(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種類のポリカチオンおよび少なくとも１種類のポリアニオンを含む生分解性の接着複合コアセルベートにおいて、前記ポリカチオンが、１つ以上のアルキルアミノ基、ヘテロアリール基、または１つ以上のアミノ基で置換された１つの芳香族基、で修飾されたゼラチンを含み、前記ポリアニオンがポリリン酸化合物を含み、前記ポリカチオンおよびポリアニオンの各々が互いに架橋可能である少なくとも１つの架橋基を含むことを特徴とする、生分解性の接着複合コアセルベート。
【請求項２】
請求項１に記載のコアセルベートにおいて、前記修飾されたゼラチンがエチレンジアミンで修飾されたゼラチンを含むことを特徴とする、コアセルベート。
【請求項３】
請求項１に記載のコアセルベートにおいて、前記ポリアニオンが：１つ以上のペンダントリン酸基を含むポリアクリル酸塩；又は式ＩＩ：
0005928825.tif 000006
を含有する少なくとも１つの断片もしくはその薬学的に許容可能な塩を含むポリマー；を含み、Ｒ４が水素またはアルキル基であり、ｎが１ないし１０である、コアセルベート。
【請求項４】
請求項１に記載のコアセルベートにおいて、前記ポリアニオンおよび／またはポリカチオンが、酸化を受けることが可能な少なくとも１つのジヒドロキシル芳香族基を含み、前記ジヒドロキシル芳香族基が、共有結合により前記ポリアニオンおよび／またはポリカチオンに付着している、請求項１に記載のコアセルベート。
【請求項５】
前記コアセルベートが少なくとも１種類の多価カチオンを含む、請求項１に記載のコアセルベート。
【請求項６】
前記コアセルベートが１種類以上の生物活性剤をさらに含む、請求項１に記載のコアセルベート。
【請求項７】
前記コアセルベートが可逆的酸化剤複合体をさらに含む、請求項１に記載のコアセルベート。
【請求項８】
前記ポリカチオン上の架橋基が求核基を含み、前記ポリアニオン上の架橋基が求電子基を含む、請求項１に記載のコアセルベート。
【請求項９】
前記ポリカチオン上の架橋基が求電子基を含み、前記ポリアニオン上の架橋基が求核基を含む、請求項１に記載のコアセルベート。
【請求項１０】
前記ポリカチオン上の架橋基およびポリアニオン上の架橋基が、酸化架橋（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）を受けることが可能なオルト−ジヒドロキシ芳香族基を含む、請求項１に記載のコアセルベート。
【請求項１１】
前記ポリアニオン上の架橋基がオルト−ジヒドロキシ芳香族基を含み、前記ポリカチオン上の架橋基が求核基を含み、前記架橋基が反応して共有結合を形成することが可能な、請求項１に記載のコアセルベート。
【請求項１２】
前記ポリカチオン上の架橋基がオルト−ジヒドロキシ芳香族基を含み、前記ポリアニオン上の架橋基が求核基を含み、前記架橋基が反応して共有結合を形成することが可能な、請求項１に記載のコアセルベート。
【請求項１３】
前記ポリアニオン上の架橋基および前記ポリカチオン上の架橋基が、化学線により架橋可能な基を含む、請求項１に記載のコアセルベート。
【請求項１４】
前記化学線により架橋可能な基が、オレフィン基（ｏｌｅｆｉｎｉｃ  ｇｒｏｕｐ）を含む、請求項１３に記載のコアセルベート。
【請求項１５】
前記オレフィン基がアクリル酸基、メタクリル酸基、アクリルアミド基、メタクリルアミド基、アリル基、ビニル基、ビニルエステル基、またはスチレニル基を含む、請求項１４に記載のコアセルベート。
【請求項１６】
前記コアセルベートが、重合開始剤および選択的に共開始剤（ｃｏ−ｉｎｉｔｉａｔｏｒ）をさらに含む、請求項１に記載のコアセルベート。
【請求項１７】
前記重合開始剤が、（１）ラジカル開始剤、熱開始剤、もしくは光開始剤（ｐｈｏｔｏｉｎｉｔｉａｔｏｒ）のうちの１つ以上、または（２）２種類以上のラジカル開始剤、熱開始剤、もしくは光開始剤、を含む、請求項１６に記載のコアセルベート。
【請求項１８】
（ａ）請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の接着複合コアセルベートを加熱するステップと；
（ｂ）前記コアセルベート中のポリカチオンとポリアニオンとを架橋するステップと；
を具える接着剤の製造方法において、（ａ）のステップが（ｂ）のステップの前、（ｂ）のステップの後、または（ｂ）のステップと同時に行って、前記接着剤を製造する方法。
【請求項１９】
（ｂ）のステップが、前記ポリカチオンとポリアニオンとの間の架橋を促進するべく、酸化剤の使用を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の接着複合コアセルベートを調製するステップと；
（ｂ）前記接着複合コアセルベートのｐＨを調整するステップと；
（ｃ）前記コアセルベート中のポリカチオンとポリアニオンとを架橋するステップと；
を具える接着剤の製造方法において、（ｂ）のステップが（ｃ）のステップの前、（ｃ）のステップの後、または（ｃ）のステップと同時に行って、前記接着剤を製造する方法。
【請求項２１】
（ｂ）のステップが、前記接着複合コアセルベートのｐＨを、７．０以上のｐＨへと上昇させるステップを具える、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
（ｂ）のステップが、前記接着複合コアセルベートのｐＨを、最大８．０までのｐＨへと上昇させるステップを具える、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
（ｃ）のステップが、前記ポリカチオンとポリアニオンとの間の架橋を促進するべく、酸化剤の使用を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
対象における骨折を修復するための薬剤の製造における、請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の接着複合コアセルベートの使用であって、該修復のステップが：
（ａ）骨折した骨を前記薬剤と接触させるステップと；
（ｂ）前記コアセルベート中のポリカチオンとポリアニオンとを架橋するステップと；
を具える、使用。
【請求項２５】
基体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を対象の骨に接着させるための薬剤の製造における、請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の接着複合コアセルベートの使用であって、該接着のステップが：
（ａ）前記骨および／または基体を前記薬剤と接触させるステップと；
（ｂ）前記基体を前記骨に適用するステップと；
（ｃ）前記コアセルベート中のポリカチオンとポリアニオンとを架橋するステップと；
を具える、使用。
【請求項２６】
骨組織の足場を対象の骨および／または組織に接着させるための薬剤の製造における、請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の接着複合コアセルベートの使用であって、該接着のステップが：
（ａ）前記骨および／または組織を前記薬剤と接触させるステップと；
（ｂ）前記骨組織の足場を前記骨および／または組織に適用するステップと；
（ｃ）前記コアセルベート中のポリカチオンとポリアニオンとを架橋するステップと；
を具える、使用。
【請求項２７】
前記足場が、前記骨および組織の成長または修復を促進する１種類以上の薬物を含む、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
歯科用途のための薬剤の製造における、請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の接着複合コアセルベートの使用。
【請求項２９】
歯科インプラントを固着させるための薬剤の製造における、請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の接着複合コアセルベートの使用であって、該固着のステップが：
（ａ）口腔の基体および／または歯科インプラントに前記薬剤を適用するステップと；
（ｂ）前記歯科インプラントを前記基体に付着させるステップと；
（ｃ）前記コアセルベート中のポリカチオンとポリアニオンとを架橋するステップと；
を具える、使用。
【請求項３０】
１種類以上の生物活性剤を対象に送達するための薬剤の製造における、請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の接着複合コアセルベートの使用。
【請求項３１】
対象において角膜および／または結膜の裂傷を修復するための薬剤の製造における、請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の接着複合コアセルベートの使用であって、該修復のステップが：
（ａ）前記裂傷に前記薬剤を適用するステップと；
（ｂ）前記コアセルベート中のポリカチオンとポリアニオンとを架橋するステップと；
を具える、使用。
【請求項３２】
対象の血管において血流を阻害するため薬剤の製造における、請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の接着複合コアセルベートの使用であって、該阻害のステップが：
（ａ）前記薬剤を前記血管中へと導入するステップと；
（ｂ）前記コアセルベート中のポリカチオンとポリアニオンとを架橋するステップと；
を具える、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００９年７月２３日に出願された米国非仮出願第１２／５０８，２８０号に基づく優先権を主張するものである。本願は、本明細書によりその全体が参照により組み入れられるものとする。
【０００２】
配列表への相互参照
本明細書に記載のタンパク質は、配列識別番号（配列番号）により参照される。これら配列番号は、配列識別子＜４００＞１、＜４００＞２、等に数値的に対応するものである。記録された、コンピュータが読める形式（ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｒｅａｄａｂｌｅ  ｆｏｒｍａｔ；ＣＦＲ）の、本配列表は、参照によりその全体が組み入れられるものとする。
【０００３】
謝辞
本発明に繋がった研究は、一部、米国国立衛生研究所、助成金番号第Ｒ０１  ＥＢ００６４６３号により資金援助を受けた。米国政府は、本発明中の特定の権利を有している。
【背景技術】
【０００４】
骨折は今日の社会における深刻な健康上の懸念事項である。骨折自体に加え、骨折には、多数のさらなる健康上のリスクが付随する。例えば、関節内骨折は、関節表面に広がり軟骨表面を断片化する骨損傷である。軟骨表面の骨折は、消耗性の（ｄｅｂｉｌｉｔａｔｉｎｇ）外傷後関節炎に繋がる場合が多い。外傷後関節炎の発症における主な決定因子は、損傷時の付与エネルギー量、外傷後関節炎に対する患者の遺伝的素因（またはその欠如）、ならびに整復（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）の精度および維持、であると考えられている。これら３つの予後因子のうち、整形外科の介護者によりコントロール可能な唯一の因子は、整復の達成および維持である。関節表面（軟骨）および骨幹端（軟骨の直下の骨の部分）の粉砕損傷は、整復した（整列させた）位置に維持することが特に困難である。これは、この領域の骨の質および種類に関係している。これは、チタンインプラントまたはステンレス鋼インプラントを用いる固定の制限にも関係している。
【０００５】
現在では、ステンレス鋼インプラントおよびチタンインプラントは固定の主要な方法であるが、それらのサイズおよびそれらを配置させるために必要なドリリングは、骨および軟骨のより小さな小片の正確な徒手整復（ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）および整復を妨げるものとなることが多い。機械的固定に対する代替法として、様々な骨接着剤が試験されてきた。これらは次の４つのカテゴリーに分類される：ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、フィブリンをベースとする糊、リン酸カルシウム（ＣＰ）セメント、およびＣＰ樹脂複合材。補綴物の固定に使用されるＰＭＭＡセメントはよく知られた欠点を有しており、そのうちの最も深刻なものの１つは、発熱凝結反応から発生した熱が、隣接する骨組織を殺してしまい得る、というものである。また、骨に対する結合が乏しいことにより、ＰＭＭＡセメント補綴物破損の主な原因である無腐性のゆるみ（ａｓｅｐｔｉｃ  ｌｏｏｓｅｎｉｎｇ）も引き起こされる。
【０００６】
１９７０年代以降、骨移植片の固定および軟骨の修復のために、血液凝固タンパク質フィブリノーゲンを基にしたフィブリン糊が試験されてきたが、未だに広く有効利用はされていない。フィブリン糊の欠点の１つは、それらが、プールされたヒトドナー血液から製造される、というものである。つまり、それらは、感染を伝染してしまうリスクを抱えており、また、可能性として、供給が限られてしまう可能性がある。
【０００７】
ＣＰセメントは、例えばリン酸四カルシウム、リン酸二カルシウム無水物、およびβ型リン酸三カルシウムなどの、１つ以上の形態のＣＰの粉末である。この粉末は、水と混合されると、ヒドロキシアパタイトを含む１つ以上の形態のＣＰ結晶が絡み合うことにより凝結し固まるペースト、を形成する。ＣＰセメントの利点としては、等温凝結（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｓｅｔ）、立証されている生体適合性、骨伝導性、が挙げられ、また、それらは、治癒の際のヒドロキシアパタイト形成のためのＣａおよびＰＯ４のリザーバーとして役に立つ。主要な欠点は、ＣＰセメントは、もろく、低い機械的強度を有しており、それゆえ、小さな関節セグメントの、安定した整復に理想的なものではない、というものである。ＣＰセメントは、多くは、骨空隙充填剤として使用されている。ＣＰセメントの機械的性質が乏しいことにより、ＣＰ粒子とポリマーとの複合セメントがもたらされた。粒子相およびポリマー相の体積分率を変動させることにより、糊の係数（ｍｏｄｕｌｕｓ）および強度を、自然骨の係数および強度へと調整することが可能であり、これは、我々に開かれている道でもある。
【０００８】
骨折に伴う全体的な健康への影響および現在の固定法の不完全な状態を考えると、新たな固定法が必要である。
【発明の概要】
【０００９】
本明細書では、生分解性の接着複合コアセルベート（ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｏａｃｅｒｖａｔｅ）の合成およびそれらの使用について記載する。当該接着複合コアセルベートは、１種類以上のポリカチオンと１種類以上のポリアニオンとの混合物で構成される。当該ポリカチオンとポリアニオンとは、硬化の際に、互いに、共有結合により架橋される。当該接着複合コアセルベートは、従来の接着剤と比較した場合には、水系用途において有効な、いくつかの望ましい特徴を有する。本明細書に記載の接着複合コアセルベートは、基体に適用する場合には、水において、低い界面張力を呈する（すなわち、それらは、玉になるというよりも、むしろ、界面全体に広がる）。加えて、当該複合コアセルベートの、分子間で架橋する能力により、当該接着複合コアセルベートの凝集強度が増加する。当該接着複合コアセルベートには、生体接着剤および薬物送達デバイスとして、数多くの生物学的用途がある。特に、本明細書に記載の接着複合コアセルベートは、水中用途、および、水が存在する状況、例えば生理学的条件など、において、特に有用である。
【００１０】
