(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を定量する方法であって、以下のａ）〜ｄ）を含んでいる方法：
ａ）所定の長さを有する参照オリゴヌクレオチドを、検出可能なマーカーで標識する工程、
ｂ）該標識された参照オリゴヌクレオチドの連続希釈物を用いて、該検出可能なマーカーの強度を標識された参照オリゴヌクレオチドの濃度に対してプロットすることによって検量線を作成する工程、
ｃ）増幅される標的核酸を標識する該検出可能なマーカーの存在下で、標的核酸を増幅する工程、
ｄ）該標識が付された増幅された標的核酸に付随する該検出可能なマーカーの強度と該検量線とを比較して、該増幅された標的核酸の量を求める工程であって、該標識された参照オリゴヌクレオチドは、増幅されず、該標的核酸との共増幅もされない工程であって、同じ該標識された参照オリゴヌクレオチドを用いて異なる標的核酸を定量する工程。
【請求項２】
上記検出可能なマーカーが色素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記色素が二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に結合する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記色素が、インターカレート色素である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記色素が、蛍光色素である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
上記使用される色素は、ＳＹＢＲグリーンＩ、ＳＹＢＲグリーンＩＩ、ＣＹＢＲゴールド、エバグリーン、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、ピコグリーン、ＴＯＴＯ、ＢＥＢＯ、または、Ｄｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅのうちのいずれか１つから選択されるものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記参照オリゴヌクレオチドの長さが、６０ｂｐ以上である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
上記参照オリゴヌクレオチドのＧＣ含有率が、４５％以上である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
上記参照オリゴヌクレオチドの長さが、６０ｂｐ〜１７０ｂｐである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
上記参照オリゴヌクレオチドのＧＣ含有率が、４５％〜７５％である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
上記参照オリゴヌクレオチドの長さが１００ｂｐであり、ＧＣ含有率が５０％である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
上記参照オリゴヌクレオチドが、上記標的核酸よりも長い、または、短い、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
上記標的核酸の増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって実施される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
単一の検量線を使用して、複数回の標的核酸の増幅および定量が実施される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
上記複数回の標的核酸の増幅および定量が、それぞれ異なるタイミングで実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記標的核酸が、１５サイクルよりも多いサイクルにて増幅される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキットであって、
蛍光色素と参照オリゴヌクレオチドとを有している、キット。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキットであって、
検出可能なマーカーで標識された参照オリゴヌクレオチドを有している、キット。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキットであって、
検出可能なマーカーで標識された参照オリゴヌクレオチドの連続希釈物を有している、キット。
【請求項２０】
参照オリゴヌクレオチドは、長さが６０ｂｐ〜１７０ｂｐであり、ＧＣ含有率が４５〜７５％である、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は核酸を定量する方法に関し、特に、データをハウスキーピング遺伝子または注目している合成遺伝子に対して規格化する必要がない、遺伝子発現研究に用いる核酸を定量する改良された普遍的な方法に関する。この方法は、診断用途、法医学的用途、および、研究用途に適用可能であるが、本発明は、これらの特定の分野の用途に限定されるものではないことは理解されよう。
【０００２】
〔背景技術〕
本明細書全体を通じて、先行技術に関するいかなる議論も、当該先行技術が広く公知であると見なすべきではなく、当該分野の通常の一般的な知識の一部を構成すると容認するものであると見なすべきでもない。
【０００３】
遺伝子発現を定量するためのＰＣＲ技術は、急速なサーモサイクラーの開発、および、各サイクルの後の増幅生成物の蛍光モニタリング（リアルタイムＰＣＲ）の導入によって向上してきた。遺伝子発現の定量は、色素（特に、蛍光色素）を使用して、反応初期における試料中の核酸の量に比例して増加しつつある蛍光を、ＰＣＲ増幅の対数期に検出することによって実施される。定量は、閾値サイクル、つまり、検出可能な蛍光を示す最初のサイクルに基づいて行われ、外部標準（通常は合成遺伝子）を用いて絶対的に実施することも可能であるし、比較用の規格化参照遺伝子を内部検量用試料（つまり、ハウスキーピング遺伝子）として用いて相対的に実施することも可能である。制御遺伝子（つまり、ハウスキーピング遺伝子）は、異なる試料間のｍＲＮＡレベルを規格化するために使用される。
【０００４】
遺伝子発現がたとえわずかに変化しても標的遺伝子の相対的定量プロファイルは変化してしまうので、選択した参照遺伝子が変動しないことが非常に重要である。ピペッティングおよび希釈の誤差も増幅レベルを変化させ、その結果、定量プロファイルを変化させる。
【０００５】
例えばグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、ポルフォビリノーゲンデスアミナーゼ（ＰＢＧＤ）、β２−マイクログロビン、βアクチンなどの遺伝子が、リアルタイムＰＣＲにおける内部検量用試料として使用されることが多い。ただし、これらの遺伝子は、実験条件または処理法に応じて変動（move）することが示されている。大量に発現する遺伝子（例えば、１８Ｓ）も、反応を圧倒しないようにＰＣＲ条件を限定する必要があるので、理想的な参照遺伝子ではない。
【０００６】
したがって、適切なハウスキーピング遺伝子は、注目している組織中で十分に発現すべきであり、もっとも重要なことは、該ハウスキーピング遺伝子の発現が、採用する実験条件下または処理法において各試料間で非常に小さな変動しか示さないことである。
【０００７】
ただし、これらの制御遺伝子のうちの多くは、発現において容認できない程度の変動を示す。このような遺伝子の発現レベルには組織間または細胞間でばらつきがある可能性があり、ある環境下、つまり、異なる処理法では変化し得ることが示されている。したがって、新しい実験システムでは、どのシステムであっても、ハウスキーピング遺伝子を検証することが重要である。特定の実験システムにおける使用に適したハウスキーピング遺伝子または参照遺伝子を見つけ出すことは、時間のかかる困難な作業であることが多い。状況によっては、見つけ出すことが不可能なことすらある。
【０００８】
遺伝子発現研究において外部標準（つまり合成配列）を使用するには、一般に、注目している遺伝子をクローン化して、合成参照遺伝子を得ることが必要である。この方法では、既知量の合成参照遺伝子配列を連続的に希釈し、増幅して、検量線を作成する。この方法の場合のクローン化配列の生成は、一般に時間と手間がかかる作業であって、希釈の誤差が指数関数的に増幅され、この増幅が核酸レベルの不正確な評価を引き起こす可能性がある。大幅に希釈されたクローン化配列の安定性および保存も問題になり得る。
【０００９】
したがって、依然として、任意の実験環境または処理状態にも適用可能であるとともに、データを規格化するためにハウスキーピング遺伝子または注目している合成遺伝子を使用しなくてもよい、速く効率的に核酸を定量する普遍的方法を開発する必要がある。
【００１０】
本発明の目的は、上記先行技術の欠点のうちの少なくとも１つを解消または緩和すること、または、有用な代替物／方法を提供することである。
【００１１】
〔発明の概要〕
本発明は、一般的な広い意味では、核酸の発現データを規格化するためにハウスキーピング遺伝子または合成参照遺伝子を使用する必要がない、核酸を定量する方法に関する。換言すれば、本発明の方法は、普遍的な参照オリゴヌクレオチド（または、１つ以上のこのようなオリゴヌクレオチド）を適切な色素と組み合わせて使用する方法であって、この方法を用いて検量線が作成可能であり、さらに、この検量線からは、試料中の増幅済みの標的核酸の絶対レベルが算出可能である。したがって、本発明の方法は、注目している互いに異なる核酸を、同じ参照オリゴヌクレオチドを用いて、個別に、または、このような注目している核酸の混合物中において定量することができる。
【００１２】
本発明は、上記本発明の方法において使用するためのキットにも関する。
【００１３】
第１の態様では、標的核酸を定量する方法であって、以下のａ）〜ｄ）を含んでいる方法が提供される：
ａ）所定の長さを有する参照オリゴヌクレオチドを、検出可能なマーカーで標識する工程、
ｂ）該標識された参照オリゴヌクレオチドの連続希釈物（serial dilutions）を用いて、該検出可能なマーカーの強度を標識された参照オリゴヌクレオチドの濃度に対してプロットすることによって検量線を作成する工程、
ｃ）増幅される標的核酸を標識する検出可能なマーカーの存在下で、標的核酸を増幅する工程、
ｄ）該標識が付された増幅された標的核酸に付随する該検出可能なマーカーの強度と該検量線とを比較して、該増幅された標的核酸の量を求める工程であって、該検量線は、増幅されず、該標的核酸との共増幅もされない工程。
【００１４】
第２の態様では、標的核酸を定量する方法であって、以下のａ）〜ｅ）を含んでいる方法が提供される：
ａ）所定の長さを有する参照オリゴヌクレオチドを、検出可能なマーカーで標識する工程、
ｂ）該標識された参照オリゴヌクレオチドの連続希釈物を用いて、該検出可能なマーカーの強度を標識された参照オリゴヌクレオチドの濃度に対してプロットすることによって検量線を作成する工程、
