(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸の自己架橋型誘導体（ＡＣＰ）のゲルと、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）で架橋したヒアルロン酸の誘導体（ＨＢＣ）のゲルとの混合物を含み、
ＡＣＰとＨＢＣとを、１０：９０から９０：１０の間の重量比で混合することによって得ることが可能である生体材料であり、
該生体材料は、新規な充填剤および／または身体整形品として、使用可能であり、
前記ヒアルロン酸の自己架橋型誘導体（ＡＣＰ）は、４％〜５％の間の平均架橋度を具えている
ことを特徴とする、生体材料。
【請求項２】
前記混合物が、ＡＣＰとＨＢＣの均質化されたゲル混合物である
ことを特徴とする、請求項１に記載の生体材料。
【請求項３】
ヒアルロン酸ヘキサデシルアミド（ＨＹＡＤＤ）のゲルと、
１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）で架橋したヒアルロン酸の誘導体（ＨＢＣ）のゲルとの混合物を含み、
ＨＹＡＤＤとＨＢＣとを、１０：９０から９０：１０の間の重量比で混合することによって得ることが可能な生体材料であり、
該生体材料は、新規な充填剤および／または身体整形品として、使用可能である
ことを特徴とする、生体材料。
【請求項４】
前記混合物が、ＨＹＡＤＤとＨＢＣの均質化されたゲル混合物である
ことを特徴とする、請求項３に記載の生体材料。
【請求項５】
前記重量比は、９０：１０から５０：５０であり、
該生体材料は、生体再活性化充填剤として、使用可能である
ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の生体材料。
【請求項６】
前記重量比は、１０：９０から５０：５０であり、
該生体材料は、ボリューム増強効果を有する生体材料として、使用可能である
ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の生体材料。
【請求項７】
前記重量比が、２５：７５である
ことを特徴とする、請求項６に記載の生体材料。
【請求項８】
ＡＣＰまたはＨＹＡＤＤと、後述する１，４−ブタンジオールジジグルシジルエーテル（ＢＤＤＥ）により架橋されたヒアルロン酸誘導体(ＨＢＣ) を調製し精製するための方法により調製される、ＨＢＣとを混合する方法であって、
該ＡＣＰまたはＨＹＡＤＤと、ＨＢＣとを混合する方法は、
ａ．ＡＣＰ粉末またはＨＹＡＤＤ粉末と、ＨＢＣ粉末とを、９０：１０から１０：９０の間のＡＣＰまたはＨＹＡＤＤ：ＨＢＣ比で混合するステップ、
ｂ．生理食塩液またはリン酸緩衝液で水和して、全ＨＡ濃度を１２から２７ｍｇ／ｍｌにするステップ、
ｃ．５０から５００μｍの間のメッシュを有する篩を通して、２５から６５℃の温度で押し出して、ＡＣＰまたはＨＹＡＤＤのゲルと、ＨＢＣのゲルの均質化されたゲル混合物を得るステップ、
ｄ．前記ゲル混合物を注射器に充填するステップ、
ｅ．少なくとも１０分間、１２０から１２４℃の間の温度で飽和水蒸気の熱により滅菌するステップ
を含み；
前記ヒアルロン酸誘導体(ＨＢＣ) を調製し精製するための方法は、下記のステップを含む：
ａ−１．ヒアルロン酸の反復単位に対して２．５から２５モル％の化学量論比で、ＢＤＤＥをアルカリ溶液中に溶解するステップ、その後、
ｂ−１．段落ａ−１）で言及した溶液中に、室温でヒアルロン酸（ＨＡ）を分散するステップ、
ｃ−１．熱活性化によって反応を誘発させるステップであって、段落ｂ−１）で言及した溶液を、３５から５５℃の間の温度で２から３６時間の間加熱するステップ、
ｄ−１．金属篩に通して、得られた塊を押し出すことによって、６００μｍまたはそれ未満のサイズの粒子にまで小さくするステップ、
ｅ−１．水で３から２０倍に希釈することによって、得られたゲルを水和するステップ、
ｆ−１．ｐＨを、ＨＣｌの水溶液で中性に補正するステップ、
ｇ−１．生成物が粉末形態で得られるまで、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、ジオキサン、アセトニトリル、アセトン、および／またはこれらの混合物からなる群より選択される水溶性有機溶媒で、沈殿させるステップ、
ｈ．水を含有する、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、ジオキサン、アセトニトリル、アセトン、および／またはこれらの混合物からなる群より選択される有機溶媒で洗浄するステップ、
ｉ−１．４００ｐｐｍ未満の残留溶媒が除去されてＨＢＣ粉末が得られるまで、真空乾燥するステップ
ことを特徴とする、ＡＣＰまたはＨＹＡＤＤと、ＨＢＣとを混合する方法。
【請求項９】
ＡＣＰまたはＨＹＡＤＤと、後述する１，４−ブタンジオールジジグルシジルエーテル（ＢＤＤＥ）により架橋されたヒアルロン酸誘導体(ＨＢＣ) を調製し精製するための方法により調製される、ＨＢＣとを混合する方法であって、
該ＡＣＰまたはＨＹＡＤＤと、ＨＢＣとを混合する方法は、
ａ．ＡＣＰまたはＨＹＡＤＤのゲルまたは粉末と、ゲル形態のＨＢＣとを、９０：１０から１０：９０の間のＡＣＰまたはＨＹＡＤＤ：ＨＢＣ比で混合するステップ、
