(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種糖タンパク質の製造方法であって、
（ａ）異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸分子と、該異種糖タンパク質をコードする核酸分子とを含むピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）宿主細胞を準備し、但し、当該宿主細胞において、内在性ＯＴａｓｅ複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現され、
（ｂ）該異種糖タンパク質を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、該異種糖タンパク質を産生させることを含み、
該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼがリーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質である、前記製造方法。
【請求項２】
該宿主細胞により産生された該異種糖タンパク質の少なくとも７０％が完全占拠Ｎ−グリコシル化部位を有する、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
該宿主細胞が、１以上の哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている、請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
該異種糖タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）；サイトカイン；インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンω；顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）；顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；凝固因子；因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸおよびヒトプロテインＣ；アンチトロンビンＩＩＩ；トロンビン；可溶性ＩｇＥ受容体α鎖；免疫グロブリン；ＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＧ融合体およびＩｇＭ；免疫接着物質および他のＦｃ融合タンパク質；可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質；ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質；インターロイキン；ウロキナーゼ；キマーゼ；尿素トリプシンインヒビター；ＩＧＦ結合性タンパク質；上皮増殖因子；成長ホルモン放出因子；アネキシンＶ融合タンパク質；アンジオスタチン；血管内皮増殖因子−２；骨髄前駆体抑制因子−１；オステオプロテジェリン；α−１−アンチトリプシン；α−フェトプロテイン；ＤＮアーゼＩＩ；ヒトプラスミノーゲンのクリングル３；グルコセレブロシダーゼ；ＴＮＦ結合タンパク質１；濾胞刺激ホルモン；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ；膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド；グルカゴン様タンパク質１；またはＩＬ−２受容体アゴニストである、請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
該異種タンパク質が抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＲＳＶ（呼吸器性シンシチウムウイルス）抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＣＤ３受容体抗体、抗ＣＤ４１  ７Ｅ３抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＥＧＦ受容体抗体または抗ＣＤ２０抗体である、請求項１記載の製造方法。
【請求項６】
該ピチア属種が、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）およびピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ））からなる群から選択される、請求項１記載の製造方法。
【請求項７】
該宿主細胞がピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）のｏｃｈ１突然変異体である、請求項１記載の製造方法。
【請求項８】
糖タンパク質組成物における糖タンパク質上のＮ−グリコシル化部位の少なくとも７０％がＮ−グリカンで占拠されている、該糖タンパク質組成物の製造方法であって、
（ａ）異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸分子と、該糖タンパク質をコードする核酸分子とを含むピチア属種宿主細胞を準備し、但し、当該宿主細胞において、内在性ＯＴａｓｅ複合体をコードする宿主細胞遺伝子が発現され、
（ｂ）該糖タンパク質を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、該組成物における糖タンパク質上のＮ−グリコシル化部位の少なくとも７０％がＮ−グリカンで占拠されている該組成物を産生させることを含み、
該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼがリーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質である、前記製造方法。
【請求項９】
該異種糖タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）；サイトカイン；インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンω；顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）；顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；凝固因子；因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸおよびヒトプロテインＣ；アンチトロンビンＩＩＩ；トロンビン；可溶性ＩｇＥ受容体α鎖；免疫グロブリン；ＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＧ融合体およびＩｇＭ；免疫接着物質および他のＦｃ融合タンパク質；可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質；ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質；インターロイキン；ウロキナーゼ；キマーゼ；尿素トリプシンインヒビター；ＩＧＦ結合性タンパク質；上皮増殖因子；成長ホルモン放出因子；アネキシンＶ融合タンパク質；アンジオスタチン；血管内皮増殖因子−２；骨髄前駆体抑制因子−１；オステオプロテジェリン；α−１−アンチトリプシン；α−フェトプロテイン；ＤＮアーゼＩＩ；ヒトプラスミノーゲンのクリングル３；グルコセレブロシダーゼ；ＴＮＦ結合タンパク質１；濾胞刺激ホルモン；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ；膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド；グルカゴン様タンパク質１；またはＩＬ−２受容体アゴニストである、請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
該異種タンパク質が抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＲＳＶ（呼吸器性シンシチウムウイルス）抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＣＤ３受容体抗体、抗ＣＤ４１  ７Ｅ３抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＥＧＦ受容体抗体または抗ＣＤ２０抗体である、請求項８記載の製造方法。
【請求項１１】
該ピチア属種宿主細胞がピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）およびピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ））からなる群から選択される、請求項８記載の製造方法。
【請求項１２】
（ａ）少なくとも１つの異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第１核酸分子と、
（ｂ）異種糖タンパク質をコードする第２核酸分子とを含むピチア属種宿主細胞であって、
該宿主細胞が、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする遺伝子を発現し、該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼがリーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質である、前記ピチア属種宿主細胞。
【請求項１３】
該宿主細胞が、１以上の哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている、請求項１２記載のピチア属種宿主細胞。
【請求項１４】
該異種糖タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）；サイトカイン；インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンω；顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）；顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；凝固因子；因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸおよびヒトプロテインＣ；アンチトロンビンＩＩＩ；トロンビン；可溶性ＩｇＥ受容体α鎖；免疫グロブリン；ＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＧ融合体およびＩｇＭ；免疫接着物質および他のＦｃ融合タンパク質；可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質；ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質；インターロイキン；ウロキナーゼ；キマーゼ；尿素トリプシンインヒビター；ＩＧＦ結合性タンパク質；上皮増殖因子；成長ホルモン放出因子；アネキシンＶ融合タンパク質；アンジオスタチン；血管内皮増殖因子−２；骨髄前駆体抑制因子−１；オステオプロテジェリン；α−１−アンチトリプシン；α−フェトプロテイン；ＤＮアーゼＩＩ；ヒトプラスミノーゲンのクリングル３；グルコセレブロシダーゼ；ＴＮＦ結合タンパク質１；濾胞刺激ホルモン；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ；膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド；グルカゴン様タンパク質１；またはＩＬ−２受容体アゴニストである、請求項１２記載のピチア属種宿主細胞。
【請求項１５】
該異種糖タンパク質が抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＲＳＶ（呼吸器性シンシチウムウイルス）抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＣＤ３受容体抗体、抗ＣＤ４１  ７Ｅ３抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＥＧＦ受容体抗体または抗ＣＤ２０抗体である、請求項１２記載のピチア属種宿主細胞。
【請求項１６】
該ピチア属種宿主細胞が、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）およびピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ））からなる群から選択される、請求項１２記載のピチア属種宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（１）発明の分野
本発明は、異種糖タンパク質を発現するように遺伝的に操作され本発明により修飾された組換え宿主細胞において産生される該異種糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠を、本発明により修飾されていない組換え宿主細胞において産生される治療用糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠と比べて増加させるための方法に関する。特に、本発明は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ［これは、特定の実施形態においては、酵母オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体の少なくとも１つの必須タンパク質の突然変異の致死表現型を、宿主細胞の内在性ＯＴａｓｅ複合体の存在下、機能的に抑制しうる］を過剰発現する組換え宿主細胞、および異種糖タンパク質を製造するためのこれらの宿主細胞の使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（２）関連技術の説明
組換えヒトタンパク質の製造は、それが可能となったことにより、ヒトに対する医療に大きな進歩をもたらしており、依然として、薬物発見の、活発な領域である。多数の治療用タンパク質は、適切な構造−機能活性およびその後のヒト血清中での安定性を確保するためには、該タンパク質の特定のアスパラギン残基へのグリカンの翻訳後付加（Ｎ−グリコシル化）を要する。ヒトにおける治療用途の場合、糖タンパク質はヒト様Ｎ−グリコシル化を要する。ヒト様糖タンパク質プロセシングを模擬しうる哺乳類細胞系（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト網膜細胞）は、低いタンパク質力価、長い発酵時間、不均一な産物および継続的なウイルス混入を含む幾つかの欠点を有する。したがって、短い発酵時間で高いタンパク質力価を与えるだけでなくヒト様糖タンパク質をも産生しうる発現系を使用することが望ましい。
【０００３】
真菌宿主、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、またはメチロトローフ酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）は治療用タンパク質の発現に関する顕著な利点を有する。例えば、それらは大量の内在性タンパク質を分泌せず、異種タンパク質を産生するための強力な誘導プロモーターが利用可能であり、それらは、動物血清の使用を伴わない規定化学培地内で増殖可能であり、それらは高い力価の組換えタンパク質を産生しうる（Ｃｒｅｇｇら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２４：４５−６６（２０００））。しかし、酵母において発現されるグリコシル化タンパク質は、一般に、付加的マンノース糖を含有していて、「高マンノース」グリカンを与える。これらの高マンノースグリカンは、ある個体に投与された場合に有害な応答を引き起こす可能性があり、酵母は、ヒトにおける使用のための治療用糖タンパク質を製造するためには、一般に使用されない。一方、米国公開出願第２００４０２３００４２号、第２００５０２０８６１７号、第２００４０１７１８２６号、第２００５０２０８６１７号および第２００６０２８６６３７号に記載されている方法に加えて、ヒト様Ｎ−グリカンを製造するために酵母を遺伝的に操作するための方法が米国特許第７，０２９，８７２号および第７，４４９，３０８号に記載されている。これらの方法は、酵母型Ｎ−グリカンではなく主としてヒト様複合体またはハイブリッドＮ−グリカンを含有する治療用糖タンパク質を産生しうる組換え酵母を構築するために用いられている。
【０００４】
遺伝的に操作された酵母は、哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生しうるが、糖タンパク質上のＮ−グリカン結合部位の占拠は多種多様であり、哺乳類細胞において産生された糖タンパク質におけるこれらの同じ部位の占拠より一般に低いことが判明している。これは、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において産生された種々の組換え抗体で観察されている。しかし、Ｎ−グリカン結合部位の占拠のばらつきは哺乳類細胞においても観察されている。例えば、Ｇａｗｌｉｔｚｅｋら，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ−ｏｃｃｕｐａｎｃｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．１０３：１１６４−１１７５（２００９）は、Ｎ−グリコシル化部位占拠が、ＣＨＯ細胞内で産生された個々の糖タンパク質の個々の部位によって変化しうること、およびこれらの部位における占拠を制御するために増殖培地における修飾が行われうることを開示している。国際公開出願番号ＷＯ  ２００６１０７９９０は、ドリコール結合オリゴ糖合成経路を用いる真核細胞のタンパク質Ｎ−グリコシル化を改善するための方法を開示している。Ｎ−グリコシル化部位占拠の制御はＪｏｎｅｓら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１７２６：１２１−１３７（２００５）に概説されている。しかし、組換え宿主細胞において産生される治療用タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠を増加させるための方法が尚も必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
発明の簡潔な概要
本発明は、本明細書に開示されているとおりに修飾された宿主細胞において産生される糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠が、本明細書に開示されているとおりには修飾されていない宿主細胞において産生される同じ糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠と比べて増加している治療用糖タンパク質の、本明細書に開示されているとおりに修飾された組換え宿主細胞における製造方法を提供する。例えば、本明細書に開示されているとおりに修飾された酵母宿主細胞においては、それにおいて産生される糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠は、組換え哺乳類またはヒト細胞において産生される同じ糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠と同じか又はより類似しているであろう。
【０００６】
組換え宿主細胞において産生される糖タンパク質上のＮ−グリコシル化部位占拠を増加させるために、該宿主細胞内での該糖タンパク質の発現の前または該発現と同時に、１以上の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）を該組換え宿主細胞において過剰発現させる。特定の態様においては、該異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼの少なくとも１つは、内在性宿主細胞ヘテロオリゴマー性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体の１以上の必須サブユニットの致死性突然変異を機能的に相補しうる。リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質は、ＳＴＴ３遺伝子座ならびにサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるＷＢＰ１、ＯＳＴ１、ＳＷＰ１およびＯＳＴ２から選択される少なくとも１つの遺伝子座における致死性突然変異を抑制することが示されている異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼの一例である（Ｎａｓｅｂら，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １９：３７５８−３７６８（２００８））。一般に、前記の１以上の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼを、宿主細胞の内在性ＳＴＴ３タンパク質を含む宿主細胞の内在性ＯＴａｓｅ複合体を含むタンパク質の存在下、構成的または誘導的に過剰発現させる。異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ遺伝子をコードする発現カセットは宿主細胞ゲノム内のいずれかの部位内に組込まれることが可能であり、あるいは宿主細胞の染色体外腔内に位置することが可能である（すなわち、自律複製遺伝的要素、例えばプラスミド、ウイルス、２μｍプラスミド、ミニ染色体など）。
【０００７】
特定の実施形態においては、該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼの１以上はリーシュマニア属種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐ．）ＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｃタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはそれらの組合せである。特定の実施形態においては、前記の１以上の単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼはリーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｃタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはそれらの組合せである。該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸分子は、宿主細胞ＳＴＴ３タンパク質を含む宿主細胞のＯＴａｓｅ複合体を含むタンパク質をコードする内在性遺伝子の発現の代わりに過剰発現されるものではない。そうではなく、該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸分子は、宿主細胞の内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする遺伝子の発現（これは、宿主細胞のＳＴＴ３をコードする内在性遺伝子の発現を含む）の存在下、構成的または誘導的に過剰発現される。単一サブユニットＯＴａｓｅをコードする各発現カセットは宿主細胞ゲノム内のいずれかの部位内に組込まれることが可能であり、あるいは宿主細胞の染色体外腔内に位置することが可能である（すなわち、自律複製遺伝的要素、例えばプラスミド、ウイルス、２μｍプラスミド、ミニ染色体など）。
【０００８】
本発明は、哺乳類またはヒト様複合Ｎ−グリカンを産生するように遺伝的に操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を用いて本明細書中に例示されているが、本発明は、他の酵母または糸状菌宿主細胞、特に、酵母または糸状菌宿主細胞において産生される糖タンパク質の全体的なＮ−グリコシル化部位占拠を改善するために、哺乳類またはヒト様複合体またはハイブリッドＮ−グリカンを産生するように遺伝的に操作された酵母または糸状菌にも適用されうる。更に詳細な態様においては、宿主細胞は、野生型または内在性宿主細胞Ｎ−グリコシル化パターン、例えば高マンノシル化または高マンノースＮ−グリカンを有する組換え異種タンパク質を産生する酵母または糸状菌である。更に詳細な態様においては、該宿主細胞としては、アルファ−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性（例えば、限定的なものではないがサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような種々の酵母株の場合にはｏｃｈ１ｐ活性）を欠き、したがって、高マンノースＮ−グリカンを有する組換え異種タンパク質を産生する酵母または糸状菌が挙げられる。更に、本発明を植物および哺乳類発現系に適用して、これらの植物または哺乳類発現系において産生される糖タンパク質、特に、３個以上のＮ結合グリコシル化部位を有する糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠を改善することも可能である。
【０００９】
したがって、前記の１つの態様においては、組換え宿主細胞における異種糖タンパク質の製造方法を提供し、該方法は、１以上の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする１以上の核酸分子と、該異種糖タンパク質をコードする核酸分子とを含む組換え宿主細胞を準備し、該異種糖タンパク質を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、該異種糖タンパク質を産生させることを含む。
【００１０】
前記のもう１つの態様においては、哺乳類もしくはヒト様複合体またはハイブリッドＮ−グリカンを有する異種糖タンパク質の、宿主細胞における製造方法を提供し、該方法は、１以上の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする１以上の核酸分子と、該異種糖タンパク質をコードする核酸分子とを含む宿主細胞を準備し、該異種糖タンパク質を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、該異種糖タンパク質を産生させることを含む。
【００１１】
一般に、前記の態様においては、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現させる。
【００１２】
前記方法の更に詳細な態様においては、該宿主細胞は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）からなる群から選択される。他の態様においては、該宿主細胞は昆虫、植物または哺乳類宿主細胞である。
【００１３】
前記のもう１つの態様においては、下等真核宿主細胞における異種糖タンパク質の製造方法を提供し、該方法は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸分子と、該異種糖タンパク質をコードする核酸分子とを含む組換え下等真核宿主細胞［ここにおいて、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される］を準備し、該異種糖タンパク質を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、該異種糖タンパク質を産生させることを含む。
【００１４】
前記方法の更に詳細な態様においては、該下等真核宿主細胞は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）からなる群から選択される。
【００１５】
前記のもう１つの態様においては、組換え酵母宿主細胞における異種糖タンパク質の製造方法を提供し、該方法は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸分子と、該異種糖タンパク質をコードする核酸分子とを含む組換え酵母宿主細胞［ここにおいて、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される］を準備し、該異種糖タンパク質を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、該異種糖タンパク質を産生させることを含む。
【００１６】
前記方法においては、該組換え酵母宿主細胞は、酵母Ｎ−グリカンパターンを有する糖タンパク質を産生し、あるいは該酵母は、酵母パターンを有するが高マンノシル化を欠く糖タンパク質を産生するが高マンノースＮ−グリカンを産生するように遺伝的に操作されている。例えば、該酵母は、α１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性、例えばＯｃｈ１ｐ活性を欠くように遺伝的に操作されうる。更に詳細な態様においては、該酵母は、哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている。
【００１７】
特定の実施形態においては、該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼはリーシュマニア属種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐ．）ＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｃタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはそれらの組合せである。特定の実施形態においては、該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼはリーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｃタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはそれらの組合せである。更に詳細な実施形態においては、該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、ＯＴａｓｅ複合体、例えば酵母ＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１つの必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制しうる。更に詳細な態様においては、ＯＴａｓｅ複合体の必須タンパク質は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および／またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＳＴＴ３遺伝子座、ＷＢＰ１遺伝子座、ＯＳＴ１遺伝子座、ＳＷＰ１遺伝子座またはＯＳＴ２遺伝子座あるいはそれらのホモログによりコードされる。例えば、更に詳細な態様においては、例えば、該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼはリーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質であり、これは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１つの必須タンパク質の致死表現型を機能的に抑制（またはレスキューもしくは相補）しうる。
【００１８】
前記方法の更に詳細な態様においては、該酵母宿主細胞は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）からなる群から選択される。
【００１９】
前記のもう１つの態様においては、組換え酵母宿主細胞における異種糖タンパク質の製造方法を提供し、該方法は、酵母オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体の少なくとも１つの必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制しうる異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸分子と、該異種糖タンパク質をコードする核酸分子とを含む組換え酵母宿主細胞［ここにおいて、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される］を準備し、該異種糖タンパク質を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、該異種糖タンパク質を産生させることを含む。
【００２０】
前記方法においては、該組換え酵母宿主細胞は、酵母Ｎ−グリカンパターンを有する糖タンパク質を産生し、あるいは該酵母は、高マンノースＮ−グリカンを含むが高マンノシル化を欠く酵母パターンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている。例えば、該酵母は、α１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性、例えばＯｃｈ１ｐ活性を欠くように遺伝的に操作されうる。更に詳細な態様においては、該酵母は、哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている。
【００２１】
特定の実施形態においては、該宿主細胞は更に、リーシュマニア属種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐ．）ＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｃタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはそれらの組合せをコードする１以上の核酸分子を含む。特定の実施形態においては、該宿主細胞は更に、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｃタンパク質またはそれらの組合せをコードする１以上の核酸分子を含む。
【００２２】
前記方法の更に詳細な態様においては、該酵母宿主細胞は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）からなる群から選択される。
【００２３】
前記のもう１つの態様においては、糸状菌宿主細胞における異種糖タンパク質の製造方法を提供し、該方法は、単一サブユニット異種オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸分子と、該異種糖タンパク質をコードする核酸分子とを含む糸状菌宿主細胞［ここにおいて、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される］を準備し、該異種糖タンパク質を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、該異種糖タンパク質を産生させることを含む。該糸状菌宿主細胞は、Ｎ−グリカンが糸状菌パターンを有する、またはそれが、哺乳類もしくはヒト様Ｎ−グリカンを含有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている、糖タンパク質を産生する。
【００２４】
特定の実施形態においては、該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼはリーシュマニア属種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐ．）ＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｃタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはそれらの組合せである。特定の実施形態においては、該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼはリーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｃタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはそれらの組合せである。更に詳細な実施形態においては、該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、ＯＴａｓｅ複合体、例えば酵母ＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１つの必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制しうる。更に詳細な態様においては、ＯＴａｓｅ複合体の必須タンパク質は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および／またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＳＴＴ３遺伝子座、ＷＢＰ１遺伝子座、ＯＳＴ１遺伝子座、ＳＷＰ１遺伝子座またはＯＳＴ２遺伝子座あるいはそれらのホモログによりコードされる。例えば、更に詳細な態様においては、例えば、該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼはリーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質であり、これは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１つの必須タンパク質の致死表現型を機能的に抑制（またはレスキューもしくは相補）しうる。
【００２５】
前記方法の更に詳細な態様においては、該糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）からなる群から選択される。
【００２６】
前記方法のいずれかの更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は、Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ａ１またはＡ２から選択される１以上の哺乳類またはヒト様複合Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は、二分岐（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）Ｎ−グリカンを有する又は多アンテナ（ｍｕｌｔｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ−グリカンを有する１以上の哺乳類またはヒト様複合Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている。他の実施形態においては、該宿主細胞は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２，ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２から選択される１以上の哺乳類またはヒト様ハイブリッドＮ−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている。更に詳細な実施形態においては、該Ｎ−グリカン構造はＧ２構造Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる。
【００２７】
前記方法のいずれかの特定の実施形態においては、該異種糖タンパク質は例えば以下のものでありうる：エリスロポエチン（ＥＰＯ）；サイトカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンω；ならびに顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）；顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；凝固因子、例えば因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸおよびヒトプロテインＣ；アンチトロンビンＩＩＩ；トロンビン；可溶性ＩｇＥ受容体α鎖；免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＧ融合体およびＩｇＭ；免疫接着物質および他のＦｃ融合タンパク質、例えば可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質；ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質；インターロイキン；ウロキナーゼ；キマーゼ；尿素トリプシンインヒビター；ＩＧＦ結合性タンパク質；上皮増殖因子；成長ホルモン放出因子；アネキシンＶ融合タンパク質；アンジオスタチン；血管内皮増殖因子−２；骨髄前駆体抑制因子−１；オステオプロテジェリン；α−１−アンチトリプシン；α−フェトプロテイン；ＤＮアーゼＩＩ；ヒトプラスミノーゲンのクリングル３；グルコセレブロシダーゼ；ＴＮＦ結合タンパク質１；濾胞刺激ホルモン；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ；膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド；グルカゴン様タンパク質１；またはＩＬ−２受容体アゴニスト。
【００２８】
前記方法のいずれかの更に詳細な実施形態においては、該異種タンパク質は抗体であり、その例には、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＲＳＶ（呼吸器性シンシチウムウイルス）抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＣＤ３受容体抗体、抗ＣＤ４１  ７Ｅ３抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＥＧＦ受容体抗体または抗ＣＤ２０抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
