(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−カルボン酸（ＨＭＦ酸）の輸送能力を有するポリペプチドをコードし、配列番号７又は９に記載のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する第一のポリヌクレオチド及び、
（ｉｉ）ＨＭＦ酸酸化還元酵素活性を有するポリペプチドをコードしている第二のポリヌクレオチドであって、ＨＭＦ酸酸化還元酵素活性を有するポリペプチドが、配列番号５に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、第二のポリヌクレオチドの導入によって遺伝的に改変されたグラム陰性細菌細胞。
【請求項２】
フランアルデヒド脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードしている第三のポリヌクレオチドを更に含み、
フランアルデヒド脱水素酵素活性を有するポリペプチドが、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の遺伝的に改変されたグラム陰性細菌細胞。
【請求項３】
エシェリキア属、アナベナ属、カウロバクター属、グルコノバクター属、ロドバクター属、シュードモナス属、パラコッカス属、リゾビウム属、シノリゾビウム属、ブラディリゾビウム属、フラボバクテリウム属、クレブシエラ属、エンテロバクター属、メチロバクテリウム属、ザイモモナス属、アセトバクター属、バクテロイデス属、セレノモナス属、メガスファエラ属、バークホルデリア属、カプリアビダス属、ラルストニア属、メチロバクテリウム属、メチロボラス属、ロドシュードモナス属、アシディフィリウム属、ディノロセオバクター属、アグロバクテリウム属、スルホロブス属及びスフィンゴモナス属からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の遺伝的に改変されたグラム陰性細菌細胞。
【請求項４】
グルコノバクター・オキシダンス、カウロバクター・クレセンタス、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、メチロバクテリウム・ラジオトレランス、メチロバクテリウム・ノデュランス、ロドバクター・スフェロイデス、シュードモナス・ゼアキサンチニファシエンス、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・プチダＳ１２、パラコッカス・デニトリフィカンス、エシェリキア・コリ、シノリゾビウム・メリロティ、ブラディリゾビウム・ジャポニクム、リゾビウム・ラジオバクター、リゾビウム・レグミノサルム、リゾビウム・レグミノサルムｂｖ．トリフォリー（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｔｒｉｆｏｌｉｉ）、アグロバクテリウム・ラジオバクター、カプリアビダス・バシレンシス、カプリアビダス・ネカトール、ラルストニア・ユートロファ、ラルストニア・ピッケティー、バークホルデリア・フィトファーマンズ、バークホルデリア・フィマタム、バークホルデリア・ゼノボランス、バークホルデリア・グラミニス、ロドシュードモナス・パルストリス、アシディフィリウム・クリプタム、ディノロセオバクター・シバエ、スルホロブス・アシドカルダリウス、スルホロブス・イスランディカス、スルホロブス・ソルファタリカス、スフホロブス・トコダイーからなる群から選択される、請求項３に記載の遺伝的に改変されたグラム陰性細菌細胞。
【請求項５】
第一及び第二のポリヌクレオチドが単一のベクターに位置する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝的に改変されたグラム陰性細菌細胞。
【請求項６】
第一、第二及び第三のポリヌクレオチドが単一のベクターに位置する、請求項２に記載の遺伝的に改変されたグラム陰性細菌細胞。
【請求項７】
（ｉ）５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−カルボン酸（ＨＭＦ酸）輸送能力を有するポリペプチドをコードしており、配列番号７又は９に記載のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する第一のポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）ＨＭＦ酸酸化還元酵素活性を有するポリペプチドをコードしている第二のポリヌクレオチドであって、ＨＭＦ酸酸化還元酵素活性を有するポリペプチドが、配列番号５に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、第二のポリヌクレオチド
を含むベクター。
【請求項８】
フランアルデヒド脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードしている第三のポリヌクレオチドを更に含み、
フランアルデヒド脱水素酵素活性を有するポリペプチドが、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のグラム陰性細菌細胞をＨＭＦ酸の存在下で該グラム陰性細菌細胞によるＨＭＦ酸の酸化のために好適な条件下でインキュベートするステップを含む、ＨＭＦ酸を酸化する方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のグラム陰性細菌細胞を、１つ又は複数のＨＭＦ酸のフラン前駆体の存在下で、該グラム陰性細菌細胞によって１つ又は複数のフラン前駆体を２，５−フランジカルボン酸（ＦＤＣＡ）に酸化するための好適な条件下でインキュベートするステップを含む、ＦＤＣＡを産生する方法。
【請求項１１】
フラン前駆体が５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−カルボアルデヒド（ＨＭＦ）、フラン−２，５−ジカルボアルデヒド（ＤＦＦ）及び［５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−イル］メタノール（ＨＭＦアルコール）を含む群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
フラン前駆体が１つ又は複数のヘキソース糖から得られる、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＦＤＣＡが、酸沈殿の後に、冷却結晶化又は溶媒抽出を実施することを含む方法によって反応混合物から回収される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、フラン化合物の生体内転換（ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の分野に一般に関する。そのような生体内転換は、フラン−２，５−ジカルボン酸（ＦＤＣＡ）の産生及びリグノセルロース含有材料の処理（例えばバイオ燃料及び生化学物質の産生のため）において有用である。より詳細には本発明は、フラン化合物の生体触媒転換についての特徴が改善された、遺伝的に改変された新規細胞に関する。本発明のさらなる態様は、フラン化合物の生体内転換についての特徴を改善するための宿主細胞の遺伝的改変のために好適なベクターに関する。本発明の他の態様は、本発明による細胞を使用した５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−カルボン酸（ＨＭＦ酸）及びその前駆体の生体内転換のための方法に関する。
【０００２】
［発明の背景］
フラン化合物の生体内転換への注目が高まっている。これは、バイオマスからの付加価値のある化学物質として期待されるフラン−２，５−ジカルボン酸（ＦＤＣＡ）の生物的産生（Ｗｅｒｐｙら、（２００４））の観点及びリグノセルロース含有材料からのバイオ燃料及び生化学物質の発酵性産生におけるフラン化合物の負の役割（Ａｌｍｅｉｄａら、（２００９））の観点の両方においてである。
【０００３】
近年フラン化合物利用生物、カプリアビダス・バシレンシス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）ＨＭＦ１４が単離された（Ｋｏｏｐｍａｎら、（２０１０ａ）。この生物は、フルフラール及び５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−カルボアルデヒド（ＨＭＦ）を代謝できる。カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４のフルフラール及びＨＭＦ分解経路は、関与する遺伝子と共にＫｏｏｐｍａｎら（２０１０ａ）によって開示されている。
【０００４】
カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４由来のｈｍｆＨ遺伝子のシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）Ｓ１２への機能的導入は、Ｋｏｏｐｍａｎら（２０１０ｂ）によって開示されている。得られた菌株は、ＨＭＦを基質として用いる優れたＦＤＣＡ産生能力を有する。しかし、５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−カルボン酸（ＨＭＦ酸）の観察された蓄積は、長い処理時間又はこの副産物を除去するための代替手段を必要とする。ＨＭＦ酸副産物の十分な除去は、ＦＤＣＡが産生される可能性がある多数の応用のために望ましく、時には必須でさえある。
【０００５】
ＨＭＦ酸蓄積の問題の解決法の探索において、本発明の発明者らは、驚くべきことにシュードモナス・プチダＳ１２  ＦＤＣＡ産生系におけるある種のポリペプチドの発現がＨＭＦ酸蓄積を効果的に減少させることを見出した。
【０００６】
［発明の概要］
本発明者らの本発見は、宿主において、配列番号１若しくは２のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその類似体／相同体（配列番号３若しくは４等）と共に、５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−カルボン酸（ＨＭＦ酸）の転換が可能である１つ又は複数のポリペプチドを発現させることが、ＨＭＦ酸の効果的な生物変換（ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）をもたらすという一般化概念をもたらした。改善されたＨＭＦ酸生物変換は、フラン化合物が有害であると考えられる供給原料（例えばバイオ燃料の産生のためのエタノール産生発酵用又は化学物質の生物学的産生のための発酵用の供給原料等）からのＨＭＦ酸及びそのフラン前駆体の除去のために有益である。他の応用において、改善されたＨＭＦ酸生物変換は、例えばＦＤＣＡ生物的産生において、ＨＭＦ酸が出発材料又は中間体である化学物質の生物的産生を改善する。
【０００７】
したがって本発明の第一の目的は、配列番号１、２、３若しくは４のアミノ酸配列を有する第一のポリペプチド又はその類似体／相同体をコードしている第一のポリヌクレオチド配列及びＨＭＦ酸転換活性を有する第二のポリペプチドをコードしている第二のポリヌクレオチド配列を含む遺伝的に改変された細胞である。ＨＭＦ酸転換ポリペプチドは、以前に報告されたカプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４ｈｍｆＨ遺伝子（Ｋｏｏｐｍａｎら、２０１０ａ及びＫｏｏｐｍａｎら、２０１０ｂ）によってコードされる酸化還元酵素であってもよい。特定の実施形態により遺伝的に改変された細胞が、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５のアミノ酸配列を有する第三のポリペプチド又はその類似体／相同体をコードしている第三のポリヌクレオチド配列を含むことは好ましい。第三のアミノ酸配列の機能的発現は、フランアルデヒドの転換を可能にするアルデヒド脱水素酵素活性をもたらす。
【０００８】
第二のポリペプチドが酸化還元酵素である場合、酸化還元酵素と同時での第一のポリペプチドの共発現は、生体触媒ＦＤＣＡ産生に関する酸化還元酵素を含む全細胞生体触媒の品質を改善する可能性もある。
【０００９】
本発明による細胞は、少なくとも第一のポリヌクレオチド配列の機能的導入によって遺伝的に改変される。好ましくは細胞は、第一及び第二のポリヌクレオチド配列の両方の機能的導入によって遺伝的に改変される。代替的に細胞は、第一及び第三のポリヌクレオチド配列の機能的導入によって遺伝的に改変される。第一、第二及び第三のポリヌクレオチドの３つ全ての機能的導入は、さらなる代替法である。
【００１０】
本発明のさらなる態様は、宿主細胞の遺伝的な改変のために好適なベクターに関する。ベクターは、配列番号１、２、３若しくは４のアミノ酸配列を有する第一のポリペプチド又はその類似体／相同体をコードしている第一のポリヌクレオチド配列及び５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−カルボン酸（ＨＭＦ酸）転換活性を有する第二のポリペプチドをコードしている第二のポリヌクレオチド配列を含む。任意選択でベクターは、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５のアミノ酸配列を有する第三のポリペプチド又はその類似体／相同体をコードしている第三のポリヌクレオチド配列を含む場合がある。そのようなベクターは、本発明による遺伝的に改変された細胞を得るために好適である。
【００１１】
本発明の他の態様は、５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−カルボン酸（ＨＭＦ酸）転換方法に関する。この方法は、本発明による細胞を使用する。好ましい実施形態によりこの方法は、ＦＤＣＡの産生のために好適である。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、フラン前駆体のＦＤＣＡへの生体内転換のための本発明による遺伝的に改変された細胞の使用を目的とする。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】フラン化合物の２，５−フランジカルボン酸への酸化反応の模式図である。次のフラン化合物が示される。１  ＨＭＦ−アルコール、２  ＨＭＦ、３  ＨＭＦ酸、４  ＦＦＡ、５  ＦＤＣＡ。
