(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
豚丹毒菌弱毒株の形質転換体である豚丹毒菌であって、サイトカインをコードする遺伝子を結合させた組換えＤＮＡとして前記組換えＤＮＡがサイトカインをコードする遺伝子を豚丹毒菌のＳｐａＡ.１遺伝子の中央部に挟むようにして設計したキメラ遺伝子を有し、前記サイトカインを発現する豚丹毒菌。
【請求項２】
サイトカインがインターロイキン、インターフェロン、造血因子、細胞増殖因子及び細胞傷害因子からなる群より選ばれた１種以上である請求項１に記載の豚丹毒菌。
【請求項３】
宿主となる豚丹毒菌弱毒株が豚丹毒菌小金井株６５−０．１５又は莢膜欠損豚丹毒弱毒ＹＳ−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４６６）である請求項１または２に記載の豚丹毒菌。
【請求項４】
請求項１〜３いずれかに記載の豚丹毒菌を非ヒト動物に投与する工程を含む非ヒト動物の疾患の予防及び／又は治療方法。
【請求項５】
請求項１〜３いずれかに記載の豚丹毒菌を非ヒト動物に投与することを特徴とする非ヒト動物体内へのサイトカインのデリバリー方法。
【請求項６】
請求項１〜３いずれかに記載の豚丹毒菌を非ヒト動物におけるワクチンアジュバントとして使用する方法。
【請求項７】
請求項１〜３いずれかに記載の豚丹毒菌を含有する非ヒト動物用ワクチン製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトカインを発現する豚丹毒菌及び非ヒト動物体内にサイトカインをデリバリーする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、豚、牛、鶏等の家畜動物を飼育する際に健康管理のためにワクチンを投与することが一般に行われているが、そのワクチンには、アジュバントを利用して家畜動物の免疫が賦活されている。しかしながら、アジュバントは、炎症惹起物質であるため、時として使用した動物に副作用や残留の問題を引き起こす可能性があり、コストも高い。したがって、アジュバントにかわる物質が求められている。このようなアジュバント代替物としては、前記の動物が体内で産生しているサイトカイン（以下、ヒト以外の動物に由来するサイトカインを動物サイトカインともいう）が注目されている。
【０００３】
動物サイトカインは、動物の生体内の免疫システムの細胞で産生されるが、アジュバント代替物のように使用するには大量に製造する必要がある。このような動物サイトカインの製造方法としては、遺伝子工学的な製造方法がすでにいくつか報告されている。例えば、本発明者らは、サイトカインとしてブタインターロイキン１８を昆虫細胞又は昆虫を用いることを特徴とする活性型インターロイキン−１８の生産方法を開発している（特許文献１）。また、非刺激下においてブタインターロイキン８を産生するブタ骨髄細胞由来細胞株やこの細胞株を用いたブタインターロイキン８の製造方法が知られている（特許文献２）。また、ブタ以外にも、ウシインターロイキン１β活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドにより形質転換されたブレビバチルス・チョーシネンシスを培養することにより、ウシインターロイキン１βを培養物中に生成、蓄積せしめ、これを採取すること、を特徴とするウシインターロイキン１βの製造方法法も知られている（特許文献３）。
【０００４】
前記の遺伝子工学的な技術は、いずれも、細胞培養液中に所望のサイトカインを分泌させるため、アジュバント代替物として使用するには精製を行う必要がある。しかしながら、このような精製を行うと、製造コストが増大するという問題がある。
【０００５】
また、前記のように動物サイトカインの製造方法はいくつか知られているものの、現在までのところ、動物サイトカインを実際に使用した製品は一製品のみに限られている。これは動物サイトカインそのものを経口投与したのでは消化酵素による影響を受けやすく、また、注射で投与した場合には一度に大量の動物サイトカインの投与が為されるために発熱などの副作用が生じやすいという技術的な課題があり、まだ十分に検討する余地があるためと考えられる。
