。液−液分配の実施には、特殊な方法や装置を採用する必要はなく、任意の方法や装置を採用することができる。
【００５０】
［実施形態３］
実施形態３に係るヒアルロン酸合成促進剤及びＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤は、ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出された第１分画物を水及び酢酸エチルで液−液分配し、酢酸エチル側に分配された第２分画物を９０％メタノール及びヘキサンでさらに液−液分配するとき、９０％メタノール側に分配される分画物であって少なくともクリシンを含む第３分画物を、有効成分として含有する。
【００５１】
第１分画物は、上記実施形態１に記載した方法で得ることができる。第２分画物は、上記実施形態２に記載した方法で得ることができる。
【００５２】
液−液分配は、第２分画物から第３分画物を分離可能な限り特に限定されず、常法に従って行うことができる。液−液分配の実施には、特殊な方法や装置を採用する必要はなく、任意の方法や装置を採用することができる。
【００５３】
［実施形態４］
実施形態４に係るヒアルロン酸合成促進剤及びＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤は、ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出された第１分画物を水及び酢酸エチルで液−液分配し、酢酸エチル側に分配された第２分画物を９０％メタノール及びヘキサンでさらに液−液分配し、９０％メタノール側に分配された第３分画物をシリカゲルクロマトグラフィーで分画するとき、クロロホルム：メタノールが９：１の混合溶媒によりシリカゲルから溶出される分画物であって少なくともクリシンを含む第４分画物を、有効成分として含有する。
【００５４】
第１分画物は、上記実施形態１に記載した方法で得ることができる。第２分画物は、上記実施形態２に記載した方法で得ることができる。第３分画物は、上記実施形態３に記載した方法で得ることができる。
【００５５】
シリカゲルクロマトグラフィーは、第３分画物から第４分画物を分離可能な限り特に限定されず、常法に従って行うことができる。シリカゲルクロマトグラフィーの際には、特殊な方法や装置を採用する必要はなく、任意の方法や装置を採用することができる。
【００５６】
［実施形態５］
実施形態５に係るヒアルロン酸合成促進剤及びＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤は、クリシンを有効成分として含有する。
【００５７】
クリシンは、以下の式（１）に記載する化合物である。
【化２】
0005976025.tif 000003
【００５８】
クリシンは、後述する試験例に示すように、上記の第１分画物〜第４分画物に含まれる。ヒアルロン酸合成促進剤及びＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤に用いるクリシンは、ソリザヤノキの種子から得られたもの（後述する試験例参照。）であってもよいし、ソリザヤノキの種子以外の天然物であって、クリシンを含有する天然物から得られたものであってもよいし、市販品や合成品であってもよい。
【００５９】
ソリザヤノキの種子からクリシンを得る場合には、例えば、実施形態４に記載した第４分画物から単離することができる。クリシンの単離・精製には、シリカゲルクロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーを好適に用いることができるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６０】
シリカゲルクロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーは、クリシンを単離・精製可能な限り特に限定されず、常法に従って行うことができる。シリカゲルクロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーの際には、特殊な方法や装置を採用する必要はなく、任意の方法や装置を採用することができる。
【００６１】
上記実施形態１〜５に係るヒアルロン酸合成促進剤及びＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤は、そのヒアルロン酸合成促進作用及びＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進作用を通じて生体内におけるヒアルロン酸の量を補う、又は、増やすことができ、その結果、皮膚の不調や関節痛等の症状の予防、抑制及び改善又は正常化を期待することができる。ただし、本発明に係るヒアルロン酸合成促進剤及びＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤は、これらの用途以外にも、ヒアルロン酸合成促進剤及びＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進作用を発揮することに意義のある全ての用途に使用することができる。
【００６２】
［実施形態６］
実施形態６に係る医薬品、食品又は化粧料は、上記実施形態１〜５のいずれかに記載のヒアルロン酸合成促進剤又はＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤を含有する。
【００６３】
実施形態６に係る医薬品が内用医薬品である場合、投与方法は特に限定されないが、例えば、経口投与・直腸内投与等の経腸投与、経鼻投与等の粘膜投与、静脈内投与・皮下投与等の注射投与とすることができる。本発明の内用医薬品の剤型は、投与方法に適した形態とすることができ、例えば、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、粉末、丸剤、トローチ剤等の固形剤、溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、注射剤などの液剤、ゲル状の製剤とすることができる。実施形態６に係る医薬品として、実施形態１〜５のいずれかに記載のヒアルロン酸合成促進剤又はＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤の純品、精製物、粗精製物等をそのまま投与してもよいが、薬理的に許容される賦形剤とともに投与してもよい。賦形剤としては、単糖類、二等類、多糖類、無機塩類、油脂、蒸留水等、製剤として一般に使用可能なものを用いることができる。実施形態６に係る内用医薬品を製剤化する際には、結合剤、滑沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、希釈剤、緩衝剤、抗酸化剤、細菌抑制剤等の添加剤を用いてもよい。
