(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キツネノマゴ又はその有機溶剤抽出物を有効成分とするドーパオキシダーゼ活性抑制剤。
【請求項２】
キツネノマゴ又はその有機溶剤抽出物を有効成分とするメラニン生成抑制剤。
【請求項３】
キツネノマゴ又はその有機溶剤抽出物を有効成分とする皮膚美白剤。
【請求項４】
前記有機溶剤が親水性有機溶剤濃度５０〜１００容量％の含水親水性有機溶剤である、請求項１〜３のいずれか１項記載の剤。
【請求項５】
前記親水性有機溶剤がアルコールである、請求項４記載の剤。
【請求項６】
前記アルコールがエタノール又は１，３−ブチレングリコールである、請求項５記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚美白剤、メラニン生成抑制剤又はドーパオキシダーゼ活性抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
美容上、色素沈着や、シミ、ソバカスの少ない白い肌が好まれる傾向にあることから、長期間使用しても安全性の高い美白作用を有する物質が望まれている。色素沈着やシミ、ソバカス等は、一般に皮膚の紫外線暴露による刺激やホルモンの異常又は遺伝的要素等によって皮膚内に存在する色素細胞（メラノサイト）が活性化されメラニン生成が亢進した結果生じるものと考えられている。このメラニン生成亢進のメカニズムは複雑であるが、メラニンは酵素チロシナーゼの作用により生合成されること、チロシナーゼのドーパオキシダーゼ活性はメラニン生成のメカニズムに深く関与していることが知られている（非特許文献１）。このメラニン生成のメカニズムを標的とした美白剤が開発されている。例えば、酵素チロシナーゼの活性を抑制してメラニン産生を抑制する作用を有する皮膚美白剤として、アスコルビン酸、アルブチン、コウジ酸等が報告されている（非特許文献２）。
【０００３】
ドーパオキシダーゼ活性を抑制し、美白作用を有する植物エキスが報告されている。例えば、トウセンダン（Ｍｅｌｉａ  ｔｏｏｓｅｎｄａｎ  Ｓｉｅｂ．ｅｔ  Ｚｕｃｃ．）、ソウカ（Ａｍｏｍｕｍ  ｔｓａｏ−ｋａ  Ｃｒｅｖｏｓｔ  ｅｔ  Ｌｅｍａｉｒｅ）、セネシオ  グラシリス（Ｓｅｎｅｃｉｏ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）及びコクリロ（Ｖｅｒａｔｒｕｍ  ｎｉｇｒｕｍ  Ｌ．）（特許文献１）、セイヨウトウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ａｒｃｈａｎｇｅｌｉｃａ）、ハナミズキ（Ｂｅｎｔｈａｍｉｄｉａ  ｆｌｏｒｉｄａ）、カンスイ（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｋａｎｓｕｉ  Ｌｉｏｕ）、ヌルデ（Ｒｈｕｓ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ  Ｍｉｌｌ．）、オカゼリ（Ｃｎｉｄｉｕｍ  ｍｏｎｎｉｅｒｉ（Ｌ．）Ｃｕｓｓ．）、キンミズヒキ（Ａｇｒｉｍｏｎｉａ  ｐｉｌｏｓａ  Ｌｅｄｅｂ．）、ロウロ（Ｄｉｕｒａｎｔｈｅｒａ  ｍｉｎｏｒ（Ｃ．Ｈ．Ｗｒｉｇｈｔ）Ｈｅｍｓｌ．）及びセイヨウメギ（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ  ａｒｉｓｔａｔａ）（特許文献２）、イヌカラマツ、タイワンコマツナギ及びチョウセンアサガオ（特許文献３）、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ）花（特許文献４）、蓮心（ａ  ｂｕｄ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｌｕｍｂｏ  ｎｕｃｉｆｅｒａ  Ｇａｅｒｔｎ）（特許文献５）、ならびにブッドレア  アキシラリス（Ｂｕｄｄｌｅｊａ  ａｘｉｌｌａｒｉｓ）（特許文献６）が知られている。
【０００４】
キツネノマゴ科植物のキツネノマゴＪｕｓｔｉｃｉａ  ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓは、漢方では爵床として知られ、関節痛や解熱等に適用されている。同じキツネノマゴ科の同属植物であるＪｕｓｔｉｃｉａ  ｇｅｎｄａｒｕｓｓａ（キダチキツネノマゴ）は、皮膚外用鎮痛剤又は皮膚外用抗かゆみ剤の成分として知られており（特許文献７）、また同じキツネノマゴ科の異なる属の植物であるＴｈｕｎｂｅｒｇｉａ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉａ、Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔａ（Ｌ．）Ｋｕｒｚ、Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａは、チロシナーゼ活性阻害、メラニン生成抑制又は美白作用を有することが知られている（特許文献８〜１０）。
【０００５】