【図２ａ】Ｐ．プチダＳ１２＿２６４２（図２ａ）及びＢ３８（図２ｂ）のＨＭＦ供給培養におけるＦＤＣＡ産生及びＨＭＦ酸蓄積を開示するグラフである（黒菱形  ＦＤＣＡ（ｍＭ）、黒四角  ＨＭＦ酸（ｍＭ）、白丸  細胞乾燥重量（ＣＤＷ、ｇ／ｌ）、点線  ＨＭＦ供給速度（ｍｌ  ４Ｍ溶液／時））。
【図２ｂ】Ｐ．プチダＳ１２＿２６４２（図２ａ）及びＢ３８（図２ｂ）のＨＭＦ供給培養におけるＦＤＣＡ産生及びＨＭＦ酸蓄積を開示するグラフである（黒菱形  ＦＤＣＡ（ｍＭ）、黒四角  ＨＭＦ酸（ｍＭ）、白丸  細胞乾燥重量（ＣＤＷ、ｇ／ｌ）、点線  ＨＭＦ供給速度（ｍｌ  ４Ｍ溶液／時））。
【図３】図２に示す流加法の際の種々の時点での特異的ＦＤＣＡ生産性を開示するグラフである（ダーク  Ｐ．プチダＳ１２＿２６４２、ライト  Ｐ．プチダＳ１２＿Ｂ３８）。
【図４ａ】Ｐ．プチダＳ１２＿Ｂ３８（図４ａ）及びＢ５１（図４ｂ）での振盪フラスコ実験におけるＦＤＣＡ産生及びＨＭＦ酸蓄積を開示するグラフである（黒三角  ＨＭＦ（ｍＭ）、黒菱形  ＦＤＣＡ（ｍＭ）、黒四角  ＨＭＦ酸（ｍＭ）、白丸  細胞乾燥重量（ＣＤＷ、ｇ／ｌ））。
【図４ｂ】Ｐ．プチダＳ１２＿Ｂ３８（図４ａ）及びＢ５１（図４ｂ）での振盪フラスコ実験におけるＦＤＣＡ産生及びＨＭＦ酸蓄積を開示するグラフである（黒三角  ＨＭＦ（ｍＭ）、黒菱形  ＦＤＣＡ（ｍＭ）、黒四角  ＨＭＦ酸（ｍＭ）、白丸  細胞乾燥重量（ＣＤＷ、ｇ／ｌ））。
【図５】高細胞密度で開始したＰ．プチダＳ１２＿Ｂ３８のＨＭＦ供給高細胞密度培養におけるＦＤＣＡ産生及びＨＭＦ酸蓄積を開示するグラフである（白四角  ＨＭＦ、黒菱形  ＦＤＣＡ（ｍＭ）、黒四角  ＨＭＦ酸（ｍＭ）、白丸  細胞乾燥重量（ＣＤＷ、ｇ／ｌ）、点線  ＨＭＦ供給速度（ｍｌ  ４Ｍ溶液／時））。
【図６ａ】Ｐ．プチダＳ１２＿Ｂ３８（ＨｍｆＨ及びＨｍｆＴ１共発現、Ａ）、Ｓ１２＿Ｂ９７（ＨｍｆＨ、ＨｍｆＴ１及びアルデヒド脱水素酵素共発現、Ｂ）及びＳ１２＿Ｂ１０１（ＨｍｆＨ及びアルデヒド脱水素酵素共発現、Ｃ）のＨＭＦ含有振盪フラスコ培養におけるＦＤＣＡ、ＦＦＡ及びＨＭＦ酸の蓄積を開示するグラフである。黒三角  ＨＭＦ（ｍＭ）、黒菱形  ＦＤＣＡ（ｍＭ）、黒四角  ＨＭＦ酸（ｍＭ）、黒丸  ＦＦＡ（ｍＭ）、白丸  細胞乾燥重量（ＣＤＷ、ｇ／ｌ）。
【図６ｂ】Ｐ．プチダＳ１２＿Ｂ３８（ＨｍｆＨ及びＨｍｆＴ１共発現、Ａ）、Ｓ１２＿Ｂ９７（ＨｍｆＨ、ＨｍｆＴ１及びアルデヒド脱水素酵素共発現、Ｂ）及びＳ１２＿Ｂ１０１（ＨｍｆＨ及びアルデヒド脱水素酵素共発現、Ｃ）のＨＭＦ含有振盪フラスコ培養におけるＦＤＣＡ、ＦＦＡ及びＨＭＦ酸の蓄積を開示するグラフである。黒三角  ＨＭＦ（ｍＭ）、黒菱形  ＦＤＣＡ（ｍＭ）、黒四角  ＨＭＦ酸（ｍＭ）、黒丸  ＦＦＡ（ｍＭ）、白丸  細胞乾燥重量（ＣＤＷ、ｇ／ｌ）。
【図６ｃ】Ｐ．プチダＳ１２＿Ｂ３８（ＨｍｆＨ及びＨｍｆＴ１共発現、Ａ）、Ｓ１２＿Ｂ９７（ＨｍｆＨ、ＨｍｆＴ１及びアルデヒド脱水素酵素共発現、Ｂ）及びＳ１２＿Ｂ１０１（ＨｍｆＨ及びアルデヒド脱水素酵素共発現、Ｃ）のＨＭＦ含有振盪フラスコ培養におけるＦＤＣＡ、ＦＦＡ及びＨＭＦ酸の蓄積を開示するグラフである。黒三角  ＨＭＦ（ｍＭ）、黒菱形  ＦＤＣＡ（ｍＭ）、黒四角  ＨＭＦ酸（ｍＭ）、黒丸  ＦＦＡ（ｍＭ）、白丸  細胞乾燥重量（ＣＤＷ、ｇ／ｌ）。
【００１４】
［配列の簡単な説明］
配列番号１は、カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４由来のＨｍｆＴ１のアミノ酸配列を記載する。配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＤＥ２０４１１．１を有する。
配列番号２は、カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４由来のＨｍｆＴ２のアミノ酸配列を記載する。配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＤＥ２０４０４．１を有する。
配列番号３は、メチロバクテリウム・ラジオトレランス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ＪＣＭ２８３１（＝ＡＴＣＣ２７３２９＝ＤＳＭ１８１９）由来の遺伝子座タグ（ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ）ｍｒａｄ２８３１＿４７２８を有する遺伝子由来のタンパク質産物のアミノ酸配列を記載する。配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣＢ２６６８９．１を有する。
配列番号４は、スルホロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）ＤＳＭ６３９由来のｓａｃｉ＿２０５８遺伝子由来のタンパク質産物のアミノ酸配列を記載する。配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＹ８１３５２．１を有する。
配列番号５は、カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４由来のＨｍｆＨのアミノ酸配列を記載する。配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＤＥ２０４０８．１を有する。
配列番号６は、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）ＵＳＤＡ１１０由来のｂｌｒ０３６７遺伝子由来のタンパク質産物のアミノ酸配列を記載する。配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＣ４５６３２．１を有する。
配列番号７は、カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４由来のｈｍｆＴ１のコード配列を記載する。
配列番号８は、カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４由来のｈｍｆＴ２のコード配列を記載する。
配列番号９は、メチロバクテリウム・ラジオトレランスＪＣＭ２８３１（＝ＡＴＣＣ２７３２９＝ＤＳＭ１８１９）由来の遺伝子座タグｍｒａｄ２８３１＿４７２８を有する遺伝子のコード配列を記載する。
配列番号１０は、スルホロブス・アシドカルダリウスＤＳＭ６３９由来のｓａｃｉ＿２０５８遺伝子のコード配列を記載する。
配列番号１１は、カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４由来のｈｍｆＨのコード配列を記載する。
配列番号１２は、ブラディリゾビウム・ジャポニクムＵＳＤＡ１１０由来のｂｌｒ０３６７遺伝子のコード配列を記載する。
配列番号１３〜１８は、種々の合成プライマーの配列を記載する。制限位置（下線）、開始及び終止（逆相補）コドン（斜体）並びに推定リボソーム結合位置（小文字）が示されている。ＦＮ２３プライマーは、ｈｍｆＨの開始コドンのすぐ上流に設計された。
配列番号１３は、合成ＤＮＡプライマーｈｍｆＴ１（ｆ）のヌクレオチド配列を記載する。
【数１】
0006017463.tif 000002
配列番号１４は、合成ＤＮＡプライマーｈｍｆＴ１（ｒ）のヌクレオチド配列を記載する。
【数２】
0006017463.tif 000003
配列番号１５は、合成ＤＮＡプライマーＦＮ２３のヌクレオチド配列を記載する。
【数３】
0006017463.tif 000004
配列番号１６は、合成ＤＮＡプライマーＦＮ２４のヌクレオチド配列を記載する。
【数４】
0006017463.tif 000005
配列番号１７は、合成ＤＮＡプライマーｍｒａｄ（ｆ）のヌクレオチド配列を記載する。
【数５】
0006017463.tif 000006
配列番号１８は、合成ＤＮＡプライマーｍｒａｄ（ｒ）のヌクレオチド配列を記載する。
【数６】
0006017463.tif 000007
配列番号１９は、カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４由来のアルデヒド脱水素酵素Ａｄｈのアミノ酸配列を記載する。
配列番号２０は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿００３６０９１５６．１を有するアミノ酸配列を記載する。
配列番号２１は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＺＰ＿０２８８１５５７．１を有するアミノ酸配列を記載する。
配列番号２２は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿００３４５１１８４．１を有するアミノ酸配列を記載する。
配列番号２３は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣＡ０９７３７．１を有するアミノ酸配列を記載する。
配列番号２４は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿５３０７４２．１を有するアミノ酸配列を記載する。
配列番号２５は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿００１５４１９２９．１を有するアミノ酸配列を記載する。
配列番号２６は、カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４由来のアルデヒド脱水素酵素Ａｄｈをコードしているａｄｈのポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号２７は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿００３６０９１５６．１を有するアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号２８は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＺＰ＿０２８８１５５７．１を有するアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号２９は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿００３４５１１８４．１を有するアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号３０は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣＡ０９７３７．１を有するアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号３１は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿５３０７４２．１を有するアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号３２は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿００１５４１９２９．１を有するアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号３３は、合成ＤＮＡプライマーＦＮ１３：
【数７】
0006017463.tif 000008
（下線付き配列：ＮｏｔＩ制限部位、アルデヒド脱水素酵素をコードしている遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）は斜体、推定リボソーム結合位置（ＲＢＳ）は小文字）のヌクレオチド配列を記載する。
配列番号３４は、合成ＤＮＡプライマーＦＮ１４：
【数８】
0006017463.tif 000009
（下線付き配列：ＮｏｔＩ制限部位、終止コドン（逆相補鎖）を斜体）のヌクレオチド配列を記載する。
【００１５】
［発明の詳細な記載］
一般的定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲全体を通じて、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等の変化形は、包含的に解釈される。つまりこれらの用語は（コンテクストが認める場合に）具体的に引用されていない他の要素又は成分の含有可能性を表すことが意図される。
【００１６】
本明細書において用いられる冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、冠詞の文法的対象の１つ又は１つより多く（すなわち１つ又は少なくとも１つ）を意味する。例として「１つの要素」は、１つの要素又は１つより多い要素を意味できる。
【００１７】
用語「多数の」は、１つ又は複数の意味を有すると理解されるべきである。
【００１８】
フラン化合物は、本明細書においてフラン環を有する任意の化合物であると理解される。好ましくはフラン化合物は、２，５−フランジカルボン酸に酸化されうる化合物である。本発明のコンテクストに関連するフラン化合物は、［５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−イル］メタノール（「ＨＭＦアルコール」）、５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−カルボアルデヒド（「ＨＭＦ」）、５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−カルボン酸（「ＨＭＦ酸」）、５−（ホルミルフラン）−２−カルボン酸（「ＦＦＡ」）、フラン−２，５−ジカルボアルデヒド（ＤＦＦ）及びフラン−２，５−ジカルボン酸（「ＦＤＣＡ」）を含む。フラン環又はフラン環の任意の置換可能な側基は、例えばＯＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、アルキル、アリル、アリール又はＲＯ−エーテル部分で、（環状基を含む）、フラン環の任意の利用可能な位置において置換されうる。多数の関連するフラン化合物の化学構造は、下に示される。