さらに、動物サイトカインを効率よく安全に動物体内にデリバリーして、所望の効果を発現させる技術も確立されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３５４１２１６号公報
【特許文献２】特開２００４−１２９６６０号公報
【特許文献３】特開２００３−１３５０６０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前記事情に鑑みてなされたものであり、サイトカインを安全に非ヒト動物の体内に供給して、非ヒト動物に免疫増強作用を発現させることができる豚丹毒菌、非ヒト動物の疾患の予防及び／又は治療方法、並びにサイトカインを非ヒト動物体内へ安全にデリバリーする方法を提供することを目的とする。また、本発明は、新規なワクチンアジュバント及び非ヒト動物用ワクチン製剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題解決のため鋭意研究を行った結果、様々な宿主細胞の候補の中から、弱毒化した豚丹毒菌に着目し、動物サイトカインの１種として豚サイトカインを発現できるように前記豚丹毒菌を形質転換して豚に投与したところ、豚サイトカインに由来する免疫増強作用が見られるという事実を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明の要旨は、
（１）豚丹毒菌弱毒株の形質転換体である豚丹毒菌であって、サイトカインをコードする遺伝子を結合させた組換えＤＮＡとして前記組換えＤＮＡがサイトカインをコードする遺伝子を豚丹毒菌のＳｐａＡ.１遺伝子の中央部に挟むようにして設計したキメラ遺伝子を有し、前記サイトカインを発現する豚丹毒菌、
（２）サイトカインがインターロイキン、インターフェロン、造血因子、細胞増殖因子及び細胞傷害因子からなる群より選ばれた１種以上である前記（１）記載の豚丹毒菌、
（３）宿主となる豚丹毒菌弱毒株が豚丹毒菌小金井株６５−０．１５又は莢膜欠損豚丹毒弱毒ＹＳ−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４６６）である前記（１）または（２）に記載の豚丹毒菌、
（４）前記（１）〜（３）いずれかに記載の豚丹毒菌を非ヒト動物に投与する工程を含む非ヒト動物の疾患の予防及び／又は治療方法、
（５）前記（１）〜（３）いずれかに記載の豚丹毒菌を非ヒト動物に投与することを特徴とする非ヒト動物体内へのサイトカインのデリバリー方法、
（６）前記（１）〜（３）いずれかに記載の豚丹毒菌を非ヒト動物におけるワクチンアジュバントとして使用する方法、
（７）前記（１）〜（３）いずれかに記載の豚丹毒菌を含有する非ヒト動物用ワクチン製剤
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の豚丹毒菌は、非ヒト動物に投与することができ、非ヒト動物の体内で菌が生存できる間、所望のサイトカインを免疫に影響を与える量で持続的に供給できる。さらに、生菌を使用するために、病原体の感染で誘導される種々のサイトカインのネットワーク全体に影響を与えることができる。
したがって、本発明の豚丹毒菌を用いることで、非ヒト動物の疾患の予防又は治療を簡単に行うことができる。
また、本発明の豚丹毒菌は、非ヒト動物の免疫増強を行うことができるため、他のワクチン製剤を併用することで、非ヒト動物における予防又は治療効果を一層得やすくなる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、実施例１における、豚丹毒菌ＹＳ−１／ＩＬ１８株の作製の手順を示す概略図である。
【図２】図２は、実施例１において、ｐｏＩＬ−１８遺伝子を導入した莢膜欠損豚丹毒菌弱毒ＹＳ−１株（ＹＳ−１／ＩＬ１８株）の培養上清及び菌体破砕遠心上清中に検出されたｐｏＩＬ−１８の含有量を示すグラフである。対照はＹＳ−１株（親株）である。
【図３】図３は、実施例２において、ｐｏＩＬ−１８遺伝子を導入した豚丹毒菌生ワクチン小金井６５−０．１５株（ＫＯ／ＩＬ１８株）の培養上清及び菌体破砕遠心上清中に検出されたｐｏＩＬ−１８の含有量を示すグラフである。対照はＫＯ株（親株）である。
【図４】図４は、実施例３において、ＹＳ−１／ＩＬ１８株の培養上清の直接刺激でマウス脾細胞が有意にＩＦＮ−γを産生したことを示すグラフである。対照はＹＳ−１株（親株）である。
