(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウムあるいはケイ素といった植物成分の正の原子価の元素と、イオウとが結合してなり、−５００ｍＶ〜−７００ｍＶの酸化還元電位（ＯＲＰ値）を有する甲状腺亢進症の治療用生物無機化合物複合体。
【請求項２】
ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウムあるいはケイ素といった植物成分の正の原子価の元素と、イオウと酸素および／または炭素とが結合してなり、−５００ｍＶ〜−７００ｍＶの酸化還元電位（ＯＲＰ値）を有する甲状腺亢進症の治療用生物無機化合物複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、減酸素、高還元力を有する生物無機化合物複合体に関し、特に、副作用が少なく短期間でのバセドウ病の治療を図り、その他の疾病への薬理効果、また、美容効果、動植物の生育効果、環境改善効果を図った減酸素、高還元力を有する生物無機化合物複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
甲状腺は、甲状腺ホルモンを産生する内分泌器官である。甲状腺ホルモンは、一般的に全身の代謝率を向上させる働きをもち、具体的には、消化管、心臓、骨、精神神経系に作用し、新陳代謝を活発にさせる。そして、この甲状腺ホルモンの分泌量は、様々なホルモンによって調節されており、特に、視床下部から分泌される甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）及び、このＴＲＨの刺激によって下垂体から分泌される甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）によって調節されている。【０００３】
甲状腺ホルモンの濃度が低下するとＴＲＨ及びＴＳＨが分泌され、甲状腺表面にあるＴＳＨ受容体を刺激し、甲状腺ホルモン（Ｔ３又はＴ４）を産生、分泌する。また、甲状腺ホルモンの濃度が上昇すると、ＴＲＨ、ＴＳＨの分泌が低下し、甲状腺ホルモンの産生、分泌が低下する。【０００４】
ここで、甲状腺機能の代表的な疾患であるバセドウ病は、甲状腺刺激ホルモン（以下、ＴＳＨ）の受容体に結合する自己抗体が生じることにより、この自己抗体がＴＳＨの代わりに受容体を過剰に刺激することで、ＴＳＨが過剰に生成され、身体に様々な影響を与えるために発症するものである。【０００５】
このバセドウ病の治療法には、薬物治療や放射線ヨード治療、外科的手術があり、現在は、薬物治療が一般的となっている。薬物治療では、メチマゾール（以下、ＭＭＩ）やプロピルチオウラシル（以下、ＰＴＵ）といった抗甲状腺薬を使用するものの、この２つの薬剤には、副作用があることが知られており、ＭＭＩは、アレルギー反応や肝臓の各種酵素の上昇、関節痛、深刻な場合には、無顆粒球症を引き起こすとされている（非特許文献１）。また、ＰＴＵは、重度の肝臓障害を引き起こすことが知られており（非特許文献２）、バセドウ病の患者にとっては、両者の薬剤を使用することは、身体に非常に高い負担を伴うものとなっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Cooper DS. (2005) Antithyroid drugs. N Engl J Med. 352:905-17.
【非特許文献２】Cooper DS, Rivkees SA. (2009) Putting propylthiouracil in perspective. J Clin Endocrinol Metab. 94:1881-2.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところが、現在でもなお、バセドウ病の薬物治療には、上記した薬剤が使用されており、定期的な甲状腺ホルモンの量を測定し、規則的かつ、適切な量の薬剤の服用を長期的ににしなければならない。これは、患者にとっては、身体的かつ精神的に負担のかかるものであり、さらに、副作用のリスクを伴う。よって、副作用が少なく、短期間での治療で効果が表れる薬剤が望まれている。【０００８】
一方、様々な疾患の原因には、「活性酸素」の影響が原因の一つとされている。この活性酸素は、生体内の代謝過程で発生し、細胞の働きを阻害したり、細胞自体を傷付けたりすることで、活性酸素の増加が多くの疾患や老化等のメカニズムに関与することが明らかになってきている。酸素は、生物にとって必要不可欠なものである反面、生体を酸化させ、種々の障害を引き起こす原因となる。通常の生理条件下では酸化による障害は極めてゆるやかであるが、生体の酸化反応と抗酸化のバランスが崩れ、酸化反応が進んだ状態になると、疾患の発症につながるとされている。このような状態が過剰酸化であり、この酸化ストレスが長く持続することで様々な疾患が生じている。また、これは、美容、動植物の生育、環境にも悪影響を及ぼしている。【０００９】
本発明は係る問題に鑑みてなされたものであり、アメリカ・カリフォルニア大学（以下、ＵＣＬＡ）の菅原正博博士の臨床治験及び各種の実験データによれば、副作用が少なく短期間でバセドウ病を治療することができ、その他疾患の原因の一つとされる活性酸素の影響（酸化）を抑えることで、種々の薬理効果、美容効果、動植物の生育効果、環境改善効果を図ることができる減酸素、高還元力を有する生物無機化合物複合体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、上記の目的を達成するための物質を開発、製造する手段である。材料はコンブ、ワカメ、ヒバマタ、ヒジキ、アラメ、カジメ、ホンダワラなどの海藻（草）、タケ、イタドリ、ヨモギ、ドクダミ、クズ、カヤ、スギナ、クマザサ、スギ、ヒノキ、クヌギ、マツなどの草木で、これらを灰化し、さらに溶融マグマ化する。これによって植物の９５％以上を構成する酸素（Ｏ：約７０％）、炭素（Ｃ：約１８％）、水素（Ｈ：約１０．５％）、窒素（Ｎ：約０．３％）の４元素の大半が除去され、生体へ有害作用をもたらすとされるほとんどの化合物を消失させることができる。つまり植物を溶融マグマ化させることによって有害作用のほとんどない減酸素で極めて安全な「生物無機化合物複合体」を生成することができる。
これを植物マグマ原末（Bio Inorganic Elements：以下ＢＩＥという）と名称する。このＢＩＥの主要な元素は、カルシウム、ケイ素、カリウムなどである。これに水を加え、煮沸し、ろ過し、水溶性の植物マグマ（Reducing Inorganic Minerals：以下ＲＩＭという）を抽出した。このＲＩＭの主要な元素は、ナトリウム、カリウム、塩素、イオウなどで、体液と共通したミネラルバランスを有する。これらＢＩＥとＲＩＭは高い還元力を有し、酸素と結合していないイオウ化合物を複数含有することを特徴とし、合成化学では製造不可能であり、地球上に存在するほとんどすべての元素を含有する生物無機化合物複合体を提供する。【００１１】
以上の構成において、ＢＩＥの酸化還元電位の実測値はＴＯＡ−ＲＭ−３０Ｐ測定器で−５００ｍＶ程度になることを特徴とする。また、ＲＩＭ液体の酸化還元電位の実測値は−６００〜−７００ｍＶ程度の範囲にあることを特徴とする。また、このＲＩＭ液体を完全に乾燥させたＲＩＭ粉末の酸化還元電位の実測値は−８０〜−３００ｍＶを示している。【００１２】
この甲状腺亢進症の治療用生物無機化合物複合体は、甲状腺亢進症の治療用の薬剤のための新物質であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の減酸素、高還元力を有する生物無機化合物複合体は植物成分の正の原子価をもつ元素とイオウの複合化合物からなり、減酸素と高還元力を有するため、副作用が少なく短期間でバセドウ病を治療することができ、その他各種疾患の原因の一つとされる活性酸素の影響（酸化）を抑えることで、薬理効果、美容効果、動植物の生育効果、環境改善効果を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】甲状腺ホルモンの生合成、分泌と甲状腺細胞における主要なシグナル伝達経路を示す図である。
【図２】ＤＵＯＸ分子を示す図である。
【図３】ペルオキシダーゼの触媒サイクルを示す図である。
【図４】酸化還元電位（ORP）メータを示す図である。（ＵＣＬＡ）
【図５】ＲＩＭの主な成分を示す図である（ＵＣＬＡ）。
【図６】Ｘ線マイクロアナライザー（ＥＤＳ）分析によるＲＩＭ粉末の元素分析結果を示した表である（株式会社ニッテクリサーチ）。
【図７】Ｘ線マイクロアナライザー（ＥＤＳ)分析によるＢＩＥの元素分析結果を示した表である（株式会社ニッテクリサーチ）。