【００１９】
【化１】
0006017463.tif 000010
【００２０】
用語「ポリヌクレオチド」は、ポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びポリリボ核酸（ＲＮＡ）を含み、用語はＤＮＡ又はＲＮＡのいずれをも意味できる。当業者は、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の安定性における差異を認識する。したがって当業者は、用語「ポリヌクレオチド」の使用のコンテクストからポリヌクレオチドのどちらの形態（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）が好適であるかを理解できる。
【００２１】
本明細書において用いられる用語配列「類似性」は、個々のポリヌクレオチド又はタンパク質の配列が同じ様である程度を意味する。２つの配列間の類似性の程度は、保存的変更の程度と組合せた同一性の程度に基づく。「配列類似性」の百分率は、同一である又は保存的に変更されたアミノ酸又はヌクレオチドの百分率であり、つまり「配列類似性」＝（％配列同一性）＋（％保存的変更）。
【００２２】
本発明の目的のために、「保存的変更」及び「同一性」は、上位語「類似性」の種であると考えられる。したがって用語、配列「類似性」が用いられる場合、それは常に配列「同一性」及び「保存的変更」を包含する。
【００２３】
用語「配列同一性」は、当業者に公知である。２つのアミノ酸配列によって又は２つの核酸配列によって共有される配列同一性の程度を決定するために、配列は最適な比較目的のために配列比較される（例えば、第二のアミノ酸又は核酸の配列との最適な配列比較のために第一のアミノ酸又は核酸の配列にギャップが導入されうる）。そのような配列比較は、比較される配列の全長にわたって実行されうる。代替的に配列比較は、短い比較長にわたって（例えば約２０、約５０、約１００又はそれ以上の核酸／塩基又はアミノ酸にわたって）実行されてもよい。
【００２４】
次いで対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第一の配列における位置が第二の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占有されている場合、分子はその位置で同一である。配列間で共有されている同一性の程度は、２つの配列間の同一性百分率の用語で典型的には表され、配列中で同一残基によって共有される同一位置の数の関数である（つまり％同一性＝対応する位置での同一残基の数／位置の総数×１００）。好ましくは比較される２つの配列は同じ又は実質的に同じ長さである。
【００２５】
「保存的変更」の百分率は、配列同一性の百分率と同様に決定されうる。しかしこの場合、元の残基の機能的特性を保存していると考えられるアミノ酸又はヌクレオチドの配列の特定位置での変更は、変化が生じなかったとして記録される。
【００２６】
アミノ酸配列に関して関連する機能的特性はアミノ酸の物理化学的特性である。本発明のポリペプチド中のアミノ酸についての保存的置換は、アミノ酸が属する種類の他のメンバーから選択されうる。例えば、特定のサイズ又は特徴（電荷、疎水性及び親水性等）を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸は（特に生物学的活性に直接関連しないタンパク質の領域において）、タンパク質の活性を変化させることなく別のアミノ酸に置換されうることはタンパク質生化学の分野において周知である。例えば非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンを含む。極性中性アミノ酸は、グリシンン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンを含む。正に荷電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン及びヒスチジンを含む。負に荷電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。保存的置換は、例えば正電荷を維持するようにＬｙｓをＡｒｇに及び逆も同様、負電荷を維持するようにＧｌｕをＡｓｐに及び逆も同様、遊離−ＯＨを維持するようにＳｅｒをＴｈｒに、並びに遊離−ＮＨ２を維持するようにＧｌｎをＡｓｎに、を含む。
【００２７】
ヌクレオチド配列に関して関連する機能的特性は、主に、転写及び／又は翻訳機構に関連して配列の翻訳領域中に特定のヌクレオチドが保有している生物学的情報である。遺伝暗号が縮重（又は重複性）を有し、複数のコドンがそれらがコードするアミノ酸に関して同じ情報を保有する場合があることは一般的知識である。例えばある種の種においてアミノ酸ロイシンは、ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、ＣＵＧコドン（又はＤＮＡについてはＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ）によってコードされ、アミノ酸セリンは、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＵＣＣ、ＵＣＵ、ＡＧＵ、ＡＧＣ（又はＤＮＡについてはＴＣＡ、ＴＣＧ、ＴＣＣ、ＴＣＴ、ＡＧＴ、ＡＧＣ）によって指定される。翻訳される情報を変えないヌクレオチド変更は、保存的変更と考えられる。
【００２８】
当業者は、異なる数学的アルゴリズムを用いるいくつかの異なるコンピュータープログラムが２つの配列間の同一性を決定するために利用可能であるという事実を認める。例えばニードルマン及びワンチアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、（１９７０））を用いるコンピュータープログラムを用いることができる。実施形態により、コンピュータープログラムはアクセルリスＧＣＧソフトウエアパッケージ（Ａｃｃｅｌｅｒｙｓ  ＧＣＧ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ）（Ａｃｃｅｌｅｒｙｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｕ．Ｓ．Ａ）のＧＡＰプログラムである。用いられうる置換マトリックスは、例えば、ギャップウエイト１６、１４、１２、１０、８、６又は４及び長さウエイト１、２、３、４、５又は６を用いるブロサム６２マトリックス（ＢＬＯＳＵＭ  ６２  ｍａｔｒｉｘ）又はＰＡＭ２５０マトリックス（ＰＡＭ２５０  ｍａｔｒｉｘ）である。当業者は、これらのさまざまな全てのパラメーターがわずかに異なる結果をもたらすが、２つの配列の全体的な同一性百分率は異なるアルゴリズムを用いても著しく変化しないことを理解する。
【００２９】
実施形態により、２つのヌクレオチド配列間の同一性百分率は、アクセルリスＧＣＧソフトウエアパッケージ（Ａｃｃｅｌｅｒｙｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｕ．Ｓ．Ａ）のＧＡＰプログラムを用いて決定される。ＮＷＳギャップｄｎａＣＭＰマトリックス及び４０、５０、６０、７０又は８０のギャップウエイト及び１、２、３、４、５又は６の長さウエイトが用いられる。
【００３０】
別の実施形態では２つのアミノ酸又はヌクレオチドの配列の同一性百分率は、ＰＡＭ１２０ウエイト残基表、１２のギャップ長さペナルティー及び４のギャップペナルティーを用いるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）（Ｇｎｅｎｓｔｒｅａｍ  ｓｅｒｖｅｒ  ＩＧＨ  Ｍｏｎｔｅｐｅｌｌｉｅｒ  Ｆｒａｎｃｅ  ｈｔｔｐ：／／ｖｅｇａ．ｉｇｈ．ｃｎｒｓ．ｆｒ／ｂｉｎ／ａｌｉｇｎ−ｇｕｅｓｓ．ｃｇｉの配列データを用い、ＡＬＩＧＮクエリーで入手可能）に組み込まれているＥ．メイヤース及びＷ．ミラーのアルゴリズム（Ｍｅｙｅｒｓら、（１９８９））を用いて決定される。
【００３１】
本発明について、ヌクレオチド又はアミノ酸の配列の間の同一性及び／又は類似性の百分率を決定するためにＢＬＡＳＴ（ベーシックローカルアラインメントツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ））を用いることは最も好ましい。
【００３２】
アルシュールら（１９９０）のＢＬＡＳＴｎ、ＢＬＡＳＴｐ、ＢＬＡＳＴｘ、ｔＢＬＡＳＴｎ及びｔＢＬＡＳＴｘプログラムを用いるクエリーは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を介して利用可能なＢＬＡＳＴのオンラインバージョンを通して送られうる。代替的に、ＮＣＢＩインターネットサイトを介してダウンロード可能であるＢＬＡＳＴの単独型バージョン（例えばバージョン２．２．２４（２０１０年８月２３日発表））も用いることができる。好ましくはＢＬＡＳＴクエリーは、次のパラメーターで実施される。アミノ酸配列間の同一性及び／又は類似性の百分率を決定するために：アルゴリズム：ｂｌａｓｔｐ；ワードサイズ：３；スコアリングマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：存在（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ）：１１、伸長：１；組成調整：調整用組成物スコアマトリックス調節；フィルター：オフ；マスク：オフ。ヌクレオチド配列間の同一性及び／又は類似性の百分率を決定するために、アルゴリズム：ｂｌａｓｔｎ；ワードサイズ：１１、クエリー範囲内の最大マッチ：０；マッチ／ミスマッチスコア：２、−３；ギャップコスト：存在：５、伸長：２；フィルター：低複雑性領域；マスク：参照テーブルに対してのみマスク。
【００３３】
「保存的変更」の百分率は、記載のアルゴリズム及びコンピュータープログラムの助けにより配列同一性の百分率と同様に決定されうる。いくつかのコンピュータープログラム（例えばＢＬＡＳＴｐ）は、陽性（＝類似性）の数／百分率及び同一性の数／百分率を表す。保存的変更の百分率は、したがって陽性／類似性の百分率から同一性の百分率を減算することによって得ることができる（保存的変更百分率＝類似性百分率−同一性百分率）。
【００３４】
ハイブリダイゼーション実験、ＰＣＲ実験、制限酵素消化、宿主の形質転換等の一般的分子生物学的技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．；及びＡｕｓｕｂｅｌら、（ｅｄｓ．）、１９９５、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．）に開示されている等の当業者に公知の標準的技法により実施されうる。
【００３５】
第一のポリヌクレオチド及びポリペプチド
本発明による遺伝的に改変された細胞は、第一のポリペプチドをコードしている第一のポリヌクレオチドを含む。第一のポリペプチドは、配列番号１、２、３又は４のアミノ酸配列と少なくとも４５％、好ましくは少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、例えば９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【００３６】
代替的に配列類似性は、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の類似性として表されうる。実施形態により示される類似性百分率は、同一性百分率であってもよい。具体的な実施形態では第一のポリペプチドは、配列番号１、２、３又は４のいずれかに記載のアミノ酸配列を含みうる。
【００３７】
そのようなポリペプチドは、ＨＭＦ酸生物変換に関する改善を提供できる。
【００３８】
いかなる理論にもとらわれることなく、そのようなポリペプチドはＨＭＦ酸輸送能力を有すると考えられている。第一のポリペプチドによるＨＭＦ酸の細胞内への輸送によって、ＨＭＦ酸は細胞内転換により良く利用されるようになる。したがってＨＭＦ酸生物変換は、改善されうる。
【００３９】
ＨＭＦ酸生物変換についてのそのような改善は、ＨｍｆＴ１（配列番号１）及び、メチロバクテリウム・ラジオトレランスＪＣＭ２８３１（＝ＡＴＣＣ２７３２９＝ＤＳＭ１８１９）由来の遺伝子座タグｍｒａｄ２８３１＿４７２８を有する遺伝子由来のタンパク質産物（配列番号３）についての例において示されている。これらの配列との配列類似性／同一性のレベルに基づいて、ＨｍｆＴ２（配列番号２）及びスルホロブス・アシドカルダリウスＤＳＭ６３９由来のＳａｃｉ＿２０５８遺伝子からのタンパク質産物が類似の効果を有すると期待することは正当化される。
【００４０】
ＨｍｆＴ２（配列番号２）は、ＨｍｆＴ１（配列番号１）に９０％を超える類似性を有する。同一性の程度は８７％である。
【００４１】
スルホロブス・アシドカルダリウスＤＳＭ６３９由来のｓａｃｉ＿２０５８遺伝子のタンパク質産物（配列番号４）について類似の機能性が、さまざまな機能的ファミリー由来の輸送体とのＣＬＵＳＴＡＬＷ２複数配列比較に基づいて期待されうる。スルホロブス輸送体は、ＨｍｆＴ１（配列番号１）及びＭｒａｄ２８３１＿４７２８（配列番号３）とクラスターを形成する。さらにＳ．アシドカルダリウスゲノムの分析は、輸送体遺伝子ｓａｃｉ＿２０５８が、それぞれのｈｍｆ遺伝子クラスターと類似の機能（ＨＭＦ（−様化合物）の分解において期待される種類の活性）をコードしている遺伝子によって隣接されていることを示している。例：Ｓａｃｉ＿２０５７、アルコール脱水素酵素；Ｓａｃｉ＿２０５９／２０６０、芳香環ジオキシゲナーゼ；Ｓａｃｉ＿２０６２、アシル−ＣｏＡ合成酵素（ｈｍｆＤに機能的に匹敵する）；Ｓａｃｉ＿２０６３、エノイル−ＣｏＡ水添加酵素（ｈｍｆＥに機能的に匹敵する）；Ｓａｃｉ＿２０６４、アルデヒド酸化酵素／キサンチン脱水素酵素（ｈｍｆＡＢＣに機能的に匹敵する）。この分析に基づいて、スルホロブス・アシドカルダリウスＤＳＭ６３９由来のＳａｃｉ＿２０５８遺伝子のタンパク質産物（配列番号４）は、ＨｍｆＴ１（配列番号１）及び／又はメチロバクテリウム・ラジオトレランスＪＣＭ２８３１（＝ＡＴＣＣ２７３２９＝ＤＳＭ１８１９）由来の遺伝子座タグｍｒａｄ２８３１＿４７２８を有する遺伝子由来のタンパク質産物（配列番号３）と類似の効果を有すると期待することは正当化される。
