(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＹＭＡＦ１蛋白質に対する抗体を含む、アスペルギルス  フミガーツス感染症を検査するための組成物。
【請求項２】
前記抗体が、ＹＭＡＦ１蛋白質中の配列番号：３３に記載のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗体が、下記（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれかに記載の抗体である、請求項１に記載の組成物
（ａ）配列番号：１〜３に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４〜６に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＹＭＡＦ１蛋白質に結合する抗体
（ｂ）配列番号：７〜９に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１０〜１２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＹＭＡＦ１蛋白質に結合する抗体
（ｃ）配列番号：１３〜１５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１６〜１８に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＹＭＡＦ１蛋白質に結合する抗体。
【請求項４】
前記抗体が、下記（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれかに記載の抗体である、請求項１に記載の組成物
（ａ）配列番号：２０に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２２に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＹＭＡＦ１蛋白質に結合する抗体
（ｂ）配列番号：２４に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２６に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＹＭＡＦ１蛋白質に結合する抗体
（ｃ）配列番号：２８に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：３０に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＹＭＡＦ１蛋白質に結合する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アスペルギルス  フミガーツスのＹＭＡＦ１（ＹＰＤ  ｍｅｄｉｕｍ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｊｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ１）蛋白質を標的とした、アスペルギルス  フミガーツス感染症の検査、予防及び治療のための方法及び当該方法に用いられる分子に関する。また、本発明は、ＹＭＡＦ１蛋白質を標的とした、前記感染症の検査、予防及び治療のための化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アスペルギルス  フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）は慢性壊死性肺アスペルギルス症（ＣＮＰＡ）などの深在性真菌症の主要な原因真菌であり、医療の現場において、臓器移植や抗がん剤投与、ＨＩＶ感染のような免疫不全状態にある患者に対して日和見的に感染し、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）等において、ときに致死的となるほど重篤な症状を引き起こす。【０００３】
深在性真菌症の原因菌としては、アスペルギルス  フミガーツスが一番多く、このほかにアスペルギルス  フラーブス（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス  ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス  ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス  テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）、別種の菌としてカンジダ  アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリプトコッカス  ネオファルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、接合菌などがあるが。しかしながら、これらの感染機構や病原因子についてはほとんど解明されていない。【０００４】
また現在、慢性壊死性肺アスペルギルス症や侵襲性アスペルギルス症（ＩＡ）といったアスペルギルス感染症の早期診断を目的として使用されているガラクトマンナン抗原検出系は、血液悪性疾患の患者では約８０％の感度を有しているが、他の基礎疾患では感度、特異度が共に低いという問題点がある。さらに、表面糖鎖抗原では、他の菌との区別がつけられない場合もあるなど、検出特異性や検出感度は必ずしも満足できるものとはいえなかった。また確定診断については組織生検や培養検査などの手段があるが、これら手段においても、患者の状態などにより実施に困難を伴うケースが生じることや、培養に数週間程度の期間を要し検査結果を得るまでに多くの時間を費やさざるを得ないこと、さらには、臨床検体からの培養検査陽性率が低いことなどの問題があった。このような状況から、例えば手術現場などで深在性真菌症と思われる症状が見られても、菌の同定を迅速に行うことができず、経験の蓄積などがないと適切な治療法の判断を下すのに困難を伴うという問題があった。【０００５】
また現在真菌症の治療においては、主にアムホテリシンＢやミカファンギンなどの低分子医薬が菌種や症状などに応じて用いられている。しかしながら深在性真菌症患者の場合、免疫不全状態になっているがゆえにこれらの治療薬が大量に投与されていて効きにくくなっており、期待通りの治療効果が得られないなどの問題が生じることもあった。【０００６】
以上のようなことから、より感染の実態を反映し、治療に対して効果を発揮できるアスペルギルス感染症の早期診断及び治療の方法の確立が求められている。【０００７】
このような問題に対しては、真菌類に対する抗体などを用いた新たな分子標的治療法や診断方法などが解決手段の一つとして考えられる。これまでアスペルギルス属における各種の細胞外抗原分子が同定され（特許文献１）、また、抗真菌抗体を利用した、あるいはそれと低分子薬とを併用した治療方法（特許文献２）が開発されてきたものの、現在まで真菌類、特に深在性真菌症に対して特異的な治療効果を有する抗体は上梓されていない。【０００８】
また、真菌類の菌体や表面部分などを抗原としてモノクローナル抗体開発を試みると、その菌体表面の糖鎖抗原に対する抗体が多くつくられる傾向にある。しかしながら、これまでの抗体医薬品開発などにおける状況から判断しても、糖鎖抗原に対する抗体は生体内での治療効果作用をもつことがあまり期待できない。  さらに、アスペルギルス  フミガーツスについてはゲノム解析が既に実施されているものの、未だ多くの遺伝子が、保存された推定タンパク質（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする遺伝子と定義されている。このため、機能未知の標的分子の存在も期待されているが、タンパク質レベルでの解析はほとんど進んでおらず、真菌症、特にアスペルギルス  フミガーツス感染症の早期診断及び治療の方法の確立に寄与する標的分子の開発には至っていないのが現状である（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２００７−５３５８９７号公報
【特許文献２】特表２００７−５３３７１６号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｃ．ら、「Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｕｓ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ（病原性、アレルゲン性を持つ糸状菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓのゲノム塩基配列）」、Ｎａｔｕｒｅ、２００５年、４３８巻、７０７１号、１１５１〜１１５６ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、アスペルギルス  フミガーツス感染症の早期診断及び治療の標的となる分子を同定し、当該分子を標的とした前記感染症の検査方法ならびに検査のための組成物を提供することにある。また、本発明の目的は、当該分子を標的とした前記感染症の予防・治療の方法ならびに予防・治療のための組成物を提供することにもある。さらなる本発明の目的は、前記感染症の検査、予防及び治療に有用な化合物のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、アスペルギルス  フミガーツスの細胞外蛋白質の中に、その病原性に関与し、診断・治療薬の優れた標的になるものが存在すると考え、まず、細胞外蛋白質を網羅的に同定できるシグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法を利用して、アスペルギルス  フミガーツスの膜蛋白質、細胞壁蛋白質、分泌蛋白質などの細胞外蛋白質を網羅的に同定した。そして、同定した細胞外蛋白質の中でも発現量が比較的高いと考えられたＹＭＡＦ１（ＹＰＤ  ｍｅｄｉｕｍ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｊｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ１）蛋白質に着目してさらなる解析を行った。【００１３】
その結果、ＹＭＡＦ１蛋白質がアスペルギルス  フミガーツスの細胞壁、細胞膜またはペリプラズムに局在している蛋白質であること、ＹＭＡＦ１遺伝子を欠損させたアスペルギルス  フミガーツス株においては、特定の温度条件下にて胞子形成能が低下していること、さらには、当該株において病原性も低下していることを見出した。【００１４】
このようなＹＭＡＦ１蛋白質の特性から、当該蛋白質に対する抗体がアスペルギルス感染症の検査、予防および治療のための有用な分子となることが期待された。そこで、本発明者らは、次に、ＹＭＡＦ１蛋白質に対する抗体を作製し、その検証を行った。その結果、当該抗体を利用したＥＬＩＳＡによりアスペルギルス  フミガーツスを感度よく検出できること、および、当該抗体を投与することによって、実験的マウスアスペルギルス症（侵襲性アスペルギルスモデルマウス）の生存率が向上することが明らかとなった。【００１５】
以上の結果より、本発明者らは、ＹＭＡＦ１蛋白質がアスペルギルス感染症の検査、予防および治療の優れた標的分子となることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１６】
従って、本発明は、アスペルギルス  フミガーツス感染症の検査、予防及び治療のための方法および当該方法に用いられる分子、並びに前記感染症の検査、予防および治療のための化合物のスクリーニング方法に関し、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１）  被検体から分離された生体試料における、ＹＭＡＦ１蛋白質の存在を検出する工程を含む、アスペルギルス  フミガーツス感染症を検査するための方法。
（２）  前記ＹＭＡＦ１蛋白質の存在をＹＭＡＦ１蛋白質に対する抗体を用いて検出する、（１）に記載の方法。
（３）  ＹＭＡＦ１蛋白質に対する抗体を含む、アスペルギルス  フミガーツス感染症を検査するための組成物。
（４）  ＹＭＡＦ１蛋白質に対する抗体を投与する工程を含む、アスペルギルス  フミガーツス感染症を予防又は治療するための方法。
（５）  ＹＭＡＦ１蛋白質に対する抗体を含む、アスペルギルス  フミガーツス感染症を予防又は治療するための組成物。
（６）  被験化合物をＹＭＡＦ１蛋白質又はその一部に接触させ、ＹＭＡＦ１蛋白質又はその一部に結合する化合物を選択する工程を含む、アスペルギルス  フミガーツス感染症の検査、予防又は治療をするための化合物のスクリーニング方法。
（７）  ＹＭＡＦ１蛋白質中の配列番号：３３に記載のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体。
（８）  下記（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれかに記載の抗体
（ａ）配列番号：１〜３に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４〜６に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＹＭＡＦ１蛋白質に結合する抗体
（ｂ）配列番号：７〜９に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１０〜１２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＹＭＡＦ１蛋白質に結合する抗体
（ｃ）配列番号：１３〜１５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１６〜１８に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＹＭＡＦ１蛋白質に結合する抗体。
（９）  下記（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれかに記載の抗体
（ａ）配列番号：２０に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２２に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＹＭＡＦ１蛋白質に結合する抗体
（ｂ）配列番号：２４に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２６に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＹＭＡＦ１蛋白質に結合する抗体
（ｃ）配列番号：２８に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：３０に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＹＭＡＦ１蛋白質に結合する抗体。【００１７】