【図８】粉末状のＲＩＭの結晶構造を示す図であり、（ａ）は粉末状のＲＩＭの電子顕微鏡写真、（ｂ）は１００％メタノールで粉末状のＲＩＭを処理し、空気乾燥させたものを可視化した図である。
【図９】図９（ａ）は粉末状のＲＩＭの結晶構造を５００倍率で示した図であり、図９（ｂ）は、粉末状のＲＩＭの結晶構造を１０００倍率で示した図である（株式会社ニッテクリサーチ）。
【図１０】粉末状のＲＩＭの結晶構造を２０００倍率で示した図である（株式会社ニッテクリサーチ）。
【図１１】図１１（ａ）は粉末状のＢＩＥの結晶構造を５００倍率で示した図であり、図１１（ｂ）は粉末状のＢＩＥの結晶構造を１０００倍率で示した図である（株式会社ニッテクリサーチ）。
【図１２】粉末状のＢＩＥの結晶構造を２０００倍率で示した図である（株式会社ニッテクリサーチ）。
【図１３】ＲＩＭ結晶のＸ線回折による結果のグラフである（ＵＣＬＡ）。
【図１４】Ｘ線回折装置によるＲＩＭ粉末の化合物の定性結果を示した表である（株式会社ニッテクリサーチ）。
【図１５】Ｘ線回折装置によるＲＩＭ粉末の化合物の定性結果を示した表である（株式会社ニッテクリサーチ）。
【図１６】Ｘ線回折装置によるＢＩＥ粉末の化合物の定性結果を示した表である（株式会社ニッテクリサーチ）。
【図１７】Ｘ線回折装置によるＢＩＥ粉末の化合物の定性結果を示した表である（株式会社ニッテクリサーチ）。
【図１８】Ｘ線回折装置によるＢＩＥ粉末の化合物の定性結果を示した表である（株式会社ニッテクリサーチ）。
【図１９】Ｘ線回折装置によるＲＩＭ粉末中の主要な化合物の同定を示したグラフである（株式会社ニッテクリサーチ）。
【図２０】Ｘ線回折装置によるＲＩＭ粉末中のＫＮａＳの同定を示したグラフである（株式会社ニッテクリサーチ）。
【図２１】人体の水分分布と主要なイオンを示したグラフである。
【図２２】Ｘ線回折装置によるＢＩＥ粉末中のＣａＣＯ３、ＳｉＯ２、ＫＣｌ、ＮａＣl，（（Ｃａ，Ｎａ）（Ｓｉ，Ａｌ））４Ｏ８の同定（日本）を示したグラフである（株式会社ニッテクリサーチ）。
【図２３】Ｘ線回折装置によるＢＩＥ粉末中のＫＮａＳの同定を示したグラフである（株式会社ニッテクリサーチ）。
【図２４】ＲＩＭの非結晶質の酸化還元電位をＯＲＰ計によって測定した結果を示す図である（ＵＣＬＡ）。
【図２５】図２５（ａ）は、ＲＩＭの各濃度における酸化還元電位を示したグラフであり、図２５（ｂ）は、ＲＩＭの還元性を示した写真である（ＵＣＬＡ）。
【図２６】ＲＩＭによるグアイアコール酸化の抑制をグラフにしたものである。
【図２７】ＲＩＭによるヨード化の抑制を示したグラフである。
【図２８】CompoundIIのレベルを示す図である。
【図２９】ＲＩＭもしくはＭＭＩによって強化された分解を示したグラフである。
【図３０】甲状腺機能の検査結果を示す図である。
【図３１】培養細胞中の過酸化水素と酸素の細胞局在診断とそれらの生成量の調査結果を示す図である。
【図３２】ＲＩＭが原形質膜に作用することを示す図である。
【図３３】細胞膜−ＴＨＳ媒介のｃＡＭＰ生成から甲状腺ホルモン形成の最も重要な信号にＲＩＭが作用するかどうかを調べた結果を示す図である。
【図３４】動物実験の結果を示す図である。
【図３５】ラットを使用した実験の実験計画を示す図である。
【図３６】（ａ）は、ミネラル溶出フィルターの構成を示した図であり、（ｂ）は、ミネラル水を製造する装置本体の構成を示した断面図である。
【図３７】図３６に示す装置を用いて行った実験の結果を示す図である。
【図３８】図３６に示す装置を用いて行った実験の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
次に、本発明の実施形態について説明する。
＜はじめに＞
還元力を有する減酸素の生物無機化合物複合体を用いた薬剤がバセドウ病をはじめとする種々の疾病に副作用を生じることなく治療に効果がある。本化合物複合体は、海藻（草）、野草、樹木葉などの野生植物を２０００℃以上の高熱で溶融マグマ化し、生成されたもので植物マグマ原末（Bil Inorganic Elements:ＢＩＥ）である。さらに、このＢＩＥに水を加え、加熱し、冷却後、濾過したものが水溶性の高還元植物マグマ（Reducing Inorganic Minerals:ＲＩＭ）で液体と固体がある。【００１６】
ＲＩＭは、食品防腐剤、スキンケア、がんの予防として用いられている。この物質は、今までに観察されたうちで最も強力な還元電位を示した。ＲＩＭ溶液０．５％は、酸化還元電位（ORP）メータによって100mMのMMIとほぼ同じ還元電位を示した。ＲＩＭは、甲状腺ホルモンの形成解析の最初のステップの反応である、ペルオキシダーゼ過酸化水素の反応を抑制した。人では、がん患者（非甲状腺がん）へのＲＩＭの経口投与は、（その症状の）一般的な人口（6.5％）よりも非常に高い甲状腺機能低下（35％）を示した。副作用や異常検査が認められなかった。【００１７】
このＲＩＭを調査するための第１の研究は、粉末Ｘ線回折法とイオン交換ＨＰＬＣによるＲＩＭの非晶質部分（非結晶形）によってＲＩＭの結晶を特徴付けることである。上記の２つの手順は、ＵＣＬＡの化学部門で実施される。【００１８】
第２の研究は、生体外（試験管）でＲＩＭの抗甲状腺作用のメカニズムを明らかにすることである。無細胞系では、過酸化水素生成システム上でのＲＩＭやＭＭＩ（比較薬）の効果は、化合物IIレベル（ペルオキシダーゼ/過酸化水素反応から生じる酸化製品）および過酸化水素分解を測定することによって検討される。細胞実験のために、培養ヒト甲状腺小胞は、過酸化水素の生成、ヨウ化有機化、およびDUOXとNOX4（甲状腺過酸化水素生成酵素）のタンパク質発現にＲＩＭの影響を調べるために使用される。【００１９】
更に、FRTL-5ラット甲状腺細胞またはNthy-ori- 3-1 の正常ヒト甲状腺細胞株は、ＲＩＭに応答して生成される細胞内細胞cAMPを測定するために使用される。なぜなら、ＲＩＭは、細胞膜の構造と可能性TSH受容体媒介性の信号に影響を与えるためである。【００２０】
第３の研究は、ヒトに使用する前にＲＩＭの必要な情報を得るために動物実験（Sprague - Dawleyラット）である。具体的には、ＲＩＭは不可逆的な甲状腺機能低下症、甲状腺萎縮や甲状腺腫を引き起こすかどうかが調査される。また、ＲＩＭの経皮効果は、ラットで試験される。【００２１】
最終目標は、バセドウ病の治療のために非毒性の強力な抗甲状腺剤としてＲＩＭを確立することである。【００２２】
＜甲状腺機能亢進症の治療＞
バセドウ病の主な治療法はチオナミド薬物療法、甲状腺亜摘術、または放射性ヨウ素治療法である。また、β遮断薬は、無機ヨウ化物またはヨウ素造影剤、炭酸リチウム、過塩素酸カリウムのグルココルチコイド、およびリツキシマブ（ヒトＣＤ２０に向けキメラ型モノクローナル抗体）は、Fumaloraによって再検討されたように二次治療のオプションである。ただし、これらの二次治療方法は一次処理を置き換えることはない。三つの主な上記の方法は、世界的に広く現場の医師によって受け入れられており、広く半世紀以上にわたり使用されている。アメリカ国内で、バセドウ病のための最も一般的に使用される治療は、まだFDAのデータベースに基づく薬物療法である。【００２３】
＜プロピルチオウラシルでの薬物療法（ＰＴＵ）およびメチマゾール（ＭＭＩ）＞
現時点では、ＭＭＩが薬物療法の最初の選択肢である。なぜなら、ＰＴＵは低付着率及び主要な毒性、特に深刻な肝臓障害を引き起こすためである。ＦＤＡはＭＭＩを受容できる患者のためにのみ、あるいは、妊娠の初期の女性のためにのみ使用する薬剤のセカンドラインとしてPTUを勧めている。一般的には、ＭＭＩの薬物療法は、その効果を達成するために12から18ヶ月間継続する必要がある。また、ＭＭＩは副作用で知られている。：アレルギー反応、肝臓酵素の上昇、関節痛、など。深刻な副作用としては、無顆粒球症、aplatsic貧血や血管が含まれる。【００２４】
甲状腺の研究は抗甲状腺薬の分野を除いて、世界的に有名な研究が大幅に進んでいる。バセドウ病を患っている患者のより良いケアについては、副作用の少ない新しい治療法が緊急に必要とされる。そこで、提案した研究に関連したトピックを記載しなければならない。【００２５】
＜甲状腺ホルモンの形成の手順＞
