(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液由来の検体において、hsa-miR-133a, hsa-miR-133b及びhsa-miR-206からなる群から選ばれる少なくとも1種のmiRNAの発現を評価することを特徴とする、横紋筋肉腫の検出方法。
【請求項２】
体液由来の検体において、hsa-miR-133a, hsa-miR-133b及びhsa-miR-206からなる群から選ばれる少なくとも1種のmiRNAの発現量が健常者より有意に亢進していることを検出の基準とする請求項1に記載の横紋筋肉腫の検出方法。
【請求項３】
少なくともhsa-miR-206の発現を評価することを特徴とする、請求項1に記載の横紋筋肉腫の検出方法。
【請求項４】
リアルタイムＰＣＲ法により検出する、請求項1に記載の横紋筋肉腫の検出方法。
【請求項５】
体液が血液であり、体液由来の検体が血漿又は血清である請求項１に記載の横紋筋肉腫の検出方法。
【請求項６】
横紋筋肉腫を有する疑いのある被験者から得た体液由来の第１の検体においてhsa-miR-1の発現を定量すること、
健常者から得た体液由来の第２の検体におけるhsa-miR-1の発現を定量すること、及び  前記第１の検体中のhsa-miR-1と前記第２の検体中のhsa-miR-1の発現を比較することからなり、発現をリアルタイムＰＣＲ法により検出し、第２検体に対する第１検体中のhsa-miR-1の発現の増加が、統計学的試験における０．０７９３以下のＰを有することにより評価されることを特徴とする、横紋筋肉腫の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体液由来検体を用いた横紋筋肉腫の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、血清中の腫瘍由来の遊離DNAを用いた非侵襲的診断技術の開発に取り組んできた（非特許文献1,2）。近年、microRNA (miRNA) というタンパク質に翻訳されない非コードRNAの存在が明らかになり、その発現プロファイルは組織や腫瘍特異的であることが報告されている（非特許文献3,4）。小児がんにおいても細胞株を用いた検討で、発現プロファイルが腫瘍により異なるとする報告がある（非特許文献5）。また、小児がんで最も多い軟部肉腫である横紋筋肉腫では、筋に特異的に発現するmiRNAの発現が上昇していることが明らかにされている（非特許文献5, 6）。一方、血清中に腫瘍由来のmiRNAが存在することも明らかにされ、大腸がん、リンパ腫、前立腺がん、肝がんなどで、miRNAのバイオマーカーとしての有用性が示唆されている（非特許文献7〜10）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Gotoh, et al. J Clin Oncol 23:5205-5210, 2005
【非特許文献２】Yagyu, et al. Clin Cancer Res 14:7011-7019, 2008
【非特許文献３】Calin GA, et al. Nat Rev Cancer;6:857-866,2006
【非特許文献４】Lu J, et al. Nature;435:834-838,2005
【非特許文献５】Wei JS, et al. Clin Cancer Res;15:5560-5568,2009
【非特許文献６】Subramanian S, et al. Oncogene;27:2015-2026,2008
【非特許文献７】Ng EKO, et al. Gut;58:1375-1381,2009
【非特許文献８】Mitchell PS, et al. PNAS;105:10513-10518, 2008
【非特許文献９】Lawrie CH, et al. Br J Haematol;141:672-675, 2008
【非特許文献１０】Yamamoto Y, et al. Biomarkers;14:529-538,2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、診断の困難な横紋筋肉腫を容易に検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、小児腫瘍患者の体液由来検体において、筋に特異的に発現するmiRNA群であるhsa-miR-1, 133a, 133b, 206を定量し、横紋筋肉腫の非侵襲的な診断が可能かについて検討を行った。その結果、これらのmiRNAにより横紋筋肉腫が検出できることを見出した。【０００６】