なお、本発明にかかるＹＭＡＦ１遺伝子に関しては、米国特許第７５０４４９０号明細書において、アスペルギルス  フミガーツスにおける発現遺伝子を網羅的に解析した結果として、その配列自体は開示されている。しかしながら、ＹＭＡＦ１遺伝子がコードする蛋白質の存在及び機能は明らかではない。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、アスペルギルス  フミガーツスを高い特異性および感度にて検出することができる、アスペルギルス  フミガーツス感染症の検査方法ならびに検査用組成物を提供することが可能となる。また、アスペルギルス  フミガーツス感染症の予防・治療方法ならびに予防・治療用組成物を提供することが可能となる。さらに、これらの方法に有用な化合物のスクリーニング方法、並びにこれらの方法に有用な抗体を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】アスペルギルス  フミガーツスのＹＭＡＦ１（ＹＰＤ  ｍｅｄｉｕｍ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｊｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ１）遺伝子の塩基配列（遺伝子配列）および当該遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列を示す図である。なお図中、下線が付してある塩基およびアミノ酸は、前記塩基配列および前記アミノ酸配列と、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＸＭ＿７２６３９４．１で特定される塩基配列およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＸＰ＿７３１４８７．１で特定されるアミノ酸配列との相違点であることを示す。
【図２】ＨＡタグを付加したＹＭＡＦ１蛋白質を酵母にて発現させ、その酵母の培養上清を抗ＨＡ抗体を用いた免疫沈降により精製したものを、抗ＨＡ抗体を用いたウェスタンブロットにて分析した結果を示す写真である。なお図中、（Ａ）はＨＡタグのみをコードするベクター（ｐＡＤＨ−ＨＡ発現ベクター）を酵母にて発現させた結果（陰性対照）を示し、（Ｂ）はＨＡタグを付加したＹＭＡＦ１蛋白質をコードするベクターを酵母にて発現させた結果を示す。
【図３】ＧＳＴとＹＭＡＦ１との融合蛋白質を大腸菌に発現させ、その大腸菌の可溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＣＢＢ染色にて分析した結果を示す写真である。なお図中、矢印で示したバンドはＧＳＴとＹＭＡＦ１との融合蛋白質に由来する。
【図４】ＧＳＴとＹＭＡＦ１との融合蛋白質を大腸菌に発現させ、その大腸菌の可溶性画分および不溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＣＢＢ染色にて分析した結果を示す写真である。なお図中、（Ａ）は前記大腸菌の可溶性画分を分析した結果を示し、（Ｂ）はマーカーを泳動した結果を示し、（Ｃ）は前記大腸菌の不溶性画分をさらに８Ｍ  ウレアにて処理して得られた可溶性画分を分析した結果を示す。また、矢印で示したバンドはＧＳＴとＹＭＡＦ１との融合蛋白質に由来する。
【図５】１Ｂ４Ｃ抗体と、ＹＭＡＦ１遺伝子を発現するＢａ／Ｆ３細胞との反応性を示す図である。免疫原細胞であるＹＭＡＦ１全長遺伝子を発現するトランスフェクタントＢａ／Ｆ３細胞（ＹＭＡＦ１  ＳＳＴ−クローン）とＹＭＡＦ１遺伝子を発現していない対照Ｂａ／Ｆ３細胞（ネガティブコントロールＳＳＴ−ｃｌｏｎｅ）に対する１Ｂ４Ｃ抗体の反応をフローサイトメーターで解析した。フローサイトメーターデータの塗りつぶしヒストグラム部分は、サンプル抗体（１Ｂ４Ｃ抗体）との反応を、白のヒストグラム部分は、陰性対照としたＩｇＭ／ｋａｐｐａ（アイソタイプ対照ＩｇＧ）との反応を示す。
【図６】２Ｇ１１ＧＢ５抗体と、ＹＭＡＦ１遺伝子を発現するＢａ／Ｆ３細胞との反応性を示す図である。免疫原細胞であるＹＭＡＦ１全長遺伝子を発現するトランスフェクタントＢａ／Ｆ３細胞（ＹＭＡＦ１  ＳＳＴ−クローン）とＹＭＡＦ１遺伝子を発現していない対照Ｂａ／Ｆ３細胞（ネガティブコントロールＳＳＴ−ｃｌｏｎｅ）に対する２Ｇ１１ＧＢ５抗体の反応をフローサイトメーターで解析した。フローサイトメーターデータの塗りつぶしヒストグラム部分は、サンプル抗体（２Ｇ１１ＧＢ５抗体）との反応を、白のヒストグラム部分は、陰性対照としたＩｇＧ３／ｋａｐｐａ（アイソタイプ対照ＩｇＧ）との反応を示す。
【図７】３Ｇ４ＦＢ７抗体と、ＹＭＡＦ１遺伝子を発現するＢａ／Ｆ３細胞との反応性を示す図である。免疫原細胞であるＹＭＡＦ１全長遺伝子を発現するトランスフェクタントＢａ／Ｆ３細胞（ＹＭＡＦ１  ＳＳＴ−クローン）とＹＭＡＦ１遺伝子を発現していない対照Ｂａ／Ｆ３細胞（ネガティブコントロールＳＳＴ−ｃｌｏｎｅ）に対する３Ｇ４ＦＢ７抗体の反応をフローサイトメーターで解析した。フローサイトメーターデータの塗りつぶしヒストグラム部分は、サンプル抗体（３Ｇ４ＦＢ７抗体）との反応を、白のヒストグラム部分は、陰性対照としたＩｇＧ３／ｋａｐｐａ（アイソタイプ対照ＩｇＧ）との反応を示す。
【図８】４Ｂ６Ｍ２ＧＫ抗体と、ＹＭＡＦ１遺伝子を発現するＢａ／Ｆ３細胞との反応性を示す図である。免疫原細胞であるＹＭＡＦ１全長遺伝子を発現するトランスフェクタントＢａ／Ｆ３細胞（ＹＭＡＦ１  ＳＳＴ−クローン）とＹＭＡＦ１遺伝子を発現していない対照Ｂａ／Ｆ３細胞（ネガティブコントロールＳＳＴ−ｃｌｏｎｅ）に対する４Ｂ６Ｍ２ＧＫ抗体の反応をフローサイトメーターで解析した。フローサイトメーターデータの塗りつぶしヒストグラム部分は、サンプル抗体（４Ｂ６Ｍ２ＧＫ抗体）との反応を、白のヒストグラム部分は、陰性対照としたＩｇＧ１／ｋａｐｐａ（アイソタイプ対照ＩｇＧ）との反応を示す。
【図９】大腸菌にて産生したＧＳＴとＹＭＡＦ１との融合蛋白質に対する、１Ｂ４Ｃ抗体、２Ｇ１１ＧＢ５抗体、３Ｇ４ＦＢ７抗体または４Ｂ６Ｍ２ＧＫ抗体を用いたウェスタンブロットの結果を示す写真である。なお図中「Ｍ」はマーカーをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展開してＣＢＢ染色により分析した結果を示し、「ＧＳＴ−ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ」はＧＳＴとＹＭＡＦ１との融合蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展開してＣＢＢ染色により分析した結果を示す。また、「１Ｂ４Ｃ」、「２Ｇ１１」、「３Ｇ４」および「４Ｂ６」は、各々１Ｂ４Ｃ抗体、２Ｇ１１ＧＢ５抗体、３Ｇ４ＦＢ７抗体および４Ｂ６Ｍ２ＧＫ抗体を用いたウェスタンブロット（ＷＢ）の結果を示す。また、矢印で示したバンドはＧＳＴとＹＭＡＦ１との融合蛋白質に由来する。
【図１０】ＹＭＡＦ１遺伝子破壊株（ｄ−ＹＭＡＦ１）およびＹＭＡＦ１遺伝子相補株（ＹＭＡＦ１−ｃｏｍｐ）のＹ１遺伝子近傍のゲノムの構造を示す概略図である。なお図中、「Ｙ１」はＹＭＡＦ１遺伝子を示し、「ｐｒｏｂｅＡ」はＹＭＡＦ１遺伝子の上流域（配列番号：５３に記載の塩基配列（ＹＭＡＦ１蛋白質をコードするゲノム配列）の１３６〜６００位の領域）に対する特異的なプローブであることを示し、「ＨｐｈＴＫ」はハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ（配列番号：５６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質）とヒトヘルペスチミジンキナーゼとの融合蛋白質をコードする遺伝子を示し、「ｐｒｏｂｅ  Ｈｐｈ」はハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子に対する特異的なプローブであることを示す。なお、ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの配列を配列番号：５５に示す。また、「ｐｒｏｂｅ  Ｈｐｈ」がハイブリダイズする領域は、配列番号：５５に記載の塩基配列の２１８〜７５５位の領域である。さらに、「ｐｔｒＡ」はピリチアミン耐性遺伝子であることを示し、「Ｂｍ」は制限酵素ＢａｍＨ１の認識部位であることを示す。また、「Ａｆｓ３５」はＹＭＡＦ１遺伝子破壊株およびＹＭＡＦ１遺伝子相補株の基となった親株のゲノムの構造を示す。
【図１１】ＹＭＡＦ１遺伝子破壊株およびＹＭＡＦ１遺伝子相補株のゲノムをサザンハイブリダイゼーションにより分析した結果を示す写真である。なお図中、「ｐｒｏｂｅＡ」はＹＭＡＦ１遺伝子の上流域に対する特異的なプローブを用いたサザンハイブリダイゼーションにより分析した結果を示し、「ｐｒｏｂｅＨｐｈ」はハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子に対する特異的なプローブを用いたサザンハイブリダイゼーションにより分析した結果を示す。また、「Ａ」および「Ｆ」は親株（Ａｆｓ３５）のゲノムを分析した結果を示し、「Ｂ」および「Ｇ」はＹＭＡＦ１遺伝子破壊株（ｄ−ＹＭＡＦ１−５）のゲノムを分析した結果を示し、「Ｃ」および「Ｈ」はＹＭＡＦ１遺伝子破壊株（ｄ−ＹＭＡＦ１−７）のゲノムを分析した結果を示し、「Ｄ」および「Ｉ」はＹＭＡＦ１遺伝子相補株（ＹＭＡＦ１−ｃｏｍｐ−３）のゲノムを分析した結果を示し、「Ｃ」および「Ｈ」はＹＭＡＦ１遺伝子相補株（ＹＭＡＦ１−ｃｏｍｐ−４）のゲノムを分析した結果を示す。
【図１２】ＹＭＡＦ１遺伝子破壊株（ｄ−ＹＭＡＦ１）、ＹＭＡＦ１遺伝子相補株（ＹＭＡＦ１  ｃｏｍｐ−４）、およびそれらの親株（Ａｆｓ３５）におけるＹＭＡＦ１  ｍＲＮＡの発現をＰＣＲにより分析した結果を示す写真である。
【図１３】ＹＭＡＦ１遺伝子破壊株（ｄ−ＹＭＡＦ１（ｄ−ＹＭＡＦ１−７））、ＹＭＡＦ１遺伝子相補株（ＹＭＡＦ１−ｃｏｍｐ４）、およびそれらの親株（Ａｆｓ３５）の胞子溶液（１ｘ１０７コニディア／２μｌ）を各種培地に添加し、３０℃にて３日間培養した結果を示す写真である。なお図中において、「ＰＤＡ」のプレート上に示した各株に由来するコロニーの位置は他の培地のプレートにおけるそれらの位置に各々対応している。
【図１４】ＹＭＡＦ１遺伝子破壊株（ｄ−ＹＭＡＦ１（ｄ−ＹＭＡＦ１−７））、およびその親株（Ａｆｓ３５）の胞子溶液（１ｘ１０４コニディア／２μｌ）を各種培地に添加し、３０℃にて３日間培養した結果を示す写真である。なお図中において、「ＰＤＡ」のプレート上に示した各株に由来するコロニーの位置は他の培地のプレートにおけるそれらの位置に各々対応している。また、上段（−Ｓｅｒｕｍ）はウシ新生仔血清を添加していない各種培地における結果を示し、下段（＋Ｓｅｒｕｍ）はウシ新生仔血清を添加している各種培地における結果を示す。
【図１５】１０％ウシ血清含有Ｓｐｉｄｅｒ培地にて培養した、ＹＭＡＦ１遺伝子破壊株（ｄ−ＹＭＡＦ１−７）、ＹＭＡＦ１遺伝子相補株（ＹＭＡＦ１−ｃｏｍｐ−４）、およびそれらの親株（Ａｆｓ３５）のコロニーの状態を観察した結果を示す写真である。
【図１６】１０％ウシ血清含有Ｓｐｉｄｅｒ培地にて培養した、ＹＭＡＦ１遺伝子破壊株（ｄ−ＹＭＡＦ１−７）およびその親株（Ａｆｓ３５）の分生子頭の形態を観察した結果を示す写真である。
【図１７】１０％ウシ血清含有ＰＤＡ培地にて２５℃で生育させた、ＹＭＡＦ１遺伝子破壊株（ｄ−ＹＭＡＦ１−７）、ＹＭＡＦ１遺伝子相補株（ＹＭＡＦ１−ｃｏｍｐ−４）、およびそれらの親株（Ａｆｓ３５）の胞子形成の状態を観察した結果を示す写真である。
【図１８】２５℃、３０℃または３７℃にて最少培地ＡＭＭで培養した、ＹＭＡＦ１遺伝子破壊株（ｄ：ｄ−ＹＭＡＦ１−７）、ＹＭＡＦ１遺伝子相補株（Ｃ：ＹＭＡＦ１−ｃｏｍｐ−４）、およびそれらの親株（Ａ：Ａｆｓ３５）の胞子数（縦軸：Ｘ１０９コニディア）を示すグラフである。
【図１９】ＹＭＡＦ１遺伝子破壊株、ＹＭＡＦ１遺伝子相補株、およびそれらの親株の細胞粗抽出液と細胞壁画分とを抗ＹＭＡＦ１ウサギポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット法により分析した結果を示す写真である。なお図中、「Ａ」および「Ｄ」は親株（Ａｆｓ３５）由来の蛋白質を分析した結果を示し、「Ｂ」および「Ｅ」はＹＭＡＦ１遺伝子破壊株（ｄ−ＹＭＡＦ１−７）由来の蛋白質を分析した結果を示し、「Ｃ」および「Ｆ」はＹＭＡＦ１遺伝子相補株（ＹＭＡＦ１−ｃｏｍｐ−４）の蛋白質を分析した結果を示す。
【図２０】Ａｆｓ３５株を抗ＹＭＡＦ１抗体を用いた免疫染色により分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお図中、左側は明視野観察の結果を示し、右側は蛍光観察の結果を示す。
【図２１】Ａｆｓ３５株を用い、各種濃度の抗ＹＭＡＦ１ポリクローナル抗体を添加した培地にて、３０℃で１４時間培養したアスペルギルス  フミガーツスの観察結果を示す顕微鏡写真である。
【図２２】Ａｆｓ３５、ＹＭＡＦ１遺伝子欠損株（ｄ−ＹＭＡＦ１）またはＹＭＡＦ１遺伝子相補株（ＹＭＡＦ１ＣＯＭＰ−４）の胞子を投与した実験的マウスアスペルギルス症（侵襲性アスペルギルスモデルマウス）の生存率を示すグラフである。
【図２３】抗ＹＭＡＦ１蛋白質モノクローナル抗体（４Ｂ６：４Ｂ６Ｍ２ＧＫ抗体）を投与した実験的マウスアスペルギルス症（侵襲性アスペルギルスモデルマウス）の生存率を示すグラフである。
【図２４】捕獲用抗体として抗ＹＭＡＦ１モノクローナル抗体（１Ｂ４Ｃ：１Ｂ４Ｃモノクローナル抗体）を用い、検出用抗体としてビオチン化した抗ＹＭＡＦ１ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ系を評価した結果を示すグラフである。
【図２５】捕獲用抗体として抗ＹＭＡＦ１モノクローナル抗体（３Ｇ４：３Ｇ４ＦＢ７モノクローナル抗体）を用い、検出用抗体としてビオチン化した抗ＹＭＡＦ１ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ系を評価した結果を示すグラフである。
【図２６】アスペルギルス  フミガーツスを様々な種類の培地にて３０℃で培養し、これらの培養液中のＹＭＡＦ１蛋白質の量をＹＭＡＦ１サンドイッチＥＬＩＳＡ系（１Ｂ４Ｃモノクローナル抗体（１Ｂ４Ｃ）を捕獲用抗体として用いた系）を用いて分析した結果を示すグラフである。なお図中、１はＹＧ培地での培養の結果を示し、２はＹＰＤｐＨ５．６培地での培養の結果を示し、３はＹＰＤｐＨ７．２培地での培養の結果を示し、４はＳｐｉｄｅｒ培地での培養の結果を示し、５はＡＭＭ培地での培養の結果を示し、６はＬＢ培地での培養の結果を示し、７はサブロー培地での培養の結果を示し、８はＳＤ−ａ．ａ．培地での培養の結果を示す。また、「培地」は各培地のみを分析した結果（陰性対照）を示す（図２７においても同様）。
【図２７】アスペルギルス  フミガーツスを様々な種類の培地にて３０℃で培養し、これらの培養液中のＹＭＡＦ１蛋白質の量をＹＭＡＦ１サンドイッチＥＬＩＳＡ系（３Ｇ４ＦＢ７モノクローナル抗体（３Ｇ４）を捕獲用抗体として用いた系）を用いて分析した結果を示すグラフである。
【図２８】抗ＹＭＡＦ１モノクローナル抗体（１Ｂ４Ｃモノクローナル抗体）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の塩基配列を示す図である。
【図２９】抗ＹＭＡＦ１モノクローナル抗体（１Ｂ４Ｃモノクローナル抗体）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図である。なお下線を付したアミノ酸配列はＮ末側から、シグナル配列、ＣＤＲ１，ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を各々示す。
【図３０】抗ＹＭＡＦ１モノクローナル抗体（３Ｇ４ＦＢ７モノクローナル抗体）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の塩基配列を示す図である。
【図３１】抗ＹＭＡＦ１モノクローナル抗体（３Ｇ４ＦＢ７モノクローナル抗体）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図である。なお下線を付したアミノ酸配列はＮ末側から、シグナル配列、ＣＤＲ１，ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を各々示す。