しかし、キツネノマゴ科Ｊｕｓｔｉｃｉａ属、とりわけＪｕｓｔｉｃｉａ  ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓに、メラニン生成抑制作用や皮膚美白作用があることはこれまで確認されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−１９５７３２号公報
【特許文献２】特開２０１０−１９５７３１号公報
【特許文献３】特開２０１０−１５９２２１号公報
【特許文献４】特開２００６−２２５２８６号公報
【特許文献５】特開２０１１−０３７８５１号公報
【特許文献６】特表２００９−５２９４９９号公報
【特許文献７】特開２００５−２８１２０６号公報
【特許文献８】特開２００９−２９８７１１号公報
【特許文献９】特開２００３−０８９６３０号公報
【特許文献１０】特開２０１０−０１３４００号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Biochimica et Biophysica Acta 1247, 1-11(1995)
【非特許文献２】美白戦略（南江堂）ＩＶ.，美白剤の薬理と臨床，p95-116
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、安全性が高く、ドーパオキシダーゼ活性を抑制することができ、化粧料や医薬等として有用な皮膚美白剤、メラニン生成抑制剤及びドーパオキシダーゼ活性抑制剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、皮膚美白作用やメラニン生成抑制作用等を有する天然由来の物質を探索したところ、キツネノマゴ科植物キツネノマゴがドーパオキシダーゼ活性抑制作用を有し、メラニン過剰生成に伴う皮膚の褐色化やシミ・ソバカス等の予防、改善、治療等の効果を発揮する医薬、化粧料、皮膚外用剤及び皮膚美白用組成物等の素材として有用であることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
本発明は、キツネノマゴ又はその有機溶剤抽出物を有効成分とするドーパオキシダーゼ活性抑制剤を提供する。
また本発明は、キツネノマゴ又はその有機溶剤抽出物を有効成分とするメラニン生成抑制剤を提供する。
また本発明は、キツネノマゴ又はその有機溶剤抽出物を有効成分とする皮膚美白剤を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のドーパオキシダーゼ活性抑制剤、メラニン生成抑制剤、又は皮膚美白剤を用いれば、皮膚におけるメラニンの過剰産生を抑制し、日焼け等による皮膚の色素沈着、シミ、ソバカスの予防、改善又は治療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】キツネノマゴのエタノール抽出物によるドーパオキシダーゼ活性抑制。
【図２】キツネノマゴのブチレングリコール抽出物によるドーパオキシダーゼ活性抑制。
【図３】キツネノマゴ抽出物によるメラニン産生抑制。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において、「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処置行為を含まない概念である。
【００１４】
本明細書において、「改善」とは、疾患、症状又は状態の好転、疾患、症状又は状態の悪化の防止又は遅延、あるいは疾患、症状又は状態の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
【００１５】
本明細書において、「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止又は遅延、あるいは個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。
【００１６】
本発明におけるキツネノマゴとは、キツネノマゴ科植物のＪｕｓｔｉｃｉａ  ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ又はＲｏｓｔｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓを意味する。
本発明において、キツネノマゴは、その植物の全草、葉（葉身、葉柄等）、果実（成熟、未熟等）、種子、花（花弁、子房等）、茎、根茎、根、塊根等を、そのまま、若しくは切断、破砕、粉砕、搾取して用いるか、又はこれらを乾燥若しくは粉末化して用いることができる。用いる部位としては、全草を使用するのが好ましい。キツネノマゴの抽出物としては、特に限定されない限り、上記部位のいずれかからの抽出物であればよいが、全草抽出物が好ましい。抽出物は、上記植物の部位から直接抽出されたものでもよいが、当該植物の部位を切断、破砕、粉砕若しくは搾取、及び／又は乾燥若しくは粉末化してから抽出されたものでもよい。
【００１７】