ｂ．粒子状物質保持係数が２５から１５０μｍの間であるフィルターに通過させることにより、破砕し均質化して、ＡＣＰまたはＨＹＡＤＤのゲルと、ＨＢＣのゲルの均質化されたゲル混合物を得るステップ、
ｃ．前記ゲル混合物を注射器に充填するステップ、
ｄ．少なくとも１０分間、１２０から１２４℃の間の温度で飽和水蒸気により熱滅菌するステップ
を含み、
前記ヒアルロン酸誘導体(ＨＢＣ) を調製し精製するための方法は、下記のステップを含む：
ａ−１．ヒアルロン酸の反復単位に対して２．５から２５モル％の化学量論比で、ＢＤＤＥをアルカリ溶液中に溶解するステップ、その後、
ｂ−１．段落ａ−１）で言及した溶液中に、室温でヒアルロン酸（ＨＡ）を分散するステップ、
ｃ−１．熱活性化によって反応を誘発させるステップであって、段落ｂ−１）で言及した溶液を、３５から５５℃の間の温度で２から３６時間の間加熱するステップ、
ｄ−１．ｐＨを、ＨＣｌの水溶液で中性に補正するステップ、
ｅ−１．水で３から２０倍に希釈することによって、得られたゲルを水和するステップ
ことを特徴とする、ＡＣＰまたはＨＹＡＤＤと、ＨＢＣとを混合する方法。
【請求項１０】
ＨＢＣ、ＡＣＰおよびＨＹＡＤＤ各誘導体の調製に使用されるＨＡが、４００から３×１０６Ｄａの間の平均分子量を有する
ことを特徴とする、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
ＨＡが、１×１０５Ｄａから１×１０６Ｄａの間の平均分子量を有する
ことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＨＡが、２００，０００から１×１０６Ｄａの間の平均分子量を有する
ことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ＡＣＰ：ＨＢＣの重量比が２５：７５である
ことを特徴とする、請求項１または２に記載の生体材料。
【請求項１４】
前記ゲルのビヒクルが生理食塩液である
ことを特徴とする、請求項１〜７、並びに１３のいずれか一項に記載の生体材料。
【請求項１５】
リドカインを更に含有する
ことを特徴とする、請求項１〜７、並びに１３のいずれか一項に記載の生体材料。
【請求項１６】
リドカインを含有し、前記ゲルのビヒクルが生理食塩液からなる
ことを特徴とする、請求項１３に記載の生体材料。
【請求項１７】
皮膚の吹出物の治療、皮膚科、皮膚術美容、および／または美顔整形手術における、新しい充填剤および／または身体整形用の新しい製品の製造のための、請求項１〜７、並びに１３〜１６のいずれか一項に記載の生体材料の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の対象
新規な充填剤としての粘弾性ゲル。
【背景技術】
【０００２】
発明の分野
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、Ｄ−グルクロン酸残基とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基とが交互に配されたものからなるヘテロ多糖である。
【０００３】
ＨＡは、ＨＡが得られる供給源と、使用される調製方法とに応じて、５０，０００から１３×１０６Ｄａに及ぶ分子量を有する直鎖ポリマーである。
【０００４】
ＨＡは、本質的に、細胞周囲ゲル中、脊椎動物の結合組織基質（ＨＡは、この主要成分の１種である。）中、硝子体液中、および臍帯中に存在する。
【０００５】
ＨＡは、組織の構造的および機械的支持体として、また皮膚、腱、筋肉、および軟骨などの組織の細胞生理学的な活性成分として、生物体内で重要な役割を演ずる。
【０００６】
ＨＡは、軟骨基質の主要分子の１種であり、滑液の主要な非タンパク質成分でもある。ＨＡは、親水性の高い粘弾性分子であるので、滑液に潤滑性を与え；したがってＨＡは、付随する疼痛を主に治療するために、３０年にわたり骨関節炎に使用されてきた。
【０００７】
ＨＡは、組織修復プロセスにおいて、構造的見地から（細胞外基質の組織化およびその水和の調節で）、および前記多糖が直接および／または間接的に働く広範な生理学的プロセス（血栓形成、食細胞活性、線維芽細胞増殖、新血管新生、再上皮化など）の刺激／調節物質として、重要な役割も演ずる（Weigel P.ら、J Theoretical Biol、1986:219-234; Abatangelo G.ら、J Surg Res、1983、35:410-416; Goa K.ら、Drugs、1994、47:536-566）。これらの性質は長い間認められてきたので、ＨＡは、創傷、潰瘍、および様々な原因の皮膚病変のケアをするためのドレッシング（ｄｒｅｓｓｉｎｇｓ）を調製するのにも使用される。
【０００８】
ヒアルロン酸は、免疫学的に不活性、無毒性、生分解性、および生体吸収性であるので、顔のしわ、溝、および小さな陥凹部の充填剤として、また、唇および頬のボリューム（ｖｏｌｕｍｅ）を増大させるのにも使用される。
【０００９】
ヒアルロン酸をベースにした治療は：
・唇のボリュームおよび輪郭
・溝（例えば、鼻唇溝）