本発明は、以下の横紋筋肉腫の検出方法を提供するものである。
項１．  体液由来の検体において、hsa-miR-1, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b及びhsa-miR-206からなる群から選ばれる少なくとも1種のmiRNAの発現を評価することを特徴とする、横紋筋肉腫の検出方法。
項２．  体液由来の検体において、hsa-miR-1, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b及びhsa-miR-206からなる群から選ばれる少なくとも1種の発現量が健常者より有意に亢進していることを検出の基準とする項1に記載の横紋筋肉腫の検出方法。
項３．  hsa-miR-133a, hsa-miR-133b及びhsa-miR-206からなる群から選ばれる少なくとも1種のmiRNAの発現を評価することを特徴とする項１に記載の横紋筋肉腫の検出方法。
項４．  少なくともhsa-miR-206の発現を評価することを特徴とする、項1に記載の横紋筋肉腫の検出方法。
項５．  リアルタイムＰＣＲ法により検出する、項1に記載の横紋筋肉腫の検出方法。
項６．  体液が血液であり、体液由来の検体が血漿又は血清である項１に記載の横紋筋肉腫の検出方法。
【発明の効果】
【０００７】
横紋筋肉腫は診断が難しい腫瘍の１つであるが、本発明によれば、従来無理と思われていた体液由来の検体を用い、横紋筋肉腫を検出することができるようになった。【０００８】
横紋筋肉腫は、化学療法、放射線療法の前に腫瘍を完全に切除することが予後の改善に重要であり、術前に暫定診断を行い初回に完全切除を目標とした手術方針を決定できることが重要である。本発明により横紋筋肉腫の診断がより正確かつ迅速にできるようになり、横紋筋肉腫の治療成績の向上が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】横紋筋肉腫細胞株で、筋特異的microRNAの発現が亢進していることを示す。縦軸は筋特異的miRNAとhsa-miR-16の比である。RMS : 横紋筋肉腫、NB : 神経芽腫、EWS : ユーイング肉腫、 MRT : 悪性横紋筋様腫瘍。
【図２】横紋筋肉腫腫瘍検体で、筋特異的microRNAの発現が亢進していることを示す。縦軸は筋特異的miRNAとhsa-miR-16の比である。RMS : 横紋筋肉腫、nonRMS : 横紋筋肉腫以外の腫瘍。
【図３】hsa-miR-1、hsa-miR-206、hsa-miR-133a、hsa-miR-133bの横紋筋肉腫細胞株の培養上清の発現量を示す。縦軸は筋特異的miRNAとhsa-miR-16の比である。RMS : 横紋筋肉腫、NB : 神経芽腫、EWS : ユーイング肉腫 、MRT : 悪性横紋筋様腫瘍。
【図４】健常人、担癌患児、横紋筋肉腫(RMS) 患児の血清hsa-miR-1の比較。縦軸はhsa-miR-1/hsa-miR-16比である。RMS : 横紋筋肉腫、nonRMS : 横紋筋肉腫以外の腫瘍。
【図５】健常人、担癌患児、横紋筋肉腫(RMS) 患児の血清hsa-miR-133aの比較。縦軸はhsa-miR-133a/hsa-miR-16比である。RMS : 横紋筋肉腫、nonRMS : 横紋筋肉腫以外の腫瘍。
【図６】健常人、担癌患児、横紋筋肉腫(RMS) 患児の血清hsa-miR-133bの比較。縦軸はhsa-miR-133b/hsa-miR-16比である。RMS : 横紋筋肉腫、nonRMS : 横紋筋肉腫以外の腫瘍。
【図７】健常人、担癌患児、横紋筋肉腫(RMS) 患児の血清hsa-miR-206の比較。縦軸はhsa-miR-206/hsa-miR-16比である。RMS : 横紋筋肉腫、nonRMS : 横紋筋肉腫以外の腫瘍。
【図８】治療後のRMS患児における筋特異的miRNA/hsa-miR-16比の低下。縦軸は筋特異的miRNA/hsa-miR-16比である。
