(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ感染を予防又は治療するための医薬の製造における、細胞骨格のＩＦを破壊する薬剤の使用であって、前記薬剤は、配列番号１から配列番号１０として識別されるペプチド又はその相同体の群から選択されるペプチドを含み、前記相同体は、配列番号１から配列番号１０のいずれか１つと少なくとも８５％の配列同一性を有し、前記哺乳動物細胞において細胞骨格のＩＦを、破壊するか、負に調節するか又は改変する能力を有する、上記使用。
【請求項２】
前記ＩＦは、ビメンチン及び／又はケラチンを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ＩＦは、ビメンチン及び／又はケラチン−１０を含む、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記薬剤は、前記ＩＦ中のビメンチン及び／又はケラチン−１０の量の低減を誘発する、請求項１から３までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記薬剤は、ビメンチン及び／又はケラチン−１０をコードする遺伝子の発現の低減を実現する、請求項１から３までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
細胞骨格のＩＦを破壊する薬剤及び薬学的に許容される担体又は添加剤を含み、前記薬剤は、配列番号１から配列番号１０として識別されるペプチド及びその相同体の群から選択されるペプチドを含み、前記相同体は、配列番号１から配列番号１０のいずれか１つと少なくとも８５％の配列同一性を有し、前記哺乳動物細胞において細胞骨格のＩＦを、破壊するか、負に調節するか又は改変する能力を有する、ＨＩＶ感染を予防又は治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ医薬品分野、より正確には感染症に対する、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による感染症に対する療法に関する。本発明は、細胞骨格、特に細胞骨格の中間フィラメント（ＩＦ）を形成するタンパク質を変化させることによりＨＩＶ複製を阻害する方法を記載する。本発明は更に、ＨＩＶ感染を予防及び治療する薬物を製造することを目的とする、細胞骨格を負に調節する又は改変する薬剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶ／後天性免疫不全症候群パンデミックの出現は、最近３０年間において全世界で生じた最も重要な健康問題の１つである。かかる出現により、感染症の進行を止め、死亡率を低減することができる抗レトロウイルス治療の開発がもたらされた（Ｄｅ  Ｃｏｃｋ  Ｋ，Ｃｒｏｗｌｅｙ  ＳＰ，Ｌｏ  ＹＲ，Ｇｒａｎｉｃｈ  ＲＭ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＢＧ，Ｂｏｌｅｔｉｎ  ｄｅ  ｌａ  Ｏｒｇａｎｉｚａｃｉｏｎ  Ｍｕｎｄｉａｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｓａｌｕｄ  ２００９；８７：４８８〜４８８）。ＵＮＡＩＤＳは、３３００万人がＨＩＶに感染し、そのうちの２７０万人は、その年に検出された新規症例であるとその２００８年度報告書で見積もった。世界の感染症のうち６７％がサハラ砂漠南部アフリカで生じていると予想されている（世界のエイズ流行に関する報告書２００８年版。ジュネーブ、ＵＮＡＩＤＳ）。２００９年に世界保健機構より発行された公報によれば、全世界で２つの主要な傾向が認められる：それぞれ、サハラ砂漠南部アフリカの人口の合計罹患数、及びその他の世界全体にわたる特定リスク群における感染の濃縮（Ｄｅ  Ｃｏｃｋ  Ｋ，Ｃｒｏｗｌｅｙ  ＳＰ，Ｌｏ  ＹＲ，Ｇｒａｎｉｃｈ  ＲＭ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＢＧ  ２００９．Ｂｏｌｅｔｉｎ  ｄｅ  ｌａ  Ｏｒｇａｎｉｚａｃｉｏｎ  Ｍｕｎｄｉａｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｓａｌｕｄ  ８７：４８８〜４８９）。
【０００３】
ＨＩＶ感染症の年間発症率は１９９０年代中頃にピークを迎えた（Ｂｏｎｇａａｒｔｓ  Ｊ，Ｂｕｅｔｔｎｅｒ  Ｔ，Ｈｅｉｌｉｇ  Ｇ，Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  Ｆ．Ｐｏｐｕｌ  Ｄｅｖ  Ｒｅｖ、２００８；３４：１９９〜２２４）。しかし、慢性的に高いウイルス罹患率及び人口増加速度に起因して、合計ＨＩＶ感染者数は、アフリカでは継続して増加している（Ｄｅ  Ｃｏｃｋ  Ｋ，Ｃｒｏｗｌｅｙ  ＳＰ，Ｌｏ  ＹＲ，Ｇｒａｎｉｃｈ  ＲＭ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＢＧ  ２００９．Ｂｏｌｅｔｉｎ  ｄｅ  ｌａ  Ｏｒｇａｎｉｚａｃｉｏｎ  Ｍｕｎｄｉａｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｓａｌｕｄ  ８７：４８８〜４８９）。
【０００４】
現在入手可能な抗ＨＩＶ薬物に対して耐性のＨＩＶ変異体が現れ、また患者の治療順守が不良であることが、治療不奏功の主要な原因としてなおも留まっている。抗レトロウイルス単剤療法が開始されて以来ウイルスの耐性が認められ、その結果、それぞれ異なる作用機除を有する２つ以上の抗ＨＩＶ薬剤を組み合わせた抗ＨＩＶ併用療法が登場した。高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）を導入して治療を受けた患者では、疾病率及び死亡率は顕著に低下した。この療法では、ヌクレオシド及び非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤とプロテアーゼ（ＰＲ）阻害剤とが併用される。それにもかかわらず、多剤併用療法はＨＩＶを完全には除去せず、長期治療を行うと一般的に多剤耐性を引き起こす。抗ＨＩＶ併用療法を受けた患者の半数は、主に、適用される１つ又は複数の薬物に対するウイルスの耐性に起因して治療に対して完全には反応しない。更に、ウイルス耐性は、最近感染した患者で検出されており、かかる患者について治療上の選択肢を顕著に制限している。
【０００５】
抗ＨＩＶ併用療法が奏功し、ウイルス根絶の可能性に展望が開けた。しかし、療法を問わずウイルスが遷延する潜在的感染細胞に、また組織にもウイルスリザーバーが存在することが記載されている。ウイルスリザーバーを根絶するには、７０年を超える継続した治療が必要とされることが見積もられているが、副次効果及び時に致命的な代謝性合併症、例えば乳酸アシドーシス、糖尿病、脂肪異栄養症、膵炎等が療法より示唆されるので、これはありえないと考えられる事実である（Ｉｇｌｅｓｉａｓ  Ｅ  ２００９．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ  Ａｐｌｉｃａｄａ  ２６：１８９〜１９４）。
【０００６】
薬物が不規則に服用される、又は治療が中断した場合には、ウイルス耐性が速やかに出現することから、ＨＩＶ抗レトロウイルス療法を順守することは、ＨＡＡＲＴ、特にＰＲ（プロテアーゼ）阻害剤について最も論ずべき問題の１つである。治療不順守には、薬物不寛容、複雑な投与法、治療上の不具合、薬物相互作用、社会的経済的諸問題等を含むいくつかの要因が存在する。
【０００７】
併用療法は、エイズの進行を遅延させるが、感染した患者に治癒をもたらさない（Ｍａｒｓｄｅｎ  ＭＤ，Ｚａｃｋ  ＪＡ  ２００９．Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈ  ６３：７〜１０）。治療によってこの感染症が致命的な疾患ではなく慢性疾患に転換され、また患者の平均余命も、一般母集団のレベルに類似したレベルにまで高められたとしても、かかる治療はなおも未解決の重大な問題を提示し、この問題は抗レトロウイルス薬の使用を低減するための新規戦略について調査を必要とする。それは、新規治療変異体に関する調査の最終目標である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
利用可能な抗ＨＩＶ療法の欠点は、いずれも主に作用機序及び／又は作用標的について異なる新規抗ＨＩＶ薬物の必要性を支持する。本発明の目的は、ＨＩＶの複製及び／又は感染を阻害する方法を提供することにある。ＨＩＶポリメラーゼ又はＨＩＶプロテアーゼを阻害するのとは異なる機構を有する、ＨＩＶの複製及び／又は感染を阻害する方法を提供することが本発明の更なる目的である。本発明の別の目的は、ウイルスではなく宿主細胞を標的とすることにより、ＨＩＶの複製及び／又は感染を阻害する方法を提供することにある。とりわけ、本発明の目的は、細胞骨格、より具体的には宿主細胞に由来する中間フィラメント（ＩＦ）を標的とすることにある。とりわけ、本発明の別の目的は、宿主タンパク質のビメンチン及びケラチン−１０を標的とすることにある。宿主細胞を標的とすることにより、ＨＩＶがエスケープ変異体を生成することがより困難になるはずであると考えられている。ビメンチン及びケラチン−１０はＩＦの構造にとって重要であるが、本発明はＩＦがＨＩＶを阻害するのに適する標的であることを明らかにした。本発明の別の目的は、細胞のＩＦを破壊する、又はビメンチン及び／若しくはケラチン−１０宿主タンパク質の量を低減する薬剤及び医薬組成物を提供することにある。
【０００９】
上記目的の少なくとも１つは、本発明により達成される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＨＩＶの複製及び／又は感染を阻害する方法として、哺乳動物細胞の細胞骨格を変化させることに関連する。細胞骨格は、細胞の完全性に寄与し、細胞のためにいくつかの役割を演ずる三次元の足場である。細胞骨格は、微小管、マイクロフィラメント、及び中間フィラメント（ＩＦ）の３つの主要な構造から形成されている。ＩＦは、各細胞型に固有の一連のタンパク質、とりわけビメンチン及びケラチン−１０タンパク質を含む。
【００１１】
ビメンチンは、ＩＦを形成する分子量（ＭＷ）５８ｋＤａのタンパク質であり、一般的に血管の内皮細胞上、ある種の上皮細胞内、及び間葉細胞内に発現している（Ａｌｂｅｒｔｓ  Ｂ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ａ，Ｌｅｗｉｓ  Ｊ，Ｒａｆｆ  Ｍ，Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｋ，Ｗａｌｔｅｒ  Ｐ  ２００２．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。ビメンチンはＨＩＶのＰＲの基質であることが公知であり、またＰＲの作用はビメンチンに影響を及ぼし、これにより細胞骨格構造に影響を及ぼし得ることが提案されている（Ｂｌａｎｃｏ  Ｒ，Ｃａｒｒａｓｃｏ  Ｌ，Ｖｅｎｔｏｓｏ  Ｉ  ２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：１０８６〜１０９３）。タンパク質分解処理により得られたビメンチンのＮ末端ペプチドを用いて処理すれば、細胞核構造を再構成することも可能であることが実証されている。この核構造の再構成は、ＨＩＶ感染細胞でも認められた（Ｓｈｏｅｍａｎ  ＲＬ，Ｈｕｔｔｅｒｍａｎｎ  Ｃ，Ｈａｒｔｉｇ  Ｒ，Ｔｒａｕｂ  Ｐ  ２００１．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １２：１４３〜１５４）。これまでに得られた証拠から、ＨＩＶはそのライフサイクルにおいてビメンチンの切り出しに依存することが示唆される。