本発明の利点は、一部は以下に続く説明において記載し、一部は当該説明から明らかであるか、または、以下に記載の各局面の実施により学びとることができる。以下に記載の利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘されている要素および組み合わせにより実現および達成される。前述の一般的な説明も、以下の詳細な説明も、単に、例示的なものであり、かつ、説明上のものであって、制限的なものではない、とのことは理解されるべきものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
本明細書に組み入れられ、かつ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、以下に記載するいくつかの局面を説明するものである。
【図１】図１は、ｐＨ依存性のコアセルベートの構造および接着メカニズムの１つのモデルを示す。（Ａ）ポリアミン（赤色）と対となる、低電荷密度を有するポリリン酸塩（黒色）は、ｎｍスケールの複合体を形成する。これら複合体は実効正電荷を有する。（Ｂ）拡張された高い電荷密度のポリリン酸塩は、二価カチオン（緑色の記号）が存在するときに、および、よりコンパクトなより低い電荷密度のポリアミンによって、連結されるネットワークを形成する。これらのコポリマー上の実効電荷は負である。（Ｃ）Ｏ２または添加された酸化剤による３，４‐ジヒドロキシフェノール（Ｄ）の酸化により、キノン（Ｑ）と一級アミン側鎖との間の架橋が開始される。このコアセルベートは、静電相互作用、３，４‐ジヒドロキシフェノール側鎖、および、基質タンパク質への、キノンにより媒介される共有結合性カップリングを通じて、ヒドロキシアパタイト表面に接着することが可能である。
【図２】図２は、本発明におけるポリカチオンおよびポリアニオンとして用いることができるＰ．カリフォルニカ（Ｐ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）により産生されるいくつかのタンパク質配列、ならびに、本発明において有用な合成ポリカチオンおよびポリアニオンを示す。
【図３】図３は、本発明におけるポリカチオンおよびポリアニオンとして用いることができるＰ．カリフォルニカ（Ｐ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）により産生されるいくつかのタンパク質配列、ならびに、本発明において有用な合成ポリカチオンおよびポリアニオンを示す。
【図４】図４は、本発明におけるポリカチオンおよびポリアニオンとして用いることができるＰ．カリフォルニカ（Ｐ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）により産生されるいくつかのタンパク質配列、ならびに、本発明において有用な合成ポリカチオンおよびポリアニオンを示す。
【図５】図５は、本発明におけるポリカチオンおよびポリアニオンとして用いることができるＰ．カリフォルニカ（Ｐ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）により産生されるいくつかのタンパク質配列、ならびに、本発明において有用な合成ポリカチオンおよびポリアニオンを示す。
【図６】図６は、本発明におけるポリカチオンおよびポリアニオンとして用いることができるＰ．カリフォルニカ（Ｐ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）により産生されるいくつかのタンパク質配列、ならびに、本発明において有用な合成ポリカチオンおよびポリアニオンを示す。
【図７】図７は、本発明におけるポリカチオンおよびポリアニオンとして用いることができるＰ．カリフォルニカ（Ｐ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）により産生されるいくつかのタンパク質配列、ならびに、本発明において有用な合成ポリカチオンおよびポリアニオンを示す。
【図８】図８は、ドーパ架橋の種々のメカニズムを示す。
【図９】図９は、本明細書に記載の複合コアセルベートの、小さな「スポット溶接による接合部（ｓｐｏｔ  ｗｅｌｄｓ）」を適用して、骨折（Ａ）、小骨損傷（Ｂ）を修復するための、または、合成足場を骨組織に結合させるため（Ｃ）の、デュアルシリンジシステムを示す。
【図１０】図１０は、模倣コポリマーの構造およびＵＶ／ＶＩＳ特徴決定を示す。（Ａ）Ｐｃ３類似体である１は、８８．４モル％のリン酸塩、９．７モル％のドーパミド、および０．１モル％のＦＩＴＣ側鎖を含有していた。Ｐｃ１類似体である２は、８．１モル％のアミン側鎖を含有していた。いずれの場合も、残りはアクリルアミドサブユニットであった。（Ｂ）カテコール型の３，４−ジヒドロキシフェノールに特徴的な２８０ｎｍにおける単一のピークが、１のスペクトル中に存在していた。ＮａＩＯ４による酸化の後に、キノン型に対応する３９５ｎｍにおけるピークが現れ、３，４−ジヒドロキシフェノール含有ポリマーの、予想された酸化還元挙動が確認された。
【図１１】図１１は、混合した高分子電解質の、ｐＨ依存性の複合コアセルベーションを示す。（Ａ）低ｐＨでは、等しい量のアミンおよびリン酸側鎖を有する１および２の５０ｍｇ／ｍｌ混合物は、安定したコロイド状ＰＥＣを形成した。ｐＨが上昇するにつれて、ポリマーは凝縮し、高密度液体複合コアセルベート相になった。ｐＨ１０では、当該コポリマーは、溶液中に溶け、酸化的に架橋されて、透明なヒドロゲルになった。（Ｂ）コポリマー側鎖密度から算出した、ｐＨの関数としてのコポリマー側鎖の実効電荷。（Ｃ）ＰＥＣの直径（丸）は、２〜４のｐＨ範囲を通じて、ほぼ３倍増加した。ｐＨ４より上では、複合体は綿状の固まりになり、それらのサイズは測定できなかった。ゼータ電位（四角）は、算出した実効電荷に一致して、ｐＨ３．６付近でゼロであった。
【図１２】図１２は、接着複合コアセルベートの液体特性を示す。ｐＨ７．４では、１および２の溶液は、等しい量のアミンおよびリン酸側鎖を含有していた。
【図１３】図１３は、二価カチオンおよび高分子電解質の相図を示す。固定されたｐＨ８．２において、アミンのリン酸側鎖に対する比およびリン酸側鎖の二価カチオンに対する比を変動させた。溶液の状態はグレースケールで表されている。コアセルベート相の質量（ｍｇ）は濃い灰色の四角で指し示されている。星印で指し示されている組成物は、結合強度を試験するのに用いられた。
【図１４】図１４は、コアセルベート結合骨の結合強度、剪断弾性係数、および寸法安定性を示す。（Ａ）二価カチオン比が、リン酸側鎖に対して０から０．４になるにつれて、破損時の結合強度はおよそ５０％増加し、剛性は２倍になった。市販のシアノアクリレート接着剤で湿潤結合させた検体を基準として使用した。（すべての条件について、ｎ＝６）（Ｂ）４ヶ月間ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に完全に沈めた、接着させた骨検体の結合は、感知できるほどは膨張しなかった。
【図１５】図１５は、酸化の前および後におけるドーパミンコポリマーのＵＶ‐ｖｉｓスペクトルを示す（ｐＨ７．２）。酸化の前に存在していたカテコールピークは、キノン型へと変わった。左上図：ｐ（ＤＭＡ［８］−Ａａｍ［９２］）。左下図：ｐ（ＡＥＭＡ［３０］−ＤＭＡ［８］）。右図：ドーパミンコポリマーの酸化架橋によるヒドロゲル形成。（Ａ）ｐ（ＤＭＡ［８］−Ａａｍ［９２］）。（Ｂ）ｐ（ＥＧＭＰ［９２］−ＤＭＡ［８］）。（Ｃ）ｐ（ＡＥＭＡ［３０］−Ａａｍ［７０］）と混合したｐ（ＤＭＡ［８］−Ａａｍ［９２］）。（Ｄ）ｐ（ＡＥＭＡ［３０］−Ａａｍ［７０］）と混合したｐ（ＥＧＭＰ［９２］−ＤＭＡ［８］）。括弧でくくられている数字は、側鎖のモル％を指し示している。矢印は、スペクトルが経時的に変化する方向を指し示している。
【図１６】図１６は、ポリ（ＥＧＭＰ［９２］−ＤＭＡ［８］）におけるドーパミン酸化のｐＨ依存性を示す。矢印は、スペクトルが時間とともに変化する方向を指し示している。上図：ｐＨ５．０、時間経過挿入図。下図：ｐＨ６．０。
【図１７】図１７は、（Ａ）ヒト包皮繊維芽細胞、（Ｂ）ヒト気管繊維芽細胞、および（Ｃ）ラット初代星状細胞の、接着剤との直接接触を示す（赤色の自己発光性の大きな塊、白色の星印）。細胞形態、フィブロネクチン分泌、および運動性は、糊の非存在下で成長している細胞と区別できない。緑色＝中間径フィラメントタンパク質。赤色＝分泌されたフィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｏｎ）。青色＝ＤＡＰＩ染色核。
【図１８】図１８は、複数断片ラット頭蓋冠欠陥モデルを示す。（Ａ）欠陥の発生。（Ｂ）骨蓋（ｂｏｎｅ  ｃａｐ）の断片化。（Ｃ）欠陥における断片の整復。（Ｄ）骨糊の適用。（Ｅ〜Ｆ）糊の硬化（暗色化）。断片は、ＥおよびＦにおいては、堅く固定されている。
【図１９】図１９は、接着複合コアセルベートの形成に対するｐＨおよび正規化実効電荷の効果を示す。
【図２０】図２０は、Ｐｃ１〜Ｐｃ８のアミノ酸モル％を提示する。
【図２１】図２１は、アミン修飾ゼラチンを作製するための反応スキームを示す。
【図２２】図２２は、（Ａ）水における接着複合コアセルベートの一例（白色の矢印）、ならびに（Ｂ）凝結および架橋のメカニズムとともに、高分子電解質の相挙動、を示す。
【図２３】図２３は、ポリリン酸塩−ゼラチン−二価カチオン混合物の相図を示しており、：（Ａ）Ｃａ２＋組成物、ｐＨ５；（Ｂ）Ｃａ２＋組成物、ｐＨ７．４；（Ｃ）Ｍｇ２＋組成物、ｐＨ５；（Ｄ）Ｍｇ２＋組成物、ｐＨ７．４。各混合物中のコポリマーの総濃度は５重量％であった。可溶性の組成物は白色であり、凝縮し複合コアセルベートになった組成物は明るい灰色であり、ゲルまたは固い固体沈殿物を形成した組成物はより暗い灰色である。四角の中の数字は、分離した複合コアセルベート相の濃度（重量％）を表す。数字のない灰色のボックスは、複合コアセルベートを含有するものであったが、体積が低すぎて濃度の正確な測定ができなかった。複合コアセルベートを含有する組成空間は、Ｍｇ２＋で、より高く、また、ｐＨに伴って増加する。Ｍｇ２＋固相は、固いＣａ２＋沈殿物よりも、より柔らかく、かつ、よりゲル様であった。
【図２４】図２４は、動的振動レオロジーにより決定された固化温度を示す。（Ａ）Ｃａ２＋／ゼラチン／ポリリン酸塩のレオロジー。弾性係数（Ｇ’、黒色の記号）は、０．１５より大きいＣａ２＋比にて温度を０℃から４０℃へ上昇させるにつれて、Ｓ字状に上昇した。（挿入図）固化またはゲル化温度である、弾性係数（Ｇ’）と粘性係数（Ｇ”、灰色の記号）との交差は、Ｃａ２＋比を増加させるに伴って低下した。明確にするために、０．２５Ｃａ２＋比は、挿入図から除外されている。（記号：◆０．３／０．６、■０．２５／０．６、▲０．２／０．６、●０．１５／０．６のＣａ２＋比）。（Ｂ）Ｍｇ２＋／ゼラチン／ポリリン酸塩のレオロジー。（記号：◆０．８／０１．０、■０．９／１．０、▲１．０／０１．０のＭｇ２＋比）。当該比較測定は、０．１％の一定の歪みおよび１．０ｈｚの周波数で行なった。
【図２５】図２５は、剪断強度を、二価カチオン比と温度との関数として示す。（Ａ）一定のアミン比にて、リン酸塩に対するＣａ２＋比を変動させた。（Ｂ）一定のアミン比で、Ｍｇ２＋比を変動させた。試験は、温度制御されたウォーターバス中に完全に沈めた被着体を用いて行なった（ｐＨ７．４）。暗色のバーは、酸化架橋なしで、３７℃で行なった剪断試験を表している。白色のバーは、酸化架橋なしで、転移温度より下で行なった剪断試験を指し示している。斜交平行線模様のバーは、ドーパミド側鎖に対して１：２の比のＮａＩＯ４による酸化架橋後に３７℃で行なった剪断試験を表している。架橋された結合を硬化させ（２４時間）、温度制御されたウォーターバス中に完全に沈めながら試験した。バーは、平均＋／−標準偏差を表している（すべての組成物について、ｎ＝９）。
【図２６】図２６は、化学線により架橋可能な基を有するポリカチオンおよびポリアニオンの合成、ならびに、それに続く、そのポリアカチオン（ｐｏｌｙａｃａｔｉｏｎ）およびポリアニオンの架橋を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法を開示および記載するに先立ち、以下に記載の各局面は、特定の化合物、合成法、または使用に限定されるものではなく、従って、当然、様々であってもよい、ことが理解されるべきである。また、本明細書において用いられている用語法は、特定の局面を記述することのみを目的としたものであり、かつ、限定することを意図したものではない、とのことも理解されるべきである。
【００１３】
本明細書では、および、添付の特許請求の範囲では、多くの用語が参照されることとなるが、それら用語は、以下の意味を有するよう定義されるものとする：
【００１４】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられているように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈から明らかにそうでないと示されていない限り、複数の指示物を含む、とのことに留意しなければならない。よって、例えば、「（１つの）医薬担体（ａ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃａｒｒｉｅｒ）」への言及には、２つ以上のそうした担体の混合物が含まれる、等である。
【００１５】
「所望により選択される（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「所望により（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、続いて記載されている事象または状況が生じても生じなくてもよいとのこと、ならびに、その記述にはその事象または状況が生じる場合の事例および生じない場合の事例が含まれるとのこと、を意味する。例えば、「所望により置換される低級アルキル」という句は、その低級アルキル基が、置換されていてもされていなくてもよいとのこと、ならびに、その記述には非置換低級アルキルおよび置換のある低級アルキルの両方が含まれるとのこと、を意味する。
【００１６】
本明細書において、範囲は、「約」ある特定の値から、および／または、「約」もう１つの特定の値まで、のように表されていることがある。このような範囲が表されている場合には、別の局面では、その、ある特定の値から、および／または、もう一方の特定の値まで、が含まれる。同様に、「約」という先行詞の使用により概数として値が表されている場合には、その特定の値は別の局面を形成する、とのことが理解されるものとする。それぞれの範囲の端点は、他方の端点に対して、および、他方の端点とは無関係に、の両方で、有意なものである、とのことがさらに理解されるものとする。
【００１７】
本明細書および結びの特許請求の範囲における、組成物または物品中のある特定の要素または成分の重量部への言及は、重量部が表されているその組成物または物品中の、その要素または成分と、他のなんらかの要素または成分との間の重量関係を示すものである。よって、２重量部の成分Ｘと５重量部の成分Ｙとを含有する化合物においては、ＸおよびＹは、２：５の重量比で存在し、また、当該化合物中にさらなる成分が含有されるかどうかにかかわらず、この比で存在する。
【００１８】
成分の重量パーセントは、そうでないと具体的に述べられていない限り、その成分が含まれている製剤または組成物の総重量を基準にしたものである。
【００１９】
本願の全体において用いられている例えばＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ１３〜Ｒ２２、Ａ、Ｘ、ｄ、ｍ、ｎ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖ、ｗ、およびｘなどの変数は、そうでないと述べられていない限り、前に定義したものと同一の変数である。
【００２０】
本明細書において用いられている「アルキル基」という語は、１〜２５個の炭素原子による、分岐した、または、分岐していない飽和炭化水素基、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシル等、である。より長鎖のアルキル基の例としては、これに限定されるものではないが、パルミチン酸基が挙げられる。「低級アルキル」基は、１〜６個の炭素原子を含有するアルキル基である。