前記方法のいずれかの特定の態様においては、該宿主細胞は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧｎＴ）Ｉ、ＧｎＴ  ＩＩ、ＧｎＴ  ＩＩＩ、ＧｎＴ  ＩＶ、ＧｎＴ  Ｖ、ＧｎＴ  ＶＩ、ＵＤＰ−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、フコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼからなる群の構成要素に由来するグリコシダーゼ、マンノシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼ活性の触媒ドメインの１以上をコードする１以上の核酸分子を含む。特定の実施形態においては、該マンノシダーゼは、シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）マンノシダーゼＩＡ、シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）マンノシダーゼＩＢ、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）マンノシダーゼＩＡ、ホモ・サピエンス（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）マンノシダーゼＩＢ、ピー・シトリヌム（Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍ）マンノシダーゼＩ、マウスマンノシダーゼＩＡ、マウスマンノシダーゼＩＢ、アスペルギルス・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）マンノシダーゼＩＡ、アスペルギルス・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）マンノシダーゼＩＢ、アスペルギルス・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）マンノシダーゼＩＣ、マウスマンノシダーゼＩＩ、シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）マンノシダーゼＩＩ、ホモ・サピエンス（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）マンノシダーゼＩＩおよびマンノシダーゼＩＩＩからなる群から選択される。
【００３０】
前記方法のいずれかの或る態様においては、少なくとも１つの触媒ドメインは、該触媒ドメインと細胞標的化シグナルペプチドとを含む融合タンパク質を形成することにより局在化される。該融合タンパク質は、細胞標的化シグナルペプチドをコードするＤＮＡ断片を、酵素活性を有する触媒ドメインをコードするＤＮＡ断片とインフレームで連結することにより形成される少なくとも１つの遺伝的構築物によりコードされうる。標的化シグナルペプチドの例には、ＥＲまたはゴルジの膜結合タンパク質、回収シグナル、ＩＩ型膜タンパク質、Ｉ型膜タンパク質、膜伸長ヌクレオチド糖輸送体、マンノシダーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、グルコシダーゼ、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホ−マンノシルトランスフェラーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
前記方法のいずれかの特定の態様においては、該宿主細胞は更に、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体、ＵＤＰ−ガラクトース輸送体、ＧＤＰ−フコース輸送体、ＣＭＰ−シアル酸輸送体およびヌクレオチドジホスファターゼからなる群から選択される１以上の酵素をコードする１以上の核酸分子を含む。
【００３２】
前記方法のいずれかの更に詳細な態様においては、該宿主細胞は、α１，２−マンノシダーゼ活性、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧｎＴ）Ｉ活性、マンノシダーゼＩＩ活性およびＧｎＴ  ＩＩ活性をコードする１以上の核酸分子を含む。
【００３３】
前記方法のいずれかの更に詳細な態様においては、該宿主細胞は、α１，２−マンノシダーゼ活性、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧｎＴ）Ｉ活性、マンノシダーゼＩＩ活性、ＧｎＴ  ＩＩ活性およびＵＤＰ−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）活性をコードする１以上の核酸分子を含む。
【００３４】
前記方法のいずれかの更に詳細な態様においては、該宿主細胞は、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホマンノシルトランスフェラーゼからなる群から選択される１以上の酵素の活性を欠く。更に詳細な態様においては、該宿主細胞は、１，６マンノシルトランスフェラーゼ、１，３マンノシルトランスフェラーゼおよび１，２マンノシルトランスフェラーゼからなる群から選択される酵素を発現しない。
【００３５】
前記方法のいずれかの特定の態様においては、該宿主細胞はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のｏｃｈ１突然変異体である。
【００３６】
更に、（ａ）異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第１核酸分子と、（ｂ）異種糖タンパク質をコードする第２核酸分子とを含む宿主細胞を提供し、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現され、これは内在性宿主細胞ＳＴＴ３遺伝子の発現を含む。
【００３７】
更に、（ａ）異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第１核酸分子と、（ｂ）異種糖タンパク質をコードする第２核酸分子とを含む下等真核宿主細胞を提供し、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される。
【００３８】
更に、（ａ）異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第１核酸分子と、（ｂ）異種糖タンパク質をコードする第２核酸分子とを含む酵母宿主細胞を提供し、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される。
【００３９】
更に、（ａ）酵母オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体の少なくとも１つの必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制しうる異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第１核酸分子と、（ｂ）異種糖タンパク質をコードする第２核酸分子とを含む酵母宿主細胞を提供し、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される。
【００４０】
更に、（ａ）異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第１核酸分子と、（ｂ）異種糖タンパク質をコードする第２核酸分子とを含む糸状菌宿主細胞を提供し、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される。
【００４１】
更に、（ａ）酵母または糸状菌オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体の少なくとも１つの必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制しうる異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第１核酸分子と、（ｂ）異種糖タンパク質をコードする第２核酸分子とを含む糸状菌宿主細胞を提供し、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される。
【００４２】
特定の実施形態においては、該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼはリーシュマニア属種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐ．）ＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｃタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはそれらの組合せである。特定の実施形態においては、該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼはリーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｃタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはそれらの組合せである。更に詳細な実施形態においては、該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、ＯＴａｓｅ複合体、例えば酵母ＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１つの必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制しうる。更に詳細な態様においては、ＯＴａｓｅ複合体の必須タンパク質は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および／またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＳＴＴ３遺伝子座、ＷＢＰ１遺伝子座、ＯＳＴ１遺伝子座、ＳＷＰ１遺伝子座またはＯＳＴ２遺伝子座あるいはそれらのホモログによりコードされる。例えば、更に詳細な態様においては、例えば、該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼはリーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質であり、これは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１つの必須タンパク質の致死表現型を機能的に抑制（またはレスキューもしくは相補）しうる。
【００４３】
更に詳細な態様においては、前記宿主細胞は更に、リーシュマニア属種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐ．）ＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｃタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはそれらの組合せをコードする１以上の核酸分子を含む。
【００４４】
前記宿主細胞のいずれかの更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は、Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ａ１またはＡ２から選択される１以上の哺乳類またはヒト様複合Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は、二分岐（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）Ｎ−グリカンを有する又は多アンテナ（ｍｕｌｔｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ−グリカンを有する１以上の哺乳類またはヒト様複合Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている。他の実施形態においては、該宿主細胞は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２，ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２から選択される１以上の哺乳類またはヒト様ハイブリッドＮ−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている。更に詳細な実施形態においては、該Ｎ−グリカン構造はＧ２構造Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる。
【００４５】
前記宿主細胞のいずれかの特定の実施形態においては、該異種糖タンパク質は、例えば、以下のものからなる群から選択されうる：エリスロポエチン（ＥＰＯ）；サイトカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンω；ならびに顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）；顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；凝固因子、例えば因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸおよびヒトプロテインＣ；アンチトロンビンＩＩＩ；トロンビン；可溶性ＩｇＥ受容体α鎖；免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＧ融合体およびＩｇＭ；免疫接着物質および他のＦｃ融合タンパク質、例えば可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質；ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質；インターロイキン；ウロキナーゼ；キマーゼ；尿素トリプシンインヒビター；ＩＧＦ結合性タンパク質；上皮増殖因子；成長ホルモン放出因子；アネキシンＶ融合タンパク質；アンジオスタチン；血管内皮増殖因子−２；骨髄前駆体抑制因子−１；オステオプロテジェリン；α−１−アンチトリプシン；α−フェトプロテイン；ＤＮアーゼＩＩ；ヒトプラスミノーゲンのクリングル３；グルコセレブロシダーゼ；ＴＮＦ結合タンパク質１；濾胞刺激ホルモン；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ；膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド；グルカゴン様タンパク質１；ならびにＩＬ−２受容体アゴニスト。
【００４６】
前記宿主細胞のいずれかの更に詳細な実施形態においては、該異種タンパク質は抗体であり、その例には、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＲＳＶ（呼吸器性シンシチウムウイルス）抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＣＤ３受容体抗体、抗ＣＤ４１  ７Ｅ３抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＥＧＦ受容体抗体または抗ＣＤ２０抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
前記宿主細胞のいずれかの特定の態様においては、該宿主細胞は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧｎＴ）Ｉ、ＧｎＴ  ＩＩ、ＧｎＴ  ＩＩＩ、ＧｎＴ  ＩＶ、ＧｎＴ  Ｖ、ＧｎＴ  ＶＩ、ＵＤＰ−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、フコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼからなる群の構成要素に由来するグリコシダーゼ、マンノシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼ活性の触媒ドメインの１以上をコードする１以上の核酸分子を含む。特定の実施形態においては、該マンノシダーゼは、シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）マンノシダーゼＩＡ、シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）マンノシダーゼＩＢ、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）マンノシダーゼＩＡ、ホモ・サピエンス（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）マンノシダーゼＩＢ、ピー・シトリヌム（Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍ）マンノシダーゼＩ、マウスマンノシダーゼＩＡ、マウスマンノシダーゼＩＢ、アスペルギルス・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）マンノシダーゼＩＡ、アスペルギルス・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）マンノシダーゼＩＢ、アスペルギルス・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）マンノシダーゼＩＣ、マウスマンノシダーゼＩＩ、シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）マンノシダーゼＩＩ、ホモ・サピエンス（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）マンノシダーゼＩＩおよびマンノシダーゼＩＩＩからなる群から選択される。
【００４８】
前記宿主細胞のいずれかの或る態様においては、少なくとも１つの触媒ドメインは、該触媒ドメインと細胞標的化シグナルペプチドとを含む融合タンパク質を形成することにより局在化される。該融合タンパク質は、細胞標的化シグナルペプチドをコードするＤＮＡ断片を、酵素活性を有する触媒ドメインをコードするＤＮＡ断片とインフレームで連結することにより形成される少なくとも１つの遺伝的構築物によりコードされうる。標的化シグナルペプチドの例には、ＥＲまたはゴルジの膜結合タンパク質、回収シグナル、例えばＨＤＥＬまたはＫＤＥＬ、ＩＩ型膜タンパク質、Ｉ型膜タンパク質、膜伸長ヌクレオチド糖輸送体、マンノシダーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、グルコシダーゼ、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホ−マンノシルトランスフェラーゼに対するものが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
前記宿主細胞のいずれかの特定の態様においては、該宿主細胞は更に、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体、ＵＤＰ−ガラクトース輸送体、ＧＤＰ−フコース輸送体、ＣＭＰ−シアル酸輸送体およびヌクレオチドジホスファターゼからなる群から選択される１以上の酵素をコードする１以上の核酸分子を含む。
【００５０】
前記宿主細胞のいずれかの更に詳細な態様においては、該宿主細胞は、α１，２−マンノシダーゼ活性、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧｎＴ）Ｉ活性、マンノシダーゼＩＩ活性およびＧｎＴ  ＩＩ活性をコードする１以上の核酸分子を含む。
【００５１】
前記宿主細胞のいずれかの更に詳細な態様においては、該宿主細胞は、α１，２−マンノシダーゼ活性、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧｎＴ）Ｉ活性、マンノシダーゼＩＩ活性、ＧｎＴ  ＩＩ活性およびＵＤＰ−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）活性をコードする１以上の核酸分子を含む。
【００５２】
前記宿主細胞の更に詳細な態様においては、該宿主細胞は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、植物細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞からなる群から選択される。
【００５３】
前記宿主細胞のいずれかの更に詳細な態様においては、該宿主細胞は、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホマンノシルトランスフェラーゼからなる群から選択される１以上の酵素の活性を欠く。更に詳細な態様においては、該宿主細胞は、１，６マンノシルトランスフェラーゼ、１，３マンノシルトランスフェラーゼおよび１，２マンノシルトランスフェラーゼからなる群から選択される酵素を発現しない。
【００５４】
前記宿主細胞のいずれかの特定の態様においては、該宿主細胞はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。更に詳細な態様においては、該宿主細胞はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のｏｃｈ１突然変異体である。
【００５５】
本発明における方法および宿主細胞は、組成物中の糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％が占拠されている糖タンパク質組成物を製造するために使用されうる。
【００５６】
更に、本発明における方法および宿主細胞は、組成物中の糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％が占拠されている糖タンパク質組成物を製造するために使用されることが可能であり、該宿主細胞は、更に詳細な態様においては、フコースを欠く哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを含有する糖タンパク質組成物を製造するために使用されうる。
【００５７】
更に、該方法および酵母または糸状菌宿主細胞は、哺乳類様またはヒト様Ｎ−グリカンを産生するように遺伝的に操作されており、組成物中の糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％が占拠されている糖タンパク質組成物を製造するために使用されることが可能であり、該宿主細胞は、更に詳細な態様においては、フコースを有する哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを含有する糖タンパク質組成物を製造するために使用されうる。
【００５８】
いくつかの態様においては、フコシル化哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを産生するように遺伝的に操作された酵母または糸状菌宿主細胞は、組成物中の糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％が占拠されている糖タンパク質組成物を製造するために使用されることが可能であり、該宿主細胞は、更に詳細な態様においては、フコースを有する哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを含有する糖タンパク質組成物を製造するために使用されうる。
【００５９】
本発明における方法および宿主細胞は、組成物中の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の抗体分子が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位を有する、抗体組成物を製造するために使用されうる。
【００６０】
更に、本発明における方法および宿主細胞は、組成物中の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の抗体分子が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位と、フコースを欠くＮ−グリカンとを有する、抗体組成物を製造するために使用されうる。
【００６１】
更に、本発明における方法および酵母または糸状菌宿主細胞は、組成物中の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の抗体分子が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位と、フコースを欠くＮ−グリカンとを有する、抗体組成物を製造するために使用されうる。
【００６２】
更に、該方法、および哺乳類様またはヒト様Ｎ−グリカンを産生するように遺伝的に操作された酵母または糸状菌宿主細胞は、組成物中の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の抗体分子が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位を有し、該抗体が、フコースを欠く哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを有する、抗体組成物を製造するために使用されるうる。いくつかの態様においては、フコシル化哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを産生するように遺伝的に操作された酵母または糸状菌宿主細胞は、組成物中の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の抗体分子が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位を有し、該抗体が、フコースを有する哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを有する、抗体組成物を製造するために使用されるうる。
【００６３】
更に、複数の抗体と医薬上許容される担体とを含む糖タンパク質組成物であって、該組成物中の完全抗体分子の約７０％〜約９９％が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位を有し、該Ｎ−グリカンの約５０〜７０モル％がＧ０構造を有し、該Ｎ−グリカンの１５〜２５モル％がＧ１構造を有し、該Ｎ−グリカンの４〜１２モル％がＧ２構造を有し、該Ｎ−グリカンの５〜１７モル％がＭａｎ５構造を有し、該Ｎ−グリカンの３〜１５モル％がハイブリッド構造を有する、糖タンパク質組成物を提供する。
【００６４】
更にまた、複数の抗体と医薬上許容される担体とを含む糖タンパク質組成物であって、該組成物中の完全抗体分子の約７０％〜約９９％が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位を有し、該Ｎ−グリカンの約５３〜５８モル％がＧ０構造を有し、該Ｎ−グリカンの２０〜２２モル％がＧ１構造を有し、該Ｎ−グリカンの約１６〜１８モル％がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有する、糖タンパク質組成物を提供する。
【００６５】
特定の実施形態においては、該抗体は、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＲＳＶ（呼吸器性シンシチウムウイルス）抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＣＤ３受容体抗体、抗ＣＤ４１  ７Ｅ３抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＥＧＦ受容体抗体および抗ＣＤ２０抗体からなる群から選択される抗体を含む。
【００６６】
更に、本明細書に記載されている宿主細胞および方法により産生される１以上の糖タンパク質を含む組成物を提供する。
【００６７】
特定の実施形態においては、本発明において提供する糖タンパク質組成物は、二分岐（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）種および多アンテナ（ｍｕｌｔｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）種を含むフコシル化および非フコシル化ハイブリッドおよび複合Ｎ−グリカン（例えば、ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２のようなＮ−グリカンを含むが、これらに限定されるものではない）を有する糖タンパク質を含む。
【００６８】
特定の実施形態においては、本発明において提供する糖タンパク質組成物は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；およびＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択される少なくとも１つのハイブリッドＮ−グリカンを有する糖タンパク質を含む。特定の態様においては、該ハイブリッドＮ−グリカンは該組成物中の主要Ｎ−グリカン種である。更に詳細な態様においては、該ハイブリッドＮ−グリカンは、該組成物中のハイブリッドＮ−グリカンの約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％を構成する特定のＮ−グリカン種である。
【００６９】
特定の実施形態においては、本発明において提供する糖タンパク質組成物は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択される少なくとも１つの複合Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を含む。特定の態様においては、該複合Ｎ−グリカンは該組成物中の主要Ｎ−グリカン種である。更に詳細な態様においては、該複合Ｎ−グリカンは、該組成物中の複合Ｎ−グリカンの約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％を構成する特定のＮ−グリカン種である。
【００７０】
特定の実施形態においては、該Ｎ−グリカンはフコシル化されている。一般に、該フコースは、該Ｎ−グリカンの還元末端におけるＧｌｃＮＡｃとのα１，３−結合、該Ｎ−グリカンの還元末端におけるＧｌｃＮＡｃとのα１，６−結合、該Ｎ−グリカンの非還元末端におけるＧａｌとのα１，２−結合、該Ｎ−グリカンの非還元末端におけるＧｌｃＮＡｃとのα１，３−結合、または該Ｎ−グリカンの非還元末端におけるＧｌｃＮＡｃとのα１，４−結合で存在する。
【００７１】
したがって、前記の糖タンパク質組成物の特定の態様においては、該グリコフォーム（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）からなる群から選択されるグリコフォームを与えるα１，３−結合またはα１，６−結合フコース；ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるグリコフォームを与えるα１，３−結合またはα１，４−結合フコース；あるいはＧａｌ（Ｆｕｃ）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるグリコフォームを与えるα１，２−結合フコースで存在する。
【００７２】
前記の更に詳細な態様においては、該複合Ｎ−グリカンは更に、フコシル化および非フコシル化二分岐（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）および多アンテナ（ｍｕｌｔｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）種を含む。
【００７３】
更に詳細な態様においては、該糖タンパク質は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（これに限定されるものではない）を含む高マンノースＮ−グリカン、またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカン構造からなるＮ−グリカンを含む。
【００７４】
定義
本明細書中で用いる「Ｎ−グリカン」および「グリコフォーム（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）」なる語は互換的に用いられ、Ｎ−結合オリゴ糖を意味し、例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基にアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合により結合しているＮ−結合オリゴ糖を意味する。Ｎ−結合糖タンパク質は、タンパク質中のアスパラギン残基のアミド窒素に結合したＮ−アセチルグルコサミン残基を含有する。糖タンパク質上で見出される主な糖としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸（例えば、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（ＮＡＮＡ））が挙げられる。Ｎ−結合糖タンパク質の場合、糖基のプロセシングは翻訳と共に小胞体の内腔（ＥＲルーメン）で生じ、翻訳後にゴルジ装置内で継続する。
【００７５】
Ｎ−グリカンはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の共通の五糖コアを有する（「Ｍａｎ」はマンノースを意味し、「Ｇｌｃ」はグルコースを意味し、「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを意味し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを意味する）。通常、Ｎ−グリカン構造は、非還元末端を左側に、そして還元末端を右側にして示される。Ｎ−グリカンの還元末端は、タンパク質上のグリコシル化部位を含むＡｓｎ残基に結合される末端である。Ｎ−グリカンは、「トリマンノースコア」、「五糖コア」または「小マンノース（ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｅ）コア」とも称されるＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）コア構造に付加される末梢糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコースおよびシアル酸）を含む分枝（アンテナ）の数に関して異なる。Ｎ−グリカンは、それらの分枝構成成分に従い分類される（例えば、高マンノース、複合またはハイブリッド）。「高マンノース」型Ｎ−グリカンは５以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ−グリカンは、典型的には、「トリマンノース」コアの１，６マンノース・アームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ、および１，３マンノース・アームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有する。複合Ｎ−グリカンはまた、シアル酸または誘導体（例えば、「ＮＡＮＡ」または「ＮｅｕＡｃ」；ここで、「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を意味し、「Ａｃ」はアセチルを意味する）で修飾されていてもよいガラクトース（「Ｇａｌ」）またはＮ−アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）残基を有しうる。複合Ｎ−グリカンはまた、コア・フコース（「Ｆｕｃ」）および「二分岐（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）」ＧｌｃＮＡｃを含む鎖内置換を有しうる。複合Ｎ−グリカンはまた、「トリマンノース・コア」上に複数のアンテナを有することが可能であり、これは、しばしば、「多アンテナグリカン」と称される。「ハイブリッド」Ｎ−グリカンは、該トリマンノース・コアの１，３マンノース・アームの末端に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを、そして該トリマンノース・コアの１，６マンノース・アーム上に０個以上のマンノースを有する。これらの種々のＮ−グリカンは「グリコフォーム」とも称される。
【００７６】
複合Ｎ−グリカンに関しては、「Ｇ−２」、「Ｇ−１」、「Ｇ０」、「Ｇ１」、「Ｇ２」、「Ａ１」および「Ａ２」なる語は以下を意味する。「Ｇ−２」は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられうるＮ−グリカン構造を意味し、「Ｇ−１」なる語は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられうるＮ−グリカン構造を意味し、「Ｇ０」なる語は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられるＮ−グリカン構造を意味し、「Ｇ１」なる語は、ＧｌｃＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられるＮ−グリカン構造を意味し、「Ｇ２」なる語は、Ｇｌｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられるＮ−グリカン構造を意味し、「Ａ１」なる語は、ＮＡＮＡＧｌｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられるＮ−グリカン構造を意味し、「Ａ２」なる語は、ＮＡＮＡ２Ｇｌｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられるＮ−グリカン構造を意味する。特に示されていない限り、「Ｇ−２」、「Ｇ−１」、「Ｇ０」、「Ｇ１」、「Ｇ２」、「Ａ１」および「Ａ２」なる語は、Ｎ−グリカンの還元末端においてＧｌｃＮＡｃ残基に結合したフコースを欠くＮ−グリカン種を意味する。該用語が「Ｆ」を含む場合、「Ｆ」は、該Ｎ−グリカン種が該Ｎ−グリカンの還元末端においてＧｌｃＮＡｃ残基上にフコース残基を含有することを示す。例えば、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ、Ａ１ＦおよびＡ２Ｆは全て、Ｎ−グリカンが、該Ｎ−グリカンの還元末端においてＧｌｃＮＡｃ残基に結合したフコース残基を更に含むことを示す。酵母および糸状菌のような下等真核生物は、通常、フコースを示すＮ−グリカンを産生しない。
【００７７】
多アンテナＮ−グリカンに関しては、「多アンテナＮ−グリカン」なる語は、該Ｎ−グリカンの１，６アームもしくは１，３アームの非還元末端を含むマンノース残基上のＧｌｃＮＡｃ残基、または該Ｎ−グリカンの１，６アームおよび１，３アームの非還元末端を含むマンノース残基のそれぞれにおいてＧｌｃＮＡｃ残基を更に含むＮ−グリカンを意味する。したがって、多アンテナＮ−グリカンは、式ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、またはＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２により特徴づけられうる。「１−４」なる語は１、２、３または４個の残基を意味する。
【００７８】
二分岐Ｎ−グリカンに関しては、「二分岐Ｎ−グリカン」なる語は、ＧｌｃＮＡｃ残基が該Ｎ−グリカンの還元末端においてマンノース残基に結合している、Ｎ−グリカンを意味する。二分岐Ｎ−グリカンは式ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２により特徴づけられることが可能であり、ここで、各マンノース残基はその非還元末端においてＧｌｃＮＡｃ残基に結合している。これに対して、多アンテナＮ−グリカンがＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられる場合、該式は、２つのＧｌｃＮＡｃ残基が、Ｎ−グリカンの、２つのアームの一方の非還元末端において、マンノース残基に結合しており、１つのＧｌｃＮＡｃ残基が、該Ｎ−グリカンの他方のアームの非還元末端において、マンノース残基に結合していることを示す。
【００７９】
本明細書中で用いる略語は、当技術分野において一般に用いられているものである。例えば、前記の糖の略語を参照されたい。他の一般的な略語には、「ＰＮＧアーゼ」または「グリカナーゼ」または「グルコシダーゼ」が含まれ、これらは全て、ペプチドであるＮ−グリコシダーゼＦ（ＥＣ３．２．２．１８）を意味する。
【００８０】
本明細書中で用いる「糖タンパク質」なる語は、１以上のＮ−グリカンが結合している任意のタンパク質を意味する。したがって、該用語は、当技術分野において糖タンパク質として一般に認識されているタンパク質、および１以上のＮ−結合グリコシル化部位を含有するように遺伝的に操作されたタンパク質の両方を意味する。
【００８１】
本明細書中で用いる「ヒト化糖タンパク質」または「ヒト様糖タンパク質」は、４個未満のマンノース残基を有するＮ−グリカンが結合しているタンパク質、および少なくとも５個のマンノース残基を有する合成糖タンパク質中間体（同様にインビトロまたはインビボにおいて有用であり更に操作されうる）を互換的に意味する。好ましくは、本発明により製造される糖タンパク質は、少なくとも一時的に、少なくとも３０モル％、好ましくは少なくとも４０モル％、より好ましくは５０、６０、７０、８０、９０または更には１００モル％の該Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を含有する。これは、例えば、「より良好な」、すなわち、より効率的なグリコシル化酵素を発現するように、本発明の宿主細胞を操作することにより達成されうる。例えば、マンノシダーゼは、それが、タンパク質がグリコシル化され宿主細胞内に導入される（これは、活性が望まれる部位である宿主細胞オルガネラへ該酵素を標的化することにより行われる）宿主細胞内部位において見られる条件下で最適活性を有するように選択される。
【００８２】
本明細書中で用いる「組換え宿主細胞」（「発現宿主細胞」、「発現宿主系」、「発現系」または単に「宿主細胞」）なる語は、組換えベクターが導入された細胞を意味すると意図される。そのような用語は、その特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代をも意味すると意図されると理解されるべきである。突然変異または環境の影響により、後の世代において、ある修飾が生じうるため、そのような後代は実際には親細胞と同一でない可能性があるが、本明細書中で用いる「宿主細胞」なる語の範囲内に尚も含まれる。組換え宿主細胞は、培養内で増殖した単離された細胞または細胞系であることが可能であり、あるいは、生きた組織または生物に存在する細胞でありうる。好ましい宿主細胞は酵母および真菌である。
【００８３】