【００４２】
第一のポリペプチド配列は、配列番号７、８、９又は１０に記載のポリヌクレオチド配列と少なくとも４５％、好ましくは少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、例えば９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有する第一のポリヌクレオチド配列によってコードされうる。配列番号７、８、９又は１０に記載の配列と第一のポリヌクレオチドとの好適な代替的類似性レベルは、少なくとも６６％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％類似性であってもよい。実施形態により示される類似性百分率は、同一性百分率であってもよい。具体的な実施形態では第一のポリペプチドは、配列番号７、８、９又は１０に記載のポリヌクレオチド配列によってコードされる場合がある。
【００４３】
第一のポリペプチド又は第一のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、生物、好ましくは特定の増殖条件下で第一のポリペプチドを発現する微生物から単離されうる。微生物は、ＨＭＦ酸又は、ＨＭＦ若しくはＨＭＦアルコール等の関連フラン物質を炭素源として用いることができるが、必要ではない。
【００４４】
典型的な手法では遺伝子ライブラリーは、好適である代替的ポリヌクレオチドを単離するためにスクリーニングされうる。ライブラリーは、細菌の上界由来の微生物から構築されうる。これらの微生物は、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）門に、より詳細にはアルファプロテオバクテリア（Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）綱又はベータプロテオバクテリア（Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）綱に属する場合がある。アルファプロテオバクテリアは、リゾビアレス（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）目に、ブラディリゾビアセアエ科（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）又はメチロバクテリアセアエ科（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に属する場合がある。ブラディリゾビアセアエは、ブラディリゾビウム属（例えばブラディリゾビウム・ジャポニクム）に又はアフィピア（Ａｆｉｐｉａ）属に属する場合がある。メチロバクテリアセアエは、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えばメチロバクテリウム・ノデュランス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕｌａｎｓ）又はメチロバクテリウム・ラジオトレランス）に属する場合がある。ベータプロテオバクテリアは、バークホルデリアレス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ）目に、より詳細にはバークホルデリアセアエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ）科に属する場合がある。それらは、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属（例えばカプリアビダス・バシレンシス）に、又はラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属（例えばラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ））に、又はバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属（例えばバークホルデリア・フィマタム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｍａｔｕｍ）、バークホルデリア・フィトファーマンズ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）若しくはバークホルデリア・グラミニス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ））に属する場合がある。細菌は、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門に、より詳細にはバシリ（Ｂａｃｉｌｌｉ）綱に、より詳細にはバシラレス（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目に属する場合がある。バシラレスは、バシラセアエ（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）科に、より詳細にはゲオバシルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えばゲオバシルス・カウストフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ））に属する場合がある。代替的に、微生物は古細菌の上界に、より詳細にはユリアーケオタ（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）門又はクレンアーケオタ（Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ）門に属する場合がある。ユリアーケオタは、未分類の属（例えばカンド（Ｃａｎｄ））、パルバルカエアム・アシディフィラム（Ｐａｒｖａｒｃｈａｅｕｍ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ）に又はテルモプラズマタ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａ）綱に、より詳細にはテルモプラズマタレス（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）目に属する場合がある。テルモプラズマタレスは、テルモプラズマタセアエ（Ｔｈｅｒｏｍｏｐ��ａｓｍａｔａｃｅａｅ）科に、より詳細にはテルモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｚｍａ）属（例えばテルモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）又はテルモプラズマ・ボルカニウム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ））に属する場合がある。クレンアーケオタは、テルモプロテイ（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｉ）科に、より詳細にはスルホロバレス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ）目に属する場合がある。スルホロバレスは、スルホロバセアエ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｃｅａｅ）科に、より詳細にはスルホロブス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属（例えばスルホロブス・アシドカルダリウス、スルホロブス・イスランディカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｉｓｌａｎｄｉｃｕｓ）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）又はスフホロブス・トコダイー（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ）に；又はメタロスファエラ（Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ）属（例えばメタロスファエア・セデュラ（Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａ））に属する場合がある。同様にテルモプロテイは、テルモプロテアレス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｌｅｓ）目、テルモプロテアセアエ（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｃｅａｅ）科に属する場合がある。テルモプロテアセアエ科は、バルカニサエタ（Ｖｕｌｃａｎｉｓａｅｔａ）属（例えばバルカニサエタ・ディストリビュータ（Ｖｕｌｃａｎｉｓａｅｔａ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔａ））に、又はカルディビルガ（Ｃａｌｄｉｖｉｒｇａ）属（例えばカルディビルガ・マキリンゲンシス（Ｃａｌｄｉｖｉｒｇａ  ｍａｑｕｉｌｉｎｇｅｎｓｉｓ））に属する。
【００４５】
好ましくは第一のポリペプチド及び／又は、第一のポリペプチドをコードしている第一のポリヌクレオチドは、カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４から単離される（Ｗｉｅｒｃｋｘら、２０１０）。代替的実施形態により第一のポリペプチド及び／又は第一のポリペプチドをコードしている第一のポリヌクレオチドは、メチロバクテリウム・ラジオトレランスから単離されうる。
【００４６】
配列番号１、２、３若しくは４に示すアミノ酸配列及び／又は配列番号７、８、９若しくは１０に示すヌクレオチド配列に基づいて、当業者は第一のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を単離するための好適なプローブ及び／又はプライマーを構築できる。
【００４７】
代替的に、配列番号１、２、３若しくは４に示すアミノ酸配列及び／又は配列番号７、８、９若しくは１０に示すヌクレオチド配列に基づいて当業者は、遺伝子合成が入手可能になってきていることから商業的供給者から第一のポリペプチドをコードしている合成配列を得ることができる。合成配列は、数例挙げると例えばＧｅｎｅａｒｔ  Ａ．Ｇ．（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から又はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）から購入されうる。
【００４８】
本発明による細胞は、第一のポリヌクレオチドの機能的導入によって遺伝的に改変される。ポリヌクレオチドの機能的導入は、前記細胞がポリヌクレオチドの機能的ポリペプチド産物を発現する可能性を獲得するような前記ポリヌクレオチドの細胞への導入を意味する。ポリヌクレオチドの宿主細胞への機能的導入のための方法及び技術は当業者の一般的知識の範囲内である。
【００４９】
ＨＭＦ酸変換ポリペプチド
本発明による遺伝的に改変された細胞は、第二のポリペプチドをコードしている第二のポリヌクレオチドを含む。第二のポリペプチドはＨＭＦ酸転換活性を有し、ＨＭＦ酸を産物に転換できる任意のポリペプチドから選択されうる。本発明者らは、ＨＭＦ酸を転換する第二のポリペプチドによるＨＭＦ酸の生物変換が細胞中の第一のポリペプチドの発現によって効果的に改善されることを観察した。
【００５０】
第二のポリペプチドをコードしている第二のポリヌクレオチドは、本発明による細胞の天然の構成成分であってもよく、つまり第二のポリヌクレオチドに関して細胞は遺伝的に改変される必要はない。しかし本発明の特定の実施形態により本発明による細胞は、第二のポリヌクレオチドの機能的導入によって第二のポリヌクレオチドに関して遺伝的に改変される。用語「機能的導入」は、第一のポリペプチド及び第一のポリヌクレオチドとの関連において上で既に説明されている。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態により第二のポリペプチドは、ＨＭＦ酸転換酸化還元酵素である。このＨＭＦ酸転換酸化還元酵素は、配列番号５若しくは６に記載のアミノ酸配列又は配列番号５若しくは６に記載のアミノ酸配列と少なくとも４５％、好ましくは少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、例えば９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するその変種ポリペプチドを含んでもよい。
【００５２】
代替的に配列類似性は、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％類似性であってもよい。実施形態により、示した類似性百分率は同一性百分率であってもよい。具体的な実施形態では第二のポリペプチドは、配列番号５又は６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含みうる。
【００５３】
