(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素とを、以下の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、以下の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、以下の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、以下の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の糖化ヘモグロビンの変性剤の存在下に反応させ、得られる反応生成物にフルクトシルペプチド酸化酵素を作用させ、生成する過酸化水素を測定することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。
【化１】
0005955220.tif 000029
（式中、Ｒ１は、炭素数８〜２０の非置換のアルキル、又は、炭素数８〜２０の非置換のアルケニルを表し、Ｒａは、水素原子又はメチルを表し、ｎは、１〜５の整数を表し、Ｘ−は、１価のアニオンを表す。）
【化２】
0005955220.tif 000030
（式中、Ｒ２は、炭素数８〜２０の非置換のアルキルを表し、Ｒ３〜Ｒ５は、同一又は異なって、炭素数１〜４の非置換のアルキルを表し、Ｙ−は、１価のアニオンを表す。）
【化３】
0005955220.tif 000031
（式中、Ｒ６は、炭素数８〜２０の非置換のアルキル、又は、炭素数８〜２０の非置換のアルケニルを表し、Ｒ８は、置換若しくは非置換のメチルを表し、Ｒ７は、水素原子又はメチルを表し、Ｒ９、Ｒ１０は、いずれも水素原子を表し、Ｚ−は、１価のアニオンを表す。）
【化４】
0005955220.tif 000032
（式中、Ｒ１１は、炭素数８〜２０の非置換のアルキル、又は、炭素数８〜２０の非置換のアルケニルを表し、Ｗ−は、１価のアニオンを表す。）
【請求項２】
過酸化水素の測定が、過酸化水素測定試薬により行われる、請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である請求項２記載の測定方法。
【請求項４】
ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である請求項３記載の測定方法。
【請求項５】
フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである請求項４記載の測定方法。
【請求項６】
ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するための試薬であって、タンパク質分解酵素、フルクトシルペプチド酸化酵素、及び、以下の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、以下の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、以下の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、以下の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の糖化ヘモグロビンの変性剤を含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定試薬。
【化５】
0005955220.tif 000033
（式中、Ｒ１は、炭素数８〜２０の非置換のアルキル、又は、炭素数８〜２０の非置換のアルケニルを表し、Ｒａは、水素原子又はメチルを表し、ｎは、１〜５の整数を表し、Ｘ−は、１価のアニオンを表す。）
【化６】
0005955220.tif 000034
（式中、Ｒ２は、炭素数８〜２０の非置換のアルキルを表し、Ｒ３〜Ｒ５は、同一又は異なって、炭素数１〜４の非置換のアルキルを表し、Ｙ−は、１価のアニオンを表す。）
【化７】
0005955220.tif 000035
（式中、Ｒ６は、炭素数８〜２０の非置換のアルキル、又は、炭素数８〜２０の非置換のアルケニルを表し、Ｒ８は、置換若しくは非置換のメチルを表し、Ｒ７は、水素原子又はメチルを表し、Ｒ９、Ｒ１０は、いずれも水素原子を表し、Ｚ−は、１価のアニオンを表す。）
【化８】
0005955220.tif 000036
（式中、Ｒ１１は、炭素数８〜２０の非置換のアルキル、又は、炭素数８〜２０の非置換のアルケニルを表し、Ｗ−は、１価のアニオンを表す。）
【請求項７】
さらに、過酸化水素測定試薬を含む、請求項６記載の測定試薬。
【請求項８】
過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である請求項７記載の測定試薬。
【請求項９】
ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である請求項８記載の測定試薬。
【請求項１０】
フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである請求項９記載の測定試薬。
【請求項１１】
ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するためのキットであって、タンパク質分解酵素、及び、以下の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、以下の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、以下の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、以下の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の糖化ヘモグロビンの変性剤を含む第１試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素を含む第２試薬とを含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定キット。
【化９】
0005955220.tif 000037
（式中、Ｒ１は、炭素数８〜２０の非置換のアルキル、又は、炭素数８〜２０の非置換のアルケニルを表し、Ｒａは、水素原子又はメチルを表し、ｎは、１〜５の整数を表し、Ｘ−は、１価のアニオンを表す。）
【化１０】
0005955220.tif 000038
（式中、Ｒ２は、炭素数８〜２０の非置換のアルキルを表し、Ｒ３〜Ｒ５は、同一又は異なって、炭素数１〜４の非置換のアルキルを表し、Ｙ−は、１価のアニオンを表す。）
【化１１】
0005955220.tif 000039
（式中、Ｒ６は、炭素数８〜２０の非置換のアルキル、又は、炭素数８〜２０の非置換のアルケニルを表し、Ｒ８は、置換若しくは非置換のメチルを表し、Ｒ７は、水素原子又はメチルを表し、Ｒ９、Ｒ１０は、いずれも水素原子を表し、Ｚ−は、１価のアニオンを表す。）
【化１２】
0005955220.tif 000040
（式中、Ｒ１１は、炭素数８〜２０の非置換のアルキル、又は、炭素数８〜２０の非置換のアルケニルを表し、Ｗ−は、１価のアニオンを表す。）
【請求項１２】
さらに、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体を、それぞれ第１試薬と第２試薬、又は、第２試薬と第１試薬に含む、請求項１１記載の測定キット。
【請求項１３】
ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である請求項１２記載の測定キット。
【請求項１４】
フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである請求項１３記載の測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法、測定試薬、及び、測定キットに関する。さらに、本発明は、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法、ロイコ型色原体の安定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖化ヘモグロビンは、ヘモグロビンにグルコースが結合した糖化物である。ヘモグロビンはα鎖、β鎖からなる四量体の構造を取っているが、β鎖のＮ末端が糖化したものはヘモグロビンＡ１ｃと呼ばれ、血糖値が高い程、増加することから、糖尿病マーカーとして、血糖コントロールの指標に、臨床検査において日常的に測定されている。【０００３】
糖化ヘモグロビンの測定方法としては、ＨＰＬＣ法等のクロマトグラフィ法、電気泳動法、ラテックス免疫凝集法など抗体を利用する免疫測定法、糖化タンパク質に作用する酵素と、糖化ペプチド及び／又は糖化アミノ酸に作用する酵素とを用いる酵素測定法等が知られている。【０００４】
糖化ヘモグロビンの酵素測定法としては、先ず、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを変性剤により変性させ、変性糖化ヘモグロビンにタンパク質分解酵素を作用させ、次いで生成した糖化ペプチドに糖化ペプチド酸化酵素を作用させ、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下に、酸化発色型色原体と反応させて色素に導き、生成した色素の吸光度から糖化ヘモグロビンを測定する方法等が知られている。ここで、変性剤は、タンパク質分解酵素の糖化ヘモグロビンへの作用を可能とするために用いられ、これまでに、酢酸基を含む化合物又はその塩、Ｎ−アシルタウリン又はその塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸又はその塩（特許文献１）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩類等の陰イオン系界面活性剤（特許文献２）、ラウリル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のスルホン酸化合物（特許文献３）、スルホン酸化合物およびニトロ化合物（特許文献４）、第四級アンモニウム塩、塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウム、ラウリルジメチルアミンオキサイド等（特許文献５）の変性剤が知られている。【０００５】
また、糖化ヘモグロビンの酵素測定法においては、糖化ヘモグロビンを過酸化水素に変換し、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下に、酸化発色型色原体と反応させて色素に導き、生成した色素の吸光度から糖化ヘモグロビンを測定する方法がしばしば用いられる。ここで酸化発色型色原体として、しばしばロイコ型色原体が用いられる。ロイコ型色原体は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、過酸化水素と反応し、色素を生成する色原体の１種であり、カップリング型色原体とは異なり、それ単独で色素を生成する色原体であり、フェノチアジン系のロイコ型色原体、トリフェニルメタン系のロイコ型色原体、ジフェニルアミン系のロイコ型色原体等が知られている（例えば、特許文献６〜８参照）。【０００６】
ロイコ型色原体は、高感度色原体として、糖化ヘモグロビンのように、試料中に微量しか存在しない定量すべき成分の定量に好適に用いられる（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、一方で、その保存安定性が悪く、特に、溶液中では時間と共に、自然発色してしまうという欠点を有し、このロイコ型色原体の有する安定性不良により、試料中の定量すべき成分が正確に測定できない、という問題が生じている。【０００７】
このロイコ型色原体の有する安定性不良という課題に対して、これまで、ロイコ型色原体の溶液中で安定化方法が検討され、報告されている（例えば、特許文献９、１０参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００６／０１３９２１パンフレット
【特許文献２】ＷＯ２００５／０４９８５８パンフレット
【特許文献３】ＷＯ２００４／００７７６０パンフレット
【特許文献４】ＷＯ２００３／１０７０１１パンフレット
【特許文献５】特開２００９−１５９９８９号公報
【特許文献６】特開昭５７−０２９２９７号公報
【特許文献７】特開平３−２０６８９６号公報
【特許文献８】特開昭６２−０９３２６１号公報
【特許文献９】ＷＯ２００５／０８８３０５パンフレット
【特許文献１０】ＷＯ２００７／０８３７０３パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】臨床検査，1997年，Vol.41，No.9，p.1014-1019
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
糖化ヘモグロビンの酵素測定法において、今まで知られている糖化ヘモグロビンの変性剤については、糖化ヘモグロビンの変性が充分でないために、タンパク質分解酵素反応が満足に進行せず、糖化ヘモグロビンの正確な測定が行えないという問題があった。また、糖化ヘモグロビンの測定方法において用いられるロイコ型色原体については、従来知られている保存方法は厳しい条件下での保存を要する等、必ずしも満足できる方法とは言えない。【００１１】