・顔の輪郭（例えば、頬および顎）の再造形
・しわ（例えば、眉間のしわおよび口角（ｏｒａｌ  ｃｏｍｍｉｓｓｕｒｅｓ））
・眼窩周囲のしわ
・にきび後線維性瘢痕
・外傷後線維性瘢痕
・軟部組織の吹出物
・鼻形成術瘢痕
の補正に適応する。
【００１０】
ヒアルロン酸は、永続的な充填剤ではない。これは、一旦注入されると、治療される領域および使用される調製のタイプに応じて様々な時間で、生成物が徐々に代謝され身体に吸収されることを意味する。充填およびボリュームの増大（しわの減衰）の効果は直ちにあり、数週間のみ継続する。市場に出ている主要な製品は、異なる吸収時間に基づいて、下記のカテゴリーに分類することができる：
・急速吸収充填剤（２〜３カ月）、
・中期吸収充填剤（５〜６カ月）、
・Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ  Ｓｕｂ  Ｑ（QMed、EP0839159）などの低速吸収充填剤（１年）。
【００１１】
真皮において、ＨＡは、水を結合させるその高い能力により水和機能を発揮し、その他の物質と結合することによって皮膚を引き締める高分子複合体を形成するので、「足場」として構造機能を発揮する。
【００１２】
したがって動作メカニズムは、生成物の粘弾性により直ちに行われるボリューム充填と、皮膚線維芽細胞の刺激による新たなコラーゲン合成とからなる。
【００１３】
しかしＨＡは、結合組織中に存在するヒアルロニダーゼ酵素によって急速に破壊される天然の多糖であり；したがって、その効果が数カ月続く充填剤を得るために、ＨＡは、その粘弾性を改善しかつその滞留時間を延ばす架橋プロセスに供される。このように形成された充填剤は、例えばＢＤＤＥ（１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）、ＢＥＬＯＴＥＲＯ（登録商標）、およびＲｅｇｅｎｙａｌ  Ｉｄｅａ）またはＤＶＳ（ジビニルスルホン、Ｈｙｌａｆｏｒｍ（登録商標））を通して架橋され、ポリマー分子間に橋を生成する。しかし架橋度を増大させると、ＨＡは、その化学的、物理的、および生物学的性質が大いに変化する程度にまで、徐々に変性する。過剰に架橋したＨＡ基質は、もはや細胞によって（特に免疫系によって）ＨＡであると認識されない粒子状固形分として存在し；したがって多糖は異物として感知され、炎症反応を引き起こしてその周りに線維性のカプセルを形成する。さらに、過剰に架橋したＨＡは、十分確立された科学的結果からわかるように、皮膚線維芽細胞によりコラーゲン合成を刺激する効果を有するＨＡ断片（特に、低分子量を有するもの）により誘発される、真皮／皮膚組織の再生を刺激することができない。
【００１４】
充填剤は、吸収性または永続性としても分類される。吸収型は、最も生体適合性があり、変性されているか、または天然形で存在するヒアルロン酸またはコラーゲンからなり、その結果、最長でも１年以内に吸収される。永続型は、ポリアクリルアミドなどの合成ポリマー、特に、水と合わせたときに安定なゲルを形成する架橋分子からなる。永続型は、常にそのままの位置に存在し、唇に充填するのに非常に有用であるが、皮膚への挿入によって急性炎症がますます頻繁に引き起こされ、充填剤の周りに線維性カプセルの形成をもたらし、それが異物として感知され、したがって有毒であるので、その使用は推奨されない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本出願人は、繰り返し注入する必要がなくなるように非常に長いｉｎ  ｖｉｖｏでの破壊時間を維持しながら、したがって副作用を低減させながら、治療された皮膚／組織を直ちに水和させる（したがって、直ちに充填される）皮膚／組織代替物を得るために、異なる方法でしかし相補的な方法で架橋させた２種のＨＡ誘導体を混合することによって形成された、新しい充填剤および／または身体整形用の新しい製品としての新規なタイプの生体材料を完成させた。
【００１６】
本発明が関係する新規な生体材料は、それ自体はヒアルロン酸と同一の生体適合性という特定の特性を示すが、その生分解性が異なっている。ｉｎ  ｖｉｖｏで埋め込まれた場合には、その滞留時間は未変性ＨＡの場合よりもさらに長くなり、したがって、その当初の引き締まった状態を失った真皮／皮膚組織を直ちに再生／再建することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ウサギの皮内投与モデルにおけるＨＹＡＤＤ：ＨＢＣゲルの皮膚充填および耐容性を示す図である。
【図２】皮内ウサギ投与モデルにおけるＡＣＰ：ＨＢＣゲルの皮膚充填および耐容性を示す図である。発明の詳細な説明  本出願人は、皮膚の吹出物の治療、皮膚科、皮膚術美容、および／または美顔整形手術における注入用の新規な製品を得るために、異なっているが相補的な特徴を有する２種のＨＡ誘導体の混合を基に、新しい充填剤および／または身体整形用の新しい製品として新規なタイプの生体材料を完成させ：１．直ちに行われる真皮／皮膚の水和２．直ちに行われる治療済み組織の充填３．ｉｎ  ｖｉｖｏでの非常に長い破壊時間４．低減された副作用がもたらされる。
【００１８】
新規な生体材料は：
・自己架橋したヒアルロン酸（ＡＣＰ）またはＨＡヘキサデシルアミド（ＨＹＡＤＤ）と、