配列番号５のＨＭＦ酸転換酸化還元酵素は、Ｋｏｏｐｍａｎら、（２０１０ａ）及びＫｏｏｐｍａｎら、（２０１０ｂ）によって以前開示され、ＨｍｆＨと称された。配列番号６のＨＭＦ酸転換酸化還元酵素は、ブラディリゾビウム・ジャポニクムＵＳＤＡ１１０から単離され、ｂｌｒ０３６７遺伝子の翻訳タンパク質産物に対応する。Ｂ．ジャポニクムＵＳＤＡ１１０は、そのゲノム中にＣ．バシレンシスＨＭＦ１４由来の全てのＨＭＦ／フルフラール利用遺伝子に対する相同体を含有する（Ｋｏｏｐｍａｎら、２０１０ａ）。ｂｌｒ０３６７遺伝子の翻訳産物は、Ｃ．バシレンシスＨＭＦ１４由来のＨｍｆＨに最も高い相同性を示したＢ．ジャポニクムＵＳＤＡ１１０のタンパク質である。Ｂ．ジャポニクムＵＳＤＡ１１０が単一炭素源としてＨＭＦを利用することが示されたという事実（Ｋｏｏｐｍａｎら、２０１０ａ）から機能的ＨｍｆＨ相同体を有しているはずである。したがって、ＨｍｆＨ類似活性がｂｌｒ０３６７から生じると期待することは正当化される。
【００５４】
本発明は、多数のＨＭＦ酸転換酸化還元酵素を参照して例示されるが、第二のポリペプチドが別のＨＭＦ酸転換酸化還元酵素である又はさらに酸化還元活性を有さない別のＨＭＦ酸転換ポリペプチドでさえあることが本発明内に明記されることは注目されるべきである。
【００５５】
第二のポリペプチドは、配列番号１１又は１２に記載のポリヌクレオチド配列と少なくとも４５％、好ましくは少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、例えば９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有する第二のポリヌクレオチド配列によってコードされうる。配列番号１１又は１２に記載の配列と第二のポリペプチドとの類似性の好適な代替的レベルは、少なくとも６６％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％類似性であってもよい。実施形態では示した類似性百分率は同一性百分率であってもよい。具体的な実施形態では第二のポリペプチドは、配列番１１又は１２に記載のポリヌクレオチド配列によってコードされうる。
酸化還元活性を有する第二のポリペプチドをコードしている好適なポリヌクレオチドのカプリアビダス・バシレンシスからの単離は、Ｋｏｏｐｍａｎら、（２０１０ａ）において開示されている。この遺伝子はｈｍｆＨと称される。
【００５６】
第二のポリヌクレオチドの単離のための手法では、好適であるポリヌクレオチドを単離するために遺伝子ライブラリーがスクリーニングされうる。ライブラリーは、細菌の上界由来の微生物から構築されうる。これらの微生物は、プロテオバクテリア門に、より詳細にはアルファプロテオバクテリア、ベータプロテオバクテリア又はガンマプロテオバクテリア（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）の綱に属する場合がある。アルファプロテオバクテリアは、リゾビアレス目又はスフィンゴモナダレス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）目に属する場合がある。リゾビアレス目は、メチロバクテリアセアエ科（例えば、Ｍ．ノデュランス若しくはＭ．ラジオトレランス等のメチロバクテリウム属からの生物又はリゾビアセアエ科からの生物）に属する場合がある。リゾビアセアエは、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）／アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）群に、より詳細にはＲ．レグミノサルム（Ｒ．ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）又はＲ．レグミノサルムｂｖ．トリフォリー（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｔｒｉｆｏｌｉｉ）等のリゾビウム属に属する場合がある。それらは、Ａ．ラジオバクター（Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）等のアグロバクテリウム属にも属する場合がある。リゾビアセアエは、ブラディリゾビアセアエ科に、より詳細にはＢ．ジャポニクム等のブラディリゾビウム属に属する場合がある。スフィンゴモナダレス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎｅｄａｌｅｓ）は、スフィンゴモナダセアエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）科に、より詳細にはＳ．ウィッチイー（Ｓ．ｗｉｔｔｉｃｈｉｉ）又はＳ．クロロフェノリクム（Ｓ．ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｍ）等のスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属に属する場合がある。ベータプロテオバクテリアは、メチロフィラレス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌａｌｅｓ）目又はバークホルデリアレス目に属する場合がある。メチロフィラレスは、メチロフィラセアエ（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌａｃｅａｅ）科に属する場合がある（例えばメチロボラス（Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ）属由来の生物）。バークホルデリアレスは、バークホルデリアセアエ科に属する場合がある（例えばカプリアビダス・バシレンシス等のカプリアビダス属由来の生物）。それらは、バークホルデリア・フィトファーマンズ、Ｂ．フィマタム、Ｂ．グラミニス、Ｂ．ゼノボランス若しくはＢ．セノセパシア（Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）等のバークホルデリア属に又はオキサロバクテラセアエ（Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）科、ジャンチノバクテリウム（Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属にも属する場合がある。ガンマプロテオバクテリアは、エンテロバクテリアレス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）目、エンテロバクテリアセアエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科、エルシニア・ルケリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｒｕｃｋｅｒｉ）等のエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属に属する場合がある。微生物は、さらにアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門、アクチノバクテリア綱、アクチノバクテリダエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｄａｅ）亜綱、アクチノマイセタレス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目の細菌であってもよい。アクチノマイセタレスは、ストレプトマイシネアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｅａｅ）亜目、シュードノカルジネアエ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉｎｅａｅ）亜目又はミクロモノスポリネアエ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒｉｎｅａｅ）亜目に属する場合がある。ストレプトマイシネアエは、ストレプトマイセタセアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）科に、より詳細にはＳ．ビオラセウスニゲル（Ｓ．ｖｉｏｌａｃｅｕｓｎｉｇｅｒ）、Ｓ．ハイグロスコピカス（Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）又はＳ．クラブリゲルス（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）等のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する場合がある。シュードノカルジネアエは、シュードノカルジアセアエ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）科、より詳細にはＳ．エリトラエア（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ）等のサッカロポリスポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）属に、又はアクチノシンネマタセアエ（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａｔａｃｅａｅ）科に、より詳細にはＳ．ムタビリス（Ｓ．ｍｕｔａｂｉｌｉｓ）若しくはＳ．ムタビリス亜種カプレオルス（ｃａｐｒｅｏｌｕｓ）等のサッカロトリクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ）属に、又はＡ．ミルム（Ａ．ｍｉｒｕｍ）等のアクチノシンネマ属に属する場合がある。ミクロモノスポリネアエは、ミクロモノスポラセアエ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）科に、より詳細にはミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属に属する場合がある。
【００５７】
配列番号５若しくは６に示すアミノ酸配列及び／又は配列番号１１若しくは１２に示すヌクレオチド配列に基づいて、当業者は第二のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を単離するための好適なプローブ及び／又はプライマーを構築できる。
【００５８】
代替的に配列番号５又は６に示すアミノ酸配列及び配列番号１１又は１２に示すヌクレオチド配列に基づいて、第一のポリペプチドを考察した節において既に示したとおり、当業者は第二のポリペプチドをコードしている合成配列を商業的供給者から得ることができる。
【００５９】
第三のポリヌクレオチド及びポリペプチド
代替的実施形態により本発明による遺伝的に改変された細胞は、第三のポリペプチドをコードしている第三のポリヌクレオチドを含む。第三のポリペプチドは、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５のアミノ酸配列と少なくとも４５％、好ましくは少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、例えば９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【００６０】
代替的に配列類似性は、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の類似性として表されうる。実施形態により示される類似性百分率は、同一性百分率であってもよい。具体的な実施形態では、第三のポリペプチドは、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む場合がある。配列番号１９のアミノ酸配列は、第三のポリペプチドの好ましい選択である。このアミノ酸配列は、国際公開第２０１１／０２６９０６号（配列番号１５）において近年公開された。
【００６１】
そのような第三のポリペプチドの機能的発現は、フランアルデヒドを転換できるアルデヒド脱水素酵素活性（Ａｄｈ）をもたらし、ＨＭＦ酸生物変換及び／又はＦＤＣＡ産生に関するさらなる改善を提供する。
【００６２】
第三のポリペプチドの発現に関連する効果は、配列番号１９のアミノ酸配列に関する例において示されている。配列類似性／同一性のレベルに基づいて、配列番号２０〜２５のポリペプチド及びそれらの類似体／相同体が同様の効果を有すると期待することは正当化される。
【００６３】
第三のポリペプチドは、配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１又は３２に記載のポリヌクレオチド配列と少なくとも４５％、好ましくは少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、例えば９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有する第三のポリヌクレオチド配列によってコードされうる。好ましくは第三のポリペプチドは、配列番号２６に記載のポリヌクレオチド配列、又は配列番号２６に記載のポリヌクレオチド配列に示した配列類似性を有する相同体によってコードされる。配列番号２６のポリヌクレオチド配列は、国際公開第２０１１／０２６９０６号（配列番号１６）において近年公開された。配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１又は３２に記載の配列と第三のポリヌクレオチドとの類似性の好適な代替的レベルは、少なくとも６６％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％類似性であってもよい。実施形態により示した類似性百分率は同一性百分率であってもよい。具体的な実施形態では、第三のポリペプチドは、配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１又は３２に記載のポリヌクレオチド配列によってコードされうる。
【００６４】
第三のポリペプチド及び対応する第三のポリヌクレオチドの単離及びさらなる操作は、上に及び以後に第一のポリペプチド及び対応する第一のポリペプチドについて考察されたとおり一般に実施されうる。
【００６５】
ベクター
