(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
GLP-1類似体の誘導体であって、
類似体は、GLP-1(7-37)(配列番号1)の27位に対応する位置において第1のK残基;GLP-1(7-37)の36位に対応する位置において第2のK残基;ならびにGLP-1(7-37)と比較して最大で9個のアミノ酸の変化を含み、第1のK残基は、K27と示され、第2のK残基は、K36と示され、
前記類似体が、式I:
式I:Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Arg-Lys-Phe-Ile-Glu-Xaa31-Leu-Val-Xaa34-Gly-Lys-Xaa37-Xaa38-Xaa39
のGLP-1類似体を含み、式中、
Xaa7は、L-ヒスチジンであり、
Xaa8は、AlaまたはAibであり、
Xaa12は、Pheであり、
Xaa16は、Valであり、
Xaa18は、Serであり、
Xaa19は、Tyrであり、
Xaa20は、Leuであり、
Xaa22は、GlyまたはGluであり、
Xaa23は、Glnであり、
Xaa24は、Alaであり、
Xaa25は、AlaまたはValであり、
Xaa31は、Trpであり、
Xaa34は、GlnまたはArgであり、
Xaa37は、Glyであり、
Xaa38は、Glu、Gln、または存在せず、
Xaa39は、Glyまたは存在せず、
誘導体は、リンカーを介して、それぞれ、K27およびK36に結合している2つの延長部分を含み、
延長部分は、Chem.2およびChem.1:
Chem.2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
Chem.1:HOOC-(CH2)x-CO-*
(式中、xは、6〜16の範囲の整数であり、yは、3〜17の範囲の整数である)から選択され、
リンカーは、Chem.5:
Chem.5:
【化１】
0006022538.tif 000071
(式中、kは、1〜5の範囲の整数であり、nは、1〜5の範囲の整数である)を含む、誘導体;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
【請求項２】
Chem.5が、m回含まれ、mが、1〜10の範囲の整数である、請求項1に記載の誘導体。
【請求項３】
kが、1である、請求項1または2に記載の誘導体。
【請求項４】
nが、1である、請求項1から3のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項５】
前記リンカーが、Chem.6、および/またはChem.7:
Chem.6
【化２】
0006022538.tif 000072
および／または
Chem.7
【化３】
0006022538.tif 000073
から選択されるGluジラジカルをさらに含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項６】
Gluジラジカルがp回含まれ、pが1〜2の範囲の整数である、請求項5に記載の誘導体。
【請求項７】
前記リンカーが、第1または第2のK残基のε-アミノ基に結合している、請求項1から6のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項８】
xが12であるか、Chem.2が、Chem.2b
【化４】
0006022538.tif 000074
である、請求項1から7のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項９】
xが12であるか、またはyが9〜11の範囲の整数である、請求項1から8のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項１０】
前記GLP-1類似体が、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、下記のアミノ酸の変化: (ii)22E、26R、27K、30E、34R、36K、38E、39G;(vi)26R、27K、30E、34R、36K、38E;(xii)25V、26R、27K、30E、34R、36K、38Q;(xiii)25V、26R、27K、30E、34Q、36K、38Eまたは(xxvii)8Aib、22E、26R、27K、30E、34R、36K、38E、39Gのいずれかで定義される一組のアミノ酸の変化を有する、請求項1から9のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項１１】
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル-Glu-Gly
Chem.51:
【化５】
0006022538.tif 000075
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル-Glu
Chem.55:
【化６】
0006022538.tif 000076
Nα(Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Val25,Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル)-Gln
Chem.61:
【化７】
0006022538.tif 000077
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Val25,Arg26,Lys27,Glu30,Gln34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル-Glu
Chem.62:
【化８】
0006022538.tif 000078
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル-Glu-Gly
Chem.80:
【化９】
0006022538.tif 000079
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル-Glu-Gly
Chem.81:
【化１０】
0006022538.tif 000080
から選択される、請求項1から10のいずれか一項に記載の誘導体、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
【請求項１２】
GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、下記のアミノ酸の変化: (ii)22E、26R、27K、30E、34R、36K、38E、39G;(vi)26R、27K、30E、34R、36K、38E;(xii)25V、26R、27K、30E、34R、36K、38Q;(xiii)25V、26R、27K、30E、34Q、36K、38Eまたは(xxvii)8Aib、22E、26R、27K、30E、34R、36K、38E、39Gのいずれかで定義される一組のアミノ酸の変化を有する、GLP-1類似体;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、参照により本明細書中にその全体が組み込まれている、米国特許法施行規則第1.53条(c)の下で2011年4月13日に出願された米国特許仮出願第61/474,913号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、グルカゴン様ペプチド1(GLP-1)の類似体の誘導体、より特に、ペプチドのK27および別のK残基においてアシル化された、二重アシル化されたGLP-1誘導体、ならびにこれらの薬学的用途に関する。
【０００３】
配列表の参照による組込み
「配列表」という表題の配列表は、568バイトであり、2012年4月11日に作成され、参照により本明細書中に組み込まれている。
【背景技術】
【０００４】
Journal of Medicinal Chemistry(2000)、第43巻、第9号、1664〜1669頁は、二重アシル化されたものも含むGLP-1(7-37)の誘導体を開示している。
【０００５】
WO98/08871A1は、二重アシル化されたものも含むいくつかのGLP-1誘導体を開示している。2009年よりNovo Nordisk A/Sによって市販されている1日1回投与用のモノアシル化されたGLP-1誘導体であるリラグルチドもまた、WO98/08871A1(実施例37)に開示されている。
【０００６】
WO99/43706A1は、いくつかのK27、26およびK27、34誘導体を含めたいくつかのモノアシル化および二重アシル化されたGLP-1誘導体を開示している。
【０００７】
WO06/097537A2は、Novo Nordisk A/Sによって開発されている週1回投与のためのモノアシル化されたGLP-1誘導体であるセマグルチド(実施例4)を含めたいくつかのGLP-1誘導体を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO99/43706A1
【特許文献２】WO98/08871A1
【特許文献３】WO06/097537A2
【特許文献４】WO09/030738
【特許文献５】WO2008/145728
【特許文献６】WO2009/083549A1
【特許文献７】EP511600
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Journal of Medicinal Chemistry(2000)、第43巻、第9号、1664〜1669頁
【非特許文献２】Angewandte Chemie International Edition、2008年、第47巻、3196〜3201頁
【非特許文献３】Needleman, S.B.およびWunsch, C.D.、(1970年)、Journal of Molecular Biology、48:443〜453頁
【非特許文献４】MyersおよびW. Miller、「Optimal Alignments in Linear Space」、CABIOS(computer applications in the biosciences)(1988年)4:11〜17頁
【非特許文献５】Chemoinformatics:A textbook、Johann GasteigerおよびThomas Engel(編)、Wiley-VCH Verlag、2003年
【非特許文献６】J. Chem. Inf. Model.、2008年、48、542〜549頁
【非特許文献７】J. Chem. Inf. Comput. Sci.、2004年、44、170〜178頁
【非特許文献８】J. Med. Chem.、2004年、47、2743〜2749頁
【非特許文献９】J. Chem. Inf. Model.、2010年、50、742〜754頁
【非特許文献１０】SciTegic Pipeline Pilot Chemistry Collection:Basic Chemistry User Guide、2008年3月
【非特許文献１１】SciTegic Pipeline Pilot Data Modeling Collection、2008年
【非特許文献１２】http://www.tripos.com/tripos_resources/fileroot/pdfs/Unity_ 111408.pdf
【非特許文献１３】http://www.tripos.com/data/SYBYL/SYBYL_072505.pdf
【非特許文献１４】GreeneおよびWuts、「Protective Groups in Organic Synthesis」、John Wiley & Sons、1999年
【非特許文献１５】Florencio Zaragoza Dorwald、「Organic Synthesis on solid Phase」、Wiley-VCH Verlag GmbH、2000年
【非特許文献１６】「Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis」、編W.C. ChanおよびP.D. White、Oxford University Press、2000年
【非特許文献１７】Hodgsonら:「The synthesis of peptides and proteins containing non-natural amino acids」、Chemical Society Reviews、第33巻、第7番(2004年)、422〜430頁
【非特許文献１８】Remington:The Science and Practice of Pharmacy、例えば、第19版(1995年)、および任意のより最近の版
【非特許文献１９】W.R. Sampson(1999年)、J. Pep. Sci.、5、403
【非特許文献２０】PoulsenおよびJensen、Journal of Biomolecular Screening、2007年、第12巻、240〜247頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
Angewandte Chemie International Edition、2008年、第47巻、3196〜3201頁は、マウス血清アルブミン(MSA)およびヒト血清アルブミン(HSA)の両方との安定的な非共有結合相互作用を示すと称されている4-(p-ヨードフェニル)酪酸誘導体の1クラスの発見および特徴付けについて報告している。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、GLP-1ペプチドの誘導体に関する。
【００１２】
誘導体は、27位における天然グルタミン酸を置換しているリシンにおいて、および別のリシン残基においてアシル化されている。側鎖は、アルブミン結合部分である。側鎖は、好ましくは、全て任意選択で置換されている遠位のフェノキシ基を有する、脂肪二酸、および脂肪酸から選択される延長部分を含む。脂肪酸または脂肪二酸のカルボキシ基は、任意選択でリンカーを介して、好ましくは、そのε-アミノ基において、GLP-1ペプチドのリシン残基にアシル化されている。
【００１３】
GLP-1ペプチドは、GLP-1(7-37)と比較して全部で10個までのアミノ酸の差異(例えば、1つもしくは複数の付加、1つもしくは複数の欠失、および/または1つもしくは複数の置換)を有するGLP-1(7-37)(配列番号1)の類似体であり得る。
【００１４】
さらに特に、本発明は、GLP-1類似体の誘導体、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルに関し、類似体は、GLP-1(7-37)(配列番号1)の27位に対応する位置において第1のK残基;GLP-1(7-37)のT位(Tは、18および27以外の7〜37の範囲の整数である)に対応する位置において第2のK残基;ならびにGLP-1(7-37)と比較して最大で10個のアミノ酸の変化を含み、第1のK残基は、K27と示され、第2のK残基は、KTと示され、誘導体は、リンカーを介して、それぞれ、K27およびKTに結合している2つのアルブミン結合部分を含み、各アルブミン結合部分は、HOOC-(CH2)x-CO-*およびHOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*(式中、xは、6〜16の範囲の整数であり、yは、3〜17の範囲の整数である)から選択される延長部分を含み、リンカーは、式Chem.5:
【００１５】
【化１】
0006022538.tif 000002
【００１６】
(式中、kは、1〜5の範囲の整数であり、nは、1〜5の範囲の整数である)のリンカー要素を含む。
【００１７】
本発明はまた、医薬として使用するため、特に、全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群の治療および/もしくは予防において使用するため、ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための、このような誘導体に関する。
【００１８】
本発明はさらに、本発明の特定の誘導体の調製に関連する新規なGLP-1類似体の形態の中間生成物に関する。
【００１９】
本発明の誘導体は、生物活性がある。また、または代わりに、本発明の誘導体は、延長性の薬物動態プロファイルを有する。また、または代わりに、これらは、胃腸の酵素による分解に対して安定である。また、または代わりに、これらは、高い経口バイオアベイラビリティーを有する。これらの特性は、皮下、静脈内、および/または特に、経口投与のための次世代のGLP-1化合物の開発において重要である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下において、ギリシャ文字は、それらの記号または対応する記載された名称によって表してもよい(例えば、α=アルファ;β=ベータ;ε=イプシロン;γ=ガンマ;ω=オメガなど)。また、ギリシャ文字のμは、「u」で表してもよい(例えば、μl=ul、またはμM=uM)。
【００２１】
化学式におけるアスタリスク(*)は、i)結合点、ii)ラジカル、および/またはiii)非共有電子を示す。
【００２２】
第1の態様において、本発明はGLP-1類似体の誘導体、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルに関し、類似体は、GLP-1(7-37)(配列番号1)の27位に対応する位置において第1のK残基;GLP-1(7-37)のT位(Tは、18および27以外の7〜37の範囲の整数である)に対応する位置において第2のK残基;ならびにGLP-1(7-37)と比較して最大で10個のアミノ酸の変化を含み、第1のK残基は、K27と示され、第2のK残基は、KTと示され、誘導体は、リンカーを介して、それぞれ、K27およびKTに結合している2つのアルブミン結合部分を含み、アルブミン結合部分は、Chem.1およびChem.2:
Chem.1:HOOC-(CH2)x-CO-*
Chem.2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
(式中、xは、6〜16の範囲の整数であり、yは、3〜17の範囲の整数である)から選択される延長部分を含み、リンカーは、Chem.5:
Chem.5:
【００２３】
【化２】
0006022538.tif 000003
【００２４】
(式中、kは、1〜5の範囲の整数であり、nは、1〜5の範囲の整数である)を含む。
【００２５】
GLP-1類似体
「GLP-1類似体」または「GLP-1の類似体」という用語は、本明細書において使用する場合、ヒトグルカゴン様ペプチド-1(GLP-1(7-37))のバリアントであるペプチド、または化合物を意味し、この配列は、配列表において配列番号1として含まれている。配列番号1の配列を有するペプチドはまた、「天然」GLP-1と示し得る。
【００２６】
配列表において、配列番号1の第1のアミノ酸残基(ヒスチジン)を、第1番と割り当てる。しかし以下において、当技術分野の慣習によると、このヒスチジン残基は、第7番と称され、それに続くアミノ酸残基は、それに応じて付番され、グリシン第37番で終わる。したがって一般に、本明細書においてアミノ酸残基番号またはGLP-1(7-37)配列の位置番号について任意に参照することは、7位におけるHisで開始し、37位におけるGlyで終了する配列について参照することである。
【００２７】
本発明の誘導体のGLP-1類似体は、i)変化しているアミノ酸残基に対応する天然GLP-1(7-37)におけるアミノ酸残基の数(すなわち、天然GLP-1における対応する位置)について、およびii)実際の変化について参照することにより記載し得る。下記は、適切な類似体の命名の非限定的な例である。
【００２８】
本発明の誘導体のGLP-1類似体の非限定的な例は、GLP-1(7-37)の27位に対応する位置において第1のリシン残基、および12位において第2のリシン残基を含むように変化した類似体である。この類似体のアミノ酸配列は、天然GLP-1のアミノ酸配列とその他の点で同一であり、この類似体は、K12,K27-GLP-1(7-37)と示し得る。この命名は、12位におけるフェニルアラニンがリシンで置換されており、27位におけるグルタミン酸がリシンで置換されている天然GLP-1のアミノ酸配列を表す。
【００２９】
本発明の誘導体の部分を形成するGLP-1類似体は、天然GLP-1(配列番号1)と比較したときに、最大で10個のアミノ酸の変化を含む。すなわち、これは、いくつかのアミノ酸残基が、天然GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較したときに変化している、GLP-1(7-37)ペプチドである。これらの変化は、独立に、1つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失を表し得る。
【００３０】
下記は、適正な類似体命名法の非限定的な例である。
【００３１】
例えば、類似体[Aib8、Lys22、Val25、Arg26、Lys27、His31、Arg34]-GLP-1-(7-37)は、GLP-1(7-37)ペプチドを示し、これは、天然GLP-1と比較したとき、下記の置換を有する。Aib(α-アミノイソ酪酸)による8位におけるアラニンの置換、リシンによる22位におけるグリシンの置換、バリンによる25位におけるアラニンの置換、アルギニンによる26位におけるリシンの置換、リシンによる27位におけるグルタミン酸の置換、ヒスチジンによる31位におけるトリプトファンの置換、およびアルギニンによる34位におけるリシンの置換。この類似体はまた、(8Aib、22K、25V、26R、27K、31H、34R)と簡潔に示し得る。
【００３２】
別の例として、類似体[Aib8、Lys20、Glu22、Arg26、Lys27、Glu30、Gly34]-GLP-1-(7-34)は、GLP-1(7-37)ペプチドを示し、これは、天然GLP-1と比較したときに、Aibによる8位におけるアラニンの置換、リシンによる20位におけるロイシンの置換、グルタミン酸による22位におけるグリシンの置換、アルギニンによる26位におけるリシンの置換、リシンによる27位におけるグルタミン酸の置換、グルタミン酸による30位におけるアラニンの置換、グリシンによる34位におけるリシンの置換、および35-36-37位におけるグリシン-アルギニン-グリシンのC末端の欠失によって変化している。この類似体はまた、GLP-1(7-37)への言及が暗示される場合、(8Aib、20K、22E、26R、27K、30E、34G、des35-37)と短く示してもよく、「des」は、欠失を表す。
【００３３】
またさらなる例として、Glu38およびGly39を含む類似体は、天然GLP-1と比較したときに、GLP-1(7-37)のC末端への(グルタミン酸-グリシン)のジペプチドの付加を含む、GLP-1(7-37)ペプチドを意味する。この類似体はまた、GLP-1(7-37)への言及が暗示される場合、(38E、39G)を含むと簡潔に言ってもよい。
【００３４】
特定の指定された変化を「含む」類似体は、配列番号1と比較したときに、さらなる変化を含み得る。(38E、39G)を含む類似体の非限定的な一例は、Chem.51のペプチド部分である。
【００３５】
上記の例から明らかなように、アミノ酸残基は、これらの完全な名称、これらの1文字コード、および/またはこれらの3文字コードによって同定し得る。これらの3つの方法は、完全に同等である。
【００３６】
「と等しい位置」または「対応する位置」という表現を使用して、天然GLP-1(7-37)(配列番号1)を参照することにより、バリアントGLP-1(7-37)配列における変化の部位を特徴付けることができる。同等または対応する位置ならびに変化の数は、例えば、単純な筆記および目視によって容易に推定され、かつ/またはNeedleman-Wunschアラインメントである「アラインメント」などの、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムを使用し得る。アルゴリズムは、Needleman, S.B.およびWunsch, C.D.、(1970年)、Journal of Molecular Biology、48:443〜453頁、およびMyersおよびW. Miller、「Optimal Alignments in Linear Space」、CABIOS(computer applications in the biosciences)(1988年)4:11〜17頁によるアラインプログラムに記載されている。アラインメントのために、デフォルトスコアリングマトリックスBLOSUM50およびデフォルト同一性マトリックスを使用してもよく、ギャップにおける第1の残基についてのペナルティは、-12、または好ましくは-10で設定してもよく、ギャップにおけるさらなる残基についてのペナルティは、-2、または好ましくは-0.5で設定してもよい。
【００３７】
このようなアラインメントの一例は、本明細書において下記で挿入されており、ここで、配列第1番(SEQ_ID_NO_1)は、配列番号1であり、配列第2番(ANALOGUE)は、その類似体(22K、26R、27K、30E、34G、des35-37)である。
# Aligned_sequences: 2
# 1: SEQ_ID_NO_1
# 2: ANALOGUE
# マトリックス:EBLOSUM62
# ギャップ_ペナルティ:10.0
# 伸長_ペナルティ:0.5
#
# 長さ:31
# 同一性:23/31(74.2%)
# 類似性:25/31(80.6%)
# ギャップ:3/31(9.7%)
# スコア:117.0
【数１】
0006022538.tif 000004
【００３８】
非天然アミノ酸、例えば、Aibが配列に含まれている場合、これらは、アラインメントの目的のために、Xで置き換えてもよい。必要に応じて、Xは、後で手作業によって補正することができる。
【００３９】
「ペプチド」という用語は、例えば、本発明の誘導体のGLP-1類似体の状況において使用されるように、アミド(または、ペプチド)結合によって相互結合している一連のアミノ酸を含む化合物を意味する。
【００４０】
本発明のペプチドは、ペプチド結合によって結合している少なくとも5個の構成アミノ酸を含む。特定の実施形態において、ペプチドは、少なくとも10個の、好ましくは、少なくとも15個の、より好ましくは、少なくとも20個の、さらにより好ましくは、少なくとも25個の、または最も好ましくは、少なくとも28個のアミノ酸を含む。
【００４１】
特定の実施形態では、ペプチドは、少なくとも5個の構成アミノ酸から構成され、好ましくは、少なくとも10個の、少なくとも15個の、少なくとも20個の、少なくとも25個のアミノ酸から構成され、または最も好ましくは、少なくとも28個のアミノ酸から構成される。
【００４２】
さらなる特定の実施形態において、ペプチドは、i)28個の、ii)29個の、iii)30個の、iv)31個の、v)32個の、またはvi)33個のアミノ酸からa)構成される、またはb)からなる。
【００４３】
またさらなる特定の実施形態において、ペプチドは、ペプチド結合によって相互結合しているアミノ酸からなる。
【００４４】
アミノ酸は、アミン基およびカルボン酸基、ならびに任意選択で、側鎖と称されることが多い1種または複数のさらなる基を含有する分子である。
【００４５】
「アミノ酸」という用語には、タンパク新生アミノ酸(遺伝コードによってコードされる、天然アミノ酸、および標準的アミノ酸を含める)、ならびに非タンパク新生アミノ酸(タンパク質において見出されない、および/または標準的遺伝コードにおいてコードされていない)、ならびに合成アミノ酸が含まれる。したがって、アミノ酸は、タンパク新生アミノ酸、非タンパク新生アミノ酸、および/または合成アミノ酸の群から選択し得る。
【００４６】
遺伝コードによってコードされないアミノ酸の非限定的な例は、γ-カルボキシグルタメート、オルニチン、およびホスホセリンである。合成アミノ酸の非限定的な例は、アミノ酸のD-異性体、例えば、D-アラニンおよびD-ロイシン、Aib(α-アミノイソ酪酸)、β-アラニン、およびデス-アミノ-ヒスチジン(desH、代替名、イミダゾプロピオン酸、略名、Imp)である。
【００４７】
以下において、光学異性体が述べられていない全てのアミノ酸は、L-異性体を意味すると理解される(他に特定しない限り)。
【００４８】
本発明のGLP-1誘導体および類似体は、GLP-1活性を有する。この用語は、GLP-1受容体に結合し、シグナル伝達経路を開始させて、当技術分野において公知のようなインスリン分泌性作用または他の生理学的作用をもたらす能力を意味する。例えば、本発明の類似体および誘導体は、本明細書において実施例33に記載されているアッセイを使用して、GLP-1活性について試験することができる。本明細書において実施例34に記載されているGLP-1受容体結合アッセイはまた、GLP-1活性を決定するために使用し得る(低HSA実験)。
【００４９】
GLP-1誘導体
「誘導体」という用語は、GLP-1ペプチドまたは類似体との関連で本明細書において使用する場合、化学修飾されたGLP-1ペプチドまたは類似体を意味し、ここで、1個または複数の置換基は、ペプチドに共有結合で結合している。置換基はまた、側鎖と称してもよい。
【００５０】
特定の実施形態において、側鎖は、アルブミンと共に非共有結合性凝集物を形成することができ、それによって血流による誘導体の循環を促進し、また、GLP-1-誘導体およびアルブミンの凝集物はゆっくりとのみ崩壊して、活性医薬成分を放出するという事実によって、誘導体の作用時間を延長させる作用を有する。したがって、置換基、または側鎖は、全体として、アルブミン結合部分と称することが好ましい。
【００５１】
別の特定の実施形態において、アルブミン結合部分は、特に、アルブミン結合、それによって延長に関連した一部分を含み、この一部分は、延長部分と称してもよい。延長部分は、ペプチドへのその結合点に対して、アルブミン結合部分の反対の末端に、または反対の末端の付近にあってよい。
【００５２】
またさらなる特定の実施形態において、アルブミン結合部分は、延長部分とペプチドへの結合点との間の一部分を含み、この一部分は、リンカー、リンカー部分、スペーサーなどと称してもよい。リンカーは任意選択でよく、したがってその場合には、アルブミン結合部分は、延長部分と同一でよい。
【００５３】
特定の実施形態では、アルブミン結合部分および/または延長部分は、生理学的pH(7.4)で、親油性であり、かつ/または負に帯電している。
【００５４】
アルブミン結合部分、延長部分、またはリンカーは、アシル化によってGLP-1ペプチドのリシン残基に共有結合で結合し得る。
【００５５】
好ましい実施形態において、好ましくは、延長部分およびリンカーを含む、アルブミン結合部分の活性エステルは、アミド結合の形成下で、リシン残基のアミノ基、好ましくは、そのεアミノ基に共有結合で連結している(この工程は、アシル化と称される)。
【００５６】
特に明記しない限り、リシン残基のアシル化について参照するとき、そのε-アミノ基への参照と理解される。
【００５７】
リンカーを介して第1および第2のK残基(例えば、K27およびKT)に結合している2つの延長部分を含む誘導体は、第1および第2のリシン残基のε-アミノ基において、例えば、GLP-1ペプチドのそれぞれ、27位およびTにおいて、2回アシル化された、二重アシル化された、または二連アシル化された誘導体と称してもよい。
【００５８】
本目的のために、「アルブミン結合部分」、「延長部分」、および「リンカー」という用語は、これらの分子の未反応および反応形態を含み得る。1つまたは他の形態が意味されるかどうかは、用語か使用される状況から明らかである。
【００５９】
一態様において、各延長部分は、Chem.1およびChem.2から独立に選択される延長部分を含み、またはこれらからなる
Chem.1:HOOC-(CH2)x-CO-*
Chem.2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
(式中、xは、6〜16の範囲の整数であり、yは、3〜17の範囲の整数である)。
【００６０】
一実施形態において、*-(CH2)x-*は、直鎖状または分岐状、好ましくは、直鎖状アルキレン(xは、6〜16の範囲の整数である)を意味する。
【００６１】
別の実施形態において、*-(CH2)y-*は、直鎖状または分岐状、好ましくは、直鎖状アルキレン(yは、3〜17の範囲の整数である)を意味する。
【００６２】
「脂肪酸」という用語は、4〜28個の炭素原子を有する脂肪族モノカルボン酸を意味し、これは好ましくは、分岐しておらず、かつ/または偶数であり、飽和もしくは不飽和でよい。
【００６３】
「脂肪二酸」という用語は、上記定義の脂肪酸を意味するが、ω位においてさらなるカルボン酸基を有する。このように、脂肪二酸は、ジカルボン酸である。
【００６４】
命名法は当技術分野で通常の通りであり、例えば、上記の式において、*-COOHおよびHOOC-*は、カルボキシを意味し、*-C6H4-*は、フェニレンを意味し、*-CO-*および*-OC-*は、カルボニル(O=C<**)を意味し、C6H5-O-*は、フェノキシを意味する。特定の実施形態では、芳香族化合物、例えば、フェノキシ、およびフェニレンラジカルは、独立に、オルト、メタ、またはパラでよい。
【００６５】
上記で説明した通り、本発明のGLP-1誘導体は、二重アシル化されており、すなわち、2つのアルブミン結合部分は、GLP-1ペプチドに共有結合で結合している。
【００６６】
特定の実施形態において、2つのアルブミン結合部分(すなわち、全側鎖)は、同様であり、好ましくは、実質的に同一であり、または最も好ましくは、同一である。
【００６７】
他の特定の実施形態において、2つの延長部分は、同様であり、好ましくは、実質的に同一であり、または最も好ましくは、同一である。
【００６８】
またさらなる特定の実施形態において、2つのリンカーは、同様であり、好ましくは、実質的に同一であり、または最も好ましくは、同一である。
【００６９】
「実質的に同一な」という用語は、1種もしくは複数の塩、エステル、および/またはアミドの形成;好ましくは、1種もしくは複数の塩、メチルエステル、および単純なアミドの形成;より好ましくは、2種以下の塩、メチルエステル、および/または単純なアミドの形成;さらにより好ましくは、1種以下の塩、メチルエステル、および/または単純なアミドの形成;あるいは最も好ましくは、1種以下の塩の形成による、同一であることからの差異を含む。
【００７０】
化合物、例えば、アルブミン結合部分、延長部分、およびリンカーとの関連で、類似性および/または同一性は、当技術分野において公知の任意の適切なコンピュータプログラムおよび/またはアルゴリズムを使用して決定し得る。
【００７１】
例えば、2つの延長部分、2つのリンカー、および/または2つの全側鎖の類似性は、分子フィンガープリントを使用して適切に決定し得る。フィンガープリントは、化学構造を表す数学的方法である(例えば、Chemoinformatics:A textbook、Johann GasteigerおよびThomas Engel(編)、Wiley-VCH Verlag、2003年を参照されたい)。
【００７２】
適切なフィンガープリントの例には、これらに限定されないが、UNITYフィンガープリント、MDLフィンガープリント、および/またはECFPフィンガープリント、例えば、ECFP_6フィンガープリント(ECFPは、拡張連結性フィンガープリントの略語である)が含まれる。
【００７３】
特定の実施形態では、2つの延長部分、2つのリンカー、および/または2つの全側鎖は、a)ECFP_6フィンガープリント;b)UNITYフィンガープリント;および/またはc)MDLフィンガープリントとして表される。
【００７４】
2つのフィンガープリントの類似性を計算するために、a)、b)またはc)が使用されようとも、谷本係数を好ましくは使用する。
【００７５】
特定の実施形態では、a)、b)またはc)を使用しようとも、それぞれ、2つの延長部分、2つのリンカー、および/または2つの全側鎖は、少なくとも0.5(50%);好ましくは、少なくとも0.6(60%);より好ましくは、少なくとも0.7(70%)、または少なくとも0.8(80%);さらにより好ましくは、少なくとも0.9(90%);または最も好ましくは、少なくとも0.99(99%)の類似性、例えば、1.0(100%)の類似性を有する。
【００７６】
UNITYフィンガープリントは、プログラムSYBYL(Tripos、1699 South Hanley Road、St. Louis、MO63144-2319、USAから入手可能)を使用して計算し得る。ECFP_6およびMDLフィンガープリントは、プログラムPipeline Pilot(Accelrys Inc.、10188 Telesis Court、Suite 100、San Diego,CA92121、USAから入手可能)を使用して計算し得る。
【００７７】
さらなる詳細については、例えば、J. Chem. Inf. Model.、2008年、48、542〜549頁;J. Chem. Inf. Comput. Sci.、2004年、44、170〜178頁;J. Med. Chem.、2004年、47、2743〜2749頁;J. Chem. Inf. Model.、2010年、50、742〜754頁;およびSciTegic Pipeline Pilot Chemistry Collection:Basic Chemistry User Guide、2008年3月、SciTegic Pipeline Pilot Data Modeling Collection、2008年(両方ともAccelrys Software Inc.、San Diego、USから)、ならびにガイドhttp://www.tripos.com/tripos_resources/fileroot/pdfs/Unity_111408.pdf、およびhttp://www.tripos.com/data/SYBYL/SYBYL_072505.pdfを参照されたい。
【００７８】
類似性計算の一例を本明細書において下記で挿入し、そこにおいて、Chem.66の全側鎖を、そのメチルエステル、すなわち、グルタミンリンカー部分のモノメチルエステル(Chem66a)と比較した。
Chem.66a:
【００７９】
【化３】
0006022538.tif 000005
【００８０】
a)ECFP_6フィンガープリントを使用して、類似性は0.798であり、b)UNITYフィンガープリントを使用して、類似性は0.957であり、MDLフィンガープリントを使用して、類似性は0.905である。
【００８１】
2つの同一の側鎖(アルブミン結合部分)の場合、誘導体は、対称的と示し得る。
【００８２】
特定の実施形態では、類似性係数は、少なくとも0.80、好ましくは少なくとも0.85、より好ましくは少なくとも0.90、さらにより好ましくは少なくとも0.95、または最も好ましくは少なくとも0.99である。
【００８３】
本発明の誘導体の2つのリンカーのそれぞれは、下記の第1のリンカー要素
Chem.5:
【００８４】
【化４】
0006022538.tif 000006
【００８５】
(式中、kは、1〜5の範囲の整数であり、nは、1〜5の範囲の整数である)を含んでもよい。
【００８６】
特定の実施形態において、k=1およびn=1であるとき、このリンカー要素は、OEG、または8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸のジラジカルと示してもよく、かつ/またはこのリンカー要素は、下記の式
Chem.5a:*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*
によって表してもよい。