・ＢＤＤＥを用いて架橋されたヒアルロン酸（ＨＢＣ）と
を混合したものからなる。
【００１９】
EP0341745に記載されるように調製された、本発明で使用されるＡＣＰは、４から５％の間の平均架橋度を保有し、平均分子量（ＭＷ）が２００ＫＤａのＨＡを使用して好ましくは調製される。水和した場合、ＡＣＰは、同じ多糖鎖および／または隣接鎖のカルボキシル基とヒドロキシル基との間のエステル結合から生じるので、天然の多糖とは異質の分子を持たない自己架橋ゲルとして存在する。したがってＡＣＰは、免疫毒性を持っておらず、天然のＨＡと同様に生体適合性があり、非常に保湿性があり、ヒアルロニダーゼによって容易に分解可能であり、コラーゲン合成を刺激することができる低分子量の分子を放出し、その結果、皮膚組織の調子および弾性が改善される。
【００２０】
ＨＡヘキサデシルアミド（ＨＹＡＤＤ）は、EP1095064およびEP1853279に記載されるように、好ましくは平均分子量（ＭＷ）が５００〜７３０ＫＤａでありかつ平均最終アミド化／置換度がモル数で１から３％の間にあるＨＡを使用して、調製される。
【００２１】
ＡＣＰおよびＨＹＡＤＤは、本発明が関係する充填剤の皮内注入によって誘発される、直ちに行われる水和（即座に行われる真皮充填をもたらす。）に関与するＨＡ誘導体である。
【００２２】
ＢＤＤＥ（ＨＡの第１級ヒドロキシル上にエーテルを形成するためのエポキシ基を含有する分子）を用いて架橋されたＨＡは、架橋分子を含有し、したがって、多糖を安定化するエーテル結合を保有するので酵素分解に対してより耐性があり、長い滞留時間を得た生成物が得られる。
【００２３】
２種の架橋ＨＡの混合によって、天然のヒアルロン酸の場合と同一の生体適合性の特徴を有するが異なる生分解性を有する新規な生体材料が形成され、したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏで埋め込まれた場合、その滞留時間は未変性ＨＡの場合よりもはるかに長く、したがって、その当初の引き締まった状態を失った真皮組織の再生／再建が可能になる。本出願人は、全く予期せぬことに、その会合によってｉｎ  ｖｉｖｏでの破壊時間が、ＢＤＤＥを用いて架橋した同じタイプのＨＡにより形成された商用の参照用充填剤の場合よりもさらに長くなり、滞留時間が結果的に長くなることも実証した。最後に本出願人は、充填剤および／または皮膚の吹出物の治療、皮膚科、皮膚術美容、および／または美顔整形手術における身体整形用の新しい製品としての、新規な生体材料の使用について主張する。
【００２４】
新規な生体材料の化学的に不均質な性質により、最終生成物の性質は、構成成分間の重量比を適切に変化させることによって調節することが可能である。２種のＨＡは、１０：９０から９０：１０のＡＣＰ（またはＨＹＡＤＤ）：ＨＢＣ比で混合することができ、重量比は、治療される部位に左右される、所望の最終粘度に基づいて選択されよう。乳房、臀部、頬、顎、または深く現れたしわの充填の場合のように、大量の生体材料の埋込みを必要とする領域が治療される場合、使用される生体材料は、好ましくは、良好な引き締まった状態、したがって優れたコンシステンシーおよび低い生分解速度を有するゲルを得るのに適した粘度を示すことになり；この場合、ＨＢＣの重量の割合を増大させることによって得られた生成物は、より長持ちするボリューム増強効果を発揮するのにより適切であるので、ＡＣＰ（またはＨＹＡＤＤ）：ＨＢＣ混合物は、１０：９０から５０：５０の間になり、好ましくは２５：７５になろう。しかし、唇の溝または微細な額のしわを治療する場合、充填剤におけるより高い割合のＡＣＰによって、皮膚の生体再活性化、および微細な線や少量現れたしわなどの補正に対してより適切な材料が生成されるので、ＡＣＰ（またはＨＹＡＤＤ）：ＨＢＣ比は、好ましくは９０：１０から５０：５０の間になる。さらに、針は非常に高いゲージを有していなければならず；したがってゲルは、上述のものよりも容易に押出し可能でありかつ粘性が低くなければならない。生成物のレオロジー特性は、その結果、選択されたＡＣＰ：ＨＢＣ比に基づき調節可能である。
【００２５】
ＡＣＰ（またはＨＹＡＤＤ）／ＨＢＣ組成が等しい場合、生体材料の性質は、その中で調製するビヒクルの目標とする選択によって、適切に調節することもできる。例えば、ＡＣＰ：ＨＢＣが５０：５０の重量の混合物を生理食塩液（０．９％ＮａＣｌ）に分散させたものは、ｐＨ＝６．９５でリン酸緩衝液に分散させた場合よりも粘性が高くなり；その結果、この特定の混合物に関し、生理食塩液は、その場での分散速度が制限された生成物を処方するのに、より適切な媒体である。大部分がＨＢＣからなる材料は、反対のプロファイルを示す。材料の粘弾性は、その結果、生成物の性能に影響を及ぼす。
【００２６】
本発明は、上述の２つの生体材料調製プロセス：プロセスＡおよびプロセスＢにも関する。
【００２７】
新規なプロセスＡおよびＢは、２つのステップに分けられる：
１．ＨＢＣ誘導体を調製するためのプロセス、および
２．これをＡＣＰまたはＨＹＡＤＤ誘導体と混合するためのプロセス。
【００２８】