本発明の別の態様は、第一及び第二のポリヌクレオチド又はその機能的等価物を含む（クローニングベクター及び発現ベクターを含む）ベクター並びにそのようなベクターを好適な宿主細胞で（例えば本発明のポリペプチドの発現が生じる条件下で）増殖させる、形質転換する又は形質移入する方法に関する。本明細書において用いる用語「ベクター」は、ベクターに結合している別の核酸を輸送できる核酸分子を意味する。
【００６６】
第一及び第二のポリヌクレオチド並びに任意選択で第三のポリヌクレオチドは、組換え複製可能ベクター（例えばクローニングベクター及び発現ベクター）に組み込まれうる。ベクターは、適合可能な宿主において核酸を複製するために用いられうる。したがってさらなる実施形態では本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能ベクターに導入するステップ、適合する宿主細胞にベクターを導入するステップ及びベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させるステップによって本発明のポリヌクレオチドを作製する方法を提供する。ベクターは、宿主細胞から回収されうる。好適な宿主細胞は、下に記載される。
【００６７】
発現カセット又は本発明のポリヌクレオチドが挿入されるベクターは、組換えＤＮＡ手順に好都合に供されうる任意のベクターであってもよく、ベクターの選択はベクターが導入される宿主細胞にしばしば依存する。
【００６８】
本発明によるベクターは、自律的複製ベクター（すなわち、染色体外の実体として存在するベクター）であってもよく、その複製は染色体の複製に依存しない（例えばプラスミド）。代替的にベクターは、宿主細胞に導入された場合に宿主細胞ゲノムに組み込まれ、ベクターが組み込まれた染色体（複数可）と一緒に複製されるものであってもよい。
【００６９】
ベクターの一型は、追加的ＤＮＡセグメントがライゲートされうる環状二重鎖ＤＮＡループを意味する「プラスミド」である。ベクターの別の型は、追加的ＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされうるウイルスベクターである。ある種のベクターは、ベクターが導入された宿主細胞において自律的複製ができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌性ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入において宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。さらにある種のベクターは、それらが作動可能に連結している遺伝子の発現を方向付けることができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。一般に組換えＤＮＡ技術における利用のための発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。用語「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も慣用される形態であることから本明細書において互換的に用いられうる。しかし本発明は、等価の機能を果たす、コスミド、ウイルス性ベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）、ファージベクター並びにトランスポゾン及びプラスポゾン等の発現ベクターの他の形態を含むことを意図する。
【００７０】
当業者は、示されるアミノ酸及びポリヌクレオチドの配列、当技術分野での当業者の知識及び商業的に入手可能な手段に基づいて本発明によるベクターを構築できる。
【００７１】
好ましい実施形態により第一及び第二のポリヌクレオチド配列は、単一のベクターに位置付けられる。このベクターは、第三のポリヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。当業者が理解するとおり、第一及び第二のポリヌクレオチド配列を含む（及び第三のポリヌクレオチド配列をさらに含んでもよい）ベクターの使用は、第一及び第二のポリペプチドを（任意選択で第三のポリペプチドと共に）機能的に発現する遺伝的に改変された細胞の構築を非常に簡易化する。しかし同様に当業者が理解するとおり、第一及び第二のポリペプチドを機能的に発現する遺伝的に改変された細胞は、代替的ベクターを含む種々の他の形質転換計画を介しても得ることができる。この観点において、特定の実施形態により第二のポリヌクレオチド配列の機能的導入が必要条件ではないことは注目されるべきである。同様に特定のさらなる代替的実施形態により、第三のポリヌクレオチド配列の機能的導入は必要条件ではない。
【００７２】
宿主細胞
本発明による遺伝的に改変された細胞は、任意の好適な宿主細胞から構築されうる。宿主細胞は、未改変細胞であってもよく、既に遺伝的に改変されていてもよい。細胞は、原核生物細胞、真核生物細胞、植物細胞又は動物細胞であってもよい。そのような細胞では、１つ又は複数の遺伝子が全長で又は部分で欠失、ノックアウト又は破壊されている場合があり、その場合任意選択で１つ又は複数の遺伝子はプロテアーゼをコードしている。実施形態により本発明による宿主細胞は、真核生物宿主細胞である。好ましくは真核生物細胞は、哺乳動物、昆虫、植物、真菌又は藻類の細胞である。好ましい哺乳動物細胞は、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、ＰｅｒＣ６細胞及び融合細胞を含む。好ましい昆虫細胞は、例えばＳｆ９及びＳｆ２１細胞並びにそれらの派生物を含む。さらに好ましくは、真核生物細胞は真菌細胞（すなわちカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）株、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）株、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）株、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）株、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）株、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）菌株又はヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）菌株等の酵母細胞）である。より好ましくは、真核生物細胞は、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）及びピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）又は糸状真菌細胞である。特定の実施形態では真核生物細胞は、糸状真菌細胞である。
【００７３】
「糸状真菌」は、ユーマイコタ（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）亜門及びオオマイコタ（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）亜門の全ての糸状形態（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈら、（１９９５）によって定義のとおり）を含む。糸状真菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン及び他の複合多糖からなる菌糸体壁によって特徴付けられる。植物性の生育は菌糸の伸長により、炭素異化反応は偏性好気性である。糸状真菌株は、これだけに限らないがアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリカス（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロマイセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ファネロカエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、プレウロタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の菌株を含む。
【００７４】
好ましい糸状真菌細胞はアスペルギルス属、クリソスポリウム属、ペニシリウム属、タラロマイセス属又はトリコデルマ属の種に、最も好ましくはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ソジャエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、タラロマイセス・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・ラクノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）又はペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）から選択される種に属する。
【００７５】
別の実施形態により本発明による宿主細胞は、原核生物細胞である。好ましくは原核生物宿主細胞は細菌細胞である。用語「細菌細胞」は、グラム陰性及びグラム陽性の微生物を含む。好適な細菌は、例えばエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）属、カウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）（シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ））属、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、セレノモナス（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）属、メガスファエラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、メチロバクテリウム属、メチロボラス（Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アシディフィリウム（Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ）属、ディノロセオバクター（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、スルホロブス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属又はスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属から選択されうる。好ましくは細菌細胞は、バシルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシルス・プンティス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｎｔｉｓ）、バシルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バシルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バシルス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、メチロバクテリウム・ラジオトレランス（Ｍｅｔｈｙｌ���ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、メチロバクテリウム・ノデュランス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕｌａｎｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、シュードモナス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・プチダＳ１２（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｓ１２）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、スタフィロコッカス・カルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）、リゾビウム・レグミノサルムｂｖ．トリフォリー（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｔｒｉｆｏｌｉｉ）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、カプリアビダス・バシレンシス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）、カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）（ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ））、ラルストニア・ピケティー（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ）、バークホルデリア・フィトファーマンズ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、バークホルデリア・フィマタム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｍａｔｕｍ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、バークホルデリア・グラミニス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、アシディフィリウム・クリプタム（Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ  ｃｒｙｐｔｕｍ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈｉｂａｅ）、スルホロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、スルホロブス・イスランディカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｉｓｌａｎｄｉｃｕｓ）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、スフホロブス・トコダイー（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ）からなる群から選択される。