キツネノマゴ抽出物を調製するために用いられる抽出溶剤としては、有機溶剤が好ましく、極性有機溶剤、非極性有機溶剤の何れも使用することができる。当該有機溶剤としては、１価、２価又は多価のアルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状又は環状のエーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；飽和又は不飽和の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ピリジン類；ジメチルスルホキシド；アセトニトリル；二酸化炭素、超臨界二酸化炭素；油脂、ワックス、その他のオイル類等が挙げられ、このうち、薬理活性の点で、アルコール類及び飽和炭化水素類が好ましい。
【００１８】
上記アルコール類としては、特に限定されないが、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アミルアルコール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール等の１価アルコール類；１，３−ブチレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール等の２価アルコール類；グリセリン等の３価以上のアルコール類等が挙げられ、このうち、薬理活性の点で、１価アルコール類及び２価アルコール類が好ましい。
【００１９】
上記アルコール類としては、炭素数１〜１０、より炭素数１〜４のものが好ましい。具体的にはメタノール、エタノール、１，３−ブチレングリコール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔ−ブタノール等が挙げられ、取り扱いが容易な点から、エタノール及び１，３−ブチレングリコールが好ましい。
【００２０】
また、上記飽和炭化水素類としては、直鎖、分岐鎖又は環状の飽和炭化水素が挙げられ、例えば、メタン、エタン、プロパン、ｎ−ブタン、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、ｎ−ノナン、ｎ−デカン等の直鎖飽和炭化水素；２−メチルブタン、２，２−ジメチルプロパン、２−メチルペンタン、３−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，２，４−トリメチルペンタン等の分岐鎖飽和炭化水素；シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン等の環状飽和炭化水素等が挙げられ、このうち、薬理活性の点で、直鎖飽和炭化水素が好ましい。
【００２１】
上記飽和炭化水素類としては、炭素数１〜１０、より炭素数５〜１０、更に炭素数５〜８のものが好ましい。具体的には、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、２−メチルブタン、２，２−ジメチルプロパン、２−メチルペンタン、３−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、シクロヘキサン等が挙げられ、取り扱いが容易な点から、ｎ−ヘキサンが好ましい。
【００２２】
上記有機溶剤は、単独で又は２種以上混合して混合液として使用することができる。
【００２３】
本発明に用いる有機溶剤は含水有機溶剤を含む。当該含水有機溶剤としては、含水の親水性有機溶剤が好ましい。親水性有機溶剤としては、特に限定されないが、上述した、アルコール類、酢酸、ピリジン類等のプロトン性親水性有機溶剤及びケトン類、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド等の非プロトン性親水性有機溶剤が挙げられ、このうちプロトン性親水性有機溶剤が好ましい。このプロトン性親水性有機溶剤のうち、取り扱いが容易な点から、上記アルコール類、より上記１価及び２価のアルコール類、更に炭素数１〜４のアルコール類、より更にエタノール及び１，３−ブチレングリコールが好ましい。尚、これらを単独で又は２種以上混合して混合液として使用することができる。
【００２４】
上記含水有機溶剤中の含水量は、特に限定されないが、薬理活性の点から７０容量％以下、好ましくは５０容量％以下、さらに好ましくは２５容量％以下とすることができる。例えば、含水有機溶剤中の親水性有機溶剤の濃度としては、少なくとも親水性有機溶剤３０容量％以上、より好ましくは５０〜１００容量％、さらに好ましくは７５〜１００容量％、なお好ましくは７５〜９９．９容量％とするのが、薬理活性の点で、好ましい。
【００２５】
本発明における抽出の手段としては、特に限定されないが、例えば、液液抽出、固液抽出、浸漬、浸出、煎出、還流抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出、遠心抽出等が挙げられ、単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。このとき、バッチ式抽出器やソックスレー抽出器等を用いてもよい。
【００２６】
抽出条件としては、特に限定されないが、抽出温度は、０〜１００℃、より４〜８０℃、さらに４〜４０℃であるのが好ましく、抽出期間は、１分〜５０日間、より１時間〜５０日間、さらに１〜３０日間であるのが好ましい。また、上記溶剤の使用量は、植物１質量部（乾燥物換算）に対して、１〜１００質量部、より１〜５０質量部、さらに５〜４０質量部であるのが好ましい。
【００２７】
