(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造の化合物：
【化１】
0006027110.tif 000029
またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
【請求項２】
請求項１に記載の以下の構造の化合物：
【化２】
0006027110.tif 000030
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を、薬学的に許容される担体と共同して含む、医薬組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を有効成分とする、Ｔ細胞急性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、赤白血病、乳癌、卵巣癌、メラノーマ、肺癌、膵臓癌、神経膠芽腫、結腸直腸癌、頭頸部癌、子宮頸癌、前立腺癌、肝臓癌、扁平上皮癌（口腔）、皮膚癌または髄芽細胞腫である癌の治療剤。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を有効成分とする、Ｔ細胞急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、赤白血病、乳癌、卵巣癌、メラノーマ、膵臓癌、神経膠芽腫または結腸直腸癌である癌の治療剤。
【請求項６】
Ｔ細胞急性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、赤白血病、乳癌、卵巣癌、メラノーマ、肺癌、膵臓癌、神経膠芽腫、結腸直腸癌、頭頸部癌、子宮頸癌、前立腺癌、肝臓癌、扁平上皮癌（口腔）、皮膚癌または髄芽細胞腫である癌の治療のための医薬品の製造のための、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物の使用。
【請求項７】
Ｔ細胞急性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、赤白血病、乳癌、卵巣癌、メラノーマ、膵臓癌、神経膠芽腫または結腸直腸癌である癌の治療のための医薬品の製造のための、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物の使用。
【請求項８】
ＣｕＫα放射線を用いたＸ線粉末回折パターンによって特徴づけられ、周囲温度および２０〜６０％の相対湿度にて１１．９６±０．２、１８．８１±０．２、２０．７８±０．２または２１．０７の±０．２度２θにおける１つまたは複数のピークとともに２２．９７±０．２度２θにおいてピークを有する、請求項１に記載の水和物結晶。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はノッチ経路シグナリングインヒビター化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ノッチシグナリングは哺乳動物における発生および組織ホメオスタシスで不可欠な役割を果たす進化的に保存された経路である。ノッチ受容体およびリガンドは単一通過の膜貫通ドメインを含有し、細胞表面上で発現され、その理由のために、ノッチシグナリングは受容体を発現する隣接する細胞とリガンドとの間のコミュニケーションの媒介において特に重要である。ノッチ１〜ノッチ４と称される、げっ歯類およびヒトにおいて見出される４つの公知のノッチ受容体がある。ノッチ受容体は、単一のポリペプチドとして最初に合成される、細胞外ドメインおよび細胞内ドメインからなるヘテロダイマー性タンパク質である。受容体リガンド相互作用はノッチ受容体ポリペプチドの一連のタンパク質分解による切断を引き起こし、その中にはγ−セクレターゼ活性が含まれる。γ−セクレターゼ活性は細胞表面からノッチ細胞内ドメインを切断し、それは核へ移動して転写因子複合体を形成する。ノッチ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）はタンパク質の活性形態である。様々なノッチシグナリング機能は、増殖、分化、アポトーシス、血管新生、遊走および自己更新を含む。正常組織の発生および維持の間のノッチシグナリングのこれらの多様な役割は癌の異なる形態において異常に活性化される。ノッチシグナリングの発癌機能はアポトーシスの阻害および細胞増殖の促進を含む。
【０００３】
γ−セクレターゼはノッチ活性化カスケードにおいて極めて重要な役割を果たす。その結果、γ−セクレターゼのインヒビターはノッチ受容体活性化をブロックする能力について活発に調べられてきた。特許文献１中で例示された化合物（７Ｃ−２０３等）はかかるγ−セクレターゼ阻害剤を代表する。このような見込みにもかかわらず、市販のノッチインヒビター化学療法剤は出現していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第９８／２８２６８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ノッチ経路シグナリング阻害活性を有する化合物を見出す必要性がある。γ−セクレターゼ阻害活性を有する化合物を見出すさらなる必要性がある。ノッチ経路シグナリング阻害活性に寄与し得る別の構造上の特色を保持する化合物を見出す必要性もある。ノッチ経路シグナリング阻害活性、ならびに所望されるｉｎ  ｖｉｖｏ分布、代謝および排泄の特性を実証する化合物を見出すさらなる必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一態様は、以下の構造のノッチシグナリングインヒビター化合物：
【化１】
0006027110.tif 000002
またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を提供する。
【０００７】
本発明の第２の態様は、４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−２−［［（７Ｓ）−５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソ−エチル］ブタンアミドまたはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を含む医薬組成物を、薬学的に許容される担体と共同して提供する。特定の実施形態において、医薬組成物は、４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−２［［（７Ｓ）−５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンゾアゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソ−エチル］ブタンアミドまたはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を、薬学的に許容される担体および任意で他の治療法上の成分と共に含む。
【０００８】
本発明の第３の態様は、治療上有効な量の４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−２−［［（７Ｓ）−５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソ−エチル］ブタンアミドまたはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を、その必要性のある癌患者へ投与することを含む、該患者においてノッチシグナリングを阻害する方法を提供する。
【０００９】
本発明の第４の態様は、治療上有効な量の４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−２−［［（７Ｓ）−５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソ−エチル］ブタンアミドまたはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を、その必要性のある患者へ投与することを含む、患者におけるＴ細胞急性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、赤白血病、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肺癌、膵臓癌、神経膠芽腫、結腸直腸癌、頭頸部癌、子宮頸癌、前立腺癌、肝臓癌、扁平上皮癌（口腔）、皮膚癌または髄芽細胞腫である癌を治療する方法を提供する。
【００１０】
本発明の第５の態様は、治療上有効な量の４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−２−［［（７Ｓ）−５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソ−エチル］ブタンアミドまたはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を、その必要性のある患者へ投与することを含む、患者におけるＴ細胞急性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、赤白血病、乳癌、卵巣癌、黒色腫、膵臓癌、神経膠芽腫または結腸直腸癌である癌を治療する方法を提供する。
【００１１】
本発明の第６の態様は、治療法における使用ための、化合物４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−２−［［（７Ｓ）−５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソ−エチル］ブタンアミドまたはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を提供する。
【００１２】
本発明の第７の態様は、Ｔ細胞急性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、赤白血病、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肺癌、膵臓癌、神経膠芽腫、結腸直腸癌、頭頸部癌、子宮頸癌、前立腺癌、肝臓癌、扁平上皮癌（口腔）、皮膚癌または髄芽細胞腫である癌の治療における使用ための、化合物４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−２−［［（７Ｓ）−５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソ−エチル］ブタンアミドまたはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を提供する。
【００１３】
本発明の第８の態様は、Ｔ細胞急性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、赤白血病または乳癌、卵巣癌、黒色腫、膵臓癌、神経膠芽腫または結腸直腸癌である癌の治療における使用ための、化合物４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−２−［［（７Ｓ）−５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソ−エチル］ブタンアミドまたはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を提供する。
【００１４】
本発明の第９の態様は、Ｔ細胞急性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、赤白血病、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肺癌、膵臓癌、神経膠芽腫、結腸直腸癌、頭頸部癌、子宮頸癌、前立腺癌、肝臓癌、扁平上皮癌（口腔）、皮膚癌または髄芽細胞腫である癌の治療のための医薬品の製造のための化合物４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−２−［［（７Ｓ）−５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソ−エチル］ブタンアミドまたはその薬学的に許容される塩もしくは水和物の使用を提供する。
【００１５】
本発明の第１０の態様は、Ｔ細胞急性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、赤白血病または乳癌、卵巣癌、黒色腫、膵臓癌、神経膠芽腫または結腸直腸癌である癌の治療のための医薬品の製造のための化合物４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−２−［［（７Ｓ）−５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソ−エチル］ブタンアミドまたはその薬学的に許容される塩もしくは水和物の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は実施例２の化合物についての代表的なＸ線粉末回折パターンである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
「患者」という用語は哺乳動物を意味し、「哺乳動物」はヒトを含むが、これらに限定されない。
【００１８】