【００２１】
本明細書に記載の化合物は、いずれも、薬剤的に許容できる塩であってもよい。一局面では、薬剤的に許容できる塩は、遊離酸を、適切な量の薬剤的に許容できる塩基で処理することにより調製する。代表的な薬剤的に許容できる塩基は、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化第一鉄、水酸化亜鉛、水酸化銅、水酸化アルミニウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、リシン、アルギニン、ヒスチジン、等である。一局面では、反応は、水単独中で、または、不活性な水混和性有機溶媒と組み合わせた水中で、約０℃〜約１００℃の温度で、例えば室温などで、行なう。当てはまる場合の特定の局面においては、用いられている塩基に対する本明細書に記載の化合物のモル比は、任意の特定の塩について望まれる比を与えるよう選択される。例えば遊離酸出発物質のアンモニウム塩を調製するには、その出発物質をおよそ１当量の薬剤的に許容できる塩基で処理して、中性塩を産生させてもよい。
【００２２】
もう１つの局面では、当該化合物が塩基性基を有する場合には、それを、例えばＨＣＩ、ＨＢｒ、またはＨ２ＳＯ４などの酸によりプロトン化して、カチオン性塩を産生させてもよい。一局面では、当該化合物の、酸または塩基との反応は、水単独中で、または、不活性な水混和性有機溶媒と組み合わせた水中で、約０℃〜約１００℃の温度で、例えば室温などで、行なう。当てはまる場合の特定の局面においては、用いられている塩基に対する本明細書に記載の化合物のモル比は、任意の特定の塩について望まれる比を与えるよう選択される。例えば遊離酸出発物質のアンモニウム塩を調製するには、その出発物質をおよそ１当量の薬剤的に許容できる塩基で処理して、中性塩を産生させてもよい。
【００２３】
本明細書において記述するのは、生分解性の接着複合コアセルベートおよびそれらの用途である。通常、当該複合体は、所望のｐＨで安定した水性複合体を生じるための、バランスのとれた比率のカチオンおよびアニオンの混合物である。当該接着複合コアセルベートは、少なくとも１種類のポリアカチオン（ｐｏｌｙａｃａｔｉｏｎ）および少なくとも１種類のポリアニオンを含むものであり、ここでは、少なくとも１種類のポリカチオンおよび／またはポリアニオンが生分解性であり、かつ、当該ポリカチオンおよびポリアニオンが、互いに架橋可能な少なくとも１つの基を含む。当該コアセルベートの各成分およびそれを作製する方法を以下に記載する。
【００２４】
当該接着複合コアセルベートは、個々のポリマー成分が相全体にわたり拡散する動的構造を有する会合性の液体である。複合コアセルベートは、レオロジー的には、粘弾性ポリマー溶液というよりもむしろ、粘性粒子分散液のように挙動する。上記で記載したように、当該接着複合コアセルベートは、水中のまたは湿った基体に適用する場合には、水において、低い界面張力を呈する。言い換えれば、当該複合コアセルベートは、玉になるというよりも、むしろ、界面全体に均等に広がる。加えて、分子間架橋の際に、当該接着複合コアセルベートは、強い、不溶性の凝集性材料を形成する。
【００２５】
反対に、本明細書に記載の接着複合コアセルベートに対する前駆体となり得る高分子電解質（ｐｏｌｙｅｌｅｔｒｏｌｙｔｅ）複合体（ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ；ＰＥＣ）は、小さなコロイド状粒子である。例えば、図１１Ａを参照すると、ｐＨ３．１および４．２におけるＰＥＣの溶液は、約３００ｎｍの直径を有するコロイド状粒子の、乳白色の溶液として存在する。ｐＨを７．２および８．１へと上昇させた際には、ＰＥＣは凝縮し、濃縮ポリマーの液相（コアセルベート相）と希薄平衡相とになる。この局面では、ＰＥＣは、本明細書に記載の接着複合コアセルベートに変わり得る。
【００２６】
高分子電解質複合体と接着複合コアセルベートとの間の相挙動の違いに関する好例のモデルを、図１に提示する。低ｐＨでは、反対に帯電した高分子電解質は静電的に会合して、当該懸濁液を安定化させる実効（ｎｅｔ）正表面電荷を有するナノ複合体になり、ＰＥＣ１を生じる。ｐＨを上昇させるにつれて、複合体の実効電荷は、正から負へと変化するが、実効中性付近にとどまる。ＰＥＣは、ｐＨをさらに上昇させることにより複合コアセルベート２に変わり得る緩い沈殿物相を形成し得る（図１）。よって、特定の局面では、ＰＥＣの、複合コアセルベートへの転換は、ｐＨおよび／または多価カチオンの濃度を調整することにより「誘因され（ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）」てもよい。例えば、ＰＥＣは、４以下のｐＨにて作製してもよく、また、ＰＥＣのｐＨは、ＰＥＣを複合コアセルベートに変えるために、７．０以上、７．０〜９．０、または８．０〜９．０へと上昇させてもよい。それに続く、ポリカチオンとポリアニオンとの間の架橋（例えば、酸化および図１Ｃに示されているような共有結合性架橋）により、結果として、本明細書に記載の接着複合コアセルベートの形成がもたらされる。
【００２７】
当該ポリカチオンおよびポリアニオンは、硬化の際にこの２つのポリマー間を架橋して新たな共有結合、および、最終的には接着剤を生じることを可能にするような基、を含有する。架橋のメカニズムは架橋基の選択に応じて様々であってもよい。一局面では、当該架橋基は、求電子体であってもよく、また、求核体であってもよい。例えば、当該ポリアニオンは、１つ以上の求電子（ｅｌｅｃｔｒｏｈｉｌｉｃ）基を有していてもよく、かつ、当該ポリカチオンは、その求電子基と反応して新たな共有結合を生じさせることが可能な１つ以上の求核基を有していてもよい。求電子基の例としては、これらに限定されるものではないが、無水物基、エステル、ケトン、ラクタム（例えば、マレイミドおよびスクシンイミド）、ラクトン、エポキシド基、イソシアネート基、およびアルデヒドが挙げられる。求核基の例は以下に提示されている。あるいは、当該ポリアニオンは、１つ以上の求核基を有していてもよく、かつ、当該ポリカチオンは、その求核基と反応して新たな共有結合を生じさせることが可能な１つ以上の求電子基を有していてもよい。
【００２８】
もう１つの局面では、当該ポリカチオンおよびポリアニオンは、それぞれ、化学線により架橋可能な基を有する。本明細書で用いられているように、硬化または重合に関連した「化学線により架橋可能な基（ａｃｔｉｎｉｃａｌｌｙ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋａｂｌｅ  ｇｒｏｕｐ）」は、当該ポリカチオンとポリアニオンとの間の架橋が、化学線照射（ａｃｔｉｎｉｃ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ）、例えばＵＶ照射、可視光照射、電離放射（例えばガンマ線またはＸ線照射）、マイクロ波照射等、によって行なわれる、ということを意味する。化学線硬化法は当業者にとって周知である。当該化学線により架橋可能な基は、例えばオレフィン基（ｏｌｅｆｉｎｉｃ  ｇｒｏｕｐ）などの不飽和有機基であってもよい。本明細書において有用なオレフィン基の例としては、これらに限定されるものではないが、アクリル酸基、メタクリル酸基、アクリルアミド基、メタクリルアミド基、アリル基、ビニル基、ビニルエステル基、またはスチレニル基が挙げられる。架橋を促進するための重合開始剤の使用について、以下に詳細に記載する。
【００２９】
もう１つの局面では、架橋は、アジド基を通じての光活性化架橋（ｌｉｇｈｔ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）を介して、当該ポリカチオンとポリアニオンとの間で起こってもよい。ここでもまた、新たな共有結合が、この種類の架橋の際に形成される。
【００３０】
もう１つの局面では、当該架橋可能な基は、酸化架橋を受けることが可能な任意の基を含む。「酸化架橋（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）」という語は、基または部分の、酸化を受け、その後、引き続き、新たな共有結合を生じさせるべく別の基と反応する能力、と定義される。酸化架橋を受けることが可能な基の一例としては、酸化剤の存在下で酸化を受けることが可能なジヒドロキシル置換芳香族基が挙げられる。一局面では、当該ジヒドロキシル置換芳香族基は、ジヒドロキシフェノールまたはハロゲン化ジヒドロキシフェノール基、例えばドーパおよびカテコール（３，４ジヒドロキシフェノール）など、である。例えば、ドーパの場合、これを酸化してドーパキノンにしてもよい。ドーパキノンは、隣接するドーパ基または別の求核基のいずれかと反応することが可能な求電子基である。酸化剤、例えば酸素など、または、他の添加剤、例えばこれらに限定されるものではないがペルオキシド、過ヨウ素酸塩（例えば、ＮａＩＯ４）、過硫酸塩、過マンガン酸塩、二クロム酸塩、遷移金属酸化剤（例えば、Ｆｅ＋３化合物、四酸化オスミウム）、もしくは酵素（例えば、カテコールオキシダーゼ）など、の存在下で、当該ジヒドロキシル置換芳香族基を酸化してもよい。
【００３１】
一局面では、当該ポリアニオンおよび／またはポリカチオンは、酸化架橋を受けることが可能な少なくとも１つのジヒドロキシル芳香族基を含み、ここでは、このジヒドロキシル芳香族基は、共有結合によりこのポリアニオンまたはポリアニオンに付着している。一局面では、当該ポリカチオンもポリアニオンも、共に、酸化架橋を受けることが可能なオルト−ジヒドロキシ芳香族基を含む。もう１つの局面では、当該ポリカチオンはオルト−ジヒドロキシ芳香族基を含み、かつ、当該ポリアニオンは、酸化型のジヒドロキシル芳香族基と反応して共有結合を形成することが可能な求核基を含む。
【００３２】
特定の局面では、当該酸化剤は安定化されていてもよい。例えば、酸化還元活性のない過ヨウ素酸塩と複合体を形成する化合物は、結果として、安定化された酸化剤になり得る。言い換えれば、この過ヨウ素酸塩は、非酸化型に安定化されており、この複合体である間はジヒドロキシル置換芳香族基を酸化することができない。この複合体は可逆的なものであり、また、非常に高い安定度定数を有している場合であっても、少量の、複合体を形成していない過ヨウ素酸塩が形成される。この安定的ではあるが可逆的な酸化剤により、酸化架橋の速度を制御するための酸化剤の徐放が可能となる。ジヒドロキシル置換芳香族基は、この少量の遊離過ヨウ素酸に対して当該化合物と競合する。この遊離過ヨウ素酸が酸化されるにつれて、より多くが当該複合体から放出されるが、これは、平衡状態にあるためである。一局面では、六員環上に一群となったシス，シス−１，２，３−トリオールを有する糖は、競合的過ヨウ素酸塩複合体を形成し得る。安定した過ヨウ素酸塩複合体を形成する具体的な化合物の一例は、１，２−Ｏ−イソプロピリデン−アルファ−Ｄ−グルコフラノースである。当該安定化された酸化剤は、架橋の速度を制御することができる。理論に縛られることは望まないが、当該安定化された酸化剤により酸化の速度が遅くなるため、接着剤が不可逆的に固まる前に、酸化剤を添加し基体を配置する時間がある。
【００３３】
当該酸化されたクロスリンカーの安定性は様々であってもよい。例えば、酸化可能なクロスリンカーを含有する、本明細書に記載のポリアニオンを含有するホスホノは、溶液中で安定であり、また、それら自身とは架橋しない。これにより、当該ポリカチオン上に存在する求核基が、当該酸化されたクロスリンカーと反応することが可能となる。これは本発明の望ましい特徴であり、これにより、分子間結合の形成、および、最終的には、強い接着剤の形成、が可能となる。有用な求核基の例としては、これらに限定されるものではないが、ヒドロキシル、チオール、および窒素含有基、例えば置換または非置換アミノ基およびイミダゾール基など、が挙げられる。例えば、リシン、ヒスチジン、および／またはシステインの残基は、当該ポリカチオン中へと組み込まれていてもよく、また、求核基を導入していてもよい。これの一例を図８に示す。ドーパ残基１を酸化して、ドーパキノン残基２を形成することができる。ドーパキノンは、反応性中間体であり、別のポリマーまたは同一のポリマー上のドーパ残基と架橋（すなわち、反応）してジ−ドーパ基を生じ得る。あるいは、このドーパキノン残基は、Ｍｉｃｈａｅｌ型付加を介して、例えばアミノ、ヒドロキシル、またはチオール基などの求核体と反応して新たな共有結合を形成し得る。図８を参照すると、リシル基、システイニル基、およびヒスチジル基は、このドーパキノン残基と反応して、新たな共有結合を生じる。ドーパは適切な架橋基であるが、例えばチロシンなどの他の基を本明細書において用いてもよい。本明細書に記載の接着複合コアセルベートの使用に関する架橋の重要性について、以下で検討する。
【００３４】
他の局面では、当該ポリカチオンおよび／またはポリアニオン上に存在するクロスリンカーは、遷移金属イオンと配位複合体を形成していてもよい。例えば、遷移金属イオンを、ポリカチオンおよびポリアニオンの混合物に添加してもよく、ここでは、両ポリマーは、この遷移金属イオンに配位することが可能なクロスリンカーを含有している。配位および解離の速度は、クロスリンカー、遷移金属イオン、およびｐＨの選択により制御することができる。よって、上記で記載したような共有結合性架橋に加え、架橋は、静電結合、イオン結合、または他の非共有結合を通じて起こってもよい。例えば鉄、銅、バナジウム、亜鉛、およびニッケルなどの遷移金属イオンを本明細書において用いてもよい。
【００３５】
当該ポリカチオンおよびポリアニオンは、通常、特定のｐＨにおいて複数の帯電可能な基を有するポリマー骨格で構成される。これらの基は、ポリマー骨格に対してペンダントで（ｐｅｎｄａｎｔ）あってもよく、および／または、ポリマー骨格内に組み込まれていてもよい。特定の局面では、（例えば、生物医学的用途においては）、当該ポリカチオンは、カチオン基またはｐＨを調整することにより容易にカチオン基へと変わり得る基を有する任意の生体適合性ポリマーである。一局面では、当該ポリカチオンはポリアミン化合物である。当該ポリアミンのアミノ基は、分岐していてもよく、または、ポリマー骨格の一部であってもよい。当該アミノ基は、選択されたｐＨにてカチオン性アンモニウム基を産生させるためにプロトン化されてもよい一級、二級、または三級アミノ基であってもよい。通常は、当該ポリアミンは、そのポリマーが実効中性電荷を有するｐＨであるその等電点（ｐＩ）に反映されるように、関係したｐＨでは、負電荷に比較して大過剰の正電荷を有するポリマーである。当該ポリカチオン上に存在するアミノ基の数は、最終的には、特定のｐＨにおけるポリカチオンの電荷を決定する。例えば、当該ポリカチオンは、１０〜９０モル％、１０〜８０モル％、１０〜７０モル％、１０〜６０モル％、１０〜５０モル％、１０〜４０モル％、１０〜３０モル％、または１０〜２０モル％のアミノ基を有していてもよい。一局面では、当該ポリアミンは、７より有意に大きいｐＩで、約７のｐＨにおいて、過剰な正の電荷を有する。以下で検討するように、ｐＩ値を上昇させるべく、さらなるアミノ基が当該ポリマー中へと組み込まれてもよい。
【００３６】
一局面では、当該アミノ基は、当該ポリカチオンに付着したリシン、ヒスチジン、またはイミダゾールの残基に由来するものであってもよい。任意のアニオン性対イオンを、当該カチオン性ポリマーとの会合において用いることができる。これらの対イオンは、当該組成物の本質的な成分に物理的かつ化学的に適合性のものであるべきであり、また、そうでない場合には、生成物のパフォーマンス、安定性または美しさ（ａｅｓｔｈｅｔｉｃｓ）を過度に損なわないものである。そうした対イオンの非限定的な例としては、ハロゲン化物（例えば、塩化物、フッ化物、臭化物、ヨウ化物）、硫酸塩およびメチル硫酸塩が挙げられる。
【００３７】