【００６４】
実施形態６に係る医薬品が外用医薬品である場合、その形態は特に限定されないが、例えば、軟膏剤、クリーム剤、発布剤、テープ剤、外用剤とすることができる。実施形態６に係る外用医薬品は、実施形態１〜５のいずれかに記載のヒアルロン酸合成促進剤又はＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤の他に、必要に応じてその他の医薬成分や賦形剤等を含有してもよい。実施形態６に係る外用医薬品を製造する際には、結合剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、希釈剤、緩衝剤、抗酸化剤、細菌抑制剤等の添加剤を用いてもよい。
【００６５】
実施形態６に係る医薬品がヒアルロン酸合成促進剤又はＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤の含有する量は、各種データ（例えば、内用医薬品であれば投与方法、剤型、ヒアルロン酸合成促進剤又はＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤自体の有効投与量、製剤としての有効投与量等のデータ）に基づき、最適な量を設定することができる。
【００６６】
実施形態６に係る食品の形態は、例えば、実施形態１〜５のいずれかに記載のヒアルロン酸合成促進剤又はＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤の純品、これらの部分精製品、ヒアルロン酸合成促進剤又はＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤を含有するペースト、ヒアルロン酸合成促進剤又はＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤を配合した一般食品とすることができる。具体的な形態としては、ドリンク剤、ゼリー、ビスケット、お茶、錠剤、丸剤、ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤を挙げることができるが、食品として提供可能な形態であれば、いずれの形態も用いることができる。実施形態６に係る食品を製造する際には、副原料として、賦形剤、結合剤、滑沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、希釈剤、緩衝剤、抗酸化剤、細菌抑制剤等の添加剤を用いてもよい。
【００６７】
実施形態６に係る化粧料の形態は、例えば、化粧水、美容液、乳液、クリーム、ジェル、パック、美容パウダー、洗顔フォーム、浴用剤等とすることができるが、化粧料として使用可能な形態であれば、いずれの形態も用いることができる。実施形態６に係る化粧料は、実施形態１〜５のいずれかに記載のヒアルロン酸合成促進剤又はＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤に加え、必要に応じて化粧料に配合される各種配合成分を含有していてもよい。配合成分としては、例えば、固形油、半固形油、液体油、低分子保湿剤、高分子保湿剤、脂溶性保湿剤、エモリエント剤、界面活性剤、防腐剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、エタノール、水を用いることができる。
【００６８】
上記実施形態６に係る医薬品、食品及び化粧料は、実施形態１〜５に係るヒアルロン酸合成促進剤及びＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤が有するヒアルロン酸合成促進作用及びＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進作用を通じて生体内のヒアルロン酸の量を補う、又は、増やすことができ、その結果、皮膚の不調や関節痛等の症状の予防、抑制及び改善又は正常化を期待することができる。ただし、実施形態６に係る医薬品、食品及び化粧料は、これらの用途以外にも、ヒアルロン酸合成促進剤及びＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進作用を発揮することに意義のある全ての用途に使用することができる。
【００６９】
なお、実施形態１〜６に記載したヒアルロン酸合成促進剤、ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、医薬品、食品及び化粧料は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【００７０】
［試験例］
以下、試験例として「１．第１分画物〜第４分画物及びクリシンを分画・単離する試験例」、「２．ヒアルロン酸合成促進作用を確認するための試験例」及び「３．ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進作用を確認するための試験例」を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。なお、以下の試験例は、分画等の方法や作用について確認した結果を示すものであり、本発明は以下の試験例に何ら制約されるものではない。
【００７１】
１．第１分画物〜第４分画物及びクリシンを分画・単離する試験例
図２は、試験例１〜５における試料ａ〜ｅを説明するために示すフローチャートである。なお、試験例６における試料ｆは、試料ａ〜ｅとは別系統の試料であるため、図２には記載していない。
以下、試験例１〜試験例６により、第１分画物〜第４分画物及びクリシンの分画・単離について説明する。
なお、以下の試験例においては、水として蒸留水を用い、メタノール、酢酸エチル及びヘキサンとして山一化学工業株式会社の国産１級のものを用いた。また、実験器具としては一般品（例えば、１００ｍＬ三角フラスコ及び３０ｍＬ三角フラスコは、岩城硝子株式会社のもの）を用いた。
【００７２】
［試験例１］
試験例１は、ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出される分画物であって少なくともクリシンを含む第１分画物を得るための試験例である。図２に示すように、試験例１で分画された第１分画物を試料ａとする。