本発明の目的は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを正確に測定する方法、試薬及びキット、並びに、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの正確な測定を可能にする、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法、及び、ロイコ型色原体の安定化方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは本課題を鋭意検討したところ、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素とを、ピリジニウム塩、ホスホニウム塩、イミダゾリウム塩、又は、イソキノリニウム塩存在下に反応させることにより、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンを充分に変性させることができ、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを正確に測定できる、という知見を見出した。さらに、ピリジニウム塩、ホスホニウム塩、イミダゾリウム塩、又は、イソキノリニウム塩がロイコ型色原体を安定化する、という知見を見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１８］に関する。【００１３】
［１］  ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素とを、以下の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、以下の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、以下の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、以下の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の存在下に反応させ、得られる反応生成物にフルクトシルペプチド酸化酵素を作用させ、生成する過酸化水素を測定することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。【００１４】
【化１】
0005955220.tif 000002
【００１５】
（式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｎは、１〜５の整数を表し、Ｘ−は、１価のアニオンを表す。）【００１６】
【化２】
0005955220.tif 000003
【００１７】
（式中、Ｒ２〜Ｒ５は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ−は、１価のアニオンを表す。）【００１８】
【化３】
0005955220.tif 000004
【００１９】
（式中、Ｒ６とＲ８は同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０は、水素原子、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アルケニルを表し、Ｚ−は、１価のアニオンを表す。）【００２０】
【化４】
0005955220.tif 000005
【００２１】
（式中、Ｒ１１は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｗ−は、１価のアニオンを表す。）
［２］  過酸化水素の測定が、過酸化水素測定試薬により行われる、［１］記載の測定方法。
［３］  過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である［２］記載の測定方法。
［４］  ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である［３］記載の測定方法。
［５］  フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである［４］記載の測定方法。【００２２】
［６］  ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するための試薬であって、タンパク質分解酵素、フルクトシルペプチド酸化酵素、及び、以下の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、以下の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、以下の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、以下の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定試薬。【００２３】
【化５】
0005955220.tif 000006
【００２４】
（式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｎは、１〜５の整数を表し、Ｘ−は、１価のアニオンを表す。）【００２５】
【化６】
0005955220.tif 000007
【００２６】
式中、Ｒ２〜Ｒ５は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ−は、１価のアニオンを表す。）【００２７】
【化７】
0005955220.tif 000008
【００２８】
（式中、Ｒ６とＲ８は同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０は、水素原子、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アルケニルを表し、Ｚ−は、１価のアニオンを表す。）【００２９】
【化８】
0005955220.tif 000009
【００３０】
（式中、Ｒ１１は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｗ−は、１価のアニオンを表す。）【００３１】
［７］  さらに、過酸化水素測定試薬を含む、［６］記載の測定試薬。
［８］  過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である［７］記載の測定試薬。
［９］  ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である［８］記載の測定試薬。
［１０］  フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである［９］記載の測定試薬。【００３２】
［１１］  ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するためのキットであって、タンパク質分解酵素、及び、以下の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、以下の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、以下の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、以下の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む第１試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素を含む第２試薬とを含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定キット。【００３３】
【化９】
0005955220.tif 000010
【００３４】
（式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｎは、１〜５の整数を表し、Ｘ−は、１価のアニオンを表す。）【００３５】
【化１０】
0005955220.tif 000011
【００３６】
（式中、Ｒ２〜Ｒ５は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ−は、１価のアニオンを表す。）【００３７】
【化１１】
0005955220.tif 000012
【００３８】
（式中、Ｒ６とＲ８は同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０は、水素原子、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アルケニルを表し、Ｚ−は、１価のアニオンを表す。）【００３９】
【化１２】
0005955220.tif 000013
【００４０】
（式中、Ｒ１１は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｗ−は、１価のアニオンを表す。）【００４１】
［１２］  さらに、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体を、それぞれ第１試薬と第２試薬、又は、第２試薬と第１試薬に含む、［１１］記載の測定キット。
［１３］  ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である［１２］記載の測定キット。
［１４］  フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである［１３］記載の測定キット。【００４２】
［１５］  ロイコ型色原体含有水溶液に、以下の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、以下の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、以下の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、以下の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種を添加することを特徴とする、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法。【００４３】
【化１３】
0005955220.tif 000014
【００４４】
（式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｎは、１〜５の整数を表し、Ｘ−は、１価のアニオンを表す。）【００４５】
【化１４】
0005955220.tif 000015
【００４６】
（式中、Ｒ２〜Ｒ５は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ−は、１価のアニオンを表す。）【００４７】
【化１５】
0005955220.tif 000016
【００４８】
（式中、Ｒ６とＲ８は同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０は、水素原子、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アルケニルを表し、Ｚ−は、１価のアニオンを表す。）【００４９】
【化１６】
0005955220.tif 000017
【００５０】
（式中、Ｒ１１は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｗ−は、１価のアニオンを表す。）【００５１】
［１６］  ロイコ型色原体を、以下の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、以下の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、以下の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、以下の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む水溶液中で共存させることを特徴とする、ロイコ型色原体の安定化方法。【００５２】
【化１７】
0005955220.tif 000018
【００５３】
（式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｎは、１〜５の整数を表し、Ｘ−は、１価のアニオンを表す。）【００５４】
【化１８】
0005955220.tif 000019
【００５５】
（式中、Ｒ２〜Ｒ５は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ−は、１価のアニオンを表す。）【００５６】
【化１９】
0005955220.tif 000020
【００５７】
（式中、Ｒ６とＲ８は同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０は、水素原子、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アルケニルを表し、Ｚ−は、１価のアニオンを表す。）【００５８】
【化２０】
0005955220.tif 000021
【００５９】
（式中、Ｒ１１は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｗ−は、１価のアニオンを表す。）【００６０】
［１７］  ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である［１５］または［１６］記載の方法。
［１８］  フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである［１７］記載の方法。
【発明の効果】
【００６１】