【図３２】抗ＹＭＡＦ１モノクローナル抗体（４Ｂ６Ｍ２ＧＫモノクローナル抗体）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の塩基配列を示す図である。
【図３３】抗ＹＭＡＦ１モノクローナル抗体（４Ｂ６Ｍ２ＧＫモノクローナル抗体）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図である。なお下線を付したアミノ酸配列はＮ末側から、シグナル配列、ＣＤＲ１，ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を各々示す。
【図３４】各抗ＹＭＡＦ１モノクローナル抗体（１Ｂ４Ｃ、２Ｇ１１ＧＢ５、３Ｇ４ＦＢ７または４Ｂ６Ｍ２ＧＫ）と、様々な長さのＹＭＡＦ１蛋白質を発現するトランスフェクタントＢａ／Ｆ３細胞（ＳＳＴクローン：ＡＣＴ２５１−１〜６）との反応性を示す概略図である。なお図中、「ＴＭ」はＭＰＬのトランスメンブランドメインを示す。
【図３５】各抗ＹＭＡＦ１モノクローナル抗体（２Ｇ１１ＧＢ５、３Ｇ４ＦＢ７、４Ｂ６Ｍ２ＧＫまたは１Ｂ４Ｃ）と、様々な長さのＹＭＡＦ１蛋白質を発現するトランスフェクタントＢａ／Ｆ３細胞（ＳＳＴクローン：ＡＣＴ２５１−１〜４）との反応性をフローサイトメーターにて解析した結果を示す図である。
【図３６】各抗ＹＭＡＦ１モノクローナル抗体（２Ｇ１１ＧＢ５、３Ｇ４ＦＢ７、４Ｂ６Ｍ２ＧＫまたは１Ｂ４Ｃ）と、様々な長さのＹＭＡＦ１蛋白質を発現するトランスフェクタントＢａ／Ｆ３細胞（ＳＳＴクローン：ＡＣＴ２５１−５〜６）又はＡＣＴ０７３−５０２細胞との反応性をフローサイトメーターにて解析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
＜アスペルギルス  フミガーツス感染症の検査方法＞
後述の実施例において示す通り、ＹＭＡＦ１蛋白質はアスペルギルス  フミガーツスの病原性ならびに胞子形成能に関与していることが本発明者らによって明らかになった。そのため、ＹＭＡＦ１蛋白質の存在を指標として、単にアスペルギルス  フミガーツスの存在を検出することのみならず、アスペルギルス  フミガーツスの病原性に起因するアスペルギルス  フミガーツス感染症を検査することができる。さらに当該蛋白質はアスペルギルス  フミガーツスの細胞壁に局在する蛋白質であることも明らかになり、細胞壁から解離したこの蛋白質はアスペルギルス  フミガーツス感染症の患者の血清等に放出されている蓋然性が極めて高いため、ＹＭＡＦ１蛋白質の存在を指標として、前記検査を高い特異性および感度をもって、簡便かつ効率的に行うことができる。
【００２１】
したがって、本発明は、被検体から分離された生体試料における、ＹＭＡＦ１蛋白質の存在を検出する工程を含むアスペルギルス  フミガーツス感染症の検査方法を提供する。
【００２２】
本発明において「アスペルギルス  フミガーツス感染症」とは、アスペルギルス  フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の感染を起因とする疾患のことであり、例えば、慢性肺アスペルギルス症（ＣＰＡ）、侵襲性アスペルギルス症（ＩＡ）、侵襲性肺アスペルギルス症（ＩＰＡ）、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）が挙げられる。
【００２３】
本発明において「生体試料」とは、本発明の検査方法において、ＹＭＡＦ１蛋白質の存在を検出する対象となる細胞、組織、臓器、体液（例えば、血清、尿）、これらの洗浄液（例えば、気管支肺胞洗浄液）等の試料を意味する。これらの中では、通常の検査（ルチン検査）の残りをＹＭＡＦ１蛋白質の存在を検出する対象とすることができるという観点から、本発明にかかる「生体試料」は血清であることが好ましい。
【００２４】
「被検体から分離された」とは、生体から細胞等を採取・摘出することによって、当該細胞等が、その由来の生体と完全に隔離されている状態を意味する。生体試料の採取等の方法は特に限定されることなく、公知の方法を用いることができる。
【００２５】
前記細胞等を採取・摘出する「被検体」は、ヒトを含む動物であるが、ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物などを対象とすることができる。具体的には、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒル、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、マウス、ラット、サルなどが挙げられる。また、アスペルギルス  フミガーツス感染個体に限らず、健常個体（アスペルギルス  フミガーツスに感染しているおそれがある個体を含む）や、臓器移植や抗がん剤投与、ＨＩＶ感染のような免疫不全状態にあり、アスペルギルス  フミガーツスが日和見的に感染するおそれのある、非健常個体を対象とすることもできる。
【００２６】
本発明において、「ＹＭＡＦ１蛋白質」は、典型的には、配列番号：３２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質である。しかしながら、蛋白質のアミノ酸配列は、そのコードする遺伝子の変異などにより、自然界において（すなわち、非人工的に）変異しうる。したがって、本発明の検出の対象となる「ＹＭＡＦ１蛋白質」には、このような天然の変異体が含まれる。天然の変異体は、通常、前記典型的なアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなる。アミノ酸配列の置換、欠失、挿入もしくは付加は、一般的には、１０アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、１アミノ酸）であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＸＰ＿７３１４８７．１で特定されるアミノ酸配列からなる蛋白質（配列番号：５４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質）が挙げられる。なお、配列番号：３２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列の典型例を配列番号：３１に示す。また、配列番号：５４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列（ゲノムの配列）の典型例を配列番号：５３に示す。
【００２７】
本発明において「ＹＭＡＦ１蛋白質の存在を検出する」とは、ＹＭＡＦ１蛋白質の存在の有無の検出、およびＹＭＡＦ１蛋白質の存在の程度の検出の双方を含む意である。ＹＭＡＦ１蛋白質の存在量は、絶対量としてまたは相対量として把握することができる。存在量を把握する場合には、例えば、用意した標準試料のＹＭＡＦ１蛋白質の存在量と比較して判断することができる。「標準試料」は、ＹＭＡＦ１蛋白質を発現しているか否かが事前に特定されている試料である。例えば、アスペルギルス  フミガーツスに感染している個体由来の血清を、本発明にかかる標準試料とすることができる。また、アスペルギルス  フミガーツスに感染していない健常個体由来の血清も、本発明にかかる標準試料とすることができる。
【００２８】
また、かかる「ＹＭＡＦ１蛋白質の存在の検出」においては、前記生体試料に含有されているアスペルギルス  フミガーツスを培養し、その培養物を検出の対象としてもよい。かかる培養物の調製方法としては、例えば、後述の実施例において示すような、アスペルギルス最少培地（ＡＭＭ）、ＳＤ培地、ＰＤＡ培地、ＹＰＤ培地、Ｓｐｉｄｅｒ培地、ＰＤＡ培地もしくはＹＧ培地、またはそれらにウシ血清を添加した培地等にて、２５〜３７℃で前記生体試料に付着や含有しているアスペルギルス  フミガーツスを培養する方法が挙げられる。
【００２９】
本発明におけるＹＭＡＦ１蛋白質の存在の検出は、ＹＭＡＦ１蛋白質に対する抗体やＹＭＡＦ１蛋白質に対する核酸アプタマー等のＹＭＡＦ１蛋白質を特異的に認識して結合できる物質を利用して行うことができる。これらの中では、迅速で感度のよい検出が可能となり、操作も簡便であるため、ＹＭＡＦ１蛋白質に対する抗体を用いた検出方法（免疫学的手法）によることが好ましい。
【００３０】
免疫学的手法では、ＹＭＡＦ１蛋白質に対する抗体（抗ＹＭＡＦ１蛋白質抗体）が使用され、当該抗体をＹＭＡＦ１蛋白質に接触させ、当該抗体のＹＭＡＦ１蛋白質への結合性（結合量）を指標として、ＹＭＡＦ１蛋白質が検出される。ここで「接触」とは、抗ＹＭＡＦ１蛋白質抗体がＹＭＡＦ１蛋白質を認識しうる生理条件下に、当該抗体とＹＭＡＦ１蛋白質とをおくことを意味する。
【００３１】
免疫学的手法に用いる「抗体」は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、また、抗体の機能的断片であってもよい。また、「抗体」には、免疫グロブリンのすべてのクラスおよびサブクラスが含まれる。本発明の抗体は、自然環境の成分から分離され、および／または回収された（即ち、単離された）抗体である。本発明において抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、標的蛋白質を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、およびこれらの重合体などが挙げられる。
【００３２】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であれば、抗原（標的蛋白質、その部分ペプチド、またはこれらを発現する細胞など）で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィーなど）によって、精製して取得することができる。また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法によって作製することができる。
【００３３】
本発明に用いられる免疫学的手法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法、免疫組織化学的染色法、フローサイトメトリー法、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、ウェスタンブロッティング、抗体アレイ、イムノクロマト法等が挙げられる。
【００３４】
前記免疫学的手法の中では、特異性、感度が高いという観点から、ＥＬＩＳＡ法が好ましい。
【００３５】
本発明にかかるＥＬＩＳＡ法は、当業者であれば、ＹＭＡＦ１蛋白質に対する抗体を利用し、適宜公知の手法を採用して実施することができる。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法においては、まず、基板に固定した抗ＹＭＡＦ１蛋白質抗体（捕獲用抗体）に、前記生体試料中のＹＭＡＦ１蛋白質、ＹＭＡＦ１蛋白質を含むアスペルギルス  フミガーツスの菌体の断片またはアスペルギルス  フミガーツスの菌体そのものを捕獲する。次いで、捕捉したＹＭＡＦ１蛋白質等に対して、後述の酵素標識がなされた抗ＹＭＡＦ１蛋白質抗体（検出用抗体）を作用させ、ＹＭＡＦ１蛋白質を化学的にまたは光学的に検出する。
【００３６】
本発明にかかるＥＬＩＳＡ法において、捕獲用抗体と検出用抗体とは、ＹＭＡＦ１蛋白質を認識する限り、同一の抗体であってもよく、異なる抗体であってもよいが、ＹＭＡＦ１蛋白質を非競合的に捕獲、検出することができるという観点から、異なる抗体であることが好ましい。異なる抗体としては、例えば、捕獲用抗体が抗ＹＭＡＦ１蛋白質ポリクローナル抗体であり、検出用抗体が抗ＹＭＡＦ１蛋白質モノクローナル抗体であるという組み合わせ、捕獲用抗体が抗ＹＭＡＦ１蛋白質モノクローナル抗体であり、検出用抗体が抗ＹＭＡＦ１蛋白質ポリクローナル抗体であるという組み合わせ、または捕獲用抗体が抗ＹＭＡＦ１蛋白質モノクローナル抗体であり、検出用抗体が当該捕獲用抗体の認識する部位（エピトープ）とは異なる部位を認識する抗ＹＭＡＦ１蛋白質モノクローナル抗体であるという組み合わせである。
【００３７】
本発明の抗体は、好ましくは、ＹＭＡＦ１蛋白質の細胞外領域である１〜３３位のアミノ酸配列からなる領域（配列番号：３３に記載のアミノ酸配列からなる領域）を認識する抗体である。
【００３８】
本発明の抗体は、より好ましくは、本実施例に記載の、４Ｂ６Ｍ２Ｋ抗体、１Ｂ４Ｃ抗体または３Ｇ４ＦＢ７抗体の軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域とを保持する抗体あるいはそれらのアミノ酸配列変異体である。具体的には、以下の抗体である。
【００３９】
「４Ｂ６Ｍ２Ｋ抗体のＣＤＲを含む可変領域を保持する抗体」
（ａ）配列番号：１〜３に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４〜６に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＹＭＡＦ１蛋白質に結合する抗体
「１Ｂ４Ｃ抗体のＣＤＲを含む可変領域を保持する抗体」
（ｂ）配列番号：７〜９に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１０〜１２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＹＭＡＦ１蛋白質に結合する抗体
「３Ｇ４ＦＢ７抗体のＣＤＲを含む可変領域を保持する抗体」
（ｃ）配列番号：１３〜１５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１６〜１８に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＹＭＡＦ１蛋白質に結合する抗体。
【００４０】
本発明の抗体は、特に好ましくは、本実施例に記載の抗体の軽鎖可変領域と、重鎖可変領域を保持する抗体あるいはそのアミノ酸配列変異体である。具体的には、以下の抗体である。
【００４１】
「４Ｂ６Ｍ２Ｋ抗体の可変領域を保持する抗体」
（ａ）配列番号：２０に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２２に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＹＭＡＦ１蛋白質に結合する抗体
「１Ｂ４Ｃ抗体の可変領域を保持する抗体」
（ｂ）配列番号：２４に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２６に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＹＭＡＦ１蛋白質に結合する抗体
「３Ｇ４ＦＢ７抗体の可変領域を保持する抗体」
（ｃ）配列番号：２８に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：３０に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＹＭＡＦ１蛋白質に結合する抗体。
【００４２】
本発明の抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、またはペプチド合成によって作製することができる。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖または軽鎖の定常領域であってもよく、また、可変領域（フレームワーク領域およびＣＤＲ）であってもよい。ＣＤＲ以外のアミノ酸の改変は、抗原との結合親和性への影響が相対的に少ないと考えられるが、現在では、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法が公知である（ＰＮＡＳ，１０２：８４６６−８４７１（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：４８５−４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２４８８０−２４８８７（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：３４５−３５１（２００８））。