２つのステップは、非常に高い純度の生成物の生成をもたらす。ＢＤＤＥを用いて架橋されるＨＡの生成に通常使用される方法では、精製は、得られるゲルの固まりを洗浄することによってまたは透析によって行われる。これらの場合は共に、その膨潤する傾向に鑑み大量の溶媒を取り込むというゲル基質の性質により、最適な精製効率を実現することができない。これらのゲルは、低い移動度および輸送能力を有し、ゼラチン状ガムとして沈殿する。このように得られた、固体として単離された沈殿物は、再水和した場合に、精製前のゲルとは異なる溶解度およびレオロジー特性を有し、特に膨潤能力、弾性、および均質性（充填剤に不可欠な特徴）を有する。
【００２９】
しかし、プロセスＡとして本出願人が以下に述べる方法は、微細粉末の形であり、その結果容易に洗浄可能な生成物を沈殿させる。さらに、反応条件の慎重な選択によって、沈殿および洗浄による単離の後に、再水和および滅菌によるゲル再建能を有する生成物が生成し、これから再現性があり、十分標準化された、弾性および均質性の特性を有する生体材料が生じる。
【００３０】
プロセスＢは、ＨＢＣ生成物を粉末として沈殿させるステップを含まず；ゲル（ＨＢＣとＡＣＰまたはＨＹＡＤＤとの混合後に得られる。）の精製および均質化は、破砕ステップで行われ、このときゲルは、粒子状物質保持係数が２５から１５０μｍの間のフィルターを通過する。このステップは、最終的なゲルを精製し、ゲルを完全に均質にする。
【００３１】
上述の誘導体（ＨＢＣ、ＡＣＰ、およびＨＹＡＤＤ）を調製するために本発明で使用されるＨＡは、鶏冠からの抽出または発酵など、任意の供給源から得ることができ、４００から３×１０６Ｄａの間、好ましくは１×１０５Ｄａから１×１０６Ｄａの間、さらにより好ましくは２００，０００から１×１０６Ｄａの間の平均分子量を有する。
【００３２】
新規な製造プロセスＡは、下記のステップを含む：
架橋ＨＢＣの合成
１．ジエポキシドＢＤＤＥのアルカリ溶液（好ましくは０．１５Ｍ〜０．３５Ｍ  ＮａＯＨ）への溶解であって、ヒアルロン酸の反復単位の２．５から２５モル％の間、好ましくは５から１５モル％の間（生成物の意図される用途に依存する；ＢＤＤＥのパーセンテージが高くなるほど、滞留時間は長くなる。）の化学量論比での溶解の後、
２．室温での、先の段落で言及された溶液へのＨＡの分散。ＨＡ濃度は８０から３００ｍｇ／ｍｌの間でなければならず、均質化時間は３０から３００分の間でなければならない。
【００３３】
３．熱活性化による反応の誘発であり、前記溶液は、３５から５５℃の間の温度で、２から３６時間の間で加熱される。
【００３４】
４．金属の篩を通して得られた塊を押し出して、その粒子を、約６００μｍのサイズの粒子に縮小させる。
【００３５】
５．水で、４から４８時間の間にわたり４から２４℃の温度で３から２５倍に希釈することによるゲルの水和。
【００３６】
６．０．５から５モル／ｌ、好ましくは１から２モル／ｌの濃度を有するＨＣｌ水溶液による、中性へのｐＨの補正。
【００３７】
７．生成物が沈殿粉末の形で得られるまでの、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、ジオキサン、アセトニトリル、アセトン、および／またはこれらの混合物（好ましくはエタノールおよびアセトン）などの水溶性有機溶媒２．５体積の添加。
【００３８】
８．水の割合が３５％よりも低い、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、ジオキサン、アセトニトリル、アセトン、および／またはこれらの混合物（好ましくはエタノールおよびアセトン）などの有機溶媒による洗浄。
【００３９】
９．３０から４５℃の間の温度での、２から７日の間にわたる真空乾燥、いずれにしても残留溶媒が４００ｐｐｍにまで除去されて、白色ＨＢＣ粉末が得られるまでの真空乾燥。
ＡＣＰ（またはＨＹＡＤＤ）とＨＢＣとの混合
１０．１０：９０から９０：１０の間のＡＣＰ：ＨＢＣ比（前述のように、選択される用途に依存する。）での、ＨＢＣ粉末とＡＣＰ（またはＨＹＡＤＤ）粉末との混合。
【００４０】
１１．生理食塩液またはリン酸緩衝液、好ましくは生理食塩液（リドカインなどのその他の添加物を含有していてもよい。）による水和であって、０から２６℃の間の温度で１２から２７ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは２０から２５ｍｇ／ｍｌの間の全ＨＡ濃度をもたらす水和。
【００４１】
１２．５０から５００μｍの間、好ましくは１００から２５０μｍの間のメッシュを有する篩を通した押出し。前記濾過は、室温で、または２５から６５℃の間、好ましくは４０から６０℃の間の温度で行われる。
【００４２】
１３．得られた生成物の、好ましくはガラスまたはポリマー材料で作製された注射器への充填。
【００４３】
１４．１２０から１２４℃の間（好ましくは１２１．５±１℃）の温度での、少なくとも１０分間の、飽和水蒸気による熱滅菌。
【００４４】
新規な製造プロセスＢは、下記のステップを含む：
架橋ＨＢＣの合成
１．ジエポキシドＢＤＤＥのアルカリ溶液（好ましくは０．１５Ｍ〜０．３５Ｍ  ＮａＯＨ）への溶解であって、ヒアルロン酸の反復単位の２．５から２５モル％、好ましくは５から１５モル％の間（生成物の意図される用途に依存する）の化学量論比での溶解、その後下記のステップが続く。