ｃ）標的核酸を増幅する工程、
ｄ）該増幅された標的核酸を、検出可能なマーカーで標識する工程、
ｅ）該標識が付された増幅された標的核酸に付随する該検出可能なマーカーの強度と該検量線とを比較して、該増幅された標的核酸の量を求める工程であって、該検量線は、増幅されず、該標的核酸との共増幅もされない工程。
【００１５】
上記参照オリゴヌクレオチドの配列は、上記標的核酸または任意のハウスキーピング遺伝子の配列に対していかなる相同性を有する必要はない。ただし、本発明の方法では、参照オリゴヌクレオチドを特定の様態で使用する（つまり、参照オリゴヌクレオチドの連続希釈にしたがって検量線を作成するために使用する）ので、上記参照オリゴヌクレオチドの配列は、標的核酸配列もしくはハウスキーピング遺伝子、または、これらの配列／遺伝子のより小さな部分に対して、ある程度の相同性または同一性さえをも有する可能性がある。本発明の有利な効果の１つは、上記方法が、同じ単一の参照オリゴヌクレオチドを利用して、異なる標的核酸を定量できることである。実際には、上記参照オリゴヌクレオチドは、特定の固定された長さおよびＧＣ含有率を有する普遍的なオリゴヌクレオチド（通常、ＧＣ含有率が５０％である１００ｂｐのオリゴヌクレオチド）であってもかまわない。
【００１６】
好ましくは、上記標的核酸の増幅をポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって実施する。通常、上記標的核酸は１５サイクルよりも多いサイクルにて増幅されるが、このサイクル数は本発明の方法にとって必須要素ではない。注目している複数個の標的核酸を１回の反応で同時に増幅（つまり多重ＰＣＲ）してもかまわない。
【００１７】
上記参照オリゴヌクレオチドは、標的核酸配列と同じまたは類似の長さを有していてもよいが、必ずしも有している必要はない。上記参照オリゴヌクレオチドは上記標的核酸よりも長くても、短くてもかまわない。好ましくは、単一の参照オリゴヌクレオチドを用いて単一の検量線を作成し、この検量線を使用して複数回の標的核酸の増幅および定量を実施する。所望であれば、この複数回の標的核酸の増幅および定量を、それぞれ異なるタイミングで実施してもかまわない。
【００１８】
好ましくは、上記検出可能なマーカーは、ｄｓＤＮＡに結合する色素であり、インターカレート色素であってもかまわない。好ましくは、該色素は蛍光色素である。上記使用される色素を、ＳＹＢＲグリーンＩ、ＳＹＢＲグリーンＩＩ、ＣＹＢＲゴールド、エバグリーン（Ｅｖａｇｒｅｅｎ）、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、ピコグリーン、ＴＯＴＯ、ＢＥＢＯ、または、Ｄｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（登録商標）のうちのいずれか１つから選択してもかまわない。ただし、他の適切な色素も使用することができ、当業者には既知であるように、色素の選択は必須要素ではない。好ましくは、上記色素の化学量論（dye stoichiometry）は１：１であるが、１：１よりも大きくてもかまわない。
【００１９】
第３の態様では、蛍光色素と１つ以上の参照オリゴヌクレオチドとを有している、第１の態様または第２の態様の方法に使用するためのキットが提供される。好ましくは、該キット中には、参照オリゴヌクレオチドが１つだけ存在する。複数のオリゴヌクレオチドが存在する場合には、各参照オリゴヌクレオチドの長さが同じであっても、異なっていてもかまわない。
【００２０】
第４の態様では、蛍光色素で標識された１つ以上の参照オリゴヌクレオチドを有している、第１の態様または第２の態様の方法に使用するためのキットが提供される。
【００２１】
第５の態様では、蛍光色素で標識された１つ以上の参照オリゴヌクレオチドの連続希釈物を有している、第１の態様または第２の態様の方法において使用するためのキットが提供される。
【００２２】
上記参照オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは６０ｂｐを超え、通常は約６０ｂｐ〜約１７０ｂｐの範囲である。もっとも好ましくは、上記参照オリゴヌクレオチドの長さは１００ｂｐであり、この長さの参照オリゴヌクレオチドを使用すれば、一般に長さが約６０ｂｐ〜約２１０ｂｐの範囲である標的核酸を定量することができる。上記参照オリゴヌクレオチドの長さの上限は必須要素ではなく、実使用時に検討すべきことに応じて決定され得る。
【００２３】
参照オリゴヌクレオチドのＧＣ含有率は４５％以上であることが望ましい。通常、参照オリゴヌクレオチドのＧＣ含有率は、約４５％〜約７５％の範囲で選択されてよく、もっとも好ましくは５０％である。ＧＣ含有率の上限は必須要素ではない。
【００２４】
上記参照オリゴヌクレオチドを、公知の手法を用いて、天然の生物学的ソースまたは天然ではない生物学的ソースから得てもよいし、合成して調製してもよい。
【００２５】
明らかに文脈と矛盾する場合を除いて、「．．．を備えている」、「．．．を含む」などの言葉は、記載および請求項全体を通して、排他的または網羅的とは反対の意味である包括的な意味、すなわち、「．．．を含めるが、これらの例に限定されない」という意味に解釈すべきものである。
【００２６】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、１５サイクルにわたる、複数の濃度における、標準とする参照オリゴヌクレオチドの蛍光を示している。各水平線が１つの濃度を表わしている。反応混合物において酵素が欠如していることによって、蛍光が多数のサイクルにわたって変化しないことが保証される。さらに、グラフは、変性およびアニーリングのサイクルを繰り返すことによって、参照オリゴヌクレオチド色素複合体の安定性および再現性が得られることを示唆している。
【００２７】
図２は、図１に示す蛍光データから作成された検量線を示している。
【００２８】
図３は、（ブラケットによって規定される）６つの遺伝子のサイクリング曲線を示している。各遺伝子が任意の３つの蛍光レベルｆ１、ｆ２、ｆ３（例えば、６５、６０、および、５５）を達成するために必要なサイクル数が、このデータから得られる。
【００２９】
図４は、ＳＨＲラットの心臓における注目している５つの遺伝子の発現を示している。注目している各遺伝子の発現量は、参照オリゴヌクレオチド（白抜きバー）、参照オリゴヌクレオチド＋２０個の塩基対（ハッチング入りバー）、および、参照オリゴヌクレオチド＋１００個の塩基対（黒塗りバー）を用いて算出した。参照オリゴヌクレオチドの長さを長くしても、注目している遺伝子の発現量の計算に大きく影響しなかった。参照オリゴヌクレオチドを参照オリゴヌクレオチド＋２０個および１００個の塩基対と比較すると、ＴＮＦα  ｐ＝０．３９４６、ＴＧＦβ  ｐ＝０．７１５１、Ａｎｇ０  ｐ＝０．６１５８、ＣＴＧＦ  ｐ＝０．４９５５、および、ＡＴ１ａ  ｐ＝０．５５８９であった（ＡＮＯＶＡ）。
【００３０】
図５は、ＷＫＹラットの心臓における、注目している５つの遺伝子の発現を示している。ラットは、ゼロ時間コントロール（１４週齢、白抜きバー）、媒体を注入して４週間後のコントロール（１８週齢、ハッチング入りバー）、および、ＶＩＰ処理から４週間後（１８週間、黒塗りバー）の３つの実験群に分けて高塩分の食事を与えられている。
【００３１】
図６は、３週間かけて作成した検量線を示している。参照オリゴヌクレオチドと色素との反応混合物は、実験から実験までの間、−２０℃で凍結させて保存し、各実験に合わせて解凍し、再凍結した。作成した検量線は、経時的に、かつ、繰り返し凍結・再解凍しても安定していることが読み取れる。
【００３２】
図７Ａ〜図７Ｆは、長さが７０塩基対〜１７０塩基対、ＧＣ含有率が５０％〜７４％の５つの参照オリゴヌクレオチドを用いて、注目している６つの遺伝子（アンジオテンシノーゲン、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＣＴＧＦ、Ａｔ１ａ、および、ＮＯＮＯ）を定量した結果を示している。これらの例に示す参照オリゴヌクレオチドは、長さ７０塩基対、ＧＣ含有率５０％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ７０／５０）、長さ７３塩基対、ＧＣ含有率７４％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ７３／７４）、長さ９０塩基対、ＧＣ含有率５０％のβアクチン（アクチン９０／５０）、長さ９０塩基対、ＧＣ含有率５０％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ９０／５０）、および、長さ１７０塩基対、ＧＣ含有率５２％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ１７０／５２）である。
【００３３】
図８Ａ〜図８Ｆは、長さが５０塩基対〜１４４塩基対、ＧＣ含有率が４０％〜５０％の４つの参照オリゴヌクレオチドを用いて、注目している６つの遺伝子（アンジオテンシノーゲン、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＣＴＧＦ、Ａｔ１ａ、および、ＮＯＮＯ）を定量した結果を示している。これらの例に示す参照オリゴヌクレオチドは、アクチン１４４／４０（長さが１４４塩基対、ＧＣ含有率が４０％のβアクチン）、ＣＴＧＦ５０／５０（長さが５０塩基対、ＧＣ含有率が５０％のＣＴＧＦ）、アクチン９０／５０（長さが９０塩基対、ＧＣ含有率が５０％のβアクチン）、および、ＣＴＧＦ９０／５０（長さが９０塩基対、ＧＣ含有率が５０％のＣＴＧＦ）である。アクチン９０／５０に対しては、＊ｐ＜０．００５、＊＊ｐ＜０．０００５、ＣＴＧＦ９０／５０に対しては＃ｐ＜０．０１、＃＃ｐ＜０．００５、＃＃＃ｐ＜０．００１、および、＃＃＃＃ｐ＜０．０００５である。
【００３４】
図９Ａは、ＳＨＲにおけるアンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）、ＴＧＦβ、および、ＣＴＧＦの発現に対する、ＶＩＰまたはエナラプリルを用いた処理の効果を示している。ゼロ時間コントロールは白抜きバー、媒体コントロールはハッチング入りバー、ＶＩＰ注入は黒塗りバー、エナラプリルを用いた処理はクロスハッチング入りバーで示してある。ＶＩＰまたはエナラプリルを用いた処理を媒体コントロールと比較した場合において、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０２５、＊＊＊ｐ＜０．０００５とする。ＶＩＰまたはエナラプリルを用いた処理をゼロ時間コントロールと比較した場合において、＃ｐ＜０．００１、＃＃ｐ＜０．０００５とする。
【００３５】
図９Ｂは、ＳＨＲにおけるＮＦ  κ  Ｂ、ＴＮＦα、および、ＡＴ１ａ受容体の発現に対する、ＶＩＰまたはエナラプリルを用いた処理の効果を示している。ＶＩＰまたはエナラプリルを用いた処理を媒体コントロールと比較した場合において、＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．０００５とする。ＶＩＰまたはエナラプリルを用いた処理をゼロ時間コントロールと比較した場合において、＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０００５とする。
