(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３０００以下の分子量からなるアカモク（Sargassum horneri）の水抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＮＦ−κＢ阻害剤。
【請求項２】
請求項１に記載のＮＦ−κＢ阻害剤を含有することを特徴とするＮＦ−κＢによる転写活性化を阻害するための組成物。
【請求項３】
３０００以下の分子量からなるアカモク水抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＮＦ−κＢの転写活性化に起因する関節骨破壊の抑制剤。
【請求項４】
３０００以下の分子量からなるアカモク水抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＮＦ−κＢの転写活性化に起因する悪性腫瘍の治療剤。
【請求項５】
３０００以下の分子量からなるアカモク水抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＮＦ−κＢの転写活性化に起因する炎症性疾患の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アカモク（Sargassum horneri）又は３０００以下の分子量からなるアカモク水抽出物等のアカモクの処理物を有効成分として含有する、ＮＦ−κＢ阻害剤や、かかるＮＦ−κＢ阻害剤を含有するＮＦ−κＢによる転写活性化を阻害するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＦ−κＢ（nuclear factor κB）は、転写因子として働くタンパク質複合体であり、炎症、免疫反応、細胞増殖、アポトーシスなどを制御する様々な遺伝子や、ＡＩＤＳ（acquired immunodeficiency syndrome：後天性免疫不全症候群）の原因ウィルスであるＨＩＶ−１(human immunodeficiency virus type1)遺伝子の転写を活性化することが知られている。また、ＮＦ−κＢはクローン病、気管支喘息、炎症性腸疾患、関節炎、敗血症などの炎症性疾患や、多くの悪性腫瘍で恒常的に活性化していることが知られている。そのため、ＮＦ−κＢに対する阻害剤はこれらの疾患に対する治療に有効であると考えられている。
【０００３】
ＮＦ−κＢは、通常細胞質内でＮＦ−κＢ活性化を抑制するタンパク質（インヒビター）、ＩκＢ（Inhibitor κB）と結合して存在している。細胞がＴＮＦ−α（tumor necrosis factor-α；腫瘍壊死因子）やＩＬ−１（interleukin-1）などの炎症性サイトカインの刺激を受けると、ＭＥＫＫ１、３（mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase 1,3）、ＮＩＫ（ＮＦ−κＢinducing kinase）などのリン酸化酵素によりＩＫＫ（ＩκＢ kinase）複合体が活性化され、活性化されたＩＫＫ複合体は、ＩκＢにおける２つの特異的なセリン残基をリン酸化し、リン酸化されたＩκＢがポリユビキチン化され２６Ｓプロテアソームにより分解されると、ＮＦ−κＢにおける核移行シグナル（nuclear localization signal：ＮＬＳ）が露出し、ＩκＢが解離したＮＦ−κＢが、核内に移行し標的遺伝子の転写を活性化することが知られている。
【０００４】
近年、ＮＦ−κＢ阻害剤を新たな抗炎症剤、抗悪性腫瘍剤などの候補として位置づけた研究や開発が精力的に行われており、様々な作用機序を持つ低分子化合物からなるＮＦ−κＢ阻害剤がいくつか報告されている。例えば、骨髄腫の治療薬として臨床試験が行われているＰＳ−３４１（Bortezomib）は、２６Ｓプロテアソーム阻害剤であり、ＩκＢの分解を抑制することでＮＦ−κＢ阻害効果を示すことが報告されている。ＤＨＭＥＱ（Dehydroxymethyl epoxyquinomycin）は、ＮＦ−κＢの核内移行を阻害することによりＮＦ−κＢによる転写活性化を抑制し、種々の骨髄腫細胞のアポトーシスを誘導することが報告されている。また、リウマチ治療薬である金化合物のうち、特にＡｕＴＧ（aurothioglucoce）は、そのレドックス制御を通じてＮＦ−κＢのＤＮＡ結合を阻害することが報告されている。また、ビタミンＫ２は、骨芽細胞及び破骨前駆細胞における、ＩκＢのｍＲＮＡの発現を増加させることにより、ＮＦ−κＢの活性化を抑制することが報告されている（非特許文献１）。さらに、Ｓ１６２７は、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合を阻害することにより、ＮＦ−κＢによる転写活性を抑制し、骨形成を増大させるとともに、骨減少症を改善させることが報告されている（非特許文献２）。
【０００５】
本発明者は、これまでに食因子による骨粗鬆症の予防と修復に関する基礎的研究を行っている。その研究過程で、食用されている海藻のうち、海藻アカモク抽出物が骨形成増進効果を有することを国内外に先がけて報告している（特許文献１、非特許文献３〜１０）。しかしながら、海藻アカモク抽出物がＮＦ−κＢ阻害効果を有するかどうかは不明であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許３７４９９７８号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Yamaguchi M. and Weitzmann M.N.: Int J Mol Med 27: 3-14 (2011).