「治療上有効な量」または「有効量」は、癌患者におけるノッチシグナリングを阻害し、標的癌細胞を破壊することまたは患者における癌の進行を遅らせるかもしくは停止させることのいずれかに必要な化合物または薬学的に許容される塩もしくはその水和物、または化合物または薬学的に許容される塩もしくはその水和物を含有する医薬組成物の投薬量を意味する。化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物の予想される投薬量は０．１〜２００ｍｇ／患者／日の範囲中である。好ましい投薬量は１〜１７５ｍｇ／患者／日の範囲中であると予想される。最も好ましい投薬量は５〜１５０ｍｇ／患者／日の範囲中であると予想される。患者の治療に要求される正確な投薬量および治療時間の長さは、個別の患者の特異的な必要性および反応に加えて疾患のステージおよび重症度を考慮して医師によって決定されるだろう。１日あたりに基づく投薬量として表現されるが、投薬レジメンを調整して、より至適な治療法上の利益を患者へ提供し、粘液性腸症（胃腸管中の粘液の分泌過多および蓄積）を管理および寛解することができる。毎日の投薬に加えて、１日おきの投薬（Ｑ２Ｄ）；５日の期間にわたり１日おきの投薬続いて２日間投薬なし（Ｔ．Ｉ．Ｗ．）；または３日ごとの投薬（Ｑ３Ｄ）が、適切であろう。１日おき、Ｔ．Ｉ．Ｗ．または３日ごとの投薬レジメンは、粘液性腸症を管理または寛解するデキサメタゾンの投与（化合物１の前投与、同時投与、または後投与）と共に行なうのが好ましい。
【００１９】
「治療」、「治療する」、および「治療すること」という用語は、患者が罹患している癌のためのインターベンションの全領域（１つまたは複数の症状を遅らせるかまたは回復させ、癌が実際に取り除かれなくても癌の進行を遅延させる、緩和する活性化合物の投与等）を含むことを意味する。治療される患者は哺乳動物、特にヒトである。
【００２０】
本発明の化合物は、薬学的に許容される担体を使用し、多様な経路によって投与されて、好ましくは医薬組成物として処方される。好ましくは、かかる組成物は経口投与のためのものである。それらの調製のためのかかる医薬組成物およびプロセスは当該技術分野において周知である。例えばＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｔ  ａｌ．編、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９９５）を参照されたい。特定の実施形態において、医薬組成物は、４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−２−［［（７Ｓ）−５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンゾアゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソ−エチル］ブタンアミドまたはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を、薬学的に許容される担体、および任意で特に一般的な癌または特異的な癌型の治療のための他の治療法上の成分と共に含む。
【００２１】
本発明の化合物は多数の無機酸および有機酸と反応させて、薬学的に許容される酸付加塩を形成することが可能である。それらの調製のためのかかる薬学的に許容される塩および一般的な方法論は当該技術分野において周知である。例えばＰ．Ｓｔａｈｌ，ｅｔ  ａｌ．，ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＵＳＥ，（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２）；Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ，“Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．６６，Ｎｏ．１，Ｊａｎｕａｒｙ  １９７７を参照されたい
【００２２】
化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物は、以下に記載されたものに加えて当該技術分野において公知の多様な手順によって調製することができる。特異的な合成工程は、化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を調製する異なる方法において組み合わせることができる。
【００２３】
化合物１は４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−２−［［（７Ｓ）−５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソ−エチル］ブタンアミドと命名され；Ｎ−［（１Ｓ）−２−［［（７Ｓ）−６，７−ジヒドロ−５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−５Ｈ−ピリド［３，２−ａ］［３］ベンズアゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソエチル］−４，４，４−トリフルオロブタンアミドとも命名することができ；他の名称を使用して明確に化合物１を同定することができる。
【００２４】
化合物１が単一の立体異性体として図示されることが理解されるだろう。４つの立体異性体を生じさせる２つの不斉中心がある。本明細書において使用される時、化合物１への参照は化合物１を含むラセミ混合物も含むことを意味する。本明細書において、（Ｒ）−および（Ｓ）−のＣａｈｎ−Ｉｎｇｏｌｄ−Ｐｒｅｌｏｇ指定は特異的な異性体を指すために使用される。特異的な立体異性体は鏡像異性的に純粋であるかまたは濃縮された出発物質を使用して立体特異的な合成によって調製することができる。化合物１を含む出発物質、中間体またはラセミ混合物のいずれかのうちの特異的な立体異性体は、キラル固定相上でのクロマトグラフィー、酵素的分割、またはその目的のために形成されたジアステレオマー（ジアステレオマー塩等）の分別結晶もしくはクロマトグラフィーを含む、当該技術分野において周知の技法（Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｅ．Ｉ．Ｅｌｉｅｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ（Ｗｉｌｅｙ  １９９４）およびＥｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｊ．，Ｊａｃｑｕｅｓ，Ａ．Ｃｏｌｌｅｔ，ａｎｄ  Ｓ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ（Ｗｉｌｅｙ  １９９１）中で見出されるもの等）によって分割することができる。本発明の化合物を含有するすべての混合物は本発明内で意図されるが、好ましい実施形態は化合物１である。
【００２５】
化合物１がアトロプ異性体または特異的な配座異性体として存在することも見出された。水溶液中で、８〜９％のアトロプ異性体２（マイナーなアトロプ異性体）は、２４時間後に周囲温度でアトロプ異性体１（主要なアトロプ異性体）との平衡において１Ｈ  ＮＭＲおよびＬＣ−ＭＳによって検出される。有機溶媒中で、およそ１〜２％のアトロプ異性体２は、２４時間後に周囲温度でアトロプ異性体１との平衡において１Ｈ  ＮＭＲおよびＬＣ−ＭＳによって検出される。１Ｈ  ＮＭＲおよびＬＣ−ＭＳ分析によって検出可能であるが、アトロプ異性体２は分離可能ではない。
【００２６】
本発明の化合物の合成における最初の出発物質として用いられる化合物は周知であり、商業的に入手可能でない程度まで、当該技術分野において当業者によって一般に用いられるかまたは一般的な参考テキストにおいて見出される標準的な手順によって、提供された具体的な参照を使用して容易に合成される。
【００２７】
公知の手順および方法の例は、一般な参考テキスト（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ，１９８９；Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−１０，１９７４−２００２，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ＭｅｃｈａｎｉｓｍｓおよびＳｔｒｕｃｔｕｒｅ、第５版、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｂ．Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｅｒｒｙ  Ｍａｒｃｈ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，２００１；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４版、Ｐａｒｔ  Ｂ，Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｆｒａｎｃｉｓ  Ａ．Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｊ．Ｓｕｎｄｂｅｒｇ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２０００等など）およびその中に引用される参照中で記載されたものを含む。
【００２８】
中間体および化合物１は、ＳｙｍａｘＤｒａｗバージョン３．２ドローイングプログラムを使用して、一貫して適用されるＩＵＰＡＣ名として構造から命名される。
【実施例】
【００２９】
調製１
ベンジル（２Ｓ）−２−（４，４，４−トリフルオロブタノイルアミノ）プロパノアート
【化２】
0006027110.tif 000003
Ｌ−アラニンベンジルエステル塩酸塩（７．００ｇ、３２．５ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（２８．３０ｍＬ、１６２．３ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（７．４６ｇ、４８．７ｍｍｏｌ）および１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（９．３３ｇ、４８．７ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（１６２ｍＬ）中の４，４，４−トリフルオロ酪酸（７．１３１ｇ、４８．７ｍｍｏｌ）の溶液へ窒素下の周囲温度で連続的に添加し、２０時間撹拌した。クエン酸（１５０ｍＬ、１６２ｍｍｏｌ）の２０％水溶液を添加し、混合物を５分間撹拌し、層を分離した。ジクロロメタン（１００ｍＬ）により水層から抽出する。合わせた有機層を重炭酸ナトリウムの飽和水溶液（１５０ｍＬ）により洗浄し、硫酸マグネシウムの上で乾燥し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーによって残渣を精製し、ヘキサン：酢酸エチル（４：１〜２：１）により溶出して、白色固形物（９．２２ｇ、３０．４ｍｍｏｌ、９４％）として表題化合物を得た。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３０４（Ｍ＋１）；［α］Ｎａ２５＝−４４．６°（ｃ＝５．０、メタノール）。
【００３０】
調製２
（２Ｓ）−２−（４，４，４−トリフルオロブタノイルアミノ）プロパン酸
【化３】
0006027110.tif 000004
パラジウム／炭素（５％、１．７６ｇ、０．８ｍｍｏｌ）を１つの小分けで、メタノール（８８ｍＬ）中のベンジル（２Ｓ）−２−（４，４，４−トリフルオロブタノイルアミノ）プロパノアート（８．８０ｇ、２９ｍｍｏｌ）の溶液へ周囲温度で添加した。混合物を脱気（真空／窒素）し、水素（１気圧）により充填し、水素（２９ｍｍｏｌ）下で５時間撹拌した。Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を通して濾過し、濾過ケーキをメタノールによりリンスし、濾液を濃縮して、白色固形物（６．１１ｇ、２８．７ｍｍｏｌ、９９％）として表題化合物を得た。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２１４（Ｍ＋１）；［α］Ｎａ２５＝−２４．７°（ｃ＝５．０、メタノール）。
【００３１】
調製３
メチル２−（２−ブロモフェニル）アセテート
【化４】
0006027110.tif 000005
ジメチルホルムアミド（２．１ｍＬ、２７．３ｍｍｏｌ）続いて塩化チオニル（５２．３ｍＬ、７１７．８ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（１．５０Ｌ）中の２−ブロモフェニル酢酸（１５０．０ｇ、６８３．６ｍｍｏｌ）の溶液へ７分間にわたって添加し、周囲温度のウォーターバスにより冷却した。混合物を５時間撹拌し、メタノール（４１．５ｍＬ、１．０ｍｏｌ）を５分間にわたって添加した。溶液を通して窒素を一晩バブリングした。濃縮して、定量的収率（１６６．０ｇ、７２４．７ｍｍｏｌ）で無色油として表題化合物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：７．５７（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．３０−７．２６（ｍ，２Ｈ），７．１９−７．１２（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｓ，２Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ）．
【００３２】
調製４
メチル２−［２−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル］アセテート
【化５】
0006027110.tif 000006