【００１２】
ケラチンは、分子量が１０から６８ｋＤａの範囲内の一連のＩＦタンパク質（約３０メンバーからなる）を含む。ケラチンは、そのＭＷ並びにその酸性（ｐＫｉ＝４〜６；タイプＩ）及び中性〜塩基性（ｐＫｉ＝６〜８；タイプＩＩ）における電気泳動挙動に応じて分類され、番号が付けられている。ケラチン−１０は、約６０ｋＤａのタイプＩケラチンで、主に完全に分化した表皮細胞のＩＦ内に認められる（Ｚｈｏｕ  ＸＭ  １９８８．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３：１５５８４〜９）。本発明は、哺乳動物細胞においてＨＩＶの複製及び／又は感染を阻害する方法であって、前記哺乳動物細胞において細胞骨格のＩＦ（の構造）を破壊するステップを含む上記方法を対象とする。更に本発明は、ＨＩＶ感染を予防又は治療するための、細胞骨格のＩＦを破壊する薬剤を対象とする。
【００１３】
第１の態様では、本発明は、哺乳動物細胞においてＨＩＶの複製を阻害する方法であって、哺乳動物細胞において細胞骨格のＩＦ（の構造）を破壊する又は負に調節するステップを含む上記方法を提供する。特に、前記哺乳動物細胞は、ＨＩＶウイルスが感染する標的細胞である。
【００１４】
前記方法の好ましい実施形態では、ＩＦはビメンチン及び／又はケラチン−１０タンパク質を含む。
【００１５】
前記方法の別の好ましい実施形態では、当該方法は、細胞骨格の中間フィラメント（の構造）を破壊又は負に調節するために、前記ＩＦ中のビメンチン及び／又はケラチン−１０の量を低減するステップ、及び／又は新規ＩＦを生成するのに利用可能な遊離したビメンチン及び／又はケラチン−１０の量を低減するステップを含む。
【００１６】
前記方法の更に別の好ましい実施形態では、当該方法は、細胞骨格の中間フィラメント（の構造）を破壊する又は負に調節するために、ビメンチン及び／又はケラチン−１０タンパク質をコードする遺伝子の発現を低減するステップを含む。
【００１７】
前記方法の更に別の好ましい実施形態では、前記ＩＦの破壊は、前記哺乳動物細胞に、ポリペプチド、ペプチド、核酸、及び化合物からなる群から選択される薬剤の治療上有効な用量を投与することにより達成される。１つの好ましい実施形態では、前記薬剤は、配列番号１〜１０として識別されるペプチド及びその相同体の群から選択されるペプチドである。別の好ましい実施形態では、前記薬剤は、ビメンチン及び／又はケラチン−１０遺伝子又はその転写物を標的とする干渉ＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。なおも別の好ましい実施形態では、前記薬剤は化合物又は脂質誘導体である。
【００１８】
別の態様では、本発明は、ＨＩＶ感染を予防又は治療するために、細胞骨格のＩＦを破壊する又は負に調節する薬剤を提供する。
【００１９】
本態様の好ましい実施形態では、前記ＩＦは、ビメンチン及び／又はケラチン−１０を含む。
【００２０】
本発明による薬剤の別の好ましい実施形態では、前記薬剤は、前記ＩＦ中のビメンチン及び／又はケラチン−１０の量の低減を誘発／実現する。
【００２１】
かかる薬剤の別の好ましい実施形態では、当該薬剤は、ビメンチン及び／又はケラチン−１０をコードする遺伝子の発現を低減する。
【００２２】
本発明による薬剤の別の好ましい実施形態では、前記薬剤は、ポリペプチド、ペプチド、核酸、及び化合物からなる群から選択される。
【００２３】
本発明による薬剤の別の好ましい実施形態では、前記薬剤は、配列番号１〜配列番号１０として識別されるペプチド及びその相同体の群から選択されるペプチドを含む。
【００２４】
本発明による薬剤の別の好ましい実施形態では、前記薬剤は、ビメンチン及び／又はケラチン−１０遺伝子又はその転写物を標的とする干渉ＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００２５】
本発明による薬剤の別の好ましい実施形態では、前記薬剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡからなる群から選択される干渉ＲＮＡである。前記干渉ＲＮＡは、ビメンチン及び／又はケラチン−１０タンパク質のメッセンジャーＲＮＡ領域に対して相補的な１５から５０個のヌクレオチド、好ましくは１８から２５個のヌクレオチドの配列を含むことが好ましい。
【００２６】
本発明による薬剤の別の好ましい実施形態では、前記薬剤は化合物であり、前記化合物は脂質化合物又は脂質誘導体である。好ましくは、前記脂質化合物はプロスタグランジンシクロペンタン１５デオキシ−Δ−１２，１４−ＰＧＪ２（１５ｄ−ＰＧＪ２）である。
【００２７】
別の態様では、本発明は、ＨＩＶ感染を治療又は予防する医薬組成物であって、上記の本発明に従って、細胞骨格のＩＦを破壊する又は負に調節する上記の本発明による薬剤及び薬学的に許容される担体又は添加剤を含む上記医薬組成物を提供する。
【００２８】
本発明による組成物の好ましい実施形態では、前記薬剤は、ビメンチン及び／又はケラチン−１０を含むＩＦを破壊するポリペプチド、ペプチド、核酸、及び化合物からなる群から選択される。
【００２９】
本発明による組成物の好ましい実施形態では、前記薬剤は、配列番号１〜配列番号１０として識別されるペプチド及びその相同体からなる群から選択されるペプチドである。
【００３０】
好ましくは、前記薬剤は、ビメンチン及び／又はケラチン−１０遺伝子又はその転写物を標的とする干渉ＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００３１】
本発明による薬剤のきわめて好ましい実施形態では、前記薬剤は、ＨＩＶ感染症の治療若しくは予防に使用され、又はＨＩＶ感染症を治療若しくは予防するための医薬の製造に使用される。
【００３２】
ＨＩＶ感染症の治療又は予防には、ウイルス複製の阻害又は妨害への言及も含まれる。
【００３３】
前記医薬組成物の好ましい実施形態では、干渉ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡからなる群から選択される。
【００３４】
前記医薬組成物の好ましい実施形態では、化合物は、脂質化合物又は脂質誘導体である。好ましくは、前記脂質化合物は、プロスタグランジンシクロペンタン１５デオキシ−Δ−１２，１４−ＰＧＪ２である。
【００３５】
別の態様では、本発明は、本明細書で上記したように、本発明による細胞骨格のＩＦを破壊する薬剤及び少なくとも１つの抗ＨＩＶ薬物を含む医薬組合せを提供する。本発明の態様で使用するのに適する抗ＨＩＶ薬物の例には、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、最も好ましくは、アタザナビル（レイアタッツ（商標））、アンプレナビル（アジェネラーゼ（商標））、ダルナビル（プリジスタ（商標））、ネルフィナビル（ビラセプト（商標））、サクイナビル（インビラーゼ（商標）又はフォートベイス（商標））、インジナビル（クリキシバン（商標））、ホサンプレナビル（レクシヴァ（商標）又はテルジル（商標））、ロピナビル（アルビア（商標））、リトナビル（ノービア（商標））、チプラナビル（アプティバス（商標））、これらの薬物の機能性誘導体、及びこれらを組み合わせたもの、例えばロピナビル＋リトナビル（カレトラ（商標））からなる群から選択されるプロテアーゼ阻害剤が含まれる。本発明の態様で利用可能なその他の抗レトロウイルス薬として、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ｎＮＲＴＩ）、例えばエファビレンツ（ストックリン（商標））及びネビラピン（ビラミューン（商標））、エトラビリン（インテレンス（商標））、リルピビリン（ＴＭＣ−２７８）、ロビリド（Ｒ８９４３９）、デラビルジン（レスクリプター（商標））、これらの薬物の機能性誘導体、及びこれらを組み合わせたものが挙げられる。本発明の態様で利用可能なその他の抗レトロウイルス薬として、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）又はヌクレオシド類似体逆写酵素阻害剤（ＮＡＲＴＩ）、例えばラミブジン（３ＴＣ又はエピビル（商標））、アバカビル（ザイアジェン（商標））、ジドブジン（ＡＺＴ又はレトロビルＡＺＴ（商標））、スタブジン（ｄ４Ｔ又はゼリット（商標））、ザルシタビン（ｄｄＣ又はハイビッド（商標））、ジダノシン（ｄｄｌ又はヴァイデックス（商標））、エムトリシタビン（ＦＴＣ又はエムトリバ（商標））、テノホビル（ビリアード（商標））、アプリシタビン（ＡＶＸ７５４）、スタンピジン、エルブシタビン（Ｌ−Ｆｄ４Ｃ）、ラシビル、アムドキソビル、これらの薬物の機能性誘導体、及びこれらを組み合わせたもの、例えばエムトリシタビン＋テノホビル（ツルバダ（商標））、ジドブジン＋ラミブジン（コンビビル（商標））、及びアバカビル＋ラミブジン＋ジドブジン（トリジビル（商標））が挙げられる。
【００３６】
上記抗レトロウイルス薬に加えて、本発明の医薬組合せは、上記抗レトロウイルス薬の様々なクラスの組合せ、例えばエファビレンツ＋ジドブジン＋ラミブジン、エファビレンツ＋テノホビル＋エムトリシタビン、リトナビル＋ジドブジン＋ラミブジンでブーストされたロピナビル、及びリトナビル＋テノホビル＋エムトリシタビンでブーストされたロピナビル等の組合せを含み得る。
【００３７】
本発明による医薬組合せの好ましい実施形態では、薬剤及び薬物は、投与レジメンの一環として同時に、個別に、又は連続して投与される。
【００３８】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象においてＨＩＶ感染を治療又は予防する方法であって、前記対象に、請求項２０〜２６までのいずれか一項に記載の医薬組成物、又は請求項２７〜２８までのいずれか一項に記載の医薬組合せの治療上有効な用量を投与するステップを含む上記方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】比較プロテオミクスにより識別されたヒトのビメンチン及びケラチン−１０タンパク質の相対的強度を示す図である。パネルＡは、抗ＨＩＶ活性を保持する抽出物で処理した培養物中のビメンチンタンパク質の低下を示す。パネルＢは、抗ＨＩＶ活性を保持する抽出物で処理した培養物中のケラチン−１０タンパク質の低下を示す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図２】両方のタンパク質それぞれについて安定的に発現抑制させた培養物中のビメンチン及びケラチン−１０タンパク質の検出を示す図である。各タンパク質について発現抑制を施したＭＴ４細胞系、ＭＴ４ｖｉｍ（Ｓ）及びＭＴ４Ｋ−１０（Ｓ）それぞれを対象として、ビメンチン（Ａ）及びケラチン−１０（Ｂ）をウェスタンブロットにより評価した。ＭＴ４ｖｉｍ（Ｓ）及びＭＴ４Ｋ−１０（Ｓ）培養物では、ＭＴ４細胞培養物と比較して各タンパク質の発現低下が認められた。β−アクチンタンパク質は、ウェスタンブロット解析を標準化するために対照として用いた。各変異体を、重複したレーンで分析した。この図では、Ｋ−１０はケラチン−１０を表す。