【００４５】
２．室温での、先の段落で言及された溶液へのＨＡの分散。ＨＡ濃度は８０から３００ｍｇ／ｍｌの間でなければならず、均質化時間は３０から３００分の間でなければならない。
【００４６】
３．熱活性化による反応の誘発であり、前記溶液は、３５から５５℃の間の温度で、２から３６時間の間で加熱される。
【００４７】
４．０．０５から１モル／ｌ、好ましくは０．１モル／ｌの濃度を有するＨＣｌ水溶液による、中性へのｐＨの補正。
【００４８】
５．水で、４から４８時間の間にわたり４から２４℃の温度で３から２０倍に希釈することによるゲルの水和。この溶液は、好ましくは塩酸塩の形をとる、ＮａＣｌ、リン酸ナトリウムまたはカリウム塩、およびリドカインなどのその他の添加物を含有していてもよい。ナトリウム塩（塩化物またはリン酸塩）は、生成物の適切な浸透圧を維持しかつ組織に適合する値にｐＨを維持する機能を有する。本発明の好ましい実施形態において、ＮａＣｌは、最終溶液がＮａＣｌを濃度で０．８から１．０％、好ましくは０．９％含有するような量で添加され；塩酸リドカインは、存在する場合には、最終製剤が塩酸リドカインを２．２から３．２ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは２．７ｍｇ／ｍｌ含有するような量で添加する。
ＡＣＰ（またはＨＹＡＤＤ）とＨＢＣとの混合
６．前述のように新規な充填剤に合わせて選択された用途に応じた、１０：９０から９０：１０（活性成分の重量で）の間のＡＣＰ（またはＨＹＡＤＤ）：ＨＢＣ比での、ＨＢＣゲルとＡＣＰ（またはＨＹＡＤＤ）粉末との混合。あるいは、共にゲル形態の成分として出発するＡＣＰまたはＨＹＡＤＤとＨＢＣとを、適切な撹拌システム（好ましくは、オービタルブレード（ｏｒｂｉｔａｌ  ｂｌａｄｅ））を使用して、３０分から２４時間の時間、０から２６℃の間の温度で混合することができる。
【００４９】
７．２５から１５０μｍの間、好ましくは４０から１１０μｍの間の粒子状物質保持係数を有するフィルターに通すことによる破砕および均質化。粘度が過剰である場合、操作は、２５から６５℃の間の温度の高温で行うことができる。
【００５０】
８．得られた生成物の、ガラスまたはポリマー材料で作製された注射器への充填。
【００５１】
９．少なくとも１０分間の、１２０から１２４℃（好ましくは１２１．５±１℃）の温度での飽和水蒸気からの熱による滅菌。
【００５２】
本発明による新規な充填剤を調製するいくつかの例について、例としてかつ限定することなく以下に記述する。
例１：ＨＢＣ５００（ＨＡ  ５００〜７３０ｋＤａ）の合成
プロセスＡ
発酵により生成された、分子量が５００〜７３０ｋＤａのＨＡ  ０．０７５モルを、ＢＤＤＥ１．４１ｍｌを含有する０．２５Ｍ  ＮａＯＨ溶液２１５ｍｌ中に分散させる。次いで混合物を４２℃に加熱し、３時間反応させる。次いで混合物を、ｐＨを中性に調節するための化学量論量のＨＣｌを含有する溶液３００ｍｌで、２４時間水和させる。全体積を７５０ｍｌにし、エタノール２．５体積で沈殿させて、濾過可能な、デカンテーション可能な沈殿物を得る。混合物を、完全に精製されるまで７５％エタノールで洗浄し、３０μＳ／ｃｍよりも低くあるべきである洗浄溶媒の比導電率を測定することによって検証し、４０℃で５日間真空乾燥する。ＨＢＣ５００の生成物が、８７％の重量収率で得られる。
例２：ＨＢＣ１０００（ＨＡ  １ＭＤａ）の合成
プロセスＡ
発酵により生成された、平均分子量が１ＭＤａのＨＡ  １．６０ｇを、ＢＤＤＥ７５μｌを含有する０．２５Ｍ  ＮａＯＨ溶液２０ｍｌ中に分散させる。次いで混合物を４２℃に加熱し、２時間反応させる。次いで混合物を、ｐＨを中性に調節するための化学量論量のＨＣｌを含有する溶液２０ｍｌで、２４時間水和させる。全体積を７５ｍｌにし、エタノール２．５体積でＨＢＣを沈殿させて、濾過可能な、デカンテーション可能な沈殿物を得る。混合物を、完全に精製されるまで７５％エタノールで洗浄し、３０μＳ／ｃｍよりも低くあるべきである洗浄溶媒の比導電率を測定することによって検証し、４０℃で５日間真空乾燥する。生成物ＨＢＣ１０００が、９０％の重量収率で得られる。
例３：ＨＢＣ２００（ＨＡ  ２００ｋＤａ）の合成
プロセスＡ
発酵により生成された、平均分子量が２００ＫＤａのＨＡ  ２．５５ｇを、ＢＤＤＥ６３μｌを含有する０．２５Ｍ  ＮａＯＨ溶液２０ｍｌ中に分散させる。次いで混合物を４２℃に加熱し、１５０分間反応させる。次いで混合物を、化学量論量のＨＣｌを含有する溶液２０ｍｌで、２４時間水和させる。全体積を７５ｍｌにし、エタノール２．５体積で沈殿させて、濾過可能な、デカンテーション可能な沈殿物を得る。混合物を、完全に精製されるまで７５％エタノールで洗浄し、３０μＳ／ｃｍよりも低くあるべきである洗浄溶媒の比導電率を測定することによって検証し、４０℃で５日間真空乾燥する。生成物ＨＢＣ２００が、８５％の重量収率で得られる。
例４：ＡＣＰ：ＨＢＣ５００ゲルの、５０：５０の比での調製
プロセスＡ