Ｎ−メチルピロリドン（９４０ｍＬ）中のメチル２−（２−ブロモフェニル）アセテート（１５６．６ｇ、６８４ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（１９４．９ｇ、７５２ｍｍｏｌ）および酢酸カリウム（１３５．６ｇ、１．４ｍｏｌ）の懸濁物を、３つの真空／窒素サイクルにより脱気した。（１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）パラジウム（ＩＩ）クロライド（１１．４ｇ、１３．７ｍｍｏｌ）を添加し、８０℃で加熱する。１５時間後に、（１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）パラジウム（ＩＩ）クロライド（１１．４ｇ、１３．７ｍｍｏｌ）を添加し、９０℃で２４時間撹拌した。周囲温度まで冷却し、氷および水の混合物（３Ｌ）の上に注ぎ、メチル第三ブチルエーテル（１Ｌ）を添加した。混合物を撹拌し、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）のパッドを通して濾過し、層を分離した。メチル第三ブチルエーテル（２×５００ｍＬ）により水層から抽出した。合わせた有機層を水（２×５００ｍＬ）、ブライン（５００ｍＬ）により洗浄し、硫酸ナトリウムの上で乾燥し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーによって残渣を精製し、ヘキサン：酢酸エチル（９：１）により溶出して、白色固形物（１６０．６ｇ、５８１．６ｍｍｏｌ、８５％）として表題化合物を得た。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２７７（Ｍ＋１）．
【００３３】
調製５
５，７−ジヒドロピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−６−オン
【化６】
0006027110.tif 000007
炭酸カリウム（２３５．７ｇ、１．７１ｍｏｌ）を、１，４−ジオキサン（５５０ｍＬ）および水（５５０ｍＬ）中の２−アミノ−３−ブロモピリジン（８８．５ｇ、５１１．７ｍｍｏｌ）の溶液へ添加した。真空／窒素の３つのサイクルにより混合物を脱気し、パラジウム（ＩＩ）アセテート（６．４ｇ、２８．４ｍｍｏｌ）およびトリ−ｔ−ブチルホスホニウムテトラフルオロボラート（１６．５ｇ、５６．９ｍｍｏｌ）を添加し、窒素下の８８℃で撹拌した。１，４−ジオキサン（５５０ｍＬ）中のメチル２−［２−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル］アセテート（１５７．０ｇ、５６８．５ｍｍｏｌ）の溶液を３分間にわたって１滴ずつ添加し、混合物を８８℃で２０分間撹拌した。混合物を５０℃まで冷却し、水（１００ｍＬ）を添加し、層を分離した。酢酸エチル（２×１００ｍＬ）により水層から抽出し、合わせた有機層を硫酸ナトリウムの上で乾燥し、濃縮した。濃縮物質をＮ−メチルピロリドン（３１４ｍＬ）中で溶解し、アイスバス中で冷却し、硫酸（３１４ｍＬ、５．９ｍｏｌ）を１滴ずつ添加して、およそ４５℃の温度を維持する。混合物を１４０℃で９０分間撹拌した。周囲温度まで冷却し、氷（４ｋｇ）を添加し、５０％ＮａＯＨ水溶液の小分けの添加により溶液がｐＨ７〜８になるまで塩基性化する。懸濁物を１０〜１５℃まで冷却し、固形物を濾過により除き、水（２Ｌ）、ヘキサン（１Ｌ）およびメチル第三ブチルエーテル（１Ｌ）により洗浄した。真空下の４０℃で乾燥した。１０％メタノール／ジクロロメタン溶液の還流混合物により物質を処理して、熱い状態で濾過した（×４）。合わせた濾液を濃縮して、薄茶色固形物（８５ｇ、４０４．３ｍｍｏｌ、７１％）として表題化合物を得た。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２１１（Ｍ＋１）．
【００３４】
調製６
５−［２−（ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル）オキシエチル］−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−６−オン
【化７】
0006027110.tif 000008
ジメチルホルムアミド（８６０ｍＬ）中の炭酸セシウム（１８６．６ｇ、５７２．７ｍｍｏｌ）、（２−ブロモエトキシ）−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラン（８８．０ｍＬ、４０９．１ｍｍｏｌ））およびヨウ化ナトリウム（６．１ｇ、４０．９ｍｍｏｌ）を、５，７−ジヒドロピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−６−オン（８６．０ｇ、４０９．１ｍｍｏｌ）の懸濁物へ添加し、７０℃で２０時間撹拌した。混合物を周囲温度まで冷却して、氷および水（１００ｍＬ）の上に注いで、酢酸エチル（２００ｍＬ）を添加した。混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）を介して濾過し、次いで酢酸エチル（１００ｍＬ）により洗浄した。濾液の層を分離し、酢酸エチル（２×５０ｍＬ）により水層から抽出した。合わせた有機層を水（２×１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）により洗浄し、硫酸ナトリウムの上で乾燥し、濃縮した。物質をテトラヒドロフラン（１．２８Ｌ）中で溶解し、Ｓｉｌｉａ（登録商標）結合パラジウム除去剤（１６．７ｇ）を添加し、周囲温度で２０時間撹拌した。シリカのパッドを通して濾過し、テトラヒドロフラン（２００ｍＬ）により洗浄し、濃縮して、結晶した薄茶色油として表題化合物（１５５ｇ、４２０．６ｍｍｏｌ）を定量的収率で得た。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３６９（Ｍ＋１）．
【００３５】
方法２：
混合物５，７−ジヒドロピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−６−オン（２２．５ｇ、１０６．９ｍｍｏｌ）およびジメチルホルムアミド（５００ｍＬ）を１００℃まで５分間加熱した。４０℃まで冷却し、炭酸セシウム（１０４．３ｇ、３２０．１ｍｍｏｌ）および（２−ブロモエトキシ）−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラン（２９．９ｍＬ、１３８．９ｍｍｏｌ）を添加し、周囲温度で一晩撹拌した。およそ６０℃まで２時間加熱し、次いで周囲温度まで冷却した。残渣を酢酸エチル（１Ｌ）と水（３Ｌ）との間で分配し、酢酸エチル（２×５００ｍＬ）により水層から再度抽出し、合わせた有機層をブライン（２×５００ｍＬ）により洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムの上で乾燥し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーによって残渣を精製し、酢酸エチル：ヘキサン（０：１００〜１００：０）により溶出して、油（３９．４ｇ、１０６．９ｍｍｏｌ、８９％）として表題化合物を得た。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３６９（Ｍ＋１）．
【００３６】
調製７
５−［２−（ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル）オキシエチル］−７−ヒドロキシイミノ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−６−オン
【化８】
0006027110.tif 000009
カリウム２−メチルプロパン−２−オラート（６６．１ｇ、５８８．８ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン（１．６Ｌ）中の５−［２−（ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル）オキシエチル］−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−６−オン（１５５．０ｇ、４２０．６ｍｍｏｌ）の溶液へ−５℃で添加し、１０分間撹拌した。亜硝酸イソアミル（６１．９ｍＬ、４６２．６ｍｍｏｌ）を−５℃で１滴ずつ添加し、混合物を１０分間撹拌した。氷／水（２Ｌ）の上に注ぎ、および酢酸エチル（３×２００ｍＬ）により抽出した。合わせた有機層をブライン（２００ｍＬ）により洗浄し、硫酸ナトリウムの上で乾燥した。トルエン（１Ｌ）を添加し、濃縮して（３×）、濃厚な茶色油（１６０．０ｇ、４０２．５ｍｍｏｌ、９６％）として表題化合物を得た。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３９８（Ｍ＋１）．
【００３７】
調製８
（７Ｓ）−７−アミノ−５−（２−ヒドロキシエチル）−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−６−オン
【化９】
0006027110.tif 000010
トリフルオロ酢酸（１２４．０ｍＬ、１．６４ｍｏｌ）を複数の小分けで、ジクロロメタン（６２０ｍＬ）およびメタノール（３１０ｍＬ））の混合物中の５−［２−（ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル）オキシエチル］−７−ヒドロキシイミノ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−６−オン（１５５．０ｇ、３８９．９ｍｍｏｌ）の溶液へ、周囲温度のウォーターバス中で添加した。内部温度が３３〜３８℃で維持されるように、亜鉛（７６．５ｇ、１．２ｍｏｌ）を複数の小分けで添加した。周囲温度で１５時間撹拌した。Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を介して混合物を濾過し、１０％メタノール／ジクロロメタン（１００ｍＬ）により洗浄し、濾液を濃縮した。ジクロロメタン（０．５Ｌ）および氷（５００ｇ）を添加し、撹拌し、５０％ＮａＯＨ水溶液により塩基性化した。固形物を濾過により除いて、濾液層を分離した。ジクロロメタン（２×１００ｍＬ）により水層から抽出し、合わせた有機層を濃縮した。ヘキサン中で固形物をスラリー化し、次いで濾過し、高真空下で乾燥し、明黄色固形物（７４．０ｇ、２７４．８ｍｍｏｌ、７１％）として表題化合物のラセミ化合物を得た。Ｃｈｉｒａｌｐａｋ（登録商標）ＡＤカラム上で物質を精製し、エタノール（０．２％ジメチルアミン（ｄｉｍｅｔｈｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ））：アセトニトリル（０：１００〜１００：０）により溶出して、白色固形物として表題化合物（３５．０ｇ、１３０ｍｍｏｌ、３３．３％）を得た。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２７０（Ｍ＋１）；［α］Ｎａ２５＝＋１８７．８３°（ｃ＝６．９、メタノール）。
【００３８】
調製９
７−アジド−５−［２−（ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル）オキシエチル］−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−６−オン
【化１０】
0006027110.tif 000011
水素化カリウム（およそ２杯、鉱物油中で３５重量％）をヘキサンにより洗浄し、デカントして油を除去し、テトラヒドロフラン（６０ｍＬ）を添加し、−７８℃まで冷却した。テトラヒドロフラン（６０ｍＬ）中の２，４，６−トリス（１−メチルエチル）−ベンゼンスルホニルアジド（３７．６ｇ、１２１．６ｍｍｏｌ）の溶液を硫酸ナトリウムの上で４５分間乾燥させた。アジド溶液を１５分間にわたって水素化カリウム懸濁物の中へデカントした。コールドバスを除去し、周囲温度まで４５分間放置して暖め；無水溶液を取っておいた。ジイソプロピルアミン（１７．０  Ｌ、１２１．０ｍｍｏｌ）およびテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）の溶液を−７８℃まで冷却し、ｎ−ブチルリチウム（５２．１ｍＬ、１３０．３ｍｍｏｌ）を５分間にわたって添加した。コールドバスを除去し、１５分間放置して暖め、次いで−７８℃まで再度冷却した。テトラヒドロフラン（４００ｍＬ）中の５−［２−（ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル）オキシエチル］−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−６−オン（３４．３ｇ、９３．１ｍｍｏｌ）の−７８℃溶液の中へ５〜１０分間にわたってニューレにより挿入した。次いで−７８℃で１時間撹拌し、コールドバスを除去し、１５分間放置して（およそ−４５℃まで）暖めた。−７８℃まで冷却し、無水２，４，６−トリス（１−メチルエチル）−ベンゼンスルホニルアジド溶液を５〜１０分間にわたってカニューレを介して添加した。バスを除去し、１時間にわたって放置して−５〜０℃へ暖めた。アイス／ウォーターバス中で冷却し、酢酸（２６．７ｍＬ、４６５．３ｍｍｏｌ））を１３分間にわたって添加した。６５分間にわたって放置して周囲温度まで暖め、飽和重炭酸ナトリウム溶液（１Ｌ）によりクエンチした。酢酸エチル（６００ｍＬ）および水（２Ｌ）により反応を希釈し、層を分離し、酢酸エチル（２×４００ｍＬ）により水層から再度抽出した。合わせた有機層を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（５００ｍＬ）およびブライン（５００ｍＬ）により洗浄し、硫酸ナトリウムの上で乾燥し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーによって残渣を精製し、酢酸エチル：ヘキサン（０：１００〜１００：０）により溶出して、油（３９．８ｇ、９２．３ｍｍｏｌ、９９％）として表題化合物を得た。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４１０（Ｍ＋１）．
【００３９】
調製１０
７−アミノ−５−［２−（ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル）オキシエチル］−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−６−オン
【化１１】
0006027110.tif 000012