糖タンパク質の調製物中に存在するグリカンの「モル％（モル百分率）」に言及する場合、この用語は、該タンパク質調製物をＰＮＧアーゼで処理し、ついで、グリコフォーム組成物により影響されない方法（例えば、ＰＮＧアーゼにより遊離したグリカンプールを２−アミノベンズアミドのような蛍光タグで標識し、ついで高速液体クロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動により分離し、ついで蛍光強度によりグリカンを定量すること）により定量した場合に遊離したＮ−結合オリゴ糖のプール内に存在する特定のグリカンのモル％を意味する。例えば、５０モル％のＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｇａｌ２ＮＡＮＡ２は、遊離したグリカンの５０％がＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｇａｌ２ＮＡＮＡ２であり、残りの５０％が他のＮ−結合オリゴ糖から構成されることを意味する。いくつかの実施形態においては、糖タンパク質の調製物中の特定のグリカンのモル％は２０％〜１００％、好ましくは２５％超（すなわち、２５％を超える）、３０％超、３５％超、４０％超または４５％超、より好ましくは５０％超、５５％超、６０％超、６５％超または７０％超、最も好ましくは７５％超、８０％超、８５％超、９０％超または９５％超である。
【００８４】
「機能的に連結」された発現制御配列は、関心のある遺伝子を制御するように、関心のある遺伝子に隣接して連結された発現制御配列、ならびに関心のある遺伝子を制御するように、トランスで又は或る距離を隔てて作用する発現制御配列を意味する。
【００８５】
「発現制御配列」または「調節配列」なる語は互換的に用いられ、本明細書中で用いられる場合には、それが機能的に連結されているコード配列の発現に影響を及ぼすのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後事象および翻訳を制御する配列である。発現制御配列には、適当な転写開始、終結配列、プロモーターおよびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増加させる配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに望ましい場合には、タンパク質分泌を促進する配列が含まれる。そのような制御配列の性質は宿主生物によって異なり、原核生物においては、そのような制御配列には、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列が含まれる。「制御配列」なる語は、少なくとも、発現のために存在が必須である全ての成分を含むと意図され、存在することが有利である追加的な成分、例えばリーダー配列および融合相手の配列をも含みうる。
【００８６】
「トランスフェクト」、「トランスフェクション」、「トランスフェクトする」などの語は、高等真核細胞および下等真核細胞の両方を含む真核細胞内への異種核酸の導入を意味する。歴史的には、酵母または真菌細胞内への核酸の導入を示すために「形質転換」が用いられてきたが、本明細書においては、酵母および真菌細胞を含む任意の真核細胞内への核酸の導入を示すために「トランスフェクション」なる語が用いられる。
【００８７】
「真核生物」なる語は有核細胞または生物を意味し、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞、動物細胞および下等真核細胞を意味する。
【００８８】
「下等真核細胞」なる語は酵母および糸状菌を含む。酵母および糸状菌には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、いずれかのサッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、いずれかのクライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、いずれかのアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、いずれかのフザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）。
【００８９】
本明細書中で用いる「抗体」、「免疫グロブリン」および「免疫グロブリン分子」なる語は互換的に用いられる。各免疫グロブリン分子は、その特異的抗原にそれが結合するのを可能にする特有の構造を有するが、全ての免疫グロブリンは、本明細書に記載されているのと同じ全体構造を有する。基本的な免疫グロブリン構造単位はサブユニットの四量体を含むことが公知である。各四量体は、ポリペプチド鎖の、２つの同一ペアを有し、各ペアは１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識をもたらす約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能をもたらす定常領域を定める。軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンのいずれかとして分類され、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥとしての抗体のイソタイプを定める。
【００９０】
軽鎖および重鎖は可変領域および定常領域に細分される（全般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ，Ｗ．編，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９），Ｃｈ．７を参照されたい）。各軽／重鎖ペアの可変領域は抗体結合部位を形成する。したがって、完全抗体は２つの結合部位を有する。二官能性または二重特異性抗体の場合を除き、それらの２つの結合部位は同一である。該鎖は全て、相補性決定領域またはＣＤＲとも称される３つの超可変領域により連結された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の、同じ全体構造を示す。各ペアの２つの鎖からのＣＤＲは該フレームワーク領域により整列され、特異的エピトープへの結合を可能にする。これらの用語は、天然に存在する形態、ならびにフラグメント（断片）および誘導体を含む。該用語の範囲内には、免疫グロブリン（Ｉｇ）のクラス、すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびＩｇＤが含まれる。ＩｇＧのサブタイプ、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４も該用語の範囲内に含まれる。該用語は最も広い意味で用いられ、単一のモノクローナル抗体（アゴニストおよびアンタゴニスト抗体を含む）、および複数のエピトープまたは抗原に結合する抗体組成物を含む。該用語は、特に、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体フラグメントを含む。ただし、それらは、ＣＨ２ドメインのＮ−結合グリコシル化部位を含む重鎖免疫グロブリン定常領域のＣＨ２ドメインの少なくとも一部分またはその変異体を含有するか又は含有するように修飾されている。Ｆｃ領域のみを含む分子、例えばイムノアドヘシン（米国公開特許出願第２００４／０１３６９８６号（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする））、Ｆｃ融合体および抗体様分子も該用語に含まれる。
【００９１】
「Ｆｃ」フラグメントなる語は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有する、抗体のＣ末端領域「結晶性フラグメント」を意味する。「Ｆａｂ」フラグメントなる語は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬドメインを含有する、抗体の「抗原結合フラグメント」領域を意味する。
【００９２】
本明細書中で用いる「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）なる語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、該集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる可能な天然で生じる突然変異の場合を除き同一である。モノクローナル抗体は単一の抗原部位に対して高特異性である。更に、種々の決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を典型的に含む通常の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各ｍＡｂは該抗原上の単一の決定基に対するものである。モノクローナル抗体は、その特異性に加えて、他の免疫グロブリンの混入を伴わないハイブリドーマ培養により合成されうる点で好都合である。「モノクローナル」なる語は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特性を示すものであり、いずれかの特定の方法による該抗体の製造を要すると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従い使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５に最初に記載されたハイブリドーマ法により製造されることが可能であり、あるいは組換えＤＮＡ法により製造されうる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい）。
【００９３】
「抗体」または「免疫グロブリン」なる語の範囲内の「フラグメント」なる語は、種々のプロテアーゼでの消化により製造されたもの、化学的切断および／または化学的解離により製造されたもの、ならびに組換え的に製造されたものを含むが、該フラグメントは尚も標的分子に特異的に結合しうるものでなければならない。そのようなフラグメントとしては、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２および一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントが挙げられる。以下、「免疫グロブリン」なる語は「フラグメント」なる語をも含む。
【００９４】
免疫グロブリンは更に、配列において修飾されているが尚も標的分子に特異的に結合しうる免疫グロブリンまたはフラグメント、例えば、種間キメラおよびヒト化抗体；抗体融合体；ヘテロマー抗体複合体および抗体融合体、例えばジアボディ（二重特異性抗体）、一本鎖ジアボディおよびイントラボディを含む（例えば、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｍａｒａｓｃｏ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｉｎｃ．，１９９８）を参照されたい）。
【００９５】
「触媒抗体」なる語は、生化学反応を触媒しうる免疫グロブリン分子を意味する。触媒抗体は当技術分野でよく知られており、Ｓｃｈｏｃｈｅｔｍａｎらの米国特許第７，２０５，１３６号、第４，８８８，２８１号および第５，０３７，７５０号、Ｂａｒｂａｓ，ＩＩＩらの米国特許第５，７３３，７５７号、第５，９８５，６２６号および第６，３６８，８３９号（それらの開示の全てを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【００９６】
抗体および抗体−抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用、ならびに種々の応答、例えば抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、免疫複合体の排除（食作用）、Ｂ細胞による抗体産生、およびＩｇＧ血清半減期は、それぞれ以下において定義されている：Ｄａｅｒｏｎら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）；ＷａｒｄおよびＧｈｅｔｉｅ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：７７−９４（１９９５）；ＣｏｘおよびＧｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：３３９−３４５（２００１）；Ｈｅｙｍａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．８８：１５７−１６１（２００３）；ならびにＲａｖｅｔｃｈ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１２１−１２５（１９９７）。
【００９７】
本明細書中で用いる「から実質的になる」なる語は、示されている整数または整数群の包含を示唆する一方で、示されている整数に対して著しい影響または改変をもたらす修飾または他の整数の除外を示唆するものと理解される。Ｎ−グリカンの種に関しては、示されているＮ−グリカン「から実質的になる」なる語は、そのＮ−グリカンが、糖タンパク質のアスパラギン残基に直接結合するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）においてフコシル化されているか否かにかかわらず、該Ｎ−グリカンを含むと理解される。
【００９８】
本明細書中で用いる「主として（主に）」なる語、またはその派生語、例えば「主要（主な）」または「優勢である」は、糖タンパク質をＰＮＧアーゼで処理し、遊離グリカンを質量分析、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳまたはＨＰＬＣにより分析した後、全中性Ｎ−グリカンに対する最高モル百分率（％）を有するグリカン種に関して用いられると理解される。言い換えると、「主として（主に）」なる語は、ある個々の実体（例えば、特定のグリコフォーム）が他のいずれの個々の実体よりも大きなモル％で存在する場合に定義される。例えば、ある組成物が、４０モル％の種Ａ、３５モル％の種Ｂおよび２５モル％の種Ｃからなる場合、該組成物は種Ａを「主として（主に）」含み、種Ｂは２番目に優勢な種ということになろう。幾つかの宿主細胞は、中性Ｎ−グリカン、および荷電Ｎ−グリカン、例えばマンノシルホスファートを含む組成物を産生しうる。したがって、糖タンパク質の組成物は複数の荷電Ｎ−グリカンおよび非荷電または中性Ｎ−グリカンを含みうる。本発明においては、主要Ｎ−グリカンが決定されるのは、該組成物中の全体的な複数の中性Ｎ−グリカンの状況においてである。したがって、本明細書中で用いる「主要Ｎ−グリカン」は、該組成物中の全体的な複数の中性Ｎ−グリカンのうち、該主要Ｎ−グリカンが、特定の構造のものであることを意味する。
【００９９】
本明細書中で用いる、フコースまたはガラクトースなどのような特定の糖残基を「実質的に含有しない」なる語は、糖タンパク質組成物が、そのような残基を含有するＮ−グリカンを実質的に欠くことを示すために用いられる。純度に関して表されている場合、実質的に含有しないは、そのような糖残基を含有するＮ−グリカン構造の量が１０％以下、好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満、最も好ましくは０．５％未満であり、ここで、該比率は重量％またはモル％である。したがって、本発明の糖タンパク質組成物におけるＮ−グリカン構造体の実質的に全ては、例えば、フコースまたはガラクトースまたはそれらの両方を含有しない。
【０１００】
本明細書において、糖タンパク質組成物がフコースまたはガラクトースのような特定の糖残基を「欠く」または「欠いている」と示されるのは、検出可能な量のそのような糖残基がいずれの時点においても該Ｎ−グリカン構造体上に存在しない場合である。例えば、本発明の好ましい実施形態においては、該糖タンパク質組成物は、酵母（例えば、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．））を含む前記の下等真核生物により産生されるが、これらの生物の細胞は、フコシル化Ｎ−グリカン構造体を産生するのに必要な酵素を有さないため、該糖タンパク質組成物は「フコースを欠く」であろう。したがって、「フコースを実質的に含有しない」なる語は「フコースを欠く」なる語を含む。しかし、組成物が一時的にフコシル化Ｎ−グリカン構造体を含有していた、または限られた量であるが検出可能な量のフコシル化Ｎ−グリカン構造体を含有する場合であっても、該組成物は「フコースを実質的に含有しない」ものとされうる。
【０１０１】
発明の詳細な説明
本発明は、糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠が、本明細書に開示されているとおりには修飾されていない宿主細胞において産生された同じ糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠と比べて増加している治療用糖タンパク質の、宿主細胞における製造方法を提供する。下等真核宿主細胞、例えば酵母宿主細胞または糸状菌宿主細胞において本発明を実施する場合、該宿主細胞において産生された組換え糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠は、哺乳類またはヒト宿主細胞において産生された同じ組換え糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠と同じであるか又はより類似している。
【０１０２】
組換え宿主細胞において産生される糖タンパク質上のＮ−グリコシル化部位占拠を増加させるために、該宿主細胞内での該糖タンパク質の発現の前または該発現と同時に、少なくとも１つの異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ［特定の実施形態においては、その少なくとも１つは、内在性宿主細胞ヘテロオリゴマー性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含む１以上の必須サブユニットの致死性突然変異を機能的に抑制しうる］をコードする少なくとも１つの核酸分子を該組換え宿主細胞において過剰発現させる。
【０１０３】
リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ａタンパク質、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｂタンパク質およびリーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるＳＴＴ３遺伝子座の欠失の致死表現型を抑制することが示されている単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼである（Ｎａｓｅｂら，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １９：３７５８−３７６８（２００８））。Ｎａｓｅｂら（同誌）は更に、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質がＷＢＰ１、ＯＳＴ１、ＳＷＰ１またはＯＳＴ２遺伝子座の欠失の致死表現型を抑制しうることを示した。Ｈｅｓｅら（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９：１６０−１７１（２００９））は、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ａ（ＳＴＴ３−１）、ＳＴＴ３Ｂ（ＳＴＴ３−２）およびＳＴＴ３Ｄ（ＳＴＴ３−４）タンパク質がＯＳＴ２、ＳＷＰ１およびＷＢＰ１遺伝子座の欠失を機能的に相補しうることを教示している。リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄ（ＬｍＳＴＴ３Ｄ）タンパク質は、宿主細胞により産生される異種糖タンパク質（例えば、抗体）のＮ−グリコシル化部位占拠を増加させうることが本明細書中の実施例に示されているΔｗｂｐ１、Δｏｓｔ１、Δｓｗｐ１およびΔｏｓｔ２突然変異の少なくとも１つの致死表現型とΔｓｔｔ３突然変異の致死表現型とを抑制しうる異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼである。
【０１０４】
前記の１以上の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼを、宿主細胞のＳＴＴ３タンパク質を含む宿主細胞の内在性ＯＴａｓｅ複合体を含むタンパク質の存在下、構成的または誘導的に過剰発現させる。各異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ遺伝子をコードする発現カセットは宿主細胞ゲノム内のいずれかの部位内に組込まれることが可能であり、あるいは宿主細胞の染色体外腔内に位置することが可能である（すなわち、自律複製遺伝的要素、例えばプラスミド、ウイルス、２μｍプラスミド、ミニ染色体など）。一般に、該異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは発現カセットにおいて該宿主細胞に供給され、それぞれの発現カセットは、特定の宿主細胞内で異種タンパク質を発現させるのに適した異種構成的または誘導的プロモーターおよび他の異種転写または翻訳調節要素に機能的に連結された単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする核酸分子を含む。各発現カセットのコピーの１以上は、組込みのための特定の遺伝子座の部位特異的標的化により、または該発現カセットをゲノム内にランダムに組込むことにより、宿主細胞のゲノム内の１以上の位置に組込まれる。標的化組込みのための遺伝子座は、該発現カセットにおける該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼの異所性構成的または誘導的発現に対する該遺伝子座の適合性に基づいて選択されうる。一重または二重交差相同組換えなどの技術により異種核酸分子を宿主細胞ゲノム内に組込むための方法は当技術分野でよく知られている（例えば、米国公開出願第２００９０１２４０００号および国際公開出願番号ＷＯ２００９０８５１３５（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい）。その代わりに、あるいは発現カセットのコピーの１以上を宿主細胞ゲノム内に組込むことに加えて、２μプラスミド、ウイルスベクター、ミニ染色体または自律的に複製する他の遺伝的ベクターを使用して、該発現カセットのコピーの１以上を宿主細胞の染色体外腔内に配置する。
【０１０５】
本発明は、複合Ｎ−グリカンを構成する哺乳類またはヒト様グリコシル化パターンを生成するように遺伝的に操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞に関して本明細書中に例示されているが、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するように本明細書に開示されているとおりには修飾されていない宿主において産生された糖タンパク質の場合と比較して、宿主細胞において産生された糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠の総量を増加させるための本発明は、哺乳類またはヒトグリコシル化パターンを生成するようには遺伝的に操作されていないが内在性または野生型グリコシル化パターン［例えば、高マンノシル化Ｎ−グリコシル化、あるいは該宿主細胞がアルファ−１，６−マンノシルアトランスフェラーゼ（ｏｃｈ１ｐ）活性を欠く場合には高マンノースＮ−グリコシル化］を有する糖タンパク質を発現するピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞にも適用されうる。本発明はまた、該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するように本明細書に開示されているとおりには修飾されていない宿主において産生される糖タンパク質の場合と比較して、宿主細胞において産生される糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠の総量を増加させるために、哺乳類またはヒト様複合体またはハイブリッドＮ−グリカンを産生するように遺伝的に操作された、あるいは内在性または野生型糖タンパク質パターン［例えば、高マンノシル化Ｎ−グリコシル化、あるいは該宿主細胞がアルファ−１，６−マンノシルアトランスフェラーゼ（ｏｃｈ１ｐ）活性を欠く場合には高マンノースＮ−グリコシル化］を有する糖タンパク質を発現する他の酵母もしくは糸状菌または植物または藻類宿主細胞にも適用されうる。本発明はまた、該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するために本明細書に開示されているとおりには修飾されていない宿主細胞において産生される糖タンパク質の場合と比較して、３以上のＮ−結合部位を有する糖タンパク質の全体的なＮ−グリコシル化部位占拠を増加させるために哺乳類発現系にも適用されうる。
【０１０６】
動物、植物および真菌のＯＴａｓｅ複合体はヘテロオリゴマー性タンパク質複合体である。十分に研究されているモデル生物サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、ＯＴａｓｅ複合体は、現在のところ、少なくとも８個の異なるサブユニット、すなわち、Ｏｓｔ１ｐ、Ｏｓｔ２ｐ、Ｗｂｐ１、Ｓｔｔ３ｐ、Ｓｗｐ１ｐ、Ｏｓｔ４ｐ、Ｏｓｔ５ｐおよびＯｓｔ３ｐ／Ｏｓｔ６ｐからなるらしい（Ｓｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ  ＆  Ｇｉｌｍｏｒｅ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１０：８４９−８５８（１９９６）；Ｋｎａｕｅｒ  ＆  Ｌｅｈｌｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４２６：２５９−２７３（１９９９）；Ｄｅｍｐｓｋｉ  ＆  Ｉｍｐｅｒｉａｌｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６：８４４−８５０（２００２）；Ｙａｎ  ＆  Ｌｅｎｎａｒｚ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４７６９２−４７７００（２００５）；Ｋｅｌｌｅｈｅｒ  ＆  Ｇｉｌｍｏｒｅ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．１６：４７Ｒ−６２Ｒ（２００６）；Ｗｅｅｒａｐａｎａ  ＆  Ｉｍｐｅｒｉａｌｉ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．１６：９１Ｒ−１０１Ｒ（２００６））。ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）においては、ＯＴａｓｅ複合体は、少なくともＯｓｔｌｐ、Ｏｓｔ２ｐ、Ｏｓｔ３ｐ、Ｏｓｔ４ｐ、Ｏｓｔ６ｐ、Ｗｂｐ１、Ｓｗｐ１ｐおよびＳｔｔ３ｐを含むらしい（Ｓｈｕｔｔｅｒら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７：５６１−５６６（２００９）を参照されたい）。
【０１０７】
ＳＴＴ３タンパク質はＯＴａｓｅ複合体における触媒サブユニットであると仮定されている（Ｙａｎ  ＆  Ｌｅｎｎａｒｚ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４７６９２−４７７００（２００２）；Ｋｅｌｌｅｈｅｒら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１２：１０１−１１１（２００３）；Ｎｉｌｓｓｏｎら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６１：７１５−７２５（２００３））。この仮定に対する裏付けは、酵母Ｓｔｔ３ｐの原核生物ホモログが、いずれの他の補助タンパク質も存在しない条件下で活性オリゴサッカリルトランスフェラーゼであることを示す実験からのものである（Ｗａｃｋｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９８：１７９０−１７９３（２００２）；Ｋｏｗａｒｉｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４：１１４８−１１５０（２００６））。酵母Ｓｔｔ３ｐと相同なタンパク質はほとんど全ての真核生物ゲノムにおいてコードされている（Ｋｅｌｌｅｈｅｒ  ＆  Ｇｉｌｍｏｒｅ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．１６：４７Ｒ−６２Ｒ（２００６））。しかし、比較ゲノム分析は、ＯＴａｓｅの組成が真核生物の進化的分岐中に複雑さを増すようになったことを示唆している。
【０１０８】
単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼはジアルディア（Ｇｉａｒｄｉａ）およびキネトプラスチッドに存在し、一方、ＳＴＴ３、ＯＳＴ１、ＯＳＴ２およびＷＢＰ１ホモログからなる４サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼはジプロモナド、アメーバおよびアピコンプレキサン種において見出される。また、推定ＳＴＴ３タンパク質の複数の形態がトリパノソマチドゲノムにおいてコードされている可能性があり、３つのＳＴＴ３ホモログがトリパノソーマ・ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）において、４つがリーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）において見出される（ＭｃＣｏｎｖｉｌｌｅら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６６：１２２−１５４（２００２）；Ｂｅｒｒｉｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３０９：４１６−４２２（２００５）；Ｉｖｅｎｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３０９：４３６−４４２（２００５）；Ｓａｍｕｅｌｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１５４８−１５５３（２００５）；Ｋｅｌｌｅｈｅｒ  ＆  Ｇｉｌｍｏｒｅ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．１６：４７Ｒ−６２Ｒ（２００６））。
【０１０９】
トリパノソマチド寄生虫においては、Ｎ−結合グリコシル化は、主として、真菌または動物細胞に関して記載されている経路をたどるが、異なるオリゴ糖構造体がタンパク質に移される（Ｐａｒｏｄｉ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３：１９３−１９９（１９９３）；ＭｃＣｏｎｖｉｌｌｅら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６６：１２２−１５４（２００２））。種に応じて、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２は、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）属においてタンパク質に移される最大グリカンであることが示されている（Ｐａｒｏｄｉ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３：１９３−１９９（１９９３））。好ましくはＧｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２を利用する酵母および哺乳類オリゴサッカリルトランスフェラーゼとは異なり、トリパノソーマオリゴサッカリルトランスフェラーゼは選択的ではなく、種々の脂質結合オリゴ糖を同率で転移する（Ｂｏｓｃｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１７３６０−１７３６５（１９８８））。したがって、最も単純な真核生物オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、細菌Ｎ−グリコシル化系において見出されるオリゴサッカリルトランスフェラーゼに類似した単一サブユニットＳＴＴ３タンパク質である。Ｎａｓａｂら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  １９：３７５８−３７６８（２００８）は、４つのリーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３タンパク質のそれぞれを別々にサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において発現させ、それらのうちの３つ、すなわち、ＬｍＳＴＴ３Ａタンパク質、ＬｍＳＴＴ３Ｂタンパク質およびＬｍＳＴＴ３Ｄタンパク質が酵母ＳＴＴ３遺伝子座の欠失を相補しうることを見出した。また、ＬｍＳＴＴ３Ｄの発現は、種々の必須ＯＴａｓｅサブユニットをコードする遺伝子における一重および二重欠失の致死表現型を抑制した。ＬｍＳＴＴ３タンパク質は酵母ＯＴａｓｅ複合体内に組込まれなかったが、その代わりに、該酵母細胞の内在性多量体酵素と置き換わりうるホモ二量体酵素を形成した。これらの単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは原核生物酵素に類似しているかもしれないが、それらは真核生物のグリコシル化に典型的な基質（すなわち、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ  Ｎ−グリコシル化認識部位およびドリコールピロホスファート結合高マンノースオリゴ糖）を利用することを、この結果は示している。
【０１１０】
酵母におけるＮ−グリコシル化部位占拠は、例えばＳｃｈｕｌｔｚおよびＡｅｂｉ，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ８：３５７−３６４（２００９）；Ｈｅｓｅら，前掲）およびＮａｓａｂら（前掲）による報告においても考察されている。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるトキソプラズマ・ゴンヂ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）またはトリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）ＳＴＴ３タンパク質の発現はｓｔｔ３欠失の致死表現型を相補することが示されており（Ｓｈａｍｓ−Ｅｌｄｉｎら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１４３：６−１１（２００５）；Ｃａｓｔｒｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：１４７５６−１４７６０（２００６））、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）ＳＴＴ３タンパク質は酵母ＯＴａｓｅ複合体内に組込まれるが、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３タンパク質はその代わりにホモ二量体を形成するらしい（Ｎａｓａｂら，前掲）。しかし、これらの報告においては、内在性タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠を測定する研究において、ＬｍＳＴＴ３Ｄタンパク質が、内在性酵母ＳＴＴ３遺伝子座および酵母ＯＴａｓｅ複合体の他の必須成分の致死性突然変異のその機能的抑制に関して試験されていた。また、該研究において使用された酵母株は、ハイブリッドまたは複合Ｎ−グリカンを含む哺乳類またはヒト様グリコシル化パターンではなく酵母グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生した。
【０１１１】
前記報告とは対照的に、本発明においては、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＬｍＳＴＴ３Ｄをコードするオープンリーディングフレームに関して本明細書に例示されているとおり）タンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、宿主細胞オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内在性遺伝子を更に発現する（これは内在性宿主細胞ＳＴＴ３遺伝子の発現を含む）組換え宿主細胞において、構成的または誘導的に過剰発現される。したがって、該宿主細胞は該異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼと該内在性宿主細胞ＯＴａｓｅ複合体（該内在性宿主細胞ＳＳＴ３タンパク質を含む）との両方を発現する。更に、組換え酵母、糸状菌、藻類または植物宿主細胞に関しては、該宿主細胞は更に、宿主細胞の内在性グリコシル化パターンを有する糖タンパク質ではなく、複合および／またはハイブリッドＮ−グリカンを含む哺乳類またはヒト様グリコシル化パターンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されうる。
【０１１２】
本発明は、哺乳類またはヒト様複合Ｎ−グリカンを産生するように遺伝的に操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を用いて本明細書中に例示されているが、酵母または真菌Ｎ−グリカン（高マンノシル化Ｎ−グリカンまたは高マンノースＮ−グリカン）を有する糖タンパク質を産生する、あるいは哺乳類またはヒト様高マンノース、複合またはハイブリッドＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された他の酵母ｏｓｔ細胞［サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を含むが、これらに限定されるものではない］または糸状菌［トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）を含むが、これに限定されるものではない］に本発明を適用して、該宿主細胞において産生される糖タンパク質の全体的なＮ−グリコシル化部位占拠を改善することが可能である。更に、植物および哺乳類発現系に本発明を適用して、これらの植物または哺乳類発現系において産生される糖タンパク質、特に、３以上のＮ−結合グリコシル化部位を有する糖タンパク質の全体的なＮ−グリコシル化部位占拠を改善することも可能である。
【０１１３】
したがって、前記の１つの態様においては、宿主細胞における異種糖タンパク質の製造方法を提供し、該方法は、少なくとも１つの異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸分子と、該異種糖タンパク質をコードする核酸分子とを含む宿主細胞［ここにおいて、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される］を準備し、該異種糖タンパク質を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、該異種糖タンパク質を産生させることを含む。
【０１１４】
前記のもう１つの態様においては、哺乳類またはヒト様複合またはハイブリッドＮ−グリカンを有する異種糖タンパク質の、宿主細胞における製造方法を提供し、該方法は、少なくとも１つの異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸分子と、該異種糖タンパク質をコードする核酸分子とを含む、ヒト様Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された宿主細胞［ここにおいて、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される］を準備し、該異種糖タンパク質を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、該異種糖タンパク質を産生させることを含む。
【０１１５】
オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子の発現は、内在性ＳＴＴ３タンパク質またはホモログをコードする内在性宿主細胞遺伝子の発現を含む。酵母宿主細胞の場合、ＯＴａｓｅ複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現され、これは、内在性ＳＴＴ３遺伝子の発現を含む。現在、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＯＴａｓｅ複合体を含むタンパク質をコードする遺伝子はＯＳＴ１、ＯＳＴ２、ＯＳＴ３、ＯＳＴ４、ＯＳＴ５、ＯＳＴ６、ＷＢＰ１、ＳＷＰ１およびＳＴＴ３を含むことが公知であり（例えば、Ｓｐｉｒｉｇら，Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５６：６２８−６３７（１９９７）を参照されたい）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）においては、ＯＴａｓｅ複合体は少なくともＯｓｔ１ｐ、Ｏｓｔ２ｐ、Ｏｓｔ３ｐ、Ｏｓｔ４ｐ、Ｏｓｔ６ｐ、Ｗｂｐ１、Ｓｗｐ１ｐおよびＳｔｔ３ｐを含むらしい（Ｓｈｕｔｔｅｒら，前掲を参照されたい）。
【０１１６】
一般に、該異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、ＯＴａｓｅ複合体、例えば酵母ＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１つの必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制しうる。したがって、該異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、ＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１つの必須タンパク質の致死突然変異を機能的に相補またはレスキューしうる。更に詳細な態様においては、ＯＴａｓｅ複合体の必須タンパク質は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および／またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＳＴＴ３遺伝子座、ＷＢＰ１遺伝子座、ＯＳＴ１遺伝子座、ＳＷＰ１遺伝子座またはＯＳＴ２遺伝子座あるいはそれらのホモログによりコードされる。一般に、Ｎ−グリコシル化部位占拠を増加させるために本発明における方法において使用されうる異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼであり、これは、特定の実施形態においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および／またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１つの必須タンパク質の致死表現型を機能的に抑制（またはレスキューもしくは相補）しうる。例えば、更に詳細な態様においては、該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼはリーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質であり、これは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１つの必須タンパク質の致死表現型を機能的に抑制（またはレスキューもしくは相補）しうる。したがって、特定の宿主細胞に関しては、特定の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼが、該単一サブユニット異種オリゴサッカリルトランスフェラーゼが酵母ＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１つの必須タンパク質の致死表現型を抑制しうる限り、その特定の宿主細胞における発現に適している。更に詳細な態様においては、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼが、該単一サブユニット異種オリゴサッカリルトランスフェラーゼがサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および／またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１つの必須タンパク質の致死表現型を機能的に抑制しうる限り、特定の宿主細胞における発現に選択される。該必須タンパク質はＯＳＴ１、ＯＳＴ２、ＷＢＰ１、ＳＷＰ１およびＳＴＴ３を含む。