抽出の一例として、植物１質量部（乾燥物換算）に対して、上記溶剤濃度５０〜９５容量％含有の１価若しくは２価のアルコール水溶液（好ましくは炭素数１〜３の１価アルコール類又は炭素数３〜５の２価アルコール類）及び／又は飽和炭化水素類（好ましくは炭素数５〜１０の飽和炭化水素）を１〜５０質量部用いて、１０〜４０℃（好ましくは２０〜４０℃）で、１時間〜３０日間（好ましくは５〜２０日間）抽出するのが好ましい。また、抽出は、煮沸脱気や窒素ガス等の不活性ガスを通気して溶存酸素を除去しつつ、非酸化的雰囲気下で行ってもよい。
【００２８】
上述のようにして得られたキツネノマゴ抽出物は、そのまま用いることもできるが、さらに希釈、濃縮又は凍結乾燥等し、及び／又は液状、粉末状又はペースト状に調製して用いることもできる。
【００２９】
また、キツネノマゴを上記溶剤、好ましくは上記親水性有機溶剤で抽出した後に、水洗や液液分液、固液抽出等の抽出手段をさらに用いると、水溶性の夾雑物等を除去でき、薬理活性の点で有利である。具体的には、キツネノマゴの抽出物、好ましくは親水性有機溶剤抽出物に、水及び／又は疎水性有機溶剤等の溶媒を添加し、混合、撹拌、振とう、遠心分離等の物理的手段を行ったのち、薬理活性成分が主として含まれる画分（層）の回収を行う。適宜この操作を１〜３回繰り返し行ってもよい。回収後は濃縮し、得られた固形物をアルコール水溶液等に溶解させても良い。
【００３０】
上記有機溶剤抽出物に添加する溶剤（以下、「添加溶剤」とする。）としては、水、疎水性有機溶剤又は水−疎水性有機溶剤混合液を用いればよい。
【００３１】
ここで、疎水性有機溶剤としては、特に限定されないが、例えば、上述した、飽和又は不飽和の炭化水素類；芳香族炭化水素類；ハロゲン化炭化水素類；鎖状若しくは環状のエーテル類又はポリエーテル類；オイル等が挙げられる。このうち、薬理活性の点から、飽和又は不飽和の炭化水素類が好ましく、飽和炭化水素類がより好ましい。飽和炭化水素類のうち、炭素数５〜１０の飽和炭化水素が好ましく、炭素数５〜８の直鎖又は分岐鎖飽和炭化水素がより好ましく、ｎ−ヘキサンがさらに好ましい。尚、これら各疎水性有機溶剤を単独で又は２種以上混合して使用することができる。
【００３２】
上記添加溶剤として、水−疎水性有機溶剤混合液を用いるのが、水洗と疎水性有機溶剤抽出とが同時に行え、作業効率がよい点で、有利である。尚、水と疎水性有機溶剤とを同時又は別々に、上述の溶剤抽出物に添加してもよい。水−疎水性有機溶剤混合液を用いて抽出、特に液液分液（分配）を行う場合には、分層性を改善するため、あるいは、抽出物中に混在する酸性成分や塩基性成分を除去する目的で、アルコール類や無機塩等をさらに加えても良い。上記水−疎水性有機溶剤混合液中の水と疎水性有機溶剤との混合割合は、特に限定されないが、水（ｖ）：疎水性有機溶剤（ｖ）＝１：０．１〜１：１０、より１：０．１〜１：５とするのが好ましい。
【００３３】
上記添加溶剤に、水溶性夾雑物の除去を容易にするため、上記アルコール類を含有させてもよく、この場合、当該溶剤中、アルコール類の含有量は、１〜５０容量％とするのが好ましい。
【００３４】
上記添加溶剤に、水溶性夾雑物の除去を容易にするため、適宜、水溶性無機塩類を含有させてもよく、当該水溶性無機塩類としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の塩化物；炭酸ナトリウム等の炭酸塩；炭酸水素ナトリウム等の炭酸水素塩；硫酸ナトリウム等の硫酸塩等；リン酸ナトリウム等のリン酸塩等が挙げられる。また、水中の水溶性無機塩類の含有量は、０．５〜１０％（ｍ／ｖ）とするのが好ましい。
【００３５】
上記添加溶剤の使用量は、特に限定されないが、乾固物１ｇに対して、１０〜１００ｍＬであるのが好ましい。また、抽出温度は、４〜８０℃であるのが好ましく、１０〜４０℃、さらに１０〜３０℃であるのがより好ましい。
【００３６】
上述のようにして得られたキツネノマゴの有機溶剤抽出物は、そのまま用いることもできるが、当該抽出物を希釈、濃縮又は凍結乾燥等して、液状、粉末状又はペースト状に調製して用いることもできる。なお、必要に応じて、上記キツネノマゴの有機溶剤抽出物を、活性炭処理、液々分配、ゲルろ過、精密蒸留等の分離精製技術に供して、不活性な夾雑物等を除去し、更に精製してもよい。
【００３７】
後記実施例に示すように、キツネノマゴの有機溶剤抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性を強く抑制するという優れたドーパ−オキシダーゼ活性抑制作用を有する。ドーパオキシダーゼ活性はメラニン生成のメカニズムに深く関与すること（非特許文献１）から、ドーパオキシダーゼ活性を抑制すれば、メラニン生成抑制効果、及び皮膚美白作用や紫外線被爆等による皮膚の色素沈着、シミ、ソバカス等の症状を予防、改善又は治療する効果を得ることができる。後記実施例にはまた、キツネノマゴの有機溶剤抽出物によるメラニン産生抑制作用が示されている。
【００３８】
すなわち、キツネノマゴ又はその有機溶剤抽出物は、ドーパ−オキシダーゼ活性抑制のため、メラニン生成抑制のため、皮膚美白のため、又は皮膚の色素沈着、シミ、ソバカス等の症状を予防、改善、若しくは治療するために使用することができる。これらの使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する組織、器官、細胞における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。