パラジウム／炭素（２．２ｇ、１．０ｍｍｏｌ、炭素に対して５％）を、エタノール（９２３ｍＬ）中の７−アジド−５−［２−（ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル）オキシエチル］−７Ｈ−ｐｙｒｉｄｏ［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−６−オン（３９．８ｇ、９２．３ｍｍｏｌ）の窒素パージした溶液へ添加した。水素により３回排出／充填し、水素（１気圧）下の周囲温度で一晩撹拌した。Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）の上を濾過し、エタノールおよび酢酸エチルによりリンスし、濃縮して、透明油（３６．６ｇ、８９．９ｍｍｏｌ、９７％）として表題化合物を得た。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３８４（Ｍ＋１）．
【００４０】
調製１１
ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［（１Ｓ）−２−［［５−［２−（ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル）オキシエチル］−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソ−エチル］カルバメート
【化１２】
0006027110.tif 000013
７−アミノ−５−［２−（ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル）オキシエチル］−７Ｈ−ｐｙｒｉｄｏ［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−６−オン（３６．３ｇ、８９．９ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（３６０ｍＬ）、トリエチルアミン（１６．３ｍＬ、１１６．９ｍｍｏｌ）、３−ヒドロキシトリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン（１５．９ｇ、１１６．９ｍｍｏｌ）および（２Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパン酸（２２．５ｇ、１１６．９ｍｍｏｌ）の混合物を０℃まで冷却した。１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（２２．４ｇ、１１６．９ｍｍｏｌ）を添加し、５分後に一晩放置して周囲温度まで暖めた。水（５００ｍＬ×２）、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２×３００ｍＬ）、ブライン（３００ｍＬ）により洗浄し、次いで硫酸ナトリウムの上で乾燥し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーによって残渣を精製し、イソプロピルアルコール：ヘキサン（５：９５〜１０：９０）により溶出して、白色泡（４３．１４ｇ、７７．７７ｍｍｏｌ、８６．５０％）として表題化合物を得た。ＭＳ（ｍ／ｚ）：５５５（Ｍ＋１）．
【００４１】
調製１２
（２Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−［５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−７−イル］プロパンアミド
【化１３】
0006027110.tif 000014
トリフルオロ酢酸（３０ｍＬ、３９６．７６ｍｍｏｌ）を、ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［（１Ｓ）−２−［［５−［２−（ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル）オキシエチル］−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソ−エチル］カルバメート（５．５６ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン（３０ｍＬ）の０℃の溶液へ５分間にわたって添加し、放置して暖め、周囲温度で５時間撹拌した。ＳＣＸ（登録商標）カラム（Ｉｓｏｌｕｔｅ  ＳＣＸ２  ｘ６）によるフラッシュクロマトグラフィーによって残渣を精製し、メタノール続いて酢酸エチル：メタノール（２Ｎアンモニア）（１：１）により溶出して、定量的収率で白色固形物（３．４８ｇ、１０．２ｍｍｏｌ）として表題化合物を得た。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３４１（Ｍ＋１）．
【００４２】
実施例１
４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−２−［［（７Ｓ）−５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソ−エチル］ブタンアミド
【化１４】
0006027110.tif 000015
（２Ｓ）−２−（４，４，４−トリフルオロブタノイルアミノ）プロパン酸（２８．９ｇ、１３５．７ｍｍｏｌ；調製２中で実質的に上で記載されるように調製した）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（２９．７ｇ、１５５．１ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（６９６ｍＬ）中の（７Ｓ）−７−アミノ−５−（２−ヒドロキシエチル）−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−６−オン（３４．８ｇ、１２９．２ｍｍｏｌ）の懸濁物へ０℃で連続して添加し、５分間で撹拌した。１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（２４．７ｇ、１５５．１ｍｍｏｌ）を添加し、１時間撹拌したままにし、次いで周囲温度まで暖めた。（２Ｓ）−２−（４，４，４−トリフルオロブタノイルアミノ）プロパン酸（０．６ｇ、２．６ｍｍｏｌ）を添加し、周囲温度で１５分間で撹拌した。水（６００ｍｌ）を添加し、白色固形物を濾過により除き、濾液の層を分離した。水（３×２００ｍＬ）により有機層を洗浄し、硫酸ナトリウムの上で乾燥し、濃縮して、薄茶色泡を得た。５０％メチル第三ブチルエーテルヘキサン（５００ｍＬ）中で物質をスラリー化し、固形物を濾過により除き、高真空下で乾燥して、６５ｇの固形物を得た。
【００４３】
水（１９５ｍＬ）および重炭酸カリウム（１４．０ｇ、１４０．０ｍｍｏｌ）を、メタノール（１９５ｍＬ）中の先に得られた固形物（６５．０ｇ、１４０．０ｍｍｏｌ）の１０℃溶液へ添加し、周囲温度で２９時間撹拌した。ジクロロメタン（３×５０ｍＬ）により濃縮および抽出した。合わせた有機層を水（３×２０ｍＬ）により洗浄し、硫酸ナトリウムの上で乾燥し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーによって残渣を精製し、メタノール：ジクロロメタン（９８：２、アンモニア中で７Ｎ）により溶出した。物質を５０％メチル第三ブチルエーテル／ヘキサンから粉砕し、次いでメチル第三ブチルエーテル（５００ｍｌ）から粉砕した。固形物をメチル第三ブチルエーテル（２００ｍＬ）およびヘキサン（２００ｍＬ）により洗浄し、高真空下で固形物を乾燥して、灰白色固形物（４２．０ｇ、９０．４ｍｍｏｌ、６５％）として表題化合物を得た。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２７０（Ｍ＋１）；［α］Ｎａ２５＝−１５３．４０°（ｃ＝５．０、メタノール）。
【００４４】
方法２：
１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（２．５０ｇ、１３．０ｍｍｏｌ）を、（２Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−［５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−７−イル］プロパンアミド（３．４ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（４０ｍＬ）、３−ヒドロキシトリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン（１．８ｇ、１３．０ｍｍｏｌ）、４，４，４−トリフルオロブタン酸（１．９ｇ、１３．０ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（１．８ｍＬ、１３．０ｍｍｏｌ）の０℃混合物へ添加した。撹拌したままにして、周囲温度まで一晩暖めた。水（４０ｍＬ）を添加し、ジクロロメタン（１００ｍＬ）と水（５０ｍＬ）との間で分配した。層を分離し、ジクロロメタンにより水層から再度抽出し、合わせた有機層を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２×１００ｍＬ）により洗浄した。ジクロロメタン（２５ｍＬ）により重炭酸塩層から再度抽出し、合わせた有機層を硫酸ナトリウムの上で乾燥し、濃縮する。フラッシュクロマトグラフィーによって残渣を精製し、メタノール（２Ｎアンモニア）：ジクロロメタン（０：１００〜５：９５）により溶出して、３．７７ｇのジアステレオマーの混合物を得た。物質をＣｈｉｒａｌｐａｋ（登録商標）ＡＤカラム上で物質を精製し、エタノール（０．２％ジメチルアミン（ｄｉｍｅｔｈｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ））：アセトニトリル（０：１００〜１００：０）により溶出して、白色固形物として表題化合物（１．７ｇ、３．７ｍｍｏｌ、３７％）を得た。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４６５（Ｍ＋１）．
【００４５】
調製１３
メチル２−（２−ブロモフェニル）アセテート
【化１５】
0006027110.tif 000016
窒素雰囲気下でメタノール（５．０Ｌ）と２−ブロモフェニル酢酸（５００．０ｇ、２．３３ｍｏｌ）を合わせた。２０〜３５℃で濃縮硫酸（１８５．８ｍＬ）を１滴ずつ添加し、次いで６０〜６５℃まで３〜４時間撹拌しながら暖めた。反応混合物を４５℃まで冷却し、４５℃より下の減圧下でおよそ７５０ｍＬの体積まで濃縮した。反応混合物を１０〜３０℃まで冷却し、ジクロロメタン（２．５Ｌ）を添加した。水酸化ナトリウム（７％、３８０．０ｍＬ）によりｐＨを７〜８に調整して、層を分離した。４５℃より下の減圧下で有機相を濃縮乾固し、黄色油として表題化合物（５１６．５ｇ、９７．０％）を得た。
【００４６】
調製１４
５，７−ジヒドロピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−６−オン
【化１６】
0006027110.tif 000017
メチル２−（２−ブロモフェニル）アセテート（１．０ｋｇ、４．３６ｍｏｌ）、ジオキサン（１１．０Ｌ）およびＮ−メチル−２−ピロリドン（７．０Ｌ）を、室温で撹拌しながら合わせた。ビス（ピナコラト）ジボロン（１．２ｋｇ、４．５８ｍｏｌ）および酢酸カリウム（８５５．９ｇ、８．７２ｍｏｌ）を混合物へ添加し、次いで溶液を通して窒素ガスを２〜３時間通過させることによって溶液を脱気した。［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）ジクロライドジクロロメタン添加物（７１．２ｇ、９７．２ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下でチャージし、次いで反応混合物を８０〜９０℃まで１８〜２０時間加熱して、単離なしに使用される溶液としてメチル２−［２−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル］アセテートを得た。反応混合物を１５〜２５℃まで冷却し、水（３．０Ｌ）中の２−アミノ−３−ブロモピリジン（６７５．０ｇ、３．９０ｍｏｌ）および三塩基性リン酸カリウム（２．４１ｋｇ、１１．３ｍｏｌ）の溶液を添加した。溶液を通して窒素ガスを２〜３時間通過させることによって溶液を脱気し、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）ジクロライドジクロロメタン添加物（１０６．８ｇ、１３０．８ｍｍｏｌ）を添加し、次いで反応混合物を８０〜９０℃まで１８〜４０時間加熱した。反応混合物を５０〜６０℃まで冷却し、飽和重炭酸ナトリウム（１３．０Ｌ）、飽和塩化ナトリウム（１３．０Ｌ）および水（１３．０Ｌ）からなる溶液を徐々に添加した。５０〜６０℃で２〜３時間混合物を撹拌し、１５〜２５℃まで冷却し、追加の１８〜２０時間撹拌した。生じた固形物を濾過し、濾過ケーキを水（２×２．０Ｌ）により洗浄した。固形物を清浄な反応容器へ移し、酢酸エチル（５．０Ｌ）を添加し、混合物を６０〜７０℃まで２〜３時間加熱した。１５〜２５℃まで溶液を冷却し、１〜２時間撹拌し、生じた固形物を濾過した。濾過ケーキを酢酸エチル（２×７５０ｍＬ）により洗浄し、生じた固形物を真空下で乾燥して、灰白色固形物として表題化合物（６４４．０ｇ、６８．１％）を得た。
【００４７】
調製１５
５−［２−（ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル）オキシエチル］−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−６−オン
【化１７】
0006027110.tif 000018
アセトニトリル（３４０．０ｍＬ）中の５，７−ジヒドロピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−６−オン（３３．８ｇ、０．１６ｍｏｌ）を添加し、２０〜３０℃で０．５〜１時間撹拌した。炭酸セシウム（１０４．６ｇ、０．３２ｍｏｌ）および（２−ブロモエトキシ）−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラン（４２．２ｇ、０．１８ｍｏｌ）を添加し、反応混合物を７０〜８０℃まで１８〜２０時間加熱した。反応混合物を２０〜２５℃まで冷却し、珪藻土（５０．６ｇ）を通して濾過した。濾過ケーキをアセトニトリル（２×５０．６ｍＬ）により洗浄し、濾液を減圧下で濃縮して、およそ６７．５ｍＬの全体積に達した。トルエン（１５２ｍＬ）、活性炭（２．５３ｇ）を添加し、混合物を６０〜７０℃まで１〜２時間加熱した。混合物を２５〜３５℃まで冷却し、反応混合物を珪藻土（５０．６ｇ）の上で濾過した。濾過ケーキをトルエン（１７．０ｍＬ）によりリンスし、減圧下で濃縮して、放置すると結晶する薄茶色油（５６．８ｇ、９２．２％）として表題化合物を得た。