【００８７】
他の特定の実施形態において、本発明の誘導体の各リンカーは、独立して、第2のリンカー要素、好ましくはGluジラジカル(Gluジラジカルは、p回(pは、1〜2の範囲の整数である)含まれてもよい)、例えば、Chem.6および/またはChem.7を含み得る。
Chem.6:
【００８８】
【化５】
0006022538.tif 000007
Chem.7:
【００８９】
【化６】
0006022538.tif 000008
【００９０】
Chem.6はまた、これが別のリンカー要素への、またはリシンのε-アミノ基への結合のためにここで使用され得る、アミノ酸であるグルタミン酸のγカルボキシ基であるという事実によって、γ-Glu、または短くgGluと称し得る。上記で説明したように、他のリンカー要素は、例えば、別のGlu残基、またはOEG分子でよい。Gluのアミノ基は、延長部分のカルボキシ基と、または例えば、OEG分子のカルボキシ基(存在する場合)と、または例えば、別のGluのγ-カルボキシ基(存在する場合)とアミド結合を形成し得る。
【００９１】
Chem.7はまた、これが別のリンカー要素への、またはリシンのε-アミノ基への結合のためにここで使用し得る、アミノ酸であるグルタミン酸のαカルボキシ基であるという事実によって、α-Glu、または簡潔にaGlu、または単純にGluと称し得る。
【００９２】
上記Chem.6およびChem.7の構造は、GluのL型、およびD型を包含する。
【００９３】
本発明の誘導体は、同じ分子式および結合した原子の配列を有する異なる立体異性体の形態で存在し得るが、空間中のこれらの原子の三次元の配向のみが異なる。本発明の例示的な誘導体の立体異性は、実験セクションにおいて、標準的な命名法を使用して名称および構造で示される。特に明記しない限り、本発明は、特許請求した誘導体の全ての立体異性体の形態に関する。
【００９４】
本発明のGLP-1誘導体の血漿中濃度は、任意の適切な方法を使用して決定し得る。例えば、LC-MS(液体クロマトグラフィー質量分析)、または免疫アッセイ、例えば、RIA(放射線免疫アッセイ)、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、およびLOCI(発光酸素チャネリング免疫アッセイ)を使用し得る。適切なRIAおよびELISAアッセイのための一般のプロトコルは、例えば、WO09/030738、116〜118頁に見出される。好ましいアッセイは、本明細書において実施例35、39、および40に記載されているLOCIアッセイである。
【００９５】
薬学的に許容される塩、アミド、またはエステル
本発明の誘導体および類似体は、薬学的に許容される塩、アミド、またはエステルの形態でよい。
【００９６】
塩は、例えば、塩基および酸の間の化学反応、例えば:2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4によって形成される。
【００９７】
塩は、塩基性塩、酸性塩でよく、または塩は、どちらでなくてもよい(すなわち、中性塩)。塩基性塩は、水中で、水酸化イオンを生成し、酸性塩は、ヒドロニウムイオンを生成する。
【００９８】
本発明の誘導体の塩は、それぞれ、アニオン基またはカチオン基と反応する、加えたカチオンまたはアニオンによって形成し得る。これらの基は、本発明の誘導体のペプチド部分において、および/または側鎖において位置し得る。
【００９９】
本発明の誘導体のアニオン基の非限定的な例には、側鎖における、もしあれば、ペプチド部分における遊離カルボキシル基が含まれる。ペプチド部分は、C末端において遊離カルボン酸基を含むことが多く、ペプチド部分はまた、内部の酸アミノ酸残基、例えば、AspおよびGluにおいて遊離カルボキシル基を含み得る。
【０１００】
ペプチド部分におけるカチオン基の非限定的な例には、N末端における遊離アミノ基、および存在する場合、内部の塩基性アミノ酸残基、例えば、His、Arg、およびLysの任意の遊離アミノ基が含まれる。
【０１０１】
本発明の誘導体のエステルは、例えば、遊離カルボン酸基とアルコールまたはフェノールとの反応によって形成されてもよく、これによって、アルコキシまたはアリールオキシ基による少なくとも1つのヒドロキシル基の置換えがもたらされる。
【０１０２】
エステル形成は、ペプチドのC末端における遊離カルボキシル基、および/または側鎖中の任意の遊離カルボキシル基が関与し得る。
【０１０３】
本発明の誘導体のアミドは、例えば、遊離カルボン酸基とアミンもしくは置換アミンとの反応によって、または遊離もしくは置換アミノ基とカルボン酸との反応によって形成し得る。
【０１０４】
アミド形成は、ペプチドおよび/または側鎖における、ペプチドのC末端における遊離カルボキシル基、側鎖中の任意の遊離カルボキシル基、ペプチドのN末端における遊離アミノ基、および/またはペプチドの任意の遊離もしくは置換アミノ基が関与し得る。
【０１０５】
特定の実施形態において、ペプチドまたは誘導体は、薬学的に許容される塩の形態である。他の特定の実施形態において、誘導体は、薬学的に許容されるアミドの形態であり、好ましくは、ペプチドのC末端におけるアミド基を有する。またさらなる特定の実施形態において、ペプチドまたは誘導体は、薬学的に許容されるエステルの形態である。
【０１０６】
中間生成物
第2の態様において、本発明は、中間生成物に関する。
本発明の中間生成物の1タイプは、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して下記の変化: (i)38Q;および/または(ii)39G;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルを含むGLP-1類似体の形態をとる。
【０１０７】
GLP-1類似体の形態の本発明の別の中間生成物は、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、下記のアミノ酸の変化を含み、好ましくは有する類似体、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルである。(i)22E、26R、27K、34R、37K;(ii)22E、26R、27K、30E、34R、36K、38E、39G;(iii)22E、26R、27K、34R、36K、des37;(iv)22E、25V、26R、27K、34R、37K;(v)8Aib、20K、22E、26R、27K、30E、34G、des35-37;(vi)26R、27K、30E、34R、36K、38E;(vii)8Aib、22K、25V、26R、27K、31H、34R;(iix)8Aib、22K、25V、26R、27K、34R、des35-37;(ix)8Aib、22K、25V、26R、27K、34R、des36-37;(x)26H、27K、30E、34R、36K、38E;(xi)22K、25V、26R、27K、30E、34Q;(xii)25V、26R、27K、30E、34R、36K、38Q;(xiii)25V、26R、27K、30E、34Q、36K、38E;(xiv)22K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xv)8Aib、25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(xvi)25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(xvii)22E、23E、25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(iixx)8Aib、12K、22E、26R、27K、31H、34Q;(ixx)8Aib、22K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xx)22E、26H、27K、30E、34R、36K、38E;(xxi)22E、24K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xxii)25V、26R、27K、34Q、36K;(xxiii)22E、24K、25V、26R、27K、31H、34R;(xxiv)22E、24K、25V、26R、27K、34G、des35-37;(xxv)22E、24K、25V、26R、27K、34R;(xxvi)8Aib、22E、24K、25V、26R、27K、31H、34Q;または(xxvii)8Aib、22E、26R、27K、30E、34R、36K、38E、39G;
【０１０８】
機能特性
第1の機能的態様において、本発明の誘導体は、良好な効力を有する。また、または代わりに、第2の機能的態様において、本発明の誘導体は、延長性の薬物動態プロファイルを有する。また、または代わりに、第3の機能的態様において、本発明の誘導体は、高い経口バイオアベイラビリティーを有する。また、または代わりに、第4の機能的態様において、本発明の誘導体の生物物理学的特性が改善される。
【０１０９】
生物活性(効力)
第1の機能的態様によると、本発明の誘導体、および構成物GLP-1ペプチドそれ自体は、生物活性があり、または強力である。
【０１１０】
特定の実施形態において、効力および/または活性とは、インビトロの効力、すなわち、機能的GLP-1受容体アッセイにおける能力を意味し、さらに特にクローン化ヒトGLP-1受容体を発現している細胞系におけるcAMP形成を刺激する能力を意味する。
【０１１１】
ヒトGLP-1受容体を含有する培地におけるcAMPの形成の刺激は、好ましくは、安定的なトランスフェクトされた細胞系、例えば、BHK467-12A(tk-ts13)を使用して、かつ/またはcAMPの決定のために、例えば、内因的に形成されたcAMPと外因的に加えたビオチン標識cAMPとの間の競合に基づいた機能的受容体アッセイを使用して決定してもよく、このアッセイにおいて、cAMPはより好ましくは、特異的抗体を使用して捕捉され、かつ/またはさらにより好ましいアッセイは、AlphaScreen cAMPアッセイであり、最も好ましくは、実施例33に記載されているものである。
【０１１２】
最大半減有効濃度(EC50)という用語は一般に、用量反応曲線を参照することにより、ベースラインと最大との中間の反応を誘発する濃度を意味する。EC50は、化合物の効力の尺度として使用され、その最大作用の50%が観察される濃度を表す。
【０１１３】
本発明の誘導体のインビトロの効力は、上記のように決定してもよく、当該の誘導体のEC50が決定される。EC50が低いほど、効力は良好である。
【０１１４】
適切な培地は、下記の組成を有する(最終のアッセイにおける濃度):50mMのTRIS-HCl;5mMのHEPES;10mMのMgCl2、6H2O;150mMのNaCl;0.01%Tween;0.1%BSA;0.5mMのIBMX;1mMのATP;1uMのGTP、pH7.4。
【０１１５】
本発明の誘導体のEC50は、3500pM以下、好ましくは3200pM以下である。EC50は、1200pM未満、好ましくは1000pM未満、さらにより好ましくは500pM未満、または最も好ましくは200pM未満でよい。
【０１１６】
第1の機能的態様の別の特定の実施形態において、効力および/または活性は、低濃度のアルブミンでのGLP-1受容体への結合の能力を意味する。低アルブミン濃度でのGLP-1受容体への結合は、低いIC50値に対応して、できる限り良好であるべきである。これは、実施例35に記載されているように決定し得る。本発明の誘導体のIC50(低アルブミン)は、500nM以下であり、多くは、100nM未満、またはさらに10nM未満である。
【０１１７】
別の特定の実施形態において、本発明の誘導体は、インビボで強力であり、これは任意の適切な動物モデルにおいて、および臨床試験において、当技術分野において公知のように決定してもよい。
【０１１８】
糖尿病性db/dbマウスは適切な動物モデルの一例であり、血中グルコース低下作用は、例えば、実施例36に記載されているように、またはWO09/030738の実施例43に記載されているように、このようなマウスにおいてインビボで決定し得る。
【０１１９】
また、または代わりに、インビボでの食物摂取量への作用は、例えば、実施例38に記載されているように、ブタにおける薬力学的研究において決定し得る。
【０１２０】
延長-受容体結合/低および高アルブミン
第2の機能的態様によれば、本発明の誘導体は、延長性である。
【０１２１】
GLP-1受容体結合
特定の実施形態において、延長は、それぞれ、低濃度および高濃度のアルブミンの存在下で、GLP-1受容体に結合する本発明の誘導体の能力を意味し、これは、実施例34に記載されているように決定し得る。
【０１２２】
一般に、低アルブミン濃度でのGLP-1受容体への結合は、低いIC50値に対応して、できる限り良好であるべきである。一実施形態において、低アルブミンは、0.005%HSAを意味する。別の実施形態において、低アルブミンは、0.001%HSAを意味する。
【０１２３】
高アルブミン濃度でのIC50値は、GLP-1受容体への誘導体の結合に対するアルブミンの影響の尺度である。公知のように、GLP-1誘導体はまた、アルブミンに結合する。これは一般に、血漿中のGLP-1誘導体の寿命を延長させる望ましい作用である。したがって、高アルブミンでのIC50値は一般に、GLP-1受容体への結合と競合するアルブミン結合に起因する、GLP-1受容体への結合の減少に対応して、低アルブミンでのIC50値より高い。
【０１２４】
したがって、高い比(IC50値(高アルブミン)/IC50値(低アルブミン))は、当該の誘導体がアルブミンに良好に結合し(長い半減期を有してもよく)、かつまたそれ自体がGLP-1受容体に良好に結合する(IC50値(高アルブミン)は高く、IC50値(低アルブミン)は低い)という指標と考えてもよい。他方、アルブミン結合は、必ずしも望ましいとは限らないことがあり、またはアルブミンへの結合は、強力となり得る。したがって、IC50(低アルブミン)/IC50(高アルブミン)についての望ましい範囲、および高/低の比は、使用目的およびこのような使用を取り巻く状況によって、ならびに潜在的な当該の他の化合物の特性によって、化合物毎に変化し得る。
【０１２５】
高および低アルブミン濃度での受容体結合を決定するための適切なアッセイを、本明細書の実施例34において開示する。本発明の化合物は、低アルブミンの存在下で非常に良好な受容体結合親和性(IC50)を有する。平均して、実施例34において試験した化合物のIC50(低アルブミン)は、14nMである。
【０１２６】
延長-ラットにおけるインビボでの半減期
第2の機能的態様によれば、本発明の誘導体は、延長性である。特定の実施形態において、延長は、i.v.投与後のラットにおけるインビボでの半減期(T1/2)として適切に決定し得る。ラットにおける半減期は少なくとも4時間であり、10時間以上ほど長くてもよい。
【０１２７】
i.v.投与後のラットにおけるインビボでの半減期を決定するための適切なアッセイを、本明細書の実施例39において開示する。
【０１２８】
延長-ミニブタにおけるインビボでの半減期
第2の機能的態様によれば、本発明の誘導体は、延長性である。特定の実施形態において、延長はまた、または代わりに、i.v.投与後のミニブタにおけるインビボでの半減期(T1/2)として決定し得る。半減期は、少なくとも12時間であり、少なくとも24時間、少なくとも36時間、少なくとも48時間、または少なくとも60時間、またはさらに長くてもよい。
【０１２９】
i.v.投与後のミニブタにおけるインビボでの半減期を決定するための適切なアッセイを、本明細書の実施例37において開示する。
【０１３０】
経口バイオアベイラビリティー
第3の機能的態様によると、本発明の誘導体は、高い経口バイオアベイラビリティーを有する。
【０１３１】
市販のGLP-1誘導体の経口バイオアベイラビリティーは、非常に低い。i.v.またはs.c.投与のために開発中のGLP-1誘導体の経口バイオアベイラビリティーはまた低い。
【０１３２】
したがって、当技術分野で改善された経口バイオアベイラビリティーのGLP-1誘導体が求められている。このような誘導体は、これらの効力が一般に満足できる限り、および/またはこれらの半減期がまた一般に満足できる限り、経口投与のための適切な候補であり得る。
【０１３３】
本発明者らは、驚くほど高い経口バイオアベイラビリティー、ならびに同時に満足できる効力、および/または半減期を有する、新規なクラスのGLP-1誘導体を同定した。
【０１３４】
また、または代わりに、これらの誘導体は、低濃度のアルブミンで、驚いたことに改善された経口バイオアベイラビリティー、および同時にGLP-1受容体への高い結合親和性(すなわち、低いIC50値)を有する。
【０１３５】
これらの特徴は、例えば、生産の経済性、潜在的な安全性の問題の可能性、および投与の快適性の問題、および環境への懸念を含めた様々な理由のために望ましい、毎日の低い経口用量の活性医薬成分を得るために重要である。
【０１３６】
一般に、バイオアベイラビリティーという用語は、未変化で体循環に達する、活性医薬成分(API)、例えば、本発明の誘導体の投与した用量の画分を意味する。定義によると、APIを静脈内に投与するとき、そのバイオアベイラビリティーは、100%である。しかし、APIを他の経路(経口的など)によって投与するとき、そのバイオアベイラビリティーは減少する(分解ならびに/または不完全な吸収および初回通過代謝によって)。バイオアベイラビリティーについての知識は、非静脈内投与経路のための投与量を計算するときに重要である。
【０１３７】
絶対的経口バイオアベイラビリティーは、経口投与の後の体循環におけるAPIのバイオアベイラビリティー(曲線下面積、またはAUCとして推定する)と、静脈内投与の後の同じAPIのバイオアベイラビリティーとを比較する。絶対的経口バイオアベイラビリティーは、同じAPIの対応する静脈内投与と比較した、非静脈内投与によって吸収されるAPIの画分である。異なる用量が使用される場合、比較は用量標準化しなくてはならない。結果的に、各AUCは、投与された対応する用量で割ることによって補正される。
【０１３８】
血漿API濃度対時間のプロットを、経口および静脈内投与の両方の後に作製する。絶対的バイオアベイラビリティー(F)は、用量補正AUC-経口をAUC-静脈内で割った商である。
【０１３９】
本発明の誘導体は、a)リラグルチド、および/またはb)セマグルチドの絶対的経口バイオアベイラビリティーより、好ましくは、少なくとも10%高い、より好ましくは、少なくとも20%高い、さらにより好ましくは、少なくとも30%高い、または最も好ましくは、少なくとも40%高い絶対的経口バイオアベイラビリティーを有する。経口バイオアベイラビリティーを試験する前に、本発明の誘導体は、例えば、WO2008/145728に記載されている製剤の任意の1つまたは複数を使用して、インスリン分泌性化合物の経口製剤の当技術分野において公知のように適切に製剤し得る。
【０１４０】
経口バイオアベイラビリティーを予測する適切な試験は、実施例35および40に記載されている。これらの試験によれば、ラットの腸管腔へのGLP-1誘導体の直接の注入の後、および/またはラットへの経口胃管栄養法の後、血漿中のその濃度(曝露)を決定し、それに続くGLP-1誘導体の血漿中曝露を決定する。
【０１４１】
生物物理学的特性
第4の機能的態様によると、本発明の誘導体は、改善された生物物理学的特性を有する。これらの特性には、これらに限定されないが、物理的安定性および溶解性が含まれる。改善された生物物理学的特性は、オリゴマー特性の変化の結果であり得る。生物物理学的特性は、タンパク質化学の標準的生物物理学的方法を使用して測定し得る。本発明の誘導体の生物物理学的特性は、天然GLP-1の生物物理学的特性と適切に比較し得る。
【０１４２】
本発明のさらなる特定の実施形態は、「特定の実施形態」と見出しがあるセクションに記載されている。
【０１４３】
生成工程
ペプチド様GLP-1(7-37)およびGLP-1類似体の生成は、当技術分野で周知である。
【０１４４】
本発明の誘導体のGLP-1部分(またはそのフラグメント)、例えば、K12,K27-GLP-1(7-37)もしくは類似体またはそのフラグメントは、例えば、古典的なペプチド合成、例えば、t-BocもしくはFmoc化学を使用した固相ペプチド合成、または他の確立した技術によって生成し得る。例えば、GreeneおよびWuts、「Protective Groups in Organic Synthesis」、John Wiley & Sons、1999年、Florencio Zaragoza  Dorwald、「Organic Synthesis on solid Phase」、Wiley-VCH Verlag GmbH、2000年、および「Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis」、W.C. ChanおよびP.D. White編、Oxford University Press、2000年を参照されたい。
【０１４５】
また、または代わりに、これらは、組換え法によって、すなわち、類似体をコードし、かつペプチドの発現を可能とする条件下で適切な栄養培地中でペプチドを発現することができる、DNA配列を含有する宿主細胞を培養することによって産生し得る。これらのペプチドの発現に適した宿主細胞の非限定的な例は、大腸菌(Escherichia coli)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、および哺乳動物のBHKまたはCHO細胞系である。
【０１４６】
非天然アミノ酸および/または共有結合で結合したN-末端モノまたはジペプチド模倣物を含む本発明のこれらの誘導体は、例えば、実験パートに記載されているように生成し得る。または例えば、Hodgsonら:「The synthesis of peptides and proteins containing non-natural amino acids」、Chemical Society Reviews、第33巻、第7番(2004年)、422〜430頁;および「Semi-recombinant preparation of GLP-1 analogues」という表題のWO2009/083549A1を参照されたい。
【０１４７】
いくつかの本発明の誘導体を調製する方法の具体例を、実験パートに含める。
【０１４８】
医薬組成物
本発明の誘導体、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル、および薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物は、当技術分野において公知のように調製し得る。
【０１４９】
「添加剤」という用語は、活性治療成分以外の任意の構成要素を広範に意味する。添加剤は、活性のない物質、不活性物質、および/または非医学的活性物質でよい。
【０１５０】
添加剤は、例えば、担体、ビヒクル、賦形剤、錠剤助剤として、ならびに/または活性物質の投与および/もしくは吸収を改善するための、様々な目的を果たし得る。
【０１５１】
様々な添加剤を有する医薬的活性成分の製剤は、当技術分野において公知である。例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy(例えば、第19版(1995年)、および任意のより最近の版を参照されたい)。
【０１５２】
添加剤の非限定的な例は、溶剤、賦形剤、緩衝液、保存剤、等張化剤、キレート剤、および安定剤である。
【０１５３】
製剤の例には、液体製剤、すなわち、水を含む水性製剤が含まれる。液体製剤は、溶液剤または懸濁剤でよい。水性製剤は典型的には、少なくとも50%w/wの水、または少なくとも60%w/w、70%w/w、80%w/w、またはさらに少なくとも90%w/wの水を含む。
【０１５４】
代わりに、医薬組成物は、固体製剤、例えば、凍結乾燥もしくは噴霧乾燥した組成物でよく、これはそのまま使用してもよく、またはこれに、医師もしくは患者が、溶剤および/もしくは賦形剤を使用前に加える。
【０１５５】
水性製剤におけるpHは、pH3〜pH10のいずれか、例えば、約7.0〜約9.5、または約3.0〜約7.0でよい。
【０１５６】
医薬組成物は、緩衝液を含み得る。緩衝液は、例えば、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、シトレート、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リシン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、スクシネート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、およびこれらの混合物からなる群から選択し得る。
【０１５７】
医薬組成物は、保存剤を含み得る。保存剤は、例えば、フェノール、o-クレゾール、m-クレゾール、p-クレゾール、p-ヒドロキシ安息香酸メチル、p-ヒドロキシ安息香酸プロピル、2-フェノキシエタノール、ブチルp-ヒドロキシベンゾエート、2-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、およびチメロサール、ブロノポル、安息香酸、イミド尿素、クロルヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、p-ヒドロオキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン(3p-クロロフェノキシプロパン-1,2-ジオール)、およびこれらの混合物からなる群から選択し得る。保存剤は、0.1mg/ml〜20mg/mlの濃度で存在し得る。
【０１５８】
医薬組成物は、等張剤を含み得る。等張剤は、例えば、塩(例えば、塩化ナトリウム)、糖または糖アルコール、アミノ酸(例えば、グリシン、ヒスチジン、アルギニン、リシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、トレオニン)、アルジトール(例えば、グリセロール(グリセリン)、1,2-プロパンジオール(プロピレングリコール)、1,3-プロパンジオール、1,3-ブタンジオール)、ポリエチレングリコール(例えば、PEG400)、およびこれらの混合物からなる群から選択し得る。任意の糖、例えば、単糖類、二糖類、もしくは多糖類、または水溶性グルカン、例えば、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、αおよびβHPCDを含み、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、ならびにカルボキシメチルセルロース-Naを使用し得る。糖アルコールは、少なくとも1つの-OH基を有するC4〜C8炭化水素と定義され、例えば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、およびアラビトールが含まれる。一実施形態において、糖アルコール添加物は、マンニトールである。
【０１５９】
医薬組成物は、キレート剤を含み得る。キレート剤は、例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、クエン酸、およびアスパラギン酸の塩、ならびにこれらの混合物から選択し得る。医薬組成物は、安定剤を含み得る。安定剤は、例えば、1種もしくは複数の酸化阻害剤、凝集阻害剤、界面活性剤、および/または1種もしくは複数のプロテアーゼ阻害剤でよい。これらの様々な種類の安定剤の非限定的な例を、下記に開示する。
【０１６０】
「凝集物形成」という用語は、可溶性のままであり得るオリゴマー、または溶液から沈殿する大きな目に見える凝集物の形成をもたらす、ポリペプチド分子の間の物理的相互作用を意味する。液体医薬組成物の貯蔵の間のポリペプチドによる凝集物形成は、このポリペプチドの生物活性に悪影響を与えることが可能であり、医薬組成物の治療有効性の喪失をもたらす。さらに、凝集物の形成によって、注入システムを使用してポリペプチド含有医薬組成物が投与されたとき、管類、膜、またはポンプの閉塞などの他の問題をもたらし得る。
【０１６１】
医薬組成物は、組成物の貯蔵の間のポリペプチドの凝集物形成を減少させるのに十分な量のアミノ酸塩基を含み得る。「アミノ酸塩基」という用語は、1種もしくは複数のアミノ酸(メチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、トレオニンなど)、またはその類似体を意味する。任意のアミノ酸は、その遊離塩基の形態でまたはその塩の形態で存在し得る。アミノ酸塩基の任意の立体異性体(すなわち、L、D、またはこれらの混合物)が存在し得る。
【０１６２】
治療剤として作用するポリペプチドが、このような酸化の影響を受けやすい少なくとも1つのメチオニン残基を含むポリペプチドであるとき、メチオニン(または他の含硫アミノ酸もしくはアミノ酸類似体)を加えて、メチオニンスルホキシドへのメチオニン残基の酸化を阻害してもよい。メチオニンの任意の立体異性体(LもしくはD)またはこれらの組合せを使用することができる。
【０１６３】
医薬組成物は、高分子ポリマーまたは低分子化合物の群から選択される安定剤を含み得る。安定剤は、例えば、ポリエチレングリコール(例えば、PEG3350)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン、カルボキシ/ヒドロキシセルロースまたはその誘導体(例えば、HPC、HPC-SL、HPC-LおよびHPMC)、シクロデキストリン、イオウ含有物質、例えば、モノチオグリセロール、チオグリコール酸および2-メチルチオエタノール、ならびに異なる塩(例えば、塩化ナトリウム)から選択し得る。医薬組成物は、これらに限定されないがメチオニンおよびEDTAなどのさらなる安定化剤(ポリペプチドをメチオニン酸化から保護する)、および非イオン性界面活性剤(ポリペプチドを冷凍-解凍または機械的剪断と関連する凝集から保護する)を含み得る。
【０１６４】
医薬組成物は、1種または複数の界面活性剤、好ましくは、界面活性剤、少なくとも1種の界面活性剤、または2種の異なる界面活性剤を含み得る。「界面活性剤」という用語は、水溶性(親水性)パート、および脂溶性(親油性)パートから構成される任意の分子またはイオンを意味する。界面活性剤は、例えば、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、および/または双性イオン性界面活性剤からなる群から選択し得る。
【０１６５】
医薬組成物は、1種または複数のプロテアーゼ阻害剤、例えば、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)、および/またはベンズアミジンHClを含み得る。
【０１６６】
医薬組成物のさらなる任意選択の成分には、例えば、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、増量剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン)、ならびに/または双生イオン(例えば、アミノ酸、例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リシンおよびヒスチジン)が含まれる。
【０１６７】
またさらに、医薬組成物は、例えば、WO2008/145728に記載されている製剤の任意の1つまたは複数を使用して、インスリン分泌性化合物の経口製剤の当技術分野において公知のように製剤し得る。
【０１６８】
投与された用量は、0.01mg〜100mgの誘導体、または0.01〜50mg、または0.01〜20mg、または0.01mg〜10mgの誘導体を含有し得る。
【０１６９】
誘導体は、医薬組成物の形態で投与し得る。誘導体は、それを必要としている患者に、いくつかの部位で、例えば、局所部位、例えば、皮膚または粘膜部位で;吸収を迂回する部位で、例えば、動脈中、静脈中、または心臓中;および吸収が関与する部位で、例えば、皮膚中、皮膚下、筋肉中、または腹部中に投与し得る。
【０１７０】
投与経路は、例えば、舌;舌下;口腔;口中;経口;胃内;腸内;経鼻;肺、例えば、細気管支、肺胞、もしくはこれらの組合せを通して;非経口、表皮;皮膚;経皮的;結膜;尿道;膣;直腸;および/または眼でよい。組成物は、経口組成物でよく、投与経路は、経口による。
【０１７１】
組成物は、例えば、溶液剤;懸濁剤;乳剤;マイクロエマルジョン;多層乳剤;フォーム剤;膏薬;ペースト剤;貼付剤;軟膏剤;錠剤;コーティング錠剤;チューインガム;リンス;カプセル剤、例えば、硬質または軟質ゼラチンカプセル剤;坐剤;直腸用カプセル剤;ドロップ剤;ゲル剤;スプレー剤;散剤;エアゾール剤;吸入剤;点眼薬;眼病用軟膏剤;眼病用リンス;膣のペッサリー;膣のリング;膣用軟膏剤;注射液;インサイチュで変形する溶液剤、例えば、インサイチュでゲル化、硬化、沈殿し、インサイチュで結晶化するもの;輸液;またはインプラントとしていくつかの剤形で投与し得る。組成物は、錠剤、任意選択でコーティングされた錠剤、カプセル剤、またはチューインガムでよい。
【０１７２】
組成物は、例えば、安定性、バイオアベイラビリティー、および/または溶解性を改善するために、薬物担体または薬物送達系中にさらに配合し得る。特定の実施形態において、組成物は、共有結合性、疎水性、および/または静電相互作用によって、このような系に結合し得る。このような配合の目的は、例えば、有害作用を減少させ、時間療法を達成し、かつ/または患者の薬剤服用順守を増加させることでよい。
【０１７３】
組成物はまた、制御放出、持続性放出、延長性放出、遅延放出、および/または持続放出の薬物送達系の製剤において使用し得る。
【０１７４】
非経口投与は、シリンジ、任意選択でペン様シリンジを用いて、または注入ポンプを用いて、皮下、筋内、腹腔内、または静脈内注射によって行ってもよい。
【０１７５】
組成物は、溶液剤、懸濁剤、もしくは散剤の形態で経鼻で投与してもよく、または組成物は、液体もしくは粉末スプレーの形態で肺に投与し得る。
【０１７６】
経皮的投与(例えば、無針注射によって、パッチ、例えば、イオン泳動的パッチから、または経粘膜的経路を介して、例えば、口腔から)は、またさらなるオプションである。
【０１７７】
組成物は、安定化した製剤でよい。「安定化した製剤」という用語は、増加した物理的および/または化学的安定性、好ましくは、両方を有する製剤を意味する。一般に、製剤は、(推奨される使用および貯蔵条件に従って)有効期限に到達するまで使用および貯蔵の間安定的でなくてはならない。
【０１７８】
「物理的安定性」という用語は、熱機械的応力への曝露、ならびに/または不安定な界面および表面(疎水性表面など)との相互作用の結果として、生物学的に不活性および/または不溶性の凝集物を形成するポリペプチドの傾向を意味する。水性ポリペプチド製剤の物理的安定性は、外観検査によって、および/または異なる温度での様々な期間の機械的/物理的応力(例えば、撹拌)への曝露の後の混濁度測定によって評価し得る。代わりに、物理的安定性は、分光学的薬剤、またはポリペプチドの立体配置的状態のプローブ、例えば、チオフラビンTまたは「疎水性パッチ」プローブを使用して評価し得る。
【０１７９】
「化学的安定性」という用語は、未変化のポリペプチドと比較して、減少した生物学的効力、および/または増加した免疫原性作用を潜在的に有する化学分解生成物の形成をもたらす、ポリペプチド構造における化学的(特に、共有結合性)変化を意味する。化学的安定性は、例えば、SEC-HPLC、および/またはRP-HPLCによって、異なる環境条件への曝露の後の様々な時点での化学分解生成物の量を測定することによって評価することができる。
【０１８０】
本発明による誘導体による治療はまた、例えば、抗糖尿病剤、抗肥満剤、食欲調節剤、降圧剤、糖尿病からもたらされる、またはそれと関連する合併症の治療および/もしくは予防のための薬剤、ならびに肥満症からもたらされる、またはそれと関連する合併症および障害の治療および/もしくは予防のための薬剤から選択される1種または複数のさらなる薬理学的活性物質と合わせてもよい。これらの薬理学的活性物質の例は、インスリン、スルホニル尿素、ビグアニド、メグリチニド、グルコシダーゼ阻害剤、グルカゴンアンタゴニスト、DPP-IV(ジペプチジルペプチダーゼ-IV)阻害剤、糖新生および/またはグリコーゲン分解の刺激に関与する肝酵素阻害剤、グルコース取込みモジュレーター、脂質代謝を変化させる化合物、例えば、抗高脂血症剤、例えば、HMG CoA阻害剤(スタチン)、胃抑制ポリペプチド(GIP類似体)、食物摂取量を減少させる化合物、RXRアゴニスト、およびβ細胞のATP-依存性カリウムチャネルに対して作用する薬剤;コレスチラミン、コレスチポール、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、プロブコール、デキストロサイロキシン、ナテグリニド、レパグリニド;β-遮断薬、例えば、アルプレノロール、アテノロール、チモロール、ピンドロール、プロプラノロールおよびメトプロロール、ACE(アンジオテンシン変換酵素)阻害剤、例えば、ベナゼプリル、カプトプリル、エナラプリル、フォシノプリル、リシノプリル、アラトリオプリル、キナプリルおよびラミプリル、カルシウムチャネル遮断薬、例えば、ニフェジピン、フェロジピン、ニカルジピン、イスラジピン、ニモジピン、ジルチアゼムおよびベラパミル、ならびにα-遮断薬、例えば、ドキサゾシン、ウラピジル、プラゾシンおよびテラゾシン;CART(コカインアンフェタミン制御転写物)アゴニスト、NPY(ニューロペプチドY)アンタゴニスト、PYYアゴニスト、Y2受容体アゴニスト、Y4受容体アゴニスト、混合Y2/Y4受容体アゴニスト、MC4(メラノコルチン4)アゴニスト、オレキシンアンタゴニスト、TNF(腫瘍壊死因子)アゴニスト、CRF(コルチコトロピン放出因子)アゴニスト、CRF BP(コルチコトロピン放出因子結合タンパク質)アンタゴニスト、ウロコルチンアゴニスト、β3ア
ゴニスト、オキシントモジュリンおよび類似体、MSH(メラニン細胞刺激ホルモン)アゴニスト、MCH(メラニン形成細胞濃縮ホルモン)アンタゴニスト、CCK(コレシストキニン)アゴニスト、セロトニン再取込み阻害剤、セロトニンおよびノルアドレナリン再取込み阻害剤、混合セロトニンおよびノルアドレナリン作動性化合物、5HT(セロトニン)アゴニスト、ボンベシンアゴニスト、ガラニンアンタゴニスト、成長ホルモン、成長ホルモン放出化合物、TRH(甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン)アゴニスト、UCP2または3(脱共役タンパク質2または3)モジュレーター、レプチンアゴニスト、DAアゴニスト(ブロモクリプチン、ドプレキシン)、リパーゼ/アミラーゼ阻害剤、RXR(レチノイドX受容体)モジュレーター、TRβアゴニスト;ヒスタミンH3アンタゴニスト、胃抑制ポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニスト(GIP類似体)、ガストリンおよびガストリン類似体である。
【０１８１】
本発明による誘導体による治療はまた、グルコースレベル、および/または脂質恒常性に影響を与える手術、例えば、胃緊縛または胃バイパスと合わせてもよい。
【０１８２】
医薬品の適応症
第3の態様において、本発明はまた、医薬として使用するための本発明の誘導体に関する。
【０１８３】
特定の実施形態では、本発明の誘導体は、好ましくは全てがどちらにしても糖尿病に関連する、下記の医学的治療のために使用してもよい。
(i)全ての形態の糖尿病、例えば、高血糖症、2型糖尿病、耐糖能異常、1型糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、MODY(若年者の成人発症型糖尿病)、妊娠糖尿病の予防および/または治療、ならびに/あるいはHbA1Cの低下;