【００３６】
図９Ｃは、ＳＨＲにおけるメタロプロテイナーゼおよびＴＩＭＰの発現に対する、ＶＩＰまたはエナラプリルを用いた処理の効果を示している。ＶＩＰまたはエナラプリルを用いた処理を媒体コントロールと比較した場合において、＊ｐ＜０．０２５、＊＊ｐ＜０．０００５とする。ＶＩＰまたはエナラプリルを用いた処理をゼロ時間コントロールと比較した場合において、＃ｐ＜０．０１、＃＃ｐ＜０．００１、＃＃＃ｐ＜０．０００５とする。各値は、ラット数ｎ＝６に対して平均±平均値の標準誤差で表わした。
【００３７】
〔定義〕
本明細書中で使用される場合、「遺伝子」または「標的核酸」または「標的遺伝子」または「注目している遺伝子」または「注目している標的配列」または「注目している標的」または「注目している核酸」という用語／表現は、互換的に使用し、同一概念を指すものである。
【００３８】
「核酸」という用語は、単量体であるヌクレオチドの鎖から構成された分子を指す。本明細書中で使用される場合、この用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ならびに、これらの変異体および誘導体を包含するものとする。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「遺伝子」は、天然（例えば、ゲノム由来）の遺伝子であってもよく、合成遺伝子であってもよく、転写および／または翻訳制御配列、および／または、コード領域、および／または、非翻訳配列（例えば、イントロンや５’−および３’−非翻訳配列）を包含する。遺伝子のコード領域は、アミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列または機能を有するＲＮＡ（例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または、アンチセンスＲＮＡなど）であってもかまわない。「遺伝子」という用語は、コード領域（例えば、エクソン）に対応するｃＤＮＡをも包含することがあり、このコード領域には、そこに繋がる５’−非翻訳配列または３’−非翻訳配列が随意的に含まれる。さらに、遺伝子は、コード領域、および／または、そこに繋がる５’−非翻訳配列もしくは３’−非翻訳配列の全て、または、その一部を含む、インビトロで生成される増幅された核酸分子であってもかまわない。
【００４０】
核酸配列の「増幅」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でうまく達成されることもあるが、別の適切な方法（例えば、リガーゼ連鎖反応）で達成されてもかまわない。本明細書の場合には、「ポリメラーゼ連鎖反応」という用語、および、「ＰＣＲ」というその略称は、当業者が理解する通常の意味にしたがって使用される。ＰＣＲ法の例は、一般的な分子生物学の教科書や当該技術分野において使用される参照用手引きに記載されている。一例としては、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (1989) Ed H A Erlich. Stockton Press, New Yorkがあげられる。ＰＣＲ増幅を最適化するためには、プライマーを異なる濃度および比で使用すればよい。これらの変数およびその他の変数の選択は、当業者であれば理解および実施できるはずである。
【００４１】
本発明の場合の「増幅産物」とは、例えばＰＣＲまたはリガーゼ連鎖反応によって実施される増幅反応によって形成される、ＤＮＡまたは核酸生成物の一部を指す。場合によっては、増幅産物は、「標的核酸」または「注目している遺伝子」または「注目している核酸」などの生成物であってもかまわない。
【００４２】
「プライマー」は、「オリゴヌクレオチド」と互換的に使用し、天然由来のものであってもよく、合成されたものであってもよく、または、これらを修飾したものであってもよく、鋳型分子において、特定のヌクレオチド配列に対して十分に相補的なヌクレオチドの合成の開始点として作用し得る。
【００４３】
本発明において、「参照オリゴヌクレオチド」または「参照核酸配列」または「普遍的な参照オリゴヌクレオチド」とは、核酸（好ましくは二重鎖ＤＮＡ）であり、検量線の作成において有用、または、注目している標的核酸の定量に対して別の態様で適切な、任意の適切なサイズの核酸を包含する。したがって、参照オリゴヌクレオチドはポリヌクレオチドであってもかまわないが、ポリヌクレオチドよりも短い配列であってもかまわない。適切な参照オリゴヌクレオチドの特性について、本明細書中に記載する。
【００４４】
参照オリゴヌクレオチドは、全体が合成されたものであってもよく、適切なサイズの核酸を参照オリゴヌクレオチドとして得るために適切な制限酵素を用いて天然由来のＤＮＡから得られるものであってもよい。
【００４５】
適切な大きな量を得るために、参照オリゴヌクレオチドを、増幅反応（例えば、ＰＣＲまたはリガーゼ連鎖反応）を利用して増幅してもよく、微生物において組換えて発現させて使用前に精製してもよい。参照オリゴヌクレオチドのサイズに問題がなければ、参照オリゴヌクレオチドを合成手段によって多量に調製してもかまわない。
【００４６】
「ハウスキーピング遺伝子」は、通常、基本的な細胞機能を維持するために必要な構成遺伝子である。このような遺伝子は全ての細胞において見られる。比較的一定のレベルで発現するハウスキーピング遺伝子もあるが、使用される実験条件によって発現量にばらつきがあるハウスキーピング遺伝子もある。
【００４７】
「検量線」とは、定量研究に用いるツールであって、物質（例えば、ＤＮＡやタンパク質）の絶対濃度を求めるために使用される、アッセイのデータをプロットする１つの方法である。
【００４８】
本発明において、「定量（化）」とは、物質（本発明の場合であれば、「注目している標的遺伝子」）の絶対量を検出することを意味する。
【００４９】
「連続希釈」とは、物質（例えば、核酸）の濃度範囲をカバーする検量線を作成するために必要な任意の形態の希釈を指し、「標的核酸」の量はこの検量線から定量することができる。
【００５０】
本発明において、「ｄｓＤＮＡ」とは二重鎖ＤＮＡを指し、「ｂｐ」とは塩基対を指し、「ｄＮＴＰ」とはデオキシヌクレオチド三リン酸を指し、「ＲＮＡ」とはリボ核酸を指し、「ｔＲＮＡ」とはトランスファーＲＮＡを指し、「ｒＲＮＡ」とはリボソームＲＮＡを指し、「ｓｉＲＮＡ」とは低分子干渉ＲＮＡを指し、「ｍｉＲＮＡ」とはマイクロＲＮＡを指し、「ｍＲＮＡ」とはメッセンジャーＲＮＡを指し、「ｃＤＮＡ」とは相補ＤＮＡを指す。
【００５１】
核酸配列（例えば、プライマー）の「ＧＣ含有率」は、融解温度（Ｔｍ）を含めたプライマーの各種特性に対して作用する。
【００５２】
〔本発明の好適な実施形態〕
本発明は、動物／ヒトのコントロール群および処理群において核酸の発現を定量するための高精度かつ効率的な手段が存在しないことが開発の動機となっている。本発明は、さらに、遺伝子発現研究に使用される既知のハウスキーピング遺伝子は、大部分が実験条件または処理に応じて変動し、したがって、結果に狂いが生じることも動機となって開発された。
【００５３】
本発明の１つの有利な効果は、記載の方法が、データを規格化して遺伝子発現を定量するために使用されるハウスキーピング遺伝子または合成参照遺伝子を不要にしてしまうことである。本発明のもう１つの有利な効果は、標的核酸の増幅（通常ＰＣＲによって増幅するが、その他の方法を使用して増幅してもかまわない）が、遺伝子発現研究に用いる通常の３０程度のサイクル数ではなく、少ないサイクル数（例えば１５サイクル）で実施可能であり、したがって、定量アッセイに使用するために十分な量の標的核酸が提供できる一方で、アッセイの時間およびコストを大幅に削減できることである。
【００５４】
本明細書中に記載する新規な取り組みでは、色素を所定の長さの参照オリゴヌクレオチドと組み合わせて使用して、検量線を作成する。なお、この参照オリゴヌクレオチドは、好適には注目している標的核酸とは無関係であってもよいが、注目している遺伝子と類似または同一であってもよい。検量線は、本発明に係る蛍光標識された参照オリゴヌクレオチドを連続的に希釈し、蛍光色素の強度レベルを標識された参照オリゴヌクレオチドの濃度に対してプロットすることによって作成される。上記検量線の作成には、参照オリゴヌクレオチドの増幅が不要である。これは、試験試料とハウスキーピング遺伝子／合成参照遺伝子との両方を、別々にまたは組み合わせて１つの反応混合物として増幅する、遺伝子発現を評価する現在の方法とは対照的である。
【００５５】
検量線を一旦作成すれば、必要であれば、その同じ検量線を何度も使用して、注目している複数の標的核酸を定量可能である。検量線の作成に使用する希釈参照オリゴヌクレオチド溶液は、経時的に（例えば約１ヶ月間）、かつ、溶液を繰り返し凍結・解凍しても安定している。これにより、実験を行う任意の必要が生じる前に参照オリゴヌクレオチド溶液を調製および保存できるようになる。
【００５６】
上記参照オリゴヌクレオチドは完全な合成配列であってもよく、増幅配列（例えば、ＰＣＲで生成した配列）であってもよく、天然の供給源から単離した大きな核酸の一部である適切なサイズの制限断片であってもよい。本発明の方法において使用する参照オリゴヌクレオチドは、いわゆる「ハウスキーピング遺伝子」または「合成参照遺伝子」ではない。つまり、本発明の参照オリゴヌクレオチドを、注目している遺伝子とともに増幅する必要はない。
【００５７】
異なる長さの標的核酸を定量するための検量線を作成するために、異なる長さの参照オリゴヌクレオチドを設計することが望ましいこともあるが、これは、本発明の方法にとって必須要素ではない。本発明の特定の１つの有利な効果は、参照オリゴヌクレオチドよりも長いまたは短い、互いに異なる核酸配列を有する標的核酸を定量する検量線において、特定の固定された長さの単一の参照オリゴヌクレオチドが使用可能であることである。
【００５８】
上記参照オリゴヌクレオチドの長さは、望ましくは、６０ｂｐを超え、通常は約６０ｂｐ〜約１７０ｂｐの範囲（つまり約６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、１１０ｂｐ、１２０ｂｐ、１３０ｂｐ、１４０ｂｐ、１５０ｂｐ、１６０ｂｐ、または、約１７０ｂｐ）であり、これらの長さであれば、長さが約８０ｂｐ〜約２１０ｂｐ、通常は約８０ｂｐ〜約１５０ｂｐの範囲の標的核酸を定量するために使用可能である。さらに、この範囲の長さを有する任意の参照オリゴヌクレオチドを使用して、この範囲の長さを有する任意の１つ以上の標的核酸生成物を定量することができる。標的配列は、上記方法を用いる人によって注目されている核酸（または、注目している複数の核酸）として選択されるのであるから、本発明の方法にとって、標的配列の長さは本質的なことではないことが理解されよう。
【００５９】
参照オリゴヌクレオチドの長さの上限は必須要素ではなく、実際の使用時に検討すべきことに応じて決定されればよい。したがって、所望であれば、１７０ｂｐよりも大きな（例えば、約１７０ｂｐ〜１８０ｂｐ、１８０ｂｐ〜２００ｂｐ、２００ｂｐ〜２２０ｂｐ、２２０ｂｐ〜２４０ｂｐ、２４０ｂｐ〜２６０ｂｐ、２６０ｂｐ〜２８０ｂｐ、２８０ｂｐ〜３００ｂｐ、３００ｂｐ〜３２０ｂｐ、３２０ｂｐ〜３４０ｂｐ、３４０ｂｐ〜３６０ｂｐ、３６０ｂｐ〜３８０ｂｐ、３８０ｂｐ〜４００ｂｐなどの長さの）参照オリゴヌクレオチドを本発明の方法に使用してもよく、これらの構成であっても、標的核酸の定量に対して悪影響を及ぼすことがない。