【非特許文献２】Alles N. et al.: Endocrinology 151: 4626-4634 (2010).
【非特許文献３】Yamaguchi M. et al. : J. Health Sci. 47: 533-538 (2001).
【非特許文献４】Uchiyama S. and Yamaguchi M.: J. Health Sci. 48: 148-153 (2002).
【非特許文献５】Uchiyama S. and Yamaguchi M.: J. Health Sci. 48: 154-160 (2002).
【非特許文献６】Uchiyama S. et al.: J. Health Sci. 50: 634-639 (2004).
【非特許文献７】Uchiyama S. and Yamaguchi M.: J. Health Sci. 48: 325-330 (2002).
【非特許文献８】Uchiyama S. and Yamaguchi M.: J Health Sci. 49: 149-155 (2003).
【非特許文献９】Matsumoto T. et al.: J. Health Sci. 54: 50-55 (2008).
【非特許文献１０】山口  正義、松本  透、保苅  義則、橋詰  昌幸：海藻アカモク成分の骨代謝調節機能：骨粗鬆症を予防する新規機能性素材ホルマックス(R)の開発. New Food Industry , 50 (1), 1-6 (2008).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、日常の食生活において容易に入手及び摂取でき、ＮＦ−κＢによる転写活性化を阻害できる、ＮＦ−κＢ阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、海藻アカモク抽出物による骨形成増進効果に関与する因子について、鋭意研究を行ってきた。かかる因子の候補としては、文献（Boyle W. et al.: Nature. 423: 337-342 (2003)）や文献（Zaidi M.: Nature Medicine: 791-801 (2007)）などに記載されているとおり、破骨細胞の分化に関わるものや、破骨細胞を増殖させるものや、破骨細胞の骨吸収に関わるものや、骨芽細胞形成を促進させるものなど、数多く知られているが、長年の経験と勘に頼りながら解析を進めたところ、ＴＮＦ−αによりＮＦ−κＢを活性化させた骨芽細胞において、３０００以下の分子量からなるアカモク水抽出物がＮＦ−κＢによる転写活性化を阻害することを見いだした。さらに、ＲＡＮＫＬ（receptor activator of NF-κB (RANK) ligand）によりＮＦ−κＢを活性化させた破骨前駆細胞においても同様に、３０００以下の分子量からなるアカモク水抽出物がＮＦ−κＢによる転写活性化を阻害することを確認した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、（１）アカモク（Sargassum horneri）又はその処理物を有効成分として含有することを特徴とするＮＦ−κＢ阻害剤や、（２）アカモクの処理物が、アカモクの抽出物であることを特徴とする上記（１）に記載のＮＦ−κＢ阻害剤や、（３）アカモクの抽出物が、アカモクの水抽出物であることを特徴とする上記（２）に記載のＮＦ−κＢ阻害剤や、（４）アカモクの水抽出物が、３０００以下の分子量からなるアカモク水抽出物であることを特徴とする上記（３）に記載のＮＦ−κＢ阻害剤に関する。
【００１１】
また、本発明は、（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のＮＦ−κＢ阻害剤を含有することを特徴とするＮＦ−κＢによる転写活性化を阻害するための組成物に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、日常の食生活において容易に入手及び摂取できる、海藻アカモク又はその処理物、特に３０００以下の分子量からなる水抽出物を有効成分とする、ＮＦ−κＢ阻害剤を提供することができる。また、本発明のＮＦ−κＢ阻害剤を用いると、ＮＦ−κＢが恒常的に活性化している炎症性疾患や悪性腫瘍を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＴＮＦ−αによりＮＦ−κＢを活性化させた骨芽細胞を用いて、本発明のアカモク水抽出物がＮＦ−κＢによる転写活性化を阻害することを示す図である。図中「＊」は、ＴＮＦ−α及びアカモク水抽出物を添加しない群（左から一番目）と比較した場合、統計的に有意差（Ｐ＜０．００１）があることを示す。また、図中「＊＊」は、ＴＮＦ−αを添加した群（左から５番目）と比較した場合、統計的に有意差（Ｐ＜０．００１）があることを示す。