【００７６】
非常に好ましい宿主細胞は、シュードモナス・プチダＳ１２である。この菌株においてカプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４由来のｈｍｆＨ遺伝子の機能的発現は、ＨＭＦ酸化能力の導入のために有効であることが証明されており、この基質からのＦＤＣＡ産生をもたらす。
【００７７】
本発明による細胞の具体的使用に関して、宿主細胞の選択はそのような使用に応じてなされうる。具体的に好ましいのは、リグノセルロース供給原料の転換のために好適であり、ＦＤＣＡ等のフラン化合物の産生のために好ましい条件に耐性である宿主である。当業者は、前述の任意の宿主細胞に第一の及び任意選択で第二のポリヌクレオチドを機能的に導入するために好適な手段及び方法を利用できる。
【００７８】
ＨＭＦ酸生体内転換
本発明によって遺伝的に操作された細胞は、改善されたＨＭＦ酸生体内転換を有する。改善されたＨＭＦ酸生物変換は、（バイオ燃料及び生化学物質の産生のためのエタノール生産発酵のための供給原料等、フラン化合物が有害であると考えられている）供給原料からのＨＭＦ酸及びそのフラン前駆体の削減のために有益である。他の応用では改善されたＨＭＦ酸生物変換は、ＦＤＣＡ生物学的産生等において、ＨＭＦ酸が出発材料又は中間体である化学物質の生物学的産生を改善する。
【００７９】
ＨＭＦ酸転換酵素がＨＭＦ酸転換酸化還元酵素である場合、本発明による細胞は生物学的酸化反応を実施できる。本明細書において酸化反応は、酸化還元酵素存在下での酸化剤とＨＭＦ酸との１つ又は複数の反応である。
【００８０】
好ましい酸化反応はＦＤＣＡの産生であり、ＨＭＦ酸がＨＭＦ酸転換酸化還元酵素の存在下での酸化剤との反応によって、ＦＤＣＡに転換される。フラン化合物のＦＤＣＡへの生物変換は、（ＨＭＦ酸が中間体であり）例えばＨＭＦを出発材料として用いる先行技術において開示されている（Ｋｏｏｐｍａｎら、２０１０ａ及びＫｏｏｐｍａｎら、２０１０ｂを参照されたい）。そのような生物変換は、それらが本発明による細胞によって実施される場合に改善される。
【００８１】
ＨＭＦ酸は、本発明による細胞又は現存する任意の他の細胞によって１つ又は複数のフラン前駆体からインサイチュで生成されうる。インサイチュでの生成で、ＨＭＦ酸が系の外から添加されないことが意味される。その代わりにＨＭＦ酸は、フラン前駆体をＨＭＦ酸に変換する１つ又は複数の生物変換を介して系中で生成される。
【００８２】
ＨＭＦ酸のフラン前駆体は、５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−カルボアルデヒド（ＨＭＦ）、フラン−２，５−ジカルボアルデヒド（ＤＦＦ）及び［５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−イル］メタノール（ＨＭＦアルコール）からなる群から選択されてもよく、好ましくはフラン前駆体はＨＭＦである。
【００８３】
ＨＭＦは、当技術分野において公知であるとおり、酸触媒脱水によって１つ又は複数のヘキソース糖から得ることができる。ヘキソース糖は、バイオマスから、好ましくはリグノセルロース系バイオマスから得ることができる。
【００８４】
酸化反応は、産生物をもたらす多数の連続的酸化反応ステップ（例えばＨＭＦ酸のＦＦＡへの酸化及びＦＦＡのＦＤＣＡへのさらなる酸化）を含む場合がある。酸化反応の例は、図１に示されている。
【００８５】
酸化反応は、好ましくは比較的穏和な温度、すなわち１０〜８０℃、より好ましくは２０〜４５℃、最も好ましくは約２５〜４０℃で実施される。塩の形成が調節されうるように、ＦＤＣＡが中性形態又は完全に解離した形態のいずれかにあるｐＨで反応を実施することは好ましい。ＦＤＣＡ中の２つの酸成分の存在を考慮すると、２つの別々の好ましいｐＨ範囲がある。反応中のｐＨは、ｐＨ１〜６、好ましくはｐＨ１〜４、最も好ましくはｐＨ１〜３である場合がある。代替的に反応中のｐＨは、ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ５〜８、最も好ましくはｐＨ５〜７である場合がある。当業者は、宿主細胞の要求条件もそのプロセスに好適なｐＨ値の選択に影響することを理解する。本発明において好適である種々の宿主細胞に好適であるｐＨ値の選択は、当業者の領域の範囲内であり、標準的教本から導かれうる。シュードモナス・プチダＳ１２を含むシュードモナス・プチダについては、好ましいｐＨ範囲はｐＨ５〜７である。
【００８６】
反応時間は、酸素分子等の酸素源又は水又はフラン酸化酵素の要求に応じたさまざまな酸素供給源からの酸素の添加を伴って６〜１５０時間である場合がある。空気は、酸素分子の供給源として好都合に用いられうる。
【００８７】
反応器は、任意の好適な（通気された）バイオリアクターであってもよい。バイオリアクターは、バッチで、継続的に又は流加操作で操作されうる。
【００８８】
生体内転換後に細胞は確立された方法によって培地から分離及び再利用されうる。ＦＤＣＡ、ＨＭＦ酸等の酸化産物は、（酸）沈殿及びそれに続く冷却結晶化、及び結晶化酸化産物（例えば結晶化ＦＤＣＡ）の分離によって反応混合物から回収されうる。しかし、当技術分野において公知のとおりこれだけに限らないが酸沈殿及び溶媒抽出等の他の回収方法は好適である。
【００８９】
リグノセルロース系供給原料からのＨＭＦ酸の除去等の多数の応用について、ＨＭＦ転換の正確な方法は無関係である。重要なことはＨＭＦ酸がフラン前駆体から形成される場合にＨＭＦ酸自体を除去するために又はその蓄積を予防するために、ＨＭＦ酸が有効に転換されることである。そのような応用についてＨＭＦ酸転換ポリペプチドは、現在公知である又は既に発見されているＨＭＦ転換活性を有する任意のポリペプチドであってもよい。
【００９０】
本発明のさらなる態様は、フラン前駆体からＦＤＣＡへの生体内転換のための本発明による遺伝的に改変された細胞の使用を目的とする。フラン前駆体は、５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−カルボアルデヒド（ＨＭＦ）、［５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−イル］メタノール（ＨＭＦアルコール）、フラン−２，５−ジカルボアルデヒド（ＤＦＦ）、５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−カルボン酸（ＨＭＦ酸）又は５−ホルミルフラン−２−カルボン酸（ＦＦＡ）から特に選択されうる。好ましくはＨＭＦが選択されたフラン前駆体である。ＨＭＦ酸はＨＭＦからＦＤＣＡへの生物変換の中間体である場合がある。
【００９１】
本発明は、次の実施例を参照してさらに例示される。
【実施例】
【００９２】
一般的方法
菌株及びプラスミド。シュードモナス・プチダＳ１２（ＡＴＣＣ７００８０１）をカプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４（Ｗｉｅｒｃｋｘら、２０１０；Ｋｏｏｐｍａｎら、２０１０ａ）及びメチロバクテリウム・ラジオトレランスＪＣＭ２８３１（＝ＡＴＣＣ２７３２９＝ＤＳＭ１８１９；ゲノム配列はｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ−ｐｓｆ．ｏｒｇ／ｍｅｔｒａ／ｍｅｔｒａ．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌで入手可能である）由来の遺伝子の発現のための宿主として用いた。エシェリキア・コリＤＨ５α又はＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）菌株を一般的クローニング目的で用いた。
【００９３】
Ｃ．バシレンシス又はＭ．ラジオトレランスの遺伝子のエピソーム発現のために、ｐＵＣＰ２２由来ｐＪＴ’ｍｃｓ（Ｋｏｏｐｍａｎら、２０１０ａ）若しくはｐＪＮＮｍｃｓ（ｔ）（Ｗｉｅｒｃｋｘら、２００８）又はｐＢＢＲ１ＭＣＳ由来ｐＢＴ’ｍｃｓ（Ｋｏｏｐｍａｎら、２０１０ａ）のいずれかを用いた。ｐＪＴ’ｍｃｓ及びｐＢＴ’ｍｃｓにおいて標的遺伝子の発現は、構成的ｔａｃプロモーターから駆動される。ｐＪＮＮｍｃｓ（ｔ）において発現は、サリチル酸誘導性ＮａｇＲ／ＰｎａｇＡａ発現カセットから駆動される。
【００９４】
培地及び培養条件。無機塩培地（ＭＭ）を合成培地として用いた。ＭＭは次の：（鉱質除去水１リットルあたり）Ｋ２ＨＰＯ４  ３．８８ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４  １．６３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２．０ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．１ｇ、ＥＤＴＡ  １０ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２ｍｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  １ｍｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ５ｍｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．４ｍｇ及びＭｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  １ｍｇを指定の炭素源を補充されて含んだ。ルリア培地（Ｌ−培地：１０ｇ／ｌ  バクトトリプトン（Ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎ）（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ／ｌ  イーストエクストラクト（ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ）をＰ．プチダＳ１２及び派生菌株、Ｃ．バシレンシス、Ｍ．ラジオトレランス並びにＥ．コリＤＨ５α及び派生菌株の増殖のための完全培地として用いた。プレート培養のために、１．５％（ｗ／ｖ）アガー（ａｇａｒ）（Ｄｉｆｃｏ）でＬ−培地を固化させた。ｐＪＴ’ｍｃｓ又はｐＪＮＮｍｃｓ（ｔ）由来プラスミドを保持しているＥ．コリ形質転換体の選択のためにアンピシリン（Ａｍｐ）を１００μｇ／ｍｌで培地に添加した。ｐＪＴ’ｍｃｓ又はｐＪＮＮｍｃｓ（ｔ）由来プラスミドを保持しているＰ．プチダＳ１２形質転換体の選択のためにゲンタマイシン（Ｇｍ）をルリア培地に３０μｇ／ｍｌで及び無機塩培地に１０μｇ／ｍｌで添加した。ｐＢＴ’ｍｃｓ由来プラスミドを保持しているＥ．コリ又はＰ．プチダＳ１２の形質転換体のいずれかの選択のために５０μｇ／ｍｌ  カナマイシン（Ｋｍ）を培地に添加した。抗生物質はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｐ．プチダ、Ｃ．バシレンシス及びＭ．ラジオトレランスは３０℃で培養し、Ｅ．コリは３７℃で培養した。
【００９５】
Ｐ．プチダＳ１２由来菌株で流加実験を、ラボフォー４バイオリアクターシステム（Ｌａｂｆｏｒｓ  ４  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｉｎｆｏｒｓ  Ｂｅｎｅｌｕｘ  ＢＶ）又はバイオフロ１１０コントローラー（ＢｉｏＦｌｏ１１０  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のいずれかによって制御された２Ｌ容器において実施した。加圧した空気又は純酸素を上部スペースに又は培地中を通してのいずれかで供給した。温度は３０℃に制御し、ＮＨ４ＯＨ、ＮａＯＨ又はＫＯＨのいずれかの自動添加によってｐＨを７．０に維持した。バッチフェーズは、菌株特異的抗生物質及び４０ｇ／ｌグリセロールを添加した２×ＭＭ培地で実施した。高細胞密度培養のためにバッチフェーズ培地には、１０ｇ／ｌ  イーストエクストラクト（ＹＥ）をさらに補充した。初期グリセロールの枯渇後、供給（必要に応じて１ｍＭ  Ｎａ−サリチル酸を補充した１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２中の４又は８Ｍグリセロール）を開始し、グリセロールを培養における制限基質として維持しながら増殖させるように制御した。ＨＭＦ供給（鉱質除去水中４Ｍ）を別の供給ポンプを介して供給した、供給速度は用いた菌株に応じて調整し、条件を検討した。溶解酸素圧力（ＤＯ）を継続的にモニターし、十分な通気を維持するために撹拌速度を調整した。
【００９６】
アッセイ及び分析方法。細胞乾燥重量（ＣＤＷ）測定：細菌培養物のＣＤＷ量を、バイオウエーブセルデンシティーメーター（Ｂｉｏｗａｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｍｅｔｅｒ）（ＷＰＡ  Ｌｔｄ）又はマイクロカントＭＱＸ２００ユニバーサルマイクロプレートスペクトロフォトメーター（μＱｕａｎｔ  ＭＱＸ２００  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）（Ｂｉｏｔｅｋ）を用い、平底９６ウエルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）を用いて６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）を測定することによって決定した。ＯＤ６００の１．０は、Ｐ．プチダについて０．５６ｇ  ＣＤＷ／Ｌ（Ｂｉｏｗａｖｅ）又は１．４ｇ  ＣＤＷ／Ｌ（μＱｕａｎｔ）に対応する。