【０１１７】
本明細書中で用いる致死性突然変異は、ＯＴａｓｅ複合体の必須タンパク質をコードする遺伝子の欠失または破壊、あるいは該必須タンパク質を非機能的にするコード配列における突然変異を含む。該用語は更に、ｓｈＲＮＡまたはＲＮＡｉを用いて機能性必須タンパク質の産生が損なわれるノックダウン突然変異を含みうる。
【０１１８】
更に、少なくとも１つの異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第１核酸分子と、異種糖タンパク質をコードする第２核酸分子とを含む宿主細胞を提供し、該宿主細胞は、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードするその内在性遺伝子を発現し、これは、宿主細胞ＳＴＴ３遺伝子（これは、酵母においてはＳＴＴ３遺伝子である）をコードする内在性宿主細胞遺伝子の発現を含む。酵母宿主細胞の更に詳細な態様においては、該宿主細胞は、ＯＴａｓｅ複合体を含むタンパク質をコードする内在性遺伝子を発現する。
【０１１９】
前記のいずれかの特定の態様においては、該宿主細胞は更に、単一サブユニットまたは多量体オリゴサッカリルトランスフェラーゼを含みうる追加的異種オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする１以上の核酸分子を含む。例えば、該宿主細胞は、ＬｍＳＴＴ３Ａタンパク質、ＬｍＳＴＴ３Ｂタンパク質およびＬｍＳＴＴ３Ｄタンパク質からなる群から選択される１以上の単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする１以上の核酸分子を含みうる。更に詳細な態様においては、該宿主細胞は更に、ＬｍＳＴＴ３Ｃタンパク質をコードする核酸分子を含みうる。前記のいずれかの更に詳細な態様においては、該宿主細胞は、トキソプラズマ・ゴンヂ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）ＳＴＴ３タンパク質、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）ＳＴＴ３タンパク質、トリパノソーマ・ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）ＳＴＴ３タンパク質およびシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ＳＴＴ３タンパク質からなる群から選択される１以上のオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする１以上の核酸分子を含みうる。前記のいずれかの更に詳細な態様においては、該宿主細胞は更に、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＳＴＴ３タンパク質をコードする核酸分子を含みうる。
【０１２０】
組換え糖タンパク質の発現には、酵母または糸状菌のような下等真核生物がしばしば使用される。なぜなら、それらは経済的に培養可能であり、高い収率を与えることが可能であり、適当に修飾された場合には適当なグリコシル化が可能だからである。酵母は特に、迅速なトランスフェクション、信頼できるタンパク質局在化法および簡便な遺伝子ノックアウト技術を可能にする確立された遺伝学を提供する。適当なベクターは、所望により、発現制御配列、例えばプロモーター（例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素を含む）、および複製起点、終結配列など有する。
【０１２１】
有用な下等真核宿主細胞には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）。種々の酵母、例えばクライベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）および、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）が細胞培養に特に適している。なぜなら、それらは高い細胞密度まで増殖可能であり、大量の組換えタンパク質を分泌しうるからである。同様に、本発明の糖タンパク質を工業的規模で製造するために、糸状菌、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）などが使用されうる。下等真核生物の場合、細胞を通常、約１．５〜３日間増殖させる。
【０１２２】
したがって、下等真核宿主細胞における異種糖タンパク質の製造方法を提供し、該方法は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸分子と、該異種糖タンパク質をコードする核酸分子とを含む組換え下等真核宿主細胞を準備し、該異種糖タンパク質を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、該異種糖タンパク質を産生させることを含む。
【０１２３】
更に、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第１核酸分子と、異種糖タンパク質をコードする第２核酸分子を含む宿主細胞とを含む下等真核宿主細胞を提供し、ここにおいて、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される。
【０１２４】
更に、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第１核酸分子と、異種糖タンパク質をコードする第２核酸分子とを含む酵母または糸状菌宿主細胞を提供し、ここにおいて、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される。これは内在性ＳＴＴ３遺伝子（これは、酵母においては、ＳＴＴ３遺伝子である）の発現を含む。
【０１２５】
特定の態様においては、前記の酵母または糸状菌宿主細胞は、酵母様または糸状菌様グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生する宿主細胞でありうる。該酵母グリコシル化パターンは高マンノシル化Ｎ−グリカンを含むことが可能であり、あるいは該酵母は、α１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠くように遺伝的に操作されうる。すなわち、該酵母宿主は、ｏｃｈ１ｐ活性を欠くように遺伝的に操作され、その場合、該酵母は、それ以上は高マンノシル化されない高マンノースＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生する。
【０１２６】
前記方法および宿主細胞の特定の実施形態においては、該異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、ＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１つの必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制しうる。更に詳細な態様においては、ＯＴａｓｅ複合体の必須タンパク質は、ＳＴＴ３遺伝子座、ＷＢＰ１遺伝子座、ＯＳＴ１遺伝子座、ＳＷＰ１遺伝子座またはＯＳＴ２遺伝子座あるいはそれらのホモログによりコードされる。更に詳細な態様においては、例えば、該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼはリーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質である。
【０１２７】
本発明における方法および宿主細胞は、宿主細胞において異種糖タンパク質を製造するための手段を提供し、ここで、該異種糖タンパク質の組成物のＮ−グリコシル化部位占拠は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼおよび該オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現するために本明細書に記載されているとおりには修飾されていない宿主細胞において産生される異種糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠より大きい。酵母のような下等真核宿主細胞の場合、異種糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠が、哺乳類またはヒト細胞において産生された場合の異種糖タンパク質に関して得られるものより低い場合、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼおよび該オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現する宿主細胞において糖タンパク質を産生させることにより、該宿主細胞において産生される糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠は、哺乳類またはヒト細胞における糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠と同じ又はより類似したものにされうる。実施例に示されているとおり、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼおよび該オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現するピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において産生される抗体の場合に類似したＮグリコシル化部位占拠を伴う抗体を産生しうる（図１９も参照されたい）。
【０１２８】
Ｎ−グリコシル化部位占拠を測定するための方法は、グリコシル化タンパク質および非グリコシル化タンパク質を分離し、それらの量を測定し、式：
（グリコシル化タンパク質のモル）／（グリコシル化タンパク質のモル＋非グリコシル化タンパク質のモル）×１００＝Ｎグリコシル化部位占拠率（％）
を用いて、Ｎ−グリコシル化部位占拠を決定するというものである。
【０１２９】
抗体組成物中の抗体のＮ−グリコシル化部位占拠を測定する場合、該組成物中の抗体を還元し、グリコシル化および非グリコシル化重鎖のモルを決定する。各重鎖はＡｓｎ−２９７に１つのＮ−グリコシル化部位を有する。Ｎ−グリコシル化部位占拠率（％）は、遊離したＮ−グリカンの合計モルおよび抗体重鎖の合計モルに基づいて決定される。例えば、９４％のＮ−グリコシル化部位占拠は、組成物中の重鎖の９４％がＡｓｎ−２９７にＮ−グリカンを有し、該重鎖の６％がＮ−グリカンを欠くことを示すであろう。抗体は２本の重鎖および２本の軽鎖からなる。前記の例では、組成物中の抗体において、両方の重鎖がＮ−グリカンに連結されている場合、２本の重鎖のうちの１本がＮ−グリカンを含有する場合、またはいずれの鎖もＮ−グリカンを含有しない場合がある。したがって、重鎖の９４％  Ｎ−グリコシル化部位占拠は、組成物中の抗体の約８８％が、Ｎ−グリコシル化された両方の重鎖を有し、該抗体の１１．４％が、２本の重鎖のうちの１本のみがＮ−グリコシル化された重鎖を有することを示唆するであろう。前記が正しいという定性的指標を得るために、Ｑ−ＴＯＦ（ＭＳ／ＭＳ能を有するハイブリッド四重極飛行時間型質量分析計）のような方法により、全抗体を分析する。
【０１３０】
抗体のＮ−グリコシル化部位占拠を測定するための一般的方法は、実施例３に例示されている以下の方法を用いることが可能である。抗体を重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）に還元し、グリコシル化重鎖（ＧＨＣ）および非グリコシル化重鎖（ＮＧＨＣ）の量をキャピラリー電気泳動のような方法により決定する。Ｎ−グリコシル化部位占拠は、式
（ＧＨＣのモル）／（ＧＨＣのモル＋ＮＧＨＣのモル）×１００＝Ｎグリコシル化部位ＨＣ占拠率（％）
を用いて決定される。
【０１３１】
いずれのＮ−グリコシル化部位に関しても、該部位は占拠されているか占拠されていないかのいずれかである。したがって、１００％のＮ−グリカン占拠は、１：１（１モルのＮ−グリコシル化部位、例えば還元抗体からの重鎖当たり１モルのＮ−グリカン）または２：１（２つのＮ−グリコシル化部位を有する１モルのタンパク質、例えば非還元抗体当たり２モルのＮ−グリカン）の比と同等であろう。８０％のＮ−グリカン占拠は、０．８：１（１モルのＮ−グリコシル化部位、例えば還元抗体からの重鎖当たり０．８モルのＮ−グリカン）または１．６：１（２つのＮ−グリコシル化部位を有する１モルのタンパク質、例えば非還元抗体当たり１．６モルのＮ−グリカン）の比と同等であろう。
【０１３２】
両方の重鎖がグリコシル化されている完全抗体の比率の推定値は、式：（ＧＨＣの割合）２×１００＝完全占拠抗体（両方のＮ−グリコシル化部位が占拠されている完全非還元抗体）により概算されうる。実施例３は、本発明における方法が、該組成物中の非還元完全抗体分子の約７０％〜約９０％が両方のＮ−グリコシル化部位の占拠を伴う、抗体組成物の製造を可能にすることを示している。Ｎ−グリコシル化部位占拠の測定は、還元抗体分子を使用して行ったため、この場合の結果は、単一グリコシル化部位を含有する糖タンパク質分子を含む組成物に関して、該糖タンパク質分子の８４％以上〜少なくとも９９％がＮ−グリコシル化されていたことを示している。したがって、本発明における方法および宿主細胞は、該組成物中の糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％が占拠されている糖タンパク質組成物の製造を可能にする。
【０１３３】
糖タンパク質組成物におけるＮ−グリコシル化部位占拠を測定するためのもう１つの方法は、該組成物中の糖タンパク質からＮ−グリカンを遊離させ、遊離したＮ−グリカンのモル量および糖タンパク質のモル量に該糖タンパク質上のグリコシル化部位の数を掛け算したものを測定することにより達成されうる。以下の式が用いられうる。
（Ｎグリカンの合計モル）／（糖タンパク質の合計モル×部位の数）×１００＝Ｎグリコシル化部位占拠率（％）
前記の式は、占拠されている合計Ｎ−グリコシル化部位の割合（％）を与えるであろう。
【０１３４】
下等真核生物、特に酵母は、グリコシル化パターンが哺乳類もしくはヒト様であるかヒト化されている糖タンパク質をそれが発現するように、遺伝的に修飾されうる。このようにして、特定の所望のグリコフォームが組成物中で優勢である糖タンパク質組成物が製造されうる。選択された内在性グリコシル化酵素を除去し、および／または宿主細胞を遺伝的に操作し、および／または米国公開出願第２００４／００１８５９０号（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているとおりに哺乳類グリコシル化経路の全部または一部を模擬するために外在性酵素を供給することにより、それは達成されうる。所望により、コアフコシル化を伴う又は伴わない糖タンパク質が産生されうるように、グリコシル化の追加的な遺伝的操作が行われうる。
【０１３５】
下等真核生物、例えば酵母は、グリコシル化パターンが哺乳類もしくはヒト様であるかヒト化されている糖タンパク質をそれが発現するように、遺伝的に修飾されうる。選択された内在性グリコシル化酵素を除去し、および／またはＧｅｒｎｇｒｏｓｓら，米国特許第７，４４９，３０８号（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているとおりに外在性酵素を供給することにより、それは達成されうる。したがって、本発明の特定の態様においては、該宿主細胞は酵母、例えばメチロトローフ酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）またはオガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）およびそれらの突然変異体およびそれらの遺伝的操作変異体である。このようにして、特定の所望のグリコフォームが組成物において優勢である糖タンパク質組成物が製造されうる。選択された内在性グリコシル化酵素を除去し、および／または宿主細胞を遺伝的に操作し、および／または米国特許第７，４４９，３０８号（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているとおりに哺乳類グリコシル化経路の全部または一部を模擬するために外在性酵素を供給することにより、それは達成されうる。所望により、コアフコシル化を伴う又は伴わない糖タンパク質が産生されうるように、グリコシル化の追加的な遺伝的操作が行われうる。下等真核宿主細胞、例えば酵母の使用は更に有利である。なぜなら、糖タンパク質の主要グリコフォームが該組成物中の糖タンパク質の３０モル％超（すなわち、３０モル％を超える）として存在しうるように、これらの細胞は糖タンパク質の比較的均一な組成物を産生しうる。特定の態様においては、該主要グリコフォームは、該組成物中に存在する糖タンパク質の４０モル％超、５０モル％超、６０モル％超、７０モル％超、最も好ましくは８０モル％超で存在しうる。選択された内在性グリコシル化酵素を除去し、および／またはＧｅｒｎｇｒｏｓｓら，米国特許第７，０２９，８７２号および米国特許第７，４４９，３０８号（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているとおりに外在性酵素を供給することにより、それは達成されうる。例えば、宿主細胞は、糖タンパク質上のＮ−グリカン上にマンノース残基を付加する１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠損するように選択または操作されうる。
【０１３６】
１つの実施形態においては、該宿主細胞は更に、α１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、α１，２−マンノシダーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る組換え糖タンパク質の通過は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。例えば、米国特許第７，０２９，８７２号、米国特許第７，４４９，３０８号および米国公開特許出願第２００５／０１７０４５２号（それらの開示の全てを参照により本明細書に組み入れることとする）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。
【０１３７】
更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩまたはＧｎＴ  Ｉ）触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。例えば、米国特許第７，０２９，８７２号、米国特許第７，４４９，３０８号および米国公開特許出願第２００５／０１７０４５２号（それらの開示の全てを参照により本明細書に組み入れることとする）は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生させることが可能である。
【０１３８】
更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、マンノシダーゼＩＩ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、マンノシダーゼＩＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号および米国公開特許出願第２００４／０２３００４２号（それらの開示の全てを参照により本明細書に組み入れることとする）は、マンノシダーゼＩＩ酵素を発現し、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に有する糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生させることが可能である。
【０１３９】
更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩまたはＧｎＴ  ＩＩ）触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号および第７，４４９，３０８号ならびに米国公開特許出願第２００５／０１７０４５２号（それらの開示の全てを参照により本明細書に組み入れることとする）は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生させることが可能である。
【０１４０】
更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、ガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２もしくはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはそれらの混合物を含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームもしくはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはそれらの混合物を主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号および米国公開特許出願第２００６／００４０３５３号（それらの開示の全てを参照により本明細書に組み入れることとする）は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をガラクトシダーゼでインビトロで処理して、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生させることが可能である。
【０１４１】
更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、シアリルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームもしくはＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはそれらの混合物を主に含む組換え糖タンパク質を産生する。下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌の場合、該宿主細胞が、Ｎ−グリカンへの転移のためのＣＭＰ−シアル酸を供与するための手段を更に含むことが有用である。米国公開特許出願第２００５／０２６０７２９号（その開示の全てを参照により本明細書に組み入れることとする）は、ＣＭＰ−シアル酸合成経路を有するように下等真核生物を遺伝的に操作するための方法を開示しており、米国公開特許出願第２００６／０２８６６３７号（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）は、シアル酸化糖タンパク質を産生するように下等真核生物を遺伝的に操作するための方法を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をノイラミニダーゼでインビトロで処理して、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームもしくはＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはそれらの混合物を主に含む組換え糖タンパク質を産生させることが可能である。
【０１４２】
前記宿主細胞はいずれも、米国特許第７，５９８，０５５号および米国公開特許出願第２００７／００３７２４８号（それらの開示の全てを参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているような二分岐（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）（ＧｎＴ  ＩＩＩ）および／または多分岐（ＧｎＴ  ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＩＸ）Ｎ−グリカン構造を有する糖タンパク質を産生させるためのＧｎＴ  ＩＩＩ、ＧｎＴ  ＩＶ、ＧｎＴ  Ｖ、ＧｎＴ  ＶＩおよびＧｎＴ  ＩＸからなる群から選択される１以上のＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを更に含みうる。
【０１４３】
更に詳細な実施形態においては、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生する宿主細胞は更に、ガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質を産生する。
【０１４４】
更に詳細な実施形態においては、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生した直前の宿主細胞は更に、シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、シアリルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生する。
【０１４５】
更に詳細な態様においては、前記宿主はいずれも、フコシルトランスフェラーゼ、およびフコースを産生しフコースをＥＲまたはゴルジ内に輸送する経路を含むように更に修飾される。Ｎ−グリカンの１以上がフコシル化されている糖タンパク質を産生しうるようにピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を修飾するための方法の具体例はＰＣＴ国際出願番号ＷＯ  ２００８１１２０９２（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。本発明の特定の態様においては、該ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞は、ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ、ＧＤＰ−ケト−デオキシ−マンノース−エピメラーゼ／ＧＤＰ−ケト−デオキシ−ガラクトース−レダクターゼ、ＧＤＰ−フコース輸送体およびフコシルトランスフェラーゼを含むフコシル化経路を含むように更に修飾される。特定の態様においては、フコシルトランスフェラーゼは、α１，２−フコシルトランスフェラーゼ、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ、α１，４−フコシルトランスフェラーゼおよびα１，６−フコシルトランスフェラーゼからなる群から選択される。
【０１４６】
種々の前記宿主細胞は更に、１以上の糖輸送体、例えばＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体［例えば、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体］、ＵＤＰ−ガラクトース輸送体［例えば、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＵＤＰ−ガラクトース輸送体］およびＣＭＰ−シアル酸輸送体（例えば、ヒトシアル酸輸送体）を含む。下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌は前記輸送体を欠くため、下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌は、前記輸送体を含むように遺伝的に操作されることが好ましい。
【０１４７】
宿主細胞には更に、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子ＰＮＯ１およびＭＮＮ４Ｂの一方または両方を欠失または破壊することにより、ホスホマンノース残基を有する糖タンパク質を排除するように遺伝的に操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が含まれる［例えば、米国特許第７，１９８，９２１号および第７，２５９，００７号（それらの開示の全てを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい］。更に詳細な態様においては、それは、ＭＮＮ４Ａ遺伝子を欠失または破壊することをも含みうる。破壊は、特定の酵素をコードするオープンリーディングフレームを破壊する（妨げる）こと、または該オープンリーディングフレームの発現を破壊する（妨げる）こと、または干渉性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを使用して、β−マンノシルトランスフェラーゼおよび／またはホスホマンノシルトランスフェラーゼの１以上をコードするＲＮＡの翻訳を阻害することを含む。該宿主細胞には更に、特定のＮ−グリカン構造を産生するように修飾された前記宿主細胞のいずれかが含まれうる。
【０１４８】
宿主細胞には更に、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ［Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：タンパク質（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子）（ＰＭＴ）（米国特許第５，７１４，３７７号（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい）］の１以上を欠失または破壊することにより糖タンパク質のＯ−グリコシル化を制御するように遺伝的に修飾された、あるいは公開国際出願番号ＷＯ  ２００７０６１６３１（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているとおりにＰｍｔｐインヒビターおよび／またはα１，２マンノシダーゼの存在下で増殖された、あるいはそれらの両方に付された下等真核細胞［例えば、酵母、例えば、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）］が含まれる。破壊は、Ｐｍｔｐをコードするオープンリーディングフレームを破壊する（妨げる）こと、または該オープンリーディングフレームの発現を破壊する（妨げる）こと、または干渉性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを使用して、Ｐｍｔｐの１以上をコードするＲＮＡの翻訳を阻害することを含む。該宿主細胞には更に、特定のＮ−グリカン構造を産生するように修飾された前記宿主細胞のいずれかが含まれうる。
【０１４９】
Ｐｍｔｐインヒビターには、ベンジリデンチアゾリジンジオンが含まれるが、これに限定されるものではない。使用されうるベンジリデンチアゾリジンジオンの例としては、５−［［３，４−ビス（フェニルメトキシ）フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、５−［［３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、および５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸が挙げられる。
【０１５０】
特定の実施形態においては、少なくとも１つの内在性ＰＭＴ遺伝子の機能または発現が低減、破壊または欠失される。例えば、特定の実施形態においては、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３およびＰＭＴ４遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの内在性ＰＭＴ遺伝子の機能または発現が低減、破壊または欠失され、あるいは該宿主細胞は１以上のＰＭＴインヒビターの存在下で培養される。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は１以上のＰＭＴ遺伝子の欠失または破壊を含み、該宿主細胞は１以上のＰｍｔｐインヒビターの存在下で培養される。これらの実施形態の特定の態様においては、該宿主細胞は分泌性α−１，２−マンノシダーゼをも発現する。
【０１５１】
ＰＭＴ欠失もしくは破壊および／またはＰｍｔｐインヒビターは、Ｏ−グリコシル化の占拠を低減することにより、すなわち、グリコシル化される糖タンパク質上のＯ−グリコシル化部位の総数を減少させることにより、Ｏ−グリコシル化を制御する。該細胞により分泌されるα−１，２−マンノシダーゼの更なる添加は、該糖タンパク質上に存在するＯ−グリカンのマンノース鎖長を減少させることにより、Ｏ−グリコシル化を制御する。したがって、ＰＭＴ欠失もしくは破壊および／またはＰｍｔｐインヒビターを分泌性α−１，２−マンノシダーゼの発現と組合せることは、占拠および鎖長を減少させることによりＯ−グリコシル化を制御する。個々の状況においては、個々の異種糖タンパク質（例えば、抗体）は種々の度合の効率で発現されゴルジ装置から輸送される可能性があり、したがって、ＰＭＴ欠失または破壊、Ｐｍｔｐインヒビターおよびα−１，２−マンノシダーゼの特定の組合せを要しうるため、ＰＭＴ欠失または破壊、Ｐｍｔｐインヒビターおよびα−１，２−マンノシダーゼの個々の組合せは実験的に決定される。もう１つの態様においては、１以上の内在性マンノシルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子が欠失される。この欠失は分泌性α−１，２−マンノシダーゼおよび／またはＰＭＴインヒビターの供与と組合されることが可能であり、あるいは分泌性α−１，２−マンノシダーゼおよび／またはＰＭＴインヒビターの供与の代わりに行われうる。
【０１５２】
したがって、Ｏ−グリコシル化の制御は、より良好な通算収率または適切に構築された糖タンパク質の収率で、本明細書に開示されている宿主細胞において特定の糖タンパク質を製造するのに有用でありうる。Ｏ−グリコシル化の低減または排除は糖タンパク質（例えば、全抗体）の構築および輸送に有益な効果をもたらすらしい。なぜなら、それらは分泌経路を横断し、細胞表面へ輸送されるからである。したがって、Ｏ−グリコシル化が制御された細胞においては、適切に構築された糖タンパク質、例えば抗体フラグメントの収率が、Ｏ−グリコシル化が制御されていない宿主細胞において得られる収率と比較して増加する。
【０１５３】
α−マンノシダーゼに耐性である、β−結合マンノース残基を有するＮ−グリカンおよびＯ−グリカンの可能性を減少させ又は排除するために、β−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（例えば、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４）の１以上を欠失または破壊することにより、α−マンノシダーゼ耐性Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を除去するために、組換え糖操作ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を遺伝的に操作する（米国特許第７，４６５，５７７号および米国特許第７，７１３，７１９号を参照されたい）。また、ＢＭＴ２とＢＭＴ１、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の１以上との欠失または破壊は、宿主細胞タンパク質に対する抗体に対する検出可能な交差反応性を低減または排除する。
【０１５４】
糖タンパク質の収率は、場合によっては、哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質をコードする核酸分子を過剰発現させることにより、あるいは１以上の内在性シャペロンタンパク質をコードする遺伝子を、１以上の哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質をコードする核酸分子で置換することにより改善されうる。また、宿主細胞における哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質の発現も該細胞におけるＯ−グリコシル化を制御するらしい。したがって、シャペロンタンパク質をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子の機能が低減または排除されており、該シャペロンタンパク質の哺乳類またはヒトホモログの少なくとも１つをコードするベクターが細胞内で発現される、本発明における宿主細胞が更に含まれる。また、該内在性宿主細胞シャペロンおよび該哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質が発現される宿主細胞も含まれる。更に詳細な態様においては、下等真核宿主細胞は酵母または糸状菌宿主細胞である。組換えタンパク質の収率の改善およびＯ−グリコシル化の低減または制御のためにヒトシャペロンタンパク質が導入される、宿主細胞のシャペロンの使用の具体例は、公開国際出願番号ＷＯ  ２００９１０５３５７およびＷＯ  ２０１００１９４８７（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。前記と同様に、該内在性シャペロンタンパク質の１以上をコードする遺伝子を、１以上の哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質をコードする核酸分子で置換すること、あるいは前記のとおりに１以上の哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質を過剰発現させることに加えて、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）タンパク質をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子の機能または発現が低減、破壊または欠失されている、下等真核宿主細胞が更に含まれる。特定の実施形態においては、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３およびＰＭＴ４遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの内在性ＰＭＴ遺伝子の機能が低減、破壊または欠失されている。
【０１５５】
したがって、本明細書に開示されている方法は、糖タンパク質を産生するように遺伝的に修飾されたいずれかの宿主細胞を使用することが可能であり、この場合、該主要Ｎ−グリカンは、複合Ｎ−グリカン、ハイブリッドＮ−グリカンおよび高マンノースＮ−グリカンからなる群から選択され、ここで、複合Ｎ−グリカンは、ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇｌｃ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されることが可能であり、ハイブリッドＮ−グリカンは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されることが可能であり、高マンノースＮ−グリカンは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されることが可能である。Ｎ−グリカン構造Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるＮ−グリカンを有する糖タンパク質（例えば、米国公開出願第２００５０１７０４５２に示されているもの）が更に含まれる。
【０１５６】
したがって、哺乳類またはヒト様複合またはハイブリッドＮ−グリカンを有する異種糖タンパク質の、下等真核宿主細胞における製造方法を提供し、該方法は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸分子と、該異種糖タンパク質をコードする核酸分子とを含む、ヒト様Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された下等真核宿主細胞を準備し、該異種糖タンパク質を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、該異種糖タンパク質を産生させることを含む。
【０１５７】
前記のもう１つの態様においては、哺乳類またはヒト様複合またはハイブリッドＮ−グリカンを有する異種糖タンパク質の、酵母または糸状菌宿主細胞における製造方法を提供し、該方法は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸分子と、該異種糖タンパク質をコードする核酸分子とを含む、ヒト様Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された酵母または糸状菌宿主細胞を準備し、該異種糖タンパク質を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、該異種糖タンパク質を産生させることを含む。
【０１５８】
更に、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第１核酸分子と、異種糖タンパク質をコードする第２核酸分子とを含む、哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された酵母または糸状菌宿主細胞を提供し、ここにおいて、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする宿主細胞遺伝子が発現される。これは内在性ＳＴＴ３遺伝子（これは、酵母においては、ＳＴＴ３遺伝子である）の発現を含む。
【０１５９】