【００４８】
調製１６
５−［２−（ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル）オキシエチル］−７−ヒドロキシイミノ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−６−オン
【化１８】
0006027110.tif 000019
５−［２−（ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル）オキシエチル］−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−６−オン３０．０ｇ、０．０８ｍｏｌ）およびトルエン（３００．０ｍＬ）を合わせ、反応混合物を−１０〜０℃まで冷却した。カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１８．２ｇ、０．１６ｍｏｌ）、亜硝酸イソアミル（１３．３４ｇ、０．１１ｍｏｌ）を添加し、次いで３〜５時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（２１０ｍＬ）および水（５１０ｍＬ）の低温の（０〜５℃）二相性溶液へ移し、１５〜３０分間撹拌した。反応混合物を１５〜２５℃まで暖め、層を分離した。水層を追加の酢酸エチル（１２０ｍＬ）およびメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１２０ｍＬ）により抽出し、有機層を合わせた。有機層をおよそ６０〜９０ｍＬの溶液体積まで減圧下で濃縮し、次いでトルエン（２４０ｍＬ）および酢酸エチル（７５ｍＬ）を添加した。溶液をシリカゲル（４５．０ｇ）を介して濾過し、シリカゲルをトルエン（２１０ｍＬ）および酢酸エチル（６０ｍＬ）の混合物によりリンスし、濾液をおよそ７５ｍＬの体積まで減圧下で濃縮した。ヘプタン（１２０ｍＬ）を添加し、混合物をおよそ６０ｍＬの体積まで濃縮し、生じた固形物を濾過した。濾過ケーキをヘプタン（２５ｍＬ）により洗浄し、真空下で乾燥して、黄色固形物として表題化合物（２８．３ｇ、７２．５％）を得た。
【００４９】
調製１７
７−アミノ−５−［２−（ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル）オキシエチル］−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−６−オン
【化１９】
0006027110.tif 000020
５−［２−（ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル）オキシエチル］−７−ヒドロキシイミノ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−６−オン（２０６．０ｇ、０．５２ｍｏｌ）およびテトラヒドロフラン（２．３Ｌ）をオートクレーブの中で窒素雰囲気下で合わせた。Ｒａｎｅｙニッケル（２３２．０ｇ、１．１３重量／重量当量）を反応混合物へ添加し、水素雰囲気（８７ｐｓｉ）を導入した。反応混合物を６０〜６５℃で２４時間撹拌した。混合物を珪藻土の上で濾過し、濾過助剤をテトラヒドロフラン（５００ｍＬ）により洗浄した。濾液を濃縮して、茶色油として表題化合物（１９６．０ｇ、９３．２％）を得た。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３８４（Ｍ＋１）．
【００５０】
調製１８
ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［（１Ｓ）−２−［［５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソ−エチル］カルバメート
【化２０】
0006027110.tif 000021
７−アミノ−５−［２−（ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル）オキシエチル］−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−６−オン（１６６．０ｇ、０．４３ｍｏｌ）、ジクロロメタン（２．２Ｌ）およびＬ−Ｂｏｃ−アラニン（１０６．４ｇ、０．５６ｍｏｌ）を窒素雰囲気下で合わせた。ヒドロキシベンゾトリアゾール（１．４６ｇ、１０．８ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１０２．５ｍＬ、０．７４ｍｏｌ）を、３０℃未満の内部温度を維持して添加した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１２８．２ｇ、０．６７ｍｏｌ）を小分けで添加し、２０〜３０℃で１６〜１８時間撹拌した。シリカゲルクロマトグラフィー（３００ｇシリカゲル）によって反応混合物を精製し、ジクロロメタン（４９８ｍＬ×２）により溶出した。ジクロロメタン溶液を合わせ、水（２×３．３Ｌ）により洗浄した。有機相を３００ｍＬ〜４００ｍＬの体積まで減圧下で濃縮し、酢酸エチル（６６４．０ｍＬ）を添加した。混合物を３００〜４００ｍＬの体積まで減圧下で濃縮し、酢酸エチル（６６４ｍＬ）を添加した。混合物を３００〜４００ｍＬの体積まで減圧下で濃縮し、酢酸エチル（１．３ｍＬ）を添加した。テトラ−ｎ−ブチルフッ化アンモニウム三水和物（１４９．４ｇ、０．４７ｍｏｌ）を添加し、２０〜３０℃で１６〜１８時間撹拌した。塩化ナトリウムの水溶液（２０％、１．６Ｌ）を添加し、層を分離し、有機相を塩化ナトリウム水溶液（２０％、１．６Ｌ）により再び洗浄した。有機層をおよそ８００〜９００ｍＬの体積まで濃縮し、混合物を２０〜３０℃で１２〜１６時間撹拌した。生じた固形物を濾過し、濾過ケーキを酢酸エチル（９１．３ｍＬ）により洗浄した。シリカゲルクロマトグラフィー（３００ｇシリカゲル）によって濾液を精製し、酢酸エチル（２×５００ｍＬ）により溶出して、黄色油として表題化合物（８２．６ｇ、８５．２％ｄｅ、１００％ｅｅ、５１．２％収率）を得た。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４１（Ｍ＋１）．
【００５１】
調製１９
（２Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−［（７Ｓ）−５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−７−イル］プロパンアミド
【化２１】
0006027110.tif 000022
ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［（１Ｓ）−２−［［５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソ−エチル］カルバメート（５４．０ｇ、０．１２ｍｏｌ）およびアセトニトリル（２１２．７ｍＬ）を窒素雰囲気下で合わせた。塩酸（３１７．５ｍＬ、４Ｎ、１．２７ｍｏｌ）を１滴ずつ添加して３０℃未満の内部温度を維持し、反応混合物を２０〜３０℃で１６〜１８時間撹拌した。水（３２４．０ｍＬ）およびジクロロメタン（４３０ｍＬ）を添加し、層を分離した。有機層を廃棄し、ジクロロメタン（６４５ｍＬ）を水相へ添加し、水酸化ナトリウム水溶液（２０％、２５２ｍＬ）を使用してｐＨをおよそ１０へ調整した。層を分離し、水層を追加のジクロロメタン（２×４３０ｍＬ）により抽出し、有機相を合わせた。有機層をおよそ１３０〜１５０ｍＬの体積まで４５℃より下の減圧下で濃縮し、テトラヒドロフラン（３２２ｍＬ）を添加した。溶液をおよそ２００〜２２０ｍＬの体積まで４５℃より下の減圧下で濃縮し、追加のテトラヒドロフラン（２１３ｍＬ）を添加した。反応混合物をおよそ２５０〜２７０ｍＬの体積まで減圧下で濃縮し、６０〜６５℃まで２〜３時間加熱した。反応混合物を５〜１５℃まで徐々に冷却し、５〜８時間撹拌した。生じた固形物を濾過し、濾過ケーキを酢酸エチル（５６ｍＬ）により洗浄した。固形物を清浄な反応容器へ移し、酢酸エチル（１５０ｍＬ）を添加し、混合物を６０〜６５℃まで２〜３時間加熱し、次いで５〜１５℃まで溶液を徐々に冷却した。この温度で２〜３時間撹拌し、生じた固形物を濾過によって回収した。濾過ケーキを酢酸エチル（４５ｍＬ）により洗浄し、固形物を６５℃より下の減圧下でオーブン中で乾燥して、灰白色固形物として表題化合物（２１．０ｇ、９９．２％ｄｅ、１００％ｅｅ、５１．０％収率）を得た。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３４１（Ｍ＋１）．
【００５２】
実施例２
４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−２−［［（７Ｓ）−５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソ−エチル］ブタンアミド水和物
【化２２】
0006027110.tif 000023
（２Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−［（７Ｓ）−５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−７−イル］プロパンアミド（４５．０ｇ、１３２．２ｍｍｏｌ）およびジメチルホルムアミド（４５２．９ｍＬ）を窒素雰囲気下で合わせた。０〜５℃まで冷却し、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン（７７．４ｍＬ、４４４．０ｍｍｏｌ）、４，４，４−トリフルオロ酪酸（１９．９ｇ、１３９．３ｍｍｏｌ）およびヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（２２．３ｇ、１５３．１ｍｍｏｌ）を添加した。５〜１０分間溶液を撹拌し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（３０．６ｇ、１５９．６ｍｍｏｌ）を１つの小分けで添加した。２０〜２５℃まで反応混合物を暖め、１〜２時間撹拌した。酢酸エチル（１．４Ｌ）および水（１．８Ｌ）を添加し、０．５〜１時間撹拌した。相を分離し、有機層を重炭酸ナトリウム水溶液（５％、１．０Ｌ）により洗浄し、溶液を減圧下で濃縮して、２００〜３００ｍＬの体積を得た。エタノール（５２２ｍＬ）を添加し、溶液を減圧下で濃縮して、２００〜３００ｍＬの体積を得た。３回反復した。エタノール（１８０ｍＬ）および炭酸カリウムの５％溶液（３４．６ｍＬ）を添加し、２０〜２５℃で０．５〜１時間撹拌した。水（６６７ｍＬ）および４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−２−［［（７Ｓ）−５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソ−エチル］ブタンアミド水和物（０．４ｇ、０．８６ｍｍｏｌ）のシード結晶（シード結晶は、以前の生成物のロットから得られた固形物から生成することができるか、または一般的に既知であり当業者によって使用される他の方法（小さなアリコートの再結晶等）を使用して得ることができる）を添加し、２０〜２５℃で２〜３時間撹拌した。濾過し、濾過ケーキをエタノール（６３ｍＬ）および水（４２ｍＬ）の混合物により２回洗浄した。生じた固形物を４０℃より下の減圧下でオーブン中で乾燥して、白色〜灰白色の固形物として表題化合物（４１．９ｇ、９９．６％ｄｅ、１００％ｅｅ、６５．３％収率）を提供した。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４６５（Ｍ−Ｈ２Ｏ＋１）．
【００５３】
実施例２のＸＲＰＤ
結晶性固体のＸＲＰＤパターンは、３５ｋＶおよび５０ｍＡで操作するＣｕＫα源（λ＝１．５４０６０Å）およびＶａｎｔｅｃ検知器を装備したＢｒｕｋｅｒ  Ｄ４  ＥｎｄｅａｖｏｒＸ線粉末回折計で得られる。サンプルは、２θにおいて０．００８７°のステップサイズおよび０．５秒／ステップのスキャン速度により、ならびに０．６ｍｍの発散スリット、５．２８ｍｍの固定した散乱防止スリット、および９．５ｍｍの検出スリットにより、２θにおいて４〜４０°の間でスキャンされる。乾燥粉末は石英サンプルホルダー上に充填され、平滑表面はスライドグラスを使用して得られる。任意の与えられた結晶形については、結晶形および晶癖等の要因から生じる好ましい配向に起因して、回析ピークの相対的強度が変動し得ることは結晶学の技術分野において周知である。好ましい配向の効果が存在する場合、ピーク強度は変化するが、多形体の特徴的なピーク位置は不変である（例えば、以下のものを参照されたい：米国薬局方３３−国民医薬品集２８章＜９４１＞Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  Ｓｏｌｉｄｓ  ｂｙ  Ｘ−ｒａｙ  Ｐｏｗｄｅｒ  Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ（ＸＲＰＤ）、公定書２０１０年１０月１日〜２０１１年２月１日）。さらに、任意の与えられた結晶形については、ピーク位置の角度がわずかに変動し得ることも結晶学の技術分野において周知である。例えば、ピーク位置は、サンプルが解析される温度または湿度における変動、サンプル変位、または内部スタンダードの存在もしくは非存在に起因してシフトし得る。本事例において、２θにおける±０．２のピーク位置変動は、示された結晶形の明確な同定を妨害せずに、これらの可能性のある変動を考慮へ入れるだろう。結晶形の確認は、際立ったピーク（°２θの単位で）、典型的にはより顕著なピークの任意のユニークな組み合わせに基づいて行なわれ得る。結晶形回折像は周囲温度（１９〜２５℃）および相対湿度（２０〜６０％）で採取される。