一局面では、当該ポリカチオンが天然に存在するものである場合には、当該ポリカチオンは、天然の生物から産生される正に帯電したタンパク質であってもよい。例えば、Ｐ．カリフォルニカ（Ｐ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）により産生されたタンパク質を、当該ポリカチオンとして用いてもよい。図２〜６は、Ｐ．カリフォルニカ（Ｐ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）により産生されるいくつかのセメントタンパク質のタンパク質配列を示している（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｅｍｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｕｂｅ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｐｏｌｙｃｈａｅｔｅ  Ｐｈｒａｇｍａｔｏｐｏｍａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５）２８０：４２９３８−４２９４４）。図２０では、各タンパク質のアミノ酸モル％が提示されている。図２〜５を参照すると、Ｐｃ１、Ｐｃ２、Ｐｃ４〜Ｐｃ１８（それぞれ、配列番号１、２、５〜１９）は、ポリカチオンであり、ここでは、これらポリマーは、中性ｐＨにおいてカチオン性である。当該タンパク質中に存在するアミノ酸の種類および数は、所望の溶液の性質を達成するべく、様々であってもよい。例えば、図２０を参照すると、Ｐｃ１はリシンが豊富（１３．５モル％）であり、一方、Ｐｃ４およびＰｃ５はヒスチジンが豊富（それぞれ、１２．６および１１．３モル％）である。
【００３８】
もう１つの局面では、当該ポリカチオンは、遺伝子または修飾された遺伝子または例えば細菌、酵母、雌ウシ、ヤギ、およびタバコ等の異種宿主中のいくつかの遺伝子からの複数の部分を含有する複合遺伝子、の人工的な発現により産生される組換えタンパク質である。もう１つの局面では、当該ポリカチオンは遺伝的に修飾されたタンパク質であってもよい。
【００３９】
もう１つの局面では、当該ポリカチオンは、生分解性ポリアミンであってもよい。当該生分解性ポリアミンは、合成ポリマーであってもよく、または天然に存在するポリマーであってもよい。当該ポリアミンを分解し得るメカニズムは、用いるポリアミンに応じて様々となる。天然ポリマーの場合には、それらは、そのポリマーを加水分解してポリマー鎖を切断することが可能な酵素があるために、生分解性である。例えば、プロテアーゼは、ゼラチンのような天然タンパク質を加水分解することができる。合成生分解性ポリアミンの場合には、それらは、化学的に不安定な結合も有する。例えば、β−アミノエステルは、加水分解可能なエステル基を有する。当該ポリアミンの性質に加え、例えば当該ポリアミンの分子量および当該接着剤の架橋密度などの他の考察は、生分解性の度合いを変更するべく、変えられてもよい。
【００４０】
一局面では、当該生分解性ポリアミンは、多糖、タンパク質、または合成ポリアミンを含む。１つ以上のアミノ基を有する多糖を本明細書において用いてもよい。一局面では、当該多糖は、例えばキトサンなどの天然の多糖である。同様に、当該タンパク質は、合成化合物であってもよく、または天然に存在する化合物であってもよい。もう１つの局面では、当該生分解性ポリアミンは、合成ポリアミン、例えばポリ（β−アミノエステル）、ポリエステルアミン、ポリ（ジスルフィドアミン）、混合ポリ（エステルおよびアミドアミン）、ならびにペプチド架橋ポリアミンなど、である。特定の局面では、当該ポリアニオンのみならず当該ポリカチオンも、ゲル化せず、かつ、低エンドトキシンであることが望ましい。
【００４１】
当該ポリカチオンが合成ポリマーである場合には、多種多様なポリマーを用いることができるが；しかしながら、例えば生物医学的用途などの特定の用途においては、当該ポリマーは、生体適合性であり、かつ、細胞および組織に対して無毒性であることが望ましい。一局面では、当該生分解性ポリアミンは、アミン修飾天然ポリマーであってもよい。「アミン修飾天然ポリマー」という語は、天然状態のポリマーを変化させるために引き続き操作または処理がなされた任意の天然ポリマー、と定義される。例えば、当該天然ポリマーは、本明細書に記載の技術を用いて、化学的に修飾されていてもよい。あるいは、当該天然ポリマーを酵素により変性させるかまたは消化してもよい。一局面では、当該アミン修飾天然ポリマーは、例えば１つ以上のアルキルアミノ基、ヘテロアリール基、または１つ以上のアミノ基で置換された１つの芳香族基、で修飾されたゼラチンまたはコラーゲンなどの、アミン修飾タンパク質であってもよい。アルキルアミノ基の例を式ＩＶ〜ＶＩに示すが、
0005928825.tif 000002
式中、Ｒ１３〜Ｒ２２は、独立して、水素、アルキル基、または窒素含有置換基であり；
ｓ、ｔ、ｕ、ｖ、ｗ、およびｘは１〜１０の整数であり；かつ
Ａは１〜５０の整数であり、
ここで、このアルキルアミノ基は、共有結合により当該天然ポリマーに付着している。一局面では、当該天然ポリマーがカルボキシル基（例えば、酸またはエステル）を有する場合には、このカルボキシル基をポリアミン化合物と反応させて、アミド結合を生じさせてもよく、また、当該アルキルアミノ基をポリマー中に組み込んでもよい。よって、式ＩＶ〜ＶＩを参照すると、アミノ基ＮＲ１３は、共有結合により当該天然ポリマーのカルボニル基に付着している。
【００４２】
式ＩＶ〜ＶＩに示されているように、アミノ基の数は、様々であってもよい。一局面では、当該アルキルアミノ基は、−ＮＨＣＨ２ＮＨ２、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＮＨＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、または−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｄＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、であり、ここで、ｄは０〜５０である。
【００４３】
一局面では、当該アミン修飾天然ポリマーは、芳香族基に直接的または間接的に付着した１つ以上のアミノ基を有するアリール基を含んでいてもよい。あるいは、当該アミノ基は、芳香環中に組み込まれていてもよい。例えば、当該芳香族アミノ基は、ピロール、イソピロール、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾール、またはインドールである。もう１つの局面では、当該芳香族アミノ基としては、ヒスチジン中に存在するイソイミダゾール基が挙げられる。もう１つの局面では、当該生分解性ポリアミンは、エチレンジアミンで修飾されたゼラチンであってもよい。
【００４４】
一局面では、当該ポリカチオンは、１つ以上のペンダントアミノ基を有するポリアクリル酸塩を含む。例えば、その骨格は、例えばこれらに限定されるものではないがアクリル酸塩、メタクリル酸塩、アクリルアミド等のアクリル酸モノマーの重合に由来するホモポリマーまたはコポリマーであってもよい。一局面では、当該ポリカチオンの骨格はポリアクリルアミドである。他の局面では、当該ポリカチオンはブロックコポリマーであり、ここでは、そのコポリマーのセグメントまたは一部は、そのコポリマーを生じさせるために用いられるモノマーの選択に応じたカチオン基を有する。
【００４５】
一局面では、当該ポリカチオンはポリアミノ化合物である。もう１つの局面では、当該ポリアミノ化合物は、１０〜９０モル％の三級アミノ基を有する。さらなる一局面では、当該ポリカチオンポリマーは、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３が、独立して、水素もしくはアルキル基であり、Ｘが酸素もしくはＮＲ５であり、ここで、Ｒ５は水素もしくはアルキル基であり、かつ、ｍが１〜１０である、式Ｉ
0005928825.tif 000003
の少なくとも１つの断片またはその薬剤的に許容できる塩を有する。もう１つの局面では、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３はメチルであり、かつ、ｍは２である。式Ｉを参照すると、ポリマー骨格は、ペンダント−Ｃ（Ｏ）Ｘ（ＣＨ２）ｍＮＲ２Ｒ３単位を有するＣＨ２−ＣＲ１単位で構成されている。この局面では、式Ｉを有する断片は、アクリル酸塩、メタクリル酸塩、アクリルアミド、またはメタクリルアミドの残基である。図３（構造ＣおよびＤ）および図６（４および７）は、式Ｉの断片を有するポリカチオンの例を示しており、ここでは、ポリマー骨格は、上記で検討したようなアクリルアミドおよびメタクリル酸塩の残基に由来するものである。一局面では、当該ポリカチオンは、分子量が１０〜２０ｋｄである、カチオン性の三級アミンモノマー（２−ジメチルアミノ−エチルメタクリレート）とアクリルアミドとのフリーラジカル重合生成物であり、１５〜３０モル％の三級モノマー濃度を有する。図４（構造ＥおよびＦ）および図６（５）では、本明細書において有用なポリカチオンの例が提示されており、ここでは、イミダゾール基は、ポリマー骨格に直接的に付着している（構造Ｆ）か、または、リンカーを介して、ポリマー骨格に間接的に付着している（メチレンリンカーを介した構造Ｅ）。
【００４６】
ポリカチオンと同様に、当該ポリアニオンは、合成ポリマーであってもよく、または天然に存在するものあってもよい。一局面では、当該ポリアニオンが天然に存在するものである場合には、当該ポリアニオンは、Ｐ．カリフォルニカ（Ｐ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）から産生される負に帯電したタンパク質である。図２および７は、Ｐ．カリフォルニカ（Ｐ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）により産生される２種類のタンパク質（Ｐｃ３ａおよびＰｃ３ｂ）の配列を示している（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｅｍｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｕｂｅ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｐｏｌｙｃｈａｅｔｅ  Ｐｈｒａｇｍａｔｏｐｏｍａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５）２８０：４２９３８−４２９４４）。図２０を参照すると、Ｐｃ３ａおよびＰｃ３ｂは、ポリホスホセリンで本質的に構成されており、これは、中性ｐＨにおいてアニオン性である。他の天然に存在するポリアニオンの例としては、グリコサミノグリカン、例えばコンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、デルマタン硫酸、およびヒアルロン酸など、が挙げられる。
【００４７】
当該ポリアニオンが合成ポリマーである場合には、それは、通常、アニオン基またはｐＨを調整することにより容易にアニオン基へと変わり得る基を有する任意のポリマーである。アニオン基へと変わり得る基の例としては、これらに限定されるものではないが、カルボン酸基、スルホン酸基、ホスホン酸基、ボロン酸基、硫酸基、ホウ酸基、またはリン酸基が挙げられる。上記で検討した考察が満たされる場合には、任意のカチオン性対イオンを、当該アニオン性ポリマーとの会合において用いることができる。アニオン性基の選択に応じて、この基は、ポリマー骨格に対してペンダントであってもよく、および／または、ポリマー骨格中に組み込まれていてもよい。
【００４８】
一局面では、当該ポリアニオンはポリリン酸塩である。もう１つの局面では、当該ポリアニオンは、１０〜９０モル％のリン酸基を有するポリリン酸化合物である。例えば、当該ポリリン酸塩は、天然に存在する化合物、例えばホスビチン（卵タンパク質）のような高度にリン酸化されたタンパク質、象牙質（天然の歯のリンタンパク質）、カゼイン（リン酸化された乳タンパク質）、骨タンパク質（例えばオステオポンチン）、またはＤＮＡなど、であってもよい。もう１つの局面では、当該ポリリン酸塩は、無機ポリホスホン酸塩、例えばポリメタリン酸ナトリウム（グラハムの塩（Ｇｒａｈａｍ’ｓ  ｓａｌｔ））など、である。
【００４９】
他の局面では、リン含有（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）ポリマーをポリアニオンに変えてもよい。例えば、リン脂質またはリン糖酸（ｐｈｏｓｐｈｏｓｕｇａｒ）はポリアニオンではないが、それらは、それらを用いてリポソームまたはミセルを作製することにより、ポリアニオンへと変えることができる。よって、この局面では、当該複合コアセルベートは帯電したコロイドである。あるいは、当該コロイドは、本明細書に記載のいずれかのポリアニオンまたはポリカチオンにより作製してもよい。
【００５０】
もう１つの局面では、当該ポリリン酸塩は合成化合物であってもよい。例えば、当該ポリリン酸塩は、ポリマー骨格に付着したペンダントリン酸基を有するポリマーであってもよく、および／または、ポリマー骨格中に存在していてもよい（例えば、ホスホジエステル骨格）。一局面では、当該ポリリン酸塩は、天然化合物を化学的または酵素学的にリン酸化することにより生じさせてもよい。一局面では、天然のセリンリッチタンパク質をリン酸化して、ホスホン酸基を当該タンパク質中へと組み込んでもよい。もう１つの局面では、多糖上に存在するヒドロキシル基をリン酸化して、本明細書において有用なポリアニオンを生じさせてもよい。
【００５１】
一局面では、当該ポリアニオンは、１つ以上のペンダントリン酸基を有するポリアクリル酸塩を含む。例えば、その骨格は、例えばこれらに限定されるものではないがアクリル酸塩、メタクリル酸塩、アクリルアミド等のアクリル酸モノマーの重合に由来するホモポリマーまたはコポリマーであってもよい。一局面では、当該ポリアニオンの骨格は、ポリアクリルアミドの重合に由来するものである。他の局面では、当該ポリアニオンはブロックコポリマーであり、ここでは、そのコポリマーのセグメントまたは一部は、そのコポリマーを生じさせるために用いられるモノマーの選択に応じたアニオン基を有する。さらなる一局面では、当該ポリアニオンは、ヘパリン硫酸、ヒアルロン酸、キトサン、および当該分野において典型的に用いられる、他の生体適合性かつ生分解性のポリマーであってもよい。
【００５２】
一局面では、当該ポリアニオンはポリリン酸塩である。もう１つの局面では、当該ポリアニオンは、Ｒ４が水素もしくはアルキル基であり、かつ、ｎが１〜１０である、式ＩＩ
0005928825.tif 000004
を有する少なくとも１つの断片またはその薬剤的に許容できる塩を有するポリマーである。もう１つの局面では、Ｒ４はメチルであり、かつ、ｎは２である。式Ｉと同様に、式ＩＩのポリマー骨格は、アクリル酸塩またはメタクリル酸塩の残基で構成されている。式ＩＩの残りの部分はペンダントリン酸基である。図７（構造Ｂ）は、式ＩＩの断片を有する、本明細書において有用なポリアニオンの一例を示しており、ここでは、ポリマー骨格は、アクリルアミドおよびメタクリル酸塩の残基に由来するものである。一局面では、当該ポリアニオンは、分子量が１０，０００〜５０，０００、好ましくは３０，０００である、エチレングリコールメタクリレートホスフェートとアクリルアミドとの共重合生成物であり、４５〜９０モル％の量のリン酸基を有する。
【００５３】
上記で記載したように、当該ポリカチオンおよびポリアニオンは、架橋可能な基を含有する。一局面では、当該ポリカチオンおよびポリアニオンには、本明細書において定義されている、化学線により架橋可能な基が含まれる。当該ポリカチオンおよびポリアニオンとして用いることができる、上記で記載した（合成のまたは天然に存在する）いずれのポリマーも、修飾されて、当該化学線により架橋可能な基を含んでいてもよい。例えば、当該ポリカチオンは、１つ以上のペンダントアミノ基（例えば、イミダゾール基）を有するポリアクリル酸塩であってもよい。ポリアニオンの場合には、一局面では、ポリリン酸塩は、修飾されて、当該化学線により架橋可能な基（単数または複数）を含んでいてもよい。例えば、ここでは、当該ポリカチオンおよびポリアニオンは、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３が、独立して、水素もしくはアルキル基であり、Ｘが酸素もしくはＮＲ５であり、ここで、Ｒ５は水素もしくはアルキル基であり、かつ、ｍが１〜１０である式ＶＩＩ