【００６０】
上記参照オリゴヌクレオチドのＧＣ含有率は４５％以上であることが望ましい。ＧＣ含有率の上限は必須要素ではない。したがって、ＧＣ含有率が７５％の参照オリゴヌクレオチドでも、ＧＣ含有率がこれより低い参照オリゴヌクレオチドと同様の結果が得られた。通常、参照オリゴヌクレオチドのＧＣ含有率は、約４５％〜約７５％の範囲で選択されればよい（例えば、約４５％、５０％、５５％、５５％、６０％、６５％、７０％、または、約７５％から選択されればよい）。
【００６１】
上記参照オリゴヌクレオチドの配列は、上記標的核酸または任意のハウスキーピング遺伝子配列に対していかなる相同性を有する必要はない。ただし、本発明の方法では参照オリゴヌクレオチドを特定の様態で使用する（つまり、参照オリゴヌクレオチドの連続希釈にしたがって検量線を設定するために使用する）ので、上記参照オリゴヌクレオチドの配列は、標的核酸配列もしくはハウスキーピング遺伝子、または、これらの配列／遺伝子のより小さな部分に対して、ある程度の相同性または同一性さえも有する可能性がある。本発明の有利な効果の１つは、上記方法が、同じ参照オリゴヌクレオチドを利用して、異なる標的核酸を定量できることである。実際には、上記参照オリゴヌクレオチドは、特定の固定された長さおよびＧＣ含有率を有する普遍的なオリゴヌクレオチド（通常、ＧＣ含有率が５０％である１００ｂｐのオリゴヌクレオチド）である。測定される通常の遺伝子（核酸）サイズの範囲を全て定量できるように、上述の範囲にある少なくとも３つの異なる参照オリゴヌクレオチドをキットに含めてもかまわない。
【００６２】
参照オリゴヌクレオチドを、適切なサイズの断片を得るために制限酵素を用いて生物学的供給源（天然由来でも、そうでなくてもよい）から得るのであれば、ＧＣ含有率は、当業者に周知の標準的な分子生物学的手法を用いて決定可能であって、適切なサイズの断片を選択し決定する単純な分析的手順を超える作業は不要である（Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989) Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）。さらに、合成参照オリゴヌクレオチドも使用可能である上に便利であり、例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989) Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.、および、Roe et al. DNA Isolation and Sequencing’’(Essential Techniques Series) (1996) John Wiley & Sons, Inc., N.Y.に記載の公知の手法で単純に調製できる。合成参照オリゴヌクレオチドの所望の長さおよびＧＣ含有率は、合成時に容易に選択可能である。
【００６３】
本発明の方法は、蛍光プローブ（色素）との使用に限らず、インターカレート色素との使用にも適している。インターカレート色素の場合には、参照オリゴヌクレオチドの長さは、参照オリゴヌクレオチドの長さが６０ｂｐ以上である限り、所定の参照オリゴヌクレオチドの濃度に対する蛍光強度に影響することがない。蛍光強度に影響する参照オリゴヌクレオチドの長さの上限は、存在しないと考えられる。この結果、異なる長さ、ＧＣ含有率、および／または、ヌクレオチド配列を有し得る、注目している任意の個数の標的核酸配列に対して、１つの参照オリゴヌクレオチドを標準品として使用して差し支えない。蛍光プローブの場合には、同一のフルオロフォアを使用する限り、連続的に試験される多数の標的核酸に対して、同一の参照オリゴヌクレオチドを使用してもかまわない。別の構成としては、マルチプレックス・ｒｔ−ＰＣＲ法による生成物を定量するフレームワークを得るために、１つの参照オリゴヌクレオチドを用いる一方で複数の異なるフルオロフォアを用いて、複数の検量線を作成してもかまわない。
【００６４】
したがって、本発明の方法は、ハウスキーピング遺伝子を増幅し、ハウスキーピング遺伝子または合成参照遺伝子のアッセイを常に稼動させて、実験をするたびに核酸の発現データを規格化することを不要にするので、好適である。１つの検量線を作成すれば、これをある期間にわたって使用し、サイズおよび配列の異なる可能性がある注目している複数の標的核酸を定量することができ、これによって、従来の遺伝子発現アッセイに比べてコストおよび時間が削減される。
【００６５】
本発明の方法は、参照オリゴヌクレオチドの検量線に関する情報を、コンピュータをベースにしたシステムに、注目している標的核酸の増幅を開始する前に保存し、増幅反応の試料をある時間的間隔で採取または蛍光の増加を経時的に（リアルタイムで）モニタリングし、この情報を上記保存しておいた検量線情報と関連付けることによって、自動化、さらに、標的核酸の増幅および定量のリアルタイムでのモニタリングにも役立つ。上記方法をこのような形態で実施する場合、検量線を周期的に（例えば１週間に１度または１ヶ月に１度）作成してもよく、さらに、新しい検量線を作成しなくても注目している標的核酸をある期間にわたって定量できるように、この情報を保存および使用してもよい。
【００６６】
本発明の方法およびキットは、分析室や研究室で一般に見られ、通常長さが８０ｂｐ〜１５０ｂｐの範囲であってＧＣ含有率が３０％〜６０％である、遺伝子（核酸）生成物を有する注目している遺伝子（核酸）を、単一の参照オリゴヌクレオチドを用いて定量するために、好適に使用可能である。さらに具体的には、本発明の方法およびキットは、長さが６０ｂｐを超え、ＧＣ含有率が３５％を超える核酸生成物を、（好ましくは、長さが１００ｂｐ、ＧＣ含有率が５０％の）単一の参照オリゴヌクレオチドを用いて定量する際に有用である。したがって、該キットの好ましい形態は、このような参照オリゴヌクレオチドまたはその連続希釈物と、注目している核酸について反応において使用される、色素またはその他の適した検出可能な標識とからなる。別の構成としては、該キットは、色素またはその他の適したマーカーで標識された参照オリゴヌクレオチド、または、このような標識された参照オリゴヌクレオチドの連続希釈物と、注目している核酸に標識するために使用される色素またはマーカーとを含む。
【００６７】
本発明の方法において使用する検量線を作成するための一般的な指針として、参照オリゴヌクレオチドを、注目している遺伝子に対して使用される反応バッファと同じ反応バッファを用いて連続的に繰り返し希釈し、反応用チューブごとに最終的な量（例えば、約０．０１ｐｍｏｌ〜約１０ｐｍｏｌの範囲であるが、これより狭い範囲であっても、広い範囲であってもかまわない）の参照オリゴヌクレオチドを得る。これによって、標準（参照）曲線を上述のように作成できるようになる。参照ヌクレオチドの濃度の範囲は、上記要件に応じて単純な試行錯誤によって求められる。次に、例えば蛍光色素などの検出可能なマーカー（注目している遺伝子に対して使用されるマーカーと同じマーカーであり、注目している遺伝子反応に対して使用される量と同じ量）が、各反応用チューブに添加される。通常、上記反応用チューブは、リアルタイムｒｔ−ＰＣＲ装置内で１５サイクルを経る（所望であればサイクル数を増やしてもかまわない）。なお、サイクリング条件は、注目している遺伝子に対して適用されるサイクリング条件を反映したものである。したがって、注目している遺伝子に対する初期の変性条件が、例えば、９４℃および２分間であれば、（検量線を作成するために使用される）上記参照オリゴヌクレオチドの連続希釈物を収納するチューブは、９４℃で２分間の初期変性を受ける。そして、次の１５サイクルは、注目している遺伝子に対する１５サイクルに相当する。したがって、注目している遺伝子のサイクリング条件が、例えば、９５℃で３０秒間の変性を実施した後に、６０℃で３０秒間のアニーリングを実施することを含むのであれば、上記参照オリゴヌクレオチドの連続希釈物を収納するチューブも、９５℃で３０秒間のサイクル（変性）、および、６０℃で３０秒間のサイクル（アニーリング）を経る。蛍光色素を標識またはマーカーとして使用すれば、図１および図２に示すように、各アニーリング段階において蛍光を得ることができる。そして、核酸（例えば、ＤＮＡ）量に対する蛍光の標準（参照）曲線を、本明細書中に記載するように作成する。
【００６８】
本発明について例をあげて記載してきたが、変更および修正を加えても、本発明の技術的範囲から逸脱するものではないことは理解されるべきである。さらに、特定の特徴点に対する公知の等価物が存在する場合、このような等価物は、本明細書において具体的に参照されているかのごとく組み込まれる。
【００６９】
〔実施例〕
〔実施例１〕
＜計算＞
ｒｔ−ＰＣＲでは、複製効率が１００％であり、各サイクルにおいて遺伝子の全ての複製物が複製されると仮定すれば、所定のサイクル数（ｃ）の後に存在する注目している遺伝子の量（Ｒ）は、ＰＣＲ増幅の開始時に存在する該遺伝子の量（ｎ）に再現可能な形式で関連している。
Ｒ＝ｎ×２ｃ
ｎ＝時刻０において存在する複製物の個数
ｃ＝所定の蛍光でのサイクル数 Ｒ＝ｃサイクル後に存在する複製物の個数
効率が１００％未満であり、各サイクルにおいて遺伝子の全ての複製物が複製されるわけではないと仮定すれば、この複製効率の減少を考慮して、上式を次のように修正する。
Ｒ＝ｎ×ｅｃ
ｅ＝複製効率
ｃ＝所定の蛍光でのサイクル数
Ｒ＝ｃサイクル後に存在する複製物の個数。
【００７０】
〔実施例２〕
＜参照オリゴヌクレオチドの調製＞
引用した実施例では、参照オリゴヌクレオチドを生成するために、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）に対応するＲＮＡを使用しているが、標準規格として使用するための参照オリゴヌクレオチドが、任意の遺伝子またはコードＤＮＡもしくは非コードＤＮＡに対応するＲＮＡから生成可能であることは理解されるべきである。
【００７１】
高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）の心臓組織から得たＣＴＧＦ遺伝子のセグメントを以下のように増幅することによって、長さが７０塩基対、９０塩基対、および、１７０塩基対の参照オリゴヌクレオチドを調製した。
【００７２】
（１）ＲＮＡ抽出