【図５】図５は、実施例３において、ＹＳ−１／ＩＬ１８株をマウスに投与した後、５日目に採取したマウスの脾細胞がコンカナバリンＡの刺激により有意にＩＦＮ−γを産生したことを示すグラフである。対照はＹＳ−１株（親株）である。
【図６】図６は、実施例４において、ＹＳ−１／ＩＬ１８株を投与したマウスの腹腔マクロファージが、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＳＴ）に対する貪食能が亢進していることを示すグラフである。
【図７】図７は、実施例５において、ＹＳ−１／ＩＬ１８株を投与後にＳＴを経口感染させたマウスでは、脾臓、腸管膜リンパ節及びパイエル板におけるＳＴの増殖がＹＳ−１株（親株）を接種した対照マウスに比べ有意に抑制されたことを示すグラフである。
【図８】図８は、実施例６において、ＫＯ／ＩＬ１８株を経口投与した豚では、親株（小金井６５−０．１５株）を経口接種した対照ブタに比べ、血清及び気管支肺胞洗浄液中の豚丹毒菌抗原ＳｐａＡ．１に対する抗体価が上昇していることを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００１３】
本発明の豚丹毒菌は、豚丹毒菌弱毒株の形質転換体である豚丹毒菌であって、サイトカインをコードする遺伝子を結合させた組換えＤＮＡを有し、前記サイトカインを発現することができる。
【００１４】
本件出願人は、以前に、株式会社微生物化学研究所と共に、豚丹毒菌の表面抗原をコードするSurface Protective Antigen(ＳｐａＡ.１)の遺伝子をクローニングし、この遺伝子ＳｐａＡ.１の一部を取り除いて外来遺伝子であるマイコプラズマ・ハイオニューモニエのＰ９７アドヘジン遺伝子の一部を挿入したキメラ遺伝子を作製し、そのキメラ遺伝子を豚丹毒菌に導入して、このキメラ遺伝子由来の蛋白質を発現する豚丹毒菌を開発している（特開２００２−１１９２８５号公報）。
【００１５】
本発明では、上記の技術を応用し、外来遺伝子としてサイトカインをコードする遺伝子を用い、ＳｐａＡ.１の一部にサイトカインをコードする遺伝子を挿入したキメラ遺伝子を作製し、このキメラ遺伝子を豚丹毒菌弱毒株に導入することで、サイトカインを発現する豚丹毒菌の形質転換体を作製する。
【００１６】
本発明で宿主として用いられる豚丹毒菌弱毒株は、エリシペロスリクス・ルシオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、エリシペロスリクス・トンジラーラム(Erysipelothrix tonsillarum)の弱毒株が挙げられ、例えば、日本においてよく使用されている、豚丹毒菌小金井株６５−０．１５や、本件出願人が以前に提出した特許公報第２９９２９８０号に記載された、豚丹毒菌強毒株Ｆｕｊｉｓａｗａ−ＳｍＲのトランスポゾン変異株に由来し、テトラサイクリン感受性を示す豚丹毒菌莢膜欠損変異株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４６６）が挙げられる。これらの宿主として用いられる豚丹毒菌弱毒株は、いずれも豚に対して弱毒化されたものであり、その生菌は、豚はもちろん豚以外の動物に感染した場合でも、疾患を引き起こさない。中でも、取り扱い易いという観点から、市販されている豚丹毒菌小金井株６５−０．１５、及び莢膜欠損豚丹毒弱毒ＹＳ−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４６６）が好ましい。
【００１７】
本発明において、サイトカインとしては、インターロイキン（ＩＬ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、造血因子、細胞増殖因子及び細胞傷害因子からなる群より選ばれた１種以上である。ＩＬとしては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１８、ＩＬ−８等、ＩＦＮとしては、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−ε、ＩＮＦ−κ等、造血因子としては、コロニー刺激因子（Coloney-Stimulating Factor (CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte- (G-)CSF）、エリスロポエチン（Erythropoietin (EPO)等、細胞増殖因子としては、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）等、細胞傷害因子としては、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、リンフォトキシン（ＴＮＦ−β）等が挙げられる。
