(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＹＧ１１（ＰＴＡ−１２３１０）、ＭＹＧ１０７（ＰＴＡ−１２３０９）、ＭＹＧ１１０（ＰＴＡ−１２３０８）およびＭＹＧ１１３（ＰＴＡ−１２３０７）からなる群から選択される、胞子形成能欠損株。
【請求項２】
細胞を不活性化するためにＢ．ラテロスポールス細胞の培養を、十分なストレスへ供することを含む、請求項１に記載の胞子形成能欠損ＢＴペプチド産生Ｂ．ラテロスポールス株を不活化させる、不活化方法。
【請求項３】
前記ストレスが、飢餓、温度衝撃、脱水、ｐＨ変化、アルコール曝露、洗浄剤による処理、加圧処理、酵素的破壊、機械的な力、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＢＴペプチド産生Ｂ．ラテロスポールス株の前記生存率を、１×１０−８未満に低減することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ストレスが、前記細胞を少なくとも５分間少なくとも５０℃に加熱すること、前記細胞を凍結防止剤の非存在下で凍結すること、前記細胞を８０％未満の水分含有量まで脱水すること、洗浄剤を添加すること、前記細胞を噴霧乾燥すること、機械的な力を印加すること、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の胞子形成能欠損ＢＴペプチド産生Ｂ．ラテロスポールス株を含む、強化された動物用飼料又は飲料。
【請求項７】
１０質量％未満の水分含有量を有する、請求項１に記載の胞子形成能欠損ＢＴペプチド産生Ｂ．ラテロスポールス株。
【請求項８】
動物（ただし、ヒトを除く）の前記成長速度及び飼料要求率を改善するための方法であって、
動物へ請求項６に記載の強化された動物飼料又は飲料を投与することと、
前記胞子欠損ＢＴ−ペプチド産生Ｂ．ラテロスポールス株を含まない飼料又は飲料を受け取る動物と比較して、前記動物の前記体重増加又は飼料要求率を改善することとを含む、方法。
【請求項９】
動物（ただし、ヒトを除く）の疾患の予防及び／又は治療のための、請求項１に記載の胞子形成能欠損株の、使用。
【請求項１０】
前記疾患の予防及び／又は治療が、前記動物における病原体の個体数を減らすことを含み、前記病原体が、アシネトバクター、バチルス、ボレリア、カンピロバクター、クロストリジウム、大腸菌、腸球菌、淋菌、口蹄疫ウイルス、ヘモフィルス、インフルエンザウイルス、マンヘミア、マイコプラズマ、マイコパスツレラ、シュードモナス、サルモネラ、ブドウ球菌及び連鎖球菌から成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記疾患が、大腸菌症、サルモネラ症、壊死性腸炎、コクシジウム症、インフルエンザ、口蹄疫、豚繁殖・呼吸障害症候群、ウシ輸送熱肺炎、尿トラック感染症、肥満／メタボリックシンドローム及び２型糖尿病から成る群から選択される、請求項９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１１年３月１日出願の米国特許仮出願番号第６１／４４７，７０３号の利益を主張し、その全体が参照によって組み込まれる。
【０００２】
本発明は、一般に、バイオテクノロジーの分野に関し、より詳細には、ブレビバチルス・テクサスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｘａｓｐｏｒｕｓ）のストレスに敏感な株又は胞子形成能欠損株、効果的且つ費用対効果の高いＢ．テクサスポルス生物体の細胞の不活性化のための方法、及びそのような株由来の飼料又は水添加物に関する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書における文献の引用は、従来技術文献であることを認めるものではなく、本明細書中の請求項の特許性の材料として考慮され、且つ、文献の内容又は日付に関する全ての記載は、出願時における適用が可能な情報に基づいており、そのが正確であることを肯定も容認もするものではない。
【０００４】
病原性細菌等の病原体に感染していない健康な動物は、比較的成長が早く、飼料１キログラム当たりの体重増加がより大きい。その結果、抗菌性化合物は、１９４０年代から家畜の成長促進剤として使用されている。通常、抗菌性化合物は、治療量以下又は低用量で飼料中に投与される。
【０００５】
抗細菌化合物の治療量以下の投与量は、家畜の健康を維持し、家畜をより早く成長させるために長い間使用されてきたが、最近の報告は、抗生物質の使用と、これらの動物から生産された食肉に対する薬剤抗生菌の存在との間の関連を示す。その結果、欧州委員会、米国農務省（ＵＳＤＡ）及び米国食品医薬局（ＦＤＡ）は全て、成長促進としての特定の抗生物質の使用に関する禁止令及びガイドラインを制定した。現在、規制は、通常、ヒトの治療に使用される抗生物質と同等又は類似の抗生物質の使用に焦点を当てている。しかしながら、家畜の成長を促進するための全ての抗生物質剤の使用に対する一般的な反対が高まっている。更に、有機生育した肉の市場が拡大しており、有機認証を得るためには、米国の食肉は、抗生物質を用いずに生育された動物由来のものでなければならない。その結果、家畜用飼料についての新たな成長促進剤が必要である。
【０００６】
更に、コンパニオンアニマルの健康は、急成長を遂げている市場である。自然免疫の刺激によるコンパニオンアニマル（例えば、高齢のコンパニオンアニマル）の健康状態維持は、コンパニオンアニマルの健康維持への魅力的なアプローチであり、経口投与免疫刺激剤が高く評価されると考えられる。
【０００７】
ブレビバチルス・テクサスポルス（ＢＴ）（例えば、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５８５４）は、カチオン性ＮＲＰＳペプチドの群を生成する土壌細菌として、最近同定された（国際公開第２００５／０７４６２６号、及びＷＵら２００５を参照）。ＢＴ由来のカチオン性ペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗菌活性の広域スペクトルを示し、グラム陽性及び陰性菌、真菌及び原虫を死滅させる（国際公開第２００５／０７４６２６号）。
【０００８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗菌活性にも関わらず、ＢＴペプチドはｉｎ  ｖｉｖｏでは抗菌活性を示さないように見える。バンコマイシン耐性腸球菌は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＢＴペプチドに対して非常に敏感である。しかしながら、最小限の阻害濃度よりも上の濃度でＢＴペプチドは、マウスＧＩトラックからの片利共生ＶＲＥを除菌し損なう。
【０００９】
しかしながら、飼料添加物として使用される場合、単離されたペプチドは、ニワトリの大腸菌症及びサルモネラ症の予防に有効であることが示された。更に、この単離されたペプチドはまた、ニワトリの成長を促進し、飼料要求率を増加させるのに有効であることが示された。
【００１０】
おそらくより重要なことに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてその最小限の阻害濃度未満の濃度で、大腸菌及びサルモネラ菌によるニワトリの感染を予防するのに有効であるため、ＢＴペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏにおける効果は、そのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抗生物質の活性に依存しないと考えられる（ＪＩＡＮＧ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５；  ＫＯＧＵＴ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７；  ＫＯＧＵＴ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０）。血液ヘテロフィル及び単核球は、ＢＴペプチドを給餌したニワトリの活性化のためにプライミングされており、活性の可能性が高いモードとして、先天的免疫刺激を指している。これらの特徴により、ＢＴペプチドが、家畜の生産において理想的な飼料添加物となり、抗生物質化合物に代わるものとなる。
【００１１】
更に、先天性免疫は、現在、肥満／メタボリックシンドローム及び２型糖尿病などの非感染症を予防するだけではなく、ウイルス及び真菌感染症の制御に重要な役割を果たすことが知られているため（ＶＩＪＡＹ−ＫＵＭＡＲ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０）、ＢＴ自然免疫モジュレータは、これらの治療の分野における重要な用途を有すると考えられる。
【００１２】
しかしながら、飼料添加物としてＢＴペプチドの経済的価値が、ペプチドを分離する必要性によって厳しく制限され、これはもはや、経済的に実行可能でない地点まで、製造コストを増加させている。ペプチドを精製する代わりに、国際公開第２００５／０７４６２６号に記載されているように、全体の生物体（ＰＴＡ−５８５４）を、飼料添加物の製造に直接使用することができる。
【００１３】