一般に、前記方法および宿主細胞においては、該異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、ＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１つの必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制しうる。更に詳細な態様においては、ＯＴａｓｅ複合体の必須タンパク質はＳＴＴ３遺伝子座、ＷＢＰ１遺伝子座、ＯＳＴ１遺伝子座、ＳＷＰ１遺伝子座またはＯＳＴ２遺伝子座あるいはそれらのホモログによりコードされる。更に詳細な態様においては、例えば、該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼはリーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質である。
【０１６０】
プロモーターは、遺伝子発現を制御するためのＤＮＡ配列要素である。特に、プロモーターは転写開始部位を特定し、ＴＡＴＡボックスおよび上流プロモーター要素を含みうる。選択されるプロモーターは、選択される個々の宿主系において機能しうると予想されるものである。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような酵母が使用される場合には、酵母プロモーターが使用されるが、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）またはトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）のような宿主細胞においては真菌プロモーターが使用されるであろう。酵母プロモーターの例には、ＧＡＰＤＨ、ＡＯＸ１、ＳＥＣ４、ＨＨ１、ＰＭＡ１、ＯＣＨ１、ＧＡＬ１、ＰＧＫ、ＧＡＰ、ＴＰＩ、ＣＹＣ１、ＡＤＨ２、ＰＨＯ５、ＣＵＰ１、ＭＦα１、ＦＬＤ１、ＰＭＡ１、ＰＤＩ、ＴＥＦ、ＲＰＬ１０およびＧＵＴ１プロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。Ｒｏｍａｎｏｓら，Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８（１９９２）は酵母プロモーターおよび発現ベクターの総説を記載している。Ｈａｒｔｎｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３６：ｅ７６（ｐｕｂ  ｏｎ−ｌｉｎｅ  ６  Ｊｕｎｅ  ２００８）は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）における異種タンパク質の微調整発現のためのプロモーターのライブラリーを記載している。
【０１６１】
本明細書に開示されている核酸分子に機能的に連結されるプロモーターは構成的プロモーターまたは誘導プロモーターでありうる。誘導プロモーター、例えばＡＯＸ１プロモーターは、誘導因子に応答して、転写因子の結合に際して、増加または減少した速度での転写を導くプロモーターである。本明細書中で用いる転写因子には、プロモーターの調節または制御領域に結合して転写に影響を及ぼしうる任意の因子が含まれる。宿主細胞における転写因子のプロモーター結合能またはＲＮＡ合成は、該宿主を誘導因子にさらす又は宿主細胞培地から誘導因子を除去することにより制御されうる。したがって、誘導プロモーターの発現を調節するためには、誘導因子を宿主細胞の増殖培地に加えるか又は該増殖培地から除去する。そのような誘導因子には、糖、ホスファート、アルコール、金属イオン、ホルモン、熱、寒冷などが含まれうる。例えば、酵母において一般的に用いられる誘導因子はグルコース、ガラクトースなどである。
【０１６２】
選択される転写終結配列は、選択される個々の宿主細胞において機能しうるものである。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような酵母宿主細胞が使用される場合には、酵母転写終結配列が発現ベクターにおいて使用されるが、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）またはトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）のような宿主細胞においては真菌転写終結配列が使用されるであろう。転写終結配列には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列（ＳｃＣＹＣ  ＴＴ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３転写終結配列（ＡＬＧ３  ＴＴ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ６転写終結配列（ＡＬＧ６  ＴＴ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ１２転写終結配列（ＡＬＧ１２  ＴＴ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１転写終結配列（ＡＯＸ１  ＴＴ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＯＣＨ１転写終結配列（ＯＣＨ１  ＴＴ）およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１転写終結配列（ＰＭＡ１  ＴＴ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。他の転写終結配列が実施例および当技術分野において見出されうる。
【０１６３】
酵母を遺伝的に操作するためには、組換え宿主細胞を構築するために、必須細胞栄養素（例えば、アミノ酸）を該酵母宿主細胞が合成するのを可能にする遺伝的機能および薬物耐性マーカーを含む選択マーカーが使用されうる。酵母において一般に使用される薬物耐性マーカーには、クロラムフェニコール、カナマイシン、メトトレキセート、Ｇ４１８（ゲネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ））、ゼオシンなどが含まれる。酵母宿主細胞が必須細胞栄養素を合成するのを可能にする遺伝的機能は、対応ゲノム機能における栄養要求性突然変異を有する利用可能な酵母株と共に用いられる。一般的な酵母選択マーカーは、ロイシン（ＬＥＵ２）、トリプトファン（ＴＲＰ１およびＴＲＰ２）、プロリン（ＰＲＯ１）、ウラシル（ＵＲＡ３、ＵＲＡ５、ＵＲＡ６）、ヒスチジン（ＨＩＳ３）、リシン（ＬＹＳ２）、アデニン（ＡＤＥ１またはＡＤＥ２）などを合成するための遺伝的機能を付与する。他の酵母選択マーカーには、亜ヒ酸塩の存在下で増殖される酵母細胞に亜ヒ酸塩耐性を付与するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＡＲＲ３遺伝子が含まれる（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，Ｙｅａｓｔ，１３：８１９−８２８（１９９７）；Ｗｙｓｏｃｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３００６１−３００６６（１９９７））。幾つかの適当な組込み部位は、米国特許第７，４７９，３８９号（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に列挙されているものを含み、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および他の酵母または真菌に関して公知の遺伝子座に対するホモログを含む。酵母内にベクターを組込むための方法はよく知られている［例えば、米国特許第７，４７９，３８９号、米国特許第７，５１４，２５３号、米国公開出願第２００９０１２４００号およびＷＯ２００９／０８５１３５（それらの開示の全てを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい］。挿入部位の例には、ピチア（Ｐｈｉｃｈｉａ）ＡＤＥ遺伝子、ピチアＴＲＰ（ＴＲＰ１〜ＴＲＰ２を含む）遺伝子、ピチアＭＣＡ遺伝子、ピチアＣＹＭ遺伝子、ピチアＰＥＰ遺伝子、ピチアＰＲＢ遺伝子およびピチアＬＥＵ遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない。ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＡＤＥ１およびＡＲＧ４遺伝子はＬｉｎ  Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら，Ｇｅｎｅ  ２６３：１５９−１６９（２００１）および米国特許第４，８１８，７００号（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されており、ＨＩＳおよびＴＲＰ１遺伝子はＣｏｓａｎｏら，Ｙｅａｓｔ  １４：８６１−８６７（１９９８）に記載されており、ＨＩＳ４はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５６１８０に記載されている。
【０１６４】
本明細書に開示されている方法は哺乳類、植物および昆虫細胞における使用に応用されうる。動物細胞の例には、ＳＣ−Ｉ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ細胞、ＣＶ−Ｉ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、マウス細胞、ヒト細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＴＣＭＫ細胞、ＬＬＣ−ＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＭＲＣ−５細胞、Ｔ−ＦＬＹ細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０、ＮＳＯ細胞およびそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されるものではない。昆虫細胞には、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来の細胞が含まれる。これらの細胞は、特定の又は主として特定のＮ−グリカンを有する免疫グロブリンを該細胞が産生可能となるように遺伝的に操作されうる。例えば、米国特許第６，９４９，３７２号は、昆虫細胞におけるシアル酸化糖タンパク質の製造方法を開示している。Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４−６２２（２００４）、Ｋａｎｄａら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９４：６８０−６８８（２００６）、Ｋａｎｄａら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．１７：１０４−１１８（２００６）ならびに米国公開出願第２００５／０２１６９５８および第２００７／００２０２６０号（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）は、Ｎ−グリカンがフコースを欠くか又は減少したフコースを有する免疫グロブリンを産生しうる哺乳類細胞を開示している。米国公開特許出願第２００５／００７４８４３号（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）は、二分岐Ｎ−グリカンを有する哺乳類細胞における抗体の製造を開示している。
【０１６５】
哺乳類、昆虫または植物細胞における発現カセットの発現を調節するために選択される調節可能なプロモーターは、選択される細胞型における機能性に関して選択されるべきである。適当な調節可能なプロモーターの例には、テトラサイクリン調節可能プロモーター（例えば、Ｂｅｒｅｎｓ  ＆  Ｈｉｌｌｅｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３１０９−３１２１（２００３）を参照されたい）、ＲＵ  ４８６誘導可能プロモーター、エクジソン誘導可能プロモーターおよびカナマイシン調節可能系が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらのプロモーターは、実施例に記載されている発現カセットにおいて例示されているプロモーターの代わりに使用されうる。捕捉部分は、選択される細胞型における使用に適した細胞表面アンカータンパク質に融合されうる。ＧＰＩタンパク質を含む細胞表面アンカータンパク質は哺乳類、昆虫および植物細胞に関してよく知られている。ＧＰＩアンカー融合タンパク質はＫｅｎｎａｒｄら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏ．８：Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｊｅｎｋｉｎｓ編．Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）ｐｐ．１８７−２００（１９９９）に記載されている。安定な組込体を作製するために発現カセットを宿主細胞ゲノム内に組込むためのゲノム標的化配列が、実施例に例示されているゲノム標的化および組込み配列の代わりに使用されうる。安定および一過性トランスフェクト化哺乳類、昆虫および植物宿主細胞を作製するためのトランスフェクション方法は当技術分野でよく知られている。本明細書に開示されているとおりにトランスフェクト化宿主細胞が構築されたら、本明細書に開示されているとおりに、該細胞を、関心のある免疫グロブリンの発現に関してスクリーニングし、選択することが可能である。
【０１６６】
したがって、前記のもう１つの態様においては、哺乳類または昆虫宿主細胞における異種糖タンパク質の製造方法を提供し、該方法は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ［例えば、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３タンパク質］をコードする少なくとも１つの核酸分子と、該異種糖タンパク質をコードする核酸分子とを含む哺乳類または昆虫宿主細胞を準備し、該異種糖タンパク質を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、該異種糖タンパク質を産生させることを含む。更に詳細な態様においては、該宿主細胞は、ヒト様Ｎ−グリカン、または該宿主細胞に通常は内在しないＮ−グリカンを含有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている。
【０１６７】
前記のもう１つの態様においては、異種糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠が哺乳類または昆虫宿主細胞において８３％を超える該異種糖タンパク質の製造方法を提供し、該方法は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ［例えば、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３タンパク質］をコードする少なくとも１つの核酸分子と、該異種糖タンパク質をコードする核酸分子とを含む哺乳類または昆虫宿主細胞を準備し、該異種糖タンパク質を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、該異種糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠が８３％を超える該異種糖タンパク質を産生させることを含む。更に詳細な態様においては、該宿主細胞は、ヒト様Ｎ−グリカン、または該宿主細胞に通常は内在しないＮ−グリカンを含有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている。
【０１６８】
前記方法のもう１つの実施形態においては、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される。
【０１６９】
前記方法の特定の実施形態においては、Ｎ−グリコシル化部位占拠は少なくとも９４％である。更に詳細な実施形態においては、Ｎ−グリコシル化部位占拠は少なくとも９９％である。
【０１７０】
更に、酵母オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体の少なくとも１つの必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制しうる異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ［例えば、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質］をコードする第１核酸分子と、異種糖タンパク質をコードする第２核酸分子とを含む哺乳類または昆虫宿主細胞を提供し、この場合、内在性宿主細胞オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される。
【０１７１】
また、特定の実施形態においては、高等真核細胞、組織または生物は、植物界、例えばコムギ、イネ、トウモロコシ、タバコなどに由来するものでありうる。あるいは、コケ植物細胞が、例えば、フィスコミトレラ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）、フナリア（Ｆｕｎａｒｉａ）、スファグヌム（Ｓｐｈａｇｎｕｍ）、セラトドン（Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ）、マルチャンシア（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ）およびスフェロカルポス（Ｓｐｈａｅｒｏｃａｒｐｏｓ）属の種から選択されうる。典型的な植物細胞は、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）のコケ植物細胞であり、これはＷＯ  ２００４／０５７００２およびＷＯ  ２００８／００６５５４（それらの開示の全てを参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。植物細胞を使用する発現系は更に、主に特定のＮ−グリカンを有する免疫グロブリンを該細胞が産生することを可能にするための改変されたグリコシル化経路を有するように操作されうる。例えば、該細胞は、コアフコスルトランスフェラーゼの機能不全を有するように若しくはコアフコスルトランスフェラーゼを有さないように、および／またはキシロシルトランスフェラーゼの機能不全を有するように若しくはキシロシルトランスフェラーゼを有さないように、および／またはβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの機能不全を有するように若しくはβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを有さないように遺伝的に操作されうる。あるいは、ガラクトース、フコースおよび／またはキシロースが、該残基を除去する酵素での処理により、免疫グロブリンから除去されうる。当技術分野で公知である、Ｎ−グリカンからガラクトース、フコースおよび／またはキシロース残基を遊離させる任意の酵素、例えばα−ガラクトシダーゼ、β−キシロシダーゼおよびα−フコシダーゼが使用されうる。あるいは、１，３−フコシルトランスフェラーゼおよび／１，２−キシロシルトランスフェラーゼおよび／または１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼにより基質として利用され得ない修飾Ｎ−グリカンを合成する発現系が使用されうる。植物細胞におけるグリコシル化経路を修飾するための方法は米国特許第７，４４９，３０８号、第６，９９８，２６７号および第７，３８８，０８１号（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されており、これらは、ヒト様Ｎ−グリカンを有する組換え糖タンパク質を産生するように植物を遺伝的に操作するための方法を開示している。ＷＯ  ２００８００６５５４（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）は、キシロースまたはフコースを含有しない糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された植物における糖タンパク質、例えば抗体の製造方法を開示している。ＷＯ  ２００７００６５７０（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）は、動物またはヒト様糖グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生するようにコケ植物、有毛虫、藻類および酵母を遺伝的に操作するための方法を開示している。
【０１７２】
したがって、前記のもう１つの態様においては、哺乳類またはヒト様複合またはハイブリッドＮ−グリカンを含有する異種糖タンパク質の、植物宿主細胞における製造方法を提供し、該方法は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ［例えば、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質］をコードする核酸分子と、該異種糖タンパク質をコードする核酸分子とを含む、哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された植物宿主細胞を準備し、該異種糖タンパク質を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、該異種糖タンパク質を産生させることを含む。
【０１７３】
前記のもう１つの態様においては、異種糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠が哺乳類または昆虫宿主細胞において８３％を超える、哺乳類またはヒト様複合またはハイブリッドＮ−グリカンを有する異種糖タンパク質の製造方法を提供し、該方法は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ［例えば、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質］をコードする核酸分子と、該異種糖タンパク質をコードする核酸分子とを含む、哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された植物宿主細胞を準備し、該異種糖タンパク質を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、該異種糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠が８３％を超える、哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを有する異種糖タンパク質を産生させることを含む。
【０１７４】
前記方法のもう１つの実施形態においては、内在性宿主細胞オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される。
【０１７５】
前記方法の特定の実施形態においては、Ｎ−グリコシル化部位占拠は少なくとも９４％である。更に詳細な実施形態においては、Ｎ−グリコシル化部位占拠は少なくとも９９％である。
【０１７６】
更に、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ［例えば、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質］をコードする第１核酸分子と、異種糖タンパク質をコードする第２核酸分子とを含む植物宿主細胞を提供し、この場合、内在性宿主細胞オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される。
【０１７７】
本発明における宿主細胞および方法は多種多様な組換えタンパク質および糖タンパク質の製造に有用である。本明細書に開示されている宿主細胞において産生されうる組換えタンパク質および糖タンパク質の例には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：エリスロポエチン（ＥＰＯ）；サイトカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンω；ならびに顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）；顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；凝固因子、例えば因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸおよびヒトプロテインＣ；アンチトロンビンＩＩＩ；トロンビン；可溶性ＩｇＥ受容体α鎖；免疫グロブリンまたは抗体、例えばＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＧ融合体およびＩｇＭ；免疫接着物質および他のＦｃ融合タンパク質、例えば可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質；ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質；インターロイキン；ウロキナーゼ；キマーゼ；尿素トリプシンインヒビター；ＩＧＦ結合性タンパク質；上皮増殖因子；成長ホルモン放出因子；アネキシンＶ融合タンパク質；アンジオスタチン；血管内皮増殖因子−２；骨髄前駆体抑制因子−１；オステオプロテジェリン；α−１−アンチトリプシン；α−フェトプロテイン；ＤＮアーゼＩＩ；ヒトプラスミノーゲンのクリングル３；グルコセレブロシダーゼ；ＴＮＦ結合タンパク質１；濾胞刺激ホルモン；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ；膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド；グルカゴン様タンパク質１；またはＩＬ−２受容体アゴニスト。
【０１７８】
本明細書に開示されている組換え宿主細胞および方法は、本明細書に開示されている組換え宿主細胞および方法は、ガラクトース含有Ｎ−グリカンの比率が、本明細書に教示されているとおりに修飾される前の宿主細胞において入手可能なガラクトースの比率に比べて増加している抗体またはＦｃ融合タンパク質組成物を得ることが望ましい場合の抗体、Ｆｃ融合タンパク質などの製造に特に有用である。本発明における宿主細胞において産生されうる抗体の例には、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、重鎖抗体（例えば、ラクダまたはラマ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。具体的な抗体には、それらの一般名（標的）として列挙される以下の抗体が含まれるが、それらに限定されるものではない：ムロモナブ（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）−ＣＤ３（抗ＣＤ３受容体抗体）、アブシキシマブ（Ａｂｃｉｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ４１  ７Ｅ３抗体）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ２０抗体）、ダクリズマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ２５抗体）、バシリキシマブ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ２５抗体）、パリビズマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）（抗ＲＳＶ（呼吸器性シンシチウムウイルス）抗体）、インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）（抗ＴＮＦα抗体）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）（抗Ｈｅｒ２抗体）、ゲムツズマブ  オゾガマイシン（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）（抗ＣＤ３３抗体）、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ５２抗体）、イブリツモマブチウキセテン（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ  ｔｉｕｘｅｔｅｎ）（抗ＣＤ２０抗体）、アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＴＮＦα抗体）、オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＩｇＥ抗体）、トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）−１３１Ｉ（抗ＣＤ２０抗体のヨウ素化誘導体）、エファリズマブ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ１１ａ抗体）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）（抗ＥＧＦ受容体抗体）、ゴリムマブ（Ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＴＮＦα抗体）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体）およびそれらの変異体。本明細書に開示されている宿主細胞において産生されうるＦｃ−融合タンパク質の例には、エタンセルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）（ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質）、ＦＧＦ−２１−Ｆｃ融合タンパク質、ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質、ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質、ＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質、グルカゴン−Ｆｃ融合体、オキシントモジュリン（ｏｘｙｎｔｏｍｏｄｕｌｉｎ）−Ｆｃ−融合体、ならびにそれらの類似体および変異体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１７９】
したがって、本発明における方法および宿主細胞は、組成物中の糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％が占拠されており、該糖タンパク質が哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを有する、糖タンパク質組成物を製造するために使用されうる。
【０１８０】
更に、本発明における方法および宿主細胞は、組成物中の糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％が占拠されており、該糖タンパク質が、フコースを欠く哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを有する、糖タンパク質組成物を製造するために使用されうる。
【０１８１】
更に、哺乳類様またはヒト様Ｎ−グリカンを産生するように遺伝的に操作された酵母または糸状菌宿主細胞および該方法は、組成物中の糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％が占拠されており、該糖タンパク質が、フコースを欠く哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを有する、糖タンパク質組成物を製造するために使用されうる。
【０１８２】
いくつかの態様においては、フコシル化哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを産生するように遺伝的に操作された酵母または糸状菌宿主細胞は、組成物中の糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％が占拠されており、該糖タンパク質が、フコースを有する哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを有する、糖タンパク質組成物を製造するために使用されうる。
【０１８３】
本明細書に開示されている組換え細胞は、異種ペプチドまたは薬物分子への化学結合に適した抗体およびＦｃフラグメントを製造するために使用されうる。例えば、ＷＯ２００５０４７３３４、ＷＯ２００５０４７３３６、ＷＯ２００５０４７３３７およびＷＯ２００６１０７１２４（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）は、ペプチドまたは薬物分子をＦｃフラグメントに化学結合させることを開示している。ＥＰ１１８０１２１、ＥＰ１１０５４０９およびＵＳ６，５９３，２９５（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）は、ペプチドなどを血液成分（これは完全抗体を含む）に化学結合させることを開示している。
【０１８４】
したがって、本発明における方法および宿主細胞は、組成物中の抗体分子の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位を有し、該抗体が哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを有する、抗体組成物を製造するために使用されうる。
【０１８５】
更に、本発明における方法および宿主細胞は、組成物中の抗体分子の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位を有し、該抗体が、フコースを欠く哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを有する、抗体組成物を製造するために使用されうる。
【０１８６】
更に、哺乳類様またはヒト様Ｎ−グリカンを産生するように遺伝的に操作された酵母または糸状菌宿主細胞および該方法は、組成物中の抗体分子の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位を有し、フコースを欠く哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを有する、抗体組成物を製造するために使用されうる。
【０１８７】
いくつかの態様においては、フコシル化哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを産生するように遺伝的に操作された酵母または糸状菌宿主細胞および該方法は、組成物中の抗体分子の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位を有し、該抗体が、フコースを有する哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを有する、抗体組成物を製造するために使用されるうる。
【０１８８】
実施例３に示されているとおり、ガラクトース末端Ｎ−グリカンを産生するように遺伝的に操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株において産生される抗体のＮ−グリコシル化組成物は、約５０〜６０モル％  Ｇ０、１８〜２４モル％  Ｇ２、１２〜１７モル％  Ｍａｎ５、および３〜６モル％  ハイブリッドであるらしい。
【０１８９】
したがって、複数の抗体と医薬上許容される担体とを含む糖タンパク質組成物であって、該組成物中の抗体分子の少なくとも７０％が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位を有し、Ｎ−グリカンの約５０〜７０モル％がＧ０構造を有し、Ｎ−グリカンの１５〜２５モル％がＧ１構造を有し、Ｎ−グリカンの４〜１２モル％がＧ２構造を有し、Ｎ−グリカンの５〜１７モル％がＭａｎ５構造を有し、Ｎ−グリカンの５〜１５モル％がハイブリッド構造を有する、糖タンパク質組成物を提供する。更に、複数の抗体と医薬上許容される担体とを含む糖タンパク質組成物であって、該組成物中の抗体分子の少なくとも７０％が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位を有し、Ｎ−グリカンの約５３〜５８モル％がＧ０構造を有し、Ｎ−グリカンの２０〜２２モル％がＧ１構造を有し、Ｎ−グリカンの１６〜１８モル％がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有する、糖タンパク質組成物を提供する。前記の更に詳細な態様においては、該Ｎ−グリカンは更にフコースを含む。
【０１９０】
したがって、複数の抗体と医薬上許容される担体とを含む糖タンパク質組成物であって、該組成物中の抗体分子の少なくとも７５％が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位を有し、Ｎ−グリカンの約５０〜７０モル％がＧ０構造を有し、Ｎ−グリカンの１５〜２５モル％がＧ１構造を有し、Ｎ−グリカンの４〜１２モル％がＧ２構造を有し、Ｎ−グリカンの５〜１７モル％がＭａｎ５構造を有し、Ｎ−グリカンの５〜１５モル％がハイブリッド構造を有する、糖タンパク質組成物を提供する。更に、複数の抗体と医薬上許容される担体とを含む糖タンパク質組成物であって、該組成物中の抗体分子の少なくとも７５％が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位を有し、Ｎ−グリカンの約５３〜５８モル％がＧ０構造を有し、Ｎ−グリカンの２０〜２２モル％がＧ１構造を有し、Ｎ−グリカンの１６〜１８モル％がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有する、糖タンパク質組成物を提供する。前記の更に詳細な態様においては、該Ｎ−グリカンは更にフコースを含む。
【０１９１】
更に、複数の抗体と医薬上許容される担体とを含む糖タンパク質組成物であって、該組成物中の抗体分子の少なくとも８０％が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位を有し、Ｎ−グリカンの約５０〜７０モル％がＧ０構造を有し、Ｎ−グリカンの１５〜２５モル％がＧ１構造を有し、Ｎ−グリカンの４〜１２モル％がＧ２構造を有し、Ｎ−グリカンの５〜１７モル％がＭａｎ５構造を有し、Ｎ−グリカンの５〜１５モル％がハイブリッド構造を有する、糖タンパク質組成物を提供する。更に、複数の抗体と医薬上許容される担体とを含む糖タンパク質組成物であって、該組成物中の抗体分子の少なくとも８０％が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位を有し、Ｎ−グリカンの約５３〜５８モル％がＧ０構造を有し、Ｎ−グリカンの２０〜２２モル％がＧ１構造を有し、Ｎ−グリカンの１６〜１８モル％がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有する、糖タンパク質組成物を提供する。前記の更に詳細な態様においては、該Ｎ−グリカンは更にフコースを含む。
【０１９２】
したがって、複数の抗体と医薬上許容される担体とを含む糖タンパク質組成物であって、該組成物中の抗体分子の少なくとも８５％が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位を有し、Ｎ−グリカンの約５０〜７０モル％がＧ０構造を有し、Ｎ−グリカンの１５〜２５モル％がＧ１構造を有し、Ｎ−グリカンの４〜１２モル％がＧ２構造を有し、Ｎ−グリカンの５〜１７モル％がＭａｎ５構造を有し、Ｎ−グリカンの５〜１５モル％がハイブリッド構造を有する、糖タンパク質組成物を提供する。更に、複数の抗体と医薬上許容される担体とを含む糖タンパク質組成物であって、該組成物中の抗体分子の少なくとも８５％が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位を有し、Ｎ−グリカンの約５３〜５８モル％がＧ０構造を有し、Ｎ−グリカンの２０〜２２モル％がＧ１構造を有し、Ｎ−グリカンの１６〜１８モル％がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有する、糖タンパク質組成物を提供する。前記の更に詳細な態様においては、該Ｎ−グリカンは更にフコースを含む。
【０１９３】
更に、複数の抗体と医薬上許容される担体とを含む糖タンパク質組成物であって、該組成物中の抗体分子の少なくとも９０％が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位を有し、Ｎ−グリカンの約５０〜７０モル％がＧ０構造を有し、Ｎ−グリカンの１５〜２５モル％がＧ１構造を有し、Ｎ−グリカンの４〜１２モル％がＧ２構造を有し、Ｎ−グリカンの５〜１７モル％がＭａｎ５構造を有し、Ｎ−グリカンの５〜１５モル％がハイブリッド構造を有する、糖タンパク質組成物を提供する。更に、複数の抗体と医薬上許容される担体とを含む糖タンパク質組成物であって、該組成物中の抗体分子の少なくとも９０％が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位を有し、Ｎ−グリカンの約５３〜５８モル％がＧ０構造を有し、Ｎ−グリカンの２０〜２２モル％がＧ１構造を有し、Ｎ−グリカンの１６〜１８モル％がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有する、糖タンパク質組成物を提供する。前記の更に詳細な態様においては、該Ｎ−グリカンは更にフコースを含む。
【０１９４】
したがって、複数の抗体と医薬上許容される担体とを含む糖タンパク質組成物であって、該組成物中の抗体分子の少なくとも９５％が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位を有し、Ｎ−グリカンの約５０〜７０モル％がＧ０構造を有し、Ｎ−グリカンの１５〜２５モル％がＧ１構造を有し、Ｎ−グリカンの４〜１２モル％がＧ２構造を有し、Ｎ−グリカンの５〜１７モル％がＭａｎ５構造を有し、Ｎ−グリカンの５〜１５モル％がハイブリッド構造を有する、糖タンパク質組成物を提供する。更に、複数の抗体と医薬上許容される担体とを含む糖タンパク質組成物であって、該組成物中の抗体分子の少なくとも９５％が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位を有し、Ｎ−グリカンの約５３〜５８モル％がＧ０構造を有し、Ｎ−グリカンの２０〜２２モル％がＧ１構造を有し、Ｎ−グリカンの１６〜１８モル％がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有する、糖タンパク質組成物を提供する。前記の更に詳細な態様においては、該Ｎ−グリカンは更にフコースを含む。
【０１９５】