【００３９】
従って、一態様において、本発明は、ドーパオキシダーゼ活性抑制のためのキツネノマゴ又はその有機溶剤抽出物の使用を提供する。
また本発明は、メラニン生成抑制のためのキツネノマゴ又はその有機溶剤抽出物の使用を提供する。
また本発明は、皮膚美白のためのキツネノマゴ又はその有機溶剤抽出物の使用を提供する。
また本発明は、皮膚の色素沈着、シミ若しくはソバカスを予防又は改善するためのキツネノマゴ又はその有機溶剤抽出物の使用を提供する。
また本発明は、皮膚の色素沈着、シミ若しくはソバカスの予防又は改善に使用するためのキツネノマゴ又はその有機溶剤抽出物を提供する。
一実施形態において、上記有機溶剤抽出物はアルコール抽出物であり得る。
上記の使用は、治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。一実施形態において、上記非治療的使用は、美容目的での使用であり得る。
【００４０】
別の態様において、本発明は、キツネノマゴ又はその有機溶剤抽出物を有効成分とするドーパオキシダーゼ活性抑制剤を提供する。
また本発明は、キツネノマゴ又はその有機溶剤抽出物を有効成分とするメラニン生成抑制剤を提供する。
また本発明は、キツネノマゴ又はその有機溶剤抽出物を有効成分とする皮膚美白剤を提供する。
一実施形態において、上記有機溶剤抽出物はアルコール抽出物であり得る。
一実施形態において、上記剤は、キツネノマゴ又はその有機溶剤抽出物から本質的に構成されていてもよい。
【００４１】
また別の態様において、本発明は、ドーパオキシダーゼ活性抑制剤の製造のためのキツネノマゴ又はその有機溶剤抽出物の使用を提供する。
また本発明は、メラニン生成抑制剤の製造のためのキツネノマゴ又はその有機溶剤抽出物の使用を提供する。
また本発明は、皮膚美白剤の製造のためのキツネノマゴ又はその有機溶剤抽出物の使用を提供する。
また本発明は、皮膚の色素沈着、シミ若しくはソバカスの予防、改善又は治療剤の製造のためのキツネノマゴ又はその有機溶剤抽出物の使用を提供する。
本態様の一実施形態において、上記剤によるメラニン生成抑制作用又は皮膚美白作用は、ドーパオキシダーゼ活性抑制作用によってもたらされ得る。
一実施形態において、上記有機溶剤抽出物はアルコール抽出物であり得る。
【００４２】
上記キツネノマゴ又はその抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性抑制のため、メラニン生成抑制のため、皮膚美白のため、あるいは皮膚の色素沈着、シミ、ソバカス等の症状を予防、改善、若しくは治療するための組成物、医薬、医薬部外品、外用剤、化粧料、飲食品、飼料、又は飲食品若しくは飼料の原料等に素材として配合することができ、あるいはそれらの製造のために使用することができる。当該組成物、医薬、医薬部外品、外用剤、化粧料、飲食品、飼料、又は飲食品若しくは飼料の原料等もまた、本発明の範囲内である。
【００４３】
上記組成物、医薬、医薬部外品、外用剤、化粧料、飲食品、飼料、又は飲食品若しくは飼料の原料等は、ヒト又は非ヒト動物用として製造され、又は使用され得る。上記キツネノマゴ又はその抽出物は、当該組成物、医薬、医薬部外品、外用剤、化粧料、飲食品、飼料、又は飲食品若しくは飼料の原料等に配合され、ドーパオキシダーゼ活性抑制のため、メラニン生成抑制のため、皮膚美白のため、あるいは皮膚の色素沈着、シミ、ソバカス等の症状を予防、改善、若しくは治療するための有効成分であり得る。
【００４４】
上記医薬又は医薬部外品は、上記キツネノマゴ又はその抽出物を有効成分として含有する。当該医薬又は医薬部外品は、任意の投与形態で投与され得る。投与は経口でも非経口でもよい。経口投与のための剤型としては、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤のような固形投薬形態、ならびにエリキシル、シロップおよび懸濁液のような液体投薬形態が挙げられ、非経口投与のための剤型としては、注射、輸液、局所、外用剤、経皮、経粘膜、経鼻、経腸、吸入、坐剤、ボーラス、貼布剤等が挙げられる。好ましくは、当該医薬又は医薬部外品は、皮膚外用剤の形態であり得る。
【００４５】
上記化粧料は、上記キツネノマゴ又はその抽出物を有効成分として含有する。化粧料とする場合の形態としては、クリーム、乳液、ローション、懸濁液、ジェル、パウダー、パック、シート、パッチ、スティック、ケーキ等、化粧料に使用され得る任意の形態が挙げられる。好ましくは、上記化粧料は皮膚美白用化粧料であり、また好ましくは、皮膚外用化粧料であり得る。より好ましくは、上記化粧料は皮膚美白用の皮膚外用化粧料である。
【００４６】