【図３】ｐ２４抗原を評価することにより求めたＭＴ４ｖｉｍ（Ｓ）及びＭＴ４Ｋ−１０（Ｓ）細胞培養物におけるＨＩＶ−１複製阻害を示す図である。ＭＴ４、ＭＴ４ｖｉｍ（Ｓ）、及びＭＴ４Ｋ−１０（Ｓ）細胞培養物について、ＨＩＶ−１系統Ｂｒｕを用いて、０．０１の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）でチャレンジ試験を行った。ウイルスの複製は、ＭＴ４ｖｉｍ（Ｓ）及びＭＴ４Ｋ−１０（Ｓ）細胞培養物中では９０％を超えて阻害された。エラーバーは標準偏差を表す。
【図４】ＭＴ４、ＭＴ４ｖｉｍ（Ｓ）、及びＭＴ４Ｋ−１０（Ｓ）細胞培養物について、ｐＬＧＷレンチウイルスベクターを用いて行ったチャレンジ分析結果を示す図である。培養細胞は、進入後の第１段階ＨＩＶ−１ウイルス複製サイクルに類似し、またＧＦＰレポーター遺伝子も担持するレンチウイルスベクターにより形質導入された。Ａ）レンチウイルスにより形質導入を行うと、発現抑制されていないＭＴ４細胞と比較して蛍光細胞の割合（％）が減少していること示す、ＭＴ４ｖｉｍ（Ｓ）及びＭＴ４Ｋ−１０（Ｓ）細胞培養物である。エラーバーは標準偏差を表す。Ｂ）各培養物のフローサイトメトリーヒストグラムである。
【図５】ＭＴ４細胞培養物におけるＩＦの構造解析結果を示す図である。ＭＴ４、ＭＴ４ｖｉｍ（Ｓ）及びＭＴ４Ｋ−１０（Ｓ）細胞培養物について、透過型電子顕微鏡で分析した。発現抑制された培養物（Ｂ、Ｃ）では、対照として用いられた発現抑制されていないＭＴ４細胞培養物に認められた長いフィラメントの代わりに、短縮したＩＦが認められた（Ａ）。パネルＤは、ＭＴ４細胞上の配列番号１として識別されるペプチドの作用により断片化されたＩＦを示す。
【図６】ＭＴ４細胞におけるペプチドによるＨＩＶ−１複製阻害を示す図である。Ａ）細胞をペプチドと共に２４時間インキュベーションし、ＨＸＢ１  ＨＩＶ−１系統を用いて、０．０５のｍ．ｏ．ｉ．で更にチャレンジ試験を行った。ウイルスの複製は高い割合（％）で阻害され、この阻害はまたペプチド濃度と共に増加した。エラーバーは、標準偏差を表す。Ｂ）細胞をペプチドと共に２４時間インキュベーションし、更にＨＩＶＢｒｕ系統と共に０．０１のｍ．ｏ．ｉでインキュベーションした。阻害濃度５０（ＩＣ５０）は、すべてのペプチドについてナノモルレベルであった。
【図７】末梢血単核球（ＰＢＭＣ）における異なるペプチドによるＨＩＶ−１複製阻害を示す図である。これらの細胞について、事前に刺激し、異なる濃度のペプチドで処理し、更にＨＩＶ−１  Ｂｒｕ系統に感染させた。ペプチドは、用量依存的にＨＩＶ複製を阻害した。
【図８】配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０として識別されるペプチドによるＨＩＶ−２複製阻害を示す図である。ＰＢＭＣについて、事前刺激し、異なる濃度のペプチドで処理し、更にＨＩＶ−２  ＣＢＬ−２０系統に感染させた。ペプチドは、用量依存的にＨＩＶ−２複製を阻害した。
【図９】配列番号１、４、５、７、８、及び９として識別されるペプチドの存在下で減少したビメンチンを示す図である。ＭＴ４細胞系を、５０μＭの前記ペプチドと共にそれぞれ２４時間インキュベーションした。ウェスタンブロット技術によりビメンチンを検知した。ビメンチンバンドは、ペプチドで処理した培養物では強度低下を示した。
【図１０】ＭＴ４細胞系における配列番号１（Ａ）及び配列番号３（Ｂ）として識別されるペプチドのインターナリゼーションの評価を示す図である。グラフは、ＭＴ４細胞系を対象として、５、１０、２０及び４０μＭの濃度におけるペプチド貫通に対応する蛍光細胞の割合（％）を異なる時刻で表す。Ｃｃ：未処理細胞。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１１】脂質誘導体によるＨＩＶ−１複製の阻害を示す図である。異なる濃度のプロスタグランジンシクロペンタン１５デオキシ−Δ−１２，１４−ＰＧＪ２（１５ｄ−ＰＧＪ２）と共に、ＭＴ４細胞をインキュベーションし、ＨＩＶ−１（Ｂｒｕ系統）を用いて、０．０１のｍ．ｏ．ｉ．で更にチャレンジ試験を行った。１５ｄ−ＰＧＪ２プロスタグランジンは、ＨＩＶ−１複製を阻害した。エラーバーは標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明は、上記問題を解決し、細胞骨格、より正確には細胞骨格のＩＦを形成するタンパク質を破壊することによりＨＩＶ複製を阻害する方法について記載する。
【００４１】
本発明の目的に照らせば、前記ＩＦは、酸性ケラチン、塩基性ケラチン、ビメンチン、デスミン、グリア線維酸性因子、ペリフェリン、神経フィラメント（ＮＦ）タンパク質、インターネキシン、フィレンシン、ファキニン、及びラミンから構成され得る。
【００４２】
本発明の１つの実施形態では、前記ＩＦは、ビメンチン及びケラチンタンパク質から構成され得る。より具体的には、前記ＩＦは、ビメンチン及びケラチン−１０タンパク質より形成され得る。変化した細胞骨格は、ヒト細胞内でＨＩＶウイルスの複製を阻害する。
【００４３】
ＩＦの細胞骨格を破壊するとは、細胞骨格のＩＦを形成するタンパク質を下方制御する、及び／又は細胞骨格のＩＦに構造的破壊をもたらしてより短いサブユニットにする、及び／又は細胞骨格ネットワークの構造形態を変化させる、及び／又はＩＦが分解するように、ＩＦの構造を改変する又は変化させることを意味する。本明細書に記載する細胞骨格とは、細胞質内に含まれる細胞の「足場」又は「骨格」を意味し、タンパク質よりなる。細胞骨格はすべての細胞内に存在し、細胞内輸送及び細胞分割の両方において、重要な役割を演ずる。細胞骨格は、３つの主要な構造物、すなわち微小管、マイクロフィラメント、及び中間フィラメント（ＩＦ）から形成される。細胞骨格は、細胞に構造及び形状をもたらす。細胞骨格の要素は、幅広く密接に細胞膜と相互作用する。
【００４４】
本明細書で定義するＩＦは、一般的な構造的及び配列的特徴が共通する関連タンパク質のファミリーである。中間フィラメントは、平均直径が１０ナノメータであり、アクチン（マイクロフィラメント）及び微小管の中間に当たる。中間フィラメントのほとんどのタイプは細胞質性であるが、１つのタイプ、ラミンは核性である。各細胞型について固有の、様々な中間フィラメントタンパク質をコードする約７０個の異なる遺伝子が存在し、ビメンチン及びケラチン−１０タンパク質はこれらに含まれる。
【００４５】
本明細書で用いる場合、用語「ビメンチン」とは、配列番号１１が付与された配列を有するＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００３３７１．２により識別されるタンパク質の中間フィラメントファミリーメンバーを意味する。ビメンチンタンパク質は、一連の会合ステップにおいて線維状のポリマーを形成し、逆平行の半分ねじれた二重二量体（又は四量体）から開始して、縦方向に会合して完全なフィラメントを形成する単位長さのフィラメント（ＵＬＦ）を形成する。
【００４６】
本明細書で用いる場合、用語「ケラチン」とは、線維性の構造タンパク質又は中間フィラメントのファミリーを意味する。ケラチンタンパク質は、一連の会合ステップにおいて線維状のポリマーを形成し、二量化に始まり、二量体は四量体及び八量体に会合し、最終的に端部と端部がアニーリングして長いフィラメントとなる能力を有するＵＬＦに至る。タイプＩケラチンは、それぞれ固有のタイプＩＩケラチンパートナーと共に同時発現され、そして特異的で好適な、事前に決定された対からなる共会合体として形成される各ケラチン対は、特定タイプの上皮細胞の分化及び特殊化に特徴的であり、またそれを示唆する。
【００４７】
本明細書で用いる場合、用語「ケラチン−１０」とは、配列番号１２が付与された配列を有するスイスプロット受け入れ番号：Ｑ６ＥＩＺ０．１により識別されるタンパク質の中間フィラメントファミリーメンバーであるケラチン、タイプＩ細胞骨格１０を意味する。
【００４８】
本明細書で用いる場合、用語「遺伝子」とは、ポリペプチド鎖に翻訳され得るｍＲＮＡに転写され、ｒＲＮＡ若しくはｔＲＮＡに転写され得る、又はＤＮＡの複製、転写、及び制御に関係する酵素及びその他のタンパク質のための認識部位として機能するＤＮＡ配列を含む、但しこれらに限定されないＤＮＡ配列を意味する。この用語は、いくつかの作動可能に連結したＤＮＡ断片、例えばプロモーター領域、５'非翻訳領域（５'ＵＴＲ）、コード領域（タンパク質をコードしてもしなくてもよい）、及びポリアデニル化部位を含む非翻訳３'領域（３'ＵＴＲ）等を含むあらゆるＤＮＡ配列を意味する。一般的に、５'ＵＴＲ、コード領域、及び３'ＵＴＲは、ＲＮＡに転写され、タンパク質をコードする遺伝子の場合には、そのＲＮＡのコード領域はタンパク質に翻訳される。遺伝子は、通常イントロン及びエクソンを含む。
【００４９】
本明細書で用いる場合、用語「ビメンチン遺伝子」とは、タンパク質であるビメンチン又はその相同体をコードする遺伝子を意味する。
【００５０】
本明細書で用いる場合、用語「ケラチン−１０遺伝子」とは、タンパク質であるケラチン−１０又はその相同体をコードする遺伝子を意味する。
【００５１】
本明細書に記載するように、中間フィラメントの破壊という意味で本明細書において用いる場合、用語「破壊する」とは、機能又は構造的組織化を妨害することを意味する。特に、破壊には、タンパク質の一次、二次、及び三次構造の形成阻害等を含む、構造的な破壊、重合化阻害、形成及び生合成阻害が含まれ得る。
【００５２】
本明細書に記載するように、中間フィラメントを負に調節するという意味で、本明細書において用いる場合、用語「負に調節する」とは、前記フィラメントの生物学的機能の喪失又は低下を引き起こすように機能又は構造的組織化を変化させる又は変更することを意味する。
【００５３】
本明細書で用いる場合、用語「細胞骨格の中間フィラメント（ＩＦ）」とは、複数の要素からなるある１つのタイプの細胞骨格としての中間フィラメントを意味し、そのサイズは、アクチン及び微小管と比較して中間にある。上記３点は共に、構造的な完全性、細胞形状、及び細胞やオルガネラの運動性を強化する。細胞骨格の中間フィラメントは、通常５つのタイプに分類される：タイプＩ及びＩＩ：酸性ケラチン及び塩基性ケラチン。ケラチンは、異なる上皮細胞に固有のサブタイプも有する；タイプＩＩＩ：線維芽細胞、内皮細胞、及び白血球内のビメンチン；筋肉内のデスミン；星状細胞及びその他のタイプのグリア内のグリア線維酸性因子、及び末梢神経線維内のペリフェリン；タイプＩＶ神経フィラメント（ＮＦ）タンパク質Ｈ（重）、Ｍ（中）及びＬ（低）、インターネキシンフィレンシン及びファキニン；及びタイプＶ：ラミン。
【００５４】
本明細書で用いる場合、用語「細胞骨格の中間フィラメント（ＩＦ）の構造」とは、複数のフィラメントからなる四量体のらせん状組織を意味する。各中間フィラメントモノマーは、アミノ（頭部）末端及びカルボキシル（尾部）末端を連結するαヘリックス状のロッドドメインから構成される。ロッドは別のフィラメント周囲に巻き付いて二量体を形成する。各フィラメントのＮ末端及びＣ末端は整列している。一部の中間フィラメントはホモ二量体を形成する；その他はヘテロ二量体を形成する。二量体は、次に頭部−尾部を整列させるようにねじれた四量体を形成する。この四量体は、中間フィラメントの塩基性サブユニットと考えられる。最終的な中間フィラメントはこれらの四量体のらせん状の連なりである。
【００５５】