ＳＨＲラットから組織を収集し、フェノールおよびグアニジンイソチオシアネートを利用する方法（Chomczynski and Sacchi 198７）に修正を加えた方法を用いて全ＲＮＡを抽出した。液体窒素で凍結させたＳＨＲの心臓を、Ｍｉｘｅｒ  Ｍｉｌｌ  ＭＭ３００（Ｒｅｔｓｃｈ  ＧｍｂＨ社、ドイツ）で均質化した。１．５ｍＬのＳａｆｅ−Ｌｏｃｋ型マイクロ試験チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｂｉｏｐｕｒ社、ハンブルグ、ドイツ）に仕込んだ１ｍＬのトリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、Ｔｕｎｇｓｔｅｎ  Ｃａｒｂｉｄｅ  Ｂｅａｄｓ  ３ｍｍ（Ｑｉａｇｅｎ社）とともに、各１００ｍｇずつの低温貯蔵試料を添加し、３０Ｈｚの振動数で粉砕した。続いて、製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の推奨にしたがってＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを得るために試料を破砕（disrupt）した後、２００ｍＬのクロロホルム（Ｌａｂ−Ｓｃａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｏｍｂ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｔａｒｅｎ  Ｐｏｉｎｔ、ＮＳＷ、オーストラリア）を添加して相分離を進めた。試料を１５秒間手で激しく振り、室温（２３℃〜３０℃）で５分間インキュベーションし、その後、Ｓｉｇｍａ  １−１５ＰＫ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  （Ｊｏｈｎ  Ｍｏｒｒｉｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃｈａｔｓｗｏｏｄ、ＮＳＷ、オーストラリア）を用いて、１２，０００ｒｐｍ（１３，２０１ｇ）、４℃で、２０分間（ブレーキはオフ）遠心分離を実施した。上部の水相を３００ｍＬ収集して新しい１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに入れ、事前に冷却しておいた５００ｍＬのプロパン−２−オール（イソプロパノール）（Ｌａｂ−Ｓｃａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｏｍｂ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｔａｒｅｎ  Ｐｏｉｎｔ、ＮＳＷ、オーストラリア）を添加し、試料を手で数回転倒混和した。この混合物を室温で１０分間インキュベーションして、ＲＮＡを沈殿させた。１２，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離（Ｊｏｈｎ  Ｍｏｒｒｉｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃｈａｔｓｗｏｏｄ、ＮＳＷ、オーストラリア）することによって、ペレットを形成した。上清を捨て、そして、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｓｔｌｅ  Ｈｉｌｌ、ＮＳＷ、オーストラリア）で希釈した７５％（ｖ／ｖ）の絶対分子グレード（ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｒａｄｅ）のエタノール（Ｌａｂ−Ｓｃａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｏｍｂ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｔａｒｅｎ  Ｐｏｉｎｔ、ＮＳＷ、オーストラリア）を１ｍＬ用いて、ペレットを洗浄し、１０，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離にかけた（Ｊｏｈｎ  Ｍｏｒｒｉｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃｈａｔｓｗｏｏｄ、ＮＳＷ、オーストラリア）。ペレットを収集して、ドラフト中で数分間空気乾燥させ、次に、ＤＥＰＣで処理したＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解させ、−８０℃で保存した。全ＲＮＡ濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  １０００（Ｎｄ−１０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を２６０ｎｍ（Ａ２６０）で用いて、分光光度計による吸光度によって決定した。Ａ２６０：Ａ２８０の比が約２．０であれば、ＲＮＡの純度は十分であるとみなした。
【００７３】
（２）デオキシリボヌクレアーゼ１（ＤＮａｓｅ−１）による処理
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）に先立って、ＲＮＡの試料をＤＮａｓｅ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて処理し、二重鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡを取り除いた。ＤＮａｓｅもＲＮａｓｅも含まない０．５ｍＬのエッペンドルフチューブにおいて、１ユニット／μＬのＤＮａｓｅ−１および１μＬの１０Ｘ  ＤＮａｓｅ−１の反応バッファを用いて、ＤＥＰＣで処理した水で１０μＬの総容積にした中で最大で１μｇまでのＲＮＡを消化させた。試料を室温で１５分間インキュベーションし、その後、溶液混合物中での２５ｍＭのＥＤＴＡ（１μＬ）によるカルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのキレート化、ならびに６５℃での１０分間の加熱によってＤＮａｓｅ−１を不活性化した。試料を氷の上に載せて冷却し、−８０℃で保存した。混合物の全ての成分はＤＮａｓｅ−１キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）において供給された。
【００７４】
（３）ＲＮＡの質および濃度の評価
ＤＮａｓｅ−１で処理したＲＮＡの試料を、マイクロチップ自動電気泳動器ＭＣＥ−２０２  ＭｕｌｔｉＮＡ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｒｙｄａｌｍｅｒｅ、ＮＳＷ、オーストラリア）で、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の１８Ｓサブユニットおよび２８Ｓサブユニットの純度、サイズ、および、濃度について分析した。なお、全てのステップを製造者の推奨にしたがいながら、わずかな修正を加えて実施した。簡潔に記すと、各試料（３μＬ）を、９６ウェルを有するプレートにおいて等しい体積の内部ＲＮＡマーカー（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ＲＮＡ  ｍａｒｋｅｒ）（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｒｙｄａｌｍｅｒｅ、ＮＳＷ、オーストラリア）と混合し、粘着性ＰＣＲアルミニウム箔（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＳＷ、オーストラリア）で封止した。上記ＲＮＡを濃度およびサイズが既知の内部標準マーカー（より低分子のサイズマーカーおよびより高分子のサイズマーカー（ｌｏｗｅｒ  ａｎｄ  ｕｐｐｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｚｅ  ｍａｒｋｅｒｓ））とともに用いることで、電気泳動の結果を自動的に補正し、ＲＮＡの試料について自動的にサイズの予測および定量を行う。ＲＮＡ−６０００ラダー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、オーストラリア）を、ＤＥＰＣで処理した水で１：５の比（ｖ／ｖ）に希釈し、次に、この混合溶液をＲＮＡマーカー溶液と１：１（ｖ／ｖ）で混合した。試料およびラダーの混合物をどちらも６５℃で５分間熱変性させ、すぐに氷の上に載せて５分間冷却した。このサイズ範囲の分離は、ＭｕｌｔｉＮＡのマイクロチップ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｒｙｄａｌｍｅｒｅ、ＮＳＷ、オーストラリア）において、ＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム、ｐＨ値８．０）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）および２０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で１：９９に希釈した蛍光性挿入色素１０，０００Ｘ  ＳＹＢＲグリーンＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含有するＲＮＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｒｙｄａｌｍｅｒｅ、ＮＳＷ、オーストラリア）中で実施した。
【００７５】
（４）逆転写
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＭｏｌｏｎｅｙ−Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋａｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴ）を製造業者の指示にしたがって用いて、第１鎖相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を一本鎖ＲＮＡ鋳型から合成した。全ての反応を０．２ｍＬの薄壁型エッペンドルフチューブの中で実施した。また、全てのインキュベーションステップをＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ６０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、Ｓｙｄｎｅｙ、オーストラリア；  Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて実施した。最大で５μｇまでの全ＲＮＡを、１μＬの５０μＭのオリゴ（ｄＴ）２０および１μＬのアニーリングバッファを用いて、総容積が８μＬのＤＥＰＣで処理した水中で６５℃で５分間熱変性させた。試料を氷の上に載せて少なくとも１分間冷却し、その後、１０μＬの２Ｘ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘおよび２μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ／ＲＮａｓｅＯＵＴ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘに添加した。試料を短時間ボルテックスして混合し、そして、パルス回転によって収集し、次に、５０℃で５０分間インキュベーションして、ｃＤＮＡを合成した。ＲＴ酵素を８５℃で５分間変性させて反応を終了させ、試料をすぐに氷の上に載せて冷却し、−２０℃で保存した。ＤＮＡの混入がないことを検証するために、ＲＴ酵素もＲＮＡも用いないネガティブコントロール用試料を一緒に用いた。
【００７６】
（５）プライマー