試験例１においては、水性有機溶媒としてメタノールを用いた。
【００７３】
まず、ソリザヤノキ（Ｏｒｏｘｙｌｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍ）の種子１ｋｇを準備した。ソリザヤノキの種子として、一般流通品の乾燥物（翼状の薄膜が付いているもの）を用いた。
次に、ソリザヤノキの種子をハサミで裁断して細かくし、これをメタノールに浸して抽出を行った。抽出はステンレス製の容器の中で行った。抽出方法は冷浸（室温、メタノール２０Ｌ、抽出時間２４時間）とし、これを合計３回行った。
【００７４】
その後、室温にて自然濾過し、抽出液（蛍光黄緑色の透明な液体）を得た。当該抽出液をさらに減圧濃縮（４０℃、６０ｍｍＨｇ）し、黒色の固体である試料ａ（第１分画物）３１．２ｇを得た。ソリザヤノキの種子の重量（１ｋｇ）を基準とする固形収率は、３．１２％であった。
【００７５】
なお、試料ａがクリシンを含むか否かの試験は行っていないが、後述する試験例５に示すように、試料ａの分画・精製を繰り返した結果クリシンが得られたので、試料ａがクリシンを含むことは明らかである。これは、後述する試験例２〜試験例４における試料ｂ〜試料ｄでも同様である。
【００７６】
［試験例２］
試験例２は、ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出された第１分画物を水及び酢酸エチルで液−液分配するとき、酢酸エチル側に分配される分画物であって少なくともクリシンを含む第２分画物を得るための試験例である。試験例２で分画された第２分画物を試料ｂとする。
【００７７】
まず、試験例１で得た試料ａ（第１分画物）３１．２ｇに水８００ｍＬを加えて懸濁液とし、当該懸濁液に対して酢酸エチルによる抽出（室温、酢酸エチル１０００ｍＬ）を合計３回行った。抽出は分液漏斗を用いて行った。
その後、酢酸エチルを回収し、減圧濃縮（４０℃、７５ｍｍＨｇ）を行って、黒色の固体である試料ｂ（第２分画物）１１．８ｇを得た。ソリザヤノキの種子の重量を基準とする固形収率は、１．１８％であった。
【００７８】
［試験例３］
試験例３は、ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出された第１分画物を水及び酢酸エチルで液−液分配し、酢酸エチル側に分配された第２分画物を９０％メタノール及びヘキサンでさらに液−液分配するとき、９０％メタノール側に分配される分画物であって少なくともクリシンを含む第３分画物を得るための試験例である。試験例３で分画された第３分画物を試料ｃとする。
【００７９】
まず、試験例２で得た試料ｂ（第２分画物）１１．８ｇに９０％メタノール３００ｍＬを加えて懸濁液とし、当該懸濁液に対してヘキサンによる抽出（室温、ヘキサン３００ｍＬ）を合計３回行った。抽出は分液漏斗を用いて行った。
その後、９０％メタノールを回収し、減圧濃縮（４０℃、７５ｍｍＨｇ）を行って、黒色の固体である試料ｃ（第３分画物）４．０ｇを得た。ソリザヤノキの種子の重量を基準とする固形収率は、０．４０％であった。
【００８０】
［試験例４］
試験例４は、ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出された第１分画物を水及び酢酸エチルで液−液分配し、酢酸エチル側に分配された第２分画物を９０％メタノール及びヘキサンでさらに液−液分配し、９０％メタノール側に分配された第３分画物をシリカゲルクロマトグラフィーで分画するとき、クロロホルム：メタノールが９：１の混合溶媒によりシリカゲルから溶出される分画物であって少なくともクリシンを含む第４分画物を得るための試験例である。試験例４で分画された第４分画物を試料ｄとする。
【００８１】
まず、試験例３で得た試料ｃ（第３分画物）４．０ｇを、少量（数十ｍＬ程度）のクロロホルム及びメタノールの混合溶媒で溶解させて溶液とした。次に、当該溶液をシリカゲル（和光純薬株式会社のＷａｋｏｓｉｌ  Ｃ−２００）を充填したカラム（２５ｍｍφ×２９０ｍｍ）に乗せた。
続いて、クロロホルム：メタノール＝９：１の混合溶媒３００ｍＬにより溶出を行い、画分Ａ−１を得た。その後、クロロホルム：メタノール＝４：１の混合溶媒３００ｍＬ、クロロホルム：メタノール＝１：１の混合溶媒３００ｍＬ、メタノール３００ｍＬで順次溶出を行い、順番に画分Ａ−２、画分Ａ−３、画分Ａ−４を得た。
このうち、画分Ａ−１に対して減圧濃縮（４０℃、６０ｍｍＨｇ）を行って、茶褐色〜黒緑色エキス状の試料ｄ（第４分画物）２．３２ｇを得た。ソリザヤノキの種子の重量を基準とする固形収率は、０．２３２％であった。
【００８２】
［試験例５］
試験例５は、クリシンを得るための試験例である。試験例５で単離されたクリシンを試料ｅとする。
なお、試験例５におけるシリカゲルクロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーでは、各フラクションから少量（２０〜３０ｍＬ程度）のサンプルを採り、ＴＬＣでスポットを確認した。スポットは、色又はＵＶランプに対する反応で確認した。スポットの様子が同様であるフラクションについては１つにまとめ、１つの画分として扱った。１つのフラクションあたりの溶液の量は必ずしも一定ではなく、溶液の色等を見ながらフラクションを分けた場合もあった。
【００８３】
まず、試験例４で得た試料ｄ（第４分画物）のうち、後半のフラクションから得られた分である２．２７ｇを、少量のクロロホルム及びメタノールの混合溶媒で溶解させて溶液とした。次に、当該溶液をシリカゲル（和光純薬株式会社のＷａｋｏｓｉｌ  Ｃ−２００）を充填したカラム（２５ｍｍφ×３４０ｍｍ）に乗せた。
続いて、クロロホルム：メタノール＝９：１の混合溶媒５００ｍＬにより溶出を行い、前半の３フラクションから画分Ｂ−１を得、後半の２フラクションから画分Ｂ−２を得た。その後、メタノール３００ｍＬで溶出を行い、画分Ｂ−３を得た。
このうち、画分Ｂ−１に対して減圧濃縮（４０℃、６０ｍｍＨｇ）を行って、画分Ｂ−１からの分画物１．０４ｇを得た。
【００８４】
さらに、画分Ｂ−１からの分画物１．０４ｇを、少量のクロロホルム及びメタノールの混合溶媒で溶解させて溶液とした。次に、当該溶液をシリカゲル（和光純薬株式会社のＷａｋｏｓｉｌ  Ｃ−２００）を充填したカラム（２５ｍｍφ×２７５ｍｍ）に乗せた。
続いて、クロロホルム５００ｍＬにより溶出を行い、前半の１フラクションから画分Ｃ−１を得、後半の３フラクションから画分Ｃ−２を得た。その後、クロロホルム：メタノール＝１９：１の混合溶媒３００ｍＬ、メタノール３００ｍＬで順次溶出を行い、順番に画分Ｃ−３、画分Ｃ−４を得た。このうち、画分Ｃ−２に対して減圧濃縮（４０℃、６０ｍｍＨｇ）を行って、画分Ｃ−２からの分画物０．３５ｇを得た。