【００４３】
改変されるアミノ酸数は、好ましくは、１０アミノ酸以内、より好ましくは５アミノ酸以内、最も好ましくは３アミノ酸以内（例えば、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。アミノ酸の改変は、好ましくは、保存的な置換である。本発明において「保存的な置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・トレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）で分類することができる。アミノ酸配列変異体は、抗原への結合活性が対象抗体（代表的には、本実施例に記載の抗体）と同等であることが好ましい。抗原への結合活性は、例えば、抗原を発現するＢａ／Ｆ３細胞を作製し、抗体サンプルとの反応性をフローサイトメーターで解析することにより評価することができる（後述の実施例３参照）。また、抗原への結合活性は、上記した通り、例えば、後述の実施例３に記載のウェスタンブロットにより評価することができる。
【００４４】
一旦、本実施例に記載の抗体が得られた場合、当業者であれば、その抗体が認識する蛋白質上のペプチド領域（エピトープ）を特定して、その領域に結合する種々の抗体を作製することができる。抗体のエピトープは、標的となる蛋白質のアミノ酸配列から得られたオーバーラップする合成オリゴペプチドへの結合を調べるなどの周知の方法によって決定することができる（例えば、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国特許４７０８８７１号）。ファージディスプレイによるペプチドライブラリーをエピトープマッピングに用いることもできる。二つの抗体が同一または立体的に重なり合ったエピトープと結合するかどうかは、競合アッセイ法により決定することができる。
【００４５】
上記の抗体は、本発明の検査方法のみならず、後述する、アスペルギルス  フミガーツス感染症を予防又は治療する方法においても有用である。
【００４６】
上記の抗体を本発明の検査方法に用いる場合には、標識物質を結合させた抗体を使用することができる。当該標識を検出することにより、標的蛋白質に結合した抗体量を直接測定することが可能である。標識物質としては、抗体に結合することができ、化学的又は光学的方法に検出できるものであれば特に制限されることはなく、例えば、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、アルカリホスファターゼ、ビオチンおよび放射性物質などが挙げられる。
【００４７】
さらに、標識物質を結合させた抗体を用いて標的蛋白質に結合した抗体量を直接測定する方法以外に、標識物質を結合させた二次抗体を利用する方法や二次抗体と標識物質を結合させたポリマーを利用する方法などの間接的検出方法を利用することもできる。ここで「二次抗体」とは、上記本発明の抗体に特異的な結合性を示す抗体である。例えば、上記本発明の抗体をウサギ抗体として調製した場合には、二次抗体として抗ウサギＩｇＧ抗体を使用することができる。ウサギ、ヤギ、マウスなどの様々な生物種に由来する抗体に対して、使用可能な標識二次抗体が市販されており、本発明の抗体の由来する生物種に応じて、適切な二次抗体を選択し、本発明において使用することができる。二次抗体に代えて、標識物質を結合させたプロテインＧやプロテインＡなどを用いることも可能である。
【００４８】
アスペルギルス  フミガーツス感染症の患者以外の者、すなわち、アスペルギルス  フミガーツス感染症が認定されていない者を対象として、上記方法を実施して得られた情報は、アスペルギルス  フミガーツス感染症の罹患の有無の判定評価等に利用できる。一方、アスペルギルス  フミガーツス感染症の患者を対象として、上記方法を実施して得られた情報は、当該患者の病態の評価ないし把握、治療効果の評価などに利用できる。例えば、アスペルギルス  フミガーツス感染症の治療と並行して本発明の方法を実施すれば、結果として得られる情報を基に治療効果を評価することができる。具体的には、薬剤投与後に本発明の方法を実施することで患者から分離された生体試料におけるＹＭＡＦ１蛋白質の存在の有無、存在量の変化を調べ、当該存在量の増減の推移から治療効果を判定することができる。このように本発明の方法を治療効果のモニターに利用してもよい。
【００４９】
被検体におけるアスペルギルス  フミガーツス感染症の検査は、通常、医師（医師の指示を受けた者も含む。以下同じ。）によって行われるが、本発明の方法によって得られる、生体試料におけるＹＭＡＦ１蛋白質の存在に関するデータは、医師による診断に役立つものである。よって、本発明の方法は、医師による診断に役立つデータを収集し、提示する方法とも表現しうる。
【００５０】
＜アスペルギルス  フミガーツス感染症の検査用組成物＞
また、本発明は、前記ＹＭＡＦ１蛋白質に対する抗体を含む、アスペルギルス  フミガーツス感染症を検査するための組成物を提供する。本発明の検査用組成物に用いる抗体は、上記した通り、標識したものであってもよい。本発明の検査用組成物は、抗体成分の他、組成物として許容される他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩、標識化合物、二次抗体などが挙げられる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ−マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはアジ化ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
【００５１】
また、上記本発明の検査用組成物の他、標識の検出に必要な基質、陽性対照や陰性対照、あるいは試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等を組み合わせることができ、アスペルギルス  フミガーツス感染症の検査用キットとすることもできる。また、標識されていない抗体を抗体標品とした場合には、当該抗体に結合する物質（例えば、二次抗体、プロテインＧ、プロテインＡなど）を標識化したものを組み合わせることができる。さらに、かかるアスペルギルス  フミガーツス感染症の検査用キットには、当該キットの使用説明書を含めることができる。
【００５２】
＜アスペルギルス  フミガーツス感染症の予防・治療用組成物並びに予防・治療方法＞
後述の実施例において示す通り、本発明者らは、ＹＭＡＦ１蛋白質がアスペルギルス  フミガーツスの病原性に関与し、当該蛋白質に対する抗体を投与することによって、アスペルギルス  フミガーツス感染症に罹患したマウスの生存率が向上することを明らかにした。
【００５３】
したがって、本発明は、前記ＹＭＡＦ１蛋白質に対する抗体を含む、アスペルギルス  フミガーツス感染症を予防又は治療するための組成物を提供する。
【００５４】
本発明の、アスペルギルス  フミガーツス感染症を予防又は治療するための組成物に含有される抗体には、前述の他、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および、これら抗体の機能的断片が含まれ、これらの中では、副作用低減の観点から、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体が望ましい。
【００５５】
本発明において「キメラ抗体」とは、ある種の抗体の可変領域とそれとは異種の抗体の定常領域とを連結した抗体である。キメラ抗体は、例えば、抗原をマウスに免疫し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（可変領域）を切り出して、ヒト骨髄由来の抗体定常部（定常領域）遺伝子と結合し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより取得することができる（例えば、特開平８−２８０３８７号公報、米国特許第４８１６３９７号公報、米国特許第４８１６５６７号公報、米国特許第５８０７７１５号公報）。また、本発明において「ヒト化抗体」とは、非ヒト由来の抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ）の遺伝子配列をヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）した抗体であり、その作製方法は、公知である（例えば、ＥＰ２３９４００、ＥＰ１２５０２３、ＷＯ９０／０７８６１、ＷＯ９６／０２５７６参照）。本発明において、「ヒト抗体」とは、すべての領域がヒト由来の抗体である。ヒト抗体の作製においては、免疫することで、ヒト抗体のレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を利用することが可能である。ヒト抗体の作製手法は、公知である（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６２，２５５−２５８、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９５，１３，６５−９３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９１，２２２，５８１−５９７、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９７，１５，１４６−１５６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，９７：７２２−７２７、特開平１０−１４６１９４号公報、特開平１０−１５５４９２号公報、特許２９３８５６９号公報、特開平１１−２０６３８７号公報、特表平８−５０９６１２号公報、特表平１１−５０５１０７号公報）。
【００５６】
本発明の予防・治療用組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤などとして、経口的または非経口的に使用することができる。
【００５７】
これら製剤化においては、薬理学上もしくは飲食品として許容される担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。
【００５８】
本発明の予防・治療用組成物は、アスペルギルス  フミガーツス感染症の予防または治療に用いられる公知の組成物と併用してもよい。かかる公知の組成物としては、例えば、アゾール系抗真菌薬、エキノキャンディン系抗真菌薬が挙げられる。また、アスペルギルス  フミガーツスが日和見的に感染するおそれのある患者に対する薬剤（例えば、臓器移植の際およびその後等に用いられる免疫抑制剤、抗がん剤、ＨＩＶ治療薬）と併用してもよい。
【００５９】
本発明の予防・治療用組成物を投与する場合、その投与量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類などに応じて、適宜選択される。例えば、１回当たりの本発明の予防・治療用組成物の投与量は、一般に、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００６０】
本発明は、このように、本発明の組成物をアスペルギルス  フミガーツス感染症の患者やアスペルギルス  フミガーツスに感染するおそれのある患者に投与することにより、アスペルギルス  フミガーツス感染症を予防または治療することができる。したがって、本発明は、前記ＹＭＡＦ１蛋白質に対する抗体を投与する工程を含む、アスペルギルス  フミガーツス感染症を予防又は治療するための方法も提供することができる。
【００６１】
本発明の予防・治療用組成物の製品（医薬品）またはその説明書は、アスペルギルス  フミガーツス感染症を予防または治療するために用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品または説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。
【００６２】
＜アスペルギルス  フミガーツス感染症の予防・治療・検査用化合物のスクリーニング方法＞
さらに、本発明は、被験化合物をＹＭＡＦ１蛋白質又はその一部に接触させ、ＹＭＡＦ１蛋白質又はその一部に結合する化合物を選択する工程を含む、アスペルギルス  フミガーツス感染症の検査、予防又は治療をするための化合物のスクリーニング方法をも提供するものである。
【００６３】
本発明のスクリーニング方法において使用する「被験化合物」としては特に制限はなく、例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液及び培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。
【００６４】
また、ここで用いる「ＹＭＡＦ１蛋白質」は、例えば、配列番号：３２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号：５４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＸＰ＿７３１４８７．１で特定されるアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。さらに、ＹＭＡＦ１蛋白質の一部としては特に制限はないが、細胞外領域であるＹＭＡＦ１蛋白質の１〜３３位のアミノ酸配列からなるポリペプチド（例えば、配列番号：３３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド）であることが好ましい。
【００６５】
ＹＭＡＦ１蛋白質又はその一部は、必要に応じて、検出を容易にするための他の蛋白質（例えば、アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ等の酵素、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）等の蛍光蛋白質）との融合蛋白質として用いることもできる。
【００６６】
ＹＭＡＦ１蛋白質又はその一部は、精製された蛋白質として用いることもでき、また、細胞などに発現させた蛋白質として用いることもできる。
【００６７】
被験化合物のＹＭＡＦ１蛋白質又はその一部への接触は、精製蛋白質を含む系への添加や当該蛋白質を発現させた細胞を培養する培養液への添加などにより行うことができる。また、被験化合物とＹＭＡＦ１蛋白質又はその一部との結合は、公知の手法、例えば、免疫共沈降法、酵母ツーハイブリッドシステム、ＥＬＩＳＡ法、表面プラズモン共鳴現象を利用した検出装置（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（ＧＥヘルスケア社製））を用いた方法、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した方法により検出することができる。
【００６８】