【００５４】
したがって、実施例２の化合物の調製されたサンプルは、表１中で以下に記載されるような回析ピーク（２θ値）を有しているとして、ＣｕＫα放射線を用いたＸＲＰＤパターンによって特徴づけられる。形態は結晶性であり、０．２度の回折角についての公差により、１１．９６、１８．８１、２０．７８および２１．０７度２θからなる群から選択された１つまたは複数のピークと組み合わせて２２．９７度でピークを含有する。
【表１−１】
0006027110.tif 000024
【表１−２】
0006027110.tif 000025
【００５５】
実施例２の固体ＮＭＲ
１３Ｃ交差分極／マジック角回転（ＣＰ／ＭＡＳ）ＮＭＲ（固体ＮＭＲまたはＳＳＮＭＲ）スペクトルは、１００．６２２ＭＨｚの炭素周波数で操作され、Ｂｒｕｋｅｒ  ４ｍｍの三重共鳴プローブ（Ｋ２９９５５１）を装備したＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩ  ４００ＭＨｚ  ＮＭＲスペクトロメーター（ＬｉｌｌｙタグＫ２９９５４７）を使用して得られる。ＴＯＳＳ側波帯抑圧は、ＳＰＩＮＡＬ６４デカップリング（７０．８ワット）およびＲＡＭＰ１００形状Ｈ核ＣＰパルスを用いる交差分極と共に使用される。捕捉パラメータは以下のとおりである。２．５μｓの９０°プロトンｒ．ｆ．パルス幅、接触時間は３．５ｍｓであり、５ｓのパルス繰り返し時間、１０ｋＨｚのＭＡＳの周波数、３０ｋＨｚのスペクトル幅、捕捉時間は３４ｍｓであり、スキャン数は１０，５８７であった。化学シフトは別の実験においてアダマンタン（δ＝２９．５ｐｐｍ）を参照する。１３Ｃ  ＮＭＲ（固体）：δ（ｐｐｍ）１８．６５，２７．５２，２８．７６，４７．６６，４９．９６，５５．０２，５８．８８，１２２．８７，１２６．４９，１２９．７３，１３１．３７，１３２．３１，１３７．２８，１４５．０１，１４９．１７，１６８．５３，１７０．３０，１７５．５５．
【００５６】
実施例２のＫａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ滴定
Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ滴定はＢｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｍｅｔｈｒｏｈｍ  ７５６  ＫＦ電量計を使用して得られる。対照スタンダードは二重で水スタンダードとしてＨｙｄｒａｎｏｌ（登録商標）を使用して決定される。三重でサンプルを実行して、サンプル中の水の量を決定するために水の平均パーセンテージを記録する。実施例２のＫａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒの滴定の平均の結果は３．９％水である。実施例２における水の１モル当量の理論的なパーセンテージは３．７％である。
【００５７】
癌は、細胞および組織の微小環境における、ＤＮＡ修復、ゲノム安定性、細胞増殖、細胞死、接着、血管新生、浸潤および転移を調節する、１つまたは複数の遺伝子の異常機能によって、その開始および進行が誘導される疾患の不均一なコレクションとしてますます認識されている。「癌」遺伝子のバリアントまたは異常機能は、天然に存在するＤＮＡ多型、ゲノムコピー数の変化（増幅、欠失、染色体消失または重複を介して）、遺伝子および染色体の構造の変化（脱調節された遺伝子発現を引き起こす染色体転座、逆位または他の再配置を介して）、ならびに点突発変異に由来し得る。癌性新生物は１つの異常な遺伝子機能によって誘導され、同じ異常な遺伝子機能によって維持されるか、または追加の異常な遺伝子機能によって維持および悪化した進行が起こり得る。
【００５８】
上で言及された遺伝的染色体異常以外に、各々の癌は、ＤＮＡメチル化、ゲノムインプリンティング、およびアセチル化、メチル化またはリン酸化によるヒストン修飾を含むゲノムの後成的修飾も含み得る。後成的修飾は悪性腫瘍の誘導および／または維持において役割を果たすことができる。
【００５９】
ヒト癌における細胞遺伝学の異常の大規模なカタログはオンラインで編集され、維持され、定期的に更新される（米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）癌ゲノム解剖プロジェクト（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｔｏｍｙ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）（ＣＧＡＰ）ウェブサイトでの癌における染色体異常のＭｉｔｅｌｍａｎデータベース（Ｍｉｔｅｌｍａｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ）：ｈｔｔｐ：／／ｃｇａｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい）。データベースは本発明の少なくともいくつかの悪性腫瘍についての染色体異常を含む。Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの癌ゲノムプロジェクト（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）は、腫瘍形成の原因として結びつけられるすべてのヒト遺伝子の詳細なオンライン「腫瘍遺伝子センサス（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｃｅｎｓｕｓ）」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＣＧＰ／Ｃｅｎｓｕｓを参照されたい）に加えて、ヒト癌における体細胞変異のＣＯＳＭＩＣ（癌における体細胞変異のカタログ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ））データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＣＧＰ／ｃｏｓｍｉｃを参照されたい）を維持している。様々な癌の原因として結びつけられる細胞遺伝学的変化に対する豊富な情報を含有するさらなるソースは、腫瘍学および血液学における遺伝学および細胞遺伝学のアトラス（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ）（ｈｔｔｐ：／／ａｔｌａｓｇｅｎｅｔｉｃｓｏｎｃｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／／Ａｎｏｍａｌｉｅｓ／Ａｎｏｍｌｉｓｔｅ．ｈｔｍｌ＃ＭＤＳ）である。これらのデータベースは、本発明の少なくともいくつかの悪性腫瘍についての染色体異常も含む。
【００６０】
生検による癌性悪性腫瘍の診断、免疫表現型分析および他の試験は公知でありルーチンに使用される。高解像度染色体分染法および高度な染色体イメージング技術に加えて、癌の疑いのある症例における染色体異常は、細胞遺伝学的解析（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、核型分析、スペクトル核型分析（ＳＫＹ）、マルチプレックスＦＩＳＨ（Ｍ−ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、一塩基変異多型アレイ（ＳＮＰチップ）および他の診断等）および当業者に公知であり使用される分析試験を介して決定することができる。
【００６１】
ノッチの発癌役割は、ノッチ１細胞内ドメインがＴ細胞レセプターのβプロモーター領域へ転座し、ノッチ１細胞内ドメインの過剰発現をもたらすことを含むヒトＴ細胞白血病において最初に報告された（Ｇｒａｂｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃａｎｃｅｒ，２００６（６）：３４７−３５９；Ｗｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４（３０６）：２６９−２７１）。マウスの造血系前駆細胞におけるノッチ１細胞内ドメインの過剰発現により、ヒトに類似するＴ細胞急性リンパ性白血病がマウスにおいて示された。Ｔ細胞急性リンパ性白血病に加えて、ノッチシグナルは、受容体増幅ならびにリガンドおよび／または受容体の過剰発現を含む複数の機構を介して、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病および赤白血病を含む他の癌において発癌性を持つという証拠が増加している。リガンドおよび／または受容体の突然変異または過剰発現に起因する異常な構成的ノッチシグナリングは、乳癌、卵巣癌（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６（６６）：６３１２−６３１８）、メラノーマ（Ｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ＆  Ｃａｎｃｅｒ，２０１０（４９）：７３３−７４５）、肺癌、非小細胞肺癌（Ｗｅｓｔｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ，２００９（１０６）：２２２９３−２２２９８）、膵臓癌、神経膠芽腫、結腸直腸癌、頭頸部癌、子宮頸癌、前立腺癌、肝臓癌、扁平上皮癌（口腔）、皮膚癌および髄芽細胞腫（Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃａｎｃｅｒ，２０１１（１１）：３３８−３５１および補遺Ｓ１（表））を含む多数の悪性固形腫瘍にも関与する。ノッチシグナリングの阻害は、疾患が構成的ノッチシグナリング経路の異常な活性化によって誘導された癌患者に対して治療法上の利益を提供する魅力的な標的である。Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００７（６７）１８７９−１８８２．
【００６２】
以下のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの研究は、様々な特異的な癌細胞株に対する化合物１のノッチ経路シグナリング阻害の活性および有効性を実証する。一般的にこれらのアッセイはヒト臨床における化学療法活性を表すものとして当業者によって認められている。γ−セクレターゼによるノッチ細胞内ドメイン切断の阻害は各々のノッチ１、ノッチ２、ノッチ３およびノッチ４受容体に対して効果的であると考えられる。ノッチ経路シグナリング阻害の活性および有効性を証明するアッセイは実質的に以下のように、または類似のデータを提供する類似のアッセイによって実行することができる。
【００６３】
ノッチ１のＮ１ＩＣＤ核内蓄積の細胞イメージングアッセイ
ＨＥＫ２９３ΔＥ１２細胞（ＨＥＫ２９３細胞は、２３アミノ酸シグナルペプチド配列のＭＰＲＬＬＴＰＬＬＣＬＴＬＬＰＡＬＡＡＲＧＬＲ（配列番号：１）をそのＮ末端で持ち、アミノ酸１７０３〜２１８３（ＮＰ＿０３２７４０．３）をコードするマウスノッチ１  ｃＤＮＡを安定的に発現するように操作された）を、９６ウェルプレート中に５０００細胞／ウェルでプレーティングし、５％ウシ胎仔血清を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地−高グルコース中で、５％ＣＯ２で３７℃で２４時間インキュベーションする。細胞は、試験化合物（１０００ｎＭ〜０．０５ｎＭの範囲にわたる１０点の１：３希釈で、０．２％の最終ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）濃度による用量）により処理される。２４時間の処理後に、細胞プレートを以下のステップを介して連続して加工する。細胞を１００μｌ／ウェルのＰＲＥＦＥＲ（商標）固定剤により室温（ＲＴ）で３０分間固定し；細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１００μｌ／ウェルの０．１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１００によりＲＴで２０分間透過性にし；各々１００μｌ／ウェルのＰＢＳにより３回洗浄し；１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ中で１：２０００で５０μｌ／ウェルのウサギ抗Ｎ１ＩＣＤ（ノッチ１細胞内ドメイン）抗体を添加し、３７℃で１．５時間インキュベーションし；各々１００μｌ／ウェルのＰＢＳにより３回洗浄し；１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ中で１：１０００希釈で５０μｌ／ウェルのヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  ４８８によりインキュベーションし、３７℃で１時間インキュベーションし；各々１００μｌ／ウェルのＰＢＳにより３回洗浄し、１００μｌ／ウェルの５０μｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅを含有する１５μＭヨウ化プロピディウムを染色核へ３０分間添加する。ＡＣＵＭＥＮ  ＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）レーザースキャニング蛍光マイクロプレートサイトメーター（ＴＴＰ  ＬＡＢＴＥＣＨ  ＬＴＤ）によりプレートをスキャンして、全細胞核カウント／ウェル、および６５５ｎｍ〜７０５ｎｍ（ＤＮＡに結合されたヨウ化プロピディウムの放射）での蛍光による全核面積／ウェル、および５０５ｎｍ〜５３０ｎｍでの核領域中のＮ１ＩＣＤへの抗体結合の蛍光を測定する。アッセイの主なアウトプットは、全核面積に対する核Ｎ１ＩＣＤの全蛍光の比率（正規化された核Ｎ１ＩＣＤシグナル）である。相対的細胞毒性プロファイリングは０．２％ＤＭＳＯ対照細胞に対する％細胞の数として採取された。切断されたノッチ１またはＮ１ＩＣＤを認識する抗体は、Ｖａｌ１７４４でのヒトノッチ１のアミノ末端切断部位へ対応するヒトペプチドに対して作製される。無処理対照細胞において、ノッチ１から生成されたＮ１ＩＣＤは、核内に移動し蓄積するだろう。細胞がノッチ１切断阻害化合物によって処理される場合、核Ｎ１ＩＣＤのシグナルは減少するだろう。濃度反応およびＩＣ５０は核Ｎ１ＩＣＤシグナルについての４パラメータロジスティックへの曲線フィッティングによって決定され、一方で％細胞数は細胞毒性プロファイリングについての同じグラフ中にプロットされる。アッセイを本質的に上記のように実行した結果、化合物１についての平均のＩＣ５０は０．４１ｎ��（ｎ＝７）である。化合物は１０００ｎＭ濃度まで細胞数に影響を与えない。