(ii)糖尿病性疾患の進行(2型糖尿病の進行など)の遅延または予防、耐糖能異常(IGT)からインスリンを必要とする2型糖尿病への進行の遅延、および/またはインスリンを必要としない2型糖尿病からインスリンを必要とする2型糖尿病への進行の遅延;
(iii)β細胞機能の改善、例えば、β細胞のアポトーシスの減少、β細胞機能および/またはβ細胞塊の増加、ならびに/あるいはβ細胞に対するグルコース感受性の回復;
(iv)認知障害の予防および/または治療;
(v)例えば、食物摂取量を減少させ、体重を低下させ、食欲を抑制し、満腹を誘発し;過食障害、神経性過食症、および/または抗精神病剤もしくはステロイドの投与によって誘発される肥満症を治療または予防し;胃運動性を低下させ;かつ/あるいは胃内容物排出を遅延させることによる、摂食障害、例えば、肥満症の予防および/または治療;
(vi)糖尿病性合併症、例えば、末梢性ニューロパシーを含めたニューロパシー;ネフロパシー;あるいは網膜症の予防および/または治療;
(vii)脂質パラメーターの改善、例えば、異脂肪血症の予防および/または治療、総血清脂質の低下;HDLの低下;小さく密なLDLの低下;VLDLの低下:トリグリセリドの低下;コレステロールの低下;HDLの増加;ヒトにおけるリポタンパク質(Lp(a))の血漿レベルの低下;インビトロおよび/またはインビボでのアポリポタンパク質(apo(a))の生成の阻害;
(iix)心血管疾患、例えば、症候群X;アテローム性動脈硬化症;心筋梗塞;冠動脈心疾患;脳卒中、脳虚血;早期心臓疾患もしくは早期心血管疾患、例えば、左室肥大;冠動脈疾患;本態性高血圧症;急性高血圧性緊急症;心筋症;心臓不全;運動耐性;慢性心不全;不整脈;心律動異常;失神;アテローム性動脈硬化症;軽度の慢性心不全;狭心症;心臓バイパス再閉塞;間欠性跛行(閉塞性動脈硬化症);拡張機能障害;および/または収縮機能障害の予防および/または治療;
(ix)胃腸疾患、例えば、炎症性腸症候群;小腸症候群、もしくはクローン病;消化不良;および/または胃潰瘍の予防および/または治療;
(x)重篤疾患の予防および/または治療、例えば、危篤状態の患者、重篤疾患ポリネフロパシー(CIPNP)患者、および/または潜在的CIPNP患者の治療;重篤疾患またはCIPNPの発生の予防;患者における全身性炎症反応症候群(SIRS)の予防、治療および/または治癒;ならびに/あるいは入院の間に菌血症、敗血症、および/または敗血症性ショックを患う患者の可能性の予防または減少のため;ならびに/あるいは
(xi)多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)の予防および/または治療。
【０１８４】
特定の実施形態において、適応症は、(i)〜(iii)および(v)〜(iix)、例えば、適応症(i)、(ii)、および/もしくは(iii);または適応症(v)、適応症(vi)、適応症(vii)、および/もしくは適応症(iix)からなる群から選択される。
【０１８５】
他の特定の実施形態において、適応症は、(i)である。さらなる特定の実施形態において、適応症は、(v)である。またさらなる特定の実施形態において、適応症は、(iix)である。
【０１８６】
下記の適応症が、特に好ましい:2型糖尿病、および/または肥満症。
【０１８７】
特定の実施形態
下記は、本発明の特定の実施形態である:
1.GLP-1類似体の誘導体であって、
GLP-1類似体は、GLP-1(7-37)(配列番号1)の27位に対応する位置において第1のK残基;GLP-1(7-37)のT位(Tは、18および27以外の7〜37の範囲の整数である)に対応する位置において第2のK残基;ならびにGLP-1(7-37)と比較して、最大で10個のアミノ酸の変化を含み、
第1のK残基は、K27と示され、第2のK残基は、KTと示され、誘導体は、それぞれ、第1および第2のリンカーを介して、それぞれ、K27およびKTに結合している第1および第2の延長部分を含み、
第1および第2の延長部分は、Chem.1およびChem.2
Chem.1:HOOC-(CH2)x-CO-*
Chem.2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
(式中、xは、6〜16の範囲の整数であり、yは、3〜17の範囲の整数である)から選択され、第1および第2のリンカーは、Chem.5:
Chem.5:
【０１８８】
【化７】
0006022538.tif 000009
【０１８９】
(式中、kは、1〜5の範囲の整数であり、nは1〜5の範囲の整数である)を含む、誘導体;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
2.Tが、18および27以外の7〜37の範囲から選択される整数である、実施形態1の誘導体。
3.Tが、7〜17、19〜26、および28〜37の範囲のいずれかから選択される、実施形態1〜2のいずれかの誘導体。
4.Tが、7〜17の範囲から選択される、実施形態1〜3のいずれかの誘導体。
5.Tが、12である、実施形態1〜4のいずれかの誘導体。
6.Tが、19〜26の範囲から選択される、実施形態1〜3のいずれかの誘導体。
7.Tが、20、22、および24からなる群から選択される、実施形態1〜3および6のいずれかの誘導体。
8.Tが、20である、実施形態1〜3、および6〜7のいずれかの誘導体。
9.Tが、22または24である、実施形態1〜3、および6〜7のいずれかの誘導体。
10.Tが、22である、実施形態1〜3、6〜7、および9のいずれかの誘導体。
11.Tが、24である、実施形態1〜3、6〜7、および9のいずれかの誘導体。
12.Tが、28〜37の範囲から選択される、実施形態1〜3のいずれかの誘導体。
13.Tが、36および37からなる群から選択される、実施形態1〜3および12のいずれかの誘導体。
14.Tが、36である、実施形態1〜3、および12〜13のいずれかの誘導体。
15.Tが、37である、実施形態1〜3、および12のいずれかの誘導体。
16.GLP-1(7-37)(配列番号1)の27位に対応する位置が、筆記および目視によって同定される、実施形態1〜16のいずれかの誘導体。
17.GLP-1(7-37)(配列番号1)のT位に対応する位置が、筆記および目視によって同定される、実施形態1〜16のいずれかの誘導体。
18.GLP-1(7-37)(配列番号1)の27位に対応する位置が、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムを使用することによって同定される、実施形態1〜17のいずれかの誘導体。
19.GLP-1(7-37)(配列番号1)のT位に対応する位置が、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムを使用することによって同定される、実施形態1〜18のいずれかの誘導体。
20.アラインメントプログラムが、Needleman-Wunschアラインメントである、実施形態19の誘導体。
21.デフォルトスコアリングマトリックスおよびデフォルト同一性マトリックスが使用される、実施形態19〜20のいずれかの誘導体。
22.スコアリングマトリックスが、BLOSUM62である、実施形態19〜21のいずれかの誘導体。
23.ギャップにおける第1の残基についてのペナルティが、-10(マイナス10)である、実施形態19〜22のいずれかの誘導体。
24.ギャップにおけるさらなる残基についてのペナルティが、-0.5(マイナスポイント5)である、実施形態19〜23のいずれかの誘導体。
25.類似体が、第1および第2のK残基以外のK残基を含まない、実施形態1〜24のいずれかの誘導体。
26.延長部分が、Chem.1である、実施形態1〜25のいずれかの誘導体。
27.xが、偶数である、実施形態1〜26のいずれかの誘導体。
28.xが、12である、実施形態1〜27のいずれかの誘導体。
29.Chem.1が、Chem.1aによって表される、実施形態1〜28のいずれかの誘導体。
Chem.1a:
【０１９０】
【化８】
0006022538.tif 000010
【０１９１】
30.延長部分が、Chem.2である、実施形態1〜25のいずれかの誘導体。
31.Chem.2が、Chem.2aによって表される、実施形態1〜25、および30のいずれかの誘導体。
Chem.2a:
【０１９２】
【化９】
0006022538.tif 000011
【０１９３】
32.yが、奇数である、実施形態1〜25、および30〜31のいずれかの誘導体。
33.yが、9〜11の範囲の整数である、実施形態1〜25、および30〜32のいずれかの誘導体。
34.yが、9である、実施形態1〜25、および30〜33のいずれかの誘導体。
35.yが、11である、実施形態1〜25、および30〜33のいずれかの誘導体。
36.Chem.2が、Chem.2bまたはChem.2cによって表される、実施形態1〜25、および30〜35のいずれかの誘導体。
Chem.2b:
【０１９４】
【化１０】
0006022538.tif 000012
【０１９５】
または、
Chem.2c:
【０１９６】
【化１１】
0006022538.tif 000013
【０１９７】
37.Chem.2が、Chem.2bによって表される、実施形態1〜25、および30〜35のいずれかの誘導体。
38.Chem.2aが、Chem.2bまたはChem.2cによって表される、実施形態31〜35のいずれかの誘導体。
Chem.2b:
【０１９８】
【化１２】
0006022538.tif 000014
【０１９９】
または、
Chem.2c:
【０２００】
【化１３】
0006022538.tif 000015
【０２０１】
39.Chem.2aが、Chem.2bによって表される、実施形態31〜35、および38のいずれかの誘導体。
40.Chem.5が、第1のリンカー要素である、実施形態1〜39のいずれかの誘導体。
41.kが、1である、実施形態1〜40のいずれかの誘導体。
42.nが、1である、実施形態1〜41のいずれかの誘導体。
43.Chem.5が、m回含まれ、mが、1〜10の範囲の整数である、実施形態1〜42のいずれかの誘導体。
44.mが、2である、実施形態43の誘導体。
45.mが1ではないとき、Chem.5要素が、アミド結合を介して相互結合している、実施形態43〜44のいずれかの誘導体。
46.リンカーが、第2のリンカー要素をさらに含む、実施形態1〜45のいずれかの誘導体。
47.第2のリンカー要素が、Gluジラジカルである、実施形態46の誘導体。
48.第2のリンカー要素が、Chem.6および/またはChem.7から選択される、実施形態46〜47のいずれかの誘導体。
Chem.6:
【０２０２】
【化１４】
0006022538.tif 000016
【０２０３】
および／または、
Chem.7:
【０２０４】
【化１５】
0006022538.tif 000017
【０２０５】
49.第2のリンカー要素が、Chem.6である、実施形態48の誘導体。
50.Gluジラジカルが、p回含まれ、pが、1〜2の範囲の整数である、実施形態46〜49のいずれかの誘導体。
51.pが、1である、実施形態50の誘導体。
52.pが、2である、実施形態50の誘導体。
53. Gluジラジカルが、L-Gluのラジカルである、実施形態46〜52のいずれかの誘導体。
54.1つまたは複数のGluジラジカルおよび1つまたは複数のChem.5要素が、アミド結合を介して相互結合している、実施形態46〜53のいずれかの誘導体。
55.リンカーが、m回のChem.5およびp回のGluジラジカルからなる、実施形態46〜54のいずれかの誘導体。
56.(m,p)が、(2,2)または(2,1)である、実施形態55の誘導体。
57.(m,p)が、(2,1)である、実施形態56の誘導体。
58.m回のChem.5要素およびp回のGluジラジカルが、アミド結合を介して相互結合している、実施形態55〜57のいずれかの誘導体。
59.リンカーおよび延長部分が、アミド結合を介して相互結合している、実施形態1〜58のいずれかの誘導体。
60.リンカーおよびGLP-1類似体が、アミド結合を介して相互結合している、実施形態1〜59のいずれかの誘導体。
61.リンカーが、第1または第2のK残基のε-アミノ基に結合している、実施形態1〜60のいずれかの誘導体。
62.リンカーが、5〜41個のC原子を有する、実施形態1〜61のいずれかの誘導体。
63.リンカーが、17または22個のC原子を有する、実施形態1〜62のいずれかの誘導体。
64.リンカーが、17個のC原子を有する、実施形態1〜63のいずれかの誘導体。
65.リンカーが、22個のC原子を有する、実施形態1〜63のいずれかの誘導体。
66.リンカーが、4〜28個のヘテロ原子を有する、実施形態1〜65のいずれかの誘導体。
67.リンカーが、12または16個のヘテロ原子を有する、実施形態1〜66のいずれかの誘導体。
68.リンカーが、12個のヘテロ原子を有する、実施形態1〜67のいずれかの誘導体。
69.リンカーが、16個のヘテロ原子を有する、実施形態1〜67のいずれかの誘導体。
70.ヘテロ原子が、N原子および/またはO原子である、実施形態66〜70のいずれかの誘導体。
71.リンカーが、1〜7個のN原子を有する、実施形態1〜70のいずれかの誘導体。
72.リンカーが、3または4個のN原子を有する、実施形態1〜71のいずれかの誘導体。
73.リンカーが、3個のN原子を有する、実施形態1〜72のいずれかの誘導体。
74.リンカーが、4個のN原子を有する、実施形態1〜72のいずれかの誘導体。
75.リンカーが、3〜21個のO原子を有する、実施形態1〜74のいずれかの誘導体。
76.リンカーが、9または12個のO原子を有する、実施形態1〜75のいずれかの誘導体。
77.リンカーが、9個のO原子を有する、実施形態1〜76のいずれかの誘導体。
78.リンカーが、12個のO原子を有する、実施形態1〜76のいずれかの誘導体。
79.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列において、2回のChem.6、および2回のChem.5からなり、リンカーは、その*-NH末端において延長部分の*-CO末端に結合しており、その*-CO末端においてGLP-1類似体のK27またはKTのεアミノ基に結合している、実施形態1〜78のいずれかの誘導体。
80.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列において、2回のChem.5、および1回のChem.6からなり、リンカーは、その*-NH末端において延長部分の*-CO末端に結合しており、その遊離*-CO末端においてGLP-1類似体のK27またはKTのεアミノ基に結合している、実施形態1〜78のいずれかの誘導体。
81.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列において、1回のChem.6、および2回のChem.5からなり、リンカーは、その*-NH末端において延長部分の*-CO末端に結合しており、その*-CO末端においてGLP-1類似体のK27またはKTのεアミノ基に結合している、実施形態1〜78のいずれかの誘導体。
82.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列において、1回のChem.6、2回のChem.5、および1回のChem.6からなり、リンカーは、その*-NH末端において延長部分の*-CO末端に結合しており、その*-CO末端においてGLP-1類似体のK27またはKTのεアミノ基に結合している、実施形態1〜78のいずれかの誘導体。
83.2つの延長部分が、実質的に同一である、実施形態1〜82のいずれかの誘導体。
84.2つの延長部分が、a)少なくとも80%;b)少なくとも85%;c)少なくとも90%;d)少なくとも95%;またはe)少なくとも99%同一である、実施形態1〜83のいずれかの誘導体。
85.2つの延長部分が、a)少なくとも0.5;b)少なくとも0.6;c)少なくとも0.7;d)少なくとも0.8;e)少なくとも0.9;またはf)少なくとも0.99の類似性を有する、実施形態1〜83のいずれかの誘導体。
86.2つの延長部分が、1.0の類似性を有する、実施形態1〜85のいずれかの誘導体。
87.2つのリンカーが、実質的に同一である、実施形態1〜86のいずれかの誘導体。
88.2つのリンカーが、少なくとも0.5の類似性を有する、実施形態1〜87のいずれかの誘導体。
89.2つのリンカーが、a)少なくとも0.6;b)少なくとも0.7;c)少なくとも0.8;d)少なくとも0.9;またはe)少なくとも0.99の類似性を有する、実施形態1〜88のいずれかの誘導体。
90.2つのリンカーが、1.0の類似性を有する、実施形態1〜89のいずれかの誘導体。
91.延長部分およびリンカーからなる2つの側鎖などの2つのアルブミンバインダーが、実質的に同一である、実施形態1〜90のいずれかの誘導体。
92.延長部分およびリンカーからなる2つの側鎖などの2つのアルブミンバインダーが、a)少なくとも80%、b)少なくとも85%、c)少なくとも90%、d)少なくとも95%、またはe)少なくとも99%同一である、実施形態1〜91のいずれかの誘導体。
93.延長部分およびリンカーからなる2つの側鎖などの2つのアルブミンバインダーが、a)少なくとも0.5;b)少なくとも0.6;c)少なくとも0.7;d)少なくとも0.8;e)少なくとも0.9;またはf)少なくとも0.99の類似性を有する、実施形態1〜92のいずれかの誘導体。
94.延長部分およびリンカーからなる2つの側鎖などの2つのアルブミンバインダーが、1.0の類似性を有する、実施形態1〜92のいずれかの誘導体。
95.比較する2つの化学構造が、フィンガープリントとして表される、実施形態83〜94のいずれかの誘導体。
96.フィンガープリントが、a)ECFP_6フィンガープリント;b)UNITYフィンガープリント;および/またはc)MDLフィンガープリントである、実施形態95の誘導体。
97.谷本係数が、2つのフィンガープリントの類似性または同一性を計算するために好ましくは使用される、実施形態95〜96のいずれかの誘導体。
98.アミノ酸の変化の数が、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、筆記および目視によって同定される、実施形態1〜97のいずれかの誘導体。
99.アミノ酸の変化の数が、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムを使用することによって同定される、実施形態1〜98のいずれかの誘導体。
100.アラインメントプログラムが、Needleman-Wunschアラインメントである、実施形態99の誘導体。
101.デフォルトスコアリングマトリックスおよびデフォルト同一性マトリックスが使用される、実施形態99〜100のいずれかの誘導体。
102.スコアリングマトリックスが、BLOSUM62である、実施形態99〜101のいずれかの誘導体。
103.ギャップにおける第1の残基についてのペナルティが、-10(マイナス10)である、実施形態99〜102のいずれかの誘導体。
104.ギャップにおけるさらなる残基についてのペナルティが、-0.5(マイナスポイント5)である、実施形態99〜103のいずれかの誘導体。
105.アミノ酸の変化が、GLP-1(7-37)(配列番号1)における下記の位置(8、12、20、22、23、24、25、26、27、30、31、34、35、36、37、38、および39)に対応する1つまたは複数の位置にある、実施形態1〜104のいずれかの誘導体。
106.類似体が、下記の変化: Aib8、K12、K20、E22またはK22、E23、K24、V25、R26またはH26、K27、E30、H31、G34またはR34またはQ34、Des35、K36またはDes36、K37またはDes37、E38またはQ38、および/または、G39の少なくとも1つを含む、実施形態1〜105のいずれかの誘導体。
107.第2のK残基が、K12であり、類似体が、変化K27に加えて、i)G34、R34、およびQ34から選択される変化、ならびにii)R26、およびH26から選択される変化をさらに含む、実施形態1〜106のいずれかの誘導体。
108.第2のK残基が、K20であり、類似体が、変化K27に加えて、i) G34、R34、およびQ34から選択される変化、ならびにii)R26、およびH26から選択される変化をさらに含む、実施形態1〜106のいずれかの誘導体。
109.第2のK残基が、K22であり、類似体が、変化K27に加えて、i) G34、R34、およびQ34から選択される変化、ならびにii)R26、およびH26から選択される変化をさらに含む、実施形態1〜106のいずれかの誘導体。
110.第2のK残基が、K24であり、類似体が、変化K27に加えて、i) G34、R34、およびQ34から選択される変化、ならびにii)R26、およびH26から選択される変化をさらに含む、実施形態1〜106のいずれかの誘導体。
111.第2のK残基が、K36であり、類似体が、変化K27に加えて、i) G34、R34、およびQ34から選択される変化、ならびにii)R26、およびH26から選択される変化をさらに含む、実施形態1〜106のいずれかの誘導体。
112.第2のK残基が、K37であり、類似体が、変化K27に加えて、i) G34、R34、およびQ34から選択される変化、ならびにii)R26、およびH26から選択される変化をさらに含む、実施形態1〜106のいずれかの誘導体。
113.類似体が、下記の変化: Aib8、E22、E23、V25、E30、H31、Des35、Des36、Des37、E38またはQ38、および/またはG39の少なくとも1つを含む、実施形態1〜112のいずれかの誘導体。
114.類似体が、Aib8を含む、実施形態1〜113のいずれかの誘導体。
115.類似体が、E22を含む、実施形態1〜114のいずれかの誘導体。
116.類似体が、E23を含む、実施形態1〜115のいずれかの誘導体。
117.類似体が、V25を含む、実施形態1〜116のいずれかの誘導体。
118.類似体が、E30を含む、実施形態1〜117のいずれかの誘導体。
119.類似体が、H31を含む、実施形態1〜118のいずれかの誘導体。
120.類似体が、Des37を含む、実施形態1〜119のいずれかの誘導体。
121.類似体が、Des36を含む、実施形態120の誘導体。
122.類似体が、Des35を含む、実施形態121の誘導体。
123.類似体が、E38またはQ38を含む、実施形態1〜119のいずれかの誘導体。
124.類似体が、Q38を含む、実施形態123の誘導体。
125.類似体が、E38を含む、実施形態123の誘導体。
126.類似体が、G39を含む、実施形態123〜125のいずれかの誘導体。
127.GLP-1(7-34)の誘導体(配列番号1のアミノ酸1〜28)である、実施形態122の誘導体。
128.GLP-1(7-35)の誘導体(配列番号1のアミノ酸1〜29)である、実施形態121の誘導体。
129.GLP-1(7-36)の誘導体(配列番号1のアミノ酸1〜30)である、実施形態120の誘導体。
130.GLP-1(7-37)の誘導体(配列番号1のアミノ酸1〜31)である、実施形態1〜119のいずれかの誘導体。
131.GLP-1(7-38)の誘導体(配列番号1のアミノ酸1〜31、および1つのC末端に付加されたアミノ酸残基)である、実施形態123〜125のいずれかの誘導体。
132.GLP-1(7-39)の誘導体(配列番号1のアミノ酸1〜31、および2つのC末端に付加されたアミノ酸残基)である、実施形態126の誘導体。
133.類似体が、最大で9個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
134.類似体が、最大で8個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
135.類似体が、最大で7個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
136.類似体が、最大で6個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
137.類似体が、最大で5個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
138.類似体が、最大で4個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
139.類似体が、最大で3個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
140.類似体が、最大で2個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
141.類似体が、最大で1個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
142.類似体が、最小で1個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜140のいずれかの誘導体。
143.類似体が、最小で2個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜139のいずれかの誘導体。
144.類似体が、最小で3個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜138のいずれかの誘導体。
145.類似体が、最小で4個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜137のいずれかの誘導体。
146.類似体が、最小で5個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜136のいずれかの誘導体。
147.類似体が、最小で6個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜135のいずれかの誘導体。
148.類似体が、最小で7個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜134のいずれかの誘導体。
149.類似体が、最小で8個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜133のいずれかの誘導体。
150.類似体が、最小で9個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
151.類似体が、1個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
152.類似体が、2個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
153.類似体が、3個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
154.類似体が、4個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
155.類似体が、5個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
156.類似体が、6個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
157.類似体が、7個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
158.類似体が、8個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
159.類似体が、9個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
160.類似体が、10個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
161.変化が、独立に、置換、付加、および/または欠失である、実施形態1〜160のいずれかの誘導体。
162.類似体が、式I
式I:Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Lys-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39
のGLP-1類似体を含み、式中、
Xaa7は、L-ヒスチジン、イミダゾプロピオニル、α-ヒドロキシ-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、Nα-ホルミル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、または4-ピリジルアラニンであり、
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Thr、Ser、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、または(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり、
Xaa12は、LysまたはPheであり、
Xaa16は、ValまたはLeuであり、
Xaa18は、Ser、Arg、Asn、GlnまたはGluであり、
Xaa19は、TyrまたはGlnであり、
Xaa20は、Leu、LysまたはMetであり、
Xaa22は、Gly、Glu、Lys、またはAibであり、
Xaa23は、Gln、Glu、またはArgであり、
Xaa24は、AlaまたはLysであり、
Xaa25は、AlaまたはValであり、
Xaa26は、Val、His、またはArgであり、
Xaa30は、Ala、Glu、またはArgであり、
Xaa31は、TrpまたはHisであり、
Xaa34は、Glu、Asn、Gly、Gln、またはArgであり、
Xaa35は、Gly、Aib、または存在せず、
Xaa36は、Arg、Gly、Lys、または存在せず、
Xaa37は、Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、Arg、または存在せず、
Xaa38は、Ser、Gly、Ala、Glu、Gln、Pro、Arg、または存在せず、
Xaa39は、Glyまたは存在しない、
実施形態1〜161のいずれかの誘導体。
163.類似体が、式IのGLP-1類似体である、実施形態162の誘導体。
164.式Iのペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)の類似体である、実施形態162〜163のいずれかの誘導体。
165.Xaa38が存在しない場合、Xaa39もまた存在しない、実施形態162〜164のいずれかの誘導体。
166.Xaa37が存在しない場合、Xaa38、およびXaa39もまた存在しない、実施形態162〜165のいずれかの誘導体。
167.Xaa36が存在しない場合、Xaa37、Xaa38、およびXaa39もまた存在しない、実施形態162〜166のいずれかの誘導体。
168.Xaa35が存在しない場合、Xaa36、Xaa37、Xaa38、およびXaa39もまた存在しない、実施形態162〜167のいずれかの誘導体。
169.Xaa7が、Hisであり、Xaa8が、AlaまたはAibであり、Xaa12が、LysまたはPheであり、Xaa16が、Valであり、Xaa18が、Serであり、Xaa19が、Tyrであり、Xaa20が、LeuまたはLysであり、Xaa22が、Glu、Gly、またはLysであり、Xaa23が、GlnまたはGluであり、Xaa24が、AlaまたはLysであり、Xaa25が、AlaまたはValであり、Xaa26が、HisまたはArgであり、Xaa30が、AlaまたはGluであり、Xaa31が、TrpまたはHisであり、Xaa34が、Gly、GlnまたはArgであり、Xaa35が、Glyまたは存在せず、Xaa36が、Arg、Lysまたは存在せず、Xaa37が、Gly、Lys、または存在せず、Xaa38が、GluまたはGlnであり、Xaa39が、Glyまたは存在しない、実施形態162〜168のいずれかの誘導体。
170.Xaa7が、Hisである、実施形態162〜169のいずれかの誘導体。
171.Xaa8が、Alaである、実施形態162〜170のいずれかの誘導体。
172.Xaa8が、Aibである、実施形態162〜170のいずれかの誘導体。
173.Xaa12が、Lysである、実施形態162〜172のいずれかの誘導体。
174.Xaa12が、Pheである、実施形態162〜172のいずれかの誘導体。
175.Xaa16が、Valである、実施形態162〜174のいずれかの誘導体。
176.Xaa18が、Serである、実施形態162〜175のいずれかの誘導体。
177.Xaa19が、Tyrである、実施形態162〜176のいずれかの誘導体。
178.Xaa20が、Leuである、実施形態162〜177のいずれかの誘導体。
179.Xaa20が、Lysである、実施形態162〜177のいずれかの誘導体。
180.Xaa22が、Gluである、実施形態162〜179のいずれかの誘導体。
181.Xaa22が、Glyである、実施形態162〜179のいずれかの誘導体。
182.Xaa22が、Lysである、実施形態162〜179のいずれかの誘導体。
183.Xaa23が、Glnである、実施形態162〜182のいずれかの誘導体。
184.Xaa23が、Gluである、実施形態162〜182のいずれかの誘導体。
185.Xaa24が、Alaである、実施形態162〜184のいずれかの誘導体。
186.Xaa24が、Lysである、実施形態162〜184のいずれかの誘導体。
187.Xaa25が、Alaである、実施形態162〜186のいずれかの誘導体。
188.Xaa25が、Valである、実施形態162〜186のいずれかの誘導体。
189.Xaa26が、Hisである、実施形態162〜188のいずれかの誘導体。
190.Xaa26が、Argである、実施形態162〜188のいずれかの誘導体。
191.Xaa30が、Alaである、実施形態162〜190のいずれかの誘導体。
192.Xaa30が、Gluである、実施形態162〜190のいずれかの誘導体。
193.Xaa31が、Trpである、実施形態162〜192のいずれかの誘導体。
194.Xaa31が、Hisである、実施形態162〜192のいずれかの誘導体。
195.Xaa34が、Glyである、実施形態162〜192のいずれかの誘導体。
196.Xaa34が、Glnである、実施形態162〜194のいずれかの誘導体。
197.Xaa34が、Argである、実施形態162〜194のいずれかの誘導体。
198.Xaa35が、Glyである、実施形態162〜197のいずれかの誘導体。
199.Xaa35が、存在しない、実施形態162〜198のいずれかの誘導体。
200.Xaa36が、Argである、実施形態162〜199のいずれかの誘導体。
201.Xaa36が、Lysである、実施形態162〜199のいずれかの誘導体。
202.Xaa36が、存在しない、実施形態162〜199のいずれかの誘導体。
203.Xaa37が、Glyである、実施形態162〜202のいずれかの誘導体。
204.Xaa37が、Lysである、実施形態162〜202のいずれかの誘導体。
205.Xaa37が、存在しない、実施形態162〜202のいずれかの誘導体。
206.Xaa38が、Gluである、実施形態162〜205のいずれかの誘導体。
207.Xaa38が、Glnである、実施形態162〜205のいずれかの誘導体。
208.Xaa38が、存在しない、実施形態162〜205のいずれかの誘導体。
209.Xaa39が、Glyである、実施形態162〜208のいずれかの誘導体。
210.Xaa39が、存在しない、実施形態162〜208のいずれかの誘導体。
211.類似体が、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、下記のアミノ酸の変化:
(i)22E、26R、27K、34R、37K;(ii)22E、26R、27K、30E、34R、36K、38E、39G;(iii)22E、26R、27K、34R、36K、des37;(iv)22E、25V、26R、27K、34R、37K;(v)8Aib、20K、22E、26R、27K、30E、34G、des35-37;(vi)26R、27K、30E、34R、36K、38E;(vii)8Aib、22K、25V、26R、27K、31H、34R;(iix)8Aib、22K、25V、26R、27K、34R、des35-37;(ix)8Aib、22K、25V、26R、27K、34R、des36-37;(x)26H、27K、30E、34R、36K、38E;(xi)22K、25V、26R、27K、30E、34Q;(xii)25V、26R、27K、30E、34R、36K、38Q;(xiii)25V、26R、27K、30E、34Q、36K、38E;(xiv)22K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xv)8Aib、25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(xvi)25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(xvii)22E、23E、25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(iixx)8Aib、12K、22E、26R、27K、31H、34Q;(ixx)8Aib、22K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xx)22E、26H、27K、30E、34R、36K、38E;(xxi)22E、24K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xxii)25V、26R、27K、34Q、36K;(xxiii)22E、24K、25V、26R、27K、31H、34R;(xxiv)22E、24K、25V、26R、27K、34G、des35-37;(xxv)22E、24K、25V、26R、27K、34R;(xxvi)8Aib、22E、24K、25V、26R、27K、31H、34Q;または(xxvii)8Aib、22E、26R、27K、30E、34R、36K、38E、39Gを含む、実施形態1〜210のいずれかの誘導体。
212.類似体が、(i)〜(xxvii)のいずれかで定義される一組のアミノ酸の変化を有する、実施形態211の誘導体。
213.下記から選択される化合物:Chem.50、Chem.51、Chem.52、Chem.53、Chem.54、Chem.55、Chem.56、Chem.57、Chem.58、Chem.59、Chem.60、Chem.61、Chem.62、Chem.63、Chem.64、Chem.65、Chem.66、Chem.67、Chem.68、Chem.69、Chem.70、Chem.71、Chem.72、Chem.73、Chem.74、Chem.75、Chem.76、Chem.77、Chem.78、Chem.79、Chem.80、およびChem.81;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
214.実施形態1〜212のいずれかに記載の化合物である、実施形態213の化合物。
215.その名称によって特徴付けられ、本明細書において実施例1〜32の化合物の名称のそれぞれのリストから選択される化合物;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