【００８５】
さらに、画分Ｃ−２からの分画物０．３５ｇを、少量のクロロホルム及びメタノールの混合溶媒で溶解させて溶液とした。次に、当該溶液をシリカゲル（和光純薬株式会社のＷａｋｏｓｉｌ  Ｃ−２００）を充填したカラム（２５ｍｍφ×２８０ｍｍ）に乗せた。
続いて、クロロホルム５００ｍＬにより溶出を行い、前半の１フラクションから画分Ｄ−１を得、後半の３フラクションから画分Ｄ−２を得た。その後、メタノール３００ｍＬで溶出を行い、画分Ｄ−３を得た。
このうち、画分Ｄ−２に対して減圧濃縮（４０℃、６０ｍｍＨｇ）を行って、画分Ｄ−２からの分画物０．３１ｇを得た。
【００８６】
さらに、画分Ｄ−２からの分画物０．３１ｇを、少量のクロロホルム及びメタノールの混合溶媒で溶解させて溶液とした。次に、当該溶液をクロマトグラフィー用のゲル濾過剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社のＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０）を充填したカラム（２５ｍｍφ×２５０ｍｍ）に乗せた。
続いて、クロロホルム：メタノール＝１：１の混合溶媒５００ｍＬにより溶出を行い、最初の２フラクションから画分Ｅ−１を得、次の１フラクションから画分Ｅ−２を得、その次の１フラクションから画分Ｅ−３を得た。
このうち、画分Ｅ−３に対して減圧濃縮（４０℃、６０ｍｍＨｇ）を行って、画分Ｅ−３からの分画物０．０７ｇを得た。
【００８７】
さらに、画分Ｅ−３からの分画物０．０７ｇを、少量のクロロホルム及びメタノールの混合溶媒で溶解させて溶液とした。次に、当該溶液をクロマトグラフィー用のゲル濾過剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社のＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０）を充填したカラム（２５ｍｍφ×２２０ｍｍ）に乗せた。
続いて、クロロホルム：メタノール＝１：１の混合溶媒５００ｍＬにより溶出を行い、最初の１フラクションから画分Ｆ−１を得、次の３フラクションから画分Ｆ−２を得、その次の１フラクションから画分Ｆ−３を得た。
このうち、画分Ｆ−２に対して減圧濃縮（４０℃、６０ｍｍＨｇ）を行って、試料ｅ（クリシン）約１０ｍｇを得た。ソリザヤノキの種子の重量を基準とする固形収率は、約０．００１％であった。
【００８８】
上記のようにして単離された試料ｅ（クリシン）について、核磁気共鳴スペクトル法により、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルデータを取得した。当該データの取得には、株式会社ＪＥＯＬ  ＲＥＳＯＮＡＮＣＥのＪＮＭ−ＥＣＡ５００を用いた。
その結果、以下のピーク（概略値として、主なピークのみ記載する。）が観測され、一般に知られているクリシンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルデータと略一致した。
【００８９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６）：δ（ｐｐｍ）＝６．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，Ｈ−６）、６．５８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，Ｈ−８）、６．７９（１Ｈ，ｓ，Ｈ−３）、７．６０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３’，Ｈ−５’）、７．６１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４’）、８．０７（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．１，１．７Ｈｚ，Ｈ−２’，Ｈ−６’）
【００９０】
また、試料ｅについて、高速液体クロマトグラフィーによる分析を行った。当該分析には、株式会社島津製作所のダイオードアレイ検出器ＳＰＤ−Ｍ２０Ａ、送液ユニットＬＣ−２０ＡＢ、カラムオーブンＣＴＯ−２０Ａ、及び、株式会社資生堂のＨＰＬＣカラムＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＭＧ  ＩＩ  ４．６ｍｍＩ.Ｄ.×２５０ｍｍを用いた。分析においては、Ａ液をリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）とし、Ｂ液を１００％メタノールとし、直線グラディエントをＡ：Ｂ＝９５：５から２０：８０（６０分）とし、カラム温度を４０℃とした。検出方法としてはダイオードアレイ（１９０−８００ｎｍ）を用いた。
【００９１】
まず、クリシン標準品（東京化成工業株式会社から購入したもの）について上記の条件で分析を行い、５３．７分に最も大きいピークが生じることを確認した。次に、試料ｅについて同じ条件で分析を行い、５２．６分に最も大きいピークが生じることを確認した。また、クリシン標準品及び試料ｅの最大ピークのスペクトルが一致することを確認した。
【００９２】
上記のように、核磁気共鳴スペクトル法及び高速液体クロマトグラフィーにより、試料ｅは主にクリシンからなることが確認できた。
また、試料ｅは試料ａ〜ｄから分画・単離されたものであるため、試料ａ〜ｄもクリシンを含むことが確認できた。
【００９３】
［試験例６］
試験例６は、ソリザヤノキの種子から水性有機溶媒により抽出される分画物であって少なくともクリシンを含む第１分画物を得るための別の試験例である。試験例６で分画された第１分画物を試料ｆとする。
試験例６においては、水性有機溶媒として５０％エタノールを用いた。
【００９４】
まず、ソリザヤノキ（Ｏｒｏｘｙｌｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍ）の種子１０Ｋｇを準備した。ソリザヤノキの種子として、一般流通品の乾燥物（翼状の薄膜が付いたままのもの）を用いた。
次に、ソリザヤノキの種子を細切し、これを５０％エタノールに浸して抽出を行った。抽出方法は加熱還流下での抽出（８０℃、５０％エタノール１５０Ｌ、抽出時間２時間）とした。
その後、室温で自然濾過して抽出液を得、当該抽出液をさらに減圧濃縮（加温。ただし６０℃以下。）して試料ｆ（第１分画物）を得た。