通常、直接供給された細菌（ＤＦＭ）又はプロバイオティクス菌株は、生存可能な形態で、十分な数が腸に到達する必要があり、食品加工及び消化中に株が生存していることを必要とする（米国特許第５，４８０，６４１号明細書、及び米国特許出願公開第２００４／０２４７５６８号明細書参照）。飼料ペレットの製造は、通常、有意に生存率を低減するのに十分な熱を伴うため、ほとんどのプロバイオティクス株は、胃の中の熱及びｐＨ条件への耐性により選択される。細胞芽胞は、耐熱性を有し、長期間の保管時に生存しているため、現在最も安定したプロバイオティクス株は、バチルス芽胞である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、ＢＴ生物は、通常家畜の腸管内（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｋ）で発見された共生細菌であると考えられていないため、使用前に生物を不活性化することが望ましい及び／又は必要である。しかしながら、これは胞子産生株において問題である。更に、少なくとも一つの政府の規制において、細菌源を含む新規の飼料を評価する際に、当局は、細菌の産生の安全性；ヒト、動物及び環境への細菌製品の安全性；水平遺伝子伝達の潜在的な影響；胃腸の細菌曩との相互作用；腸内での持続性；特に肉の汚染による健康への影響が認識されている場合は、生存可能な細菌の排出に起因する、ヒト及び環境への潜在的影響の基準を考慮する。（Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ｏｎ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｆｅｅｄｓ：  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｏｕｒｃｅｓ，  Ｄｒａｆｔ  −  Ｊｕｎｅ  ２００７，  Ｔｈｅ  Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ）。従って、食品添加物として細菌を利用する場合、相反する２つの望ましい結果が存在する。第一は、処理及び消化を通して生存可能な状態で生物体を維持することであり、第二の正反対の所望の結果は、活性ペプチドの不活性化をすることなく、完全に又はほぼ完全に生体を不活性化することである。不活性化の更なる利益は、腸内環境において、Ｂ．テクサスポルス及び細菌の間で、水平遺伝子伝達の可能性を除去又は低減すること；胃腸（ＧＩ）細菌相との相互作用を排除又は制限すること；生存細胞の脱落を介して、ヒト及び環境への潜在的な危険性を排除又は低減すること；及び／又は、飼料を消費する動物由来の肉の汚染を排除又は低減することである。従って、胞子は、栄養細胞を不活性化するために使用されるほとんどの方法へ非常に耐性があるため、ＰＴＡ−５８５４による連続的な胞子形成は、厳格にＤＦＭとしてこの株を使用する能力を制限し、それらの除去のために厳しく、効果な方法が義務付けられる。
【００１５】
結果として、不活性化されたＤＦＭとして有効に使用することができる、通常ブレビバチルス・テクサスポルス株についての当該技術分野における必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
一実施形態において、本発明は、胞子欠損Ｂ．テクサスポルス菌株の不活化細胞又は不活化培養物を含む、飼料又は水添加物である。また、本発明は、家禽、家畜、ウシ、ブタ、ニワトリ、ウマ、シチメンチョウ、ヒツジ、ヤギ、アヒル、ウズラ、コーニッシュゲームニワトリ、ハト、養殖魚、カニ、エビ、淡水カメ、イヌ及びネコを含むがそれらに限定されない、１つ以上の動物のための飼料又は飲料に加えることができる本発明の不活化乾燥細胞又は培養物（例えば、凍結乾燥又は噴霧乾燥した細胞又は培養物）の使用にも関する。例えば、胞子形成能欠損Ｂ．テクサポルス株の培養物の細胞は、殺菌、飢餓状態、温度（熱、冷却又は凍結）、脱水（例えば、熱乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥、日光乾燥、空気乾燥又は真空乾燥）、酸性化、アルカリ化、アルコール、洗剤、リゾチーム、機械力、四級アンモニウムカチオン、酸化剤（例えば、塩素酸化物、過酸化水素、次亜塩素酸塩又はオゾン）及び／又は照射（例えば、ＵＶ、Ｘ線又はガンマ線）によって、不活性化することができ、不活性化された細胞又は培養物は、次に、飲料水又は、例えば、大麦、大豆、小麦、ライ小麦、ライ麦、トウモロコシ及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、少なくとも一つの穀物を含む飼料などの穀物ベースの飼料のような、動物飼料中に含まれ得る。実際に、本発明は、多種多様な飼料中に含まれ得る。本発明の不活性化された細胞又は単離されたペプチドは、飲料水又は、代用乳、栽培用飼料、仕上飼料、プレスターター飼料、スターター飼料、水及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、家畜用飼料と混合することができる。
【００１７】
また、本発明は、胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルス細胞又は細胞培養物を不活性化すること（例えば、熱処理又は脱水）、及び成長を増加させるのに十分な量で、動物へ、不活性化した胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルス細胞又は培養培地＋細胞を提供することによって、家畜及びコンパニオンアニマルにおける、体重の増加及び飼料要求率を増加させるための方法を含む。必要に応じて、効果的な量の胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルス細胞又はその細胞を含む培養培地は、乾燥され（脱水）、及び／又は、ペレット化され（熱処理の形態）、動物飼料中又は飲料水中へ加えられ得る。
【００１８】
飼料成分の例はまた、穀物、大豆ミール、分離大豆蛋白、分離大豆油、分離大豆脂肪、脱脂粉乳、魚粉、肉粉、骨粉、血粉、血漿蛋白質、ホエー、米ぬか、小麦ふすまを含み、更に、甘味料、ミネラル、ビタミン、塩、及び草を含み得る。
【００１９】
例示的な実施形態において、胞子形成能欠損Ｂ．テクサポルス細胞は、飼料成分（例えば、トウモロコシ粉及び大豆粉など）の懸濁液を含む、培地中で育成される。培養物は、次に、飼料添加物（その中で、培養中の粒子がＢＴペプチドのためのキャリアとして機能することを特徴とする）、又は、強化された飼料を作るために、細胞の不活性化及び／又は、乾燥／脱水へ供され得る。
【００２０】
また、本発明は、動物における細菌感染を治療及び／又は予防するのに十分な有効量で、不活性化された胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルス細胞又は培養物を提供することによって、動物における細菌感染を予防及び／又は治療するための方法を含む。
【００２１】
また、本発明は、動物における細菌感染を治療及び／又は予防するのに十分な有効量で、不活性化された胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルス細胞又は培養物を提供することによって、成長中の動物における、体重増加及び飼料要求率を促進するための方法を含む。
【００２２】
また、本発明は、ヒトの食品又は水の添加剤としての、胞子形成能欠損細胞の飼料の使用を含む。
【００２３】
例示的な実施形態において、本発明は、約３．５×１０−３未満、約１×１０−４未満、約１×１０−５未満、約１×１０−６未満、約１×１０−７未満、約１×１０−８未満又は、約１×１０−９未満の生存率を有する、胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルス株を提供し、これは、約５０℃の温度へ約５分間供し、生存率又はコロニー形成能を決定することによって測定することができる。
【００２４】
例示的な実施形態において、培養が、飢餓状態、凍結（有効量の凍結剤の無い状態で）、脱水（２３℃でのスピード真空を用いて）、極端なｐＨ（例えば、ｐＨ１．０又はｐＨ１３．０）、飽和ブタノール、洗剤（例えば、１％ＳＤＳ）又は、溶解剤（例えば、リゾチーム）の追加、超音波処理、機械的な力（例えば、動物飼料ペレットマシンのフレンチプレス）又は、過酸化水素（例えば、１％以上のＨ２Ｏ２）などの、不活性化処理へ供された場合、胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルス株は、約１×１０−９未満などの低い生存率を示す。
【００２５】
また、本発明は、胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルス株由来の細胞を用いた、Ｂ．テクサスポルス調製におけるＢＴペプチド収率を増加させるための方法に関する。また、本発明は、ＢＴペプチドの精製も単離もせずに、胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルス株由来の細胞を有した、Ｂ．テクサスポルス調整におけるＢＴペプチドの安定性及び経済的効用を増加させるための方法に関する。
【００２６】
また、本発明は、Ｂ．テクサスポルス細胞の粉状形態に関し、前記粉は胞子を実質的に含まない。例示的な実施形態において、胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルスの培養は、十分な密度まで液体媒体中で増殖され、培養は、実質的に胞子を含まない粉を生成するために、脱水又は乾燥される。粉は、次に、Ｂ．テクサスポルス細菌由来の生存した胞子を有効量含まない、強化された動物飲料又は食料を生成するために、水又は飼料成分と混合され得る。
【００２７】
また、本発明は、装置からＢ．テクサスポルス細胞を除去又は除染する方法、及び／又は、胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルス株を不活性化又は殺し、その後細胞を単純に洗い流すことができるための設備に関する。例えば、水がそれらを取り除き、且つ、殺し（温度による）、それによって、効果的に装置及び／又は、設備からＢ．テクサスポルス細胞を除去する場合、蒸気又は高温水を、装置及び／又は設備を洗浄するために使用することができる。
【００２８】
また、本発明は、胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルス株の有効量を投与することによって、動物又はヒトの免疫系を刺激する方法に関する。例えば、胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルス株は、培養培地の有無に関わらず、胞子形成能欠損増殖でき、細胞を収穫することができ、投与される動物の免疫系を刺激する、強化された飲料又は食料を生成するために、その細胞を水又は追加の食品成分と混合することができる。例えば、胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルス株は、不活性化し、動物又はヒトの免疫系を刺激するために、直接的に動物又はヒトへ供給することができる。別の例示的な実施形態において、本発明は、動物又はヒトへ、効果的な量の胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルス株及び食品キャリアを投与することによって、動物又はヒトの免疫系を刺激する、強化された食品に関する。
【００２９】
胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルス株を増殖でき、免疫系を刺激する強化された飲料又は食料を生成するために、水又は食品成分と混合することができ、例えば、強化された飲料若しくは食料と組み合わせて、又は、強化された飲料若しくは食料の提供の後で、動物又はヒトへ投与される、ワクチンへ対する免疫応答を高めることができる。更に、胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルス株を、不活性化し、動物又はヒトへ供給することができ、例えば、不活性化された細胞を乾燥させて、所望の処理及び／又は投与部位へ送ることができ、動物又はヒトによって消費されるだろう水又は食品と混合することができ、ここで前述の食品又は水は、Ｂ．テクサスポルス株由来の生存可能な胞子を含まない。
【００３０】
また、本発明は、一つ以上のワクチンと組み合わせて、胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルス株の有効量を投与することにより、ヒトを含む動物の免疫系を刺激するための組成物に関する。例えば、胞子形成能欠損株を増殖でき、細胞を収穫することができ（培養培地の有無に関わらず、例えば、細胞を遠心分離後に洗浄してもよい）、ワクチンの前又はワクチンと組み合わせてのいずれかで動物へ投与でき、その細胞はワクチンに対する免疫システムの応答をプライム又はブーストする。
【００３１】
また、本発明は、動物への胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルス株を投与することを含む、動物の疾患を予防及び／又は治療するための組成物及び／又は方法に関する。例えば、処理は、動物の病原性細菌の個体数を減らすことができる。低減することができる、例示的な病原体は、アシネトバクター、バチルス、ボレリア、カンピロバクター、クロストリジウム、大腸菌、腸球菌、口蹄疫ウイルス、淋菌、ヘモフィルス、インフルエンザウイルス、マンヘミア、マイコバクテリア、マイコプラズマ、パスツレラ、シュードモナス、サルモネラ、ブドウ球菌及び連鎖球菌を含むがそれらに限定されない。例示的な疾患は、大腸菌症、サルモネラ症、壊死性腸炎、コクシジウム症、インフルエンザ、口蹄疫、ブタ生殖及び呼吸症候群、ウシ輸送熱肺炎、尿トラック感染症、肥満／メタボリックシンドローム及び２型糖尿病を含むがそれらに限定されない。
【００３２】
ＰＴＡ−１２３０７（株ＭＹＧ１１３）、ＰＴＡ−１２３０８（株ＭＹＧ１１０）、ＰＴＡ−１２３０９（株ＭＹＧ１０７）、及びＰＴＡ−１２３１０（株ＭＹＧ１１）として指定された、胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルスを、２０１１年１２月７日に寄託した。これらの株の全ては、米国バージニア州マナッサスユニバーシディ・ブルーバード１０８０１  ２０１１０−２２０９所在の米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）とのブダペスト条約に基づいて寄託され、参照により組み込まれる。
【００３３】
また、本発明は、ＰＴＡ−１２３０７、ＰＴＡ−１２３０８、ＰＴＡ−１２３０９及びＰＴＡ−１２３１０の少なくとも一つから成る群から選択されたブレビバチルス属に属する少なくとも一つの菌株に関する。
【００３４】
本発明の細胞を不活性化するために使用され得る一つのアプローチは、適切な培地中での細胞の増殖を含み、その後、細胞への飼料成分の添加、又は、細胞を脱水するために、飼料成分への培養の添加を含む。
【００３５】
本発明の細胞を不活性化するために使用することができる、他のアプローチ（熱ショック以外）は、細胞を、約１、約２、約３、約４、約５、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、又は約１４のｐＨなどの極端なｐＨへ細胞を供することを含む。
【００３６】
本発明の細胞を不活性化させるのに十分はｐＨの変化は、効果的に生理学的に許容される範囲を超えて、ｐＨをシフトするために、塩基、酸及び／又は他の組成物を加えることによって、成すことができる。例えば、炭酸を生成し、細胞の不活性を引き起こすためにｐＨを低下させるために、二酸化炭素を水中に溶解することができる。
【００３７】
本発明の細胞を不活性化するために使用することができる他のアプローチは、高圧処理（「高圧処理」又は「超高圧処理」又は「超高圧滅菌」としても知られている）であり、これは、細菌の栄養細胞、これらの細胞が存在している場所におけるカビなどを排除するための１００〜１，０００ＭＰａ（１４，５００〜１４５，０００ｐｓｉ）、又は、１５０〜６００ＭＰａ（２５，０００〜９０，０００ｐｓｉ）の範囲の圧力の印加を含み得る。
【００３８】
高圧処理の例は、フレンチプレスアプローチ（フレンチプレス）であり、細胞懸濁液へ圧力（最大４０，０００ｐｓｉ）を印加し、その後突然圧力を開放することによって、細胞を破壊する。従って、本発明の胞子形成能欠損株は、約４０，０００ｐｓｉ、２０，０００、１０，０００、５，０００、２，０００、１，０００ｐｓｉ及びそれらの任意の組み合わせの圧力の印加及び開放により不活性化することができる。
【００３９】
本発明の細胞を不活性化するために使用することが可能な更に別のアプローチは、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、約５％、約２％又は約１％（容積／容積）の最終濃度で、細胞をアルコールへ供することを含む。
【００４０】
本発明の細胞を不活性化するために使用することが可能な更に別のアプローチは、約１０％、約５％、約２％、約１％、約０．５％、約０．２％又は約０．１％（質量／容積）の最終濃度で、細胞を洗剤へ供することを含む。
【００４１】
本発明の細胞を不活性化するために使用することが可能な更に別のアプローチは、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約２％又は約１％未満のレベルまで、Ｂ．テクサスポルス細胞を囲む環境における水分含有量を低減することによって、細胞を脱水へ供することを含む。
【００４２】
例示的な実施形態において、本発明による胞子形成能欠損細胞の培養は、一つ以上の不活性化方法によって調製、処理し、動物用飼料へ適用される。例えば、胞子形成能欠損細胞の培養を、高収率システムを用いて増殖することが可能であり、その後、噴霧乾燥して粉末を生成する。このシナリオでは、噴霧乾燥は、細胞を不活性化し、その後乾燥した飼料ストックへ添加することができる生成物を生成するために使用される。或いは、細胞培養物は、例えばペレット化された飼料を調製するプロセスの間に、熱及び／又は圧力を加えることによって不活性化することができる。
【００４３】
別の例示的な実施形態において、ＭＹＧ１０７、ＭＹＧ１１０又はＭＹＧ１１３などの本発明による胞子形成能欠損細胞の培養を、液体媒体中で増殖し、次に、約１０％〜約２５％（固体に対して）の最終水分含有量を有する混合物を生成するために、動物用飼料成分の実質的に乾燥した混合物又は動物飼料穀物に加え、湿らせた混合物を次に、適当な大きさのペレットを生成するために、ペレットミルへ通し、次に例えば５％の最終水分含有量まで乾燥させる。この例において、動物飼料成分の実質的に乾燥した混合物への細胞の添加は、熱を加え、ペレットを乾燥させることにより強調される脱水の形態を提供する。これらの条件下で、全ての又は実質的に全ての細胞が不活性化されるであろうと考えられている。
【００４４】
別の例示的な実施形態において、＃２イエローコーン、大豆ミール、籾殻、与えられたタンパク質製品、塩、粉末状の石灰石リン酸塩、液体動物性脂肪、及び液体コリンを含む飼料成分を、本発明の不活性化した細胞を含む飼料を生成するために使用する。均質な状態へ乾燥粉末又は砕いた成分を混合し、その後に液体成分を加えることによって、飼料のバッチを一般的に調製し、これは、Ｂ．テクサスポルス細胞の胞子形成能欠損培養（脱水形態）を含み得る。湿らせた混合物を、調整チャンバへ搬送し、そこでは蒸気を加えると（熱ショックの形態を提供すると）、飼料がマッシュ状態になる。このマッシュを、ペレット形成及びペレットミルへ入れる前に、完全に混合する。ペレットミルの中において、柔らかくて熱いマッシュを、鋳型を通し、円筒形のペレットへ成形する。ペレットを、冷却器／乾燥器へ送り、ここではペレットから水分を除去（更なる脱水）し、熱を除去するために、ファンはペレットのベッドを介して周囲の空気を引く。コンベア及びバケットエレベータを、次に、飼料を液体コーティングプロセスへ移すために使用することが可能であり、ここでは、動物性脂肪は、約２重量％で飼料へ噴霧される。仕上げした飼料は、これで、使用する準備ができる。
【００４５】
別の例示的な実施形態において、約１．０×１０１０、１．０×１０１１、１．０×１０１２、１．０×１０１３、１．０×１０１４、又は１．０×１０１５の胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルス株の不活性化した細胞を、約１０００ｋｇの動物飼料に添加する。
【００４６】
更に別の例示的な実施形態において、胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルス株の効果的な用量を、動物へ投与する。更に別の例示的な実施形態において、水中又は飼料中の効果的な胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルス細胞は、約５ｐｐｍ〜約１０００ｐｐｍ、約１５ｐｐｍ〜約１０００ｐｐｍ、約２０ｐｐｍ〜約１０００ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約１０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約２０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約７５ｐｐｍ、約１０ｐｐｍ〜約７５ｐｐｍ、約２０ｐｐｍ〜約７５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約５０ｐｐｍ、約１０ｐｐｍ〜約５０ｐｐｍ、又は、約２０ｐｐｍ〜約５０ｐｐｍのＢＴペプチドを含む。
【００４７】
別の例示的な実施形態において、本発明の胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルスの脱水は、凍結乾燥、真空乾燥、噴霧乾燥、振盪脱水、流動床脱水、溶媒蒸発脱水、超音波によってアシストされた脱水、マイクロ波によってアシストされた脱水、ＲＦによってアシストされた脱水、及び／又はそれらの組み合わせによって行う。
【００４８】