図１は、以下に表す甲状腺ホルモンの生合成、分泌と甲状腺細胞における主要なシグナル伝達経路を示す。ヨウ素は、積極的に側底膜上のナトリウム/ヨウ化共輸送（NIS）によって、甲状腺細胞に活発に輸送され、一部、頂端膜のpendrin（PDS/SLC26A4）によって濾胞腔に輸送される。ヨウ化物は、頂端膜の内腔側のサイログロブリン（Ｔｇ）のチロシル残基に共有結合で得られた過酸化水素の存在下でTPOによって急速に酸化される。このステップでは、モノヨードチロシン（ＭＩＴ）とジヨードチロシン（ＤＩＴ）を製造する。そして、適切な間隔のＴｇ内のＭＩＴとＤＩＴのみが、チロキシン（Ｔ４）とトリヨードチロニン（Ｔ３）を形成するためにカップリング反応に関与する。この反応は、また、過酸化水素とTPOによって触媒される。甲状腺過酸化水素のソースはDUOXA2（DUOX成熟因子）で調整された頂端部細胞膜で表されるDUOX2である。甲状腺ホルモンは、Tgの消化後循環にリリースされる。 MITとDITはヨードチロシン脱ハロゲン酵素1（DEHAL1）で非ヨウ素化される。甲状腺ホルモンの形成は、主に甲状腺刺激ホルモン（TSH）により調節される。TSH受容体に対するTSHの結合は、GsとGqのタンパク質の両方を活性化する。前者は、成長調節、分化及び甲状腺ホルモンの分泌を活性化し、後者は、ホスホリパーゼC依存性イノシトールリン酸Ca2 +/ジアシルグリセロールの経路を介して、過酸化水素の生成とタンパク質に結合するヨウ化物を活性化する。【００２６】
図１における略語の意味は以下のとおりである。
AC：アデニルシクラーゼ、
cAMP：サイクリックアデノシン一リン酸、
DAG：ジアシルグリセロール、
DEHAL1：デハロゲナーゼ1、
DIT：ジヨードチロシン、
DUOX：デュアルオキシダーゼ、
DUOXA：デュアルオキシダーゼの成熟因子、
IP3：イノシトール三リン酸、
MIT：モノヨードチロシン、
NIS：ナトリウム、ヨウ化共輸送体、
PDS：pendrin、
PKA：プロテインキナーゼA、
PKC：プロテインキナーゼC、
PLC：ホスホリパーゼC、
T3：トリヨードチロニン、
T4：チロキシン、
TG：サイログロブリン、
TPO：甲状腺ペルオキシダーゼ、
TSH：甲状腺刺激ホルモン、
TSHR：甲状腺刺激ホルモン受容体【００２７】
＜甲状腺細胞におけるDUOX過酸化水素生成システム＞
この提案は過酸化水素発生にＲＩＭの影響を伴うので、甲状腺の過酸化水素発生システムを詳細に記載しなければならない。甲状腺ホルモンを形成するためには、過酸化水素が必要である。
甲状腺の過酸化水素生成システムの詳細は、割愛するが、甲状腺過酸化水素生産の重要な側面について簡単に説明する。甲状腺におけるNADPHオキシダーゼの存在は長い間、知られている。甲状腺過酸化水素の主な原因としてのデュアルオキシダーゼ（DUOX）タンパク質を識別するために15年かかった。もともとは、甲状腺酵素と呼ばれていた。DUOX1とDUOX2甲状腺がある。DUOX2及び非DUOX1は、甲状腺過酸化水素の生産を担当している。頂端部細胞膜へのDUOX酵素の輸送については、その熟成要因、DUOX1AとDUOXA2、が必要である。DUOXは、6つのNADPHオキシダーゼ（NOX）酵素の一つであり、そのイソ型はNOX2と50％同族関係を共有している。DUOX分子は図２の通りである。【００２８】
＜DUOX2タンパク質と報告された変異部位の構造モデル＞
アミノ酸レベルでの変異部位は、小さな黒丸で示される。矢印は変異によるアミノ酸の変化を説明するものである。ペルオキシダーゼ様ドメインはN末端細胞外部分に位置している。Ca2 +結合部位の2つのEF-ハンドは、最初の長い細胞内ループになる。FADとNADPH結合空洞は細胞内C末端部分にある。
FAD： フラビンアデニンジヌクレオチド
NADPH：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸【００２９】
DUOX蛋白質は7膜貫通［透過］領域を有し、そして第７領域の構造のようなペルオキシダーゼを有している。ペルオキシダーゼのDUOX機能には議論の余地があるか。特徴的に、DUOXは酵素活性の主要な刺激剤であるカルシウム結合のためのEF-ハンドを持っている。すべての窒素酸化物のメンバーに見られるように、それは膜貫通領域のヘムが含まれている。DUOXの機能はFADとヘムを介してNADPHから酸素にモノ（単一の）電子を輸送することである。NADPHは、DUOXシステムにおいてNADHに置き換えることはできない。電子が酸素に与えられている場合は、超酸化物アニオンを形成している（O2-）。しかし、スーパーオキシドジスムターゼによってO2 -から過酸化水素への急速な変換は、O2 -の生物学的検出をできなくしてしまう。ＲＩＭの添加は電子伝達系を乱すかどうかを試験することは興味深いことである。【００３０】
＜DUOXの制御因子＞
カルシウムは、上記したようにバインディングからDUOX分子のEF-ハンドまでずっとDUOXの最も強力な刺激物である。また、蛋白質キナーゼCはDUOX1ではなくDUOX2をアクティブにする。 TSHは甲状腺ホルモンの形成のほぼすべての過程を刺激する。しかし、それはPCCI3のラット甲状腺細胞株を除き甲状腺細胞内DUOX2を刺激しない。TSHによって刺激される甲状腺DUOX1は、過酸化水素の生成に大幅に貢献していない。NOX酵素の強力かつ特異的な防止剤（阻害剤）はない。ほとんどの防止剤（阻害剤）が非特異的である。ヨードニウム誘導体ジフェニレンのヨードニウム（DPI）が一般的に使用されている。何故なら、この化合物は、電子輸送から電子を取り出し、ラジカルを形成するからである。そして、この化合物はそれぞれの電子輸送を阻害する。一般的に使用される酸化防止剤、N -アセチルシステイン、は甲状腺マウスで発現するDUOXタンパク質を抑制する。【００３１】
＜DUOX活動を測定する方法＞
DUOX活性を測定する2つの方法がある。ミュールバウアー（Muhlbauer）は、微粒子甲状腺分（10,000 xgペレット）からのDUOX活性の検出方法を簡略に説明している。培養培地は、カルシウム、FADおよびNADPHが含まれる。過酸化水素の生産量は、活性測定の終点（エンドポイント）であった。リグットらは培養されたCos-7細胞共発現DUOX/ DUOXAを使用し、DUOX2活性0.8 nMPMAの低濃度の存在下で過酸化水素生産を測定した。DUOX1活性を測定するために、FSKを培養液中に追加した。DUOXA2（熟成因子）は、ヒト甲状腺細胞に存在しているため、このメソッドは、DUOXA2のトランスフェクション（遺伝子・ウイルスなどの核酸を細胞に取り込んで増殖させること）なしに、ヒト甲状腺細胞におけるDUOX2活性と過酸化水素生産の測定に使用される。【００３２】
＜変異DUOXの人間の甲状腺機能低下症を引き起こす遺伝子＞
甲状腺機能低下症を引き起こす異常DUOXが知られている。Morenoらの後、2002年にDUOX2突然変異の最初の4つのケースが報告されている。DUOX2突然変異は、これまでのところ22例が報告されている。 Morenoらによると、両アレル変異は永続性甲状腺機能低下症につながり、単アレル変異は過性甲状腺機能低下症につながる。しかし、Maruoらは、切断DUOX2タンパク質を引き起こす両アレル変異にもかかわらず、一時的な甲状腺機能低下症例を報告した。このレポートは、DUOX2がその機能を失ったときに過酸化水素を生成する代替のメカニズムの存在を示唆している。【００３３】
＜過酸化水素の測定＞
このプロジェクトでは、過酸化水素の測定が非常に重要である。これには、有効な方法を使用することが不可欠である。ここに、実験で使用される過酸化水素の検出方法について説明する。過酸化水素の測定は、生物学的流体（無細胞培地および試験管反応混合物）または細胞内コンパートメントのようなサンプルのソースによって異なる。生物学的流体から過酸化水素を測定することは比較的簡単である。しかし、細胞内の過酸化水素は、過酸化水素プローブは、細胞膜が最初に通過する必要があるため、測定することは困難である。また、最も一般的に使用されるプローブは、他の活性酸素やフリーラジカルと交差反応する。しかし、問題のいくつかを克服するために進展が見られた。【００３４】
＜生物学的流体からのH2O2試験＞
１）超高感度な蛍光基質であるAmplex Red試薬を用いたAmplexレッド[N- アセチル-3,7 -ジハイドロキシフェノキサジン]方法
基本的な原理は、過酸化水素が西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）による触媒反応1:1の化学量でAmplexRed（Molecular Probes社 - Invitrogen社）と反応させることである。これは、波長587 nmの最大蛍光放射及び最大励起563 nmを示す高い蛍光生成物レゾルフィンが発生させる。その吸光係数は54,000 M-1 cm -1である。この試験は過酸化水素にとっては高感度であり選択的な試験であって、50nMより低い過酸化水素を検出することができる。この方法は、一般的には、蛍光または分光マイクロプレートフォーマットにおける過酸化水素の低レベル測定に使用される。【００３５】