【００９５】
２．ヒアルロン酸合成促進作用を確認するための試験例
［試験例７］
試験例７は、本発明における第１分画物、第３分画物、第４分画物及びクリシンについてヒアルロン酸合成促進作用を確認するための試験例であり、ヒアルロン酸合成促進作用の測定を行った。
【００９６】
まず、試験方法について説明する。
播種・継代用培地として、１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清（ＦＢＳ。株式会社ニチレイバイオサイエンスより購入。ＣＣＢ社）含有最小必須培地α（ＭＥＭα。ＧＩＢＣＯより購入。Ｃａｔ.Ｎｏ.１１９００−０２４）を使用した。当該培地を使用し、ヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ。理研バイオリソースセンターより購入。Ｒｅｓｏｕｒｃｅ．Ｎｏ．ＲＢＲＣ−ＲＣＢ０２２）を、２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルプレートに播種した。２４時間後に細胞が接着していることを確認し、培地中の血清を除去するためにＦＢＳフリーの最小必須培地αで２回洗浄を行った。その後、アッセイ用の培地である０．５％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清含有最小必須培地αを、１００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう、全ウェルに添加した。その後、各種試料を含む培地（アッセイ用の培地にて、終濃度の倍の濃度となるように調製したもの）及び試料を含まない培地（コントロール用）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、さらに７２時間培養を行った。
【００９７】
培養終了後、培養上清について、ＥＬＩＳＡ測定キットであるＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、及び、吸光マイクロプレートリーダーであるＭｕｌｔｉｓｋａｎ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いて、ヒアルロン酸量を測定した。また、ニュートラル・レッド法により、細胞生存率を測定した。細胞生存率８０％を目安として設定し、試料の濃度がそれ以上細胞生存率に影響を及ぼさない範囲で評価を行った。ＥＬＩＳＡ法によるヒアルロン酸量の測定及びニュートラル・レッド法による細胞生存率の測定は、それぞれ測定キットや機器の使用方法に沿って常法により行ったため、詳しい説明は省略する。
【００９８】
試料としては、第１分画物として試験例６の試料ｆを、第３分画物として試験例３の試料ｃを、第４分画物として試験例４の試料ｄを、クリシンとして試験例５の試料ｅをそれぞれ用いた。
【００９９】
次に、試験結果について説明する。
表１は、試験例７の結果（各試料によるヒアルロン酸合成促進作用）を示す表である。なお、表１において、「濃度」は培養時における各試料の濃度を表し、単位はμｇ／ｍＬである。また、「活性量」はコントロールにおけるヒアルロン酸産生量を１００とした場合のヒアルロン酸産生量であり、単位は％である。さらに、「細胞生存率」はコントロールにおける細胞生存率を１００とした場合の細胞生存率であり、単位は％である。
【０１００】
［表１］
各試料によるヒアルロン酸合成促進作用                      
試料                    濃度（μｇ／ｍＬ）    活性量（％）    細胞生存率（％）
試料ｆ（第１分画物）          ０．７８            １２４              ９１      
試料ｆ（第１分画物）          １．５６            １１９              ９０      
試料ｆ（第１分画物）          ３．１３            １０９              ８８      
試料ｆ（第１分画物）          ６．２５            １１５              ７４      
試料ｃ（第３分画物）          ０．２０            １３４              ９７      
試料ｃ（第３分画物）          ０．３９            １３６              ９５      
試料ｃ（第３分画物）          ０．７８            １１１              ９９      
試料ｃ（第３分画物）          １．５６            １３１              ８６      
試料ｄ（第４分画物）          １．５６            １２６              ８９      
試料ｄ（第４分画物）          ３．１３            １１５              ８４      
試料ｅ（クリシン）            ０．２０            １４２              ９６      
試料ｅ（クリシン）            ０．３９            １３８              ９４      
試料ｅ（クリシン）            ０．７８            １４９              ８９      
試料ｅ（クリシン）            １．５６            １１９              ８５      
【０１０１】
表１に示すように、本発明における第１分画物、第３分画物、第４分画物及びクリシンについて、ヒト新生児皮膚線維芽細胞に対してヒアルロン酸合成促進作用を示すことが確認できた。また、試験例７で用いた試料の中では、試料ｃ（第３分画物）及び試料ｅ（クリシン）が高いヒアルロン酸合成促進作用を示す傾向にあることが確認できた。
なお、試験例７では第２分画物に関する試験を行っていないが、他の分画物及びクリシンの全てについてヒアルロン酸合成促進作用が確認できたので、第２分画物もヒアルロン酸合成促進作用を当然に有するものと考えられる。
【０１０２】
３．ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進作用を確認するための試験例
［試験例８］