別の例示的な実施形態において、胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルス細胞又は培養の脱水は、吸水性物質（例えば、飼料成分）、熱（動物飼料のペレット化プロセスにおいて発生したようなもの）及び／又は蒸発を加えることによって行う。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、ＰＴＡ−５８５４の胞子によるＢＴペプチドの消費量を示す。本発明の  を示す図である。ＰＴＡ−５８５４をＬＢへ接種し、３７℃の空気シェイカーで増殖させた。サンプルを毎日採取し、ＢＴペプチドを抽出し、活性についてアッセイした。一つの人工単位は、０．８μｇ／ｍｌのＢＴペプチドである。３日目に、培養物を３つのアリコートへ分割した（＃１、＃２、＃３）。アリコート＃１は処理しなかった。アリコート＃２を、１０分間ＵＶ架橋剤中でＵＶ照射した。アリコート＃３を１０分間煮沸した。アリコートを次に、３７℃空気シェイカーでインキュベートした。
【図２】図２は、第一（１）及び第二（２）の試験の間の鳥の成長を示す。
【図３】図３は、２０日での両方の試験から組み合わせた鳥の平均体重を示す（平均±ＳＥ）。Ｎ＝３９〜４２の処理当たりの検証した鳥、及びＮ＝１６〜１９の処理当たりの検証していない鳥。＊ｐ≦０．０５。
【図４】図４は、全体の給餌処理について測定した両方の試験についての平均飼料変換率を示す（平均±ＳＥ、Ｎ＝３檻／処理／試験曝露した鳥、Ｎ＝１檻／処理／試験非曝露鳥）（１＝試験１、２＝試験２）。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１
【図５】図５は、両方の試験（１＝試験１、２＝試験２）からの、アイメリア−曝露鳥（Ｎ＝２０〜２４）及び非曝露鳥（Ｎ＝８）における、小腸の長さの平均値（平均±ＳＥ）を示す。
【図６】図６は、アイメリア−曝露鳥（Ｎ＝１０〜１２）及び非曝露鳥（Ｎ＝４）における、鳥の体重に対する嚢重量の平均比率（平均±ＳＥ）を示す。
【図７】図７は、対照（Ｎ＝８）及びＢＴペプチド（Ｎ＝１２）群についての、アイメリア属病変スコアリングの結果を示す（平均±ＳＥ）。処理方法の間に、統計的に有意な差があった（ｐ＝０．０９８）。
【図８】図８は、曝露した鳥（処理あたりＮ＝５〜６プール）及び非曝露鳥（処理あたりＮ＝２）における、回腸消化の乾燥物質の平均割合（平均±ＳＥ）を示す。
【図９】図９は、曝露した鳥（処理あたりＮ＝４〜６プール）及び非曝露鳥（処理あたりＮ＝２）における、盲腸消化の乾燥物質の平均割合（平均±ＳＥ）を示す。
【図１０】図１０は、曝露した鳥（処理あたりＮ＝４〜６プール）及び非曝露鳥（処理あたりＮ＝２）における、回腸中の総菌数（平均±ＳＥ）を示す。
【図１１】図１１は、曝露した鳥（処理あたりＮ＝５〜６プール）及び非曝露鳥（処理あたりＮ＝２プール）における、盲腸中の総菌数（平均±ＳＥ）を示す。
【図１２】図１２は、両方の試験からのアイメリア−曝露鳥の回腸内の細菌量の差（処理あたりＮ＝５〜６プール）を示す。Ｐ値対照対ＢＴ．試験１＝０．０３７。
【図１３】図１３は、両方の試験からの非曝露鳥の回腸内の細菌量の差（処理あたりＮ＝２プール）を示す。グループ間の有意な差は無かった。
【図１４】図１４は、両方の試験からのアイメリア曝露鳥の盲腸内の細菌量の差（処理あたりＮ＝５〜６プール）を示す。グループ間の有意な差は無かった。
【図１５】図１５は、両方の試験からの非曝露鳥の盲腸内の細菌量の差（処理あたりＮ＝２プール）を示す。グループ間の有意な差は無かった。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する、例えば「ａ」「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」などの単数形は、文脈によって明示されない限り、複数形を含む。例えば、「Ｂ．テクサポルス細菌（単数）」への言及は、複数のそのような細菌を含み、「細胞（単数）」への言及はまた、複数の同様の細胞及びその均等物を指す。
【００５１】
本明細書で使用する「約」は、記載した数又は量に合理的に近い、およそ、又は、多少上下することを意味する。
【００５２】
本明細書で使用する「動物」は、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ゲームヘン、ガチョウ、アヒル、イヌ、ネコ、オウム、サカナ、カニ、エビ、淡水カメ、ヒトなどを含む、任意の無脊椎動物又は脊椎動物を意味する。
【００５３】
本明細書で使用する「飼料」又は「食料」は、動物又はヒトの栄養要求の少なくとも一部を提供するため、及び／又は、動物における栄養障害を予防若しくは治療する目的のために、家畜及び飼育動物又はヒトなどの動物によって消費されるために、製造、販売又は提示された、アミノ酸、酸化防止剤、炭水化物、調味料、酵素、脂肪、ミネラル、非タンパク質窒素製品、タンパク質、ビタミン、及び／又は結合剤を含有し、ペレット化剤、着色剤、発泡剤及び／又は香料を含有し得る任意の物質又は物質の混合物を意味する。不可欠な栄養素として、水は、飼料成分として見なされ、水性飲料は飼料又は食料である。
【００５４】
本明細書で使用する「不活性する」又は「不活性化」は、飢餓、温度衝撃、脱水／凍結乾燥／乾燥（例えば、加熱乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥、太陽乾燥、空気乾燥及び／又は真空乾燥）、ｐＨ変化（例えば、酸性化又はアルカリ性化）、アルコール処理、洗剤を用いた処理、濾過、銀及び亜鉛などの金属を用いた処理、高圧処理などの加圧処理、酵素的破壊（例えば、リゾチームによる処理）、機械的処理（例えば、超音波処理）、第四級アンモニウムカチオンによる処理、酸化剤（例えば、塩素酸化物、過酸化水素、次亜塩素酸及び／又はオゾン）、塩類化、電界処理、マイクロ波処理、電子ビーム処理、照射及び／又はそれらの組み合わせなどの、任意の処理又はストレスを意味し、それは一般的に胞子を殺すことはできず、培養の相対的なコロニー形成効率（生存率）を、約１×１０−３未満、約１×１０−４未満、約１×１０−５未満、約１×１０―６未満、約１×１０−７未満、約１×１０−８未満又は約１×１０−９未満に低下させる。
【００５５】
本明細書で使用する、胞子形成能欠損Ｂ，テクサスポルス株の「不活性化された細胞又は培養物」は、少なくとも部分的に、細胞内含有物及び／又は培養培地成分が放出された、非生存Ｂ．テクサスポルス細胞の混合物を意味する。本発明の胞子形成能欠損株の不活性化は、使用される不活性化条件に応じて、多くの、ほとんどの又は全ての細胞を溶解させ得ることに注意すべきである。従って、「不活性化された細胞」「不活性化された培養」及び同様の文言は、少なくとも部分的に、不活性化プロセスによって生成された細胞溶解物を、その意味の中に含む。
【００５６】
本明細書で使用する「突然変異」は、一つ以上のヌクレオチドの、挿入、欠失、トランジション、トランスバージョンを含む、核酸の配列の任意の変化を意味する。欠失又は挿入のサイズは、単一のヌクレオチドから多くの遺伝子へ変わる可能性がある。
【００５７】
本明細書で使用する「表現型」は、細胞又は細胞の培養物の、観察された生化学的、生理学的、及び／又は、形態学的特徴を意味する。
【００５８】
本明細書で使用する「胞子形成能欠損」は、完全に胞子形成能のある、野生型（ｗｔ）カウンターパート株と比較して、胞子形成プロセス又は生成物において、任意の検出可能な血管を示す菌株を指す。従って、用語「胞子形成能欠損」は、約８．１×１０−７未満、約３．５×１０−３未満、約１×１０−４未満、約１×１０−５未満、約１×１０−６未満、約１×１０−７未満、約１×１０−８未満又は１×１０−９未満まで、培養の相対的コロニー形成効率（生存率）を低減する、飢餓、温度衝撃、脱水、酸性化、アルカリ性化、アルコール類、界面活性剤、リゾチーム、機械的力、四級アンモニウムカチオン、酸化剤及び／又は照射を有する任意の株を指し、これは、胞子形成能欠損及び実質的に胞子形成に障害がある細胞又は、言い換えると、株ができないため縫製がそこで形成されていない細胞又は、胞子又は胞子がその中で形成されている細胞の形成能力が低減している細胞を含むが、胞子は生存可能でなく、又は胞子が不活性化ストレスに敏感であり、そこへの曝露に応じて生育不可能にされている。胞子形成能欠損は、本明細書に記載の任意の方法によって測定することができ、例えば、活発に成長している培養は、約５分間約５０℃又は約７０℃の熱ショックへ供され得、未処理の培養又は培養物のアリコートに対して測定された相対的コロニー形成効率は、熱ショックへさらされていない。
【００５９】
「飢餓」は、活性な細胞又は栄養細胞（及び胞子形成及び／又は細胞死を促進する）の数の低減を引き起こす、栄養枯渇である。野生型Ｂ．テクサスポルス細胞は、飢餓を生き残るために、少なくとも部分的に胞子形成を受けるが、しかし、胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルス細胞は、飢餓によって引き起こされる細胞死を避けることができない。従って、胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルス株の不活性化された培養は、細胞が初期成長フェーズの後に餓死するように、培養培地へ菌株を摂取し、長期間菌株をインキュベートすることによって、簡単に得ることができる。
【００６０】
本明細書で使用する「温度衝撃」は、約５０℃〜約１００℃の熱、約０℃〜約１６℃の冷却又は凍結を意味する。
【００６１】
「脱水」は、Ｂ．テクサスポルスを囲む環境における水分含有量を低下させる任意のプロセス又は処理、浸透圧衝撃として定義され、例えば、周囲環境の水分量を、約８０％未満、約７０％未満、約６０％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約２％未満又は約１％未満のレベルに低下させる。
【００６２】
本発明の細胞の効果的な量は、好ましくは、例えば、動物の大きさ、年齢、体重及び／又は病状などの要因に基づいて、医師又は獣医師によって決定される。
【００６３】
ＰＴＡ−５８５４胞子は、ＢＴペプチドを分解すると考えられるため、ＰＴＡ−５８５４中の胞子形成はＢＴペプチドの収量レベルを限定する。理論に束縛されるものではないが、胞子形成及び／又は胞子活性化は、ＰＴＡ−５８５４によるＢＴペプチドの生成を低減することを表している。図１において示すように、その時点で栄養の枯渇が少なくとも始まった、３７℃で３日を超えたＬＢ培養中における継続的なＰＴＡ−５８５４の培養は、ＢＴペプチド（＃１）を低下させた。このＢＴペプチドの枯渇は、３日目でＵＶ照射によって防止することが可能であり、これは、アクティブ（栄養）細胞及び胞子の両方を死滅させた（＃２）。しかしながら、ＢＴ枯渇は、３日目で煮沸することによって防止することはできず、活性細胞のみを死滅させたが、胞子は不活性化しなかった（＃３）。