本発明により、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを正確に測定する方法、試薬及びキット、並びに、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの正確な測定を可能にする、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法、及び、ロイコ型色原体の安定化方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】実施例１及び比較例１のキットを用いる試料中のヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃとも記す）の測定における、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。▲は、実施例１のキット、●は、比較例１のキットを用いた測定を表し、縦軸は反応吸光度（×１０−４Ａｂｓ）を、横軸はＨｂＡ１ｃ理論濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を表す。
【図２】実施例２及び比較例１のキットを用いる試料中のＨｂＡ１ｃの測定における、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。▲は、実施例２のキット、●は、比較例１のキットを用いた測定を表し、縦軸は反応吸光度（×１０−４Ａｂｓ）を、横軸はＨｂＡ１ｃ理論濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を表す。
【図３】実施例３及び比較例１のキットを用いる試料中のＨｂＡ１ｃの測定における、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。▲は、実施例３のキット、●は、比較例１のキットを用いた測定を表し、縦軸は反応吸光度（×１０−４Ａｂｓ）を、横軸はＨｂＡ１ｃ理論濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を表す。
【図４】実施例４及び比較例１のキットを用いる試料中のＨｂＡ１ｃの測定における、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。▲は、実施例４のキット、●は、比較例１のキットを用いた測定を表し、縦軸は反応吸光度（×１０−４Ａｂｓ）を、横軸はＨｂＡ１ｃ理論濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を表す。
【図５】実施例５及び比較例１のキットを用いる試料中のＨｂＡ１ｃの測定における、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。□は、実施例５のキット、●は、比較例１のキットを用いた測定を表し、縦軸は反応吸光度（×１０−４Ａｂｓ）を、横軸はＨｂＡ１ｃ理論濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を表す。
【図６】実施例６及び比較例１のキットを用いる試料中のＨｂＡ１ｃの測定における、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。▲は、実施例６のキット、●は、比較例１のキットを用いた測定を表し、縦軸は反応吸光度（×１０−４Ａｂｓ）を、横軸はＨｂＡ１ｃ理論濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を表す。
【図７】実施例１３及び比較例３のキットを用いる試料中のＨｂＡ１ｃの測定における、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。■は、実施例１３のキット、●は、比較例３のキットを用いた測定を表し、縦軸は反応吸光度（×１０−４Ａｂｓ）を、横軸はＨｂＡ１ｃ理論濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
（１）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法
本発明の、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素とを、後述の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、後述の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、後述の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、後述の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の存在下に反応させ、得られる反応生成物にフルクトシルペプチド酸化酵素を作用させ、生成する過酸化水素を測定することを特徴とする方法である。
具体的には、以下の工程を含む測定方法である。
【００６４】
（１）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素とを、後述の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、後述の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、後述の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、後述の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む水性媒体中で反応させる工程；
（２）工程（１）で得られる反応生成物にフルクトシルペプチド酸化酵素を作用させ、過酸化水素を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（４）既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン濃度との関係を表す検量線に、工程（３）で測定した過酸化水素量を照らし合わせて、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
【００６５】
また、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン（すなわち、ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンを合わせた総ヘモグロビン）量に対する割合を算出する方法をも包含する。この場合、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、具体的には、以下の工程を含む測定方法である。
（１）ヘモグロビン含有試料中の総ヘモグロビン（すなわち、ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンを合わせた総ヘモグロビン）量を測定する工程；
（２）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素とを、後述の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、後述の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、後述の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、後述の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む水性媒体中で反応させる工程；
（３）工程（２）で得られる反応生成物にフルクトシルペプチド酸化酵素を作用させ、過酸化水素を生成させる工程；
（４）工程（３）で生成した過酸化水素を測定する工程；
（５）既知量の糖化ヘモグロビンを用いて予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン量との関係を表す検量線に、工程（４）で測定した過酸化水素量を照らし合わせて、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量を測定する工程；及び、
（６）工程（１）で測定した総ヘモグロビン量と、工程（５）で測定した糖化ヘモグロビン量から、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン量に対する割合を算出する工程。
【００６６】
尚、上記工程（１）の総ヘモグロビン量の測定は、ヘモグロビン含有試料に、後述の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、後述の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、後述の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、後述の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種を添加して、ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンを変性させた後に行うこともできる。
【００６７】
また、ヘモグロビン含有試料中の総ヘモグロビン量の測定は、ヘモグロビン含有試料に、タンパク質分解酵素と、後述の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、後述の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、後述の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、後述の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種とを添加して、変性させたヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンをタンパク質分解酵素で分解させた後に行うこともできる。
【００６８】
本発明の測定方法におけるヘモグロビン含有試料は、ヘモグロビンを含有し、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法が適用可能な試料であれば特に制限はなく、例えば全血、血球、血球に血漿が混在した試料、これらの試料を溶血処理した試料等が挙げられる。溶血処理としては、全血、血球、血球に血漿が混在した試料を溶血させる処理であれば特に制限はなく、例えば物理的方法、化学的方法、生物学的方法等が挙げられる。物理的方法としては、例えば蒸留水等の低張液を用いる方法、超音波を用いる方法等が挙げられる。化学的方法としては、例えばメタノール、エタノール、アセトン等の有機溶媒を用いる方法、ポリオキシエチレン系界面活性剤を用いる方法等が挙げられる。生物学的方法としては、例えば抗体や補体を用いる方法等が挙げられる。
【００６９】
本発明における糖化ヘモグロビンは、ヘモグロビンにグルコース等の糖が結合して生成したものであり、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ヘモグロビンＡ１ｃ等が挙げられ、ヘモグロビンＡ１ｃが好ましい。
【００７０】
本発明において、ピリジニウム塩としては、以下の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩［以下、化合物（Ｉ）という］が使用される。
【００７１】
【化２１】
0005955220.tif 000022
【００７２】
式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｎは、１〜５の整数を表し、Ｘ−は、１価のアニオンを表す。
【００７３】
Ｒ１において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数１〜２０の直鎖アルキル、炭素数３〜２０の分岐アルキル等が挙げられ、炭素数８〜２０の直鎖アルキル、炭素数８〜２０の分岐アルキルが好ましい。炭素数１〜２０の直鎖アルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。炭素数３〜２０の分岐アルキルとしては、例えばイソプロピル、イソブチル、イソペンチル、イソヘキシル、イソヘプチル、イソオクチル、イソノニル、イソデシル、イソウンデシル、イソドデシル、イソトリデシル、イソテトラデシル、イソペンタデシル、イソヘキサデシル、イソヘプタデシル、イソオクタデシル、イソノナデシル、イソイコシル、オクチルドデシル等が挙げられる。炭素数８〜２０の直鎖アルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。炭素数８〜２０の分岐アルキルとしては、例えばイソオクチル、イソノニル、イソデシル、イソウンデシル、イソドデシル、イソトリデシル、イソテトラデシル、イソペンタデシル、イソヘキサデシル、イソヘプタデシル、イソオクタデシル、イソノナデシル、イソイコシル、オクチルドデシル等が挙げられる。
【００７４】
Ｒ１において、置換若しくは非置換のアルケニルにおけるアルケニルとしては、例えば炭素数２〜２０のアルケニル等が挙げられ、炭素数８〜２０のアルケニルが好ましい。炭素数２〜２０のアルケニルとしては、例えばビニル、プロピル、アリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オクタデセニル、オレイル、ノナデセニル、イコセニル等が挙げられる。炭素数８〜２０のアルケニルとしては、例えばオクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オクタデセニル、オレイル、ノナデセニル、イコセニル等が挙げられる。
【００７５】
Ｒ１において、置換アルキル及び置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００７６】