上記医薬、医薬部外品又は化粧料は、上記キツネノマゴ又はその抽出物を単独若しくは組み合わせて含有していてもよく、又は薬学的に若しくは化粧料として許容される担体と組み合わせて含有していてもよい。斯かる担体としては、例えば、賦形剤、被膜剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、分散剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、香料、矯味剤、矯臭剤等が挙げられる。また、当該医薬や医薬部外品は、上記キツネノマゴ又はその抽出物のドーパオキシダーゼ活性抑制作用が失われない限り、他の有効成分や薬理成分を含有していてもよい。また、当該化粧料は、上記キツネノマゴ又はその抽出物のドーパオキシダーゼ活性抑制作用が失われない限り、他の有効成分や化粧成分、例えば、保湿剤、美白剤、紫外線保護剤、細胞賦活剤、洗浄剤、角質溶解剤、メークアップ成分（例えば、化粧下地、ファンデーション、おしろい、パウダー、チーク、口紅、アイメーク、アイブロウ、マスカラ、その他）等を含有していてもよい。
【００４７】
上記医薬、医薬部外品又は化粧料は、上記キツネノマゴ又はその抽出物から、あるいは必要に応じて上記担体及び／又は他の有効成分や、化粧成分、薬理成分を組みあわせて、常法により製造することができる。例えば、上述した皮膚外用剤である医薬若しくは医薬部外品又は皮膚外用化粧料は、上記キツネノマゴ又はその抽出物を、単独で、又は外用剤、外用医薬品、医薬部外品若しくは皮膚化粧料に通常配合される、油又は油状物質（例えば、油脂類、ロウ類、高級脂肪酸類、精油類、シリコーン油類等）、保湿剤（例えば、グリセロール、ソルビトール、ゼラチン、ポリエチレングリコール等）、粉体（例えば、チョーク、タルク、フラー土、カオリン、デンプン、ゴム等）、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬効成分、香料、樹脂、防菌防黴剤、他の植物抽出物（例えば、生薬、漢方薬、ハーブ類）、アルコール類、多価アルコール類、無機酸（例えば、重炭酸塩、炭酸塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム等）、有機酸（例えば、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、グルタミン酸、リンゴ酸、クエン酸、アスコルビン酸等）、ビタミン類（例えば、ビタミンＡ類、ビタミンＥ類、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、葉酸等）、水溶性高分子、アニオン性界面活性剤（例えば、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩等）、カチオン性界面活性剤（例えば、アルキル四級アンモニウム塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩等）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等）、両性界面活性剤（例えば、アルキル基を有するイミダゾリン系、カルボベタイン系等）等と組み合わせることにより調製することができる。
【００４８】
当該医薬、医薬部外品又は化粧料におけるキツネノマゴ又はその抽出物の含有量は、皮膚外用剤である医薬又は医薬部外品の場合、乾燥重量として、０．００００１〜２０質量％が好ましく、０．０００１〜１０質量％がより好ましく、また化粧料とする場合、乾燥重量として、０．０００１〜２０質量％が好ましく、０．０００１〜１０質量％がより好ましい。
【００４９】
上記飲食品や飼料は、ドーパオキシダーゼ活性抑制、メラニン生成抑制、皮膚美白、又は皮膚の色素沈着、シミ、ソバカス等の症状の予防、改善若しくは治療等の機能を得ることを企図し、当該機能を必要に応じて表示した飲食品、機能性飲食品、病者用飲食品、特定保健用飲食品、ペットフード等であり得る。
【００５０】
上記飲食品の種類は特に限定されない。飲料としては、例えば、果汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、コーヒー飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料等、あらゆる飲料が挙げられる。食品の形態は、固形、半固形、液状等の任意の形態であってもよく、また錠剤形態、丸剤形態、タブレット、カプセル形態、液剤形態、シロップ形態、粉末形態、顆粒形態等であってもよい。例えば、食品としては、パン類、麺類、パスタ、ゼリー状食品、各種スナック類、ケーキ類、菓子類、アイスクリーム類、スープ類、乳製品、冷凍食品、インスタント食品、その他加工食品、調味料、サプリメント等が挙げられる。上記飼料の種類も特に限定されず、任意の動物のための飼料であってよく、その形態も上記食品の場合と同様に任意の形態であり得る。
【００５１】
上記飲食品、飼料、又はそれらの原料は、上記キツネノマゴ又はその抽出物を単独で含有していてもよく、又は他の食材や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等の添加剤を組み合わせて含有していてもよい。当該飲食品若しくは飼料中の上記キツネノマゴ又はその抽出物の含有量は、乾燥重量として、０．０００１〜１０質量％が好ましく、０．０００１〜５質量％がより好ましく、０．００１〜１質量％がさらに好ましい。
【００５２】
また本発明は、細胞のドーパオキシダーゼ活性を抑制する方法を提供する。当該方法は、チロシナーゼ発現能を有し且つドーパオキシダーゼ活性を抑制したい細胞に、上記キツネノマゴ又はその抽出物を添加する工程を含む。