本明細書の文脈において、用語「治療」及び「治療する」とは、状態若しくは疾患又はその症状を改善する、状態若しくは疾患又はその症状が確立するのを防止する、さもなければ状態若しくは疾患又はその他の望ましくない症状の進行を、いずれにせよ防止する又は妨げる又は逆転させるあらゆるすべての使用を意味する。
【００５６】
本明細書で用いる場合、用語「治療上有効な用量」とは、所望の治療効果をもたらす、例えば所望の疾患又は状態を治療する、改善する、若しくは予防する、又は検出可能な治療効果若しくは予防効果を発揮するのに十分な無毒の量の治療薬を意味する。この効果は、例えば化学マーカー又は抗原の濃度により検出可能である。治療効果には身体的症状の低減も含まれる。対象にとっての正確な有効量は、対象のサイズ及び健康、状態の性質及び程度、並びに投与用として選択された治療薬又は治療薬の組合せに依存する。従って、予め正確な有効量を規定するのは有用ではない。しかし、所定の状況に応じた有効量は、ルーチン実験により決定可能であり、また臨床医の判断が及ぶ範囲内である。
【００５７】
本発明の目的に照らせば、有効用量は、投与される個体を対象として、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、又は０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇのポリヌクレオチド又はポリペプチド組成物である。
【００５８】
本明細書で用いる場合、用語「薬学的に許容される担体又は添加剤」とは、治療薬、例えばポリペプチド、ポリヌクレオチド、及びその他の治療薬等を投与するための担体を意味する。この用語は、それ自体は組成物の投与を受ける個体にとって有害な抗体生成を誘発せず、また過度の毒性を有さずに投与され得る任意の医薬品担体を意味する。適する担体は、大型でゆっくりと代謝される高分子、例えばタンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び不活性化ウイルス粒子等であり得る。かかる担体は、当業者には周知されている。治療組成物中の薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水、グリセリン、及びエタノール等の液体を含有し得る。更に、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質等の補助剤もかかる媒体中に存在し得る。薬学的に許容される添加剤の徹底した考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）にて入手可能である。一般的に、治療組成物は、液体溶液若しくは懸濁液のいずれかのように注射剤として、又は液体媒体中の溶液若しくは懸濁液として、又は直接摂取用として適する固体状態で調製される。リポソームは、アロゾールと同様に薬学的に許容される担体の定義に含まれる。
【００５９】
本明細書で用いる場合、またペプチドについて引用するとき、用語「相同体」とは、配列番号１〜配列番号１０の配列と、例えばＢｌａｓｔ等を用いた配列アライメントにより立証されるように、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、又は９５％さえも、最も好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含み、並びに細胞骨格、特に細胞骨格のＩＦを形成するタンパク質、及びより正確にはビメンチン及びケラチン−１０タンパク質を破壊する、負に調節する、又は改変する能力を備えたペプチドを意味する。適する相同体は、アミノ酸が保存的に置換したペプチドである。好適には１０％未満のアミノ酸が置換され、より好適には５％未満、３％未満、及び最も好ましくは１％未満のアミノ酸が置換される。好適には１０個未満のアミノ酸残基が置換され、より好適には５個未満、及び最も好適には２個未満のアミノ酸が置換される。保存的置換とは、アミノ酸が別の非常に類似したアミノ酸と置き換わったものであり、かかる置換はタンパク質の活性にほとんど又はまったく影響を及ぼさない。「保存的な置換」とは、あるアミノ酸が同一の正味電荷及びほぼ同一のサイズと形状を有する別のアミノ酸と置き換わることである。脂肪族アミノ酸側鎖又は置換された脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、側鎖内の炭素及びヘテロ原子の合計数が約４個を上回らないで異なるときほぼ同一のサイズを有する。側鎖内の分岐数が１個を超えないで異なるとき、アミノ酸はほぼ同一形状を有する。側鎖内にフェニル基又は置換されたフェニル基を有するアミノ酸は、ほぼ同一のサイズ及び形状を有すると考えられる。下記に５群からなるアミノ酸を掲載する。ポリペプチド内のアミノ酸を同一群に由来する別のアミノ酸に置換すれば、保存的な置換となる：グループＩ：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、及びＣ１  Ｃ４脂肪族側鎖又はＣ１  Ｃ４ヒドロキシル置換された脂肪族側鎖（直鎖状又は単分岐状）を有する非天然アミノ酸。グループＩＩ：グルタミン酸、アスパラギン酸、及びカルボン酸で置換されたＣ１  Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐状又は単分岐点）を有する非天然アミノ酸。グループＩＩＩ：リシン、オルニチン、アルギニン、及びアミン又はグアニジン置換されたＣ１  Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐状又は単分岐点）を有する非天然アミノ酸。グループＩＶ：グルタミン、アスパラギン、及びアミド置換されたＣ１  Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐状又は単分岐点）を有する非天然アミノ酸。グループＶ：フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシン、及びトリプトファン。
【００６０】
用語「％配列同一性」は、最大の配列同一性割合（％）が得られるように配列を揃え、また必要な場合には任意選択的にギャップを導入した後、対象となる核酸配列内ヌクレオチドと同一の核酸配列内ヌクレオチドの割合（％）として本明細書では定義される。整列のための方法及びコンピュータプログラムは当技術分野において周知されている。本明細書で用いる場合、用語「核酸配列」及び「ヌクレオチド」には、例えば人工的に改変された核酸配列等の核酸配列に基づく、及び／又は由来する非天然の分子、ペプチド核酸、並びに少なくとも１つの改変されたヌクレオチド及び／又は例えばイノシン等の非天然のヌクレオチドを含む核酸配列も含まれる。
【００６１】
用語「ＲＮＡ干渉」とは、干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）が、特定のｍＲＮＡの細胞内分解を引き起こし、所望のｍＲＮＡ標的の翻訳を妨害するのに利用可能であるプロセスを意味する。
【００６２】
用語「干渉ＲＮＡ」とは、二重鎖又は一本鎖ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）剤を指し、ＲＮＡ干渉で用いられる小型の核酸分子を意味する。長さ約１５〜３０ヌクレオチドの短いｉＲＮＡ剤は、「低分子干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」と呼ばれる。より長いｉＲＮＡ剤は、一般的に「二本鎖ＲＮＡ」又は「ｄｓＲＮＡ」と呼ばれ、ｉＲＮＡ剤のその他の形態は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子である。ｉＲＮＡ剤は、未修飾の又は化学的に修飾された核酸分子であり得る。ｉＲＮＡ剤は、化学的に合成され、又はベクターから発現され、又は酵素的に合成され得る。化学的に修飾されたｉＲＮＡ剤を使用すれば、分解抵抗性が高まり、標的部分に対する特異性が向上し、細胞への取り込みが改善する等により、ｉＲＮＡ剤の１つ又は複数の特性を改善し得る。ｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを転写するＤＮＡ分子（例えば、ヘアピン二本鎖として）もＲＮＡ干渉をもたらす。ｄｓＲＮＡを転写するＤＮＡ分子は、米国特許第６，５７３，０９９号、及び米国特許出願公開第２００２０１６０３９３号及び同第２００３００２７７８３号に開示されている。ｓｉＲＮＡを転写するＤＮＡ分子は、Ｔｕｓｃｈｌ及びＢｏｒｋｈａｒｄｔの、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ，２：１５８（２００２）でレビューされている。
【００６３】
本明細書で用いる場合、用語「アンチセンスＲＮＡ」とは、ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質の量を低下させるのに十分なアフィニティーを備えた、ｍＲＮＡに結合するあらゆるＲＮＡを意味する。ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質の量は、好ましくは２０％を超えて低下し、より好ましくは５０％、７０％、及び８０％を超えて低下し、及び最も好ましくは９０％を超えて低下する。アンチセンスＲＮＡ物質及び方法は、当技術分野では周知されている。
【００６４】
本明細書で用いる場合、用語「発現」とは、本発明の核酸断片に由来するセンス（ｍＲＮＡ）又はアンチセンスＲＮＡの転写及び安定な蓄積を意味する。発現は、ｍＲＮＡがポリペプチドに翻訳されることも意味し得る。「アンチセンス阻害」とは、標的タンパク質の発現を抑制する能力を有するアンチセンスＲＮＡ転写物の生成を意味する。
【００６５】
用語「発現を阻害する」とは、遺伝子又は核酸の発現抑制又は下方制御を意味するが、これは標的核酸配列、すなわちｉＲＮＡが標的とする配列の転写及び／又は翻訳が検出可能なまで低下すること、又は干渉ＲＮＡ若しくはその他の核酸配列が存在しない場合に検知される正常なレベルと比較して、標的配列若しくはタンパク質の量若しくは活性が低下することを指す。検出可能な低下は、約５％又は１０％ほどに小さくても、また約８０％、９０％、又は１００％ほどに大きくてもよい。より一般的には、検出可能な低下は、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、又は７０％である。
【００６６】
本明細書で用いる場合、用語「脂質化合物」とは、例えば一不飽和脂肪酸、多価不飽和脂肪酸、及び１〜６個の三重結合を含む脂質に由来する脂肪酸類似体を意味する。
【００６７】
「ＨＩＶ」とは、レトロウイルスのヒト免疫不全ウイルスであり、身体内のＣＤ４＋細胞を攻撃することにより免疫不全を引き起こすウイルスである。本明細書で用いる場合、用語「ＨＩＶ」には、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２のすべての群及びサブタイプ（クレード）、例えばＨＩＶ−１  Ｍ及びＨＩＶ−１  Ｏ群を含め、あらゆるＨＩＶが含まれ、本発明は公知のクレードそれぞれを包含するが、ＨＩＶ−１が好ましい。
【００６８】