Ｒａにおいて、置換もしくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数１〜２０の直鎖アルキル、炭素数３〜２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数１〜２０の直鎖アルキルとしては、例えば前述の炭素数１〜２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数３〜２０の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数３〜２０の分岐アルキル等が挙げられる。
【００７７】
Ｒａにおいて、置換もしくは非置換のアルケニルにおけるアルケニルにとしては、例えば炭素数２〜２０のアルケニル等が挙げられる。炭素数２〜２０のアルケニルとしては、例えば前述の炭素数２〜２０のアルケニル等が挙げられる。
【００７８】
Ｒａにおいて、置換アルキル及び置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１−フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００７９】
ピリジン環上に２つ以上の置換基がある場合、置換基は同じであっても異なっていてもよい。化合物（Ｉ）におけるＸ−は、１価のアニオンを表す。１価のアニオンとしては、例えばハロゲンイオン、OH-、PF6-、BF4-、CH3CH2OSO3-、(CF3SO2)2N-等のアニオンが挙げられる。ハロゲンイオンとしては、例えばCl-、Br-、I-等が挙げられる。
【００８０】
化合物（Ｉ）の具体例（製品）としては、例えば１−ドデシルピリジニウムクロライド（以下、Ｃ１２ｐｙと記す；東京化成社製）、１−セチルピリジニウムクロライド（以下、Ｃ１６ｐｙと記す；東京化成社製）、１−セチル−４−メチルピリジニウムクロライド（東京化成社製）、Ｎ−オクタデシル−４−スチルバゾールブロミド（東京化成社製）等が挙げられる。
【００８１】
本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法における化合物（Ｉ）の反応液中の濃度は、通常０．０００１〜１０％である。
【００８２】
本発明において、ホスホニウム塩としては、以下の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩［以下、化合物（ＩＩ）という］が使用される。
【００８３】
【化２２】
0005955220.tif 000023
【００８４】
式中、Ｒ２〜Ｒ５は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ−は、１価のアニオンを表す。
【００８５】
Ｒ２において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数８〜２０の直鎖アルキル、炭素数８〜２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数８〜２０の直鎖アルキルとしては、例えば前述の炭素数８〜２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数８〜２０の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数８〜２０の分岐アルキル等が挙げられる。置換アルキルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１−フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００８６】
Ｒ３〜Ｒ５において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数１〜２０の直鎖アルキル、炭素数３〜２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数１〜２０の直鎖アルキルとしては、例えば前述の炭素数１〜２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数３〜２０の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数３〜２０の分岐アルキル等が挙げられる。置換アルキルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１−フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００８７】
Ｙ−は、１価のアニオンを表す。１価のアニオンとしては、例えばハロゲンイオン、OH-、PF6-、BF4-、CH3CH2OSO3-、(CF3SO2)2N-、B(C6H5)4-、ベンゾトリアゾレート等のアニオンが挙げられる。ハロゲンイオンとしては、例えばCl-、Br-、I-等が挙げられる。
【００８８】
化合物（ＩＩ）の具体例（製品）としては、例えばテトラオクチルホスホニウムブロマイド（東京化成社製）、トリブチルオクチルホスホニウムブロマイド（東京化成社製）、トリブチルドデシルホスホニウムブロマイド（以下、Ｃ１２ＴＢＰと記す；東京化成社製）、トリブチルヘキサデシルホスホニウムブロマイド（以下、Ｃ１６ＴＢＰと記す；東京化成社製）等が挙げられる。
【００８９】
本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法における化合物（ＩＩ）の反応液中の濃度は、通常０．０００１〜１０％である。
【００９０】
本発明において、イミダゾリウム塩としては、以下の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩［以下、化合物（ＩＩＩ）という］が使用される。
【００９１】
【化２３】
0005955220.tif 000024
【００９２】
式中、Ｒ６とＲ８は同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０は、水素原子、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アルケニルを表し、Ｚ−は、１価のアニオンを表す。
【００９３】
Ｒ６において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数８〜２０の直鎖アルキル、炭素数８〜２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数８〜２０の直鎖アルキルとしては、例えば前述の炭素数８〜２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数８〜２０の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数８〜２０の分岐アルキル等が挙げられる。
【００９４】
Ｒ６において、置換若しくは非置換のアルケニルにおけるアルケニルとしては、例えば炭素数８〜２０のアルケニル等が挙げられる。炭素数８〜２０のアルケニルとしては、例えば前述の炭素数８〜２０のアルケニル等が挙げられる。
【００９５】
Ｒ６において、置換アルキル及び置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１−フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００９６】
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数１〜２０の直鎖アルキル、炭素数３〜２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数１〜２０の直鎖アルキルとしては、前述の炭素数１〜２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数３〜２０の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数３〜２０の分岐アルキル等が挙げられる。
【００９７】
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０において、置換若しくは非置換のアルケニルにおけるアルケニルとしては、例えば炭素数２〜２０のアルケニル等が挙げられる。炭素数２〜２０のアルケニルとしては、例えば前述の炭素数２〜２０のアルケニル等が挙げられる。
【００９８】
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０において、置換アルキル及び置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１−フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００９９】
Ｚ−は、１価のアニオンを表す。１価のアニオンとしては、例えばハロゲンイオン、OH-、PF6-、BF4-、CH3CH2OSO3-、(CF3SO2)2N-、(CH3O)2P(=O)O-、B(C6H5)4-、FeCl4-、CF3BF3-、CF3SO3-、(NC)2N-、CH3(OCH2CH2)2OSO3-、CH3CH2OSO3-、HSO4-、4-CH3C6H4SO3-等のアニオンが挙げられる。ハロゲンイオンとしては、例えばCl-、Br-、I-等が挙げられる。
【０１００】
化合物（ＩＩＩ）の具体例（製品）としては、例えば１−メチル−３−オクチルイミダゾリウムブロマイド（東京化成社製）、１−メチル−３−オクチルイミダゾリウムクロライド（東京化成社製）、１−ドデシル−２−メチル−３−ベンジルイミダゾリウムクロライド（以下、Ｃ１２ＭＢＩと記す；和光純薬工業社製）等が挙げられる。
【０１０１】
本発明の測定方法における化合物（ＩＩＩ）の反応液中の濃度は、通常０．０００１〜１０％である。
【０１０２】
本発明において、イソキノリニウム塩としては、以下の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩［以下、化合物（ＩＶ）という］が使用される。
【０１０３】
【化２４】
0005955220.tif 000025
【０１０４】
式中、Ｒ１１は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｗ−は、１価のアニオンを表す。
【０１０５】
Ｒ１１において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数８〜２０の直鎖アルキル、炭素数８〜２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数８〜２０の直鎖アルキルとしては、例えば前述の炭素数８〜２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数８〜２０の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数８〜２０の分岐アルキル等が挙げられる。
【０１０６】
Ｒ１１において、置換若しくは非置換のアルケニルにおけるアルケニルとしては、例えば炭素数８〜２０のアルケニル等が挙げられる。炭素数８〜２０のアルケニルとしては、例えば前述の炭素数８〜２０のアルケニル等が挙げられる。
【０１０７】
Ｒ１１において、置換アルキル及び置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１−フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【０１０８】
Ｗ−は、１価のアニオンを表す。１価のアニオンとしては、例えばハロゲンイオン等のアニオンが挙げられる。ハロゲンイオンとしては、例えばCl-、Br-、I-等が挙げられる。
【０１０９】
化合物（ＩＶ）の具体例（製品）としては、例えばＮ−ラウリルイソキノリニウムクロライド（日油社製）、Ｎ−ラルリルイソキノリニウムブロマイド（日油社製）等が挙げられる。
【０１１０】
本発明の測定方法における化合物（ＩＶ）の反応液中の濃度は、通常０．０００１〜１０％である。
【０１１１】
総ヘモグロビン量は、公知の方法、例えばシアンメトヘモグロビン法、オキシヘモグロビン法、ＳＬＳ−ヘモグロビン法等によって決定することができる。総ヘモグロビン量は、ヘモグロビン含有試料そのもののみならず、ヘモグロビン含有試料に、化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）からなる群より選ばれる少なくとも１種を添加して得られる試料や、ヘモグロビン含有試料に、化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）からなる群より選ばれる少なくとも１種とタンパク質分解酵素とを添加して得られる試料に対して、シアンメトヘモグロビン法、オキシヘモグロビン法、ＳＬＳ−ヘモグロビン法等を適用することによっても決定することができる。
【０１１２】
化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む水性媒体中での、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応は、タンパク質分解酵素が糖化ヘモグロビンに作用し得る条件であれば、いかなる条件下でも行うことができる。ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応は、水性媒体中で行うことが好ましい。水性媒体としては後述の水性媒体等が挙げられる。ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応における反応温度は、通常１０〜５０℃であり、２０〜４０℃が好ましく、反応時間は、通常１分間〜３時間であり、２．５分間〜１時間が好ましい。タンパク質分解酵素の濃度としては、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応が進行する濃度であれば特に制限はなく、通常５０〜２５０００ｋＵ／Ｌであり、好ましくは２５０〜１００００ｋＵ／Ｌである。