また本発明は、細胞のメラニン生成を抑制する方法を提供する。当該方法は、メラニン生成能を有し且つメラニン生成を抑制したい細胞に、上記キツネノマゴ又はその抽出物を添加する工程を含む。
【００５３】
本発明においてドーパオキシダーゼ活性又はメラニン生成を抑制する「細胞」は、天然又は遺伝子工学的に改変されたチロシナーゼ発現能又はメラニン生成能を有する細胞であれば特に限定されない。細胞としては、好ましくは色素細胞（メラノサイト、網膜色素上皮細胞等）が挙げられ、より好ましくはメラノサイトが挙げられる。あるいは、当該「細胞」は、上記で挙げた細胞の細胞片または細胞分画物であってもよく、あるいは上記で挙げた細胞を含む組織又は上記で挙げた細胞に由来する培養物であってもよい。細胞が細胞培養物の場合、好ましくは、当該細胞は、上記キツネノマゴ又はその抽出物の存在下で培養される。添加される上記キツネノマゴ又はその抽出物の濃度は、細胞が細胞培養物の場合、培養物中での最終濃度として、乾燥重量換算で、０．００００１〜２％（ｗ/ｖ）であり、好ましくは０．００００５〜０．５％（ｗ/ｖ）であり、より好ましくは０．０００１〜０．１％（ｗ/ｖ）である。
【００５４】
また本発明において、上記キツネノマゴ又はその抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性抑制のため、メラニン生成抑制のため、皮膚美白のため、あるいは皮膚の色素沈着、シミ、ソバカス等の症状を予防、改善、若しくは治療するために、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取され得る。当該投与又は摂取は、健康増進又は美容目的により非治療的に行われてもよい。投与又は摂取の対象としては、ドーパオキシダーゼ活性の抑制を必要とする動物が挙げられる。あるいは、投与又は摂取の対象としては、メラニン生成抑制や皮膚美白を所望する動物、又は皮膚の色素沈着、シミ、ソバカス等の症状の予防、改善、若しくは治療することを所望する動物が挙げられる。動物は、好ましくはヒト又は非ヒト哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
【００５５】
投与又は摂取の有効量は、対象の細胞のドーパオキシダーゼ活性又はメラニン生成を抑制することができる量であればよい。好ましい投与又は摂取量は、対象の種、体重、性別、年齢、状態又はその他の要因に従って変動し得る。投与又は摂取の用量、経路、間隔、及び摂取の量や間隔は、当業者によって適宜決定され得る。例えば、ヒトの皮膚に局所投与する場合、投与量は、上記キツネノマゴ又はその抽出物の乾燥重量換算で、成人（６０ｋｇ）１人当たり、０．００１〜１ｍｇ／日とすることが好ましく、０．０１〜０．１ｍｇ／日がより好ましい。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５７】
製造例  キツネノマゴ抽出物の調製
（製造例１）キツネノマゴ５０％エタノール抽出物の調製
キツネノマゴ（新和物産社製）８０ｇに、５０％エタノール８００ｍＬを加え、室温７日間抽出後、濾過して粗抽出液を得た後、濃縮乾固して抽出固形分６．６ｇを得た。この抽出固形分を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう５０％エタノールに溶解し、キツネノマゴ５０％エタノール抽出物を調製した。
【００５８】
（製造例２）キツネノマゴ９５％エタノール抽出物の調製
キツネノマゴ（新和物産社製）５０ｇに、９５％エタノール５００ｍＬを加え、室温７日間抽出後、濾過して粗抽出液を得た後、濃縮乾固して抽出固形分８９７ｍｇを得た。この抽出固形分を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう９５％エタノールに溶解し、キツネノマゴ９５％エタノール抽出物を調製した。
【００５９】
（製造例３）キツネノマゴ５０％ブチレングリコール抽出物の調製
キツネノマゴ（中之島テクノス社製）１０ｇに、５０％ブチレングリコール（ＢＧ）１００ｍＬを加え、室温７日間抽出後、濾過して蒸発残分１．３ｗ／ｖ％のキツネノマゴ５０％ＢＧ抽出物を得た。
【００６０】
（製造例４）キツネノマゴ８０％ブチレングリコール抽出物の調製
キツネノマゴ（中之島テクノス社製）１０ｇに、８０％ＢＧ１００ｍＬを加え、室温７日間抽出後、濾過して蒸発残分０．３８ｗ／ｖ％のキツネノマゴ８０％ＢＧ抽出物を得た。
【００６１】
（製造例５）キツネノマゴ１００％ブチレングリコール抽出物の調製
キツネノマゴ（中之島テクノス社製）１０ｇに、１００％ＢＧ１００ｍＬを加え、室温７日間抽出後、水２５ｍＬ加えた後濾過して蒸発残分０．０６ｗ／ｖ％のキツネノマゴ１００％ＢＧ抽出物を得た。
【００６２】
実施例１  キツネノマゴ抽出物によるドーパオキシダーゼ活性抑制
【００６３】
（１）細胞培養
正常ヒト新生児表皮由来メラノサイト（ＮＨＥＭｓ；クラボウ社）を９６ウェルプレートに１×１０4細胞／ウェル（１００μＬ／ウェル）の細胞密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ2下にて培養した。培地には、ＰＭＡ（−）の増殖用添加剤（ＨＭＧＳ）を含むＭｅｄｉｕｍ  ２５４を用いた。