216.実施形態1〜214のいずれかに記載の化合物である、実施形態215の化合物。
217.GLP-1活性を有する、実施形態1〜216のいずれかの誘導体。
218.GLP-1活性が、ヒトGLP-1受容体を活性化する能力を意味する、実施形態217の誘導体。
219.ヒトGLP-1受容体の活性化が、インビトロのアッセイにおいて測定される、実施形態217の誘導体。
220.ヒトGLP-1受容体の活性化が、cAMP生成の効力として測定される、実施形態217〜219のいずれかの誘導体。
221.a)10000pM未満、より好ましくは、5000pM未満、さらにより好ましくは、4000pM未満、または最も好ましくは、3000pM未満;
b)2000pM未満、好ましくは、1500pM未満、より好ましくは、1200pM未満、さらにより好ましくは、1000pM未満、または最も好ましくは、500pM未満;
c)400pM未満、好ましくは、300pM未満、より好ましくは、200pM未満、さらにより好ましくは、150pM未満、または最も好ましくは、100pM未満;あるいは
d)80pM未満、好ましくは、60pM未満、より好ましくは、40pM未満、さらにより好ましくは、30pM未満、または最も好ましくは、20pM未満
のEC50に対応する効力を有する、実施形態217〜220のいずれかの誘導体。
222.効力が、ヒトGLP-1受容体を含有する培地におけるcAMPの用量依存的な形成を示す用量反応曲線についてのEC50として決定される、実施形態217〜221のいずれかの誘導体。
223.BHK467-12A(tk-ts13)などの安定的なトランスフェクトされた細胞系である、実施形態219〜222のいずれかの誘導体。
224.cAMPの決定のための機能的受容体アッセイである、実施形態219〜223のいずれかの誘導体。
225.アッセイが、内因的に形成されたcAMPと外因的に加えたビオチン標識cAMPとの間の競合に基づいた、実施形態219〜224のいずれかの誘導体。
226.そのアッセイにおいて、cAMPが、特異的抗体を使用して捕捉される、実施形態219〜225のいずれかの誘導体。
227.アッセイが、AlphaScreen cAMPアッセイである、実施形態219〜226のいずれかの誘導体。
228.アッセイが、実施例33に記載されている、実施形態219〜227のいずれかの誘導体。
229.ヒトGLP-1受容体の活性化が、低アルブミン濃度の存在下での受容体への結合能力として測定され、低アルブミン濃度が、0.005%HSA、または好ましくは、0.001%HSAである、実施形態217〜228のいずれかの誘導体。
230.比[2.0%HSA(高アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC50)を、0.001%HSA(低アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC50)で割った商]が、
a)少なくとも1.0、好ましくは、少なくとも10、さらにより好ましくは、少なくとも25、または最も好ましくは、少なくとも50;
b)少なくとも60、好ましくは、少なくとも70、より好ましくは、少なくとも80、さらにより好ましくは、少なくとも90、または最も好ましくは、少なくとも100;
c)少なくとも125、好ましくは、少なくとも150、より好ましくは、少なくとも200、またより好ましくは、少なくとも250、さらにより好ましくは、少なくとも400、または最も好ましくは、少なくとも500;あるいは
d)少なくとも600、好ましくは、少なくとも800、さらにより好ましくは、少なくとも900、または最も好ましくは、少なくとも1000である、実施形態217〜229のいずれかの誘導体。
231.0.001%HSA(低アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC50)が、
a)1000nM未満、好ましくは、750nM未満、より好ましくは、500nM未満、または最も好ましくは、400nM未満;あるいは
b)300nM未満、好ましくは、250nM未満、より好ましくは、200nM未満、または最も好ましくは、100nM未満;あるいは
c)50.0nM未満、好ましくは、15.0nM未満、より好ましくは10.0nM未満、さらにより好ましくは、5.0nM未満、または最も好ましくは、1.0nM未満
d)0.80nM未満、好ましくは、0.60nM未満、より好ましくは0.40nM未満、さらにより好ましくは、0.30nM未満、または最も好ましくは、0.20nM未満である、実施形態217〜230のいずれかの誘導体。
232.2.0%HSA(高アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC50)が、
a)1000nM未満、より好ましくは、900nM未満、または最も好ましくは、800nM未満;あるいは
b)500nM未満、好ましくは、400nM未満、より好ましくは、300nM未満、さらにより好ましくは、150nM未満、または最も好ましくは、50.0nM未満である、実施形態217〜231のいずれかの誘導体。
166.GLP-1受容体への結合親和性を、受容体からの125I-GLP-1の移動によって測定する、実施形態217〜232のいずれかの誘導体。
233.SPA結合アッセイが使用される、実施形態217〜232のいずれかの誘導体。
234.GLP-1受容体を、安定的なトランスフェクトされた細胞系を使用して調製する、実施形態217〜233のいずれかの誘導体。
235.ハムスター細胞系、好ましくは、ベビーハムスター腎細胞系、例えば、BHK tk-ts13が使用される、実施形態217〜234のいずれかの誘導体。
236.IC50値が、受容体からの125I-GLP-1の50%を移動させる濃度として決定される、実施形態229〜235のいずれかの誘導体。
237.セマグルチドの経口バイオアベイラビリティーより高い、経口バイオアベイラビリティー、好ましくは、絶対的経口バイオアベイラビリティーを有する、実施形態1〜236のいずれかの誘導体。
238.経口バイオアベイラビリティーを、ラットにおいてインビボで測定する、実施形態237の誘導体。
239.経口バイオアベイラビリティーを、腸管腔中への直接の注入後の血漿中曝露として測定する、実施形態237〜239のいずれかの誘導体。
240.ラットの空腸への誘導体の溶液の注入の30分後に決定した誘導体の血漿濃度(pM)を、注入した溶液の濃度(μM)(30分での用量補正した曝露)で割った商が、a)少なくとも39、b)少なくとも40、c)少なくとも60、d)少なくとも80、e)少なくとも100、f)少なくとも125、またはg)少なくとも150である、実施形態237〜239のいずれかの誘導体。
241.ラットの空腸への誘導体の溶液の注入の30分後に決定した誘導体の血漿濃度(pM)を、注入した溶液の濃度(μM)(30分での用量補正した曝露)で割った商が、a)少なくとも160、b)少なくとも180、c)少なくとも200、またはd)少なくとも250である、実施形態237〜240のいずれかの誘導体。
242.GLP-1誘導体を、55mg/mlのカプリン酸ナトリウムと混合して、1000uMの濃度で試験する、実施形態237〜241のいずれかの誘導体。
243.雄性Sprague Dawleyラットが使用される、実施形態237〜242のいずれかの誘導体。
244.ラットが、概ね240gの到着時の体重を有する、実施形態237〜243のいずれかの誘導体。
245.ラットを、実験の前に概ね18時間絶食させる、実施形態237〜244のいずれかの誘導体。
246.絶食させた後、および空腸中への誘導体の注入前に、ラットに全身麻酔をかける、実施形態237〜245のいずれかの誘導体。
247.誘導体を、空腸の近位部(十二指腸について10cm遠位)または中腸(盲腸について50cm近位)に投与する、実施形態237〜246のいずれかの誘導体。
248.100μlの誘導体を、シリンジを有するカテーテルを通して空腸管腔中に注入し、続いて200μlの空気を、別のシリンジで空腸管腔中に押し入れ、次いでカテーテルへの逆流を防止するために、これをカテーテルに結合したままとする、実施形態237〜247のいずれかの誘導体。
249.血液試料(200ul)を、尾静脈からEDTAチューブ中に所望の間隔(0分、10分、30分、60分、120分および240分などの時点)で集め、5分遠心分離する(10000G、4℃で20分以内)、実施形態237〜248のいずれかの誘導体。
250.血漿(例えば、75ul)を分離し、直ちに冷凍し、誘導体の血漿濃度について分析するまで-20℃で保持する、実施形態237〜249のいずれかの誘導体。
251.LOCI(発光酸素チャネリング免疫アッセイ)を、誘導体の血漿濃度を分析するために使用する、実施形態237〜250のいずれかの誘導体。
252.誘導体が、db/dbマウスにおいて血中グルコースをインビボで低下させるのに有効である、実施形態1〜251のいずれかの誘導体。
253.誘導体が、db/dbマウスにおいて体重をインビボで低下させるのに有効である、実施形態1〜252のいずれかの誘導体。
254.db/dbマウスを、適切な範囲の用量のGLP-1誘導体でs.c.処置し、血中グルコースおよび/または体重を適正な間隔で決定する、実施形態252〜253のいずれかの誘導体。
255.GLP-1誘導体の用量が、0.3nmol/kg、1.0nmol/kg、3.0nmol/kg、10nmol/kg、30nmol/kg、および100nmol/kgであり、kgが、マウスの体重を意味する、実施形態252〜254のいずれかの誘導体。
256.対照群を、ビヒクル(s.c.)、好ましくは、GLP-1誘導体が溶解される培地(例えば、下記の組成(50mMのリン酸ナトリウム、145mMの塩化ナトリウム、0.05%Tween80、pH7.4)を有する)で処置する、実施形態252〜255のいずれかの誘導体。
257.-1/2時間の時点(投与(t=0)の30分前)で、ならびに1時間、2時間、4時間、および8時間の時点で、血中グルコースを決定し、かつ/またはマウスを秤量する、実施形態252〜256のいずれかの誘導体。
258.グルコースオキシダーゼ法を使用して、グルコース濃度を測定する、実施形態252〜257のいずれかの誘導体。
259.(i)ED50(体重(BW))を、誘導体の皮下投与の8時間後の、δ(例えば、減少)BWに対する最大半量効果を生じさせる用量として計算し;かつ/または
(ii)ED50(血中グルコース(BG))を、類似体の皮下投与の8時間および/または24時間後の、AUC(曲線下面積)δ(例えば、減少)BGに対して最大半量効果を生じさせる用量として計算する、実施形態252〜258のいずれかの誘導体。
260.好ましくは、最大反応を明確に定義して、シグモイド用量反応関係が存在する、実施形態252〜259のいずれかの誘導体。
261.リラグルチドより延長性の作用プロファイルを有する、実施形態1〜260のいずれかの誘導体。
262.延長とは、関連する動物種におけるインビボでの半減期を意味する、実施形態261の誘導体。
263.動物が、a)db/dbマウス、b)ラット、c)ブタ、および/または、d)ミニブタである、実施形態261〜262のいずれかの誘導体。
264.動物が、ミニブタである、実施形態263の誘導体。
265.誘導体を、i)s.c.、および/または、ii)i.v.で投与する、実施形態261〜264のいずれかの誘導体。
266.誘導体を、i.v.で投与する、実施形態1〜265のいずれかの誘導体。
267.ミニブタにおけるi.v.投与後の末端半減期(T1/2)が、
a)少なくとも12時間、好ましくは、少なくとも24時間、より好ましくは、少なくとも36時間、さらにより好ましくは、少なくとも48時間、または最も好ましくは、少なくとも60時間;
b)少なくとも7時間、好ましくは、少なくとも16時間、より好ましくは、少なくとも24時間、さらにより好ましくは、少なくとも30時間、または最も好ましくは、少なくとも40時間;
c)少なくとも50時間、好ましくは、少なくとも60時間、より好ましくは、少なくとも70時間、さらにより好ましくは、少なくとも80時間、または最も好ましくは、少なくとも90時間;
である、実施形態1〜266のいずれかの誘導体。
268.ミニブタが、雄性Gottingenミニブタである、実施形態264〜267のいずれかの誘導体。
269.ミニブタが、7〜14カ月齢である、実施形態267〜268のいずれかの誘導体。
270.ミニブタの体重が、16〜35kgである、実施形態267〜269のいずれかの誘導体。
271.ミニブタを、個々に収容し、好ましくは、SDSミニブタ食餌を1日1回または2回摂食させる、実施形態267〜270のいずれかの誘導体。
272.少なくとも2週間の順化の後に、誘導体をi.v.で投与する、実施形態267〜271のいずれかの誘導体。
273.動物を投与の前に概ね18時間、および投与の後に少なくとも4時間絶食させ、全期間の間に水に自由にアクセスさせる、実施形態267〜272のいずれかの誘導体。
274.GLP-1誘導体が、50mMのリン酸ナトリウム、145mMの塩化ナトリウム、0.05%Tween80、pH7.4に、適切な濃度、好ましくは、20〜60nmol/mlで溶解している、実施形態267〜273のいずれかの誘導体。
275.誘導体の静脈内注射が、1〜2nmol/kgに対応する容量で与えられる、実施形態267〜275のいずれかの誘導体。
276.ブタにおいて、食物摂取量の減少をもたらす、実施形態1〜275のいずれかの誘導体。
277.対照、すなわち好ましくは、ビヒクル処置、または未処置に対して摂取量が減少する、実施形態276の誘導体。
278.食物摂取量(0〜24時間)が、a)ビヒクル処置対照に対して、90%以下、b)好ましくは、80%以下、c)より好ましくは、70%以下、d)さらにより好ましくは、60%以下、またはe)最も好ましくは、50%以下である、実施形態276〜277のいずれかの誘導体。
279.食物摂取量(0〜24時間)とは、誘導体またはビヒクルの投与後最初の24時間を意味する、実施形態276〜278のいずれかの誘導体。
280.ブタが、雌性Landrace Yorkshire Duroc(LYD)ブタである、実施形態276〜279のいずれかの誘導体。
281.ブタが、3カ月齢である、実施形態276〜280のいずれかの誘導体。
282.ブタが、30〜35kgの体重を有する、実施形態276〜281のいずれかの誘導体。
283.動物が、順化のために1〜2週間群で収容される、実施形態276〜282のいずれかの誘導体。
284.実験期間の間、動物を、個々の食物摂取量の測定のために月曜日の朝から金曜日の午後まで個々の檻に入れる、実施形態276〜283のいずれかの誘導体。
285.動物にブタ飼料(Svinefoder、Antonioなど)を自由に摂食させる、実施形態276〜284のいずれかの誘導体。
286.好ましくは、Mpigwinシステムを使用して、飼料の重量を15分毎にロギングすることによって、食物摂取量をオンラインでモニターする、実施形態276〜285のいずれかの誘導体。
287.0.3nmol/kg、1.0nmol/kg、3.0nmol/kg、10nmol/kg、または30nmol/kgで投与する、実施形態276〜286のいずれかの誘導体。
288.好ましくは、12nmol/ml、40nmol/ml、120nmol/ml、400nmol/ml、または1200nmol/mlの濃度で、リン酸緩衝液(50mMのホスフェート、145mMの塩化ナトリウム、0.05%Tween80、pH8)に溶解させる、実施形態276〜287のいずれかの誘導体。
289.リン酸緩衝液が、ビヒクルとしての役割を果たす、実施形態276〜288のいずれかの誘導体。
290.動物に1日目の朝に、誘導体またはビヒクルの単回皮下用量(好ましくは、0.025ml/kgの投与容量)を投与し、食物摂取量を、投与後に4日間測定する、実施形態276〜289のいずれかの誘導体。
291.a)少なくとも4時間、b)少なくとも6時間、c)少なくとも8時間、またはd)少なくとも10時間の、i.v.投与後のラットにおけるインビボでの半減期(T1/2)を有する、実施形態1〜290のいずれかの誘導体。
292.a)少なくとも12時間、b)少なくとも15時間、c)少なくとも18時間、またはd)少なくとも20時間の、i.v.投与後のラットにおけるインビボでの半減期(T1/2)を有する、実施形態1〜291のいずれかの誘導体。
293.a)少なくとも24時間、b)少なくとも26時間、またはc)少なくとも30時間の、i.v.投与後のラットにおけるインビボでの半減期(T1/2)を有する、実施形態1〜292のいずれかの誘導体。
294.ラットが、概ね400gの体重を有する雄性Sprague-Dawleyラットである、実施形態291〜294のいずれかの誘導体。
294.30〜180分の時点の用量補正した(すなわち、注入した誘導体の用量(pmol)で割った)血漿曝露曲線(すなわち、時間に対する血漿中濃度(pM))のAUCを決定する(すなわち、結果は、(分×pM/pmol)または単純に分/Lで示す)、実施形態238〜294のいずれかの誘導体。
295.用量補正した血漿曝露曲線のAUCが、
a)少なくとも50分/L、好ましくは少なくとも100分/L、またはより好ましくは少なくとも150分/Lであり、
b)少なくとも200分/L、好ましくは少なくとも250分/L、より好ましくは少なくとも300分/L、または最も好ましくは少なくとも320分/Lであり、あるいは
c)セマグルチドについての対応するAUC値の少なくとも1.5倍、好ましくは少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも3倍、または最も好ましくは少なくとも4倍である、実施形態294の誘導体。
296.経口バイオアベイラビリティーを、経口胃管栄養法後の血漿中曝露としてラットにおいてインビボで測定する、実施形態1〜295のいずれかの誘導体。
297.30〜180分の時点の用量補正した(すなわち、投与した誘導体の用量(pmol)で割った)血漿曝露曲線(すなわち、時間に対する血漿中濃度(pM))のAUCを決定する(すなわち、結果は、(分×pM/pmol)または単純に分/Lで示し得る)、実施形態296の誘導体。
298.用量補正した血漿曝露曲線のAUCが、
a)少なくとも10分/L、好ましくは少なくとも20分/L、またはより好ましくは少なくとも30分/Lであり、
b)少なくとも40分/L、好ましくは少なくとも50分/L、より好ましくは少なくとも60分/L、または最も好ましくは少なくとも70分/Lであり、あるいは
c)セマグルチドについての対応するAUC値の少なくとも1.5倍、好ましくは少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも3倍、または最も好ましくは少なくとも4倍である、実施形態297の誘導体。
299.GLP-1誘導体を、250mg/mlのN-[8-(2-ヒドロキシベンゾイル)アミノ]カプリル酸ナトリウム(SNAC)の溶液中で約1000uMの濃度で試験する、実施形態294〜298のいずれかの誘導体。
300.好ましくは、概ね240gの到着時の体重を有する雄性Sprague-Dawleyラットを使用する、実施形態294〜299のいずれかの誘導体。
301.ラットを実験前に概ね18時間絶食させる、実施形態294〜300のいずれかの誘導体。
302.絶食させた後、およびそれぞれ、空腸への誘導体の注入、または経口胃管栄養法の前に、ラットに全身麻酔をかける、実施形態294〜301のいずれかの誘導体。
303.腸管腔への注入のために、誘導体を、空腸の近位部(十二指腸について10cm遠位)または中腸(盲腸について50cm近位)に、好ましくは空腸の近位部に投与する、実施形態294〜302のいずれかの誘導体。
304.100μlの誘導体を、1mlのシリンジを有するカテーテルを通して空腸管腔中に注入し、続いて200μlの空気を、別のシリンジで空腸管腔中に押し入れ、次いでカテーテルへの逆流を防止するために、これをカテーテルに結合したままとする、実施形態294〜303のいずれかの誘導体。
305.血液試料(200ul)を、尾静脈からEDTAチューブ中に所望の間隔(0分、10分、30分、60分、120分および240分などの時点)で集め、5分遠心分離する(10000G、4℃で20分以内)、実施形態294〜304のいずれかの誘導体。
306.血漿(例えば、75ul)を分離し、直ちに冷凍し、誘導体の血漿濃度について分析するまで-20℃に保持する、実施形態294〜305のいずれかの誘導体。
307.LOCI(発光酸素チャネリング免疫アッセイ)を、誘導体の血漿濃度を分析するために使用する、実施形態294〜306のいずれかの誘導体。
308.GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、下記の変化:(i)38Q;および/または(ii)39Gを含む、GLP-1類似体;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルの形態の中間生成物。
309.(38E、39G)を含む、実施形態308のGLP-1類似体。
310.GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して下記のアミノ酸の変化: (i)22E、26R、27K、34R、37K;(ii)22E、26R、27K、30E、34R、36K、38E、39G;(iii)22E、26R、27K、34R、36K、des37;(iv)22E、25V、26R、27K、34R、37K;(v)8Aib、20K、22E、26R、27K、30E、34G、des35-37;(vi)26R、27K、30E、34R、36K、38E;(vii)8Aib、22K、25V、26R、27K、31H、34R;(iix)8Aib、22K、25V、26R、27K、34R、des35-37;(ix)8Aib、22K、25V、26R、27K、34R、des36-37;(x)26H、27K、30E、34R、36K、38E;(xi)22K、25V、26R、27K、30E、34Q;(xii)25V、26R、27K、30E、34R、36K、38Q;(xiii)25V、26R、27K、30E、34Q、36K、38E;(xiv)22K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xv)8Aib、25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(xvi)25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(xvii)22E、23E、25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(iixx)8Aib、12K、22E、26R、27K、31H、34Q;(ixx)8Aib、22K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xx)22E、26H、27K、30E、34R、36K、38E;(xxi)22E、24K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xxii)25V、26R、27K、34Q、36K;(xxiii)22E、24K、25V、26R、27K、31H、34R;(xxiv)22E、24K、25V、26R、27K、34G、des35-37;(xxv)22E、24K、25V、26R、27K、34R;(xxvi)8Aib、22E、24K、25V、26R、27K、31H、34Q;または(xxvii)8Aib、22E、26R、27K、30E、34R、36K、38E、39G;を含む、GLP-1類似体の形態の中間生成物;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
311.(i)〜(xxvii)のいずれかにおいて定義するような一組のアミノ酸の変化を有する、実施形態310のGLP-類似体。
312.医薬として使用するための、実施形態1〜307のいずれかの誘導体。
313.全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群の治療および/もしくは予防において使用するため、ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための、実施形態1〜307のいずれかの誘導体。
314.医薬的活性量の実施形態1〜307のいずれかに記載の誘導体を投与することにより、全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群を治療もしくは予防するための、ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための方法。
下記は、本発明のさらなる特定の実施形態である。
1. GLP-1類似体の誘導体であって、
類似体は、GLP-1(7-37)(配列番号1)の27位に対応する位置において第1のK残基;GLP-1(7-37)(配列番号1)のT位(Tは、18および27以外の7〜37の範囲の整数である)に対応する位置において第2のK残基;ならびにGLP-1(7-37)と比較して最大で10個のアミノ酸の変化を含み、第1のK残基は、K27と示され、第2のK残基は、KTと示され、
誘導体は、それぞれ、K27およびKTに結合している2つのアルブミン結合部分を含み、
アルブミン結合部分は、Chem.1およびChem.2:
Chem.1:HOOC-(CH2)x-CO-*
Chem.2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
(式中、xは、6〜18の範囲の整数であり、yは、3〜17の範囲の整数であり、ただし、延長部分がChem.1の場合、アルブミン結合部分は式Chem.5のリンカーをさらに含む)から選択される延長部分を含み、
Chem.5:
【０２０６】
【化１６】
0006022538.tif 000018
【０２０７】
(式中、kは、1〜5の範囲の整数であり、nは、1〜5の範囲の整数である)を含む、誘導体;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
2.実施形態1の誘導体であって、
GLP-1類似体は、GLP-1(7-37)(配列番号1)の27位に対応する位置において第1のK残基;GLP-1(7-37)のT位(Tは、18および27以外の7〜37の範囲の整数である)に対応する位置において第2のK残基;ならびにGLP-1(7-37)と比較して、最大で10個のアミノ酸の変化を含み、
第1のK残基は、K27と示され、第2のK残基は、KTと示され、
誘導体は、それぞれ、K27およびKTに結合している2つのアルブミン結合部分を含み、
アルブミン結合部分は、Chem.2:
Chem.2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
(式中、yは、3〜17の範囲の整数である)の  延長部分を含む誘導体;
またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
3.アルブミン結合部分が、リンカーをさらに含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
4.リンカーが、i)Gluジラジカル;および/またはii)式Chem.5:
Chem.5:
【０２０８】
【化１７】
0006022538.tif 000019
【０２０９】
(式中、kは、1〜5の範囲の整数であり、nは、1〜5の範囲の整数である)のリンカーを含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
5.Gluジラジカルが、Chem.6、および/またはChem.7:
Chem.6:
【０２１０】
【化１８】
0006022538.tif 000020
Chem.7:
【０２１１】
【化１９】
0006022538.tif 000021
【０２１２】
好ましくはChem.6から選択される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
6.上記の実施形態のいずれかの誘導体であって、
GLP-1類似体は、GLP-1(7-37)(配列番号1)の27位に対応する位置において第1のK残基;GLP-1(7-37)のT位(Tは、18および27以外の7〜37の範囲の整数である)に対応する位置において第2のK残基;ならびにGLP-1(7-37)と比較して、最大で10個のアミノ酸の変化を含み、
第1のK残基は、K27と示され、第2のK残基は、KTと示され、
誘導体は、それぞれ、K27およびKTに結合している2つのアルブミン結合部分を含み、
アルブミン結合部分は、
i)式Chem.1:
Chem.1:HOOC-(CH2)x-CO-*
(式中、xは、6〜18の範囲の整数である)  の延長部分;および
ii)式Chem.5:
Chem.5:
【０２１３】
【化２０】
0006022538.tif 000022
【０２１４】
(式中、kは、1〜5の範囲の整数であり、nは、1〜5の範囲の整数である)  のリンカーを含む、誘導体;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
7.上記の実施形態のいずれかの誘導体であって、
GLP-1類似体は、GLP-1(7-37)(配列番号1)の27位に対応する位置において第1のK残基;GLP-1(7-37)のT位(Tは、18および27以外の7〜37の範囲の整数である)に対応する位置において第2のK残基;ならびにGLP-1(7-37)と比較して、最大で10個のアミノ酸の変化を含み、
第1のK残基は、K27と示され、第2のK残基は、KTと示され、
誘導体は、リンカーを介して、それぞれ、K27およびKTに結合している2つの延長部分を含み、
延長部分は、Chem.1およびChem.2:
Chem.1:HOOC-(CH2)x-CO-*
Chem.2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
(式中、xは、6〜18の範囲の整数であり、yは、3〜17の範囲の整数である)から選択され、リンカーは、Chem.5:
Chem.5:
【０２１５】
【化２１】
0006022538.tif 000023
【０２１６】
(式中、kは、1〜5の範囲の整数であり、nは、1〜5の範囲の整数である)を含む、誘導体;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
8.Tが、18および27以外の7〜37の範囲から選択される整数である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
9.Tが、7〜17、19〜26、および28〜37の範囲のいずれかから選択される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
10.Tが、7〜17の範囲から選択される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
11.Tが、12である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
12.Tが、19〜26の範囲から選択される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
13.Tが、20、22、および24からなる群から選択される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
14.Tが、20である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
15.Tが、22または24である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
16.Tが、22である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
17.Tが、24である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
18.Tが、28〜37の範囲から選択される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
19.Tが、36および37からなる群から選択される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
20.Tが、36である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
21.Tが、37である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
22.GLP-1(7-37)(配列番号1)の27位に対応する位置が、筆記および目視によって同定される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
23.GLP-1(7-37)(配列番号1)のT位に対応する位置が、筆記および目視によって同定される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
24.GLP-1(7-37)(配列番号1)の27位に対応する位置が、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムを使用することによって同定される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
25.GLP-1(7-37)(配列番号1)のT位に対応する位置が、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムを使用することによって同定される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
26.アラインメントプログラムが、Needleman-Wunschアラインメントである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
27.デフォルトスコアリングマトリックスおよびデフォルト同一性マトリックスが使用される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
28.スコアリングマトリックスが、BLOSUM62である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
29.ギャップにおける第1の残基についてのペナルティが、-10(マイナス10)である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
30.ギャップにおけるさらなる残基についてのペナルティが、-0.5(マイナスポイント5)である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
31.類似体が、第1および第2のK残基以外のK残基を含まない、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
32.延長部分が、Chem.1である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
33.xが、偶数である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
34.xが、12である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
35.Chem.1が、Chem.1a:
Chem.1a:
【０２１７】
【化２２】
0006022538.tif 000024
【０２１８】
(式中、xは、上記の実施形態のいずれかにおいて定義されている通りである)によって表される、上記の実施形態のいずれか1つの誘導体。
36.延長部分が、Chem.2、好ましくはChem.2a:
Chem.2a:
【０２１９】
【化２３】
0006022538.tif 000025
【０２２０】
(式中、yは、上記の実施形態のいずれかにおいて定義されている通りである)である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
37.yが、奇数である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
38.yが、9である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
39.Chem.2が、Chem.2bまたはChem.2c:
Chem.2b:
【０２２１】
【化２４】
0006022538.tif 000026
【０２２２】
Chem.2c:
【０２２３】
【化２５】
0006022538.tif 000027
【０２２４】
好ましくはChem.2b (式中、yは、上記の実施形態のいずれかにおいて定義されている通りである)によって表される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
39a.Chem.2aが、Chem.2bまたはChem.2c:
Chem.2b:
【０２２５】
【化２６】
0006022538.tif 000028
【０２２６】
Chem.2c:
【０２２７】
【化２７】
0006022538.tif 000029
【０２２８】
好ましくはChem.2b (式中、yは、前記実施形態のいずれかにおいて定義されている通りである)によって表される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
40.Chem.5を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
41.Chem.5が、第1のリンカー要素である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
42.kが、1である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
43.nが、1である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
44.Chem.5が、m回含まれ、mが、1〜10の範囲の整数である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
45.mが、2である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
46.mが1ではないとき、Chem.5要素が、アミド結合を介して相互結合している、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
47.リンカーが、第2のリンカー要素、好ましくは、Gluジラジカル、より好ましくは、Chem.6、および/またはChem.7:
Chem.6:
【０２２９】
【化２８】
0006022538.tif 000030
【０２３０】
Chem.7:
【０２３１】
【化２９】
0006022538.tif 000031
【０２３２】
から選択され、最も好ましくは、Chem.6をさらに含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
48.Gluジラジカルが、p回含まれ、pが、1〜2の範囲の整数である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
49.pが、1である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