２）TMB法（3,5は3'5'テトラメチルベンジジンを生成）
TMBは、波長653 nm でe=3.9× 104のM- 1 cm - 1で測定されるTMB陽イオン（カチオン）遊離基（フリーラジカル）を生成するために、西洋ワサビペルオキシダーゼとH2O2によって酸化される。HRPとのさらなる酸化でジミインを生成する（波長450 nmの吸光度とe=5.9× 104のM-1 cm - 1）。これは、高感度で簡単な方法である。【００３６】
＜過酸化水素の細胞検出＞
３）5、6クロロメチル-2'、7'- dichlorodihydrofluoresceinジアセテート（CM- DCFH- DA）法
CM- DCFHは、受動的に細胞内に拡散し、ROSによるこの化合物の細胞内プロセシングは、530 nmの発光と488 nmの励起発光で測定することができる非常に蛍光性のあるCM- DCFを生成する（26）。これは、実行が容易で感度が良い。したがって、メジャーな細胞内ROSである細胞内過酸化水素を検出するために広く用いられている。しかし、この検査は、過酸化水素に固有のものではない。なぜならば、それは他の酸化剤と反応するからである。【００３７】
４）最も具体的な細胞内過酸化水素の検出方法としてのハイパー蛍光法
遺伝的にエンコードされたレシオメトリックセンサであるHyperは、他のROS(活性酸素)を超えて過酸化水素に対して選択性が高い。Hyperは、環状に順序を変えたYEPと融合する細菌過酸化水素感受転写因子から構成される。OxyRの部分のシステイン酸化は500nm（YFP500）で励起された発光を増加し、420 nmの（YFP420）で励起された発光を減少させる立体構造変化を誘発する。この変更は、還元細胞質環境の中で急激に可逆的であり、そしてそれは細胞内H2O2濃度の動的な監視を可能にする。この方法は、蛍光顕微鏡で過酸化水素の生産をトレースするのに適している。HyPerベクトルは、市販されており入手可能である（バージニア州一致モンドEvrogenの代理店である和光ケミカルズ社）。【００３８】
＜ペルオキシダーゼと過酸化水素の反応：スペクトルの側面＞
過酸化水素、甲状腺ペルオキシダーゼ（TPO）間の反応は、甲状腺ホルモンの形成の最初のステップである。次の4つの哺乳動物のペルオキシダーゼはヨウ化物の酸化を触媒する。：ミエロペルオキシダーゼ、好酸球ペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ（LPO）と甲状腺ペルオキシダーゼ（TPO）。 
これらの4つのペルオキシダーゼは、オープンリーディングフレームの解析に基づいて同様の構造を持っている。ここで、LPOとTPOに焦点を当てる。何故なら、これらは、甲状腺ホルモンの形成に（触媒作用を及ぼすからである）。他のペルオキシダーゼとしては、LPOとTPOは、分子、ペルオキシダーゼ酵素の電子移動（酸化還元）の重要な要素のヘムを持っている。 LPO近位のヘム配位子は、His468とAsn554、TPO His494およびAsn579である。精製TPOは得ることが困難であるので、ここでLPO- H2O2反応のスペクトル特性について説明する。しかし、同様のスペクトル応答は、TPOはから予想することができる。ペルオキシダーゼの触媒サイクルを図３に示す。【００３９】
＜LOPと過酸化水素による化合物I, II and IIIの形成＞
天然のLPOの光スペクトルは、412 nmでソレー帯を示す（ε=114 000M-1cm - 1）。
等モルへの暴露または二重の過剰な過酸化水素は、420または416 nmで吸収することを特徴とするポルフィリンラジカルCPDを生成する。
過酸化物の存在下でのみ、CPD Iは、430 nmで検出することができる、比較的安定な化学種CPD IIに（200ms以内）自発的に変換される。
わずかな過酸化物を過剰に暴露すると、急速にLPOを不活性化し、（424 nmの帯域で）CPD IIIを生成する。
CPD Iは、甲状腺ホルモンの形成の最後のステップであるサイログロブリンのチロシン残基のヨード化を触媒し、イオジチロジンの結合を触媒する役割がある。
さらに、異性体CPD1 - [FeIV= O、aa+?]またはCPD II、これはCPD Iより酸化力が低い、はヨードチロシンの結合を触媒する可能性がある。【００４０】
＜酸化還元電位（ORP）メータ＞
ＵＣＬＡの菅原正博博士は、提案された研究でORPメータを広範囲に使用している。従って、ORPメータのためのセンシティブな電極を説明する。ＵＣＬＡでは、携帯のpH酸化還元メータ（モデル6230、Jenco社、カリフォルニア州サンディエゴ）に接続されたメモリ付きpH酸化還元電極（酸化還元電位-146C微小;ラザールラボラトリーズ社、ロサンゼルス、カリフォルニア州）を使用している。この装置の基本原理は、溶液中のプラチナ微小電極へのあるいは溶液中のプラチナ微小電極からの電子移動を計測することである。たとえば、還元剤は電子供与体である。従って、この電極は負側にチャージされた電子を受け取る、それはマイナスに読み取りを行う。対照的に、酸化剤（電子受容体）は正のｍVとなる。装置の図を図４に示す。この電極の利点は、非常に感度が良く10〜20μlのサンプルサイズに適用することができることである。
なお、日本ではＤＫＫ−ＴＯＡ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＯＲＰ−ｍｅｔｅｒ  ＲＭ３０Ｐを使用し、本願のデータは実測値で示した。【００４１】
＜意義＞
バセドウ病は、VA患者の一般的な甲状腺疾患の一つである。バセドウ病患者の数は、薬の副作用に苦しんでおり、放射性ヨウ素治療を取らざるを得ない。ここで提案された研究は、臨床的に非常には重要でありながらすっかり忘れられあるいは無視された甲状腺研究領域−抗甲状腺薬を含む。医師や患者が重篤な薬物の副作用が発生したら、新しいエージェントを開発する必要性は容易に理解することができる。本研究の結果は大幅にVA患者だけでなく、非VA患者のためのバセドウ病の治療を向上させるものである。ＲＩＭ剤は、有機化学物質を使用しないミネラルで構成され、かつ、酸素プアで強力な還元剤である。したがって、副作用の少なさが期待できる。 ＲＩＭの治療は将来的にはバセドウ病の60年来の薬物療法に代わるものである。
【実施例】
【００４２】
図５は、アメリカ・カリフォルニア大学（ＵＣＬＡ）菅原正博博士のもとで実施した３％ＲＩＭ液の元素分析結果を示したものである。図によると、ナトリウム、カリウム、イオウが圧倒的に多く塩素がそれに続いている。１５％ＲＩＭ液の分析は、日本食品分析センターに依頼したもので、ナトリウム３．３５％、カリウム２．４１％（原子吸光）、塩素３．４％（電位差滴法）、イオウ１．７９％（バリウム重量法）となっており、おおむね同じような傾向にある。
次に株式会社ニッテクリサーチによるＸ線マイクロアナライザーを用いてＲＩＭ粉末とＢＩＥ粉末の分析した結果を図６及び図７に示す。
図示するように、ＲＩＭではナトリウムが１５．８％、カリウムが１２．１％、塩素が１８．４％と日本食品分析センターとほぼ同様の結果を示したが、イオウが５．８％と易くなく、逆にホウ素が１１．１％、炭素１４．３％、酸素が２２．０％みられた。
また、ＢＩＥ粉末は、カルシウムが１８．５％、ケイ素が８．２％、カリウムが５．５％、塩素が４．５％、ナトリウムが４．０％、そしてイオウが２．９％であった。なお、酸素は３６．４％で炭素が８．６％であった。
これにより、マグマ状まで加熱してもなお酸素と炭素は完全には除去されない。しかし、本来、植物中の酸素量は約７０％、炭素は約１８％であるとされており、マグマ化することで水素と窒素はほぼ除去され、酸素と炭素はおおよそ半分に減少されていることから、かなりの減酸素状態、つまり酸素リッチから酸素プアな無機複合化合物になっていると考えられる。【００４３】
図８は、ＵＣＬＡで行った粉末状のＲＩＭは結晶構造を示したものである。
図８（ａ）は、粉末状のＲＩＭの電子顕微鏡写真であり、図８（ｂ）は、１００％メタノールで粉末状のＲＩＭを処理し、空気乾燥させ可視化することで結晶構造が鮮明に確認することができる。【００４４】
図９及び図１０は、株式会社ニッテクリサーチで行ったＲＩＭとＢＩＥの走査型電子顕微鏡による結晶構造を示したものである。図９（ａ）は、５００倍率で撮影した組成像であり、図９（ｂ）は、１０００倍率で撮影した組成像である。図１０は、２０００倍率で撮影した組成像である。
また、図１１及び図１２は、株式会社ニッテクリサーチで行ったＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）による植物マグマ原末の組成像を示した図である。図１１（ａ）は、５００倍率で撮影した組成像であり、図１１（ｂ）は、１０００倍率で撮影した組成像であり、図１２は、２０００倍率で撮影した組成像である。【００４５】