【００６４】
ＢＴペプチドレベルの低減に加え、ＰＴＡ−５８５４における胞子形成は、飼料添加物として株を使用する、最も経済的な方法を防止する。特に、飼料添加物としてのＢＴペプチドの使用には、低い生成コストが必要であり、これは、実質的に任意のペプチドの精製段階を支配する。結果として、最も経済的なＢＴ−ベースの飼料添加物は、脱水したＢ．テクサスポルス培養物であろう。脱水は栄養細胞を不活性化するのみであるが、Ｂ．テクサスポルスの胞子を活性かせず、従って、脱水は胞子形成株を不活性化することはできない。更に、そのような株からの胞子は、周囲のＢＴペプチドを発芽させ、枯渇することが可能であり、ここで、発芽胞子によるＢＴペプチドの分解はまた、任意の飼料製品の安定性について深刻な問題になると考えられる。
【００６５】
最後に、Ｂ．テクサスポルスの胞子を含む飼料添加物は、規制基準を満たしていないかもしれず、生産者菌株の核酸についての懸念を引き起こし得る。結果として、胞子を効果的に不活性化又は排除できるようにすることが、非常に望ましい。
【００６６】
しかしながら、Ｂ．テクサスポルスは、排除又は不活性化することが困難である胞子を、連続的に形成する。Ｂ．テクサスポルス及び得られた胞子を活性化するために使用することができる共通の技法は、γ線照射、オートクレーブ及び他の極端な処理方法を含む。γ線照射は、特定の物理的な設定においてＢＴペプチドを損傷することなく、胞子を除去するのに効果的であり、それは業界によって、一般的に実用的でも費用対効果が良いとも考えられていない。オートクレーブは、胞子を排除するための別の効果的な方法であるが、そのプロセスはＢＴペプチドを損傷し、従ってこの方法を望ましくないものにしている。
【００６７】
工業環境での細胞の不活性化の、最も実用的かつ費用対効果の良い方法は、適度な熱（低温殺菌などの、例えば７０℃で３０分間）及び／又は脱水の簡単な処理であり、これはＢＴペプチドが耐えることが可能である。Ｂ．テクサスポルス胞子は、非常に熱処理に対して耐性があるため（胞子は、１００℃で６０分間沸騰する、表１、及び脱水、表２などの、著しいストレスレベルに耐えることが可能である）、温度及び／又は脱水を緩和するために、敏感な胞子形成能欠損株は、例えばＤＦＭなどのＢ．テクサスポルスの実用的及び／又は費用対効果の高い用途のために必要とされる。本発明は、低温殺菌、ペレット化、凍結乾燥及び／又は簡素などのＢＴペプチドの安全な技法を用いて不活性化することが可能である、胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルスを提供し、前記不活性化条件は、栄養細胞を不活性化することはできるが、一般的には野生型胞子を不活性化することはできない。
【００６８】
栄養細胞の不活性化に有用な技法の例は、飢餓、温度衝撃（例えば、低温殺菌などの熱又は、凍結などの冷却）、脱水／凍結乾燥／乾燥（例えば、加熱乾燥、凍結乾燥、太陽乾燥、空気乾燥及び／又は真空乾燥）、ｐＨの変化（例えば、酸性化又はアルカリ性化）、アルコール処理、洗剤を用いた処理、濾過、銀及び亜鉛などの金属を用いた処理、高圧処理などの加圧処理、酵素的破壊（例えば、リゾチームによる処理）、機械的な力（例えば、超音波処理）、第四級アンモニウムカチオンによるより、酸化剤（例えば、塩素酸化物、過酸化水素、次亜塩素酸及び／又はオゾン）、塩類、ラジオ周波数（ＲＦ）エネルギーを用いた（パルス）電界処理、マイクロ波処理、電子ビーム処理、照射（例えば、ＵＶ、Ｘ線又はγ線）及びそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。例示的な実施形態において、一つ以上のこれらの技法を、本発明の胞子形成能欠損細胞を不活性化するために、使用することができる。
【００６９】
発明者の最善の知識によると、＜１０−６、＜１０−７、＜１０−８又は＜１０−９のストレス生存率で不活性化したＤＦＭについて認識された規制基準を満たす、胞子欠乏症を文献化する出版物はない。例えば、学術出版物において、１０−２での菌のストレス生存率は、胞子欠損と呼ばれる（ＬＥＥら、２００１）。一方、発行済みの米国特許第４，３０２，５４４号明細書、同第４，４５０，２３５号明細書、同第４，４５０，２３６号明細書、同第４，４６５，７７３号明細書、同第６，２８４，４９０号明細書、及び同第７，６５５，４５２号明細書に開示された方法は、１０−７のオーダーのストレス生存率を有する胞子形成能欠損（「胞子形成の」又は「胞子形成的な」）菌株を、生成することができるのみである。従って、＜１０−９のストレス生存率で、胞子体欠乏症の菌株を生成するための当技術分野は、欠けているように見えた。そのような技術を作る必要性は、より強力な遺伝子欠損方法は、２つの理由から適切な選択ではない（及び突然誘発の唯一の使用可能な方法は、サイレントな又は「漏れやすい」ポイント変異を主に引き起こす化学的方法である）という事実を考慮すると、最もであった。第一に、Ｂ．テクサスポルスは、非遺伝子的に扱いやすい生物であり、遺伝子欠損を行うことができない。第二に、結果として得られる遺伝子ノックアウト株は、欧州連合などの地域でヒトの食品には禁止されている、遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）となる。別の例示的な実施形態において、不活性化方法は、本発明による胞子形成能欠損株の生存率を、約１×１０−４未満、約１×１０−５未満、約１×１０−６未満、約１×１０−７未満、約１×１０−８未満又は約１×１０−９未満へ低減させるのに十分であるが、その不活性化方法は、胞子形成有能ＰＴＡ−５８５４の生存率を、約３．３×１０−１又は約４．３×１０−１未満へ低減するのに不十分である。
【００７０】
実施例１
ＰＴＡ−５８５４の胞子形成能欠損変異体を単離する試みは、次のように行った。ＰＴＡ−５８５４細胞を、ＥＭＳを用いて突然変異させた後、ＬＢ寒天上に播種した。約５０，０００のコロニーを、１時間７５℃で、処理に対する感度についてスクリーニングし、４２の温度感受性候補株を単離した。これらの初期の候補株を、コロニー精製し、熱感度について再試験した。ＰＴＡ−５８５４株及び温度感度候補株を、液体ＬＢ培地中で、３７℃で３日間増殖した。次に細胞を、１００μＬのアリコートとして滅菌マイクロチューブへ分注し、様々な温度（７５、７０、６５、６０、５５、５０又は３７℃）で、異なる時間（５、１５、３０又は６０分間）インキュベートした。処理した細胞をＬＢ寒天上に播種し、播種効率を決定するために、一晩３７℃でインキュベートした。熱ショック処理の後の生存率を、熱ショック無しでの３７℃における播種効率で割った、熱ショック後の播種効率として計算した。
【００７１】
初期の４２の単離株の、いくつかの温度に敏感な変異が確認された。株Ｂ７は、最も温度に敏感な表現型を示した（表１）。５０℃での短い５分間の処理は、８×１０−７（約１×１０−６）の生存率を与え、より高い温度でより長い時間のインキュベーションは、著しく生存率を減少させなかった。この細胞不活性化のレベルは、ＤＦＭとしてＢ．テクサスポルスを使用する目的については不十分であると考えられる。繰り返しの変異誘発及びＰＴＡ−５８５４の変異体単離は、Ｂ７よりも優れた、温度感受性表現型を有する菌株を生成しなかった。複数の変異は、より効率的な細胞不活性化を可能にするために、より緊密な温度感受性表現型について必要であり得ることを推論した。しかしながら、Ｂ７の変異誘発は、おそらくＢ７の不健康（親のＰＴＡ−５８５４と比較して）が原因で、完全された温度感受性表現型を有する、突然変異体は得られなかった。
表１．Ｂ．テクサスポルス細胞（２日齢のＬ−ブロス培養として）の温度感受性
【表１】
0005970483.tif 000002
【００７２】
新規の菌株（ＭＹＧ１１、寄託番号ＰＴＡ−１２３１０）を、土壌サンプルから単離した。この株の１６ＳｒＤＮＡシーケンシングは、それがＰＴＡ−５８５４と同じ種であるが、熱処理に関して著しく異なる表現型を有することを示している。ＭＹＧ１１はＬ−ブロス培地中で３７℃で迅速に増殖し、高温又は胞子形成能欠損への初期感受性を示している。５分間５０℃で処理することによって、３．５×１０−３の生存率であった（表１）。従って、ＭＹＧ１１を突然変異させ、約５０，０００個のコロニーを、上昇した温度感受性示す変異体についてスクリーニングした。少なくとも３つの変異体、ＭＹＧ１０７（寄託番号ＰＴＡ−１２３０９）、ＭＹＧ１１０（寄託番号ＰＴＡ−１２３０８）及びＭＹＧ１１３（寄託番号ＰＴＡ−１２３０７）を、この方法によって単離し、重度の胞子形成能欠損を示すことが分かった。ＰＴＡ−５８５４及びＢ７とは対称的に、５分間５０℃の温度での処理は、ＭＹＧ１０７、ＭＹＧ１１０及びＭＹＧ１１３について１０−９未満の、生存率を与えた。このように、本発明は、少なくとも５分間、少なくとも５０℃の温度に晒された場合、約１０−８又は約１０−９よりも低い生存率を有する、Ｂ．テクサスポルス株を提供する。
【００７３】
ＭＹＧ１０７は、対数期Ｌ−ブロス培養において約４５分間の倍増時間を有し、更に特徴付けられた。ＭＹＧ１０７、ＭＹＧ１１０及びＭＹＧ１１３の生存率は、この実験で使用した文化の検出限界以下であることを考えると、縫製形成の根本的な欠陥を有しているＭＹＧ１０７、ＭＹＧ１１０及びＭＹＧ１１３は、高度な胞子形成能欠損株であると考えられ、これは更に、ＭＹＧ１０７からのＢＴ収率が、ＰＴＡ−５８５４と比較して３倍以上であると考えられる事実によりサポートされる。
【００７４】
更に、典型的な横方向の内生胞子は、ほぼすべての段階において、ＰＴＡ−５８５４の文化の中で検出可能である。そのような横方向の内生胞子は、いかなる段階でもＭＹＧ１０７の培養においては観察されておらず、ＭＹＧ１０７が胞子形成の根本的な欠陥を有しているという概念をサポートしている。更に、ＭＹＧ１０７は、胞子ではなく栄養細胞を不活性化するストレスの他の種類についての感受性を表示する（表２）。
表２．Ｂ．テクサスポルス細胞（２日齢のＬ−ブロス培養物として）のストレス感受性
【表２】
0005970483.tif 000003
【００７５】