【００９７】
ＨＰＬＣ分析：フラン化合物（ＦＤＣＡ、ＨＭＦ、ＨＭＦアルコール、ＨＭＦ酸及びＦＦＡ）をＫｏｏｐｍａｎら、（２０１０ａ）によって記載されたとおりＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。糖、アルコール及び有機酸も屈折率（ＲＩ）検出器を用いるＨＰＬＣ（アジレント１１００システム（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ｓｙｓｔｅｍ））によって分析した。用いたカラムは、バイオラッドアミネックスＨＰＸ−８７Ｈ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ）（３００×７．８ｍｍ、水素型、粒子サイズ９μｍ、架橋８％、ｐＨ範囲１〜３）、５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４を溶離液とし、流速０．６ｍｌ／分であった。
【００９８】
化学物質
ＨＭＦはＳｉｇｍａ、Ｅｕｒｏｌａｂｓ  Ｌｔｄ（Ｐｏｙｎｔｏｎ、ＵＫ）又はＹｏｒｅ  Ｃｈｅｍｉｐｈａｒｍ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．（Ｎｉｎｇｂｏ、Ｃｈｉｎａ）のいずれかで購入した。ＦＤＣＡ及び５−ヒドロキシメチル−フロン酸（ＨＭＦ酸）の分析標準は、それぞれＩｍｍｕｎｏｓｏｕｒｃｅ  Ｂ．Ｖ．（Ｈａｌｌｅ−Ｚｏｅｒｓｅｌ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  ＳＣ、ＵＳＡ）から購入した。他の全ての化学物質はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂ．Ｖ．（Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から購入した。
【００９９】
分子及び遺伝子技術：ゲノムＤＮＡをＣ．バシレンシスＨＭＦ１４及びＭ．ラジオトレランスＪＣＭ２８３１からＤＮイージーティッシューキット（ＤＮｅａｓｙ  ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ）（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて単離した。プラスミドＤＮＡをＱＩＡプレップスピンミニプレップキット（ＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ）（ＱＩＡＧＥＮ）で単離した。アガロース捕捉ＤＮＡ断片をＱＩＡＥＸＩＩゲルエクストラクションキット（ＱＩＡＥＸＩＩ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ）（ＱＩＡＧＥＮ）で単離した。
【０１００】
ＰＣＲ反応を製造者の説明書に従ってアクプライムＰｆｘポリメラーゼ（Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｐｆｘ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で実施した。オリゴヌクレオチドプライマー（実施例において明記する）はＭＧＷバイオテックＡＧ（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＧ）（Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成された。プラスミドＤＮＡをジーンパルサーエレクトロポレーションデバイス（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ）（ＢｉｏＲａｄ）を用いてエレクトロコンピテント細胞に導入した。他の標準的分子生物学技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）に従って実施した。
【０１０１】
実施例Ｉ：ＨｍｆＨとＨｍｆＴ１との共発現はＰ．プチダＳ１２においてＦＤＣＡ産生を改善する
ｈｍｆＴ１遺伝子（以前はｍｆｓ１と記載（Ｋｏｏｐｍａｎら、２０１０ａ）；配列番号７）をカプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４のゲノムＤＮＡからプライマーｈｍｆＴ１（ｆ）（配列番号１３）及びｈｍｆＴ１（ｒ）（配列番号１４）を用いたＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を１３５９ｂｐ  ＥｃｏＲＩ−ＮｈｅＩ断片としてｐＪＮＮｍｃｓ（ｔ）に導入し、ｐＪＮＮｈｍｆＴ１（ｔ）を得た。天然リボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含むｈｍｆＨ遺伝子（配列番号１１）をＰＣＲによってＣ．バシレンシスＨＭＦ１４のゲノムＤＮＡから、プライマーＦＮ２３（配列番号１５）及びＦＮ２４（配列番号１６）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を１７７７ｂｐ  ＥｃｏＲＩ断片としてｐＢＴ’ｍｃｓ中にクローン化し、プラスミドｐＢＴ’ｈｍｆＨを得た。プラスミドｐＢＴ’ｈｍｆＨ及びｐＪＮＮｈｍｆＴ１（ｔ）をＰ．プチダＳ１２に連続的に導入し、Ｐ．プチダＳ１２＿Ｂ３８を得た。
【０１０２】
Ｐ．プチダＳ１２＿Ｂ３８を一般的方法の節で記載したとおり流加で培養した。バッチ相では、グリセロール供給及びＨＭＦ供給が開始した後におよそ３ｇ  ＣＤＷ／ｌの細胞密度が達成された。対照流加培養をＨｍｆＴ１を発現しないＰ．プチダＳ１２＿２６４２で実施した（Ｐ．プチダＳ１２＿ｈｍｆＨと同様（Ｋｏｏｐｍａｎら、２０１０ｂ））。
【０１０３】
図２は、Ｐ．プチダＳ１２＿２６４２菌株及びＳ１２＿Ｂ３８菌株のＨＭＦ供給培養におけるＦＤＣＡ及びＨＭＦ酸の濃度を示す。ＨＭＦ酸の多量の蓄積がＰ．プチダＳ１２＿２６４２について明らかであった。対照的にＨＭＦ酸蓄積は、Ｐ．プチダＳ１２＿Ｂ３８培養においてわずかであった。減少したＨＭＦ酸蓄積は、ＨＭＦ供給速度の増加をさらに可能にし、比較的短い処理時間での高いＦＤＣＡ力価をもたらす。これは、検査した菌株について特異的ＦＤＣＡ生産性にも明らかに反映された（図３）。
【０１０４】
実施例ＩＩ：ＨｍｆＨとメチロバクテリウム・ラジオトレランスＪＣＭ２８３１由来のポリペプチドとの共発現は、Ｐ．プチダＳ１２においてＦＤＣＡ産生を改善する
遺伝子座タグｍｒａｄ２８３１＿４７２８（配列番号９）を有する遺伝子を、メチロバクテリウム・ラジオトレランスＪＣＭ２８３１のゲノムＤＮＡから、プライマーＭｒａｄ（ｆ）（配列番号１７）及びＭｒａｄ（ｒ）（配列番号１８）を用いたＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を１３８１ｂｐ  ＥｃｏＲＩ−ＮｈｅＩ断片としてｐＪＮＮｍｃｓ（ｔ）に導入し、ｐＪＮＮ＿Ｍｒａｄ（ｔ）を得た。プラスミドｐＢＴ’ｈｍｆＨ（実施例Ｉ参照）及びｐＪＮＮ＿Ｍｒａｄ（ｔ）をＰ．プチダＳ１２に連続的に導入し、Ｐ．プチダＳ１２＿Ｂ５１を得た。
【０１０５】
Ｐ．プチダ＿Ｂ５１を振盪フラスコで、１ｇ／ｌイーストエクストラクト、８０ｍＭグリセロール、２ｍＭグルコース、１００μＭサリチル酸Ｎａ、５０μｇ／ｍｌカナマイシン及び１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを補充した無機塩培地（４×緩衝液強度）で培養した。対照菌株としてＰ．プチダＳ１２＿Ｂ３８を用いた（実施例Ｉ参照）。一晩培養後、培養物に８０ｍＭグリセロール及び１００μＭサリチル酸Ｎａを補充した。次におよそ１０ｍＭ  ＨＭＦを添加し、ＦＤＣＡ産生を評価した。
【０１０６】
図４は、ＦＤＣＡ産生の際のＨＭＦ酸蓄積が両方の菌株においてわずかであったことを示し、ＨｍｆＴ１及びＭｒａｄ２８３１＿４７２８ポリペプチドが同様の機能性を示すことを確認している。Ｐ．プチダＳ１２＿Ｂ３８についてＦＤＣＡ産生は、低い初期バイオマス密度のためでありうる長い対数相及びいくらか遅い速度を示した（図４）。しかし、具体的な最大ＦＤＣＡ生産性は、両方の菌株について同じであり（すなわち２．３６ｍｍｏｌ  ＦＤＣＡ／（ｇＣＤＷ、時））、Ｍｒａｄ２８３１＿４７２８及びＨｍｆＴ１ポリペプチドがＨＭＦ酸蓄積を最少化し、ＦＤＣＡ産生を最大化するために等しく有効であったことを示した。
【０１０７】
実施例ＩＩＩ：ＨｍｆＨ及びＨｍｆＴ１を共発現するＰ．プチダＳ１２による高レベルＨＭＦ酸転換能力
実施例Ｉにおいて実証したとおり、Ｐ．プチダＳ１２におけるＨｍｆＨ及びＨｍｆＴ１の共発現は、ＨＭＦをＦＤＣＡに酸化する特異的能力を著しく改善した。この改善された能力を最適に使用するために、流加実験をＰ．プチダＳ１２＿Ｂ３８について高バイオマス密度で開始して実施した。
【０１０８】
Ｐ．プチダＳ１２＿Ｂ３８の酸化能力を飽和させ、ＨＭＦ及びＨＭＦ酸の蓄積を誘発するためにＨＭＦ供給を、高速（２０ｍｌ／時；４Ｍ  ＨＭＦ供給溶液）で開始した（図５）。ＨＭＦ酸がおよそ２０ｍＭに蓄積したときに、ＨＭＦ供給速度を５ｍｌ／時に低下させ、フラン濃度をモニターした。最初に、蓄積した残存ＨＭＦの酸化のためＨＭＦ酸濃度はおよそ３７ｍＭに増加したが、その後、ＨＭＦ供給速度０．７２ｍｍｏｌ／（ｇ／ＣＤＷ．時）で５時間以内に２ｍＭ未満に低下した。
【０１０９】
これらの結果は、ＨＭＦ酸酸化能力がＨｍｆＨ及びＨｍｆＴ１の共発現によって改善されたことを明らかに実証する。Ｋｏｏｐｍａｎら、（２０１０ｂ）による結果は、Ｐ．プチダＳ１２＿ｈｍｆＨ（ＨｍｆＴ１を欠失している）が、より低いＨＭＦ供給速度（０．０９ｍｍｏｌ／（ｇＣＤＷ．時））でＨＭＦ酸濃度をおよそ５０ｍＭから５ｍＭ未満に低下させるために、５０時間以上を必要としたことを示した。改善されたＨＭＦ酸酸化能力は、より短い処理時間（９４時間対１１５時間、Ｋｏｏｐｍａｎら、（２０１０ｂ）による）でさらに達成したより高い最終ＦＤＣＡ力価（Ｋｏｏｐｍａｎら、（２０１０ｂ）により１５２ｇ／ｌ対３０．１ｇ／ｌ）をもたらした。
【０１１０】
実施例ＩＶ：ＨｍｆＨ、ＨｍｆＴ１及びＣ．バシレンシスＨＭＦ１４由来のアルデヒド脱水素酵素の共発現は、Ｐ．プチダＳ１２においてＦＤＣＡ産生を改善する
カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４中のＨＭＦ分解オペロン（Ｗｉｅｒｃｋｘら、２０１１）と関連するアルデヒド脱水素酵素をコードしている遺伝子（配列番号２６；翻訳されたアミノ酸配列：配列番号１９）をプライマーＦＮ１３（配列番号３３）及びＦＮ１４（配列番号３４）を用いてＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を１５４３ｂｐ  ＮｏｔＩ断片として、Ｂｓｐ１２０Ｉ消化（ＮｏｔＩに適合する）ｐＢＴ’ｈｍｆＨ（実施例Ｉ参照）に導入し、ｐＢＴ’ｈｍｆＨ−ａｄｈを得た。アルデヒド脱水素酵素をコードしている遺伝子がフォワード（ｆ）方向で存在したプラスミド変種（ｐＢＴ’ｈｍｆＨ−ａｄｈ（ｆ））及びｐＪＮＮｈｍｆＴ１（ｔ）（実施例Ｉ参照）をＰ．プチダＳ１２に連続的に導入した。得られた菌株Ｐ．プチダＳ１２＿Ｂ９７は、ＨｍｆＨ、ＨｍｆＴ１及びアルデヒド脱水素酵素を共発現した。ＨｍｆＨ酸化還元酵素及びアルデヒド脱水素酵素の共発現（つまりＨＭＦ酸輸送体ＨｍｆＴ１を含まない）についての対照菌株として、ｐＢＴ’ｈｍｆＨ−ａｄｈ（ｆ）だけを含有しているＰ．プチダＳ１２＿Ｂ１０１を構築した。Ｐ．プチダＳ１２＿Ｂ３８（実施例Ｉ参照）をアルデヒド脱水素酵素を含まないＨｍｆＴ１及びＨｍｆＨの共発現についての対照菌株として用いた。
【０１１１】
Ｐ．プチダ菌株Ｓ１２＿Ｂ３８、Ｓ１２＿Ｂ９７及びＳ１２＿Ｂ１０１を振盪フラスコで、１ｇ／ｌイーストエクストラクト、８０ｍＭグリセロール、２ｍＭグルコース、５０μｇ／ｍｌカナマイシン及び１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを補充した無機塩培地（４×緩衝液強度）で培養した（注：Ｂ１０１菌株についてはカナマイシンだけを添加した）。サリチル酸Ｎａ（１μＭ）をｈｍｆＴ１の誘導のため前培養だけに添加した。およそ１０ｍＭ  ＨＭＦの添加後に、ＦＤＣＡ及びＨＭＦ酸の蓄積を評価した。
【０１１２】
ＨｍｆＨ（酸化還元酵素）及びＨｍｆＴ１（ＨＭＦ酸輸送体）を共発現した菌株において（Ｓ１２＿Ｂ３８菌株、図６Ａ）、ＦＤＣＡ産生は、ＦＦＡが相当レベルに蓄積した後にだけ始まった。ＨＭＦ酸は、以前観察されたとおり少量で一過的に蓄積した（実施例ＩＩ参照）。アルデヒド脱水素酵素がＨｍｆＨ及びＨｍｆＴ１と共発現された場合（菌株Ｓ１２＿Ｂ９７；図６Ｂ）、ＦＤＣＡ形成は遅延無く始まり、ＦＦＡ及びＨＭＦ酸の両方が痕跡量だけ観察された。ＨｍｆＴ１を含まないアルデヒド脱水素酵素とＨｍｆＨとの共発現（Ｓ１２＿Ｂ１０１菌株；図６Ｃ）は、ＨＭＦ酸の多量の蓄積をもたらした一方でＦＦＡ及びＦＤＣＡはごく少量だけ産生された。
【０１１３】
結果は、ＨＭＦのＨＭＦ酸への酸化がアルデヒド脱水素酵素を発現することによって顕著に増強されたことを実証した。しかしＨｍｆＴ１は、産生されたＨＭＦ酸の効率的な生体内転換を可能にするために共発現されなければならない。アルデヒド脱水素酵素は、中間体産物ＦＦＡのＦＤＣＡへの酸化をさらに改善した。したがってアルデヒド脱水素酵素とＨｍｆＴ１との同時発現は、ＨＭＦ酸を介した最終産物へのＨＭＦ酸化についての全体的な潜在力及び速度を著しく改善する。
【０１１４】
参考文献
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【配列表】
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