【図２】ＲＡＮＫＬによりＮＦ−κＢを活性化させた破骨前駆細胞を用いて、本発明のアカモク水抽出物がＮＦ−κＢによる転写活性化を阻害することを示す図である。図中「＊」は、ＲＡＮＫＬ及びアカモク水抽出物を添加しない群（左から一番目）と比較した場合、統計的に有意差（Ｐ＜０．００１）があることを示す。また、図中「＊＊」は、ＲＡＮＫＬを添加した群（左から５番目）と比較した場合、統計的に有意差（Ｐ＜０．００１）があることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のＮＦ−κＢ阻害剤は、ＮＦ−κＢによる転写活性化を阻害する作用を有する。ＮＦ−κＢによる転写活性化の阻害作用には、例えば、ＮＦ−κＢのインヒビターであるＩκＢのリン酸化が阻害されることによりＩκＢの分解が阻害され、ＮＦ−κＢの活性化が阻害される作用や、ＩκＢの発現が増加することにより、ＮＦ−κＢの活性化が阻害される作用や、ＩκＢが解離したＮＦ−κＢの核内移行が阻害されることにより、ＮＦ−κＢが標的とする遺伝子のｍＲＮＡの発現が抑制・阻害される作用や、核内移行したＮＦ−κＢの標的遺伝子の調節領域（ＤＮＡ）への結合が阻害されることにより、ＮＦ−κＢが標的とする遺伝子のｍＲＮＡの発現が抑制・阻害される作用などが含まれる。
【００１５】
本発明のＮＦ−κＢ阻害剤としては、アカモク又はその処理物を有効成分として含有するものであれば特に制限されるものではなく、かかるアカモク又はその処理物としては、アカモク全体を乾燥させて得られたアカモク乾燥物や、乾燥させたアカモクを粉末化処理して得られたアカモク乾燥粉末や、常温水、熱水、脱イオン水等の水を用いて可溶性成分を分離することにより得られたアカモク水抽出物や、アルコール水、ヘキサン等の有機溶媒を用いて可溶性成分を分離することにより得られたアカモク有機溶媒抽出物や、セルラーゼなどの酵素を用いてアカモクを処理することにより得られたアカモク酵素処理物などを挙げることができ、これらの中でもアカモク有機溶媒抽出物やアカモク水抽出物が好ましく、中でもアカモクの水抽出物を好適に例示することができる。
【００１６】
上記アカモク有機溶媒抽出物やアカモク水抽出物は、そのままでＮＦ−κＢ阻害剤の有効成分として用いることができるが、当該抽出物を、更に適当な精製手段、例えばシリカゲルカラムクロマト法、逆相カラムクロマト法、ゲル濾過クロマトグラフ法、膜ろ過法などによりＮＦ−κＢ阻害活性の高い画分を分画して用いることもできる。ＮＦ−κＢ阻害活性の高い画分としては、５００００以下の分子量、好ましくは１００００以下の分子量、より好ましくは５０００以下の分子量、さらに好ましくは３０００以下の分子量からなるものを好適に例示することができる。
【００１７】
アカモク乾燥物の調製方法としては、生アカモクを水で洗浄後、凍結真空乾燥、天日乾燥、風乾、熱風乾燥、加熱乾燥、マイクロ波乾燥等により乾燥する方法を挙げることができ、アカモク乾燥粉末の調製方法としては、生アカモクの乾燥後にミキサー等で粉末化する方法などを挙げることができる。また、アカモク有機溶媒抽出物やアカモク水抽出物の調製方法としては、生アカモクをホモジナイザー等で破砕処理したものに１〜５倍量、好ましくは２〜４倍量、特に好ましくは３倍量程度の常温水、熱水、脱イオン水等の水や、５〜８０％、好ましくは１０〜４０％、より好ましくは２０％程度のメタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール水、ヘキサンなどの各種有機溶媒を加えて抽出処理し、４０００〜７０００ｇ、好ましくは５０００〜６０００ｇで５〜１５分間、好ましくは１０分間程度遠心処理して、可溶性画分を分離することにより、抽出物を得る方法を具体例に例示することができるが、破砕処理したアカモクに３倍量程度の水を加えて抽出処理し、５０００〜６０００ｇで１０分間程度遠心処理して、可溶性画分を分離する方法を好適に例示することができる。また、抽出処理するアカモクとしては、破砕処理しないインタクトなアカモクを用いることもでき、その場合は、抽出処理後にホモジナイザー等で破砕処理することが好ましい。また、採取したアカモクをすぐに加工処理しない場合は、１０℃以下の低温、例えば４〜５℃にて保存することが好ましい。
【００１８】