凍結感受性試験において、野生型ＰＴＡ−５８５４株及びＭＹＧ１０７を液体ＬＢ培地中で、２日間３７℃で増殖し、次に細胞を１００μＬのアリコートとして滅菌したマイクロチューブへ分注し、−２０℃で６０分間（又は氷の形成時）培養した。凍結処理した細胞及び未処理の細胞をＬＢ−寒天上へ播種し、播種効率を決定するために一晩３７℃でインキュベートした。凍結についての生存率を計算した（処理した細胞についての播種効率／未処理の細胞についての播種効率）。凍結によって、約４．２×１０−１のＰＴＡ−５８５４の生存率と比較して、ＭＹＧ１０７について約１０−９未満の生存率であった。
【００７６】
酸性化感受性試験において、野生型ＰＴＡ−５８５４株及びＭＹＧ１０７を、液体ＬＢ培地中で２日間３７℃で増殖し、次に細胞を、１００μＬのアリコートとして滅菌したマイクロチューブへ分注した。ｐＨを、それぞれのアリコートへ１０μＬの１ＭのＨＣｌを加えることによって、約１．０に調整し（室温）、次に、直ちに１０μＬの１ＭのＮａＯＨを加えることによって中性化した。酸処理した細胞及び未処理の細胞を、ＬＢ−寒天上に播種し、播種効率を決定するために、一晩３７℃でインキュベートした。酸性化により、約４．１×１０−１のＰＴＡ−５８５４の生存率と比較して、ＭＹＧ１０７について約１０−９未満の生存率であった。
【００７７】
アルカリ性化感受性試験を、ｐＨを１３．０に調整するためにＮａＯＨを最初に加え、次に、ＨＣｌを中性化のために加えたことを除き、同様の方法で行った。アルカリ性化によって、約５．１×１０−１のＰＴＡ−５８５４の生存率と比較して、約１０−９未満の生存率であった。
【００７８】
アルコール感受性試験を、ブタノールを１％（容積／容積）まで加えたことを除き、同様の方法で行った。ブタノール処理により、約５．６×１０−１のＰＴＡ−５８５４の生存率と比較して、ＭＹＧ１０７について約１０−９未満の生存率であった。
【００７９】
洗剤感受性試験を、ＳＤＳを１％（質量／容積）まで加えたことを除き、同様の方法で行った。ＳＤＳ処理により、約３．３×１０−１のＰＴＡ−５８５４の生存率と比較して、ＭＹＧ１０７について約１０−９未満の生存率であった。
【００８０】
酸化感受性試験を、過酸化水素を１％（質量／容積）まで加えたことを除き、同様の方法で行った。過酸化水素処理により、約３．３×１０−１のＰＴＡ−５８５４の生存率と比較して、ＭＹＧ１０７について約１０−９未満の生存率であった。
【００８１】
リゾチーム感受性試験において、野生型ＰＹＡ−５８５４株及びＭＹＧ１０７を、液体ＬＢ培地中で２日間３７℃で増殖させ、次に細胞を、１００μＬのアリコートとして滅菌したマイクロチューブへ分注した。リゾチームを１ｍｇ／ｍｌの濃度まで加え、細胞を６０分間３７℃でインキュベートした。リゾチーム処理した細胞及び未処理の細胞をＬＢ寒天上に播種し、播種効率を決定するために一晩３７℃でインキュベートした。リゾチーム処理により、約７．２×１０−１のＰＴＡ−５８５４の生存率と比較して、ＭＹＧ１０７について約１０−９未満の生存率であった。
【００８２】
圧力感受性試験において、野生型ＰＴＡ−５８５４株及びＭＹＧ１０７を、液体ＬＢ培地中において２日間３７℃で増殖させた。培養物の一部を、室温で３回フレンチプレス内において、圧力処理をした（４０，０００ｐｓｉで）。フレンチプレスについての生存率を計算した（処理した細胞の播種効率／未処理の細胞の播種効率）。フレンチプレス処理によって、約１．５×１０−１のＰＴＡ−５８５４の生存率と比較して、ＭＹＧ１０７について約１０−９未満の生存率であった。
【００８３】
飢餓感受性試験において、野生型ＰＴＡ−５８５４株及びＭＹＧ１０７を液体ＬＢ培地中において数時間３７℃で増殖させた。飢餓についての生存率を、計算した（７日目の播種効率／２日目の播種効率）。飢餓処理によって、約３．３×１０−１のＰＴＡ−５８５４の生存率と比較して、ＭＹＧ１０７について約１０−９未満の生存率であった。
【００８４】
脱水感受性試験において、野生型ＰＴＡ−５８５４株及びＭＹＧ１０７を液体ＬＢ培地中において２日間３７℃で増殖させ、次に細胞を、１００μＬのアリコートとして滅菌したマイクロチューブ中へ分注し、室温で６０分間スピード真空へ供した。真空乾燥した細胞（１００μＬの滅菌蒸留水で再水和）及び未処理の細胞を、ＬＢ寒天上に播種し、播種効率を決定するために一晩３７℃でインキュベートした。真空乾燥についての生存率を計算した（処理した細胞についての播種効率／未処理の細胞についての播種効率）。真空乾燥によって、約３．９×１０−１のＰＴＡ−５８５４の生存率と比較して、ＭＹＧ１０７について約１０−９未満の生存率であった。
【００８５】
別の脱水感受性試験において、野生型ＰＴＡ−５８５４株及びＭＹＧ１０７細胞を、それぞれ１０％及び２０％の大豆ミールを含む増殖培地に接種した。細胞増殖は、両方の株について１０％の大豆ミールを含む培地中で達成されたが、２０％の大豆ミールを含む培地中では達成されなかった。滅菌蒸留水を用いた２０％の大豆ミール培養物の希釈（１：１）は、ＭＹＧ１０７ではなくＰＴＡ−５８５４についての増殖を復元し、これは、胞子形成能欠損Ｂ．テクサスポルス株の細胞が生存率を維持するための環境に、少なくとも約８０％の含水量を必要とすることを示している。
【００８６】
ＭＹＧ１０７、ＭＹＧ１１０及びＭＹＧ１１３の特性及びそのような株の作成方法によって、Ｂ．テクサスポルスの胞子形成能欠損株を、経済的に実現可能なＤＦＭとして使用することが可能になった。特に、本発明の株は、野生型Ｂ．テクサスポルス細胞の不活性化と互換性のない複数の不活性化方法（例えば、殺菌及び／又は脱水）の使用を提供し、これは、経済的に実現可能なＤＦＭとして使用できる菌株を提供している。
【００８７】
不活性化したＢ．テクサスポルス細胞を、不活性化した細胞が精製されたペプチドと同等に機能することを示すために、精製したペプチドと比較した。ＢＴペプチドは、活発にＢ．テクサスポルス細胞を分裂することによって生成され、ＢＴペプチドが飢餓に応答して生成された「二次代謝産物」ではないことを示している。ＬＢ培養において、１０６ＢＴ細胞は、約１０μｇのＢＴペプチドを含む。言い換えると、１０１１ＢＴ細胞は、約１ｇのＢＴペプチドを含む。
【００８８】
不活性化されたＢ．テクサスポルス細胞中のＢＴペプチド濃度を決定し、所望の濃度の精製したペプチドと等しい量の不活性化した細胞を、研究で用いた。孵化したばかりのヒナに、異なる濃度の精製したＢＴペプチド又は不活性化したＢ．テクサスポルス細胞を含む飼料を２日間与えた。３日目に、ヒナに侵襲性サルモネラ菌血清型Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（ＳＥ）株を接種した。４日目に、ヒナを屠死滅させた。肝臓及び脾臓を採取し、均質化した。均質化物質中のＳＥ株の有無を判定した。ＢＴペプチドも細胞も受容していない鳥は、６０％のＳＥ感染率を有し、１２ｐｐｍの精製したペプチド又は１２ｐｐｍに等しい量の不活性化した細胞を受容した鳥は、２８％の感染率、及び生成したペプチドについて５２％、及び不活性化した細胞について３５％を有することが分かった。２４ｐｐｍ又は等しい量の不活性化した細胞を受容した鳥は、３６＆の感染率、及び精製したペプチドについて１６％、不活性化した細胞について２５％を有していた。４８ｐｐｍ又は等しい量の不活性化した細胞を受容した鳥は、２７％の感染率、及び精製したペプチドについて２４％、不活性化した細胞について１０％を有していた。
【００８９】
不活性化した細胞中の非精製ペプチドは、精製したタンパク質としてサルモネラ器官の侵入を防止することにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏ中で同じ有効性を示した。従って、不活性化したＢ．テクサスポルス細胞は、精製したペプチドに相当する。
【００９０】
実施例２
ウェルシュ菌（タイプＡ）の経口曝露によって引き起こされた壊死性腸炎の予防における、獣医グレードのＢＴペプチド（免疫調節性ＢＴカチオンペプチドを含有する不活性化Ｂ．テクサスポルス細胞を含む）の影響を評価するために、壊死性腸炎病変及び／又は脂肪率は、曝露した鳥において得た。
【００９１】
実験１において、飼料内で送達された約２４ｐｐｍ及び約４８ｐｐｍでの獣医グレードのＢＴは、壊死性腸炎の病原スコアを、２．３から０．６に、及び０．５にそれぞれ低減し、死亡率をそれぞれ１７％から６％へ及び７％に低下させ、ウェルシュ菌の腸管回収をそれぞれ、３．６０から２．３６に、及び２．４８に（ｌｏｇ１０ｃｆｕ／ｇ）低下させた（ｐ≦０．０５）。
【００９２】
実験２において、飼料内で送達された約２４ｐｐｍ及び約４８ｐｐｍでの獣医グレードのＢＴは、壊死性腸炎の病原スコアを、それぞれ２．８から０．８及び０．６に、死亡率をそれぞれ２１％から５％及び１％に、ウェルシュ菌の腸管回収をそれぞれ、３．１２から１．８８及び１．３１（ｌｏｇ１０ｃｆｕ／ｇ）に低下させた（ｐ≦０．０５）。
【００９３】
これらの結果は、経口投与した不活性化Ｂ．テクサスポルス細胞は、ブロイラーにおける壊死性腸炎の予防に有効であることを示す。
【００９４】
結果
表３．不活性化Ｂ．テクサスポルス細胞の経口投与を用いた、ブロイラーにおける壊死性腸炎の予防
【表３】
0005970483.tif 000004
１  ２４及び４８ｐｐｍにより表される治療群は、一日目から投与されたＢＴ濃度である。
２  病変スコアは、平均二乗誤差を含む治療サブセット＊ｎ＝２５の平均値によって表された。
３  死亡率は、陽性対照（対照飼料）と比較した発生率データにより表される（ｐ＜０．０５）。
４  ｌｏｇ１０ｃｆｕ／ｇは、治療サブセットの平均値により表される（ｎ＝１０）。
Ａ−Ｂ  一般的な上付き文字の内同じ列内の平均は、大きく異なる（ｐ＜０．０５）。
【００９５】
材料及び方法
孵化の日、ニワトリのヒナをサンダーソンファーム（ブライアン）から得て、無作為に実験群にわけ、清潔な松の削り屑の上の個々の床飼育檻へ配置した。全ての動物は、ＮＲＣガイドラインを満たし又は基準を超えている、市販の全粒小麦ベースのブロイラースターター飼料及び水を自由に摂取した。鳥は、１日目から２４日目を通して、対照飼料又は２４ｐｐｍ又は４８ｐｐｍの獣医グレードのＢＴペプチドを含む飼料のいずれかを給餌した。
【００９６】
バージニア州、ノースカロライナ州及びジョージア州におけるアクティブなフィールドケースから得られたウェルシュ菌の複数の単離株（Ａ）を、本調査で用いた。単離株をチオグリコール酸培地中で増殖した。滅菌したチオグリコール酸培地を、ニワトリをインキュベートするために用い、鳥を強制経口投与により（１．５ｍｌ／曝露）、３日間（孵化後、１７〜１９日）一日一回曝露させた。
【００９７】