【００１８】
前記サイトカインの起源となる動物としては、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、鳥類、イルカ等、種々の動物が挙げられるが、免疫増強しようとする動物であればよく、特に限定はない。
【００１９】
前記サイトカインをコードする遺伝子のクローニングは、常法に従って各種原料からｍＲＮＡを抽出、精製後に、DDBJ/GenBank/EMBL等のデータベースにより入手した所望のサイトカインのＤＮＡ情報に基づいて選択したプライマーを用い、逆転写酵素により合成したｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応によって行えばよい。なお、前記ＰＣＲによって増幅される前記サイトカインをコードする遺伝子を含む遺伝子産物は、サイトカインをコードする遺伝子の上流側と下流側にＥｃｏＲＩの切断部位を有する遺伝子配列となるように作製する。後述のキメラ遺伝子を作製に用いるために、前記遺伝子産物を予めＥｃｏＲＩで酵素処理して断片化しておいてもよい。
【００２０】
本発明において、前記サイトカインをコードする遺伝子を結合させた組換えＤＮＡとして、特開２００２−１１９２８５号公報に記載の方法に準じて、前記サイトカインをコードする遺伝子を豚丹毒菌のＳｐａＡ．１遺伝子の中央部に挟むようにして設計したキメラ遺伝子を作製する。
【００２１】
前記キメラ遺伝子の作製に用いるＳｐａＡ．１遺伝子としては、特開２００２−１１９２８５号公報に記載のｓｐａＡ．１遺伝子の完全長を含むファージミドｐＥＲｃ６．１を用いる。
【００２２】
なお、前記ファージミドｐＥＲｃ６．１は、以下のようにして作製されたものである。具体的には、本発明者である下地らがすでに報告（Infection and Immunity 1999,p1646-1651）しているとおり、豚丹毒菌藤沢株の染色体遺伝子をGalanとTimoneyらの方法(Infection and Immunity 1990,58,p3116-3121)にしたがい抽出し、この染色体遺伝子を制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分消化し、3-5キロベースペアの遺伝子断片をシクロースグラジエント遠心法で分画し、得られた遺伝子断片をZap Express Vector（Stratagene社製: La Jolla,Calf.）のＢａｍＨＩサイトに連結し、Gigapack III Gold packaging extract(Stratagene社製)を用いてインビトロパッケージングを行い、得られた組換えファージを大腸菌に感染させ、寒天平板上にファージプラークをつくらせた。このファージプラークを予めＩＰＴＧ(isopropylthiogalactoside)を染み込ませたニトロセルロース膜に転写し、実験的に豚丹毒強毒株を感染させた豚から得られた血清と反応させ、酵素抗体法により、反応するプラークを検出した。選択された組換えファージにクローニングされている豚丹毒の遺伝子を大腸菌内で発現させ、発現された蛋白を精製し、マウスに免疫した。免疫後、強毒豚丹毒菌藤沢株で攻撃した。この攻撃に対し、防御能を示した蛋白を発現する組換えファージクローンを最終的に選択した。さらに、選択したクローンをExAssistヘルパーファージ・大腸菌XLOLR システム（Stratagene社製）を用いてファージミドｐＥＲｃ６を作製した。ファージミドｐＥＲｃ６の挿入遺伝子配列をサイクルシークエンス法により決定し、この配列をジーンバンクに登録されている配列と比較したところ、牧野らの報告している豚丹毒菌の表面防御蛋白(Surface protective antigen:ＳｐａＡ)と高いホモロジーを示した。しかし、牧野らの報告とは、特にＣ末端側の配列が異なることから、この遺伝子をｓｐａＡ．１とした。ファージミドｐＥＲｃ６をサブクローニングし、ｓｐａＡ．１遺伝子の完全長を含むファージミド（プラスミド）ｐＥＲｃ６．１を作製した。