調製したアカモクの処理物が、ＮＦ−κＢによる転写活性化の阻害作用を有していることは、ＮＦ−κＢが標的とする遺伝子のｍＲＮＡの発現やＮＦ−κＢが標的とする遺伝子のｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質の発現を、公知の分子生物学的手法を用いて解析することにより確認することができる。ＮＦ−κＢが標的とする遺伝子のｍＲＮＡの発現を解析する方法としては、例えば、定量ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）法、ＲＴ−ＰＣＲ法、サザンブロティング法などの方法を具体的に挙げることができ、また、ＮＦ−κＢが標的とする遺伝子のｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質の発現を解析する方法としては、例えば、ウエスタンブロッティング法、ＮＦ−κＢにより発現調節されるプロモーターの下流にルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子が挿入されたプラスミドを用いたレポーターアッセイ法、質量分析法などの方法を具体的に挙げることができる。
【００１９】
本発明のＮＦ−κＢによる転写活性化を阻害するための組成物としては、本発明のＮＦ−κＢ阻害剤を含有するものであれば特に制限されず、本発明のＮＦ−κＢ阻害剤を医薬用の治療剤として用いる場合などの、ＮＦ−κＢ阻害剤に薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤等の各種調剤用配合成分が添加された組成物や、本発明のＮＦ−κＢ阻害剤をサプリメントとして用いる場合などの、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の配合成分が添加された組成物を例示することができる。
【００２０】
本発明のＮＦ−κＢ阻害剤やＮＦ−κＢによる転写活性化を阻害するための組成物の投与形態としては、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で投与する経口投与や、溶液、乳剤、懸濁液等の剤型を注射、又はスプレー剤の型で鼻孔内投与する非経口投与を挙げることができる。また、本発明のＮＦ−κＢ阻害剤やＮＦ−κＢによる転写活性化を阻害するための組成物は、ＮＦ−κＢの活性化が関与する疾患の治療、予防に有用な医薬品、サプリメント、機能性食品として用いることができる。ＮＦ−κＢの活性化が関与する疾患としては、大腸がん、直腸がん、前立腺がん、子宮頚がん、血液がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、咽頭がん、精巣がん、膀胱がん、卵巣がん、子宮がん、気管支がん、膵臓がん、頚部がん、胃がん、皮膚がん、腎臓がん、食道がん、口腔がん等のがんや、喘息、気管支炎、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、ルー・ゲーリック病、敗血症、結膜炎、紫斑病、鼻ポリープ、紅斑性狼瘡、急性呼吸窮迫症候群、クローン病、胃炎、食道炎、肝炎、膵炎、腎炎、過敏性腸症候群、粘液性大腸炎、潰瘍性大腸炎、骨関節炎、痛風、乾癬、湿疹、皮膚炎、慢性関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、嚢胞性繊維症、炎症性腸疾患、多発性硬化症等の炎症や、全身性強皮症、ベーチェット病、結節性動脈周囲炎、潰瘍性大腸炎、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、活動性慢性肝炎、糸球体腎炎、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ヒトパピローマウィルスによる感染症、ヒトＴ細胞白血病ウィルスによる感染症、Ｂ型肝炎ウィルスによる感染症、Ｃ型肝炎ウィルスによる感染症等の自己免疫症や感染症などの疾患を挙げることができる。
【００２１】
また、上記機能性食品としては、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、プリン、クッキー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、チーズ、バター等の乳製品や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜を挙げることができる。
【００２２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２３】
１．材料
アカモクは岩手県沿岸で採取したものを用いた。アカモクを粉砕した後、得られたアカモク粉砕物に精製蒸留水を加えてポッターホモジナイザーで１０〜６０分間懸濁抽出し、その抽出物を、遠心分離機を用いて室温（１０〜２５℃）下、３０００回転、３０分間遠心した。遠心後、その上清液を回収し、膜ろ過法で、分子量３０００以下のアカモク水抽出物を単離した。かかるアカモク水抽出物を凍結乾燥し、実験に使用するときには精製蒸留水に溶解して用いた。