＜ＲＩＭ結晶質の分析＞
次に、ＲＩＭの結晶質をＸ線回折で分析する。
図１３は、ＵＣＬＡによるＲＩＭ結晶のＸ線回折による結果をグラフにしたものである。
図１３に示す上段のグラフは、オリジナルピークを示し、中段及び下段のグラフはオリジナルピークを取り除いたメジャーピークのグラフである。図示するように、この回析で分析された粉末は、複数のピークを示し、主に特定された２つのピークは、ＮａＣl（塩化ナトリウム）とＫＣｌ（塩化カリウム）である。また、残りのいくつかのピークは、ジチオン酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）、aphitalite（ＮａＫ３ＳＯ４）、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）である。
しかし、残りの複数のピークは、JCPDS-ICCDデータベースからは同定することができなかった。【００４６】
次に、図１４〜図２０、図２２、図２３を参照してＲＩＭ粉末及びＢＩＥ粉末の化合物の定性結果及び同定について説明する。
図１４〜図１５は、Ｘ線回折装置によるＲＩＭ粉末の化合物の定性結果を示した表である。
図示するように、ＲＩＭ粉末には、Ｋ３Ｎａ（ＳＯ４）２やＮａ４（ＳＯ４）１．３９（ＣＯ３）０．６１、Ｎａ４（ＳＯ４）１．４５（ＣＯ３）０．５５、Ｎａ４（ＳＯ４）１．５１（ＣＯ３）０．４９、ＫＮａ（ＳＯ４）、ＫＨＳ、Ｓ、Ｎａ２Ｓ、ＫＮａＳ、ＳｉＯ２、ＮａＳ２、Ｓ６、Ａｌ（ＯＨ）３、Ｎａ２Ｓ４が含まれていることを示すピークが見られた。【００４７】
また、図１６〜１８は、Ｘ線回折装置によるＢＩＥ粉末の化合物の定性結果を示した表である。
図示するように、ＢＩＥ粉末には、Ｋ２ＣＳ３が含まれていることがわかった。
また、図１９は、Ｘ線回折装置によるＲＩＭ粉末中の主要な化合物の同定を示したグラフであり、図２０は、Ｘ線回折装置によるＲＩＭ粉末中のＫＮａＳの同定を示したグラフである。
図示するように、ＢＩＥ粉末中にＮａＣｌやＮａ６（ＣＯ３）（ＳＯ４）２、ＫＣｌ、Ｋ３Ｎａ（ＳＯ４）２、Ｎａ４（ＳＯ４）１．３９（ＣＯ３）６、Ｓ、Ｎａ２Ｓといった物質が含まれることを示すピークが見られた。また図２０には、ＢＩＥ粉末にはＫＮａＳが含まれることを示すピークが見られた。【００４８】
図２１は、人体の水分分布と主要イオンを示したグラフである。
図示するように、細胞内液及び細胞外液のイオン組成とＲＩＭ又はＢＩＥに含まれるミネラル成分とで共通している点が多いことがわかる。【００４９】
次に、図２２は、Ｘ線回折装置によるＢＩＥ粉末中のＣａＣＯ３、ＳｉＯ２，ＫＣｌ，ＮａＣｌ，（Ｃａ，Ｎａ）（Ｓｉ，Ａｌ）４Ｏ８の同定を示した図であり、図２３は、Ｘ線回折装置によるＢＩＥ粉末中のＫＮａＳの同定を示したグラフである。
図示するように、ＢＩＥ粉末中にＣａＣＯ３、ＳｉＯ２，ＫＣｌ，ＮａＣｌ，（Ｃａ，Ｎａ）（Ｓｉ，Ａｌ）４Ｏ８が含まれることを示すピークが見られた。
図２３は、Ｘ線回折装置によるＢＩＥ粉末中のＫＮａＳの同定を示したグラフである。
図示するように、ＢＩＥ粉末にはＫＮａＳが含まれることを示すピークが見られた。【００５０】
＜ＲＩＭの非結晶質の分析＞
次に、ＲＩＭの非結晶質を分析した。
ＲＩＭの非結晶質については、酸化還元電位をＯＲＰ計によって測定した。結果は、図２４に示す。【００５１】
図２４に示すように、精製水１ｍｌで酸化還元電位が＋２２ｍＶで示すのに対し、２ｍｇのＲＩＭの非結晶質の溶解液は−８０ｍＶを示し、５ｍｇのＲＩＭの非結晶質の溶解液は−１７０ｍＶを示した。
この結果からすると、ＲＩＭの還元性を示す部分が非結晶質であることがわかった。【００５２】
＜ＲＩＭの還元性について＞
図２５（ａ）は、ＲＩＭの各濃度における酸化還元電位を示したグラフであり、図２５（ｂ）は、ＲＩＭの還元性を示した写真である。
まず、図２５（ａ）に示すグラフは、ＲＩＭの各濃度における酸化還元電位を示したものである。図示するように、２〜３％濃度のＲＩＭが−３００ｍＶ以上の酸化還元電位を示し、これは、甲状腺機能亢進症の治療に用いられるメチマゾール（ＭＭＩ）が有する還元力よりも高いことを示す。【００５３】
また、図２５（ｂ）に示すように、錆びた金属バネ（上段に示す）を２％濃度のＲＩＭに１週間、曝露させたところ、金属バネの錆を除去することができ（下段に示す）、ＲＩＭが強力な還元力を有することがわかった。【００５４】
また、ＲＩＭは、煮沸したり凍結させたりしても還元力が減少することなく、３カ月以上安定した状態を保持することができる。【００５５】
＜ＲＩＭによるペルオキシダーゼ−過酸化水素反応の抑制＞
（１）グアイアコール酸化法
この分析は、甲状腺ペルオキシダーゼ（以下、ＴＰＯ）とラクトペルオキシダーゼ（以下、ＬＰＯ）活性の測定に使用される。
ＴＰＯ（ＬＰＯ）と過酸化水素が生成するテトラグアイアコールによるグアイアコール酸化では、ＯＤ（吸光度）４７０ｎｍが測定された。
図２６は、ＲＩＭによるグアイアコール酸化の抑制をグラフにしたものであり、ＲＩＭが用量反応方法においてＬＰＯ触媒によってグアイアコール酸化を抑制したことがわかる。
なお、煮沸したＲＩＭでもグアイアコール酸化を抑制することが示されている。
反応混合物は、ｐＨ７．０で全量１ｍｌの０．０５Ｍのリン酸緩衝液中、３００μＭのグアイアコール、１０μｇのＬＰＯ（Worthington Biochemical, Lakewood, NJ）、１％のＲＩＭ、１ｍＭの過酸化水素を含む。１分間で測定された吸光度（４７０ｎｍ）がペルオキシダーゼ活性として考慮される。結果は、３つのサンプルの平均値である。ＳＤ値は、非常に小さい値であるため、このグラフからは除外された。【００５６】
（２）ヨード化分析方法
甲状腺ホルモンの形成は、ペルオキシダーゼと過酸化水素によるチログロブリンのヨード化を含む。そこで、in vitroでウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の放射性ヨウ素化をＬＰＯと過酸化水素の存在下で行われた。
５ｍｇのＢＳＡ、微量の１２５Ｉ−ヨウ化物（２０，０００ｃｐｍ）、１００ｎＭのヨウ化カリウム、過酸化水素、２０μｇのＬＰＯの反応混合物を３７℃、１０分間、培養を行い、次に、反応を停止させるために１００μｌの冷却した１Ｍのトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加えた。これにより、ＴＣＡ沈殿物のペレットが生じ、このペレットをＰＢＳで洗浄後、放射線を測定した。結果を図２７に示す。【００５７】
図２７は、ＲＩＭによるヨード化の抑制を示したグラフである。
図示するように、ＲＩＭが狭い範囲内でＬＰＯ媒介によるヨード化を抑制したことがわかる。これにより、ＲＩＭが生理的条件で甲状腺に作用することが確認された。【００５８】
＜ＲＩＭのペルオキシダーゼ反応の抑制＞
まず、ＲＩＭのペルオキダーゼ反応の抑制を分析するために、Compound II形成におけるＲＩＭの影響と、in vitroでの過酸化水素の劣化を検査した。Compound Iは、最も酸化フリーラジカルとして活性、ヨウ化物酸化に影響を与えるものの、０．２秒で消滅してしまうため測定が困難である。そこで、Compound IIは、比較的安定しており、吸光度も４３０ｎｍと測定することができる。Compound IIレベルは、ＬＰＯと過酸化水素の混合後でも維持することができる（図２８参照）１％のＲＩＭを５０μｌ加えたＬＰＯ−過酸化水素混合物は、完全にCompound IIを抑制し、Compound IもしくはCompound IIの形成、もしくはこれら両方を抑制することを示す。Compound IIは、Compound Iに由来するので、Compound Iの抑制も同様に説明することができる。また、Compound Iと可能なCompound IIがヨウ化物酸化に利用されるので、１μＭのヨウ化カリウムは、部分的にCompound IIの形成を抑制する。【００５９】
＜ＲＩＭによる過酸化酸素の分解＞
ＲＩＭによるＬＰＯ−過酸化水素の抑制は、無細胞系でＲＩＭによる過酸化水素の分解を測定することで説明することができる。
測定方法としては、２０μＭの過酸化水素にＲＩＭもしくはＭＭＩを混合させ、定温放置後に、過酸化水素レベルを測定し、結果を図２９に示す。
図２９は、ＲＩＭもしくはＭＭＩによって強化された分解を示したグラフである。