３日間培養した後、それぞれ培地中終濃度で１ｎＭになるように調整したＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１（ＥＴ−１）、ＳＣＦ、α−ＭＳＨ、Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ、ＰＧＥ2とともに、上記製造例１〜５に従って調製したキツネノマゴ抽出物を表１に記載の終濃度となるように添加し、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で３日間培養を行った。コントロールとしては、同量のエタノール水溶液（５０％又は９５％）又はブチレングリコール（ＢＧ）水溶液（５０％、８０％又は１００％）を添加した。
（２）ドーパオキシダーゼ活性の測定
培養終了後、アラマーブルー（インビトロジェン社）試薬を２０μＬ／ウェルで添加し、２〜３時間インキュベートした後、培地の蛍光強度を測定して細胞呼吸活性を測定した。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、抽出バッファー（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．２）、１％  ＮＰ−４０、０．０１％ＳＤＳ、１００μＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍアプロチニン）を２０μＬ／ウェル、Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ（４％ジメチルホルムアミド、１００ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ（ｐＨ７．１））を２０μＬ／ウェル添加し、４℃、３時間で細胞を可溶化し、ドーパオキシダーゼ活性の測定を行った。ドーパオキシダーゼ活性測定は、ＭＢＴＨ法（Ｗｉｎｄｅｒ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：３１７−３２６）を参考に、以下の方法で行った。
可溶化した細胞溶液の各ウェルに、上記Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒを８０μＬ、２０．７ｍＭ  ＭＢＴＨ（３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン）溶液を６０μＬ、基質として５ｍＭ  Ｌ−ドーパ（Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン）溶液を４０μＬ、それぞれ加え、３７℃で３０〜６０分反応させた後、その呈色反応を４９０ｎｍの吸光度で測定した（Ｎ＝３）。測定値をコントロールの結果に対する相対値として表した。
【００６４】
（３）結果
結果を表１ならびに図１及び図２に示す。キツネノマゴの５０％エタノール抽出物、９５％エタノール抽出物、５０％ＢＧ抽出物、８０％ＢＧ抽出物、及び１００％ＢＧ抽出物によってドーパオキシダーゼ活性がエキス添加濃度依存的に抑制された。アラマーブルー法による細胞呼吸活性の測定から、表１に示す濃度のキツネノマゴエキス添加が細胞増殖に影響を及ぼさないことを確認した。
【００６５】
【表１】
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【００６６】
実施例２  キツネノマゴ抽出物によるメラニン産生抑制
ＥＴ−１とＳＣＦを終濃度１０ｎＭで添加したＥＰＩ−１００−ＮＭＭ１１３培地を用いて、三次元培養皮膚モデル（ＭＥＬ３００Ａ）を３７℃、５％ＣＯ2条件下にて培養した。培養初日より、上記製造例１に従って調製した蒸発残分１．０ｗ／ｖ％のキツネノマゴ５０％エタノール抽出物を、終濃度が０．０５ｖ／ｖ％及び０．１ｖ／ｖ％（エキス分終濃度０．０００５ｗ／ｖ％及び０．００１ｗ／ｖ％）になるように添加した。コントロールとしては、同量の５０％エタノールを添加した。培地交換は３日に一度行った。１４日後に、アラマーブルー試薬を用いて実施例１と同様に細胞呼吸活性を測定した。続いて三次元培養皮膚を培養支持体であるカップごとＰＢＳで洗浄し、ピンセットで皮膚シートを剥離してチューブに移し、さらにＰＢＳで３回洗浄した。５０％エタノールで３回、１００％エタノールで２回洗浄した後、室温で一晩放置して完全に乾燥させた。最終的に２Ｍ  ＮａＯＨを２００μＬ加えた後で１００℃にて溶解させ、遠心分離によって得られた上清について４０５ｎｍの測定波長で吸光度を測定し、メラニン量を算出した。測定値をコントロールの結果に対する相対値として表した。
【００６７】
１４日培養後の三次元培養皮膚モデルの写真及びメラニン量測定結果を図３に示す。キツネノマゴエキス添加により、細胞の黒化抑制効果が視覚的に認められ（図３Ａ）、細胞のメラニン量が８０％以上減少した（図３Ｂ）。また、アラマーブルー法による細胞呼吸活性測定の結果、この濃度の抽出物が細胞毒性を示さないことが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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