【実施例２】
【００２４】
２．方法
２−１  骨芽細胞の前培養方法
骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１）の前培養は、文献（Yamaguchi M, Weitzmann MN: Vitamin K2 stimulates osteoblastogenesis and suppresses osteoclastogenesis by NF-κB activation. Int J Mol Med 27:3-14 (2011)）記載の方法にしたがって行った。すなわち、１２穴の培養プレートに１０％ 牛胎児血清（fetal bovine serum；ＦＢＳ）を含むα−ＭＥＭ（α-modified essential medium）（インヴィトロゲン社製）培養液（以下、単に培養液という）１ｍｌを添加し、骨芽細胞（細胞数１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ／ｗｅｌｌ）を含有させ、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃、３日間前培養を行った。
【００２５】
２−２  アカモク水抽出物を用いた骨芽細胞の石灰化（ミネラリゼーション；mineralization）解析方法
アカモク水抽出物を用いた骨芽細胞の石灰化解析は、文献（Yamaguchi M, Weitzmann MN: Vitamin K2 stimulates osteoblastogenesis and suppresses osteoclastogenesis by NF-κB activation. Int J Mol Med 27:3-14 (2011)）記載の方法を基に、以下の〔１〕〜〔８〕に示す手順にしたがって行った。
〔１〕「２−１  骨芽細胞の前培養方法」の項目に記載の方法により前培養した骨芽細胞を、石灰化基質（１００μｇ／ｍｌ Ｌ−アスコルビン酸［L-ascorbic acid］及び４ｍＭ β-グリセロリン酸［β-glycerophosphate］）、ＴＮＦ−α（５ｎｇ／ｍｌ）（シグマ社製）、及び実施例１に記載の方法で単離したアカモク水抽出物（５、１０及び２５μｇ／ｍｌ培養液）を含む培養液（０．８ｍｌ）中で、２１日間培養した。なお、コントロールとして、培養液、石灰化基質を含む培養液、並びに石灰化基質及びＴＮＦ−αを含む培養液を用いた。それぞれの培養液は、３日間ごとに新しいものに交換した。
〔２〕培養液を除去した培養プレートに生理食塩水（phosphate buffered saline；ＰＢＳ）１ｍｌを各培養プレートに加え、細胞を洗浄した。
〔３〕その後、４℃で冷却した７５％エタノール（０．５ｍｌ）を各培養プレートに加え、４℃で３０分間静置することにより細胞を固定した後、エタノールを除去した。
〔４〕精製蒸留水１ｍｌを加えて洗浄後、２時間空気乾燥した。
〔５〕空気乾燥後、４０ｍＭ １％アリザリンレッド（Alizarin Red-S）の０．５ｍｌを各培養プレートに加え、３０分間室温に静置することにより、アリザリンレッド染色を行った。
〔６〕染色液を除去し、精製蒸留水１ｍｌを加えて、４回洗浄した。
〔７〕洗浄後、一夜空気乾燥し、染色した培養プレートをスキャナーで複写し、データ化した。
〔８〕骨芽細胞の石灰化の定量化のために、１０％塩化セチルピリジニウム(cetylpyridium chloride)溶液（シグマ社製）を乾燥した培養プレートに添加して石灰化したカルシウムを溶解し、マイクロプレートリーダーを用いて５７０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
【００２６】
２−３  ルシフェラーゼアッセイ（luciferase assay）法
２−３−１  骨芽細胞を用いたルシフェラーゼアッセイ法
骨芽細胞を用いたルシフェラーゼアッセイ法は、文献（Yamaguchi M, Weitzmann MN: Vitamin K2 stimulates osteoblastogenesis and suppresses osteoclastogenesis by NF-κB activation. Int J Mol Med 27:3-14 (2011)）記載の方法を基に、以下の〔１〕〜〔５〕に示す手順にしたがって行った。