【図９】ヒト血清中におけるmiRNAの安定性。4℃保存にて血清microRNAの安定性を検証した。Ct値はhsa-miR-16,  hsa-miR-133b両者において、保存期間とともに漸増傾向にありday30で3から4上昇した（絶対量として16分の1から8分の1）。一方、hsa-miR-133b/has-miR-16について大きな変化は認めなかった。
【図１０】血清筋特異的miRNAは、横紋筋肉腫の病勢を反映することを示す。
【図１１】横紋筋肉腫患児の血清以外の体液（髄液、胸水）においても筋特異的miRNAが検出されることを示す。
【図１２】体液中の筋特異的miRNAは、横紋筋肉腫の病勢を反映することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明で検出の対象とするhsa-miR-1, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b及びhsa-miR-206の配列を以下に示す。また、発現が高く、組織間での発現にばらつきが少ないためにinternal controlとして使用可能なhsa-miR-16の配列を合わせて表1に示す。
【００１１】
【表１】
0005928725.tif 000002
【００１２】
hsa-miR-1, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b及びhsa-miR-206は、図３に示すように、横紋筋肉腫細胞株の培養上清に多量に放出されており、腫瘍由来のmiRNAが腫瘍細胞内から遊離して存在する。人体内においても、腫瘍由来の遊離のmiRNAが体液中に存在することにより、横紋筋肉腫の検出、診断に利用できるものと考えられる。
【００１３】
本明細書において、体液としては、血液、胸水、腹水、髄液、尿などが挙げられる。血液は横紋筋肉腫の発生部位もしくは転移部位によらず有効であるが、発生部位もしくは転移部位が泌尿器である場合には尿が、中枢神経系などの場合には髄液が、腹腔内などの場合には腹水が、胸腔内の場合には胸水が各々有効である。
【００１４】
体液として血液を使用する場合、血液由来サンプル(血漿、血清)を18,000g, 10分の遠心処理を行い、その上清を用いて、白血球、赤血球の混入を防止することが必要である。
【００１５】
本発明で使用するmiRNAは、20年前の-20℃保存血清検体からも検出可能であり、血清中で本発明に使用するのに十分な安定性を有している(図９)。例えば、血清を4℃で３０日間保存すると絶対量として16分の1から8分の1程度になるが、hsa-miR-133bとhsa-miR-16の比には大きな変化を認めなかった。
【００１６】
miRNAの検出、定量は、miRNAを含むサンプルを逆転写してcDNAを得て、これを定量的リアルタイムPCRなどの適当な方法により実施することができる。cDNAは、例えばTaqMan MicroRNA RT kit (Applied Biosystems)、TaqMan MicroRNA assays のMature microRNA特異的RT primerなどを用いて、逆転写反応を行うことにより調製できる。また、定量的リアルタイムPCRは、TaqMan MicroRNA assays のTaqman primer とprobe、TaqMan Universal PCR Master Mixを用いて実施することができる。
【００１７】
横紋筋肉腫の検出に関しては、p＜0.05で有意に筋特異的miRNAの発現が、横紋筋肉腫群において増加する。
【００１８】
測定対象のmiRNAとしては、hsa-miR-206が感度、特異度ともに最も高く、有用と考えられる。hsa-miR-133a, hsa-miR-133b、hsa-miR-206については、腫瘍と血清のmicroRNA量の相関が認められた。
【００１９】
本発明の横紋筋肉腫の検出に関し、筋特異的miRNA（hsa-miR-1, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b及びhsa-miR-206）とhsa-miR-16の比（筋特異的miRNA/hsa-miR-16）は、横紋筋肉腫の診断時の体液、特に血清のバイオマーカーとして期待される。
【００２０】