【００２３】
本発明において、前記キメラ遺伝子は、以下のようにして作製することができる。
即ち、前記プラスミドｐＥＲｃ６．１のＳｐａＡ．１遺伝子内に２箇所の制限酵素ＥｃｏＲＩサイトが存在しているため、プラスミドｐＥＲｃ６．１を制限酵素ＥｃｏＲＩで処理する。次にサイトカインをコードする遺伝子を含む遺伝子産物（両端に制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部位を有する遺伝子断片）と、準備したプラスミドｐＥＲｃ６．１とを、常法により連結させ、大腸菌にトランスフォーメーションし、キメラ遺伝子であるプラスミドを保有する大腸菌を得る。このプラスミドはＳｐａＡ．１遺伝子のＮ末端側にプロモーター配列を含むため、通常使用されるＩＰＴＧ等の蛋白発現のために添加される薬剤の添加なしに、大腸菌で蛋白を発現することができる。大腸菌の増殖に伴って発現された蛋白をウェスターン・ブロティングで解析することで、発現された蛋白質の分子量と、ＳｐａＡ．１に対する単クローン抗体とサイトカインに対する単クローン抗体の両抗体の反応を確認することができる。このＳｐａＡ．１に対する単クローン抗体は受身感染防御能をもつ抗体となる。この結果から豚丹毒菌ＳｐａＡ蛋白とサイトカインとが融合したキメラ蛋白の発現が確認でき、さらに合わせて、この蛋白の発現に関わる遺伝子カセットが作製できる。
【００２４】
次に、前記キメラ遺伝子を特開２００２−１１９２８５号公報に記載の方法に準じて、以下の手順で豚丹毒菌弱毒株に形質転換する。
即ち、キメラ遺伝子であるプラスミドのインサート全体を増幅するための制限酵素ＣｌａＩサイトをもつＰＣＲプライマーを５’側に設計し、そのプライマーとＴ７プライマーを用いてＰＣＲを行う。その増幅産物を制限酵素ＣｌａＩで処理し、予め制限酵素ＣｌａＩで処理しておいたストレプトコッカス・スイス(Streptococcus suis)と大腸菌のシャトルベクターｐＧＡ１４に連結する。このプラスミドをエレクトロポレーションにより豚丹毒菌弱毒株に導入する。
前記形質転換体の中から、ｓｐａＡ．１遺伝子上下流領域が、導入した遺伝子、すなわちｐＥＲ６．１／ＩＬ１８プラスミド上にある相同性領域とダブルクロスオーバーにより置き換わった結果、薬剤耐性を示さなくなった株を選択し、ＰＣＲ法によりこの株が目的とする遺伝子を保有することを確認する。
なお、前記形質転換法に用いるコンピタントセルの作製法、及び、形質転換に用いたエレクトロポレーション法の条件、形質転換株の選択法は、本発明者である下地らがすでに報告した方法（Infection and Immunity, 70: 226-232, 2002）に準じて行う。
【００２５】
以上のようにして得られる本発明の豚丹毒菌は、常法の培養手段を用いることで、低コストで簡易に増殖させることができる。また、本発明の豚丹毒菌は非ヒト動物に投与されると、非ヒト動物体内の各部に定着し、その各部にサイトカインを投与することができる。
さらに、本発明の豚丹毒菌は、生きている限り、定着している非ヒト動物体内にサイトカインを供給し続けることが可能であるため、一度、豚丹毒菌を投与すれば所望の効果が奏される。
したがって、本発明は、精製したサイトカインを必要となるたびに投与する必要がない点で、簡便でしかも安全な、非ヒト動物へのサイトカインのデリバリー方法である。
【００２６】
本発明の豚丹毒菌を非ヒト動物に投与する経路としては、経口投与、経鼻投与、注腸投与等が挙げられるが、操作が容易である観点から、経口投与が好ましい。例えば、前記豚丹毒菌そのものや、水等に前記菌体を懸濁した液体を用いることができる。
【００２７】
前記のように豚丹毒菌を投与された非ヒト動物の体内では、サイトカインが安全に供給されることで、免疫増強作用が奏される。