本明細書で用いる場合、用語「複製」とは、核酸分子の相補鎖がポリメラーゼ酵素により合成されるプロセスを意味する。本発明の特別な文脈では、用語「複製」とは、ウイルスと関連して本明細書で用いる場合、ウイルスのライフサイクルが完全に又はその全体が完了することを意味し、この場合感染性ウイルス粒子又はビリオンは宿主細胞表面に付着する（通常、感染の特異性を説明する特異的細胞表面分子に結合する）。細胞内に進入すると、ビリオンは非被覆状態となり、ウイルス遺伝子は、ゲノムの複製に必要とされるタンパク質の発現を開始し、また新規タンパク質の合成は新規カプシドを生み出し、そしてコアはそれ自身、新規宿主細胞内で感染及び複製する能力を有する子孫感染性ウイルス粒子の会合を引き起こす。従って、ウイルスのライフサイクルは、単細胞内にあるときに限り完全であり、１つ若しくは複数のウイルス粒子又はビリオンによる感染は、最終的に完全に感染性の子孫ウイルス粒子の生成まで進行する。レトロウイルスの特別な場合では、完全なウイルスのライフサイクルには、ウイルスＲＮＡを含む感染性ウイルス粒子が細胞内に進入し、当該ＲＮＡはＤＮＡに逆転写され、当該ＤＮＡは宿主染色体内にプロウイルスとして組み込まれ、そして感染した細胞はビリオンタンパク質を産生し、完全長ウイルスゲノムＲＮＡと共にこれらを新たな等しく感染性の粒子に組み立てるステップが含まれる。
【００６９】
本明細書で用いる場合、用語「宿主細胞」とは、ウイルスゲノムの発現又はベクター若しくはウイルスの増殖に用いられる細胞を意味する。
【００７０】
本明細書で用いる場合、用語「ＣＤ４＋細胞」とは、Ｔリンパ球の主要な分類を意味し、ＣＤ４抗原を担持する細胞を指す。
【００７１】
特に、本発明は、細胞骨格のＩＦを負に調節する、改変する、又は破壊する方法について言及する。好ましいＩＦは、ビメンチン及び／又はケラチン−１０タンパク質を含有する。好ましい実施形態では、当該方法はＩＦ内のビメンチン及び／又はケラチン−１０の量を低下させるステップを含む。ビメンチン及び又はケラチン−１０の低下は、いくつかの方法で影響を受け得る。好ましい実施形態は、ビメンチン及び／又はケラチン−１０のコード遺伝子発現を低下させる又は阻害する。より好ましくは、ＩＦ内のビメンチン及び／又はケラチン−１０の発現レベルが低下し、又は細胞骨格のビメンチン及び／又はケラチン−１０の構造が変化する。細胞骨格ＩＦの構造は、好ましくはビメンチン及び／又はケラチン−１０の構造を例えば切断し又はミスフォールディングさせることにより、ＩＦタンパク質の構造を改変することにより変化し得る。
【００７２】
技術的文献に引用されている証拠より、ＨＩＶはそのライフサイクル期間中にビメンチンの切除を必要とすることが示唆される。驚くべきことに、本発明では、ウイルス複製は、ウイルス感染期間中に存在する天然の機構と思われるものにより阻害される。ＨＩＶ感染の阻害手段として細胞骨格を破壊する、及び／又はビメンチンを除去しようとしているのかは定かではないが、実際、細胞骨格の破壊は正常な感染のさなかでも生じているので、感染は思ったよりもかなり速いものと予想される。
【００７３】
本出願者は、抗ＨＩＶ活性を示すヒト白血球抽出物の分画で処理されたＭＴ４細胞の比較プロテオミック解析により、ビメンチン及びケラチン−１０細胞骨格タンパク質を同定した。抗ＨＩＶ活性を有する白血球抽出物は、ビメンチン及び／又はケラチン−１０及び／又はＩＦの低下及び／又は不安定化を示すことが判明した。これまでに、Ｔｈｏｍａｓらは、抗ビメンチン抗体はＨＩＶ−１  ｇｐ１２０糖タンパク質が細胞表面のビメンチンに結合するのをブロックし、ウイルスが細胞に進入するのを防止することが可能であることを実証した（Ｔｈｏｍａｓ  ＥＫ，Ｃｏｎｎｅｌｌｙ  ＲＪ，Ｐｅｎｎａｔｈｕｒ  Ｓ，Ｄｕｂｒｏｕｓｋｙ  Ｌ，Ｈａｆｆａｒ  ＯＫ，Ｂｕｋｒｉｎｓｋｙ  ＭＩ  １９９６．Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：７３〜８７）。驚くべきことに、ビメンチンに対する抗体を用いると（ＨＩＶ感染を低減する目的で）、本発明で試験された実験条件下では、阻害レベルが非常に低いウイルス複製が検出された。Ｔｈｏｍａｓらは、ビメンチンに対する抗体を用い、従って当該抗体と接近可能なビメンチンをブロックする。これは、本発明で提案された作用とは非常に異なる。本発明では、ビメンチンはＩＦを破壊するように変更され及び／又は減少している。Ｔｈｏｍａｓらが行ったようにビメンチンをブロックしても、ＩＦは変化を受けない。実験データも本発明の方法の異なる作用機序を確認する。Ｔｈｏｍａｓらの報告では、最大４７％の阻害が認められたのに対し、例２、図３及び４で認められるように、標的細胞内のビメンチンレベルが低下し、及び／又はビメンチン構造が不安定化すると、最大１００％の非常に高い割合（％）のウイルス複製阻害が得られた。
【００７４】
更に、ケラチン−１０のｇｐ１２０ウイルスタンパク質への結合について報告は存在しないが、精密には、例２、図３、及び４に示す通り、ケラチン−１０を阻害及び／又は不安定化することによっても、やはりＨＩＶ複製は阻害された。
【００７５】
ＨＩＶ複製阻害機構について更に見識を深めるために、細胞への進入がｇｐ１２０ウイルスタンパク質により媒介されない実験系が用いられた。当該系は、ｇｐ１２０を欠損し、また緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）も発現しているＨＩＶ−１に基づく非複製レンチウイルスベクターを含む。例２に示す通り、このレンチウイルスによるＭＴ４細胞の効率的な「感染」が認められ、また培養物は、このレンチウイルスベクターの効率的な細胞貫通及び細胞ゲノムへの組み込みを示唆する高い割合（％）のＧＦＰ発現を示した。このＨＩＶ−１に基づくレンチウイルス「感染」系では、例２に示す通り、ビメンチンが減少することにより、レンチウイルス「感染」の劇的な減少が生み出される。これは、ＨＩＶ−１感染を阻害するために本発明で用いられる方法は、Ｔｈｏｍａｓらが提案するようなビメンチンのｇｐ１２０への結合とは関連しないことを実証する。従って、本発明は、ＨＩＶ感染阻害を目的としたこれまでに未報告の方法と関連する。
【００７６】
更に、本発明者らは、ビメンチンの発現が停止されたＭＴ４細胞（ＭＴ４ｖｉｍ（Ｓ））、並びにケラチン−１０の発現が停止された細胞（ＭＴ４Ｋ−１０（Ｓ））内でＩＦは不安定化し、ＨＩＶ−１に基づくレンチウイルスベクターの「感染」阻害を引き起こすことを、伝達電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）を用いて実証した（例３）。ＭＴ４ｖｉｍ（Ｓ）及びＭＴ４Ｋ−１０（Ｓ）細胞は、タンパク質コード遺伝子それぞれに固有のＲＮＡヘアピンを導入することにより得られる。
【００７７】
ＩＦの破壊は、ポリペプチド、ペプチド、核酸、及び化合物からなる群から選択される薬剤により実現可能である。好ましい実施形態では、薬剤はペプチド、より好ましくは、ペプチドは、配列番号１から配列番号１０として識別されるペプチド及びその相同体からなる群から選択されるペプチドである。
【００７８】
別の好ましい実施形態では、薬剤は、ビメンチン及び／又はケラチン−１０遺伝子を標的とする干渉ＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００７９】
別の好ましい実施形態では、薬剤は、化合物又は脂質誘導体である。適する脂質化合物はプロスタグランジンシクロペンタン１５デオキシ−Δ−１２，１４−ＰＧＪ２である前記脂質化合物である。
【００８０】
本発明は、ＨＩＶによるヒト細胞の感染を治療及び／又は予防する方法について記載する。かかる方法は、細胞におけるＨＩＶ感染を予防又は治療するための、細胞内のＩＦの破壊、特にビメンチン及び／又はケラチン−１０の破壊を含む。
【００８１】
負の制御は、対象の宿主細胞が有効に感染するのを予防又は阻害する手段として、特定の対象のＨＩＶ宿主細胞内に生ずる。従って、本発明は、同様に対象のＨＩＶ感染を治療及び／又は予防する方法を含む。
【００８２】
本発明に記載する方法を用いてＨＩＶへの感染を阻害することは、細胞レベル及び生物全体の両方に適用される。用語、阻害とは、感染の完全又は部分的な阻害を意味する。
【００８３】
本発明は、ＨＩＶ複製を阻害するためのＩＦ、特にビメンチン及び／又はケラチン−１０細胞骨格タンパク質の取り扱いについて記載する。上記タンパク質は、ウイルス性ではなく内因性の細胞タンパク質であるので、この戦略は、現在入手可能な抗レトロウイルス薬に対して、ウイルス耐性が最低限度でしか又はまったく存在しないという長所を提供する。本発明の薬物の作用機序は、すでに記載されている経路とは異なる経路を経由して働き、高い阻害能力を示す。従って、ＨＩＶ感染症を対象とする現在入手可能な薬物と本発明を併用すれば、抗ＨＩＶ治療の有効性が強化され得る。更に、本発明の治療薬の使用は、改変された内因性遺伝子を保持する幹細胞の移植のような最新技術分野ですでに提案されている新規治療戦略と併用され得る。本発明の治療方式は、現在利用可能な療法で治療を受けた患者において高い割合（％）を占めている、多剤耐性を呈する患者にとって新たな選択肢を提供する。
【００８４】
ＩＦ構造に可能な損傷をもたらし、毒性又は細胞死さえも引き起こすにもかかわらず、本発明の驚くべき重要な成果は、細胞の生存能力に影響を及ぼさずにＨＩＶ感染を阻害するステップを含み、これらすべては、ＨＩＶに感染した患者の治療に対してより多くの新規性を付加する。
【００８５】
本発明は、ＨＩＶ感染を予防又は治療する医薬品を製造するための、細胞骨格、より正確には細胞骨格のＩＦを形成するタンパク質、特にビメンチン及び／又はケラチン−１０を負に調節する、改変する、又は破壊する薬剤の使用も含む。かかる薬剤は、その他の分子と融合及び／又は結合し得る。かかる薬剤として、負の調節を生み出す、又は細胞骨格、ＩＦを改変するペプチド様化合物、干渉ＲＮＡ、及び脂質化合物、特にビメンチン及び／又はケラチン−１０を負に調節する薬剤が挙げられる。
【００８６】
ビメンチン及び／又はケラチン−１０は、細胞をビメンチン及び／又はケラチン−１０を負に調節する薬剤と接触させることにより負に調節され得る。当該薬剤は、必要に応じてその細胞貫通能力を高めるように製剤化され得る。負の調節は、対象に薬剤を投与することにより実現可能であり、かかる薬剤は、対象の細胞内のビメンチン及び／又はケラチン−１０を負に調節する。薬剤は、これがＨＩＶにすでに感染している又は潜在的に感染している可能性のある対象の細胞と接触するように投与される。かかる細胞は、本明細書ではＨＩＶ宿主細胞と呼ばれる。薬剤の投与は、薬剤を宿主細胞と接触させるステップを含む。投与経路には、非経口経路及び薬剤が対象の粘膜を経由して送達される経路が含まれる。本発明の態様の特定の実施形態では、宿主細胞はＣＤ４＋細胞である。
【００８７】
本発明の１つの実施形態では、負の調節又は改変は、遺伝子発現又はタンパク質合成を低下させること、これらのタンパク質により形成されるフィラメントの構造を改変すること、フィラメント構造を不安定化させること、又はその活性／機能を低下させることのいずれかによって、ビメンチン及び／又はケラチン−１０に直接影響を及ぼすことにより実現可能である。
【００８８】
本発明の文脈内において、負の調節（又は改変）は、細胞内のビメンチン及び／又はケラチン−１０タンパク質のレベルを阻害すること、又は上記タンパク質を含むＩＦの構造を、当該細胞内において改変、不安定化、分解、若しくは破壊さえも行うことを含む。
【００８９】
ＩＦ、特にビメンチン及び／又はケラチン−１０を阻害する又は負に調節するものとして公知の任意の薬剤が、本発明で説明する方法に基づき、ＨＩＶ感染を阻害するのに利用可能である。
【００９０】