本発明の検出方法によれば、横紋筋肉腫(RMS)を他の小児の腫瘍である神経芽腫(NB)、ユーイング肉腫(EWS)、悪性横紋筋様腫瘍(MRT)と区別して検出可能である。従来これらの腫瘍との鑑別は困難であり、本発明は、横紋筋肉腫の特異的な検出に極めて有効な手段を提供する。
【００２１】
本発明の筋特異的miRNAは、横紋筋肉腫の治療後に発現量が低下するので、治療の有効性の指標にもなる(図８，１０，１１)。
【００２２】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
実施例1
１．方法
細胞株、腫瘍検体、血清
京都府立医科大学小児科で保有している16細胞株（横紋筋肉腫7、神経芽腫4、ユーイング肉腫3、悪性横紋筋様腫瘍2）、21腫瘍検体（横紋筋肉腫7、未分化肉腫4、ウイルムス腫瘍2、神経芽腫2、ユーイング肉腫1、悪性横紋筋様腫瘍1、副腎がん1、網膜芽腫1、胞巣状軟部肉腫1、骨肉腫1）、48血清検体（横紋筋肉腫8、神経芽腫3、ウイルムス腫瘍2、ユーイング肉腫2、肝芽腫2、網膜芽腫2、骨肉腫2、未分化肉腫2、悪性横紋筋様腫瘍1、胞巣型軟部肉腫1、副腎がん1、膵芽腫1、奇形腫1、急性リンパ芽球性白血病1、ランゲルハンス細胞組織球症1、神経膠腫1、健常人ボランティア17）、15体液検体（横紋筋肉腫2（髄液1、胸水1）、神経芽腫3（髄液1、胸水1、腹水1）、髄芽腫3（髄液3）、上衣腫1（髄液1）、網膜芽腫1（髄液1）、悪性横紋筋様腫瘍1（髄液1）、ウイルムス腫瘍1（髄液1）、胚細胞腫瘍1（腹水1）、乳び胸1（胸水1）、自己免疫疾患1（髄液1））を用いて検討を行った。【００２４】
RNAの抽出
miRNAを含むtotal RNAはmirVana PARIS kit（Ambion）を用いて抽出した。細胞株培養液の上清、血清については、細胞成分を除去するため、15,000 rpm、10分間の遠心処理をさらに加え、その上清を用いた。【００２５】
逆転写反応
Taqman MicroRNA RT kit（Applied Biosystems）, Taqman MicroRNA assays（Applied Biosystems）のmature miRNA特異的逆転写反応用プライマーを用いて逆転写反応を行った。【００２６】
定量的リアルタイムPCR
逆転写したcDNA溶液、Taman MicroRNA assyasのプライマーとプローブを用いて、定量的リアルタイムPCRを行った。体液以外の検体では、組織間で発現のばらつきが少なく、高発現しているhsa-miR-16を内在コントロールとし、筋特異的miRNAの発現をnormalizeして、ΔΔCt法を用いて定量した。体液検体では、hsa-miR-16の発現が一定しなかったため、コピー数が既知である合成miRNAを用いて検量線を作成し、絶対定量を用いて定量した。血清1μl当たりのhsa-miR-206コピー数を算出し比較した。筋特異的miRNA（hsa-miR-1, 133a, 133b, 206）、およびhsa-miR-16の配列を表1に示す。【００２７】
統計解析
血清におけるmiRNAの発現は、Mann-WhitneyのU検定を用いて比較した。腫瘍と血清のmiRNAの発現の相関はSpearmanの順位相関係数を用いて検討した。いずれの検定も両側検定で行い、p<0.05を有意差ありとした。【００２８】
統計解析
血清におけるmiRNAの発現は、Mann-WhitneyのU検定を用いて比較した。腫瘍と血清のmiRNAの発現の相関はSpearmanの順位相関係数を用いて検討した。いずれの検定も両側検定で行い、p<0.05を有意差ありとした。【００２９】
２．結果
細胞株における筋特異的miRNAの発現
細胞株における検討では、横紋筋肉腫細胞株（n=7）では、神経芽腫（n=4）、ユーイング肉腫（n=3）、悪性横紋筋様腫瘍（n=2）細胞株に比べて筋特異的miRNAの発現が増加していた（図1）。【００３０】
臨床腫瘍検体における筋特異的miRNAの発現
臨床腫瘍検体における検討では、横紋筋肉腫腫瘍検体（n=7）で他の小児がん腫瘍検体（n=14）に比べて筋特異的miRNAの発現が増加していた（図2）。【００３１】
細胞株培養液上清における筋特異的miRNAの発現
細胞株培養液上清における検討では、横紋筋肉腫細胞株の培養液上清（n=7）で、神経芽腫（n=4）、ユーイング肉腫（n=3）、悪性横紋筋様腫瘍（n=2）細胞株の培養液上清に比べて筋特異的miRNAの発現が増加していた（図3）。【００３２】