0005928825.tif 000005
を有する少なくとも１つの断片またはその薬剤的に許容できる塩を含むが、ここで、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つは化学線により架橋可能な基である。一局面では、式ＶＩＩを参照すると、Ｒ１はメチルであり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３はアクリル酸基またはメタクリル酸基であり、ＸはＮＨであり、かつｍは２である。
【００５４】
一局面では、当該ポリアニオンは、前に記載したような酸化架橋を受けることができる１つ以上の基を含んでいてもよく、かつ、当該ポリカチオンは、酸化されたクロスリンカーと反応して新たな共有結合を生じさせることができる１つ以上（ｏｎ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）の求核体を含有する。一局面では、当該ポリアニオンは、酸化を受けることが可能な少なくとも１つのジヒドロキシル芳香族基を含み、ここでは、このジヒドロキシル芳香族基は、共有結合によりこのポリアニオンに付着している。ジヒドロキシル芳香族基の例としては、ドーパ残基またはカテコール残基が挙げられる。上記で記載したいずれのポリアニオンも、修飾されて、１つ以上のジヒドロキシル芳香族残基を含んでいてもよい。一局面では、当該ポリアニオンは、２つ以上のモノマー間の重合生成物であり、ここでは、それらモノマーのうちの１つは、共有結合によりそのモノマーに付着しているジヒドロキシル芳香族基を有する。例えば、このモノマーは、このモノマーに付着しているジヒドロキシル芳香族基とのフリーラジカル重合を受けることが可能な不飽和基を有していてもよい。例えば、当該ポリアニオンは、（１）ホスフェートアクリレートおよび／またはホスフェートメタクリレートと（２）第二アクリル酸塩および／または第二メタクリル酸塩との間の重合生成物であって、その第二アクリル酸塩または第二メタクリル酸塩に共有結合したジヒドロキシル芳香族基を有する重合生成物であってもよい。もう１つの局面では、当該ポリアニオンは、リン酸モノアクリロキシエチルとドーパミンメタクリルアミドとの間の重合生成物である。図６中のポリマー３および７は、それぞれ、ポリアニオンおよびポリカチオン中へと組み込まれたドーパ残基の例を提示したものである。これらポリマーのそれぞれでは、ペンダントドーパ残基を有するポリアニオン３およびポリカチオン７を生じさせるべく、ペンダントドーパ残基を含有するアクリル酸塩が、適切なモノマーと重合されている。
【００５５】
理論に縛られることは望まないが、ジヒドロキシル芳香族基（単数または複数）を有するポリアニオンは、それらが、それ自身と溶液中でゆっくりと反応するという点で、安定である。よって、当該ポリアニオンは、まず、ポリカチオンと、分子間架橋経由で反応して（例えば、ポリカチオンは求核基またはジヒドロキシル芳香族基を有する）、複合コアセルベートを生じる。これにより、当該複合コアセルベートの使用および投与に関する数多くの利点がもたらされる。例えば、当該ポリカチオンおよびポリアニオンは、予め混合し、これらポリマーの連続投与の代わりに、対象に対して投与してもよい。これにより、現在利用可能な生体接着剤では選択肢ではない複合コアセルベートの投与が大いに単純化される。
【００５６】
当該ポリカチオンは天然に存在する化合物（例えば、Ｐ．カリフォルニカ（Ｐ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）からのタンパク質）であってもよく、かつ、当該ポリアニオンは合成化合物である、とのことが想定される。もう１つの局面では、当該ポリカチオンは、合成化合物であってもよく、かつ、当該ポリアニオンは天然に存在する化合物（例えば、Ｐ．カリフォルニカ（Ｐ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）からのタンパク質）である。さらなる一局面では、当該ポリアニオンもポリカチオンも共に合成化合物である。
【００５７】
当該接着複合コアセルベートは、所望により、１種類以上の多価カチオン（すなわち＋２以上の電荷を有するカチオン）を含有していてもよい。一局面では、当該多価カチオンは、１種類以上のアルカリ土類金属で構成される二価カチオンであってもよい。例えば、当該二価カチオンは、Ｃａ＋２および／またはＭｇ＋２であってもよい。他の局面では、＋２以上の電荷を有する遷移金属イオンを、当該多価カチオンとして用いてもよい。ｐＨに加え、当該多価カチオンの濃度により、コアセルベート形成の速度および程度が決まり得る。理論に縛られることは望まないが、流体における粒子間の弱い凝集力は、過剰な負の表面電荷を架橋する多価カチオンにより媒介され得る。本明細書において用いられる多価カチオンの量は様々であってもよい。一局面では、この量は、当該ポリアニオンおよびポリカチオン中に存在するアニオン基およびカチオン基の数に基づく。例えば、当該多価カチオンがカルシウムおよびマグネシウムの混合物である場合には、当該ポリカチオンはポリアミンであり、当該ポリアニオンはポリリン酸塩であり、ならびに、カルシウムのアミン／リン酸基に対する比は０．１〜０．３であってもよく、また、マグネシウムのアミン／リン酸基に対する比は０．８〜１．０であってもよい。実施例では、接着複合コアセルベートの作製に関する多価カチオンの量および他の物理的状態の選択について取り組む。
【００５８】
特定の局面では、当該コアセルベートは、１種類以上の開始剤も含む。例えば、光開始剤（ｐｈｏｔｏｉｎｉｔｉａｔｏｒ）が当該コアセルベート中に捕捉されていてもよい。よって、架橋可能な基が、化学線により架橋可能な基である場合には、当該光開始剤が活性化される（例えば光に曝される）際に、架橋が当該ポリカチオンとポリアニオンとの間で起こり得る。光開始剤の例としては、これらに限定されるものではないが、ホスフィンオキシド、ペルオキシド基、アジド基、α−ヒドロキシケトン、またはα−アミノケトンが挙げられる。一局面では、当該光開始剤としては、これらに限定されるものではないが、カンファーキノン、ベンゾインメチルエーテル、１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン、またはＤａｒｏｃｕｒｅ（登録商標）型もしくはＩｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）型、例えばＤａｒｏｃｕｒｅ（登録商標）１１７３もしくはＩｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）２９５９、が挙げられる。参照により組み入れられる欧州特許第０６３２３２９号において開示されている光開始剤を、本明細書において用いてもよい。他の局面では、当該光開始剤は、例えばこれらに限定されるものではないがリボフラビン、エオシン、エオシンｙ、およびローズベンガルなどの、水溶性光開始剤である。
【００５９】
特定の局面では、開始速度を上昇させるべく、開始剤系の吸収プロファイルを広幅化するために、複数の開始剤を用いてもよい。例えば、異なる波長の光により活性化される２種類の異なる光開始剤を用いてもよい。もう１つの局面では、化学的な開始剤を光開始剤と組み合わせて用いてもよい。もう１つの局面では、共開始剤（ｃｏ−ｉｎｉｔｉａｔｏｒ）を、本明細書に記載の重合開始剤のいずれかと組み合わせて用いてもよい。一局面では、当該共開始剤は、２−（ジエチルアミノ）エチルアクリレート、２−（ジメチルアミノ）エチルアクリレート、２−（ジメチルアミノ）エチルベンゾエート、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、２−エチルヘキシル４−（ジメチルアミノ）ベンゾエート、３−（ジメチルアミノ）プロピルアクリレート、４，４’−ビス（ジエチルアミノ）ベンゾフェノン、または４−（ジエチルアミノ）ベンゾフェノンである。
【００６０】
特定の局面では、当該光開始剤および／または共開始剤は、共有結合により当該ポリカチオンおよび／またはポリアニオンに付着している。もう１つの局面では、当該開始剤は、当該ポリカチオンおよびポリアニオンの骨格上に化学的にグラフトしてもよい。よって、これらの局面では、当該光開始剤および／または共開始剤は、共有結合によりポリマーに付着しており、ポリマー骨格に対してペンダントである。このアプローチは、製剤を単純化（ｓｉｍｐｌｙ）し、かつ、おそらく、保存および安定性を高めるものとなる。
【００６１】
当該接着複合コアセルベートは、多数の種々の方法で合成してもよい。一局面では、当該接着複合コアセルベートは、少なくとも１種類のポリアカチオン（ｐｏｌｙａｃａｔｉｏｎ）と少なくとも１種類のポリアニオンとを混和することを含むプロセスにより作製してもよく、ここでは、少なくとも１種類のポリカチオンおよび／またはポリアニオンは生分解性であり、かつ、当該ポリカチオンおよびポリアニオンは、互いに架橋可能な少なくとも１つの基を含む。
【００６２】
特定の局面では、混和物のｐＨおよび／または少なくとも１種類の多価カチオンの濃度を調整して、当該接着複合コアセルベートを作製してもよい。重合可能なモノマーを用いて当該コアセルベートを作製するための好例の技術は、実施例において提示されている。
【００６３】
本明細書において作製される接着複合コアセルベートは、その後の相変化を受けることが可能であり、これにより、水に不溶性の接着剤の形成が最終的にもたらされる。一局面では、接着剤は、当該接着複合コアセルベート中のポリカチオンとポリアニオンとを架橋することにより製造される。本明細書において前に記載の技術およびアプローチのいずれを用いて当該ポリカチオンとポリアニオンとを架橋してもよい。もう１つの局面では、当該接着剤は、：
（ａ）本明細書に記載の接着複合コアセルベートを加熱すること；および
（ｂ）そのコアセルベート中のポリカチオンとポリアニオンとを架橋すること、
を含むプロセスにより製造してもよく、ここでは、工程（ａ）が工程（ｂ）の前、工程（ｂ）の後、または工程（ｂ）と同時に行なわれて接着剤が製造されてもよい。
【００６４】
この局面では、当該接着複合コアセルベートを加熱および架橋することにより、このコアセルベートは不溶性の固体（すなわち接着剤）に変わる。温度は、コアセルベートの性質（すなわち、ポリカチオン、ポリアニオン、多価カチオン等の選択）に応じて様々であってもよい。例えば、室温で、複合コアセルベートが存在していてもよい。しかしながら、温度が３７℃である対象中へと当該コアセルベートを注入することにより、当該コアセルベートは、体温にて固化する。以下で検討するように、これには、薬物の送達についてのみならず、組織／骨修復においても、数多くの用途がある。
【００６５】
他の局面では、当該接着剤は、
（ａ）本明細書に記載の接着複合コアセルベートを調製すること；
（ｂ）その接着複合コアセルベートのｐＨを調整すること；および
（ｃ）そのコアセルベート中のポリカチオンとポリアニオンとを架橋すること、
を含むプロセスにより製造されるが、ここでは、工程（ｂ）が工程（ｃ）の前、工程（ｃ）の後、または工程（ｃ）と同時に行なわれて接着剤が製造されてもよい。
【００６６】
この局面では、ｐＨを調整することにより複合コアセルベートを接着剤に変える。ｐＨの調整は多数の技術により達成され得る。例えば、複合コアセルベートと組み合わせての第二成分（例えば、酸または塩基）の送達によりｐＨを能動的に変化させて、この複合コアセルベートを不溶性の固体に変えてもよい。あるいは、複合コアセルベートを、ｐＨの変化により複合コアセルベートが不溶性の固体に変わり得る、複合コアセルベートのｐＨとは異なるｐＨを有する環境の中へと導入してもよい。一局面では、ｐＨを、７．０以上のｐＨへ、または最大８．０のｐＨまで、上昇させる。
【００６７】
本明細書に記載の接着複合コアセルベートおよびそれらから製造される接着剤には、生物学的な糊（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｇｌｕｅ）および送達デバイスとしての数多くの用途がある。例えば、当該コアセルベートは、低初期粘度、重量ではほとんどが水である、１より大きい比重、水性環境における低い界面張力を有しているが、これらはすべて、それらの、湿った表面に対して接着する能力に寄与するものである。当該接着複合コアセルベートの結合メカニズム（すなわち架橋）に関するさらなる利点としては、凝結の際の熱発生が低いことが挙げられるが、これにより、生きている組織に対するダメージが防がれる。ｉｎ  ｓｉｔｕ発熱重合による熱の発生を避けるべく、成分を予備重合してもよい。これは、大部分は、上記で記載したような非常に穏やかな条件下における、分子間で架橋する当該接着複合コアセルベートの能力により、当然のことである。
【００６８】
本明細書に記載の接着複合コアセルベートは、多数の種々の生物学的基体に適用することができる。当該基体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで接触させてもよい。当該コアセルベート中のポリカチオンとポリアニオンとを架橋する際に、水に不溶性の固体が生じ、これが、強い接着剤をもたらす。接着複合コアセルベート内の架橋の速度は、例えばｐＨおよび酸化剤または架橋を促進するような他の薬剤の存在により制御してもよい。接着複合コアセルベートを基体に適用するための１つのアプローチは、図９中に見い出すことができる。図９に示されている技術は、本明細書では、「スポット溶接（ｓｐｏｔ  ｗｅｌｄｉｎｇ）」と称するが、そこでは、接着複合コアセルベートは、基体の明確な特定の領域において適用される。一局面では、当該接着複合コアセルベートは、ｉｎ  ｓｉｔｕで作製してもよい。図９Ａを参照すると、低ｐＨ（例えば５）のポリカチオンおよびポリアニオンで構成される予め形成された安定したＰＥＣ溶液１が、シリンジの使用により、より高いｐＨ（例えば、１０）の酸化剤で構成される硬化溶液２と同時に基体に適用されている。混合の際、この硬化溶液は、基体の表面上でそれらポリマーを架橋することにより、接着複合コアセルベートを同時に生じる。
【００６９】
もう１つの局面では、図９Ｂを参照すると、ポリアニオン３およびポリカチオン４の溶液が、同時に基体に適用されている。この溶液の一方は、接着複合コアセルベートを産生させるべく、もう一方よりも高いｐＨを有している。図９Ｂを参照すると、ポリアニオン３は、ポリカチオン溶液４よりもｐＨが低いが；しかしながら、当該ポリアニオンは当該ポリカチオンよりも高いｐＨを有する溶液中にあってもよい、とのことも想定される。より高いｐＨを有する溶液は、架橋を促進するべく、酸化剤を含んでいてもよい。
【００７０】
図９Ｃは、スポット溶接のもう１つの局面を示している。この局面では、基体は、ある特定のｐＨのポリカチオンでプライミングされる。次に、当該接着複合コアセルベートをｉｎ  ｓｉｔｕで作製するべく、より高いｐＨの当該ポリアニオンの溶液が、当該ポリカチオンに適用される。基体はまずポリアニオンでプライミングされ、その後にポリカチオンが続いてもよい、とのことも想定される。次いで、架橋を促進するために酸化剤を当該複合コアセルベート上に別々に適用して、接着複合コアセルベートを産生させてもよい。あるいは、基体がプライミングされた後に適用される溶液は、当該接着複合コアセルベートが形成され、その後ｉｎ  ｓｉｔｕで架橋されるよう、酸化剤を含有していてもよい。
【００７１】