この測定方法は、96-wellプレートに２０μＭの過酸化水素の反応緩衝液（全容積５０μｌ）にＲＩＭを混合させ、３７℃で３０分間、定温放置する。その時、Amplex red（Invitrogen）を加え、暗室で３０分間定温放置する。次に、蛍光マイクロプレートリーダー（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）で、５６０ｎｍの吸光度を測定した。図示するように、標準曲線は、０〜２０μＭの過酸化水素によるものであり、ＲＩＭもしくはＭＭＩの０濃度は、２０μＭの過酸化水素を示したものである。【００６０】
ＲＩＭは、用量反応方法で過酸化水素を分解した。また、ＭＭＩは、高濃度であることが必要であるが、過酸化水素を分解することができた。これにより、ＲＩＭによる過酸化水素の分解は、ＬＰＯ−過酸化水素反応の抑制を説明することができる。【００６１】
＜ＲＩＭによるヒト甲状腺機能低下＞
ＲＩＭのin vitroでのデータは、抗甲状腺薬剤として裏付けるものであり、そこで、重要なことは、in vivoで甲状腺ホルモンの形成が抑制されるかどうかである。
日本のShunichi Magara医師は、再発性ガンの治療にＲＩＭ（３％のＲＩＭ溶液を１００ｍｌ）を日常的に用いている。この治療を受けている患者の中から無作為に選択し、甲状腺機能の検査を行い、その結果を図３０に示す。【００６２】
ＲＩＭを使用した治療は次の理由に基づくものである。活性酸素種（ＲＯＳ）は、ガン細胞の多くの種類で増加し、ＲＯＳが腫瘍の血管新生を増加させる。すべての患者が長期間の化学療法や放射線療法を終えた後、少なくとも２カ月間もしくはそれ以上、ＲＩＭの投与を受けた。治療前に患者は、臨床的に甲状腺機能低下症の疑いがなかったので、甲状腺機能検査は受けていない。なお、全ての患者は、非甲状腺の病気を引き起こす病気ではない。【００６３】
１７人の患者のうち６人（３５％）が、ＲＩＭ治療の間、甲状腺機能低下（４人が無症候性甲状腺機能低下症、２人が顕性甲状腺機能低下症）を患っていた。無作為に選択した１７人の患者の３５％の甲状腺機能低下症の発症率は、日本の人口の６．５％の甲状腺機能低下症の有病率を考慮したとしても異常に高い数値である。さらに、甲状腺機能低下症の６人の患者は、ＴＰＯ抗体検査に基づいた橋本甲状腺炎（甲状腺機能低下症の最も一般的な原因）を患っていなかった。ＣＢＣ、肝臓及び腎機能検査を含む他の検査で、全ての患者（ここで示されていない）は正常であった。その結果、ヒトにおけるＲＩＭの抗甲状腺作用が期待されている。【００６４】
しかしながら、これが強力な抗甲状腺薬であるならば、全ての患者が甲状腺機能低下症を発症する。甲状腺機能低下症が比較的低い罹患率（３５％）は、投与方法の変更の重要なカギとなる。推測すると、ＲＩＭの経口投与は、あまり効果を期待することができないが、甲状腺に及ぼすＲＩＭの量が重要な点である。頸（甲状腺領域）への局所使用もしくは直接、甲状腺へＲＩＭを注射することは、ＲＩＭ治療として有効であるかを考慮する必要がある。興味深いことに、ＲＩＭは容易に皮膚から吸収される。【００６５】
＜還元活性を有するＲＩＭのコア構成要素の同定＞
ＲＩＭのコア構成要素の同定は、この研究では、重要である。この研究には、無機化学とＸ線結晶構造解析の専門知識を必要とするため、ＵＣＬＡのSaeed I.Khan博士とHerbert Kaesz教授に協力を依頼した。ＲＩＭのコア構成要素の同定において、ＲＩＭ中に存在するナトリウム、カリウム、イオウに焦点を置いた。具体的には、ナトリウムとカリウムとで形成されるイオウ化合物、もしくは、ＮａＫＳの複塩が対象である。【００６６】
＜結晶質のＲＩＭの分析＞
ＲＩＭ結晶の分析は、Saeed I. Khan博士がUCLAのJD.McClloughＸ線結晶構造回析研究所で行った。まずは、様々な結晶化技術を用いて高品質の単結晶を得る。このアイデアは、ＲＩＭの多くの異なる状態の１つを選択的に結晶化させることである。我々は、ＲＩＭの多くの異なる相を選択的に抽出するために、異なる溶媒（アセトン、エタノール、メタノール、formide等）の多様性を用いることを提案するとともに、単結晶法、粉末法の両方によってそれらの相を特定する。【００６７】
結晶の性質は、回折スポットを見ることで判断することができ、重なったスポットは、単結晶として複数の結晶が表示される。単結晶分析をするためには、この分析に適した単結晶が必要となる。単結晶分析には、Bruker Smart 1000 Apex II（Bruker AXS Inc, Madison WI）を使用する。粉末Ｘ線回折分析には、PANalytical X’ Pert PRO回析計（Westborough, MA）を使用する。【００６８】
＜非結晶質ＲＩＭの分析＞
ＲＩＭは、非結晶質成分（非結晶物質）を有し、水溶性非結晶質がＯＲＰメータによると良い還元力を保持していることがわかった。そこで、非結晶物質がＲＩＭ分子のコアかもしれないという可能性がある。単一のＮａ２Ｓと、もしくはＫ２ＳのＸ線回折によるスポットの欠如は、重要な還元ソースとして有利に働く。また、もう１つの可能性は、まだ特定されていないＮａＫＳ化合物の複塩の構造であり、その構造は、Dr. Kaesz（協力者）が予測するには、結晶構造を形成するものではないとしている。【００６９】
水溶性ＲＩＭからイオウ含有化合物を分離するためにイオン交換もしくは高圧液体クロマトグラフィーを使用する。分離した成分は、ＯＲＰメータで還元力を分析する。強力な還元力を保持する対象サンプルは、結晶化させた後にＸ線回折分析または元素分析によって分析される。【００７０】
分析するにあたって、注目する点は、ＲＩＭのミネラル含有物に基づくイオウ化合物と、イオウ化合物の還元電位である。ＲＩＭ形成の過程において、液体イオウにナトリウムとカリウムが作用するイオウは、２０００℃の加熱で簡単に熔融する。そして、高温における液体イオウ中へのナトリウムとカリウムの混合は、予期しないイオウ化合物を生成するかもしれず、高い強力なイオウ化合物の還元活性を有するにも関わらず、ＲＩＭは副作用を引き起こさない。【００７１】
＜ヒト甲状腺小胞もしくは甲状腺細胞株を使用した実験＞
（１）甲状腺小胞の生理的単位での過酸化水素生成にＲＩＭが与える影響の試験
実験に使用するヒト甲状腺小胞は、グレーブス病患者から採取し、凍結したものを、ハーバーＵＣＬＡ病院のAndrew Gianoukakis博士から手に入れた。この小胞を培養するに当たって、培養皿の底に、１％濃度の寒天培地がコーティングされている。このコーティングがないと、小胞が単層細胞に分離してしまう。
ヒト小胞は、６−ｗｅｌｌプレート中において、２ｍｌの６Ｈ培地（ＴＳＨ）もしくは５Ｈ培地（ＴＳＨ無し）で保持することができる。過酸化水素の測定のために、小胞を分析の前一日、１．５ｍＭの塩化カルシウムと８ｍＭのグルコースの存在下で前保温する。そのとき、培地は、ｐＨ７．４のＲＩＭ（１％のＲＩＭ０〜２０μｌ）の有無に関わらず、１ｎＭのＰＭＡ（ＤＵＯＸ２の直接刺激）、１．５ｍＬの塩化カルシウム、８ｍＭのグルコース、ＴＳＨ（０〜１ｍＵ／ｍｌ）を含む１．２ｍｌのＨＢＳＳに変えられる。【００７２】
この混合物をＣＯ２培養器で１時間培養した後に、培地５０μｌを吸光度５６０ｎｍでマイクロプレートリーダーを使用し、Ａｍｐｅｘ試薬混合物によって過酸化水素レベルを測定するために、９６−ｗｅｌｌプレートに入れる。過酸化水素生成量は、マイクロモルＨ２Ｏ２／ｍｇタンパク質で示される。【００７３】
（２）甲状腺細胞中のヨード有機化のＲＩＭの効果試験
甲状腺小胞の優位性の１つは、培養中にヨード有機化を示すことである。単層細胞中で培養された甲状腺細胞は、３次元小胞形状の不足により、ヨード有機化には不適当である。この実験の目的は、ＲＩＭが細胞レベルでヨード有機化を抑制するかどうかである。【００７４】
１２−ｗｅｌｌプレート中のヒト甲状腺小胞は、上記に示すように、５Ｈ培地と６Ｈ培地で培養される。実験の当日、培地は、１．５ｍＭの塩化カルシウム、２．８ｍＭのグルコース、１ｎＭのＰＭＡ、０〜１ｍＵ／ｍｌのＴＳＨ、０〜２０μｌのＲＩＭを含んだｐＨ７．４のＨＢＳＳに変更される。そのとき、ヨウ素１２５のヨウ化物（３０，０００ｃｐｍ）と１０ｎＭのヨウ化カリウム（ヨウ化物担体）の混合物は、培養培地に加えられる。培養は、ＣＯ２培養器で３７℃、２時間で行われる。培養培地の全小胞を超音波で分解し、１０分間、５０００×ｇで遠心分離器にかける。【００７５】
（３）ＤＵＯＸとＮＯＸ４のノックダウンによってＤＵＯＸ媒介もしくはＮＯＸ４媒介による過酸化水素生成にＲＩＭが主に作用するかの測定