血清における筋特異的miRNAの発現
血清における検討では、横紋筋肉腫の患児血清（n=8）において、他の小児がん患児血清（n=23）、健常人ボランティア血清（n=17）に比べて、筋特異的miRNAの発現が統計学的に有意差をもって増加していた（図4-7）。ROC曲線を用いて、cut off値を設定し感度、特異度を算出したところ、hsa-miR-206が最も高い感度、特異度を示し、感度100%、特異度91.3%であった（図7）。また、腫瘍と血清の両方の検体が得られたものについて、miRNAの発現の相関について検討したところ、hsa-miR-1ではp=0.0793と統計学的に有意ではないものの相関する傾向がみられ、hsa-miR-133a, 133b, 206では、有意な相関を認めた（表2）。また、治療前後のペア血清が得られた3症例について、治療による筋特異的miRNAの発現の変化についても検討を行っており、治療後には、いずれもcut off値を下回っており、発現は健常人ボランティアと同程度にまで低下した（図8）。血清中の筋特異的miRNAは、横紋筋肉腫の病勢を反映して増減し、治療奏功時には低下し、再発時や増悪時には上昇した（図10）。【００３３】
【表２】
0005928725.tif 000003
【００３４】
体液における筋特異的miRNAの発現
血清以外の体液である髄液、胸水においても、横紋筋肉腫患者（n=2）では、筋特異的miRNAの発現が、非横紋筋肉腫患者（n=13）と比較して高値であった（図11）。癌性髄膜炎を発症した横紋筋肉腫患者の髄液においても、その病勢を反映して増減し、治療奏功時には低下し、再発時や増悪時には上昇した（図12）。【００３５】
３．考察
横紋筋肉腫の細胞株、臨床腫瘍検体において、いずれも筋特異的miRNAの発現は増加しており、横紋筋肉腫が未分化な筋細胞に由来する腫瘍であることと矛盾しない結果であった。また、細胞成分を除去した細胞株培養液上清からも筋特異的miRNAは検出可能であり、横紋筋肉腫において、発現が最も増加していた。これは、細胞外にも筋特異的miRNAが遊離していることを示唆しており、臨床腫瘍検体の結果と合わせると、横紋筋肉腫患児血清中にも筋特異的miRNAが多量に存在していると考えられた。【００３６】
血清での検討では、いずれの筋特異的miRNAの発現も横紋筋肉腫患児血清において有意に増加しており、横紋筋肉腫の術前診断に有用であると考えられた。なかでも、hsa-miR-206は感度100%、特異度91.3%とバイオマーカーとして最も有用であると考えられた。さらに、臨床腫瘍検体と血清のmiRNAの発現量は相関を認め、また、治療後には、横紋筋肉腫患児血清において筋特異的miRNAの発現は健常人ボランティアと同レベルまで低下しており、これらの結果は血清で検出されるmiRNAは腫瘍由来であることを示唆している。血清以外の体液においても横紋筋肉腫患者において、筋特異的miRNAの発現は高く、病勢に応じて発現の変化を認めた。【００３７】
横紋筋肉腫は、小児で最も多い軟部肉腫であるにもかかわらず、現在、血液検査で測定できる腫瘍マーカーは存在せず、その術前診断は困難である。一方、本腫瘍では初回手術後の残存腫瘍の存在は予後不良因子であるため、初回手術前に横紋筋肉腫の暫定診断がなされていれば、全摘を目標とした手術を計画することができる。このため、横紋筋肉腫の術前診断につながる非侵襲的なバイオマーカーの存在は重要である。今回検討した筋特異的miRNAは、高い感度、特異度をもって、横紋筋肉腫の術前診断を可能にし、予後の改善に寄与しうる新規バイオマーカーであると考えられる。
【図１】
0005928725.tif 000004
【図２】
0005928725.tif 000005
【図３】
0005928725.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0005928725.tif 000011
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
0005928725.tif 000014
【図１２】
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【配列表】
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