【００６４】
これらのデータは、化合物１がノッチ１への親和性を有しており、ノッチ１細胞内ドメイン細胞シグナリングペプチドの細胞内蓄積を阻害することを証明する。
【００６５】
ヒト腫瘍細胞株におけるＮ１ＩＣＤ切断の阻害
Ｎ１ＩＣＤ切断を阻害する能力における化合物１の有効性を評価するために、複数のヒト腫瘍細胞株を利用する。Ａ２７８０はヒト卵巣細胞株（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、番号９３１１２５１９）であり；ＭＩＡ  ＰａＣａ−２はヒト膵臓細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４２０）であり；ＢｘＰＣ−３はヒト膵臓細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６８７）であり；ＳＷ４８０はヒト結腸直腸細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２２８）であり；ＨＣＴ  １１６はヒト結腸直腸細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２４７）であり；ＤＬＤ−１はヒト結腸直腸細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２２１）であり；ＭＤＡ−ＭＢ−２３１はヒト乳腺細胞株（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−２６）であり；Ｕ−８７  ＭＧはヒト神経膠芽腫細胞株（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１４）であり；Ａ３７５はヒト悪性メラノーマ細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６１９）であり；ＣＣＲＦ−ＣＥＭはヒト急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１１９）であり；ＳＵＰ−Ｔ１はヒトＴ細胞リンパ芽球性白血病細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１９４２）であり；Ｋ−５６２はＢｃｒ遺伝子およびＡｂｌ１の遺伝子からなる融合転写物の存在によって特徴づけられるヒト慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２４３）であり；Ｊｕｒｋａｔ（クローンＥ６−１）はヒト急性Ｔ細胞白血病細胞株（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−１５２）であり；ＭＯＬＴ−３はヒト急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５５２）であり；ＭＯＬＴ−４はヒト急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５８２）であり；ＨＥＬ  ９２．１．７はヒト赤白血病細胞株（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−１８０）である。各々の細胞株は、明示されたカタログ番号でのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得られるＡ２７８０細胞株以外は、明示されたＡＴＣＣ番号でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得られる。細胞は、湿潤雰囲気において５％ＣＯ２中の３７℃でそれぞれの培養培地中で増殖される。Ａ２７８０ヒト卵巣癌についての細胞培養培地は、２．０５ｍＭ  Ｌ−グルタミン含有ＲＰＭＩ−１６４０（フェノールレッド不含有）に２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．０１ｍｇ／ｍｌインスリンおよび１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したものであり；ＨＣＴ  １１６ヒト結腸直腸癌については、１．５ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．０７５％重炭酸ナトリウムおよび１０％ＦＢＳを含有するＭｃＣｏｙ５Ａであり；ＳＷ４８０ヒト結腸直腸癌については、２．０５ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０であり；Ｕ−８７  ＭＧヒト神経膠芽腫については、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１０％ＦＢＳを含有する最小必須培地／Ｅａｒｌ平衡塩類溶液であり；ＭＩＡ  ＰａＣａ−２ヒト膵臓癌については、高グルコース（４５００ｍｇ／ｍｌ）、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２．５％ウマ血清および１０％ＦＢＳを含有するピルビン酸ナトリウム不含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）であり；Ｋ−５６２ヒトＣＭＬについては、��グルコース（４５００ｍｇ／ｍｌ）、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ  ＮＥＡＡ、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭであり；Ｊｕｒｋａｔ（クローンＥ６−１）ヒト急性Ｔ細胞白血病については、２．０５ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２．５ｇ／Ｌグルコース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．０７５％重炭酸ナトリウムおよび１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０であり；Ａ−３７５ヒト悪性メラノーマおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳腺腺癌については、高グルコース（４５００ｍｇ／ｍｌ）、４ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭであり；ＢｘＰＣ−３ヒト膵臓腺癌、ＤＬＤ−１ヒト結腸直腸腺癌、ＳＵＰ−Ｔ１ヒトリンパ芽球性白血病、ＭＯＬＴ−３ヒトＡＬＬ、Ｍｏｌｔ−４ヒトＡＬＬ、ＣＣＲＦ−ＣＥＭヒトＡＬＬ、およびＨＥＬ  ９２．１．７ヒト赤白血病については、２．０５ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２．５ｇ／Ｌグルコース、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０である。８０〜９０％コンフルエントの時に、細胞を、化合物（５０ｎＭ〜０．００２５ｎＭの範囲にわたる１０点の１：３希釈で、０．０１％の最終ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）濃度による用量）により処理する。２４時間の処理後に、細胞プレートを本質的に以下のステップを介して連続して加工する。細胞をトリプシン処理後に回収し、氷冷ＰＢＳにより１回洗浄し、１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ錠剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）番号１１  ６９７  ４９８  ００１）および１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ８３４０）を含有する、１００μｌの氷冷ＸＹ溶解バッファー（２５ｍＭトリスｐＨ７．５、１０μｇ／ｍｌトリプシン／キモトリプシン阻害剤、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、６０ｍＭ  β−グリセリンリン酸、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、１０ｍＭ  ＮａＦ、２．５ｍＭピロリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ｐＨ８．０、５ｍＭエチレングリコール−ビス（２−アミノエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）ｐＨ８．０、１ｍＭバナジウム酸ナトリウム、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭジチオスレイトール、１μＭミクロシスチンＬＲ、１０μｇ／ｍｌ  Ｎ−ｐ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）、２ｍＭ  Ｎα−ｐ−トシル−エルアルギニンメチルエステル塩酸塩（ＴＡＭＥ）、１５ｍＭ  ４−ニトロフェニルホスフェートジ（トリス）塩（ＰＮＰＰ）、０．１ｍＭ  ４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフッ化物塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）、５ｍＭベンズアミジン、１μＭオカダ酸）中で溶解する。溶解物を５分ごとの短いボルテックスでの撹拌により１５分間氷上でインキュベーションし、１分間氷上で超音波で処理する。サンプルをｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機中で３００００ｒｐｍで４℃で３０分間遠心し、８０μｌの上清を分析のために回収する。全タンパク質濃度は、Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ（商標）プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ���ＣＡ）を使用するＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質分析キット（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して決定される。Ｎ１ＩＣＤレベルはカスタムＮ１ＩＣＤ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して決定される。切断されたノッチ１（Ｖａｌ１７４４）特異的カスタムウサギモノクローナル抗体により検体を捕捉し、Ｃ末端ノッチ１  ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（登録商標）（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）ポリクローナルヒツジ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）により検出する。溶解物を、１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ錠剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）ミニ番号１１  ８３６  １５３  ００１）および１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ８３４０）を含有する氷冷ＥＬＩＳＡトリス溶解バッファーＲ６０ＴＸ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）中で１μｇ／μｌへ希釈し、２５μｌをＥＬＩＳＡプレートへ添加する。２５μｇのタンパク質溶解物のインキュベーションを、検体の捕捉および検出抗体のために、各々ＲＴで１時間行なう。Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（商標）（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）上でプレートを読み取る。バックグラウンドを引いたＮ１ＩＣＤを全タンパク質に対して正規化し、ベヒクル処理群と比較して％阻害として示す。ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）４ソフトウェアを使用して、「４パラメータシグモイド用量反応（可変勾配）」モデルに対して濃度応答データをフィッティングさせることによって決定される。様々な腫瘍細胞株における化合物１についてのＩＣ５０値を表１中に示す。
【表２】
0006027110.tif 000026
【００６６】
表１中のデータは、特異的なヒト腫瘍細胞株におけるγ−セクレターゼ活性および結果としてのＮ１ＩＣＤシグナリングペプチド蓄積を阻害することによって、Ｎ１ＩＣＤシグナリングペプチド生成を阻害する能力における化合物１の有効性を証明する。
【００６７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性および標的阻害の研究
動物研究