同様に、ＨＩＶ感染は、ＩＦ、特にビメンチン及び／又はケラチン−１０を負に調節する又は不安定化するペプチド様又はポリペプチド様の薬剤を用いても阻害可能である。かかる薬剤は、内因性タンパク質、又は通常宿主細胞内に存在しないタンパク質を含む。これらは、例えば突然変異タンパク質、遺伝子工学的に生み出されたタンパク質、ペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、キメラタンパク質、抗体断片、ヒト化タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、化学修飾タンパク質、及びこれらすべての断片であり得る。
【００９１】
本発明では、ＩＦ、特にビメンチン及び／又はケラチン−１０を含有するＩＦの構造を破壊する能力を有するペプチドを使用すると、ＨＩＶによるＭＴ４細胞の感染を強く阻害することが判明し、ＭＴ４ｖｉｍ（Ｓ）及びＭＴ４Ｋ−１０（Ｓ）細胞で得られた結果が確認された。これは、本発明の一環として、ＨＩＶ感染を予防又は治療するためにかかるペプチドを使用することの裏づけとなる。
【００９２】
本発明の態様の好ましい実施形態では、ペプチドは、配列番号１から配列番号１０として掲載する配列で識別されるペプチドである。本発明は、上記ペプチドの相同体の使用も含む。当該ペプチドは、別の分子と融合し得る、例えば貫通ペプチドと融合し得る。
【００９３】
本発明によるＨＩＶを予防又は治療するのに有用な薬剤は、ビメンチン及び／又はケラチン−１０遺伝子の発現、又はそのタンパク質合成、又はビメンチン及び／又はケラチン−１０を含有するＩＦの構造を阻害することができる薬剤である。本発明による好ましい薬剤は、ｉＲＮＡ、例えば小型の干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等を用いることにより、ビメンチン及び／又はケラチン−１０遺伝子又はその転写物を発現抑制させる薬剤を含む。
【００９４】
ＲＮＡ干渉とは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に結合し、ｍＲＮＡのプロセシングを阻害する分子を用いて特異的ｍＲＮＡを破壊する、選択的転写後遺伝子発現抑制プロセスの一種を意味する。例えば、ＲＮＡ干渉はＲＮＡの翻訳を阻害し又はこれを分解し得る。本発明の文脈内において、ｉＲＮＡとは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、内因性ｍｉＲＮＡ、及び人工的なｍｉＲＮＡを含む、但しこれらに拘束されないあらゆる種類の干渉ＲＮＡを意味する。
【００９５】
本明細書で用いられる用語、ｓｉＲＮＡは、ビメンチン及び／又はケラチン−１０遺伝子の発現を低減又は阻害することができる、二重鎖ＲＮＡを形成する核酸を意味する。ｓｉＲＮＡ配列は、ビメンチン及び／又はケラチン−１０遺伝子の全配列に対応し得る。代表的なｓｉＲＮＡは、少なくとも１５から５０ヌクレオチド長で、優先的には１９から３０ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡは化学的に合成され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により生成され、又はｓｉＲＮＡ産生用として特別に用いられる細胞内で産生され得る。
【００９６】
用語ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの一種として本明細書では用いられる。かかるｓｈＲＮＡは、例えば１９から２５ヌクレオチドからなる短いアンチセンス鎖、及びこれに続く５から９ヌクレオチドからなるループ、及び類似のセンス鎖から構成される。或いは、センス鎖は、ヌクレオチドループの上流及びアンチセンス鎖の下流に位置し得る。ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ及び／又はｓｉＲＮＡ種と同じように機能するが、ｓｈＲＮＡは安定性が向上するように特別なヘアピン様の構造を示すという点で異なる。本明細書に記載するその他の薬剤と同様に、かかるｓｈＲＮＡは、プラスミド、レトロウイルス、及びレンチウイルスとして送達可能であり、Ｕ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター等のプロモーターから発現可能である。
【００９７】
干渉ＲＮＡタイプの薬剤を標的細胞に送達する方法として、例えば薬剤を含む組成物の注射、又は前記組成物と細胞との直接接触、例えば、造血細胞と干渉ＲＮＡを含む組成物との接触を挙げることができる。別の場合では、干渉ＲＮＡタイプの薬剤は、静脈又は動脈経路等の血流に直接接種するために、例えば流体力学的注射法又はカテーテル法により任意の経路から直接注射可能である。場合によっては、干渉ＲＮＡ剤は、特定の器官に、又は全身的に送達可能である。薬剤のｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を向上させるために、コロイド状の分散系が送達媒体として利用可能である。
【００９８】
薬剤は、例えばオリゴヌクレオチド又は核酸類似体で用いられる機構に類似した機構を経由してビメンチン及び／又はケラチン−１０遺伝子の発現を阻害し得る。かかる薬剤には、例えばペプチド−核酸（ＰＮＡ）、擬似相補的ＰＮＡ（ｐｃ−ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、及びこれらの誘導体が含まれる。核酸配列は、転写レプレッサとして作用するタンパク質、アンチセンス分子、リボザイム、例えば干渉ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びアンチセンスオリゴヌクレオチド等の小型の阻害性核酸配列をコードする。
【００９９】
薬剤は、細胞又は生物に投与されるレベルで通常存在する又は存在しない、任意の実体の形状に類似し得る。例えば化学物質、小分子、アプタマー等の薬剤は、ＩＦ、特にビメンチン及び／又はケラチン−１０を負に調節するために識別され又は生成され得る。本発明の文脈内において、アプタマーは、十分に定義された三次元構造を示す一本鎖の核酸であり、概念的には抗体結合に類似した方式でこれが標的分子に結合するのを促進する。アプタマーは、高い特異性及び親和性、化学的安定性、低免疫原性、及びタンパク質−タンパク質相互作用を攻撃する能力を含む、小分子及び抗体両方の最適な特性を併せ持つ。当該薬剤は、投与されたら直接機能し得るが、ビメンチン及び／又はケラチン−１０の負の調節を生み出すために、細胞内で改変又は利用され得る。例えば、細胞内に核酸配列を導入し、それが転写されると、細胞内でＩＦタンパク質、特にビメンチン及び／又はケラチン−１０を阻害する核酸及び／又はタンパク質の生成を引き起こす。
【０１００】
薬剤はベクターを含み得る。ベクターは、例えばサイトメガロウイルス、アデノウイルス等のウイルスに由来するエピソーム性の例えばプラスミド、ベクターであり得、又は標的細胞のゲノムに組み込み可能であり、例えばモロニーマウス白血病ウイルス、ＨＩＶ−１、ニワトリ白血病ウイルス等のレトロウイルスに由来するベクターが該当し得る。ＨＩＶ又はネコ白血病ウイルスに基づくベクターが、非分裂細胞をトランスフェクトするのに利用可能である。異なるレトロウイルスを組み合わせたベクターが利用可能である。
【０１０１】
いくつかのウイルス及びウイルス関連ベクターが、最新技術分野で記載されている。かかるベクターは、核酸構築物を細胞に移入するための担体として利用可能である。当該構築物は、アデノウイルス（アデノ関連ウイルス、ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス等と同様に、細胞を感染させる又はこれに形質導入するためのレトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターを含め、非複製ウイルスゲノムに組み込まれ得る。ＨＩＶに基づくベクターはＨＩＶ宿主細胞で特に有用であり得る。
【０１０２】
本発明の別の実施形態は、本発明による薬剤を含む医薬組成物を含む。本発明に記載され、前記組成物に含まれる薬剤は、互いに併用可能であり、又はその他の治療薬、例えば非限定的にすでに公知の抗ＨＩＶ薬物（例えば、ジドブジン（ＡＺＴ））と関連付けられる。
【０１０３】
好ましい実施形態では、ＩＦ、特にビメンチン及び／又はケラチン−１０の負の調節は、本発明では、ＨＩＶにより感染可能な細胞に対して、当該細胞におけるＨＩＶ感染を予防する又は低減することを目的として適用される。好ましい実施形態では、ヒト細胞はＣＤ４＋細胞である。かかる負の調節を生物全体、ヒト、又は霊長類に適用すると、生物にとってＨＩＶ感染に対する有効な治療となり得る。
【０１０４】
本発明の別の実施形態は、本発明による薬剤及び抗ＨＩＶ薬物を含む医薬組合せである。医薬組合せでは、その一部をなす薬剤及び薬物は、同時に、個別に、又は連続して投与され得る。
【０１０５】
（発明の効果）
本発明は、ウイルス耐性を回避する又はその出現確率を最低限に抑えるので、現在入手可能な抗レトロウイルス薬よりも有利である。本発明は、ウイルス起源ではなく細胞の内因性ＩＦ、特にビメンチン及びケラチン−１０タンパク質に基づく。
【０１０６】
本発明の薬物は、先行技術ですでに記載されている機構とは異なる機構により高い阻害能力を伴い作用する。従って、ＨＩＶ感染症に特異的な現在入手可能な治療薬と併用すると、抗ＨＩＶ治療の有効性を強化し得る。
【０１０７】
一方、本発明の治療薬の使用は、最新技術分野で提案されている新規の治療代替法、例えば内因性改変遺伝子を保持する幹細胞の移植と併用可能である。
【０１０８】
本発明は、現在入手可能な療法で治療を受けた患者において高い割合（％）を占める、多剤耐性を呈する患者に新規療法を提供する。
【０１０９】
送達方法
製剤化されると、本発明の医薬組成物は、（１）対象に直接投与される、（２）対象に由来する細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで送達される、又は（３）組換えタンパク質発現用としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで送達されることができる。
【０１１０】
組成物の直接送達は、一般的に皮下、腹腔内、経静脈内、又は筋肉内のいずれかの注射により達成され、又は組織の間質腔に送達される。組成物は、神経系にも投与され得る。その他の投与様式として、局所法、経口法、坐薬法、及び経皮投与法、ニードル法、及びパーティクルガン法又は皮下噴射器が挙げられる。投与治療は、単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールであり得る。
【０１１１】
対象にｅｘ  ｖｉｖｏ送達する、及び形質転換された細胞を再移植する方法は、当技術分野において公知であり、例えば国際公開第９３／１４７７８号に記載されている。ｅｘ  ｖｉｖｏの用途で有用な細胞の例として、例えば幹細胞、特に造血性幹細胞、リンパ液細胞、マクロファージ、樹状細胞、又は腫瘍細胞が挙げられる。
【０１１２】