試験例８は、本発明における第１分画物及びクリシンについてＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進作用を確認するための試験例であり、ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進作用の測定を行った。
【０１０３】
まず、試験方法について説明する。
播種・継代用培地及びアッセイ用の培地としては、上記試験例７と同様のものを用いた。播種・継代用培地を使用し、ヒト新生児皮膚線維芽細胞（上記試験例７と同様のもの）を、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように１２ウェルプレートに播種し、２４時間後に１×ＰＢＳ（−）溶液で１回洗浄を行った。その後、アッセイ用の培地を、７００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう、全ウェルに添加した。その後、各種試料を含む培地（アッセイ用の培地にて、終濃度の倍の濃度となるように調製したもの）及び試料を含まない培地（コントロール用）を７００μＬ／ｗｅｌｌ添加した。培養時間は、同一の試料について４，８，１２，１６，２０，２４時間の６段階に分けて行った。培養終了後、各ウェルの上清を抜き、１×ＰＢＳ（−）溶液１ｍＬで洗浄を行った。
【０１０４】
ＲＮＡの抽出については、ｔｏｔａｌＲＮＡ精製キットであるＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ（タカラバイオ株式会社）を用いて行った。
１×ＰＢＳ（−）溶液での洗浄後、Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＡ１（ｔｏｔａｌＲＮＡ精製キットの細胞溶解緩衝液）と２−メルカプトエタノールとの混合試薬を各ウェルに加えた。Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＡ１及び２−メルカプトエタノールの量は、２ウェルごとに３５０μＬ及び３．５μＬとした。各ウェルから混合試薬を回収し、サンプル分別チューブ（ＲＮＡ用の滅菌１．５ｍＬチューブ）に移し、チューブごとにボルテックスミキサーにかけて撹拌した。チューブの内容物から精製キットを用いてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、−８０℃で保管した。ＲＮＡの抽出は精製キットのプロトコールに沿って常法により行ったため、詳しい説明は省略する。
【０１０５】
このように抽出したｔｏｔａｌＲＮＡについて、ＳｍａｒｔＳｐｅｃ  Ｐｌｕｓ  スペクトロフォトメーター（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ社）を用いて、吸光度（２６０ｎｍ）からＲＮＡ濃度を測定した。逆転写反応は、５００ｎｇのｔｏｔａｌＲＮＡをＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ株式会社）を用いて行い、ヒートブロックにより３７℃で１５分間、８５℃で５秒間インキュベートし、ｃＤＮＡ１０μＬを得た。次に、調製したｃＤＮＡ２μＬに各遺伝子のセンス及びアンチセンスプライマー（１０μＭ）を各１μＬ、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  ＥＸ  Ｔａｑ  ＩＩ（タカラバイオ株式会社）を１２．５μＬ、バランスとしてＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏを加えて、全量を２５μＬとした。ＨＡＳ２のセンスプライマーとして、５´‐ＧＡＣＡＧＧＣＡＴＣＴＣＡＣＧＡＡＣＣＧ‐３´、アンチセンスプライマーとして、５´‐ＣＡＡＣＧＧＧＴＣＴＧＣＴＧＧＴＴＴＡＧＣ‐３´を用いた。内部標準には、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ‐３‐ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）を用いた。Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ（タカラバイオ株式会社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現量を測定した。
また、試験例８においても、試験例７と同様の方法により細胞生存率の測定を行った。
【０１０６】
試料としては、第１分画物として試験例６の試料ｆを、クリシンとして試験例５の試料ｅをそれぞれ用いた。
【０１０７】
次に、試験結果について説明する。
表２は、試験例８の結果（各試料によるＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進作用）を示す表である。なお、表２において、「濃度」は培養時における各試料の濃度を表し、単位はμｇ／ｍＬである。また、「促進率」はコントロールにおけるＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現量を１とした場合のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現量の倍率であり、単位は倍である。なお、試料を含む培地の培養時間として、４〜２４時間の６段階に分けたことは上述したが、表２においては、最も促進率が大きくなった培養時間についての結果を記載している。促進率の数値の後にかっこ書きで示すのは、培養時間である。「細胞生存率」はコントロールにおける細胞生存率を１００とした場合の細胞生存率であり、単位は％である。
【０１０８】
［表２］
各試料によるＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進作用                    
試料                  濃度（μｇ／ｍＬ）  促進率（倍）        細胞生存率（％）
試料ｆ（第１分画物）      ５０．００        ９．０（２０時間）        ９０      
試料ｆ（第１分画物）    １００．００      ２１．７（２０時間）        ９０      
試料ｅ（クリシン）          ３．１３        １．７  （８時間）      １０６      
試料ｅ（クリシン）          ６．２５        ２．０  （８時間）        ９１      
【０１０９】