したがって、非ヒト動物に豚丹毒菌を投与することで、感染症等の疾患に罹患し難くしたり、症状を軽減したり、さらに他のワクチン製剤を併用することでより早期に疾患を完治することができる。また、本発明の豚丹毒菌は、非ヒト動物用のワクチンと混合した場合でも、大きな影響はないと考えられることから、例えば、本発明の豚丹毒菌を非ヒト動物用ワクチン製剤に含有させることができる。
【実施例】
【００２８】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２９】
（実施例１：ｐｏＩＬ−１８遺伝子を導入した莢膜欠損豚丹毒菌弱毒ＹＳ−１株（ＹＳ−１／ＩＬ１８株）の作製）
特開２００２−１１９２８５号公報に記載の方法に準じて、導入する外来遺伝子としてマイコプラズマ・ハイオニューモニエの付着蛋白質であるＰ９７アドヘジン遺伝子に替えて豚インターロイキン１８（ｐｏＩＬ−１８）遺伝子を導入した莢膜欠損豚丹毒菌弱毒ＹＳ−１株（ＹＳ−１／ＩＬ１８株）の作製を行った。
【００３０】
なお、前記ｐｏＩＬ−１８遺伝子としては、本発明者である下地らが提出した特許第３５４１２１６号公報に記載されたブタＩＬ−１８をコードする遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ（ｐＶＬ１３９２−ＩＬ１８）を用い、このプラスミドＤＮＡのＰＣＲ産物からＥｃｏＲＩで切り出したＤＮＡ断片（カスパーゼの切断認識アミノ酸配ＬＥＳＤ以降のブタＩＬ−１８をコードする遺伝子）を用いた。
【００３１】
全てのクローニング及び解析手法は、標準的なプロトコル（Sambrook J., E.F. Fritsch, and T.Maniatis. 1989. Molecular cloning: a Laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)に従って行った。
【００３２】
また、前記形質転換法に用いるコンピタントセルの作製法、及び、形質転換に用いたエレクトロポレーション法の条件、形質転換株の選択法は、本発明者である下地らがすでに報告した方法（Infection and Immunity, 70: 226-232, 2002）に準じて行った。
【００３３】
前記形質転換体の中から、ｓｐａＡ．１遺伝子の上下流領域が、導入した遺伝子、すなわちｐＥＲ６．１／ＩＬ１８プラスミド上にある相同性領域とダブルクロスオーバーにより置き換わった結果、薬剤耐性を示さなくなった株を選択し、ＰＣＲ法によりこの株が目的とする遺伝子を保有することを確認した。この株をＹＳ−１／ＩＬ１８株とした。
なお、図１に、豚丹毒菌ＹＳ−１／ＩＬ１８株の作製の手順を示す。
【００３４】
前記ＹＳ−１／ＩＬ１８株を培養培地（組成：０．１％ツイーン８０を添加したブレイン・ハート・インフュージョン）において３７℃で一晩培養し、遠心分離（×９，０００ｇ）して培養上清を得た。次いで、得られた菌体をバッファー（組成：０．１％ツイーン２０を添加したリン酸緩衝生理食塩水）と混合した後、超音波処理により破砕し、遠心分離して菌体破砕遠心上清を得た。
前記培養上清及び前記菌体破砕遠心上清のＯＤ４５０ｎｍにおける吸光度を特開２００１−１０３９６７号公報に記載の方法に準じて測定し、これらの上清中に含まれるｐｏＩＬ−１８の濃度を測定した。
また、対照として、形質転換を行っていないＹＳ−１株（親株）の培養上清と菌体破砕遠心上清についても調べた。これらの結果を図２に示す。
図２に示す結果より、ＹＳ−１株（親株）では、培養上清と菌体破砕遠心上清のいずれにもｐｏＩＬ−１８がほとんどみられないのに対して、ＹＳ−１／ＩＬ１８株では培養上清と菌体破砕遠心上清のいずれにもｐｏＩＬ−１８が顕著に発現されていることがわかる。
【００３５】
（実施例２：ｐｏＩＬ−１８遺伝子を導入した豚丹毒菌小金井６５−０．１５株（ＫＯ／ＩＬ１８株）の作製）
宿主細胞として、莢膜欠損豚丹毒菌弱毒ＹＳ−１株に替えて豚丹毒菌小金井６５−０．１５株を用いた以外は実施例１と同様にして、ｐｏＩＬ−１８遺伝子を導入した豚丹毒菌小金井６５−０．１５株（ＫＯ／ＩＬ１８株）の作製を行った。なお、ｐｏＩＬ−１８遺伝子としては、実施例１と同じＤＮＡ断片を用いた。
【００３６】
形質転換体の中から、ｓｐａＡ．１遺伝子の上下流領域が、導入した遺伝子、すなわちｐＥＲ６．１／ＩＬ１８プラスミド上にある相同性領域とダブルクロスオーバーにより置き換わった結果、薬剤耐性を示さなくなった株を選択し、ＰＣＲ法によりこの株が目的とする遺伝子を保有することを確認した。この株をＫＯ／ＩＬ１８株とした。