アスペルギルス  フミガーツス感染症の予防又は治療をするための化合物のスクリーニングにおいては、前記（ａ）および（ｂ）の工程に加えて、さらに、前記（ｂ）の工程において選択されたＹＭＡＦ１蛋白質又はその一部に結合する化合物がアスペルギルス  フミガーツスの病原性を抑制する活性を有するかどうかを解析する工程を実施してもよい。アスペルギルス  フミガーツスの病原性を抑制する活性を有するかどうかを解析する方法としては、後述の実施例において示すような、前記化合物を添加した培地においてアスペルギルス  フミガーツスを培養した際に、前記化合物を添加していない培地における培養と比較して、当該アスペルギルス  フミガーツスのアグリゲーションや胞子形成能が低下しているかどうかを解析する方法が挙げられる（実施例４  参照）。また、実験的マウスアスペルギルス症（侵襲性アスペルギルスモデルマウス）に前記化合物を投与し、前記化合物の非投与例と比較して、生存率が向上するかどうかを解析する方法が挙げられる（実施例６  参照）。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００７０】
（実施例１）  ＳＳＴ−ＲＥＸの実施
アスペルギルス  フミガーツスの細胞表面に発現している膜蛋白質又は分泌蛋白質をコードする遺伝子の情報を網羅的に得るためにＳＳＴ−ＲＥＸを実施した。【００７１】
（１）ｃＤＮＡの作製
アスペルギルス  フミガーツス臨床分離株ＭＦ−１３の分生子をＹＰＤ培地３７℃で３日間培養した。培養により分生子から菌糸体が形成され、さらに当該菌糸体を直径約５〜１０ｍｍの糸状に増殖させた。そして、アスペルギルス  フミガーツスを集菌した後に、当該菌からトータル（ｔｏｔａｌ）  ＲＮＡを調製した。そして、このトータルＲＮＡを材料にファストトラック２．０  ｍＲＮＡ  ｍＲＮＡ分離キット（ＦａｓｔＴｒａｃｋ２．０  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、＃Ｋ１５９３−０２）を用いて、ｍＲＮＡ  １２μｇを得た。次いで、スーパースクリプト（ＴＭ）チョイスシステム（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（ＴＭ）  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ、ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社製、＃１８０９０−０１９）を用いて、得られたｍＲＮＡ３μｇから２本鎖ｃＤＮＡの作製を行った。【００７２】
（２）ｐＭＸ−ＳＳＴベクターへのｃＤＮＡ配列の組み込み（キメラ化）
レトロウイルスベクターｐＭＸ−ＳＳＴに得られたｃＤＮＡを組み込むためにｐＭＸ−ＳＳＴベクター（Ｋｏｊｉｍａ  Ｔ．およびＫｉｔａｍｕｒａ  Ｔ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９９年、１７巻、４８７〜４９０ページ  参照）５μｇを制限酵素ＢｓｔＸＩを用いて、１００μｌの反応系で４５℃で４時間切断処理した。反応液すべてを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ベクター部位に相当する約５０００塩基の長さのＤＮＡ断片を切り出した。さらにウィザード（登録商標）ＳＶゲル及びＰＣＲクリーンアップシステム（Ｗｉｚａｒｄ（Ｒ）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ、ｐｒｏｍｅｇａ社製、＃Ａ９２８２）を用いて、約５０００塩基の長さのＤＮＡ断片を精製した。このようにして得られたＤＮＡ断片をｐＭＸ−ＳＳＴベクターをＢｓｔＸＩで制限酵素処理したものとし、これを１μｌ当たり５０ｎｇ含む水溶液となるよう調製した。【００７３】
先に調製した２本鎖ｃＤＮＡは、平滑末端であり、ＢｓｔＸＩで制限酵素処理したｐＭＸ−ＳＳＴと直接結合させることはできない。そこで、２本鎖ｃＤＮＡの両端にＢｓｔＸＩの制限酵素切断後のＤＮＡ配列を持たせるための作業を行った。ＢｓｔＸＩアダプター（ＢｓｔＸＩ  Ａｄａｐｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社製、＃Ｎ４０８−１８）９μｇを１０μｌの水に溶かし、さらに当該ＢｓｔＸＩ  Ａｄａｐｔｅｒ水溶液に２本鎖ｃＤＮＡを溶かした。これにライゲ―ションハイ（ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ、ＴＯＹＯＢＯ社製、＃ＬＧＫ−２０１）を５μｌ添加し、懸濁して、１６℃で１６時間反応させて、ＢｓｔＸＩ  Ａｄａｐｔｅｒと２本鎖ｃＤＮＡとを結合させた。そして、このように調製して得られたＤＮＡを１．５％のアガロースゲルにて電気泳動した。その後、約５００塩基〜約４０００塩基の長さを持った２本鎖ｃＤＮＡ断片とＢｓｔＸＩ  Ａｄａｐｔｅｒとの結合体を含んだゲルを切り出し、Ｗｉｚａｒｄ（Ｒ）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、２本鎖ｃＤＮＡとＢｓｔＸＩ  Ａｄａｐｔｅｒとの結合体を精製した。【００７４】
次いで、ＢｓｔＸＩで制限酵素処理したｐＭＸ−ＳＳＴベクター５０ｎｇ、前記にて精製して得られた２本鎖ｃＤＮＡとＢｓｔＸＩ  Ａｄａｐｔｅｒとの結合体の全量およびＴ４  ＤＮＡライゲース（ｌｉｇａｓｅ）を、２０μｌの反応系にて室温で３時間処理し、ｐＭＸ−ＳＳＴベクターをＢｓｔＸＩで制限酵素処理したものと前記結合体とを結合させた。なお、反応液の組成は能書にしたがって調整した。【００７５】
（３）ｃＤＮＡライブラリの増幅
ｐＭＸ−ＳＳＴベクターを用いて構築したｃＤＮＡライブラリを大腸菌に導入して増幅を行った。ｃＤＮＡライブラリに、５μｇのｔＲＮＡ、１２．５μｌの７．５Ｍ酢酸ナトリウムおよび７０μｌのエタノールを加え、転倒混和した後、２０，４００×ｇで３０分遠心し、上清を捨て沈殿を得た。得られた沈殿に５００μｌの７０％エタノールを加え、２０，４００×ｇで５分遠心し、上清を捨て得られた沈殿を６μｌの水に溶かした。ｃＤＮＡを大腸菌内で増幅させるために、そのうちの２μｌを、コンピテントセル（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、＃１８９２０−０１５）２３μｌと混ぜ、１．８ｋＶの条件でエレクトロポレーションを行い、１ｍｌのＳＯＣ培地に全量を懸濁した。この作業を２回行い、大腸菌を懸濁したＳＯＣ培地を３７℃で９０分間、振とう培養した。その後、この培養溶液全量を、培地１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを含むＬＢ培地３００ｍｌに投入し、３７℃で１６時間、振とう培養した。なお、ＬＢ培地の組成は、トリプトン  １％（ｗ／ｖ）、酵母エキス  ０．５％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム  １％（ｗ／ｖ）である。【００７６】
また、ｃＤＮＡライブラリの大腸菌への導入数およびｐＭＸ−ＳＳＴベクターと結合したｃＤＮＡの鎖長を確認するために、培養液３μｌを取り出し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にプレーティングした。その結果、３μｌをプレーティングしたＬＢ寒天培地に２８０個のコロニーの生育が見られた。これにより培養液５００ｍｌ中に２．８×１０７個の独立したｃＤＮＡライブラリがあると考えられた。【００７７】
また、コロニーのうち任意の１６個についてプラスミドを抽出し、制限酵素ＢｓｔＸＩで制限酵素処理し、処理物を１％アガロースゲルにて電気泳動を行い、ｐＭＸ−ＳＳＴベクター上のｃＤＮＡの長さを計測した。その結果、平均値は約１２００塩基であった。【００７８】
そして、残りの培養液から集菌し、ヌクレオボンド（登録商標）ＡＸ５００カラム（ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（Ｒ）  ＡＸ  ５００  ｃｏｌｕｍｎｓ、日本ジェネティクス社製、＃７４０５７４）を用いてプラスミドを精製し、増幅されたｃＤＮＡライブラリ系を確立した。【００７９】
（４）ｃＤＮＡライブラリのパッケージングおよびＳＳＴ−ＲＥＸ法の実施
ｃＤＮＡライブラリ由来遺伝子が組み込まれたｐＭＸ−ＳＳＴレトロウイルスベクターＲＮＡを含むレトロウイルスを産生させるため、ウイルスパッケイジング細胞Ｐｌａｔ−Ｅ（Ｍｏｒｉｔａ  Ｓ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２０００年６月、７巻、１２号、１０６３〜１０６６ページ  参照）２×１０６個を、４ｍｌのＤＭＥＭ培地（Ｗａｋｏ社製、＃０４４−２９７６５）を含む６ｃｍディッシュに懸濁し、３７℃で５％ＣＯ２の条件で２４時間培養した。一方、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製、＃３１９８５０７０）と９μｌのヒュージーン（Ｆｕｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅ社製、＃１８１４４４３）を混ぜ、５分室温で放置後、３μｇのｃＤＮＡライブラリを添加し、１５分室温で放置した。ｃＤＮＡライブラリを含む溶液を、培養後のＰｌａｔ−Ｅ細胞に滴下し、２４時間後に上清を入れ替えて同一条件で培養を続けた。さらに２４時間後の上清を０．４５μｍのフィルターを通してろ過した。【００８０】
この取得したろ過上清０．５ｍｌを、４×１０６個のＢａ／Ｆ３細胞を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（コージンバイオ株式会社製）９．５ｍｌが入れられた１０ｃｍディッシュ中に加えた。【００８１】
さらに１０μｌのポリブレン（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製、＃ＴＲ−１００３−Ｇ）と１０ｎｇのＩＬ−３とを添加し、２４時間培養した。その後、細胞を３回ＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄し、新しいＲＰＭＩ−１６４０培地２００ｍｌに懸濁して９６ウェルプレート２０枚に均等分量になるようにまき、Ｂａ／Ｆ３細胞の自律増殖能に基づくセレクションおよびクローニングを試みた。１０日後〜２０日後までに増殖が見られた細胞をＳＳＴ−ＲＥＸに基づいて選抜されたものとし、該細胞が各ウェル全体に増殖するまでさらに培養を続けた。【００８２】
（５）ＳＳＴ−ＲＥＸで得られた遺伝子産物の解析
各ウェルから得られた細胞の半分量は拡大培養して、細胞ストックとした。さらに、細胞ストックからの細胞を培養して、組み込まれたｃＤＮＡ由来のペプチド分子を細胞外に発現するトランスフェクタントＢａ／Ｆ３細胞を、抗体作製のための免疫源細胞として、また、スクリーニング対象の細胞として用いた。各ウェルから得られた細胞の残り半分からはゲノムを抽出してシークエンスを行い、導入されたｃＤＮＡ由来の遺伝子を解析した。シークエンスにおいては、得られたゲノムに対して、プライムスター  マックス  ＤＮＡポリメラ―ゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＭＡＸ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＴａＫａＲａ社製、＃Ｒ０４５Ａ）を用いて、ＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲには以下の配列からなるプライマーを用いた。
ＳＳＴ３’側−Ｔ７  ５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＣＧＣＡＧＣＴＧＴＡＡＡＣＧＧＴＡＧ−３’（配列番号：３４）
ＳＳＴ５’側−Ｔ３  ５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡ−３’（配列番号：３５）。【００８３】
そして、得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ（Ｒ）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍなどを用いて精製した。その後、精製したＰＣＲ産物について、ビッグダイターミネーターｖ３．１サイクルシークエンシング（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＡＢＩ社製、＃４３３７４５６）およびＤＮＡシークエンサーＡＢＩ３１００ＸＬを用いて、シークエンスを行った。なお、シークエンスのプライマーには以下のものを用いた。
ＳＳＴ５’側−Ｔ３  ５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡ−３’（配列番号：３５）。【００８４】
得られたシークエンスデータは、ＢＬＡＳＴ検索（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）とＳｉｇｎａｌＰ  ３．０  Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を利用して解析した。【００８５】
上記の通り、細胞を材料として、ＳＳＴ−ＲＥＸ法を実施した結果、４０７個のトランスフェクタントＢａ／Ｆ３細胞からのｃＤＮＡ由来の遺伝子のシークエンスを行い、異なる遺伝子７５種類を取得できた。遺伝子解析に供したトランスフェクタントＢａ／Ｆ３細胞系には、ｃＤＮＡ由来の遺伝子１種類のみ含まれていることを確認し、以降の実験に供した。以後このようにして得られたｃＤＮＡ由来遺伝子を含む細胞を「ＳＳＴクローン細胞」と称する。【００８６】
（実施例２）  ＹＭＡＦ１遺伝子のクローニングと発現系の構築
（１）発現遺伝子の同定とクローニング
実施例１のＳＳＴ−ＲＥＸ法で得られた分泌蛋白質、膜蛋白質をコードすると考えられる遺伝子に対し、アスペルギルス  フミガーツスのゲノムデータベースに記載されているアノテーション（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）情報などから対応遺伝子を同定した。同定された多くの遺伝子がデータベース上の情報では機能不明であったが、得られた遺伝子を含むＳＳＴクローン数を考慮し、該遺伝子を含むＳＳＴクローン細胞が最多数とれて、発現量が高いと考えられた遺伝子  ＹＭＡＦ１（ＹＰＤ  ｍｅｄｉｕｍ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｊｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、ＳＳＴクローン細胞コード：ＡＣＴ０７３−５０２）をターゲットとした。【００８７】
ＹＭＡＦ１遺伝子はデータベース上では分子量約２３ＫＤａの保存された仮想蛋白質（Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする遺伝子であり、相同性検索では、Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓにおいて本遺伝子と相同性６０％の遺伝子が存在するが、Ａ．ｆｌａｖｕｓ、Ａ．ｎｉｇｅｒおよびＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓでは相同性の高い遺伝子は存在しなかった。【００８８】
次に、アスペルギルス  フミガーツス  ｍＲＮＡよりｏｌｉｇｏ−ｄＴをテンプレートとして逆転写酵素により１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成し、ＹＭＡＦ１遺伝子のコーディング領域をＰＣＲ法により増幅し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  IIへクローニングした。【００８９】