例１で記述されるように調製されたＨＢＣ５００  １．００ｇを、ＨＡ  ＡＣＰ内部エステル１．００ｇと混合する。粉末を、０．９重量／体積％の滅菌生理食塩液１００ｍｌで、８℃の温度で１６時間水和する。得られたゲルを４８℃に加熱し、０．１７ｍｍのメッシュを有する金属篩に通して濾過し、次いで１ｍｌのガラス注射器の間に分布させ、これに引き続き、飽和水蒸気を用いて１２１℃で１０分間滅菌サイクルを行う。局所投与に適した均質な滅菌ゲルが得られる。
例５：ＡＣＰ：ＨＢＣ１０００ゲルの、３０：７０の比での調製
プロセスＡ
例２で記述されるように調製されたＨＢＣ１０００  １．４０ｇと、ＨＡ  ＡＣＰ内部エステル０．６０ｇとを混合する。粉末を、０．９％ｗ／ｖの滅菌生理食塩液１００ｍｌで、８℃の温度で１６時間水和する。得られたゲルを４８℃に加熱し、０．１７ｍｍのメッシュを有する金属篩に通して濾過し、次いで１ｍｌのガラス注射器の間に分布させ、これに引き続き、飽和水蒸気を用いて１２１℃の温度で１０分間滅菌サイクルを行う。局所投与に適した均質な滅菌ゲルが得られる。
例６：ＡＣＰ：ＨＢＣ５００ゲルの、２５：７５の比での調製
プロセスＡ
例１で記述されるように調製されたＨＢＣ５００  １．８７５ｇを、ＨＡ内部エステルＡＣＰ  ０．６２５ｇと混合する。粉末を、０．９％ｗ／ｖ滅菌生理食塩液１００ｍｌを用いて、８℃の温度で１６時間水和させる。得られたゲルを４８℃に加熱し、０．１９ｍｍのメッシュを有する金属篩に通して濾過し、次いで１ｍｌのガラス注射器の間に分布させ、これに引き続き、飽和水蒸気を用いて１２１℃の温度で１２分間滅菌サイクルを行う。局所投与に適した均質な滅菌ゲルが得られる。
例７：ＡＣＰ：ＨＢＣ１０００ゲルの、７５：２５の比での調製
プロセスＡ
例２で記述されるように調製されたＨＢＣ１０００  ０．５０ｇを、ＨＡ内部エステルＡＣＰ  １．５０ｇと混合する。粉末を、０．９％ｗ／ｖ滅菌生理食塩液１００ｍｌを用いて、８℃の温度で２４時間水和させる。得られたゲルを４２℃に加熱し、０．１７ｍｍのメッシュを有する金属篩に通して濾過し、次いで２ｍｌのガラス注射器の間に分布させ、これに引き続き、飽和水蒸気を用いて１２１℃の温度で１２分間滅菌サイクルを行う。局所投与に適した均質な滅菌ゲルが得られる。
例８：ＨＹＡＤＤ：ＨＢＣ５００ゲルの、６０：４０の比での調製
プロセスＡ
例１で記述されるように調製されたＨＢＣ５００  １．２０ｇを、ＨＡヘキサデシルアミド（ＨＹＡＤＤ）０．８０ｇと混合する。粉末を、０．９％ｗ／ｖ滅菌生理食塩液１００ｍｌを用いて、８℃の温度で２４時間水和させる。得られたゲルを５２℃に加熱し、０．１７ｍｍのメッシュを有する金属篩に通して濾過し、次いで１ｍｌのガラス注射器の間に分布させ、これに引き続き、飽和水蒸気を用いて１２１℃の温度で１１分間滅菌サイクルを行う。局所投与に適した均質な滅菌ゲルが得られる。
例９：ＨＹＡＤＤ：ＨＢＣ５００ゲルの、４０：６０の比での調製
プロセスＡ
発酵により生成された、平均分子量が５００〜７３０ｋＤａのＨＡナトリウム塩８．０ｇを、ＢＤＤＥ０．４４ｍｌを含有する０．２５Ｍ  ＮａＯＨ溶液４０ｍｌ中に分散させる。混合物を４１．５℃で２時間４０分加熱する。次いで０．１Ｍ  ＨＣｌ溶液１００ｍｌおよび水２００ｍｌで一晩水和させる。飽和ＮａＣｌ溶液５０ｍｌを添加し、混合物を一晩放置して膨潤させる。翌日、アセトン１７０ｍｌおよび飽和ＮａＣｌ溶液３０ｍｌを添加し、混合物を、エタノール１リットルをゆっくり添加することによって沈殿させる。沈殿物を、ＮａＣｌ残留物が除去されるまで、同じ溶媒で洗浄し、次いで残留溶媒が除去されるまで、真空下３５℃の乾燥機で乾燥する。このように得られたＨＢＣ粉末を、特許EP1853279に記載されるように調製されたＨＹＡＤＤとの比５：３で混合する。混合粉末を、生理食塩液で水和させ、全濃度を２０ｍｇ／ｍｌ（ＨＢＣ  １２．５ｍｇ／ｍｌおよびＨＹＡＤＤ４  ７．５ｍｇ／ｍｌに相等）にする。生成物を５℃で一晩膨潤させたままにし、翌日、粒子状物質公称保持レートが１００μｍである平膜に通して濾過する。１ｍｌのガラス注射器に、このように得られた生成物を充填し、１２１．５℃でＦ０＝１３のサイクルで滅菌する。
例１０：ウサギの皮内投与モデルにおけるＨＹＡＤＤ：ＨＢＣゲルの皮膚充填および耐容性
実験の目的は、皮膚充填、任意の巨視的有害事象の発生、およびウサギの皮内組織に注入されたＨＹＡＤＤ：ＨＢＣゲル（例９で記述されるように調製された。）によって誘発された組織応答を、商用の充填剤ＢＥＬＯＴＥＲＯ（登録商標）と比較することによって、評価することであった。
【００５３】
前記評価では、試験をしたゲルを、体重１．８〜２．３ｋｇのオスＮＺＷ−ＫＢＬウサギに皮内投与した。
実験計画：
動物に、ケタミンおよびキシラジンの静脈内投与によって麻酔をかけた。３匹の動物を、試験がなされた各充填剤に使用した
０日：Ｔ０
−  ウサギの背中を剃毛した後に、サンプル（１サンプル当たりヒドロゲル１ｍｌ）を注入；
−  全てのウサギに関する膨潤の測定、および有害事象に関する巨視的観察。
７日目：Ｔ７
−  膨潤体積の測定、および有害事象に関する巨視的観察。
【００５４】
膨潤体積を、下式により計算した：
（２／３×π）×（ｒ１）×（ｒ２）×（ｒ３）