50.pが、2である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
51. Gluジラジカルが、L-Gluのラジカルである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
52.1つまたは複数のGluジラジカルおよび1つまたは複数のChem.5要素が、アミド結合を介して相互結合している、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
53.リンカーが、m回のChem.5およびp回のGluジラジカルからなる、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
54.(m,p)が、(2,2)または(2,1)、好ましくは(2,1)である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
55.m回のChem.5要素およびp回のGluジラジカルが、アミド結合を介して相互結合している、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
56.リンカーおよび延長部分が、アミド結合を介して相互結合している、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
57.リンカーおよびGLP-1類似体が、アミド結合を介して相互結合している、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
58.リンカーが、第1または第2のK残基のε-アミノ基に結合している、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
59.リンカーが、5〜41個のC原子、好ましくは17または22個C原子を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
60.リンカーが、17個のC原子を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
61.リンカーが、22個のC原子を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
62.リンカーが、4〜28個のヘテロ原子、好ましくは12または16個のヘテロ原子を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
63.リンカーが、12個のヘテロ原子を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
64.リンカーが、16個のヘテロ原子を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
65.ヘテロ原子が、N原子および/またはO原子である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
66.リンカーが、1〜7個のN原子、好ましくは3または4個のN原子を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
67.リンカーが、3個のN原子を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
68.リンカーが、4個のN原子を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
69.リンカーが、3〜21個のO原子、好ましくは9または12個のO原子を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
70.リンカーが、9個のO原子を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
71.リンカーが、12個のO原子を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
72.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列において、2回のChem.6、および2回のChem.5からなり、リンカーは、その*-NH末端において延長部分の*-CO末端に結合しており、その*-CO末端においてGLP-1類似体のK27またはKTのεアミノ基に結合している、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
73.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列において、2回のChem.5、および1回のChem.6からなり、リンカーは、その*-NH末端において延長部分の*-CO末端に結合しており、その遊離*-CO末端においてGLP-1類似体のK27またはKTのεアミノ基に結合している、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
74.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列において、1回のChem.6、および2回のChem.5からなり、リンカーは、その*-NH末端において延長部分の*-CO末端に結合しており、その*-CO末端においてGLP-1類似体のK27またはKTのεアミノ基に結合している、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
75.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列において、1回のChem.6、2回のChem.5、および1回のChem.6からなり、リンカーは、その*-NH末端において延長部分の*-CO末端に結合しており、その*-CO末端においてGLP-1類似体のK27またはKTのεアミノ基に結合している、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
76.2つの延長部分が、実質的に同一である、例えば、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
77.2つの延長部分が、少なくとも0.5;好ましくは、少なくとも0.6;より好ましくは、少なくとも0.7、または少なくとも0.8;さらにより好ましくは、少なくとも0.9;または最も好ましくは、少なくとも0.99の類似性、例えば、1.0の類似性を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
78.2つのリンカーが、少なくとも0.5;好ましくは、少なくとも0.6;より好ましくは、少なくとも0.7、または少なくとも0.8;さらにより好ましくは、少なくとも0.9;または最も好ましくは、少なくとも0.99の類似性、例えば、1.0の類似性を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
79.延長部分およびリンカーからなる2つの側鎖などの2つのアルブミンバインダーが、実質的に同一である、例えば、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
80.延長部分およびリンカーからなる2つの側鎖などの2つのアルブミンバインダーが、少なくとも0.5;好ましくは、少なくとも0.6;より好ましくは、少なくとも0.7、または少なくとも0.8;さらにより好ましくは、少なくとも0.9;または最も好ましくは、少なくとも0.99の類似性、例えば、1.0の類似性を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
81.比較する2つの化学構造が、フィンガープリント、例えば、a)ECFP_6フィンガープリント;b)UNITYフィンガープリント;および/またはc)MDLフィンガープリントとして表され、a)、b)およびc)のそれぞれについて、谷本係数が、2つのフィンガープリントの類似性または同一性を計算するために好ましくは使用される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
82.アミノ酸の変化の数が、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、筆記および目視によって同定される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
83.アミノ酸の変化の数が、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムを使用することによって同定される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
84.アラインメントプログラムが、Needleman-Wunschアラインメントである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
85.デフォルトスコアリングマトリックスおよびデフォルト同一性マトリックスが使用される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
86.スコアリングマトリックスが、BLOSUM62である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
87.ギャップにおける第1の残基についてのペナルティが、-10(マイナス10)である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
88.ギャップにおけるさらなる残基についてのペナルティが、-0.5(マイナスポイント5)である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
89.アミノ酸の変化が、GLP-1(7-37)(配列番号1)における下記の位置(8、12、20、22、23、24、25、26、27、30、31、34、35、36、37、38、および39)に対応する1つまたは複数の位置にある、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
90.類似体が、下記の変化: Aib8、K12、K20、E22またはK22、E23、K24、V25、R26またはH26、K27、E30、H31、G34またはR34またはQ34、Des35、K36またはDes36、K37またはDes37、E38またはQ38、および/または、G39の少なくとも1つを含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
91.第2のK残基が、K12であり、類似体が、変化K27に加えて、i)G34、およびQ34から選択される変化、ならびにii)R26およびH26から選択される変化をさらに含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
92.第2のK残基が、K20であり、類似体が、変化K27に加えて、i)G34、およびQ34から選択される変化、ならびにii)R26、およびH26から選択される変化をさらに含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
93.第2のK残基が、K22であり、類似体が、変化K27に加えて、i)G34、およびQ34から選択される変化、ならびにii)R26、およびH26から選択される変化をさらに含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
94.第2のK残基が、K24であり、類似体が、変化K27に加えて、i)G34、およびQ34から選択される変化、ならびにii)R26、およびH26から選択される変化をさらに含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
95.第2のK残基が、K36であり、類似体が、変化K27に加えて、i)G34、およびQ34から選択される変化、ならびにii)R26、およびH26から選択される変化をさらに含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
96.第2のK残基が、K37であり、類似体が、変化K27に加えて、i)G34、およびQ34から選択される変化、ならびにii)R26、およびH26から選択される変化をさらに含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
97.類似体が、下記の変化: Aib8、E22、E23、V25、E30、H31、Des35、Des36、Des37、E38またはQ38、および/またはG39の少なくとも1つを含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
98.類似体が、Aib8を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
99.類似体が、E22を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
100.類似体が、E23を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
101.類似体が、V25を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
102.類似体が、E30を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
103.類似体が、H31を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
104.類似体が、Des35を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
105.類似体が、Des36を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
106.類似体が、Des37を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
107.類似体が、E38またはQ38、好ましくはQ38、より好ましくはE38を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
108.類似体が、G39を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
109.類似体が、Des35、Des36、およびDes37を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
110.類似体が、Des36およびDes37を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
111.GLP-1(7-34)の誘導体(配列番号1のアミノ酸1〜28)である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
112.GLP-1(7-35)の誘導体(配列番号1のアミノ酸1〜29)である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
113.GLP-1(7-36)の誘導体(配列番号1のアミノ酸1〜30)である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
114.GLP-1(7-37)の誘導体(配列番号1のアミノ酸1〜31)である、上記の実施形態のいずれかのいずれかの誘導体。
115.GLP-1(7-38)の誘導体(配列番号1のアミノ酸1〜31、および1つのC末端に付加されたアミノ酸残基)である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
116.GLP-1(7-39)の誘導体(配列番号1のアミノ酸1〜31、および2つのC末端に付加されたアミノ酸残基)である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
117.類似体が、最大で10個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
118.類似体が、最大で9個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
119.類似体が、最大で8個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
120.類似体が、最大で7個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
121.類似体が、最大で6個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
122.類似体が、最大で5個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
123.類似体が、最大で4個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
124.類似体が、最大で3個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
125.類似体が、最大で2個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
126.類似体が、最大で1個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
127.類似体が、最小で1個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
128.類似体が、最小で2個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
129.類似体が、最小で3個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
130.類似体が、最小で4個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
131.類似体が、最小で5個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
132.類似体が、最小で6個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
133.類似体が、最小で7個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
134.類似体が、最小で8個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
135.類似体が、最小で9個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
136.類似体が、最小で10個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
137.類似体が、1個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
138.類似体が、2個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
139.類似体が、3個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
140.類似体が、4個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
141.類似体が、5個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
142.類似体が、6個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
143.類似体が、7個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
144.類似体が、8個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
145.類似体が、9個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
146.類似体が、10個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
147.変化が、独立に、置換、付加、および/または欠失である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
148.類似体が、a)式I:のGLP-1類似体を含み、および/またはb)式IのGLP-1類似体であり:
式I:Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Lys-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39
であり、式中、
Xaa7は、L-ヒスチジン、イミダゾプロピオニル、α-ヒドロキシ-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、Nα-ホルミル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、または4-ピリジルアラニンであり、
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Thr、Ser、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、または(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり、
Xaa12-は、LysまたはPheであり、
Xaa16は、ValまたはLeuであり、
Xaa18は、Ser、Arg、Asn、GlnまたはGluであり、
Xaa19は、TyrまたはGlnであり、
Xaa20は、Leu、LysまたはMetであり、
Xaa22は、Gly、Glu、Lys、またはAibであり、
Xaa23は、Gln、Glu、またはArgであり、
Xaa24は、AlaまたはLysであり、
Xaa25は、AlaまたはValであり、
Xaa26は、Val、His、またはArgであり、
Xaa30は、Ala、Glu、またはArgであり、
Xaa31は、TrpまたはHisであり、
Xaa34は、Glu、Asn、Gly、Gln、またはArgであり、
Xaa35は、Gly、Aib、または存在せず、
Xaa36は、Arg、Gly、Lys、または存在せず、
Xaa37は、Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、Arg、または存在せず、
Xaa38は、Ser、Gly、Ala、Glu、Gln、Pro、Arg、または存在せず、
Xaa39は、Glyまたは存在しない、
上記の実施形態のいずれかの誘導体。
149.式Iのペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)の類似体である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
150.Xaa38が存在しない場合、Xaa39もまた存在しない、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
151.Xaa37が存在しない場合、Xaa38、およびXaa39もまた存在しない、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
152.Xaa36が存在しない場合、Xaa37、Xaa38、およびXaa39もまた存在しない、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
153.Xaa35が存在しない場合、Xaa36、Xaa37、Xaa38、およびXaa39もまた存在しない、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154.Xaa7が、Hisであり、Xaa8が、AlaまたはAibであり、Xaa12が、LysまたはPheであり、Xaa16が、Valであり、Xaa18が、Serであり、Xaa19が、Tyrであり、Xaa20が、LeuまたはLysであり、Xaa22が、Glu、Gly、またはLysであり、Xaa23が、GlnまたはGluであり、Xaa24が、AlaまたはLysであり、Xaa25が、AlaまたはValであり、Xaa26が、HisまたはArgであり、Xaa30が、AlaまたはGluであり、Xaa31が、TrpまたはHisであり、Xaa34が、Gly、GlnまたはArgであり、Xaa35が、Glyまたは存在せず、Xaa36が、Arg、Lysまたは存在せず、Xaa37が、Gly、Lys、または存在せず、Xaa38が、GluまたはGlnであり、Xaa39が、Glyまたは存在しない、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154a.Xaa7が、Hisである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154b.Xaa8が、Alaである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154b1.Xaa8が、Aibである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154c.Xaa12が、Lysである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154d.Xaa12が、Pheである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154e.Xaa16が、Valである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154f.Xaa18が、Serである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154g.Xaa19が、Tyrである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154h.Xaa20が、Leuである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154i.Xaa20が、Lysである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154j.Xaa22が、Gluである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154k.Xaa22が、Glyである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154l.Xaa22が、Lysである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154m.Xaa23が、Glnである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154n.Xaa23が、Gluである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154o.Xaa24が、Alaである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154p.Xaa24が、Lysである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154q.Xaa25が、Alaである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154r.Xaa25が、Valである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154s.Xaa26が、Hisである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154t.Xaa26が、Argである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154u.Xaa30が、Alaである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154v.Xaa30が、Gluである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154x.Xaa31が、Trpである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154y.Xaa31が、Hisである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154z.Xaa34が、Glyである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154aa.Xaa34が、Glnである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154ab.Xaa34が、Argである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154ac.Xaa35が、Glyである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154ad.Xaa35が、存在しない、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154ae.Xaa36が、Argである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154af.Xaa36が、Lysである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154ag.Xaa36が、存在しない、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154ah.Xaa37が、Glyである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154ai.Xaa37が、Lysである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154aj.Xaa37が、存在しない、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154ak.Xaa38が、Gluである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154al.Xaa38が、Glnである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154am.Xaa38が、存在しない、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154an.Xaa39が、Glyである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154ao.Xaa39が、存在しない、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
155.類似体が、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、下記のアミノ酸の変化: (i)22E、26R、27K、34R、37K;(ii)22E、26R、27K、30E、34R、36K、38E、39G;(iii)22E、26R、27K、34R、36K、des37;(iv)22E、25V、26R、27K、34R、37K;(v)8Aib、20K、22E、26R、27K、30E、34G、des35-37;(vi)26R、27K、30E、34R、36K、38E;(vii)8Aib、22K、25V、26R、27K、31H、34R;(iix)8Aib、22K、25V、26R、27K、34R、des35-37;(ix)8Aib、22K、25V、26R、27K、34R、des36-37;(x)26H、27K、30E、34R、36K、38E;(xi)22K、25V、26R、27K、30E、34Q;(xii)25V、26R、27K、30E、34R、36K、38Q;(xiii)25V、26R、27K、30E、34Q、36K、38E;(xiv)22K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xv)8Aib、25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(xvi)25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(xvii)22E、23E、25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(iixx)8Aib、12K、22E、26R、27K、31H、34Q;(ixx)8Aib、22K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xx)22E、26H、27K、30E、34R、36K、38E;(xxi)22E、24K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xxii)25V、26R、27K、34Q、36K;(xxiii)22E、24K、25V、26R、27K、31H、34R;(xxiv)22E、24K、25V、26R、27K、34G、des35-37;(xxv)22E、24K、25V、26R、27K、34R;または(xxvi)8Aib、22E、24K、25V、26R、27K、31H、34Qを含む、好ましくは、有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
156.下記から選択される、好ましくは上記の実施形態のいずれかの化合物:Chem.50、Chem.51、Chem.52、Chem.53、Chem.54、Chem.55、Chem.56、Chem.57、Chem.58、Chem.59、Chem.60、Chem.61、Chem.62、Chem.63、Chem.64、Chem.65、Chem.66、Chem.67、Chem.68、Chem.69、Chem.70、Chem.71、Chem.72、Chem.73、Chem.74、Chem.75、Chem.76、Chem.77、Chem.78、およびChem.79;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
157.その名称によって特徴付けられ、本明細書において実施例1〜30の化合物の名称のそれぞれのリストから選択され、好ましくは上記の実施形態のいずれかの化合物;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
158.GLP-1活性を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
159.GLP-1活性が、ヒトGLP-1受容体を活性化する能力を意味する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
160.ヒトGLP-1受容体の活性化が、cAMP生成の効力としてインビトロのアッセイにおいて測定される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
161.a)10000pM未満、より好ましくは、5000pM未満、さらにより好ましくは、4000pM未満、または最も好ましくは、3000pM未満;
b)2000pM未満、好ましくは、1500pM未満、より好ましくは、1200pM未満、さらにより好ましくは、1000pM未満、または最も好ましくは、500pM未満;
c)400pM未満、好ましくは、300pM未満、より好ましくは、200pM未満、さらにより好ましくは、150pM未満、または最も好ましくは、100pM未満;あるいは
d)80pM未満、好ましくは、60pM未満、より好ましくは、40pM未満、さらにより好ましくは、30pM未満、または最も好ましくは、20pM未満
のEC50に対応する効力を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
162.効力を、好ましくは安定的なトランスフェクトされた細胞系、例えば、BHK467-12A(tk-ts13)を使用して、かつ/またはcAMPの決定のために、例えば、内因的に形成されたcAMPと外因的に加えたビオチン標識cAMPとの間の競合に基づいた機能的受容体アッセイを使用して、ヒトGLP-1受容体を含有する培地におけるcAMPの用量依存的な形成を示す用量反応曲線についてのEC50として決定し、このアッセイにおいて、cAMPはより好ましくは、特異的抗体を使用して捕捉され、かつ/またはさらにより好ましいアッセイは、AlphaScreen cAMPアッセイであり、最も好ましくは実施例31に記載されているものである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
163.比[2.0%HSA(高アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC50)を、0.005%HSA(低アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC50)で割った商]が、
a)少なくとも1.0、好ましくは、少なくとも10、さらにより好ましくは、少なくとも25、または最も好ましくは、少なくとも50;
b)少なくとも60、好ましくは、少なくとも70、より好ましくは、少なくとも80、さらにより好ましくは、少なくとも90、または最も好ましくは、少なくとも100;
c)少なくとも125、好ましくは、少なくとも150、より好ましくは、少なくとも200、またより好ましくは、少なくとも250、さらにより好ましくは、少なくとも400、または最も好ましくは、少なくとも500;あるいは
d)少なくとも600、好ましくは、少なくとも800、さらにより好ましくは、少なくとも900、または最も好ましくは、少なくとも1000である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
164.0.005%HSA(低アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC50)が、
a)1000nM未満、好ましくは、750nM未満、より好ましくは、500nM未満、または最も好ましくは、100nM未満;あるいは
b)50.0nM未満、好ましくは、15.0nM未満、より好ましくは10.0nM未満、さらにより好ましくは、5.0nM未満、または最も好ましくは、1.0nM未満である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