曝露のために生成したウェルシュ菌の各バッチを連続的に希釈し、ＳＦＰ寒天プレート上に播種し、その後、２４時間３７℃のインキュベーターへ入れた。プレートを次にカウントし、鳥類へ付与されたウェルシュ菌の量を決定するために記録した。ウェルシュ菌の回収率を定量的に測定するために、小腸の一部を除去した。腸のこの断片は、メッケル憩室の上部であった。腸を取り除いた後、それを１０ｍＬのチオグリコール酸が入ったｗｈｉｒｌ  ｐａｋバッグへ入れ、３０秒間納めた。次に、０．５ｍＬを取り除き、嫌気性チオグリコール酸中に入れ、連続的に希釈し、ＳＦＰ寒天上に播種した。ＳＦＰ寒天を、ラベルの指示に従って調製した。この培地は、初期層が実験の数日前に注がれたオーバーレイ培地であり、汚染について試験するためにインキュベートした。第二の層は、サンプルが播種された後、好気的条件下で剖検の日に塗布した。プレートを、次に、ｃｏｙ箱（ｃｏｙ  ｂｏｘ）へ輸送し、プレートを２４時間インキュベートし、翌日読み取った。
【００９８】
ＮＥに関連付けられた肉眼的病変を評価するために、小腸の空腸及び回腸を調べた。以下の基準を用いて記録した。
０＝肉眼病変はなく、正常な腸の外観。
１＝薄壁又は砕けやすい、グレーの外観
２＝薄壁、巣状壊死、灰色の外観、少量のガス生産。
３＝薄壁、かなりのパッチの壊死、ガスが満たされた腸、血液の小さな斑点。
４＝重度の広範な壊死、顕著な出血、腸内に満たされた大量のガス。
【００９９】
本研究は、細菌の曝露の前に、動物の免疫システムのプライミングにおける不活性化したＢ．テクサスポルス細胞の有効性、及びプライミングされた免疫システムは、より迅速に、より効率的に、そのような曝露へ応答することを示す。
【０１００】
実施例３
細胞がインビトロアッセイにより測定した場合、抗生物質活性を有するように見える天然のＢＴペプチドを運搬するにも関わらず、獣医グレードのＢＴ（不活性化されたＢ．テクサスポルス細胞）は実際に非抗生物質である。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、人工的な結果を生成すると考えられる。ＢＴは、ｉｎ  ｖｉｖｏでは抗生物質として作用せず、代わりにそれは動物の免疫システムを強化する／プライミングすると考えられており、有益な共生細菌のレベルは相対的に影響を受けないままである理由を説明しているが、有害な細菌のレベルは、ＢＴペプチド又は細胞を用いて処置された動物において低減される。これはまた、９６ｐｐｍで経口的に送達された獣医グレードのＢＴ（不活性化細胞内）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、ＢＴセンシティブな有益である共生腸内細菌であるように考えられるものについて、ｉｎ  ｖｉｖｏでの影響がなかったことを説明する（実施例４を参照）。
【０１０１】
実施例４
この実験の目的は、アイメリア属最大曝露のストレス有り又は無しのブロイラーにおける、９６ｐｐｍの高レベルで、獣医グレードＢＴ（「ＢＴペプチド」と呼ばれる、ＢＴペプチドを含む不活性化されたブレビバチルス・テクサスポルス細胞）の供給の安全性を評価することであった。給餌試験は、２つの連続した別個の試験として実施した。
【０１０２】
材料及び方法
Ｒｏｓｓ５０８型ブロイラーは、商業的孵化場で約一ヶ月離れて２つの別々の日に孵化した。両方の試験において、６６匹のオスのヒナをニワトリ小屋へ輸送した。ヒナを計量し、４又は５のグループでケージに入れた。鳥時間で到着後１３日目に鳥を、それぞれ２つの檻を含む４部屋に移動し、それぞれの檻には、８羽を収容した。一つの対照群及び一つのＢＴ群は、それぞれの部屋に存在していた。鳥を檻へ移した後、Ｅ．ｍａｘｉｍａオーシスト（対照の鳥のための飲料水）を、鳥の作物へチューブフィードした。
【０１０３】
温度及び相対的な水分を、自動的に一日２４時間測定した。第一及び第二の実験日の間、温度は３０℃以上であり、次に、温度が２０℃へ到達するまで、日ごとに約０．５℃低下した。光プログラムは実験を通して、２４時間毎日点灯していた。
表４．処理あたりの鳥の量
【表４】
0005970483.tif 000005
【０１０４】
飼料は、小麦、大豆ミール、大麦、菜種ミール、ナタネ油、ビタミン、ミネラル及びアミノ酸で構成されていた。非改良の飼料は、農業食品研究所フィンランドＭＴＴ、Ｊｏｋｉｏｉｎｅｎから入手した。飼料はメッシュ状であり、全く抗コクシジウムも酵素も加えられていなかった。獣医グレードのＢＴを、９６ｐｐｍのＢＴペプチド濃度に相当するまで、飼料へ加えた。治療群は、実験を通じて同じ飼料を得た。飼料及び水は、自由摂取で提供された。
表５．飼料組成物
【表５】
0005970483.tif 000006
飼料１＝対照飼料
飼料２＝対照飼料＋ｋｇあたり０．０９６ｇのペプチドと同等で獣医グレードＢＴ
【０１０５】
４部屋の内の３部屋の全ての鳥は、１３日目にＥ．ｍａｘｉｍａオーシストを受取り、一方、第四の部屋は、非曝露鳥についての対照部屋であった。用量は、鳥あたり、約２５，０００胞子形成オーシストであった。オーシストは、２ｍＬの水道水中の作物中へチューブフィードした。Ｅｉｍｅｒｉａオーシストは、獣医研究所庁、サリー州、イギリスから購入した。一つの部屋は曝露無しであった。
【０１０６】
鳥は、到着時、生後６、１３、１７、（試験２において１８及び１９）及び２０日で、ケージごとに秤量した。飼料摂取量を、生後６、１３及び２０日で測定した。飼料摂取量を、ケージ又は檻に基づいて測定した。鳥の状態は、少なくとも一日に２回確認した。死亡率及び死亡した鳥の重量を記録した。非常に病気又は損傷していた鳥は、人為的に安楽死させた。生後２０日で、ヒナを頚椎脱臼により屠殺し、回腸及び盲腸消化物についてのサンプリングを行い、処置及び試験あたり３２の消化物サンプルを得た。
【０１０７】
消化物サンプル及び細胞溶解及び染色体ＤＮＡの単離物の細菌分析
回収した細菌ＤＮＡを定量的ＰＣＲにより分析し、異なる細菌群の量を算出することが可能になった。以下の細菌は、分析されたビフィドバクテリウム属、大腸菌、バチルス属菌、及びウェルシュ菌群クラスターＩであった。ＤＮＡの決定のために、三重サンプルを使用し、新鮮な消化のグラムあたりの細菌の平均量を算出した。
【０１０８】
消化物飼料中の総菌数は、フローサイトメトリーによって決定した。
【０１０９】
アイメリア病変スコアは最初の試験のためにのみ実行され、公平な専門家が病変の同定をした。アイメリア属病変の同定は、空腸及び回腸全体の最後の部分に行われた。病変は０〜４のスケールで採点され、０は正常な腸を示し、４は重傷を負った腸を示す。
曩の重量は全てのプールごとに２羽から測定した。曩は、第二の試験についてのみ秤量した。
【０１１０】
小腸（空腸＋回腸）の合計長さは、全ての鳥から測定した。
【０１１１】
Ｔ検定を計算し、処置間の統計的差異を測定した。
【０１１２】
結果
アイメリア曝露は、大幅に対照鳥の成長を減少させた。しかしながら、ＢＴペプチド補完食は、対照群と比較して、非曝露及びアイメリア曝露群の両方において鳥のいくらかの増加した成長を示した（図２）。２０日目で、ＢＴペプチド群の鳥は、少し重く感じられたが、統計学的有意差を見出すことはできなかった。２０日目の非曝露鳥の重量は、第一及び第二の試験とは別に調べた場合、第二の試験における鳥の重量は、対照群と比較した場合、ＢＴペプチド補完飼料により、有意に（ｐ＝０．０２６）増加した。
【０１１３】
アイメリア曝露の間（１３日〜２０日）、飼料変換率（ＦＣＲ）は、対照群と比較した場合、ＢＴペプチド群で改善した（第一の試験ではｐ＝０．０２、第二の試験ではｐ＝０．００６）（図４）。
【０１１４】
アイメリア曝露は、予想通り小腸の長さを増加させた。増加した小腸の長さは、減少した栄養吸収に起因する、代償性発育を示唆し得る。しかしながら、処置間の小腸の平均長さにおいて、統計的に有意な差は認められなかった（図５）。
【０１１５】
ファブリキウス嚢は鳥類でのみ見つかった上皮細胞とリンパ器官である。曩は造血の部位であり、且つ、Ｂ細胞の発達に必須の専門器官である。曩は、排出腔のｐｒｏｃｔａｄａｅｌ領域の背憩室として発達している。第二の試験について、曩を秤量し、重量を鳥の生体重と比較した。鳥の生体重と比較した場合、曩の重量の割合は、アイメリア曝露鳥よりも、非曝露鳥における方が僅かに大きいようであった。ＢＴペプチド補完及び対照群の間に、有意差は認められなかった。しかしながら、非曝露鳥の曩は、ＢＴペプチド群におけるよりも、対照群におけるほうがいくらか大きいようであった（図６）。
【０１１６】
Ｅ．ｍａｘｉｍａは主に、小腸の中間領域、遠位空腸及び近位回腸に感染した。病変スコアがＥ．ｍａｘｉｍａの摂取後７日目に予備成形された場合、おそらく感染のピークは既に超えていたため、高い感染スコアは検出されなかった。Ｅ．ｍａｘｉｍａの平均ライフサイクルは、５〜６日である。平均スコアは、早い回復又は低減した炎症の指標として、ＢＴペプチド補完鳥において低かった（ｐ＝０．０９８）（図７）。
【０１１７】
両方の試験において、いずれかの飼料で非曝露の鳥における死亡率はなかった。アイメリア曝露鳥の死亡率は、比較的高かった。第一の試験の間、死亡率は対照群において最も高く、ＢＴペプチド群において最も低かったが（ｐ＝０．０１１）、一方、第二の試験の間に逆転した。両方の試験の死亡率を組み合わせた場合、全体的な死亡率は、対照群におけるものと比較して、ＢＴペプチド群においていくらか低いようであるが、その差は有意ではなかった（表６）。試験２よりも、試験１における処置間で死亡率が異なっていた理由は、試験２においては、非常に深刻な病気の鳥は速やかに安楽死させたことであり得る。試験１において、ＢＴペプチド群からの鳥は試験終了前に屠殺さず、対照飼料群からの３羽の鳥を試験終了前に屠死滅させた。試験２において、ＢＴペプチド群からの３羽、及び対照飼料群からの１羽を、試験終了前に屠死滅させた。
表６．死亡率（％）
【表６】
0005970483.tif 000007
【０１１８】
消化物の乾燥物質の割合は、腸の健康及び細菌のバランスを示しているため、重要なバックグラウンドデータである。アイメリア曝露により鳥は下痢症になり、且つ、回腸及び盲腸消化物の乾燥した物質含有量を減少させた。これらの結果は、曝露した鳥は、腸の健康にいくらかの問題を有し、アイメリア曝露は、腸内細菌曩のバランスに影響を与えることを示している。アイメリア曝露及び非曝露鳥の回腸乾燥物質におけるＢＴペプチドの効果は、有意ではなかった（図８）。
【０１１９】
曝露した鳥における盲腸の消化物乾燥物質の含有量は、非曝露鳥における量よりも、低かった。アイメリア曝露鳥の盲腸の乾燥物質は、ＢＴペプチドの補完によって正常値に向かって僅かに上昇してきているかもしれない（図９）。
【０１２０】