本明細書に記載の接着複合コアセルベートの性質により、それらは、水中用途、例えば対象に対する投与など、に理想的なものとなっている。例えば、当該接着複合コアセルベートおよびそれらから製造される接着剤を用いて、数多くの種々の骨折および骨破壊（ｂｒｅａｋ）を修復してもよい。当該コアセルベートは、いくつかのメカニズムを通じて、骨（および他のミネラル）に接着する（図１Ｃ参照）。骨のヒドロキシアパタイトミネラル相（Ｃａ５（ＰＯ４）３（ＯＨ））の表面は、正および負の両電荷の配列である。当該ポリアニオン上に存在する陰性基（例えばリン酸基）は、正の表面電荷と直接的に相互作用し得るか、または、それは、当該ポリカチオンおよび／または多価カチオン上のカチオン基を通じて負の表面電荷へ架橋され得る。同様に、当該ポリカチオンの、これらの負の表面電荷との直接相互作用は接着に寄与するであろう。また、当該ポリカチオンおよび／またはポリアニオンがカテコール部分を含有する場合には、それらは、当該コアセルベートの、湿りやすいヒドロキシアパタイトへの接着を促進し得る。他の接着メカニズムとしては、酸化されていないクロスリンカー（例えば、ドーパまたは他のカテコール）の、ヒドロキシアパタイトへの直接結合が挙げられる。あるいは、酸化されたクロスリンカーは、骨基質タンパク質（ｂｏｎｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の求核性側鎖にカップリングしていてもよい。
【００７２】
このような破壊（ｂｒｅａｋ）の例としては、完全骨折、不完全骨折、線状骨折、横骨折、斜骨折、圧迫骨折、らせん骨折、粉砕骨折、圧縮骨折（ｃｏｍｐａｃｔｅｄ  ｆｒａｃｔｕｒｅ）、または開放骨折が挙げられる。一局面では、当該骨折は、関節内骨折または頭蓋顔面骨骨折である。例えば関節内骨折などの骨折は、軟骨表面に広がり軟骨表面を断片化する骨損傷である。当該接着複合コアセルベートは、そうした骨折の整復の維持に役立ち、より低侵襲性の手術を可能にし、手術室時間を低減させ、コストを削減し、かつ、外傷後関節炎のリスクを低減させることによってより良好な転帰をもたらす可能性がある。
【００７３】
他の局面では、当該接着複合コアセルベートおよびそれらから製造される接着剤を用いて高度粉砕骨折の小断片をつないでもよい。この局面では、骨折した骨の小さな小片を既存の骨に接着させてもよい。例えば、当該コアセルベートを、骨折した骨および／または既存の骨に適用してもよい。機械的固定器を用いて小断片に穴をあけることにより小断片の整復を維持することは特に困難なことである。断片の数が少なくなるほど、および、多くなるほど、問題はより大きくなる。一局面では、裂け目全体を充填するというよりも、むしろ、骨折を固定するために、当該接着複合コアセルベートまたはその前駆体を、少量注入して、上記で記載したようなスポット溶接による接合部を作製してもよい。この小さな生体適合性のスポット溶接による接合部は、周辺組織の治癒の妨害を最小限に抑えるであろうし、また、必ずしも生分解性である必要がなくなるであろう。この点では、これは、永久的にインプラントされる金物（ｈａｒｄｗａｒｅ）と同様のものとなるであろう。
【００７４】
他の局面では、当該接着複合コアセルベートおよびそれらから製造される接着剤を用いて、足場を、骨および他の組織、例えば軟骨、靱帯、腱、軟部組織、器官、膜様組織（例えば膣膜、鼻粘膜、羊膜）およびこれら物質の合成誘導体など、に固着させてもよい。本明細書に記載の複合体およびスポット溶接技術を用いて、当該接着複合コアセルベートおよびそれらから製造される接着剤を、生物学的な足場を対象中に配置するために使用することができる。当該コアセルベートは、生物学的な足場に適用してもよく、および／または、足場を固着させる前に骨または組織に適用してもよい。本明細書に記載の接着複合コアセルベートで構成される小さい接着性タック（ｔａｃｋ）は、足場の中または外への細胞の遊走または小分子の輸送を妨げないであろう。特定の局面では、当該足場は、骨および組織の成長または修復を促進する１種類以上の薬物を含有していてもよい。他の局面では、当該足場は、感染を防ぐ薬物、例えば抗生物質など、を含んでいてもよい。例えば、当該足場は、当該薬物でコーティングされていてもよく、または、その代替として、当該薬物は、その薬物が足場から経時的に溶出するよう足場内に組み込まれていてもよい。
【００７５】
当該接着複合コアセルベートおよびそれらから製造される接着剤には、数多くの歯科用途がある。本明細書に記載のスポット溶接技術を用いて、当該接着複合コアセルベートを、口腔中の特定の点（例えば、顎、歯の部分）に適用してもよい。例えば、当該コアセルベートは、退縮欠陥の治療に用いて歯肉組織の高さおよび幅を増加させることができ、また、歯肉縁における付着した歯肉組織の量を増加させることができ、また、付着した歯肉組織の区域を増加させることができる。口腔外科においては、それらを用いて、軟部組織の転帰を改善すること、および、新しい骨を骨再生誘導法（ｇｕｉｄｅｄ  ｂｏｎｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）の処置において成長させること、ができるであろう。さらに、当該コアセルベートは、歯周処置の後に歯茎の創傷治癒を促進すること、および、出血を防ぐかまたは減少させるのを助けること、ができる。以下で検討するように、当該コアセルベートを用いて、生物活性剤（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）を送達してもよい。よって、当該コアセルベートを用いて、生物活性剤を歯茎および歯根に送達してもよい。他の局面では、当該コアセルベートを用いて、歯科インプラントを歯に固着させてもよい（例えば、歯冠、義歯）。あるいは、当該コアセルベートを、歯の象牙質またはエナメル質表面の準備をするためのプライマーとして用いて、歯科用セメントを結合させてもよい。
【００７６】
他の局面では、当該接着複合コアセルベートおよびそれらから製造される接着剤は、基体を骨に接着させることができる。基体の例としては、金属基体（例えば、プレート、医療用インプラント等）、繊維、ホイル、布切れ、または対象内にインプラントすることができる他のあらゆる材料、が挙げられる。当該コアセルベートは、使用前に、基体および／または骨に適用してもよい。例えば、骨折した骨を修復するのに、酸化チタン、ステンレス鋼、または他の金属から作られたインプラントが一般に用いられている。当該接着複合コアセルベートまたはその前駆体は、基体を骨に接着させる前に、金属基体、骨、または、その両方に対して適用してもよい。特定の局面では、当該ポリカチオンまたはポリアニオン上に存在する架橋基は、酸化チタンと強い結合を形成することができる。例えば、ドーパは湿った酸化チタン表面に強く結合することができる、とのことが示されてきた（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０３：１２９９９（２００６））。よって、骨の断片を結合させることに加え、本明細書に記載の接着複合コアセルベートは、金属基体の骨への結合を促進することができ、これにより、骨の修復および回復が促進され得る。
【００７７】
当該接着複合コアセルベートおよびそれらから製造される接着剤は、１種類以上の生物活性剤を含んでいてもよい、とのことも想定される。当該生物活性剤は、当該複合体を骨に適用する場合に骨の成長および修復を促進することとなる任意の薬物であってもよい。放出の速度は、当該複合体を調製するのに用いる材料の選択、ならびに、その薬剤が塩である場合には当該生物活性剤の電荷、により制御してもよい。特定の局面では、温度および／またはｐＨの変化により接着複合コアセルベートを不溶性の固体に変える場合には、当該複合コアセルベートを対象に投与し、ｉｎ  ｓｉｔｕで不溶性の固体を生じさせてもよい。よって、この局面では、この不溶性の固体は、限局性制御薬物放出デポ剤（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｄｒｕｇ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｄｅｐｏｔ）として働き得る。生物活性剤を送達するのみならず、組織と骨とを同時に固定もすることで、より多くの患者に快適さをもたらし、骨の治癒を加速させ、および／または感染を防ぐことができる可能性がある。
【００７８】
当該接着複合コアセルベートおよびそれらから製造される接着剤を、他の種々の外科的処置において用いてもよい。例えば、接着複合コアセルベートおよびそれらから製造される接着剤を用いて、外傷により、または、外科的処置自体により引き起こされる裂傷を修復してもよい。一局面では、当該接着複合コアセルベートおよびそれらから製造される接着剤を用いて、対象において角膜または結膜の裂傷を修復してもよい。他の局面では、当該接着複合コアセルベートおよびそれらから製造される接着剤を用いて、対象の血管において血流を阻害してもよい。通常は、当該接着複合コアセルベートを当該血管中へと注入し、その後に、当該コアセルベートを不溶性の固体に変え、かつ、その血管を部分的または完全にブロックするべく、架橋（例えば、複合コアセルベートの加熱または本明細書に記載の他の架橋技術）が続く。この方法には、止血、または腫瘍もしくは動脈瘤への血流を阻害するための人工的な塞栓症の作製など、数多くの用途がある。
【実施例】
【００７９】
以下の実施例は、本明細書において記載および請求されている化合物、組成物、および方法をどのように作製および評価するのかについての完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されたものであり、また、純粋に例示的なものであるよう意図されたものであり、かつ、本発明者らが彼らの発明であると考えるものについての範囲を限定するよう意図されたものではない。数字（例えば、量、温度等）に関する精度を確保するべく努力がなされてきたが、いくらかの誤差および偏差は考慮されるべきである。特に断りがない限り、部は重量部であり、温度は℃で表されているかまたは周囲温度であり、また、圧力は大気圧であるかまたはその付近である。反応条件、例えば成分の濃度、所望される溶媒、溶媒の混合物、温度、圧力、ならびに、記載のプロセスから得られる生成物の純度および収率を最適化するために用いることができる他の反応の範囲および条件など、についての数多くの変形および組み合わせが存在する。こうしたプロセス条件を最適化するために必要となるのは、合理的かつルーチン的な実験法のみである。
【００８０】
Ｉ．接着複合コアセルベートの合成および特徴決定
模倣コポリマーの合成および特徴決定
Ｐｃ３類似体
ドーパ類似モノマー（ドーパミンメタクリルアミド、ＤＭＡ）を、公開されている手順のわずかな改変により調製した。（Ｌｅｅ  ＢＰ，Ｈｕａｎｇ  Ｋ，Ｎｕｎａｌｅｅ  ＦＮ，Ｓｈｕｌｌ  ＫＲ，Ｍｅｓｓｅｒｓｍｉｔｈ  ＰＢ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（ＤＯＰＡ）ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｏｎｏｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｏ−ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＰＥＧ−ｄｉａｃｒｙｌａｔｅ  ｔｏ  ｆｏｒｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ  ２００４；１５（４）：４４９−４６４）。簡単に言うと、ホウ酸塩−ドーパミン複合体を、ｐＨ＞９にて、塩化メタクリロイルと反応させた。酸性化によりホウ酸塩−カテコール結合を壊した後に、生成物を、酢酸エチルで洗浄し、ヘキサンから再結晶し、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ＴＭＳ）により検証した：ｄ８．８−８．５８（２Ｈ、（ＯＨ）２−Ａｒ−）、７．９２（１Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、６．６４−６．５７（２Ｈ、Ｃ６ＨＨ２（ＯＨ）２−）、６．４２（１Ｈ、Ｃ６Ｈ２Ｈ（ＯＨ）２−）、５．６１（１Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（−ＣＨ３）＝ＣＨＨ）、５．３０（１Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（−ＣＨ３）＝ＣＨＨ）、３．２１（２Ｈ、Ｃ６Ｈ３（ＯＨ）２−ＣＨ２−ＣＨ２（ＮＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−）、２．５５（２Ｈ、Ｃ６Ｈ３（ＯＨ）２−ＣＨ２−ＣＨ２（ＮＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−）、１．８４（３Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（−ＣＨ３）＝ＣＨ２）。
【００８１】
重合の前に、リン酸モノアクリロキシエチル（ｍｏｎｏａｃｒｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＭＡＥＰ、ポリサイエンス社）をＭｅＯＨ中に希釈し、ヘキサンで抽出して、ジエンを除去した。コポリマー１は、９０モル％のＭＡＥＰ、８モル％のＤＭＡ、２モル％のアクリルアミド（Ａａｍ、ポリサイエンス社）、および０．１モル％のＦＩＴＣ−メタクリルアミドを、ＭｅＯＨ中で、５重量％の最終モノマー濃度にて混合することにより調製した。フリーラジカル重合は、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）で開始され、６０℃で、２４時間、密封アンプル中で進行した。同様の手順を用いて、図２〜７に示されているポリマー３〜７を作製した。コポリマー１（図１０）は、セファデックスＬＨ−２０カラム（シグマアルドリッチ社）上、ＭｅＯＨ中でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により回収し、回転蒸発により濃縮し、ＤＩ水に溶解させ、凍結乾燥させた。
【００８２】
１のＭＷおよび多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ；ＰＤＩ）は、小角光散乱検出器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  ＢＩ−ＭＷＡ）および屈折率モニター（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  ＢＩ−ＤＮＤＣ）に接続されたＰＬｇｅｌカラム（ポリマーラボ社）上、ＤＭＦ中でのＳＥＣにより決定した。カラムはポリスチレン標準により較正した。１のＭＷは２４５ｋｄａであり、１．９のＰＤＩであった。ドーパミン側鎖濃度および反応性はＵＶ／ＶＩＳ分光法により検証した（ｅ２８０＝２６００Ｍ−１ｃｍ−１）。リン酸側鎖濃度は、自動滴定装置（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｔｉｔｒａｎｄｏ  ８０８）を用いて、０．００５ＭのＮａＯＨでの滴定により決定した。１のＵＶ／ｖｉｓスペクトルは、カテコール型のドーパミンに特徴的な２８０ｎｍにおける単一の吸収ピークを含有していた（図１０Ｂ）。ｐＨ５．０での、１：１のモル比のＮａＩＯ４の、１への添加により、このドーパカテコールは、予想通り、３９５ｎｍ付近に吸収ピークを有するドーパキノンへと酸化された。このドーパキノンピークは、ｐＨ＜５では、数時間の間、安定であった。
【００８３】
Ｐｃ１類似体