ノッチプロセッシング薬力学（ＰＤ）の阻害に対する化合物１のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性および効果を評価するために、複数の細胞株および患者由来の異種移植モデルを使用する。１：１マトリゲル混合物（０．２ｍＬ体積）中のＡ２７８０（２×１０６）、ＳＷ４８０（６×１０６）、ＨＣＴ  １１６（６×１０６）、Ｕ−８７  ＭＧ（６×１０６）およびＡ−３７５（１０×１０６）細胞を、皮下注射によって６〜８週齢のメスの無胸腺ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の後脚中に移植する。１：１マトリゲル混合物（０．２ｍＬ体積）中のＫ−５６２（６×１０６）細胞を皮下注射によって６〜８週齢のメスのＣＤ１  ｎμ／ｎμマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の後脚中に移植する。１：１マトリゲル混合物（０．２ｍＬ体積）中のＨＥＬ  ９２．１．７（７×１０６）細胞を皮下注射によって６〜８週齢のメスのＣＢ１７重度複合免疫不全マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ）の後脚中に移植する。患者由来の腫瘍を１〜２ｍｍ片へとミンスし、体積０．２ｍｌでマトリゲル（１：１）と混合し、皮下注射によって６〜８の週齢のメスの無胸腺ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の後脚中に移植する。患者由来の腫瘍モデルは以下のものを含む。患者の同意および病院の承認後に、ＩＵ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｉｓｔ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ、米国４６２０６）から得られたサンプルによる、ヒト神経膠芽腫（ＥＬ２１４４）、ヒトトリプルネガティブ浸潤性乳管癌（ＥＬ１９９７）およびヒト結腸癌（ＥＬ１９８９、ＥＬ  １９８６およびＥＬ  ２０５６）。合計７〜１０匹のマウスを各群について使用する。Ａ２７８０、ＳＷ４８０、ＨＥＬ  ９２．１．７、Ａ−３７５、Ｋ−５６２、患者由来の腫瘍モデルの移植直前に動物に照射する（４５０全身照射）。マウスは通常の餌を自由摂食させる。腫瘍サイズが１５０±５０ｍｍ３に達した時に、０．２ｍＬ体積で化合物またはベヒクル（０．２５％ツイーン８０中の１％Ｎａ−ＣＭＣ）の経口投与（強制投与）により、処理を開始する。処理後の表記された時間点で、動物をＣＯ２窒息および頸椎脱臼によって屠殺する。腫瘍を取り出し、ＰＤ応答解析のために使用する。腫瘍増殖および体重を有効性および毒性徴候を評価する時間にわたってモニタリングする。腫瘍の二次元の測定を週に２回実行し、腫瘍体積を以下の式に基づいて計算する。（腫瘍体積）＝［（Ｌ）×（Ｗ２）×（Π／６）］、式中、Ｌは中央軸の長さであり、Ｗは中央軸の幅である。腫瘍体積データは、時間および処理群にわたる変化を等しくするように、ｌｏｇスケールに転換される。ｌｏｇ体積データは、ＳＡＳ（商標）ソフトウェア（バージョン８．２）中のＭＩＸＥＤ（商標）手順を使用する、時間および処理による二元配置反復測定分散分析により解析される。反復測定についての相関モデルは空間的な検出力である。処理群を各時間点で対照群に比較する。ＭＩＸＥＤ（商標）手順を各処理群についても個別に使用して、各時間点での調整された平均および標準誤差を計算する。両方の分析は各動物内の自己相関を説明し、大きな腫瘍を持つ動物が研究から早期に除���される場合データの損失が起こる。調整された平均および標準誤差を、各処理群ｖｓ時間についてプロットする。抗腫瘍活性を腫瘍増殖阻害パーセンテージ（ＴＧＩ％）として表現し、処理群中の腫瘍体積をベヒクル処理群と比較することによって計算する。化合物１のパーセンテージ腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）および統計的有意性値（ｐ値）を本質的に上記のように測定し、表２中に要約する。
【００６８】
Ｎ１ＩＣＤ分析
腫瘍中のＮ１ＩＣＤレベルを評価するために、およそ７５ｍｇを凍結した腫瘍からカットし、ホモジナイゼーション前にミンスする（実際の質量を記録する）。凍結した腫瘍サンプルをＬｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ−Ｄ（商標）チューブへ移し、１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ錠剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）番号１１６９７  ４９８  ００１）および１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ８３４０）を含有する、氷冷ＸＹ溶解バッファー（２５ｍＭトリスｐＨ７．５、１０μｇ／ｍｌトリプシン／キモトリプシン阻害剤、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、６０ｍＭ  β−グリセリンリン酸、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、１０ｍＭ  ＮａＦ、２．５ｍＭピロリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ｐＨ８．０、５ｍＭエチレングリコール−ビス（２−アミノエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）ｐＨ８．０、１ｍＭバナジウム酸ナトリウム、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭジチオスレイトール、１μＭミクロシスチンＬＲ、１０μｇ／ｍｌ  Ｎ−ｐ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）、２ｍＭ  Ｎα−ｐ−トシル−エルアルギニンメチルエステル塩酸塩（ＴＡＭＥ）、１５ｍＭ  ４−ニトロフェニルホスフェートジ（トリス）塩（ＰＮＰＰ）、０．１ｍＭ  ４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフッ化物塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）、５ｍＭベンズアミジン、１μＭオカダ酸）中で、７５ｍｇ／ｍｌのバッファーの質量：体積の比率で再懸濁する。組織を４℃で３０秒間６．０のスピードでＦａｓｔ  Ｐｒｅｐ  ＦＰ１２０ホモジナイザー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）中でホモジナイズし、続いて氷上で１５分間インキュベーションする。ホモジナイゼーションが完全になるまで、これを合計２〜３サイクルで反復する。溶解物を３００００ｒｐｍで４℃で１５分間ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機中で遠心して、残屑を除去する。４００μｌの上清を取り出し、新しいエッペンドルフチューブへ移し、凍結／解凍サイクルを行なう。サンプルを３００００ｒｐｍで４℃で３０分間ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機中で再び遠心し、１２０μｌの上清を分析のために回収する。全タンパク質濃度は、Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ（商標）プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用するＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質分析キット（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して決定される。Ｎ１ＩＣＤレベルはカスタムＮ１ＩＣＤ  ＥＬＩＳＡを使用して決定される。検体を、切断されたノッチ１（Ｖａｌ１７４４）特異的カスタムウサギモノクローナル抗体により検体を捕捉し、Ｃ末端ノッチ１  ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（登録商標）（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）ポリクローナルヒツジ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）により検出する。溶解物を、１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ錠剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）ミニ番号１１  ８３６  １５３  ００１）および１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ８３４０）を含有する氷冷ＥＬＩＳＡトリス溶解バッファー（Ｒ６ＯＴＸ）（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）中で１μｇ／μｌへ希釈し、２５μｌをＥＬＩＳＡプレートへ添加する。５０μｇのタンパク質溶解物のインキュベーションを、検体の捕捉および検出抗体のために、各々ＲＴで１時間行なう。Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（商標）（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）上でプレートを読み取る。バックグラウンドを引いたＮ１ＩＣＤを全タンパク質に対して正規化し、ベヒクル処理群と比較して％阻害として示す。化合物１の最後の用量の４時間後に採取した腫瘍において、Ｄｕｎｅｔｔの方法によって測定されるようなＮ１ＩＣＤ％阻害および統計的有意性（ｐ値）を、本質的に上記のように解析し、表２中で要約する。
【表３−１】
0006027110.tif 000027
【表３−２】
0006027110.tif 000028
【００６９】
表２中のデータは、ヒト腫瘍の様々な異種移植モデルにおける化合物１による腫瘍増殖阻害およびＮ１ＩＣＤ切断の阻害を証明する。表２中のデータは、表１中で記載される機能的活性の細胞データに対するｉｎ  ｖｉｖｏ相関性をさらに提供する。
【００７０】
代謝および排泄
シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）代謝および修飾が低いかまたは無い化合物は、患者が服用している他の医薬物との有害な相互作用（用量の変化または医薬物をすべて停止する必要性をもたらし得る）の可能性は減少する。ＣＹＰ４５０代謝により患者の活性代謝物質への大きな曝露が引き起こされる場合、複数の活性種の寄与に関連するより大きな変動性から、有効性および安全性の問題が生じ得る。したがって、一般的に活性代謝物質を欠く薬物が好ましい。ＣＹＰ４５０代謝および修飾が低いかまたは無い治療法剤が所望され、患者中でそしてその患者についての優れた安全性プロフィールを有することができる。Ｌｙｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｆａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ，７６，３９１（２００７）．ＣＹＰ４５０酵素相互作用の可能性は単に活性医薬剤の構造に基づいて予測することができない。
【００７１】
化合物１は主要なＣＹＰ４５０酵素のインヒビターまたはインデューサーでなく、酸化ＣＹＰ４５０代謝に至適化された肝臓ミクロソームによって大きな程度には代謝されなかった。ラットおよびイヌのｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、主要な酸化代謝物質は血中循環または排泄物中で観察されなかった。したがって、化合物１は、癌の治療を受けている患者における用量調整または追加の医薬物を限定もしくは停止する必要性をもたらし得る他の医薬物とのＣＹＰ４５０に基づく相互作用についての可能性が低い。
【００７２】
全身的な薬物動態（ＰＫ）、排泄および代謝を研究するために、化合物１はカニューレが胆管に挿入されたラットにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで評価された。ｉｎ  ｖｉｖｏでＩＶ用量の５１％は変化せず主に尿中で排泄され、活性Ｎ−脱アルキル化代謝物質（４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−１−メチル−２−オキソ−２−［［（７Ｓ）−６−オキソ−５，７−ジヒドロピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−７−イル］アミノ］エチル］ブタンアミド）への低い（親化合物の２％）全身暴露であった。代謝物質についてのラット血漿のプロファイリングは、追加の血中代謝物の非存在を示した。胆管に手を加えていないイヌにおけるさらなる研究も、親化合物の排泄に加えて主要な血中循環活性代謝物質の非存在による大きなクリアランスを支持した。
【００７３】
化合物１についての全体的な代謝および排泄データは、所望されるクリアランス機構（親化合物の尿中排泄、および不活性かつ非血中循環断片へのアミド加水分解（それはＣＹＰ４５０代謝に至適化された肝臓ミクロソームによるインキュベーションにおいて形成されない））に加えて、主要な活性血中代謝物の非存在を示した。
【００７４】
臨床設定において、前臨床的に観察される化合物１のクリアランス特性が所望される。主として酸化代謝によって取り除かれる化合物は、併用医薬物および特定のフルーツジュース／ハーブとの薬物相互作用、肝臓病、ならびに酵素活性の患者間差異に起因する可変的な曝露を示すことが公知である。複数のクリアランス機構は１つの任意の排出経路で起こる薬物相互作用のインパクトを減らすので、好ましい。したがって、排泄（５１％）および代謝（アミド加水分解）の両方による化合物１のクリアランスは、主要な活性血中代謝物の産生なしに、患者に有利である。全体として、これらのクリアランス特性は、臨床用量調整の可能性を低下させ、加えて主要な活性血中代謝物、併用医薬物の投与、およびＣＹＰ４５０活性における患者間差異と関連する安全性および有効性の懸念を最小限にする。
【図１】
0006027110.tif 000031
【配列表】
0006027110000001.app