更に、複数の抗体と医薬上許容される担体とを含む糖タンパク質組成物であって、該組成物中の抗体分子の少なくとも９８％が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位を有し、Ｎ−グリカンの約５０〜７０モル％がＧ０構造を有し、Ｎ−グリカンの１５〜２５モル％がＧ１構造を有し、Ｎ−グリカンの４〜１２モル％がＧ２構造を有し、Ｎ−グリカンの５〜１７モル％がＭａｎ５構造を有し、Ｎ−グリカンの５〜１５モル％がハイブリッド構造を有する、糖タンパク質組成物を提供する。更に、複数の抗体と医薬上許容される担体とを含む糖タンパク質組成物であって、該組成物中の抗体分子の少なくとも９８％が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位を有し、Ｎ−グリカンの約５３〜５８モル％がＧ０構造を有し、Ｎ−グリカンの２０〜２２モル％がＧ１構造を有し、Ｎ−グリカンの１６〜１８モル％がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有する、糖タンパク質組成物を提供する。前記の更に詳細な態様においては、該Ｎ−グリカンは更にフコースを含む。
【０１９６】
したがって、複数の抗体と医薬上許容される担体とを含む糖タンパク質組成物であって、該組成物中の抗体分子の少なくとも９９％が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位を有し、Ｎ−グリカンの約５０〜７０モル％がＧ０構造を有し、Ｎ−グリカンの１５〜２５モル％がＧ１構造を有し、Ｎ−グリカンの４〜１２モル％がＧ２構造を有し、Ｎ−グリカンの５〜１７モル％がＭａｎ５構造を有し、Ｎ−グリカンの５〜１５モル％がハイブリッド構造を有する、糖タンパク質組成物を提供する。更に、複数の抗体と医薬上許容される担体とを含む糖タンパク質組成物であって、該組成物中の抗体分子の少なくとも９９％が、占拠された両方のＮ−グリコシル化部位を有し、Ｎ−グリカンの約５３〜５８モル％がＧ０構造を有し、Ｎ−グリカンの２０〜２２モル％がＧ１構造を有し、Ｎ−グリカンの１６〜１８モル％がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有する、糖タンパク質組成物を提供する。前記の更に詳細な態様においては、該Ｎ−グリカンは更にフコースを含む。
【０１９７】
特定の実施形態においては、該抗体は、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＲＳＶ（呼吸器性シンシチウムウイルス）抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＣＤ３受容体抗体、抗ＣＤ４１  ７Ｅ３抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＥＧＦ受容体抗体または抗ＣＤ２０抗体からなる群から選択される抗体を含む。
【０１９８】
本明細書において言及または記載されている全ての特許および刊行物は、本発明に関連した技術分野の当業者の技術水準を示しており、それぞれのそのような言及されている特許または刊行物を、その全体が個々に参照により組込まれている又は本明細書に完全に記載されているのと同様に、参照により本明細書に組み入れることとする。
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１Ａ】図１  Ａ〜Ｈは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０（図１Ａ）から始まるピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ１３９９２（図１Ｆ）および株ＹＧＬＹ１４４０１（図１Ｇ）の系統を示す。
【図１Ｂ】図１  Ａ〜Ｈは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０（図１Ａ）から始まるピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ１３９９２（図１Ｆ）および株ＹＧＬＹ１４４０１（図１Ｇ）の系統を示す。
【図１Ｃ】図１  Ａ〜Ｈは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０（図１Ａ）から始まるピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ１３９９２（図１Ｆ）および株ＹＧＬＹ１４４０１（図１Ｇ）の系統を示す。
【図１Ｄ】図１  Ａ〜Ｈは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０（図１Ａ）から始まるピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ１３９９２（図１Ｆ）および株ＹＧＬＹ１４４０１（図１Ｇ）の系統を示す。
【図１Ｅ】図１  Ａ〜Ｈは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０（図１Ａ）から始まるピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ１３９９２（図１Ｆ）および株ＹＧＬＹ１４４０１（図１Ｇ）の系統を示す。
【図１Ｆ】図１  Ａ〜Ｈは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０（図１Ａ）から始まるピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ１３９９２（図１Ｆ）および株ＹＧＬＹ１４４０１（図１Ｇ）の系統を示す。
【図１Ｇ】図１  Ａ〜Ｈは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０（図１Ａ）から始まるピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ１３９９２（図１Ｆ）および株ＹＧＬＹ１４４０１（図１Ｇ）の系統を示す。
【図１Ｈ】図１  Ａ〜Ｈは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０（図１Ａ）から始まるピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ１３９９２（図１Ｆ）および株ＹＧＬＹ１４４０１（図１Ｇ）の系統を示す。
【図２】図２は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）アルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸ１）プロモーターおよびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列の制御下でＬｍＳＴＴ３Ｄ  ＯＲＦをコードするプラスミドｐＧＬＹ６３０１の地図を示す。該プラスミドは、ＵＲＡ６遺伝子座を標的化するロールイン（ｒｏｌｌ−ｉｎ）ベクターである。形質転換体の選択は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＲＰＬ１０プロモーターおよびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列の制御下でサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＲＲ３  ＯＲＦによりコードされるヒ素耐性を利用する。
【図３】図３は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーターおよびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列の制御下でＬｍＳＴＴ３Ｄ  ＯＲＦをコードするプラスミドｐＧＬＹ６２９４の地図を示す。該プラスミドは、ＴＲＰ１遺伝子座を標的化するＫＩＮＫＯベクターであり、ＴＲＰ１  ＯＲＦの３’末端はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３転写終結配列に隣接している。形質転換体の選択は、アシビア・ゴシッピィ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１プロモーター（ＰＴＥＦ）およびアシビア・ゴシッピィ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１終結配列（ＴＴＥＦ）の制御下でストレプトマイセス・ノウルセイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｕｒｓｅｉ）ナーセオスリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ）ＯＲＦによりコードされるナーセオスリシン耐性を利用する。
【図４】図４はプラスミドｐＧＬＹ６の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ６は、ＵＲＡ５遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼ遺伝子または転写単位（ＳｃＳＵＣ２）を含む核酸分子を含有し、該核酸分子は、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＵＲＡ５−５’）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＵＲＡ５−３’）を含む核酸分子に隣接している。
【図５】図５はプラスミドｐＧＬＹ４０の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ４０は、ＯＣＨ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む核酸分子を含有しており、該核酸分子は、５’領域からのｌａｃＺ反復（ｌａｃＺ反復）を含む核酸分子に隣接しており、そしてこれは、一方の側では、ＯＣＨ１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＯＣＨ１−５’）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＯＣＨ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＯＣＨ１−３’）を含む核酸分子に隣接している。
【図６】図６はプラスミドｐＧＬＹ４３ａの地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ４３ａは、ＢＭＴ２遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ケイ・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）輸送体遺伝子または転写単位（ＫｌＧｌｃＮＡｃＴｒａｎｓｐ．）を含む核酸分子を含有しており、該核酸分子は、ｌａｃＺ反復（ｌａｃＺ反復）を含む核酸分子に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む核酸分子に隣接している。該隣接遺伝子は、一方の側では、ＢＭＴ２遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＰＢＳ２−５’）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＢＭＴ２遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＰＢＳ２−３’）を含む核酸分子に隣接している。
【図７】図７はプラスミドｐＧＬＹ４８の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ４８は、ＭＮＮ４Ｌ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体（ＭｍＧｌｃＮＡｃＴｒａｎｓｐ．）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のマウスホモログをコードする核酸分子を含む発現カセットを含有しており、該マウスホモログコード化核酸分子は、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーター（ＰｐＧＡＰＤＨ  Ｐｒｏｍ）を含む核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ終結配列（ＳｃＣＹＣ  ＴＴ）を含む核酸分子に機能的に連結されており、さらに前記マウスホモログコード化核酸分子は、ｌａｃＺ反復（ｌａｃＺ反復）に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む核酸分子に隣接しており、ここで、これらの発現カセットは全体として、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＭＮＮ４Ｌ１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＭＮＮ４Ｌ１−５’）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＭＮＮ４Ｌ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＭＮＮ４Ｌ１−３’）を含む核酸分子に隣接している。
【図８】図８はプラスミドｐＧＬＹ４５の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ４５は、ＰＮＯ１／ＭＮＮ４遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む核酸分子を含有し、これは、ｌａｃＺ反復（ｌａｃＺ反復）を含む核酸分子に隣接しており、そしてこの核酸分子は、一方の側では、ＰＮＯ１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＰＮＯ１−５’）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＭＮＮ４遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＭＮＮ４−３’）を含む核酸分子に隣接している。
【図９】図９はプラスミドｐＧＬＹ１４３０の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ１４３０は、ＡＤＥ１遺伝子座の発現を損なうことなくＡＤＥ１遺伝子座を標的化するＫＩＮＫＯ組込みベクターであり、（１）ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＳＥＣ１２リーダーペプチド（ＣＯ−ＮＡ１０）にＮ末端において融合したヒトＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン（コドン最適化されている）、（２）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体のマウスホモログ（ＭｍＴｒ）、（３）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＥＣ１２リーダーペプチド（ＦＢ８）にＮ末端において融合したマウスマンノシダーゼＩＡ触媒ドメイン（ＦＢ）、および（４）ｌａｃＺ反復（ｌａｃＺ）に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）をコードする４つの発現カセットを縦列配置で含有する。全体はＡＤＥ１遺伝子およびＯＲＦの５’領域（ＡＤＥ１  ５’およびＯＲＦ）、ならびにＡＤＥ１遺伝子の３’領域（ＰｐＡＤＥ１−３’）に隣接している。ＰｐＰＭＡ１  ｐｒｏｍはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターであり、ＰｐＰＭＡ１  ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１終結配列であり、ＳＥＣ４はピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＳＥＣ４プロモーターであり、ＯＣＨ１  ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＯＣＨ１終結配列であり、ＳｃＣＹＣ  ＴＴはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ終結配列であり、ＰｐＯＣＨ１  Ｐｒｏｍはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＯＣＨ１プロモーターであり、ＰｐＡＬＧ３  ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３終結配列であり、ＰｐＧＡＰＤＨはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＤＰＨプロモーターである。
【図１０】図１０はプラスミドｐＧＬＹ５８２の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ５８２は、ＨＩＳ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、（１）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＵＤＰ−グルコースエピメラーゼ（ＳｃＧＡＬ１０）、（２）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＲＥ２−ｓリーダーペプチド（３３）にＮ末端において融合したヒトガラクトシルトランスフェラーゼＩ（ｈＧａｌＴ）触媒ドメイン、（３）ｌａｃＺ反復（ｌａｃＺ反復）に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）、および（４）キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＵＤＰ−ガラクトース輸送体（ＤｍＵＧＴ）をコードする４つの発現カセットを縦列配置で含有する。全体はＨＩＳ１遺伝子の５’領域（ＰｐＨＩＳ１−５’）およびＨＩＤ１遺伝子の３’領域（ＰｐＨＩＳ１−３’）に隣接している。ＰＭＡ１はピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターであり、ＰｐＰＭＡ１  ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１終結配列であり、ＧＡＰＤＨはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＤＰＨプロモーターであり、ＳｃＣＹＣ  ＴＴはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ終結配列であり、ＰｐＯＣＨ１  Ｐｒｏｍはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＯＣＨ１プロモーターであり、ＰｐＡＬＧ１２  ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ１２終結配列である。
【図１１】図１１はプラスミドｐＧＬＹ１６７ｂの地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ１６７ｂは、ＡＲＧ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、（１）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＮＮ２リーダーペプチド（ＣＯ−ＫＤ５３）にＮ末端において融合したキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）マンノシダーゼＩＩ触媒ドメイン（コドン最適化されたもの）、（２）ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＨＩＳ１遺伝子または転写単位、および（３）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＮＮ２リーダーペプチド（ＣＯ−ＴＣ５４）にＮ末端において融合したラットＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）トランスフェラーゼＩＩ触媒ドメイン（コドン最適化されたもの）をコードする３つの発現カセットを縦列配置で含有する。全体はＡＲＧ１遺伝子の５’領域（ＰｐＡＲＧ１−５’）およびＡＲＧ１遺伝子の３’領域（ＰｐＡＲＧ１−３’）に隣接している。ＰｐＰＭＡ１  ｐｒｏｍはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターであり、ＰｐＰＭＡ１  ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１終結配列であり、ＰｐＧＡＰＤＨはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＤＰＨプロモーターであり、ＳｃＣＹＣ  ＴＴはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ終結配列であり、ＰｐＯＣＨ１  Ｐｒｏｍはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＯＣＨ１プロモーターであり、ＰｐＡＬＧ１２  ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ１２終結配列である。
【図１２】図１２はプラスミドｐＧＬＹ３４１１（ｐＳＨ１０９２）の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ３４１１（ｐＳＨ１０９２）は、ｌａｃＺ反復（ｌａｃＺ反復）に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む発現カセットを含有する組込みベクターであり、該ｌａｃＺ反復は、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ４遺伝子の５’ヌクレオチド配列（ＰｐＰＢＳ４  ５’）に、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ４遺伝子の３’ヌクレオチド配列（ＰｐＰＢＳ４  ３’）に隣接している。
【図１３】図１３はプラスミドｐＧＬＹ３４１９（ｐＳＨ１１１０）の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ３４３０（ｐＳＨ１１１５）は、ｌａｃＺ反復（ｌａｃＺ反復）に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む発現カセットを含有する組込みベクターであり、該ｌａｃＺ反復は、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ１遺伝子の５’ヌクレオチド配列（ＰＢＳ１  ５’）に、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ１遺伝子の３’ヌクレオチド配列（ＰＢＳ１  ３’）に隣接している。
【図１４】図１４はプラスミドｐＧＬＹ３４２１（ｐＳＨ１１０６）の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ４４７２（ｐＳＨ１１８６）は、ｌａｃＺ反復（ｌａｃＺ反復）に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む発現カセットを含有する組込みベクターであり、該ｌａｃＺ反復は、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ３遺伝子の５’ヌクレオチド配列（ＰｐＰＢＳ３  ５’）に、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ３遺伝子の３’ヌクレオチド配列（ＰｐＰＢＳ３  ３’）に隣接している。
【図１５】図１５はプラスミドｐＧＬＹ３６７３の地図である。プラスミドｐＧＬＹ３６７３は、ＰＲＯ１遺伝子座の発現を損なうことなくＰＲＯ１遺伝子座を標的化するＫＩＮＫＯ組込みベクターであり、キメラタンパク質を分泌経路および該細胞からの分泌に導くためのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドにＮ末端において融合したティー・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）α−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメイン（ａＭＡＴＴｒＭａｎ）をコードする発現カセットを含有する。
【図１６】図１６は、抗Ｈｅｒ２抗体の軽鎖および重鎖をコードするｐＧＬＹ６８３３の地図である。該プラスミドは、ＴＲＰ２遺伝子座を標的化するロールイン（ｒｏｌｌ−ｉｎ）ベクターである。軽鎖および重鎖をコードするＯＲＦは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーターおよびピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＣＩＴ１  ３ＵＴＲ転写終結配列の制御下にある。形質転換体の選択は、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＥＦ１プロモーターおよびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列の制御下のゼオシン耐性タンパク質（ＺｅｏｃｉｎＲ）ＯＲＦによりコードされるゼオシン耐性を利用する。
【図１７】図１７は、抗ＲＳＶ抗体の軽鎖および重鎖をコードするｐＧＬＹ６５６４の地図である。該プラスミドは、ＴＲＰ２遺伝子座を標的化するロールイン（ｒｏｌｌ−ｉｎ）ベクターである。該重鎖をコードするＯＲＦは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーターおよびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列の制御下にある。該軽鎖をコードするＯＲＦは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーターおよびピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１転写終結配列の制御下にある。形質転換体の選択は、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＥＦ１プロモーターおよびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列の制御下のゼオシン耐性タンパク質（ＺｅｏｃｉｎＲ）ＯＲＦによりコードされるゼオシン耐性を利用する。
【図１８】図１８は、ＬｍＳＴＴ３Ｄが構成的（ＧＡＰＤＨプロモーター）または誘導的（ＡＯＸ１プロモーター）に発現される株の場合に対する、対照株において産生された抗Ｈｅｒ２および抗ＲＳＶ抗体のＮ−グリコシル化部位占拠率（％）を示す。
【図１９Ａ】図１９は、ＣＨＯ細胞において産生された商業的に入手可能な抗Ｈｅｒ２抗体（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）のＮ−グリコシル化部位占拠と比較した場合の、株ＹＧＬＹ１３９９２および株ＹＧＬＹ１７３５１において産生された抗Ｈｅｒ２抗体のＮ−グリコシル化部位占拠の比較を示す。株ＹＧＬＹ１３９９２は、ＬｍＳＴＴ３Ｄをコードする発現カセットを含まないが、株ＹＧＬＹ１７３５１は、誘導性ＰｐＡＯＸ１プロモーターの制御下でＬｍＳＴＴ３をコードする発現カセットを含む。
【図１９Ｂ】図１９は、ＣＨＯ細胞において産生された商業的に入手可能な抗Ｈｅｒ２抗体（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）のＮ−グリコシル化部位占拠と比較した場合の、株ＹＧＬＹ１３９９２および株ＹＧＬＹ１７３５１において産生された抗Ｈｅｒ２抗体のＮ−グリコシル化部位占拠の比較を示す。株ＹＧＬＹ１３９９２は、ＬｍＳＴＴ３Ｄをコードする発現カセットを含まないが、株ＹＧＬＹ１７３５１は、誘導性ＰｐＡＯＸ１プロモーターの制御下でＬｍＳＴＴ３をコードする発現カセットを含む。
【図１９Ｃ】図１９は、ＣＨＯ細胞において産生された商業的に入手可能な抗Ｈｅｒ２抗体（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）のＮ−グリコシル化部位占拠と比較した場合の、株ＹＧＬＹ１３９９２および株ＹＧＬＹ１７３５１において産生された抗Ｈｅｒ２抗体のＮ−グリコシル化部位占拠の比較を示す。株ＹＧＬＹ１３９９２は、ＬｍＳＴＴ３Ｄをコードする発現カセットを含まないが、株ＹＧＬＹ１７３５１は、誘導性ＰｐＡＯＸ１プロモーターの制御下でＬｍＳＴＴ３をコードする発現カセットを含む。
【図２０】図２０は、種々のバイオリアクターにおいて増殖した株ＹＧＬＹ１７３５１において産生された抗Ｈｅｒ２抗体のＮ−グリコシル化部位占拠率（％）が、バイオリアクターの規模には無関係に一致していたことを示している。
【図２１Ａ】図２１は抗Ｈｅｒ２抗体（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）の市販ロットのＣＥおよびＱ−ＴＯＦ分析の結果を示す。
【図２１Ｂ】図２１は抗Ｈｅｒ２抗体（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）の市販ロットのＣＥおよびＱ−ＴＯＦ分析の結果を示す。
【図２２Ａ】図２２は、図２１で使用したのと同じ市販ロットに関するものであるが或る期間にわたってＰＮＧアーゼで処理された後のＣＥおよびＱ−ＴＯＦ分析の結果を示す。
【図２２Ｂ】図２２は、図２１で使用したのと同じ市販ロットに関するものであるが或る期間にわたってＰＮＧアーゼで処理された後のＣＥおよびＱ−ＴＯＦ分析の結果を示す。
【図２３Ａ】図２３Ａ〜Ｅは、ＹＧＬＹ７９６１から始まるピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ１２９００の系統を示す。
【図２３Ｂ】図２３Ａ〜Ｅは、ＹＧＬＹ７９６１から始まるピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ１２９００の系統を示す。
【図２３Ｃ】図２３Ａ〜Ｅは、ＹＧＬＹ７９６１から始まるピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ１２９００の系統を示す。
【図２３Ｄ】図２３Ａ〜Ｅは、ＹＧＬＹ７９６１から始まるピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ１２９００の系統を示す。
【図２３Ｅ】図２３Ａ〜Ｅは、ＹＧＬＹ７９６１から始まるピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ１２９００の系統を示す。
【図２４】図２４はｐＧＬＹ２４５６の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ２４５６は、ＴＲＰ２遺伝子座の発現を損なうことなくＴＲＰ２遺伝子座を標的化するＫＩＮＫＯ組込みベクターであり、（１）コドン最適化マウスＣＭＰ−シアル酸輸送体（ＣＯ  ｍＣＭＰ−Ｓｉａ  Ｔｒａｎｓｐ）、（２）ヒトＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ  ２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（コドン最適化されたもの）（ＣＯ  ｈＧＮＥ）、（３）ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＲＧ１遺伝子または転写単位、（４）コドン最適化ヒトＣＭＰ−シアル酸シンターゼ（ＣＯ  ｈＣＭＰ−ＮＡＮＡＳ）、（５）コドン最適化ヒトＮ−アセチルノイラミナート−９−ホスファートシンターゼ（ＣＯ  ｈＳＩＡＰ  Ｓ）、および（６）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＲＥ２リーダーペプチドにＮ末端において融合したコドン最適化マウスａ−２，６−シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメイン（ｃｏｍＳＴ６−３３）をコードする６つの発現カセットを含有する。全体はＴＲＰ２遺伝子およびＯＲＦの５’領域（ＰｐＴＲＰ２  ５’）ならびにＴＲＰ２遺伝子の３’領域（ＰｐＴＲＰ２−３’）に隣接している。ＰｐＰＭＡ１  ｐｒｏｍはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターであり、ＰｐＰＭＡ１  ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１終結配列であり、ＣＹＣ  ＴＴはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ終結配列であり、ＰｐＴＥＦ  Ｐｒｏｍはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＥＦ１プロモーターであり、ＰｐＴＥＦ  ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＥＦ１終結配列であり、ＰｐＡＬＧ３  ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３終結配列であり、ｐＧＡＰはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＤＰＨプロモーターである。
【図２５】図２５はｐＧＬＹ５０４８の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ５０４８は、ＳＴＥ１３遺伝子座を標的化するＫＩＮＫＯ組込みベクターであり、（１）キメラタンパク質を分泌経路および該細胞からの分泌に導くためのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドにＮ末端において融合したティー・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）α−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメイン（ａＭＡＴＴｒＭａｎ）、ならびに（２）ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５または転写単位をコードする発現カセットを含有する。
【図２６】図２６はプラスミドｐＧＬＹ５０１９の地図である。プラスミドｐＧＬＹ５０１９は、ＤＡＰ２遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、アシビア・ゴシッピィ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１プロモーターおよびアシビア・ゴシッピィ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１終結配列に機能的に連結されたナーセオスリシン（Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）耐性（ＮＡＴＲ）ＯＲＦをコードする核酸分子を含む発現カセットを含有し、該核酸分子は、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＤＡＰ２遺伝子の５’ヌクレオチド配列に隣接しており、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＤＡＰ２遺伝子の３’ヌクレオチド配列に隣接している。
【図２７】図２７はｐＧＬＹ５０８５のプラスミド地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ５０８５は、シアル酸化Ｎ−グリカンの産生に関与する第２セットの遺伝子をピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）内に導入するためのＫＩＮＫＯプラスミドである。該プラスミドは、ヒグロマイシン耐性（ＨｙｇＲ）をコードする発現カセットでピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＲＧ１遺伝子が置換されていること、および該プラスミドがピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＲＰ５遺伝子を標的化すること以外は、プラスミドＹＧＬＹ２４５６に類似している。それらの６つの縦列カセットは、一方の側では、ＴＲＰ５遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列およびＯＲＦ（これは終止コドンで終わる）ならびにそれに続くピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３終結配列を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＴＲＰ５遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子に隣接している。
【図２８】図２８はｐＧＬＹ７２４０のプラスミド地図を示す。該プラスミドは、ＴＰ２遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＥＦ１プロモーターおよびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ終結配列の制御下でゼオシン耐性タンパク質（ＺｅｏｃｉｎＲ）をコードするＯＲＦを含有する。該プラスミドは、５’末端においてピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーターに、そして３’末端においてサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列に機能的に連結されたＧＭ−ＣＳＦ／ＣＷＰ１融合タンパク質をコードしている。
【図２９】図２９は、ＬｍＳＴＴ３Ｄを共発現する株ＹＧＬＹ１６３４９において産生されたＧＭ−ＣＳＦのウエスタンブロットを示す。ＧＭ−ＣＳＦ（レーン２〜８）の大部分が２Ｎ−結合部位でグリコシル化されていることが示されており、これとは対照的に、対照株（ＹＧＬＹ１５５６０、レーン９）においては、ＧＭ−ＣＳＦは主に１Ｎ部位でＮ−グリコシル化されており、２Ｎ部位での少量のＮ−グリコシル化体および非グリコシル化体を伴うことが示されている。
【図３０Ａ】図３０は、それぞれＹＧＬＹ１５５６０（Ａ）およびＹＧＬＹ１６３４９（Ｂ）から発現されたＧＭ−ＣＳＦのＱ−ＴＯＰ分析を示す。非グリコシル化ＧＭ−ＣＳＦは検出されなかった。
【図３０Ｂ】図３０は、それぞれＹＧＬＹ１５５６０（Ａ）およびＹＧＬＹ１６３４９（Ｂ）から発現されたＧＭ−ＣＳＦのＱ−ＴＯＰ分析を示す。非グリコシル化ＧＭ−ＣＳＦは検出されなかった。  以下の実施例は本発明の更なる理解を促すことを意図したものである。
【実施例１】
【０２００】
誘導または構成プロモーターに機能的に連結されたリーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄ（ＬｍＳＴＴ３Ｄ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする発現カセットを含むプラスミドを以下のとおりに構築した。
【０２０１】
ＬｍＳＴＴ３Ｄをコードするオープンリーディングフレーム（配列番号１２）をピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における最適発現のためにコドン最適化し、合成した（ＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧ，Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙにより行われた）。ＬｍＳＴＴ３Ｄをコードするコドン最適化核酸分子をｐＧＬＹ６２８７と命名し、それは、配列番号１１に示されているヌクレオチド配列を有する。
【０２０２】
プラスミドｐＧＬＹ６３０１（図２）は、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるＵＲＡ６遺伝子座を標的化するロールイン（ｒｏｌｌ−ｉｎ）組込みプラスミドである。ＬｍＳＴＴ３Ｄをコードする発現カセットは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における有効な発現のためにコドン最適化されたＬｍＳＴＴ３Ｄ  ＯＲＦをコードする核酸分子を含み、該核酸分子は、５’末端においては、誘導性ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーター配列（配列番号２３）を有する核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列（配列番号２４）を有する核酸分子に機能的に連結されている。形質転換体を選択するために、該プラスミドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＲＲ３  ＯＲＦをコードする発現カセットを含み、ここで、該ＯＲＦ（配列番号３２）をコードする核酸分子は、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＲＬ１０プロモーター配列（配列番号２５）を有する核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列（配列番号２４）を有する核酸分子に機能的に連結されている。該プラスミドは更に、ＵＲＡ６遺伝子座（配列番号３３）を標的化するための核酸分子を含む。５’末端においてＥｃｏＲＩ部位に、そして３’末端においてＦｓｅＩ部位に隣接したコドン最適化ＬｍＳＴＴ３Ｄ  ＯＲＦ（ｐＧＬＹ６２８７）をコードするＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩおよびＦｓｅＩで消化されたプラスミドｐＧＦＩ３０ｔ内にクローニングすることにより、プラスミドｐＧＬＹ６３０１を構築した。
【０２０３】