まず、ＮＯＸ４とＤＵＯＸ２のノックダウン実験を行う。どのようにＮＯＸ４とＤＵＯＸ２が甲状腺細胞で過酸化水素生成の原因となるかは知られていない。そこで、ＲＩＭがＤＵＯＸもしくはＮＯＸ４介在での過酸化水素生成に作用するかどうかを測定する。この実験のアプローチは、ＮＯＸ４もしくはＤＵＯＸ２遺伝子がノックダウンすることと、ＲＩＭの有無で過酸化水素が生成されるかを調べることである。プールした４つのNOX4 siRNAもしくはDUOX2 siRNA (Dharmacon, Chicago. IL, siGENOME, SMART pool)とscrambled siRNA control (Dharmacon)を使用する。そして、ヒト小胞由来の単分子層ヒト甲状腺細胞を使用する。ヒト甲状腺細胞の初代培養の導入は、Weyemiらとして、JetPEIトランスフェクション媒体（Ployplus, New York, NY）を使用する。ヒト甲状腺細胞は、３日間TSH無しで培養され、引き続き、８時間、プールされたNOX4もしくはDUOX2 siRNA- JetPEI複合体で培養する。ノックダウン効率は、リアルタイムで定量PCRによってチェックし、甲状腺細胞中のNOX４もしくはDUOX2を免疫組織化学染色でチェックする。過酸化水素生成は、次のサンプルを使用して、Amplex Red法（Invitrogen）により実行する。【００７６】
培養細胞中の過酸化水素と酸素の細胞局在診断とそれらの生成量は、特定のH2O2 HyPer protein (30) (Wako Chemical Inc, Richmond, VA)とO2- specific mitoSOX Red probe (Invitrogen)を使用して調べる。結果は、図３１に示す。【００７７】
（４）ＲＩＭへの曝露後のＤＵＯＸとＮＯＸ４分子のウェスタンブロット試験
これは、ＲＩＭが直接、細胞膜ＤＵＯＸと細胞内ＮＯＸ４分子に作用するかどうかを調べることである。それは、ＲＩＭが原形質膜（図３２参照）に作用するからであり、そして、ＲＩＭがＢＨＰ細胞（未発表記録）中でＲＩＭへ曝露後、細胞内還元電位が増加することが証明されることにより、原形質膜を透過するものと思われる。ヒト小胞は、６−ｗｅｌｌ培養皿で２時間、１％のＲＩＭの有無に関わらず、６Ｈ培地で培養する。そして、培養された小胞の原形質膜の一部は、Ｓｏｎｇらによってプールされた小胞から手に入れた。細胞膜の一部は、ウェスタンブロット法に使用するまで−８０℃で保管される。ＤＵＯＸ２とＮＯＸ４のためのウサギポリクローナル抗体は、それぞれDr. Jacqueline Van Sande（University Libre de Brussels）と、Novus biological、Littleton株式会社から手に入れる。細胞膜タンパク質の内部コントロールのために、我々は、caveolin-1ウサギポリクローナル抗体（Cell Signaling Technology, Danvers, MA）を使用する。【００７８】
＜ｃＡＭＰ生成へのＲＩＭの影響＞
この実験は、細胞膜−ＴＨＳ媒介のｃＡＭＰ生成から甲状腺ホルモン形成の最も重要な信号にＲＩＭが作用するかどうかを調べる。ｃＡＭＰの生成は、リガンド（ＴＳＨ）がＧタンパク質共役受容体に結合を引き起こし、酵素アデニリルシクラーゼを刺激してＡＴＰの環化に触媒作用を及ぼす。この信号がＲＩＭによるものであるならば、甲状腺ホルモン形成の抑制の別のメカニズムである。【００７９】
手順としては、ＦＲＴＬ−５細胞を使用する。
２４−ｗｅｌｌ中の細胞は、ＣＯ２培養器で５日間、５Ｈ培地（ＴＨＳ無し）で培養する。実験当日、培養培地は、ＨＢＳＳ培地に変えられ、ｐＨ７．４、１％のＲＩＭの５０μｌをいくつかのグループに加える。細胞に１０分間ＲＩＭに曝露後、ウシ属ＴＳＨ（１ｍＵ／ｍ）もしくは２００μＭのホルスコリンをグループのいくつかに加える。１時間培養後、細胞を０．１Ｍの塩酸に溶解し、細胞内ｃＡＭＰレベルを取扱説明書に従って、パラメータｃＡＭＰ分析キット（R&D Inc. Minneapolis MN）で測定した。結果は、図３３に示す。【００８０】
＜無細胞実験＞
ＭＭＩと一体のＲＩＭの抗甲状腺薬の効能の比較を行う。抗甲状腺薬剤としてのＲＩＭの相対的な効能を証明するために、次の二つの方法によってＭＭＩの抗甲状腺薬の効能と比較する。
ＢＳＡの放射線ヨード化は、ＬＰＯ、過酸化水素、１２５Ｉ−ヨウ化物とＢＳＡの存在下で行われる。この反応混合物へ異なる濃度のＲＩＭもしくはＭＭＩが加えられ、ＲＩＭもしくはＭＭＩによるＢＳＡの放射線ヨード化の割合が測定される。抗甲状腺薬の効能は、ＲＩＭもしくはＭＭＩによってヨード化の５０％を抑制する計算された濃度で測定される。化合物II（甲状腺ホルモン形成のためのペルオキシダーゼ−過酸化水素反応の酸化生成物）におけるＲＩＭもしくはＭＭＩの効能は、化合物II（４３０ｎｍ）のスペクトル分析によって分析される。【００８１】
第１の実験は、ＬＰＯと過酸化水素を添加する前に、ＲＩＭもしくはＭＭＩを前もって混合させることである。反応混合は、ＲＩＭもしくはＭＭＩ、ＬＰＯが含まれている。４３０ｎｍの吸光度は、島津スペクトロメータによって、過酸化水素の添加後にすぐに、記録された。【００８２】
第２の実験は、最初に、ＬＰＯと過酸化水素を加え、次に、ＲＩＭもしくはＭＭＩを加えることにより、化合物IIの形成前に関与する。化合物IIレベルは、ＬＰＯと過酸化水素を混合させた後すぐに記録される。その時、ＲＩＭもしくはＭＭＩは、加えられ、化合物IIレベルの変化は、スペクトロメータの運動モードを使用して３分間記録される。【００８３】
＜動物実験＞
動物実験の主な目的は、ＲＩＭが可逆性もしくは不可逆性の甲状腺機能低下、甲状腺腫形成もしくは甲状腺委縮を誘導するかどうかを証明することである。加えて、ＲＩＭの経皮的効果が、グレーブス病の治療のために、ＲＩＭの局所適用の可能性を考慮して試験する。そして、甲状腺実験で一般的に使用される動物の一つとして、Sprague Dawlyラットを使用する。なお、ラットの性別は、特にこだわらない。それ以上の年齢のラットは、自発性甲状腺腫もしくは腫瘍の可能性があるので、１〜２カ月齢のラットを使用する。このラットは、GLA VA病院の指定された動物施設に収容され、資格を有する動物のスタッフや獣医師によって飼育されている。動物実験は、GLA-VA Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)によって制定されたガイドラインによって行われる。【００８４】
試験的な実験は、ＲＩＭの最適な服用量、治療に最適な持続時間、統計的検出力の分析によって使用されるラットの数の情報を取得するために行われる。また、統計的検出力の分析のために、StatMate (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA)を使用する。結果は、図３４に示す。【００８５】
実験終了後、ラットをＣＯ２チャンバーで処理する。血液サンプルは、Antech Diagnostics, Irvine, CAにて、ＴＳＨ血清、遊離Ｔ４、ＣＢＣ、腎臓、肝臓機能を測定のために心穿刺によってすぐに採取する。頸部は、甲状腺の大きさを撮影するために解剖して剥き出しにし、甲状腺を取り出す。甲状腺は、顕微鏡分析するために、重さを量り、スライスし、ヘマトキシリン・エオジン染色する。ラット甲状腺組織の一部は、甲状腺におけるＴ３とＴ４の分析に使用される。甲状腺ホルモンの含有量の測定は、甲状腺組織をプロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＰＢＳで超音波処理し、プロナーゼ消化（Calbiochem, La Jolla CA）を行う。その時、甲状腺ホルモンは、エタノールで抽出する。【００８６】
甲状腺組織内の含有するＴ３とＴ４の総量は、放射免疫測定によって測定される。超音波で分解した甲状腺の一定分量は、ＯＲＰメータによって組織還元力の測定のために使用される。コントロールとＲＩＭ処理したグループとの間で行う甲状腺の還元力の比較は、甲状腺組織でのＲＩＭの効果の存在を開示すべきである。【００８７】
試験的な実験は、将来的なＲＩＭの最適な服用量、処理時間（治療期間）、将来の実験に使用するラット数を決定するための統計的検出力といった情報を提供する。ＲＩＭの経口摂取は、消化管からＲＩＭの吸収は、予測不可能な吸収に変化しやすいので、飲料水におけるＲＩＭの経口投与は検討されない。Ｔ３とＴ４の総量の測定は、小さいラットの甲状腺組織からでは困難である。この問題を回避するために、貯蓄した甲状腺組織で試した。Dr. GH Pezや病理学者は、協力者であり、ラット甲状腺組織構造を調べた。また、実際の問題として、常習的なＲＩＭの導入である。Innovative Research of Americaから提供される徐々に薬剤を放出するカスタムペレットにように、変わりの選択肢として、このペレットを皮下注入することである。ＲＩＭが効果的に甲状腺へ到達する望ましい、インプラントサイトとして頸部にペレットを使用することが有利な点である。この方法は、予備的な研究は行っていないものの、試験的な実験で試してみる価値があるものである。【００８８】