表２に示すように、本発明における第１分画物及びクリシンについて、ヒト新生児皮膚線維芽細胞に対してＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進作用を示すことが確認できた。
なお、試験例７では第２分画物〜第４分画物に関する試験を行っていないが、第１分画物及びクリシンの全てについてＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進作用が確認できたので、第２分画物〜第４分画物もＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進作用を当然に有するものと考えられる。
【実施例】
【０１１０】
実施例１．軟膏の作製
上記の試験例１に記載した方法に従って調製された第１分画物を用いて、次の処方で、常法により軟膏（１００ｇ）を作製する。
（油相成分）
第１分画物                                      ０．０１ｇ
白色ワセリン                                  ２０．００ｇ
ミネラルオイル                                ２０．００ｇ
ステアリルアルコール                            ５．００ｇ
ステアレス−２                                  ３．００ｇ
プロピルパラベン                                ０．１０ｇ
天然ビタミンＥ                                  ０．１０ｇ
（水相成分）
１，３−ブチレングリコール                      ５．００ｇ
フェノキシエタノール                            ０．４０ｇ
ポリソルベート  ６０                            ４．５０ｇ
精製水                                          適量
全量  １００ｇ
【０１１１】
（調製法）
油相成分及び水相成分をそれぞれ８０℃に熱して均一にし、水相を油相に攪拌しながら加え、乳化後冷却し軟膏を作製した。
【０１１２】
実施例２．テープ剤の作製
上記の試験例２に記載した方法に従って調製された第２分画物を用いて、次の処方で、常法によりテープ剤（１００ｇ）を作製する。
（粘着剤溶剤）
スチレン−イソプロピレン−スチレンブロック共重合体    ７．００ｇ
ピコライト                                          ２５．００ｇ
イソプロピレンゴム                                    ５．００ｇ
トルエン                                            １５．００ｇ
酢酸エチル                                          １４．２０ｇ
ヘキサン                                            ２５．００ｇ
（薬効成分）
第２分画物                                            ０．０１ｇ
エタノール                                            ７．９９ｇ
（経皮吸収促進剤）
オレイルアルコール                                    ０．８０ｇ
全量  １００ｇ
【０１１３】
（調製法）
粘着剤溶剤及び薬効成分をそれぞれ均一にし、薬効成分及び経皮吸収促進剤を粘着剤溶剤に加え、室温で攪拌し組成物を作製した。この組成物をシリコーン処理したポリエステルフィルム上に延展し、１２０℃で乾燥させ冷却後、ポリエチレンフィルムへ粘着剤層を転写させ、テープ剤を作製する。
【０１１４】
実施例３．ローションの作製
上記の試験例３に記載した方法に従って調製された第３分画物を用いて、次の処方で、常法によりローション（１００ｇ）を作製する。
（油相成分）
ポリオキシエチレン（６０モル）硬化ヒマシ油      １．０ｇ
スクワラン                                    ０．０５ｇ
（水相成分）
第３分画物                                      ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール                      ５．０ｇ
グリセリン                                      ５．０ｇ
フェノキシエタノール                            ０．３ｇ
クエン酸                                        ０．１ｇ
クエン酸ナトリウム                              ０．２ｇ
エタノール                                      ２．０ｇ
精製水                                          適量
全量  １００ｇ
【０１１５】
（調製法）
油相成分及び水相成分をそれぞれ均一に溶解する。油相を加熱し、水相の一部に攪拌しながら加えて調製し、その調製液を残りの水層に加えて、化粧水を作製する。
【０１１６】
実施例４．乳液の作製
上記の試験例４に記載した方法に従って調製された第４分画物を用いて、次の処方で、常法により乳液（１００ｇ）を作製する。
ポリオキシエチレン（４０モル）硬化ヒマシ油      ３．０ｇ
スクワラン                                      ５．０ｇ
カルボキシビニルポリマー                        ０．１ｇ
水酸化カリウム                                ０．０５ｇ
ベヘニルアルコール                              １．０ｇ
クエン酸                                        ０．１ｇ
クエン酸ナトリウム                              ０．２ｇ
第４分画物                                      １．５ｇ
１，３−ブチレングリコール                      ４．０ｇ
グリセリン                                      ５．０ｇ
パラオキシ安息香酸エステル                      ０．１ｇ