【０１１３】
タンパク質分解酵素としては、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに作用し、糖化ヘモグロビンから糖化ペプチドを生成させる酵素であれば特に制限はなく、例えばセリンプロテアーゼ（キモトリプシン、スブチリシン等）、システインプロテアーゼ（パパイン、カスパーゼ等）、アスパラギン酸プロテアーゼ（ペプシン、カテプシンＤ等）、メタロプロテアーゼ（サーモリシン等）、Ｎ−末端スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ等が挙げられる。本発明においては、市販のタンパク質分解酵素も使用することができ、市販品としては例えばプロテアーゼＰ「アマノ」３Ｇ、プロテアーゼＫ「アマノ」（以上、天野エンザイム社製）、アクチナーゼＡＳ、アクチナーゼＥ（以上、科研ファルマ社製）、サーモリシン（大和化成社製）、スミチームMP(新日本化学工業社製)等が挙げられる。
【０１１４】
ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応により、糖化ペプチドを含む反応生成物が生成する。次いで、この反応生成物中の糖化ペプチドはフルクトシルペプチド酸化酵素と反応し、過酸化水素を生成する。糖化ペプチドとフルクトシルペプチド酸化酵素との反応は、水性媒体中で行うことが好ましい。水性媒体としては後述の水性媒体等が挙げられる。糖化ペプチドとフルクトシルペプチド酸化酵素との反応における反応温度は、通常１０〜５０℃であり、２０〜４０℃が好ましく、反応時間は、通常１分間〜３時間であり、２．５分間〜１時間が好ましい。フルクトシルペプチド酸化酵素の濃度としては、糖化ヘモグロビンとフルクトシルペプチド酸化酵素との反応が進行する濃度であれば特に制限はなく、通常０．１〜３０ｋＵ／Ｌであり、好ましくは０．２〜１５ｋＵ／Ｌである。
【０１１５】
本発明に用いられるフルクトシルペプチド酸化酵素としては、糖化ペプチドに作用して過酸化水素を生成させる酵素であれば特に制限はなく、例えば糸状菌由来、酵母由来、放線菌由来、バクテリア由来、古細菌由来のフルクトシルペプチド酸化酵素等が挙げられる。本発明においては、市販のフルクトシルペプチド酸化酵素も使用することができ、市販品としては例えばＦＰＯＸ−ＣＥ（キッコーマン社製）、ＦＰＯＸ−ＥＥ（キッコーマン社製）、ＦＰＯＸ−ＣＥＴ（キッコーマン社製）等が挙げられる。
【０１１６】
生成した過酸化水素の測定方法としては、過酸化水素を測定し得る方法であれば特に制限はなく、例えば電極を用いる方法、過酸化水素測定用試薬を用いる方法等が挙げられ、過酸化水素測定用試薬を用いる方法が好ましい。過酸化水素測定用試薬は、過酸化水素を検出可能な物質に変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素、光（発光）、蛍光等が挙げられ、色素が好ましい。
【０１１７】
検出可能な物質が色素の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と酸化発色型色原体を含む試薬等が挙げられる。酸化発色型色原体としては、酸化カップリング型色原体、ロイコ型色原体等が挙げられ、ロイコ型色原体が好ましい。ロイコ型色原体としては、例えばフェノチアジン系色原体、トリフェニルメタン系色原体、ジフェニルアミン系色原体、ｏ−フェニレンジアミン、ヒドロキシプロピオン酸、ジアミノベンジジン、テトラメチルベンジジン等が挙げられ、フェノチアジン系色原体が好ましい。フェノチアジン系色原体としては、例えば１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、１０−Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ−６７）等が挙げられる。フェノチアジン系色原体の中でも、１０−Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ−６７）が特に好ましい。トリフェニルメタン系色原体としては、例えばＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４’’−トリアミノトリフェニルメタン（ＴＰＭ−ＰＳ）等が挙げられる。ジフェニルアミン系色原体としては、例えばＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。
【０１１８】
検出可能な物質が光（発光）の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と化学発光物質を含む試薬等が挙げられる。化学発光物質としては、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等が挙げられる。
【０１１９】
検出可能な物質が蛍光の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と蛍光物質を含む試薬等が挙げられる。蛍光物質としては、例えば４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリン等が挙げられる。
【０１２０】
（２）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬
本発明の、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬は、タンパク質分解酵素、フルクトシルペプチド酸化酵素、及び、化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む試薬であり、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定方法に用いられる。本発明の測定試薬は、さらに、過酸化水素測定試薬を含んでいてもよい。
【０１２１】
本発明の測定試薬におけるタンパク質分解酵素、フルクトシルペプチド酸化酵素、化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（ＩＶ）及び過酸化水素測定試薬としては、例えば、それぞれ、前述のタンパク質分解酵素、フルクトシルペプチド酸化酵素、化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（ＩＶ）及び過酸化水素測定試薬等が挙げられる。
【０１２２】
本発明の測定試薬におけるタンパク質分解酵素の濃度は、通常５０〜２５０００ｋＵ／Ｌであり、好ましくは２５０〜１００００ｋＵ／Ｌである。本発明の測定試薬におけるフルクトシルペプチド酸化酵素の濃度は、通常０．１〜３０ｋＵ／Ｌであり、好ましくは０．２〜１５ｋＵ／Ｌである。
【０１２３】
本発明の測定試薬における化合物（Ｉ）の濃度は、通常０．０００１〜１０％である。本発明の測定試薬における化合物（ＩＩ）の濃度は、通常０．０００１〜１０％である。本発明の測定試薬における化合物（ＩＩＩ）の濃度は、通常０．０００１〜１０％である。本発明の測定試薬における化合物（ＩＶ）の濃度は、通常０．０００１〜１０％である。
【０１２４】
本発明の測定試薬には、必要に応じて、水性媒体、安定化剤、防腐剤、塩類、干渉物質消去剤、有機溶媒等が含有されてもよい。
水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。
【０１２５】
水性媒体のｐＨは、本発明の糖化ヘモグロビンの測定試薬を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とするｐＨであれば特に制限はなく、例えばｐＨ４〜１０である。水性媒体として緩衝液を用いる場合には、設定するｐＨに応じた緩衝剤を用いることが望ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
【０１２６】
グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。
【０１２７】
緩衝液の濃度は、通常０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌであり、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌが好ましい。
【０１２８】
安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硝酸カルシウム、フェロシアン化カリウム、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等のポリオキシエチレン系界面活性剤等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等があげられる。塩類としては、例えば塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム、硫酸カリウム、炭酸カリウム、ギ酸カリウム、酢酸カリウム等が挙げられる。干渉物質消去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。有機溶媒としては、例えばロイコ型色原体の水性媒体への溶解補助剤としてのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）、ジオキサン、アセトン、メタノール、エタノール等が挙げられる。
【０１２９】
（３）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット
本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬は、キットの形態で保存、流通及び使用されてよい。本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キットは、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法に用いられる。本発明の測定キットとしては、例えば２試薬系のキット、３試薬系のキット等が挙げられ、２試薬系キットが好ましい。
【０１３０】
本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キットは、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定方法を可能とするキットであれば、特に制限はなく、２試薬系キットの場合は、例えばタンパク質分解酵素、及び、化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む第１試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素を含む第２試薬とを含むキットや、タンパク質分解酵素、及び、化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む第１試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素を含む第２試薬とを含み、過酸化水素測定試薬を、第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含むキット等が挙げられる。過酸化水素測定試薬として、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬を用いる場合は、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とは別々の試薬に含まれることが好ましい。すなわち、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とが、それぞれ第１試薬と第２試薬に、又は、第２試薬と第１試薬に含まれることが好ましい。
【０１３１】
本発明の測定キットにおけるタンパク質分解酵素の濃度は、通常１００〜３００００ｋＵ／Ｌであり、好ましくは５００〜１００００ｋＵ／Ｌである。本発明の測定キットにおけるフルクトシルペプチド酸化酵素の濃度は、通常０．５〜１００ｋＵ／Ｌであり、好ましくは１〜５０ｋＵ／Ｌである。
【０１３２】
本発明の測定キットを構成する試薬における化合物（Ｉ）の濃度は、通常０．０００１〜１０％である。本発明の測定キットにおける化合物（ＩＩ）の濃度は、通常０．０００１〜１０％である。本発明の測定キットにおける化合物（ＩＩＩ）の濃度は、通常０．０００１〜１０％である。本発明の測定キットにおける化合物（ＩＶ）の濃度は、通常０．０００１〜１０％である。
【０１３３】
（４）ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法とロイコ型色原体の安定化方法
本発明は、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法に関する。本発明のロイコ型色原体含有水溶液の保存方法により、水溶液中でロイコ型色原体が安定に保存される。本発明において、ロイコ型色原体が水溶液中で安定に保存されるとは、水溶液中でロイコ型色原体が熱に対して安定であるか、又は、光に対して安定であることを意味するが、好ましくは、熱及び光に対して安定であることを意味する。本発明のロイコ型色原体含有水溶液の保存方法においては、化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）からなる群より選ばれる少なくとも１種が、ロイコ型色原体含有水溶液に添加される。化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）としては、前述の化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）が挙げられる。