【００３７】
また、ＫＯ／ＩＬ１８株を培養培地（組成：０．１％ツイーン８０を添加したブレイン・ハート・インフュージョン）において３７℃で一晩培養し、遠心分離（×９，０００ｇ）して培養上清を得た。次いで、得られた菌体をバッファー（組成：０．１％ツイーン２０を添加したリン酸緩衝生理食塩水）と混合した後、超音波処理により破砕し、遠心分離して菌体破砕遠心上清を得た。
培養上清及び菌体破砕遠心上清のＯＤ４５０ｎｍにおける吸光度を測定して、これらの上清中に含まれるｐｏＩＬ−１８の濃度を測定した。
また、対照として、形質転換を行っていない小金井６５−０．１５株（親株）の培養上清と菌体破砕遠心上清についても調べた。これらの結果を図３に示す。
図３に示す結果より、小金井６５−０．１５株（親株）では、培養上清と菌体破砕遠心上清のいずれにもｐｏＩＬ−１８がほとんどみられないのに対して、ＫＯ／ＩＬ１８株では培養上清と菌体破砕遠心上清のいずれにもｐｏＩＬ−１８が顕著に発現されていることがわかる。
【００３８】
（実施例３）
マウス（１０週齢）２匹から脾細胞を取り出し、10％牛胎児血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（Invitrogen社）にて２×１０6／ｍｌ個に調整後、この細胞浮遊液１００μｌに実施例１で得られたＹＳ−１／ＩＬ１８株の培養上清の２倍希釈液１００μｌを加えて２晩３７℃で培養し、マウスＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡキット（Invitrogen社）により、ＩＦＮ−γの産生量を調べた。また、対照として、ＹＳ−１株（親株）の培養上清を用いて、同様にＩＦＮ−γの産生量を調べた。結果を図４に示す。
図４に示す結果より、ＹＳ−１株（親株）の培養上清ではＩＦＮ−γの産生が検出限界以下であるのに対して、ＹＳ−１／ＩＬ１８株の培養上清では、ＩＦＮ−γの産生が確認された。
【００３９】
また、ＹＳ−１／ＩＬ１８株とＹＳ−１株（親株）のＩＦＮ−γの誘導能について、ＹＳ−１／ＩＬ１８株又はＹＳ−１株（親株）１．３×１０8ＣＦＵの菌を含むブレイン・ハート・インフュージョン（BHI）培地（Becton,Dickinson and Company（ＢＤ）社）をマウス（９週齢）７匹に腹腔内投与後、５日目にマウスの脾細胞を採取して、２×１０6／ｍｌ個に調整した。その細胞浮遊液１００μｌに、１００μｌのコンカナバリンＡ溶液（５μｇ／ｍｌ）を加えて一晩３７℃で培養後、マウスＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡキット（Invitrogen社）により、その培養上清中のＩＦＮ−γの量を調べた。その結果を図５に示す。
図５の結果から、ＹＳ−１／ＩＬ１８株は、マウスの体内にＹＳ−１／ＩＬ１８株が定着してＩＬ１８が供給されることによって、ＹＳ−１株（親株）と比べて、マウスにおいて有意にＩＦＮ−γの産生を促進することがわかる。
【００４０】
以上の結果から、本発明の豚丹毒菌は、非ヒト動物であるマウスの免疫増強を行うことができることがわかる。
【００４１】
（実施例４）
マウス（７週齢）３２匹に、実施例１で得られたＹＳ−１／ＩＬ１８株を１．３×１０7ＣＦＵ／匹の菌を含むBHI培地を腹腔内投与した。また、対照として、同数のマウスにＹＳ−１株（親株）１．０×１０7ＣＦＵ／匹を腹腔内接種した。菌を投与後、５日目、１週間目、２週間目、３週間目に、各菌投与群のマウス、それぞれ8匹ずつを安楽殺し、マウスの腹腔から採取したマクロファージを用いて、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＳＴ）に対する貪食能を調べた。貪食能は、貪食1時間後のマクロファージを培地に滴下し，出現した菌のコロニーをカウントすることにより測定した。結果を図６に示す。
図６に示す結果より、ＹＳ−１／ＩＬ１８株を投与したマウスの腹腔マクロファージは、ＹＳ−１株（親株）を接種したマウスのマクロファージに比較し、菌を投与後1週目及び2週目において、ＳＴに対する貪食能が亢進していることが確認された。