〔１〕骨芽細胞（２ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／０．１ｍｌ／ｗｅｌｌ）を２４時間培養し、培養後の骨芽細胞に、１ｎｇ／ｍｌ培養液のnuclear factor-kappa B (NF-κB)-luciferase plasmid (NF-κB-ルシフェラーゼプラスミッド)（バイオサイエンス社製）をトランスフェクションした。
〔２〕トランスフェクションして５時間培養後、ＴＮＦ−α（１ｎｇ／ｍｌ 培養液）（サンタクルズバイオテクノロジー社製）を含む、実施例１に記載の方法で単離したアカモク水抽出物（５、２５、５０又は１００μｇ／ｍｌ培養液）を添加したアカモク水抽出物含有培養液に培地を交換し、２４時間培養した。なお、コントロールとして培養液、ＴＮＦ−αを含む培養液、及びアカモク水抽出物（５、２５、５０又は１００μｇ／ｍｌ培養液）を含む培養液で培養した細胞を用いた。
〔３〕培養後、アカモク水抽出物含有培養液を除去し、細胞溶解用溶液（プロメガ社製、２０μｌ）を培養プレートに添加して、３０分間振とうしながら細胞を溶解した。
〔４〕得られた細胞溶解液にルシフェラーゼアッセイの基質溶液を添加し、ルミノアッセイ（luminoassay）計（ターナーデザイン社製）で発光強度をカウントした。
〔５〕ルシフェラーゼ活性は、測定カウント（arbitrary unit）数として表示した。
【００２７】
２−３−２  破骨細胞を用いたルシフェラーゼアッセイ方法
破骨細胞を用いたルシフェラーゼアッセイ法は、文献（Yamaguchi M, Weitzmann MN: Vitamin K2 stimulates osteoblastogenesis and suppresses osteoclastogenesis by NF-κB activation. Int J Mol Med 27:3-14 (2011)）記載の方法を基に、以下の〔１〕〜〔５〕に示す手順にしたがって行った。
〔１〕破骨前駆細胞（ＲＡＷ２６７．４）（２ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／０．１ｍｌ／ｗｅｌｌ）を２４時間培養し、培養後の破骨前駆細胞にNF-κB-luciferase plasmid（バイオサイエンス社製）をトランスフェクションした。
〔２〕トランスフェクションして５時間培養後、ＲＡＮＫＬ（３０ｎｇ／ｍｌ培養液)(Ｒ＆Ｄシステム社製)を含む、実施例１に記載の方法で単離したアカモク水抽出物（５、２５、５０又は１００μｇ／ｍｌ培養液）を添加したアカモク水抽出物含有培養液に培地を交換し、２４時間培養した。なお、コントロールとして培養液、ＴＮＦ−αを含む培養液、及びアカモク水抽出物（５、２５、５０又は１００μｇ／ｍｌ培養液）を含む培養液で培養した細胞を用いた。
〔３〕培養後、アカモク水抽出物含有培養液を除去し、細胞溶解用溶液（プロメガ社製、２０μｌ）を培養プレートに添加して、３０分間振とうしながら細胞を溶解した。
〔４〕得られた細胞溶解液にルシフェラーゼアッセイの基質溶液を添加し、ルミノアッセイ（luminoassay）計（ターナーデザイン社製）で発光強度をカウントした。
〔５〕ルシフェラーゼ活性は、測定カウント（arbitrary unit）数として表示した。
【００２８】
２−４  破骨細胞形成の解析方法
破骨前駆細胞（ＲＡＷ２６７．４）(１ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／０．２ｍｌ培養液／ｗｅｌｌ)に、破骨細胞形成を誘導する、anti-poly-histidine antibody（２．５μｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄシステム社製）でクロスリンクしたＲＡＮＫＬ(３０ｎｇ／ｍｌ培養液)（Ｒ＆Ｄシステム社製）、及び、実施例１に記載の方法で単離したアカモク水抽出物（５、２５、５０又は１００μｇ／ｍｌ培養液）を添加したアカモク水抽出物含有培養液中で、細胞を６日間培養した。なお、コントロールとして、培養液中で培養した細胞を用いた。培養後、形成された破骨細胞は、破骨細胞のマーカー酵素であるtartrate resistant acid phosphatase（ＴＲＡＰ）活性をleukocyte acid phosphatase kit (シグマ社製)を使用して破骨細胞を染色した。３以上の核を有する破骨細胞をＴＲＡＰ陽性細胞として計数した。
【００２９】
２−５  統計処理
各値の有意差は、one-way analysis of variance（ＡＮＯＶＡ）とTukey-Kramer multiple comparisons post testを用いて、解析した。ｐ＜０．０５を有意差ありとした。
【実施例３】
【００３０】