Ｐｃ１のリシン側鎖は、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（ＡＰＭＡ、ポリサイエンス社）により模倣した。コポリマー２（図１０）は、１０モル％のＡＰＭＡおよび９０モル％のＡａｍをＤＩ水に溶解させ、Ｎ２で脱気し、２モル％の過硫酸アンモニウム（ポリサイエンス社）で重合を開始させることにより合成した。重合は、５０℃で、２４時間、密封アンプル中で進行した。ポリマーは、３日間の水に対する透析により回収し、次いで、凍結乾燥させた。一級アミン側鎖モル％は、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ＴＭＳ）により、ｄ１３．４５（３Ｈ、−ＣＨ３）とｄ５１．０４（１Ｈ、ＲＣ（＝Ｏ）ＣＨＲ２）との比から決定した。２のＭＷおよびＰＤＩは、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６カラム（ファルマシア社）上、ＰＢＳ（２０ｍＭ  ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中でのＳＥＣにより決定した。カラムはポリ−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート標準により較正した。２のＭＷは１６５ｋｄであり、ＰＤＩは２．４であった。
【００８４】
コアセルベートの形成および特徴決定
２の５重量％水溶液を、１の５重量％水溶液に、撹拌しながら、標的とするアミン／リン酸塩比に達するまで滴加した。総コポリマー濃度は５０ｍｇ／ｍｌであった。３０分間混合した後に、ｐＨを、ＮａＯＨ（６Ｍ）で調整した。高分子電解質複合体（ＰＥＣ）形成の助けとなるｐＨ（＜４）の組成物を、ＤＩ  Ｈ２Ｏ中で、１ｍｇ／ｍｌへと希釈し、ＰＥＣのゼータ電位とサイズ分布とを、ゼータサイザー３０００ＨＳ（マルバーン・インスツルメンツ社）上で測定した。より高いｐＨにて、コアセルベートした（ｃｏａｃｅｒｖａｔｅｄ）組成物を、２５００ｒｐｍで、マイクロフュージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）（エッペンドルフ）中で、２５℃で２分間遠心し、コアセルベート相を収集した。両相の体積を測定した。このコアセルベート相を、凍結乾燥させ、秤量して、それらの質量と濃度とを決定した。
【００８５】
３〜１０のｐＨ範囲にわたる、リン酸塩のアミン側鎖に対するモル比１：１にて混合した、１および２（合わせた濃度が５０ｍｇ／ｍｌ）の相挙動を、図１１Ａに示す。総イオン化可能側鎖濃度に正規化した、算出した実効コポリマー電荷を、図１１Ｂに示す。還元剤であるアスコルビン酸塩を、ドーパに対して１：５のモル比で添加し、Ｏ２によるドーパの酸化およびそれに続く上昇したｐＨでの架橋の速度を減じた。低ｐＨでは、当該高分子電解質は、コロイド状の高分子電解質複合体（ＰＥＣ）の、安定した乳白色の溶液を形成した。動的光散乱により決定した、ｐＨ２．１におけるＰＥＣの平均直径は、狭い分散度で３６０ｎｍであり、ｐＨ４．０では１０８０ｎｍまで増加した（図１１Ｃ）。ｐＨ３．６におけるゼータ電位の正から負への交差は、当該複合体の、算出したｐＨ依存性の実効電荷に、十分に合致した（図１１Ｂ）。粒子サイズは、ｐＨ４より上では、複合体が綿状の固まりになったため、正確には測定できなかった。実効電荷がリン酸側鎖の脱プロトン化に起因して増加するにつれて、コポリマーは凝縮し、高密度第二相になった。ｐＨ５．１では、分離した相は、緩い低密度沈殿物の特性を有していた。ｐＨ７．２および８．３では、高密度相は、凝集性の液体複合コアセルベートの特性を有していた（図１２）。これらコポリマーを、コアセルベートした相において、それぞれ、１４８および１５３ｍｇ／ｍｌへと約３倍濃縮した。ｐＨ９．５では、高分子電解質混合物は、高密度非液体イオン性ゲルを形成した。ｐＨ１０では、コポリマーは、溶液中に溶け、ドーパキノンおよびアミン側鎖を通じて自然に架橋されて、透明なヒドロゲルになった。
【００８６】
キレート剤ＥＤＴＡを用いての二価カチオンの抽出の結果、Ｐ．カリフォルニカ（Ｐ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）チューブの圧縮強度が５０％減少し、接着性が１０倍減少し、糊の多孔質構造がつぶれた。模倣高分子電解質の相挙動に対する二価カチオンの効果は、０：１〜１：１の範囲の、二価カチオンのリン酸側鎖に対する比とともに、１：１〜０：１の範囲の、アミンのリン酸側鎖に対する比で、１および２を混合して、コアセルベート相図（図１３）を作製することにより調査した。ｐＨは海水のｐＨである８．２に固定し、二価カチオンは、元素分析により決定された天然糊における近似Ｍｇ２＋／Ｃａ２＋比であるＭｇ２＋およびＣａ２＋の４：１混合物として添加した。最も高い質量のコアセルベート（濃い灰色の四角）は、より高い、アミンのリン酸側鎖に対する比と、より低い、二価カチオンのリン酸側鎖に対する比とを有する混合物において生じた。より低いポリアミン比を有する混合物は、より高い二価カチオン／リン酸側鎖比においてさえ透明であった（透明色の四角）。より高いアミン／リン酸塩比および二価カチオン／リン酸塩比においては、溶液は、わずかな沈殿物を伴って混濁していた（明るい灰色の四角）が、ＰＥＣを含有する溶液（中くらいの灰色の四角）よりも混濁はずっと少なかった。
【００８７】
機械的結合試験
帯鋸を用いて、地元の食料品店から入手したウシ大腿骨皮質骨から、およそ１ｃｍ３の骨試験検体を切断し、３２０グリットのサンドペーパーで磨き、−２０℃で保存した。ドーパ側鎖に対して１：２のモル比のＮａＩＯ４を、２つの湿った骨検体それぞれの１つの面に、均等に適用した。１ｃｍ２の骨界面間の空間を完全に満たすのに十分な体積である４０ｍｌの試験コアセルベート溶液をピペットで適用し、また、それらの骨検体を、少し過剰な接着剤をひねり出しながら互いに押し合わせ、クランプし、すぐに、ＰＢＳ（２０ｍＭ  ＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に浸したガーゼの中に包んだ。この適用されたコアセルベートは、時期尚早の架橋を防ぐべく、ドーパに対して１：５のモル比でアスコルビン酸塩を含有していた。この結合させた検体を、１００％の湿度維持するために、浸されたスポンジを含有する密封容器中で、３７℃にて、少なくとも２４時間インキュベートした。基準検体を、４０ｍｌのロックタイト４０１瞬間接着剤を用いて全く同じ様式で結合させた。比較のための利用可能な硬組織医療用接着剤がなにもないため、市販の非医療グレードのシアノアクリレートを用いた。機械的試験は、特注の材料試験システム上で、１ｋｇのロードセルを用いて行なった。機器を制御し、ＬａｂＶｉｅｗ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いてデータを取得した。結合させた対のうちの一方の骨を、結合界面から１ｍｍ横にクランプした。２つ目の骨は、結合界面の１ｍｍ横に配置された切れ味の悪い刃に対して、０．０２ｍｍ／秒のクロスヘッド速度で押した。結合強度試験は、乾燥を防ぐべく、当該湿った検体の包みをはがした直後に、室温にて行なった。試験の後に、それら結合を、破損の様式について調べた。結合領域は、紙上に骨接触表面の輪郭をトレースし、そのトレースを切り出し、その面積を、切り出した紙の重量から決定することにより測定した。少なくとも６つの検体を、各条件について試験した。
【００８８】
剪断弾性係数および破損時の強度は、図１３において星印でマークされた３つのコアセルベート化（ｃｏａｃｅｒｖａｔｉｎｇ）組成物に湿っている間に結合させたウシ皮質骨検体を用いて測定した。この３つの組成物におけるコアセルベート密度は、二価カチオン比を増加させるに伴って（それぞれ、１２０、１２５、および１３０ｍｇ／ｍｌへと）増加した。十分に水和させた検体の当該係数および結合強度は、いずれも、二価カチオン濃度を増加させるに伴って増加し、市販のシアノアクリレート接着剤で結合した湿った骨の３７％の強度に達した（図１４Ａ）。基準点としてシアノアクリレート接着剤を用いたが、これは、比較のための臨床用の骨接着剤がなにもないためである。当該模倣接着剤の強度は、３５０ｋＰａであると推定される天然のＰ．カリフォルニカ（Ｐ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）糊および季節に応じて３２０〜７５０ｋＰａにわたると推定されるイガイ（ｍｕｓｓｅｌ）の足糸の糊の強度の約１／３でもある。ほぼすべての場合において、これらの結合は、凝集的に両骨界面上に接着剤を残して破綻したが、これは、これら組成物が、ヒドロキシアパタイトとの強い界面結合を形成した、とのことを示唆していた。これらの結合は、数ヶ月間ｐＨ７．２でＰＢＳ中に完全に沈めた後において、感知できるほどの収縮も膨張もなく、寸法的には安定であった（図１４Ｂ）。硬化および長期間の水への曝露の際の寸法安定性は、有用な骨接着剤には重要な要件である。
【００８９】
ドーパミンにより媒介されるコポリマー架橋
１：１のモル比での３の溶液へのＮａＩＯ４の添加により、すぐに、および、定量的に、ドーパ（２８０ｎｍ）はドーパキノン（３９２ｎｍ）へと酸化された。数分以内に、このキニン（ｑｕｉｎｉｎｅ）ピークは、反応性キノンが共有結合性ジドーパ架橋を形成するにつれて、広い全吸収（ｇｅｎｅｒａｌ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）へと減衰した（図１５、左上図）。キノンと一級アミンとの間の架橋（図１５、左下図）は、ジドーパ架橋よりもより広い全吸収をもたらした。したがって、ドーパミン酸化および架橋化学現象は、当該ドーパミンコポリマーにおいて、予想通りに挙動した。当該ドーパミンコポリマーは、酸化架橋の結果、速やかにヒドロゲルを形成した（図１５、ＡおよびＣ）。酸化されたホスホドーパミン３は、単独ではゲル化しなかった（図１５Ｂ）が、４と混合した場合には速やかにゲル化した（図１５Ｄ）。ＰＯ４コポリマー間の分子間ジドーパ架橋は阻害されたが、分子間ドーパ−アミン架橋は阻害されなかった。これにより、合成接着剤の製剤および送達に有用であり得る架橋制御メカニズムが提供される。
【００９０】
ｐＨにより誘因される、ドーパにより媒介される架橋
ドーパ酸化のｐＨ依存性と動態とを探究するために、当該ドーパミンコポリマーの架橋を、ＵＶ−Ｖｉｓ分光法により評価した。ｐ（ＥＧＭＰ［９２］−ＤＭＡ［８］）（３）を用いた結果を図１６に示す。ＵＶ−ｖｉｓスペクトルは、化学量論量のＮａＩＯ４の添加後、時間を増加させて取得した。ｐＨ５．０（上図）では、ドーパキノン吸光度（３９８ｎｍ）は、およそ１５分で最大となり、数時間にわたり安定なままであった（挿入図）。ｐＨ６．０では、３９８ｎｍにおける吸光度は、＜１分でピークになり、３１０および５２５ｎｍにおけるピークを有する広い吸光度へと展開した。この広い吸光度は、ゲルが形成されないことから、ドーパキノン架橋に起因するものではない（図１６）。比較のために、６を低ｐＨで酸化し架橋したが、より有意に低い速度においてであった（不掲載）。
【００９１】
結果が示しているのは、当該ドーパキノンは低ｐＨで安定であるとのこと、および、ジドーパ架橋は、ホスホドーパミンコポリマーにおいては、より高いｐＨにおいて阻害されたとのことである。当該ポリアミンの存在下では、共有結合性架橋は、分子間アミン−ドーパ結合の方へと向けられた。それが、当該合成接着剤の制御された送達および凝結への経路をつくるものであることから、これは重要な観察である。
【００９２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性
各４０重量％の３および４の溶液を低ｐＨで混合して、高分子電解質複合体を形成した。この溶液を、ＮａＩＯ４で部分的に酸化し、滅菌ガラス製カバースリップへの適用の直前にＮａＯＨで塩基性化した。接着剤で処理したカバースリップを、培養プレートのウェルの底に置き、かつ、血清含有培地に入ったヒト包皮繊維芽細胞、ヒト気管繊維芽細胞、およびラット初代星状細胞を、３０Ｋ個の細胞／ウェルにて、別々のウェルに添加した（図１７）。２４時間後に、これらの細胞を、４％パラ−ホルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｄｙｅ）で固定し、次いで、細胞形態を可視化するために中間径フィラメントタンパク質であるビメンチン（緑色、Ａ〜Ｂ）、ＥＣＭ分泌を評価するために細胞周囲のフィブロネクチン（赤色、Ｂ）、初代星状細胞の形態を可視化するためにグリア繊維性タンパク質（緑色、Ｃ）、および核を可視化するためにＤＡＰＩ（青色、Ｃ）、について免疫染色した。接着剤の顆粒状の塊は、オレンジがかった赤色に自己発光した（Ａ〜Ｃ）。
【００９３】
代表的画像（図１７）においては、すべての細胞型は、接着剤なしでガラス上で成長している細胞と区別できない形態を有していた。これらの細胞は、正常な運動性を有しており、いくつかの場合においては、接着剤に直接接触するプロセスに至っていた。毒性は見られなかった。
【００９４】
ラット頭蓋冠欠陥モデル
断片化欠陥の作製と接着複合コアセルベートによる修復とを図１８Ａ〜Ｆに示す。オスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ系ラット（２５６〜２９０ｇ）（ハーラン社）を、ケタミン（６５ｍｇ／ｋｇ）、キシラジン（７．５ｍｇ／ｋｇ）、およびアセプロマジン（０．５ｍｇ／ｋｇ）の混合液で麻酔した。十分な麻酔深度にて、目を眼軟膏剤で覆い、頭の毛を剃り、頭皮をイソプロパノールおよびブタジエンで消毒した。定位フレームにて準備したラットを用い、およそ５０００ＲＰＭで作動する圧縮空気駆動式ドリルは、定位の目の細かいマニピュレーターを用いて下げた。開頭部位にて滅菌生理食塩水またはＰＢＳを連続的に適用し、その一方で、特注の穿頭器具を、６００ミクロン（ラットの頭蓋の厚さとして前に決定し、このラットの年齢を本実験で用いた）下げた。その結果が、頭蓋を貫く、円形の精確な穴であり、その下にある硬膜または脈管構造には観察できるような影響はほとんど見られない（図１８Ａ〜Ｂ）。細い曲がったピンセットで骨プラグを回収し、止血鉗子と細い骨鉗子とを用いて砕いて断片化した（図１８Ｂ）。骨の断片を当該欠陥へと戻して（図１８Ｃ）、５μｌの試験接着剤（当該骨折の適用直前に混合した３および４）をマイクロピペッターで適用した（図１８Ｄ）。低粘度接着剤溶液（送達の直前に硬化溶液と混合した予め形成させたＰＥＣ）は、直ちに、かつ、きれいに、当該骨折中へと入り込んだ。５分以内にこれら断片は十分に固定され、変位することなくピンセットでトントントンと素早く叩くことができた。接着剤は、硬化するにつれて、暗い赤みがかった茶色に変化し続けた（図１８Ｅ〜Ｆ）。
【００９５】
ＩＩ．アミン修飾ポリマーから作製される接着複合コアセルベート
Ａ．材料および方法
材料
低エンドトキシンのゲル化しないゼラチン（ＭＷ  ３．５ｋＤａ）は、Ｇｅｌｉｔａ社（アイオワ州スーシティ（Ｓｏｕｉｘ  Ｃｉｔｙ））により提供されたものであった。１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびエチレンジアミン二塩酸塩は、サーモサイエンティフィック社から購入した。リン酸モノアクリロキシエチル（ＭＡＥＰ）、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）は、ポリサイエンス社から購入した。過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）、セファデックスＬＨ−２０、塩酸ドーパミンは、シグマアルドリッチ社から入手した。
【００９６】
ポリホスホドーパミド合成
ポリホスホドーパミド（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈｏｄｏｐａｍｉｄｅ）コポリマー（ポリ（ＭＡＥＰ８５−ＤＭＡ１５））は、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を開始剤として用いる、ＭＡＥＰとドーパミンメタクリルアミド（ＤＭＡ）とのフリーラジカル重合により合成した。当該コポリマーは、セファデックスＬＨ−２０カラム（シグマアルドリッチ社）上、ＭｅＯＨ中でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により回収した。ＭｅＯＨを除去し、当該コポリマーを、水に再懸濁し、凍結乾燥させ、−８０℃で保存した。当該コポリマー中のドーパミド側鎖のモル％を、ＵＶ／ｖｉｓ分光法により決定したが、：カテコール型のドーパミドは、２７９ｎｍにおける吸収ピークを有する（λ２７９＝２６００Ｍ−１ｃｍ−１）。