165.2.0%HSA(高アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC50)が、
a)1100nM未満、好ましくは、1000nM未満、より好ましくは、900nM未満、または最も好ましくは、600nM未満;あるいは
b)500nM未満、好ましくは、350nM未満、より好ましくは、200nM未満、さらにより好ましくは、100nM未満、または最も好ましくは、50.0nM未満である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
166.GLP-1受容体への結合親和性を、好ましくは、SPA結合アッセイを使用して、受容体からの125I-GLP-1の移動によって測定する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
167.GLP-1受容体を、安定的なトランスフェクトされた細胞系、好ましくは、ハムスター細胞系、より好ましくは、ベビーハムスター腎細胞系、例えば、BHK tk-ts13を使用して調製する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
168.IC50値が、受容体からの125I-GLP-1の50%を移動させる濃度として決定される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
169.セマグルチドの経口バイオアベイラビリティーより高い、経口バイオアベイラビリティー、好ましくは、絶対的経口バイオアベイラビリティーを有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
170.経口バイオアベイラビリティーを、ラットにおいて腸管腔中への直接の注入後の血漿中曝露としてインビボで測定する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
171.ラットの空腸への誘導体の溶液の注入の30分後に決定した誘導体の血漿濃度(pM)を、注入した溶液の濃度(μM)(30分での用量補正した曝露)で割った商が、少なくとも39、または少なくとも40、好ましくは、少なくとも60、より好ましくは、少なくとも80、またより好ましくは、少なくとも100、さらにより好ましくは、少なくとも125、または最も好ましくは、少なくとも150である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
172.ラットの空腸への誘導体の溶液の注入の30分後に決定した誘導体の血漿濃度(pM)を、注入した溶液の濃度(μM)(30分での用量補正した曝露)で割った商が、少なくとも160、好ましくは、少なくとも180、より好ましくは、少なくとも200、または最も好ましくは、少なくとも250である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
173.GLP-1誘導体を、55mg/mlのカプリン酸ナトリウムと混合して、1000uMの濃度で試験する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
174.好ましくは、概ね240gの到着時の体重を有する雄性Sprague-Dawleyラットを使用する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
175.ラットを、実験の前に概ね18時間絶食させる、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
176.絶食させた後、および空腸中への誘導体の注入前に、ラットに全身麻酔をかける、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
177.誘導体を、空腸の近位部(十二指腸について10cm遠位)または中腸(盲腸について50cm近位)に投与する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
178.100μlの誘導体を、シリンジを有するカテーテルを通して空腸管腔中に注入し、続いて200μlの空気を、別のシリンジで空腸管腔中に押し入れ、次いでカテーテルへの逆流を防止するために、これをカテーテルに結合したままとする、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
179.血液試料(200ul)を、尾静脈からEDTAチューブ中に所望の間隔(0分、10分、30分、60分、120分および240分などの時点)で集め、5分遠心分離する(10000G、4℃で20分以内)、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
180.血漿(例えば、75ul)を分離し、直ちに冷凍し、誘導体の血漿濃度について分析するまで-20℃で保持する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
181.LOCI(発光酸素チャネリング免疫アッセイ)を、誘導体の血漿濃度を分析するために使用する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
182.誘導体が、db/dbマウスにおいて血中グルコースをインビボで低下させるのに有効である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
183.誘導体が、db/dbマウスにおいて体重をインビボで低下させるのに有効である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
184.db/dbマウスを、適切な範囲の用量のGLP-1誘導体でs.c.処置し、血中グルコースおよび/または体重を適正な間隔で決定する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
185.GLP-1誘導体の用量が、0.3nmol/kg、1.0nmol/kg、3.0nmol/kg、10nmol/kg、30nmol/kg、および100nmol/kgであり、kgが、マウスの体重を意味する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
186.対照群を、ビヒクル(s.c.)、好ましくは、GLP-1誘導体が溶解される培地(例えば、下記の組成(50mMのリン酸ナトリウム、145mMの塩化ナトリウム、0.05%Tween80、pH7.4)を有する)で処置する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
187.-1/2時間の時点(投与(t=0)の30分前)で、ならびに1時間、2時間、4時間、および8時間の時点で、血中グルコースを決定し、かつ/またはマウスを秤量する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
188.グルコースオキシダーゼ法を使用して、グルコース濃度を測定する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
189.(i)ED50(体重(BW))を、誘導体の皮下投与の8時間後の、δ(例えば、減少)BWに対する最大半量効果を生じさせる用量として計算し;かつ/または
(ii)ED50(血中グルコース(BG))を、類似体の皮下投与の8時間および/または24時間後の、AUC(曲線下面積)δ(例えば、減少)BGに対して最大半量効果を生じさせる用量として計算する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
190.好ましくは、最大反応を明確に定義して、シグモイド用量反応関係が存在する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
191.リラグルチドより延長性の作用プロファイルを有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
192.延長とは、関連する動物種、例えば、db/dbマウス、ラット、ブタ、および/または、好ましくは、ミニブタにおけるインビボでの半減期を意味し;誘導体を、i)s.c.、および/または、ii)i.v.;好ましくは、ii)i.v.で投与する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
193.ミニブタにおけるi.v.投与後の末端半減期(T1/2)が、
a)少なくとも12時間、好ましくは、少なくとも24時間、より好ましくは、少なくとも36時間、さらにより好ましくは、少なくとも48時間、または最も好ましくは、少なくとも60時間;
b)少なくとも7時間、好ましくは、少なくとも16時間、より好ましくは、少なくとも24時間、さらにより好ましくは、少なくとも30時間、または最も好ましくは、少なくとも40時間;
c)少なくとも50時間、好ましくは、少なくとも60時間、より好ましくは、少なくとも70時間、さらにより好ましくは、少なくとも80時間、または最も好ましくは、少なくとも90時間;
である、上記の実施形態のいずれかのいずれかの誘導体。
194.ミニブタが、雄性Gottingenミニブタである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
195.ミニブタが、7〜14カ月齢であり、好ましくは、16〜35kgの体重である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
196.ミニブタを、個々に収容し、好ましくは、SDSミニブタ食餌を1日1回または2回摂食させる、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
197.少なくとも2週間の順化の後に、誘導体をi.v.で投与する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
198.動物を投与の前に概ね18時間、および投与の後に少なくとも4時間絶食させ、全期間の間に水に自由にアクセスさせる、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
199.GLP-1誘導体が、50mMのリン酸ナトリウム、145mMの塩化ナトリウム、0.05%Tween80、pH7.4に、適切な濃度、好ましくは、20〜60nmol/mlで溶解している、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
200.誘導体の静脈内注射が、1〜2nmol/kgに対応する容量で与えられる、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
201.ミニブタにおいてグルコースによって刺激されるインスリン分泌を増加させる、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
202.ミニブタが、雄性Gottingenミニブタである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
203.ミニブタが、7〜14カ月齢である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
204.ミニブタを単一の檻に収容し、好ましくは、SDSミニブタ飼料を1日1回または2回摂食させる、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
205.任意選択で漸増法の期間後に、単回用量を、耳の後ろの薄い皮膚にi.v.、またはs.c.で与える、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
206.動物を投与前に概ね18時間絶食させる、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
207.ベースライン群、および2〜6つの異なる血漿濃度レベルに対応するいくつかの誘導体投与群を試験し、ベースライン群が、a)ビヒクル処置、またはb)未処置である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
208.血漿濃度レベルが3000〜80000pMである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
209.1時間または2時間の静脈内グルコース負荷試験(IVGTT)が行われる、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
210.0.3g/kgのグルコースを、i.v.で30秒の期間に亘って与え、血液試料を、適切な時点で、例えば、下記の時点(t=0は、グルコースのボーラスに対応する)(-10分、-5分、0分、2分、5分、10分、15分、20分、25分、30分、40分、50分、60分、70分、80分、90分、100分、110分、120分)で採取する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
211.誘導体、グルコース、およびインスリンの血漿中濃度を決定する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
212.誘導体濃度を、t=0分に、および任意選択で、試験の終わり(t=60分、またはt=120分)に測定する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
213.グルコースを、グルコースオキシダーゼ法を使用して分析する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
214.インスリン曲線下面積(AUCインスリン)を計算し、インスリン分泌の尺度として使用する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
215.少なくともその1つの濃度について、AUCインスリンが、ベースラインのAUCインスリンより高く、好ましくは、少なくともその110%、より好ましくは、少なくともその120%、さらにより好ましくは、少なくともその130%、または最も好ましくは、少なくともその140%高い、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
216.ブタにおいて対照(好ましくは、ビヒクル処置、または未処置)に対して餌の摂取の減少をもたらし、
任意選択で餌の摂取(0〜24時間)は、ビヒクル処置対照に対して、90%以下、好ましくは、80%以下、より好ましくは、70%以下、さらにより好ましくは、60%以下、または最も好ましくは、50%以下でよく、
餌の摂取(0〜24時間)とは、誘導体またはビヒクルの投与後最初の24時間を意味する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
217.ブタが、雌性Landrace Yorkshire Duroc(LYD)ブタである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
218.ブタが、3カ月齢であり、好ましくは、30〜35kgの体重である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
219.動物が、順化のために1〜2週間群で収容される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
220.実験期間の間、動物を、個々の食物摂取量の測定のために月曜日の朝から金曜日の午後まで個々の檻に入れる、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
221.動物にブタ飼料(Svinefoder、Antonioなど)を自由に摂食させる、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
222.好ましくは、Mpigwinシステムを使用して、飼料の重量を15分毎にロギングすることによって、食物摂取量をオンラインでモニターする、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
223.より好ましくは、12nmol/ml、40nmol/ml、120nmol/ml、400nmol/ml、または1200nmol/mlの濃度で、好ましくは、リン酸緩衝液(50mMのホスフェート、145mMの塩化ナトリウム、0.05%Tween80、pH8)に溶解して、0.3nmol/kg、1.0nmol/kg、3.0nmol/kg、10nmol/kg、または30nmol/kgで投与する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
224.リン酸緩衝液が、ビヒクルとしての役割を果たす、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
225.動物に1日目の朝に、誘導体またはビヒクルの単回皮下用量(好ましくは、0.025ml/kgの投与容量)を投与し、食物摂取量を、投与後に4日間測定する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
226.少なくとも4時間、好ましくは少なくとも6時間、さらにより好ましくは少なくとも8時間、または最も好ましくは少なくとも10時間の、i.v.投与後のラットにおけるインビボでの半減期(T1/2)を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
227.少なくとも12時間、好ましくは少なくとも15時間、さらにより好ましくは少なくとも18時間、または最も好ましくは少なくとも20時間の、i.v.投与後のラットにおけるインビボでの半減期(T1/2)を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
228.少なくとも24時間、好ましくは少なくとも26時間、または最も好ましくは少なくとも30時間の、i.v.投与後のラットにおけるインビボでの半減期(T1/2)を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
229.ラットが、概ね400gの体重を有する雄性Sprague-Dawleyラットである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
230.GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、下記の変化:(i)38Q;および/または(ii)39Gを含む、GLP-1類似体;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルの形態の中間生成物。
231.(38E、39G)を含む、実施形態230のGLP-1類似体。
232.GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、下記のアミノ酸の変化: (i)22E、26R、27K、34R、37K;(ii)22E、26R、27K、30E、34R、36K、38E、39G;(iii)22E、26R、27K、34R、36K、des37;(iv)22E、25V、26R、27K、34R、37K;(v)8Aib、20K、22E、26R、27K、30E、34G、des35-37;(vi)26R、27K、30E、34R、36K、38E;(vii)8Aib、22K、25V、26R、27K、31H、34R;(iix)8Aib、22K、25V、26R、27K、34R、des35-37;(ix)8Aib、22K、25V、26R、27K、34R、des36-37;(x)26H、27K、30E、34R、36K、38E;(xi)22K、25V、26R、27K、30E、34Q;(xii)25V、26R、27K、30E、34R、36K、38Q;(xiii)25V、26R、27K、30E、34Q、36K、38E;(xiv)22K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xv)8Aib、25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(xvi)25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(xvii)22E、23E、25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(iixx)8Aib、12K、22E、26R、27K、31H、34Q;(ixx)8Aib、22K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xx)22E、26H、27K、30E、34R、36K、38E;(xxi)22E、24K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xxii)25V、26R、27K、34Q、36K;(xxiii)22E、24K、25V、26R、27K、31H、34R;(xxiv)22E、24K、25V、26R、27K、34G、des35-37;(xxv)22E、24K、25V、26R、27K、34R;または(xxvi)8Aib、22E、24K、25V、26R、27K、31H、34Q;を含み、好ましくは有する、GLP-1類似体;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルの形態の中間生成物。
233.医薬として使用するための、上記の実施形態のいずれかに記載の誘導体。
234.全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群の治療および/もしくは予防において使用するため、ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための、上記の実施形態のいずれかに記載の誘導体。
235.医薬的活性量の上記の実施形態のいずれかに記載の誘導体を投与することにより、全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群を治療もしくは予防するため、ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための方法。
【０２３３】
下記は、本発明のまたさらなる特定の実施形態である。
1. GLP-1類似体の誘導体であって、
類似体は、GLP-1(7-37)(配列番号1)の27位に対応する位置において第1のK残基;GLP-1(7-37)のT位(Tは、18および27以外の7〜37の範囲の整数である)に対応する位置において第2のK残基;ならびにGLP-1(7-37)と比較して最大で10個のアミノ酸の変化を含み、第1のK残基は、K27と示され、第2のK残基は、KTと示され、
誘導体は、リンカーを介して、それぞれ、K27およびKTに結合している2つの延長部分を含み、
延長部分は、Chem.1およびChem.2:
Chem.1:HOOC-(CH2)x-CO-*
Chem.2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
(式中、xは、6〜18の範囲の整数であり、yは、3〜17の範囲の整数である)から選択され、
リンカーは、Chem.5:
Chem.5:
【０２３４】
【化３０】
0006022538.tif 000032
【０２３５】
(式中、kは、1〜5の範囲の整数であり、nは、1〜5の範囲の整数である)を含む、誘導体;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
2.リンカーが、Chem.6および/またはChem.7:
Chem.6:
【０２３６】
【化３１】
0006022538.tif 000033
【０２３７】
Chem.7:
【０２３８】
【化３２】
0006022538.tif 000034
【０２３９】
から選択されるGluジラジカルをさらに含む、実施形態1の誘導体。
3.リンカーが、第1または第2のK残基のε-アミノ基に結合している、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
4.Tが、12、20、22、24、36、または37である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
5.類似体が、第1および第2のK残基以外のK残基を含まない、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
6.xが、12である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
7.yが、9である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
8.kが、1である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
9.nが、1である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
10.類似体が、式I:
式I:Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Lys-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39
のGLP-1類似体を含み、式中、
Xaa7は、L-ヒスチジン、イミダゾプロピオニル、α-ヒドロキシ-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、Nα-ホルミル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、または4-ピリジルアラニンであり、
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Thr、Ser、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、または(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり、
Xaa12は、LysまたはPheであり、
Xaa16は、ValまたはLeuであり、
Xaa18は、Ser、Arg、Asn、GlnまたはGluであり、
Xaa19は、TyrまたはGlnであり、
Xaa20は、Leu、LysまたはMetであり、
Xaa22は、Gly、Glu、Lys、またはAibであり、
Xaa23は、Gln、Glu、またはArgであり、
Xaa24は、AlaまたはLysであり、
Xaa25は、AlaまたはValであり、
Xaa26は、Val、His、またはArgであり、
Xaa30は、Ala、Glu、またはArgであり、
Xaa31は、TrpまたはHisであり、
Xaa34は、Glu、Asn、Gly、Gln、またはArgであり、
Xaa35は、Gly、Aib、または存在せず、
Xaa36は、Arg、Gly、Lys、または存在せず、
Xaa37は、Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、Arg、または存在せず、
Xaa38は、Ser、Gly、Ala、Glu、Gln、Pro、Arg、または存在せず、
Xaa39は、Glyまたは存在しない、
上記の実施形態のいずれかの誘導体。
11.下記から選択される、上記の実施形態のいずれかに記載の化合物:Chem.50、Chem.51、Chem.52、Chem.53、Chem.54、Chem.55、Chem.56、Chem.57、Chem.58、Chem.59、Chem.60、Chem.61、Chem.62、Chem.63、Chem.64、Chem.65、Chem.66、Chem.67、Chem.68、Chem.69、Chem.70、Chem.71、Chem.72、Chem.73、Chem.74、Chem.75、Chem.76、Chem.77、Chem.78、およびChem.79;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
12.GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、下記の変化:(i)38Q;および/または(ii)39Gを含むGLP-1類似体;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルの形態の中間生成物。
13.医薬として使用するための、実施形態1〜11のいずれかに記載の誘導体。
14.全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群の治療および/もしくは予防において使用するため、ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための、実施形態1〜11のいずれかに記載の誘導体。
15.医薬的活性量の実施形態1〜11のいずれかに記載の誘導体を投与することにより、全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群を治療もしくは予防するため、ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための方法。
【０２４０】
(実施例)
この実験パートは、略語のリストから開始し、本発明の類似体および誘導体を合成し特徴付けるための一般の方法を含むセクションが続く。次いで、特定のGLP-1誘導体の調製に関するいくつかの実施例が続き、最後に、これらの類似体および誘導体の活性および特性に関するいくつかの実施例が含まれる(薬理学的方法と見出しがあるセクション)。
【０２４１】
実施例は、本発明を例示する役割を果たす。
【０２４２】
略語
下記においてアルファベット順に、下記の略語を使用する。
Aib:アミノイソ酪酸(α-アミノイソ酪酸)
API:活性医薬成分
AUC:曲線下面積
BG:血中グルコース
BHK:ベビーハムスター腎臓
BW:体重
Boc:t-ブチルオキシカルボニル
BSA:ウシ血清アルブミン
コリジン:2,4,6-トリメチルピリジン
DCM:ジクロロメタン
Dde:1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)エチル
DIC:ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA:ジイソプロピルエチルアミン
DMAP:4-ジメチルアミノピリジン
DMEM:ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)
EDTA:エチレンジアミン四酢酸
EGTA:エチレングリコール四酢酸
FCS:ウシ胎仔血清
Fmoc:9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
HATU:(O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)
HBTU:(2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-)-1,1,3,3テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)
HEPES:4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸
HFIP:1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールまたはヘキサフルオロイソプロパノール
HOAt:1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
HOBt:1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC:高速液体クロマトグラフィー
HSA:ヒト血清アルブミン
IBMX:3-イソブチル-1-メチルキサンチン
Imp:イミダゾプロピオン酸(デス-アミノヒスチジン、DesHともまた称してよい)
i.v:静脈内
ivDde:1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル
IVGTT:静脈内グルコース負荷試験
LCMS:液体クロマトグラフィー質量分析
LYD:Landrace Yorkshire Duroc
MALDI-MS:MALDI-TOF MSを参照されたい
MALDI-TOF MS:マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析
MeOH:メタノール
Mmt:4-メトキシトリチル
Mtt:4-メチルトリチル
NMP:N-メチルピロリドン
OBz:ベンゾイルエステル
OEG:8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸
OtBu:tertブチルエステル
PBS:リン酸緩衝生理食塩水
PD:薬力学
Pen/Strep:ペニシリン/ストレプトマイシン
PK:薬物動態学
RP:逆相
RP-HPLC:逆相高速液体クロマトグラフィー
RT:室温
Rt:保持時間
s.c.:皮下
SD:標準偏差
SEC-HPLC:サイズ排除高速液体クロマトグラフィー
SEM:平均の標準誤差
SPA:シンチレーション近接アッセイ
SPPS:固相ペプチド合成
tBu:tertブチル
TFA:トリフルオロ酢酸
TIS:トリイソプロピルシラン
Tris:トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンまたは2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-プロパン-1,3-ジオール
Trt:トリフェニルメチルまたはトリチル
Trx:トラネキサム酸
UPLC:超高速液体クロマトグラフィー
【０２４３】
調製方法
A、一般の方法
このセクションは、固相ペプチド合成のための方法(アミノ酸の脱保護のための方法、樹脂からペプチドを切断する方法、およびその精製の方法を含めた、SPPS法)、ならびにこのように得られたペプチドを検出し特徴付けるための方法(LCMS、MALDI、およびUPLC法)に関する。ペプチドの固相合成は、場合によっては、ジペプチドアミド結合上で酸性条件下にて切断することができる基(これらに限定されないが、2-Fmoc-オキシ-4-メトキシベンジル、または2,4,6-トリメトキシベンジルなど)で保護されたジペプチドを使用することによって改善し得る。セリンまたはトレオニンがペプチド中に存在する場合、疑似プロリンジペプチドを使用し得る(例えば、Novabiochemから入手可能、W.R. Sampson(1999年)、J. Pep. Sci.、5、403をまた参照されたい)。使用される保護されたアミノ酸誘導体は、標準的なFmoc-アミノ酸であった(例えば、Anaspec、IRIS、またはNovabiochemから供給)。N末端アミノ酸は、αアミノ基においてBoc保護されていた(例えば、N末端においてHisを有するペプチドについて、Boc-His(Boc)-OH、またはBoc-His(Trt)-OH)。配列中のリシンのεアミノ基を、アルブミン結合部分およびスペーサーの結合のための経路によって、Mtt、Mmt、Dde、ivDde、またはBocで保護した。アルブミン結合部分および/またはリンカーは、樹脂結合ペプチドのアシル化によって、または保護されていないペプチドの溶液中のアシル化によって、ペプチドに結合させることができる。保護されたペプチジル樹脂へのアルブミン結合部分および/またはリンカーの結合の場合、結合は、SPPSを使用したモジュールおよび適切に保護された構造単位(これらに限定されないが、Fmoc-Oeg-OH(Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸)、Fmoc-Trx-OH(Fmoc-トラネキサム酸)、Fmoc-Glu-OtBu、オクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、ノナデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、または4-(9-カルボキシノニルオキシ)安息香酸tert-ブチルエステルなど)でよい。
【０２４４】
1.樹脂結合ペプチドの合成
SPPS法B
SPPS法Bは、マイクロ波ベースのLibertyペプチド合成機(CEM Corp.、North Carolina)によるFmoc化学を使用した保護されたペプチジル樹脂の合成を意味する。適切な樹脂は、Novabiochemから入手可能な事前充填、低充填Wang樹脂(例えば、低充填Fmoc-Lys(Mtt)-Wang樹脂、0.35mmol/g)である。Fmoc脱保護は、70℃または75℃までにてNMP中の5%ピペリジンで行った。カップリング化学は、NMP中のDIC/HOAtであった。アミノ酸/HOAt溶液(3〜10倍モル過剰の、NMP中の0.3M)、それに続いて同じモル当量のDIC(NMP中0.75M)を、樹脂に加えた。例えば、下記の量の0.3Mのアミノ酸/HOAt溶液を、カップリング毎に下記のスケール反応のために使用した。スケール/ml、0.10mmol/2.5ml、0.25mmol/5ml、1mmol/15ml。カップリング時間および温度は一般に、70℃または75℃までで5分であった。より大きなスケールの反応ためにより長いカップリング時間、例えば、10分を使用した。ヒスチジンアミノ酸を、50℃で二重カップリングし、または前のアミノ酸に立体障害があった場合(例えば、Aib)、四重カップリングした。アルギニンアミノ酸をRTで25分間カップリングし、次いで、70℃または75℃に5分間加熱した。これらに限定されないがAibなどのいくつかのアミノ酸を、「二重カップリング」したが、これは、第1のカップリング(例えば、75℃で5分)後に、樹脂から液体を排出させ、さらなる試薬(アミノ酸、HOAtおよびDIC)を加え、混合物を再び加熱する(例えば、75℃で5分)ことを意味する。リシン側鎖の化学修飾が望ましいとき、リシンをLys(Mtt)として組み込んだ。樹脂をDCMで洗浄し、樹脂を無溶媒(無希釈)ヘキサフルオロイソプロパノール中に20分間懸濁させ、続いてDCMおよびNMPによって洗浄することによって、Mtt基を除去した。手作業によるカップリングを任意選択で含めた、適切に保護された構造単位(一般方法を参照されたい)を使用して、手作業による合成(SPPS法Dを参照されたい)によって、または上記のようなLibertyペプチド合成機による1つもしくは複数の自動化されたステップによって、リシンの化学修飾を行った。
【０２４５】
SPPS法D
SPPS法Dは、手作業によるFmoc化学を使用する保護されたペプチジル樹脂の合成を意味する。これは典型的には、ペプチド骨格へのリンカーおよび側鎖の結合のために使用された。下記の条件を、0.25mmolの合成スケールで用いた。カップリング化学は、4〜10倍モル過剰の、NMP中のDIC/HOAt/コリジンであった。カップリング条件は、室温で1〜6時間であった。NMP中の20〜25%ピペリジン(3×20ml、各10分)、それに続くNMP(4×20ml)洗浄によって、Fmoc脱保護を行った。NMP中の2%ヒドラジン(2×20ml、各10分)、それに続くNMP(4×20ml)洗浄によって、Dde-またはivDde-脱保護を行った。DCM中の2%TFAおよび2〜3%TIS(5×20ml、各10分)、それに続くDCM(2×20ml)、DCM中の10%MeOHおよび5%DIPEA(2×20ml)、ならびにNMP(4×20ml)洗浄によって、または無溶媒ヘキサフルオロイソプロパノール(5×20ml、各10分)による処理、それに続く上記のような洗浄によって、Mtt-またはMmt-脱保護を行った。アルブミン結合部分および/またはリンカーは、樹脂結合ペプチドのアシル化によって、または保護されていないペプチドの溶液中のアシル化によって、ペプチドに結合させることができる(下記の経路を参照されたい)。保護されたペプチジル樹脂へのアルブミン結合部分および/またはリンカーの結合の場合、結合は、SPPSを使用したモジュールおよび適切に保護された構造単位でよい(一般方法を参照されたい)。