一般的に、ｅｘ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方の用途で用いられる核酸の送達は、例えば、デキストラン媒介型トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介型トランスフェクション、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチド（単数又は複数）のリポソーム内カプセル化、及びＤＮＡの直接マイクロインジェクションにより実現可能であり、すべて当技術分野において周知されている。ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）を細胞内に導入する方法は、当技術分野において公知である。例えば、核酸導入法は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、又はリポソーム媒介型トランスフェクションを含む。或いは、ポリヌクレオチドの直接注射が採用される。しかし好ましくは、核酸配列は、ベクター、好ましくはウイルスベクターにより細胞内に導入される。前記ベクターは、好ましくはレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、又はレンチウイルスのベクターを含む。
【０１１３】
様々な方法が、治療組成物を身体の特定の部位に直接投与するのに用いられる。アンチセンスポリヌクレオチド、サブゲノムポリヌクレオチド、又は抗体を含む治療組成物を、特定の組織に送達する場合、受容体により媒介された標的送達法も用いられる。受容体により媒介されたＤＮＡ送達法は、例えば、ＦｉｎｄｅｉｓらのＴｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.（１９９３）１１：２０２〜２０５；ＷｕらのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：５４２〜４６に記載されている。
【０１１４】
遺伝子療法プロトコールでは、ポリヌクレオチドを含む医薬組成物は、好ましくは局所投与用のポリヌクレオチドについて約１００ｎｇから約２００ｍｇの範囲で投与される。約５００ｎｇから約５０ｍｇ、約１μｇから約２ｍｇ、約５μｇから約５００μｇ、及び約２０μｇから約１００μｇの濃度範囲のポリヌクレオチドも遺伝子療法プロトコールにおいて利用され得る。作用機序、及び形質転換効率や発現効率等の要因は、ポリヌクレオチドの最終的な有効性に必要とされる用量に影響を及ぼす検討項目である。組織のより広い領域にわたり、より多く発現することが望ましい場合には、より多量のポリヌクレオチド、又は連続的な投与プロトコールで同一量を再投与すること、又は組織、例えば神経終末又はシナプスに隣接した又は接近した異なる部分に複数回投与することが、好ましい治療上の転帰に影響を及ぼすために必要となり得る。いずれの場合にも、臨床試験で行われるルーチン実験法により、最適な治療効果を得るための特定範囲が決定される。遺伝子療法ベクター、特にレトロウイルスベクターに関するより完全な説明は、国際公開第９８／００５４２号に記載されている。
【実施例】
【０１１５】
（例１）
抗ＨＩＶ活性を示す白血球抽出物で処理されたＭＴ４細胞の比較プロテオミクス
ＭＴ４細胞系を、抗ＨＩＶ活性を示す白血球抽出物で処理し（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｏｒｔｅｇａ  Ｃ；Ｄｕｂｅｄ  Ｍ；Ｒｕｉｂａｌ  Ｉ；Ｖｉｌａｒｒｕｂｉａ  ＯＬ；Ｍｅｎｅｎｄｅｚ  ＪＣ；ＮａｖｅａＬら、１９９６、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ９：３３〜４０）、得られたタンパク質発現プロファイルを、未処理細胞の対照と比較した。細胞を溶解し、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を集め、ペレットについて２回目の溶解手順を実施した。同一条件下で２回目の遠心分離ステップを行った後、２回目の上清を１回目のものと一緒に集め、更にエチルアルコールで脱脂処理し、そしてポリアクリルアミドでアルキル化した。その後、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を沈殿させ、このサンプルについて、１２．５から３％のトリス−トリシンポリアクリルアミドゲルを用いて、４℃で二次元電気泳動を実施した。
【０１１６】
Ｍｅｌａｎｉｅ５ソフトウェアを用いて分析用ゲルの画像を分析した。同定対象スポットを調製用のゲルから切り出し、トリプシンで更に消化した。タンパク質分解ペプチドを、質量分析用に抽出し、そしてＱＴＯＦ−２直交幾何学配置の、ナノスプレイイオン源を備えたハイブリッド型質量分析計を用いて質量スペクトルを得た。
【０１１７】
ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルを分析し、米国国立生物工学情報センターの非冗長性タンパク質配列データベース及びドイツにある欧州分子生物学研究所データベースにおいてタンパク質を同定するために各調査を実施した。抗ＨＩＶ白血球抽出物で処理されたサンプルにおいて、細胞骨格のタンパク質、特にＩＦを形成するタンパク質（ビメンチン及びケラチン−１０）の低下が認められた（図１）。
【０１１８】
（例２）
ビメンチン及びケラチン−１０に対する干渉ＲＮＡは、ＨＩＶ感染を阻害する。
ビメンチン及びケラチンタンパク質の発現をそれぞれ発現抑制するＲＮＡヘアピンをコードする配列を保持するｐＬｅｎｔｉ−ｓｈＲＮＡｖｉｍ又はｐＬｅｎｔｉ−ｓｈＲＮＡＫ−１０レンチウイルスベクターを用いてＭＴ４細胞系に形質導入を行った。これらのレンチウイルスベクターを、４つのプラスミドを用いて形質導入された２９３Ｔ細胞系内でパッケージングすることにより会合させた。前記プラスミドはｐＬＰ１、ｐＬＰ２、ｐＬＰ／ＶＳＶＧ、及びｐ−ｓｈＲＮＡであり、この最後のものはビメンチン又はケラチン−１０のいずれかに特異的であった。ｐＬＰ１ベクターは、ＨＩＶ−１のｇａｇ／ｐｏｌ配列に関する遺伝子産物をコードする。ｐＬＰ／ＶＳＶＧは、水疱性口内炎ウイルスの表面タンパク質をコードし、またｐ−ｓｈＲＮＡは、ビメンチン−又はケラチン−１０−特異的ＲＮＡヘアピンをコードする配列を保持するレンチウイルスベクターのゲノムを含有する（Ｕｉ−Ｔｅｉ  Ｋ，Ｎａｉｔｏ  Ｙ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｆ，Ｈａｒａｇｕｃｈｉ  Ｔら，２００４  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２：９３６〜９４８；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。すべてのプラスミドは、アンピシリン選択下、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＸＬ−１系統内で増幅した。４つのプラスミドベクターを、カラムクロマトグラフィーによりトランスフェクション品質に精製し、一緒にしてポリエチレンイミン存在下、２９３Ｔパッケージング細胞系と接触させた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で４８時間インキュベーションし、ビリオンを超遠心分離により２００００×ｇで更に精製した。レンチウイルスベクターを精製したら、ＭＴ４細胞に形質導入を行い、組換え体をブラストサイジン耐性について選別した。組換えクローンを限界希釈法により単離し、採集するまでこれを５％ＣＯ２雰囲気下、９５％相対湿度、３７℃で、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が１０％となるように補給されたＲＰＭＩ培地内で培養した。総タンパク質を培養物から抽出し、またビメンチンの発現抑制をＭＴ４（ＭＴ４ｖｉｍ（Ｓ））細胞内で、並びにケラチン−１０については、ケラチン−１０が発現抑制されたＭＴ４Ｋ−１０（Ｓ）細胞内でウェスタンブロットを行うことにより実証した。形質導入された培養物では、ＭＴ４の形質導入されない対照と比較してビメンチン又はケラチン−１０の発現がそれぞれ低下していることが明らかとなった（図２）。
【０１１９】
抗ＨＩＶ活性を２つのチャレンジ系で評価した：
系Ａ：ビメンチンタンパク質について安定的に発現抑制された細胞（ＭＴ４ｖｉｍ（Ｓ））又はケラチン−１０について安定的に発現抑制された細胞（ＭＴ４Ｋ−１０（Ｓ））を、５％ＣＯ２雰囲気下、９５％相対湿度、３７℃で、ＦＢＳが１０％となるように補給されたＲＰＭＩ培地内で培養した。総ウイルスによるチャレンジ試験を、ＭＴ４ｖｉｍ（Ｓ）、ＭＴ４Ｋ−１０（Ｓ）、及びＭＴ４細胞培養物について実施した。Ｂｒｕウイルス系統を０．０１のｍ．ｏ．ｉ．で用い、ＥＬＩＳＡ法により培養物上清内のｐ２４抗原濃度を測定することから複製を評価した。これらのタンパク質それぞれについて発現抑制されていないＭＴ４細胞培養物と比較して、ＭＴ４ｖｉｍ（Ｓ）及びＭＴ４Ｋ−１０（Ｓ）細胞は、ウイルス複製について約９０％の阻害を示した（図３）。
【０１２０】
系Ｂ：ＭＴ４ｖｉｍ（Ｓ）、ＭＴ４Ｋ−１０（Ｓ）、及びＭＴ４細胞培養物について、ＨＩＶ−１ゲノムの部分を保持し、感染及び進入に関わる遺伝子を欠いているレンチウイルスベクター（ｐＬＧＷ）を用いてチャレンジ試験を実施した。このベクターは、２９３Ｔ細胞系内の４つのプラスミド産物をパッケージングすることにより構築した。前記プラスミドは、ｐＬＰ１、ｐＬＰ２、ｐＬＰ／ＶＳＶＧ、及びｐＬＧＦＰであり、この最後はＧＦＰをコードする。ｐＬＰ１プラスミドはＨＩＶ−１ｇａｇ／ｐｏｌ配列の遺伝子産物をコードする。ｐＬＰ２プラスミドは、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質の遺伝子配列を保持し、ｐＬＰ／ＶＳＶＧは水疱性口内炎ウイルスの表面タンパク質をコードする。ｐＬＧＦＰプラスミドは、パッケージング配列、ＨＩＶ  Ｒｅｖ−応答配列（ＲＲＥ）も保持するＧＦＰをコードし、またレンチウイルスベクターゲノムを構成する３’欠損ＨＩＶ−１の末端反復配列（ＬＴＲ）もコードする。進入後から組み込みまでのウイルス複製サイクルの完了を示すマーカーとして、ＧＦＰ発現を追跡した。結果を蛍光顕微鏡検査で追跡し、ＭＴ４細胞培養物の場合と比較してＭＴ４ｖｉｍ（Ｓ）及びＭＴ４Ｋ−１０（Ｓ）培養物では蛍光細胞数が減少した（データ図示せず）。サンプルをフローサイトメトリーにより分析し、ＧＦＰの発現に起因する蛍光細胞の数が、発現抑制されていないＭＴ４細胞培養物と比較して約７０％減少した（図４）。
【０１２１】
（例３）
ＭＴ４細胞内中間フィラメントの構造変化
最初に、ＭＴ４ｖｉｍ（Ｓ）、ＭＴ４Ｋ−１０（Ｓ）、及びＭＴ４細胞を、３．２％グルタルアルデヒド内で４℃にて１時間固定し、次に２％四酸化オスミウム内で４℃、１時間固定した。これらをその後０．１Ｍリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２で洗浄し、エタノール濃度を増加させながら（３０、５０、７０、及び１００％）、４℃で各１０分間脱水した。封入を行い、極薄い４０〜５０ｎｍ幅の切片を、ウルトラミクロトーム（ＮＯＶＡ、ＬＫＢ）で採取し、これを４００孔のニッケルトレイ上に配置した。極薄い切片を採取しトレイ上に配置したら、これらを飽和酢酸ウラニウム及びクエン酸鉛で造影し、ＪＥＯＬ  ＪＥＭ  ２０００ＥＸ（ＪＥＯＬ）顕微鏡下で更に調べた。顕微鏡写真５例を異なる倍率で分析した。ＭＴ４細胞の未処理状態のＩＦを図５Ａに示すが、一方これらの構造物は、ＭＴ４ｖｉｍ（Ｓ）、ＭＴ４Ｋ−１０（Ｓ）細胞では短縮した状態で現れた（それぞれ図５Ｂ及びＣ）。セクションＤは、ＭＴ４細胞内のビメンチン構造を分解するペプチド（配列番号１として識別されるペプチド）の作用により引き起こされたＩＦ内の効果を示す。ウイルス複製阻害を、上記条件下で観察した。ビメンチン又はケラチン−１０タンパク質が、免疫顕微鏡によりＩＦにおいて識別された。