３．結果及び考察
３−１  骨芽細胞における、本発明のアカモク水抽出物のＮＦ−κＢ活性化阻害効果
ＴＮＦ−αは、細胞内のＮＦ−κＢ活性化シグナルを介して、多彩な細胞機能を調節しており、例えば骨芽細胞において、ＴＮＦ−αは骨芽細胞の石灰化を抑制することが知られている（非特許文献４、５、Yamaguchi M, Weitzmann MN: Vitamin K2 stimulates osteoblastogenesis and suppresses osteoclastogenesis by NF-κB activation. Int J Mol Med 27:3-14 (2011)、Li Y, Li A, Strait K, Zhang H, Nanes MS and Weitzmann MN: Endogenous TNFalpha Lowers Maximum Peak Bone Mass and Inhibits Osteoblastic Smad Activation, through NF-kappaB. J Bone Miner Res 22: 646-655 (2007)）。本実験においても、骨芽細胞をＴＮＦ−α（１ｎｇ／ｍｌ 培養液)を添加して培養すると骨芽細胞の石灰化が阻害されることが確認された。かかる骨芽細胞におけるＴＮＦ−αによる石灰化阻害は、実施例１に記載の方法により単離されたアカモク水抽出物（５０及び１００μｇ／ｍｌ培養液）の添加により、有意に抑制されることが明らかとなった。
【００３１】
骨芽細胞における、ＴＮＦ−αを介した石灰化阻害に関与する因子は数多く知られているが、その中でＮＦ−κＢに着目して解析を進めた。まず、骨芽細胞において、ＴＮＦ−α依存的なＮＦ−κＢによる転写活性化が誘導されることを確認した（図１、左から５番目）。かかるＮＦ−κＢによる転写活性化は、アカモク水抽出物(２５、５０及び１００μｇ／ｍｌ)の添加により、有意（ｐ＜０．００１）に抑制されることが明らかとなった（図２、左から７〜９番目）。
以上の結果は、本発明のアカモク水抽出物が、骨芽細胞におけるＮＦ−κＢの活性化を阻害することを示すとともに、本発明のアカモク水抽出物が、病態時に血清中のＴＮＦ−α増加により引き起こされる骨芽細胞の機能低下を抑制し、骨芽細胞の石灰化による骨修復を増進させる作用を有していることを示唆している。
【００３２】
３−２  ＲＡＮＫＬにより増加される破骨前駆細胞のＮＦ−κＢ活性化に及ぼす本発明のアカモク水抽出物の効果
破骨前駆細胞において、ＲＡＮＫＬの受容体であるＲＡＮＫを介した破骨細胞への分化誘導が起こると、破骨細胞が形成されることが知られている。かかる破骨細胞形成におけるアカモク水抽出物（５、２５、５０及び１００μｇ／ｍｌ)の阻害効果を調べた。その結果、ＲＡＮＫＬ（３０ｎｇ／ｍｌ）による破骨細胞形成は、アカモク水抽出物（５０及び１００μｇ／ｍｌ）の添加により有意（Ｐ＜０．０１）に抑制されることが明らかとなった。なお、アカモク水抽出物による破骨細胞形成阻害効果は、細胞毒性によるものでないことは確認した。
【００３３】
破骨前駆細胞における、ＲＡＮＫＬを介した破骨細胞形成に関与する因子は数多く知られているが、その中でＮＦ−κＢに着目して解析を進めた。まず、破骨前駆細胞において、ＲＡＮＫＬ依存的なＮＦ−κＢによる転写活性化が誘導されることを確認した（図２、左から５番目）。かかるＮＦ−κＢによる転写活性化は、アカモク水抽出物(２５、５０及び１００μｇ／ｍｌ)の添加により、有意（ｐ＜０．００１）に抑制されることが明らかとなった（図２、左から７〜９番目）。
以上の結果は、本発明のアカモク水抽出物が、破骨前駆細胞におけるＮＦ−κＢの活性化を阻害することを示すとともに、本発明のアカモク水抽出物が、関節炎時に増加する、ＲＡＮＫＬによる破骨前駆細胞から破骨細胞への形成増進による関節骨破壊を抑制できる可能性を示唆している。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明は、海藻アカモク又はその処理物、特に３０００以下の分子量からなる水抽出物を有効成分として用いることで、ＮＦ−κＢが恒常的に活性化している炎症性疾患や悪性腫瘍を治療することができる。また、食経歴の長い海藻であるアカモクからの調製物であるため安全性が高く、若い時期から日常的に予防目的で摂取することができるので、個人の老後の健康的な生活に資するばかりでなく、高齢化社会の医療費削減への貢献が期待できる。
【図１】
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【図２】
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