【０２４６】
樹脂結合ペプチドへの結合-経路I:
活性化された(活性エステルまたは対称性無水物)アルブミン結合部分またはリンカー、例えば、オクタデカン二酸モノ-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル)エステル(Ebashiら、EP511600、樹脂結合ペプチドに対して4モル当量)を、NMP(25mL)に溶解し、樹脂に加え、室温で一晩振盪した。反応混合物を濾過し、樹脂をNMP、DCM、2-プロパノール、メタノールおよびジエチルエーテルで十分に洗浄した。
【０２４７】
樹脂結合ペプチドへの結合-経路II:
アルブミン結合部分を、NMP/DCM(1:1、10ml)に溶解した。活性化試薬、例えば、HOBt(樹脂に対して4モル当量)およびDIC(樹脂に対して4モル当量)を加え、溶液を15分間撹拌した。溶液を樹脂に加え、DIPEA(樹脂に対して4モル当量)を加えた。樹脂を室温で2〜24時間振盪した。樹脂をNMP(2×20ml)、NMP/DCM(1:1、2×20ml)およびDCM(2×20ml)で洗浄した。
【０２４８】
溶液中でのペプチドへの結合-経路III:
活性化された(活性エステルまたは対称性無水物)アルブミン結合部分またはリンカー、例えば、オクタデカン二酸モノ-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル)エステル(Ebashiら、EP511600)(ペプチドに対して1〜1.5モル当量)を、有機溶媒、例えば、アセトニトリル、THF、DMF、DMSOまたは水/有機溶媒の混合物(1〜2ml)に溶解し、10モル当量のDIPEAと一緒に、ペプチドの水溶液(10〜20ml)に加えた。アルブミン結合残基上の保護基、例えば、tert-ブチルの場合、反応混合物を一晩凍結乾燥し、単離した粗ペプチドをその後脱保護した。tert-ブチル保護基の場合、トリフルオロ酢酸、水およびトリイソプロピルシランの混合物(90:5:5)にペプチドを溶解することによって脱保護を行った。30分後、混合物を真空中で蒸発させ、粗ペプチドを下記で記載するように分取HPLCによって精製した。
【０２４９】
SPPS法E
SPPS法Eは、Protein Technologies(Tucson、AZ85714、U.S.A.)からのPrelude固相ペプチド合成機上のFmoc化学によるペプチド合成を意味する。適切な樹脂は、Novabiochemから入手可能な事前充填、低充填Wang樹脂(例えば、低充填fmoc-Lys(Mtt)-Wang樹脂、0.35mmol/g)である。Fmoc脱保護は、NMP中の25%ピペリジンによって2×10分行った。カップリング化学は、NMP中のDIC/HOAt/コリジンであった。アミノ酸/HOAt溶液(3〜10倍モル過剰の、NMP中の0.3M)、続いて同じモル当量のDIC(NMP中3M)およびコリジン(NMP中3M)を、樹脂に加えた。例えば、下記の量の0.3Mのアミノ酸/HOAt溶液を、下記のスケール反応のためにカップリング毎に使用した。スケール/ml、0.10mmol/2.5ml、0.25mmol/5ml。カップリング時間は一般に、60分であった。これらに限定されないが、アルギニン、Aibまたはヒスチジンを含めたいくつかのアミノ酸を「二重カップリング」したが、これは、第1のカップリング後(例えば、60分)に、樹脂から液体を排出させ、さらなる試薬を加え(アミノ酸、HOAt、DIC、およびコリジン)、混合物を(例えば、60分)再び反応させることを意味する。これらに限定されないが、Fmoc-OEG-OH、Fmoc-Trx-OH、Fmoc-Glu-OtBu、オクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、ノナデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、または4-(9-カルボキシノニルオキシ)安息香酸tert-ブチルエステルを含めたいくつかのアミノ酸および脂肪酸誘導体を、長時間、例えば、6時間カップリングした。リシン側鎖の化学修飾が望ましいとき、リシンをLys(Mtt)として組み込んだ。樹脂をDCMで洗浄し、樹脂をヘキサフルオロイソプロパノール/DCM(75:25)中に3×10分間懸濁させ、続いてDCM、20%ピペリジンおよびNMPで洗浄することによって、Mtt基を除去した。適切に保護された構造単位(一般方法を参照されたい)を使用して、手作業による合成(SPPS法Dを参照されたい)によって、または上記のようなPreludeペプチド合成機による1つもしくは複数の自動化されたステップによって、リシンの化学修飾を行った。
【０２５０】
2.樹脂からのペプチドの切断、および精製
合成後、樹脂をDCMで洗浄し、TFA/TIS/水(95/2.5/2.5または92.5/5/2.5)による2〜3時間の処理、それに続くジエチルエーテルによる沈殿によって、ペプチドを樹脂から切断した。ペプチドを適切な溶媒(例えば、30%酢酸など)に溶解し、アセトニトリル/水/TFAを使用するC18、5μMのカラム上での標準的RP-HPLCによって精製した。画分を、UPLC、MALDIおよびLCMS法の組合せによって分析し、適正な画分をプールし、凍結乾燥した。
【０２５１】
3.検出および特徴付けのための方法
LCMS法
LCMS法1(LCMS1)
Agilent1200シリーズHPLCシステムからの溶出の後、Agilent Technologies LC/MSD TOF(G1969A)質量分析計を使用して、試料の質量を同定した。タンパク質スペクトルのデコンボリューションを、Agilentのタンパク質確認ソフトウェアで計算した。
溶離液:
A:水中の0.1%トリフルオロ酢酸
B:アセトニトリル中の0.1%トリフルオロ酢酸
カラム:Zorbax5u、300SB-C3、4.8×50mm
勾配:15分に亘り25%〜95%B
【０２５２】
LCMS法2(LCMS2)
Perkin Elmerシリーズ200HPLCシステムからの溶出の後、Perkin Elmer Sciex API3000質量分析計を使用して、試料の質量を同定した。
溶離液:
A:水中の0.05%トリフルオロ酢酸
B:アセトニトリル中の0.05%トリフルオロ酢酸
カラム:Waters Xterra MS C-18×3mm、id、5μm
勾配:1.5ml/分で7.5分に亘り5%〜90%B
【０２５３】
LCMS法3(LCMS3)
Waters Alliance HT HPLCシステムからの溶出の後、Waters Micromass ZQ質量分析計を使用して、試料の質量を同定した。
溶離液:
A:水中の0.1%トリフルオロ酢酸
B:アセトニトリル中の0.1%トリフルオロ酢酸
カラム:Phenomenex、Jupiter C4 50×4.60mm、id、5μm
勾配:7.5分に亘り1.0ml/分で10%〜90%B
【０２５４】
LCMS法4(LCMS4)
LCMS4を、Waters Acquity UPLCシステムおよびMicromassからのLCT Premier XE質量分析計からなる設定で行った。UPLCポンプを、A:水中の0.1%ギ酸、B:アセトニトリル中の0.1%ギ酸を含有する2つの溶離液レザバーに結合した。
分析は、適正な容量の試料(好ましくは、2〜10μl)をカラム(AおよびBの勾配で溶出した)に注入することによってRTで行った。
UPLC条件、検出器の設定および質量分析計の設定:
カラム:Waters Acquity UPLC BEH、C-18、1.7μm、2.1mm×50mm
勾配:4.0分(代わりに、8.0分)の間、0.4ml/分で直線状の5%〜95%アセトニトリル
検出:214nm(TUV(チューナブル紫外吸光検出器)からの類似体の結果)
MSイオン化モード:API-ES
スキャン:100〜2000原子質量単位(代わりに、500〜2000原子質量単位)、ステップ0.1原子質量単位
【０２５５】
UPLC法およびHPLC法
方法05_B5_1
UPLC(方法05_B5_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:0.2MのNa2SO4、0.04MのH3PO4、10%CH3CN(pH3.5);B:70%CH3CN、30%H2Oを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。60%A、40%Bから30%A、70%B、8分に亘り0.40ml/分の流量。
【０２５６】
方法05_B7_1
UPLC(方法05_B7_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:0.2MのNa2SO4、0.04MのH3PO4、10%CH3CN(pH3.5);B:70%CH3CN、30%H2Oを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。80%A、20%Bから40%A、60%B、8分に亘り0.40ml/分の流量。
【０２５７】
方法04_A2_1
UPLC(方法04_A2_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:90%H2O、10%CH3CN、0.25Mの炭酸水素アンモニウム;B:70%CH3CN、30%H2Oを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。90%A、10%Bから60%A、40%B、16分に亘り0.40ml/分の流量。
【０２５８】
方法04_A3_1
UPLC(方法04_A3_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:90%H2O、10%CH3CN、0.25Mの炭酸水素アンモニウム;B:70%CH3CN、30%H2Oを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。75%A、25%Bから45%A、55%B、16分に亘り0.40ml/分の流量。
【０２５９】
方法04_A4_1
UPLC(方法04_A4_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:90%H2O、10%CH3CN、0.25Mの炭酸水素アンモニウム;B:70%CH3CN、30%H2Oを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。65%A、35%Bから25%A、65%B、16分に亘り0.40ml/分の流量。
【０２６０】
方法08_B2_1
UPLC(方法08_B2_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:99.95%H2O、0.05%TFA;B:99.95%CH3CN、0.05%TFA
を含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。95%A、5%Bから40%A、60%B、16分に亘り0.40ml/分の流量。
【０２６１】
方法08_B4_1
UPLC(方法08_B4_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:99.95%H2O、0.05%TFA;B:99.95%CH3CN、0.05%TFAを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。95%A、5%Bから95%A、5%B、16分に亘り0.40ml/分の流量。
【０２６２】
方法05_B10_1
UPLC(方法05_B10_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:0.2MのNa2SO4、0.04MのH3PO4、10%CH3CN(pH3.5);B:70%CH3CN、30%H2Oを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。40%A、60%Bから20%A、80%B、8分に亘り0.40ml/分の流量。
方法01_A4_2
UPLC(方法01_A4_2):RP-分析を、waters996ダイオードアレイ検出器を取り付けたWaters600Sシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、Symmetry300(C18、5um、3.9mm×150mmカラム、42℃)を使用して集めた。HPLCシステムを、A:100%H2O、B:100%CH3CN、C:H2O中の1%トリフルオロ酢酸を含有する3つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。90%A、5%B、5%Cから0%A、95%B、5%C、15分に亘り、1.0ml/分の流量。
【０２６３】
方法09_B2_1
UPLC(方法09_B2_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:99.95%H2O、0.05%TFA;B:99.95%CH3CN、0.05%TFAを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。95%A、5%Bから40%A、60%B、16分に亘り0.40ml/分の流量。
【０２６４】
方法09_B4_1
UPLC(方法09_B4_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:99.95%H2O、0.05%TFA;B:99.95%CH3CN、0.05%TFAを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。95%A、5%Bから5%A、95%B、16分に亘り0.40ml/分の流量。
【０２６５】
方法:05_B8_1
UPLC(方法05_B8_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:0.2MのNa2SO4、0.04MのH3PO4、10%CH3CN(pH3.5);B:70%CH3CN、30%H2Oを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。50%A、50%Bから20%A、80%B、8分に亘り0.40ml/分の流量。
【０２６６】
方法:10_B14_1
UPLC(方法10_B14_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH Shield RP18、1.7um、2.1mm×150mmカラム、50℃を使用して集めた。UPLCシステムを、A:99.95%H2O、0.05%TFA;B:99.95%CH3CN、0.05%TFAを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。70%A、30%Bから40%A、60%B、12分に亘り0.40ml/分の流量。
【０２６７】
方法:04_A6_1
UPLC(方法04_B6_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:10mMのTRIS、15mMの硫酸アンモニウム、80%H2O、20%、pH7.3;B:80%CH3CN、20%H2Oを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。95%A、5%Bから10%A、90%B、16分に亘り0.35ml/分の流量。
【０２６８】
方法01_B4_1
HPLC(方法01_B4_1):RP-分析を、Waters996ダイオードアレイ検出器を取り付けたWaters600Sシステムを使用して行った。Waters3mm×150mm、3.5um、C-18対称カラムを使用して、UV検出を集めた。カラムを42℃に加熱し、5〜95%のアセトニトリル、90〜0%の水、および水中の5%のトリフルオロ酢酸(1.0%)の直線勾配により15分に亘り1ml/分の流量で溶出させた。
【０２６９】
方法04_A7_1
UPLC(方法04_A7_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:10mMのTRIS、15mMの硫酸アンモニウム、80%H2O、20%、pH7.3;B:80%CH3CN、20%H2Oを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。95%A、5%Bから40%A、60%B、16分に亘り0.40ml/分の流量。
【０２７０】
方法:05_B9_1
UPLC(方法05_B9_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:0.2MのNa2SO4、0.04MのH3PO4、10%CH3CN(pH3.5);B:70%CH3CN、30%H2Oを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。70%A、30%Bから20%A、80%B、8分に亘り0.40ml/分の流量。
【０２７１】
方法:10_B12_1
UPLC(方法10_B12_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH ShieldRP18(1.7um、2.1mm×150mmカラム、50℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:99.95%H2O、0.05%TFA、;B:99.95%CH3CN、0.05%TFAを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。50%A、50%Bから0%A、100%B、16分に亘り0.40ml/分の流量。
【０２７２】
方法04_A9_1
UPLC(方法04_A9_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH Shield RP18(C18、1.7um、2.1mm×150mmカラム、60℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:90%H2O/10%CH3CN中の200mMのNa2SO4+20mMのNa2HPO4+20mMのNaH2PO4、pH7.2;B:70%CH3CN、30%H2Oを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記のステップ勾配を使用した:3分に亘り90%A、10%Bから80%A、20%B、17分に亘り80%A、20%Bから50%A、50%B、0.40ml/分の流量。
【０２７３】
MALDI-MS法
分子量を、マトリックス支援レーザー脱離およびイオン化飛行時間型質量分析を使用して決定し、MicroflexまたはAutoflex(Bruker)に記録した。α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸のマトリックスを使用した。
【０２７４】
NMR方法
プロトンNMRスペクトルを、テトラメチルシランを内部標準としてBrucker Avance DPX300(300MHz)を使用して記録した。化学シフト(σ)はppmで示し、分裂パターンは、下記のように示す。s、一重線;d、二重線;dd、二重線の二重線;dt、三重線の二重線;t、三重線、tt、三重線の三重線;q、四重線;quint、五重線;sext、六重線;m、多重線、およびbr=広幅化。
【０２７５】
B.中間体の合成
1.脂肪二酸のモノエステルの合成
トルエン中のBoc-無水物、DMAP、およびt-ブタノールによるC12、C14、C16およびC18二酸の一晩の還流によって、主にt-ブチルモノエステルを得る。得られるのは、後処理後の一酸、二酸およびジエステルの混合物である。洗浄、ショートプラグシリカ濾過および結晶化によって、精製を行う。
【０２７６】
B.本発明の化合物の合成
【０２７７】
(実施例1)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Glu22,Arg26,Lys27,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.50:
【０２７８】
【化３３】
0006022538.tif 000035
【０２７９】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法09_B2_1):Rt=12.4分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=8.3分
LCMS4:Rt=2.0分、m/z=1659(m/3)、1244(m/4)、996(m/5)
【０２８０】
(実施例2)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル-Glu-Gly
Chem.51:
【０２８１】
【化３４】
0006022538.tif 000036
【０２８２】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法09_B2_1):Rt=13.1分
UPLC(方法04_A7_1):Rt=6.3分
LCMS4:Rt=2.1分、m/z=1707(m/3)、1280(m/4)、1025(m/5)
【０２８３】
(実施例3)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Glu22,Arg26,Lys27,Arg34,Lys36],des-Gly37-GLP-1-(7-36)-ペプチド
Chem.52:
【０２８４】
【化３５】
0006022538.tif 000037
【０２８５】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法09_B2_1):Rt=13.3分
UPLC(方法05_B5_1):Rt=6.5分
LCMS4:Rt=2.3分、m/z=1607(m/3)、1205(m/4)、964(m/5)
【０２８６】
(実施例4)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Glu22,Val25,Arg26,Lys27,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.53:
【０２８７】
【化３６】
0006022538.tif 000038
【０２８８】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法09_B2_1):Rt=13.0分
UPLC(方法04_A7_1):Rt=6.9分
LCMS4:Rt=2.0分、m/z=1668(m/3)、1251(m/4)、1001(m/5)
【０２８９】
(実施例5)
Nε20-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys20,Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,Gly34]-GLP-1-(7-34)-ペプチド
Chem.54:
【０２９０】
【化３７】
0006022538.tif 000039
【０２９１】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法08_B4_1):Rt=9.02分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=4.61分
LCMS4:Rt=2.17分、m/z=1540(m/3)、1155(m/4)
【０２９２】
(実施例6)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル-Glu
Chem.55:
【０２９３】
【化３８】
0006022538.tif 000040
【０２９４】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法09_B2_1):Rt=13.0分
UPLC(方法05_B5_1):Rt=5.6分
LCMS4:Rt=2.2分、m/z=1664(m/3)、1248(m/4)、999(m/5)
【０２９５】
(実施例7)
Nε22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys22,Val25,Arg26,Lys27,His31,Arg34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.56:
【０２９６】
【化３９】
0006022538.tif 000041
【０２９７】
調製方法:SPPS法B
LCMS2:Rt=4.00分、m/z=1599(m/3)、1199(m/4)
UPLC(方法08_B4_1):Rt=7.83分
UPLC(方法05_B9_1):Rt=7.45分
【０２９８】
(実施例8)
Nε22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys22,Val25,Arg26,Lys27,Arg34]-GLP-1-(7-34)-ペプチド
Chem.57:
【０２９９】
【化４０】
0006022538.tif 000042
【０３００】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法10_B12_1):Rt=8.92分
LCMS4:Rt=2.58分、m/z=1525(m/3)、1144(m/4)、915(m/5)
【０３０１】
(実施例9)
Nε22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys22,Val25,Arg26,Lys27,Arg34]-GLP-1-(7-35)-ペプチド
Chem.58:
【０３０２】
【化４１】
0006022538.tif 000043
【０３０３】
調製方法:SPPS法E
4628Daの理論的分子量を、MALDI_MSによって確認した。
UPLC(方法09_B4_1):Rt=9.29分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=6.49分
【０３０４】
(実施例10)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル-Glu
Chem.59:
【０３０５】
【化４２】
0006022538.tif 000044
【０３０６】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法08_B2_1):Rt=12.9分
UPLC(方法05_B5_1):Rt=5.5分
LCMS4:Rt=2.2分、m/z=1657(m/3)、1243(m/4)、995(m/5)
【０３０７】
(実施例11)
Nε22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys22,Val25,Arg26,Lys27,Glu30,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.60:
【０３０８】
【化４３】
0006022538.tif 000045
【０３０９】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法08_B2_1):Rt=13.5分
LCMS4:Rt=2.2分、m/z=1621(m/3)、1216(m/4)、973(m/5)
【０３１０】
(実施例12)
Nα(Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Val25,Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル)-Gln
Chem.61:
【０３１１】
【化４４】
0006022538.tif 000046
【０３１２】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法09_B4_1):Rt=8.9分
UPLC(方法05_B7_1):Rt=8.8分
LCMS4:Rt=2.2分、m/z=1673(m/3)、1255(m/4)、1004(m/5)
【０３１３】
(実施例13)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Val25,Arg26,Lys27,Glu30,Gln34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル-Glu
Chem.62:
【０３１４】
【化４５】
0006022538.tif 000047
【０３１５】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法05_B9_1):Rt=7.9分
UPLC(方法05_B7_1):Rt=8.8分
LCMS4:Rt=2.3分、m/z=1663(m/3)、1248(m/4)、999(m/5)
【０３１６】
(実施例14)
Nε22-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル],Nε27-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Lys22,Arg26,Lys27,His31,Gly34]-GLP-1-(7-34)-ペプチド
Chem.63:
【０３１７】
【化４６】
0006022538.tif 000048
【０３１８】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.5分
UPLC(方法05_B7_1):Rt=8.8分
LCMS4:Rt=2.1分、m/z=1462(m/3)、1097(m/4)、878(m/5)
【０３１９】
(実施例15)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Val25,Arg26,Lys27,His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.64:
【０３２０】
【化４７】
0006022538.tif 000049
【０３２１】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.3分
UPLC(方法05_B9_1):Rt=7.1分
LCMS4:Rt=2.1分、m/z=1589(m/3)、1192(m/4)、954(m/5)
【０３２２】
(実施例16)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Val25,Arg26,Lys27,His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.65:
【０３２３】
【化４８】
0006022538.tif 000050
【０３２４】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.1分
LCMS4:Rt=2.1分、m/z=1585(m/3)、1189(m/4)、951(m/5)
【０３２５】
(実施例17)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Glu22,Glu23,Val25,Arg26,Lys27,His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.66:
【０３２６】
【化４９】
0006022538.tif 000051
【０３２７】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.0分
UPLC(方法05_B9_1):Rt=6.6分
LCMS4:Rt=2.1分、m/z=1609(m/3)、1206(m/4)、966(m/5)
【０３２８】
(実施例18)
Nεl2-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys12,Glu22,Arg26,Lys27,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.67:
【０３２９】
【化５０】
0006022538.tif 000052
【０３３０】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法09_B4_1):Rt=7.66分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=4.09分
LCMS4:Rt=1.83分、m/z=1181(m/4)、945(m/5)
【０３３１】
(実施例19)
Nε22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys22,Arg26,Lys27,His31,Gly34]-GLP-1-(7-34)-ペプチド
Chem.68:
【０３３２】
【化５１】
0006022538.tif 000053
【０３３３】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法09_B4_1):Rt=8.37分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=4.41分
LCMS4:Rt=2.00分、m/z=1466(m/3)、1100(m/4)
【０３３４】
(実施例20)
Nε22-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル],Nε27-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Lys22,Val25,Arg26,Lys27,Glu30,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.69:
【０３３５】
【化５２】
0006022538.tif 000054
【０３３６】
調製方法:SPPS法E
UPLC(方法09_B4_1):Rt=9.00分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=6.50分
LCMS4:Rt=2.23分、m/z=1215(m/4)、972(m/5)
【０３３７】
(実施例21)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Glu22,His26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル-Glu
Chem.70:
【０３３８】
【化５３】
0006022538.tif 000055
【０３３９】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法09_B4_1):Rt=8.4分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=9.3分
LCMS4:Rt=2.2分、m/z=1681(m/3)、1261(m/4)、1009(m/5)
【０３４０】
(実施例22)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル],Nε27-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Glu22,Lys24,Arg26,Lys27,His31,Gly34]-GLP-1-(7-34)-ペプチド
Chem.71:
【０３４１】
【化５４】
0006022538.tif 000056
【０３４２】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法09_B4_1):Rt=8.17分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=4.65分
LCMS4:Rt=1.98分、m/z=1481(m/3)、1111(m/4)
【０３４３】
(実施例23)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Val25,Arg26,Lys27,Gln34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.72:
【０３４４】
【化５５】
0006022538.tif 000057
【０３４５】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.82分
UPLC(方法05_B5_1):Rt=6.10分
LCMS4:Rt=2.37分、m/z=1687(m/3)、1266(m/4)、1013(m/5)
【０３４６】
(実施例24)
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Glu22,Lys24,Val25,Arg26,Lys27,His31,Arg34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.73:
【０３４７】
【化５６】
0006022538.tif 000058
【０３４８】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法08_B4_1):Rt=7.52分
UPLC(方法04_A9_1):Rt=10.35分
LCMS4:Rt=1.92分、m/z=1613(m/3)、1210(m/4)、968(m/5)、807(m/6)
【０３４９】
(実施例25)
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Glu22,Lys24,Arg26,Lys27,His31,Gly34]-GLP-1-(7-34)-ペプチド
Chem.74:
【０３５０】
【化５７】
0006022538.tif 000059
【０３５１】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.01分
UPLC(方法04_A9_1):Rt=8.00分
LCMS4:Rt=2.08分、m/z=1513(m/3)、1135(m/4)、908(m/5)
【０３５２】
(実施例26)
Nε27-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4R)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル],Nε36-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4R)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Val25,Arg26,Lys27,Gln34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.75:
【０３５３】
【化５８】
0006022538.tif 000060
【０３５４】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法09_B4_1):Rt=8.96分