なお、得られたＹＭＡＦ１遺伝子及び当該遺伝子がコードする蛋白質は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ  ＡＦ２９３  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＵＡ＿６Ｇ００６９０），ｐａｒｔｉａｌ  ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＸＭ＿７２６３９４．１）およびｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ［Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ  Ａｆ２９３］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＸＰ＿７３１４８７．１）と、各々塩基配列にて３箇所、アミノ酸配列にて１箇所の違いが見られたが、そのほかの配列は同じであった（図１  参照）。【００９０】
（２）  出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）発現系による組換え蛋白質の作製
クローニングしたＹＭＡＦ１遺伝子をＨＡ  ｔａｇを蛋白質のＣ末端に付加するｐＡＤＨ−ＨＡ発現ベクターに挿入し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入した。このように調製したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの培養上清を回収後、抗ＨＡ抗体で免疫沈降し、抗ＨＡ−抗体で分泌蛋白質を検出するウエンスタンブロットに供した。その結果、約２３ＫＤａのバンドが確認された（図２  参照）。【００９１】
（３）  大腸菌による組換え蛋白質の作製
ＹＭＡＦ１遺伝子をコードする領域をｐＧＥＸ−６Ｐ−１−Ｈｉｓ６ａ−Ｆｌａｇベクターにクローニングし、大腸菌で発現させて大量培養を行った。培養して得られた菌を緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  グリセロール）に懸濁し、超音波破砕処理を施して、可溶性画分を得た。次いで、このようにして調製した可溶性画分からＹＭＡＦ１とＧＳＴとの融合蛋白質を、グルタチオン  セファロース（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムにより精製した。そして、このように精製した組換え蛋白質を、ウサギによるポリクローナル抗体作製、ウエスタンブロット、サンドイッチＥＬＩＳＡのコントロールに使用した。また、前記超音波破砕処理における不溶性画分は８Ｍ  ウレアにて処理し、その可溶性画分も回収した。なお、この大腸菌の発現系においては、超音波破砕処理における可溶性画分、不溶性画分（前記８Ｍ  ウレア可溶性画分）のいずれからも分子量約６０ＫＤａのＹＭＡＦ１とＧＳＴとの融合蛋白質の発現が確認された（図３および４  参照）。【００９２】
（実施例３）  ＹＭＡＦ１抗体の作製
（１）ポリクローナル抗体
実施例２（３）に記載のＹＭＡＦ１遺伝子をクローニングしたベクターを大腸菌ＢＬ２１に導入し、前記組換え蛋白質を過剰発現させて精製した。すなわち、１Ｌの三角フラスコにＬＢ培地を１００ｍＬ入れ、前培養した培養液のうち１００分の１量をさらに加えて３７℃で振とう培養を行った。次いで、Ｏ．Ｄ．６００＝０．７になった時点でＩＰＴＧを終濃度１ｍＭになるよう培養液に入れ、３７℃でさらに３時間の振とう培養を行った。そして、得られた大腸菌体に２ｍＬ程度のＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）を加え、過熱せぬよう氷上でソニケーションを行った。次いで、先と同じＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファーでペレットを洗い、再度ソニケーションを行った。この作業を３回繰り返して前記組換え蛋白質の濃縮を行った。そして、濃縮した蛋白質溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、前記組換え蛋白質の部分をゲルから切り出して破砕した後、ＰＢＳバッファーに漬け、１００Ｖで１昼夜通電し、ゲルから溶出させた。次いで、溶出した蛋白質をアミコンウルトラ（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、カタログ番号：ＵＦＣ９０１０９６）にて濃縮し、１ｍｇ／ｍＬになるよう調製し、免疫原蛋白質とした。【００９３】
免疫動物はＳＰＦ日本白色ウサギ（ＳＰＦ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｗｈｉｔｅ  Ｒａｂｂｉｔ）を使用した。免疫賦活剤であるタイターマックスゴールド（ＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ、Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、ＡＬＸ−５１０−００２−Ｌ０１０）１００μＬと等量のＹＭＡＦ１蛋白質溶液（１ｍｇ／ｍＬ）１００μＬとを混和した。このようにして得られた乳化した免疫原を皮下に１羽当たり毎回２００μＬ、隔週で１回、合計６回投与注入し免疫した。免疫後のウサギより採血し、遠心分離機で血清を採取した。【００９４】
また、活性型ＣＮＢｒ−アガロースカラム３ｍｌに１０ｍｇのＧＳＴ蛋白質を結合させ、血清に含まれる抗ＧＳＴ抗体吸収カラムを作製した。そして、該カラムに採取した血清を添加し、ペリスタポンプで一晩循環させた。翌日、ＧＳＴカラムを洗浄し、抗ＧＳＴ抗体を溶出した。さらにカラムスルーの血清に対して同作業を３回繰り返し、抗ＧＳＴ抗体を吸収させた（除去した）血清（抗ＧＳＴ抗体除去血清）を取得した。なお、ＧＳＴを固相化したＥＬＩＳＡプレートに対し当該血清を反応させ、抗ＧＳＴ抗体活性が消失している事を確認した。【００９５】
次に、抗ＧＳＴ抗体除去血清をプロテインＡセファロース（ＧＥヘルスケア社製、１７−１２７９−０３）、ＭＡＰＳ−II結合バッファー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、１５３−６１６１）および１Ｍ  Ｌ−Ａｒｇ溶出バッファーを用いて精製した。そして、溶出されたウサギＩｇＧをＰＢＳにて透析し、精製抗体画分（以後、「抗ＹＭＡＦ１ポリクローナル抗体」とも称する）を得た。また、得られた精製抗体画分について、ＧＳＴ蛋白質を固相化したＥＬＩＳＡプレートおよびＹＭＡＦ１蛋白質を固相化したＥＬＩＳＡプレートにて反応性試験を実施し、ＹＭＡＦ１蛋白質固相化ＥＬＩＳＡプレートに特異的に反応を示すことを確認した。【００９６】
なお、ＹＭＡＦ１蛋白質固相化ＥＬＩＳＡプレートは、マキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ＮＵＮＣ社製、９８４６８８）に５μｇ／ｍＬの濃度になるようＰＢＳにて希釈したＹＭＡＦ１蛋白質溶液を５０ｍＬ添加し、４℃で一晩静置し、翌日反応液を捨て４％  ＢＳＡおよび５％スクロースを含むＰＢＳ溶液を添加し、さらに４℃で一晩静置して翌日に反応液を捨てドラフトで乾燥させて作製した。【００９７】
また、ＥＬＩＳＡ反応は、各蛋白質を固相化したＥＬＩＳＡプレートに対して、一次抗体を１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬになるようＰＢＳにて希釈して調製し、５０μＬ／ウェルで添加した。次いで、１時間室温で反応させた後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて洗浄し、酵素標識二次抗体（ＭＢＬ  ４５８）を添加し、さらに室温で１時間反応させた。反応後０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて洗浄し、ＴＭＢ酵素基質を添加し、２０分後１．５Ｎリン酸溶液にて反応を停止し、プレートリーダーでＡ４５０ｎｍ吸光度を測定した。【００９８】
（２）モノクローナル抗体
免疫動物はマウスＢＡＬＢ/ｃを使用し、まず、免疫賦活剤として、ＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄを等量のＰＢＳと混和して乳化したもの５０μｌをＢａｌｂ／ｃマウスに投与した。翌日、抗原遺伝子を有するＳＳＴクローン細胞（ＡＣＴ０７３−５０２）を免疫原細胞として５×１０６個投与し、さらに免疫原細胞を２日おきに４回注入した。最初の免疫から約２週間後、摘出した二次リンパ組織をすりつぶし、抗体産生細胞を含む細胞集団を得た。それらの細胞と融合パートナー細胞とを混合し、ポリエチレングリコール（ＭＥＲＣＫ社製、１．０９７２７．０１００）を用いた細胞融合によりハイブリドーマを作製した。なお、融合パートナー細胞としては、マウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１）を用いた。【００９９】
作製したハイブリドーマは、選択培地ＨＡＴ（ＳＩＧＭＡ社製、Ｈ０２６２）、５％  ＢＭコンディムド（ＢＭ−ｃｏｎｄｉｍｅｄ、Ｒｏｃｈｅ社製、６６３５７３）、１５％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトイマイシン溶液（ＧＩＢＣＯ社製、１５１４０−１２２、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ、以降「Ｐ／Ｓ」と略す）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｗａｋｏ社製）選択培地で１０〜１４日間培養した。次に、一次スクリーニングとして、フローサイトメトリーにより免疫原細胞ＡＣＴ０７３−５０２に反応し、抗原遺伝子を含まないＳＳＴクローン細胞を陰性コントロール細胞として用い、これに反応しないハイブリドーマを選択した。このハイブリドーマをＨＴ（ＳＩＧＭＡ社製、Ｈ０１３７）、Ｔ−２４細胞の培養上清３０ｍｌを含む１５％ＦＢＳ、終濃度１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＰ／Ｓ入りＤ−ＭＥＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、８０２９３１）選択培地で拡大培養した後、二次スクリーニングとして、再度フローサイトメトリーによりＡＣＴ０７３−５０２細胞に反応し、これ以外のＢａ／Ｆ３由来細胞（ネガティブコントロール）に反応しないハイブリドーマを選択した（図５〜８  参照）。【０１００】
この結果１Ｂ４Ｃ、２Ｇ１１ＧＢ５、３Ｇ４ＦＢ７、４Ｂ６Ｍ２ＧＫの４クローンが得られ、これらを単クローン化した後、抗体のアイソタイプをアイソストリップキット（Ｒｏｃｈｅ社製、１４９３０２７）を用いて決定した。すなわち、１Ｂ４Ｃ抗体のアイソタイプはＩｇＭであり、２Ｇ１１ＧＢ５抗体のアイソタイプはＩｇＧ３／κであり、３Ｇ４ＦＢ７抗体のアイソィプはＩｇＧ３／κであり、４Ｂ６Ｍ２ＧＫ抗体のアイソタイプはＩｇＧ１／κであった。【０１０１】
なお、得られた各抗体の単クローン化したハイブリドーマから精製抗体を得る際は、無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ：ＧＩＢＣＯ社製、１２０４５−０７６）に馴化して拡大培養した後、一定期間培養して培養上清を得た。この培養上清に含まれるＩｇＧ画分をプロテインＡセファロース（ＧＥヘルスケア社製、１７−１２７９−０３）、ＭＡＰＳ−II結合バッファー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、１５３−６１６１）および１Ｍ  Ｌ−Ａｒｇ溶出バッファーを用いて精製した。溶出されたＩｇＧをＰＢＳにて透析し、精製抗体画分を得た。ＩｇＭである１Ｂ４ＣについてはＭＥＰハイパーセル（ＭＥＰ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌｌ、Ｂｉｏｓｅｐｒａ社製）、酢酸、酢酸ナトリウムを用いて精製し、溶出されたＩｇＧをＰＢＳにて透析し、精製抗体画分を得た。【０１０２】
また、各抗体については、実施例２（３）にて調製した組換え蛋白質を用いたウェスタンブロットにより、ＹＭＡＦ１蛋白質に対する特異性・結合性を確認した（図９  参照）。【０１０３】
（実施例４）  ＹＭＡＦ１遺伝子の機能解析
ＹＭＡＦ１遺伝子がコードする蛋白質の機能を解析するために、アスペルギルス  フミガーツスのＹＭＡＦ１遺伝子破壊株並びにその相補性株を図１０に示すコンストラクトに基づき作製した。なお、これらの株の作製には、ファンガル  ジェネティクス  ストック  センター（Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ）から臨床分離株Ｄ１４１に由来するＡｆｓ３５を購入して用いた。この株はａｋｕＡ遺伝子が欠失されており相同組換えの頻度が高くなっている。【０１０４】
（１）ＹＭＡＦ１遺伝子破壊株の作製
ＹＭＡＦ１遺伝子を破壊するために用いたＤＮＡ断片（ＹＭＡＦ１遺伝子破壊用ＤＮＡ断片）については、先ず、精製したＡｆｓ３５株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＹＭＡＦ１遺伝子の５’側の非コーディング領域約５００ｂｐと３’側の非コーディング領域約５００ｂｐをＰＣＲにて増幅し、薬剤耐性遺伝子（ハイグロマイシンチミジンキナーゼ融合蛋白質）の両側に連結してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  IIへクローニングした。そして、得られたプラスミドが期待される組換え体であることをシークエンスにより確認した後、それを鋳型としてＰＣＲ法にて増幅することにより、ＹＭＡＦ１遺伝子破壊用ＤＮＡ断片を調製した。【０１０５】
Ａｆｓ３５株を培養した後、細胞壁を酵素処理により消化し、プロトプラストを調製した。その後、ＣａＣｌ２とＰＥＧとを用いてＹＭＡＦ１遺伝子破壊用ＤＮＡ断片を該プロトプラストに導入し、寒天培地に播き、ハイグロマイシン２００μｇ／ｍｌで選択した。そして、３０℃で培養して出現したコロニーを分離した後、それぞれの胞子を直接ＰＣＲにかけて遺伝子破壊株を同定した。【０１０６】
その結果、ＹＭＡＦ１遺伝子破壊株（ｄ−ＹＭＡＦ１株）として、選択培地で分離して解析した９株のうち６株を得ることができた。なお、このように７割弱の株が相同組換え体として得られたのは、親株として用いたＡｆｓ３５株のａｋｕＡ遺伝子産物のＫｕ７０蛋白質が欠損しているために高頻度で得られたものと考えられる。【０１０７】
（２）ＹＭＡＦ１遺伝子相補株の作製
ＹＭＡＦ１遺伝子破壊株クローンｄ−ＹＭＡＦ１を用い、ＹＭＡＦ１遺伝子相補株（ＹＭＡＦ１−ｃｏｍｐ）を作製した。すなわち先ず、ＹＭＡＦ１遺伝子のプロモーターを含む５’領域およびＹＭＡＦ１遺伝子のＣ末端に３ｘＨＡペプチドタグを付加し、その下流にピリチアミン（ｐｙｒｉｔｈｉａｍｉｎｅ）耐性遺伝子を連結したプラスミドｐＣＲ４−ＹＭＡＦ１ｃｏｍｐ−３ＨＡ−ｐｔｒＡを作製した。そして、このプラスミドを鋳型として遺伝子導入に用いるＤＮＡ断片をＰＣＲ法によって作製し、このＤＮＡ断片をＣａＣｌ２とＰＥＧとを用いてＡｆｓ３５株に導入し、寒天培地に播き０．２μｇ／ｍｌ  ｐｙｒｉｔｈｉａｍｉｎｅにて選択し遺伝子導入株を得た。また、得られた株からＲＴ−ＰＣＲおよびサザンハイブリダイゼーション法により、相補株を同定した。得られた結果を図１１および図１２に示す。【０１０８】