このことから、ＹＳ−１／ＩＬ１８株を投与されたマウスではマクロファージの貪食能が亢進したことからも分かるように、マウスの体内にＹＳ−１／ＩＬ１８株が定着してＩＬ１８が供給されることによって、非特異的に免疫能が賦活されていることがわかる。
なお、上記の実験中、マウスの飼育は、常法に従い温度、湿度がコントロールされた部屋にて行い、食餌と水は自由に与えた。
【００４２】
（実施例５）
実施例１で得られたＹＳ−１／ＩＬ１８株をマウス（１０週齢）５匹に１．３×１０7ＣＦＵ／匹の菌を含むＢＨＩ培地を腹腔内投与した後、５日目にＳＴを１．０×１０9ＣＦＵ／headの菌を含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＢＤ社）を経口接種させ、１９日目にマウスを安楽殺して、脾臓、腸管膜リンパ節、パイエル板を常法により取り出し、それぞれの器官に存在するＳＴ数を、組織のホモジネートを培地に滴下し，出現した菌のコロニーをカウントすることにより測定した。
また、対照として、ＹＳ−１株（親株）１．２×１０7ＣＦＵ／匹を用いて、同様に各器官におけるＳＴ数を測定した。結果を図７に示す。
図７に示す結果より、前記３種類の器官におけるサルモネラ菌の存在数は、ＹＳ−１／ＩＬ１８株を接種した場合の方が、ＹＳ−１株（親株）を用いた場合に比べて有意に低かった。特に腸管膜リンパ節及びパイエル板におけるサルモネラ菌の存在数は顕著に低かったことから、ＹＳ−１／ＩＬ１８株を投与されたマウスでは、その体内にＹＳ−１／ＩＬ１８株が定着してＩＬ１８が供給されることによって、免疫が賦活された結果、サルモネラ菌の排除能が亢進していることがわかる。
したがって、本発明の豚丹毒菌は、非ヒト動物であるマウスの疾患の予防及び／又は治療に有効であることがわかる。
なお、上記の実験中、マウスの飼育は、実施例４と同様にして行った。
【００４３】
（実施例６）
実施例２で得られたＫＯ／ＩＬ１８株を無菌豚（動衛研にて作出）２頭に７×１０10ＣＦＵ／頭となるように添加した人口ミルクを経口投与した。菌投与後、１３日目に、ＳｐａＡ．１抗原に対するＩｇＡ及びＩｇＧの抗体濃度を測定した。
また、対照として、ＫＯ株（親株）を投与した無菌豚２頭を用いて、同様にＳｐａＡ．１抗原に対する抗体濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図８に示す。
図８に示す結果より、ＫＯ／ＩＬ１８株を経口投与した豚では、ＫＯ株（親株）を経口接種した対照ブタに比べ、血清及び気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の豚丹毒菌抗原ＳｐａＡ．１（ＩｇＡ、ＩｇＧ）に対する抗体価が上昇していた。
このことから、ＫＯ／ＩＬ１８株を経口投与された豚では、体内にＫＯ／ＩＬ１８株が定着してＩＬ１８が供給されることによって、豚の免疫が賦活された結果、抗体産生能が亢進しており、アジュバント効果があることがわかる。
したがって、本発明の豚丹毒菌は、非ヒト動物におけるワクチンアジュバントとして使用することが可能である。この場合、ワクチン製剤において、アジュバントのかわりに本発明の豚丹毒菌を使用することで、非ヒト動物用ワクチン製剤を調製することができる。
また、本発明の豚丹毒菌を単独で使用した場合でも、非ヒト動物である豚の疾患の予防及び／又は治療に有効であることがわかる。
なお、上記の実験中、豚の飼育は常法に従い温度、湿度がコントロールされた部屋にて行い、水は自由に与えたが、食餌は一日一回必要量を与えた。
【００４４】
前記の実施例１、２では、サイトカインとして、豚ＩＬ−１８を用いたが、他の豚サイトカインや他の動物由来のサイトカインを用いる場合でも、実施例１、２に記載の手順に準じて、所望のサイトカインを産生する豚丹毒菌弱毒株ＹＳ−１、ＫＯ株の形質転換株を作出することができる。
【図１】
0005991650.tif 000002
【図２】
0005991650.tif 000003
【図３】
0005991650.tif 000004
【図４】
0005991650.tif 000005
【図５】
0005991650.tif 000006
【図６】
0005991650.tif 000007
【図７】
0005991650.tif 000008
【図８】
0005991650.tif 000009