【０１３４】
本発明のロイコ型色原体含有水溶液の保存方法における化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）の濃度としては、通常０．０００１〜１０％であり、０．０００５〜５％が好ましい。
【０１３５】
本発明のロイコ型色原体の保存方法において、ロイコ型色原体の保存安定性は、ロイコ型色原体含有水溶液の着色により評価することができ、着色が大きい程、すなわち、ロイコ型色原体含有水溶液の吸光度が大きい程、安定性が悪いと評価することができる。一方、ロイコ型色原体含有水溶液の着色が小さい程、すなわち、ロイコ型色原体含有水溶液の吸光度が小さい程、安定性が良いと評価することができる。
【０１３６】
本発明におけるロイコ型色原体含有水溶液とは、ロイコ型色原体が水性媒体中に溶解された水溶液であり、ロイコ型色原体を水性媒体に添加して溶解させることにより調製することができる。ロイコ型色原体が溶解される水性媒体は、ロイコ型色原体が溶解されれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。また、ロイコ型色原体含有水溶液の調製に際して、ロイコ型色原体の水性媒体への溶解補助剤として、有機溶媒を用いることもできる。有機溶媒に溶解させたロイコ型色原体を水性媒体に添加し、ロイコ型色原体を水性媒体に溶解させ、ロイコ型色原体含有水溶液を調製することもできる。有機溶媒としては、ロイコ型色原体を溶解させるものであれば特に制限はなく、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジオキサン、アセトン、メタノール、エタノール等が挙げられる。
【０１３７】
水性媒体のｐＨは、ロイコ型色原体が溶解されるｐＨであれば特に制限はなく、例えばｐＨ４〜１０である。水性媒体として緩衝液を用いる場合には、設定するｐＨに応じた緩衝剤を用いることが望ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えば前述の緩衝剤等が挙げられる。
【０１３８】
緩衝液の濃度は、ロイコ型色原体が溶解される濃度であれば特に制限はなく、通常０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌであり、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌが好ましい。
【０１３９】
本発明におけるロイコ型色原体としては、例えば前述のロイコ型色原体等が挙げられる。
【０１４０】
さらに、本発明は、ロイコ型色原体の安定化方法に関する。本発明におけるロイコ型色原体の安定化とは、ロイコ型色原体含有水溶液中のロイコ型色原体が、熱に対して安定化されるか、又は、光に対して安定化されることを意味するが、好ましくは、熱及び光に対して安定化されることを意味する。ここで、ロイコ型色原体の安定化は、ロイコ型色原体含有水溶液の着色により評価することができ、着色が大きい程、すなわち、ロイコ型色原体含有水溶液の吸光度が大きい程、安定性が悪いと評価する。一方、ロイコ型色原体含有水溶液の着色が小さい程、すなわち、ロイコ型色原体含有水溶液の吸光度が小さい程、安定性が良いと評価する。
【０１４１】
本発明のロイコ型色原体の安定化方法においては、ロイコ型色原体を化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む水溶液中で共存させる。本発明のロイコ型色原体の安定化方法に用いられる化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）としては、前述の化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）が挙げられる。
【０１４２】
本発明の安定化方法において用いられるロイコ型色原体及びロイコ型色原体含有水溶液としては、前述のロイコ型色原体の保存方法におけるロイコ型色原体及びロイコ型色原体含有水溶液が挙げられる。本発明においてロイコ型色原体含有水溶液中のロイコ型色原体の濃度は、ロイコ型色原体が水性媒体に溶解される濃度であれば特に制限はされないが、通常０．０００１〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌであり、０．０００５〜１．０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。
【０１４３】
本発明において水溶液中にロイコ型色原体と共存させる化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）の濃度としては、通常０．０００１〜１０％であり、０．０００５〜５％が好ましい。
【０１４４】
本発明におけるロイコ型色原体の熱に対する安定性を測定する方法は、熱に対するロイコ型色原体の安定性を測定することができれば特に制限はなく、例えば、ロイコ型色原体を含有する水溶液を、５℃または３０℃で保存した後の水溶液の着色を吸光度計により測定する方法等が挙げられる。
【０１４５】
また、本発明におけるロイコ型色原体の光による安定性を測定する方法は、光に対するロイコ型色原体の安定性を測定することができれば特に制限はなく、例えば、ロイコ型色原体を含有する水溶液に１５時間光を照射し、照射後の水溶液の着色を吸光度計により測定する方法等が挙げられる。
【０１４６】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
尚、本実施例、比較例及び試験例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を使用した。
【０１４７】
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（同仁化学研究所社製）、ＡＤＡ（同仁化学研究所社製）、ＭＥＳ（同仁化学研究所社製）、酢酸カルシウム１水和物（関東化学社製）、塩化カルシウム２水和物（和光純薬工業社製）、ＤＡ−６７（和光純薬工業社製）、１−ドデシルピリジニウムクロライド（Ｃ１２ｐｙ）（ピリジニウム塩；東京化成社製）、１−セチルピリジニウムクロライド（Ｃ１６ｐｙ）（ピリジニウム塩；東京化成社製）、ドデシルトリブチルホスホニウムクロライド（Ｃ１２ＴＢＰ）（ホスホニウム塩；東京化成社製）、ヘキサデシルトリブチルホスホニウムクロライド（Ｃ１６ＴＢＰ）（ホスホニウム塩；東京化成社製）、１−ドデシル−２−メチル−３−ベンジルイミダゾリウムクロライド（Ｃ１２ＭＢＩ）（イミダゾリウム塩；和光純薬工業社製）、Ｎ−ラウリルイソキノリニウムクロライド（フィレットＱ）（イソキノリニウム塩；日油社製）、サーモリシン（タンパク質分解酵素；大和化成社製）、アクチナーゼＡＳ（タンパク質分解酵素；科研ファルマ社製）、ＦＰＯＸ−ＣＥ（フルクトシルペプチド酸化酵素；キッコーマン社製）、ペルオキシダーゼ（東洋紡績社製）。
【実施例１】
【０１４８】
以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．０）          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１２ｐｙ                              ２．０ｇ／Ｌ
酢酸カルシウム１水和物                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                            １２００ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                              ２０μｍｏｌ／Ｌ
第二試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                    ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                          １２ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                        １２０ｋＵ／Ｌ
【実施例２】
【０１４９】
以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．０）          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１６ｐｙ                              ０．３５ｇ／Ｌ
酢酸カルシウム１水和物                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                            １２００ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                              ２０μｍｏｌ／Ｌ
第二試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                    ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                          １２ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                        １２０ｋＵ／Ｌ
【実施例３】
【０１５０】
以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．０）          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１２ＴＢＰ                            ０．８ｇ／Ｌ
酢酸カルシウム１水和物                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                            １２００ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                              ２０μｍｏｌ／Ｌ
第二試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                    ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                          １２ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                        １２０ｋＵ／Ｌ
【実施例４】
【０１５１】
以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．０）          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１６ＴＢＰ                            ０．２ｇ／Ｌ
酢酸カルシウム１水和物                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                            １２００ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                              ２０μｍｏｌ／Ｌ
第二試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                    ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                          １２ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                        １２０ｋＵ／Ｌ
【実施例５】
【０１５２】
以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．０）          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１２ＭＢＩ                            ０．５ｇ／Ｌ
酢酸カルシウム１水和物                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                            １２００ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                              ２０μｍｏｌ／Ｌ