【００９７】
ゼラチン修飾
アミン修飾ゼラチンを作製するための一般的な反応スキームを図２１に提示する。ゼラチン（１００ｍｇ／ｍｌ）を、エチレンジアミン二塩酸塩（ゼラチンカルボキシル基に対して１：１のモル比）と混合した。６ＭのＨＣｌでｐＨを５．２に調整した。エチレンジアミン二塩酸塩に対して１．２：１のモル比のＥＤＣを、この反応混合物に、撹拌しながら添加した。反応は、室温で２時間進行した。このアミン修飾ゼラチンを、ＤＩ水に対して３日間透析し、次いで、凍結乾燥させた。一級アミン側鎖濃度は、標準としてグリシンを用いて、ニンヒドリンアッセイにより決定した。ゼラチン（水中、１ｍｇ／ｍｌ）のゼータ電位測定値は、マルバーン・ゼータサイザー・ナノ−ＺＳ  ＺＥＮ  ３６００（マルバーン・インスツルメンツ社、英国ウスターシャー）を用いて、電気泳動により決定した。
【００９８】
ゼラチンコアセルベート形成
アミン修飾ゼラチンの５０ｍｇ／ｍｌ水溶液（ｐＨ５．０）を、種々の二価カチオン比（Ｃａ２＋またはＭｇ２＋）を有するポリ（ＭＡＥＰ８５−ドーパ１５）の５０ｍｇ／ｍｌ水溶液（ｐＨ５．０）に、撹拌しながら、標的とするアミン／リン酸塩比に達するまで滴加した。この混合物のｐＨを、ＮａＯＨで、７．４へと上昇させた。コアセルベート相を、２４時間、沈降させておいた。このコアセルベート相と平衡相とを分離し、それらの体積を測定した。このコアセルベート相を、凍結乾燥させ、秤量して、それらの質量と濃度とを決定した。
【００９９】
動的レオロジー
弾性係数（Ｇ’）および貯蔵弾性係数（ｓｔｏｒａｇｅ  ｍｏｄｕｌｕｓ）（Ｇ”）は、応力制御レオメーター（ＴＡインスツルメント社、ＡＲ５００）上にて、コーンおよびプレート配置（２０ｍｍの直径、４℃のコーン）を用いて測定した。コアセルベート組成物を比較するために、当該測定は、温度を０．５℃／分の速度で０℃から４０℃へと上昇させながら、１Ｈｚの一定の周波数および０．１％の動的な歪みで行なった。
【０１００】
接着剤結合強度
水鋸を用いて、５０５２アルミニウムシート（０．０５０インチ）から、０．１２×０．６×５ｃｍのアルミニウム試験被接着体を切断した。これら被接着体を、６００グリットのスーパーファインサンドペーパーで磨き、次いで、ＡＳＴＭ  Ｄ２６５１の手順に従ってクリーニングした。簡単に言うと、これら被接着体を、ＭｅＯＨ中で２回超音波処理し、風乾させ、ノクロミックス（ｎｏｃｈｒｏｍｉｘ）および硫酸の溶液中へと１５分間漬け、次いで、ＤＩ水で徹底的にすすぎ、結合させるまでＤＩ水中で保存した。クリーニングの１２時間以内に、これら被接着体を結合させた。各接着剤試料について、９つの湿ったアルミニウム試験検体を結合させた。ドーパミド側鎖に対して１：２のモル比のＮａＩＯ４を、２つのアルミニウム被接着体の結合領域に、均等に適用した。試験コアセルベート溶液（６μｌ）を、ピペットで、湿った被接着体に適用し、次いで、これらを、約２５ｍｍ重なり合わせながら互いに押し合わせ、クランプし、すぐに、ＮａＯＨによりｐＨ７．４に調整された水の中に沈めた。硬化したこれら結合させた検体は、特定の温度にて、およそ２４時間、水の中に完全に沈めた。剪断強度は、温度制御されたウォーターバス中に完全に沈めたこれら被接着体を、１００Ｎのロードセルを備えたインストロン３３４２材料試験システム上に載せて、測定した。機器を制御し、Ｂｌｕｅｈｉｌｌ  Ｌｉｔｅソフトウェア（インストロン社）を用いてデータを取得した。
【０１０１】
Ｂ．結果
接着複合コアセルベートは、低ＭＷ（３〜５ｋｄａ）のゲル化しないコラーゲン加水分解物を当該ポリカチオンとして用いて作製した。理解される通り、このコラーゲン加水分解物は、生理的ｐＨでは、ホスホドーパコポリマー（ポリ（ＭＡＥＰ）８５−コ−ドーパミド１５））を有する複合コアセルベートを形成しなかった。エチレンジアミンを用いてのカルボン酸側鎖のアミノ化により、アミン濃度はおよそ１６モル％へと上昇し、ｐＩは５．５から１０．４へとシフトした。アミノ化コラーゲンは、２５℃で、広い範囲の組成物にわたって、高密度コアセルベートを形成した。ｐＨ５では、濃縮コアセルベートは、０．５〜１．０の、アミンのリン酸側鎖に対する比、および、最大０．８までの、Ｃａ２＋のリン酸塩に対する比、にて形成された（図２３Ａ）。いずれの組成物も沈殿しなかった。ｐＨ７．４では、コアセルベーション空間はより狭まり、；０．２よりも高いＣａ２＋比では、コポリマーは、ｐＨの上昇に伴う、混合した高分子電解質およびＣａ２＋の、低下した溶解度を反映して、固い固体として沈殿した（図２３Ｂ）。
【０１０２】
Ｍｇ２＋の、当該高分子電解質のコアセルベーションに対する個々の効果についての調査により、Ｃａ２＋と比較しての有意な違いが明らかとなった。ｐＨ５では、コアセルベートした領域は、より広かった。リン酸塩に対して最大１：１までのＭｇ２＋の比において、いずれの組成物も沈殿しなかった（図２３Ｃ）。Ｍｇ２＋に伴って、コポリマーは凝縮し、より濃縮されたコアセルベートになったが、＞３８０ｍｇ／ｍｌのいくつかの場合においては、初期コポリマー濃度からほぼ８倍の増加となった。ｐＨ７．４では、コアセルベーション範囲はより広くなり、高いＭｇ２＋比においては、上昇したｐＨに伴う低下した溶解度に起因して、流体および固体の混合相を有する組成物が生じる（図２３Ｄ）。より高いｐＨにおける、この広がったコアセルベーション空間は、当該高密度流体コアセルベートが、可溶性の高分子電解質と不溶性の固体との間の安定してバランスのとれた中間体である、とのことを再び説明している。高いＭｇ２＋比における固化状態の物理的性質は、非流体ではあるが、固いＣａ２＋沈殿物よりも、より柔らかく、かつ、よりゲル様であり、これは、ことによると、流体コアセルベートおよび固体に対する脱溶媒和の中間状態を反映している。Ｍｇ２＋複合体のこのはっきりとした物理的性質および溶解度プロファイルは、おそらく、Ｃａ２＋イオンと比較した、Ｍｇ２＋イオンの、より小さい半径、より高い電荷密度、およびより小さい配位数の結果である。Ｍｇ２＋は、リン酸塩のような、単一の嵩高い配位子を配位させる傾向があるが、これは、この小さなイオンの周りに複数の配位子は収まらないためである。結果として、その溶媒和圏（ｓｏｌｖａｔｉｏｎ  ｓｐｈｅｒｅ）のうちの多くが保持される。他方では、より大きいＣａ２＋イオンは、いくつかの嵩高い配位子を収容することができ、その結果、その溶媒和圏の置換および配位子間の架橋形成がもたらされる。混合したＭｇ２＋およびＣａ２＋を用いて調製されたコアセルベートは、それぞれのカチオンのコアセルベートした領域間の空間を塞いだ。
【０１０３】
図２３中の相図が経験的に説明しているのは、どのようにして、分泌顆粒と海水との間のｐＨ差が、当該天然接着剤の急速ではあるがタイミングのよい初期凝結反応を駆動する相変化を誘因することができたのか、ということである。凝縮した流体複合コアセルベート相は、安定したコロイド状複合体とゲル化または沈殿したポリマー塩との間の熱力学的バランスがとれている。当該天然接着剤の組成物は、分泌経路内でコアセルベーション境界の内側に収まるよう、しかし、海水の上昇したｐＨではコアセルベートした領域の外側となるよう、適合させてもよい。言い換えれば、それらは、分泌に際してｐＨ依存性の相変化を受けるよう構成される。例えば、０．４のＣａ２＋比および０．３より大きいアミン比を有する４列目の組成物（図２３ＡおよびＢ）は、ｐＨ５ではコアセルベートされるが、ｐＨ７．４以上では固体である。
【０１０４】
０℃では、図２３Ｂ中のコアセルベートした領域はおよそ１列下へとシフトしたが、一方、３７℃では、１列上へシフトする（不掲載）。上昇するＣａ２＋比および０．６の固定されたアミン比でのｐＨ７．４におけるいくつかの組成物のこの温度依存性の相転移を、動的振動レオロジーにより、より詳細に調査した（図２４Ａ）。低い温度では、粘性剪断弾性係数（ｖｉｓｃｏｕｓ  ｓｈｅａｒ  ｍｏｄｕｌｕｓ）（Ｇ”）は、弾性係数（Ｇ’）よりも大きかったが、これは、当該複合コアセルベートの流体特性に合致する。温度を増加させるに伴い、Ｇ’はＣａ２＋比依存的様式でＳ字状に上昇した。組成物が粘性の流体から耐荷重弾性固体へと変化し始める転移温度と解される、Ｇ’＝Ｇ”である交差点（図２４Ａ、挿入図）は、０．１５、０．２０、０．２５、および０．３０のＣａ２＋比について、それぞれ、３６、２１、１２、および９℃であった。Ｍｇ２＋含有コアセルベートは性質的に類似した挙動を示し、：ｐＨ７．４では、最大０．８までのＭｇ２＋のリン酸塩に対する比においては、Ｇ’とＧ”との交差がなく、より高い比においては、交差温度は、Ｍｇ２＋比を増加させるに伴って再び下降した。３７℃での弾性係数は、Ｍｇ２＋では、Ｃａ２＋でよりもずっと低かった（図２４Ｂ）が、これは、固化したＭｇ２＋コアセルベートの、より水和したゲル様の質に合致する。
【０１０５】
０．６で固定されたアミン比とともに０〜０．３の範囲のＣａ２＋比を用いて形成した結合は、当該組成物の転移温度を十分に上回る３７℃で温度制御されたウォーターバス中に完全に沈めた磨いたアルミニウム被接着体を用いて試験した。重ね剪断強度は、Ｃａ２＋を最大０．３の比まで増加させるに伴って増加した（図２５Ａ、黒色のバー）。０．２および０．２５Ｃａ２＋／０．６アミンの組成物は、それらのそれぞれの転移温度よりわずかに下、１０および２０℃においても試験した。いずれの場合にも、転移温度より上での結合強度は、転移温度より下で（図２５Ａ、白色のバー）よりも大きかった。当該試験セットアップの条件下では、ポリリン酸塩のドーパミド側鎖とゼラチンのアミンとの間には、共有結合性酸化架橋がほとんどないようであり、：ドーパ酸化の速度は、ｐＨ７．４では、８．２よりもずっと遅く、溶解したＯ２の、狭い結合間隙（６２μｍ）への拡散は限られ、また、ドーパ酸化を示す、接着剤の、はっきりとした褐色化は見られなかった。したがって、この、転移温度より上での結合強度の増加は、主に、接着剤の状態変化に起因するものであった。１．０のＭｇ２＋比での同様の試験は、より著しい増加、すなわち、転移温度より下でよりも、転移温度より上では、結合強度が６倍以上の増加を示した（図２５Ｂ）。実際問題として、これらの結果が示したのは、温度差を、当該合成接着剤の初期凝結を誘因するための便利な手段として利用することができるということ、および、この温度誘因は、二価カチオン比の小さな変化により生理学的に妥当な範囲内に調整することができるということである。
【０１０６】
次に、当該合成接着剤の結合強度への、共有結合性架橋の寄与について調査するべく、ドーパミド側鎖に対して０．５当量のＮａＩＯ４を結合手順の最中に添加することにより、ポリホスフェートドーパミド（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｏｐａｍｉｄｅ）側鎖とゼラチンアミンとの間の酸化カップリングを開始させた。結合を硬化させ、ｐＨ７．４に調整した水の中に完全に沈めながら、３７℃で試験した。結合強度は、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋の両方とも、二価カチオン比を増加させるに伴って増加した（図２５、平行線模様のバー）。Ｍｇ２＋での最大結合強度は、７６５ｋＰａに達し、Ｃａ２＋の結合強度の２倍であった。
【０１０７】
結論として、当該接着複合コアセルベートは、可溶性ポリマーと不溶性ポリマー塩との間で不安定にバランスのとれた、高密度の、部分的に水に非混和性の流体であった（図２２Ａ中の白色の矢印を参照）。図２２Ｂを参照すると、上列は、当該高分子電解質の相挙動を表している。下列は、相挙動の特徴を、水中糊の作製に関するいくつかの問題の解決に結びつけたものである。初期凝結反応である、流体複合コアセルベートから不溶性の固体への変化は、ｐＨ、温度、またはその両方の変化により誘因される。共有結合性硬化は、カテコールと一級アミン側鎖との間の酸化カップリングを通じて起こる。
【０１０８】
ＩＩＩ．光架橋性（ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋａｂｌｅ）ポリマーの調製
メタクリル酸グラフトポリリン酸塩の合成（図２６）
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（５モル％）、リン酸モノメタクリロキシエチル（９４．９５モル％）およびＦＩＴＣ−メタクリルアミド（０．０５モル％）の混合物をメタノール（９０重量％）に溶解させた。開始剤ＡＩＢＮ（２モル％）を添加し、この溶液をアルゴンで３０分間パージした。重合は６５℃で２４時間進行した。メタクリル酸塩に、コポリマーのアミン側鎖、ごく少量のｔ−オクチルピロカテキン、２．１当量のトリエチルアミンおよび１当量の塩化メタクリオリル（ｍｅｔｈａｃｒｙｏｌｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を添加し、この反応物を３０分間撹拌した。このメタクリル酸グラフトコポリマーを、ＬＨ−２０セファデックス上、ＭｅＯＨ中でのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。このコポリマーを、回転蒸発により濃縮し、次いで、脱イオン水に溶解させ、凍結乾燥させた。
【０１０９】
メタクリル酸グラフトポリアミンの合成（図２６）
保護モノマーＮ−（ｔ−ＢＯＣ−アミノプロピル）メタクリルアミド（１０モル％）を、最小量のメタノールに溶解させ、水で希釈した。モノマーＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（５モル％）およびヒドロキシプロピルメタクリルアミド（８５モル％）および開始剤ＡＩＢＮ（２モル％、最小量のメタノール中）を添加した。総モノマー濃度は２重量％であった。この溶液をアルゴンで３０分間パージし、次いで、６５℃で２４時間加熱した。このターポリマーを、３日間の脱イオン水における透析（１２，０００〜１４，０００ＭＷＣＯ）により精製し、次いで、凍結乾燥させて、当該ポリマーを白色固体として得た。
【０１１０】
このメタクリル酸塩ターポリマーをＤＭＦに溶解させ、次いで、遊離アミン基に対して、２．１当量のトリエチルアミンを、続いて１当量の塩化メタクリロイルを、添加した。この反応物を３０分間撹拌した。ｔ−ＢＯＣ基は、５当量のＴＦＡを添加することにより除去した。この脱保護したターポリマーを、ジエチルエーテルで沈殿させ、ＤＩ水に再懸濁し、凍結乾燥させた。メタクリロリル（ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｌｙｌ）置換の度合いは、１Ｈ  ＮＭＲにより、ビニルプロトンシグナルの、エチルおよびプロピルプロトンシグナルに対する比を用いて算出した。
【０１１１】
光架橋（ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）（図２６）
光開始剤ＩＲＧＡＣＵＲＥ２９５９（０．１重量％）を、メタクリレート化した（ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅｄ）コポリマーの５重量％水溶液に添加した。この溶液を、ノバキュア光硬化光源を用いて、３６５ｎｍで照射した。
【０１１２】
本願全体を通じて、様々な文献が参照されている。本明細書に記載の化合物、組成物および方法をより十分に記述するために、これら文献の開示内容全体は、本明細書により、参照により本願中へと組み入れられるものとする。
【０１１３】
本明細書に記載の化合物、組成物および方法に対して、種々の変更および変形を行なうことが可能である。本明細書に記載の化合物、組成物および方法の他の局面は、本明細書の考察ならびに本明細書において開示されている化合物、組成物および方法の実施から自明となる。本明細書および実施例は例示的なものとみなされる、ということが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ−６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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