盲腸中の細菌の総数は、回腸中よりも高かった。アイメリア曝露は、対照及びＢＴペプチド補完群の両方において、回腸中の細菌の総数を増加させた。盲腸中の細菌の数は、アイメリア曝露のために、両方の試験及び両方の処理群において減少した。いずれかの試験において２つの飼料処理の間には、全く統計的に有意な差は検出できなかった（図１０及び１１）。
【０１２１】
２つの試験の間、アイメリア曝露は、対照飼料及びＢＴペプチド補完群の両方において、回腸及び盲腸消化物の両方で、ラクトバチルス属及びビフィズス菌属の数を増加させる傾向にあった。試験２において、ＢＴペプチド群において回腸内の減少した細菌のレベルへ向けて、統計学的に有意な傾向があったが、試験１において、ＢＴペプチド群で、Ｃ．  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ−Ｅ．ｒｅｃｔａｌｅの回腸レベルの増加があった（図１２）。非曝露鳥においては差が観察されなかった（図１３及び１５）。盲腸の細菌含有量は、ＢＴによって影響を受けなかった（図１４及び１５）。いずれの試験においても、サルモネラ菌種は検出されなかった。まとめると、細菌分析は、現在の用量で、ＢＴペプチドはネイティブの（非病原性）細菌集団にほとんど、又は全く影響を与えないことを示唆しており、これは、ＢＴペプチドは処置された動物により十分に許容され、抗生物質の効果を発揮しないことを示している。
【０１２２】
本実験は、９６ｐｐｍでＢＴペプチドが補完されたニワトリで検出された、ネイティブの又は所望の腸内細菌には全く影響しないことを示唆している。対照群と比較すると、アイメリア曝露ブロイラーにおけるＢＴペプチド補足群において、ＦＤＲが大幅に改善された（それぞれ第一及び第二の試験について、ｐ＝０．０２及びｐ＝０．００６）。第二の試験における鳥の重量は、対照群と比較すると、ＢＴペプチド補完飼料によって有意に（ｐ＝０．０２６）改善した。第一の試験におけるアイメリア曝露ブロイラーの死亡率は、対照群と比較して、ＢＴペプチド処理により有意に（ｐ＝０．０１１）減少した。更に、ＢＴペプチドによる飼料の補完は、感染組織の平均病変スコアを減少させた（ｐ＝０．０９８）。
【０１２３】
実施例５
本研究は、体重増加、サルモネラコロニー化及び白血球機能に対する効果のために、ブタの飼料添加物としての、獣医グレードのＢＴ（不活性化Ｂ．テクサスポルス細胞）の使用の試験である。
【０１２４】
材料及び方法
実験の設計。離乳時（生後１７〜２１日）に、仔ブタを５個体のグループで、暖房のために熱ランプを備える檻へランダムに配置した。仔ブタに、水、及び国立研究評議会（１９９４）のガイドラインを満たす非薬用フェーズＩ飼料を自由摂取で与えた。離乳後０日、３日、５日及び７日に体重を記録した。ブタを４つの実験グループに配置した。それぞれ５匹のブタを含んだグループ１及び２は、それぞれ０ｐｐｍ又は１２ｐｐｍ（反復１）又は２４ｐｐｍ（反復２、３）ＢＴペプチドを含む、コントロールバランスの薬用ではないトウモロコシ及び大豆ミールベースの飼料を給餌した。グループ３及び４は、０又は１２（又は２４）ｐｐｍのＢＴペプチドを含む飼料を給餌されたが、これらのグループ中のブタは、ネズミチフス菌（ＳＴ）に曝露した。実験の間中、ブタにこれらの飼料を給餌した。ＢＴペプチドは、予混合として不活性化したＢ．テクサスポルス細胞の形態で送達した。
【０１２５】
サルモネラ菌血清型ネズミチフス菌（ＳＴ）。サルモネラ菌血清型ネズミチフス菌（ＳＴ）（国立獣医科学研究所［ＮＶＳＬ］）の単離物を使用し、それは、カルペニシリン及びノボビオシン（ＣＮ）に対する耐性のために選択された株であり、４℃でＴＳＢ又はトリプシン大豆寒天に維持される。サルモネラについての選択培地である、ブリリアントグリーン寒天（ＢＧＡ）を、実験研究において耐性分離株を培養するために用い、他の細菌の増殖を防ぐために、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン及び２５μｇ／ｍｌのノボビオシン（即ち、ＢＧＡ＋ＣＮ）を含んでいた。曝露のための摂取を１８〜２４時間調製した（ＴＳＢ＋ＣＮ培養物は、４１℃に維持され、滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で希釈した）。ストック溶液（１×１０９ｃｆｕ／ｍｌ）を、曝露実験のために調製した。
【０１２６】
離乳の３日後、曝露グループ内の仔ブタを、強制経口投与で、１０７ｃｆｕＳＴを投与した。曝露の５日後（離乳の七日後）、ブタを安楽死させ、各ブタの盲腸内容物１．０ｇのサンプルを無菌的に採取した。盲腸のサンプルを連続希釈し、ブリリアントグリーン寒天（ＢＧＡ）のプレート上に広げ、播種した。プレートを次に３７℃で２４時間インキュベートし、盲腸内容物のグラム当たりのＳＴのｃｆｕの数を決定した。更に、細胞（肝臓、脾臓、回腸−盲腸リンパ節、盲腸及び直腸）を、確立された方法を使用して、ＳＴの存在下で培養した。疑わしいサルモネラコロニーは、３種の糖の寒天及びリジン鉄寒天培地上で、生化学的検査によって確認し、更に、サルモネラＯ抗血清を使用して、ＳＴとして確認した。サルモネラのコロニープレート数は盲腸内容物グラム当たりｌｏｇ１０のサルモネラとして表される。
【０１２７】
離乳後のブタにおける先天性免疫応答。白血球を前述したように、密度勾配を使用して単離した（ＫＯＧＵＴら２０１０）。機能アッセイを、様々な処置を受けたブタから分離された好中球の機能を評価するために行った。好中球により使用される殺細菌の２つの方法を検討した。具体的には、好中球の脱細粒化、好中球内部の細粒からの殺菌生成物の放出、及び酸化的破裂、殺菌活性酸素種（ＲＯＳ）の生成をアッセイした。簡潔に、アッセイを以下に説明する。
【０１２８】
機能的アッセイ。白血球の酸化的破壊を、（Ｈｅら２００３）により記載されるように、ＤＣＦＨ−ＤＡを経口ＤＣＦへ酸化することによって測定した。白血球は、測定前に、ホルボールＡ−ミリステート１３アセテート（ＰＭＡ［２．０μｇ／ｍｌ］、Ｓｉｇｍａ）又は、ＲＰＭＩ  １６４０培地を用いて、６０分間刺激した。細胞を９６ウェルプレートへ播種し、蛍光度を、ＧＥＮｉｏｓＰｌｕｓ蛍光マイクロプレートリーダー［（４８５／５３０ｎｍ）Ｔｅｃａｎ  ＵＳ  Ｉｎｃ．，  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，  ＮＣ］を用いて測定した。
【０１２９】
統計解析：データについての統計分析は、ＳｉｇｍａＳｔａｔ（登録商標）統計ソフトウェア（Ｊａｎｄｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を使用して行った。実験群間の差は、スチューデントＴ検定を用いて決定される。Ｐ≦０．０５は、統計的に有意であると考えられた。
【０１３０】
結果
以下に表したデータから、サルモネラ感染（２４ｐｐｍ）の存在下で行われたにも関わらず、対照食を与えたブタよりも、ＢＴを給餌したブタは平均日増体重（ＡＤＧ）がより優れていたようである。
表７、平均日増体重。反復３、２４ｐｐｍＢＴ。ポンドの値（ポンド）。個々のブタから離乳後、０に、３に、５に及び７日に収集した体重のデータは、各時点についてプールした。データは、平均体重増加＋／−標準偏差を表す。
【表７】
0005970483.tif 000008
【０１３１】
直腸スワブデータ（表８）に示すように、ＳＴの糞便排出において一部の減少が観察された。反復１において、５日目を除き、１２ｐｐｍＢＴでの糞便排泄に差は見られなかった。反復２において、対照及び２４ｐｐｍでのＢＴは、４日目を除き、ＳＴ排出において同様であり、ここでＢＴ２４ｐｐｍ群は、対照群よりも多くの陽性のブタを有していた。反復３において、２４ｐｐｍでのＢＴ群は、全ての測定日において、対照群がしたよりも、ブタのＳＴ排出が少なかった。反復３において、ブタを、反復１及び２におけるように、５日間の代わりに感染後７日間追跡調査した。
表８．毎日の直腸スワブデータ
【表８】
0005970483.tif 000009
【０１３２】
ペプチドを給餌したブタは、全体として対照のブタと比較して、リンパ節、肝臓、脾臓などの臓器におけるサルモネラ含有用は少なかったが、回腸（反復３を除く）、盲腸、直腸などの腸組織においては減少は見られなかった。反復１において、１２ｐｐｍでのＢＴ群は、肝臓及び脾臓の両方において、ＳＴについて陽性のブタの数は少なかったが、ＳＴの回収率は、リンパ節及び盲腸及び直腸で同じであった（表９）。反復２において、ＢＴ群は、盲腸を除く全ての組織において、陽性のブタが少なかった。反復３において、リンパ節、脾臓、回腸、盲腸、直腸におけるＳＴ陽性のＢＴ群のブタは少なかった。コロニー形成データ（ＣＦＵ）は、ＳＴの低い回収率のために不確定であった（データは示さず）。ペプチドは、離乳したブタにおけるサルモネラ浸潤とコロニー形成について、いくらかのプラスの効果を有しているようである。
表９．組織から単離されたサルモネラ
【表９】
0005970483.tif 000010
【０１３３】
ＢＴ胞子形成能欠損株を給餌したブタからの白血球は、ＢＴペプチドを給餌して３、５及び７日目に、対照ブタから得た白血球よりも、有意に高い酸化バースト応答（表１０）を有していた（ｐ＜０．０５）。
表１０．ブタ白血球酸化バースト活性。ブタは、試験器官を通じて、それぞれの飼料を与えた（２４ｐｐｍＢＴ）。ブタは、離乳後３、５及び７日目に採血した。データは、２回の反復を表し、１０匹のブタ／群からプールした。データは、平均＋／−標準偏差として表した。ＲＦＵ＝反射蛍光単位（１，０００における）。
【表１０】
0005970483.tif 000011
【０１３４】
データは、不活性化したＢ．テクサスポルス細胞は、体重増加において潜在的なプラスの効果を有するブタにおいて効果的な免疫調節物質であり、腸及び組織におけるサルモネラの保菌体であることを示している。
【図１】
0005970483.tif 000012
【図２】
0005970483.tif 000013
【図３】
0005970483.tif 000014
【図４】
0005970483.tif 000015
【図５】
0005970483.tif 000016
【図６】
0005970483.tif 000017
【図７】
0005970483.tif 000018
【図８】
0005970483.tif 000019
【図９】
0005970483.tif 000020
【図１０】
0005970483.tif 000021
【図１１】
0005970483.tif 000022
【図１２】
0005970483.tif 000023
【図１３】
0005970483.tif 000024
【図１４】
0005970483.tif 000025
【図１５】
0005970483.tif 000026