第二試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                    ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                          １２ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                        １２０ｋＵ／Ｌ
【実施例６】
【０１５３】
以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．０）          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
フィレットＱ                            ０．５ｇ／Ｌ
酢酸カルシウム１水和物                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                            １２００ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                              ２０μｍｏｌ／Ｌ
第二試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                    ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                          １２ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                        １２０ｋＵ／Ｌ【０１５４】
比較例１
以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．０）          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
酢酸カルシウム１水和物                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                            １２００ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                              ２０μｍｏｌ／Ｌ
第二試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                    ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                          １２ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                        １２０ｋＵ／Ｌ
【実施例７】
【０１５５】
ＨｂＡ１ｃ測定用キットとして、実施例１のキットを、試料として、ヒトの血液を遠心分離して得られる血球を脱イオン水で希釈して溶血させて調製され、ＨｂＡ１ｃ測定の基準法であるＫＯ５００法と、ヘモグロビン測定法の１つであるＳＬＳ−ヘモグロビン法とからＨｂＡ１ｃ濃度が２．７μｍｏｌ／Ｌ、３．４μｍｏｌ／Ｌ、４．０μｍｏｌ／Ｌ、５．０μｍｏｌ／Ｌ、６．８μｍｏｌ／Ｌと値付されている溶血試料を用いて、以下の手順により、各試料に対する反応吸光度を測定した。【０１５６】
反応セルへ、各試料９．６μＬと、実施例１のキットの第一試薬１２０μＬとを添加し、３７℃で５分間加温し（第一反応）、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、次いでこの反応液に第二試薬４０μＬを添加しさらに３７℃で５分間加温し（第二反応）、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、Ｅ２からＥ１を差し引き、吸光度差△Ｅを算出した。各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度と△Ｅとの関係を第１図に示す。【０１５７】
比較例２
実施例７における実施例１のキットの代わりに、比較例１のキットを用いる以外は実施例７と同様の方法により、各試料に対する反応吸光度を算出した。
第１図に示す通り、Ｃ１２ｐｙを含まない比較例１のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出されないのに対して、Ｃ１２ｐｙを含む実施例１のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出された。従って、実施例１のキットを用いることにより、試料中のＨｂＡ１ｃを測定できることが明らかとなった。
【実施例８】
【０１５８】
実施例７における実施例１のキットの代わりに、実施例２のキットを用いる以外は実施例７と同様の方法により、各試料に対する反応吸光度を算出した。各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度と△Ｅとの関係を第２図に示す。
第２図に示す通り、Ｃ１６ｐｙを含まない比較例１のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出されないのに対して、Ｃ１６ｐｙを含む実施例２のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出された。従って、実施例２のキットを用いることにより、試料中のＨｂＡ１ｃを測定できることが明らかとなった。
【実施例９】
【０１５９】
実施例７における実施例１のキットの代わりに、実施例３のキットを用いる以外は実施例７と同様の方法により、各試料に対する反応吸光度を算出した。各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度と△Ｅとの関係を第３図に示す。
第３図に示す通り、Ｃ１２ＴＢＰを含まない比較例１のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出されないのに対して、Ｃ１２ＴＢＰを含む実施例３のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出された。従って、実施例３のキットを用いることにより、試料中のＨｂＡ１ｃを測定できることが明らかとなった。
【実施例１０】
【０１６０】
実施例７における実施例１のキットの代わりに、実施例４のキットを用いる以外は実施例７と同様の方法により、各試料に対する反応吸光度を算出した。各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度と△Ｅとの関係を第４図に示す。
第４図に示す通り、Ｃ１６ＴＢＰを含まない比較例１のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出されないのに対して、Ｃ１６ＴＢＰを含む実施例４のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出された。従って、実施例４のキットを用いることにより、試料中のＨｂＡ１ｃを測定できることが明らかとなった。
【実施例１１】
【０１６１】
実施例７における実施例１のキットの代わりに、実施例５のキットを用いる以外は実施例７と同様の方法により、各試料に対する反応吸光度を算出した。各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度と△Ｅとの関係を第５図に示す。
第５図が示す通り、Ｃ１２ＭＢＩを含まない比較例１のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出されないのに対して、Ｃ１２ＭＢＩを含む実施例５のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出された。従って、実施例５のキットを用いることにより、試料中のＨｂＡ１ｃを測定できることが明らかとなった。
【実施例１２】
【０１６２】
実施例７における実施例１のキットの代わりに、実施例６のキットを用いる以外は実施例７と同様の方法により、各試料に対する反応吸光度を算出した。各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度と△Ｅとの関係を第６図に示す。
第６図が示す通り、フィレットＱを含まない比較例１のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出されないのに対して、フィレットＱを含む実施例６のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出された。従って、実施例６のキットを用いることにより、試料中のＨｂＡ１ｃを測定できることが明らかとなった。
【実施例１３】
【０１６３】
以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１６ｐｙ                              ０．３５ｇ／Ｌ
酢酸カルシウム１水和物                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
アクチナーゼＡＳ                        ４５０ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                              ２０μｍｏｌ／Ｌ
第二試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                    ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                          １２ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                        １２０ｋＵ／Ｌ【０１６４】
比較例３
以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
酢酸カルシウム１水和物                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
アクチナーゼＡＳ                        ４５０ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                              ２０μｍｏｌ／Ｌ
第二試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                    ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                          １２ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                        １２０ｋＵ／Ｌ
【実施例１４】
【０１６５】
ＨｂＡ１ｃ測定用キットとして、実施例１３のキットを、試料として、ヒトの血液を遠心分離して得られる血球を脱イオン水で希釈して溶血させて調製され、「デタミナーＬ  ＨｂＡ１ｃ」（協和メデックス社製）を用いる免疫測定法と、ヘモグロビン測定法の１つであるＳＬＳ−ヘモグロビン法とからＨｂＡ１ｃ濃度が２．５μｍｏｌ／Ｌ、３．７μｍｏｌ／Ｌ、４．０μｍｏｌ／Ｌ、４．７μｍｏｌ／Ｌ、６．３μｍｏｌ／Ｌと値付されている溶血試料を用いて、以下の手順により、各試料に対する反応吸光度を測定した。
反応セルへ、各試料９．６μＬと、実施例１のキットの第一試薬１２０μＬとを添加し、３７℃で５分間加温し（第一反応）、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、次いでこの反応液に第二試薬４０μＬを添加しさらに３７℃で５分間加温し（第二反応）、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、Ｅ２からＥ１を差し引き、吸光度差△Ｅを算出した。各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度と△Ｅとの関係を第７図に示す。【０１６６】
比較例４
実施例１４における実施例１３のキットの代わりに、比較例３のキットを用いる以外は実施例１４と同様の方法により、各試料に対する反応吸光度を算出した。
第７図に示す通り、Ｃ１６ｐｙを含まない比較例３のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出されないのに対して、Ｃ１６ｐｙを含む実施例１３のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出された。従って、実施例１３のキットを用いることにより、試料中のＨｂＡ１ｃを測定できることが明らかとなった。
【実施例１５】
【０１６７】
以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１２ｐｙ                              １．６ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                            １２００ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                              ２０μｍｏｌ／Ｌ