長さが７０ｂｐ、９０ｂｐ、および、１７０ｂｐのＰＣＲ生成物を生成するプライマー対を、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）に対応するラットのｍＲＮＡ（受託番号ＡＢ０２３０６８）についてＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋによって報告されている配列に基づいて設計した。このプライマー配列（プライマーの配列自身が２１〜２４個の塩基の長さである）を委託して（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）脱塩凍結乾燥生成物として合成した。ＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ値８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、上記プライマーの濃度を５０μＭにし、−２０℃で保存した。
【００７７】
【表１】
0005870030.tif 000002
【００７８】
（６）ＰＣＲ
各プライマーのセットを固定量のエバグリーンに結合するｄｓＤＮＡの異なる濃度を決定できるように設定して、ＳＨＲの心臓に対してＰＣＲを実施した。このＰＣＲにおいて使用する全ての試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社からキットの一部として、または、個別に購入した。１０Ｘ  ＰＣＲバッファ（５μＬ）、１０ｍＭのｄＮＴＰ混合物（１μＬ）、５０ｍＭのＭｇＣｌ２（１．５μＬ）、１０μＭのプライマー対混合物（各２μＬ）、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（０．２μＬ）、および、ＤＥＰＣで処理した水（３９．３μＬ）を含有する全体で５０μＬの反応混合物において、１μＬのｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ６０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、Ｓｙｄｎｅｙ、オーストラリア；  Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて実施した。増幅条件は、最初に９４℃で２分間変性、９５℃で１０秒間の変性を３０サイクル〜３５サイクル、６０℃で２０秒間のアニーリング、および、７２℃で２０秒間の合成である。ｃＤＮＡを用いないネガティブコントロールを、全ての実験時に一緒に用いた。
【００７９】
（７）ＰＣＲ生成物の濃度
最大で４μＬまでのプールしておいたＰＣＲ生成物を、ＤＮＡを濃縮するためのセルロース膜である、３０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４フィルタユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｎｏｒｔｈ  Ｒｙｄｅ、ＮＳＷ、オーストラリア）、に追加し、スウィンギングバケットローター、Ｓｉｇｍａ  ２−１６ＰＫ（Ｊｏｈｎ  Ｍｏｒｒｉｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃｈａｔｓｗｏｏｄ、ＮＳＷ、オーストラリア）を用いて、５０００ｒｐｍ（４０２５ｇ）、２２℃で１０分間遠心分離にかけた。濃縮溶質をフィルタユニットの底部において収集し、次のＰＣＲに備えて−２０℃で保存した。
【００８０】
（８）ＤＮＡサイズの確認および定量
濃縮ＰＣＲ生成物を、マイクロチップ自動電気泳動器ＭＣＥ−２０２  ＭｕｌｔｉＮＡ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｒｙｄａｌｍｅｒｅ、ＮＳＷ、オーストラリア）で分析し、バンドサイズおよび濃度の確認を行った。全てのステップを製造者の指示にしたがいながら、わずかな修正を加えて実施した。簡潔に記すと、濃縮ＰＣＲ生成物を、ＤＥＰＣで処理した水で希釈した１／１０（ｖ／ｖ）希釈物（６μＬ）を、９６ウェルを有するプレートの各ウェルに加え、粘着性ＰＣＲアルミニウム箔（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＳＷ、オーストラリア）で封止した。１０，０００Ｘ  ＳＹＢＲゴールド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）からなるＤＮＡ−５００  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｒｙｄａｌｍｅｒｅ、ＮＳＷ、オーストラリア）を、ＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム、ｐＨ値８．０）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で１／１００に希釈して使用し、マイクロチップ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｒｙｄａｌｍｅｒｅ、ＮＳＷ、オーストラリア）でＤＮＡ試料を分離した。ＤＮＡのバンドサイズおよび濃度を、それぞれ、２５ｂｐのＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム、ｐＨ値８．０）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で１：４９に希釈したもの、および、内部マーカーＤＮＡ−５００（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｒｙｄａｌｍｅｒｅ、ＮＳＷ、オーストラリア）を用いて分析した。 参照文献  Chomczynski, P., and Sacchi, N. (1987) Anal. Biochem. 162, 156。
【００８１】
〔実施例３〕
ｉ）検量線の作成
反応容積が５０μＬのＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ値８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を収納する０．２ｍＬのＰＣＲ用チューブ中の、１：１（ｖ／ｖ）のＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ値８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）（希釈していない状態から１／３２まで）、および、１．２５μＭのエバグリーン色素（Ｂｉｏｔｉｕｍ  Ｉｎｃ，社、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ；  Ｊｏｍａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ＳＡ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）において、７μＬの濃縮ＤＮＡ試料（つまり、７０ｂｐ、９０ｂｐ、または、１７０ｂｐ生成物）を、連続的に繰り返し希釈した。滴定は、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ６０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、Ｓｙｄｎｅｙ、オーストラリア；  Ｑｉａｇｅｎ社）で実施した。サイクリング条件は、最初に９４℃で２分間変性、９５℃で３０秒間の変性を１５サイクル、さらに、６０℃で３０秒間の各アニーリングステップ間に、蛍光性シグナルを取得した。鋳型を用いないコントロール、および、エバグリーン色素を用いないもっとも高い濃度のオリゴヌクレオチドの２つのネガティブコントロールを、各検量線を作成する実験時に一緒に用いた。ＤＮＡの混合物は、次の蛍光繰り返し測定に備えて−２０℃で保存した。
【００８２】
参照オリゴヌクレオチドの各濃度に対する蛍光を得た（図１を参照）。そして、データを、参照オリゴヌクレオチド（ｐｍｏｌ）（Ｘ軸）に対する蛍光（Ｙ軸）としてプロットした（図２を参照）。最良適合曲線を最小二乗直線回帰によって生成し、検量線式を生成した。
【００８３】
ｉｉ）計算
検量線式から、３つの蛍光レベルｆ１、ｆ２、ｆ３をｐｍｏｌに換算したものを算出する（つまり、３つの閾値を選択した。図３を参照）。
【００８４】
試験試料／標的試料のＲＴ−ＰＣＲから、
・注目している遺伝子の効率（ｅ）を得、
・３つの各蛍光レベル（ｆ１、ｆ２、ｆ３）のサイクル（ｃ１、ｃ２、ｃ３）を得、さらに、
・検量線式を用いて、ｆ１、ｆ２、ｆ３に対応する、試料［ＤＮＡ（ｐｍｏｌ）ｉ］中に存在する注目している遺伝子の発現量をｐｍｏｌで求める。
ｎ（反応の開始時に存在する注目している遺伝子の発現量（単位はｐｍｏｌ））を次式から算出する。
【００８５】
ＤＮＡ（ｐｍｏｌ）ｉ＝ｎｉ×ｅｃｉ、つまり、ｎｉ＝ＤＮＡｉ／ｅｃｉ
ｎｉの平均値を計算して、試料中に存在する注目している遺伝子のモル数を求める。各反応中に存在する全ＲＮＡについて補正し、ｎｉを全ＲＮＡ１００ｎｇ当たりのｐｍｏｌ数で表わす。アボガドロ数を掛ければ、ＲＮＡ１００ｎｇ当たりの複製物の個数として別の形で表わすことができる（図４を参照）。
【００８６】
〔実施例４〕
以上によって、図１は、繰り返し実施した参照オリゴヌクレオチドの各濃度に対する蛍光を示している。存在する参照オリゴヌクレオチド（ｐｍｏｌ）（ｘ軸）に対する蛍光（ｙ軸）としてプロットした図２のデータによって、この関係を規定する等式の値を最小二乗回帰で計算できるようになる。ｆ１、ｆ２、ｆ３（ｆ１、ｆ２、ｆ３はサイクル数に対する注目している各遺伝子の蛍光のプロットから求められる。図３を参照）を上記検量線式に代入すると、サイクルｃ１、ｃ２、ｃ３において存在する注目している遺伝子（ＤＮＡｉ）のｐｍｏｌ数が算出できる。次に、時刻ゼロにおいて存在する注目している遺伝子のｐｍｏｌを上述のように算出することができ、全ＲＮＡについて補正し、アボガドロ数を掛けた後に複製物の個数として表わされる。
【００８７】
＜ｎを計算する基準としての、長さが異なる参照オリゴヌクレオチドの比較＞
長さが２０塩基対および１００塩基対異なる３つのオリゴヌクレオチドを使用し、上記ｉ）検量線の作成法に記載したようにして３つの検量線を作成した。次に、ｉｉ）計算に記載したように各検量線を順に用いて、注目している５つの遺伝子を独立して定量した。３つの曲線によって各遺伝子について得られた結果をＡＮＯＶＡによって比較した。有意差を０．０５レベルに設定した（図４を参照）。注目している遺伝子の発現量は、この３群間で有意な差がなかった。したがって、最大で１００塩基対までの参照オリゴヌクレオチドの長さの違いは、注目している遺伝子の計算に影響しなかったと言える。
【００８８】
＜実験環境への適用（図５を参照）＞
上述の方法を用いて、ゼロ時間コントロール（白抜きバー）、媒体コントロール（ハッチング入りバー）、および、ＶＩＰ処理後（黒塗りバー）の３つの実験群のＷＫＹラットの心臓において、注目している５つの遺伝子を測定した。
【００８９】
＜検量線の安定性および再現性＞
３週間かけて繰り返し凍結・解凍した後に、さまざまな濃度の参照オリゴヌクレオチドおよびエバグリーン色素を収納するチューブについて蛍光を測定した。蛍光レベルは、全ての濃度について安定していた。したがって、同じバッチの色素を使用し、各実験間で色素濃度にばらつきがない限り、多数のｒｔ−ＰＣＲ実験について、１つの基準を定量基準として使用してかまわないと言える（図６を参照）。