なお、サザンハイブリダイゼーションは、親株Ａｆｓ３５、遺伝子欠損株、遺伝子相補株からＤＮｅａｓｙプラントミニキット（ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてゲノムＤＮＡを調製し，制限酵素ＢａｍＨＩにて消化して１％アガロースゲル電気泳動にて分離した後、サザンブロット法に供した。またプローブ（図１０に記載の「ｐｒｏｂｅ  Ａ」および「ｐｒｏｂｅＨｐｈ」）は、ＡｌｋＰｈｏｓダイレクトラベリングキットおよびＣＤＰ−スター試薬（ＡｌｋＰｈｏｓ  ｄｉｒｅｃｔ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ  ａｎｄ  ＣＤＰ−Ｓｔａｒ  ｒｅａｇｅｎｔ、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にて標識したものを用いた。【０１０９】
ＲＴ−ＰＣＲによるＹＭＡＦ１  ｍＲＮＡの検出については、先ず親株Ａｆｓ３５、遺伝子欠損株、遺伝子相補株からＲＮＡｅａｓｙミニキット（ＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてトータルＲＮＡを調製した。次いで、調製したトータルＲＮＡをリバトラエース（ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ、Ｔｏｙｏｂｏ社製）にて逆転写し、得られたｃＤＮＡ断片を鋳型として、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ社製）にてＰＣＲを行い、２％アガロースゲル電気泳動にて分離した後、エチジウムブロミドにて増幅したＤＮＡを検出した。【０１１０】
図１１に示す通り、サザンハイブリダイゼーション法およびＲＴ−ＰＣＲによる解析によって、２株が期待される相補株であることがわかった。【０１１１】
また、図１２に示す通り、最少培地（ＡＭＭ）にて３７℃で培養したこれらの菌体からＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ法にてＹＭＡＦ１遺伝子の発現について調べたところ、ＹＭＡＦ１遺伝子破壊株（前記ｄ−ＹＭＡＦ１の６株のうちのひとつ：ｄ−ＹＭＡＦ１−７）では予想通りＹＭＡＦ１  ｍＲＮＡは検出できなかったが、親株Ａｆｓ３５およびＹＭＡＦ１遺伝子相補株（前記ＹＭＡＦ１−ｃｏｍｐの２株のうちのひとつ：ＹＭＡＦ１−ｃｏｍｐ−４）では、ＹＭＡＦ１の発現が確認された。【０１１２】
（３）各種培地での生育の比較
先ず、アスペルギルス最少（ＡＭＭ）培地、ＳＤ培地、ＰＤＡ培地、ＹＰＤ培地、Ｓｐｉｄｅｒ培地およびＹＧ培地、ならびにそれらにウシ新生仔血清を１０％加えた寒天培地を調製した。【０１１３】
なお、ＡＭＭ培地についてはＲ．Ｗ．Ｂａｒｒａｔｔら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９６５年、５２巻、２３３〜２４６ページ  参照のこと。また、ＡＭＭ培地に関しては、炭素源を変更した培地を調製して後述の培養に供した。すなわち図１３に示す通り、１％グルコース含有ＡＭＭ培地（ＡＭＭ＋ｇｌｕｃｏｓｅ）、２％スクロース含有ＡＭＭ培地（ＡＭＭ＋ｓｕｃｕｒｏｓｅ）、２％ソルビトール含有ＡＭＭ培地（ＡＭＭ＋ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、２％グリセロール含有ＡＭＭ培地（ＡＭＭ＋ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、０．２％ＢＳＡ含有ＡＭＭ培地（ＡＭＭ＋ＢＳＡ）を調製した。ＳＤ培地の組成は、酵母窒素ベース培地（アミノ酸を除く）（Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  （ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ））  ０．６７％、グルコース  ２％、補充アミノ酸およびピリミジン（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ）  ２０〜５０μｇ／ｍｌである。ＰＤＡ培地は、ジャガイモの煮汁（２００〜４００ｇ／Ｌ）に、グルコース  ２０ｇ、寒天  １５ｇを加えて調製した。ＹＰＤ培地の組成は、酵母エキス（Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）１％、ペプトン２％、グルコース２％である。Ｓｐｉｄｅｒ培地については、Ｈ  ＬｉＵら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９４年、２６６巻、５１９１号、１７２３〜１７２６ページ  参照のこと。ＹＧ培地については、Ｅｄｙｔａ  Ｓｚｅｗｃｚｙｋ１ら、ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２００７年、１巻、３１１１〜３１２０ページ  参照のこと。【０１１４】
そして、それら培地に、前記ｄ−ＹＭＡＦ１およびＹＭＡＦ１−ｃｏｍｐの胞子溶液を各々スポットし、２５℃、３０℃または３７℃にて３日培養し、これらの生育を親株Ａｆｓ３５と比較した。得られた結果を図１３〜１５に示す。また、ウシ血清を１０％加えたＳｐｉｄｅｒ培地における生育状況ならびに分生子の状態を観察した結果を図１６および１７に示す。【０１１５】
図１３および１４に示す通り、各種培地での生育速度には差は見られなかった。なお、図には示していないが、２５℃および３７℃の場合においても、図１３に示した３０℃の場合と同様に、アスペルギルスの生育状況に差はなかった。【０１１６】
しかしながら、図１５に示す通り、唯一１０％ウシ新生仔血清（ＦＢＳ）入りＳｐｉｄｅｒ培地にてコロニーの表面の状態に差が観察された。なお、図１６に示す通り、分生子頭の形態には差はなかった。【０１１７】
また、図１７に示す通り、１０％血清を添加したＰＤＡ培地にて２５℃で生育させた場合、ＹＭＡＦ１遺伝子欠損（破壊）株の胞子は白っぽく、胞子形成の状態も悪く、ＹＭＡＦ１遺伝子欠損株の胞子形成能が低下していることが示唆された。【０１１８】
次に、ＹＭＡＦ１蛋白質を欠損させたことにより、胞子形成能に差が生じることを確認するために、親株Ａｆｓ３５、ＹＭＡＦ１遺伝子欠損株、ＹＭＡＦ１遺伝子相補株を２５℃、３０℃または３７℃にて、最少培地（ＡＭＭ）で培養した後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ８０  ＰＢＳにて胞子を洗い落し、血球計算板で胞子数を数えた。得られた結果を図１８に示す。【０１１９】
図１８に示した結果から明らかなように、ＰＤＡ培地にて２５℃で生育させた場合に、ＹＭＡＦ１遺伝子欠損株の胞子形成能が低下することが明らかになった。【０１２０】
（４）ＹＭＡＦ１蛋白質の局在についての解析
ＹＭＡＦ１蛋白質の局在についての解析するために、先ずウエスタンブロットを行った。すなわち、最少培地ＡＭＭにて３７℃で培養した各菌体（Ａｆｓ３５、ｄ−ＹＭＡＦ１、ＹＭＡＦ１−ｃｏｍｐ）を液体窒素で凍結し破砕後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  グリセロールおよびプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ社製）に懸濁した。次いで、この懸濁液を遠心にかけ、得られた上清を細胞粗抽出液とし、得られた沈殿物を細胞壁等（細胞壁、細胞膜およびペリプラズム）の画分として調製した。そして、これらをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、次いで、抗ＹＭＡＦ１ポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法により、ＹＭＡＦ１蛋白質を検出した。得られた結果を図１９に示す。【０１２１】
図１９に示した結果から明らかなように、Ａｆｓ３５およびＹＭＡＦ１−ｃｏｍｐの細胞壁等の画分に分子量約６０ｋＤａのＹＭＡＦ１蛋白質が検出された。なお、ＹＭＡＦ１蛋白質自体の分子量は２３ｋＤａであるので、糖鎖等の修飾を受けて分子量がシフトしているものと推測される。【０１２２】
ＹＭＡＦ１蛋白質の局在についての解析するために、次に免疫染色を行った。すなわち、Ａｆｓ３５を４％パラフォルムアルデヒドで固定後、ポリ−Ｌリシンをコートしたガラスプレートに細胞を接着させた。次いで、当該細胞をメタノールにて固定した後、ブロックキングを行い、抗ＹＭＡＦ１ポリクローナル抗体を処理し、アレクサフルオロ４８８抗ウサギＳＦＸキット（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４  ＧＯＡＴ  ＡＮｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ＳＦＸ  Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にてＹＭＡＦ１蛋白質を検出した。得られた結果を図２０に示す。【０１２３】
図２０に示した結果から明らかなように、抗ＹＭＡＦ１ポリクローナル抗体を用いた免疫染色により発芽した菌体の細胞壁部分が染まった像が得られた。【０１２４】
また、２４穴プレートを用いて、アスペルギルス  フミガーツスの分生子を１．５Ｘ１０４コニディア（胞子数）／１ｍｌになるように添加した培地を、各種濃度の抗ＹＭＡＦ１ポリクローナル抗体にて処理し、３０℃で１４時間培養した後に観察した。得られた結果を図２１に示す。【０１２５】
図２１に示した結果から明らかなように、抗ＹＭＡＦ１ポリクローナル抗体の濃度依存的に菌体の湿重量は変化しなかった。しかしながら、該抗体にて処理した培養液においては、菌体のアグリゲ−ションが見られなくなっていた。かかる結果から、前記ウェスタンブロットや免疫染色にて確認されたようにＹＭＡＦ１は主に細胞壁表面に存在しており、さらに菌体どうしのアグリゲ−ションに寄与している蛋白質であることが示唆された。【０１２６】
（実施例５）  アスペルギルスマウス感染モデルによるＹＭＡＦ１蛋白質の病原性への関与
ＹＭＡＦ１蛋白質とアスペルギルスマウス感染症との関連性を調べるために、親株Ａｆｓ３５、ＹＭＡＦ１遺伝子欠損株、ＹＭＡＦ１遺伝子相補株  ５ｘ１０６個の胞子をそれぞれ７個体のＩＣＲマウスの気管支に投与し、生存率を調べた。得られた結果を図２２に示す。【０１２７】
図２２に示した結果から明らかなように、Ａｆｓ３５またはＹＭＡＦ１遺伝子相補株を投与したマウスは投与後４〜１０日以内に死亡したのに対し、ＹＭＡＦ１遺伝子欠損株では、他の検体と異なり４日目以降に死亡する個体が見られなかった。したがって、かかる生存率の差から、ＹＭＡＦ１蛋白質は病原性に関与していることが示唆された。【０１２８】
（実施例６）  抗ＹＭＡＦ１抗体による治療（延命）効果
実験的マウスアスペルギルス症（侵襲性アスペルギルスモデルマウス）を用いて、抗体を用いた治療効果を検証した。すなわち、先ずＩＣＲマウス（８週齢、雌）に菌接種の前日、当日、１日後にそれぞれ酢酸コルチゾン２００μｇ／ｋｇ  皮下投与し免疫抑制の前処理を行った。そして、このモデルマウスにＡ．Ｆｕｍｍｉｇａｔｕｓ  ＭＦ１３株の胞子サスペンド１Ｘ１０８／ｍｌ  ５０μｌを気管内投与した。菌接種の翌日に１個体あたり抗ＹＭＡＦ１モノクローナル抗体（４Ｂ６Ｍ２ＧＫ抗体）１５０μｇをこのモデルマウスに投与し、生存率の推移を検証した。得られた結果を図２３に示す。【０１２９】
図２３に示した結果から明らかなように、４Ｂ６Ｍ２ＧＫ抗体（４Ｂ６）を投与したマウスについて、コントロールに用いたマウスＩｇＧ１抗体（ＡＣＴＧｅｎ社作製）よりも延命効果が観察された。【０１３０】
（実施例７）  ＹＭＡＦ１サンドイッチＥＬＩＳＡ系の構築
ＹＭＡＦ１蛋白質を標的としたアスペルギルス感染症の診断に好適に用いることができる、ＹＭＡＦ１サンドイッチＥＬＩＳＡ系の構築を試みた。【０１３１】
すなわち先ず、実施例３（２）で調製した抗ＹＭＡＦ１モノクローナル抗体精製画分に対し、１０倍モル量のＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（ＰＩＥＡＣＥ社製）を混ぜ、遮光下で４時間反応させてビオチン化し、その後ＰＢＳにて透析して、ビオチン化モノクローナル抗体を作製した。また、大腸菌で作製した蛋白質  ＧＳＴ−ＹＭＡＦ１−Ｈｉｓ６−Ｆｌａｇ  ５ｍｇ／ｍｌを５０μｌ／ウェルにて９６穴マイクロプレートに吸着・感作させた。そして、このようにして作製した抗原プレートを用いて、ビオチン化抗ＹＭＡＦ１モノクローナル抗体の力価を確認し、サンドイッチＥＬＩＳＡ系における２次抗体として用いるのに適切な濃度を検討した。【０１３２】
次に、サンドイッチＥＬＩＳＡの条件検討のため、修飾していない各濃度の抗ＹＭＡＦ１モノクローナル抗体を一次抗体（捕獲用抗体）とする抗体感作プレートを作製し、１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ、０μｇ／ｍｌの各濃度の組換え蛋白質（ＧＳＴ−ＹＭＡＦ１−Ｈｉｓ６−Ｆｌａｇ）を反応させた。次いで、２次反応として、ビオチン化抗ＹＭＡＦ１モノクローナル抗体（二次抗体、検出用抗体）を前記にて決定した適切な濃度にて反応させ、さらに３次反応としてニュートラアビジン−ＰＯＤ（Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ−ＰＯＤ）を反応させた後、酵素発色基質を加え発色させ、吸光度を測定した。【０１３３】
このようにして、実施例３（２）で調製した４種類のモノクローナル抗体を一次抗体または二次抗体として用いた全ての組み合わせにて、サンドイッチＥＬＩＳＡ系の構築を試みたが、ＹＭＡＦ１組換え蛋白質の濃度に依存性を示す系は得られなかった。【０１３４】
そこで、前述の通り、ウサギにＹＭＡＦ１組換え蛋白質を免疫することで、ポリクローナル抗体を作製した。【０１３５】
そして、一次抗体として前記４種類の抗ＹＭＡＦ１モノクローナル抗体、二次抗体として、前記同様の手法にてビオチン化した抗ＹＭＡＦ１ポリクローナル抗体を用い、サンドイッチＥＬＩＳＡ系の構築を試みた。１Ｂ４Ｃモノクローナル抗体（１Ｂ４Ｃ）および３Ｇ４ＦＢ７モノクローナル抗体（３Ｇ４）を二次抗体として各々用いた系を評価した結果について、図２４および図２５に示す。【０１３６】
図２４および図２５に示した結果から明らかなように、また図には示していないが、４種類のうちのどのモノクローナル抗体を用いても同じように、ＹＭＡＦ１組換え蛋白質に対して濃度依存性を示した。また、その感度は０．３ｎｇ／ｍｌ以上であり、極めて高感度の系を構築することができた。【０１３７】
次に、アスペルギルス  フミガーツスを様々な種類の培地を用いて３０℃で振盪培養を行い、かかる培養上清中のＹＭＡＦ１蛋白質の量をＹＭＡＦ１サンドイッチＥＬＩＳＡ系（１Ｂ４Ｃモノクローナル抗体（１Ｂ４Ｃ）および３Ｇ４ＦＢ７モノクローナル抗体（３Ｇ４）を一次抗体として各々用いた系）を用いて測定した。なお、アスペルギルス  フミガーツスの培養に用いたサブロー培地の組成は、１Ｌあたり、カゼインの膵液消化物（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｄｉｇｅｓｔ  ｏｆ  Ｃａｓｅｉｎ）５．０ｇ、動物組織のペプシン消化物（Ｐｅｐｔｉｃ  Ｄｉｇｅｓｔ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ）５．０ｇ、デキストロース  ２０．０ｇである。
得られた結果を図２６および図２７に示す。【０１３８】
図２６および図２７に示した結果から明らかなように、培養上清中に放出されるＹＭＡＦ１蛋白質の量は培地の種類により変化することがわかった。【０１３９】
（実施例８）  抗体可変領域決定方法