【０１２２】
（例４）
ＭＴ４細胞内でＨＩＶ複製を阻害する合成ペプチド
ヒトケラチン−１０、ヒトケラチン１、及びヒトビメンチンのアミノ酸配列に対応するペプチドを合成した（Ｇｏｌｄｍａｎ  ＲＤ，Ｋｈｕｏｎ  Ｓ，Ｈａｏ  Ｃｈｏｕ  Ｙ，Ｏｐａｌ  Ｐ，Ｓｔｅｉｎｅｒｔ  ＰＭ  １９９６，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３４：９７１〜９８３；Ｓｔｅｉｎｅｒｔ  ＰＭ，Ｙａｎｇ  ＪＭ，Ｂａｌｅ  ＳＪ，Ｃｏｍｐｔｏｎ  ＪＧ  １９９３，ＢＢＲＣ  １９７：８４０〜８４８）。これらのペプチドのうちの１つは、そのＣ末端に結合した細胞貫通ペプチドを有する（Ｖａｌｌｅｓｐｉ  ＭＧ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ＪＲ，Ｔｏｒｒｅｎｓ  Ｉ，Ｇａｒｃｉａ  Ｉ，Ｇａｒａｙ  Ｈ，Ｍｅｎｄｏｚａ  Ｏら、２００９．Ｊ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６：４０〜４７）。前記ペプチドの抗ＨＩＶ活性を、異なるウイルス系統：ＨＸＢ１（ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢクローン）及びＢｒｕの存在下で総ウイルスチャレンジ系を用いて評価した。ウイルスチャレンジ前に、ＭＴ４細胞系をペプチドと共に２４時間インキュベーションした。各実験用変異体について９個の複製物を含め、０．０１及び０．０５のｍ．ｏ．ｉ．値で分析を行った。ｐ２４ウイルス抗原の値を、細胞培養物内でＥＬＩＳＡタイプ分析法を用いて求め、結果を、いずれについてもペプチド濃度に対してウイルス阻害の割合（％）又は感染の割合（％）として表した。培養物を高ウイルス濃度（配列番号１、図６Ａ）及び０．０１のｍ．ｏ．ｉ．（図６Ｂ）でチャレンジ試験したときに、いずれについてもペプチドの存在下でウイルス複製の重要な阻害が認められた。ペプチドのＩＣ５０は、ナノモル範囲であった。
【０１２３】
（例５）
末梢血単核球においてＨＩＶ複製を阻害する合成ペプチド
ＰＢＭＣを健常個体の全血から塩化セシウムＦｉｃｏｌｌ密度勾配法により単離した。２０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのインターロイキン２（ＩＬ−２）、及び５μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）となるように補給されたＲＰＭＩ培地内において２日間細胞を事前刺激した。その後、上記細胞を、ＰＨＡを含まない培地内で保持し、９６ウェルプレートのウェル１個当り１５００００個の細胞を播種した。２４時間後、異なる濃度でペプチドを添加し、培養物を、０．０１のｍ．ｏ．ｉ．でＨＩＶ−１  Ｂｒｕ系統に感染させた。３日置きに培地を交換し、ペプチドを添加しながら、培養物を７日間保持した。培養物を採集し、上清を集めてｐ２４ウイルスタンパク質の有無を評価した。ペプチドは用量依存的にＨＩＶ−１複製を阻害した（図７）。ＨＩＶ−１  ＢａＬ１系統に感染した培養物では、ナノモル範囲の類似したＩＣ５０結果が得られた。
【０１２４】
（例６）
合成ペプチドによるＨＩＶ−２の阻害
ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配法を用いて健常個体の全血から単離した。２０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２、及び５μｇ／ｍＬのＰＨＡとなるように補給されたＲＰＭＩ培地を用いて、細胞を２日間事前刺激した。その後細胞を、ＰＨＡを含まない培地内で維持し、９６ウェルプレートのウェル１個当り１５００００個の細胞を播種した。２４時間後、異なる濃度でペプチドを添加し、培養物を、ＣＢＬ−２０  ＨＩＶ−２系統に感染させた。３日置きに培地を交換し、ペプチドを添加しながら、培養物を７日間保持した。培養物を採集し、上清を集めてｐ２４ウイルスタンパク質の有無を評価した。ペプチドは用量依存的にＨＩＶ−２複製を阻害した（図８）。
【０１２５】
（例７）
配列番号１、４、５、７、８、及び９として識別されるペプチド存在下におけるビメンチンの低下
ＭＴ４細胞系を、各ペプチドにつき５０μＭで２４時間インキュベーションした。ビメンチンタンパク質をウェスタンブロット技術により検出した。細胞抽出物を１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）に再懸濁し、１０％ポリアクリルアミドゲルに適用し、更にＨｙｂｏｎｄ−Ｐセルロース膜に移行させた。免疫学的同定を目的として、抗ビメンチン及び抗βアクチン（対照として）抗体を用いた。二次抗体として抗マウスＩｇＧ抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲートを用いた。過酸化水素及びＰＢＳの存在下でジアミノベンジジンを用いて、ペルオキシダーゼ酵素の活性を可視化した。ペプチドで処理したＭＴ４細胞ではビメンチンタンパク質が低下した（図９）。
【０１２６】
（例８）
配列番号１及び配列番号３として識別されるペプチドの細胞貫通
ＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞を、１０％ＦＢＳとなるように補給したＲＰＭＩ培地に播種し、単層の６０％コンフルエンスに達するまでインキュベーションした。ＭＴ４細胞を、１ウェル当り５００００個の細胞となるように１０％ＦＢＳのＲＰＭＩ培地内に播種した。配列番号１及び配列番号３として識別されるペプチドを注射液に再懸濁し、５、１０、２０、及び４０μＭの濃度で評価した。ペプチドを、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で２４時間インキュベーションし、貫通を、１５、３０、及び６０分後に評価した。各時間経過後、細胞を採集し、フローサイトメトリーにより速やかに分析した。１つの実験用変異体につき３つの複製物を分析した。図１０に示す通り、ペプチドは、ＭＴ４細胞内に独自に貫通可能であった。
【０１２７】
（例９）
ビメンチンと結合し、ＨＩＶ−１複製を阻害する脂質誘導体
プロスタグランジンシクロペンタン１５デオキシ−Δ−１２，１４−ＰＧＪ２（１５ｄ−ＰＧＪ２）はビメンチンタンパク質と結合することが公知である（Ｓｔａｍａｔａｋｉｓ  Ｋ，Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｇｏｍｅｚ  ＦＪ，Ｐｅｒｅｚ−Ｓａｌａ  Ｄ  ２００６，Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １７：８９〜９８）。本発明では、１５ｄ−ＰＧＪ２はｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＩＶ複製を阻害することが実証された。抗ウイルス活性分析を、ＨＩＶ−１（Ｂｒｕ系統）チャレンジの対象とされたＭＴ４細胞について実施した。細胞を異なる濃度の１５ｄ−ＰＧＪ２でインキュベーションし、更に０．０１のｍ．ｏ．ｉ．でＨＩＶ−１チャレンジの対象とした。５日間インキュベーションした後、細胞培養物を採集し、上清中のｐ２４タンパク質を評価した（図１１）。
【０１２８】
（例１０）
合成ペプチド及び１５ｄ−ＰＧＪ２がＨＩＶ−１に感染した患者のＰＢＭＣに与える効果
ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配法によりＨＩＶ−１感染個体の全血から単離した。細胞を事前刺激し、例５に記載するのと同様にペプチドで処理し、又は５μＭの１５ｄ−ＰＧＪ２で処理した。培養物上清についてＥＬＩＳＡ法によりｐ２４抗原濃度を測定することから、複製物を評価した。ペプチド又は脂質誘導体で処理したＰＢＭＣでは、未処理細胞と比較してｐ２４の値は有意に低下した（表１）。これは、上記化合物を用いた処理によりもたらされたＨＩＶ−１複製の阻害を示唆する。
【表１】
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例３に記載する試験法に従い、ＩＦ構造を伝達電子顕微鏡検査により分析した。ＩＦは、ペプチド又は脂質誘導体で治療を受けた感染個体のＰＢＭＣでは、未処理細胞と比較して非常に短いことが明らかとなった。
【０１２９】
（例１１）
ビメンチン及びケラチン−１０を標的とする干渉ＲＮＡは、感染個体のＰＢＭＣに存在するＨＩＶを阻害する。
Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配法により、ＰＢＭＣをＨＩＶ−１感染個体の全血から単離した。２０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２、及び５μｇ／ｍＬのＰＨＡとしたＲＰＭＩ培地内で細胞を２日間事前刺激した。その後、上記細胞を、ＰＨＡを含まない培地内で保持し、更にビメンチン及びケラチン−１０タンパク質のそれぞれを発現抑制させるＲＮＡヘアピンをコードする配列を保持するレンチウイルスベクターｐＬｅｎｔｉ−ｓｈＲＮＡｖｉｍ、又はｐＬｅｎｔｉ−ｓｈＲＮＡＫ−１０を用いて形質導入した。例２に記載するようにベクターを得た。ＥＬＩＳＡ法で培養物上清のｐ２４抗原濃度を測定することにより、複製物を評価した。ビメンチン又はケラチン−１０タンパク質について発現抑制されたＰＢＭＣは、上記タンパク質のそれぞれについて発現抑制されていない培養物と比較して、高いウイルス複製阻害を示した（表２）。
【表２】
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例３に記載する試験法に従い、ＩＦ構造を伝達電子顕微鏡検査により分析した。ＩＦ構造は、レンチウイルスベクターを用いて形質導入された感染個体由来のＰＢＭＣでは、形質導入されない細胞と比較して短いことが明らかとなった。
【０１３０】
（例１２）
配列番号１及び２として識別されるペプチドを含む製剤によるＨＩＶ−１感染患者の治療
診断から１年未満で、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数値が細胞３５０個／ｍｍ３よりも高いＨＩＶ−１血清陽性患者８例を、配列番号１として識別されるペプチドを含む製剤、又は配列番号２として識別されるペプチドを含む製剤で治療した。ペプチドを１日当り１５０ｍｇ投与し、ウイルス負荷及びＣＤ４＋Ｔ細胞カウントに注目して患者を６カ月間フォローアップした。治療後患者２例でウイルス負荷が検出不能となり、他の患者６例では、１．５ｌｏｇ単位を超えて減少した。一方、患者７例は、細胞５０個／ｍｍ３より多いＣＤ４＋Ｔ細胞の増加を示したが、もう一人の患者ではＣＤ４＋Ｔ細胞カウントは低下した。配列番号１として識別されるペプチドで治療を受けた患者２例、及び配列番号２で治療を受けた患者３例について、例３に記載する試験法に従い、ＩＦ構造を伝達電子顕微鏡検査により分析した。いずれの場合もＩＦは短縮しているように見えた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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