プラスミドｐＧＬＹ６２９４（図３）は、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるＴＲＰ１遺伝子座を、該遺伝子座の発現を破壊することなく標的化するＫＩＮＫＯ組込みベクターである。ＫＩＮＫＯ（Ｋｎｏｃｋ−Ｉｎ  ｗｉｔｈ  ｌｉｔｔｌｅ  ｏｒ  Ｎｏ  Ｋｎｏｃｋ−Ｏｕｔ）組込みベクターは、標的化遺伝子座内への異種ＤＮＡの挿入を、該標的化遺伝子座における遺伝子の発現を損なうことなく可能にし、米国公開出願第２００９０１２４０００号に記載されている。ＬｍＳＴＴ３Ｄをコードする発現カセットは、ＬｍＳＴＴ３Ｄ  ＯＲＦをコードする核酸分子を含み、該核酸分子は、５’末端においては、構成的ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーター配列（配列番号２６）を有する核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列（配列番号２４）を有する核酸分子に機能的に連結されている。形質転換体を選択するために、該プラスミドは、ノウルセオスリシン（Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）耐性（ＮＡＴＲ）ＯＲＦ［元々はｐＡＧ２５（ＥＲＯＳＣＡＲＦ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ＧｍｂＨ，Ｄａｉｍｌｅｒｓｔｒａｓｓｅ  １３ａ，Ｄ−６１３５２  Ｂａｄ  Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）由来；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら，Ｙｅａｓｔ  １５：１５４１（１９９９）を参照されたい］をコードする発現カセットを含み、ここで、該ＯＲＦ（配列番号３４）をコードする核酸分子は、５’末端においては、アシビア・ゴシピィ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１プロモーター配列（配列番号８６）を有する核酸分子に、そして３’末端においては、アシビア・ゴシピィ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１終結配列（配列番号８７）を有する核酸分子に機能的に連結されている。それらの２つの発現カセットは、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３終結配列（配列番号２９）を有する核酸分子に連結された、終止コドンで終わるＴｒｐ１ｐをコードするＯＲＦの５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号３０）を含む核酸分子に、そして他方の側では、ＴＲＰ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号３１）を含む核酸分子に隣接している。５’末端においてＮｏｔＩ部位に、そして３’末端においてＰａｃＩ部位に隣接したコドン最適化ＬｍＳＴＴ３Ｄ  ＯＲＦ（ｐＧＬＹ６２８７）をコードするＤＮＡ断片を、ＮｏｔＩおよびＦｓｅＩで消化されたプラスミドｐＧＬＹ５９７内にクローニングすることにより、プラスミドｐＧＬＹ６２９４を構築した。アシビア・ゴシピィ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１プロモーター（ＰＴＥＦ）およびアシビア・ゴシピィ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１終結配列（ＴＴＥＦ）に機能的に連結されたノウルセオスリシン（Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）耐性ＯＲＦ（ＮＡＴ）をコードする核酸分子を含む発現カセット。
【０２０４】
前記プラスミドは、以下の実施例に示されているとおりに、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において産生される糖タンパク質上のＮ−グリコシル化部位占拠を増加させるためにＬｍＳＴＴ３Ｄ発現カセットをピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）内に導入するために使用されうる。
【実施例２】
【０２０５】
遺伝的に操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ１３９９２は、組換えヒト抗Ｈｅｒ２抗体を産生する株であり、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ１４４０１は、組換えヒト抗ＲＳＶ抗体を産生する株である。該株の構築は図１Ａ〜１Ｈに図示されている。簡潔に説明すると、以下のとおりに該株を構築した。
【０２０６】
株ＹＧＬＹ８３１６は、既に記載されている方法（例えば、米国特許第７，４４９，３０８号、米国特許第７，４７９，３８９号、米国公開出願第２００９０１２４０００号、公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ２００９０８５１３５、ＮｅｔｔおよびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｙｅａｓｔ  ２０：１２７９（２００３）、Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：５０２２（２００３）、Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：１２４４（２００３）を参照されたい）を用いて野生型ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＮＲＲＬ−Ｙ  １１４３０から構築した。全てのプラスミドは、標準的な分子生物学的方法を用いて、ｐＵＣ１９プラスミドにおいて作製した。ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関して最適化されたヌクレオチド配列に関しては、天然ヌクレオチド配列をＧＥＮＥＯＰＴＩＭＩＺＥＲソフトウェア（ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により解析し、その結果を用いて、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現に関してコドンが最適化されたヌクレオチド配列を得た。酵母株をエレクトロポレーション（エレクトロポレーターＢｉｏ  Ｒａｄの製造業者により推奨されている標準的な技術を用いるもの）により形質転換した。
【０２０７】
プラスミドｐＧＬＹ６（図４）は、ＵＲＡ５遺伝子座を標的化する組込みベクターである。それは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼ遺伝子または転写単位（ＳｃＳＵＣ２；配列番号３８）を含む核酸分子を含有し、該核酸分子は、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号３９）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号４０）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ６を線状化し、該線状化プラスミドを野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ  １１４３０内に形質転換して、ＳｃＳＵＣ２遺伝子がＵＲＡ５遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ１−３を選択した。これはウラシルに対して栄養要求性である。
【０２０８】
プラスミドｐＧＬＹ４０（図５）は、ＯＣＨ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（配列番号４１）を含む核酸分子を含有しており、該核酸分子は、ｌａｃＺ反復を含む核酸分子（配列番号４２）に隣接しており、そしてこれは、一方の側では、ＯＣＨ１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号４３）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＯＣＨ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号４４）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ４０をＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ１−３内に形質転換して、ｌａｃＺ反復に隣接したＵＲＡ５遺伝子がＯＣＨ１遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ２−３を選択した。これはＵＲＡ５に対して原栄養性である。株ＹＧＬＹ２−３を５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）の存在下で対抗選択して、ＵＲＡ５遺伝子が喪失しｌａｃＺ反復だけがＯＣＨ１遺伝子座内に残存した幾つかの株を得た。これは、該株をウラシルに対して栄養要求性にする。株ＹＧＬＹ４−３を選択した。
【０２０９】
プラスミドｐＧＬＹ４３ａ（図６）は、ＢＭＴ２遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ケイ・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）輸送体遺伝子または転写単位（ＫｌＭＮＮ２−２、配列番号４５）を含む核酸分子を含有しており、該核酸分子は、ｌａｃＺ反復を含む核酸分子に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位を含む核酸分子に隣接している。該隣接遺伝子は、一方の側では、ＢＭＴ２遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号４６）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＢＭＴ２遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号４７）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ４３ａをＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ４−３内に形質転換して、ｌａｃＺ反復に隣接したＫｌＭＮＮ２−２遺伝子およびＵＲＡ５遺伝子がＢＭＴ２遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。ＢＭＴ２遺伝子はＭｉｌｌｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：９７２４−９７３６（２００８）および米国特許第７，４６５，５５７号に開示されている。得られた株から株ＹＧＬＹ６−３を選択した。これはウラシルに対して原栄養性である。株ＹＧＬＹ６−３を５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ＵＲＡ５遺伝子が喪失しｌａｃＺ反復だけが残存した株を得た。これは、該株をウラシルに対して栄養要求性にする。株ＹＧＬＹ８−３を選択した。
【０２１０】
プラスミドｐＧＬＹ４８（図７）は、ＭＮＮ４Ｌ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体（配列番号４８）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のマウスホモログをコードする核酸分子を含む発現カセットを含有しており、該マウスホモログコード化核酸分子は、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーターを含む核酸分子（配列番号２６）に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ終結配列を含む核酸分子（配列番号２４）に機能的に連結されており、さらに前記マウスホモログコード化核酸分子は、ｌａｃＺ反復に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子を含む核酸分子に隣接しており、ここで、これらの発現カセットは全体として、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＭＮＮ４Ｌ１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号４９）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＭＮＮ４Ｌ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号５０）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ４８をＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ８−３内に形質転換して、マウスＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体およびＵＲＡ５遺伝子をコードする発現カセットがＭＮＮ４Ｌ１遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。ＭＮＮ４Ｌ１遺伝子（ＭＮＮ４Ｂとも称される）は米国特許第７，２５９，００７号に開示されている。得られた株から株ＹＧＬＹ１０−３を選択し、ついで５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ＵＲＡ５遺伝子が喪失しｌａｃＺ反復だけが残存した幾つかの株を得た。株ＹＧＬＹ１２−３を選択した。
【０２１１】
プラスミドｐＧＬＹ４５（図８）は、ＰＮＯ１／ＭＮＮ４遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位を含む核酸分子を含有し、これは、ｌａｃＺ反復を含む核酸分子に隣接しており、そしてこの核酸分子は、一方の側では、ＰＮＯ１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号５１）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＭＮＮ４遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号５２）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ４５をＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ１２−３内に形質転換して、ｌａｃＺ反復に隣接したＵＲＡ５遺伝子がＰＮＯ１／ＭＮＮ４遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。ＰＮＯ１遺伝子は米国特許第７，１９８，９２１号に開示されており、ＭＮＮ４遺伝子（ＭＮＮ４Ｂとも称される）は米国特許第７，２５９，００７号に開示されている。得られた株から株ＹＧＬＹ１４−３を選択し、ついで５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ＵＲＡ５遺伝子が喪失しｌａｃＺ反復だけが残存した幾つかの株を得た。株ＹＧＬＹ１６−３を選択した。
【０２１２】
プラスミドｐＧＬＹ１４３０（図９）は、ＡＤＥ１遺伝子座の発現を損なうことなくＡＤＥ１遺伝子座を標的化するＫＩＮＫＯ組込みベクターであり、（１）キメラ酵素をＥＲまたはゴルジに標的化するピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＳＥＣ１２リーダーペプチド（１０）にＮ末端において融合したヒトＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン（ＮＡ）、（２）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体のマウスホモログ（ＭｍＴｒ）、（３）キメラ酵素をＥＲまたはゴルジに標的化するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＥＣ１２リーダーペプチド（８）にＮ末端において融合したマウスマンノシダーゼＩＡ触媒ドメイン（ＦＢ）、および（４）ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位をコードする４つの発現カセットを縦列配置で含有する。ＫＩＮＫＯ（Ｋｎｏｃｋ−Ｉｎ  ｗｉｔｈ  ｌｉｔｔｌｅ  ｏｒ  Ｎｏ  Ｋｎｏｃｋ−Ｏｕｔ）組込みベクターは、標的化遺伝子座内への異種ＤＮＡの挿入を、該標的化遺伝子座における遺伝子の発現を損なうことなく可能にし、米国公開出願第２００９０１２４０００号に記載されている。ＮＡ１０をコードする発現カセットは、ＳＥＣ１２リーダー１０をコードする核酸分子（配列番号５４）に５’末端において融合している、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたヒトＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ触媒ドメインをコードする核酸分子（配列番号５３）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。ＭｍＴｒをコードする発現カセットは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体ＯＲＦのマウスホモログをコードする核酸分子を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＳＥＣ４プロモーターを含む核酸分子（配列番号５５）に、そして３’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＯＣＨ１終結配列を含む核酸分子（配列番号５６）に機能的に連結されている。ＦＢ８をコードする発現カセットは、ＳＥＣ１２−ｍリーダー８をコードする核酸分子（配列番号５８）に５’末端において融合している、マウスマンノシダーゼＩＡ触媒ドメインをコードする核酸分子（配列番号５７）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＤＰＨプロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。該ＵＲＡ５発現カセットは、ｌａｃＺ反復を含む核酸分子に隣接したピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位を含む核酸分子を含む。それらの４つの縦列カセットは、一方の側では、ＡＤＥ１遺伝子の５’領域および完全ＯＲＦからのヌクレオチド配列（配列番号５９）ならびにそれに続くピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３終結配列（配列番号２９）��含む核酸分子に、そして他方の側では、ＡＤＥ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号６０）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ１４３０をＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ１６−３内に形質転換して、それらの４つの縦列発現カセットがＡＤＥ１  ＯＲＦの直後のＡＤＥ１遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ２７９８を選択した。これはアルギニンに対して栄養要求性であり、今やウリジン、ヒスチジンおよびアデニンに対して原栄養性である。ついで該株を５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ウリジンに対して今や栄養要求性である幾つかの株を得た。株ＹＧＬＹ３７９４を選択した。これは、主としてガラクトースを末端とするＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生しうる。
【０２１３】
プラスミドｐＧＬＹ５８２（図１０）は、ＨＩＳ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、（１）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＵＤＰ−グルコースエピメラーゼ（ＳｃＧＡＬ１０）、（２）キメラ酵素をＥＲまたはゴルジに標的化するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＲＥ２−ｓリーダーペプチド（３３）にＮ末端において融合したヒトガラクトシルトランスフェラーゼＩ（ｈＧａｌＴ）触媒ドメイン、（３）ｌａｃＺ反復に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位、および（４）キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＵＤＰ−ガラクトース輸送体（ＤｍＵＧＴ）をコードする４つの発現カセットを縦列配置で含有する。ＳｃＧＡＬ１０をコードする発現カセットは、ＳｃＧＡＬ１０  ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号６１）を含み、該ＯＲＦは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターを含む核酸分子（配列番号８８）に機能的に連結されており、３’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１転写終結配列を含む核酸分子（配列番号６２）に機能的に連結されている。キメラガラクトシルトランスフェラーゼＩをコードする発現カセットは、ＫＲＥ２−ｓリーダー３３をコードする核酸分子（配列番号６４）に５’末端において融合している、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたｈＧａｌＴ触媒ドメインをコードする核酸分子（配列番号６３）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。該ＵＲＡ５発現カセットは、ｌａｃＺ反復を含む核酸分子に隣接したピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位を含む核酸分子を含む。ＤｍＵＧＴをコードする発現カセットは、ＤｍＵＧＴ  ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号６５）を含み、該ＯＲＦは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＯＣＨ１プロモーターを含む核酸分子（配列番号６６）に機能的に連結されており、３’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ１２転写終結配列を含む核酸分子（配列番号６７）に機能的に連結されている。それらの４つの縦列カセットは、一方の側では、ＨＩＳ１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号６８）を含む核酸分子に、そして他方の側では、ＨＩＳ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号６９）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ５８２を線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ３７９４内に形質転換して、それらの４つの縦列発現カセットがＨＩＳ１遺伝子座内に相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。株ＹＧＬＹ３８５３を選択した。これはヒスチジンに対して栄養要求性であり、ウリジンに対して原栄養性である。
【０２１４】
プラスミドｐＧＬＹ１６７ｂ（図１１）は、ＡＲＧ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、（１）キメラ酵素をＥＲまたはゴルジに標的化するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＮＮ２リーダーペプチド（５３）にＮ末端において融合したキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）マンノシダーゼＩＩ触媒ドメイン（ＫＤ）、（２）ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＨＩＳ１遺伝子または転写単位、および（３）キメラ酵素をＥＲまたはゴルジに標的化するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＮＮ２リーダーペプチド（５４）にＮ末端において融合したラットＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）トランスフェラーゼＩＩ触媒ドメイン（ＴＣ）をコードする３つの発現カセットを縦列配置で含有する。ＫＤ５３をコードする発現カセットは、ＭＮＮ２リーダー５３をコードする核酸分子（配列番号７１）に５’末端において融合している、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）マンノシダーゼＩＩ触媒ドメインをコードする核酸分子（配列番号７０）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。該ＨＩＳ１発現カセットは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＨＩＳ１遺伝子または転写単位（配列番号７２）を含む核酸分子を含む。ＴＣ５４をコードする発現カセットは、ＭＮＮ２リーダー５４をコードする核酸分子（配列番号７４）に５’末端において融合している、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたラットＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインをコードする核酸分子（配列番号７３）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。それらの３つの縦列カセットは、一方の側では、ＡＲＧ１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号７５）を含む核酸分子に、そして他方の側では、ＡＲＧ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号７６）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ１６７ｂをＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ３８５３内に形質転換して、それらの３つの縦列発現カセットがＡＲＧ１遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ４７５４を選択した。これはアルギニンに対して栄養要求性であり、ウリジンおよびヒスチジンに対して原栄養性である。ついで該株を５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ウリジンに対して今や栄養要求性である幾つかの株を得た。株ＹＧＬＹ４７９９を選択した。
【０２１５】
プラスミドｐＧＬＹ３４１１（図１２）は、ｌａｃＺ反復に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子を含む発現カセットを含有する組込みベクターであり、該ｌａｃＺ反復は、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ４遺伝子の５’ヌクレオチド配列（配列番号７７）に、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ４遺伝子の３’ヌクレオチド配列（配列番号７８）に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ３４１１を線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ４７９９内に形質転換して、該ＵＲＡ５発現カセットがＢＭＴ４遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ６９０３を選択した。これはウラシル、アデニン、ヒスチジン、プロリン、アルギニンおよびトリプトファンに対して原栄養性である。ついで該株を５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ウリジンに対して今や栄養要求性である幾つかの株を得た。株ＹＧＬＹ７４３２およびＹＧＬＹ７４３３を選択した。
【０２１６】
プラスミドｐＧＬＹ３４１９（図１３）は、ｌａｃＺ反復（ｌａｃＺ反復）に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む発現カセットを含有する組込みベクターであり、該ｌａｃＺ反復は、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ１遺伝子の５’ヌクレオチド配列（配列番号７９）に、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ１遺伝子の３’ヌクレオチド配列（配列番号８０）に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ３４１９を線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ７４３２およびＹＧＬＹ７４３３内に形質転換して、該ＵＲＡ５発現カセットがＢＭＴ１遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ７６５６およびＹＧＬＹ７６５１を選択した。これはウラシル、アデニン、ヒスチジン、プロリン、アルギニンおよびトリプトファンに対して原栄養性である。ついで該株を５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ウリジンに対して今や栄養要求性である幾つかの株を得た。株ＹＧＬＹ７９３０およびＹＧＬＹ７９４０を選択した。
【０２１７】
プラスミドｐＧＬＹ３４２１（図１４）は、ｌａｃＺ反復（ｌａｃＺ反復）に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む発現カセットを含有する組込みベクターであり、該ｌａｃＺ反復は、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ３遺伝子の５’ヌクレオチド配列（配列番号８１）に、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ３遺伝子の３’ヌクレオチド配列（配列番号８２）に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ３４１９を線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ７９３０およびＹＧＬＹ７９４０内に形質転換して、該ＵＲＡ５発現カセットがＢＭＴ１遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ７９６５およびＹＧＬＹ７９６１を選択した。これはウラシル、アデニン、ヒスチジン、プロリン、アルギニンおよびトリプトファンに対して原栄養性である。
【０２１８】
プラスミドｐＧＬＹ３６７３（図１５）は、ＰＲＯ１遺伝子座の発現を損なうことなくＰＲＯ１遺伝子座を標的化するＫＩＮＫＯ組込みベクターであり、キメラタンパク質を分泌経路および該細胞からの分泌に導くためのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドにＮ末端において融合したティー・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）α−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメイン（ａＭＡＴＴｒＭａｎ）をコードする発現カセットを含有する。ａＭＡＴＴｒＭａｎをコードする発現カセットは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドをコードする核酸分子（配列番号１３）に５’末端において融合したティー・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）触媒ドメインをコードする核酸分子（配列番号８３）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーターを含む核酸分子（配列番号２３）に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を含む核酸分子（配列番号２４）に機能的に連結されている。該カセットは、一方の側では、ＰＲＯ１遺伝子の５’領域および完全ＯＲＦからのヌクレオチド配列（配列番号８９）ならびにそれに続くピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３終結配列を含む核酸分子に、そして他方の側では、ＰＲＯ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号９０）を含む核酸分子に隣接している。該プラスミドはＰｐＡＲＧ１遺伝子を含有する。プラスミドｐＧＬＹ３６７３を株ＹＧＬＹ７９６５およびＹＧＬＹ７９６１内に形質転換して幾つかの株を得、得られた株からＹＧＬＹ７８３１６およびＹＧＬＹ８３２３を選択した。
【０２１９】
プラスミドｐＧＬＹ６８３３（図１６）は、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるＴＲＰ２遺伝子座を標的化する抗Ｈｅｒ２抗体の軽鎖および重鎖をコードするロールイン（ｒｏｌｌ−ｉｎ）組込みプラスミドである。抗Ｈｅｒ２重鎖をコードする発現カセットは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における有効な発現のためにコドン最適化された重鎖ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号１５）を含み、これは、５’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）接合因子プレシグナル配列（配列番号１４）をコードする核酸分子に機能的に連結されており、そしてこれは、そのＮ末端において、誘導性ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーター配列（配列番号２３）を有する核酸分子に、そして３’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＣＩＴ１転写終結配列（配列番号８５）を有する核酸分子に融合している。抗Ｈｅｒ２軽鎖をコードする発現カセットは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における有効な発現のためにコドン最適化された軽鎖ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号１７）を含み、これは、５’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）接合因子プレシグナル配列（配列番号１４）をコードする核酸分子に機能的に連結されており、そしてこれは、そのＮ末端において、誘導性ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーター配列（配列番号２３）を有する核酸分子に、そして３’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＣＩＴ１転写終結配列（配列番号８５）を有する核酸分子に融合している。形質転換体を選択するために、該プラスミドは、ゼオシンＯＲＦをコードする発現カセットを含み、ここで、該ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号３５）は、５’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＥＦプロモーター配列（配列番号３７）を有する核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列（配列番号２４）を有する核酸分子に機能的に連結されている。該プラスミドは更に、ＴＲＰ２遺伝子座を標的化するための核酸分子（配列番号９１）を含む。
【０２２０】
プラスミドｐＧＬＹ６５６４（図１７）は、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるＴＲＰ２遺伝子座を標的化する抗ＲＳＶ抗体の軽鎖および重鎖をコードするロールイン（ｒｏｌｌ−ｉｎ）組込みプラスミドである。抗ＲＳＶ重鎖をコードする発現カセットは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における有効な発現のためにコドン最適化された重鎖ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号１９）を含み、これは、５’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）接合因子プレシグナル配列（配列番号１４）をコードする核酸分子に機能的に連結されており、そしてこれは、そのＮ末端において、誘導性ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーター配列（配列番号２３）を有する核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列（配列番号２４）を有する核酸分子に融合している。抗ＲＳＶ軽鎖をコードする発現カセットは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における有効な発現のためにコドン最適化された軽鎖ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号２１）を含み、これは、５’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）接合因子プレシグナル配列（配列番号１４）をコードする核酸分子に機能的に連結されており、そしてこれは、そのＮ末端において、誘導性ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーター配列（配列番号２３）を有する核酸分子に、そして３’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１転写終結配列（配列番号３６）を有する核酸分子に融合している。形質転換体を選択するために、該プラスミドは、ゼオシンＯＲＦをコードする発現カセットを含み、ここで、該ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号３５）は、５’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＥＦプロモーター配列（配列番号３７）を有する核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列（配列番号２４）を有する核酸分子に機能的に連結されている。該プラスミドは更に、ＴＲＰ２遺伝子座を標的化するための核酸分子（配列番号９１）を含む。
【０２２１】
抗Ｈｅｒ２抗体をコードするｐＧＬＹ６８３３をＹＧＬＹ８３１６内に形質転換することにより、株ＹＧＬＹ１３９９２を作製した。得られた株から株ＹＧＬＹ１３９９２を選択した。この株においては、抗Ｈｅｒ２重鎖および軽鎖をコードする発現カセットはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＲＰ２遺伝子座（ＰｐＴＲＰ２）に標的化される。この株はＬｍＳＴＴ３Ｄ発現カセットを含まない。抗ＲＳＶ抗体をコードするｐＧＬＹ６５６４をＹＧＬＹ８３２３内に形質転換することにより、株ＹＧＬＹ１４４０１を作製した。得られた株から株ＹＧＬＹ１４４０１を選択した。この株においては、抗ＲＳＶ重鎖および軽鎖をコードする発現カセットはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＲＰ２遺伝子座（ＰｐＴＲＰ２）に標的化される。この株はＬｍＳＴＴ３Ｄ発現カセットを含まない。
【０２２２】
前記ＬｍＳＴＴ３Ｄ発現／組込みプラスミドベクターでの本明細書に開示されている適当な株の形質転換は、実質的に以下のとおりに行った。適当なピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を５０ｍＬのＹＰＤ培地［酵母エキス（１％）、ペプトン（２％）およびデキストロース（２％）］内で約０．２〜６のＯＤまで一晩増殖させた。氷上で３０分間のインキュベーションの後、２５００〜３０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により細胞をペレット化した。培地を除去し、該細胞を氷冷無菌１Ｍ  ソルビトール３回洗浄した後、０．５ｍＬ  氷冷無菌１Ｍソルビトールに再懸濁させた。１０μＬの洗浄化ＤＮＡ（５〜２０μｇ）および１００μＬの細胞懸濁液をエレクトロポレーションキュベット内で一緒にし、氷上で５分間インキュベートした。エレクトロポレーションは、予め設定されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）プロトコール（２ｋＶ、２５μＦ、２００Ω）に従いＢｉｏ−Ｒａｄ  ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌにおいて行い、その直後に１ｍＬのＹＰＤＳ回収培地（ＹＰＤ培地＋１Ｍ  ソルビトール）を加えた。該形質転換細胞を室温（２４℃）で４時間〜一晩で回収した後、該細胞を選択培地上でプレーティングした。
【０２２３】
ついで株ＹＧＬＹ１３９９２およびＹＧＬＹ１４４０１のそれぞれを、前記のとおり、誘導性ＡＯＸ１プロモーターの制御下でＬｍＳＴＴ３ＤをコードするｐＧＬＹ６３０１、または構成的ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下でＬｍＳＴＴ３ＤをコードするｐＧＬＹ６２９４で形質転換して、実施例３に記載されている株を得た。
【実施例３】
【０２２４】
ＬｍＳＴＴ３ＤをコードするＯＲＦが誘導性ＰｐＡＯＸ１プロモーターに機能的に連結された発現カセットを含む組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ６３０１、またはＬｍＳＴＴ３ＤをコードするＯＲＦが構成的ＰｐＧＡＰＤＨプロモーターに機能的に連結された発現カセットを含むｐＧＬＹ６２９４を、それぞれＳｐｅＩまたはＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドをピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ１３９９２またはＹＧＬＹ１４４０１内に形質転換して、表１に示されている株ＹＧＬＹ１７３５１、ＹＧＬＹ１７３６８、ＹＧＬＹ１７３１９およびＹＧＬＹ１７３５４を得た。実施例２に記載されているのと実質的に同じ方法で形質転換を行った。
【０２２５】
【表１】