１Ｂ４Ｃ、２Ｇ１１ＧＢ５、３Ｇ４ＦＢ７、４Ｂ６Ｍ２ＧＫモノクローナル抗体の各可変領域の遺伝子配列を明らかにするため、１Ｂ４Ｃ、２Ｇ１１ＧＢ５、３Ｇ４ＦＢ７、４Ｂ６Ｍ２ＧＫ抗体産生細胞ハイブリドーマ細胞２×１０６をトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、＃１５５９６−０２６）１ｍｌに懸濁して５分放置し、クロロフォルムを２００μｌ添加して、１５秒間懸濁した後、１２，０００×ｇで１５分間遠心し、上清を得た。この上清と５００μｌイソプロパノールとを混合した後、１２，０００×ｇで１０分間遠心した。得られたペレットを８０％エタノールで洗浄し、トータルＲＮＡを得た。そして、その全量を２０μｌの水で溶かし、そのうち、トータルＲＮＡ  ５μｇ分の溶液を使用して、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（ＴＭ）  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、トータルＲＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを作製した。得られた２本鎖ｃＤＮＡにエタノール沈殿処理を施した後、ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈを用いて２本鎖ｃＤＮＡの５’末端と３’末端とを結合させ、そのうち１μｌを鋳型としてＰＣＲを行った。プライマーとしては、重鎖と軽鎖の定常領域に対して設計したものを使用した。プライマーの配列は、次の通りである。
＜１Ｂ４Ｃ＞
重鎖５’側  ＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＡＴＧＡＣＴＴＣＡＧ（配列番号：３６）
重鎖３’側  ＣＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧ（配列番号：３７）
＜２Ｇ１１ＧＢ５および３Ｇ４ＦＢ７＞
重鎖５’側  ＡＧＧＧＴＡＣＡＧＴＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧ（配列番号：３８）
重鎖３’側  ＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＣＣＡＴＡＡＣ（配列番号：３９）
＜４Ｂ６Ｍ２ＧＫ＞
重鎖５’側  ＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣ（配列番号：４０）
重鎖３’側  ＣＴＧＣＴＣＴＧＴＧＴＴＡＣＡＴＧＡＧＧ（配列番号：４１）
＜共通＞
軽鎖５’側  ＣＡＣＴＧＣＣＡＴＣＡＡＴＣＴＴＣＣＡＣ（配列番号：４２）
軽鎖３’側  ＴＧＴＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＡ（配列番号：４３）。【０１４０】
ＰＣＲ産物を１．５％ゲルにて電気泳動を行った後、切り出して精製を行った。そして、精製したＤＮＡを用いてシークエンスを行った。また、軽鎖については、精製したＤＮＡをクローニングした後、シークエンスを行った。結果、２Ｇ１１ＧＢ５および３Ｇ４ＦＢ７は同一の可変領域を有していることが分かった、また、決定された１Ｂ４Ｃ抗体の軽鎖の可変領域の塩基配列を配列番号：２３に、アミノ酸配列を配列番号：２４に、重鎖の可変領域の塩基配列を配列番号：２５に、アミノ酸配列を配列番号：２６に示す（図２８および２９  参照）。また、決定された３Ｇ４ＦＢ７抗体（２Ｇ１１ＧＢ５抗体）の軽鎖の可変領域の塩基配列を配列番号：２７に、アミノ酸配列を配列番号：２８に、重鎖の可変領域の塩基配列を配列番号：２９に、アミノ酸配列を配列番号：３０に示す（図３０および３１  参照）。さらに、決定された４Ｂ６Ｍ２ＧＫ抗体の軽鎖の可変領域の塩基配列を配列番号：１９に、アミノ酸配列を配列番号：２０に、重鎖の可変領域の塩基配列を配列番号：２１に、アミノ酸配列を配列番号：２２に示す（図３２および３３  参照）。【０１４１】
また、これら可変領域のアミノ酸配列について、ＵＣＬの「Ａｎｄｒｅｗ  Ｃ．Ｒ．  Ｍａｒｔｉｎ’ｓ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐ」のサイトにおける配列分析（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｙｓｉｓ／ｔｏｏｌｓ／ａｎａｌｙｚｅ．ｃｇｉ）を利用してナンバリングし、「Ｔａｂｌｅ  ｏｆ  ＣＤＲ  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ」に記載の基準（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／＃ｋａｂａｔｎｕｍ）に従ってＣＤＲ領域を同定した。ＣＤＲ予測の結果と軽鎖および重鎖のシグナル配列とを図２９、３１および３３に示す。また、１Ｂ４Ｃ抗体の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号：７〜９に、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号：１０〜１２に示す。さらに、３Ｇ４ＦＢ７抗体（２Ｇ１１ＧＢ５抗体）の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号：１３〜１５に、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号：１６〜１８に示す。また、４Ｂ６Ｍ２ＧＫ抗体の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号：１〜３に、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号：４〜６に示す。【０１４２】
（実施例９）  モノクローナル抗体のエピトープ解析
１Ｂ４Ｃ、３Ｇ４ＦＢ７（２Ｇ１１ＧＢ５）、４Ｂ６Ｍ２ＧＫモノクローナル抗体のエピトープを特定するために、鎖長の異なる数種のＹＭＡＦ１ポリペプチドを発現するＢａ／Ｆ３細胞を作製し、抗体との反応性を評価した。【０１４３】
すなわち、ＹＭＡＦ１の３３ａａ（Ｎ末端からの鎖長さ。以下、同様）、６３ａａ、９３ａａ、１２３ａａ、１５３ａａおよび１８３ａａからなるポリペプチドを各々、解析対象とした。そして、ＹＭＡＦ１全長を含む組換えプラスミドを鋳型として、下記配列のＤＮＡをプライマーとして使用し、プライムスター  マックス  ＤＮＡポリメラ―ゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＭＡＸ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＴａＫａＲａ社製、＃Ｒ０４５Ａ）をポリメラーゼとして使用して、前記７種類のポリペプチドをコードする遺伝子の単離を行った。
フォワードプライマー（配列番号：４４）：ＧＣＡＣＴＣＣＧＴＴＣＴＧＧＡＴＡＡＴＧ
リバースプライマー(Rに付加した数字は、増幅産物がコードするポリペプチドの鎖長を意味する)
Ｒ３３（配列番号：４５）：ＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＧＧＧＣＧＣＴＧＴＴＧＴＣＴＧＣＧＣＡＧＧＡＧＧ
Ｒ６３（配列番号：４６）：ＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＧＧＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＧＴＣＡＣＧ
Ｒ９３（配列番号：４７）：ＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＡＧＴＧＡＣＣＡＴＡＧＴＣＣＣＣＡＴＡＴＴＧＡＣＣＡＴＡ
Ｒ１２３（配列番号：４８）：ＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＡＴＴＧＡＣＣＡＴＡＧＴＴＴＣＣＧＴＡＧＴＴＴＧＣＴＧＧ
Ｒ１５３（配列番号：４９）：ＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＧＴＡＧＴＣＧＧＣＧＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴ
Ｒ１８３（配列番号：５０）：ＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴＧＧＴＡＧＴＣＧＴＧＣＧＡＧＧＣＴＣＧＴＣＧＴＣＴＣＴ。【０１４４】
得られた各ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動を行った後、切り出し精製を行い、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩとで制限酵素処理を行った。また、ｐＭＸ−ＳＳＴもＥｃｏＲＩとＮｏｔＩとで制限酵素処理を行い、切り出して精製した。さらにそれぞれをＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈにて処理し、前記ＰＣＲ産物が各々挿入されたプラスミドを作製した。そして、このプラスミドを導入した大腸菌を５０μｇアンピシリン含有ＬＢアガロースプレートにプレーティングした。次いで、３７℃で１晩培養して得られたコロニーについて、前記プラスミドのインサート（挿入）部分を増幅するようにＰＣＲを行い、当該プラスミドが希望する配列を含んだｐＭＸ−ＳＳＴベクターであるかをシークエンスにて確認した。シークエンス用ＰＣＲプライマーとしては、次のオリゴヌクレオチドを用いた。
ＳＳＴ３’側  ５’−ＧＧＣＧＣＧＣＡＧＣＴＧＴＡＡＡＣＧＧＴＡＧ−３’（配列番号：５１）
ＳＳＴ５’側  ５’−ＣＧＧＧＧＧＴＧＧＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡ−３’（配列番号：５２）。【０１４５】
その後、実施例１（４）に記載のウイルスパッケイジング以降についての方法と同様の方法にて、各種鎖長のＹＭＡＦ１遺伝子のＤＮＡ配列を含むＢａ／Ｆ３細胞（ＳＳＴクローン：ＡＣＴ２５１−１〜ＡＣＴ２５１−６）を作製した。そして、実施例３（２）に記載の方法と同様の手法にて、ＡＣＴ２５１−１〜ＡＣＴ２５１−６と１Ｂ４Ｃ、３Ｇ４ＦＢ７（２Ｇ１１ＧＢ５）、４Ｂ６Ｍ２ＧＫ抗体との反応性をフローサイトメーターにて解析した。得られた結果を図３４〜３６に示す。【０１４６】
図３４〜３６に示した結果から明らかなように、１Ｂ４Ｃ、３Ｇ４ＦＢ７（２Ｇ１１ＧＢ５）、４Ｂ６Ｍ２ＧＫ抗体は、いずれもＹＭＡＦ１蛋白質のＮ末端側から１〜３３アミノ酸からなるポリペプチドを発現させたクローンに対しては反応性を示した。したがって、ＹＭＡＦ１蛋白質のＮ末端から１位から３３位の間にこれら抗体のエピトープが含まれることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１４７】
以上説明したように、本発明によれば、アスペルギルス  フミガーツスを高い感度にて検出することができる、アスペルギルス  フミガーツス感染症の検査方法ならびに検査用組成物を提供することが可能となる。また、アスペルギルス  フミガーツス感染症の予防・治療方法ならびに予防・治療用組成物を提供することが可能となる。さらに、これらの方法に有用な化合物のスクリーニング方法、並びにこれらの方法に有用な抗体を提供することが可能となる。【０１４８】
したがって、本発明は、慢性壊死性肺アスペルギルス症（ＣＮＰＡ）等の検査、予防、および治療において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１４９】
配列番号１
＜２２３＞  ４Ｂ６Ｍ２Ｋ抗体  軽鎖可変領域  ＣＤＲ１
配列番号２
＜２２３＞  ４Ｂ６Ｍ２Ｋ抗体  軽鎖可変領域  ＣＤＲ２
配列番号３
＜２２３＞  ４Ｂ６Ｍ２Ｋ抗体  軽鎖可変領域  ＣＤＲ３
配列番号４
＜２２３＞  ４Ｂ６Ｍ２Ｋ抗体  重鎖可変領域  ＣＤＲ１
配列番号５
＜２２３＞  ４Ｂ６Ｍ２Ｋ抗体  重鎖可変領域  ＣＤＲ２
配列番号６
＜２２３＞  ４Ｂ６Ｍ２Ｋ抗体  重鎖可変領域  ＣＤＲ３
配列番号７
＜２２３＞  １Ｂ４Ｃ抗体  軽鎖可変領域  ＣＤＲ１
配列番号８
＜２２３＞  １Ｂ４Ｃ抗体  軽鎖可変領域  ＣＤＲ２
配列番号９
＜２２３＞  １Ｂ４Ｃ抗体  軽鎖可変領域  ＣＤＲ３
配列番号１０
＜２２３＞  １Ｂ４Ｃ抗体  重鎖可変領域  ＣＤＲ１
配列番号１１
＜２２３＞  １Ｂ４Ｃ抗体  重鎖可変領域  ＣＤＲ２
配列番号１２
＜２２３＞  １Ｂ４Ｃ抗体  重鎖可変領域  ＣＤＲ３
配列番号１３
＜２２３＞  ３Ｇ４ＦＢ７抗体  軽鎖可変領域  ＣＤＲ１
配列番号１４
＜２２３＞  ３Ｇ４ＦＢ７抗体  軽鎖可変領域  ＣＤＲ２
配列番号１５
＜２２３＞  ３Ｇ４ＦＢ７抗体  軽鎖可変領域  ＣＤＲ３
配列番号１６
＜２２３＞  ３Ｇ４ＦＢ７抗体  重鎖可変領域  ＣＤＲ１
配列番号１７
＜２２３＞  ３Ｇ４ＦＢ７抗体  重鎖可変領域  ＣＤＲ２
配列番号１８
＜２２３＞  ３Ｇ４ＦＢ７抗体  重鎖可変領域  ＣＤＲ３
配列番号１９
＜２２３＞  ４Ｂ６Ｍ２Ｋ抗体  軽鎖可変領域  ｃＤＮＡ
配列番号２１
＜２２３＞  ４Ｂ６Ｍ２Ｋ抗体  重鎖可変領域  ｃＤＮＡ
配列番号２３
＜２２３＞  １Ｂ４Ｃ抗体  軽鎖可変領域  ｃＤＮＡ
配列番号２５
＜２２３＞  １Ｂ４Ｃ抗体  重鎖可変領域  ｃＤＮＡ
配列番号２７
＜２２３＞  ３Ｇ４ＦＢ７抗体  軽鎖可変領域  ｃＤＮＡ
配列番号２９
＜２２３＞  ３Ｇ４ＦＢ７抗体  重鎖可変領域  ｃＤＮＡ
配列番号３４〜５２
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列
【図１】
0005925783.tif 000002
【図２】
0005925783.tif 000003
【図３】
0005925783.tif 000004
【図４】
0005925783.tif 000005
【図５】
0005925783.tif 000006
【図６】
0005925783.tif 000007
【図７】
0005925783.tif 000008
【図８】
0005925783.tif 000009
【図９】
0005925783.tif 000010
【図１０】
0005925783.tif 000011
【図１１】
0005925783.tif 000012
【図１２】
0005925783.tif 000013
【図１３】
0005925783.tif 000014
【図１４】
0005925783.tif 000015
【図１５】
0005925783.tif 000016
【図１６】
0005925783.tif 000017
【図１７】
0005925783.tif 000018
【図１８】
0005925783.tif 000019
【図１９】
0005925783.tif 000020
【図２０】
0005925783.tif 000021
【図２１】
0005925783.tif 000022
【図２２】
0005925783.tif 000023
【図２３】
0005925783.tif 000024
【図２４】
0005925783.tif 000025
【図２５】
0005925783.tif 000026
【図２６】
0005925783.tif 000027
【図２７】
0005925783.tif 000028
【図２８】
0005925783.tif 000029
【図２９】
0005925783.tif 000030
【図３０】
0005925783.tif 000031
【図３１】
0005925783.tif 000032
【図３２】
0005925783.tif 000033
【図３３】
0005925783.tif 000034
【図３４】
0005925783.tif 000035
【図３５】
0005925783.tif 000036
【図３６】
0005925783.tif 000037
【配列表】
0005925783000001.app