＜甲状腺におけるＲＩＭの可逆性もしくは不可逆性効果の試験＞
ＲＩＭが永続的または可逆的甲状腺機能低下を引き起こすかどうかが、人間に使用したときに重要な問題となる。ラットを使用した実験は、この問題に答えるために行われる。なお、この実験計画を図３５に示す。【００８９】
ＲＩＭの服用量と動物数は、試験的実験の後に決定される。この実験においてコントロールグループ（ＮＳ導入）は含めない。【００９０】
＜ＲＩＭの経皮的効果＞
これは、ＲＩＭの局所的な塗布が皮膚を貫通し、皮膚組織に届くかどうかの試験であり、グレーブス甲状腺が容易に触知するところの頸部へのＲＩＭの局所的な塗布を検討する。この物質は、皮膚から容易に吸収される。まず、手順として、Sprague-Dawley ラット（ｎ＝５）は、この実験に使用する。ＲＩＭと通常の生理食塩水の応用分野は、皮膚に曝露するために電気シェーバーで剃毛する。ＲＩＭ（５％溶液）もしくは通常の生理食塩水（コントロール）は、指定した箇所に１日２回、小さいペイントブラシを使って塗布される。この実験を１週間行った。【００９１】
ラットを処理にした後、皮膚から皮膚組織を採取し、重さを量り、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で超音波分解した。超音波で分解した一定分量は、ＯＲＰメータによって還元力を測定する。コントロールとＲＩＭの部位からの皮膚組織のＯＲＰ測定値が比較される。ＲＩＭの浸透の深さが、異なる部分（表面組織と深い組織）の皮膚組織における還元力の測定によって検討される。【００９２】
ラットの頸部への局所適用は、ＴＳＨ／フリーＴ４の血中濃度における局所ＲＩＭの効果を調べるための最も実用的なアプローチだと思われる。しかしながら、ラット甲状腺は、容易に触知できるヒトの甲状腺と比べると、筋肉に覆われている。また、浅麻酔が導入されない限り、ラットの頸部領域を剃ることは困難である。【００９３】
次に、上記した強力な還元力を有するナトリウム、カリウムなどの正の原子価の元素と、イオウからなる減酸素の生物無機化合物複合体の他の薬理効果や美容効果等について説明する。【００９４】
＜他の薬理効果について＞
強力な還元力を有するナトリウム、カリウム、イオウからなる減酸素の生物無機化合物複合体は、その強力な還元力を利用して、酸化ストレス状態を和らげ、疾患の改善や修復を行うというものである。例えば、アトピー性皮膚炎や水虫といった皮膚炎の場合、患部にＲＩＭの水溶液を塗布することにより、強力な還元作用により皮膚炎の炎症を和らげることができる。また、やけどや傷、痔等にも効果があり、患部の修復も強力な還元力によって可能となる。さらに、肺炎や腫れ物、痛みや痒みにも効果があり、身体表面に塗布することで症状を抑制することができる。
このＲＩＭは体液のミネラルバランスと概ね共通していることから、ＲＩＭの０．６〜０．８％の液体をｐＨ調整することで点滴剤として利用することが可能である。【００９５】
＜美容効果について＞
強力な還元力を有するナトリウム、カリウムなどの正の原子価の元素と、イオウからなる減酸素の生物無機化合物複合体は、石鹸やクリーム、ローション、美容液といった化粧品に混合させて使用することにより、肌に適度な刺激と使用時の快感を与え、肌の保湿を保持し、うるおいを与えることができる。また、酸化状態の肌に対して塗布することで、強力な還元力によって肌の状態を改善したり、紫外線による肌のダメージを防ぐこともできる。また、育毛効果も生じる。【００９６】
＜農業への利用＞
強力な還元力を有するＲＩＭやＢＩＥは、植物や作物の栽培にも適用させることができる。
ＲＩＭの０．０１〜０．１％液にまく種を一日漬け込むことで、種に付着させている化学薬剤を除去することができると共に、ＲＩＭの還元力と自然界のミネラルバランスが種に浸漬される。肥料として使用すれば、植物や作物に対して十分なミネラルを与えることができる。また、植物や作物本体に水溶液として散布することで、病気の予防や害虫駆除に役立つことができる。また、収穫された作物や、草花に散布することで洗浄することができ、かつ、鮮度保持も可能である。また、このままヒトが摂取しても人体に影響がないことも利点である。【００９７】
＜畜産・養殖への利用＞
牛や豚、鶏といった畜産や魚介類の養殖にも、強力な還元性を有するＲＩＭやＢＩＥを利用することができる。この新物質を飼料に混合させることにより、これまで使用してきた合成飼料や抗生物質等を必要とすることなく、安全にかつ病気に強い家畜や魚介類を飼育することができる。【００９８】
＜食品への利用＞
この強力な還元力を有するＲＩＭは、食品にも利用することができる。例えば、食品の鮮度保持やうまみの抽出、洗浄に使用することができる。また、このＲＩＭの水溶液を食品にスプレーしたり浸漬したりすることで、強力な還元力により、食品の殺菌することができ、食中毒の予防をすることができる。【００９９】
次に、強力な還元力を有するＢＩＥを利用してミネラル水を製造する装置について説明する。
図３６（ａ）は、ミネラル溶出フィルターの構成を示した図であり、図３６（ｂ）は、ミネラル水を製造する装置本体の構成を示した断面図である。
まず、野草や草木、木葉、海草を燃焼させて灰にした後、２０００℃で溶融させたものを粉末状にし、水に溶かしてろ過することで、水溶性のミネラル分を除去し、不溶性植物ミネラル分を得る。この不溶性植物ミネラル分を１０μｍ以下の微粉末にし、ミネラル溶出フィルター１の原料とする。【０１００】
ミネラル溶出フィルター１は、繊維状または網目状のナイロン製のフィルターであり、このフィルターに、上記した２０００℃で溶融したのちの粉末物質と、不溶性植物ミネラル分を熱などによって吸着させる。また、活性炭や殺菌効果のある銀、鉱石などを加えて吸着させることもできる。このミネラル溶出フィルター１は、複数枚のフィルターを重ね合わせて中空の円柱状に形成させたものであり、これを、このフィルター１よりも直径が大きいハウジング２に収容する。【０１０１】
ハウジング２には、水道水を供給する供給管３と、生成されるミネラル水を取り出す取水管４が接続されている。まず、供給管３からハウジング２内（ミネラル溶出フィルター１の外側）に水道水を供給する。供給された水は、ミネラル溶出フィルター１内を通過し、中空部分から取水管４によってミネラル水と得ることができる。
なお、ハウジング２へ水道水を供給する、ミネラル水を取り出す仕組みは公知の技術を使って行うことができる。【０１０２】
ハウジング２へ供給した水道水をミネラル溶出フィルター１に通過させると、水道水に含まれる塩素がミネラル溶出フィルター１に吸着して除去することができる。また、予めミネラル溶出フィルター１に吸着しているミネラル分が溶出して、ミネラル分を多く含んだ水を生成することができる。さらに、上記した強力な還元力を有するＲＩＭによって酸化力のある水道水が還元され、酸化還元電位（ＯＲＰ）は下がり、アルカリ性を示すミネラル水を生成することができる。【０１０３】
生成されたミネラル水は当然のことながら生物に最も適応した水であり、植物や作物の栽培や家畜の用水に利用することができ、なお、人体に安全なことから食品可能や食品の洗浄にも適している。
図３７に示すように、生成されたミネラル水の含有ミネラルを測定したもので、カリウム１．６ｍｇ／１００ｇ、ナトリウム１．１ｍｇ／１００ｇ、カルシウム０．６ｍｇ／１００ｇ、マグネシウム０．２ｍｇ／１００ｇ、ｐＨが９．８であり、まさに、体液に共通するミネラルバランスを示した。【０１０４】
＜実験例＞
５０ｃｍタイプのミネラル溶出フィルター（活性炭入り）の性能テスト
・使用した水：東京都の水道水
・水量      ：８Ｌ／１分の流速でフィルターを通過させる。
実験の結果を図３８に示す。【０１０５】
上記した実験例のように、ミネラル溶出フィルター１に通過させた水道水は、ＯＲＰ値が低下して還元力を有し、ｐＨ値もアルカリ性に変化することが明らかとなった。【０１０６】
また、ミネラル溶出フィルター１を空気清浄装置や空調機、換気装置に設置し、汚染された空気を通過させることで空気を浄化させることができる。汚染された空気がこのフィルター１を通過することで、繊維状または網目状のフィルターに汚れが吸着するとともに、還元性のミネラルによって、汚染物質を還元し、浄化させることができる。このような装置は、動物の飼育室や植物生産室、喫煙所、トイレといった場所に設置することで効果を発揮することができる。
【符号の説明】
【０１０７】
１    ミネラル溶出フィルター
２    ハウジング
３    供給管
４    取水管
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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