エデト酸２ナトリウム                          ０．０１ｇ
精製水                                        適量
全量  １００ｇ
【０１１７】
（調製法）
上記素材を攪拌・混合して乳液を作製する。
【０１１８】
実施例５．美容液の作製
上記の試験例５に記載した方法に従って調製されたクリシンを用いて、次の処方で、常法により美容液（１００ｇ）を作製する。
クリシン                                        １．０ｇ
カルボキシビニルポリマー                        ０．１ｇ
イソステアリン酸ポリグリセリル−１０            ２．０ｇ
グリセリン                                      ６．５ｇ
１，３−ブチレングリコール                      ７．５ｇ
フェノキシエタノール                            ０．３ｇ
水酸化カリウム                                ０．０５ｇ
ヒアルロン酸ナトリウム                          ０．１ｇ
スクワラン                                      １．０ｇ
ビタミンＥアセテート                          ０．０５ｇ
ステアリン酸                                  ０．２０ｇ
精製水                                        適量
全量  １００ｇ
【０１１９】
（調製法）
上記素材を攪拌・混合・溶解して美容液を作製する。
【０１２０】
実施例６．錠剤の作製
上記の試験例６に記載した方法に従って調製された第１分画物を用いて、次の処方で錠剤（１錠あたり５００ｍｇ）を作製する。
第１分画物                                        １０ｍｇ
乳糖                                            ４７０ｍｇ
乾燥コーンスターチ                                １０ｍｇ
タルク                                              ９ｍｇ
ステアリン酸カルシウム                              １ｍｇ
【０１２１】
（調製法）
乳糖（９４ｇ）に、第１分画物（２ｇ）、乾燥コーンスターチ（２ｇ）、タルク（１．８ｇ）、ステアリン酸カルシウム（０．２ｇ）を添加して混合する。次いで、単発式打錠機を用いて常法により錠剤を作製する。
【０１２２】
実施例７．ハードカプセル剤の作製
上記の試験例６に記載した方法に従って調製された第１分画物を用いて、次の処方でハードカプセル剤（１カプセルあたり３６０ｍｇ）を作製する。
第１分画物                                          ５ｍｇ
乳糖                                            ２２０ｍｇ
コーンスターチ                                  １１０ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース                      ２５ｍｇ
【０１２３】
（調製法）
第１分画物（５ｇ）に、乳糖（２２０ｇ）及びコーンスターチ（１１０ｇ）を添加して混合し、これにヒドロキシプロピルセルロース（２５ｇ）の水溶液を添加して練合する。次いで、押し出し造粒機を用いて、常法により顆粒を製造する。この顆粒をゼラチンハードカプセルに充填することにより、ハードカプセル剤を作製する。
【０１２４】
実施例８．ソフトカプセル剤の作製
上記の試験例６に記載した方法に従って調製された第１分画物を用いて、次の処方でソフトカプセル剤（１カプセルあたり１７０ｍｇ）を作製する。
第１分画物                                          ５ｍｇ
大豆油                                          １６５ｍｇ
【０１２５】
（調製法）
大豆油（１６５ｇ）に、第１分画物（５ｇ）を添加して混合する。次いで、ロータリー・ダイ式自動成型機を用いて、常法に従い、ソフトカプセルに充填することにより、ソフトカプセル剤を作製する。
【０１２６】
実施例９．丸剤の作製
上記の試験例６に記載した方法に従って調製された第１分画物を用いて、次の処方で丸剤（１粒あたり１００ｍｇ）を作製する。
第１分画物                                      ０．５ｍｇ
モロヘイヤ末                                  ２０．０ｍｇ
デンプン                                      ３０．０ｍｇ
糖蜜                                          ２０．０ｍｇ
茶抽出物                                      １５．０ｍｇ
大豆ファイバー                                １４．０ｍｇ
セラック                                        ０．５ｍｇ
【０１２７】
（調製法）
上記配合で原料を混合し、適量加水後、練合機で均質な練合物を製造し、得られた練合物を圧延し製丸機を用いて製丸後乾燥して丸剤を作製する。
【０１２８】
実施例１０．ゼリーの作製
上記の試験例６に記載した方法に従って調製された第１分画物を用いて、次の処方で、常法によりゼリー（１００ｇ）を作製する。
第１分画物                                    ０．０２ｇ
ゼラチン                                      ２．００ｇ
オレンジ果汁                                ２０．００ｇ
水                                          ７７．９８ｇ
【０１２９】
（調製法）
上記成分を混合し、９０℃へ加熱する。ゼラチンの溶解を確認してから容器に充填し、冷却する。ゼラチンを固化することでゼリーを作製する。
【図１】
0005976025.tif 000004
【図２】
0005976025.tif 000005