【００９０】
〔実施例５〕
長さが５０塩基対〜１７０塩基対の範囲であり、ＧＣ含有率が４０％〜７５％の範囲である参照オリゴヌクレオチドを、ＣＴＧＦ、αアクチン、および、βアクチンのさまざまな部分から得た。参照オリゴヌクレオチドを実施例２に記載のように調製し、検量線を実施例３記載のように作成した。参照オリゴヌクレオチド（５０ｂｐ〜１７０ｂｐ）を生成するプライマーを、ＣＴＧＦに対応するラットｍＲＮＡ（受託番号ＡＢ０２３０６８）ならびにαアクチンおよびβアクチンに対応するラットｍＲＮＡ（受託番号ＮＭ＿０１９１８３およびＢＣ０６３１６６）についてＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋによって報告されている配列に基づいて設計した（表２を参照）。
【００９１】
ｉｉ）計算に記載したように各検量線を順に用いて、注目している６つの遺伝子（ＡＴ１ａ、アンジオテンシン、ＴＧＦβ、ＴＮＦａ、ＮＯＮＯ、および、ＣＴＧＦ）を独立して定量した。３つの曲線によって各遺伝子について得られた結果をＡＮＯＶＡによって比較した。
【００９２】
【表２】
0005870030.tif 000003
【００９３】
結果を図７Ａ〜図７Ｆおよび図８Ａ〜図８Ｆに示す。これらの実験では、注目している遺伝子の定量は、長さが５０ｂｐ、ＧＣ含有率が４０％の参照オリゴヌクレオチドによってのみ、影響を受けた（注目している遺伝子の複製物の値が大幅に高くなった）。長さがこれより大きくＧＣ含有率がこれより高い参照オリゴヌクレオチドについては、どちらのパラメータの上限にも制限がないようであり、どの参照オリゴヌクレオチドも注目している遺伝子の高精度の定量が実現できた。これらの実験から、参照オリゴヌクレオチドの長さの下限は（本発明の方法において有用である）６０ｂｐであり、ＧＣ含有率の下限は４５％であると結論できる。これらの値は、これらの値の有用な範囲の下限を表わしていてもよい。上限は要件に応じて設定可能である。単一の普遍的な参照オリゴヌクレオチドを使用するのであれば、長さを１００ｂｐ、ＧＣ含有率を５０％に設定してもよく、このように設定すれば便利である。本明細書中に記載のデータから、参照オリゴヌクレオチドのこれ以外の適した任意の長さおよびＧＣ含有率を選択してもかまわない。
【００９４】
〔実施例６〕
これらの各参照オリゴヌクレオチドを順に使用して、遺伝子産物が８０塩基対〜１２０塩基対の範囲である、注目している９つの遺伝子（アンジオテンシノーゲン、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、ＣＴＧＦ、ＮＯＮＯ ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、および、ＴＩＭＰ１）を定量した（増幅産物の配列については表３を参照）。
【００９５】
【表３】
0005870030.tif 000004
【００９６】
上述の方法を用いて、ゼロ時間コントロール（白抜きバー）、媒体コントロール（ハッチング入りバー）、ＶＩＰ処理後（黒塗りバー）、および、エナラプリルを用いた処理（クロスハッチング入りバー）の４つの実験群のＳＨＲラット（ｎ＝６）の心臓において、上記注目している９つの遺伝子を測定した。
【００９７】
結果を図９Ａ〜図９Ｃに示す。これらの結果が、上記参照オリゴヌクレオチドを用いた方法の、核酸生成物の量を精度よく定量し、こうすることによって、高血圧ラットを例えばＶＩＰやエナラプリルなどの化合物で処理することによってもたらされる遺伝子発現における変化を精度よく解明できる能力を実証している。該方法は、処理を受けた動物とコントロール動物との間に統計学的に有意な差を規定し、さらに、複数の処理法による遺伝子発現の制御に関して、複数の処理法の効力を規定できる感度を提供する。本方法が特定の実験環境においてどのように作用するかを示す簡便な例として、特定の動物試験を使用したが、これと同じ定量原理および方法は、ハウスキーピング遺伝子などにおけるいかなる望ましくない変化によっても影響されない、核酸生成物の高精度の定量が必要とされる、このような任意の状況に対して適用可能である。
【００９８】
ＳＹＢＲグリーンＩ、ＳＹＢＲグリーンＩＩ、ＣＹＢＲゴールド、エバグリーン、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、ピコグリーン、ＴＯＴＯ、および、ＢＥＢＯの各色素および上述のプロトコールを用いて実施した同様の各実験からは、同様の結果が得られた。
【００９９】
説明した本方法が、ハウスキーピング遺伝子または合成遺伝子に対して規格化しなくても、または、標的配列を用いてハウスキーピング／合成参照遺伝子を共増幅する必要がない、遺伝子発現生成物が定量できる改良型方法を提供することが理解されよう。
【０１００】
本発明について具体的な例を参照しながら記載してきたが、当業者であれば、本発明は上記以外の多数の形態で具現化され得ることが理解できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】１５サイクルにわたる、複数の濃度における、標準とする参照オリゴヌクレオチドの蛍光を示している。各水平線が１つの濃度を表わしている。反応混合物において酵素が欠如していることによって、蛍光が多数のサイクルにわたって変化しないことが保証される。さらに、グラフは、変性およびアニーリングのサイクルを繰り返すことによって、参照オリゴヌクレオチド色素複合体の安定性および再現性が得られることを示唆している。
【図２】図１に示す蛍光データから作成された検量線を示している。
【図３】（ブラケットによって規定される）６つの遺伝子のサイクリング曲線を示している。各遺伝子が任意の３つの蛍光レベルｆ１、ｆ２、ｆ３（例えば、６５、６０、および、５５）を達成するために必要なサイクル数が、このデータから得られる。
【図４】ＳＨＲラットの心臓における注目している５つの遺伝子の発現を示している。注目している各遺伝子の発現量は、参照オリゴヌクレオチド（白抜きバー）、参照オリゴヌクレオチド＋２０個の塩基対（ハッチング入りバー）、および、参照オリゴヌクレオチド＋１００個の塩基対（黒塗りバー）を用いて算出した。参照オリゴヌクレオチドの長さを長くしても、注目している遺伝子の発現量の計算に大きく影響しなかった。参照オリゴヌクレオチドを参照オリゴヌクレオチド＋２０個および１００個の塩基対と比較すると、ＴＮＦα  ｐ＝０．３９４６、ＴＧＦβ  ｐ＝０．７１５１、Ａｎｇ０  ｐ＝０．６１５８、ＣＴＧＦ  ｐ＝０．４９５５、および、ＡＴ１ａ  ｐ＝０．５５８９であった（ＡＮＯＶＡ）。
【図５】ＷＫＹラットの心臓における、注目している５つの遺伝子の発現を示している。ラットは、ゼロ時間コントロール（１４週齢、白抜きバー）、媒体を注入して４週間後のコントロール（１８週齢、ハッチング入りバー）、および、ＶＩＰ処理から４週間後（１８週間、黒塗りバー）の３つの実験群に分けて高塩分の食事を与えられている。
【図６】３週間かけて作成した検量線を示している。参照オリゴヌクレオチドと色素との反応混合物は、実験から実験までの間、−２０℃で凍結させて保存し、各実験に合わせて解凍し、再凍結した。作成した検量線は、経時的に、かつ、繰り返し凍結・再解凍しても安定していることが読み取れる。
【図７Ａ】長さが７０ｂｐ〜１７０塩基対、ＧＣ含有率が５０％〜７４％の５つの参照オリゴヌクレオチドを用いて、注目している６つの遺伝子（アンジオテンシノーゲン、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＣＴＧＦ、Ａｔ１ａ、および、ＮＯＮＯ）を定量した結果を示している。これらの例に示す参照オリゴヌクレオチドは、長さ７０塩基対、ＧＣ含有率５０％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ７０／５０）、長さ７３塩基対、ＧＣ含有率７４％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ７３／７４）、長さ９０塩基対、ＧＣ含有率５０％のβアクチン（アクチン９０／５０）、長さ９０塩基対、ＧＣ含有率５０％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ９０／５０）、および、長さ１７０塩基対、ＧＣ含有率５２％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ１７０／５２）である。
【図７Ｂ】長さが７０ｂｐ〜１７０塩基対、ＧＣ含有率が５０％〜７４％の５つの参照オリゴヌクレオチドを用いて、注目している６つの遺伝子（アンジオテンシノーゲン、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＣＴＧＦ、Ａｔ１ａ、および、ＮＯＮＯ）を定量した結果を示している。これらの例に示す参照オリゴヌクレオチドは、長さ７０塩基対、ＧＣ含有率５０％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ７０／５０）、長さ７３塩基対、ＧＣ含有率７４％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ７３／７４）、長さ９０塩基対、ＧＣ含有率５０％のβアクチン（アクチン９０／５０）、長さ９０塩基対、ＧＣ含有率５０％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ９０／５０）、および、長さ１７０塩基対、ＧＣ含有率５２％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ１７０／５２）である。
【図７Ｃ】長さが７０ｂｐ〜１７０塩基対、ＧＣ含有率が５０％〜７４％の５つの参照オリゴヌクレオチドを用いて、注目している６つの遺伝子（アンジオテンシノーゲン、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＣＴＧＦ、Ａｔ１ａ、および、ＮＯＮＯ）を定量した結果を示している。これらの例に示す参照オリゴヌクレオチドは、長さ７０塩基対、ＧＣ含有率５０％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ７０／５０）、長さ７３塩基対、ＧＣ含有率７４％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ７３／７４）、長さ９０塩基対、ＧＣ含有率５０％のβアクチン（アクチン９０／５０）、長さ９０塩基対、ＧＣ含有率５０％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ９０／５０）、および、長さ１７０塩基対、ＧＣ含有率５２％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ１７０／５２）である。