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ＵＲＡ６遺伝子座におけるｐＧＬＹ６３０１のゲノム組込みを、プライマーＰｐＵＲＡ６ｏｕｔ／ＵＰ（５’−ＣＴＧＡＧＧＡＧＴＣＡＧＡＴＡＴＣＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＣＣＡＴ−３’；配列番号１）およびＰｕｃｌ９／ＬＰ（５’−ＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴ−３’；配列番号２）またはＳｃＡＲＲ３／ＵＰ（５’−ＧＧＣＡＡＴＡＧＴＣＧＣＧＡＧＡＡＴＣＣＴＴＡＡＡＣＣＡＴ−３’；配列番号３）およびＰｐＵＲＡ６ｏｕｔ／ＬＰ（５−ＣＴＧＧＡＴＧＴＴＴＧＡＴＧＧＧＴＴＣＡＧＴＴＴＣＡＧＣＴＧＧＡ−３’；配列番号４）を使用するコロニーＰＣＲ（ｃＰＣＲ）により確認した。
【０２２６】
ＴＲＰ１遺伝子座におけるｐＧＬＹ６２９４のゲノム組込みを、プライマーＰｐＴＲＰ−５’ｏｕｔ／ＵＰ（５’−ＣＣＴＣＧＴＡＡＡＧＡＴＣＴＧＣＧＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴ−３’；配列番号５）およびＰｐＡＬＧ３ＴＴ／ＬＰ（５’−ＣＣＴＣＣＣＡＣＴＧＧＡＡＣＣＧＡＴＧＡＴＡＴＧＧＡＡ−３’；配列番号６）またはＰｐＴＥＦＴＴ／ＵＰ（５’−ＧＡＴＧＣＧＡＡＧＴＴＡＡＧＴＧＣＧＣＡＧＡＡＡＧＴＡＡＴＡＴＣＡ−３’；配列番号７）およびＰｐＴＲＰ１−３’ｏｕｔ／ＬＰ（５’−ＣＧＴＧＴＧＴＡＣＣＴＴＧＡＡＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＴＡＣＴＴＴＧＡ−３’；配列番号８）を使用するｃＰＣＲにより確認した。ＬｍＳＴＴ３Ｄをコードする発現カセットの、該ゲノム内への組込みを、ｃＰＣＲプライマーＬｍＳＴＴ３Ｄ／ｉＵＰ（５’−ＧＣＧＡＣＴＧＧＴＴＣＣＡＡＴＴＧＡＣＡＡＧＣＴＴ−３’（配列番号９）およびＬｍＳＴＴ３Ｄ／ｉＬＰ（５’−ＣＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＣＣＴＣＧＴＡＡＧＴＡＣＡＧ−３’（配列番号１０）を用いて確認した。該ＰＣＲ条件は、９５℃で２分間の１サイクル、９５℃で２０秒間、５５℃で２０秒間および７２℃で１分間の３５サイクルならびにそれに続く７２℃で１０分間の１サイクルであった。
【０２２７】
Ｎ−グリコシル化部位占拠分析のための抗体を製造するために、該株をＳｉｘｆｏｒ発酵槽内で培養した。抗体製造のための形質転換株の細胞増殖条件は一般に以下のとおりであった。
【０２２８】
該形質転換酵母株のタンパク質発現を、１％  酵母エキス、２％  ペプトン、１００ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）、１．３４％  酵母窒素原礎培地、４×１０−５％  ビオチンおよび１％  グリセロールからなる緩衝グリセロール−複合培地（ＢＭＧＹ）を含有する振とうフラスコ内で行った。タンパク質発現のための誘導培地は、ＢＭＧＹにおけるグリセロールの代わりに１％  メタノールからなる緩衝メタノール−複合培地（ＢＭＭＹ）であった。メタノールにおけるＰｍｔインヒビターＰｍｔｉ−３を、該誘導培地を加えた時点で１８．３μＭの最終濃度まで該増殖培地に加えた。細胞を集め、２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
【０２２９】
ＳｉｘＦｏｒｓ発酵槽スクリーニング法は、表２に示されているパラメーターに従った。
【０２３０】
【表２】
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接種後の約１８時間の時点で、３５０ｍＬの培地Ａ（後記表３を参照されたい）＋４％  グリセロールを含有するＳｉｘＦｏｒｓ容器に、関心のある株を接種した。少用量（１００％  メタノール中の０．２ｍｇ／ｍＬの０．３ｍＬ）のＰｍｔｉ−３（５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸）（公開国際出願番号ＷＯ  ２００７０６１６３１を参照されたい）を接種物と共に加えた。約２０時間の時点で、１７ｍＬ  ５０％  グリセロール溶液（グリセロール・フェッド・バッチ・フィード、後記表４を参照されたい）＋より大用量（４ｍｇ／ｍＬの０．３ｍＬ）のＰｍｔｉ−３のボーラスを容器ごとに加えた。約２６時間の時点で、溶存酸素（ＤＯ）濃度における正のスパイクにより示されるとおりグリセロールが消費され、メタノール供給（後記表５を参照されたい）を０．７ｍＬ／時間で連続的に開始した。同時に、別用量のＰｍｔｉ−３（０．３ｍＬの４ｍｇ／ｍＬストック）を容器ごとに加えた。約４８時間の時点で、別用量（０．３ｍＬの４ｍｇ／ｍＬ）のＰｍｔｉ−３を容器ごとに加えた。接種の約６０時間の時点で、培養を集め、加工した。
【０２３１】
【表３】
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【０２３２】
【表４】
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【０２３３】
【表５】
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【０２３４】
【表６】
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抗Ｈｅｒ２または抗ＲＳＶ抗体上のＮ−グリカンの占拠を、以下のとおりに、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）を用いて測定した。該抗体を細胞培養培地から回収し、プロテインＡカラムクロマトグラフィーにより精製した。プロテインＡ精製サンプル（１００〜２００μｇ）を約１００μＬまで濃縮し、ついでバッファーを、１％  ＳＤＳを含有する１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）と交換した。ついで該サンプルを、２μＬの１０ｋＤａ  内部標準（Ｂｅｃｋｍａｎにより提供されたもの）と共に、５μＬのβ−メルカプトエタノールの添加により還元し、５分間沸騰させた。ついで約２０μＬの還元サンプルを、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒにより推奨されている方法により、裸溶融（ｂａｒｅ−ｆｕｓｅｄ）シリカキャピラリー（約７０ｍｍ、５０μｍ  Ｉ．Ｄ．）で分離した。
【０２３５】
図１８はＣＥ分析からの重鎖のＮ−グリコシル化部位占拠を示す。この図は、どちらの抗体に関しても、該抗体の発現が誘導されたのと同時にＬｍＳＴＴ３Ｄの発現が誘導された場合にＬｍＳＴＴ３Ｄが約９９％まで構成的に発現された場合、Ｎ−結合重鎖種の量が約８０％から約９４％に増加したことを示している。
【０２３６】
表７は、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＳＴ）複合体の存在下でＬｍＳＴＴ３Ｄが過剰発現した宿主細胞から抗体が得られた組成物に関して、抗ＨＥＲ２および抗ＲＳＶ抗体のＮ−グリコシル化部位占拠が増加したことを示している。Ｎ−グリコシル化部位占拠を測定するために、抗体を還元し、重鎖のＮ−グリカン占拠を測定した。この表は、一般に、試験された両方の抗体に関して、誘導プロモーターの制御下のＬｍＳＴＴ３Ｄの過剰発現が約８２〜８３％から約９９％へのＮ−グリコシル化部位占拠を増加を引き起こしたことを示している（ＬｍＳＴＴ３Ｄの過剰発現の非存在下のＮ−グリコシル化部位占拠と比べて約１９％の増加）。ＬｍＳＴＴ３Ｄおよび該抗体の発現は同じ誘導プロモーターの制御下にあった。ＬｍＳＴＴ３Ｄの過剰発現が構成的プロモーターの制御下にあった場合、試験された両方の抗体に関して、Ｎ−グリコシル化部位占拠の増加は約９４％まで増加した（ＬｍＳＴＴ３Ｄの過剰発現の非存在下のＮ−グリコシル化部位占拠と比べて約１３％の増加）。
【０２３７】
【表７】
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表８は、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＳＴ）複合体の存在下でＬｍＳＴＴ３Ｄが過剰発現された宿主細胞から得られた完全抗体を含む組成物に関する、還元抗体調製物からの個々の重鎖のＮ−グリコシル化部位占拠の測定に基づくＮ−グリコシル化部位占拠を示している。式（比率ＧＨＣ）２×１００は、Ｎ−グリコシル化された重鎖の比率の測定に基づく完全占拠抗体の百分率の概算値または近似値を与える。
【０２３８】
【表８】
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Ｑ−ＴＯＦ分析
用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）系は、自動注入装置、カラム加熱区画ならびに２１０および２８０ｎｍで検出するＵＶ検出装置を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００からなるものであった。この系で行った全てのＬＣ−ＭＳ実験は１ｍＬ／分で行った。該流速はＭＳ検出で分かれ（ｓｐｌｉｔ）なかった。質量分析は、Ａｃｃｕｒａｔｅ−Ｍａｓｓ  Ｑ−ＴＯＦ  ＬＣ／ＭＳ  ６５２０（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で正イオンモードで行った。二重ＥＳＩ源の温度は３５０℃に設定された。窒素気流速度はコーンに関しては１３Ｌ／時間および３５０Ｌ／時間に設定され、ネブライザーは４５ｐｓｉｇに設定され、キャピラリーに４５００ボルトが加えられた。質量校正およびタンパク質質量測定のために、ＡＰＩ−ＴＯＦ参照質量対処キットにより、９２２．００９の参照質量をＨＰ−０９２１から調製した。３００〜３０００ｍ／ｚのイオンスペクトル範囲のデータを得、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍａｓｓｈｕｎｔｅｒを使用して処理した。
【０２３９】
サンプル調製は以下のとおりに行った。完全抗体サンプル（５０μｇ）を、５０μＬの２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ７．８）を使用して調製した。脱グリコシル化抗体に関しては、５０μＬのアリコートの完全抗体サンプルをＰＮＧアーゼＦ（１０単位）で３７℃で１８時間処理した。還元抗体を、完全抗体または脱グリコシル化抗体のアリコートに１Ｍ  ＤＴＴを１０ｍＭの最終濃度まで加えることにより調製し、３７℃で３０分間インキュベートした。
【０２４０】
３μｇの完全または脱グリコシル化抗体サンプルを、７０℃に維持されたＰｏｒｏｓｈｅｌｌ  ３００ＳＢ−Ｃ３カラム（２．１ｍｍ×７５ｍｍ，５μｍ）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上にローディングした。まず、該タンパク質をカートリッジ上で９０％  溶媒Ａ（０．１％  ＨＣＯＯＨ）、５％  溶媒Ｂ（０．１％  ＨＣＯＯＨ中の９０％  アセトニトリル）で１分間洗浄した。ついで、２６分にわたる５〜１００％のＢの勾配およびそれに続く１００％のＢでの３分間の再生およびそれに続く５％  Ｂでの１０分間の最終的平衡化時間により、溶出を行った。
【０２４１】
還元抗体に関しては、３μｇのサンプルを、４０℃に維持されたＰｏｒｏｓｈｅｌｌ  ３００ＳＢ−Ｃ３カラム（２．１ｍｍ×７５ｍｍ，５μｍ）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上にローディングした。まず、該タンパク質をカートリッジ上で９０％  溶媒Ａ、５％  溶媒Ｂで３分間洗浄した。ついで、２０分にわたる５〜８０％のＢの勾配およびそれに続く８０％のＢでの７分間の再生およびそれに続く５％  Ｂでの１０分間の最終的平衡化時間により、溶出を行った。
【０２４２】
図１９はＱ−ＴＯＦ分析の結果を示す。ここでは、ＹＧＬＹ１７３５１において産生された非還元抗Ｈｅｒ２抗体のＮ−グリコシル化部位占拠を、ＣＨＯ細胞において産生された商業的に入手可能な非還元抗Ｈｅｒ２抗体（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）のＮ−グリコシル化部位占拠と比較した。この図は、株ＹＧＬＹ１７３５１において産生された抗Ｈｅｒ２が、ＣＨＯ細胞において産生された抗Ｈｅｒ２抗体のＮ−グリコシル化部位占拠と同様のＮ−グリコシル化部位占拠を有することを示している。この図は、抗体が株ＹＧＬＹ１７３５１により産生された場合、ただ１つのＮ−グリコシル化部位が占拠された抗体の量が減少し、両方のＮ−グリコシル化部位が占拠された抗体の量が増加したことを示している。ＹＧＬＹ１７３５１において産生された抗Ｈｅｒ２抗体に関して示されている結果は、表８に示されている近似占拠と合致した。
【０２４３】
図２０は、ＹＧＬＹ１７３５１において産生された抗Ｈｅｒ２抗体上のＮ−グリコシル化部位占拠のスケーラビリティを示す。Ｎ−グリカン占拠のスケーラビリティを評価するために、５ｍＬ〜４０Ｌの範囲のバイオリアクターにおいてＹＧＬＹ１７３５１を試験した。一般に、糖操作ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠は、該糖タンパク質を製造するために用いた加工条件によって様々であることが観察されている。しかし、ＬｍＳＴＴ３Ｄ過剰発現株は、バイオリアクターの規模および加工条件に無関係に、非常に一貫したＮ−グリコシル化部位占拠（９９％）を示した。したがって、本発明は、小規模条件下で増殖させた糖操作ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠が大規模条件下での増殖の場合に維持される方法を提供する。
【０２４４】
図２１および２２は例示目的で記載されている。図２１は、ＣＨＯ細胞において産生された抗Ｈｅｒ２抗体（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）の市販ロットのＣＥおよびＱ−ＴＯＦ分析の結果を示す。図２２は、ある期間にわたってＰＮＧアーゼで処理された後の、抗Ｈｅｒ２抗体の同一市販ロットに関するＣＥおよびＱ−ＴＯＦ分析の結果を示す。該ＣＥは非グリコシル化重鎖の増加を示し、該Ｑ−ＴＯＦはＰＮＧアーゼＦ処理後の非グリコシル化抗体の存在を示す（図２１と図２２とを比較されたい）。
【０２４５】
表９は、ＬｍＳＴＴ３Ｄを過剰発現しない株と比較して、ＬｍＳＴＴ３Ｄを過剰発現する株において産生された抗Ｈｅｒ２および抗ＲＳＶ抗体のＮ−グリカン組成を示す。この図は、ＬｍＳＴＴ３Ｄ過剰発現株からの抗体のＮ−グリカンの質が、ＬｍＳＴＴ３Ｄを過剰発現しない株からのものに匹敵することを証明している。抗体をＳｉｘＦｏｒｓ（０．５Ｌ  バイオリアクター）から産生させ、プロテインＡ精製抗体からのＮ−グリカンを２ＡＢ標識で分析した。全体的には、ＬｍＳＴＴ３Ｄの過剰発現は該抗体のＮ−グリカン組成に有意な影響を及ぼさないようであった。該グリコシル化組成は発酵条件の関数として変動しうる。したがって、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株において産生された抗体のグリコシル化組成は約５０〜７０モル％  Ｇ０、１５〜２５モル％  Ｇ１、４〜１２モル％  Ｇ２、５−１７モル％  Ｍａｎ５、および３〜１５モル％  ハイブリッドの範囲でありうる。
【０２４６】
【表９】
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表１０は、ＣＨＯ細胞において産生され商品名ＳＹＮＡＧＩＳでパリビズマブ（ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）として販売されている抗ＲＳＶ抗体の市販ロットの幾つかと比較された場合の、株ＹＧＬＹ１４４０１において産生された抗ＲＳＶ抗体のグリコシル化パターンの比較を示す。
【０２４７】
【表１０】
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この実施例は、本発明が、組換え糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠が、ＣＨＯ細胞のような哺乳類発現系において産生された組換え糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占拠に匹敵するピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）における組換え糖タンパク質の製造を可能にすることを示している。
【実施例４】
【０２４８】
リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ａタンパク質、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｂタンパク質およびリーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質は全て、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるＳＴＴ３遺伝子座の欠失の致死表現型を抑制することが示されている異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼの具体例である（Ｎａｓｅｂら，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １９：３７５８−３７６８（２００８））。Ｎａｓｅｂら（同誌）は更に、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるＷＢＰ１、ＯＳＴ１、ＳＷＰ１またはＯＳＴ２遺伝子座の突然変異の致死表現型を抑制しうることを示した。Ｈｅｓｅら（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９：１６０−１７１（２００９））は、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ａ、ＳＴＴ３ＢおよびＳＴＴ３Ｄタンパク質がＷＢＰ１、ＯＳＴ２、ＳＷＰ１およびＯＳＴ２遺伝子座の突然変異を機能的に相補しうることを示唆するデータを記載している。他の単一サブユニット異種オリゴサッカリルトランスフェラーゼには、単一サブユニットジアルデジア（Ｇｉａｒｄｉａ）またはキネトプラスチッドＳＴＴ３タンパク質、例えばセノルハブジティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）ＳＴＴ３タンパク質、トリパノソーマ・ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）ＳＴＴ３タンパク質、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）ＳＴＴ３タンパク質およびトキソプラズマ・ゴンヂ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）ＳＴＴ３タンパク質が含まれるが、これらに限定されるものではない。リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＯＴａｓｅ複合体内に組込まれないとＮａｓｅｂｒａ（前掲）らが教示しているのとは対照的に、Ｃａｓｔｒｏら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：１４７５６−１４７６０（２００６））は、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）ＳＴＴ３タンパク質がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＯＴａｓｅ複合体内に組込まれるらしいと教示している。
【０２４９】
この実施例においては、前実施例における宿主細胞と同様に構築された宿主細胞を、ＡＯＸ１プロモーターに機能的に連結された、セノルハブジティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）およびリーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３ＣからのＳＴＴ３タンパク質をコードする発現カセットを含有するプラスミドベクターで形質転換した。ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｓｔｔ３ｐをコードする発現カセットを含有するベクターを該実験に含めた。表１１に示すとおり、抗Ｈｅｒ２抗体の発現を伴う種々のＳＴＴ３タンパク質の発現はＮ−グリコシル化部位占拠の増加をもたらさないようであった。しかし、種々のＳＴＴ３タンパク質は基質特異性を示しうる。例えば、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ａ、Ｂ、ＣおよびＤタンパク質はグリコシル化のレベルでの基質特異性において異なっており、このことは、必須Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ結合部位に加えて、該基質の追加的特徴が特定の結合部位におけるＮ−結合グリコシル化に影響を及ぼしうることを示唆している（Ｎａｓｅｂｒａ，前掲）。表９に示されている結果は、抗Ｈｅｒ２抗体を基質として使用したものである。抗体の各重鎖のＣＨ２ドメインはＮ−結合グリコシル化のための単一部位を含有し、これは通常、アスパラギン残基２９７（Ａｓｎ−２９７）に存在する（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ΝＩΗ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）。したがって、表９に示されている結果は、Ｎ−グリコシル化部位占拠（％）が、使用されている個々の単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼの基質特異性により影響されうることを示唆している。
【０２５０】
【表１】
0005976549.tif 000012
【実施例５】
【０２５１】
シアル酸化Ｎ−グリカンを産生しうる株を以下のとおりに構築した。ヒトＧＭ−ＣＳＦをコードするプラスミドベクター、およびリーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄをコードするプラスミドベクターで、該株をトランスフェクトした。該株の構築は図２３Ａ〜２３Ｄに図示されている。簡潔に説明すると、該株は、以下のとおりに構築した。
【０２５２】
プラスミドｐＧＬＹ２４５６（図２４）は、ＴＲＰ２遺伝子座の発現を損なうことなくＴＲＰ２遺伝子座を標的化するＫＩＮＫＯ組込みベクターであり、（１）マウスＣＭＰ−シアル酸輸送体（ｍＣＭＰ−Ｓｉａ  Ｔｒａｎｓｐ）、（２）ヒトＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ  ２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ｈＧＮＥ）、（３）ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＲＧ１遺伝子または転写単位、（４）ヒトＣＭＰ−シアル酸シンターゼ（ｈＣＳＳ）、（５）ヒトＮ−アセチルノイラミナート−９−ホスファートシンターゼ（ｈＳＰＳ）、（６）キメラ酵素をＥＲまたはゴルジに標的化するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＲＥ２リーダーペプチド（３３）にＮ末端において融合したマウスα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメイン（ｍＳＴ６）をコードする６つの発現カセット、およびピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＲＧ１遺伝子または転写単位を含有する。マウスＣＭＰ−シアル酸輸送体をコードする発現カセットは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたｍＣＭＰ  Ｓｉａ  Ｔｒａｎｓｐ  ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号９２）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。ヒトＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼをコードする発現カセットは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたｈＧＮＥ  ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号９３）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＲＧ１遺伝子をコードする発現カセットは（配列番号９４）を含む。ヒトＣＭＰ−シアル酸シンターゼをコードする発現カセットは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたｈＣＳＳ  ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号９５）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。ヒトＮ−アセチルノイラミナート−９−ホスファートシンターゼをコードする発現カセットは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたｈＳＩＡＰ  Ｓ  ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号９６）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、ピチア・パ��トリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。キメラマウスα−２，６−シアリルトランスフェラーゼをコードする発現カセットは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＲＥ２シグナルペプチドをコードする核酸分子に５’末端において融合している、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたｍＳＴ６触媒ドメインをコードする核酸分子（配列番号９７）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＥＦ１プロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＥＦ転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。それらの６つの縦列カセットは、一方の側では、ＴＲＰ２遺伝子の５’領域およびＯＲＦ（これは終止コドンで終わる）からのヌクレオチド配列（配列番号９８）ならびにそれに続くピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３終結配列を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＴＲＰ２遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号９９）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ２４５６をＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ７９６１内に形質転換して、それらの６つの発現カセットがＴＲＰ２  ＯＲＦの直後のＴＲＰ２遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ８１４６を選択した。ついで該株を５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ウリジンに今や栄養要求性である幾つかの株を得た。株ＹＧＬＹ９２９６を選択した。
【０２５３】
プラスミドｐＧＬＹ５０４８（図２５）は、ＳＴＥ１３遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、（１）キメラタンパク質を分泌経路および該細胞からの分泌に導くためのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドにＮ末端において融合したティー・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）α−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメイン（ａＭＡＴＴｒＭａｎ）、ならびに（２）ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５または転写単位をコードする発現カセットを含有する。ａＭＡＴＴｒＭａｎをコードする発現カセットは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドをコードする核酸分子（配列番号１３）に５’末端において融合している、ティー・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）触媒ドメインをコードする核酸分子（配列番号８３）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。該ＵＲＡ５発現カセットは、ｌａｃＺ反復を含む核酸分子に隣接したピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位を含む核酸分子を含む。それらの２つの縦列カセットは、一方の側では、ＳＴＥ１３遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号１００）を含む核酸分子に、そして他方の側では、ＳＴＥ１３遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号１０１）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ５０４８をＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ９２９６内に形質転換して、幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ９４６９を選択した。この株は、単一マンノースＯ−グリコシル化を有する糖タンパク質を産生しうる（公開米国出願第２００９０１７０１５９号を参照されたい）。
【０２５４】
プラスミドｐＧＬＹ５０１９（図２６）は、ＤＡＰ２遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、アシビア・ゴシッピィ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１プロモーターおよびアシビア・ゴシッピィ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１終結配列に機能的に連結されたナーセオスリシン（Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）耐性（ＮＡＴＲ）発現カセット［元々はｐＡＧ２５（ＥＲＯＳＣＡＲＦ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ＧｍｂＨ，Ｄａｉｍｌｅｒｓｔｒａｓｓｅ  １３ａ，Ｄ−６１３５２  Ｂａｄ  Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）由来；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら，Ｙｅａｓｔ  １５：１５４１（１９９９）を参照されたい］をコードする核酸分子を含む発現カセットを含有する。ＮＡＴＲ発現カセット（配列番号３４）は、アシビア・ゴシッピィ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１プロモーターおよびアシビア・ゴシッピィ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１終結配列に対して機能的に調節され、その全体は、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＤＡＰ２遺伝子の５’ヌクレオチド配列（配列番号１０２）に隣接しており、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＤＡＰ２遺伝子の３’ヌクレオチド配列（配列番号１０３）に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ５０１９を線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ９４６９内に形質転換して、該ＮＡＴＲ発現カセットがＤＡＰ遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ９７９７を選択した。
【０２５５】
プラスミドｐＧＬＹ５０８５（図２７）は、シアル酸化Ｎ−グリカンの産生に関与する第２セットの遺伝子をピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）内に導入するためのＫＩＮＫＯプラスミドである。該プラスミドは、ヒグロマイシン耐性（ＨｙｇＲ）をコードする発現カセットでピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＲＧ１遺伝子が置換されていること、および該プラスミドがピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＲＰ５遺伝子を標的化すること以外は、プラスミドＹＧＬＹ２４５６に類似している。該ＨＹＧＲ耐性カセットは配列番号１０４である。ＨＹＧＲ発現カセット（配列番号１０４）は、アシビア・ゴシッピィ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１プロモーターおよびアシビア・ゴシッピィ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１終結配列に対して機能的に調節されている（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら，Ｙｅａｓｔ  １５：１５４１（１９９９）を参照されたい）。それらの６つの縦列カセットは、一方の側では、ＴＲＰ５遺伝子の５’領域およびＯＲＦ（これは終止コドンで終わる）からのヌクレオチド配列（配列番号１０５）ならびにそれに続くピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３終結配列を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＴＲＰ５遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号１０６）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ５０８５を株ＹＧＬＹ９７９７内に形質転換して幾つかの株を得、それらから株ＹＧＬＹ１２００を選択した。
【０２５６】
プラスミドｐＧＬＹ７２４０（図２８）はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＲＰ２遺伝子座（ＰｐＴＲＰ２）を標的化し、該プラスミドは、Ｋｅｘ２切断部位を含有するリンカーを介してピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＣＷＰ１タンパク質に融合したヒトＧＭ−ＣＳＦを含む融合タンパク質をコードしている。ＣＷＰ１タンパク質は後期ゴルジにおいてＫｅｘ２エンドプロテアーゼによりＧＭ−ＣＳＦから除去されて、遊離ＧＭ−ＣＳＦが発酵上清中に分泌される。該ヒトＧＭ−ＣＳＦは、配列番号１０８に示されているアミノ酸配列を有し、配列番号１０８に示されているヌクレオチド配列によりコードされる。該融合タンパク質（配列番号１０９）は、配列番号１１０に示されているヌクレオチド配列によりコードされている。ＣＷＰ１シグナル配列はアミノ酸１−１８であり、ＣＷＰ１アミノ酸配列はアミノ酸１９−２８９からのものであり、ＧＧＧＳＬＶＫＲ  Ｋｅｘ２リンカーのアミノ酸配列（配列番号１１１）はアミノ酸２９０−２９７からのものであり、ＧＭ−ＣＳＦアミノ酸配列はアミノ酸２９８−４２４からのものである。該融合タンパク質の発現はＰｐＡＯＸ１プロモーターおよびＳｃＣＹＣ終結配列に機能的に連結されている。プラスミドｐＧＬＹ７２４０を株ＹＧＬＹ１２９００内に形質転換して幾つかの株を得、それらから株ＹＧＬＹ１５６６０を選択した。株ＹＧＬＹ１５６６０をプラスミドｐＧＬＹ６３０１［リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄをコードしている］で形質転換して幾つかの株を得、それらから株ＹＧＬＹ１６３４９を選択した。
【０２５７】
図２９は、ＬｍＳＴＴ３Ｄが非抗体糖タンパク質ＧＭ−ＣＳＦのＮ−グリカン占拠をも改善することを示している。ＧＭ−ＣＳＦは２つのＮ−結合部位を含有し、野生型ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）においては、ＧＭ−ＣＳＦ上の１つのＮ−結合部位が主にグリコシル化されている。ＧＭ−ＣＳＦのＮ−グリカン占拠に対するＬｍＳＴＴ３Ｄの影響を調べるために、ＧＭ−ＣＳＦ産生株ｙＧＬＹ１５５６０においてメタノール誘導性ＬｍＳＴＴ３Ｄを過剰発現させた。Ｍｉｃｒｏ２４バイオリアクター（Ｍ２４）を使用してＮ−グリカン占拠を評価した。ウエスタンブロットおよび１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、Ｍ２４からの無細胞上清をＮ−グリカン占拠に関して分析した。ＧＭ−ＣＳＦ特異的抗体で検出されたウエスタンブロットにおいて示されたとおり、大部分のＧＭ−ＣＳＦ（レーン２〜８）は２つのＮ−結合部位でグリコシル化されており、一方、対照株（ｙＧＬＹ１５５６０、レーン９）においては、ＧＭ−ＣＳＦは主に１つの部位でＮ−グリコシル化されており、わずかな部分が２つのＮ部位でＮ−グリコシル化されており又はグリコシル化されていない。総合すると、これは、ＬｍＳＴＴ３Ｄが、複数のＮ−結合部位を含有する糖タンパク質のＮ−グリカン占拠を改善しうることを示している。
【０２５８】
図３０は、それぞれｙＧＬＹ１５５６０（Ａ）およびｙＧＬＹ１６３４９（Ｂ）から発現されたＧＭ−ＣＳＦのＱ−ＴＯＰ分析を示す。この分析は、ＧＭ−ＣＳＦの大部分が、ＬｍＳＴＴ３Ｄの存在下、２つのＮ−結合部位でグリコシル化されていることを証明している。非グリコシル化ＧＭ−ＣＳＦは検出されなかった。
【０２５９】
ＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ
この研究において用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）系は、自動注入装置、カラム加熱区画ならびに２１０および２８０ｎｍで検出するＵＶ検出装置を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００からなるものであった。この系で行った全てのＬＣ−ＭＳ実験は１ｍＬ／分で行った。該流速はＭＳ検出で分かれ（ｓｐｌｉｔ）なかった。質量分析は、Ａｃｃｕｒａｔｅ−Ｍａｓｓ  Ｑ−ＴＯＦ  ＬＣ／ＭＳ  ６５２０（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で正イオンモードで行った。二重ＥＳＩ源の温度は３５０℃に設定された。窒素気流速度はコーンに関しては１３Ｌ／時間および３５０Ｌ／時間に設定され、ネブライザーは４５ｐｓｉｇに設定され、キャピラリーに４５００ボルトが加えられた。質量校正およびタンパク質質量測定のために、ＡＰＩ−ＴＯＦ参照質量対処キットにより、９２２．００９の参照質量をＨＰ−０９２１から調製した。３００〜３０００ｍ／ｚのイオンスペクトル範囲のデータを得、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍａｓｓｈｕｎｔｅｒを使用して処理した。
【０２６０】
サンプル調製
完全抗体サンプル（５０μｇ）を、５０μＬの２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ７．８）を使用して調製した。脱グリコシル化抗体に関しては、５０μＬのアリコートの完全抗体サンプルをＰＮＧアーゼＦ（１０単位）で３７℃で１８時間処理した。還元抗体を、完全抗体または脱グリコシル化抗体のアリコートに１Ｍ  ＤＴＴを１０ｍＭの最終濃度まで加えることにより調製し、３７℃で３０分間インキュベートした。
【０２６１】
３μｇの完全または脱グリコシル化抗体サンプルを、７０℃に維持されたＰｏｒｏｓｈｅｌｌ  ３００ＳＢ−Ｃ３カラム（２．１ｍｍ×７５ｍｍ，５μｍ）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上にローディングした。まず、該タンパク質をカートリッジ上で９０％  溶媒Ａ（０．１％  ＨＣＯＯＨ）、５％  溶媒Ｂ（０．１％  ＨＣＯＯＨ中の９０％  アセトニトリル）で１分間洗浄した。ついで、２６分にわたる５〜１００％のＢの勾配およびそれに続く１００％のＢでの３分間の再生およびそれに続く５％  Ｂでの１０分間の最終的平衡化時間により、溶出を行った。
【０２６２】
還元抗体に関しては、３μｇのサンプルを、４０℃に維持されたＰｏｒｏｓｈｅｌｌ  ３００ＳＢ−Ｃ３カラム（２．１ｍｍ×７５ｍｍ，５μｍ）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上にローディングした。まず、該タンパク質をカートリッジ上で９０％  溶媒Ａ、５％  溶媒Ｂで３分間洗浄した。ついで、２０分にわたる５〜８０％のＢの勾配およびそれに続く８０％のＢでの７分間の再生およびそれに続く５％  Ｂでの１０分間の最終的平衡化時間により、溶出を行った。
【０２６３】
配列
実施例１〜４に開示されている株の幾つかを製造するために使用した配列を表１２に示す。
【０２６４】
【表１２】
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本発明は例示実施形態に関して本明細書に記載されているが、本発明はそれらに限定されないと理解されるべきである。当技術分野における通常の技量を有し本明細書中の教示を利用する当業者はその範囲内の追加的な修飾および実施形態を認識するであろう。したがって、本発明は、本明細書に添付されている特許請求の範囲のみによって限定される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
0005976549.tif 000098
【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
0005976549.tif 000106
【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【配列表】
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