UPLC(方法05_B5_1):Rt=6.54分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=5.69分
LCMS4:m/z:Rt=3.07分、m/z=1687(m/3)、1266(m/4)、1013(m/5)
【０３５５】
(実施例27)
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Glu22,Lys24,Val25,Arg26,Lys27,Gly34]-GLP-1-(7-34)-ペプチド
Chem.76:
【０３５６】
【化５９】
0006022538.tif 000061
【０３５７】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法09_B4_1):Rt=9.25分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=6.01分
LCMS4:Rt=3.31分、m/z=1506(m/3)、1130(m/4)、4520(m/5)
【０３５８】
(実施例28)
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Glu22,Lys24,Val25,Arg26,Lys27,Arg34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.77:
【０３５９】
【化６０】
0006022538.tif 000062
【０３６０】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.19分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=5.24分
LCMS4:Rt=3.22分、m/z=1663(m/3)、1247(m/4)、998(m/5)、832(m/6)
【０３６１】
(実施例29)
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Glu22,Lys24,Val25,Arg26,Lys27,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.78:
【０３６２】
【化６１】
0006022538.tif 000063
【０３６３】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法08_B4_1):Rt=7.79分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=4.87分
【０３６４】
(実施例30)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル],Nε27-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Glu22,Lys24,Val25,Arg26,Lys27,Gly34]-GLP-1-(7-34)-ペプチド
Chem.79:
【０３６５】
【化６２】
0006022538.tif 000064
【０３６６】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法08_B4_1):Rt=9.33分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=6.13分
LCMS4:Rt=2.98分、m/z=1506(m/3)、1130(m/4)、904(m/5)
【０３６７】
(実施例31)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル-Glu-Gly
Chem.80:
【０３６８】
【化６３】
0006022538.tif 000065
【０３６９】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法09_B4_1:_Rt=8.58分
UPLC(方法10_B29_1):Rt=10.6分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=4.43分
LCMS4:Rt=3.72分;m/3:1712;m/4:1284;m/5:1028
【０３７０】
(実施例32)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル-Glu-Gly
Chem.81:
【０３７１】
【化６４】
0006022538.tif 000066
【０３７２】
調製方法:SPPS法B
UPLC(方法09_B4_1):Rt=9.19分
UPLC(方法10_B29_1):Rt=13.73分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=5.40分
LCMS4:Rt=2.44分;m/3:1726;m/4:1294;m/5:1036
【０３７３】
薬理学的方法
(実施例33)
インビトロでの効力
この実施例の目的は、GLP-1誘導体のインビトロでの活性または効力を試験することである。
【０３７４】
実施例1〜32のGLP-1誘導体の効力を、下記のように、すなわち、ヒトGLP-1受容体を発現している膜を含有する培地におけるサイクリックAMP(cAMP)の形成の刺激として決定した。
【０３７５】
原理
ヒトGLP-1受容体を発現している安定的なトランスフェクトされた細胞系、BHK467-12A(tk-ts13)からの精製した形質膜を、当該のGLP-1類似体または誘導体で刺激し、cAMP生成の効力を、Perkin Elmer Life SciencesからのAlphaScreenTM cAMPアッセイキットを使用して測定した。AlphaScreenアッセイの基本的原理は、内因性cAMPと外因的に加えたビオチン-cAMPとの間の競合である。cAMPの捕捉は、アクセプタービーズに結合している特異的抗体を使用することによって達成される。
【０３７６】
細胞培養および膜の調製
安定的なトランスフェクトされた細胞系および高発現しているクローンを、スクリーニングのために選択した。細胞を、5%CO2で、DMEM、5%FCS、1%Pen/Strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)および0.5mg/mlの選択マーカーG418中で増殖させた。
【０３７７】
概ね80%コンフルエンスの細胞を、PBSで2回洗浄し、Versene(エチレンジアミン四酢酸のテトラナトリウム塩の水溶液)と共に収集し、1000rpmで5分遠心分離し、上清を除去した。さらなるステップは、全て氷上で行った。細胞ペレットを、10mlの緩衝液1(20mMのNa-HEPES、10mMのEDTA、pH=7.4)中でUltrathuraxによって20〜30秒間ホモジナイズし、20,000rpmで15分遠心分離し、ペレットを10mlの緩衝液2(20mMのNa-HEPES、0.1mMのEDTA、pH=7.4)に再懸濁させた。懸濁液を20〜30秒間ホモジナイズし、20,000rpmで15分遠心分離した。緩衝液2への懸濁、ホモジナイゼーションおよび遠心分離を1回繰り返し、膜を緩衝液2に再懸濁させた。タンパク質濃度を決定し、膜を使用するまで-80℃で保存した。
【０３７８】
フラットボトムの96ウェルプレート(Costarカタログ番号:3693)でアッセイを行った。ウェル毎の最終容量は、50μlであった。
【０３７９】
溶液および試薬
Perkin Elmer Life SciencesからのAlphaScreen cAMPアッセイキット(カタログ番号:6760625M);抗-cAMPアクセプタービーズ(10U/μl)、ストレプトアビジンドナービーズ(10U/μl)およびビオチン化-cAMP(133U/μl)を含有。
【０３８０】
AlphaScreen緩衝液、pH=7.4:50mMのTRIS-HCl(Sigma、カタログ番号:T3253);5mMのHEPES(Sigma、カタログ番号:H3375);10mMのMgCl2、6H2O(Merck、カタログ番号:5833);150mMのNaCl(Sigma、カタログ番号:S9625);0.01%Tween(Merck、カタログ番号:822184)。下記を、使用前にAlphaScreen緩衝液に加えた(最終濃度を示す):BSA(Sigma、カタログ番号A7906):0.1%;IBMX(Sigma、カタログ番号I5879):0.5mM;ATP(Sigma、カタログ番号A7699):1mM;GTP(Sigma、カタログ番号G8877):1uM。
cAMP標準(アッセイにおける希釈係数=5):cAMP溶液:5μLのcAMP-ストック(5mM)+495μLのAlphaScreen緩衝液。
【０３８１】
AlphaScreen緩衝液中の適切な希釈系列を、cAMP標準、および試験するGLP-1類似体または誘導体、例えば、GLP-1化合物の下記の8つの濃度:(10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13Mおよび10-14M)、ならびに、例えば、10-6〜3×10-11の系列のcAMPについて調製した。
【０３８２】
膜/アクセプタービーズ
膜を、0.6mg/mlに対応する6μg/ウェルの濃度でhGLP-1/BHK467-12A細胞から調製した(ウェル毎に使用する膜の量は変化し得る)
「膜なし」:AlphaScreen緩衝液中のアクセプタービーズ(15μg/ml、最終)
「6μg/ウェルの膜」:AlphaScreen緩衝液中の膜+アクセプタービーズ(15μg/ml、最終)
一定分量(10μl)の「膜なし」を、cAMP標準(二連ウェル中でウェル毎)ならびに陽性および陰性対照に加えた
一定分量(10μl)の「6μg/ウェルの膜」を、GLP-1および類似体(二連または三連ウェル中でウェル毎)に加えた
陽性対照:10μlの「膜なし」+10μlのAlphaScreen緩衝液
陰性対照:10μlの「膜なし」+10μlのcAMPストック溶液(50μM)
ビーズは直接の光に対して感受性であるため、いかなる取扱いも、暗中(できるだけ暗く)で、または緑色の光の中であった。全ての希釈は氷上で行った。
【０３８３】
手順
1.AlphaScreen緩衝液を作製する。
2.GLP-1/類似体/cAMP標準をAlphaScreen緩衝液に溶解および希釈する。
3.ストレプトアビジンドナービーズ(2単位/ウェル)およびビオチン化cAMP(1.2単位/ウェル)を混合し、暗中室温で20〜30分インキュベートすることによって、ドナービーズ溶液を作製する。
4.cAMP/GLP-1/類似体を、プレートに加える:ウェル毎に10μl。
5.膜/アクセプタービーズ溶液を調製し、これをプレートに加える:ウェル毎に10μl。
6.ドナービーズを加える:ウェル毎に30μl。
7.プレートをアルミホイルで包み、振盪機上でRTにて3時間(非常にゆっくりと)インキュベートする。
8.AlphaScreenで計数する。各プレートをAlphaScreenにおいて計数の前に3分間プレインキュベートする。
【０３８４】
結果
EC50[pM]値を、Graph-Pad Prismソフトウェア(バージョン5)を使用して計算し、下記のTable 1(表1)に示す。インビトロでの全ての誘導体の効力を確認した。
【０３８５】
【表１】
0006022538.tif 000067
【０３８６】
試験した化合物についてのインビトロの平均効力(EC50平均)は、340pMであった。大部分の誘導体は、1200pM未満のEC50に対応する良好なインビトロの効力を有した。
【０３８７】
比較のために、Journal of Medicinal Chemistry(2000)、第43巻、第9号、1664〜669頁の表1における化合物番号13(ビス-C12-二酸でK26,34においてアシル化されているGLP-1(7-37))は、1200pMのEC50に対応するインビトロの効力を有した。
【０３８８】
(実施例34)
GLP-1受容体結合
この実験の目的は、GLP-1受容体へのGLP-1誘導体の結合、および結合がアルブミンの存在によってどのように潜在的に影響されるかを調査することである。これは、インビトロの実験で下記のように行われる。
【０３８９】
ヒトGLP-1受容体への、実施例1〜32のGLP-1誘導体の結合親和性を、受容体から125I-GLP-1を移動させるGLP-1誘導体の能力によって測定した。アルブミンへの誘導体の結合を試験するために、低濃度のアルブミン(0.001%-トレーサー中のその残留量に対応する)、および高濃度のアルブミン(2.0%を加える)でアッセイを行った。結合親和性、IC50におけるシフトは、当該のペプチドがアルブミンに結合する指標であり、それによって動物モデルにおける当該のペプチドの潜在的な延長性の薬物動態プロファイルの予測となる。
【０３９０】
条件
種(インビトロ):ハムスター
生物学的エンドポイント:受容体結合
アッセイ法:SPA
受容体:GLP-1受容体
細胞系:BHK tk-ts13
【０３９１】
細胞培養および膜精製
安定的なトランスフェクトされた細胞系および高発現しているクローンを、スクリーニングのために選択した。細胞を、5%CO2で、DMEM、10%FCS、1%Pen/Strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)および1.0mg/mlの選択マーカーG418中で増殖させた。
【０３９２】
細胞(概ね80%コンフルエンス)を、PBS中で2回洗浄し、Versene(エチレンジアミン四酢酸のテトラナトリウム塩の水溶液)と共に収集し、これに続いて細胞を1000rpmでの5分間の遠心分離によって分離した。細胞/細胞ペレットは、それに続くステップにおいて可能な範囲内で氷上に保持しなければならない。細胞ペレットを、適切な量の緩衝液1(細胞の量によるが、例えば、10ml)中でUltrathurraxによって20〜30秒間ホモジナイズした。ホモジネートを、20000rpmで15分間遠心分離した。ペレットを、10mlの緩衝液2に再懸濁(ホモジナイズ)し、再遠心分離した。このステップをもう一回繰り返した。このように得られたペレットを、緩衝液2に再懸濁し、タンパク質濃度を決定した。膜を、-80℃で保存した。
緩衝液1:20mMのNa-HEPES+10mMのEDTA、pH7.4
緩衝液2:20mMのNa-HEPES+0.1mMのEDTA、pH7.4
【０３９３】
結合アッセイ:
SPA:
試験化合物、膜、SPA-粒子および[125I]-GLP-1(7-36)NH2を、アッセイ緩衝液中で希釈した。50ul(マイクロリットル)のHSA(2%HSAを含有する「高アルブミン」実験)、または緩衝液(0.001%HSAを含有する「低アルブミン」実験)をOptiplateに加え、25ulの試験化合物を加えた。0.1〜0.2mgのタンパク質/ml(各膜調製のために好ましくは、最適化される)に対応する5〜10ugの膜タンパク質/試料を、加えた(50u1)。SPA-粒子(コムギ胚芽凝集素SPAビーズ、Perkin Elmer、#RPNQ0001)を、0.5mg/ウェル(50ul)の量で加えた。インキュベーションを、[125I]-GLP-1(7-36)NH2(49.880DPM、25ulに対応する最終濃度0.06nM)と共に開始した。プレートをPlateSealerで密封し、振盪しながら30℃で120分間インキュベートした。プレートを遠心分離(1500rpm、10分)し、Topcounterで計数した。
【０３９４】
アッセイ緩衝液:
50mMのHEPES
5mMのEGTA
5mMのMgC12
0.005%Tween20
pH7.4
HSAは、SIGMA A1653であった。
【０３９５】
計算
IC50値は、受容体からの125I-GLP-1の50%を移動させる濃度として曲線から読み取り、[(IC50/nM)高HSA]/[(IC50/nM)低HSA]の比を決定した。
【０３９６】
一般に、低アルブミン濃度でのGLP-1受容体への結合は、低いIC50値に対応して、できる限り良好であるべきである。
【０３９７】
高アルブミン濃度でのIC50値は、GLP-1受容体への誘導体の結合に対するアルブミンの影響の尺度である。公知のように、GLP-1誘導体はまた、アルブミンに結合する。これは一般に、血漿中のGLP-1誘導体の寿命を延長させる望ましい作用である。したがって、高アルブミンでのIC50値は一般に、GLP-1受容体への結合と競合するアルブミン結合に起因する、GLP-1受容体への結合の減少に対応して、低アルブミンでのIC50値より高い。
【０３９８】
したがって、高い比(IC50値(高アルブミン)/IC50値(低アルブミン))は、当該の誘導体がアルブミンに良好に結合し(長い半減期を有してもよく)、かつまたそれ自体がGLP-1受容体に良好に結合する(IC50値(高アルブミン)は高く、IC50値(低アルブミン)は低い)という指標と考えてもよい。
【０３９９】
結果
下記の結果を得たが、「比」とは、[(IC50/nM)高HSA]/[(IC50/nM)低HSA]を意味する。
【０４００】
【表２】
0006022538.tif 000068
【０４０１】
平均比は、非常に良好であった(約300)。大部分の誘導体は、50超の比を有した。
【０４０２】
さらに、IC50(低アルブミン)に関して、試験した化合物の平均IC50は、14nMであり、大部分の誘導体は15.0nM未満であった。
【０４０３】
最終的に、IC50(高アルブミン)に関して、大部分の誘導体は、900nM未満のIC50(高アルブミン)を有した。
【０４０４】
比較のために、Journal of Medicinal Chemistry(2000)、第43巻、第9号、1664〜669頁の表1における化合物番号13(ビス-C12-二酸でK26,34においてアシル化されているGLP-1(7-37))は、51.3の比、17.7nMのIC50(低アルブミン)、および908nMのIC50(高アルブミン)を有した。
【０４０５】
(実施例35)
経口バイオアベイラビリティーの推定-ラットにおける消化管注入(カプレート)
この実験の目的は、GLP-1誘導体の経口バイオアベイラビリティーを推定することである。
【０４０６】
この目的のために、実施例2〜17および19〜22のGLP-1誘導体の腸管腔中への直接の注入後の血漿中曝露を、下記に記載されているように、ラットにおいてインビボで研究した。
【０４０７】
GLP-1誘導体を、55mg/mlのカプリン酸ナトリウムの溶液中で1000uMの濃度で試験した。
【０４０８】
概ね240gの到着時の体重を有する雄性Sprague-DawleyラットをTaconic(Denmark)から得て、単純な無作為化によって群毎に4匹のラットで異なる処置に割り当てた。ラットを実験の前に概ね18時間絶食させ、全身麻酔(Hypnorm/Dormicum)にかけた。
【０４０９】
GLP-1誘導体を、空腸の近位部(十二指腸について10cm遠位)または中腸(盲腸について50cm近位)に投与した。PE50-カテーテル(10cm長さ)を空腸に挿入し、空腸中に少なくとも1.5cm進め、投与前に先端の遠位で3/0縫合糸によって消化管およびカテーテルの周りを結紮することによって固定し、漏れまたはカテーテルの移動を防止した。カテーテルをシリンジおよび針を伴わずに入れ、切開部を創傷クリップで閉じる前に、2mlの食塩水を腹部に投与した。
【０４１０】
100μlのそれぞれのGLP-1誘導体を、1mlのシリンジを有するカテーテルを通して空腸管腔中に注入した。続いて、200μlの空気を別のシリンジで空腸管腔中に押し入れ、カテーテルを「フラッシュ」した。カテーテルへの逆流を防止するために、このシリンジをカテーテルに結合したままとした。
【０４１１】
血液試料(200ul)を、尾静脈からEDTAチューブ中に所望の間隔(通常、0分、10分、30分、60分、120分および240分の時点)で集め、5分遠心分離した(10000G、4℃で20分以内)。血漿(75ul)をMicronicチューブに分離し、直ちに冷凍し、PoulsenおよびJensen、Journal of Biomolecular Screening、2007年、第12巻、240〜247頁によってインスリンの決定について一般に記載されているように、LOCI(発光酸素チャネリング免疫アッセイ)によってそれぞれのGLP-1誘導体の血漿濃度について分析するまで-20℃で保持した。ドナービーズは、ストレプトアビジンでコーティングし、一方、アクセプタービーズは、ペプチドの中央/C末端エピトープを認識するモノクローナル抗体と結合させた。N末端に特異的な別のモノクローナル抗体を、ビオチン化した。3種の反応物を分析物と合わせ、2部位免疫複合体を形成させた。複合体を照射すると、ドナービーズから一重項酸素原子が放出し、これはアクセプタービーズ中に導かれ、化学発光を誘発したが、これをEnvisionプレートリーダーで測定した。光の量は、化合物の濃度と比例した。
【０４１２】
血液採取後、ラットを麻酔下で屠殺し、腹部を開き、正確なカテーテルの配置を確認した。
【０４１３】
平均(n=4)血漿濃度(pmol/l)を、時間の関数として決定した。血漿濃度(pmol/l)を投与溶液の濃度(μmol/l)で割った比を、各処置について計算し、腸のバイオアベイラビリティーの代替的測定値として、t=30分(空腸中への化合物の注入の30分後)についての結果を評価した(30分での用量補正した曝露)。用量補正した曝露は、実際のバイオアベイラビリティーと有意な相関を示した。
【０４１４】
下記の結果を得たが、30分での用量補正した曝露とは、(空腸中への化合物の注入30分後の血漿濃度(pM))を、(投与溶液中の化合物の濃度(pM))で割った商を意味する。
【０４１５】
【表３】
0006022538.tif 000069
【０４１６】
全ての誘導体は、38超の30分での用量補正した曝露を有した。
【０４１７】
比較のために、Journal of Medicinal Chemistry(2000年)、第43巻、第9号、1664〜669頁の表1における化合物番号13(ビス-C12-二酸でK26、34においてアシル化されたGLP-1(7-37))は、38の30分での用量補正した曝露を有した。
【０４１８】
(実施例36)
血中グルコースおよび体重に対する作用
研究の目的は、糖尿病性の状態における血中グルコース(BG)および体重(BW)に対するGLP-1誘導体の作用を検証することである。
【０４１９】
下記に記載されているように、GLP-1誘導体を、肥満の糖尿病性マウスモデル(db/dbマウス)で用量反応研究において試験した。
【０４２０】
生まれたときからNIH31食餌(NIH31Mげっ歯類用食餌、Taconic Farms、Inc.、USから市販されている。www.taconic.comを参照されたい)を摂食させたdb/dbマウス(Taconic、Denmark)を、7〜9週齢で研究に登録した。マウスは標準的飼料(例えば、Altromin1324、Brogaarden、Gentofte、Denmark)および水道水に自由にアクセスさせ、24℃に保持した。1〜2週間の順化後、基礎血中グルコースを、連続2日で2回評価した(すなわち、9am)。最も低い血中グルコース値を有するマウスを、実験から除外した。平均血中グルコース値に基づいて、残りのマウスをさらなる実験法のために選択し、対応する血中グルコース値を有する7つの群(n=6)に割り当てた。マウスを、48時間の期間、および4回まで実験において使用した。最後の実験の後に、マウスを安楽死させた。
【０４２１】
7つの群は、下記のように処置を受けた。
1:ビヒクル、s.c.
2:GLP-1誘導体、0.3nmol/kg、s.c.
3:GLP-1誘導体、1.0nmol/kg、s.c.
4:GLP-1誘導体、3.0nmol/kg、s.c.
5:GLP-1誘導体、10nmol/kg、s.c.
6:GLP-1誘導体、30nmol/kg、s.c.
7:GLP-1誘導体、100nmol/kg、s.c.
ビヒクル:50mMのリン酸ナトリウム、145mMの塩化ナトリウム、0.05%Tween80、pH7.4。
【０４２２】
GLP-1誘導体を、0.05nmol/ml、0.17nmol/ml、0.5nmol/ml、1.7nmol/ml、5.0nmol/mlおよび17.0nmol/mlの濃度に、ビヒクルに溶解した。動物に、6ml/kgの投与容量でs.c.投与した(すなわち、50gのマウス毎に300μl)。
【０４２３】
投与の日に、-1/2時間の時点(8.30am)で血中グルコースを評価した(マウスを秤量した後)。GLP-1誘導体を、概ね9am(0時点)に投与した。投与の日において、1時間、2時間、4時間および8時間の時点(10am、11am、1pmおよび5pm)で血中グルコースを評価した。8時間の時点での血液採取に続いて、マウスを秤量する。
【０４２４】
それに続く日に、血中グルコースを、投与後、24時間および48時間の時点(すなわち、2日目および3日目の9am)で評価した。毎日、血中グルコースの試料採取に続いてマウスを秤量した。
【０４２５】
マウスを個々にデジタルウェイトで秤量した。
【０４２６】
血中グルコースの測定のための試料は、意識のあるマウスの尾の先端の毛細管から得た。血液(10μl)をヘパリン処理した毛細管に集め、500μlのグルコース緩衝液(EKF system solution、Eppendorf、Germany)に移した。グルコース濃度を、グルコースオキシダーゼ法を使用して測定した(グルコース分析器Biosen5040、EKF Diagnostic、GmbH、Barleben、Germany)。分析まで試料を室温で1時間まで保持した。分析を延期しなくてはならない場合、試料を4℃で最大で24時間保持した。
【０４２７】
ED50は、最大半減効果を生じさせる用量である(nmol/kg)。この値は、下記で説明するように、誘導体が体重を低下させる能力、および血中グルコースを低下させる能力を基準として計算する。
【０４２８】
体重についてのED50は、誘導体の皮下投与の8時間後に、δBWに対して最大半量効果を生じさせる用量として計算する。例えば、8時間後の体重の最大減少が2.0gである場合、ED50体重は、8時間後に1.0gの体重減少を生じさせる用量(nmol/kg)である。この用量(ED50体重)は、用量反応曲線から読み取ってもよい。
【０４２９】
血中グルコースについてのED50は、類似体の皮下投与の8時間後および/または24時間後に、AUCδBGに対して最大半量効果を生じさせる用量として計算する。
【０４３０】
ED50値は、最大反応を明確に定義して、適切なシグモイド用量反応関係が存在する場合のみ計算し得る。したがって、これが当てはまらない場合、当該の誘導体を、シグモイド用量反応関係が得られたかどうか確認するために、異なる範囲の用量で再試験してもよい。
【０４３１】
(実施例37)
ミニブタにおける半減期
この研究の目的は、ミニブタへのi.v.投与の後のGLP-1誘導体のインビボでの延長、すなわち、これらの作用時間の延長を決定することである。これは、当該の誘導体の末端半減期を決定する薬物動態学的(PK)研究において行われる。末端半減期とは一般に、最初の分布相の後に測定して、特定の血漿濃度を半減させるのにかかる期間を意味する。
【０４３２】
雄性Gottingenミニブタは、Ellegaard Gottingenミニブタ(Dalmose、Denmark)から入手した。概ね7〜14カ月齢および概ね16〜35kgの体重を、研究において使用した。ミニブタを個々に収容し、SDSミニブタ食餌(Special Diets Services、Essex、UK)を1日1回または2回制限的に摂食させた。少なくとも2週間の順化の後、2つの永久中心静脈カテーテルを、各動物の下大静脈または上大静脈にインプラントした。動物は手術後に1週間回復させ、次いで連続的なGLP-1誘導体投与の間に適切な休薬期間を取って繰り返される薬物動態研究のために使用した。
【０４３３】
動物に投与の前概ね18時間および投与の後0〜4時間絶食させたが、全期間の間に水に自由にアクセスさせた。
【０４３４】
GLP-1誘導体を、50mMのリン酸ナトリウム、145mMの塩化ナトリウム、0.05%Tween80、pH7.4に通常20〜60nmol/mlの濃度まで溶解した。化合物の静脈内注射(容量は通常1〜2nmol/kg、例えば0.033ml/kgに対応する)を、1つのカテーテルによって与え、投与後13日まで事前に定めた時点において血液を試料採取した(好ましくは、他のカテーテルによって)。血液試料(例えば、0.8ml)をEDTA緩衝液(8mM)中で集め、次いで、4℃および1942Gで10分間遠心分離した。血漿を、ドライアイス上のMicronicチューブ中にピペットで移し、ELISAまたは同様の抗体をベースとするアッセイまたはLC-MSを使用してそれぞれのGLP-1化合物の血漿濃度について分析するまで-20℃で保持した。個々の血漿濃度-時間プロファイルを、Phoenix WinNonLin v.6.2(Pharsight Inc.、Mountain View、CA、USA)でノンコンパートメントモデルによって分析し、このように得られた末端半減期(調和平均)を決定した。
【０４３５】
結果
実施例2の誘導体を試験し、これは87時間の半減期を有した。
【０４３６】
比較のために、Journal of Medicinal Chemistry(2000)、第43巻、第9号、1664〜669頁の表1における化合物番号13(ビス-C12-二酸でK26,34においてアシル化されているGLP-1(7-37))は、5時間の半減期を有した。
【０４３７】
(実施例38)
食物摂取量に対する作用
この実験の目的は、ブタにおいて食物摂取量に対するGLP-1誘導体の作用を調査することである。これは、下記のような薬力学的(PD)研究において行う。食物摂取量を、ビヒクル処置対照群と比較して、単回用量のGLP-1誘導体の投与の1〜4日後に測定する。
【０４３８】
概ね3カ月齢、概ね30〜35kgの体重の雌性Landrace Yorkshire Duroc(LYD)ブタを使用した(群毎にn=3〜4)。動物は、動物施設への順化の間、概ね1週間、群で収容した。実験期間の間、個々の食物摂取量の測定のために、投与の前少なくとも2日および全実験の間、動物を個々の檻に入れた。動物に順化および実験期間の間の両方で常に、ブタ飼料(Svinefoder Danish Top)を自由に摂食させた。食物摂取量は、15分毎に飼料の重量をロギングすることによってオンラインでモニターした。使用したシステムは、Mpigwin(Ellegaard Systems、Faaborg、Denmark)であった。
【０４３９】
GLP-1誘導体を、リン酸緩衝液(50mMのリン酸ナトリウム、145mMの塩化ナトリウム、0.05%Tween80、pH7.4)に、0.3nmol/kg、1nmol/kg、3nmol/kg、10nmol/kgまたは30nmol/kgの用量に対応する、12nmol/ml、40nmol/ml、120nmol/ml、400nmol/mlまたは1200nmol/mlの濃度で溶解した。リン酸緩衝液は、ビヒクルの役割を果たした。動物に、1日目の朝にGLP-1誘導体またはビヒクル(投与容量0.025ml/kg)の単回皮下用量を投与し、投与後に食物摂取量を1〜4日間測定した。各研究の最終日の投与1〜4日後に、GLP-1誘導体の血漿曝露の測定のための血液試料を、麻酔した動物の心臓から採取した。動物はその後、ペントバルビトンの心臓内過剰投与によって安楽死させた。GLP-1誘導体の血漿含量を、ELISAまたは同様の抗体をベースとするアッセイ、またはLC-MSを使用して分析した。
【０４４０】
食物摂取量を、各実験日の24時間食物摂取量の平均±SEMとして計算した。ビヒクル群対GLP-1誘導体群における24時間食物摂取量の統計的比較は、二元配置ANOVA反復測定、続いてボンフェローニ事後試験を使用して行った。
【０４４１】
実施例10の化合物を、3nmol/kgの用量で試験し、この用量において、食物摂取量に対する作用は見られなかった。実施例2の化合物を3nmol/kgの用量で試験し、実験の両方の日において食物摂取量の有意な減少が示された(1日目に23%、および2日目に35%)。
【０４４２】
(実施例39)
ラットにおける薬物動態
この実施例の目的は、ラットにおけるインビボでの半減期を調査することである。
【０４４３】
ラットにおいてインビボの薬物動態研究を、下記に記載されているように、実施例2、10、17〜18、および31のGLP-1誘導体で行った。セマグルチドを、比較のために含めた。
【０４４４】
概ね400の体重を有する同じ週齢の雄性Sprague-DawleyラットをTaconic(Denmark)から得て、各群における全ての動物が同様の体重であるように、体重について単純な無作為化によって群毎に概ね4匹のラットで処置に割り当てる。
【０４４５】
GLP-1誘導体(概ね6nmole/ml)は、50mMのリン酸ナトリウム、145mMの塩化ナトリウム、0.05%Tween80、pH7.4に溶解した。化合物の静脈内注射(1.0ml/kg)を、右頸静脈にインプラントしたカテーテルによって与えた。投与後5日間、血液を舌下静脈から試料採取した。血液試料(200μl)を、EDTA緩衝液(8mM)中に集め、次いで4℃および10000Gで5分間遠心分離した。血漿試料を、それぞれのGLP-1化合物の血漿濃度について分析するまで-20℃で保持した。
【０４４６】
GLP-1化合物の血漿濃度は、PoulsenおよびJensen、Journal of Biomolecular Screening、2007年、第12巻、240〜247頁によってインスリンの決定について一般に記載されているように発光酸素チャネリング免疫アッセイ(LOCI)を使用して決定した。ドナービーズは、ストレプトアビジンでコーティングし、一方、アクセプタービーズは、ペプチドの中央/C末端エピトープを認識するモノクローナル抗体と結合させた。N末端特異的な別のモノクローナル抗体を、ビオチン化した。3種の反応物を分析物と合わせ、2部位免疫複合体を形成させた。複合体を照射すると、ドナービーズから一重項酸素原子が放出し、これはアクセプタービーズ中に導かれ、化学発光を誘発したが、これをEnvisionプレートリーダーで測定した。光の量は、化合物の濃度と比例した。
【０４４７】
血漿濃度-時間プロファイルを、Phoenix WinNonlin(バージョン6.2、Pharsight Inc.、Mountain View、CA、USA)を使用して分析し、半減期(T1/2)を、各動物からの個々の血漿濃度-時間プロファイルを使用して計算した。
【０４４８】
結果
同じ設定(しかし、n=8)で試験したセマグルチドの半減期は、11時間であった。
【０４４９】
【表４】
0006022538.tif 000070
【０４５０】
試験する本発明の誘導体は、セマグルチドの半減期と同様またはより良好な半減期を有した。
【０４５１】
(実施例40)
経口バイオアベイラビリティーの推定-ラットにおける消化管注入および経口胃管栄養法(SNAC)
この実験の目的は、ラットモデルにおけるGLP-1誘導体の経口バイオアベイラビリティーを推定することである。手短に言えば、GLP-1誘導体のN-[8-(2-ヒドロキシベンゾイル)アミノ]カプリル酸ナトリウム(SNAC)溶液を、消化管注入(腸)によって、または経口胃管栄養法(胃)によって投与し、それに続きGLP-1誘導体の血漿中曝露を測定する。
【０４５２】
250mg/mlのSNACのストック溶液を、SNAC(12.5g)を非常に純粋な実験室用水(MilliQ)(50.0ml)に溶解することによって調製する。1NのNaOH(水溶液)で、pHを約8.5に調整する。
【０４５３】
250mg/mlのSNAC中に約1000uM(800〜1200uM)のGLP-1誘導体を有する溶液を、所望の量のそれぞれのGLP-1誘導体をSNACストック溶液に溶解することによって調製する。GLP-1誘導体の濃度を、現況技術の方法、例えば、CLND-HPLC(HPLCのための化学発光窒素検出)による投与の前に決定する。
【０４５４】
概ね240gの到着時の体重を有する32匹の雄性Sprague-DawleyラットをTaconic(Denmark)から得て、単純な無作為化によって群毎に8匹のラットで異なる処理に割り当てる。全てのラットは、グリッド上で実験の前に概ね18時間絶食させる。
【０４５５】
消化管注入のために、実験の日に、ラットを全身麻酔(Hypnorm/Dormicum)にかけ、全実験の間麻酔し続けた。実施例5〜7のGLP-1誘導体を、空腸の近位部(十二指腸について10cm遠位)に投与する。PE50-カテーテル(10cm長さ)を空腸に挿入し、空腸中に少なくとも1.5cm進め、投与前に消化管の周りを結紮することによって固定する。さらに、カテーテルに、先端の遠位で3/0縫合糸を施し、漏れまたはカテーテルの移動を防止する。カテーテルをシリンジおよび針を伴わずに入れ、切開部を創傷クリップで閉じる前に、2mlの食塩水を腹部に投与する。
【０４５６】
それぞれのGLP-1誘導体の100μlのSNAC溶液を、1mlのシリンジを有するカテーテルを通して空腸管腔中に注入する。続いて、200μlの空気を、別のシリンジで空腸管腔に押し入れ、カテーテルを「フラッシュ」する。このシリンジは、カテーテルへの逆流を防止するために、カテーテルに結合したままとする。
【０４５７】
血液試料(200ul)を、尾静脈からEDTAチューブ中に所望の間隔(通常、0分、30分、60分、120分および180分の時点)で集める。
【０４５８】
経口胃管栄養法のために、全実験の間に動物は意識がある。
【０４５９】
100μlのGLP-1誘導体のSNAC溶液を、経口胃管栄養法によって胃に直接投与する。
【０４６０】
血液試料(200ul)を、舌下神経叢からEDTAチューブ中に所望の間隔(通常、0分、30分、60分、120分および180分の時点)で集める。
【０４６１】
全ての得られた血液試料を氷上に保持し、5分間遠心分離する(10000G、4℃で20分以内)。血漿(75ul)をMicronicチューブに分離し、直ちに冷凍し、PoulsenおよびJensen、Journal of Biomolecular Screening、2007、第12巻、240〜247頁によってインスリンの決定について一般に記載されているように、LOCI(発光酸素チャネリング免疫アッセイ)によってそれぞれのGLP-1誘導体の血漿濃度について分析するまで-20℃で保持する。ドナービーズは、ストレプトアビジンでコーティングし、一方、アクセプタービーズは、ペプチドの中央/C末端エピトープを認識するモノクローナル抗体と結合させる。N末端に特異的な別のモノクローナル抗体を、ビオチン化する。3種の反応物を分析物と合わせ、2部位免疫複合体を形成させる。複合体を照射すると、ドナービーズから一重項酸素原子が放出し、これはアクセプタービーズ中に導かれ、化学発光を誘発するが、これをEnvisionプレートリーダーで測定する。光の量は、化合物の濃度と比例する。
【０４６２】
血液採取後、全てのラットを麻酔下で屠殺し、消化管注入したラットの腹部を開き、正確なカテーテルの配置を確認する。
【０４６３】
平均(n=8)血漿濃度(pmol/l)を、時間の関数として決定する。30〜180(分)の時点の時間曲線に対する血漿曝露(pmol/l)のAUCを、用量補正、すなわち、投与する溶液中の誘導体の量(用量)(pmol)によって割る。30〜180分の時点の血漿曝露のこのように用量補正したAUC(分×pM/pmol=分/Lの単位を有する)を、ラットモデルにおける誘導体の吸収に関して誘導体を順位付ける尺度である、バイオアベイラビリティーの代替的測定値として使用する。
【０４６４】
本発明の特定の特徴を本明細書に例示および記載してきた一方で、多くの修正、置換、変化、および同等物がいまや当業者には思い当たるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神内に入るものとして全てのこのような修正および変更を包含することを意図することが理解される。
【配列表】
0006022538000001.app