【図７Ｄ】長さが７０ｂｐ〜１７０塩基対、ＧＣ含有率が５０％〜７４％の５つの参照オリゴヌクレオチドを用いて、注目している６つの遺伝子（アンジオテンシノーゲン、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＣＴＧＦ、Ａｔ１ａ、および、ＮＯＮＯ）を定量した結果を示している。これらの例に示す参照オリゴヌクレオチドは、長さ７０塩基対、ＧＣ含有率５０％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ７０／５０）、長さ７３塩基対、ＧＣ含有率７４％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ７３／７４）、長さ９０塩基対、ＧＣ含有率５０％のβアクチン（アクチン９０／５０）、長さ９０塩基対、ＧＣ含有率５０％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ９０／５０）、および、長さ１７０塩基対、ＧＣ含有率５２％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ１７０／５２）である。
【図７Ｅ】長さが７０ｂｐ〜１７０塩基対、ＧＣ含有率が５０％〜７４％の５つの参照オリゴヌクレオチドを用いて、注目している６つの遺伝子（アンジオテンシノーゲン、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＣＴＧＦ、Ａｔ１ａ、および、ＮＯＮＯ）を定量した結果を示している。これらの例に示す参照オリゴヌクレオチドは、長さ７０塩基対、ＧＣ含有率５０％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ７０／５０）、長さ７３塩基対、ＧＣ含有率７４％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ７３／７４）、長さ９０塩基対、ＧＣ含有率５０％のβアクチン（アクチン９０／５０）、長さ９０塩基対、ＧＣ含有率５０％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ９０／５０）、および、長さ１７０塩基対、ＧＣ含有率５２％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ１７０／５２）である。
【図７Ｆ】長さが７０ｂｐ〜１７０塩基対、ＧＣ含有率が５０％〜７４％の５つの参照オリゴヌクレオチドを用いて、注目している６つの遺伝子（アンジオテンシノーゲン、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＣＴＧＦ、Ａｔ１ａ、および、ＮＯＮＯ）を定量した結果を示している。これらの例に示す参照オリゴヌクレオチドは、長さ７０塩基対、ＧＣ含有率５０％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ７０／５０）、長さ７３塩基対、ＧＣ含有率７４％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ７３／７４）、長さ９０塩基対、ＧＣ含有率５０％のβアクチン（アクチン９０／５０）、長さ９０塩基対、ＧＣ含有率５０％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ９０／５０）、および、長さ１７０塩基対、ＧＣ含有率５２％のＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ１７０／５２）である。
【図８Ａ】長さが５０塩基対〜１４４塩基対、ＧＣ含有率が４０％〜５０％の４つの参照オリゴヌクレオチドを用いて、注目している６つの遺伝子（アンジオテンシノーゲン、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＣＴＧＦ、Ａｔ１ａ、および、ＮＯＮＯ）を定量した結果を示している。これらの例に示す参照オリゴヌクレオチドは、アクチン１４４／４０（長さが１４４塩基対、ＧＣ含有率が４０％のβアクチン）、ＣＴＧＦ５０／５０（長さが５０塩基対、ＧＣ含有率が５０％のＣＴＧＦ）、アクチン９０／５０（長さが９０塩基対、ＧＣ含有率が５０％のβアクチン）、および、ＣＴＧＦ９０／５０（長さが９０塩基対、ＧＣ含有率が５０％のＣＴＧＦ）である。アクチン９０／５０に対しては、＊ｐ＜０．００５、＊＊ｐ＜０．０００５、ＣＴＧＦ９０／５０に対しては＃ｐ＜０．０１、＃＃ｐ＜０．００５、＃＃＃ｐ＜０．００１、および、＃＃＃＃ｐ＜０．０００５である。
【図８Ｂ】長さが５０塩基対〜１４４塩基対、ＧＣ含有率が４０％〜５０％の４つの参照オリゴヌクレオチドを用いて、注目している６つの遺伝子（アンジオテンシノーゲン、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＣＴＧＦ、Ａｔ１ａ、および、ＮＯＮＯ）を定量した結果を示している。これらの例に示す参照オリゴヌクレオチドは、アクチン１４４／４０（長さが１４４塩基対、ＧＣ含有率が４０％のβアクチン）、ＣＴＧＦ５０／５０（長さが５０塩基対、ＧＣ含有率が５０％のＣＴＧＦ）、アクチン９０／５０（長さが９０塩基対、ＧＣ含有率が５０％のβアクチン）、および、ＣＴＧＦ９０／５０（長さが９０塩基対、ＧＣ含有率が５０％のＣＴＧＦ）である。アクチン９０／５０に対しては、＊ｐ＜０．００５、＊＊ｐ＜０．０００５、ＣＴＧＦ９０／５０に対しては＃ｐ＜０．０１、＃＃ｐ＜０．００５、＃＃＃ｐ＜０．００１、および、＃＃＃＃ｐ＜０．０００５である。
【図８Ｃ】長さが５０塩基対〜１４４塩基対、ＧＣ含有率が４０％〜５０％の４つの参照オリゴヌクレオチドを用いて、注目している６つの遺伝子（アンジオテンシノーゲン、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＣＴＧＦ、Ａｔ１ａ、および、ＮＯＮＯ）を定量した結果を示している。これらの例に示す参照オリゴヌクレオチドは、アクチン１４４／４０（長さが１４４塩基対、ＧＣ含有率が４０％のβアクチン）、ＣＴＧＦ５０／５０（長さが５０塩基対、ＧＣ含有率が５０％のＣＴＧＦ）、アクチン９０／５０（長さが９０塩基対、ＧＣ含有率が５０％のβアクチン）、および、ＣＴＧＦ９０／５０（長さが９０塩基対、ＧＣ含有率が５０％のＣＴＧＦ）である。アクチン９０／５０に対しては、＊ｐ＜０．００５、＊＊ｐ＜０．０００５、ＣＴＧＦ９０／５０に対しては＃ｐ＜０．０１、＃＃ｐ＜０．００５、＃＃＃ｐ＜０．００１、および、＃＃＃＃ｐ＜０．０００５である。
【図８Ｄ】長さが５０塩基対〜１４４塩基対、ＧＣ含有率が４０％〜５０％の４つの参照オリゴヌクレオチドを用いて、注目している６つの遺伝子（アンジオテンシノーゲン、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＣＴＧＦ、Ａｔ１ａ、および、ＮＯＮＯ）を定量した結果を示している。これらの例に示す参照オリゴヌクレオチドは、アクチン１４４／４０（長さが１４４塩基対、ＧＣ含有率が４０％のβアクチン）、ＣＴＧＦ５０／５０（長さが５０塩基対、ＧＣ含有率が５０％のＣＴＧＦ）、アクチン９０／５０（長さが９０塩基対、ＧＣ含有率が５０％のβアクチン）、および、ＣＴＧＦ９０／５０（長さが９０塩基対、ＧＣ含有率が５０％のＣＴＧＦ）である。アクチン９０／５０に対しては、＊ｐ＜０．００５、＊＊ｐ＜０．０００５、ＣＴＧＦ９０／５０に対しては＃ｐ＜０．０１、＃＃ｐ＜０．００５、＃＃＃ｐ＜０．００１、および、＃＃＃＃ｐ＜０．０００５である。
【図８Ｅ】長さが５０塩基対〜１４４塩基対、ＧＣ含有率が４０％〜５０％の４つの参照オリゴヌクレオチドを用いて、注目している６つの遺伝子（アンジオテンシノーゲン、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＣＴＧＦ、Ａｔ１ａ、および、ＮＯＮＯ）を定量した結果を示している。これらの例に示す参照オリゴヌクレオチドは、アクチン１４４／４０（長さが１４４塩基対、ＧＣ含有率が４０％のβアクチン）、ＣＴＧＦ５０／５０（長さが５０塩基対、ＧＣ含有率が５０％のＣＴＧＦ）、アクチン９０／５０（長さが９０塩基対、ＧＣ含有率が５０％のβアクチン）、および、ＣＴＧＦ９０／５０（長さが９０塩基対、ＧＣ含有率が５０％のＣＴＧＦ）である。アクチン９０／５０に対しては、＊ｐ＜０．００５、＊＊ｐ＜０．０００５、ＣＴＧＦ９０／５０に対しては＃ｐ＜０．０１、＃＃ｐ＜０．００５、＃＃＃ｐ＜０．００１、および、＃＃＃＃ｐ＜０．０００５である。
【図８Ｆ】長さが５０塩基対〜１４４塩基対、ＧＣ含有率が４０％〜５０％の４つの参照オリゴヌクレオチドを用いて、注目している６つの遺伝子（アンジオテンシノーゲン、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＣＴＧＦ、Ａｔ１ａ、および、ＮＯＮＯ）を定量した結果を示している。これらの例に示す参照オリゴヌクレオチドは、アクチン１４４／４０（長さが１４４塩基対、ＧＣ含有率が４０％のβアクチン）、ＣＴＧＦ５０／５０（長さが５０塩基対、ＧＣ含有率が５０％のＣＴＧＦ）、アクチン９０／５０（長さが９０塩基対、ＧＣ含有率が５０％のβアクチン）、および、ＣＴＧＦ９０／５０（長さが９０塩基対、ＧＣ含有率が５０％のＣＴＧＦ）である。アクチン９０／５０に対しては、＊ｐ＜０．００５、＊＊ｐ＜０．０００５、ＣＴＧＦ９０／５０に対しては＃ｐ＜０．０１、＃＃ｐ＜０．００５、＃＃＃ｐ＜０．００１、および、＃＃＃＃ｐ＜０．０００５である。
【図９Ａ】ＳＨＲにおけるアンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）、ＴＧＦβ、および、ＣＴＧＦの発現に対する、ＶＩＰまたはエナラプリルを用いた処理の効果を示している。ゼロ時間コントロールは白抜きバー、媒体コントロールはハッチング入りバー、ＶＩＰ注入は黒塗りバー、エナラプリルを用いた処理はクロスハッチング入りバーで示してある。ＶＩＰまたはエナラプリルを用いた処理を媒体コントロールと比較した場合において、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０２５、＊＊＊ｐ＜０．０００５とする。ＶＩＰまたはエナラプリルを用いた処理をゼロ時間コントロールと比較した場合において、＃ｐ＜０．００１、＃＃ｐ＜０．０００５とする。
【図９Ｂ】ＳＨＲにおけるＮＦ  κ  Ｂ、ＴＮＦα、および、ＡＴ１ａ受容体の発現に対する、ＶＩＰまたはエナラプリルを用いた処理の効果を示している。ＶＩＰまたはエナラプリルを用いた処理を媒体コントロールと比較した場合において、＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．０００５とする。ＶＩＰまたはエナラプリルを用いた処理をゼロ時間コントロールと比較した場合において、＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０００５とする。
【図９Ｃ】ＳＨＲにおけるメタロプロテイナーゼおよびＴＩＭＰの発現に対する、ＶＩＰまたはエナラプリルを用いた処理の効果を示している。ＶＩＰまたはエナラプリルを用いた処理を媒体コントロールと比較した場合において、＊ｐ＜０．０２５、＊＊ｐ＜０．０００５とする。ＶＩＰまたはエナラプリルを用いた処理をゼロ時間コントロールと比較した場合において、＃ｐ＜０．０１、＃＃ｐ＜０．００１、＃＃＃ｐ＜０．０００５とする。各値は、ラット数ｎ＝６に対して平均±平均値の標準誤差で表わした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【配列表】
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