第二試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                    ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                          １２ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                        １２０ｋＵ／Ｌ
【実施例１６】
【０１６８】
以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１２ＴＢＰ                            ０．８ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                            １２００ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                              ２０μｍｏｌ／Ｌ
第二試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                    ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                          １２ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                        １２０ｋＵ／Ｌ
【実施例１７】
【０１６９】
以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１２ＭＢＩ                            ０．９ｇ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物                  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                            １２００ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                              ２０μｍｏｌ／Ｌ
第二試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                    ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                          １２ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                        １２０ｋＵ／Ｌ
【実施例１８】
【０１７０】
ＨｂＡ１ｃ測定用キットとして、実施例１５のキットを、試料として、糖尿病が疑われる１０名の被験者由来の全血を用いて、以下の手順により、各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度（量）の総ヘモグロビン濃度（量）に対する割合［ＨｂＡ１ｃ（％）］を決定した。【０１７１】
（１）総ヘモグロビン濃度決定のための検量線の作成
測定キットとして、総ヘモグロビン測定用キットであるヘモグロビンＢ−テストワコー（ＳＬＳ−ヘモグロビン法）（和光純薬工業社製）を用いて、検体として、ヘモグロビンＢ−テストワコーに付属の標準品（ヘモグロビン濃度：１５．３ｍｇ／ｍＬ）を用いて測定を行い、ヘモグロビン濃度と吸光度との関係を示す検量線を作成した。【０１７２】
（２）ＨｂＡ１ｃ濃度決定のための検量線の作成
ラテックス免疫凝集法によりＨｂＡ１ｃ濃度が２．７７μｍｏｌ／Ｌ、６．３３μｍｏｌ／Ｌと値付けされている２つの血球画分について、実施例１５のＨｂＡ１ｃ測定用キットを用いて測定し、各血球画分に対する吸光度を測定した。当該血球画分の代わりに生理食塩水を用いて、生理食塩水に対するＨｂＡ１ｃ濃度を測定した。当該血球画分に対するそれぞれの吸光度から、生理食塩水に対する吸光度を差し引いて算出した値を、当該血球画分に対するブランク補正吸光度とした。当該血球画分に対するブランク補正吸光度と、生理食塩水に対するブランク補正吸光度（０ Ａｂｓ）とから、ＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。【０１７３】
（３）各血球画分におけるヘモグロビン濃度の決定
各試料に対して、２５℃、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、血球画分を得た。各血球画分について、ヘモグロビンＢ−テストワコーを用いて測定し、得られた測定値と（１）の検量線とから、各血球画分中のヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を決定した。【０１７４】
（４）各血球画分におけるＨｂＡ１ｃ濃度の決定
各血球画分について、本発明の測定キットを用いて測定し、得られた測定値と（２）の検量線とから、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を決定した。【０１７５】
（５）ＨｂＡ１ｃ（％）（＝ＨｂＡ１ｃ濃度のヘモグロビン濃度に対する割合）の決定
上記（３）で決定した各血球画分におけるヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と、上記（４）で決定した各血球画分におけるＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）とから、以下の式により、日本糖尿病学会（Japan Diabetes Society；ＪＤＳ）値のＨｂＡ１ｃ（％）を算出した。【０１７６】
【数１】
0005955220.tif 000026
【０１７７】
（６）同一血球画分中のＨｂＡ１ｃ（％）の免疫測定法での決定
上記（５）でのＨｂＡ１ｃ（％）の決定に使用した血球画分と同一の血球画分を用いて、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ（％）を、デタミナーＬ  ＨｂＡ１ｃ（協和メデックス社製）を用いる免疫測定法により、デタミナーＬ  ＨｂＡ１ｃの添付文書に記載の方法に従って決定した。【０１７８】
（７）本発明の測定方法と免疫測定法との相関
本発明の測定方法を用いて、上記（５）で決定したＨｂＡ１ｃ（％）と、免疫測定法を用いて、上記（６）で決定したＨｂＡ１ｃ（％）とから、本発明の測定方法と免疫測定法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。
その結果、両測定法間の相関係数が０．９９４となり、両測定法間に良好な相関関係が認められた。従って、実施例１５のキットを用いる本発明の測定方法により、試料中のＨｂＡ１ｃを正確に測定できることが明らかとなった。
【実施例１９】
【０１７９】
実施例１８における実施例１５のキットの代わりに、実施例１６のキットを用いて同様の手順により、デタミナーＬ  ＨｂＡ１ｃ（協和メデックス社製）を用いた測定との間の相関係数を決定した結果、相関係数が０．９８４となり、両測定法間に良好な相関関係が認められた。従って、実施例１６のキットを用いる本発明の測定方法により、試料中のＨｂＡ１ｃを正確に測定できることが明らかとなった。
【実施例２０】
【０１８０】
実施例１８における実施例１５のキットの代わりに、実施例１７のキットを用いて同様の手順により、デタミナーＬ  ＨｂＡ１ｃ（協和メデックス社製）を用いた測定との間の相関係数を決定した結果、相関係数が０．９４９となり、両測定法間に良好な相関関係が認められた。従って、実施例１７のキットを用いる本発明の測定方法により試料中のＨｂＡ１ｃを正確に測定できることが明らかとなった。
【実施例２１】
【０１８１】
（１）ＤＡ−６７含有水溶液、及び、ＤＡ−６７の安定性測定用試料の調製
以下の組成からなるＤＡ−６７含有水溶液を調製した。
＜ＤＡ−６７含有水溶液＞
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                              ２０μｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤（第１表参照）                ０．５％
上記組成のＤＡ−６７含有水溶液を５℃で７日間保存したもの、及び、３０℃で７日間保存したものをＤＡ−６７安定性測定用試料として用いた。【０１８２】
（２）ＤＡ−６７安定性測定用試薬の調製
以下の組成からなるＤＡ−６７安定性測定用試薬を調製した。
＜ＤＡ−６７安定性測定用試薬＞
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ                                  ０．００５％【０１８３】
（３）ＤＡ−６７含有水溶液中のＤＡ−６７の安定性の評価
調製直後のＤＡ−６７含有水溶液３０μＬに（２）で調製したＤＡ−６７安定化測定用試薬１２０μＬを添加し、３７℃で５分間加温した後の溶液の吸光度（Ｅ直後）を、主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで日立７１７０Ｓ形自動分析装置にて測定した。調製直後のＤＡ−６７含有水溶液の代わりに、（２）のＤＡ−６７安定化測定用試薬を用いて同様の測定を行い、吸光度（Ｅブランク）を測定した。Ｅ直後からＥブランクを差し引き、調製直後のＤＡ−６７含有水溶液に対する吸光度（△Ｅ直後）とした。【０１８４】
同様に、５℃で７日間保存したＤＡ−６７含有水溶液、及び、３０℃で７日間保存したＤＡ−６７含有水溶液を試料として用いて測定を行い、５℃で７日間保存したＤＡ−６７含有水溶液に対する吸光度（△Ｅ５℃）、及び、３０℃で７日間保存したＤＡ−６７含有水溶液に対する吸光度（△Ｅ３０℃）を測定した。【０１８５】
測定した△Ｅ５℃、△Ｅ３０℃それぞれから△Ｅ直後を差し引いた値を、それぞれ△Ｅ１、△Ｅ２とし、ＤＡ−６７の安定性の指標とした。その結果を第１表に示す。値が０に近い程、水溶液中での着色が抑制され、ＤＡ−６７が水溶液中で安定に保存されること、すなわち、水溶液中でＤＡ−６７が安定化されることを示している。【０１８６】
【表１】
0005955220.tif 000027
【０１８７】
第１表に示される通り、化合物（Ｉ）（Ｃ１２ｐｙ、Ｃ１６ｐｙ）を含む水溶液では、化合物（Ｉ）を含有しない場合と比較して、５℃でも３０℃においても保存後の着色が顕著に抑制されていた。このことから、化合物（Ｉ）を含む水溶液中のＤＡ−６７が熱に対して安定であり、ＤＡ−６７含有水溶液が化合物（Ｉ）により安定に保存され、ＤＡ−６７が化合物（Ｉ）により水溶液中で安定化されることが明らかとなった。【０１８８】
同様に、化合物（ＩＩ）（Ｃ１２ＴＢＰ、Ｃ１６ＴＢＰ）を含む水溶液では、化合物（ＩＩ）を含有しない場合と比較して、５℃でも３０℃においても保存後の着色が顕著に抑制されていた。このことから、化合物（ＩＩ）を含む水溶液中のＤＡ−６７が熱に対して安定であり、ＤＡ−６７含有水溶液が化合物（ＩＩ）により安定に保存され、ＤＡ−６７が化合物（ＩＩ）により水溶液中で安定化されることが明らかとなった。
【実施例２２】
【０１８９】
実施例２１で調製したＤＡ−６７含有水溶液に対して、１１００ルクスの光を１５時間照射し、光によるＤＡ−６７の安定性を評価した。光照射後のＤＡ−６７含有水溶液を試料として用いて、実施例２１と同様の方法を行い、光照射後のＤＡ−６７含有水溶液に対する吸光度△Ｅ３を測定した。測定結果を第２表に示す。【０１９０】
【表２】
0005955220.tif 000028
【０１９１】
第２表に示される通り、化合物（Ｉ）（Ｃ１２ｐｙ、Ｃ１６ｐｙ）を含む水溶液では、化合物（Ｉ）を含有しない場合と比較して、光照射による着色が顕著に抑制されていた。このことから、化合物（Ｉ）を含む水溶液中のＤＡ−６７が光に対して安定であり、ＤＡ−６７含有水溶液が化合物（Ｉ）により安定に保存され、ＤＡ−６７が化合物（Ｉ）により水溶液中で安定化されることが明らかとなった。【０１９２】
同様に、化合物（ＩＩ）（Ｃ１２ＴＢＰ、Ｃ１６ＴＢＰ）を含む水溶液では、化合物（ＩＩ）を含有しない場合と比較して、光照射による着色が顕著に抑制されていた。このことから、化合物（ＩＩ）を含む水溶液中のＤＡ−６７が光に対して安定であり、ＤＡ−６７含有水溶液が化合物（ＩＩ）により安定に保存され、ＤＡ−６７が化合物（ＩＩ）により水溶液中で安定化されることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１９３】
本発明により、糖尿病の診断に有用な糖化ヘモグロビンの測定等に有用な、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法、測定試薬、及び、測定キット、並びに、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法、及び、ロイコ型色原体の安定化方法が提供される。
【図１】
0005955220.tif 000041
【図２】
0005955220.tif 000042
【図３】
0005955220.tif 000043
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0005955220.tif 000047