（式中：（ｒ１）、（ｒ２）、および（ｒ３）は、それぞれ、カリパスで測定された膨潤の幅、長さ、および高さを表す。）。
結果：
新規な充填剤は、治療した真皮にいかなる炎症事象も引き起こさなかった。
【００５５】
滞留時間に関して得られた結果を図１に示す：第１週の治療で評価された膨潤の量（ｍｍ３で表す。）から、本発明によるゲルが、対照より大きく、７日後でも高く維持される皮膚膨潤体積を、比較基準（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）として使用される商用充填剤を、やはりはるかに超える程度まで誘発できることが示された。この知見は、新規な充填剤が有意な真皮水和を直ちに生成することを明らかに裏付けており、この作用は、その化学的／レオロジー特性が原因となって経時的に安定なままの直ちに行われる皮膚充填を促進させるのに不可欠であることが証明された、ＨＹＡＤＤ誘導体の存在に起因するものである。
例１１：ＨＢＣ５００（ＨＡ  ５００〜７３０ｋＤａ）の合成
プロセスＢ
発酵により生成された、分子量が５００から７３０ｋＤａのＨＡナトリウム塩１８．７５ｇを、ＢＤＤＥ８８５μｌを含有するＮａＯＨ  ０．２５Ｍ溶液１３３ｍｌ中に分散させる。次いで混合物を、４５℃で２．５時間加熱する。混合物を、化学量論量のＨＣｌ、ＮａＣｌ２．６５ｇ、および塩酸リドカイン２．７ｇを含有する溶液０．６２ｌを用い、ゆっくり撹拌しながら一晩水和させる。
例１２：ＡＣＰ：ＨＢＣ５００ゲルの、２５：７５の比での調製
プロセスＢ
ヒアルロン酸ＡＣＰ２００の内部エステル６．２５ｇを、ＮａＣｌ４．４ｇを含有する溶液２５０ｍｌに、ゆっくり撹拌しながら可溶化する。水和が終了したら、このゲルと例１１により得られたゲルとを、半固形分を混合するためのシステムを備えたミキサー内で、均質になるまで一緒に合わせる。得られたゲルを、粒子状物質公称保持レート７０μｍの平膜フィルターに通して押し出す。このように得られた生成物をガラス注射器内に導入し、１２１．５℃で、Ｆ０＝１３のサイクルで滅菌する。
例１３：ＨＹＡＤＤ：ＨＢＣ５００ゲルの、２５：７５の比での調製
プロセスＢ
ＨＹＡＤＤヘキサデシルアミド６．２５ｇを、ゆっくり撹拌しながらＮａＣｌ４．４ｇを含有する溶液２５０ｍｌ中に可溶化する。水和が終了したら、ゲルを、オービタル混合システムを備えたミキサーで、例１１により得られたゲルと、均質になるまで混合する。得られたゲルを、粒子状物質公称保持レート７０μｍの平膜フィルターに通して押し出す。このように得られた生成物をガラス注射器内に導入し、１２１．５℃で、Ｆ０＝１３のサイクルで滅菌する。
例１４：ＨＢＣ５００（ＨＡ  ５００〜７３０ｋＤａ）の合成
プロセスＢ
発酵により生成された、分子量５００〜７３０ｋＤａのＨＡナトリウム塩１２５ｇを、ＢＤＤＥ９．４ｍｌを含有する０．２５Ｍ  ＮａＯＨ溶液１．３３リットルに分散させる。混合物を、４５℃で２．５時間加熱する。混合物を、化学量論量のＨＣｌ、ＮａＣｌ２６．５ｇ、および塩酸リドカイン２７ｇを含有する溶液６．２リットルで、ゆっくり撹拌しながら一晩水和させる。
例１５：ＡＣＰ：ＨＢＣ５００ゲルの、５０：５０の比での調製
プロセスＢ
ヒアルロン酸ＡＣＰ２００の内部エステル１２５ｇを、ゆっくり撹拌しながら、ＮａＣｌ４４ｇを含有する溶液２．５ｌ中に可溶化する。水和が終了したら、ゲルを、バッフルおよびスクレーパーを有するオービタル混合システムを備えたミキサーで、例１４により得られたゲルと混合する。得られたゲルを、粒子状物質公称保持レート４５μｍの平膜フィルターに通して押し出す。このように得られた生成物をガラス注射器内に導入し、１２１．５℃で、Ｆ０＝１３のサイクルで滅菌する。
例１６：皮内ウサギ投与モデルにおけるＡＣＰ：ＨＢＣゲルの皮膚充填および耐容性
実験は、例１１から１２に記述されるように調製されたゲルを使用して、Ｂｅｌｏｔｅｒｏ（登録商標）対照および第２の市販の充填剤、Ｒｅｇｅｎｙａｌ  Ｉｄｅａと比較することにより、例１０に記述されるように行った。
【００５６】
この実験では、本出願人は、治療によって引き起こされた皮膚膨潤ボリュームを決定するだけではなく、本発明によるゲル／充填剤の全滞留時間についても、共にＢＤＤＥに架橋したＨＡからなる最終的な比較基準である２つの周知の商用充填剤と比較することによって評価した。
【００５７】
治療したウサギの皮膚膨潤を、最長９６日間にわたり隔週で（有害事象に関する巨視的観察）測定した。
結果：
図２は、得られた結果を示す：上述の知見、すなわち、対照を驚くほど超える程度までの治療済み真皮の即時的水和が確認された（主に最初の７日間以内で）；さらに、２種の商用比較基準の場合よりも、皮膚膨潤のサイズはより明らかであり、かつ滞留時間は長くなった。実験の終わりに、本発明による新規な充填剤は依然として存在し、それに対して２種の対照はほぼ消失していた。
【００５８】
本明細書に記述される方法は、明らかに、様々な手法により修正することができる。そのような修正は、本発明の精神および今後の見通しから逸脱すると見なすべきではなく、当業者に明らかにされると考えられる全ての修正は、下記の特許請求の範囲に含まれる。
【図１】
0005976537.tif 000002
【図２】
0005976537.tif 000003